RS61455B1 - Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora - Google Patents

Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora

Info

Publication number
RS61455B1
RS61455B1 RS20210210A RSP20210210A RS61455B1 RS 61455 B1 RS61455 B1 RS 61455B1 RS 20210210 A RS20210210 A RS 20210210A RS P20210210 A RSP20210210 A RS P20210210A RS 61455 B1 RS61455 B1 RS 61455B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
cell
segments
locus
gene
Prior art date
Application number
RS20210210A
Other languages
English (en)
Inventor
Lynn Macdonald
Andrew J Murphy
John Mcwhirter
Naxin Tu
Vera Voronina
Cagan Gurer
Karolina Meagher
Sean Stevens
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS61455B1 publication Critical patent/RS61455B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/30—Vector systems comprising sequences for excision in presence of a recombinase, e.g. loxP or FRT

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ovde je data izolovana ćelija glodara koja u svom genomu sadrži varijabilne genske lokuse humanog ili humanizovanog T ćelijskog receptora (TCR).
[0002] Ovde je obelodanjena genetski modifikovana ne-humana životinja, npr., glodar (npr., miš ili pacov), koji u svom genomu sadrži humane ili humanizovane T ćelijske receptore (TCR) varijabilne genske lokuse (npr., TCRα i TCRβ varijabilni genski lokusi i/ili TCRδ i TCRγ varijabilni genski lokusi) i ispoljava humane ili humanizovane TCR polipeptide (npr., TCRα i TCRβ polipeptide i/ili TCRδ i TCRγ polipeptide) iz humanih ili humanizovanih TCR varijabilnih genskih lokusa. Ne-humana životinja sa humanim ili humanizovanim TCR varijabilnim genskim lokusima kako je ovde opisano sadrži neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona (npr., V, D i/ili J segmenti) na endogenim ne-humanim TCR genskim lokusima. Ovde su obelodanjeni embrioni, tkiva i ćelije (npr., T ćelije) koji sadrže humane ili humanizovane TCR varijabilne genske lokuse i eksprimiraju humane ili humanizovane TCR polipeptide. Takođe su obelodanjeni postupci za stvaranje genetski modifikovanih ne-humanih životinja koji sadrže humane ili humanizovane TCR varijabilne genske lokuse; i postupke upotrebe ne-humanih životinja, embriona, tkiva i ćelija koje sadrže humane ili humanizovane TCR varijabilne genske lokuse i eksprimiraju humane ili humanizovane TCR polipeptide iz tih lokusa.
POZADINA PRONALASKA
[0003] U adaptivnom imunskom odgovoru, strani antigeni su prepoznati od strane molekula receptora na B limfocitima (npr., imunoglobulina) i T limfocita (npr., T ćelijskih receptora ili TCR). Dok antitela prepoznaju patogene u krvi i vanćelijskom prostoru tokom humoralnog imunskog odgovora, uništavanje patogena unutar ćelija posreduje se tokom ćelijskog imunskog odgovora od strane T ćelija.
[0004] T ćelije prepoznaju i napadaju antigene koji su im predstavljeni u kontekstu Glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na površini ćelije. Prepoznavanje antigena posreduje TCR ispoljavanih na površini T ćelija. Dve glavne klase T ćelija služe ovoj funkciji: citotoksične T ćelije, koje eksprimiraju protein CD8 na ćelijskoj površini, i pomoćne T ćelije, koje eksprimiraju protein CD4 na ćelijskoj površini. Citotoksične T ćelije aktiviraju signalne kaskade koje rezultiraju direktnim uništenjem ćelije koja predstavlja antigen (u kontekstu MHC I), dok se pomoćne T ćelije diferenciraju u nekoliko klasa, i njihova aktivacija (predvođena prepoznavanjem antigena predstavljenog u kontekstu MHC II) rezultira uništavanjem patogena posredstvom makrofaga i stimulisanjem stvaranja antitela od strane B ćelija.
[0005] Zbog svoje antigenske specifičnosti, antitela su trenutno široko proučavana zbog svog terapijskog potencijala protiv brojnih ljudskih poremećaja. Da bi generisali antitela sposobna da neutrališu ljudske ciljeve, istovremeno izbegavajući aktiviranje imunoloških odgovora protiv takvih antitela, naučnici su koncentrisali svoje napore na proizvodnju humanih ili humanizovanih imunoglobulina. Jedan od načina proizvodnje humanizovanih antitela in vivo je upotreba VELOCIMMUNE® miša, humanizovanog miša koji sadrži (1) neuređeni repertoar humanog imunoglobulina V, D i J se međusobno operativno vezuje i konstantni region miša na teškom lancu endogenog mišjeg imunoglobulina lokusa i (2) neuređenog repertoara humanog Vκ i Jκ segmenta koji su operativno povezani jedni sa drugima i konstante miša κ regiona na endogenom mišjem imunoglobulinu κ lokusa lakog lanca. Kao takvi, VELOCIMMUNE® miševi pružaju bogat izvor vrlo raznolikih preuređenih varijabilnih domena antitela za upotrebu u inženjeringu humanih antitela.
[0006] Slično antitelu, receptor za T ćeliju sadrži varijabilni region, kodiran neuređenim lokusima (α i β lokusi, ili δ i γ lokusi) koji sadrže V(D)J segmente varijabilnog regiona, i ovaj varijabilni region T ćeliji daje svoju specifičnost vezivanja antigena. Takođe slično antitelu, TCR specifičnost za njegov antigen može se koristiti za razvoj novih terapeutskih sredstava. Prema tome, u struci postoji potreba za ne-humanim životinjama (npr., glodari, npr., pacovi ili miševi) koji sadrže neuređene segmente gena varijabilnog regiona humanih T ćelija koji su sposobni da se preurede da formiraju gene koji kodiraju varijabilne domene receptora humanih T ćelija, uključujući domene koji su međusobno povezani, i domene koji se specifično vezuju za antigen od interesa. Takođe postoji potreba za nehumanim životinjama koje sadrže lokuse varijabilnog regiona T-ćelija koji sadrže konzervativne humanizacije, uključujući ne-humane životinje koje sadrže neuređene segmente humanog gena koji se mogu preurediti da formiraju gene varijabilnog regiona T-receptora koji su povezani sa ne-humanim konstantnim genskim sekvencama (endogenih) T ćelijskih receptora. Ostaje potreba za ne-humanim životinjama koje su sposobne da generišu raznovrstan repertoar varijabilnih sekvenci humanih T ćelijskih receptora. Postoji potreba za ne-humanim životinjama koje su sposobne da preurede većinu ili sve funkcionalne segmente varijabilnog regiona T-receptora, kao odgovor na antigen od interesa, da formiraju polipeptide receptora T-ćelija koji sadrže potpuno humane varijabilne domene.
[0007] WO 2007/131092 odnosi se na himerni receptor za T ćelije, kao i na polipeptide, proteine, nukleinske kiseline, rekombinantne ekspresione vektore, ćelije domaćina i farmaceutske sastave povezane sa ili koji kodiraju TCR. Cohen i dr., ((2006), Cancer Research, 66(17):8878-8886) istražuje himernu funkciju i ekspresiju T ćelijskih receptora čoveka i miša. Madsen i dr., ((1999), Nature Genetics, 23(3):343-347) odnosi se na humanizovani model multiple skleroze koji koristi receptor humanih T ćelija. Kawamura i dr., ((2008), Journal of Immunology, 181(8):5462-5472) odnosi se na razvoj transgenskih T ćelija receptora humanih T ćelija u timusu i na periferiji. Pietropaolo i dr., ((2008), Diabetes, 57(11):2872-2882) odnosi se na model transgenskih receptora T ćelije-MHC klase II za proučavanje dijabetesa. Baker i dr., ((1996), Journal of Neuroscience Research, 45(4):487-491) odnose se na vektore ekspresije receptora T ćelija i njihovu upotrebu u konstruisanju himernih transgena T-ćelijskih receptora specifičnih za protein mijelina.
REZIME PRONALASKA
[0008] Obelodanjene su ne-humane životinje, npr., glodari, koji sadrže ne-humane ćelije koje eksprimiraju humanizovane molekule koji funkcionišu u ćelijskom imunološkom odgovoru. Obelodanjene su i ne-humane životinje koje sadrže neuređene varijabilne lokuse TCR gena. Obelodanjeni su sistemi in vivo i in vitro koji sadrže humanizovane ćelije glodara, pri čemu ćelije glodara eksprimiraju jedan ili više humanizovanih molekula imunog sistema. Takođe su obelodanjeni neuređeni humanizovani TCR lokusi glodara koji kodiraju humanizovane TCR proteine.
[0009] U jednom aspektu, ovde je obezbeđena genetski modifikovana izolovana ćelija glodara (npr., miš ili ćelija pacova) koja u svom genomu (a) sadrži TCRα neuređenog varijabilnog genskog lokusa koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα glodara segment, operativno povezan sa glodarom mišem ili pacovom) TCR α konstantna sekvenca gena na endogenom TCRα varijabilnom genskom lokusu i/ili (b) neuređeni varijabilni genski lokus TCRβ koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment glodara, operativno vezan za glodara, npr., miša ili pacova) TCRβ konstantna sekvenca gena na endogenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu; pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humane T ćelije sposobni da se preurede u T ćeliji da bi stvorili gene koji kodiraju varijabilne domene receptora humanih T ćelija koji se specifično vezuju za antigen od interesa.
[0010] U jednom otelotvorenju, neuređeni TCRα varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni TCRα varijabilni genski lokus glodara na endogenom TCRα varijabilnom genskom lokusu. U jednom otelotvorenju, neuređeni TCRβ varijabilni genski lokus zamenjuje endogeni TCRβ varijabilni genski lokus glodara na endogenom TCRβ varijabilnom genskom lokusu. U jednom otelotvorenju, endogeni Vα i Jα segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu. U jednom otelotvorenju, endogeni Vβ, Dβ i Jβ segmenti glodara nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. U jednom otelotvorenju izolovane ćelije glodara, izolovana ćelija glodara sadrži deleciju tako da genom ćelije ne sadrži funkcionalni endogeni Vα i funkcionalni endogeni Jα segment. U jednom otelotvorenju, izolovana ćelija glodara sadrži deleciju tako da genom ćelije ne sadrži funkcionalni endogeni Vβ, funkcionalni endogeni Dβ i funkcionalni izolovani endogeni Jβ segment glodarskih ćelija. U jednom otelotvorenju, izolovana ćelija glodara sadrži deleciju svih izolovanih funkcionalnih endogenih segmenata Vα i Jα ćelija glodara. U jednom otelotvorenju, izolovana ćelija glodara sadrži deleciju svih funkcionalnih endogenih segmenata Vβ, Dβ i Jβ U jednom otelotvorenju, humani segmenti Vα i Jα preuređuju se tako da formiraju preuređeni niz Vα/Jα. U jednom otelotvorenju, humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti se preuređuju tako da formiraju preuređenu izolovanu sekvencu Vβ/Dβ/Jβ ćelija glodara. Stoga, u različitim otelotvorenjima, izolovana ćelija glodara eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži varijabilni humani region i konstantni region glodara na površini T ćelije.
[0011] U nekim primerima, T ćelije ne-humane životinje prolaze kroz razvoj T ćelija u primerima, timusu, da bi proizvele CD4 i CD8 pojedinačno pozitivne T ćelije. U nekim primerima, ne-humana životinja sadrži normalan odnos CD3+ T ćelija slezine prema ukupnim splenocitima. U različitim primerima, ne-humana životinja generiše populaciju T ćelija centralne i efektorske memorije na periferiji.
[0012] U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus u ovde opisanoj ne-humanoj životinji sastoji se iz 61 humanog Jα segmenta i 8 humanih Vα segmenata. U drugom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus u ne-humanoj životinji sadrži kompletan repertoar humanih Jα segmenata i kompletan repertoar humanih Vα segmenata.
[0013] U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus ovde opisane ne-humane životinje sadrži 14 humanih Jβ segmenata, 2 humana Dβ segmenta i 14 humanih Vβ segmenata. U drugom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus u ne-humanoj životinji sadrži kompletan repertoar humanih Jβ segmenata, kompletan repertoar humanih Dβ segmenata i kompletan repertoar humanih Vβ segmenata.
[0014] U dodatnom primeru, ovde opisana ne-humana životinja (npr., glodar) dalje sadrži nukleotidne sekvence varijabilnih segmenata humanog TCRδ na humanizovanom TCRα lokusu. U jednom primeru, ne-humana životinja (npr., glodari) dalje sadrži najmanje jedan ljudski Vδ, Dδ i Jδ segment, na primer, kompletan repertoar humanih Vδ, Dδ i Jδ segmenata na humanizovanom TCRα lokusu.
[0015] U jednom primeru, ne-humana životinja zadržava endogeni ne-humani lokus TCRα i/ili TCRβ, pri čemu je lokus nefunkcionalni lokus.
[0016] U jednom primeru, ne-humana životinja je glodar. U jednom primeru, glodar je izabran između miša i pacova. U jednom primeru, glodar je miš.
[0017] Ovde je obelodanjen genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži (a) neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži repertoar humanih Jα segmenata i repertoar humanih Vα segmenata, operativno povezan sa ne-humanim (npr., mišem ili pacovom) TCRα konstantna sekvenca gena i/ili (b) neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži repertoar humanih Jβ segmenata, repertoar humanih Dβ segmenata i repertoar humanih Vβ segmenata, operativno povezanih sa ne-humanom (npr., miša ili pacova) konstantnom genskom TCRβ sekvencom. U jednom primeru, miš sadrži kompletan repertoar humanih Vα segmenata. U jednom primeru, miš sadrži kompletan repertoar humanih Vβ segmenata. U jednom primeru, miš sadrži kompletan repertoar humanih Vα i humanih Jα segmenata. U jednom primeru, miš sadrži kompletan repertoar humanih Vα i humanih Vβ segmenata. U jednom primeru, miš sadrži kompletan repertoar humanih Vα, humanih Jα, humanih Vβ, humanih Dβ i humanih Jβ segmenata.
[0018] U jednom primeru, miš sadrži najmanje jedan endogeni Vα segment miša i najmanje jedan endogeni Jα segment miša, pri čemu endogeni segmenti nisu sposobni da se preurede da bi formirali preuređenu sekvencu Vα/Jα, a takođe sadrži i najmanje jedan endogeni Vβ segment, najmanje jedan endogeni Dβ segment, i najmanje jedan endogeni Jβ segment miša, pri čemu endogeni segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređeni Vβ/Dβ/Jβ sekvencu.
[0019] U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente varijabilnog regiona humanog TCRα zamenjuje varijabilne genske TCRα miša na endogenom varijabilnom TCRα lokusu miša, a neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente varijabilnog regiona humanog TCRβ zamenjuje varijabilne genske TCRβ na endogenom varijabilnom TCRβ lokusu miša.
[0020] U jednom primeru, humani segmenti Vα i Jα preuređuju se tako da formiraju preuređenu humanu sekvencu Vα/Jα, a humani segmenti Vβ, Dβ i Jβ preuređuju se tako da formiraju preuređeni humanu sekvencu Vβ/Dβ/Jβ. U jednom primeru, preuređena humana Vα/Jα sekvenca operativno je povezana sa sekvencom konstantnog regiona TCRα miša. U jednom primeru, preuređena humana Vβ/Dβ/Jβ sekvenca operativno je povezana sa sekvencom konstantnog regiona TCRβ miša. Stoga, u različitim primerima, miš eksprimira T ćelijski receptor na površini T ćelije, pri čemu T ćelijski receptor sadrži varijabilni region čoveka i konstantni region miša.
[0021] U jednom primeru, miš dalje sadrži repertoar segmenata humanog TCRδ varijabilnog regiona (npr., humanih Vδ, Jδ i Dδ segmenata) na humanizovanom TCRα lokusu. U jednom primeru, repertoar segmenata humanog TCRδ varijabilnog regiona je kompletan repertoar humanog TCRδ varijabilnog regiona. U jednom primeru, segmenti varijabilnog humanog TCRδ regiona nalaze se u endogenom lokusu TCRδ. U jednom primeru, humani segmenti TCRδ varijabilnog regiona zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRδ miša.
[0022] U jednom primeru, genetski modifikovani miš eksprimira T ćelijski receptor koja sadrži varijabilni region čoveka i mišji konstantni region na površini T ćelije. U jednom primeru, T ćelije miša prolaze kroz razvoj timusnih T ćelija da bi proizvele CD4 i CD8 pojedinačno pozitivne T ćelije. U jednom primeru, miš sadrži normalan odnos CD3+ T ćelija slezine prema ukupnim splenocitima; u jednom primeru, miš generiše populaciju T ćelija centralne i efektorske memorije do antigena od interesa.
[0023] Takođe su ovde opisani postupci za stvaranje genetski modifikovanih glodara (npr., miševa ili pacova).
[0024] U jednom primeru, obelodanjen je postupak za stvaranje humanizovanog glodara (npr., miša ili pacova), koji obuhvata zamenu segmenata TCRα i TCRβ varijabilnog regiona glodara, ali ne i konstantnih gena glodara, sa neuređenim humanim segmentima TCRα i TCRβ varijabilnog regiona, na endogenom lokusu TCR glodara. U jednom primeru, postupak obuhvata zamenu segmenata TCRα varijabilnog regiona glodara (Vα i/ili Jα) humanim TCRα segmentima varijabilnog regiona (Vα i/ili Jα), pri čemu su segmenti TCRα varijabilnog regiona operativno povezani sa ne-humanom TCR konstantom genskog regiona koji formira humanizovani TCRα lokus; i zamena segmenata TCRβ varijabilnog regiona glodara (Vβ i/ili Dβ i/ili Jβ) humanim segmentima TCRβ varijabilnog regiona (Vβ i/ili Dβ i/ili Jβ), pri čemu su segmenti TCRβ varijabilnog regiona operativno povezani sa ne-humanim TCR konstantnim genskim regionima za formiranje humanizovanog TCRβ lokusa. U jednom primeru, humanizovani glodar je miš, a germinalna linija miša sadrži segmente varijabilnog regiona humanog TCRα koji su operativno povezani sa endogenom TCRα konstantnom sekvencom miša na endogenom TCRα lokusu; i germinalna linija miša obuhvata segmente varijabilnog regiona humanog TCRβ koji su operativno povezani sa endogenim sekvencama konstantne TCRβ miša na endogenom TCRβ lokusu.
[0025] Ovde je obelodanjen postupak za stvaranje genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) koji eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži humani varijabilni region ili humanizovani i nehumani (npr., glodari) konstantni region na površini T ćelije koja sadrži: zamena kod prve ne-humane životinje endogenog varijabilnog genskog TCRα lokusa sa neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRα lokusom koji sadrži najmanje jedan humani Va segment i najmanje jedan humani Ja segment, pri čemu je humanizovani varijabilni genski TCRα lokus operativno povezan sa endogenim ne-humanim TCRα konstantnim regionom; zamena u drugoj ne-humanoj životinji endogenog varijabilnog genskog TCRβ lokusa sa neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRβ lokusom koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, pri čemu je humanizovani varijabilni genski TCRβ lokus operativno povezan sa endogenim TCRβ konstantnim regionom; i uzgoj prve i druge ne-humane životinje, da bi se dobila ne-humana životinja, a koja eksprimira receptor za T ćeliju koja sadrži humani ili humanizovani varijabilni region i ne-humani konstantni region.
[0026] U jednom primeru postupka, endogeni ne-humani (npr., glodari) segmenti Vα i Jα nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu sekvencu Vα/Jα i endogeni ne-humani (npr., glodari) Vβ, Dβ i Jβ segmenti nisu sposobni za primer preuređivanja da bi se formirala preuređena sekvenca Vβ/Dβ/Jβ. U jednom primeru postupka, humani Vα i Jα segmenti se preuređuju da bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu, a humani Vβ, Dβ i Jβ segmenti se preuređuju da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. U jednom primeru postupka, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCRα lokus sadrži 61 humanih Jα segmenata i 8 humanih Vα segmenata, a neuređeni humanizovani varijabilni genski TCRβ lokus sadrži 14 humanih Vβ segmenata, 2 humana Dβ segmenta i 14 humanih Jβ segmenata. U drugom primeru postupka, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCRα lokus sadrži kompletan repertoar humanih Jα segmenata i kompletan repertoar humanih Va segmenata, a neuređeni humanizovani varijabilni genski TCRβ lokus sadrži kompletan repertoar humanih Vβ segmenata, kompletan repertoar humanih Dβ segmenata i kompletan repertoar humanih Jβ segmenata.
[0027] U ovde opisanom postupku, T ćelije ne-humane životinje (npr., glodar) mogu da se podvrgnu razvoju timusnih T ćelija da bi proizvele CD4 i CD8 pojedinačno pozitivne T ćelije. Ne-humana životinja (npr., glodar) može da sadrži normalan odnos CD3+ T ćelija slezine prema ukupnim splenocitima. Ne-humana (npr., glodar) može da generiše populaciju T ćelija centralne i efektorske memorije do antigena od interesa.
[0028] U nekim primerima, zamena endogenog ne-humanog varijabilnog genskog TCRα lokusa koji je ovde opisan vrši se u jednoj ES ćeliji, a pojedinačna ES ćelija se uvodi u ne-humani embrion (npr., glodara, npr., miša ili pacova) da napravi genetski modifikovanu ne-humanu životinju (tj. prvu ne-humanu životinju, npr., prvog glodara); i zamena endogenog ne-humanog varijabilnog genskog TCRβ lokusa koji je ovde opisan vrši se u jednoj ES ćeliji, a pojedinačna ES ćelija se uvodi u ne-humani embrion (npr., glodara, npr., miša ili pacova) da napravi genetski modifikovanu ne-humanu životinju (tj., drugu ne-humanu životinju, npr., drugog glodara); U jednom primeru, prvi glodar i drugi glodar su uzgajani da bi formirali potomstvo, pri čemu potomstvo sadrži u svojoj germinalnoj liniji humanizovani varijabilni TCRα lokus i humanizovani varijabilni TCRβ lokus.
[0029] U jednom otelotvorenju postupka, glodar je miš. Prema tome, predmetni pronalazak takođe obezbeđuje postupak za izradu genetski modifikovanog miša.
[0030] Takođe su ovde date ćelije, npr., izolovane T ćelije (npr., citotoksične T ćelije, pomoćne T ćelije glodara, memorijske T ćelije, itd.), izvedene iz ovde opisanih glodara (npr., miševa ili pacova). Takođe su obelodanjena tkiva i embrioni izvedeni iz ovde opisanih ne-humanih životinja.
[0031] Ovde je obelodanjen postupak za stvaranje humanog TCR varijabilnog domena koji sadrži genetsku modifikaciju glodara kako je ovde opisano da bi obuhvatio humanizovani TCRα lokus i/ili humanizovani TCRβ lokus, održavajući glodara pod uslovima dovoljnim da formiraju T ćeliju, pri čemu T ćelija eksprimira humani TCRα i/ili humani TCRβ varijabilni domen.
[0032] Ovde je obelodanjen postupak za pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji se vezuje za epitop od interesa, koji uključuje izlaganje ne-humane životinje kako je ovde opisano, epitopu od interesa, održavajući ne-humanu životinju pod uslovima dovoljnim za životinju da predstavi epitop od interesa za humanizovani TCR životinje i identifikujući nukleinsku kiselinu životinje koja kodira polipeptid humanog TCR varijabilnog domena koji vezuje epitop od interesa.
[0033] Upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana obelodanjena je za stvaranje humanizovanog TCR receptora. U jednom primeru je obelodanjena upotreba ne-humana životinja kako je ovde opisano za stvaranje humanog TCR varijabilnog domena. U jednom primeru je obelodanjena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisano za stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen.
[0034] U jednom primeru je obelodanjena upotreba sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen ili njegov fragment za stvaranje proteina koji vezuje antigen. U jednom primeru, protein koji vezuje antigen sadrži TCR varijabilni domen koji sadrži humani TCRα i/ili humani TCRβ varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa.
[0035] U jednom primeru, upotreba ne-humane životinje, kao što je ovde opisano, obelodanjena je za stvaranje nehumane ćelije koja na svojoj površini eksprimira humanizovani T-ćelijski receptor.
[0036] U jednom primeru je obelodanjen humanizovani T ćelijski receptor ne-humane životinje kako je ovde opisano.
[0037] U jednom primeru je obelodanjena sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen ili njegov fragment, napravljena od ne-humane životinje kako je ovde opisano.
[0038] Bilo koje od ovde opisanih otelotvorenja i aspekata može se koristiti zajedno jedni sa drugima, osim ako nije drugačije naznačeno ili očigledno iz konteksta. Ostala otelotvorenja postaće očigledna stručnjacima iz pregleda iz sledećeg detaljnog opisa. Sledeći detaljan opis uključuje uzorne prikaze različitih otelotvorenja pronalaska, koji nisu restriktivni za pronalazak kako se zahteva. Priložene slike čine deo ove specifikacije i, zajedno sa opisom, služe samo za ilustraciju otelotvorenja, a ne za ograničavanje pronalaska.
KRATAK OPIS SLIKA
[0039]
Sl. 1 prikazuje interakciju miša između molekula TCR i molekula MHC: levi panel prikazuje T ćeliju (vrh) miša od humanizovanog TCR miša koji sadrži T ćelijski receptor sa humanim varijabilnim TCR domenima i mišjim konstantnim TCR domenima, koji prepoznaje antigen (siva lopta) predstavljen kroz MHC klasu I pomoću antigena koji predstavlja ćelija (dno); desni panel pokazuje isto za MHC klase II. Kompleksi MHC I i MHC II su prikazani zajedno sa njihovim odgovarajućim ko-receptorima, CD8 i CD4. Područja miša su u crnoj, a humana u beloj boji.
Sl.2 prikazuje (bez skaliranja) opštu organizaciju miša (gornji panel, prvi lokus) i čoveka (gornji panel, drugi lokus) TCRα lokusa. Donji panel ilustruje strategiju zamene segmenata TCRα varijabilnog regiona u mišu (zatvoreni simboli) humanim segmentima TCRα varijabilnog regiona (otvoreni simboli) u endogenom lokusu miša na hromozomu 14; prikazan je humanizovani TCRα lokus koji ima humane Vα i Jα segmente sa mišjim konstantnim regionom i pojačivačem miša; u prikazanom otelotvorenju, lokus TCRδ se briše tokom humanizacije.
Sl. 3 prikazuje (bez skaliranja) progresivnu strategiju za humanizaciju mišjeg TCRα lokusa, pri čemu se segmenti genskog TCRα varijabilnog regiona sekvencijalno dodaju uzvodno od početne humanizacije izbrisanog lokusa miša (MAID1540). Mišija sekvenca označena je zatvorenim simbolima; humana sekvenca označena je otvorenim simbolima; MAID se odnosi na modifikovani ID broja alela. TRAV=TCR Vα segment, TRAJ = TCR Jα segment (hTRAJ=humani TRAJ), TRAC=TCR Cα domen, TCRD=TCRd.
Sl.4 je detaljan prikaz (bez skaliranja) strategije progresivne humanizacije na TCRα lokusu. Sl.4A prikazuje brisanje miša TCRα V i J segmenata; Sl.4B prikazuje strategiju za umetanje 2V i 61J humanih segmenata u izbrisani lokus TCRα miša; Sl. 4C prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih V segmenata, što rezultira sa ukupno 8V i 61J humanih segmenata; Sl.4D prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih V segmenata, što rezultira sa ukupno 23V i 61J humanih segmenata; Sl. 4E prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih V segmenata, što rezultira sa 35V i 61J humanih segmenata; Sl.4F prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih segmenata, što rezultira sa 48V i 61J humanih segmenata; i Sl. 4G prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih segmenata, što rezultira sa 54V i 61J humanih segmenata. MAID se odnosi na modifikovani ID broja alela.
Sl. 5 prikazuje (bez skaliranja) jedno otelotvorenje strategije humanizacije lokusa TCRa miša, u kojoj su humane TCR δ sekvence (TCRδ Vs, TCRδ Ds, TCRδ Js, TCRδ enh (pojačivač) i TCRδ konstanta (C)) takođe postavljene na humanizovani TCRα lokus. Mišija sekvenca označena je zatvorenim simbolima; humana sekvenca označena je otvorenim simbolima; LTVEC se odnosi na veliki vektor ciljanja; hTRD=humani TCRδ.
Sl.6 prikazuje (bez skaliranja) opštu organizaciju miša (gornja ploča, prvo mesto; na mišjem hromozomu 6) i čoveka (gornja ploča, drugi lokus; na humanom hromozomu 7) TCRβ lokusi. Donji panel ilustruje strategiju zamene segmenata TCRβ varijabilnog regiona u mišu (zatvoreni simboli) humanim segmentima TCRβ varijabilnog regiona (otvoreni simboli) u endogenom lokusu miša na mišijem hromozomu 6; Humanizovani TCRβ lokus koji ima humane Vβ, Dβ i Jβ segmente prikazan je sa mišjim konstantnim regionima i pojačivačem miša; u prikazanom otelotvorenju, humanizovani lokus zadržava mišiće miša tripsinogena (jednobojni pravougaonici); i u posebnom prikazanom otelotvorenju, jedan mišji V segment zadržava se uzvodno od 5' gena miša tripsinogena.
Sl. 7 prikazuje (bez skaliranja) progresivnu strategiju za humanizaciju mišjeg TCRβ lokusa, pri čemu se segmenti gena TCRβ varijabilnog regiona sekvencijalno dodaju u izbrisani varijabilni TCRβ lokus miša. Mišija sekvenca označena je zatvorenim simbolima; humana sekvenca označena je otvorenim simbolima; MAID se odnosi na modifikovani ID broja alela. TRBV ili TCRBV= TCRβ V segment.
Sl. 8 je detaljan prikaz progresivne strategije humanizacije na TCRβ lokusu. Sl. 8A prikazuje strategiju za brisanje mišijih TCRβ V segmenata; Sl.8B prikazuje strategiju za umetanje 14V segmenata u izbrisani TCRβ lokus; Sl.8C prikazuje strategiju za umetanje 2D i 14J segmenata u TCRβ lokus (i), praćeno brisanjem IoxP mesta (ii), što dovodi do 14V, 2D i 14J humanih segmenata; Sl.8D prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih V segmenata što rezultira 40V, 2D i 14J humanim segmentima; i Sl. 8E prikazuje strategiju za umetanje dodatnih humanih V segmenata što rezultira 66V, 2D i 14J humanim segmentima; Sl.8F prikazuje zamenu V segmenta miša nizvodno od pojačivača miša, što rezultira humanim segmentima 67V, 2D i 14J. U ovom konkretnom otelotvorenju, jedan mišji V segment zadržava 5' tripsinogen gena miša.
Sl.9 prikazuje reprezentativne histograme FACS analize za procenat ćelija slezine (gde je Y osa broj ćelija, X osa je srednji intenzitet fluorescencije, a kapija prikazuje učestalost CD3+ T ćelija unutar pojedinačne populacije limfocita) obojene anti-CD3 antitelom u divljem tipu (WT) miša; miš homozigotan za izbrisani TCRα lokus (prvi gornji panel; MAID 1540 sa SL. 3); miš homozigotan za izbrisani TCRα lokus i sadrži 8 humanih Vα i 61 humanih Jα segmenata (drugi gornji panel; MAID 1767 sa SL. 3 ili humanizovani TCRα miš); miš homozigot za izbrisani TCRβ lokus, sa izuzetkom jednog uzvodno i jednog nizvodnog Vβ segmenta miša (prvi donji panel; MAID 1545 sa SL. 7); miš homozigot za izbrisani TCRβ lokus sa jednim uzvodno i jednim Vβ segmentom miša i koji sadrži 14 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humanih Jβ segmenata (drugi donji panel; MAID 1716 sa SL. 7 ili humanizovani TCRβ miš); i miš homozigot za deleciju TCRα i TCRβ lokusa (sa izuzetkom pomenuta dva mišja Vβ segmenta) i koji sadrži 8 humanih Vα i 61 humanih Jα segmenata na endogenom TCRα lokusu, kao i 14 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humani Jβ segmenti na endogenim TCRβ lokusima (MAID 1767/1716 ili humanizovani TCRα/β miš).
Sl.10 je reprezentativni FACS konturni prikaz mišićnih timusnih ćelija iz WT, homozigotnog humanizovanog TCRα (1767 HO; hTCRα); homozigotnog humanizovanog TCRβ (1716 HO; hTCRβ); i homozigotnog humanizovanog TCRα/β miša (1716 HO 1767 HO; hTCRα/β) obojeni antitelima protiv CD4 (Y osa) i anti-CD8 (X osa) (gornja ploča) i antitelima anti-CD44 (Y os) i anti-CD25 (X osa) (donji panel). FACS grafikon na gornjoj ploči omogućava razlikovanje dvostruko negativnih (DN), dvostruko pozitivnih (DP), CD4 pojedinačno pozitivnih (CD4 SP) i CD8 pojedinačno pozitivnih (SP CD8) T ćelija. FACS grafik na donjem panelu omogućava razlikovanje različitih faza dvostruko negativnih T ćelija tokom razvoja T ćelija (DN1, DN2, DN3 i DN4).1716 i 1767 odnose se na MAID brojeve kako su identifikovani na Sl.3 i 7.
Sl.11 prikazuje ili frekvenciju (gornji panel) ili apsolutni broj (donji panel) DN, DP, CD4 SP i CD SP T ćelija u timusu bilo WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miša (n=4).
Sl.12 je reprezentativna FACS analiza ćelija slezine WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miša: levi panel predstavlja analizu anti-CD19 antitela na osnovu singularnih ćelija (Y osa; mrlja za limfocite B) ili anti-CD3 antitelo (X osa; mrlja za limfocite T) bojenje; srednji panel predstavlja analizu CD3+ ćelija na osnovu bojenja antitela protiv CD4 (Y os) ili anti-CD8 (X osa); a desni panel predstavlja analizu ili CD4+ ili CD8+ ćelija na osnovu bojenja antitela na CD44 (Y os) ili anti-CD62L (X osa), mrlje omogućavaju razlikovanje različitih vrsta T ćelija na periferiji (naivne T ćelije vs. T ćelije centralne memorije (Tcm) u odnosu na efektorske ili efektorske memorijske T ćelije (Teff/Tem)).
Sl.13 prikazuje broj CD4+ (levi panel) ili CD8+ (desni panel) T ćelija po slezini (Y ose) WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miša (n=4).
Sl.14 prikazuje broj T naivnih, Tcm i Teff/em ćelija po slezini (Y ose) CD4+ (gornja ploča) ili CD8+ (donja ploča) T ćelija WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miša (n=4).
Sl.15 su tabele koje rezimiraju ekspresiju (određenu FACS analizom korišćenjem promenljivih specifičnih za segmente antitela) različitih humanih TCRβ V segmenata u CD8+ T ćelijama slezine (Sl. 15A) ili CD4+ T ćelije (Sl.15B) miševa WT, hTCRβ (1716 HO) ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO). Podaci su predstavljeni kao Prosek±SD (n =4 miša u grupi)
Sl. 16 prikazuje ekspresiju mRNK (Y ose) različitih humanih TCRβ V segmenata prisutnih u WT, hTCRα (1767 HO); hTCRβ (1716 HO); ili hTCRα/β (1716 HO 1767 HO) miševa u T ćelijama timusa ili slezine; Sl.
16A predstavlja analizu ekspresije mRNK humanog TCRβ varijabilnog segmenta (hTRBV) 18, 19, 20 i 24; i Sl.16B predstavlja analizu mRNK ekspresije hTRBV 25, 27, 28 i 29.
Sl. 17 prikazuje reprezentativne FACS histograme ćelija slezine (gde je I osa broj ćelija, X osa je srednji intenzitet fluorescencije, a kapija pokazuje učestalost CD3+ T ćelija unutar pojedinačne populacije limfocita) obojene anti-CD3 antitelom u WT mišu, miš homozigot za izbrisani TCRα lokus (TCRA ΔV), miš homozigot za izbrisani TCRα lokus sa 2 humana V segmenta i 61 humanog J segmenta (TCRA 2 hV; MAID 1626 sa SL.
3), miš homozigot za izbrisani TCRα lokus sa 8 humanih V segmenata i 61 humanog J segmenta (TCRA 8 hV; MAID 1767 sa SL.3), i miš homozigot za izbrisani TCRα lokus sa 23 humanih V segmenata i 61 humanog J segmenta (TCRA 23 hV; MAID 1979 sa SL.3).
Sl. 18, na levoj gornjoj ploči, predstavlja reprezentativnu FACS analizu CD3+ T ćelija timusa dobijenu bilo od WT ili homozigotnog hTCRα miša sa 23 humana V segmenta i 61 humanog J segmenta (1979 HO) obojenim bilo kojim anti-CD4 (Y osa) ili antitelo protiv CD8 (X osa); na levom donjem panelu je FACS analiza DN T ćelija bilo WT ili 1979 miša obojenog ili anti-CD44 (I os) ili anti-CD25 (X osa); na desnom panelu su grafici procenata timocita (Y osa) koji su DN, DP, CD4 SP ili CD8 SP kod miševa WT ili 1979 HO (n=4).
Sl. 19, na levom panelu, predstavlja reprezentativnu FACS analizu limfocita slezine iz WT ili 1979 HO miša obojenog anti-CD19 ili anti-CD3 antitelima; na desnom panelu su grafici procenta splenocita (Y osa) dobijeni od WT i 1979 HO miševa (n=4) koji su CD3+.
DETALJNI OPIS PRONALASKA
Definicije
[0040] Predmetni pronalazak obelodanjuje genetski modifikovane ne-humane životinje, npr., glodare, npr., miševe ili pacove, koji eksprimiraju humanizovane T ćelijske receptore. Predmetni pronalazak se takođe odnosi na genetski modifikovane ne-humane životinje koje u svojoj germinalnoj liniji sadrže neuređene lokuse gena varijabilnih T ćelijskih receptora. Takođe su obelodanjeni embrioni, ćelije i tkiva koji ih sadrže; postupci pravljenja istih; kao i postupke korišćenja istih. Ukoliko nije drugačije definisano, svi termini i fraze korišćeni ovde uključuju značenja koja su termini i fraze stekli u struci, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se termin ili fraza koristi.
[0041] Termin "konzervativni", kada se koristi za opis konzervativne supstitucije aminokiselina, uključuje supstituciju aminokiselinskog ostatka drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima (npr., punjenje ili hidrofobnost). Konzervativne zamene aminokiselina mogu se postići modifikovanjem nukleotidne sekvence tako da se uvede nukleotidna promena koja će kodirati konzervativnu supstituciju. Generalno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće suštinski promeniti funkcionalna svojstva koja su od značaja za protein, na primer, sposobnost T ćelije da prepozna peptid predstavljen molekulom MHC. Primeri grupa aminokiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatično-hidroksilni bočni lanci kao što su serin i treonin; bočni lanci koji sadrže amid kao što su asparagin i glutamin; aromatični bočni lanci kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; osnovni bočni lanci kao što su lizin, arginin i histidin; kiseli bočni lanci kao što su asparaginska kiselina i glutaminska kiselina; i bočni lanci koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe aminokiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izolevcin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin/glutamin. U nekim otelotvorenjima, konzervativna supstitucija aminokiselina može biti supstitucija bilo kog izvornog ostatka u proteinu alaninom, kao što se koristi u, na primer, mutagenezi skeniranja alanina. U nekim otelotvorenjima je napravljena konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u PAM250 matrici log-nalik verovatnoće obelodanjene u Gonnet i dr. ((1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45). U nekim otelotvorenjima, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima ne negativnu vrednost u PAM250 matrici verovatnoće log.
[0042] Dakle, ovde je obelodanjena genetski modifikovana ne-humana životinja koja eksprimira humanizovane TCR α i β polipeptide (i/ili humanizovane TCRδ i TCRγ polipeptide) koja sadrži konzervativne aminokiselinske supstitucije u aminokiselinskoj sekvenci koja je ovde opisana.
[0043] Stručnjak u ovoj oblasti bi razumeo da pored ostataka nukleinske kiseline koji kodiraju ovde opisane humanizovane TCR α i β polipeptide, zbog degeneracije genetskog koda, druge nukleinske kiseline mogu kodirati polipeptide pronalaska. Prema tome, pored genetski modifikovane ne-humane životinje koja u svom genomu sadrži nukleotidne sekvence koje kodiraju ovde opisane humanizovane TCR polipeptide, ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži nukleotidne sekvence koje se razlikuju od ovde opisanih zbog degeneracije genetskog koda su takođe obelodanjene.
[0044] Termin "identitet" kada se koristi u vezi sa sekvencom uključuje identitet utvrđen brojem različitih algoritama poznatih u struci koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidnih i/ili aminokiselinskih sekvenci. U nekim ovde prikazanim otelotvorenjima, identiteti se određuju pomoću poravnanja ClustalW v. 1.83 (sporo) primenom kazne za otvoreni jaz od 10,0, kazne za produženi jaz od 0,1 i upotrebom matrice sličnosti Gonnet (MacVector™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008). Dužina sekvenci u poređenju sa identitetom sekvenci zavisiće od određenih sekvenci. U različitim otelotvorenjima, identitet se određuje upoređivanjem sekvence zrelog proteina od njegovog N-završetka do njegovog C-završetka. U različitim otelotvorenjima, kada se upoređuje himerna humana/ne-humana sekvenca sa sekvencom čoveka, humani deo himerne humane/ne-humane sekvence (ali ne i nehumani deo) se koristi u poređenju u svrhu utvrđivanje nivoa identiteta između humane sekvence i humanog dela himerne humane/ne-humane sekvence (npr., upoređivanje humanog ektodomena himernog humanog/mišijeg proteina sa humanim ektodomenom humanog proteina).
[0045] Termini "homologija" ili "homologni" u odnosu na sekvence, npr., nukleotidne ili aminokiselinske sekvence, označavaju dve sekvence koje su, nakon optimalnog poravnanja i poređenja, identične u najmanje oko 75% nukleotida ili aminokiselina, najmanje oko 80% nukleotida ili aminokiselina, najmanje oko 90-95% nukleotida ili aminokiselina, npr., više od 97% nukleotida ili aminokiselina. Stručnjak u ovoj oblasti bi razumeo da, za optimalno ciljanje gena, konstrukcija za ciljanje treba da sadrži krakove homologne endogenim sekvencama DNK (tj. „homološke ruke“); tako, može doći do homologne rekombinacije između ciljanog konstrukta i ciljane endogene sekvence.
[0046] Termin "operativno povezan" se odnosi na suprotstavljanje u kome su tako opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kao takva, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein može biti operativno povezana sa regulatornim sekvencama (npr., promoter, pojačivač, prigušivač sekvence, itd.) tako da zadrži odgovarajuću regulaciju transkripcije. Pored toga, različiti delovi humanizovanog proteina pronalaska mogu biti operativno povezani kako bi se zadržalo pravilno presavijanje, obrada, ciljanje, ekspresija i druga funkcionalna svojstva proteina u ćeliji. Ukoliko nije drugačije naznačeno, različiti domeni humanizovanog proteina pronalaska operativno su povezani jedni sa drugima.
[0047] Termin "zamena" u odnosu na zamenu gena se odnosi na postavljanje egzogenog genetskog materijala na endogeni genetski lokus, čime se zamenjuje ceo ili deo endogenog gena ortološkom ili homolognom sekvencom nukleinske kiseline. U jednom slučaju, endogeni ne-humani gen ili njegov fragment se zamenjuje odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog, homolog ili je u osnovi identičan ili isti po strukturi i/ili funkciji kao endogeni ne-humani gen ili njegov fragment koji je zamenjen. Kao što je prikazano u primerima ispod, nukleotidne sekvence endogenih nehumanih TCR α i β varijabilnih genskih lokusa zamenjene su nukleotidnim sekvencama koje odgovaraju humanim TCR α i β varijabilnim genskim lokusima.
[0048] "Funkcionalni", kako se ovde koristi, na primer, u odnosu na funkcionalni protein, se odnosi na protein koji zadržava najmanje jednu biološku aktivnost koja je normalno povezana sa izvornim proteinom. Na primer, u nekim otelotvorenjima pronalaska, zamena na endogenom lokusu (npr., zamena na endogenim ne-humanim TCRα, TCRβ, TCRδ i/ili TCRγ varijabilnim genskim lokusima) rezultira lokusom koji ne eksprimira funkcionalni endogeni protein.
[0049] TCR lokus ili TCR genski lokus (npr., TCRα lokus ili TCRβ lokus), kako se ovde koristi, odnosi se na genomsku DNK koja sadrži TCR kodirajući region, uključujući čitav TCR kodirajući region, uključujući neuređene V(D)J sekvence, pojačivač, sekvencu, konstantne sekvence, i bilo koje uzvodno ili nizvodno (UTR, regulatorni regioni, itd.) ili intervenišuće DNK sekvence (introni, itd.). TCR varijabilni lokus ili TCR varijabilni genski lokus (npr., TCRα promenljivi genski lokus ili TCRβ promenljivi genski lokus), odnosi se na genomsku DNK koja obuhvata region koji uključuje segmente TCR promenljivog regiona (V(D)J region), ali isključuje TCR konstantne sekvence i, u različitim otelotvorenjima, sekvence pojačivača. Ostale sekvence mogu biti uključene u TCR varijabilni genski lokus u svrhu genetske manipulacije (npr., selekcione kasete, restrikciona mesta, itd.), i one su ovde obuhvaćene.
Genetski modifikovane TCR životinje
[0050] U različitim primerima, pronalazak generalno obelodanjuje genetski modifikovane ne-humane životinje, pri čemu ne-humane životinje sadrže u genomu neuređene humanizovane TCR varijabilne genske lokuse.
[0051] T ćelije vezuju epitope na malim antigenskim odrednicama na površini ćelija koje predstavljaju antigen i koje su povezane sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC; kod miševa) ili humani leukocitni antigen (HLA; kod ljudi) složen. T ćelije vezuju ove epitope kroz kompleks T ćelijskih receptora (TCR) na površini T ćelije. T ćelijski receptori su heterodimerne strukture sastavljene od dve vrste lanaca: α (alfa) i β (beta) lanca, ili γ (gama) i δ (delta) lanca. α lanac je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar α lokusa (na hromozomu čoveka ili miša 14), koji takođe obuhvata ceo δ lokus, a β lanac je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja se nalazi unutar β lokusa (na mišijem hromozomu 6 ili humanom hromozomu 7). Većina T ćelija ima αβ TCR; dok manjina T ćelija nosi γδ TCR. Interakcije TCR sa molekulima MHC klase I (predstavljanje CD8+ T ćelijama) i molekulima MHC klase II (predstavljanje CD4+ T ćelijama) prikazane su na Sl.1 (zatvoreni simboli predstavljaju ne-humane sekvence; otvoreni simboli predstavljaju humane sekvence, prikazujući jedno određeno otelotvorenje TCR proteina predmetnog pronalaska).
[0052] Polipeptidi α i β receptora za T ćelije (i slično γ i δ polipeptidi) povezani su jedni sa drugima preko disulfidne veze. Svaki od dva polipeptida koji čine TCR sadrži vanćelijski domen koji sadrži konstantne i varijabilne regione, transmembranski domen i citoplazmatski rep (transmembranski domen i citoplazmatski rep takođe su deo konstantnog regiona). Varijabilni region TCR određuje njegovu antigensku specifičnost, i sličan imunoglobulinama, sadrži 3 komplementarna određujuća regiona (CDR). Takođe slični genima imunoglobulina, lokusi varijabilnih genskih T ćelijskih receptora (npr., TCRα i TCRβ lokusi) sadrže brojne neuređene segmente V(D)J (varijabla (V), spajanje (J), a u TCRβ i δ različitost (G) segmenti). Tokom razvoja T ćelija u timusu, lokus varijabilnog genskog TCRα podvrgava se preuređivanju, tako da se rezultujući TCR α lanac kodira specifičnom kombinacijom VJ segmenata (Vα/Jα sekvenca); i lokus varijabilnog genskog TCRβ podvrgava se preuređivanju, tako da se rezultujući TCR β lanac kodira specifičnom kombinacijom VDJ segmenata (Vβ/Dβ/Jβ sekvenca).
[0053] Interakcije sa stromom timusa pokreću timocite u nekoliko razvojnih faza, koje karakteriše ekspresija različitih markera na površini ćelija. Rezime karakterističnih markera površinske ćelije u različitim razvojnim fazama u timusu dat je u Tabeli 1. Preuređivanje u varijabilnom genskom TCRβ lokusu započinje u fazi DN2 i završava se u fazi DN4, dok se preuređivanje varijabilnog genskog TCRα lokusa dešava u fazi DP. Nakon završetka preuređenja TCRβ lokusa, ćelije eksprimiraju TCRβ lanac na površini ćelije zajedno sa surogatom α lanca, pTα. Videti, Janeway's Immunobiology, Chapter 7, supra.
Tabela 1: Faze razvoja T ćelija u timusu
[0054] Naivne CD4+ i CD8+ T ćelije izlaze iz timusa i ulaze u periferne limfoidne organe (npr., slezinu) gde su izložene antigenima i aktiviraju se da se klonski šire i diferenciraju u brojne efektorske T ćelije (Teff), npr., citotoksične T ćelije , TREGćelije, TH17 ćelije, TH1 ćelije, TH2 ćelije, itd. Nakon infekcije, brojne T ćelije opstaju kao memorijske T ćelije i klasifikuju se ili kao T ćelije centralne memorije (Tcm) ili kao efektorske T ćelije (Tem). Sallusto i dr. (1999) Two subsets of memory T lymphocytes with distinct homing potentials and effector functions, Nature 401:708-12 i komentari Mackay (1999) Dual personality of memory T cells, Nature 401:659-60. Sallusto i kolege su predložili da nakon početne infekcije Tem ćelije predstavljaju lako dostupan bazen memorijskih T ćelija pripremljenih antigenom u perifernim tkivima sa efektorskim funkcijama, dok Tcm ćelije predstavljaju memorijske T ćelije u perifernim limfoidnim organima koje su sekundarno izazov mogu postati nove efektorske T ćelije. Dok sve memorijske T ćelije eksprimiraju CD45RO izoformu CD45 (naivne T ćelije eksprimiraju CD45RA izoformu), Tcm karakterišu ekspresija L-selektina (takođe poznatog kao CD62L) i CCR7+, koji su važni za vezivanje i signalizaciju u perifernim limfoidnim organima i limfni čvorovi. Id. Dakle, sve T ćelije koje se nalaze u perifernim limfoidnim organima (npr., naivne T ćelije, Tcm ćelije, itd.) eksprimiraju CD62L. Pored CD45RO, poznato je da sve memorijske T ćelije eksprimiraju brojne različite površinske markere ćelija, npr., CD44. Za rezime različitih markera na površini ćelija na T ćelijama, videti Janeway's Immunobiology, Chapter 10, supra.
[0055] Dok TCR varijabilni domen funkcioniše prvenstveno u prepoznavanju antigena, vanćelijski deo konstantnog domena, kao i transmembranski i citoplazmatski domeni TCR takođe služe važnim funkcijama. Kompletni kompleks TCR receptora zahteva više od α i β ili γ i δ polipeptida; dodatni potrebni molekuli uključuju CD3γ, CD3δ, i CD3ε, kao i homodimer ζ lanca (ζζ). Po završetku preuređivanja TCRβ, kada ćelije eksprimiraju TCRβ/pTα, ovaj pre-TCR kompleks postoji zajedno sa CD3 na ćelijskoj površini. TCRα (ili pTα) na ćelijskoj površini ima dva osnovna ostatka u svom transmembranskom domenu, od kojih jedan regrutuje CD3γε heterodimer, a drugi regrutuje ζζ preko njihovih odgovarajućih kiselih ostataka. TCRβ ima dodatni osnovni ostatak u svom transmembranskom domenu za koji se veruje da regrutuje CD3δε heterodimer. Videti, npr., Kuhns i dr. (2006) Deconstructing the Form and Function of the TCR/CD3 Complex, Immunity 24:133-39; Wucherpfennig i dr. (2009) Structural Biology of the T-cell Receptor: Insights into Receptor Assembly, Ligand Recognition, and Initiation of Signaling, Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2:a005140. Sastavljeni kompleks, koji sadrži TCRαβ heterodimer, CD3γε, CD3δε i ζζ, eksprimiran je na površini T ćelije. Polarni ostaci u transmembranskom domenu su predloženi da služe kao kontrola kvaliteta za izlazak iz endoplazmatskog retikuluma; pokazano je da se u odsustvu CD3 podjedinica TCR lanci zadržavaju u ER i ciljaju na razgradnju. Videti npr., Call and Wucherpfennig (2005) The T Cell Receptor: Critical Role of the Membrane Environment in Receptor Assembly and Function, Annu. Rev. Immunol.23:101-25.
[0056] CD3 i ζ lanci sklopljenog kompleksa pružaju komponente za TCR signalizaciju jer TCRαβ heterodimer (ili TCRγδ heterodimer) sam po sebi nema aktivnost transdukcije signala. Lanci CD3 poseduju po jedan motiv za
1
aktiviranje na osnovu imunološkog receptora-tirozina (ITAM), dok lanac sadrži tri tandemska ITAM-a. ITAM sadrže ostatke tirozina koji mogu biti fosforilisani od pridruženih kinaza. Dakle, sklopljeni TCR-CD3 kompleks sadrži 10 ITAM motiva. Videti npr., Love and Hayes (2010) ITAM-Mediated Signaling by the T-Cell Antigen Receptor, Cold Spring Harb. Perspect. Biol.2:e002485. Nakon angažovanja TCR, ITAM motivi fosforilišu tirozin kinaze porodice Src, Lck i Fyn, što pokreće signalnu kaskadu, što rezultira Ras-aktivacijom, mobilizacijom kalcijuma, preuređivanjem citoskeleta aktina i aktivacijom transkripcionih faktora, što sve na kraju dovodi do diferencijacije T-ćelija, širenja i efektorske akcije. Id., videti takođe, Janeway's Immunobiology, 7th Ed., Murphy i dr. eds., Garland Science, 2008.
[0057] Pored toga, smatra se da TCRβ transmembranski i citoplazmatski domeni imaju ulogu u ciljanju mitohondrija i indukciji apoptoze; u stvari, u timocitima postoje molekuli TCRβ koji se prirodno skraćuju N-terminalno. Shani i dr. (2009) Incomplete T-cell receptor--β peptides target the mitochondrion and induce apoptosis, Blood 113:3530-41. Dakle, nekoliko važnih funkcija služi TCR konstantni region (koji u različitim otelotvorenjima sadrži deo vanćelijskih kao i transmembranskih i citoplazmatskih domena); i u različitim otelotvorenjima struktura ovog regiona treba da se uzme u obzir prilikom dizajniranja humanizovanih TCR ili genetski modifikovanih nehumanih životinja koje isti ekspresuju.
[0058] Miševi transgenski za preuređene sekvence T ćelijskih receptora su poznati u struci. Predmetni pronalazak obelodanjuje genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodare, npr., pacove, miševe) koji sadrže neuređene humane ili humanizovane T ćelijske varijabilne genske lokuse koji su sposobni da se preurede u sekvence nukleinskih kiselina koji kodiraju varijabilne domene humanih T ćelijskih receptora, uključujući životinje koje sadrže T ćelije koje sadrže preuređene humane varijabilne domene i ne-humane (npr., miševe ili pacove) konstantne regione. Predmetni pronalazak takođe obelodanjuje ne-humane životinje (npr., glodare, npr., pacove, miševe) koji su sposobni da generišu raznovrstan repertoar sekvenci varijabilnog regiona humanih T ćelijskih receptora; stoga, predmetni pronalazak obelodanjuje ne-humane životinje koje eksprimiraju TCR sa potpuno humanim varijabilnim domenima kao odgovor na antigen od interesa i koje vezuju epitop antigena od interesa. U nekim primerima su obelodanjene ne-humane životinje koje generišu raznovrstan repertoar T ćelijskih receptora sposobnih da reaguje sa različitim antigenima, uključujući, ali ne ograničavajući se na antigene predstavljene APC.
[0059] U jednom primeru, ovde su obelodanjeni genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodari, npr., pacovi, miševi) koji u svom genomu sadrže neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmenti), pri čemu neuređeni humani TCR varijabilni segmenti regiona zamenjuju, na endogenom ne-humanom (npr., glodaru) varijabilnom genskom TCR lokusu (npr., TCRα, β, δ, i/ili γ varijabilni genski lokus), endogene nehumane varijabilne TCR segmente regiona. U jednom primeru, neuređeni varijabilni humani genski TCR lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCR lokus.
[0060] U drugom primeru, pronalazak obelodanjuje genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodare, npr., pacove, miševe) koji u svom genomu sadrže neuređene segmente humanog TCR varijabilnog regiona (V(D)J segmenti), pri čemu neuređeni humani segmenti TCR varijabilnog regiona su operativno povezani sa sekvencom gena ne-humanog TCR konstantnog regiona što rezultira humanizovanim TCR lokusom, pri čemu se humanizovani TCR lokus nalazi na mestu u genomu, a ne na endogenom ne-humanom TCR lokusu. Prema tome, u jednom primeru je takođe obelodanjena ne-humana životinja (npr., glodar, npr., miš, pacov) koji sadrži transgen koji sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCR koji su operativno povezani sa sekvencom konstantnog TCR ne-humanog regiona.
[0061] U jednom aspektu, genetski modifikovane izolovane ćelije glodara prema pronalasku sadrže u svom genomu segmente humanog TCR varijabilnog regiona, dok zadržavaju konstantne segmente gena TCR kod glodara, npr., miša, pacova. U različitim primerima, konstantni regioni uključuju transmembranski domen i citoplazmatski rep TCR. Tako, u različitim ovde prikazanim primerima, genetski modifikovane ne-humane životinje zadržavaju endogeni ne-humani TCR transmembranski domen i citoplazmatski rep. U drugim primerima, ne-humane životinje sadrže ne-humane ne-endogene TCR konstantne sekvence gena, na primer, ne-humani ne-endogeni TCR transmembranski domen i citoplazmatski rep. Kao što je iznad naznačeno, konstantni region TCR učestvuje u signalnoj kaskadi iniciranoj tokom aktivacije T ćelija podvrgnutih antigenu; tako, endogeni TCR konstantni region komunicira sa raznim ne-humanim sidrenim i signalnim proteinima u T ćeliji. Tako, u jednom primeru, ovde otkrivene genetski modifikovane ne-humane životinje izražavaju humanizovane receptore T ćelija koji zadržavaju sposobnost regrutovanja različitih endogenih ne-humanih sidrenih ili signalnih molekula, npr., CD3 molekula (npr., CD3γ, CD3δ, CD3ε), lanac ζ, Lck, Fin, ZAP-70, itd. Neograničavajući spisak molekula koji se regrutuju u TCR kompleks opisan je u Janeway's Immunobiology, supra. Pored toga, slično VELOCIMMUNE® miševima, koji pokazuju normalan razvoj B ćelija i normalne postupke klonske selekcije za koje se veruje da su delimično nastali zbog postavljanja promenljivih regiona u endogeni mišji lokus i održavanja mišjih konstantnih domena, u jednom ovde obelodanjene ne-humane životinje pokazuju normalan razvoj T ćelija i procese diferencijacije T ćelija.
[0062] U nekim primerima, obelodanjena je ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCRα, pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRα operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog regiona ne-humanog TCRα što rezultira humanizovanim TCRα lokusom. U jednom primeru, humanizovani TCRα lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije endogeni nehumani TCRα lokus. U drugom primeru, neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRα zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRα, zadržavajući endogeni ne-humani TCRα konstantni region. U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski humani TCRα lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus. U nekim primerima, životinja zadržava endogene ne-humane TCRβ varijabilne regione i sekvence gena konstantnog regiona. Prema tome, životinja eksprimira TCR koji sadrži himerni humani/ne-humani (tj., humanizovani) TCRα lanac i ne-humani TCRβ lanac.
[0063] U drugim primerima, obelodanjena je ne-humana životinja koja u svom genomu sadrži neuređene segmente varijabilnog regiona humanog TCRβ, pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRβ operativno povezani sa sekvencom gena konstantnog regiona ne-humanog TCRβ što rezultira humanizovanim TCRβ lokusom. U jednom primeru, humanizovani TCRβ lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije endogeni nehumani TCRβ lokus. U drugom primeru, neuređeni segmenti varijabilnog regiona humanog TCRβ zamenjuju endogene segmente varijabilnog regiona TCRβ, zadržavajući endogeni ne-humani TCRβ konstantni region. U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski humani TCRβ lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus. U nekim primerima, životinja zadržava endogene ne-humane TCRα varijabilne regione i sekvence gena konstantnog regiona. Prema tome, životinja eksprimira TCR koji sadrži himerni humani/ne-humani (tj., humanizovani) TCRβ lanac i ne-humani TCRα lanac.
[0064] U nekim konkretnim primerima, pronalazak obelodanjuje genetski modifikovanu ne-humanu životinju (npr., glodara, npr., miša ili pacova) koja u svom genomu (a) sadrži neuređeni T ćelijski receptor α varijabilnog genskog lokusa koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment, operativno povezani sa endogenim ne-humanim (npr., glodara, npr., miša ili pacova) TCRα konstantnim sekvencama gena i/ili (b) sadrži neuređeni TCRβ varijabilnog genskog lokusa koji sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment, operativno povezan sa endogenim ne-humanim (npr., glodara, npr., miša ili pacova) TCRβ konstantnom sekvencom gena.
[0065] U različitim primerima pronalaska, neuređeni humani ili humanizovani varijabilni genski TCR lokus (npr., TCRα i/ili TCRβ varijabilni genski lokus) obuhvaćen je germinalnom linijom ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova). U različitim primerima, zamene TCR V(D)J segmenata neuređenim humanim TCR V(D)J segmentima (npr., Vα i Jα, i/ili Vβ i Dβ i Jβ segmenti) nalaze se na endogenom nehumanom varijabilnom TCR lokusu (ili lokusima), pri čemu su neuređeni humani V i J i/ili V i D i J segmenti operativno povezani sa ne-humanim TCR genima konstantnog regiona.
[0066] U nekim ovde prikazanim primerima, ne-humana životinja sadrži dve kopije neuređenog humanog ili humanizovanog varijabilnog genskog TCRα lokusa i/ili dve kopije neuređenog humanog ili humanizovanog varijabilnog genskog TCRβ lokusa. Dakle, ne-humana životinja je homozigotna za jedan ili oba neuređena humana ili humanizovana varijabilna genska TCRα i TCRβ lokusa. U nekim ovde prikazanim primerima, ne-humana životinja sadrži jednu kopiju neuređenog humanog ili humanizovanog varijabilnog genskog TCRα lokusa i/ili jednu kopiju neuređenog humanog ili humanizovanog varijabilnog genskog TCRβ lokusa. Dakle, ne-humana životinja je heterozigotna za jedan ili oba neuređena humana ili humanizovana varijabilna genska TCRα i TCRβ lokusa.
[0067] U jednom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona (npr., humani segmenti Vα i Jα) pozicioniran je u ne-humanom genomu tako da segmenti humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće ne-humane segmente varijabilnog regiona. U jednom primeru, neurešeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus. U jednom primeru, endogeni nehumani Vα i Jα segmenti nisu sposobni da se preurede da bi formirali preuređenu Vα/Jα sekvencu. Dakle, u jednom primeru, humani segmenti Vα i Jα u neuređenom varijabilnom genskom TCRα lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vα/Jα sekvencu.
[0068] Slično, u jednom primeru, neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona (npr., humani segmenti Vβ, Dβ, i Jβ ) pozicioniran je u ne-humanom genomu tako da segmenti humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće ne-humane segmente varijabilnog regiona. U jednom primeru, neurešeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus. U jednom primeru, endogeni ne-humani Vβ, Dβ, i Jβ segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. Dakle, u jednom primeru, humani segmenti Vβ, Dβ, i Jβ u neuređenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu humanu Vαβ/Dβ/Jβ sekvencu.
[0069] U još jednom primeru, i neuređeni varijabilni genski TCRα i β lokusi koji sadrže segmente humanog varijabilnog regiona zamenjuju odgovarajuće endogene varijabilne genske TCRα i β lokuse. U jednom primeru, endogeni ne-humani Vα i Jα segmenti nisu sposobni da se preurede da bi formirali preuređeni Vα/Jα niz, a endogeni ne-humani Vβ, Dβ, i Jβ segmenti nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. Dakle, u jednom primeru, humani segmenti Vα i Jα u neuređenom lokusu promenljivog gena TCRα sposobni su da se preurede da bi formirali preuređenu sekvencu Va/Ja čoveka, a segmenti čoveka Vβ, Dβ, i Jβ u neuređenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu su sposobni za preuređivanje da bi formirali preuređenu humanu Vap/Dp/jp sekvencu.
[0070] U nekim primerima, ne-humana životinja koja sadrži humanizovani genski TCRα i/ili TCRβ lokus (koji sadrži neuređeni varijabilni genski TCRα i/ili TCRβ lokus) zadržava endogeni ne-humani varijabilni genski TCRα i/ili TCRβ lokus. U jednom primeru, endogeni varijabilni genski TCRα i/ili TCRβ lokus je nefunkcionalni lokus. U jednom primeru, nefunkcionalni lokus je inaktivirani lokus, npr., obrnuti lokus (npr., kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline varijabilnog genskog lokusa je u obrnutoj orijentaciji u odnosu na sekvencu konstantnog regiona, tako da nema uspešnih preuređivanja moguće korišćenje segmenata varijabilnog regiona iz obrnutog lokusa). U jednom primeru, humanizovani varijabilni genski TCRα i/ili TCRβ lokus pozicioniran je između endogenog genskog ne-humanog TCRα lokusa i/ili endogenog genskog TCRβ lokusa i endogenog ne-humanog genskog TCRα i/ili TCRβ konstantnog lokusa.
[0071] Broj, nomenklatura, položaj, kao i drugi aspekti V i J i/ili V, D i J segmenata TCR lokusa čoveka i miša mogu se utvrditi pomoću baze podataka IMGT koja je dostupna na www.imgt.org. Varijabilni lokus miša TCRα je približno 1,5 megabaza i sadrži ukupno 110Vα i 60 Jα segmenata (SL. 2). Humani TCRα varijabilni lokus je približno 1 megabaza i sadrži ukupno 54Vα i 61 Jα segmenata, sa 45Vα i 50Jα za koje se veruje da su funkcionalni. Ako nije drugačije naznačeno, brojevi humanih V(D)J segmenata na koje se poziva u celoj specifikaciji odnose se na ukupan broj V(D)J segmenata. U jednom primeru, genetski modifikovana ne-humana životinja (npr., glodar, npr., miš ili pacov) sadrži najmanje jedan humani Vα i najmanje jedan humani Jα segment. U jednom primeru, nehumana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50 ili do 54 humana Vα segmenta. U nekom primeru, humanizovani TCRα lokus sadrži 2, 8, 23, 35, 48 ili 54 humana Vα segmenta. Tako, u nekim primerima, humanizovani TCRα lokus kod ne-humane životinje može da sadrži 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% , 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% humanog Vα; u nekom primeru može sadržati oko 2%, oko 3%, oko 15%, oko 65%, oko 90% ili 100% humanog Vα.
[0072] U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Vα40 do Vα41 (Vα segment se takođe naziva „TRAV“ ili „TCRAV“) i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog Ja segmenta (Ja segment se takođe naziva „TRAJ“ ili „TCRAJ“). U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV35 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV22 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV13-2 do TRAV41 i fragment DNK koji sadrži susedna humana sekvenca od 61 humanog TRAJ. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV6 do TRAV41 i 61 humanih TRAJ. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRα lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRAV1-1 do TRAV 41 i 61 humanog TRAJ. U različitim primerima, fragmenti DNK koji sadrže susedne humane sekvence segmenata humanog TCRα varijabilnog regiona takođe sadrže mesta restrikcionih enzima, selekcione kasete, mesta endonukleaze ili druga mesta koja su umetnuta da olakšaju kloniranje i selekciju tokom procesa humanizacije lokusa. U različitim primerima, ova dodatna mesta ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr., preuređivanje, spajanje itd.) različitih gena na TCRα lokusu.
[0073] U jednom primeru, humanizovani TCRα lokus sadrži 61 humani Jα segment, ili 100% humanog Jα segmenta. U određenom primeru, humanizovani TCRα lokus sadrži 8 humanih Vα segmenata i 61 humani Jα segment; u drugom određenom primeru, humanizovani TCRα lokus sadrži 23 humana Vα segmenta i 61 humana Jα segmenta. U drugom konkretnom primeru, humanizovani TCRα lokus sadrži kompletan repertoar humanih Vα i Jα segmenata, tj. svih segmenata humanog genskog promenljivog α regiona kodiranih α lokusom, ili 54 humanih Vα i 61 humanih Jα segmenata. U različitim primerima, ne-humana životinja ne sadrži nijedan endogeni ne-humani Vα ili Jα segment na TCRα lokusu.
[0074] Varijabilni lokus miša TCRβ je približno 0,6 megabaza i sadrži ukupno 33 Vβ, 2 Dβ, i 14 Jβ segmenata (SL.
6). Varijabilni lokus čoveka TCRβ je približno 0,6 megabaza i sadrži ukupno 67 Vβ, 2 Dβ, i 14 Jβ segmenata. U jednom primeru, genetski modifikovana ne-humana životinja (npr., glodar, npr., miš ili pacov) sadrži najmanje
1
jedan humani Vβ, sadrži najmanje jedan humani Dβ i najmanje jedan humani Jα segment. U jednom primeru, nehumana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25, 30, 35, 40, 45, 48, 50, 55, 60 ili do 67 humana Vβ segmenta. U nekim primerima, humanizovani TCRβ lokus sadrži 8, 14, 40, 66 ili humani 67 Vβ segmenti. Tako, u nekim primerima, humanizovani TCRβ lokus kod ne-humane životinje može da sadrži 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55% , 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% ili 100% humanog Vβ; u nekim primerima može sadržati oko 20%, oko 60%, oko 15%, oko 98% ili 100% humanog Vβ.
[0075] U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Vβ18 do Vβ29-1 (Vβ segment se takođe naziva "TRBV" ili "TCRBV"). U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV18 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1 (tj., humanog Dβ1-Jβ1-1-Jb1-6 segmenti) i odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 (tj., humani Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmenti). U jednom primeru, nehumana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV6-5 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1 (tj., humanog Dβ1-Jβ1-1-Jb1-6 segmenti) i odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 (tj., humani Dβ2-Jβ2-1-Jβ2-7 segmenti). U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV1 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1 i zaseban DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži humanizovani TCRβ lokus koji sadrži fragment DNK koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog TRBV1 do TRBV29-1, odvojeni DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ1-Jβ1, zasebnu DNK fragment koji sadrži susednu humanu sekvencu humanog Dβ2-Jβ2 i odvojeni DNK fragment koji sadrži sekvencu humanog TRBV30. U različitim primerima, fragmenti DNK koji sadrže susedne humane sekvence segmenata humanog TCRβ varijabilnog regiona takođe sadrže mesta restrikcionih enzima, selekcione kasete, mesta endonukleaze ili druga mesta koja su umetnuta da olakšaju kloniranje i selekciju tokom procesa humanizacije lokusa. U različitim primerima, ova dodatna mesta ne ometaju pravilno funkcionisanje (npr., preuređivanje, spajanje itd.) različitih gena na TCRβ lokusu.
[0076] U jednom primeru, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 humanih Jb segmenata, ili 100% humanih Jβ segmenata, i 2 humana Dβ segmenta ili 100% humanih Jβ segmenata. U drugim primerima, humanizovani TCRβ lokus sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, npr.14 humanih Vβ segmenata, i sve mišje Dβ i Jβ segmente. U određenim primerima, humanizovani TCRβ lokus sadrži 14 humanih Vβ segmenata, 2 humana Dβ segmenta i 14 humanih Jβ segmenata. U drugim konkretnim primerima, humanizovani TCRβ lokus sadrži kompletan repertoar humanih Vβ, Dβ i Jβ segmenata, tj., sve segmente humanog varijabilnog genskog β regiona kodiranih β lokusom ili 67 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humanih Jβ segmenata. U jednom primeru, ne-humana životinja sadrži jedan (npr., 5') ne-humani Vβ segment na humanizovanom TCRβ lokusu. U različitim primerima, ne-humana životinja ne sadrži nijedan endogeni ne-humani Vβ, Dβ, ili Jβ segment na TCRβ lokusu.
[0077] U različitim primerima, gde ne-humana životinja (npr., glodari) sadrži repertoar segmenata TCRα i TCRβ čoveka (i opciono humani TCRδ i TCRγ) (npr., kompletan repertoar segmenata varijabilnog regiona), repertoar različitih segmenti (npr., kompletan repertoar različitih segmenata) životinja koristi za stvaranje raznolikog repertoara molekula TCR za različite antigene.
[0078] U različitim primerima, ne-humane životinje sadrže susedne delove humanog genskom varijabilnom TCR lokusu koji sadrže V, D i J, ili D i J, ili V i J, ili V segmente raspoređene kao u neuređenom humanom genskom varijabilnom lokusu, npr. koji sadrži promoterske sekvence, vodeće sekvence, intergenske sekvence, regulatorne sekvence, itd., raspoređene kao u humanom genskom varijabilnom TCR lokusu. U drugim primerima, različiti segmenti su raspoređeni kao u neuređenom ne-humanom genomskom TCR varijabilnom lokusu. U različitim primerima, humanizovanog TCRα i/ili β lokusa, humanizovani lokus može sadržati dva ili više humanih genomskih segmenata koji se ne pojavljuju u ljudskom genom u susedstvu, npr. Fragment V segmenata humanog V lokusa smeštenog u humanom genomu proksimalno od konstantne regije, u kombinaciji sa fragmentom V segmenata humanog V lokusa smeštenog u humanom genomu na uzvodnom kraju humanog V lokusa.
[0079] I kod miša i kod čoveka, segmenti TCRδ gena su locirani sa TCRα lokusom (videti SL.2 i 5). TCRδ J i D segmenti nalaze se između Vα i Jα segmenata, dok su TCRδ V segmenti prošarani kroz TCRα lokus, pri čemu se većina nalazi među različitim Vα segmentima. Broj i lokacije različitih TCRδ segmenata mogu se odrediti iz baze podataka IMGT. Zbog genomskog rasporeda segmenata TCRδ gena unutar TCRα lokusa, uspešno preuređivanje na TCRα lokusu generalno briše segmente TCRδ gena.
[0080] U nekim primerima, ne-humana životinja koja sadrži neuređeni humani varijabilni TCRa lokus takođe sadrži najmanje jedan humani Vδ segment, na primer, do kompletnog repertoara humanih Vδ segmenata. Stoga, u nekim primerima, zamena endogenog genskog varijabilnog TCRα lokusa rezultira zamenom najmanje jednog ne-humanog Vδ segmenta humanim Vδ segmentom. U drugim primerima, ovde obelodanjena ne-humana životinja sadrži kompletan repertoar humanih Vδ, Dδ i Jδ segmenata na neuređenom humanizovanom TCRα lokusu; u još drugim primerima, ne-humana životinja sadrži kompletan neuređeni lokus TCRδ čoveka na neuređenom humanizovanom TCRα lokusu (tj., TCRδ lokus, uključujući humane varijabilne segmente regiona, kao i humani pojačivač i konstantni region). Primeri za konstruisanje neuređenog humanizovanog TCRα lokusa koji sadrži kompletni neuređeni TCRδ lokus prikazani su na Sl.5.
[0081] U još sledećim primerima, ovde obelodanjena ne-humana životinja dalje sadrži neuređeni humanizovani TCRγ lokus, npr., TCRγ lokus koji sadrži najmanje jedan humani Vγ i najmanje jedan humani Jγ segment (npr., kompletan repertoar humanog Vγ i humanog Jγ segmenti varijabilnog regiona). Humani TCRγ lokus je na humanom hromozomu 7, dok je mišji TCRγ lokus na mišjem hromozomu 13. Pogledajte IMGT bazu podataka za više detalja o lokusu TCRγ.
[0082] U jednom primeru, ovde opisana ne-humana životinja (npr., glodar, npr., miš ili pacov) koja sadrži humanizovane TCRα i β varijabilne genske lokuse (i, opciono humanizovane TCRδ/γ varijabilne genske lokuse), eksprimiraju humanizovani T ćelijski receptor koji sadrži varijabilni region čoveka i konstantni region ne-čoveka (npr., glodara, npr., miša ili pacova) na površini T ćelije. U nekim primerima, ne-humana životinja je sposobna ili može da izrazi raznoliki repertoar humanizovanih receptora T ćelija koji prepoznaju niz predstavljenih antigena.
[0083] U različitim primerima, ovde opisani humanizovani polipeptidi T ćelijskih receptora sadrže sekvence humanog vođe. U alternativnim primerima, sekvence nukleinske kiseline humanizovanog TCR receptora napravljene su tako da humanizovani TCR polipeptidi sadrže ne-humane vodeće sekvence.
[0084] Ovde opisani humanizovani TCR polipeptidi mogu se ekspresovati pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata (npr., regulatornih elemenata glodara), npr., promotera, prigušivača, pojačivača, itd. Ovde opisani humanizovani TCR polipeptidi mogu se alternativno ekspresovati pod kontrolom humanih regulatornih elemenata. U različitim primerima, ovde opisane ne-humane životinje dalje sadrže sve regulatorne i druge sekvence koje se normalno nalaze in situ u humanom genomu.
[0085] U različitim primerima, humani varijabilni region humanizovanog TCR proteina sposoban je za interakciju sa različitim proteinima na površini iste ćelije ili druge ćelije. U jednom primeru, humani varijabilni region humanizovanog TCR deluje u interakciji sa MHC proteinima (npr., MHC proteini klase I ili II) predstavljajući antigene na površini druge ćelije, npr., ćelije koja predstavlja antigen (APC). U nekim primerima, protein MHC I ili II je ne-humani (npr., glodar, npr., miš ili pacov) protein. U drugim primerima, protein MHC I ili II je humani protein. U jednom primeru, druga ćelija, npr., APC, je endogena ne-humana ćelija koja eksprimira humani ili humanizovani molekul MHC. U drugom primeru, druga ćelija je ćelija čoveka koja eksprimira humani molekul MHC.
[0086] U jednom primeru, ne-humana životinja eksprimira humanizovani T ćelijski receptor sa konstantnim nehumanim regionom na površini T ćelije, pri čemu je receptor sposoban za interakciju sa ne-humanim molekulima, npr., sidrenim ili signalnim molekulima u T ćeliji (npr., molekuli CD3, ζ lanac ili drugi proteini usidreni za TCR kroz molekule CD3 ili ζ lanac).
[0087] Dakle, u jednom primeru je obelodanjen ćelijski kompleks, koji sadrži ne-humanu T-ćeliju koja eksprimira TCR koji sadrži humanizovani TCRα lanac kako je ovde opisano i humanizovani TCRβ lanac kako je ovde opisano, i ćeliju koja ne predstavlja antigen koji sadrži antigen vezan za MHC I ili MHC II. U jednom primeru, ne-humani konstantni lanci TCRα i TCRβ su složeni sa homodimerom ne-humanog zeta (ζ) lanca i CD3 heterodimerima. U jednom primeru, ćelijski kompleks je in vivo ćelijski kompleks. U jednom primeru, ćelijski kompleks je in vitro ćelijski kompleks.
[0088] Genetski modifikovana ne-humana životinja obelodanjena ovde može se odabrati iz grupe koju čine miš, pacov, zec, svinja, govedo (npr., krava, bik, bivoli), jelen, ovca, koza, piletina, mačka, pas, tvor, primat (npr., marmozet, rezus majmun). Za ne-humane, gde odgovarajuće genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci za pravljenje ne-humane životinje koja sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikovanje ne-ES ćelijskog genoma (npr., fibroblast ili indukovana pluripotentna ćelija) i primenu nuklearnog transfera za prenos modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, na primer, oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr., modifikovani oocit) kod ne-humane životinje pod pogodnim uslovima da se formira embrion.
[0089] U jednom primeru, ne-humana životinja je sisar. U jednom primeru, ne-humana životinja je mali sisar, na primer, iz superporodice Dipodoidea ili Muroidea. U jednom primeru, genetski modifikovana životinja je glodar. U jednom primeru, glodar je izabran između miša, pacova i hrčka. U jednom primeru, glodar je izabran iz superporodice Muroidea. U jednom primeru, genetski modifikovana životinja je iz porodice izabrane iz vrste
1
Calomyscidae (npr., hrčci slični mišima), Cricetidae (npr., hrčci, pacovi i miševi Novog sveta, voluharice), Muridae (pravi miševi i pacovi, skočimiševi, bodljikavi miševi, grivasti pacovi), Nesomyidae (miševi koji se penju, kameni miševi, pacovi sa repom, malgaški pacovi i miševi), Platacanthomyidae (npr., bodljikavi pacovi) i Spalacide (npr., slepo kuče, bambusovi pacovi i zokori). U konkretnom primeru, genetski modifikovani glodar se bira između pravog miša ili pacova (porodica Muridae), skočimiša, bodljikavog miša i krestastog pacova. U jednom primeru, genetski modifikovani miš potiče iz člana porodice Muridae. U jednom primeru, životinja je glodar. U specifičnom primeru, glodar je izabran između miša i pacova. U jednom primeru, ne-humana životinja je miš.
[0090] U konkretnom primeru, ne-humana životinja je glodar koji je miš soja C57BL odabranog između C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr i C57BL/Ola. U još jednom primeri, miš je 129. soja, odabranim iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (videti npr., Festing i dr. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836, videti takođe, Auerbach i dr (2000) Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv- and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines). U specifičnom primeru, genetski modifikovani miš je mešavina iznad pomenutog soja 129 i iznad pomenutog soja C57BL/6. U još jednom specifičnom primeru, miš je mešavina iznad pomenutih 129 sojeva ili mešavina iznad pomenutih sojeva BL/6. U specifičnom primeru, soj 129 smeše je soj 129S6 (129/SvEvTac). U još jednom primeru, miš je soj BALB, na primer, soj BALB/c. U još jednom primeru, miš je mešavina soja BALB i drugog iznad pomenutog soja.
[0091] U jednom primeru, ne-humana životinja je pacov. U jednom primeru, pacov se bira između pacova Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344, F6 i Dark Agouti. U jednom primeru, soj pacova je mešavina dva ili više sojeva izabranih iz grupe koju čine Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
[0092] Prema tome, u jednom ovde obelodanjenom primeru je genetski modifikovani miš koji u svom genomu sadrži neuređeni lokus humanog ili humanizovanog TCR varijabilnog gena, na primer, TCRα, TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγ varijabilni genski lokus. U nekim primerima, neuređeni humani ili humanizovani varijabilni genski TCR lokus zamenjuje endogeni varijabilni genski TCR lokus. U drugim primerima, neuređeni humani ili humanizovani TCR varijabilni genski lokus nalazi se na mestu u genomu koje nije odgovarajući endogeni mišji TCR lokus. U nekim primerima, humani ili humanizovani neuređeni varijabilni genski TCR lokus operativno je povezan sa TCR konstantnim regionom miša.
[0093] U jednom primeru obelodanjen je genetski modifikovani miš, pri čemu miš u svom genomu sadrži neuređeni varijabilni genski lokus T-receptora (TCR) α koji sadrži najmanje jedan humani Jα segment i najmanje jedan humani Vα segment, operativno povezan sa mišem TCRα konstantna sekvenca gena i neuređeni lok TCRβ promenljivog gena koji sadrži najmanje jedan humani Jβ segment, najmanje jedan humani Db segment i najmanje jedan humani Vβ segment, operativno povezan sa mišjom TCRβ konstantnom genskom sekvencom. U jednom konkretnom primeru, miš u svom genomu sadrži neuređeni varijabilni genski TCRα lokus, koji sadrži kompletan repertoar humanih Jα segmenata i kompletan repertoar humanih Vα segmenata, operativno povezan sa konstantnom sekvencom gena TCRα miša, i neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži kompletan repertoar humanih Jβ segmenata, kompletan repertoar humanih Dβ segmenata i kompletan repertoar humanih Vβ segmenata, operativno povezan sa mišjom TCRβ konstantnom genskom sekvencom.
[0094] U nekim primerima, neuređeni varijabilni genski TCRα lokus koji sadrži segmente varijabilnog humanog TCRα regiona zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRα lokus miša, a neuređeni varijabilni genski TCRβ lokus koji sadrži segmente promenljivog regiona humanog TCRβ zamenjuje endogeni varijabilni genski TCRβ lokus. U nekim primerima, endogeni mišji segmenti Vα i Jα nisu sposobni da se preurede da bi formirali preuređenu sekvencu Vα/Jα, a endogeni segmenti Vβ, Dβ, i Jβ miša nisu u stanju da se preurede da bi formirali preuređenu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu. U nekim primerima, humani segmenti Vα i Jα preuređuju se tako da formiraju preuređenu humanu sekvencu Vα/Jα, a humani segmenti Vβ, Dβ i Jβ preuređuju se tako da formiraju preuređenu humanu Vβ/Dβ/Jβ sekvencu.
[0095] U različitim primerima, ovde opisane ne-humane životinje (npr., glodari, npr., miševi ili pacovi) proizvode T ćelije koje su sposobne za razvoj timusa, napredujući od DN1 do DN2 do DN3 do DN4 do DP i do CD4 ili CD8 SP T ćelije. Takve T ćelije ne-humane životinje obelodanjene ovde eksprimiraju molekule ćelijske površine tipično proizvedene od strane T ćelije tokom određenog stadijuma razvoja timusa (npr., CD25, CD44, Kit, CD3, pTα, itd.). Dakle, ovde opisane ne-humane životinje eksprimiraju pTα u kompleksu sa TCRβ u DN3 fazi razvoja timusa. Ovde opisane ne-humane životinje eksprimiraju T ćelije sposobne da se podvrgnu razvoju timusa da bi proizvele CD4+ i CD8+ T ćelije. Obično je u timusu fiziološki odnos CD4+ prema CD8+ T ćelijama između oko 2:1 i 3:1. Videti npr., Ge and Stanley (2008) The O-fucose glycan in the ligand-binding domain of Notch 1 regulates embryogenesis and T cell development, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:1539-44. Tako, u jednom primeru, ovde opisane ne-humane životinje proizvode CD4+ i CD8+ T ćelije u timusu u odnosu od oko između 2:1 i 3:1 (CD4+:CD8+).
1
[0096] U različitim primerima, ovde opisane ne-humane životinje proizvode T ćelije koje su sposobne da se podvrgnu normalnoj diferencijaciji T ćelija na periferiji. U nekim primerima, ovde opisane ne-humane životinje sposobne su da proizvedu normalan repertoar efektorskih T ćelija, npr., CTL (citotoksični T limfociti), TH1, TH2, TREG, TH17, itd. Dakle, u ovim primerima ovde obelodanjene ne-humane životinje generišu efektorske T ćelije koje ispunjavaju različite funkcije tipične za određeni tip T ćelija, npr. prepoznaju, vezuju i reaguju na strane antigene. U različitim primerima, ovde opisane ne-humane životinje proizvode efektorske T ćelije koje ubijaju ćelije koje prikazuju peptidne fragmente citosolnih patogena eksprimirane u kontekstu molekula MHC I; prepoznaju peptide izvedene iz antigena razgrađenih u unutarćelijskim vezikulama i predstavljene molekulima MHC II na površini makrofaga i navode makrofage da ubijaju mikroorganizme; proizvode citokine koji pokreću diferencijaciju B ćelija; aktiviraju B ćelije da proizvedu opsonizujuća antitela; indukuju epitelne ćelije da proizvode hemokine koji regrutuju neutrofile na mesta infekcije; itd.
[0097] U dodatnim primerima, ovde opisane ne-humane životinje sadrže normalan broj CD3+ T ćelija u periferiji, npr., u slezini. U nekim primerima, procenat perifernih CD3+ T ćelija kod ovde opisanih ne-humanih životinja uporediv je sa onim kod divljih životinja (tj., životinja koje sadrže sve endogene segmente TCR varijabilnog regiona). U jednom primeru, ovde opisane ne-humane životinje sadrže normalan odnos CD3+ T ćelija slezine prema ukupnim splenocitima.
[0098] U drugim primerima, ovde opisane ne-humane životinje sposobne su da generišu populaciju memorijskih T ćelija kao odgovor na antigen od interesa. Na primer, ovde obelodanjene ne-humane životinje generišu i centralne memorijske T ćelije (Tcm) i efektorske T ćelije (Tem) do antigena, npr., antigena od interesa (npr., antigena koji se testira za razvoj vakcine, itd.).
[0099] DN1 i DN2 ćelije koje ne prime dovoljno signala (npr., Notch signali) mogu se razviti u B ćelije, mijeloidne ćelije (npr., dendritične ćelije), mastocite i NK ćelije. Videti npr., Yashiro-Ohtani i dr. (2010) Notch regulation of early thymocyte development, Seminars in Immunology 22:261-69. U nekim primerima, ovde opisane ne-humane životinje razvijaju normalan broj B ćelija, mijeloidnih ćelija (npr., dendritičnih ćelija), mastocita i NK ćelija. U nekim primerima, ovde opisane ne-humane životinje razvijaju normalnu populaciju dendritičnih ćelija u timusu.
[0100] Preovlađujući tip receptora za T ćelije izraženi na površini T ćelija je TCRα/β, s tim što manji broj ćelija eksprimiraju TCRδ/γ. U nekim primerima, T ćelije ne-humanih životinja koje sadrže humanizovani TCRα i/ili β lokusi pokazuju normalno korišćenje TCRα/β i TCRδ/γ lokusa, na primer, korišćenje TCRα/β i TCRδ/γ lokusa koje je slično životinja divljeg tipa (npr., T ćelije ovde opisanih ne-humanih životinja eksprimiraju proteine TCRα/β i TCRδ/γ u uporednim proporcijama sa onim koje eksprimiraju životinje divljeg tipa). Prema tome, u nekim primerima, ne-humane životinje koje sadrže humanizovani TCRα/β i endogene ne-humane TCRδ/γ lokuse pokazuju normalno korišćenje svih lokusa.
[0101] Pored ovde opisanih ne-humanih životinja stvorenih genetskim inženjeringom, obelodanjen je i ne-humani embrion (npr., embrion glodara, npr., embrion miša ili pacova), pri čemu embrion sadrži ES ćeliju davaoca koja je izvedena iz ne-humane životinje (npr., glodar, npr., miš ili pacov) kako je ovde opisano. U jednom primeru, embrion sadrži ES donatorsku ćeliju koja sadrži neuređeni humanizovani TCR lokus i ćelije domaćina embriona.
[0102] Takođe je obelodanjeno tkivo, pri čemu je tkivo izvedeno od ne-humane životinje (npr., miš ili pacov), kako je ovde opisano, i eksprimira humanizovani TCR polipeptid (npr., TCRα i/ili TCRβ, ili TCRδ, i/ili TCRγ polipeptid).
[0103] Pored toga, obezbeđena je ćelija glodara izolovana od glodara kako je ovde opisano. U jednom otelotvorenju, ćelija je ES ćelija. U jednom otelotvorenju, ćelija je T ćelija. U jednom otelotvorenju, T ćelija je CD4+ T ćelija. U jednom otelotvorenju, T ćelija je CD8+ T ćelija.
[0104] Takođe je obelodanjena ne-humana ćelija koja sadrži hromozom ili njegov fragment ne-humane životinje kako je ovde opisano. U jednom primeru, ne-humana ćelija sadrži jezgro ne-humane životinje kako je ovde opisano. U jednom primeru, ne-humana ćelija sadrži hromozom ili njegov fragment kao rezultat nuklearnog prenosa.
[0105] Takođe je obezbeđena ćelija glodara koja eksprimira TCR protein koji sadrži varijabilni region čoveka i konstantni region glodara. TCR protein može sadržati TCRα, TCRβ ili njihovu kombinaciju. U jednom aspektu, ćelija je T ćelija, npr., CD4+ ili CD8+ T ćelija.
[0106] U jednom primeru, obelodanjena je pluripotentna indukovana ćelija koja sadrži neuređeni humanizovani TCR lokus koji kodira humanizovani TCR polipeptid kako je ovde opisano. U jednom primeru, indukovana pluripotentna ćelija je izvedena od ne-humane životinje, kao što je ovde opisano.
[0107] U jednom aspektu, obezbeđen je hibridom ili kvadrom, izveden iz ćelije glodara kako je ovde opisano. Glodar je miš ili pacov.
[0108] Takođe je ovde dat postupak za pravljenje genetski modifikovanog glodara (npr., miša ili pacova). Postupak za genetski modifikovane glodare rezultira životinjom čiji genom sadrži humanizovani neuređeni TCR lokus (npr.,
1
humanizovani neuređeni TCRα, TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγg lokus). Ovde je obelodanjen postupak za stvaranje genetski modifikovane ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) koji eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži varijabilni region čoveka i ne-humani (npr., glodara, npr., miša ili pacova) konstantni region na površini T ćelije pri čemu postupak obuhvata zamenu kod prve ne-humane životinje endogenog ne-humanog lokusa TCRα varijabilnog gena neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRα lokusom koji sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment, pri čemu je humanizovani TCRα varijabilni genski lokus operativno povezan sa endogenim TCRα konstantnim regionom; zamena u drugoj ne-humanoj životinji endogenog varijabilnog genskog TCRβ lokusa sa neuređenim humanizovanim varijabilnim genskim TCRβ lokusom koji sadrži jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i jedan humani Jβ segment, pri čemu je humanizovani varijabilni genski TCRβ lokus operativno povezan sa endogenim TCRβ konstantnim regionom; i uzgoj prve i druge ne-humane životinje, da bi se dobila ne-humana životinja, a koja eksprimira receptor za T ćeliju koja sadrži humani varijabilni region i ne-humani konstantni region. U drugim primerima, pronalazak obelodanjuje postupke stvaranja genetski modifikovane ne-humane životinje čiji genom sadrži humanizovani neuređeni lokus TCRα, ili ne-humane životinje čiji genom sadrži humanizovani neuređeni lokus TCRβ, generisan prema ovde opisanim postupcima. U različitim primerima, zamene se vrše na endogenim lokusima. U nekim primerima, postupak koristi jednu ili više konstrukcija za ciljanje napravljenih korišćenjem tehnologije VELOCIGENE®, uvođenjem konstrukta u ES ćelije i uvođenjem ciljanih klonova ES ćelija u embrion miša pomoću VELOCIMOUSE® tehnologije, kao što je opisano u primerima. U nekim primerima, ES ćelije su izvedene od miša koji je mešavina 129 i C57BL/6 sojeva. U različitim primerima, postupak obuhvata strategiju progresivne humanizacije, pri čemu se konstrukcija koja sadrži dodatne segmente varijabilnog regiona uvodi u ES ćelije u svakom sledećem koraku humanizacije, što na kraju rezultira mišem koji sadrži kompletan repertoar segmenata humanog varijabilnog regiona (videti, npr. Sl.3 i 7).
[0109] Tako su takođe obelodanjeni nukleotidni konstrukti koji se koriste za generisanje ovde opisanih ne-humanih životinja. U jednom primeru, nukleotidni konstrukt sadrži: 5' i 3' homološki krakovi, fragment ljudske DNK koji sadrži segmente gena humanog TCR varijabilnog regiona i selekcionu kasetu uz bok rekombinacionih mesta. U jednom primeru, fragment ljudske DNK je fragment TCRα gena i sadrži najmanje jedan humani segment TCRα varijabilnog regiona. U drugom primeru, fragment ljudske DNK je fragment TCRβ i sadrži najmanje jedan humani segment TCRβ varijabilnog genskog regiona. U jednom primeru, najmanje jedan homološki krak je ne-humani homološki krak i homologan je ne-humanom TCR lokusu (npr., ne-humanom TCRα ili TCRβ lokusu).
[0110] Selekciona kaseta je nukleotidna sekvenca umetnuta u konstrukciju za ciljanje da bi se olakšao odabir ćelija (npr., ES ćelija) koje su integrisale konstrukt od interesa. U struci je poznat niz pogodnih selekcionih kaseta. Obično selekciona kaseta omogućava pozitivnu selekciju u prisustvu određenog antibiotika (npr., Neo, Hyg, Pur, CM, Spec, itd.). Pored toga, selekciona kaseta može biti uz bok mestima rekombinacije, koja omogućavaju brisanje selekcione kasete nakon tretmana enzimima rekombinaze. Uobičajena mesta rekombinacije su loxP i Frt, prepoznata od strane Cre i Flp enzima, ali druga su poznata u tehnici.
[0111] Selekciona kaseta može se nalaziti na 5' kraju fragmenta ljudske DNK. Selekciona kaseta može se nalaziti na 3' kraju fragmenta ljudske DNK. Selekciona kaseta može biti smeštena unutar fragmenta ljudske DNK, na primer, unutar ljudskog introna. Selekciona kaseta može se nalaziti na spoju fragmenta DNK čoveka i miša.
[0112] Razni primeri strategije ciljanja za generiranje genetski stvorenih ne-humanih životinja, konstrukcije i vektori ciljanja koji se koriste za iste predstavljeni su na Sl.3, 4, 5, 7 i 8.
[0113] Po završetku ciljanja gena, ES ćelije ili genetski modifikovane nehumane životinje se pregledaju da bi se potvrdilo uspešno uključivanje egzogene nukleotidne sekvence od interesa ili ekspresije egzogenog polipeptida (npr., segmenti varijabilnog regiona humanog TCR). Stručnjacima su poznate brojne tehnike, koje uključuju (ali nisu ograničene na) zapadno blotovanje, dugu PCR, kvantitativnu PCT (npr. PCR u realnom vremenu pomoću TAKMAN®), fluorescentnu hibridizaciju in situ, Severno blotovanje, protočnu citometriju, Zapadna analiza, imunocitohemija, imunohistohemija, itd. U jednom primeru, ne-humane životinje (npr., miševi) koje nose genetsku modifikaciju od interesa mogu se identifikovati skriningom na gubitak alela miša i/ili dobit od alela čoveka korišćenjem modifikacije test alela opisan u Valenzuela i dr. (2003) Inženjering genoma miša velike propusnosti, zajedno sa analizom ekspresije visoke rezolucije, Nature Biotech. 21(6):652-659. Drugi testovi koji identifikuju specifične sekvence nukleotida ili aminokiselina u genetski modifikovanim životinjama poznati su stručnjacima u ovoj oblasti.
[0114] Ovde je obelodanjen postupak modifikovanja varijabilnog genskog TCR lokusa (npr., TCRα, TCRβ, TCRδ, i/ili TCRγ genski lokus) ne-humane životinje da bi se ekspresovao humanizovani TCR protein opisan ovde. U jednom primeru, ovde obelodanjen postupak je modifikovanja varijabilnog genskog TCR lokusa da bi se izrazio humanizovani TCR protein na površini T ćelije, pri čemu postupak obuhvata zamenu endogenog varijabilnog genskog TCR lokusa kod ne-humane životinje neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus. U jednom primeru, gde je varijabilni genski TCR lokus TCRα varijabilni genski lokus, neuređeni humanizovani varijabilni
1
genski TCR lokus sadrži najmanje jedan humani Vα segment i najmanje jedan humani Jα segment. U jednom primeru, gde je varijabilni genski TCR lokus varijabilnog genskog TCRβ lokusa, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus sadrži najmanje jedan humani Vβ segment, najmanje jedan humani Dβ segment i najmanje jedan humani Jβ segment. U različitim primerima, neuređeni humanizovani varijabilni genski TCR lokus operativno je povezan sa odgovarajućim endogenim ne-humanim TCR konstantnim regionom.
[0115] Humanizovani TCR protein napravljen od ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova), kako je ovde opisan, takođe je obelodanjen, gde humanizovani TCR protein sadrži humani varijabilni region i ne-humani konstantni region. Prema tome, humanizovani TCR protein sadrži humane komplementarne regione koji određuju (tj., humani CDR1, 2 i 3) u svom varijabilnom domenu i ne-humanom konstantnom regionu.
[0116] Iako Primeri koji slede opisuju genetski napravljenu ne-humanu životinju čiji genom sadrži humanizovani TCRαi/ili humanizovani TCRβ varijabilni genski lokus, stručnjak u tehnici bi razumeo da se slična strategija može koristiti za proizvodnju genetski napravljenih životinja čiji genom obuhvata humanizovani TCRδ i/ili TCRγ varijabilni genski lokus. Takođe je obelodanjena genetski napravljena ne-humana životinja sa humanizacijom sva četiri TCR varijabilna genska lokusa.
Upotreba genetski modifikovanih TCR životinja
[0117] U različitim primerima, ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje prave T ćelije sa humanizovanim TCR molekulima na njihovoj površini, što bi kao rezultat prepoznalo peptide koji su im predstavljeni od MHC kompleksa na ljudski način. Ovde opisane genetski modifikovane ne-humane životinje mogu se koristiti za proučavanje razvoja i funkcije ljudskih T ćelija i procesa imunološke tolerancije; da testira kandidate za vakcine ljudi; da generišu TCR sa određenim specifičnostima za TCR gensku terapiju; za generisanje TCR biblioteka za antigene povezane sa bolestima (npr., antigeni povezani sa tumorom (TAA)); itd.
[0118] U tehnici postoji sve veći interes za terapiju T ćelijama, jer se T ćelije (npr., citotoksične T ćelije) mogu usmeriti na napad i dovesti do uništavanja antigena od interesa, npr., virusnog antigena, bakterijskog antigena, antigena tumora, itd., ili ćelije koje ga predstavljaju. Početna ispitivanja u terapiji T ćelijama ciljane na izolaciju limfocita koji se infiltriraju u tumor (TILs; populacije limfocita u tumorskoj masi koje verovatno sadrže T ćelije reaktivne protiv tumorskih antigena) iz tumorske ćelijske mase, proširujući ih in vitro pomoću faktora rasta T ćelija i prenoseći ih nazad na pacijenta u procesu koji se naziva usvojeni prenos T ćelija. Videti npr., Restifo i dr. (2012) Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response, Nature Reviews 12:269-81; Linnermann i dr. (2011) T-Cell Receptor Gene Therapy: Critical Parameters for Clinical Success, J. Invest. Dermatol.131:1806-16. Međutim, uspeh ovih terapija do sada je bio ograničen na melanom i karcinom bubrežnih ćelija; a usvojeni prenos TIL nije posebno usmeren na definisane antigene povezane sa tumorom (TAA). Linnermann i dr., supra.
[0119] Pokušaji su započeti TCR gensku terapiju gde su T ćelije ili odabrane ili programirane da ciljaju antigen od interesa, npr., TAA. Trenutna TCR genska terapija oslanja se na identifikaciju sekvenci TCR koje su usmerene na specifične antigene, npr., na tumore povezane antigene. Na primer, Rosenberg i kolege objavili su nekoliko ispitivanja u kojima su transdukovali limfocite periferne krvi izvedene od pacijenta sa melanomom sa genima koji kodiraju TCRα i β lance specifične za antigene MART-1 povezane sa melanomom i koristili rezultujuće limfocite za usvojenu terapiju T ćelijama. Johnson i dr. (2009) Gene therapy with human and mouse T-cell receptors mediates cancer regression and targets normal tissues expressing cognate antigen, Blood 114:535-46; Morgan i dr. (2006) Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes, Science 314:126-29. MCR-1 specifični TCR izolovani su od pacijenata koji su doživeli regresiju tumora nakon terapije TIL. Međutim, identifikacija takvih TCR, naročito TCR visoke avidnosti (koji će najverovatnije biti terapeutski korisni), komplikovana je činjenicom da je većina tumorskih antigena samoantigena, a TCR koji ciljaju ove antigene često se ili brišu ili imaju neoptimalni afinitet, prvenstveno zbog imunološke tolerancije.
[0120] U različitim primerima, predmetno obelodanjivanje rešava ovaj problem obelodanjivanjem genetski napravljenih ne-humanih životinja koje u svom genomu sadrže neuređeni humanog varijabilnog genskog TCR lokusa. Ovde opisana ne-humana životinja je sposobna da generiše T ćelije sa raznolikim repertoarom humanizovanih receptora T ćelija. Prema tome, ovde opisane ne-humane životinje mogu biti izvor raznolikog repertoara humanizovanih receptora T ćelija, npr., humanizovani receptori T ćelija velike avidnosti za upotrebu u usvojenom prenosu T ćelija.
[0121] Prema tome, ovde je obelodanjen postupak generisanja T ćelijskog receptora na humani antigen koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje (npr., glodara, npr., miša ili pacova) antigenom od interesa, omogućavajući životinji da postavi imuni odgovor, izolujući od životinje aktiviranu T ćeliju sa specifičnošću za antigen od interesa i određujući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora eksprimiranu T ćelijom specifičnom za antigen.
[0122] Ovde je obelodanjen postupak za proizvodnju humanih T ćelijskih receptora specifičnih za antigen od
1
interesa (npr., antigen povezan sa bolešću), koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje, antigenom od interesa; omogućavanje životinji da uspostavi imuni odgovor; izolovanje od životinje T ćelije reaktivne na antigen od interesa; određivanje sekvence nukleinske kiseline humanog TCR varijabilnog regiona ekspresovanog T ćelijom; kloniranje humanog TCR varijabilnog regiona u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona humanog TCR tako da je humani TCR varijabilni region operativno povezan sa humanim TCR konstantnim regionom; i ekspresujući iz konstrukcije receptor humane T ćelije specifičan za antigen od interesa. Koraci izolovanja T ćelije, određivanje sekvence nukleinske kiseline humanog TCR varijabilnog regiona ekspresovanog T ćelijom, kloniranje varijabilnog regiona humanog TCR u nukleotidni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline konstantnog regiona TCR čoveka i ekspresija receptor za humane T ćelije može se izvesti korišćenjem standardnih tehnika poznatih stručnjacima.
[0123] U jednom primeru, nukleotidna sekvenca koja kodira receptor T ćelije specifičan za antigen od interesa eksprimira se u ćeliji. U jednom primeru, ćelija koja eksprimira TCR odabrana je između ćelije CHO, COS, 293, HeLa, PERC.6™, itd.
[0124] Antigen od interesa može biti bilo koji antigen za koji je poznato da izaziva ili je povezan sa bolešću ili stanjem, npr., antigen povezan sa tumorom; antigen virusnog, bakterijskog ili drugog patogenog porekla; itd. Mnogi antigeni povezani sa tumorom poznati su u struci. Izbor antigena povezanih sa tumorom predstavljen je u Baza podataka o peptidima za imunitet protiv raka (Časopis Instituta za istraživanje raka) (archive.cancerimmuniti.org/peptidedatabase/Tcellepitopes.htm). U nekim primerima, antigen od interesa je humani antigen, npr., antigen povezan sa humanim tumorom. U nekim primerima, antigen je unutarćelijski antigen specifičan za ćelijski tip, a T ćelijski receptor koristi se za ubijanje ćelije koja eksprimira antigen.
[0125] Ovde je obelodanjen postupak identifikovanja T ćelije sa specifičnošću protiv antigena od interesa, npr., antigena povezanog sa tumorom, koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje antigenom od interesa, omogućavajući životinji da uspostavi imuni odgovor, i izolujući od ne-humane životinje T ćeliju sa specifičnošću za antigen.
[0126] Ovde su obelodanjeni novi postupci za usvojenu terapiju T ćelijama. Prema tome, ovde obelodanjen postupak za lečenje ili poboljšanje bolesti ili stanja (npr., karcinoma) kod ispitanika (npr., ispitanika sisara, npr., ljudskog ispitanika) sastoji se od imunizacije ovde opisane ne-humane životinje antigenom povezanim sa bolešću ili stanjem, omogućavajući životinji da uspostavi imuni odgovor, izolujući od životinje populaciju antigenspecifičnih T ćelija i ubrizgavajući izolovane antigen-specifične T ćelije u ispitanika. Ovde je obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja kod ljudskog ispitanika, koji uključuje imunizaciju ovde opisane ne-humane životinje antigenom od interesa (npr., antigen povezan sa bolešću ili stanjem, npr., antigen povezan sa tumorom), omogućavajući životinji da uspostavi imuni odgovor, izolujući od životinje populaciju antigen-specifičnih T ćelija, određujući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora eksprimiranu antigenom specifičnim T ćelijama, klonirajući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijski receptor u ekspresioni vektor (npr., retrovirusni vektor), uvođenjem vektora u T ćelije izvedene od ispitanik tako da T ćelije eksprimiraju antigen specifični T ćelijski receptor i unošenjem T ćelija u ispitanika. Sekvenca nukleinske kiseline T ćelijskog receptora može se dalje humanizovati pre uvođenja u T ćelije izvedene od ispitanika, npr., sekvenca koja kodira ne-humani konstantni region može biti modifikovana da dalje podseća na humani TCR konstantni region (npr., ne-humani konstantni region može se zameniti humanim konstantnim regionom). U nekim primerima bolest ili stanje je rak. U nekim primerima, populacija T ćelija specifična za antigen se proširuje pre infuzije u ispitanika. U nekim primerima, populacija imunih ćelija ispitanik je imunodeptirana pre infuzije antigen-specifičnih T ćelija. U nekim primerima, TCR specifičan za antigen je TCR visoke avidnosti, npr., TCR visoke avidnosti za antigen povezan sa tumorom. U nekim primerima, T ćelija je citotoksična T ćelija. U drugim primerima, bolest ili stanje uzrokuje virus ili bakterija.
[0127] U drugom primeru, bolest ili stanje može biti autoimuna bolest. TREG ćelije su subpopulacija T ćelija koje održavaju toleranciju na samoantigene i sprečavaju patološku samoreaktivnost. Prema tome, ovde su takođe obelodanjeni postupci za lečenje autoimune bolesti koji se oslanjaju na stvaranje antigen-specifičnih TREG ćelija kod ovde opisane ne-humane životinje prema pronalasku.
[0128] Takođe je ovde obelodanjen postupak lečenja ili poboljšanja bolesti ili stanja (npr., karcinoma) kod ispitanik koji se sastoji od uvođenja ćelija pogođenih bolešću ili stanjem (npr., ćelije karcinoma) od ispitanik u ne-humanu životinju, omogućavajući životinja da uspostavi imuni odgovor na ćelije, izolujući od životinje populaciju T ćelija reaktivnih na ćelije, određujući sekvencu nukleinske kiseline T ćelijskog receptora eksprimiranu T ćelijama, klonirajući sekvencu receptora T ćelije u vektor, uvođenjem vektora u T ćelije izvedene od ispitanika i infuzijom T ćelija koje u sebi sadrže receptor T ćelija.
[0129] Takođe je ovde obelodanjena upotreba ne-humane životinje kako je ovde opisana za pravljenje sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju humane TCR promenljive domene (npr., TCR α i/ili β varijabilnih domena). Obelodanjen je postupak za pravljenje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen,
2
uključujući imunizaciju ne-humane životinje kako je ovde opisano, antigenom od interesa, omogućavajući nehumanoj životinji da uspostavi imuni odgovor na antigen od interesa, i dobijanje odatle sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji vezuje antigen od interesa. U jednom primeru, postupak dalje uključuje stvaranje sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji je operativno povezan sa ne-humanim TCR konstantnim regionom, što uključuje izolaciju T ćelije od ovde opisane ne-humane životinje i dobijanje od nje nukleinske kiseline kiselinska sekvenca koja kodira TCR varijabilni domen povezan sa TCR konstantnim regionom.
[0130] Ovde je takođe obelodanjena upotreba ne-humane životinje, kako je ovde opisana, za izradu humanih terapeutskih sredstava, uključujući imunizaciju ne-humane životinje antigenom od interesa (npr., antigen povezan sa tumorom), omogućavajući ne-humanoj životinji da postavi imunološki odgovor, dobijanje od životinjskih T ćelija reaktivnih na antigen od interesa, dobijanje od T ćelija sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovani TCR protein koji vezuje antigen od interesa i korišćenje sekvenci nukleinske kiseline kodira humanizovani TCR protein u humanom terapijskom preparatu.
[0131] Stoga je takođe obelodanjen postupak za izradu terapije za čoveka, koji uključuje imunizaciju ne-humane životinje kako je ovde opisano, antigenom od interesa, omogućavajući ne-humanoj životinji da uspostavi imuni odgovor, dobijajući od životinjskih T ćelija reaktivnih na antigen od interesa, dobijanje od T ćelija sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju humanizovani receptor T ćelija koje vezuju antigen od interesa, i primenom humanizovanog receptora T ćelija u humanom terapijskom preparatu.
[0132] Humani terapeut može biti T ćelija (npr., humana T ćelija, npr. T ćelija izvedena od humanog ispitanika) koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline od interesa (npr., transfektovana ili transdukovana ili na neki drugi način unesena sa nukleinskom kiselinom od interesa) takav da T ćelija eksprimira humanizovani TCR protein sa afinitetom za antigen od interesa. Ispitanik kod koga je terapijski pogrešno zaposlen možda treba terapiju za određenu bolest ili stanje, a antigen može biti povezan sa bolešću ili stanjem. T ćelija može biti citotoksična T ćelija, antigen može biti antigen povezan sa tumorom, a bolest ili stanje može biti rak. T ćelija može biti izvedena od ispitanika.
[0133] Humani terapeutski preparat može biti T ćelijski receptor. Terapeutski receptor može biti rastvorljivi T ćelijski receptor. Mnogo napora je prošireno da bi se stvorili rastvorljivi T ćelijski receptori ili TCR varijabilni regioni za upotrebu terapijskih sredstava. Stvaranje rastvorljivih T ćelijskih receptora zavisi od dobijanja preuređenih TCR varijabilnih regiona. Jedan od pristupa je dizajniranje jednolančanih TCR koji sadrže TCRα iTCRβ i, slično formatu imunoglobulina scFv, spajaju ih zajedno preko veznika (videti, npr., Međunarodnu patentnu prijavu br. WO 2011/044186). Dobijeni scTv, ako je analogan scFv, obezbedio bi termički stabilan i rastvorljiv oblik proteina koji vezuje TCRα/β. Alternativni pristupi su uključivali dizajniranje rastvorljivog TCR koji ima TCRβ konstantne domene (videti, npr., Chung i dr., (1994) Functional three-domain single-chain T-cell receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91:12654-58); kao i inženjerstvo nativne disulfidne veze u interfejsu između TCR konstantnih domena (pregledano u Boulter and Jakobsen (2005) Stable, soluble, high-affinity, engineered T cell receptors: novel antibody-like proteins for specific targeting of peptide antigens, Clinical and Experimental Immunology 142:454-60; videti takođe, Patent SAD br. 7,569,664). Opisani su i drugi formati rastvorljivih T ćelijskih receptora. Ovde opisane ne-humane životinje mogu se koristiti za određivanje sekvence T-ćelijskog receptora koji se sa velikim afinitetom vezuje za antigen od interesa, i zatim dizajnirati rastvorljivi T-ćelijski receptor na osnovu sekvence.
[0134] Rastvorljivi T ćelijski receptor izveden iz sekvence TCR receptora eksprimiranog od strane ne-humane životinje može se koristiti za blokiranje funkcije proteina od interesa, npr., proteina u vezi sa virusom, bakterijom ili tumorom. Alternativno, rastvorljivi T ćelijski receptor može se spojiti sa delom koji može da ubije inficiranu ćeliju ili ćeliju raka, npr., citotoksični molekuli (npr., hemoterapeutski), toksin, radionuklid, prolek, antitelo, itd., takođe se mogu spojiti sa imunomodulatornim molekulom, npr., citokinom, hemokinom, itd., rastvorljivi T ćelijski receptor takođe može biti spojen sa molekulom inhibitorne imunosti, npr., molekulom koji inhibira T ćeliju da ubije druge ćelije koje sadrže antigen prepoznat od T ćelija. Takvi rastvorljivi T ćelijski receptor fuzionisani sa imunoinhibitornim molekulima mogu se koristiti, na primer, za blokiranje autoimunosti. Pregledani su razni primerni imunološki inhibitorski molekuli koji se mogu spojiti sa rastvorljivim T ćelijskim receptorima Ravetch and Lanier (2000) Immune Inhibitory Receptors, Science 290:84-89.
[0135] Predmetni pronalazak takođe obelodanjuje postupke za proučavanje imunološkog odgovora u kontekstu humanog TCR, uključujući preuređivanje TCR čoveka, razvoj T ćelija, aktivaciju T ćelija, imunološku toleranciju itd.
[0136] Takođe su obelodanjeni postupci ispitivanja kandidata za vakcinu. Ovde je obelodanjen postupak određivanja da li će vakcina aktivirati imunološki odgovor (npr., proliferacija T ćelija, oslobađanje citokina, itd.) I dovesti do stvaranja efektora, kao i memorijskih T ćelija (npr., centralne i efektorske memorije T ćelije).
PRIMERI
[0137] Pronalazak će biti dalje ilustrovan sledećim neograničavajućim primerima. Ovi primeri su postavljeni da pomognu u razumevanju pronalaska, ali nisu namenjeni i ne bi trebalo tumačiti da ograničavaju njegov obim na bilo koji način. Primeri ne uključuju detaljne opise konvencionalnih postupaka koji bi bili dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti (tehnike molekularnog kloniranja, itd.). Ako nije drugačije naznačeno, delovi su maseni delovi, molekulska masa je prosečna molekulska masa, temperatura je naznačena u Celzijusu, a pritisak je na ili blizu atmosferskog.
Primer 1. Generacija miševa sa humanizovanim TCR varijabilnim genskim lokusima
[0138] Miševi koji sadrže deleciju endogenih TCR (α ili β) varijabilnih lokusa i zamenu endogenih segmenata V i J ili V, D i J su napravljeni korišćenjem tehnologije genetskog inženjeringa VELOCIGENE® (videti, npr., US Pat. No. 6,586,251 i Valenzuela, D.M., i dr. (2003) Inženjering velike propusnosti para genoma miša sa analizom ekspresije visoke rezolucije. Nat. Biotech. 21(6): 652-659), pri čemu se humane sekvence izvedene iz BAC biblioteka koje koriste bakterijsku homolognu rekombinaciju koriste za stvaranje vektora ciljanja (LTVEC) koji sadrže genomske fragmente humanih TCR varijabilnih lokusa flankiranih ciljanjem krakova da ciljaju LTVEC endogene mišje TCR varijabilne lokuse u mišu ES ćelije. LTVEC se ponovo linearizuju i elektroporiraju u mišju ES ćelijsku liniju prema Valenzuela i dr. ES ćelije su odabrane za rezistenciju na higromicin ili neomicin i pregledane zbog gubitka alela miša ili dobitka od alela čoveka.
[0139] Ciljani ES-ćelijski klonovi se uvode u 8-ćelijski embrion miša u stadijumu (ili ranije) postupkom VELOCIMOUSE® (Poueymirou, W.T. i dr. (2007). Miševi generacije F0 u potpunosti izvedeni iz embrionalnih matičnih ćelija ciljanih na gene, omogućavajući neposredne fenotipske analize. Nat. Biotech. 25: 91-99.). VELOCIMICE® (F0 miševi u potpunosti izvedeni iz donatorske ES ćelije) koji nose humanizovane TCR lokuse identifikuju se skriningom na gubitak endogenog TCR varijabilnog alela i dobitak humanog alela korišćenjem modifikacije testa alela (Valenzuela i dr.). Mladunci F0 su genotipizovani i uzgajani do homozigotnosti. Miševi homozigotni za humanizovane TCRα i/ili TCRβ varijabilne lokuse (npr., koji sadrže podskup humanih TCRα i/ili TCRβ varijabilnih segmenata) su napravljeni i fenotipizovani kako je ovde opisano.
[0140] Svi miševi su smešteni i uzgajani u specifičnom pogonu bez patogena u Regeneron Pharmaceuticals. Sve eksperimente na životinjama odobrili su IACUC i Regeneron Pharmaceuticals.
Primer 2: Progresivna humanizacija varijabilnog TCRα lokusa
[0141] 1,5 megabaze DNK na lokusu miša TCRα koji odgovara segmentima miša od 110 V i 60 J zamenjen je sa 1 megabazom DNK koji odgovara segmentima 54 V i 61 J humanog TCRα, koristeći strategiju progresivne humanizacije rezimiranu na Sl.2 i 3. Spojne sekvence nukleinskih kiselina različitih ciljnih vektora koji se koriste za strategiju progresivne humanizacije TCRα lokusa sumirani su u Tabeli 2 i uključeni u Popis sekvenci.
Tabela 2: Spojne sekvence nukleinske kiseline za različite vektore ciljanja TCRα lokusa
[0142] Konkretno, kao što je prikazano na Sl. 4A, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-6A14 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljni vektor (MAID 1539) da bi zamenila TCRAJ1-TCRAJ28 region endogenog mišjeg TCRα lokusa sa Ub-higromicin kasetom praćenom IoxP sajt. DNK iz mišjeg BAC klona RP23-117i19 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor (MAID 1535) da zameni ∼15kb region koji okružuje (i uključuje) TCRAV1 endogenog mišjeg TCRα i δ lokusa sa PGK-neomicinom kaseta praćena IoxP stranicom. ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRα lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAKMAN ™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane CRE rekombinazom, posredujući na taj način posredstvom delecije regiona između dva loxP mesta (tj., regiona koji se sastoji od endogenog mišjeg TCRα lokusa od TCRAV1 do TCRAJ1) i ostavljajući iza sebe samo jedno mesto IoxP, kasetu neomicina i konstantog regiona i pojačivača miša. Ova strategija je rezultirala stvaranjem izbrisanog miša TCR α/δ lokusa (MAID 1540).
[0143] Prvi humani ciljni vektor za TCRα imao je 191.660 bp humane DNK iz CTD2216p1 i CTD2285m07 BAC klonova (Invitrogen) koji su sadržali prva dva uzastopna segmenta humanog TCRαV gena (TRAV40 & 41) i 61 TCRαJ (50 funkcionalnih) segmenata gena. Ovaj BAC je modifikovan homolognom rekombinacijom tako da sadrži Not1 mesto 403 bp nizvodno (3') od segmenta gena TCRαJ1 za ligaciju 3' ruke homologije miša i 5' AsiSI mesto za ligaciju 5' ruke mišije homologije. Za podvezivanje na ovaj fragment čoveka korišćena su dva različita homološka kraka: 3' homološki krak sadržao je endogene mišje TCRα sekvence iz RP23-6A14 BAC klona i 5' homološka ruka sadržala je endogenu TCRα sekvencu 5 'mišjeg TCRαV iz mišjeg BAC klona RP23-117i19. Ovaj himerni BAC miša i čoveka korišćen je kao ciljni vektor (MAID 1626) za inicijalno umetanje segmenata humanog TCRα gena plus uzvodno Ixp-ub-higromicin-Ioxp kaseta na miševima TCRα (Sl.4B). Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 1-3) za ciljni vektor MAID 1626 opisani su u Tabeli 2.
[0144] Posle toga je napravljena serija vektora za ciljanje ljudi koji su koristili istu mišju 5' ruku koja je sadržala endogenu TCRα sekvencu 5' mišjeg TCRαV od BAC klona miša RP23-117i19 sa naizmeničnim IoxP-neomicin-IoxP i IoxP-higromicin-IoxP (ili frt-higromicin-frt za MAID 1979) kasete za izbor.
[0145] Da bi se generisao humani TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 8 humanih TCRαV (7 funkcionalnih) i 61 humani TCRαJ (50 funkcionalnih) segmenata gena, DNK iz humanog BAC klona RP11-349p11 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1767) (Sl. 4C). Ovim je dodato 104.846 bp humane DNK koja sadrži sledećih 6 (5 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRαV segmenata gena (TRAV35 do TRAV39) i 5' IoxP-ub-neomicin-IoxP kasetu. Rezultirajući TCRα lokus sadržao je 5' Ioxp-ubneomicin-IoxP kasetu plus ukupno 8 humanih TCRαV (7 funkcionalnih) i 61 humanih TCRαJ genskih segmenata koji su operativno povezani sa TCRα konstantnim genima i pojačivačima miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 4 i 5) za ciljni vektor MAID 1767 opisani su u Tabeli 2.
[0146] Da bi se generisao humani TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 23 humana TCRαV (17 funkcionalnih) i 61 humani segment TCRαJ gena, DNK iz mišjeg BAC klona koji sadrži od 5' do 3': jedinstveno I-Ceul nalazište, miš od 30 kb miša TCRA 5' miša TCRA lokusa koji će se koristiti za homolognu rekombinaciju u ES ćelije i kaseta IoxP-Ub-Hyg-IoxP u obrnutoj orijentaciji, modifikovana je homolognom rekombinacijom bakterija da sadrži od 5' do 3': jedinstvena I-Ceul lokacija, miš od 20 kb TCRA mišica 5' od mišijeg TCRA lokusa, frt-pgk-Hyg-frt kaseta i jedinstvena AsiSI lokacija. DNK iz humanog BAC klona RP11-622o20 (Invitrogen), koji sadrži humani TCRαV22-V34, modifikovana je homolognom rekombinacijom tako da sadrži Spec kasetu uz bok jedinstvenih I-Ceul i AsiSI
2
lokacija. Posle toga, Spec kaseta u modifikovanom humanom BAC klonu zamenjena je sekvencom koja se sastoji između I-Ceul i AsiSI mesta u modifikovanom mišjem BAC klonu standardnim restrikcionim tehnikama digestije/ligacije. Dobijeni vektor ciljanja (MAID 1979; Sl. 4D) dodao 136.557 bp ljudske DNK koja je sadržala sledećih 15 (10 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRαJ segmenata gena (TRAV22 do TRAV34) i 5' frt-pgk-Hyg-frt kasetu. Rezultirajući TCRα lokus sadržao je 5' frt-pgk-Hyg-frt kasetu plus ukupno 23 humana TCRαV (17 funkcionalnih) i 61 humani segment TCRαV gena koji su operativno povezani sa konstantnim genima i pojačivačima TCRα miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 6 i 7) za ciljni vektor MAID 1979 opisani su u Tabeli 2.
[0147] Da bi se generisao humani TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 35 humanih TCRαV (28 funkcionalnih) i 61 humani TCRαJ segmenata gena, DNK iz humanog BAC klona CTD2501-k5 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1769) (Sl. 4E). Ovim je dodato 124.118 bp humane DNK koja sadrži sledećih 12 (11 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRαV segmenata gena (TRAV13-2 do TRAV21) i 5' loxp-ub-neomicin-IoxP kasetu. Rezultirajući TCRα lokus sadržao je 5' loxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 35 humanih TCRαV (28 funkcionalnih) i 61 humanih TCRαJ genskih segmenata koji su operativno povezani sa TCRα konstantnim genima i pojačivačima miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 8 i 9) za ciljni vektor MAID 1769 opisani su u Tabeli 2.
[0148] Da bi se generisao humani TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 48 humanih TCRαV (39 funkcionalnih) i 61 humani TCRαJ segmenata gena, DNK iz humanog BAC klona RP11-92F11 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1770) (Sl. 4F). Ovim je dodato 145.505 bp humane DNK koja sadrži sledećih 13 (11 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRαJ segmenata gena (TRAV6 do TRAV8.5) i 5' Ioxp-ub-higromicin-IoxP kasetu. Rezultirajući TCRα lokus sadrži 5' loxp-ub-higromicin-IoxP kasetu plus ukupno 48 humanih TCRαV (39 funkcionalnih) i 61 humanih TCRαJ genskih segmenata koji su operativno povezani sa TCRα konstantnim genima i pojačivačima miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 10 i 11) za ciljni vektor MAID 1770 opisani su u Tabeli 2.
[0149] Da bi se generisao humani TCRα mini-lokus koji sadrži ukupno 54 humanih TCRαV (45 funkcionalnih) i 61 humani TCRαJ segmenata gena, DNK iz humanog BAC klona RP11-780M2 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1771) (Sl. 4G). Ovim je dodato 148.496 bp humane DNK koja sadrži sledećih 6 (6 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRαV segmenata gena (TRAV1-1 do TRAV5) i 5' loxp-ub-neomicin-IoxP kasetu. Rezultirajući TCRα lokus sadrži 5' loxp-ub-neomicin-IoxP kasetu plus ukupno 54 humanih TCRαV (45 funkcionalnih) i 61 humanih TCRαJ genskih segmenata koji su operativno povezani sa TCRα konstantnim genima i pojačivačima miša. Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 12 i 13) za ciljni vektor MAID 1771 opisani su u Tabeli 2.
[0150] U bilo kom od gornjih koraka, selekcione kasete se uklanjaju brisanjem pomoću Cre ili Flp rekombinaze. Pored toga, može se uvesti i humani TCRδ lokus kao što je prikazano na Sl.5.
Primer 3: Progresivna humanizacija varijabilnog TCRβ lokusa
[0151] 0,6 megabaze DNK na lokusu miša TCRβ koji odgovara segmentima miša od 33 V i 14 J zamenjen je sa 0,6 megabazom DNK koji odgovara segmentima 67 V, 2D i 14 J humanog TCRβ, koristeći strategiju progresivne humanizacije rezimiranu na Sl.6 i 7. Spojne sekvence nukleinskih kiselina različitih ciljnih vektora koji se koriste za strategiju progresivne humanizacije TCRβ lokusa sumirani su u Tabeli 3 i uključeni u Popis sekvenci.
Tabela 3: Spojne sekvence nukleinske kiseline za različite vektore ciljanja TCRβ lokusa
[0152] Konkretno, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-153p19 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor (MAID 1544) da zameni 17kb region (uključujući TCRBV30) neposredno uz klaster 3' tripsinogena gena u endogenom mišjem TCRβ lokusa sa PGK-neo kasetom praćenom IoxP stranicom (Sl. 8A). DNK iz mišjeg BAC klona RP23-461h15 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena je kao ciljni vektor (MAID 1542) da zameni 8355 bp region (uključujući TCRBV2 i TCRBV3) nizvodno od 5' klastera tripsinogena u endogenom mišjem TCRβ lokusu. sa Ub-higromicin kasetom praćenom IoxP stranicom. ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAKMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane CRE rekombinazom, posredujući u deleciji regiona između 5' i 3' IoxP mesta (koje se sastoje od endogenog mišjeg TCRβ lokusa od TCRBV2 do TCRBV30) i ostavljajući iza sebe samo jedno IoxP mesto, higromicinsku kasetu i mišji TCRBD, TCRBJ, konstante i pojačivačke sekvence. Jedan miš TCRVβ ostavljen je uzvodno od 5' klastera gena tripsinogena, a jedan miš TCRBβ nizvodno od miša Eβ, kao što je zabeleženo na Sl.8A.
[0153] Prvi humani ciljni vektor za TCRβ imao je 125.781 bp humane DNK iz CTD2559j2 BAC klona (Invitrogen) koji je sadržao prvih 14 uzastopnih humanih TCRβV genskih segmenata (TRBV18-TRBV29-1). Ovaj BAC je modifikovan homolognom rekombinacijom tako da sadrži 5' AsiSI mesto i 3' AscI mesto za ligaciju 5' i 3' mišjih ruku za homologiju. Za podvezivanje na ovaj fragment čoveka korišćena su dva različita homološka kraka: jedan set homoloških krakova sadržao je endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje nizvodne miševe tripsinogene gene iz RP23-153p19 BAC klona, a drugi set je sadržao endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje uzvodne mišje tripsinogene gene iz mišjeg BAC klona RP23-461h15. Ovaj himerni BAC miša i čoveka korišćen je kao ciljni vektor (MAID 1625) za inicijalno umetanje segmenata humanog TCRβ gena plus frt-ub-neomicin-frt kaseta na lokusu mišjeg TCRβ, i rezultirao je humanim TCRβ mini-lokus koji sadrži 14 humanih (8 funkcionalnih) TCRβV (Sl.8B). Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 14-16) za ciljni vektor MAID 1625 opisani su u Tabeli 3.
[0154] Da bi se segmenti TCRβ D i J miša zamenili humanim TCRβ D i J segmentima, DNK iz mišjeg BAC klona RP23-302p18 (Invitrogen) i humanog BAC klona RP11-701D14 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljanje vektor (MAID 1715) u ES ćelije koje su sadržale TCRβV mini-lokus opisan iznad (tj., MAID 1625). Ova modifikacija je zamenila ∼18540 bp region (od 100 bp nizvodno od poliA gena 3' tripsinogena do 100bp nizvodno od J segmenata u D2 klasteru koji je uključivao miša TCRBD1-J1, mišju konstantu 1 i miša TCRBD2-J2) endogeni mišji TCRβ lokus sa ∼ 25425 bp sekvence koja sadrži humani TCRBD1-J1, IoxP Ub-higromicin-IoxP kasetu, konstantu miša 1, humani TCRBD2-J2 (SL. 8C(i)). ES ćelije koje nose dvostruko ciljani hromozom (tj., jedan endogeni mišji TCRβ lokus ciljani sa oba ciljna vektora) potvrđene su postupcima kariotipizacije i skrininga (npr., TAKMAN™) poznatim u struci. Modifikovane ES ćelije su tretirane sa CRE rekombinazom, posredovanjem pri deleciji kasete higromicina, ostavljajući iza sebe samo jedno IoxP mesto nizvodno od humanih J segmenata u D1J klasteru (Sl. 8C(ii)). Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 17-21) za ciljni vektor MAID 1715 opisani su u Tabeli 3.
2
[0155] Potom je napravljena serija vektora za ciljanje ljudi koji su koristili isti mišji 5' krak koji je sadržao endogenu TCRβ sekvencu koja okružuje uzvodne mišje miševe tripsinogena iz mišjeg BAC klona RP23-461h15 sa naizmeničnom selekcionom kasetom.
[0156] Da bi se generisao humani TCRβ mini-lokus koji sadrži ukupno 40 humanih TCRβV (30 funkcionalnih) i humani TCRβ D i J segmenti, DNK iz humanih BAC klonova RP11-134h14 i RP11-785k24 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i kombinovana u ciljni vektor (MAID 1791) koristeći standardnu bakterijsku homolognu rekombinaciju, restrikcionu digestiju/ligaciju i druge tehnike kloniranja. Uvođenje vektora za ciljanje MAID 1791 rezultiralo je dodavanjem 198.172 bp humane DNK koja je sadržala sledećih 26 (22 funkcionalna) uzastopna segmenta humanih TCRβV gena (TRBV6-5 do TRBV17) i 5' frt-ub-higromicin-frt kasetu. Rezultirajući TCRβ lokus sadržao je 5' frt-ub-higromicin-frt kasetu plus ukupno 40 humanih TCRβV (30 funkcionalnih) i humanih TCRβ D i J segmenata gena koji su operativno povezani sa genima i pojačivačima konstantnih TCRβ miša (Sl.8D). Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 22 i 23) za ciljni vektor MAID 1791 opisani su u Tabeli 3.
[0157] Da bi se generisao humani TCRβ mini-lokus koji sadrži ukupno 66 humanih TCRβV (47 funkcionalnih) i humani TCRβ D i J segment, DNK iz humanog BAC klona RP11-902B7 (Invitrogen) modifikovana je homolognom rekombinacijom i korišćena kao ciljni vektor (MAID 1792). Ovim je dodato 159.742 bp humane DNK koja sadrži sledećih 26 (17 funkcionalnih) uzastopnih humanih TCRβV segmenata gena (TRBV1 do TRBV12-2) i 5' frt-ubneomicin-frt kasetu. Rezultirajući TCRβ lokus sadržao je 5' frt-ub-neomicin-frt kasetu plus ukupno 66 humanih TCRβV (47 funkcionalnih) i humanih TCRβ D i J segmenata gena koji su operativno povezani sa genima i pojačivačima konstantnih TCRβ miša. (Sl.8E). Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 24 i 25) za ciljni vektor MAID 1792 opisani su u Tabeli 3.
[0158] U bilo kom od gornjih koraka, selekcione kasete se uklanjaju brisanjem pomoću Cre ili Flp rekombinaze. Na primer, kao što je prikazano na Sl.7, MAID 1716 odgovara MAID 1715 sa brisanjem higromicinske kasete.
[0159] Konačno, generisan je humani TCRβ mini-lokus koji sadrži ukupno 67 humanih TCRβV (48 funkcionalnih) i humani TCRβ D i J segment. Mišiji TCRBV31 se nalazi ∼ 9,4 kb 3 'TCRBC2 (drugi redosled konstantnog regiona TCRB) i u suprotnoj je orijentaciji od ostalih TCRBV segmenata. Ekvivalentni V segment čoveka je TCRBV30, koji se nalazi u sličnom položaju u humanom lokusu TCRB.
[0160] Da bi se humanizovao TCRBV31, mišji BAC klon koji sadrži miš TCRBV31, modifikovan je homolognom bakterijskom rekombinacijom da bi se LTVEC MAID 6192 (Sl.8F). Čitav kodirajući region, počevši od početnog kodona u egzonu 1, intron, 3' UTR i sekvence signalnih rekombinacija (RSS) TCRBV31 zamenjeni su homolognim humanim TCRBV30 sekvencama. UTR 5' je zadržan kao sekvenca miša. Za selekciju, u intron je ubačena kaseta sa automatskim brisanjem (lox2372-Ubiquitin promoter-Hyg-PGKpolyA-Protamin promoter-Cre-SV40polyA-Iox2372) (72 bp 3' egzona 1,289 bp 5' egzona 2). Radi jednostavnosti, Sl. 7 i 8 prikazuju selekcionu kasetu 3' hTCRBV30, dok je projektovana da se nalazi u intronu između egzona 1 i egzona 2 gena hTCRBV30. Ekspresija promotora protamina koji pokreće Cre transkribuje se isključivo u postmitotične spermatide, tako da se kaseta „samoizbriše“ u F1 generaciji miševa.
[0161] Sekcije spojnih nukleinskih kiselina (SEQ ID NO: 26 i 27) za ciljni vektor MAID 6192 opisani su u Tabeli 3. DNK MAID 6192 se elektroporuje u MAID1792 ES ćelije. ES ćelijski klonovi su odabrani za rezistenciju na higromicin i pregledani za gubitak alela miša TCRB31 i dobitak humanog alela TCRB30.
[0162] Slična inženjerska strategija koristi se za opciono brisanje preostalog 5' miša TCRβ V segmenta.
Primer 4: Generisanje TCRα/TCRβ miševa
[0163] U svakom koraku progresivne humanizacije TCRα i TCRβ lokusa, miševi homozigotni za humanizovani TCRα varijabilni lokus mogu se uzgajati sa miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ varijabilni lokus da bi se formiralo potomstvo koje sadrži humanizovani TCRα i TCRβ varijabilni lokus. Potomci su uzgajani do homozigotnosti u odnosu na humanizovani TCRα i humanizovani TCRβ lokusi.
[0164] U jednom otelotvorenju, miševi homozigotni za humanizovani TCRα varijabilni lokus koji sadrži 8 humanih Vα i 61 humanih Jα (MAID 1767; "1767 HO") su uzgajani sa miševima homozigotnim za humanizovani TCRβ varijabilni lokus koji sadrži 14 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humanih Jβ (MAID 1716; "1716 HO"). Potomci su uzgajani do homozigotnosti u odnosu na oba humanizovana lokusa.
Primer 5: Proizvodnja T ćelija slezine kod homozigotnih miševa za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0165] Slezine od miševa divljeg tipa (WT); miševi sa izbrisanim lokusom TCRα miša („MAID1540“, videti Sl.3); homozigotni miševi za humani TCRα lokus ("MAID 1767", videti Sl.3); miševi sa izbrisanim TCRβ V segmentima, sa izuzetkom dva preostala miševa V segmenta ("MAID1545", videti Sl.7); homozigotni miševi za humani TCRβ lokus, koji takođe sadrže dva preostala mišja V segmenta ("MAID 1716", videti Sl.7); i homozigotni miševi za oba
2
humana TCRα i TCRβ lokusa, pri čemu TCRβ lokus takođe sadrži dva preostala mišja V segmenta ("MAID 1767 1716") perfundovani su sa Kolagenazom D (Roche Bioscience) i eritrociti su lizirani sa puferom za liziranje ACK, praćeno pranjem u RPMI medijumu.
[0166] Splenociti iz jedne WT, MAID 1540, 1767, 1545, 1716 i 17161767 reprezentativne životinje ispitivani su protočnom citometrijom. Ukratko, ćelijske suspenzije su napravljene primenom standardnih postupaka.1x10<6>ćelije su inkubirane sa anti-mišjim CD16/CD32 (2.4G2, BD) na ledu tokom 10 minuta, obojene odgovarajućim koktelom antitela tokom 30 minuta na ledu. Nakon bojenja, ćelije su isprane i zatim fiksirane u 2% formaldehidu. Prikupljanje podataka izvršeno je na protočnom citometru LSRII/Cantoll/LSRFortessa i analizirano sa FlowJo.
[0167] Za bojenje splenocita korišćen je FITC-CD3 (17A2, BD) protiv miša. Kao što je prikazano na SL.9, miševi sa humanim TCR segmentima uspeli su da proizvedu značajan broj CD3+ T ćelija, dok miševi sa TCRα delecijom lokusa miša nisu. Miševi sa delecijom TCRβ lokusa takođe su proizveli CD3+ T ćelije, verovatno zbog korišćenja preostalog 3' mišjeg V segmenta (videti ispod).
Primer 6: Razvoj timusnih ćelija kod homozigotnih miševa za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0168] Da bi se utvrdilo da li su homozigotni miševi za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus pokazali normalan razvoj T ćelija u timusu, splenociti od četiri svake WT, 1767 HO, 1716 HO i 1716 HO 1767 HO životinje (7-10 nedelja) su korišćeni u protočnoj citometriji za procenu proizvodnje T ćelija u različitim razvojnim fazama, kao i za procenu učestalosti i apsolutnog broja svake od DN, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelija.
[0169] Određivanje tipa ćelija je izvršeno na osnovu prisustva CD4, CD8, CD44 i CD25 površinskih markera, kao što je sumirano u Tabeli 1. Korelacija između označavanja tipa ćelije i ekspresije markera na ćelijskoj površini u timusu je sledeća: dvostruko negativne (DN) ćelije (CD4- CD8-), dvostruko pozitivne (DP) ćelije (CD4+ CD8+), CD4 pojedinačno pozitivne ćelije (CD4+ CD8-), CD8 pojedinačno pozitivne ćelije (CD4- CD8+), dvostruko negativne 1/DN1 ćelije (CD4- CD8-, CD25- CD44+), dvostruko negativne 2/DN2 ćelije (CD4- CD8-, CD25+ CD44+), dvostruko negativne 3/DN3 ćelije (CD4- CD8-, CD25+ CD44-), dvostruko negativne 4/DN4 ćelije (CD4-CD8-, CD25- CD44-).
[0170] Timociti su ispitivani protočnom citometrijom. Ukratko, ćelijske suspenzije su napravljene primenom standardnih postupaka. Protočna citometrija je izvedena kako je opisano u Primeru 5. Korišćena antitela su: antimišiji PE-CD44 (IM7, BioLegend), PeCi7-CD25 (PC61, BioLegend), APC-H7-CD8a (53-6,7, BD) i APC-CD4 (GK1,5, eBioscience).
[0171] Kao što je prikazano na Sl.10 i 11, homozigotni miševi za humanizovane TCRα, TCRβ, i oba TCRα i TCRβ bili su u stanju da proizvedu DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelije, što ukazuje da T ćelije proizvedeni iz humanizovanih lokusa sposobni su za razvoj T ćelija u timusu.
Primer 7: Diferencijacija T ćelija slezine kod homozigotnih miševa za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus
[0172] Da bi se utvrdilo da li su miševi homozigotni za humanizovani TCRα i/ili TCRβ lokus pokazali normalnu diferencijaciju T ćelija na periferiji (npr., slezina), po četiri životinje u starosti WT, 1767 HO, 1716 HO i 1716 HO 1767 HO (7-10 nedelje) korišćeni su u protočnoj citometriji za procenu proizvodnje različitih tipova T ćelija u slezini (CD3+, CD4+, CD8+, T naivni, Tcm i Teff/em), kao i za procenu apsolutnog broja svakog tipa T ćelija u slezini.
[0173] Određivanje tipa ćelija je izvršeno na osnovu prisustva CD19 (marker B ćelije), CD3 (marker T ćelije), CD4, CD8, CD44 i CD62L (L-selektin) površinski markeri ćelija. Korelacija između označavanja tipa ćelije i ekspresije markera na ćelijskoj površini u slezini je sledeća: T ćelije (CD3+), CD4 T ćelije (CD3+ CD4+ CD8-), CD8 T ćelije (CD3+ CD4- CD8+), CD4 efektorske/efektorske memorijske T ćelije (CD3+ CD4+ CD8- CD62L-CD44+), CD4 centralne memorijske T ćelije (CD3+ CD4+ CD8- CD62L+ CD44+), CD4 naivne T ćelije (CD3+ CD4+ CD8-CD62L+ CD44-), CD8 efektorske/efektorske memorijske T ćelije (CD3+ CD4-CD8+ CD62L- CD44+), CD8 centralne memorije T ćelije (CD3+ CD4- CD8+ CD62L+ CD44+ ), CD8 naivne T ćelije (CD3+ CD4- CD8+ CD62L+ CD44-).
[0174] Splenociti su ispitivani protočnom citometrijom. Ukratko, ćelijske suspenzije su napravljene primenom standardnih postupaka. Protočna citometrija je izvedena kako je opisano u Primeru 5. Korišćena antitela su: antimišiji FITC-CD3 (17A2, BD), PE-CD44 (IM7, BioLegend), PerCP-Cy5.5-CD62L (Mel-14, BioLegend), APC-H7-CD8a (53-6.7, BD), APC -CD4 (GK1.5, eBioscience) i V450-CD19 (1D3, BD).
[0175] Kao što je prikazano na Sl.12-14, T ćelije u slezini homozigotnih miševa za humanizovani TCRα, TCRβ i TCRα i TCRβ su bile u stanju da se podvrgnu diferencijaciji T ćelija, a prisutne su i CD4+ i CD8+ T ćelije. Pored toga, memorisane T ćelije su obelodanjene u slezinama testiranih miševa.
Primer 8: Upotreba humanih V segmenata kod humanizovanih TCR miševa
2
[0176] Ekspresija humanih TCRβ V segmenata procenjena je na nivou proteina i RNK primenom protočne citometrije i TAKMAN™ u realnom vremenu PCR, kod miševa homozigotnih za humanizovani TCRβ lokus (1716 HO) i homozigotnih miševa i za humanizovani TCRβ i TCRα lokus (1716 HO 1767 HO).
[0177] Za protočnu citometriju, pripremljene su T ćelije slezine i sprovedena analiza kako je opisano u Primeru 5. Za protočnu citometriju korišćen je komplet repertoara TCRβ (IOTEST® Beta Mark, Beckman Coulter). Komplet sadrži anti-humana antitela specifična za brojne humane TCRBV, npr., HTRBV-18, -19, -20, -25, -27, -28 i -29.
[0178] Rezultati su rezimirani na Sl. 15. Tabele predstavljene na Sl. 15A (prekrivanje CD8 T ćelija) i Sl. 15B (prekrivanje CD4 T ćelija) pokazuju da su T ćelije slezine i kod miševa 1716 HO i 1716 HO 1767 HO koristile izvestan broj humanih TCRβ V segmenata. Miševi divljeg tipa su korišćeni kao negativna kontrola.
[0179] Za PCR u realnom vremenu, ukupna RNK je prečišćena iz slezine i timusa korišćenjem MAGMAX™ -96 za komplet za izolaciju RNK Microarrais (Ambion od Life Technologies) prema specifikacijama proizvođača. Genomska DNK je uklonjena upotrebom MAGMAX™ TURBO™ DNase pufera i TURBO DNase iz iznad navedenog MAGMAX kompleta (Ambion od Life Technologies). mRNK (do 2,5 ug) je obrnuto transkribovana u cDNK koristeći SUPERSCRIPT® VILO™ Master Mix (Invitrogen bi Life Technologies). cDNK je razblažena na 2-5ng/µL, a 10-25ng cDNK je pojačana TAQMAN® Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems od Life Technologies) koristeći ABI 7900HT sistem za detekciju sekvence (Applied Biosystems), koristeći prajmere i Taqman MGB sonde (Applied Biosystems) ili BHQ1/BHQ-Plus sonde (Biosearch Technologies) prikazane u Tabeli 4 prema uputstvima proizvođača. Relativni izraz svakog gena normalizovan je na mišju TCR beta konstantu 1 (TRBC1) kontrolu.
Tabela 4: Prajmeri i sonde koji se koriste za otkrivanje ekspresije RNK TCR V segmenata i konstantnog regiona u humanizovanim TCR miševima pomoću PCR u realnom vremenu (TAQMAN™)
2
[0180] Kao što je prikazano na Sl. 16A-B, homozigotni miševi za humanizovani TCRβ lokus (1716 HO) i homozigotni miševi i za humanizovani TCRβ i TCRα lokus (1716 HO 1767 HO) pokazali su ekspresiju RNK različitih humanih TCRβ segmenata i u timusu i u slezini. Miševi su takođe pokazali ekspresiju RNK na mišjim segmentima TRBV-1 i TRBV-31 (podaci nisu prikazani), ali protočnim citometrijskim postupkom nije otkriven nijedan miš TRBV-1 protein (podaci nisu prikazani).
[0181] Mišji TRBV-31 segment zamenjen je humanim TRBV-30 segmentom kao što je prikazano na Sl. 8F, a miševi se generišu iz MAID 6192 ES ćelija kako je ovde opisano. Slezina i timus nastalih homozigotnih životinja testiraju se na upotrebu ljudskih Vβ segmenata, uključujući TRBV-30, protočnom citometrijom i/ili PCR-om u realnom vremenu, kao što je ovde opisano. mTRBV-1 segment takođe može biti izbrisan.
Primer 9: Razvoj T ćelija u homogenih miševa za 23 humana TCR Vα segmenta
[0182] Homozigotni humanizovani TCRα miševi naznačeni u prethodnim primerima sadržali su 8 humanih Vα segmenata i 61 humani Jα segment (1767 HO, videti Sl.3). Homozigotni humanizovani TCRα miševi koji se sastoje od 23 humana Vα segmenta i 61 humanog Jα segmenta (1979 HO, videti Sl.3) su testirani na njihovu sposobnost da generišu CD3+ T ćelije slezine i pokazuju razvoj T ćelija u timusu.
[0183] Eksperimentalni podaci su dobijeni primenom protočne citometrije koristeći odgovarajuća antitela kako je opisano u prethodnim primerima. Kao što je prikazano na Sl.17, miš homozigotan za 23 humana Vα segmenta i 61 humani Jα segmenta proizveo je značajan broj CD3+ T ćelija slezine, a procenat perifernih CD3+ T ćelija bio je uporediv sa postojanjem divljih životinja (Sl.19).
[0184] Štaviše, timociti u 1979 HO miševima su mogli da se podvrgnu razvoju T ćelija i sadržali su T ćelije u DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP fazama (Sl.18).
Primer 10: Razvoj i diferencijacija T ćelija kod homogenih miševa za kompletan repertoar i segmenta varijabilnog regiona humanog TCRα i TCR β
[0185] Homozigotni miševi za kompletan repertoar segmenata humanog TCRα varijabilnog regiona (tj., 54 humana Vα i 61 humani Jα) i homozigotni za kompletan repertoar segmenata varijabilnog regiona TCRβ čoveka (67 humanih Vβ, 2 humana Dβ i 14 humanih Jβ), "1771 HO 6192 HO" (videti Sl. 3 i 7), testiraju se na njihovu sposobnost da proizvode timocite koji prolaze kroz normalan razvoj T ćelija, proizvode T ćelije koje se podvrgavaju normalnoj diferencijaciji T ćelija na periferiji i koriste kompletan repertoar njihovih humanih Vα i Vβ segmenata.
[0186] Protočna citometrija se sprovodi da bi se utvrdilo prisustvo DN1, DN2, DN3, DN4, DP, CD4 SP i CD8 SP T ćelija u timusu, koristeći antitela CD4, CD8, CD25 i CD44, kao što je iznad opisano u Primerima 5 i 6. Protočna citometrija se takođe sprovodi da bi se odredio broj CD3+ T ćelija na periferiji, kao i da bi se procenila diferencijacija T ćelija na periferiji (npr., prisustvo efektorskih i memorijskih T ćelija na periferiji). Eksperiment se izvodi koristeći antitela CD3, CD19, CD4, CD8, CD44 i CD62L protiv miša, kao što je iznad opisano u Primerima 5 i 7.
[0187] Konačno, protočna citometrija i/ili PCR u realnom vremenu se sprovode kako bi se utvrdilo da li T ćelije kod 1771 HO 6192 HO miševa koriste kompletan repertoar TCRB i TCRA V segmenata. Za ekspresiju proteina primenom protočne citometrije koristi se TCRβ repertoarski komplet (IOTEST® Beta Mark, Beckman Coulter), koji sadrži antitela specifična na hTCRBV (videti Primer 8). Za ekspresiju RNK koristeći PCR u realnom vremenu, cDNK iz slezine ili timusa se pojačavaju upotrebom humanih TCR-V prajmera i Taqman sondi, u skladu sa uputstvima proizvođača i kako je iznad opisano u Primeru 8.
Ekvivalenti
[0188] Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznaće ili će moći da utvrde, koristeći samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente ovde opisanih specifičnih primera pronalaska. Takvi ekvivalenti su predviđeni da budu obuhvaćeni sledećim patentnim zahtevima.
2
1
2
4
4

Claims (17)

Patentni zahtevi
1. Izolovana ćelija glodara koja sadrži:
najmanje jedan neuređeni varijabilni humani T ćelijski region Vα segmenta i najmanje jedan neuređeni varijabilni humani T ćelijski region Jα segmenta koji je operativno povezan sa konstantnom sekvencom TCR gena α na endogenom varijabilnom genskom TCR α lokusu glodara, i/ili
najmanje jedan neuređeni varijabilni humani T ćelijski region Vβ segmenta, najmanje jedan neuređeni varijabilni humani T ćelijski region Dβ segmenta i najmanje jedan neuređeni varijabilni humani T ćelijski region Jβ segmenta operativno povezan sa konstantnom sekvencom TCRβ gena glodara na endogenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu glodara,
pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog regiona humane T ćelije sposobni da se preurede u T ćeliji da bi stvorili gene koji kodiraju varijabilne domene humanih T ćelijskih receptora koji se specifično vezuju za antigen od interesa.
2. Izolovana ćelija glodara prema patentnom zahtevu 1, gde ćelija glodara sadrži deleciju odabranu iz grupe koju čine (a) delecija svih endogenih segmenata Vα gena, (b) delecija svih endogenih segmenata Jα gena i (c) njihova kombinacija i/ili gde ćelija glodara sadrži deleciju odabranu iz grupe koju čine (a) delecija svih endogenih segmenata Vβ gena, (b) delecija svih endogenih segmenata Dβ gena, (c) delecija svih endogenih Jβ segmenti gena i (d) njihova kombinacija.
3. Izolovana ćelija glodara prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2, gde je ćelija embrionalna matična ćelija.
4. Izolovana T ćelija glodara, koja sadrži na endogenom varijabilnom genskom TCRα lokusu preuređenu humanu TCR sekvencu Vα/Jα i/ili na endogenom varijabilnom genskom TCRβ lokusu preuređenu humanu TCR sekvencu Vβ/Dβ/Jβ, pri čemu T ćelija eksprimira T ćelijski receptor koji sadrži humani TCRα varijabilni domen koji je operativno povezan sa TCRα konstantnim regionom glodara i/ili TCRβ varijabilni domen koji je operativno povezan sa TCRβ konstantnim regionom glodara na svojoj ćelijskoj površini.
5. Izolovana T ćelija glodara prema patentnom zahtevu 4, gde je T ćelija CD4+ T ćelija, CD8+ T ćelija, hibridom ili kvadroma izvedena iz CD4+ T ćelije ili hibridom ili kvadrom izvedena iz CD8+ T ćelije.
6. Izolovana ćelija glodara ili T ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde je glodar pacov.
7. Izolovana ćelija glodara ili T ćelija prema bilo kom od patentnih zahteva 1-5, gde je glodar miš.
8. In vitro sistem koji sadrži ćeliju prema bilo kom od patentnih zahteva 1-7.
9. In vitro ćelijski kompleks koji sadrži prvu ćeliju prema bilo kom od patentnih zahteva 4-7 i drugu ćeliju, gde je druga ćelija ćelija koja predstavlja antigen, koja eksprimira humani ili humanizovani molekul MHC.
10. In vitro ćelijski kompleks prema patentnom zahtevu 9, gde je druga ćelija ćelija čoveka ili ćelija glodara.
11. Postupak za izradu genetski modifikovanog glodara, koji sadrži:
modifikovanje endogenog varijabilnog genskog TCR α lokusa tako da sadrži najmanje jedan neuređeni humani varijabilni genski T ćelijski region Vα segmenta i najmanje jedan neuređeni humani varijabilni genski T ćelijski region Jα segmenta operativno povezan sa TCR α konstantnom genskom sekvencom i/ili
modifikovanje endogenog varijabilnog genskog TCRβ lokusa tako da sadrži najmanje jedan neuređeni humani varijabilni T ćelijski region Vβ segmenta, bar jedan neuređeni humani varijabilni T ćelijski region Dβ segmenta i najmanje jedan neuređeni humani varijabilni T ćelijski region Jβ segmenta koji je operativno povezan sa konstantnom genskom TCRβ sekvencom glodara,
pri čemu su neuređeni segmenti varijabilnog humanog T ćelijskog regiona sposobni da se preurede da bi formirali gene koji kodiraju varijabilne humane genske T ćelijske receptore, uključujući domene koji se specifično vezuju za antigen od interesa.
12. Postupak prema patentnom zahtevu 11, gde ćelija glodara sadrži deleciju odabranu iz grupe koju čine (a) delecija svih endogenih segmenata Vα gena, (b) delecija svih endogenih segmenata Jα gena i (c) njihova kombinacija i/ili gde glodar sadrži deleciju odabranu iz grupe koju čine (a) delecija svih endogenih segmenata Vβ gena, (b) delecija svih endogenih segmenata Dβ gena, (c) delecija svih endogenih Jβ segmenti gena i (d) njihova kombinacija.
13. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11-12, gde je glodar pacov.
14. Postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 11-12, gde je glodar miš.
15. Postupak prema patentnom zahtevu 14, gde se modifikacija vrši u jednoj ES ćeliji, a pojedinačna ES ćelija se uvodi u mišji embrion da bi se stvorio miš.
16. Postupak dobijanja sekvence nukleinske kiseline koja kodira humani TCR varijabilni domen koji sadrži:
određivanje sekvence nukleinske kiseline varijabilnog humanog TCR regiona, ekspresovanog izolovanom ćelijom glodara prema bilo kom od patentnih zahteva 4-7.
17. Postupak za proizvodnju T ćelijskih receptora koji sadrži:
dobijanje izolovane ćelije glodara prema bilo kom od patentnih zahteva 4-7,
izolovanje sekvence nukleinske kiseline koja kodira najmanje humani varijabilni TCR domen ekspresovan izolovanom ćelijom glodara,
kloniranje sekvence nukleinske kiseline u nukleotidni konstrukt i ekspresija navedenog T ćelijskog receptora u ćeliji.
4
RS20210210A 2011-10-28 2012-10-26 Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora RS61455B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161552582P 2011-10-28 2011-10-28
US201261621198P 2012-04-06 2012-04-06
US201261700908P 2012-09-14 2012-09-14
EP18176096.8A EP3424947B1 (en) 2011-10-28 2012-10-26 Genetically modified t cell receptor mice

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61455B1 true RS61455B1 (sr) 2021-03-31

Family

ID=47178340

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181207A RS57893B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija
RS20210210A RS61455B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Genetski modifikovani miševi t ćelijskog receptora

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20181207A RS57893B1 (sr) 2011-10-28 2012-10-26 Miševi sa genetski modifikovanim receptorom t ćelija

Country Status (25)

Country Link
US (4) US9113616B2 (sr)
EP (3) EP3795587A1 (sr)
JP (7) JP6254528B2 (sr)
KR (5) KR102321909B1 (sr)
CN (5) CN114891798B (sr)
AU (5) AU2012327204B2 (sr)
BR (1) BR112014009203B1 (sr)
CA (1) CA2853707A1 (sr)
CY (2) CY1120945T1 (sr)
DK (2) DK2771357T3 (sr)
ES (2) ES2858978T3 (sr)
HR (2) HRP20181626T1 (sr)
HU (1) HUE053444T2 (sr)
IL (4) IL305550B2 (sr)
IN (1) IN2014CN03890A (sr)
LT (2) LT3424947T (sr)
MX (2) MX353134B (sr)
PL (2) PL2771357T3 (sr)
PT (2) PT3424947T (sr)
RS (2) RS57893B1 (sr)
RU (1) RU2661106C2 (sr)
SG (2) SG11201401030WA (sr)
SI (2) SI2771357T1 (sr)
SM (2) SMT202100243T1 (sr)
WO (1) WO2013063361A1 (sr)

Families Citing this family (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
LT3424947T (lt) * 2011-10-28 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos t ląstelių receptorių pelės
US20150073043A1 (en) * 2012-01-19 2015-03-12 Institut Pasteur Of Shanghai, Chinese Academy Of Sciences Use of phosphorylation pathway-related factor in regulating function of regulatory t cell
IN2014DN09261A (sr) 2012-04-25 2015-07-10 Regeneron Pharma
GB2508414A (en) * 2012-11-30 2014-06-04 Max Delbrueck Centrum Tumour specific T cell receptors (TCRs)
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
US9546384B2 (en) 2013-12-11 2017-01-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for the targeted modification of a mouse genome
TWI681969B (zh) * 2014-01-23 2020-01-11 美商再生元醫藥公司 針對ｐｄ-１的人類抗體
RS60359B1 (sr) * 2014-06-06 2020-07-31 Regeneron Pharma Postupci i kompozicije za modifikovanje ciljanog lokusa
ES2783424T3 (es) * 2014-06-19 2020-09-17 Regeneron Pharma Animales no humanos que tienen un gen de muerte celular programada 1 humanizado
KR102386101B1 (ko) 2014-06-26 2022-04-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 그 조성물, 및 사용 방법
CA2959428A1 (en) * 2014-09-19 2016-03-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors
ES2731437T3 (es) 2014-11-21 2019-11-15 Regeneron Pharma Métodos y composiciones para la modificación genética dirigida mediante el uso de pares de ARN guías
RU2020122439A (ru) * 2014-11-24 2020-09-24 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Не относящиеся к человеку животные, экспрессирующие гуманизированный комплекс cd3
KR102530821B1 (ko) 2014-12-19 2023-05-10 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 단계 다중 표적화를 통한 표적화된 유전자 변형을 위한 방법 및 조성물
CN113349159B (zh) * 2015-04-06 2022-11-11 瑞泽恩制药公司 非人动物中的人源化t细胞介导的免疫应答
CN107667173A (zh) 2015-05-06 2018-02-06 斯尼普技术有限公司 改变微生物种群和改善微生物群
SG11201803409UA (en) 2015-11-20 2018-05-30 Regeneron Pharma Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
CN109415687A (zh) * 2016-04-07 2019-03-01 蓝鸟生物公司 嵌合抗原受体t细胞组合物
PL3440105T3 (pl) 2016-04-08 2022-08-29 Immunocore Limited Receptory komórek t
HUE061619T2 (hu) * 2016-06-03 2023-07-28 Regeneron Pharma Exogén terminális dezoxinukleotid-transzferázt expresszáló rágcsálók
GB201609811D0 (en) 2016-06-05 2016-07-20 Snipr Technologies Ltd Methods, cells, systems, arrays, RNA and kits
CN110996974A (zh) 2017-06-16 2020-04-10 梅约医学教育与研究基金会 增加免疫应答的材料和方法
BR112020006643A2 (pt) 2017-10-03 2020-09-24 Juno Therapeutics Inc moléculas de ligação específica ao hpv
US10760075B2 (en) 2018-04-30 2020-09-01 Snipr Biome Aps Treating and preventing microbial infections
CA3094468A1 (en) * 2018-04-05 2019-10-10 Juno Therapeutics, Inc. Methods of producing cells expressing a recombinant receptor and related compositions
CN112752838A (zh) * 2018-07-26 2021-05-04 国立大学法人京都大学 制备引入外源抗原受体的细胞的方法
US11851663B2 (en) 2018-10-14 2023-12-26 Snipr Biome Aps Single-vector type I vectors
CA3154287A1 (en) * 2019-09-12 2021-03-18 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
JP7726881B2 (ja) 2019-12-02 2025-08-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ペプチド－ｍｈｃ ｉｉタンパク質構築物およびそれらの使用
AU2021244594A1 (en) * 2020-03-27 2022-12-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. T cell receptors
CN113684258B (zh) 2020-05-18 2024-08-20 上海赛比曼生物科技有限公司 用于检测鼠源tcr转基因拷贝数的试剂盒及方法
AU2022249328A1 (en) 2021-03-31 2023-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice comprising humanized cellular immune system components with improved diversity of tcrβ repertoire
GB202209518D0 (en) 2022-06-29 2022-08-10 Snipr Biome Aps Treating & preventing E coli infections
EP4568989A2 (en) * 2022-08-12 2025-06-18 Ingenious Targeting Laboratories Genetically modified non-human having humanized gamma and delta tcr variable genes
CA3265218A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Immunocore Ltd MAGE A4 SPECIFIC T LYMPHOCYTE RECEPTOR FUSION PROTEINS
IL319406A (en) * 2022-09-22 2025-05-01 Regeneron Pharma Genetically modified mice expressing components of the human cellular immune system
TW202520975A (zh) 2023-08-09 2025-06-01 英商劍橋企業有限公司 基因改造之囓齒動物及囓齒動物細胞以及其等用途
GB2640828A (en) 2024-04-22 2025-11-12 T Therapeutics Ltd Methods and products for the generation and identification of T cells and TCRs
GB2642411A (en) 2024-04-22 2026-01-14 T Therapeutics Ltd T Cell Receptor identification and provision

Family Cites Families (43)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0663952A4 (en) 1992-09-11 1997-06-11 Univ California Transgenic non-human animals having targeted lymphocyte transduction genes.
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
EP0910409A4 (en) 1996-03-05 2003-03-19 Scripps Research Inst RECOMBINANT GENE CONSTRUCTS ENCODING T-CELL RECEPTORS SPECIFIC TO HUMAN-RESTRICTED TUMORANTANTIGENS
US6320306B1 (en) * 1996-08-05 2001-11-20 Samsung Display Devices Co., Ltd. Shadow mask with porous insulating layer and heavy metal layer
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
WO2001027291A1 (en) 1999-10-12 2001-04-19 Institut Pasteur Design of a polyepitopic construct for the induction of hla-a2.1 restricted hiv 1 specific ctl responses using hhd mice
US7462486B2 (en) 2000-05-12 2008-12-09 Oregon Health & Science University Methods of selecting T cell receptor V peptides for therapeutic use
US6596541B2 (en) * 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US7105348B2 (en) 2000-10-31 2006-09-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
US20050050580A1 (en) 2000-12-13 2005-03-03 Masashi Gotoh Transgenic animal expressing hla-a24 and utilization thereof
EP1409646B1 (en) 2000-12-19 2012-06-13 Altor BioScience Corporation Transgenic animals comprising a humanized immune system
FR2827302B1 (fr) 2001-07-13 2003-10-10 Genoway Cellule et animal transgenique modelisant la presentation antigenique humaine et leurs utilisations
AU2002321581C1 (en) 2001-08-31 2008-09-18 Adaptimmune Limited Soluble T cell receptor
US20050177884A1 (en) 2001-11-15 2005-08-11 Kirin Beer Kabushiki Kaisha Chimeric nonhuman animal
DK1321477T3 (da) 2001-12-22 2005-02-14 4Antibody Ag Fremgangsmåde til frembringelsen af genetisk modificerede vertebrate precursor-lymfocytter og anvendelse deraf til fremstillingen af heterologe bindende proteiner
IL162111A0 (en) 2001-12-22 2005-11-20 4Antibody Ag Method for the generation of generically modified vertebrate precursor lymphocytes and use thereof for the production of heterologo
DE10244457A1 (de) 2002-09-24 2004-04-01 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Verfahren zur rationalen Mutagenese von alpha/beta T-Zell Rezeptoren und entsprechend mutierte MDM2-Protein spezifische alpha/beta T-Zell Rezeptoren
AU2003271904B2 (en) 2002-10-09 2009-03-05 Adaptimmune Limited Single chain recombinant T cell receptors
US20060156419A1 (en) * 2002-10-30 2006-07-13 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Mouse model for autoimmune disorders
US7663017B2 (en) 2003-07-30 2010-02-16 Institut Pasteur Transgenic mice having a human major histocompatability complex (MHC) phenotype, experimental uses and applications
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
CA2651174A1 (en) * 2006-05-03 2007-11-15 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services Chimeric t cell receptors and related materials and methods of use
EP1878342A1 (en) 2006-07-13 2008-01-16 Institut Pasteur Immunodeficient mice transgenic for HLA class I and HLA class II molecules and their uses
WO2008051854A2 (en) 2006-10-20 2008-05-02 Trustees Of Boston University A tunable genetic switch for regulating gene expression
JP2008159109A (ja) 2006-12-21 2008-07-10 Matsushita Electric Ind Co Ltd データ転送装置
EP2262898B1 (en) 2008-03-07 2018-01-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Es cell-derived mice from diploid host embryo injection
US20090328240A1 (en) 2008-06-24 2009-12-31 Sing George L Genetically modified mice as predictors of immune response
WO2010107400A1 (en) 2009-03-20 2010-09-23 Agency For Science, Technology And Research Genetically modified animal and method of obtaining the same
BR112012000536A2 (pt) * 2009-07-08 2020-08-11 Kymab Limited métodos para produção de anticorpo ou cadeia leve ou pesada de anticorpo específico para um antígeno desejado, para produção de anticorpo ou cadeia de anticorpo e seu uso, composição farmacêutica e derivado de anticorpo quimérico
RU2425880C2 (ru) 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
GB0917090D0 (en) 2009-09-29 2009-11-11 Ucl Biomedica Plc T-cell receptor
CA2777053A1 (en) 2009-10-06 2011-04-14 The Board Of Trustees Of The University Of Illinois Human single-chain t cell receptors
US8956828B2 (en) 2009-11-10 2015-02-17 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted disruption of T cell receptor genes using engineered zinc finger protein nucleases
KR102203727B1 (ko) 2010-03-31 2021-01-18 아블렉시스, 엘엘씨 키메라 항체의 제조를 위한 비-인간 동물의 유전적 조작
JP6482757B2 (ja) 2010-07-26 2019-03-13 トリアンニ インコーポレイテッドＴｒｉａｎｎｉ，Ｉｎｃ． トランスジェニック動物および使用方法
WO2012039779A1 (en) 2010-09-24 2012-03-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy Humanized transgenic mouse model
CN105950654B (zh) 2010-11-27 2020-03-20 朱坚 一种人源化的转基因动物
LT3424947T (lt) * 2011-10-28 2021-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetiškai modifikuotos t ląstelių receptorių pelės
CN113349159B (zh) 2015-04-06 2022-11-11 瑞泽恩制药公司 非人动物中的人源化t细胞介导的免疫应答
IL318469A (en) 2018-06-14 2025-03-01 Regeneron Pharma Non-human animals capable of reorganizing transgenic DH-DH, and their uses

Also Published As

Publication number Publication date
KR20190037354A (ko) 2019-04-05
US20220386575A1 (en) 2022-12-08
JP2020146045A (ja) 2020-09-17
AU2024204645A1 (en) 2024-08-01
EP3424947B1 (en) 2020-11-25
CY1123831T1 (el) 2022-05-27
BR112014009203A2 (pt) 2020-10-27
NZ623147A (en) 2016-03-31
PT2771357T (pt) 2018-11-09
IL305550A (en) 2023-10-01
CN104011071B (zh) 2017-11-07
EP2771357B1 (en) 2018-07-18
IL305550B1 (en) 2024-10-01
EP3424947A1 (en) 2019-01-09
JP2018007696A (ja) 2018-01-18
HK1198171A1 (en) 2015-03-13
KR101964776B1 (ko) 2019-04-04
CN114891798B (zh) 2025-12-02
AU2012327204B2 (en) 2016-01-21
IL232098A0 (en) 2014-05-28
CN104011071A (zh) 2014-08-27
US12582105B2 (en) 2026-03-24
DK3424947T3 (da) 2021-02-22
KR102397961B1 (ko) 2022-05-13
KR20210133325A (ko) 2021-11-05
SMT202100243T1 (it) 2021-05-07
CN114891798A (zh) 2022-08-12
IN2014CN03890A (sr) 2015-10-16
CY1120945T1 (el) 2019-12-11
JP6254528B2 (ja) 2017-12-27
JP6706311B2 (ja) 2020-06-03
IL305550B2 (en) 2025-02-01
PT3424947T (pt) 2021-03-01
PL3424947T3 (pl) 2021-06-14
ES2858978T3 (es) 2021-09-30
SG11201401030WA (en) 2014-04-28
RU2661106C2 (ru) 2018-07-11
DK2771357T3 (en) 2018-10-29
RS57893B1 (sr) 2019-01-31
JP6532924B2 (ja) 2019-06-19
KR20200102001A (ko) 2020-08-28
JP7656580B2 (ja) 2025-04-03
IL274914B1 (en) 2023-10-01
IL274914B2 (en) 2024-02-01
AU2016202512A1 (en) 2016-05-12
CN107858333A (zh) 2018-03-30
AU2012327204A1 (en) 2013-05-23
KR102148387B1 (ko) 2020-08-26
JP2022093637A (ja) 2022-06-23
AU2021203192A1 (en) 2021-06-10
MX2014004894A (es) 2014-09-12
EP2771357A1 (en) 2014-09-03
AU2021203192B2 (en) 2024-04-11
US9113616B2 (en) 2015-08-25
WO2013063361A1 (en) 2013-05-02
IL315445A (en) 2024-11-01
KR20140077219A (ko) 2014-06-23
HRP20181626T1 (hr) 2018-12-14
PL2771357T3 (pl) 2018-12-31
LT3424947T (lt) 2021-03-10
KR20220066197A (ko) 2022-05-23
CA2853707A1 (en) 2013-05-02
US11528895B2 (en) 2022-12-20
JP2014532413A (ja) 2014-12-08
HUE053444T2 (hu) 2021-06-28
AU2016202512C1 (en) 2018-10-11
MX379517B (es) 2025-03-10
US20210051930A1 (en) 2021-02-25
US20160021856A1 (en) 2016-01-28
CN114891797A (zh) 2022-08-12
IL232098B (en) 2020-06-30
JP2019033770A (ja) 2019-03-07
JP7305840B2 (ja) 2023-07-10
ES2691475T3 (es) 2018-11-27
CN107858332A (zh) 2018-03-30
US20130109053A1 (en) 2013-05-02
CN107858333B (zh) 2022-05-27
RU2014121160A (ru) 2015-12-10
LT2771357T (lt) 2018-10-25
SI3424947T1 (sl) 2021-04-30
SMT201800553T1 (it) 2018-11-09
IL274914A (en) 2020-07-30
MX353134B (es) 2017-12-20
EP3795587A1 (en) 2021-03-24
KR102321909B1 (ko) 2021-11-05
AU2018204700A1 (en) 2018-07-19
SG10201914043XA (en) 2020-03-30
SI2771357T1 (sl) 2018-11-30
AU2018204700C1 (en) 2021-10-14
AU2016202512B2 (en) 2018-03-29
AU2018204700B2 (en) 2021-04-01
KR102542272B1 (ko) 2023-06-13
BR112014009203B1 (pt) 2023-02-28
JP2024019646A (ja) 2024-02-09
HRP20210256T1 (hr) 2021-04-02
JP2023024744A (ja) 2023-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220386575A1 (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK40049273A (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK40002846A (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK40002846B (en) Genetically modified t cell receptor mice
HK1198171B (en) Genetically modified t cell receptor mice