RS61691B1 - Imune ćelije defektne za suv39h1 - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na oblast adoptivne terapije. Ovaj pronalazak obezbeđuje imune ćelije defektne za Suv39h1 sa poboljšanim preživljavanjem, potencijalom rekonstitucije i centralnim memorijskim fenotipom nakon adoptivnog transfera.

UVOD

[0002] Adoptivna T-ćelijska terapija (ATCT) pomoću T-ćelija naoružana tehnologijama rekombinantnih T-ćelijskih receptora (TCR) i himernih antigenskih receptora (CAR) pokazuje veoma ohrabrujuće dejstvo u ranoj fazi kliničkog ispitivanja protiv nekoliko maligniteta u nekoliko institucija (Kershaw MH, Westwood JA, Darcy PK. Nat Rev Cancer.2013; 13:525-541).

[0003] Tema u razvoju je da je efikasno kalemljenje i dugotrajna istrajnost terapeutskih T-ćelija u korelaciji sa pozitivnim terapeutskim ishodima. Nekoliko prekliničkih ispitivanja pokazalo je da naivne i rano-diferencirane T-ćelije poseduju poboljšan kapacitet za dugotrajnu istrajnost (Berger C et al., J Clin Invest.2008; 118:294-305; Hinrichs CS et al., Proc Natl Acad Sci.2009; 106:17469-17474; Tanel A et al., Expert Rev Vaccines.2009; 8(3):299-312) i mogu da izazovu snažne antitumorske odgovore (Gattinoni L et al., J Clin Investig.2005; 115:1616-1626; Lugli E et al. J Clin Invest.2013; 123:594-599). Pored toga, povećana istrajnost adoptivno prenetih ćelija izgleda da zavisi od akvizicije populacija centralnih memorijskih T-ćelija (TCM) (Powell DJ et al., Blood.2005; 105(1):241-50; Huang J, Khong HT et al. J Immunother. 2005; 28:258-267).

[0004] Stabilan prenos gena rutinski se postiže u kliničkim uslovima, naročito upotrebom gama retrovirusnih vektora radi transdukcije poliklonalnih T-ćelija sa CAR (vidi, na primer, Guest RD et al., Cancer Immunol Immunother.2014;63:133-145) i TCR (vidi posebno Johnson LA et al., Blood.

2009;114(3):535-46), pri čemu ove modifikovane ćelije ne prikazuju nikakve očigledne indikacije štetne po bezbednost kod pacijenata sa presađenim CAR T-ćelijama duže od 10 godina (Scholler J et al., Sci Transl Med.2012;4:132ra153).

[0005] Radi efikasne transdukcije sa retrovirusnim vektorima ili lentivirusnim, primarne T-ćelije treba da se aktivno razmnožavaju (Stacchini A et al., Leuk Res.1999; 23:127-136), što se uopšteno postiže mitogenom stimulacijom mirujućih, primarnih T-ćelija. Međutim, nakon aktivacije, T-ćelije nepovratno linearno napreduju ka efektorskom (TE) fenotipu (Mahnke YD et al., Eur J Immunol.2013; 43:2797-2809; Farber DL. Semin Immunol.2009; 21:84-91). Mitogena aktivacija za retrovirusnu ili lentivirusnu transdukciju, zbog toga, pokreće diferenciranje T-ćelija od naivnog ka TE fenotipu. U kombinaciji sa exvivo protokolima kultivisanja za povećanje broja transdukovanih T-ćelija do onog potrebnog za kliničku primenu (oko 10<9>-10<11>), T-ćelije su vođene ka više diferenciranom fenotipu, koji je suboptimalan za sistemsku istrajnost.

[0006] Tako, dok adoptivna T-ćelijska terapija, uključujući terapiju na bazi CAR T-ćelija, ima izuzetne terapeutske uspehe naročito u lečenju određenih hematoloških kancera u poslednjih nekoliko godina, efikasnost se samo pokazala kod manjeg broja vrsta kancera krvi i kod nekoliko vrsta čvrstih tumora. Postavljena je hipoteza da mala efikasnost lečenja može biti rezultat ograničenog preživljavanja T-ćelija nakon adoptivnog transfera.

[0007] Prema tome, ostaje potreba u tehnici za izmenjenim ili modifikovanim T-ćelijama koje pokazuju poboljšani centralni memorijski fenotip i poboljšano preživljavanje nakon adoptivnog transfera.

Posebno, ostaje potreba za obezbeđivanjem imunih ćelija, naročito T-ćelija, koje se mogu koristiti za adoptivnu terapiju, koje posebno podržavaju efikasno lečenje kancera i u širokim razmerama.

KRATAK SADRŽAJ PRONALASKA

[0008] Pronalazači su sad iznenađujuće otkrili da T-ćelije defektne za Suv39h1 nose poboljšan centralni memorijski fenotip i poboljšano preživljavanje nakon adoptivnog transfera. Posebno, pronalazači su pokazali da se T-ćelije defektne za Suv39h1 akumuliraju i reprogramiraju sa povećanom efikasnošću u centrale memorijske T-ćelije koje dugo žive i koje eksprimiraju i CD44 i CD62L. Prema tome, ovaj pronalazak odnosi se na izmenjene ili modifikovane imune ćelije, naročito modifikovane T-ćelije, kod kojih je Suv39h1 inaktiviran.

[0009] Pomenute izmenjene ili modifikovane imune ćelije su, prema tome, od velikog interesa za njihovu upotrebu u adoptivnoj terapiji. Zbog toga se ovaj pronalazak određenije odnosi na modifikovanu ili izmenjenu imunu ćeliju defektnu za Suv39h1, pri čemu ta imuna ćelija poželjno dalje obuhvata genetski modifikovani antigenski receptor koji specifično vezuje ciljani antigen.

[0010] Obično, modifikovana imuna ćelija prema patentnom zahtevu 1 predstavlja T-ćeliju ili NK ćeliju, naročito CD4+ ili CD8+ T-ćeliju. Poželjne ćelije mogu biti odabrane od TNćelija, TSCM, TCMili TEMćelija i njihove kombinacije.

[0011] Obično je, takođe, modifikovana imuna ćelija izolovana iz nekog subjekta. Poželjno, pomenuti subjekat boluje od nekog kancera ili je u riziku da oboli od nekog kancera.

[0012] Ciljani antigen za koji se genetski modifikovani antigenski receptor specifično vezuje, poželjno se eksprimira na ćelijama kancera i/ili je univerzalni tumorski antigen.

[0013] Genetski modifikovani antigenski receptor može biti himerni antigenski receptor (CAR) koji obuhvata vanćelijski domen za prepoznavanje antigena koji specifično vezuje ciljani antigen. Genetski modifikovani antigenski receptor može takođe da bude T-ćelijski receptor (TCR).

[0014] Poželjno, aktivnost i/ili ekspresija Suv39h1-a u pomenutoj modifikovanoj imunoj ćeliji selektivno je inhibirana ili blokirana. U jednom načinu ostvarivanja, pomenuta modifikovana imuna ćelija eksprimira Suv39h1 nukleinsku kiselinu koja kodira nefunkcionalni Suv39h1 protein.

[0015] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak za proizvodnju genetski modifikovanih imunih ćelija, koji obuhvata fazu koja se sastoji od inhibicije ekspresije i/ili aktivnosti Suv39h1-a u imunoj ćeliji; i fazu koja se sastoji od uvođenja u imunu ćeliju genetski modifikovanog antigenskog receptora koji se specifično vezuje za ciljani antigen.

[0016] Poželjno, inhibicija aktivnosti i/ili ekspresije Suv39h1-a obuhvata kontakt ili uspostavljanje kontakta ćelija sa najmanje nekim agensom koji inhibira ekspresiju i/ili aktivnost Suv39h1-a i/ili ometanje Suv39h1 gena. Pomenuti agens može biti odabran od inhibitora malih molekula; derivata antitela, aptamera, molekula nukleinskih kiselina koje blokiraju transkripciju ili translaciju ili agenasa za editovanje gena.

[0017] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na modifikovanu imunu ćeliju kao što je opisano ovde ili kompoziciju koja obuhvata pomenutu modifikovanu imunu ćeliju, za upotrebu u adoptivnoj ćelijskoj terapiji, naročito adoptivnoj terapiji kancera.

DETALJNI OPIS

Definicije

[0018] Pojam "antitelo" koristi se ovde u najširem smislu i uključuje poliklonalna i monoklonalna antitela, uključujući intaktna antitela i funkcionalne (antigen-vezujuće) fragmente antitela, uključujući antigen vezujući fragment (Fab) fragmente, F(ab')2 fragmente, Fab' fragmente, Fv fragmente, rekombinantne IgG (rlgG) fragmente, varijabilne regione teškog lanca (VH) koji mogu specifično da vezuju antigen, jednolančane fragmente antitela, uključujući jednolančane varijabilne fragmente (scFv) i fragmente jednodomenskih antitela (npr., sdAb, sdFv, nanotelo). Pojam obuhvata genetski modifikovane i/ili na drugi način izmenjene oblike imunoglobulina, kao što su intratela, peptitela, himerna antitela, potpuno humana antitela, humanizovana antitela i heterokonjugovana antitela, multispecifična, npr., bispecifična, antitela, dijatela, trijatela i tetratela, tandem di-scFv, tandem tri-scFv. Ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "antitelo" treba razumeti da obuhvata njegove funkcionalne fragmente antitela. Pojam takođe obuhvata intaktna ili antitela pune dužine, uključujući antitela bilo koje klase ili podklase, uključujući IgG i njegove podklase, IgM, IgE, IgA i IgD.

[0019] "Fragment antitela" odnosi se na molekul koji nije intaktno antitelo, koji obuhvata deo intaktnog antitela koji vezuje antigen za koji se vezuje intaktno antitelo. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; dijatela; linearna antitela; varijabilne regione teškog lanca (VH), jednolančane molekule antitela kao što su scFv i jednodomenska VH lančana antitela; i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela. U određenim načinima ostvarivanja, antitela su jednolančani fragmenti antitela koji obuhvataju varijabilni region teškog lanca i/ili varijabilni region lakog lanca, kao što su scFv.

[0020] "Jednodomenska antitela" su fragmenti antitela koji obuhvataju ceo ili deo varijabilnog domen teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. U određenim načinima ostvarivanja, jednodomensko antitelo je humano jednodomensko antitelo.

[0021] Kao što se ovde koristi, "represija" ekspresije gena odnosi se na uklanjanje ili smanjenje ekspresije jednog ili više genskih proizvoda kodiranih od strane predmetnog gena u ćeliji, u poređenju sa nivoom ekspresije genskog proizvoda u odsustvu represije. Primerni genski proizvodi uključuju mRNK i proteinske proizvode kodirane tim genom. Represija je u nekim slučajevima prolazna ili reverzibilna, a u drugim slučajevima je stalna. Represija je u nekim slučajevima funkcionalnog proteina ili mRNK ili pune dužine, uprkos činjenici da skraćeni ili nefunkcionalni proizvod može da se proizvede. U nekim načinima ostvarivanja ovde, genska aktivnost ili funkcija, nasuprot ekspresiji, je potisnuta. Represija gena se uopšteno indukuje veštačkim postupcima, tj., dodavanjem ili uvođenjem jedinjenja, molekula, kompleksa ili kompozicije i/ili ometanjem nukleinske kiseline gena ili povezane sa genom, kao što je na DNK nivou. Primeri postupaka represije gena uključuju tehnike utišavanja gena, nokdaun, nokaut i/ili ometanje gena, kao što je editovanje gena. Primeri uključuju antisensnu tehnologiju, kao što su RNKi, siRNK, shRNK i/ili ribozimi, koja uopšteno rezultuje prolaznim smanjenjem ekspresije, kao i tehnike editovanja gena koje rezultuju inaktivacijom ili ometanjem ciljanog gena, npr., indukcijom prekida i/ili homologne rekombinacije.

[0022] Kao što se ovde koristi, "ometanje" gena odnosi se na promenu u sekvenci gena, na DNK nivou. Primeri uključuju umetanja, mutacije i delecije. Ometanja obično rezultuju represijom i/ili potpunim odsustvom ekspresije normalnog proizvoda ili proizvoda "divljeg tipa" kodiranog genom. Primer tih ometanja gena su umetanja, mutacijom pomeranja okvira čitanja i mutacijom pogrešnog smisla, brisanja, nokin i nokaut gena ili dela gena, uključujući brisanja celog gena. Takva ometanja mogu da se jave u kodirajućem regionu, npr., u jednom ili više eksona, što dovodi do nemogućnosti proizvodnje proizvoda pune dužine, funkcionalnog proizvoda ili bilo kojeg proizvoda, kao što je umetanjem stop kodona. Takva ometanja mogu takođe da se jave ometanjem u promoteru ili pojačivaču ili drugom regionu koji utiče na aktivaciju transkripcije, kako bi se sprečila transkripcija gena. Ometanja gena uključuju ciljanje gena, uključujući inaktivaciju ciljanog gena homolognom rekombinacijom.

Ćelije ovog pronalaska

[0023] Ćelije prema ovom pronalasku obično su eukariotske ćelije, kao što su ćelije sisara (koje se u ovom pronalasku nazivaju i životinjske ćelije), npr., humane ćelije.

[0024] Određenije, ćelije ovog pronalaska dobijaju se iz krvi, koštane srži, limfe ili limfoidnih organa (naročito timus) i to su ćelije imunog sistema (tj., imune ćelije), kao što su ćelije urođenog ili adaptivnog imuniteta, npr., mijeloidne ili limfoidne ćelije, uključujući limfocite, obično T-ćelije i/ili NK ćelije.

[0025] Poželjno prema ovom pronalasku, ćelije su naročito limfociti uključujući T-ćelije, B ćelije i NK ćelije.

[0026] Ćelije prema ovom pronalasku mogu takođe da budu progenitori imunih ćelija, kao što su limfoidni progenitori, a poželjnije progenitori T-ćelija.

[0027] Progenitori T-ćelija obično izražavaju skup konsenzus markera uključujući CD44, CD117, CD135 i Sca-1, a vidi takođe Petrie HT, Kincade PW. Many roads, one destination for T cell progenitors. The Journal of Experimental Medicine.2005;202(1):11-13.

[0028] Ćelije su obično primarne ćelije, kao što su one izolovane direktno iz subjekta i/ili izolovane iz subjekta i zamrznute.

[0029] U vezi sa subjektom koji se tretira, ćelije ovog pronalaska mogu biti alogene i/ili autologne.

[0030] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije uključuju jedan ili više podskupova T-ćelija ili druge vrste ćelija, kao što su cele populacije T-ćelija, CD4+ ćelije, CD8+ ćelije i njihove subpopulacije, kao što su one definisane funkcijom, stanjem aktivacije, zrelošću, potencijalom za diferenciranjem, širenjem, recirkulacijom, lokalizacijom i/ili kapacitetima istrajnosti, antigenskom specifičnošću, vrstom antigenskog receptora, prisustvom u određenom organu ili odeljku, profilom izlučivanja markera ili citokina i/ili stepenom diferenciranja.

[0031] Među podvrstama i subpopulacijama T-ćelija i/ili CD4+ i/ili CD8+ T-ćelija su naivne T (TN) ćelije, efektorske T-ćelije (TEFF), memorijske T-ćelije i njihove podvrste, kao što su memorija matičnih ćelija T (TSCM), centralne memorijske T-ćelije (TCM), efektorske memorijske T (TEM) ili terminalno diferencirane efektorske memorijske T-ćelije, tumor-infiltrirajući limfociti (TIL), nezrele T-ćelije, zrele T-ćelije, pomoćne T-ćelije, citotoksične T-ćelije, mukoza-povezane invarijantne T (MAIT) ćelije, prirodne i adaptivne regulatorne T (Treg) ćelije, pomoćne T-ćelije, kao što su TH1 ćelije, TH2 ćelije, TH3 ćelije, TH17 ćelije, TH9 ćelije, TH22 ćelije, folikularne pomoćne T-ćelije, alfa/beta T-ćelije i delta/gama T-ćelije. Poželjno, ćelije prema ovom pronalasku su TEFFćelije sa svojstvima matičnih/memorijskih i većim kapacitetom rekonstitucije zbog inhibicije Suv39h1, kao i TNćelije, TSCM, TCM, TEMćelije i njihove kombinacije.

[0032] U nekim načinima ostvarivanja, jedna ili više populacija T-ćelija obogaćena je ili iscrpljena ćelijama koje su pozitivne za ili eksprimiraju visoke nivoe jednog ili više određenih markera, kao što su površinski markeri ili koje su negativne za ili eksprimiraju relativno niske nivoe jednog ili više markera. U nekim slučajevima, takvi markeri su oni koji nisu prisutnu ili koji su eksprimirani na relativno niskim nivoima na određenim populacijama T-ćelija (kao što su ne-memorijske ćelije), ali su prisutni ili eksprimirani na relativno visokim nivoima na određenim drugim populacijama T-ćelija (kao što su memorijske ćelije). U jednom načinu ostvarivanja, ćelije (kao što su CD8<+>ćelije ili T-ćelije, npr., CD3<+>ćelije) obogaćene su za (tj., pozitivno odabrane za) ćelije koje su pozitivne ili eksprimiraju visoke površinske nivoe CD117, CD135, CD45RO, CCR7, CD28, CD27, CD44, CD127 i/ili CD62L i/ili iscrpljene (npr., negativno odabrane za) ćelijama koje su pozitivne za ili eksprimiraju visoke površinske nivoe CD45RA. U nekim načinima ostvarivanja, ćelije su obogaćene ili iscrpljene ćelijama pozitivnim ili koje eksprimiraju visoke površinske nivoe CD122, CD95, CD25, CD27 i/ili IL7-Ra (CD127). U nekim primerima, CD8+ T-ćelije su obogaćene ćelijama pozitivnim za CD45RO (ili negativnim za CD45RA) i za CD62L.

[0033] Na primer, prema ovom pronalasku, ćelije mogu da uključuju populaciju CD4+ T-ćelija i/ili subpopulaciju CD8+ T-ćelija, npr., subpopulacija obogaćena centralnim memorijskim (TCM) ćelijama. Alternativno, ćelije mogu biti druge vrste limfocita, uključujući (NK) ćelije prirodne ubice, MAIT-ćelije, urođene limfoidne ćelije (ILC) i B ćelije.

[0034] Ćelije i kompozicije koje sadrže te ćelije za modifikovanje prema ovom pronalasku izolovane su iz uzorka, naročito biološkog uzorka, npr., dobijenog od ili izolovanog iz subjekta. Obično je subjekat onaj kom je potrebna ćelijska terapija (adoptivna ćelijska terapija) i/ili je onaj koji će primiti ćelijsku terapiju. Subjekat je poželjno sisar, naročito čovek. U jednom načinu ostvarivanja ovog pronalaska, subjekat ima kancer.

[0035] Uzorci uključuju tkivo, fluid i ostale uzorke uzete direktno iz subjekta, kao i uzorke dobijene iz jedne ili više faza obrade, kao što su separacija, centrifugiranje, genetički inženjering (na primer, transdukcija sa virusnim vektorom), ispiranje i/ili inkubacija. Biološki uzorak može biti uzorak dobijen direktno iz biološkog izvora ili uzorak koji je obrađen. Biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, telesne tečnosti, kao što su krv, plazma, serum, cerebrospinalna tečnost, sinovijalna tečnost, urin i znoj, uzorci tkiva i organa, uključujući obrađene uzorke dobijene od njih. Poželjno, uzorak iz kog su ćelije dobijene ili izolovane je krv ili uzorak dobijen iz krvi ili jeste ili je dobijen od proizvoda afereze ili leukafereze. Primeri uzoraka uključuju celokupnu krv, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), leukocite, koštanu srž, timus, biopsiju krvi, tumor, leukemiju, limfom, limfni čvor, limfoidno tkivo povezano sa crevima, limfoidno tkivo povezano sa mukozom, slezinu, druga limfoidna tkiva i/ili ćelije izvedene iz njih. Uzorci uključuju, u kontekstu ćelijske terapije (obično adoptivne ćelijske terapije), uzorke iz autolognih i alogenih izvora.

[0036] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije su dobijene iz ćelijskih linija, npr., T-ćelijskih linija. Ćelije mogu takođe da se dobiju iz ksenogenog izvora, kao što je miš, pacov, nehumani primat ili svinja.

Poželjno, ćelije su humane ćelije.

Ćelije defektne za Suv39h1

[0037] Kao što se ovde koristi pojam "Suv39h1" ili "H3K9-histon metiltransferaza Suv39h1" ima opšte značenje u tehnici i odnosi se na histonsku metiltransferazu "supresor raznolikosti 3-9 homologa 1 (Drozofila)" koji specifično trimetiluje Lys-9 ostatak histona H3 pomoću monometilovanog H3-Lys-9 kao supstrat (vidi takođe Aagaard L, Laible G, Selenko P, Schmid M, Dorn R, Schotta G, Kuhfittig S, Wolf A, Lebersorger A, Singh PB, Reuter G, Jenuwein T (Jun 1999). " Functional mammalian homologues of the Drosophila PEVmodifier Su(var)3-9 encode centromere-associated proteins which complex with the heterochromatin component M31 " . EMBO J 18 (7): 1923-38.). Pomenuta histon metiltransferaza takođe je poznata kao MG44, KMT1A, SUV39H, SUV39H1, histon-lizin N-metiltransferaza SUV39H1, H3-K9-HMTaza 1, OTTHUMP00000024298, Su(var)3-9 homolog 1, lizin N-metiltransferaza 1A, histon H3-K9 metiltransferaza 1, položaj-efekat raznolikost 3-9 homolog, histon-lizin N-metiltransferaza ili H3 lizin-9 specifični 1. Humana Suv39h1 metiltransferaza je označena 043463 u UNIPROT i kodirana je pomoću gena Suv39h1 smeštenog na hromozomu x (gen ID: 6839 u NCBI). Pojam Suv39h1 prema ovom pronalasku takođe obuhvata sve ortologe SUV39H1-a kao što je SU(VAR)3-9.

[0038] Kao što se ovde koristi izraz "defektna za Suv39h1" prema ovom pronalasku odnosi se na inhibiciju ili blokadu aktivnosti Suv39h1-a (tj., metilacija Lys-9 histona H3 od strane H3K9-histon metiltransferaze) u ćeliji prema ovom pronalasku.

[0039] "Inhibicija aktivnosti Suv39h1-a" prema ovom pronalasku odnosi se na smanjenje aktivnosti Suv39h1-a od najmanje 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ili 99% ili više u poređenju sa aktivnošću ili nivoom Suv39h1 proteina koji nije inhibiran. Poželjno, inhibicija aktivnosti Suv39h1-a dovodi do odsustva u ćeliji znatne detektabilne aktivnosti Suv39h1-a.

[0040] Inhibicija aktivnosti Suv39h1-a takođe se može postići represijom ekspresije Suv39h1 gena ili ometanjem Suv39h1 gena. Prema ovom pronalasku, pomenuta represija smanjuje ekspresiju Suv39h1-a u ćeliji, naročito imunoj ćeliji ovog pronalaska za najmanje 50, 60, 70, 80, 90 ili 95 % u odnosu na istu ćeliju proizvedenu postupkom u odsustvu represije. Ometanje gena može takođe da dovede do smanjene ekspresije Suv39h1 proteina ili do ekspresije nefunkcionalnog Suv39h1 proteina.

[0041] Pod "nefunkcionalnim" Suv39h1 proteinom ovde se podrazumeva protein sa smanjenom aktivnošću ili nedostatkom detektabilne aktivnosti kao što je opisano gore.

[0042] Tako inhibitori aktivnosti Suv39h1-a u ćeliji prema ovom pronalasku mogu biti odabrani između bilo kog jedinjenja ili agensa koji prirodno ima ili nema sposobnost inhibicije metilacije Lys-9 histona H3 H3K9-histon metiltransferazom ili inhibicije ekspresije SUV39H1 gena H3K9-histon metiltransferaze.

[0043] Inhibicija Suv39h1-a u imunoj ćeliji prema ovom pronalasku može biti trajna i nepovratna ili prolazna ili povratna. Poželjno, međutim, Suv39h1 inhibicija je trajna i nepovratna. Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji može se postići pre ili posle ubrizgavanja ćelije u ciljanog pacijenta kao što je opisano u nastavku.

Genetski modifikovane ćelije prema ovom pronalasku

[0044] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije obuhvataju jednu ili više nukleinskih kiselina uvedenih putem genetskog inženjeringa koje kodiraju jedan ili više antigenskih receptora.

[0045] Obično su nukleinske kiseline heterologne, (tj., na primer koje se obično ne nalaze u ćeliji koja se modifikuje i/ili u organizmu iz kog se takva ćelija izoluje). U nekim načinima ostvarivanja, nukleinske kiseline ne javljaju se prirodno, uključujući himerne kombinacije nukleinskih kiselina koje kodiraju razne domene iz višestrukih različitih vrsta ćelija.

[0046] Među antigenskim receptorima prema ovom pronalasku su genetski modifikovani T-ćelijski receptori (TCR) i njihove komponente, kao i funkcionalni ne-TCR antigenski receptori, kao što su himerni antigenski receptori (CAR).

Himerni antigenski receptori (CAR)

[0047] U nekim načinima ostvarivanja, modifikovani antigenski receptori obuhvataju himerne antigenske receptore (CAR), uključujući aktivirajuće ili stimulatorne CAR, kostimulatorne CAR

(vidi WO2014/055668) i/ili inhibitorne CAR (iCAR, vidi Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (Decembar, 2013)).

[0048] Himerni antigenski receptori (CAR), (takođe poznati kao himerni imunoreceptori, himerni T-ćelijski receptori, veštački T-ćelijski receptori) su modifikovani receptori, koji kaleme proizvoljnu specifičnost na imunu efektorsku ćeliju (T-ćelija). Obično se ovi receptori koriste da kaleme specifičnost monoklonalnog antitela na T-ćeliju, sa prenosom njihove kodirajuće sekvence koji je olakšan retrovirusnim vektorima.

[0049] CAR uopšteno uključuju vanćelijski antigen (ili ligand) vezujući domen vezan za jednu ili više unutarćelijskih komponenata signalizacije, u nekim aspektima preko linkera i/ili transmembranskog(ih) domena. Takvi molekuli obično oponašaju ili približavaju signal putem prirodnog antigenskog receptora, signal putem receptora u kombinaciji sa kostimulatornim receptorom i/ili signal putem samo kostimulatornog receptora.

[0050] U nekim načinima ostvarivanja, CAR je konstruisan sa specifičnošću za određeni antigen (ili marker ili ligand), kao što je antigen eksprimiran u određenoj vrsti ćelija koja se cilja adoptivnom terapijom, kao što je kancer marker. Tako, CAR obično uključuje u svom vanćelijskom delu jedan ili više antigen vezujućih molekula, kao što je jedan ili više antigen-vezujući fragment, domen ili deo ili jedan ili više varijabilnih domena antitela i/ili molekula antitela.

[0051] Ostaci korišćeni da vežu antigen spadaju u tri opšte kategorije, ili jednolančani fragmenti antitela (scFv) dobijeni iz antitela, Fab odabrani iz biblioteka ili prirodni ligandi koji uključuju svoj srodni receptor (za prvu generaciju CAR). Uspešni primeri u svakoj od ovih kategorija su naročito objavljeni u Sadelain M, Brentjens R, Riviere I. The basic principles of chimeric antigen receptor (CAR) design. Cancer discovery.

2013; 3(4):388-398 (vidi naročito tabelu 1) i uključeni su u ovu prijavu. scFv izvedeni iz mišjeg imunoglobulina često se koriste, jer se jednostavno dobijaju iz dobro okarakterisanih monoklonalnih antitela.

[0052] Obično, CAR ukuljučuje antigen-vezujući deo ili delove molekula antitela, kao što je jednolančani fragment antitela (scFv) izveden iz varijabilnih teških (VH) i varijabilnih lakih (VL) lanaca monoklonalnog antitela (mAb).

[0053] U nekim načinima ostvarivanja, CAR obuhvata domen teškog lanca antitela koji specifično vezuje antigen, kao što je kancer marker ili antigen ćelijske površine ćelije ili bolesti koja se cilja, kao što je tumorska ćelija ili ćelija kancera, kao što je bilo koji od ciljanih antigena opisanih ovde ili poznatih u tehnici.

[0054] U nekim načinima ostvarivanja, CAR sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment (npr. scFv) koji specifično prepoznaje antigen, kao što je intaktni antigen, eksprimiran na površini ćelije.

[0055] U nekim načinima ostvarivanja, CAR sadrži TCR-slično antitelo, kao što je antitelo ili antigenvezujući fragment (npr. scFv) koji specifično prepoznaje unutarćelijski antigen, kao što je tumor-povezan antigen, prisutan na ćelijskoj površini kao MHC-peptidni kompleks. U nekim načinima ostvarivanja, antitelo ili njegov antigen-vezujući deo koji prepoznaje MHC-peptidni kompleks može biti eksprimiran na ćelijama kao deo rekombinantnog receptora, kao što je antigenski receptor. Među antigenskim receptorima su funkcionalni ne-TCR antigenski receptori, kao što su himerni antigenski receptori (CAR). Uopšteno, CAR koji sadrži antitelo ili antigen-vezujući fragment koji pokazuje TCR-sličnu specifičnost usmerenu protiv peptid-MHC kompleksa takođe može da se označi kao TCR-sličan CAR.

[0056] U nekim aspektima, komponenta koja specifično vezuje ili prepoznaje antigen vezana je za jedan ili više transmembranskih i unutarćelijskih domena signalizacije. U nekim načinima ostvarivanja, CAR uključuje transmembranski domen fuziran sa vanćelijskim domenom CAR-a. U jednom načinu ostvarivanja, koristi se transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u CAR. U nekim primerima, transmembranski domen odabran je ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom da bi se izbeglo vezivanje takvih domena za transmembranske domene istih ili različitih površinskih membranskih proteina radi minimiziranja interakcija sa drugim članovima receptorskog kompleksa.

[0057] Transmembranski domen u nekim načinima ostvarivanja dobijen je ili iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodan, domen se može izolovati iz bilo kog membrana-vezanog ili transmembranskog proteina. Transmembranski regioni uključuju one izvedene iz (tj. obuhvataju najmanje transmembranski region(e) iz) alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, CD28, CD3 epsilon,

1

CD45, CD4, CD5, CDS, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD 134, CD137, CD 154). Transmembranski domen takođe može biti sintetički.

[0058] U nekim načinima ostvarivanja, kratki oligopeptidni ili polipeptidni linker, na primer, linker dužine između 2 i 10 aminokiselina, prisutan je i obrazuje vezu između transmembranskog domena i citoplazmatičnog domena signalizacije CAR-a.

[0059] CAR uopšteno uključuje najmanje jednu unutarćelijsku komponentu ili komponente signalizacije. CAR prve generacije obično su imali unutarćelijski domen iz CD3 ζ- lanca, koji je primarni transmiter signala od endogenih TCR. CAR druge generacije obično dalje obuhvataju unutarćelijske domene signalizacije iz različitih kostimulatornih proteinskih receptora (npr., CD28, 41BB, ICOS) do citoplazmatičnog produžetka CAR-a da bi se obezbedili dodatni signali T-ćeliji. Preklinička ispitivanja ukazala su da druga generacija poboljšava antitumorsku aktivnost T-ćelija. Skorije, CAR treće generacije kombinuju višestruke domene signalizacije, kao što su CD3z-CD28-41BB ili CD3z-CD28-OX40, radi povećanja potentnosti.

[0060] Na primer, CAR može da uključuje unutarćelijsku komponentu TCR kompleksa, kao što je TCR CD3+ lanac koji posreduje aktivaciju i citotoksičnost T-ćelija, npr., CD3 zeta lanac. Tako, u nekim aspektima, antigen vezujući molekul je vezan za jedan ili više modula ćelijske signalizacije. U nekim načinima ostvarivanja, moduli ćelijske signalizacije uključuju CD3 transmembranski domen, CD3 domene unutarćelijske signalizacije i/ili druge CD transmembranske domene. CAR može takođe dalje da uključuje deo jednog ili više dodatnih molekula kao što su Fc receptor γ, CD8, CD4, CD25 ili CD16.

[0061] U nekim načinima ostvarivanja, nakon ligacije CAR-a, citoplazmatični domen ili unutarćelijski domen signalizacije CAR-a aktivira najmanje jednu od normalnih efektorskih funkcija ili odgovora odgovarajuće ne-modifikovane imune ćelije (obično T-ćelija). Na primer, CAR može da indukuje funkciju T-ćelije kao što su citolitička aktivnost ili T-pomoćna aktivnost, sekrecija citokina ili drugi faktori.

[0062] U nekim načinima ostvarivanja, unutarćelijski domen(i) signalizacije uključuje(u) citoplazmatične sekvence T-ćelijskog receptora (TCR) i u nekim aspektima takođe one ko-receptora koji u prirodnom kontekstu deluju u saradnji sa takvim receptorom radi iniciranja signalne transdukcije koja prati angažovanje antigenskog receptora i/ili bilo koji derivat ili varijantu tih molekula i/ili bilo koju sintetičku sekvencu koja ima istu funkcionalnu sposobnost.

[0063] T-ćelijska aktivacija je, u nekim aspektima, opisana kao posredovana dvema klasama citoplazmatičnih sekvenci signalizacije: one koje iniciraju antigen-zavisnu primarnu aktivaciju putem TCR (primarne citoplazmatične sekvence signalizacije) i one koje deluju na antigen-nezavisan način da bi se obezbedio sekundarni ili ko-stimulatorni signal (sekundarne citoplazmatične sekvence signalizacije). U nekim aspektima, CAR uključuje jednu ili obe te komponente signalizacije.

[0064] U nekim aspektima, CAR uključuje primarnu citoplazmatičnu sekvencu signalizacije koja reguliše primarnu aktivaciju TCR kompleksa ili na stimulatorni način ili na inhibitorni način. Primarne citoplazmatične sekvence signalizacije koje deluju na stimulatorni način mogu da sadrže motive signalizacije koji su poznati kao aktivacioni motivi na bazi imunoreceptorskog tirozina ili ITAM. Primeri ITAM-a koji sadrže primarne citoplazmatične sekvence signalizacije uključuju one izvedene iz TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CDS, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. U nekim načinima ostvarivanja, citoplazmatični molekul(i) signalizacije u CAR sadrži(e) citoplazmatični domen signalizacije, njegov deo ili sekvencu izvedenu iz CD3 zeta.

[0065] CAR može takođe da uključuje domen signalizacije i/ili transmembranski deo kostimulatornog receptora, kao što su CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 i ICOS. U nekim aspektima, isti CAR uključuje i aktivacione i kostimulatorne komponente; alternativno, aktivacioni domen obezbeđen je jednim CAR, dok je kostimulatorna komponenta obezbeđena drugim CAR koji prepoznaje drugi antigen.

[0066] CAR ili drugi antigenski receptor takođe može da bude inhibitorni CAR (npr. iCAR) i uključuje unutarćelijske komponente koje prigušuju ili potiskuju odgovor, kao što je imunološki odgovor. Primeri takvih unutarćelijskih komponenata signalizacije su oni pronađeni na molekulima imunoloških kontrolnih tačaka, uključujući PD-1, CTLA4, LAG3, BTLA, OX2R, TIM-3, TIGIT, LAIR-1, PGE2 receptore, EP2/4 adenozin receptore koji uključuju A2AR. U nekim aspektima, modifikovana ćelija uključuje inhibitorni CAR koji uključuje domen signalizacije od ili izveden iz takvog inhibitornog molekula, tako da služi da priguši odgovor od. Takvi CAR se koriste, na primer, da smanje verovatnoću off-target efekata kada je antigen prepoznat od strane aktivacionog receptora, npr., CAR, takođe eksprimiran ili može takođe da se eksprimira na površini normalne ćelije.

TCR

[0067] U nekim načinima ostvarivanja, genetski modifikovani antigenski receptori uključuju rekombinantne T-ćelijske receptore (TCR) i/ili TCR klonirane od prirodnih T-ćelija.

[0068] "T-ćelijski receptor" ili "TCR" odnosi se na molekul koji sadrži varijabilne a i β lance (takođe poznati kao TCRa i TCRp, tim redom) ili varijabilne γ i δ lance (takođe poznate kao TCRy i TCR5, tim redom) i koji može da se specifično vezuje za antigenski peptid vezan za MHC receptor. U nekim načinima ostvarivanja, TCR je u αβ obliku. Obično, TCR koji postoje u αβ i γδ oblicima su uopšteno strukturno slični, ali T-ćelije koje ih eksprimiraju mogu da imaju različite anatomske lokacije ili funkcije. TCR može se nalaziti na površini ćelije ili u rastvorljivom obliku. Uopšteno, TCR se nalazi na površini T-ćelija (ili T limfocita) gde je uopšteno odgovoran za prepoznavanje antigena vezanih za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). U nekim načinima ostvarivanja, TCR takođe sadrži konstantni domen, transmembranski domen i/ili kratki citoplazmatični produžetak (vidi, npr., Janeway et ah, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3. izd., Current Biology Publications, p.4:33, 1997). Na primer, u nekim aspektima, svaki lanac TCR-a može da ima jedan N-terminalni imunoglobulinski varijabilni domen, jedan imunoglobulinski konstantni domen, transmembranski region i kratki citoplazmatični produžetak na C-terminalnom kraju. U nekim načinima ostvarivanja, TCR je povezan sa invarijantnim proteinima CD3 kompleksa uključenih u posredovanje signalne transdukcije. Ukoliko nije drugačije naznačeno, pojam "TCR" treba razumeti da obuhvata njihove funkcionalne TCR fragmente. Pojam takođe obuhvata intaktne ili TCR pune dužine, uključujući TCR u αβ obliku ili γδ obliku.

[0069] Prema tome, za svrhe ovde, referenca za TCR uključuje bilo koji TCR ili funkcionalni fragment, kao što je antigen-vezujući deo TCR-a koji se vezuje za specifični antigenski peptid vezan u MHC molekulu, tj. MHC-peptidni kompleks. "Antigen-vezujući deo" ili antigen-vezujući fragment" TCR-a, koji mogu da se koriste naizmenično, odnosi se na molekul koji sadrži deo strukturnih domena TCR-a, ali koji vezuje antigen (npr. MHC-peptidni kompleks) za koji se ceo TCR vezuje. U nekim slučajevima, antigen-vezujući deo sadrži varijabilne domene TCR-a, kao što je varijabilni a lanac i varijabilni β lanac TCR-a, dovoljan da obrazuje vezujuće mesto za vezivanje za specifični MHC-peptidni kompleks, kao što je uopšteno gde svaki lanac sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost.

[0070] U nekim načinima ostvarivanja, varijabilni domeni TCR lanaca se udružuju kako bi obrazovali petlje ili regione koji određuju komplementarnost (CDR) analogno imunoglobulinima, koji dodeljuju prepoznavanje antigena i određuju specifičnost za peptid obrazovanjem vezujućeg mesta TCR molekula određuju specifičnost za peptid. Obično, poput imunoglobulina, CDR su razdvojeni okvirnim regionima (FR) {vidi, npr., Jores et al., Pwc. Nat'lAcad. Sci. U.S.A.87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J.7:3745, 1988; vidi takođe Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol.27:55, 2003). U nekim načinima ostvarivanja, CDR3 je glavni CDR odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, iako se takođe pokazalo da CDR1 alfa lanca da uzajamno reaguje sa N-terminalnim delom antigenskog peptida, dok CDR1 beta lanca uzajamno reaguje sa C-terminalnim delom peptida. Smatra se da CDR2 prepoznaje MHC molekul. U nekim načinima ostvarivanja, varijabilni region β-lanca može da sadrži dalji region hipervarijabilnosti (HV4).

[0071] U nekim načinima ostvarivanja, TCR lanci sadrže konstantni domen. Na primer, poput imunoglobulina, vanćelijski deo TCR lanaca {npr., a-lanac, β-lanac) može da sadrži dva imunoglobulinska domena, varijabilni domen {npr., Va ili Vp; obično aminokiseline 1 do 116 na osnovu Kabat numerisanja Kabat et al., " Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5. izd.) na N-kraju i jedan konstantni domen {npr., konstantni domen a-lanca ili Ca, obično aminokiseline 117 do 259 na osnovu Kabat, konstantni domen β-lanca ili Cp, obično aminokiseline 117 do 295 na osnovu Kabat) pored ćelijske membrane. Na primer, u nekim slučajevima, vanćelijski deo TCR-a obrazovanog od dva lanca sadrži dva membrana-proksimalna konstantna domena i dva membrana-distalna varijabilna domena koji sadrže CDR. Konstantni domen TCR domena sadrži kratke povezujuće sekvence u kojima ostatak cisteina obrazuje disulfidnu vezu, čineći spoj između dva lanca. U nekim načinima ostvarivanja, TCR može da ima

1

dodatni ostatak cisteina u svakom od a i β lanaca tako da TCR sadrži dve disulfidne veze u konstantnim domenima.

[0072] U nekim načinima ostvarivanja, TCR lanci mogu da sadrže transmembranski domen. U nekim načinima ostvarivanja, transmembranski domen je pozitivno naelektrisan. U nekim slučajevima, TCR lanci sadrže citoplazmatični produžetak. U nekim slučajevima, struktura omogućava da se TCR poveže sa drugim molekulima poput CD3. Na primer, TCR koji sadrži konstantne domene sa transmembranskim regionom može da usidri protein u ćelijskoj membrani i poveže sa invarijantnim subjedinicama CD3 aparata ili kompleksa signalizacije.

[0073] Uopšteno, CD3 je multi-proteinski kompleks koji može da poseduje tri različita lanca (γ, δ i ε) kod sisara i ζ-lanac. Na primer, kod sisara, kompleks može da sadrži CD3y lanac, CD35 lanac, dva CD3s lanca i homodimer CD3ζ lanaca. CD3y, CD35 i CD3s lanci su visoko srodni proteini ćelijske površine superfamilije imunoglobulina koji sadrže jedan imunoglobulinski domen. Transmembranski regioni CD3y, CD35 i CD3s lanaca su negativno naelektrisani, što je karakteristika koja omogućava da se ovi lanci vezuju za pozitivno naelektrisane lance T-ćelijskih receptora. Unutarćelijski produžeci CD3y, CD35 i CD3s lanaca, svaki, sadrže jedan očuvan motiv poznat kao aktivacioni motiv na bazi imunoreceptorskog tirozina ili ITAM, dok svaki CD3ζ lanac ima tri. Uopšteno, ITAM su uključeni u kapacitet signalizacije TCR kompleksa. Ovi pomoćni molekuli imaju negativno naelektrisane transmembranske regione i imaju ulogu u širenju signala od TCR u ćeliju. CD3- i ζ-lanci, zajedno sa TCR, obrazuju ono što je poznato kao T-ćelijski receptorski kompleks.

[0074] U nekim načinima ostvarivanja, TCR može biti heterodimer dva lanca a i β (ili opciono γ i δ) ili može biti jednolančani TCR konstrukt. U nekim načinima ostvarivanja, TCR je heterodimer koji sadrži dva zasebna lanca (a i β lance ili γ i δ lance) koji su povezani, kao što je disulfidnom vezom ili disulfidnim vezama.

[0075] Primeri antigenskih receptora, uključujući CAR i rekombinantne TCR, kao i postupaka za modifikovanje i uvođenje tih receptora u ćelije, uključuju one opisane, na primer, u međunarodnim prijavama patenata, brojevi objava WO200014257, WO2013126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061, U.S. prijavama patenata, brojevi objava US2002131960, US2013287748, US20130149337, U.S. patentima br.: 6,451,995, 7,446,190, 8,252,592, , 8,339,645, 8,398,282, 7,446,179, 6,410,319, 7,070,995, 7,265,209, 7,354,762, 7,446,191, 8,324,353 i 8,479,118 i prijavi evropskog patenta broj EP2537416 i/ili one opisane od strane Sadelain et al., Cancer Discov. April 2013.; 3(4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., Oktobar 2012.; 24(5): 633-39; Wu et al., Cancer, Mart 2012.18(2): 160-75. U nekim aspektima, genetski modifikovani antigenski receptori uključuju CAR kao što je opisano u U.S. patentu br.: 7,446,190 i one opisane u objavi međunarodne prijave patenta br.: WO/2014055668 A1.

Antigeni

[0076] Mađu antigenima ciljanim genetski modifikovanim antigenskim receptorima su oni eksprimirani u kontekstu bolesti, stanja ili vrste ćelije koji se ciljaju adoptivnom ćelijskom terapijom. Među bolestima i stanjima su proliferativne, neoplastične i maligne bolesti i stanja, određenije kanceri.

[0077] Kancer može biti čvrsti kancer ili "tečni tumor" kao što su kanceri koji napadaju krv, koštanu srž i limfoidni sistem, takođe poznati kao tumori hematopoetskih i limfoidnih tkiva, koji naročito uključuju leukemiju i limfom. Tečni tumori uključuju, na primer, akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu limfocitnu leukemiju (ALL) i hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), (uključujući razne limfome kao što su limfom mantle ćelija, ne-Hodžkinsov limfom (NHL), adenom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom grkljana, kanceri žučne kese i žučnog kanala, kanceri mrežnjače kao što je retinoblastom).

[0078] Čvrsti kanceri naročito uključuju kancere koji pogađaju jedan od organa odabranih iz grupe koju čine kolon, rektum, koža, endometrijum, pluća (uključujući plućni karcinom ne-malih ćelija), materica, kosti (kao što su osteosarkom, hondrosarkomi, Juingov sarkom, fibrosarkomi, tumori džinovskih ćelija, adamantinomi i hordomi), jetra, bubreg, jednjak, želudac, bešika, pankreas, grlić materice, mozak (kao što su meningiomi, glioblastomi, astrocitomi nižeg stepena, oligodendrocitomi, tumori hipofize, švanomi i metastatski kanceri mozga), jajnik, dojke, region glave i vrata, testis, prostata i štitna žlezda.

[0079] Poželjno, kancer prema ovom pronalasku je kancer koji napada krv, koštanu srž i limfoidni sistem kao što je opisano gore. Obično, kancer jeste ili je povezan, sa multipli mijelomom.

[0080] Bolesti prema ovom pronalasku takođe obuhvataju infektivne bolesti ili stanja, kao što su, ali bez ograničenja na, virusne, retrovirusne, bakterijske i protozoalne infekcije, imunodeficijencija, citomegalovirus (CMV), Epštajn-Barov virus (EBV), adenovirus, BK poliomavirus; autoimune ili zapaljenske bolesti ili stanja, kao što su artritis, npr., reumatoidni artritis (RA), dijabetes tipa I, sistemski eritemski lupus (SLE), zapaljenska bolest creva, psorijaza, skleroderma, autoimuna bolest štitne žlezde, Grejvsova bolest, Kronova bolest multipla skleroza, astma i/ili bolesti ili stanja povezana sa transplantom.

[0081] U nekim načinima ostvarivanja, antigen je neki polipeptid. U nekim načinima ostvarivanja, to je neki ugljeno-hidrat ili drugi molekul. U nekim načinima ostvarivanja, antigen se selektivno eksprimira ili prekomerno eksprimira na ćelijama bolesti ili stanja, npr., tumor ili patogene ćelije, u odnosu na normalne ili neciljane ćelije ili tkiva. U drugim načinima ostvarivanja, antigen se eksprimira na normalnim ćelijama i/ili se eksprimira na modifikovanim ćelijama. U nekim takvim načinima ostvarivanja, višeciljni pristup i/ili pristup ometanja gena kao što je navedeno ovde, koristi se za poboljšanje specifičnosti i/ili efikasnosti.

1

[0082] U nekim načinima ostvarivanja, antigen je univerzalni tumorski antigen. Izraz "univerzalni tumorski antigen" odnosi se na imunogeni molekul, kao što je protein, to jest, uopšteno, eksprimiran na višem nivou u tumorskim ćelijama u odnosu na netumorske ćelije i takođe se eksprimira u tumorima različitog porekla. U nekim načinima ostvarivanja, univerzalni tumorski antigen eksprimira se u više od 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ili više humanih kancera. U nekim načinima ostvarivanja, univerzalni tumorski antigen eksprimira se u najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, najmanje šest, najmanje sedam, najmanje osam ili više različitih vrsta tumora. U nekim slučajevima, univerzalni tumorski antigen može da se eksprimira u netumorskim ćelijama, kao što su normalne ćelije, ali na nižim nivoima nego što se eksprimira u tumorskim ćelijama. U nekim slučajevima, univerzalni tumorski antigen uopšte se ne eksprimira u netumorskim ćelijama, kao što je da se ne eksprimira u normalnim ćelijama. Primeri univerzalnih tumorskih antigena uključuju, na primer, humanu reverznu transkriptazu telomeraze (hTERT), survivin, mišji dvostruki minutni 2 homolog (MDM2), citohrom P450 1B1 (CYP1B), HER2/neu, gen 1 Vilmsovog tumora (WT1), livin, alfafetoprotein (AFP), karcinoembrionski antigen (CEA), mucin 16 (MUC16), MUC1, prostata-specifični membranski antigen (PSMA), p53 ili ciklin (DI). Peptidni epitopi tumorskih antigena, koji uključuju univerzalne tumorske antigene, poznati su u tehnici i, u nekim aspektima, mogu da se koriste za generisanje MHC-ograničenih antigenskih receptora, kao što su TCR ili TCR-slični CAR (vidi npr. objavljenu PCT prijavu br. WO2011009173 ili WO2012135854 i objavljenu U.S. prijavu br. US20140065708).

[0083] U nekim aspektima, antigen se eksprimira na multipli mijelomu, kao što su CD38, CD138 i/ili CS-1. Drugi primeri antigena multipli mijeloma uključuju CD56, TIM-3, CD33, CD 123 i/ili CD44. Antitela ili antigen-vezujući fragmenti opisani protiv tih antigena poznati su i uključuju, na primer, one opisane u U.S. patentu br.8,153,765; 8,603477, 8,008,450; U.S. objavljenoj prijavi br. US20120189622; i objavljenoj međunarodnoj PCT prijavi br. WO2006099875, WO2009080829 ili WO2012092612. U nekim načinima ostvarivanja, takva antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti (npr. scFv) mogu da se koriste za generisanje CAR.

[0084] U nekim načinima ostvarivanja, antigen može biti onaj koji se eksprimira ili ushodno reguliše na ćelijama kancera ili tumorskim ćelija, ali koji takođe može da se eksprimira u imunoj ćeliji, kao što je mirujuća ili aktivirana T-ćelija. Na primer, u nekim slučajevima, prijavljeno je da je ekspresija hTERT, survivina i ostalih univerzalnih tumorskih antigena prisutna u limfocitima, uključujući aktivirane T limfocite (vidi npr., Weng et al. (1996) J Exp. Med., 183:2471-2479; Hathcock et al. (1998) J Immunol, 160:5702-5706; Liu et al. (1999) Proc. Natl Acad Sci., 96:5147-5152; Turksma et al. (2013) Journal of Translational Medicine, 11: 152). Slično, u nekim slučajevima, CD38 i drugi tumorski antigeni mogu takođe da se eksprimiraju u imunim ćelijama, kao što su T-ćelije, kao što su ushodno regulisani u aktiviranim T-ćelijama. Na primer, u nekim aspektima, CD38 je poznat marker aktivacije T-ćelija.

1

[0085] U nekim načinima ostvarivanja kao što je navedeno ovde, imuna ćelija, kao što je T-ćelija, može biti modifikovana da potisne ili prekine gen koji kodira antigen u imunoj ćeliji tako da eksprimirani genetski modifikovani antigenski receptor specifično ne vezuje antigen u kontekstu njegove ekspresije na samoj imunoj ćeliji. Tako, u nekim aspektima, na ovaj način mogu biti izbegnuti off-target efekti, kao što su vezivanje modifikovanih imunih ćelija za sebe, što može da smanji efikasnost modifikovanih imunih ćelija, na primer, u vezi sa adoptivnom ćelijskom terapijom.

[0086] U nekim načinima ostvarivanja, kao što je u slučaju inhibitornog CAR, meta je off-target marker, kao što je antigen koji se ne eksprimira na oboleloj ćeliji ili ćeliji koja se cilja, ali koji se eksprimira na normalnoj ili neoboleloj ćeliji koja takođe eksprimira bolest-specifičnu metu koja se cilja aktivacionim ili stimulatornim receptorom u istoj modifikovanoj ćeliji. Primeri tih antigena su MHC molekuli, kao što su MHC molekuli I klase, na primer, u vezi sa lečenjem bolesti ili stanja u kojima takvi molekuli postaju nishodno regulisani, ali se i dalje eksprimiraju u neciljanim ćelijama.

[0087] U nekim načinima ostvarivanja, modifikovane imune ćelije mogu da sadrže antigen koji cilja jedan ili više drugih antigena. U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više drugih antigena su tumorski antigen ili kancer marker. Drugi antigen ciljan antigenskim receptorima na obezbeđenim imunim ćelijama može, u nekim načinima ostvarivanja, da uključuje orfan receptor tirozin kinaze ROR1, tEGFR, Her2, LI-CAM, CD19, CD20, CD22, mezotelin, CEA i površinski antigen hepatitisa B, anti-folat receptor, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, EGP-2, EGP-4, EPHa2, ErbB2, 3 ili 4, FBP, fetalni acetiholin e receptor, GD2, GD3, HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, kdr, kapa laki lanac, Lewis Y, Ll-ćelijski adhezioni molekul, MAGE-A1, mezotelin, MUC1, MUC16, PSCA, NKG2D ligande, NY-ESO-1, MART-1, gplOO, onkofetalni antigen, ROR1, TAG72, VEGF-R2, karcinoembrionski antigen (CEA), specifični antigen prostate, PSMA, Her2/neu, estrogenski receptor, progesteronski receptor, efrinB2, CD 123, CS-1, c-Met, GD-2 i MAGE A3, CE7, Vilmsov tumor 1 (WT-1), ciklin, kao što je ciklin Al (CCNA1) i/ili biotinilovane molekule i/ili molekule eksprimirane od strane HIV, HCV, HBV ili drugih patogena.

[0088] U nekim načinima ostvarivanja, CAR vezuje patogen-specifični antigen. U nekim načinima ostvarivanja, CAR je specifičan za virusne antigene (kao što su HIV, HCV, HBV, itd.), bakterijske antigene i/ili parazitske antigene.

[0089] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije ovog pronalaska su genetski modifikovane da eksprimiraju dva ili više genetski modifikovana receptora na ćeliji, pri čemu svaka prepoznaje različiti antigen i obično svaka uključuje različitu unutarćelijsku komponentu signalizacije. Takve višeciljne strategije su opisane, na primer, u međunarodnoj prijavi patenta, br. objave: WO 2014055668 A1 (koji opisuje kombinacije aktivacionih i kostimulatornih CAR, npr., ciljanje dva različita antigena prisutna pojedinačno na offtarget, npr., normalnim ćelijama, ali prisutna zajedno samo na ćelijama bolesti ili stanja koje se leči) i Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (Decembar, 2013) (koji opisuje ćelije koje eksprimiraju aktivacioni i inhibitorni CAR, kao što su one u kojima se aktivacioni CAR vezuje za jedan antigen

1

eksprimiran i na normalnim ili neobolelim ćelijama i na ćelijama bolesti ili stanja koje se leči, a inhibitorni CAR se vezuje za drugi antigen eksprimiran samo na normalnim ćelijama ili ćelijama koje nije poželjno lečiti).

[0090] U nekim kontekstima, prekomerna ekspresija stimulatornog faktora (na primer, limfokina ili citokina) može biti toksična za subjekta. Tako, u nekim kontekstima, modifikovane ćelije uključuju segmente gena koji uzrokuju da ćelije budu podložne negativnoj selekciji in vivo, kao što je nakon davanja u adoptivnoj imunoterapiji. Na primer, u nekim aspektima, ćelije su modifikovane tako da mogu da se uklone kao rezultat promene u in vivo stanju pacijenta kom su date. Negativni selektivni fenotip može da proizađe iz umetanja gena koji dodeljuje osetljivost na dati agens, na primer, neko jedinjenje. Negativni selektivni geni uključuju gen timidin kinaze virusa herpes simpleksa tipa I (HSV-I TK) (Wigler et al., Cell II :223, 1977) koji dodeljuje osetljivost na ganciklovir; gen ćelijske hipoksantin fosforiboziltransferaze (HPRT), gen ćelijske adenin fosforiboziltransferaze (APRT), bakterijska citozin deaminaza, (Mullen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD.89:33 (1992)).

[0091] U drugim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, ćelije, npr., T-ćelije, nisu modifikovane da bi eksprimirale rekombinantne receptore, već uključuju prirodne antigenske receptore specifične za željene antigene, kao što su tumor-infiltrirajući limfociti i/ili T-ćelije kultivisane in vitro ili ex vivo, npr., tokom faze(a) inkubacije, radi promovisanja širenja ćelija koje imaju određenu antigensku specifičnost. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, ćelije su proizvedene za adoptivnu ćelijsku terapiju izolovanjem tumor-specifičnih T-ćelija, npr. autologni tumor-infiltrirajući limfociti (TIL). Direktno ciljanje humanih tumora pomoću autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita može, u nekim slučajevima, da posreduje regresiju tumora (vidi Rosenberg SA, et al.(1988) N Engl J Med.319: 1676-1680). U nekim načinima ostvarivanja, limfociti su izdvojeni iz resektovanih tumora. U nekim načinima ostvarivanja, takvi limfociti razmnožavaju se in vitro. U nekim načinima ostvarivanja, takvi limfociti se kultivišu sa limfokinima (npr., IL-2). U nekim načinima ostvarivanja, takvi limfociti posreduju specifičnu lizu autolognih tumorskih ćelija, ali ne i alogenih tumorskih ili autolognih normalnih ćelija.

[0092] Među dodatnim nukleinskim kiselinama, npr., geni za uvođenje su oni koji poboljšavaju efikasnost terapije, kao što je promovisanjem vijabilnosti i/ili funkcije prenetih ćelija; geni za obezbeđivanje genetičkog markera za selekciju i/ili evaluaciju ćelija, kao što je za ocenu in vivo preživljavanja ili lokalizacije; geni za poboljšanje bezbednosti, na primer, čineći ćeliju osetljivom na negativnu selekciju in vivo kao što je opisano od strane Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991); i Riddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992); vidi takođe objave PCT/US91/08442 i PCT/US94/05601 od strane Lupton et al. koji opisuju upotrebu bifunkcionalnih selektivnih fuziranih gena dobijenih od fuzije dominantnog pozitivnog selektivnog markera sa negativnim selektivnim markerom. Vidi, npr., Riddell et al., US patent br.6,040,177, u kolonama 14-17.

1

Postupak za dobijanje ćelija prema ovom pronalasku

[0093] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak za proizvodnju izmenjene ili modifikovane imune ćelije, koji obuhvata fazu koja se sastoji od inhibicije ekspresije i/ili aktivnosti Suv39h1-a u imunoj ćeliji.

[0094] Poželjno, postupak za dobijanje ćelija prema ovom pronalasku dalje obuhvata fazu koja se sastoji od uvođenja u pomenute imune ćelije genetski modifikovanog antigenskog receptora koji se specifično vezuje za ciljani antigen.

[0095] Inhibicija ekspresije i/ili aktivnosti Suv39h1-a i uvođenje genetski modifikovanog antigenskog receptora koji se specifično vezuje za ciljani antigen u imunoj ćeliji može da se izvodi istovremeno ili sekvencijalno bilo kojim redosledom.

Inhibicija Suv39h1-a

[0096] Prema ovom pronalasku, modifikovana imuna ćelija može se dovesti u kontakt sa najmanje jednim agensom koji inhibira ili blokira ekspresiju i/ili aktivnost Suv39h1-a.

[0097] Pomenuti agens može biti odabran od inhibitora malih molekula; derivata antitela kao što su intratela, nanotela ili afitela koji obično blokiraju ili inhibiraju ekspresiju ili aktivnost Suv39h1-a; aptamera koji obično blokiraju ili inhibiraju ekspresiju ili aktivnost Suv39h1-a; molekula nukleinskih kiselina koji blokiraju transkripciju ili translaciju, kao što su antisensni molekuli komplementarni sa Suv39h1; RNK interferirajućih agenasa (kao što su kratka interferirajuća RNK (siRNK), kratka RNK oblika ukosnice (shRNK), mikroRNK (miRNK) ili piwiRNK (piRNK); ribozima neke njihove kombinacije.

[0098] Najmanje jedan agens može takođe da bude egzogena nukleinska kiselina koja obuhvata a) modifikovanu, neprirodnu vodeću RNK klasterisanih redovnih međusobno razmaknutih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR) koji hibridizuju sa Suv39h1 sekvencom genomske nukleinske kiseline i/ili b) nukleotidnu sekvencu koja kodira CRISPR protein (obično Cas9 protein tipa-II), opciono, pri čemu su ćelije transgene za eksprimiranje Cas9 proteina. Agens može takođe da bude protein cinkovog prsta (ZFN) ili TAL protein.

[0099] Pojam "mali organski molekul" odnosi se na molekul veličine uporedive sa onom organskih molekula uopšteno korišćenih u farmaceutskim proizvodima. Pojam isključuje biološke makromolekule (npr., proteine, nukleinske kiseline, itd.). Poželjni mali organski molekuli su u rasponu veličina do oko 5000 Da, poželjnije do 2000 Da, a najpoželjne do oko 1000 Da.

[0100] U određenom načinu ostvarivanja, inhibitor H3K9 -histon metiltransferaze SUV39H1 je haetocin (CAS 28097-03-2) kao što je opisano od strane Greiner D, Bonaldi T, Eskeland R, Roemer E, Imhof A. "Identification of a specific inhibitor of the histone methyltransferase SU(VAR)3-9". Nat Chem Biol.2005

1

Aug;I(3): 143-5.; Weber, H. P., et al, "The molecular structure and absolute configuration of chaetocin", Acta Cryst, B28, 2945-2951 (1972) ; Udagawa, S., et al, " The production of chaetoglobosins, sterigmatocystin, O-methylsterigmatocystin, and chaetocin by Chaetomium spp. and related fungi ", Can. J. microbiol, 25, 170-177 (1979); i Gardiner, D. M., et al, " The epipolythiodioxopiperazine (ETP) class of fungal toxins: distribution, mode of action, functions and biosynthesis ", Microbiol, 151, 1021-1032 (2005). Na primer, haetocin je komercijalno dostupan od Sigma Aldrich.

[0101] Inhibitor Suv39h1-a može takođe da bude ETP69 (Rac-(3S,6S,7S,8aS)-6-(benzo[d][1,3]dioksol-5-il)-2,3,7-trimetil-1,4-dioksoheksahidro-6H-3,8a-epiditiopirolo[1,2-a]pirazin-7-karbonitril), racemski analog epiditiodiketopiperazin alkaloid haetocina A (vidi WO2014066435, ali vidi takođe Baumann M, Dieskau AP, Loertscher BM, et al. Tricyclic Analogues of Epidithiodioxopiperazine Alkaloids with Promising In Vitro and In Vivo Antitumor Activity. Chemical science (Royal Society of Chemistry: 2010).

2015;6:4451-4457 i Snigdha S, Prieto GA, Petrosyan A, et al. H3K9me3 Inhibition Improves Memory, Promotes Spine Formation, and Increases BDNF Levels in the Aged Hippocampus. The Journal of Neuroscience.2016;36(12):3611-3622).

[0102] Inhibirajuća aktivnost jedinjenja može se odrediti pomoću različitih postupaka kao što je opisano u Greiner D. Et al. Nat Chem Biol.2005 Aug;I(3): 143-5 ili Eskeland, R. et al. Biochemistry 43, 3740-3749 (2004).

[0103] Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji može se postići pre ili posle ubrizgavanja u ciljnog pacijenta. U nekom načinu ostvarivanja, inhibicija kao što je prethodno definisana izvodi se in vivo nakon davanja ćelije subjektu. Obično, Suv39h1 inhibitor kao što je ovde definisan može da bude uključen u kompoziciju koja sadrži ćeliju. Suv39h1 može takođe da se daje zasebno pre, istovremeno sa ili posle davanja ćelije(a) subjektu.

[0104] Obično, inhibicija Suv39h1-a prema ovom pronalasku može se postići inkubacijom ćelije prema ovom pronalasku sa kompozicijom koja sadrži najmanje jedan farmakološki inhibitor kao što je prethodno opisano. Inhibitor je uključen tokom širenja anti-tumorskih T-ćelija in vitro, na taj način modifikujući njihovu rekonstituciju, preživljavanje i terapeutsku efikasnost nakon adoptivnog transfera.

[0105] Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji prema ovom pronalasku može se postići intratelima. Intratela su antitela koja se vezuju unutarćelijski za njihov antigen nakon što su proizvedena u istoj ćeliji (za pregled, na primer, Marschall AL, Dübel S i Böldicke T " Specific in vivo knockdown of protein function by intrabodies ", MAbs.2015;7(6):1010-35. ali vidi takođe Van Impe K, Bethuyne J, Cool S, Impens F, Ruano-Gallego D, De Wever O, Vanloo B, Van Troys M, Lambein K, Boucherie C, et al. "A nanobody targeting the F-actin capping protein CapG restrains breast cancer metastasis ". Breast Cancer Res 2013;

15:R116; Hyland S, Beerli RR, Barbas CF, Hynes NE, Wels W.. " Generation and functional characterization of intracellular antibodies interacting with the kinase domain of human EGF receptor. Oncogene 2003; 22:1557-67"; Lobato MN, Rabbitts TH. " Intracellular antibodies and challenges facing

2

their use as therapeutic agents ". Trends Mol Med 2003; 9:390-6 i Donini M, Morea V, Desiderio A, Pashkoulov D, Villani ME, Tramontano A, Benvenuto E. " Engineering stable cytoplasmic intrabodies with designed specificity ". J Mol Biol.2003 Jul 4;330(2):323-32.).

[0106] Intratela se mogu generisati kloniranjem respektivne cDNK od postojećeg hibridomskog klona ili pogodnije, novi scFv/Fab mogu biti odabrani od in vitro tehnika displeja kao što je fagni displej koji obezbeđuje potrebni gen koji kodira antitelo od pojave i omogućava detaljniji prethodni dizajn fine specifičnosti antitela. Pored toga, mogu da se koriste displej ćelijske površine bakterija, kvasaca, sisara i ribozomski displej. Međutim, najčešće korišćeni in vitro displej sistem za selekciju specifičnih antitela je fagni displej. U proceduri koja se naziva ispiranje (afinitetna selekcija), fage rekombinantnog antitela odabrane su inkubiranjem repertoara faga antitela sa antigenom. Ovaj postupak se ponavlja nekoliko puta što dovodi do obogaćenih repertoara antitela koji obuhvataju specifična veziva antigena za skoro bilo koju moguću metu. Do danas, biblioteke in vitro sklopljenih rekombinantnih humanih antitela već su donele hiljade fragmenata novih rekombinantnih antitela. Treba napomenuti da je preduslov za specifični proteinski nokdaun citoplazmatičnim intratelom da je antigen neutralizovan/inaktiviran vezivanjem antitela. Pojavilo se pet različitih pristupa za generisanje pogodnih antitela: 1) In vivo selekcija funkcionalnih intratela u eukariotama kao što je kvasac i u prokariotama kao što je E.coli (antigen-zavisna i nezavisna); 2) generisanje fuziranih proteina antitela za poboljšanje citosolne stabilnosti; 3) upotreba specijalnih okvira za poboljšanje citosolne stabilnosti (npr., kalemljenjem CDR ili uvođenjem sintetičkih CDR u okvire stabilnih antitela); 4) upotreba jednodomenskih antitela za poboljšanu citosolnu stabilnost; i 5) selekcija disulfidne veze bez stabilnih intratela. Ovi pristupi su naročito detaljno opisani u Marschall, A. L et al., mAbs 2015 kao što je prethodno navedeno.

[0107] Najčešće korišćen format za intratela je scFv, koji se sastoji od varijabilnog domena H i L lanca antitela (VH i VL) koje drži zajedno kratka, fleksibilna linker sekvenca (često (Gly4Ser)3), da bi se izbegla potreba za odvojenom ekspresijom i sklapanjem 2 lanca antitela celog IgG ili Fab molekula. Alternativno, koristi se Fab format koji obuhvata, pored toga, C1 domen teškog lanca i konstantni region lakog lanca. Nedavno, opisan je novi, mogući format za intratela, scFab. scFab format obećava lakše subkloniranje dostupnih Fab gena u unutarćelijski ekspresioni vektor, ali ostaje da se vidi da li ovo obezbeđuje bilo kakvu prednost nad dobro ustanovljenim scFv formatom. Pored scFv i Fab, bispecifični formati se koriste kao intratela. Bispecifično Tie-2 x VEGFR-2 antitelo ciljano na ER demonstriralo je produženi poluživot u odnosu na monospecifične pandane antitela. Bispecifično transmembransko intratelo razvijeno je kao specijalni format da bi se istovremeno prepoznali unutarćelijski i vanćelijski epitopi epidermalnog faktora rasta, kombinujući različite karakteristike srodnih monospecifičnih antitela, tj., inhibiciju autofosforilacije i vezivanja liganda.

[0108] Drugi format intratela naročito pogodan za citoplazmatičnu ekspresiju su jednodomenska antitela (takođe se nazivaju nanotela) izvedena iz kamila ili koja se sastoje od jednog humanog VH domena ili humanog VL domena. Ova jednodomenska antitela često imaju povoljna svojstva, npr., visoku stabilnost; dobru rastvorljivost; jednostavnost kloniranja i izbora biblioteke; visok prinos ekspresije u E.coli i kvascu.

[0109] Gen intratela može da bude eksprimiran unutar ciljne ćelije nakon transfekcije sa ekspresijom transdukcije plazmida ili virusa sa rekombinantnim virusom. Obično, izbor je usmeren na obezbeđivanje optimalnih nivoa transfekcije i proizvodnje intratela. Uspešna transfekcija i naknadna proizvodnja intratela može da se analizira detekcijom proizvedenog antitela pomoću imunoblota, ali, za evaluaciju ispravne intratelo/antigen interakcije, može da se koristi zajedničko imunotaloženje iz ekstrakata HEK 293 ćelija prolazno kotransfektovanih sa odgovarajućim antigenom i ekspresionim plazmidima intratela.

[0110] Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji prema ovom pronalasku može se takođe izvesti aptamerima koji inhibiraju ili blokiraju Suv39h1 ekspresiju ili aktivnost. Aptameri su klasa molekula koja predstavlja alternativu antitela u smislu molekularnog prepoznavanja. Aptameri su sekvence oligonukleotida (DNK ili RNK) ili oligopeptida sa kapacitetom da prepoznaju praktično bilo koju klasu ciljnih molekula sa visokim afinitetom i specifičnošću.

[0111] Oligonukleotidni aptameri mogu se izolovati Sistematskom evolucijom liganada pomoću Eksponencijalnog obogaćivanja (SELEX) biblioteke nasumičnih sekvenci, kao što je opisano u Tuerk C. i Gold L., 1990. Biblioteka nasumičnih sekvenci može se dobiti kombinatornom hemijskom sintezom DNK. U ovoj biblioteci, svaki član je linearni oligomer, eventualno hemijski modifikovan, jedinstvene sekvence. Moguće modifikacije, upotrebe i prednosti ove klase molekula objavljene su u Jayasena S.D., 1999.

[0112] Peptidni aptameri sastoje se od konformaciono ograničenog varijabilnog regiona antitela prikazanog proteinom platforme, kao što je tioredoksin A od E. coli koji su izabrani iz kombinatornih biblioteka pomoću dva hibridna postupka (Colas P, Cohen B, Jessen T, Grishina I, McCoy J, Brent R. " Genetic selection of peptide aptamers that recognize and inhibit cyclin-dependent kinase 2". Nature. 1996 Apr 11;380(6574):548-50).

[0113] Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji prema ovom pronalasku može se takođe izvesti molekulima afitela. Afitelo su mali proteini modifikovani da se vezuju za veliki broj ciljnih proteina ili peptida sa visokim afinitetom, imitirajući monoklonalna antitela, i zato su član porodice mimetika antitela (vidi za pregled Löfblom J, Feldwisch J, Tolmachev V, Carlsson J, Ståhl S, Frejd FY. Affibody molecules: engineered proteins for therapeutic, diagnostic and biotechnological applications. FEBS Lett. Jun 2010.

18;584(12):2670-80). Molekuli afitela zasnovani su na modifikovanoj varijanti (Z domen) B-domena u imunoglobulin-vezujućim regionima proteina A stafilokoka, pri čemu se specifično vezuju za teoretski bilo koju datu metu. Biblioteke molekula afitela su uopšteno konstruisane kombinatornom randomizacijom 13 aminokiselinskih položaja u spiralama jedan i dva koje obuhvataju originalnu Fcvezujuću površinu Z-domena. Biblioteke su obično prikazane na fagovima, praćeno bioispiranjem prema željenim metama. Ako se poveća afinitet primarne, sazrevanje afiniteta uopšteno rezultuje poboljšanim vezivima i može se postići ili kombinovanjem spirala ili poravnanjem sekvenci kombinovano sa usmerenom kombinatornom mutagenezom. Novo identifikovani molekuli sa svojom izmenjenom vezujućom površinom uopšteno zadržavaju originalnu spiralnu strukturu kao i visoku stabilnost, iako su prijavljeni jedinstveni izuzeci sa zanimljivim svojstvima. Zbog njihove male veličine i svojstava brzog savijanja, molekuli afitela mogu se proizvesti hemijskom sintezom peptida.

[0114] U drugim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, inhibicija aktivnosti Suv39h1-a može se postići represijom/supresijom gena genskim nokdaunom pomoću RNK interferencije (RNKi) kao što su kratka interferirajuća RNK (siRNK), kratka RNK oblika ukosnice (shRNK) ili ribozimi. siRNK tehnologija uključuje onu baziranu na RNKi koja koristi dvolančani RNK molekul koji ima sekvencu homolognu sa nukleotidnom sekvencom mRNK koja je prepisana iz gena i sekvencu komplementarnu sa nukleotidnom sekvencom. siRNK uopšteno je homologna/komplementarna sa jednim regionom mRNK koji je prepisan iz gena ili može biti siRNK koja uključuje veći broj RNK molekula koji su homologni/komplementarni sa različitim regionima.

[0115] Antisensni oligonukleotidi, uključujući antisensne RNK molekule i antisensne DNK molekule, delovaće tako da direktno blokiraju translaciju H3K9-histon metiltransferaze Suv39h1 i, na taj način, sprečiće translaciju proteina ili povećanje mRNK razgradnje, čime će se smanjiti nivo H3K9-histon metiltransferaze SUV39H1 i, time, njegova aktivnost u ćeliji. Na primer, mogu da se sintetišu antisensni oligonukleotidi od najmanje oko 15 baza i komplementarni jedinstvenim regionima mRNK transkript sekvence koja kodira H3K9-histon metiltransferazu SUV39H1, npr., konvencionalnim fosfodiestarskim tehnikama i davanjem npr., intravenoznom injekcijom ili infuzijom. Postupci za upotrebu antisensnih tehnika za specifično inhibiranje genske ekspresije gena čija je sekvenca poznata, dobro su poznati u tehnici (vidi na primer U.S. Pat. br.6,566,135; 6,566, 131; 6,365,354; 6,410,323; 6,107,091; 6,046,321; i 5,981,732).

[0116] "RNK interferirajući agens" kao što se ovde koristi, definiše se kao bilo koji agens, koji interferiše sa ili inhibira ekspresiju ciljnog biomarker gena RNK interferencijom (RNKi). Takvi RNK interferirajući agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, molekule nukleinskih kiselina koji uključuju RNK molekule, koji su homologni prema ciljnom genu ovog pronalaska (npr., Suv39h1) ili neki njen fragment, malu interferirajuću RNK (siRNK) i male molekule koji ometaju ili inhibiraju ekspresiju ciljne nukleinske kiseline RNK interferencijom (RNKi).

[0117] Male inhibitorne RNK (siRNK) mogu takođe da funkcionišu kao inhibitori ekspresije za upotrebu u ovom pronalasku. Genska ekspresija H3K9-histon metiltransferaze SUV39H1 može se smanjiti dovođenjem u kontakt subjekta ili ćelije sa malom dvolančanom RNK (dsRNK) ili vektorom ili konstruktom koji izaziva proizvodnju male dvolančane RNK, tako da je genska ekspresija H3K9-histon metiltransferaze SUV39H1 specifično inhibirana (tj. RNK interferencija ili RNKi). Postupci za selekciju odgovarajućeg vektora koji kodira dsRNK ili dsRNK dobro su poznati u tehnici za gene čija je sekvenca

2

poznata (vidi na primer Tuschl, T. et al. (1999); Elbashir, S. M. et al. (2001); Hannon, GJ. (2002);

McManus, MT. et al. (2002); Brummelkamp, TR. et al. (2002); U.S. Pat. br.6,573,099 i 6,506,559; i objave međunarodnih patenata br. WO 01/36646, WO 99/32619 i WO 01/68836). Sve ili deo fosfodiestarskih veza kod siRNK ovog pronalaska su povoljno zaštićene. Ova zaštita se uopšteno izvodi hemijskim putem pomoću postupaka koji su poznati u tehnici. Fosfodiestarske veze mogu se zaštititi, na primer, tiolnom ili aminskom funkcionalnom grupom ili fenil grupom.5'- i/ili 3'- krajevi u siRNK ovog pronalaska takođe su povoljno zaštićeni, na primer, pomoću tehnike prethodno opisane za zaštitu fosfodiestarskih veza. siRNK sekvence povoljno obuhvataju najmanje dvanaest susednih dinukleotida ili njihove derivate.

[0118] Kao što se ovde koristi, pojam "siRNK derivati" u vezi sa ovim sekvencama nukleinske kiseline odnosi se na nukleinsku kiselinu koja ima procenat identiteta od najmanje 90% sa eritropoietinom ili njegovim fragmentom, poželjno od najmanje 95%, kao na primer od najmanje 98%, a poželjnije od najmanje 98%.

[0119] Kao što se ovde koristi, izraz "procenat identiteta" između dve sekvence nukleinske kiseline, predstavlja procenat identične nukleinske kiseline, između dve sekvence koje se porede, dobijen najboljim poravnanjem pomenutih sekvenci, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički, a razlike između ove dve sekvence nasumično se šire preko sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što se ovde koristi, "najbolje poravnanje" ili "optimalno poravnanje", predstavlja poravnanje za koje je određeni procenat identiteta (vidi dole) najveći. Poređenje sekvenci između dve sekvence nukleinskih kiselina obično se izvodi poređenjem ovih sekvenci koje su prethodno poravnate prema najboljem poravnanju; ovo poređenje izvodi se na segmentima poređenja da bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti. Najbolje poravnanje sekvenci za izvođenje poređenja može da se izvede, osim manuelno, pomoću globalnog algoritma homologije razvijenog od strane SMITH i WATERMAN (Ad. App. Math., vol.2, p:482, 1981), pomoću lokalnog algoritma homologije razvijenog od strane NEDDLEMAN i WUNSCH (J. Mol. Biol, vol.48, p:443, 1970), pomoću postupka sličnosti razvijenog od strane PEARSON i LIPMAN (Proc. Natl. Acd. Sci. SAD, vol.85, p:2444, 1988), pomoću računarskih softvera koji koriste te algoritme (GAP, BESTFIT, BLAST P, BLAST N, FASTA, TFASTA u Wisconsin Genetics software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI SAD), pomoću MUSCLE algoritama višestrukih poravnanja (Edgar, Robert C, Nucleic Acids Research, vol.32, p: 1792, 2004). Da bi se dobilo najbolje lokalno poravnanje, poželjno može da se koristi BLAST softver. Procenat identiteta između dve sekvence nukleinskih kiselina određuje se poređenjem ove dve optimalno poravnate sekvence, pri čemu sekvence nukleinskih kiselina mogu da obuhvataju adicije ili delecije u odnosu na referentnu sekvencu da bi se dobilo optimalno poravnanje između ove dve sekvence. Procenat identiteta izračunava se određivanjem broja identičnih položaja između ove dve sekvence i deljenjem ovog broja ukupnim brojem upoređenih položaja i množenjem dobijenog rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta između ove dve sekvence.

[0120] shRNK (kratka RNK oblika ukosnice) mogu takođe da deluju kao inhibitori ekspresije za upotrebu u ovom pronalasku. shRNK obično se sastoje od kratkog (npr., 19-25 nukleotida) antisensnog lanca, praćenog petljom od 5-9 nukleotida i analognim sensnim lancem. Alternativno, sensni lanac može prethoditi strukturi nukleotidne petlje, a antisensni lanac može da sledi.

[0121] Ribozimi mogu takođe da funkcionišu kao inhibitori ekspresije za upotrebu u ovom pronalasku. Ribozimi su enzimski RNK molekuli koji mogu da katalizuju specifično cepanje RNK. Mehanizam ribozimskog delovanja uključuje sekvenca-specifičnu hibridizaciju molekula ribozima za komplementarnu ciljnu RNK, praćeno endonukleolitičkim cepanjem. Modifikovani molekuli ribozima motiva ukosnice ili čekića koji specifično i efikasno katalizuju endonukleolitičko cepanje mRNK sekvenci H3K9-histon metiltransferaze SUV39H1, prema tome, su korisni unutar obima ovog pronalaska.

Specifična mesta ribozimskog cepanja u okviru bilo koje potencijalne RNK mete, inicijalno se identifikuju pretragom ciljnog molekula za mesta ribozimskog cepanja, koja obično uključuju sledeće sekvence, GUA, GUU i GUC. Kada se identifikuju, kratke RNK sekvence od između oko 15 i 20 ribonukleotida koji odgovaraju regionu ciljnog gena koji sadrži mesto cepanja mogu se oceniti za predviđene strukturne karakteristike, kao što je sekundarna struktura, koje mogu da učine oligonukleotidnu sekvencu neprikladnom.

[0122] I antisensni oligonukleotidi i ribozimi korisni kao inhibitori ekspresije mogu da se pripreme poznatim postupcima. Oni uključuju tehnike za hemijsku sintezu kao što je, npr., hemijskom sintezom fosforamadita u čvrstoj fazi. Alternativno, antisensni RNK molekuli mogu da se generišu in vitro ili in vivo transkripcijom DNK sekvenci koje kodiraju RNK molekul. Takve DNK sekvence mogu da se ugrade u širok spektar vektora koji uključuju pogodne promotere RNK polimeraze kao što su T7 ili SP6 promoteri polimeraze. Razne modifikacije oligonukleotida ovog pronalaska mogu da se uvedu kao sredstvo povećanja unutarćelijske stabilnosti i poluživota. Moguće modifikacije uključuju, ali nisu ograničene na, dodavanje flankirajućih sekvenci ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida na 5' i/ili 3' krajevima molekula ili upotrebu fosforotioata ili 2'-0-metila pre nego veza fosfodiesteraze unutar oligonukleotidne kičme.

[0123] Antisensni oligonukleotidi, siRNK, shRNK i ribozimi ovog pronalaska mogu da budu dostavljeni in vivo sami ili zajedno sa vektorom. U njegovom najširem smislu, "vektor" je bilo koji nosač koji može da olakša prenos nukleinske kiseline antisensnog oligonukleotida, siRNK, shRNK ili ribozima u ćelije, a poželjno ćelije koje eksprimiraju H3K9-histon metiltransferazu SUV39H1. Poželjno, vektor prenosi nukleinsku kiselinu u ćelije sa smanjenom razgradnjom u odnosu na stepen razgradnje koji bi se postigao u odsustvu vektora. Uopšteno, vektori korisni u ovom pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, plazmide, fagemide, viruse, ostale nosače izolovane iz virusnih ili bakterijskih izvora koji su manipulisani umetanjem ili ugradnjom sekvenci nukleinske kiseline antisensnih oligonukleotida, siRNK, shRNK ili ribozima. Virusni vektori su poželjan tip vektora i uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence nukleinske kiseline iz sledećih virusa: retrovirus, kao što su Moloney-ev mišji virus leukemije, Harvey-ev mišji virus

2

sarkoma, mišji virus tumora mlečne žlezde i Rous-ov virus sarkoma; adenovirus, adeno-povezani virus; virusi SV40-tipa; polioma virusi; Epštajn-Barovi virusi; papiloma virusi; herpes virus; virus vakcinije; polio virus; i R A virus kao što je retrovirus. Poželjno mogu da se koriste drugi vektori, nenavedeni, ali poznati u tehnici.

[0124] Poželjni virusni vektori su na bazi ne-citopatskih eukariotskih virusa u kojima su neesencijalni geni zamenjeni genom od interesa. Ne-citopatski virusi uključuju retroviruse (npr., lentivirus), životni ciklus koji uključuje reverznu transkripciju genomske virusne RNK u DNK sa naknadnom provirusnom integracijom u DNK ćelije domaćina. Retrovirusi su odobreni za humane probe genskih terapija.

Najkorisniji su oni retrovirusi sa nedostatkom replikacije (tj., koji mogu da usmeravaju sintezu željenih proteina, ali ne mogu da proizvodu infektivnu česticu). Takvi genetski izmenjeni retrovirusni ekspresioni vektori uopšteno se koriste za visokoefikasnu transdukciju gena in vivo. Standardni protokoli za proizvodnju retrovirusa sa nedostatkom replikacije (uključujući faze ugradnje egzogenog genetičkog materijala u plazmid, transfekcije ćelijskih linija pakovanja sa plazmidom, proizvodnje rekombinantnih retrovirusa pomoću ćelijskih linija pakovanja, prikupljanje virusnih čestica iz podloge za kulturu tkiva i infekcije ciljanih ćelija virusnim česticama) dati su u Kriegler, 1990 i u Murry, 1991).

[0125] Poželjni virusi za određene primene su adenovirusi i adeno-povezani (AAV) virusi, koji su dvolančani DNK virusi koji su već odobreni za humanu upotrebu u genskoj terapiji. Stvarno je poznato 12 različitih AAV serotipova (AAV1 do 12), svaki sa različitim tropizmom tkiva (Wu, Z Mol Ther 2006;

14:316-27). Rekombinantni AAV dobijeni su od zavisnog parvovirusa AAV2 (Choi, VW J Virol 2005;

79:6801-07). Adeno-povezani virus tipa 1 do 12 može da se modifikuje da ne bi imao sposobnost replikacije i može da inficira širok spektar ćelijskih tipova i vrsta (Wu, Z Mol Ther 2006; 14:316-27). Dalje ima prednosti kao što su toplotna stabilnost i stabilnost na lipidni rastvarač; visoke učestalosti transdukcije u ćelijama raznovrsnih loza, uključujući hemopoietične ćelije; i nedostatak inhibicije superinfekcije čime su omogućene višestruke serije transdukcija. Navodno, adeno-povezani virus može da se ugradi u humanu ćelijsku DNK na mesto-specifičan način, čime se minimizira mogućnost insercione mutageneze i promenljivost karakteristike umetnute genske ekspresije retrovirusne infekcije. Pored toga, infekcije adeno-povezanim virusom divljeg tipa praćene su u kulturi tkiva u više od 100 pasaža u odsustvu selektivnog pritiska, podrazumevajući da je genomska integracija adeno-povezanih virusa relativno stabilan događaj. Adeno-povezan virus može takođe da funkcioniše na ekstrahromozomalni način.

[0126] Ostali vektori uključuju plazmidne vektore. Plazmidni vektori opširno su opisani u tehnici i dobro su poznati stručnjacima u tehnici. Vidi npr. Sambrook et al, 1989. Poslednjih nekoliko godina, plazmidni vektori korišćeni su kao DNK vakcine za dostavljanje antigen-kodirajućih gena u ćelije in vivo. Oni su naročito poželjni za ovo jer nemaju iste bezbednosne probleme kao što imaju mnogi virusni vektori. Ovi plazmidi, međutim, koji imaju promoter kompatibilan sa ćelijom domaćina, mogu da eksprimiraju peptid

2

od gena operativno kodiranog unutar plazmida. Neki obično korišćeni plazmidi uključuju pBR322, pUC18, pUC19, pRC/CMV, SV40 i pBlueScript. Ostali plazmidi dobro su poznati prosečnim stručnjacima u tehnici. Pored toga, plazmidi mogu biti po potrebi dizajnirani pomoću restrikcionih enzima i reakcija ligacije da bi se uklonili i dodali specifični fragmenti DNK. Plazmidi mogu biti dostavljeni raznim parenteralnim, mukozalnim i topikalnim putevima. Na primer, DNK plazmid može da se ubrizga intramuskularnim, intradermalnim, subkutanim ili ostalim putevima. Takođe se može dati putem intranazalnih sprejeva ili kapi, rektalnom supozitorijom i oralno. Takođe se može dati u epidermis ili mukozalnu površinu pomoću genskog pištolja. Plazmidi se mogu dati u vodenom rastvoru, osušeni na česticama zlata ili u vezi sa drugim DNK dostavnim sistemom koji uključuje, ali nije ograničen na, lipozome, dendrimere, kohleate kao nosače za dostavu i mikroenkapsulaciju.

[0127] Sekvenca nukleinske kiseline antisensnog oligonukleotida, siRNK, shRNK ili ribozima prema ovom pronalasku je uopšteno pod kontrolom heterolognog regulatornog regiona, npr., heterologni promoter. Promoter može biti specifičan za Muller-ove glijalne ćelije, ćelije mikroglije, endotelijalne ćelije, pericitne ćelije i astrocite. Na primer, poželjna je specifična ekspresija u Muller-ovim glijalnim ćelijama koja se može dobiti preko promotera gena glutamin sintetaze. Promoter može takođe da bude, primera radi, virusni promoter, kao što je CMV promoter ili bilo koji sintetički promoteri.

Genska represija ili ometanje Suv39h1-a

[0128] Inhibicija Suv39h1-a u ćeliji prema ovom pronalasku može se takođe izvesti represijom ili ometanjem Suv39h1gena, kao što je brisanjem, npr., brisanjem celog gena, eksona ili regiona i/ili zamenom sa egzogenom sekvencom i/ili mutacijom, npr., mutacijom pomeranja okvira čitanja ili mutacijom pogrešnog smisla, unutar gena, obično unutar eksona gena. U nekim načinima ostvarivanja, ometanje rezultuje preuranjenim stop kodonom koji se ugrađuje u gen, tako da se Suv39h1 protein ne eksprimira ili je nefunkcionalan. Ometanje se uopšteno izvodi na DNK nivou. Ometanje je uopšteno trajno, nepovratno ili nije prolazno.

[0129] U nekim načinima ostvarivanja, ometanje ili represija gena postiže se pomoću agenasa za editovanje gena kao što je DNK-ciljajući molekul, kao što je DNK-vezujući protein ili DNK-vezujuća nukleinska kiselina ili kompleks, jedinjenje ili kompozicija, koja sadrži isto, koji se specifično vezuje za ili hibridizuje za gen. U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul obuhvata DNK-vezujući domen, npr., DNK-vezujući domen proteina cinkovog prsta (ZFP), DNK-vezujući domen proteina sličnog aktivatoru transkripcije (TAL) ili TAL efektora (TALE), DNK-vezujući domen klasterisanih redovnih međusobno razmaknutih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR) ili DNK-vezujući domen iz meganukleaze.

2

[0130] Vezujući domeni cinkov prst, TALE i CRISPR sistema mogu biti "modifikovani" da bi se vezivali za prethodno određenu nukleotidnu sekvencu.

[0131] U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul, kompleks ili kombinacija sadrži DNK-vezujući molekul i jedan ili više dodatnih domena, kao što je efektorski domen da bi se olakšala represija ili ometanje gena. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, ometanje gena se izvodi fuziranim proteinima koji obuhvataju DNK-vezujuće proteine i heterologni regulatorni domen ili njegov funkcionalni fragment.

[0132] Obično, dodatni domen je domen nukleaze. Prema tome, u nekim načinima ostvarivanja, ometanje gena je olakšano genskim ili genomskim editovanjem, pomoću modifikovanih proteina, kao što su nukleaze i kompleksi koji sadrže nukleaze ili fuzirani proteini, koji se sastoje od sekvencaspecifičnih DNK-vezujućih domena fuziranih sa ili grade kompleks sa, ne-specifičnim DNK-cepajućim molekulima kao što su nukleaze.

[0133] Ove ciljane himerne nukleaze ili kompleksi koji sadrže nukleaze izvode precizne genetske modifikacije uvođenjem ciljanih dvolančanih prekida ili jednolančanih prekida, stimulišući ćelijske mehanizme DNK popravke, uključujući spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ) sklono greškama i popravku usmerenu homologijom (HDR). U nekim načinima ostvarivanja, nukleaza je endonukleaza, kao što je nukleaza cinkovog prsta (ZFN), TALE nukleaza (TALEN), RNK-vođena endonukleaza (RGEN), kao što je CRISPR-povezani (Cas) protein ili meganukleaza. Takvi sistemi dobro su poznati u tehnici (vidi, na primer, U.S. Pat. br.8,697,359; Sander i Joung (2014) Nat. Biotech.32:347-355; Hale et al. (2009) Cell 139:945-956; Karginov i Hannon (2010) Mol. Cell 37:7; U.S. Pat. Publ.2014/0087426 i 2012/0178169; Boch et al. (2011) Nat. Biotech.29: 135-136; Boch et al. (2009) Science 326: 1509-1512; Moscou i Bogdanove (2009) Science 326: 1501; Weber et al. (2011) PLoS One 6:el9722; Li et al. (2011) Nucl. Acids Res.39:6315-6325; Zhang et al. (2011) Nat. Biotech.29: 149-153; Miller et a/. (2011) Nat. Biotech.29: 143-148; Lin et al. (2014) Nucl. Acids Res.42:e47). Takve genetičke strategije mogu da koriste sisteme konstitutivne ekspresije ili sisteme inducibilne ekspresije prema dobro poznatim postupcima u tehnici.

ZFP i ZFN; TAL, TALE i TALEN

[0134] U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul uključuje DNK-vezujući protein kao što je jedan ili više proteina cinkovog prsta (ZFP) ili proteina sličnog aktivatoru transkripcije (TAL), fuziran sa efektorskim proteinom kao što je endonukleaza. Primeri uključuju ZFN, TALE i TALEN. Vidi Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221), 1-7 (2013).

[0135] U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul obuhvata jedan ili više proteina cinkovog prsta (ZFP) ili njihovih domena koji se vezuju za DNK na sekvenca-specifičan način. ZFP ili njegov domen je protein ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na sekvenca-specifičan način preko jednog ili

2

više regiona cinkovih prstiju aminokiselinske sekvence unutar vezujućeg domena čija je struktura stabilizovana koordinacijom jona cinka. Uopšteno, specifičnost ZFP prema sekvenci može biti izmenjena izvođenjem aminokiselinskih supstitucija na četiri položaja u spirali (-1, 2, 3 i 6) na spirali prepoznavanja cinkovog prsta. Prema tome, u nekim načinima ostvarivanja, ZFP ili molekul koji sadrži ZFP je neprirodan, npr., modifikovan je da se vezuje za ciljno mesto po izboru. Vidi, na primer, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol.20: 135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol.19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416.

[0136] U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul je ili obuhvata DNK-vezujući domen cinkovog prsta fuziran sa DNK-cepajućim domenom da bi se obrazovala nukleaza cinkovog prsta (ZFN). U nekim načinima ostvarivanja, fuzirani proteini obuhvataju cepajuće domene (ili cepajući polu-domen) iz najmanje jednog restrikcionog enzima tipa IIS i jedan ili više vezujućih domena cinkovog prsta, koji može biti ili ne mora biti modifikovan. U nekim načinima ostvarivanja, cepajući domen je iz restrikcione endonukleaze tipa IIS Fok I. Vidi, na primer, U.S. Pat. br.5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem.

269:31,978-31,982.

[0137] U nekim aspektima, ZFN efikasno generišu dvolančani prekid (DSB), na primer na prethodno određenom mestu u kodirajućem regionu ciljanog gena (tj. Suv39h1). Obično ciljani regioni gena uključuju eksone, regione koji kodiraju N-terminale regione, prvi ekson, drugi ekson i promoter ili pojačavačke regione. U nekim načinima ostvarivanja, prolazna ekspresija ZFN promoviše visokoefikasno i trajno ometanje ciljnog gena u modifikovanim ćelijama. Posebno, u nekim načinima ostvarivanja, dostava ZFN rezultuje trajnim ometanjem gena sa efikasnostima koje prelaze 50%. Mnogi gen-specifični modifikovani cinkovi prsti komercijalno su dostupni. Na primer, Sangamo Biosciences (Richmond, CA, SAD) razvio je platformu (CompoZr) za konstrukciju cinkovih prstiju zajedno sa Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD), što omogućava istraživačima da u potpunosti zaobiđu konstrukciju i validaciju cinkovih prstiju, i obezbeđuje specifično ciljane cinkove prste za hiljade proteina. Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405. U nekim načinima ostvarivanja, koriste se komercijalno dostupni cinkovi prsti ili se dizajniraju po porudžbini. (Vidi, na primer, Sigma-Aldrich kataloške brojeve CSTZFND, CSTZFN, CT11-1KT i PZD0020).

[0138] U nekim načinima ostvarivanja, DNK-ciljajući molekul obuhvata prirodni ili modifikovani (neprirodni) DNK-vezujući domen proteina sličnog aktivatoru transkripcije (TAL), kao što je u proteinu efektora proteina sličnog aktivatoru transkripcije (TALE), Vidi, npr., U.S. objavu patenta br.

20110301073. U nekim načinima ostvarivanja, molekul je DNK vezujuća endonukleaza, kao što je TALE-nukleaza (TALEN). U nekim aspektima, TALEN je fuzirani protein koji obuhvata DNK-vezujući domen

2

izolovan iz TALE i katalitički domen nukleaze za cepanje ciljne sekvence nukleinske kiseline. U nekim načinima ostvarivanja, TALE DNK-vezujući domen je modifikovan radi vezivanja ciljne sekvence unutar gena koji kodiraju ciljani antigen i/ili imunosupresivni molekul. Na primer, u nekim aspektima, TALE DNK-vezujući domen može da cilja CD38 i/ili adenozinski receptor, kao što je A2AR.

[0139] U nekim načinima ostvarivanja, TALEN prepoznaje i cepa ciljnu sekvencu u genu. U nekim aspektima, cepanje DNK rezultuje dvolančanim prekidima. U nekim aspektima, prekidi stimulišu brzinu homologne rekombinacije ili spajanje nehomogenih krajeva (NHEJ). Uopšteno, NHEJ je nesavršen postupak popravke koji često dovodi do promena DNK sekvence na mestu cepanja. U nekim aspektima, mehanizmi popravke uključuju ponovno spajanje onoga što ostaje od dva DNK kraja direktnom religacijom (Critchlow i Jackson, Trends Biochem Sci.1998 Oct;23(10):394-8) ili takozvanim mikrohomologija-posredovanim spajanjem krajeva. U nekim načinima ostvarivanja, popravka putem NHEJ rezultuje malim umetanjima ili brisanjima i može da se koristi za ometanje i, time, represiju gena. U nekim načinima ostvarivanja, modifikacija može biti supstitucija, brisanje ili dodavanje najmanje jednog nukleotida. U nekim aspektima, ćelije u kojima dolazi do događaja mutageneze indukovane cepanjem, tj. događaja mutageneze uzastopno NHEJ događaju, mogu se identifikovati i/ili odabrati pomoću dobro poznatih postupaka u tehnici.

[0140] TALE ponavljanja mogu se sastaviti da bi se specifično ciljao Suv39h1 gen. (Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405). Konstruisana je biblioteka TALEN-a koji ciljaju 18.740 humanih protein-kodirajućih gena (Kim et al., Nature Biotechnology.31, 251-258 (2013)). TALE nizovi, po porudžbini dizajnirani, komercijalno su dostupni preko Cellectis Bioresearch (Pariz, Francuska), Transposagen Biopharmaceuticals (Leksington, KY, SAD) i Life Technologies (Grand Island, NY, SAD). Specifično, TALEN koji ciljaju CD38 komercijalno su dostupni (Vidi Gencopoeia, kataloški brojevi HTN222870-1, HTN222870-2 i HTN222870-3, dostupno na World Wide Web na www. genecopoeia.com/product/search/detail.php ?prt=26&cid=&key=HTN222870). Primeri molekula su opisani, npr., u U.S. objavama patenata br. US 2014/0120622 i 2013/0315884.

[0141] U nekim načinima ostvarivanja, TALEN se uvode kao transgeni kodirani sa jednim ili više plazmidnih vektora. U nekim aspektima, plazmidni vektor može da sadrži selekcioni marker koji obezbeđuje identifikaciju i/ili selekciju ćelija koje su primile pomenuti vektor.

RGEN (CRISPR/Cas sistemi)

[0142] Represija gena može se izvesti pomoću jedne ili više DNK-vezujućih nukleinskih kiselina, kao što je ometanje putem RNK-vođene endonukleaze (RGEN) ili drugi oblik represije drugim RNK-vođenim efektorskim molekulom. Na primer, u nekim načinima ostvarivanja, represija gena može se izvesti pomoću klasterisanih redovnih međusobno razmaknutih kratkih palindromskih ponavljanja (CRISPR) i CRISPR-povezanih proteina. Vidi Sander i Joung, Nature Biotechnology, 32(4): 347-355.

[0143] Uopšteno, "CRISPR sistem" u celosti se odnosi na transkripte i ostale elemente uključene u ekspresiju ili usmeravanje aktivnosti, CRISPR-povezane ("Cas") gene, uključujući sekvence koje kodiraju Cas gen, tracr (trans-aktivirajući CRISPR) sekvencu (npr. tracrRNK ili aktivna delimična tracrRNK), tracrmate sekvencu (koja obuhvata "direktno ponavljanje" i tracrRNK-obrađeno delimično direktno ponavljanje u kontekstu endogenog CRISPR sistema), vodeću sekvencu (takođe se naziva "spejser" u kontekstu endogenog CRISPR sistema) i/ili druge sekvence i transkripte iz CRISPR lokusa.

[0144] Obično, CRISPR/Cas nukleaza ili sistem CRISPR/Cas nukleaze uključuje nekodirajući RNK molekul (vodeću) RNK, koji se sekvenca-specifično vezuje za DNK i CRISPR protein, sa funkcionalnošću nukleaze (npr., dva domena nukleaze). Jedan ili više elemenata CRISPR sistema može se dobiti iz CRISPR sistema tipa I, tipa II ili tipa III, kao što je Cas nukleaza. Poželjno, CRISPR protein je cas enzim kao as9. Cas enzimi dobro su poznati u ovoj oblasti; na primer, aminokiselinska sekvenca od S. pyogenes Cas9 proteina može se naći u SwissProt bazi podataka pod pristupnim brojem Q99ZW2. U nekim načinima ostvarivanja, Cas nukleaza i gRNK uvode se u ćeliju. U nekim načinima ostvarivanja, CRISPR sistem indukuje DSB na ciljnom mestu, praćeno ometanjima kao što su ovde opisani. U drugim načinima ostvarivanja, Cas9 varijante, koje se smatraju "nikazama" mogu se koristiti da zaseku jedan lanac na ciljnom mestu. Mogu da se koriste uparene nikaze, npr., da se poboljša specifičnost, svaka usmerena parom različitih gRNK koje ciljaju sekvence. U još nekim drugim načinima ostvarivanja, katalitički neaktivan Cas9 može biti fuziran sa heterolognim efektorskim domenom, kao što je transkripcioni represor, da bi uticao na ekspresiju gena.

[0145] Uopšteno, CRISPR sistem je okarakterisan elementima koji promovišu obrazovanje CRISPR kompleksa na mestu ciljne sekvence. Obično, u kontekstu obrazovanja CRISPR kompleksa, "ciljna sekvenca" uopšteno se odnosi na sekvencu prema kojoj je vodeća sekvenca dizajnirana da ima komplementarnost, gde hibridizacija između ciljne sekvence i vodeće sekvence promoviše obrazovanje CRISPR kompleksa. Potpuna komplementarnost nije nužno potrebna, pod uslovom da postoji dovoljna komplementarnost da se izazove hibridizacija i promoviše obrazovanje CRISPR kompleksa. Ciljna sekvenca može da obuhvata bilo koji polinukleotid, kao što su DNK ili RNK polinukleotidi. Uopšteno, sekvenca ili šablon koji može da se koristi za rekombinaciju u ciljani lokus koji obuhvata ciljne sekvence označava se kao "šablon editovanja" ili "polinukleotid editovanja" ili "sekvenca editovanja". U nekim aspektima, egzogeni polinukleotid šablona može da se označi kao šablon editovanja. U nekim aspektima, rekombinacija je homologna rekombinacija.

[0146] U nekim načinima ostvarivanja, jedan ili više vektora koji pogone ekspresiju jednog ili više elemenata CRISPR sistema uvode se u ćeliju tako da ekspresija elemenata CRISPR sistema usmerava obrazovanje CRISPR kompleksa na jednom ili više ciljnih mesta. Na primer, Cas enzim, vodeća sekvenca

1

vezana za tracr-mate sekvencu i tracr sekvenca mogu, svaka, da budu radno povezane sa odvojenim regulatornim elementima na odvojenim vektorima. Alternativno, dva ili više od elemenata eksprimirana od istih ili različitih regulatornih elemenata, mogu da se kombinuju u jednom vektoru, sa jednim ili više dodatnih vektora koji obezbeđuju bilo koje komponente CRISPR sistema neobuhvaćene u prvom vektoru. U nekim načinima ostvarivanja, elementi CRISPR sistema koji su kombinovani u jednom vektoru mogu biti raspoređeni u bilo kojoj pogodnoj orijentaciji. U nekim načinima ostvarivanja, CRISPR enzim, vodeća sekvenca, tracr mate sekvenca i tracr sekvenca radno su povezani za i eksprimirani iz istog promotera. U nekim načinima ostvarivanja, vektor obuhvata regulatorni element radno povezan za enzim-kodirajuću sekvencu koja kodira CRISPR enzim, kao što je Cas protein.

[0147] U nekim načinima ostvarivanja, CRISPR enzim u kombinaciji sa (i opciono koji gradi komplek sa) vodećom sekvencom dostavlja se ćeliji. Obično se CRISPR/Cas9 tehnologija može koristiti za nokdaun ekspresije gena Suv39h1-a u modifikovanim ćelijama. Na primer, Cas9 nukleaza i vodeća RNK specifična za Suv39h1 gen može da se uvede u ćelije, na primer, pomoću lentivirusnih vektora za dostavu ili bilo kojim od niza poznatih dostavnih postupaka ili nosača za prenos u ćelije, kao što je bilo koji od niza poznatih postupaka ili nosača za dostavljanje Cas9 molekula i vodećih RNK (vidi, takođe, dole).

Dostavljanje nukleinskih kiselina koje kodiraju molekule i komplekse za ometanje gena

[0148] U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina koja kodira DNK-ciljajući molekul, kompleks ili kombinaciju, daje se ili uvodi u ćeliju. Obično, postupci prenosa gena koji su na bazi virusa ili nisu na bazi virusa mogu da se koriste za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju komponente CRISPR, ZFP, ZFN, TALE i/ili TALEN sistema u ćelije u kulturi.

[0149] U nekim načinima ostvarivanja, polipeptidi se sintetišu in situ u ćeliji kao rezultat uvođenja polinukleotida koji kodiraju polipeptide u ćeliji. U nekim aspektima, polipeptidi mogu da se proizvedu izvan ćelije, a potom da se uvedu u nju.

[0150] Postupci za uvođenje polinukleotidnog konstrukta u životinjske ćelije poznati su i uključuju, kao neograničavajući primeri, postupke za stabilnu transformaciju u kojima se polinukleotidni konstrukt integriše u genom ćelije, postupke za prolaznu transformaciju u kojima se polinukleotidni konstrukt ne integriše u genom ćelije i postupke posredovane virusima.

[0151] U nekim načinima ostvarivanja, polinukleotidi se mogu uvesti u ćeliju, na primer, rekombinantnim virusnim vektorima (npr. retrovirusi, adenovirusi), lipozomom i slično. Postupci za prolaznu transformaciju uključuju mikroinjekciju, elektroporaciju ili bombardovanje česticama.

Nukleinska kiselina se daje u obliku ekspresionog vektora. Poželjno, ekspresioni vektor je retrovirusni ekspresioni vektor, adenovirusni ekspresioni vektor, DNK plazmidni ekspresioni vektor ili AAV ekspresioni vektor.

2

[0152] Postupci nevirusnog dostavljanja nukleinskih kiselina uključuju lipofekciju, nukleofekciju, mikroinjekciju, biolistike, virozome, lipozome, imunolipozome, polikatjon ili lipid:nukleinska kiselina konjugate, golu DNK, veštačke virione i agens-poboljšani unos DNK. Lipofekcija je opisana npr. u U.S. Pat. br. 5,049,386, 4,946,787; i 4,897,355), a reagensi lipofekcije komercijalno su dostupni (npr., Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasnu receptorprepoznavanje lipofekciju polinukleotida uključuju one iz Feigner, WO 91/17424; WO 91/16024.

Dostavljanje može biti u ćelije (npr. in vitro ili ex vivo davanje) ili ciljna tkiva (npr. in vivo davanje).

[0153] Sistemi na bazi RNK ili DNK virusa uključuju retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adenopovezane vektore i vektore virusa herpes simpleksa za prenos gena.

[0154] Za pregled procedura genskih terapija, vidi Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11: 162-166 (1993); Dillon. TIBTECH 11: 167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds) (1995); i Yu et al., Gene Therapy 1: 13-26 (1994).

[0155] Reporter gen koji uključuje, ali nije ograničen na, glutation-5-transferazu (GST), perokidazu iz rena (HRP), hloramfenikol acetiltransferazu (CAT) beta-galaktozidazu, beta-glukuronidazu, luciferazu, zeleni fluorescentni protein (GFP), HcRed, DsRed, cijan fluorescentni protein (CFP), žuti fluorescentni protein (YFP) i autofluorescentne proteine uključujući plavi fluorescentni protein (BFP), može se uvesti u ćeliju da kodira genski proizvod koji služi kao marker kojim se meri izmena ili modifikacija ekspresije genskog proizvoda.

Pripremanje ćelija

[0156] Izolovanje ćelija uključuje jednu ili više faza pripreme i/ili separacije ćelija koja nije na osnovu afiniteta, prema dobro poznatim tehnikama u oblasti. U nekim primerima, ćelije se ispiraju, centrifugiraju i/ili inkubiraju u prisustvu jednog ili više reagenasa, na primer, da bi se uklonile neželjene komponente, obogatile željenim komponentama, lizirale ili uklonile ćelije osetljive na određene reagense. U nekim primerima, ćelije se odvajaju na osnovu jednog ili više svojstava, kao što su gustina, adherentna svojstva, veličina, osetljivost i/ili otpornost na određene komponente.

[0157] U nekim načinima ostvarivanja, pripremanje ćelija uključuje faze zamrzavanja, npr., krioprezervaciju, ćelija, ili pre ili posle izolovanja, inkubacije i/ili modifikovanja. Može da se koristi bilo koji od raznih poznatih rastvora za zamrzavanje i parametara u nekim aspektima.

[0158] Obično, ćelije su inkubirane pre ili u vezi sa genetičkim inženjeringom i/ili Suv39h1 inhibicijom.

[0159] Faze inkubacije mogu da obuhvataju kultivisanje, inkubiranje, stimulisanje, aktivaciju, širenje i/ili propagaciju.

[0160] Inhibicija Suv39h1-a prema ovom pronalasku može se takođe postići in vivo nakon ubrizgavanja ćelija u ciljane pacijente. Tipična inhibicija suv39h1-a izvodi se pomoću farmakoloških inhibitora kao što je prethodno opisano.

[0161] Inhibicija Suv39h1-a prema postupku kao što je prethodno opisan može se takođe izvesti tokom faza stimulisanja, aktivacije i/ili širenja. Na primer, PBMC ili prečišćene T-ćelije ili prečišćene NK ćelije ili prečišćeni limfoidni progenitori, šire se in vitro u prisustvu farmakoloških inhibitora Suv39h1-a pre adoptivnog transfera u pacijente. U nekim načinima ostvarivanja, kompozicije ili ćelije se inkubiraju u stimulišućim uslovima ili u prisustvu nekog stimulatornog agensa. Takvi uslovi uključuju one izvedene da indukuju proliferaciju, širenje, aktivaciju i/ili preživljavanje ćelija u populaciji, da imitiraju izlaganje antigenima i/ili da spreme ćelije za genetički inženjering, kao što je za uvođenje genetski modifikovanog antigenskog receptora.

[0162] Uslovi inkubacije mogu da uključuju jedan ili više od odgovarajućih podloga, temperature, sadržaja kiseonika, sadržaja ugljendioksida, vremena, agenasa, npr., nutritijenti, aminokiseline, antibiotici, joni i/ili stimulatorni faktori, kao što su citokini, hemokini, antigeni, vezujući partneri, fuzirani proteini, rekombinantni rastvorljivi receptori i bilo koji drugi agensi dizajnirani da aktiviraju ćelije.

[0163] U nekim načinima ostvarivanja, stimulišući uslovi ili agensi za stimulaciju uključuju jedan ili više agenasa, npr., ligand, koji može da aktivira unutarćelijski domen signalizacije TCR kompleksa. U nekim aspektima, agens uključuje ili pokreće TCR/CD3 kaskadu unutarćelijske signalizacije u T-ćeliji. Takvi agensi mogu da uključuju antitela, kao što su ona specifična za TCR komponentu i/ili kostimulatorni receptor, npr., anti-CD3, anti-CD28, na primer, vezan za čvrst nosač kao što je perlica i/ili jedan ili više citokina. Opciono, postupak širenja može dalje da obuhvata fazu dodavanja anti-CD3 i/ili anti CD28 antitela podlozi za kulturu (npr., u koncentraciji od najmanje oko 0,5 ng/ml). U nekim načinima ostvarivanja, agensi za stimulaciju uključuju 1L-2 i/ili IL-15, na primer, IL-2 koncentracija od najmanje oko 10 jedinica/mL.

[0164] U nekim aspektima, inkubiranje se izvodi u skladu sa tehnikama kao što su one opisane u US Patentu br.6,040,177 od Riddell et al., Klebanoff et al., J Immunother.2012; 35(9): 651-660, Terakura et al., Blood.2012; 1:72-82 i/ili Wang et al. J Immunother.2012,35(9):689-701.

[0165] U nekim načinima ostvarivanja, T-ćelije se šire dodavanjem ćelijama hranilicama kompozicije za iniciranje kulture, kao što su mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) koje se ne dele, (npr., tako da dobijena populacija ćelija sadrži najmanje oko 5, 10, 20 ili 40 ili više PBMC ćelija hranilica za svaki T limfocit u inicijalnoj populaciji koja se širi); i inkubiranje kulture (npr. za vreme dovoljno da se prošire brojne T-ćelije). U nekim aspektima, ćelije hranilice koje se ne dele mogu da obuhvataju gama-ozračene PBMC ćelije hranilice. U nekim načinima ostvarivanja, PBMC se zrače gama zracima u opsegu od oko

4

3000 do 3600 rad da bi se sprečila ćelijska deoba. U nekim aspektima, ćelije hranilice dodaju se podlozi za kulturu pre dodavanja populacija T-ćelija.

[0166] U nekim načinima ostvarivanja, stimulišući uslovi uključuju temperaturu pogodnu za rast humanih T limfocita, na primer, najmanje oko 25 stepeni Celzijusa, uopšteno najmanje oko 30 stepeni i uopšteno na ili oko 37 stepeni Celzijusa. Opciono, inkubacija može dalje da obuhvata dodavanje EBV-transformisanih limfoblastoidnih ćelija (LCL) koje se ne dele kao ćelije hranilice. LCL mogu da se ozrače gama zracima u opsegu od oko 6000 do 10.000 rad. LCL ćelije hranilice u nekim aspektima obezbeđene su u bilo kojoj pogodnoj količini, kao što je odnos LCL ćelija hranilica prema inicijalnim T limfocitima od najmanje oko 10:1.

[0167] U načinima ostvarivanja, antigen-specifične T-ćelije, kao što su antigen-specifične CD4+ i/ili CD8+ T-ćelije, dobijaju se stimulisanjem naivnih ili antigen-specifičnih T limfocita antigenom. Na primer, antigen-specifične T-ćelijske linije ili klonovi mogu se generisati na citomegalovirusne antigene izolovanjem T-ćelija iz inficiranih subjekata i stimulisanjem ćelija in vitro istim tim antigenom.

[0168] U nekim aspektima, postupci uključuju ocenjivanje ekspresije jednog ili više markera na površini modifikovanih ćelija ili ćelija koje se modifikuju. U jednom načinu ostvarivanja, postupci uključuju ocenjivanje površinske ekspresije jednog ili više ciljanih antigena (npr., antigen prepoznat od strane genetski modifikovanog antigenskog receptora) koji treba da se ciljaju adoptivnom ćelijskom terapijom, na primer, postupcima detekcije na osnovu afiniteta kao što je protočnom citometrijom.

Vektori i postupci za genetički inženjering ćelija

[0169] U nekim aspektima, genetički inženjering uključuje uvođenje neke nukleinske kiseline koja kodira genetski modifikovanu komponentu ili drugu komponentu za uvođenje u ćeliju, kao što je komponenta koja kodira protein ili nukleinsku kiselinu ometanja gena.

[0170] Uopšteno, modifikovanje CAR u imunim ćelijama (npr., T-ćelije) zahteva da ćelije budu kultivisane da bi se omogućila transdukcija i širenje. Transdukcija može da koristi razne postupke, ali potreban je stabilan prenos gena da bi se omogućila održiva CAR ekspresija u klonalnom širenju i perzistenciji modifikovanih ćelija.

[0171] U nekim načinima ostvarivanja, prenos gena se postiže prvim stimulisanjem rasta ćelija, npr., T-ćelijskog rasta, proliferacije i/ili aktivacije, praćeno transdukcijom aktiviranih ćelija i širenjem u kulturi do broja dovoljnog za kliničku primenu.

[0172] Različiti postupci za uvođenje genetski modifikovanih komponenata, npr., antigenskih receptora, npr., CAR, dobro su poznati i mogu da se koriste sa obezbeđenim postupcima i kompozicijama. Primeri postupaka uključuju one za transfer nukleinskih kiselina koje kodiraju receptore, uključujući putem virusa, npr., retrovirusa ili lentivirusa, transdukcije, transpozona i elektroporacije.

[0173] U nekim načinima ostvarivanja, rekombinantne nukleinske kiseline prenose se u ćelije pomoću čestica rekombinantnih infektivnih virusa, kao što su, npr., vektori dobijeni od majmunskog virusa 40 (SV40), adenovirusa, adeno-povezanog virusa (AAV). U nekim načinima ostvarivanja, rekombinantne nukleinske kiseline prenose se u T-ćelije pomoću rekombinantnih lentivirusnih vektora ili retrovirusnih vektora, kao što su gama-retrovirusni vektori (vidi, npr., Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3.; Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93; Park et al., Trends Biotechnol. Novembar 2011.; 29(11): 550-557.

[0174] U nekim načinima ostvarivanja, retrovirusni vektor ima dugu terminalnu ponavljajuću sekvencu (LTR), npr., retrovirusni vektor dobijen od Moloney-evog mišjeg virusa leukemije (MoMLV), virusa mijeloproliferativnog sarkoma (MPSV), virusa mišjih embrionskih matičnih ćelija (MESV), virusa mišjih matičnih ćelija (MSCV), virusa formiranja fokusa u slezini (SFFV) ili adeno-povezanog virusa (AAV).

Najviše retrovirusnih vektora dobija se od mišjih retrovirusa. U nekim načinima ostvarivanja, retrovirusi uključuju one dobijene od bilo kog izvora ćelija ptica ili sisara. Obično su retrovirusi amfotropni, što znači da oni mogu da inficiraju ćelije domaćina nekoliko vrsta, uključujući ljude. U jednom načinu ostvarivanja, gen koji treba da se eksprimira zamenjuje retrovirusne gag, pol i/ili env sekvence. Opisani su brojni ilustrativni retrovirusni sistemi (npr., U.S. Pat. br.5,219,740; 6,207,453; 5,219,740; Miller i Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90:8033-8037; i Boris-Lawrie i Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop.3: 102-109.

[0175] Postupci lentivirusne transdukcije takođe su poznati. Primeri postupaka opisani su u npr. Wang et al. (2012) J. Immunother.35(9): 689-701; Cooper et al. (2003) Blood.101: 1637-1644; Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol.506: 97-114; i Cavalieri et al. (2003) Blood.102(2): 497-505.

[0176] U nekim načinima ostvarivanja, rekombinantne nukleinske kiseline prenose se u T-ćelije putem elektroporacije {vidi, npr., Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298 i Van Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437). U nekim načinima ostvarivanja, rekombinantne nukleinske kiseline prenose se u T-ćelije putem transpozicije (vidi, npr., Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437; Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74; i Huang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126). Ostali postupci uvođenja i eksprimiranja genetičkog materijala u imunim ćelijama uključuju transfekciju pomoću kalcijumfosfata (npr., kao što je opisano u Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.), fuziju protoplasta, transfekciju posredovanu katjonskim lipozomima; bombardovanje česticama olakšano česticama volframa (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); i zajedničko taloženje DNK i stroncijumfosfata (Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)).

[0177] Drugi pristupi i vektori za transfer genetski modifikovanih nukleinskih kiselina koje kodiraju genetski modifikovane proizvode su oni opisani, npr., u međunarodnoj prijavi patenta, objava br.: WO2014055668 i U.S. Patentu br.7,446,190.

Kompozicija ovog pronalaska

[0178] Ovaj pronalazak takođe uključuje kompozicije koje sadrže ćelije kao što je opisano ovde i/ili proizvedene obezbeđenim postupcima. Obično, pomenute kompozicije su farmaceutske kompozicije i formulacije za davanje, kao što je za adoptivnu ćelijsku terapiju.

[0179] Farmaceutska kompozicija ovog pronalaska uopšteno obuhvata najmanje jednu modifikovanu imunu ćeliju ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljivi nosač.

[0180] Kao što se ovde koristi izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" uključuje slani rastvor, rastvarače, disperzione podloge, obloge, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično, kompatabilne sa farmaceutskim davanjem. Suplementarna aktivna jedinjenja mogu dalje da budu ugrađena u kompozicije. U nekim aspektima, izbor nosača u farmaceutskoj kompoziciji određuje se delimično pomoću određenog modifikovanog CAR ili TCR, vektora, ili ćelija koje eksprimiraju CAR ili TCR, kao i određenim postupkom koji se koristi za davanje vektora ili ćelija domaćina koje eksprimiraju CAR. Prema tome, postoje razne pogodne formulacije. Na primer, farmaceutska kompozicija može da sadrži konzervanse. Pogodni konzervansi mogu da uključuju, na primer, metilparaben, propilparaben, natrijumbenzoat i benzalkonijum hlorid. U nekim aspektima, koristi se mešavina dva ili više konzervanasa. Konzervansi ili njihove mešavine obično su prisutni u količini od oko 0,0001 do oko 2mas.% ukupne kompozicije.

[0181] Farmaceutska kompozicija formuliše se tako da bude kompatabilna sa namerenim putem njenog davanja.

Terapeutski postupci

[0182] Ovaj pronalazak se, takođe, odnosi na ćelije kao što su prethodno definisane za njihovu upotrebu u adoptivnoj terapiji (naročito adoptivnoj T-ćelijskoj terapiji), obično u lečenju kancera kod subjekta kom je to potrebno.

[0183] Tretiranje" ili "lečenje" kao što se ovde koristi, definiše se kao primena ili davanje ćelija prema ovom pronalasku ili kompozicije koja obuhvata te ćelije pacijentu kom je to potrebno u svrhu izlečenja, isceljenja, ublažavanja, olakšanja, izmene, zalečenja, poboljšanja, boljitka ili delovanja na bolest kao što je kancer ili bilo koji simptom bolesti (npr., kancera). Posebno, pojam "lečiti' ili lečenje" odnosi se na smanjenje ili ublažavanje najmanje jednog nepovoljnog kliničkog simptoma povezanog sa bolešću kao što je kancer kancer, npr., bol, oticanje, loša krvna slika itd.

[0184] Upućivanjem na lečenje kancera, pojam "lečiti' ili lečenje" takođe se odnosi na usporavanje ili preokretanje progresije neoplastičnog nekontrolisanog umnožavanja ćelija, tj. širenja postojećih tumora i/ili zaustavljanja rasta tumora. Pojam "lečiti' ili lečenje" takođe se odnosi na indukovanje apoptoze ćelija kancera ili tumora kod subjekta.

[0185] Subjekat ovog pronalaska (tj. pacijent) je neki sisar, obično primat, kao što je čovek. U nekim načinima ostvarivanja, primat je majmun ili čovekoliki majmun. Subjekat može biti muško ili žensko i može biti bilo koje odgovarajuće starosti, uključujući novorođenče, maloletnika, adolescenta, odrasle i gerijatrijske subjekte. U nekim načinima ostvarivanja, subjekat je sisar koji nije primat, kao što je glodar. U nekim primerima, pacijent ili subjekat je neki validirani životinjski model za bolest, adoptivnu ćelijsku terapiju i/ili za ocenjivanje toksičnih ishoda kao što je sindrom oslobađanja citokina (CRS). U nekim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, pomenuti subjekat ima kancer, je u riziku da dobije kancer ili je u remisiji kancera.

[0186] Kancer može biti neki čvrsti kancer ili "tečni tumor" kao što su kanceri koji napadaju krv, koštanu srž i limfoidni sistem, takođe poznati kao tumori hematopoetskih i limfoidnih tkiva, koji naročito uključuju leukemiju i limfom. Tečni tumori uključuju, na primer, akutnu mijelogenu leukemiju (AML), hroničnu mijelogenu leukemiju (CML), akutnu limfocitnu leukemiju (ALL) i hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), (uključujući razne limfome kao što su limfom mantle ćelija, ne-Hodžkinsov limfom (NHL), adenom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom grkljana, kanceri žučne kese i žučnog kanala, kanceri mrežnjače kao što je retinoblastom).

[0187] Čvrsti kanceri naročito uključuju kancere koji napadaju jedan od organa odabranih iz grupe koju čine kolon, rektum, koža, endometrijum, pluća (uključujući plućni karcinom ne-malih ćelija), materica, kosti (kao što su osteosarkom, hondrosarkomi, Juingov sarkom, fibrosarkomi, tumori džinovskih ćelija, adamantinomi i hordomi), jetra, bubreg, jednjak, želudac, bešika, pankreas, grlić materice, mozak (kao što su meningiomi, glioblastomi, astrocitomi nižeg stepena, oligodendrocitomi, tumori hipofize, švanomi i metastatski kanceri mozga), jajnik, dojke, region glave i vrata, testis, prostata i štitna žlezda.

[0188] Poželjno, kancer prema ovom pronalasku je kancer koji napada krv, koštanu srž i limfoidni sistem kao što je opisano gore. Obično, kancer jeste ili je povezan sa multipli mijelomom.

[0189] U nekim načinima ostvarivanja, subjekat pati od ili je u riziku da oboli od neke infektivne bolesti ili stanja, kao što su, ali nije ograničen na, virusne, retrovirusne, bakterijske i protozoalne infekcije, imunodeficijencija, citomegalovirus (CMV), Epštajn-Barov virus (EBV), adenovirus, BK poliomavirus. U nekim načinima ostvarivanja, bolest ili stanje je autoimuna ili zapaljenska bolest ili stanje, kao što je artritis, npr., reumatoidni artritis (RA), dijabetes tipa I, sistemski eritemski lupus (SLE), zapaljenska bolest creva, psorijaza, skleroderma, autoimuna bolest štitne žlezde, Grejvsova bolest, Kronova bolest multipla skleroza, astma i/ili neka bolest ili stanje povezano sa transplantom.

[0190] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na postupak lečenja, a naročito adoptivnu ćelijsku terapiju, poželjno adoptivnu T-ćelijsku terapiju, koji obuhvata davanje nekom subjektu, kom je potrebno, kompozicije kao što je prethodno opisana.

[0191] U nekim načinima ostvarivanja, ćelije ili kompozicije daju se subjektu, kao što je subjekat koji ima ili je u riziku da oboli od kancera ili bilo koje od bolesti kao što su prethodno navedene. U nekim aspektima, postupci, pri tom, leče, npr., ublažavaju jedan ili više simptoma, bolest ili stanje, kao što je u vezi sa kancerom, smanjenjem opterećenja tumorom kod kancera koji eksprimira antigen prepoznat od strane modifikovane ćelije.

[0192] Postupci za davanje ćelija za adoptivnu ćelijsku terapiju poznati su i mogu da se koriste u vezi sa obezbeđenim postupcima i kompozicijama. Na primer, postupci adoptivne T-ćelijske terapije opisani su, npr., u US prijavi patenta, objava br.2003/0170238 od Gruenberg et al; US Patentu br.4,690,915 od Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85). Vidi, npr., Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol.31(10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438(1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338.

[0193] U nekim načinima ostvarivanja, ćelijska terapija, npr., adoptivna ćelijska terapija, npr., adoptivna T-ćelijska terapija, izvodi se autolognim transferom, u kom se ćelije izoluju i/ili na drugi način pripremaju za subjekat koji treba da primi ćelijsku terapiju ili iz uzorka dobijenog od takvog subjekta. Prema tome, u nekim aspektima, ćelije se dobijaju od subjekta, npr., pacijenta, kom je potrebno lečenje i ćelije, nakon izolovanja i obrade, daju se istom tom subjektu.

[0194] U nekim načinima ostvarivanja, ćelijska terapija, npr., adoptivna ćelijska terapija, npr., adoptivna T-ćelijska terapija, izvodi se alogenim transferom, u kom se ćelije izoluju i/ili na drugi način pripremaju od subjekta koji nije subjekat koji će primiti ili koji ultimativno prima ćelijsku terapiju, npr., prvi subjekat. U takvim načinima ostvarivanja, ćelije se zatim daju nekom drugačijem subjektu, npr., drugom subjektu, iste vrste. U nekim načinima ostvarivanja, prvi i drugi subjekti su genetički identični. U nekim načinima ostvarivanja, prvi i drugi subjekti su genetički slični. U nekim načinima ostvarivanja, drugi subjekat eksprimira istu HLA klasu ili supertip kao prvi subjekat.

[0195] Davanje najmanje jedne ćelije prema ovom pronalasku nekom subjektu, kom je to potrebno, može da se kombinuje sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili zajedno sa drugom terapeutskom intervencijom, ili istovremeno ili sekvencijalno bilo kojim redosledom. U nekim kontekstima, ćelije se zajednički daju sa drugom terapijom dovoljno vremenski blizu tako da ćelijske populacije poboljšavaju efekat jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa ili obrnuto. U nekim načinima ostvarivanja, ćelijske populacije daju se pre jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa. U nekim načinima ostvarivanja, ćelijske populacije se daju nakon jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa.

[0196] U vezi sa lečenjem kancera, kombinovano lečenje kancera može da uključuje, ali nije ograničeno na, hemoterapeutske agense, hormone, anti-angiogene, radio-obeležena jedinjenja, imunoterapiju, hirurgiju, krioterapiju i/ili radioterapiju.

[0197] Imunoterapija uključuje, ali nije ograničena na, modulatore imunoloških kontrolnih tačaka (tj. inhibitore i/ili agoniste), monoklonalna antitela, vakcine protiv kancera.

[0198] Poželjno, davanje ćelije u adoptivnoj T-ćelijskoj terapiji prema ovom pronalasku kombinovano je sa davanjem modulatora imunoloških kontrolnih tačaka. Najpoželjnije, modulatori imunoloških kontrolnih tačaka obuhvataju anti-PD-1 i/ili anti-PDL-1 inhibitore.

[0199] Ovaj pronalazak takođe se odnosi na upotrebu kompozicije koja obuhvata modifikovanu imunu ćeliju kao što je ovde opisana za proizvodnju leka za lečenje kancera, neke infektivne bolesti ili stanja, neke autoimune bolesti ili stanja ili neke zapaljenske bolesti ili stanja kod subjekta.

CRTEŽI

[0200]

Fig.1: Broj centralnih memorijskih CD8+ T-ćelija raste kod Suv39h1-deficijentnih miševa. A.

Reprezentativni FACS tačkasti dijagrami izdvojenih CD8+ T-ćelija slezine. B. Procenat centralnih memorijskih CD8+ T-ćelija izmeren je u različitim hematopoetskim odeljcima (crni krugovi, Suv39h1 KO; beli krugovi: WT ista legla).

Fig.2: Matičnost i memorijski potpis u endogenim antigen-specifičnim Suv39h1 KO CD8+ T-ćelijama. Suv39h1-deficijentne Kb-OVA+ CD8+ T-ćelije imaju potpis ekspresije gena poput matičnih ćelija i memorijskih. Prikazana je analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA).

Fig.3: Povećano preživljavanje i samo-obnavljanje Suv39h1 deficijentnih CD8T-ćelija. A. Eksperimentalna postavka koja prikazuje transfer urođenih CD45.2 Kb-OVA pentameri+ CD8+ T-ćelije, izolovani iz WT i Suv39h1 KO LM-OVA inficiranih miševa, u naivne CD45.1 miševe primaoce (1: sortiranje i transfer CD8+ T podskupova (D0); 2: analiza samo-obnavljanja i diferenciranja (D40-44).40 dana nakon adoptivnog transfera naivni miševi primaoci su čelendžovani sa LM-OVA i 4 dana kasnije Kb-OVA pentameri+ CD8+ T-ćelije su analizirane pomoću FACS. B. Reprezentativni FACS dijagrami donorskih i primalačkih CD8+ T-ćelija su prikazani. C. Ukupan broj oporavljenih CD8+ T-ćelija je prikazan. Rezultati su kombinovani podaci iz 2 nezavisna eksperimenta.

Fig 4: Suv39h1 deficijentne CD8+ OT-1 ćelije kontrolišu rast tumora. (A) Tretirane IL-2/OVA Suv39h1-KO CD45.2 OT-1 i WT-ćelije istog legla prenete su i.v. u miševe primaoce koji nose tumor, nakon 7 dana od inokulacije i intraperitonealno im je ubrizgano anti- PD-1 antitelo (Bio X Cell, RMP-14). Krive rasta tumora tretiranih IL-2/OVA isto leglo WT (B) i Suv39h1-KO OT-1 ćelija (C) adoptivno prenetih u miševe primaoce koji nose tumor.

REZULTATI

4

Materijal i postupci:

[0201] Miševi iz stog legla i Suv39h1 -KO miševi su inficirani i.v. sa 5x10<3>CFU i čelendžovani 40 dana kasnije sa 2x10<6>CFU rekombinantnim Listeria monocytogenes koje eksprimiraju OVA (LM-OVA, izolovan iz soja divljeg tipa 140403s). Bakterije su uzgajane u TSB podlozi (BD Bioscience) do rane log faze i njihov rast je ocenjen fotometrom na OD600. Naivne, depo<->CD44<visok>K<b>-OVA<+>CD8<+>T-ćelije i srodni podskupovi su FACS-sortirani. Za svaki analizirani podskup, prikupljeno je 3 ili 4 biološka replikata. RNK je ekstrahovana pomoću Rneasy Micro kompleta (QUIGEN) prema protokolu proizvođača. Uključeno je kolonsko tretiranje DNKzom (QUIGEN). Za svaki uslov, RNK je korišćena za sintezu cDNK prema standardnom Affymetrix protokolu. Obeležena DNK je hibridizovana na Affymetrix mišjem genu 2.1 ST i obrađena na Affymetrix GeneTitan uređaju.

Analiza podataka mikročipa:

[0202] Podaci mikročipa obrađeni su u R (verzija 3.0.0) upotrebom paketa od Bioconductor. Korišćene su CEL datoteke sa sirovim podacima i analiza kontrole kvaliteta izvedena je pomoću ArrayQualityMetrics paketa. Sirovi podaci su obrađeni pomoću RMA postupka dostupnog u oligo paketu. Probe bez anotacije uklonjene su iz analize. Uređeni t-testovi izvedeni su pomoću limma paketa i pvrednosti su podešene pomoću višestrukog testiranja sa Benjamini Hochberg postupkom. Konačno, smatralo se statistički značajnim ako je podešena p-vrednost niža od 5%.

[0203] Analiza obogaćivanja skupa gena. Analiza obogaćivanja skupa gena (GSEA) izvedena je sa genom sa imunološkim potpisima (C7) i C2 (uređenim) skupovima gena iz Molecular Signatures DataBase (MSigDB database v5.1, http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp). GMT datoteka je preuzeta sa informacijom o simbolima gena. GCT datoteku činilo je ukupno 41345 proba i uvezena je u GSEA. GSEA pokrenuta je sa zadatim parametrima osim broja permutacije (n = 10000). BubbleGUM analiza izvedena je kao što je prethodno opisano.

Analiza rasta tumora u Suv39h1 deficijentnim CD8+ OT-1 ćelijama izvedena je kao što sledi:

[0204] Cela slezina i limfni čvor iz mužjaka Suv39h1-KO CD45.2 OT-1 (specifična za OVA257-264 peptid SIINFEKL u kontekstu H2-Kb MHC klase I) i WT miševa istog legla kultivisani su u kompletnoj podlozi (RPMI 1640 dopunjena sa 10% FBS, penicilin-streptomicinom i L-glutaminom) tokom 3 dana i zatim su aktivirani sa 100UI/ml IL-2 i 1 ug/ml OVA257-264 peptida tokom naredna 3 dana.

[0205] Za inokulaciju tumora, 1x10<6>EL4-OVA ćelija limfoma ubrizgano je subkutano u desni bok CD45.1/C57BL/6 mužjaka miševa i nakon 7 dana, miševima je ubrizgano i.v.2x10<6>IL-2/OVA tretiranih Suv39h1-KO CD45.2 OT-1 ćelija ili WT-ćelije istog legla.

[0206] Miševima su intraperitonealno ubrizgani anti-PD1 (Bio X Cell, RMP-14) koji su dati u dozi od 7,5mg/Kg telesne mase po dozi dvaput/nedeljno tokom 2 nedelje. Rast tumora je izmeren pomoću ručnog kalipera.

Rezultati:

[0207]

1) Rezultati pokazuju da u ćelijskoj populaciji dobijenoj iz Suv39h1-KO miševa, rani progenitori sa fenotipom "poput matičnih ćelija" akumuliraju i reprogramiraju sa povećanom efikasnošću u dugotrajne centralne memorijske T-ćelije koje eksprimiraju i CD44 i CD62L u odnosu na ćelijsku populaciju dobijenu iz miševa divljeg tipa. Kao što je prikazano na Fig.1, proporcija i brojevi centralnih memorijskih T-ćelija (koje eksprimiraju i CD44 i CD62L) su povećani kod Suv39h1-defektnih miševa.

2) Transkriptomska analiza korišćena je radi razumevanja mehanizma ovog jedinstvenog fenotipa:

Miševi divljeg tipa i Suv39h1-deficijentni miševi su imunizovani sa OVA-eksprimirajućom Listeria m. i OVA-specifične T-ćelije su izolovane 7 dana nakon imunizacije pomoću sortirajuće protočne citometrije.

Nakon Affymetrix analize ćelija, otkriveno je da efektorske T-ćelije od Suv39h1 eksprimiraju više nivoe mRNK koje kodiraju ćelijski povezane proteine matičnih ćelija (CD8+ T memorijski potpis poput matičnih ćelija (86 gena): Abcb1a Irf8 Rest Abcb1b Jarid2 Rif1 Alpl Kat6a Rnf138 Antxr2 Klf4 Rras Arl4c Ldha Sall4 Atr Ldhb Satb1 Baalc Ldhc Setbp1 Basp1 Ldhd Setdb1 Bcl6 Lect1 Skil Bub1 Lpin1 Smarcad1 Ccr7 Ly6a Sox2 Ccr9 Ly6e Spon1 Cd27 Map3k8 Stat3 Cxcr6 Mapk12 Tbx3 Dock9 Mcm3ap Tcf3 Dusp9 Mcoln2 Tcl1 Eomes Myc Tdgf1 Esrrb Nanog Tert Evl Ncor2 Tigit Fas Nr0b1 Tnfaip2 Fgf2 Nr1d2 Tnfrsf1b Fut4 P2ry14 Traf1 Gzmk Pax6 Traf4 Hand1 Pcgf2 Trib2 Hesx1 Plekha5 Txnip ler3 Podxl Zfp42 Il2rb Pou5f1 Zfx Il7r Pou6f1 Zic3 Irf4 Prkce).

Zaključeno je da OVA-specifične T-ćelije iz Suv39h1-deficijentnih miševa stimulisanih nakon Listeria m. infekcije, eksprimiraju mRNK potpis poput "matičnih ćelija".

3) Suv39h1 deficijentne CD8+ T-ćelije pokazuju povećano preživljavanje i samo-obnavljanje in vivo.

[0208] Kongene CD45.2 Kb-OVA pentameri+ CD8+ T-ćelije, izolovane iz WT i Suv39h1 KO LM-OVA inficiranih miševa prenete su u naivne CD45.1 miševe primaoce.40 dana nakon adoptivnog transfera,

Claims (14)

1. naivni miševi primaoci čelendžovani su sa LM-OVA i 4 dana kasnije Kb-OVA pentameri+ CD8+ T-ćelije su analizirane pomoću FACS.
2. [0209] Kao što je prikazano na Fig.
3. 3, rezultat pokazuje da Suv39h1-deficijentna-ćelija eksprimira povišene nivoe potpisa "poput matičnih ćelija". Takođe su bolje preživljavale i efikasnije su ponovo naseljavale miševe divljeg tipa nakon adoptivnog transfera.
4. 4) Suv39h1 deficijentne CD8+ OT-1 ćelije kontrolišu rast tumora in vivo

   [0210] Fig.4 B i C prikazuju da su miševi kojima su adoptivno prenete Suv39h1-KO OT-1 ćelije i tretirani sa anti-PD1 monoklonalnim antitelom, kontrolisali rast tumora bolje od miševa koji su primili sličnu terapiju ali sa WT OT-1 ćelijama. Napomena, do 30. dana nakon ubrizgavanja tumora, 4 od 5 WT miševa sa prenetim OT-1 pokazalo je rast tumora, u odnosu na samo 1 od 5 miševa sa ubrizganim Suv39h1-KO OT-1 ćelijama.

   Zaključci

   [0211] Odsustvo aktivnosti Suv39h1-a u CD8+ T-ćelijama povezano je sa boljom anti-tumorskom efikasnošću u terapeutskom pristupu na bazi adoptivnog transfera T-ćelija.

   Patentni zahtevi

   1. Modifikovana imuna ćelija defektna za Suv39hl, za upotrebu u adoptivnoj ćelijskoj terapiji kancera, pri čemu je ekspresija i/ili aktivnost Suv39hl-a selektivno blokirana ili inhibirana i gde pomenuta modifikovana imuna ćelija:

   - predstavlja T-ćeliju, NK ćeliju ili progenitor T-ćelija, i

   - dalje obuhvata jedan ili više genetski modifikovanih antigenskih receptora koji specifično vežu ciljani antigen.

   2. Modifikovana imuna ćelija defektna za Suv39hl za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je SUV39hl gen potisnut ili prekinut.

   4

   3. Modifikovana imuna ćelija defektna za Suv39hl za upotrebu prema zahtevu 2, pri čemu se represija ili ometanje gena postiže utišavanjem gena, genskim nokdaunom, nokautom, nokinom i/ili tehnikama ometanja gena, kao što je editovanje gena.

   4. Modifikovana imuna ćelija defektna za Suv39hl za upotrebu prema zahtevu 2 ili 3, pri čemu represija ili ometanje Suv39hl gena uključuje brisanje čitavog gena, eksona ili regiona, zamenu egzogenom sekvencom i/ili mutaciju mutacijom pomeranja okvira čitanja ili mutacijom pogrešnog smisla unutar tog gena.
5. 5. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 4, pri čemu T-ćelija predstavlja CD4<+>T-ćeliju, CD8<+>T-ćeliju ili CD4<+>/CD8<+>T-ćeliju.
6. 6. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je ta ćelija autologna.
7. 7. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 5, pri čemu je ta ćelija alogena.
8. 8. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu se ciljani antigen eksprimira na ćelijama kancera i/ili je univerzalni tumorski antigen.
9. 9. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 8, pri čemu jedan ili više genetski modifikovanih antigenskih receptora predstavlja T-ćelijski receptor (TCR) ili himerni antigenski receptor (CAR) koji uključuje jedan ili više antigen vezujućih molekula u njihovom vanćelijskom delu.
10. 10. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu ta ćelija dalje eksprimira najmanje drugi genetski modifikovani receptor koji prepoznaje različiti antigen.
11. 11. Modifikovana imuna ćelija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1 do 10, koja je sadržana u farmaceutskoj kompoziciji.
12. 12. Modifikovana imuna ćelija ili kompozicija koja je obuhvata za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-11, pri čemu se pomenuta ćelija ili kompozicija daje u kombinaciji sa modulatorom imunoloških kontrolnih tačaka.
13. 13. Modifikovana imuna ćelija ili kompozicija koja je obuhvata za upotrebu prema zahtevu 12, pri čemu se modulator imunoloških kontrolnih tačaka bira od anti-PD1 ili anti-PDL1.
14. 14. Postupak za proizvodnju genetski modifikovane imune ćelije kakva je definisana u bilo kom od zahteva 1-13, koji obuhvata inhibiciju ekspresije i/ili aktivnosti Suv39hl-a u imunoj ćeliji; i uvođenje jednog ili više genetski modifikovanih antigenskih receptora koji se specifično vezuju za ciljani antigen u pomenutu imunu ćeliju.

    4