RS61808B1 - Antitela i polipeptidi usmereni protiv cd127 - Google Patents

Antitela i polipeptidi usmereni protiv cd127

Info

Publication number
RS61808B1
RS61808B1 RS20210520A RSP20210520A RS61808B1 RS 61808 B1 RS61808 B1 RS 61808B1 RS 20210520 A RS20210520 A RS 20210520A RS P20210520 A RSP20210520 A RS P20210520A RS 61808 B1 RS61808 B1 RS 61808B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
antigen
cells
antibodies
Prior art date
Application number
RS20210520A
Other languages
English (en)
Inventor
Nicolas Poirier
Caroline Mary
Bernard Vanhove
Virginie Thepenier
Original Assignee
Ose Immunotherapeutics
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ose Immunotherapeutics filed Critical Ose Immunotherapeutics
Publication of RS61808B1 publication Critical patent/RS61808B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na oblast polipeptida i antitela korisnih u terapijskim i dijagnostičkim primenama koje ciljano deluju na CD 127, alfa lanac IL7 receptora, i naročito obezbeđuje humanizovana monoklonska antitela protiv CD 127, naročito humanog CD 127, njegovu terapijsku upotrebu i dijagnostičke primene.
Kratak opis pronalaska
[0002] Alfa lanac (ili podjedinica) receptora za irterleukin 7 (IL-7) označen je kao CD 127 ili p90 IL-7R ili IL-7Ralfa ili IL-7Rα (ponekada takođe označen kao IL-7Ra). U posebnom aspektu, antitela, posebno monoklonska antitela, obezbeđena ovde usmerena su protiv alfa lanca receptora za humani IL-7 eksprimiran na ljudskim ćelijama. U posebnom aspektu, ovde navedena antitela imaju antagonistička svojstva za interakciju IL-7-IL-7R, mogu da predstavljaju citotoksičnu aktivnost prema CD 127 pozitivnim ćelijama, ali ne povećavaju sazrevanje dendritskih ćelija (DCs) indukovanih TSLP-om. Posebno, ovde navedena antitela prepoznaju humani CD 127 etiop koji sadrži sekvence od 2b mesta CD127, posebno etiop sadrži humane CD 127 sekvence domena D1 i 2b mesta CD 127, posebno etiop sadrži najmanje jednu sekvencu iz D1 i najmanje jednu sekvencu sa 2b mesta, poželjno sa treće beta ravni 2b mesta CD 127. Alternativno ili pored toga, u posebnom aspektu, ovde navedena antitela ne indukuju internalizaciju CD 127 i/ili inhibiraju internalizaciju CD 127 izazvanu IL-7. U posebnomn aspektu, ovde pomenuta antitela su humanizovana i sadrže najmanje 80% i poželjno najmanje 84%, ili najmanje 85% ljudskih ostataka. U posebnom aspektu, ovde pomenuta antitela imaju brz efekat na efektorske memorijske T ćelije, dugotrajni efekat na efektorske memorijske T ćelije, ili, poželjno, brz i dugotrajan efekat na efektorske memorijske ćelije. U posebnom aspektu, ovde pomenuta antitela omogućavaju efikasnu proizvodnju. U posebnom aspektu, nivoi ekspresije CD 127, IL-7 i/ili TSLP mogu se meriti da bi se procenila verovatnoća odgovora, posebno koristeći ovde obezbeđena antitela protiv CD 127. Pored ovde obezbeđenih antitela, posebno kao alati za proizvodnju antitela i/ili za upotrebu sličnu pomenutim antitelima, su polipeptidi, posebno antitela sa varijabilnim domenima lakog lanca ili laki lanci antitela, fragmenti za vezivanje antigena i molekuli mimetici antitela od takvih antitela i polinukleotida.
[0003] Istraživači su pokušali da dobiju poboljšana humanizovana antitela u poređenju sa antitelima N13B2-h1, N13B2-h2 i N13B2-h3 otkrivenim u WO 2015/189302. Iako je poznato da su neki ostaci u okvirom regionu sekvenci varijabilnog domena, koji uključuju ostatke u Vernier-ovoj zoni, kanonske ostatke, ostatke na VH/VL interfejsu, itd., kritični u strukturi antitela i ne bi trebali biti mutitani da bi se sačuvala biohemijske i biološka aktivnost antitela, istraživači su iznenađujuće otkrili da neke mutacije unutar okvirnog regiona N13B2 sekvence varijabilnog domena lakog lanca, koji uključuje neke od takvih kritičnih ostataka, omogućavaju povećavanje sadržaja ljudskih ostataka (viših od N13B2-h3 i do 86,3%) i poboljšanu proizvodnju (do 4 puta veću od N13B2-h3) uz očuvanje svih funkcionalnih karakteristika.
[0004] Ove mutacije se sastoje od 16 aminokiselinskih supstitucija unutar okvirnog regiona sekvence N13B2 varijabilnog domena lakog lanca i posebno dodatno u supstituciji ostataka valina na poziciji 48 ostacima leucina (V48L) i/ili u supstituciji ostataka fenilaalanina na poziciji 87 ostacima tirozina (F87Y). Ove pozicije i bilo koje pozicije aminokiselina sa lanaca antitela pomenutih ovde, ukoliko nije drugačije naglašeno, obezbeđeni su pomoću brojanja po Kabatu. Ovde su obezbeđeni poboljšani varijabilni domeni lakih lanaca antitela koji se sastoje od sledećih sekvenci:
- SEQ ID Br: 9 (koja uključuje pomenute supstitucije 16 aminokiselina – pomenuti varijabilni domen lakog lanca antitela označen u daljem tekstu kao N 13B2-hVL3); - SEQ ID Br: 10 (koja uključuje pomenute supstitucije 16 aminokiselina i dodatno mutaciju V48L - pomenuti varijabilni domen lakog lanca antitela označen u daljem tekstu kao N13B2-hVL4);
- SEQ ID Br: 11 (koja uključuje pomenute supstitucije 16 aminokiselina i dodatno mutaciju F87Y - pomenuti varijabilni domen lakog lanca antitela označen u daljem tekstu kao N 13B2-hVL5); i
- SEQ ID Br: 12 (koja uključuje pomenute supstitucije 16 aminokiselina i dodatno obe mutacije V48L i F87Y – pomenuti varijabilni domen lakog lanca antitela označen u daljem tekstu kao N13B2-hVL6).
[0005] Stoga, varijabilni domen lakog lanca antitela označen u daljem tekstu kao N13B2-hVL3, sadrži CDRs N13B2- h3, pomenute supstitucije 16 aminokiselina i originalne ostatke N13B2 na kritičnim pozicijama 48 i 87 (tj., respektivno, V i F) unutar okvirnog regiona humanih sekvenci i ima sekvencu SEQ ID Br: 9. Varijabilni domen lakog lanac poželjnog poboljšanog antitela pomenutog ovde, označen kao N13B2-hVL6, koji sadrži dodatne dve mutcije V48L i F87Y, sastoji se od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 12.
[0006] Stručnjaci ne bi očekivali da bi pomenute mutacije, posebno na takvim pozicijama u okvirnim regionima varijabilnog domena lakog lanca, ostavile nepromenjen afinitet antitela sa CD 127: V48 je kanonski ostatak i F87 se nalazi na VH/VL interfejsu; očekuje se da mutacija takvih ostataka, koja je poznata stručnjacima i o kojoj se raspravlja u npr. Clark, 2014, utiče na afinitet i/ili stabilnost antitela. Kako je upotrebljen ovde, termin “kanonski” ostatak se odnosi na ostatak u CDR ili okvirnom regionu koji definiše određenu kanonsku strukturu CDR kako su definisali Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901- 907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992). Prema Chothia et al., kritični delovi CDRs mogih antitela imaju skoro identične konformacione okosnice peptida uprkos velikoj raznovrsnosti na nivou aminokiselinske sekvence. Svaka kanonska struktura precizira prvenstveno skup torzijskih uglova okosnice peptidna za susedni segment ostataka aminokiselina koji čine petlju. Nije bilo predvidljivo da bi uvođenje otkrivenih mutacija na obe pozicije rezultovalo poboljšanom proizvodnjom, uz istovremeno očuvanje karakeristika vezivanja i povoljno drugih funkcionalnih karakteristika antitela.
[0007] Shodno tome, ovde obezbeđen polipeptid je koristan posebno za proizvodnju takvih antitela, posebno varijabilnog domena lakog lanca antitela ili lakog lanca antitela, koji se sastoji od sekvence, posebno do 250 aminokiselina, koji sadrži ili se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br : 9; SEQ ID Br : 10; ili SEQ ID Br : 11; ili SEQ ID Br : 12, ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena ili njegovog molekula mimetika kako je ovde definisano. Pronalazak se odnosi na antitela ili njegov fragment za vezivanje antigena, posebno humanizovana monoklonska antitela, koji se specificno vezuju za CD 127, posebno za humani CD 127 i sadrži:
- laki lanac antitela koji sadrži ili varijabilni domen lakog lanca antitela koji se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 9; SEQ ID Br: 10; SEQ ID Br: 11; SEQ ID Br: 12; posebno SEQ ID Br: 12; i
- varijabilni domen teškog lanca antitela koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7.
U poželjnom primeru izvođenja, pronalazak se odnosi na antitela ili njegove fragmente za vezivanje antigena, ovde obezbeđene, posebno humanizovana monoklonska antitela, koja se specifično vezuju za humani CD 127, i sadrže:
- varijabilni domen lakog lanca koji se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 9, SEQ ID Br: 10, SEQ ID Br: 11 i SEQ ID Br: 12, posebno SEQ ID Br: 12; i
- varijabilnog domena teškog lanca koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7.
[0008] U posebnom aspektu, ovde obezbeđena antitela sadrže varijabilni domen lakog lanca kako je prethodno objašnjeno i konstantni domen koji se sastoji od sekvence odabrane uzmeđu SEQ ID Br: 27 ili 28, poželjno SEQ ID Br:27 i varijabilni domen teškog lanca kako je prethodno objašnjeno i konstantni domen koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br:26.
[0009] Takođe je ovde obezbeđen izolovani polipeptid koji se sastoji od sekvence do 250 aminokiselina, posebno do 217, do 214, do 211, poželjnije do 200, do 175, do 150, do 135, do 120, do 107 i čak još posebnije do 100, do 90, do 80, do 74, do 70, do 60 aminokiselina, pri čemu pomenuta sekvenca sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od:
- SEQ ID Br: 9 (CDRs N13B2-h3 unutar okvirnog regiona humanih sekvenci);
- SEQ ID Br: 10 (CDRs N13B2-h3 unutar okvirnog regiona humanih sekvenci, uključujući V48L mutaciju);
- SEQ ID Br: 11 (CDRs N13B2-h3 unutar okvirnog regiona humanih sekvenci, uključujući F87Y mutaciju);
- SEQ ID Br: 12 (CDRs N13B2-h3 unutar okvirnog regiona humanih sekvenci, uključujući obe V48L i F87Y mutacije); i
- njegov fragment za vezivanje antigena, posebno pomenuti fragment koji sadrži tri CDRs koje se sastoje od sekvenci prikazane u SEQ ID Br: 4, SEQ ID Br: 5 i SEQ ID Br: 6, posebnije fragment koji sadrži najmanje 74 aminokiselina koje se sastoje od aminokiselina 24 do 97 SEQ ID Br:12.
[0010] Ovde su takođe obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju ovde obezbeđene polipeptide, posebno antitela ili njihove fragmente za vezivanje antigena prema pronalasku. Takvi polinukleotidi posebno kodiraju polipeptide koji sadrže ili se sastoje od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Brojevi: 9 do 12 i takođe kodiraju polipeptide koji sadrže ili se sastoje od sekvence SEQ ID Br: 7, i mogu takođe kodirati polipeptide koji sadrže ili se sastoje od sekvenci odabranih iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Brojevi 26 do 28. Posebno, navedeni polinukleotidi sadrže ili se sastoje u kombinaciji od najmanje dve izolovane sekvence nukleinske kiseline (molekuli), prvi izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Brojevi:15 do 18; posebno SEQ ID Br. 18; pomenuta kombinacija koja takođe sadrži ili se sastoji od drugog izolovanog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 13 i SEQ ID Brojevi: 29 do 31, posebno SEQ ID Br.13.
[0011] Posebno, polipeptid prema pronalasku sadrži varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela, pomenuti polipeptid sadrži najmanje 84 % i posebnije najmanje 85 % humanih ostataka. Navedeni polipeptid može biti fragment za vezivanje antigena i/ili molekul mimetika antitela iz antitela otkrivenog ovde.
[0012] Ovde su takođe obezbeđene kompozicije koje sadrže pomenute polipeptide, posebno varijabilni domeni lakih lanaca antitela ili laki lanci antitela, antitela, njegov fragment za vezivanje antigena ili njegov molekul mimetik, postupci za dobijanje pomenutih antitela, molekula nukleinske kiseline koji kodiraju pomenute polipeptide i antitela i upotreba pomenutih polipeptida, antitela i kompozicija.
[0013] Shodno tome polipeptidi, varijabilni domeni lakih lanaca, laki lanci antitela, antitela, fragmenti za vezivanje antigena, molekuli mimetici antitela i kompozicija obezbeđeni ovde mogu biti namenjeni i/ili pogodni za upotrebu da bi se lečila dijagnostikovana stanja kod ljudi koja su rezultat patogeneze povezane sa limfopoezom, kada signalni putevi IL-7 doprinose navedenoj pateogenezi, posebno kada se povećava sazrevanje, preciznije povišena regulacija kostimulatornih molekula dendritskih ćelija je nepoželjna.
Detanjan opis pronalaska
Biohemija
[0014] CD127 je zajednički za IL-7 receptor (IL-7R) i za TSLP receptor (TSLPR). IL-7R je sastavljen od heterodimera CD127 i zajedničkog gama lanca (yc) interleukinskih receptora. Zajednički gama lanac yc se ponekada ovde pominje, i u literature, kao CD 132. IL-7R se vezuje interleukinom 7. TSLP receptor je heterodimer CD 127 i faktora 2 nalik citokinskom receptoru (CRLF2). TSLP receptor se vezuje TSLP-om. U literaturi, TSLPR se ponekada koristi da označi i CRLF2 lanac receptora, i CD127/CRLF2 komleks. Da bi se izbegla konfuzija, u nastavku TSLPR obično označava kompleks.
[0015] CD127 (švajcarski pristupni broj protokola P16871) može postojati u četiri izoforme. Kanonska izoforma, takođe nazvana H20 (švajcarski protokol P16871.1) je transmembranski protein koji jednom prolazi kroz membranu i ima 459 aminokiselina koje sadrže, od N- do C kraja, 20 aminokiselinskih signalnih peptida, 219 aminokiselinskih ekstracelularnih domena, 25 aminokiselinskih transmembranskih domena i 195 aminokiselinskih intracelularnih domena. Druge izoforme dele sekvencu svih (ili većine) ekstracelularnih domena H20 i prikazuju različite sekvence na C-kraju. Izoforme 2 i 4 se izlučuju (švajcarski protokol P16871 -4 i P16871 -3), dok je izoforma 3 (švajcarski protokol P16871-2) takođe transmembranski protein. Navodi se da CD 127 ima sekvencu SEQ ID Br: 21, i njegov ekstracelularni domen, kada se ukloni signalni peptid, ima sekvencu SEQ ID Br: 22. Ako nije drugačije naznačeno, ovde se koristi brojanje za aminokiseline CD127 brojanjem iz SEQ ID Br: 22.
[0016] CD127 je receptor homologe klase I receptora citokina (CRH I). Kao što je dobro poznato u tehnici, ekstracelularni domeni ovih receptora se sastoji od dva fibronektin 3 domena, nazvana D1 i D2. Precizna kristalna struktura CD127 je objavljena i diskutovana u npr. McElroy et al., 2009; McElroy et al., 2012 i Walsh, 2012 i posebno su otkriveni podaci o proteinskoj strukturi u bazi podataka Research Collaboratory for Structural Bioinformatics Protein Data Bank (RCSB PDB), sa pristupnim brojem 3UP1. Generalno se smatra da je D1 uključen u vezivanje sa IL-7, dok je D2 uključen u vezivanje sa yc lancem (i takođe sa IL-7). Važno je da mesto 2b domena D2 sadrži tri beta ravni uključujući sledeće sekvence SEQ ID Br. 32 (FDLSVIYRE); SEQ ID Br: 33 (NDFVVTFNTS) i SEQ ID Br: 34 (TKLTLLQR). Mesto 2b domena D2 stoga uključuje između 109 i 180 aminokiselina SEQ ID Br: 22 (videti Walsh, 2012; Verstraete, K. et al., Nature Com 2017). Mesto 2b domena D2 takođe može da se definiše kao uključeno između aminokiselina 109 i 173 SEQ ID Br.22. Mesto 2b domena D2 takođe može da se definiše kao uključeno između aminokiselina 113 i 180 SEQ ID Br.22. Mesto 2b domena 2b takođe može da se definiše kao uključeno između aminokiselina 113 i 173 SEQ ID Br. 22. Naročito, mesto 2b domena D2 sadrži, posebno se u osnovi sastoji od, aminokiselina 109 do 133 SEQ ID Br: 22, posebno 109 do 127, pri čemu su prve dve beta ravni lokalizovane; i aminokiseline 166 do 180 SEQ ID Br: 22, pri čemu je treća beta ravan lokalizovana. Preciznije, 2b mesto se u osnovi sastoji od aminokiselina 113 do 133, posebno 113 do 127, SEQ ID Br: 22 i aminokiselina 166 do 180 SEQ ID Br: 22. Preciznije, 2b mesto se u osnovi sastoji od aminokiselina 109 do 133, posebno 109 do 127, SEQ ID Br: 22 i aminokiselina 166 do 173 SEQ ID Br: 22. Preciznije, 2b mesto se u osnovi sastoji od aminokiselina 113 do 133, posebno 113 do 127, SEQ ID Br: 22 i aminokiselina 166 do 173 SEQ ID Br: 22. Mesto 2b domena D2 je kritično za CD127-yc interakciju, posebno za omogućavanje ili povećavanje vezivanja CD 127 sa yc u prisustvu IL-7. Posebno, smatra se da mutacije na P112 i L115, koje su identifikovane kod pacijenata koji pate od teške kombinovane imunodeficijencije (SCID) destabilizuju hidrofobno jezgro D2 domena što verovatno dovodi do njihovih patogenim osobinama. Kao što je prethodno rečeno, 2b mesto se u osnovi sastoji od aminokiselina 109 do 180 SEQ ID Br: 22, ili se u osnovi sastoji od aminokiselina 109 do 173 SEQ ID Br.22, ili se u osnovi sastoje od aminokiselina 113 do 180 SEQ ID Br.22, ili se u osnovi sastoje od aminokiselina 113 do 173 SEQ ID Br.22. Stručnjaci će proceniti da krajevi takvog domena ne moraju nužno biti jednoznačno definisani sa precinošću jedne baze i da se može podrazumevati da 2b mesto sadržiji jedan ili oba kraja pomenute sekvence (sekvenci), 1, 2, ili 3 više ili manje aminokiselina. Prema tome, kada se ovde poziva na 2b mesto CD127, trebalo bi podrazumevati da se odnosi na sekvencu CD127 koja počinje na poziciji 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili 113 i koja se završava na poziciji 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 ili 180 SEQ ID Br: 22; posebno na takvu sekvencu za koju se misli ili za koju se pokazalo da predstavlja suštinsko mesto vezivanja sa yc lancem IL7-R, posebno u prisustvu IL-7. Preciznije, kada se ovde poziva na 2b mesto CD 127 trebalo bi podrazumevati da se odnosi na senvencu CD 127 koja počinje na poziciji 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112 ili 113 i koja se završava na poziciji 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132 ili 133 SEQ ID Br: 22, ali takođe i na sekvencu CD127 koja počinje na poziciji 162, 163, 164, 165 ili 166 i koja se završava na poziciji 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179 ili 180 SEQ ID Br: 22. Treba napomenuti da tri beta ravni kako su ovde definisane mogu sadržati sekvence epitopa specifične za antitela ili fragmente za vezivanje antogena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku. Antitela, fragmenti za vezivanje antogena ili mimetici za vezivanje antigena prema pronalasku mogu biti u mogućnosti da se specifično vežu za SEQ ID Br: 32, SEQ ID Br: 33 i/ili SEQ ID Br: 34. Štaviše, aminokiselinska sekvenca koja sadrži najmanje deo jedne beta ravni i neke susedne aminokiseline lokalizovane na jednom kraju bilo koje beta ravni mogu takođe biti sekvenca epitopa specifična za antitelo prema pronalasku. Kao na primer, sekvenca SEQ ID Br: 35 (TLLQRKLQPAAMYEI) sadrži poslednjih pet aminokiselina treće beta ravni i deset dodatnih aminokiselina lokalizovanih izvan treće beta ravni. Kao drugi primer, SEQ ID Br. 96 (RKLQPAAM) sadrži jednu aminokiselinu lokalizovanu unutar treće beta ravni i sedam dodatnih aminokiselina lokalizovanih izvan treće beta ravni. Posebno, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu se specifično vezati za R173 SEQ ID Br: 22. Posebno, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu se specifično vezati za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 32; SEQ ID Br: 33; SEQ ID Br: 34, SEQ ID Br. 35 i SEQ ID Br. 96. Posebno, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu se specifično vezati za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 36 (LVEVKCLNFR); SEQ ID Br: 37 (ICGALVEVKCLNFR) i SEQ ID Br: 38 (LVEVKCLNFRK). Alternativno ili komplementarno, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu se specifično vezati za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 39 (KKFLLIG); SEQ ID Br: 40 (KKFLLIGKSNI) i SEQ ID Br: 41 (FIETKKFLLIG). SEQ ID Br: 36 do SEQ ID Br: 41 su lokalizovane unutar domena D1 CD 127 i sekvence epitopa se prepoznaju antitelom ili njegovim fragmentom za vezivanje antigena ili molekulom mimetikom antitela prema pronalasku. U alternativnom ili kompelemntarnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili molekul mimetik antitela prema pronalasku može se specifično vezati za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 42 (CLNFR) i SEQ ID Br: 43 (FIETKKF). Ove dve sekvence su sekvence epitopa smeštene unutar domena D1 CD127. U posebnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik antitela prema pronalasku može se specifično vezati za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 32; SEQ ID Br: 33; SEQ ID Br: 34, SEQ ID Br: 35 i SEQ ID Br.96, posebno iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br.34, SEQ ID Br. 35 i SEQ ID Br. 96; i najmanje jedne sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 36; SEQ ID Br: 37; SEQ ID Br: 38; SEQ ID Br: 39; SEQ ID Br: 40; SEQ ID Br: 41; SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43, posebno iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br.42 i SEQ ID Br.43. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena može se specifično vezati za SEQ ID Br 34 i najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br. 42 i SEQ ID Br. 43, posebno od SEQ ID Br. 42 i SEQ ID Br. 43. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu se specifično vezati za SEQ ID Br: 35 i najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43, posebno za SEQ ID Br.42 i SEQ ID Br.43. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena može se specifično vezati za SEQ ID Br: 96 i najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43, posebno sa SEQ ID Br.
42 i SEQ ID Br. 43. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu se specifično vezati za obe sekvence SEQ ID Br: 35 i SEQ ID Br: 96. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu se specifično vezati za obe sekvence SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu speciično da prepoznaju najmanje treću beta ravan mesta 2b domena D2 CD 127. Treća beta ravan se prvenstveno definiše kao lokalizovana između aminokiselina 166 i 173 SEQ ID Br: 22, što odgovara SEQ ID Br.34, i preciznije treća beta ravan odgovara SEQ ID Br. 34. U poželjnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu speciično da prepoznaju najmanje dve beta ravni smeštene unutar mesta 2b domena D2, i preciznije, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena prema pronalasku mogu speciično da prepoznaju tri beta ravni smeštene unutar mesta 2b domena D2 kako je prethodno definisano ovde. U poželjnijem primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu speciično da prepoznaju najmanje jednu beta ravan smeštenu unutar mesta 2b domena D2, posebno treću beta ravan koja odgovara SEQ ID Br.34, i vezuju se za najmanje jednu sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 36; SEQ ID Br: 37; SEQ ID Br: 38; SEQ ID Br: 39; SEQ ID Br: 40; SEQ ID Br: 41; SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43. U poželjnijem primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu speciično da prepoznaju najmanje treću beta ravan koja odgovara SEQ ID Br: 34, i najmanje jednoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 42 i SEQ ID Br: 43, posebno SEQ ID Br. 42 i SEQ ID Br. 43. U poželjnijem primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu speciično da prepoznaju linearni peptid ili linearni epitop koji se sastoji od aminokiselina SEQ ID Br: 35. Alternativno ili komplementarno, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu speciično da prepoznaju konformacioni peptid ili konformacioni epitop koji se sastoji od aminokiselinske sekvence ID Br. 96. U posebnijem primeru izvođenja, antitelo ili fragment za vezivanje antigena ili mimetik za vezivanje antigena mogu speciično da prepoznaju linearni epitop ili linearni peptid aminokiselinske sekvence SEQ ID Br: 35, i konformacioni epitop ili konformacioni peptid SEQ ID Br: 96.
1
[0017] Signalizacija IL-7R. Vezivanje IL-7 za IL-7R pokreće aktivaciju nekoliko signalnih puteva, uključujući Janus kinaze (JAK) -1 i -3, signalni transduktor i akivator transkripcije 5 (STAT5) i fosfatidil-inozitol 3- kinazu (PI3-k). Saopšteno je da su putevi STAT1 i STAT3 aktivirani, iako ne izgleda da su to glavni putevi. Aktivacija STAT5 je potrebna za indukciju anti-apoptotskog proteina Bcl- 2 i sprečavanje ulaska pro-apoptotskog proteina Bax u mitohondrije i time za preživljavanje prekursora T ćelija čije je razviće u timusu. Aktivacija PI3-k puta rezultuje fosforilacijom i zadržavanjem u citoplazmi pro-apoptotskog proteina Bad.
[0018] Signalizacija TSLPR. Timusni stromalni limfopoetin, (TSLP) je citokin epitelnih ćelija koji je aktivan u limfopoezi i posebno je uključen u regulaciju razvića ćelija imunog sistema, pomenuta regulacija posebno utiče na sazrevanje pomenutih ćelija. Humani TSLP (pristupni broj u banci gena AF338732) je faktor koji vrši polarizaciju dendritskih ćelija i promoviše proliferaciju i diferencijaciju T i B ćelija. TSLP takođe potiskuje stvaranje Treg ćelija (Lei et al., 2011).
[0019] Pokazano je da se signalni putevi indukovani sa TSLP na molekularnom nivou razlikuju od puteva indukovanih sa IL-7. Posebno, dok vezivanje TSLP za njegov receptor takođe aktivira Jak-1, on ne aktivira Jak-3 ali aktivira Jak-2. Ove razlike su u skladu sa zapažanjem da se Jak-1 povezuje sa CD 127, koji dele oba receptora, dok se Jak- 2 povezuje sa CRLF2, a Jak-3 sa yc (Rochman et al., 2010). Aktivacija STAT5 puta je takođe saopštena za signalizaciju indukovanu sa TSLP (Zhong et al., 2014). Jedan od glavnih efekata TSLP je da dovede do aktivacije dendritskih ćelija, koja indukuje prekomernu ekspresiju kostimulatornih molekula kao što je CD80, koji podstiču time inflamatorne odgovore posredovane sa TH-2 (Reche et al., 2001).
Biologija ćelija
[0020] „CD 127-pozitivne ćelije“ označavaju ćelije koje eksprimiraju CD 127 na površini njihove ćelije. U većini slučajeva, CD 127-pozitivne ćelije eksprimiraju CD 127 u kompleksu koji formira IL-7R (IL-7R pozitivne ćelije) i/ili u kompleksu koji formira TSLPR (TSLPR pozitivne ćelije). CD 127 se eksprimira u različitim ćelijama, uključujući memorijske i naivne T ćelije. CD 127 se posebno eksprimira efektorskim T ćelijama (Teff), uključujući T ćelije koje miruju i memorijske T ćelije, i nezrelim B ćelijama, ali se posebno ne eksprimira prirodnim regulatornim T ćelijama koje miruju (prorodni Treg). CD 127 je neophodan za podsticanje diferencijacije timocita i klonalnu ekspanziju limfocita.
[0021] Važnost puta IL7-CD127 za homeostazu naivnih T-ćelija podvučena je u nekoliko nedavnih studija koje pokazuju da nivoi ekspresije CD 127 vezanih za membranu na konvencionalnim CD4+ T ćelijama koreliraju sa frekvencijama nedavnih timusnih emigranata (RTE)- CD4+ T ćelija kod zdravih pojedinaca i pacijenata zaraženih HIV-om, kao i kod pacijenata sa MS (Albuquerque et al., 2007) (Broux et al., 2010). CD 127 je takođe komponenta TSLP receptora. Dokazano je da lučenje TSLP Hassall-ovim telašcima, strukturama koje se sastoje od epitelnih ćelija u meduli timusa, uslovljava CD11c<+>mijeloidne dendritske ćelije (MDCs) da indukuju diferencijaciju timocita u Treg (Watanabe et al., 2005a). Shodno tome, za razvoj Treg potrebni su signali iz receptora IL-7, kao što je pokazano kod CD127 nokaut miševa (Mazzucchelli et al., 2008). U (Haas et al., 2011), autori su pokazali smanjenu ekspresiju CD127 na konvencionalnim T ćelijama i povećane nivoe regulacije IL-7 u plazmi, zajedno sa smanjenjem nedavnih frekvencija timusog emigranta Treg i funkcije Treg u MS, bez jasnog genetičkog uticaja (Haas et al., 2011).
[0022] Razčlanjivanje kako IL-7 reguliše promet svojih srodnih membranskih receptora, presudno je za potpuno razumevanje uloge IL-7/IL-7R u funkciji limfocita. Prethodne studije su ukazale da stimulacija T ćelija sa IL-7 dovodi do smanjene modulacije površine CD 127 u roku od 30 minuta, verovatno zbog internalizacije receptora. Kasnije (2-6 sati) pokazano je da IL-7 indukuje smanjenu transkripcionu regulaciju CD127. Međutim, stvarna dinamika internalizacije CD 127 i regulacija mehanizma prometa pomoću IL-7 tek treba da se razjasni (Henriques et al., 2010). Takođe je ukazivano da signalizacija indukovana sa IL-7 zavisi od internalizacije CD127 i da se naknadna degradacija receptora oslanja na aktivnost JAK3 i da je posredovana proteazomima i lizozomima.
Fiziopatologija
[0023] Dendritske ćelije eksprimiraju visoke nivoe kostimulatornih molekula nakon sazrevanja, kao što je CD80, koji promovišu imune odgovore posredovane T ćelijama. Oni takođe proizvode citokin TARC (CCL 17), koji indukuje hemotaksu u T ćelijama. Kao takve, zrele dendrititčne ćelije doprinose fiziopatologiji nekoliko imunološki posredovanih bolesti gde su odgovori T ćelija važni, kao na primer kod astme, reumatoidnog artritisa, kolitisa, multipne skleroze i uveitisa. Zrele dendritske ćelije takođe imaju ključnu ulogu u postupku odbacivanja ćelija, tkiva ili alotransplantata organa. Stoga, mnoge terapijske strategije imaju za cilj sprečavanje sazrevanja dendritskih ćelija.
[0024] Prisustvo ili odsustvo kostimulatornih molekula na antigen-prezentujućim ćelijama (APCs), kao što su dendritske ćelije, značajno utiče na kvalitativnu i kvantitativnu prirodu imunog odgovora. Prekomerna ekspresija CD80 pomoću dendritskih ćelija uzrokuje sazrevanje DC i povećava aktivaciju memorijskih T ćelija (Bour-Jordan et al., 2011). Mehanički, interakcija CD 28 i CD80 zauzima centralni klaster imunološke sinapse i zajedno su smešteni sa uključenim TCR, čime se stabilizuje imunološka sinapsa (Dustin and Shaw, 1999) (Grakoui et al., 1999). Interakcija između CD28 i CD80 zapravo generiše odgovarajući razmak za TCR da bi efikasno interagovao sa HLA molekulima (Shaw and Dustin, 1997).
[0025] Multipna skleroza (MS) je zapaljensko demijelinizirajuće oboljenje centralnog nervnog sistema (CNS). Pojava demijelinizacionih delova u CNS pacijenata sa MS povezana je sa inflamatornim infiltratom koji se uglavnom sastoji od makrofaga i T limfocita. Na mehaničkom nivou, MS se smatra autoimunom bolešću. MS se obično smatra bolešću koja je primarrno posredovana CD4+ T ćelijama. Određeni podskupovi CD4<+>: Th1 i nedavno Th17, bili su uključeni u patofiziologiju bolesti. Trenutno je još uvek teško proceniti određene uloge za svaku subpopulaciju Th1 i Th17. Dalje, inhibicija prometa leukocita antagonizmom alfa 4 (α4)-integrina je sada potvrđena kao terapeutski pristup za lečenje inflamatornih bolesti poput MS i inflamatorne bolesti creva (IBD), kao i za lečenje arteroskleroze (Zhi et al., 2014). α4β7 se eksprimira na ograničenijem skupu leukocita, uključujući aktivirani makrofag, podskupove leukocita, NK ćelije, mastocite i eozinofile.
[0026] Humani IL-7 indukuje snažnu ekspresiju α4 i β7 integrina in vitro na humanim T limfocitima i dramatično povećava frekvenciju humanih T limfocita koji eksprimiraju α4, β7 i α4/β7 integrine, koji su potrebni za navođenje i zadržavanje T limfocita u ne-limfoidnim tkivima kao što su creva, mozak i koža (Denucci et al., 2009; Gorfu et al., 2009).
[0027] Naivne ćelije su delimično odgovorne za akutno odbacivanje transplatiranih organa i tkiva. Ove ćelije se mogu kontrolisati trenutnim imunosupresivnim lekovima (inhibitori kalcineurina) i monoklonskim antitelima koja blokiraju kostimulaciju (anti adhezija, inhibitori CD80/86). Memorijske T ćelije su takođe odgovorne za odbacivanje transplantata. Memorijske T ćelije se akumuliraju u čoveku usled stečene imunološke istorije, uglavnom prošlih reakcija protiv virusa. Poznato je da memorijske ćelije mogu da se reaktiviraju aloantigenima kao rezultat “heterolognog imuniteta”, što je unakrsna reakcija naše antivirusne odbrane sa aloantigenima (Adams et al., 2003). Heterologni imunitet predstavlja moćnu barijeru za toleranciju indukcije, jer su memorijske T ćelije, za razliku od naivnih T ćelija, programirane da se brzo aktiviraju, sa smanjenim zahtevima za kostimulatornim signalima. Memorijske T ćelije takođe mogu biti uključene u hronično odbacivanje. Pored njihove uloge
1
u transplantaciji organa i tkiva, naivne i memorijske T ćelije su takođe udruženo odgovorne za mnoge autoimune bolesti. Ovo je slučaj sa ulceroznim kolitisom (Shinohara et al., 2011), reumatoidnim artritisom, psorijazom ili bolesti kalem protiv domaćina.
[0028] Inflamatorne bolesti creva (IBD), poput ulceroznog kolitisa (UC) i Crohn-ove bolesti (CD), su hronični recidivirajući gastrointestinalni poremećaji koje karakterišu hronična upala creva, poremećeni imunološki odgovori na crevnu mikrobiotu i disfunkciju epitelne barijere (Khor et at., 2011; Abraham and Cho, 2009). Stope incidencije ili preovlađivanja IBD se povećavaju širom sveta i ove bolesti su povezane sa izraženim morbiditetom i imaju veliki uticaj na kvalitet života i radnu sposobnost (Danese and Fiocchi, 2011; Baumgart and Sandbom, 2012). Trenutna uobičajena lečenja imaju za cilj ublažavanje upale postepenom upotrebom antiinflamatornih sredstava, imunosupresivnih lekova i bioloških sredstava koji ciljano deluju na inflamatorne citokine kao što je faktor nekroze tumora alfa (TNFa). Ključna karakteristika IBD je takođe brza regrutacija i produžena perzistencija leukocita na mestu upale, što je omogućeno interakcijom integrina sa srodnim receptorima eksprimiranim pomoću endotelnih ćelija koje omogućavaju adheziju i transmigraciju ćelija (Adams and Eksteen, 2006; Agace, 2006). Terapije koje nastaju ciljano deluju na ovaj ulazni otvor u creva molekulima protiv adhezije, posebno one koje ciljano deluju na put α4β7 integrina specifičnog za creva (Feagan et al., 2013; Sandbom et al., 2013)<7,8>. Međutim ove terapije ne održavaju remisiju kod više od polovine pacijenata, recidivi se javljaju u velikom broju pacijenata sa primarnim odgovorom. Oportunističke infekcije se takođe razvijaju kao posledica opšte imunosupresije. Stoga je jedan od glavnih ciljeva obezbediti nove tretmane za IBD i identifikovati markere koji određuju hroničnost, odgovor i recidiv IBD.
[0029] Štaviše, pokazano je da nekoliko malignih ćelija pokazuje IL-7R. To je slučaj sa Sezary-jev kožnim limfomom (njih 60%) ili akutnom limfoblastnom leukemijom u detinjstvu kod kojih se u oko 15% slučajeva razvija mutacija sa dodatnom funkcijom u CD 127, koja čini ove tumore delimično zavisnim od IL-7 (Shochat et al., 2011).
[0030] Trošenje T limfocita bio je očigledan imunosupresivni pristup za sprečavanje odbacivanja alotransplantata ili borbu protiv autoimunosti. Međutim, ukupno trošenje T ćelija možda neće biti povoljno za indukciju imunološke tolerancije. Ciljno delovanje na subpopulacije T ćelija ili selektivno aktivirane T ćelije, bez modifikovanja Treg ćelija, moglo bi predstavljati pro-tolerogeni pristup (Haudebourg et al., 2009). CD127 se stoga može smatrati potencijano atraktivnim terapijskim ciljem za monoklonska antitela (Mabs) čiji je cilj modulacija imunoloških odgovora, jer takva monoklonska antitela mogu imati potencijal iscrpljivanja efektora, ali ne i regulatornih limfocita.
Shodno tome, pretpostavlja se da bi oni mogli pokazati efikasnost u transplantaciji, autoimunosti (Michel et al., 2008) i malignim bolestima antagonizujući pristup IL-7 do IL-7-R i time ograničavajući funkciju i rast T i B ćelija.
[0031] Terapija monoklonskim antitelom protiv ćelija CD127<+>koja ometa put IL-7 može ispuniti taj cilj eliminisanjem/neutralizacijom naivnih i memorijskih T ćelija i/ili smanjenjem njihovog broja uz očuvanje Treg ćelija ili uklanjanjem ili smanjenjem broja CD127-pozitivnih malignih ćelija. Terapija monoklonskim antitelom protiv ćelija CD 127<+>, međutim, može delovati kao mač sa dvostrukom oštricom ako dovodi do aktivacije dendritskih ćelija. Zapravo, CD 127 se takođe eksprimira u dendritskim ćelijama zajedno sa CRLF 2, koji formira TSLP receptor. U prisustvu TSLP, dendritske ćelije se aktiiviraju i promovišu imunološke odgovore posredovane T ćelijama. Neka monoklonska antitela protiv CD127, verovatno modifikujući način na koji TSLP interaguju sa TSLP receptorima, imaju svojstvo da povećavaju sazrevanje dendritskih ćelija indukovanih TSLP-om. Kao posledica terapija sa monoklonskim antitelom protiv CD127 koja ne bi povećavala sazrevanje dendritskih ćelija indukovanih TSLP prestavljala bi prednost terapije. Korist bi predstavljala blokada IL7R bez smetnje aktiviranja dendritskih ćelija u inflamatornom okruženju koje sadrži TSLP.
[0032] U publikaciji (Racapé et al., 2009) autori su analizirali interesovanje za IL-7 receptor alfa (IL7Rα) kao potencijalni terapijski cilj u transplantaciji. Pregledavši ekspresiju IL-7Rα na različitim T ćelijama i ćelijama koje reaguju na IL-7, autori su utvrdili da li ciljano delovanje memorijskih T ćelija koje eksprimiraju IL-7Rα može produžiti preživljavanje alotransplantata kod miševa i zaključili da bi ciljano delovanje IL-7 ili IL-7Rα povoljno poštedelo Treg ćelije. Među perspektivama, autori su istakli da ciljano delovanje IL-7 ili IL-7Rα u terapijskom tretmanu može imati različite posledice na preživljavanje ćelija koje eksprimraju CD 127 i može izazvati različite vrste limfopenije. Pitanje efekata antitela koja bi bila usmerena protiv IL-7Rα u zavisnosti od toga da li će blokirati ili netralizovati ili su citotoksična antitela takođe je postavljeno sa konceptualnog stanovišta. Autori, ipak nisu pokazali da li su dobili i analizirali takva antitela, već su izrazili potrebu za daljim ispitivanjem da bi se procenila relevantnost hipoteze.
[0033] S obizirom na nedostatke dostupnih terapisjkih pristupa kod imunološki povezanih bolesti i drugih bolesti koje uključuju IL-7/IL-7Rα, kao što su različite vrste karcinoma, uključujući neke karcinome dojke, i dalje postoje potrebe za dodatnim lekovima kandidatima, posebno za aktivne kandidate u odnosu na odabranije ciljeve u svrhu kontrolisanja npr. moduliranja imunološke aktivacije kod humanih pacijenata.
1
[0034] U tom kontekstu, monoklonska antitela protiv IL-7Rα koja imaju antagonistička svojstva prema IL-7R otkrivena su u WO2010/017468 i njihove humanizovane verzije u WO2011/094259 u pogledu lečenja autoimunih bolesti poput multiple skleroze. Za opisana antitela se kaže da su antagonisti vezivanja IL-7 za njegov receptor i aktivni su protiv širenja i preživljavanja ćelija TH17 i TH1 za koje je rečeno da zahtevaju interakciju IL-7 sa njihovim CD 127 receptorom. Efekat ovih antitela na sazrevanje imunih ćelija, a naročito dendritskih ćelija, nije razmatran. Pored toga, za ova antitela se kaže da ne inhibiraju TSLP indukovanu proizvodnju TARC-a (str.107 WO2011/094259). Slično tome, antitela protiv CD127 saopštena u WO2011/104687 ili u WO2013/056984, koja su predviđena za upotrebu u lečenju dijabetesa, lupusa, reumatoidnog artritisa i drugih autoimunih bolesti, nisu razmatrana u odnosu na njihov mogući efekat na sazrevanje dendritskih ćelija i njihova interakcija sa TSLP-indukovanom signalizacijom nije zabeležena. Pored toga, kako su objavili Kern i saradnici (Kern et al., 2013; Kern et al., 2015) i kako je ovde prikazano, antitela protiv CD 127 prethodne tehnike indukuju internalizaciju receptora. S obzirom da antagonistička antitela protiv CD127 koja takođe indukuju internalizaciju CD127 ne uspevaju da kontrolišu preosetljivost kože tipa IV, dok antagonistička antitela protiv CD127 koja ne indukuju internalizaciju to čine, postupak internalizacije može aktivirati signalni put, ublažavajući antagonistički efekat antitela. Na kraju, antitela prethodne tehnike prepoznaju epitop koji ne sadrži nijednu sekvencu sa 2b mesta CD127 (tj. posebno od aminokiselina 109-180 SEQ ID Br:22, ili posebno od aminokiselina 109-173 SEQ ID Br. 22, ili posebno od aminokiselina 113-180 SEQ ID Br. 22, ili posebno od aminokiselina 113-173 SEQ ID Br. 22) i nije pokazano da remeti vezivanje CD 127 sa yc lancem IL7-R.
[0035] Uprkos nedavnom interesovanju za razvoj CD127 antitela, napori su usresređeni na inhibiciju IL7 indukovane IL-7R signalizacije. Ipak, TSLP i TSLPR su bili uključeni u brojne patologije. Pokazalo se da TSLP ima ulogu u bolestima kože i pluća (He and Geha, 2010) i da se povezuje sa različitim patologijama, koje uključuju inflamatornu bolest disajnih puteva i atopijski dermatitis kod ljudi i miševa (Ying et al., 2008) (Jariwala et al., 2011). Pored toga, pokazano je da se TSLP povezuje sa regulacijom imuniteta creva i inflamacije (Taylor et al., 2009). Ostale patologije koje uključuju TSLP i TSLPR uključuju dečiju leukemiju B ćelija (van Bodegom et al., 2012), specifične alergijske poremećaje pluća i kože, bolesti povezane sa autoimunitetom (Roan et al., 2012) i kancer uključujući kancer dojke (Olkhanud et al., 2011).
[0036] Antitela koja ne pokazuju efekat povećanja sazrevanja dendritskih ćelija i/ili koji ne indukuju internalizaciju CD127 i/ili koja inhibiraju internalizaciju indukovanu IL7, otkrivena su u WO 2015/189302. Pomenuta antitela, nazvana N13B2 (himerno antitelo), N13B2-h1,
1
N13B2-h2 i N13B2-h3 (humanizovani N13B2) u pomenutoj prijavi i ovde u nastavku teksta, imaju visoku efikasnost, naročito in vivo, a posebno se pokazalo da imaju brz efekat na efektorske memorijske T ćelije, kako je definisano ovde u nastavku teksta. Međutim, pomenuta antitela su humanizovana u ograničenoj meri i njihova efikasna proizvodnja je takođe ograničena. Štaviše, nije zabeležen dugotrajni efekat pomenutih antitela na efektorske memorijske T ćelije.
[0037] Ovaj pronalazak se odnosi na alate za dizajniranje novih antitela pogodnih kao terapijskih kandidata za upotrebu kod pacijenata sa ili rizikom od bolesti koje uključuju IL-7 signalne puteve. Prema različitim pristupima obezbeđenim ovde, takvi alati poboljšavaju pripremu antitela namenjenih za upotrebu kod ljudi domaćina. Takvi alati sadrže posebno humanizovana, posebno monoklonska, antitela koja sadrže sve CDRs sekvence N13B2-h3.
[0038] Takvi polipeptidi (ili polinukleotidi koji kodiraju takve polipeptide) su obezbeđeni posebno za proizvodnju antitela (ili njegovih fragmenata za vezivanje antigena) i/ili kao antitela (ili njegovih fragmenata za vezivanje antigena), posebno koji se specifično vezuju za CD 127; pomenuta antitela, posebno monoklonska antitela, sadrže varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7, ili ima pomenutu sekvencu sa dodatnim mutacijama, posebno substitucijom, delecijom ili insercijom četiri ostatka, poželjno tri ili dva ostatka i čak poželjnije jednog ostatka, poželjno pri čemu pomenute mutacije nisu ni u CDR sekvencama ni kanonskim ili Vernier-ovim pozicijama okvirnog regiona sekvenci.
[0039] Anitela obezbeđena ovde su poželjno monoklonska antitela, što znači da je kompozicija ovih antitela homogena, posebno identična, u smislu specifičnosti za vezivanje antigena i prema tome u smislu kompozicije varijabilnog regiona.
[0040] Pronalazak obezbeđuje antitela koja dele CDRs N13B2-h3 antitela ali imaju poseban okvirni region varijabilnog domena lakog lanca. Istraživači su iznenađujuće pokazali da antitela koja sadrže iste CDRs varijabilnog domena lakog lanca N13B2-h3, tj. CDRs sa SEQ ID Br: 4 i 5 i 6 ali koja sadrže različitu sekvencu varijabilnog domena lakog lanca, tj. SEQ ID Br: 9; SEQ ID Br: 10; SEQ ID Br: 11 ili SEQ ID Br: 12; dok su u velikoj meri humaniovana, visoko su produktivna u poređenju sa N13B2-h3 (do 4 puta više), uz očuvanje svih funkcionalnih karakteristika.
[0041] Ovo otkriće obezbeđuje sredstva pogodna u ovom kontekstu, koja sadrže posebno specifična monoklonska antitela protiv IL-7Rα. U posebnom primeru izvođenja, pomenuta antitela samo negativno ometaju TSLP put. Shodno tome, u poželjnim primerima izvođenja pomenuta antitela ne povećavaju sazrevanje dendritskih ćelija izazvanih TSLP. Pored toga ili alternativno, u određenim primerima izvođenja, pomenuta antitela ne indukuju internalizaciju
1
CD127 i/ili inhibiraju internalizaciju CD127 indukovanu IL7. U određenim primerima izvođenja, pomenuta antitela kombinuju ova svojstva sazrevanja i/ili povezane internalizacije DC sa antagonističkom aktivnošću prema signalizaciji IL-7/IL-7-R. U određenim primerima izvođenja, navedena antitela inhibiraju IL7 indukovanu ekspresiju α4, β7 i α4/β7 integrina u T ćelijama, posebno in vivo. U određenim primerima izvođenja, pomenuta antitela ciljano deluju citotoksično protiv CD127<+>ćelija što fizički smanjuju njihov broj (kontrakcija subpopulacije). Pored toga ili alternativno, u određenim primerima izvođenja, pomenuta antitela sadrže najmanje 80%, poželjno najmanje 84%, ili više od 84% i još poželjnije najmanje 85% ljudskih ostataka kako je definisano ovde u nastavku. Pored toga ili alternativno, u određenim primerima izvođenja pomenuta antitela se proizvode najmanje isto tako efikasno kao N13B2-h3, poželjno najmanje dvostruko efikasnije, kako je ovde definisano u nastavku. Pored toga ili alternativno, u određenim primerima izvođenja navedena antitela imaju brz i/ili dugotrajan efekat na efektorske memorijske T ćelije.
[0042] Posebno, antitela obezbeđena ovde sadrže varijabilni težak (VH) lanac koji sadrži sledeće aminokiselinske sekvence:
VHCDR1 SEQ ID Br: 1;
VHCDR2 SEQ ID Br: 2;
VHCDR3 SEQ ID Br: 3,
VH lanac se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7:
Pomenuti varijabilni teški lanac je posebno povezan sa konstantnim teškim lancem koji se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 26 da bi se formirao kompletan teški lanac antitela.
[0043] Posebno, antitela obezbeđena ovde sadrže VL lanac koji se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 9, SEQ ID Br: 10, i sekvence SEQ ID Br: 11, i sekvence SEQ ID Br: 12, posebno sekvence SEQ ID Br: 12: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRTSEDIYQGLAWYQQKPGKAPKLLLYSANTLHIGV PSRFSG SGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQYYDYPLAFGGGTKVEIK. Pomenuti varijabilni laki lanac je posebno povezan sa konstantnim lakim lancem koji se sastoji od sekvence odabrane iz SEQ ID Br: 27 i SEQ ID Br: 28, posebno SEQ ID Br: 27, da bi se formirao kompletni laki lanac antitela.
1
[0044] Antitelo ili njegov segment za vezivanje antigena prema pronalasku, specifično se vezuje sa CD127, posebno kod humanih CD27 i sadrži:
- laki lanac antitela koji sadrži ili varijabilni domen lakog lanca antitela koji se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 9; SEQ ID Br: 10; SEQ ID Br: 11; SEQ ID Br: 12; posebno SEQ ID Br: 12; i
- varijabilni domen teškog lanca antitela koji se sastoje od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7.
[0045] U posebnom primeru izvođenja pronalaska, antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, specifično se vezuju za humani CD127 i sadrži:
- varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela prema pronalasku posebno se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 9; SEQ ID Br: 10; SEQ ID Br: 11; SEQ ID Br: 12; posebno SEQ ID Br: 12; i
- varijabilni domen teškog lanca antitela koji se sastoje od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7.
Vezivanje CD127
[0046] U skladu sa pronalaskom, “vezivanje” za IL-7Rα protein se odnosi na antigen-antitelo tip interakcije i obuhvata osobine“specifičnog vezivanja” antitela ili njegovih fragmenata za vezivanje antigena što znači da se antitela ili fragmenti za vezivanje antigena specifično vezuju sa IL-7Rα protein dok se oni ne vezuju ili se vezuju sa značajno slabijim afinitetom za druge proteine (npr. zajednički γ lanac receptora citokina). Specifično vezivanje je poželjno definisano i/ili određeno u fiziološkim uslovima, posebno u smislu pH i sadržaja soli u rastvoru za ispitivanje. Vezivanje i specifičnost vezivanja mogu se analizirati u skladu sa testovima otkrivenim u Primerima i posebno se mogu analizirati pomoću biosenzora Blitz, Biacore, ELISA, ili Western Blot analize.
[0047] U posebnim primerima izvođenja, antitela obezbeđena ovde ciljano deluju i vezuju IL-7-R alfa lanac kada je složen u TSLP receptor (sa CCRF2; pristupni broj u Banci gena AF338733; Reche et al., 2001). U posebnim primerima izvođenja, antitela obezbeđena ovde
1
vezjuju se za CD127 kao izolovanim proteinom sa konstantnim afinitetom (KD) jednakim ili nižim od 5E-9 M, što se može odrediti pomoću biosenzorne analize posebno pomoću Blitz postupka. U posebnim primerima izvođenja, osobine vezivanja antitela se određuju ili definišu pomoću antigena humanog CD127 koji sadrži sekvence ep1 (SEQ ID Br: 19) i/ili ep2 (SEQ ID Br: 20). U posebnom primeru izvođenja, antigen sadrži fragment humanog CD127 koji sadrži i ep1 i ep2 (tj. antigen sadrži sekvence ep1 i ep2 i interkalirane sekvence humanog CD127). U posebnim primerima izvođenja, antitela obezbeđena ovde imaju najmanje isti afinitet za pomenuti antigen kao N13B2-h3 antitelo otkriveno u WO 2015/189302, i/ili kao ovde otkriveno N13B2-hVL6 antitelo (sa VH koji ima sekvencu SEQ ID Br: 7 i VL koji ima sekvencu SEQ ID Br: 12) i/ili kao antitelo sa VH koji ima sekvencu SEQ ID Br: 7 i VL sa sekvencom SEQ ID Br: 10 ili sa sekvencom SEQ ID Br: 11.
[0048] Postupci za ispitivanje vezivanja antitela sa ciljanim delovanjem, ili kompletna dužina CD127, izolovan ili kao TSLPR ili IL7R, ili njegov antigen kako je prethodno pomenuto, koji sadrži posebno Blitz postupak, poznati su stručnjacima i posebno su ilustrovani na Slici 3, Primeru 3 i Primeru 4 ovde i na strani 14, Slikama 3,4 i 6 i odgovarajućim opisima slika, i Primerima 1, 2, 6, 7 WO 2015/189302.
Odsustvo povećanja sazrevanja dendritskih ćelija izazvanih TSLP-om
[0049] Antitela obezbeđena ovde mogu da vežu CD127 u TSLP receptor (tj. mogu da vežu CD127 kada je u kompleksu sa CRLF2, koji formira TSLP receptor). Stoga, antitela obezbeđena ovde mogu ometati TSLP indukovanu signalizaciju i/ili TSLP posredovanu signalizaciju. Poželjno, antitela obezbeđena ovde ne sinergizuju sa TSLP za sazrevanje imunih ćelija, posebno dendritskih ćelija. Drugim rečima, antitela prema pronalasku ne povećavaju sazrevanje imunih ćelija indukovanih pomoću TSLP.
[0050] Ovaj efekat na sazrevanje dendritskih ćelija je posebno poželjan. Sredstva za merenje takvog efekta poznata su stučnjacima i otkrivena su posebno u WO 2015/189302 na stranama 16-17 i u njegovom Primeru 9. Posebno, antitela obezbeđena ovde ne povećavaju ekspresiju CD40 za više od 50% kada se uporedi sa simulacijom samo sa TSLP (bez antitela). Poželjno, ekspresija CD40 se ne povećava za više od 25%, poželjno ne za više od 10% i čak poželjnije ne za više od 5%. U posebno poželjnim primerima izvođenja, ekspresija CD40 se ne povećava ili smanjuje u ćelijama stimulisanim sa TSLP i sa pomenutim antitelima u poređenju sa ćelijama stimulisanim samo sa TSLP.
2
Inhibicija IL7-indukovane ekspresije α4, β7 i α4/β7 integrina
[0051] U posebnim primerima izvođenja, antitela obezbeđena ovde inhibiraju IL7-indukovanu ekspresiju α4, β7 i α4/β7 integrina in vitro. IL7-indukovana ekspresija α4, β7 i α4/β7 integrina, kako je upotrebljeno ovde, označava povećanje u nivou ekspresije α4 i β7 integrina i/ili povećanje u broju ili odnosu T limfocita koji eksprimiraju α4, β7 i/ili α4/β7 integrine. Inhibicija može biti delimična, tj. nivo ekspresije α4, β7 i α4/β7 integrina u prisustvu IL7 se povećava u odnosu na početni nivo (tj. nivo bez antitela ili IL7) u prisustvu antitela, ali manje nego u odsustvu antitela, ili inhibicija može biti potpuna, tj. nivo ekspresije α4, β7 i α4/β7 integrina u prisustvu IL7 i antitela nije veći od početnog nivoa.
[0052] U posebnim primerima izvođenja, antitela obezbeđena ovde inhibiraju ekspresiju α4, β7 i α4/β7 integrina in vitro tj. nivo ekspresije α4, β7 i α4/β7 integrina je niži u ćelijama tretiranim antitelima (i sa i/ili bez IL7) nego u netretiranim ćelijama (tj. bez antitela ili IL7). Obim inhibicije može zavisiti od doze. Inhibicija ekspresije može se preciznije definisati, testirati i/ili izmeriti kako je navedeno u WO 2015/189302 na strani 18, u određenom pasusu [58], i u Primeru 16.
Inhibitori CD127 internalizacije
[0053] U posebnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde inhibiraju IL7-indukovanu internalizaciju CD127. Stoga, kada se inkubira sa pomenutim antitelima, prisustvo IL7 ne indukuje smanjenje ekspresije CD127 na površini ćelije, ili indukuje manje snažno smanjenje ekspresije CD127 na površini ćelije od ćelija inkubiranih bez antitela.U posebnom primeru izvođenja kada se inkubira sa pomenutim antitelima, nivo ekspresije CD127 na površini čelije kada se ćelije inkubiranju na 37 °C 15 minuta sa 5 ng/mL IL7 je najmanje 80%, poželjno najmanje 90% nivoa ekspresije površine ćelije u ćelijama inkubiranim bez IL7. In vitro, ekspresija površine ćelije se poželjno meri posle ograničenog vremena kako je prethodno navedeno. Pored toga, kako se većina postupaka ćelijske internalizacije inhibira na niskoj temperaturi, efekat se obično bolje primećuje na fiziološkoj temperaturi, posebno 37 °C. Međutim, takođe se planira inkubacija ćelija na nižoj temperaturi, posebno 4 °C.
[0054] U posebnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde ne indukuju internalizaciju CD127. Stoga, ekspresija CD127 na površini ćelije u ćelijama inkubiranim u prisustvu pomenutih antitela nije smanjena, ili nije značajno smanjena, u odnosu na ekspresiju na površini ćelije u ćelijama inkubiranim u inače identičnim uslovima, ali u odsustvu antitela. U posebnim primerima izvođenja, kada se inkubiraju na 37 °C tokom 30 do 45 minuta u prisustvu 50 ng/mL antitela, nivo ekspresije CD127 na površini ćelije je najmanje 80%, poželjno najmanje 90% njegovog nivoa u inkubiranim ćelijama u odsustvu antitela. Ovaj efekat se može posmatrati i u odsustvu IL7 (i kod ćelija tretiranih antitelima i kod ne tretiranih ćelija) i/ili u prisustvu IL7.
[0055] Dve osobine povezane sa internalizacijom CD127 prethodno opisane (tj. inhibicija IL-7 indukovane internalizacije ili ne indukovanje internalizacije) mogu se dalje definisati i/ili testirati kao što je navedeno u WO2015/189302 posebno u pasusima [59]-[63] na stranama 19-20 i na Slici 16 i Primeru 5.
Remećenje interakcije između CD127 i yc lanca
[0056] Prema posebnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde mogu da poremete vezivanje CD127 sa yc lancem IL7-R. Ovo znači da pod uslovima (posebno hemijskim i fizičkim uslovima) gde su CD127 i yc lanac povezani zajedno u odsustvu antitela, a posebno u prisustvu IL7, prisustvo pomenutih antitela značajno smanjuje pomenutu vezu. U posebnim primerima izvođenja, u prisustvu antitela i IL7, CD127 se ne vezuje za yc. Posebno, u prisustvu antitela i IL7, pronađena količina yc lanca povezana sa (ili vezana za) CD127 je manja od 80%, poželjno manja od 50% ,čak poželjnije manja od 25% ili 10% količine veze u odsustvu antitela (ili u prisustvu drugog antitela protiv CD-127 kao što je MD707-13) u inače identičnim uslovima, posebno u prisustvu IL7. Takva osobina antitela može se proceniti posebno pomoću postupaka koimunoprecipitacije, dobro poznatih stručnjacima za ispitivanje interakcije proteina i ilustrovanim npr. u WO2015/189302 u Primeru 21. Posebno, ćelije se mogu inkubirati u prisustvu ili odsustvu testiranog antitela, zatim rastvoriti u uslovima koji omogućavaju očuvanje proteinskih kompleksa, i nastali lizat može biti podvrgnut imunoprecipitaciji protiv CD127, a prisustvo γc u imunopercipitivnom komleksu koji obuhvata CD127 je procenjeno pomoću western blota upotrebom anti-γc antitela (obrnuto, imunopercipitacija se može izvršiti upotrebom anti-γc antitela i prisustvo CD127 je procenjeno pomoću antitela protiv CD127).
Antagonist IL7-IL7-R interakcije
[0057] Prema posebnom primeru izvođenja, makromolekul, posebno antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema pronalasku dalje ima antagonistička svojstva prema interleukinu 7 (IL7) čime antagonizira pristup tj. vezivanje IL7 za CD 127 na CD 127 pozitivnim ćelijama.
[0058] "Antagonistička svojstva prema interakciji IL7-IL7-R" se odnose na to da antitela ili njegovi fragmenti za vezivanje antigena prema pronalasku, koji ciljano deluju na IL7-Ralpha, imaju efekat na sprečavanje pristupačnosti IL7 receptora eksprimiranog na CD 127 ćelijama, posebno humanim efektorskim T ćelijama, posebno humanim memorijskim T ćelijama, za njihovog partnera za vezivanje IL7, posebno humanog IL7. Kao rezultat antagonističkog vezivanja IL7, antitela prema pronalasku ili njihovi funkcionalni fragmenti dovode do limfopenije sprečavajući stvaranje T ćelija timusa zavisno od IL7.
[0059] Antagonistička svojstva mogu biti posebno antagonistična prema IL7-R signalizaciji koju indukuje IL7. Antagonist IL7-R signalizacije koju indukuje IL7 može se identifikovati merenjem inhibicije fosforilacije STAT5 kako je opisano u Primerima. Fosforilacija STAT5 koju indukuje IL7 je marker IL7-R aktivacije i očekuje se da antitelo koje je antagonist interakcije IL7-IL7-R smanji fosforilaciju STAT5 koju indukuje IL7.
[0060] U poželjnim primerima izvođenja, makromolekul prema pronalsku je antagonist IL7-R signalizacije koju indukuje IL7. U poželjnom primeru izvođenja, makromolekul prema pronalsku inhibira fosforilaciju STAT5 koju indukuje IL7. U poželjnim primerima izvođenja, inhibicija fosforilacije STAT5 je veća od 50% pri niskim koncentracijama antitela 55 ng/ml i/ili je inhibicija fosforilacije STAT5 veća od 80 % pri niskim koncentracijama antitela 100 ng/ml. Inhibicija fosforilacije STAT5 može se proceniti postupcima poznatim stručnjacima i posebno pomoću postupka navedenog u delu primeri, posebno u Primeru 5, i/ili na strani 21, pasusi [69] i [70] i Primeru 3 WO2015/189302.
[0061] Takođe je poželjno da makromolekul prema pronalasku (posebno antitelo, njegov fragment za vezivanje antigena ili molekul mimetik antitela) inhibira aktivaciju i/ili ne aktivira ili poveća aktivaciju, PI3-k i/ili ERK (ekstraćelijskim signalima regulisanih kinaza) signalnih puteva i posebno inhibira fosforilaciju i/ili ne indukuje ili poveća fosforilaciju PI3-k i/ili ERK 1 i/ili ERK 2. Posebno, antitelo, njegov segment za vezivanje antigena ili molekul mimetik antitela obezbeđen ovde, i posebno takvo antitelo, njegov fragment za vezivanje antigena i mimetički molekul antitela koji je antagonist prema IL-7 – IL-7R interakciji, ne indukuje aktivaciju PI3-k i/ili ERK puteva (poželjno PI3-k i ERK puta), i poželjno ne indukuje fosforilaciju PI3-k i/ili ERK 1 i/ili ERK 2, preciznije ne indukuje fosforilaciju PI3-k i ERK 1 i ERK 2. Posebno, antitelo, njegov segment za vezivanje antigena ili mimetički molekul antitela obezbeđen ovde, i posebno takvo antitelo, njegov fragment za vezivanje antigena i mimetički molekul antitela koji je antagonist prema IL-7 – IL-7R interakciji,
2
inhibiraju aktivaciju PI3-k i/ili ERK puteva, i posebno inhibira fosforilaciju PI3-k i/ili ERK 1 i/ili ERK 2, preciznije inhibira fosforilaciju PI3-k i ERK 1 i ERK 2. Aktivacija puteva i/ili fosforilacija pomenutih proteina, može se testirati postupcima poznatim stručnjacima i posebno pomoću Western blota kao što je ilustrovano na Slici 7 i Primeru 8.
Antagonist za vezivanje TSLP
[0062] Iako antitela obezbeđena ovde vezuju CD127 u IL7-R, ona takođe mogu da vezuju CD127 u TSLPR, i posebno pomoću steričnih smetnji i/ili kompeticijom na zajedničkim mestima za vezivanje, oni mogu inhibirati vezivanje TSLP sa TSLPR. Drugim rečima, antitela obezbeđena ovde mogu pokazivati antagonističku aktivnost za vezivanje TSLP.
Inhibitor proizvodnje TARC koju indukuje TSLP
[0063] U posebnnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde inhibiraju proizvodnju TARC koju indukuje TSLP CD127 pozitivnih ćelija. Kako je prethodno pomenuto, dendritske ćelije stimulisane sa TSLP proizvode povišene nivoe TARC. Ovo može biti rezultat njihovog vezivanja za TSLPR i njihovog potencijalnog delovanja kao antagonista za vezivanje sa TSLP. U posebnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde ne povećavaju sazrevanje dendritskih ćelija (sazrevanje je, na primer, određeno povećanom ekspresijom CD40 i/ili CD80 markera površine ćelije).
[0064] Nivo proizvodnje TARC koji indukuje TSLP može biti niži u ćelijama tretiranim zajedno sa TSLP i sa antitelima protiv CD127 obezbeđenim ovde, nego u ćelijama tretiranim samo sa TSLP. Drugim rečima, antitela obezbeđena ovde mogu biti inhibitori proizvodnje TARC koji indukuje TSLP. U primeru izvođenja pronalaska, antitela obezbeđena ovde smanjuju nivoe proizvodnje TARC. U posebnom primeru izvođenja, nivo proizvodnje TARC u ćelijama tretiranim sa TSLP i antitelima obezbeđenim ovde se smanjuje za više od 10%, poželjno više od 20%, u poređenju sa nivoom u ćelijama tretiranim samo sa TSLP, pri niskim koncentracijama antitela od 1 µg/ml. Merenje proizvodnje TARC može se sprovesti na CD127-pozitivnim imunim ćelijama, posebno dendritskim ćelijama, iz uzorka krvi pomoću bilo kog standardnog postupka poznatog stručnjacima i ilustrovanog npr.u WO2015/189302 u primeru 9.
Citotoksična aktivnost
[0065] U posebnom primeru izvođenja, antitela obezbeđena ovde su citotoksična protiv humanih ćelija, posebno humanih T ćelija koje eksprimiraju CD127. Humane ćelije koje eksprimiraju CD127 kao lanac receptora za IL7, na koje ciljano deluju pomenuta antitela, uglavnom su T limfociti i preciznije subpopulacije efektorskih T limfocita koje uključuju naivne i memorijske T ćelije, ali nisu regulatorne T ćelije (Treg), posebno ne prirodne Treg koji miruju. Memorijske T ćelije nastaju kao rezultat priminga antigena i uglavnom su definisane njegovim funkcionalnim karakteristikama, uključujući sposobnost da se podvrgnu ponovnoj proliferaciji nakon reaktivacije i diferencijacije u sekundarne efektorske i memorijske ćelije. Slično tome, ciljni TSLP receptor (kao kompleks koji uključuje IL-7-R alfa lanac) reguliše diferencijaciju T pomoćnih limfocita, B ćelija i proliferaciju dendritskih ćelija.
[0066] Posebno, antitela obezbeđena ovde koja imaju “citotoksičnu aktivnost protiv T ćelija” ili citotoksična svojstva (citotoksična antitela) kada se primenjuju dovode do trošenja populacije efektorskih T ćelija ubijanjem ovih ćelija i shodno tome do smanjenja broja ovih ćelija. Suprotno, pomenuta antitela ne menjaju subpopulaciju regulatornih T ćelija ili je ne menjaju u značajnom obimu, omogućavajući Treg ćelijama da obavljaju njihovu funkciju. U ovom smislu, u posebnom primeru ivođenja, odnos regulatornih T (Treg) ćelija nasuprot efektorskim T ćelijama (Teff) raste nakon primene pomenutih antitela. Posebno, antitela obezbeđena ovde omogućavaju povećanje pomenutog odnosa oko 10% ili više. Posebno, povećanje odnosa Treg nasuprot Teff je oko 20%.
[0067] Posebno, citotoksična antitela pokazuju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Alternativno, antitela obezbeđena ovde nemaju ADCC svojstva. Potencijal ADCC antitela može se smatrati pozitivnim kada je specifična citotoksičnost npr. superiorno do 10%. ADCC svojstva mogu se proceniti u ADCC analizi kao što je test opisan u Primeru 10 WO2015/189302. Kada se radi o antitelu pacova efektorske ćelije korišćene u ADCC analizi su poželjno LAK (limfokinima aktivisane ćelije ubice) ćelije pacova. Kada se antitela humanizuju, ADCC analiza se može izvršiti posebno na humanim NK ćelijama.
[0068] Antitela prema pronalasku koja imaju i citotoksična i antagonistička svojstva za CD127 pozitivne ćelije omogućavaju kumulativne efekte ovih svojstava u odnosu na trošenje efektorskih T ćelija, posebno memorijskih T ćelija, omogućavajući tako jače trošenje (iscrpljivanje pula CD127+ ćelija) i odgovarajuće smanjenje broja ciljnih T ćelija.
[0069] Prehodno navedeni pasusi kao i Primeri opisuju kako se testiraju relevantne željene funkcionalne karakteristike antitela koja su obezbeđena ovde. U sledećim delovima će detaljno biti objašnjene različite strukturne karakteristike i moguće modifikacije antitela.
2
Imajući na umu ova upustva, stručnjaci će moći da dobiju antitela koja imaju strukturne karakteristike date u nastavku zajedno sa željenim funkcionalnm karakteristikama, posebno polazeći od N13B2-hVL6 antitela koje ima željene funkcionalen karakteristike.
[0070] Kada je namenjeno za primenu na ljudima, poželjno je da antitela pokazuju što je moguće jaču homologiju sa humanim antitelima, kao što je poznato stručnjacima. Stepen istovetnosti sa humanim antitelom se meri kao % ljudskih ostataka u sekvenci antitela, posebno u okvirnom regionu varijabilnog domena lakog ili teškog lanca antitela, tj. % ostataka u sekvenci antitela, posebno u okvirnom regionu varijabilnog domena lakog ili teškog lanca antitela, koji su identični na istom funkcionalnom položaju sa ostatkom u najhomologijem poznatom humanom antitelu, posebno u okvirom regionu najhomologijeg poznatog varijabilnog domena lakog ili teškog lanca humanog antitela. Ova karakteristika je generalno izražena ovde, kao i u literaturi, jer “antitelo A (ili okvirni region sekvence njegovog varijabilnog domena) ima xx% ljudskih ostataka”, što znači da antitelo A (ili okvirni region sekvence njegovog varijabilnog domena) ima xx% ostataka koji su identični na istom funkcionalnom položaju sa ostacima najhomolofijeg poznatog humanog antitela (ili okvirnog regiona sekvence njegovog varijabilnog domena). Takav stepen istovetnosti može se meriti sredstvima koja su poznata stručnjacima, a posebno pomoću alata za poravnjanje praznina u domenu Međunarodnog imunogenetičkog informacionog sistema (IMGT), kako je razjašnjeno tokom otvorene sesije Svetske zdravstvene organizacije INN ekspertske grupe (april 2015). Poželjno je da ovde obezbeđena antitela imaju više od 80%, čak poželjnije najmanje 84%, više od 84% i čak još poželjnije najmanje 85% istovetnosti sa humanim antitelom, posebno onako kako je određeno pomoću alata za poravnjanje praznina u domenu. Navedeni stepen istovetnosti može se odrediti samo za varijabilni domen lakog lanca ili samo za laki lanac (upoređivanjem sa varijabilnim domenom lakog lanca ili lakim lancem humanog antitela) ili za laki i teški lanac uzet zajedno, upoređivanjem svakog lanca sa najhomologijim odgovarajućim lancem humanog antitela, i izveštavajući o kumulativnom procentu istovetnosti. Posebno, varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela prema pronalasku sadrži najmanje 80%, preciznije 84% i još preciznije najmanje 85% ljudskih ostataka. Određeni varijabilni domeni lakog lanca antitela obezbeđeni ovde imaju respektivno 84.2% (SEQ ID Br: 9); 85.3 % (SEQ ID Br:10 i SEQ ID Br:11) i 86.3 % (SEQ ID Br: 12) humanih ostataka. Poželjni varijabilni domen teškog lanca antitela obezbeđen ovde (SEQ ID Br: 7) ima 90.8 % ljudskih ostataka.
[0071] Varijabilni domen lakog lanca antitela obezbeđen ovde može sadržati do 135 aminokiselina, poželjno do 120 aminokiselina i čak poželjnije do 110 ili 107 aminokiselina.
2
Varijabilni domen lakog lanca antitela obezbeđen ovde može sadržati najmanje 80 aminokiselina, poželjno najmanje 90 i čak poželjnije najmanje 100 ili 106 aminokiselina. Varijabilni domen lakog lanca antitela obezbeđen ovde može sadržati 80 do 135, poželjno 90 do 120 i čak poželjnije 105 do 110 aminokiselina.
[0072] Laki lanac antitela obezbeđen ovde može sadržati do 250 aminokiselina, poželjno do 230 aminokiselina i čak poželjnije do 214 ili 211 aminokiselina. Laki lanac antitela obezbeđen ovde može sadržati najmanje 150, poželjno najmanje 190 i čak poželjnije najmanje 200 ili 210 aminokiselina. Laki lanac antitela obezbeđen ovde može sadržati 150 do 250, poželjno 190 do 230 i čak poželjnije 210 do 220 aminokiselina.
[0073] Ovde su takođe obezbeđeni polipeptidi koji su (i) fragmenti antitela za vezivanje antigena obezbeđenog ovde, posebno fragmenti za vezivanje antigena koji se sastoje od ili sadrže fragment lakih lanaca antitela ili varijabilne regione lakog lanca antitela obezbeđenog ovde, varijabilni domen teškog lanca antitela obezbeđenog ovde i/ili (ii) molekule mimetike antitela obezbeđenog ovde.
[0074] Fragment za vezivanje antigena je polipeptid koji se specifično vezuje za CD 127 protein kako je prethodno definisano u odgovarajućem odeljku (pasusi [44] do [47]) i sadrži najmanje tri CDRs N13B2-h3 (sastoji se od sekvenci SEQ ID Brojevi:4 do 6), poželjno fragment varijabilnih domena lakog lanca obezbeđenog ovde (sa SEQ ID Brojevi: 9 do 12) koji sadrži pomenute CDR sekvence. Fragment za vezivanje antigena može sadržati najmanje 40, poželjno najmanje 50 i čak poželjnije najmanje 70 ili 74 aminokiseline. Fragment za vezivanje antigena može sadržati najviše 100, poželjno najviše 90 i čak poželjnije najviše 80 ili 74 aminokiseline. Fragment za vezivanje antigena može sadržati 40 do 100, 50 do 90 i poželjno 60 do 100 i čak poželjnije 50 do 70 ili 60 do 80 aminokiselina. Fragment za vezivanje antigena kako je obezbeđen ovde može posebno imati bilo koju pogodnu funkcionalnu karakteristiku otkrivenu u odnosu na antitela obezbeđena ovde posebno osobine otkrivene u pasusima [47] do [62].
[0075] Shodno tome, izolovani polipeptid obezbeđen ovde može se sastojati od sekvence do 250 aminokiselina, posebno do 217, do 214, do 211, posebnije do 200, do 175, do 150, do 135, do 120, do 107, i čak još posebnije do 100, do 90, do 80, do 74, do 70, do 60 aminokiselina.
[0076] Mimetički molekul antitela je polipeptid sa svojstvima sličnim antitelima, posebno sa sličnim svojstvima vezivanja za CD127. Mimetici antitela mogu biti, na primer, molekuli affikota, affilini, affimeri, antikalini, monotela itd. Mimetički molekul antitela kako je obezbeđen ovde može posebno imati bilo koju pogodnu funkcionalnu karakteristiku koja je
2
otkrivena u odnosu na antitela otkrivena ovde, posebno karakteristike otkrivene u pasusima [47] do [62].
[0077] Posebno, antitelo prema pronalasku je humanizovano antitelo, koje sadrži konstantne domene izvedene iz humanih konstantnih domena. Posebno, konstantni domen lakog lanca antitela je izveden iz humanog kappa konstantnog domena lakog lanca i/ili je konstantni domen teškog lanca antitela izveden iz humanog IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4 konstantnog regiona teškog lanca, posebno iz humanog IgG4 konstantnog regiona teškog lanca. “Izvedeno iz” označava neke tačkaste mutacije koje rezultuju zamenama aminokiselima kao što su IgG4 (S228P) ili IgG1(E333A). Ove mutacije dobro poznate stučnjacima iz oblasti, uglavnom modifikuju neka svojstva parentalnog lanca. Na primer, oni dovode do manje imunogenosti u poređenju sa parentalnim antitelom ili izbegavanja vezivanja za Fcy receptor ili izbegavanja dimerizacije monomernog antitela ili stabilizacije dimerizacije koja čini antitela boljim za terapijsku upotrebu na ljudima. Antitelo prema pronalasku izvedeno iz parentalnog konstantnog domena teškog i lakog lanca sadrži ili se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 26, SEQ ID Br: 27 ili u SEQ ID Br: 28 ili njihovog fragmenta, respektivno. Posebnije, konstantni domen lakog lanca antitela koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 27. Posebno, konstantni domen teškog lanca antitela sadrži ili se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 26 ili njegovog fragmenta. Posebnije, konstantni domen teškog lanca antitela se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 26.
[0078] Ovde su takođe obezbeđeni molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju polipeptid prema pronalasku, ili obezbeđeno ovde antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena. Posebno, navedeni molekuli nukleinske kiseline kodiraju varijabilni domen lakog lanca ili laki lanac antitela obezbeđenog ovde, u kombinaciji sa izolovanim molekulima nukleinske kiseline koji kodiraju teški lanac antitela obezbeđenog ovde, prema bilo kojoj od ovde obezbeđenih definicija. Posebno, ovde je obezbeđen izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br : 9; SEQ ID Br : 10; SEQ ID Br : 11; SEQ ID Br : 12. Posebno, izolovani molekul nukleinske kiseline prema pronalasku sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br : 15, SEQ ID Br : 16, SEQ ID Br :17 ili SEQ ID Br :18. Posebno, navedeni izolovani molekul nukleinske kiseline je obezbeđen u kombinaciji sa izolovanim molekulom nukleinske kiseline koji kodira teški lanac koji sadrži tri CDRs koji se sastoji od sekvenci prikazanih u SEQ ID Br: 1, SEQ ID Br: 2, i SEQ ID Br: 3, i koji kodira varijabilni domen teškog lanca koji se sastoji od sekvecne prikazane u SEQ ID Br: 7, posebnije izolovanog molekula nukleinske kiseline koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 13. U
2
poželjnom primeru izvođenja, obezbeđena je kombinacija izolovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, pomenuta kombinacija sadrži ili se sastoji od prvo izolovanog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 15, SEQ ID Br: 16, SEQ ID Br: 17 i SEQ ID Br: 18; i drugo izolovanog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 13. U drugom poželjnom primeru izvođenja, obezbeđena je kombinacija izolovanih molekula nukleinske kiseline koja kodira antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, a navedena kombinacija sadrži ili se sastoji od prvo izolovanog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 18; i drugo izolovanog molekula nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 13.
[0079] Ovde su takođe obezbeđeni polinukleotidi koji kodiraju polipeptidnu sekvencu komlpetnog lakog lanca, koji sadrži i varijabilni i konstantni domen, tj. posebno polinukleotidi koji kodiraju jednu od sekvenci SEQ ID Br: 9 do 12 i sekvencu SEQ ID Br:27 ili 28, posebno polinukleotidi koji sadrže ili se sastoje od jedne od sekvenci SEQ ID Br: 15 do 18 povezane sa SEQ ID Br:30 ili SEQ ID Br:31. Takvi polinukleotidi su posebno obezbeđeni u kombinaciji sa polinukleotidom koji kodira polipeptidnu sekvencu kompletnog teškog lanca, koji sadrži i varijabilni i konstantni domen, tj. pogodno polinukleotidi koji kodiraju SEQ ID Br: 7 i sekvencu SEQ ID Br:26, posebno polinukleotidi koji sadrže ili se sastoje od SEQ ID Br: 13 povezane sa SEQ ID Br:29.
[0080] Posebno, izolovani molekuli nukleinske kiseline obezbeđeni ovde mogu povoljno da sadrže, pored sekvence koja kodira laki lanac i opciono teški lanac antitela koje je obezbeđeno ovde, uzvodno od sekvence koja kodira pomenute lance antitela, sekvencu koja kodira signalini peptid koji omogućava sekreciju pomenutih lanaca kada se eksprimiraju u proizvedenoj ćeliji. Oni takođe mogu sadržati jednu sekvencu ili više sekvenci koje kodiraju jedan peptid ili više peptida koji su markeri za otkivanje, i/ili olakšavanje puferisanja, pomenutih lanaca.
[0081] Ovde je takođe obezbeđen vektor za kloniranje i/ili ekspresiju molekula nukleinske kiseline koji je ovde obezbeđen. Posebno, pomenuti obezbeđeni vektor je plazmid pogodan za kloniranje i/ili ekspresiju u sisarskim ćelijama, koji sadrži regulatorne sekvence za transkripciju i ekspresiju. Shodno tome, ovde je obezbeđen vektor koji sadrži polinukleotid kako je prethodno otkriveno, posebno polinukleotid kako je otkriveno u pasusima [76] do [78].
2
[0082] Dalje, ovde su obezbeđene ćelije i ćelijske linije rekombinovane sa molekulom nukleinske kiseline kako je prethodno navedeno, posebno vektor, posebno ćelija ili ćelijska linija sisara ili ptica, posebno detaljno prikazano na Slici 2. Na primer, ćelije jajnika kineskog hrčka, genetički su modifikovane da bi se smanjila globalna fukozilacija. Zaista, antitela kojima nedostaje fukolizacija jezgra pokazuju značajno poboljšanu ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) (von Horsten et al., 2010). Drugi primer je ćelijska linija EB66 koja prirodno ima niska svojstva fukolizacioje (Olivier et al., 2010). Antitela se takođe mogu proizvesti u ćelijama koje su privremeno tranformisane sa molekulom nukleinske kiseline kako je prethodno navedeno, posebno vektorom, posebno COS ćelijama, posebno kako je detaljno opisano u Primeru 2.
[0083] Ovde su takođe obezbeđeni postupci za proizvodnju polipeptida koji je ovde obezbeđen, posebno lakog lanca antitela i/ili monoklonskog antitela, pomenuti postupci sadrže korak ekspresije pomenutog polipeptida, lakog lanca antitela ili monoklonskog antitela (ili lakog i opciono teškog lanca monoklonskog antitela) u ćelijama koje sadrže molekul nukleinske kiseline koji kodira pomenuti polipeptid, u uslovima koji omogućavaju oporavak pomenutog polipeptida i korak oporavljanja pomenutog polipeptida. Posebno, antitela ili njihov fragment se pripremaju u ćelijama koje pokazuju niska svojstva fukolizacije, kao što su EB66 ćelije ptica.
[0084] Ovde je takođe obezbeđena i farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid (posebno varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela) i/ili antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili njegov mimetički molekul i/ili izolovani molekul nukleinske kiseline kako je prethodno definisano, i farmaceutski vehikulum. Pomenuta farmaceutska kompozicija može opciono dalje da sadrži različit aktivni sastojak. Pomenuta kompozicija je posebno obezbeđena u pogodnoj formulaciji za sistemsku primenu ili za lokalnu primenu. Posebno, ovde su obezbeđene kompozicije pogodne za lokalnu primenu, posebno za intramuskularno ili potkožno ubrizgavanje, za ubrizgavanje pomoću uređaja kao što je autoinjektor (ili olovka za ubrizgavanje), za transdermalnu primenu, posebno pomoću transdermalnog flastera, za transmukoznu primenu, naročito intranazalnu ili rektalnu primenu. Posebno, ovde su obezbeđene pogodne kompozicije za lokalnu primenu u gastrointestinalnom (GI) traktu, posebno putem oralne primene, posebno za lečenje intersticijalnih bolesti kao što je Crohn-ova bolest ili UC, naročito pogodne kompozicije za isporuku u debelo crevo. Posebno, ovde su obezbeđene pogodne kompozicije za sistemsku primenu, posebno za parenteralnu ili enteralnu primenu, posebno za intravensko ubrizgavanje ili oralnu primenu. Kao što je stručnjacima poznato, enteralna primena može biti ili lokalna primena do GI trakta ili sistemska primena. Gde god su takve farmaceutske kompozicije ili njihova upotreba ovde obezbeđeni, mora se podrazumevati da se takođe mogu obezbediti vehikulum za primenu i njihova upotreba, npr. kada je obezbeđena izričito ubrizgavajuća farmaceutska kompozicija, mora se podrazumevati da je kompozicija obezbeđena kao takva, kao i u uređaju ili u kombinaciji sa uređajem koji omogućava primenu i/ili ubrizgavanje pomenute kompozicije („uređaj za isporuku“). Primeri uređaja za isporuku uključuju, ali se ne ograničavaju na, autoinjektore, posebno višekomorne špriceve i transdermalne flastere. Shodno tome, ovde su obezbeđeni uređaj za isporuku, posebno autoinjektor, pumpa ili transdermalni flaster koji sadrži pomenutu kompoziciju, i njihova upotreba kako je u nastavku obezbeđena u odnosu na farmaceutske kompozicije. Ovde je takođe obezbeđen i komplet koji sadrži farmaceutsku kompoziciju i uređaj za lokalno davanje, posebno potkožni, enteralni ili oralni uređaj za isporuku, posebno prethodno napunjen špric ili uređaj bez igle, koji sadrži pomenutu kompoziciju i/ili je pogodan za primena pomenute kompozicije i njegovu upotrebu kako je u nastavku obezbeđeno u odnosu na farmaceutske kompozicije. Obezbeđena je farmaceutska kompozicija u bilo kom pogodnom obliku za primenu, uključujući kao rastvor, posebno sterilni vodeni rastvor, kao suspenzija, kao čvrsta supstanca, posebno liofilizovana čvrsta supstanca, posebno za adsorpciju na (ili adsorbiran na) flasteru i/ili za resuspenziju i primenu kao rastvora, u obliku pilule, tablete ili drugog čvrstog oblika pogodnog za oralnu primenu, posebno sa odloženim ili produženim oslobađanjem, kao nanočestice, npr. kompozicija koja sadrži nanočestice sa polipeptidom adsorbiranim na površini, ili unutar navedenih nanočestica itd. Oblik farmaceutske kompozicije i opciono priroda uređaja za isporuku mogu biti pogodni za isporuku aktivnog sastojka kako je ovde obezbeđeno sistemski ili lokalno, tj. mogu biti pogodni da aktivni sastojak u aktivnom stanju dođe do ciljanih ćelija, tkiva, organa. Posebno, oblik farmaceutske kompozicije i opciono priroda uređaja za isporuku mogu biti pogodni za isporuku u GI trakt, posebno u debelo crevo. Za farmaceutsku kompoziciju je pomenuto da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač; međutim, takođe su obezbeđene farmaceutske kompozicije bez nosača za slične namene i svrhe, kada takav nosač nije potreban za farmaceutsku upotrebu, npr. ako se proizvod daje kao čista liofilizovana čvrsta supstanca. Posebno, primena se izvodi u skladu sa bilo kojim pogodnim sredstvima kako je opisano ovde sa intersticijalnim oslobađanjem, posebno sa odloženim intersticijalnim oslobađanjem.
[0085] Ovde su takođe obezbeđene kompozicije koje sadrže kao aktivni sastojak, polipeptid (posebno varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela) i/ili antitelo (posebno monoklonsko antitelo), njegov fragment za vezivanje antigena ili njegov mimetički molekul kako je prethodno definisano, ili farmaceutsku kompoziciju kako je prethodno definisano, u
1
formulaciji pogodnoj za kontrolisanje preživljavanja ili ekspanzije humanih CD127 pozitivnih ćelija, posebno humanih CD127 pozitivnih efektorskih ćelije, posebno za preživljavanje ili ekspanziju CD127+ memorijskih T ćelija, posebno memorijskih T ćelija koje su i CD127<+>i CD8+ , ili koje su i CD127+ i CD4+ ćelije, kada se primenjuju na humanim pacijentima. Posebno, pomenuta kompozicija koja sadrži antitelo (ili drugo sredstvo kao što je prethodno pomenuto) kao aktivni sastojak je u formulaciji koja je pogodna za kontrolisanje diferencijacije i/ili sazrevanje dendritskih ćelija kada se primenjuju na pacijentu.
[0086] Istraživači su iznenađujuće pokazali da jedno ubrizgavanje ovde obezbeđenog antitela omogućava održivi efekat, a inflamatorni odgovor je i dalje značajno smanjen kod životinja koje su lečene jednim ubrizgavanjem odezbeđenih antitela čak 14 meseci, i čak 18 meseci nakon pomenutog pojedinačnog ubrizgavanja. Primena, a poželjno jedna primena polipeptida, posebno lakog lanca antitela i posebnije antitela, njegovog fragmenta za vezivanje antigen ili njegovog mimetičkog molekula obezbeđenog ovde, poželjno ima brz i/ili dugotrajan efekat na efektorske memorije T ćelije. Brzi efekat se primećuje poželjno u toku jedne nedelje, a poželjnije u roku od 48 sati, i čak poželjnije u roku od jednog dana od primene pomenutog polipeptida, lanca antitela ili antitela. Dugotrajni efekat se primećuje poželjno najmanje 12 meseci, a poželjnije najmanje 14 meseci nakon najnovije (i, poželjno, jedne) primene pomenutog polipeptida, lanca antitela ili antitela. Takav efekat je posebno reverzibilan (posebno odgovor T ćelija može se povratiti novom vakcinacijom). Takav efekat je poželjno antigen i/ili odgovor-specifičan i poželjno nije povezan sa merljivim trošenjem limfocita (tj. globalni broj limfocita kod jedinki nije smanjen, kao što je izmereno uobičajenim postupcima). Takav efekat se inače može definisati kao klonsko brisanje memorijskih T ćelija ili kao reverzibilno, antigen specifično brisanje imunološke memorije T ćelija. Efekat takve primene na efektorske memorijske T ćelije može se proceniti upoređivanjem nivoa ćelija koje sekretuju IFN- γ (mereno npr. ELISPOT-om) kao odgovor na antigen, npr. tuberkulin, kod vakcinisanih jedinki (posebno kod babuna) koji su kasnije tretirani sa ovde obezbđenim polipeptidom, lancem antitela ili monoklonskim antitelom, i kod nelečenih vakcinisanih jedinki: efekat se primećuje ako je izmereni nivo antigen-specifičnih T ćelija znatno niži (poželjno najmanje 10%, poželjnije najmanje 40% niže) kod lečenih jedinki, u relevantnom vremenskom trenutku nakon lečenja. Takav efekat se takođe može meriti na drugi način procenjivanjem inflamatornog odgovora na dati antigen, npr. lokalna, pogodno kožna, inflamatorna reakcija kao odgovor na lokalno primenjeni antigen. Alternativno, može se koristiti analiza MHC tetramera. Postupci za ispitivanje takvog efekta poznati su stručnjacima i ovde su posebno ilustrovani u primeru 6.
2
[0087] Dodatno, istraživači su iznenađujuće pokazali da ovde obezbeđeno antitelo može imati brz efekat, posebno na aktivaciju T-ćelija, posebno na oslobađanje citokina pomoću T-ćelija, posebno u inflamatornom tkivu. Takav efekat se posebno primećuje u roku od nedelju dana, a poželjno u roku od 48, a još poželjnije u roku od 24 sata od primene antitela, a posebno se primećuje kao smanjenje produkcije (ili oslobađanja) IFNγ . Takav efekat se posebno primećuje lokalno, tj. na mestu primene antitela ili na mestu isporuke. Posebno, ovde obezbeđeno antitelo ima brz efekat, posebno brz lokalni efekat, posebno na oslobađanje citokina pomoću T ćelija, posebno ima efekat primećen u roku od 24 sata od primene. Kada se antitelo lokalno isporučuje, ali ne direktno na mestu predviđene isporuke, antitelo može imati brz efekat kao što je prethodno opisano na mestu isporuke, u istim vremenskim periodima od isporuke, a ne od primene, što može ili ne mora odložiti primenu kao što je poznato stručnjacima.
[0088] Kompoizicija koja je ovde obezbeđena može dalje da sadrži dodatno jedinjenje koje ima efekat imunomodulatorne terapije, posebno na ćelije uključene u alergiju ili autoimunost. U svrhu prikazivanja, primeri imunomodulatora od interesa su druga monoklonska antitela koja deluju na T ćelije, kao što su anti-CD3, anti-ICOS ili anti-CD28 antitela ili rekombinantni proteini ili antitela koja deluju na pomoćne ćelije kao što su CTLA4Ig ili anti-CD40 antitela.
[0089] Obezbeđeni ovde polipeptid, antitelo, njegov fragment za vezivanje antigena ili mimetički molekul antitela, izolovani molekul nukleinske kiseline, ćelija i/ili kompozicija mogu biti obezbeđeni u kombinovanom proizvodu koji sadrži dodatne proizvode, posebno sredstvo sa efektom imunomodulatorne terapije kao što je prethodno opisano, posebno namenjen za istovremenu odvojenu ili uzastopnu primenu. Obezbeđen ovde kombinovani proizvod koji sadrži polipeptid (posebno varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela) i/ili antitelo, njegov fragment za vezivanje antigena ili njegov mimetički molekul, i/ili izolovani molekul nukleinske kiseline, vektor, ćeliju ili ćelijsku liniju, i/ili farmaceutsku kompoziciju kako je prethodno definisano i opciono dalje sadrži:
- sredstvo sa efektom imunomodulatorne terapije, posebno namenjeno za primenu u kombinaciji sa npr. ovde obezbeđenim antitelom, posebno pri čemu je navedena primena ili istovremena ili odvojena u vremenu, i/ili pri čemu je navedena primena putem istog ili različitog puta; i/ili
- uređaj za primenu proizvoda.
[0090] Polipeptid, posebno laki lanac antitela i/ili antitelo, posebno monoklonsko antitelo i/ili fragment za vezivanje antigena ili mimetički molekul antitela i/ili nukleinska kiselina, vektor, ćelija ili ćelijska linija i/ili farmaceutska kompozicija ili kompozicija kako je prethodno definisano su posebno obezbeđeni za upotrebu kod ljudi za lečenje patologija ili patoloških stanja pod uticajem imunih odgovora, posebno odgovora memorijskih T ćelija. Takva stanja ili patologije sadrže one izazvane odbacivanjem transplantata, autoimunih bolesti, alergijskih bolesti, respiratornih bolesti, hroničnih virusnih infekcija, hroničnih inflamatornih bolesti, posebno hroničnih intersticijalnih inflamatornih bolesti, limfoma, leukemija i drugih bolesti kancera koje uključuju one koji proizilaze iz čvrstih tumora kada su ove patologije povezane sa CD 127 pozitivnim ćelijama kao i sa IL-7 signalnim putem, posebno kada se povećanje u sazrevanju dendritskih ćelija mora izbeći. Shodno tome, istraživači su pokazali da se upotreba pomenutih sredstava može razmatrati za lečenje određenih alergijskih poremećaja kože, inflamatorne bolesti creva (IBD), posebno Crohn-ove bolesti (CD) ili ulceroznog kolitisa (UC), ili primarnog Sjögren-ovog sindroma, ili sistemskog eritemskog lupusa, ili sistemske skleroze ili multiple skleroze, ili tipa I dijabetesa, ili akutne limfoblastne leukemije (npr. T-ALL) ili Hodgkin-ovog limfoma, ili karcinoma dojke povezanog sa CD 27+ ćelijama, karcinoma bubrega, karcinoma bešike, karcinoma pluća, karcinoma pankreasa, ili za lečenje kožnog T ćelijskog limfoma, kao što je Sezary-jev limfom, ili za lečenje akutne limfoblastne leukemije sa dobijenom funkcijom usled mutacije IL-7-R/TSLP puta ili lečenje odbacivanja transplantata i/ili pacijenata kojima je potrebna transplantacija i/ili su pred transplantacijom i/ilii su bili podvrgnuti transplantaciji. Lečenje inflamatorne bolesti creva (IBD), posebno Crohn-ove bolesti (CD) ili ulceroznog kolitisa (UC), ili primarnog Sjögren-ovog sindroma, ili sistemskog eritemskog lupus, ili sistemske skleroze ili multiple skleroze, ili tipa I dijabetesa, je razmatrano u poželjnim primerima izvođenja. Posebno, pronalazak se odnosi na polipeptid, ili antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena ili njegov mimetički molekul, ili izolovani molekul nukleinske kiseline, ili farmacutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu kao medikamenta, posebnije za upotrebu u sprečavanju ili lečenju odbacivanja transplantata organa ili tkiva ili bolesti ili bolesti odabranih iz grupe koja se sastoji od autoimunih bolesti, posebno reumatoidnog artritisa, sistemske skleroze, multiple skleroze, tipa I dijabetesa, autoimunog tireoiditisa, sistemski eritemski lupus, primarnog Sjögren-ovog sindroma, i inflamatornih bolesti, posebno inflamatorne bolesti creva (IBD), posebnije Crohnove bolesti i ulceroznog kolitisa i encefalomijelitisa i alergijskih bolesti i bolesti kancera i bolesti povezanih sa transplantacijom i respiratornih bolesti, poželjno lokalnom primenom.
4
[0091] Ovde su obezbeđene upotrebe polipeptida, lakog lanca antitela ili antitela, njegovog fragmenta za vezivanje antigena ili mimetičkog molekula antitela u lečenju patoloških stanja koja uključuju promenu imunološkog odgovora kod pacijenta koja dovodi do dominantno tolerogenog stanja ili, naprotiv, nedostatka tolerancije gde bi bila potrebna kontrola nivoa imunološkog odgovora, kao i uništavanje malignih CD127 pozitivnih ćelija.
[0092] Pod "lečenjem" ili "terapijskim lečenjem" podrazumeva se da izvedeni koraci primene rezultuju poboljšanjem kliničkog stanja životinje ili čoveka kome je to potrebno, a koji pati od poremećaja povezanih sa IL-7 putem, tj. koji uključuje aktivaciju ili proliferaciju CD 127 pozitivnih ćelija. Takav tretman ima za cilj poboljšanje kliničkog statusa pacijenta, životinje ili čoveka, uklanjanjem ili ublažavanjem simptoma povezanih sa poremećajem (poremećajima) povezanim sa putem IL-7, tj. koji uključuje aktivaciju ili proliferaciju CD127 pozitivnih ćelija. Poželjno, ovde obezbeđeni tretman omogućava obnavljanje zdravlja. Poželjno je da navedeni tretman nema neželjene negativne efekte usled povećanog sazrevanja imunih ćelija, posebno dendritskih ćelija.
[0093] U određenim aspektima lečenja pacijenata obezbeđen je poliptid, antitelo, fragment za vezivanje antigena, mimetički molekul antitela, polinukleotid, ćelija ili ćelijska linija ili kompozicija, namenjena i/ili pogodna za upotrebu da bi se potrošile CD127 pozitivne ćelije uz očuvanje CD127-negativnih ćelija.
[0094] U određenim aspektima lečenja pacijenata, obezbeđena je upotreba polipeptida, antitela, fragmenta za vezivanje antigena, mimetičkog molekula antitela, polinukleotida, ćelije ili ćelijske linije ili kompozicije, namenjene i/ili pogodne za upotrebu da bi se sprečila diferencijacija i/ili ekspanzija i/ili sazrevanje CD127-pozitivnih ćelija, posebno diferencijacija, ekspanzija ili sazrevanje indukovano IL-7 i/ili TSLP, uz mali ili nikakav direktan efekat na CD 127-negativne ćelije.
[0095] U određenim aspektima lečenja pacijenata, obezbeđena je upotreba polipeptida, antitela, fragmenta za vezivanje antigena, mimetičkog molekula antitela, polinukleotida, ćelije ili ćelijske linije ili kompozicije, namenjene i/ili pogodne za upotrebu za uklanjanje/neutralisanje naivnih i memorijskih T ćelija ometanjem signalizacije indukovane sa IL-7, uz očuvanje Treg ćelija.
[0096] U određenim aspektima lečenja pacijenata, obezbeđena je upotreba polipeptida, antitela, fragmenta za vezivanje antigena, mimetičkog molekula antitela, polinukleotida, ćelije ili ćelijske linije ili kompozicije, namenjene i/ili pogodne za upotrebu trošenja subpopulacija limfocita, ili drugih populacija ćelija koje eksprimiraju CD127 (koje uključuju normalne ili patološke T i B limfocite, NK ćelije, dendritske ćelije i druge tipove ćelija, uključujući epitelne ćelije) kao rezultat citotoksičnog delovanja antitela, moguće ali ne isključivo putem ADCC (ćelijska citotoksičnost zavisna od antitela) i opciono putem CDC (citotoksičnost zavisna od komplementa).
[0097] Ovde je takođe obezbeđen polipeptid, posebno laki lanac antitela i/ili antitelo, fragment za vezivanje antigena, mimetički molekula antitela, polinukleotid, ćelija ili ćelijska linija ili kompozicija, kako je prethodno definisano za upotrebu kao aktivnog sastojka u kombinaciji ili kao dodatni terapijski režim kod pacijenata kojima je to potrebno. Takođe obezbeđen je polipeptid, posebno laki lanac antitela i/ili antitelo, fragment za vezivanje antigena, mimetički molekul antitela, polinukleotid, ćelija ili ćelijska linija ili kompozicija, kako je prethodno definisano kao terapijski aktivni sastojak u kombinaciji ili kao dodatak terapijskom režimu kod pacijenata kojima je to potrebno.
[0098] U prethodno navedenim aspektima, predviđene upotrebe su takođe primenljive na nukleinskim kiselinama, vektorima, ćelijama, ćelijskim linijama, kompozicijama i farmaceutskim kompozicijama prethodno obezbeđenim ovde.
[0099] Ovde su obezbeđena sredstva i proizvodi prethodno navedeni koji su predviđeni i/ili pogodni za upotrebu u patologijama kao što su one izazvane odbacivanjem transplantata, autoimune bolesti, alergijske bolesti, respiratorne bolesti, hronične virusne infekcije, hronične inflamatorne bolesti, posebno hronične inflamatorne bolesti creva, limfomi, leukemije ili drugih bolesti karcinoma, uključujući one koje su rezultat čvrstih tumora kada su ove patologije povezane sa CD127 pozitivnim ćelijama, kao i signalnim putem IL-7, posebno tamo gde se mora izbegavati povećanje sazrevanja dendritskih ćelija. Shodno tome, navedena sredstva i proizvodi su posebno namenjeni i/ili pogodni za lečenje određenih alergijskih poremećaja kože, zapaljenskih bolesti creva (IBD), posebno Crohn-ove bolesti (CD) ili ulceroznog kolitisa (UC) ili akutne limfoblastne leukemije (npr. T -ALL) ili Hodgkin-ovog limfoma, ili karcinoma dojke povezan sa CD127<+>ćelijama, karcinoma bubrega, karcinoma bešike, karcinoma pluća, karcinoma pankreasa ili za lečenje kožnog T ćelijskog limfoma, kao što je Sezary-jev limfom, ili za lečenje akutne limfoblastne leukemije sa dobijenom funkcijom usled mutacije IL-7-R/TSLP puta ili za lečenje odbacivanja transplantata i/ili pacijenata kojima je potrebna transplantacija i/ili su pred transplantacijom i/ili koji su bili podvrgnuti transplantaciji.
[0100] Posebno, ovde je obezbeđena upotreba polipeptida, posebno lakog lanca antitela i/ili antitela, fragmenta za vezivanje antigena, mimetičkog molekula antitela, nukleinske kiseline, ćelije, ćelijske linije ili kompozicije kod ljudi za lečenje stanja i/ili patologija kao što su one izazvane odbacivanjem transplantata, autoimune bolesti, alergijske bolesti, respiratorne bolesti, hronične virusne infekcije, hronične inflamatorne bolesti, posebno hronične inflamatorne bolesti creva, limfoma, leukemija ili drugih bolesti karcinoma, uključujući one koje su rezultat čvrstih tumora kada su ove patologije povezane sa CD127 pozitivnim ćelijama, kao i signalnim putem IL-7, posebno tamo gde se mora izbegavati povećanje sazrevanja dendritskih ćelija. Shodno tome, navedeni proizvodi su posebno za lečenje određenih alergijskih poremećaja kože, zapaljenskih bolesti creva (IBD), posebno Crohn-ove bolesti (CD) ili ulceroznog kolitisa (UC) ili akutne limfoblastne leukemije (npr. T -ALL) ili Hodgkin-ovog limfoma, ili karcinoma dojke povezanog sa CD127<+>ćelijama, karcinoma bubrega, karcinoma bešike, karcinomaa pluća, karcinom pankreasa ili za lečenje kožnog T ćelijskog limfoma, kao što je Sezary-jev limfom, ili za lečenje akutne limfoblastne leukemije sa dobijenom funkcijom usled mutacije IL-7-R/TSLP puta ili za lečenje odbacivanja transplantata i/ili pacijenata kojima je potrebna transplantacija i/ili su pred transplantacijom i/ili koji su bili podvrgnuti transplantaciji, autoimune bolesti ili alergijske bolesti ili lečenju leukemija kao što je akutna limfoblastna leukemija ili za lečenje limfoma, ili za lečenje bolesti kancera, ili za lečenje hronične virusne infekcije, ili za lečenje inflamatornih bolesti, posebno IBD, posebno CD ili UC, ili za lečenje respiratornih bolesti, ili za sprečavanje i/ili lečenje simptoma povezanih sa transplantacijom.
[0101] Posebno, ovde je obezbeđen postupak lečenja koji sadrži primenu polipeptida (posebno varijabilni domen lakog lanca antitela ili laki lanac antitela) i/ili antitela, fragmenta za vezivanje antigena, mimetičkog molekula antitela, ili izolovanog molekula nukleinske kiseline, ćelije, i/ili ćelijske linije ili kompozicije i/ili farmaceutske kompozicije kako je prethodno definisano kod ljudi za lečenje stanja i/ili patologija izazvanih odbacivanjem transplantata, autoimune bolesti, alergijske bolesti, respiratorne bolesti, hronične virusne infekcije, hronične inflamatorne bolesti, posebno hronične inflamatorne bolesti creva, limfoma, leukemija ili drugih bolesti karcinoma, uključujući one koje su rezultat čvrstih tumora kada su ove patologije povezane sa CD127 pozitivnim ćelijama, kao i signalnim putem IL-7, posebno tamo gde se mora izbegavati povećanje sazrevanja dendritskih ćelija. Shodno tome, navedeni postupci su posebno za lečenje određenih alergijskih poremećaja kože, zapaljenskih bolesti creva (IBD), posebno Crohn-ove bolesti (CD) ili ulceroznog kolitisa (UC) ili akutne limfoblastne leukemije (npr. T -ALL) ili Hodgkin-ovog limfoma, ili karcinoma dojke povezanog sa CD127<+>ćelijama, karcinoma bubrega, karcinoma bešike, karcinomaa pluća, karcinom pankreasa ili za lečenje kožnog T ćelijskog limfoma, kao što je Sezary-jev limfom, ili za lečenje akutne limfoblastne leukemije sa dobijenom funkcijom usled mutacije IL-7-R/TSLP puta ili za lečenje odbacivanja transplantata i/ili pacijenata kojima je potrebna transplantacija i/ili su pred transplantacijom i/ili koji su bili podvrgnuti transplantaciji, autoimune bolesti ili alergijske bolesti ili lečenju leukemija kao što je akutna limfoblastna leukemija ili za lečenje limfoma, ili za lečenje bolesti kancera, ili za lečenje hronične virusne infekcije, ili za lečenje inflamatornih bolesti, posebno IBD, posebno CD ili UC, ili za lečenje respiratornih bolesti, ili za sprečavanje i/ili lečenje simptoma povezanih sa transplantacijom.
[0102] Istraživači su dalje pokazali da kod pacijenata sa UC, nivoi IL7, CD127 i/ili TSLPR mRNA omogućavaju predviđanje odgovora na konvencionalna imunosupresivna lečenja: ispitanici (tj. pacijenti koji pokazuju izrazito smanjenje simptoma kao odgovor na lečenje) imaju niže nivoe IL 7 i CD127 i više nivoe TLSPR od onih koji ne reaguju na lečenje. Shodno tome, ovde su obezbeđeni in vivo postupci da bi se procenila verovatnoća odgovora na imunosupresivna lečenja kod pacijenata, naročito kod ljudi koji imaju ulcerozni kolitis (UC), koji uključuju merenje nivoa IL7, CD127 i/ili TLSPR mRNA ili proteina u uzorku dobijenom od navedenog pacijenta, i na osnovu kojih se zaključuje da se verovatnoća odgovora povećava u poređenju sa referentnom grupom kada je izmereni nivo IL7 i/ili CD127 niži od prosečnog nivoa u navedenoj grupi i/ili kada je izmereni nivo TSLPR veći od prosečnog nivoa u navedenoj grupi. Postupci za izvođenje potrebnih merenja su poznati stručnjacima i mogu uključivati upotrebu antitela protiv CD127, posebno za merenje nivoa ekspresije proteina CD127. Polipeptid, posebno laki lanac antitela i/ili monoklonsko antitelo obezbeđeno ovde, je obezbeđen posebno za upotrebu u takvim postupcima, a takvi postupci su obezbeđeni, posebno korišćenjem takvog polipeptida, lakog lanca antitela i/ili monoklonskog antitela.
[0103] Posebno, ovde je otkriven postupak odabira jedinjenja iz grupe koja se sastoji od antitela, njegovog fragmenta za vezivanje antigena i mimetičkog molekula antitela, postupak se sastoji od najmanje jednog od sledećih koraka:
i. ispitivanje vezivanja jedinjenja za CD127, posebno za humani CD127, posebno za sekvencu epitopa iz domena D1 i/ili sa mesta 2b domena D2 CD127. Sekvenca epitopa iz domena D1 i/ili sa mesta 2b domena D2, može biti bilo koja ovde opisana sekvenca epitopa, posebno kako je otkriveno u pasusima [016], posebno sekvenca epitopa je odabrana iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br. 32, SEQ ID Br. 33, SEQ ID Br. 34, SEQ ID Br. 35, SEQ ID Br. 36 ili SEQ ID Br. 96, i posebnije SEQ ID Br 34, SEQ ID Br. 35 i SEQ ID Br.96. U posebnom primeru izvođenja pronalaska, test vezivanja može obuhvatiti ispitivanje vezivanja jedinjenja za sekvencu epitopa odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 34, SEQ ID Br. 35 i SEQ ID Br. 96 i ispitivanje vezivanja jedinjenja za sekvencu epitopa odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br. 42 i SEQ ID Br. 43. Kapacitet vezivanja jedinjenja može se testirati bilo kojim postupcima poznatim u tehnici, posebno Blitz postupkom, poznatom stručnjacima i posebno ilustrovana sa Slici 3, primeru 3 i primeru 4 ovde i na strani 14, Slikama 3, 4 i 6 i odgovarajućim opisima slika, i primerima 1, 2, 6, 7 iz WO 2015/189302., i/ili otkrivenim ovde postupkom iz primera 10; i/ili
ii. ispitivanje inhibicije IL7-R signalizacije indukovane sa IL-7, posebno fosforilacijom STAT5, u prisustvu jedinjenja. Inhibicija indukovana sa IL7 u prisustvu jedinjenja može se testirati postupkom otkrivenom u primeru 8 i / ili primeru 11 ovde; i / ili
iii. ispitivanje aktivacije fosfatidil-inozitol 3-kinaze u prisustvu jedinjenja. Aktivacija fosfatidil-inozitol 3-kinaze u prisustvu jedinjenja može se ispitati prema postupku otkrivenom u primeru 8 i / ili primeru 11 ovde; i / ili
iv. ispitivanje aktivacije ERK signalnog puta u prisustvu jedinjenja. Aktivacija ERK signalnog puta u prisustvu jedinjenja može se ispitati prema postupku otkrivenom u primeru 8 i / ili primeru 11 ovde;
v. ispitivanje kapaciteta vezivanje jedinjenja za najmanje jednu beta ravan mesta 2b domena D2 CD 127, posebno najmanje za treću beta ravan mesta 2b, definisanog kao nukleinske kiseline SEQ ID Br. 34, i/ili za najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID Br.35 i SEQ ID Br. 96. Kapacitet vezivanja jedinjenja može se ispitati bilo kojim postupkom poznatom u tehnici, posebno Blitz postupkom, poznatom stručnjacima i posebno ilustrovanim na slici 3, primeru 3 i primeru 4 ovde i na strani 14, slikama 3, 4 i 6 i odgovarajućim opisima slika, i primerima 1, 2, 6, 7 iz WO 2015/189302., i/ili otkrivenim ovde postupkom iz primera 10.
[0104] Postupak dalje može sadržati bilo koji od sledećih opcionih koraka, ili najmanje jedan od sledećih opcionih koraka:
vi. ispitivanje vezivanja CD127, posebno humanog CD127, za yc zajednički lanac receptora citokina u prisustvu jedinjenja. Vezivanje CD127 za yc zajednički lanac receptora citokina u prisustvu jedinjenja može se proceniti posebno postupcima koimunoprecipitacije, dobro poznatim stručnjacima za ispitivanje interakcije proteina i ilustrovanim npr. u WO2015/189302 u Primeru 21. Posebno, ćelije se mogu inkubirati u prisustvu ili odsustvu testiranog jedinjenja, zatim rastvoriti u uslovima koji omogućavaju očuvanje proteinskih kompleksa, a nastali lizat može biti podvrgnut anti-CD 127 imunoprecipitaciji, a prisustvo yc u imunoprecipitiranom kompleksu koji sadrži CD127 je procenjeno pomoću Western blot-om upotrebom antitela protiv yc (obrnuto, imunoprecipitacija se može izvesti upotrebom antitela protiv yc i prisustvo CD 127 se može proceniti upotrebom antitela protiv CD 127); i / ili
vii. ispitivanje internalizacije CD127, posebno humanog CD127, i/ili internalizacije CD127 indukovane sa IL-7 u prisustvu jedinjenja. Internalizacija CD127, definisana ovde u pasusima [51] do [53], može se dalje definisati i/ili ispitati kako je pokazano u WO2015/189302 posebno u pasusima [59]-[63] na stranama 19-20 i na Slici 16 i primeru 5; i/ili
viii. ispitivanje sazrevanje dendritskih ćelija indukovanih sa TSLP u prisustvu jedinjenja. Sazrevanje dendritskih ćelija izazvanih sa TSLP je definisano ovde u pasusima [47] i [48]. Sredstva za merenje takvog efekta poznata su stručnjacima i posebno su otkrivena u WO 2015/189302 na stranama 16-17 i njegovom primeru 9. Posebno, sredstva za merenje takvog efekta sadrže merenje ekspresije CD40 između ćelija stimulisanih sa jedinjenjem i ćelija stimulisanih samo sa TSLP (bez jedinjenja).
[0105] U posebnom primeru izvođenja, odabrano je jedinjenje koje se specifično vezuje za CD 127, posebno humani CD127, koje je antagonist IL7-R signalnog puta izazvanog sa IL7, koji ne izaziva aktivaciju fosfatidil-inozitol 3-kinaze i/ili ERK signalnog puta. U posebnijem primeru izvođenja postupka, odabrano je jedinjenje koje se specifično vezuje za CD 127, posebno humani CD127, koji je antagonist IL7-R signalnog puta izazvanog sa IL7, koji ne izaziva aktivaciju fosfatidil-inozitol 3-kinaze i ne izaziva aktiviraciju ERK signalnog puta.
[0106] Posebno, ovde je obezbeđen postupak za proizvodnju antitela ili njegovog fragmenta za vezivanje antigena prema pronalasku, koje se pravi protiv CD127, moguće nastao imunizacijom kod životinje (ne uključujući ljude), kao što je soj pacova LOU/C Igk1a dostupan na Univerzitetu u Luvenu, Belgija). Imunizacija se može sprovesti upotrebom fragmenta aminokiselinske sekvence SEQ ID Br.22, i posebno fragmenta SEQ ID Br.22 koji sadrži sekvencu epitopa kako je ovde definisano, i posebno SEQ ID Br. 35 i/ili SEQ ID Br.
4
96, kao imunogena. Hibridom se može dobiti spajanjem mononuklearnih ćelija slezine sa imunocitom IR983F kod LOU pacova. Hibridom se može pregledati prema kapacitetu izlučenih monoklonskih antitela da se vežu za aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 22, SEQ ID Br. 35 i SEQ ID Br. 96, posebno SEQ ID Br: 35 i/ili SEQ ID Br: 96. Stoga, pronalazak obuhvata imunogeno jedinjenje, pomenuto imunogeno jedinjenje je fragment aminokiselinske sekvence SEQ ID Br.22, posebno fragment koji sadrži najmanje jednu aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe SEQ ID Br.32, SEQ ID Br.33, SEQ ID Br.34, SEQ ID Br.35 i SEQ ID Br.96, posebno SEQ Br.34, SEQ ID Br.35 i SEQ ID Br.96, posebnije SEQ ID Br.96. U posebnom primeru izvođenja, imunogeno jedinjenje je linearni peptid posebno linearni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID Br. 96, posebnije, linearni peptid koji sadrži ili se sastoji od, poželjno se sastoji od, aminokiselinske sekvence SEQ ID Br.35.
Kratak opis crteža
[0107]
Slika 1. Aminokiselinske sekvence antitela koja su ovde obezbeđena
Panel A. Sekvenca teškog lanca (VH). CDRs su podebljani karakteri.
Panel B. Sekvenca humanizovanih lakih lanaca (LH) dobijenih iz N13B2. CDRs su podebljani karakteri. N13B2-VL3 sadrži originalne ostatke okvirnog regiona sekvence N13B2-h3 na pozicijama 48 i 87 (podvučeno); N13B2-VL4-V48L i N13B2-VL5-F87Y sadrže odgovarajući humanizovani ostatak okvirnog regiona i N13B2-VL6-V48L-F87Y sadrži oba humanizovana ostatka okvirnog regiona.
Slika 2. Proizvodnja antitela - stabilna transfekcija
Izvedene su tri različite proizvodne serije za svako od pomenutih antitela u CHO-M ćelijama prema uobičajenim postupcima, pomoću komercijalno dostupnog medijuma bez seruma, i titri dobijeni u klasičnim eksperimentima, mereni ELISA analizom, su saopšteni ovde. Horizontalna osa predstavlja vreme kulture u danima, dok vertikalna osa predstavlja dobijene titre antitela, u µg/ml.
Slika 3. Vezivanje za CD127
Vezivanje naznačenih antitela za rekombinantnu CD127 je procenjeno ELISA analizom prema postupku detaljno opisanom u primeru 3. Horizontalna osa prdstavlja koncentraciju antitela u ng/mL, a vertikalna osa predstavlja optičku gustinu na 450 nm, u proizvoljnim jedinicama.
Slika 4. Inhibicija fosforilacije STAT5
Inhibicija fosforilacije STAT5 naznačenim antitelima ispitivana je citofluorometrijom prema postupku detaljno opisanom u primeru 5. Procenat CD3<+>ćelija obojenih sa pSTAT5 antitelima prikazan je na panelu A (horizontalna osa: koncentracija antitela u ng/ml), a srednja vrednost intenziteta fluorescencije (u proizvoljnim jedinicama) pSTAT5 signala za CD3<+>ćelije je prikazan na panelu B.
Slika 5. Efekat na memorijske T ćelije
Panel A. DTH odgovor (površina ispod krive kriva eritema) kod babuna posle ubrizgavanja N13B2.
Preosetljivost odloženog tipa kao odgovor na izazov tuberkulina analizirana je kod vakcinisanih babuna, nakon primene N13B2 (n = 7 babuna) ili ekscipijenta (n = 4 babuna), merenjem reakcije kože prema postupku detaljno opisanom u primeru 6. Vertikalna osa predstavlja površinu ispod krive eritema, u proizvoljnim jedinicama. Vrednosti su saopštene za intradermalne reakcije izvedene u datim vremenskim tačkama, naznačene u danima na horizontalnoj osi, pre ili posle primene N13B2 ili ekscipijenta (primenjenog na dan 0). „Post-BCG“ odgovara rezultatima reakcije kože izvedene nakon nove vakcinacije sa BCG (nd = nije određeno). Kontrola ekscipijenta nije određena na 150 dan i na 180 dan i „post-BCG“ (nd).
Panel B.
DTH odgovor (površina ispod krive kriva eritema) kod babuna nakon ubrizgavanja humanizovanog N13B2. Preosetljivost odloženog tipa kao odgovor na izazov tuberkulina analizirana je kod vakcinisanih babuna, nakon primene humanizovanog N13B2 (AA892BB, 32257, V915GK, 33874) ili pufera, merenjem reakcije kože prema postupku detaljno opisanom u primeru 6. Vertikalna osa predstavlja površinu ispod krive eritema, u proizvoljnim jedinicama. Vrednosti su saopštene za intradermalne reakcije izvršene pre primene humanizovanog N13B2 ili pufera („IDR1“, prvi stubić sleva za svakog babuna), 4 sata nakon primene humanizovanog N13B2 ili pufera („IDR2“, drugi stubić sleva), jedan, dva i tri meseca ("IDR3-5", treći do peti stubić sleva) i četiri meseca ("IDR6", šesti stubić sleva, samo za V915GA) nakon primene humanizovanog N13B2 ili pufera i nakon nove vakcinacije sa BCG ("IDR7", poslednji stućić sleva).
Panel C.
IFNγ ELISPOT je izvršen na PBMC krvi kod BCG vakcinisanih babuna izazvanih tuberkulinom i lečenih sa humanizovanim N13B2.
Učestalost T ćelija specifičnih za AG nakon izazova tuberkulina je analizirana kod vakcinisanih babuna nakon primene humanizovanog N13B2 (AA892BB, 32257, V915GK, 33874) ili pufera IFNγ ELISPOT analizom prema postupku detaljno opisanom u primeru 6. Vertikalna osa predstavlja frekvenciju tačke za 100.000 ćelija. Vrednosti su saopštene za Elispot bez antigena (W/o Ag, levi stubići) ili sa antigenom tuberkulina (desni stubići) izvedene pre primene humanizovanog N13B2 ili pufera (prvi stubić sleva za svaku grupu stubića), 4 dana nakon primene humanizovanog N13B2 ili pufera ("IDR2"), jedan, dva i tri meseca ("IDR3-5") i četiri meseca ("IDR6", samo za V915GA) nakon primene humanizovanog N13B2 ili pufera i nakon nove vakcinacije sa BCG ( poslednji stubić sleva, isprekidan).
Slika 6. Ekspresija IL-7, CD127 i TSLP kod IBD pacijenata
Nivoi ekspresije mRNA IL-7, CD127 (rastvorljivi oblik IL-7Rα) i TSLP (puna dužina) su izmereni prema postupku detaljno opisanom u primeru 7 u uzorcima tkiva zdravih kontrolnih jedinki (kontrola bez IBD), zdravih i bolesnih (inflamatornih) uzoraka biopsije debelog creva kod pacijenata sa aktivnim ulceroznim kolitisom (UC) koji nisu reagovali (ili više nisu reagovali) na antiinflamatorno lečenje i u uzorcima pacijenata sa UC kod kojih je bolest u stanju u mirovanja - tj. su bili izlečeni ili su u stanju remisije u vreme uzorkovanja (ispitanici). Vertikalna osa predstavlja relativne jedinice fluorescencije. Vrednost se crta za svaki uzorak u datoj grupi, horizontalni stubić predstavlja prosečne vrednosti za grupu, a greška na stubiću predstavlja standardnu devijaciju. "*" označava pvrednost <0.05; "**" p-vrednost <0.01; "****" p-vrednost <0.0001.
Slika 7. Inhibicija CD127 signalnih puteva
Efekat različitih humanih antitela protiv CD127 na aktivaciju signalnih puteva je procenjena Western Blot-om kao što je detaljno prikazano u primeru 8. Slika prikazuje reprezentativne rezultate 6 različitih davalaca. „Nema IL-7“ odgovara uzorku koji nije
4
stimulisan sa IL-7. "C" odgovara kontrolnom uzorku, stimulisanom sa IL-7 u odsustvu antitela protiv CD 127. Horizontalne linije levo od mrlja predstavljaju migraciju markera naznačene molekulske težine. Strelice desno od mrlja ukazuju na migraciju tirozinfosforilisanog STAT5, tirozin 199-fosforiliranog PI3-k p55, fosforilisanog Akt, fosforilisanog ERK 1/2 i, kao dopunsku referencu, GAPDH.
Slika 8. Prigušivanje oslobađanja citokina iz T ćelija iz UC biopsija
Panel A. Proizvodnja IFNγ pomoću UC uzoraka biopsije gajenih ex-vivo. Panel B. Proizvodnja IFNγ pomoću CD uzoraka biopsije gajenih ex-vivo.
U oba panela, uzorci su dobijeni i tretirani kako je detaljno opisano u primeru 9. Svaki simbol predstavlja jedan uzorak pacijenta, kultivisan sa IgG („Ctrl Ab“) ili sa antitelom protiv CD127 („aIL-7Rα“). Povezani simboli su upareni uzorci istog pacijenta. ** p <0.01 sa Wilcoxon-ovim testom na osnovu ekvivalentnih parova. Proizvodnja IFNγ je značajno inhibirana sa mAb protiv IL7Rα. Slični rezultati su primećeni i na CD uzorcima biopsije.
Slika 9. mAbs protiv humanog IL-7Rα i agonistički signali
Efekat različitih humanih antitela protiv CD127 na aktivaciju signalnih puteva STAT5, PI3K i ERK je procenjen Western Blot-om kao što je detaljno opisano u primeru 11. Slika 9A prikazuje jednu od sedam različitih donatorskih ćelija u odsustvu egzogenih rekombinantnih humanih IL7. Panel A. „medijum“ odgovara uzorku bez humanog antitela protiv CD127. „Nema IL7“ znači da četiri uzorka nisu stimulisana IL-7. Tri uzorka su prethodno tretirana sa 10 µg/ml jednog mAb protiv IL-7Rα (N13B2-hVL6 ili MD707-13-G4 ili 1A11-G1).
Panel B. Kvantifikacija pI3K i pERK je korigovana za ekspresiju GAPDH i normalizovana na srednjim kontrolnim uslovima (n = 7 različitih davalaca). Vertikalna osa predstavlja normalizovanu ekspresiju za kontrolu. Vrednost se crta za svaki uzorak u jednoj grupi, horizontalni stubić predstavlja prosečnu vrednost za grupu, a greška stubića predstavlja standardnu devijaciju.
Slika 10. Efekat mAbs protiv humanog IL7-Rα na putu aktivacije IL7
Kvantifikacija fosfo-STAT5 signala je korigovana za ekspresiju GADPH i normalizovana na srednjim kontrolnim uslovima. PBMCs su prethodno tretirani sa 10 µg/ml jednog mAb protiv IL7-Rα (N13B2-hVL6 ili MD707-13-G4 ili 1A11) i zatim inkubirani 10 minuta na 37 °C sa 5ng/ml humanog IL7. Kvantifikovanja fosfo-STAT5 signala su korigovana za ekspresiju GAPDH (n = 7 različitih davalaca). Isprekidana linija predstavlja stanje samo sa medijumom bez tretmana. Vrednost se crta za svaki uzorak u jednoj grupi, horizontalni stubić predstavlja prosečnu vrednost za grupu, a greška stubića predstavljaju standardnu devijaciju. "*" označava p-vrednost <0.05 između naznačenih grupa.
Slika 11. Dvostruki agonist/antagonist mAbs protiv IL7-Rα izaziva trakskripcione modifikacije
Analiza RNA sekvenci humanih PBMCs (n = 7) inkubiranih 3.5 sata (1) sa 5ng/ml humanog IL7, (2) bez IL7, (3,4,5) sa 5ng/ml humanog IL7 i različitim mAbs protiv humanog IL7-Rα ((3): 10 µg/ml N13B2-hVL6; (4): 10 µg/ml MD707-13-Ig4; (5): 10 µg/ml 1A11).
Panel A. Toplotna mapa ekspresije 93 različito eksprimirana gena (stopa lažnog otkrivanja (FDR) 5%, put promene (FD) > 2) između IL7 stimulacije i kontrolnih uslova.
Panel B. Kvantifikacija srednjeg profila tri klastera indukovana sa IL7 u IL7 stimulisanim uslovima, kontrolisanim uslovima i uslovima sa IL7 i mAbs protiv humanog IL7-Rα.
Panel C. Venn-ov dijagram analize sekvenci RNK humanih PBMCs (n = 7) inkubiranih bez IL-73.5 sata sa različitim mAbs protiv humanog IL-7Rα (10 µg/ml N13B2-hVL6, 10 µg/ml MD707-13- Ig4 # 1, ili 10µg/mL 1A11). Venn-ov dijagram 481 različito eksprimiranih gena (FDR 5%, FC> 1.5) koji se upoređuje sa mAbs protiv humanog IL-7Rα i srednjim uslovima kontrole. Veličina kruga je proporcionalna broju gena za svaku kategoriju.
Primeri
Primer 1. Humanizacija lakih lanaca
[0108] Sledeći teški lanac je korišćen u svim ovde saopštenim eksperimentima, osim ako nije drugačije predviđeno N13B2 humanizovani_VH, nukelotidne sekvence (SEQ ID Br: 13):
4
N13B2 humanizovani_VH, Aminokiselinska sekvenca (SEQ ID Br: 7): videti Sliku 1A [0109] Sledeće optimizovane nukleotidne sekvence su korišćene za proizvodnju lakih lanaca antitela (aminokiselinske sekvence koje su obezbeđene na Slici 1B):
N13B2-h3 (SEQ ID Br:14):
4
N13B2hVL5 (SEQ ID Br: 17):
[0110] Svaka VL sekvenca dobijena sintezom gena, ubačena je u vektor kloniranja (pUC57) sa BsiWI 5’i 3’ krajevima i dodavanjem Kozak sekvence (GCCACC) pre ATG. Kao vektor ekspresije korišćen je plazmid ekspresije pFuseCLIg-hk (Invivogen), koji sadrži CLkappa konstantni domen humanog IgG1.
[0111] Svaki plazmid za kloniranje (VL-pUC57-Genscript) prerađen je BsiWI restrikcionim enzimom da bi se ekstrahovao VL dodatak (400 bp). Prečišćeni dodatak je povezan u plazmidu ekspresije pFuseCLIg-hk, linearizovan BsiWI preradom i defosforilisan. Pozitivni klonovi, koji imaju pravilno orijentisane umetnute VL fragmente pre konstantnih humanih domena, su amplifikovani i prečišćeni sa Midiprep-om bez endotoksina (Macherei-Nagel) za korak transfekcije. Teški lanac je kloniran na sličan način, sa konstantnim domenom koji se sastoji od SEQ ID Br: 26.
Primer 2. Proizvodnja humanizovanih lakih lanaca
[0112] Za testirana humanizovana antitela protiv CD 127 transfekcija i odabir stabilnih klonova izvršeno je prema konvencionalnim postupcima. Pripremljena su i testirana tri supernatanta za svako antitelo koji odgovaraju različitom odnosu transfekcije teškog lanca
4
(HC) i lakih lanaca (LC): 2:1, 1:1.3 i 1:2 HC: LC. Dobijeni titri su prikazani na slici 2, dobijeni nakon proizvodnje u CHO ćelijama zasejanim na 300’000 ćelija/ml; bez antibiotika, prema konvencionalnim postupcima: titar je analiziran pomoću ELISA na imobilizovanom anti-humanom IgG (Fc) odgovarajućeg antitela, a otkrivanje je izvedeno sa mAb miša protiv humanog kappa plus antitelima magarca protiv antitela miša obeleženih peroksidazom, i otkriven je kolorimetrijom na 450nm koristeći TMB podlogu.
[0113] Proizvodnja N13B2-h3 i N13B2-hVL6 je takođe testirana u eksperimentima privremene transfekcije. Dan pre transfekcije, COS ćelije su posejane na 100 000 ćelija/udubljenju u P12 ploču sa kompletnim medijumom (DMEM SVF10% (Hyclone) PS 1% Glu 1%) i inkubirane na 37 °C, 5% CO2. Dan transfekcije, COS ćelije su korišćene na 50 do 90% sastava. Isprani su PBS-om i držani sa 500 µl u kompletnom medijumu. 0.6 µg VH varijante 0.4 µg VL varijante je pomešano u 200 µl OptiMEM medijuma i dodato je 1 µl Plus reagensa (Invitrogen) (inkubacija 15 minuta na sobnoj temperaturi). U smešu je dodato 3.5 µl lipofektamina LTX (Invitrogen) 100 µl i inkubirano 25 minuta na sobnoj temperaturi. Cela mešavina se taloži kap po kap na COS ćelije i inkubira 48 sati na 37%, 5% CO2. Posle 48 h, supernatanti su sakupljeni i centrifugirani (1500 rpm 10 min 4 °C). Supernatanti su kvantifikovani sa ELISA n °TH-MO-43. Analiza aktivnosti je rađena sa ELISA TH-MO-44.
Primer 3. Vezivanje za CD127 – Elisa
[0114] Za “sendvič” ELISA, magareće anti-humano IgG (Fc specifično) antitelo je obloženo na 1.2 µg/ml na P96-ploči i dodata su prečišćena antitela za merenje koncentracije u funkciji standardnog opsega. Nakon inkubacije i pranja, dodat je laki lanac antitela miša protiv humanog, specifična kappa (Effimune, klon NaM76-5F3), plus antitela magaraca protiv antitela miševa obeležena peroksidazom (Jackson Immunoresearch, referenca 715-036-151) i otkrivena konvencionalnim postupcima.
[0115] ELISA analizom za aktivnost, rekombinantni hCD127 (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 10975-H08H) je imobilizovan na plastici na 1 µg/ml i dodata su razblažena antitela protiv CD 127 da bi se izmerilo vezivanje. Posle inkubacije i pranja, dodani su laki lanac (kappa specifičan) antitela miša protiv humanog antitela plus antitela magarca protiv antitela miša obeležena peroksidazom i otkriveni su kolorimetrijom na 450 nm koristeći TMB supstrat konvencionalnim postupcima.
4
[0116] Sledeće ED50 vrednosti su dobijene (koncentracija potrebna da bi se dostiglo 50 % maksimalnog signala):
Table
[0117] Stabilnost antitela je proučavana inkubiranjem antitela 7, 14, ili 30 dana na 4 °C, 25 °C i 42°C. Vezivanje antitela sa CD127 je još uvek odlično čak i nakon 30 dana inkubacije. Vrednosti ED50 određene pomoću ELISA posle 30 dana inkubacije su saopšteni u tabeli 2.
Tabela 2. ED50 vrednost (u ng/ml) za vezivanje sa CD127 antitela, nakon 30 dana inkubacije
Primer 4. Vezivanje za CD127 - Blitz
[0118] Ovaj postupak je izvršen sa Blitz (Forte Bio, C22-2 Br 61010-1).
[0119] Rekombinantni hCD127 (Sino Biologicals, Peking, Kina; referenca 10975-H08H) / rekombinantni protein (SinoBiological Cat: 11612-H08H) je imobilizovan na 50 µg/ml
4
pomoću Fc fragmenta u anti-humanom IgG Fc (AHC) biosenzorom (Forte Bio, 18 -5063) u trajanju od 30 sekundi. Zatim su dodata antitela protiv CD 127 na 20 µg/ml (koncentracija zasićenja) tokom perioda udruživanja od 120 sekundi, nakon čega je sledio period disocijacije antitela protiv CD 127 u kinetičkom puferu tokom 120 sekundi. Analiza podataka je napravljena sa Blitz pro 1.2 softverom, koji je izračunao konstantu asocijacije (ka) i konstantu disocijacije (kd) i odredio konstantu afiniteta KD (ka/kd). Rezultati su saopšteni u tabeli 3.
Table 3. Analiza afiniteta antitela protiv CD127 na humani CD127 rekombinantni protein pomoću Blitz
Primer 5. Inhibicija fosforilacije STAT5
[0120] Da bi se testirala inhibicija IL7R u funkcionalnoj analizi, antitelo je inkubirano sa humanim PBMC tokom 30 minuta na 37 °C, pre stimulacije sa IL7 (AbD Serotec, ref. PHP046) na 0.1 ng/ml tokom 15 minuta na 37 °C. Reakcija je zaustavljena na 4 °C, i isprano je sa Perm Wash puferom pre fiksiranja sa Cytofix/Cytoperm kitom (BD Bioscience, ref.
554722) tokom 15 minuta na 4 °C. Ćelije su isprane i obojene sa FITC obeleženim anti-CD3 (BD Bioscience, ref. 557694) tokom 30 minuta na 4 °C. Zatim su ćelije permeabilizovane u inkubaciji sa Perm puferom III (BD Bioscience, ref.558050) tokom 30 minuta na 4 ° C. Posle pranja sa PBS BSA1% Azid 0.1%, ćelije su obojene sa Alexa-647 obeleženim antitelom protiv pStat5 (BD Bioscience, ref.612599) tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su analizirani na BD Cantoll citofluorometru. hPBMC-CD3+ sa IL7 indukuje fosforilaciju pStat5, dok bez IL7 nemamo fosforilaciju. Rezultati su saopšteni na slici 4 i u tabeli u nastavku, prikazujući ED50, tj. koncentraciju naznačenog antitela za dostizanje 50% signala u ovoj analizi.
Tabela 4. Inhibicija fosforilacije STAT5 pomoću antitela protiv CD127
[0121] Ovaj eksperiment je potvrdio da modifikacija u germinativnim ćelijama i modifikacija strukturnih ostataka humanizovanom aminokiselinom nije promenila biološku aktivnost antitela protiv CD 127. Sve testirane varijante (N13B2-h3, N13B2-hVL3, N13B2-hVL4, N13B2-hVL5, N13B2-hVL6) mogu inhibirati fosforilaciju Stat5 nakon stimulacije sa IL7 na hPBMC, poput prethodno proizvedenih referentnih serija N13B2. Fokusirajući se na N13B2-hVL6 (najhumanizovaniji i najoptimizovaniji), primetili smo da je bio u stanju da održi svoju biološku aktivnost u inhibiranju fosforilacije Stat5, u istoj meri kao referentni N13B2-h3. Štaviše, ova varijanta je bila vrlo stabilna nakon 14 dana inkubacije na 42 °C, 25 °C ili 4 °C, nije indukovala stvaranje agregata i zadržala je aktivnost vezivanja.
Primer 6. Efekat na memorijske T ćelije
Model preosetljivosti odloženog tipa izazvan tuberkulinom
[0122] Babuni su imunizovani dva puta intradermalno vakcinom protiv bacila Calmette-Guerin (0.1 ml; 2-8105 CFU; Sanofi Pasteur MSD, Lion, Francuska) u gornjem delu noge, 4 i 2 nedelje pre testa preosetljivosti kože odloženog tipa (DTH ). Intradermalne reakcije (IDR) su izvedene sa intradermalnim injekcijama 2000 ili 1000 UI prečišćenog proteinskog derivata tuberkulina (PPD; Simbiotics Corporation, San Diego, CA). Fiziološki rastvor (0.1 ml) je korišćen kao negativna kontrola. Kožne promene na mestima ubrizgavanja su merene pomoću kvadratnog kalipra pomoću najmanje dva posmatrača i smatrale su se pozitivnim kada su prečnika > 4 mm. Drugi IDR je izvršen nakon tri nedelje perioda ispiranja i životinje su primile jednu intravensku injekciju od 10 mg/Kg N13B2 (n = 7) ili 10 mg/kg (V915GA, AA892BB, 32257, 33874) (n = 4) humanizovanog N13B2 ili ekvivalentnu zapreminu ekscipijenta (n = 4). Dodatni IDR su izvršeni svakog meseca nakon injekcije. Posle perioda pranja, neki babuni (prethodno tretirani sa N13B2) ponovo su imunizovani intradermalno dva
1
puta sa BCG, nakon čega je primenjen novi IDR. Srednja vrednost očitavanja je zabeležena i ucrtana za svaku vremensku tačku. Da bi se uporedilo više eksperimentalnih uslova, pojave eritema su kvantifikovane kao površina ispod krive (AUC) pomoću softvera Graph Pad Prism za izračunavanje (Slika 5A i B).
Elispot
[0123] Frekvencija antigen- specifičnih T ćelija je praćena IFN-g ELISPOT analizom (IFN-g ELISPOT komplet za primate ne uključujući ljude; R&D Systems, Minneapolis, MN) na sveže izolovanom PBMC ponovo stimulisanim tuberkulinom, prema uputstvima proizvođača.
[0124] Ukratko, antitelo za hvatanje (R&D sistemi, kataloški broj SEL961) je dodato u svako udubljenje Elispot Multi-Screen® HTS filter ploča (Merck Millipore) i inkubirano jednu noć na 4 °C. Posle tri pranja, dodat je pufer za blokiranje i ploča je inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi. PBMC babuna su sveže ekstrahovani iz krvi babuna Ficoll-ovim gradijentnim centrifugiranjem (GE Healthcare Life Science, Pariz, Francuska). Crvene krvne ćelije su zatim lizirane i ćelije su isprane pre rekonstitucije u odgovarajućoj koncentraciji u medijumu za kulturu (TexMacs medijum dopunjen penicilin-streptomicinom (Gibco)) sa proteinskim derivatom prečišćenim ili ne od tuberkulina. Ploča je inkubirana na 37 °C i 5% CO2tokom 18-24 sata. Posle tri pranja puferom za pranje, dodato je antitelo za detekciju (R&D sistemi, kataloški broj SEL961) i inkubirano na 4 °C tokom 24 sata. Streptavidin-AP (R&D sistemi, kataloški broj SEL002) je dodat nakon tri pranja i inkubiran dva sata na sobnoj temperaturi tokom 2 sata. Tri pranja su urađena. BCIP/NBT (R&D sistemi, kataloški broj SEL002) su dodati i stavljeni u mrak tokom 30 minuta. Bilo je potrebno nekoliko ispiranja sa puferom za pranje, i jedno dejionizovanom vodom (slika 5C).
Životinje
[0125] Babuni (Papio anubis; 7-14 kg) su dobijeni iz the Centre National de la Recherche Scientifique Centre de Primatologie (Rousset, Francuska). Životinje su bile smeštene u velikom objektu za životinje INSERM jedinice 1064. Studije na životinjama odobrio je Francuski nacionalni etički komitet.
Rezultati
2
[0126] U prvom eksperimentu, prvi IDR sa tuberkulinom izvršen je na vakcinisanim babunima sa BCG vakcinom koji u to vreme nisu lečeni (dan -30). Nakon perioda pranja od jednog meseca, izvršen je drugi IDR 4h i svakog meseca nakon intravenskog ubrizgavanja 10 mg/Kg N13B2 (beli stubići). Poslednji IDR je izvršen nakon nove vakcinacije sa BCG (14 meseci nakon ubrizgavanja antitela). Kontrolne životinje (crni stubići) dobile su intravenski sličnu zapreminu ekscipijenta i bilie su izazvane istim protokolom. Rezultati su pokazali da su himerna antitela protiv IL7Ra izazvala vrlo dugotrajnu zaštitu (do 14 meseci) nakon jedne primene. Odgovor se oporavio tek nakon nove vakcinacije.
[0127] U drugom eksperimentu, prvi IDR sa tuberkulinom je izveden na babunima vakcinisanim sa BCG (isprekidani stubići - npr. IDR1 za V915GA). Nakon perioda pranja od jednog meseca, izvršen je drugi IDR 4h i svakog meseca nakon intravenskog ubrizgavanja 10 mg/Kg humanizovanog N13B2 (popunjeni stubići - npr. IDR2-6 za V915GA). Poslednji IDR je izvršen nakon nove vakcinacije sa BCG i tuberkulinom (tačkasti stubići- npr. IDR7 za V915GA). Kontrolne životinje (crni stubići) dobile su intravenski sličnu zapreminu ekscipijenta i bile su izazvane istim protokolom. Rezultati su pokazali da je humanizovani N13B2 takođe izazvao dugotrajnu zaštitu nakon jedne primene kod 3 od 4 procenjena babuna. Životinja "33874" je u početku reagovala odmah nakon ubrizgavanja antitela, ali odgovor se spontano oporavio mesec dana kasnije.
[0128] PBMC krvi su ponovo stimulisani ex vivo sa tuberkulinom. Prvi IFNγ elispot sa ili bez tuberkulina izveden je na babunima vakcinisanim sa BCG (isprekidani stubići). Drugi IFNγ elispot je izveden 4 dana nakon ubrizgavanja 10 mg/Kg humanizovanog N13B2 (popunjeni stubići). Novi ELISPOT su zatim izvedeni svakog meseca na svakom novom IDR sa tuberkulinom in vivo. Poslednji IFNγ elispot je izveden nakon nove vakcinacije sa BCG (isprekidani stubići). Rezultati su pokazali da primena humanizovanog N13B2 izaziva uklanjanje antigen-specifičnih memorijskih T ćelija kod životinja sa dugotrajnim odgovorom. Babun "33874" nije pokazao značajno smanjenje memorijskih T ćelija specifičnih za tuberkulin paralelno sa nepostojanjem dugotrajne zaštite u DTH modelu. Nakon nove vakcinacije sa BCG, životinje sa dugotrajnim odgovorom pokazale su povećanu učestalost antigen-specifičnih memorijskih T ćelija koje se oporavljaju do bazalnog nivoa (pre ubrizgavanja mAb) i to je povezano sa oporavkom DTH odgovora in vivo. Sve zajedno, ovi rezultati su pokazali da je dugoročna zaštita izazvana humanizovanim N13B2 povezana sa uklanjanjem antigen-specifičnih memorijskih T ćelija, što objašnjava dugotrajan efekat leka.
Primer 7. Ekspresija IL-7, CD127 i TSLP kod IBD pacijenata
[0129] Podaci o ekspresiji ne obrađenih mRNK dobijeni kako su detaljno opisali u Planell et al. Gut 2013 su analizirani kako je detaljno prikazano u opisu slike 6.
Primer 8. Signalni put humanog PBMCstimulisanog sa antitelima protiv CD127 i IL7
[0130] IL7 signalni putevi su proučavani iz lizata humanog PBMC inkubiranog 30 minuta na 37 °C sa 10 µg/ml rastvorljivih antitela protiv humanih CD127 i stimulisanog sa IL7 (AbD Serotec, ref. PHP046) na 5 ng/ml tokom 10 minuta na 37 °C. Western Blot-ovi su izvedeni u redukovanim uslovima sa 20 µg proteina ćelijskih lizata u 7.5% poliakrilamidnim gelovima i upijeni na nitroceluloznim membranama (GeHealthcare). Fragmenti su zasićeni sa 5% fiziološkim rastvorom BSA-Tris pufera (TBS) i otkriveni takođe sa fosfo-Stat5, fosfo-PI3-kinazom p85, fosfo-Akt i fosfo-ERK1/2 antitelom (Cell Signaling Technologi) na 1/1000 u 1 % BSA-TBS (preko noći na 4 °C) praćeno poliklonalnim kozjim antitelom protiv zečijih koji su obeleženi peroksidazom iz rena (Cell Signalling Technology) na 1/2000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi ili sa GAPDH antitelom (Santa Cruz) na 1/1000 u 1% BSA-TBS (preko noći na 4 °C), praćeno poliklonalnim kozjim antitelom protiv miševih koji su obeleženi peroksidazom iz rena (Jackson Immunoresearch) na 1/2000 tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Membrane su otkrivene hemiluminescencijom primenom LAS-3000 sistema za snimanje (Fujifilm). Tako su analizirana sledeća antitela protiv humanog CD127: N13B2-h3 i N13B2-hVL6 (ovde su otkrivena oba antitela protiv mesta 1/2b); MD707-13-G4 („antitelo protiv mesta 1“, otkriveno u međunarodnoj patentnoj prijavi WO2013/056984) i 1A11 (otkriven u GSK patentu WO2011/094259).
Primer 9. Efekat oslobađanje citokina T ćelija u IBD tkivu
[0131] Biopsije pacijenata sa IBD mogu se koristiti kao inflamatorni model bolesti ex-vivo i ovde je pokazano da se spontano oslobađaju visoki nivoi proinflamatornih citokina nakon 24 sata kulture (UC: IFNγ, 130 ± 19 pg/ml; IL-6 , 4042 ± 529 pg/ml; IL-8, 25626 ± 1640 pg/ml -CD: IFNγ, 180 ± 38 pg/ml; IL-6, 3653 ± 734 pg/ml; IL-8, 15540 ± 2452 pg/ml [srednje vrednosti ± standardna greska za UC i CD, respektivno]).
[0132] Primenjeno je 10 µg/ml mAb protiv CD 127 u ovoj analizi kulture organa, u kojoj se koriste hirurški uzorci uzeti iz inflamatorne sluzokože debelog creva 20 pacijenata sa IBD (10
4
sa Crohn-ovom bolešću i 10 sa ulceroznim kolitisom, a kultura je urađena na 37 °C 24 sata u medijumu sa 10 µg/ml IgG kontrolnog mAb ili blokirajućeg mAb protiv humanog IL-7Rα (videti u nastavku detalje o uzorkovanju i uslovima kulture). Uzet je upareni kontrolni uzorak za svakog pacijenta i kultivisan u istim uslovima, sa IgG kontrolom umesto antitela protiv CD 127. Koncentracija citokina izmerena je pomoću ELISA (kao što je detaljno objašnjeno u nastavku) u supernatantu ex-vivo uzgajanih uzoraka.
[0133] Proizvodnja IFNγ u uzorcima UC biopsije uzgajanih ex-vivo značajno je inhibirana sa mAb protiv IL7Rα . Slični rezultati su primećeni za neke uzorke CD biopsije koji izlučuju visoku količinu IFNγ.
Ex-vivo uzorkovanje organa i kultura
[0134] Ako je korišćeno resekciono tkivo sluzokože, makazama su isečeni fragmenti male veličine kao za biopsiju. Sledeće, biopsije ili fragmenti veličine kao za biopsiju stavljeni su u 300 µl medijuma sa serumom bez HL-1 (Lonza, Cambridge BioScience, UK), dopunjenog L-glutaminom, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina i 50 µg/ml gentamicina. Eksplanti sluzokože inkubirani su 24 sata na 37 ° C i 5% CO2. Odgovarajuća testirana antitela (N13B2) ili IgG kontrola korišćena na 10 µg/ml je dodata u podlogu na početku vremena inkubacije. Na kraju, supernatant i materijal za biopsiju su brzo zamrznuti i čuvani na -70 ° C za buduću analizu.
Enzimska imunoadsorpciona analiza (ELISA)
[0135] Produkcija citokina u supernatantu biopsije je izmerena pomoću enzimske imunoadsorpcione analize (ELISA). Humani recombinant IFN-γ iz ImmunoTools (#31673539, Friesoythe, Nemačka) je korišćen u skladu sa upustvom proizvođača.
Primer 10. Poređenje antitela protiv humanog IL7-Rα u odnosu sa karakterizaciju njihovog epitopa
Analiza masene spektrometrije: profilisanje antitela korišćenjem peptidnog mikročipa
[0136] PepStar TM mikročipovi peptida peptidne technologije sadrže prečišćene sintetičke peptide izvedene iz antigena ili drugih izvora koji su hemoselektivno i kovalentno imobilisani na staklenoj površini. Optimizovani hidrofilni deo linkera se ubacuje između staklene površine i peptidne sekvence izvedene iz antigena da bi se izbegle lažne negativnosti izazvane sternom smetnjom. Iz tehničkih razloga svi peptidi obuhvataju C-kraj glicina. Eksperimenti profilisanja uzoraka su izvedeni na grupi peptida koja se sastojala od 52 peptida. Kompletna lista peptida prikazana je u nastavku:
Tabela 5. Lista peptida korišćenih u analizama mikročipova peptida
[0137] Ukupno su 4 uzorka inkubirana na staklima za mikročipove koristeći format sa većim brojem udubljenja. Za antitelo na N13B2-h3VL6 i druge uzorke (MD707-13, HAL i 1A11) primenjeno je 6 različitih koncentracija (10 µg/ml; 2 µg/ml; 1 µg/ml; 0.1 µg/ml; 0.01 µg/ml; 0.001 µg/ml). Serijski razblaženi uzorci inkubirani su 1 sat na 30 °C na staklu za mikročip sa većim brojem udubljenja, koje sadrži 21 individualni mini niz (1 mini niz po razblaženom uzorku). Posle inkubacije uzorka, dodat je 1 µg/ml sekundarnog antitela protiv humanog IgG i ostavljeno da reaguje 1 sat. Dodatna kontrola inkubacije koja se primenjuje samo na sekundarno antitelo izvedena je paralelno na istom staklu za mikročip za procenu lažno pozitivnog vezivanja za peptide. Posle pranja i sušenja, staklo je skenirano laserskim skenerom visoke rezolucije na 635 nm da bi se dobili profili intenziteta fluorescencije. Dobijene slike su kvantifikovane da bi se dobila srednja vrednost piksela za svaki peptid. Slike su kvantifikovane da bi se dobila srednja vrednost piksela za svaki peptid. Sekundarno antitelo protiv humanog IgG bilo je obeleženo sa 1 µg/ml Cy5.
[0138] Puferi i rastvori. Upotrijebljeni pufer je bio TBS-pufer koji uključuje 0.05% Tween20 (JPT) i Assay pufer T20 (Pierce, SuperBlock TBS T20, # 37536). Dobijanje i analiza su izvršeni pomoću mikročipova peptida (JPT Peptide Technologies GmbH, Berlin, Nemačka; serija # 2668, komora za inkubaciju sa više udubljenja, Axon Genepix Scanner 4200AL, Mikročipovi su skenirani pomoću fluorescentnog skenera visoke rezolucije. Postavke lasera i primenjena rezolucija bili su identični za sva izvedena merenja. Dobijene slike su analizirane i kvantifikovane pomoću softvera za prepoznavanje tačaka GenePix (Molecular Devices). Za svaku tačku izdvojen je srednji intenzitet signala (između 0 i 65535 proizvoljnih jedinica).
[0139] Za dalju procenu podataka određene su takozvane MMC2 vrednosti. MMC2 je jednaka srednjoj vrednosti sva tri slučaja na mikročipu, osim kada je koeficijent varijacije (CV) -standardna devijacija podeljena sa srednjom vrednošću - veći od 0.5. U ovom slučaju srednja vrednost dve najbliže vrednosti (MC2) je MMC2.
Analiza deuterijuma
[0140] Koristeći sistem HDX-2 (Waters S.A./N.V.; Zellik, Belgija), rekombinantni humani CD127 i 0 ili 1 molarni ekvivalent mAb su pomešani i razblaženi u 99.9% D2O, 10mM natrijum fosfatu, 100mM NaCl, pH 6.8 do konačnog D2O sadržaja od 90% i koncentracije kompleksa CD127 ili CD127/mAb od 27.5 µM. Zamena vodonik-deuterijum je izvršena na 20.0 °C tokom 30 minuta. Razmena je utoljena razblaživanjem 1:1 (zapr./zapr.) uzoraka sa 100 mM natrijum fosfatom, 4M gvanidina HCI, 0.4 M TCEP, pH 2.3, na 1.0 ° C što rezultuje konačnim pH od 2.5. Posle 2 minuta, utoljeni uzorci su učitani u HDX kontrolor za digestiju pepsina uživo na 20.0 °C (Enzymate BEH Pepsin, 2.1 × 30 mm; 5 µm), nakon čega je usledila desalinacija (Acquity BEH C18 Vanguard 2.1 mm × 5 mm; 1.7 µm) i reverzna faza odvajanja (Acquity BEH C18 1.0 mm × 100 mm; 1.7 µM) korišćenjem gradijenta od 5% -40% 0.2% mravlje kiseline u acetonitrilu (pH 2.5) tokom 10 minuta pri brzini protoka od 40 µl/min na 0.0 °C. Analiza masene spektrometrije izvedena je na masenom spektrometru Waters Xevo G2-XS ESIQ-TOF u režimu pozitivnih jona, sa korekcijom raspršivanja. Korišćeni su umereni izvorni uslovi (temperatura: 90 °C, kapilarni napon: 2.5 kV, kupa za uzimanje uzoraka: 30 V, protok desolviranog gasa: 800 L/h, temperatura desolvacije: 250 °C) da bi se minimalizovala povratna razmena, istovremeno obezbeđujući odgovarajuću desolvaciju (73). Identifikacija peptida je potpomognuta disocijacijom izazvanom sudaranjem prikupljenim u MSE režimu, koristeći PLGS 3.0.2 i UNIFI 1.8. Ugrađivanje deuterijuma je određeno u DinamX 3.0. Slike struktura su pripremljene korišćenjem PyMOL 1.8.2.3 (Schrödinger LLC, Cambridge, MA, USA) iz PDB ID 3DI3 (19). Monobazni i dvobazni natrijum fosfat, natrijum hlorid, gvanidin hidrohlorid, tris (2-karboksietil) fosfin hidrohlorid (TCEP), 50% natrijum hidroksid i mravlja kiselina su kupljeni od Sigme Aldrich (Schnelldorf, Nemačka) sa najvišom dostupnom čistoćom. Gradusi LC-MS rastvarača su dobijeni iz Biosolve Chimie (Dieuze, Francuska), deuterijum oksid (99.9% D) i 20% deuterijum hlorida u deuterijum oksidu (99.96% D) iz Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA, SAD), 37% hlorovodonične kiseline iz VWR International (Fontenai-sous-Bois, Francuska), i goveđi digestirani citohrom C iz kompanije Thermo Fisher Scientific (Germering, Nemačka). Amicon ultracentrifugalni filteri (0.5 ml; granična vrednost 10 kDa) dobijeni su od Merck Millipore (Molsheim, Francuska).
Rezultati
[0141] Karakterizacijom epitopa linearnim nizom peptida različitih mAbs protiv IL7Ra identifikovana su dva tipa mAb antagonista: (1) mAbs koja se vezuju za region (mesto-1) interakcije sa IL-7, kako su prethodno opisale dve druge grupe (klon 1A11 otkriven u WO/2011/094259 i klon HAL otkriven u WO/2011/104687) i uključujući MD707-13, i (2) mAb, tj. N13B2-h3VL6 prema ovom pronalasku, koji se vezuje i za mesto-1 i za epitop koji se preklapaju predviđenim domenom (mestom-2b) heterodimerizacije između IL-7Rα i podjedinica γ lanca (Valsh 2012).
[0142] N13B2-h3VL6 i MD707-13 sa visokim i sličnim afinitetima (povezivanja sa mestom-1/2b sa KD od 2.10-10M i povezivanje sa mestom-1 sa sličnim KD od 5.10<-10>M) rekombinantno su eksprimirani sa humanim IgG4 Fc izotipom (koji sadrži S228P zglobnu mutaciju da bi se sprečila Fab-arm razmena) i upoređeni sa prethodno opisanim drugim mAb sa sličnim afinitetom za mesto-1, klon 1A11, otkriven u WO/2011/094259 (KD od 6.10<-10>M) i rekombinantno eksprimirani sa humanim IgG1 Fc izotipom kako se razvija u klinici (NCT02293161). Analiza konformacionog epitopa korišćenjem razmene vodonik-deuterijum sa masenom spektrometrijom (HDX-MS) potvrdila je prethodna zapažanja i pokazala da je antitelo prema pronalasku, tj. N13B2-h3VL6 (mAb mesto-1/2b), štitilo od ugradnje deuterijuma u nekoliko peptida mesta-1, ali takođe i u peptid koji se preklapa sa mestom-2b, dok druga dva mAbs (MD707-13 i 1A11) značajno sprečavaju ugradnju deuterijuma samo u peptide sa mesta-1 (podaci nisu prikazani).
[0143] Antitelo prema pronalasku je jedino prepoznalo konformacioni epitop smešten na mestu 1 iz domena 1 i konformacioni epitop smešten na mestu 2b humanog CD127.
Primer 11. Poređenja antitela protiv humanog IL-7Rα sa njihovom sposobnošću da budu agonisti i/ili antagonisti IL-7 puta
Western Blot
[0144] Sveže izolovani humani PBMC inkubirani su 30 minuta na 37 °C sa 10 µg/ml mAbs protiv humanih IL-7Rα , a zatim uzgajani sami ili sa 5 ng/ml rekombinantnog humanog IL-7 (AbDSerotec) 10 minuta na 37 °C. Nakon zaustavljanja reakcija na ledu, ćelijski lizati su pripremljeni sa RIPA puferom (sa koktelom inhibitora proteaze). Proteini (15 µg) su rastvoreni pod redukcionim uslovima na 7.5% poliakrilamidnim gelovima i imobilisani na nitroceluloznim membranama (Ge-Healthcare) pomoću standardnih postupaka. Mrlje su isprane sa 5% fiziološkim rastvorom BSA-Tris pufera i inkubirani sa Fosfo-STAT 5, Fosfo-PI3K p55 ili Fosfo-ERK specifičnim antitelima u 1% BSA-TBS (preko noći na 4 °C), zatim poliklonalnim kozjim antitelom protiv zečijih koji su obeleženi peroksidazom iz rena (Cell Signalling Technology) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Alternativno, mrlje su obojene korišćenjem GAPDH antitela (Santa Cruz) u 1% BSA-TBS (preko noći na 4 °C), zatim poliklonalnim kozjim antitelom protiv miševih koji su obeleženi peroksidazom iz rena (Jackson Immunoresearch) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Membrane su otkrivene hemiluminescencijom primenom LAS-3000 sistema za snimanje (Fujifilm).
RNA sekvenciranje
[0145] Sveže izolovani humani PBMCs su inkubirani sa 10 µg/ml mAbs protiv humanog IL-7Rα (30 min na 37 °C), a zatim su uzgajani sami ili sa 5 ng/ml rekombinantnog humanog IL-7 (AbDSerotec) tokom 3 sata na 37 °C. Reakcije su zaustavljene na ledu i ćelije peleta su resuspendovane u RLT puferu (Qiagen) koji sadrži 1% β merkaptoetanola u vodi bez RNaze/DNaze i čuvane na -80 °C. RNK je ekstrahovana pomoću RNA mini ekstrakcionog kita prema uputstvima proizvođača (Qiagen). Kvalitet i količina RNK procenjeni su infracrvenom spektrometrijom (Nanodrop) i Agilent bioanalizatorom (Agilent RNA 6000 Pico Kit). Grupe Smart-Seq2 su pripremljene pomoću the Broad Technology Labs, a sekvencirane su korišćenjem the Broad Genomics Platform prema SmartSeq2 protokolu sa nekim modifikacijama. Ukratko, ukupna RNK je prečišćena upotrebom RNA-SPRI kapljica, poliA mRNA je reverzno transkribovana u cDNA, a amplifikovana cDNA je bila podvrgnuta fragmentaciji zasnovanoj na transpozonu koja je koristila dvostruko indeksiranje za barkodiranje svakog fragmenta svakog konvertovanog transkripta sa kombinacijom barkodova specifičnih za svaki uzorak. Sekvenciranje je izvedeno kao upareni krajevi 2x25bp sa dodatnih 8 ciklusa za svaki indeks. Podaci su odvojeni barkodom i poravnjani pomoću Tophat verzije 2.0.10 sa podrazumevanim podešavanjima. Transkripti su kvantifikovani pomoću the Broad Technology Labs računskim propuštanjem koristeći Cuffquant verziju 2.2.1. Ukratko, podaci su obrađeni preko CuffNorm ako je 50% očitavanja poravnjano i ako je po uzorku poravnjano najmanje 100,000 parova. Normalizacija je koristila podrazumevane postavke, uključujući „geometrijsku“ normalizaciju, a informacije o nivou ekspresije transformisanih vrednosti FPKM sa log2 (fragmenti po kilobazi transkripta po milionu mapiranih fragmenata) su korišćene za naknadne analize. Za identifikaciju različitih gena izvedeno je linearno modeliranje sa procenom odnosa srednje vrednosti-varijanse (limmatrend) sa empirijskim Bajesovim statističkim postupkom primenom limma paketa u R. Geni sa Benjamini i Hochberg prilagođenjem p-vrednost <5% i putom promene (FC )> 1.5 su smatrani različito eksprimiranim. Za prikaz ekspresije gena, analiza glavnih komponenata (PCA) i grupisanje su izvedeni u R v3.3.2 koristeći pakete ade4/adegraphics i pheatmap, respektivno. Biološki značaj odabranih gena procenjen je pomoću paketa R clusterProfiler. Odabrane su kategorije ontologije gena (GO) obogaćene stopom lažnih pronalazaka (FDR) <5% i sa najmanje pet zastupljenih gena. Podacima RNA-sekvenci može se pristupiti pod GEO pristupnim brojem GSE.
Rezultati
STAT5, PIK3 i ERK signalni putevi
[0146] Zatim su upoređeni mAbs protiv humanog IL-7Rα (N13B2-h3VL6, MD707-13, 1A11 i HAL) po njihovoj sposobnosti da aktiviraju ili blokiraju STAT5, PI3K i ERK signalne puteve prethodno povezane sa IL-7R signalizacijom (slike 9 i 10). Kao što je prethodno prikazano (videti na primer Sliku 7), IL-7 indukuje moćnu fosforilaciju STAT5 na humanim PBMCs i svi testirani mAbs su snažni inhibitori ove fosforilacije STAT5 (vidi sliku 7).
Suprotno tome, i kao što je prikazano na slikama 9 i 10, istraživači su otkrili da dok IL-7 indukuje varijabilnu PI3K fosforilaciju i ne indukuje ERK fosforilaciju, antitela prethodne tehnike (nazvana MD707-13, 1A11 i HAL) značajno indukuju ERK fosforilacija i u manjoj meri PI3K signal, čak i u odsustvu egzogenog IL-7, suprotno antitelu prema pronalasku. Ova otkrića pokazuju da antitela protiv humanog IL-7Rα prethodne tehnike imaju delimična agonistička svojstva, i stoga se smatraju dvostrukim agonistima/antagonistima mAbs za humani IL-7R. Suprotno tome, antitelo prema pronalasku, a posebno N13B2-h3VL6, ima samo antagonističko svojstvo za humani IL-7R.
[0147] Istraivači su procenjivali da li antitela sa agonističkim/antagonističkim svojstvima mogu da isporuče efikasan agonistički signal sposoban da modifikuje humane T ćelije. Transkriptomi humanih PBMCs inkubirani 3.5 sata bez egzogenog humanog IL-7, sa humanim IL-7 i sa IL-7 i antitelom (MD707-13, 1A11 mesto-1 (IgG4 # 1 ili IgG1 # 2, respektivno) ili N13B2 -hVL6 mesto-1/2b (IgG4)) su analizirani na osnovu nove generacije sekvenciranja RNK (RNASEQ). Ukupno 481 gen je različito eksprimiran u humanim PBMCs inkubiranim sa mAbs protiv humanog IL-7Rα u poređenju sa kontrolnim uslovima, dok je ukupno 334 gena bilo različito eksprimirano samo stimulacijom sa humanim IL-7 u poređenju sa kontrolnim uslovima.
1
�
�
�
Tabela 6. Lista gena značajno (FDR 5%) i različito (put promene > 1.5) eksprimiranih nakon inkubacije humanih PBMCs (n=7) sa mAbs protiv IL7Rα u poređenju sa nestimulisanim ćelijama
[0148] Analizom Venn-ovog dijagrama (slika 11C) identifikovano je 61 uobičajeno različito eksprimiranih gena sa tri mAbs bez ikakvog posebnog GoMiner obogaćivanja ontologije gena. Uprkos 61 uobičajenom genu, antitelo prema pronalasku indukuje samo 31 značajnu modifikaciju gena bez obogaćivanja ontologije gena. Nasuprot tome, dva antitela prethodne
2
tehnike indukuju važnu transkripcionu modifikaciju humanih PBMCs transkriptoma, sa 245 različito eksprimiranih gena indukovanih pomoću IgG4 # 1 mAb na mestu 1 i 237 različito eksprimiranih gena indukovanih pomoću IgG1 #2 mAb na mestu 1.78 različito eksprimiranih gena bilo je obično između ova dva mAbs na mestu 1, ali ovi geni nisu različito ekspimirami kada se PBMCs stimulišu sa N13B2-hVL6.
[0149] Analiza glavnih komponenata (PCA) IL-7 potpisa pokazuje da se različito eksprimirani geni indukovani antitelima prethodne tehnike jako razlikuju od različito eksprimiranih gena indukovanih pomoću IL-7. GoMiner obogaćivanje ontologije gena sugeriše da oba antitela prethodne tehnike modifikuju biološke funkcije PBMCs, kao što su aktivacija leukocita, proliferacija, migracija, hemotaksa, sekrecija citokina i inflamatorni odgovori povezani sa putem MAPK/ERK.
[0150] Između 334 različito eksprimiranih gena sa IL7 u poređenju sa kontrolnim uslovima, 93 gena su različito eksprimirana sa velikom promenom puta (> 2) i podeljena su u 3 različita klastera analizom toplotne mape (slika 11A). Prvi klaster manje regulisanih gena procenjen obogaćivanjem ontologije gena uglavnom se dovodio u vezu sa diferencijacijom i apoptozom leukocita, drugi klaster visoko više regulisanih gena bio je povezan sa adhezijom, diferencijacijom i aktivacijom leukocita, a treći klaster više regulisanih gena imao je mešovitu ontologiju gena. Zanimljivo je da su sva testirana mAbs (i mesta-1 i mesta-1/2b) pokazali slične efekte sprečavanjem modifikacije klastera-1 i klastera-2, ali bez uticaja na klaster-3 (Slika 11B).
[0151] Sveukupno, transkripcione analize su potvrdile da su uprkos tome što su mAbs protiv humanog IL-7Rα mesta-1 i mesta-1/2b delila slična antagonistička svojstva, dva mAbs mesta-1 opisana u stanju tehnike indukovala značajne transkripcione modifikacije humanih PBMCs kompatibilno sa aktivacijom T-ćelija i inflamatornim odgovorima indukovanim MAPK/ERK putem.
[0152] mAb protiv humanog IL-7Rα mesta 1/2b prema pronalasku, tj. N13B2-hVL6, indukovalo je manje transkripcione modifikacije humanih PBMCs u poređenju sa dva mAbs mesta-1 opisana u stanju tehnike.
[0153] Nedostatak specifičnih i “samo antagonističkih” mAbs protiv IL-7Rα za krupnije vrste sprečavao je verifikaciju ovog efekta kod primata ili ljudi. Istraživači su otkrili da agonistička/antagonistička svojstva mAbs protiv IL-7Rα zavise od specifičnog ciljanog epitopa, jer izgleda da antitela stanja tehnike koja se vezuju za domen interakcije mesta-1 i IL-7 imaju i agonistička/antagonistička svojstva, dok antitelo prema pronalasku koje se vezuje za dimerizovan domen IL-7Rα/γc (mesto 2b) pokazuje striktno antagonističku aktivnost. Istraživači sugerišu da bi antitelo prema pronalasku moglo da poremeti dimerizaciju IL-7Rα/γc potrebnu za internalizaciju receptora i signalizaciju. „Samo antagonistična“ antitela protiv IL-7R sprečavaju upalu kože kod primata posredovanu dugotrajnim memorijskim T-ćelijama, čak i posle hronične stimulacije antigenom, bez indukovanja limfopenije ili funkcionalnih ili metaboličkih nedostataka poliklonalnih T-ćelija.
[0154] Pokazano je da IL-7 indukuje proliferativne i anti-apoptotske signale putem IL-7R signalizacije uglavnom aktiviranjem JAK/STAT puta. Takođe se veruje da IL-7R signalizacija uključuje PI3K/AKT put, ali to je primećeno kod transformisanih imortalizovanih ćelijskih linija ili primarnih timocita i ti signali nisu otkriveni u perifernim naivnim ili memorijskim humanim T limfocitima (Watanabe, J. Exp. Med., 1998). Nekoliko saopštenja takođe sugeriše da bi IL-7R signalizacija mogla da amplifikuje fosforilaciju ERK bilo u T limfocitima ili u podskupinama pro-B ćelija (Deshpande P. I. Immunol, 2013; Fleming HE i Paige CJ, Immunity, 2001). Uloga ovih puteva u signalizaciji IL-7R u zrelim i humanim T ćelijama je manje jasna. Korišćenje primarnih sveže izolovanih humanih PBMCs (uglavnom sastavljenih od T i B limfocita, monocita i NK ćelija) zdravih dobrovoljaca stimulisanih visokom koncentracijom rekombinantnog humanog IL-7 (5000pg/ml, dok je koncentracija u serumima ∼ 5 pg/ml u ne-limfopeničnim uslovima Wong H-L, Cancer Epidemiol Biomarkers Prev, 2008)), istraživači su potvrdili da je IL-7 indukovao ponovnu fosforilaciju STAT5. Aktiviranje signala PI3K je bilo više promeljivo i oni nisu primetili bilo kakvu ERK fosforilaciju. Iako su svi mAbs protiv IL7Rα korišćeni u ovoj studiji bili snažni inhibitori pSTAT5 indukovanog sa IL-7 i pokazivali slična svojstva transkripcionih antagonista, otkrili smo da su dva mAbs mesta 1 stanja tehnike indukovala PI3K/ERK agonistične signale i važne transkripcione modifikacije povezane sa aktivacijom T-ćelija i inflamatornim odgovorima indukovanim MAPK/ERK putem. Ova suprotstavljena dualna svojstva agonista/antagonista nekih mAbs nisu jedinstvena, jer su drugi ciljani poput IL-4, IL-6R, IL-15, CD28, CD38, CD40 ili HER2 pokazali slične aktivnosti nakon endocitoze/internalizacije receptora.
[0155] Heterodimerizacija ovog mesta 2b sa TSLPR takođe je nedavno potvrđena i pokazalo se da je spremno za signalizaciju receptorima kao što je već predviđeno za IL-7Rα i γ-lanac (Verstraete K., Nature Communications, 2017). Zanimljivo je da se predviđeno mesto heterodimerizacije između IL-7Rα/γ-lanca i IL-7Rα/TSLPR preklapa, što sugeriše na zajednički mehanizam signalizacije posredovan heterodimerizacijom između oba receptora.
4
[0156] Otkrili smo da in vitro analizom inhibicije pSTAT5 nije bila predviđena efikasnost antitela protiv IL-7R in vivo. U prethodnom saopštenju, drugo mAb protiv IL7Rα sprečavalo je in vitro i ex vivo pSTAT5 indukovanu sa IL-7 kod primata, ali nije zaštitilo marmozete od upale mozga u eksperimentalnom modelu autoimunskog encefalitisa (EAE) (Dunham J., J. Neuroimmune.Pharmacol, 2016).
[0157] IL-7 je dobro opisan u održavanju pula perifernih naivnih i memorijskih T limfocita kod miševa. Međutim, kod primata važnost IL-7 u održavanju homeostaze perifernih T-ćelija može stoga biti manje evidentna i/ili suvišni mehanizmi mogu objasniti razliku između vrsta.
[0158] Ovi podaci su pokazali da nisu samo antagonistička svojstva mAbs protiv IL-7Rα i efikasnost in vivo povezani sa sprečavanjem vezivanja IL-7 i inhibicijom pSTAT5. Ovi podaci su pokazali da je antitelo prema pronalasku, koje takođe ciljano deluje na mesto receptora heterodimerizacije (mesto 2b), „samo antagonist“ i rezultuje većom efikasnošću inhibitornih odgovora T ćelija in vivo.
[0159] Ciljano interagovanje IL7R sa antitelima „samo antagonistima“ ima potencijal da reguliše opstanak i akumulaciju antigen-specifičnih memorijskih T ćelija i stoga može podsticati sprečavanje dugotrajnog recidiva kod autoimunih i inflamatornih bolesti.
Reference
[0160]
Abraham, C. & Cho, J. H. Inflammatory Bowel Disease. New England Journal of Medicine 361, 2066-2078 (2009).
Adams, D. H. & Eksteen, B. Aberrant homing of mucosal T cells and extra-intestinal manifestations of inflammatory bowel disease. Nat. Rev. Immunol.6, 244-251 (2006).
Agace, W. W. Tissue-tropic effector T cells: generation and targeting opportunities. Nat. Rev. Immunol. 6, 682-692 (2006). Albuquerque AS, Cortesao CS, Foxall RB, Soares RS, Victorino RM, Sousa AE. Rate of increase in circulating IL-7 and loss of IL-7Ralpha expression differ in HIV-1 and HIV-2 infections: two lymphopenic diseases with similar hyperimmune activation but distinct outcomes. J Immunol. 2007 Mar 1;178(5):3252-9. PubMed PMID: 17312174.
Baumgart, D. C. & Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet 380, 1590-1605 (2012).
Broux, B., Hellings, N., Venken, K., Rummens, J.-L., Hensen, K., Van Wijmeersch, B., and Stinissen, P. (2010). Haplotype 4 of the multiple sclerosis-associated interleukin-7 receptor alpha gene influences the frequency of recent thymic emigrants. Genes Immun.11, 326-333.
Chothia, C., and Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. J. Mol. Biol.196, 901-917.
Chothia C, Lesk AM, Gherardi E, Tomlinson IM, Walter G, Marks JD, Llewelyn MB, Winter G. Structural repertoire of the human VH segments. J Mol Biol.1992 Oct 5;227(3):799-817.
Clark LA, Demarest SJ, Eldredge J, Jarpe MB, Li Y, Simon K, van Vlijmen HW. Influence of canonical structure determining residues on antibody affinity and stability. J Struct Biol.2014 Feb;185(2):223-7. doi: 10.1016/j.jsb.2013.08.009. PubMed PMID: 23994046
Danese, S. & Fiocchi, C. Ulcerative colitis. N. Engl. J. Med.365, 1713-1725 (2011).
Denucci, C.C., Mitchell, J.S., and Shimizu, Y. (2009). Integrin function in T-cell homing to lymphoid and nonlymphoid sites: getting there and staying there. Crit. Rev. Immunol.29, 87-109.
Feagan, B. G. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Ulcerative Colitis. New England Journal of Medicine 369, 699-710 (2013).
Deshpande, P., Cavanagh, M.M., Le Saux, S., Singh, K., Weyand, C.M., and Goronzy, J.J. (2013). IL-7- and IL-15-mediated TCR sensitization enables T cell responses to self-antigens. J. Immunol. Baltim. Md 1950190, 1416-1423.
Dunham, J., Lee, L.-F., Driel, N. van, Laman, J.D., Ni, I., Zhai, W., Tu, G.-H., Lin, J.C., Bauer, J., Hart, B.A. ’t, et al. (2016). Blockade of CD127 Exerts a Dichotomous Clinical Effect in Marmoset Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Neuroimmune Pharmacol. 11, 73-83.
Fleming, H.E., and Paige, C.J. (2001). Pre-B Cell Receptor Signaling Mediates Selective Response to IL-7 at the Pro-B to Pre-B Cell Transition via an ERK/MAP Kinase-Dependent Pathway. Immunity 15, 521-531.
Gorfu, G., Rivera-Nieves, J., and Ley, K. (2009). Role of beta7 integrins in intestinal lymphocyte homing and retention. Curr. Mol. Med.9, 836-850.
Haas, J., Korporal, M., Schwarz, A., Balint, B., and Wildemann, B. (2011). The interleukin-7 receptor α chain contributes to altered homeostasis of regulatory T cells in multiple sclerosis. Eur. J. Immunol. 41, 845-853.
Haudebourg, T., Poirier, N., and Vanhove, B. (2009). Depleting T-cell subpopulations in organ transplantation. Transpl. Int. Off. J. Eur. Soc. Organ Transplant. 22, 509-518.
He, R., and Geha, R.S. (2010). Thymic stromal lymphopoietin. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1183, 13-24.
Henriques, C.M., Rino, J., Nibbs, R.J., Graham, G.J., and Barata, J.T. (2010). IL-7 induces rapid clathrin-mediated internalization and JAK3-dependent degradation of IL-7Ralpha in T cells. Blood 115, 3269-3277.
Kabat, E.A., Wu, T.T., Reid-Miller, M., Perry, H.M. and Gottesman, K.S. (1992) Sequences of Proteins of Immunological Interest (DIANE publishing, 1992).
Kern, B., Kraynov, E., Lee, L.-F., Ray, R. (2013). Receptor occupancy and internalization of an anti-IL-7 receptor antibody. Cytokine 63, 276-277.
Kern B, Li W, Bono C, Lee LF, Kraynov E. Receptor occupancy and blocking of STAT5 signaling by an anti-IL-7 receptor α antibody in cynomolgus monkeys. Cytometry B Clin Cytom. 2016 Mar;90(2):191-8.
Khor, B., Gardet, A. & Xavier, R. J. Genetics and pathogenesis of inflammatory bowel disease. Nature 474, 307-317 (2011).
Lei, L., Zhang, Y., Yao, W., Kaplan, M.H., and Zhou, B. (2011). Thymic Stromal Lymphopoietin Interferes with Airway Tolerance by Suppressing the Generation of Antigen-Specific Regulatory T Cells. J. Immunol.186, 2254-2261.
Mazzucchelli, R., Hixon, J.A., Spolski, R., Chen, X., Li, W.Q., Hall, V.L., Willette-Brown, J., Hurwitz, A.A., Leonard, W.J., and Durum, S.K. (2008). Development of regulatory T cells requires IL-7Ralpha stimulation by IL-7 or TSLP. Blood 112, 3283-3292.
McElroy CA, Dohm JA, Walsh ST. Structural and biophysical studies of the human IL-7/IL-7Ralpha complex. Structure.2009 Jan 14;17(1):54-65. doi: 10.1016/j.str.2008.10.019.
McElroy CA, Holland PJ, Zhao P, Lim JM, Wells L, Eisenstein E, Walsh ST. Structural reorganization of the interleukin-7 signaling complex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14;109(7):2503-8. doi: 10.1073/pnas.1116582109
Michel, L., Berthelot, L., Pettré, S., Wiertlewski, S., Lefrère, F., Braudeau, C., Brouard, S., Soulillou, J.-P., and Laplaud, D.-A. (2008). Patients with relapsing-remitting multiple sclerosis have normal Treg function when cells expressing IL-7 receptor alpha-chain are excluded from the analysis. J. Clin. Invest. 118, 3411-3419.
Planell N, Lozano JJ, Mora-Buch R, Masamunt MC, Jimeno M, Ordás I, Esteller M, Ricart E, Piqué JM, Panes J, Salas A. Transcriptional analysis of the intestinal mucosa of patients with ulcerative colitis in remission reveals lasting epithelial cell alterations. Gut. 2013 Jul;62(7):967-76. doi: 10.1136/gutjnl-2012-303333
Racapé, M., Vanhove, B., Soulillou, J.-P., and Brouard, S. (2009). Interleukin 7 receptor alpha as a potential therapeutic target in transplantation. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz.) 57, 253-261.
Reche PA, Soumelis V, Gorman DM, Clifford T, Liu Mr, Travis M, Zurawski SM, Johnston J, Liu YJ, Spits H, de Waal Malefyt R, Kastelein RA, Bazan JF. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 2001 Jul 1;167(1):336-43 Roan, F., Bell, B.D., Stoklasek, T.A., Kitajima, M., Han, H., and Ziegler, S.F. (2012). The multiple facets of thymic stromal lymphopoietin (TSLP) during allergic inflammation and beyond. J. Leukoc. Biol.91, 877-886.
Rochman, Y., Kashyap, M., Robinson, G.W., Sakamoto, K., Gomez-Rodriguez, J., Wagner, K.-U., and Leonard, W.J. (2010). Thymic stromal lymphopoietin-mediated STAT5 phosphorylation via kinases JAK1 and JAK2 reveals a key difference from IL-7-induced signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.107, 19455-19460.
Sandborn, W. J. et al. Vedolizumab as Induction and Maintenance Therapy for Crohn’s Disease. New England Journal of Medicine 369, 711-721 (2013).
Shochat C, Tal N, Bandapalli OR, Palmi C, Ganmore I, te Kronnie G, Cario G, Cazzaniga G, Kulozik AE, Stanulla M, Schrappe M, Biondi A, Basso G, Bercovich D, Muckenthaler MU, Izraeli S. Gain-of-function mutations in interleukin-7 receptor-α (IL7R) in childhood acute lymphoblastic leukemias. J Exp Med. 2011 May 9; 208(5):901-8. doi: 10.1084/jem.20110580. Erratum in: J Exp Med. 2011 May 9;208(5):preceding 901. J Exp Med. 2011 Jun 6;208(6):1333
Taylor, B.C., Zaph, C., Troy, A.E., Du, Y., Guild, K.J., Comeau, M.R., and Artis, D. (2009). TSLP regulates intestinal immunity and inflammation in mouse models of helminth infection and colitis. J. Exp. Med.206, 655-667.
Van Bodegom, D., Zhong, J., Kopp, N., Dutta, C., Kim, M.-S., Bird, L., Weigert, O., Tyner, J., Pandey, A., Yoda, A., et al. (2012). Differences in signaling through the B-cell leukemia oncoprotein CRLF2 in response to TSLP and through mutant JAK2. Blood 120, 2853-2863.
Verstraete, K., Peelman, F., Braun, H., Lopez, J., Van Rompaey, D., Dansercoer, A., Vandenberghe, I., Pauwels, K., Tavernier, J., Lambrecht, B.N., et al. (2017). Structure and antagonism of the receptor complex mediated by human TSLP in allergy and asthma. Nat. Commun. 8.
Walsh ST. Structural insights into the common γ-chain family of cytokines and receptors from the interleukin-7 pathway. Immunol Rev. 2012 Nov;250(1):303-16
Watanabe, M., Ueno, Y., Yajima, T., Okamoto, S., Hayashi, T., Yamazaki, M., Iwao, Y., Ishii, H., Habu, S., Uehira, M., et al. (1998). Interleukin 7 transgenic mice develop chronic colitis with decreased interleukin 7 protein accumulation in the colonic mucosa. J. Exp. Med.
187, 389-402.
Watanabe, N., Wang, Y.-H., Lee, H.K., Ito, T., Wang, Y.-H., Cao, W., and Liu, Y.-J. (2005a). Hassall’s corpuscles instruct dendritic cells to induce CD4+CD25+ regulatory T cells in human thymus. Nature 436, 1181-1185.
Wong, H.-L., Pfeiffer, R.M., Fears, T.R., Vermeulen, R., Ji, S., and Rabkin, C.S. (2008). Reproducibility Ying, S., O’Connor, B., Ratoff, J., Meng, Q., Fang, C., Cousins, D., Zhang, G., Gu, S., Gao, Z., Shamji, B., et al. (2008). Expression and cellular provenance of thymic stromal lymphopoietin and chemokines in patients with severe asthma and chronic obstructive pulmonary disease. J. Immunol. Baltim. Md 1950181, 2790-2798.
Zhi, K., Li, M., Zhang, X., Gao, Z., Bai, J., Wu, Y., Zhou, S., Li, M., and Qu, L. (2014). α4β7 Integrin(LPAM-1) is upregulated at atherosclerotic lesions and is involved in atherosclerosis progression. Cell. Physiol. Biochem. Int. J. Exp. Cell. Physiol. Biochem. Pharmacol. 33, 1876-1887
Zhong, J., Sharma, J., Raju, R., Palapetta, S.M., Prasad, T.S.K., Huang, T.-C., Yoda, A., Tyner, J.W., van Bodegom, D., Weinstock, D.M., et al. (2014). TSLP signaling pathway map: a platform for analysis of TSLP-mediated signaling. Database J. Biol. Databases Curation 2014, bau007.
1
2
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena, koje se specifično vezuje za CD127, posebno humani CD127, koje sadrži:
- laki lanac antitela koji sadrži ili varijabilni domen lakog lanca antitela koji se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 9; SEQ ID Br: 10; SEQ ID Br: 11; SEQ ID Br: 12; posebno SEQ ID Br: 12; i
- varijabilni domen teškog lanca antitela koji se sastoji od sekvence prikazane u SEQ ID Br: 7.
2. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da je pomenuto antitelo humanizovano monoklonsko antitelo, posebno pri čemu je konstantan domen lakog lanca antitela izveden iz konstantnog domena humanog kapa lakog lanca, posebno pri čemu se konstantni domen lakog lanca sastoji od sekvence SEQ ID Br:27 ili 28, i pri čemu je konstantni domen teškog lanca antitela izveden iz humanog konstantnog domena teškog lanca IgG1, IgG2, IgG3, ili IgG4, posebno iz humanog konstantnog domena teškog lanca IgG4, posebno pri čemu se konstantni domen teškog lanca antitela sastoji od sekvence sa SEQ ID Br:26.
3. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time da laki lanac antitela sadrži ili se varijabilni domen lakog lanca antitela sastoji od SEQ ID Br: 12.
4. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, koje je antagonist IL-7R signalizacije koju izaziva IL-7 i koje ne izaziva aktivaciju fosfatidil-inozitol 3 kinaze i/ili ERK signalnog puta.
5. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, koje prepoznaje epitop koji sadrži sekvencu uzetu sa 2b mesta CD127 i/ili ometa vezivanje CD127 sa yc zajedničkim lancem receptora citokina, posebno koje prepoznaje najmanje treću beta ravan 2b mesta CD127.
6. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, koje ne izaziva internalizaciju CD127 i/ili inhibira internalizaciju CD127 koju izaziva IL-7.
7. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, koje ne povećava sazrevanje dendritskih ćelija koje je izazvano sa TSLP.
8. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7, koje ima dugotrajni efekat i/ili brz efekat, posebno koje ima brz lokalni efekat.
9. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, koje se specifično vezuje sa humani CD127 sa konstantnim afinitetom KD nižim od 5E-9 M, što se može utvrditi pomoću analize biosenzorom.
10. Kombinacija izolovanih molekula nukleinske kiseline koji kodiraju antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, posebno prvi izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Br: 15, SEQ ID Br: 16, SEQ ID Br: 17 i SEQ ID Br: 18; i drugi izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID Br: 13.
11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9 i/ili kombinaciju izolovanih molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10, i farmaceutski vehikulum.
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11, koja je pogodna za lokalnu primenu, posebno za lokalnu potkožnu, enteričnu ili oralnu primenu, preciznije za isporuku na debelo crevo.
13. Komplet koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema patentnom zahtevu 11 ili patentnom zahtevu 12 i uređaj za isporuku pogodan za lokalnu primenu, naročito potkožni, enterični ili oralni uređaj za isporuku, preciznije navedeni uređaj koji sadrži prethodno napunjen špric ili uređaj bez igle.
1
14. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili kombinacija izolovanih molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 ili 12, za upotrebu kao medikament.
15. Antitelo ili njegov fragment za vezivanje antigena prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, ili kombinacija izolovanih molekula nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 10, ili farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 ili 12, za upotrebu prema patentnom zahtevu 14 u sprečavanju ili lečenju odbacivanja transplantata organa ili tkiva ili bolesti odabrane iz grupe koja se sastoji od autoimunih bolesti, posebno reumatoidnog artritisa, sistemske skleroze, multiple skleroze, dijabetesa tipa I, autoimunog tiroiditisa, sistemskog eritemskog lupusa, primarnog Sjögren-ovog sindroma i inflamatornih bolesti, posebno inflamatorne bolesti creva (IBD), preciznije Crohn-ove bolesti i ulceroznog kolitisa i encefalomijelitisa i alergijskih bolesti i bolesti karcinoma i bolesti povezanih sa transplantacijom i respiratornim bolestima.
1
RS20210520A 2016-12-09 2017-12-07 Antitela i polipeptidi usmereni protiv cd127 RS61808B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP16306655 2016-12-09
PCT/EP2017/081911 WO2018104483A1 (en) 2016-12-09 2017-12-07 Antibodies and polypeptides directed against cd127
EP17835592.1A EP3551664B1 (en) 2016-12-09 2017-12-07 Antibodies and polypeptides directed against cd127

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61808B1 true RS61808B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=57796143

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210520A RS61808B1 (sr) 2016-12-09 2017-12-07 Antitela i polipeptidi usmereni protiv cd127

Country Status (39)

Country Link
US (3) US11098128B2 (sr)
EP (1) EP3551664B1 (sr)
JP (1) JP6986559B2 (sr)
KR (1) KR102306366B1 (sr)
CN (1) CN110392695B (sr)
AR (1) AR110326A1 (sr)
AU (1) AU2017373819B2 (sr)
CA (1) CA3042582C (sr)
CL (1) CL2019001530A1 (sr)
CO (1) CO2019005909A2 (sr)
CR (1) CR20190273A (sr)
CY (1) CY1124153T1 (sr)
DK (1) DK3551664T3 (sr)
EA (1) EA201991005A1 (sr)
ES (1) ES2867900T3 (sr)
HR (1) HRP20210697T1 (sr)
HU (1) HUE054206T2 (sr)
IL (1) IL266837B (sr)
LT (1) LT3551664T (sr)
MA (1) MA49727B1 (sr)
MD (1) MD3551664T2 (sr)
MX (1) MX2019006577A (sr)
MY (1) MY190770A (sr)
NZ (1) NZ753213A (sr)
PE (1) PE20191152A1 (sr)
PH (1) PH12019501285B1 (sr)
PL (1) PL3551664T3 (sr)
PT (1) PT3551664T (sr)
PY (1) PY1794093A (sr)
RS (1) RS61808B1 (sr)
RU (1) RU2769352C2 (sr)
SA (1) SA519401906B1 (sr)
SI (1) SI3551664T1 (sr)
SM (1) SMT202100267T1 (sr)
TW (1) TWI777996B (sr)
UA (1) UA126386C2 (sr)
UY (1) UY37511A (sr)
WO (1) WO2018104483A1 (sr)
ZA (1) ZA201902743B (sr)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016156468A1 (en) 2015-03-31 2016-10-06 Vhsquared Limited Polypeptides
CN107427577A (zh) 2015-03-31 2017-12-01 韦斯夸尔德有限公司 具有蛋白酶可切割接头的肽构建体
WO2017125578A1 (en) 2016-01-21 2017-07-27 Vhsquared Limited Polypeptides
CA3066054A1 (en) 2017-06-04 2018-12-13 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Method of predicting personalized response to cancer therapy and kit therefor
US12016900B2 (en) 2017-06-04 2024-06-25 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Method of treating cancer with an immune checkpoint inhibitor in combination with another therapeutic agent
US12070489B2 (en) 2018-12-12 2024-08-27 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Method of treating cancer with a cancer therapy in combination with another therapeutic agent
KR20230128134A (ko) 2019-01-22 2023-09-01 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 Il-7r 알파 서브유닛에 대한 항체 및 이의 용도
AU2020296979A1 (en) 2019-06-21 2022-02-24 Sorriso Pharmaceuticals, Inc. Polypeptides
MX2021015761A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Polipeptidos.
MX2021015762A (es) 2019-06-21 2022-04-18 Sorriso Pharmaceuticals Inc Composiciones.
AU2020380296A1 (en) 2019-11-05 2022-06-16 Medikine Inc. IL-2RβγC binding compounds
CN110894237B (zh) * 2019-12-05 2021-08-03 山东省分析测试中心 抗cd127的抗体、分泌该抗体的细胞株及其制备方法和应用
JP2023514128A (ja) 2020-02-03 2023-04-05 メディカイン、インコーポレイテッド ＩＬ－７Ｒαγｃ結合化合物
US20220389104A1 (en) * 2021-05-28 2022-12-08 Ose Immunotherapeutics Method for Treating CD127-Positive Cancers by Administering an Anti-CD127 Agent
CN113501499A (zh) * 2021-08-11 2021-10-15 无锡贝塔医药科技有限公司 一种高纯无水溴化氘气体的制备方法及其应用
US11999771B2 (en) 2022-04-07 2024-06-04 Medikine, Inc. IL-7Rαγc ligand immunoglobulin fusion proteins
CA3250546A1 (en) 2022-05-30 2023-12-07 Ose Immunotherapeutics IL7R MODULATOR ACTIVITY BIOMARKERS
CN115925955B (zh) * 2022-12-30 2025-09-26 浙江正熙生物技术有限公司 一种抗cd127抗体及其制备方法和应用
EP4455308A1 (en) 2023-04-24 2024-10-30 Les Laboratoires Servier Il-7r gene signatures
AU2024318231A1 (en) * 2023-07-31 2026-03-12 Q32 Bio Inc. Treatment of atopic dermatitis
WO2025098341A1 (en) * 2023-11-10 2025-05-15 Inmagene Biopharmaceuticals (Hangzhou) Co., Ltd. IL-7Ra TARGETING ANTIBODIES AND USES THEREOF
WO2026022216A1 (en) 2024-07-23 2026-01-29 Ose Immunotherapeutics Uses of anti-cd127 antibodies in the treatment of inflammatory bowel diseases

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
UY32038A (es) * 2008-08-08 2010-03-26 Glaxo Wellcome Mfg Pte Ltd Inmunoblobulinas anti-cd127 y sus usos
US8940303B2 (en) * 2010-01-28 2015-01-27 Glaxo Group Limited CD127 binding proteins
US8298535B2 (en) 2010-02-24 2012-10-30 Rinat Neuroscience Corp. Anti-IL-7 receptor antibodies
EP2583980A1 (en) 2011-10-19 2013-04-24 Effimune Antibodies directed against the alpha chain of IL7 receptor - their use for the preparation of drug candidates
EP2955196A1 (en) 2014-06-10 2015-12-16 Effimune Antibodies directed against CD127
GB201506869D0 (en) * 2015-04-22 2015-06-03 Ucb Biopharma Sprl Method

Also Published As

Publication number Publication date
PH12019501285A1 (en) 2019-12-16
MA49727A (fr) 2019-10-16
CN110392695A (zh) 2019-10-29
DK3551664T3 (da) 2021-05-03
IL266837B (en) 2020-06-30
SI3551664T1 (sl) 2021-08-31
JP2020500542A (ja) 2020-01-16
BR112019010595A2 (pt) 2019-09-17
CN110392695B (zh) 2021-02-02
KR102306366B1 (ko) 2021-09-29
MY190770A (en) 2022-05-12
UA126386C2 (uk) 2022-09-28
PT3551664T (pt) 2021-04-21
PH12019501285B1 (en) 2023-09-08
CA3042582C (en) 2023-05-23
SA519401906B1 (ar) 2022-12-20
TW201833137A (zh) 2018-09-16
CO2019005909A2 (es) 2019-07-31
ES2867900T3 (es) 2021-10-21
US20210395376A1 (en) 2021-12-23
RU2019115610A (ru) 2021-01-12
TWI777996B (zh) 2022-09-21
EP3551664B1 (en) 2021-02-17
NZ753213A (en) 2022-05-27
HUE054206T2 (hu) 2021-08-30
AU2017373819B2 (en) 2022-03-31
EP3551664A1 (en) 2019-10-16
PY1794093A (es) 2019-03-01
KR20190090005A (ko) 2019-07-31
CA3042582A1 (en) 2018-06-14
CY1124153T1 (el) 2022-05-27
EA201991005A1 (ru) 2019-12-30
PL3551664T3 (pl) 2021-08-02
CR20190273A (es) 2019-10-17
PE20191152A1 (es) 2019-09-05
US20190375844A1 (en) 2019-12-12
US11926671B2 (en) 2024-03-12
SMT202100267T1 (it) 2021-07-12
LT3551664T (lt) 2021-05-25
RU2019115610A3 (sr) 2021-04-05
MD3551664T2 (ro) 2021-06-30
WO2018104483A1 (en) 2018-06-14
US20220332834A2 (en) 2022-10-20
MX2019006577A (es) 2019-10-07
RU2769352C2 (ru) 2022-03-30
US11098128B2 (en) 2021-08-24
JP6986559B2 (ja) 2022-01-05
AU2017373819A1 (en) 2019-05-30
ZA201902743B (en) 2025-11-26
UY37511A (es) 2018-06-29
CL2019001530A1 (es) 2019-10-11
HRP20210697T1 (hr) 2021-07-23
US20240352135A1 (en) 2024-10-24
AR110326A1 (es) 2019-03-20
IL266837A (en) 2019-07-31
MA49727B1 (fr) 2021-05-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11926671B2 (en) Antibodies and polypeptides directed against CD127
US12371502B2 (en) Antibodies directed against CD127
JP2021517130A (ja) 抗ヒトＳＩＲＰａｖ１抗体の使用および抗ｖ１抗体を製造する方法
WO2023041745A1 (en) Treatment and prevention of cancer using vista antigen-binding molecules
HK40012892A (en) Antibodies and polypeptides directed against cd127
HK40012892B (en) Antibodies and polypeptides directed against cd127
BR112019010595B1 (pt) Anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, combinação de moléculas de ácido nucleico isoladas, composição farmacêutica, kit, e, uso
EA041126B1 (ru) Антитела и полипептиды, направленные против cd127
OA19665A (en) Antibodies and polypeptides directed against CD127.
OA20097A (en) Antibodies directed against CD127.