RS61516B1 - Konjugati anti-ptk7 antitelo-lek - Google Patents

Konjugati anti-ptk7 antitelo-lek

Info

Publication number
RS61516B1
RS61516B1 RS20210270A RSP20210270A RS61516B1 RS 61516 B1 RS61516 B1 RS 61516B1 RS 20210270 A RS20210270 A RS 20210270A RS P20210270 A RSP20210270 A RS P20210270A RS 61516 B1 RS61516 B1 RS 61516B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
ptk7
drug
antibodies
seq
Prior art date
Application number
RS20210270A
Other languages
English (en)
Inventor
Marc Isaac Damelin
Puja Sapra
Alexander John Bankovich
Scott J Dylla
Original Assignee
Pfizer
Abbvie Stemcentrx Llc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pfizer, Abbvie Stemcentrx Llc filed Critical Pfizer
Publication of RS61516B1 publication Critical patent/RS61516B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68031—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being an auristatin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6847—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a hormone or a hormone-releasing or -inhibiting factor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6871—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting an enzyme
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na protein tirozin kinaza 7 (PTK7) antitela i konjugate antitelo-lek. Predmetni pronalazak se dalje odnosi na postupke korišüenja takvih antitela i konjugata antitelo-lek za leþenje karcinoma.
STANJE TEHNIKE
[0002] Protein tirozin kinaze 7(PTK7), takoÿe poznat kao karcinom debelog creva kinaza 4 (CCK4), je receptorska tirozin kinaza prvobitno klonirana iz normalnih humanih melanocita i odvojeno od tkiva karcinoma debelog creva. Visok nivo PTK7 identifikovan je u brojnim üelijama tumora, ukljuþujuüi rak bešike, dojke, debelog creva, bubrega, i rak pluüa i melanoma.
Ekspresija PTK7 je takoÿe primeüena na üelijama odrasle mijeloidne leukemije (AML) i akutne limfoblastne leukemije (ALL).
[0003] Leþenje karcinoma poboljšalo se tokom poslednje decenije hirurgijom, terapijom zraþenjem i hemoterapijom kao primarnim opcijama leþenja. Takva leþenja mogu produžiti preživljavanje i / ili ublažiti simptome kod mnogih pacijenata, ali verovatno neüe proizvesti lek za mnoge pacijente. Shodno tome, ostaje znaþajna potreba za dodatnim terapijskim opcijama za kancere.
[0004] U tu svrhu, predmetni pronalazak obezbeÿuje nove konjugate antitelo-lek koji ciljaju PTK7-pozitivne karcinome. Otkriveni konjugati anti-PTK7 antitelo-lek mogu da izvrše kliniþki koristan citotoksiþni efekat na PTK7 koji ekspresuje tumorske üelije bez vršenja neželjenih efekata na üelije koje ne ekspresuju PTK7.
[0005] US 2013/0129753 A1 odnosi se na citotoksiþne peptide i njihove konjugate lekova antitela. US 2013/0122020 A1 se odnosi na antitela specifiþna za antigen-2 üelijske površine trofoblasta i njihovu upotrebu.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0006] Na osnovu ovde opisanog pronalaska, predmetni pronalazak pruža predmet definisan u priloženim zahtevima.
[0007] Predmetni pronalazak obezbeÿuje konjugate PTK7 antitelo-lek i njihovu upotrebu u otkrivanju, profilaksi i terapiji poremeüaja povezanih sa PTK7. Konjugat PTK7 antitelo-lek pronalaska je generalno formule: Ab- (L-D), gde je Ab antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se vezuje za PTK7 ili njegov fragment koji se vezuje za PTK7; i L-D je veza linklek, gde je L veza, a D je lek.
[0008] Ab otkrivenog konjugata antitelo-lek može biti bilo koje antitelo koje se vezuje za PTK7. U nekim aspektima pronalaska, Ab je himerno, CDR kalemljeno, humanizovano ili rekombinantno humano antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za PTK7. U nekim aspektima pronalaska, Ab je internalizujuüe antitelo i / ili neutrališuüe antitelo.
[0009] Predmetni pronalazak takoÿe obezbeÿuje konjugate PTK7 antitelo-lek i njihovu upotrebu u otkrivanju, profilaksi i terapiji poremeüaja povezanih sa PTK7. Konjugat PTK7 antitelo-lek pronalaska je generalno formule: Ab- (L-D), gde je Ab antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se vezuje za PTK7 ili njegov fragment koji se vezuje za PTK7; i L-D je vezni deolek, gde je L vezni i D je auristatin.
[0010] U odreÿenim aspektima pronalaska, Ab je antitelo hu23, hu24 ili hu58, ili antitelo koje se takmiþi za vezivanje za humani PTK7 sa hu23, hu24 ili hu58, i / ili antitelo koje se vezuje za isti epitop kao hu23, hu24 ili hu58 antitelo. Na primer, Ab se može takmiþiti za vezivanje za humani PTK7 sa i / ili za isti epitop kao antitelo koje sadrži (a) varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 15; (b) varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 39; ili (c) varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 63.
[0011] Meÿu Abs, koji se takmiþe za vezivanje za humani PTK7 sa hu23 i / ili vezuju se za isti epitop kao hu23, reprezentativni Abs korisni za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek iz ovog pronalaska ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan promenljivi region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan promenljivi region teškog lanca sadrži tri CDRs definisana sa SEQ ID NOs: 3, 7, i 11. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan promenljivi region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs definisana kao SEQ ID NOs: 17, 19, i 21. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja imaju (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NOs: 3, 7, i 11; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NOs: 17, 19, i 21.
[0012] U drugim konjugatima PTK7 antitelo-lek pronalaska, Ab sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 1 i varijablu lakog lanca koja ima amino kiselinsku sekvencu koja je na najmanje 90% identiþno sa SEQ ID NO: 15, na primer, varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca prikazana kao SEQ ID NO: 15.
[0013] Meÿu Abs, koji se takmiþe za vezivanje za humani PTK7 sa hu24 i / ili vezuju se za isti epitop kao hu24, reprezentativni Abs korisni za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek pronalaska ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca sadrži tri CDRs definisana SEQ ID NO: 27, 31 i 35. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilnii region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs definisana kao SEQ ID NO: 41, 43 i 45. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja sadrže (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NO: 27 , 31 i 35; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NOs: 41, 43, i 45.
[0014] U drugim konjugatima PTK7 antitelo-lek pronalaska, Ab sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 25 i varijablu lakog lanca koja ima amino kiselinsku sekvencu koja je na najmanje 90% identiþno SEQ ID NO: 39, na primer, varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 39.
[0015] Meÿu Abs, koji se takmiþe za vezivanje za humani PTK7 sa hu58 i / ili vezuju se za isti epitop kao hu58, reprezentativni Abs korisni za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek pronalaska ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca sadrži tri CDRs definisana SEQ ID NO: 51, 55 i 59. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja sadrže najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca sadrži tri CDRs definisana kao SEQ ID NO: 65, 67 i 69. Dodatni Abs ukljuþuju antitela koja sadrže (a) varijabilni region teškog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NO: 51, 55 i 59; i (b) varijabilni region lakog lanca koji sadrži tri CDRs prikazana kao SEQ ID NOs: 65, 67, i 69.
[0016] U drugim konjugatima PTK7 antitelo-lek pronalaska, Ab sadrži varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 49 i varijablu lakog lanca koja ima amino kiselinsku sekvencu koja je na najmanje 90% identiþno SEQ ID NO: 63, na primer, varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 63.
[0017] U nekim aspektima pronalaska, PTK7 konjugati antitela i leka sadrže Ab koji sadrži konstantni region teškog lanca IgG1, konstantni region kapa lakog lanca ili konstantni region teškog lanca IgG1 i konstantni region kapa lakog lanca. Na primer, Abs koristan za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek pronalaska ukljuþuje antitela koja se sastoje od teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 13, lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 23 ili teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 23. Dodatni primeri ukljuþuju antitela koja sadrže teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 37, laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 47 ili teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 47. Još dalji primeri ukljuþuju antitela koja sadrže teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 61, laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 71 , ili teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 71.
[0018] U drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek pronalaska sadrži antitelo koje ima varijabilni region teškog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 1, 25 ili 49. U ostalim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek pronalaska sadrži antitelo koje ima varijabilni region lakog lanca prikazan kao SEQ ID NO: 15, 39, ili 63.
[0019] U odreÿenim aspektima pronalaska, Ab je antitelo hu23, hu24 ili hu58, ili antitelo koje se takmiþi za vezivanje za humani PTK7 antitelom hu23, hu24 ili hu58 i / ili antitelom koje se vezuje za isti epitop kao hu23, hu24 ili antitelo hu58. Na primer, Ab se može takmiþiti za vezivanje za humani PTK7 sa i / ili za isti epitop kao antitelo koje sadrži (a) varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 13 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 23; (b) varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 39; ili (c) varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO:63.
[0020] U drugom aspektu pronalaska, Ab je humanizovano monoklonsko antitelo kao što je hu23, hu24 ili hu58 antitelo.
[0021] Bilo koji od ovde opisanih konjugata PTK7 antitelo-lek može se pripremiti sa veznikom koji se može cepati ili necepati. U jednom aspektu cepivi veznik može biti maleimidokaproilvalin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc). U drugom aspektu cepivi veznik može biti 4 (4’acetilfenoksi) butanska kiselina (AcBut). U drugom aspektu, nepovezivi veznik može biti maleimidokaproil (mc).
[0022] Bilo koji od ovde opisanih konjugata PTK7 antitelo lek se može pripremiti sa lekom koji je auristatin. U jednom aspektu, auristatin može biti 0101 (2-metilalanil-N - [(3R, 4S, 5S) -3-metoksi-1 - {(2S) -2 - [(1R, 2R) -1-metoksi-2 -metil-3-okso-3 - {[(1S) -2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il) etil] amino} propil] pirolidin-1-il} -5-metil-1 -oksoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamid). U drugom aspektu, auristatin može biti 82612-metilalanil-N - [(3R, 4S, 5S) -1 - {(2S) -2 - [(1R, 2R) -3 -{[(1S) -1- karboksi-2-feniletil] amino} -1-metoksi-2-metil-3-oksopropil] pirolidin-1-il} -3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il] -N-metil-L -valinamid.
[0023] Bilo koji od ovde opisanih konjugata PTK7 antitelo lek se može pripremiti sa lekom koji je kaliheamicin, ukljuþujuüi N acetil derivate kaliheamicina kao što su N-acetil-Ȗ-kaliheamicin i N-acetil-Ȗ-kaliheamicin dimetil hidrazid (CM).
[0024] Bilo koje od ovde otkrivenih PTK7 antitela se može koristiti u konjugatu antitelo-lek konjugacijom sa ostatkom veznik-lek (LD). U jednom aspektu, LD može biti vc0101 (N- [6- (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il) heksanoil] -L-valil-N- {4 - [(21S, 24S, 25R) -24 - [(2S) -butan-2-il] -25- (2 - {(2S) -2 - [(1R, 2R) -1-metoksi-2-metil-3-okso- 3 - {[(1S) -2-fenil-1- (1,3-tiazol-2-il) etil] amino} propil] pirolidin-1-il} -2-oksoetil) -18,18,23-trimetil -3,16,19,22-tetraokso-21- (propan-2-il) -2,7,10,13,26-pentaoksa-4,17,20,23-tetraazaheptakos-1-il] fenil} - N~5~-karbamoil-L-ornitinamid). U drugom aspektu, LD može biti mc8261 (N- [6- (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il) heksanoil] -2-metilalanil-N - [(3R, 4S , 5S) -1 - {(2S) -2 - [(1R, 2R) -3 - {[(1S) -1-karboksi-2-feniletil] amino} -1-metoksi-2-metil-3-oksopropil) ] pirolidin-1-il} -3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il] -N-metil-L-valinamid). U još jednom aspektu, L-D može biti AcButCM (4 (4’acetilfenoksi) butanska kiselina N-acetil-g-kaliheamicin dimetil hidrazid). Bilo koji od ovde opisanih konjugata PTK7 antitelo-lek može imati odnos leka i antitela (DAR) od 1 do 8.
[0025] U odreÿenom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 23; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde je L veznik, a D lek, gde veznik je maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0026] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 47; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0027] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 71; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde venik je maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0028] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 23; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je maleimidokaproil (mc), i gde lek je 8261.
[0029] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 47; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je maleimidokaproil (mc), i gde lek je 8261.
[0030] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 71; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je maleimidokaproil (mc), i gde lek je 8261.
[0031] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 23; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je AcBut (4 (4’acetilfenoksi) butanska kiselina) i gde lek je CM (N-acetil-Ȗ-caliheamicin dimetil hidrazid).
[0032] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 47; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde veznik je AcBut (4 (4’acetilfenoksi) butanska kiselina) i gde lek je CM (N-acetil-Ȗ-caliheamicin dimetil hidrazid).
[0033] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (LD) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, Ab, koji sadrži teški lanac prikazan kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac prikazan kao SEQ ID NO: 71; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, gde beznik je AcBut (4 (4’acetilfenoksi) butanska kiselina) i gde lek je CM (N-acetil-Ȗ-caliheamicin dimetil hidrazid).
[0034] Ovaj pronalazak obezbeÿuje kompozicije koje sadrže mnoštvo ovde otkrivenih konjugata antitelo-lek i opciono farmaceutski nosaþ, pri þemu kompozicija ima proseþni DAR u rasponu od 1 do 8. U odreÿenom aspektu pronalaska, kompozicija može imati proseþni DAR u opsegu od 3 do 5. U drugom aspektu pronalaska, kompozicija može imati proseþni DAR u opsegu od 3 do 4. U drugom aspektu pronalaska, kompozicija može imati proseþni DAR od oko 4.
[0035] Ovaj pronalazak dalje obezbeÿuje kompoziciju koja sadrži mnoštvo ovde otkrivenog konjugata antitelo-lek i opciono farmaceutski nosaþ, pri þemu kompozicija ima najmanje 50% konjugata antitelo-lek koji imaju DAR od 3 do 5. U drugom aspektu pronalaska, kompozicija ima najmanje 60% konjugata antitelo-lek koji imaju DAR od 3 do 5.
[0036] Predmetni pronalazak dalje obezbeÿuje konjugat PTK7 antitelo-lek koji je generalno formule: Ab- (L-D), gde Ab je antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i koji se vezuje za PTK7 ili njegov fragment koji se vezuje za PTK7; i L-D je ostatak veznik-leka, gde L je vc ili mc ili AcBut, a D je lek.
[0037] Predmetni pronalazak dalje obezbeÿuje konjugat PTK7 antitelo-lek koji je generalno formule: Ab- (L-D), gde Ab je antitelo, ili njegov fragment koji se vezuje za antigen i koji se vezuje za PTK7, ili njegov fragment koji se vezuje za PTK7; i L-D je ostatak veznik-lek, gde L je veznik, a D je auristatin (kao što je 0101 ili 8261) ili CM.
[0038] Predmetni pronalazak dalje obezbeÿuje postupke za pripremu konjugata PTK7 antitelolek koji su ovde otkriveni. Na primer, postupak za proizvodnju konjugata antitelo-lek može da ukljuþuje korake (a) povezivanja veznika sa lekom; (b) konjugacija ostatka veznik-leka sa antitelom; i (c) preþišüavanje konjugata antitelo-lek.
[0039] Sledeüi aspekt pronalaska ukljuþuje postupke pravljenja, postupke pripreme, postupke sinteze, postupke konjugacije i postupke preþišüavanja ovde predstavljenih konjugata antitelolek i meÿuproizvode za pripremu, sintezu i konjugaciju konjugata antitelo-lek koji su ovde otkriveni.
[0040] Dalje su obezbeÿene farmaceutske kompozicije koje sadrže ovde otkriveni konjugat PTK7 antitelo-lek i farmaceutski prihvatljiv nosaþ.
[0041] U drugim aspektima su obezbeÿeni postupci za leþenje poremeüaja povezanih sa PTK7 davanjem terapeutski efikasne koliþine kompozicije koja sadrži konjugat PTK7 antitelo-lek ovde otkriveni. Reprezentativni poremeüaji povezani sa PTK7 ukljuþuju hiperproliferativne poremeüaje, poput neoplastiþnih poremeüaja, kao što su þvrsti tumori (npr., rak dojke, kao što je trostruko negativni rak dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteronski receptor (PR ), pozitivni estrogenreceptorski rak dojke (ER ) i dvostruko pozitivan rak dojke; rak jajnika; rak debelog creva; rak jednjaka; rak želuca; melanom; sarkom; rak bubrega; rak pankreasa; rak prostate; rak jetre, kao što je hepatocelularni karcinom (HCC); i rak pluüa, kao što je ne -mali üelijski rak pluüa (NSCLC) i rak malih üelija pluüa (SCLC) itd.) i hematološki maligni (npr. leukemija, kao što je mieloiþna leukemija odraslih (AML) ili akutna limfoblastna leukemija (ALL), itd.). Takoÿe su date upotrebe otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek za proizvodnju leka za leþenje poremeüaja povezanog sa PTK7 kod subjekta. Takoÿe su obezbeÿeni konjugati PTK7 antitelo-lek za upotrebu u leþenju poremeüaja povezanog sa PTK7.
[0042] U drugim aspektima, predmetni pronalazak obezbeÿuje postupke leþenja poremeüaja povezanog sa PTK7 kod subjekta davanjem terapeutski efikasne koliþine kompozicije koja sadrži ovde otkriveni konjugat PTK7 antitelo-lek i hemoterapeutski agens.
[0043] Sledeüi aspekt pronalaska ukljuþuje postupke leþenja poremeüaja koji se karakterišu prekomernom ekspresijom PTK7 kod pacijenta sa ovde otkrivenim konjugatom antitelo-lek. U drugim aspektima, predmetni pronalazak obezbeÿuje postupke leþenja karcinoma koje karakteriše prekomerna ekspresija PTK7 kod pacijenta sa ovde otkrivenim konjugatom antitelolek.
[0044] U još drugim aspektima, predmetni pronalazak obezbeÿuje postupak smanjenja üelija koje iniciraju tumor u populaciji tumorskih üelija. Na primer, postupak može obuhvatati kontakt populacije tumorskih üelija, gde populacija sadrži üelije koje iniciraju tumor i üelije tumora, osim üelija koje iniciraju tumor, sa konjugatom PTK7 antitelo-lek; pri þemu je smanjena uþestalost üelija koje iniciraju tumor u populaciji tumorskih üelija. Korak kontaktiranja može se izvršiti in vitro ili in vivo.
[0045] Sledeüi aspekt pronalaska ukljuþuje dijagnostiþku i terapeutsku upotrebu ovde opisanih jedinjenja i kompozicija.
[0046] Ostali aspekti pronalaska ukljuþuju proizvodne predmete, odn. komplete, koji sadrže ovde otkriveni konjugat antitelo-lek, posudu, i uložak ili nalepnicu u paketu koji oznaþavaju leþenje.
[0047] Ovi i drugi aspekti pronalaska üe biti ocenjeni pregledom prijave u celini.
KRATAK OPIS SLIKA
[0048]
FIG.1 obezbeÿuje aminokiselinsku sekvencu reprezentativnog proteina PTK7 pune dužine (SEQ ID NO.73)
FIGS.2A-B pokazuju da vezivanje hu24 korelira sa ekspresijom üelije PTK7. (A) Imunoblot lizata celih üelija sa antitelima na PTK7 i anti-GAPDH. Signal imunoblota je prethodno potvrÿen demonstriranjem gubitka signala kada je ekspresija gena PTK7 inhibirana siRNA. (B) Srednje
1
vrednosti intenziteta fluorescencije iz protoþne citometrije sa anti-PTK7 (hu24) na istim üelijskim linijama karcinoma kao u imunoblotu. Isprekidana linija predstavlja signal kada je primarno antitelo pre bilo negativno kontrolno antitelo hu24.
FIG.3 prikazuje ekspresiju PTK7 na uzorcima tkiva iz sedam PDKS modela imunohistohemije. Bojenje ukazuje na PTK7. Reprezentativni mikrografi su prikazani za svaki model. Lestvica skale, 100 mM.
Figs. 4A-C su grafikoni koji pokazuju ekspresiju PTK7 mRNK u primarnim tumorima. (A) rak dojke; (B) prikazani su karcinomi NSCLC i (C) rak jajnika.
FIG.5 je grafikon koji prikazuje korelaciju izmeÿu veüe ekspresije PTK7 mRNA i lošijih ukupnih stopa preživljavanja kod NSCLC pacijenata.
FIG.6 is a graph showing PTK7 protein levels in serum from healthy humans and cancer patients representing 8 different tumor types. The horizontal lines indicate the mean value for each group.
FIG.7 pruža analizu hidrofobne interakcione hromatografije (HIC) hu24-vc0101.
FIG.8 je grafikon koji pokazuje efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs kod Breast-13 (BR13) triplenegativnog raka dojke (TNBC) PDX.
FIG.9 je tabela podataka koja pokazuje efikasnost hu24-vc0101 i anti-PTK7-mc8261 ADCs kod BR13 TNBC PDX.
FIG.10 je grafikon podataka sa FIG.9 koja prikazuje efikasnost hu24-vc0101 i anti-PTK7-mc8261 ADCs kod BR13 TNBC PDX.
FIG.11 je grafikon koji pokazuje efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs kod Breast-22 (BR22) TNBC PDX.
FIG.12 je tabela podataka koja pokazuje efikasnost hu23-vc0101 i anti-PTK7-mc8261 ADCs kod BR22 TNBC PDX.
FIG.13 je grafikon podataka sa FIG.12 koja pokazuje efikasnost hu23-vc0101 i anti-PTK7-mc8261 ADCs kod BR22 TNBC PDX.
FIG.14 je grafikon koji prikazuje efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs kod Breast-31 (BR31) TNBC PDX.
FIG.15 je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC kod Breast-64 (BR64) TNBC PDX.
FIG.16 je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC kod BR5 TNBC PDX.
FIG.17 je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC kod BR36 PR+ TNBC PDX. FIGS.18A-B je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 i hu23-AcBut CM kod dva razliþita SCLC PDX modela (A) H1048 PDX model i (B) SCLC 95 PDX model.
FIGS.19A-B je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-AcButCM kod dva razliþita SCLC PDX modela (A) SCLC 117 PDX model i (B) SCLC 102 PDX model.
FIG.20 je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC kod Lung-135 (LU135) ne-malih üelija raka pluüa (NSCLC) PDX.
FIG.21 je grafikon koji prikazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC kod Lung-176 (LU176) ne-malih üelija raka pluüa (NSCLC) PDX.
FIG.22 prikazuje mikrografije mikrotubularne strukture nakon tretmana sa 4 mg/mL hu24-vc0101 ADC, 4 mg/mL nekonjugovanog hu24 mAb, 4 mg/mL negativna kontrola ADC, ili 0.1 nM slobodni 0101 auristatin. H661 üelije su tretirane na 48 sati i potom obojeni na anti-tubulin i DAPI kako bi se vizualizovao DNK.
FIG.23 pokazuje efikasnost hu24-vc0101 ADC na endotelialnih üelija in vitro.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0049] Predmetni pronalazak obezbeÿuje konjugate antitelo-lek koji se vezuju za PTK7, postupke za pripremu konjugata koristeüi PTK7 antitela, veznike, i lekove. Konjugati antitelo-lek pronalaska su korisni za pripremu i proizvodnju kompozicija, kao što su lekovi koji se mogu koristiti u dijagnozi, profilaksi i / ili leþenju hiperproliferativnih poremeüaja koji se karakterišu ekspresijom PTK7. U nekim aspektima pronalaska, otkriveni konjugati antitelo-lek mogu smanjiti Xþestalost üelija koje iniciraju tumor (TIC), koje obuhvataju i üelije koje održavaju tumor (TPC) i visoko proliferativne tumorske progenitorne üelije (TProg).
L PTK7 Fiziologija
[0050] Protein tirozin kinaza (PTK7), takoÿe poznat i kao karcinom debelog creva kinaza 4 (CCK4), je receptorska tirozin kinaza prvobitno klonirana iz normalnih humanih melanocita (Lee et al., Oncogene 8(12):3403-3410, 1993) a odvojeno od tkiva karcinoma debelog creva (Mossie et al., Oncogene 11(10):2179-2184, 1995). Gen PTK7 se nalazi na 6p21.1-pl2.2. Pet spojenih izoformi humanog PTK7 klonirano je iz testisa cDNK (Jung, et al., Biochim Biophys Acta 1579, 2002). Relativna brojnost izoforma u odnosu jedna na drugu razlikuje se izmeÿu linija testisa i hepatoma ili karcinoma debelog creva, ali funkcionalni znaþaj ovih izoformi, ako postoje, nije poznat. Analize bioinformatike sugerišu da miš može da izrazi rastvorljivi izoform PTK7 iz alternativno spojenog mRNKs (Forrest, Taylor et al., Genome Biol 7, 2006).
[0051] PTK7 protein pune dužine je transmembranski protein tipa I, sa ekstraüelijskim domenom (ECD) od 674 amino kiseline, praüen kratkim delom koji obuhvata TM i citoplazmatskim domenom od 345 amino kiselina. Reprezentativna amino kiselinska sekvenca PTK7 pune dužine prikazana je na FIG.1 (SEQ ID NO.73). Amino kiselinske sekvence reprezentativnih izoformi PTK7 nalaze se u GenBank Pristupni Br. EAX04154.1 (izoform a), EAX04155.1 (izoform b), EAX04156.1 (izoform c), EAX04157.1 (izoform d), EAX04158.1 (izoform e), EAX04159.1 (izoform f), i EAX04160.1 (izoform g). Sve izoforme kodiraju isti intraüelijski domen. Kompletna sekvenca nukleinske kiseline reprezentativne izoforme humanog PTK7 (odn. varijanta transkripta PTK7-1), ima Genbank Pristupni Br. NM_002821.
[0052] Zreli PTK7 ECD pune dužine obuhvata sedam domena sliþnih imunoglobulina, dok razliþite spojne varijante kodiraju PTK7 izoforme koje se razlikuju u svojoj ECD strukturi. Sve izoforme sadrže citoplazmatski domen sa znaþajnom homologijom u odnosu na onaj koji se nalazi u opštoj klasi tirozin kinaza. Meÿutim, PTK7 nema uoþljivu aktivnost tirozin kinaze i kao takav pripada podfamiliji pseudokinaza u kojoj nekoliko promena amino kiselina u razliþitim konzerviranim poddomenima kinaze dovodi do ošteüenja vezivanja ATP (Boudeau, et al., Trends Cell Biol.16, 2006 ). Konkretno, kljuþni ostaci u poddomenima I i VII su izmenjeni u PTK7 tako da bi bila narušena direktna interakcija sa ne-prenosivim fosfatima ATP, kao i helacija Mg<2+>kofaktora koji premošüuje ove fosfate.
[0053] Biološka važnost funkcije PTK7 se može zakljuþiti iz prisustva oþuvanih ortologa iz Hidre preko Drosophile do piletine i þoveka, za koje se predviÿa da u analizi sekvenci nedostaje aktivnost kinaze. Na osnovu visoke oþuvanosti specifiþnog motiva TM domena povezanog sa sklonošüu ka asocijaciji helik-helik, predloženo je da TM domen može posredovati dimerizaciju PTK7. Ne oþekuje se da sam domen pseudokinaze PTK7 direktno prenosi signal, ali može da deluje kao skela za druge molekule u signalnom putu ili može regrutovati druge tirozin kinaze. Pokazano je da PTK7 može funkcionisati u üelijskoj adheziji, migraciji üelija, polaritetu üelija, proliferaciji, reorganizaciji aktinskog citoskeleta i apoptozi za regulaciju embriogeneze, organizacije epitelnog tkiva, zatvaranja neuronske cevi, stvaranja grebena neurona i voÿenja aksona (Peradziryi, H. et al. Arch Biochem Biophys.524, 2012).
[0054] Uobiþajena tkiva i üelije za koje se navodi da ekspresuju PTK7 ukljuþuju pluüa, štitnjaþu, jajnik, CD4 nedavne emigrantske T-üelije, i normalne mijeloiþne progenitorne i CD34 CD38-üelije koštane srži. Što se tiþe kancerogenih tkiva, ekspresija PTK7 je takoÿe pronaÿena u
1
üelijama karcinoma debelog creva, uzorcima mijeloiþne leukemije odraslih (AML), CD34-pre-TALL üelijama i karcinomu želuca. PTK7 se može izgubiti kod odreÿenih karcinoma dojke koji sadrže delecije hromozoma 6p21, mada je ekspresija promenljiva u üelijskim linijama karcinoma dojke. PTK7 se takoÿe izražava u adenokarcinomu pluüa. Fino mapiranje pojaþanja 6pl 2-p21 regiona u osteosarkomima pokazalo je da poveüanje broja kopija gena ne mora nužno rezultirati prekomernom ekspresijom PTK7, kako je odreÿeno qRT-PCR.
[0055] Ligand ili ligandi za PTK7 nisu poznati, iako je PTK7 povezan sa nizom bioloških signalnih puteva i razvojnih procesa. Na primer, PTK7 deluje kao ko-receptor i u nekanonskim (takoÿe poznatim kao signalizacija Wnt / planarne polarnosti üelije) i kanonskim signalnim putevima Wnt. U nekanoniþnom Wnt putu, PTK7 aktivira nizvodnu signalizaciju direktnom interakcijom sa RACK1 i regrutovanjem DSH u membranski lokalizovani receptorski kompleks. PTK7 vrši inhibitorni efekat na kanonsku transdukciju signala Wnt puta kroz nadmetanje za iskrivljeno vezivanje receptora na površini membrane. Ekspresiju gena PTK7 reguliše Cdx, dok stabilnost proteina reguliše degradacija proteinaze koja je povezana sa membranom. PTK7 je namenjen proteolitiþkoj degradaciji i sipanju ekstraüelijskog domena sa metaloproteinazama MMP14 i Adam17, što dovodi do pojaþane proliferacije üelija, migracije i olakšane invazije üelija karcinoma (Peradziryi, et al. Arch Biochem Biophys.524, 2012). Rastvorljivi PTK7 (sPTK7) korišüen je da pokaže ulogu PTK7 u VEGF-indukovanoj angiogenezi, kao i, in vitro formiranje epruveta, migracija i invazija humanih endotelnih üelija.
[0056] Unutar kancerogenih tkiva, pored svog potencijala za modulaciju Wnt puteva, þini se da PTK prenosi pro-proliferaciju i anti-apoptotiþne signale u liniji karcinoma debelog creva HCT116, fenotipove koji bi mogli da se ponište nokautiranjem posredovanog RNKi PTK7 (Meng, et al., 2010, PLoS One 5(11):e14018). Anti-apoptotski signali PTK7 prenosili su otpor prema ubijanju üelija posredovanih antraciklinima u blastima odrasle mijeloiþne leukemije (AML), koje bi se mogle poništiti pomoüu rastvorljivog proteina PTK7-Fc (Prebet, et al., 2010, Blood 116(13):2315-23). Prekomerna ekspresija PTK7 od strane specifiþnih üelija karcinoma iskorišüena je u strategiji za ciljanje isporuke daunorubicina T-ALL üelijama u kulturi koristeüi aptamere koji vezuju PTK7 i potom se internalizuju.
II. Konjugati PTK7 Antitelo-Lek
[0057] Predmetni pronalazak obezbeÿuje konjugate antitelo-lek formule Ab- (L-D), gde (a) Ab je antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koje se vezuje za PTK7, i (b) L-D je ostatak veznik-lek, gde L je veznik, a D je lek. Takoÿe su dati postupci za pripremu i proizvodnju takvih konjugata antitelo-lek, i upotreba istih u kliniþkim primenama. "Konjugat antitelo-lek" ili "ADC" odnosi se na antitela, ili njegov fragment koji vezuje antigen, ukljuþujuüi derivate antitela koji se vezuju za PTK7 i koji su konjugovani sa lekom kao što je citotoksiþni, citostatski i / ili terapijski agens, kako je dalje opisano ovde u nastavku. Na primer, citotoksiþni agens može biti vezan ili konjugovan sa anti- PTK7 antitelom, kao što je ovde opisano, za ciljanu lokalnu isporuku citotoksiþnog agensa na tumore (npr., PTK7 ekspresioni tumori).
[0058] Kao što je ovde korišüeno, izraz "PTK7" ukljuþuje varijante, izoforme, homologe, ortologe i paraloge. PTK7 je takoÿe poznat u struci kao karcinom debelog creva kinaza 4 (CCK4 ili CCK-4). U svrhu predmetne prijave, imaüe se na umu da se izrazi "PTK7" i "CCK4" koriste naizmeniþno i ukljuþuju varijante spajanja, izoforme, ortologe vrsta i homologe humanog PTK7 ili humanog CCK4. Dalje üe se uvažiti da se izrazi mogu takoÿe odnositi na bilo koji derivat ili fragment nativnog ili varijantnog oblika PTK7 ili CCK4 koji sadrže epitop za koji se antitelo na PTK7 može specifiþno vezati.
[0059] U nekim aspektima pronalaska, antitela i konjugati antitelo-lek unakrsno reaguju sa PTK7 iz vrsta koje nisu ljudske, kao što je PTK7 miša, pacova ili primata, kao i razliþiti oblici PTK7 (npr., glycosylated PTK7). U drugim aspektima, antitela i konjugati antitelo-lek mogu biti potpuno specifiþni za humani PTK7 i ne moraju pokazivati vrste ili druge vrste unakrsne reaktivnosti. Kao što je ovde korišüeno, izraz PTK7 se odnosi na humani PTK7 koji se javlja u prirodi, osim ako kontekstualno nije drugaþije odreÿeno. Prema tome, "PTK7 antitelo" ili "anti-PTK7 antitelo" ili druga sliþna oznaka, oznaþava bilo koje antitelo (kako je ovde definisano) koje se povezuje, veže ili reaguje sa humanim PTK7, ili njegovim fragmentom ili derivatom. Dalje, "konjugat PTK7 antitelo-lek" ili "konjugat anti-PTK7 antitelo-lek" znaþi bilo koji konjugat antitelolek ili ADC (kako je ovde definisano) koji se povezuje, veže ili reaguje sa humanim PTK7, ili njegovim fragmentom ili derivatom.
[0060] "Veznik (L)" opisuje direktnu ili indirektnu vezu antitela sa lekom. Vezivanje veznika na antitelo može se postiüi na razliþite naþine, kao što su površinski lizini, reduktivno vezivanje za oksidisane ugljene hidrate, ostaci cisteina osloboÿeni redukcijom interlanþanih disulfidnih veza, reaktivni ostaci cisteina stvoreni na odreÿenim mestima i glutamin donatora acila koji sadrži tag
1
ili endogeni glutamin koji je napravljen reaktivnim sa polipeptidnim inženjeringom u prisustvu transglutaminaze i amina. U tehnici su poznati razliþiti ADC sistemi za povezivanje, ukljuþujuüi veze na bazi hidrazona, disulfida i peptida.
[0061] "Lek (D)" je bilo koja supstanca koja ima biološku ili detektivnu aktivnost, na primer, terapeutski agensi, detektujuüe oznake, vezivni agensi, itd., i prolekovi, koji se metabolizuju u aktivni agens in vivo. Izrazi lek, korisni teret, i jedinjenje koriste se naizmeniþno.
[0062] "L-D" je ostatak veznik-lek koji rezultuje iz leka (D) koji je povezan za veznik (L).
[0063] Dodatni nauþni i tehniþki izrazi koji se koriste u vezi sa predmetnim pronalaskom, ukoliko ovde nije drugaþije naznaþeno, imaüe znaþenja koja obiþno razumeju struþnjaci iz ove oblasti. Dalje, osim ako kontekstom nije drugaþije odreÿeno, izrazi u jednini ukljuþuju množinu, a izrazi u množini ukljuþuju jedninu. Uopšteno, nomenklatura koja se koristi u vezi sa i tehnike kulture üelija i tkiva, molekularna biologija, imunologija, mikrobiologija, genetika i ovde opisana hemija i hibridizacija proteina i nukleinskih kiselina su one koje su dobro poznate i þesto se koriste u struci.
[0064] U odreÿenom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO : 1 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 15; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valincitrulin-p-aminobenzil oksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0065] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 23; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0066] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 39; i (b)
1
ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valincitrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0067] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 47; and (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0068] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 63; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valincitrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0069] U drugom aspektu pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek formule Ab- (L-D) sadrži (a) antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, Ab, koji sadrži teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 71; i (b) ostatak veznik-lek, L-D, gde L je veznik, a D je lek, pri þemu je veznik maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), i gde lek je 0101.
[0070] DAR (odnos leka i antitela) ili optereüenje lekom, ukazujuüi na broj molekula lekova konjugovanih po antitelu, može biti od 1 do 8. Kompozicije, serije i / ili formulacije više konjugata antitela i leka mogu se okarakterisati proseþnim DAR. DAR i proseþni DAR mogu se odrediti razliþitim konvencionalnim sredstvima kao što su UV spektroskopija, masena spektroskopija, ELISA test, radiometrijske metode, hidrofobna interakciona hromatografija (HIC), elektroforeza i HPLC.
[0071] U odreÿenim aspektima pronalaska, preþišüeni anti-PTK7 ADCs mogu da ne sadrže nekonjugovana antitela (slobodna antitela). U drugim aspektima pronalaska, preþišüeni anti-PTK7 ADCs mogu biti monomerni ADCs, a agregati i dimeri odsutni. U drugim aspektima pronalaska, preþišüeni anti-PTK7 ADCs mogu da ne sadrže slobodan lek. U daljim aspektima pronalaska, preþišüeni anti-PTK7 ADC mogu biti monomerni ADC i u njima nema slobodnog leka.
1
IIA. PTK7 Antitela
[0072] Za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen može biti bilo koje antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, a koje se specifiþno vezuje za PTK7. Antitela predmetnog pronalaska su dalje otkrivena i okarakterisana u PCT meÿunarodnoj objavi br. WO 2012/112943, taþnije, sekvencama PTK7 antitela koja su tamo otkrivena, ukljuþujuüi kompletne teške i lagane lance, njihove promenljive regione i njihove CDR.
[0073] Za upotrebu u pripremi konjugata PTK7 antitelo-lek, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen mogu biti izolovani, preþišüeni ili derivatizovani.
[0074] "Antitelo" ili "Ab" je molekul imunoglobulina sposoban da prepozna i veže se za odreÿenu metu ili antigen, kao što su ugljeni hidrati, polinukleotidi, lipidi, polipeptidi itd., kroz najmanje jedno mesto prepoznavanja antigena, smešteno u varijabilnom regionu molekula imunoglobulina. Kao što je korišüeno ovde, izraz "antitelo" može da obuhvati bilo koju vrstu antitela, ukljuþujuüi, ali ne ograniþavajuüi se na monoklonska antitela, poliklonalna antitela, "fragmente koji vezuju antigen" (ili njihov deo), kao što su Fab, Fab ', F (ab') 2, Fd, Fv, Fc, itd., intaktna antitela koja zadržavaju sposobnost specifiþnog vezivanja za dati antigen (npr. PTK7), izolovani region koji odreÿuje komplementarnost (CDR), bispecifiþna antitela, heterokonjugovana antitela, njihovi mutanti, fuzioni proteini koji imaju antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen (npr., antitelo na domenu), jedno lanþani (ScFv) i singl domen antitela (npr., antitela ajkule i kamelida), maksitela, intratela, diatela, triatela, tetratela, v -NAR i bis-scFv (videti, npr., Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology 23(9): 1126-1136), humanizovana antitela, himerna antitela i bilo koja druga modifikovana konfiguracija molekula imunoglobulina koja ukljuþuje mesto prepoznavanja antigena potrebne specifiþnosti, ukljuþujuüi varijante glikozilacije antitela, varijante antitela sekvence amino kiselina i kovalentno modifikovana antitela. Antitela mogu biti mišja, pacovska, humana ili bilo kog drugog porekla (ukljuþujuüi himerna ili humanizovana antitela). U nekim aspektima pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, otkriveni konjugati PTK7 antitelo-lek su himerno, humanizovano ili rekombinantno humano antitelo, ili njegov PTK7-vezujuüi fragment.
[0075] Antitelo, konjugat antitelo-lek ili polipeptid koji se "specifiþno vezuje" ili "preferencijalno vezuje" (ovde se naizmeniþno koristi) na cilj ili antigen (npr., PTK7 protein) je izraz koji se dobro
1
razume u struci i metode da se utvrditi takvo specifiþno ili preferencijalno vezivanje takoÿe su dobro poznati u tehnici. Kaže se da molekul pokazuje „specifiþno vezivanje“ ili „preferencijalno vezivanje“ ako reaguje ili se udružuje þešüe, brže, sa veüim trajanjem i / ili sa veüim afinitetom sa odreÿenom üelijom ili supstancom, nego sa alternativnim üelijama ili supstancama. Antitelo se "specifiþno vezuje" ili se "preferencijalno vezuje" za metu ili antigen ako se veže sa veüim afinitetom, avidnošüu, lakše i / ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifiþno ili preferencijalno vezuje za PTK7 epitop je antitelo koje ovaj epitop veže sa veüim afinitetom, avidnošüu, lakše i / ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za druge PTK7 epitope ili epitope koji nisu PTK7.
[0076] Izraz "afinitet vezivanja" ili "KD" kao što je korišüeno ovde, ima za nameru da se odnosi na konstantu disocijacije ravnoteže odreÿene interakcije antigen-antitelo. KDje odnos stepena disocijacije, takoÿe poznate kao "off-rate" ili "Kd", u odnosu na stepen asocijacije, ili "on-rate" ili "Ka". Stoga, KDje jednako Kd/ Kai iskazuje se kao molarna koncentracija (M). Iz toga sledi da što je manji KD, jaþi je afinitet vezivanja. Stoga, KDod 1 µM ukazuje na slabi afinitet vezivanja u poreÿenju sa KDod 1 nM. KDvrednosti antitela se mogu odrediti korišüenjem postupaka dobro poznatih u struci. Jedan postupak za odreÿivanje KDantitela jeste korišüenje rezonance površinskog plazmona, obiþno koristi sistem biosenzora kao što je BIACORE® sistem.
[0077] Specifiþno vezivanje otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek odnosi se na preferencijalno vezivanje konjugata antitelo-lek na humani PTK7 antigen u heterogenom uzorku koji ima više razliþitih antigena. Tipiþno, specifiþno vezivanje se dešava ako je afinitet vezivanja konjugata antitelo-lek ili njegovog dela antitela (Ab) najmanje oko 10<-7>M ili više, kao što je bar oko 10<-8>M ili više, ukljuþujuüi bar oko 10<-9>M ili više, bar oko 10<-10>M ili više, bar oko 10<-11>M ili više, ili bar oko 10<-12>M ili više. Na primer, specifiþno vezivanje konjugata antitelo-lek ili njegovog dela antitela (Ab) pronalaska za humani PTK7 antigen ukljuþuje vezivanje u opsegu od najmanje oko 1 X 10<-7>M do oko 1 X 10<-12>M, kao što je u opsegu od oko 1 X 10<-8>M do oko 1 X 10<-12>M, ili u opsegu od oko 1 X 10<-8>M do oko 1 X 10<-11>M, ili u opsegu od oko 1 X 10<-8>M do oko 1 X 10<-10>M, ili u opsegu od oko 1 X 10<-9>M do oko 1 X 10<-10>M. Specifiþno vezivanje se takoÿe odnosi na selektivno ciljanje konjugata PTK7 antitelo-lek, ili njegovog dela antitela (Ab), na PTK7-ekspresione üelije koje prate primenu antitela na subjekta.
[0078] Takoÿe se podrazumeva da se antitelo (ili ostatak ili epitop) koje se specifiþno ili preferencijalno vezuje za prvu metu može ili ne mora specifiþno ili preferencijalno vezati za
1
drugu metu. Kao takvi, „specifiþno vezivanje“ ili „preferencijalno vezivanje“ ne zahteva nužno (iako može ukljuþivati) ekskluzivno vezivanje. Uopšteno, ali ne nužno, pozivanje na vezivanje znaþi preferencijalno vezivanje.
[0079] Kao što je ovde korišüeno, "epitop" ukljuþuje bilo koju proteinsku odrednicu koja je sposobna da se specifiþno veže za imunoglobulin ili T-üelijski receptor ili da na bilo koji drugi naþin reaguje sa molekulom. Epitopske odrednice se uopšteno sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino kiseline ili boþni lanci ugljenih hidrata ili šeüera i uglavnom imaju specifiþne trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifiþne karakteristike punjenja. Epitop može biti „linearni“ ili „konformacijski“. U linearnom epitopu, sve taþke interakcije izmeÿu proteina i molekula koji interaguju (kao što je antitelo) javljaju se linearno duž primarne amino kiselinske sekvence proteina. U konformacionom epitopu, taþke interakcije ukljuþuju amino kiselinske ostatke na proteinu koji su odvojeni jedni od drugih.
Jednom kada se odredi željeni epitop na antigenu, moguüe je generisati antitela na taj epitop, na primer, koristeüi tehnike opisane u ovom pronalasku. Alternativno, tokom procesa otkrivanja, stvaranje i karakterizacija antitela mogu razjasniti informacije o poželjnim epitopima. Iz ovih informacija je tada moguüe kompetitivno proveriti antitela za vezivanje za isti epitop. Pristup da se to postigne je sprovoÿenje studija unakrsne konkurencije kako bi se pronašla antitela koja se meÿusobno kompetitivno vezuju, odn., antitela se takmiþe za vezivanje za antigen. Postupak velike propusnosti za „vezivanje“ antitela na osnovu njihove unakrsne konkurencije opisan je u PCT meÿunarodnoj objavi br. WO 03/48731. Kako se ovde koristi, izraz „vezivanje“ odnosi se na metod za grupisanje antitela na osnovu njihovih karakteristika vezivanja antigena i meÿusobne konkurencije.
[0080] "Izolovano antitelo", kako je ovde korišüeno, se odnosi na antitelo koje je u suštini bez drugih antitela koja imaju razliþite antigenske specifiþnosti (npr., izolovano antitelo koje se specifiþno vezuje za PTK7 je u suštini bez antitela koje se specifiþno vezuje za antigene koji nisu PTK7). Štaviše, izolovano antitelo može biti u osnovi bez drugih üelijskih materijala i / ili hemikalija. Izolovano antitelo koje se specifiþno vezuje za PTK7 može, meÿutim, imati unakrsnu reaktivnost za druge antigene, kao što su molekuli PTK7 iz drugih vrsta (odn. ortolog) ili sa više od jedne izoforme PTK7.
[0081] U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo koje se takmiþi za vezivanje za humani PTK7 sa i / ili veže isti epitop kao antitelo ili njegov fragment koji
2
vezuje antigen, imajuüi (a) varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 15; ili (c) varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 39; ili (c) varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca naveden kao SEQ ID NO: 63.
[0082] Izraz "takmiþiti se", kako je ovde korišüeno u odnosu na antitelo, znaþi da se prvo antitelo, ili njegov fragment za vezivanje antigena, vezuje za epitop na naþin koji je dovoljno sliþan vezivanju drugog antitela ili njegovog antigen-vezujuüeg fragmenta na njega, tako da se rezultat vezivanja prvog antitela sa srodnim epitopom opažno smanjuje u prisustvu drugog antitela u poreÿenju sa vezivanjem prvog antitela u odsustvu drugog antitela. Alternativa, gde se vezivanje drugog antitela za njegov epitop takoÿe osetno smanjuje u prisustvu prvog antitela, može, ali ne mora biti sluþaj. To jest, prvo antitelo može inhibirati vezivanje drugog antitela za njegov epitop, a da to drugo antitelo ne inhibira vezivanje prvog antitela za njegov odgovarajuüi epitop. Meÿutim, tamo gde svako antitelo detektuje inhibiciju vezivanja drugog antitela sa srodnim epitopom ili ligandom, bilo u istoj, veüoj ili manjoj meri, za antitela se kaže da se „meÿusobno nadmeüu“ za vezivanje svog odgovarajuüeg epitopa(a). I konkurentska i unakrsna antitela su obuhvaüena ovim pronalaskom. Bez obzira na mehanizam kojim se javlja takvo takmiþenje ili unakrsna konkurencija (npr., steriþka prepreka, konformaciona promena ili vezivanje za zajedniþki epitop ili njegov deo), struþnjak üe ceniti, na osnovu ovde datih uþenja, da takvo takmiþenje i / ili unakrsna konkurentska antitela su obuhvaüena i mogu biti korisna za ovde opisane postupke.
[0083] Nativna antitela ili antitela koja se javljaju u prirodi, i nativni imunoglobulini, su tipiþno heterotetramerni glikoproteini od oko 150000 daltona, sastavljeni od dva identiþna laka (L) lanca i dva identiþna teška (H) lanca. Svaki laki lanac povezan je sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira meÿu teškim lancima razliþitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takoÿe ima redovno rasporeÿene intralanþane disulfidne mostove. Svaki teški lanac ima na jednom kraju promenljivi domen (VH) praüen brojem konstantnih domena. Svaki laki lanac ima promenljivi domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na drugom kraju; konstantni domen lakog lanca je poravnat sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a promenljivi domen lakog lanca je poravnat sa promenljivim domenom teškog lanca. Veruje se da odreÿeni amino kiselinski ostaci þine interfejs izmeÿu promenljivih domena lakog i teškog lanca. Izraz "promenljiva" odnosi se na þinjenicu da se odreÿeni delovi promenljivih domena uveliko razlikuju u sekvenci meÿu antitelima.
[0084] Antitela i gore pomenuti domeni antitela mogu se opisati kao „polipeptidi“, „oligopeptidi“, „peptidi“ i „proteini“, odn. lanci amino kiselina bilo koje dužine, poželjno relativno kratki (npr.10-100 amino kiselina ). Lanac može biti ravan ili razgranat, može sadržati modifikovane amino kiseline i / ili ga mogu prekinuti ne-amino kiseline. Dalje se razume da se polipeptidi mogu pojaviti kao pojedinaþni lanci ili povezani lanci. Amino kiseline se ovde mogu oznaþiti ili sa njihovim opštepoznatim troslovnim simbolima ili sa jednoslovnim simbolima koje preporuþuje IUPAC-IUB Biochemical. Pojmovi „polipeptidi“, „oligopeptidi“, „peptidi“ i „proteini“ takoÿe obuhvataju amino kiselinski lanac koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidiranje, acetiliranje, fosforilacija ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Takoÿe su obuhvaüeni definicijom, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga amino kiseline (ukljuþujuüi, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), Kao i druge modifikacije poznate u tehnici. Modifikacije amino kiselina mogu se izvršiti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici, a mnogi takvi postupci su dobro poznati i rutinski za struþnjake u tehnici. Na primer, ali ne ograniþavajuüe, supstitucije, delecije i insercije amino kiselina mogu se izvršiti korišüenjem bilo koje dobro poznate tehnike zasnovane na PCR. Amino kiselinske supstitucije se mogu izvršiti mutagenezom usmerenom na mesto (videti, na primer, Zoller and Smith, 1982, Nucl. Acids Res.
10:6487-6500; and Kunkel, 1985, Proc. Natl. Acad. Sci USA 82:488).
[0085] "Konstantni region" antitela odnosi se na konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji. Konstantni regioni himernih i humanizovanih PTK7 antitela mogu se dobiti iz konstantnih regiona bilo kog od IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, bilo kojih njihovih izotipova (npr., IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4 izotipi IgG), kao i njihove podklase i njihove mutirane verzije. U zavisnosti od amino kiselinske sekvence antitela konstantnog regiona njegovih teških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti razliþitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se dalje može podeliti u podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni regioni teškog lanca koji odgovaraju razliþitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije razliþitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
[0086] Konstantni domeni nisu direktno ukljuþeni u vezivanje antitela za antigen, ali pokazuju razliþite efektorske funkcije, kao što je vezivanje Fc receptora (FcR), uþešüe antitela u üelijskoj toksiþnosti zavisnoj od antitela, opsonizacija, pokretanje citotoksiþnosti zavisne od komplementa i degranulacija mastocita. Kao što je poznato u struci, izraz "Fc region" se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. "Fc region" može biti Fc region nativne sekvence ili varijanta Fc regiona. Iako se granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu razlikovati, Fc region humanog IgG teškog lanca se obiþno definiše tako da se proteže od amino kiselinskog ostatka na poziciji Cys226, ili od Pro230, do njegovog karboksil-kraja. Brojanje ostataka u Fc regionu je indeksa EU kao u Kabat. Kabat i sar., Sekvence proteina od imunološkog interesa, 5. izd. Služba javnog zdravlja, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md., 1991. Fc region imunoglobulina uglavnom ima dva konstantna regiona, CH2 i CH3.
[0087] Kao što je korišüeno u tehnici, "Fc receptor" i "FcR" opisuju receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativni sled humanog FcR. Štaviše, poželjni FcR je onaj koji veže IgG antitelo (gama receptor) i ukljuþuje receptore podvrsta FciR, FciRII i FciRIII, ukljuþujuüi alelne varijante i alternativno spojene oblike ovih receptora. FciRII receptori ukljuþuju FciRIIA („aktivirajuüi receptor“) i FciRIIB („inhibitorni receptor“), koji imaju sliþne sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. FcRs su pregledana u Ravetch i Kinet, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92, 1991; Capel et al., Immunomethods, 4:25-34, 1994; and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med., 126:330-41, 1995. "FcR" takoÿe ukljuþuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenos majþinih IgGs na fetus (Guyer et al., J. Immunol., 117:587-593 (1976); and Kim et al., European J. Immunol., 24:2429-2434 (1994)).
[0088] Ranije je izveštavano da su odreÿeni ostaci koji su verovatno prisutni na površini CH2 ili CH3 domena teškog lanca antitela, ili na konstantnom domenu lakog lanca, ili su dostupni na bilo koji drugi naþin, pogodni za supstituciju prirodnih pojava divljeg tipa amino kiseline sa, na primer, cisteinom, i stoga su korisne za projektovanje mesta sposobnog za konjugaciju sa razliþitim agensima.
[0089] Pod "projektovanim Fc polipeptidom", "projektovanim Fc regionom" i "projektovanim Fc", kako se izrazi ovde naizmeniþno koriste, podrazumeva se Fc polipeptid ili njegov deo, koji sadrži najmanje jednu mutaciju, npr. supstituciju amino kiseline, uvoÿenje mesto za konjugaciju.
2
Mutacija uvodi cistein umesto prirodnog amino kiselinskog ostatka na tom položaju, gde mutacija stvara reaktivno mesto (npr., reaktivnu sulfhidrilnu grupu) za konjugaciju dela sa Fc.
[0090] Izraz „acilni dodnor glutamina koji sadrži rag“ ili „glutamin tag“, kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid ili protein koji sadrži jedan ili više Gln ostataka, koji deluju kao akceptor transglutaminaznog amina.
[0091] ’’Varijabilni region“ antitela odnosi se na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji. Kao što je poznato u struci, varijabilni regioni teškog i lakog lanca sastoje se od þetiri okvirna regiona (FR) povezana tri regiona koja odreÿuju komplementarnost (CDR), takoÿe poznatim kao hipervarijabilni regioni. CDR u svakom lancu FR drže u neposrednoj blizini i, zajedno sa CDR iz drugog lanca, doprinose stvaranju mesta vezivanja antigena na antitela. Postoje najmanje dve tehnike za odreÿivanje CDRs: (1) pristup zasnovan na promenljivosti sekvence meÿu vrstama (odn., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); i (2) pristup zasnovan na kristalografskim studijama kompleksa antigenantitelo (Al-Lazikani et al., J. Molec. Biol.273:927-948 (1997). Kao što je korišüeno ovde, CDR se može odnositi na CDR definisane bilo kojim pristupom, ili kombinacijom oba pristupa.
[0092] CDR varijabilnog domena su amino kiselinski ostaci unutar varijabilnog regiona koji su identifikovani u skladu sa definicijama Kabat, Chothia, akumulacijom i Kabat i Chothia, VBASE2, AbM, kontakt, i / ili konformacione definicije ili bilo koja metoda odreÿivanja CDR dobro poznate u tehnici. CDR antitela mogu se identifikovati kao hipervarijabilni regioni koje je prvobitno definisao Kabat et al. See, e.g., Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C. Pozicije CDRs se takoÿe mogu identifikovati kao strukturne strukture petlje koje je prvobitno opisao Chothia and others. See, e.g., Chothia et al., Nature 342:877-883, (1989). Pozicije CDRs takoÿe mogu biti izvedeni iz analize baze podataka VBASE2. (Videti, npr. Retter et al., 2005, Nucleic Acids Res.
33(Database Issue):D671-D674).
[0093] Ostali pristupi CDR identifikacije ukljuþuju „AbM definiciju“, koja predstavlja kompromis izmeÿu Kabata i Chothije i izvedena je pomoüu softvera za modeliranje antitela AbM kompanije Oxford Molecular (sada ACCELRIS®), ili „definicije kontakata“ CDRs na osnovu uoþenih antigenskih kontakata, izloženo u MacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, (1996). U drugom pristupu, ovde navedenom kao "konformaciona definicija" CDRs, položaji CDRs se mogu identifikovati kao ostaci koji entalpiþno doprinose vezivanju antigena. Vidite, npr., Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008. Ipak, druge definicije granica CDR možda neüe striktno slediti jedan od gore navedenih pristupa, ali üe se ipak preklapati sa barem delom Kabat-ovih CDRs, iako mogu biti skraüene ili produžene u svetlu predviÿanja ili eksperimentalnih nalaza da odreÿeni ostaci ili grupe ostataka ili þak þitavi CDR ne utiþu znaþajno na vezivanje antigena. Kako se ovde koristi, CDR se može odnositi na CDR definisane bilo kojim pristupom poznatim u tehnici, ukljuþujuüi kombinacije pristupa. Ovde korišüeni postupci mogu da koriste CDR definisani u skladu sa bilo kojim od ovih pristupa. Za ovde opisane konjugate PTK7 antitelo-lek, CDR mogu biti definisani u skladu sa bilo kojom od definicija Kabat, Chothia, VBASE2, AbM, kontaktom i / ili konformacionim definicijama.
[0094] U drugim aspektima pronalaska, PTK7 antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, ukljuþuje jedan ili više CDRs antitela (kao što su jedan, dva, tri, þetiri, pet ili svih šest CDRs).
[0095] Za predmetni pronalazak, CDRs hu23, hu24 i hu58 navedeni u Tabeli 1 u nastavku (SEQ ID NOS: 1-72) izvedeni su koristeüi Kabat i Chothia. CDRs kako je prikazano na FIG.6 PCT meÿunarodne objave br. WO 2012/112943 izvedeni su iz analize baze podataka VBASE2. Shodno tome, antitela koja imaju CDR definisane u svim takvim nomenklaturama izriþito su obuhvaüena obimom ovog pronalaska. Šire gledano, izraz "CDR amino kiselinski ostatak sa varijabilnim regionom" ukljuþuje amino kiseline u CDR kako je identifikovano korišüenjem bilo koje metode zasnovane na sekvenci ili strukturi kako je gore navedeno.
[0096] U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima CDRs hu23 antitela. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, ukljuþujuüi najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ima tri CDRs navedeni kao SEQ ID NO: 3, 7 i 11. U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ima tri CDRs prikazana kao SEQ ID NO: 17, 19 i 21. Konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska takoÿe može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen, ukljuþujuüi (a) varijabilni
2
region teškog lanca koji ima tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 3, 7 i 11; i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri CDRs predstavljena kao SEQ ID NO: 17, 19, i 21.
[0097] U još drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima jedan ili više hu23 CDRs definisanih prema Chothia ili izvedenih iz analize baze podataka VBASE2. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ukljuþuje tri hu23 CDRs koje je definisao Chothia (videti Tabelu 1) ili tri hu23 CDRs izvedeni iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT meÿunarodnu objavu br. WO 2012/112943). Kao drugi primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ukljuþuje tri hu23 CDR, definisane od strane Chothia (videti Tabelu 1), ili tri hu23 CDR, izvedena iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT meÿunarodnu objavu br. WO 2012/112943). U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca sa tri hu23 CDRs definisana prema Chothia (videti Tabelu 1); i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri hu23 CDR definisana prema Chothia (videti Tabelu 1). U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca, ukljuþujuüi tri hu23 CDRs, izvedena iz analize baze podataka VBASE2 (vidi PCT Meÿunarodna objava br. WO 2012/112943); i (b) varijabilni region lakog lanca koji ukljuþuje tri hu23 CDRs izveden iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT Meÿunarodnu obajvu Br. WO 2012/112943).
[0098] U drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima CDR hu24 antitela. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ukljuþuje tri CDRs navedeni kao SEQ ID NO: 27, 31 i 35. U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ukljuþuje tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 41, 43 i 45. Konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska takoÿe
2
može da ukljuþuje (a) varijabilni region teškog lanca sa tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 27, 31 i 35; i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 41, 43, i 45.
[0099] U drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima jedan ili više hu24 CDRs definisanih prema Chothia ili izvedenih iz analize baze podataka VBASE2. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ukljuþuje tri hu24 CDRs definisani od strane Chothia (videti Tabelu 1) ili tri hu24 CDRs izvedeni iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT meÿunarodnu objavu br. WO 2012/112943). Kao drugi primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ukljuþuje tri hu24 CDR, definisane Chothia (videti Tabelu 1), ili tri hu24 CDR, izvedena iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT meÿunarodnu obajvu br. WO 2012/112943). U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca sa tri hu24 CDR definisana prema Chothia (videti tabelu 1); i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri hu24 CDR definisana prema Chothia (videti Tabelu 1). U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca, ukljuþujuüi tri hu24 CDRs, izvedene iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT Meÿunarodna objavu br. WO 2012/112943); i (b) promenljivi region lakog lanca koji ukljuþuje tri hu24 CDRs izveden iz analize baze podataka VBASE2 (videti PCT Meÿunarodna objavu br. WO 2012/112943).
[0100] U drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima CDR hu58 antitela. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ukljuþuje tri CDRs navedeni kao SEQ ID NO: 51, 55 i 59. U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ukljuþuje tri
2
CDRs navedena kao SEQ ID NO: 65, 67 i 69. Konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska takoÿe može da ukljuþuje (a) varijabilni region teškog lanca koji ima tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 51, 55 i 59; i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri CDRs navedena kao SEQ ID NO: 65, 67, i 69.
[0101] U drugim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima jedan ili više hu58 CDRs definisanih prema Chothia ili izvedenih iz analize baze podataka VBASE2. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region teškog lanca ukljuþuje tri hu58 CDRs definisani Chothia ili tri hu58 CDRs izvedeni iz analize baze podataka VBASE2. Kao drugi primer, konjugat PTK7 antitelo-lek može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima najmanje jedan varijabilni region teškog lanca i najmanje jedan varijabilni region lakog lanca, pri þemu najmanje jedan varijabilni region lakog lanca ukljuþuje tri hu58 CDR, definisane Chothia, ili tri hu58 CDR, izvedena iz analize baze podataka VBASE2. U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca sa tri hu58 CDRs definisana prema Chothia; i (b) varijabilni region lakog lanca koji ima tri hu58 CDRs definisana prema Chothia. U nekim aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima (a) varijabilni region teškog lanca, ukljuþujuüi tri hu58 CDRs, izvedena iz analize baze podataka VBASE2; i (b) varijabilni region lakog lanca koji ukljuþuje tri hu24 CDRs izveden iz analize baze podataka VBASE2.
[0102] U nekim aspektima pronalaska, antitela koja se koriste za pripremu PTK7 konjugata antitelo-lek prema pronalasku biüe monoklonska antitela. Izraz "monoklonsko antitelo" ili "mAb" odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, odn. pojedinaþna antitela koja þine populaciju su identiþna, osim moguüih prirodnih mutacija koje mogu biti prisutne u manjim koliþinama. Monoklonska antitela su visoko specifiþna i usmerena su prema jednom antigenom mestu. Dalje, za razliku od preparata za poliklonska antitela, koja obiþno ukljuþuju razliþita antitela usmerena protiv razliþitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne odrednice na antigenu. Modifikator "monoklonalni" ukazuje na karakter antitela koji je dobijen iz suštinski homogene populacije antitela i ne sme se tumaþiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim odreÿenim postupkom. Na primer, monoklonska
2
antitela koja üe se koristiti u skladu sa ovim pronalaskom mogu se dobiti metodom hibridoma koju su prvi opisali Kohler i Milstein, Nature 256: 495-497 (1975), ili mogu dobiti metodom rekombinantne DNK, kao što je opisano u U.S. Patentu br.4,816,567. Monoklonska antitela se takoÿe mogu izolovati iz biblioteka faga generisanih tehnikama opisanim u McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990) na primer.
[0103] U nekim aspektima pronalaska, antitela koja se koriste za pripremu konjugata antitelo-lek iz pronalaska biüe monovalentna, odn., imaju jedno mesto vezivanja za antigen po molekulu (npr., IgG ili Fab). U nekim sluþajevima, monovalentno antitelo može imati više mesta za vezivanje antigena, ali mesta za vezivanje potiþu iz razliþitih antigena. U nekim aspektima pronalaska, antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, konjugata antitelo-lek prema pronalasku može sadržati "bivalentno antitelo", odn., koje ima dva mesta za vezivanje antigena po molekulu (npr. IgG). U nekim sluþajevima, dva mesta vezivanja imaju iste antigenske specifiþnosti. Alternativno, dvovalentna antitela mogu biti bispecifiþna. ’’Bispecifiþno“, ’’dvostruko specifiþno“ ili ’’bifunkcionalno“ antitelo je hibridno antitelo koje ima dva razliþita mesta vezivanja antigena. Dva mesta za vezivanje antigena bispecifiþnog antitela vezuju se za dva razliþita epitopa, koji mogu boraviti na istim ili razliþitim proteinima.
[0104] Izraz "himerno antitelo" namerava da se odnosi na antitela u kojima su deo ili sve sekvence varijabilnog regiona izvedene iz jedne vrste, a sekvence konstantnog regiona izvedene iz druge vrste, kao što je antitelo u kome su izvedene sekvence varijabilnog regiona iz antitela miša i sekvence konstantnih regiona su izvedene iz humanog antitela.
[0105] Kako se ovde koristi, "humanizovano" ili "CDR kalemljeno" antitelo odnosi se na oblike ne-humanih (npr., mišjih) antitela koja su himerni imunoglobulini, imunoglobulinski lanci ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab ', F (ab' ) 2 ili druge antigen vezujuüe podsekvence antitela) koje sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz ne-humanog imunoglobulina. Poželjno je da su humanizovana antitela humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima se ostaci iz jednog ili više komplementarnih odreÿujuüih regiona (CDR) primaoca zamenjuju ostacima jednog ili više CDRs ne-humane vrste (antitelo davalac) kao što su miš, pacov, ili zec koji ima željenu specifiþnost, afinitet i kapacitet.
[0106] U nekim sluþajevima, ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajuüim ne-humanim ostacima. Dalje, humanizovano antitelo može
2
sadržati ostatke koji se ne nalaze ni u primaocu antitela, ni u uvezenim CDR ili sekvencama okvira, ali su ukljuþeni da bi se dodatno usavršilo i optimizovalo delovanje antitela. Uopšteno, humanizovano antitelo üe sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipiþno dva promenljiva domena, u kojima svi ili suštinski svi CDR regioni odgovaraju oblastima ne-humanog imunoglobulina i svi ili suštinski svi FR regioni. su oni iz sekvence konsenzusa humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takoÿe optimalno ukljuþuje najmanje deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipiþno onog od humanog imunoglobulina. U nekim aspektima pronalaska, antitela imaju Fc regione modifikovane kako je opisano u PCT meÿunarodnoj objavi br. WO 99/58572. Ostali oblici humanizovanih antitela imaju jedan ili više CDRs (CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2 ili CDR H3) koji mogu biti izmenjeni u odnosu na originalno antitelo, koje se takoÿe naziva jedan ili više CDRs " izveden iz „jednog ili više CDRs iz originalnog antitela.
[0107] Humanizacija se u osnovi može izvoditi metodom Winter i saradnika (Jones i sar. Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i sar. Nature 332: 323-327 (1988); Verhoeyen i sar. Science 239: 1534-1536 (1988)), zamenom CDRs ili CDR sekvenci glodara ili mutanata glodara za odgovarajuüe sekvence humanog antitela. Takoÿe videti U.S. Patent br.5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205. U nekim sluþajevima, ostaci unutar okvirnih regiona jednog ili više varijabilnih regiona humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajuüim ne-humanim ostacima (videti, na primer, U.S. Patent br.5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; i 6,180,370). Dalje, humanizovana antitela mogu da sadrže ostatke koji se ne nalaze u antitelu primaocu ili u antitelu davaocu. Ove modifikacije su napravljene da bi se dalje usavršile performanse antitela (npr., da bi se dobio željeni afinitet). Uopšteno, humanizovano antitelo üe sadržati suštinski sve od najmanje jednog, i tipiþno dva promenljiva domena, u kojima svi ili suštinski svi hipervarijabilni regioni odgovaraju oblastima ne-humanog imunoglobulina i svim ili suštinski svim okvirnim regionima su oni iz sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo opciono takoÿe ukljuþuje najmanje deo konstantnog dela imunoglobulina (Fc), tipiþno onog od humanog imunoglobulina. Za dalje detalje pogledajte Jones et al. Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988); i Presta Curr. Op. Struct. Biol.2:593-596 (1992). Shodno tome, takva "humanizovana" antitela mogu obuhvatati antitela u kojima je znatno manje od netaknutog humanog promenljivog domena supstituisano odgovarajuüom sekvencom iz nehumane vrste. U praksi, humanizovana antitela su tipiþno humana antitela u kojima su neki CDR ostaci i možda neki okvirni ostaci supstituisani ostacima sa analognih mesta u antitelima glodara. Videti, na primer, U.S. Patent br.5,225,539; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,762; 5,859,205. Videti takoÿe U.S. Patent br.6,180,370 i PCT meÿunarodnu objavu br. WO 01/27160, gde su otkrivena humanizovana antitela i tehnike za proizvodnju humanizovanih antitela koja imaju poboljšani afinitet za unapred odreÿeni antigen.
[0108] "Rekombinantno humano antitelo" ili "potpuno humano antitelo" odnosi se na ona antitela koja imaju amino kiselinsku sekvencu koja odgovara sekvenci antitela koje je þovek proizveo i / ili koja su napravljena korišüenjem bilo koje od tehnika za stvaranje humanih antitela poznatih struþnjacima ili ovde otkriveni. Ova definicija humanog antitela ukljuþuje antitela koja imaju najmanje jedan humani polipeptid teškog lanca ili najmanje jedan humani polipeptid lakog lanca. Jedan takav primer je antitelo sa mišjim polipeptidima lakog lanca i humanog teškog lanca. Humana antitela se mogu proizvesti upotrebom razliþitih tehnika poznatih u tehnici. Na primer, humano antitelo se bira iz biblioteke faga, gde ta biblioteka faga izražava humana antitela (Vaughan et al., Nature Biotechnology, 14:309-314, (1996); Sheets et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 95:6157-6162, (1998); Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227(2):381-388 (1992); Marks et al., J. Mol. Biol., 222(3):581-597 (1991)). Humana antitela se takoÿe mogu stvoriti imunizacijom životinja u koje su transgeniþki uvedeni lokusi humanog imunoglobulina umesto endogenih lokusa, npr., miševi kod kojih su geni endogenih imunoglobulina delimiþno ili u potpunosti inaktivirani. Ovaj pristup je opisan u U.S. Patentima br.5,545,807; 5,545,806;
5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5.661.016. Alternativno, humano antitelo se može pripremiti ovekoveþenjem humanih B limfocita koji proizvode antitelo usmereno protiv ciljnog antigena (takvi B limfociti mogu da se dobiju od pojedinca ili od kloniranja cDNK od jedne üelije, ili su imunizovani in vitro). Vidite, npr., Cole et al. Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77, (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95, (1991); i U.S. Pat. Br.
5,750,373.
[0109] Antitela iz pronalaska mogu se proizvesti korišüenjem tehnika dobro poznatih u tehnici, npr., rekombinantnih tehnologija, tehnologija prikazivanja faga, sintetiþkih tehnologija ili kombinacija takvih tehnologija ili drugih tehnologija koje su u struci lako poznate (videti, na primer, Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50 (1999) and Fellouse, F.A., et al, J. Mol. Biol., 373(4):924-40 (2007)). Dodatna uputstva mogu se naüi u Sambrook J. & Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John & Sons, Inc. (2002); Harlow and Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold
1
Spring Harbor, N.Y. (1998); and Coligan et al., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John & Sons, Inc. (2003). Reprezentativne metode su takoÿe opisane u Primeru 1 ovde u nastavku.
[0110] Uopšteno, za proizvodnju üelijskih linija hibridoma, put i raspored imunizacije životinje domaüina uglavnom su u skladu sa ustaljenim i konvencionalnim tehnikama za stimulaciju i proizvodnju antitela. Smatra se da bilo kojim subjektom sisara, ukljuþujuüi ljude ili üelije koje proizvode antitela od njega, može se manipulisati kako bi poslužilo kao osnova za proizvodnju sisara, ukljuþujuüi üelijske linije þoveka i hibridoma. Tipiþno, životinja domaüina se inokulira intraperitonealno, intramuskularno, oralno, subkutano, intraplantarno i / ili intradermalno sa koliþinom imunogena, ukljuþujuüi kako je ovde opisano.
[0111] Hibridomi se mogu pripremiti iz limfocita i imortalizovanih üelija mijeloma koristeüi opštu tehniku hibridizacije somatskih üelija Kohler, B. i Milstein, C., Nature 256:495-497, 1975 ili kako je modifikovano od strane Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381, 1982. Dostupne linije mijeloma, ukljuþujuüi, ali bez ograniþenja, Ks63-Ag8.653 i one iz Salk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USA, mogu se koristiti u hibridizaciji. Uopšteno, tehnika ukljuþuje stapanje üelija mijeloma i limfoidnih üelija upotrebom fusogena kao što je polietilen glikol ili elektriþnim sredstvima dobro poznatim struþnjacima. Nakon fuzije, üelije su odvojene od fuzionog medija i gajene u selektivnom medijumu za rast, kao što je medijum hipoksantinaminopterin-timidin (HAT), da bi se eliminisale nehibridizovane matiþne üelije. Bilo koji od ovde opisanih medija, dopunjen sa ili bez seruma, može se koristiti za kultivisanje hibridoma koji luþe monoklonska antitela. Kao druga alternativa tehnici üelijske fuzije, EBV imortalizovane B üelije mogu se koristiti za proizvodnju PTK7 monoklonskih antitela predmetnog pronalaska. Hibridomi se po želji proširuju i subkloniraju, a supernatanti se ispituju na anti-imunogenu aktivnost konvencionalnim postupcima imunoanalize (npr., radioimunološki test, imunološki test ili fluorescentni imunološki test). Hibridomi koji se mogu koristiti kao izvor antitela obuhvataju sve derivate, progenske üelije matiþnih hibridoma koji proizvode monoklonska antitela specifiþna za PTK7 ili njihov deo.
[0112] Hibridomi koji proizvode takva antitela mogu se uzgajati in vitro ili in vivo koristeüi poznate postupke. Monoklonska antitela mogu se izolovati iz medijuma za kulturu ili telesnih teþnosti, konvencionalnim postupcima preþišüavanja imunoglobulina, kao što je taloženje amonijum sulfata, gel elektroforeza, dijaliza, hromatografija i ultrafiltracija, ako je to potrebno. Neželjena aktivnost, ako je prisutna, može se ukloniti, na primer, prenošenjem preparata preko
2
adsorbenta napravljenih od imunogena priþvršüenog za þvrstu fazu i eluiranjem ili oslobaÿanjem željenih antitela sa imunogena. Imunizacija životinje domaüina sa humanim PTK7 ili fragmentom koji sadrži ciljanu amino kiselinsku sekvencu konjugovanu sa proteinom koji je imunogen u vrstama koje se imunizuju, npr., hemocijanin u limenci u kljuþaonici, serumski albumin, tiroglobulin goveÿeg mesa ili inhibitor tripsina soje bifunkcionalno ili derivatizujuüe sredstvo, na primer, maleimidobenzoil sulfosukcinimidni estar (konjugacija kroz ostatke cisteina), N-hidroksisukcinimid (kroz ostatke lizina), glutaraldehid, anhidrid sukinske kiseline, SOCl2ili R<1>N = C = NR, gde su R i R<1>razliþite alki grupe, može dati populaciju antitela (npr., monoklonska antitela).
[0113] Ako se želi, PTK7 antitelo (monoklonsko ili poliklonsko) od interesa može biti sekvencirano, a polinukleotidna sekvenca se zatim može klonirati u vektor za ekspresiju ili propagaciju. Sekvenca koja kodira antitelo od interesa može se održati u vektoru u üeliji domaüina, a üelija domaüina se zatim može proširiti i zamrznuti za buduüu upotrebu.
Proizvodnja rekombinantnih monoklonskih antitela u üelijskoj kulturi se može izvršiti kloniranjem gena antitela iz B üelija na naþin poznat u struci. Videti, npr. Tiller et al., J. Immunol. Methods 329:112-124 (2008); U.S. Patent Br.7,314,622.
[0114] "ûelija domaüin" ukljuþuje pojedinaþnu üeliju ili üelijsku kulturu koja može biti ili je bila primalac vektora za ugradnju polinukleotidnih umetaka. ûelije domaüina ukljuþuju potomstvo jedne üelije domaüina, a potomstvo ne mora nužno biti potpuno identiþno (u morfologiji ili u komplementu genomske DNK) originalnoj matiþnoj üeliji zbog prirodne, sluþajne ili namerne mutacije. ûelija domaüina ukljuþuje üelije transfekovane in vivo sa polinukleotidom(ima) iz ovog pronalaska.
[0115] Izraz "vektor" oznaþava konstrukciju koja je sposobna da isporuþi i, poželjno, da ekspresuje jedan ili više gena ili sekvenci (a) od interesa u üeliji domaüinu. Primeri vektora ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, virusne vektore, gole vektore ekspresije DNK ili RNK, plazmidne, kozmidne ili fagne vektore, vektore ekspresije DNK ili RNK povezane sa katjonskim kondenzacionim agensima, vektore ekspresije DNK ili RNK kapsulirane u lipozome i odreÿene eukariotske üelije, poput üelija proizvoÿDþa.
[0116] Izraz "sekvenca za kontrolu ekspresije" oznaþava sekvencu nukleinske kiseline koja usmerava transkripciju nukleinske kiseline. Kontrolna sekvenca ekspresije može biti promoter, kao što je konstitutivni ili inducibilni promotor, ili pojaþivaþ. Kontrolna sekvenca ekspresije operativno je povezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja se transkribuje.
[0117] Alternativno, polinukleotidna sekvenca se može koristiti za genetsku manipulaciju za „humanizaciju“ antitela ili za poboljšanje afiniteta ili drugih karakteristika antitela. Na primer, konstantni region može biti napravljen tako da više liþi na humani konstantni region kako bi se izbegao imuni odgovor ako se antitelo koristi u kliniþkim ispitivanjima i leþenju na ljudima.
Možda üe biti poželjno genetski manipulisati sekvencom antitela da bi se dobio veüi afinitet prema PTK7 i veüa efikasnost u inhibiciji PTK7.
[0118] Postoje þetiri opšta koraka koja se mogu koristiti za humanizaciju monoklonskih antitela: (1) odreÿivanje nukleotida i predviÿene amino kiselinske sekvence polaznog lakog i teškog varijabilnog domena antitela (2) dizajniranje humanizovanog antitela, odn., odluþivanje koji okvirni region antitela da se tokom procesa humanizacije koriste (3) stvarne humanizujuüe metodologije / tehnike i (4) transfekcija i ekspresija humanizovanog antitela. Vidi, na primer, U.S. Patente br.4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; i 6,180,370.
[0119] Humanizovana antitela se mogu pripremiti korišüenjem bilo koje od razliþitih metoda, ukljuþujuüi furniranje, kalemljenje regiona koji odreÿuju komplementarnost (CDRs), kalemljenje skraüenih CDR, kalemljenje regiona koji odreÿuju specifiþnost (SDRs) i Frankenstein skup, kao što je opisano u nastavku. Humanizovana antitela takoÿe ukljuþuju superhumanizovana antitela, u kojima je u CDRs uvedena jedna ili više promena. Na primer, ljudski ostaci mogu biti zamenjeni ne-humanim ostacima u CDRs. Ovi opšti pristupi mogu se kombinovati sa standardnim tehnikama mutageneze i sinteze da bi se proizvelo antitelo protiv PTK7 bilo koje željene sekvence.
[0120] Furniranje se zasniva na konceptu smanjenja potencijalno imunogenih amino kiselinskih sekvenci kod glodara ili drugog ne-humanog antitela obnavljanjem spoljašnjeg dela antitela dostupnog rastvaraþu humanim amino kiselinskim sekvencama. Prema tome, furnirana antitela izgledaju manje strana humanim üelijama od nemodifikovanih ne-humanih antitela. Videti Padlan (1991) Mol. Immunol.28: 489-98. Ne-humano antitelo je furnirano identifikovanjem izloženih ostataka spoljašnjeg okvira u ne-humanom antitelu, koji se razlikuju od onih na istim
4
položajima u okvirnim regionima humanog antitela, i zamenom identifikovanih ostataka amino kiselinama koje tipiþno zauzimaju iste te položaje u humanim antitelima.
[0121] Kalemljenje CDRs se izvodi zamenom jednog ili više CDRs akceptorskog antitela (npr., humanog antitela ili drugog antitela sa željenim okvirnim ostacima) sa CDRs donatorskog antitela (npr., ne-humanog antitela). Akceptorska antitela se mogu odabrati na osnovu sliþnosti okvirnih ostataka izmeÿu antitela kandidata za akceptor i donora antitela. Na primer, prema Frankensteinovom pristupu, identifikuju se humani okvirni regioni koji imaju znaþajnu homologiju sekvence za svaki okvirni region relevantnog ne-humanog antitela, a CDR ne-humanog antitela kalemljeni su na kompozit razliþitih humanih okvirnih regiona . Srodni postupak takoÿe koristan za pripremu antitela iz pronalaska je opisan u U.S. Patentu br.7,321,026.
[0122] Kalemljenje skraüenih CDRs je povezan pristup. Skraüeni CDRs ukljuþuju ostatke koji odreÿuju specifiþnost i susedne amino kiseline, ukljuþujuüi one na položajima 27d-34, 50-55 i 89-96 u lakom lancu i na položajima 31-35b, 50-58 i 95-101 u teškom lancu (konvencija o numerisanju (Kabat i sar. (1987)). Videti (Padlan i sar. (1995) FASEB J.9: 133-9). Kalemljenje ostataka koji odreÿuju specifiþnost (SDR) poþiva na shvatanju da specifiþnost vezivanja i afinitet mesta kombinovanja antitela odreÿuju se najpromenljivijim ostacima unutar svakog od regiona koji odreÿuju komplementarnost (CDR). Analiza trodimenzionalnih struktura kompleksa antitela antigena, kombinovana sa analizom dostupnih podataka o sekvenci amino kiselina mogu se koristiti za modeliranje varijabilnosti sekvence na osnovu strukturne razliþitosti amino kiselinskih ostataka koji se javljaju na svakom položaju unutar CDRs. SDRs su identifikovani kao minimalno imunogeni polipeptidni nizovi koji se sastoje od kontaktnih ostataka. Videti, Padlan et al. (1995) FASEB J.9: 133-139.
[0123] Uopšteno, humani akceptorski okviri su selektovani na osnovu da su oni suštinski sliþni okvirnim regionima donora antitela, ili koji su veþinski sliþni konsenzusnoj sekvenci varijabilnog regiona podfamilije. Prateüi kalemljenje, dodatne promene se mogu napraviti u donorskoj i / ili akceptorskoj sekvenci kako bi se optimizovao vaezivanje antitela, funkcionalnost, upotreba kodona, ekspresioni nivoi, itd., ukljuþujuüi uvoÿenje ne-humanih ostataka u okvirne regione. Videti npr., PCT meÿunarodnu objavu br. WO 91/09967.
[0124] Za kalemljenje CDRs na varijabilni okvirni region teškog lanca, korisne sekvence okvira mogu se dobiti iz DP-21 (VH7), DP-54 (VH3-07), DP-47 (VH3-23), DP-53 (VH-74), DP-49 (VH330), DP-48 (VH3-13), DP-75, DP-8(VH1-2), DP-25, VI-2b and VI-3 (VH1-03), DP-15 i V1-8 (VH1-08), DP-14 i V1-18 (VH1-18), DP-5 i V1-24P (VH1-24), DP-4 (VH1-45), DP-7 (VH1-46), DP-10, DA-6 i YAC-7 (VH1-69), DP-88 (VH1-e), DP-3 i DA-8 (VH1-f). Za kalemljenje CDRs na varijabilni okvirni region lakog lanca, korisne sekvence okvira mogu se izvesti iz DPK24 podgrupe IV germ linije klona, podgrupe Will (DPK23, DPK22, DPK20, DPK21), ili VțI podgrupe germ linije klona (DPK9, DPK1, O2, DPK7).
[0125] Fragmenti koji se vezuju za antigen ili fragmenti antitela se mogu dobiti proteolitiþkom ili drugom razgradnjom antitela, rekombinantnim metodama (odn., pojedinaþnim ili fuzionim polipeptidima) kako je gore opisano ili hemijskom sintezom. Polipeptidi antitela, naroþito kraüi polipeptidi do oko 50 amino kiselina, pogodno se dobijaju hemijskom sintezom. Postupci hemijske sinteze su poznati u tehnici i komercijalno su dostupni. Na primer, antitelo ili fragment antitela može se proizvesti automatskim sintetizatorom polipeptida primenom metode u þvrstoj fazi. Takoÿe videti, U.S. Patente br.5,807,715; 4,816,567; i 6,331,415.
[0126] U drugim aspektima pronalaska, konjugati PTK7 antitelo-lek ukljuþuju antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region hu23, hu24 ili hu58 teškog lanca i / ili lakog lanca, ili varijabilni region koji je u suštini sliþan hu23, hu24 ili hu58 varijabilnom regionu teškog lanca ili lakog lanca.
[0127] Kao što se primenjuje na polipeptide, izraz ’’suštinski identitet“ ili ’’znaþajna sliþnost“ znaþi da dve amino kiselinske sekvence, kada su optimalno poravnate, kao što su sa programima GAP ili BESTFIT, koristeüi zadate težine gapova, isporuþene sa programima, dele najmanje 70% , 75% ili 80% identiteta sekvence, poželjno najmanje 90% ili 95% identiteta sekvence, i još poželjnije najmanje 97%, 98% ili 99% identiteta sekvence. U nekim suštinski sliþnim amino kiselinskims ekvencama, položaji ostataka koji nisu identiþni razlikuju se konzervativnim amino kiselinskim supstitucijama.
[0128] Suštinski sliþni polipeptidi takoÿe ukljuþuju konzervativno supstituisane varijante u kojima je jedan ili više ostataka konzervativno supstituisano sa funkcionalno sliþnim ostatkom. Primeri konzervativnih supstitucija ukljuþuju supstituciju jednog nepolarnog (hidrofobnog) ostatka kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin drugim; supstitucija jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka za drugi, na primer izmeÿu arginina i lizina, izmeÿu glutamina i asparagina, izmeÿu glicina i serina; supstitucija jednog osnovnog ostatka kao što je lizin, arginin ili histidin drugim; ili supstitucija jednog kiselog ostatka, kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina, drugim.
[0129] Sledeüi pokazatelj da su dva proteina u osnovi identiþna jeste da dele ukupnu trodimenzionalnu strukturu ili su biološki funkcionalni ekvivalenti.
[0130] U nekim aspektima pronalaska, konjugat antitelo-lek, koji se vezuje za PTK7, ukljuþuje antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca naveden kao bilo koji od SEQ ID NO: 1, 25, ili 49 i / ili varijabilni region lakog lanca naveden kao bilo koji od SEQ ID NO: 15, 39 ili 63. Na primer, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 15; ili antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 1 i varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 15. Kao drugi primer, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca koji imaju amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 39; ili antitelo, ili njegov fragmentkoji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 25 i varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 39. Kao drugi primer, konjugat PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može da sadrži antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca koji imaju amino kiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identiþna SEQ ID NO: 63; ili antitelo, ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji ima varijabilni region teškog lanca naveden kao SEQ ID NO: 49 i varijabilni region lakog lanca koji ima amino kiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 63.
[0131] Antitela se takoÿe mogu modifikovati, npr. u varijabilnim domenima teškog i / ili lakog lanca, na primer, da promene svojstvo vezivanja antitela. Na primer, može se napraviti mutacija u jednom ili više CDR regiona da bi se poveüao ili smanjio KD antitela za PTK7, poveüao ili smanjio Koffili promenila specifiþnost vezivanja antitela. Tehnike mutageneze usmerene na lokaciju su dobro poznate u tehnici. Videti, npr., Sambrook et al. and Ausubel et al., supra.
[0132] Modifikacija ili mutacija se takoÿe može izvršiti u okvirnom ili konstantnom regionu da bi se poveüao poluživot PTK7 antitela. Videti, npr. PCT meÿunarodnu objavu br. WO 00/09560. Takoÿe se može izvršiti mutacija u okvirnom ili konstantnom regionu da bi se izmenila imunogenost antitela, da bi se obezbedilo mesto za kovalentno ili nekovalentno vezivanje za drugi molekul ili da bi se izmenila takva svojstva kao što su fiksacija komplementa, vezivanje FcR i üelijski posredovano zavisno od antitela citotoksiþnost. Prema pronalasku, pojedinaþno antitelo može imati mutacije u bilo kojem jednom ili više CDRs ili okvirnih regiona varijabilnog domena ili u konstantnom regionu.
[0133] U procesu poznatom kao „klijanje“, odreÿene amino kiseline u VH i VL sekvencama mogu biti mutirane tako da se podudaraju sa onima koje se prirodno nalaze u germlinisjkim VH i VL sekvencama. Naroþito, amino kiselinske sekvence okvirnih regiona u VH i VL sekvencama mogu biti mutirane tako da se podudaraju sa germlinijskim sekvencama kako bi se smanjio rizik od imunogenosti kada se daje antitelo. Kako se ovde koristi, izraz "germlinijska" odnosi se na nukleotidne sekvence i sekvence amino kiselina gena antitela i segmenata gena dok se prenose sa roditelja na potomstvo putem polnih üelija. Ova germlinijska sekvenca se razlikuje od nukleotidnih sekvenci koje kodiraju antitela u zrelim B üelijama koje su izmenjene dogaÿajima rekombinacije i hipermutacije tokom sazrevanja B üelija. Antitelo koje „koristi“ odreÿenu germliniju ima nukleotidnu ili amino kiselinsku sekvencu koja se najbliže poklapa sa tom nukleotidnom sekvencom germlinije ili sa amino kiselinskom sekvencom koju ona navodi. Takva antitela su þesto mutirana u poreÿenju sa germlinijskom sekvencom. Germlinijska DNK sekvenca za humane VH i VL gene su poznate u tehnici (videti npr., the "Vbase" human germline sequence database; see also Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242; Tomlinson et al., J. Mol. Biol.227:776-798, 1992; and Cox et al., Eur. J. Immunol.24:827-836, 1994.
[0134] Druga vrsta amino kiselinske supstitucije koja se može izvršiti je uklanjanje potencijalnih proteolitiþkih mesta u antitelu. Takva mesta mogu da se pojave u CDR ili u okviru regiona varijabilnog domena ili u konstantnom regionu antitela. Zamena ostataka cisteina i uklanjanje proteolitiþkih mesta mogu smanjiti rizik od heterogenosti u proizvodu antitela i tako poveüati njegovu homogenost. Druga vrsta amino kiselinske supstitucije jeste uklanjanje parova asparagin-glicin, koji þine potencijalna mesta deamidacije, promenom jednog ili oba ostatka. U drugom primeru, C-terminalni lizin teškog lanca PTK7 antitela iz pronalaska može da se odcepi. U razliþitim aspektima pronalaska, teški i laki lanci PTK7 antitela mogu opciono da sadrže signalnu sekvencu.
[0135] Da bi se ekspresovala PTK7 antitela predmetnog pronalaska, DNK fragmenti koji kodiraju VH i VL regione mogu se prvo dobiti korišüenjem bilo koje gore opisane metode. Kao što je poznato u struci, "polinukleotid", "nukleinska kiselina / nukleotid" i "oligonukleotid" se ovde koriste naizmeniþno i ukljuþuju polimerne oblike nukleotida bilo koje dužine, bilo deoksiribonukleotide ili ribonukleotide, njihove analoge ili bilo koji supstrat koji može biti ugraÿeni u lanac pomoüu DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotidi mogu imati bilo koju trodimenzionalnu strukturu i mogu vršiti bilo koju funkciju, poznatu ili nepoznatu. Slede neograniþavajuüi primeri polinukleotida: gen ili fragment gena, egzoni, introni, mesendžer RNK (mRNA), transfer RNK, ribozomalna RNK, ribozimi, DNK, cDNK, genomska DNK, rekombinantni polinukleotidi, razgranati polinukleotidi, plazmidi, vektori , izolovana DNK bilo koje sekvence, izolovana RNK bilo koje sekvence, sonde nukleinske kiseline i prajmeri.
Polinukleotidi mogu biti prirodni, sintetiþki, rekombinantni ili bilo koja njihova kombinacija.
Polinukleotid može sadržati modifikovane nukleotide, kao što su metilirani nukleotidi i njihovi analogi. Ako je prisutna, modifikacija nukleotidne strukture može se dati pre ili posle sklapanja lanca. Sekvenca nukleotida može biti prekinuta ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon polimerizacije, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Druge vrste modifikacija ukljuþuju, na primer, "kape", supstituciju jednog ili više prirodnih nukleotida sa analognim, internukleotidnim modifikacijama, kao što su, na primer, one sa nenaelektrisanim vezama (npr., metil fosfonati, fosfotristri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa naelektrisanim vezama (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji sadrže privezne ostatke, kao što su, na primer, proteini (npr., nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, poli-L-lizin, itd.), oni sa interkalatorima (npr., akridin, psoralen itd.), oni koji sadrže helatore (npr., metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali itd.), oni koji sadrže alkilatore, oni sa modifikovanim vezama (npr., alfa anomerni nukleinske kiseline itd.), kao i nemodifikovani oblici polinukleotida (a). Dalje, bilo koja hidroksilna grupa koja je obiþno prisutna u šeüerima može biti zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštiüenim standardnim zaštitnim grupama, ili aktiviranim za pripremu dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili može biti konjugovana sa þvrstim nosaþima.5 ’i 3’ terminalni OH mogu biti fosforilisani ili supstituisani aminima ili organskim ostacima grupe od 1 do 20 atoma ugljenika. Ostali hidroksili se takoÿe mogu derivatizovati u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi takoÿe mogu da sadrže analogne oblike šeüera riboze ili deoksiriboze koji su opšte poznati u struci, ukljuþujuüi, na primer, 2'-O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ili 2'-azido- riboza, analozi karbocikliþnog šeüera, alfa- ili beta-anomerni šeüeri, epimerni šeüeri kao što su arabinoza, ksiloze ili liksoze, piranozni šeüeri, furanozni šeüeri, sedoheptuloze, acikliþni analozi i abasiþni nukleozidni analozi kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza mogu biti zamenjene alternativnim veznim grupama. Ove alternativne grupe za povezivanje ukljuþuju, ali nisu ograniþene na, karakteristike u kojima je fosfat zamenjen sa P (O) S ("tioat"), P (S) S ("ditioat"), (O) NR2("amidat"), P(O)R, P(O)OR ', CO ili CH2("formacetal"), u kojima je svaki R ili R' nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etar (-O -) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu biti identiþne. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide na koje se ovde odnosi, ukljuþujuüi RNK i DNK.
[0136] Reprezentativne DNK koje kodiraju varijabilne regione teškog lanca i lakog lanca anti-PTK7 antitela predstavljene su kao SEQ ID NO: 2 (hu23 VH DNA), SEQ ID NO: 16 (hu23 VL DNA), SEQ ID NO: 26 (hu24 VH DNA) , SEQ ID NO: 40 (hu24 VL DNA), SEQ ID NO: 50 (hu58 VH DNA) i SEQ ID NO: 64 (hu58 VL DNA). Reprezentativne DNK koje kodiraju teške lance i lake lance anti-PTK7 antitela predstavljene su kao SEQ ID NO: 14 (hu23 HC DNA), SEQ ID NO: 24 (hu23 LC DNA), SEQ ID NO: 38 (hu24 HC DNA), SEQ ID NO: 48 (hu24 LC DNK), SEQ ID NO: 62 (hu58 HC DNK) i SEQ ID NO: 72 (hu58 LC DNA)
[0137] Razne modifikacije, npr. mutacije, supstitucije, delecije i / ili dodaci se takoÿe mogu uvesti u sekvence DNK hu23, hu24 i hu58 primenom standardnih postupaka poznatih struþnjacima. Na primer, mutageneza se može izvesti standardnim metodama, poput mutageneze posredovane PCR-om, u kojoj se mutirani nukleotidi ugraÿuju u PCR prajmere tako da PCR proizvod sadrži željene mutacije ili mutagenezu usmerenu na lokaciju.
[0138] Shodno tome, na osnovu otkrivanja trenutne prijave, struþnjak u ovoj oblasti lako bi prepoznao sekvence DNK u osnovi sliþne hu23, hu24 i hu58 DNK. Izraz „suštinska sliþnost“ ili „znaþajna sliþnost sekvence“, kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili njen fragment, znaþi da kada je optimalno poravnat sa odgovarajuüim nukleotidnim insercijama ili delecijama sa drugom nukleinskom kiselinom (ili njenim komplementarnim lancem), postoji identitet nukleotidne sekvence u najmanje oko 85%, poželjno najmanje oko 90%, a poželjnije najmanje oko 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% baza nukleotida, mereno bilo kojim dobro poznatim algoritmom identiteta sekvence , kao takav FASTA, BLAST ili Gap.
4
[0139] Izraz ’’procenat identiteta sekvence“ u kontekstu sekvenci nukleinske kiseline oznaþava ostatke u dve sekvence koji su isti kada se poravnaju radi maksimalne korespondencije. Dužina poreÿenja identiteta sekvenci može biti na potezu od najmanje oko devet nukleotida, obiþno najmanje oko 18 nukleotida, obiþno najmanje oko 24 nukleotida, tipiþno najmanje oko 28 nukleotida, tipiþnije najmanje oko 32 nukleotida, i poželjno najmanje oko 36, 48 ili više nukleotida. U struci je poznat niz razliþitih algoritama koji se mogu koristiti za merenje identiteta nukleotidne sekvence. Na primer, polinukleotidne sekvence se mogu uporeÿivati pomoüu FASTA, Gap ili Bestfit, koji su programi u Wisconsin Package Version 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, koji ukljuþuje, na primer, programe FASTA2 i FASTA3, pruža poravnanja i procentualni identitet sekvence regiona najboljeg preklapanja izmeÿu upita i sekvenci pretraživanja (Pearson, Methods Enzymol.183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol.132:185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol.266:227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol.276:71-84 (1998). Ako nije drugaþije naznaþeno, koriste se zadati parametri za odreÿeni program ili algoritam. Na primer, procenat identiteta sekvence izmeÿu sekvenci nukleinske kiseline može se odrediti pomoüu FASTA sa njenim zadatim parametrima (veliþina reþi 6 i NOPAM faktor za matricu bodovanja) ili pomoüu Gap sa njenim zadanim parametrima kako je predviÿeno u GCG Version 6.1.
[0140] Sledeüi pokazatelj da su dve sekvence nukleinskih kiselina u osnovi identiþne je da su proteini kodirani nukleinskim kiselinama u osnovi identiþni, dele ukupnu trodimenzionalnu strukturu ili su biološki funkcionalni ekvivalenti. Ovi pojmovi su dalje ovde definisani. Molekuli nukleinske kiseline koji se meÿusobno ne hibridizuju pod strogim uslovima su i dalje u osnovi identiþni ako su odgovarajuüi proteini u osnovi identiþni. To se može dogoditi, na primer, kada dve nukleotidne sekvence sadrže konzervativno supstituisane varijante kako je to dozvoljeno genetskim kodom.
[0141] Konzervativno supstituisane varijante su sekvence nukleinske kiseline koje imaju degenerisane supstitucije kodona gde je treüi položaj jednog ili više izabranih (ili svih) kodona supstituisan ostacima mešane baze i / ili deoksiinozina. Vidite Batzer et al. (1991) Nucleic Acids Res.19:5081; Ohtsuka et al. (1985) J. Biol. Chem.260:2605-2608; and Rossolini et al. (1994) Mol. Cell Probes 8:91-98.
[0142] Jedna vrsta supstitucije, na primer, koja se može izvršiti je promena jednog ili više cisteina u antitelu, koji mogu biti hemijski reaktivni, u drugi ostatak, kao što je, bez ograniþenja, alanin ili serin. Na primer, može doüi do zamene nekanonskog cisteina. Supstitucija se može izvršiti u CDR ili okvirnom regionu varijabilnog domena ili u konstantnom regionu antitela. Kao još jedan primer, cistein može biti kanonski.
[0143] Jednom kada se dobiju fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL segmente predmetnog pronalaska, ovim fragmentima DNK može se dalje manipulisati standardnim tehnikama rekombinantne DNK, na primer za pretvaranje gena varijabilnog regiona u gene lanca antitela pune dužine, u gene fragmenata Fab, ili na scFv gen. U ovim manipulacijama, fragment DNK koji kodira VL ili VH operativno je povezan sa drugim fragmentom DNK koji kodira drugi protein, kao što je konstanti region antitela ili fleksibilni linker. Izraz „operativno povezan“, kako se koristi u ovom kontekstu, podrazumeva da se dva DNK fragmenta spoje tako da amino kiselinske sekvence kodirane sa dva fragmenta DNK ostanu u okviru.
[0144] Izolovana DNK koja kodira VH region može se pretvoriti u gen teškog lanca pune dužine operativnim povezivanjem DNK koja kodira VH sa drugim molekulom DNK koji kodira konstantne regione teškog lanca (CH1, CH2 i CH3). Sekvence gena konstantnog regiona teškog lanca þoveka su poznate u tehnici (videti npr., Kabat, E. A., et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Objava Br.91-3242) a fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region teškog lanca može biti IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ili IgD konstantni region, ali najpoželjnije je konstantan region IgG1 ili IgG2. Sekvenca konstantnog regiona IgG može biti bilo koji od razliþitih alela ili alotipova za koje se zna da se javljaju meÿu razliþitim pojedincima, kao što su Gm(1), Gm(2), Gm(3) i Gm(17). Ovi alotipovi predstavljaju supstituciju amino kiselina koja se javlja u prirodi u konstantnim regionima IgG1. Za gen teškog lanca Fab fragmenta, DNK koja kodira VH može se operativno povezati sa drugim molekulom DNK koji kodira samo CH1 konstantni region teškog lanca. Stalni region teškog lanca CH1 može se dobiti iz bilo kog gena teškog lanca.
[0145] Izolovana DNK koja kodira VL region može se pretvoriti u gen lakog lanca pune dužine (kao i Fab gen lakog lanca) operativnim povezivanjem DNK koja kodira VL sa drugim molekulom DNA koji kodira konstantni region lakog lanca, CL. Sekvence humanog gena konstantnog regiona lakog lanca poznate su u tehnici (videti npr., Kabat, E. A., etal., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Objava Br.91-3242) a fragmenti DNK koji obuhvataju ove regione mogu se dobiti standardnom PCR amplifikacijom. Konstantni region lakog lanca može biti kapa ili lambda konstantan region. Kapa konstantni region može biti bilo koji od razliþitih alela za koje se zna da se javljaju meÿu razliþitim pojedincima, kao što su Inv(1), Inv(2) i Inv(3). Lambda konstantni region može biti izveden iz bilo kog od tri lambda gena.
[0146] Da bi se stvorio scFv gen, fragmenti DNK koji kodiraju VH i VL operativno su povezani sa drugim fragmentom koji kodira fleksibilni veznik tako da se sekvence VH i VL mogu izraziti kao susedni jedno lanþani protein, sa VL i VH regionima pridruženi sa fleksibilnim veznikom (Videti npr., Bird et al., 1988, Science 242:423-426; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., 1990, Nature 348:552-554. Jedno lanþana antitela mogu biti monovalentna, ako se koriste samo jedan VH i VL, dvovalentna, ako se koriste dva VH i VL, ili polivalentna, ako se koriste više od dva VH i VL. Mogu se stvoriti bispecifiþna ili polivalentna antitela koja se specifiþno vezuju za PTK7 i drugi molekul.
[0147] U drugom aspektu pronalaska, može se napraviti fuziono antitelo ili imunoadhezin koji ukljuþuje celo ili deo PTK7 antitelo iz pronalaska povezano za drugi polipeptid. U drugom aspektu, samo su varijabilni domeni PTK7 antitela povezani sa polipeptidom. U drugom aspektu, VH domen PTK7 antitela je povezan sa prvim polipeptidom, dok je VL domen PTK7 antitela povezan sa drugim polipeptidom koji se povezuje sa prvim polipeptidom na naþin da VH i VL domeni mogu da interaguju jedan sa drugim da bi formirali mesto vezivanja antigena. U drugom aspektu, VH domen je odvojen od VL domena pomoüu veznika tako da VH i VL domeni mogu meÿusobno da komuniciraju. VH-veznik-VL antitelo je zatim povezano sa polipeptidom od interesa. Pored toga, mogu se stvoriti fuzijska antitela u kojima su dva (ili više) jedno lanþana antitela povezana jedno sa drugim. Ovo je korisno ako neko želi da stvori dvovalentno ili polivalentno antitelo na jednom polipeptidnom lancu ili ako želi da stvori bispecifiþno antitelo.
[0148] Druga modifikovana antitela mogu se pripremiti korišüenjem PTK7 antitela koja kodiraju molekule nukleinske kiseline. Na primer, "Kapa tela" (III et al., Protein Eng.10:949-57, 1997), "Minitela" (Martin et al., EMBO J., 13:5303-9, 1994), "Diatela" (Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448, 1993), ili "Janusini" (Traunecker et al., EMBO J.10:3655-3659, 1991 and Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7:51-52, 1992) mogu se dobiti korišüenjem standardnih tehnika molekularne biologije prateüi uþenja iz opisa.
4
[0149] Bispecifiþna antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu se proizvesti razliþitim metodama, ukljuþujuüi fuziju hibridoma ili povezivanje Fab’ fragmenata. Vidite, npr., Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol.79:315-321, 1990, Kostelny et al., J. Immunol.148:1547-1553, 1992. Pored toga, bispecifiþna antitela mogu se formirati kao „diatela“ ili „Janusini“. U nekim aspektima pronalaska, bispecifiþno antitelo se vezuje za dva razliþita epitopa PTK7. U drugim aspektima, modifikovana antitela opisana gore se pripremaju koristeüi jedan ili više varijabilnih domena ili CDR regiona iz PTK7 antitela koja su ovde data.
[0150] Za upotrebu u pripremi konjugata antitelo-lek, ovde opisana PTK7 antintela mogu biti u osnovi þista, odn. najmanje 50% þista (odn., bez zagaÿivaþa), još poželjnije, najmanje 90% þista, još poželjnije, najmanje 95% þista, a još poželjnija, najmanje 98% þista, a najpoželjnija, najmanje 99% þista.
[0151] Tabela 1 obezbeÿuje amino kiselinske (proteinske) sekvence i pridružene sekvence nukleinske kiseline (DNK) humanizovanih anti-PTK7 antitela predemtnog pronalaska. CDRs hu23 VH, hu23 VL, hu24 VH, hu24 VL, hu58 VH i hu58 VL kako su definisali Kabat i Chothia, predstavljeni su kao zasebne sekvence.
Tabela 1. Sekvence humanizovanih anti-PTK7 antitela.
4
4
4
4
4
1
2
II.B. Veznici
[0152] Konjugati anti-PTK7 antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu se pripremiti pomoüu veznika za povezivanje ili konjugaciju leka sa anti- PTK7 antitelom. Veznik je bifunkcionalno jedinjenje koje se može koristiti za povezivanje leka i antitela za formiranje konjugata leka antitela (ADC). Takvi konjugati su korisni, na primer, u formiranju imunokonjugata usmerenih protiv tumorskih antigena. Takvi konjugati omoguüavaju selektivnu isporuku citotoksiþnih lekova u üelije tumora. Pogodni veznici ukljuþuju, na primer, rascepljive i necepljive veznike. Cepivi veznik je obiþno podložan cepanju u intraüelijskim uslovima. Glavni mehanizmi kojima se konjugovani lek odvaja od antitela ukljuþuju hidrolizu kiselog pH lizozoma (hidrazoni, acetali i cis-akonitati sliþni amidi), cepanje peptida lizosomskim enzimima (katepsini i drugi lizosomski enzimi) i redukcija disulfida. Kao rezultat ovih razliþitih mehanizama cepanja, mehanizmi povezivanja leka sa antitelom takoÿe se veoma razlikuju i može se koristiti bilo koji pogodan veznik.
[0153] Pogodni cepljivi veznci ukljuþuju, na primer, peptidni veznik koji se može cepiti intraüelijskom proteazom, poput lizosomske proteaze ili endozomske proteaze. U aspektima pronalaska, veznik može biti dipeptidni veznik, kao što je valin-citrulin (val-cit), fenilalanin-lizin (phe-lis) veznik, ili maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc) veznik. U drugom aspektu, veznik može biti Sulfosukcinimidil-4- [Nmaleimidometil] cikloheksan-1-karboksilat (smcc). Konjugacija Sulfo-smcc se javlja preko maleimidne grupe koja reaguje sa sulfhidrilima (tioli, -SH), dok je njegov Sulfo-NHS estar reaktivan prema primarnim aminima (kao što se nalazi u lizinu i proteinu ili peptidnom N-kraju). Dalje, veznik može biti maleimidokaproil (mc).
[0154] Ostali pogodni veznici ukljuþuju veznike koji se hidrolizuju pri odreÿenom pH ili opsegu pH, kao što je hidrazonski veznik. Dodatni pogodni cepljivi veznici ukljuþuju disulfidne veznike. Veznik može biti kovalentno vezan za antitelo do te mere da se antitelo mora razgraditi intraüelijski da bi se lek oslobodio npr. mc veznik i sliþno.
[0155] U odreÿenim aspektima pronalaska, veznik konjugata PTK7 antitelo-lek može biti maleimidokaproil-valin-citrulin-p-aminobenziloksikarbonil (vc), maleimidokaproil (mc) ili AcBut.
[0156] Primer pogodnog postupka konjugacije oslanja se na konjugaciju hidrazida i drugih nukleofila sa aldehidima generisanim oksidacijom ugljenih hidrata koji se prirodno javljaju na antitelima. Konjugati koji sadrže hidrazon mogu se napraviti sa uvedenim karbonilnim grupama koje pružaju željena svojstva oslobaÿanja leka. Konjugati se takoÿe mogu napraviti pomoüu veznika koji na jednom kraju ima disulfid, u sredini alkilni lanac i na drugom kraju derivat hidrazina. Antraciklini su jedan od primera citotoksina koji se pomoüu ove tehnologije mogu konjugovati sa antitelim.
[0157] Veznici koji sadrže funkcionalne grupe koje nisu hidrazoni imaju potencijal da se cepaju u kiselom miljeu lizozoma. Na primer, konjugati mogu da se naprave od tiol-reaktivnih veziva koji sadrže mesto koje nije hidrazon i koje se cepa intraüelijski, kao što su estri, amidi i acetali / ketali. Kamptotecin je jedan citotoksiþni agens koje se može konjugovati koristeüi ove veznike. Takoÿe se mogu koristiti i ketali napravljeni od 5 do 7-þlana ketona u prstenu i koji ima jedan od
4
kiseonika vezan za citotoksiþni agens, a drugi za veznik za vezivanje antitela. Antraciklini su takoÿe primer pogodnog citotoksina za upotrebu sa ovim veznicima.
[0158] Još jedan primer klase pH osetljivih veznika su cis-akonitati, koji imaju karboksilnu kiselinu koja je u suprotnosti sa amidnom vezom. Karboksilna kiselina ubrzava hidrolizu amida u kiselim lizozomima. Takoÿe se mogu koristiti veznici koji postižu sliþan tip ubrzanja brzine hidrolize sa nekoliko drugih vrsta struktura. Maitansinoidi su primer citotoksina koji može da se konjuguje sa veznicima vezanim na C-9.
[0159] Još jedan metod potencijalnog oslobaÿanja za konjugate lekova je enzimatska hidroliza peptida pomoüu lizosomskih enzima. U jednom primeru, peptid je vezan amidnom vezom za para-aminobenzil alkohol, a zatim je napravljen karbamat ili karbonat izmeÿu benzil alkohola i citotoksiþnog agensa. Cepanje peptida dovodi do kolapsa ili samozapaljenja aminobenzil karbamata ili karbonata. Citotoksiþni agensi prikazani ovom strategijom ukljuþuju antracikline, taksane, mitomicin C i auristatine. U jednom primeru, fenol se takoÿe može osloboditi kolapsom veznika umesto karbamata. U drugoj varijaciji, redukcija disulfida se koristi za iniciranje kolapsa para-merkaptobenzil karbamata ili karbonata.
[0160] Mnogi citotoksiþni agensi konjugovani sa antitelima imaju malo, ako uopšte postoje, rastvorljivosti u vodi i to može ograniþiti optereüenje leka na konjugat zbog agregacije konjugata. Jedan od naþina da se ovo prevaziÿe je dodavanje rastvorljivih grupa u veznike. Mogu se koristiti konjugati napravljeni veznikom koji se sastoji od PEG i dipeptida, ukljuþujuüi one koji imaju PEG di-kiselinu, tiol-kiselinu ili maleimid-kiselinu vezanu za antitelo, dipeptidni odstojnik, i amidnu vezu sa aminom antraciklin ili analog duokarmicina. Sledeüi primer je konjugat pripremljen sa PEGkoji sadrži veznik disulfid vezanim za citotoksiþni agens i amidom vezanim za antitelo. Pristupi koji ukljuþuju PEG grupe mogu biti korisni u prevazilaženju agregacije i ograniþenja u optereüenju lekovima.
[0161] U.S. Patent Br.5,773,001 otkriva veznike koji se mogu koristiti sa nukleofilnim lekovima, posebno hidrazidima i srodnim nukleofilima, pripremljenim od kaliheamicina. Ovi veznici su posebno korisni u onim sluþajevima kada se postiže bolja aktivnost kada se veza koja nastaje izmeÿu leka i veznika hidrolizuje. Ovi veznici sadrže dve funkcionalne grupe, ukljuþujuüi (1) grupu za reakciju sa antitelom (npr., karboksilna kiselina) i (2) karbonilnu grupu (npr., aldehid ili keton) za reakciju sa lekom. Karbonilne grupe mogu da reaguju sa hidrazidnom grupom na leku da bi stvorile hidrazonsku vezu. Ova veza se može cepati, hidrolizuje se, omoguüavajuüi oslobaÿanje terapeutskog agensa iz konjugata nakon vezivanja za cilajne üelije. U odreÿenim aspektima pronalaska, veznik konjugata PTK7 antitelo-lek iz pronalaska može 4- (4-acetilfenoksi) butanska kiselina (AcBut). U drugim aspektima pronalaska, konjugati antitela i leka mogu se pripremiti upotrebom (3-acetilfenil) sirüetne kiseline (AcPAc) ili 4-merkapto-4-metil-pentanske kiseline (amida) kao molekula veze.
[0162] N-hidroksisukcinimidni (OSu) estri ili drugi uporedivo aktivirani estri mogu se koristiti za generisanje aktiviranog hidrolizujuüeg ostatka veznik-leka. Primeri drugih pogodnih aktivirajuüih estara ukljuþuju NHS (N-hidroksisukcinimid), sulfo-NHS (sulfonirani NHS), PFP (pentafluorofenil), TFP (tetrafluorofenil) i DNP (dinitrofenil).
[0163] U nekim aspektima pronalaska, konjugati antitelo-lek se pripremaju reakcijom kaliheamicina ili njegovih derivata, AcBut veznika i anti-PTK7 antitela predmetnog pronalaska. Videti, na primer, U.S. Patent br.5,773,001. AcBut veznik proizvodi konjugate koji su u osnovi stabilni u cirkulaciji, oslobaÿajuüi procenjenih 2% kaliheamicina dnevno kada se ispituje na 37 °C u humanoj plazmi in vitro. Konjugati oslobaÿaju kaliheamicin u kiselim lizozomima.
[0164] U nekim aspektima pronalaska, AcButCM deo se može generisati upotrebom metoda i procesa opisanih u tehnici, kao što je PCT meÿunarodna objava br. WO 08/147765 i u U.S. Patent Br.8,273,862.
[0165] U nekim aspektima pronalaska, AcButCM deo se može generisati korišüenjem poboljšanog procesa sinteze, kao što je opisano u U.S. Provizornoj Prijavi Br.61/899,682.
[0166] Reprezentativni veznici korisni za konjugaciju radioizotopa ukljuþuju dietilenetriamin pentaacetat (DTPA) -izotiocijanat, sukcinimidil 6-hidrazinijum nikotinat hidrohlorid (SHNH) i heksametilpropilen amin oksim (HMPAO) (Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med.31: 1501-1509, Chattopadhyay et al. (2001) Nucl. Med. Biol.28: 741-744, Dewanjee et al. (1994) J. Nucl. Med.
35: 1054-63, Krenning et al. (1989) Lancet 1: 242-244, Sagiuchi et al. (2001) Ann. Nucl. Med.
15: 267-270); U.S. Pat. Br.6,024,938). Alternativno, ciljani molekul može biti izveden tako da se radioizotop može vezati direktno za njega (Yoo et al. (1997) J. Nucl. Med.38: 294-300). Metode jodiranja su takoÿe poznate u tehnici, a reprezentativni protokoli se mogu naüi, na primer, u Krenning et al. (1989) Lancet 1:242-4 i u Bakker et al. (1990) J. Nucl. Med.31:1501-9.
II.C. Lekovi
[0167] Lekovi korisni u pripremi otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek ukljuþuju bilo koju supstancu koja ima biološku ili detektivnu aktivnost, na primer, terapeutske agense, detektujuüu oznake, vezivni agensi, itd., i prolekove, koji se metabolišu u aktivni agens in vivo. Lek takoÿe može biti derivat leka, pri þemu je lek funkcionalizovan da omoguüi konjugaciju sa antitelom iz pronalaska. U skladu sa otkrivenim metodama, lekovi se koriste za pripremu konjugata antitelolek formule Ab- (L-D), gde (a) Ab je antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, koji se vezuje za PTK7; i (b) L-D je ostatak veznik-lek, pri þemu L je veznik, a D je lek. Odnos leka i antitela (DAR) ili optereüenje lekom ukazuje na broj molekula leka (D) koji su konjugovani po antitelu. Konjugati antitelo-lek predemtnog pronalaska imaju DAR u opsegu od 1 do 8. Dakle, u aspektima pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek može sadržati 1 molekul leka (DAR 1) ili 2 leka molekula (DAR od 2), ili 3 molekula leka (DAR od 3), ili 4 molekula leka (DAR od 4), ili 5 molekula leka (DAR od 5), ili 6 molekula leka (DAR od 6), ili 7 molekula leka (DAR od 7), ili 8 molekula lekova (DAR od 8). DAR se može odrediti razliþitim konvencionalnim sredstvima kao što su UV spektroskopija, masena spektroskopija, ELISA test, radiometrijske metode, hidrofobna interakciona hromatografija (HIC), elektroforeza i HPLC.
[0168] Kompozicije, serije i / ili formulacije konjugata antitelo-lek (ADC), formule Ab- (L-D), mogu da ukljuþuju mnoštvo antitela, svako antitelo konjugovano sa odreÿenim brojem molekula leka (od DAR 1 do 8). Kompozicije, serije i / ili formulacije imaju proseþni DAR.
[0169] U odreÿenim aspektima pronalaska, kompozicija, serija i / ili formulacija konjugata antitelo-lek mogu biti okarakterisani proseþnim DAR u opsegu od oko 1 do oko 8, na primer, proseþnim DAR u opsegu od oko 2 do oko 7, ili proseþni DAR u opsegu od oko 3 do oko 6, ili proseþni DAR u opsegu od oko 4 do oko 5, ili proseþni DAR u opsegu od oko 5 do oko 7, ili proseþni DAR u opsegu od oko 6 do oko 8. U nekim aspektima kompozicije, serije i / ili formulacije konjugata antitelo-lek mogu imati proseþni DAR od oko 1, ili proseþni DAR od oko 2, ili proseþni DAR od oko 3 , ili proseþni DAR od oko 4, ili proseþni DAR od oko 5, ili proseþni DAR od oko 6, ili proseþni DAR od oko 7, ili proseþni DAR od oko 8. Kao što se koristi u prethodnim opsezima proseþnog DAR , izraz "oko" znaþi /- 0.5%.
[0170] Štaviše, kompozicija, serija i / ili formulacija konjugata antitelo-lek mogu se okarakterisati poželjnim opsegom proseþnog DAR, npr. proseþnim DAR u opsegu od oko 3 do oko 5, proseþnim DAR u opsegu od oko 3 do oko 4, ili proseþni DAR u opsegu od oko 4 do oko 5. Dalje, kompozicija, serija i / ili formulacija konjugata antitelo-lek mogu biti okarakterisani poželjnim opsegom proseþnog DAR, npr. DAR u opsegu od 3 do 5, proseþni DAR u opsegu od 3 do 4, ili proseþni DAR u opsegu od 4 do 5.
[0171] Kompozicije, serije i / ili formulacije ADCs formule Ab- (L-D), mogu se okarakterisati DAR raspodelom. DAR raspodela daje procenat ili udeo razliþitih vrsta ADC, npr. DAR 1 do 8 koji mogu biti prisutni u kompoziciji, seriji i / ili formulaciji ADCs. DAR raspodela kompozicije, serije i / ili formulacije ADCs može se odrediti metodama poznatim u struci, kao što je kapilarno izoelektriþno fokusiranje (clEF).
[0172] U jednom aspektu pronalaska, DAR raspodela kompozicije, serije i / ili formulacije ADC-a, formule Ab- (LD), može se okarakterisati kao visoko heterogena smeša ADCs sa širokom DAR distribucijom, koja uopšteno sadrži širok spektar ADC vrsta sa DAR od 1 do 8.
[0173] U drugom aspektu pronalaska, DAR distribucija kompozicije, serije i / ili formulacije ADCs može se okarakterisati kao visoko homogena smeša sa uskom DAR distribucijom, koja obiþno sadrži uski raspon ADC vrsta sa odreÿenim DAR, kao što je DAR 3 do 5.
[0174] Na primer, terapeutski agens je agens koje vrši citotoksiþni, citostatiþki i / ili imunomodulatorni efekat na üelije karcinoma ili aktivirane imune üelije. Primeri terapeutskih agenasa ukljuþuju citotoksiþne agense, hemoterapeutske agense, citostatiþne agense i imunomodulatorne agense. Hemoterapeutski agensi su hemijska jedinjenja korisna u leþenju karcinoma.
[0175] Terapeutski agensi su kompozicije koje se mogu koristiti za leþenje ili spreþavanje poremeüaja kod subjekta kome je to potrebno. Terapeutski agensi korisni u otkrivanju ukljuþuju agense protiv raka, odn., agense koji imaju antikancerogenu aktivnost u üelijama koje eksprimiraju PTK7, kao što su üelije karcinoma dojke, kao što je trostruko negativni rak dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteronereceptor (PR ), rak dojke pozitivan na estrogenske receptore (ER ) i dvostruko pozitivan rak dojke; rak jajnika; kolorektalni kancer; leukemije, poput akutne mijeloiþne leukemije (AML) i akutne limfoblastne leukemije (ALL); kancer jednjaka; kancer želuca; melanom; sarkom; rak bubrega; kancer pankreasa; karcinom prostate; rak jetre, kao što je hepatocelularni karcinom (HCC); i karcinom pluüa, kao što su karcinom pluüa koji nema malih üelija (NSCLC) i karcinom pluüa malih üelija (SCLC).
[0176] Reprezentativni terapeutski agensi ukljuþuju citotoksine, citotoksiþne agense i citostatike. Citotoksiþni efekat se odnosi na iscrpljivanje, uklanjanje i / ili ubijanje ciljne üelije. Citotoksiþni agens se odnosi na agens koje ima citotoksiþni i / ili citostatiþki efekat na üeliju. Citostatiþki efekat se odnosi na inhibiciju proliferacije üelija. Citostatiþki agens se odnosi na agens koji ima citostatiþki efekat na üeliju, þime inhibira rast i / ili širenje odreÿenog podseta üelija.
[0177] Dodatni reprezentativni terapeutski agensi ukljuþuju radioizotope, hemoterapeutske agense, imunomodulatorne agense, anti-angiogene agense, anti-proliferativne agense, proapoptotiþke agense i citolitiþke enzime (npr. RNAze). Agens takoÿe može obuhvatati terapijsku nukleinsku kiselinu, kao što je gen koji kodira imunomodulatorni agens, anti-angiogeni agens, anti-proliferativni agens ili pro-apoptotiþki agens. Ovi deskriptori lekova se meÿusobno ne iskljuþuju, pa se stoga terapeutski agens može opisati koristeüi jedan ili više gore pomenutih izraza. Na primer, odabrani radioizotopi su takoÿe citotoksini. Terapeutski agensi se mogu pripremiti kao farmaceutski prihvatljive soli, kiseline ili derivati bilo kog od gore navedenih.
Uopšteno, konjugati koji imaju radioizotop kao lek nazivaju se radioimunokonjugati, a oni koji imaju hemoterapeutski agens kao lek, nazivaju se hemoimunokonjugati.
[0178] Primeri citotoksiþnih agenasa ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na antraciklin, auristatin, CC-1065, dolastatin, duokarmicin, enedijn, geldanamicin, matanzin, puromicin, taksan, alkaloid vinca, SN- 38, tubulizin, hemiasterlin i njihovi stereoizomeri, izostere, analoge ili derivate.
Takoÿe se mogu koristiti hemoterapeutski agensi, biljni toksini, drugi bioaktivni proteini, enzimi (odn., ADEPT), radioizotopi, fotosenzibilizatori (odn., za fotodinamiþku terapiju). U jednom sluþaju, citotoksiþni agens nije protein koji deaktivira ribosom. U konkretnijem sluþaju, citotoksiþni agens nije saporin.
[0179] Antraciklini su izvedeni iz bakterija Streptomices i korišüeni su za leþenje širokog spektra karcinoma, poput leukemija, limfoma, karcinoma dojke, materice, jajnika i pluüa. Primeri antraciklina ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, daunorubicin, doksorubicin (odn., adriamicin), epirubicin, idarubicin, valrubicin i mitoksantron.
[0180] Dolastatini i njihovi peptidni analogi i derivati, auristatini, su veoma moüni antimitotiþki agensi za koje je dokazano da imaju antikancerogenu i antifungalnu aktivnost. Vidite, npr., U.S. Patent Br.5,663,149 i Pettit et al., Antimicrob. Agents Chemother.42:2961-2965, (1998).
Primeri dolastatina i auristatina ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, dolastatin 10, auristatin E, auristatin EB (AEB), auristatin EFP (AEFP), MMAD (monometil Auristatin D ili monometil dolastatin 10), MMAF (monometil auristatin F ili N-metil) -valin-dolaizoleuin-dolaproinfenilalanin), MMAE (monometil Auristatin E ili N-metilvalin-valin-dolaizoleuin-dolaproinnorefedrin), 5-benzoilvalerinska kiselina-AE estar (AEVB).
[0181] U nekim aspektima pronalaska, ovde se koriste auristatini opisani u PCT meÿunarodnoj objavi br. WO 2013/072813 i postupci za proizvodnju tih auristatina.
[0182] Na primer, auristatin je 0101, (2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirolidin-1-il}-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamid), koji ima sledeüu strukturu:
[0183] U drugom primeru, auristatin je 8261, (82612-Metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-karboksi-2-feniletil]amino}-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil]pirolidin-1-il}-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamid), koji ima sledeþu strukturu:
[0184] Duocarmicin i CC-1065 su DNK alkilacionih agenasa sa citotoksiþnim potencijalom. Videti Boger i Johnson, PNAS 92:3642-3649, 1995. Primerni dolastatini i auristatini ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, (+)-docarmicin A i (+)-duocarmicin SA, i (+)-CC-1065.
[0185] Enediini su klasa anti-tumorskih bakterijskih proizvoda koje karakterišu ili deveto- i desetoþlani prstenovi ili prisustvo cikliþnog sistema konjugovanih trostrukih-dvostrukih-trostrukih veza. Primerni enediini ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, kaliheamicin, esperaminin i dinemicin.
[0186] U nekim aspektima pronalaska, citotoksiþni agens je antibiotik, kao što je kaliheamicin, takoÿe nazvan kompleks LL-E33288, na primer, ȕ-kaliheamicin, Ȗ-kaliheamicin ili N-acetil-Ȗ-kaliheamicin (gama-kaliheamicin (Ȗ1)). Primeri kaliheamicina pogodnih za upotrebu u predmetnom pronalasku su otkriveni, na primer, u U.S. Patentima Br.4,671,9584,970,198, 5,053,394, 5,037,651, 5,079,233 i 5,108,912.
[0187] Ova jedinjenja sadrže metiltrisulfid koji može da reaguje sa odgovarajuüim tiolima da bi se formirali disulfidi, istovremeno uvodeüi funkcionalnu grupu kao što je hidrazid ili druga funkcionalna grupa koja je korisna za konjugaciju kaliheamicina sa anti- PTK7 antitelom.
Analozi disulfida kaliheamicina mogu se takoÿe koristiti, na primer, analozi opisani u U.S.
Patentima br.5,606,040 i 5,770,710. U nekim aspektima pronalaska, analog disulfida je N-acetil-Ȗ-kaliheamicin dimetil hidrazid (u daljem tekstu "CM").
[0188] Geldanamicini su benzohinonski ansamicin antibiotik koji se vezuju za Hsp90 (Heat Shock Protein 90) i koristili su antitumorski lekovi. Primeri geldanamicina ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, 17-AAG (17-N-Alilamino-17-Demetoksigeldanamicin) i 17-DMAG (17-Dimetilaminoetilamino-17-demetoksigeldanamicin).
[0189] Maitanzini ili njihovi derivati maitanzinoidi inhibiraju proliferaciju üelija inhibirajuüi stvaranje mikrotubula tokom mitoze inhibicijom polimerizacije tubulina. Vidite Remillard et al., Science 189:1002-1005, 1975. Primeri matanzinina i majtanzinoida ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, mertanzin (DM1) i njegove derivate, kao i ansamitocin.
[0190] Taksani su diterpeni koji deluju kao anti-tubulinski agensi ili mitotski inhibitori. Primeri taksana ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, paklitaksel (npr., TAXOL®) i docetaksel
(TAXOTERE®).
1
[0191] Vinka alkiloidi su takoÿe agensi protiv tubulina. Primeri vinka alkaloida ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, vinkristin, vinblastin, vindesin i vinorelbin.
[0192] U nekim aspektima pronalaska, agens je imunomodulatorni agens. Primeri imunomodulirajuüeg agensa ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, ganciklovir, etanercept, takrolimus, sirolimus, voklosporin, ciklosporin, rapamicin, ciklofosfamid, azatioprin, mofetil mikofenolgat, metotrekstrat, rastvor glukokortikoida, glukokortikoidi, matiþni ksetoksini, sintetiþki sintetiþki sintetiþki molekuli, rastvor glukokortikoida i njegovi analogni molekuli limfotoksini, faktor tumorske nekroze (TNF), hematopoetski faktori, interleukini (npr., interleukin-1 (IL-1), IL-2, IL-3, IL-6, IL-10, IL-12, IL-18, i IL-21), faktori koji stimulišu koloniju (npr., faktor stimulisanja granulocita-kolonije (G-CSF) i faktor stimulisanja granulocitnih makrofaga-kolonija (GM-CSF)), interferoni (npr., interferoni-Į, -ȕ i -Ȗ), faktor rasta matiþnih üelija oznaþen kao "S1 faktor", eritropoetin i trombopoietin, ili njihova kombinacija.
[0193] Imunomodulatorni agensi korisna u pronalasku takoÿe ukljuþuju anti-hormone koji blokiraju delovanje hormona na tumore i imunosupresivni agensi koji suzbijaju proizvodnju citokina, regulišu ekspresiju samoantigena ili maskiraju MHC antigene. Reprezentativni antihormoni ukljuþuju anti-estrogene, ukljuþujuüi, na primer, tamoksifen, raloksifen, aromatazu koja inhibira 4 (5) -imidazole, 4-hidroksitamoksifen, trioksifen, keoksifen, LY 117018, onapnston i toremifen; i anti-androgeni kao što su flutamid, nilutamid, bikalutamid, leuprolid i goserelin; i anti-andrenalni agensi. Reprezentativni imunosupresivni agensi ukljuþuju 2-amino-6-aril-5-supstituisane pirimidin, azatioprin, ciklofosfamid, bromokriptin, danazol, dapson, glutaraldehid, anti-idiotipska antitela za MHC antigene i MHC fragmente, ciklosporin A, steroidni steroidi, steroidni steroidi antagonisti receptora citokina (npr., antitela protiv interferona, antitela na IL10, antitela na TNFa, antitela na IL2), streptokinaza, TGFȕ, rapamicin, receptor T-üelija, fragmenti T-üelijskih receptora i antitela na T-receptor.
[0194] U nekim aspektima pronalaska, lek je terapijski protein koji ukljuþuje, ali nije ograniþen na toksin, hormon, enzim i faktor rasta.
[0195] Primeri toksin proteina (ili polipeptida) ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, difteriju (npr., difterija A lanac), Pseudoomonasa eksotoksin i endotoksin, ricin (npr., ricin A lanca), abrin (npr., abrin A lanac), modecin (npr., modecin A lanac), alfa-sarcin, proteini Aleurites fordii, proteini diantina, ribonukleaza (RNaza), DNaza I, Staphylococcal enterotoksin-A, antivirusni protein
2
pokeweed, gelonin, difterin toksin, proteini Phytolaca americana (PAPI, PAPII, PAPS), inhibitor momordica karantia, kurcin, crotin, inhibitor sapaonaria officinalis, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, trikoteceni, peptidi inhibitora cistin þvor (ICK) (npr. ceratotoksini) i konotoksin (npr., KIIIA ili Smllla).
[0196] Primeri hormona ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, estrogene, androgene, progestine i kortikosteroide.
[0197] U nekim aspektima pronalaska, citotoksiþni agens se može dobiti upotrebom lipozoma ili biokompatibilnog polimera. Ovde opisana anti- PTK7 antitela mogu biti konjugovana sa biokompatibilnim polimerom da bi se poveüao poluživot i bioaktivnost seruma i / ili produžio poluživot in vivo. Primeri biokompatibilnih polimera ukljuþuju polimer rastvorljiv u vodi, kao što je polietilen glikol (PEG) ili njegovi derivati, i biokompatibilni polimeri koji sadrže cviterjon (npr., polimer koji sadrži fosforilholin).
[0198] U nekim aspektima pronalaska, lek je oligonukleotid, kao što su antisensni oligonukleotidi.
[0199] Dodatni lekovi korisni u pronalasku ukljuþuju antiangiogene agense koji inhibiraju stvaranje krvnih sudova, na primer, inhibitori famesiltransferaze, inhibitori COX-2, VEGF inhibitori, inhibitori bFGF, inhibitori steroidne sulfataze (npr., 2-metoksiestradiol bis-sulfamat (2-MeOE2bisMATE )), interleukin-24, trombospondin, metalospondinski proteini, interferoni klase I, interleukin 12, protamin, angiostatin, laminin, endostatin i fragmenti prolaktina.
[0200] Anti-proliferativni agensi i pro-apoptotiþni agensi ukljuþuju aktivatore PPAR-gama (npr., ciklopentenonski prostaglandini (ciPG)), retinoide, triterpinoide (npr., cikloartan, lupan, ursan, oleanane, frilalan, damaran, kukurbitacin i limononoid) inhibitori EGF receptora (npr., HER4), rampamicin, CALCITRIOL® (1,25-dihidroksiholekalciferol (vitamin D)), inhibitori aromataze (FEMARA® (letrozon)), inhibitori telomeraze, helatori gvožÿa (npr., 3-aminopiridin-2-karboksaldehid tiosemikarbazon (Triapine)), apoptin (virusni protein 3 - VP3 iz virusa pileüe aneamije), inhibitori Bcl-2 i Bcl-X (L), TNF-alfa, FAS ligand, TNF povezan ligand koji indukuje apoptozu (TRAIL / Apo2L), aktivatore signalizacije TNF-alfa / FAS liganda / TNF-povezanog apoptoze-indukujuüeg liganda (TRAIL / Apo2L) i inhibitore signalizacije PI3K-Akt puta preživljavanja (npr., UCN-01 i geldanamicin).
[0201] Reprezentativni hemoterapeutski agensi ukljuþuju alkilacione agense kao što su tiotepa i ciklosfosfamid; alkil sulfonati kao što su busulfan, improsulfan i piposulfan; aziidini kao što su benzodopa, karboken, meturedopa i uredopa; etilenimini i metilamelamini, ukljuþujuüi altretamin, trietilenmelamin, trietilenfosforamid, trietilentiofosforamid i trimetilolomelamin; azotni mustardi kao što su hlorambucil, hlornafazin, holofosfamid, estramustin, ifosfamid, mehioretamin, mehioretamin oksid hidrohlorid, melfalan, novembichin, fenesterin, prednimustin, trofosfarnid, uracil senf; nitrosureje kao što su karmustin, hlorozotocin, fotemustin, lomustin, nimustin, ranimustin; antibiotici kao što su aklacinomizini, aktinomicin, autramicin, azaserin, bleomicini, kaktinomicin, kaliheamicin, karabinin, karminomicin, karzinofilin, hromomicini, daktinomicin, daunorubicin, detorubicin, 6-diazo-5-okso-L-norubicub, esor-kiselina , marcelolomicin, mitomicini, mikofenolna kiselina, nogalamicin, olivomicini, peplomicin, potfiromicin, puromicin, kvelamicin, rodorubicin, streptonigrin, streptozocin, tubercidin, ubenimeks, zinostatin, zorubicin; anti-metaboliti poput metotreksata i 5-fluorouracila (5-FU); analozi folne kiseline kao što su denopterin, metotreksat, pteropterin, trimetreksat; purinski analozi kao što su fludarabin, 6-merkaptopurin, tiamiprin, tioguanin; analozi pirimidina kao što su ancitabin, azacitidin, 6-azauridin, karmofur, citarabin, dideoksiuridin, doksifluridin, enocitabin, floksuridin, 5-EU; androgeni kao što su kalusteron, dromostanolon propionat, epitiostanol, mepitiostan, testolakton; antiadrenali kao što su arninoglutetimid, mitotan, trilostan; dodavaþi folne kiseline kao što je frolinska kiselina; aceglaton; aldofosfarnid glikozid; aminolevulinska kiselina; amsakrin; bestrabucil; bisantren; edatraksat; defofamin; demekolcin; diazikuone; elfornitin; eliptinijum acetat; etoglucid; galijum nitrat; hidroksiurea; lentinan; lonidamin; mitoguazon; mitoksantron; mopidamol; nitracrine; pentostatin; fenamet; pirarubicin; podofilinska kiselina; 2-etilhidrazid; prokarbazin; razoksan; sizofiran; spirogermanijum; tenuazonska kiselina; triazikuone; 2,2’,2’-trihlorotrijetilamin; urethan; vindesine; dakarbazin; manomustin; mitobronitol; mitolactol; pipobroman; gacitozin; arabinozid (Ara-C); ciklofosfamid; tiotepa; taksoidi, npr. paklitaksel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb Oncology iz Princetona, N.J.) i doksetaksel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer iz Antony, Francuska); hiorambucil; gemcitabin; 6-tioguanin; merkaptopurin; metotreksat; analogi platine kao što su cisplatin i karboplatin; vinblastin; platina; etopozid (VP-16); ifosfamid; mitomicin C; mitoksantron; vinkristin; vinorelbin; pupak; novantrone; tenipozid; daunomicin; aininopterin; keloda; ibandronat; CPT-11; inhibitor topoizomeraze RFS 2000; difluorometilornitin (DMFO); retinoiþna kiselina; esperamicini; i kapecitabin.
4
[0202] Dodatni terapeutski agensi koji se mogu koristiti u skladu sa predmetnim pronalaskom ukljuþuju fotosenzibilizujuüe agense, kao što su U.S. Patenti br.7,498,029 i 5,952,329 za fotodinamiþku terapiju; magnetne þestice za termoterapiju, kao što je U.S. patent br.6,997,863; vezivni agensi, kao što su peptidi, ligandi, ligandi üelijske adhezije itd., i prolekovi kao što su prolekovi koji sadrže fosfate, prolekovi koji sadrže tiofosfat, prolekovi koji sadrže sulfate, prolekovi koji sadrže b-laktam, zamenjeni prolekovi koji sadrže fenoksiacetamid ili supstituisani prolekovi koji sadrže fenilacetamid, 5-fluorocitozin i drugi 5-fluorouridinski prolekovi koji se mogu pretvoriti u aktivniji citotoksiþni lek.
[0203] Za dijagnostiþke metode koje koriste anti- PTK7 antitelo, lek može sadržati detektivnu oznaku koja se koristi za otkrivanje prisustva üelija koje ekspresuju PTK7 in vitro ili in vivo. Radioizotopi koji se mogu otkriti in vivo, poput onih oznaka koje se mogu otkriti pomoüu scintigrafije, magnetne rezonance ili ultrazvuka, mogu se koristiti u kliniþkim dijagnostiþkim aplikacijama. Korisne scintigrafske oznake ukljuþuju pozitronske emitere i Ȗ-emitere.
Reprezentativni kontrastni agensi za snimanje magnetnih izvora su paramagnetni ili superparamagnetski joni (npr., gvožÿe, bakar, mangan, hrom, erbijum, evropijum, disprozijum, holmijum i gadolinijum), þestice oksida gvožÿa i kontrastni agensi rastvorljivi u vodi. Za ultrazvuþno otkrivanje, gasovi ili teþnosti mogu da se zaglave u poroznim neorganskim þesticama koje se oslobaÿaju kao kontrastni agensi od mikro mehuriüa. Za in vitro detekciju korisne detektibilne etikete ukljuþuju fluorofore, detektujuüe epitope ili vezivne agense i radioaktivne oznake.
[0204] Dakle, u nekim aspektima pronalaska, lek je oznaka za agens za obradu slike (npr., fluorofor ili PET (Pozitronska Emisiona Tomografija), SPECT oznaka (raþunarska tomografija sa jednom fotonskom emisijom) ili MRI (magnetna rezonantna tomografija) oznaka.
[0205] Izraz "oznaka" kada se ovde koristi odnosi se na otkriveno jedinjenje ili kompoziciju koja je konjugovana direktno ili indirektno sa antitelom tako da generiše "obeleženo" antitelo.
Oznaka se može detektovati sama po sebi (npr., radioizotopne oznake ili fluorescentne oznake) ili, u sluþaju enzimatske oznake, može katalizovati hemijske promene supstratnog jedinjenja ili kompozicije koja se može detektovati. Radionuklidi koji mogu poslužiti kao detektibilne oznake ukljuþuju, na primer, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, Re-186, At-211, Cu-67, Bi-212, i Pd-109. Oznaka takoÿe može biti entitet koji se ne može otkriti, kao što je toksin.
[0206] Primeri fluorofora ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, fluorescein izotiocijanat (FITC) (npr.5-FITC), fluorescein amidit (FAM) (npr.5-FAM), eozin, karboksifluorescein, eritrozin, Alexa Fluor® (npr. Alexa 350, 405, 430, 488, 500, 514, 532, 546, 555, 568, 594, 610, 633, 647, 660, 680, 700 ili 750), karboksitetrametilrodamin (TAMRA) (npr.5, -TAMRA), tetrametilrodamin (TMR), i sulforhodamin (SR) (npr., SR101).
[0207] Terapeutski ili dijagnostiþki radioizotopi ili druge oznake (npr., PET ili SPECT oznake) mogu se ugraditi u agens za konjugaciju sa anti- PTK7 antitelom kako je ovde opisano. Izotop se može direktno vezati za antitelo, na primer, na ostatku cisteina koji je prisutan u antitelu, ili se helator može koristiti za posredovanje vezivanja antitela i radioizotopa. Radioizotopi pogodni za radioterapiju ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, Į-emitore, ȕ-emitere i pužne elektrone. Za dijagnostiþke primene, korisni radioizotopi ukljuþuju pozitronske emitere i Ȗ-emitere. Anti- PTK7 antitelo iz pronalaska može se dalje jodirati, na primer, na ostatku tirozina antitela, da bi se olakšalo otkrivanje ili terapeutski efekat antitela.
[0208] Primeri radioizotopa ili druge oznake ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na,<3>H, "C,<13>N,<14>C,<15>N,<15>O,<35>S,<18>F,<32>P,<33>P,<47>Sc,<51>Cr,<57>Co,<58>Co,<59>Fe,<62>Cu,<64>Cu,<67>Cu,<67>Ga,<68>Ga,<75>Se,<76>Br,<77>Br,<86>Y,<89>Zr,<90>Y,<94>Tc,<95>Ru,<97>Ru,<99>Tc,<103>Ru,<105>Rh,<105>Ru,<107>Hg,<109>Pd,<111>Ag,<111>In,<113>In,<121>Te,<122>Te,<123>I,<124>I,<125>I,<125>Te,<126>I,<131>I,<131>In,<133>I,<142>Pr,<143>Pr,<153>Pb,<153>Sm,<161>Tb,<165>Tm,<166>Dy,<166>H,<167>Tm,<168>Tm,<169>Yb,<177>Lu,<186>Re,<188>Re,<189>Re,<197>Pt,<198>Au,<199>Au,<201>TI,<203>Hg,<211>At,<212>Bi,<212>Pb,<213>Bi,<223>Ra,<224>Ac, i<225>Ac.
II.D. Postipci za Dobijanje Konjugata PTK7 Antitelo-Lek
[0209] Takoÿe su obezbeÿeni postupci za dobijanje konjugata antitelo-lek predmetnog pronalaska. Na primer, postupak za proizvodnju konjugata PTK7 antitelo-lek, kako je ovde otkriven, može da ukljuþuje (a) povezivanje veznika sa lekom; (b) konjugacija ostatka veznik-lek sa antitelom; i (c) preþišüavanje konjugata antitelo-lek. Reprezentativni postupci za sintezu vc0101 i mc8261 su opisani u Primeru 9, a reprezentativni postupci za konjugaciju anti-PTK7-vc0101, anti-PTK7-mc8621 ADC i anti-PTK7-AcButCM ADC su opisani u Primeru 10.
[0210] U jednom aspektu, konjugat antitelo-lek formule Ab- (L-D) može se dobiti (a) dodavanjem ostatka veznik-lek (npr. Vc0101 ili mc8261) na anti-PTK7 antitelo, ili njegovom fragment koji vezuje antigen, pri þemu anti-PTK7 antitela mogu se delimiþno redukovati u rastvoru koji sadrži: 2-10 molarnih suviška tris (2-karboksietil) fosfina (TCEP), 100 mM pufera 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansulfonske kiseline (HEPES) koji ima pH od 6-9 i 1 mM dietilentriaminpentasirüetne kiseline (DTPA) tokom vremenskog perioda u rasponu od oko 30 minuta do 16 sati na temperaturi u rasponu od oko 0-37 °C. Tada se može dodati vc0101 ili mc8261 veznik-nosivost u molarnom odnosu veznik-nosivost / antitelo od oko 4-10 sa dimetilacetamidom (DMA) tokom perioda inkubacije u rasponu od oko 30 minuta do 16 sati na temperaturi od oko 0-37 °C. Posle toga, nereagovani tioli mogu se zatvoriti N-etilmaleimidom, a nereagovani veznik-nosivost može se zaustaviti sa L-Cis.
[0211] U drugom aspektu, konjugat antitelo-lek formule Ab- (L-D) može se dobiti (a) dodavanja ostatka veznik-lek (npr. AcButCM) anti-PTK7 antitelu ili njegovom fragmentu koji vezuje antigen, pri þemu koncentracija antitela može se kretati od 1 do 25 mg/ml, a ostatak veznik-lek je u molarnom odnosu koji se kreüe od oko 1-15 do 1 anti- PTK7 antitela; (b) inkubacija ostataka veznik-lek i anti- PTK7 antitela u ne-nukleofilni, proteinski kompatibilni puferisani rastvor koji ima pH u opsegu od oko 7 do 9 za proizvodnju monomernog konjugata antitelo-lek, pri þemu rastvor dalje ustupa (i) pogodan organski korastvaraþ i (ii) aditiv koji ima najmanje jednu C8-C18karboksilnu kiselinu ili njenu so, i pri þemu se inkubacija izvodi na temperaturi u rasponu od oko 0 °C do oko 45 °C, tokom vremenskog perioda od oko 1 minuta do oko 24 sata; i (c ) podvrgavanje konjugata proizvedenog u koraku (b) procesu hromatografskog razdvajanja kako bi se razdvoili konjugati antitelo-lek sa DAR od 1 do 8; i obezbeÿuje nisku konjugovanu frakciju (LCF) ispod 10% od nekonjugovanog anti- PTK7 antitela, ostatka veznik-lek i agregiranih konjugata.
[0212] Optimalni reakcioni uslovi za stvaranje konjugata mogu se empirijski odrediti promenom reakcionih promenljivih kao što su temperatura, pH, ostatak veznik-nosilac, i koncentracija aditiva. Uslovi pogodni za konjugaciju drugih lekova mogu da odrede struþnjaci u ovoj oblasti bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0213] U nekim aspektima lek se može modifikovati tako da ukljuþuje grupu reaktivnu sa taþkom konjugacije na antitelu. Na primer, lek može biti vezan alkilacijom (npr., na lizinima epsilonamino grupe ili N-kraju antitela), reduktivnom aminacijom oksidovanih ugljenih hidrata, transesterifikacijom izmeÿu hidroksilnih i karboksilnih grupa, amidacijom na amino grupama ili karboksilnim grupama i konjugacijom do tiola. U nekim rešenjima, broj molekula leka (D) konjugovanih po molekulu antitela kreüe se od 1 do 8; 1 do 7, 1 do 6, 1 do 5, 1 do 4, 1 do 3 ili 1 do 2. U drugim rešenjima, broj molekula leka (D) konjugovanih po antitelu je 1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7 ili 8. U nekim sluþajevima, kompozicije, serije i / ili formulacije veüeg broja konjugata antitelo-lek mogu biti okarakterisane proseþnim DAR. Proseþni DAR se kreüe od oko 1 do oko 8, oko 1 do oko 7, oko 1 do oko 6, oko 1 do oko 5, oko 1 do oko 4; oko 1 do oko 3, oko 1 do oko 2. U nekim sluþajevima, proseþni DAR za kompoziciju, seriju i / ili formulaciju veüeg broja konjugata antitelo-lek kreüe se od oko 2 do oko 8, oko 2 do oko 7 oko 2 do oko 6, oko 2 do oko 5, oko 2 do oko 4, oko 2 do oko 3 ili oko 3 do oko 5 ,. Kao što se koristi u prethodnim opsezima proseþnog DAR, izraz „oko“ znaþi /- 0.5%. Za primere hemikalija koje se mogu koristiti za konjugaciju, videti npr., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc.), Chapter 15 (Chemical Modifications of Proteins).
[0214] Drugi postupci za pripremu konjugata antitelo-lek opisani su u raznim objavama. Na primer, hemijska modifikacija se može izvršiti u antitelima bilo putem lizina amina boþnog lanca ili putem cistein sulfhidril grupa koje se aktiviraju smanjenjem meÿulanþanih disulfidnih veza da bi došlo do reakcije konjugacije. Videti, na primer, Tanaka et al., FEBS Letters 579: 2092-2096, 2005, i Gentle et al., Bioconjugate Chem.15: 658-663, 2004. Dalje su takoÿe opisani reaktivni ostaci cisteina stvoreni na specifiþnim mestima antitela za specifiþnu konjugaciju leka sa definisanom stehiometrijom. Vidite, npr., Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, 2008.
[0215] Dalje, kao što je opisano u meÿunarodnoj objavi br. WO 2013/093809, odreÿeni ostaci koji su verovatno prisutni na površini CH2 ili CH3 domena teškog lanca antitela ili na konstantnom domenu lakog lanca ili su na drugi naþin dostupni, su pogodni za supstituciju divljeg tipa amino kiseline koja se javlja u prirodi sa, na primer, cisteinom, i stoga su korisne za projektovanje mesta sposobnog za konjugaciju sa razliþitim agensima.
[0216] U nekim aspektima, konstruisani Fc polipeptid iz pronalaska se može koristiti za pripremu PTK7 antitela ili konjugata antitelo-lek, tako da antitelo ili njegov fragment time sadrži projektovani Fc region koji se može koristiti za konjugaciju na konstruisanom ostatku (odn., amino kiselina supstituisana u poreÿenju sa divljim tipom nemodifikovanog Fc), širokim spektrom agenasa.
[0217] PTK7 antitela i konjugati antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu obuhvatati konstruisani Fc polipeptid gde 1, 2 ili više amino kiselina biraju se iz položaja: 347, 392, 398, 422 i 443 teškog lanca antitela (HC) matiþnog, nativnog, ili divljeg tipa antitela, supstituisan drugom amino kiselinom (ukljuþujuüi prirodne i neprirodne / sintetiþke amino kiseline), pri þemu je sistem numerisanja konstantnog regiona sistem indeksa EU prema Kabat.
[0218] Treba napomenuti da pojedinaþna supstitucija u Fc polipeptidu, na primer cistein ostatak, obiþno rezultira prikazom dva odgovarajuüa ostatka u rezultujuüem IgG antitelu zbog homodimerne prirode molekula IgG antitela. Prema tome, rezultujuüa IgG antitela iz pronalaska mogu pokazivati najmanje 1, 2, 3, 4 ili više reaktivnih grupa u svrhu konjugacije sa lekom ili jedinjenjem. U jednom aspektu, jedna ili više supstitucija je sa cistein ostatkom, a rezultujuüa antitela mogu pokazivati najmanje 1, 2, 3, 4 ili više tiol grupa u svrhu konjugacije sa lekom ili jedinjenjem.
[0219] U drugom aspektu, konstruisani Fc polipeptid iz pronalaska može sadržati jednu ili više supstitucija izabranih sa položaja 347, 392, 398, 422 i 443 teškog lanca (HC) antitela, pri þemu sistem numerisanja konstantnog regiona je indeks EU kako je izloženo u Kabatu, a pri þemu je amino kiselinska sekvenca teškog lanca izabrana iz grupe koju þine SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 37, i SEQ ID NO: 61.
[0220] PTK7 antitela i konjugati antitela i leka iz predmetnog pronalaska mogu obuhvatati konstruisani konstantni region lakog lanca antitela (LC) ili njegov deo, pri þemu su 1, 2 ili 3 amino kiseline odabrane iz položaja 111, 183 ili 188, laki lanac antitela, pri þemu je sistem numerisanja konstantnog regiona lakog lanca onaj Kabata, matiþnog, nativnog ili divljeg tipa antitela, supstituisanog drugom amino kiselinom (ukljuþujuüi prirodne i neprirodne / sintetiþke amino kiseline).
[0221] U nekim aspektima, konstruisani LC polipeptid iz pronalaska sadrži jednu ili više supstitucija sa položaja 111, 183 ili 188 lakog lanca antitela, pri þemu je amino kiselinska sekvenca lakog lanca izabrana iz grupe koju þine SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 47, i SEQ ID NO: 71
[0222] U drugim aspektima, zbog dimerne prirode mnogih antitela (npr., IgGs sadrže dva laka lanca i dva teška lanca, svaki teški lanac sadrži Fc polipeptid), antitelo iz pronalaska može sadržati najmanje jedan konstruisani Fc polipeptid i može dalje sadrže najmanje jedan konstruisani konstantni polipeptid lakog lanca, obezbeÿujuüi tako najmanje dva mesta specifiþna za konjugaciju - jedno u Fc polipeptidu i drugo u LC polipeptidu.
[0223] U nekim aspektima pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek ukljuþuje konstantni region IgG1 teškog lanca, na primer teški lanac hu23 naveden kao SEQ ID NO: 13, hu24 teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 37, ili hu58 teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 61. U drugim aspektima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek ukljuþuje kapa konstantni region lakog lanca, na primer hu23 laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 23, hu24 laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 47, ili hu58 laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 71. Posebni aspekti pronalaska, konjugat PTK7 antitelo-lek može da ukljuþuje konstantni region teškog lanca IgG1 i konstantni region kapa lakog lanca, na primer, teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 13 i laki lanac naveden kao SEQ ID NO : 23; ili kao drugi primer, teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac naveden kao SEK ID NO: 47; ili kao drugi primer, teški lanac naveden kao SEQ ID NO: 61 i laki lanac naveden kao SEQ ID NO: 71.
[0224] Takoÿe, kao što je opisano u meÿunarodnoj objavi br. WO2012 / 059882, postupci konjugacije ukljuþuju upotrebu oznake koja sadrži acil donor glutamin ili endogeni glutamin koji postaje reaktivan (odn., sposobnost da formira kovalentnu vezu kao acil donor) pomoüu polipeptidnog inženjerstva u prisustvo transglutaminaze i amina (npr., citotoksiþni agens koji sadrži ili je vezano za reaktivni amin).
[0225] U nekim aspektima, PTK7 antitelo ili konjugat antitelo-lek mogu da sadrže oznaku koja sadrži acil donor glutamin, napravljenu na odreÿenom mestu antitela (npr., karboksilni terminal, amino terminal ili na drugom mestu) PTK7 antitela. U nekim aspektima, oznaka sadrži amino kiselinu glutamin (K) ili amino kiselinsku sekvencu GGLLQGG (SEQ ID NO:74), LLQGA (SEQ ID NO:75), GGLLQGA (SEQ ID NO:76), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81), LLQPGK (SEQ ID NO: 82), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX1X2X3X4X5, gde X1 je G ili P, gde X2 je A, G, P, ili odsutan, gde X3 je A, G, K, P, ili odsutan, gde X4 je G, K ili odsutan, i gde X5 je K ili odsutan (SEQ ID NO: 86), ili LLQX1X2X3X4X5, gde je X1 bilo koja amino kiselina koja se prirodno javlja, a gde su X2, X3, X4 i X5 bilo koje amino kiseline koje se javljaju u prirodi ili su odsutne (SEQ ID NO: 87). U nekim rešenjima, PTK7 antitelo ili konjugat antitelo-lek mogu sadržati amino kiselinsku supstituciju od asparagina (N) do glutamina (Q) na poziciji 297 PTK7 antitela.
[0226] U drugom aspektu, PTK7 antitelo ili konjugat antitelo-lek mogu sadržati oznaku koja sadrži acil donor glutamin i modifikaciju amino kiseline na položaju 222, 340 ili 370 antitela (šema EU numerisanja), pri þemu je modifikacija delecija amino kiseline, umetanje, supstitucija, mutacija ili bilo koja njihova kombinacija. Shodno tome, u nekim aspektima, PTK7 antitelo ili konjugat antitelo-lek mogu sadržati oznaku acil donora koja sadrži glutamin (npr., Q, GGLLQGG (SEQ ID NO:74), LLQGA (SEQ ID NO:75), GGLLQGA (SEQ ID NO:76), LLQ, LLQGPGK (SEQ ID NO: 77), LLQGPG (SEQ ID NO: 78), LLQGPA (SEQ ID NO: 79), LLQGP (SEQ ID NO: 80), LLQP (SEQ ID NO: 81), LLQPGK (SEQ ID NO: 82), LLQGAPGK (SEQ ID NO: 83), LLQGAPG (SEQ ID NO: 84), LLQGAP (SEQ ID NO: 85), LLQX1X2X3X4X5, gde X1 je G ili P, gde X2 je A, G, P, ili odsutan, gde X3 je A, G, K, P, ili odsutan, gde X4 je G, K ili odsutan, i gde X5 je K ili odsutan (SEQ ID NO: 86), ili LLQX1X2X3X4X5, gde X1 je bilo koja amino kiselina koja se javlja u prirodi i gde X2, X3, X4, i X5 su bilo koje amino kiseline koje se javljaju u prirodi ili odsutan (SEQ ID NO: 87) konjugovane na odreÿenom mestu (npr., na karboksilnom terminalu teškog ili lakog lanca ili na drugom mestu) PTK7 antitela i modifikacija amino kiseline na položaju 222, 340 ili 370 antitela (EU šema numerisanja).
[0227] Da bi se dalje poveüao broj molekula leka po konjugatu antitelo-lek, lek može da se konjuguje sa polietilen glikolom (PEG), ukljuþujuüi ravne ili razgranate polietilen glikol polimere i monomere. PEG monomer je formule: - (CH2CH2O) -. Lekovi i / ili analogi peptida mogu se vezati za PEG direktno ili indirektno, odn., putem odgovarajuüih odstojnih grupa kao što su šeüeri. Sastav PEG-antitelo-lek može takoÿe da sadrži dodatne lipofilne i / ili hidrofilne delove kako bi se olakšala stabilnost leka i isporuka na ciljano mesto in vivo. Reprezentativni postupci za pripremu kompozicija koje sadrže PEG mogu se naüi u U.S. Pat. Br.6,461,603; 6,309,633; i 5.648.095, izmeÿu ostalog.
[0228] Na primer, da bi se poveüala koliþina auristatina ili kaliheamicina u ovde opisanim konjugatima PTK7 antitelo-lek, antitelo može biti konjugovano sa PEG pre konjugacije sa lekom, na primer, koristeüi PEG-SPA, PEGSBA ili PEG-bismaleimid. Konjugati antitela i leka dobijeni korišüenjem PEG mogu pokazati smanjeni afinitet vezivanja za ciljani antigen, ali su i dalje efikasni kao rezultat poveüanog optereüenja lekom.
1
[0229] Nakon konjugacije, konjugati se mogu odvojiti i preþistiti od nekonjugovanih reaktanata i / ili agregiranih oblika konjugata konvencionalnim metodama. To može da ukljuþuje procese kao što su hromatografija za iskljuþivanje veliþine (SEC), ultrafiltracija / diafiltracija, hromatografija sa jonoizmenjivaþkom izmenom (IEC), hromatofocusing (CF) HPLC, FPLC ili Sephacril S-200 hromatografija. Odvajanje se takoÿe može izvršiti hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC). Pogodni HIC mediji ukljuþuju hromatografski medijum fenil sefaroza 6 brzi protok, hromatografski medijum brzi protok butil sefaroza 4, hromatografski medijum brzi protok Oktil sefaroza 4 hromatografski medijum Toyopearl Ether-650M, Macro-Prep metil HIC medijum ili Macro-Prep t-Butil HIC medijum.
[0230] U nekim aspektima pronalaska, razdvajanje se može izvršiti upotrebom hromatografskog medijuma Butil Sefaroza 4 brzi protok. Kada se koristi prilagoÿeni gradijent, uklanjaju se veüe DAR vrste koje ostaju vezane za kolonu. U nekim aspektima, postupak preþišüavanja može ukljuþivati korak uklanjanja üelije centrifuge, opciono korak hvatanja afiniteta proteina A praüen jednim ili dva ortogonalna koraka hromatografskog poliranja, korak filtriranja virusa i korak filtriranja tangencijalnog protoka za koncentraciju i formulaciju.
III. Funkcionalne Analize za Karakterizaciju Konjugata PTK7 Antitelo-Lek
[0231] Predmetni pronalazak dalje otkriva in vitro i in vivo analize da bi se okarakterisale aktivnosti konjugata PTK7 antitela, ukljuþujuüi aktivnost vezivanja PTK7, üelijsku internalizaciju nakon vezivanja za PTK7 antigen predstavljen na površini üelije i ciljanje na üelije koje wkspresuju PTK7 kod subjekta. U nekim aspektima pronalaska, konjugati PTK7 antitelo-lek su okarakterisani sa neutralizujuüim ili iscrpljujuüim aspektima antitela, ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen. U nekim aspektima pronalaska, konjugati PTK7 antitelo-lek su okarakterisani sa neoþekivanom efikasnosti odreÿenog leka u poreÿenju sa nedostatkom efikasnosti alternativnog leka. U nekim aspektima pronalaska, konjugati PTK7 antitela su okarakterisani kao da nadmašuju terapijski agens standardne nege koje ima isti naþin delovanja kao lek.
[0232] Tehnike za otkrivanje vezivanja konjugata PTK7 antitelo-lek za PTK7 antigen ili drugi PTK7 antigen poznate su u tehnici, ukljuþujuüi, na primer, BIACORE® analize. Dodatne reprezentativne tehnike ukljuþuju centrifugiranje, afinitetnu hromatografiju i druge imunohemijske metode. Videti npr., Manson (1992) Immunochemical Protocols, Humana Press, Totowa, N.J., United States of America; Ishikawa (1999) Ultrasensitive and Rapid Enzyme
2
Immunoassay, Elsevier, Amsterdam/New York. Analize vezivanja antigena se mogu izvoditi pomoüu izolovanog PTK7 antigen ili üelija koje ekspresuju PTK7.
[0233] Specifiþnost vezivanja konjugata PTK7 antitelo-lek može se dalje opisati definicijom vezujuüeg epitopa, odn., identifikacijom ostataka, ukljuþujuüi nesusedne ostatke koji uþestvuju u vezivanju antigena, i / ili definicijom ostataka koji utiþu na vezivanje antigena.
[0234] Internalizacija konjugata PTK7 antitela-lek pomoüu üelija koje ekspresuju PTK7 može se ispitati posmatranjem koliþine antitela ili konjugata vezanih za površinu üelija koje ekspresuju PTK7 tokom vremena. Videti, na primer, Primer 7. Odabrani ligandi PTK7 ili njihovi izoformi mogu biti prisutni u rastvorljivom obliku, a najmanje neki PTK7 verovatno ostaje povezan sa üelijskom površinom, što omoguüava internalizaciju ovde otkrivenih antitela. Shodno tome, konjugati anti-PTK7 antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu biti internalizovani üelijama koje ekspresuju PTK7. Na primer, konjugat anti-PTK7 antitelo-lek koji se vezuje za PTK7 na površini üelije koja inicira tumor može biti internalizovan üelijom koja inicira tumor. Broj internalizovanih ADC molekula može biti dovoljan ili adekvatan da ubije üeliju koja ekspresuje PTK7, posebno tumorsku üeliju koja ekspresuju PTK7. U zavisnosti od snage ADC, u nekim sluþajevima je unos jednog molekula ADC u üeliju dovoljan da ubije ciljnu üeliju za koju se ADC veže. Na primer, odreÿeni toksini su veoma moüni u ubijanju, tako da je internalizacija jednog molekula toksina konjugovanog sa antitelom dovoljna da ubije üeliju tumora.
[0235] Internalizacija PTK7 antitela se može proceniti korišüenjem funkcionalnog testa u kome se üelije inkubiraju sa PTK7 antitelom i sekundarnim antitelom Fab fragmentom koji je konjugovan sa toksinom saporina. Zatim se üelijska održivost meri bilo kojim pogodnim postupkom, sa üelijskom citotoksiþnošüu koja ukazuje na internalizaciju antitela. Pogledajte Primer 7.
[0236] U nekim aspektima pronalaska, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen, otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek je "antagonist" kako se koristi u najširem smislu, odn., bilo koji molekul koji delimiþno ili u potpunosti blokira, inhibira, ili neutrališe biološku aktivnost nativnog cilja ovde otkrivenog ili njegovu transkripciju ili translaciju. Izrazi "inhibiraju" ili "neutrališu" kao što je ovde korišüeno u odnosu na bioaktivnost antitela prema pronalasku znaþe sposobnost antitela da u osnovi antagonizuje, zabrani, spreþi, ograniþi, uspori, poremeti, eliminiše, zaustavi, smanji ili preokrene npr. progresija ili težina onoga što se inhibira, ukljuþujuüi, ali bez ograniþenja, biološku aktivnost. Na primer, u nekim aspektima pronalaska, konjugat anti-PTK7 antitelo-lek olakšava ubijanje üelija nakon internalizacije konjugata antitelo-lek. Na primer, neutrališuüe antitelo ili antagonist üe poželjno umanjiti funkciju PTK7 za najmanje oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% , 99% ili više.
[0237] U drugim aspektima pronalaska, konjugati anti-PTK7 antitelo-lek predemtnog pronalaska mogu uništavati antitela. Izraz osiromašujuüe antitelo odnosi se na antitelo koje se vezuje ili povezuje sa PTK7 na ili u blizini üelijske površine i indukuje, promoviše ili uzrokuje smrt ili uklanjanje üelije (npr., sa citotoksiþnošünu zavisnom od komplementa ili üelijskom citotoksiþnošüu zavisnom od antitela). Poželjno je da iscrpljujuüe antitelo bude u stanju da ukloni, eliminiše ili ubije najmanje 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ili 99% tumora koji održavaju üelije u odreÿenoj populaciji üelija.
[0238] Funkcionalni testovi takoÿe ukljuþuju metode za procenu antikancerogene aktivnosti konjugata antitelo-lek, na primer, sposobnost uništavanja postojeüih üelija karcinoma ili odlaganja ili spreþavanja rasta üelija karcinoma. Karcinomi ciljani konjugatima antitelo-lek pronalaska ukljuþuju i primarne i metastazirane tumore i karcinome bilo kog tkiva kod subjekta, ukljuþujuüi karcinome i hematopoetske maligne bolesti kao što su leukemije i limfomi.
[0239] Konjugati PTK7 antitelo-lek koji imaju aktivnost inhibicije rasta mogu eliminisati üelije koje ekspresuju PTK7 ili spreþiti ili smanjiti proliferaciju üelija karcinoma koji ekspresuje PTK7.
Reprezentativni metodi za brzu in vitro procenu inhibicije rasta üelija opisani su u Jones et al. (2001) J. Immunol. Methods 254:85-98.
[0240] Konjugati PTK7 antitelo-lek mogu takoÿe da ukljuþuju sposobnost indukovanja üelijske smrti, na primer, programiranu üelijsku smrt koju karakteriše nuklearna degradacija DNK, nuklearna degeneracija i kondenzacija, gubitak integriteta membrane i fagocitoza.
Reprezentativne analize za procenu üelija opisani su u Hoves et al. (2003) Methods 31:127-34; Peng et al. (2002) Chin. Med. Sci. J.17:17-21; Yasuhara et al. (2003) J. Histochem. Cytochem.
51:873-885.
[0241] Na primer, da bi se procenila citotoksiþnost konjugata PTK7 antitelo-lek in vitro, üelije kancera koje eskpresuju PTK7 i kontrolne üelije se uzgajaju u prisustvu konjugata PTK7 antitelo-lek i odvojeno sa slobodnim lekom. Citotoksiþnost svakog agensa se izveštava kao
4
ED50 (ng/ml), što je koliþina leka koja se daje kao konjugat ili kao slobodni lek koji uzrokuje 50% smanjenje üelijske kulture u odnosu na neleþenu kontrolu. Broj üelija u kulturi odreÿuje se pomoüu vitalne boje (MTS) nakon izlaganja leku. Videti Primer 12.
[0242] Da bi se procenila citotoksiþnost konjugata PTK7 antitelo-lek in vivo, tumori se pripremaju u NOD / SCID, goli (nu/nu) ili drugom soju imunokompromitovanih miševa supkutanom injekcijom razliþitih üelija karcinoma. Konjugati i kontrolna jedinjenja PTK7 antitela mogu se davati miševima koji nose tumore, na primer, intraperitonealnom injekcijom dva puta nedeljno tokom dve nedelje (q4dx4). Merljivi terapijski rezultati ukljuþuju inhibiciju rasta tumorskih üelija. Pogledajte Primer 13.
[0243] Dalje, predmetni pronalazak obezbeÿuje konjugate PTK7 antitelo-lek koji mogu da unište, utišaju, neutrališu, eliminišu ili inhibiraju rast, širenje ili preživljavanje tumorskih üelija, ukljuþujuüi üelije koje iniciraju tumor (TIC) i / ili pridružene neoplazije kroz niz mehanizama , ukljuþujuüi agoniju ili antagonizaciju izabranih puteva ili uklanjanje odreÿenih üelija u zavisnosti, na primer, od anti- PTK7 antitela, ili doziranja i naþina isporuke.
[0244] Kao što je ovde korišüeno, izraz üelija koja inicira tumor (TIC) obuhvata i üelije koje održavaju tumor (TPC; odn., matiþne üelije karcinoma ili CSC) i visoko proliferativne üelije progenitor tumora (TProg), koje zajedno uglavnom ukljuþuju jedinstvenu subpopulaciju (odn., 0.1-40 %) bulk tumora ili mase. U svrhu predemtnog pronalaska, izrazi koji održavaju tumor i matiþne üelije kancera su ekvivalentni i ovde se mogu koristiti naizmeniþno. Suprotno tome, TPC se razlikuju od TProga po tome što mogu u potpunosti rekapitulirati sastav tumorskih üelija koje postoje u tumoru i imaju neograniþeni kapacitet samoobnavljanja, što je prikazano serijskom transplantacijom (dva ili više prolaza kroz miševe) sa malim brojem izolovanih üelija. Kako se ovde koristi, izraz "üelija koja inicira tumor" takoÿe se odnosi na matiþne üelije karcinoma razliþitih hematoloških malignih bolesti, koje same po sebi nisu karakterizovane tumorom.
[0245] Predmetni pronalazak obezbeÿuje konjugate PTK7 antitelo-lek koji ciljaju üelije koje iniciraju tumor (TIC), a posebno üelije koje održavaju tumor (TPC), omoguüavajuüi tako leþenje, leþenje ili prevenciju neoplastiþnih poremeüaja i hiperproliferativnih poremeüaja. Preciznije, specifiþne subpopulacije tumorskih üelija izražavaju PTK7 i verovatno menjaju lokalizovanu koordinaciju signalizacije morfogena važnu za samoobnavljanje matiþnih üelija karcinoma i preživljavanje üelija. Dakle, konjugati PTK7 antitelo-lek se mogu koristiti za smanjenje Xþestalosti TIC nakon primene kod subjekta. Smanjenje uþestalosti üelija koje iniciraju tumor može se desiti kao rezultat a) eliminacije, iscrpljivanja, senzibilizacije, utišavanja ili inhibicije üelija koje iniciraju tumor; b) kontrolu rasta, ekspanzije ili recidiva üelija koje iniciraju tumor; c) prekid inicijacije, širenja, održavanja ili proliferacije üelija koje iniciraju tumor; ili d) na drugi naþin ometajuüi preživljavanje, regeneraciju i / ili metastaze tumorogenih üelija. U nekim aspektima pronalaska, smanjenje uþestalosti üelija koje iniciraju tumor nastaje kao rezultat promene jednog ili više fizioloških puteva. Promena puta, bilo smanjenjem ili uklanjanjem üelija koje iniciraju tumor ili modifikovanjem njihovog potencijala (npr., indukovana diferencijacija, poremeüaj niše) ili na drugi naþin ometajuüi njihovu sposobnost da vrše efekte na tumorsko okruženje ili druge üelije, zauzvrat omoguüava za efikasnije leþenje poremeüaja povezanih sa PTK7 inhibicijom tumorigeneze, održavanja tumora i / ili metastaza i recidiva.
[0246] Meÿu metodama koje se mogu koristiti za procenu takvog smanjenja uþestalosti üelija koje iniciraju tumor je ograniþavanje analize razblaživanja bilo in vitro ili in vivo, po moguünosti praüeno nabrajanjem pomoüu Poissonove statistike distribucije ili procena uþestalosti unapred definisanih konaþnih dogaÿaja kao što je sposobnost da generišu tumore in vivo ili ne. Takoÿe je moguüe odrediti smanjenje frekvencije pomoüu dobro poznatih protoþnih citometrijskih ili imunohistohemijskih sredstava. Što se tiþe svih gore pomenutih metoda, videti, na primer, Dylla et al.2008, PMCID: PMC2413402 & Hoey et al.2009, PMID: 19664991.
Ostale metode kompatibilne sa predmetnim pronalaskom koje se mogu koristiti za izraþunavanje uþestalosti üelija koje iniciraju tumor ukljuþuju merljive protoþne citometrijske tehnike i postupke imunohistohemijskog bojenja.
[0247] Koristeüi bilo koji od gore pomenutih metoda, tada je moguüe kvantifikovati smanjenje Xþestalosti TIC (ili TPC u njemu) koje pružaju otkriveni konjugati PTK7 antitelo-lek u skladu sa ovde navedenim uþenjima. U nekim sluþajevima, konjugati PTK7 antitelo-lek predmetnog pronalaska mogu smanjiti uþestalost TIC (nizom gore pomenutih mehanizama, ukljuþujuüi eliminaciju, indukovanu diferencijaciju, poremeüaj niše, utišavanje, itd.) Za 10%, 15% 20%, 25%, 30% ili þak za 35%. U ostalim aspektima pronalaska, smanjenje uþestalosti TIC može biti reda od 40%, 45%, 50%, 55%, 60% ili 65%. U odreÿenim aspektima pronalaska, otkrivena jedinjenja smanjuju uþestalost TIC za 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili þak 95%. Podrazumeva se da svako smanjenje uþestalosti TIC verovatno rezultira odgovarajuüim smanjenjem tumorogenosti, perzistentnosti, recidiva i agresivnosti neoplazije.
[0248] Zbirni dokazi podržavaju hipotezu da rast tumora, otpornost na terapiju i relaps poremeüaja kontroliše TPC. Uþestalost TPC može varirati u zavisnosti od tipa tumora ili izmeÿu pacijenata sa istim tipom tumora kao produktom faze poremeüaja i / ili stepena diferencijacije unutar tumora. TPC se može identifikovati i obogatiti pomoüu panela markera na površini üelija koji se þesto preklapaju u svom izražavanju kod pacijenata sa odreÿenim vrstama karcinoma. TPC se najbolje definišu njihovom funkcionalnom sposobnošüu da iniciraju tumore nakon serijske transplantacije, dok su ne-tumorogene (NTG) üelije lišene ovog kapaciteta. ûelije þvrstih tumora obogaüene jedinstvenim kapacitetom iniciranja tumora prvi put su identifikovane kod raka dojke; meÿutim, rak dojke ukljuþuje spektar malignih bolesti. Do danas nauþna zajednica nije uspela da poveže odreÿene TPC identitete sa odreÿenim podtipovima poremeüaja, što može biti temelj neusaglašenih rezultata kako unutar grupa tako i unutar njih, a takoÿe može poveüati verovatnoüu neuspele translacije na klinici.
[0249] Predmetni pronalazak pruža kombinaciju novih proizvoÿDþa üelijskih površina koji poboljšavaju obogaüivanje TPC. U odreÿenom aspektu, pronalazak daje kombinaciju novih proizvoÿDþa üelijske površine koji olakšavaju obogaüivanje trostrukog negativnog TPC raka dojke (TNBC). Predmetni pronalazak dalje omoguüava identifikaciju PTK7 kao novog terapijskog cilja povezanog sa TPC u TNBC; þiji je nivo ekspresije znatno veüi nego kod ostalih podtipova karcinoma dojke i normalnog tkiva.
[0250] Farmakokinetika konjugata PTK7 antitelo-lek može se proceniti i uporediti sa farmakokinetikom nekonjugovanih antitela kod razliþitih životinja. Na primer, to se može uraditi nakon pojedinaþne intravenske bolus primene kod ženki NOD / SCID, golih (nu/nu) ili drugih vrsta imunološki ugroženih miševa, mužjaka Sprague-Davlei pacova i ženki majmuna cinomolgus. Farmakokinetiku konjugata PTK7 antitelo-lek uopšteno karakteriše nizak klirens, mali obim distribucije i dug oþigledni terminalni poluživot kod razliþitih vrsta. Oþekuje se da su serumske koncentracije nekonjugovanih derivata auristatina ispod granice kvantifikacije.
2þekuje se da üe profil toksiþnosti za ove konjugate u studijama u rasponu toksiþnosti u jednoj dozi biti sliþan onom dobijenom za druge konjugate antitela i lekova u uporedivim dozama.
[0251] Antitelo, konjugat antitelo-lek ili drugi agens koji "indukuje apoptozu" je ono koje izaziva programiranu üelijsku smrt utvrÿenu vezivanjem aneksina V, fragmentacijom DNK, skupljanjem üelija, širenjem endoplazmatskog retikuluma, fragmentacijom üelija i / ili stvaranjem membranski mehuriüi (zvani apoptotiþka tela). ûelija je tumorska üelija, npr., dojke, jajnika, debelog creva, prostate, jetre i pluüa. Dostupne su razne metode za procenu üelijskih dogaÿaja povezanih sa apoptozom. Na primer, translokacija fosfatidil serina (PS) može se meriti vezivanjem aneksina; Fragmentacija DNK može se proceniti pomoüu DNK lestvice; i kondenzacija nuklearnog / hromatina zajedno sa fragmentacijom DNK može se proceniti bilo kojim poveüanjem hipodiploidnih üelija.
[0252] Kao što je korišüeno vode, "antitelom zavisna üelijski posredovana citotoksiþnost" ili "ADCC" odnosi se na üelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifiþne citotoksiþne üelije koje ekspresuju Fc receptore (FcR) (npr., üelije prirodnih ubica (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezana antitela na ciljanu üeliju i poslediþno uzrokuju lizu ciljane üelije. Aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti korišüenjem in vitro ADCC testa, kao što je opisano u U.S. Patentima br.5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske üelije za takve testove ukljuþuju mononuklearne üelije periferne krvi (PBMC) i NK üelije. Alternativno, ili dodatno, aktivnost ADCC molekula od interesa može se proceniti in vivo, npr., na životinjskom modelu kakav je otkriven u Clynes et al., PNAS (USA), 95:652-656 (1998).
[0253] "Citotoksiþnost koja zavisi od komplementa" ili "CDC" odnosi se na liziranje cilja u prisustvu komplementa. Put aktivacije komplementa zapoþinje vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1 q) za molekul (npr., antitelo) koji je kompleksan sa srodnim antigenom. Da bi se procenila aktivacija komplementa, CDC test, npr., kako je opisano u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163-171 (1997), može se izvesti.
[0254] „Humane efektorske üelije“ su leukociti koji izražavaju jedan ili više FcRs i vrše efektorske funkcije. ûelije mogu da ekspresuju FcȖRIII i izvršavaju efektorsku funkciju zavisnu od üelija posredovanu üelijom (ADCC). Primeri ljudskih leukocita koji posreduju u ADCC ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, mononuklearne üelije periferne krvi (PBMC), üelije prirodnih ubica (NK), monocite, makrofage, eozinofile i neutrofile, s tim što se preferiraju PBMC i NK üelije. Antitela koja imaju ADCC aktivnost su tipiþno IgG1 ili IgG3 izotipa. Takva antitela koja posreduju ADCC mogu se takoÿe proizvesti inženjeringom promenljivog regiona od ne-ADCC antitela ili fragmenta promenljivog regiona do konstantnog regiona IgG1 ili IgG3 izotipa.
IV. Primena Konjugata PTK7 Antitelo-Lek
[0255] Antitela i konjugati antitelo-lek predmetnog pronalaska su korisni u razliþitim primenama, ukljuþujuüi, ali nisu ograniþeni na, terapijske metode leþenja i dijagnostiþke metode leþenja.
IV.A. In Vitro Primene
[0256] Predmetni pronalazak obezbeÿuje in vitro metode koje koriste konjugate PTK7 antitelolek. Na primer, otkrivena antitela mogu se koristiti, bilo sama, ili u kombinaciji sa citotoksiþnim agensima ili drugim lekovima, za specifiþno vezivanje PTK7-pozitivnih üelija karcinoma da iscrpe takve üelije iz üelijskog uzorka. Takoÿe su obezbeÿene metode za indukovanje apoptoze i / ili inhibiciju üelijske proliferacije kontaktiranjem üelija koje eksprimiraju PTK7 sa konjugatom PTK7 antitelo-lek. Reprezentativne in vitro metode su ovde opisane gore pod naslovom „Funkcionalni testovi za karakterizaciju konjugata PTK7 antitelo-lek".
[0257] Konjugati PTK7 antitelo-lek prema pronalasku takoÿe imaju koristi u otkrivanju PTK7-pozitivnih üelija in vitro na osnovu njihove sposobnosti da specifiþno vezuju PTK7 antigen. Metoda za otkrivanje üelija koje ekspresuju PTK7 može da ukljuþuje: (a) pripremu biološkog uzorka koji ima üelije; (b) kontaktiranje konjugata PTK7 antitelo-lek sa biološkim uzorkom in vitro, pri þemu je lek prepoznatljiva etiketa; i (c) otkrivanje vezivanja konjugata PTK7 antitelolek.
[0258] Konjugati PTK7 antitelo-lek ovde otkriveni su takoÿe korisni za smanjenje uþestalosti üelija koje iniciraju tumor u uzorku tumora. Na primer, metoda može da ukljuþuje korake u kontaktima in vitro sa populacijom tumorskih üelija, gde populacija sadrži üelije koje iniciraju tumor i üelije tumora, osim üelija koje iniciraju tumor, sa konjugatom PTK7 antitelo-lek; pri þemu se smanjuje procenat üelija koje iniciraju tumor u populaciji üelija. Kako se ovde koristi, izraz üelija koja inicira tumor" takoÿe se odnosi na matiþne üelije karcinoma razliþitih hematoloških malignih bolesti, koje same po sebi nisu okarakterisane tumorom. Reprezentativni uzorci tumora ukljuþuju bilo koji biološki ili kliniþki uzorak koji sadrži üelije tumora, na primer uzorak tkiva, biopsiju, uzorak krvi, plazmu, pljuvaþku, urin, semensku teþnost itd..
IV.B. Terapeutske Primene
[0259] Poremeüaji ili stanja povezani sa PTK7 ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, mezoteliom, hepatobilijarni (jetreni i bilijarni kanal), hepatocelularni karcinom, primarni ili sekundarni tumor CNS, primarni ili sekundarni tumor mozga, rak pluüa (NSCLC i SCLC), rak kostiju, pankreasa rak, rak kože, rak glave ili vrata, melanom, rak jajnika, rak debelog creva, rak rektuma, rak analnog regiona, rak želuca, gastrointestinalni (poput karcinoma želuca, debelog creva i dvanaestopalaþnog creva), rak dojke (kao što je trostruko negativni rak dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteron receptor (PR ), pozitivan na estrogen receptor rak dojke (ER ) i dvostruko pozitivan rak dojke), rak materice, karcinom jajovoda, karcinom endometrijuma, karcinom grliüa materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodgkinova bolest, rak jednjaka, rak tankog creva, rak endokrinog sistema, rak štitaste žlezde, rak paratireoidne žlezde žlezda, rak nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, rak uretre, rak penisa, rak prostate, rak testisa, leukemije (poput akutne mijeloiþne leukemije (AML) i akutne limfoblastne leukemije (ALL), hroniþne mijeloiþne leukemije ), limfocitni limfomi, rak bešike, rak bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih üelija, karcinom bubrežne karlice, novotvorine centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS, ne-Hodgkinov limfom, tumori kiþmene ose, gliom moždanog stabla, adenom hipofize, rak adrenokortikalne kiseline, rak žuþne kese, multipli mijelom, holangiokarcinom, fibrosarkom, neuroblastom, retinoblastom i svi karcinomi predstavljeni tipovima üelija koji izražavaju PTK7 prikazanim u Tabelama 8 i 9 ili kombinacijom jednog ili više ovde otkrivenih karcinoma.
[0260] Fraza "efikasna koliþina", "efikasna doza" ili kako se ovde koristi odnosi se na koliþinu leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije neophodna za postizanje bilo kog jednog ili više korisnih ili željenih terapijskih rezultata. Za profilaktiþku upotrebu, korisni ili željeni rezultati ukljuþuju uklanjanje ili smanjenje rizika, smanjenje težine ili odlaganje poþetka poremeüaja, ukljuþujuüi biohemijske, histološke i / ili bihejvioralne simptome poremeüaja, njegove komplikacije i srednje patološke fenotipove koji se javljaju tokom razvoja poremeüaj. Za terapijsku upotrebu, korisni ili željeni rezultati ukljuþuju kliniþke rezultate kao što je smanjenje incidence ili poboljšanje jednog ili više simptoma razliþitih poremeüaja povezanih sa PTK7, smanjenje doze drugih lekova potrebnih za leþenje poremeüaja, pojaþavanje dejstva drugog leka i / ili odlaganje progresija poremeüaja pacijenata povezanih sa PTK7.
[0261] U jednom aspektu, pronalazak pruža postupak za leþenje poremeüaja povezanog sa ekspresijom PTK7 kod subjekta. Pronalazak takoÿe obezbeÿuje konjugat antitelo-lek ili farmaceutsku kompoziciju, kako je ovde opisan, za upotrebu u metodi za leþenje poremeüaja povezanog sa ekspresijom PTK7 kod subjekta. Pronalazak dalje obezbeÿuje upotrebu konjugata antitelo-lek ili farmaceutske kompozicije, kako je ovde opisano, u proizvodnji leka za leþenje poremeüaja povezanog sa ekspresijom PTK7 kod subjekta.
[0262] U nekim aspektima pronalaska, postupak leþenja poremeüaja povezanog sa ekspresijom PTK7 kod subjekta ukljuþuje davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koliþine kompozicije (npr., farmaceutske kompozicije) koja ima konjugate PTK7 antitelo-lek, kako je ovde opisano . Poremeüaji povezani sa ekspresijom PTK7 ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na, abnormalnu ekspresiju PTK7, izmenjenu ili nepravilnu ekspresiju PTK7, prekomernu ekspresiju PTK7 i proliferativni poremeüaj (npr., kancer).
[0263] U jednom aspektu pronalaska, poremeüaj je kancer, ukljuþujuüi, ali bez ograniþenja, mezoteliom, hepatobilijarni (jetreni i bilijarni kanal), hepatocelularni karcinom, primarni ili sekundarni tumor CNS, primarni ili sekundarni tumor na mozgu, rak pluüa (NSCLC i SCLC), rak kostiju, rak pankreasa, rak kože, rak glave ili vrata, melanom, rak jajnika, rak debelog creva, rak rektuma, rak analnog regiona, rak želuca, gastrointestinalnog trakta (kao što su želudac, kolorektalni i duodenalni karcinomi dojke (karcinom dojke, kao što su trostruko negativni rak dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteron-receptor (PR+), pozitivan rak dojke na estrogen-receptor (ER+) i dvostruko pozitivan rak dojke), rak materice, karcinom jajovoda epruvete, karcinom endometrijuma, karcinom grliüa materice, karcinom vagine, karcinom vulve, Hodgkinova bolest, rak jednjaka, rak tankog creva, rak endokrinog sistema, rak štitaste žlezde, rak paratiroidna žlezda, rak nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, rak uretre, rak penisa, rak prostate, rak testisa, leukemije (kao što je akutna mijeloiþna leukemija (AML) i akutna limfoblastna leukemija (ALL), hroniþna mijeloiþna leukemija), limfocitni limfomi, rak bešike, rak bubrega ili uretera, karcinom bubrežnih üelija, karcinom bubrežne karlice, novotvorine centralnog nervnog sistema (CNS), primarni limfom CNS, ne-Hodžkinov limfom, kiþmena os tumori, gliom moždanog debla, adenom hipofize, rak nadbubrežne žlezde, rak žuþne kese, multipli mijelom, holangiokarcinom, fibrosarkom, neuroblastom, retinoblastom i svi karcinomi predstavljeni tipovima üelija koji izražavaju PTK7 prikazanim u tabelama 8 i 9 ili kombinacijom jednog ili više ovde otkrivenih karcinoma.
1
[0264] U drugom sluþaju, karcinomi pogodni za ciljanje pomoüu konjugata anti-PTK7 antitelo-lek ukljuþuju primarne i metastatske karcinome koji eksprimiraju PTK7, kao što je rak dojke (kao što je trostruko negativni rak dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteron-receptor (PR ), rak dojke pozitivan na estrogenske receptore (ER ) i dvostruko pozitivan rak dojke); rak jajnika; kolorektalni kancer; kancer jednjaka; kancer želuca; melanom; sarkom; rak bubrega; kancer pankreasa; karcinom prostate; rak jetre, kao što je hepatocelularni karcinom (HCC); i karcinom pluüa, kao što su karcinom pluüa koji nema malih üelija (NSCLC) i karcinom pluüa malih üelija (SCLC).
[0265] U konkretnijem sluþaju, karcinomi pogodni za ciljanje pomoüu konjugata anti-PTK7 antitelo-lek ukljuþuju primarne i metastatske karcinome koji ekspresuju PTK7, kao što je rak dojke (poput trostruko negativnog karcinoma dojke (TNBC), rak dojke pozitivan na progesteronreceptor PR+), rak dojke pozitivan na estrogenske receptore (ER ) i dvostruko pozitivan rak dojke) NSCLC, rak prostate i rak jednjaka. U konkretnijem sluþaju, karcinomi pogodni za ciljanje pomoüu konjugata anti-PTK7 antitelo-lek ukljuþuju primarne i metastatske karcinome koji eksprimiraju PTK7, kao što je rak dojke (kao što je trostruko negativni rak dojke (TNBC)) i NSCLC.
[0266] U nekim aspektima pronalaska, data je metoda za inhibiranje rasta ili napredovanja tumora kod subjekta koji ima tumor koji ekspresuje PTK7, ukljuþujuüi davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koliþine kompozicije koja ima konjugate PTK7 antitelo-lek, kako je opisano ovde. U drugim aspektima pronalaska, obezbeÿen je postupak za inhibiranje metastaziranja PTK7 koji ekspresuje üelije karcinoma kod subjekta, ukljuþujuüi davanje subjektu kome je to potrebno efikasne koliþine kompozicije koja ima konjugate PTK7 antitelo-lek, kao što je ovde opisano. U drugim aspektima pronalaska, obezbeÿen je postupak za indukovanje regresije PTK7 koji izražava regresiju tumora kod subjekta, ukljuþujuüi davanje subjektu kome je to potrebno, efikasne koliþine kompozicije koja ima konjugate PTK7 antitelo-lek, kao što je ovde opisano. U drugim aspektima, pronalazak obezbeÿuje konjugat antitelo-lek ili farmaceutsku kompoziciju, kako je ovde opisan, za upotrebu u gore opisanom postupku. U drugim aspektima pronalazak obezbeÿuje upotrebu konjugata antitelo-lek ili farmaceutske smeše, kako je ovde opisano, u proizvodnji leka za upotrebu u gore opisanim postupcima.
[0267] Dakle, pacijenti koji üe se leþiti konjugatima PTK7 antitelo-lek prema pronalasku mogu biti izabrani na osnovu ekspresije biomarkera, ukljuþujuüi, ali ne ograniþavajuüi se na mRNK
2
(qPCR) bulk tumorskih uzoraka i povišenu ekspresiju PTK7 antigena, što rezultira populacijom pacijenata koja je izabrana za obogaüena ekspresija cilja, a ne poreklo tumora ili histologija. Ekspresija cilja može se meriti u funkciji broja bojenja üelija u kombinaciji sa intenzitetom bojenja üelija. Na primer, klasifikacija visoke ekspresije PTK7 ukljuþuje one pacijente sa više od 30% (odn., 40%, 50% ili 60%) üelija testiranih imunohistohemijskim bojenjem pozitivnim na PTK7 na nivou 3+ (na skali od 1 do 4), dok umerena ekspresija PTK7 može ukljuþivati one pacijente sa više od 20% üelijskih üelija koje boje 1+ do 2+. Ekspresija cilja takoÿe se može meriti otkrivanjem ekspresije PTK7 na üelijama koje iniciraju tumor (TIC), kao što je ovde opisano.
[0268] Biomarkeri koji nisu ekspresija PTK7 mogu se takoÿe koristiti za odabir pacijenta, ukljuþujuüi na primer karakterizaciju tumora na osnovu rezistencije na više lekova (MDR).
Gotovo 50% ljudskih karcinoma je ili potpuno otporno na hemoterapiju, ili reaguje samo privremeno, nakon þega na njih više ne utiþu uobiþajeni lekovi protiv raka. Ovaj fenomen se naziva MDR i inherentno se izražava kod nekih vrsta tumora, dok drugi MDR stiþu nakon izlaganja hemoterapijskom leþenju. P-glikoprotein izlivne pumpe posreduje u veüini MDR povezanih sa citotoksiþnim hemoterapeuticima. Fenotipska i funkcionalna analiza MDR mehanizama prisutnih u uzorcima tumora pacijenata sa kancerom može se izvršiti kako bi se povezali specifiþni MDR mehanizmi sa otpornošüu na hemoterapiju kod odreÿenih vrsta tumora.
[0269] Rast karcinoma ili abnormalna proliferacija odnosi se na bilo koji od brojnih indeksa koji sugerišu promenu unutar üelija u razvijeniji oblik kancera ili stanje bolesti. Inhibicija rasta üelija karcinoma ili üelija ne-neoplastiþnog proliferativnog poremeüaja može se ispitati postupcima poznatim u tehnici, kao što su odloženi rast tumora i inhibicija metastaza. Ostali indeksi za merenje inhibicije rasta karcinoma ukljuþuju smanjenje preživljavanja üelija karcinoma, smanjenje zapremine tumora ili morfologije (na primer, kako se utvrÿuje pomoüu raþunarske tomografije (CT), sonografije ili druge slikovne metode), uništavanje vaskularne vaskulacije, poboljšano performanse u odloženom preosetljivom testu kože, poveüanju aktivnosti citolitiþkih T-limfocita i smanjenju nivoa tumorskih specifiþnih antigena.
[0270] Željeni ishodi otkrivenih terapijskih metoda su obiþno merljive mere u poreÿenju sa kontrolnim ili osnovnim merenjima. Kako se ovde koristi, relativni izrazi kao što su „poboljšati“, „poveüati“ ili „smanjiti“ oznaþavaju vrednosti u odnosu na kontrolu, kao što je merenje kod istog pojedinca pre poþetka ovde opisanog leþenja ili merenje kod kontrolnog pojedinca (ili više kontrolnih osoba) u odsustvu ovde opisanog leþenjaa. Reprezentativni kontrolni pojedinac je pojedinac oboleo od istog oblika hiperproliferativnog poremeüaja kao i pojedinac koji se leþi i koji je približno iste starosti kao i pojedinac koji se leþi (kako bi se osiguralo da su faze poremeüaja kod leþene osobe i kontrolne osobe uporedive).
[0271] Promene ili poboljšanja kao odgovor na terapiju su uglavnom statistiþki znaþajni. Kako se ovde koristi, izraz "znaþaj" ili "znaþajan" odnosi se na statistiþku analizu verovatnoüe da postoji ne sluþajna povezanost izmeÿu dva ili više entiteta. Da bi se utvrdilo da li je veza „znaþajna“ ili ima „znaþaj“, statistiþke manipulacije podacima mogu biti „p-vrednost“. Te p-vrednosti koje padnu ispod korisniþki definisane graniþne taþke smatraju se znaþajnim. p-vrednost manja od ili jednaka 0.1, manja od 0.05, manja od 0.01, manja od 0.005 ili manja od 0.001 može se smatrati znaþajnom.
[0272] Kao što je ovde gore opisano pod naslovom "III. Funkcionalne analize za karakterizaciju konjugata PTK7 antitelo-lek", predmetni pronalazak takoÿe pruža metode za ciljanje üelija koje iniciraju tumor. Preciznije, konjugati PTK7 antitelo-lek prema pronalasku mogu iscrpeti, utišati, neutralisati, eliminisati ili inhibirati rast, širenje ili preživljavanje tumorskih üelija, ukljuþujuüi üelije koje iniciraju tumor.
[0273] Prema tome, ovde otkriveni konjugati PTK7 antitelo-lek takoÿe su korisni za smanjenje Xþestalosti üelija koje iniciraju tumor u uzorku tumora. Na primer, metoda može da ukljuþuje korake u kontaktu sa populacijom tumorskih üelija, gde populacija sadrži üelije koje iniciraju tumor i üelije tumora, osim üelija koje iniciraju tumor, sa konjugatom PTK7 antitelo-lek; pri þemu se smanjuje procenat üelija koje iniciraju tumor u populaciji üelija. Kako se ovde koristi, izraz üelija koja inicira tumor" takoÿe se odnosi na matiþne üelije karcinoma razliþitih hematoloških malignih bolesti, koje same po sebi nisu okarakterisane tumorom. Korak kontaktiranja može se izvršiti in vitro, pri þemu je populacija tumorskih üelija sadržana u biološkom uzorku, kao što je gore opisano. Alternativno, korak kontaktiranja može se izvršiti in vivo, kao što se dešava nakon primene konjugata PTK7 antitelo-lek na subjekta.
IV.C. In Vivo Detekcija i Dijagnoze
[0274] U drugom aspektu, obezbeÿena je metoda otkrivanja, dijagnoze i / ili praüenja poremeüaja povezanih sa ekspresijom PTK7. Na primer, PTK7 antitela kako su ovde opisana
4
mogu biti obeležena detektujuüim ostatkom kao što su agensi za obradu slike i oznaka enzima i supstrata. Ovde opisana antitela takoÿe se mogu koristiti za in vivo dijagnostiþke testove, kao što su in vivo slike (npr., PET ili SPECT), ili reagens za bojenje.
[0275] Nakon primene konjugata PTK7 antitelo-lek na subjekta, pri þemu je lek detektabilna oznaka, a nakon vremena dovoljnog za vezivanje, može se vizualizovati biodistribucija üelija koje eskpresuju PTK7 sa antitelom. Otkrivene dijagnostiþke metode mogu se koristiti u kombinaciji sa metodama leþenja. Pored toga, konjugati PTK7 antitelo-lek pronalaska mogu se primenjivati za dvostruku svrhu detekcije i terapije.
[0276] Reprezentativne neinvazivne metode detekcije ukljuþuju scintigrafiju (npr., SPECT (raþunarska tomografija sa jednom fotonskom emisijom), PET (pozitronska emisiona tomografija), snimanje gama kamera i pravolinijsko skeniranje), snimanje magnetnom rezonancom (npr., konvencionalno snimanje magnetne rezonance, snimanje prenosa magnetizacije) (MTI), protonska magnetna rezonancna spektroskopija (MRS), difuzijski ponderisano slikanje (DVI) i funkcionalno MR snimanje (fMRI)) i ultrazvuk.
IV.D. Formulacija
[0277] Predmetni pronalazak dalje obezbeÿuje farmaceutske smeše, ukljuþujuüi bilo koji od ovde predstavljenih konjugata PTK7 antitelo-lek, i farmaceutski prihvatljiv nosaþ. Dalje, kompozicije mogu da ukljuþuju više od jednog PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek (npr., smeša PTK7 antitela koja prepoznaju razliþite epitope PTK7). Druge primerne kompozicije ukljuþuju više od jednog PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek koji prepoznaju isti epitop(e), ili razliþite vrste PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek koji se vezuju za razliþite epitope PTK7 (npr., humani PTK7).
[0278] Kompozicija koja se koristi u predmetnom pronalasku može dalje da ukljuþuje farmaceutski prihvatljive nosaþe, ekscipijente ili stabilizatore (Remington: The Science and practice of Pharmacy 21st Ed., 2005, Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosaþi, ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksiþni za primaoce u dozama i koncentracijama i mogu sadržati pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanse, ukljuþujuüi askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentarezol; polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, ukljuþujuüi glukozu, manozu ili dekstrane; helatni agensi kao što je EDTA; šeüere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protiv-joni koji formiraju sol, kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i / ili nejonske površinski aktivne supstance kao što su TWEEN ™, PLURONICS ™ ili polietilen glikol (PEG). "Farmaceutski prihvatljiva so", kako se ovde koristi, odnosi se na farmaceutski prihvatljive organske ili neorganske soli molekula ili makromolekule. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti su ovde dalje opisani.
[0279] Za davanje se mogu koristiti razliþite formulacije PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek. U nekim aspektima pronalaska, PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-leka mogu se davati uredno. PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens mogu biti u razliþitim formulacijama. Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi su poznati u struci i relativno su inertne supstance koje olakšavaju primenu farmakološki efikasne supstance. Na primer, ekscipijens može dati oblik ili konzistenciju ili delovati kao razblaživaþ. Pogodni ekscipijensi ukljuþuju, ali nisu ograniþeni na agense za stabilizaciju, agense za vlaženje i emulgovanje, soli za promenljivu osmolarnost, agense za kapsuliranje, pufere i pojaþivaþe prodiranja kroz kožu. Ekscipijensi kao i formulacije za parenteralno i neparenteralno davanje lekova su date u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000.
[0280] U nekim aspektima pronalaska, ovi agensi su formulisani za primenu injekcijom (npr., intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intramuskularno, itd.). Shodno tome, ovi agensi se mogu kombinovati sa farmaceutski prihvatljivim nosaþima kao što su fiziološki rastvor, Ringerov rastvor, rastvor dekstroze i sliþno. Odreÿeni režim doziranja, odn. doza, vreme i ponavljanje, zavisiüe od odreÿenog pojedinca i njegove istorije bolesti.
[0281] Terapeutske formulacije PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek korišüene u skladu sa predmetnim pronalaskom pripremaju se za skladištenje mešanjem antitela željenog stepena þistoüe sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosaþima, ekscipijensima ili stabilizatorima (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosaþi, ekscipijensi ili stabilizatori nisu toksiþni za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i mogu sadržati pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidanse, ukljuþujuüi askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabene, kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; m-pentaresol; polipeptide niske molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; amino kiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharide, disaharide i druge ugljene hidrate, ukljuþujuüi glukozu, manozu ili dekstrine; helatne agense kao što je EDTA; šeüere kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protiv-jone koji formiraju sol, kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Zn-proteinski kompleksi); i / ili nejonski surfaktanti kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).
[0282] Lipozomi koji sadrže PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek su dobijeni postupcima poznatim u tehnici, kao što je opisano u Eppstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030-4034 (1980); i U.S. Patenti Br.
4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa poveüanim vremenom cirkulacije su otkriveni u U.S. Patentu br. 5,013,556. Naroþito korisni lipozomi se mogu generisati postupkom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji ukljuþuje fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veliþine pora dajuüi lipozome željenog preþnika.
[0283] Aktivni sastojci se takoÿe mogu uhvatiti u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili polimerizacijom na površini, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli- (metilmetakrilat) mikrokapsule, u koloidne sisteme za isporuku lekova (na primer lipozome, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanoþestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Takve tehnike su otkrivene u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005.
[0284] Mogu se dobiti preparati za produženo oslobaÿanje. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobaÿanjem ukljuþuju polupropusne matrice þvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, pri þemu su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi, ili mikrokapsule.
Primeri matrica sa produženim oslobaÿanjem ukljuþuju poliestere, hidrogelove (na primer, poli (2-hidroksietil-metakrilat) ili 'poli (vinilalkohol)), polilaktide (US patent 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i 7 etil- L-glutamat, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mleþne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT ™ (mikrosfere za ubrizgavanje sastavljene od kopolimera mleþne kiseline i glikolne kiseline i leuprolida acetata), izobutirata saharoze acetata i poli-D-(-)-3-hidroksimaslena kiselina.
[0285] Formulacije koje se koriste za in vivo primenu moraju biti sterilne. To se lako postiže, na primer, filtriranjem kroz sterilne filtracione membrane. Terapeutske kompozicije PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitela-lek se obiþno stavljaju u posudu koja ima sterilni pristupni otvor, na primer, vreüu za intravenski rastvor ili boþicu koja ima þep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju.
[0286] Kompozicije prema predmetnom pronalasku mogu biti u jediniþnim oblicima doziranja kao što su tablete, pilule, kapsule, praškovi, granule, rastvori ili suspenzije ili supozitorije, za oralnu, parenteralnu ili rektalnu primenu ili davanje inhalacijom ili insuflacijom.
[0287] Za pripremu þvrstih kompozicija kao što su tablete, glavni aktivni sastojak se pomeša sa farmaceutskim nosaþem, npr., konvencionalni sastojci za tabletiranje kao što su kukuruzni skrob, laktoza, saharoza, sorbitol, talk, stearinska kiselina, magnezijum stearat, dikalcijum fosfat ili gume i drugi farmaceutski razblaživaþi, npr., voda, da bi se formirao þvrsti preparat za preformulaciju koji sadrži homogenu smešu jedinjenja predmetnog pronalaska, ili njegovu netoksiþnu farmaceutski prihvatljivu so. Kada se odnosi na ove preformulacijske kompozicije poznate kao homogenim, podrazumeva se da je aktivni sastojak ravnomerno raspršen kroz celu kompoziciju, tako da se kompozicija može lako podeliti na podjednako efikasne jediniþne dozne oblike kao što su tablete, pilule i kapsule. Ova þvrsta kompozicija za preformulaciju je zatim podeljen u jediniþne oblike doziranja gore opisanog tipa koji sadrže od 0.1 do oko 500 mg aktivnog sastojka ovog pronalaska. Tablete ili pilule nove kompozicije mogu biti obložene ili na bilo koji drugi naþin složene da bi se dobio oblik doziranja koji daje prednost produženog delovanja. Na primer, tableta ili pilula mogu da sadrže unutrašnju dozu i spoljašnju komponentu doziranja, pri þemu je poslednja u obliku koverte preko prve. Dve komponente mogu biti odvojene enteriþkim slojem koji služi da se odupre raspadanju u želucu i omoguüava unutrašnjoj komponenti da netaknuta preÿe u dvanaestopalaþno crevo ili da se odloži u oslobaÿanju. Za takve enteriþke slojeve ili prevlake mogu se koristiti razni materijali, kao što su materijali koji ukljuþuju brojne polimerne kiseline i smeše polimernih kiselina sa materijalima kao što su šelak, cetil alkohol i celulozni acetat.
[0288] Pogodni površinski aktivni agensi ukljuþuju, naroþito, nejonske agense, poput polioksietilensorbitana (npr. TWEEN ™ 20, 40, 60, 80 ili 85) i drugih sorbitana (npr. Span™ 20, 40, 60, 80 ili 85). Kompozicije sa površinski aktivnim agensom üe povoljno sadržati izmeÿu 0.05 i 5% površinski aktivnog agensa, a mogu biti izmeÿu 0.1 i 2,5%. Podrazumeva se da se po potrebi mogu dodati i drugi sastojci, na primer manitol ili drugi farmaceutski prihvatljivi nosaþi.
[0289] Pogodne emulzije mogu se pripremiti uz pomoü komercijalno dostupnih emulzija masti, kao što su INTRALIPID™, LIPOSIN™, INFONUTROL™, LIPOFUNDIN™ i LIPIPHISAN™. Aktivni sastojak može biti rastvoren u prethodno pomešanoj emulzionoj kompoziciji ili alternativno može biti rastvoren u ulju (npr., sojino ulje, ulje šafranike, ulje semena pamuka, susamovo ulje, kukuruzno ulje ili bademovo ulje) i emulzija koja nastaje mešanjem sa fosfolipid (npr. fosfolipidi jaja, fosfolipidi soje ili lecitin soje) i voda. Podrazumeva se da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer glicerol ili glukoza, da bi se podesila toniþnost emulzije. Pogodne emulzije obiþno sadrže do 20% ulja, na primer izmeÿu 5 i 20%. Emulzija masti može sadržati kapljice masti izmeÿu 0.1 i 1.0 µm, naroþito 0.1 i 0.5 µm, i imaju pH u opsegu od 5.5 do 8.0.
[0290] Kompozicije emulzije mogu biti one koji se pripremaju mešanjem PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek sa INTRALIPID ™ ili njegovim komponentama (sojino ulje, fosfolipidi jaja, glicerol i voda).
[0291] Kompozicije za inhalaciju ili insuflaciju ukljuþuju rastvore i suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaraþima ili njihovim smešama, i prahove. Teþne ili þvrste kompozicije mogu sadržati odgovarajuüe farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što je gore navedeno. U nekim aspektima pronalaska, kompozicije se primenjuju oralnim ili nazalnim respiratornim putem radi lokalnog ili sistemskog efekta. Kompozicije u poželjno sterilnim farmaceutski prihvatljivim rastvaraþima mogu se raspršiti upotrebom gasova. Nebulirani rastvori se mogu udisati direktno iz ureÿaja za nebulozu, ili se ureÿaj za stvaranje magle može priþvrstiti na masku za lice, šator ili na prekidnu mašinu za disanje sa pozitivnim pritiskom. Kompozicije rastvora, suspenzije ili praha mogu se davati, poželjno oralno ili nazalno, sa ureÿaja koji na odgovarajuüi naþin isporuþuju formulaciju.
[0292] Pronalazak takoÿe pruža komplete za upotrebu u trenutnim metodama. Kompleti pronalaska ukljuþuju jedan ili više posuda, ukljuþujuüi PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelolek, kao što je ovde opisano i uputstva za upotrebu u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka otkrivanja. Uopšteno, ova uputstva ukljuþuju opis primene PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek za gore opisane terapijske tretmane.
[0293] Uputstva koja se odnose na upotrebu PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitela, kao što je ovde opisano, obiþno ukljuþuju informacije o doziranju, rasporedu doziranja i naþinu primene za planirano leþenje. Posude mogu biti jediniþne doze, pakovanja u rinfuzi (npr., pakovanja sa više doza) ili dozne jedinice. Uputstva koja se isporuþuju u kompletu pronalaska su obiþno napisana uputstva na nalepnici ili ulošku paketa (npr., list papira koji se nalazi u kompletu), ali takoÿe su i mašinski þitljiva uputstva (npr., uputstva na magnetnom ili optiþkom disku za skladištenje) prihvatljiva.
[0294] Kompleti ovog pronalaska se nalaze u odgovarajuüem pakovanju. Odgovarajuüa ambalaža ukljuþuje, ali nije ograniþena na, boþice, boce, tegle, fleksibilnu ambalažu (npr., zatvoreni Mylar ili plastiþne kese) i sliþno. Takoÿe se razmatraju pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa odreÿenim ureÿajem, kao što su inhalator, ureÿaj za nazalno davanje (npr., atomizer) ili ureÿaj za infuziju kao što je mini pumpa. Komplet može imati sterilni otvor za pristup (na primer, posuda može biti vreüa za intravenski rastvor ili boþica koja ima þep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Posuda takoÿe može imati sterilni otvor za pristup (na primer, posuda može biti vreüa za intravenski rastvor ili boþica sa þepom koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek. Posuda može dalje da sadrži drugi farmaceutski aktivni agens.
[0295] Kompleti mogu opcionalno da sadrže dodatne komponente kao što su baferi i interpretativne informacije. Obiþno komplet ukljuþuje posudu i etiketu ili umetke u ambalaži na ili povezani sa posudom.
IV.E. Doza i Primena
[0296] Za in vitro i in vivo primene, konjugati PTK7 antitelo-lek se obezbeÿuju ili daju u efikasnoj dozi. U kliniþkom kontekstu, efikasna doza leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije je dovoljna koliþina za postizanje profilaktiþkog ili terapijskog leþenja bilo direktno ili indirektno. Efikasna doza se može primeniti u jednoj ili više primena. Efikasna doza leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije može ili ne mora da se postigne zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom. Prema tome, „efikasna doza“ se može razmotriti u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih agenasa, a pojedinaþni agens se može smatrati datom u efikasnoj koliþini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa, poželjan rezultat može biti ili je postignuto. Za detekciju PTK7-pozitivnih üelija korišüenjem otkrivenih konjugata PTK7 antitelo-lek, subjektu se primenjuje detektujuüa koliþina kompozicije pronalaska, odn., doza konjugata takva da se prisustvo konjugata može utvrditi in vitro ili in vivo.
[0297] Na primer, kada se daje subjektu koji ima rak, efikasna koliþina ukljuþuje koliþinu dovoljnu da izazove antikancerogenu aktivnost, ukljuþujuüi citolizu üelija karcinoma, inhibiciju proliferacije üelija karcinoma, indukciju apoptoze üelija karcinoma, smanjenje antigena üelija karcinoma, odloženo rast tumora i / ili inhibicija metastaza. Skupljanje tumora je dobro prihvaüeno kao kliniþki surogatni marker za efikasnost. Još jedan dobro prihvaüen pokazatelj efikasnosti je preživljavanje bez progresije.
[0298] PTK7 antitelo ili konjugati PTK7 antitelo-lek mogu se davati pojedincu na bilo koji pogodan naþin. Struþnjaci u ovoj oblasti treba da shvate da ovde opisani primeri nisu ograniþeni veü da ilustruju dostupne tehnike. Shodno tome, u nekim aspektima pronalaska, PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitela daju se pojedincu u skladu sa poznatim metodama, kao što je intravenska primena, npr., u bolusu ili kontinuiranom infuzijom tokom odreÿenog vremena, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, intrakranijalno, transdermalno, potkožno, intraartikularno, sublingvalno, intrasinovijalno, putem insuflacije, intratekalnim, oralnim, inhalacijskim ili topikalnim putem. Primena može biti sistemska, na primer, intravenska primena ili lokalizovana. Komercijalno dostupni raspršivaþi za teþne formulacije, ukljuþujuüi mlazne i ultrazvuþne nebulizatore, korisni su za primenu. Teþne formulacije se mogu direktno raspršiti, a liofilizovani prah se može raspršiti nakon rekonstitucije. Alternativno, PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek mogu se aerosolizovati upotrebom formulacije fluorougljenika i inhalatorom odmerene doze, ili udisati kao liofilizovani i mleveni prah.
[0299] U nekim aspektima pronalaska, PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek se daje putem specifiþnih za lokaciju ili ciljanih lokalnih tehnika isporuke. Primeri specifiþnih ili ciljanih lokalnih tehnika isporuke ukljuþuju razliþite implantabilne depo izvore PTK7 antitela ili konjugata
1
PTK7 antitelo-lek ili katetere za lokalnu isporuku, kao što su infuzijski kateteri, kateteri u kojima se stalno boravi ili igleni kateteri, sintetiþki graftovi, adventitijalni oblozi, šantovi. i stentovi ili drugi ureÿaji za implantaciju, nosaþi specifiþni za lokaciju, direktno ubrizgavanje ili direktna primena. Videti, npr. PCT meÿunarodna objavu br. WO 2000/53211 i U.S. Patent br.5,981,568.
[0300] PTK7 antitela ili konjugati PTK7 antitelo-lek, kako su ovde opisani, mogu se primenjivati bilo kojim pogodnim postupkom, ukljuþujuüi injekcije (npr., intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intramuskularno, itd.). PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek se takoÿe mogu davati inhalacijom, kao što je ovde opisano. Uopšteno, za primenu PTK7 antitela i konjugata PTK7 antitelo-lek, poþetna doza kandidata može biti oko 2 mg/kg. U svrhu ovog pronalaska, tipiþna dnevna doza se može kretati od oko bilo koje od 3 mg/kg do 30 mg/kg do 300 mg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg, do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od gore pomenutih faktora. Na primer, može se koristiti doza od oko 1 mg/kg, oko 2,5 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg i oko 25 mg/kg. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od poremeüaja, leþenje se održava sve dok se ne dogodi željena supresija simptoma ili dok se ne postignu dovoljni terapeutski nivoi, na primer, da se inhibira ili odlaže rast / progresija tumora ili metastaze üelija karcinoma. Primeran režim doziranja ukljuþuje primenu poþetne doze od oko 2 mg/kg, nakon þega sledi nedeljna doza održavanja od oko 1 mg/kg PTK7 antitela ili konjugat PTK7 antitelo-lek, ili praüena dozom održavanja od oko 1 mg/kg svake druge nedelje. Drugi primerni režimi doziranja ukljuþuju primenu sve veüih doza (npr., poþetna doza od 1 mg/kg i postepeno poveüanje do jedne ili više veüih doza svake nedelje ili dužeg vremenskog perioda). Drugi režimi doziranja takoÿe mogu biti korisni, u zavisnosti od obrasca farmakokinetiþkog propadanja koji lekar želi da postigne. Na primer, u nekim aspektima pronalaska predviÿa se doziranje od jednom do þetiri puta nedeljno. U drugim aspektima se razmatra doziranje jednom meseþno ili jednom u svaki drugi mesec ili svaka tri meseca, kao i nedeljno, dvonedeljno i svake tri nedelje. Napredak ove terapije može se lako pratiti konvencionalnim tehnikama i testovima. Režim doziranja (ukljuþujuüi upotrebljeno PTK7 antitelo ili upotrebljeni konjugat PTK7 antitelolek) može vremenom da varira.
[0301] Za svrhu predmetnog pronalaska, odgovarajuüa doza PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek zavisiüe od PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek (ili njihovih kompozicija), vrste i težine simptoma da li se lek primenjuje u terapeutske svrhe, prethodna terapija, kliniþka istorija pacijenta i odgovor na agens, stopa klirensa pacijenta za primenjeni agens i diskrecija lekara koji dolazi. Lekar može da daje PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek dok se ne
2
postigne doza koja postiže željeni rezultat i dalje. Doza i / ili uþestalost mogu se razlikovati tokom leþenja, ali takoÿe mogu ostati konstantne. Empirijska razmatranja, poput poluvremena, uglavnom üe doprineti odreÿivanju doze. Na primer, antitela koja su kompatibilna sa humanim imunološkim sistemom, kao što su humanizovana antitela ili potpuno humana antitela, mogu se koristiti za produžavanje poluvremena antitela i za spreþavanje antitela od napada imunološkog sistema domaüina. Uþestalost primene može se odrediti i prilagoditi tokom leþenja i uglavnom se, ali ne nužno, zasniva na leþenju i / ili suzbijanju i / ili ublažavanju i / ili odlaganju simptoma, npr., inhibicija ili odlaganje rasta tumora itd. Alternativno, formulacije sa kontinuiranim oslobaÿanjem PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek mogu biti prikladne. U tehnici su poznate razne formulacije i ureÿaji za postizanje usporenog oslobaÿanja.
[0302] U nekim aspektima pronalaska, doze za PTK7 antitelo ili konjugat PTK7 antitelo-lek mogu se empirijski odrediti kod pojedinaca kojima je data jedno ili više davanje PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek. Pojedincima se daju inkrementalne doze PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek. Da bi se procenila efikasnost, može se pratiti indikator poremeüaja.
[0303] Primena PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek u skladu sa postupkom u predmetnom pronalasku može biti kontinuirana ili povremena, u zavisnosti, na primer, od fiziološkog poremeüaja primaoca, da li je svrha primene terapijska ili profilaktiþka, i drugi faktori poznati kvalifikovanim praktiþarima. Primena PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek može biti u osnovi kontinuirana tokom unapred izabranog vremenskog perioda ili može biti u nizu razmaka doza.
IV.F. Kombinovane Terapije
[0304] U nekim aspektima pronalaska, ovde opisani postupci dalje ukljuþuju korak leþenja subjekta dodatnim oblikom terapije. U nekim aspektima, dodatni oblik terapije je dodatna terapija protiv raka koja ukljuþuje, ali nije ograniþena na, hemoterapiju, zraþenje, hirurgiju, hormonsku terapiju i / ili dodatnu imunoterapiju.
[0305] Otkriveni konjugati PTK7 antitelo-lek mogu se primenjivati kao poþetno leþenje ili za leþenje poremeüaja koji ne reaguju na konvencionalne terapije. Pored toga, konjugati PTK7 antitelo-lek mogu se koristiti u kombinaciji sa drugim terapijama (npr., hirurškom ekscizijom, zraþenjem, dodatnim lekovima protiv raka, itd.) da bi se na taj naþin izazvali aditivni ili potencirani terapeutski efekti i / ili smanjila hepatocitotoksiþnost nekih anti-kancer agenasa. Konjugati PTK7 antitelo-lek prema pronalasku se mogu davati istovremeno ili istovremeno formulisati sa dodatnim agensima, ili formulisati za uzastopnu primenu sa dodatnim agensima u bilo kom redosledu.
[0306] Reprezentativni agensi korisni za kombinovanu terapiju ukljuþuju bilo koji od gore opisanih lekova koji su korisni za pripremu konjugata PTK7 antitelo-lek u podnaslovu „Lekovi“. Konjugati PTK7 antitelo-lek prema pronalasku mogu se takoÿe koristiti u kombinaciji sa drugim terapijskim antitelima i konjugatima antitelo-lek, ukljuþujuüi anti-PTK7 antitela drugaþija od otkrivenih anti-PTK7 antitela, kao i antitela i konjugati koji ciljaju drugi antigen. Reprezentativna antitela, koja se mogu koristiti samostalno ili kao konjugat antitelo-lek, ukljuþuju anti-5T4 antitela (npr., A1, A2, i A3), anti-CD19 antitela, anti-CD20 antitela (npr., RITUXAN®, ZEVALIN®, BEXXAR®), anti-CD22 antitela, anti-CD33 antitela, konjugati anti-CD33 antitelo-lek (npr., MYLOTARG®), anti-Lewis Y antitela (npr., Hu3S193, Mthu3S193, AGmthu3S193), anti-HER-2 antitela (npr., HERCEPTIN® (trastuzumab), MDX-210, OMNITARG® (pertuzumab, rhuMAb 2C4)), anti-CD52 antitela (npr., CAMPATH®), anti-EGFR antitela (npr., ERBITUX® (cetuksimab), ABX-EGF (panitumumab)), anti-VEGF antitela (npr., AVASTIN® (bevacizumab)), anti-DNA/histon kompleks antitela (npr., ch-TNT-1/b), anti-CEA antitela (npr., CEA-Cide, YMB-1003) hLM609, anti-CD47 antitela (npr., 6H9), anti-VEGFR2 (ili receptor koji sadrži domen koji ubacuje kinazu, KDR) antitela (npr., IMC-1C11), anti-Ep-CAM antitela (npr., ING-1), anti-FAP antitela (npr., sibrotuzumab), anti-DR4 antitela (npr., TRAIL-R), anti-progesteron receptor antitela (npr., 2C5), anti-CA19.9 antitela (npr., GIVAREX®) i anti-fibrin antitela (npr., MH-1).
[0307] Otkriveni konjugati PTK7 antitelo-lek se mogu takoÿe primenjivati zajedno sa jednom ili više kombinacija citotoksiþnih agenasa kao deo režima leþenja. Korisni citotoksiþni preparati u ovu svrhu ukljuþuju CHOPP (ciklofosfamid, doksorubicin, vincristin, prednison i procarbazin); CHOP (ciklofosfamid, doksorubicin, vincristin, i prednison); COP (ciklofosfamide, vincristin, prednison); CAP-BOP (ciklofosfamid, doksorubicin, procarbazin, bleomicin, vincristin i prednison); m-BACOD (metotreksate, bleomicin, doksorubicin, ciklofosfamid, vincristin, deksametason, i leucovorin; ProMACE-MOPP (prednison, metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, etoposid, leukovorin, mehloetamin, vincristin, prednison i procarbazine);
ProMACECytaBOM (prednison, metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, etoposid, leukovorin, citarabin, bleomicin i vincristin); MACOP-B (metotreksat, doksorubicin, ciklofosfamid, vincristin, prednison, bleomicin i leukovorin); MOPP (mehloetamin, vincristin, prednison i procarbazin);
4
ABVD (adriamicin/doksorubicin, bleomicin, vinblastin i dacarbazin); MOPP (mehloetamin, vincristin, prednison i procarbazin) naizmeniþno sa ABV (adriamicin/doksorubicin, bleomicin, vinblastin); MOPP (mehloetamin, vincristin, prednison i procarbazin) naizmeniþno sa ABVD (adriamicin/doksorubicin, bleomicin, vinblastine i dacarbazin); ChIVPP (hlorambucil, vinblastin, procarbazin, prednison); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat, etoposid); MIME (metil-gag, ifosfamid, metotreksat, etoposid); DHAP (deksametason, visoka doza citaribina i cisplatina); ESHAP (etoposid, metilpredisolon, HD citarabin, i cisplatin); CEPP(B) (ciklofosfamid, etoposide, procarbazin, prednison i bleomicin); CAMP (lomustin, mitoksantron, citarabin i prednison); i CVP-1 (ciklofosfamid, vincristine i prednison); DHAP (cisplatin, visoka doza citarabina i deksametasona); CAP (ciklofosfamid, doksorubicin, cisplatin); PV (cisplatin, vinblastin ili vindesin); CE (carboplatin, etoposid); EP (etoposid, cisplatin); MVP (mitomicin, vinblastine ili vindesin, cisplatin); PFL (cisplatin, 5-fluorouracil, leucovorin); IM (ifosfamid, mitomicin); IE (ifosfamid, etoposid); IP (ifosfamide, cisplatin); MIP (mitomicin, ifosfamide, cisplatin); ICE (ifosfamid, carboplatin, etoposid); PIE (cisplatin, ifosfamide, etoposid); Viorelbine i cisplatin; Carboplatin i paclitaksel; CAV (ciklofosfamid, doksorubicin, vincristin); CAE (ciklofosfamid, doksorubicin, etoposid); CAVE (ciklofosfamid, doksorubicin, vincristin, etoposid); EP (etoposid, cisplatin); i CMCcV (ciklofosfamid, metotreksat, lomustin, vincristin).
[0308] Konjugati PTK7 antitelo-lek se mogu koristiti u kombinaciji sa sistemskim lekovima protiv raka, kao što su epitiloni (BMS-247550, Epo-906), reformulacije taksana (Abraxane, Xyotax), mikrotubulin inhibitori (MST-997, TTI-237), ili sa ciljanim citotoksinima kao što su CMD-193 i SGN-15. Dodatni korisni agensi protiv raka ukljuþuju TAXOTERE®, TARCEVA®, GEMZAR® (gemcitabine), 5-FU, AVASTIN® ERBITUX®, TROVAX®, anatumomab mafenatoks, letrazol, docetaksel, i antraciklini.
[0309] Za kombinovane terapije, daje se konjugat PTK7 antitelo-lek i / ili jedno ili više dodatnih terapijskih ili dijagnostiþkih agenasa u bilo kom vremenskom okviru koji je pogodan za izvoÿenje predviÿene terapije ili dijagnoze. Prema tome, pojedinaþni agensi se mogu davati u osnovi istovremeno (odn., kao pojedinaþna formulacija ili u roku od nekoliko minuta ili sati) ili uzastopno, bilo kojim redosledom. Na primer, leþenje pojedinaþnim agensima mogu se primenjivati u roku od približno jedne godine, na primer u roku od oko 10, 8, 6, 4 ili 2 meseca, ili u roku od 4, 3, 2 ili 1 nedelje, ili u roku od oko 5, 4, 3, 2 ili 1 dan(a). Primena konjugata PTK7 antitelo-lek u kombinaciji sa drugim terapijskim agensom poželjno izaziva veüi efekat od primene bilo kog od njih samog.
[0310] U nekim aspektima pronalaska, dodatni oblik terapije ukljuþuje primenu jednog ili više terapeutskih agenasa u odnosu na PTK7 antitela ili konjugate PTK7 antitelo-lek, kao što je ovde opisano. Terapeutski agensi ukljuþuju, ali nisu ograniþena na, drugo antitelo (npr., anti- VEGF antitelo, anti- HER2 antitelo, anti- CD25 antitelo i / ili anti- CD20 antitelo), inhibitor angiogeneze, citotoksiþni agens, antiinflamatorni agens (npr., paklitaksel, docetaksel, cisplatin, doksorubicin, prednizon, mitomicin, progesteron, tamoksifen ili fluorouracil).
[0311] U nekim aspektima pronalaska, može biti prisutno više od jednog PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek. Može biti prisutno najmanje jedno, najmanje dva, najmanje tri, najmanje þetiri, najmanje pet razliþitih ili više PTK7 antitela ili konjugata PTK7 antitelo-lek.
Uopšteno, ta PTK7 antitela ili konjugati PTK7 antitelo-lek mogu imati komplementarne aktivnosti koje ne utiþu negativno jedan na drugoga. Na primer, može se koristiti jedno ili više sledeüih PTK7 antitela: prvo PTK7 antitelo usmereno na jedan epitop na PTK7 i drugo PTK7 antitelo usmereno na drugi epitop na PTK7.
[0312] Otkrivene kombinovane terapije mogu izazvati sinergijski terapeutski efekat, odn., efekat veüi od zbira njihovih pojedinaþnih efekata ili terapijskih ishoda. Merljivi rezultati terapije su ovde opisani. Na primer, sinergijski terapeutski efekat može biti efekat najmanje dvostruko veüi od terapeutskog efekta koji izaziva pojedinaþni agens, ili zbir terapeutskih efekata izazvanih pojedinaþnim agensima date kombinacije, ili bar oko pet puta veüi, ili bar oko desetostruko veüi, ili barem oko dvadeset puta veüi, ili bar oko pedeset puta veüi ili bar oko sto puta veüi.
Sinergijski terapeutski efekat se takoÿe može posmatrati kao poveüanje terapeutskog efekta za najmanje 10% u poreÿenju sa terapeutskim efektom koji izaziva pojedinaþni agens, ili zbir terapeutskih efekata izazvanih pojedinaþnim agensima date kombinacije, ili barem 20%, ili najmanje 30%, ili najmanje 40%, ili najmanje 50%, ili najmanje 60%, ili najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 100% , ili više. Sinergijski efekat je takoÿe efekat koji omoguüava smanjeno doziranje terapijskih agenasa kada se koriste u kombinaciji.
[0313] Kako se koristi u detaljnom opisu, pojam „oko“ znaþi vrednost /- 1% od vrednosti koja sledi posle izraza „oko“, ukoliko nije drugaþije naznaþeno.
Primeri
[0314] Sledeüi primeri su ponuÿeni samo u ilustrativne svrhe i nisu namenjeni ograniþavanju obima ovog pronalaska na bilo koji naþin.
Primer 1
Generacija i Humanizacija Anti-PTK7 Antitela
[0315] PTK-7 antitela u obliku mišjih antitela proizvedena su u skladu sa postupcima poznatim u tehnici i kao što je opisano u PCT Meÿunarodnoj Objavi br. WO 2012/112943. Stvorena mišja antitela su humanizovana pomoüu kalemljenja regiona koji odreÿuje komplementarnost (CDR). Humani okviri za teške i lake lance izabrani su na osnovu sliþnosti sekvenci i strukture s obzirom na funkcionalne gene genetske generacije. Strukturna sliþnost je procenjena uporeÿivanjem kanonske CDR strukture miša sa ljudskim kandidatima sa istim kanonskim strukturama kao što je opisano u Chothia et al. (supra).
[0316] Preciznije, mišja antitela ovde oznaþena mu23, mu24 i mu58 opisana u PCT Meÿunarodnoj Objavi br. WO 2012/112943 humanizovana su korišüenjem kompjuterski potpomognute CDR metode kalemljenja (Abysis Database, UCL Business Plc.) i standardnih tehnika molekularnog inženjeringa kako bi se obezbedilo humanizovani mu23, mu24 i mu58, u daljem tekstu hu23, hu24 i hu58, respektivno. Regioni humanog okvira promenljivih regiona izabrani su na osnovu njihove najviše homologije sekvence sa sekvencom okvira miša i njegove kanonske strukture. Za potrebe analize, dodeljivanje amino kiselina svakom od CDR domena bilo je u skladu sa Kabat et al. numerisanje. Napravljeno je nekoliko varijanti humanizovanih antitela kako bi se generisalo optimalno humanizovano antitelo sa humanizovanim antitelima koja generalno zadržavaju regione za odreÿivanje komplementarnosti koji vežu antigen (CDR) od hibridoma miša u saradnji sa humanim okvirnim regionima. Hu23, hu24 i hu58 mAb vezani za humani PTK7 antigen sa sliþnim afinitetom kao i njihovi mišji pandani, mereno sistemom BIACORE®.
[0317] Postupci molekularnog inženjerstva su sprovedeni korišüenjem tehnika priznatih u tehnici. Ukupna mRNK je ekstrakovana iz hibridoma prema protokolu proizvoÿDþa (TRIZOL® Plus RNA Purification System, Life Technologies). Prajmer vodeüe sekvence specifiþan za sekvencu, dizajniran da pojaþa svaki hibridom, korišüen je u kombinaciji sa 3 ’humanim Cylprimerom za pojaþavanje i kloniranje promenljivih regiona svakog humanizovanog antitela.
Sliþno tome, 5’Vk vodeüa sekvenca dizajnirana posebno za pojaþavanje svakog od Vk regiona u kombinaciji sa jednim reverznim prajmerom specifiþnim za humani kapa konstantni region korišüena je za pojaþavanje i kloniranje kapa lakog lanca. Pojaþani fragmenti su klonirani kao himerni humani gama1 / kapa lanci i služili su kao referentna oznaka za svaki humanizovani mAb.
[0318] Iz informacija o nukleotidnoj sekvenci dobijeni su podaci koji se odnose na segmente gena V, D i J teškog i lakog lanca mišjih antitela mu23, mu24 i mu58. Na osnovu podataka o sekvencama, novi setovi prajmera specifiþni za vodeüu sekvencu Ig VH i Vk lanca antitela dizajnirani su za kloniranje rekombinantnog monoklonskog antitela. Potom su sekvence V- (D) -J poravnate sa mišjim Ig germ linijskim sekvencama.
[0319] Geni teškog lanca mu23 identifikovani su kao VH3609 (V), DSP2.3 (D) i JH3. Geni teškog lanca mu24 identifikovani su kao VHJ558 (V), DSP2.7 (D) i JH4. Geni teškog lanca mu58 identifikovani su kao IGHV 4-1 (V), DFL 16.1 (D) i JH4. Sva tri laka lanca bila su k klase. Geni lakog lanca su identifikovani kao IGKVI4-111 i JK5 za mu23, IGKV3-5 i JK1 za mu24, i IGKV17-121 i JK4 germ linijske sekvence za mu58. Ovi rezultati su sumirani u donjoj Tabeli 2.
Tabela 2
[0320] Dobijene sekvence teškog i lakog lanca iz sva tri klona poravnate su sa funkcionalnim sekvencama varijabilnog humanog regiona i pregledane su homologija i kanonska struktura. Rezultati humanizovane analize teškog i lakog lanca prikazani su dole u Tabelama 3 odnosno 4, za humanizovana anti- PTK7 antitela hu23, hu24 i hu58.
Tabela 3
Tabela 4
[0321] Amino kiselinske sekvence i pridružene sekvence nukleinskih kiselina hu23, hu24 i hu58 prikazane su gore u Tabeli 1 gore. Aminok iselinske sekvence VH regiona za hu23, hu24 i hu58 prikazane su u SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 25, odnosno SEQ ID NO: 49, sa odgovarajuüim sekvencama nukleinske kiseline navedene u SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO: 26, odnosno SEQ ID NO: 50. Amino kiselinske sekvence kapa VL regiona hu23, hu24 i hu58 prikazane su u SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 39, odnosno SEQ ID NO: 63, sa odgovarajuüim sekvencama nukleinske kiseline navedene u SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 40, odnosno SEQ ID NO: 64.
[0322] Kao što je prikazano u Primerima u nastavku dole, svako od gore pomenutih humanizovanih antitela funkcioniše kao efikasan konjugat anti-PTK7 antitelo-lek u skladu sa ovde navedenim uþenjima.
Primer 2
Ekspresiona Humanizovana Antitela
[0323] Anti-PTK7 antitela hu23, hu24 i hu58 su izražena i izolovana upotrebom tehnika priznatih u tehnici i kao što je opisano u PCT Meÿunarodnoj Objavi Br. WO 2012/112943. Sintetiþki humanizovani varijabilni fragmenti DNK (Integrisane DNK tehnologije) teških lanaca klonirani su u humane IgG 1 ekspresione vektore. Fragmenti varijabilnog lakog lanca klonirani su u humane vektore ekspresije C-kapa. Svako antitelo je izraženo istovremenom transfekcijom odgovarajuüeg teškog i lakog lanca u CHO üelije.
[0324] Naroþito, za proizvodnju antitela, preduzeto je usmereno kloniranje humanizovanih proizvoda PCR varijabilnog gena u vektore ekspresije humanog imunoglobulina. Svi prajmeri korišüeni u PCR specifiþnim za Ig gena obuhvatali su restrikciona mesta, Agel i Xhol za IgH, Xmal i Dralll za Igk, što je omoguüavalo direktno kloniranje u ekspresione vektore koji sadrže humani IgG 1, odnosno Igk konstantne regione. Ukratko, PCR proizvodi su preþišüeni Qiaquick PCR kompletom za preþišüavanje (Qiagen, Inc.) praüen varenjem sa Agel i Xhol (IgH), Xmal i Dralll (Igk), respektivno. Digestirani PCR proizvodi su preþišüeni pre ligacije u ekspresione vektore. Reakcije ligacije su izvedene u ukupnoj zapremini od 10 µl sa 200 U T4-DNK Ligaze (New England Biolabs), 7.5 µl digestiranog i preþišüenog PCR proizvoda specifiþnog za gen i 25ng linearne vektorske DNK. Nadležne bakterije E. coli DHI0B (Life Technologies) transformisane su toplotnim šokom na 42 °C sa 3 µl proizvoda za ligaciju i postavljene na ampicilinske ploþe (100 µ /ml). Zatim je fragment Agel-EcoRI iz VH regiona umetnut na ista mesta ekspresionog vektora pEE6.4HulgG1 (Lonza AG), dok je sintetiþki Xmal-Dralll Vk umetak kloniran u Xmal-Dralll mesta odgovarajuüeg pEE12.4Hu-Kapa ekspresionog vektora.
[0325] ûelije koje proizvode humanizovana antitela nastale su transfekcijom HEK 293 üelija odgovarajuüim plazmidima korišüenjem 293fectin. DNK plazmida je preþišüena pomoüu QIAprep Spin kolona (Qiagen). ûelije humanog embrionalnog bubrega (HEK) 293T (ATCC Br. CRL-11268) uzgajane su na ploþama od 150 mm (Falcon, Becton Dickinson) pod standardnim uslovima u Dulbecco-ovom Modifikovanom srednjem orlovskom medijumu (DMEM), dopunjenom sa 10% inaktiviranim toplotom FCS, 100 µg/ml streptomicina, 100 U/mL penicilina G (svi iz Life Technologies).
[0326] Za privremene transfekcione üelije su uzgajane do 80% konfluentnosti. Jednake koliþine IgH i odgovarajuüe DNK vektorskog lanca IgL (12.5 µg svake vektorske DNK) dodane su u 1.5 µl OptiMEM pomešanog sa 50 µl HEK 293 transfekcionog reagensa u 1.5 ml opti-MEM. Smeša je inkubirana 30 minuta na sobnoj temperaturi i ravnomerno rasporeÿena na ploþicu za kulturu. Supernatanti su sakupljeni tri dana nakon transfekcije, zamenjeni sa 20 ml svežeg DMEM dopunjenog sa 10% FBS i ponovo sakupljeni 6. dana nakon transfekcije. Supernatanti kulture su oþišüeni od ostataka üelija centrifugiranjem na 800xg tokom 10 minuta i þuvani na 4 °C. Rekombinantna himerna i humanizovana antitela preþišüena su zrncima proteina G (GE
1
Healthcare). Dalje preþišüavanje hu23 i hu24 jono izmenjivaþkom hromatografijom bilo je potrebno kako bi se postigla konzistentna, ponovljiva biokonjugacija sa vc0101 i mc8261. Bez dodatnog koraka preþišüavanja, efikasnost redukcije tiola i time rezultujuüi odnos ADC lekantitela (DAR), opisan u Primeru 10, dramatiþno je fluktuirao i nepredvidiv. Zahtev za dodatnim preþišüavanjem nije bio predviÿen, veü je empirijski utvrÿen.
Primer 3
Karakterizacija Vezivanja hu24
[0327] Poreÿenje himernog i humanizovanog klona od 24 mAb je odreÿeno SPR upotrebom Biacore ™ 2000 (GE Healthcare). Komplet za hvatanje antihumanih antitela korišüen je za imobilizaciju hvatanja mAb na CM5 biosenzorskom þipu. Pre svakog ciklusa ubrizgavanja antigena, humanizovani mAb u koncentraciji od 2 µg/ml je uhvaüen na površini sa vremenom kontakta od 2 minuta i brzinom protoka od 5 µL/minut. Uhvaüeno optereüenje mAb od osnovne linije bilo je konstantno na 80-120 jedinica odgovora. Nakon hvatanja testiranog þlana i 1 minute poþetne linije, monomerni humani protein PTK7 je pretoþen površinom u koncentracijama od 50, 25 i 12.5 nM tokom 2-minutne faze pridruživanja praüene 2-minutnom fazom disocijacije pri brzini protoka od 5 µL/minut. Nakon svakog ciklusa, površina protiv hvatanja ljudi obnovljena je sa vremenom kontakta od 30 sekundi 3M MgCl2na 10 µL/minute.
[0328] Podaci Biacore ™ obraÿeni su prvobitnim oduzimanjem kontrolne površine IgG od specifiþne površine vezivanja za mAb. Podaci o odgovoru su zatim skraüeni u fazu udruživanja i razdvajanja. Rezultujuüe krive odgovora sa tri razliþite koncentracije antigena korišüene su da se uklapaju u model vezivanja Langmuira u odnosu 1:1 i da se generišu prividni afiniteti izraþunatim konstantama Koni Koffkinetike, sa konstantom ravnotežne disocijacije definisanom kao Kd = Koff/Kon. Svi koraci analize podataka su završeni u BiaEvaluation Softveru 3.1 (GE Healthcare).
[0329] Utvrÿeno je da su izraþunate afinitetne i kinetiþke konstante dvostruko veüe izmeÿu himernih i humanizovanih mAbs (Tabela 5).
1 1
Tabela 5. Konstante afiniteta himernog i humanizovanog klona 24 mAb prema humanom PTK7
[0330] U cilju da bi se odredio epitop prepoznat od hu24 mAb, procenjeno je njegovo vezivanje za nekoliko varijanti ektodomena PTK7. Ektodomen PTK7 sastoji se od 7 Ig domena, a varijante su dizajnirane da ukljuþuju dva ili više susednih Ig domena. Varijante su izražene kao Fc fuzioni proteini, a vezivanje hu24 je odreÿeno ELISA.
[0331] Konstrukcije su dizajnirane sa prajmerima koji su pojaþavali razliþite susedne PTK7 Ig domene kako je predviÿeno strukturnom homologijom. Dobijene sekvence su fuzionisane u okviru i iznad Fc domena humanog imunoglobulina G2 (IgG2) koristeüi standardne tehnike molekularne biologije. Fc fuzioni proteini su transfektovani u üelije sisara, a supernatanti su sakupljeni 72 sata kasnije. Anti-PTK7 mAb hu24 je testiran sa ELISA na njegovu sposobnost vezivanja za PTK7 protein varijante sa definisanim Ig domenima.
[0332] Rezultati pokazuju da su Ig domeni 1-4 potrebni za vezivanje hu24 za PTK7 (Tabela 6) i podrazumevaju da mAb prepoznaje tercijarne strukturne karakteristike PTK7.
Tabela 6. Vezivanje hu24 mAb za PTK7 Domene
1 2
[0333] Izvedeni su eksperimenti za karakterizaciju svojstava vezivanja üelija anti-PTK7 mAb hu24. Da bi se potvrdila specifiþnost antigena, vezivanje je procenjeno u üelijskim linijama bilo sa znaþajnom ili zanemarljivom ekspresijom PTK7 kako je odreÿeno imunoblotiranjem.
[0334] Ekstrakti celih üelija su rastvoreni gel elektroforezom i prebaþeni u nitroceluloznu membranu. Membrana je inkubirana sa hu6M024 u fiziološkom rastvoru puferisanom u Tris-u sa 0.1% Tween-20 (TBST)) sa 5% težine/zapremine mleka bez masti, zatim isprana TBST, inkubirana sa kozjim antitelima konjugovanim sa renom peroksidazom (Sant Cruz Biotechnology No sc-2453) i obilno opran pre izlaganja hemiluminscentnoj podlozi.
[0335] Imunobloting je ukazao na znaþajnu ekspresiju PTK7 u üelijskim linijama BxPC3 i MDAMB436 i zanemarljivu ekspresiju PTK7 u üelijskoj liniji ASPC1 (FIG.2A). Rezultati vezivanja üelija zasnovani na protoþnoj citometriji sa hu24 bili su u potpunosti u skladu sa podacima imunoblottinga (FIG.2B) koji su pokazali antigensku specifiþnost hu24.
[0336] Dodatni eksperimenti protoþne citometrije su sprovedeni da bi se procenilo vezivanje hu24 mAb za üelijske linije karcinoma sa endogenom ekspresijom PTK7. Ukratko, adherentne üelije su razdvojene sa TrypLE ™ Express (Gibco® br.12604-021) koji je zatim neutralizovan sa kulturnim medijumom. ûelije suspenzije su sakupljene centrifugiranjem. ûelije su resuspendovane u puferu za bojenje (PBS sa 3% BSA) sa navedenom koncentracijom mAb i inkubirane na ledu 30 minuta. ûelije su isprane u puferu za bojenje, resuspendovane u puferu za bojenje antihumanim antitelom obeleženim fikoeritrinom (PE) (Jackson ImmunoResearch br.
109-115-098) i inkubirane na ledu 30 minuta. ûelije su isprane, resuspendovane u puferu za bojenje sa 7-AAD vijabilnom bojom (BD Biosciences, Pharmingen br.51-68981E) i analizirane protoþnom citometrijom sa BD FACSCalibur ™. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) u PE kanalu populacije održivih üelija odreÿen je za svaki uzorak.
[0337] Hu24 mAb je pokazivao vezivanje za razliþite üelijske linije karcinoma u najnižoj ispitivanoj koncentraciji (0.1 µg/ml). Suprotno tome, kontrolno antitelo nije pokazalo znaþajno vezivanje pri najvišoj ispitivanoj koncentraciji (10 µg/ml) (Tabela 7).
1
Tabela 7. Svojstva vezivanja hu24 mAb za üelijske linije kancera
Primer 4
Ekspresija PTK7 u raznim ûelijskim Linijama Kancera
[0338] Anti-PTK7 antitela hu23 i hu24 pokazivala su specifiþno vezivanje za kultivisane üelijske linije kancera koje su ustanovljene iz širokog spektra tumorskih vrsta, ukljuþujuüi þvrste i hematološke indikacije, videti Tabelu 8 dole. Adherentne üelije su razdvojene pomoüu TrypLE Express (GIBCO), neutralisane medijumom za üelijske kulture i prebrojane. ûelije su postavljene u ploþu sa U-dnom sa 96 bunarþLüa sa 5x10<5>üelija / 100 µL medijum / bunarþLü. Ploþa je centrifugirana na 300xg, tokom 5 minuta na 4 °C do üelija peleta i supernatant je odbaþen. Svaka peleta je resuspendovana u 10 µg/mL hu23, hu24 ili nevezujuüe kontrolno antitelo u 3% BSA u PBS, a ploþa je inkubirana na ledu 30 minuta. Ploþa je centrifugirana, a üelijske pelete su isprane u 200 µL ledeno hladnog 3% BSA u PBS. Svaka üelijska kuglica je resuspendovana u 100 µL fragmentiranog kozjeg anti-humanog IgG Fc-konjugovanog kozjeg konjugovanog rfikoeritrina (PE) koji je razblažen 1:50 u 3% BSA u PBS, a ploþa je inkubirana na ledu 30 minuta. Ploþa je centrifugirana i üelijske pelete su isprane u 200 µL 3% BSA u PBS na 4 °C. Svaka kuglica je resuspendovana u 100 µL 3% BSA u PBS i prebaþena u polikarbonatnu epruvetu od 5 µL koja sadrži 250 µL 3% BSA u PBS. Uzorci su analizirani protoþnom citometrijom koristeüi 5 µL 7-amino-aktinomicin D (7-AAD) rastvora za bojenje po uzorku kao mrlju održivosti. Iz analize su iskljuþene neživotne üelije.
[0339] Podaci u Tabeli 8 pokazuju srednji fluorescentni intenzitet (MFI) vezivanja antitela za üelijske linije karcinoma protoþnom citometrijom. Vezivanje üelija sa humanizovanim antitelima hu23 i hu24 ukazuje na ekspresiju PTK7 u brojnim üelijskim linijama. Ekspresija PTK7 je istaknuta u raznim üelijskim linijama karcinoma pluüa (NSCLC), malih üelija karcinoma pluüa
1 4
(SCLC), debelog creva, dojke, pankreasa i eritroleukemiþnih üelijskih linija. Za poreÿenje je korišüeno antitelo negativne kontrole koje se ne vezuje za PTK7.
Tabela 8
1
[0340] Podaci o mikromrežama prikazani u Tabeli 9 za 29 PDKS tumorskih linija generisani su pomoüu Agilent SurePrint GE 8x60 v2 nizova koristeüi ukupnu RNK izolovanu iz PDX tumorskih üelija. Obrada sirovih podataka mikro mikseta prikupljenih u jednoj boji obuhvatala je oduzimanje pozadine i normalizaciju kvantila. Normalizovani podaci su transformisani u log base 2, generišuüi vrednosti ekspresije gena za upotrebu u nizvodnim analizama. Ovi podaci odražavaju relativnu koliþinu PTK7 ekspresije povezane sa naznaþenom PDX üelijskom linijom. BR = dojke, LU-pluüa, OV = jajnici, SK = melanom, CR = kolorektalni, LIV = jetra.
Tabela 9
1
[0341] Ekspresija PTK7 takoÿe je procenjena imunohistohemijom u sedam PDX modela kod imunokompromitovanih miševa: þetiri trostruko negativna PDX za rak dojke (BR13, BR22, BR31 i BR5); jedan pozitivan na progesteronski receptor (PR ) rak dojke PDKS (BR36); i dva NSCLC PDXs (NSCLC135 i NSCLC176).
[0342] Ukratko, fragment tkiva iz svakog ksenografta je fiksiran formalinom, obraÿen i ugraÿen parafinom (FFPE) primenom standardnih histoloških postupaka. Preseci od pet mikrona preseþeni su na napunjenim slajdovima, osušeni, deparafinisani u ksilolu i rehidrirani gradiranim alkoholima u destilovanoj vodi. Dobijanje epitopa indukovanog toplotom izvedeno je u Borg Decloakeru (Biocare Medical) pomoüu šporeta pod pritiskom Retriever 2100 (Electron Microscopi Sciences) i hlaÿeno do sobne temperature (RT) tokom 20 minuta (min). Endogena
1
peroksidaza je ugašena sa Perokidazed 1 (Biocare Medical) tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Nespecifiþne interakcije proteina blokirane su pomoüu Background Punisher (Biocare Medical) tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi. Delovi tkiva su inkubirani sa primarnim antitelom u dozi od 0.5 µg/ml tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Primarna antitela su bili ili zeþji anti-PTK7 klon (Stem CentRk ™ Inc) ili zeþji izotip kontrole (DA1E) mAb imunoglobulin G (IgG) XP® (Cell Signaling Technologies br.3900). Vezivanje primarnog antitela otkriveno je pomoüu reagensa za otkrivanje sa SignalStain® Boost IHC (Cell Signaling Technologies br.8114) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Bojenje je razvijeno sa DAB (3’,3’-diaminobenzidin; DAKO) tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Slajdovi su nakratko obojeni u CAT hematoksilinu (Biocare Medical), isprani vodom, dehidrirani u gradiranim alkoholima, oþišüeni u ksilolu, i prekriveni sa Permount ™ sredstvom za montiranje (Fisher Chemicals).
[0343] PTK7 je primeüen na plazma membrani u svim PDX modelima (FIG.3).
Primer 5
Ekspresija PTK7 u raznim tkivima tumora
[0344] Ekspresija PTK7 mRNK je odreÿena u primarnim humanim tumorima. Ukratko, smrznuti tumor i normalna tkiva su fragmentirani, a mRNK je izolovana pomoüu Qiagen RNeasy Mini kompleta (Qiagen, maþka # 74106). Kvantifikacija i procena kvaliteta RNK izvršena je korišüenjem HT RNK mikrofluidnog LabChip testa i LabChip GKS mikrofluidnog instrumenta za kapilarnu elektroforezu (Perkin Elmer). RNK za svaki od uzoraka je razblažena tako da je koliþina pala u linearni opseg instrumenta (25 - 250 µg/ml). Izolovani uzorci RNK su obrnuto transkribovani u cDNK pomoüu Life Technologies, kompleta RNK-cDNK visokog kapaciteta (kat. Br.4387406), sledeüi protokol naveden u uputstvima proizvoÿDþa. Reakcija qRT-PCR izvedena je korišüenjem TaqMan analize ekspresije gena zasnovane na sondi i ABI ViiA7 PCR sistema u realnom vremenu (Life Technologies). Ciljani gen i endogene kontrole pokrenute su þetvorostruko za svaku sondu postavljenu na prefabrikovanim TaqMan karticama niza gustine. Softver ExpressionSuite v1.0.3 (Life Technologies) je korišüen za generisanje automatizovanih graniþnih vrednosti za pojaþavanje signala za veüinu uzoraka. Retko su se automatizovani pragovi podešavali ruþno. Grafikoni pojaþanja koji su rezultirali vrednostima Ct > 35 su odbaþeni, kao i oni grafikoni koji su generisali vrednost Ct, ali nisu pokazali trend logaritamskog
1
pojaþavanja. Sve vrednosti Ct izvezene su iz softvera ExpressionSuite i izvršeni su proraþuni relativne kvantifikacije u Microsoft Excel 2010 (Microsoft Corporation, Inc).
[0345] FIGS.4A-C pokazuju nivoe PTK7 mRNK u (A) dojci, (B) NSLC i (C) raku jajnika.
Kvantifikacija ekspresije PTK7 procenjena je primenom relativne razlike u naborima (RK) ili uporednom Ct metodom, (2<ǻǻCt>) metodom koristeüi jednaþinu RQ = 2<ǻǻCt>. Podaci RQ predstavljaju razliku PTK7 ekspresije izraza u odnosu na kontrolne uzorke RNK. Za uzorke karcinoma dojke korišüen je normalan uzorak RNK dojke kupljen od BioChain (Newark, CA, maþka # R1234086-50, partija # B610189, ženka stara 75 godina) za generisanje RQ podataka. Za karcinom pluüa, prijavljeni podaci RQ predstavljaju preklopne razlike u ekspresiji PTK7 u odnosu na normalnu pluünu RNK kupljenu od Life Technologies (maþka # AM7968, partija # 1308017, ženka stara 80 godina). Za uzorke karcinoma jajnika prijavljeni podaci RQ predstavljaju preklopne razlike u ekspresiji PTK7 u odnosu na RNK izolovanu iz normalnog tkiva jajnika (ID tkiva # 0204C011C) koju je obezbedila klinika Cleveland (Cleveland, OH). Vrednosti RQ za sve tumore takoÿe su izraþunate u odnosu na RNK bazen iz normalnih ljudskih tkiva (BioChain, maþka # R4234565, partija # B611043), kao i na univerzalni humani referentni RNK fond (Agilent, maþka # 740000), koji se sastoji od jednakih delova RNK iz 10 jedinstvenih üelijskih linija karcinoma.
[0346] Tumori dojke, NSCLC i jajnika pokazali su poveüanu ekspresiju PTK7 mRNK u poreÿenju sa odgovarajuüim normalnim tkivom (FIG.4A-C. Prekomerna ekspresija u TNBC bila je najuoþljivija, dok je prekomerna ekspresija kod tumora jajnika bila umerena.
[0347] FIG.5 pokazuje korelaciju izmeÿu veüe ekspresije PTK7 mRNK i lošijeg ukupnog preživljavanja kod pacijenata sa NSCLC. Da bi se utvrdilo da li je ekspresija PTK7 povezana sa krajnjom taþkom preživljavanja kod raka pluüa, primenjena je Kaplan-Meierova analiza na skupu podataka bioinformatike sa besplatnim programom http://kmplot.com/analisis (Gyorffy i sar., 2013, PloS One.18;8(12):e82241). Nivoi PTK7 mRNK i podaci o preživljavanju pacijenta ucrtani su za 719 pacijenata sa NSCLC-adenokarcinomom pomoüu automatskog izbora najboljeg preseka alata. Visoka ekspresija PTK7 povezana je sa kraüim preživljavanjem (odnos opasnosti HR = 4.06, logrank P=1.1E-16).
[0348] Ekspresija PTK7 proteina viÿena je kod karcinoma jednjaka. Za imunohistohemiju je korišüen mikromreža tkiva (ES1502 iz US Biomax). Ukratko, delovi tumorskih blokova
1
ugraÿenih u parafin ugraÿeni u formalin iseþeni su na 5 mikrona i peþeni na staklenim slajdovima. Klizaþi su oþišüeni u ksilolu i rehidrirani u gradiranim alkoholnim ispiranjima koja se završavaju u dejonizovanoj vodi. Slajdovi su preuzeti u pH6 Citratnom HIER puferu u Retrieveru 2100 (Elektronska Mikroskopija). Peroksidazovani rastvor bloka vodonik-peroksida (Biocare Medical) nanesen je na slajdove tokom 10 minuta. Slajdovi su isprani TBST 2x, praüeni Background Punisherom, proteinskim blokom, (Biocare Medical) tokom 10 minuta. Primarno antitelo, H.235 (Lot #: 110325MM, koncentracija zaliha: 12.7mg / mL) primenjivano je tokom 60 minuta u koncentraciji od 2 ug/mL. Posle pranja sa TBST (2x), sekundarno antitelo, DAKO antimiš Envision+, primenjivano je tokom 30 minuta. Posle ponovnog pranja sa TBST (2x), dijapozitivi su razvijani Betazoid DAB+ (Biocare Medical) tokom 5 minuta. Zatim su dijapozitivi 30 sekundi obojeni u CAT Hematokilin (Biocare Medical) i poklopljeni.
[0349] ýetrdeset od 70 uzoraka tumora dobilo je pozitivne rezultate za ekspresiju PTK7 na üelijskoj membrani. Od 40 uzoraka koji su bili pozitivni na PTK7, 1 je pokazao visoku ekspresiju, 11 umerenu, a 28 nisku ekspresiju.
[0350] Ekspresija PTK7 proteina viÿena je kod karcinoma prostate. Mikropodruþje tkiva (BC19013 iz Biomaka) je korišüeno za imunohistohemiju, kao što je gore opisano za rak jednjaka. Jedanaest od 26 uzoraka tumora ima pozitivnu ocenu za ekspresiju PTK7. Od 11 uzoraka koji su bili PTK7 pozitivni, 2 su pokazali umerenu, a 9 nisku ekspresiju.
Primer 6
Merenje PTK7 Proteina u Serumu
[0351] Izveštaji u literaturi karakterišu cepanje PTK7 na plazma membrani što rezultuje u osipanju dela ekstaüelijskog domena (Golubkov et al., 2010, J Biol Chem 285(46):35740-9; Golubkov et al., 2012, J Biol Chem 287(50):42009-18; Na et al., 2012, J Biol Chem 287(30):25001-9). Cirkulišuüi antigen može uticati na farmakokinetiku terapijskih jedinjenja kao što je PTK7 ADC. Cirkulišuüi nivoi prolivenog PTK7 su procenjeni iz razliþitih izvora seruma. Nivoi PTK7 proteina izmereni su kvantitativnim testom koristeüi Meso Scale Discovery (MSD®) platformu.
11
[0352] Uzorci seruma zdravih ljudi kupljeni su od banke krvi Univerziteta Stanford. Uzorci seruma od pacijenata sa rakom kupljeni su od Asterand Inc i Bioreclamation Inc. Uzorci seruma majmuna Cinomolgus kupljeni su od Bioreclamation Inc.
[0353] Uzorci seruma miševa dobijeni su od imunokompromitovanih miševa koji su gajili ksenografte humanog tumora. Ženski miševi sa ne-gojaznim dijabetesom-teškom kombinovanom imunodeficijencijom (NOD-scid) kupljeni su od Harlan Laboratories® i smešteni u skladu sa smernicama Institucionalnog odbora za negu i upotrebu životinja (IACUC).
Ksenotransplantati izvedeni od pacijenta (PDX) uspostavljeni su direktnom implantacijom sveže resekovanih uzoraka humanog tumora i razmnožavani sa prolaznim ksenograftima na naivne životinje. Ksenografti su izvedeni iz uzoraka primarnih resekcija tumora koji su nabavljeni sa kliniþkih lokacija nakon odobrenja Institucionalnog odbora za zaštitu ljudskih subjekata i u skladu sa propisima Zakona o prenosivosti i odgovornosti zdravstvenog osiguranja (HIPAA).
[0354] U analizi za merenje nivoa PTK7 proteina korišüena su dva specifiþna anti-PTK7 monoklonska antitela (mAbs) koja su generisana hibridomskom tehnologijom. mAbs vezuju humani i cinomolgus majmunski PTK7, ali ne i mišji PTK7. Analiza je razvijena na MSD® platformi i optimizovana je za linearni odgovor. MSD® ploþa sa visokim vezivanjem presvuþena je sa PTK7 specifiþnim mAb H2.35 u koliþini od 1 µg/ml u fiziološkom rastvoru puferisanom sa fosfatom (PBS). Ploþa je inkubirana na 4 °C preko noüi. Sledeüeg dana ploþa je isprana i dodat je drugi mAb. Za uzorke ljudi i majmuna dodato je 25 µl sulfo-oznaþenog PTK7 specifiþnog mAb 6M38 sa 0.5 µg/ml u MSD® razblaživaþu 2 (MSD # R51 BB-4), a za uzorke miša koji nose tumore, biotinilirani 6M380.5 µg/ml u MSD® razblaživaþu 2 (MSD # R51 BB-4) praüenom streptavidinom konjugovanim sa hrenom peroksidazom. Ploþa je inkubirana muükanjem 30 minuta. Posle inkubacije, bez pranja, uzorci seruma ili razliþite koliþine rekombinantnog PTK7 proteina dodani su u bunarþLüe i inkubirani 2 sata na tresilici za ploþe. Uzorci seruma su razblaženi 4x do 25% konaþno u MSD® razblaživaþu 2. Ploþe su isprane 3 puta fiziološkim rastvorom puferisanim fosfatom sa 0.2 % Tween-20. MSD® 1x pufer za þitanje (MSD # R92TC-3) je dodat ploþama (150 ml po jamici) i ploþe su oþitane na MSD® Sector Imager-u. Vrednosti za uzorke seruma interpolirane su iz standardne krive zasnovane na rekombinantnom proteinu.
[0355] Nivoi proteina PTK7 u humanom serumu izmereni su u uzorcima zdravih ljudi i pacijenata sa rakom koji su predstavljali 8 vrsta tumora. Rezultati su sumirani u Tabeli 10. Prijavljena vrednost u svakoj kategoriji ukazuje na srednju vrednost svih pojedinaþnih uzoraka.
Srednja vrednost PTK7 u serumu zdravih ljudi bila je 12.4 ± 3.3 ng/mL. Uopšteno, srednje vrednosti za pacijente sa karcinomom bile su nešto veüe, kreüXüi se do 24.6 ± 3.8 ng/mL i sa širom distribucijom pojedinaþnih vrednosti (FIG.6).
Tabela 10. Nivoi PTK7 Protein u Humanom Serumu
[0356] Nivoi PTK7 proteina u naivnom serumu majmuna cinomolgus izmereni su u uzorcima od 29 životinja. Srednja vrednost je bila 35.8 ± 13.4 ng/mL (Tabela 11) što je više od odgovarajuüih vrednosti za zdrave ljude i pacijente sa rakom.
Tabela 11. Nivoi PTK7 Proteina u Serumu Cynomolgus Majmuna
[0357] Uzorci seruma miševa dobijeni su od imunokompromitovanih miševa koji su gajili ksenografte humanog tumora. Konkretno, ksenografti su PDXs koji tipiþno þuvaju arhitekturu i genotip humanih tumora iz kojih potiþu (DeRose et al, 2011, Nat Med 17(11):1514-20). Srednje vrednosti PTK7 proteina u serumu za svih 11 tipova tumora bile su < 1 ng/mL za sve tipove tumora (Tabela 12) i, prema tome, znaþajno niže od vrednosti dobijenih za ljude i majmune. S obzirom da mAb korišüeni u testu ne reaguju unakrsnom reakcijom sa mišjim PTK7, vrednosti se tumaþe kao humani protein PTK7 koji je izliven iz ksenografta tumora, a ne iz normalnog mišjeg tkiva.
Tabela 12. Nivoi PTK7 Proteina u Serumu miša koji nosi tumor
Primer 7
Internalizacija
[0358] Internalizacija antitela je kritiþna karakteristika za isporuku ADCs za citotoksiþnost u üelijama koje ekspresuju PTK7. Primeüeno je da se anti- PTK7 antitelo hu24 internalizuje u üelije karcinoma, što sugeriše da je antitelo pogodno sredstvo za isporuku toksina u üelije. Adherentne üelije su razdvojene upotrebom TrypLE Express (Gibco), neutralisane podlogom za üelijske kulture i zatim prebrojane. ûelije su alikvotisane u ploþi sa U-dnom sa 96 bunarþLüa sa 5x10<5>üelija/100 µL medijuma po bunarþLüu. Ploþa je centrifugirana na 300xg, tokom 5 minuta na 4 °C da bi se üelije peletirale, a supernatanti aspirirali. Svi reagensi su držani na ledu u sledeüim koracima.
11
[0359] Svaka üelijska peleta je resuspendovana u 3 µg/mL hu24 ili nevezujuüe antitelo (Human IgG, Thermo Scientific) u 100 µL 3% BSA u PBS. Ploþa je inkubirana na ledu 30 minuta, a zatim centrifugirana, a üelijske pelete su isprane u 200 µL 3% BSA u PBS. ûelijske pelete su resuspendovane u 100 µL 37 °C prethodno zagrejane podloge za üelijske kulture i stavljene u inkubator od 37 °C tokom 1 ili 4 sata. ûelijske pelete koje üe se inkubirati na 4 °C su na sliþan naþin resuspendovane i zatim stavljene na led. Posle inkubacija, uzorci su centrifugirani, supernatanti aspirirani i isprani sa 200 µL/bunarþLüu ledeno hladnog 3% BSA u PBS i resuspendovani u 100 µL/bunarþLüu ledeno hladnog 3% BSA u PBS i stavljeni na led. Svi uzorci su zatim centrifugirani, supernatanti su aspirirani, svaka üelijska peleta je resuspendovana u 100 µL fragmenta anti-humanog IgG Fc konjugovanog sa Allophycocyanin (APC) koji je razblažen 1:50 u ledeno hladnom 3% BSA u PBS. Ploþa je inkubirana na ledu 30 minuta, a zatim centrifugirana, a üelijske pelete su isprane u 200 µL 3% BSA u PBS, resuspendovane u 100 µL 3% BSA u PBS i prenete u polikarbonatnu epruvetu od 5 µL koja je sadržala 250 µL 3 % BSA u PBS. Uzorci su analizirani protoþnom citometrijom koristeüi 5 µL 7-AAD po uzorku kao mrlju održivosti. Srednji intenzitet fluorescencije (MFI) izmeren je za svaki uzorak sa neživim üelijama koje su iskljuþene iz analize. Vrednost za „% internalizovanog“ izraþunata je kao (100% - [MFI nakon inkubacije / MFI pre inkubacije]). Rezultati u Tabeli 13 pokazuju da je hu24 antitelo internalizovano u sve testirane üelijske linije i da je internalizacija zavisila od temperature, što odražava aktivnu (ne pasivnu) internalizaciju üelije.
Tabela 13
Primer 8
Citotoksiþnost posredovana sa konjugovanim saporin anti-humanim Fab fragmentom
[0360] Izvršen je in vitro test citotoksiþnosti da bi se utvrdilo da li hu23 ili hu24 antitelo može posredovati u isporuci citotoksiþnog agensa u üelijske linije. U tom pogledu, anti-humani IgG Fab fragment kovalentno vezan za saporinski toksin (Napredni sistemi ciljanja) kombinovan je sa neobeleženim hu23, hu24 ili 8,84 Ab (nevezujuüe, antitelo negativne kontrole) i zatim inkubiran sa üelijama 4 dana (PTK7 ekspresovane üelije H446 i DMS114) ili 7 dana (OE19 ne-PTK7ekspresovane üelije; OE21 PTK7 ekspresovane üelije) nakon þega je merena održivost.
[0361] U jednom eksperimentu, H446 ili DMS114 üelijske linije karcinoma postavljene su na prozirnu ploþu kulture sa ravnim dnom na 9600 üelija po bunarþLüu (H446) ili 6400 üelija po bunarþLüu (DMS114) u 100 µl medijuma za üelijske kulture. ûelije su inkubirane preko noüi na 37 °C u 5% CO2inkubatoru. Sledeüeg dana üelijama je dodato 50 µl hu23, hu24 ili 8,84 Ab prethodno pomešanog sa saporin konjugovanim anti-humanim IgG Fab (Fab-ZAP; napredni sistemi za ciljanje) u molarnom odnosu 1:2 u koncentraciji od 10 taþaka kriva sa trostrukim uzorcima koji poþinju sa 1 µg/ml sa 1:3 razblaženjima u medijumu üelijske kulture. Ploþa je inkubirana u inkubatoru sa 37 °C, 5% CO2tokom 4 dana. Za merenje održivosti üelija, korišüen je MTS test (Promega Cell Titer 96 Aqueous Non-Radioactive Cell Proliferation Test) u skladu sa uputstvima dobavljaþa. U svakom bunarþLüu je dodato 30 µl kombinovanog MTS reagensa. Ploþa je inkubirana u 37 °C, 5% CO2inkubatoru 2 sata. Optiþka gustina (OD) je odreÿena na 490 nm pomoüu þitaþa ploþa sa 96 bunarþLüa. Proseþno oþitavanje iz bunarþLüa samo sa medijumom oduzeto je od oþitavanja bunarþLüa sa üelijama za kontrolu pozadinske OD. Podaci su podvrgnuti logistiþkoj nelinearnoj regresionoj analizi (GraphPad Prism Softver) kako bi se utvrdila koncentracija primarnog antitela kod koje održivosti üelija inhibirana sa 50% (IC50).
[0362] Podaci u Tabeli 14 ukazuju da su i anti- PTK7 antitela hu23 i hu24 davala saporinposredovanu citotoksiþnost na üelije H446 i DMS114, dok 8.84 negativna kontrola antitela nije. Rezultati pokazuju da je aktivnost hu23 i hu24 specifiþna za üelije koje ekspresuju PTK7.
Tabela 14
[0363] U drugom eksperimentu, analiza saporina je izvedena na dve üelijske linije izvedene iz karcinoma jednjaka, OE19 i OE21 (Sigma Aldrich). Da bi se utvrdila ekspresija PTK7 na üelijskim linijama, üelije su kultivisane i izolovane su suspenzije pojedinaþnih üelija upotrebom
11
Versene (Invitrogen). ûelije su isprane u PBS / 2% FCS i inkubirane sa hu24 antitelom ili HulgG1 (kontrola izotipa) u koncentraciji od 5 µg/mL tokom 30 minuta. ûelije su ponovo isprane u PBS / 2% FCS, zatim inkubirane na 1:200 sa anti-humanim Alexa Fluor647 (Jackson Immunoresearch) tokom 20 minuta. ûelije su ponovo isprane, resuspendovane u DAPI, a zatim analizirane na BD FACSCanto da bi se utvrdila promena srednjeg intenziteta fluorescencije ǻMFI). ûelije OE19 nisu pokazale fluorescenciju bojenja iznad izotipske kontrole (ǻMFI = 0), dok su üelije OE21 pokazale gotovo dvostruko poveüanje intenziteta fluorescencije (ǻMFI = 5976), što je ukazivalo na ekspresiju PTK7 na površini OE21, jednjaka skvamozne üelije karcinoma.
[0364] Da bi se utvrdilo da li hu24 može da posreduje u isporuci citotoksiþnih agenasa, na üelije za kulturu tkiva BD (BD Biosciences) u podloga za kulturu je postavljeno 2500 üelija / bunarþLüu disocirane jednoüelijske suspenzije ili iz OE21 ili iz OE19. Jednog dana nakon postavljanja u kulture, dodate su razliþite koncentracije preþišüenog hu24 i fiksne koncentracije od 4 nM anti-HuIgG Fab fragmenta, kovalentno povezane sa saporinom (napredni sistemi za ciljanje). Posle 7-dnevne inkubacije, brojevi održivih üelija su izbrojani pomoüu CELL TITER GLO® (Promega) prema uputstvima proizvoÿDþa. Brojevi sirove luminiscencije korišüenjem kultura koje sadrže üelije sa saporin Fab fragmentom postavljeni su kao 100% referentne vrednosti i svi ostali brojevi su izraþunati u skladu s tim (nazvano „Normalizovani RLU“). Korišüenjem ove analize pokazano je da hu24 posreduje citotoksiþnost prema üelijama OE21, ali ne i üelijama OE19, a kontrola izotipa nije uticala na broj üelija, kao što je prikazano u Tabeli 15. Ovi rezultati ukazuju da je vezivanje üelija hu24 antitela neophodno za izazivanje citotoksiþnosti posredovana saporinom za üeliju koja ekspresuju PTK7, ali nema efekat na üeliju koja ne ekspresuje PTK7.
Tabela 15
Primer 9
Sinteze vc0101 i mc8261
11
[0365] Sinteza vc0101 (vc je veznik, a 0101 je lek) i mc8261 (mc je veznik, a 8261 je lek) pripremljena je prema postupcima opisanim u meÿunarodnoj objavi br. WO / 2013/072813, koja je ovde ukljuþena referencom u celini.
A. Eksperimentalni postupak za sintezu vc0101
Dobijanje N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1 H-pirol-1-il) heksanoil]-L-valil-N-{4-[(21 S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]-25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il) etil] amino} propil]pirolidin-1-il}-2-oksoetil)-18,18,23-trimetil-3,16,19,22-tetraokso-21-(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoksa-4,17,20,23-tetraazaheptakos-1-il]fenil}-N~5~karbamoil-L-ornitinamid (vc0101).
[0366]
11
Korak 1. Sinteza N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil] pirolidin-1-il}-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#53). Rastvoru jedinjenja #32 (2.05 g, 2.83 mmol, 1 eq.) u dihlorometanu (20 mL, 0.1 M) i N,N-dimetilformamidu (3 mL) je dodat amine #19 (2.5 g, 3.4 mmol, 1.2 eq.), HATU (1.29 g, 3.38 mmol, 1.2 eq.) i trietilamin (1.57 mL, 11.3 mmol, 4 eq.). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi dok je progres reakcije praüen sa LC-MS i TLC. Kada je završena, reakcija je koncentrovana u vakuumu, ostatak je azeotropiran tri puta sa heptanima, i rezultujuüi sirovi proizvod je preþišüen sa silika gel hromatografijom (Gradient: 0% do 55% aceton u heptanu), dajuüi jedinjenje #53 (2.42 g, 74%) kao þvrsta supstanca. LC-MS: m/z 965.7 [M+H+], 987.6 [M+Na+], vreme retencije = 1.04 minuta (Protokol H-ispod); HPLC (Protocol A-below): m/z 965.4 [M+H+], vreme retencije = 11.344 minuta (þistoüa > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSOd6), za koju se pretpostavlja da je mešavina rotamera, karakteristiþni signali: į 7.86-7.91 (m, 2H), [7.77 (d, J=3.3 Hz) i 7.79 (d, J=3.2 Hz), ukupno 1H], 7.67-7.74 (m, 2H), [7.63 (d, J=3.2 Hz) i 7.65 (d, J=3.2 Hz), ukupno 1H], 7.38-7.44 (m, 2H), 7.30-7.36 (m, 2H), 7.11-7.30 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11.4, 8.4, 4.1 Hz) i 5.52 (ddd, J=11.7, 8.8, 4.2 Hz), ukupno 1H], [4.49 (dd, J=8.6, 7.6 Hz) i 4.59 (dd, J=8.6, 6.8 Hz), ukupno 1H], 3.13, 3.17, 3.18 and 3.24 (4 s, ukupno 6H), 2.90 i 3.00 (2 br s, ukupno 3H), 1.31 i 1.36 (2 br s, ukupno 6H), [1.05 (d, J=6.7 Hz) i 1.09 (d, J=6.7 Hz), ukupno 3H].
Korak 2. Sinteza 0101: 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino}propil]pirolidin-1-il}-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-Lvalinamida (#54).
Rastvoru jedinjenja #53 (701 mg, 0.726 mmol) u dihlorometanu (10 mL, 0.07 M) je dodat dietilamin (10 mL), i reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi dok je progres rreakcije praüen sa LCMS i TLC. Kada je jednom završena, reakcija je koncentrovana u vakuumu, ostatak je azeotropiran tri puta sa heptanima, i rezultujuüi sirovi proizvod je preþišüen sa silika gel hromatografijom (Gradient: 0% do 10% metanol u dihlorometanu). Ostatak je razblažen sa dietil etrom i heptanom i koncentrovan u vakuumu kako bi se dobio #54 (406 mg, 75%) kao bela þvrsta supstanca. LC-MS: m/z 743.6 [M+H+], vreme retencije = 0.70 minuta (Protocol F-below); HPLC (Protocol A-below): m/z 743.4 [M+H+], vreme retencije = 6.903 minuta, þistoüa > 97%); 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), za koju se pretpostavlja da je mešavina rotamera, karakteristiþni signali: į [8.64 (br d, J=8.5 Hz) and 8.86 (br d, J=8.7 Hz), ukupno 1H], [8.04 (br d, J=9.3 Hz) i 8.08 (br d, J=9.3 Hz), ukupno 1H], [7.77 (d, J=3.3 Hz) i 7.80 (d, J=3.2 Hz), ukupno 1H], [7.63 (d, J=3.3 Hz) and 7.66 (d, J=3.2 Hz), ukupno 1H], 7.13-7.31 (m, 5H), [5.39 (ddd, J=11, 8.5, 4 Hz) i 5.53 (ddd, J=12, 9, 4 Hz), ukupno 1H], [4.49 (dd, J=9, 8 Hz) i 4.60 (dd, J=9, 7
11
Hz), ukupno 1H], 3.16, 3.20, 3.21 i 3.25 (4 s, ukupno 6H), 2.93 i 3.02 (2 br s, ukupno 3H), 1.21 (s, 3H), 1.13 and 1.13 (2 s, ukupno 3H), [1.05 (d, J=6.7Hz) i 1.10 (d, J=6.7 Hz), ukupno 3H], 0.73-0.80 (m, 3H).
Korak 3. Sinteza vc0101: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihydro-1H-pirol-1-il)hexanoil]-L-valil-N-{4-[(21S,24S,25R)-24-[(2S)-butan-2-il]-25-(2-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-2-metil-3-okso-3-{[(1S)-2-fenil-1-(1,3-tiazol-2-il)etil]amino} propil]pirolidin-1-il}-2-oksoetil)-18,18,23-trimetil-3,16,19,22-tetraokso-21-(propan-2-il)-2,7,10,13,26-pentaoxa-4,17,20,23-tetraazaheptacos-1-il]fenil}-N~5~-karbamoil-L-ornitinamida.
[0367] Kuplovanje jedinjenja 0101 (#54) za veznik vc (N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-L-valil-N5-karbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoksi)karbonil]oksi}metil)fenil]-L-ornitinamid) (MalcValCitPABC-PNP) j ezavršeno prema Opštem Postupku E (u nastavku) koristeüi odgovarajuüe koliþine DMA kao rastvaraþa, i HOAT i 2,6-Lutidina kao aditiva, i rezultujuüi sirovi željeni materijal je preþišüen prema Postupku D (u nastavku) kako bi se dobilo 33 mg (36%) željenog proizvoda. Pod uslovima naznaþenim u Protokolu A (u nastavku) sa kolonom održavanim na 45°C, ovaj materijal daje HPLC vreme retencije od 9.114 minuta (Protokol A-u nastavku); LC-MS: m/z 1342.6 [M+H+], vreme retencije 3.48 minuta (Protokol H-u nastavku).
B. Eksperimentalni postupak za sintezu mc8261
Dobijanje N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-2-methilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1 R,2R)-3-{[(1S)-1-karboksi-2-feniletil]amino}-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil]pirolidin-1-il}-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (mc8261).
[0368]
11
Korak 1. Sinteza metil N-{(2R,3R)-3-metoksi-2-metil-3-[(2S)-pirolidin-2-il]propanoil}-L-fenilalaninata, hidrohloridna so (#67). Prema Opštem Postupku C (u nastavku), iz #37 (2.39 g, 5.33 mmol, 1 eq.), dioksana (10 mL, 0.53 M) i 4 M rastvora hlorovodoniþne kiseline u dioksanu (10 mL, 40 mmol, 7.5 eq.) je sintetizovan #67 (2.21 g) kao bela þvrsta supstanca, koja je korišüena u sledeüem koraku bez daljeg preþišüavanja. LC-MS: m/z 349.2 [M+H+], vreme retencijee = 0.53 minuta; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) į 9.45-9.58 (br m, 1H), 8.63 (d, J=8.1 Hz, 1H), 8.51-8.62 (br m, 1H), 7.25-7.33 (m, 4H), 7.18-7.25 (m, 1H), 4.50 (ddd, J=10.8, 8.1, 4.5 Hz, 1H), 3.65 (s, 3H), 3.54 (dd, J=6.8, 4.5 Hz, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.11 (dd, J=13.8, 4.5 Hz, 1H), 2.99-3.14 (br m, 3H), 2.89 (dd, J=13.8, 10.9 Hz, 1H), 2.44-2.50 (m, 1H, predpostalja; delimiþno zaklonjen vrhom rastvaraþa), 1.77-1.89 (m, 1H), 1.60-1.73 (m, 2H), 1.46-1.57 (m, 1H), 1.05 (d, J=6.8 Hz, 3H).
Korak 2. Sinteza N-[(9H-fluoren-9-ilmetoksi)karbonil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-3-metoksi-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-metoksi-3-{[(2S)-1-metoksi-1-okso-3-fenilpropan-2-il]amino}-2-metil-3-oksopropil]pirolidin-1-il}-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida (#68). Prema Opštem Postupku D (u nastavku), iz #32 (353 mg, 0.488 mmol, 1 eq.),
12
u dihlorometanu (10 mL, 0.04 M), amin #67 (271 mg, 0.588 mmol, 1.3 eq.), HATU (223 mg, 0.586 mmol, 1.2 eq.) i diizopropiletilamin (238 mL, 1.71 mmol, 3.5 eq.) je sintetizovano do sirovog željenog materijala, koji je preþišüen sa silika gel hromatografijom (Gradient: 0% do 40% aceton u heptanu), dajuüi #68 (404 mg, 88% tokom dva koraka) kao þvrstu supstancu. LC-MS: m/z 940.7 [M+H+], 962.7 [M+Na+], vreme retencije = 1.04 minuta; HPLC (Protokol C u nastavku): vreme retencije = 9.022 minuta; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), pretpostavlja se da je mešavina rotamera, karakteristiþn signali: į [8.25 (br d, J=8 Hz) and 8.48 (br d, J=8 Hz), total 1H], 7.89 (d, J=7.4 Hz, 2H), 7.67-7.75 (m, 2H), 7.38-7.44 (m, 2H), 7.31-7.36 (m, 2H), 7.14-7.24 (m, 5H), 4.43-4.69 (m, 3H), 4.17-4.26 (m, 3H), 3.91-3.99 (br m, 1H), 3.63 i 3.65 (2 s, total 3H), 3.19 i 3.24 (2 s, ukupno 3H), 3.14 i 3.15 (2 s, ukupno 3H), 2.90 i 2.99 (2 br s, ukupno 3H), 1.36 i 1.37 (2 br s, ukupno 3H), 1.30 i 1.32 (2 s, ukupno 3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz) i 1.06 (d, J=6.6 Hz), ukupno 3H].
Korak 3A. Sinteza 8261: 2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-karboksi-2-feniletil] amino}-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil]pirolidin-1-il}-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-Lvalinamide, so trifluorosirüetne kiseline (#69).
Rastvoru #68 (143 mg, 0.152 mmol, 1 eq.) u tetrahidrofuranu (5 mL, 0.02 M) je dodat rastvor litijum hidroksida (9.10 mg, 0.378 mmol, 2.5 eq.) u vodi (3 mL). Posle 5 sati, reakcija je koncentrovana u vakuumu, azeotropirana tri puta sa heptanom, rastvorena u dimetil sulfoksidu (2.2 mL) i preþišüena sa reverzno faznom hromatografijom (Postupak C-u nastavku) kako bi se dobilo #69 (56 mg, 52%). HPLC (Protokol A-u nastavku na 45 °C): 704.4 [M+H+], vreme retencije = 6.623 minuta; 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6), pretpostavlja se da je mešavina rotamera, karakteristiþn signali: į 8.08-8.22 i 8.37-8.49 (2 m, ukupno 5H), 7.12-7.28 (m, 5H), 3.18, 3.20 i 3.24 (3 s, ukupno 6H), 2.95 i 3.04 (2 br s, ukupno 3H), 1.52 i 1.53 (2 s, ukupno 3H), 1.39 and 1.41 (2 s, ukupno 3H), [1.02 (d, J=6.8 Hz) i 1.05 (d, J=6.6 Hz), ukupno 3H], 0.74-0.81 (m, 3H).
Korak 4: Sinteza mc8261: N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-2-metilalanil-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-karboksi-2-feniletil]amino}-1-metoksi-2-metil-3-oksopropil]pirolidin-1-il}-3-metoksi-5-metil-1-oksoheptan-4-il]-N-metil-L-valinamida.
[0369] Kuplovanje jedinjenja 8261 (# 69) sa veznikom maleimidokaproil (mc):
je postignuto prema Opštem Postupku D (u nastavku) i rezultujuüi sirovi željeni materijal je preþišüen prema Postupku C (u nastavku) kako bi se dobilo 30.2 mg (24%) željenog proizvoda. Pod uslovima naznaþenim u Protokolu A (u nastavku) sa kolonom održavanim na 45°C, ovaj materijal daje HPLC vreme retencije od 9.058 minuta (Protokol A u nastavku); LC-MS: m/z 897.7 [M+H+], vreme retencije 0.81 minuta (Protokol H-u nastavku).
C. Opšte Procedure, Postupci i Protokoli
[0370] Opšta Procedura C: Boc uklanjanje ili cepanje terc-butil estra (takoÿe se odnosi na t-Bu estar) korišüenjem hlorovodoniþne kiseline u dioksanu. Rastvoru jedinjenja koje sadrži Boc ili jedinjenju koje sadrži terc-butil estar u dioksanu (ili u nekim sluþajevima nijednom rastvoru ili drugom relevantnom rastvaraþu) dodat je 4 M rastvor hlorovodoniþne kiseline u dioksanu. Progres reakcije je praüen sa LC-MS (ili HPLC ili TLC). Reakcija je koncentrovana u vakuumu i u nekim sluþajevima azeotropirana jedan do þetiri puta sa heptanima.
[0371] Opšta Procedura D: kuplovanje sa O-(7-azabenzotriazol-1-il)-N,N,N’,N’-tetrametiluronijum heksafluorofosfat (HATU). Rastvoru amina (1.0 eq.) i kiseline (1.0-2.0 eq.) koji se meša u dihlorometanu, dodat je N,N-dimetilformamid (takoÿe se naziva i DMF), ili smeša oba, HATU (1.0-2.0 eq.) praüeno sa trietilaminom (2.0-4.0 eq.) ili diizopropiletilaminom (2.0-4.0 eq., takoÿe se naziva i Hunigova baza). Progres reakcije je praüen sa LCMS (ili HPLC ili TLC); reakcija je obiþno završena u okviru tri sata. Rastvaraþi su uklonjeni u vakuumu. Ostatak je preþišüen sa silika gel ili reverzno faznom hromatografijom ili u nekim sluþajevima azeotropirana tri puta sa heptanima, razblažena sa malom koliþinom etil acetata pre nego što je redukovana na silici ili C18 vezanoj silici i preþišüena sa silika gel ili reverzno faznom hromatografijom.
[0372] Opšta Procedura E: kuplovanje sa N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-L-valil-N<5>-karbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoksi)karbonil]oksi)metil)fenil] - L-ornitinamid (MalcValCitPABC-PNP). Smeši korisnog amina (1 eq.) i N-[6-(2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il)heksanoil]-L-valil-iN<5>-karbamoil-N-[4-({[(4-nitrofenoksi) karbonil]oksi}metil)fenil]-L-ornithinamida (MalcValCitPABC-PNP, Eur. Pat. Appl. (1994), EP624377, 1.0-2.0 eq.) u N,N-dimetilformamidu ili dimetilacetamidu (takoÿe se naziva i DMA), piridin (0.0-4.0 eq.), diizopropiletilamin (0.0-4.0 eq.), 2,6-dimetilpiridin (0.0-4.0 eq., takoÿe se naziva i 2,6-Luditin) i 1-hidroksibenzotriazol hidrat (0.01-1.1 eq., takoÿe se naziva i HOBT) ili 3H-[1,2,3]triazolo[4,5-b] piridin-3-ol (0.01-1.1 eq., takoÿe se naziva i HOAT) je dodat. Posle mešanja na 40°C-50°C 1-48 sata, reakciona smeša je koncentrovana u vakuumu i azetropirana tri puta sa heptanom. Sirovi materijal je preþišüen sa reverzno faznom hromatografijom prema naznaþenom postupku kako bi se dobio željeni materijal.
[0373] Postupak C: Kolona: Phenomenex Luna C18, 100 x 30 mm, 10 mm; Mobilna faza A: 0.02% trifluorosirüetna kiselina u vodi (v/v); Mobilna faza B: 0.02% trifluorosirüetna kiselina u metanolu (v/v); Gradient: 10% do 90% B tokom 20 minuta; Brzina protoka: 20 mL/minuta.
Temperatura: nije kontrolisana; Detekcija: DAD 210 nm, 254 nm; Zapremina ubrizgavanja: variabilna; Instrument: Gilson.
[0374] Postupak D: Kolona: Phenomenex Synergi Max-RP, 150 x 21.2 mm, 4 mm; Mobilna faza A: 0.1% mravlja kisleina u vodi; Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu;
Gradient: 30% B na 1.5 minuta, 30% do 60% B tokom 8.5 minuta, 60 do 100% B tokom 0.5 minuta potom 100% B tokom 2 minute; Brzina protoka: 27 mL/ minut; Detekcija: DAD 210-360 nm; MS (+) opseg 150-2000 daltona; Instrument: Waters FractionLynx.
[0375] Protokol A: Kolona: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 mm; Mobilna faza A: 0.1% mravlja kiselina u vodi (v/v); Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu (v/v); Gradient: 5% B tokom 1.5 minute, 5% to 100% B tokom 8.5 minuta, potom 100% B za 1 minut;
12
Brzina protoka: 0.75 mL/minuta. Temperatura: 25°C; Detekcija: DAD 215 nm; MS (+) opseg 150-2000 daltona; Zapremina ubrizgavanja: 10 mL Instrument: Agilent 1200 LCMS.
[0376] Protokol C: Kolona: Phenomenex Luna C18 (2), 150 x 3.0 mm, 5 mm; Mobilna faza A: 0.02% trifluorosirüetna kiselina u vodi (v/v); Mobilna faza B: 0.02% trifluorosirüetna kiselina u metanolu (v/v); Gradient: 50% do 100% B tokom 10 minuta; Brzina protoka: 0.75 mL/minuta. Temperatura: nije kontrolisana; Detekcija: DAD 215 nm, 254 nm; Zapremina ubrizgavanja: 10 mL; Instrument: Agilent 1100 HPLC.
[0377] Protokol F: Kolona: Waters Acquity UPLC BEH, C18, 2.1 x 50 mm, 1.7 mm; Mobilna faza A: 0.1% mravlja kiselina u vodi (v/v); Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu (v/v); Gradient: 5% B tokom 0.1 minute, 5% do 95% B tokom 0.7 minuta, 95% B tokom 0.1 minute; Brzina protoka: 1.25 mL/minute. Temperatura: 60 °C; Detekcija: 200-450nm; MS (+) opseg 100-1200 daltona; Zapremina ubrizgavanja: 5 mL; Instrument: Waters Acquity.
[0378] Protokol H: Kolona: Phenomenex Gemini-NX, C18, 4.6 x 50 mm, 3mm, 110 A; Mobilna faza A: 0.1% mravlja kiselina u vodi (v/v); Mobilna faza B: 0.1% mravlja kiselina u acetonitrilu (v/v); Gradient: 0% do 100% B tokom 4.10 minute, linearna potom 100% B tokom 0.4 minute; Brzina protoka: 1.5 mL/minuta. Temperatura: 60 °C; Detekcija: DAD 200-450 nm; MS (+) opseg 100-2000 daltona; Zapremina ubrizgavanja: 5 mL; Instrument: Agilent.
Primer 10
Biokonjugacija Anti-PTK7 Antitela
A. Konjugati Anti-PTK7-vc0101 Antitelo-Lek
[0379] U predmetnom pronalasku, anti-PTK7 antitela hu23, hu24 i hu58 su konjugovana u vc0101 kako bi generisali hu23-vc0101 ADC, hu24-vc0101 ADC i hu58-vc0101 ADC, ili su konjugovana u mc8261 kako bi generisali hu23-mc8261 ADC, hu24- mc8261 ADC i hu58-mc8261 ADC. Konjugacija hu23, hu24, i hu58 do vc0101 mc8261 je postignuta sa derivatizacijom boþnih lanaca cistein ostataka. Ovi cisteini su normalni upareni kao meÿulanþani cistein disulfidni mostovi, od kojih postoje 4 oþuvana para (koja ukljuþuju 8 ostataka cisteina) na IgG1 antitelu. Delimiþno smanjenje ovih disulfidnih veza obezbeÿuje distribuciju slobodnih tiola koji se mogu funkcionalizovati pomoüu maleimidne drške na vc vezinika. Konkretno, anti- PTK7 antitela predmetnog pronalaska su delimiþno smanjena dodavanjem 2.4 molarnog viška tris (2-karboksietil) fosfina (TCEP) u 100 mM HEPES (4-(2-hidroksietil)-1-piperazinetansulfonska kiselinski pufer) , pH 7.0 i 1 mM dietilentriamin pentaoctenska kiselina (DTPA) tokom 2 sata na 37 °C. Tada je vc0101 ili mc8261 veznik-nosivost dodat reakcionoj smeši pri molarnom odnosu veznik-nosivost / antitelo od 7 i reagovao je dodatnih 1 sat na 25 °C u prisustvu 15% v / v dimetilacetamida (DMA). Posle perioda od 1 sata inkubacije, dodat je 3 puta višak N-etilmaleimida da pokrije nereagovane tiole i ostavljeno je da reaguje 15 minuta, praüeno dodavanjem 6 puta viška L-Cis da bi se zaustavio svaki nereagovani veznik-nosivost.
[0380] Reakciona smeša je dijalizovana preko noüi na 4 °C u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS), pH 7.4, i preþišüena hromatografijom za iskljuþivanje veliþine (SEC; AKTA explorer, Superdex 200). Konaþna supstanca ADC leka je formulisana u 20mM Histidinu, 85 mg/mL saharoze, pH 5.8 puferu.
[0381] Konjugati anti-PTK antitelo-lek su dalje okarakterisani sa SEC za hromatografiju þistoüe i hidrofobne interakcije (HIC), i teþna hromatografija elektrosprejna jonizacija masena spektrometrija (LC-ESI MS) koja je korišüena za izraþunavanje odnosa lek-antitelo (punjenje leka). Koncentracija proteina je odreÿena ultraljubiþastom (UV) spektrofotometrijom. Ovaj postupak obezbeÿuje konjugat antitelo-lek kao heterogenu smešu funkcionalizovanih antitela koja sadrže proseþan odnos leka i antitela (DAR) od približno 4 mol/mol.
[0382] Profil distribucije leka je procenjen putem HIC za hu24-vc0101 i predstavljen u hromatogramu na FIG.7. Ukratko, izveden je analitiþki HIC na koloni TSK gel butil-NPR. ADC je vezan za kolonu u 1.5 M amonijum sulfatu, 50 mM dvokaloriþnog kalijum fosfata, pH 7 i eluiran sa 50 mM dvobaznog kalijum fosfata i 20% izopropanol (IPA), pH 7.
B. Konjugati Anti-PTK7-AcBut CM Antitelo-Lek
[0383] U predmetnom pronalasku, anti-PTK7 antitela hu23, hu24 i hu58 su konjugovani u AcBut-N-acetil-Ȗ-caliheamicin dimetl hdrazid (AcButCM) OSu estar kako bi se dobio hu23-AcButCM ADC, hu24-AcButCM ADC i hu58-AcButCM ADC kao što je prikazano u nastavku, gde X može da bude bilo koje antitelo, kao što je hu23, hu24 i hu58.
12
[0384] Reakciona smeša ukljuþuje 10 mg/ml ili manje anti-PTK7 antitela i AcButCM OSu estar u molarnom odnosu od 4- 4.5 do 1. Tokom dodavanja AcButCM u vrtlog za mešanje izvedeno je veliko mešanje. Reakciona pH je bila 8.3, a koncentracije ostalih komponenata reakcije su sledeüe: 180 mM HEPES pufera, 41 mM natrijum dekanoata i 8% (v/v) etanola. Reakcija je sprovedena na 33 °C tokom 5 minuta. Nakon završetka reakcije konjugacije, reakciona smeša je polako razblažena sa 1.3 zapremine 1M K2HPO4, podešavanjem na pH 8.5 uz mešanje.
[0385] Da bi se preþistila, razblažena gornja reakciona smeša je napunjena u dve šarže na koloni Butil Sefaroza-4 Brzim Protokom HIC (GE Healthcare) koja je prethodno bila uravnotežena u pet zapremina kolona (cv) od 0.52 M pufera kalijum fosfata, pH 8.5. Protein napunjen na koloni bio je 3.5 mg/ml zapremine sloja. Brzina protoka je bila 15 ml/minuti kroz punjenje uzorka i 22 ml/minuti tokom faze pranja i eluiranja hromatografije. Ovaj poboljšani gradijent uklanja više DAR ADCs koji su bili vezani za kolonu.
[0386] Nevezana frakcija tokom punjenja bili su pretežno reakcijski reagensi i veüina nekonjugovanog antitela, koje je odbaþeno. Kolona je zatim isprana sa 0.3 cv 0.52 M pufera kalijum fosfata, pH 8.5, da bi se uklonili svi preostali reagensi. Gradijent koraka sa 1 cv od 0.52 M do 0.4 M kalijum-fosfatnog pufera, pH 8.5, zatim je korišüen za eluiranje bilo kog labavo vezanog nekonjugovanog antitela, zajedno sa slabo optereüenim anti-PTK7-AcButCM, ako je prisutan. Glavna frakcija je zatim eluirana korišüenjem gradijenta od 1 cv od 0.4 M do 5 mM pufera kalijum fosfata, pH 8.5, da bi se dobio anti-PTK7-AcButCM koji ima DAR u opsegu od 3 do 5, prema kraju gradijenta. Ako su bili prisutni anti-PTK7-AcButCM konjugati sa višim DAR, frakcija je eluirana pomoüu gradijenta od 2 cv 5mM pufera kalijum fosfata, pH 8.5, a zatim elucijom þiste dejonizovane vode. Bilo koji konjugat anti-PTK7-AcButCM sa višim DAR koji je
12
ostao vezan nakon eluiranja dejonizovane vode eluiran je upotrebom 2 cv 10mM natrijum hidroksida koji sadrži 20% etanola. Preþišüene serije su sadržale anti-PTK7-AcButCM konjugate sa DAR od 3 do 5.
[0387] Ovim poboljšanim procesima konjugacije i preþišüavanja generisani su ADCs koji imaju DAR manji od 6, a u nekim aspektima u opsegu od 3 do 5. Dalje, procesi generišu užu raspodelu optereüenja, na primer, manju heterogenost u proizvodu. Poboljšanja procesa konjugacije i preþišüavanja su dalje obuhvatala: 1) smanjenje odnosa AcButCM na anti-PTK7 antitela na 4-4.5 do 1 da bi se dobio ADC sa nižim DAR, 2) sprovoÿenje velike agitacije tokom dodavanja AcButCM na anti- PTK7 antitelo za generisanje ADC sa malim koliþinama nekonjugovanog antitela (slobodno antitelo), 3) smanjenjem vremena inkubacije na 5 minuta, u poreÿenju sa 60-90 minuta, da bi se dobili niski agregati i 4) smanjenjem koliþine etanola na 6-8%, da bi se obezbedilo mali agregati. Preþišüeni objedinjeni vrhovi iz obe serije su dva puta dijalizovani u odnosu na formulisani pufer da bi se olakšalo skladištenje u zamrznutom stanju. Formulisana puferska kompozicija je 20mM Tris, 7.5% sukroza, 0.01 % polisorbat 80, 10mM NaCl, pH 8.0.
Primer 11
Karakteristike Vezivanja hu24 mAb i hu24 ADC
[0388] Da bi se utvrdilo da li se hu24 mAb i hu24-vc0101 ADC vezuju za ortolog PTK7 majmuna cinomolgus, PTK7 protein majmuna cinomologus je kloniran i ekspresovan. Analiza sekvence otkrila je da je protein 97.9% identiþan humanom PTK7 proteinu.
[0389] Analiza površinske plazmonske rezonance (SPR) je sprovedena da bi se okarakterisale karakteristike vezivanja mAb i ADC za ektodomene PTK7 proteina þoveka i cinomolgus majmuna. SPR analizom utvrÿeno je da je vezivanje uporedivo. Nije bilo znaþajne razlike u afinitetu izmeÿu mAb i ADC za PTK7 protein kod majmuna ili cinomolgus majmuna (Tabela 16). Sva Konmerenja su unutar 3 puta, a sva Koffmerenja su unutar 2 puta, a opsezi na terenu smatraju se tipiþnom sistematskom greškom i stoga verovatno neüe biti fiziološki znaþajni.
12
Tabela 16. Konstante afiniteta hu24 i hu24-vc0101 za Humani PTK7 i Cinomolgus Majmunski
PTK7
[0390] Sposobnost anti-PTK7 mAb da se vežu za PTK7 ortologe takoÿe je procenjena pomoüu sendviþ ELISA. Ukratko, PTK7-obeleženi protein majmuna, cinomolgus majmuna, pacova ili miša uhvaüen je na ELISA ploþi direktnim premazivanjem. Svi antigeni su uhvaüeni pri 1 µg/ml, 100 µl/ bunarþLüu. Hu24 mAb i hu24-vc0101 ADC su serijski razblaženi poþev od 810 ng/ml i dodavani u oprane i blokirane bunarþLüe da bi se testiralo vezivanje za antigen. Vezivanje mAb i ADC otkriveno je poliklonskim anti-humanim IgG konjugatom peroksidaze rena i oþitano sa TMB supstratom.
[0391] I mAb i ADC su se uporeÿivali sa PTK7 proteinima majmuna i cinomolgus majmuna pomoüu ELISA (Tabela 17). Zajedno sa rezultatima SPR, ovi rezultati su potvrdili unakrsnu reaktivnost na PTK7 cinomolgus majmuna i pokazali da proces biokonjugacije nije promenio uoþene karakteristike vezivanja mAb. Meÿutim, ni mAb ni ADC nisu pokazivali vezivanje za PTK7 protein pacova ili miša pri 100 puta višoj koncentraciji antigena nego što je bilo potrebno za posmatranje vezivanja za humani PTK7 (Tabela 17). Potvrÿeno je da su antigeni pacova i miša pravilno savijeni vezivanjem za poznata unakrsna reaktivna antitela (podaci nisu prikazani).
Tabela 17. Vezivanje hu24 i hu24-vc0101 za PTK7 proteine sa ELISA
12
[0392] Nekonjugovani hu24 i hu24 konjugovani sa vc0101 uporeÿivani su zbog njihove sposobnosti da se vezuju za üelije koje ekspresuju PTK7 protoþnom citometrijom primenom metoda opisanih u Primeru 3. Ukratko, uzgajane su kultivisane üelije H1975 ili EKVX i inkubirane na 4 °C sa hu24- vc0101 ADC ili nekonjugovanim hu24 mAb, praüeni sekundarnim mAb konjugovanim sa fluoroforom i mrljom održivosti, a zatim analizirani protoþnom citometrijom.
[0393] Tabela 18 daje srednju fluorescenciju kanala populacije održivih üelija. Uporedni podaci su dobijeni u nezavisnom ponovljenom eksperimentu, tako da konjugacija hu24 sa korisnim optereüenjem veznika ne menja njegovo vezivanje za üelije koje ekspresuju PTK7.
Tabela 18. Uporedivo vezivanje üelija konjugovanog i nekonjugovanog hu24
Primer 12
In Vitro Citotoksiþne Analize
[0394] Citotoksiþnost konjugata antitelo-lek hu24-vc0101 procenjena je na üelijskim linijama koje izražavaju ciljani PTK7. Konstruisana üelijska linija koja ekspresuje HEK293T-PTK7 postavljena je u prozirnu ploþu za kulturu tkiva ravnog dna (BD Falcon) na 500 üelija po 180 µL medijuma üelijskih kultura po bunarþLüu. U ovom testu su takoÿe testirane üelijske linije humanog karcinoma i postavljene su na gustinu za koju je prethodno utvrÿeno da je optimalna za svaku üelijsku liniju u skladu sa brzinom rasta (H6611500 üelija/ bunarþLüu i H4469600 üelija/bunarþLüa u 150 µl). ûelije su inkubirane preko noüi na 37 °C u 5% CO2inkubatoru. Sledeüeg dana, hu24-vc0101 ADC i 8.84 Ab-vc0101 ADC (negativna kontrola) dodati su üelijama na krivoj koncentracije od 10 taþaka u trostrukim uzorcima, poþevši od 3 ili 10 µg/mL sa razblaženjima 1:3 u üeliji medijuma kulture. Ploþa je inkubirana u inkubatoru sa 37 °C, 5% CO2tokom 4 dana. MTS analiza (Promega CellTiter 96 vodeni neradioaktivni rast üelijske
12
proliferacije) je korišüen u skladu sa uputstvima dobavljaþa. U svaki bunarþLü je dodato 30 µL (H446, H661) ili 40 µL (HEK293T-PTK7) kombinovanog MTS reagensa i ploþa je inkubirana u inkubatoru sa 37 ºC, 5% CO2tokom 2 sata. OD je odreÿen na 490 nm pomoüu þitaþa ploþa sa 96 bunarþLüa. Proseþno oþitavanje iz bunara samo sa medijumom oduzeto je od oþitavanja bunara sa üelijama za kontrolu pozadinske OD. Podaci su podvrgnuti logistiþkoj nelinearnoj regresivnoj analizi (GraphPad Prism Softvare) kako bi se utvrdila koncentracija konjugata antitelo-lek na kojoj je inhibicija održivosti üelija sa 50% (IC50).
[0395] Tabela 19 daje IC50 vrednosti za hu24-vc0101 ADC u analizi citotoksiþnosti. U sve tri üelijske linije, hu24-vc0101 je izazvao snažnu citotoksiþnost, dok nevezujuüi 8.84 Ab-vc0101 nije; ovi podaci pokazuju da je snažna citotoksiþnost hu24-vc0101 zavisila od anti- PTK7 antitela.
Tabela 19
Primer 13
In Vivo Efikasnost Konjugata Anti-PTK7 Antitelo-Lek
[0396] Efekti konjugata anti-PTK7 antitelo-lek su dalje procenjeni na in vivo rast ksenografta (PDX) koji potiþe od humanog tumora. Primeri resekcije primarnog tumora nabavljeni su sa kliniþkih lokacija nakon odobrenja Institucionalnog revizijskog odbora za zaštitu ljudskih subjekata i u skladu sa HIPAA propisima. Fragmenti tumora su uskladišteni i otpremljeni u Hipothermasol (Biolife Solutions) na ledu i ugraÿeni su u Matrigel (BD) koji sadrži vlasniþku mešavinu faktora rasta i supkutano implantirani u mleþnu masnu masku ženskih NOD / SCID miševa u roku od 24 sata od resekcije. Miševi su svakodnevno praüeni za zdravstveno stanje i za rast tumora vizuelnim pregledom dva puta nedeljno. Kada su tumori opipljivi, merenja
1
zapremine tumora poþinju da prate rast tumora i procenjuju vreme udvostruþavanja üelija. Zapremina tumora procenjena je pomoüu jednaþine V = (A * B2) / 2 gde je A duža os, a B kraüa os. Kada su tumori dostigli zapreminu od 500 mm<3>do 1.500 mm<3>, sakupljani su za prouþavanje i za ponovnu transplantaciju kao ksenograft dobijen od pacijenta (PDX). U zavisnosti od linije, mehaniþka i / ili hemijska disocijacija mogu se koristiti za odvajanje pojedinaþnih üelija za prolaz. Žive üelije su inokulirane na naivnim životinjama sa 10000 do 50000 üelija po životinji.
[0397] Za studije efikasnosti, tumori su sakupljeni iz studija pasažiranja, a üelije su razdvojene u suspenziju jednoüelija. Prebrojani su preparati za žive üelije korišüenjem Tripan blue ekskluzije, a 10000 do 50000 üelija je inokulirano po mišu u Matrigelu. Da bi se uzeli u obzir diferencijalne stope rasta PDX, zapoþeto je najmanje 25% više životinja da bi se omoguüila minimalna varijanta zapremine tumora pri nasumiþnom odabiru. Rast tumora je u poþetku praüen opipljivošüu, a merenja su zapoþela kada je koliþina tumora dostigla oko 30 mm<3>. Studije su randomizirane na osnovu veliþine tumora kada je grupa miševa koji nose tumore dostigla 140 mm<3>do 180 mm<3>. Životinjama su dozirane intraperitonealne injekcije dva puta nedeljno tokom dve nedelje (q4dx4). Ispitne grupe su praüene sve dok pojedinaþni miševi ili merenja tumora cele grupe nisu dostigli 1200 mm<3>kada je žrtva naznaþena u skladu sa IACUC protokolom. Za odabrane studije doziranja, izvršena su farmakokinetiþka submandibularna krvarenja tokom 2 sata, 36 sati i 72 sata. Zapremina od 10 µL krvi odmah je pipetirano u 90 µL HBS-P (GE Healthcare). Uzorci su þuvani na -80 ° C pre analize. Za svako merenje tumora obezbeÿena je standardna greška srednje vrednosti zapremine 6 (SEM). GT = Grupa Prekinuta zbog velike veliþine tumora. Sve studije su ukljuþivale konjugat leka za kontrolno antitelo koji se sastojao od nevezujuüeg hIgG1 antitela konjugovanog za isti veznik-teret koji se analizira i sa uporedivim odnosom leka i antitela (DAR) i raspodelom optereüenja.
[0398] Tabele 20-37 pokazuju efikasnost konjugata antitelo-lek hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-AcButCM, hu24-AcButCM i hu58-AcButCM u PDX modelima uspostavljenim korišüenjem razliþitih üelija humanih tumora koje imaju relativni PTK7 izraz za koji je utvrÿeno da je nizak, srednji ili visok.
A. Rak Dojke (BR)
[0399] Tabela 20 i FIG.8 pokazuju da su AD23 hu23-vc0101, hu24-vc0101 i hu58-vc0101 efikasni u PDX modelu koristeüi humani Breast-13 (BR13) trostruko negativni model karcinoma
1 1
dojke (TNBC) PDKS (visoka PTK7 ekspresija) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolama leka. AD24 hu24-vc0101 je bio efikasniji od hu23-vc0101 i hu58-vc0101 u modelu BR13 PDX. Svi testirani PTK7 ADCs su bili efikasniji od doksorubicina, koji je standard u leþenju TNBC.
Tabela 20 Efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs u BR13 TNBC PDX
1 2
[0400] FIGS.9 i 10 pokazuju efikasnost ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 i hu58-mc8261 u modelu BR13 TNBC PDX (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa hu24-vc0101. Leþenje sa hu24-vc0101 dalo je trajnu regresiju tumora tokom više od 200 dana i pokazalo veüu inhibiciju rasta tumora u poreÿenju sa anti-PTK7-mc8261 ADCs.
[0401] Tabela 21 i FIG.11 pokazuju da su AD23 hu23-vc0101, hu24-vc0101 i hu58-vc0101 ADC efikasni u PDX modelu koristeüi humani Breast-22 (BR22) TNBC PDKS model (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaüem i kontrolnim lekovima. U ovom modelu, hu23-vc0101 i hu24-vc0101 ADC su bili efikasniji od hu58-vc0101, demonstrirajuüi sliþna antitela na isti cilj (PTK7) sa razliþitim stepenom efikasnosti. Svi testirani PTK7 ADCs su bili efikasniji od docetaksela, što je standardni naþin leþenja za TNBC. Primetno je da docetaksel i komponenta leka ADCs, auristatin 0101, imaju sliþne mehanizme delovanja jer inhibiraju polimerizaciju tubulina.
Tabela 21. Efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs u BR22 TNBC PDX
1
[0402] Tabela 22 pokazuje da su hu23-AcButCM, hu24-AcButCM i hu58-AcButCM ADCs bili efikasni u modelu BR22 TNBC PDX (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolnim lekovima. Meÿutim, hu58-AcButCM je bio efikasniji i od hu23-AcButCM i od hu24-AcButCM, što ilustruje nepredvidivu prirodu upotrebe razliþitih korisnih tereta sa sliþnim antitelima na isti cilj. ADC hu23-vc0101 i hu24-vc0101 bili su efikasniji od hu58-vc0101, dok je hu58-AcButCM bio efikasniji od AD23 hu23-AcButCM i hu24-AcButCM. Svi testirani PTK7 ADCs su bili efikasniji od doksorubicina, koji je standard u leþenju TNBC.
1 4
Tabela 22. Efikasnost ADCs u BR22 TNBC PDX
[0403] FIGS.12 i 13 pokazuju efikasnost AD23 hu23-mc8261, hu24-mc8261 i hu58-mc8261 u modelu BR22 TNBC PDX (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa hu23-vc0101. Leþenje sa hu23-vc0101 dalo je trajnu regresiju tumora tokom više od 200 dana i pokazalo veüu inhibiciju rasta tumora u poreÿenju sa anti-PTK7-mc8261 ADCs.
[0404] Tabele 23-25 i FIG.14 pokazuju efikasnost hu23-vc0101, hu24-vc0101, hu58-vc0101, hu23-mc8261 i hu24-mc8261, hu58-mc8261 i hu23-AcButCM, hu24-AcButCM, hu58-AcButCM TNC u Breast-31 PDX modelu (visoka ekspresija PTK7). U ovom modelu, sva tri ADCs koja imaju vc0101 veznik-nosilac bila su efikasnija od ADCs koji imaju AcButCM ili mc8261. Ovaj rezultat je bio neoþekivan, jer je korisno optereüenje veznika AcButCM uopšteno bilo moünije od korisnog vc0101 veznika nosioca u testiranim in vivo PDX modelima. Pored toga, PTK7-vc0101 ADC bili su efikasniji od docetaksela, a PTK7-AcButCM ADC efikasniji od doksorubicina. I docetaksel i doksorubicin su standardi u nezi za TNBC.
Tabela 23. Efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs u BR31 TNBC PDX
1
Tabela 24. Efikasnost anti-PTK7-mc8261 ADCs u BR31 TNBC PDX
Tabela 25. Efikasnost anti-PTK7-AcButCM ADCs u BR31 TNBC PDX
1
84 882 ± 183
[0405] Tabela 26 i FIG.15 pokazuju da je hu24-vc0101 ADC bio efikasan u ljudskom modelu Breast-64 (BR64) TNBC PDX (srednja ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolnim lekovima. Podaci pokazuju da je PDX model koji ima umerenu eksrpesiju PTK7 cilj je efikasno ciljan sa hu24-vc0101. Hu24-vc0101 je bio efikasniji od docetaksela, standarda nege za TNBC.
Tabela 26. Efikasnost hu24-vc0101 u BR64 TNBC PDX
[0406] FIG.16 pokazuje efikasnost hu24-vc0101, i nedostatak efikasnosti nekonjugovanog hu24, u modelu BR5 TNBC PDX. Miševima koji sadrže ksenografte Br5 humanog karcinoma dojke dozirana su svaka þetiri dana tokom þetiri ciklusa (Q4Dx4) sa hu24-vc0101 ADC, nekonjugovanim hu24 mAb ili nosaþem. Merenja tumora zabeležena su dva puta nedeljno korišüenjem digitalnih kalipera i prikazana su kao Srednja vrednost ± SEM. Doza od 3 mg/kg hu24-vc0101 ADC izazvala je regresiju tumora bez rasta tumora tokom 49. dana. Nasuprot tome, nekonjugovani hu24 mAb nije inhibirao rast tumora (FIG 16). Prema tome, uoþena efikasnost je zavisna od isporuke veznika-nosaþa.
[0407] FIG.17 pokazuje efikasnost hu24-vc0101 u poreÿenju sa paklitakselom u BR36 PR TNBC PDX modelu. Miševima koji sadrže BR36 ksenografte humanog karcinoma dojke dozirani su Q4Dx4 sa hu24-vc0101 ADC, paklitakselom, negativnom kontrolom ADC ili nosaþem.
1
Merenja tumora zabeležena su dva puta nedeljno korišüenjem digitalnih kalipera i prikazana su kao Srednja vrednost ± SEM. Doza od 3 mg/kg hu24-vc0101 ADC izazvala je regresiju tumora bez rasta tumora tokom 103. dana. Hu24-vc0101 je izbacio preformirani paklitaksel primenjen na MTD. Negativna kontrola ADC pokazala je samo umerenu aktivnost (FIG.17).
B. Rak Pluüa Malih ûelija (SCLC)
[0408] Podaci u Tabelama 27-28 ilustruju efikasnost AD24 hu24-vc0101 i hu24-AcButCM u PDC modelu karcinoma pluüa malih üelija-64 (LU64) (niska ekspresija PTK7). U ovom modelu pokazalo se da su oba ADCs efikasna u ovom PDX sa niskom ekspresijom PTK7, iako su ADCsi koji imaju nosivost AcButCM veznika bili efikasniji od ADCs koji imaju vc0101 nosivost veznika. I hu24-vc0101 i hu24-AcButCM bili su efikasniji od standardne nege za SCLC (koji je cisplatin plus etopozid).
Tabela 27. Efikasnost hu24-vc0101 ADCs u LU64 PDX
Tabela 28. Efikasnost hu24-AcButCM ADCs u LU64 PDX
1
[0409] Tabela 29 prikazuje efikasnost ADC hu23-mc8261, hu24-mc8261 i hu58-mc8261 u modelu LU64 PDX (niska ekspresija PTK7). Leþenje sa hu24-vc0101 pokazalo je veüu inhibiciju rasta tumora od anti-mc8261 ADCs u ovom modelu.
Tabela 29. Efikasnost anti-PTK7-mc8261 ADCs u LU64 PDX
[0410] Tabele 30-31 prikazuju efikasnost AD24 hu24-vc0101, hu23-vc0101 i hu24-AcButCM u PDC modelu karcinoma pluüa malih üelija-86 (LU86) (visoka ekspresija PTK7). U ovom modelu, i hu24-vc0101 i hu23-vc0101 su bili efikasni u suzbijanju rasta tumora. Hu24-vc0101 je bio efikasniji od kontrol-vc0101 ADC. Meÿutim, hu24-AcButCM ADC je bio snažniji od oba ADCs koji su imali vc0101 veznik-nosaþ (Tabela 22) pružajuüi dalji primer opšteg veüeg potencijala AcButCM u poreÿenju sa vc0101 u SCLC modelima. Hu24-AcButCM je bio efikasniji od cisplatina i etopozida, što je standardna nege za SCLC.
1
Tabela 30. Efikasnost anti-PTK7-vc0101 ADCs u LU86 PDX
Tabela 31. Efikasnost hu24-AcButCM ADCs u LU86 PDX
14
[0411] Tabela 32 prikazuje efikasnost hu23-mc8261, hu24-mc8261 i hu58-mc8261 ADCs u modelu LU86 PDX (visoka ekspresija PTK7). Leþenje sa hu23-vc0101 dalo je trajnu regresiju tumora u modelu LU86 PDX i pokazalo veüu inhibiciju rasta tumora u poreÿenju sa anti-PTK7-mc8261 ADCs.
Tabela 32. Efikasnost anti-PTK7-mc8261 ADCs u LU86 PDX
[0412] FIGS.18A-B pokazuju efikasnost PTK7 ADC konjugovanih sa 0101 ili CM u dva razliþita SCLC PDX modela, H1048 PDX model (visoka ekspresija PTK7) i SCLC 95 PDX model (visoka ekspresija PTK7), FIGS.19A-B prikazuju efikasnost hu24-AcBut CM u dva razliþita SCLC PDKS modela, SCLC 117 PDX modelu (umerena ekspresija PTK7), odnosno SCLC 102 PDX modelu (niska ekspresija PTK7). Rezultati pokazuju da su hu24-AcButCM ili hu23-AcButCM ADC efikasniji od huLC-vc0101 ADC protiv SCLC. Ovo otkriüe je neoþekivano u svetlu jake antitumorske aktivnosti hu24-vc0101 u PDX modelima drugih vrsta tumora kao što su TNBC i NSCLC. Pored toga, rezultati sugerišu da aktivnost ADC korelira sa ekspresijom PTK7, jer je hu24-AcButCM ADC izazvao najslabiji odgovor u SCLC 102 koji ima nisku ekspresiju PTK7.
C. Rak Pluüa Ne-malih ûelija (NSCLC)
[0413] Tabela 33 i FIG.20 pokazuju da je hu24-vc0101 ADC bio efikasan u ljudskom modelu PDC karcinoma pluüa ne-malih üelija-135 (LU135) (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolnim lekovima. Ovi podaci pokazuju efikasnost hu24-vc0101 u suzbijanju rasta tumora u NSCLC PDX. Hu24-vc0101 je bio efikasniji od paklitaksela, što je standardna nega u NSCLC.
Tabela 33. Efikasnost hu24-vc0101 u LU135 PDX
[0414] Tabela 34 i FIG.21 pokazuju da je hu24-vc0101 ADC bio efikasan u ljudskom PDX modelu kancera pluüa ne-mailh üelija -176 (LU176) (visoka ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolnim lekovima. Ovi podaci pokazuju efikasnost hu24-vc0101 u suzbijanju rasta tumora u NSCLC PDX. Hu24-vc0101 je bio efikasniji od cisplatina, što je standardna nege kod NSCLC.
Tabela 34. Efikasnost hu24-vc0101 u LU176 PDX
D. Karcinom Jajnika (OV)
[0415] Tabela 35 pokazuje efikasnost hu24-vc0101 i hu24-AcButCM ADCs u PDX modelu jajnika-55 (OV55) (srednja ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolama lekova. Ovi podaci pokazuju da PDX model jajnika koji ima umerenu ekspresiju PTK7 cilja efikasno cilja oba ADCs. Iznenaÿujuüe je da životinje leþene sa hu24-vc0101 nisu imale tumor kada je eksperiment završen, a hu24-AcButCM ADC je bio manje efikasan u ovom modelu.
Tabela 35 Efikasnost hu24 ADCs u OV55 PDX
14
E. Melanom (SK)
[0416] Tabela 36 pokazuje da je hu24-vc0101 ADC bio efikasan u PDX modelu humanog melanoma-23 (SK23) (srednja ekspresija PTK7) u poreÿenju sa nosaþem i kontrolnim lekovima. Ovi podaci pokazuju efikasnost hu24-vc0101 u PDX modelu melanoma koji ima umerenu ekspresuju PTK7 cilja, pružajuüi potencijalnu indikaciju za upotrebu ADC.
Tabela 36. Efikasnost hu24-vc0101 u SK23 PDX
F. Inhibicija Rasta Tumora u modelima Dojke i NSCLC PDX
[0417] Životinjama su dozirana svaka þetiri dana tokom þetiri ciklusa (Q4Dx4) sa intraperitonealnom injekcijom, osim studije BR5 koja je bila intravenskom injekcijom po istom rasporedu. Merenja tumora su zabeležena jedan ili dva puta nedeljno pomoüu digitalnih kalipera, a zapremina tumora procenjena je pomoüu jednaþine V = (A x B<2>) / 2 gde je A duža os, a B kraüa os. Telesne težine životinja izmerene su i beležene najmanje jednom nedeljno.
Ispitivane grupe su praüene sve dok pojedinaþni miševi ili merenja tumora cele grupe nisu dostigli 1200 mm<3>i tada je ukazano na žrtvu u skladu sa protokolom IACUC. Za BR5 studiju, životinje su žrtvovane kada se zapremina tumora približi 15% telesne težine na inscenaciji, u skladu sa IACUC protokolom.
[0418] Inhibicija rasta tumora (TGI) izraþunata je koristeüi jednaþinu % TGI = [1- (srednja vrednost zapremine tumora koji se leþi) / (srednjom vrednosti zapremina zapremine tumora nosaþa)]. TGI je izraþunat u najnovijoj moguüoj vremenskoj taþki, što je obiþno poslednje merenje pre nego što je kontrolna grupa prekinuta, kao što je gore opisano. Regresija tumora definisana je kao smanjenje srednje vrednosti zapremine tumora nakon doziranja. U sluþajevima kada su tumori nazadovali, Vreme do progresije (TTP) ukazuje na broj dana izmeÿu prvog uþinka i vremena u kojem se srednja vrednost zapremine tumora poveüala od prethodnog merenja do statistiþki znaþajnog stepena. Ako se tumor nije ponovo razvio tokom eksperimenta, TTP je broj dana izmeÿu prve doze i kraja eksperimenta.
[0419] Da bi se potvrdila izloženost hu24-vc0101 ADC u studijama efikasnosti, utvrÿene su koncentracije ADC i ukupnih antitela u plazmi za dva PDX modela, BR13 PDX i BR22 PDX. Uzorci su sakupljani u tri vremenske taþke nakon treüe primene ADC i koncentracije su merene testom vezivanja liganda (LBA) (podaci nisu prikazani). Podaci ukazuju da je izloženost lekovima bila uporediva u ovim modelima tumora.
[0420] Hu24-vc0101 ADC izazvao je antitumorsku aktivnost u modelima tumora raka dojke i NSCLC. Tumori su nazadovali tokom leþenja i obiþno se nisu obnavljali mesecima nakon poslednje primene ADC. Nekonjugovani hu24 mAb nije izazvao antitumorsku aktivnost u testiranom modelu koji je pokazao mehanizam delovanja zavisan od auristatina. Rezultati su sumirani u Tabeli 37.
Tabela 37. Rezime In Vivo farmakoloških studija sa hu24-vc0101 ADC
14
Primer 14
Mehanizam delovanja 0101
[0421] Da bi se prouþio mehanizam delovanja hu24-vc0101 ADC, üelije su tretirane ADC, a zatim je procenjena njihova struktura mikrotubula. Auristatin je potpuno sintetiþki inhibitor pentapeptida na bazi dolastatina polimerizacije tubulina koji indukuje zaustavljanje G2/M üelijskog ciklusa i üelijsku smrt pri niskim picomolarnim ekstraüelijskim koncentracijama (Sapra et al., 2011, Expert Opin Investig Drugs 20(8):1131-49 and Turner et al., 1998, Prostate 34(3):175-81).
[0422] ûelije raka pluüa H661 posejane su na sistem klizaþa sa 4 bunarþLüa sa CC2 obloženom površinom za rast (Thermo Scientific) i obraÿivane 48 sati sa hu24-vc0101, negativnom kontrolom ADC, nekonjugovanim hu24mAb u koliþini od 0 - 4 µg/ml ili slobodnom 0101 auristatin na 0.1 - 10 nM. ûelije su zatim fiksirane u 3% paraformaldehidu, isprane sa PBS, permeabilizovane sa 0.5% Triton-X® (Sigma Chemical) u PBS, oprane sa PBS i inkubirane sa puferom za blokiranje (5% normalnog kozjeg seruma i 0.2% Tween-20 u PBS). ûelije su inkubirane sa primarnim anti-Į-tubulinskim antitelom (Sigma NoT9026, klon DM1A) u puferu za blokiranje 1 sat na sobnoj temperaturi. Posle toga, üelije su isprane sa PBS i inkubirane 30 minuta sa Alexa Fluor® 488 konjugovanim sekundarnim antitelom (Invitrogen Corp) i 4’,6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) radi bojenja DNK. ûelije su vizualizovane na konfisnom mikroskopu Zeiss LSM 510 Meta.
[0423] Tretiranje üelija sa slobodnim 0101 ili hu24-vc0101 ADC poremetio je strukturu mikrotubula i doveo do zaustavljanja G2/M üelijskog ciklusa. Suprotno tome, ni nekonjugovani hu24 mAb ni negativni kontrolni mAb nisu izazvali ove odgovore (FIG.22). Ovi rezultati
14
pokazuju da hu24-vc0101 ADC može izazvati citotoksiþnost na naþin zavisan od antigena narušavanjem strukture mikrotubula i izazivanjem hapšenja G2/M. Ovaj mehanizam je u skladu sa prethodnim studijama o nekonjugovanim auristatinim.
Primer 15
hu24-vc0101 ADC Efekat na Endotelialne ûelije
[0424] FIG.23 pokazuje da hu24-vc0101 ADC inhibira angiogenezu u standardnom in vitro testu nicanja HUVEC. Ukratko, HUVEC üelije (Lonza- # CC-2517) korišüene su za oblaganje Citodek perli (Sigma # C0646-5G) u odnosu od približno 1x10<6>üelija/2500 perli, a zatim stavljene preko noüi u inkubator od 37 °C/5% CO2sa medijumom za rast endotelnih üelija (Lonza # CC-3162). Sledeüeg dana perlice su isprane medijumom za rast endotelnih üelija i ponovo suspendovane u rastvoru od 2.0 mg/ml fibrinogena tipa I (sterilisani filterom) u DPBS i 0.15 jedinica/ml Aprotinina. U svaki bunarþLü ploþe sa 24 bunarþLüa dodato je 0.3125 jedinica trombina pre dodavanja 500 ul rastvora zrna. Da bi se olakšalo zgrušavanje, ploþe su stavljene u inkubator pri 37ºC na 15 minuta. Na kraju, üelije fibroblasta kože (Detroit 551 - ATCC # CCL-110), suspendovane u medijumu za rast endotelnih üelija, pažljivo su položene na vrh formiranog ugruška fibrinogena. ûelije su hranjene, uz odgovarajuüe leþenje lekovima, svaki drugi dan i uzgajane 8 dana. Primeüen je stepen nicanja HUVEC i formiranje granastih posuda.
[0425] Hu24-vc0101 ADC inhibirao je nicanje angiogeneze u ovoj analizi na 1 µg/ml, dok negativni kontrolni ADC nije. Ovaj rezultat pokazuje da anti-PTK7 ADC može inhibirati angiogenezu na specifiþan naþin.
Primer 16
Redukcija ûelija koje Iniciraju Tumor (TIC)
[0426] Da bi se utvrdilo da li leþenja konjugatima anti-PTK7 antitela-lek smanjuje uþestalost tumorskih üelija (TIC) kod tumora, tumori dojke BR13 TNBC leþeni su sa 4 mg/kg hu24-vc0101 ADC, 4 mg/kg kontrolnog IgG ADC ili 20 mg/kg hemoterapije docetakselom dva puta nedeljno u ukupno 3 doze (dani 0, 3 i 7). Žive, rezidualne üelije humanog tumora (odn. HESA<+>mCD45-mH-2Kd-) izolovane su iz razdvojenih tumora 10. dana i ponovo implantirane naivnim
14
životinjama u analizi graniþnog razblaženja (LDA). Rezultirajuüa incidencija tumora praüena je do 40 nedelja nakon transplantacije. Dan berbe tumora (dan 10) i serijska transplantacija izabrani su na osnovu toga kada su tumori poþeli da nazaduju nakon izlaganja hu24-vc0101. Tumori su razdvojeni i obojeni anti-humanim ESA, anti-mišjim CD45, i anti-mišjim H-2Kd antitelima. Tri tumora po leþenoj grupi su objedinjena, a žive üelije humanog tumora su sortirane protoþnom citometrijom. Grupama od 10 miševa ubrizgano je ili 293, 73, 37 ili 15 tumorskih üelija sortiranih iz kontrolnih IgG ADC tretiranih tumora; 159, 90, 40 ili 10 tumorskih üelija sortiranih iz tretiranih tumora hu24-vc0101; ili 257, 33 ili 15 tumorskih üelija sortiranih iz tretiranih tumora docetakselom. Tumori u miševa primalaca mereni su nedeljno, a tumori koji su prelazili 200 mm<3>kod miševa primalaca ocenjeni su kao pozitivni. Koristeüi Poissonovu statistiku distribucije, pomoüu softvera L-Calc (Stemcell Technologies, Vankuver, BC), ubrizgane üelijske doze primalaca sa i bez tumora do 40 nedelja nakon transplantacije korišüene su za izraþunavanje uþestalosti TIC nakon svakog leþenja.
[0427] Uþestalost TIC u tumora tretiranih hu24-vc0101 bila je 5.5 puta niža nego kod tumora leþenih kontrolnim IgG ADC (p = 0.0013; Tabela 38). Uþestalost TIC u tumorima leþenim docetakselom bila je 2.1 puta niža u odnosu na kontrolne tumore leþene IgG ADC (p = 0.09; Tabela 38). Ukratko, miševi injektirani sa tumorskim üelijama tretiranim sa hu24-vc0101 dosledno proizvode manje tumora od miševa kojima je ubrizgan sliþan broj kontrolnih IgG ADC tretiranih tumorskih üelija, što ukazuje da je leþenje sa hu24-vc0101 specifiþno smanjilo TICs.
Tabela 38. Uþestalost üelija koje iniciraju tumor (TIC) u modelu tumora BR13
14
14
1
11
12
1
14
�
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
�
�
1
1
11
12
1
��
1
1
1
1
1
1
11
12
1
14
1
1
1
�
1
�
11
��
�
��
1
1
1
1
1
2

Claims (2)

  1. Patentni zahtevi 1. Konjugat antitelo-lek formule: Ab-(L-D), pri þemu: Ab je antitelo koje sadrži teški lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 37 i laki lanac koji ima amino kiselinsku sekvencu navedenu kao SEQ ID NO: 47; i L je veznik, a D je auristatin, pri þemu veznik i auristatin imaju formulu:
  2. 2. Konjugat antitelo-lek prema zahtevu 1, pri þemu konjugat antitelo-lek ima odnos leka prema antitelu (DAR) od 1 do 8.
RS20210270A 2014-04-30 2015-04-27 Konjugati anti-ptk7 antitelo-lek RS61516B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461986520P 2014-04-30 2014-04-30
EP15774735.3A EP3137114B8 (en) 2014-04-30 2015-04-27 Anti-ptk7 antibody-drug conjugates
PCT/US2015/027791 WO2015168019A2 (en) 2014-04-30 2015-04-27 Anti-ptk7 antibody-drug conjugates

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61516B1 true RS61516B1 (sr) 2021-03-31

Family

ID=54249561

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210270A RS61516B1 (sr) 2014-04-30 2015-04-27 Konjugati anti-ptk7 antitelo-lek

Country Status (30)

Country Link
US (2) US9777070B2 (sr)
EP (2) EP3711780A3 (sr)
JP (2) JP6629837B2 (sr)
KR (2) KR102275513B1 (sr)
CN (1) CN106659801B (sr)
AR (1) AR100215A1 (sr)
AU (2) AU2015253422B2 (sr)
BR (1) BR112016025291A2 (sr)
CA (1) CA2947148C (sr)
CY (1) CY1124131T1 (sr)
DK (1) DK3137114T3 (sr)
ES (1) ES2856927T3 (sr)
HR (1) HRP20210292T1 (sr)
HU (1) HUE053287T2 (sr)
IL (1) IL248475B (sr)
LT (1) LT3137114T (sr)
MX (1) MX375284B (sr)
NZ (1) NZ725480A (sr)
PE (1) PE20170517A1 (sr)
PH (1) PH12016502142B1 (sr)
PL (1) PL3137114T3 (sr)
PT (1) PT3137114T (sr)
RS (1) RS61516B1 (sr)
RU (1) RU2708075C2 (sr)
SG (2) SG10201809628SA (sr)
SI (1) SI3137114T1 (sr)
SM (1) SMT202100146T1 (sr)
TW (1) TWI679022B (sr)
WO (1) WO2015168019A2 (sr)
ZA (1) ZA201607385B (sr)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SA112330278B1 (ar) * 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
RU2686085C2 (ru) * 2014-01-10 2019-04-24 Синтон Байофармасьютикалс Б. В. Конъюгаты антитело-лекарственное средство (adc) с дуокармицином, применяемые для лечения рака эндометрия
AU2015329625B2 (en) * 2014-10-10 2018-04-05 Pfizer Inc. Synergistic auristatin combinations
US11583593B2 (en) 2016-01-14 2023-02-21 Synthis Therapeutics, Inc. Antibody-ALK5 inhibitor conjugates and their uses
KR20210025522A (ko) 2018-06-25 2021-03-09 유니버시티 오브 워싱톤 강력하고 선택적인 인터루킨 모방체의 드 노보 디자인
JP7708662B2 (ja) 2018-10-24 2025-07-15 エフ・ホフマン－ラ・ロシュ・アクチェンゲゼルシャフト コンジュゲート化された化学的分解誘導物質および使用方法
CN113260384A (zh) 2018-11-05 2021-08-13 西纳福克斯股份有限公司 用于靶向表达trop-2的肿瘤的抗体缀合物
JP2022511390A (ja) 2018-11-20 2022-01-31 ユニバーシティ オブ ワシントン 分割インターロイキン模倣体およびその使用
WO2020256721A1 (en) * 2019-06-19 2020-12-24 Synthis, Llc Antib0dy-alk5 inhibitor conjugates and their uses
TW202208412A (zh) 2020-05-06 2022-03-01 瑞士商Ｃｒｉｓｐｒ治療公司 對酪胺酸蛋白激酶樣７（ｐｔｋ７）特異的經掩蔽的嵌合抗原受體和表現其的免疫細胞
WO2021224850A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Crispr Therapeutics Ag Mask peptides and masked anti-ptk7 antibodies comprising such
WO2021231762A2 (en) * 2020-05-13 2021-11-18 The Trustees Of Indiana University Combination therapy for the treatment of tnbc with a pi3k pathway inhibitor that targets pi3kdelta and pi3kgamma tnbc
EP4161565A4 (en) * 2020-06-05 2024-07-24 The Johns Hopkins University Humanized antibodies directed against kcnk9
US12605433B2 (en) 2020-07-16 2026-04-21 Uif (University Industry Foundation), Yonsei University Antibody specifically binding to PTK7 and use thereof
CN112394166B (zh) * 2020-11-09 2024-06-25 广东希格生物科技有限公司 六氟磷酸盐在制备抑制elisa反应基质效应的制剂中的应用
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
CN115894696A (zh) * 2021-08-18 2023-04-04 和迈生物科技有限公司 抗ptk7单域抗体及其应用
WO2023052541A1 (en) 2021-09-30 2023-04-06 Imcheck Therapeutics Combination of an anti-btn3a activating antibody and an il-2 agonist for use in therapy
CN114028579B (zh) * 2021-12-01 2023-09-05 中南大学湘雅三医院 核酸适配体-药物结合物PTK7-GEMs在制备治疗膀胱癌药物中的应用
IL315366A (en) 2022-03-23 2024-11-01 Synaffix Bv Antibody pairs for targeting PTK7-expressing tumors
CN119604535A (zh) * 2022-08-19 2025-03-11 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 Ptk7结合蛋白及其用途
US20260078201A1 (en) * 2022-09-06 2026-03-19 Uif (University Industry Foundation), Yonsei University Anti-ptk7 antibody, and use thereof
TW202421657A (zh) * 2022-10-14 2024-06-01 日商Ｊｓｒ股份有限公司 抗體或其片段、抗癌劑及抗癌用藥物組成物
CN119997983A (zh) 2022-10-14 2025-05-13 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 抗体药物偶联物及其制备方法和用途
CN115990264A (zh) * 2022-12-21 2023-04-21 中国科学院基础医学与肿瘤研究所(筹) 一种ptk7靶向核酸适体偶联药物
AU2024218327A1 (en) 2023-02-09 2025-09-25 Beone Medicines I Gmbh Self-stabilizing linker conjugates
CN118852442A (zh) 2023-04-26 2024-10-29 上海麦科思生物医药有限公司 抗ptk7抗体及其用途
CN121568721A (zh) 2023-06-29 2026-02-24 广州百济神州生物制药有限公司 生物活性缀合物、其制备方法和其用途
AR133125A1 (es) 2023-06-29 2025-08-27 Beigene Switzerland Gmbh Conjugados bioactivos, método de preparación y uso de estos
WO2025040588A1 (en) * 2023-08-18 2025-02-27 Oncoinvent As Monoclonal anti-ptk7 antibodies and derivatives
WO2025149667A1 (en) 2024-01-12 2025-07-17 Pheon Therapeutics Ltd Antibody drug conjugates and uses thereof
WO2025195180A1 (zh) * 2024-03-20 2025-09-25 上海华奥泰生物药业股份有限公司 Ptk7抗原结合蛋白及其应用
WO2025231037A1 (en) 2024-04-30 2025-11-06 Solve Therapeutics, Inc. Conjugates of anti-ptk7 antibodies
US12534529B1 (en) 2024-11-19 2026-01-27 Solve Therapeutics, Inc. PTK7-binding proteins
CN120501877A (zh) * 2024-11-20 2025-08-19 中国科学院杭州医学研究所 一种ptk7靶向核酸适体偶联药物及其新应用

Family Cites Families (93)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4671958A (en) 1982-03-09 1987-06-09 Cytogen Corporation Antibody conjugates for the delivery of compounds to target sites
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4970198A (en) 1985-10-17 1990-11-13 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
EP0216846B2 (en) 1985-04-01 1995-04-26 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US5037651A (en) 1987-01-30 1991-08-06 American Cyanamid Company Dihydro derivatives of LL-E33288 antibiotics
US5079233A (en) 1987-01-30 1992-01-07 American Cyanamid Company N-acyl derivatives of the LL-E33288 antitumor antibiotics, composition and methods for using the same
US5108912A (en) 1987-01-30 1992-04-28 American Cyanamid Company Antitumor antibiotics (LL-E33288 complex)
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9116610D0 (en) 1991-08-01 1991-09-18 Danbiosyst Uk Preparation of microparticles
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
DK0752248T3 (da) 1992-11-13 2000-11-13 Idec Pharma Corp Terapeutisk anvendelse af kimæriske og radioaktivt mærkede antistoffer mod humant B-lymfocytbegrænset differentieringsantig
US7744877B2 (en) 1992-11-13 2010-06-29 Biogen Idec Inc. Expression and use of anti-CD20 Antibodies
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
ZA955642B (en) 1994-07-07 1997-05-06 Ortho Pharma Corp Lyophilized imaging agent formulation
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
WO1997026885A1 (en) 1996-01-23 1997-07-31 The General Hospital Corporation Doing Business As Massachusetts General Hospital Benzophenothiazine and benzoporphyrin dye combination photodynamic therapy of tumors
GB9809951D0 (en) 1998-05-08 1998-07-08 Univ Cambridge Tech Binding molecules
EP1105427A2 (en) 1998-08-17 2001-06-13 Abgenix, Inc. Generation of modified molecules with increased serum half-lives
WO2000053211A2 (en) 1999-03-09 2000-09-14 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
US6309633B1 (en) 1999-06-19 2001-10-30 Nobex Corporation Amphiphilic drug-oligomer conjugates with hydroyzable lipophile components and methods for making and using the same
US6849425B1 (en) 1999-10-14 2005-02-01 Ixsys, Inc. Methods of optimizing antibody variable region binding affinity
WO2001062299A2 (en) 2000-02-28 2001-08-30 Shearwater Corporation Water-soluble polymer conjugates of artelinic acid
CA2445898A1 (en) 2001-05-01 2002-12-19 The General Hospital Corporation Photoimmunotherapies for cancer using photosensitizer immunoconjugates and combination therapies
US7321026B2 (en) 2001-06-27 2008-01-22 Skytech Technology Limited Framework-patched immunoglobulins
US6997863B2 (en) 2001-07-25 2006-02-14 Triton Biosystems, Inc. Thermotherapy via targeted delivery of nanoscale magnetic particles
US7771951B2 (en) 2001-12-03 2010-08-10 Amgen Fremont Inc. Antibody categorization based on binding characteristics
WO2003075957A1 (en) 2002-03-04 2003-09-18 Medimmune, Inc. The prevention or treatment of cancer using integrin alphavbeta3 antagonists in combination with other agents
GB0219776D0 (en) 2002-08-24 2002-10-02 Oxford Glycosciences Uk Ltd A protein involved in carcinoma
AU2003268345A1 (en) 2002-09-24 2004-04-19 The Burnham Institute Novel agents that modulate eph receptor activity
WO2004101756A2 (en) 2003-05-09 2004-11-25 Diadexus, Inc. Ovr110 antibody compositions and methods of use
CA2544074A1 (en) 2003-10-24 2005-05-06 Esbatech Ag Method for the identification and/or validation of receptor tyrosine kinase inhibitors
NZ579482A (en) * 2004-06-01 2011-02-25 Genentech Inc Antibody drug conjugates and methods
EP1778726A4 (en) 2004-08-16 2009-03-18 Medimmune Inc INTEGRIN ANTAGONISTS WITH IMPROVED ANTIBODY-DEPENDENT CELL-ASSAYED CYTOTOXICITY ACTIVITY
WO2006052409A2 (en) 2004-10-23 2006-05-18 Case Western Reserve University Peptide and small molecule agonists of epha and their uses
CA2604238C (en) 2005-04-15 2015-07-07 Neogenix Oncology, Inc. Recombinant monoclonal antibodies and corresponding antigens for colon and pancreatic cancers
EP1928912A4 (en) 2005-09-07 2010-02-24 Medimmune Inc EPH ANTI-RECEPTOR ANTIBODIES CONJUGATED TO TOXINS
EA017812B1 (ru) 2005-12-08 2013-03-29 Медарекс, Инк. Выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающий участок, которые связываются с протеинтирозинкиназой 7 ( ptk7) человека, и их применение
EP1973574B1 (en) 2005-12-30 2014-04-02 Institut Gustave Roussy Use of inhibitors of scinderin and/or of ephrin-a1 for treating tumors
TW200806685A (en) 2006-02-21 2008-02-01 Wyeth Corp Processes for the convergent synthesis of calicheamicin derivatives
US8343461B2 (en) 2006-03-08 2013-01-01 Wake Forest University Health Sciences Molecular signature of cancer
WO2007145901A1 (en) 2006-06-06 2007-12-21 University Of Tennessee Research Foundation Compositions enriched in neoplastic stem cells and methods comprising same
ES2987072T3 (es) 2006-09-07 2024-11-13 Scott & White Memorial Hospital Métodos y composiciones basados en conjugados de toxina diftérica-interleucina-3
KR101547705B1 (ko) 2007-05-22 2015-08-26 와이어쓰 엘엘씨 히드라지드의 개선된 제조 방법
WO2008149803A1 (ja) 2007-06-06 2008-12-11 The University Of Tokyo 表面抗原マーカーを用いた急性リンパ性白血病における癌幹細胞の分離同定方法
US9289492B2 (en) 2007-07-17 2016-03-22 The General Hospital Corporation Collecting ovarian cancer stem cells from ovarian cancer cells
WO2009043051A2 (en) 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
WO2009070767A2 (en) 2007-11-28 2009-06-04 Whitehead Institute For Biomedical Research Systemic instigation systems to study tumor growth or metastasis
CL2008003527A1 (es) 2007-11-30 2009-10-09 Medarex Inc Conjugado de anticuerpo o porcion de union de antigeno del mismo, que se une a la proteina tirosina quinasa 7 (ptk-7/cck4); composicion que lo comprende; acido nulceico cidificante del anticuerpo; vector y celula huesped; uso del conjugado para tratar o prevenir una enfermedad de celulas tumorales que expresan ptk7
WO2009116764A2 (ko) 2008-03-17 2009-09-24 연세대학교 산학협력단 Ptk7 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제
KR101123130B1 (ko) 2008-03-17 2012-03-30 연세대학교 산학협력단 Ｐｔｋ７ 단백질의 기능 저해를 통한 세포의 이동, 침윤 또는 혈관신생 억제제
US8197809B2 (en) 2008-06-25 2012-06-12 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology CD9-specific human antibodies
KR20110108390A (ko) 2009-01-12 2011-10-05 신텔렉트 인코포레이티드 레이저로 매개된 박막 절개 및 세포 군체의 이동
US20110020221A1 (en) 2009-04-09 2011-01-27 The Johns Hopkins University Cancer stem cell expression patterns and compounds to target cancer stem cells
EP2380909A1 (en) 2010-04-26 2011-10-26 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. PTK-7 protein involved in breast cancer
US20130061340A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
WO2013119964A2 (en) 2012-02-08 2013-08-15 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US9778264B2 (en) 2010-09-03 2017-10-03 Abbvie Stemcentrx Llc Identification and enrichment of cell subpopulations
EP2689787A1 (en) 2010-09-03 2014-01-29 Stem Centrx, Inc. Identification and enrichment of cell subpopulations
US20130061342A1 (en) 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2446895A1 (en) 2010-10-01 2012-05-02 Stemgen S.P.A. EPH receptor expression in tumor stem cells
CA2813411C (en) 2010-11-05 2016-08-02 Rinat Neuroscience Corporation Engineered polypeptide conjugates and methods for making thereof using transglutaminase
SA112330278B1 (ar) * 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
US8852599B2 (en) * 2011-05-26 2014-10-07 Bristol-Myers Squibb Company Immunoconjugates, compositions for making them, and methods of making and use
TWI495644B (zh) * 2011-11-11 2015-08-11 Rinat Neuroscience Corp 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途
CN104185477B (zh) 2011-11-17 2017-05-24 辉瑞公司 细胞毒性肽及其抗体‑药物缀合物
JP2015502397A (ja) 2011-12-23 2015-01-22 ファイザー・インク 部位特異的コンジュゲーションのための操作された抗体定常領域、ならびにそのための方法および使用
CN107753954A (zh) * 2012-12-13 2018-03-06 免疫医疗公司 功效改进且毒性降低的抗体与sn‑38的免疫缀合物的剂量
SG11201601424PA (en) 2013-08-28 2016-03-30 Stemcentrx Inc Site-specific antibody conjugation methods and compositions
EP3209334A2 (en) 2014-10-20 2017-08-30 Igenica Biotherapeutics, Inc. Novel antibody-drug conjugates and related compounds, compositions, and methods of use

Also Published As

Publication number Publication date
JP6629837B2 (ja) 2020-01-15
RU2016143119A3 (sr) 2018-11-29
IL248475A0 (en) 2016-12-29
PH12016502142B1 (en) 2021-05-05
US20180094075A1 (en) 2018-04-05
AU2015253422A1 (en) 2016-11-10
SG11201608953WA (en) 2016-11-29
US9777070B2 (en) 2017-10-03
KR102275513B1 (ko) 2021-07-08
AU2020281105A1 (en) 2021-01-07
US20150315293A1 (en) 2015-11-05
SMT202100146T1 (it) 2021-05-07
WO2015168019A2 (en) 2015-11-05
ES2856927T3 (es) 2021-09-28
SI3137114T1 (sl) 2021-11-30
JP2017514905A (ja) 2017-06-08
KR20170020753A (ko) 2017-02-24
HRP20210292T1 (hr) 2021-04-16
EP3711780A3 (en) 2020-12-09
KR20210040182A (ko) 2021-04-12
AU2015253422B2 (en) 2020-09-03
PE20170517A1 (es) 2017-05-18
AR100215A1 (es) 2016-09-21
CA2947148C (en) 2022-02-08
TWI679022B (zh) 2019-12-11
LT3137114T (lt) 2021-03-25
WO2015168019A3 (en) 2015-12-23
DK3137114T3 (da) 2021-01-25
EP3137114B8 (en) 2021-08-04
TW201625312A (zh) 2016-07-16
EP3137114B1 (en) 2020-12-23
JP2020055846A (ja) 2020-04-09
MX2016014247A (es) 2017-05-30
PH12016502142A1 (en) 2017-01-09
IL248475B (en) 2020-05-31
RU2016143119A (ru) 2018-05-30
RU2708075C2 (ru) 2019-12-04
CN106659801B (zh) 2019-12-10
MX375284B (es) 2025-03-06
PT3137114T (pt) 2021-02-26
HUE053287T2 (hu) 2021-06-28
EP3137114A2 (en) 2017-03-08
EP3711780A2 (en) 2020-09-23
KR102238032B1 (ko) 2021-04-08
PL3137114T3 (pl) 2021-06-28
CN106659801A (zh) 2017-05-10
NZ725480A (en) 2024-08-30
CY1124131T1 (el) 2022-03-24
ZA201607385B (en) 2022-05-25
BR112016025291A2 (pt) 2017-12-26
CA2947148A1 (en) 2015-11-05
SG10201809628SA (en) 2018-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US9777070B2 (en) Anti-PTK7 antibody-drug conjugates
JP7383682B2 (ja) 抗ｅｄｂ抗体および抗体－薬物コンジュゲート
TW201333036A (zh) 營養層細胞表面抗原（Ｔｒｏｐ－２）之專一性抗體類及彼等之用途
US20180296691A1 (en) Anti-efna4 antibody-drug conjugates
HK1235708B (zh) 抗-ptk7抗体-药物缀合物
HK40012788A (en) Anti-edb antibodies and antibody-drug conjugates
HK1235708A1 (en) Anti-ptk7 antibody-drug conjugates
HK1227320A1 (en) Anti-efna4 antibody-drug conjugates