RS61728B1 - Jednograni fuzioni receptorski proteini tipa i i tipa ii i njihove upotrebe - Google Patents

Jednograni fuzioni receptorski proteini tipa i i tipa ii i njihove upotrebe

Info

Publication number
RS61728B1
RS61728B1 RS20210481A RSP20210481A RS61728B1 RS 61728 B1 RS61728 B1 RS 61728B1 RS 20210481 A RS20210481 A RS 20210481A RS P20210481 A RSP20210481 A RS P20210481A RS 61728 B1 RS61728 B1 RS 61728B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
polypeptide
seq
tgf
type
amino acid
Prior art date
Application number
RS20210481A
Other languages
English (en)
Inventor
Ravindra Kumar
Asya Grinberg
Dianne S Sako
Original Assignee
Acceleron Pharma Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Acceleron Pharma Inc filed Critical Acceleron Pharma Inc
Publication of RS61728B1 publication Critical patent/RS61728B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] Natporodica transformišućeg faktora rasta-beta (transforming growth factor-beta, TGF-beta) sadrži različite faktore rasta koji imaju zajedničke sekvencione elemente i strukturne motive. Za ove proteine se zna da ispoljavaju biološke efekte prema velikom broju različitih tipova ćelija kod kičmenjaka i beskičmenjaka. Članovi natporodice obavljaju važne funkcije tokom embrionalnog razvića u formiranju obrazaca i specifikaciji tkiva i mogu uticati na različite procese diferencijacije, uključujući adipogenezu, miogenezu, hondrogenezu, kardiogenezu, hematopoezu, neurogenezu i diferencijaciju ćelija epitela. Natporodica je podeljena u dve opšte filogenetske klade: kladu skorije razvijenih članova natporodice, koja uključuje TGF-beta, aktivine, i nodal i kladu proteina natporodice udaljenije srodnosti, koja uključuje veći broj BMP i GDF. Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870. Članovi TGF-beta natporodice imaju različite, često komplementarne biološke efekte. Manipulisanjem aktivnošću članova TGF-beta natporodice često je moguće proizvesti značajne fiziološke promene organizma. Na primer, rase goveda pijemont i belgijskog plavog goveda nose mutaciju gubitka funkcije u GDF8 (nazvanom još i miostatin) genu, koja dovodi do upadljivog porasta mišićne mase. Grobet et al. (1997) Nat Genet., 17(1):71-4. Pored toga, kod ljudi, neaktivni aleli GDF8 udruženi su sa porastom mišićne mase i, kako se navodi, izuzetnom snagom. Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8.
[0002] Promene u mišićima, kostima, masnom tkivu, crvenim krvnim ćelijama, i drugim tkivima mogu se postići pojačanjem ili inhibiranjem signalizacije (npr., SMAD 1, 2, 3, 5, i/ili 8) posredovane ligandima iz TGF-beta natporodice. Dakle, postoji potreba za sredstvima koja regulišu aktivnost različitih liganada TGF-beta natporodice.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0003] Delom, objava obezbeđuje heteromultimerne komplekse koji uključuju jedan serin/treonin kinazni receptoski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, ili MISRII polipeptid), uključujući njihove fragmente i varijante. Ovi konstrukti mogu da se označe u ovom tekstu kao "jednograni" polipeptidni kompleksi. Opciono, jednograni polipeptidni kompleksi objavljeni u ovom tekstu (npr., jednograni ActRIIB polipeptidni kompleks, kao što je ActRIIB-Fc:Fc heterodimer) imaju različite ligand-vezujuće specifičnosti/profile u odnosu na odgovarajući homodimerni kompleks (npr., ActRIIB homodimer, kao što je ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc). Nove osobine ispoljavaju heteromultimerni polipeptidni kompleksi koji uključuju jedan domen serin/treonin kinaznog receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, kako je pokazano Primerima u ovom tekstu.
[0004] Heteromultimerne strukture uključuju, na primer, heterodimere, heterotrimere, i komplekse višeg reda. Poželjno, ovde opisani receptorski polipeptidi tipa I i tipa II TGF-beta natporodice sadrže ligand-vezujući domen receptora, na primer, vanćelijski domen receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Prema tome, u određenim aspektima, proteinski kompleksi opisani u ovom tekstu uključuju vanćelijski domen receptora tipa II TGF-beta natporodice odabranih između: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII, kao i njihove skraćene oblike i varijante, ili vanćelijski domen receptora tipa I TGF-beta natporodice odabranih između: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7, kao i njihove skraćene oblike i varijante. Poželjno, ovde opisani polipeptidi tipa I i tipa II TGF-beta natporodice, kao i proteinski kompleksi koji ih sadrže, su rastvorljivi. U određenim aspektima, heteromultimerni kompleksi objave vezuju se sa jednim ili više liganada TGF-beta natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, neurotrofni faktor poreklom iz glijskih ćelija (glial cell-derived neurotrophic factor, GDNF), neurturin, artemin, persefin, milerijanska inhibitorna supstanca (Mullerian-inhibiting substance, MIS), i Lefty). Opciono, proteinski kompleksi objave vezuju se za jedan ili više ovih liganada sa KDjednakom ili manjom od 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, ili 10<-12>. Uopšteno, heteromultimerni kompleksi objave antagonizuju (inhibiraju) jednu ili više aktivnosti najmanje jednog liganda TGF-beta natporodice, i takve promene aktivnosti mogu da se mere korišćenjem različitih testova poznatih u struci, uključujući, na primer, test baziran na ćelijama, kako je opisano u ovom tekstu. Poželjno, proteinski kompleksi objave imaju poluživot u serumu od najmanje 4, 6, 12, 24, 36, 48, ili 72 sata, kod sisara (npr., miša ili čoveka). Opciono, proteinski kompleksi objave mogu imati poluživot u serumu od najmanje 6, 8, 10, 12, 14, 20, 25, ili 30 dana, kod sisara (npr., miš ili čovek).
[0005] U određenim aspektima, proteinski kompleksi opisani u ovom tekstu uključuju prvi polipeptid kovalentno ili nekovalentno udružen sa drugim polipeptidom, pri čemu prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i aminokiselinsku sekvencu prvog člana interakcionog para, a drugi polipeptid uključuje drugog člana interakcionog para i ne sadrži aminokiselinsku sekvencu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Opciono, drugi polipeptid uključuje, pored drugog člana interakcionog para, dodatnu polipeptidnu sekvencu koja nije receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i može opciono uključivati ne više od 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 300, 400 ili 500 amino-kiselina. Opciono, receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice povezan je direktno sa prvim članom interakcionog para, ili međusekvenca, kao što je linker, može se nalaziti između aminokiselinske sekvence receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i aminokiselinske sekvence prvog člana interakcionog para. Primeri linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na sekvence TGGG, TGGGG, SGGGG, GGGGS, i GGG.
[0006] Interakcioni parovi opisani u ovom tekstu dizajnirani su tako da promovišu dimerizaciju ili formiraju multimere višeg reda. U nekim primerima izvođenja, interakcioni par mogu činiti bilo koje dve polipeptidne sekvence koje interaguju da formiraju kompleks, posebno heterodimerni kompleks, mada se u operativnim primerima izvođenja može upotrebiti i interakcioni par koji formira homodimerni kompleks. Prvi i drugi član interakcionog para mogu činiti asimetrični par, što znači da se članovi para preferencijalno udružuju jedan sa drugim, a ne samoudružuju. Prema tome, prvi i drugi član asimetričnog interakcionog para mogu da se udružuju da bi formirali heterodimerni kompleks. Alternativno, interakcioni par može biti nevođen, što znači da članovi para mogu da se udružuju jedan sa drugim ili da se samoudružuju bez suštinske preferencije i tako mogu imati iste ili različite aminokiselinske sekvence. Prema tome, prvi i drugi član nevođenog interakcionog para mogu da se udružuju da formiraju homodimerni kompleksa ili heterodimerni kompleks. Opciono, prvi član interakcionog para (npr., asimetričnog para ili nevođenog interakcionog para) udružuje se kovalentno sa drugim članom interakcionog para. Opciono, prvi član interakcionog para (npr., asimetričnog para ili nevođenog interakcionog para) udružuje se nekovalentno sa drugim članom interakcionog para.
[0007] Tradicionalni Fc fuzioni proteini i antitela primeri su nevođenih interakcionih parova, dok su različiti inženjerisani Fc domeni bili dizajnirani kao asimetrični interakcioni parovi. Prema tome, prvi član i/ili drugi član interakcionog para opisan ovde mogu sadržati konstantni domen imunoglobulina, uključujući, na primer, Fc deo imunoglobulina. Opciono, prvi član interakcionog para može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je izvedena iz Fc domena IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 imunoglobulina. Na primer, prvi član interakcionog para može sadržati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa bilo kojom od SEQ ID NO: 200-214. Opciono, drugi član interakcionog para može sadržati aminokiselinsku sekvencu koja je izvedena iz Fc domena IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4. Na primer, drugi član interakcionog para može sadržati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa bilo kojom od SEQ ID NO: 200-214. U nekim primerima izvođenja, prvi član i drugi član interakcionog para uključuju Fc domene izvedene iz iste klase i podtipa imunoglobulina. U drugim primerima izvođenja, prvi član i drugi član interakcionog para uključuju Fc domene izvedene iz različitih klasa ili podtipova imunoglobulina. Opciono, prvi član i/ili drugi član interakcionog para (npr., asimetričnog para ili nevođenog interakcionog para) uključuju modifikovani konstantni domen imunoglobulina, uključujući, na primer, modifikovani Fc deo imunoglobulina. Na primer, proteinski kompleksi objave mogu uključivati prvi Fc deo IgG koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe: SEQ ID NO: 200-214 i drugi Fc deo IgG, koji može biti isti ili različit od aminokiselinske sekvence prvog modifikovanog Fc dela IgG, koji uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe: SEQ ID NO: 200-214.
[0008] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji uključuju jedan receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ActRIIA receptora. Na primer, ActRIIA polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ActRIIA sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, i 402). Opciono, ActRIIA polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 21-30 (npr., aminokiselinske rezidue 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, ili 30) SEQ ID NO: 9, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 110-135 (npr., 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134 ili 135) SEQ ID NO: 9. Opciono, ActRIIA polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ActRIIA. Na primer, ActRIIA polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ActRIIA polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 101, 103, 401, i 402). U nekim primerima izvođenja, multimerizacioni domeni opisani u ovom tekstu uključuju jednu komponentu interakcionog para. Heteromerni kompleksi koji uključuju ActRIIA polipeptid ne uključuju drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice ali mogu sadržati dodatne polipetide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0009] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji uključuju receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ActRIIB receptora. Na primer, ActRIIB polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ActRIIB sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, i 404). Opciono, ActRIIB polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 20-29 (npr., aminokiselinske rezidue 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) SEQ ID NO: 1, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 109-134 (npr., aminokiselinske rezidue 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 SEQ ID NO: 1. Opciono, ActRIIB polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ActRIIB. Na primer, ActRIIB polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ActRIIB polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 104, 106, 403, i 404).
[0010] U nekim primerima izvođenja, multimerizacioni domeni opisani u ovom tekstu sadrže jednu komponentu interakcionog para. Heteromerni kompleksi koji sadrže ActRIIB polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0011] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz TGFBRII receptora. Na primer, TGFBRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa TGFBRII sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, i 410). Opciono, TGFBRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ili 51 SEQ ID NO: 42, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165 ili 166 SEQ ID NO: 42. Opciono, TGFBRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 ili 44 SEQ ID NO: 67, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 ili 191 SEQ ID NO: 67. Opciono, TGFBRII polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa TGFBRII. Na primer, TGFBRII polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između TGFBRII polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 113, 115, 409, i 410). U nekim primerima izvođenja, multimerizacioni domeni opisani u ovom tekstu uključuju jednu komponentu interakcionog para. Heteromerni kompleksi koji uključuju TGFBRII polipeptid ne uključuju još jedan receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0012] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz BMPRII receptora. Na primer, BMPRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa BMPRII sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, i 406). Opciono, BMPRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 27-34 (npr., aminokiselinske rezidue 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, i 34) SEQ ID NO: 46 ili 71, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 123-150 (npr., aminokiselinske rezidue 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, i 150) SEQ ID NO: 46 ili 71. Opciono, BMPRII polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa BMPRII. Na primer, BMPRII polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između BMPRII polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 107, 109, 405, i 406). Heteromerni kompleksi koji uključuju BMPRII polipeptid ne uključuju još jedan receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0013] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz MISRII receptora. Na primer, MISRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa MISRII sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, i 408). Opciono, MISRII polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 17-24 (npr., aminokiselinske rezidue 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, i 24) SEQ ID NO: 50, 75, ili 79, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 116-149 (npr., aminokiselinske rezidue 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, i 149) SEQ ID NO: 50, 75, ili 79. Opciono, MISRII polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa MISRII. Na primer, MISRII polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između MISRII polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 110, 112, 407, i 408). U nekim primerima izvođenja, multimerizacioni domeni opisani u ovom tekstu uključuju jednu komponentu interakcionog para. Heteromerni kompleksi koji uključuju MISRII polipeptid ne uključuju drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0014] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK1 receptora. Na primer, ALK1 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK1 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, i 412). Opciono, ALK1 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 22-34 (npr., aminokiselinske rezidue 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, i 34) SEQ ID NO: 14, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 95-118 (npr., aminokiselinske rezidue 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, i 118) SEQ ID NO: 14. Opciono, ALK1 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK1. Na primer, ALK1 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK1 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 116, 118, 411, i 412). Heteromerni kompleksi koji uključuju ALK1 polipeptid ne uključuju drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0015] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK2 receptora. Na primer, ALK2 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK2 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121, 413, i 414). Opciono, ALK2 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 21-35 (npr., aminokiselinske rezidue 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, i 35) SEQ ID NO: 18, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 99-123 (npr., aminokiselinske rezidue 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, i 123) SEQ ID NO: 18. Opciono, ALK2 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK2. Na primer, ALK2 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK2 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 119, 121, 413, i 414). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK2 polipeptid ne sadrži drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0016] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK3 receptora. Na primer, ALK3 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK3 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, i 416). Opciono, ALK3 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 24-61 (npr., aminokiselinske rezidue 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, i 61) SEQ ID NO: 22, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 130-152 (npr., aminokiselinske rezidue 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, i 152) SEQ ID NO: 22. Opciono, ALK3 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK3. Na primer, ALK3 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK3
1
polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 122, 124, 415, i 416). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK3 polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0017] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK4 receptora. Na primer, ALK4 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK4 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, i 418). Opciono, ALK4 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 23-34 (npr., aminokiselinske rezidue 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34) SEQ ID NO: 26 ili 83, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 101-126 (npr., aminokiselinske rezidue 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, i 126) SEQ ID NO: 26 ili 83. Opciono, ALK4 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK4. Na primer, ALK4 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK4 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 125, 127, 417, i 418). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK4 polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0018] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK5 receptora. Na primer, ALK5 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK5 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, i 420). Opciono, ALK5 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 25-36 (npr., aminokiselinske rezidue 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, i 36) SEQ ID NO: 30 ili 87, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 106-126 (npr., aminokiselinske rezidue 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, i 126) SEQ ID NO: 30 ili 87. Opciono, ALK5 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK5. Na primer, ALK5 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK5 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 128, 130, 419, i 420). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK5 polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0019] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK6 receptora. Na primer, ALK6 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK6 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, i 422). Opciono, ALK6 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 14-32 (npr., aminokiselinske rezidue 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, i 32) SEQ ID NO: 34, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 102-126 (npr., aminokiselinske rezidue 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, i 126) SEQ ID NO: 34. Opciono, ALK6 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 26-62 (npr., aminokiselinske rezidue 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, i 62) SEQ ID NO: 91, i b) završava se bilo kojom od amino-kiselina 132-156 (npr., aminokiselinske rezidue 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, i 156) SEQ ID NO: 91. Opciono, ALK6 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK6. Na primer, ALK6 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK6 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 131, 133, 421, i 422). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK6 polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0020] U nekim primerima izvođenja, objava obezbeđuje heteromerne polipeptidne komplekse koji sadrže receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, pri čemu je receptorski polipeptid TGF-beta natporodice izveden iz ALK7 receptora. Na primer, ALK7 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa ALK7 sekvencom objavljenom u ovom tekstu (npr., SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, i 424). Opciono, ALK7 polipeptidi mogu uključivati, sastojati se suštinski, ili sastojati se od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji a) počinje bilo kojom od amino-kiselina 21-28 SEQ ID NO: 38 (npr., amino-kiseline 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, ili 28) i završava se bilo kojom od amino-kiselina 92-113 SEQ ID NO: 38 (npr., amino-kiseline 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, ili 113 SEQ ID NO: 38). Opciono, ALK7 polipeptidi objave mogu biti fuzioni proteini koji uključuju još i jedan ili više delova (domena) koji su heterologni sa ALK7. Na primer, ALK7 polipeptid može biti fuzionisan sa heterolognim polipeptidom koji uključuje multimerizacioni domen, opciono sa linkerskim domenom smeštenim između ALK7 polipeptida i heterolognog polipeptida (npr., SEQ ID NO: 134, 136, 423, i 424). Heteromerni kompleksi koji sadrže ALK7 polipeptid ne sadrže drugi receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, ali mogu sadržati dodatne polipeptide koji nisu receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0021] U nekim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice objavljeni u ovom tekstu sadrže jednu ili više modifikovanih aminokiselinskih rezidua odabranih između: glikozilovane amino-kiseline, PEGilisane amino-kiseline, farnezilovane amino-kiseline, acetilisane amino-kiseline, biotinisane amino-kiseline, aminokiseline konjugovane sa lipidnom komponentom, i amino-kiseline konjugovane sa organskim derivatizujućim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice opisani u ovom tekstu su glikozilovani i imaju obrazac
1
glikozilacije koji se može dobiti ekspresijom polipeptida u sisarskoj ćeliji, uključujući, na primer, CHO ćeliju.
[0022] U određenim aspektima, objava obezbeđuje nukleinske kiseline koje kodiraju bilo koji od receptorskih polipeptida tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice opisanih u ovom tekstu, uključujući bilo koje fuzione proteine koji uključuju članove interakcionog para. Nukleinske kiseline objavljene u ovom tekstu mogu biti operabilno povezane sa promotorom za ekspresiju, a objava obezbeđuje još i ćelije transformisane takvim rekombinantnim polipeptidima. Poželjno, ćelija je ćelija sisara kao što je COS ćelija ili CHO ćelija.
[0023] U određenim aspektima, objava obezbeđuje postupke za pravljenje nekog od receptorskih polipeptida tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice opisanih u ovom tekstu kao i proteinskih kompleksa koji uključuju takve polipeptide. Takav postupak može uključivati ekspresiju neke od nukleinskih kiselina objavljenih u ovom tekstu u pogodnoj ćeliji (npr., CHO ćelija ili COS ćelija). Takav postupak može uključivati: a) kultivisanje ćelije pod uslovima pogodnim za ekspresiju receptorskih polipeptida tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice opisanih u ovom tekstu, pri čemu je pomenuta ćelija transformisana ekspresionim konstruktom polipeptida tipa I ili tipa II; i b) oporavljanje tako eksprimiranih polipeptida tipa I ili tipa II. Polipeptidi tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice opisani u ovom tekstu, kao i proteinski kompleksi istih, mogu biti oporavljeni u vidu sirovih, delimično prečišćenih, ili visokoprečišćenih frakcija, korišćenjem neke od dobro poznatih tehnika za dobijanje proteina iz ćelijskih kultura.
[0024] Svaki od proteinskih kompleksa opisanih u ovom tekstu može se inkorporisati u farmaceutski preparat. Opciono, takvi farmaceutski preparati su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ili 99% čisti u pogledu drugih polipeptidnih komponenti. Opciono, farmaceutski preparati objavljeni u ovom tekstu mogu uključivati jedno ili više dodatnih aktivnih sredstava.
[0025] Objava obezbeđuje još i postupke za upotrebu proteinskih kompleksa i farmaceutskih preparata opisanih u ovom tekstu za lečenje ili prevenciju različitih stanja udruženih sa TGF-beta, uključujući bez ograničavanja oboljenja i poremećaje udružene sa, na primer, kancerom, mišićima, kostima, masnim tkivom, crvenim krvnim ćelijama, metabolizmom, fibrozom i drugim tkivima na koja utiče jedan ili više liganada TGF-beta natporodice.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0026]
Slika 1 prikazuje šematske primere jednogranih heteromernih proteinskih kompleksa koji uključuju receptorski polipeptid tipa I ili receptorski polipeptid tipa II. Takvi kompleksi mogu da se asambliraju kovalentno ili nekovalentno preko multimerizacionog domena sadržanog u okviru svakog polipeptidnog lanca. Dva asamblirana multimerizaciona domena čine interakcioni par koji može biti vođen ili nevođen.
Slika 2 prikazuje šematski primer jednogranog heteromernog proteinskog kompleksa koji uključuju receptorski polipeptid tipa I (označen kao "I") (npr. polipeptid koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa vanćelijskim domenom ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6 ili ALK7 proteinom iz čoveka ili druge vrste) ili receptorski polipeptid tipa II (označen kao "II") (npr. polipeptid koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa vanćelijskim domenom ActRIIA, ActRIIB, MISRII, BMPRII, ili TGFBRII proteinom iz čoveka ili druge vrste). U ilustrovanom primeru izvođenja, receptorski polipeptid tipa I ili tipa II deo je fuzionog polipeptida koji uključuje prvog člana interakcionog para ("B"), koji se udružuje sa drugim članom interakcionog para ("C"). U fuzionom polipeptidu, linker može biti smešten između receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II i odgovarajućeg člana interakcionog para. Prvi i drugi član interakcionog para (B, C) mogu biti vođeni (asimetrični) par, što znači da se članovi para udružuju preferencijalno jedan sa drugim, a ne da se samoudružuju, ili interakcioni par može biti nevođen, što znači da članovi para mogu da se udružuju jedan sa drugim ili da se samoudružuju bez suštinske preferencije i mogu imati iste ili različite aminokiselinske sekvence. Tradicionalni Fc fuzioni proteini i antitela primeri su nevođenih interakcionih parova, dok su različiti inženjerisani Fc domeni dizajnirani kao vođeni (asimetrični) interakcioni parovi.
Slika 3 prikazuje poravnavanje vanćelijskih domena humanog ActRIIA (SEQ ID NO: 500) i humanog ActRIIB (SEQ ID NO: 2) sa reziduama određenim u ovom tekstu, na osnovu kompozitne analize više kristalnih struktura ActRIIB i ActRIIA, za direktni kontakt sa ligandom, koje su označene tako što su uokvirene.
Slika 4 prikazuje poravnavanje više sekvenci različitih kičmenjačkih ActRIIB prekursorskih proteina, bez unutarćelijskih domena (SEQ ID NO: 501, 502, 503, 504, 505, i 506, respektivno),humanog ActRIIA prekursorskog proteina bez njegovog
1
unutarćelijskog domena (SEQ ID NO: 507), i konsenzusnog ActRII prekursorskog proteina (SEQ ID NO: 508).
Slika 5 prikazuje poravnavanje više sekvenci Fc domena iz humanih IgG izotipova, uz korišćenje Clustal 2.1. Regioni "šarki" naznačeni su tako što su podvučeni istačkanom linijom. Dvostrukom linijom podvučeni su primeri pozicija inženjerisanog IgG1 Fc za promovisanje asimetričnog sparivanja lanaca i odgovarajuće pozicije u odnosu na druge izotipove IgG2, IgG3 i IgG4.
Slika 6 prikazuje podatke za vezivanje liganda za jednograni ActRIIB-Fc:Fc heterodimerni proteinski kompleks u poređenju sa ActRIIB-Fc homodimerom. Za svaki proteinski kompleks, ligandi su rangirani prema stopi disocijacije (off-rate, koffili kd), kinetičkoj konstanti koja je u dobroj korelaciji sa inhibicijom signalizacije ligandom, i navedeni su opadajućim redosledom u odnosu na vezujući afinitet (ligandi koji se najčvršće vezuju navedeni su na vrhu). Levo, žuta, crvena, zelena i plava linija označavaju jačinu konstante stope disocijacije. Ligandi od posebnog interesa istaknuti su debljim slovima, dok su ostali prikazani sivo, i jake crne linije označavaju ligande čije je vezivanje za heterodimer pojačano ili nepromenjeno u poređenju sa homodimerom, dok isprekidane linije označavaju znatno smanjeno vezivanje u poređenju sa homodimerom. Kao što je pokazano, ActRIIB-Fc homodimer vezuje se za svaki od pet visokoafinitetnih liganada sa sličnio visokim afinitetom, dok jednograni ActRIIB-Fc lakše pravi razliku između ovih liganada. Prema tome, jednograni ActRIIB-Fc vezuje se jače za aktivin B i GDF11 i sa intermedijarnom jačinom za GDF8 i aktivin A. U još jednoj suprotnosti sa ActRIIB-Fc homodimerom, jednograni ActRIIB-Fc ispoljava samo slabo vezivanje za BMP10 i ne vezuje se za BMP9. Ovi podaci ukazuju na to da jednograni ActRIIB-Fc ima veću selektivnost prema ligandima nego homodimerni ActRIIB-Fc.
Slika 7 prikazuje podatke za vezivanje liganda za jednograni ALK3-Fc:Fc heterodimerni proteinski kompleks u poređenju sa ALK3-Fc homodimerom. Format je isti kao za Sliku 6. Kao što je pokazano, jednograni ALK3-Fc heterodimer zadržava izuzetno čvrsto vezivanje za BMP4 zapaženo sa ALK3-Fc homodimerom, dok ispoljava smanjenu snagu vezivanja za BMP2 i prema tome bolje pravi razliku između BMP4 i BMP2 nego ALK3-Fc homodimer. Jednograni ALK3-Fc takođe bolje pravi razliku između BMP5 (intermedijarno vezivanje), GDF7 (slabo vezivanje), i GDF6
1
(bez vezivanja) u poređenju sa ALK3-Fc homodimerom, koji se za ova tri liganda vezuje veoma sličnom snagom (intermedijarna za sve). Ovi podaci ukazuju na to da jednograni ALK3-Fc ima veću selektivnost prema ligandima nego homodimerni ALK3-Fc.
Slika 8 prikazuje podatke za vezivanje liganda za jednograni ActRIIA-Fc:Fc heterodimerni proteinski kompleks u poređenju sa ActRIIA-Fc homodimerom. Format je isti kao za Sliku 6. Kao što je pokazano, ActRIIA-Fc homodimer ispoljava preferencijalno vezivanje za aktivin B, kombinovano sa snažnim vezivanjem za aktivin A i GDF11, dok jednograni ActRIIA-Fc ima obrnutu preferenciju za aktivin A u odnosu na aktivin B, kombinovano sa izuzetno povećanom selektivnošću za aktivin A u odnosu na GDF11 (slabo se vezuje). Ovi podaci ukazuju na to da jednograni ActRIIA-Fc ima suštinski različitu selektivnost prema ligandima u poređenju sa homodimernim ActRIIA-Fc.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
1. Pregled
[0027] Delom, predmetna objava odnosi se na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa I TGFβ natporodice ili vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice, postupke spravljanja takvih jednogranih heteromultimernih kompleksa, i njihove upotrebe. Kako je opisano u ovom tekstu, jednograni heteromultimerni kompleksi mogu sadržati vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa I TGFβ natporodice odabranog između: ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7, ili vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice odabranog između: ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII. U određenim poželjnim primerima izvođenja, heteromultimerni kompleksi objave imaju izmenjeni profil vezivanja za ligande TGFβ natporodice u odnosu na odgovarajući homomultimerni kompleks (npr., ActRIIB-Fc:Fc heterodimerni u poređenju sa ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc homodimernim kompleksom).
[0028] TGF-β natporodica sastoji se od preko trideset sekretovanih faktora uključujući TGF-beta, aktivine, nodale, proteine morfogeneze kosti (bone morphogenetic proteins, BMP), faktore rasta i deferencijacije (growth and differentiation factors, GDF), i antimilerijanski hormon (anti-Mullerian hormone, AMH). Vidi, npr., Weiss et al. (2013) Developmental
1
Biology, 2(1): 47-63. Članovi natporodice koji se nalaze kod kičmenjaka i beskičmenjaka, široko se eksprimiraju u različitim tkivima i funkcionišu od najranijih stupnjeva razvića, tokom čitavog života životinje. Zaista, proteini TGF-β natporodice ključni su medijatori samoobnavljanja matičnih ćelija, gastrulacije, diferencijacije, morfogeneze organa, i homeostaze adultnih tkiva. Konzistentno sa ovom sveprisutnom aktivnošću, aberantna signalizacija TGF-beta natporodicom udružena je sa širokim rasponom oboljenja kod ljudi uključujući, na primer, autoimunsku bolest, kardiovaskularnu bolest, fibrotsku bolest, i kancer.
[0029] Ligandi TGF-beta natporodice imaju istu dimernu strukturu u kojoj se centralna zavojnica od 3-1/2 zavoja jednog monomera pakuje naspram konkavne površine koju formiraju beta-nizova drugog monomera. Većina članova TGF-beta porodice dodatno je stabilisana međumolekularnom disulfidnom vezom. Ove disulfidne veze pružaju se kroz prsten koji formiraju dve druge disulfidne veze stvarajući ono što se naziva motiv 'cisteinskog čvora'. Vidi, npr., Lin et al., (2006) Reproduction 132: 179-190 i Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870.
[0030] Signalizacija TGF-beta natporodicom posredovana je heteromernim kompleksima serin/treonin kinaznih receptora tipa I i tipa II, koji, posle stimulacije ligandom, fosforilišu i aktiviraju nizvodne SMAD proteine (npr., SMAD proteini 1, 2, 3, 5, i 8). Vidi, npr., Massagué (2000) Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1:169-178. Ovi receptori tipa I i tipa II su transmembranski proteini, sastavljeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom specifičnošću. Uopšteno, receptori tipa I posreduju u unutarćelijskoj signalizaciji, dok su receptori tipa II potrebni za vezivanje liganada TGF-beta natporodice. Receptori tipa I i II formiraju stabilni kompleks posle vezivanja liganda, što rezultuje fosforilacijom receptora tipa I receptorima tipa II.
[0031] TGF-beta porodica može da se podeli u dve filogenetske grane na osnovu receptora tipa I za koje se vezuju i Smad proteina koje aktiviraju. Jedna je skorije razvijena grana, koja uključuje, npr., the TGF-beta, aktivine, GDF8, GDF9, GDF11, BMP3 i nodal. Druga grana sadrži proteine natporodice koji su dalje srodnosti i uključuje, npr., BMP2, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF1, GDF5, GDF6, i GDF7. Vidi, npr. Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870.
[0032] Izoforme TGF-beta su članovi-utemeljivači TGF-beta natporodice, od kojih postoje 3 poznate izoforme kod sisara označene kao TGF-beta1, TGF-beta2 i TGF-beta3. Zreli
1
bioaktivni TGF-beta ligandi funkcionišu kao homodimeri i preovlađujuće prenose signale preko receptora tipa I ALK5, ali je nađeno da prenose signale i preko ALK1 u endotelskim ćelijama. Vidi, npr., Goumans et al. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. TGF-beta1 je najzastupljenija i svuda eksprimirana izoforma. Poznato je da TGF-beta1 ima važnu ulogu u zarastanju rana, a miševi koji konstitutivno eksprimiraju aktivni TGF-beta1 transgen razvijaju fibrozu. Vidi npr., Clouthier et al., (1997) J Clin. Invest. 100(11): 2697-2713. TGF-beta1 je takođe uključen u aktivaciju T ćelija i odražavanje T regulatornih ćelija. Vidi, npr., Li et al., (2006) Immunity 25(3): 455-471. Ekspresija TGF-beta2 bila je prvo opisana u ćelijama humanog glioblastoma, a sreće se u neuronima i astroglijskim ćelijama nervnog sistema embriona. Poznato je takođe da TGF-beta2 suprimira rast T limfocita zavisan od interleukina-2. TGF-beta3 inicijalno je izolovan iz ćelijske linije humanog rabdomiosarkoma, a zatim je nađen u ćelijskim linijama adenokarcinoma pluća i karcinoma bubrega. Poznato je da je TGF-beta3 važan za morfogenezu nepca i pluća. Vidi, npr., Kubiczkova et al., (2012) Journal of Translational Medicine 10:183.
[0033] Aktivini su članovi TGF-beta natporodice, koji su inicijalno otkriveni kao regulatori sekrecije folikulostimulirajućeg hormona, a zatim su okarakterisane njihove različite reproduktivne i nereproduktivne uloge. Glavne forme aktivina A, B, i AB su homo/heterodimeri dve blisko srodne β subjedinice (βAβA, βBβB, odnosno βAβB). Humani genom kodira i aktivin C i aktivin E, koji se prvenstveno eksprimiraju u jetri, a poznate su i heterodimerne forme koje sadrže βCili βE. U TGF-beta natporodici, aktivini su jedinstveni i multifunkcionalni faktori koji mogu da stimulišu proizvodnju hormona u ćelijama ovarijuma i placente, podržavaju preživljavanje neurona, utiču na odvijanje ćelijskog ciklusa pozitivno ili negativno u zavisnosti od tipa ćelija, i indukuju diferencijaciju mezoderma bar u embrionu vodozemaca. Vidi, npr., DePaolo et al. (1991) Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512; Dyson et al. (1997) Curr Biol. 7:81-84; i Woodruff (1998) Biochem Pharmacol. 55:953-963. U nekoliko tkiva, aktivinska signalizacija je antagonizovana njemu srodnim heterodimerom, inhibinom. Na primer, u regulaciji sekrecije folikulostimulirajućeg hormona (folliclestimulating hormone, FSH) iz hipofize, aktivin promoviše sintezu i sekreciju FSH, dok inhibin redukuje FSH sintezu i sekreciju. Drugi proteini koji mogu regulisati bioaktivnost aktivina i/ili vezivati se za aktivin uključiju folistatin (follistatin, FS), folistatinu slični protein (follistatin-related protein, FSRP, poznat i kao FLRG ili FSTL3), i α2-makroglobulin.
[0034] Kako je opisano u oovm tekstu, sredstva koja se vezuju za "aktivin A" su sredstva koja se specifično vezuju za βAsubjedinicu, bilo u kontekstu izolovane βAsubjedinice ili dimernog
1
kompleksa (npr., βAβAhomodimer ii βAβBheterodimer). U slučaju heterodimernog kompleksa (npr., βAβBheterodimer), sredstva koja se vezuju za "aktivin A" specifična su za epitope prisutne u okviru βAsubjedinice, ali se ne vezuju za epitope prisutne u okviru ne-βAsubjedinice kompleksa (npr., βBsubjedinica kompleksa). Slično tome, sredstva objavljena u ovom tekstu, koja antagonizuju (inhibiraju) "aktivin A" su sredstva koja inhibiraju jednu ili više aktivnosti posredovanih βAsubjedinicom, bilo u kontekstu izolovane βAsubjedinice ili dimernog kompleksa (npr., βAβAhomodimer βAβBheterodimer). U slučaju βAβBheterodimera, sredstva koja inhibiraju "aktivin A" su sredstva koja specifično inhibiraju jednu ili više aktivnosti βAsubjedinice, ali ne inhibiraju aktivnost ne-βAsubjedinice kompleksa (npr., βBsubjedinica kompleksa). Ovaj princip važi i za sredstva koja se vezuju i/ili inhibiraju "aktivin B", "aktivin C", i "aktivin E". Sredstva objavljena u ovom tekstu, koja antagonizuju "aktivin AB" su sredstva koja inhibiraju jednu ili više aktivnosti posredovanih βAsubjedinicom i jednu ili više aktivnosti posredovanih βBsubjedinicom.
[0035] BMP i GDF zajedno formiraju porodicu citokina sa cistenskim čvorom, sa savijenošću karakterističnom za TGF-beta natporodicu. Vidi, npr., Rider et al. (2010) Biochem J., 429(1):1-12. Ova porodica uključuje, na primer, BMP2, BMP4, BMP6, BMP7, BMP2a, BMP3, BMP3b (poznat i kao GDF10), BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8, BMP8a, BMP8b, BMP9 (poznat i kao GDF2), BMP10, BMP11 (poznat i kao GDF11), BMP12 (poznat i kao GDF7), BMP13 (poznat i kao GDF6), BMP14 (poznat i kao GDF5), BMP15, GDF1, GDF3 (poznat i kao VGR2), GDF8 (poznat i kao miostatin), GDF9, GDF15, i dekapentaplegik. Pored sposobnosti da indukuju formiranje kosti, po čemu su BMP dobili ime, BMP/GDF pokazuju morfogenetske aktivnosti u razvijanju širokog raspona različitih tkiva. BMP/GDF homo- i hetero-dimeri interaguju sa kombinacijama dimera receptora tipa I i tipa II da proizvedu veliki broj mogućih signalnih kompleksa, dovodeći do aktivacije jednog ili dva kompetirajuća seta SMAD transkripcionih faktora. BMP/GDF imaju visokospecifične i lokalizovane funkcije. Regulisani su na brojne načine, uključujući razvojnu restrikciju ekspresije BMP/GDF i putem sekrecije nekoliko proteina koji se vezuju sa određenim ligandima TGF-beta natporodice sa visokim afinitetom i time inhibiraju aktivnost liganda. Zanimljivo, neki od ovih endogenih antagonista podsećaju na same ligande TGF-beta natporodice.
[0036] Faktor rasta i diferencijacije-8 (GDF8) poznat je i kao miostatin. GDF8 je negativni regulator mase skeletnih mišića i visoko se eksprimira u skeletnom mišiću u razvoju i odraslom skeletnom mišiću. GDF8 "nula" mutacija kod transgenih miševa karakteriše se
2
upadljivom hipertrofijom i hiperpalzijom skeletne muskulature. Vidi, npr., McPherron et al., Nature (1997) 387:83-90. Sličan porast mase skeletnih mišića evidentan je kod mutacija GDF8 koje se prirodno sreću kod goveda i, začuđujuće, kod ljudi. Vidi, npr., Ashmore et al. (1974) Growth, 38:501-507; Swatland and Kieffer, J. Anim. Sci. (1994) 38:752-757; McPherron and Lee, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997) 94:12457-12461; Kambadur et al., Genome Res. (1997) 7:910-915; i Schuelke et al. (2004) N Engl J Med, 350:2682-8. Studije su pokazale i to da je gubitak mišićne mase udružen sa HIV-infekcijom kod ljudi udružen sa porastom ekspresije GDF8 proteina. Vidi, npr., Gonzalez-Cadavid et al., PNAS (1998) 95:14938-43. Pored toga, GDF8 može da moduliše proizvodnju mišićno-specifičnih enzima (npr., kreatin kinaze) i moduliše proliferaciju mioblasta. Vidi, npr., Objavljenu međunarodnu patentnu prijavu br. WO 00/43781). GDF8 propeptid može nekovalentno da se vezuje za zreli GDF8 domenski dimer, inaktivirajući njegovu biološku aktivnost. Vidi, npr., Miyazono et al. (1988) J. Biol. Chem., 263: 6407-6415; Wakefield et al. (1988) J. Biol. Chem., 263; 7646-7654; i Brown et al. (1990) Growth Factors, 3: 35-43. Drugi proteini koji se vezuju za GDF8 ili strukturno srodne proteine i inhibiraju njihovu biološku aktivnost uključuju folistatin, i potencijalno, folistatinu srodne proteine. Vidi, npr., Gamer et al. (1999) Dev. Biol., 208: 222-232.
[0037] GDF11, poznat i kao BMP11, sekretovani je protein koji se eksprimira u začetku repa, začetku ekstremiteta, maksilarnom i mandibularnom luku, i ganglijama dorzalnih korenova tokom razvića miša. Vidi, npr., McPherron et al. (1999) Nat. Genet., 22: 260-264; i Nakashima et al. (1999) Mech. Dev., 80: 185-189. GDF11 ima jedinstvenu ulogu u uspostavljanju obrazaca mezodermalnog i nervnog tkiva. Vidi, npr., Gamer et al. (1999) Dev Biol., 208:222-32. Pokazano je da je GDF11 negativni regulator hondrogeneze i miogeneze tokom razvoja ekstremiteta kod pileta. Vidi, npr., Gamer et al. (2001) Dev Biol., 229:407-20. Ekspresija GDF11 u mišiću takođe sugeriše njegovu ulogu u regulaciji rasta mišića na sličan način kao GDF8. Pored toga, ekspresija GDF11 u mozgu sugeriše da GDF11 može imati i aktivnosti koje su povezane sa funkcijom nervnog sistema. Interesantno, nađeno je da GDF11 inhibira neurogenezu u mirisnom epitelu. Vidi, npr., Wu et al. (2003) Neuron., 37:197-207. Prema tome, GDF11 može imati in vitro i in vivo primene u lečenju bolesti kao što su bolesti mišića i neurodegenerativne bolesti (npr., amiotrofična lateralna skleroza).
[0038] Dobro je poznato da BMP7, nazvan još i osteogeni protein-1 (osteogenic protein-1, OP-1), indukuje formiranje hrskavice i kosti. Pored toga, BMP7 reguliše široko područje fizioloških procesa. Na primer, BMP7 može biti osteoinduktivni faktor odgovoran za fenomen epitelne osteogeneze. Nađeno je takođe da BMP7 ima ulogu u regulaciji kalcijuma i homeostazi koštanog tkiva. Kao i aktivin, BMP7 se vezuje za receptore tipa II, ActRIIA i ActRIIB. Međutim, BMP7 i aktivin regrutuju različite receptore tipa I u heteromerne receptorske komplekse. Glavni zapaženi BMP7 receptor tipa I bio je ALK2, dok se aktivin vezuje isključivo za ALK4 (ActRIIB). BMP7 i aktivin pobuđuju različite biološke odgovore i aktiviraju različite SMAD puteve. Vidi, npr., Macias-Silva et al. (1998) J Biol Chem.
273:25628-36.
[0039] Antimilerijanski hormon (AMH), poznat i kao milerijanska inhibitorna supstanca (MIS), je glikoprotein TGF-beta porodice. Jedan receptor tipa II udružen sa AMH identifikovan je i označen kao AMHRII, ili alternativno MISRII. AMH indukuje regresiju milerijanskih kanala u muškom embrionu kod ljudi. AMH se eksprimira u reproduktivnom periodu žene i ne fluktuira tokom ciklusa i trudnoće, ali nađeno je da se postupno smanjuje sa smanjenjem kvantiteta i kvaliteta oocita, što sugeriše da AMH može da služi kao biomarker fiziologije ovarijuma. Vidi npr. Zec et al., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30.
[0040] Aktivinskom receptoru slična kinaza-1 (activin receptor-like kinase-1, ALK1), proizvod ACVRL1 gena, poznata alternativno kao ACVRLK1, je receptor tipa I čija je ekspresija prevashodno ograničena na endotelske ćelije. Vidi, npr., OMIM ulaz 601284. ALK1 se aktivira vezivanjem liganada TGF-beta porodice kao što su BMP9 i BMP10, a ALK1 signalizacija je kritična u regulaciji formiranja krvnih sudova tokom razvića i patoloških stanja. Ekspresija ALK1 preklapa se sa mestima vaskulogeneze i angiogeneze tokom ranog razvića miša, i ALK1 "nokaut"-miševi umiru oko embrionalnog dana 11.5 zbog velikih vaskularnih abnormalnosti (vidi npr., Cunha and Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.) Ekspresija ALK1 bila je opisana i u drugim tipovima ćelija kao što su stelatne ćelije jetre i hondrociti. Pored toga, nađeno je da je ALK1 uz aktivinskom receptoru sličnu kinazu-2 (ALK2) važna za BMP9-indukovanu osteogenu signalizaciju u mezenhimskim matičnim ćelijama. Vidi npr., Cunha and Pietras (2011) Blood 117(26):6999-7006.
[0041] ALK2, proizvod ACVR1 gena poznat alternativno kao ActRIA ili ACVRLK2, je receptor tipa I za koji je pokazano da se vezuje sa aktivinima i BMP. ALK2 je kritičan za embriogenezu jer ALK2 "nokaut"-miševi umiru ubrzo posle gastrulacije. Vidi, npr., Mishina et al. (1999) Dev Biol. 213: 314-326 i OMIM ulaz 102576. Konstitutivno aktivne mutacije u ALK2 udružene su sa progresivnom osifikujućom fibrodisplazijom (fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP), retkim genetičkim poremećajem koji dovodi do toga da se vezivno tkivo, uključujući mišić, tetivu i ligament, osifikuje spontano ili kada se ošteti. Mutacija arginina u histidin na poziciji 206 ALK2 prirodna je mutacija udružena sa FOP kod ljudi. Ova mutacija indukuje BMP-specifičnu signalizaciju preko ALK2 bez vezivanja liganda. Vidi, npr., Fukuda et al., (2009) J Biol Chem. 284(11):7149-7156 i Kaplan et al., (2011) Ann N.Y. Acad Sci.
1237: 5-10.
[0042] Aktivinskom receptoru slična kinaza-3 (ALK3), proizvod BMPR1A gena, poznata alternativno kao ACVRLK3, je receptor tipa I koji posreduje u efektima većeg broja liganada BMP porodice. Za razliku od nekoliko receptora tipa I koji se eksprimiraju u svim tkivima, ALK3 pokazuje ograničeni obrazac ekspresije konzistentan sa specijalizovanijom funkcijom. Vidi, npr., ten Dijke (1993) Oncogene, 8: 2879-2887 i OMIM ulaz 601299. ALK3 se obično prepoznaje kao visokoafinitetni receptor za BMP2, BMP4, BMP7 i druge članove BMP porodice. BMP2 i BMP7 su potentni stimulatori osteoblastne diferencijacije, i sada se klinički koriste da indukuju formiranje kosti u fuzijama kičme i određenim neujedinjujućim frakturama. Smatra se da je ALK3 ključni receptor u posredovanju BMP2 i BMP4 signalizacije u osteoblastima. Vidi, npr., Lavery et al. (2008) J. Biol. Chem. 283: 20948-20958. Homozigotni ALK3 "knockout"-miš umire rano tokom embriogeneze (∼dan 9.5), međutim, nedavno je saopšteno da odrasli miševi koji nose uslovno narušeni ALK3 u osteoblastima imaju povećanu koštanu masu, iako novoformirana kost pokazuje dezorganizovanost. Vidi, npr., Kamiya (2008) J. Bone Miner. Res., 23:2007-2017; i Kamiya (2008) Development 135: 3801-3811. Ovaj podatak je u začuđujućoj suprotnosti sa efikasnošću BMP2 i BMP7 (ligandi za ALK3) u izgradnji kosti, koji su u kliničkoj upotrebi.
[0043] Aktivinskom receptoru slična kinaza-4 (ALK4), proizvod ACVR1B gena alternativno poznata kao ACVRLK4, je receptor tipa I koji transdukuje signalizaciju brojnih liganada TGF-beta porodice uključujući aktivine, nodal i GDF. Mutacije ALK4 udružene su sa kancerom pankreasa, a ekspresija dominantnih negativnih skraćenih ALK4 izoformi visoko je prisutna u tumorima hipofize kod ljudi. Vidi, npr., Tsuchida et al., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21 i OMIM ulaz 601300.
[0044] Aktivinskom receptoru slična kinaza-5 (ALK5), proizvod TGFBR1 gena, široko se eksprimira u većini tipova ćelija. Nekoliko liganada TGF-beta natporodice, uključujući TGF-beta, aktivin, i GDF-8, signaliziraju preko ALK5 i aktiviraju nizvodne Smad 2 i Smad 3. Miševi deficijentni u ALK5 pokazuju jake defekte u razvoju vaskulature žumancentne kese i placente, nemaju cirkulišuće crvene krvne ćelije, i umiru sredinom gestacije. Nađeno je da ovi embrioni imaju normalan hematopoezni potencijal, ali pojačanu proliferaciju i neodgovarajuću migraciju endotelskih ćelija. Prema tome, ALK5-zavisna signalizacija važna
2
je za angiogenezu, ali ne i za razvoj hematopetskih progenitorskih ćelija i funkcionalnu hematopoezu. Vidi, npr. Larsson et al., (2001) The EMBO Journal, 20(7): 1663-1673 i OMIM ulaz 190181. U endotelskim ćelijama, ALK5 deluje kooperativno i suprotno ALK1 signalizaciji. ALK5 inhibira migraciju i proliferaciju ćelija, što je primetno suprotan efekat od ALK1. Vidi, npr., Goumans et al. (2003) Mol Cell 12(4): 817-828. Pored toga, veruje se da ALK5 negativno reguliše rast mišića. Nađeno je da "knockdown" ALK5 u mišiću mišjeg modela mišićne distrofije smanjuje fibrozu i povećava ekspresiju gena udruženih sa mišićnim rastom. Vidi, npr. Kemaladewi et al., (2014) Mol Ther Nucleic Acids 3, e156.
[0045] Aktivinskom receptoru slična kinaza-6 (ALK6) je proizvod BMPR1B gena, čija je deficijencija udružena sa hondrodisplazijom i defektima ekstremiteta kod ljudi i miševa. Vidi, npr., Demirhan et al., (2005) J Med Genet.42:314-317. ALK6 se široko eksprimira u skeletu u razvoju, i potreban je za hondrogenezu kod miševa. Vidi, npr., Yi et al., (2000) Development 127:621-630 i OMIM ulaz 603248.
[0046] Aktivinskom receptoru slična kinaza-7 (ALK7) je proizvod ACVR1C gena. ALK7 "nula" miševi su vijabilni, fertilni, i ne pokazuju malformacije skleteta ni ekstremiteta. Izgleda da GDF3 signalizacija preko ALK7 ima ulogu u insulinskoj senzitivnosti i gojaznosti. Ovo je podržano rezultatima da ALK7 "nula" miševi pokazuju smanjenu akumulaciju masti i otpornost na gojaznost indukovanu dijetom. Vidi, npr., Andersson et al., (2008) PNAS 105(20): 7252-7256. ALK7-posredovana Nodal signalizacija povezana je i sa tumorpromovišućim i sa tumor-suprimirajućim efektima kod većeg broja različitih kancerskih ćelijskih linija. Vidi, npr., De Silva et al., (2012) Frontiers in Endocrinology 3:59 i OMIM ulaz 608981.
[0047] Kako se koristi u ovom tekstu "ActRII" označava porodicu aktivinskih receptora tipa II. Ova porodica uključuje aktivinski receptor tipa IIA (ActRIIA), kodiran genom ACVR2A, i aktivinski receptor tipa IIB (ActRIIB), kodiran genom ACVR2B. ActRII receptori su receptori tipa II TGF-beta natporodice, koji se vezuju sa različitim ligandima TGF-beta natporodice uključujući aktivine, GDF8 (miostatin), GDF11, i podgrupu BMP, posebno BMP6 i BMP7. ActRII receptori su u vezi sa različitim biološkim poremećajima uključujući mišićne i neuromišićne poremećaje (npr., mišićnu distrofiju, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (amyotrophic lateral sclerosis, ALS), i mišićnu atrofiju), neželjeni rast kosti/hrskavice, poremećaje masnog tkiva (npr., gojaznost), metaboličke poremećaje (npr., dijabetes tipa 2), i neurodegenerativne poremećaje. Vidi, npr., Tsuchida et al., (2008) Endocrine Journal 55(1): 11-21, Knopf et al., U.S.8,252,900, i OMIM ulazi 102581 i 602730.
[0048] Receptor II za transformišući faktor rasta beta (transforming growth factor beta receptor II, TGFBRII), kodiran TGFBR2 genom, receptor je tipa II za koji je poznato da se vezuje sa TGF-beta ligandima i aktivira nizvodne Smad 2 i Smad 3 efektore. Vidi, npr., Hinck (2012) FEBS Letters 586: 1860-1870 i OMIM ulaz 190182. TGF-beta signalizacija preko TGFBRII kritična je za proliferaciju T-ćelija, održavanje T regulatornih ćelija i proliferaciju prehrskavičavih matičnih ćelija. Vidi, npr., Li et al., (2006) Immunity 25(3): 455-471 i Cheng et al., Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 12665-12676.
[0049] Receptor II za protein morfogeneze kosti (bone morphogenetic protein receptor II, BMPRII), kodiran BMPR2 genom, receptor je tipa II za koji je poznato da se vezuje sa BMP ligandima uključujući BMP7 i BMP4. Efikasno vezivanje liganda za BMPRII zavisi od prisustva odgovarajućih TGFBR receptora tipa I. Vidi, npr., Rosenzweig et al., (1995) PNAS 92:7632-7636. Mutacije u BMPRII udružene su sa plućnom hipertenzijom kod ljudi. Vidi OMIM ulaz 600799.
[0050] Receptor II za milerijansku inhibirajuću supstancu (Müllerian-inhibiting substance receptor II, MISRII), proizvod AMHR2 gena poznat alternativno kao receptor za antimilerijanski hormon tipa II, je receptor tipa II TGF-beta natporodice. MISRII se vezuje za MIS ligand, ali za transdukciju signala zahteva prisustvo odgovarajućeg receptora tipa I, kao što je ALK3 ili ALK6. Vidi, npr., Hinck (2012) FEBS Letters 586:1860-1870 i OMIM ulaz 600956. MISRII je uključen u diferenciranje pola kod ljudi i potreban je za regresiju Milerovih kanala kod muškaraca. AMH se eksprimira kod žena u reproduktivnom periodu i ne fluktuira sa ciklusom ili trudnoćom, ali nađeno je da se postepeno smanjuje sa smanjenjem kvantiteta i kvaliteta oocita, što sugeriše da AMH može da služi kao biomarker fiziologije ovarijuma. Vidi, npr., Zec et al., (2011) Biochemia Medica 21(3): 219-30 i OMIM ulaz 600956.
[0051] U određenim aspektima, predmetna objava odnosi se na upotrebu jednogranih heteromultimernih kompleksa koji sadrže vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa I TGFβ natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7) ili vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice (npr., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII), poželjno solubilne heteromultimerne komplekse, za antagonizovanje unutarćelijske signalne transdukcije (npr., Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacija) inicirane jednim ili večim brojem liganada TGFβ natporodice (npr., aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, Nodal, GDF8, GDF11, BMP6 i/ili BMP7). Kako je opisano u ovom tekstu, takvi
2
antagonistički jednograni heteromultimerni kompleksi mogu biti korisni za lečenje ili prevenciju različitih stanja udruženih sa TGF-beta uključujući, bez ograničavanja, bolesti i poremećaje udružene, na primer, sa kancerom, mišićima, kostima, masnim tkivom, crvenim krvnim ćelijama, metabolizmom, fibrozom i drugim tkivima na koja utiču jedan ili više liganada TGF-beta natporodice.
[0052] Posebno, podaci iz predmetne objave pokazuju da jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa I TGFβ natporodice ili vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice imaju različite profile selektivnosti prema ligandima u poređenju sa odgovarajućim homomultimernim kompleksima.
[0053] Izrazi upotrebljeni u ovoj specifikaciji uopšteno imaju svoja u struci uobičajena značenja, u kontekstu ove objave i u specifičnom kontekstu u kojem se svaki od izraza koristi. O određenim izrazima biće reči u nastavku ili na drugom mestu u specifikaciji, da bi se stručnjaku obezbedila dodatna uputstva u opisivanju kompozicija i postupaka objave i kako ih napraviti i koristiti. Obim ili značenje svake upotrebe izraza biće jasno iz specifičnog konteksta u kojem se koriste.
[0054] Izrazi "heteromer" ili "heteromultimer" označavaju kompleks koji uključuje najmanje prvi polipeptid i drugi polipeptid, pri čemu se drugi polipeptid razlikuje u aminokiselinskoj sekvenci od prvog polipeptida za najmanje jednu aminokiselinsku reziduu. Heteromer može uključivati "heterodimer" formiran od prvog i drugog polipeptida ili može formirati strukture višeg reda u kojima su pored prvog i drugog polipeptida prisutni i dodatni polipeptidi. Primeri struktura heteromultimera uključuju heterodimere, heterotrimere, heterotetramere i druge oligomerne strukture. Heterodimeri su označeni u ovom tekstu kao X:Y ili ekvivalentno kao X-Y, gde X predstavlja prvi polipeptidni lanac i Y predstavlja drugi polipeptidni lanac. Heteromeri višeg reda i oligomerne strukture označene su ovde na odgovarajući način. U određenim primerima izvođenja, heteromultimer je rekombinantan (npr., jedna ili više polipeptidnih komponenti mogu biti rekombinantni protein), izolovan i/ili prečišćen.
[0055] "Homolog" u svim svojim gramatičkim formama i varijacijama, označava odnos između dva proteina koji poseduju "zajedničko evoluciono poreklo", uključujući proteine iz natporodica u organizmu iste vrste, kao i homologne proteine iz organizama različitih vrsta. Takvi proteini (i njihove kodirajuće nukleinske kiseline) imaju sekvencionu homologiju, što se ogleda u njihovoj sekvencionoj sličnosti, bilo da je reč o procentu identičnosti ili prisustvu specifičnih rezidua ili motiva i konzerviranih pozicija. Međutim, u uobičajenoj upotrebi i ovoj
2
prijavi, izraz "homolog" kada se modifikuje prilogom kao što je "visoko" može označavati sekvencionu sličnost i može, ali ne mora biti u vezi sa zajedničkim evolucionim poreklom.
[0056] Izraz "sekvenciona sličnost" u svim svojim gramatičkim formama, označava stepen identičnosti ili korespondiranja između sekvenci nukleinskih kiselina ili sekvenci aminokiselina koje mogu, ali ne moraju imati zajedničko evoluciono poreklo.
[0057] "Procenat (%) sekvencione identičnosti" u odnosu na referentnu polipeptidnu (ili nukleotidnu) sekvencu definiše se kao procenat aminokiselinskih rezidua (ili nukleinskih kiselina) u kandidatskoj sekvenci koje su identične sa aminokiselinskim reziduama (ili nukelinskim kiselinama) u referentnoj polipeptidnoj (nukleotidnoj) sekvenci, posle poravnavanja sekvenci i uvođenja procepa, po potrebi, da se dostigne maksimalni procenat sekvencione identičnosti, i ne razmatra nikakve konzervativne supstitucije kao deo sekvencione identičnosti. Poravnavanje u cilju određivanja procenta identičnosti aminokiselinskih sekvenci može da se postigne na različite načine koji su u okvirima poznavanja struke, na primer, korišćenjem javno dostupnog kompjuterskog softvera kao što je BLAST, BLAST-2, ALIGN ili Megalign (DNASTAR) softvera. Stručnjaci u oblasti mogu odrediti odgovarajuće parametre za poravnavanje sekvenci, uključujući sve algoritme potrebne za postizanje maksimalnog poravnavanja čitavom dužinom sekvenci koje se upoređuju. Za potrebe ovog teksta, međutim, vrednosti % aminokiselinske (nukleinskokiselinske) sekvencione identičnosti stvorene su korišćenjem kompjuterskog programa za upoređivanje sekvenci ALIGN-2. ALIGN-2 kompjuterski program za upoređivanje sekvenci autorsko je vlasništvo Genentech, Inc., i izvorni kod zaveden je sa korisničkom dokumetacijom u U.S. Copyright Office (Biro za autorska prava SAD) Washington D.C., 20559, gde je registrovan kao U.S. Copyright Registration No. (registracioni br. autorskog prava) TXU510087. Program ALIGN-2 javno je dostupan kod Genentech, Inc., South San Francisco, Calif., ili može da se sastavi na osnovu izvornog koda. Program ALIGN-2 trebalo bi da bude sastavljen za korišćenje na UNIX operativnom sistemu, uključujući digitalni UNIX V4.0D. Svi parametri upoređivanja sekvenci zadati su ALIGN-2 programom i ne menjaju se.
[0058] Kako se koristi u ovom tekstu "suštinski se ne vezuje za X" znači da sredstvo ima KDkoja je veća od oko 10<-7>, 10<-6>, 10<-5>, 10<-4>ili više (npr., bez detektabilnog vezivanja u testu upotrebljenom za određivanje KD) za "X".
2. Heteromultimerni kompleksi koji sadrže jednograne receptorske polipeptide TGFβ natporodice
2
[0059] U određenim aspektima, objava se tiče heteromultimernih proteinskih kompleksa koji uključuju jedan ili više jednogranih receptorskih polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. U određenim primerima izvođenja, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu mogu formirati proteinske komplekse koji uključuju prvi polipeptid kovalentno ili nekovalentno udružen sa drugim polipeptidom, pri čemu prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II i aminokiselinsku sekvencu prvog člana interakcionog para; i drugi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu drugog člana interakcionog para, i pri čemu drugi polipeptid ne sadrži receptorski polipeptid tipa I ili tipa II. Interakcioni par mogu činiti bilo koje dve polipeptidne sekvence koje interaguju da formiraju kompleks, posebno heterodimerni kompleks, iako operativni primeri izvođenja mogu takođe koristiti interakcioni par koji formira homodimernu sekvencu. Kako je opisano u ovom tekstu, jedan član interakcionog para može biti fuzionisan sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II, kao što je polipeptid koji uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 67, 68, 71, 72, 75, 76, 79, 80, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310, i 313. Poželjno, interakcioni par se bira tako da obezbedi poboljšani poluživot u serumu, ili da deluje kao adapter na koji se druga komponenta, kao što je polietilenska glikolna komponenta, prikači da obezbedi poboljšan poluživot u serumu u odnosu na monomernu formu receptorskog polipetida tipa I ili tipa II.
[0060] Kako je pokazano u ovom tekstu, monomerne (jednograne) forme receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice mogu ispoljavati znatno izmenjenu ligand-vezujuću selektivnost u poređenju sa svojim odgovarajućim homodimernim formama, ali monomerne forme teže da imaju kratko vreme boravka u serumu (poluživot), koje je nepoželjno u terapijskoj postavci. Opšti mehanizam za poboljšanje poluživota u serumu je eksprimiranje polipeptida kao homodimernog fuzionog proteina sa delom konstantnog domena (npr., Fc deo) IgG. Međutim, receptorski polipeptidi TGF-beta natporodice eksprimirani kao homodimerni proteini (npr., u Fc fuzionom konstruktu) ne moraju ispoljavati isti profil aktivnosti kao monomerna forma. Kao što je pokazano u ovom tekstu, problem se može rešiti fuzijom monomerne forme sa komponentom koja produžava poluživot, i iznenađujuće, ovo može lako da se postigne eksprimiranjem takvih proteina u vidu asimetričnog heterodimernog fuzionog proteina u kojem je jedan član interakcionog para fuzionisan sa receptorskim polipeptidom TGF-beta natporodice, a drugi član interakcionog para ili nije fuzionisan sa komponentom ili je
2
fuzionisan sa heterolognom komponentom, što rezultuje novim ligand-vezujućim profilom povezanim sa poboljšanjem poluživota u serumu, kao doprinosom interakcionog para.
[0061] U određenim aspektima, predmetna objava odnosi se na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju najmanje jedan receptorski polipeptid tipa I TGF-beta natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7 kao i SEQ ID NO: 14, 15, 18, 19, 22, 23, 26, 27, 30, 31, 34, 35, 38, 39, 83, 84, 87, 88, 91, 92, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313) ili najmanje jedan receptorski polipeptid tipa II TGF-beta natporodice (npr., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII kao i SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 9, 10, 11, 42, 43, 46, 47, 50, 51, 67, 68, 71, 72, 75, 76, 79, i 80), koji su uopšteno ovde označeni kao "jednograni heteromultimerni kompleksi objave" ili "jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice". Poželjno, jednograni heteromultimerni kompleksi objave su solubilni, npr., jednograni heteromultimerni kompleks uključuje solubilni deo najmanje jednog receptorskog polipeptida tipa I TGF-beta natporodice ili solubilni deo najmanje jednog receptorskog polipeptida tipa II TGF-beta natporodice. Uopšteno, vanćelijski domeni receptora tipa I i tipa II TGFβ natporodice odgovaraju solubilnom delu receptora tipa I ili tipa II. Prema tome, u nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa I TGFβ natporodice (npr., jedan ili više ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i/ili ALK7 receptorskih vanćelijskih domena) ili vanćelijski domen receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice (npr., jedan ili više ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i/ili MISRII receptorskih vanćelijskih domena). Primeri vanćelijskih domena ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII objavljeni su u ovom tekstu i takve sekvence, kao i njihovi fragmenti, funkcionalne varijante, i modifikovane forme, mogu se upotrebiti u skladu sa pronalascima predmetne objave (npr., kompozicije jednogranih heteromultimernih kompleksa i njihove upotrebe).
[0062] Definišući strukturni motiv, poznat kao troprsti toksinski nabor, važan je za vezivanje liganda sa receptorima tipa I i tipa II i formira ga 10, 12, ili 14 konzerviranih cisteinskih rezidua lociranih na pozicijama unutar vanćelijskog domena svakog monomernog receptora. Vidi, npr., Greenwald et al. (1999) Nat Struct Biol 6:18-22; Hinck (2012) FEBS Lett 586:1860-1870. Svaki od heteromernih kompleksa opisanih u ovom tekstu može sadržati takav domen receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Sržni ligand-vezujući domeni receptora TGFβ natporodice, ograničeni spoljnim od ovih konzerviranih cisteina, odgovaraju pozicijama 29-109 SEQ ID NO: 1 (prekursor ActRIIB); pozicijama 30-110 SEQ ID NO: 9
2
(prekursor ActRIIA); pozicijama 34-95 SEQ ID NO: 14 (prekursor ALK1); pozicijama 35-99 SEQ ID NO: 18 (prekursor ALK2); pozicijama 61-130 SEQ ID NO: 22 (prekursor ALK3); pozicijama 34-101 SEQ ID NO: 26 i 83 (prekursori ALK4); pozicijama 36-106 SEQ ID NO: 30 i 87 (prekursori ALK 5); pozicijama 32-102 SEQ ID NO: 34 (prekursor ALK6 izoforma B); pozicijama 28-92 SEQ ID NO: 38, 305, i 309 (prekursori ALK7); pozicijama 51-143 SEQ ID NO: 42 (prekursor TGFBRII izoforma B); pozicijama 34-123 SEQ ID NO: 46 i 71 (prekursori BMPRII); pozicijama 24-116 SEQ ID NO: 50, 75, i 79 (prekursori MISRII); pozicijama 44-168 SEQ ID NO: 67 (prekursor TGFBRII izoforma A); i pozicijama 62-132 SEQ ID NO: 91 (prekursor ALK6 izoforma A). Strukturno manje uređene amino-kiseline na bokovima ovih cisteinom ograničenih sržnih sekvenci mogu biti skraćene za 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, ili 37 rezidua na oba terminusa, bez obaveznog menjanja vezivanja sa ligandom. Primeri vanćelijskih domena za N-terminalno i/ili C-terminalno skraćenje uključuju SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 1115, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310, i 313.
[0063] U drugim poželjnim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave vezuju se i inhibiraju (antagonizuju) aktivnost jednog ili više liganada TGF-beta natporodice uključujući, ali ne ograničavajući se na BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, neurotrofni faktor poreklom iz glijskih ćelija (GDNF), neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty. Posebno, jednograni heteromultimerni kompleksi objave mogu da se koriste za antagonizovanje unutarćelijske signalne transdukcije (npr., Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) inicirane jednim ili više liganada TGFβ natporodice. Kako je opisano u ovom tekstu, takvi antagonistički heteromultimerni kompleksi mogu služiti za lečenje ili prevenciju različitih stanja udruženih sa TGF-beta, uključujući, bez ograničavanja, bolesti i poremećaje u vezi sa, na primer, kancerom, mišićima, kostima, masnim tkivom, crvenim krvnim ćelijama, metabolizmom, fibrozom i drugim tkivima na koja utiču jedan ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave imaju drugačije ligand-vezujuće profile u poređenju sa sebi odgovarajućim homomultimernim kompleksom (npr., ActRIIB-Fc:Fc heterodimer prema odgovarajućem ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc ili Fc:Fc homodimeru). Kako je opisano u ovom tekstu, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju, npr., heterodimere, heterotrimere, heterotetramere i druge oligomerne strukture bazirane na jednogranom jediničnom kompleksu. U određenim poželjnim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave su heterodimeri.
[0064] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ActRIIB" odnosi se na porodicu aktivinskih receptorskih proteina tipa IIB (ActRIIB) iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ActRIIB proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Podrazumeva se da se pozivanje na ActRIIB u ovom tekstu odnosi na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ActRIIB porodice su, uopšteno, transmembranski proteini sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena koji uključuje region bogat cisteinom, transmembranski domen, i citoplazmatski domen sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0065] Izraz "ActRIIB polipeptid" uključuje polipeptide koji sadrže svaki prirodni polipeptid koji je član ActRIIB porodice, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Primeri takvih varijantnih ActRIIB polipeptida obezbeđeni su u predmetnoj objavi kao i u Objavljenoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2006/012627. Numerisanje amino-kiselina za sve polipeptide srodne sa ActRIIB opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju prekursorske proteinske sekvence humanog ActRIIB date u nastavku (SEQ ID NO: 1), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0066] Prekursorska proteinska sekvenca humanog ActRIIB je kako sledi:
1
[0067] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom; vanćelijski domen naznačen je debljim slovima; i potencijalna, endogena mesta N-glikozilacije označena su tako što su podvučena dva puta.
[0068] Obrađena vanćelijska ActRIIB polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0069] U nekim primerima izvođenja, protein može da se proizvede sa "SGR..." sekvencom na N-terminusu. C-terminalni "rep" vanćelijskog domena označen je tako što je podvučen jednom. Sekvenca sa uklonjenim "repom" (Δ15 sekvenca) je sledeća:
[0070] U literaturi je saopštena i forma ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 SEQ ID NO: 1 (A64) Vidi, npr., Hilden et al. (1994) Blood, 83(8): 2163-2170. Podnosioci su utvrdili da ActRIIB-Fc fuzioni protein koji sadrži vanćelijski domen ActRIIB sa supstitucijom A64 ima relativno nizak afinitet za aktivin i GDF11. Nasuprot tome, isti ActRIIB-Fc fuzioni protein sa argininom na poziciji 64 (R64) ima afinitet za aktivin i GDF11 u rasponu od nisko nanomolarnog do visoko pikomolarnog. Prema tome, sekvence sa R64 koriste se kao referentna sekvenca "divljeg tipa" za humani ActRIIB u ovoj objavi.
[0071] Forma ActRIIB sa alaninom na poziciji 64 je sledeća:
2
[0072] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen označen je debljim slovima.
[0073] Obrađena vanćelijska ActRIIB polipeptidna sekvenca alternativne A64 forme je sledeća:
[0074] U nekim primerima izvođenja, protein može da se proizvede sa "SGR..." sekvencom na N-terminusu. C-terminalni "rep" vanćelijskog domena označen je tako što je podvučen jednom. Sekvenca sa uklonjenim "repom" (Δ15 sekvenca) je sledeća:
[0075] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ActRIIB prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 7), sastoji se od nukleotida 25-1560 Genbank referentne sekvence NM_001106.3, koja kodira amino-kiseline 1-513 ActRIIB prekursora. Prikazana sekvenca obezbeđuje arginin na poziciji 64 i može biti modifikovana da bi umesto toga obezbedila alanin. Signalna sekvenca je podvučena.
[0076] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski humani ActRIIB polipeptid je sledeća (SEQ ID NO: 8). Prikazana sekvenca obezbeđuje arginin na poziciji 64, i može se modifikovati da bi umesto toga obezbedila alanin.
4
[0077] Poravnavanje aminokiselinskih sekvenci solubilnog vanćelijskog domena humanog ActRIIB i solubilnog vanćelijskog domena humanog ActRIIA ilustrovane su na Slici 3. Ovo poravnavanje ukazuje na aminokiselinske rezidue u okviru oba receptora za koje se veruje da direktno kontaktiraju sa ActRII ligandima. Slika 4 prikazuje poravnavanje većeg broja sekvenci različitih kičmenjačkih ActRIIB proteina i humanog ActRIIA. Iz ovih poravnavanja moguće je predvideti ključne aminokiselinske pozicije u okviru ligand-vezujućeg domena, koje su važne za normalne aktivnosti vezivanja ActRII-ligand, kao i predvideti aminokiselinske pozicije koje će verovatno biti tolerantne na supstituciju bez značajne promene normalnih aktivnosti vezivanja ActRII-ligand. ActRII proteini okarakterisani su u struci u pogledu strukturnih i funkcionalnih odlika, posebno u pogledu vezivanja sa ligandom. Vidi, npr., Attisano et al. (1992) Cell 68(1):97-108; Greenwald et al. (1999) Nature Structural Biology 6(1): 18-22; Allendorph et al. (2006) PNAS 103(20: 7643-7648; Thompson et al. (2003) The EMBO Journal 22(7): 1555-1566; kao i U.S. patente br: 7,709,605, 7,612,041, i 7,842,663.
[0078] Na primer, Attisano et al. pokazali su da delecija prolinskog čvora na C-terminusu vanćelijskog domena ActRIIB smanjuje afinitet receptora za aktivin. ActRIIB-Fc fuzioni protein koji sadrži amino-kiseline 20-119 predmetne SEQ ID NO: 1, "ActRIIB(20-119)-Fc", ima smanjeno vezivanje za GDF11 i aktivin u odnosu na ActRIIB(20-134)-Fc, koji uključuje region prolinskog čvora i kompletni jukstamembranski domen (vidi, npr., US. patent br.
7,842,663). Međutim, ActRIIB(20-129)-Fc protein zadržava sličnu, ali nešto smanjenu aktivnost u odnosu na divlji tip, čak i u slučaju narušenosti regiona prolinskog čvora. Prema tome, očekuje se da su vanćelijski domeni ActRIIB koji se završavaju amino-kiselinama 134, 133, 132, 131, 130 i 129 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) svi aktivni, ali konstrukti koji se završavaju na 134 ili 133 mogu biti najaktivniji. Slično tome, ne očekuje se da mutacije na bilo kojoj od rezidua 129-134 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) u većoj meri promene ligandvezujući afinitet. Kao podrška ovome, u struci se zna da mutacije P129 i P130 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ne smanjuju značajno vezivanje liganda. Dakle, ActRIIB polipeptid predmetne objave može se završiti već amino-kiselinom 109 (finalni cistein), međutim, očekuje se da forme koje se završavaju na ili između 109 i 119 (npr., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, ili 119) imaju smanjeno vezivanje liganda. Amino-kiselina 119 (u odnosu na predmetnu SEQ ID NO:1) slabo je konzervirana tako da se lako menja i skraćuje. ActRIIB polipeptidi i GDF klopke bazirane na ActRIIB, koji se završavaju na 128 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) ili kasnije trebalo bi da zadržavaju ligand-vezujuću aktivnost. ActRIIB polipeptidi i GDF klopke bazirane na ActRIIB, koji se završavaju na ili između 119 i 127 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, ili 127), u odnosu na SEQ ID NO: 1, imaće intermedijarnu sposobnost vezivanja. Svaka od ovih formi može biti poželjna za upotrebu, u zavisnosti od kliničke ili eksperimentalne postavke.
[0079] Na N-terminusu ActRIIB, očekuje se da će protein koji počinje na amino-kiselini 29 ili ranije (u odnosu na SEQ ID NO: 1) zadržati ligand-vezujuću aktivnost. Amino-kiselina 29 predstavlja početni cistein. Mutacija alanina u asparagin na poziciji 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) uvodi N-glikozilacionu sekvencu, ne utičući suštinski na vezivanje liganda. Vidi, npr., U.S. patent br. 7,842,663. Ovo potvrđuje da se mutacije u regionu između odsecanja signalnog peptida i regiona cisteinskog unakrsnog povezivanja, što odgovara aminokiselinama 20-29, dobro tolerišu. Posebno, ActRIIB polipeptidi i GDF klopke bazirane na ActRIIB, koji počinju na poziciji 20, 21, 22, 23, i 24 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) trebalo bi da zadržavaju opštu ligand-vezujuću aktivnost, i ActRIIB polipeptidi i GDF klopke bazirane na ActRIIB, koji počinju na pozicijama 25, 26, 27, 28, i 29 (u odnosu na SEQ ID NO: 1) takođe se očekuje da zadržavaju ligand-vezujuću aktivnost. Podaci prikazani u, npr., U.S. patentu br.7,842,663 pokazuju, iznenađujuće, da će ActRIIB konstrukt koji počinje na 22, 23, 24, ili 25 imati najveću aktivnost.
[0080] Zajedno uzevši, aktivni deo (npr., ligand-vezujući deo) ActRIIB uključuje aminokiseline 29-109 SEQ ID NO: 1. Prema tome ActRIIB polipeptidi predmetne objave mogu, na primer, uključivati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa delom ActRIIB koji počinje reziduom koja odgovara amino-kiselinama 20-29 (npr., počinje amino-kiselinama 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) SEQ ID NO: 1 i završava se pozicijama koje odgovaraju amino-kiselinama 109-134 (npr., završava se amino-kiselinama 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) SEQ ID NO: 1. Drugi primeri uključuju polipeptide koji počinju pozicijama 20-29 (npr., pozicija 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) ili 21-29 (npr., pozicija 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) i završavaju se pozicijama 119-134 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), 119-133 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ili 133), 129-134 (npr., 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), ili 129-133 (npr., 129, 130, 131, 132, ili 133) SEQ ID NO: 1. Drugi primeri uključuju konstrukte koji počinju pozicijama 20-24 (npr., 20, 21, 22, 23, ili 24), 21-24 (npr., 21, 22, 23, ili 24), ili 22-25 (npr., 22, 22, 23, ili 25) i završavaju se pozicijama 109-134 (npr., 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), 119-134 (npr., 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) ili 129-134 (npr., 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) SEQ ID NO: 1. U vidu se imaju i varijante u ovim rasponima, posebno one koje imaju najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičnosti sa odgovarajućim delom SEQ ID NO: 1.
[0081] Objava uključuje rezultate analize kompozitnih ActRIIB struktura, pokazane na Slici 3, koji pokazuju da je ligand-vezujući džep definisan, delom, reziduama Y31, N33, N35, L38 do T41, E47, E50, Q53 do K55, L57, H58, Y60, S62, K74, W78 do N83, Y85, R87, A92, i E94 do F101. Očekuje se da će se konzervativne mutacije na ovim pozicijama tolerisati. R40 je K u Xenopus, što ukazuje da će se bazne amino-kiseline na toj poziciji tolerisati. Q53 je R u ActRIIB kod goveda i K u ActRIIB kod Xenopus, i prema tome amino-kiseline koje uključuju R, K, Q, N i H tolerisaće se na tim pozicijama. Dakle, opšta formula za ActRIIB polipeptid objave je ona koja uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa amino-kiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1, opciono počevši pozicijom u rasponu 20-24 (npr., 20, 21, 22, 23, ili 24) ili 22-25 (npr., 22, 23, 24, ili 25) i završavajući se pozicijom u rasponu 129-134 (npr., 129, 130, 131, 132, 133, ili 134), i sadrži ne više od 1, 2, 5, 10 ili 15 konzervativnih zamena amino-kiselina u ligand-vezujućem džepu, i nula, jednu, dve ili više nekonzervativnih promena na pozicijama 40, 53, 55, 74, 79 i/ili 82 u ligand-vezujućem džepu. Mesta izvan vezujućeg džepa, na kojima se varijabilnost može naročito dobro tolerisati, uključuju amino- i karboksi-terminuse vanćelijskog domena (kako je rečeno gore), i pozicije 42-46 i 65-73 (u odnosu na SEQ ID NO: 1). Promena asparagina u alanin na poziciji 65 (N65A) zapravo poboljšava vezivanje liganda u A64 okruženju, tako da se očekuje da nema štetni efekat na vezivanje liganda u R64 okruženju. Vidi, npr., U.S. patent br. 7,842,663. Ova promena verovatno eliminiše glikozilaciju na N65 u A64 okruženju, pokazujući time da će se značajna promena u ovom regionu verovatno tolerisati. Dok se R64A promena loše toleriše, R64K dobro se toleriše, tako da još jedna bazna rezidua, kao što je H može da se toleriše na poziciji 64. Vidi, npr., U.S. patent br.7,842,663.
[0082] ActRIIB je dobro konzerviran kod gotovo svih kičmenjaka, sa velikim nizovima u vanćelijskom domenu koji su potpuno konzervirani. Mnogi ligandi koji se vezuju za ActRIIB takođe su visokokonzervirani. Prema tome, upoređivanja sekvenci ActRIIB iz različitih kičmenjačkih organizama daju uvid u rezidue koje se mogu izmeniti. Dakle, aktivni, humani ActRIIB varijantni polipeptid koristan prema ovde objavljenim postupcima može uključivati jednu ili više amino-kiselina na odgovarajućim pozicijama sekvence ActRIIB drugog kičmenjaka, ili može uključivati reziduu koja je slična onoj u sekvenci čoveka ili drugog kičmenjaka. Sledeći primeri ilustruju ovaj pristup za definisanje aktivne varijante ActRIIB. L46 je valin u ActRIIB Xenopus, tako da ova pozicija može da se promeni, i opciono može da se promeni u drugu hidrofobnu reziduu, kao što je V, I ili F, ili nepolarnu reziduu kao što je A. E52 je K kod Xenopus, što ukazuje da ovo mesto može da toleriše veliki broj različitih promena, uključujući polarne rezidue, kao što su E, D, K, R, H, S, T, P, G, Y i verovatno A. T93 je K kod Xenopus, što ukazuje da ova pozicija može da toleriše široko strukturno variranje, uz favorizovanje polarnih rezidua kao što su S, K, R, E, D, H, G, P, G i Y. F108 je Y kod Xenopus, i prema tome Y ili druga hidrofobna grupa, kao što je I, V ili L trebalo bi da se tolerišu. E111 je K kod Xenopus, što ukazuje da će se naelektrisane rezidue tolerisati na toj poziciji, uključujući D, R, K i H, kao i Q i N. R112 je K kod Xenopus, što ukazuje da se bazne rezidue tolerišu na toj poziciji, uključujući R i H. A na poziciji 119 je relativno slabo konzervirana, i izgleda da je P kod glodara i V kod Xenopus, tako da bi suštinski svaka amino-kiselina trebalo da se toleriše na toj poziciji.
[0083] Varijacije opisane u ovom tekstu mogu se kombinovati na različite načine. Pored toga, rezultati programa mutageneze opisani u struci, ukazuju da ima aminokiselinskih pozicija u ActRIIB koje je često korisno konzervirati. U odnosu na SEQ ID NO: 1, one uključuju poziciju 64 (bazna amino-kiselina), poziciju 80 (kisela ili hidrofobna amino-kiselina), poziciju 78 (hidrofobnaa, i posebno triptofan), poziciju 37 (kisela, i posebno asparaginska ili glutaminska kiselina), poziciju 56 (bazna amino-kiselina), poziciju 60 (hidrofobna aminokiselina, posebno fenilalanin ili tirozin). Prema tome, u ActRIIB polipeptidima objavljenim u ovom tekstu, objava obezbeđuje okvir amino-kiselina koje mogu biti konzervirane. Druge pozicije koje može biti poželjno konzervirati su sledeće: pozicija 52 (kisela amino-kiselina), pozicija 55 (bazna amino-kiselina), pozicija 81 (kisela), 98 (polarna ili naelektrisana, posebno E, D, R ili K), sve u odnosu na SEQ ID NO: 1.
[0084] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ActRIIB polipeptidi za upotrebu u skladu sa pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ActRIIB polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ActRIIB). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ActRIIB polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji uključuje, sastoji se, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa delom ActRIIB koji počinje reziduom koja odgovara amino-kiselinama 20-29 (npr., počinje amino-kiselinom 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) SEQ ID NO: 1 i završava se pozicijom koja odgovara amino-kiselinama 109-134 (npr., završava se amino-kiselinom 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) SEQ ID NO: 1. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji uključuje, sastoji se, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa delom ActRIIB koji počinje reziduom koja odgovara amino-kiselinama 20-29 (npr., počinje amino-kiselinom 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29) SEQ ID NO: 1 i završava se pozicijom koja odgovara amino-kiselinama 109-134 (npr., završava se amino-kiselinom 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134) SEQ ID NO: 1, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 SEQ ID NO: 1 kisela aminokiselina (tj., D ili E aminokiselinska rezidua). U određenim poželjnim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji uključuje, sastoji se, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa amino-kiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1. U drugim poželjnim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji uključuje, sastoji se, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa amino-kiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 SEQ ID NO: 1 kisela amino-kiselina (tj., D ili E aminokiselinska rezidua). U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, ili 404. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIB polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, ili 404, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 SEQ ID NO: 1 kisela amino-kiselina (tj., D ili E aminokiselinska rezidua). U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju, sastoje se, ili se suštinski sastoje od najmanje jednog ActRIIB polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, ili 404. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju, sastoje se, ili se suštinski sastoje od najmanje jednog ActRIIB polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 104, 106, 403, ili 404, pri čemu je pozicija koja odgovara L79 SEQ ID NO: 1 kisela amino-kiselina (tj., D ili E aminokiselinska rezidua).
[0085] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava se odnosi na proteinski kompleks koji uključuje ActRIIA polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ActRIIA" označava porodicu proteina aktivinskog receptora tipa IIA (ActRIIA) iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ActRIIA proteina, mutagenezom ili drugim modifikacijama. Pozivanje na ActRIIA u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ActRIIA porodice su uopšteno transmembranski proteini sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena koji uključuje region bogat cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0086] Izraz "ActRIIA polipeptid" uključuje polipeptide koji obuhvataju svaki prirodni polipeptid koji je član ActRIIA porodice, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Primeri takvih varijanti ActRIIA polipeptida obezbeđeni su u predmetnoj objavi kao i u Objavljenoj međunarodnoj patentnoj prijavi br. WO 2006/012627. Numerisanje amino-kiselina za sve ActRIIA-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence
4
humanog ActRIIA prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 9), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0087] Sekvenca humanog ActRIIA prekursorskog proteina je sledeća:
[0088] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom; vanćelijski domen je označen debljim slovima; i potencijalna endogena mesta N-glikozilacije označena su tako što su podvučena dva puta.
[0089] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca humanog ActRIIA je sledeća:
[0090] C-terminalni "rep" vanćelijskog domena označen je tako što je podvučen jednom. Sekvenca sa uklonjenim "repom" (Δ15 sekvenca) je sledeća:
[0091] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ActRIIA prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 12), odgovara nukleotidima 159-1700 Genbank referentne sekvence NM_001616.4. Signalna sekvenca je podvučena.
[0092] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ActRIIA polipeptid je sledeća:
[0093] Opšta formula aktivnog (npr., ligand-vezujućeg) ActRIIA polipeptida je ona koja sadrži polipeptid koji počinje amino-kiselinom 30 i završava se amino-kiselinom 110 SEQ ID NO: 9. Prema tome, ActRIIA polipeptidi predmetne objave mogu uključivati polipeptid koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa aminokiselinama 30-110 SEQ ID NO: 9. Opciono, ActRIIA polipeptidi predmetne objave uključuju polipeptid koji je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa amino-kiselinama 12-82 SEQ ID NO: 9, opciono počinjući pozicijom u rasponu 1-5 (npr., 1, 2, 3, 4, ili 5) ili 3-5 (npr., 3, 4, ili 5) i završavajući se pozicijom u rasponu od 110-116 (npr., 110, 111, 112, 113, 114, 115, ili 116) ili 110-115 (npr., 110, 111, 112, 113, 114, ili 115), respektivno, i uključujuči ne više od 1, 2, 5, 10 ili 15 konzervativnih aminokiselinskih zamena u ligand-vezujućem džepu, i nula, jednu ili više nekonzervativnih zamena na pozicijama 40, 53, 55, 74, 79 i/ili 82 u ligand-vezujućem džepu, u odnosu na SEQ ID NO: 9.
[0094] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju najmanje jedan ActRIIA polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ActRIIA polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ActRIIA polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ActRIIA). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ActRIIA polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ActRIIA polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, ili 402. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju, sastoje se, ili sastoje se suštinski od najmanje jednog ActRIIA polipeptida koji je
4
najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 9, 10, 11, 101, 103, 401, ili 402.
[0095] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju TGFBRII polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "TGFBRII" odnosi se na proteine porodice receptora II za transformišući faktor rasta-beta (transforming growth factorbeta receptor II, TGFBRII) iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na TGFBRII u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi TGFBRII porodice su uopšteno transmembranski proteini sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0096] Izraz "TGFBRII polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član TGFBRII porodice, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve TGFBRII-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog TGFBRII prekursorskog proteina, date u nastavku (SEQ ID NO: 42), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0097] Sekvenca kanonskog humanog TGFBRII prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_003233.4) je sledeća:
[0098] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0099] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca humanog TGFBRII je sledeća:
[0100] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TGFBRII prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 44), odgovara nukleotidima 383-2083 Genbank referentne sekvence NM_003242.5. Signalna sekvenca je podvučena.
4
[0101] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski TGFBRII polipeptid je sledeća:
[0102] Alternativna izoforma TGFBRII, izoforma A (NP_001020018.1), je sledeća:
[0103] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0104] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca humanog TGFBRII (izoforma A) je sledeća
4
[0105] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira TGFBRII prekursorski protein (izoforma A) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 69), odgovara nukleotidima 383-2158 Genbank referentne sekvence NM_001024847.2. Signalna sekvenca je podvučena.
[0106] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski TGFBRII polipeptid (izoforma A) je sledeća:
4
[0107] Bilo koja od gore navedenih TGFβRII izoformi (SEQ ID NO: 42, 43, 67, i 68) može da inkorporiše inserciju 36 amino-kiselina (SEQ ID NO: 95) između para glutamatskih rezidua (pozicije 151 i 152 SEQ ID NO: 42; pozicije 129 i 130 SEQ ID NO: 43; pozicije 176 i 177 SEQ ID NO: 67; ili pozicije 154 i 155 SEQ ID NO: 68) lociranih blizu C-terminusa TGFβRII ECD, kako se prirodno sreće u TGFβRII izoformi C (Konrad et al., BMC Genomics 8:318, 2007).
GRCKIRHIGS NNRLQRSTCQ NTGWESAHVM KTPGFR (SEQ ID NO: 95)
[0108] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju najmanje jedan TGFBRII polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, TGFBRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju TGFBRII polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen TGFBRII). U drugim poželjnim primerima izvođenja, TGFBRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan TGFBRII polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, ili 410. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan TGFBRII polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa bilo kojom od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, ili 410, u koju je insertovana SEQ ID NO: 95 između parnih glutamatskih rezidua, kako je opisano gore. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili se suštinski sastoje od najmanje jednogTGFBRII polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%,
4
ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 42, 43, 67, 68, 113, 115, 409, ili 410.
[0109] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju BMPRII polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "BMPRII" odnosi se na porodicu receptorskih proteina tipa II za protein morfogeneze kosti (bone morphogenetic protein receptor type II, BMPRII) iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih BMPRII proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na BMPRII u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi BMPRII porodice su uopšteno transmembranski proteini sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0110] Izraz "BMPRII polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član BMPRII porodice, kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve BMPRII-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog BMPRII prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 46), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0111] Kanonska sekvenca humanog BMPRII prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_001195.2) je sledeća:
4
[0112] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0113] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca humanog BMPRII je sledeća
[0114] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira BMPRII prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 48), kao sledeći nukleotidi 1149-4262 Genbank referentne sekvence NM_001204.6. Signalna sekvenca je podvučena.
�
[0115] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski BMPRII polipeptid je sledeća:
[0116] Alternativna izoforma BMPRII, izoforma 2 (GenBank: AAA86519.1) je sledeća:
2
[0117] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0118] Obrađena vanćelijska BMPRII polipeptidna sekvenca (izoforma 2) je sledeća:
[0119] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira BMPRII prekursorski protein (izoforma 2) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 73), odgovara nukleotidima 163-1752 Genbank referentne sekvence U25110.1. Signalna sekvenca je podvučena.
[0120] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski BMPRII polipeptid (izoforma 2) je sledeća:
[0121] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji uključuju najmanje jedan BMPRII polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, BMPRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju BMPRII polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen BMPRII). U drugim poželjnim primerima izvođenja, BMPRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan BMPRII polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, ili 406. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili sastoje se suštinski od najmanje jednog BMPRII polipeptida koji je najmanje 70%, 75%,
4
80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 46, 47, 71, 72, 107, 109, 405, ili 406.
[0122] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju MISRII polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "MISRII" odnosi se na porodicu receptorskih proteina tipa II za milerijansku inhibirajuću supstancu (MISRII) iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih MISRII proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na MISRII u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi MISRII porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0123] Izraz "MISRII polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član MISRII porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve MISRII-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog MISRII prekursorskog proteina, date u nastavku (SEQ ID NO: 50), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0124] Kanonska sekvenca humanog MISRII prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_065434.1) je sledeća:
[0125] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0126] Obrađena vanćelijska MISRII polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0127] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira MISRII prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 52), odgovara nukleotidima 81-1799 Genbank referentne sekvence NM_020547.2. Signalna sekvenca je podvučena.
[0128] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski humani MISRII polipeptid je sledeća:
[0129] Alternativna izoforma prekursorske proteinske sekvence humanog MISRII, izoforma 2 (NCBI ref sekv NP_001158162.1), je sledeća:
[0130] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0131] Obrađena vanćelijska MISRII polipeptidna sekvenca (izoforma 2) je sledeća:
[0132] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira MISRII prekursorski protein (izoforma 2) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 77), odgovara nukleotidima 81-1514 Genbank referentne sekvence NM_001164690.1. Signalna sekvenca je podvučena.
[0133] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni solubilni (vanćelijski) humani MISRII polipeptid (izoforma 2) je sledeća:
[0134] Alternativna izoforma prekursorske proteinske sekvence humane MISRII,, izoforma 3 (NCBI ref. sekv. NP_001158163.1), je sledeća:
[0135] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0136] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca MISRII (izoforma 3) je sledeća
[0137] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani MISRII prekursorski protein (izoforma 3) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 81), odgovara nukleotidima 81-1514 Genbank referentne sekvence NM_001164691.1. Signalna sekvenca je podvučena.
[0138] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni solubilni (vanćelijski) humani MISRII polipeptid (izoforma 3) je sledeća:
[0139] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan MISRII polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, MISRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju MISRII polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen MISRII). U drugim poželjnim primerima izvođenja, MISRII polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan MISRII polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, ili 408. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili se suštinski sastoje od najmanje jednog MISRII polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 50, 51, 75, 76, 79, 80, 110, 112, 407, ili 408.
[0140] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju ALK1 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK1" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-1 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK1 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK1 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK1 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligandvezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0141] Izraz "ALK1 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK1 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK1-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK1 prekursorskog proteina, date u nastavku (SEQ ID NO: 14), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0142] Sekvenca humanog ALK1 prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_000011.2) je sledeća:
[0143] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
1
[0144] Obrađena vanćelijska ALK1 polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0145] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ALK1 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 16), odgovara nukleotidima 284-1792 Genbank referentne sekvence NM_000020.2. Signalna sekvenca je podvučena.
[0146] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ALK1 polipeptid je sledeća:
2
[0147] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK1 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK1 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK1 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK1). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK1 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK1 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, ili 412. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili se suštinski sastoje od najmanje jednog ALK1 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 14, 15, 116, 118, 411, ili 412.
[0148] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju ALK2 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK2" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-2 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK2 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK2 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK2 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligandvezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0149] Izraz "ALK2 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK2 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK2-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK2 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 18), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0150] Sekvenca humanog ALK2 prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_001096.1) je sledeća:
[0151] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0152] Obrađena vanćelijska ALK2 polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0153] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ALK2 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 20), odgovara nukleotidima 431-1957 Genbank referentne sekvence NM_001105.4. Signalna sekvenca je podvučena.
4
[0154] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski ALK2 polipeptid je sledeća:
[0155] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK2 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK2 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK2 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK2). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK2 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK2 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18,19, 119, 121, 413, ili 414. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili suštinski se sastoje od najmanje jednog ALK2 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18, 19, 119, 121, 413, ili 414.
[0156] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji sadrže ALK3 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK3" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-3 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK3 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK3 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK3 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0157] Izraz "ALK3 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK3 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK3-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK3 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 22), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0158] Sekvenca humanog ALK3 prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_004320.2) je sledeća:
[0159] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0160] Obrađena vanćelijska ALK3 polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0161] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ALK3 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 24), odgovara nukleotidima 549-2144 Genbank referentne sekvence NM_004329.2. Signalna sekvenca je podvučena, a vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0162] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski humani ALK3 polipeptid je sledeća:
[0163] Opšta formula za aktivni (npr., ligand-vezujući) ALK3 polipeptid je ona koja uključuje polipeptid koji počinje bilo kojom aminokiselinskom pozicijom 25-31 (tj., pozicijom 25, 26, 27, 28, 29, 30, ili 31) SEQ ID NO: 22 i završava se bilo kojom aminokiselinskom pozicijom 140-152 SEQ ID NO: 22 (tj., 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, ili 152). Vidi U.S. patent 8,338,377.
[0164] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK3 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK3 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK3 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK3). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK3 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sadrže najmanje jedan ALK3 polipeptid koji uključuje, sastoji se ili sastoji se suštinski od amino kiseline počevši bilo kojom aminokiselinskom pozicijom 25-31 (tj., pozicijom 25, 26, 27, 28, 29, 30, ili 31) SEQ ID NO: 22 i završavajući se aminokiselinskom pozicijom 140-153 SEQ ID NO: 22 (tj., 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, ili 152) SEQ ID NO: 22. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK3 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, ili 416. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili se suštinski sastoje od najmanje jednog ALK3 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 22, 23, 122, 124, 415, ili 416.
[0165] U određenim aspektima, predmetna objava odnosi se na proteinske komplekse koji uključuju ALK4 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK4" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-4 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK4 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK4 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno poznatih formi. Članovi ALK4 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligand-vezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0166] Izraz "ALK4 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK4 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK4-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK4 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 26), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0167] Kanonska sekvenca humanog ALK4 prekursorskog proteina (izoforma A, NCBI ref. sekv. NP_004293) je sledeća:
[0168] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0169] Obrađena vanćelijska polipeptidna sekvenca humanog ALK4 je sledeća:
1
[0170] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ALK4 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 28), odgovara nukleotidima 78-1592 Genbank referentne sekvence NM_004302.4. Signalna sekvenca je podvučena a vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0171] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski ALK4 polipeptid je sledeća:
2
[0172] Alternativna izoforma humanog ALK4 prekursora, izoforma B (NCBI ref. sekv. NP_064732.3), je sledeća:
[0173] Vanćelijski domen označen je debljim slovima.
[0174] Sekvenca vanćelijskog ALK4 polipeptida (izoforma B) je sledeća:
[0175] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira izoformu B ALK4 prekursorskog proteina prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 85), odgovara nukleotidima 186-1547 Genbank referentne sekvence NM_020327.3. Vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0176] Nukleinska kiselina koja kodira vanćelijski domen ALK4 polipeptida (izoforma B) je sledeća:
[0177] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK4 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK4 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK4 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK4). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK4 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8
4
signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK4 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, ili 418. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili suštinski se sastoje od najmanje jednog ALK4 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 26, 27, 83, 84, 125, 127, 417, ili 418.
[0178] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju ALK5 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK5" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-5 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK4 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK5 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK5 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligandvezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0179] Izraz "ALK5 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK5 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK5-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK5 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 30), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0180] Kanonska sekvenca humanog ALK5 prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_004603.1) je sledeća:
[0181] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0182] Obrađena vanćelijska ALK5 polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0183] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ALK5 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 32), odgovara nukleotidima 77-1585 Genbank referentne sekvence NM_004612.2. Signalna sekvenca je podvučena i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0184] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski humani ALK5 polipeptid je sledeća:
[0185] Sekvenca alternativne izoforme humanog ALK5 prekursorskog proteina, izoforma 2 (NCBI ref. sekv. XP_005252207.1), je sledeća:
[0186] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0187] Obrađena vanćelijska ALK5 polipeptidna sekvenca (izoforma 2) je sledeća:
[0188] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ALK5 prekursorski protein (izoforma 2) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 89), odgovara nukleotidima 77-1597 Genbank referentne sekvence XM_005252150.1. Signalna sekvenca je podvučena i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0189] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ALK5 polipeptid je sledeća:
[0190] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK5 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK5 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK5 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK5). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK5 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK5 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, ili 420. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili suštinski se sastoje od najmanje jednog ALK5 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 30, 31, 87, 88, 128, 130, 419, ili 420.
[0191] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju ALK6 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK6" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-6 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK6 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK6 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK6 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligandvezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0192] Izraz "ALK6 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK6 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK6-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK6 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 34), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0193] Kanonska sekvenca humanog ALK6 prekursorskog proteina (NCBI ref. sekv. NP_001194.1) je sledeća:
[0194] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0195] Obrađena vanćelijska ALK6 polipeptidna sekvenca je sledeća:
[0196] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ALK6 prekursorski protein prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 36), odgovara nukleotidima 275-1780 Genbank referentne sekvence NM_001203.2. Signalna sekvenca je podvučena i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0197] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ALK6 polipeptid je sledeća:
1
[0198] Sekvenca alternativne izoforme humanog ALK6 prekursorskog proteina, izoforma 2 (NCBI ref. sekv. NP_001243722.1) je sledeća:
[0199] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0200] Obrađena vanćelijska ALK6 polipeptidna sekvenca (izoforma 2) je sledeća:
[0201] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ALK6 prekursorski protein (izoforma 2) prikazana je u nastavku, odgovara nukleotidima 22-1617 Genbank referentne sekvence
2
NM_001256793.1. Signalna sekvenca je podvučena i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0202] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ALK6 polipeptid je sledeća:
[0203] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrže najmanje jedan ALK6 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK6 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK6 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK6). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK6 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK6 polipeptid koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, ili 422. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili suštinski se sastoje od najmanje jednog ALK6 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 34, 35, 91, 92, 131, 133, 421, ili 422.
[0204] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na proteinske komplekse koji uključuju ALK7 polipeptid. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "ALK7" odnosi se na porodicu proteina aktivinskom receptoru sličnih kinaza-7 iz bilo koje vrste i varijante izvedene iz takvih ALK7 proteina, mutagenezom ili drugom modifikacijom. Pozivanje na ALK7 u ovom tekstu treba razumeti kao pozivanje na bilo koju od trenutno identifikovanih formi. Članovi ALK7 porodice su uopšteno transmembranski proteini, sačinjeni od ligandvezujućeg vanćelijskog domena sa regionom bogatim cisteinom, transmembranskog domena, i citoplazmatskog domena sa predviđenom serin/treonin kinaznom aktivnošću.
[0205] Izraz "ALK7 polipeptid" obuhvata polipeptide koji uključuju bilo koji prirodni polipeptid koji je član ALK7 porodice kao i sve njegove varijante (uključujući mutante, fragmente, fuzije, i peptidomimetičke forme) koje zadržavaju korisnu aktivnost. Numerisanje amino-kiselina za sve ALK7-srodne polipeptide opisane u ovom tekstu bazirano je na numerisanju sekvence humanog ALK7 prekursorskog proteina date u nastavku (SEQ ID NO: 38), ukoliko specifično nije naznačeno drugačije.
[0206] Opisano je nekoliko prirodnih izoformi humanog ALK7. Kanonska sekvenca humanog ALK7 prekursorskog proteina, izoforma 1, (NCBI ref. sekv. NP_660302.2) je sledeća:
4
[0207] Signalni peptid označen je tako što je podvučen jednom i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0208] Obrađena vanćelijska ALK7 polipeptidna sekvenca, izoforma 1, je sledeća:
[0209] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira humani ALK7 prekursorski protein, izoforma 1, prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 40), odgovara nukleotidima 244-1722 Genbank referentne sekvence NM_145259.2. Signalna sekvenca je podvučena i vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0210] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni vanćelijski ALK7 polipeptid (izoforma 1) je sledeća:
[0211] Aminokiselinska sekvenca alternativne izoforme humanog ALK7, izoforma 2 (NCBI ref. sekv. NP_001104501.1), prikazana je u svojoj obrađenoj formi kako sledi (SEQ ID NO: 301), pri čemu je vanćelijski domen naznačen debljim slovima.
1 MLTNGKEQVI KSCVSLPELN AQVFCHSSNN VTKTECCFTD FCNNITLHLP TASPNAPKLG
[0212]
[0213] Aminokiselinska sekvenca vanćelijskog ALK7 polipeptida (izoforma 2) je sledeća: MLTNGKEQVIKSCVSLPELNAQVFCHSSNNVTKTECCFTDFCNNITLHLPTASPNAPK LGPME (SEQ ID NO: 302).
[0214] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni ALK7 polipeptid (izoforma 2) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 303), odgovara nukleotidima 279-1607 Genbank referentne sekvence NM_001111031.1. Vanćelijski domen je označen debljim slovima.
[0215] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vanćelijski ALK7 polipeptid (izoforma 2) je sledeća (SEQ ID NO: 304):
[0216] Aminokiselinska sekvenca alternativnog humanog ALK7 prekursorskog proteina, izoforma 3 (NCBI ref. sekv. NP_001104502.1), prikazana je kako sledi (SEQ ID NO: 305), pri čemu je signalni peptid označen tako što je podvučen jednom.
[0217] Aminokiselinska sekvenca obrađenog ALK7 polipeptida (izoforma 3) je kako sledi (SEQ ID NO: 306). Ova izoforma nema transmembranski domen i stoga je predloženo da je solubilna u celini (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). N-terminalne varijante SEQ ID NO: 306 predviđene su kako je objašnjeno u nastavku.
[0218] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira neobrađeni prekursorski protein ALK7 polipeptida (izoforma 3) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 307), odgovara nukleotidima 244-1482 NCBI referentne sekvence NM_001111032.1. Signalna sekvenca je označena tako što je podvučena debelom linijom.
[0219] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni ALK7 polipeptid (izoforma 3) je sledeća (SEQ ID NO: 308):
[0220] Aminokiselinska sekvenca alternativnog humanog ALK7 prekursorskog proteina, izoforma 4 (NCBI ref. sekv. NP_001104503.1), prikazana je kako sledi (SEQ ID NO: 309), pri čemu je signalni peptid označen tako što je podvučen jednom.
[0221] Aminokiselinska sekvenca obrađenog ALK7 polipeptida (izoforma 4) je kako sledi (SEQ ID NO: 310). Kao ALK7 izoforma 3, izoforma 4 nema transmembranski domen i stoga je predloženo da je solubilna u celini (Roberts et al., 2003, Biol Reprod 68:1719-1726). N-terminalne varijante SEQ ID NO: 310 predviđene su kako je objašnjeno u nastavku.
[0222] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira neobrađeni prekursorski protein ALK7 polipeptida (izoforma 4) prikazana je u nastavku (SEQ ID NO: 311), odgovara nukleotidima 244-1244 NCBI referentne sekvence NM_001111033.1. Signalna sekvenca je označena tako što je podvučena debljom linijom.
[0223] Sekvenca nukleinske kiseline koja kodira obrađeni ALK7 polipeptid (izoforma 4) je sledeća (SEQ ID NO: 312):
1
[0224] Na osnovu signalne sekvence ALK7 pune dužine (izoforma 1) kod pacova (vidi NCBI referentna sekvenca NP_620790.1) i visokog stepena sekvencione identičnosti između ALK7 čoveka i pacova, pretpostavljeno je da je obrađena forma humanog ALK7, izoforma 1, sledeća (SEQ ID NO: 313).
[0225] Predviđene su aktivne varijante obrađenog ALK7, izoforma 1, u kojima je SEQ ID NO: 39 skraćena za 1, 2, 3, 4, 5, 6, ili 7 amino-kiselina na N-terminusu i SEQ ID NO: 313 je skraćena za 1 ili 2 amino-kiseline na N-terminusu. Konzistentno sa SEQ ID NO: 313, dalje se očekuje da je leucin N-terminalna amino-kiselina u obrađenim formama humanog ALK7, izoforma 3 (SEQ ID NO: 306) i humanog ALK7, izoforma 4 (SEQ ID NO: 310).
[0226] U određenim primerima izvođenja, objava se odnosi na jednograne heteromultimerne komplekse koji sadrži najmanje jedan ALK7 polipeptid, koji uključuje fragmente, funkcionalne varijante, i modifikovane forme istog. Poželjno, ALK7 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave (npr., jednograni heteromultimerni kompleksi koji uključuju ALK7 polipeptid i njihove upotrebe) su solubilni (npr., vanćelijski domen ALK7). U drugim poželjnim primerima izvođenja, ALK7 polipeptidi za upotrebu prema pronalascima objave vezuju se i/ili inhibiraju (antagonizuju) aktivnost (npr., indukciju Smad 2/3 i/ili Smad 1/5/8 signalizacije) jednog ili više liganada TGF-beta natporodice. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave uključuju najmanje jedan ALK7 polipeptid
2
koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, ili 424. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi objave sastoje se ili suštinski se sastoje od najmanje jednog ALK7 polipeptida koji je najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 38, 39, 134, 136, 301, 302, 305, 306, 309, 310, 313, 423, ili 424.
[0227] U nekim primerima izvođenja, predmetna objava razmatra spravljanje funkcionalnih varijanti modifikovanjem strukture receptorskog polipeptida tipa I TGF-beta natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7) ili receptorskog polipeptida tipa II TGF-beta natporodice (npr., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII) za potrebe kao što su pojačavanje terapijske efikasnosti ili stabilnosti (npr., rok trajanja i otpornost na proteolitičku degradaciju in vivo). Varijante se mogu proizvesti supstitucijom, delecijom ili adicijom amino-kiselina, ili kombinacijom navedenog. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena amino-kiseline strukturno srodnom amino-kiselinom (npr., konzervativne mutacije) neće imati velikog uticaja na biološku aktivnost rezultirajućeg molekula. Konzervativne zamene su one koje se dešavaju u okviru porodice amino-kiselina srodnih po svojim bočnim lancima. Da li će promena aminokiselinske sekvence polipeptida objave rezultovati funkcionalnim homologom može se lako odrediti procenom sposobnosti varijantnog polipeptida da proizvede odgovor u ćelijama na način sličan polipeptidu divljeg tipa, ili da se vezuje sa jednim ili više TGF-beta liganada uključujući, na primer, BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty.
[0228] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava razmatra specifične mutacije receptorskog polipeptida tipa I TGF-beta natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7) ili receptorskog polipeptida tipa II TGF-beta natporodice (npr., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII) objave tako da se menja glikozilacija polipeptida. Ove mutacije mogu se odabrati tako da dođe do uvođenja ili eliminisanja jednog ili više mesta glikozilacije, kao što su O- ili N-glikozilaciona mesta. Mesta prepoznavanja za glikozilaciju povezanu sa asparaginom obično uključuju tripeptidnu sekvencu, asparagin-Xtreonin ili asparagin-X-serin (gde je "X" bilo koja amino-kiselina) koju specifično prepoznaju odgovarajući ćelijski glikozilacioni enzimi. Izmene mogu da se naprave i adicijom ili supstitucijom jedne ili više serinskih ili treononskih rezidua u sekvenci polipeptida (za O-glikozilaciona mesta). Različite aminokiselinske supstitucije ili delecije na jednoj ili obe od prve ili treće aminokiselinske pozicije glikozilacionog mesta prepoznavanja (i/ili aminokiselinska delecija na drugoj poziciji) rezultuju izostankom glikozilacije modifikovane tripeptidne sekvence. Drugi način povećanja broja ugljenohidratnih komponenti na polipeptidu je hemijsko ili enzimsko kuplovanje glikozida za polipeptid. U zavisnosti od upotrebljenog modaliteta kuplovanja, šećer(i) se može prikačiti za (a) arginin i histidin; (b) slobodne karboksilne grupe; (c) slobodne sulfhidrilne grupe kao što su one na cisteinu; (d) slobodne hidroksilne grupe kao što su one na serinu, treoninu, ili hidroksiprolinu; (e) aromatične rezidue kao što su rezidue fenilalanina, tirozina, ili triptofana; ili (f) amidnu grupu glutamina. Uklanjanje jedne ili više ugljenohidratnih komponenti prisutnih na polipeptidu može se obaviti hemijski i/ili enzimski. Hemijska deglikozilacija može uključivati, na primer, izlaganje polipeptida jedinjenju trifluorometansulfonskoj kiselini, ili ekvivalentnom jedinjenju. Ovaj tretman rezultuje odsecanjem većine ili svih šećera osim povezujućeg šećera (N-acetilglukozamin ili N-acetilgalaktozamin), pri čemu aminokiselinska sekvenca ostaje intaktna. Enzimsko odsecanje ugljenohidratnih komponenti na polipeptidima može se postići upotrebom različitih endo- i egzoglikozidaza, kako su opisali Thotakura et al. [Meth. Enzymol. (1987) 138:350]. Sekvenca polipeptida može da se podesi, po potrebi, u zavisnosti od tipa upotrebljenog ekspresionog sistema, jer sisarske, kvaščeve, insekatske i biljne ćelije mogu uvesti različite obrasce glikozilacije na koje mogu uticati amino-kiselinske sekvence peptida. Uopšteno, jednograni receptorski kompleksi tipa I i tipa II TGF-beta natporodice predmetne objave za upotrebu kod ljudi mogu se eksprimirati u sisarskoj ćelijskoj liniji koja obezbeđuje ispravnu glikozilaciju, kao što su HEK293 ili CHO ćelijske linije, iako se očekuje da i druge sisarske ekspresione ćelijske linije takođe mogu biti od koristi.
[0229] Predmetna objava dodatno razmatra postupak stvaranja mutanata, posebno setova kombinatornih mutanata receptorskog polipeptida tipa I TGF-beta natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, i ALK7) ili receptorskog polipeptida tipa II TGF-beta natporodice (npr., ActRIIA, ActRIIB, TGFBRII, BMPRII, i MISRII) predmetne objave, kao i skraćenih mutanata. Pulovi kombinatornih mutanata posebno su korisni za identifikovanje sekvenci receptora tipa I TGF-beta natporodice ili receptora tipa II TGF-beta natporodice. Svrha pretraživanja takvih kombinatornih biblioteka može biti stvaranje, na primer,
4
polipeptidnih varijanti koje imaju izmenjene osobine, kao što su izmenjena farmakokinetika ili izmenjeno vezivanje liganda. Različiti testovi pretraživanja obezbeđeni su u nastavku, i takvi testovi mogu se koristiti za evaluaciju varijanti. Na primer, varijante receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice mogu se pretražiti u pogledu sposobnosti vezivanja liganda TGF-beta natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty), da bi se sprečilo vezivanje liganda TGF-beta natporodice za receptor TGF-beta natporodice, i/ili interferiralo sa signalizacijom izazvanom ligandom TGF-beta natporodice.
[0230] Aktivnost jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može se testirati i testom na bazi ćelija ili in vivo. Na primer, može se procenjivati efekat jednogranog heteromultimernog kompleksa na ekspresiju gena uključenih u proizvodnju mišića u mišićnoj ćeliji. Ovo se po potrebi može izvesti u prisustvu jednog ili više rekombinantnih ligandnih proteina TGF-beta natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty), a ćelije se mogu transfektovati tako da proizvedu jednograni kompleks receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, i opciono, ligand TGF-beta natporodice. Slično tome, jednograni heteromultimerni kompleks objave može se primeniti kod miša ili druge životinje, i jedno ili više merljivih karaktera, na primer formiranje mišića i njihova snaga, mogu se procenjivati korišćenjem u struci poznatih postupaka. Slično tome, aktivnost receptorskog polipeptida TGF-beta natporodice ili njegovih varijanti može se testirati u osteoblastima, adipocitima, i/ili neuronima, u pogledu nekog od efekata na rast ovih ćelija, na primer, testovima koji su opisani u ovom tekstu i opštepoznati u struci. Reporterski gen koji odgovara na SMAD može se u takvim ćelijskim linijama upotrebiti za praćenje efekata nizvodne signalizacije.
[0231] Mogu se napraviti varijante kombinatornog porekla, koje imaju povećanu selektivnost ili, uopšteno, povećanu potenciju u odnosu na referentni jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice. Takve varijante, kada se eksprimiraju na osnovu rekombinantnih DNK konstrukata, mogu se upotrebiti u protokolima genske terapije. Slično tome, mutageneza može dati varijante čiji je poluživot izvan ćelije izrazito različit u poređenju sa odgovarajućim nemodifikovanim jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice. Na primer, izmenjeni protein može se načiniti ili stabilnijim ili manje stabilnim na proteolitičku degradaciju ili druge ćelijske procese koji rezultuju destrukcijom, ili na drugi način inaktivacijom, nemodifikovanog polipeptida. Takve varijante, i geni koji ih kodiraju, mogu se upotrebiti za menjanje nivoa polipeptidnog kompleksa modulisanjem poluživota polipeptida. Na primer, kratak poluživot može dovesti do prolaznijih bioloških efekata i, kada su deo inducibilnog ekspresionog sistema, mogu omogućiti prisniju kontrolu nivoa rekombinantnog polipeptidnog kompleksa izvan ćelije. U Fc fuzionom proteinu, mogu se napraviti mutacije u linkeru (ako ga ima) i/ili Fc delu da bi promenio poluživot jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice.
[0232] Kombinatorna biblioteka može se proizvesti degenerisanjem biblioteke gena koji kodiraju biblioteku polipeptida od kojih svaki uključuje najmanje deo potencijalnih sekvenci receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Na primer, mešavina sintetskih oligonukleotida može se enzimski povezati u genske sekvence tako da se degenerisani set potencijalnih nukleotidnih sekvenci koje kodiraju receptor tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice može eksprimirati u vidu individualnih polipeptida, ili alternativno, u vidu seta većih fuzionih proteina (npr., za prikazivanje na fagu).
[0233] Postoji mnogo načina kojima se biblioteka potencijalnih homologa može stvoriti od degenerisane oligonukleotidne sekvence. Hemijska sinteza degenerisane genske sekvence može se obaviti u automatskom DNK sintetizeru, i sintetski geni se zatim mogu povezati u odgovarajući vektor, za ekspresiju. Sinteza degenerisanih oligonukleotida dobro je poznata u struci. Vidi, npr., Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier str. 273-289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11:477. Takve tehnike bile su korišćene u usmerenoj evoluciji drugih proteina. Vidi, npr., Scott et al., (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al., (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; kao i U.S. patentima br: 5,223,409, 5,198,346, i 5,096,815.
[0234] Alternativno, druge forme mutageneze mogu se koristiti za stvaranje kombinatorne biblioteke. Na primer, jednograni heteromultimerni receptorski kompleksi TGF-beta natporodice objave mogu se napraviti i izolovati iz biblioteke skriningom, korišćenjem, na primer, alanin-skenirajuće mutageneze [vidi, npr., Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al. (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al. (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al. (1991) Biochemistry 30:10832-10838; i Cunningham et al. (1989) Science 244:1081-1085], linker-skenirajuće mutageneze [vidi, npr., Gustin et al. (1993) Virology 193:653-660; i Brown et al. (1992) Mol. Cell Biol.12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316], saturacione mutageneze [vidi, npr., Meyers et al., (1986) Science 232:613]; PCR mutageneze [vidi, npr., Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19]; ili nasumične mutageneze, uključujući hemijsku mutagenezu [vidi, npr., Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; i Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34]. Linker-skenirajuća mutageneza, posebno u kombinatornoj postavci, atraktivan je postupak za identifikovanje skraćenih (bioaktivnih) formi receptorskih polipeptida tipa I i tipa II TGF-beta natporodice.
[0235] U struci je poznat širok raspon tehnika za pretraživanje genskih proizvoda kombinatornih biblioteka napravljenih tačkastim mutacijama i skraćivanjima, i, u tom slučaju, za pretraživanje cDNK biblioteka za genske proizvode koji imaju određene odlike. Takve tehnike moći će, obično, da se prilagode brzom pretraživanju genskih biblioteka napravljenih kombinatornom mutagenezom jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave. Najšire korišćene tehnike pretraživanja velikih genskih biblioteka tipično uključuju kloniranje genske biblioteke u replikabilne ekspresione vektore, transformisanje odgovarajućih ćelija dobijenom bibliotekom vektora, i eksprimiranje kombinatornih gena pod uslovima u kojima detekcija željene aktivnosti omogućava relativno laku izolaciju vektora koji kodira gen čiji je proizvod detektovan. Poželjni testovi uključuju testove vezivanja i/ili testove ćelijske signalizacije za ligande TGF-beta natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty).
[0236] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora tipa I i tipa II TGF-beta natporodice objave mogu uključivati još i posttranslacione modifikacije, pored onih koje su prirodno prisutne u receptorskom polipeptidu tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Takve modifikacije uključuju, ali se ne ograničavaju na acetilaciju, karboksilaciju, glikozilaciju, fosforilaciju, lipidaciju, i acilaciju. Kao rezultat, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice mogu uključivati neaminokiselinske elemente kao što su polietilen glikoli, lipidi, polisaharidi ili monosaharidi, i fosfati. Efekti neaminokiselinskih elemenata na funkcionalnost jednogranog heteromultimernog kompleksa mogu se testirati kako je opisano u ovom tekstu za druge varijante jednogranog heteromultimernog kompleksa. Kada se polipeptid objave proizvede u ćelijama sečenjem nascentne forme polipeptida, posttranslaciona obrada može takođe biti važna za ispravno savijanje i/ili funkciju proteina. Različite ćelije (npr., CHO, HeLa, MDCK, 293, WI38, NIH-3T3 ili HEK293) poseduju specifičnu ćelijsku mašineriju i karakteristične mehanizme za takve posttranslacione aktivnosti i mogu se odabrati tako da osiguraju ispravnu modifikaciju i obradu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice.
[0237] U određenim aspektima, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu mogu formirati proteinske komplekse koji uključuju najmanje jedan receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice udružen, kovalentno ili nekovalentno, sa najmanje jednim polipeptidom koji uključuje komplementarnog člana interakcionog para. Poželjno, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu formiraju jednograne heterodimerne komplekse, iako su heteromultimerni kompleksi višeg reda (heteromultimeri) takođe uključeni, kao na primer, ali bez ograničavanja, heterotrimerne, heterotetramerne, i druge oligomerne strukture (vidi, npr., Sliku 1). U nekim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice predmetne objave uključuju najmanje jedan multimerizacioni domen. Kako je objavljeno u ovom tekstu, izraz "multimerizacioni domen" odnosi se na amino-kiselinu ili sekvencu amino-kiselina koje promovišu kovalentnu ili nekovalentnu interakciju između najmanje prvog polipeptida i najmanje drugog polipeptida. Polipeptidi objavljeni u ovom tekstu mogu biti kovalentno ili nekovalentno spojeni sa multimerizacionim domenom. Poželjno, multimerizacioni domen promoviše interakciju između jednogranog polipeptida (npr., fuzionog polipeptida koji uključuje receptorski polipeptid tipa I TGF-beta natporodice ili receptorski polipeptid tipa II TGF-beta natporodice) i komplementarnog člana interakcionog para za promociju formiranja heteromultimera (npr., formiranje heterodimera), i opciono ometa ili na drugi način defavorizuje formiranje homomultimera (npr., formiranje homodimera), povećavajući time prinos željenog heteromultimera (vidi, npr., Sliku 2).
[0238] Mnogi postupci poznati u struci mogu se koristiti za stvaranje jednogranih receptorskih kompleksa TGF-beta natporodice objave. Na primer, disulfidne veze koje se ne sreću u prirodi mogu se konstruisati zamenom, na prvom polipeptidu (npr., fuzioni polipeptid koji uključuje receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice), prirodne aminokiseline reziduom koja sadrži slobodni tiol, kao što je cistein, tako da slobodni tiol interaguje sa drugom reziduom koja sadrži slobodni tiol na drugom polipeptidu (npr., komplementarni član interakcionog para) tako da se formira disulfidna veza između prvog i drugog polipetida. Dodatni primeri interakcija za promovisanje formiranja heteromultimera uključuju, ali se ne ograničavaju na jonske interakcije kao što je opisano u Kjaergaard et al., WO2007147901; efekte elektrostatičkog upravljanja kao što je opisano u Kannan et al., U.S.8,592,562; interakcije "namotanog kalema" kao što je opisano u Christensen et al., U.S.20120302737; leucinski patent-zatvarači kao što je opisano u Pack & Plueckthun,(1992) Biochemistry 31: 1579-1584; i motive zavojnica-petlja-zavojnica kao što je opisano u Pack et al., (1993) Bio/Technology 11: 1271-1277. Povezivanje različitih segmenata može se postići npr., kovalentnim povezivanjem kao što su hemijsko unakrsno povezivanje, peptidni linkeri, disulfidni mostovi, itd., ili afinitetnim interakcijama kao što su avidin-biotin ili tehnologija leucinskog patent-zatvarača.
[0239] U određenim aspektima, multimerizacioni domen može sadržati jednu komponentu interakcionog para. U nekim primerima izvođenja, polipeptidi objavljeni u ovom tekstu mogu formirati proteinske komplekse koji uključuju prvi polipeptid kovalentno ili nekovalentno udružen sa drugim polipeptidom, pri čemu prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i aminokiselinsku sekvencu prvog člana interakcionog para; i drugi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu drugog člana interakcionog para. Interakcioni par mogu činiti bilo koje dve polipeptidne sekvence koje interaguju da formiraju kompleks, posebno heterodimerni kompleks iako operativni primeri izvođenja mogu koristiti i interakcioni par koji može formirati homodimerni kompleks. Jedan član interakcionog para može biti fuzionisan sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice kako je opisano u ovom tekstu, uključujući na primer, polipeptidnu sekvencu koja uključuje, suštinski se sastoji ili se sastoji od aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa sekvencom bilo koje od SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 10, 11, 15, 19, 23, 27, 31, 35, 39, 43, 47, 51, 68, 72, 76, 80, 84, 88, 92, 302, 306, 310, i 313. Interakcioni par može da se odabere tako da obezbedi poboljšanu osobinu/aktivnost kao što je produženi poluživot u serumu, ili da deluje kao adaptor na koji se prikači druga komponenta da bi se obezbedila poboljšana osobina/aktivnost. Na primer, polietilen-glikolna komponenta može da se prikači za jednu ili obe komponente interakcionog da bi se obezbedila poboljšana osobina/aktivnost kao što je poboljšani poluživot u serumu.
[0240] Prvi i drugi član interakcionog para mogu biti asimetrični par, što znači da se članovi para preferencijalno udružuju jedan sa drugim pre nego da se samoudružuju. Prema tome, prvi i drugi član asimetričnog interakcionog para udružuju se da formiraju heterodimerni kompleks interakcionog para (vidi, npr., Sliku 2). Alternativno, interakcioni par može biti nevođen, što znači da članovi para mogu da se udružuju jedan sa drugim ili samoudružuju bez suštinske preferencije i tako mogu imati iste ili različite aminokiselinske sekvence. Prema tome, prvi i drugi član nevođenog interakcionog para mogu se udruživati da formiraju homodimerni kompleks interakcionog para ili heterodimerni kompleks akcionog para. Opciono, prvi član interakcionog para (npr., asimetričnog para ili nevođenog interakcionog para) udružuje se kovalentno sa drugim članom interakcionog para. Opciono, prvi član interakcionog para (npr., asimetričnog para ili nevođenog interakcionog para) udružuje se nekovalentno sa drugim članom interakcionog para.
[0241] Kao specifični primere, predmetna objava obezbeđuje fuzione proteinske komplekse koji uključuju najmanje jedan receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice fuzionisan sa polipeptidom koji uključuje konstantni domen imunoglobulina, kao što je CH1, CH2, ili CH3 domen imunoglobulina ili Fc domen. Fc domeni izvedeni iz humanog IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4 obezbeđeni su u ovom tekstu. Poznato je da druge mutacije smanjuju CDC ili ADCC aktivnost, i zajedno, sve ove varijante uključene su u objavu i mogu se koristiti kao korisne komponente jednogranog heteromultimernog kompleksa objave. Opciono, IgG1 Fc domen SEQ ID NO: 208 ima jednu ili više mutacija na reziduama kao što su Asp-265, Lys-322, i Asn-434 (numerisanje prema odgovarajućem IgG1 pune dužine). U određenim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr., Asp-265 mutacija) ima smanjenu sposobnost vezivanja za Fcγ receptor u odnosu na Fc domen divljeg tipa. U drugim slučajevima, mutantni Fc domen koji ima jednu ili više ovih mutacija (npr., Asn-434 mutacija) ima povećanu sposobnost vezivanja za Fc-receptor vezan za MHC klase I (FcRN) u odnosu na Fc domen divljeg tipa.
[0242] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja može da se koristi za Fc deo humanog IgG1 (G1Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 208). Region šarke označen je tako što je podvučen tačkastom linijom, a pozicije sa prirodnim varijantama označene su podvlačenjem punom linijom. Delom, objava obezbeđuje polipeptide koji uključuju aminokiselinske sekvence sa 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 208.
1
Prirodne varijante u G1Fc uključivale bi E134D i M136L, prema sistemu numerisanja upotrebljenom u SEQ ID NO: 208 (vidi Uniprot P01857).
[0243] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja može da se upotrebi za Fc deo humanog IgG2 (G2Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 209). Region šarke označen je tako što je podvučen tačkastom linijom, a dvostruka linija ukazuje na pozicije na kojima postoje konflikti u sekvenci (prema UniProt P01859). Delom, objava obezbeđuje polipeptide koji uključuju aminokiselinske sekvence sa 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 209.
[0244] Dva primera aminokiselinskih sekvenci koje mogu da se koriste kao Fc deo humanog IgG3 (G3Fc) prikazana su dole. Region šarke u G3Fc može biti i do četiri puta duži nego u drugim Fc lancima i sadrži tri identična segmenta od 15 rezidua kojima prethodi sličan segment od 17 rezidua. Prva G3Fc sekvenca prikazana dole (SEQ ID NO: 210) sadrži kratki region šarke koji se sastoji od jednog segmenta od 15 rezidua, dok druga G3Fc sekvenca (SEQ ID NO: 211) sadrži region šarke pune dužine. U oba slučaja, tačkastom linijom podvučen je region šarke, a punom linijom podvučene su pozicije sa prirodnim varijantama, prema UniProt P01859. Delom, objava obezbeđuje polipeptide koji uključuju aminokiselinske sekvence sa 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 210 i 211.
1 1
[0245] Varijante koje se prirodno sreću u G3Fc (na primer, vidi Uniprot P01860) uključuju E68Q, P76L, E79Q, Y81F, D97N, N100D, T124A, S169N, S169del, F221Y, kada se konvertuju u numerički sistem upotrebljen u SEQ ID NO: 210, i predmetna objava obezbeđuje fuzione proteine koji uključuju G3Fc domene koji sadrže jednu ili više ovih varijacija. Pored toga, humani imunoglobulinski IgG3 gen (human immunoglobulin IgG3 gene, IGHG3) pokazuje strukturni polimorfizam koji se karakteriše različitim dužinama šarke [vidi Uniprot P01859]. Specifično, varijanti WIS nedostaje veći deo V regiona i ceo CH1 region. Ona ima dodatnu međulančanu disulfidnu vezu na poziciji 7, pored 11 normalno prisutnih u regionu šarke. Varijanti ZUC nedostaje veći deo V regiona, ceo CH1 region, i deo šarke. Varijanta OMM može predstavljati alelnu formu ili drugu potklasu gama lanca. Predmetna objava obezbeđuje dodatne fuzione proteine koji uključuju G3Fc domene koji sadrže jednu ili više ovih varijanti.
[0246] Primer nativne aminokiselinske sekvence koja se može upotrebiti za Fc deo humanog IgG4 (G4Fc) prikazan je u nastavku (SEQ ID NO: 212). Tačkastom linijom podvučen je region šarke. Delom, objava obezbeđuje polipeptide koji uključuju aminokiselinske sekvence sa 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa SEQ ID NO: 212.
[0247] Različite inženjerisane mutacije u Fc domenu predstavljene su u ovom tekstu u odnosu na G1Fc sekvencu (SEQ ID NO: 208), i analogne mutacije u G2Fc, G3Fc, i G4Fc mogu se izvesti iz poravnavanja sa G1Fc na Slici 5. Zbog nejednakih dužina šarki, analogne Fc pozicije bazirane na poravnavanju izotipova (Slika 5) poseduju različite aminokiselinske brojeve u SEQ ID NO: 208, 209, 210, i 212. Isto tako, procenjuje se da će data aminokiselinska pozicija u imunoglobulinskoj sekvenci koja se sastoji od zgloba, CH2, i CH3 regiona (npr., SEQ ID NO: 208, 209, 210, 211, ili 212) biti obeležena različitim brojem nego
1 2
ista pozicija kada numerisanje obuhvata čitav konstantni domen teškog lanca IgG1 (koji se sastoji od CH1, šarke, CH2, i CH3 regiona) kao u Uniprot bazi podataka. Na primer, korespondiranje između odabranih CH3 pozicija u sekvenci humanog G1Fc (SEQ ID NO: 208), konstantnom domenu teškog lanca humanog IgG1 (Uniprot P01857), i teškom lancu humanog IgG1 je sledeća.
[0248] Problem koji nastaje u proizvodnji velikih količina asimetričnih proteina na bazi imunoglobulina u jednoj ćelijskoj liniji poznat je kao "problem udruživanja lanaca". Zapažen kao izrazit u proizvodnji bispecifičnih antitela, problem udruživanja lanaca odnosi se na pitanje efikasne proizvodnje željenog multilančanog proteina od više kombinacija koje inherentno nastaju kada se različiti teški lanci i/ili laki lanci proizvode u jednoj ćelijskoj liniji [vidi, na primer, Klein et al (2012) mAbs 4:653-663]. Ovaj problem je najistaknutiji kada se dva različita teška lanca i dva različita laka lanca proizvode u istoj ćeliji, u kom slučaju postoji ukupno 16 mogućih kombinacija lanaca (iako su neki od njih identični) a tipično se
1
želi samo jedna. Bilo kako bilo, isti princip objašnjava smanjeni prinos željenog multilančanog fuzionog proteina koji inkorporiše samo dva različita (asimetrična) teška lanca.
[0249] U struci su poznati različiti postupci kojima se povećava željeno sparivanje Fcsadržavajućih fuzionih polipeptidnih lanaca u jednoj ćelijskoj liniji da bi se proizveo željeni asimetrični fuzioni protein, sa prihvatljivim prinosima [vidi, na primer, Klein et al (2012) mAbs 4:653-663]. Postupci za dobijanje željenog sparivanja Fc-sadržavajućih lanaca uključuju, ali se ne ograničavaju na, sparivanje na bazi naelektrisanja (elektrostatičko upravljanje), steričko sparivanje "čvorići u rupicama" (knob-into-holes), SEEDbody sparivanje, i sparivanje na bazi leucinskog patent-zatvarača. Vidi, na primer, Ridgway et al (1996) Protein Eng 9:617-621; Merchant et al (1998) Nat Biotech 16:677-681; Davis et al (2010) Protein Eng Des Sel 23:195-202; Gunasekaran et al (2010); 285:19637-19646; Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339; US5932448; WO 1993/011162; WO 2009/089004, i WO 2011/034605.
[0250] Na primer, jedan način na koji se interakcije između specifičnih polipeptida mogu promovisati jeste inženjerisanje komplementarnih regiona "čvorići u rupicama", kao što je opisano u Arathoon et al., U.S.7,183,076 i Carter et al., U.S.5,731,168. "Izbočine" se konstruišu zamenom malih aminokiselinskih bočnih lanaca sa interfejsa prvog polipeptida (npr., prvi interakcioni par) većim bočnim lancima (npr., tirozinom ili triptofanom). Komplementarna "udubljenja" identične ili slične veličine kao izbočina opciono se naprave na interfejsu drugog polipeptida (npr., drugi interakcioni par) zamenom velikih aminokiselinskih bočnih lanaca manjim (npr., alaninom ili treoninom). Kada postoje izbočine i udubljenja na pogodnim pozicijama i pogodne veličine, na interfejsu prvog ili drugog polipeptida, potrebno je samo inženjerisati odgovarajuće udubljenje, odnosno izbočinu, na susednom interfejsu.
[0251] Na neutralnom pH (7.0), asparaginska kiselina i glutaminska kiselina su negativno naelektrisane, a lizin, arginin, i histidin su pozitivno naelektrisani. Ove naelektrisane rezidue mogu da se koriste za promovisanje formiranja heterodimera, a u isto vreme ometaju formiranje homodimera. Interakcije privlačenja postoje između suprotnih naelektrisanja, a do interakcija odbijanja dolazi između sličnih naelektrisanja. Delom, proteinski kompleksi objavljeni u ovom tekstu koriste interakcije privlačenja za promociju formiranja heteromultimera (npr., formiranje heterodimera), i opciono interakcije odbijanja za ometanje formiranja homodimera (npr., formiranje homodimera), izvođenjem usmerene mutageneze naelektrisanih rezidua interfejsa.
1 4
[0252] Na primer, interfejs CH3 domena IgG1sadrži četiri jedinstvena naelektrisana para rezidua, uključena u "domen-domen" interakcije: Asp356-Lys439', Glu357-Lys370', Lys392-Asp399', i Asp399-Lys409' [rezidue numerisana u drugom lancu označena je pomoću (')]. Treba napomenuti da šema numerisanja koja je ovde upotrebljena za označavanje rezidua u CH3 domenu IgG1 odgovara EU šemi numerisanja po Kabatu. Zbog dvostruke simetrije prisutne u interakcijama CH3-CH3 domena, svaka pojedinačna interakcija biće predstavljena u strukturi dva puta (npr., Asp-399-Lys409' i Lys409-Asp399'). U sekvence divljeg tipa, K409-D399' favorizuje formiranje i heterodimera i homodimera. Jedna mutacija koja menja polarnost nelektrisanja (npr., K409E; pozitivno u negativno naelektrisanje) u prvom lancu dovodi do interakcija nepovoljnih za formiranje homodimera prvog lanca. Nepovoljne interakcije nastaju zbog interakcija odbijanja do kojih dolazi između istih naelektrisanja (negativno-negativno; K409E-D399' D399-K409E'). Slična mutacija koja menja polarnost nelektrisanja (D399K'; negativno u pozitivno) u drugom lancu dovodi do interakcija (K409'-D399K' i D399K-K409') nepovoljnih za formiranje homodimera drugog lanca. Ali, u isto vreme, ove dve mutacije (K409E i D399K') dovode do povoljnih interakcija (K409E-D399K' i D399-K409') za formiranje heterodimera.
[0253] Efekat elektrostatičkog upravljanja na formiranje heterodimera i ometanje formiranja homodimer može se dodatno pojačati mutacijom dodatnih naelektrisanih rezidua koje mogu, ali ne moraju biti sparene sa suprotno naelektrisanim reziduama u drugom lancu uključujući, na primer, Arg355 i Lys360. Tabela u nastavku navodi moguće mutacije koje menjaju naelektrisanje, koje se mogu koristiti, same ili u kombinaciji, za pojačavanje formiranja heteromultimera polipeptidnih kompleksa objavljenih u ovom tekstu.
1
[0254] U nekim primerima izvođenja, jedna ili više rezidua koje čine CH3-CH3 interfejs u fuzionom proteinu ove prijave zamene se naelektrisanim amino-kiselinama tako da interakcija postane elektrostatički nepovoljna. Na primer, pozitivno naelektrisana amino-kiselina na interfejsu (npr., lizin, arginin, ili histidin) zameni se negativno naelektrisanom aminokiselinom (npr., asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina). Alternativno, ili u kombinaciji sa prethodnom supstitucijom, negativno naelektrisana amino-kiselina na interfejsu zameni se pozitivno naelektrisanom amino-kiselinom. U određenim primerima izvođenja, aminokiselina se zameni amino-kiselinom koja se ne sreće u prirodi, koja ima željenu karakteristiku naelektrisanja. Treba napomenuti da će mutiranje negativno naelektrisanih rezidua (Asp ili Glu) u His dovesti do povećanja zapremine bočnog lanca, što može izazvati steričke probleme. Pored toga, His proton-donorska i akceptorska forma zavise od lokalnog okruženja. Ova pitanja treba uzeti u obzir u vezi sa strategijom dizajniranja. Pošto su rezidue interfejsa visoko konzervirane kod IgG potklasa čoveka i miša, efekti elektrostatičkog upravljanja objavljeni u ovom tekstu mogu se primeniti na čovečji i mišji IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4. Ova strategija može se proširiti i na modifikovanje nenaelektrisanih rezidua u naelektrisane rezidue na interfejsu CH3 domena.
[0255] Delom, objava obezbeđuje željeno sparivanje asimetričnih Fc-sadržavajućih polipeptidnih lanaca korišćenjem Fc sekvenci inženjerisanih tako da budu komplementarne na osnovu sparivanja naelektrisanja (elektrostatičko upravljanje). Jedna iz para Fc sekvenci sa elektrostatičkom komplementarnošću može se arbitrarno fuzionisati sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta, sa ili bez opcionog linkera, da bi nastao fuzioni receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Ovaj pojedinačni lanac može da se koeksprimira u ćeliji po izboru zajedno sa Fc sekvencom koja je komplementarna sa prvim Fc da bi se favorizovalo stvaranje željenog multilančanog konstrukta (npr., jednograni heteromerni receptorski kompleks TGF-beta natporodice). U ovom primeru zasnovanom na elektrostatičkom upravljanju, SEQ ID NO: 200 [humani G1Fc(E134K/D177K)] i SEQ ID NO: 201 [humani G1Fc(K170D/K187D)] primeri su
1
komplementarnih Fc sekvenci u kojima su inženjerisane aminokiselinske supstitucije dvostruko podvučene, a receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta može biti fuzionisan sa SEQ ID NO: 200 ili SEQ ID NO: 201, ali ne sa obe. S obzirom na visok stepen identičnosti aminokiselinske sekvence između nativnog hG1Fc, nativnog hG2Fc, nativnog hG3Fc, i nativnog hG4Fc, može se očekivati da će aminokiselinske supstitucije na odgovarajućim pozicijama u hG2Fc, hG3Fc, ili hG4Fc (vidi Sliku 5) stvoriti komplementarne Fc parove koji mogu da se koriste umesto komplementarnog hG1Fc para dole (SEQ ID NO: 200 i 201).
[0256] Delom, objava obezbeđuje željeno sparivanje asimetričnih Fc-sadržavajućih polipeptidnih lanaca korišćenjem Fc sekvenci inženjerisanih za steričnu komplementarnost. Delom, objava obezbeđuje sparivanje tipa "čvorići u rupicama" kao primer sterične komplementarnosti. Jedna iz para Fc sekvenci sa steričkom komplementarnošću može arbitrarno da se fuzioniše sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta, sa ili bez opcionog linkera, da bi se dobio receptorski fuzioni polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Ovaj pojedinačni lanac može da se koeksprimira u ćeliji po izboru, zajedno sa Fc sekvencom komplementarnom sa prvim Fc da bi se favorizovalo stvaranje željenog multilančanog konstrukta (npr., jednogranog heteromernog receptorskog kompleksa TGF-beta natporodice). U ovom primeru baziranom na sparivanju tipa "čvorići u rupicama", SEQ ID NO: 202 [humani G1Fc(T144Y)] i SEQ ID NO: 203 [humani G1Fc(Y185T)] primeri su komplementarnih Fc sekvenci u kojima su inženjerisane aminokiselinske supstitucije dvostruko podvučene, a receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta može biti fuzionisan sa SEQ ID NO: 202 ili SEQ ID NO: 203, ali ne sa obe. S obzirom na visok stepen identičnosti aminokiselinske sekvence između nativnog hG1Fc, nativnog hG2Fc, nativnog hG3Fc, i nativnog hG4Fc, može se očekivati da
1
će aminokiselinske supstitucije na odgovarajućim pozicijama u hG2Fc, hG3Fc, ili hG4Fc (vidi Sliku 5) stvoriti komplementarne Fc parove koji mogu da se koriste umesto komplementarnog hG1Fc para dole (SEQ ID NO: 202 i 203).
[0257] Primer Fc komplementarnosti baziran na sparivanju tipa "čvorići u rupicama" u kombinaciji sa inženjerisanom disulfidnom vezom objavljen je u SEQ ID NO: 204 [hG1Fc(S132C/T144W)] i SEQ ID NO: 205 [hG1Fc(Y127C/T144S/L146A/Y185V)]. Inženjerisane aminokiselinske supstitucije u ovim sekvencama podvučene su dvostruko, i polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta može da se fuzioniše sa SEQ ID NO: 204 ili SEQ ID NO: 205, ali ne sa oba. S obzirom na visok stepen identičnosti aminokiselinske sekvence između nativnog hG1Fc, nativnog hG2Fc, nativnog hG3Fc, i nativnog hG4Fc, može se očekivati da će aminokiselinske supstitucije na odgovarajućim pozicijama u hG2Fc, hG3Fc, ili hG4Fc (vidi Sliku 5) stvoriti komplementarne Fc parove koji mogu da se koriste umesto komplementarnog hG1Fc para dole (SEQ ID NO: 204 i 205).
1
[0258] Delom, objava obezbeđuje željeno sparivanje asimetričnih Fc-sadržavajućih polipeptidnih lanaca korišćenjem Fc sekvenci inženjerisanih da stvore interdigitirajuće βlančane segmente CH3 domena humanog IgG i IgA. Takvi postupci uključuju upotrebu inženjerisanog domena sa razmenom lanaca (strand-exchange engineered domain, SEED) CH3 heterodimera dopuštajući formiranje SEEDbody fuzionih proteina [vidi, na primer, Davis et al (2010) Protein Eng Design Sel 23:195-202]. Jedna iz para Fc sekvenci sa komplementarnošću sa SEEDbody može se arbitrarno fuzionisati sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta, sa ili bez opcionog linkera, da nastane receptorski fuzioni polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Pojedinačni lanac može da se koeksprimira u ćeliji po izboru zajedno sa Fc sekvencom komplementarnom sa prvim Fc da bi se favorizovalo stvaranje željenog multilančanog konstrukta. U ovom primeru baziranom na SEEDbody (Sb) sparivanju, SEQ ID NO: 206 [hG1Fc(SbAG)] i SEQ ID NO: 207 [hG1Fc(SbGA)] primeri su komplementarnih IgG Fc sekvenci u kojima su inženjerisane aminokiselinske supstitucije iz IgA Fc dvostruko podvučene, i receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta može da se fuzioniše sa SEQ ID NO: 206 ili SEQ ID NO: 207, ali ne sa obe. S obzirom na visok stepen identičnosti aminokiselinske sekvence između nativnog hG1Fc, nativnog hG2Fc, nativnog hG3Fc, i nativnog hG4Fc, može se očekivati da će aminokiselinske supstitucije na odgovarajućim pozicijama u hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc, ili hG4Fc (vidi Sliku 5) stvoriti Fc monomer koji može da se koristi u komplementarnom IgG-IgA paru dole (SEQ ID NO: 206 i 207).
[0259] Delom, objava obezbeđuje željeno sparivanje asimetričnih Fc-sadržavajućih polipeptidnih lanaca sa domenom leucinkog patent-zatvarača, koji može da se odseca, prikačenim na C-terminus Fc CH3 domena. Prikačenost leucinskog patent-zatvarača dovoljna je da dovede do preferencijalnog sklapanja heterodimernih teških lanaca antitela. Vidi, npr.,
1
Wranik et al (2012) J Biol Chem 287:43331-43339. Kako je objavljeno u ovom tekstu, jedna iz para Fc sekvenci prikačenih za lanac koji formira leucinki patent-zatvarač može arbitrarno biti fuzionisana sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta, sa ili bez opcionog linkera, da nastane receptorski fuzioni polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Ovaj pojedinačni lanac može da se koeksprimira u ćeliji po izboru zajedno sa Fc sekvencom prikačenom za komplementarni lanac koji formira leucinki patentzatvarač da bi se favorizovalo stvaranje željenog multilančanog konstrukta. Proteolitička digestija konstrukta bakterijskom endoproteinazom Lys-C posle prečišćavanja može osloboditi domen leucinskog patent-zatvarača, rezultujući Fc konstruktom čija je struktura identična strukturi nativnog Fc. U ovom primeru baziranom na sparivanju leucinskog patentnzatvarača, SEQ ID NO: 213 [hG1Fc-Ap1 (kiseli)] i SEQ ID NO: 214 [hG1Fc-Bp1 (bazni)] primeri su komplementarnih IgG Fc sekvenci u kojima su inženjerisane komplementarne sekvence leucinskog patent-zatvarača podvučene, i receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice konstrukta može biti fuzionisan sa SEQ ID NO: 213 ili SEQ ID NO: 214, ali ne sa obe. S obzirom na visok stepen identičnosti aminokiselinske sekvence između nativnog hG1Fc, nativnog hG2Fc, nativnog hG3Fc, i nativnog hG4Fc, može se očekivati da će sekvence koje formiraju leucinski patent-zatvarač prikačene, sa ili bez opcinog linkera, za hG1Fc, hG2Fc, hG3Fc, ili hG4Fc (vidi Sliku 5) stvoriti Fc monomer koji može da se koristi u komplementarnom paru koji formira leucinski patent-zatvarač, dole (SEQ ID NO: 213 i 214).
[0260] Podrazumeva se da različiti elementi fuzionih proteina (npr., imunoglobulinski Fc fuzioni proteini) mogu da se aranžiraju na bilo koji način koji je konzistentan sa željenom funkcionalnošću. Na primer, receptorski polipeptidni domen tipa I ili tipa II TGF-beta
11
natporodice može da se postavi C-terminalno u odnosu na heterologni domen, ili alternativno, heterologni domen može da se postavi C-terminalno u odnosu na receptorski polipeptidni domen receptora tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. Receptorski polipeptidni domen tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i heterologni domen ne moraju biti jedan uz drugoga u fuzionom proteinu, i dodatni domeni ili aminokiselinske sekvence mogu biti uključeni C- ili N-terminalno u odnosu na neki od domena ili između domena.
[0261] Na primer, receptorski fuzioni polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice može uključivati aminokiselinsku sekvencu kao što je navedeno u formuli A-B-C. B deo odgovara domenu receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice. A i C delovi mogu biti, nezavisno, nula, jedna ili više amino-kiselina, i A i C deo, kada su prisutni, heterologni su sa B. A i/ili C delovi mogu biti prikačeni za B deo preko linkerske sekvence. Linker može biti bogat glicinom (npr., 2-10, 2-5, 2-4, 2-3 glicinskih rezidua) ili glicinskim i prolinskim reziduama i može, na primer, sadržati jednu sekvencu treonina/serina i glicina ponavljajuće sekvence treonina/serina i/ili glicina, npr., GGG (SEQ ID NO: 58), GGGG (SEQ ID NO: 59), TG4(SEQ ID NO: 60), SG4(SEQ ID NO: 61), TG3(SEQ ID NO: 62), ili SG3(SEQ ID NO: 63) singlete, ili ponovke. U određenim primerima izvođenja, receptorski fuzioni polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice uključuje amino-kiselinsku sekvencu koja je navedena u formuli A-B-C, pri čemu je A liderska (signalna) sekvenca, B se sastoji od domena receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, i C je polipeptidni deo koji pojačava jedno ili više od in vivo stabilnosti, in vivo poluživota, preuzimanje/primenu, tkivnu lokalizaciju ili distribuciju, formiranje proteinskih kompleksa, i/ili prečišćavanje. U određenim primerima izvođenja, fuzioni receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je navedena u formuli A-B-C, pri čemu je A TPA liderska sekvenca, B se sastoji od domena receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, i C je imunoglobulinski Fc domen. Poželjni fuzioni polipeptidi uključuju aminokiselinsku sekvencu navedenu u bilo kojoj od SEQ ID NO: 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, i 401-424.
[0262] U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice predmetne objave uključuju i jedan ili više heterolognih delova (domena) koji im daju željenu osobinu. Na primer, neki fuzioni domeni su posebno korisni za izolaciju fuzionih proteina afinitetnom hromatografijom. Dobro poznati primeri takvih fuzionih domena uključuju, ali se ne ograničavaju na polihistidin, Glu-Glu, glutation S-transferazu (glutathione S-transferase, GST), tioredoksin, protein A, protein G, konstantni region imunoglobulinskog teškog lanca (Fc), maltoza-vezujući protein (maltose binding protein, MBP), ili humani serumski albumin. Za potrebe afinitetnog prečišćavanja, mogu se koristiti relevantni matriksi za afinitetnu hromatografiju, kao što su glutation-, amilaza-, i nikl- ili kobalt- konjugovane smole. Mnogi takvi matriksi raspoloživi su u vidu "kita", na primer Pharmacia GST sistem za prečišćavanje i QIAexpress™ sistem (Qiagen) korisni sa (HIS6) fuzionim partnerima. Kao još jedan primer, fuzioni domen može da se bira tako da olakša detekciju polipeptida koji su klopke za ligand. Primeri takvih detekcionih domena uključuju različite fluorescentne proteine (npr., GFP) kao i "epitopske obeleživače" koje su obično kratke peptidne sekvence za koje postoje dostupna specifična antitela. Dobro poznati epitopski obeleživači za koje na raspolaganju već postoje specifična monoklonska antitela uključuju obeleživače FLAG, hemaglutinin virusa influence (influenza virus haemagglutinin, HA), i c-myc. U nekim slučajevima, fuzioni domeni imaju mesto za sečenje proteazom, na primer faktorom Xa ili trombinom, koja omogućavaju da relevantna proteaza delimično digestira fuzione proteine i tako iz njih oslobodi rekombinantne proteine. Oslobođeni proteini mogu zatim da se izoluju iz fuzionog domena hromatografskom separacijom koja će uslediti.
[0263] U određenim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice predmetne objave sadrže jednu ili više modifikacija koje mogu da stabilišu polipeptide. Na primer, takve modifikacije produžavaju in vitro poluživot polipeptida, produžavaju poluživot polipeptida u cirkulaciji, i/ili smanjuju proteolitičku degradaciju polipeptida. Takve stabilišuće modifikacije uključuju, ali se ne ograničavaju na fuzione polipeptide (uključujući, na primer, fuzione polipeptide koji uključuju domen receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice i stabilišući domen), modifikacije glikozilacionog mesta (uključujući, na primer, dodavanje glikozilacionog mesta polipeptidu objave), i modifikacije ugljenohidratne komponente (uključujući, na primer, uklanjanje ugljenohidratnih komponenti sa polipeptida objave). Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "stabilišući domen" ne odnosi se samo na fuzioni domen (npr., imunoglobulinski Fc domen) kao u slučaju fuzionih polipeptida, nego uključuje i neproteinske modifikacije kao što je ugljenohidratna komponenta, ili neproteinsku komponentu, kao što je polietilen glikol.
[0264] U poželjnim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice koji će se koristiti u skladu sa postupcima opisanim u ovom tekstu su izolovani polipeptidni kompleksi. Kako se koristi u ovom tekstu, izolovani protein (ili proteinski kompleks) ili polipeptid (ili polipeptidni kompleks) je onaj koji je odvojen od komponenti svog prirodnog okruženja. U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks objave prečišćen je do više od 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% čistoće, kako je određeno, na primer, elektroforezom (npr., SDS-PAGE, izoelektrično fokusiranje (isoelectric focusing, IEF), kapilarna elektroforeza) ili hromatografijom (npr., jonoizmenjivačka ili reverzno-fazna HPLC). Postupci za procenu čistoće antitela dobro su poznati u struci [Vidi, npr., Flatman et al., (2007) J. Chromatogr. B 848:79-87].
[0265] U određenim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGF-beta natporodice, kao i njihovi jednograni heteromultimerni kompleksi objave mogu se proizvesti različitim tehnikama poznatim u struci. Na primer, polipeptidi objave mogu se sintetisati korišćenjem standardnih tehnika hemije proteina kao što su one opisane u Bodansky, M. Principles of Peptide Synthesis, Springer Verlag, Berlin (1993) i Grant G. A. (ed.), Synthetic Peptides: A User's Guide, W. H. Freeman and Company, New York (1992). Pored toga, komercijalno su dostupni automatizovani sintetizeri peptida (vidi, npr., Advanced ChemTech Model 396; Milligen/Biosearch 9600). Alternativno, polipeptidi i kompleksi objave, uključujući njihove fragmente ili varijante, mogu se proizvesti rekombinantno korišćenjem različitih ekspresionih sistema [npr., E. coli, ćelije ovarijuma kineskog hrčka (Chinese Hamster Ovary, CHO), COS ćelije, bakulovirus] kao što je dobro poznato u struci. U drugim primerima izvođenja, modifikovani ili nemodifikovani polipeptidi objave mogu se proizvesti digestijom rekombinantno proizvedenih receptorskih polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice pune dužine korišćenjem, na primer, proteaze, npr., tripsina, termolizina, himotripsina, pepsina, ili enzima za konvertovanje uparenih baznih amino-kiselina (paired basic amino acid converting enzyme, PACE). Kompjuterska analiza (uz korišćenje komercijalno dostupnog softvera, npr., MacVector, Omega, PCGene, Molecular Simulation, Inc.) može se koristiti za identifikovanje mesta proteolitičkog sečenja.
3. Nukleinske kiseline koje kodiraju receptorske polipeptide TGFβ natporodice
[0266] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava obezbeđuje izolovane i/ili rekombinantne nukleinske kiseline koje kodiraju receptore tipa I ili tipa II TGFβ natporodice (uključujući njihove fragmente, funkcionalne varijante, i fuzione proteine) objavljene u ovom tekstu. Na primer, SEQ ID NO: 12 kodira prirodni humani ActRIIA prekursorski polipeptid, dok SEQ ID NO: 13 kodira obrađeni vanćelijski domen ActRIIA. Predmetne nukleinske kiseline mogu biti jednolančane ili dvolančane. Takve nukleinske kiseline mogu biti molekuli DNK ili RNK. Ove nukleinske kiseline mogu se upotrebiti, na primer, u postupcima za
11
pravljenje jednogranih heteromultimernih kompleksa TGF-beta natporodice predmetne objave.
[0267] Kako se koristi u ovom tekstu, izolovana nukleinska kiselina(-e) odnosi se na molekul nukleinske kiseline koji je odvojen od komponenti svog prirodnog okruženja. Izolovana nukleinska kiselina uključuje molekul nukleinske kiseline sadržan u ćelijama koje obično sadrže molekul nukleinske kiseline, ali je molekul nukleinske kiseline prisutan van hromozoma ili na hromozomskoj lokaciji koja je drugačija njegove prirodne hromozomske lokacije.
[0268] U određenim primerima izvođenja, podrazumeva se da nukleinska kiselina koja kodira receptorske polipeptide tipa I ili tipa II TGFβ natporodice predmetne objave uključuje nukleinske kiseline koje su varijante bilo koje od SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, 312. Varijantne nukleotidne sekvence uključuju sekvence koje se razlikuju po jednoj ili više nukleotidnih supstitucija, adicija, ili delecija uključujući alelske varijante, i prema tome, uključivaće kodirajuće sekvence koje se razlikuju od nukleotidne sekvence označene u bilo kojoj od SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312.
[0269] U određenim primerima izvođenja, receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II TGFβ natporodice predmetne objave kodirani su sekvencama izolovane ili rekombinantne nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identične sa SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti razumeće da su sekvence nukleinske kiseline koje su najmanje 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ili 99% identične sa sekvencama komplementarnim sa SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312 takođe obuhvaćene obimom predmetne objave. U dodatnim primerima izvođenja, sekvence nukleinske kiseline objave mogu biti izolovane, rekombinantne, i/ili fuzionisane sa heterolognom nukleotidnom sekvencom ili u DNK biblioteci.
[0270] U drugim primerima izvođenja, nukleinske kiseline predmetne objave uključuju i nukleotidne sekvence koje se hibridizuju pod visoko stringentnim uslovima sa nukleotidnom sekvencom određenom u SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312, komplementnom sekvencom SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312, ili fragmentima istog. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti lako će razumeti da odgovarajući uslovi stringencije koji promovišu hibridizaciju DNK mogu da se variraju. Na primer, može se izvesti hibridizacija pri 6.0 x natrijum hlorida/natrijum citrata (SSC) na oko 45 °C, praćeno ispiranjem sa 2.0 x SSC na 50 °C. Na primer, koncentracija soli u koraku ispiranja može se birati od niske stringencije od oko 2.0 x SSC na 50 °C do visoke stringencije od oko 0.2 x SSC na 50 °C. Pored toga, temperatura u koraku ispiranja može se povisiti sa uslova niske stringencije na sobnoj temperaturi, oko 22 °C, do uslova visoke stringencije na oko 65 °C. Temperatura i slanost mogu biti varirane, ili se temperatura i koncentracija soli mogu držati konstantnim, a druge varijable se mogu menjati. U jednom primeru izvođenja, objava obezbeđuje nukleinske kiseline koje se hibridizuju pod uslovima niske stringencije od 6 x SSC na sobnoj temperaturi, praćeno ispiranjem sa 2 x SSC na sobnoj temperaturi.
[0271] Izolovane nukleinske kiseline koje se razlikuju od nukleinskih kiselina navedenih u SEQ ID NO: 7, 8, 12, 13, 16, 17, 20, 21, 24, 25, 28, 29, 32, 33, 36, 37, 40, 41, 44, 45, 48, 49, 52, 53, 69, 70, 73, 74, 77, 78, 81, 82, 85, 86, 89, 90, 93, 94, 102, 105, 108, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 303, 304, 307, 308, 311, i 312 usled degenerisanosti genetičkog koda takođe su obuhvaćene obimom objave. Na primer, više amino-kiselina određeno je više nego jednim tripletom. Kodoni koji specifikuju istu amino-kiselinu, ili sinonimi (na primer, CAU i CAC su sininimi za histidin) mogu rezultovati "tihim" mutacijama koje ne utiču na aminokiselinsku sekvencu proteina. Međutim, očekivano je da polimorfizam DNK sekvence, koji dovodi do promena u aminokiselinskim sekvencama datih proteina postoji među sisarskim ćelijama. Stručnjak u oblasti će razumeti da ove varijacije u jednom ili više nukleotida (do oko 3-5% nukleotida) nukleinskih kiselina koje kodiraju određeni protein mogu postojati između individua date vrste, zbog prirodnih alelskih varijacija. Svaka i sve takve nukleotidne varijacije i rezultujući polimorfizmi amino-kiselina obuhvaćeni su obimom ove objave.
11
[0272] U određenim primerima izvođenja, rekombinantne nukleinske kiseline predmetne objave mogu biti operabilno povezane sa jednom ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci u ekspresionom konstruktu. Regulatorne nukleotidne sekvence će uopšteno biti odgovarajuće za ćeliju-domaćina upotrebljenu za ekspresiju. Brojni tipovi odgovarajućih ekspresionih vektora i pogodnih regulatornih sekvenci poznati su u struci, za različite ćelije-domaćine. Tipično, pomenute jedna ili više regulatornih nukleotidnih sekvenci mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na, promotorske sekvence, liderske ili signalne sekvence, mesta vezivanja ribozoma, sekvence početka i završetka transkripcije, sekvence početka i završetka translacije, i enhenserske ili aktivatorske sekvence. Objava razmatra konstitutivne ili inducibilne promotore poznate u struci. Promotori mogu biti ili prirodni promotori, ili hibridni promotori u kojima se kombinuju elementi više od jednog promotora. Ekspresioni konstrukt može biti prisutan u ćeliji ili na epizomu kao što je plazmid, ili se ekspresioni konstrukt može insertovati u hromozom. U nekim primerima izvođenja, ekspresioni vektor sadrži selektabilni markerski gen da bi se omogućila selekcija transformisanih ćelija-domaćina. Selektabilni markerski geni dobro su poznati u struci i variraće u zavisnosti od upotrebljene ćelijedomaćina.
[0273] U određenim aspektima predmetne objave, predmetna nukleinska kiselina obezbeđena je u ekspresionom vektoru koji uključuje nukleotidnu sekvencu koja kodira receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice i operabilno je povezana sa najmanje jednom regulatornom sekvencom. Regulatorne sekvence su poznate u struci i biraju se tako da usmeravaju ekspresiju receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Prema tome, izraz regulatorna sekvenca uključuje promotore, enhensere, i druge ekspresione kontrolne elemente. Primeri regulatornih sekvenci opisani su u Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Na primer, svaka od velikog broja različitih ekspresionih kontrolnih sekvenci koje kontrolišu ekspresiju DNK sekvence kada su operabilno sa njom povezane, može se koristiti u ovim vektorima za ekspresiju DNK sekvenci koje kodiraju receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Takve korisne ekspresione kontrolne sekvence, uključuju, na primer, rane i kasne promotore SV40, tet promotor, adenovirusni ili citomegalovirusni neposredni rani promotor, RSV promotore, lac sistem, trp sistem, TAC ili TRC sistem, T7 promotor čija je ekspresija usmerena T7 RNK polimerazom, glavne operatorske i promotorske regione lambda faga, kontrolne regione fd oblažućeg proteina, promotor za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, promotore kisele fosfataze, npr., Pho5, promotore α-sparujućih faktora
11
kvasca, poliedronski promotor gena bakulovirusnog sistema i druge sekvence za koje je poznato da kontrolišu ekspresiju gena prokariotskih ili eukariotskih ćelija ili njihovih virusa, i njihove različite kombinacije. Treba razumeti da dizajn ekspresionog vektora može zavisiti od faktora kao što su izbor ćelije-domaćina koja će se transformisati i/ili tipa proteina čija se ekspresija želi. Pored toga, u obzir treba uzeti i broj kopija vektora, sposobnost kontrole tog broja kopija i ekspresiju nekog drugog proteina kodiranog vektorom, kao što su antibiotski markeri.
[0274] Rekombinantna nukleinska kiselina predmetne objave može se proizvesti povezivanjem kloniranog gena, ili njegovog dela, u vektor pogodan za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, eukariotskim ćelijama (kvasac, ptica, insekt ili sisar), ili oba. Ekspresioni prenosnici za proizvodnju rekombinantnog receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice uključuju plazmide i druge vektore. Na primer, pogodni vektori uključuju plazmide sledećih tipova: pBR322-izvedeni plazmidi, pEMBL-izvedeni plazmidi, pEX-izvedeni plazmidi, pBTac-izvedeni plazmidi i pUC-izvedeni plazmidi, za ekspresiju u prokariotskim ćelijama, kao što je E. coli.
[0275] Neki sisarski ekspresioni vektori sadrže prokariotske sekvence za olakšavanje propagacije vektora u bakteriji i jednu ili više eukariotskih transkripcionih jedinica koje se eksprimiraju u eukariotskim ćelijama. pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo i pHyg izvedeni vektori primeri su sisarskih ekspresionih vektora pogodnih za transfektovanje eukariotskih ćelija. Neki od ovih vektora modifikovani su sekvencama iz bakterijskih plazmida, kao što je pBR322, da bi se olakšala replikacija i selekcija prema otpornosti na lek, i u prokariotskim i u eukariotskim ćelijama. Alternativno, derivati virusa kao što su goveđi papiloma virus (bovine papilloma virus, BPV-1), ili Epstein-Barr virus (pHEBo, pREP-izvedeni i p205) mogu se upotrebiti za prolaznu ekspresiju proteina u eukariotskim ćelijama. Primeri drugih virusnih (uključujući retrovirusne) ekspresionih sistema mogu se naći u nastavku, u opisu sistema za dostavu genske terapije. Različiti postupci korišćeni u pripremanju plazmida i transformaciji organizama-domaćina dobro su poznati u struci. Za druge pogodne ekspresione sisteme za prokariotske i eukariotske ćelije, kao i za opšte rekombinantne procedure, vidi, npr., Molecular Cloning A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001). U nekim slučajevima, može biti poželjno da se rekombinantni polipeptidi eksprimiraju korišćenjem bakulovirusnog ekspresionog sistema. Primeri takvih bakulovirusnih ekspresionih sistema uključuju pVL-izvedene vektore (kao što
11
su pVL1392, pVL1393 i pVL941), pAcUW-izvedeni vektori (kao što su pAcUW1), i pBlueBac-izvedeni vektori (kao što je β-gal-sadržavajući pBlueBac III).
[0276] U poželjnom primeru izvođenja, vektor će biti dizajniran za proizvodnju predmetnog receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice u CHO ćelijama, na primer Pcmv-Script vektor (Stratagene, La Jolla, Calif.), pcDNA4 vektori (Invitrogen, Carlsbad, Calif.) i pCI-neo vektori (Promega, Madison, Wise.). Kao što će biti očigledno, predmetni genski konstrukti mogu da se koriste da izazovu ekspresiju predmetnog receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice u ćelijama propagiranim u kulturi, npr., za proizvodnju proteina, uključujući fuzione proteine ili varijantne proteine, za prečišćavanje.
[0277] Ova objava odnosi se i na ćelije-domaćine transfektovane rekombinantnim genom koji uključuje kodirajuću sekvencu za jedan ili više predmetnih receptorskih polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Ćelija-domaćin može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ćelija. Na primer, receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice objave može se eksprimirati u bakterijskim ćelijama kao što je E. coli, insekatskim ćelijama (npr., korišćenjem bakulovirusnog ekspresionog sistema), kvascu ili sisarskim ćelijama [npr. ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO)]. Druge pogodne ćelije-domaćini poznate su stručnjacima u oblasti.
[0278] Prema tome, predmetna objava se odnosi i na postupke proizvodnje predmetnih receptorskih polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Na primer, ćelija-domaćin transfektovana ekspresionim vektorom koji kodira receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice može se kultivisati pod odgovarajućim uslovima da omogući da dođe do ekspresije receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Polipeptid može da se sekretuje i izoluje iz mešavine ćelija i medijuma koji sadrži polipeptid. Alternativno, receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice može da se izoluje iz citoplazmatske ili membranske frakcije dobijene iz sakupljenih i liziranih ćelija. Ćelijska kultura uključuje ćelije-domaćine, medijum i druge sporedne proizvode. Pogodni medijumi za ćelijsku kulturu dobro su poznati u struci. Predmetni polipeptidi mogu da se izoluju iz medijuma za kulturu ćelija, ćelija-domaćina, ili oba, korišćenjem tehnika poznatih u struci za prečišćavanje proteina, uključujući jonoizmenjivačku hromatografiju, gel-filtracionu hromatografiju, ultrafiltraciju, elektroforezu, imunoafinitetno prečišćavanje antitelima specifičnim za određene epitope receptorskih polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice i afinitetno prečišćavanje sredstvom koje se vezuje za domen fuzionisan sa receptorskim polipeptidom tipa I ili tipa II TGFβ natporodice (npr., protein A-kolona može da se koristi za prečišćavanje
11
fuzionog polipeptida receptor tipa I-Fc ili receptor tipa II-Fc TGFβ natporodice ili proteinskog kompleksa). U nekim primerima izvođenja, receptorski polipeptid tipa I ili tipa II TGFβ natporodice je fuzioni polipeptidni ili proteinski kompleks koji sadrži domen koji olakšava njegovo prečišćavanje.
[0279] U nekim primerima izvođenja, prečišćavanje se postiže nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledečih, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, fenilsefarozna hromatografija, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonsko-razmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje se može završiti filtracijom virusa i promenom pufera. Fuzioni polipeptid ili proteinski kompleks receptor tipa I TGFβ natporodice-Fc ili receptor tipa II-Fc može se prečistiti do čistoće od >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99% kako je određeno hromatografijom zasnovanom na veličini čestica i >90%, >95%, >96%, >98%, ili >99% kako je određeno pomoću SDS PAGE. Ciljni nivo čistoće trebalo bi da bude onaj koji je dovoljan da se postignu željeni rezultati u sisarskim sistemima, posebno nehumanim primatima, glodarima (miševi), i ljudima.
[0280] U sledećem primeru izvođenja, fuzioni gen koji kodira lidersku sekvencu za prečišćavanje, kao što je sekvenca poli-(His)/enterokinazno mesto sečenja na N-terminusu željenog dela rekombinantnog receptorskog polipeptida tipa I ili tipa II TGFβ natporodice, može omogućiti prečišćavanje eksprimiranog fuzionog proteina afinitetnom hromatografijom uz korišćenje smole koja sadrži Ni<2+>. Liderska sekvenca za prečišćavanje može zatim da se ukloni tretmanom enterokinazom da se obezbedi prečišćeni polipeptidni ili proteinski kompleks receptora tipa I ili tipa II TGFβ natporodice. Vidi, npr., Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411:177; i Janknecht et al. (1991) PNAS USA 88:8972.
[0281] Tehnike pravljenja fuzionih gena dobro su poznate. Suštinski, spajanje različitih DNK fragmenata koji kodiraju različite polipeptidne sekvence obavlja se u skladu sa konvencionalnim tehnikama, u kojima se koriste tupi krajevi ili krajevi sa prepustom za povezivanje, digestija restrikcionim enzimom za obezbeđivanje odgovarajućih završetaka, odgovarajuće popunjavanje kohezivnih krajeva, tretman alkalnom fosfatazom da bi se izbeglo neželjeno spajanje, i enzimsko povezivanje. U sledećem primeru izvođenja, fuzioni gen može da se sintetiše konvencionalnim tehnikama uključujući automatizovane DNK sintetizere. Alternativno, PCR amplifikacija genskih fragmenata može se izvesti korišćenjem ukotvljujućih prajmera koji daju komplementarne prepuste između dva uzastopna genska fragmenta koji zatim mogu da se spare da bi dali himernu gensku sekvencu. Vidi, npr., Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992.
11
4. Testovi pretraživanja
[0282] U određenim aspektima, predmetna objava se odnosi na upotrebu jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora tipa I i tipa II TGFβ natporodice za identifikovanje jedinjenja (sredstava) koja su agonisti ili antagonisti receptora TGFβ natporodice. Jedinjenja identifikovana ovim pretraživanjem mogu se testirati da bi se procenila njihova sposobnost da modulišu tkiva kao što su kost, hrskavica, mišićno tkivo, masno tkivo, i/ili neuroni, da bi se procenila njihova sposobnost da modulišu rast tkiva in vivo ili in vitro. Ova jedinjenja mogu da se testiraju, na primer, u životinjskim modelima.
[0283] Postoje brojni pristupi za pretraživanje terapijskih sredstava za modulisanje rasta tkiva ciljanjem signalizacije ligandom TGFβ natporodice (npr., SMAD 2/3 i/ili SMAD 1/5/8 signalizacija). U određenim primerima izvođenja, visokopropusno pretraživanje jedinjenja može se obaviti da bi se identifikovala sredstva koja ometaju efekte posredovane receptorima TGFβ natporodice na odabranoj ćelijskoj liniji. U određenim primerima izvođenja, test se obavlja da bi se pronašla i identifikovala jedinjenja koja specifično inhibiraju ili smanjuju vezivanje jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice sa svojim vezujućim partnerom, kao što je ligand TGFβ natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty). Alternativno, test može da se upotrebi za identifikovanje jedinjenja koja pojačavaju vezivanje jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice sa njegovim vezujućim partnerom kao što je ligand TGFβ natporodice. U dodatnim primerima izvođenja, jedinjenja mogu da se identifikuju prema svojoj sposobnosti da interaguju sa jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice objave.
[0284] Različti testni formati biće dovoljni i, u svetlu predmetne objave, prosečno obučen stručnjak u oblasti će razumeti one koji nisu izričito opisani u ovom tekstu, bez obzira na to. Kako je opisano u ovom tekstu, testna jedinjenja (sredstva) pronalaska mogu se kreirati bilo kojim kombinovanim hemijskim postupkom. Alternativno, predmetna jedinjenja mogu biti prirodni molekuli koji se sintetišu in vivo ili in vitro. Jedinjenja (sredstva) koja će se testirati u pogledu svoje sposobnosti da deluju kao modulatori rasta tkiva mogu se proizvesti, na primer, bakterijama, kvascem, biljkama ili drugim organizmima (npr., prirodni proizvodi), mogu se proizvesti hemijski (npr., mali molekuli, uključujući peptidomimetici), ili se proizvode
12
rekombinantno. Testna jedinjenja koja razmatra predmetni pronalazak uključuju nepeptidilne organske molekule, peptide, polipeptide, peptidomimetike, šećere, hormone, i molekule nukleinskih kiselina. U određenim primerima izvođenja, testno sredstvo je mali organski molekul sa molekulskom težinom manjom od oko 2,000 daltona.
[0285] Testna jedinjenja objave mogu se obezbediti kao pojedinačni, zasebni entiteti, ili se mogu obezbediti u bibliotekama veće kompleksnosti, kao što su one napravljene kombinatornom hemijom. Ove biblioteke mogu uključivati, na primer, alkohole, alkil halide, amine, amide, estre, aldehide, etre i druge klase organskih jedinjenja. Testna jedinjenja se mogu prezentovati testnom sistemu ili u izolovanoj formi ili u mešavini jedinjenja, posebno u početnim koracima pretraživanja. Opciono, jedinjenja se mogu opciono derivatizovati sa drugim jedinjenjima i imati derivatizujuće grupe koje olakšavaju izolaciju jedinjenja. Neograničavajući primeri derivatizujućih grupa uključuju biotin, fluorescein, digoksigenin, zeleni fluorescentni protein, izotope, polihistidin, magnetne perlice, glutation S-transferazu (GST), fotoaktivirajuće unakrsne povezivače ili bilo koje njihove kombinacije.
[0286] U mnogim programima za pretraživanje lekova, kojima se testiraju biblioteke jedinjenja i prirodnih ekstrakata, poželjni su visokopropusni testovi da bi se maksimizirao broj pregledanih jedinjenja u datom periodu vremena. Testovi koji se izvode u sistemima bez ćelija, kao što su oni koji se mogu dobiti sa prečišćenim ili poluprečišćenim proteinima, često su poželjni za "primarnu" pretragu jer se mogu napraviti tako da dopuste brz razvoj i relativno laku detekciju promena u molekularnom cilju posredovanih testnim jedinjenjem. Štaviše, efekti toksičnosti za ćelije ili bioraspoloživosti testnog jedinjenja mogu se obično zanemariti u sistemu in vitro, test je umesto toga usmeren prvenstveno na efekat leka na molekularni cilj što se može manifestovati promenom afiniteta vezivanja između jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i njegovog vezujućeg partnera (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty).
[0287] Samo kao ilustracija, u primeru testa pretraživanja predmetne objave, jedinjenje od interesa dovodi se u kontakt sa izolovanim i prečišćenim jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice koji je uobičajeno sposoban da se vezuje sa ligandom TGF-beta natporodice, što je pogodno za potrebe testa. U mešavinu jedinjenja i jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice zatim se doda odgovarajući ligand TGF-beta natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty). Detekcija i kvantifikacija kompleksa jednogranih heteromultimera i liganada natporodice obezbeđuje način za određivanje efikasnosti jedinjenja u inhibiranju (ili potenciranju) formiranja kompleksa između jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i njegovog vezujućeg proteina. Efikasnost jedinjenja može da se proceni konstruisanjem dozno-zavisnih krivih iz podataka dobijenih korišćenjem različitih koncentracija testnog jedinjenja. Pored toga, kontrolni test može da se izvede i da bi se obezbedila bazalna vrednost za upoređivanje. Na primer, u kontrolnom testu, izolovani i prečišćeni ligand TGF-beta natporodice dodaje se kompoziciji koja sadrži jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, i formiranje kompleksa heteromultimer-ligand kvantifikuje se u odsustvu testnog jedinjenja. Podrazumeva se da, uopšteno, redosled kojim će se reaktanti dodavati u mešavinu može varirati i da se mogu umešati istovremeno. Pored toga, umesto prečišćenih proteina, za uspostavljanje pogodnog besćelijskog sistema mogu se koristiti ćelijski ekstrakti i lizati.
[0288] Vezivanje jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice sa drugim proteinom može se detektovati različitim tehnikama. Na primer, modulacija formiranja kompleksa može se kvantifikovati korišćenjem, na primer, detektabilno obeleženih proteina kao što su radioobeleženi (npr.,<32>P,<35>S,<14>C ili<3>H), fluorescentno obeleženi (npr., FITC), ili enzimski obeleženog jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice ili njegovog vezujućeg proteina imunotestom ili hromatografskom detekcijom.
[0289] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava razmatra upotrebu testova polarizacije fluorescencije i testova fluorescentno-rezonantnog energetskog transfera (fluorescence resonance energy transfer, FRET) za direktno ili indirektno mmerenje stepena interakcije između jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i njegovog vezujućeg proteina. Pored toga, drugi načini detekcije, kao što su oni koji se zasnivaju na optičkim talasovodima (vidi, npr., PCT publikaciju WO 96/26432 i U.S. pat. br. 5,677,196), rezonanciji površinskog plazmona (surface plasmon resonance, SPR), senzorima površinskog naelektrisanja, i senzorima površinskih sila, kompatibilni su sa mnogim primerima izvođenja objave.
[0290] Pored toga, predmetna objava razmatra upotrebu testa interakcione zamke, poznatog i kao "dvohibridni test", za identifikovanje sredstava koja ometaju ili potenciraju interakciju između jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i njegovog vezujućeg partnera. Vidi, npr., U.S. pat. br. 5,283,317; Zervos et al. (1993) Cell 72:223-232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268:12046-12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920-924; i Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8:1693-1696). U specifičnom primeru izvođenja, predmetna objava razmatra upotrebu reverznih dvohibridnih sistema za identifikovanje jedinjenja (npr., malih molekula ili peptida) koja disociraju interakcije između jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i njegovog vezujućeg partnera [vidi, npr., Vidal and Legrain, (1999) Nucleic Acids Res 27:919-29; Vidal and Legrain, (1999) Trends Biotechnol 17:374-81; i U.S. pat. br. 5,525,490; 5,955,280; i 5,965,368].
[0291] U određenim primerima izvođenja, predmetna jedinjenja se identifikuju prema svojoj sposobnosti da interaguju sa jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice objave. Interakcija između jedinjenja i jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice može biti kovalentna ili nekovalentna. Na primer, takva interakcija može da se identifikuje na proteinskom nivou korišćenjem in vitro biohemijskih postupaka, uključujući foto-unakrsno povezivanje, vezivanje radioobeleženog liganda, i afinitetnu hromatografiju. Vidi, npr., Jakoby WB et al. (1974) Methods in Enzymology 46:1. U određenim slučajevima, jedinjenja mogu da se pretražuju u testu baziranom na mehanizmu, kao što je test za detektovanje jedinjenja koja se vezuju za jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice. Ovo može uključivati događaje vezivanja na čvrstoj fazi illi u tečnoj fazi. Alternativno, gen koji kodira jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice može da se transfektuje reporterskim sistemom (npr., β-galaktozidaza, luciferaza, ili zeleni fluorescentni protein) u ćeliju i da se izvrši pretraživanje biblioteke poželjno visokopropusnim pretraživanjem ili pretraživanjem pojedinačnih članova biblioteke. Mogu se koristiti i drugi testovi vezivanja bazirani na mehanizmu; na primer, testovi vezivanja koji detektuju promene slobodne energije. Testovi vezivanja mogu da se izvode sa ciljem fiksiranim za bunarčić, perlicama na čipu ili kaptiranim imobilisanim antitelom ili razdvojenim kapilarnom
12
elektroforezom. Vezana jedinjenja mogu se detektovati korišćenjem kolorimetrije ili rezonancije površinskog plazmona.
5. Primeri korišćenja u terapiji
[0292] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, predmetne objave može se koristiti za lečenje ili prevenciju bolesti ili stanja udruženih sa nenormalnom aktivnošću receptora TGFβ natporodice (npr., ALK1, ALK2, ALK3, ALK4, ALK5, ALK6, ALK7, ActRIIA, ActRIIB, BMPRII, TGFBRII, i MISRII) i/ili liganda TGFβ natporodice (npr., BMP2, BMP2/7, BMP3, BMP4, BMP4/7, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8a, BMP8b, BMP9, BMP10, GDF3, GDF5, GDF6/BMP13, GDF7, GDF8, GDF9b/BMP15, GDF11/BMP11, GDF15/MIC1, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, aktivin BE, nodal, GDNF, neurturin, artemin, persefin, MIS, i Lefty). Ove bolesti, poremećaji ili stanja uopšteno se označavaju u ovom tekstu kao "stanja udružena sa TGFβ natporodicom". U određenim primerima izvođenja, predmetni pronalazak obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije, kod osobe kojoj je to potrebno, tako što se osobi daju terapijski efikasne količine jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, kako je opisano u ovom tekstu. Izrazi "subjekt", "osoba" ili "pacijent" koriste se naizmenično u ovoj specifikaciji. Svaki od jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave može se potencijalno upotrebiti pojedinačno ili u kombinaciji za terapijsku upotrebu objavljenu u ovom tekstu. Ovi postupci su posebno namenjeni terapijskom i profilaktičkiom tretmanu sisara uključujući, na primer, glodare, primate, i ljude.
[0293] Kako se koristi u ovom tekstu, terapijsko sredstvo koje "prevenira" poremećaj ili stanje odnosi se na jedinjenje koje, u statističkom uzorku, smanjuje pojavu poremećaja ili stanja u uzorku lečenih, u poređenju sa uzorkom nelečene kontrole, ili odlaže pojavu ili smanjuje jačinu jednog ili više simptoma poremećaja ili stanja u odnosu na kontrolni uzorak. Izraz "lečiti/tretirati", kako se koristi u ovom tekstu, uključuje ublažavanje ili eliminaciju stanja kada je ono već uspostavljeno. U oba slučaju, prevencija ili lečenje mogu se raspoznati na osnovu dijagnoze koju je postavio lekar ili drugi pružalac zdravstvene nege i željenog rezultata primene terapijskog sredstva.
[0294] Nativni kompleksi receptor TGFβ natporodice-ligand imaju važne uloge u rastu tkiva i procesima ranog razvića kao što je pravilno formiranje različitih struktura, ili u jednom ili više postrazvojnih kapaciteta uključujući razvoj pola, proizvodnju hormona hipofize, i stvaranje kosti i hrskavice. Prema tome, stanja/poremećaji udruženi sa TGFβ natporodicom uključuju nenormalni rast tkiva i poremećaje u razviću. Pored toga, stanja udružena sa TGFβ natporodicom uključuju, ali se ne ograničavaju na poremećaje rasta i diferencijacije ćelija kao što su zapaljenje, alergija, autoimunske bolesti, infektivne bolesti i tumori.
[0295] Primeri stanja udruženih sa TGFβ natporodicom uključuju neuromuskularne poremećaje (npr., mišićnu distrofiju i mišićnu atrofiju), kongestivnu opstruktivnu bolest pluća (i gubitak mišićne mase udružen sa COPD), sindrom gubitka mišične mase, sarkopeniju, kaheksiju, poremećaje masnog tkiva (npr., gojaznost), dijabetes tipa 2 (NIDDM, dijabetes sa pojavom u odraslom dobu), i koštano degenerativno oboljenje (npr., osteoporoza). Drugi primeri stanja udruženih sa TGFβ natporodicom uključuju mišićno-degenerativne i neuromuskularne poremećaje, reparaciju tkiva (npr., zarastanje rane), neurodegenerativne bolesti (npr., amiotrofična lateralna skleroza), i imunološke poremećaje (npr., poremećaji povezani sa nenormalnom proliferacijom ili funkcijom limfocita).
[0296] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave koriste se kao deo tretmana mišićne distrofije. Izraz "mišićna distrofija" odnosi se na grupu degenerativnih mišićnih bolesti koje se karakterišu postupnim slabljenjem i propadanjem skeletnih mišića i, ponekad, srčanog i respiratornih mišića. Mišićne distrofije su genetički poremećaji koji se karakterišu progresivnim gubljenjem mišićne mase i slabošću koja počinje mikroskopskim promenama u mišiću. Kako se mišić tokom vremena degeneriše, snaga mišića date osobe opada. Primeri mišićnih distrofija koje se mogu lečiti režimom koji uključuje predmetne jednograne heteromultimerne komplekse receptora TGF-beta natporodice uključuju: Duchennevu mišićnu distrofiju (Duchenne muscular dystrophy, DMD), Beckerovu mišićnu distrofiju (Becker muscular dystrophy, BMD), Emery-Dreifussovu mišićnu distrofiju (Emery-Dreifuss muscular dystrophy, EDMD), pojasnu mišićnu distrofiju (limb-girdle muscular dystrophy, LGMD), fascioskapulohumeralnu mišićnu distrofiju (facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSH ili FSHD) (poznata i kao Landouzy-Dejerine), miotoničnu distrofiju (myotonic dystrophy, MMD; poznata i kao Steinertova bolest), okulofaringealnu mišićnu distrofiju (oculopharyngeal muscular
12
dystrophy, OPMD), distalnu mišićnu distrofiju (distal muscular dystrophy, DD), kongenitalnu mišićnu distrofiju (muscular dystrophy, CMD).
[0297] Duchenneovu mišićnu distrofiju (DMD) prvi je opisao francuski neurolog Guillaume Benjamin Amand Duchenne oko 1860. Beckerova mišićna distrofija (BMD) nazvana je po nemačkom lekaru Peteru Emilu Beckeru, koji je prvi opisao ovu varijantu DMD oko 1950. DMD je jedna od najčešćih naslednih bolesti kod muškaraca, i sreće se kod jednog od 3,500 dečaka. DMD javlja se kada je gen za distrofin, lociran na kratkom kraku X hromozoma, defektan. Pošto muškarci imaju samo jednu kopiju X hromozoma, oni imaju i samo jednu kopiju gena za distrofin. Bez proteina distrofina, mišić se lako oštećuje tokom ciklusa kontrakcije i relaksacije. Rano tokom bolesti mišić to kompenzuje regeneracijom, kasnije mišićne progenitorske ćelije ne mogu da drže korak sa oštećenjima i zdravi mišić biva zamenjen nefunkcionalnim, vezivno-masnim tkivom.
[0298] BMD je rezultat različitih mutacija u genu za distrofin. Oboleli od BMD imaju nešto distrofina, ali je on ili u nedovoljnoj količini ili lošeg kvaliteta. Prisustvo izvesne količine distrofina štiti mišiće pacijenata sa BMD od degeneracije koja bi bila jaka ili brza kao kod pacijenata sa DMD.
[0299] Studije na životinjama ukazuju da inhibicija GDF8 signalnog puta može efikasno lečiti razlličite aspekte bolesti kod pacijenata sa DMD i BMD (Bogdanovich et al., 2002, Nature 420:418-421; Pistilli et al., 2011, Am J Pathol 178:1287-1297). Prema tome, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice objave mogu delovati kao GDF8 inhibitori (antagonisti), i predstavljati alternativni način blokiranja signalizacije GDF8 i/ili srodnim ligandima TGFβ natporodice in vivo kod pacijenata sa DMD i BMD.
[0300] Slično tome, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice objave mogu obezbediti efikasan način za povećanje mišićne mase u drugim bolesnim stanjima u kojima je potreban rast mišića. Na primer, amiotrofična lateralna skleroza (ALS), nazvana i Lou Gehrigova bolest ili bolest motornih neurona, je hronični, progresivni, i neizlečivi poremećaj CNS koji napada motorne neurone, koji su komponente centralnog nervnog sistema potrebne za otpočinjanje kontrakcije skeletnog mišića. U ALS, motorni neuroni propadaju i na kraju umiru, i iako mozak osobe ostaje normalno potpuno aktivan i budan, započinjanje mišićne kontrakcije je blokirano na nivou kičmene moždine. Osobe koje razviju ALS stare su tipično između 40 i 70 godina i prvi motorni neuroni koji podležu degeneraciji su oni koji inervišu ruke ili noge. Pacijenti sa ALS mogu imati teškoće pri hodu, mogu ispuštati stvari, padati, govoriti nerazgovetno, i nekontrolisano se smejati ili vikati. Sa
12
napredovanjem bolesti, mišići udova počinju da atrofiraju usled nekorišćenja. Mišićna slabost postaje onesposobljavajuća, i pacijentima su na kraju potrebna invalidska kolica ili postaju vezani za postelju. Većina pacijenata sa ALS umire usled otkazivanja respiratornog sistema ili zbog komplikacija asistirane ventilacije, na primer pneumonije, 3-5 godian od pojave bolesti.
[0301] Promocija povećanja mišićne mase jednogranim heteromultimernim kompleksima receptora TGF-beta natporodice može biti korisna i za one koji pate od bolesti gubitka mišićne mase. Gonzalez-Cadavid et al. (gore) saopštili su da je, kod ljudi, ekspresija GDF8 u inverznoj korelaciji sa telesnom masom bez masnog tkiva, i da je povećana ekspresija GDF8 gena udružena sa gubitkom težine kod muškaraca sa sindromom gubitka težine u AIDS. Inhibicijom funkcije GDF8 kod pacijenata sa AIDS, bar određeni simptomi AIDS mogu da se ublaže, ako ne i potpuno eliminišu, čime se značajno poboljšava kvalitet života pacijenata sa AIDS.
[0302] Pošto je gubitak funkcije GDF8 udružen i sa gubitkom masti bez smanjenja unosa nutrijenata (Zimmers et al., gore; McPherron and Lee, gore), predmetni jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice mogu da se koriste i kao terapijsko sredstvo za usporavanje ili prevenciju razvoja gojaznosti i dijabetesa tipa 2.
[0303] Sindorm anoreksije-kaheksije u kanceru je među aspektima kancera koji najviše iscrpljuju i najviše ugrožavaju život. Ovaj sindrom je uobičajena osobina mnogih tipova kancera - u trenutku smrti prisutan je kod približno 80% pacijenata sa kancerom - i odgovoran je ne samo za loš kvalitet života i loš odgovor na hemioterapiju nego i za kraće vreme preživljavanja od onog koje se sreće kod pacijenata sa uporedivim kancerom, ali bez gubitka težine. Kaheksija je tipično suspektna kod pacijenata sa kancerom ako do nenamernog gubitka telesne težine većeg od pet procenata u odnosu na težinu pre bolesti dođe u okviru perioda od šest meseci. Udružena sa anoreksijom, gubitkom masnog i mišićnog tkiva, i psihološkim stresom, kaheksija nastaje u kompleksnoj interakciji između kancera i domaćina. Kancerska kaheksija utiče na proizvodnju citokina, oslobađanje faktora koji mobilišu lipide i indukuju proteolizu, i promene intermedijarnog metabolizma. Iako je anoreksija česta, smanjeni unos hrane sam ne može da objasni promene u telesnom sastavu kod pacijenata sa kancerom, a povećanje unosa nutrijenata ne može da dovede do reverzije sindroma gubitka telesne težine. Trenutno, ne postoji tretman kojim se kontroliše ili revertuje proces kaheksije. Pošto je ustanovljeno da sistemska prekomerna ekspresija GDF8 kod adultnih miševa indukuje izražen gubitak mišića i masnog tkiva analogan onom koji se viđa u sindromima kaheksije kod ljudi (Zimmers et al., gore), farmaceutska kompozicija predmetnog jednogranog
12
heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice može se korisno upotrebiti za prevenciju, lečenje, ili ublažavanje simptoma sindroma kaheksije, gde je poželjan rast mišićnog tkiva.
[0304] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu se koristiti u postupcima indukovanja formiranja kosti i/ili hrskavice, prevencije gubitka koštanog tkiva, povećanja mineralizacije kosti, prevencije demineralizacije kosti, i/ili povećanja gustine koštanog tkiva. Jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice mogu biti korisni kod pacijenata kojima je dijagnostikovana subklinički niska gustina koštanog tkiva, kao zaštitna mera protiv razvoja osteoporoze.
[0305] U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, predmetne objave mogu naći medicinsku upotrebu u zarastanju preloma kostiju i defekata hrskavice kod ljudi i drugih životinja. Predmetni postupci i kompozicije mogu imati i profilaktičku upotrebu u redukciji zatvorenih i otvorenih preloma, kao i u poboljšanju fiksacije veštačkih zglobova. De novo formiranje kosti indukovano osteogenim sredstvom korisno je za reparaciju kraniofacijalnih defekata koji su kongenitalni, indukovani traumom, ili izazvani onkološkom resekcijom, i takođe korisno je u kozmetičkoj plastičnoj hirurgiji. Pored toga, postupci i kompozicije pronalaska mogu se koristiti u lečenju periodontne bolesti i drugim procesima reparacije zuba. U određenim slučajevima, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, mogu obezbediti sredinu za privlačenje ćelija koje formiraju koštano tkivo, stimulisati rast ćelija koje formiraju koštano tkivo, ili indukovati diferencijaciju progenitora ćelija koje formiraju koštano tkivo. Jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice objave mogu biti korisni i u lečenju osteoporoze. Pored toga, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice mogu se koristiti za reparaciju defekata hrskavice i prevenciju/reverziju osteoartritisa.
[0306] Rosen et al. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7th ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C. obezbeđuje široku raspravu o poremećajima koštanog tkiva, koji se mogu lečiti jednogranim heteromultimernim kompleksima receptora TGF-beta natporodice ili kombinacijama
12
jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice. Delimičan spisak dat je u ovom tekstu. Postupci i kompozicije pronalaska mogu se primeniti na stanja koja se karakterišu ili izazivaju gubitak koštane mase, kao što su osteoporoza (uključujući sekundarnu osteoporozu), hiperparatiroidizam, poremećaj mineralizacije kostiju u hroničnom oboljenju bubrega, gubitak ili snižavanje polnih hormona (npr. androgen i/ili estrogen), lečenje glukokortikoidima, reumatoidni artritis, jake opekotine, hiperparatiroidizam, hiperkalcemija, hipokalcemija, hipofosfatemija, osteomalacija (uključujući osteomalaciju indukovanu tumorom), hiperfosfatemiju, deficijenciju vitamina D, hiperparatiroidizam (uključujući porodični hiperparatiroidizam) i pseudohipoparatiroidizam, tumorske metastaze u kostima, gubitak koštanog tkiva kao posledica tumora ili hemioterapije, tumori kosti i kostne srži (npr., multipli mijelom), ishemični poremećaji kosti, periodontna bolest i gubitak oralne kosti, Cushingova bolest, Pagetova bolest, tirotoksikoza, stanje hronične dijareje ili malapsorpcija, bubrežna tubularna acidoza, ili anoreksija nervoza. Postupci i kompozicije pronalaska mogu se primeniti i u stanjima koja se karakterišu neuspešnim formiranjem ili zarastanjem kostiju, uključujući prelome koji se ne ujedinjuju, prelomima koji na drugi način sporo zarastaju, fetalnoj i neonatalnoj displaziji kosti (npr., hipokalcemija, hiperkalcemija, defekti kalcijumskih receptora i deficijencija vitamina D), osteonekrozi (uključujući osteonektorzu vilice) i osteogenezis imperfekta. Pored toga anabolički efekti dovešće do toga da takvi antagonisti smanje bol udružen sa oštećenjem ili erozijom kosti. Kao posledica antiresorptivnih efekata, takvi antagonisti mogu biti korisni za lečenje poremećaja nenormalnog formiranja kosti, kao što su osteoblastne tumorske metastaze (npr., udružene sa primarnim kancerom prostate ili dojke), osteogeni osteosarkom, osteopetroza, progresivna dijafizna displazija, endostealna hiperostoza, osteopoikiloza, i meloreostoza. Drugi poremećaji koji mogu da se leče uključuju fibroznu displaziju i hondroplaziju.
[0307] U još jednom specifičnom primeru izvođenja, objava obezbeđuje terapijski postupak i kompoziciju za reparaciju preloma i drugih stanja u vezi sa defektima hrskavice i/ili kosti ili periodontnom bolešću. Pronalazak obezbeđuje još i terapijske postupke i kompozicije za zarastanje rana i reparaciju tkiva. Tipovi rana uključuju, ali se ne ograničavaju na opekotine, posekotine i čireve. Vidi, npr., PCT publikaciju br. WO 84/01106. Takve kompozicije uključuju terapijski efikasnu količinu najmanje jednog jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave u mešavini sa farmaceutski prihvatljivim prenosnikom, nosačem, ili matriksom.
12
[0308] U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se primeniti kod stanja koja izazivaju gubitak koštanog tkiva kao što su osteoporoza, hiperparatiroidizam, Cushingova bolest, tirotoksikoza, hronično stanje dijareje ili malapsorpcija, bubrežna tubularna acidoza, ili anoreksija nervoza. Uobičajeno se smatra da su osobe ženskog pola, male telesne težine i koje vode sedentaran način života pod povećanim rizikom za osteoporozu (gubitak mineralne gustine kostiju, što stvara rizik za prelome). Međutim, osteoporoza može biti i rezultat dugotrajne upotrebe nekih lekova. Osteoporoza koja je rezultat upotrebe lekova ili drugih medicinskih stanja poznata je kao sekundarna osteoporoza. U Cushingovoj bolesti, povećana količina kortizola koju telo proizvodi rezultuje osteoporozom i prelomima. Lekovi koji su najčešće udruženi sa sekundarnom osteoporozom su koritikosteroidi, klasa lekova koji deluju kao kortizol, hormon koji prirodno proizvode nadbubrežne žlezde. Iako su odgovarajući nivoi tiroidnih hormona potrebni za razvoj skeleta, višak tiroidnih hormona vremenom može smanjiti koštanu masu. Antacidi koji sadrže aluminijum mogu dovesti do gubitka koštane mase ako ih u visokim dozama uzimaju ljudi koji imaju probleme sa bubrezima, posebno oni koji su na dijalizi. Drugi lekovi koji mogu da izazovu sekundarnu osteoporozu uključuju fenitoin (Dilantin) i barbiturate koji se koriste za prevenciju napada; metotreksat (Rheumatrex, Immunex, Folex PFS), lek za neke forme artritisa, kancera, i imunske poremećaje; ciklosporin (Sandimmune, Neoral), lek koji se koristi za lečenje nekih autoimunskih bolesti i za supresiju imunskog sistema kod pacijenata sa transplantiranim organom; agoniste gonadotropin-oslobađajućeg hormona (Lupron, Zoladex), upotrebljene za lečenje kancera prostate i endometrioze; heparin (Calciparine, Liquaemin), lek protiv zgrušavanja krvi; i holestiramin (Questran) i kolestipol (Colestid), koji se koriste za lečenje visokog holesterola. Gubitak koštane mase koji je rezultat terapije kancera široko je prepoznat i označen je kao gubitak koštane mase indukovan terapijom kancera (cancer therapy-induced bone loss, CTIBL). Metastaze u kostima mogu stvoriti šupljine u kostima, koje se mogu korigovati lečenjem heteromultimernim kompleksom TGF-beta natporodice. Gubitak koštane mase može biti izazvan i bolešću desni, hroničnom infekcijom u kojoj bakterije locirane u udubljenjima desni proizvode toksine i štetne enzime.
[0309] U još jednom primeru izvođenja, predmetna objava obezbeđuje postupke i terapijska sredstva za lečenje bolesti i poremećaja udruženih sa nenormalnim ili neželjenim rastom kostiju. Na primer, pacijenti sa kongenitalnim poremećajem progresivnom fibrodisplazijom sa
1
okoštavanjem (fibrodysplasia ossificans progressiva, FOP) pate od progresivnog ektopičnog rasta koštanog tkiva u mekim tkivima, spontano ili u odgovoru na traumu tkiva, sa velikim uticajem na kvalitet života. Pored toga, nenormalni rast koštanog tkiva može se desiti posle operacije zamene kuka i tako upropastiti hirurški ishod. Ovo je češći primer patološkog rasta kosti i situacija kada predmetni postupci i kompozicije mogu biti terapijski korisni. Isti postupci i kompozicije mogu biti korisni i za lečenje drugih formi nenormalnog rasta kosti (npr., patološki rast kosti posle traume, opekotina ili povrede kičmene moždine), i za lečenje ili prevenciju neželjenih stanja udruženih sa nenormalnim rastom kosti koji se viđa u vezi sa metastatskim kancerom prostate ili osteosarkomom.
[0310] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se upotrebiti za promociju formiranja koštanog tkiva kod pacijenata sa kancerom. Pacijenti koji imaju određene tumore (npr. tumor prostate, dojke, multipli mijelom ili neki tumor koji dovodi do hiperparatiroidizma) imaju visok rizik za gubitak koštane mase zbog gubitka koštanog tkiva indukovanog tumorom, metastaza u kostima, i terapijskih sredstava. Takvi pacijenti mogu se lečiti jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacijama jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, čak i u odsustvu dokaza o gubitku koštane mase ili metastazama u kostima. Pacijenti mogu i da se prate u pogledu pojave gubitka koštane mase ili metastaza u kostima, i mogu da se leče jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice u slučaju da pokazatelji sugerišu povećan rizik. Uobičajeno, DEXA skenovi se koriste za procenu promena gustine kosti, dok pokazatelji remodeliranja kosti mogu da se koriste za procenu verovatnoće koštanih metastaza. Mogu da se prate serumski markeri. Alkalna fosfataza specifična za kost (bone specific alkaline phosphatase, BSAP) je enzim koji je prisutan u osteoblastima. Nivoi BSAP u krvi povišeni su kod pacijenata sa metastazama u kostima i drugim stanjima koja rezultuju povećanim remodeliranjem koštanog tkiva. Osteokalcin i prokolageni peptidi takođe su udruženi sa formiranjem kosti i metastazama u kostima. Porast BSAP detektuje se kod pacijenata sa metastazama u kostima izazvanim kancerom prostate, i u manjoj meri, u metastazama u kostima kod kancera dojke. Nivoi BMP7 su visoki u kanceru prostate koji je metastazirao u kost, ali ne i u metastazi u kostima usled kancera mokraćne bešike, kože, jetre, ili pluća. Karboksiterminalni telopeptid tipa I (type I carboxy-terminal telopeptide, ICTP) je ukršteni telopeptid nađen u kolagenu koji se formira tokom resorpcije kosti. Pošto se kost
1 1
stalno razgrađuje i ponovo formira, ICTP će se naći u čitavom telu. Međutim, na mestu metastaze u kosti, nivo će biti značajno viši nego u oblasti normalne kosti. ICTP je nađen u visokim nivoima u metastazama u kostima kod kancera prostate, pluća i dojke. Još jedna ukrštena veza u kolagenu, N-terminalni polipeptid tipa I (type I N-terminal telopeptide, NTx), proizvodi se zajedno sa ICTP tokom prometa koštanog tkiva. Količina NTx je povećana kod metastaza u kostima izazvanim mnogim razičitim tipovima kancera uključujući kancer pluća, prostate, i dojke. Isto tako, nivoi NTx rastu sa progresijom metastaza u kostima. Prema tome ovaj marker može da se koristi za detektovanje metastaza kao i za merenje obima bolesti. Drugi markeri resorpcije uključuju piridinolin i deoksipiridinolin. Svaki porast resorpcionih markera ili markera metastaza na kostima ukazuje na potrebu za terapijom jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacijama jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, kod pacijenta.
[0311] U sledećem primeru izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, mogu se koristiti kod pacijenata sa poremećajem mineralizacije koštanog tkiva u hroničnom oboljenju bubrega (chronic kidney disease mineral bone disorder, CKD-MBD), širokom sindromu međusobno povezanih skeletnih, kardiovaskularnih, i mineralometaboličkih poremećaja proisteklih iz oboljenja bubrega. CKD-MBD obuhvata različite patologije skeleta često označene kao bubrežna osteodistrofija (renal osteodystrophy, ROD), koja je poželjan primer izvođenja za lečenje jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacijama jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice. u zavisnosti od relativnog doprinosa različitih patogenih faktora, ROD se manifestuje u vidu različitih patoloških obrazaca remodeliranja koštanog tkiva (Hruska et al., 2008, Chronic kidney disease mineral bone disorder (CKD-MBD); u Rosen et al. (ed) Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism, 7th ed. American Society for Bone and Mineral Research, Washington D.C., str 343-349). Na jednom kraju spektra je ROD sa uremijskom osteodistrofijom i niskim prometom koštanog tkiva, karakterisana malim brojem aktivnih mesta remodeliranja, izrazito suprimiranim formiranjem kosti, i niskom resorpcijom kosti. Na drugom polu je ROD sa hiperparatiroidizmom, visokim prometom koštanog tkiva, i fibroznim osteitisom. S obzirom na to da jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice,
1 2
mogu ispoljiti i anaboličke i antiresorptivne efekte, ova sredstva mogu biti korisna kod pacijenata duž čitavog spektra ROD patologije.
[0312] Jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, objave mogu se primeniti udruženi sa drugim farmaceutskim sredstvima koja ispoljavaju aktivnost prema koštanom tkivu. Udružena primena može se izvršiti primenom jedne koformulacije, istovremenom primenom, ili primenom u različito vreme. Jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice mogu biti posebno povoljni ako se primene sa drugim sredstvima koja su aktivna prema koštanom tkivu. Pacijent može imati koristi od istovremenog primanja jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice i uzimanja suplemenata kalcijuma, vitamina D, odgovarajućih vežbi i/ili, u nekim slučajevima, drugog leka. Primeri drugih lekova uključuju bisfosfonate (alendronat, ibandronat i risedronat), kalcitonin, estrogene, paratiroidni hormon i raloksifen. Bisfosfonati (alendronat, ibandronat i risedronat), kalcitonin, estrogeni i raloksifen utiču na ciklus remodeliranja i klasifikovani su kao antiresorptivni lekovi. Remodeliranje kostiju sastoji se od dva različita stupnja: resorpcije kosti i formiranja kosti. Antiresorptivni lekovi usporavaju ili zaustavljaju koštano-resorptivni deo ciklusa remodeliranja kosti, ali ne usporavaju koštanoformirajući deo ciklusa. Kao rezultat, novo formiranje se nastavlja većom brzinom, a gustina koštanog tkiva može rasti tokom vremena. Teriparatid, forma paratiroidnog hormona, povećava brzinu formiranja kosti tokom ciklusa remodeliranja kosti. Alendronat je odobren za prevenciju (5 mg na dan ili 35 mg jednom nedeljno) i lečenje (10 mg na dan ili 70 mg jednom nedeljno) postmenopauzalne osteoporoze. Alendronat smanjuje gubitak koštane mase, povećava gustinu kostiju i smanjuje rizik od preloma kičme, ručnog zgloba i kuka. Alendronat je odobren i za lečenje glukokortikoidima indukovane osteoporoze kod muškaraca i žena, nastale usled dugotrajne upotrebe ovih lekova (tj., prednizon i kortizon) i za lečenje osteoporoze kod muškaraca. Alendronat plus vitamin D odobren je za lečenje osteoporoze kod žena u postmenopauzi (70 mg jednom nedeljno plus vitamin D), i za tretman u cilju povećanja koštane mase kod muškaraca sa osteoporozom. Ibandronat je odobren za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. U vidu pilule, jednom mesečno (150 mg), ibandronat treba uzimati svakog meseca istog dana. Ibandronat smanjuje gubitak koštane mase, povećava gustinu kostiju i smanjuje rizik od preloma kičme. Risedronat je odobren za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. Kada se uzima dnevno (doza od 5 mg) ili nedeljno (doza od 35 mg ili doza od 35 mg sa kalcijumom), risedronat usporava gubitak
1
koštane mase, povećava gustinu kosti i smanjuje rizik za prelome kičme i druge prelome. Risedronat je takođe odobren za upotrebu kod muškaraca i žena za prevenciju i/ili lečenje glukokortikoidima indukovane osteoporoze nastale usled dugotrajne primene ovih lekova (tj., prednizona ili kortizona). Kalcitonin je prirodni hormon uključen u regulaciju metabolizma kalcijuma i koštanog tkiva. Kod žena koje su više od 5 godina u menopauzi, kalcitonin usporava gubitak kosti, povećava gustinu kosti kičmenog stuba, i može olakšati bol udružen sa prelomima kostiju. Kalcitonin smanjuej rizik od preloma kičme. Kalcitonin je dostupan u vidu injekcije (50-100 IU dnevno) ili u vidu nazalnog spreja (200 IU dnevno).
[0313] Pacijent može imati koristi i ako istovremeno prima jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice i dodatne lekove koji ispoljavaju aktivnost prema koštanom tkivu. Estrogenska terapija (estrogen therapy, ET)/hormonska terapija (hormone therapy, HT) odobrena je za prevenciju osteoporoze. Pokazano je da ET smanjuje gubitak kosti, povećava gustinu kosti kičme i kuka, i smanjuje rizik za prelom kuka i kičme kod žena u postmenopauzi. ET se primenjuje najčešće u vidu pilule ili flastera za kožu koji dostavlja malu dozu od približno 0.3 mg dnevno ili standardnu dozu od približno 0.625 mg dnevno i efikasan je čak i kada se sa davanjem počne posle navršenih 70 godina. Kada se estrogen uzima sam, on može povećati rizik da žena razvije kancer sloja koji oblaže uterus (kancer endometrijuma). Da bi se taj rizik eliminisao, pružaoci zdravstvene nege prepisuju hormon progestin u kombinaciji sa estrogenom (hormonska zamenska terapija ili HT) za one žene koje imaju intaktan uterus. ET/HT olakšava simptome menopauze i pokazano je da ima povoljne efekte na zdravlje kostiju. Sporedni efekti mogu uključiti vaginalno krvarenje, osetljivost dojki, promene raspoloženja i oboljenje žučne kese. Raloksifen, 60 mg na dan, odobren je za prevenciju i lečenje postmenopauzalne osteoporoze. On pripada klasi lekova nazvanih selektivni modulatori estrogenskih receptora (selective estrogen receptor modulators, SERM) koji su razvijeni da bi obezbedili korisne efekte estrogena bez potencijalnih neželjenih dejstava. Raloksifen povećava koštanu masu i smanjuje rizik od preloma kičmenog stuba. Još uvek nema raspoloživih podataka koji bi pokazali da raloksifen može da smanji rizik za prelom kuka i druge prelome osim preloma kičme. Teriparatid, forma paratiroidnog hormona, odobren je za lečenje osteoporoze kod postmenopauzalnih žena i muškaraca koji su pod povišenim rizikom za prelom. Ovaj lek stimuliše formiranje novog koštanog tkiva i značajno povišava mineralnu gustinu kosti. Kod postmenopauzalnih žena, primećeno je smanjenje fraktura kičme kuka, stopala, rebara i ručnog zgloba. Kod muškaraca,
1 4
primećeno je smanjenje fraktura kičme, ali nema dovoljno podataka za evaluaciju smanjenja preloma na drugim mestima. Teriparatid se samoprimenjuje u vidu injekcije jednom dnevno, do 24 meseca.
[0314] U drugim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice mogu se upotrebiti za regulisanje sadržaja telesne masti kod životinje i za lečenje ili prevenciju stanja povezanih sa tim. i posebno stanja povezanih sa tim koja ugrožavaju zdravlje. Prema predmetnom pronalasku, regulisati (kontrolisati) telesnu težinu može da se odnosi na smanjenje ili povećanje telesne težine, smanjenje ili povećanje brzine dobijanja težine, ili povećanje ili smanjenje brzine gubitka težine, a takođe uključuje i aktivno održavanje telesne težine, ili njeno menjanje bez značajnosti (npr., deluje protiv spoljašnjih ili unutrašnjih uticaja koji bi inače povećali ili smanjili telesnu težinu). Jedan primer izvođenja predmetne objave odnosi se na regulaciju telesne težine primenom kod životinje (npr., čoveka) kojoj je to potrebno jednogranog heteromultimernog kompleksa receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, objave.
[0315] U nekim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu se upotrebiti za smanjenje telesne težine i/ili smanjenje povećanja telesne težine kod životinje, i preciznije, za lečenje ili ublažavanje gojaznosti kod pacijenata koji su pod rizikom da postanu gojazni. U još jednom specifičnom primeru izvođenja, predmetni pronalazak je usmeren na postupke i jedinjenja za lečenje životinje koja ne može da dobije ili zadrži težinu (npr., životinja sa sindromom gubitka telesne težine). Takvi postupci efikasni su za povećanje telesne težine i/ili mase, ili za smanjenje gubitka telesne težine i/ili mase, ili za poboljšanje stanja udruženih ili prouzrokovanih neželjeno niskom (npr., nezdravom) telesnom težinom i/ili masom. Pored toga, poremećaji povišenog holesterola (npr., hiperholesterolemija ili dislipidemija) mogu se lečiti jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacijom jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, objave.
[0316] U određenim aspektima, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu se upotrebiti za povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija,
1
lečenje ili prevenciju anemije, lečenje i/ili prevenciju neefikasne eritropoeze kod subjekta kojem je to potrebno. U određenim aspektima, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, može se koristiti u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim pristupima za povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija, posebno onih koji se koriste za lečenje anemija multifaktorijalnog porekla. Konvencionalni terapijski pristupi za povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija uključuju, na primer, transfuziju crvenih krvnih ćelija, primenu jednog ili više aktivatora EPO receptora, transplantaciju matičnih ćelija hematopoeze, imunosupresivna biološka sredstva i lekove (npr., kortikosteroide). U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, predmetne objave može se upotrebiti za lečenje ili prevenciju neefikasne eritropoeze i/ili poremećaja udruženih sa neefikasnom eritropoezom kod subjekta kojem je to potrebno. U određenim aspektima, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave može se upotrebiti u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim pristupima za lečenje anemije ili poremećaja neefikasne eritropoeze, posebno onih koji se koriste za lečenje anemija multifaktorijalnog porekla
[0317] Uopšteno, lečenje ili prevencija bolesti ili stanja kako je opisano u predmetnoj objavi postiže se primenom jednogranog heteromultimernog receptorskog kompleksa TGF-beta natporodice, ili kombinacije jednogranih heteromultimernih receptorskih kompleksa TGF-beta natporodice, predmetne objave u "efikasnoj količini". Efikasna količina sredstva odnosi se na količinu koja je efikasna u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog terapijskog ili profilaktičkog rezultata. "Terapijski efikasna količina" sredstva predmetne objave može varirati u skladu sa faktorima kao što je stanje bolesti, starost, pol, i težina individue, i sposobnosti sredstva da izazove željeni odgovor kod individue. "Profilaktički efikasna količina" odnosi se na količinu koja je efikasna, u potrebnim dozama i vremenskim periodima, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata
[0318] U određenim primerima izvođenja, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacija jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, može se upotrebiti za povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija, hemoglobina, ili retikulocita kod zdravih osoba i odabranih populacija pacijenata. Primeri odgovarajućih populacija pacijenata
1
uključuju one sa neželjeno niskim nivoima crvenih krvnih ćelija ili hemoglobina, kao što su pacijenti koji imaju anemiju, i oni koji su pod rizikom da razviju neželjeno niske nivoe crvenih krvnih ćelija ili hemoglobina, kao što su pacijenti koji treba da se podvrgnu velikoj hirurškoj intervenciji ili drugim procedurama koje mogu dovesti do značajnog gubitka krvi. U jednom primeru izvođenja, pacijent sa adekvatnim nivoima crvenih krvnih ćelija tretira se jednogranim heteromultimernim kompleksom receptora TGF-beta natporodice, ili kombinacijom jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice, da bi mu se povećali nivoi crvenih krvnih ćelija, a zatim mu se uzima krv i skladišti za kasniju upotrebu u transfuzijama.
[0319] Jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, može se upotrebiti za povišenje nivoa crvenih krvnih ćelija, nivoa hemoglobina, i/ili nivoa hematokrita kod pacijenta koji ima anemiju. Kada se posmatraju nivoi hemoglobina i/ili hematokrita kod čoveka, nivo manji od normalnog za odgovarajuću starosnu i polnu kategoriju može ukazivati na anemiju, mada treba uzeti u obzir individualne varijacije. Na primer, smatra se da je nivo hemoglobina od 10-12.5 g/dl, i tipično oko 11.0 g/dl u okvirima normalnog za zdrave adulte, iako u terapijskim okvirima, niži ciljni nivo može izazvati manje kardiovaskularnih sporednih efekata [vid, npr., Jacobs et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15, 15-19]. Alternativno, nivoi hematokrita (procenat zapremine uzorka krvi zauzet ćelijama) mogu se koristiti kao mera anemije. Nivoi hematokrita za zdrave osobe u rasponu su od oko 41-51% za odrasle muškarce i od 35-45% za odrasle žene. U određenim primerima izvođenja, pacijent može da se leči doznim režimom koji je namenjen vraćanju pacijenta na ciljni nivo crvenih krvnih ćelija, hemoglobina, i/ili hematokrita. Kako nivoi hemoglobina i hematokrita variraju od osobe do osobe, optimalno, ciljni nivo hemoglobina, i/ili hematokrita može biti individualizovan za svakog pacijenta.
[0320] Anemija se često uočava kod pacijenata koji imaju povredu tkiva, infekciju, i/ili hronično oboljenje, posebno kancer. Kod nekih subjekata, anemija se karakteriše niskim nivoima eritropoetina i/ili neadekvatnim odgovorom kostne srži na eritropoetin [vidi, npr., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, str.628-634]. Potencijalni uzroci anemije uključuju, na primer, gubitak krvi, nutricione deficite (npr. smanjeni unos proteina u ishrani), reakciju na lekove, različite probleme udružene sa kostnom srži, i mnoge bolesti. Preciznije, anemija je udružena sa različitim poremećajima i stanjima koji obuhvataju, na primer, transplantaciju kostne srži; solidne
1
tumore (npr., kancer dojke, kancer pluća, i kancer kolona); tumore limfnog sistema (npr., hronična limfocitna leukemija, ne-Hodgkinov limfom, i Hodgkinov limfom); tumore hematopoeznog sistema (npr., leukemija, mijelodisplastični sindrom i multipli mijelom); terapiju zračenjem; hemioterapijua (npr., režimi koji sadrže paltinu); zapaljenske i autoiminske bolesti, uključujući, ali ne ograničavajući se na reumatoidni artritis, druge zapaljenske artritise, sistemski eritemski lupus (systemic lupus erythematosis, SLE), akutna ili hronična oboljenja kože (npr., psorijaza), zapaljenske bolesti creva (npr., Crohnova bolest i ulcerativni kolitis); akutno ili hronično oboljenje bubrega ili otkazivanje, uključujući idiopatska ili kongenitalna stanja; akutno ili hronično oboljenje jetre; akutno ili hronično krvarenje; situacije u kojima transfuzija crvenih krvnih ćelija nije moguća zbog pacijentovih alo- ili autoantitela i/ili iz religioznih razloga (npr., neki Jehovini svedoci); infekcije (npr., malarija i osteomijelitis); hemoglobinopatije uključujući, na primer, bolest srpastih ćelija (anemija), talasemije; upotrebu ili zloupotrebu lekova (npr., zloupotreba alkohola); pedijatrijske pacijente sa anemijom iz bilo kog razloga da bi se izbegla transfuzija; i stare pacijente ili pacijente koji kao osnovno oboljenje imaju kardiopulmonalno oboljenje, sa anemijom, koji ne mogu da primaju transfuzije kako ne bi preopteretili cirkulatorni sistem [vidi, npr., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, pp 628-634].
[0321] Mnogi faktori mogu doprineti anemiji udruženoj sa kancerom. Neki su udruženi sa samim procesom bolesti i stvaranjem inflamatornih citokina kao što su interleukin-1, interferon-gama, i faktor nekroze tumora [Bron et al. (2001) Semin Oncol 28(Suppl 8):1-6]. Među svojim efektima, zapaljenje indukuje ključni peptid koji reguliše gvožđe, hepcidin, čime se inhibira izvoz gvožđa iz makrofaga i generalno ograničava raspoloživost gvožđa za eritropoezu [vidi, npr., Ganz (2007) J Am Soc Nephrol 18:394-400]. Gubitak krvi na različite načine takođe može doprineti anemiji povezanoj sa kancerom. Prevalenca anemije zbog progresije kancera varira sa tipom kancera, u rasponu od 5% u kanceru prostate do 90% u multiplom mijelomu. Anemija povezana sa kancerom ima izražene posledice po pacijenta, uključujući zamor i smanjen kvalitet života, smanjenu efikasnost lečenja, i povećanu smrtnost. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje anemije povezane sa kancerom.
[0322] Hipoproliferativna anemija može biti rezultat primarne disfunkcije ili otkazivanja kostne srži. Hipoproliferativne anemije uključuju: anemiju hroničnog oboljenja, anemiju
1
oboljenja bubrega, anemiju udruženu sa hipometaboličkim stanjima, i anemiju udruženu sa kancerom. U svakom od ovih tipova, endogeni nivoi eritropoetina su neodgovarajuće niski za zapaženi stepen anemije. Druge hipoproliferativne anemije uključuju: rani stupanj anemije sa deficijencijom gvožđa, i anemiju izazvanu oštećenjem kostne srži. U ovim tipovima, endogeni nivoi eritropoetina su odgovarajuće povišeni za zapaženi stepen anemije. Istaknuti primeri bili bi mijelosupresija izazvana kancerom i/ili hemioterapijskim lekovima ili terapija kancera zračenjem. U širem pregledu kliničkih studija nađeno je da blaga anemija može da se javi kod 100% pacijenata posle hemioterapije, dok se jača anemija može javiti kod čak i do 80% takvih pacijenata [vidi, npr., Groopman et al. (1999) J Natl Cancer Inst 91:1616-1634]. Mijelosupresivni lekovi uključuju, na primer: 1) alkilirajuća sredstva kao što su azotni iperiti (npr., melfalan) i nitrozouree (npr., streptozocin); 2) antimetabolite kao što su antagonisti folne kiseline (npr., metotreksat), purinski analozi (npr., tioguanin), i pirimidinski analozi (npr., gemcitabin); 3) citotoksične antibiotike kao što su antraciklini (npr., doksorubicin); 4) inhibitore kinaze (npr., gefitinib); 5) inhibitore mitoze kao što su taksani (npr., paklitaksel) i alkaloidi vinke (npr., vinorelbin); 6) monoklonska antitela (npr., rituksimab); i 7) inhibitore topoizomeraze (npr., topotekan i etopozid). Pored toga, stanja koja rezultuju smanjenom stopom metabolizma mogu proizvesti blagu do umerenu hipoproliferativnu anemiju. Među takvim stanjima su stanja endokrine deficijencije. Na primer, anemija može da se sretne u Addisonovoj bolesti, hipotiroidizmu, hiperparatiroidizmu, ili kod muškaraca koji su kastrirani ili lečeni estrogenom. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje hiperproliferativne anemije.
[0323] Hronično oboljenje bubrega je ponekad udruženo sa hipoproliferativnom anemijom, i stepen anemije varira po jačini u zavisnosti od nivoa ometenosti rada bubrega. Takva anemija nastaje prvenstveno zbog neodgovarajuće proizvodnje eritropoetina i smanjenog preživljavanja crvenih krvnih ćelija. Hronično oboljenje bubrega obično napreduje postepeno godinama ili decenijama dok ne dostigne završni stadijum (stadijum 5), kada su za pacijentovo preživljavanje neophodni dijaliza ili transplantacija bubrega. Anemija se često razvija rano tokom ovog procesa i pogoršava se sa napredovanjem bolesti. Kliničke posledice anemije u oboljenju bubrega dobro su dokumentovane i uključuju razvoj hipertrofije leve komore, ometenu kognitivnu funkciju, smanjen kvalitet života, i izmenjenu imunsku funkciju [vidi, npr., Levin et al. (1999) Am J Kidney Dis 27:347-354; Nissenson (1992) Am J Kidney Dis 20(Suppl 1):21-24; Revicki et al. (1995) Am J Kidney Dis 25:548-554; Gafter et al.,
1
(1994) Kidney Int 45:224-231]. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje anemije udružene sa akutnim ili hroničnim oboljenjem bubrega ili otkazivanjem rada bubrega.
[0324] Anemija koja je rezultat akutnog gubitka dovoljne zapremine krvi, na primer usled traume ili postporođajnog krvarenja, poznata je i kao akutna posthemoragična anemija. Akutan gubitak krvi inicijalno dovodi do hipovolemije bez anemije jer dolazi do srazmernog iscrpljivanja RBC i drugih konstituenata krvi. Međutim, hipovolemija će brzo pokrenuti fiziološke mehanizme koji će premestiti tečnost iz ekstravaskularnog u vaskularni odeljak, što će rezultovati razblaživanjem krvi i anemijom. Ako je hroničan, gubitak krvi će postepeno isprazniti rezerve gvožđa u telu i na kraju dovesti so deficijencije gvožđa. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje anemije koja je rezultat akutnog gubitka krvi.
[0325] Anemija usled deficijencije gvožđa je završni stupanj u postepenoj progresiji rastuće deficijencije gvožđa koja, kao prelazne stupnjeve, uključuje negativni balans gvožđa i eritropoezu deficijentnu u gvožđu. Deficijencija gvožđa može biti rezultat povećanih zahteva za gvožđem, smanjenog unosa gvožđa, ili povećanog gubitka gvožđa, za šta su primeri stanja kao što su trudnoća, neodgovarajuća ishrana, loša apsorpcija u crevima, akutno ili hronično zapaljenje, i akutni ili hronični gubitak krvi. Uz blagu do umerenu anemiju ovog tipa, kostna srž ostaje hipoproliferativna, i morfologija RBC je uglavnom normalna; međutim, čak i blaga anemija može rezultovati pojavom mikrocitnih hipohromnih RBC, i prelaz ka jakoj anemiji usled deficijencije gvožđa udružen je sa hiperproliferacijom kostne srži i sve većom zastupljenošću mikrocitnih i hipohromnih RBC [vidi, npr., Adamson (2008) Harrison's Principles of Internal Medicine, 17th ed.; McGraw Hill, New York, str. 628-634]. Odgovarajuća terapija za anemiju usled deficijencije gvožđa zavisi od njenog uzroka i jačine, uz oralne preparate gvožđa, parenteralne formulacije gvožđa, i transfuziju RBC kao glavne uobičajene opcije. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje hronične deficijencije gvožđa.
[0326] Mijelodisplastični sindrom (myelodysplastic syndrome (MDS) predstavlja raznoliki skup hematoloških stanja koja se odlikuju neefikasnom proizvodnjom mijeloidnih krvnih ćelija i rizikom za transformaciju u akutnu mijelogenu leukemiju. Kod pacijenata sa MDS,
14
matične ćelije krvi ne sazrevaju u zrele crvene krvne ćelije, bele krvne ćelije, ili pločice. MDS pormećaji uključuju, na primer, refraktornu anemiju, refraktornu anemiju sa prstenastim sideroblastima, refraktornu anemiju sa viškom blasta, refraktornu anemiju sa viškom blasta u transformaciji, refraktornu citopeniju sa multilinijskom displazijom, i mijelodisplastični sindrom udružen sa izolovanom 5q hromozomskom abnormalnošću. Kako se ovi poremećaji manifestuju kao ireverzibilni defekti kvantiteta i kvaliteta hematopoeznih ćelija, većina MDS pacijenata pogođena je hroničnom anemijom. Prema tome, MDS pacijenti na kraju zahtevaju transfuzije krvi i/ili lečenje faktorima rasta (npr., eritropoetin ili G-CSF) da bi se povisili nivoi crvenih krvnih ćelija. Međutim, mnogi pacijenti sa MDS razvijaju sporedne efekte zbog učestalosti takvih terapija. Na primer, kod pacijenata koji često primaju transfuziju crvenih krvnih ćelija može doći do oštećenja tkiva i organa zbog nakupljanja viška gvožđa. Prema tome, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, mogu se koristiti za lečenje pacijenata sa MDS. U određenim primerima izvođenja, pacijenti koji pate od MDS mogu se lečiti korišćenjem jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora. U drugim primerima izvođenja, pacijenti koji pate od MDS mogu se lečiti korišćenjem kombinacije jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave i jednog ili više dodatnih terapijskih sredstava za lečenje MDS uključujući, na primer, talidomid, lenalidomid, azacitadin, decitabin, eritropoetine, deferoksamin, antitimocitni globulin, i filgrastrim (G-CSF).
[0327] Originalno se, na bazi ferokinetičkih studija, razlikujući od aplastične anemije, hemoragije, ili periferne hemolize [vidi, npr., Ricketts et al. (1978) Clin Nucl Med 3:159-164], neefikasna eritropoeza odnosi se na raznoliku grupu anemija u kojima je proizvodnja zrelih RBC manja nego što bi se očekivalo imajući u vidu dati broj eritroidnih prekursora (erithroblasta) prisutnih u kostnoj srži [Tanno et al. (2010) Adv Hematol 2010:358283]. U takvim anemijama, tkivna hipoksija opstaje zbog neefikasne proizvodnje zrelih RBC, uprkos povišenim nivoima eritropoetina. Na kraju se razvija začarani krug u kojem povišeni nivoi eritropoetina pokreću masivnu ekspanziju eritroblasta, potencijalno dovodeći do splenomegalije (uvećanja slezine) zbog ekstramedularne hematopoeze [vidi, npr., Aizawa et al. (2003) Am J Hematol 74:68-72], eritroblastima indukovane patologije kosti [vidi, npr., Di Matteo et al. (2008) J Biol Regul Homeost Agents 22:211-216], i preopterećenja tkiva gvožđem, čak i u odsustvu terapijskih transfuzija RBC [vidi, npr., Pippard et al. (1979) Lancet 2:819-821]. Prema tome, podsticanjem efikasnosti eritropoeze, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu prekinuti pomenuti ciklus i ublažiti ne samo anemiju koja je u njegovoj osnovi nego i komplikacije udružene sa povišenim nivoima eritropoetina, splenomegaliju, patologiju kosti, i preopterećenost tkiva gvožđem. U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu se upotrebiti za lečenje ili prevenciju neefikasne eritropoeze, uključujući anemiju i povišene nivoe EPO, kao i komplikacija kao što su splenomegalija, eritroblastima indukovana patologija kosti, preopterećenost gvožđem, i njima prateće patologije. Kod splenomegalije, takve patologije uključuju torakalni ili abdominalni bol i retikuloendotelnu hiperplaziju. Ekstramedularna hematopoeza može da se sretne ne samo u slezini nego potencijalno i u drugim tkivima u formi ekstramedularnih hematopoeznih pseudotumora [vidi, npr., Musallam et al. (2012) Cold Spring Harb Perspect Med 2:a013482]. Kod eritroblastima indukovane patologije kosti, prateće patologije uključuju nisku mineralnu gustinu kostiju, osteoporozu, i bol u kostima [vidi, npr., Haidar et al. (2011) Bone 48:425-432]. Kod preopterećenosti gvožđem, prateće patologije uključuju supresiju hepcidina i hiperapsorpciju gvožđa iz hrane [vidi, npr., Musallam et al. (2012) Blood Rev 26(Suppl 1):S16-S19], višestruke endokrinopatije i fibrozu/cirozu jetre [vidi, npr., Galanello et al. (2010) Orphanet J Rare Dis 5:11], i kardiomiopatiju usled preopterećenosti gvožđem [Lekawanvijit et al., 2009, Can J Cardiol 25:213-218].
[0328] Najčešći uzroci neefikasne eritropoeze su talasemijski sindromi, hereditarne hemoglobinopatije u kojima neravnoteža u proizvodnji intaktnih alfa- i beta-hemoglobinskih lanaca dovodi do porasta apoptoze tokom sazrevanja eritroblasta [vidi, npr., Schrier (2002) Curr Opin Hematol 9:123-126]. Talasemije su, zbirno, među najčešćim genetičkim poremećajima u svetu, uz promenljive epidemiološke obrasce za koje se predviđa da će doprineti porastu problema u vezi sa javnim zdravljem i u SAD i globalno [Vichinsky (2005) Ann NY Acad Sci 1054:18-24]. Talasemijski sindromi su nazvani prema svojoj jačini. Tako, α-talasemije uključuju α-talasemiju minor (poznata i kao α-talasemija u tragu; dva zahvaćena gena za α-globin), oboljenje hemoglobina H (tri zahvaćena gena za α-globin), i α-talasemiju major (poznata i kao hidrops fetalis; četiri zahvaćena gena za α-globin). β-talasemije uključuju β-talasemiju minor (poznata i kao β-talasemija u tragu; jedan zahvaćen gen za βglobin), β-talasemiju intermedija (dva zahvaćena gena za β-globin), talasemiju hemoglobina E (dva zahvaćena gena za β-globin), i β-talasemiju major (poznata i kao Cooleyjeva anemija; dva zahvaćena gena za β-globin, rezultuje kompletnim odsustvom β-globinskog proteina). βtalasemija utiče na mnoge organe, udružena je sa značajnim morbiditetom i mortalitetom, i trenutno zahteva doživotno lečenje. Iako je očekivani životni vek pacijenata sa βtalasemijama poslednjih godina produžen zahvaljujući korišćenju redovnih transfuzija krvi u kombinaciji sa heliranjem gvožđa, preopterećenost gvožđem koje je rezultat i transfuzija i povećane gastrointestinalne apsorpcije gvožđa može dovesti do ozbiljnih komplikacija kao što su oboljenje srca, tromboza, hipogonadizam, hipotiroidizam, dijabetes, osteoporoza, i osteopenija [vidi, npr., Rund et al. (2005) N Engl J Med 353:1135-1146]. U određenim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje ili prevenciju talasemijskog sindroma.
[0329] U nekim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, mogu se koristiti za lečenje poremećaja neefikasne eritropoeze različitih od talasemijskih sindroma. Takvi poremećaji uključuju sideroblastnu anemiju (nasleđenu ili stečenu); diseritropoeznu anemiju (tipovi I i II); anemiju srpastih ćelija; hereditarnu sferocitozu; deficijenciju piruvat kinaze; megaloblastne anemije, potencijalno izazvane stanjima kao što su deficijencija folata (zbog kongenitalnih bolesti, smanjenog unosa ili povećanih potreba), deficijencija kobalamina (zbog kongenitalnih bolesti, perniciozne anemije, ometene apsorpcije, insuficijencije pankreasa, ili smanjenog unosa), određeni lekovi ili iz neobjašnjenih razloga (kongenitalna diseritropoezna anemija, refraktorna megaloblastna anemija, ili eritroleukemija); mijeloftizne anemije uključujući, na primer, mijelofibrozu (mijeloidnu metaplaziju) i mijeloftizu; kongenitalnu eritropoeznu prfiriju; i trovanje olovom.
[0330] U određenim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se koristiti u kombinaciji sa potpornim terapijama za neefikasnu eritropoezu. Takve terapije uključuju transfuziju crvenih krvnih ćelija ili cele krvi u cilju lečenja anemije. U hroničnim ili hereditarnim anemijama, normalni mehanizmi homeostaze gvožđa nadvladani su ponavljanim transfuzijama, što na kraju dovodi do toksične i potencijalno fatalne akumulacije gvožđa u vitalnim tkivima kao što su srce, jetra, i endokrine žlezde. Dakle, potporna terapija za pacijente sa hroničnom neefikasnom eritropoezom uključuje i lečenje jednim ili više helirajućih molekula da bi se potpomogla ekskrecija gvožđa u urinu i/ili stolici i time sprečila ili izvršila reverzija preopterećenosti tkiva gvožđem [vidi, npr., Hershko (2006) Haematologica 91:1307-1312; Cao et al. (2011), Pediatr Rep 3(2):e17]. Efikasna sredstva za heliranje gvožđa trebalo bi da
14
mogu da se selektivno vezuju i neutrališu gvožđe u feri obliku, oksidisanoj formi gvožđa nevezanog za transferin, koja verovatno najviše doprinosi toksičnosti gvožđa, preko katalitičke proizvodnje hidroksil radikala i proizvoda oksidacije [vidi, npr., Esposito et al. (2003) Blood 102:2670-2677]. Ova sredstva su strukturno raznovrsna, ali sva poseduju kiseoničke ili azotne donorske atome koji mogu da formiraju neutralizujuće oktaedarne koordinacione komplekse sa pojedinačnim atomima gvožđa u stehiometrijskim odnosima 1:1 (heksadentatna sredstva), 2:1 (tridentatna), ili 3:1 (bidentatna) [Kalinowski et al. (2005) Pharmacol Rev 57:547-583]. Uopšteno, efefikasna sredstva za heliranje gvožđa su takođe male molekularne težine (npr., manje od 700 daltona), rastvorljiva u vodi i lipidima kako bi mogla da pristupe zahvaćenim tkivima. Specifićni primeri molekula za heliranje gvožđa uključuju deferoksamin, heksadentatno sredstvo bakterijskog porekla, koje zahteva svakodnevnu parenteralnu primenu, i oralno aktivna sintetska sredstva deferipron (bidentatni) i deferasiroks (tridentatni). Kombinovana terapija koja se sastoji od primene dva sredstva koja heliraju gvožđe, istog dana, pokazala se obećavajućom kod pacijenata koji ne odgovaraju na helacionu monoterapiju i takođe za prevazilaženje problema nesaradljivosti pacijenata prilikom primene samog dereroksamina [Cao et al. (2011) Pediatr Rep 3(2):e17; Galanello et al. (2010) Ann NY Acad Sci 1202:79-86].
[0331] Kako se koristi u ovom tekstu, "u kombinaciji sa" ili "istovremena primena" odnosi se na svaku formu primene pri kojoj je druga terapija i dalje efikasna u telu (npr., dva jedinjenja su istovremeno efikasna kod pacijenta, što može uključiti sinergističke efekte dva jedinjenja). Efikasnost ne mora biti u korelaciji sa merljivom koncentracijom sredstva u krvi, serumu, ili plazmi. Na primer, različita terapijska jedinjenja mogu se primeniti u istoj formulaciji ili u zasebnim formulacijama, istovremeno ili sekvencijalno, i po različitim rasporedima. Osoba koja prima takav tretman, dakle, može imati koristi od kombinovanog efekta različitih terapija. Jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se primeniti istovremeno, pre ili posle jednog ili više drugih dodatnih sredstava ili potpornih terapija. Uopšteno, svako terapijsko sredstvo primeniće se u dozi i/ili po vremenskom rasporedu određenom za to posebno sredstvo. Određena kombinacija koja će se koristiti u režimu zavisiće od kompatibilnosti antagonista predmetne objave sa terapijom i/ili željenog terapijskog efekta koji treba postići.
[0332] U određenim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se koristiti u kombinaciji sa hepcidinom ili hepcidinskim agonistom, kod neefikasne eritropoeze. Cirkulišući polipeptid proizveden uglavnom u jetri, hepcidin, smatra se za glavnog regulatora metabolizma gvožđa zahvaljujući svojoj sposobnosti da indukuje degradaciju feroportina, proteina za izvoz gvožđa lokalizovanog na apsorptivnim enterocitima, hepatocitima, i makrofagima. Uopštenije rečeno, hepcidin smanjuje raspoloživost vanćelijskog gvožđa, tako da hepcidinski agonisti mogu da budu korisni u lečenju neefikasne eritropoeze [vidi, npr., Nemeth (2010) Adv Hematol 2010:750643]. Ovo stanovište je podržano korisnim efektima povećane ekspresije hepcidina u mišjem modelu β-talasemije [Gardenghi et al. (2010) J Clin Invest 120:4466-4477].
[0333] Jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, opciono u kombinaciji sa aktivatorom EPO receptora, bili bi pogodni i za lečenje anemija usled poremećaja maturacije RBC, koje se karakterišu delom smanjenim (mikrocitnim), povećanim (makrocitnim), deformisanim, ili nenormalno obojenim (hipohromnim) RBC.
[0334] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava obezbeđuje postupke lečenja ili prevencije anemije, kod osobe kojoj je to potrebno, primenom, kod te osobe, terapijski efikasne količine jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptorskih TGF-beta natporodice objave i aktivatora EPO receptora. U određenim primerima izvođenja, jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se koristiti u kombinaciji sa aktivatorima EPO receptora za smanjenje potrebne doze ovih aktivatora, kod pacijenata koji su podložni negativnim efektima EPO. Ovi postupci mogu da se upotrebe u terapijskim i profilaktičkim tretmanima pacijenta.
[0335] Jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se koristiti u kombinaciji sa aktivatorima EPO receptora, da bi se postiglo povećanje broja crvenih krvnih ćelija, posebno pri nižim rasponima doza aktivatora EPO receptora. Ovo može biti korisno za smanjenje poznatih sporednih efekata i rizika udruženih sa visokim dozama aktivatora EPO receptora. Primarni negativni efekti EPO uključuju, na primer, prekomerno povećanje nivoa hematokrita ili hemoglobina i policitemiju. Povišeni nivoi hematokrita mogu dovesti do hipertenzije (tačnije do pogoršanja hipertenzije) i vaskularne tromboze. Drugi ranije saopšteni neželjeni efekti EPO, od kojih su neki povezani sa hipertenzijom, su glavobolja, sindrom sličan gripu, opstrukcija šantova, infarkt miokarda i cerebralne konvulzije zbog tromboze, hipertenzivna encefalopatija, i aplazija crvenih krvnih ćelija. Vidi, npr., Singibarti (1994) J. Clin Investig 72(suppl 6), S36-S43; Horl et al. (2000) Nephrol Dial Transplant 15(suppl 4), 51-56; Delanty et al. (1997) Neurology 49, 686-689; i Bunn (2002) N Engl J Med 346(7), 522-523).
14
[0336] Pod uslovom da jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice predmetne objave deluju drugačijim mehanizmima nego EPO, ovi antagonisti mogu biti korisni za povećanje nivoa crvenih krvnih ćelija i hemoglobina kod pacijenata koji ne odgovaraju dobro na EPO. Na primer, jednograni heteromultimerni kompleks receptora TGF-beta natporodice predmetne objave može biti koristan za pacijenta kod kojeg primena normalne do povišene doze EPO (>300 IU/kg/nedeljno) ne rezultuje porastom nivoa hemoglobina do ciljnog nivoa. Pacijenata sa neodgovarajućim odgovorom na EPO ima u sva tri tipa anemija, ali veći broj onih koji ne odgovaraju zapaža se posebno često među pacijentima sa kancerima i pacijentima sa završnim stupnjevima oboljenja bubrega. Neodgovarajući odgovor na EPO može biti ili konstitutivan (zapažen posle prvog tretmana korišćenjem EPO) ili stečen (zapažen posle ponovljenog EPO tretmana).
[0337] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava obezbeđuje postupke za kontrolisanje pacijenta koji je bio lečen ili je kandidat da bude lečen jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, merenjem jednog ili više pacijentovih hematoloških parametara. Hematološki parametri mogu se koristiti za evaluaciju pogodnog doziranja za pacijenta koji je kandidat da bude lečen antagonistom predmetne objave, za praćenje hematoloških parametara tokom tretmana, za evaluaciju da li je potrebno podešavati dozu tokom tretmana jednim ili većim brojem antagonista objave, i/ili za evaluaciju odgovarajuće doze održavanja za jednog ili više antagonista objave. Ako jedan ili više hematoloških parametara odstupa od normalnog nivoa, doziranje jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može se smanjiti, odložiti ili okončati.
[0338] Hematološki parametri koji se mogu meriti u skladu sa postupcima obezbeđenim u ovom tekstu uključuju, na primer, nivoe crvenih krvnih ćelija, krvni pritisak, rezerve gvožđa, i drugih sredstava koja se nalaze u telesnim tečnostima, koja koreliraju sa povišenim nivoima crvenih krvnih ćelija, korišćenjem postupaka poznatih u struci. Takvi parametri mogu se odrediti korišćenjem uzoraka pacijentove krvi. Porast nivoa crvenih krvnih ćelija, nivoa hemoglobina, i/ili nivoa hematokrita mogu dovesti do porasta krvnog pritiska.
[0339] U jednom primeru izvođenja, ako jedan ili više hematoloških parametara odstupa od normalnog nivoa, ili ako su na gornjoj granici normalnog kod pacijenta koji je kandidat da bude lečen jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, onda početak primene jednog ili većeg broja jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se odloži dok
14
se hematološki parametri ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo, prirodno ili posle terapijske intervencije. Na primer, ako je kandidatski pacijent hipertenzivan ili prehipertenzivan, onda pacijent može da se leči sredstvom za sniženje krvnog pritiska da bi mu se snizio krvni pritisak. Može se koristiti bilo koje sredstvo za sniženje krvnog pritiska pogodno za stanje datog pacijenta, uključujući, na primer, diuretike, adrenergičke inhibitore (uključujući alfa blokatore i beta blokatore), vazodilatatore, blokatore kalcijumskih kanala, inhibitore angiotenzin-konvertujućeg enzima (angiotensin-converting enzyme, ACE), ili blokatore angiotenzin-II receptora. Krvni pritisak može alternativno da se leči dijetom i režimom vežbanja. Slično tome, ako kandidatski pacijent ima rezerve gvožđa niže od normalnih, ili na donjoj granici normalnog, onda pacijent može da se leči odgovarajućim režimom dijete i/ili suplementima gvožđa dok se pacijentove rezerve gvožđa ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo. Za pacijente koji imaju nivoe crvenih krvnih ćelija i/ili nivoe hemoglobina više nego što je normalno, primena jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se odloži dok se nivoi ne vrate na normalan ili prihvatljiv nivo
[0340] U određenim primerima izvođenja, ako su jedan ili više hematoloških parametara izvan normalnog opsega ili na gornjoj granici normalnog, kod pacijenta koji je kandidat da bude lečen jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, početak primene ne mora da se odlaže. Međutim, dozna količina ili učestalost doziranja jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave mogu se podesiti na količinu koja bi smanjila rizik od neprihvatljivog porasta hematoloških parametara posle primene jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptorskih TGF-beta natporodice objave. Alternativno, za pacijenta se može razviti terapijski režim u kojem se jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptorskih TGF-beta natporodice objave kombinuje sa sredstvom za terapiju neželjenog nivoa hematološkog parametra. Na primer, ako pacijent ima povišen krvni pritisak, onda se može dizajnirati terapijski režim koji uključuje primenu jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave i sredstva za snižavanje krvnog pritiska. Za pacijenta čije su rezerve gvožđa niže od željenih, može se razviti terapijski režim sa jednim ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave i suplementom gvožđa.
[0341] U jednom primeru izvođenja, mogu se uspostaviti bazalni nivoi jednog ili više hematoloških parametara za pacijenta koji je kandidat za lečenje jednim ili većim brojem
14
jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave i na osnovu jedne ili više bazalnih vrednosti može se uspostaviti pogodni dozni režim za tog pacijenta. Alternativno, bazalne vrednosti parametara uspostavljene na osnovu pacijentove medicinske istorije, mogu se koristiti kao informacija za uspostavljanje doznog režima pogodnog za pacijenta. Na primer, ako zdrav pacijent ima uspostavljenu bazalnu vrednost krvnog pritiska koja je iznad definisanog normalnog opsega, ne mora biti neophodno da se pacijentov krvni pritisak dovede u opseg koji se smatra normalnim za opštu populaciju, pre tretmana jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave. Pacijentove bazalne vrednosti jednog ili više hematoloških parametara pre tretmana jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, mogu se koristiti kao relevantne komparativne vrednosti za praćenje eventualnih promena hematoloških parametara tokom tretmana jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave.
[0342] U određenim primerima izvođenja, jedan ili više hematoloških parametara mere se kod pacijenata koji su lečeni jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave. Hematološki parametri mogu se koristiti za praćenje pacijenta tokom tretmana i omogućavaju podešavanja ili okončanja doziranja jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave ili dodatno doziranje drugim terapijskim sredstvom. Na primer, ako primena jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave rezultuje porastom krvnog pritiska, nivoa crvenih krvnih ćelija, ili nivoa hemoglobina, ili smanjenjem rezervi gvožđa, onda doza jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se smanji po količini ili učestalosti doziranja da bi se samnjili efekti jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave na jedan ili više hematoloških parametara. Ako primena jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave rezultuje promenom jednog ili više hematoloških parametara koji su nepovoljni kod pacijenta, onda doziranje jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se prekine privremeno, dok se jedan ili više hematoloških parametara ne vrati na prihvatljivi nivo, ili trajno. Slično tome, ako se jedan ili više hematoloških parametara ne dovede u prihvatljivi opseg posle smanjenja doze ili frekvencije primene jednog ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta
14
natporodice objave, onda doziranje može da se prekine. Kao alternativa, ili dodatno, smanjenju ili prekidanju doziranja jednim ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, pacijent može biti doziran dodatnim terapijskim sredstvom namenjenim neželjenom nivou jednog ili više hematoloških parametara, kao što su, na primer, sredstvo za sniženje krvnog pritiska ili suplement gvožđa. Na primer, ako pacijent koji je tretiran jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave ima povišen krvni pritisak, doziranje jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se nastavi na istom nivou, a sredstvo za snižavanje krvnog pritiska se uključuje u režim lečenja, doziranje jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptorskih TGF-beta natporodice objave može da se smanji (npr., po količini ili učestalosti) a sredstvo za snižavanje krvnog pritiska se dodaje režimu lečenja, ili doziranje jednim ili većim brojem jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave može da se prekine i pacijent može da se leči sredstvom za snižavanje krvnog pritiska.
6. Farmaceutske kompozicije
[0343] U određenim aspektima, jednograni heteromultimerni kompleksi receptora TGF-beta natporodice predmetne objave mogu da se primene sami ili kao komponenta farmaceutske formulacije (označene i kao terapijska kompozicija ili farmaceutska kompozicija). Farmaceutska formulacija odnosi se na preparat koji je u formi koja omogućava efikasnu biološku aktivnost aktivnog sastojka (npr., sredstvo predmetne objave) sadržanog u njoj i koja ne sadrži dodatne komponente koje bi bile neprihvatljivo toksične za subjekta kod kojeg se formulacija primenjuje. Predmetno jedinjenje može da se formuliše za primenu bilo kojim načinom upotrebe pogodnim u humanoj ili veterinarskoj medicini. Na primer, jedno ili više sredstava predmetne objave može se formulisati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Farmaceutski prihvatljivi nosač odnosi se na sastojak farmaceutske formulacije, različit od aktivnog sastojka, koji obično nije toksičan za subjekta. Farmaceutski prihvatljivi nosač uključuje, ali se ne ograničava na pufer, ekscipijent, stabilizer, i/ili prezervans. Uopšteno, farmaceutske formulacije za upotrebu u predmetnoj objavi ne sadrže pirogene i imaju fiziološki prihvatljivu formu kada se primenjuju kod subjekta. Terapijski korisna sredstva različita od opisanih u ovom tekstu, koja mogu opciono da se uključe u formulaciju opisanu gore, mogu se primeniti u kombinaciji sa predmetnim sredstvima u postupcima predmetne objave.
14
[0344] U određenim primerima izvođenja, kompozicije će se primeniti parenteralno [npr., intravenskom (I.V.) injekcijom, intraarterijskom injekcijom, intrakostnom injekcijom, intramuskularnom injekcijom, intratekalnom injekcijom, supkutanom injekcijom, ili intradermalnom injekcijom]. Farmaceutske kompozicije pogodne za parenteralnu primenu mogu uključivati jedno ili više sredstava objave u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih sterilnih izotoničnih vodenih ili nevodenih rastvora, disperzija, suspenzija ili emulzija, ili sterilnih praškova koji mogu da se rekonstituišu u sterilne injektabilne rastvore ili disperzije, neposredno pre upotrebe. Injektabilni rastvori ili disperzije mogu sadržati antioksidante, pufere, bakteriostatike, suspendujuća sredstva, sredstva za zgušnjavanje, ili rastvore koji formulaciju čine izotoničnom sa krvlju primaoca kojem je namenjana. Primeri pogodnih vodenih i nevodenih nosača koji se mogu upotrebiti u farmaceutskim formulacijama predmetne objave uključuju vodu, etanol, poliole (npr., glicerol, propilen glikol, polietilen glikol, itd.), biljna ulja (npr., maslinovo ulje), injektabilne organske estre (npr., etil oleat), i njihove pogodne mešavine. Odgovarajuća fluidnost može da se održi, na primer, upotrebom oblažućih materijala (npr., lecitina), održavanjem željene veličine čestica u slučaju disperzija, i upotrebom surfaktanata.
[0345] U nekim primerima izvođenja, terapijski postupak predmetne objave uključuje primenu farmaceutske kompozicije sistemski, ili lokalno, iz implanta ili uređaja. Pored toga, farmaceutska kompozicija može biti inkapsulirana ili injektirana u formi za dostavu do ciljnog tkivnog mesta (npr., kostna srž ili mišić). U određenim primerima izvođenja, kompozicije predmetne objave mogu uključivati matriks koji može da dostavi jedno ili više sredstava predmetne objave do ciljnog tkivnog mesta (npr., kostna srž ili mišić), koji obezbeđuje strukturu za tkivo u razvoju i optimalno može da se resorbuje u telu. Na primer, matriks može obezbediti sporo oslobađanje jednog ili više sredstava predmetne objave. Takvi matriksi mogu da se formiraju od materijala koji su danas u upotrebi za druge implante koji se primenjuju u medicini.
[0346] Izbor matriksnog materijala može da se zasniva na jednom ili više od sledećeg: biokompatibilnost, biodegradabilnost, mehanička svojstva, kozmetički izgled, i osobine interfejsa. Posebna primena predmetnih kompozicija definisaće pogodnu formulaciju. Potencijalni matriksi za kompozicije mogu biti biodegradabilni i hemijski definisani kalcijum sulfat, trikalcijumfosfat, hidroksiapatit, polilaktična kiselina, i polianhidridi. Drugi potencijalni materijali su biodegradabilni i biološki dobro definisani uključujući, na primer, kolagen kosti ili kože. Drugi matriksi sačinjeni su od čistih proteina ili komponenti
1
vanćelijskog matriksa. Drugi potencijalni matriksi nisu biorazgradivi i hemijski definisani uključujući, na primer, sinterovani hidroksiapatit, biostaklo, aluminate, ili druge keramičke materijale. Matriksi mogu da se sastoje od kombinacija bilo kojeg od gore pomenutih materijala uključujući, na primer, polilaktičnu kiselinu i hidroksiapatit ili kolagen i trikalcijumfosfat. Biokeramički materijali mogu biti izmenjeni u kompozicijama (npr., kalcijum-aluminat-fosfat) i obrađeni tako da izmene jedno ili više od veličine pora, veličine čestica, oblika čestica, i biorazgradljivosti.
[0347] U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetne objave mogu da se primene površinski. "Površinska primena" ili "površinski" označava kontakt farmaceutske kompozicije sa površinama tela uključujući, na primer, kožu, mesta na kojima su rane, i mukozne membrane. Površinske farmaceutske kompozicije mogu biti u različitim formama primene i tipično uključuju sloj koji sadrži lek, prilagođen da se postavi blizu ili da bude u direktnom kontaktu sa tkivom na koje će se kompozicija površinski naneti. Farmaceutske kompozicije pogodne za površinsku primenu mogu uključivati jedan ili više jednogranih heteromultimernih kompleksa receptora TGF-beta natporodice objave, u kombinaciji formulisanoj u vidu tečnosti, gela, krema, losiona, masti, pene, paste, kita, u polučvrstom ili čvrstom stanju. Kompozicije u vidu tečnosti, gela, krema, losiona, masti, pene, paste, ili kita mogu se primeniti nanošenjem, naprskavanjem, razmazivanjem, utrljavanjem ili kotrljanjem kompozicije po ciljnom tkivu. Kompozicijama takođe mogu da se impregniraju sterilna gaza, transdermalni flasteri, gips, i zavoji. Kompozicije kita, polučvrstih ili čvrstih formi mogu biti podložne deformaciji. One mogu biti elastične ili neelastične (npr., fleksibilne ili rigidne). U određenim aspektima, kompozicija formira deo složenog materijala i može uključivati vlakna, čestice, ili veći broj slojeva sa istom ili različitim kompozicijama.
[0348] Površinske kompozicije u tečnoj formi mogu uključivati farmaceutski prihvatljive rastvore, emulzije, mikroemulzije, i suspenzije. Pored aktivnog sastojka(aka), tečna dozna forma može sadržati inertni razblaživač koji se obično koristi u struci uključujući, na primer, vodu ili drugi rastvarač, solubilišuće sredstvo i/ili emulgator [npr., etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, ili 1,3-butilen glikol, ulje (npr., ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslinovo ulje, ricinusovo ulje i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikol, masnokiselinski estar sorbitana, i njihove mešavine].
[0349] Površinski gel, krem, losion, mast, polučvrste ili čvrste kompozicije mogu uključivati jedno ili više sredstava za zgušnjavanje, kao što su polisaharid, sintetski polimer ili polimer na
1 1
bazi proteina. U jednom primeru izvođenja pronalaska, želatinizujuće sredstvo u ovom tekstu je ono koje je pogodno netoksično i daje željenu viskoznost. Sredstvo za zgušnjavanje može uključivati polimere, kopolimere, i monomere: vinilpirolidona, metakrilamida, akrilamida N-vinilimidazola, karboksi vinila, vinil estara, vinil etara, silicijum dioksida, polietilenoksida, polietileneglikola, vinilalkohola, natrijum akrilata, akrilata, maleinske kiseline, NN-dimetilakrilamida, diaceton akrilamida, akrilamida, akriloil morfolina, pluronika, kolagena, poliakrilamida, poliakrilata, polivinil alkohola, polivinilena, polivinil silikata, poliakrilata supstituisanih šećerom (npr., saharoza, glukoza, glukozamini, galaktoza, trehaloza, manoza, ili laktoza), acilamidopropana sulfonske kiseline, tetrametoksiortosilikata, metiltrimetoksiortosilikata, tetraalkoksiortosilikata, trialkoksiortosilikata, glikola, propilen glikola, glicerina, polisaharida, alginata, dekstrana, ciklodekstrina, celuloza, modifikovanih celuloza, oksidisanih celuloza, hitozana, hitina, guara, karagenana, hijaluronskih kiselina, inulina, skrobova, modifikovanih skrobova, agaroze, metilceluloza, biljnih smola, hijaluronana, hidrogelova, želatina, glikozaminoglikana, karboksimetil celuloza, hidroksietil celuloza, hidroksi propil metil celuloza, pektina, niskih metoksi pektina, unakrsno povezanih dekstrana, skrob-akrilonitrilnih graft-kopolimera, skrob-natrijum poliakrilata, hidroksietil metakrilata, hidroksil etil akrilata, polivinilena, polietilviniletara, polimetil metakrilata, polistirena, poliuretana, polialkanoata, polilaktičnih kiselina, polilaktata, poli(3-hidroksibutirata), sulfonisanih hidrogelova, AMPS (2-akrilamido-2-metil-1-propansulfonska kiselina), SEM (sulfoetilmetakrilat), SPM (sulfopropil metakrilat), SPA (sulfopropil akrilat), N,N-dimetil-N-metakriloksietil-N-(3-sulfopropil)amonijum betaina, amidopropil-dimetil amonijum sulfobetaina metakrilne kiseline, SPI (itakonska kiselina-bis(1-propil sulfonizacid-3) estar dikalijumova so), itakonskih kiselina, AMBC (3-akrilamido-3-metilbutanska kiselina), beta-karboksietil akrilata (dimeri akrilne kiseline), i polimera maleinskog anhidridametilvinil etra, njihovih derivata, njihovih soli, njihovih kiselina, i njihovih kombinacija. U određenim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije predmetne objave mogu se primeniti oralno, na primer, u formi kapsula, kašeta, pilula, tableta, lozengi (korišćenjem ukusne baze kao što su saharoza i akacija ili tragant), praškova, granula, rastvora ili suspenzije u vodenoj ili nevodenoj tečnosti, emulzije ulja u vodi ili vode u ulju, ili eliksira ili sirupa, ili pastila (uz korišćenje inertne baze, kao želatin i glicerin, ili saharoza i akacija), i/ili vodice za usta, svaka sadrži unapred određenu količinu jedinjenja predmetne objave i opciono jedan ili više drugih aktivnih sastojaka. Jedinjenje predmetne objave i opciono jedan ili više drugih aktivnih sastojaka mogu se primeniti i kao bolus, elektuarijum ili pasta.
1 2
[0350] U čvrstim doznim formama za oralnu primenu (npr., kapsule, tablete, pilule, dražeje, praškovi, i granule), jedno ili više jedinjenja predmetne objave mogu se pomešati sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača uključujući, na primer, natrijum citrat, dikalcijum fosfat, potporno sredstvo ili ekstender (npr., skrob, laktoza, saharoza, glukoza, manitol, i silicijumova kiselina), povezivač (npr. karboksimetilceluloza, alginat, želatin, polivinil pirolidon, saharoza, i akacija), humektant (npr., glicerol), dezintegrišuće sredstvo (npr., agaragar, kalcijum karbonat, krompirov ili tapiokin skrob, alginska kiselina, silikat, i natrijum karbonat), sredstvo za usporavanje rastvaranja (npr. parafin), ubrzivač apsorpcije (npr. kvaternarno amonijum-jedinjenje), sredstvo za vlaženje (npr., cetil alkohol i glicerol monostearat), apsorbent (npr., kaolin i bentonitna glina), lubrikans (npr., talk, kalcijum stearat, magnezijum stearat, čvrsti polietilen glikoli, natrijum lauril sulfat), sredstvo za bojenje, i njihove mešavine. U slučaju kapsula, tableta i pilula, farmaceutska formulacija (kompozicija) može sadržati i puferišuće sredstvo. Čvrste kompozicije sličnog tipa mogu se upotrebiti i kao punila za meke i tvrde želatinske kapsule za punjenje uz korišćenje jednog ili više ekscipijenata uključujući, npr., laktozu ili mlečni šećer kao i polietilen glikol velike molekulske težine.
[0351] Tečne dozne forme za oralnu primenu farmaceutske kompozicije mogu uključivati farmaceutski prihvatljive emulzije, mikroemulzije, rastvore, suspenzije, sirupe, i eliksire. Pored aktivnog sastojka(aka) tečna dozna forma može sadržati inertni razblaživač koji se često koristi u struci, na primer, vodu ili drugi rastvarač, solubilizujuće sredstvo i/ili emulgator [npr., etil alkohol, izopropil alkohol, etil karbonat, etil acetat, benzil alkohol, benzil benzoat, propilen glikol, ili 1,3-butilen glikol, ulje (npr., ulje semena pamuka, kikirikija, kukuruza, klica, maslinovo ulje, ricinusovo ulje i susamovo ulje), glicerol, tetrahidrofuril alkohol, polietilen glikol, masnokiselinski estar sorbitana, i njihove mešavine]. Pored inertnih rastvarača, oralna formulacija može uključivati i adjuvans uključujući, na primer, sredstvo za vlaženje, emulgujuće i suspendujuće sredstvo, zaslađivač, sredstvo za poboljšanje ukusa, sredstvo za bojenje, sredstvo za poboljšanje mirisa, prezervans, i njihove kombinacije.
[0352] Suspenzije, pored aktivnih jedinjenja, mogu sadržati suspendujuća sredstva uključujući, na primer, etoksilisani izostearil alkohol, polioksietilen sorbitol, estar sorbitana, mikrokristalnu celulozu, aluminijum metahidroksid, bentonit, agar-agar, tragant, i njihove kombinacije.
1
[0353] Sprečavanje delovanja i/ili rasta mikroorganizama može se obezbediti uvođenjem različitih antibakterijskih i antigljivičnih sredstava uključujući, na primer, paraben, hlorobutanol, i fenol sorbinsku kiselinu.
[0354] U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno uključiti izotonično sredstvo uključujući u kompozicije, na primer, šećer ili natrijum hlorid. Pored toga, produžena apsorpcija injektabilne farmaceutske forme može se postići uvođenjem sredstva koje odlaže apsorpciju uključujući, na primer, aluminijum monostearat i želatin.
[0355] Podrazumeva se da će dozni režim odrediti nadležni lekar uzimajući u obzir različite faktore koji modifikuju delovanje jednog ili više sredstava predmetne objave. U slučaju jednogranih heteromultimernih receptorskih kompleksa TGF-beta natporodice, koji promovišu formiranje crvenih krvnih ćelija, različiti faktori mogu uključivati, ali se ne ograničavaju na broj crvenih krvnih ćelija kod pacijenta, nivo hemoglobina, željeni ciljni broj crvenih krvnih ćelija, pacijentovu starost, pacijentov pol, pacijentovu ishranu, jačinu bilo koje bolesti koja može doprineti sniženom nivou crvenih krvnih ćelija, vremenu primene i drugim kliničkim faktorima. Dodavanje drugih poznatih aktivnih sredstava konačnoj kompoziciji takođe može uticati na doziranje. Napredovanje se može pratiti periodičnom procenom jednog ili više od nivoa crvenih krvnih ćelija, nivoa hemoglobina, nivoa retikulocita, i drugih pokazatelja procesa hematopoeze.
[0356] U određenim primerima izvođenja, predmetna objava takođe obezbeđuje gensku terapiju za in vivo proizvodnju jednog ili više sredstava predmetne objave. Takva terapija bi svoj terapijski efekat postizala uvođenjem sekvence sredstva u ćelije ili tkiva koji imaju jedan ili više poremećaja navedenih ranije u ovom tekstu. Dostava sekvenci sredstava može se postići, na primer, korišćenjem rekombinantnog ekspresionog vektora kao što je himerni virus ili koloidni disperzioni sistem. Poželjna terapijska dostava jedne ili više sekvenci sredstva objave je upotreba ciljajućih lipozoma.
[0357] Različiti virusni vektori koji se mogu upotrebiti za gensku terapiju o kojoj uči ovaj tekst uključuju adenovirus, herpes virus, vacinija, ili RNK virus (npr., retrovirus). Retrovirusni vektor može biti derivat mišjeg ili ptičjeg retrovirusa. Primeri retrovirusnih vekotra u kojima jedan strani gen može da se insertuje uključuju, ali se ne ograničavaju na: virus Moloney mišje leukemije (Moloney murine leukemia virus, MoMuLV), virus Harvey mišjeg sarkoma (Harvey murine sarcoma virus, HaMuSV), mišji virus tumora dojke (murine mammary tumor virus, MuMTV), i virus Rous sarkoma (Rous Sarcoma Virus, RSV). Dodatni brojni retrovirusni vektori mogu inkorporisati više gena. Svi ovi vektori mogu da prenesu ili
1 4
inkorporišu gen za selektabilni marker tako da transdukovane ćelije mogu da se identifikuju i generišu. Retrovirusni vektori mogu da se učine specifičnim za cilj prikačinjanjem, na primer, šećera, glikolipida, ili proteina. Poželjno ciljanje se obavlja korišćenjem antitela. Stručnjaci u oblasti prepoznaće da specifične polinukleotidne sekvence mogu da se insertuju u retrovirusni genom ili prikače za virusni omotač da bi se omogućila ciljno-specifična dostava retrovirusnog vektora koji sadrži jedno ili više sredstava predmetne objave.
[0358] Alternativno, ćelije kulture tkiva mogu direktno da se transfektuju plazmidima koji kodiraju retrovirusne strukturne gene (gag, pol, i env), konvencionalnom transfekcijom u prisustvu kalcijum fosfata. Ove ćelije se zatim transfektuju vektorskim plazmidom koji sadrži gene od interesa. Rezultujuće ćelije oslobađaju retrovirusni vektor u medijum za kulturu.
[0359] Sledeći ciljajući dostavni sistem za jednu ili više sredstava predmetne objave je koloidni disperzioni sistem. Koloidni disperzioni sistemi uključuju, na primer, makromolekulske komplekse, nanokapsule, mikrosfere, perlice, i sisteme bazirane na lipidima uključujući emulzije ulja u vodi, micele, mešovite micele, i lipozome. U određenim primerima izvođenja, poželjni koloidni sistem ove objave je lipozom. Lipozomi su veštačke membranske vezikule korisne kao dostavni prenosnici in vitro i in vivo. RNK, DNK, i intaktni virioni mogu da se inkapsuliraju u vodenu unutrašnjost i da se dostave ćelijama u biološki aktivnoj formi. Vidi, npr., Fraley, et al. (1981) Trends Biochem. Sci., 6:77. Postupci za efikasan genski transfer korišćenjem lipozomskog prenosnika poznati su u struci. Vidi, npr., Mannino, et al. (1988) Biotechniques, 6:682, 1988.
[0360] Kompozicija lipozoma je obično kombinacija fosfolipida, koja može uključivati steroid (npr. holesterol). Fizičke karakteristike lipozoma zavise od pH, jonske snage, i prisustva dvovalentnih katjona. Drugi fosfolipidi ili drugi lipidi mogu takođe da se koriste uključujući, na primer fosfatidilno jedinjenja (npr., fosfatidilglicerol, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanolamin, sfingolipid, cerebrozid, i gangliozid), fosfatidilholin jajeta, dipalmitoilfosfatidilholin, i distearoilfosfatidilholin. Usmeravanje lipozoma moguće je i na osnovu specifičnosti za organ, specifičnosti za ćelije, i specifičnosti za organelu i poznato je u struci.
PRIMERI
[0361] Pronalazak koji je sada uopšteno opisan, lakše će se razumeti pozivanjem na sledeće primere koji su ovde uključeni jedino u cilju ilustrovanja određenih primera izvođenja predmetnog pronalaska, i nisu namenjeni ograničavanju pronalaska.
1
Primer 1. Stvaranje i karakterizacija jednogranog ActRIIB-Fc heterodimera
[0362] Podnosioci su konstruisali rastvorljivi jednograni ActRIIB-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ActRIIB fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid, i njihove sekvence date su u nastavku.
[0363] Postupak za promociju formiranja ActRIIB-Fc:Fc heteromernih kompleksa pre nego ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc ili Fc:Fc homodimernih kompleksa je uvođenje promena u aminokiselinskoj sekvenci Fc domena za vođenje formiranja asimetričnih heteromernih kompleksa. Mnogi različiti pristupi pravljenja asimetričnih interakcionih parova uz klorišćenje Fc domena opisani su u ovoj objavi.
[0364] U jednom pristupu, ilustrovanom u polipeptidnim sekvencama ActRIIB-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 104-106, odnosno 137-139, jedan Fc domen je izmenjen da bi se na strani interakcije uvele katjonske amino-kiseline, dok je drugi Fc domen izmenjen da bi se na strani interakcije uvele anjonske amino-kiseline. ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid, svaki, koriste lider tkivnog plazminogen aktivatora (TPA): MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP (SEQ ID NO: 100).
[0365] ActRIIB-Fc polipeptidna sekvenca (SEQ ID NO: 104) prikazana je dole:
[0366] Liderska (signalna) sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIB-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ActRIIB-Fc:ActRIIB-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena kisele amino-kiseline lizinom) mogu se uvesti u Fc domen ActRIIB fuzionog proteina što je označeno tako što je podvučeno dvostrukom linijom gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 104 može se opciono obezbediti sa uklonjenim C-terminalnim lizinom (K).
1
[0367] Ovaj ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom sekvencom nukleinske kiseline (SEQ ID NO: 105):
[0368] Zreli ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 106) je kako sledi i može se opciono obezbediti sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
1
[0369] Komplementarni humani G1Fc polipeptid (SEQ ID NO: 137) koristi TPA lider i sledi u nastavku:
[0370] Liderska sekvenca je podvučena, i opciona N-terminalna ekstenzija Fc polipeptida je označen tako što je dvostruko podvučena. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIB-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim reziduama) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 137 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0371] Komplementarni Fc polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 138).
1
[0372] Sekvenca zrelog monomernog Fc polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 139) i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0373] ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 106, odnosno SEQ ID NO: 139, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ActRIIB-Fc:Fc.
[0374] U drugom pristupu promocije formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da bi se uvele komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza, kao što je ilustrovano sekvencama ActRIIB-Fc i monomernog Fc polipeptida SEQ ID NO: 403-404, odnosno 425-426.
[0375] ActRIIB-Fc polipeptidna sekvenca (SEQ ID NO: 403) koristi TPA lider i prikazana je u nastavku:
[0376] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIB-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu se uvesti u Fc domen fuzionog proteina što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 403 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0377] Zreli ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid je kako sledi:
1
[0378] Komplementarna forma monomernog Fc polipeptida (SEQ ID NO: 425) koja koristi TPA lider je kako sledi.
[0379] Liderska sekvenca je podvučena, i opciona N-terminalna ekstenzija Fc polipeptida je označena tako što je dvostruko podvučana. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIB-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 425 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0380] Zrela monomerna Fc polipeptidna sekvenca (SEQ ID NO: 426) je kako sledi i može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0381] ActRIIB-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 404, odnosno SEQ ID NO: 426, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ActRIIB-Fc:Fc.
1
[0382] Prečišćavanje različitih ActRIIB-Fc:Fc kompleksa može se izvršiti nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0383] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog ActRIIB-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom ActRIIB-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni ActRIIB-Fc i homodimerni ActRIIB-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli, u kojoj su stope disocijacije liganda (ligand off-rates, kd) tipično udružene sa najefikasnijim zadržavanjem liganda označene sivom senkom.
[0384] Ovi uporedni podaci o vezivanju pokazuju da jednograni ActRIIB-Fc ima veću selektivnost prema ligandu nego homodimerni ActRIIB-Fc. Dok se ActRIIB-Fc homodimer snažno vezuje za pet važnih liganada (vidi klaster aktivin A, aktivin B, BMP 10, GDF8, i
1 1
GDF11 na Sl. 6), jednograni ActRIIB-Fc lakše pravi razliku među ovim ligandima. Dakle, jednograni ActRIIB-Fc snažno se vezuje za aktivin B i GDF11 i sa intermedijarnom snagom za GDF8 i aktivin A. U dodatnom kontrastu sa ActRIIB-Fc homodimerom, jednograni ActRIIB-Fc pokazuje samo slabo vezivanje za BMP10 i ne vezuje se sa BMP9. Vidi Sliku 6.
[0385] Ovi rezultati ukazuju na to da je jednograni ActRIIB-Fc selektivniji antagonist nego ActRIIB-Fc homodimer. Prema tome, jednograni ActRIIB-Fc biće korisniji od ActRIIB-Fc homodimera u određenim primenama za koje je takav selektivan antagonizam pogodan. Primeri uključuju terapijske primene u kojima je poželjno zadržati antagonizam jednog ili više od aktivina A, aktivina B, GDF8, i GDF11, ali na najmanju meru svesti antagonizam jednog ili više od BMP9, BMP10, BMP6, i GDF3. Selektivna inhibicija liganada u prvoj grupi bila bi terapijski posebno pogodna jer oni čine potporodicu koja teži da se funkcionalno razlikuje od druge grupe i njoj pridruženog seta kliničkih stanja.
Primer 2. Stvaranje i karakterizacija jednogranog ALK3-Fc heterodimera
[0386] Podnosioci su konstruisali rastvorljivi jednograni ALK3-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK3 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK3-Fc fuzioni polipeptid, i njihove sekvence date su u nastavku.
[0387] Formiranje jednogranog ALK3-Fc heterodimera može biti vođeno pristupom sličnim onom koji je opisan za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK3-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 122-124, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonskeh amino-kiseline na strani interakcije.
[0388] ALK3-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1 2
[0389] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK3-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK3-Fc:ALK3-Fc ili Fc:Fc, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog proteina što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 122 može opciono da se obezbedi sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0390] Ovaj ALK3-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 123).
1
[0391] Sekvenca zrelog ALK3-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 124) i može se opciono obezbediti sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0392] Komplementarni humani G1Fc polipeptid (SEQ ID NO: 140) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0393] Liderska sekvenca je podvučena, i opciona N-terminalna ekstenzija Fc polipeptida označena je tako što je dvostruko podvučena. Da bi se promovisalo formiranje ALK3-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije
1 4
(zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid što je gore označeno tako što je dvostruko podvučeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može se opciono obezbediti sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0394] Komplementarni Fc polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 141).
[0395] Sekvenca monomernog Fc polipeptida je sledeća (SEQ ID NO: 142) i može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0396] ALK3-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 124, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije da bi dali jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK3-Fc:Fc.
[0397] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionisanih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu
1
komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kao što je ilustrovano u polipeptidnim sekvencama ALK3-Fc i Fc SEQ ID NO: 415-416, odnosno 427-428.
[0398] ALK3-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 415) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0399] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK3-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK3 fuzionog polipeptida označene su tako što su dvostruko podvučene gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 415 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0400] Zreli ALK3-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 416) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0401] Komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koja koristi TPA lider je kako sledi:
1
[0402] Liderska sekvenca je podvučena, i opciona N-terminalna ekstenzija Fc polipeptida je označena tako što je dvostruko podvučena. Da bi se promovisalo formiranje ALK3-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0403] Sekvenca zrelog monomernog Fc polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 428) i može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0404] ALK3-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 416, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni kompleks koji uključuje ALK3-Fc:Fc.
[0405] Prečišćavanje različitih ALK3-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0406] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog ALK3-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom ALK3-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni ALK3-Fc i homodimerni ALK3-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli, u
1
kojoj su stope disocijacije liganda (kd) tipično udružene sa najefikasnijim zadržavanjem liganda označene sivom senkom.
[0407] Ovi uporedni podaci pokazuju da jednograni ALK3-Fc ima veću selektivnost prema ligandu nego homodimerni ALK3-Fc. Dok jednograni ALK3-Fc heterodimer zadržava izuzetno čvrsto vezivanje za BMP4 zapaženo sa ALK3-Fc homodimerom, on ispoljava smanjenu snagu vezivanja za BMP2 i time bolje pravi razliku između BMP4 i BMP2 (i dalje
1
jako vezivanje) bego ALK3-Fc homodimer. Jednograni ALK3-Fc takođe bolje pravi razliku između BMP5 (srednje vezivanje), GDF7 (slabo vezivanje), i GDF6 (bez vezivanja) u poređenju sa ALK3-Fc homodimerom koji vezuje ova tri liganda sa veoma sličnom snagom (srednja za sve). Vidi Sliku 7. Za razliku od konstrukata objavljenih u Primeru 1, ni jednograni ALK3-Fc ni homodimerni ALK3-Fc ne vezuju aktivine, GDF8, GDF11, ili BMP10.
[0408] Ovi rezultati dakle ukazuju na to da je jednograni ALK3-Fc selektivniji antagonist BMP4 nego što je to ALK3-Fc homodimer. Može se očekivati da jednograni ALK3-Fc antagonizuje BMP4 na bolje ciljani način - sa samnjenim efektima istovremenog antagonizovanja BMP2 ili BMP5 i posebno GDF6 ili GDF7 - u poređenju sa ALK3-Fc homodimerom. Prema tome, jednograni ALK3-Fc biće korisniji nego ALK3-Fc homodimer u određenim primenama u kojima je takav selektivni antagonizam pogodan. Primeri uključuju terapijske primene u kojima je poželjno zadržati antagonizam jednog ili više od BMP4, BMP2, i potencijalno BMP5, ali na najmanju meru svesti antagonizovanje jednog ili više od BMP6, GDF6, i GDF7.
Primer 3. Stvaranje i karakterizacija jednogranog ActRIIA-Fc heterodimera
[0409] Podnosioci su konstruisali solubilni jednograni ActRIIA-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ActRIIA fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid, i njihove sekvence date su u nastavku.
[0410] Formiranje jednogranog ActRIIA-Fc heterodimera može biti vođeno pristupom sličnim onom koji je opisan za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ActRIIA-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 101-103, odnosno 137-139, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske aminokiseline na strani interakcije, dok je drugi Fc domen izmenjen da se uvedu anjonske aminokiseline na strani interakcije.
[0411] ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid koristi TPA lider i ima sekvencu kako sledi:
1
[0412] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIA-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ActRIIA-Fc:ActRIIA-Fc ili Fc-Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 101 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0413] Ovaj ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 102).
1
[0414] Sekvenca zrelog ActRIIA-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 103) i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0415] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 137) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIA-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim reziduama) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 137 može opciono biti obezbeđena bez C-terminalnog lizina. Komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 138, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 139) može opciono biti obezbeđen sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0416] ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 103, odnosno SEQ ID NO: 139, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koi uključuje ActRIIA-Fc:Fc.
[0417] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionisanih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kao što je ilustrovano u polipeptidnim sekvencama ActRIIA-Fc i Fc SEQ ID NO: 401-402, odnosno 425-426.
[0418] ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 401) koji koristi TPA lider je kako sledi:
1 1
[0419] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIA-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida ActRIIA, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 401 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0420] Zreli ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 402) je kako sledi i može opciono biti obezbeđen sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0421] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 425) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ActRIIA-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 425 i zrelog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 426) može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0422] ActRIIA-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 402, odnosno SEQ ID NO: 426, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ActRIIA-Fc:Fc.
1 2
[0423] Prečišćavanje različitih ActRIIA-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se obavi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0424] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog ActRIIA-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom ActRIIA-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni ActRIIA-Fc i homodimerni ActRIIA-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli, u kojoj su stope disocijacije liganda (kd) tipično udružene sa najefikasnijim zadržavanjem liganda označene sivom senkom.
[0425] Ovi uporedni podaci pokazuju da jednograni ActRIIA-Fc ima drugačiju selektivnost prema ligandu nego homodimerni ActRIIA-Fc (i takođe različitu od jednogranog ActRIIB-Fc ili homomernog ActRIIB-Fc - vidi Primer 1). Dok ActRIIA-Fc homodimer pokazuje preferencijalno vezivanje za aktivin B u kombinaciji sa snažnim vezivanjem za aktivin A i GDF11, jednograni ActRIIA-Fc ima obrnutu preferenciju za aktivin A u odnosu na aktivin B u kombinaciji sa znatno pojačanom selektivnošću za aktivin A u odnosu na GDF11 (slabo
1
vezivanje). Vidi Sliku 8. Pored toga, jednograni ActRIIA-Fc u znatnoj meri zadržava intermedijarno vezivanje za GDF8 i BMP10 zapaženo sa ActRIIA-Fc homodimerom.
[0426] Ovi rezultati pokazuju da je jednograni ActRIIA-Fc heterodimer antagonist sa suštinski izmenjenom selektivnošću za ligand u poređenju sa ActRIIA-Fc homodimerom. Prema tome, jednograni ActRIIA-Fc biće korisniji nego ActRIIA-Fc homodimer u određenim primenama za koje je takav antagonizam pogodan. Primeri uključuju terapijske primene u kojima je poželjno antagonisati aktivin A preferencijalno u odnosu na aktivin B uz minimiziranje antagonisanja GDF11.
[0427] Navedeni primeri zajedno pokazuju da receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II, kada se stave u kontekst jednogranog heteromernog proteinskog kompleksa, formiraju nove vezujuće džepove koji pokazuju izmenjenu selektivnost u odnosu na svaki tip homomernog proteinskog kompleksa, omogućavajući formiranje novih proteinskih sredstava za moguću upotrebu kao terapijskih sredstava.
Primer 4. Stvaranje i karakterizacija jednogranog BMPRII-Fc heterodimera
[0428] Podnosioci su konstruisali solubilni jednograni BMPRII-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog BMPRII fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno BMPRII-Fc fuzioni polipeptid, i sekvence svakog od njih date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne BMPRII-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen BMPRII izoforma A (SEQ ID NO: 72).
[0429] Formiranje jednogranog BMPRII-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama BMPRII-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 107-109, odnosno 137-139, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske aminokiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske aminokiseline na strani interakcije.
[0430] BMPRII-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1 4
[0431] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje BMPRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (BMPRII-Fc:BMPRII-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 107 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0432] Ovaj BMPRII-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 108).
1
[0433] Sekvenca zrelog BMPRII-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 109) i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0434] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 137) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje BMPRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim reziduama) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 137 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 138, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 139) može opciono biti obezbeđen sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0435] BMPRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 103, odnosno SEQ ID NO: 139, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje BMPRII-Fc:Fc.
[0436] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu
1
komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u BMPRII-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 405-406, odnosno 425-426.
[0437] BMPRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 405) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0438] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje BMPRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u Fc domen BMPRII fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 405 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0439] Zreli BMPRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 406) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0440] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 425) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje BMPRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid
1
kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 425 i zreli Fc polipeptid (SEQ ID NO: 426) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0441] BMPRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 406, odnosno SEQ ID NO: 426, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleksa koji uključuje BMPRII-Fc:Fc.
[0442] Prečišćavanje različitih BMPRII-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0443] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog BMPRII-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom BMPRII-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni BMPRII-Fc i homodimerni BMPRII-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli.
Vezivanje liganda jednogranim BMPRII-Fc u poređenju sa BMPRII-Fc homodimerom
1
[0444] Ovi uporedni podaci o vezivanju uukazuju na to da jednograni BMPRII-Fc heterodimer zadržava vezivanje samo za podgrupu liganada koji se vezuju BMPRII-Fc homodimerom. Posebno, dok jednograni BMPRII-Fc heterodimer zadržava vezivanje za BMP10 i BMP15, vezivanje za BMP9 je suštinski eliminisano.
Primer 5. Stvaranje jednogranog MISRII-Fc heterodimera
[0445] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog MISRII-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog MISRII fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno MISRII-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne MISRII-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen MISRII izoforma 2 ili 3 (SEQ ID NO: 76, 80).
[0446] Formiranje jednogranog MISRII-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama MISRII-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 110-112, odnosno 137-139, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0447] MISRII-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1
[0448] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje MISRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (MISRII-Fc:MISRII-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 110 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0449] Zrela MISRII-Fc fuziona polipeptidna sekvenca je sledeća (SEQ ID NO: 112) i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0450] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 137) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje MISRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim reziduama) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 137 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 138, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 139) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0451] MISRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 112, odnosno SEQ ID NO: 139, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji sadrži MISRII-Fc:Fc.
1
[0452] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u MISRII-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 407-408, odnosno 425-426.
[0453] MISRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 407) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0454] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje MISRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u Fc domen MISRII fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 407 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0455] Zreli MISRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 408) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0456] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 425) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje MISRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih
1 1
kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 425 i zreli Fc polipeptid (SEQ ID NO: 426) mogu opciono biti obezbeđene sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0457] MISRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 408, odnosno SEQ ID NO: 426, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje MISRII-Fc:Fc.
[0458] Prečišćavanje različitih MISRII-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
Primer 6. Stvaranje i karakterizacija jednogranog TGFβRII-Fc heterodimera
[0459] Podnosioci su konstruisali solubilni jednograni TGFβRII-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog TGFβRII (kratka izoforma SEQ ID NO: 43) fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid, i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne TGFβRII-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen TGFβRII izoforma A (SEQ ID NO: 68) kao i jednograne TGFβRII-Fc komplekse u kojima vanćelijski domen kanonskog TGFβRII (kratka izoforma, SEQ ID NO: 43) ili onaj iz TGFβRII izoforma A (SEQ ID NO: 68) sadrži insert od 36 aminokiselina (SEQ ID NO: 95) izveden iz TGFβRII izoforma C, kako je opisano u ovom tekstu.
[0460] Formiranje jednogranog TGFβRII-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama TGFβRII-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 113-115, odnosno 137-139, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske aminokiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske aminokiseline na strani interakcije.
[0461] TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1 2
[0462] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje TGFβRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (TGFβRII-Fc: TGFβRII-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 113 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0463] Ovaj TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 114).
1
[0464] Sekvenca zrelog TGFβRII-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 115) i može se opciono obezbediti sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0465] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 137) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje TGFβRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim reziduama) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 137 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 138, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 139) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
1 4
[0466] TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 115, odnosno SEQ ID NO: 139, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje TGFβRII-Fc:Fc.
[0467] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u TGFβRII-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 409-410, odnosno 425-426.
[0468] TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 409) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0469] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje TGFβRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u Fc domen TGFβRII fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 409 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom
[0470] Zreli TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 410) je kako sledi i može opciono biti obezbeđen sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
1
[0471] Kako je opisano u Primeru 1, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 425) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje TGFβRII-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 425 i zreli Fc polipeptid (SEQ ID NO: 426) mogu opciono biti obezbeđeni sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0472] TGFβRII-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 410, odnosno SEQ ID NO: 426, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje TGFβRII-Fc:Fc.
[0473] Prečišćavanje različitih TGFβRII-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0474] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog TGFβRII-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom TGFβRII-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni TGFβRII-Fc i homodimerni TGFβRII-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli.
Vezivanje liganda jednogranim TGFβRII-Fc u poređenju sa TGFβRII-Fc homodimerom
* Neodređeno zbog prolazne prirode interakcije
Primer 7. Stvaranje i karakterizacija jednogranog ALK1-Fc heterodimera
[0475] Podnosioci su konstruisali solubilni jednograni ALK1-Fc heterodimerni kompleks koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK1 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa
1
linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti označeni su kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK1-Fc fuzioni polipeptid, i sekvenca svakog od njih data je u nastavku.
[0476] Formiranje jednogranog ALK1-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK1-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 116-118, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiselinena strani interakcije.
[0477] ALK1-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0478] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK1-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK1-Fc:ALK1-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 116 može opciono da se obezbedi sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0479] Ovaj ALK1-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 117).
1
[0480] Sekvemca zrelog ALK1-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 118) i može opciono biti obezbeđena sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0481] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK1-Fc:Fc heterodimera pre nego nekog od mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu se uvesti u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno.
1
Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono biti obezbeđena sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0482] ALK1-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 118, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijskih linija dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK1-Fc:Fc.
[0483] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u polipeptidnim sekvencama ALK1-Fc i Fc SEQ ID NO: 411-412, odnosno 427-428.
[0484] ALK1-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 411) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0485] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK1-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK1 fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 411 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0486] Sekvenca zrelog ALK1-Fc fuzionog polipeptida (SEQ ID NO: 412) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
1
[0487] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK1-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zrelog Fc polipeptida (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0488] ALK1-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 412, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK1-Fc:Fc.
[0489] Prečišćavanje različitih ALK1-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0490] Biacore™-bazirani test vezivanja koristi se za upoređivanje selektivnosti za vezivanje sa ligandom jednogranog ALK1-Fc heterodimernog kompleksa opisanog gore sa onom ALK1-Fc homodimernog kompleksa. Jednograni ALK1-Fc i homodimerni ALK1-Fc nezavisno se kaptiraju na sistem korišćenjem anti-Fc antitela. Ligandi se injektiraju i ostave se da protiču preko kaptiranog receptorskog proteina. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli u kojoj su stope disocijacije liganda (kd) tipično udružene sa sa najefikasnijim zadržavanjem liganda označene sivom senkom.
1
[0491] Ovi uporedni podaci za vezivanje ukazuju na to da jednograni ALK1-Fc ima izmenjenu selektivnost prema ligandu u poređenju sa homodimernim ALK1-Fc. Jednograni ALK1-FRc zadržava snažno vezivanje sa BMP10 zapaženo za homodimerni ALK1-Fc dok se sa BMP9 vezuje manje čvrsto nego ALK1-Fc homodimer, jer je stopa disocijacije BMP9 vezivanja za jednograni ALK1-Fc približno 10-struko brža nego što je za njegovo vezivanje sa homodimernim AK1-Fc. Ovi rezultati pokazuju da je jednograni ALK1-Fc selektivniji antagonist od ActRIIB-Fc homodimera. Prema tome, jednograni ALK1-Fc biće korisniji od homodimernog ALK1-Fc u određenim primenama za koje je pogodan takav selektivni antagonizam. Primeri uključuju terapijske primene u kojima je poželjno zadržati antagonizovanje BMP10, ali smanjiti antagonizovanje BMP9.
Primer 8. Stvaranje jednogranog ALK2-Fc heterodimera
[0492] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog ALK2-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK2 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK2-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku.
[0493] Formiranje jednogranog ALK2-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK2-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 119-121, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0494] ALK2-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1 1
[0495] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK2-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK2-Fc:ALK2-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 119 može opciono da se obezbedi dodavanjem lizina na C-terminusu.
[0496] Ovaj ALK2-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 120).
1 2
[0497] Sekvenca zrelog ALK2-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 121) i opciono može se obezbediti sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0498] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK2-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0499] ALK2-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 121, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu se koeksprimirati i prečistiti iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK2-Fc:Fc.
[0500] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je
1
ilustrovano u polipeptidnim sekvencama ALK2-Fc i Fc SEQ ID NO: 413-414, odnosno 427-428.
[0501] ALK2-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 413) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0502] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK2-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK2 fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 413 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom
[0503] Zreli ALK2-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 414) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0504] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK2-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zreli Fc polipeptid (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
1 4
[0505] ALK2-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 414, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK2-Fc:Fc.
[0506] Prečišćavanje različitih ALK2-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
Primer 9. Stvaranje jednogranog ALK4-Fc heterodimera
[0507] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog ALK4-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK4 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK4-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne ALK4-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen ALK4 izoforma B (SEQ ID NO: 84).
[0508] Formiranje jednogranog ALK4-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK4-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 125-127, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0509] ALK4-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
1
[0510] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK4-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK4-Fc:ALK4-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 125 može opciono da se obezbedi dodavanjem lizina na C-terminusu.
[0511] Ovaj ALK4-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 126).
[0512] Sekvenca zrelog ALK4-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 127) i može opciono da se obezbedi sa lizinom dodatim na C-terminusu.
1
[0513] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK4-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0514] ALK4-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 127, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK4-Fc:Fc.
[0515] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u ALK4-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 417-418, odnosno 427-428.
[0516] ALK4-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 417) koji koristi TPA lider je kako sledi:
1
[0517] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK4-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK4 fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 417 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom
[0518] Zreli ALK4-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 418) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0519] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK4-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zreli Fc polipeptid (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0520] ALK4-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 418, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK4-Fc:Fc.
[0521] Prečišćavanje različitih ALK4-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
Primer 10. Stvaranje jednogranog ALK5-Fc heterodimera
[0522] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog ALK5-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-
1
terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK5 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK5-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne ALK5-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen ALK5 izoforma 2 (SEQ ID NO: 88).
[0523] Formiranje jednogranog ALK5-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK5-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 128-130, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja tako da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0524] ALK5-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0525] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK5-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK5-Fc:ALK5-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 128 može opciono da se obezbedi dodavanjem lizina na C-terminusu.
[0526] Ovaj ALK5-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 129).
1
[0527] Sekvenca zrelog ALK5-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 130) i može se opciono obezbediti sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0528] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK5-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska
2
sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc polipeptid (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0529] ALK5-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 130, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK5-Fc:Fc.
[0530] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza kako je ilustrovano u ALK5-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 419-420, odnosno 427-428.
[0531] ALK5-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 419) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0532] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK5-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK5 fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 419 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0533] Zreli ALK5-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 420) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
2 1
[0534] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK5-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zrelog monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0535] ALK5-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 420, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK5-Fc:Fc.
[0536] Prečišćavanje različitih ALK5-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
Primer 11. Stvaranje jednogranog ALK6-Fc heterodimera
[0537] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog ALK6-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je vanćelijski domen humanog ALK6 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK6-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne ALK6-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju vanćelijski domen ALK6 izoforma 2 (SEQ ID NO: 92).
[0538] Formiranje jednogranog ALK6-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu,
2 2
ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK6-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 131-133, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0539] ALK6-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0540] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK6-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK6-Fc:ALK6-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida, što je naznačeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 131 može opciono da se obezbedi dodavanjem lizina na C-terminusu.
[0541] ALK6-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 132).
2
[0542] Sekvenca zrelog ALK6-Fc fuzionog polipeptida je kako sledi (SEQ ID NO: 133) i može opciono da se obezbedi sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0543] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK6-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim
2 4
lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc protein (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0544] ALK6-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 133, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK6-Fc:Fc.
[0545] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza, kako je ilustrovano u ALK6-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 421-422, odnosno 427-428.
[0546] ALK6-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 421) koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0547] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK6-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK6 fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 421 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0548] Zreli ALK6-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 422) je kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
2
[0549] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK6-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zrelog monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0550] ALK6-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 422, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK6-Fc:Fc.
[0551] Prečišćavanje različitih ALK6-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
Primer 12. Stvaranje jednogranog ALK7-Fc heterodimera
[0552] Podnosioci predviđaju konstruisanje solubilnog jednogranog ALK7-Fc heterodimernog kompleksa koji uključuje monomerni Fc polipeptid sa kratkom N-terminalnom ekstenzijom i drugi polipeptid u kojem je N-terminalno skraćeni (NΔ4) vanćelijski domen humanog ALK7 fuzionisan sa zasebnim Fc domenom, sa linkerom smeštenim između vanćelijskog domena i ovog drugog Fc domena. Pojedinačni konstrukti su označeni kao monomerni Fc polipeptid, odnosno ALK7-Fc fuzioni polipeptid i njihove sekvence date su u nastavku. Podnosioci takođe predviđaju dodatne jednograne ALK7-Fc heterodimerne komplekse koji uključuju druge N-terminalno skraćene varijante (npr., NΔ5 varijanta) ALK7 izoforma 1 (SEQ ID NO: 313), vanćelijski domen ALK7 izoforma 2 (SEQ ID NO: 302), ili nativne obrađene sekvence ALK7 izoforma 3 i 4 (SEQ ID NO: 306, 310).
2
[0553] Formiranje jednogranog ALK7-Fc heterodimera može biti vođeno pristupima sličnim onima koji su opisani za jednograni ActRIIB-Fc heterodimer u Primeru 1. U prvom pristupu, ilustrovanom polipeptidnim sekvencama ALK7-Fc i monomernog Fc SEQ ID NO: 134-136, odnosno 140-142, jedan Fc domen se menja da se uvedu katjonske amino-kiseline na strani interakcije, dok se drugi Fc domen menja da se uvedu anjonske amino-kiseline na strani interakcije.
[0554] ALK7-Fc fuzioni polipeptid koji koristi TPA lider je kako sledi:
[0555] Liderska i linkerska sekvenca su podvučene. Da bi se promovisalo formiranje ALK7-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa (ALK7-Fc:ALK7-Fc ili Fc:Fc), dve aminokiselinske supstitucije (zamena lizina anjonskim amino-kiselinama) mogu da se uvedu u Fc domen fuzionog polipeptida, kako je naznačeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 134 može opciono da se obezbedi dodavanjem lizina na C-terminusu.
[0556] Ovaj ALK7-Fc fuzioni polipeptid kodiran je sledećom nukleinskom kiselinom (SEQ ID NO: 135).
2
[0557] Očekuje se da je sekvenca zrelog ALK7-Fc fuzionog polipeptida kako sledi (SEQ ID NO: 136) i može opciono da se obezbedi sa lizinom dodatim na C-terminusu.
[0558] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 140) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK7-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena anjonskih rezidua lizinima) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 140 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom. Ovaj komplementarni Fc polipeptid kodiran je nukleinskom kiselinom SEQ ID NO: 141, i zreli monomerni Fc protein (SEQ ID NO: 142) može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
2
[0559] ALK7-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 136, odnosno SEQ ID NO: 142, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK7-Fc:Fc.
[0560] U drugom pristupu za promociju formiranja heteromultimernih kompleksa korišćenjem asimetričnih Fc fuzionih polipeptida, Fc domeni se menjaju da se uvedu komplementarne hidrofobne interakcije i dodatna međumolekulska disulfidna veza, kako je ilustrovano u ALK7-Fc i Fc polipeptidnim sekvencama SEQ ID NO: 423-424, odnosno 427-428.
[0561] ALK7-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 423) koristi TPA lider i ima sledeću sekvencu:
[0562] Liderska sekvenca i linker su podvučeni. Da bi se promovisalo formiranje ALK7-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, četiri aminokiselinske supstitucije mogu da se uvedu u Fc domen ALK7 fuzionog polipeptida, što je označeno tako što je dvostruko podvučeno gore. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 423 može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0563] Očekuje se da je zreli ALK7-Fc fuzioni polipeptid (SEQ ID NO: 424) kako sledi i može opciono da se obezbedi sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
2
[0564] Kako je opisano u Primeru 2, komplementarna forma monomernog humanog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 427) koristi TPA lider i inkorporiše opcionu N-terminalnu ekstenziju. Da bi se promovisalo formiranje ALK7-Fc:Fc heterodimera pre nego mogućih homodimernih kompleksa, dve aminokiselinske supstitucije (zamena serina cisteinom i treonina triptofanom) mogu da se uvedu u monomerni Fc polipeptid, kako je naznačeno. Aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO: 427 i zrelog monomernog G1Fc polipeptida (SEQ ID NO: 428) mogu opciono da se obezbede sa uklonjenim C-terminalnim lizinom.
[0565] ALK7-Fc fuzioni polipeptid i monomerni Fc polipeptid SEQ ID NO: 424, odnosno SEQ ID NO: 428, mogu da se koeksprimiraju i prečiste iz CHO ćelijske linije dajući jednograni heteromerni proteinski kompleks koji uključuje ALK7-Fc:Fc.
[0566] Prečišćavanje različitih ALK7-Fc:Fc kompleksa moglo bi se postići nizom koraka hromatografije na koloni, uključujući, na primer, tri ili više od sledećeg, bilo kojim redom: hromatografija na proteinu A, hromatografija na Q sefarozi, heomatografija na fenilsefarozi, hromatografija zasnovana na veličini čestica, i katjonska izmenjivačka hromatografija. Prečišćavanje može da se završi filtracijom virusa i promenom pufera.
[0567] Ovi primeri zajedno pokazuju da receptorski polipeptidi tipa I ili tipa II, kada se smeste u kontekst jednogranog heteromernog proteinskog kompleksa, formiraju nove vezujuće džepove koji pokazuju izmenjenu selektivnost u odnosu na homodimerni kompleks istog receptorskog polipeptida, čime se omogućava formiranje novih proteinskih sredstava koja bi se mogla upotrebljavati kao terapijska sredstva.
21

Claims (15)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Proteinski kompleks, koji uključuje prvi polipeptid kovalentno ili nekovalentno udružen sa drugim polipeptidom, naznačen time što:
a. prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu prvog člana interakcionog para i aminokiselinsku sekvencu receptorskog polipeptida tipa II TGFβ natporodice, gde je receptorski polipeptid tipa II TGFβ natporodice ActRIIB polipeptid, pri čemu ActRIIB polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 85% identična sa amino-kiselinama 29-109 SEQ ID NO: 1, i pri čemu prvi polipeptid uključuje leucin na aminokiselinskoj poziciji koja odgovara poziciji 79 SEQ ID NO: 1; i
b. drugi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu drugog člana interakcionog para, i gde drugi polipeptid ne uključuje receptorski polipeptid tipa II TGFβ natporodice;
pri čemu je prvi član interakcionog para Fc koji uključuje multimerizacioni domen, i pri čemu je drugi član interakcionog para Fc koji uključuje multimerizcioni domen i pri čemu je ActRIIB polipeptid sposoban za vezivanje sa GDF8 i/ili GDF11.
2. Proteinski kompleks iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što receptorski polipeptid tipa II TGFβ natporodice je ActRIIB polipeptid koji uključuje, sastoji se ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence koja je:
a. najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa bilo kojom od sekvenci SEQ ID No: 1, 2, 3, 4, 5, i 6; ili
b. najmanje 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa polipeptidom koji počinje bilo kojom od amino-kiselina 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, ili 29 SEQ ID NO: 1, i završava se bilo kojom od amino-kiselina 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 SEQ ID NO: 1.
3. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-2, naznačen time, što je proteinski kompleks rekombinantni heterodimer.
4. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-3, naznačen time, što prvi član interakcionog para uključuje prvi konstantni region iz teškog lanca IgG, i/ili gde drugi član interakcionog para uključuje drugi konstantni region iz teškog lanca IgG.
5. Proteinski kompleks iz patentnog zahteva 4, naznačen time, što je konstantni region Fc domen imunoglobulina.
6. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-5, naznačen time, što prvi polipeptid i/ili drugi polipeptid uključuje jednu ili više modifikovanih aminokiselinskih rezidua koje se biraju između: glikozilovane amino-kiseline, PEGilisane amino-kiseline, farnezilovane amino-kiseline, acetilisane amino-kiseline, biotinsane amino-kiseline, amino-kiseline konjugovane sa lipidnom komponentom, i amino-kiseline konjugovane sa organskim derivatizujućim sredstvom.
7. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-6, naznačen time, što proteinski kompleks ima jednu ili više od sledećih karakteristika: i) vezuje se sa ligandom TGF-beta natporodice sa KDmanjom ili jednakom 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, ili 10<-10>M; i ii) inhibira transdukciju ćelijskih signala posredovanih receptorima tipa I i/ili tipa II TGF-beta natporodice.
8. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-7, naznačen time, što se proteinski kompleks vezuje sa jednim ili više od: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, aktivin A, aktivin B, aktivin C, aktivin E, aktivin AB, aktivin AC, aktivin AE, aktivin BC, ili aktivin BE.
9. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-8, naznačen time, što proteinski kompleks inhibira aktivnost jednog ili više liganada TGF-beta natporodice u testu baziranom na ćelijama; pri čemu se ligand TGF-beta natporodice bira između: BMP10, GDF8, GDF11/BMP11, aktivina A, aktivina B, aktivina C, aktivina E, aktivina AB, aktivina AC, aktivina AE, aktivina BC, ili aktivina BE.
10. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-9, naznačen time, što ActRIIB polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa amino-kiselinama 29-109 SEQ IDNO: 1.
11. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-10, naznačen time, što ActRIIB polipeptid uključuje amino-kiseline 29-109 SEQ ID NO: 1.
12. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-11, naznačen time, što prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 404, i gde drugi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična sa SEQ ID NO: 426.
13. Proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-11, naznačen time, što prvi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 404, i gde drugi polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 426.
14. Proteinski kompleks iz patentnog zahteva 5, naznačen time, što je imunoglobulinski Fc domen Fc domen imunoglobulina IgG1.
15. Farmaceutski preparat, naznačen time, što uključuje proteinski kompleks iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-14 i farmaceutski prihvatljivi nosač.
21
RS20210481A 2015-04-06 2016-04-06 Jednograni fuzioni receptorski proteini tipa i i tipa ii i njihove upotrebe RS61728B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562143579P 2015-04-06 2015-04-06
US201562259422P 2015-11-24 2015-11-24
PCT/US2016/026275 WO2016164501A1 (en) 2015-04-06 2016-04-06 Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof
EP16777227.6A EP3280727B1 (en) 2015-04-06 2016-04-06 Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61728B1 true RS61728B1 (sr) 2021-05-31

Family

ID=57015654

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210481A RS61728B1 (sr) 2015-04-06 2016-04-06 Jednograni fuzioni receptorski proteini tipa i i tipa ii i njihove upotrebe

Country Status (21)

Country Link
US (3) US10358476B2 (sr)
EP (2) EP3865505A1 (sr)
JP (2) JP6810702B2 (sr)
KR (1) KR20170141215A (sr)
CN (3) CN113683708A (sr)
AU (2) AU2016246602B2 (sr)
CA (1) CA2981793A1 (sr)
CY (1) CY1124247T1 (sr)
DK (1) DK3280727T3 (sr)
ES (1) ES2864850T3 (sr)
HR (1) HRP20210411T1 (sr)
HU (1) HUE054180T2 (sr)
LT (1) LT3280727T (sr)
MA (1) MA53883A (sr)
MD (1) MD3280727T2 (sr)
PL (1) PL3280727T3 (sr)
PT (1) PT3280727T (sr)
RS (1) RS61728B1 (sr)
SI (1) SI3280727T1 (sr)
SM (1) SMT202100246T1 (sr)
WO (1) WO2016164501A1 (sr)

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10588980B2 (en) 2014-06-23 2020-03-17 Novartis Ag Fatty acids and their use in conjugation to biomolecules
CN113683708A (zh) 2015-04-06 2021-11-23 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
EP3280435B1 (en) 2015-04-06 2021-06-02 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
WO2017024171A1 (en) 2015-08-04 2017-02-09 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating myeloproliferative disorders
US20170306027A1 (en) 2016-04-06 2017-10-26 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
WO2017176938A1 (en) * 2016-04-06 2017-10-12 Acceleron Pharma, Inc. Bmprii polypeptides and uses thereof
AU2017296040C1 (en) 2016-07-15 2023-06-22 Acceleron Pharma Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
EP3522912A4 (en) 2016-10-05 2020-10-14 Acceleron Pharma Inc. HETEROMULTIMERS OF TYPE I AND TYPE II RECEIVERS OF THE TGF-BETA SUPERFAMILY AND THEIR USES
CN110678195A (zh) 2016-10-05 2020-01-10 阿塞勒隆制药公司 ALK4:ActRIIB异多聚体及其用途
AU2017338916B2 (en) 2016-10-05 2022-03-24 Acceleron Pharma Inc. Variant ActRIIB proteins and uses thereof
CA3043184A1 (en) 2016-11-10 2018-05-17 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
WO2018144542A1 (en) * 2017-02-01 2018-08-09 Acceleron Pharma Inc. TGFβ AND ACTRII ANTAGONISTS FOR USE IN INCREASING IMMUNE ACTIVITY
LT3628049T (lt) * 2017-05-04 2023-08-25 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta ii tipo receptoriaus sulieti baltymai ir jų panaudojimo būdai
EP3706777B1 (en) 2017-11-09 2024-05-22 Keros Therapeutics, Inc. Activin receptor type iia variants and methods of use thereof
WO2019136043A1 (en) * 2018-01-03 2019-07-11 Acceleron Pharma Inc. Single-arm co-receptor fusion proteins and uses thereof
IL320014A (en) 2018-01-12 2025-06-01 Keros Therapeutics Inc Activin receptor type iib variants and methods of use thereof
US12364736B2 (en) 2018-02-09 2025-07-22 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating heterotopic ossification
CN119431579A (zh) 2018-03-09 2025-02-14 艾吉纳斯公司 抗cd73抗体及其使用方法
AU2019262139A1 (en) * 2018-05-03 2020-11-26 Acceleron Pharma Inc. Multispecific binders of TGFβ-superfamily ligands and uses thereof
IL278546B2 (en) 2018-05-09 2026-03-01 Keros Therapeutics Inc Activin receptor type IIA variants and methods of using them
KR20210063348A (ko) * 2018-08-28 2021-06-01 이뮤노테크 바이오팜 씨오., 엘티디. 개선된 치료용 t 세포
EP3999527A4 (en) * 2019-07-18 2024-04-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center METHODS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING TGF-BETA SIGNALIZING IN CD4+ HELPER T CELLS FOR CANCER IMMUNOTHERAPY
WO2021119136A1 (en) * 2019-12-10 2021-06-17 Acceleron Pharma Inc. Single-arm actriia and actriib heteromultimers and methods for treating pulmonary hypertension
CN115515618A (zh) * 2020-03-13 2022-12-23 阿塞勒隆制药公司 用于治疗肾脏疾病或病症的单臂ActRIIA和ActRIIB异多聚体和方法
EP4121078A4 (en) 2020-03-20 2024-08-14 Keros Therapeutics, Inc. ACTIVIN RECEPTOR TYPE II CHIMERAS AND METHODS OF USE THEREOF
EP4121088A4 (en) 2020-03-20 2024-07-03 Keros Therapeutics, Inc. Methods of using activin receptor type iib variants
US20230174620A1 (en) 2020-04-28 2023-06-08 Acceleron Pharma Inc. Actrii proteins and use in treating post-capillary pulmonary hypertension
WO2021257655A1 (en) * 2020-06-17 2021-12-23 Acceleron Pharma Inc. Actrii-alk4 antagonists and methods of treating heart failure
CN112190694B (zh) * 2020-09-17 2023-11-10 南通大学 细胞因子活化素c在治疗神经病理性疼痛方面的应用

Family Cites Families (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0105014B1 (en) 1982-09-24 1992-05-20 THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by the Secretary United States Department of Commerce Repair of tissue in animals
US5080891A (en) 1987-08-03 1992-01-14 Ddi Pharmaceuticals, Inc. Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5198346A (en) 1989-01-06 1993-03-30 Protein Engineering Corp. Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides
US5096815A (en) 1989-01-06 1992-03-17 Protein Engineering Corporation Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
US7592428B1 (en) 1992-11-17 2009-09-22 Ludwig Institute For Cancer Research Antibodies which bind specifically to activin receptor like kinases
US5677196A (en) 1993-05-18 1997-10-14 University Of Utah Research Foundation Apparatus and methods for multi-analyte homogeneous fluoro-immunoassays
US5525490A (en) 1994-03-29 1996-06-11 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Reverse two-hybrid method
US5814565A (en) 1995-02-23 1998-09-29 University Of Utah Research Foundation Integrated optic waveguide immunosensor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
EP0830459B1 (en) 1995-04-11 2007-01-24 The General Hospital Corporation Reverse two-hybrid systems
US20020062010A1 (en) 1997-05-02 2002-05-23 Genentech, Inc. Method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
JP2003517580A (ja) 1999-01-21 2003-05-27 メタモーフイクス・インコーポレーテツド 増殖分化因子インヒビター及びそれらの用途
US20040223966A1 (en) 2002-10-25 2004-11-11 Wolfman Neil M. ActRIIB fusion polypeptides and uses therefor
WO2005028517A2 (en) * 2003-05-09 2005-03-31 The General Hospital Corporation SOLUBLE TGF-β TYPE III RECEPTOR FUSION PROTEINS
AU2004274433B2 (en) 2003-09-15 2010-08-12 Research Development Foundation Cripto antagonism of activin and TGF-beta signaling
BRPI0406605B8 (pt) * 2003-11-13 2021-05-25 Hanmi Holdings Co Ltd conjugado de proteína, método para a preparação do mesmo e composição farmacêutica para intensificar a duração e estabilidade in vivo de um polipeptídeo fisiologicamente ativo
JP2008507288A (ja) 2004-07-23 2008-03-13 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ＡｃｔＲＩＩ受容体ポリペプチド、方法、および組成物
BRPI0618947B1 (pt) 2005-11-23 2022-07-19 Acceleron Pharma Inc Polipeptídeo actriia que se liga à ativina, polinucleotídeo isolado, polinucleotídeo recombinante, métodopara preparar um polipeptídeo actriia que se liga à ativina, preparação farmacêutica e uso de uma proteína de fusão actriia-fc para promover o crescimento ósseo e inibir a ressorção óssea
WO2007147901A1 (en) 2006-06-22 2007-12-27 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
KR20170012582A (ko) 2006-11-02 2017-02-02 악셀레론 파마 인코포레이티드 Ａｌｋ１ 수용체 및 리간드 길항제 및 그의 용도
TWI584815B (zh) * 2007-02-01 2017-06-01 艾瑟勒朗法瑪公司 活化素-ＡｃｔＲＩＩａ拮抗劑及其治療或預防乳癌之用途
TW201627320A (zh) 2007-02-02 2016-08-01 艾瑟勒朗法瑪公司 衍生自ＡｃｔＲＩＩＢ的變體與其用途
TW201718635A (zh) 2007-03-06 2017-06-01 安美基公司 變異之活動素受體多肽及其用途
WO2008113185A1 (en) 2007-03-19 2008-09-25 National Research Counsil Of Canada Antagonists of ligands and uses thereof
EP3663318A1 (en) 2008-01-07 2020-06-10 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
WO2010031168A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 National Research Council Of Canada HETERO-MULTIVALENT BINDING AGENTS FOR MEMBERS OF THE TGFβ SUPERFAMILY
CN105963695A (zh) * 2008-05-02 2016-09-28 阿塞勒隆制药公司 用于调节血管发生和周细胞包裹的基于alk1拮抗剂的方法和组合物
KR20110031951A (ko) 2008-06-26 2011-03-29 악셀레론 파마 인코포레이티드 액티빈-ａｃｔｒｉｉａ의 길항물질 및 적혈구 수준을 증가시키기 위한 이들의 용도
DK3750552T5 (da) 2008-08-14 2024-08-26 Acceleron Pharma Inc Gdf-fælder
US8216997B2 (en) 2008-08-14 2012-07-10 Acceleron Pharma, Inc. Methods for increasing red blood cell levels and treating anemia using a combination of GDF traps and erythropoietin receptor activators
PE20150680A1 (es) * 2008-11-26 2015-05-16 Amgen Inc Variantes de polipeptidos receptores de activina iib y aplicaciones de estos
CN102548617B (zh) 2009-03-30 2017-11-07 阿塞勒隆制药公司 Bmp‑alk3拮抗剂和促进骨生长的用途
CN107267520A (zh) 2009-06-12 2017-10-20 阿塞勒隆制药公司 截短的actriib‑fc融合蛋白
CN102712696A (zh) 2009-09-16 2012-10-03 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含卷曲螺旋和/或系链的蛋白质复合体及其用途
FR2951408B1 (fr) 2009-10-15 2012-01-13 Renault Sa Cadre moteur pour moteur electrique de vehicule automobile
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
EP3260130B1 (en) * 2009-11-03 2021-03-10 Acceleron Pharma Inc. Methods for treating fatty liver disease
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
CN102850458B (zh) 2011-06-28 2014-10-01 华博生物医药技术（上海）有限公司 新型重组双功能融合蛋白及其制法和用途
WO2013149094A1 (en) 2012-03-28 2013-10-03 The Board Of Regents Of The University Of Texas System TGFβ TYPE II-TYPE III RECEPTOR FUSIONS
HK1225742A1 (zh) * 2013-08-22 2017-09-15 Acceleron Pharma, Inc. TGF-β受体II型变体及其用途
WO2016090035A2 (en) 2014-12-02 2016-06-09 La Jolla Institute For Allergy And Immunology Modulators of activin and methods for modulating immune responses and t follicular helper cells
CA2980757A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 Acceleron Pharma Inc. Follistatin-related fusion proteins and uses thereof
MA41919A (fr) 2015-04-06 2018-02-13 Acceleron Pharma Inc Hétéromultimères alk4:actriib et leurs utilisations
EP3280435B1 (en) 2015-04-06 2021-06-02 Acceleron Pharma Inc. Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
CN113683708A (zh) 2015-04-06 2021-11-23 阿塞勒隆制药公司 单臂i型和ii型受体融合蛋白和其用途
CA2983440C (en) 2015-04-22 2024-03-12 Alivegen Usa Inc. Novel hybrid actriib ligand trap proteins for treating muscle wasting diseases
WO2016205370A1 (en) 2015-06-15 2016-12-22 Santa Maria Biotherapeutics, Inc. Methods of using activin receptor iib-based proteins
US20200231652A1 (en) 2015-08-31 2020-07-23 National Research Council Of Canada Tgf-b-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
US20170306027A1 (en) 2016-04-06 2017-10-26 Acceleron Pharma Inc. Alk7 antagonists and uses thereof
AU2017293778B2 (en) 2016-07-07 2022-03-24 Acceleron Pharma Inc. TGF-beta superfamily heteromultimers and uses thereof
US20180008672A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Anti-activin a antibodies and methods of use thereof for treating pulmonary arterial hypertension
CN110678195A (zh) 2016-10-05 2020-01-10 阿塞勒隆制药公司 ALK4:ActRIIB异多聚体及其用途
JOP20190085A1 (ar) 2016-10-20 2019-04-17 Biogen Ma Inc طرق علاج الضمور العضلي ومرض العظام باستخدام بروتينات احتجاز مركب ترابطي actriib هجين حديثة

Also Published As

Publication number Publication date
EP3280727A1 (en) 2018-02-14
LT3280727T (lt) 2021-04-12
CY1124247T1 (el) 2022-07-22
JP7203807B2 (ja) 2023-01-13
AU2021200906B2 (en) 2023-04-06
EP3865505A1 (en) 2021-08-18
EP3280727B1 (en) 2021-02-17
US20200055920A1 (en) 2020-02-20
CN107849114B (zh) 2021-08-20
US20160289298A1 (en) 2016-10-06
HK1252958A1 (zh) 2019-06-06
US11208460B2 (en) 2021-12-28
KR20170141215A (ko) 2017-12-22
DK3280727T3 (da) 2021-03-15
ES2864850T3 (es) 2021-10-14
WO2016164501A1 (en) 2016-10-13
JP6810702B2 (ja) 2021-01-06
JP2018517664A (ja) 2018-07-05
AU2016246602B2 (en) 2020-11-19
CA2981793A1 (en) 2016-10-13
JP2021054839A (ja) 2021-04-08
CN113683708A (zh) 2021-11-23
AU2016246602A1 (en) 2017-10-26
SI3280727T1 (sl) 2021-07-30
PT3280727T (pt) 2021-04-23
CN113683709A (zh) 2021-11-23
US20220315642A1 (en) 2022-10-06
MA53883A (fr) 2021-08-18
EP3280727A4 (en) 2019-02-13
HUE054180T2 (hu) 2021-08-30
CN107849114A (zh) 2018-03-27
HRP20210411T1 (hr) 2021-04-30
US10358476B2 (en) 2019-07-23
AU2021200906A1 (en) 2021-03-04
SMT202100246T1 (it) 2021-05-07
MD3280727T2 (ro) 2021-06-30
PL3280727T3 (pl) 2021-07-19
US12338273B2 (en) 2025-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7617962B2 (ja) バリアントＡｃｔＲＩＩＢタンパク質およびその使用
JP7203807B2 (ja) シングルアームｉ型およびｉｉ型受容体融合タンパク質およびその使用
EP3280435B1 (en) Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
JP7504947B2 (ja) Ｔｇｆ－ベータスーパーファミリーｉ型およびｉｉ型受容体ヘテロ多量体ならびにその使用
JP7159148B2 (ja) Ｔｇｆベータスーパーファミリーホモ多量体およびその使用
TW201813978A (zh) ＡＬＫ４：ＡｃｔＲＩＩＢ異多聚體及其用途
RS53455B (sr) VARIJANTE IZVEDENE IZ ActRIIB I NJIHOVE UPOTREBE
JP2019527547A5 (sr)
JP2018510637A (ja) フォリスタチン関連融合タンパク質およびその使用
HK40057061A (en) Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof
HK40078293A (en) Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
HK1248732B (en) Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof
HK1252958B (en) Single-arm type i and type ii receptor fusion proteins and uses thereof
WO2019136043A1 (en) Single-arm co-receptor fusion proteins and uses thereof
HK1248733B (en) Tgf-beta superfamily type i and type ii receptor heteromultimers and uses thereof
HK40011178A (zh) 变体actriib蛋白及其用途