RS61444B1 - Bispecifična antitela za upotrebu u imunoterapiji kancera - Google Patents

Description

Opis

Oblast ovog pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak se bavi oblašću imunoterapije kancera, a naročito lekovima kojima može da se prevaziđe otpornost na lekove.

[0002] Određenije, ovaj pronalazak se bavi novim bispecifičnim antitelima koja mogu da se vezuju i za TRAIL-R2 i za CD3 T limfocita.

[0003] Pronalazak se dalje odnosi na farmaceutske kompozicije koja obuhvataju bispecifična antitela i na upotrebu tih bispecifičnih antitela u lečenju tumora.

Stanje tehnike

[0004] Maligni tumori su jedan od najvećih uzroka smrti kod ljudi i predstavljaju veoma veliki zdravstveni problem. Poslednjih decenija, naučnici su razvili mnoge terapije koje su, pored toga što imaju dobre rezultate u pretkliničkim ispitivanjima, često slabo efikasne ili gotovo neefikasne u narednim kliničkim ispitivanjima, u mnogim slučajevima zbog toksičnosti ili zbog razvoja otpornosti na lek. Otkriće FasL, TNFα i liganda koji izaziva apoptozu povezanog sa TNF (TRAIL), članova prirodnih citokina superporodice faktora nekroze tumora, je otvorilo nove mogućnosti za razvoj novih terapijskih sredstava za kancer zahvaljujući njihovoj sposobnosti izazivanja apoptoze. Prva dva člana superporodice, FasL i TNFα, su razmatrana za upotrebu kao anti-kancerski molekuli.

[0005] Nakon početnih odličnih rezultata u eradikaciji ćelija tumora in vitro, terapije koje koriste dve strategije su pokazale nove ozbiljne neželjene efekte in vivo, upotrebom pretkliničkih modela: upotreba TNFα je izazvala jak zapaljenski odgovor, dok je upotreba rekombinantnih anti-Fas agonističkih antitela uzrokovala ozbiljnu toksičnost jetre.

[0006] TRAIL je tumorski pro-apoptotički ligand za koji, za razliku od TNFα i FasL, in vivo ispitivanja isključuju toksičnost jer je specifična za ćelije tumora, čime se čuvaju normalne ćelije. TRAIL-R1 i TRAIL-R2 su oba uzvodno regulisani u mnogim ćelijama tumora, ili prirodno ili kao odgovor na određene hemoterapijske lekove.

[0007] Klinička ispitivanja su započeta sa jedinjenjima agonista receptora TRAIL, kao što su rekombinantni oblici TRAIL i agonistička antitela. Rekombinantni TRAIL može da cilja oba receptora (TRAIL-R1 i TRAIL-R2) i stoga ima veći spektar dejstva.

[0008] Nasuprot tome, antitela usmerena protiv TRAIL-R1 (mapatumuab) ili TRAIL-R2 (drozitumab, konatumumab, leksatumumab i tigatuzumab) mogu da prepoznaju samo jedan receptor i samim tim mogu da imaju manji spektar dejstva u poređenju sa rekombinantnim TRAIL, ali im je prednost ta što ih ne odvajaju mamac receptori TRAIL-R3 i TRAIL-R4 koji imaju ulogu da odvoje ligand koji sprečava vezivanje TRAIL za funkcionalne receptore.

[0009] Dok su ispitivanja tokom faze I, koja su ispitivala ova sredstva, bila ohrabrujuća (davanje rekombinantnog proteina određenom podskupu pacijenata je bilo bezbedno i utvrđena su neka antitumorska dejstva, sa delimičnim ili potpunim odgovorima), II faza kliničkih ispitivanja nije otkrila antikancersko dejstvo. U većini slučajeva do neuspeha je dolazilo zbog novonastale otpornosti tumorskih ćelija.

[0010] Da bi se otpornost zaobišla, jedinjenja agonista TRAIL-R2 su korišćena u vezi sa lekovima koji se zovu "TRAIL senzibilizatori". Nekoliko konvencionalnih hemoterapijskih sredstava (kao što su doksorubicin, karbo- ili cis-platin, irinotekan, bortezomib) se smatra da su dobri "TRAIL-senzibilizatori" i pokazali su dobre pretkliničke rezultate, ali su bili razočaravajući u kliničkim ispitivanjima.

[0011] Nakon pojave rekombinantne tehnologije, u medicinskom istraživanju je došlo do porasta bispecifičnih antitela (BsAb). Ova antitela mogu istovremeno da vezuju dva različita cilja i, iz ovog razloga, mogu da udruže dva mehanizma dejstva u jednom molekulu ili mogu da pojačaju dejstvo. Više od 50 različitih BsAb formata je konstruisano. BsAb bi mogla da se koriste sa strategijom prethodnog ciljanja u radiološkom snimanju ili radiološkoj imunoterapiji ili dvostrukim ciljanjem dva različita antigena na istoj ćeliji ili dva rastvorljiva liganda, ali najučestalija upotreba je da se preusmeri cilj imunih ćelija na ćelije tumora.

[0012] Naročito dobri rezultati su dobijeni sa bispecifičnim antitelima koja mogu ponovo da ciljaju T-ćelije kako bi se lizirale ćelije tumora (receptore T-ćelija) na način koji ne zavisi od TCR. Primeri ovih antitela uključuju katumaksomab (EpCAM x CD3), napravljen od IgG proizvedenog tehnologijom hibridnog hibridoma, i blinatumomab (CD19 x CD3), bispecifičan aktivator t-ćelija (BiTE). Oba molekula imaju mogućnost vezivanja tumora povezanog sa antigenom i CD3, konstantnim delom receptora T-ćelije. Određenije, BsAb BITE klase, blinatumomab, je odobreno od strane FDA u decembru 2014. godine. BiTE su napravljeni od dva povezana fragmenta jednolančanog antitela (ScFv). Dobijena struktura je kompaktna i omogućava stvaranje imunocitolitičke sinapse između tumora i imunih ćelija: ova struktura omogućava aktivaciju T-ćelija subnanomoralnom koncentracijom BiTE i, od značaja, samo kada učestvuju oba kraka sa svojim ciljanim antigenima.

[0013] Dva bispecifična molekula su razvijena sa ciljem pojačavanja citotoksičnog naoružanja T-ćelija sa TRAIL-om. Svaki konstrukt se sastojao od tri fuziona proteina sastavljena od sTRAIL i scFv, anti-CD3 ili anti-CD7, spojena zajedno kako bi se formirao trimerni oblik TRAIL-a. Uprkos što su T-ćelije naoružane ovim jedinjenjima dovele do veće citotoksičnosti za ćelije tumora od sTRAIL, trimerni oblici scFv anti-CD3 ili anti-CD7 bi mogli da deaktiviraju T-ćelije koje nisu ciljane čime se uzrokuju ozbiljni neželjeni efekti kao oluja citokina i toksičnost na normalne ćelije. Autori iz ovog razloga predlažu upotrebu ovih jedinjenja samo da se leče tumori ograničeni na određene anatomski ograničene regione. Upotreba bispecifičnog antitela koje sadrži samo anti-CD3 vezujuće mesto bi mogla da zaobiđe ovaj problem a ovo BsAb može biti korišćeno za sistemsko lečenja zato što vezivanje samo jednog CD3 nije dovoljno da bi se postigla aktivacija T-ćelija. Upotrebom bispecifičnih antitela u scFv tandemu ili formatu jednolančanog dijatela (scDb) formata, T-ćelije se aktiviraju samo ukoliko je formirana imunocitolitička sinapsa, tako da samo nakon vezivanja antigena na ćelijama tumora (de Bruyn M. et al, Clinical cancer Res 2011, Sep 1;17(17):5626-37).

[0014] Imunoterapija posredovana bispecifičnim dijatelom u oblasti kancera prostate je istražena sa bispecifičnim dijatelom koje cilja membranski antigen koji je specifičan za prostatu i CD3 (Buhler P. et al, Cancer Immunol immunother 2008, 57:43-52).

[0015] Efekat dijatela na rast humanog limfoma B ćelija su ispitivali Cochlovius B., et al., Journal of Immunology, 2000, 165: 888-895. Heterodimerno dijatelo specifično za humani CD19 na B ćelijama i CD3ε lanac TCR kompleksa je korišćeno kako bi se istražila efikasnost na inhibiciju rasta tumora i in vitro i in vivo na imunodeficijentne miševe koji nose ksenografte B limfoma.

[0016] WO 2014161845 opisuje bispecifična antitela koja ciljaju protein aktivacije fibroblasta (FAP) i TRAIL receptor smrti 5 (DR5), koji su ispitivani za upotrebu u izazivanju apoptoze.

[0017] Sve više se oseća potreba i važnost za identifikacijom jedinjenja koja prepoznaju antigene koji su uzvodno regulisani kod mnogih različitih ćelija tumora.

[0018] TRAIL-R2 se može smatrati nekonvencionalnim antigenom povezanim sa tumorom, zapravo na tumorima taj receptor može biti uzvodno regulisan ali bi takođe mogao biti prisutan na istom nivou normalnih ćelija. Trebalo bi imati u vidu da TRAIL-R2 može da ubije ćelije tumora koje čuvaju normalne ćelije: nezavisno od nivoa ekspresije, normalne ćelije su razvile više mehanizama kako bi stvorile otpornost na ubijanje izazvano TRAIL-R2. Uprkos ovoj važnoj karakteristici, ćelije tumora su takođe mogle da razviju otpornost na TRAIL agonističko lečenje. Imajući to u vidu, predmet ovog pronalaska je razvoj BsAb sa anti-TRAIL-R2 krakom koje konkretno ubija ćelije tumora koje dejstvuju kao TRAIL jedinjenje agonista, i anti-CD3 krakom koji preusmerava cilj T-ćelije na ćelije tumora kako bi ih lizirale.

Kratak sadržaj ovog pronalaska

[0019] Problem koji je u osnovi ovog pronalaska je pravljenje dostupnim jedinjenja koja mogu specifično da vezuju i ubijaju ćelije tumora, kako bi se omogućila proizvodnja medikamenata za terapiju povezanih neoplastičnih patologija.

[0020] Ovaj problem se rešava ovim nalazom upotrebom bispecifičnih antitela koja mogu da imaju ove vezujuće specifičnosti i citotoksične mogućnosti kako je opisanu u ovom opisu, primerima i priloženim zahtevima.

[0021] Ovaj pronalazak se bavi novim bispecifičnim antitelima u scDb formatu koja imaju sposobnost vezivanja i TRAIL-R2 i CD3 eksprimiranih na T ćelijama. Pored toga što ima istu mogućnost da prepozna TRAIL-R2 u velikom opsegu tumora (kao što su melanom, karcinom jajnika, karcinom dojke, karcinom prostate, kolorektalni adenokarcinomi, hepatocelularni karcinom i skvamozni karcinom pluća) ovde prisutno bispecifično antitelo može da dejstvuje i kao agonist TRAIL-a i pokretanjem limfocitne citotoksičnosti putem CD3.

[0022] Aktivacija T-ćelija se pokazala da je specifična u smislu cilja.

[0023] Ovaj pronalazak se odnosi na jednolančano bispecifično dijatelo koje obuhvata:

a. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa prvom specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, pri čemu je prva specifičnost (A) usmerena protiv TRAIL-R2 antigena;

b. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa drugom specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3, pri čemu je druga specifičnost (B) usmerena protiv T limfocita CD3;

c. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5; i

d. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:7;

pri čemu su VH i VL domeni jednolančanog bispecifičnog antitela povezani po redosledu VHA-VLB-VHB-VLA, pri čemu je svaki VH i VL domen povezan sa peptidnim veznikom, pri čemu se pomenuti peptidni veznik između VHAi VLBdomena i između VHBi VLAdomena sastoji od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i jednog serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS), a peptidni veznik između VLBi

VHBdomena se sastoji od tri sekvence veznika koje se sastoje od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i po jednog serinskog aminokiselinskog ostataka (GGGGS)3.

[0024] Kako će dalje biti opisano u detaljnom opisu ovog pronalaska, prednost bispecifičnog antitela je združivanje potencijalne antitumorske mogućnosti TRAIL sa mogućnošću zaobilaženja otpornosti.

[0025] Zapravo, BsAb ima dva kraka: jedan krak vezuje TRAIL-R2 i oponaša pro-apoptotični potencijal rastvorljivog TRAIL, i anti CD3 krak koji preusmerava cilj T ćelije na tumorske ćelije i ubija ćelije tumora.

[0026] U daljem aspektu ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja obuhvata jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0027] Prema drugom aspektu, opisani pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za preusmeravanje citotoksičnog dejstva T-limfocita na ćeliju tumora, koji obuhvata fazu stupanja u kontakt pomenutih ćelija tumora sa jednolančanim bispecifičnim antitelom kako je ovde otkriveno.

[0028] Prema drugom aspektu, opisani pronalazak obezbeđuje jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku, za upotrebu u lečenju tumora.

Kratak opis crteža

[0029] Karakteristike i prednosti ovog pronalaska će biti očigledne iz detaljnog opisa datog u nastavku, iz primera datih u ilustrativne i neograničavajuće svrhe, i iz priloženih crteža 1-7, pri čemu:

Na Fig.1 su prikazane crtane prezentacije formata bispecifičnih konstrukata koji su konstruisani da bi se napravilo bispecifično antitelo koje može da vezuje TRAIL-R2 i da ponovo efikasno preusmeri cilj T-ćelija na ćelije tumora, kako je opisano u primerima 2 i 3.

Fig.1A: Format tandema scFv BsAb: anti-TRAIL-R2 scFv (svetlo sivo) združeni kratkim veznikom sa anti-CD3 scFv (tamno sivo) (dobijenim iz TR66 ili hUCTH1);

Fig.1B: Format bispecifičnog scDb: anti-TRAIL-R2 varijabilni domeni predstavljaju ekstremitete strukture i združeni su sa anti-CD3 scFv pomoću dva identična kratka veznika 5 aminokiselina koji izbegavaju stvaranje loše sparenih parova.

Fig.1C: Crtana prezentacija bispecifičnog scDb konstrukta.

Fig.2: prikazuje poređenje rezultata profila ekskluzione hromatografije prema veličini čestica između BsAb 16e2ATR66 u konformaciji poput BITE i onih dobijenih sa scDb 16e2/hUCTH1, prema ovom pronalasku, kako je opisano u primerima 2 i 3. Mogućnost vezivanja je ocenjena putem FACS na ćelijama koje eksprimiraju ili ne eksprimiraju TRAIL-R2 i CD3. Prazan pik: negativna kontrola; sivi pik: scDb plus anti-Tag i anti-mišja antitela.

Fig.2A: profil ekskluzione hromatografije prema veličini čestica tandema scFv BsAb 16e2/TR66 koja gubi svoju vezujuću sposobnost nakon nekoliko dana i ima tendenciju da se gomila.

Fig.2B: profil ekskluzione hromatografije prema veličini čestica od scDb 16e2/hUCTH1 koji je postao stabilan a agregati nisu premašili 0,5% takođe nakon 2 godine.

Fig.2C: profil ekskluzione hromatografije prema veličini čestica formata tandema scFv, izgrađenog upotrebom hUCTH1kao anti-CD3. Ovaj konstrukt prepoznaje CD3 ali nije mogao da prepozna TRAIL-R2.

Fig.2D: profil ekskluzione hromatografije prema veličini čestica scDb, koji je izgrađen takođe upotrebom kao anti-TRAIL-R2 drozitumaba derivata 16e“ koji varira od !6e“ samo u nekoliko aminokiselina i kao hUCTH1 anti-CD3. U ovom slučaju konstrukt radi samo nekoliko dana i prinos proizvodnje je veoma mali.

Fig.3 Funkcionalna i biohemijska analiza scDb 16e2/hUCTH1, kako je opisano u primeru 3.

Fig.3A: Analiza protočne citometrije izvedena na panelu TRAIL-R2+ melanomske ćelijske linije sa različitim nivoima ekspresije receptora, na CD3+ Jurkat i na TRAIL-R2-\ CD3<->MDA-MB-468.

[0030] Ispitivanje je potvrdilo specifičnost vezivanja BsAb: scDb vezujući profili (prvi red) nakon kojih sledi ekspresija receptora na različitim ćelijskim linijama. Komercijalno anti-TRAIL-R2 antitelo ili TR66 anti-CD3 antitelo za Jurkat (drugi red) su korišćeni kao kontrole.

[0031] Prazan pik: negativna kontrola; sivi pik: scDb plus anti-Tag i anti-mišja antitela (prvi red) ili komercijalno antitelo plus anti-mišje antitelo (drugi red).

[0032] Fig.3B: Biacore analiza (postupak baziran na površinskoj rezonanci plazmona koji omogućava praćenje kinetičke interakcije između dva proteina u stvarnom vremenu) levi panel: demonstrirano je da je scDb16e2/hUCTH1 imao i brzo vezivanje i brzo odvajanje od TRAIL-R2 rekombinantnog proteina imobilisanog na CM5 čipu. Konstanta disocijacije na ekvilibrijumu (KD) je 148 nmolova/L i izračunata je pomoću 5 različitih koncentracija, počevši od 400 nM od scDb do 25 nM.

desni panel: senzogram od BIAcore koji ilustruje ispitivanje kompeticije. Na crnoj strelici 1 µM od sTRAIL je ubrizgan da bi se zasitili svi prisutni receptori na čipu; na sivoj strelici 400 nM od ubrizgan je scDb16e2/hUCTH1. Na zasićenom receptoru nije primećeno vezivanje scDb koje otkriva da su dva jedinjenja u kompeticiji za isto vezujuće mesto.

[0033] Fig.3C: SDS strana i vestern blot analiza su otkrili da je masa scDb oko 54kDa.

[0034] Fig.3D: SELDI-TOF analiza koja potvrđuje podatke dobijene na Fig.3C. Fig.4 Citotoksično dejstvo [0035] Fig.4A. Citotoksičnost bispecifičnog scDb 16e2/hUCTH1 na M64 (niska ekspresija TRAIL-R2 i sTRAIL otporan) i M15 (visoka ekspresija TRAIL-R2 i sTRAIL senzibilnog) melanomskim ćelijskim linijama. Različit E:T odnos i koncentracija su korišćeni da bi se procenila scDb citotoksičnost. ScDb je korišćen na 1, 0,5 i 0,1 µg/ml sa E:T odnosom počevši od 10:1 do 0,15:1 sa F2 razblaženjima u eksperimentima citotoksičnosti kako bi se odredila scDb doza i E:T odnos. Eksperimenti su ukazali da je najbolji E:T odnos bio 5:1 i primetili smo odsustvo citotoksičnosti na netretiranim ćelijama tumora i da pri koncentraciji od 0,5 ug/ml dejstvo scDb doseže zaravnjanje, kako je opisano u primeru 3.

[0036] Fig.4B. grafikoni su ilustrovali 9 ispitivanja različite inhibicije rasta, izvedenih kako bi se ispitala reproduktivnost rezultata lečenja. Različita šarža PBL-ova (dobijena od zdravih davalaca) je korišćena u svakom eksperimentu. Tretiranje M64, M41 i M15 sa 0,5 ug/ml od scDb plus PBL-ovima (E:T odnos od 5:1) je dalo slične rezultate u svim eksperimentima. TRAIL-R2 negativan MDA-MB-468 nije odgovorio na lečenje, kao što je očekivano.

[0037] Fig.4C. Inhibicija rasta posredovana PBL-ovima zavisnim od antitela je izvedena za nekoliko ćelijskih linija kancera pomoću koncentracije scDb od 0,5 µg/ml i E:T odnosa od 5:1. Ćelije su izložene tretiranju tokom 48 ili 96 sati. Tretiranje je izazvalo inhibiciju proliferacije na svim ispitivanim pozitivnim ćelijskim linijama TRAIL-R2 tumora; nije primećena toksičnost na TRAIL-R2 negativnim MDA-MB-468 ćelijama i na normalnim HEK293 ćelijama TRAIL-R2-velike ekspresije.

[0038] Fig.4D. Inhibicija rasta posredovana PBL-ovima zavisnim od antitela je izvedena za nekoliko kancerskih ćelija pomoću koncentracije od scDb 0,5 µg/ml i E:T odnos 5:1. Ćelije su izložene tretiranju tokom 48 ili 96 sati. Tretiranje je izazvalo inhibiciju proliferacije na svim ispitivanim tumorskim ćelijskim linijama pozitivnim na TRAIL-R2.

[0039] Fig.4E. Ispitivanje oslobađanja Calcein-AM. Ćelije tumora su napunjene sa Calcein-AM koja, jednom kada uđe u ćelije je esterifikovana i postaje fluorescentna. Ćelije su tretirane tokom 4 i 16 sati kako bi se izmerila toksičnost T-ćelija, kada je preusmerena sa scDb. Grafikoni pokazuju procenat liziranih ćelija. Nakon 4 sata oko 45-50% TRAIL-R2 M15 i M41 velike ekspresije su lizirani, dok za M64 male ekspresije, varijacija tretiranih ćelija nije značajna u poređenju sa kontrolom. Nakon 16 sati 100% tretiranih ćelija, takođe M64, je bilo lizirano kao posledica tretiranja. Liza nije primećena u TRAIL-R2-MDA-MB-468 ćelijama. Grafikon predstavlja srednju vrednost ± SD, n =5, * p < 0,01, * p < 0,001. Fig. 5 Agonističko dejstvo

[0040] Fig.5A Crtež koji prikazuje način na koji je scDb multimerizovano: anti-tag MAb bi moglo da vezuje tag prisutan na scDb-ovima koji ih dimerizuju. Dodavanje anti-mišjeg MAb anti-tag/scDb, konjugatu bi mogao da dimerizuje i izazove tetramerizaciju BsAb-ova.

[0041] Fig.5B Agonističko proapoptoičko dejstvo scDb protiv M15 ćelija osetljivih na sTRAIL. M15 ćelije su tretirane sa nekoliko doza scDb samog ili jednakih doza scDb dimerizovanih ili tetramerizovanih prema opisu na Fig.5A. Toksičnost ćelija je ocenjena nakon 24 sata tretiranja, pomoću ispitivanja CellTiterGlo. sTRAIL, u jednakoj scDb koncentraciji, je korišćen kao pozitivna kontrola. Rezultati su izraženi kao procenat negativne kontrole.

[0042] Fig.5C Agonističko proapoptoičko dejstvo scDb na ćelije melanoma sa različitom osetljivošću na TRAIL. M15 osetljiv na sTRAIL, poluotporni M41 i otporni M64 su tretirani, sa 0,5 µg/ml samog scDb ili multimerizovanog sa anti-tag i anti-mišjom strategijom, tokom 24 sata (C). Rastvorljiv TRAIL (100 ng/ml) je korišćen kao pozitivna kontrola izazivanja apopotoze posredovane receptorom.

[0043] Fig.5D crtež koji predstavlja tetramerizaciju scDb putem biotin-straptavidin vezivanja. ScDb je biotinilisan in vitro pomoću estra biotin N-hidorksi-sukcinimida (Sigma) i inkubiran sa straptavidinom. Tetramerni scDb je prečišćen ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica.

[0044] Fig.5E Agonističko proapoptoičko dejstvo streptavidina tetrametizovanog scDb protiv sTRAIL osetljivih na M15 ćelija. M15 ćelije su tretirane sa 0,5 ili 0,05 µg/ml tetramiziranog scDb. Toksičnost ćelija je ocenjena nakon 24 časa tretiranja pomoću ispitivanja CellTiterGlo. Rezultati su izraženi kao procenat negativne kontrole.

[0045] Fig.6 Analiza ScDb-posredovane aktivacije T-ćelija.

[0046] Fig.6A sveže izolovane T-ćelije su inkubirane, u koncentraciji od E:T=5:1, sa ili bez 0,5 µg/ml scDb na 3 različite melanomske ćelijske linije tumora, kako je opisano u primeru 3.

Ekspresija CD25 i CD69.

[0047] Površinska ekspresija ćelija CD69 i CD25, markera povezanih sa aktivacijom na preusmerenim T-ćelijama, je izmerena analizom protočne citometrije 24h nakon početka zajedničke kulture. Grafikoni predstavljaju procenat pozitivnih ćelija u poređenju sa populacijom ukupnih T-ćelija za svaki marker. Samoaktivacija T-ćelija je izmerena inkubiranjem T-ćelija bez ćelija tumora. Rezultati predstavljaju srednju vrednost ± SD 3 različita ispitivanja izvedena sa 3 različite šarže T-ćelija dobijenih od zdravih davalaca.

[0048] Fig.6B Sveže izolovane T-ćelije su inkubirane, u koncentraciji E:T=5:1, sa ili bez koncentracije u titraciji od 0,01 do 0,5 µg/ml scDb na M15 ćelijskim linijama tumora, kako je opisano u primeru 3.

Ekspresija CD25, CD137, PD-1 i CD69 na CD4 i CD8 preusmerenim T-ćelijama.

[0049] Površinska ekspresija CD137, PD-1, CD69 i CD25, markera povezanih sa aktivacijom na preusmerenim T-ćelijama, je izmerena analizom protočne citometrije 16h nakon započinjanja zajedničke kulture. Grafikoni predstavljaju procenat pozitivnih ćelija u poređenju sa ukupnom populacijom T-ćelija CD4+ ili CD8+ za svaki marker. Samoaktivacija T-ćelija je izmerena inkubiranjem T-ćelija bez ćelija tumora.

[0050] Fig.7: Profil oslobađanja citokina (ck) preusmerenih T-ćelija scDb, kako je opisano u primeru 3.

[0051] Podloga ćelija tumora, inkubirana sa T-ćelijama i sa ili bez scDb, je birana dnevno tokom 4 dana: količina IL-2 (Fig.7A), IL-4 (Fig.7B), IL-6 (Fig.7C), IL-10 (Fig.7D), TNFα (Fig.7E), IFNγ (Fig.7F), GM-CSF (Fig.7G) i IL-8 (Fig.7H) je izmerena pomoću Bioplex. Srednja vrednost bunarčića duplikata je predstavljena na svakom grafikonu. Svaka tačka predstavlja nivo ck proizvedenih nakon tretiranja scDb i T-ćelijama oduzetim od bazalne proizvodnje citokina T-ćelija kada su T-ćelije inkubirane samo sa ćelijama tumora.

Detaljan opis ovog pronalaska

[0052] Ovaj pronalazak se bavi novim bispecifičnim antitelima u scDb formatu koja mogu da se vezuju i za TRAIL-R2 i CD3 koji su eksprimirani na T-ćelijama. Mnoge terapije su bile razvijene u oblasti imunoterapije kancera, ali se one nisu uvek pokazale kao efektivne niti su dale dobre rezultate.

[0053] Zapravo, u većini slučajeva, nakon preliminarne remisije ili stabilizacije ove bolesti, tumor se vratio i ta činjenica da se vratio je naročito zbog nastajanja otpornosti na lek u ćelijama tumora.

Poslednjih godina, ciljana terapija, u kombinaciji sa hemoterapijom, se pokazala da poboljšava ishode u poređenju sa samom hemoterapijom. Određenije nova klasa terapeutskih sredstava, bispecifična antitela su postala koristan alat u imunoterapiji. Bispecifična antitela dejstvuju tako što preusmeravaju cilj imunih ćelija na ćelije tumora kako bi ih ubile.

[0054] Ovaj pronalazak se bavi bispecifičnim antitelom koje može da vezuje TRAIL-R2 i CD3 prisutne na T-ćelijama.

[0055] Među različitim konstruktima anti-TRAIL-R2/anti-CD3, samo je jedan pokazao dobra biohemijska svojstva i biološko dejstvo. Pomoću različitih postupaka smo demonstrirali da BsAb može da omogući stvaranje imunocitolitičke sinapse između ćelija tumora i limfocita. Nakon stvaranja sinapse, možemo da primetimo aktivaciju T-ćelija (oba CD4+ i CD8+) sa uzvodnom regulacijom CD69, CD137, PD-1 i CD25 i proizvodnju zapaljenskih citokina bez ciljane toksičnosti. Nakon stvaranja sinapse i aktivacije, T ćelije su mogle da liziraju ćelije tumora dobijene iz veoma različitih maligniteta, kao što su kancer dojke, melanom, kancer jajnika, kancer prostate, kolorektalni kancer, hepatocelularni kancer i kancer pluća. Isti eksperimenti izvedeni na normalnim ćelijama nisu pokazali aktivaciju T-ćelija koja dovodi do odsustva citotoksičnih događaja.

[0056] Ovaj pronalazak stoga opisuje jednolančano bispecifično dijatelo koje obuhvata:

a. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa prvom specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, pri čemu je prva specifičnost (A) usmerena protiv TRAIL-R2 antigena;

b. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa drugom specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3, pri čemu je druga specifičnost (B) usmerena protiv T limfocita CD3;

c. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5; i

d. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:7; pri čemu VH i VL domeni jednolančanog bispecifičnog antitela su povezani po redosledu VHA-VLB-VHB-VLA, pri čemu je svaki VH i VL domen povezan sa peptidnim veznikom, pri čemu se pomenuti peptidni veznik između VHAi VLBdomena i između VHBi VLAdomena sastoji od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i jednog serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS), a peptidni veznik između VLBi VHBdomena se sastoji od tri sekvence veznika koje se sastoje od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i po jednog serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS)3.

[0057] BsAb je aktivno na različitim ćelijama tumora kao što su melanom, karcinom jajnika, karcinom dojke, karcinom prostate, kolorektalni adenokarcinomi, hepatocelularni karcinom i skvamozni karcinom pluća i združuje potencijalnu antitumorsku sposobnost TRAIL-a sa sposobnošću zaobilaženja otpornosti.

[0058] ScDb format se dobija od formata dijatela (Db). BsAb, u Db formatu sa anti-CD3 grupom, su pokazala da mogu efikasno da preusmere cilj T-ćelija kako bi se lizirali tumori, uključujući kancer ćelija prostate putem vezivanja za membranski antigen specifičan za prostatu (Buhler P. et al, Kancer Immunol immunother 2008, 57:43-52) i B ćelija limfoma putem vezivanja za CD19 (Cochlovius B., et al., Journal of Immunology, 2000, 165: 888-895).

[0059] Uprkos ohrabrujućim in vitro rezultatima, Db su se susrela sa značajnim nedostacima koji su ograničili njihovu upotrebu kao što je smanjena in vivo stabilnost i prisustvo neaktivnih homodimera zajedno sa funkcionalnim heterodimerima. Ovi problemi su prevaziđeni uvođenjem drugog peptidnog veznika od oko 15 aa koji povezuje dva polipeptidna lanca koja omogućavaju efikasnije sparivanje između srodnih varijabilnih domena, fuziju dva domena antitela što dovodi do jednolančanih dijatela.

[0060] U ovom pronalasku:

• pojam "specifičnost" kako se ovde upotrebljava se odnosi na mogućnost prepoznavanja određene sekvence ili domena i odnosi se na sposobnost vezivanja sekvence ili domena;

• pojam jednolančano bispecifično antitelo (scBsAb) se odnosi na višestruki antigen-vezujući molekul koji ima dva kraka: anti-TRAIL-R2 krak, koji vezuje TRAIL-R2 i oponaša pro-apoptotički potencijal rastovrljivog TRAIL, i anti CD3 krak koji preusmerava T ćelije na tumorske ćelije i ubija ćelije tumora. BsAb prema ovom pronalasku je u scDb;

• pojam "njegov fragment" kako se ovde upotrebljava se odnosi na fragmente jednolančanog antitela koji su manji po veličini u odnosu na odgovarajuće antitelo.

[0061] Jednolančano bispecifično antitelo prema ovom pronalasku je scDB format, koji poželjno ima kompaktniji oblik u poređenju sa drugim formatima bispecifičnih antitela i omogućava stvaranje imunocitolitičnih sinapsi. Isti varijabilni domeni antitela organizovani/spojeni u formatu poput BiTE nisu funkcionalni.

[0062] Rezultati opisani u primeru 3 i prikazani na Fig.2 označavaju da tandem scFv BsAb 16e2/TR66 koji je u formatu poput BITE, gubi mogućnost vezivanja samo nakon 2 dana. Bez vezivanja za bilo koju teoriju, ovo bi moglo da bude zbog nestabilnosti strukture koja je imala tendenciju da se taloži kao što je pokazano profilom ekskluzione hromatografije prema veličini čestica.

[0063] Nasuprot tome, scDb 16e2/hUCTH1 prema ovom pronalasku, koji je u formatu dijatela, je bio iznenađujuće stabilan i agregati nisu prelazili 0,5% takođe nakon 2 godine (Fig.2B). Pomoću istih varijabilnih regiona (16e2 i hUCTH1) ali pretvarajući BsAb u Tandem scFv format, može se primetiti da konstrukt nikada ne prepoznaje TRAIL-R2 već samo CD3 (Fig.2C). Mi smo takođe izgradili scDb koristeći kao anti-TRAIL-R2 drozitumab, derivat 16e2 koji se razlikuje od 16e2 samo u nekoliko aminokiselina kao CD3, hUCTH1. Takođe, u ovom slučaju konstrukt funkcioniše samo nekoliko dana.

[0064] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jednolančano bispecifično antitelo, pri čemu pomenuti direktni ekvivalenti imaju najmanje 95% celokupne homologije/identiteta sa pomenutim varijabilnim domenima.

[0065] Direktni ekvivalenti VH i VL varijabilnih domena prema ovom pronalasku imaju najmanje 96%, 97% 98% ili 99% sličnosti ili homologije celokupne sekvence. U poželjnom pronalasku jednolančano bispecifično antitelo, ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO: 13, i takođe je označeno kao "scDb 16e2/hUCHT1" ili njegovi direktni ekvivalenti. BsAb prema ovom pronalasku je takođe na primer prikazano na Fig.1C, na kojoj je prijavljen primer sekvence u kojoj su VHi VL domeni povezani.

[0066] U jednom aspektu, primer BsAb prema ovom pronalasku je u narednoj sekvenci:

VHAdomen, nakon kojeg sledi sekvenca veznika koja se sastoji od četiri (4) glicinska aminokiselinska ostataka i jendog (1) serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS), VLBdomen, nakon kojeg slede tri (3) sekvence veznika pri čemu se svaka sastoji od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i jednog serinskog aminokiselinskog ostatka ((GGGGS)3) koji odgovaraju SEQ ID NO:15), nakon čega sledi VHBdomen, nakon kojeg sledi sekvenca veznika koja se sastoji od četiri (4) glicinske aminokiselinske ostatka i jednog (1) serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS) i VLAdomen.

[0067] U daljem aspektu, primer BsAb prema ovom pronalasku ima veznike i domene u sledećim sekvencama: SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:8, terminalni veznik GCGGCCGC.

[0068] Sekvence veznika mogu da uključuju restriktivno mesto enzima u svrhu kloniranja, ali stručnjak lako može da shvati da takva restriktivna mesta mogu biti modifikovana prema potrebama istraživača, i da sekvence veznika nisu ograničene na određeno restriktivno mesto.

[0069] U poželjnom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje obezbeđuje BsAb sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO 13, i nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO: 21.

[0070] U njegovom drugom aspektu, ovaj pronalazak štaviše obezbeđuje kompoziciju koja obuhvata molekul jednolančanog bispecifičnog antitela, prema ovom pronalasku i sredstvo za obeležavanje.

[0071] U poželjnom aspektu, kompozicija prema ovom pronalasku, obuhvata sredstvo za obeležavanje izabrano iz grupe koju čine radionukleotid, fluorescentne nanočestice ili bilo koji postupci koji mogu da multimerizuju BsAb (kao što je, biotin tag ili leucin ili leucinski zatvarač) prema ovom pronalasku.

[0072] U daljem aspektu ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja obuhvata jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0073] Farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku je za topikalni, intramuskularni, intravenskom infuzijom, supkutani, ili druge puteve davanja.

[0074] Obezbeđena farmaceutska kompozicija može da se koristi u kombinaciji sa najmanje jednim daljim jedinjenjem koje može da pojača ili smanji njenu efikasnost. Primeri jedinjenja koja mogu da pojačaju ili umanje efikasnost farmaceutske kompozicije prema ovom pronalasku uključuju TRAIL senzibilizatore koji su obuhvaćeni grupom antraciklina (kao što je doksorubicin), HDAC inhibitora (npr. suberoilanilidhidroksaminska kiselina), CDK inhibitora (npr. flavopiridol), ER inhibitora (npr. tamoksifen), Bcl-2 inhibitora (npr. ABT-737), Smac mimetika (npr. LBW242), karbo- ili cis-platin, irinotekan, bortezomib.

[0075] Prema drugom aspektu, opisani pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za preusmeravanje citotoksičnog dejstva T-limfocita na ćeliju tumora, koji obuhvata fazu stupanja u kontakt pomenutih ćelija tumora sa jednolančanim bispecifičnim antitelom kako je ovde otkriveno.

[0076] Prema drugom aspektu, opisani pronalazak obezbeđuje jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku, za upotrebu u lečenju tumora.

[0077] U poželjnom aspektu, jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku je za upotrebu u lečenju tumora, pri čemu je pomenuti tumor izabran iz grupe koju čine melanom, karcinom jajnika, karcinom dojke, karcinom prostate, kolorektalni adenokarcinomi, hepatocelularni karcinom i skvamozni karcinom pluća.

[0078] Poželjno ScDb prema ovom pronalasku može da se koristi u lečenju svih TRAIL-R2 pozitivnih tumora dobijenih iz različitih organa i u drugim fazama i stadijumima.

[0079] U poželjnom aspektu, jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku je takođe za upotrebu u lečenju pacijenata koji su otporni ili netolerantni na prethodno lečenje najmanje jednim antitumorskim sredstvom ili pri čemu bi to lečenje antitumorskim sredstvom trebalo biti izbegnuto. Ovo daje dodatnu šansu lečenju za one pacijente koji su otporni ili koji su postali otporni na druga lečenja.

[0080] Dalje, jednolančano bispecifično antitelo, prema ovom pronalasku je za lečenje koje je profilaktičko ili terapeutsko.

[0081] U svrhu ovog pronalaska, svaki domen ili veznik jednolančanog bispecifičnog antitela ima odgovarajuću SEQ ID NO. na sledeći način:

SEQ ID NO:1 odgovara aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena teškog lanca imunoglobulina (VH): VHA16E2 (Klasa IGHV 3-20∗01);

SEQ ID NO.2 odgovara nukleotidnoj sekvenci varijabilnog domena teškog lanca imunoglobulina (VH): VHA;

SEQ ID NO.3 odgovara aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena lakog lanca imunoglobulina (VL): VLB(hUCTH1);

SEQ ID NO.4 odgovara nukleotidnoj sekvenci varijabilnog domena lakog lanca imunoglobulina (VL): VLB;

SEQ ID NO.5 odgovara aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena teškog lanca imunoglobulina (VH): VHB(hUCTH1);

SEQ ID NO.6 odgovara nukleotidnoj sekvenci varijabilnog domena teškog lanca imunoglobulina (VH): VHB;

SEQ ID NO.7 odgovara aminokiselinskoj sekvenci varijabilnog domena lakog lanca imunoglobulina (VL): VLA16E2 (Klasa IGLV3-19∗01);

SEQ ID NO.8 odgovara nukleotidnoj sekvenci varijabilnog domena lakog lanca imunoglobulina (VL): VLA;

SEQ ID NO: 9 (sekvenca koja dolazi pre VHA domen, Sfi I restriktivno mesto) SEQ ID NO: 10 (veznik između VHAi VLB domena, Age I restriktivno mesto)

SEQ ID NO: 11 (veznik između VLBi VHB domena, (GGGGS)3veznik)

SEQ ID NO: 12 (veznik između VHBi VLA domena, Xba I restriktivno mesto) sekvenca terminalnog veznika: GCGGCCGC (terminal veznik, posle VLAdomena, Not I restriktivno mesto)

SEQ ID NO: 13 odgovara aminokiselinskoj sekvenci jednolančanog bispecifičnog antitela scDb 16e2/hUCTH1

SEQ ID NO.14 odgovara nukleotidnoj sekvenci jednolančanog bispecifičnog antitela scDb 16e2/hUCTH1 sa uzvodnom sekvencom koja je korišćena kako bi se kloniralo scDb u vektoru.

SEQ ID NO.15 odgovara aminokiselinskoj sekvenci alternativnog veznika između VLB i VHB domena SEQ ID NO.16 odgovara aminokiselinskoj sekvenci jednolančanog bispecifičnog antitela sa His i Myc tagovima

SEQ ID NO.17 odgovara aminokiselinskoj sekvenci klona 7 anti-TRAIL-R2 ScFv izolovanog sa prikazom faga

SEQ ID NO.18 odgovara aminokiselinskoj sekvenci klona 8 anti-TRAIL-R2 ScFv izolovanog sa prikazom faga

SEQ ID NO.19 odgovara aminokiselinskoj sekvenci klona 44 anti-TRAIL-R2 ScFv izolovan sa prikazom faga

SEQ ID NO.20 odgovara aminokiselinskoj sekvenci klona 56 anti-TRAIL-R2 ScFv izolovan sa prikazom faga

SEQ ID NO.21 odgovara nukleotidnoj sekvenci jednolančanog bispecifičnog antitela scDb 16e2/hUCTH1 (BsAb)

SEQ ID NO.22 odgovara nukleotidnoj sekvenci (GGGGS) veznika. U prilog različitim načinima ostvarivanja i aspektima kako su goreopisani i kako su zaštićeni u odeljku sa zahtevima u nastavku ovog pronalaska, idu i sledeći primeri.

PRIMERI

[0082] Pozivanje na sledeće primere zajedno sa gornjim opisom ilustruje neke od načina ostvarivanja ovog pronalaska.

Ćelijske linije

[0083] Ćelije humanog melanoma M41, M15 i M64 su korišćene. M15, M64 i M41 su ćelije koje imaju različitu TRAIL-R2 ekspresiju i osetljivost na sTRAIL lečenje: određenije, M15 su sTRAIL-osetljivi i visokoekspresivni; M41 su delimično osetljivi na sTRAIL i visokoekspresivni dok su M64 otporni sa manjom ekspresijom.

[0084] HeLa (epitelijalni adenokarcinom grlića), A431 (epitelijalni epidermoidni karcinom), SKOV3, A2774, A2780 i NL3507 INT-Ov-11 (epitelijalni karcinom jajnika), MDA-MB-231 i MT-3 (trostruki negativni kancer dojke), LnCAP, DU145 i PC3 (karcinom prostate), CaCo2 (kolorektalni adenokarcinomi), HepG2 (hepatocelularni karcinom), SkMes (skvamozni karcinom pluća), HEK-293 (normalni embrionski bubreg), Jurkat (umrtvljena linija humanih T limfocita) i MDA-MB-468 (trostruki negativni kancer dojke, TRAIL-R2 negativna ćelijska linija) SU-DHL-4 (limfom) su nabavljeni iz Američke kolekcije kulture sojeva (Manassas, MD). Naša grupa je razvila INT-Ov-11 (epitelijalni karcinom jajnika).

[0085] Hibridom koji proizvodi mAb anti-myc tag mAb 9E10 (CRL-1729) je nabavljen iz ATCC.

Bakterijski sojevi.

[0086] Sojevi escherichia coli. TG1 {supEthi-1 ((lac-proAB) hsd (5[F' traD36+ proAB+ laclq lacZ(M15)]} je korišćen za paniranje prikaza faga antitela, a HB2151 {nalr thi-1 ara lac-proAB [F' proAB+ laciq lacZ(M15)]} je korišćen za rastvorljivu proizvodnju bispecifičnog antitela.

Primer 1.

Izolacija fragmenata jednolančanog antitela (jednolančano varijabilni fragment scFv) protiv TRAIL-R2.

[0087] Tri ciklusa obogaćivanja su izvedena kako bi se izolovao scFv protiv TRAIL-R2 kako je opisano u nastavku. Titar eluiranih fagova se postepeno povećavao nakon svakog ciklusa, a vezivanje proizvedenih fagova je ispitano u Phage ELISA i proporcionalno se povećavalo sa obogaćivanjem.768 nasumično izabranih kolonija, dobijenih od fagova nakon obogaćivanja, je ispitivano u fagu pojedinačnog klona ELISA i 4 klona, specifičnih za naivan TRAIL-R2, bile su izolovane, sekvencirane i okarakterisane.4 scFv su proizvedena u rastvorljivom obliku i postali su sposobni za specifično vezivanje TRAIL-R2+ ćelije.

Materijali i postupci:

Prikaz faga antitela

[0088] ScFv usmereni protiv TRAIL-R2 su izolovani pomoću tehnike za prikaz faga anitela. Prethodno napravljena biblioteka (svojstvena) za humani ScFv prikaz faga je korišćena i izvedena su 3 kruga izbora. Za izbor na naivnom TRAIL-R2, 6x10<6>limfomu lizirane su SU-DHL-4 receptor-pozitivne ćelije. TRAIL-R2 protein, koji je sadržan u lizatu, je uhvaćen sa mišjim anti-humanim TRAIL-R2 antitelom (R&D Systems) prethodno konjugovanim na DYNABEADS® M-280 ovčijim anti-mišjim IgG (Life Technologies). TRAIL-R2 uhvaćen u zamku sa magnetnim perlama je inkubiran u MPBS (mleko+ 4% PBS) uz mešanje tokom jednog sata i posle dodavanja bibliotke faga i inkubiranja tokom 2 sata na sobnoj temperaturi uz mešanje i opran PBST-om (PBS i Tween 0,1%) 20, 15 i 10 puta redom, u prvom, drugom i trećem ciklusu obogaćivanja. Nakon faze pranja, fagovi koji su prikazali fragment antitela specifičan za receptor, su ostali vezani za perle i korišćeni su da bi se inficirala 2 ml TG1 E.Coli gajene na O.D.0,4-0,5 u 2xTY podlozi. Inficirane bakterije su postavljene u 2xTYE 100 µg/mL ampicilina u sud ploče u obliku kvadrata (100 x 15mm) i uzgajane na 30°C O/N (tokom noći). Kolonije su prebrojane, pregledane putem PCR i ploča je sastrugana. Da bi se proizveli fagovi za naredni krug, 50 µl sastruganih bakterija je inokulisano u 50 ml 2xTY podloge sa 1% glukoznog ampicilina (100 mg/ml). Kada je O.D. dosegao 0,4-0,5, bakterije su inficirane sa 5x 10<5>pfu M13KO7 faga pomoćnika (New England Biolabs) tokom 30 minuta na 37°C u termostatičkom kupatilu. Bakterije su zatim centrifugirane i ponovo suspendovane u istoj podlozi bez glukoze i uzgajane su na 30°C O/N. Fagovi su PEG-precipirani, ponovo suspendovani u PBS-u i titrirani pre njihove upotrebe za naredni krug izbora. Nakon trećeg kruga fagovi su ispitivani u FACS kakao bi se procenila sposobnost vezivanja TRAIL-R2. Sa pojedinačnim kolonijama dobijenim nakon obogaćivanja, ELISA pojedinačnog faga je izvedena.

ELISA faga pojedinačnog klona.

[0089] Posle trećeg kruga izbora, fagom-inficirane bakterije su postavljene na ploče 2xTYE ampicilin. Proizvodnja fagova pojedinačnog klona je izvedena, kako je gore opisano, u svakom bunarčiću od 96 bunarčića duboke ploče. Da bi se ispitala mogućnost vezivanja supernatanta svakog bunarčića, izvedena je Elisa pojedinačnog faga. ELISA ploča sa 96 bunarčića sa anti-TRAIL-R2 (R&D Systems) je obložena O/N na 4°C. Nakon 3 pranja sa PBS-Tween 0,1% i PBS, 0,5 µg lizata SU-DHL-4 inkubirana je tokom 1 h na sobnoj temperaturi. Otkriveno je prisustvo specifičnih klonova sa anti-M13 HRP antitelom.

Ekspresija rastvorljivog fragmenta antitela.

[0090] Rastvorljiva bispecifična antitela ili fragmenti antitela su proizvedeni u E.Coli. Kompetentne HB2151 E.Coli su sveže transformisane, postavljene na 2xTYE ploče i uzgajane O/N na 37°C. Jedna pojedinačna kolonija je inokulisana i uzgajana u 2xTY (0,1% glukoze i 100 µg/mL ampicilina) podlozi tokom noći na 37°C. Sledećeg dana, kultura je inokulisna u svežoj podlozi počevši od OD 0,1 a bakterije su uzgajane dok kultura nije dostigla OD od 0,8-0,9. Kultura je centrifugirana a podloga za ispuštanje je zamenjena svežom podlogom specifičnom za indukciju rastvorljivog proteina (2xTY 0,1% glukoze 100 µg/mL ampicilin 1 mM IPTG). Da bi se omogućila efikasna ekspresija rastvorljivog proteina, bakterije su inkubirane O/N na temperaturi optimalnoj za svaki protein (25-30°C). Sledećeg dana, bakterije su sakupljene centrifugiranjem i izveden je protokol osmotskog šok lečenja, upotrebom 200 mM Tris pufera pH 7,5 koji sadrži 1 mM EDTA i 20% saharoze tokom 1 sata na 4°C uz mešanje, kako bi se ekstrahovali periplazmatski proteini koji sadrže bispecifično antitelo ili fragment antitela.

[0091] Periplazmatski preparati su prečišćeni pomoću IMAC protokola sa niklom ili kolonom hromatografije L proteina.

Primer 2.

Konstrukcija bispecifičnih antitela.

[0092] Koristili smo varijabilne domene 4 izolovana anti-TRAIL-R2 scFv opisana u primeru 1, i povezali smo ih sa varijabilnim domenima jednog ili dva mišja anti-CD3 hibridoma opisana u nastavku (TR66 i OKT3) kako bi izgradili bispecifična antitela u formatu tandema ScFv (SEQ ID NO 17, 18, 19 i 20).

Struktura bispecifičnog antitela je sastavljena od dva ScFv, prvog anti-TRAIL-R2 i drugog anti-CD3, udružena kratkim GGGGS veznikom koji obezbeđuje rigidnost strukture i ne dozvoljava loše uparene parove varijabilnih domena različitih specifičnosti (FIG 1A). Jedan od ovih klonova, klon 8 (SEQ ID NO; 18), u sparivanju sa TR66 scFv kao format Tandem ScFv, je pokazao najbolju sposobnost vezivanja. Pod FACS na NHL, HeLa i melanomske ćelijske linije sa različitom ekspresijom TRAIL-R2 BsAb pokazuju dobru reakciju sličnu celoj IgG bivalentnoj pozitivnoj kontroli uprkos njegovom monovalentnom vezivanju. Na žalost, BsAb su pokazala slabu stabilnost tokom vremena verovatno zbog prisustva agregata kako je pokazano ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica (SEC). Da bi se pronašao stabilniji klon mi smo nasumično mutagenizirali klon 8 i bazen mutiranih scFV je kloniran u vektor koji sadrži TR66 scFv. ELISA pojedinačnog klona je izvedena kako bi se izolovali klonovi sa boljim vezivanjem na pozitivne ćelije. Od 90 klonova, dva, C2 i C3, daju dobro vezivanje i specifičnost. Njihove sekvence pokazuju da oni imaju mutacije na tačkama 2 i 1 u okvirima, redom. Preciznije, u C2 postoji 1 aminokiselinska promena u ramu 1 i 1 u ramu 2 VH a, u C3 postoji 1 aminokiselinska promena u ramu 1 VL. Stabilnost u svakom slučaju još uvek nije dovoljna za naše ciljeve.

[0093] Paralelno mi odlučujemo da započnemo odabir biblioteke direktno u BsAb formatu poput BiTE: različiti tipovi veznika mogu da utiču na vezivanje i svojstva scFv fragmenata a scFv mogu da imaju različito ponašanje ukoliko se sklope kao BsAb. Bazen fragmenata dobijenih nakon 2. paniranja naivne scFv biblioteke, iz koje smo izabrali gore opisane klonove, je kloniran u vektoru koji sadrži TR66 scFv. Takođe konstrukt, koji sadrži dobro okarakterisan anti-TRAIL-R2 klon 16e2, je generisan i proizveden da bi se koristio kao pozitivna kontrola. Dobijena biblioteka je prelazno zagrejana kako bi izazvala odmotavanja i kako bi promovisala agregacje. Nakon hlađenja fragmenti antitela prikaza faga su odmotani u suprotnom smeru kako bi se promovisale agregacije. Nakon hlađenja fragmenti antitela prikaza faga koji su se odmotavali u suprotnom smeru pri čemu su bili obogaćeni u odnosu na sve koji nisu. Nakon dva kruga odabira, 6 od 90 klonova je pronađeno da je pozitivno u ELISA-i na melanomske ćelije a negativno na ćelijsku liniju koja ne eksprimira TRAIL- R2 (MDA-MB-468). Ovih 6 klonova je dalje analizirano putem FACS i tri od njih je demonstriralo dobro vezivanje na oba kraka. Takođe klonovi koji sadrže scFv 16e2 su mogli specifično da se vezuju za TRAIL-R2 i CD3 ali kao drugih 6 klonova, održavali su specifičnost tokom najmanje 1 nedelje i nakon što je vezivanje izgubljeno usled prisustva agregata kako je pokazano ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica (SEC) (FIG 2A).

Tabela 1: Različiti konstrukti proizvedeni i problemi na koje se nailazilo

Materijali i postupci:

Bispecifično antitelo u konstrukciji formata poput Bite.

[0094] Za naše ciljeve, izolovani fragmenti jednolančanog Fv usmereni protiv TRAIL-R2 su združeni sa fleksibilnim GGGGS veznikom sa anti CD3 scFv. Korišćeni anti-CD3 scFv su dobijeni od dva mišja hibridoma TR66 i OKT3. Geni antitela su klonirani u pIT2 vektoru koji sadrži, nakon bispecifičnog kasetnog gena, i eksahistidin i Myc tagove. Bispecifična antitela su eksprimirana u HB2151 E.Coli i prečišćena kako je opisano u primeru 1.

Amplifikacija Vh i VI dobijena iz druge anti TRAIL-R2 paniranja

[0095] Plazmidi iz fagova dobijeni nakon dva ciklusa paniranja na naivnom TRAIL-R2 su izolovani pomoću Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification (Promega). Pomoću bazena prajmera specifičnog za sve Vh i Jk zametne ćelije, scFv su bili amplifikovani PCR-om i bili su klonirani, u pIT2 vektoru koji sadrži TR66 scFv putem mesta prajmera kodiranih Sfil/Notl, kako bi se generisala biblioteka bispecifičnih antitela. Ova biblioteka je skrinovana protiv prirodnog TRAIL-R2 imobilisanog na magnetnim perlama pomoću komercijalnog antitela anti-TRAIL-R2.

Specifičnost vezivanja rekombinantnog antitela: FACS.

[0096] U svim eksperimentima, 2 x 10<5>ćelije su inkubirane primarnim antitelom u PBS koji sadrži 1% zasićenog FCS tokom 30 minuta na 4°C. BsAb su detektovani pomoću anti-histidin tag antitela i anti mišjeg IgG (H+L specifičan) Alexa 488 obeleženog. Mišji anti-humani TRAIL-R2 (R&D Systems) i mišje TR66 mAb, dobijeni iz hibridoma, su korišćeni kao pozitivne kontrole. Fluorescentno obeležavanje je izmereno pomoću FACS Calibur instrument (Becton Dickinson, Heidelberg, Germany). Analiza podataka je izvedena pomoću FlowJo softvera (Tree Star Inc).

Primer 3.

Novi format.

[0097] Nedostatak stabilnosti u formatu poput BiTE nas je izazvao da konsturišemo bispecifična antitela u različitom formatu. Kompaktni format, koji omogućava bliskost T- i ćelija tumora neophodnih za imunocitolitičku sinapsu, predstavlja jednolančano bispecifično dijatelo (scDb). Format bispecifičnog dijatela (Fig.1B) se sastoji od dva scFv u kojima je C-terminus VH domena povezan sa N-terminusom VL domena druge specifičnosti pomoću kratkog rigidnog veznika kako bi se ograničavalo uparivanje unutar lanca VH i VL. U scDb formatu, drugi veznik (GGGGS)3između dva lanca stabilizuje strukturu. Konstruisali smo scDb sa sekvencom varijabilnih domena svih izolovanih anti-TRAIL-R2 scFv, 16e2 ili drozitumaba (Genentech) i sa humanizovanim antitelom UCTH1 (hUCTH1) za anti-CD3 specifičnost. scFv hUCTH1 je korišćen u mnogim BsAb konstruktima i pokazao se kao stabilan kada se udruži sa 16e2 da bi se formiralo scDb.

[0098] Konstrukti su klonirani u pIT2 plazmidu koji omogućava sekreciju scDb u periplazmi HB2151 bakterija nakon indukcije sa IPTG. Proizvedena BsAb imaju dve sekvence C-terminala koje kodiraju redom za c-myc i eksaghistidinskim tagovima. His-tag je umetnut kako bi se omogućilo prečišćavanje BsAb pomoću IMAC protokola.

[0099] Među svim različito proizvedenim konstruktima u bispecifičnom tandemu scFv ili u scDb formatima, primetili smo da mali prinos proizvodnje, nedostatak vezivanja i/ili prisustvo agregacije ne dopuštaju mogućnost stabilnog reagensa osim scDb konstruisanog sa 16e2 i hUCTH1.

[0100] Svi konstrukti su imali veoma mali prinos proizvodnje u poređenju sa 16e2 x hUCTH1 scDb. Prinos standardizovane proizvodnje od oko 50-100 µg/L dok je za scDb oko 1-2 mg/L. Da bi se isključilo da se razlika u proizvodnim prinosima ne javlja slučajno, oko 20 različitih pokušaja proizvodnje je izvedeno i rezultati su bili uporedivi.

[0101] Takođe se može primetiti da 16e2 x hUCTH1 TaScFv ne bi mogao da vezuje TRAIL-R2 specifičnost (Fig.2C), i da su drugi konsturkti kao što je drozitumab x hUCTH1 scDb (Fig.2D) ili 16e2 x TR66 TaScFv (Fig.2A), mogli da vezuju i specifičnosti neposredno nakon proizvodnje, ali su izgubile TRAIL-R2 ili CD3 mogućnost vezivanja redom, nakon 1-3 dana čuvanja. Istraživanjem uzroka ovog gubitka vezivanja, ispitivanje ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica (SUPEROSE 1210/300) (razdvajanje opsega: 300 Kd-10 Kd; GE Healthcare) i primećena je agregacija 16E2 x TR66 TaScFv koja se javila u roku od 16 sati nakon prečišćavanja.16E2 x hUCTH1 scDb format je bio superiorniji u poređenju sa drugim konstruktima bez tendencije ka agregaciji i očuvanju afiniteta vezivanja za obe specifičnosti, TRAIL-R2 i CD3, takođe nakon dve godine čuvanja (Fig.2B).

Karakterizacija jednolačanog dijatela

[0102] Prečišćeno scDb je ispitano elektroforezom na 4- 12% SDS gelu i ili obojeno sa Comassie plavom ili, nakon blotovanja na nitroceluloznoj membrani, pomoću MAb anti-His specifičnog za epitop eksahistidinila. Detektovana traka je bila na pravoj molekulskoj masi i nisu primećene druge trake (FIG.

3C). Analiza ekskluzionom hromatografijom prema veličini čestica, na SUPEROSE 1210/300 koloni, je pokazala da je čistoća scDb nakon prečišćavanja veća od 97%. FACScalibur testovi su pokazali specifično vezivanje scDb na TRAIL-R2+ melanomskim ćelijama i na CD3+ Jurkat ćelijama. Nije primećeno vezivanje na MDA-MB-468 u potpunosti negativnim ćelijama za obe specifičnosti (Fig.3 A).

BIAcore analiza.

[0103] TRAIL-R2 afinitet vezivanja BsAb je izmeren površinskom rezonancom plazmona pomoću BIAcore. Analiza je izvedena pomoću rekombinantnog humanog TRAIL-R2 imobilisanog na čipu. Na osnovu eksperimentalnih podataka, krive asocijacije i disocijacije su izračunate a kinetičke procene su dovele do izračunate konstante afiniteta (KD) od 1.48 x 10<7>nM (FIG.3B, levi panel).

[0104] Da bi se procenila kompeticija vezivanja scDb anti-TRAIL-kraka sa sTRAIL, rekombinantni receptor je bio imobilisan na čipu i zasićen sa 1 µM rastvorljivog TRAIL. Analiza je pokazala jaku kompeticiju za isto mesto vezivanja zato što nije primećeno BsAb vezivanje na sTRAIL zasićenom TRAIL-R2 (Fig.3B desni panel). Iz ovog razloga smo istražili da li bi scDb moglo da dejstvuje kao sTRAIL na agonistički način. ScDb agonističko dejstvo.

[0105] Kako bi se dublje okarakterisalo TRAILR2 agonističko dejstvo, koristili smo scDb u monomernom obliku ili multimerizovanom sa različitim postupcima. Prvi postupak, koji smo koristili, eksploatisao je mogućnost prepoznavanja Myc taga kojeg koristi 9E10 monoklonalno antitelo: ovo antitelo je moglo da prepozna myc tag i da omogući dimerizaciju scDb i, ukoliko je inkubirano sa Fc-specifičnim anti-mišjim antitelom, koje bi moglo da vezuje d Fc 9E10, bi moglo da ima veštački tetramerni oblik scDb. Drugi postupak je eksploatisao svojstva biotinske tetramerizacije streptavidina: scDb je biotinilisan i inkubiran sa streptavidinom. Tetramerizovana scDb su izolovana sa SEC i korišćena kako bi se tretirale ćelije. M15, M64 i M41 su ćelije koje imaju različitu TRAIL-R2 ekspresiju i senzitivnost na sTRAIL lečenje: određenije M15 su osetljivi na sTRAIL i visoko ekspresivni; M41 su sTRAIL delimično osetljivi i visoko ekspresivni. Svi postupci koji se koriste kako bi se multimerizovalo scDb ukazuju na agonistički efekat i određenije scDb multimerizovno sa biotin-streptavidin strategijom je pokazalo najbolje agonističko dejstvo Izazivanje citotoksičnosti putem scDb

[0106] Mogućnost bispecifičnog antitela da izazove inhibiciju rasta ili citotoksičnost na ćelijama tumora je istražena preusmeravanjem aktiviranih ili neaktiviranih PBL, izolovanih iz zdravih davalaca, na ćelijama tumora. M15, M41 i M64 ćelijske linije melanoma, A2774, A2780, SKOV3, NL3507 i 431 ćelijske linije kancera jajnika, A431 ćelijska linija epidermoidnog kancera, MDA-MB-231 i ćelijske linije MT-3 trostruko negativnog karcinoma dojke, LnCap, DU145 i PC3 ćelijske linije karcinoma prostate, CaCO2 ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma, HepG2 ćelijska linija hepatocelularnog karcinoma i SkMes ćelijska linija skvamoznog karcinoma pluća koja eksprimira TRAIL-R2 su korišćene kao ciljane ćelije. MDA-MB-468, TRAIL-R2 negativna ćelijska linija, je korišćena kako bi se ispitalo odsustvo neciljane citotoksičnosti; HEK-293, umrtvljena ćelijska linija normalnog bubrega, je korišćena da se isključi toksičnost na normalnim ćelijama. Efekat scDb je izmeren pomoću CellTiterGlo za inhibiciju rasta ili ispitivanje oslobađanja Calcein AM zbog direktne citotoksičnosti T-ćelija. Prvi eksperimenti su izvedeni pomoću različitih koncentracija BsAb (počevši od 1 µg/ml sa razblaženjima 1:2 do postizanja 0,01 µg/ml), različitog efektora kako bi se ciljali odnosi (20:1 do 1.25:1) i aktivirani ili neaktivirani PBL.

[0107] Najbolji rezultati su dobijeni pomoću koncentracije od 0,5 µg/ml i E:T odnosom od 5:1. scDb pokazuje dobar efekat na svim korišćenim ćelijskim linijama tumora. Podaci koji se odnose na M64 i M15 su prijavljeni na Fig.4A.

[0108] Drugi eksperimenti su izvedeni koristeći ove uslove da bi se testirala reproduktivnost rezultata pomoću PBL ekstrahovanih iz periferne krvi 10 različitih zdravih davalaca. Da bi se izbegle distorzije usled različite citotoksične moći PBMC dobijenih od različitih davalaca, pre lečenja ćelija tumora, PBMC bazalno aktivaciono stanje je procenjeno pomoću FACS. Ukoliko su CD69 i CD25 markeri isuviše visoki, PBMC se smatraju upravo aktiviranim i nisu korišćeni u ovom lečenju. Na melanomskim ćelijskim linijama, lečenje sa scDb i PBMC je ponovilo iste rezultate. Neciljana citotoksičnost je primećena u MDA-MB-468. Dalje, veoma mala standardna devijacija izračunata u svakoj grupi je ukazivala da lečenje ima mogućnost ponavljana i da na njega ne utiču različiti bazeni PBL (FIG.4B).

[0109] Kako bi se dalje okarakterisala reaktivnost bispecifičnog antitela, procenjeno je prisustvo TRAIL-R2 receptora na različitim ćelijskim linijama kancera. Površinska ekspresija TRAIL-R2 je analizirana FACS-om pomoću anti-TRAIL-R2 mAb. Iz ove analize smo zaključili da INT-Ov-11, A2774, A2780, SKOV3, NL3507 ćelijske linije karcinoma jajnika, MDA-MB-231 i ćelijske linije MT-3 trostruko negativnog karcinoma dojke, LnCap, DU145 i PC3 ćelijske linije karcinoma prostate, CaCO2 ćelijska linija kolorektalnog adenokarcinoma, HepG2 ćelijska linija hepatocelularnog karcinoma, SkMes ćelijska linija skvamoznog karcinoma pluća, A431 ćelijska linija epidermoidnog kancera, eksprimira TRAIL-R2 i korišćene su kao ciljane ćelije. HEK-293, umrtvljena ćelijska linija normalnog bubrega, imala je visok nivo TRAIL-R2 i korišćena je kako bi se isključila toksičnost na normalnim ćelijama.

[0110] Nakon preusmeravanja cilja PBL-ova (E:T odnos 5:1) sa 0,5 ug/ml scDb primetili smo da je BsAb sposobno da izazove inhibiciju rasta ciljane ćelije za sve korišćene ćelijske linije. Nije primećena citotoksičnost na tretiranim HEK-293 (Fig.4C-4D)

Oslobađanje Calcein AM-a

[0111] Da bi se istražila direktna citotoksičnost T-ćelija, korišćeno je oslobađanje (Lichtenfels et al., 1994 and Roden et al., 1999) Calcein-AMa (estar Calcein-acetoksimetildiacetila), postupka koji je bio uporediv sa<51>Cr oslobađanjem. Koncentracija Calcein-AM za broj ciljanih tumorskih ćelija i gustinu je bila određena inkubiranjem ćelija do koncentracionog opsega od 1-10 µM, čime je procenjena optimalno razdvajanje između maksimalnog i spontanog oslobađanja (podaci nisu prikazani). Lečenje sa scDb je pokazalo dobre rezultate i moglo je da preusmeri cilj T-ćelija kako bi se lizirale melanomske ćelije M15, M64 i M41. Preusmeravanje cilja T-ćelija je moglo da ošteti ćelije tumora i Calcein bi bio oslobođen u podlozi. Nakon 4 sata citotoksičnost je bila oko 50% za TRAIL-R2 M15 i M41 velike ekspresije i oko 30% za malu ekspresiju M64. Nakon 16 sati citotoksičnost je dostigla 100% za sve tretirane ćelijske linije. Nije primećena direktna citotoksičnost u MDA-MB-468, TRAIL-R2 negativnoj ćelijskoj liniji (Fig.4E).

Aktivacija T-ćelija

[0112] Kako bi se raščlanio mehanizam citotoksičnosti, analizirano je PBMC stanje aktivacije, nakon zajedničke inkubacije sa TRAIL-R2 pozitivnim i negativnim tumorom i normalnim ćelijama. CD69 i CD25 aktivacioni markeri, eksprimirani na T-ćeliji prisutnoj u PBMC nakon inkubacije sa TRAIL-R2+ ćelijama, su porasli samo u prisustvu scDb. Nasuprot tome, uzvodna regulacija ova dva markera nije bila prisutna u odsustvu scDb ili nakon zajedničke kulture sa TRAIL-R2- MDA-MB-468 ili sa TRAIL-R2 velike ekspresije HEK-293 normalnih ćelija (Fig.6A). Eksperimenti izvedeni tretiranjem M15 ćelijske linije su otkrili da je dozno zavisna ekspresija aktivacionih markera T-ćelija CD25, CD137, CD69 i PD-1 izazvana i u CD4+ i u CD8+ subpopulacijama T-ćelija (Fig.6B).

[0113] Aktivacija T ćelija, nakon scDb-posredovanog preusmeravanja cilja na ćelije tumora, dalje je demonstrirana porastom koncentracije citokina oslobođenih u podlozi. Određenije Fig.7 pokazuje da je porast proizvodnje ovih citokina specifično izazvan samo u prisustvu scDb sa najvećom proizvodnjom nakon 24 sata. Proizvodnja citokina, u odnosu na 24h supernatante, se smanjila nakon 48h i vratila se slična nakon 72h. U sva četiri vremena, izmereni citokini u scDb tretiranim podlogama su viši u odnosu na one proizvedene u podlogama ćelija tretiranih samo sa PBMC. Nije primećena proizvodnja citokina upotrebom negativnog TRAIL-R2 ili normalnih ćelija.

Materijali i postupci:

BIAcore

[0114] Vezivanje BsAb anti-TRAIL-R2 kraka je procenjeno površinskom rezonancom plazmona pomoću BIAcore 2000 opremljenog CM5 senzornim čipovima za istraživanje (Biacore AB, Upsala, Švedska). Rekombinantni humani TRAIL-R2 (R&D Systems) i BSA (Thermo Scientific) nepovezani protein su imobilisani na dva drugačije trake CM5 senzornih čipova pomoću standardnog amino-kuplujućeg protokola, sa N-hidroksisukcinimidom (NHS), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-karbodiimidom (EDC) i etanolaminhidrohloridom (pH 8.5). BsAb je ubrizgavan tokom 3 min pri protoku tečnosti od 30 µL/min. Kinetičke analize su izvedene pri koncentracijama koje su u opsegu od 400 do 25 nM od scDb. Vraćanje početne osnovne linije je verifikovano nakon svakog ubrizgavanja. Dobijeni podaci su analizirani softverom BIAevalutaion 3.2 (globalno uklapanje) koji uključuje model 1:1 Langmuir-vezivanje.

Biohemijska karakterizacija i integritet

[0115] Veličina i homogenost su analizirani elektroforezom na gelu natrijumdodekil sulfatpoliakrilamida (SDS-STRANA), vestern blot metodom i masenom spektrometrijom (SELDI-TOF).

[0116] Potencijalna dimerizacija je analizirana ekslkuzionom hromatografijom prema veličini čestica na SUPEROSE 1210/300 (razdvajanje opsega: 300 Kd-10 Kd; GE Healthcare)

Izolacija PBL-ova.

[0117] PBMC su izolovane iz sloja belih ćelija u ugrušku zdravog davaoca putem Ficoll standardnog protokola za centrifugiranje gradijenta gustine (Ficoll plus hystopaque, GE Healthcare). Izolovane PBMC su suspendovane u RPMI 1640 kompletnoj podlozi i broj ćelija je podešen na 1 x 10<6>/ml. Sud je položen, tokom 30 minuta na 37°C u 5% CO2vlažnom inkubatoru, kako bi se omogućilo vezivanje monocita. PBL-ovi prisutni u supernatantu su uklonjeni i stavljeni u drugi sud. PBL-ovi su kultivisani na RPMI1640 sa 5% FBS ili su aktivirani pomoću IL-2 i PHA tokom 4 dana.

Ispitivanja inhibicije proliferacije i citotoksičnosti tumorskih/normalnih ćelija

[0118] Inhibicija proliferacije preusmerenih T-ćelija je procenjena MTT ispitivanjem pomoću PBL-ova i skupa različitih TRAIL-R2+ ćelijskih linija.1.2 x 10<4>ćelije su stavljene u svaki od 96 bunarčića ploče sa ravnim dnom sa odgovarajućom podlogom i inkubirane ON kako bi se omogućilo njihovo vezivanje.0,5 µg/ml scDb je dodato i ćelije su inkubirane tokom 1 sata pre dodavanja PBL-ova (E:T Odnos: 5:1). Kao negativne kontrole: korišćene su netretirane ćelije, ćelije inkubirane samo sa scDb ili ćelije inkubirane samo sa PBL-ovima. Nakon 48 ili 96 sati, supernatant je uklonjen i bunarčići su oprani tri puta sa PBS kako bi se uklinili PBL-ovi. U svakom bunarčiću dodato je 100 µl sveže podloge koja sadrži 0,5 mg/ml MTT soli. Nakon 3 sata, supernatant je odbačen i 150 µl MTT rastvarača (izopropanol 4 mM HCI 0,1% NP40) je korišćeno kako bi se ponovo suspendovale formirane soli formazana. Apsorbanca na 590 nm (620 nm referentni filter) je očitana pomoću Biorad-550 čitača mikroploča.

[0119] Citotoksičnost preusmerenih T-ćelija je ispitana ispitivanjem oslobađanja Calcein AM (Biovision Inc).10<6>ciljane ćelije su suspendovane u 1 ml kompletne podloge koja sadrži 15 µM Calcein-AM, inkubirane 30 minuta na 37°C i oprane 3 puta svežom podlogom.10<4>ćelije su posejane u ploče sa okruglim dnom sa 96 bunarčića nakon istog tretmana (tri primerka za svaki) koje se koriste za ispitivanje inhibicije proliferacije. Za merenje spontanog oslobađanja i za maksimalno oslobađanje (ciljane ćelije u podlozi koja sadrži 2% Triton X-100) je korišćeno 6 replika bunarčića. Nakon 4 sata, ploče su centrifugirane na 1500 obrtaja u minutu tokom 10 minuta i supernatant, koji sadrži fluorescentni Calcein, je prenesen u crnu ploču sa 96 bunarčića. Intenzitet fluorescencije je izmeren čitačem Ultra multiplate reader (Tecan Group, Manedorf/Cirih, Švajcarska), sa talasnim dužinama gašenja/emisije od 485/535nm.

AKTIVACIJA T ĆELIJA

Procena aktivacionih markera

[0120] TRAII-R2+ melanom (M15, M41 i M64) i Hek-293 normalne ćelije i TRAII-R2-MDA-MB-468 ćelije su korišćene kao ciljane ćelije i uzgajane su u RPMI 1640 u pločama sa 48 bunarčića (Corning) pri gustini od 3.5 × 10<4>ćelija za bunarčić. Posle 12 sati 0,5 ug/ml od scDb je dodato i inkubirano 1 h kako bi se omogućilo vezivanje za TRAIL-R2 prisutnog na ćelijama tumora. Sveže izolovani humani PBMC su korišćene kao ćelije efektora i dodati su u scDb tretirane/netretirane ciljane ćelije u odnosu efektor-cilj od 5:1. Posle inkubacije tokom 16 h na 37 °C u 5% CO2, T-ćelije u supernatantu su bile oporavljene, oprane PBS-om i obojene anti-humanim CD137 (Miltenyi Biotec), anti-humanim PD-1 BV421 (Biolegend), anti-humanim CD69 (BD Biosciences) i anti-humanim CD25 (Caltag Laboratories), obeležene različitim fluorohromima, tokom 30 min na ledu. Nakon pranja tri puta sa PBS+FCS 1%, ćelije su analizirane protočnom citometrijom na FACSCalibur-u.

Određivanje oslobađanja citokina (Bioplex)

[0121] Da bi se odredile količine izlučenih IFN-γ, IL-4, TNF, i IL-2, supernatanti su sakupljani na dnevnom nivou tokom 4 dana nakon početka lečenja ćelijskih tumora sa scDb plus T-ćelijama. Supernatanti su analizirani zbog izlučivanja citokina pomoću Bio-plex ProTM humanog standarda citokina 27-Plex, Group I (BIORAD), prema protokolu proizvođača. Apsorpcija uzoraka je izmerena, i dobijene vrednosti su korišćene da bi se izračunala koncentracija citokina u uzorcima, prema vrednostima dobijenim za standardne serije koje obezbeđuje proizvođač.

[0122] Iz gornjeg opisa i gore-zabeleženih primera, prednost koja se postiže opisanim proizvodom i dobijenim prema ovom pronalasku je očigledna.

Claims (12)

1. Patentni zahtevi 1. Jednolančano bispecifično dijatelo koje obuhvata: a. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa prvom specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:1, pri čemu je prva specifičnost (A) usmerena protiv TRAIL-R2 antigena; b. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa drugom specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:3, pri čemu je druga specifičnost (B) usmerena protiv T limfocita CD3; c. varijabilni domen teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću (B), pri čemu pomenuti varijabilni domen teškog lanca (VHB) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:5; i d. varijabilni domen lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću (A), pri čemu pomenuti varijabilni domen lakog lanca (VLA) ima aminokiselinsku sekvencu prema SEQ ID NO:7; pri čemu su VH i VL domeni jednolančanog bispecifičnog antitela povezani po redosledu VHA-VLB-VHB-VLA, pri čemu je svaki VH i VL domen povezan sa peptidnim veznikom, pri čemu se pomenuti peptidni veznik između VHAi VLBdomena i između VHBi VLAdomena sastoji od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i jednog serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS), a peptidni veznik između VLBi VHBdomena se sastoji od tri sekvence veznika koje se sastoje od četiri glicinska aminokiselinska ostatka i po jednog serinskog aminokiselinskog ostatka (GGGGS)3.
2. 2. Jednolančano bispecifično antitelo prema zahtevu 1, sa aminokiselinskom sekvencom prema SEQ ID NO: 13.
3. 3. Kompozicija koja obuhvata jednolančano bispecifično antitelo, prema bilo kom od zahteva 1 ili 2 i sredstvo za obeležavanje.
4. 4. Kompozicija prema zahtevu 3, pri čemu je pomenuto sredstvo za obeležavanje izabrano iz grupe koju čine radionuklid ili fluorescentne nanočestice.
5. 5. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata jednolančano bispecifično antitelo, prema bilo kom od zahteva 1 ili 2 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
6. 6. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 5, za intramuskularni, intravenskom infuzijom, supkutani, ili inhalacioni put davanja.
7. 7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 5 ili 6, koja se koristi u kombinaciji sa najmanje jednim daljim jedinjenjem, koje može da pojača ili smanji njenu efikasnost.
8. 8. In vitro postupak za preusmeravanje citotoksičnog dejstva T-limfocita na ćeliju tumora, koji obuhvata fazu stupanja u kontakt pomenute ćelije tumora sa jednolančanim bispecifičnim antitelom prema bilo kom od zahteva 1 ili 2.
9. 9. Jednolančano bispecifično antitelo, prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, za upotrebu u lečenju tumora.
10. 10. Jednolančano bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu je pomenuti tumor izabran iz grupe koju čine melanom, karcinom jajnika, karcinom dojke, karcinom prostate, kolorektalni adenokarcinomi, hepatocelularni karcinom i skvamozni karcinom pluća.
11. 11. Jednolančano bispecifično antitelo za upotrebu prema zahtevu 9, pri čemu se pomenuto lečenje odnosi na pacijente koji su otporni ili netolerantni na prethodno lečenje najmanje jednim antitumorskim sredstvom ili pri čemu bi lečenje antitumorskim sredstvom trebalo izbegavati.
12. 12. Jednolančano bispecifično antitelo za upotrebu prema bilo kom od zahteva 10 do 11, pri čemu je pomenuto lečenje profilaktičko ili terapeutsko.