RS61423B1 - Ciklična dinukleotidna jedinjenja - Google Patents

Description

Oblast pronalaska

Predmetni pronalazak se odnosi na nova ciklična dinukleotidna jedinjenja ("CDNs") formule I, uključujući njegove farmaceutski prihvatljive soli, koji sadrže ne-purinsku nukleobazu imidazopiridazinona, jednu purinsku nukleobazu i jedan ne-kanonski 2’, 5’ fosforotioatni deo i indukuju proizvodnju citokina. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije i kombinacije koje sadrže jedinjenja predmetnog pronalaska, i na njihovu medicinsku upotrebu za lečenje bolesti povezanih sa ili modulisani sa STING-om (ili stimulišući geni za interferon). Naročito, farmaceutske kompozicije pronalaska su pogodne za lečenje upale, alergijskih i autoimunih bolesti, zaraznih bolesti, karcinoma i kao dodatne supstance za vakcinu.

Stanje tehnike

Uloga imunološkog sistema je da zaštiti telo od patogena i malignih ćelija. Međutim, virusi i ćelije raka pronalaze načine da izbegnu imuni sistem. Cilj imunoterapija je stoga iniciranje antigenski specifičnog imunološkog odgovora ili ponovno aktiviranje postojećeg odgovora u određenim tipovima ćelija imunog sistema protiv patogenih napadača ili ćelija karcinoma.

Imuni sistem se sastoji od nekoliko specijalizovanih loza koje se mogu grubo grupisati u dva kraka, urođeni i adaptivni imuni sistem. Za uspešnu imunološku reakciju loze oba kraka moraju delovati zajedno. Glavna uloga urođenog imunološkog sistema je uspostavljanje brzog imunološkog odgovora na patogene ili maligne ćelije koji, za razliku od adaptivnog sistema, nije specifičan za antigen i dugotrajan. Pored direktnog ubijanja patogena ili transformisanih ćelija, urođeni imuni sistem takođe aktivira i naknadno usmerava adaptivni imuni sistem. ûelije koje predstavljaju antigen, poput dendritičnih ćelija, hvataju i predstavljaju antigene u obliku kompleksa histokompatibilnosti sa glavnim peptidom (MHC) T ćelijama u limfoidnim tkivima. Ova prezentacija antigena zajedno sa sekrecijom određenih citokina dovodi do aktivacije i diferencijacije antigen specifičnih efektorskih CD4 i CD8 T ćelija. Proizvodnja interferona tipa I (IFN) sa ćelijama koje predstavljaju antigen i drugim tipovima ćelija smatra se ključnim događajem u aktivaciji T ćelija jer je nedostatak IFN tipa I rezultirao smanjenim imunološkim odgovorom T virusnih infekcija ili ćelija tumora (Zitvogel et al, Nature Reviews Immunology 15, 405 - 414, 2015). S druge strane, prisustvo potpisa IFN tipa I tokom lečenja raka povezano je sa povećanim brojem T ćelija koje infiltriraju tumor i potencijalno povoljnim kliničkim ishodom (Sistigu et al, Nature Medicine 20, 1301 – 1309, 2014).

Nedavne studije na miševima pokazale su da efikasno lučenje IFN tipa I u mikrookolini tumora i indukcija imunološkog odgovora zavisnog od T ćelija protiv ćelija karcinoma zavisi od prisustva adaptera proteinskog stimulatora gena interferona (STING, takođe poznat kao Tmem173, MPYS, MITA, ERIS) (Woo et al, Immunity 41, 5, 830 – 842, 2014; Corrales et al, Cell Reports 11, 1018 – 1030, 2015; Deng et al, Immunity 41, 5, 843 – 852, 2014). Važnost prisustva IFN tipa I naglašena je činjenicom da je brisanje STING-a rezultiralo smanjenim nivoom IFN tipa I u mikrookolini tumora i smanjenim antitumorskim efektom na nekoliko modela tumorskih miševa. S druge strane, specifična aktivacija STING-a rezultirala je poboljšanim, antigenom specifičnim imunološkim odgovorom T ćelija protiv ćelija karcinoma.

STING pripada porodici senzora nukleinske kiseline i adapter je za citosolnu DNK signalizaciju. U svom bazalnom stanju STING postoji kao dimer sa svojim N terminalnim domenom usidrenim u ER i C-terminalnim domenom koji boravi u citozolu. Ciklični di-nukleotidi (CDN), generisani protein cikličnom GMP-AMP sintazom (cGAS) su prirodni ligandi STING-a (Ablasser et al, Nature 498, 380 – 384, 2013). Vezivanje CDN-a za STING indukuje konformacione promene koje omogućavaju vezivanje i aktiviranje TANK vezujuće kinaze (TBK1) i interferonskog regulatornog faktora 3 (IRF3) i relokalizaciju iz ER u perinuklearne endosome (Liu et al, Science 347, Issue 6227, 2630-1 – 2630-14, 2015). Fosforilacija transkripcionog faktora IRF3 i NF-kB pomoću TBK1 dovodi do ekspresije višestrukih citokina, uključujući IFN tipa I.

S obzirom na značaj IFN tipa I u nekoliko malignih oboljenja, uključujući virusne infekcije i terapiju karcinoma, terapijske strategije koje omogućavaju specifičnu aktivaciju STING-a su od terapeutskog interesa.

WO 2014/189805 opisuje ciklična dinukleotidna jedinjenja koja sadrže dve purinske nukleobaze i najmanje jedan nekanonski 2’, 5’ fosfodiestarski ili fosforotioatni deo i indukuju STING-zavisnu proizvodnju citokina.

WO 2015/185565 opisuje ciklična dinukleotidna jedinjenja koja sadrže dve purinske nukleobaze, jedan ili dva ciklopentana umesto riboznih tetrahidrofuranskih prstenova i jedan nekanonski 2’, 5’ fosfodiestarski deo i moduliraju STING.

WO 2016/120305 opisuje ciklična dinukleotidna jedinjenja koja sadrže dve purinske nukleobaze, jedan ostatak riboze u kojem je 2’-OH zamenjen sa 2’-F i jedan nekanonski 2’, 5’ fosfodiestarski deo i moduliraju STING.

US 2014/0329889, WO 2014/099824, WO 2015/017652, Cell 154, 748–762 (2013), i Molecular Cell 51, 226–235 (2013) opisuju ciklični dinukleotid 2’3’-cGAMP (ciklični [G(2’,5’)pA(3’,5’)p]) koji sadrži dve purinske nukleobaze, jedan kanonski 3’,5’ i jedan ne-kanonski 2’,5’ fosfodiestarske delove. Ne-kanonski povezan 2’3’-cGAMP vezuje se za humani STING sa većim afinitetom od kanonski povezanog 3’3’-cGAMP ili simetričnog bakterijskog c-di-GMP i indukuje proizvodnju interferona tipa I.

WO 2014/093936 opisuje ciklična dinukleotidna jedinjenja koja sadrže dve purinske nukleobaze i dva kanonska 3’, 5’ fosfodiestarska ili fosforotioatna dela i indukuju STING-zavisnu proizvodnju citokina.

US 7,709,458 opisuje ciklična jedinjenja dinukleotida koja sadrže dve purinske nukleobaze i dva kanonska 3 ’, 5’ fosfodiestarska dela i mogu se koristiti za inhibiranje proliferacije ćelija karcinoma ili za povećanje apoptoze ćelija karcinoma, posebno simetrične bakterijske CDN c-di-GMP.

US 7,592,326 opisuje imunostimulatorna ciklična dinukleotidna jedinjenja koja sadrže dve purinske nukleobaze i dva kanonska 3’,5’ fosfodiestarska dela, posebno simetrične bakterijske CDN c-di-GMP.

WO 2016/096174 i WO 2016/145102 opisuju ciklična jedinjenja dinukleotida koja sadrže dve purinske nukleobaze i dva kanonska 3’, 5’ fosfodiestarska ili fosforotioatna dela i indukuju STING-zavisnu proizvodnju citokina.

Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 5631–5634 opisuje imunostimulatorne mono- i bisfosforotioatne analoge simetrične bakterije CDN c-di-GMP.

Kratak opis pronalaska

U prvom aspektu pronalazak obezbeđuje ciklična dinukleotidna jedinjenja formule I

gde

R<1>je odabran između grupe koja se sastoji od H, F, -O-C1-3-alk i OH, i

R<2>je H, ili

R<2>je -CH2- i R<1>je –O–, obrazuju zajedno -CH2-O- most ((Zaključana Nukelinska Kiselina) “Locked Nucleic Acid”; “LNA”), i

R<3>je purinska nukelobaza odabrana između grupe koja se sastoji od purina, adenina, guanina, ksantina, hipoksantina, povezani kroz njegov N<9>azot;

tautomeri, stereoizomeri, solvati, hidrati,

i njihove soli, naročito njihove fiziološki prihvatljive soli sa neorganskim ili organskim bazama, ili njihove kombinacije.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja formule I, uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli, koja in vitro i / ili in vivo indukuju proizvodnju citokina u zavisnosti od STING-a i poseduju pogodna farmakološka i farmakokinetička svojstva za upotrebu u terapiji, odn. za upotrebu kao medikamenti.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja formule I, uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli, za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja povezanih sa ili modulisanih sa STING.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja formule I, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, za lečenje upale, alergijskih ili autoimunih bolesti, na primer alergijskog rinitisa ili astme, za lečenje zaraznih bolesti ili karcinoma, ili za upotrebu kao pomoćne supstance za vakcine.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja bolesti ili stanja povezanog sa ili moduliranog sa STING-om, kod subjekta koji se sastoji od davanja terapeutski efikasne količine jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, subjektu.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja upale, alergijskih ili autoimunih bolesti, na primer alergijskog rinitisa ili astme, za lečenje zaraznih bolesti ili karcinoma kod pacijenta kome je to potrebno, koji uključuje primenu terapeutski efikasne količine jedinjenje formule I ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pacijenta.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I, uključujući njegove farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji leka za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja u kojima je modulacija STING-a korisna ili za upotrebu u lečenje bolesti ili stanja povezanog ili moduliranog od strane STING.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, u proizvodnji leka za upotrebu u lečenju upala, alergijskih ili autoimunih bolesti, na primer alergijskog rinitisa ili astme, za lečenje zaraznih bolesti ili karcinoma, ili za upotrebu kao pomoćna supstanca za vakcine.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje jedan dodatni terapeutski agens.

Dalji cilj predmetnog pronalaska je da obezbedi farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje još jedan dodatni terapeutski agens i jednu ili više farmaceutski prihvatljivih pomoćnih supstanci.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje jedan dodatni terapeutski agens za upotrebu u terapiji.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje još jedan terapeutski agens za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja u kojima je modulacija STING-a korisna ili za upotrebu u lečenju bolesti ili stanja povezanog sa ili modulisanog od strane STING.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kombinaciju koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje jedan dodatni terapeutski agens za upotrebu u lečenju upala, alergijskih i autoimunih bolesti, zaraznih bolesti i raka.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja bolesti ili stanja u kome je modulacija STING-a korisna ili bolesti ili stanja koja su povezana ili modulirana sa STING-om, kod pacijenta, koja uključuje davanje pacijentu terapeutski efikasne količine kombinacija koja sadrži jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, i najmanje još jedan dodatni terapeutski agens.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja upale, alergijskih ili autoimunih bolesti, zaraznih bolesti ili karcinoma kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pacijentu terapeutski efikasne količine kombinacije koja sadrži jedinjenje formule I ili farmaceutski njegova prihvatljiva so i najmanje još jedan dodatni terapeutski agens.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje pomoćnu supstancu za vakcine koji sadrži jedinjenje formule I ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje imunogensku kompoziciju koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju i jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje imunogensku kompoziciju koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju i jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju imunogenske kompozicije koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju, za lečenje ili prevenciju bolesti.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ili sprečavanja bolesti, koji uključuje primenu na ljudskom subjektu koji pati ili je podložan bolesti, imunogene kompozicije koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju i jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju i jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja formule I, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju kompozicije vakcine koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju, za lečenje ili prevenciju bolesti.

U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja ili sprečavanja bolesti koji uključuje primenu na ljudskom subjektu koji pati ili je podložan bolesti, kompozicije vakcine koja sadrži antigen ili antigensku kompoziciju i jedinjenje formule I, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so.

Dalji ciljevi predmetnog pronalaska postaju očigledni stručnjaku u ovoj oblasti prethodno opisanim tekstom, kao i sledećim i primerima.

Jedinjenja predmetnog pronalaska pokazuju nekoliko prednosti, kao što su povoljan afinitet vezivanja za humani STING, povoljna ćelijska aktivnost, odn. u ćelijama koje nose različite humane STING alele, povoljna stabilnost u ćelijskim testovima, i povoljna farmakokinetička (PK) svojstva.

Detaljan Opis

Ukoliko nije drugačije naznačeno, R<1>, i R<2>i R<3>su definisani kao gore i dalje u nastavku. U nastavku će se dati neka poželjna značenja pojedinačnih supstituenata jedinjenja prema pronalasku. Svaka od ovih definicija može se međusobno kombinovati.

R<1>i R<2>:

U prvom izvođenju R<1>i R<2>su definisani kao što je navedeno gore.

U drugom izvođenju R<1>i R<2>oba su H.

U još jednom izvođenju R<1>je F a R<2>je H.

U još jednom izvođenju R<1>je -OH a R<2>je H.

U još jednom izvođenju R<1>je –OCH3a R<2>je H.

U još jednom izvođenju R<1>je –O– a R<2>je -CH2-, obrazujući zajedno -O-CH2- most.

R<3>:

U prvom izvođenju R<3>je definisan kao što je gore navedeno.

U drugom izvođenju R<3>je purin, povezan kroz njegov N<9>azot.

U drugom izvođenju R<3>je adenin, povezan kroz njegov N<9>azot.

U još jednom izvođenju R<3>je guanin, povezan kroz njegov N<9>azot.

U još jednom izvođenju R<3>je ksantin, povezan kroz njegov N<9>azot.

U još jednom izvođenju R<3>je hipoksantin, povezan kroz njegov N<9>azot.

Sledeća tabela predstavlja dalja specifična izvođenja I-1 do I-16 jedinjenja formule I:

1

Poželjna podstruktura jedinjenja prema pronalasku prikazana je u formuli Ia,

Ia,

gde R<1>i R<2>kao i njihova izvođenja su definisano kao što je opisano gore.

Poželjna podstruktura jedinjenja prema pronalasku prikazana je u formuli Ib,

Ib

gde R<1>i R<2>kao i njihova izvođenja su definisano kao što je opisano gore.

Sledeća jedinjenja prema pronalasku su naročito poželjna:

njihovi tautomeri i stereoizomeri, njihove soli, posebno njihove fiziološki prihvatljive soli sa neorganskim ili organskim bazama, njihovi solvati ili hidrati.

Jedinjenja predmetnog pronalaska poseduju atome hiralnog fosfora bilo sa Rp ili Sp konfiguracijom. Svi stereoizomeri jedinjenja opšte formule I, la, lb, la.1, la.2, la.3 i lb.1, bilo u suštinski čistom obliku ili kao njihove smeše, obuhvaćeni su predmetnim pronalaskom. Jedinjenja opšte formule I, Ia, Ib, Ia.1, Ia.2, Ia.3 i Ib.1 kao suštinski čisti (Rp, Rp), (Rp, Sp), (Sp, Rp) ili (Sp, Sp) stereoziomeri su poželjna, posebno suštinski čisti (Rp, Rp) stereoizomer, odn. oba atoma fosfora imaju Rp konfiguraciju.

Jedinjenja prema pronalasku i njihovi intermedijari mogu se dobiti korišćenjem metoda sinteze koje su poznate stručnjaku i opisane u literaturi o organskoj sintezi. Poželjno je da se jedinjenja dobijaju analogno postupcima pripreme koji su u nastavku detaljnije objašnjeni, naročito kao što je opisano u eksperimentalnom delu. U nekim slučajevima redosled usvojen u sprovođenju reakcionih šema može biti različit. Takođe se mogu koristiti varijante ovih reakcija koje su poznate stručnjaku, ali ovde nisu detaljno opisane. Opšti postupci za pripremu jedinjenja prema pronalasku postaće očigledni stručnjaku pri proučavanju šema koje slede. Polazna jedinjenja su komercijalno dostupna ili se mogu pripremiti postupcima koji su opisani u literaturi ili ovde, ili se mogu pripremiti na analogan ili sličan način. Pre nego što se reakcija izvede, bilo koje odgovarajuće funkcionalne grupe u jedinjenjima mogu biti zaštićene upotrebom konvencionalnih zaštitnih grupa. Ove zaštitne grupe mogu se ponovo

1

cepati u pogodnoj fazi unutar reakcione sekvence primenom metoda poznatih stručnjaku u ovoj oblasti.

Ovde opisani ciklični dinukleotidi mogu se pripremiti kako je detaljno opisano u daljem tekstu, ili drugim metodama poznatim stručnjacima. Običnom stručnjaku u tehnici će biti jasno da ove šeme ni na koji način ne ograničavaju i da se mogu napraviti varijacije detalja bez odstupanja od predmeta pronalaska.

Ciklična dinukleotidna jedinjenja se mogu dobiti postupcima koji su opisani u Chem. Rev. 113, 7354í7401 (2013), Org. Lett., 12, 3269-3271 (2010), Tetrahedron 49, 1115-1132 (1993), WO 2014/189805, WO 2016/096174, WO 2015/185565, WO 2016/145102 ili WO 2016/120305 i referencama citiranim u njima.

Izraz "zaštitna grupa", kako se ovde koristi, i ukoliko nije drugačije definisano, odnosi se na hemijsku funkcionalnu grupu koja je vezana za atom kiseonika, azota ili fosfora radi sprečavanja dalje reakcije tog atoma ili u druge svrhe. Širok spektar zaštitnih grupa poznat je stručnjacima u oblasti organske sinteze i opisani su, na primer, u “Protective Groups in Organic Synthesis” od strane T.W. Greene and P.G.M. Wuts , Third Edition, 1999.

Jedinjenja formule (I) i njihove soli mogu se dobiti prema dole opisanoj metodologiji, koja čini dalje aspekte ovog pronalaska.

Oni koji su vešti u tehnici shvatiće da fosforotioatni delovi u formuli (I) mogu da postoje u R konfiguraciji (RP) ili S konfiguraciji (SP). Metodologija opisana u daljem tekstu može dati do četiri dijastereomera u odnosu na atome fosfora koji se mogu razdvojiti hromatografskim metodama poznatim stručnjaku, na primer tečnom hromatografijom visokog pritiska sa odgovarajućim sistemima rastvarača i kolonama u različitim fazama sinteza. U nekim slučajevima, na primer kada se jedan korak sumporisanja odvija dijastereoselektivno, ovde opisana metodologija može preferencijalno dati samo dva dijastereomera koji se mogu razdvojiti hromatografskim metodama poznatim stručnjaku u različitim fazama sinteze.

Supstituenti koji nisu izričito navedeni u sledećim metodama pripreme podrazumevaju se da pokrivaju definicije pomenute ranije u Kratkom opisu pronalaska.

Jedinjenje formule

gde R<4>i opciono R<1>su OH, može se dobiti

uklanjanjem zaštite jedinjenja formule (II),

gde R<4.1>i opciono R<1.1>je kiseonik koji nosi pogodnu zaštitnu grupu, kao što je tercbutdimetsil (TBS). Na primer, R<1.1>je H, F, O-alkil ili OTBS ili, zajedno sa R<2>, obrazuje -CH2-O- most, a R<4.1>je OTBS. Na primer, jedinjenje formule (II) je rastvoreno u pogodnom rastvaraču, na primer piridin, tretiran sa smešom trietamin trihidrofluorida i trietamina i mešan na pogodnoj temperaturi, na primer 20-60°C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 1-6 sati.

Jedinjenje formule (II) može biti dobijeno uklanjanjem zaštite jedinjenja formule (III),

1

gde ili R<3.1>označava NH noseći pogodnu zaštitnu grupu, kao što je benzo, i R<3.2>označava H (“zaštićeni adenin”) ili

R<3.1>označava OH i R<3.2.>označava NH koji nosi pogodnu zaštitnu grupu, kao što je izo-butir (“zaštićeni guanin”) ili

R<3.1>označava OH i R<3.2.>označava H (“hipoksantin”) ili

R<3.1>i R<3.2>oba označavaju H (“purin”).

Na primer, jedinjenje formule (III) je rastvoreno u pogodnoj smeši, na primer metamina ili vodenog amonijaka u metanolu ili etanolu, i mešano na pogodnoj temperaturi, na primer 20-60°C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 1-24 sati.

Jedinjenje formule (III) može se dobiti ciklizacijom i naknadnom sulfurizacijom jedinjenja formule (IV), gde R<2>, R<3.1>,R<3.2.>, R<1.1>i R<4.1>su definisani kao što je navedeno ranije gore:

Na primer, jedinjenje formule (IV) je rastvoreno u pogodnom rastvaraču, na primer piridinu, i tretiran je sa odgovarajućim reagensom za kuplovanje, na primer 2-hloro-5, 5-dimeti-1,3,2-dioksafosforinana 2- oksida (DMOCP) ili pivaloil hlorida ili adamanto hlorida, i mešano na pogodnoj temperaturi, na primer 20 °C, u pogodnom vremenskom periodu, na primer 0.1-2 sata. Reakcija ciklizacije je zaustavljena tretiranjem odgovarajućim reagensom za sulforizaciju, na primer, 3H-1,2-benzoditiol-3-on ili elementarnim sumporom, i mešana na odgovarajućoj temperaturi, na primer 20 °C, u odgovarajućem vremenskom periodu , na primer 0.1-2 sata.

Jedinjenje formule (IV) se može dobiti spajanjem jedinjenja formule (V) sa jedinjenjem formule (Vl), pri čemu R<2>, R<3.1>,R<3.2.>, R<1.1>i R<4.1>su definisani kao što je navedeno ranije gore:

1

Na primer, jedinjenje formule (Vl) je rastvoreno u pogodnom rastvaraču, na primer acetonitrilu, i tretiran je sa rastvorom jedinjenja formule (V) rastvorenim u pogodnom rastvaraču, na primer acetonitrilom, opciono u prisustvu pogodnog reagensa za kuplovanje, na primer tetrazol, Activator 42<®>(aktivator rastvor, koji sadrži 5-(3,5-bis(trifluorometil)fenil)-1H-tetrazol u acetonitrilu), piridinijum dihloroacetat ili piridinijum trifluoroacetat (ili smeše reagenasa za kuplovanje), i mešan na pogodnoj temperaturi, na primer 20°C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 0.1-2 sata. Reakcija kuplovanja je zaustavljena tretiranjem sa pogodnim reagensom za sulforizaciju, na primer, 3-((N,N-dimetaminometiden)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tion (DDTT) ili fenacetil disulfid (PADS) ili 3H-1,2-benzodihiol-3-on 1,1-dioksid (Beaucage’s reagens), i mešan na pogodnoj temperaturi, na primer 20°C, za određeni period vremena, na primer 0.1-2 sati. Posle uparavanja rastvarača, ostatak je rastvoren u pogodnom rastvaraču, na primer smeši dihlorometana i vode, i tretiran sa pogodnim reagensom, na primer dihlorosirćetna kiselina, i mešan na pogodnoj temparaturi, na primer 20°C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 0.1-2 sati. Rastvor koji sadrži proizvod (IV) dobija se dodavanjem pogodnog rastvarača, na primer piridina, i koncentrovanjem isparavanjem.

Jedinjenje formule (V) može se dobiti reakcijom jedinjenja formule (Vll), gde R<2>, R<3.1>,R<3.2.>, R<1.1>i R<4.1>su definisani kao što je navedeno ranije gore:

1

Na primer, jedinjenje formule (Vll) je rastvoreno u pogodnoj smeši, na primer acetonitrilu koji sadrži vodu, i tretiran sa piridinijum trifluoroacetatom, i mešan na pogodnoj temperaturi, na primer 20°C, za određeni period vremena, na primer 1-30 minuta. Potom je dodat terc-butamin i smeša je mešana na pogodnoj temperaturi, na primer 20°C, za određeni period vremena, na primer 0.1-1 sat. Proizvod je izolovan uparavanjem rastvarača, a potom rastvoren u pogodnom rastvaraču, na primer dihlorometanu koji sadrži vodu, i tretiran sa dihlorosirćetnom kiselinom i mešan na pogodnoj temperaturi, na primer 20°C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 0.1-1 sat. Koncentrovani rastvor proizvoda (V) u acetonitrilu se dobija, na primer, dodavanjem piridina, a zatim azeotropiranjem smeše sa acetonitrilom.

Jedinjenje formule (Vl) se može dobiti reakcijom jedinjenja formule (VIII), gde je R<4.1>definisan kao što je navedeno ranije gore:

O

Na primer, nakon azeotropiranja sa pogodnim rastvaračem, na primer acetontrilom, jedinjenje formule (VIII) se rastvara u pogodnom rastvaraču, na primer dihlormetanu, i reaguje sa fosfitirajućim reagensom, na primer 2-cijanoetil N,N,N',N'-tetraizoprofosforodiamidit, u prisustvu aktivatora, na primer 1H-tetrazola, i meša se na pogodnoj temperaturi, na primer 20 °C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 1-48 sati.

Jedinjenje formule (VIII) se može dobiti reakcijom jedinjenja formule (IX):

1

Na primer, jedinjenje formule (IX) je rastvoreno u pogodnom rastvaraču, na primer, piridinu, i reaguje sa pogodnim silirajućim reagensom, na primer terc-butimetilsilil hloridom, u prisustvu pogodne baze, na primer imidazola, i mešano na pogodnoj temperaturi, na primer 20 °C, u odgovarajućem vremenskom periodu, na primer 1-48 sati. Regioizomerni 2 ’i 3’ silirani proizvodi su izolovani nakon obrade u vodi i mogu se odvojiti, na primer hromatografijom na silika gelu sa odgovarajućim sistemima rastvarača.

Jedinjenje formule (IX) se može dobiti reakcijom jedinjenja formule (X):

Na primer, jedinjenje formule (X) je rastvoreno u pogodnom rastvaraču, na primer piridinu, i reaguje sa 4,4'-dimetoksitritil hloridom i meša na pogodnoj temperaturi, na primer 20 °C, u odgovarajućem vremenskom periodu , na primer 1-48 sati.

Jedinjenja opšte formule I, ili njihovi sintetski intermedijari, mogu se razdvojiti u svoje diastereomere kao što je dole navedeno. Dijastereomerne smeše jedinjenja opšte formule I mogu se razdvojiti u njihove dijastereomere tako što će se iskoristiti njihova različita fizičko-hemijska svojstva, koristeći metode poznate same po sebi, npr. hromatografija i / ili frakciona kristalizacija.

Kao što je gore navedeno, jedinjenja formule I se mogu pretvoriti u soli, naročito za farmaceutsku upotrebu, u farmaceutski prihvatljive soli.

1

Jedinjenja prema pronalasku se takođe povoljno mogu dobiti korišćenjem postupaka opisanih u primerima koji slede, koji se u tu svrhu takođe mogu kombinovati sa metodama poznatim stručnjaku iz literature.

Izrazi i definicije

Izrazi koji ovde nisu posebno definisani treba dati značenja koja bi im dao stručnjak u tehnici u svetlu otkrivanja i konteksta. Međutim, kako se koristi u opisu, ukoliko nije drugačije naznačeno, sledeći izrazi imaju naznačeno značenje i pridržavaju se sledećih konvencija.

Izrazi "jedinjenje(a) prema ovom pronalasku", "jedinjenje(a) formule (I)", "jedinjenje(a) pronalaska" i slično označavaju jedinjenja formule (I) prema predmetnom pronalasku, uključujući njihove tautomere, stereoizomere i njihove smeše i njihove soli, posebno njihove farmaceutski prihvatljive soli, i solvate i hidrate takvih jedinjenja, uključujući solvate i hidrate takvih tautomera, stereoizomera i njihovih soli.

Izrazi "lečenje" i "koji se leči" obuhvataju i preventivni, odn. profilaktički, ili terapeutski, odn. lekovito i / ili palijativno, lečenje. Prema tome, izrazi "lečenje" i "koji se leči" obuhvataju terapijsko lečenje pacijenata koji su već razvili navedeno stanje, posebno u manifestnom obliku. Terapijsko lečenje može biti simptomatsko lečenje u cilju ublažavanja simptoma specifične indikacije ili uzročnog lečenja kako bi se preokrenuli ili delimično preokrenuli uslovi indikacije ili zaustavilo ili usporilo napredovanje bolesti. Prema tome, kompozicije i postupci ovog pronalaska mogu se koristiti, na primer, kao terapijsko lečenje tokom određenog vremenskog perioda, kao i za hroničnu terapiju. Pored toga, izrazi "lečenje" i "koji se leči" uključuju profaktičko lečenje, odn. lečenje pacijenata sa rizikom da razviju prethodno pomenuto stanje, čime se smanjuje navedeni rizik.

Kada se ovaj pronalazak odnosi na pacijente kojima je potrebno lečenje, prvenstveno se odnosi na lečenje sisara, naročito ljudi.

Izraz "terapeutski efikasna količina" označava količinu jedinjenja predmetnog pronalaska koja (i) leči ili sprečava određenu bolest ili stanje, (ii) umanjuje,

2

poboljšava ili uklanja jedan ili više simptoma određene bolesti ili stanja, ili (iii) sprečava ili odlaže pojavu jednog ili više simptoma određene bolesti ili stanja opisanog ovde.

Izrazi "modulisani" ili "modulirajući", ili "moduliran(i)", kako se ovde koriste, ukoliko nije drugačije naznačeno, odnose se na aktiviranje STING puta sa jednim ili više jedinjenja predemtnog pronalaska, u ovom slučaju koji predstavljaju STING agoniste.

Izrazi „posredovano“ ili „koji posreduje“ ili „posredovanje“, kako su ovde upotrebljeni, ukoliko nije drugačije naznačeno, odnose se na (i) lečenje, uključujući prevenciju određene bolesti ili stanja, (ii) slabljenje, ublažavanje ili uklanjanje jednog ili više simptoma određene bolesti ili stanja, ili (iii) sprečavanje ili odlaganje pojave jednog ili više ovde opisanih simptoma određene bolesti ili stanja.

U slučaju da je jedinjenje predemtnog pronalaska prikazano u obliku hemijskog naziva i kao formula u slučaju bilo kakvih odstupanja, formula će prevladati.

Zvezdica se može koristiti u pod-formulama da označi vezu koja je povezana sa molekulom jezgra kako je definisano.

Ukoliko nije posebno naznačeno, u celom opisu i priloženim zahtevima, data hemijska formula ili naziv obuhvataće tautomere i sve stereo, optičke i geometrijske izomere (npr. enantiomere, dijastereomere, E / Z izomere itd.) i njihove racemate, kao i njihove smeše u različitim proporcijama odvojenih enantiomera, smeša diastereomera ili smeša bilo kog od prethodno navedenih oblika gde takvi izomeri i enantiomeri postoje, kao i soli, uključujući njihove farmaceutski prihvatljive soli i njihove solvate, kao što su na primer hidrati, uključujući solvate slobodnih jedinjenja ili solvate soli jedinjenja.

Izraz ‘’suštinski čist“ kako se ovde koristi u odnosu na jedinjenja opšte formule I odnosi se na jedan (Rp, Rp), (Rp, Sp), (Sp, Rp) ili (Sp, Sp) diastereomer koji je najmanje 75% čista u odnosu na ostale moguće dijastereomere u odnosu na atome fosfora. U poželjnim izvođenjima, suštinski čista jedinjenja opšte formule I su najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 97% i najmanje 99% čisti.

Izraz "farmaceutski prihvatljiv" se ovde koristi da bi se odnosio na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i / ili dozne oblike koji su, u okviru zdrave medicinske presude, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudi i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacija, alergijski odgovor, ili drugi problem ili komplikacija, i srazmerno razumnom odnosu koristi / rizika.

Kako je ovde korišćeno, ‘’farmaceutski prihvatljive soli“ se odnose na derivate otkrivenih jedinjenja, pri čemu je matično jedinjenje modifikovano pravljenjem njihovih soli sa bazama. Farmaceutski prihvatljive soli predmetnog pronalaska mogu se sintetizovati iz matičnog jedinjenja koje sadrži kiselinski ostatak uobičajenim hemijskim metodama. Uopšteno, takve soli se mogu dobiti reakcijom oblika slobodnih kiselina ovih jedinjenja sa dovoljnom količinom odgovarajuće baze u vodi ili u organskom razblaživaču poput etra, ecetata, etanola, izopropanola ili acetonitrila ili njihove smeše. Alternativno, soli se mogu pripremiti jonskom razmenom, na primer tretiranjem vodenih rastvora jedinjenja prema pronalasku (oblik slobodne kiseline ili soli) pomoću izmenjivača katjona.

Farmakološka Aktivnost

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku pokazuju povoljan afinitet za vezivanje za humani STING. Afinitet vezivanja se, na primer, može odrediti testom kompetitivnog vezivanja na osnovu scintilacionog testa (SPA), kao što je opisano u Nat. Chem. Biol.

10, 1043–1048 (2014). Alternativno, afinitet vezivanja može se, na primer, odrediti izotermnom titracionom kalorimetrijom (ITC) kako je opisano u Molecular Cell 51, 226-235 (2013). Alternativno, afinitet vezivanja se, na primer, može odrediti površinskom plazmonskom rezonancom (SPR) kako je opisano u WO 2016/145102. Alternativno, afinitet vezivanja može se odrediti diferencijalnom skenirajućom fluorimetrijom (DSF), na primer kako je opisano u WO 2016/145102.

Jedinjenja prema predmetnom pronalasku pokazuju povoljnu ćelijsku aktivnost. In vitro indukcija citokina se može meriti u referentnim ćelijskim linijama, na primer u THP1 ćelijama, na sličan način kao što je opisano u WO 2016/096174. Jedinjenja prema predmetnom pronalasku pokazuju povoljnu ćelijsku aktivnost u ćelijama koje nose različite humane STING alele. Humani STING postoji u najmanje pet poznatih varijanti (WT, HAQ, REF / 232H, AQ, Q / 293 Q). Da bi se testirala aktivnost različitih CDN-ova na humanim STING varijantama, THP1-STING KO ćelije mogu biti stabilno transdukovane vektorima koji kodiraju za različite STING varijante. Dalje, in vitro indukcija citokina se može meriti u ljudskim primarnim PBMC ili ljudskim dendritičnim ćelijama.

Jedinjenja prema predemetnom pronalasku pokazuju povoljnu stabilnost u in vitro ćelijskim testovima, na primer sa THP1 ćelijama, Calu-3 ćelijama ili humanim hepatocitima. Dalje, jedinjenja prema predmetnom pronalasku pokazuju povoljnu hemijsku stabilnost u rastvoru i čvrstom stanju.

Pored toga, jedinjenja prema predmetnom pronalasku pokazuju povoljna farmakokinetička (PK) svojstva. Svojstva PK mogu se odrediti u pretkliničkim vrstama životinja, na primer miš, pacov, hrčak, pas, zamorčLć, mini svinja, majmun cinomolgus, rezus majmun. PK svojstva jedinjenja se mogu opisati, na primer, sledećim parametrima: Srednje vreme zadržavanja (MRT), poluživot eliminacije (t1/2, odn. vreme potrebno da koncentracija leka dostigne polovinu svoje prvobitne vrednosti), zapremina distribucije (VD, odn. prividna zapremina u kome se lek distribuira), površina ispod krive (AUC, odn. integral krive koncentracija-vreme nakon jedne doze), klirens (CL, odn. zapremina očišćene od leka u plazmi u jedinici vremena) , kako je opisano u E. Kerns & L. Di (Drug-like properties: concepts, structure design and methods: from ADME to toxicity optimization, Elsevier, 1<st>ed, 2008).

Određena jedinjenja prema predemtnom pronalasku pokazuju povoljnu in vivo farmakološku aktivnost, na primer na mišjim modelima MC38, 4T1, Colon26, EMT6 nakon intra-tumorske ili intravenske primene.

Povoljan afinitet vezivanja u kombinaciji sa povoljnom ćelijskom aktivnošću i / ili povoljnom ćelijskom stabilnošću i / ili poboljšanim PK svojstvima mogu omogućiti niže doze za farmakološku efikasnost. Niže doze imaju prednosti nižeg „opterećenja lekom“ ili „opterećenja lekom“ (matični lek i njegovi metaboliti) za pacijenta koji uzrokuju potencijalno manje neželjene efekte, i niže troškove proizvodnje leka.

2

Vezivanje jedinjenja pronalaska za humani STING može se demonstrirati korišćenjem sledećeg testa:

DIFERENCIJALNO SKENIRANJE FLUORIMETRIJE (DSF)

Materijali:

Hard-Shell<®>PCR Ploče 384-Well thin-wall (Catalog# HSP3805R, BIO-RAD) Microseal<®>’B’ Adhesive Seals for PCR Plates (Catalog# MSB-1001, BIO-RAD) SYPRO naranđasti rastvor u DMSO (SIGMA cat.-no. S5692-500UL), koncentracije “5000x”

Instrumentacija: ýitač: CFX384 Real-Time System (Bio-Rad)

Robot za pipetiranje: HamiltonStarlet

Pufer analize: 20mM Tris, 150mM NaCl pH7.5

Ciljani Protein: Humani STING (hSTING, ostaci 155-341, sekvenca divljeg tipa sa N-terminalom His8-tag i TEV-mestom cepanja, MW: 23601,5Da)

Rastvor porteina: c = 309µM rastvor u puferu analize

Konačne koncentracije ispitivanih jedinjenja: 100uM, 3uM ciljani protein, “5x” SYPR Orange

Postupak analize:

1) Osnovni rastvori jedinjenja i njihova razblaženja pripremljeni su u puferu za analizu 2) 5ul rastvor fluorescentne boje (5000x SYPRO Orange) je izmešan sa 50ul ciljanog proteina (309uM) i 945ul pufera.

3) 2ul ove smeše proteina-boje (25x SYPRO Orange i 15uM Protein) je dodato u 8ul rastvor jedinjenja. Konačna zapremina je 10uL.

4) Određeni položaji bunarčLća korišćeni su kao negativna kontrola.

5) Ploče su pripremljene za dvostruko merenje i centrifugirane 2 min na 1000g.

6) Kod merenja, korišćeno je 160 ciklusa 0,5 degC (rampa temperature 15s/ciklusu, 15 degC do 95 degC).

Analiza podataka: Krive disocijacije su obrađene u Bio-Rad CFX Manager. Tip pika je postavljen na "negativni". U slučaju Primera 1.1, Primera 2.1 i Primera 4.1, najmanje dva Tm merenja su bila prosečna.

Utvrđene promene u Tm prikazane su u tabeli 1.

Tabela 1: hSTING Tm promena

ûelijska aktivnost jedinjenja prema pronalasku se može demonstrirati korišćenjem sledećeg in vitro THP1 analize:

IN VITRO INDUKCIJA CITOKINA

Aktivnosti indukcije citokina u jedinjenjima prema predmetnom pronalasku su demonstrirane upotrebom THP1 reporter ćelijske linije.

Aktivacija STING proteina izražena u ćelijskim linijama dovodi do povećanja proizvodnje interferona. Stabilnom integracijom interferona regulatornog faktora (IRF) -inducibilnog SEAP (izlučene embrionalne alkalne fosfataze) reporter konstrukcije se može nadgledati funkcionalni signalni put interferona. Korišćenjem Invivogen-ovog KUANTI-Blue ™ kolorimetrijskog testa enzima i odgovarajućeg čitača optičke gustine (OD) aktivnost SEAP se može otkriti i kvantifikovati. Ova tehnika bi se mogla koristiti za karakterizaciju farmakološke modifikacije STING proteina.

Merenja SEAP aktivnosti su izvedena u THP1-Blue ISG ćelijama koje stabilno eksprimiraju humani STING protein i IRF-inducibilni SEAP reporter konstrukt. ûelije su gajene za širenje u RPMI1640 medijumu sa 10% fetalnim telećim serumom, 50 µg/ml Penicillin-Streptomycin, 100µg/ml Zeocin, i 100µg/ml Normocin na 37°, 95% vlažnosti i 5% CO2inkubator. ûelije spremne za analizu čuvane su kao zamrznute zalihe.

2

U pripremi za test, ćelije su odmrznute u medijumu bez Zeocin / Normocin i raspodeljene su u test pločice sa gustinom 15000 ćelija/ 15 µL po bunarčLću. Jedinjenja su pripremljena serijskim razblaživanjem od 8 ili 16 tačaka u 50% vodenom DMSO i završnim korakom razblaživanja u medijum kako bi se osigurala konačna koncentracija DMSO od 0.5% u analizi. 5µL razblaženog jedinjenja plus 5 µL medjiuma su dodati u pločama, praćeno sa 24 satnom inkubacijom na 37°C.

Na dan ispitivanja, 75 µl po bunarčLću Quanti-Blue reagensa je dodato u sve bunarčLće na ploči i ploča je inkubirana dodatnih 30 minuta na 37°C. OD na 620 nm je izmerena na EnVision čitaču (PerkinElmer).

EC50vrednosit i Hill nagibi su izvedeni iz četvoro- ili šesnaesto tačke parametarskih nelinearnih krivih fitinga sa Megalab softverom (Boehringer Ingelheim) koristeći OD na 620 nM. EC50vrednosti za Primer 1.1, Primer 2.1, Primer 3.1 i Primer 4.1 su srednja vrednost najmanje dva merenja. Pogledajte tabelu 2.

Tabela 2: EC50vrednosti

U gore navedenom THP1 testu, Primer 1.1 je snažniji od odgovarajućeg dijastereomernog Primera 1.2. Rengen iz Primera 1.1 u kompleksu sa humanim STING ukazuje da oba atoma fosfora imaju Rp konfiguraciju. Stoga se na analogan način pretpostavlja da jači odgovarajući dijastereomeri Primer 2.1, Primer 3.1, Primer 4.1 takođe sadrže Rp konfiguraciju na oba atoma fosfora.

2

U humanom STING genu je identifikovano nekoliko polimorfizama jednostrukih nukleotida koji mogu uticati na odgovor na ciklične dinukleotide. Da bi se utvrdila aktivnost jedinjenja prema pronalasku, generisane su THP1-BLUE ISG reporter ćelijske linije koje izražavaju različite verzije humanog STING. Da bi se to postiglo, endogeni humani STING je prvo izbrisan pomoću sistema CRISPR / CAS9: THP1-Blue ISG ćelije su elektroporisane plazmidima ALL-IN-ONE CRISPR koji ciljaju gen STING (kupljeni od Sigme koji kodiraju gRNA i GFP kao reporter gen za uspešnu transdukciju). GFP pozitivne ćelije su potom sortirane 24 sata nakon transfekcije i proširene. ûelije su zatim raspršene u polučvrstom medijumu metocela kako bi se omogućile izolacije pojedinačnih ćelija. Klonovi su zatim pregledani na cGAMP reakciju pomoću Kuanti-blue reporter testa. Klonovi koji ne reaguju su naknadno analizirani na STING gubitak vestern blotiranjem i sekvenciranjem STING lokusa. Za prekomernu ekspresiju humanih STING varijanti, potvrđeni THP1-Blue ISG hSTING KO klon je preveden sa pojedinačnim retrovirusnim plazmidima (MSCV-ires-GFP-Blasti) koji kodiraju alelne varijante hSTING (WT, HAQ, R232H, AQ i R293Q) . Transdukovane ćelije su sortirane za različite nivoe GFP fluorescencije i ekspresija STING alela je analizirana Western blot-om. Populacije koje eksprimiraju ektopični STING protein (WT, HAQ, R232H, AQ i R293Q) na uporedivim nivoima sa endogenim nivoima STING čine roditeljske, nemodifikovane THP1-Blue ISG ćelijske linije i korišćene su za karakterizaciju CDN-a. Primeri ovog pronalaska pokazuju ćelijsku aktivnost u svih pet gore navedenih varijanti.

ûelijska stabilnost jedinjenja prema pronalasku merena je na sledeći način: Jedinjenje je rastvoreno u medijumu ćelijske kulture (MEM sa dodatkom 10% FCS, 1% ne-esencijalnih aminokiselina i 1% piruvata) do krajnje koncentracije od 10 µM i inkubirano sa humanom epitelnom ćelijskom linijom Calu-3 (60000 ćelija / bunarčLća u ploči sa 24 bunarčLća) do 24 sata. Uzorci supernatanta ćelijske kulture uzeti su u 1, 6, 24h i kvantifikovani u LC-MS/MS.

Mišji PK jedinjenja prema pronalasku određen je korišćenjem sledećeg postupka:

MIŠJI PK

Eksperiment na životinjama

2

Jedinjenje je rastvoreno u rastvoru fiziološkog NaCl i primenjeno intravenski na mužjaku miša C57BL / 6NRj u dozi od 10 µmol / kg. Uzorak krvi od 20 µL je sakupljen na 0.25, 0.5, 0.75, 1 i 2 sata uzimajući ETDA kao antikoagulant. Krvna plazma je generisana centrifugiranjem i čuvana na -20 °C. Koncentracija jedinjenja je određena LC-MS / MS. Utvrđeni odnosi koncentracije i vremena (srednja vrednost dvostrukih eksperimenata) prikazani su u tabeli 3.

Tabela 3:

Shodno tome, predmetni pronalazak se odnosi na jedinjenja opšte formule I kao medikament.

Dalje, predemtni pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja opšte formule I ili farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku za lečenje i / ili prevenciju bolesti ili stanja na koja može uticati modulacija STING kod pacijenta ili bolesti ili uslovi povezani sa ili modulirani od strane STING kod pacijenta. Poželjno je da je pacijent čovek.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje bolesti ili stanja povezanih ili modulisanih STING kod sisara, kojima je potrebno takvo lečenje, koji uključuje korak primene terapeutski efikasne količine sisaru, poželjno čoveku jedinjenja ili farmaceutske kompozicije predmetnog pronalaska.

Bolesti i stanja koja su povezana sa modulacijom STING ili su na nju modulisana ili mogu na nju uticati uključuju upalu, alergijske ili autoimune bolesti, na primer alergijski rinitis ili astmu, zarazne bolesti ili rak. Dalje, zbog svoje aktivnosti, jedinjenja predmetnog pronalaska su pogodna kao pomoćna supstanca za vakcinu.

2

Autoimune bolesti uključuju, ali se ne ograničavaju na sistemski eritmatosus lupus. Psorijaza, insulin zavisni dijabetes melitus (IDDM), dermatomiozitis i Sjogrenov sindrom (SS).

Upala predstavlja grupu vaskularnih, ćelijskih i neuroloških odgovora na traumu. Upala se može okarakterisati kao kretanje inflamatornih ćelija kao što su monociti, neutrofili i granulociti u tkivu. Ovo je obično povezano sa smanjenom funkcijom endotelne barijere i edemom u tkivima. Upala se može klasifikovati kao akutna ili hronična. Akutno zapaljenje je početni odgovor tela na štetne stimuluse i postiže se povećanim kretanjem plazme i leukocita iz krvi u oštećena tkiva. Kaskada biohemijskih događaja širi i sazreva inflamatorni odgovor, uključujući lokalni vaskularni sistem, imuni sistem i razne ćelije u oštećenom tkivu. Dugotrajno zapaljenje, poznato kao hronična upala, dovodi do progresivnog pomeranja tipa ćelija koje su prisutne na mestu upale i koje karakteriše istovremeno uništavanje i zarastanje tkiva od zapaljenog procesa.

Kada se javlja kao deo imunološkog odgovora na infekciju ili kao akutni odgovor na traumu, upala može biti korisna i obično se samo ograničava. Međutim, upala može biti štetna pod različitim uslovima. To uključuje stvaranje prekomerne upale kao odgovor na zarazne agense, što može dovesti do značajnih oštećenja organa i smrti (na primer, u slučaju sepse). Štaviše, hronična upala je uglavnom štetna i u korenu je brojnih hroničnih bolesti, što uzrokuje ozbiljna i nepovratna oštećenja tkiva. U takvim postavkama imuni odgovor je često usmeren protiv samo-tkiva (autoimunost), iako hronični odgovori stranim entitetima takođe mogu dovesti do oštećenja samo-tkiva od strane posmatrača. Cilj antiinflamatorne terapije je stoga smanjenje ove upale, inhibiranje autoimunosti kada je prisutna i omogućavanje napredovanja fiziološkog procesa ili zarastanja i popravke tkiva.

Jedinjenja prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje upale bilo kog tkiva i organa tela, uključujući mišićno-skeletnu upalu, vaskularno zapaljenje, neuralnu upalu, zapaljenje digestivnog sistema, upale oka, upalu reproduktivnog sistema i druga upala, kao što je ilustrovano u nastavku.

2

Upala mišićno-skeletnog sistema odnosi se na svako zapaljensko stanje mišićnoskeletnog sistema, posebno ona stanja koja pogađaju zglobove skeleta, uključujući zglobove šake, zgloba, lakta, ramena, vilice, kičme, vrata, kuka, zgloba i stopala i stanja koja utiču na tkiva povezujući mišiće sa kostima kao što su tetive. Primeri mišićno-skeletnog zapaljenja koje se mogu lečiti jedinjenjima pronalaska uključuju artritis (uključujući, na primer, osteoartritis, reumatoidni artritis, psorijatični artritis, sponditis koji leči, akutni i hronični zarazni artritis, artritis povezan sa gihtom i pseudogutom, i juvenilni idiopatski artritis) , tendonitis, sinovitis, tenosinovitis, bursitis, fibrositis (fibromialgija), epikonditis, miozitis i osteitis (uključujući, na primer, Pagetovu bolest, osteitis pubis i osteitis fibrosa cistični). Očna upala se odnosi na upalu bilo koje strukture oka, uključujući očne kapke. Primeri očne upale koja se može lečiti jedinjenjima prema pronalasku uključuju blefaritis, blefarohalazu, konjunktivitis, dakrioadenitis, keratitis, keratoconjunctivitis sicca (suvo oko), skleritis, trihijazu i uveitis. Primeri upale nervnog sistema koji se mogu lečiti jedinjenjima pronalaska uključuju encefalitis, Guillain-Barre-ov sindrom, meningitis, neuromiotoniju, narkolepsiju, multiplu sklerozu, mijelitis i šizofreniju.

Primeri upale vaskulatornog sistema ili limfnog sistema koji se mogu lečiti jedinjenjima pronalaska uključuju artrosklerozu, artritis, flebitis, vaskulitis i limfangitis.

Primeri zapaljenskih stanja digestivnog sistema koja se mogu lečiti jedinjenjima pronalaska uključuju holangitis, holecistitis, enteritis, enterokolitis, gastritis, gastroenteritis, zapaljenske bolesti creva (kao što su Crohnova bolest i ulcerozni kolitis), ileitis i proktitis.

Primeri zapaljenskih stanja reproduktivnog sistema koja se mogu lečiti jedinjenjima pronalaska uključuju cervicitis, horioamnionitis, endometritis, epididimitis, omfalitis, ooforitis, orhitis, salpingitis, apsces jajnika, uretritis, vaginitis, vulvitis i vulvodiniju.

Agensi se mogu koristiti za lečenje autoimunih stanja koja imaju zapaljensku komponentu. Takva stanja uključuju akutnu diseminiranu alopeciju univerzalizma, Behcetovu bolest, Chagasovu bolest, sindrom hroničnog umora, disautonomiju, encefalomielitis, ankozni sponditis, aplastičnu anemiju, hidradenitis suppurativa, autoimunski hepatitis, autoimuni ooforitis, celijakiju, Crohnovu bolest, dijabetes melititus tip 1 ćelijski arteritis, sindrom goodpasture-a. Graveova bolest, Guillain-Barre-ov sindrom, Hashimoto-ova bolest, Henoch-Schonlein purpura, Kavasaki-jeva bolest, eritematozni lupus, mikroskopski kolitis, mikroskopski poliarteritis, mešana bolest vezivnog tkiva, multipla skleroza, miastenija gravis, opsoclonus mioklonus sindrom, optički neuritisitis optički neuritis. , poliarteritis nodosa, polimijalgija, reumatoidni artritis, Reiterov sindrom, Sjogrenov sindrom, temporalni arteritis, Vegenerova granulomatoza, topla autoimuna hemolitička anemija, intersticijski cistitis, lajmska bolest, morphea, psorijaza, sarkoidoza, sklerodermija, ulcerativni kolitis, ulcerativni kolitis.

Agensi se mogu koristiti za lečenje bolesti preosetljivosti posredovanih T-ćelijama koje imaju zapaljensku komponentu. Takva stanja uključuju kontaktnu preosetljivost, kontaktni dermatitis (uključujući onaj zbog otrovnog bršljana), urtikariju, kožne alergije, respiratorne alergije (senena groznica, alergijski rinitis) i enteropatiju osetljivu na gluten (celijakija).

Ostala zapaljenska stanja koja se mogu lečiti agensima uključuju, na primer, slepo crevo, dermatitis, dermatomiozitis, endokarditis, fibrositis, gingivitis, glositis, hepatitis, hidradenitis suppurativa, iritis, laringitis, mastitis, miokarditis, nefritis, otitis, pankreatitis, parotitis, perkarditis, peritonoitis, faringitis, pleuritis, pneumonitis, prostatistis, pijelonefritis i stomatisi, odbacivanje transplantata (uključujući organe poput bubrega, jetre, srca, pluća, pankreasa (npr. ostrvske ćelije), koštane srži, rožnjače, tankog creva, alotransplantacije kože) , homografti na koži i ksenografti na srčanim zaliscima, bolest seruma i transplantacija protiv bolesti domaćina), akutni pankreatitis, hronični pankreatitis, sindrom akutnog respiratornog distresa. Sekari-ov sindrom, kongenitalna nadbubrežna hiperplaza, nesuppurativni tiroiditis, hiperkalcemija povezana sa rakom, pemfigus, bulozni dermatitis herpetiformis, teški multiformni eritem, eksfoliativni dermatitis, seboroični dermatitis, sezonski ili višegodišnji alergijski rinitis, bronhijalna astma, kontaktni dermatitis, aperitivni dermatitis alergijski konjunktivitis, keratitis, herpes zoster oftalmikus, iritis i oiridociklitis, horioretinitis, optički neuritis, simptomatska sarkoidoza, hemonizacija u plućima ili širenje plućne tuberkuloze, idiopatska trombocitopenična purpura kod

1

odraslih, sekundarni trombocitopeimizam, hemoroidi, hemoroidi odrasli, akutna leukemija u detinjstvu, regionalni enteritis, autoimunski vaskulitis, multipla skleroza, hronična opstruktivna plućna bolest, odbacivanje transplantata solidnih organa, sepsa. Poželjni tretmani uključuju lečenje odbacivanja transplantata, reumatoidnog artritisa, psorijatičnog artritisa, multiple skleroze. Dijabetes tipa 1, astma, zapaljenska bolest creva, sistemska eritematoza lupusa, psorijaza, hronična plućna bolest i upala koja prate infektivna stanja (npr., sepsa).

U jednom aspektu, bolest ili stanje koje se leči upotrebom jedinjenja pronalaska je karcinom. Primeri bolesti i stanja karcinoma u kojima jedinjenja formule I ili njihove farmaceutski prihvatljive soli ili solvati mogu imati potencijalno korisne antitumorske efekte uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom pluća, kostiju, pankreasa, kože, glave, vrata, materica, jajnika, stomaka, debelog creva, dojke, jednjaka, tankog creva, creva, endokrinog sistema, štitne žlezde, paratiroidne žlezde, nadbubrežne žlezde, uretra, prostate, penisa, testisa, ureter, bešike, bubrega ili jetre; karcinom rektuma; karcinom analnog regiona; karcinomi jajovoda, endometrijuma, grlića materice, vagine, vulve, bubrežne karlice, bubrežne ćelije; sarkom mekog tkiva; miksoma; rabdomioma; fibroma; lipoma; teratoma; holangiokarcinom; hepatoblastoma; angiosarkom; hemagioma; hepatoma; fibrosarkom; hondrosarkom; mijelom; hronična ili akutna leukemija; limfocitni limfomi; primarni limfom CNS-a; neoplazme u CNS-u; tumori kičmene ose; karcinomi skvamoznih ćelija; sinovijalni sarkom; maligni mezoteliomi pleure; gliom moždanog stabla; adenom hipofize; adenom bronhija; hondromatozni hanlartom; inozoteliom; Hodgkinova bolest ili kombinacija jednog ili više gorenavedenih karcinoma.

Poželjni karcinomi, koji se mogu lečiti jedinjenjima prema pronalasku, su kože, pluća, jetre, debelog creva, mozga, dojke, jajnika, karcinom prostate, pankreasa, bubrega, stomaka, glave, vrata i urotelijalni karcinom, kao i limfom i leukemija.

Nova jedinjenja se mogu koristiti za prevenciju, kratkotrajno ili dugotrajno lečenje gore pomenutih bolesti, opciono i u kombinaciji sa hirurškom intervencijom, radioterapijom ili drugim jedinjenjima „savremenog stanja“, kao što je npr. citostatske

2

ili citotoksične supstance, inhibitori ćelijske proliferacije, anti-angiogene supstance, steroidi ili antitela.

U svojoj ulozi pomoćnih supstanci, u određenim izvođenjima predmetna jedinjenja i smeše se mogu koristiti kao pomoćne supstance u terapijskoj ili profaktičkoj strategiji koja koristi vakcine. Prema tome, suštinski čisti CDNs predmetnog pronalaska, ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu se koristiti zajedno sa jednom ili više vakcina odabranih da stimulišu imuni odgovor na jedan ili više unapred određenih antigena. Suštinski čisti CDNs predmetnog pronalaska, ili njihovi prolekovi ili farmaceutski prihvatljive soli, se mogu dobiti zajedno sa takvim vakcinama ili kao dodatak njima.

Takve vakcine mogu sadržati inaktivirane ili oslabljene bakterije ili viruse koji sadrže antigene od interesa, prečišćene antigene, žive virusne ili bakterijske vektore za isporuku rekombinantno napravljene da eksprimiraju i / ili izlučuju antigene, vektori ćelije koji predstavljaju antigen (APC) koji sadrže ćelije koje su napunjene antigenima ili transfektovane sa kompozicijom koja sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira antigene, dostavne nosače lipozomskih antigena, ili gole vektore nukleinske kiseline koji kodiraju antigene. Ova lista nije ograničena. Kao primer, takve vakcine mogu takođe sadržati inaktiviranu tumorsku ćeliju koja eksprimira i luči jedan ili više GM-CSF, CCL20, CCL3, IL-12p70, FLT-3 liganda, citokina.

U povezanom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupke indukovanja, stimulisanja, ili prilagođavanja imunog odgovora kod pojedinca. Ovi postupci uključuju primenu suštinski čistih CDNs predmetnog pronalaska, ili farmaceutski prihvatljivih soli, pojedincu.

Raspon doze jedinjenja opšte formule I koja se primenjuje dnevno je obično od 0.0001 do 10 mg, na primer od 0.001 do 1 mg. Svaka dozna jedinica može pogodno da sadrži od 0.0001 do 10 mg, na primer od 0.001 do 1 mg.

Stvarna terapeutski efikasna količina ili terapeutska doza će naravno zavisiti od faktora poznatih stručnjacima, kao što su starost i težina pacijenta, način primene i težina bolesti. U svakom slučaju, jedinjenje ili kompozicija će se primenjivati u dozama i na način koji omogućava isporuku terapeutski efikasne količine na osnovu jedinstvenog stanja pacijenta.

Jedinjenja, kompozicije, uključujući bilo koje kombinacije sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa, prema pronalasku, mogu se primenjivati sluznicom (npr. oralno, sublingvalno, vaginalno, nazalno, cervikalno, itd.), intra-tumorskim, pertumorskim, transdermalnim, inhalacioni ili parenteralni (npr. subkutana, intravenska, intramuskularna, intraarterijska, intradermalna, intratekalna i epiduralna primena). U većini slučajeva može se izdati jedan od načina intravenske, intra-tumorske, pertumorske ili potkožne primene.

Farmaceutske Kompozicije

Za potrebe ovog pronalaska, farmaceutske kompozicije se mogu primenjivati na različita sredstva, uključujući neparenteralno, parenteralno, sprejom za inhalaciju, lokalno ili rektalno u formulacijama koje sadrže farmaceutski prihvatljive nosače, dodatke i nosače. Intra-tumorska (direktno u tumorsku masu) ili peri-tumorska (oko tumorske mase) primena jedinjenja predemtnog pronalaska može direktno aktivirati lokalno infiltrirani DC, direktno promovisati apoptozu tumorskih ćelija ili osetiti tumorske ćelije na citotoksične agense.

Farmaceutske kompozicije iz ovog otkrića mogu biti u obliku sterilnog preparata za injekcije, kao što je sterilna vodena ili uljana suspenzija za injekcije. Ova suspenzija se može formulisati u skladu sa poznatom tehnikom, koristeći one pogodne agense za dispergovanje ili vlaženje i suspenzije koja su gore pomenuta. Sterilni injekcioni preparat takođe može biti sterilni injekcioni rastvor ili suspenzija u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču kao što je rastvor u 1,3-butandiolu ili pripremljen u obliku liofilizovanog praha. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna fiksna ulja mogu se konvencionalno koristiti kao rastvarač ili medijum za suspendovanje. U tu svrhu može se koristiti bilo koje blago fiksirano ulje, uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Pored toga, masne kiseline kao što je oleinska kiselina se mogu takođe koristiti u pripremi injekcija.

4

Formulacije pogodne za lokalnu primenu u ustima uključuju pastile koje sadrže aktivni sastojak u aromatizovanoj bazi, obično saharozi i bagremu ili tragakantu; pastele koje sadrže aktivni sastojak u inertnoj bazi kao što su želatin i glicerin ili saharoza i bagrem; i sredstva za ispiranje usta koja sadrže aktivni sastojak u pogodnom tečnom nosaču.

Formulacije pogodne za vaginalnu primenu se mogu predstaviti u obliku pesara, tampona, krema, gelova, pasta, pena ili formulacija u spreju, koje pored aktivnog sastojka sadrže i one nosače za koje je u struci poznato da su odgovarajući.

Formulacije pogodne za parenteralnu primenu uključuju vodene i nevodene izotonične sterilne injekcione rastvore koji mogu sadržati antioksidante, pufere, bakteriostate i rastvorene supstance koji čine formulaciju izotoničnom sa krvlju željenog primaoca; i vodene i nevodene sterilne suspenzije koje mogu da sadrže suspenzivna sredstva i agense za zgušnjavanje. Formulacije mogu biti u zatvorenoj ambalaži za jedinične doze ili u više doza, na primer u ampule i bočice, i mogu se čuvati u liofilizovanom stanju, zahtevajući samo dodavanje sterilnog tečnog nosača, na primer vode za injekcije, neposredno pre upotrebe. Rastvori za injekcije i suspenzije mogu se pripremiti od sterilnih prahova, granula i tableta prethodno opisanih vrsta.

Kombinovana Terapija

Jedinjenja prema pronalasku mogu se koristiti samostalno ili se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima, u količini dovoljnoj da indukuju, modifikuju ili stimulišu odgovarajući imunološki odgovor. Imunološki odgovor može da sadrži, bez ograničenja, specifični imunološki odgovor, nespecifični imunološki odgovor, kako specifični tako i nespecifični odgovor, urođeni odgovor, primarni imunološki odgovor, adaptivni imunitet, sekundarni imunološki odgovor, imunološki odgovor memorije, aktivacija imunih ćelija, imunološka proliferacija ćelija, diferencijacija imunih ćelija i ekspresija citokina. U određenim izvođenjima, ovde opisana jedinjenja i kompozicije se daju zajedno sa jednom ili više dodatnih kompozicija, uključujući vakcine namenjene stimulisanju imunološkog odgovora na jedan ili više unapred određenih antigena; adjuvanti; antagonisti puta CTLA-4 i PD-1, lipidi, lipozomi, hemoterapeutski agensi, imunomodulatorne ćelijske linije itd..

Ovde opisana jedinjenja i kompozicije se mogu primenjivati pre, posle i / ili istovremeno sa dodatnom terapeutskom ili profaktičkom kompozicijom ili modalitetom. Tu spadaju, bez ograničenja, B7 kostimulatorni molekul, interleukin-2, interferon-g, GM-CSF, antagonisti CTLA-4, OX-40 / OX-40 ligand, CD40 / CD40 ligand, sargramostim, levamisol, virus vakcinije, Bacille Calmette -Guerin (BCG), lipozomi, alum, Freundov kompletni ili nepotpuni adjuvans, detoksifikovani endotoksini, mineralna ulja, površinski aktivne supstance kao što su lipolecitin, pluronski polioli, polianioni, peptidi i emulzije ulja ili ugljovodonika. Poželjni su nosači za indukovanje imunološkog odgovora T ćelija koji preferencijalno stimulišu odgovor citolitičkih T ćelija u odnosu na odgovor antitela, mada se mogu koristiti i oni koji stimulišu obe vrste odgovora. U slučajevima kada je agens polipeptid, može se primeniti sam polipeptid ili polinukleotid koji kodira polipeptid. Nosač može biti ćelija, kao što je ćelija koja predstavlja antigen (APC) ili dendritična ćelija. ûelije koje predstavljaju antigen uključuju tipove ćelija kao što su makrofagi, dendritične ćelije i B ćelije. Ostale profesionalne ćelije koje prezentuju antigen uključuju monocite, Kupffer ćelije marginalne zone, mikrogliju, Langerhansove ćelije, interdigitacione dendritične ćelije, folikularne dendritične ćelije i T ćelije. Takođe se mogu koristiti fakultativne ćelije koje prezentuju antigen. Primeri fakultativnih ćelija koje predstavljaju antigen uključuju astrocite, folikularne ćelije, endotelijum i fibroblaste. Nosač može biti bakterijska ćelija koja se transformiše da eksprimira polipeptid ili da isporuči polinukleoteid koji se naknadno eksprimira u ćelijama vakcinisane osobe. Dodaci, kao što su aluminijum hidroksid ili aluminijum fosfat, mogu se dodati da bi se povećala sposobnost vakcine da pokreće, pojačava ili produžava imuni odgovor. Dodatni materijali, kao što su citokini, hemokini i sekvence bakterijskih nukleinskih kiselina, poput CpG, agonista receptora sličnog putarini (TLR) 9, kao i dodatni agonisti za TLR 2, TLR 4, TLR 5, TLR 7, TLR 8, TLR9 , uključujući lipoprotein, LPS, monofosforni lipid A, lipoteihoičnu kiselinu, imikvimod, resikimod i, pored toga, agoniste gena I (RIG-I inducibilne retinoične kiseline) kao što je poli I: C, koji se koriste odvojeno ili u kombinaciji sa opisanim kompozicijama potencijalni pomoćnici. Ostali reprezentativni primeri pomoćnih sredstava uključuju sintetički adjuvans KS-21 koji sadrži homogeni saponin prečišćen iz kore Kuillaja saponaria i Corynebacterium parvum (McCune et al., Cancer, 1979; 43:1619).

Postupci za istovremenu primenu sa dodatnim terapeutskim agensom su opšte poznati u tehnici (Hardman, et al. (eds.) (2001) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed., McGraw-Hill, New York, NY; Poole and Peterson (eds.) (2001) Pharmacotherapeutics for Advanced Practice:A Practical Approach, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA; Chabner and Longo (eds.) (2001) Cancer Chemotherapy and Biotherapy, Lippincott, Williams & Wilkins, Phila., PA). Uopšteno, istovremena primena ili primena zajedno ukazuje na lečenje subjekta sa dva ili više agenasa, gde se agensi mogu primenjivati istovremeno ili u različitim vremenima. Na primer, takvi agensi mogu biti dostavljeni pojedinačnom subjektu kao odvojene administracije, koje mogu biti u suštini u isto vreme ili u različito vreme, a koje mogu biti istim putem ili različitim putevima administracije. Takvi agensi se mogu isporučiti jednom subjektu u istoj administraciji (npr. ista formulacija), tako da se daju istovremeno istim putem administracije.

Zbog pomoćnih svojstava jedinjenja predmetnog pronalaska, njihova upotreba se takođe može kombinovati sa drugim terapeutskim modalitetima, uključujući druge vakcine, adjuvanse, antigen, antitela i imune modulatore. Primeri su dati u nastavku.

Adjuvansi (pomoüne supstance)

Pored jedinjenja predmetnog pronalaska i njihovih ovde opisanih kompozicija, kompozicije ili postupci predmetnog pronalaska mogu dalje sadržati jednu ili više dodatnih supstanci koje zbog svoje prirode mogu delovati da stimulišu ili na drugi način koriste imuni sistem da odgovore antigenima karcinoma prisutnim na ciljanim ćelijama tumora. Takve pomoćne supstance uključuju, ali nisu ograničena na, lipide, lipozome, inaktivirane bakterije koje indukuju urođeni imunitet (npr. inaktivirani ili oslabljeni Listeria monocytogenes), kompozicije koje posreduju urođenu imunološku aktivaciju putem Toll-sličnih Receptora (TLRs), (NOD)-sličnih receptora (NLRs), inducibilni (RIG) -I-slični receptori retinoinske kiseline nalik na gen (RLR), lektinski receptori tipa C (CLR) i / ili molekularni obrasci povezani sa patogenima („PAMPS“).

Primeri PAMP-a uključuju lipoproteine, lipopolipeptide, peptidoglikane, zimozan, lipopolisaharid, neisserijske porine, flagellin, profillin, galaktoceramid, muram dipeptid. Peptidoglikani, lipoproteini i lipoteihoične kiseline su Gram-pozitivne komponente ćelijskog zida. Većina bakterija eksprimira lipopolisaharide, a primer MPL je. Flagellin se odnosi na strukturnu komponentu bakterijskih bičeva koju luče patogene i komensalne bakterije. Galaktoskeramid je aktivator prirodnih ubica T (NKT) ćelija. Muram dipeptid je bioaktivni motiv peptidoglikana koji je zajednički svim bakterijama.

Inhibitori Imunske Kontrolne taþke

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa inhibitorom imunske kontrolne tačke, kao što je inhibitor imunske kontrolne tačke odabran iz grupe koju čine antagonist puta CTLA-4, antagonist puta PD-1, antagonist puta Tim-3 antagonista puta Viste, antagonista puta BTLA, antagonista puta LAG-3 ili antagonista puta TIGIT. U nekim izvođenjima, inhibitor imunske kontrolne tačke je izabran iz grupe koja se sastoji od anti-CTLA-4 antitela, anti- PD-1 antitela, anti- Tim-3 antitela, anti- Vista antitela, anti-BTLA antitela , anti- LAG-3 antitela ili anti- TIGIT antitela.

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa antagonistima puta CTLA-4. U nekim izvođenjima, kombinacija se koristi za lečenje čvrstog tumora ili hematološkog maligniteta. Smatra se da je CTLA-4 važan negativni regulator adaptivnog imunološkog odgovora. Aktivirane T ćelije pojačano regulišu CTLA-4, koji vezuje CD80 i CD86 na ćelije koje predstavljaju antigen sa većim afinitetom od CD28, čime inhibiraju stimulaciju T-ćelija, ekspresiju gena IL-2 i proliferaciju T-ćelija. Antitumorski efekti blokade CTLA4 primećeni su na mišjim modelima karcinoma debelog creva, metastatskog karcinoma prostate i metastatskog melanoma. U nekim izvođenjima, antogonist puta CTLA-4 je molekul anti- CTLA-4 antitela izabran iz grupe koju čine tremelimumab i ipilimumab.

Ipilimumab (CTLA-4 antitelo, takođe poznato kao MDX-010, CAS Br. 477202-00-9) i tremelimumab (IgG2 monoklonalno antitelo prethodno poznato kao ticilimumab, CP675,206) su humanizovana monoklonalna antitela koja se vezuju za humani CTLA4 i sprečavaju njegovu interakciju sa CD80 i CD86. Ostali negativni imunski regulatori koji mogu biti ciljani sličnom strategijom uključuju programiranu ćelijsku smrt 1 (PD-1), atenuator B i T limfocita, transformišući faktor rasta beta, interleukin-10 i vaskularni endotelni faktor rasta.

U nekim izvođenjima, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa anti- CTLA-4 antitelom i anti- PD-1 antitelom. U jednom izvođenju, kombinacija uključuje molekul anti- PD-1 antitela, npr., kako je ovde opisano, i anti-CTLA-4 antitelo, npr., ipilimumab. Primerne doze koje se mogu koristiti uključuju dozu molekula anti- PD-1 antitela od oko 1 do 10 mg/kg, npr. 3 mg/kg, i dozu anti-CTLA-4 antitela, npr. ipilimumab, od oko 3 mg/kg.

Jedinjenja iz ovog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa antagonistima PD-1 puta. U nekim realizacijama, kombinacija se koristi za lečenje solidnog tumora ili hematološkog maligniteta. PD-1 je još jedan negativni regulator adaptivnog imunološkog odgovora koji se izražava na aktiviranim T-ćelijama. PD-1 se vezuje za B7-H1 i B7-DC, a angažovanje PD-1 potiskuje aktivaciju T-ćelija. Antitumorski efekti su demonstrirani blokadom puta PD-1. U literaturi su zabeleženi molekuli antitela na PD-1 (npr. Nivolumab (Opdivo®), pembrolizumab (Keitruda®) i pidilizumab) i AMP-224 kao primeri blokatora puteva PD-1 koji mogu naći koristi u predmetnom pronalasku. U nekim izvođenjima, antogonista puta PD-1 je molekul anti- PD-1 antitela izabran iz grupe koju čine nivolumab, pembrolizumab ili pidilizumab.

U nekim izvođenjima antagonist puta PD-1 je imunoadhezin (npr., an imunoadhezin koji sadrži ekstraćelijski ili PD-1 vezujući deo PD-L1 ili PD-L2 spojen za konstantni region (npr., Fc region imunoglobulinske sekvence). U nekim izvođenjima, PD-1 inhibitor je AMP-224 (B7-DCIg; Amplimmune; npr., opisan u WO2010/027827 i WO2011/066342) je PD-L2 Fc u fuziji rastvorljiv receptor koji blokira interakciju između PD-1 and B7-H1.

U nekim izvođenjima antagonist puta PD-1 je PD-L1 ili PD-L2 inhibitor. U nekim izvođenjima PD-L1 iliPD-L2 inhibitor je anti-PD-L1 antitelo ili anti-PD-L2 antitelo. U nekim izvođenjima, anti-PD-Ll inhibitor je izabran između YW243.55.S70, MPDL3280A, MEDI-4736, MSB-0010718C, ili MDX-1105. U nekim izvođenjima, PD-L1 inhibitor je anti-PD-L1 antitelo MSB0010718C. MSB0010718C (takođe se naziva i A09-246-2; Merck Serono) je monoklonsko antitelo koje se vezuje za PD-L1.

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa antagonistima puta TIM-3. U nekim izvođenjima, kombinacija se koristi za lečenje čvrstog tumora ili hematološkog maligniteta. U nekim izvođenjima, antagonist puta TIM-3 je anti- TIM-3 antitelo. U nekim izvođenjima, molekuli anti- TIM-3 antitela su otkriveni u US 2015/0218274, objavljenom 6. avgusta 2015. godine, pod naslovom “Antibody Molecules to TIM-3 and Uses Thereof”.

Jedinjenja predemtnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa antagonistima puta LAG-3. U nekim izvođenjima, kombinacija se koristi za lečenje čvrstog tumora ili hematološkog maligniteta. U nekim izvođenjimaa, antagonist puta LAG-3 je anti-LAG-3 antitelo U nekim izvođenjima molekuli anti-LAG-3 antitela su otkriveni u US 2015/0259420, podneto 13. marta, 2015, pod naslovom “Antibody Molecules to LAG-3 and Uses Thereof”.

Katabolizam amino kiseline

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa inhibitorom metabolizma amino kiselina kao što je IDO ili inhibitor Arginaze1 ili Arginaze2 za antagonizaciju imuno-inhibitornog efekta imuno-supresivnih imunih ćelija kao što su supresorske ćelije izvedene iz mijeloida.

Purinergiþki Signalni Put

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa inhibitorima purinergičkog signalnog puta kao što su antagonisti CD39 i CD73 puta ili inhibitori A2A / A2B receptora.

Hemokini i hemokinski receptori

4

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa hemokinom ili antagonistom hemokinskih receptora da inhibiraju regrutovanje supresivnih imunih ćelija u tumorsko mikrookolno okruženje. Na primer, ali ne isključivo, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji CCR2 ili CCR5 antagonista za smanjenje infiltracije mieloidnih supresorskih ćelija i regulitetnih T ćelija.

Agonisti Receptora T-üelija

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa agonistom T-ćelijskog receptora, kao što je CD28 agonist, OX40 agonist, GITR agonist, CD137 agonist, CD27 agonist ili HVEM agonist.

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa CD27 agonistom. Primerni CD27 agonisti uključuju anti-CD27 agonističko antitelo, npr. kao što je opisano u PCT Objavi Br. WO 2012/004367.

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa GITR agonistom. U nekim izvođenjima, kombinacija se koristi za lečenje čvrstog tumora ili hematološkog maligniteta. Primerni GITR agonisti uključuju, npr., GITR fuzione proteine i anti-GITR antitela (npr., bivalentna anti-GITR antitela).

TLR Agonisti

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa agonistom receptora sličnog Toll-u. Termin „Toll-sličan receptor“ (ili „TLR“), kako se ovde koristi, odnosi se na člana porodice proteina sličnog Toll-u, ili njegov fragment koji oseti mikrobni proizvod i / ili pokreće adaptivni imuni odgovor. U jednom izvođenju, TLR aktivira dendritičku ćeliju (DC). Receptori slični Toll-u (TLR) su porodica receptora za prepoznavanje obrasca koji su u početku identifikovani kao senzori urođenog imunološkog sistema koji prepoznaju mikrobne patogene. TLRs čine porodicu konzerviranih membranskih molekula koji sadrže ektodomen ponavljanja bogatih leucinom, transmembranski domen i intraćelijski TIR (Toll/IL-1R) domen. TLR prepoznaju različite strukture u mikrobima, koje se često nazivaju „PAMP“ (molekularni obrasci povezani sa patogenima). Vezivanje liganda za TLRs poziva na kaskadu intraćelijskih signalnih puteva koji indukuju proizvodnju faktora koji su uključeni u upalu i imunitet.

TLR agonisti poznati u struci i koji pronalaze upotrebu u predmetnom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće:

Pam3Cys, a TLR-1/2 agonist;

CFA, a TLR-2 agonist;

MALP2, a TLR-2 agonist;

Pam2Cys, a TLR-2 agonist;

FSL-1, a TLR-2 agonist;

Hib-OMPC, a TLR-2 agonist;

poliribozinska:poliribocitidinska kiselina acid (Poly I:C), TLR-3 agonist;

poliadenozin-poliuridinska kiselina (poly AU), TLR-3 agonist;

Poliinozinska-Policitidinska kiselina stabilizovana sa poli-L-lizinom i karboksi metilcelulozom

(Hiltonol<®>), TLR-3 agonist;

monofosforni lipid A (MPL), TLR-4 agonist;

LPS,TLR-4 agonist;

bakterijski flagellin, TLR-5 agonist;

sial-Tn (STn), karbohidrat povezan sa MUC1 mucinom na određenom broju humanih ćelija karcinoma i TLR-4 agonist;

imihimod, TLR-7 agonist;

resihimod, TLR-7/8 agonist;

loksoribin, TLR-7/8 agonist; i

neobrađen CpG dinukleotid (CpG-ODN), TLR-9 agonist.

Zbog svojih adjuvantnih kvaliteta, TLR agonisti se poželjno koriste u kombinacijama sa drugim vakcinama, adjuvansima i / ili imunološkim modulatorima i mogu se kombinovati u različitim kombinacijama. Dakle, u određenim izvođenjima, mono- ili di-FCDN jedinjenja koja se vezuju za STING i indukuju STING-zavisnu aktivaciju TBK1 i inaktivirana tumorska ćelija koja eksprimira i luči jedan ili više citokina koji stimulišu indukciju, regrutovanje i / ili sazrevanje dendritičnih ćelija, kako je ovde opisano, može se primenjivati zajedno sa jednim ili više TLR agonista u terapeutske svrhe.

Terapija Antitelima

Jedinjenja predmetnog pronalaska se mogu koristiti u kombinaciji sa terapijskim antitelima. U nekim izvođenjima, mehanizam delovanja terapijskog antitela je Antitelno Zavisna ûelijski Posredovana Citotoksičnost (ADCC). ADCC je mehanizam imunološke odbrane posredovane ćelijama, pri čemu efektorska ćelija imunog sistema aktivno lizira ciljnu ćeliju, čiji su antigeni na površini membrane vezani specifičnim antitelima. To je jedan od mehanizama putem kojih antitela, kao deo humoralnog imunološkog odgovora, mogu delovati ograničavajući i zadržavajući infekciju. Klasični ADCC posreduju ćelije prirodnih ubica (NK); makrofagi, neutrofili i eozinofili takođe mogu da posreduju u ADCC. ADCC je važan mehanizam delovanja terapijskih monoklonskih antitela, uključujući trastuzumab i rituksimab, protiv tumora. Jedinjenja predmetnog pronalaska mogu delovati da pojačaju ADCC.

Sledi primer liste antitela koja se mogu koristiti zajedno sa jedinjenjima predmetnog pronalaska:

Muromonab-CD3, Infliksimab, adalimumab, Omalizumab, Daclizumab, Rituksimab, Ibritumomab, Tositumomab, Cetuksimab, Trastuzumab, Alemtuzumab, Lim-1 Ipilimumab, Vitaksin, Bevacizumab and Abciksimab.

Dodatna terapijska antitela koja se mogu koristiti u kombinaciji sa jedinjenjima predmetnog pronalaska uključuju inhibitor prolaktinskog receptora (PRLR), inhibitor HER3, inhibitor EGFR2 i / ili EGFR4, inhibitor M-CSF, antitelo protiv APRIL ili anti-SIRPĮ ili anti-CD47 antitelo.

Hemoterapeutski Agensi

U dodatnim izvođenjima ovde opisanih postupaka, jedinjenja predmetnog pronalaska se koriste u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensima (npr. farmaceutska jedinjenja sa malim molekulima). Prema tome, postupci dalje uključuju davanje subjektu efikasne količine jednog ili više hemoterapeutskih agenasa kao dodatno lečenje ili kombinovano lečenje. U određenim izvođenjima jedan ili više

4

hemoterapeutskih agenasa odabrano je iz grupe koju čine abiraterone acetat, altretamin, anhidrovinblastin, auristatin, beksaroten, bicalutamid, BMS 184476, 2,3,4,5,6-pentafluoro-N-(3-fluoro-4-metoksifenil)benzen sulfonamid, bleomicin, N,N-dimetil-L-valil-L-valil-N-metil-L-valil-L-proli- 1-Lprolin-tbutilamid, cachektin, cemadotin, hlorambucil, ciklofosfamid, 3',4'-didehidro-4'- deoksi-8'-norvin-caleukoblastin, docetaksol, doksetaksel, ciklofosfamid, carboplatin, carmustin, cisplatin, criptoficin, ciklofosfamid, citarabin, dacarbazin (DTIC), daktinomicin, daunorubicin, decitabin dolastatin, doksorubicin (adriamicin), etoposid, 5-fluorouracil, finasterid, flutamid, hidroksiurea i hidroksiureataksanes, ifosfamid, liarozol, lonidamin, lomustin (CCNU), enzalutamid, mehloretamin (nitrogen mustard), melfalan, mivobulin isetionat, rizoksin, sertenef, streptozocin, mitomicin, metotreksat, taksanes, nilutamid, onapriston, paclitaksel, prednimustin, procarbazin, RPR109881, stramustin fosfat, tamoksifen, tasonermin, taksol, tretinoin, vinblastin, vinkristin, vindesin sulfat, i vinflunin.

U dodatnom izvođenju ovde opisanih postupaka, jedinjenja predmetnog pronalaska se koriste u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensima i / ili dodatnim agensima za lečenje indikacija kako je opisano u ovde navedenim postupcima. U nekim izvođenjima, jedinjenja predmetnog pronalaska se koriste u kombinaciji sa jednim ili više agenasa izabranih iz grupe koju čine sotrastaurin, nilotinib, 5-(2,4-dihidroksi-5-izopropilfenil)-N-etil-4-(4-(morfolinometil)fenil)izoksa-zol-3-karboksamid, dactolisib, 8-(6-Metoksi-piridin-3-il)-3-metil-1-(4-piperazin-1-il-3-trifluorometil-fenil)-1,3-dihidroimidazo[4,5-c]hinolin-2-on, 3-(2,6-dihloro-3,5-dimetoksifenil)-1-(6-((4-(4-etilpiperazin-1-il)fenil)amino)pirimidin-4-il)-1-metilurea, buparlisib, 8-(2,6-difluoro-3,5- dimetoksi fenil)-N-(4-((dimetilamino)metil)-1H-imidazol-2-)hinoksalin-5-karboksamid, (S)-N1-(4-metil-5-(2-(1,1,1-trifluoro-2-metilpropan-2-il)piridin-4-il)tiazol-2-il)pirolidin-1,2-dikarboksamid, (S)-1-(4-hlorofenil)-7-izopropoksi-6-metoksi-2-(4-(metil-(((1r,4S)-4-(4-metil-3-oksopiperazin-1-il)ciklohesil)metil)amino)fenil)-1,2-dihidroizohinolin-3(4H)-on, deferasiroks, letrozol, (4S,5R)-3-(2'-amino-2-morfolino-4'-(trifluorometil)-[4,5'-bipirimidin]-6-il)-4-(hidroksimetil)-5-metoksazolidin-2-on, (S)-5-(5-hloro-1-metil-2-okso-1,2-dihidropiridin-3-il)-6-(4-hlorofenil)-2-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-1-izoprop-5,6-dihidropirrolo[3,4-d]imidazol-4(1H)-on, 4-((2-(((1R,2R)-2-hidroksicikloheks)amino) benzo[d]tiazol-6-il)oksi)-N-metilpicolin-amid, imatinib mesat, 2-fluoro-N-metil-4-(7-(hinolin-6-metil)imidazo[1,2-b][1,2,4]triazin-2-il)benzamid, ruksolitinib, panobinostat, osilodrostat, (S)-N-((S)-1-cikloheksil-2-((S)-2-(4-(4-fluorobenzo)tiazol-2-il)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-2-(metamino)propanamid, (S)-N-((S)-1-cikloheksil-2-((S)-2-(4-(4-fluoro benzo)tiazol-2-il)pirolidin-1-il)-2-oksoetil)-2-(metilamino)propanamid, sonidegib fosfat, ceritinib, 7-ciklopentil-N,N-dimetil-2-((5-(piperazin-1-il)piridin-2-il) amino)-7H-pirolo [2,3-d]pirimidin-6-karboksamid, N-(4-((1R,3S,5S)-3-amino-5-metilcikloheksil) piridin-3-)-6-(2,6-difluorofenil)-5-fluoropikolinamid, 2-(2',3-dimetil-[2,4'-bipiridin]-5-il)-N-(5-(pirazin-2-)piridin-2-il)acetamid, encorafenib, 7-ciklopentil-N,N-dimetil-2-((5-((1R,6S)-9-metil-4-okso-3,9-diazabiciklo[4.2.1]-nonan-3-il)piridin-2-il)amino)-7H-pirolo[2,3-d] pirimidin-6-karboksamid, binimetinib, midostaurin, everolimus, 1-metil-5-((2-(5-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il)piridin-4-il)oksi)-N-(4-(trifluorometil)fenil)-1H-benzo[d] imidazol 2-amin, pasireotid diaspartat, dovitinib, (R,E)-N-(7-hloro-1-(1-(4-(dimetilamino)but-2-enoil)azepan-3-il)-1H-benzo[d]imidazol-2-il)-2-metilizonikotin amid, N6 -(2-izopropoksi-5-metil-4-(1-metilpiperidin-4-il)fenil)-N4 -(2-(izopropil sulfonil)-fenil)-1H-pirazolo[3,4-d]pirimidin-4,6-diamin, 3-(4-(4-((5-hloro-4-((5-metil-1H-pirazol-3-il)amino)pirimidin-2-il)amino)-5-fluoro-2-metilfenil)piperidin-1-il)tietan 1,1-dioksid, 5-hloro-N2 -(2-fluoro-5-metil-4-(1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)piperidin-4-il)fenil)-N4 -(5-metil-1H-pirazol-3-il)pirimidin-2,4-diamin, 5-hloro-N2-(4-(1-etilpiperidin-4-il)-2-fluoro-5-metilfenil)-N4 -(5-metil-1H-pirazol-3-il)pirimidin-2,4-diamin, valspodar, i vatalanib sukcinat.

U drugim izvođenjima, jedinjenja predmetnog pronalaska mogu se koristiti u kombinaciji sa PKC inhibitorom, BCR-ABL inhibitorom, HSP90 inhibitorom, inhibitorom PI3K i / ili mTOR, FGFR inhibitorom, PI3K inhibitorom, FGFR inhibitorom, PI3K inhibitorom, inhibitor citohroma P450 (npr., CIP17 inhibitor), HDM2 inhibitorom, inhibitorom aromataze, inhibitor p53 i / ili p53 / Mdm2 interakcije, ili inhibitor CSF-1R tirozin kinaze.

Pogodni preparati uključuju, na primer, tablete, kapsule, supozitorije, rastvore -naročito rastvore za injekcije (s.c., i.v., i.m.) i infuzije - eliksire, emulzije ili disperzivni prah. Sadržaj farmaceutski aktivnih jedinjenja treba da bude u opsegu od 0.1 do 90 mas.%, Poželjno 0.5 do 50 mas.% kompozicije u celini, odn. u količinama koje su dovoljne za postizanje doznog opsega navedenog u nastavku. Navedene doze mogu se, ako je potrebno, davati nekoliko puta dnevno.

4

Doziranje za gore pomenute kombinacione partnere je obično 1/5 najniže preporučene doze do 1/1 uobičajeno preporučene doze.

U još jednom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za lečenje bolesti ili stanja povezanih sa ili moduliranim od strane ili na koje može uticati modulacija STING kod pacijenta, pomenuti postupak uključuje korak davanja pacijentu, poželjno čoveku, kojme je potrebno takvo lečenje, terapeutski efikasne količine jedinjenja predmetnog pronalaska u kombinaciji sa terapeutski efikasnom količinom jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa opisanih u prethodnom tekstu.

Upotreba jedinjenja prema pronalasku u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensom može se odvijati istovremeno ili u raspoređenim vremenima.

Jedinjenje prema pronalasku i jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa mogu biti prisutni zajedno u jednoj formulaciji ili odvojeno u dve identične ili različite formulacije, na primer kao takozvani komplet delova.

Shodno tome, u drugom aspektu, ovaj pronalazak se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedinjenje prema pronalasku i jedan ili više dodatnih terapeutskih agenasa opisanih ovde ranije i u daljem tekstu, opciono sa jednim ili više inertnih nosača i / ili razblaživača.

Ostale karakteristike i prednosti predmetnog pronalaska postaće očigledne iz sledećih detaljnijih primera koji ilustruju, kao primer, principe pronalaska.

Sinteza jedinjenja prema predmetnom pronalasku

OPŠTE TEHNIýKE NAPOMENE

Izrazi "temperatura okoline" i "sobna temperatura" koriste se naizmenično i označavaju temperaturu od oko 20 °C, npr.15 do 25 °C.

4

Po pravilu,<1>H NMR spektra i / ili maseni spektri su dobijeni od pripremljenih jedinjenja. Ako nije drugačije naznačeno, sve hromatografske operacije su izvedene na sobnoj temperaturi. Tokom ciklične sinteze dinukleotida, isparavanje rastvarača se tipično vrši rotacijskim isparavanjem pod smanjenim pritiskom sa temperaturama vodenog kupatila koje nisu veće od 35 °C. Dalje, tokom ciklične sinteze dinukleotida, reakcije su se izvodile pod azotom ili argonom.

Spektar nuklearne magnetne rezonance (NMR): Za<1>H spektar, hemijski pomaci su se odnosili na signal DMSO rastvarača (2,50 ppm) ili, za merenja u D2O, do DSS (4,4-dimetil-4-silapentan-1-sumporna kiselina).<31>P NMR spektra bili su indirektno referencirani upoređivanjem apsolutnih frekvencija<1>H/<31>P (Bruker BioSpin GmbH, Software : TopSpin, au program: xsi). Svi<31>P NMR spektri su zabeleženi sa odvajanjem protona.

Lista Skraćenica

ACN acetonitril

aq. vodeni

°C stepen Celuloze

DA diodni niz

DBU diazabiciklo[5.4.0]undec-7-en

CEP (2-cijanoetil)-(N,N-diizopropil)]-fosforamidit

DCM dihlorometan

DDTT3-((N,N-dimetil-aminometiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazol-3-tion

DIPEA diizopropetilamin

DMAP 4-dimetilaminopiridin

DMF N,N-dimetilformamid

DMOCP 2-hloro-5,5-dimetil-2-okso-1,3,2-dioksafosforinan

DMT 4,4’-dimetiloksitritil

ESI-MS masena spektrometrija jonizacije elektrosprejom

EtOAc etil acetat

eq ekvivalent

FC Brza hromatografija, SiO2je korišćen ako nisu dati

4

dodatni podaci

h sat

HCl hidrogenhlorid

[dimetilamino-(1,2,3-triazolo[4,5-b]piridin-3-iloksi)-HATU

metilen]-dimetil-amonijum heksafluorofosfat HPLC hromatografija visokih performansi

L litar

LiHMDS litijum Heksametildisilazid

m/z odnos masa-naelektrisanje

MeOH metanol

min minut

mL mililitar

MS maseni spektrum

n.d. nije određen

NH4OH rastvor NH3u vodi

dihloro[1,3-bis(2,6-Di-3-pentilfenil)imidazol-2-iden](3-Pd-PEPPSI-IPent™

hloropiridil)paladijum(II)

psi funta po kvadratnom inču

RT sobna temperatura (oko 20°C)

SEM 2-(trimetilsilil)etoksimetil

Sol rastvarač

TBS terc-but-dimetilsilil

TEA trietil amin

TEAF trietilamonijum format

TF / TFA trifluorosirćetna kiselina

TFAA anhidrid trifluorosirćetne kiseline

THF tetrahidrofuran

tRvreme zadržavanja u minutima

Analitičke HPLC-konfiguracije:

Konfiguracija A (gradient HPLC):

4

VWR / Hitachi: L-2130 Pumpa; VWR / Hitachi: L-2200 Autosampler; VWR / Hitachi: L-2350 Kolonska rerna (podešena na 30°C); VWR / Hitachi: L-2400 promenljive talasne dužine UV/Vis detektor; EZChrom softver verzija 3.3.1 SP1.

YMC*GEL ODS-A 12 nm (10 µm; 250 x 0.4 mm)) kanal A= 20 mM TEAF (pH 6.8) u vodi; kanal B= 100 % acetonitril, 20 mM TEAF (pH 6.8). Gradient: 0 min 100 % A; 30 min 100 % B; 40 min 100 % B, 30°C; brzina protoka: 1.0 mL/min; UV 261 nm;

Konfiguracija B (isocratic HPLC):

VWR / Hitachi: L-7100 Pumpa; VWR / Hitachi: L-7400 promenjiva talasna dužina UV/Vis detektor; VWR / Hitachi: D-7500 Integrator.

Analitički HPLC (konfiguracija C; YMC*GEL ODS-A 12 nm (10 µm; 250 x 0.4 mm)) 11 % acetonitril, 20 mM TEAF (pH 6.8) u vodi; brzina protoka: 1.0 mL/min; UV 264 nm;

LC-MS-Analitike:

HPLC-Sistem: VWR / Hitachi: L-2130 Pumpa; VWR / Hitachi: L-2200 Autosampler; VWR / Hitachi: L-2300 Kolonska Rerna; VWR / Hitachi: L-2450 Detektor Niza Dioda; Agilent: OpenLab

MS-Sistem: Bruker Esquire LC 6000 spektrometar

Sistem A

Kolona: Kromasil 100-5 C8, 5 µm, 50 mm x 3 mm.

Brzina protoka: 0.4 mL/min, 35°C, opseg UV-detekcije: 220 - 300 nm

Maseni spektrum: Snimljeno na spektrometru mase primenom negativne i pozitivne jonizacije elektrosprejom

Rastvarači: A: acetonitril

B: voda

C: 20 mM NH4HCO3(pH 7) u vodi

4

Priprema uzorka: Uzorci (2 µL – 10 µL) su rastvoreni u 175 µL acetonitrila i 175 µL vode, zapremina ubrizgavanja 2 µL – 10 µL.

Sistem B

Kolona: ACE 3 AQ 110-3 C18, 5 µm, 50 mm x 3 mm.

Brzina protoka: 0.4 mL/min, 35°C, opseg UV-detekcije: 220 - 300 nm

Maseni spektrum: Snimljeno na spektrometru mase primenom negativne i pozitivne jonizacije elektrosprejom

Rastvarači: A: acetonitril

B: voda

C: 20 mM NH4HCO3(pH 7) u vodi

Gradijent: Vreme A% B% C%

0 2 93 5

20 60 35 5

23 95 0 5

24 2 93 5

30 2 93 5

1

SINTEZA INTERMEDIJERA INTERMEDIJER 1.1

Imidazopyridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (1-(ȕ-D-ribofuranozil) imidazo [4,5-d] piridazin-4(5H)-on)

Naslovno jedinjenje je dobijeno kao što je opisano u J. Chem. Soc. Perkin Trans.1 1989, 1769-1774.

2

INTERMEDIJER 1.2

5’-DMT-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid

Imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozie (INTERMEDIJER 1.1, 4.00 g, 14.9 mmol) je azeotropiran sa anhidrovanim piridinom (3 x 20 mL), osušen in vacuo i rastvoren u anhidrovanom piridinom (25 mL). Ovom rastvoru je dodat rastvor 4,4'-dimetoksitritil hlorid (5.05 g, 14.9 mmol) u anhidrovanom piridinu (15 mL) i reakciona smeša je mešana 1 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je uparena pod smanjenim pritiskom i rezultujući ostatak je prečišćen preparativnom reverznom fazom HPLC (X-Bridge C18, acetonitril/ voda / NH3)

LC-MS (sistem D):

tRet= 0.82 min; ESI-MS: 571 [M+H]<+>

INTERMEDIJER 1.3-a and INTERMEDIJER 1.3-b

5’-DMT-2’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.3-a) i 5’-DMT-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.3-b)

INTERMEDIJER 1.3-a INTERMEDIJER 1.3-b 5’-DMT-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.2, 5.30 g, 9.29 mmol) je azeotropiran sa anhidrovanim piridinom (3 x 30 mL), osušen in vacuo i rastvoren u anhidrovanom piridinu (20 mL). Ovom rastvoru je dodat imidazol (1.90 g, 27.9 mmol) i terc-buthlorodimetilsilan (1.54 g, 10.2 mmol) i reakciona smeša je mešana 6 h na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je podeljena između dihlorometana i vode. Organski sloj je odvojen, a vodeni sloj ekstrahovan dihlorometanom. Kombinovani organski ekstrakti su isprani slanim rastvorom, osušeni hidrofobnim fritom i upareni pod smanjenim pritiskom. Rezultujući ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom srednjeg pritiska (silika gel, gradijent 5-20% aceton u dihlorometanu).

LC-MS (sistem F):

INTERMEDIJER 1.3-a : tRet= 1.57 min; ESI-MS: 685 [M+H]<+>INTERMEDIJER 1.3-b: tRet= 1.67 min; ESI-MS: 685 [M+H]<+>

INTERMEDIJER 1.4

5’-DMT-3’-TBS-2’-CEP-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid

5’-DMT-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.3-b, 1.75 g, 2.56 mmol) je azeotropiran sa anhidrovanim acetonitrilom (3 x 25 mL), osušen in vacuo i rastvoren u anhidrovanom dihlorometanu (45 mL). Ovom rastvoru je dodat 2-cijanoetil N,N,N',N'-tetraizopropilfosforodiamidit (1.62 mL, 5.12 mmol) i tetrazol (5.69 mL 0.5 M rastvora u acetonitrilu, 2.85 mmol) i rekaciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 4 h. Reakciona smeša je razblažena sa dihlorometanom i isprana sa vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata. Organski sloj je odvojen, a vodeni sloj je ekstrahovan dihlorometanom. Kombinovani organski ekstrakti su osušeni hidrofobnim fritom i upareni pod smanjenim pritiskom. Dobijeni ostatak je prečišćen kolonskom hromatografijom srednjeg pritiska (silika gel (deaktiviran sa trietilaminom

4

u dihlorometanu), gradijent od 20-100% etil acetata (3% trietilamin) u cikloheksanu). Proizvod je dobijen kao smeša diastereoizmera.

LC-MS (sistem D):

tRet= 1.33 min; ESI-MS: 885 [M+H]<+>

<31>P NMR (162 MHz, 303 K, CDCl3) į 150.9 i 149.7 ppm.

INTERMEDIJER 1.5

5’-OH-2’-TBS-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-adenozin

N<6>-Bz-5’-DMT-2’-TBS-3’-CEP-adenozin (dobijen iz ChemGenes, 0.890 g, 0.90 mmol) je rastvoren u acetonitrilu (15 mL) i vodi (0.033 mL, 1.83 mmol, 2 eq.) na sobnoj temepraturi. Piridinijum trifluoroacetat (0.210 g, 1.09 mmol, 1.2 eq.) je dodat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 10 minuta. terc-Butamin (10 mL, 95.7 mmol) je dodat i rekaciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Reakciona smeša je uparena pod sniženim pritiskom, ponovo rastvorena u anhidrovanom acetonitrilu (25 ml) i uparena pod sniženim pritiskom da bi se dobila bela do bezbojna pena. Ostatak je rastvoren u dihlorometanu (25 ml) i vodi (0.162 ml, 9 mmol, 10 ekv.). Dodata je dihlorosirćetna kiselina (0.670 ml, 8.12 mmol, 9 ekv.) u dihlorometanu (25 ml) i dobijeni narandžasti rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 10 minuta. Dodan je piridin (1.31 ml, 16.23 mmol, 18 ekv.) i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta.

LC-MS analitika sirovine potvrdila je prisustvo INTERMEDIJER 1.5.

LC-MS (sistem A):

tRet= 3.10 min; ESI-MS: 550 [M+H]<+>

Posuda je začepljena, pažljivo zatvorena i čuvana na 2 °C 16 sati. Rastvarači su upareni pod smanjenim pritiskom, a ostatak je azeotropiran anhidrovanim acetonitrilom (4 x 15 ml). Tokom poslednjeg postupka isparavanja, rastvor je koncentrovan na približno 5 ml konačnog azeotropa. Dobijeni bezvodni rastvor intermedijera 1.5 je odmah korišćen u sledećem nizu reakcija.

INTERMEDIJER 1.6

Linearni dimer 5’-OH-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetil-fosforotioat-2’-TBS-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-adenozin

5’-DMT-3’-TBS-2’-CEP-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.4, 1.340 g, 1.51 mmol, 1.7 eq.) je azeotropiran sa anhidrovanim acetonitrilom (4x10 mL). Tokom poslednje procedure uparavanja rastvor je koncentrovan do približno 3 mL finalnog azeotropa. Rezultujući rastvor je dodat 5’-OH-2’-TBS-3’-H-fosfonat-N<6>-Bzadenozinu (INTERMEDIJER 1.5) rastvorenom u približno 5 mL anhidrovanog acetonitrila (teoretska količina željenog materijala: 0.495 g, 0.90 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. ((N,N-dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazolin-3-tion (DDTT) (0.203 g, 0.99 mmol, 1.1 eq.) je dodat i rakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta.

Isparljive materije su uparene pod smanjenim pritiskom, a ostatak je rastvoren u dihlorometanu (25 ml) i vodi (0.162 mL, 9 mmol, 10 ekv.). Dihlorosirćetna kiselina (1.340 mL, 16.24 mmol, 18 ekv.) u dihlorometanu (25 mL), je dodat i narandžasti rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 20 minuta. Piridin (10 mL) je dodat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta.

LC-MS analitika sirovine potvrdila je prisustvo INTERMEDIJER 1.6 kao smeša diastereoizomera.

LC-MS (sistem A):

INTERMEDIJER 1.6-a: tRet= 7.36 min; INTERMEDIJER 1.6-b: tRet= 7.57 min;

ESI-MS: 1063 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

Posuda je začepljena, pažljivo zatvorena i čuvana na 2 °C 16 sati. Smeša je uparena pod sniženim pritiskom, a ostatak je zajedno uparen sa anhidrovanim piridinom (2 x 20 mL) pod smanjenim pritiskom. Dodat je sledeći deo 40 mL anhidrovanog piridina i ostatak je koncentrovan pod smanjenim pritiskom na približno 20 mL ukupne zapremine. Dobijeni bezvodni rastvor INTERMEDIJER 1.6 odmah je korišćen u sledećem nizu reakcija.

INTERMEDIJER 1.7

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetilfosforotioat-2’-TBS-N<6>-Bz-adenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat

2-Hloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafosforinan 2-oksid (DMOCP) (0.581 g, 3.15 mmol, 3.5 ekv.) je dodat sirovom 5’-OH-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-CE-PS-2’-TBS-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-adenozinu (INTERMEDIJER 1.6) (teoretska količina željenog materijala u sirovom preparatu: 0.957 g, 0.90 mmol) u anhidrovanom piridinu u ukupnoj zapremini od približno 20 mL. Rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi 20 minuta. Voda (0.570 mL, 31.6 mmol, 35.1 ekv.) i 3H-1,2-benzoditiol-3-on (0.230 g, 1.37 mmol, 1.5 ekv.) su dodati i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi. Posle 20 minuta, reakciona smeša je sipana u rastvor natrijum hidrogen karbonata (4.500 g, 53.6 mmol) u 150 mL vode i mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta, praćeno sa dodavanjem smeše etil acetata / metilterc-butiletar (150 mL, 1:1). Organske faze su odvojene, a vodena faza je dalje ekstrakovana dva puta sa etil acetatom / metil-terc-butiletar (2 x 75 mL, 1:1).

Kombinovane organske faze su sušene anhidrovanim magnezijum sulfatom, praćeno uparavanjem rastvarača pod sniženim pritiskom i završnim istovremenim isparavanjem sa 100 ml anhidrovanog toluena. Sirovina je prečišćena preparativnom brzom hromatografijom (160 g silika gel, gradijent 0–12.5% MeOH u dihlorometanu) kako bi se dobilo 0.78 g čistog obogaćenog INTERMEDIJER 1.7 (semša diastereomera).

LC-MS (sistem A):

INTERMEDIJER 1.7-a: tRet= 7.56 min; INTERMEDIJER 1.7-b: tRet= 8.18 min; INTERMEDIJER 1.7-c: tRet= 9.02 min; INTERMEDIJER 1.7-d: tRet= 10.17 min; ESI-MS: 1077 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 1.8

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-2’-TBS-adenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat

125 mL 33 % metamina u apsolutnom etanolu je dodat čistom obogaćenom 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetil-fosforotioat-2’-TBS-N<6>-Bzadenozin-(3'ĺ5')-fosforotioatu (INTERMEDIJER 1.7; 0.780 g) i rezultujući rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 4 sata. Sve isparljive materije su uparene pod sniženim pritiskom i dalje osušene in vacuo kako bi se dobilo 0.758 g sirovog INTERMEDIJER 1.8 (smeša diastereomera), koja je direktno korišćena u sledećoj reakciji.

LC-MS (sistem A):

INTERMEDIJER 1.8-a: tRet= 1.47 min; INTERMEDIJER 1.8-b: tRet= 3.60 min;

INTERMEDIJER 1.8-c: tRet= 3.90 min; INTERMEDIJER 1.8-d: tRet= 5.53 min;

ESI-MS: 920 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 2.1

5’-OH-2’-F-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-2’-deoksiadenozin

N<6>-Benzo-5’-DMT-2’-F-2’-deoksiadenozin-3’-CEP (dobijen od strane Alfa Aesar) (1.05 g, 1.20 mmol) je rastvoren u acetonitrilu (6 mL) i vodi (0.043 mL, 2.40 mmol, 2 ekv.) na sobnoj temperaturi. Piridinijum trifluoroacetat (278 mg, 1.44 mmol, 1.2 ekv.) je dodat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta. Posle toga, terc-butamin (6.0 mL, 57.1 mmol) je dodat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 15 minuta. Reakciona semša je uparena in vacuo, ponovo rastvorena (2x) u anhidrovanom acetonitrilu (12 mL) i ponovo uparena in vacuo kako bi se dobila bela do bezbojna pena. Ostatak je rastvoren u dihlorometanu (14.4 mL) i vodi (0.22 mL, 12.0 mmol, 10 ekv.). Dihlorosirćetna kiselina u dihlorometanu (6%, 14.4 mL) je dodata i rezultujući narandžasti rastvor je mešan na sobnoj temperaturi 10 minuta. Piridin (1.64 mL, 20.3 mmol, 17 ekv.) je dodat i reakciona smeša je uparena in vacuo i azeotropirana sa anhidrovanim acetonitrilom (3 x 11 mL). Na kraju, preostali sirovi proizvod se suši u visokom vakuumu dodatnih 30 minuta i koristi bez daljeg prečišćavanja.

LC-MS analitika sirovine potvrdila je prisustvo INTERMEDIJER 2.1.

LC-MS (sistem E):

tRet= 0.64 min ESI-MS: 438 [M+H]<+>.

INTERMEDIJER 2.2

Linearni dimer 5’-OH-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetil-fosforotioat-2’-F-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-2’-deoksiadenozin

5’-DMT-3’-TBS-2’-CEP-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid (INTERMEDIJER 1.4, 1.38 g, 1.56 mmol, 1.0 ekv.) je rastvoren u anhidrovanom acetonitrilu (10 mL) i azeotropikalno uparen in vacuo. Ova operacija je ponovljena još tri puta, ostavljajući oko 5 ml azeotropa u elermajeru pri poslednjem isparavanju. 10 komada molekularnog sita (3Å) su dodati i rezultujuća smeša je dodata u 5’-OH-2’-F-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-2’-deoksiadenozin (INTERMEDIJER 2.1) rastvoren u približno 3 mL anhidrovanog acetonitrila (teoretska količina željenog materijala: 523 mg, 1.20 mmol) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta. ((N,N-dimetilamino-metiliden)amino)-3H-1,2,4-ditiazolin-3-tion (DDTT) (275 mg, 1.34 mmol, 0.9 ekv.) je dodat i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi 30 minuta. Isparljive materije su uparene in vacuo, a ostatak je rastvoren u dihlorometanu (20 ml) i vodi (0.216 ml, 12 mmol, 7.7 ekv.). Dodata je dihlorosirćetna kiselina u dihlorometanu (6%, 19.2 ml) i dobijeni narandžasti rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta. Posle ovog perioda, dodat je piridin (12 ml) i reakciona smeša je uparena in vacuo. Na kraju, preostali sirovi proizvod se suši u visokom vakuumu dodatnih 30 minuta i koristi bez daljeg prečišćavanja i karakterizacije.

INTERMEDIJER 2.3

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetilfosforotioat-2’-F-N<6>-Bz-2’-deoksiadenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat

Sirovi intermedijer 2.2 (maksimalna teoretska količina željenog materijala: 1.48 g, 1.56 mmol) je ratsvoren u 36 mL anhidrovanom piridinu i redukovan do približno 20 mL in vacuo. 2-Hloro-5,5-dimetil-1,3,2-dioksafosforinan 2-oksid (DMOCP) (775 mg, 4.20 mmol, 2.7 ekv.) je dodat i rezultujuća smeša je mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta. Voda (0.75 mL, 41.3 mmol, 26.5 ekv.) i 3H-1,2-Benzoditiol-3-on (0.302 g, 1.80 mmol, 1.15 eq.) su dodati i mešanje je nastavljeno na sobnoj temperaturi. Posle 5 minuta, reakciona smeša je sipana u rastvor natrijum hidrogen karbonata (4.00 g, 47.6 mmol) u 140 mL vode i mešana na sobnoj temperaturi 5 minuta, praćeno sa dodavanjem smeše etil acetata / metil-terc-butiletar (140 mL, 1:1). Organska faza je odvojena, a vodena faza je dalje ekstrahovana sa etil acetatom / metil-terc-butiletrom (1:1). Organske faze su kombinovane i rastvarač je uklonjen in vacuo.

Preostali ostatak je rastvoren u minimalnoj zapremini dihlorometana i prečišćen preparativnom brzom hromatografijom (silika gel, DCM/MeOH: 100/0 Æ 80/20). Frakcije su analizirane sa HPLC-MS. Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane i rastvarač je uklonjen in vacuo do prinosa od 900 mg smeše diastereoizomera.

LC-MS analitika materijala potvrdila je prisustvo INTERMEDIJERs 2.3-a/b/c/d.

LC-MS (sistem E):

INTERMEDIJER 2.3-a: tRet= 0.95 min; INTERMEDIJER 2.3-b: tRet= 0.98 min;

INTERMEDIJER 2.3-c: tRet= 1.00 min; INTERMEDIJER 2.3-d: tRet= 1.03 min;

ESI-MS: 965 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 2.4

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-2’-F-2’-deoksiadenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat

Na 10 mL metanola i 10 mL vod. amonijaka (30-33%) dodato je 300 mg (maksimalna teoretska količina željenog materijala: 0.31 mmol) INTERMEDIJER 2.3. Dobijena smeša je mešana na 50 °C tokom 15 h. Reakciona smeša je ohlađena na sobnu temperaturu i azot je produvan kroz smešu 30 minuta. Rastvarač je uklonjen in vacuo, smeša je ponovo rastvorena u anhidrovanom acetonitrilu (30 mL) i ponovo uparen in vacuo. Ostatak je triturisan sa anhidrovanim acetonitrilom, filtriran, ispran sa 5 ml ACN i sušen preko noći na sobnoj temperaturi. Sirovi proizvod je rastvoren u DMF i prečišćen sa preparativnim HPLC (X-Bridge C-18; acetonitril/H2O/NH3). Frakcije koje sadrže proizvod su sakupljene i rastvarač je uklonjen liofilizacijom. Ovom metodom mogla su se razdvojiti sva četiri dijastereoizomera.

LC-MS analitika materijala potvrdila je prisustvo INTERMEDIJERs 2.4-a/b/c/d.

LC-MS (sistem C):

1

INTERMEDIJER 2.4-a: tRet= 1.04 min; INTERMEDIJER 2.4-b: tRet= 1.10 min;

INTERMEDIJER 2.4-c: tRet= 1.13 min; INTERMEDIJER 2.4-d: tRet= 1.15 min;

ESI-MS: 808 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 3.1

5’-OH-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-LNA-adenin

INTERMEDIJER 3.1 je pripremljen analogno INTERMEDIJER 2.1 korišćenjem “LNA-A amidita“ (EQ-0063-1000, dobijenog iz Exiqon) kao polazni materijal.

LC-MS analitika materijala potvrdila je prisustvo INTERMEDIJER 3.1.

LC-MS (sistem E):

tRet= 0.63 min; ESI-MS: 448 [M+H]<+>

INTERMEDIJER 3.2

Linearni dimer 5’-OH-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetil-fosforotioat-3’-H-fosfonat-N<6>-Bz-LNA-adenin

INTERMEDIJER 3.2 je dobijen analogno INTERMEDIJER 2.2 korišćenjem INTERMEDIJER 3.1 i INTERMEDIJER 1.4 kao polazni materijali.

INTERMEDIJER 3.3

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetilfosforo-tioat- N<6>-Bz-LNA-adenin-(3'ĺ5')-fosforotioat

2

INTERMEDIJER 3.3 je dobijen analogno INTERMEDIDATE 2.3 korišćenjem INTERMEDIJER 3.2 kao polaznog materijala.

LC-MS analitika materijala potvrđuje prisustvo INTERMEDIJERs 3.3-a/b/c/d.

LC-MS (sistem E):

INTERMEDIJER 3.3-a: tRet= 0.94 min; INTERMEDIJER 3.3-b: tRet= 0.98 min;

INTERMEDIJER 3.3-c: tRet= 0.99 min; INTERMEDIJER 3.3-d: tRet= 1.03 min;

ESI-MS: 975 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 3.4

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-LNA-adenin-(3'ĺ5')-fosforotioat

INTERMEDIJER 3.4 je dobijen analogno INTERMEDIJER 2.4 koristeći INTERMEDIJER 3.3 kao polazni materijal.

LC-MS analitika materijala potvrđuje prisustvo INTERMEDIJERs 3.4-a/b/c/d.

LC-MS (sistem C):

INTERMEDIJER 3.4-a: tRet= 0.81 min; INTERMEDIJER 3.4-b: tRet= 0.89 min;

INTERMEDIJER 3.4-c: tRet= 0.91 min; INTERMEDIJER 3.4-d: tRet= 0.99 min; ESI-MS: 818 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 4.1

5’-OH-2’-TBS-3’-H-fosfonat-purin-ȕ-D-ribofuranozid

INTERMEDIJER 4.1 je dobijen analogno INTERMEDIJER 1.5 koristeći 5’-DMT-2’-TBS-3’-CEP-purin-ȕ-D-ribofuranozid kao polazni materijal koji je dobijen kao što je opisano u Fu et al. Biochemistry 1993, 32, 10629 – 10637. U odnosu na INTERMEDIJER 1.5 ovaj intermedijer nije čuvan preko noći u sledećim koracima reakcija.

LC-MS analitika sirovog materijala potvrđuje prisustvo INTERMEDIJER 4.1.

LC-MS (sistem B):

tRet= 8.56 min; ESI-MS: 431 [M+H]<+>

INTERMEDIJER 4.2

Linearni dimer 5’-OH-3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetil-fosforotioat-2’-TBS-3’-H-fosfonat-purin-ȕ-D-ribofuranozid

INTERMEDIJER 4.2 je dobijen analogno INTERMEDIJER 1.6 korišećenjem INTERMEDIJER 1.4 i gore opisanog INTERMEDIJER 4.1 kao polaznih materijala. LC-MS analitika sirovog materijala potvrđuje prisustvo INTERMEDIJER 4.2 kao smeša diastereoizomera.

LC-MS (sistem B):

INTERMEDIJER 4.2-a: tRet= 14.86 min; INTERMEDIJER 4.2-b: tRet= 15.01 min;

ESI-MS: 944 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

4

INTERMEDIJER 4.3

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-cijanoetilfosforo-tioat-2’-TBS-purin-ȕ-D-ribofuranozid-(3'ĺ5')-fosforotioat

INTERMEDIJER 4.3 (kao smeša diastereomera) je dobijena analogno INTERMEDIJER 1.7 korišćenjem INTERMEDIJER 4.2 kao polaznog materijala.

LC-MS (sistem B):

INTERMEDIJER 4.3-a: tRet= 15.76 min; INTERMEDIJER 4.3-b: tRet= 16.61 min;

INTERMEDIJER 4.3-c: tRet= 17.68 min; INTERMEDIJER 4.3-d: tRet= 19.26 min;

ESI-MS: 958 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

INTERMEDIJER 4.4

Ciklični dimer 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-2’-TBS-purin-ȕ-D-ribofuranozid-(3'ĺ5')-fosforotioat

INTERMEDIJER 4.4 (kao smeša diastereomera) je dobijen analogno INTERMEDIJER 1.8 korišćenjem INTERMEDIJER 4.3 kao polaznog materijala.

LC-MS (sistem B):

INTERMEDIJER 4.4-a: tRet= 10.31 min; INTERMEDIJER 4.4-b: tRet= 11.82 min;

INTERMEDIJER 4.4-c: tRet= 12.26 min; INTERMEDIJER 4.4-d: tRet= 14.47 min;

ESI-MS: 905 [M+H]<+>za svaki diastereoizomer.

SINTEZE JEDINJENJA PREMA PREDEMTNOM PRONALASKU

Opšta napomena: Sledeći parovi jedinjenja su dijastereomeri i razlikuju se u odnosu na konfiguraciju bar prema jednom atomu fosfora:

PRIMER 1.1 i PRIMER 1.2;

PRIMER 2.1 i PRIMER 2.2;

PRIMER 3.1 i PRIMER 3.2;

PRIMER 4.1 i PRIMER 4.2.

PRIMER 1.1 i PRIMER 1.2

Ciklični (imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-adenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat)

30 mL anhidrovani piridin i 15 mL anhidrovani trietamin su dodati sirovom 3’-TBS-imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-2’-TBS-adenozin-(3'ĺ5')-fosforotioatu (INTERMEDIJER 1.8; 0.76 g). Dobijeni rastvor je koncentrovan pod smanjenim pritiskom na približno 5 mL ukupne zapremine, praćen istovremenim dodavanjem trieiltamin trihidrofluorida (3.590 mL, 21.7 mmol) i 11 mL anhidrovanog trietilamina. Ovaj rastvor je mešan na 50 °C tokom 3.5 sata. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, reakcija je ugašena sa metoksitrimetsilanom (10 mL, 72.4 mmol) i dalje mešana na sobnoj temperaturi da bi potrošila bilo koji višak HF. Posle 30 minuta, sve isparljive komponente su uparene pod smanjenim pritiskom, praćeno završnim istovremenim uparavanjem sa 50 mL anhidrovanog toluena pod smanjenim pritiskom. Ostatak je dalje osušen in vacuo kako bi se dobila sirova smeša koja sadrži Primer 1.1 i Primer 1.2.

65 mL vode je dodati i rezultujuća suspenzija je stavljena u ultrazvučno kupatilo na sobnoj temperaturi. Posle 15 minuta, ova suspenzija je sipana u 60 mL hloroforma i organska faza je odvojena. Ova ekstrakcija je ponovljena još dva puta sa hloroformom. Kombinovane organske faze se ekstrahuju sa 50 mL vode i kombinovana vodena faza koja sadrži proizvod je filtrirana sa 0.45 µm Rotilabo®-CME-filter šprica (spoljašnji prečnik: 33 mm) kako bi se uklonile odgovarajuće komponente. Rastvor proizvoda je razblažen vodom do 500 mL i primen na Q Sepharose™ Brzi Protok kolona za jonsku razmenu (40 – 165 µm; 125 x 35 mm; ~120 mL) Cl--oblik, prethodno regenerisan sa 2 M natrijum hlorida i ispran vodom. Kolona je isprana vodom (2 zapremine kolone), praćena gradijentom 0 - 1M pufera trietilamonijum bikarbonata (TEAB, pH 7) u vodi preko 25 zapremina kolona (detekcija talasne dužine 254 nm). PRIMER 1.1 i PRIMER 1.2 eluira se kao smeša izomera sa ~ 0.6 M TEAB. Frakcije koje sadrže proizvod pažljivo su koncentrovane do konačne zapremine od približno 10 mL pod smanjenim pritiskom.

Razdvajanje PRIMER 1.1 (četvrto eluiranje) i PRIMER 1.2 (treće eluiranje) postignuto je ponovljenim polu-preparativnim HPLC prečišćavanjem reverzne faze. Rastvor proizvoda je nanesen na YMC*GEL ODS-A 12 nm kolona (10 µm; 250 x 16 mm; ~50 mL), prethodno uravnotežen sa 4 % acetonitrilom, 20 mM trietiamonijum formatom (TEAF, pH 6.8) u vodi. Elucija je izvedena sa gradijentom koraka od 4 %, 6 % i 20 % acetonitrila, 20 mM TEAF (pH 6.8) u vodi

Priprema PRIMER 1.1, natrijumova so (“četvrti eluirani dijastereomer”) Desalinizacija PRIMER 1.1, TEA-soli izvedena je preparativnom tečnom hromatografijom reverzne faze srednjeg pritiska (MPLC). Rastvor proizvoda (~40 mL) je primenjen na Merck LiChroprep®RP-18 koloni (15 - 25 µm; 450 x 25 mm; ~220 mL), prethodno uravnotežen sa vodom. Kolona je isprana sa vodom kako bi se uklonio višak TEAF pufera. Posle toga, 2 % 2-propanol u vodi je korišćen kako bi se eluirao desalinizovan PRIMER 1.1. Frakcije koje sadrže proizvod su delimično koncentrovani pod sniženim pritiskom i naknadno primenjeni na SP Sepharose™ Brz Protok kolona za razmenu katjona (45 – 165 µm; 125 x 35 mm; ~120 mL) Na<+>-oblik, prethodno regenerisan sa 2 M natrijum hlorida i ispran vodom. Kolona je isprana vodom sve dok se više nije detektovala UV apsorpcija (detekcija talasne dužine 254 nm). Frakcije koje sadrže proizvod pažljivo su isparene pod smanjenim pritiskom i dodatno osušene in vacuo kako bi se dobio PRIMER 1.1 kao dinatrijumova so.

HPLC (konfiguracija A): tRet= 8.56 min;

ESI-MS: 692 [M+H]<+>

<1>H NMR (400 MHz, 318 K, 500 µL (CD3)2SO 30 µL D2O) į 8.70 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.16 (s, 1H), 6.07 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.91 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 5.07 – 4.99 (m, 2H), 4.95 (dd, J = 7.5, 4.5 Hz, 1H), 4.44 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.33 – 4.21 (m, 3H), 4.05 – 3.93 (m, 1H), 3.92 – 3.77 (m, 2H) ppm.

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 52.4 (s, 1P), 55.3 (s, 1P) ppm.

Priprema PRIMER 1.2, natrijumova so (“treći eluirani diastereomer”) Desalinizacija i izmena soli iz TEA u natrijum PRIMER 1.2, TEA so je izvedena na sličan način kao pto je opisano za PRIMER 1.1, TEA so.

HPLC (konfiguracija A): tRet= 7.75 min;

ESI-MS: 692 [M+H]<+>

<1>H NMR (400 MHz, 318 K, 500 µL (CD3)2SO 30 µL D2O) į 8.72 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.33 (s, 1H), 8.15 (s, 1H), 6.04 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 5.88 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 5.25 (dd, J = 8.5, 4.4 Hz, 1H), 5.08 (ddd, J = 11.2, 8.4, 4.5 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 8.2, 4.3 Hz, 1H), 4.37 – 4.27 (m, 1H), 4.27 – 4.21 (m, 3H), 4.08 (dd, J = 11.0, 4.2 Hz, 1H), 3.82 – 3.77 (m, 1H), 3.67 – 3.60 (m, 1H) ppm.

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 55.8 (s, 1P), 57.0 (s, 1P) ppm.

PRIMER 2.1 i PRIMER 2.2

Ciklični (imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-2’-F-2’-deoksiadenozin-(3'ĺ5')-fosforotioat

16 mg (19 µmol) of INTERMEDIJER 2.4-d je dodat u 1 mL anhidrovanog piridina i 4 mL anhidrovanog acetonitrila i rastvarač je azeotropikovan upsravanjem in vacuo. Ostatak je dva puta ponovo suspendovan u 10 mL bezvodnog acetonitrila i ponovo azeotropno uparen in vacuo. 80.7 µL (1.0 mmol) anhidrovanog piridina i 168 µL (1.2 µmol) TEA su dodati ostatku pre nego što je pažljivo dodat 103 µL (0.63 mmol) TEA*3HF uz pomoć šprica. Rezultujuća smeša je mešana na 50 °C 90 min. Posle hlađenja na sobnu temperaturu, reakcija je zaustavljena dodavanjem 20 mL vod. rastvora trietilamonijum karbonata (konc.= 1 mol/L). Rezultujuća smeša je mešana was dodatnih 15 min na sobnoj temperaturi. Smeša je pažljivo naneta na Water Sep Pak C18 © ketridž (5g C18-materijal, preduslov sa prvim 25 mL acetonitrila i posle sa 25 mL vode) i isrpana sa 60 mL vode. Posle toga je proizvod eluiran iz kertridža upotrebom 100 mL smeše acetonitrila / trietilamonijum acetata / vode (pripremljene dodavanjem 1 mL vodenog rastvora trietilamonijum acetata (konc. = 1 mol / L) u 100 mL vode i 25 mL acetonitrila). Frakcije koje sadrže proizvod su kombinovane a rastvarač je uklon liofilizacijom. Dobijeni proizvod je dalje prečišćen sa prep. HPLC (Atlantis C18; 20 mM aq. NH4OAc / acetonitril = 98/2 Æ 80/20.). Nakon što je rastvarač uklonjen liofilizacijom, proizvod je rastvoren u 2 mL vode i sipan na Bio-Rad Spin kolonu (napunjen sa 250 mg BT AG 50W-2 ostatak 100-200 Mesh vodonikov Oblik, uslovljen sa 3 mL 1M vod. NaOH i posle toga ispran sa 6 mL vode rezultujući sa pH~7)) i eluiran sa 12 mL vode. Frakcije koje sadrže konačni proizvod su kombinovane i rastvarač je uklonjen liofilizacijom.

PRIMER 2.1:

LC-MS (sistem C):

tRet = 0.61 min; ESI-MS: 694 [M+H]+

1H NMR (400 MHz, 303 K, D2O) į ppm 8.73 (s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 7.96 (s, 1 H), 6.40 (d, J=15.9 Hz, 1 H), 6.26 (d, J=8.6 Hz, 1 H), 5.55 (dd, J=51.1, 3.8 Hz, 1 H), 4.83 - 4.99 (m, 2 H), 4.75 (d, J=4.2 Hz, 1 H), 4.65 (ddd, J=12.2, 9.0, 2.2 Hz, 1 H), 4.53 - 4.59 (m, 2 H), 4.43 – 4.48 (m, 1 H), 4.16 - 4.24 (m, 2 H)

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 55.7 (s, 1P), 52.2 (s, 1P) ppm.

PRIMER 2.2

PRIMER 2.2 je pripremljen analogno PRIMER 2.1 koristeći INTERMEDIJER 2.4-c kao polazni materijal.

LC-MS (sistem C):

tRet= 0.30 min; ESI-MS: 694 [M+H]<+>

1H NMR (400 MHz, 303K, D2O) į ppm 8.80 (s, 1 H), 8.55 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 8.24 (s, 1 H), 6.44 (d, J=15.0 Hz, 1 H), 6.28 (d, J=8.5 Hz, 1 H), 5.54 - 5.73 (m, 1 H), 4.99 5.10 (m, 2 H), 4.64 - 4.70 (m, 1 H), 4.58 (d, J=4.4 Hz, 1 H), 4.52 - 4.57 (m, 2 H), 4.37 - 4.45 (m, 1 H), 4.22 (ddd, J=12.3, 3.5, 1.1 Hz, 1 H), 4.08 (ddd, J=11.7, 3.6, 1.7 Hz, 1 H)

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 55.5 (s, 1P), 55.9 (s, 1P) ppm.

PRIMER 3.1 i PRIMER 3.2

Ciklični (imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-LNA-adenin-(3'ĺ5')-fosforotioat), natrijumova so

PRIMERI 3.1 i 3.2 su pripremljeni analogno PRIMER 2.1 i 2.2 koristeći INTERMEDIJER 3.4-d (za PRIMER 3-1) i 3.4-c (za PRIMER 3-2) kao polazni materijal, respektivno.

PRIMER 3.1:

LC-MS (sistem E):

tRet= 0.37 min; ESI-MS: 704 [M+H]+

1H NMR (400 MHz, 303 K, D2O) į ppm 8.79 (s, 1 H), 8.53 (s, 1 H), 8.22 (s, 1 H), 7.95 (s, 1 H), 6.26 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 6.14 (s, 1 H), 5.08 (s, 1 H), 4.97 (ddd, J=9.6, 8.4, 4.4 Hz, 1 H), 4.81 (d, J=5.4 Hz, 1 H), 4.82 - 4.70 (m, 3 H), 4.55 (d, J=2.0 Hz, 1 H), 4.35 (dd, J=11.9, 2.7 Hz, 1 H), 4.25 - 4.16 (m, 3 H), 4.08 (d, J=8.5 Hz, 1 H)<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 56.0 (s, 1P), 53.0 (s, 1P) ppm.

PRIMER 3.2:

LC-MS (sistem E):

tRet= 0.29 min; ESI-MS: 704 [M+H]<+>

1H NMR (400 MHz, 303 K, D2O) į ppm 8.85 (s, 1 H), 8.56 (s, 1 H), 8.23 (s, 1 H), 8.15 (s, 1 H), 6.26 (d, J=8.4 Hz, 1 H), 6.16 (s, 1 H), 5.20 (s, 1 H), 5.00 (ddd, J=13.0, 8.4, 4.5 Hz, 1 H), 4.87 (d, J=5.0 Hz, 1 H), 4.83 – 4.73 (m, 2 H), 4.62 (d, J=4.5 Hz, 1 H), 4.54 – 4.52 (m, 1 H), 4.47 (dd, J=11.3, 5.0 Hz, 1 H), 4.27 – 4.20 (m, 2 H), 4.12 (dd, J=11.3, 3.1 Hz, 1 H), 4.10 (d, J=8.5 Hz, 1 H).

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 57.3 (s, 1P), 55.8 (s, 1P) ppm.

PRIMER 4.1 i PRIMER 4.2

Ciklični (imidazopiridazinon-ȕ-D-ribofuranozid-(2'ĺ5')-fosforotioat-purin-ȕ-D ribofuranozid-(3'ĺ5')-fosforotioat), natrijumova so

PRIMERI 4.1 i 4.2 su pripremljeni analogno PRIMER 1.1 i 1.2 koristeći INTERMEDIJER 4.4-d i INTERMEDIJER 4.4-c kao polazni materijal. Pored postupka opisanog za PRIMERE 1.1 i 1.2, pre započinjanja reakcije, polazni materijal je jednom azeotropiran upotrebom 2:1 smeše anhidrovanog piridina i anhidrovanog trietamina.

PRIMER 4.1:

HPLC (konfiguracija B): tRet= 10.22 min;

ESI-MS: 677 [M+H]+

<1>H NMR (400 MHz, 318 K, 500 µL (CD3)2SO 30 µL D2O) į 9.16 (s, 1H), 8.95 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.68 (s, 1H), 8.62 (s, 1H), 6.06 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 6.06 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 5.11 – 4.98 (m, 3H), 4.44 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 4.34 – 4.25 (m, 3H), 4.08 – 3.97 (m, 1H), 3.93 – 3.83 (m, 1H), 3.84 – 3.77 (m, 1H).

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 55.3 (s, 1P), 52.6 (s, 1P) ppm.

1

PRIMER 4.2:

HPLC (konfiguracija B): tRet= 5.50 min;

ESI-MS: 677 [M+H]<+>

<1>H NMR (400 MHz, 318 K, 500 µL (CD3)2SO 30 µL D2O) į 9.16 (s, 1H), 8.94 (s, 1H), 8.82 (s, 1H), 8.72 (s, 1H), 8.59 (s, 1H), 6.04 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 6.03 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.30 (dd, J = 8.5, 4.3 Hz, 1H), 5.09 (ddd, J = 11.3, 8.4, 4.6 Hz, 1H), 5.01 (dd, J = 8.2, 4.3 Hz, 1H), 4.45 – 4.32 (m, 1H), 4.32 – 4.19 (m, 3H), 4.13 (dd, J = 11.0, 4.1 Hz, 1H), 3.84 – 3.75 (m, 1H), 3.71 – 3.61 (m, 1H).

<31>P NMR (162 MHz, D2O): į 55.8 (s, 1P), 57.8 (s, 1P) ppm.

2

Claims (18)

1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje formule I

   gde R<1>je odabran između grupe koja se sastoji od H, F, -O-C1-3alkil i OH, i R<2>je H, ili R<2>je -CH2- i R<1>je –O–, obrazujuću zajedno -CH2-O- most, i R<3>je purinska nukleobaza odabrana između grupe koja se sastoji od purina, adenina, guanina, ksantina, hipoksantina, povezan kroz njegov N<9>azot, njegovi solvati i hidrati, ili njegove soli.
2. 2. Jedinjenje formule Ia prema zahtevu 1

   njegovi solvati i hidrati, ili njegove soli.
3. 3. Jedinjenje formule Ib prema zahtevu 1

   njegovi solvati i hidrati, ili njegove soli.
4. 4. Jedinjenje formule Ia.1 prema zahtevu 2

   njegovi solvati i hidrati.
5. 5. Jedinjenje formule Ia.2 prema zahtevu 2 4

   njegovi solvati i hidrati.
6. 6. Jedinjenje formule Ia.3 prema zahtevu 2

   njegovi solvati i hidrati.
7. 7. Jedinjenje formule Ib.1 prema zahtevu 3

   njegovi solvati i hidrati.
8. 8. Suštinski čist (Sp,Sp), (Rp,Rp), (Sp,Rp), ili (Rp,Sp) stereoizomer jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji je najmanje 90% čisto u odnosu na druge moguće diastereomere, ili njegovu so.
9. 9. Suštinski čist (Rp, Rp) stereoizomer jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 7, koji je najmanje 90% čisto u odnosu na druge moguće dijastereomere, ili njegovu so.
10. 10. Farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 9.
11. 11. Natrijumova so jedinjenja prema zahtevu 4, 5, 6 ili 7.
12. 12. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedno ili više jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 9, ili jednu ili više farmaceutski prihvatljivih soli prema zahtevu 10, opciono zajedno sa jednim ili više inertnih nosača i / ili razblaživača.
13. 13. Vakcina koja sadrži jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 10.
14. 14. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu kao pomoćna supstanca za vakcinu.
15. 15. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu kao medikament.
16. 16. Jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 10 za upotrebu u lečenju oboljenja ili stanja odabranih između upale, alergijske bolesti, autoimune bolesti, zarazne bolesti i raka.
17. 17. Farmaceutska kompozicija koja sadrži jedno ili više jedinjenja prema bilo kom od zahteva 1 do 10 i jedno ili više dodatnih terapeutskih agenasa, opciono zajedno sa jednim ili više inertnih nosača i / ili razblaživača.
18. 18. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 17 koja sadrži jedno jedinjenje prema bilo kom od zahteva 1 do 10 i jedno ili više dodatnih terapeutskih agenasa. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5