RS61542B1 - Novi filter za cigarete koji sadrži alginit - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak se odnosi na filter cigareta. Posebno se ovaj pronalazak odnosi na nove filtere cigareta, u kojima se koriste materijali prirodnog porekla koji ranije nisu primenjivani u ovoj oblasti. Naročito se pronalazak odnosi na filter cigareta, koji se može koristiti za adsorbciju toksičnih komponenti dima cigareta, kao i za snižavanje oštećenja tkiva izazvanih dimom cigareta na respiratornim organima, kardiovaskularnom sistemu i mukozi. Naročito se pronalazak odnosi na filter cigareta koji sadrži alginit.

STANJE TEHNIKE

[0002] Pušenje duvana je rasprostranjena, štetna ljudska navika, za koju se zna da izaziva ozbiljnu i često nepovratnu zdravstvenu štetu. Trenutno je pušenje jedan od najzastupljenijih etioloških faktora koji doprinose develu – razvoju raka pluća i hroničnoj opstruktivnoj plućnoj bolesti (COPD). Zdravstvena šteta nastala pušenjem stvara ozbiljne socijalne i finansijske probleme širom sveta. Na primer, samo u zemljama EU preuranjena smrt više od 500.000 ljudi uzrokovana je štetnim efektima pušenja.

[0003] Pre oko 50 godina, kancelarija Američkog ministarstva zdravstva objavila je svoj prvi izveštaj o pušenju i zdravlju (Ministarstvo zdravlja, obrazovanja i socijalne zaštite SAD, 1964). U ovom izveštaju procenjeno je da prosečan pušač ima 9-10 puta veću šansu da razvije rak pluća u poređenju sa nepušačem, dok su teški pušači imali povećan rizik od oko 20 puta. Pored toga, u izveštaju se ističe da je pušenje primarni uzrok hroničnog bronhitisa i da postoji asocijacija između pušenja i emfizema, kao i sa kardiovaskularnim bolestima. Treba napomenuti da se hronični bronhitis i emfizem sada smatraju dva aspekta hronične opstruktivne bolesti pluća (COPD). U proteklih 50 godina Američka kancelarija ministarstva zdravstva objavila je brojne izveštaje o pušenju i zdravlju, od kojih se neki bave specijalizovanim temama, kao što su prestanak pušenja, pušenje tokom trudnoće i ekološki duvanski dim. Najnoviji izveštaj objavljen je 2014. godine - tačno 50 godina posle prvog izveštaja (Ministarstvo zdravlja i ljudskih usluga SAD, 2014).

[0004] U proteklih 50 godina, lista bolesti povezanih sa pušenjem se znatno proširila. Fokusirajući se samo na rak, sada postoje brojne vrste karcinoma povezanih sa pušenjem pored raka pluća, uključujući rak gornjeg respiratornog trakta (oropharynx, pharynx, trachea, i bronchus), rak želuca, rak jetre, rak bubrega, rak pankreasa, rak bešike, rak grlića materice, kolorektalni rak i akutni mijeloidni leukemija Štaviše, Američko ministarstvo zdravlja ukazuje na to da je možda čak 20 miliona Amerikanaca prerano umrlo u proteklih 50 godina zbog uticaja pušenja. S obzirom na očigledne štetne efekte pušenja, ublažavanje ovih efekata je ogroman zdravstveni problem, a sve mere koje se mogu preduzeti da bi se smanjio problem očigledno su vredne istrage. Bez sumnje, najbolje je da se prestane pušenje. Prednosti prestanka pušenja su dobro poznate (videti, na primer, Fagerstrom, 2002). Međutim, mnogo je pušača koji ili biraju da ne odustanu ili kojima je preteško da odustanu. Iako bi prestanak pušenja bio najefikasnija mera, upotreba nove tehnologije, kao što su novi filteri koji efikasno uklanjaju štetne konstituente dima, mogla bi značajno da smanji bolest povezanu sa duvanom. Kao posledica toga, sve mere koje se mogu preduzeti da se smanje zdravstveni efekti pušenja imaće značajnu korist. Bez pogovora, dodavanje filtera za cigarete je najočigledniji pokušaj ublažavanja zdravstvenih efekata pušenja putem modifikacije cigarete . Međutim, upotreba filtera nije bila naročito uspešna.

[0005] Jedan od najranijih predloga za dodavanje filtera cigareta nesumnjivo je dao Ernst Vajnder, epidemiolog koji je bio jedan od prvih naučnika koji je demonstrirao asocijaciju pušenja sa rakom pluća. U ranoj studiji koju je kao koautor Vajnder objavio 1988. je sagledala razliku između ove dve vrste pušača u odnosu na Rakberg I (KI) i Krejberg II (KII) karcinome. (Krejbergova nomenklatura je bila na snazi u to vreme, sa KI rakom pluća uključujući skvamni ćelijski karcinom pluća, veliki rak pluća ćelija i mali rak pluća ćelija, dok kiI rak pluća koji se sastoji samo od adenokarcinoma pluća.) Smanjenje od oko 45-50% je pronađeno i za muškarce i za žene u pogledu KI tumora, iako ni jedan ni drugi nisu bili statistički značajni, dok je kod muškaraca primećena samo slabija razlika i nema razlike kod žena za KI I tumore. Filteri za cigarete postali su izuzetno popularni u drugoj polovini 20. veka, a približno 0,5 odsto cigareta prodatih sa filterima 1950. godine se povećavalo na 88,5 odsto 1976. u SAD (Nacionalni institut za zloupotrebu droga, 1977). Trenutno blizu 100 odsto cigareta koje se prodaju širom sveta su filter cigarete. U istom vremenskom periodu kada je upotreba filtera rasla velikom brzinom u SAD (1950-1976), mašinski izmerene isporuke ponderisane cigarete ponderisane prodajom smanjile su se sa 37 na 16 mg (Hoffmann D et al., 1996). Smanjenje isporuke katrana u ovom periodu bilo je posledica dva trenda. Prvi je, kao što je gore napomenuto, jednostavno nagli porast upotrebe filtiranih cigareta. Drugi je, međutim, bio posledica povećanja efikasnosti filtera tokom vremena. Filter za cigarete je konceptualno prilično jednostavan, sastoji se od poroznog utikača datog materijala koji može da apsorbuje i katran cigarete i gasnu fazu. Iako su neki rani filteri koristili papirna vlakna kao materijal za upijanje, trenutno velika većina filtera koristi celuloza acetatna vlakna. Filter je, dakle, jednostavno papirna cev ispunjena celulozom acetatom koji se pričvršćen za cigaretu pomoću prevlačenja. Povećanje efikasnosti može se postići kako povećanjem mase celuloze acetatom u filteru, tako i smanjenjem prečnika filamenta. Oba ova pristupa se, međutim, mogu uzeti samo do sada, jer je na kraju otpor cigarete da postane dovoljno veliki proizvod neprihvatljiv za potrošača. Pristup koji su usvojile praktično sve duvanske kompanije za rešavanje ovog problema bio je uvođenje perforacija u prevlast filtera. Tako pušač udiše mešavinu vazduha i dima. Ventilacione rupe smanjuju otpornost na vučenje, a uzimanjem vazduha kao i dima dim se razblažuje i smanjuje se isporuka birača dima. Što je veći obim ventilacije, veća je količina vazduha i manja količina dima koji udiše pušač. Iako se većina stručnjaka slaže da filtrirana cigareta barem donekle smanjuje rizik od pušenja u poređenju sa nefiltriranom cigaretom, cigarete sa niskim sadržajem katrana, kako su ih nazivali, koje smanjuju isporuku katrana čak i niže nego što bi to mogao postići uobičajeni filter za cigarete nije izgledalo da dovodi do zdravstvene koristi. Ovaj zaključak zasnovan je i na podacima stanovništva i na epidemiološkim studijama. Predstavljeni su znatni podaci koji dokumentuju činjenicu da pušači značajno kompenzuju kada puše "nisku katransku cigaretu" bilo da bi održali nivo nikotina ili nivo ukusa, čime se povećava stvarna isporuka dima iznad prinosa koji meri mašina. Pored toga, brojni naučnici izrazili su zabrinutost da bi pušač mogao namerno ili nenamerno da blokira rupe za ventilaciju, čime bi se takođe značajno povećala isporuka dima (Ministarstvo zdravlja i ljudskih usluga SAD, 2001). Jedan od opipljivih rezultata tih zabrinutosti je da paklica cigareta više ne sme da nalaže prinose katrana i nikotina u barem SAD i E.U. Uprkos ovim pitanjima, možda će i dalje biti moguće razviti nove filtere koji mogu da smanje zdravstvene efekte pušenja, posebno ako takvi filteri mogu da se razviju bez potrebe za ventilacijom filtera. Takvi filteri mogli bi da budu dizajnirani da selektivno uklone specifičnu fazu gasa i polupostabilne komponente dima koje zabrinjavaju. Važno je napomenuti da se dim sastoji od gasne faze, polupostajanosti i čestica faze. Konstituenti za koje postoje dokazi u pogledu zdravstvenih efekata mogu se naći u sve tri faze. Ne postoji trenutna tehnologija koja omogućava selektivnu filtraciju komponenti čestica faze; međutim, i faza gasa i polu-nestabilne komponente mogu selektivno da se filtriraju. Odličan primer takvog filtera koji je trenutno u komercijalnoj upotrebi je filter ugljenika. Praktično celokupno japansko tržište sastoji se od cigareta filtriranih ugljenikom, dok oko 50 odsto južnokorejskih pušača koristi ove proizvode. Napravljen je niz drugih tehnoloških pomaka u razvoju filtera, ali ništa od toga trenutno nije u značajnoj komercijalnoj upotrebi. Trenutno je filter segment integrisan direktno u cigaretu na kraju usta, tako da dim cigareta mora da prođe kroz filter pre ulaska u vazdušni put i pluća. Trenutno samo 3% svih cigareta na svetu prodaje bez filtera. Iako se količina štetnih materija koje dopiru do pušača može smanjiti filterima za cigarete, to se generalno postiže jednostavnim smanjenjem količine dima koji stiže do usta kraja cigarete. U većini slučajeva nema mnogo selektivne filtracije. Tako su istraživači veoma zainteresovani za konstruisanje filtera za cigarete, koji selektivno može da ukloni određene konstituente opasnog dima kako bi se smanjile zdravstvene posledice pušenja.

[0006] Dim cigareta sadrži mnoge reaktivne čestice kao što su niska molekularna težina ugljeničnih jedinjenja, slobodni radikali, kinoni, vodonik cijanid, azotni oksidi i aromatični amini, koji su veoma toksični, mutagenski i kancerogeni. Stoga selektivno snižavanje količine ovih supstanci u dimu cigareta može smanjiti zdravstvene rizike izazvane pušenjem.

[0007] Vladini propisi sve češće zahtevaju veću efikasnost filtracije kako bi se smanjila količina duvanskog dima koji se isporučuje pušaču. Koristeći trenutno dostupne filtere acetat celuloze, neka se može postići selektivnošću dopingovanja filtera sa povećanom koncentracijom čestica kao što su aktivirani ugljenik ili druge prirodne supstance koje se javljaju. Međutim, sve veće promene u koncentraciji čestica privlače karakteristike vučenja dima kod pušača. Još više, aktivne čestice ugljenika u filteru doprinose smanjenju količine štetnih nestabilnih supstanci u dimu cigareta ali zbog nedostatka neiskorišćenih elektrona ne mogu da obezbede potreban plus elektron da upotpune nesparene elektrone slobodnih radikala. Stoga, ugljenik nije pogodan za suprotstavljanje slobodnom radikalnom uticaju na razna tkiva, koja doprinose zapaljenju i drugim štetnim procesima u organizmu izazvanim dimom cigareta.

[0008] Jedno važno svojstvo cigarete je enkapsulirani pad pritiska. Termin "enkapsulirani pritisak "drop" ili "EPD" odnosi se na statičnu razliku pritiska između dva kraja cigarete kada je pređen protokom vazduha pod stabilnim uslovima. Veće vrednosti EPD-a prevode se na to da pušač mora da vuče na uređaju za pušenje sa većom silom.

[0009] S obzirom da povećanje konvencionalne efikasnosti filtera povećava EPD filtera, javnost, a samim tim i proizvodnja, sporo usvajaju ove proizvode. Stoga i dalje postoji interesovanje za razvoj unapređenih i efektivnijih filtera koji minimalno utiču na vučne karakteristika cigareta uz istovremeno uklanjanje višeg nivoa određenih konstituenata u mejnstrim duvanskom dimu kao što su gore navedeni konstituenti kao i ugljen-monoksid i fenoli.

[0010] Najčešći filer koji se koristi u proizvodnji filtera za cigarete je celuloza acetat koji ima stepen zamene od oko 2,5 acetatnih grupa po jedinici hidroglukoze. Tokom proizvodnje, acetatni polimer se obično ekstrudira kao vuča od vlakana i meša se sa jednim ili više plastičara (npr. triacetin, polietilen glikol, glicerin). Celulozni acetat u procesima je opisan, na primer, u U.S. Pat. No.2,953,838 to Crawford et al. and U.S. Pat. No. 2,794,239 to Crawford et al. Razne tečnosti mogu da se ubrizgaju u multifilamentnu vlakna koja se koriste u proizvodnji filtera za duvanski dim. Ove tečnosti, koje se mogu koristiti u vuči samostalno ili u kombinaciji sa tečnim ili gasovitim nosačima, mogu biti arome, agenti cvetajuce vuče, maziva, rastvori za određivanje veličine, završne smeše, plastifikatori ili slično. Takve tečnosti su namenjene da se željene fizičke ili karakteristike ukusa pretoče u dim cigareta putem vuča od vlakana tretiranu tečnošću. Procesi ubrizgavanja tečnosti su postavljeni, na primer, u U.S. Pat. br.5.387.285 do Riversa.

[0011] Ćelijska acetatna vlakna koja čine filter element obično su premazana sastavom završnice vlakana. Takvi sastavi su generalno emulzije na bazi vode koje se sastoje od više komponenti. Svaka komponenta može da služi određenoj funkciji tokom obrade vlakana ili tokom naknadne upotrebe filtera formiranog od vlakana. Tipične komponente sastava završne obrade vlakana uključuju podmazivanje ulja kako bi se smanjilo trenje tako da vlakna mogu da se obrade bez razbijanja, anti-statički agensi za smanjenje statičkog nagomilavanja vlakana i emulzifikatori da inhibiraju fazno odvajanje u formulaciji vlakana tokom obrade. Druge pomoćne komponente mogu da uključuju anti-mikrobiološke agense, hidrofilne agense ili druga reaktivna jedinjenja. Nakon montaže vlaknastog šlepa u materijal spremljen za filter, mogu se primeniti plastičari koji omekšavaju vlakna i omogućiti formiranje među-vlaknastih veza kako bi se filter stvrdnuo do željene tvrdoće/ konzistencije. Površinska hemija celuloze acetat i plastelizera može da obezbedi ukus dima koji pušači široko žele i prihvataju. Određeni drugi dizajni filtera/formulacije mogu da obezbede drugačiji ukus dima. Do danas, filteri za vunu bez celuloze generalno nisu prihvaćeni niti su naišli na komercijalni uspeh.

[0012] Stanje sadrži nekoliko publikacija koje se odnose na filtere cigareta i razna poboljšanja koja se tamo primenjuju.

[0013] W02013/1869838 otkriva filter cigarete koji se sastoji od filterskog utikača koji sadrži celulozu ester stegnute vlakna, kašu i alkalnu metalnu so anioničnog polimera rastvorljivog u vodi. Utikač za filter ima alkalni metalni sadržaj od 2 do 100 limota po gramu utikača filtera. Anionični polimer rastvorljiv u vodi može da sadrži najmanje jednog člana izabranog iz grupe koja se sastoji od poliakrilne kiseline i polisaharida koji ima grupu karboksila.

[0014] Japanski patent br. 3677309 otkriva materijal filtera za cigarete u obliku lista koji ima papirnu strukturu i sastoji se od neprikosnobanog celuloznog esternog vlakana i utučene kaše, gde utučena kaša ima stepen prebijanja Šoper-Riegler slobodnosti od 20 do 90°SR, a neprikosnovena celuloza ester štep vlakana je štepno vlakno koje ima prosečnu dužinu vlakana od 1 do 10 mm i finoću od 1 do 10 deniera. Ovaj dokument otkriva da u pripremi lima postoji povez (na primer, adhesiv rastvorljiv u vodi) povez može biti upotrebljen pod uslovom da nema negativne zdravstvene efekte, niti smanjuje ukus i palatabilnost duvanskog dima, niti može dovesti do dezintegracije filter materijala. Generalno, količina poveznika je po mogućstvu što je manja moguća (na primer, ne više od 10% po težini u ukupnoj težini materijala). Primer u ovom dokumentu opisuje materijal lista formiran od neprikosnovenog celuloznog acetatnog štepa i utabanu kašu procesom proizvodnje vlažnog papira, koji je potom prskan akustimulasnim rastvorom karboksimetil celuloze (3% po težini na suvoj težini).

[0015] Japanska prijava patenta sa publikacijom br. 7-75542 otkriva cigaretni filter koji sadrži vuču od celuloznog estarskog vlakna i vodorastvorni polimer koji je sadržan u vuči od vlakana pri čemu je vuča od vlakana prerađena u filter štap koji koristi najviše 25 težinskih delova vode u odnosu na 100 po težini vuče. Primeri u ovom dokumentu uključuju vrh filtera za cigarete koji se dobija dodavanjem 5% mase natrijumove soli karboksimetil celuloze kao vodorastvornog polimera u otvorenu vuču od celuloznih acetata nabijenih vlakana i puštanje otvorene vuče u mašinu za umotavanje da omota otvorenu vuču sa omotom filtera.

[0016] Japanska prijava patenta sa publikacijom br.8-322539 (patentni dokument 3, JP-8-322539A) otkriva filter za cigarete koji sadrži netkano platno koje se sastoji od celuloznog estra i veziva koje dobro dispergira u vodi, pri čemu se netkani materijal umotava gore u oblik štapa. Primeri u ovom dokumentu uključuju čep za filter proizveden duvanjem sito žice celuloznim acetatnim osnovnim vlaknima protokom vazduha za laminiranje ili taloženje i prskanjem laminatne materije na žicu sa 10 težinskih% 5% vodenog rastvora karboksimetila celuloze, presovanjem i sušenjem vlažnog laminata, podvrgavanjem nastalog netkanog materijala obradi krep-valjkom, a zatim umotavanjem tkanine.

[0017] Mdjunarodna objava br. WO 2014/164492 se odnosi na filtere za dim koji smanjuju koncentraciju ugljen-monoksida i fenola u dimnom potoku. Rekli su da filteri uključuju porozan masovni deo koji se sastoji od višestrukosti aktivnih čestica, pluraliteta čestica poveznice i aktivnog premaza koji se odlaže na najmanje deo aktivnih čestica i čestica poveznice, gde su aktivne čestice i čestice poveznice povezane u pluralitetu kontaktnih tačaka; i odeljak sa filterima. U nekim slučajevima, filter može da sadrži poroznu masu koja se sastoji od pluraliteta aktivnih čestica i višestrukosti čestica poveznice, pri kojoj su aktivne čestice i čestice poveznice povezane u pluralitetu kontaktnih tačaka bez adheziva; i odeljak filtera koji se sastoji od aktivnog dodatka. Iako ovaj filter za dim može dati poboljšane rezultate, njegova priprema je prilično komplikovana i materijali koji se koriste za postizanje željenog efekta filtriranja su skupi.

[0018] Visoko efikasan filter cigareta opisan je u WO 2010/125412. Filter za cigarete se sastoji pored uobičajenih komponenti filtera za cigarete pseudoboehmita (A100H). H20), i komponente grožđa, astaksantina i brusnica kao antioksidans. Prednost filtera za cigarete je takođe Povoljan efekat filtera za cigarete je takođe posledica upotrebe komponenti grožđa u koštici grožđa i obliku zrna kože. US2003168071 otkriva mineralne apsorpcione zeolit i/ili ugljenik u filteru za filtriranje duvanskog dima.

[0019] HU189383 opisuje proces za vezivanje gasova koji se emituju iz truljenja organskih materija.

[0020] Kao što je gore pomenuto, dobro je poznato da je pušenje glavno pitanje javnog zdravlja i važan etiološki faktor koji doprinosi razvoju raka pluća i hronične opstruktivne plućne bolesti. Stoga bi identifikovanje novih tehnika za smanjenje bolesti pluća izazvanih cigaretama bilo od velike koristi.

[0021] U skladu sa tim, cilj sadašnjeg pronalaska je da se obezbedi filter za cigarete, koji ima prednosti rešenja koja već pripadaju struci, ali istovremeno eliminiše njihove mane u najboljoj mogućoj meri. Dodatni cilj Sadašnjeg pronalaska je da se obezbedi filter za cigarete koji dodatno smanjuje štetan sadržaj dima cigareta u poređenju sa poznatim filterima cigareta.

[0022] Iznenađujuće je da je utvrđeno da se ciljevi pronalaska mogu uspešno postići, ako se prirodna supstanca, alginit, koja se ranije ne koristi u tu svrhu, primenjuje u filteru za cigarete.

[0023] Naši eksperimenti su pokazali da se značajno smanjenje količine štetnih materija u dimu cigareta, u poređenju sa trenutnim filterima, može realizovati ako se alginit koristi u filterima.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0024] Ovaj pronalazak odnosi se na filter cigareta, što dodatno smanjuje štetan sadržaj dima cigareta u poređenju sa poznatim filterima cigareta. Pomenuta povoljna svojstva su posledica upotrebe alginita u filterima cigareta. Alginit se može koristiti sam ili u kombinaciji sa drugim supstancama, koje se već koriste u filterima cigareta.

[0025] Alginite je taloženi kamen koji se sastoji od biomase algi i tufe, vulkanske prašine raščlanjene glinom. U jezerima Karpatskog basena intenzivna vulkanska aktivnost dogodila se u Pliocenu pre nekih 3-5 miliona godina. Ova aktivnost stvorila je poznate bazaltne planine, istovremeno formirajući i specijalne prstenove tufe. Nakon prestanka vulkanske aktivnosti prstenovi tufe su bili poplavljeni vodom formirajući tako eksplozijska jezera (maars). Voda eksplozijskih jezera bila je zagrejana termalnim izvorima, a vreli rastvori koji su se tu nalazili obogatili su vodu mikroelementima, mineralnim solima i drugim hranljivim sredstvima. Elementi u mineralnim koloidima koji su rezultat razgradnje staklenog materijala vulkanske tufe dodatno su obogatili hranljiv sadržaj jezera eksplozije. U mirnim vodama eksplozijskih jezera velike količine algi (posebno zelene alge Botriococcus braunii) i drugih plutajućih životinjskih ili biljnih organizama su se nagomilale. Nagomilani biljni i životinjski organizmi su uginuli i pomešali se sa ožiljcima lišća i anterdusta opranim od guste vegetacije obale i deponovanim na dnu eksplozicijskih jezera. U anoksičnom okruženju zajedno sa raspadnutim tufama i drugim mrtvim planktonskim organizmima akumulirali su se kao raspadajuće (sapro-pel) blato. U siltacionoj fazi eksplozicijskih jezera tela većih životinja uvedena su u toplo blato, a kao rezultat toga blato je obogaćeno fosfornim materijalima. Ova osiromašena i očvrsla biomasa prošla je kroz specifične fizičke i hemijske promene tokom nekoliko miliona godina i formirala se u sadašnjem obliku: kamenu alginitu.

[0026] Alginit je zemljani kamen koja ima glinenu strukturu koja se sastoji od povremeno odvojivih lamela nalik lišću. Alginite nema toksičan efekat (pogledajte Dr. Solti Gabor: Az Alginit. Ismerteto tanulmany. Az Alginit a Mezogazdasagert es KOrnyezetvedelemert Alapitvany tevekenysege (1993-2013) 2014). Njena boja je rezedo (zelena) ili siva ponekad se pretvara u oker. Njena struktura lamele može se bolje videti putem isušivanja, a često se biljni otisci ili biljni otisci mogu naći između lamela.

[0027] Njeno najvažnije fizičko svojstvo je da može da veže 0,5-1,01 vodu po kilogramu. Alginit se sastoji od 80-90 % gline i sitnih razlomaka, sa taloženjem koje sadrži grube čestice blizu obale. U poslednjoj fazi siltacionih kratera (laguna) sadržaj organskih materijala se smanjio i sadržaj bentonita se povećao. Sastav alginita pokazuje visoku devijaciju u uzorcima uzetim sa istih lokacija. Prosečan humus sadržaj je 30 odsto, dostižući povremeno 45 odsto. Prosečan sadržaj kreča (u obliku CaCO3) je 33%, povremeno dostiže 40%. Dokazano je da fosilna biomasa sadrži 64 elementa. To znači da je alginit posebno bogat makro- i mikroelementima, sa najvažnijim elementima na sledeći način: azotom (N): 0,5%, fosforom (u P2O5 obliku): 0,6%, kalijumom (u K2O obliku): 0,9%, magnezijum (Mg): 1,0%. Tipične mineralne komponente su montmorillonite, ilit, dolomit, kalcit, arag- onte, kvarcni gips, plagio-klaud, siderit, magnezit, pirit i ortoklaza. Pored navedenih važniji mikroelementi su gvožđe (Fe), mangan (Mn), bakar (Cu), cink (Zn), kobalt (Co), nikl (Ni), litijum (Li), titanijum (Ti), hrom (Cr) i kadmijum (Cd). Jedna od posebnih karakteristika humus sastojaka je njen biohemijski rast biljaka koji pospešuje efekat. Kada se alginit koristi u poljoprivredi humičke kiseline vrše enzimski i takođe hormonski pospešujući efekat, i - kroz regulaciju sposobnosti apsorbovanja vode korena - takođe indirektno pospešuje efekat na rast biljaka.

[0028] Alginit pronalazi široku upotrebu u razne svrhe. U biljnom i voćnom uzgoju alginit se može koristiti za amelioraciju. Njegova jednostruka upotreba povećava plodnost zemljišta za 20-30 % u prvoj godini. Zbog svojih glinenih minerala, veštačko đubrivo mora da se koristi na višem nivou, stoga se povećava prenos fosfora, azota i kalijuma iz tla u podzemne vode, reke i jezera. Njegov efekat traje 4-6 godina. Alginit je prirodni materijal, zadržava svoj kvalitet neograničeno, ne može se preterano koristiti i još viši nivoi upotrebe nemaju nikakve negativne efekte. Alginit se takođe može koristiti kao baštensko zemljište u obliku mešavine. Pripremljeni su i drugi prirodni materijali kao što su zeolit, perlit, peat ili bazalt, bez agensa, visoko efikasne mešavine zemljišta. Upotreba alginita rezultira povećanjem kvantiteta i kvaliteta prinosa u uzgajanju olitora i ukrasa bilo u bašti ili u politunelima pri žetvi. Alginit se takođe može koristiti kao starter u sadnji rupa od šumskih vrsta drveća. Upotreba alginita rezultira kvantitativnim rastom od 6-13 odsto i 20 odsto bržim rastom. Prskanje vešanjem alginitom na jesen ima efekat zaštite biljaka i pomaže u hibernaciji drveća, dok prolećno prskanje pruža zaštitu od štetočina. Kao rezultat prskanja alginita, povećava se sadržaj mangana, gvozdenog cinka i bakra biljaka, dok sadržaj kalcijuma u plodovima obezbeđuje više ukusa i duži vek trajanja. U stočarstvu alginit u kombinaciji sa tečnim đubrivom obezbeđuje veoma efikasan proizvod za upotrebu kao komplementarni tretman organskog đubriva, ili za zamenu istog. Alginit smanjuje period degradacije đubriva i može se kombinovati sa drugim hranljivim materijama. Admiksing alginit sa smećem rezultira znatnijim đubrivom i pospešuje rast domaćih životinja i živine. Alginit takođe vrši ekološke zaštitne efekte. Zbog svojih visokih adsorptivnih afiniteta, efikasno vezuje mirise životinjskih štala i smanjuje koncentraciju SO2i NH3u vazdušnom prostoru (pogledajte na primer mađarski patent br.189.383: "Proces vezivanja gasova sa neprijatnim mirisom proizveden rastvaranjem organskih materijala i za proizvodnju organskog đubriva sa visokom efikasnošću").

[0029] Ljudska upotreba alginita uključuje njegovu upotrebu kao blato za probleme sa zglobovima, reumatikom i sportom, a takođe ima prednost u formiranju u mast protiv reume. Alginite je takođe koristan protiv proširenih vena i psorijaze i takođe se mogu koristiti za regeneraciju kože i opšte poboljšanje statusa kože. Dalje, alginit se takođe može koristiti kao baza za medicinske osveživače.

[0030] Alginite se može naći u Mađarskoj i komercijalno je dostupan od strane brojnih mađarskih firmi, na primer Gerce-Alginit Kft, (Gerce, Mađarska).

[0031] Iznenađujuće, sada je utvrđeno da je alginit efikasan u novom tehničkom polju. Naše studije dokazuju da je alginit posebno efikasan kada se koristi samo u filterima cigareta ili u kombinaciji sa drugim poznatim komponentama o kojima se govori u nastavku. Neočekivano, utvrđeno je da je upotreba alginita u filterima cigareta rezultirala znatno manje reaktivnim vrstama kiseonika (ROS) u pljuvačci, znatno manjom formacijom ROS-a u serumu krvi, manjim oštećenjima endotelija, manjim oštećenjem epitela pluća, znatno većim nivoom glutiona, manjim oštećenjima plućnih tkiva i manjim upalama pluća

[0032] Upotreba alginita izaziva znatno manje reaktivne vrste kiseonika (ROS) u pljuvački. Iako i sama pljuvačka ima određenu koncentraciju slobodnih radikala, dim cigareta uzrokuje povećanje nivoa slobodnih radikala. Procenjuje se da postoji više od 1014 slobodnih radikala po oblaku dima cigareta (Crkva i Prajor, 1985; Church DF, Prayor WA, "Free-radical chemistry of cigarette smoke and its toxicological implications," Environ Health Perspect, 1985, 64:111-26). S obzirom na to da slobodni radikali mogu da komuniciraju sa brojnim organskim supstratima za proizvodnju ROS-a, nije iznenađujuće da dim cigareta povećava nivo ROS-a u pljuvačci. Međutim, pored radikala sadržanih u dimu cigareta, značajno radikalno formiranje kao i direktna proizvodnja ROS-a mogu nastati iz zapaljivog odgovora izazvanog dimom cigareta, što dovodi do povećanja nivoa neutrofila i makrofaga. (Mesner i Bernhard, 2014; Mesner B, Bernhard D, "Pušenje i kardiovaskularne bolesti. Mehanizmi endotelialne disfunkcije i rane aterogeneze", Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2014, 34:509-15). Izmerili smo antioksidativni kapacitet netretirane pljuvačke naših volontera, koji su potom popušili jednu cigaretu, nakon čega je njihova pljuvačka ponovo prikupljena. Izmerili smo promenu nivoa antioksidativnog kapaciteta u pljuvačci koristeći dim iz kontrolne cigarete. Istu vežbu smo ponovili sa različitim filterima koji sadrže samo mono alginit i u četiri različite kombinacije alginita sa - kožice grožđa i semena (GSS), alginita - specijalnog Al oksida, alginita - zeolit alginita - ugljenika istih filtera u 50-50% mešavine. Svi kombinovani filteri sa alginitom proizveli su znatno manji pad antioksidativnog kapaciteta u pljuvačci u poređenju sa kontrolnim filterom. Samo Alginit proizvodi značajnu razliku u antioksidativnom kapacitetu u poređenju sa kontrolom, ali sve kombinacije cigareta su prošle znatno bolje od samog alginita, što je jasan dokaz da alginit i kombinacijski partneri deluju sinergično.

[0033] Upotreba alginitnog filtera izazvala je znatno manje formira ROS-a u krvnom serumu. Eksperiment koji je pokazao da je ovo sličan eksperiment pljuvačke, ali je sproveden sa krvnim serumom. Sam serum ima određenu koncentraciju slobodnih radikala. Iako sam serum ima određenu koncentraciju slobodnih radikala, dim cigareta uzrokuje povećanje nivoa slobodnih radikala. Procenjuje se da ima više od 1014 slobodnih radikala po oblaku dima cigareta (Crkva i Prajor, 1985). S obzirom na to da slobodni radikali mogu da komuniciraju sa brojnim organskim supstratima za proizvodnju ROS-a, nije iznenađujuće da dim cigareta smanjuje antioksidativni kapacitet seruma. Međutim, pored radikala sadržanih u dimu cigareta, značajno radikalno formiranje kao i direktna proizvodnja ROS-a mogu nastati iz zapaljivog odgovora izazvanog dimom cigareta koji dovodi do povećanog nivoa neutrofila i makrofaga. (Messner and Bernhard, 2013). Izmerili smo antioksidativni kapacitet nelečenog seruma. Onda smo koristili našu mašinu za pušenje da kanališemo ceo dim cigareta kroz cev seruma. Izmerili smo promenu antioksidativnog kapaciteta u serumu koristeći dim iz kontrolne cigarete. Istu vežbu smo ponovili sa različitim filterima koji sadrže samo mono alginit i kombinaciju alginita sa četiri različita filcit materijala, npr. alginit – ljuska grožđa i seme (GSS), alginit - specijalni Al oksid, alginit - zeolit, alginit - ugljenik istih filtera. Svi filteri koji sadrže alginit proizveli su znatno manji pad antioksidativnog kapaciteta u serumu u poređenju sa kontrolnim filterom.

[0034] Upotreba alginita proizvela je dim koji je prouzrokovao manje endotelialne štete. Ćelije koje poređaju unutrašnju površinu krvnih sudova nazivaju se endotelialne ćelije. Ove ćelije imaju važnu ulogu u zaštiti ovih sudova. Jednom kada se endotelijum ošteti, koji se često naziva endotelialnom disfunkcijom, povećavaju se rizici za kardiovaskularne bolesti. Pošto dim, prilikom izlaska iz pluća kroz alveole, ulazi u krvotok, dolazi do izlaganja endotelijuma dimu i u početku dovodi do endotelialne disfunkcije, dobro poznato kao ključni prvi korak u razvoju pušenjaPovezane kardiovaskularne bolesti (Ambose i Barua, 2004; Ambrose JA, Barua RS, patofiziologija cigareta i kardiovaskularnih bolesti. Ispravka," J. Am Coll Cardiol, 2004, 43:1731-7; Messner and Bernhard, 2014). Merimo oštećenja endotelialnih ćelija koja nastaju kada se endotelialne ćelije izložene punom dimu porede sa nelečenim ćelijama. Znatno manje oštećenja ćelija javljaju se kada je ista linija ćelija izložena alginitnom filtriranom dimu ili dimu filtriranom kombinacijom koja sadrži alginit.

[0035] Upotreba alginita takođe je rezultirala dimom koji je prouzrokovao manje oštećenja epitela pluća. Epitel pluća je prva linija odbrane u odnosu na udisane toksine. Poznato je da su alveolarne epitelne ćelije u plućima oštećene izlaganjem dima do i uključujući smrt ćelija (Kosmider et al., 2011; Kosmider B, Messier EM, Chu HW, Mason RJ, "Human alveolar epithelial cell injury induced by cigarette smoke," PLoS One, 2011, 6:e26059), što je dokazano padom zdravog broja ćelija u poređenju sa nelečenim ćelijama. Alginit koji sadrži filtrirani dim izazvao je znatno manje smanjenje broja zdravih ćelija u poređenju sa kontrolnom cigaretom. Pošto nekrotične ćelije epitela luče proteine u pluća koja pokreću upalu, što eventualno može dovesti do raka pluća ili COPD-a, štiteći epitet od strane filtera koji sadrže alginit i kombinaciju četiri različita filciona materijala uparena sa koščicama i ljuspicama grožđa (GSS), alginitom - specijalnim Al oksidom, alginitom - ugljenik istih filtera je očigledno zdravstvena korist za pušače.

[0036] Nivo glutationa je takođe bio znatno veći sa alginit filtriranim dimom cigareta u poređenju sa kontrolnom cigaretom. I epitealne i endotelialne ćelijske linije bile su izložene kontroli cigareta i alginita i kombinaciji alginita sa – koščice i ljuspice grožđa (GSS), alginita - specijalnog Al oksida, alginita - ugljenika istih filtera, takvog alginita koji sadrži filtrirane cigarete celog dima. Određivanje nivoa glutathiona ukazalo je na znatno veći nivo glutationa u ćelijama izloženim dimu iz alginit filtriranih cigareta u poređenju sa kontrolnom cigaretom. S obzirom na to da je dobro poznato da glutation štiti od oksidativnog stresa (Rahman i MacNee, 2000; Rahman I, MacNee W, "Oxidative stress and regulation of glutathione in lung inflammation," Eur Respir J, 2000, 16:534-54), to znači da alginit koji sadrži filtere bolje štiti autohtoni odbrambeni mehanizam pluća od oksidativnog stresa tkiva pluća nego kontrolna cigareta.

1

[0037] Alginite filtrirani dim izazvao je manje oštećenja u plućnim tkivima i izazvao manje upale u poređenju sa kontrolom dima cigareta. Trodimenzionalno plućno tkivo, označeno kao sferoidi, izgrađeno je iz ljudskih ćelija sa poznatim profilom, tačnije epitetnim ćelijama pluća, fibroblastima, endotelialnim ćelijama i makrofagama. Trodimenzionalna konstrukcija omogućava ćelijama da razviju funkcionalnu organizaciju, sličnu onoj koja se nalazi u njihovim in vivo kolegama.3D modeli nude mnogo bolji eksperimentalni model za simulaciju in vivo okruženja od konvencionalnih monokulturno-monoslojnih (2D) sistema. Biohemijski profil kulture 3D tkiva upadljivo je sličan onom u živom organizmu.3D sferoidi reaguju na spoljašnje stimulanse slično živom perifernom plućnom tkivu. Njihov zapaljiv odgovor je skoro identičan, a proizvode i surfaktant. Kada su ovi 3D sferoidi bili izloženi dimu cigareta filtriranom kroz novele alginite filtere cigareta, nivo citokina IL-8 i IL-6, poznatih zapaljivih posrednika, izražen je u znatno manjoj meri u poređenju sa kontrolom cigareta.

[0038] Kao što je gore pomenuto, alginit se može koristiti samo u filterima prema pronalasku ili u kombinaciji sa drugim supstancama koje se koriste u filterima cigareta pre datuma podnošenja ovog pronalaska. Takvi materijali, kao i njihova priprema i upotreba poznati su strucnjacima.

[0039] Na primer, kada se u pogledu filtera za cigarete "ugljenik" ili "grožđe" ili "komponente grožđa", oni označavaju aktivni ugljen i koštice grožđa i ljusku grozda , mada, iz prethodne struke je očigledno za osobu veštu u struci da komponente grožđa mogu biti prisutne i u drugim oblicima. Ove komponente, kao i njihova dostupnost takođe su dobro poznati osobama veštim u struci.

[0040] Ovaj pronalazak je ovim detaljnije izveden kroz sledeće primere. Primeri su samo u ilustrativne svrhe. Iz primera će strucnjak razumeti da je alginit čak i sam značajno poboljšao karakteristike filtriranja u odnosu na poznate materijale za filtriranje. Štaviše, primeri koji sadrže podatke u vezi sa kombinacijama koje sadrže alginit i određene filtracione materijale koji pripadaju prethodnoj struci jasno će učiniti jasno osobi veštom u struci, da alginit deluje sinergično sa drugim materijalima za filtriranje. Što se tiče pomenutih materijala pozivamo se na primer i na slobodne radikalne čistače izvedene u WO 2010/125412 koji su gore pomenuti.

Primer 1.: Upotreba alginita uzrokuje znatno manji porast antioksidativnog statusa u pljuvačci i serumu - Eksperimenti Tehnološkog univerziteta u Budimpešti (BUT)

[0041] Cilj ove studije je bio da istraži uticaj različitih filtera na sposobnost dima cigareta da izmeni antioksidativno stanje uzoraka (serum i pljuvačka). Merenja uzoraka seruma izvršena su sa RANDOX® TAS test. Uzorci seruma pripremljeni su rekonstituisanjem liofilizovanog seruma, koji je izmeren ili nakon ponovnog ustava (prazan) ili nakon što je filtriran dim cigareta protutnjao kroz njega. Ukupan antioksidativni status pljuvačke izmeren je pre i posle pušenja konvencionalnih ili eksperimentalnih cigareta opremljenih filterima prema izumu. Podaci stečeni našim merenjima mogu da odražavaju slobodne radikalne i ROS obavezujuće kapacitete filtera.

Materijali i metode

Merenja za antioksidativni status sa benzidinom test i Randox® Komplet totalnog antioksidativnog statusa (TAS)

[0042] Merenja za antioksidativni status izvršili su široko prihvaćeni benzidinski test i komercijalno dostupan Randox® Total Antioxidant Status (TAS) komplet. Benzidinski test koristi sistem za generisanje peroksida (vodonik peroksid i peroksidaza) i peroksid osetljiv hromogen (benzidin). U situ generisani peroksidi reaguju sa hromogenom da daju posredničko jedinjenje sa vrhunskim apsorbovanjem na 620 nm detektovano spektrofotometrom. Antioksidansi prisutni u uzorku takmiče se sa hromogenom u njegovim reakcijama sa peroksidima i ometaju generaciju detektovanog signala. Upoređivanjem detektovanog formiranja hromogena uzoraka sa negativnom kontrolom bez prisutnih antioksidanata i pozitivnom kontrolom sa poznatom antioksidativnom koncentracijom, može se proceniti antioksidativni status uzoraka.

Reagensi i instrumenti koji se koriste

Reagens A (rastvoren u tipu II prečišćena voda)

[0043]

-155 mM natrijum hlorid (Reanal, mačka br.24640-1-08-38)

- 25 mU/m1 horseradish peroxidase (Sigma®, mačkabr.77332)

-233 µM benzidin dihydrochloride (Sigma®, cat. no. B3383)

Reagens B (rastvoren u tipu II prečišćena voda)

[0044]

-250 µM urea-hydrogen peroksid (Sigma®, cat. no.289132)

Uzorci

[0045] Uzorci pljuvačke uzeti su od 17 subjekata pre i posle pušenja cigareta. Volontere je regrutovala laboratorija Univerziteta za tehnologiju i ekonomiju u Budimpešti. Svaki volonter prijavio se između 8-9 sati ujutru za žetvu pljuvačke, pušenje cigareta i ponovo sakupljanje pljuvačke. Svakog jutra se jedna probna cigareta pušila i skupljala se pljuvačka. Svaki volonter je popušio 4 različite cigarete (izdvaja se po filteru); dve između 4-7. decembra 2015. i dve između 5-8. januara 2016. Od pušača je zatraženo da se jave zbog toga što tog jutra nisu uzimali nikakvu hranu ili tečnost i što nisu oprali zube. Pljuvačka je bila ledena i preneta na procenu unutar prostorija u laboratorije BUT- a.

Male- musko; Female – zensko; smoker-pusac; people – ljudi; person – osoba;age- starost

[0046] Uzorci seruma su rekonstituisani iz liofilizovanog seruma (Analyticon Contronorm® PLUS), prema uputstvu proizvođača, u Tipu II prečišćene vode. Uzorci seruma su izmereni direktno (prazno) ili nakon filtriranog dima cigarete koji je optiFilter prošao kroz serum. Cigarete su pušene pomoću luke Filtrona SM3028, linearne mašine za pušenje. Cigarete su pušene prema ISO 3308 sa 100% rupe za ventilaciju filtera Blokiran. Dim je prošao kroz Kembridž filter (Filter staklenih vlakana 44mm, struka. br: 80202851, Borgwaldt KC), a rezultujuća faza gasa kanalisana je kroz silikonsku cev i puštena u plastičnu posudu sa poklopcem (impinger) koja sadrži rastvor seruma od 1,5 ml. Posle svake cigarete, Podloga za Kembridž filter zamenjena je novom, nakon što je svaka cigareta silikonsku cev zamenjena novom. Filteri su označeni sa 1-3.

Alati za kontrole i merenje

[0047]

- negativna kontrola (Tip II prečišćene vode)

- pozitivna kontrola (Calibrator standard iz Randox® Total Antioxidant Status kit cat. no. NX 2332) - Randox® Total Antioxidant Status kit

- Spectrophotometer (Thermo ScientificTm MultiskanTM GO Microplate Spectrophotometer)

Benzidin test metoda

[0048] Merenja su izvršena sa gore opisanim mikroplatnim spektrofotometrom, ćelije su inkubirane na 37°C na 96 ploči. Mešavina za reakciju na mikroplati pripremljena je na sledeći način: 5 λ uzoraka ili kontrole i 250 λ Reagent A su povezane na plocu. Smesa je tada homogenizovana, a zatim pročitana od strane čitača

1

mikroplata. Inicijalno očitavanje apsorpcije na 2.=620 nm utvrđeno je pre dodavanja 50 λ Reagent B u cilju pokretanja proizvodnje peroksida, nakon čega su apsorbovana očitavanja utvrđena na λ=620 nm od 0 do 3 minuta. Rezultati absorbovanje smatrani su izmerenim vrednostima absorbovanje u 2,5 minuta. Svi uzorci i kontrole su bili uskladišteni na ledu, a svaki uzorak je izmeren u 3 paralelna bunara za statističku analizu.

Randox® Total Antioxidant Status (TAS) metoda kompleta

[0049] Merenja su izvršena prema isporučenom priručniku koristeći mikroplatni spektrofotometar opisan iznad. Korišćenjem mikroplate umesto kuvete svi potrebni volumeni reagensa smanjeni su za faktor 4. To je rezultiralo konačnim obimom reakcije od 305 λ, što je rezultat dodavanja 5 λ uzoraka ili kontrole, 250 λ reagensa A i 50 obolelih od reagensa B kao što je opisano u uputstvu.

Materijal za cigarete

[0050] Cigarete koje su korišćene u eksperimentu obezbedio je OptiFilter Zrt. Specifikacije i proizvođenje cigareta bile su sledeće. Kentucky Reference Cigarete 3R4F je proizveo i sastavio Univerzitet u Kentakiju, KEJ SAD. Referentne cigarete dao je OptiFilter Zrt iz Mađarske od strane Celanske korporacije, Užice, VA, SAD. Sastavljeni su filteri za cigarete, a probne cigarete proizvela je kompanija OptiFilter Zrt. CellFx filterske šipke pripremila je i obezbedila Celanska korporacija. Oni su sadržali različite materijale za filtriranje, ponekad pomešane. Dodatni materijali filtera acetat sa različitim karakteristikama tkanja, čime se proizvode različite vrednosti pada pritiska, proizvedeni su i obezbeđeni od strane Celanese Korporacije. Delovi acetatnog filtera Kentucky Reference (KRC) 3R4F filtera od 27 mm (2,9/41.000) su uklonjeni i odbačeni. Šipke filtera, proizvedene po Celanese's CellFx tehnologiji, sadržale su različite materijale za popunjavanje. Uvedena je jedna odabrana šipka filtera okrenuta ka zapaljenoj površini cigarete, a odabran je i uveden dodatni deo acetata, čime je osiguran pad pritiska (ukupna otpornost na vučenje) vrednosti cigarete (zatvorena ventilacija filtera) ista kao i vrednost pada pritiska KRC-a (otpornost na crtanje 170 mm H2O /-2%). Celanski štapovi su bili dugački 12 mm. Delovi acetata su bili dugački 15 mm. Ukupna dužina filtera bila je 27mm.

Rezime filtera korišćenih u eksperimentu

[0051]

Saliva- pljuvacka; Filtr description – opis filtera; Abbreviation – skracenica; Rezultati

[0052] Tokom testa izvedenog na pljuvačci i serumu dobijeni su sledeći rezultati testa.

Eksperiment seruma

[0053]

Sample – uzorak; Antioxidant capacity – Antioksidativni kapacitet; Alternation in antioxidabt state -Izmena u stanju antioksidata; Blank – prazno;

[0054] Izmena u antioksidativnom stanju je prikazana u FIG 1.

[0055] Merenja su izvršena u pet replika. Rezultati ukazuju na to da je filter 3 superiorniji od kontrolne cigarete (filter 1).

Rezultati merenja uzorka pljuvačke benzidinom

[0056] Merenje je izvršeno sa 17 subjekata. Svaki uzorak prikupljen od subjekata izmeren je 3 puta.

Decrease in antioxidabt state - Smanjenje antioksidativnog stanja

Statistička analiza eksperimenta pljuvačke

1

- Procena statističkog značaja promena u antioksidativnom stanju pre i posle pušenja cigareta sprovedena je pomoću Wilcoxon Matched par Testa (StatSoft-STATISTICA10). Rezultati su smatrani značajnim na p<0,05.

Pair of variables - Par promenljivih; Before – pre; Marked test are significant - Označeni test su značajni.

[0058] Promena antioksidativnog stanja pre i posle pušenja Filtera 1 je značajna. Rezultati dobijeni testom ukazuju na jaku statističku razliku.

[0059] Promena antioksidativnog stanja pre i posle pušenja Filtera 2 je značajna. Rezultati dobijeni testom ukazuju na jaku statističku razliku.

[0060] Ne postoji statistički značajna promena u antioksidativnom stanju pre i posle pušenja Filter 3; iako postoji primetna razlika (p=0,065) ona ne dostiže prag za statistički značaj.

- Procena statističkog značaja promena u antioksidativnom stanju izazvanih pušenjem različitih cigareta sprovedena je pomoću Wilcoxon Matched par Testa (StatSoft - STATISTICA10). Rezultati su smatrani značajnim na p<0,05.

[0061] Promena antioksidativnog stanja između filtera 1 i 2 nije značajna.

1

[0062] Promena antioksidativnog stanja između filtera 1 i 3 je značajna.

Predstavljanje rezultata smanjenja antioksidativnog statusa pomoću Box Plot dijagrama

[0063] Srodni Box Plot dijagram koji prikazuje multivarijable je pokazan na Slici 2. Spoljna mesta podataka su prikazana odvojeno (StatSoft - STATISTICA10).

Zaključci

[0064] Rezultati pokazuju da je dim cigarete koji je prošao kroz filter 1 ili 2 smanjio status serum antioksidativnog za 15-20%. Filter 3 je rezultirao znatno manjim smanjenjem antioksidativnog kapaciteta, u poređenju sa kontrolom.

[0065] Očitavanja uzoraka pljuvačke upoređivana su sa pozitivnim i negativnim kontrolama za procenu antioksidativnog statusa. Naši rezultati ukazuju na to da je dim cigareta koji je prošao kroz Filter 1 i 2 snizio stanje pljuvačke antioksidansa za oko 30 odsto, što je utvrđeno kao statistički značajno, dok je Filter 3 pokazao smanjenje od 12 odsto, statistički značajno u odnosu na kontrolu cigarete. Ovi rezultati odgovaraju onima o merenju seruma. Naši rezultati pokazuju da komponente filtera pronalaka imaju značajan efekat na sposobnost dima cigareta da promeni antioksidativno stanje uzoraka u opisanim uslovima.

Primer 2.: Upotreba alginita izaziva znatno manji porast antioksidativnog statusa u pljuvačiji i serumu - eksperimenti prof. Tibora Szarvasa

[0066] Efekat na pljuvačku i serum dima cigarete filtriran filterima pronalaska takođe je testiran u dodatnom eksperimentu na sledeći način.

Materijali i metode

[0067] Cigarete koje su korišćene u eksperimentu bile su Kentucky Reference Cigarettes 3R4F, proizvedene i sastavljene od strane Univerziteta u Kentakiju, KEJ, SAD. Probne cigarete obezbedio je OptiFilter Zrt iz Mađarske od strane Celanske korporacije, Užice, VA, SAD. Sastavljeni su filteri za cigarete, a probne cigarete proizvela je kompanija OptiFilter Zrt. CellFx filterske šipke pripremila je i obezbedila Celanska korporacija. Oni su sadržali različite materijale za filtriranje, ponekad pomešane. Dodatni materijali filtera acetat sa različitim karakteristikama tkanja, čime se proizvode različite vrednosti

1

pada pritiska, proizvedeni su i obezbeđeni od strane Celanese Korporacije. Delovi acetatnog filtera Kentucky Reference Cigarette 3R4F (2,9/41.000) su uklonjeni i odbačeni. Šipke filtera, proizvedene po Celanese's CellFx tehnologiji, sadržale su različite materijale za popunjavanje. Prva, izabrana šipka filtera uvedena je okrenuta ka zapaljenoj površini cigarete, odabran je dodatni acetatni deo i uveden u filter, čime je osigurano da pad pritiska (ukupna otpornost na vučenje) vrednosti cigarete (filter ventilacija zatvorena) bude isti kao i vrednost pada pritiska KRC-a (otpor da se izvuče 170 mmH2O /- 2%). Celanske šipke su bile dugačke ili 10mm ili 12 mm ili 15mm. Delovi acetata bili su dugački ili 17mm ili 15 mm ili 12mm. Ukupna dužina filtera bila je 27mm. Cigarete opremljene CellFx filter šipkama koje sadrže različite materijale za punjenje su izmerene i u poređenju sa kontrolom u ovoj biološkoj proceni.

[0068] U eksperimentima su korišćeni sledeći filteri:

Filter description - opis filtera; Abbreviation - skracenice

Eksperimentalno podešavanje

[0069] Cigarete su pušene u OF laboratoriji na Tehnološko-ekonomskom univerzitetu u Budimpešti, u Filtroni SM302 8-port, linearna mašina za pušenje prema protokolu ISO 3308. Cigarete su popušene ventilacijone rupe filtera blokirane. Dim cigarete je prošao kroz Kembridž filter (Stakleni filter vlakana 44mm, art.no: 80202851, Borgwaldt KC), a rezultujuća faza gasa kanalisana je kroz silikonsku cev i ušiljena u staklenu posudu (impinger) koja sadrži rastvor seruma od 1,5 ml. Posle svake cigarete, Podloga za Kembridž filter zamenjena je novom, a posle svake cigarete silikonska cev je zamenjena novom.

Merenje kapaciteta seruma antioksidansa

[0070] Za procenu slobodnih radikalnih obavezujućih kapaciteta novih eksperimentalnih filtera cigareta upotrebljene su dve metode:

1.) Randox - total antioxidant kit (kupljen od Randox Lab. Ltd., Crumlin, UK)

2.) HRP - peroksid - benzidinski test

1

[0071] Contronorm Plus kontrolni serum je isporučila Analyticon Biotechnologies AG, Nemačka. Pušenje cigareta i tretiranje seruma dimom izvršeno je u laboratorijama OF-a na Univerzitetu tehnologije i ekonomije u Budimpešti, a testa za vučenje izveo je dr Szarvas na Centralnom istraživačkom institutu za fiziku Kampus, u Energetskom centru Mađarske akademije nauka u Budimpešti. Korišćeni su sveže pripremljeni reagensi. Kontrolni serum je rastvoren u 5 ml duplo destilovane vode. Nakon što je dim cigarete (1 cigareta) prošao kroz Kembridž filter, rezultujuća faza gasa je ubačena u 1,5 ml rastvorenog seruma prema ISO 3308 protokolu sa blokiranim rupama za ventilaciju filtera. Nakon toga, 20 obolelih od tretiranog seruma pomešano je sa 1 ml Reagenta 1 (sastav je obezbeđen ispod), homogenizovan i reakcija je počela sa 200 μl reages 2 (sastav je naveden ispod). Promena apsorbovanje izmerena je posle 3 minuta. Upijanje mehurića seruma je upoređivano sa upijajućim nereagovanim kontrolnim serumom. Prazna vrednost je određena bez kontrolnog seruma koristeći 20 μl dvostruko destilovane vode. Merenja su izvršena i na čitaču ploča (parametri: 5μl seruma, 250 μ l od R1, 50 μl od R2 reagensa).

Randox test za određivanje ukupnog antioksidativnog statusa u serumu

[0072] Test princip: ABTS (2,2,'-Azino-bis(3-ethilbenztiazolin-6-sulfonate) je inkubiran peroksidazom (metmioglobin) i H202za proizvodnju radikalnog cation ABTS+. Ovo ima relativno stabilnu plavo-zelenu boju, koja se meri na 600 nm. Antioksidansi u dodatom uzorku uzrokuju suzbijanje ove boje, do stepena proporcionalnog njihovoj koncentraciji.

Uzorak: Kontronorm kontrolni serum.

[0073]

Reagent – reagens; Composition – jeedinjenje; Conc in test – koncentracija kod testa;

Procedura

[0074]

1

Talasna duzina – 600nm

Kuveta – 1 cm svetlosne duzine

Tmperatura - 37C

Merenje - protiv vazduha

[0075] Dvostruko destilovana voda je pomešana sa 1mL R2 reagensom. Standard je pomešan sa 1mL R2 reagensom. Uzorak je pomešan sa 1mL R2 reagensom. Svako rešenje je dobro pomešano, inkubirano da bi se postigla neophodna temperatura i čita se početno apsorbovanje (A1). Svakom rešenju se dodaje 200 RI R3. Miks i tajmer se aktiviraju istovremeno. Upijanje se čita posle tačno 3 minuta (A2). Ukupan antioksidativni status izražen u % uspostavlja se upoređujući reagens - vrednost seruma.

HRP peroksid-benzidin test

[0076]

Reagens 1: HRP (ren peroksidaza) 9000 U/L, benzidin hidrohlorid 233 μmol/L, natrijum hlorid 155 mmol/L,

Reagens 2: Karbamid peroksid 0.36mmol/L

Rastvarač: Dvostruko destilovana voda

Instrument: UV-VIS spektrofotometar, temperatura 25° C

[0077] Korišćeni su sveže pripremljeni reagensi. Kontrolni serum je rastvoren u 5 ml duplo destilovane vode. Nakon što je dim cigarete filtriran pomoću Kembridž filtera (1 cigareta), rezultujuća faza gasa je unazađena u 1,5m1 količinu rastvora seruma prema ISO 3308 protokolu. Filterske ventilacione rupe su blokirane. Nakon toga je 20 μ1 rastvor tretiranog seruma pomešano sa 1 ml Reagensa 1 i homogenizovano, a reakcija je započeta sa 200 μ1 reagensa 2. Promena upijanja na 620 nm izmerena je odmah posle 3 minuta. Upijanje mehurića seruma je upoređivano sa upijajućim nereagovanim kontrolnim serumom. Prazan rezultat je dobijen bez kontrolnog seruma koristeći 20 μl duplo destilovane vode.

Rezultati eksperimenata su rezimirani u tabelama. Merenja su izvršena i na čitaču ploča (parametri: 5 μI seruma, 250 μl od R1, 50 μl R2 reagensa.

Rezultati

1. HRP peroksid-benzidin test

[0078]

2

Type – tip; Abbreviation – skracnice; Reactive O Radical Production - Reaktivna o radikalna produkcija;

Imporovment compared to control - Poboljsanjee u poređenju sa kontrolom;

[0079] Antioksidativni kapacitet i poboljšanje u odnosu na kontrolu prikazani su u FIG.3 i FIG 4.

2, poređenje šupljina i CelFx filtera pronalaska u serumu

Test HRP perokside-benzidin

[0080]

Type – tip; Abbreviation – skracnice; Reactive O Radical Production - Reaktivna o radikalna produkcija;

Imporovment compared to control - Poboljsanjee u poređenju sa kontrolom;

[0081] Antioksidativni kapacitet i poboljšanje u odnosu na kontrolu prikazani su u FIG. 5 i FIG 6. respectively.

3, Randoks test

[0082] Eksperiment seruma je ponovljen metodologijom Randox Antioxidant Kit. Rezultati su prikazani u nastavku.

Type – tip; Abbreviation – skracnice; Reactive O Radical Production - Reaktivna o radikalna produkcija; Imporovment compared to control - Poboljsanjee u poređenju sa kontrolom; Absorbance – apsorpcija;

Antioxidant capacity - Antioksidativni kapacitet

[0083] Antioksidativni kapacitet, promena antioksidativnog kapaciteta u kontrolni serum i promena antioksidativnog kapaciteta u cigaretu Kentucki prikazana je na sl.7, SL.8. i SLIKA 9. respektivno.

[0084] Rezultati seruma metodologijom Randox potvrdili su da filteri pronalaska, kako u CellFx strukturama, tako i u šupljinama, značajno poboljšavaju antioksidativni status izazvan dimom cigareta u fazi gasa. Imajući u vidu da dim cigareta ulazi u krvotok nekoliko sekundi nakon udisanja, upotreba filtera pronalaska može rezultirati zdravijim statusom endotelijuma kod pušača.

Merenje kapaciteta pljuvačke antioksidansa

[0085] Da bi se procenila promena statusa slobodnih radikala pljuvačke posle pušenja i uporedile različite filtrirane cigarete, izmerene su i poređene promene u pljuvački pušača.

.

Materijali i metode

[0086] Cigarete korišćene u eksperimentu bile su Kentucky Reference Cigarettes 3R4F, proizvedene i sastavljene od strane Univerziteta u Kentakiju, KEJ, SAD. Probne cigarete obezbedio je OptiFilter Zrt iz Mađarske od strane Celanske korporacije, Užice, VA, SAD. Sastavljeni su filteri za cigarete, a probne cigarete proizvela je kompanija OptiFilter Zrt. CellFx filterske šipke pripremila je i obezbedila Celanska korporacija. Oni su sadržali različite materijale za filtriranje, ponekad pomešane. Dodatni materijali filtera acetat sa različitim karakteristikama tkanja, čime se proizvode različite vrednosti pada pritiska, proizvedeni su i obezbeđeni od strane Celanese korporacije. Delovi acetatnog filtera Kentucky Reference Cigarette 3R4F (2,9/41.000) su uklonjeni i odbačeni. Šipke filtera, proizvedene po Celanese's CellFx tehnologiji, sadržale su različite materijale za popunjavanje. Prva, izabrana šipka filtera uvedena je okrenuta ka zapaljenoj površini cigarete, odabran je dodatni acetatni deo i uveden u filter, čime je osigurano da pad pritiska (ukupna otpornost na vučenje) vrednosti cigarete (filter ventilacija zatvorena) bude isti kao i vrednost pada pritiska KRC-a (otpor da se izvuče 170 mmH2O /- 2%). Celanske šipke su bile dugačke ili 10mm ili 12 mm ili 15mm. Delovi acetata bili su dugački ili 17mm ili 15 mm ili 12mm. Ukupna dužina filtera bila je 27mm. Cigarete opremljene CellFx filter šipkama koje sadrže različite materijale za punjenje su izmerene i u poređenju sa kontrolom u ovoj biološkoj proceni

Eksperimentalno podešavanje

[0087] Uzorci pljuvačke uzeti su od 38 subjekata pre i posle pušenja cigareta. Volontere je regrutovala laboratorija Univerziteta za tehnologiju i ekonomiju u Budimpešti. Svaki volonter prijavio se između 8 i 9 časova ujutru za žetvu pljuvačke, pušenje cigareta i ponovo sakupljanje pljuvačke. Svakog jutra jedna probna cigareta je pušila i pljuvačka je sakupljala iz nje. Svaki volonter je pušio 6 različitih cigareta (razlikuje se po filteru) između 19. oktobra - 20. novembra 2015. Od pušača je zatraženo da se jave zbog toga što tog jutra nisu uzimali nikakvu hranu ili tečnost i što nisu oprali zube. Pljuvačka je bila ledena i nošena za procenu laboratorija KFKI.

Test HRP peroxide-benzidine

[0088]

Reagens 1: HRP (ren peroksidaza) 9000 U/L, benzidin hidrohlorid 233 μmol/L, natrijum hlorid 155 mmol/L,

Reagens 2: Karbamid peroksid 0.36mmol/L

Rastvarač: Dvostruko destilovana voda

Instrument: UV-VIS spektrofotometar, temperatura 25° C

[0089] Korišćeni su sveže pripremljeni reagensi. Kontrola je rastvorena u 5 ml dvostruko destilovane vode. Prikupljena je pljuvačka prikupljena od volontera. Nakon toga 20 μl rastvora tretirane pljuvačke pomešano je sa 1 ml Reagent 1 i homogenizovano, a reakcija je počela sa 200μl Reagent 2. Promena upijanja na 620 nm izmerena je odmah posle 3 minuta. Upijanje pljuvačke prikupljene posle pušenja upoređivano je sa apsorbovanjem nereagovane kontrolne pljuvačke. Prazan rezultat je dobijen bez kontrolne pljuvačke koristeći 20 μl duplo destilovane vode. Rezultati eksperimenata su rezimirani u tabelama.

[0090] U studiji je učestvovalo 38 volontera prema sledećem:

2

Male- musko; Female – zensko; smoker-pusac; people – ljudi; person – osoba;age- starost

Rezultati

[0091] Rezultati testa su prikazani u FIG.10 i FIG 11. gde u FIG11. Cigarette1 =Kentucky Ref., Cigareta 2 = Ugljenični štap, cigareta 3 = Štap od alg grožđa i cigareta 4 = Šupljina alg grožđa

Rezime filtera korišćenih u eksperimentu

[0092]

Saliva – pljuvacka; Filter description – opis filtra; Abbreviation - skracnice Rezultati

[0093]

Change in Antioxidant capacity – Promene u Antioksidativni kapacitetu

Zaključci

[0094] Naši eksperimenti sa serumom potvrdili su da su filteri pronalaska, kako u CellFx strukturama, tako i u šupljinama, značajno poboljšali antioksidativni kapacitet izazvan dimom cigareta. Imajući u vidu da dim cigareta ulazi u krvotok nekoliko sekundi nakon što se udahne, mislimo da ovi podaci ukazuju da filteri Sadašnjeg pronalaska mogu doprineti zdravijem endotelijumskom statusu kod pušača. Naši eksperimenti pljuvačke potvrdili su da filteri pronalaska, kako u CellFx strukturama, tako i u šupljinama, značajno poboljšavaju antioksidativni kapacitet u ustima. Mislimo da ovo može doprineti zdravijoj mukosi kod pušača.

Primer 3.: Efekat sastava filtera cigareta na dim izazvao je smrt endotelijalnih i epitetnih ćelija.

[0095] Dim cigareta je kompleksna kombinacija hemikalija koje karakterišu visoki nivoi oksidanta. Sve veći broj papira pokazuje da dim cigareta izaziva aktiviranje plućnih vaskularnih endotelialnih ćelija, što je povezano sa gubitkom endotelialne barijere. Ovaj gubitak je obeležje endotelialne disfunkcije. U ovom procesu dim cigareta izazvao je oksidativni stres dovodi do oštećenja endotelijalnih ćelija, što omogućava prodor monocita i aktivirane makrofagije. Oštećenje endotelialne barijere možda čak predstavlja rani element povrede pluća kao odgovor na izloženost dimu cigareta.

[0096] Pokazalo se i da dim cigareta izaziva apoptozu alveolarnog tkiva pluća putem apoptoze njihovih epitelnih ćelija, što doprinosi razvoju hronične bolesti pluća kao što je emfizem. Iako sve vrste ćelija unutar pluća mogu biti oštećene oksidativnim oštećenjima, epitelne ćelije su glavna meta za povredu oksidanta u tome što čine prvu liniju odbrane u plućima. Stoga nije iznenađujuće da je povreda epitela dimom cigareta važan proces u patogenezi plućnih bolesti povezanih sa pušenjem.

[0097] Brojevi studija pokazali su da visoko reaktivni konstituenti dima, nestabilni kancerogeni i reaktivne vrste kiseonika (ROS) izvedene iz dima cigareta i ćelija oštećenih dimom cigareta doprinose povredi pluća koja uključuje povredu epitela putem smrti ćelija i dalju proizvodnju ROS-a u aktiviranim epitelnim ćelijama. Stoga se zaštita epitela od povreda cigaretnim dimom smatra presudnom za lečenje brojnih plućnih bolesti povezanih sa pušenjem cigareta. Naše istrage su pokazale da sastav filtera za cigarete može biti važan u modifikovanju uticaja dima cigareta na indukovanu smrt epitela ćelija, koje predstavljaju prvi susret ćelijske linije sa dimom cigareta, kao i oštećenje endotelialnih ćelija. Filteri koji bi efikasnije mogli da uklone komponente dima cigareta koje imaju najveći štetan potencijal na epitetnim ćelijama, kao i na endotelialnim ćelijama, mogli bi da smanje oštećenja pluća izazvana dimom cigareta.

Materijali, subjekti i metode

[0098] Cigarete korišćene u eksperimentu bile su Kentucky Reference Cigarettes 3R4F, proizvedene i sastavljene od strane Univerziteta u Kentakiju, KEJ SAD. Cigarete je OptiFilter Zrt iz Mađarske obezbedila Celanska korporacija, Užice, VA, SAD. Filteri za cigarete su sklopljeni, a probne cigarete je proizvela

2

kompanija OptiFilter Zrt., CellFx filterske šipke je pripremila i obezbedila Celanska korporacija. Oni su sadržali različite materijale za filtriranje, ponekad pomešane. Dodatni materijali filtera acetat sa različitim karakteristikama tkanja, čime se proizvode različite vrednosti pada pritiska, proizvedeni su i obezbeđeni od strane Celanese Korporacije. Delovi acetatnog filtera Kentucky Reference Cigarette 3R4F (2,9/41.000) su uklonjeni i odbačeni. Šipke filtera, proizvedene po Celanese's CellFx tehnologiji, sadržale su različite materijale za popunjavanje. Jedna odabrana šipka filtera uvedena je u cigaretu okrenuta ka zapaljenoj krajnje površini cigarete, odabran je dodatni acetatni deo i uveden u filter, čime je osiguran pad pritiska (totalni otpor za crtanje) cigarete (zatvorena ventilacija filtera) isto kao i vrednost pada pritiska KRC-a (otpor da se izvuče 170 mm H2O /- 2%). Celanske šipke su bile dugačke ili 10mm ili 12 mm ili 15mm. Delovi acetata bili su dugački ili 17mm ili 15 mm ili 12mm. Ukupna dužina filtera bila je 27mm. Cigarete opremljene CellFx filter šipkama koje sadrže različite materijale za punjenje su izmerene i u poređenju sa kontrolom u ovoj biološkoj proceni.

[0099] Endotelne ćelije igraju ključnu ulogu u razvoju COPD, jer su barijerna funkcija endotelnih ćelija neophodne za zdravu funkciju pluća; stoga, gubitak funkcije endotelne barijere može doprineti infiltraciji leukocita, karakterističnom znaku plućnih bolesti, uključujući COPD. Dim izazvan smrću ćelija i zapaljenjem u endotelialnim ćelijama doprinose razvoju COPD-a. Ovde pokazujemo da korišćenjem različitih kompozicija filtera cigareta možemo modifikovati sastav dima i da možemo da posvetimo štetne biološke efekte. Sl. 2 pokazuje da dim iz Alginite / Zeolite / Carbon / Grape mix koji sadrži filtere manje šteti endotelialnim ćelijama.

[0100] Epitelne ćelije su važne komponente plućnog tkiva i imaju značajnu ulogu u raku pluća i COPD razvoju. Koristeći A549 liniju epitela pluća pokazali smo da Alginite / Zeolit / Carbon / Grape mix-containing filteri značajno smanjuju smrt epitela ćelija i tako verovatno dovodi do smanjenog COPD rizika. Rezultati su pokazali da filteri izuma koji sadrži Alginite / Zeolite Carbon i Grape mix oduzimaju neke komponente dima, i tako izazivaju manje oštećenja u epitealnim i endotelialnim ćelijama pluća.

[0101] Zaštita epitelnih i endotelnih ćelija može doprineti slabljenju COPD izazvanog cigaretnim dimom i razvoju drugih respiratornih bolesti.

Priprema ekstrakta dima cigarete

[0102] Priprema ekstrakta dima cigareta izvedena je kao što je ranije opisano (Chen et al.; Chen ZH, Lam HC, Jin Y, Kim HP, Cao J, Lee SJ, lfedigbo E, Parameswaran H, Ryter SW, Choi AM. Protein povezan sa autofagijom mikrotubula 1 laki lanac-3B (LC3B) aktivira ekstributivnu apoptozu tokom emfizema izazvanog dimom cigareta. Proc Natl Acad Sci USA. 2010 Nov 2; 107(44):18880-5). Za pripremu ekstrakta dima cigareta, kentucky 3R4F istraživačka referenca filtrirala je cigarete (Tobacco Research Institute, University of Kentucky, Lexington, KY) su pušene pomoću peristaltičke pumpe (VWR International) koristeći različitu vrstu filtera. Pun dim je požnjeven. Svaka cigareta je popušila za 4 min sa preostalim 15-mm duksom i probijana je kroz 7,5 mL srednjeg rasta ćelija preko silikonske cevi. Ovo rešenje, koje se smatra ekstraktom

2

dima cigarete snage 100 odsto snage, prilagođeno je pH od 7,45 i korišćeno je u roku od 15 min nakon pripreme. Nakon što je svaka cigareta popušio silikonsku cev zamenjena je novom.

HUVEC i A549 ćelijska kultura i tretmani.

[0103] HUVEC ćelije (endotelne ćelije humane umbilikalne vene) dobijene su od Lonza (Anaheim, CA, USA) Cat. br .: C2519A, i uzgajani su u endotelnom rastnom medijumu (Lonza, Anaheim, CA, SAD) u vlažnoj atmosferi koji sadrže 5% CO2.. Za analizu smrti ćelija, 5 x 103/well HUVEC po bunaru su zasejani u 96-bunarske ploče u endotelijalnom rastu medijuma koji sadrži faktore rasta i 2 % seruma. Pre svakog eksperimenta, medijum je zamenjen svežim medijumom koji ne sadrži faktor rasta i sadrži 1% seruma i inkubiran je ekstrakt dima od 10% u periodu od 24 sata. [0104] alveolarne bazalne epitelne ćelije su dobijene iz Evropske zbirke autentifikovanih ćelijskih kultura (ECACC) (ćelijska linija: A549 Kataloški broj: 86012804 A549 ćelije su kulturne u DMEM medijumu koji sadrži 10% FCS u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5% CO2. Za analizu smrti ćelija, 5 x 103 /well A549 ćelije 5 su zasejene u 96-bunarske ploče u DMEM medijumu koje sadrže 10% FCS i tretirane sa 10% CS ekstrakta 24 sata.

Test održivosti ćelija

MTT test

[0105] Ćelije su posađene u 96-ploce u početnoj gustini kao što je dato u Figurama i kultivisane preko noći pre tretmana dimom. Nakon perioda inkubacije, mediji su uklonjeni i zamenjeni za 4 h sa RPMI koji sadrži odgovarajuću količinu MTT rešenja (3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromid) (ChemiconInc., El Segundo, CA) (14). MTT reakcija je prekinuta dodavanjem HCI medijuma u konačnoj koncentraciji od 15 10 mM. Količina vodeno-nerešive plave formasan boje formirane od MTT-a bila jeproporena broju živih ćelija i određena je sa Anthos Labtech 200 imunosorbentni test čitačem na 550 nm talasne dužine nakon rastvaranja taloga plave forme u 10% SDS-u. Svi eksperimenti su pokrenuti u najmanje 6 replika i ponavljani tri puta.

Sulforhodamine B (SRB) asay.

[0106] Ćelije su inkubirane u pločama sa 96 jažica tokom 24 sata, kao što je gore opisano. Kulturni medijum je potom odbačen, a ćelije su fiksirane u situ dodavanjem 100 RI hladnih 10% (w/v) trihloroacetičke kiseline i inkubirane za 30 min na 4 °C. Supernatant je odbačen, a ploče su pet puta prane vodom iz česme i vazduhom osušenim 24 sata. Supernatant je odbačen, a ploče su isprane pet puta vodom iz slavine i sušene na vazduhu 24 sata. Dodan je SRB rastvora (100 pLI) pri 0,4% (m / v) u 1% sirćetne kiseline i ploče su inkubirane 20 minuta u sobi temperatura. Posle bojenja, nevezana boja uklonjena je

2

pranjem pet puta sa 1% sirćetnom kiselinom, a ploče su sušene na vazduhu. Vezana mrlja je naknadno solubilizovana sa (200 RI) 10 mM Tris (pH 10.5), a upijanje je pročitano u čitaču od 96- ploče na 560 nm oduzimanjem merenja pozadine na 600 nm pomoću Promega Glomax sistema za otkrivanje višemoda.

Rezultati: uticaj dima na epitele pluća i ljudske endotelialne ćelije

[0107] Kao što je napomenuto, ćelije epitela pluća igraju kritičnu ulogu u razvoju hronične opstruktivne plućne bolesti (COPD). Promene u sastavu filtera cigareta mogle bi potencijalno da proizvedu dim koji bi smanjio smrt epitela ćelija u poređenju sa dimom iz konvencionalne cigarete. Stoga smo analizirali ulogu različitog sastava filtera o smrti epitela izazvanih dimom. Sl. 1 prikazuje uticaj različitih sastava filtera na smrt ćelija u ćelijama A549. Rezultati prikazani u Sl.1 dobijeni su korišćenjem 10 % ekstrakta dima koji se primenjuje na ćelijske kulture. Međutim, verovatno je da su rezultati korišćenja koncentracije dima od 10 odsto razumniji jer je povećanje koncentracije dima pokazalo proliferativni efekat dima cigareta. Podaci u FIG. 12. označava da tri filtera izuma koji sadrže Alginite/Zeolite/koščica i ljuski grožđa (GSSG), alginite/GSSG i alginite/carbon filtere značajno smanjuju dim izazvan smrću epitela A549.

[0108] FIG. 13. prikazuje efekte različitih sastava filtera na smrt ćelija izazvanih dimom primarnih ljudskih pupčanih vena Endotelialnih ćelija (HUVEC). Ovde smo koristili 4 cigarete za svaku meru za svaki filter i uradili 6 replika, a ovi podaci pokazuju da filteri pronalaska koji sadrže razne materijale za filtriranje u filteru značajno smanjuju dim izazvan endotelialnom smrću ćelija.

[0109] Ovi eksperimenti su pokazali da filteri cigareta izuma značajno menjaju obrazac preživljavanja i epitela i endotelijumnog tkiva izloženog dimu cigareta. Ovo može biti korisno u borbi protiv dima cigareta izazvanih respiratornim i kardiovaskularnim bolestima.

Primer 4.: Upalna proizvodnja citokina posle izlaganja dimu cigareta u ljudskom modelu plućnog tkiva

[0110] Pušenje cigareta je glavni faktor povezan sa mnogim složenim bolestima u plućima. Izloženost dimu može da izazove upalne odgovore kroz upalno oslobađanje citokina. Makrofage igraju važnu ulogu u rasplamsanom mematornomodgovoru i određeni suizvori interleukin-8 (IL-8) i interleukin-6 (I L-6). IL-8 je multifunkcionalni citokin, uglavnom deluje kao neutrofilni hemo-privlačni, dok je IL-6 povezan sa oštećenim metabolizmom kod pacijenata sa COPD-om. Kako oba citokina igraju važnu ulogu u mnogim bolestima pluća, kao što su COPD, plućna fibroza ili astma; izgledalo je razumno istražiti efekat novel filtera cigareta na nivoe ovih citokina u našem nedavnom razvoju kompleksni sistem modela pluća. Upalni procesi u plućima povezani su sa proizvodnjom nekoliko citokina i neutrofilnim regrutovanjem u disajne puteve. IL-6 i IL-8 igraju ključne uloge u pokretanju i produžetku zapaljivih reakcija. Izloženost dimu cigareta može aktivirati zapaljenje putem poboljšanja proinflamatornog sekreta citokina, što dovodi do hronične upale. Dim cigareta takođe može da izazove promene na nivou organa, kao što je uništavanje vazdušnih putevai gubitak

2

površina za razmenu gasa, što može dovesti do oštećenih plućnih funkcija. Svi ovi negativni efekti mogu doprineti teškoj pojavi bolesti, uključujući COPD ili rak. Korišćenjem kulture 3D tkiva kao metoda testiranja, kombinacija ćelija koje deluju kao funkcionalna jedinica tkiva može se proceniti u poređenju sa jednom ćelijom. Plućno tkivo se sastoji od epitela ćelija koje imaju istaknutu ćeliju arhitekture. Ove ćelije imaju specijalizovane ćelijske kontakte, polarizovanu morfologiju i prikačene su na osnovnu podrumsku membranu. Održavanje ovih osobina je od suštinskog značaja za normalnu funkciju tkiva, uključujući širenje, razlikovanje, preživljavanje i lučenje. Ćelije prirodno rastu u 3D okruženju. Prostorni raspored ćelija unutar ovog okruženja utiče na to kako međusobno komuniciraju i njihov mikrookolina. Zauzvrat, ovi intracelularni signali utiču na morfologiju i niz ćelijskih funkcija. Stoga, kada se kandidati za drogu ili toksični agens testiraju pomoću asaja na bazi ćelija, metode kulture koje se koriste trebalo bi da oponašaju najprirodnije u vivo reprezentativnom obliku. Najprirodniji metod oponašanja tkiva za primenu otkrivanja droge je, verovatno, 3D. U vitro testiranju dima cigareta je komplikovano. Procenjen je veliki broj linija ćelija, ali svi imaju svoja ograničenja. I L-8 i IL-6 mogu da proizvedu nekoliko zapaljivih i plućnih ćelija, ali istraga jednog određenog tipa ćelija može pogrešno da predstavi ukupan uticaj izloženosti dimu. Ćelije koje rastu u 2-dimenzionalnim ćelijskim kulturama se rutinski koriste u nekoliko vrsta farmakoloških ispitivanja, ali ove u vitro okolnostima su manje relevantne za vivo situaciju nego što je to slučaj za sistem 3-dimenzionalnog modela. Trodimenzionalne kulture plućnih ćelija su reprezentativnije od onoga što se dešava u vivu, imajući arhitekturu i obrazac izraza koji se usko podudara sa ljudskim plućima. Kako je pluća složen organ, neophodno je istražiti biološke procese u složenom sistemu modela, imajući u vidu da uređenje ćelija može uticati na dati odgovor određenog stimulansa. Humeltisova 3D plućna tkiva kombinuju više tipova ćelija, koji predstavljaju glavne ćelije trakta za vazdušni put.

Metode

[0111] Normalne primarne ljudske male ćelije vazdušnog puta (SAEC) i normalni ljudski fibroblasti pluća (NHLF) kupljeni su od Lonze. Ove ćelije su izolovane od anonimnih donatora različitog pola i uzrasta. Ljudski periferni monociti bili su izolovani CD14 pozitivnim MicroBead izolacionim kompletom (Miltenyi Biotec). Za 3D kultne SAEC i NHLF ćelije pomešan je odnos 1:1 (SN sferoidi), a ljudski monociti su takođe pomešani sa ovim ljudskim primarnim ćelijama (SNM sferoidi). Ćelije su zasejene na nisku prilozinu 96-dobro U-donju ploču. Sferoidi su tretirani ekstraktima dima cigareta (CSE) 48 sati pre merenja. Cigarete korišćene u eksperimentu bile su Kentucky Reference Cigarettes 3R4F, proizvedene i sastavljene od strane Univerziteta u Kentakiju, KEJ, SAD Cigarete su obezbeđene OptiFilter Zrt iz Mađarske od strane Celanese Corporation, Užice, VA US. Sastavljeni su filteri za cigarete, a probne cigarete proizveo je OptiFilter Zrt. CellFx filterske šipke su pripremljene i obezbeđene od strane Celanese Corporation. Dodatni materijali filtera acetat sa različitim karakteristikama tkanja, čime se proizvode različite vrednosti pada pritiska, proizvedeni su i obezbeđeni od strane Celanese Korporacije. Delovi acetatnog filtera Kentucky Reference (KRC) 3R4F filtera od 27mm (2,9/41.000) su uklonjeni i odbačeni. Filterske šipke, proizvedene po Celanese's CellFx

2

tehnologiji i sadrže različite materijale za punjenje uvedene su okrenute ka zapaljenoj površini cigarete. Odabran je i uveden dodatni deo acetatnog dela, čime je osigurano da pad pritiska (ukupna otpornost na vučenje) vrednosti cigarete (rupe za ventilaciju filtera zatvorene) bude isti kao vrednost pada pritiska KRC-a (otpor da se izvuče 170 mmH2O -F1- 2%). Celanski štapovi su bili dugački 12 mm. Delovi acetata su bili dugački 15 mm. Ukupna dužina filtera bila je 27mm. Napravljena su ukupno dva različita filtera, a KRC-ovi su bili opremljeni njima. Dim iz cigareta opremljen filterima sadašnjeg pronalaska, CellFx filteri koji sadrže različite materijale za punjenje, izmereni su i upoređivani sa kontrolom u biološkoj proceni. Kategorizacija cigareta je bila sledeća:

[0112] CSE je pripremljen penušanjem dima od 2 cigarete do 10 ml ćelijske kulture srednje na konstantnom protoku vazduha koji je snabdevala Hidrotehnološka vakuumska pumpa (BioRad) u ukupnom periodu od dva minuta. Izloženi medijum je filtriran pod sterilnim uslovima sa filterom špriceva od 0,22 urne. Lagano rasipanje rastvorenih čestica nije pokazalo značajne razlike u rasponu od 320-350 nm. Smatralo se da je ovo rešenje 100% E. CSE je pripremljen u roku od 30 minuta za svaki eksperiment. CSE (0,5%) primenjen je na trodimenzionalne kulture tkiva 48 sati. Posle 48 sati zapaljivi citokini koje je proizvelo 3D mikro tkivo izmereni su u supernatantnim medijima od strane BD Cytometric Bead Array Human Inflammatory Cytokine Kit (BD Biosciences). Ovaj komplet obezbeđuje kvantitativno merenje IL-8 i IL-6 nivoa proteina u kulturi tkiva supernatant. Metoda se zasniva na fluorescentnim konjugiranim mikro perlama poznate veličine i reagensu detekcije, što daje proporcionalan signal količini povezanog citokina. Tokom 3 sata inkubacije, hvatanje mikro-beads formira kompleks sa citokinom iz supernatanta zajedno sa reagensom za detekciju. Fluorescentni intenzitet je analiziran citometra protoka FACS Canto II (BD Immunocytometry Systems, Erembodegem, Belgija) sa BD FACS DIVA softverom V6, a podaci su analizirani sa FCS Express V3 Softver. Rezultati predstavljaju mean fluorescenciju intenziteta konjugovanih mikro perlama nakon vezivanja IL-6 i IL-8.

Rezultati

[0113] Da bi se istražila zapaljiva proizvodnja citokina kao funkcije tipa filtera, sferoidi su tretirani CSE-om od standardnih cigareta i dva različita filtera koji sadrže cigarete 48 sati. Podaci pokazuju da su i IL-8 i IL-6 smanjeni u makrofagu koja sadrži agregate nakon CSE tretmana od broja 3 filtriranih cigareta, što ukazuje na smanjenu sposobnost da se pokrene upalne reakcije. Pokazalo se da su razlike statistički značajne za oba citokina.

[0114] FIG.14. prikazuje Ljudski IL-8 protein u supernaranima makrofaga koji sadrže sferoide pluća posle 48 sati u 3 agregata tipa ćelija (SAEC, fibroblasti i makrofagije).

[0115] FIG.15. pokazuje Ljudski IL-6 protein u supernaranima makrofaga koji sadrže sferoide pluća posle 48 sati.

[0116] Smanjenje nivoa citokina bilo je statistički značajno samo u agregatima koji sadrže makrofage i tek posle 48 sati. U agregatima koje su formirali fibroblasti i primarne ćelije epitela samo (bez makrofaga) smanjenje nivoa citokina nije bilo značajno ni posle 24 ni 48 sati. Cigareta broj 3 smanjila je nivo oba citokina na nivo utvrđen u kontrolnom medijumu.

Zaključci

[0117] IL-6 i IL-8 igraju ključne uloge u pokretanju i propagaciji zapaljivih reakcija. Izloženost dimu cigareta može da aktivira upalu putem izazivanja oštećenja tkiva, čime se pospešuje proinflamatorni sekret citokina, što može dovesti do hronične upale. 3D kulture ljudskog tkiva pokazuju blisku sličnost sa biohemijskim i patološkim procesima ljudskih tkiva u vivu. S tim u vezi, može biti razumno pretpostaviti da bi statistički značajno smanjenje istraženih citokina u imunološki aktivnim agregatima (koji sadrže makrofage), kada je dim filtriran filterom #3 moglo biti korisno i u vivo postavci. Podaci se rezimiraju na sledeći način (SN označava agregate koji sadrže primarne epitelne ćelije i fibroblaste, dok SNM označava agregate koji sadrže ćelije epitela, fibroblaste i makrofage):

Rezime

[0118] Gore navedeni primeri jasno pokazuju da je alginit posebno efikasan kada se koristi samo u filterima cigareta ili u kombinaciji sa drugim poznatim komponentama kao što je gore navedeno. Kao neočekivane i romanitetne karakteristike izuma da je upotreba alginita u filterima cigareta rezultirala znatno manje reaktivnim vrstama kiseonika (ROS) u pljuvačci, znatno manje formiranja ROS-a u krvnom serumu, manje endotelnog oštećenja, manje oštećenja epitela pluća, značajno veći nivo glutationa manje oštećenja plućnih tkiva i manje upale plućnih tkiva.

1

[0119] In vitro biološki testovi koji su izabrani su dobro odabrani po tome što imaju jasnu i dobro utvrđenu vezu sa vivo biološkim putevima koji su dokumentovani za izazivanje velikih bolesti povezanih sa pušenjem. Dalje, u svakom slučaju pokazalo se da filteri izuma proizvode dim faze gasa koji je bio daleko manje štetan u vitro testovima od dima proizvedenog iz referentnog filtera Kentakija. Ovi rezultati stoga pružaju ubedljive dokaze da cigarete opremljene ovim filterima mogu dobro da smanje trenutne zdravstvene efekte pušenja cigareta.

[0120] Primeri su dodatno ilustrovali da je alginit čak i sam značajno poboljšao karakteristike filtriranja u odnosu na poznate filtracione materijale, kao i da su alginit i filtracioni materijali koji pripadaju prethodnom stručnom činu sinergistički. Stoga, iako nisu sve kombinacije koje sadrže pomenute u primerima, očigledno je da će osoba vešta u struci i bilo koju kombinaciju alginitnih i poznatih materijala za filtriranje u određenom tehničkom polju imati ista svojstva.

2

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Primena alginita za filtriranje dima cigarete.

2. Primena prema zahtevu 1, pri čemu se alginit primenjuje u filterima za cigarete.

3. Primena alginita za izradu filtera za cigarete.

4. Primena prema zahtevu 2, pri čemu se alginit primenjuje sam ili u kombinaciji sa drugim supstancama koje se primenjuju u filterima za cigarete za smanjenje štetnih efekata dima cigarete.

5. Primena prema zahtevu 4, pri čemu su druge supstance izabrane iz grupe koja se sastoji od aktivnog uglja ili sastojaka grožđa.

6. Primena prema zahtevu 5 pri čemu je druga supstanca aktivni ugalj.

7. Primena prema zahtevu 5, gde su druga supstanca sastojak, odnosno sastojci grožđa.

8. Primena prema zahtevu 7 pri čemu su sastojci grožđa u obliku samlevenih koštica i ljuski grožđa.

9. Alginit za primenu u smanjenju rizika od oštećenja dima cigarete kod čoveka.

10. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu se alginit primenjuje u obliku filtera za cigarete koji sadrže alginit.

11. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje ROS u pljuvački.

12. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje ROS u serumu.

13. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje oštećenje epitelnih ćelija.

14. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje oštećenje endotelnih ćelija.

15. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači viši nivo glutationa.

16. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje oštećenje plućnih tkiva.

17. Alginit za primenu prema zahtevu 9, pri čemu smanjenje rizika od oštećenja znači manje zapaljenje u plućnim tkivima.

4