RS61866B1 - Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3 - Google Patents

Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3

Info

Publication number
RS61866B1
RS61866B1 RS20210623A RSP20210623A RS61866B1 RS 61866 B1 RS61866 B1 RS 61866B1 RS 20210623 A RS20210623 A RS 20210623A RS P20210623 A RSP20210623 A RS P20210623A RS 61866 B1 RS61866 B1 RS 61866B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
lag
polypeptide
rodent
gene
humanized
Prior art date
Application number
RS20210623A
Other languages
English (en)
Inventor
Alexander O Mujica
Elena Burova
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS61866B1 publication Critical patent/RS61866B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0276—Knock-out vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/075—Animals genetically altered by homologous recombination inducing loss of function, i.e. knock out
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/15—Animals comprising multiple alterations of the genome, by transgenesis or homologous recombination, e.g. obtained by cross-breeding
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2517/00—Cells related to new breeds of animals
    • C12N2517/02—Cells from transgenic animals

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Description

Opis
UNAKRSNE REFERENCE U VEZI SA PRIJAVAMA
[0001] Ova prijava polaže pravo na temelju SAD privremene patentne prijave br. 62/258,181, podnete 20. novembra 2015 i SAD privremene patentne prijave br.62/370,430, podnete 3. avgusta 2016.
LISTING SEKVENCI
[0002] Lista sekvenci u ASCII tekstualnoj datoteci, nazvanoj 34031_10212US01_SequenceListing.txt od 49 KB, kreiranoj 18. oktobra 2016, dostavlјena je Uredu za patente i žigove Sjedinjenih Država putem EFS-Web-a.
STANJE TEHNIKE
[0003] Rak ostaje ogroman izazov u zdravstvenoj industriji širom sveta, delom i zato što ćelije raka imaju sposobnost da izbegnu imuni sistem domaćina. Podrazumeva se da je takva sposobnost rezultat inhibicije i/ili smanjenja antitumorskog imuniteta. Ipak, nedostaje razvoj in vivo sistema za optimalno određivanje terapijskog potencijala novih terapija protiv raka i/ili terapijskih režima koji su dizajnirani da aktiviraju i/ili unapređuju antitumorski imunitet i odrede mehanizme kako ćelije raka daju inhibitorne signale imunološkim ćelijama, naročito T ćelijama. Takvi sistemi pružaju izvor za ispitivanja za procenu terapijske efikasnosti sredstava - kandidata koji unapređuju antitumorsko okruženje in vivo.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] Predmetni pronalazak obuhvata prepoznavanje da je poželjno da se proizvedu glodari kako bi se omogućili poboljšani sistemi za identifikaciju i razvoj novih terapija i/ili terapijskih režima koji se mogu koristiti za lečenje raka. Predmetni pronalazak, takođe, obuhvata prepoznavanje da je poželjno da se proizvedu glodari kako bi se omogućili poboljšani in vivo sistemi za identifikaciju i razvoj novih terapija koji se mogu koristiti za lečenje autoimunih (ili upalnih, ili infektivnih) bolesti, poremećaja ili stanja. Predmetni pronalazak, takođe, obuhvata prepoznavanje da je poželjno da se proizvedu glodari kako bi se omogućili poboljšani in vivo sistemi za identifikovanje i razvoj novih terapeutskih sredstava koja promovišu antitumorski imunitet. Dalje, predmetni pronalazak, takođe, obuhvata prepoznavanje da su poželjni glodari koji imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3) i /ili poželjno je na drugi način eksprimovanje, sadržavanje ili proizvodnja humanog ili humanizovanog polipeptida Lag-3, na primer za upotrebu u identifikovanju i razvoju terapija protiv raka koje regulišu podizanje anti-tumorskog imuniteta. U nekim realizacijama, glodari predmetnog pronalaska obezbeđuju poboljšane in vivo sisteme za identifikaciju i razvoj kombinovane terapije koji uključuju ciljanje Lag-3 i/ili programiranu ćelijsku smrt 1 (PD-1).
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje glodara čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna domena slična imunoglobulinu (Ig) humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva domena slična Ig endogenog polipeptida Lag-3; transmembranski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i unutarćelijski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i pri čemu je dati glodar miš ili pacov. Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje glodara čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid obuhvata prva dva N-terminalna domena slična Ig humanog LAG-3 polipeptida; pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; i pri čemu je dati glodar miš ili pacov. Dakle, obezbeđeni glodari imaju genom koji se sastoji od konstruisanog (inžinjeringom dobijenog) Lag-3 gena, a konstruisani Lag-3 gen uključuje genetski materijal dve različite vrste (čoveka i glodara). Tako konstruisani Lag-3 gen uključuje genetski materijal koji kodira jedan ili više imunoglobulinu sličnih (Ig-sličnih) domena humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, genetski materijal kodira Ig-slične domene humanog LAG-3 polipeptida koji su odgovorni za vezivanje liganda (npr. vezivanje MHC klase II). Tako, proizvedeni Lag-3 gen glodara, kako je ovde opisano, kodira polipeptid Lag-3 koji sadrži humane i endogene delove, pri čemu su humani i endogeni delovi povezani zajedno i formiraju funkcionalni Lag-3 polipeptid. Konstruisani Lag-3 gen glodara kako je ovde opisan kodira Lag-3 polipeptid koji sadrži prva dva Ig-slična domena (D1 i D2), u celini ili delimično, humanog LAG-3 polipeptida. Uopšteno govoreći, prva dva Ig-slična domena (D1 i D2) sadržana su u N-terminalih 260 amino-kiselina humanog LAG-3 polipeptida; i u nekim realizacijama, unutar amino-kiselinskih ostataka 21-260, 23-260 ili 29-260 humanog LAG-3 polipeptida. Videti, takođe, slike 1-2, na primer.
[0006] Proizvedeni glodar eksprimuje Lag-3 polipeptid, a Lag-3 polipeptid sadrži humani deo i endogeni deo.
[0007] U nekim realizacijama, u obezbeđenom glodaru, čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen (ili lokus) koji sadrži endogeni deo i humani deo, endogeni i humani delovi su operativno povezani sa Lag-3 promoterom koji nije humani.
[0008] Endogeni deo Lag-3 polipeptida sadrži intracelularni deo endogenog Lag-3 polipeptida. Endogeni deo polipeptida Lag-3 sadrži unutarćelijski domen endogenog Lag-3 polipeptida. Endogeni deo Lag-3 polipeptida dalje sadrži transmembranski deo endogenog Lag-3 polipeptida. Endogeni deo polipeptida Lag-3 sadrži transmembranski domen endogenog Lag-3 polipeptida. U nekim realizacijama, endogeni deo Lag-3 polipeptida dalje sadrži vanćelijski deo endogenog Lag-3 polipeptida, npr. C-terminalni deo vanćelijskog domena endogenog Lag-3 polipeptida koji ne uključuje prvi dva Ig-slična domena, ali uključuje poslednja dva Ig-slična domena (D3 i D4). U nekim realizacijama, endogeni deo Lag-3 polipeptida sadrži amino-kiseline signalnog peptida endogenog Lag-3 polipeptida. Na primer, endogeni deo Lag-3 polipeptida sadrži u osnovi signalni peptid endogenog Lag-3 polipeptida.
[0009] U nekim realizacijama, endogeni deo Lag-3 polipeptida ima sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, pri najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% ili najmanje 98% identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiselina koja se pojavljuje u Lag-3 polipeptidu glodara sa SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4. U nekim realizacijama, endogeni deo Lag-3 polipeptida ima sekvencu amino-kiseline koja je suštinski identična ili identična odgovarajućoj sekvenci aminokiseline koja se pojavljuje u glodarskom Lag-3 polipeptidu u SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4.
[0010] U nekim realizacijama, endogeni deo humanizovanog Lag-3 gena sadrži endogene nehumane Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8. U nekim realizacijama, eksoni 1, 5, 6, 7 i 8 endogenog Lag-3 gena koji nije humani su najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95 %, ili najmanje 98% identični odgovarajućim eksonima 1, 5, 6, 7 i 8 koji se pojavljuju kod glodara Lag-3 mRNK sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO: 3. U nekim realizacijama, eksoni 1, 5, 6, 7 i 8 endogenog Lag-3 gena koji nije humani su u suštini identični ili identični odgovarajućim eksonima 1, 5, 6, 7 i 8 koji se pojavljuju kod glodara Lag-3 mRNK sekvence SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:3.
[0011] U nekim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca) humanizovanog Lag-3 polipeptida sadrži jedan ili više Ig-sličnih domena humanog LAG-3 polipeptida koji su odgovorni za vezivanje liganda (npr. vezivanje MHC klase II). Humani deo humanizovanog polipeptida Lag-3 sadrži prva dva Ig-slična domena (D1 i D2), u celini ili delimično, humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, unutar ostataka amino-kiselina 21-260, 23-260 ili 29-260 humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo humanizovanog polipeptida Lag-3 sadrži amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca) Lag-3 polipeptida sadrži sekvencu amino-kiseline koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%,najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline koja se pojavljuje kod humanog LAG-3 polipeptida u SEQ ID NO:6. U nekim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca) Lag-3 polipeptida sadrži sekvencu amino-kiseline koja je suštinski identična ili identična odgovarajućoj sekvenci amino-kiseline koja se pojavljuje kod humanog LAG-3 polipeptida u SEQ ID NO:6.
[0012] U nekim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca) humanizovanog Lag-3 gena kodira najmanje amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca) humanizovanog Lag-3 gena sadrži eksone 2-4 (ili eksone 2, 3 i 4) humanog LAG-3 gena.
[0013] U nekim realizacijama, eksoni 2-4 humanog LAG-3 gena su najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95% , ili najmanje 98% identični odgovarajućim eksonima 2-4 koji se pojavljuju u humanoj LAG-3 sekvenci mRNК SEQ ID NO:5. U nekim realizacijama, eksoni 2-4 humanog LAG-3 gena su u suštini identični ili identični odgovarajućim eksonima 2-4 koji se pojavljuju u humanoj LAG-3 sekvenci mRNК SEQ ID NO:5. U nekim realizacijama, humani deo humanizovanog Lag-3 gena sadrži sekvencu koja je kodon-optimizovana za ekspresiju kod ne-humane životinje (životinje koja nije čovek) kako je ovde opisano.
[0014] U nekim realizacijama, Lag-3 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo kodiran je sekvencom nukleinske kiseline postavljenom na endogeni Lag-3 lokus (ili gen) kako je ovde opisano.
[0015] U nekim realizacijama, endogeni deo Lag-3 polipeptida je kodiran endogenim Lag-3 eksonima 1, 5, 6, 7 i 8.
[0016] U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen uključuje endogeni nehumani Lag-3 ekson 1, humane LAG- 3 eksone 2-4, i nehumane Lag-3 eksone 5-8, pri čemu su nehumani i humani eksoni operativno povezani jedni sa drugima i sa endogenim nehumanim Lag-3 promotorom. U nekim realizacijama, takvi su humanizovani Lag-3 gen se nalazi na endogenom Lag-3 lokusu.
[0017] U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kodira humanizovani Lag-3 polipeptid koji uključuje signalni peptid koji je u osnovi identičan signalnom peptidu endogenog nehumanog Lag-3 polipeptida; vanćelijski domen koji uključuje humani i nehumani deo, pri čemu humani deo sadrži prva dva Ig-slična domena (npr. sekvenca koja sadrži amino-kiseline 26-290) humanog LAG-3 polipeptida i nehumani deo sadrži poslednja dva Igslična domena endogenog nehumanog Lag-3 polipeptida; i transmembranski i unutarćelijski domen endogenog nehumanog polipeptida Lag-3.
[0018] Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara prema pronalasku. U nekim realizacijama, obezbeđen je Lag-3 polipeptid koji je proizveden ili eksprimovan od glodara kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, Lag-3 polipeptid proizveden ili eksprimovan od ne-humane životinje, kao što je ovde opisano, prevodi se u ćeliju glodara sa signalnim peptidom koji nije humani, u celini ili delimično (npr. himerni signalni peptid). U nekim realizacijama, Lag-3 polipeptid proizveden ili eksprimovan od glodara, kao što je ovde opisano, sadrži sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50%, najmanje 55%, najmanje 60%, najmanje 65%, najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%,najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična sekvenci amino-kiseline koja se pojavljuje kod humanog Lag-3 polipeptida u SEQ ID NO:8. U nekim realizacijama, Lag-3 polipeptid proizveden ili eksprimovan od glodara, kao što je ovde opisano, sadrži sekvencu amino-kiselina koja je suštinski identična ili identična sekvenci amino-kiseline koja se pojavljuje kod humanizovanog Lag-3 polipeptida u SEQ ID NO:8.
[0019] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovanu ćeliju ili tkivo glodara prema pronalasku. U nekim realizacijama obezbeđena je izolovana ćelija ili tkivo glodara, čiji genom sadrži Lag-3 gen (ili lokus) kako je ovde opisano i koja je ćelija pacova ili miša ili tkivo pacova ili miša. U nekim realizacijama, ćelija je limfocit. U nekim realizacijama, ćelija se bira između B ćelije, dendritične ćelije, makrofaga, monocita i T ćelije. U nekim realizacijama, tkivo se bira između masnog tkiva, bešike, mozga, dojke, koštane srži, oka, srca, creva, bubrega, jetre, pluća, limfnog čvora, mišića, pankreasa, plazme, seruma, kože, slezine, želuca, timusa, testisa, jajnika i njihove kombinacije.
[0020] U nekim realizacijama obezbeđena je besmrtna ćelija napravljena, generisana ili proizvedena od izolovane ćelije glodara kako je ovde opisano.
[0021] Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje embrionalnu matičnu ćeliju (ES) glodara čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu koji kodira humanizovani Lag-3 polipeptid, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva Ig-slična domena endogenog Lag-3 polipeptida; transmembranski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i unutarćelijski domen endogenog Lag-3 polipeptida glodara; pri čemu humanizovani Lag-3 gen je operativno povezan sa Lag-3 promoterom glodara, i pri čemu data ES ćelija glodara je ES ćelija miša ili pacova. Predmetni pronalazak, takođe, obezbeđuje embrionalnu matičnu ćeliju (ES) glodara čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu koji kodira humanizovani Lag-3 polipeptid, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida; pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; pri čemu humanizovani Lag-3 gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara; i pri čemu data ES ćelija glodara je ES ćelija miša ili pacova. U nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša i potiče od soja 129, C57BL soja ili njihove smeše. U nekim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša i smeša 129 i C57BL sojeva. U nekim realizacijama, obezbeđena je nehumana ES ćelija kako je ovde opisano koja sadrži bilo koju od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 i SEQ ID NO:15.
[0022] U nekim realizacijama, obezbeđena je upotreba embrionalnih matičnih ćelija glodara, kako je ovde opisano, za stvaranje glodara. U nekim određenim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija miša i koristi se za pravljenje miša koji sadrži humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, embrionalna matična ćelija glodara je embrionalna matična ćelija pacova i koristi se za dobijanje pacova koji sadrži Lag-3 gen (ili lokus) kako je ovde opisano.
[0023] U predmetnom pronalasku takođe se obezbeđuje embrion glodara generisan iz ES ćelije predmetnog pronalaska. U nekim realizacijama, obezbeđen je embrion glodara koji sadrži, napravlјen je od, dobijen je ili je stvoren od embrionalne matične ćelije glodara kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, embrion glodara je embrion miša; u nekim realizacijama, embrion pacova.
[0024] U nekim realizacijama, obezbeđena je upotreba embriona glodara, kako je ovde opisano, za stvaranje glodarske životinje. U nekim određenim realizacijama, embrion glodara je mišji embrion i koristi se za dobijanje miša koji sadrži humanizovani Lag- 3 gen (ili lokus) kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, embrion glodara je embrion pacova i koristi se za dobijanje pacova koji sadrži humanizovani Lag- 3 gen (ili lokus) kako je ovde opisano.
[0025] U nekim realizacijama, obezbeđen je komplet koji sadrži izolovanu ćeliju glodara ili tkivo kako je ovde opisano, besmrtnu ćeliju kako je ovde opisano, embrionalnu matičnu ćeliju glodara kako je ovde opisano, embrion glodara kako je ovde opisano, ili glodara kako je ovde opisano.
[0026] U nekim realizacijama, obezbeđen je komplet kako je ovde opisan, za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) za terapiju ili dijagnostiku.
[0027] U nekim realizacijama obezbeđen je komplet kako je ovde opisan, za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka (npr. antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta) za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0028] Ovde su takođe stavljeni na uvid javnosti transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor. U nekim slučajevima, konstrukt transgena, nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor sadrži a Lag-3 gen (ili lokus), u celini ili delimično, kako je ovde opisano. U nekim određenim slučajevima, konstrukt transgena, nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor sadrži fragment DNК koji uključuje Lag-3 gen (ili lokus), u celini ili delimično, kako je ovde opisano. U nekim određenim realizacijama, konstrukt transgena, nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor sadrži Lag-3 gen (ili lokus) koji sadrži bilo koju od SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14 i SEQ ID NO:15.. U nekim određenim slučajevima, konstrukt transgena, nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor dalje sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim određenim slučajevima, konstrukt transgena, nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor dalje sadrži jedno ili više mesta rekombinacija specifičnih za mesto (npr. loxP, Frt, ili njihove kombinacije). U nekim određenim slučajevima, transgen, konstrukt nukleinske kiseline, DNК konstrukt ili ciljajući vektor prikazan je na slici 3.
[0029] U nekim realizacijama, obezbeđena je upotreba transgena, konstrukta nukleinske kiseline, DNК konstrukta ili ciljajućeg vektora kako je ovde opisano za stvaranje matičnih ćelija embriona glodara, ćelija glodara, embriona glodara i/ili glodara.
[0030] Takođe je obezbeđen postupak pravljenja glodara koji sadrži:
modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu a humanizovani gen je operativno povezan sa Lag-3 promoterom glodara, čineći tako datog glodara, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva Ig-slična domena endogenog Lag-3 polipeptida; transmembranski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i unutarćelijski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i pri čemu je dati glodar miš ili pacov. Dalje je dat način pravljenja glodara koji obuhvata:
modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu a humanizovani gen je operativno povezan sa Lag-3 promoterom glodara, čineći tako datog glodara, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida; i
pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8;
i pri čemu je dati glodar miš ili pacov.
[0031] U nekim realizacijama postupka pravljenja glodara koji eksprimuje Lag-3 polipeptid iz endogenog Lag-3 gena, postupak dalje uključuje korak stavljanja genomskog fragmenta u endogeni Pdcd1 gen nehumane embrionalne matične ćelije (a), dati genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja u celosti ili delimično kodira humani PD-1 polipeptid. U nekim realizacijama postupka pravljenja glodara koji eksprimuje Lag-3 polipeptid iz endogenog Lag-3 gena, genomski fragment koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja u celini ili delimično kodira humani PD-1 polipeptid smešten je u endogeni Pdcd1 gen ne-humane embrionalne matične ćelije (a) pre, istovremeno sa ili nakon postavljanja genomskog fragmenta koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja u celini ili delimično kodira humani Lag-3 polipeptid u endogeni Lag-3 gen. Glodar se može uzgajati sa drugim glodarom, pri čemu dati drugi glodar ima genom koji sadrži Pdcd1 gen koji kodira PD-1 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo.
[0032] U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži humane Lag-3 eksone 2-4. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca kodira najmanje amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži jedan ili više selekcionih markera. U nekim realizacijama, nukleotidna sekvenca sadrži jedno ili više mesta rekombinacije specifične za lokacije.
[0033] U nekim realizacijama, obezbeđen je postupak za pravljenje glodara čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, postupak uključuje modifikaciju genoma glodara tako da sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo, čiji delovi su operativno povezani sa ne-humanim Lag-3 promotorom, čineći tako pomenutog glodara.
[0034] U nekim realizacijama postupka pravljenja glodara čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani i endogeni deo, a Lag-3 gen je modifikovan tako da uključuje eksone 2-4 (ili eksone 2, 3 i 4) humanog LAG-3 gena. U nekim realizacijama postupka pravljenja glodara čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani i endogeni deo, a Lag- 3 gen je modifikovan da kodira najmanje amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida.
[0035] U nekim realizacijama postupka izrade glodara čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani i endogeni deo, postupak dalje uključuje modifikovanje genoma glodara tako da sadrži Pdcd1 gen koji kodira PD-1 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo. U nekim realizacijama postupka pravljenja glodara čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani i endogeni deo, modifikujući genom glodara tako da sadrži Pdcd1 gen koji kodira PD-1 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo izvodi se pre, istovremeno sa ili nakon modifikovanja genoma glodara tako da sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani i endogeni deo. Glodar čiji genom sadrži Lag-3 gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji ima humani deo i endogeni deo može se uzgajati sa drugom životinjom koja nije čovek, dati drugi glodar ima genom koji sadrži Pdcd1 gen koji kodira PD-1 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo.
[0036] U nekim realizacijama obezbeđen je glodar koji se može dobiti bilo kojim od postupaka kako je ovde opisano (napravljenim od, dobijenim od ili generisanim od).
[0037] U nekim realizacijama obezbeđen je postupak procene antitumorske efikasnosti leka koji cilja na humani LAG-3, a postupak uključuje korake davanja leka na glodaru kako je ovde opisano, i izvođenje testa za određivanje jednog ili više antitumorskih svojstava leka koji cilja humani LAG-3. Posebno, takođe je obezbeđen postupak za procenu antitumorske efikasnosti ili farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani LAG-3, postupak koji sadrži korake:
davanje leka glodaru prema pronalasku; i
obavljanje testa za određivanje jednog ili više anti-tumorskih svojstava leka koji cilja humani LAG-3, pri čemu, opcionalno:
(a) lek koji cilja humani LAG-3 je antitelo protiv Lag-3; i/ili
(b) lek koji cilja humani LAG-3 daje se glodaru intravenozno, intraperitonealno ili supkutano.
[0038] U nekim realizacijama, obezbeđen je postupak procene farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja na humani LAG-3, postupak koji obuhvata korake davanja leka na glodaru kako je ovde opisano, i izvođenje testa za određivanje jednog ili više farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani LAG-3.
[0039] U nekim realizacijama, lek koji cilja humani LAG-3 je Lag-3 antagonist. U nekim realizacijama, lek koji cilja humani LAG-3 je Lag-3 agonist. U nekim realizacijama, lek koji cilja humani LAG-3 je anti-Lag-3 antitelo.
[0040] U nekim realizacijama, lek koji cilja humani LAG-3 daje se glodaru, kao što je ovde opisano, intravenski, intraperitonealno ili supkutano.
[0041] U nekim realizacijama, obezbeđeni glodar je onaj čiji genom sadrži Lag-3 gen koji uključuje endogeni deo koji sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; i humani deo koji sadrži eksone 2-4 (ili eksone 2, 3 i 4) humanog LAG-3 gena; pri čemu su endogeni i humani delovi operativno povezani sa endogenim Lag-3 promoterom koji nije humani, i pri čemu nehumana životinja eksprimuje Lag-3 polipeptid koji sadrži amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida.
[0042] U nekim realizacijama, obezbeđen je model tumora glodara, a glodar eksprimuje Lag-3 i/ili PD-1 polipeptid kako je ovde opisano.
[0043] U nekim realizacijama obezbeđen je model tumora glodara, a glodar ima genom koji sadrži Lag-3 i/ili Pdcd1 gen kako je ovde opisan.
[0044] U nekim realizacijama, obezbeđen je model glodara, dobijen (a) tako što se obezbeđuje glodar čiji genom sadrži Lag-3 i/ili Pdcd1 gen kako je ovde opisano; i (b) implantacijom jedne ili više tumorskih ćelija u glodara iz (a); čime se obezbeđuje dati model tumora glodara.
[0045] U nekim realizacijama, obezbeđen je glodar ili ćelija kako je ovde opisano, za upotrebu u proizvodnji i/ili razvoju leka za terapiju ili dijagnostiku.
[0046] U nekim realizacijama, obezbeđen je glodar ili ćelija kako je ovde opisano, za upotrebu u proizvodnji leka za lečenje, prevenciju ili ublažavanje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0047] U nekim realizacijama, obezbeđena je upotreba glodara ili ćelije, kako je ovde opisano, za izradu i/ili razvoj leka ili vakcine za upotrebu u medicini, kao što je upotreba u vidu leka.
[0048] U nekim realizacijama, obezbeđena je upotreba glodara ili ćelije kako je ovde opisano u proizvodnji leka za lečenje bolesti, poremećaja ili stanja.
[0049] U nekim realizacijama je obezbeđena upotreba glodara ili ćelije kako je ovde opisano u proizvodnji i/ili razvoju antitela koje veže imuni molekul kontrolne tačke.
[0050] U nekim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje kako su ovde opisani je rak ili neoplazma. U nekim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje kako su ovde opisani je autoimuna (ili inflamatorna) bolest, poremećaj ili stanje. U nekim realizacijama, bolest, poremećaj ili stanje kako su ovde opisani je zarazna bolest, poremećaj ili stanje.
[0051] U različitim realizacijama, nehumani Lag-3 promoter je ili sadrži endogeni Lag-3 promoter koji nije humani.
[0052] U različitim realizacijama, humani deo (ili humana sekvenca, ili nukleotidna sekvenca) Lag-3 ili Pdcd1 gena kako je ovde opisano jeste ili sadrži sekvencu koja je kodon-optimizovana za ekspresiju u glodaru (ili ćeliji glodara ili tkivu) kako je ovde opisano.
[0053] U različitim realizacijama, glodar (ili ćelija ili tkivo glodara, ili matična ćelija embriona glodara, ili embrion glodara), kako je ovde opisano, dalјe eksprimuje humanizovani PD-1 polipeptid, a humanizovani PD-1 polipeptid sadrži humani deo i endogeni deo. U nekim realizacijama, humani deo PD-1 polipeptida u osnovi sadrži vanćelijski domen humanog PD-1 polipeptida; i u specifičnim realizacijama, humani deo sadrži amino-kiseline 21-170, 26-169, 27-169, 27-145 ili 35-145 humanog PD-1 polipeptida. U nekim realizacijama, endogeni deo PD-1 polipeptida sadrži unutarćelijski deo i/ili transmembranski deo endogenog PD-1 polipeptida; u nekim realizacijama, endogeni deo PD-1 polipeptida sadrži unutarćelijski domen endogenog PD-1 polipeptida, a u nekim realizacijama, endogeni deo PD-1 polipeptida dalјe u suštini sadrži transmembranski domen endogenog PD- 1 polipeptida.
[0054] U različitim realizacijama, genom glodara (ili ćelija ili tkivo glodara, matična ćelija embrionalnih glodara ili embrion glodara), kako je ovde opisano, dalјe sadrži Pdcd1 gen koji sadrži endogeni i humani deo, pri čemu su endogeni i humani delovi operativno povezani sa nehumanim Pdcd1 promotorom. U nekim realizacijama, endogeni deo Pdcd1 gena sadrži endogene Pdcd1 eksone 1, 4 i 5. U nekim realizacijama, endogeni deo Pdcd1 gena dalјe sadrži endogeni Pdcd1 ekson 3 u celini ili delimično, na primer, 3’ deo endogenog eksona 3 koji kodira aminokiseline koje su deo transmembranskog domena endogenog PD-1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo Pdcd1 gena kodira amino-kiseline 35-145, 27-145, 27-169, 26-169 ili 21-170 humanog PD-1 polipeptida. U nekim realizacijama, humani deo Pdcd1 gena sadrži ekson 2 humanog PDCD1 gena; u nekim određenim realizacijama, dalјe sadrži humani PDCD1 ekson 3 u celini ili delimično, na primer, 5’ deo humanog eksona 3 koji kodira aminokiseline koje su deo vanćelijskog domena humanog PD-1 polipeptida. U specifičnim realizacijama, humanizovani Pdcd1 gen glodara sadrži ekson 1 endogenog Pdcd1 gena glodara, ekson 2 i deo eksona 3 (npr.5’ deo eksona 3 koji kodira amino-kiseline koje su deo vanćelijskog domena) humanog PDCD1 gena, praćen delom eksona 3 (npr.3’ deo eksona 3 koji kodira amino-kiseline koji su deo transmembranskog domena) i eksonima 4-5 endogenog nehumanog Pdcd1 gena.
[0055] U različitim realizacijama, Pdcd1 promoter koji nije humani jeste ili sadrži endogeni nehumani Pdcd1 promoter.
[0056] U različitim realizacijama, humani deo Lag-3 gena kodira sekvencu amino-kiselina imunoglobulinu sličnih (Ig-sličnih) domena 1 (D1) i 2 (D2) humanog LAG-3 polipeptida ili kodira sekvencu amino-kiselina humanog LAG-3 polipeptida koji je odgovoran za vezivanje MHC II.
[0057] U različitim realizacijama, humani deo polipeptida Lag-3 sadrži sekvencu amino-kiselina imunoglobulinskih (Ig-sličnih) domena 1 (D1) i 2 (D2) humanog LAG-3 polipeptida, ili sadrži sekvencu aminokiselina humanog LAG-3 polipeptida koji je odgovoran za vezivanje MHC II.
[0058] Kako je ovde opisano, ne-humana životinja je glodar koji je miš ili pacov; u nekim realizacijama miš; u nekim realizacijama, pacov. U nekim realizacijama ovde je opisani miš izabran iz grupe koja sadrži 129 soj, BALB/C soj, C57BL/6 soj i mešoviti soj 129xC57BL/6; u nekim određenim realizacijama soj C57BL/6.
[0059] Kako su upotrebljeni u ovoj prijavi, izrazi „oko“ i „približno“ se koriste kao ekvivalenti. Bilo koji broj koji se koristi u ovoj prijavi sa ili bez oko/približno ima za cilj da pokriva sve normalne fluktuacije koje su poznate stručnjaku iz odgovarajuće tehnike.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0060] Ovde je priloženi crtež, koji je sačinjen od sledećih slika, je samo radi ilustracije, a ne kao ograničenje.
Slika 1 prikazuje dijagram, koji nije u razmeri, genomske organizacije nehumanog (npr. mišjeg) i humanog gena za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3). Eksoni su numerisani iznad ili ispod svakog eksona. Neprevedeni regioni (otvoreni okviri) takođe su naznačeni za svaki gen. Domeni slični imunoglobulinu označeni su, ne u razmeri, ogolјenim kutijama i simboličnom skraćenicom „Ig“ iznad kodirajućih eksona.
Slika 2 prikazuje poravnanje reprezentativnih sekvenci amino-kiselina humanog LAG-3 (hLAG3) (SEQ ID NO: 6), mišjeg Lag-3 (mLag3) (SEQ ID NO: 4) i humanizovanog Lag-3 (HumLAG3) (SEQ ID NO: 8). Zvezdice označavaju domene slične imunoglobulinu (Ig-slične), a podvučeni tekst označava amino-kiseline kodirane insertvanim humanim LAG- 3 eksonima (tj. eksonima 2, 3 i 4). Ig-slični domeni 1 (D1) i 2 (D2) odvojeni su jednim amino koji je označen kosom crtom ispod sekvence.
Slika 3 prikazuje dijagram, ne u razmeri, primera postupka za humanizaciju ne-humanog gena 3 za aktivaciju limfocita (Lag-3). Odabrane lokacije nukleotidnog spajanja označene su linijom ispod svakog spajanja i svaka je označena sa SEQ ID NO.
Slika 4 prikazuje dijagram, ne u razmeri, genomske organizacije mišjeg i humanog gena 3 za aktivaciju limfocita (Lag-3) koji ukazuje na približne lokacije proba korišćenih u ispitivanju opisanom u Primeru 1. Slika 5 prikazuje reprezentativne histograme aktiviranih splenocita divlјeg tipa C57BL/6 (divlјi tip), homozigotnog humanizovanog Lag-3 (HumLAG-3), homozigotnog humanizovanog PD-1 (HumPD-1) i homozigotnog dvostruko humanizovanog Lag-3xPD-1 (HumPD -1kLAG-3) tipa miševa obojenih antitelima na humani LAG-3, humani PD-1, mišji Lag-3 i mišji PD-1 ili obojeni odgovarajućim antitelom za kontrolu izotipa. Pozitivno bojenje označeno je ispunjenim krivama, dok je bojenje izotipskim antitelima za kontrolu označeno nepopunjenim krivama. Svi profili za bojenje predstavlјaju ćelije unutar CD4+ gejtinga. Srednji fluorescentni intenzitet (MFI) sa bojenjem antitela na CD4+ T ćelije je naznačen za svaki histogram (gornji red: eksprimovanje humanog LAG-3; 2. red: eksprimovanje Lag-3 miša; 3. red: eksprimovanje humanog PD-1; donji red: eksprimovanje PD-1 miša). Genotip miševa je naznačen na vrhu svake kolone. Za humanizovane PD-1 miševe videti U.S. Patentnu prijavu serijski br. 14/744,592, podnetu 19. juna 2015, i međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US15/036649, podnetu 19. juna 2015.
Slika 6 pokazuje reprezentativnu prosečnu zapreminu tumora (mm<3>+SEM) tokom 35 dana u različitim grupama za tretiranje dvostruko humanizovanih Lag-3 / PD-1 miševa (kontrola, krug: antitelo za kontrolu humanog izotipa koje nije specifično za mišji ili humani LAG-3 ili mišji ili humani PD-1; anti-LAG3, dijamant: anti-humani LAG-3 antitelo; anti-PDl, heksagon: anti-humani PD-1 antitelo;). Strelice označavaju dane tretmana antitelom.
Slika 7 pokazuje prosečne zapremine tumora (mm<3>+SEM) u različitim grupama za tretiranje dvostruko humanizovanih Lag-3 / PD-1 miševa u više vremenskih tačaka nakon implantacije tumora u eksperimentu za procenu efikasnosti anti-LAG3 antitela samo u kombinaciji sa anti-humanim PD-1 antitelom protiv utvrđenih MC38 tumora (kontrola, krug: antitelo za kontrolu humanog izotipa koje nije specifično za mišji ili humani LAG-3 ili mišji ili humani PD-1; anti-LAG3, dijamant: antitelo LAG-3 antitelo; anti-PD1, heksagon: anti- humani PD-1 antitelo; anti-LAG3 anti-PD-1, trougao: kombinacija anti-humanog antitela na LAG-3 i antitela na PD-1). Dani tretmana označeni su strelicama.
Slika 8 prikazuje primer sekvence glodara (npr. pacova i miša), humanog i humanizovanog gena za aktivaciju limfocita 3 (Lag- 3), kao i primer sintetičkog fragmenta DNK za humanizaciju nehumanog Lag-3 gena. Za sekvence mRNK, podebljana slova označavaju kodirajuću sekvencu, a uzastopni eksoni, gde su naznačeni, razdvajaju se naizmeničnim podvučenim tekstom; za humanizovane mRNK sekvence, humane sekvence su sadržane u zagradama. Za sekvence amino-kiselina, transmembranske sekvence su označene podvučenim slovima; za humanizovane sekvence amino-kiselina, humane sekvence su označene podeblјanim slovima i u zagradama su.
Slike 9A-9D pokazuju sekvence spoja u određenim primerima humanizovanih Lag-3 lokusa. Slika 9A prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 12) preko ushodne tačke insercije, koja ukazuje na endogenu mišju sekvencu (sadržanu u zagradama dole) koja se nastavlja na humanu LAG-3 genomsku sekvencu na tački insercije. Slika 9B prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 13) preko 5' kraja samobrišućeg neomicinskog ketridža, koja ukazuje na humanu LAG-3 genomsku sekvencu koja se nastavlja na sekvencu kasete (koja se nalazi u donjim zagradama sa SalI-XhoI kompatibilnim krajem u kurzivu i loxP sekvencom zadebljanim slovima) nishodno od tačke insercije. Slika 9C prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 14) preko nizvodne tačke insercije na 3’ kraju samo-brišućeg kertridža neomicina, što ukazuje na sekvencu kertridža (koja se nalazi u zagradama dole, sa loxP mestom podeblјanim, I-CeuI lokacija za prepoznavanje je podvučena i NheI lokacija za prepoznavanje nakošena) susedna sa mišjom Lag-3 genomskom sekvencom.
Slika 9D prikazuje nukleotidnu sekvencu (SEQ ID NO: 15) preko ushodne tačke insercije posle delecije neomicinske kasete (preostali 77 bp u intronu 4), koja ukazuje na mišju i humanu genomsku sekvencu na jukstapoziciji sa preostalom sekvencom kasete loxP sekvencu (koja se nalazi u donjim zagradama sa SalI-XhoI kompatibilnim krajem u kurzivu, loxP mesto zadebljanim slovima, I-CeuI restrikcijsko mesto podvučenim slovima i NheI restrikcijsko mesto u kurzivu.
DEFINICIJE
[0061] Ovaj pronalazak nije ograničen na ovde opisane posebne postupke i eksperimentalne uslove, jer takvi postupci i uslovi mogu varirati. Takođe, treba razumeti da je ovde upotrebljena terminologija samo u svrhu opisivanja određenih realizacija i da nije namenjena ograničavanju, pošto je obim predmetnog pronalaska definisan u patentnim zahtevima.
[0062] Ako nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni izrazi i značenja uključuju značenja koja izrazi i fraze imaju u tehnici, osim ako je suprotno jasno naznačeno ili jasno vidljivo iz konteksta u kojem se koristi izraz ili fraza. Iako se bilo koji postupak i materijal sličan ili ekvivalentan ovde opisanima mogu koristiti u praksi ili testiranju predmetnog pronalaska, sada će biti opisani određeni postupci i materijali.
[0063] Približno: kako je ovde primenjen na jednu ili više vrednosti od interesa, uključuje vrednost koja je slična navedenoj referentnoj vrednosti. U određenim realizacijama, izraz „približno" ili „oko" upućuje na raspon vrednosti koje spadaju u 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, ili manje u bilo kojem smeru (veće ili manje od) navedene referentne vrednosti, osim ako je drugačije navedeno ili je drugačije vidljivo iz konteksta (osim u slučaju kada bi takav broj premašio 100% moguće vrednosti).
[0064] Biološki aktivan: kako se ovde koristi, uključuje odliku bilo kog sredstva koje ima aktivnost u biološkom sistemu, in vitro ili in vivo (npr. u organizmu). Na primer, sredstvo koje, kada je prisutno u organizmu, ima biološko dejstvo u tom organizmu, smatra se da je biološki aktivno. U posebnim realizacijama, gde je protein ili polipeptid biološki aktivan, deo tog proteina ili polipeptida koji deli barem jednu biološku aktivnost proteina ili polipeptida obično se naziva „biološki aktivnim” delom.
[0065] Uporediv: kao što se ovde koristi, uključuje dva ili više sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd. koji možda nisu identični jedni drugima, ali koji su dovoljno slični da omogućuju poređenje među sobom tako da se zaključci mogu razumno izvući na osnovu uočenih razlika ili sličnosti. Stručnjaci sa uobičajenim veštinama razumeće, u kontekstu, koji stepen identiteta je potreban u datim okolnostima da bi se dva ili više takvih sredstava, entiteta, situacija, skupova uslova, itd., smatrala uporedivim.
[0066] Konzervativan: kao što se ovde koristi da opiše konzervativnu supstituciju amino-kiselina, uključuje supstituciju amino-kiselinskog ostatka sa drugim amino-kiselinskim ostatkom koji ima R grupu bočnog lanca sa sličnim hemijskim svojstvima ( npr. naelektrisanje ili hidrofobnost). Uopšteno, konzervativna supstitucija aminokiselina neće bitno promeniti funkcionalna svojstva od interesa za protein, na primer, sposobnost receptora da se veže za ligand. Primeri grupa amino-kiselina koje imaju bočne lance sa sličnim hemijskim svojstvima uključuju: alifatske bočne lance kao što su glicin, alanin, valin, leucin i izoleucin; alifatsko-hidroksilne bočne lance, kao što su serin i treonin; bočne lance koji sadrže amide kao što su asparagin i glutamin; aromatične bočne lance kao što su fenilalanin, tirozin i triptofan; bazne bočne lance kao što su lizin, arginin i histidin; kisele bočne lance kao što su aspartanska kiselina i glutaminska kiselina; i bočne lance koji sadrže sumpor, poput cisteina i metionina. Konzervativne supstitucione grupe amino-kiselina uključuju, na primer, valin/leucin/izoleucin, fenilalanin/tirozin, lizin/arginin, alanin/valin, glutamat/aspartat i asparagin /glutamin. U nekim realizacijama, konzervativna supstitucija amino-kiselina može biti supstitucija bilo kog nativnog ostatka u proteinu alaninom, kao što je korišćeno u, na primer, alanin skenirajućoj mutagenezi. U nekim realizacijama, napravljena je konzervativna supstitucija koja ima pozitivnu vrednost u matrici log-verovatnoće PAM250 opisanoj u Gonnet et al. (1992) Exhaustive Matching of the Entire Protein Sequence Database, Science 256:1443-45. U nekim realizacijama, supstitucija je umereno konzervativna supstitucija pri čemu supstitucija ima nenegativnu vrednost u matrici logverovatnoće PAM250.
[0067] Kontrola:kao što se ovde koristi, uključuje značenje "kontrole" koje je standard sa kojim se upoređuju rezultati. Obično se kontrole koriste za povećanje integriteta u eksperimentima izolovanjem promenljivih da bi se mogao izvesti zaključak o takvim promenljivim. U nekim realizacijama, kontrola je reakcija ili ispitivanje koje se izvodi istovremeno sa testnom reakcijom ili ispitivanjem da bi se dobio upoređivač. Kako se ovde koristi „kontrola” može da uključuje „kontrolnu životinju". "Kontrolna životinja" može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano, ili nema modifikacije (tj. životinja sa divljim tipom). U jednom eksperimentu, primenjuje se „test“ (tj. promenljiva koja se testira). U drugom eksperimentu, se ne primenjuje „kontrola“ (tj. promenljiva koja se testira). U nekim realizacijama, kontrola je istorijska kontrola (tj. prethodno sprovedeni test ili ispitivanje, ili određena količina ili rezultat koji je prethodno poznat). U nekim realizacijama, kontrola je ili sadrži odštampan ili na drugi način sačuvan zapis. Kontrola može biti pozitivna ili negativna kontrola.
[0068] Disrupcija: kao što se ovde koristi, uključuje rezultat homologne rekombinacije sa molekulom DNK (npr. sa endogenom homolognom sekvencom kao što je gen ili lokus gena). U nekim realizacijama, disrupcija može postići ili predstavljati inserciju, deleciju, supstituciju, zamenu, besmislenu mutaciju, ili promenu okvira DNK sekvenci, ili bilo koje njihove kombinacije. Insercije mogu da uključuju ubacivanje celih gena ili fragmenata gena, npr., eksona, koji mogu biti različitog porekla od endogene sekvence (npr. heterologne sekvence). U nekim realizacijama, disrupcija može povećati ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda (npr. proteina kodiranog genom). U nekim realizacijama, disrupcija može smanjiti ekspresiju i/ili aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija može promeniti sekvencu gena ili kodiranog genskog proizvoda (npr. kodiranog proteina). U nekim realizacijama, disrupcija može skratiti ili fragmentisati gen ili kodirani genski proizvod (npr. kodirani protein). U nekim realizacijama, disrupcija može proširiti gen ili kodirani genski proizvod; u nekim takvim realizacijama može doći do poremećaja sklapanja fuzionisanog proteina. U nekim realizacijama, disrupcija može uticati na nivo, ali ne i aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija može uticati na aktivnost, ali ne i na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na nivo gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj na aktivnost gena ili genskog proizvoda. U nekim realizacijama, disrupcija možda neće imati značajan uticaj bilo na nivo ili aktivnost gena ili genskog proizvoda.
[0069] Određivanje, merenje, ocena, procenjivanje, ispitivanje i analiziranje: koriste se naizmenično da bi označili bilo koji oblik merenja i uključuju određivanje da li je neki element prisutan ili ne. Ovi izrazi uključuju i kvantitativne i/ili kvalitativne determinante. Ispitivanje može biti relativno ili apsolutno. “Ispitivanje prisustva” može biti utvrđivanje količine nečeg prisutnog i/ili utvrđivanje da li je nešto prisutno ili ne.
[0070] Endogeni lokus ili endogeni gen: kako se ovde koristi, uklјučuje genetski lokus pronađen u roditelјskom ili referentnom organizmu pre uvođenja promene, prekida, delecije, umetanja, modifikacije, zamene ili supstitucije kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, endogeni lokus ima sekvencu koja se nalazi u prirodi. U nekim realizacijama, endogeni lokus je lokus divljeg tipa. U nekim realizacijama, referentni organizam je organizam divljeg tipa. U nekim realizacijama, referentni organizam je stvoreni organizam. U nekim realizacijama, referentni organizam je laboratorijski uzgojen organizam (bilo da je divlji ili stvoreni).
[0071] Endogeni promotor: kako se ovde koristi, uključuje promotor koji je prirodno povezan, na primer, u organizmu divljeg tipa, sa endogenim genom.
[0072] Konstruisan: kako se ovde koristi, uopšte uklјučuje aspekt rukovanja čovekovom rukom. Na primer, u nekim realizacijama, polinukleotid se može smatrati „konstruisanim" kada se čovekovom rukom manipuliše sa dve ili više sekvenci koje nisu međusobno povezane tim redom u prirodi da bi bile direktno povezane jedna sa drugom u konstrisanom polinukleotidu. U nekim određenim takvim realizacijama, konstruisani polinukleotid može da sadrži regulatornu sekvencu koja se nalazi u prirodi u operativnoj asocijaciji sa prvom kodirajućom sekvencom, ali ne i u operativnoj asocijaciji sa drugom kodirajućom sekvencom, povezan je čovekovom rukom tako da je operativno povezan sa drugom kodirajućom sekvencom. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, sekvence prve i druge nukleinske kiseline koje svaki kodiraju polipeptidne elemente ili domene koji u prirodi nisu međusobno povezani mogu biti povezane jedna sa drugom u jednom konstruisanom polinukleotidu. Uporedno, u nekim realizacijama, ćelija ili organizam se može smatrati „konstruisanim“ ako je njime manipulisano tako da se menjaju njegove genetske informacije (npr. uveden je novi genetski materijal koji ranije nije bio prisutan ili je prethodno prisutni genetski materijal izmenjen ili uklonjen). Kao što je to uobičajena praksa i razumeju je stručnjaci u tehnici, potomci konstruisanog polinukleotida ili ćelije obično se i dalјe nazivaju „konstruisanim“ iako je stvarna manipulacija izvršena na prethodnom entitetu. Štaviše, kako će proceniti stručnjaci u tehnici, dostupne su razne metodologije putem kojih se „inženjering“ kako je ovde opisano može postići. Na primer, u nekim realizacijama, „inženjering“ može uklјučivati selekciju ili dizajn (npr. sekvenci nukleinskih kiselina, polipeptidnih sekvenci, ćelija, tkiva i/ili organizama) upotrebom računarskih sistema programiranih za obavlјanje analize ili upoređivanja ili na drugi način za analizu, preporuku i/ili odabir sekvenci, alteracija, itd.). Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, „inženjering“ može da uklјučuje upotrebu in vitro metodologije hemijske sinteze i/ili tehnologije rekombinantnih nukleinskih kiselina, kao što su, na primer, amplifikacija nukleinske kiseline (npr. lančanom reakcijom polimeraze), hibridizacija, mutacija, transformacija, transfekcija itd., i/ili bilo koja od različitih kontrolisanih metodologija uparivanja. Kao što će ceniti stručnjaci u tehnici, niz uspostavlјenih takvih tehnika (npr. za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija, itd.)) dobro je poznat u tehnici i opisan u raznim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i/ili diskutovane tokom ove specifikacije. Vidi, npr. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989).
[0073] Gen: kako se ovde koristi, uklјučuje sekvencu DNK u hromozomu koja kodira za proizvod (npr. RNK proizvod i/ili polipeptidni proizvod). U nekim realizacijama, gen uklјučuje kodirajuću sekvencu (tj. sekvencu koja kodira određeni proizvod). U nekim realizacijama, gen uklјučuje nekodirajuću sekvencu. U nekim određenim realizacijama, gen može da uklјučuje i kodirajuću (npr. eksonsku) i nekodirajuću sekvencu (npr. intronsku). U nekim realizacijama, gen može da sadrži jednu ili više regulatornih sekvenci (na primer, promotori, pojačivači, itd.) i/ili intronske sekvence koje, na primer, mogu da kontrolišu ili utiču na jedan ili više aspekata ekspresije gena (npr. ekspresija specifična za ćelijski tip, inducibilna ekspresija, itd.). Radi jasnoće napominjemo da, kao što se koristi u ovoj prijavi, izraz „gen“ generalno uklјučuje deo nukleinske kiseline koji kodira polipeptid; izraz može opciono da obuhvati regulatorne sekvence, što će biti jasno iz konteksta stručnjacima u tehnici. Ova definicija nije namenjena isklјučivanju primene izraza „gen“ na ekspresione jedinice koje ne kodiraju proteine, već da bi se razjasnilo da, u većini slučajeva, izraz kako se koristi u ovom dokumentu uklјučuje nukleinsku kiselinu koja kodira polipeptide.
[0074] Heterologni: kao što se ovde koristi, uključuje sredstvo ili entitet iz drugog izvora. Na primer, kada se koristi u vezi sa polipeptidom, genom ili genskim proizvodom ili je prisutan u određenoj ćeliji ili organizmu, izraz pojašnjava da je relevantni polipeptid, gen ili genski proizvod: 1) napravio čovek; 2) je unet u ćeliju ili organizam (ili njihov prekursor) od strane čoveka (npr., genetskim inženjeringom); i/ili 3) nije prirodno proizveden ili prisutan u odgovarajućoj ćeliji ili organizmu (npr. relevantni tip ćelije ili tip organizma).
[0075] Ćelija domaćin: kao što se ovde koristi, uključuje ćeliju u koju je uvedena heterologna (npr. egzogena) nukleinska kiselina ili protein. Stručnjaci u tehnici posle čitanja ovog otkrića razumeće da se takvi pojmovi ne odnose samo na određenu predmetnu ćeliju, već se koriste da uključe potomstvo takve ćelije. Budući da se u sledećim generacijama mogu dogoditi određene modifikacije ili zbog mutacija ili uticaja okoline, takvo potomstvo ne može, u stvari, biti identično matičnoj ćeliji, ali je još uvek uključeno u opseg izraza "ćelija domaćin"kao što se ovde koristi. U nekim realizacijama, ćelija domaćin jeste ili sadrži prokariotsku ili eukariotsku ćeliju. Generalno, ćelija domaćin je svaka ćelija koja je pogodna za prijem i/ili proizvodnju heterologne nukleinske kiseline ili proteina, bez obzira na biološko carstvo za koje je ćelija označena. Primerne ćelije uključuju one prokariota i eukariota (jednoćelijske ili višećelijske), bakterijske ćelije (npr. sojevi E. coli, Bacillus spp., Streptomyces spp. itd.), . elije mikobakterija, gljivične ćelije, ćelije kvasca ( npr. S. cerevisiae, S. pombe, P. pastoris, P. methanolica, itd.), biljne ćelije, ćelije insekata (npr. SF-9, SF-21, ćelije insekata inficirane bakulovirusom, Trichoplusia ni, itd.), životinjske ćelije koje nisu humane, humane ćelije ili fuzije ćelija kao što su, na primer, hibridomi ili kvadromi. U nekim realizacijama, ćelija je ćelija čoveka, majmuna, čovekolikog majmuna, hrčka, pacova ili ćelija miša. U nekim realizacijama, ćelija je eukariotska i bira se iz sledećih ćelija: CHO (npr. CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (npr. COS-7), ćelija mrežnjače, Vero, CV1, bubrega (npr. HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK ), HeLa, HepG2, VI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60 (npr. BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidermalni), CV-1, U937, 3T3, L ćelija, C127 ćelija, SP2/0, NS-0, MMT 060562, ćelija Sertoli, BRL 3A ćelija, ćelija HT1080, ćelija mijeloma, tumorska ćelija i ćelijska linija izvedena iz gore pomenute ćelije. U nekim realizacijama, ćelija sadrži jedan ili više virusnih gena, npr. ćeliju retine koja eksprimuje virusni gen (npr. ćeliju PER.C6™). U nekim realizacijama, ćelija domaćin jeste ili sadrži izolovanu ćeliju. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je deo tkiva. U nekim realizacijama, ćelija domaćin je deo organizma.
[0076] Humanizovani: se ovde koristi u skladu sa značenjem razumljivim od strane stručnjaka da uključi nukleinske kiseline ili proteine čija struktura (tj. nukleotidne ili amino-kiselinske sekvence) obuhvata delove koji u osnovi ili identično odgovaraju strukturama određenog gena ili proteina koji se nalaze u prirodi kod ne-humanih životinja, a takođe uključuju delove koji se razlikuju od onih koji se nalaze u odgovarajućem određenom genu ili proteinu koji nije humani, i umesto toga, oni bliže odgovaraju uporedivim strukturama koje su pronađene u odgovarajućem humanom genu ili proteinu. U nekim realizacijama, "humanizovani" gen je onaj koji kodira polipeptid koji u osnovi ima sekvencu amino-kiseline kao humani polipeptid (npr. humani protein ili njegov deo -npr. njegov karakteristični deo). Daćemo samo jedan primer, u slučaju membranskog receptora, "humanizovani" gen može kodirati polipeptid koji ima ekstracelularni deo, u celini ili delom, koji ima sekvencu amino-kiseline kao humani ekstracelularni deo i preostalu sekvencu kao onu kod polipeptida koji nije humani (npr. mišjeg). U nekim realizacijama, humanizovani gen sadrži najmanje deo sekvence DNK humanog gena. U nekim realizacijama, humanizovani gen sadrži čitavu sekvencu DNK humanog gena. U nekim realizacijama, humanizovani protein sadrži sekvencu koja ima deo koji se pojavljuje u humanom proteinu. U nekim realizacijama, humanizovani protein sadrži čitavu sekvencu humanog proteina i eksprimuje se iz endogenog lokusa ne-humane životinje, a koji odgovara homologu ili ortologu humanog gena.
[0077] Identičnost: kao što se ovde koristi, u vezi sa upoređivanjem sekvenci, uključuje identitet određen brojem različitih algoritama poznatih u tehnici, koji se mogu koristiti za merenje identičnosti nukleotida i/ili sekvenci aminokiselina. U nekim realizacijama, identičnosti, kao što je ovde opisano, određuju se pomoću ClustalW v. 1.83 (sporog) poravnanja korišćenjem vrednosti otvorene praznine od 10.0, vrednosti za produženi razmak od 0.1 i korišćenjem Gonetove matrice sličnosti (MACVECTOR™ 10.0.2, MacVector Inc., 2008).
[0078] In vitro: kako se ovde koristi uklјučuje događaje koji se dešavaju u veštačkom okruženju, npr. u epruveti ili reakcionoj posudi, u ćelijskoj kulturi, itd., a ne unutar višećelijskog organizma.
[0079] In vivo: kako se ovde koristi uklјučuje događaje koji se dešavaju u višećelijskim organizmima, kao što su čovek i nehumana životinja. U kontekstu sistema zasnovanih na ćelijama, izaz se može koristiti za uklјučivanje događaja koji se dešavaju unutar žive ćelije (za razliku od, na primer, in vitro sistema).
[0080] Izolovan: kao što se ovde koristi, uključuje supstancu i/ili entitet koji je (1) odvojen od barem nekih komponenti sa kojima je povezan kada je inicijalno proizveden (bilo u prirodi i/ili u eksperimentalnom okruženju) i/ili (2) dizajniran, proizveden, pripremljen i/ili proizveden od strane čoveka. Izolovane supstance i/ili entiteti mogu se odvojiti od oko 10%, oko 20%, oko 30%, oko 40%, oko 50%, oko 60%, oko 70%, oko 80%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% ostalih komponenti sa kojima su bili u početku povezani. U nekim realizacijama, izolovana sredstva su oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 91%, oko 92%, oko 93%, oko 94%, oko 95%, oko 96%, oko 97%, oko 98%, oko 99%, ili više od oko 99% čista. Supstanca je „čista”ako je u osnovi bez drugih komponenti. U nekim realizacijama, kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, supstanca se još može smatrati „izolovanom” ili čak „čistom”, nakon što je kombinovana sa određenim drugim komponentama kao što su, na primer, jedan ili više nosača ili ekscipijenasa (npr. pufer, rastvarač, voda, itd.); u takvim realizacijama, izračunava se procenat izolacije ili čistoće materije, bez uključivanja takvih nosača ili ekscipijenasa. Dajući samo jedan primer, u nekim realizacijama, biološki polimer, poput polipeptida ili polinukleotida koji se javlja u prirodi, smatra se „izolovanim” kada: a) na osnovu svog porekla ili izvora dobijanja nije povezan sa nekim ili svim komponentama koje ga prate u svom izvornom stanju u prirodi; b) u osnovi ne sadrži druge polipeptide ili nukleinske kiseline iste vrste od vrsta koje ih proizvode u prirodi; ili c) je eksprimovan ili je na neki drugi način povezan sa komponentama ćelije ili drugog sistema ekspresije koji nije od vrste koja ga proizvodi u prirodi. Tako se, na primer, u nekim realizacijama, polipeptid koji je hemijski sintetizovan ili se sintetiše u ćelijskom sistemu različitom od onoga koji ga proizvodi u prirodi, smatra „izolovanim” polipeptidom. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, polipeptid koji je podvrgnut jednoj ili više tehnika prečišćavanja može se smatrati „izolovanim” polipeptidom u meri u kojoj je odvojen od drugih komponenti: a) sa kojima je povezan u prirodi; i/ili b) sa kojim je povezan kada je prvobitno proizveden.
[0081] „Locus” ili „Loci”: kako se ovde koristi, uklјučuje određenu lokaciju (lokacije) gena (ili značajne sekvence), sekvencu DNK, sekvencu koja kodira polipeptid ili položaj na hromozomu genoma organizma. Na primer, „Lag-3 locus" može da uklјučuje određenu lokaciju Lag-3 gena, Lag-3 DNK sekvencu, Lag-3 kodirajuću sekvencu ili Lag-3 položaj na hromozomu genoma organizma koji je identifikovan gde se takva sekvenca nalazi. „Lag-3 locus" može da sadrži regulatorni element a Lag-3 gena, uklјučujući, ali bez ograničenja, pojačivač, promotor, 5’ i/ili 3’ UTR, ili njihovu kombinaciju. Prosečan stručnjak u tehnici shvatiće da hromozomi mogu, u nekim realizacijama, da sadrže stotine ili čak hilјade gena i da pokažu fizičku kolokalizaciju sličnih
1
genetskih lokusa u poređenju između različitih vrsta. Takvi genetski lokusi mogu se opisati kao da dele zajedničku sintetiku.
[0082] Životinja koja nije čovek (ne-humana): Genetski modifikovana nehumana životinja iz pronalaska je glodar koji je miš ili pacov. U nekim realizacijama, ne-humana životinja ovde opisana je miš.
[0083] U nekim realizacijama, ne-humana životinja ovde opisana je glodar koji je miš C57BL soja odabranog između C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, i C57BL/Ola. U nekim određenim realizacijama, miš ovde opisan je soj 129 izabran iz grupe koja se sastoji od soja koji je 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (npr. 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi npr. Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10:836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5): 1024-1028, 1030, 1032). U nekim određenim realizacijama, ovde opisani genetski modifikovani miš je kombinacija gore pomenutog soja 129 i pomenutog soja C57BL/6. U nekim određenim realizacijama, ovde opisani miš je kombinacija gore pomenutih sojeva 129 ili kombinacija gore pomenutih sojeva BL/6. U nekim određenim realizacijama, soj 129 kombinacije kako je ovde opisano je soj 129S6 (129/SvEvTac). U nekim realizacijama, ovde opisani miš je soj BALB, npr. soj BALB/c. U nekim realizacijama, ovde opisani miš je kombinacija soja BALB i drugog već pomenutog soja.
[0084] U nekim realizacijama, ne-humana životinja ovde opisana je pacov. U nekim određenim realizacijama, pacov ovde opisan odabran je od pacova Wistar, soja LEA, soja Sprague Dawley, Fischerovog soja, F344, F6, i Dark Agouti. U nekim određenim realizacijama, soj pacova ovde opisan je kombinacija dva ili više sojeva odabranih iz grupe koja se sastoji od Wistar, LEA, Sprague Dawley, Lischer, F344, F6 i Dark Agouti.
[0085] Nukleinska kiselina: kao što se ovde koristi, u svom najširem smislu, uključuje bilo koje jedinjenje i/ili supstancu koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" je jedinjenje i/ili supstanca koja jeste ili se može ugraditi u lanac oligonukleotida putem fosfodiestarske veze. Kao što će biti jasno iz konteksta, u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", uključuje pojedinačne ostatke nukleinske kiseline (npr. nukleotide i/ili nukleozide); u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", uključuje oligonukleotidni lanac koji sadrži pojedinačne ostatke nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", jeste ili sadrži RNK; u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", jeste ili sadrži DNK. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više ostataka prirodne nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina", jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više analoga nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, analog nukleinske kiseline razlikuje se od "nukleinska kiselina" po tome što ne koristi fosfodiestarsku kičmu. Na primer, u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednu ili više " peptidnih nukleinskih kiselina ", koje su poznate u tehnici i imaju peptidne veze umesto fosfodiestarskih veza u kičmi, razmatrane su u okviru obima predmetnog pronalaska. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, „nukleinska kiselina” ima jednu ili više fosforotioatnih i/ili 5’-N-fosforamiditnih veza umesto fosfodiestarskih veza. U nekim realizacijama, „nukleinska kiselina” jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više prirodnih nukleozida (npr. adenozina, timidina, guanozina, citidina, uridina, deoksiadenozin, deoksitimidin, deoksiguanozin i deoksi citidin). U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" jeste, sadrži ili se sastoji od jednog ili više nukleozidnih analoga (npr.2-aminoadenozina, 2-tiotimidina, inozina, pirolo-pirimidina, 3-metil adenozina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenozina, C5-bromouridina, C5-fiuorouridina, C5-jodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenozina, 7-deazaadenozina, 7-deazaguanozina, 8-oksoadenozina, 8-oksoguanozina, O(6) -metilguanina, 2-tiocitidina, metilovane baze, interkalirane baze i njihove kombinacije). U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" sadrži jedan ili više modifikovanih šećera (npr. 2'-fluororiboza, riboza, 2'-deoksiriboza, arabinoza i heksoza) u poređenju sa onima u prirodnim nukleinskim kiselinama. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja kodira funkcionalni genski proizvod kao što je RNK ili protein. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" uključuje jedan ili više introna. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" se priprema jednom ili više izolacija iz prirodnog izvora, enzimskom sintezom polimerizacijom na osnovu komplementarnog uzorka (in vivo ili in vitro), reprodukcijom u rekombinantnoj ćeliji ili sistemu i hemijskom sintezom. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" je najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ili više ostataka dugačka. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" je jednolančana; u nekim realizacijama, "nukleinska kiselina"]” je dvolančana. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima nukleotidnu sekvencu koja sadrži najmanje jedan element koji kodira, ili je komplement sekvence koja kodira, polipeptid. U nekim realizacijama, "nukleinska kiselina" ima enzimsku aktivnost.
[0086] Operativno povezan: kao što se ovde koristi, uključuje jukstapoziciju u kome su opisane komponente u odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operativno povezana" na kodirajuću sekvencu se liguje na takav način da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama. "Operativno povezane” sekvence obuhvataju i kontrolne sekvence ekspresije koje su susedne genu od interesa i kontrolnim sekvencama ekspresije koje transregulišu ili su na daljini radi kontrole gena od interesa. Izraz "kontrolna sekvenca ekspresije", kao što se ovde koristi, uključuje polinukleotidne sekvence, koje su neophodne da bi se izvršila ekspresija i obrada kodirajućih sekvenci za koje su vezani. "Kontrolna sekvenca ekspresije", uključuju: odgovarajuće inicijacije transkripcije, terminacije, promotorne i pojačivačke sekvence; efikasni RNK signali za obradu kao što su splajsujući i poliadenilacioni signali; sekvence koje stabilizuju citoplazmatsku mRNA; sekvence koje povećavaju efikasnost translacije (tj., Kozak konsenzusna sekvenca); sekvence koje povećavaju stabilnost proteina; i po želji, sekvence koje pojačavaju lučenje proteina. Priroda takvih kontrolnih sekvenci razlikuje se u zavisnosti od organizma domaćina. Na primer, u prokariotima, takve kontrolne sekvence obično uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za završavanje transkripcije, dok u eukariotima obično takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završavanje transkripcije. Izraz "kontrolne sekvence"treba da obuhvati komponente čiji je prisustvo neophodno za ekspresiju i obradu, a može uključivati i dodatne komponente čija je prisutnost korisna, na primer, vodećih sekvenci i fuzionih partnerskih sekvenci.
[0087] Pacijent ili subjekt: kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji organizam kome je data ili se može dati data kompozicija, npr. za eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke, kozmetičke i/ili terapeutske svrhe. Uobičajeni pacijenti uključuju životinje (npr. sisari, poput miševa, pacova, zečeva, ne-humanih primata i/ili ljudi). U nekim realizacijama, pacijent je ne-humana životinja. U nekim realizacijama, pacijent (npr. pacijent koji je nehumana životinja) može imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano ili nemati modifikaciju (tj. divlji tip pacijenta koji je ne-humana životinja). U nekim realizacijama, ne-humana životinja pati ili je podložna jednom ili više poremećaja ili stanja. U nekim realizacijama, ne-humana životinja pokazuje jedan ili više simptoma poremećaja ili stanja. U nekim realizacijama, ne-humanoj životinji dijagnostikovan je jedan ili više poremećaja ili stanja.
[0088] Polipeptid: kao što se ovde koristi, uključuje bilo koji polimerni lanac amino-kiselina. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se javlja u prirodi. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja se ne pojavljuje u prirodi. U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu aminokiselina koja sadrži delove koji se javljaju u prirodi odvojeno jedan od drugog (tj. od dva ili više različitih organizama, na primer, humane i ne-humane delove). U nekim realizacijama, polipeptid ima sekvencu amino-kiselina koja je napravljena tako da je dizajnirana i/ili proizvedena radom ruku čoveka.
[0089] Rekombinant: kao što se ovde koristi, namenjen je da uključi polipeptide (npr. Lag-3 polipeptide kao što je ovde opisano) koji su dizajnirani, kreirani, pripremljeni, izraženi, stvoreni ili izolovani rekombinantnim sredstvima, kao što su polipeptidi eksprimovani korišćenjem rekombinantnog vektora ekspresije transfektovanog u ćeliju domaćina, polipeptide izolovane iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke humanog polipeptida (Hoogenboom H. R., (1997) TIB Tech.15:62-70; Azzazy H., and Highsmith W. E., (2002) Clin. Biochem.35:425-445; Gavilondo J. V., and Larrick J. W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H., and Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja je transgena za humane gene imunoglobulina (videti npr. Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Kellermann S-A., and Green L. L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al. (2000) Immunology Today 21:364-370; Murphy, A.J., et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111(14):5153-5158) ili polipeptide koji su pripremljeni, eksprimovani, stvoreni ili izolovani na bilo koji drugi način koji uključuje spajanje odabranih elemenata sekvence jedan za drugi. U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence nalaze se u prirodi. U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence je dizajnirano in silico. U nekim realizacijama, jedan ili više takvih odabranih elemenata sekvence rezultat je mutageneze (npr. in vivoili in vitro) poznatog elementa sekvence, npr. iz prirodnog ili sintetičkog izvora. Na primer, u nekim realizacijama, rekombinantni polipeptid se sastoji od sekvenci nađenih u genomu organizma izvora koji nas zanima (npr. čoveka, miša itd.). U nekim realizacijama, rekombinantni polipeptid ima sekvencu amino-kiseline koja je rezultat mutageneze (npr. in vitroili in vivona primer kod ne-humane životinje), tako da su sekvence amino-kiselina rekombinantnih polipeptida sekvence koje, iako potiču iz i povezane su sa sekvencama polipeptida, ne mogu prirodno postojati unutar genoma ne-humane životinje in vivo.
[0090] Zamena: kao što je ovde opisano, uključuje postupak kroz koji je "zamenjena" sekvenca nukleinskih kiselina (npr. gen) koja se nalazi u lokusu domaćina (npr. u genomu) uklonjena iz tog lokusa i postavljena je drugačija "zamenska" nukleinska kiselina na njenom mestu. U nekim realizacijama, zamenjene sekvence nukleinske kiseline i zamenske sekvence nukleinske kiseline su uporedive jedna sa drugom, na primer, one su homologne jedna drugoj i/ili sadrže odgovarajuće elemente (npr. elemente koji kodiraju proteine, regulatorne elemente, itd.). U nekim realizacijama, zamenjena sekvenca nukleinskih kiselina uključuje jedan ili više promotora, pojačivača, splajsujuće mesto za donora, mesta prihvata splajsa, intron, ekson, neprevedene regije (UTR); u nekim realizacijama, zamenska sekvenca nukleinske kiseline uključuje jednu ili više kodirajućih sekvenci. U nekim realizacijama, zamenska sekvenca nukleinske kiseline je homolog zamenjene sekvence nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, zamenska nukleinska kiselina je ortolog zamenjene sekvence. U nekim realizacijama, zamenska nukleinska kiselina jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline. U nekim realizacijama, uključujući gde zamenska sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline, zamenjena sekvenca nukleinske kiseline jeste ili sadrži sekvencu glodara (npr. sekvencu miša ili pacova). Tako postavljena nukleinska kiselina može da sadrži jednu ili više regulatornih sekvenci koje su deo izvorne sekvence nukleinske kiseline koja se koristi za dobijanje tako postavljene sekvence (npr., promotora, pojačivača, 5’- ili 3’-neprevedene regije, itd.). Na primer, u različitim aspektima, zamena je supstitucija endogene sekvence heterolognom sekvencom koja rezultira proizvodnjom genskog proizvoda iz tako postavljene sekvence nukleinske kiseline (koja sadrži heterolognu sekvencu), ali ne i ekspresijom endogene sekvence; zamena je od endogene genske sekvence sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira polipeptid koji ima sličnu funkciju kao polipeptid kodiran endogenom sekvencom (npr. endogena genomska sekvenca kodira Lag-3 polipeptid, a DNK fragment kodira jedan ili više humanih Lag-3 polipeptida, u celini ili delom). U različitim realizacijama, endogeni gen ili njegov fragment je zamenjen odgovarajućim humanim genom ili njegovim fragmentom. Odgovarajući humani gen ili njegov fragment je humani gen ili fragment koji je ortolog ili je u osnovi sličan ili isti u strukturi i/ili funkciji, endogenom genu ili njegovom fragmentu koji je zamenjen.
[0091] Referenca: kako se ovde koristi, opisuje standardno ili kontrolno sredstvo, životinju, kohortu, jedinku, populaciju, uzorak, sekvencu ili vrednost protiv koje se sredstvo, životinja, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost od interesa poredi. U nekim realizacijama, referentni agent, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost testira se i / ili određuje u suštini istovremeno sa testiranjem ili određivanjem agensa, kohorte, pojedinca, populacije, uzorka, sekvence ili vrednosti od interesa. U nekim realizacijama, referentno sredstvo, kohorta, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost predstavlja istorijsku referencu, opciono realizovanu u opipljivom medijumu. U nekim realizacijama, referenca se može odnositi na kontrolu. Kao što se ovde koristi, „referenca” može da se odnosi na „referentnu životinju”. „Referentna životinjamože imati modifikaciju kako je ovde opisana, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano ili može biti bez modifikacije (tj. životinja divljeg tipa). Uobičajeno, kao što će stručnjaci u tehnici podrazumevati, referentno sredstvo, životinja, kohort, pojedinac, populacija, uzorak, sekvenca ili vrednost se određuje ili karakteriše pod uslovima uporednim sa onima korišćenim za određivanje ili karakterizaciju sredstva, životinje (npr., sisara), kohorta, pojedinca, populacije, uzorka, redosleda ili vrednosti od interesa.
[0092] U osnovi: kao što se ovde koristi, uključuje kvalitativni uslov ispoljavanja ukupnog ili skoro ukupnog obima ili stepena karakteristike ili svojstva od interesa. Stručnjak u biološkoj tehnici razumeće da biološke i hemijske pojave retko, ako ikad, završe i/ili pristupe dovršenosti ili postignu ili izbegnu apsolutni rezultat. Izraz „u osnovi” se ovde koristi za hvatanje potencijalnog nedostatka potpunosti koji je svojstven mnogim biološkim i hemijskim pojavama. Izraz se ovde, takođe, koristi kada se odnosi na sekvencu, molekul nukleinske kiseline ili proteina, ili proteinski domen, u poređenju sa referentnom sekvencom, molekulom ili domenom. Na primer, kada se odnosi na humanizovani Lag-3 polipeptid koji sadrži u osnovi signalni peptid nehumanog Lag-3 polipeptida, fraza „u osnovi signalni peptid nehumanog Lag-3 polipeptida“ uklјučuje peptid koji je u suštini identičan signalnom peptidu nehumanog Lag-3 polipeptida, čiji je peptid u nekim realizacijama najmanje 85%, 90%, 95%, 95%, 99% ili 100% identičan u sekvenci sa signalnim peptidom nehumanog Lag-3 polipeptida; i u nekim realizacijama, razlikuje se od signalnog peptida nehumanog Lag-3 polipeptida za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 amino-kiseline, poželјno samo na N-ili C-kraju signalnog peptida, npr. nedostatkom amino-kiselina(e) ili dodatnim amino-kiselinama na kraju N- ili C-kraja signalnog peptida. Kao drugi primer, u pozivanju na humanizovani PD-1 polipeptid koji sadrži u osnovi vanćelijski domen humanog proteina PD-1, fraza „u suštini vanćelijski domen humanog PD-1 proteina“ uklјučuje polipeptid koji je u suštini identičan sa vanćelijskim domenom humanog PD-1 proteina, čiji je polipeptid, u nekim realizacijama, najmanje 85%, 90%, 95%, 95%, 99% ili 100% identičan u sekvenci sa vanćelijskim domenom humanog PD-1 proteina; i u nekim realizacijama, razlikuje se od vanćelijskog domena humanog proteina PD-1 za ne više od 5, 4, 3, 2 ili 1 amino-kiseline, poželјno samo na N- ili C-kraju, npr. kojima nedostaju amino-kiseline ili koji imaju dodatne amino-kiseline na N- ili C-kraju.
[0093] Suštinska homologija: kao što se ovde koristi, uključuje poređenje između sekvenci amino-kiselina ili sekvenci nukleinskih kiselina. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, dve sekvence se obično smatraju „suštinski homolognim”, ako sadrže homologne ostatke na odgovarajućim pozicijama. Homologni ostaci mogu biti identični ostaci. Alternativno, homologni ostaci mogu biti neidentični ostaci koji će imati odgovarajuće slične strukturne i/ili funkcionalne karakteristike. Na primer, kao što je dobro poznato stručnjacima iz tehnike, određene amino-kiseline su po pravilu klasifikovane kao "hidrofobne" ili "hidrofilne" amino-kiseline i/ili kao da imaju "polarni" ili "nepolarni" bočni lanac. Supstitucija jedne amino-kiseline drugom istog tipa često se može smatrati "homolognom" supstitucijom. Tipične kategorizacije amino-kiselina sumirane su dole:
1
[0094] Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence aminokiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, S. F. et al., 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al., 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res.25:3389-3402; Baxevanis et al., 1998 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and Misener et al. (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol.
132), Humana Press. Pored identifikacije homolognih sekvenci, gore navedeni programi obično daju i stepen homologije. U nekim realizacijama, dve sekvence smatraju se suštinski homolognim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više njihovih odgovarajućih ostataka homologno u odnosu na odgovarajući deo ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili više ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo uključuje susedne ostatke duž kompletne sekvence. U nekim realizacijama, relevantni deo uključuje diskontinuirane ostatke duž kompletne sekvence. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
[0095] Suštinski identitet: kao što se ovde koristi, uključuje poređenje između sekvenci amino-kiselina ili nukleinskih kiselina. Kao što je ponato stručnjacima u tehnici, dve sekvence se obično smatraju "suštinski identičnim" ako sadrže identične ostatke na odgovarajućim pozicijama. Kao što je dobro poznato u tehnici, sekvence amino-kiselina ili nukleinskih kiselina mogu se porediti koristeći bilo koji od različitih algoritama, uključujući one dostupne u komercijalnim računarskim programima, kao što su BLASTN za nukleotidne sekvence i BLASTP, BLAST sa razmacima i PSI-BLAST za sekvence amino-kiselina. Primeri takvih programa opisani su u Altschul, S. F. et al., 1990, Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410; Altschul et al., 1996, Methods Enzymol. 266:160-80; Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402; Baxevanis et al., 1998, Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley; and Misener et al., (eds.) (1999) Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press. Pored identifikovanja identičnih sekvenci, gore navedeni programi obično daju i stepen identiteta. U nekim realizacijama, dve sekvence se smatraju suštinski identičnim ako je barem 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više odgovarajućih ostataka identično u relevantnom delu ostataka. U nekim realizacijama, relevantni deo je potpuna sekvenca. U nekim realizacijama, relevantni deo je najmanje 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ili više ostataka.
[0096] Ciljajući vektor ili ciljajući konstrukt: kao što se ovde koristi, uključuje polinukleotidni molekul koji sadrži ciljajući region. Ciljajući region sadrži sekvencu koja je identična ili suštinski identična sekvenci u ciljnoj ćeliji, tkivu ili životinji i omogućava integraciju ciljajućeg konstrukta u položaj unutar genoma ćelije, tkiva ili životinje putem homologne rekombinacije. Ciljajući regioni koji ciljaju upotrebu lokacija za prepoznavanje rekombinacija specifičnih za lokacije (npr. loxP i/ili Frtmesta) su takođe uključeni. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt dalje sadrži sekvencu nukleinske kiseline ili gen od posebnog interesa, selekcioni marker, kontrolne i/ili regulatorne sekvence i druge sekvence nukleinske kiseline koje omogućavaju rekombinaciju posredovanu egzogenim dodavanjem proteina koji pomažu u ili olakšavaju rekombinaciju koja uključuje takve sekvence. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt dalje sadrži gen od interesa u celosti ili delimično, pri čemu je gen od interesa heterologni gen koji kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt dalje sadrži humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu humanizovani gen od interesa kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom. U nekim realizacijama, ciljajući konstrukt sadrži humanizovani gen od interesa, u celini ili delimično, pri čemu proizvedeni gen od interesa kodira protein, u celini ili delimično, koji ima sličnu funkciju kao protein kodiran endogenom sekvencom.
[0097] Varijanta: kao što se ovde koristi, obuhvata entitet koji pokazuje značajan strukturni identitet sa referentnim entitetom, ali se strukturno razlikuje od referentnog entiteta u prisustvu ili nivou jedne ili više hemijskih grupa u poređenju sa referentnim entitetom. U mnogim realizacijama, "varijanta" se, takođe, funkcionalno razlikuje od svog referentnog entiteta. Uopšteno, da li se određeni entitet ispravno smatra "varijantom" referentnog entiteta, zasniva se na njegovom stepenu strukturnog identiteta sa referentnim entitetom. Kao je poznato stručnjacima u tehnici, bilo koji biološki ili hemijski referentni entitet ima određene karakteristične strukturne elemente. "Varijanta", po definiciji, je različiti hemijski entitet koji deli jedan ili više takvih karakterističnih strukturnih elemenata. Da bismo dali nekoliko primera, mali molekul može imati karakteristični strukturni element jezgra (npr. jezgro makrocikla) i/ili jedan ili više karakterističnih visećih grupa, tako da je varijanta malog molekula ona koja deli strukturni element jezgra i karakteristične viseće grupe, ali se razlikuje kod ostalih visećih grupa i/ili u vrstama veza (jednostruke nasuprot dvostrukoj, E protiv Z, itd.) unutar jezgra, polipeptid može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja amino-kiselina koje imaju označene pozicije jedna u odnosu na drugu u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru i/ili doprinose određenoj biološkoj funkciji, nukleinska kiselina može imati karakteristični element sekvence koji se sastoji od većeg broja nukleotidnih ostataka koji imaju određene položaje jedan u odnosu na drugi u linearnom ili trodimenzionalnom prostoru. Na primer "varijanta polipeptida" može se razlikovati od referentnog polipeptida kao rezultat jedne ili više razlika u sekvenci amino-kiselina i/ili jedne ili više razlika u hemijskim delovima (npr. ugljeni hidrati, lipidi, itd.) kovalentno vezanim za polipeptidnu kičmu. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" pokazuje ukupni identitet sekvence sa referentnim polipeptidom koji je najmanje 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% ili 99%. Alternativno ili dodatno, u nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" ne deli barem jedan karakteristični element sekvence sa referentnim polipeptidom. U nekim realizacijama, referentni polipeptid ima jednu ili više bioloških aktivnosti. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" deli jednu ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida" nedostaje jedna ili više bioloških aktivnosti referentnog polipeptida. U nekim realizacijama, "varijanta polipeptida“ pokazuje smanjeni nivo jedne ili više bioloških aktivnosti u poređenju sa referentnim polipeptidom. U mnogim realizacijama, polipeptidom od interesa se smatra "varijanta" “ roditelja ili referentnog polipeptida ako polipeptid od interesa ima sekvencu amino-kiselina koja je identična onoj roditeljskoj (matičnoj) ali sa malim brojem izmena sekvenci na određenim pozicijama. Uobičajeno je manje od 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ostataka u varijanti supstituisano u poređenju sa matičnim. U nekim realizacijama, "varijanta" ima 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 supstituisanih ostataka u poređenju sa matičnim. Često, "varijanta"ima veoma mali broj (npr. manji od 5, 4, 3, 2 ili 1) supstituisanih funkcionalnih ostataka (tj. ostataka koji učestvuju u određenoj biološkoj aktivnosti ). Dalje, "varijanta" obično nema više od 5, 4, 3, 2 ili 1 dodataka ili delecija i često nema dodataka ili delecija, u poređenju sa matičnim. Štaviše, bilo koji dodaci ili delecije su obično manji od oko 25, oko 20, oko 19, oko 18, oko 17, oko 16, oko 15, oko 14, oko 13, oko 10, oko 9, oko 8, oko 7, oko 6, i obično su manje od oko 5, oko 4, oko 3 ili oko 2 ostatka. U nekim realizacijama, roditeljski ili referentni polipeptid je onaj koji se nalazi u prirodi. Kao što će razumeti stručnjaci u tehnici, u prirodi se može naći veći broj varijanti određenog polipeptida od interesa, posebno kada je polipeptid od interesa polipeptid sa infektivnim agensom.
[0098] Vektor : kao što se ovde koristi, uključuje molekul nukleinske kiseline koji je sposoban da transportuje drugu nukleinsku kiselinu sa kojom je povezan. U nekim realizacijama, vektori su sposobni za ekstrahromozomsku replikaciju i/ili ekspresiju nukleinskih kiselina na koje su povezani u ćeliji domaćinu, kao što je eukariotska i/ili prokariotska ćelija. Vektori koji mogu usmeravati ekspresiju operativno povezanih gena ovde se zovu „ekspresioni vektori".
[0099] Divlji tip: kao što se ovde koristi, ima značenje razumljivo u struci koje uključuje entitet koji ima strukturu i/ili aktivnost kakvu nalazimo u prirodi u "normalnoj" (nasuprot mutantnom, bolesnom, izmenjenom, itd.) stanju ili kontekstu. Stručnjaci u tehnici će ceniti da geni i polipeptidi divljeg tipa često postoje u više različitih oblika (npr. aleli).
DETALJNI OPIS ODREĐENIH REALIZACIJA
[0100] Predmetni pronalazak obezbeđuje, između ostalog, pobolјšane i/ili konstruisane glodare koji imaju humanizovani genetski materijal koji kodira polipeptid gena za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3) za određivanje terapeutske efikasnosti Lag-3 modulatora (npr. anti-Lag-3 antitela) za lečenje raka i testove u odgovorima T ćelija i transdukciju signala. Smatra se da takvi ne-glodari pružaju poboljšanje u određivanju terapijske efikasnosti Lag-3 modulatora i njihovog potencijala za blokadu Lag-3. Zato je predmetni pronalazak posebno koristan za razvoj anti-Lag-3 terapija za lečenje različitih oblika raka i autoimunih bolesti, poremećaja ili stanja. Naročito, predmetni pronalazak obuhvata humanizaciju glodarskog (mišjeg) Lag-3 gena što rezultira eksprimovanjem humanizovanog Lag-3 polipeptida na površini ćelija glodara. Takvi humanizovani Lag-3 polipeptidi imaju sposobnost da obezbede izvor humanih Lag-3+ ćelija za određivanje efikasnosti anti-Lag-3 terapija za unapređenje anti-tumorskih imunih odgovora. U nekim realizacijama, glodari ovde opisani pokazuju uvećane imune odgovore blokadom Lag-3 signalizacije kroz humanizovani Lag-3 polipeptid eksprimovan na površini ćelija glodara. U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptidi sadrže sekvencu koja odgovara vanćelijskom delu humanog LAG-3 polipeptida, na primer, vanćelijski deo koji sadrži prva dva Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptidi sadrže sekvencu koja odgovara amino-kiselinama 29-260 (ili 23-260, ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptidi sadrže sekvencu koja odgovara transmembranskom domenu i/ili unutarćelijskom repu Lag-3 polipeptida glodara. U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži vanćelijski deo koji sadrži prva dva Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida, pri čemu se preostali delovi humanizovanog Lag-3 polipeptida sastoje od amino-kiselina nehumanog (npr. glodarskog kao što je mišji) Lag-3 polipeptida. U nekim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid uklјučuje signalni peptid koji je u suštini identičan signalnom peptidu endogenog polipeptida Lag-3 glodara, vanćelijski domen koji uklјučuje humani deo i deo glodara gde humani deo sadrži prva dva Ig-slična
1
domena humanog LAG-3 polipeptida i deo glodara obuhvata poslednja dva Ig-slična domena endogenog nehumanog Lag-3 polipeptida; i transmembranske i unutarćelijske domene endogenog nehumanog Lag-3 polipeptida. U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani sadrže humanizovani Lag-3 gen koji sadrži genetski materijal životinje glodara i heterologne vrste (npr. čoveka). U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani sadrže humanizovani Lag-3 gen, pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži eksone 2 do 4 humanog LAG-3 gena. U nekim određenim realizacijama, glodari kako su ovde opisani sadrže humanizovani Lag-3 gen, pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži ∼1.741 bp humanog [g10]LAG-3 [/g10]gena koji odgovara eksonima 2 do 4 i delu introna 4 (npr. ∼68 bp) humanog LAG-3 gena. U nekim realizacijama, glodar kako je ovde opisan sadrži humanizovani Lag-3 gen, pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži ekson 1 endogenog Lag-3 gena glodara, eksone 2 do 4 humanog LAG-3 gena i eksone 5-8 endogenog Lag-3 gena glodara, pri čemu se humanizovani Lag-3 gen nalazi na endogenom Lag-3 lokusu i operativno povezan sa endogenim Lag-3 promotorom na lokusu.
[0101] Različiti aspekti pronalaska detaljno su opisani u sledećim odeljcima. Upotreba odeljaka nije namenjena da ograniči pronalazak. Svaki odeljak može da se odnosi na bilo koji aspekt ovog pronalaska. U ovoj prijavi, upotreba „ili“ znači „i/ili“ osim ako nije drugačije navedeno.
Gen za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3)
[0102] Gen za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3, takođe poznat i kao CD223) je transmembranski receptor koji se eksprimuje na aktiviranim CD4 i CD8 T ćelijama, γδ T ćelijama, prirodnim T ćelijama ubicama, B ćelijama, prirodnim ćelijama ubicama, plazmocitoidnim dendritičnim ćelijama i regulatornim T ćelije. Lag-3 je član superfamilije imunoglobulina, po strukturi je sličan CD4 i sadrži četiri vanćelijska domena slična Ig (takođe poznati kao domeni D1, D2, D3 i D4, videti zvezdice u poravnanju sekvenci na slici 2). Lag-3 funkcioniše za ublažavanje imunološkog odgovora i zabeleženo je da veže glavne molekule kompleksa histokompatibilnosti (MHC) klase II (za koje se veruje da se vezuju interakcijama sa D1 i D2 domenima Lag-3) i dovodi do isporuke negativnih signala na Lag- 3-ekspresione ćelije i reguliše smanjivanjem antigen-zavisne odgovore CD4 i CD8 T ćelija. Trenutno je MHC II jedini poznati vezni partner za Lag-3. Takođe je prijavlјeno da lag-3 negativno reguliše sposobnost T ćelija da se razmnožavaju, proizvode citokine i liziraju cilјne ćelije, što se naziva iscrplјivanjem T ćelija. Dalјe, prijavlјeno je da Lag-3 igra ulogu u pobolјšanju regulatorne funkcije T (Treg) ćelija (Pardoll, D.M., 2012, Nat. Rev. Cancer 12:252-64).
[0103] Kostimulativni i koinhibitorni molekuli T ćelija (zajednički nazvani kosignalni molekuli) igraju presudnu ulogu u regulisanju aktivacije T ćelija, diferencijacije podskupina, efektorske funkcije i preživlјavanja (Chen, L. i D.B. Flies, 2013, Nat. Rev. Immunol. 13:227-42). Nakon prepoznavanja srodnih peptid-MHC kompleksa na ćelijama koje prezentuju antigen od strane receptora T ćelije, kosignalni receptori se lokalizuju sa receptorima T ćelija u imunološkoj sinapsi, gde sinergišu sa TCR signalizacijom da promovišu ili inhibiraju aktiviranje i funkciju T ćelija (Flies, D.B. et al., 2011, Yale J. Biol. Med. 84:409-21). Krajnji imunološki odgovor reguliše se ravnotežom između kostimulacionih i koinhibitornih signala, koji su se nazivali „imuni kontrolne tačke“ (Pardoll, D.M., supra). Takve „imune kontrolne tačke“ mogu se opisati kao molekuli koji deluju u imunološkom sistemu da bi pojačali ili smanjili signale, posebno signale T ćelija. Lag-3 funkcioniše kao jedna od mnogih „imunih kontrolnih tačaka“ u posredovanju periferne tolerancije na T ćelije.
[0104] Potrebno je temeljnije i detaljnije razumevanje funkcija posredovanih Lag-3 i putanje Lag-3 u tumorskom, auto- i infektivnom imunitetu kako bi se razvile praktične ciljane terapije za buduće lečenje pacijenata.
Lag-3 sekvence
[0105] Primeri sekvenci glodara (npr. pacova i miša), humanih i humanizovanih gena za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3) prikazani su na slici 8. Primer fragmenta sintetičke DNK za humanizaciju nehumanog Lag-3 gena je, takođe, prikazan na slici 8. Za sekvence mRNK, podebljana slova označavajukodirajuću sekvencu, a uzastopni eksoni, gde su naznačeni, razdvajaju se naizmeničnim podvučenim tekstom; za humanizovane mRNK sekvence, humane sekvence su sadržane u zagradama. Za sekvence amino-kiselina, transmembranske sekvence su označene podvučenim fontom; za humanizovane sekvence amino-kiselina, humane sekvence su označene podeblјanim slovima i u zagradama su.
DNK konstrukti
[0106] Uglavnom, polinukleotidni molekul koji sadrži a Lag-3 gen, u celini ili delimično, ubacuje se u vektor, poželјno DNK vektor, kako bi se replicirao polinukleotidni molekul u pogodnoj ćeliji domaćinu.
[0107] U zavisnosti od veličine, Lag-3 gen ili Lag-3 kodirajuća sekvenca može se klonirati direktno iz cDNK izvora dostupnih od komercijalnih dobavlјača ili dizajnirati u silikonu na osnovu objavlјenih sekvenci dostupnih iz GenBank-a. Alternativno, biblioteke bakterijskog veštačkog hromozoma (BAC) mogu da obezbede heterologne Lag-3 sekvence iz gena od interesa (npr. heterologni Lag-3 gen). BAC biblioteke sadrže prosečnu veličinu insercije od 100-150 kb i sposobne su da čuvaju umetke veličine do 300 kb (Shizuya, H. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A.89:8794-7; Swiatek, P.J. i T. Gridley, 1993, Genes Dev.7:2071-84; Kim, U.J. et al., 1996, Genomics 34:213-8). Na primer, humane i mišje genomske BAC biblioteke su napravlјene i komercijalno su dostupne (npr. Invitrogen, Carlsbad Calif.). Genomske BAC biblioteke, takođe, mogu da posluže kao izvor heterologne Lag-3 sekvence kao i regiona za kontrolu transkripcije.
1
[0108] Alternativno, heterologne Lag-3 sekvence mogu biti izolovane, klonirane i/ili prenete iz veštačkih hromozoma kvasca (YAC). Čitav heterologni gen ili lokus može se klonirati i sadržati u jednom ili nekoliko YAC-a. Ako se koristi više YAC-ova i sadrže regione homologije koji se preklapaju, mogu se rekombinovati unutar sojeva domaćina kvasca da bi se dobio jedinstveni konstrukt koji predstavlјa ceo lokus. YAC krakovi mogu se dodatno modifikovati selekcionim kertridžima sisara naknadnom ugradnjom kako bi se pomoglo u uvođenju konstrukata u embrionalne matične ćelije ili embrione postupcima poznatim u tehnici i/ili ovde opisanim.
[0109] Primeri mRNK i sekvenci amino-kiselina za upotrebu u konstruisanju humanizovanog Lag-3 gena u životinjama koje nisu lјudi ovde su dati, na primer, na slici 8. Druge heterologne Lag-3 sekvence se, takođe, mogu naći u bazi podataka GenBank ili u drugim bazama podataka o sekvencama poznatim u tehnici.
[0110] DNK konstrukti koji sadrže Lag-3 sekvence kako su ovde opisane, u nekim realizacijama, sadrže humane LAG-3 genomske sekvence koje kodiraju vanćelijski deo humanog LAG-3 polipeptida, npr. najmanje amino-kiseline 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida, operativno povezane sa nehumanim regulatornim sekvencama (npr. promotorom glodara) za ekspresiju u transgenom glodaru. U nekim realizacijama, DNK konstrukti koji sadrže Lag-3 sekvence kako su ovde opisane uklјučuju humane LAG-3 genomske sekvence koje kodiraju najmanje amino-kiseline 29-260 humanog LAG-3 polipeptida operativno povezane sa nehumanim Lag-3 promotorom i jednim ili više nehumanih Lag-3 eksona (npr. endogenim Lag-3 eksonima). Humane i/ili nehumane Lag-3 sekvence uklјučene u ovde opisane DNK konstrukte mogu biti identične ili u suštini identične sa humanim i/ili nehumanim Lag-3 sekvencama koje se nalaze u prirodi (npr. genomske), koje su veštačke (npr. sintetičke) ili mogu biti napravljene čovekovom rukom. U nekim realizacijama, Lag-3 sekvence su sintetičkog porekla i uklјučuju sekvencu ili sekvence koje se nalaze u humanom LAG-3 genu koji se nalazi u prirodi. Na primer, DNK konstrukt može da sadrži sintetičku DNK koja odgovara eksonima 2 do 4 humanog LAG-3 gena, i koji kodira vanćelijski deo humanog LAG-3 polipeptida, npr. najmanje amino-kiseline 29-260 humanog LAG-3 polipeptida, operativno povezanog sa nehumanim Lag-3 regulatornim (npr. promotorskim) i kodirajućim sekvencama (npr. jedan ili više nehumanih eksona) tako da se dobijenim DNK konstruktom kodira Lag-3 polipeptid koji ima humane i nehumane delove. U nekim realizacijama, Lag-3 sekvence sadrže sekvencu koja je prirodno povezana sa heterolognim Lag-3 genom (tj. humanim LAG-3 genom). U nekim realizacijama, Lag-3 sekvence sadrže sekvence koje nisu prirodno povezane sa heterolognim Lag-3 genom (tj. humanim LAG-3 genom). U nekim realizacijama, Lag- 3 sekvence sadrže sekvencu koja je optimizovana za eksprimovanje u životinji koja nije čovek. U nekim realizacijama, heterologne Lag-3 sekvence operativno povezane sa nehumanim Lag-3 sekvencama kodiraju deo Lag-3 polipeptida koji se u prirodi pojavlјuje u odvojenim polipeptidima. Ako su dodatne sekvence korisne u optimizaciji ekspresije heterolognih Lag-3 sekvenci, takve sekvence se mogu klonirati koristeći postojeće sekvence kao probe. Dodatne sekvence neophodne za maksimalizovanje ekspresije heterolognog Lag-3 gena ili heterologne Lag-3-kodirajuće sekvence mogu se dobiti iz genomskih sekvenci ili drugih izvora u zavisnosti od želјenog ishoda.
[0111] DNK konstrukti se mogu pripremiti korišćenjem postupaka poznatih u tehnici. Na primer, DNK konstrukt se može pripremiti kao deo većeg plazmida. Takva priprema omogućava efikasno kloniranje i odabir ispravnih konstrukata kao što je poznato u tehnici. DNK fragmenti koji sadrže jednu ili više nukleotidnih kodirajućih sekvenci kako je ovde opisano mogu se nalaziti između pogodnih restrikcionih mesta na plazmidu, tako da se mogu lako izolovati iz preostalih sekvenci plazmida za ugradnju u želјenu životinju.
[0112] U tehnici su poznati različiti postupci koji se koriste za pripremu plazmida i organizama domaćina koji ih sadrže. Za ostale pogodne ekspresione sisteme i za prokariotske i za eukariotske ćelije, kao i za opšte rekombinantne postupke, videti Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989.
Proizvodnja glodara koji imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3
[0113] Obezbeđeni su glodari koji eksprimuju humanizovane Lag-3 polipeptide na površini ćelija glodara koji su rezultat genetske modifikacije endogenog lokusa (npr., Lag-3 lokusa) glodara koji kodira Lag-3 polipeptid. Glodari su pacovi ili miševi, posebno miševi.
[0114] Humanizovani Lag-3 gen, u nekim realizacijama, sadrži genetski materijal od heterologne vrste (npr. ljudi), pri čemu humanizovani Lag-3 gen kodira Lag-3 polipeptid koji sadrži kodirani deo genetskog materijala heterologne vrste. U nekim realizacijama, ovde opisani humanizovani Lag-3 gen, kao što je ovde opisan, sadrži genomsku DNK heterologne vrste koja kodira vanćelijski deo Lag-3 polipeptida koji se eksprimuje na plazma membrani ćelije. Takođe su obezbeđeni glodari, embrioni, ćelije i ciljajući konstrukti za stvaranje glodara, embriona glodara i ćelija koje sadrže pomenuti humanizovani Lag-3 gen.
[0115] U nekim realizacijama, endogeni Lag-3 gen je izbrisan. U nekim realizacijama, endogeni Lag-3 gen je izmenjen, pri čemu je deo endogenog Lag-3 gena zamenjen heterolognom sekvencom (npr., humanom LAG-3 sekvencom, u celini ili delimično). U nekim realizacijama, ceo ili u osnovi ceo endogeni Lag-3 gen je zamenjen heterolognim genom (npr., humanim LAG-3 genom). U nekim realizacijama, deo heterolognog Lag-3 gena je insertovan u endogeni Lag-3 gen koji nije humani na endogenom Lag-3 lokusu. Heterologni gen je humani gen. U nekim realizacijama, modifikacija ili humanizacija se vrši na jednoj od dve kopije endogenog Lag-3 gena, što stvara glodara koji je heterozigotan u odnosu na humanizovani Lag-3 gen. U drugim realizacijama obezbeđen je glodar koji je homozigotan za humanizovani Lag-3 gen.
[0116] U različitim aspektima, glodar sadrži humani LAG-3 gen, u celini ili delimično, na endogenom nehumanom Lag-3 lokusu. Prema tome, takvi glodari mogu se opisati kao da imaju heterologni Lag-3 gen. Zamenjeni, insertovani, modifikovani ili izmenjeni Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu ili polipeptid eksprimovan iz takvog gena može se otkriti korišćenjem različitih metoda, uključujući, na primer, PCR, Western blot, Southern blot, test
1
polimorfizma dužine restrikcionog fragmenta (RFLP) ili test na dobitak ili gubitak alela. U nekim realizacijama, glodar je heterozigotan u odnosu na humanizovani Lag-3 gen.
[0117] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan uklјučuje eksone 2 do 4 humanog LAG-3 gena.
[0118] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen, kao što je ovde opisan, uključuje Lag-3 gen koji ima drugi, treći i četvrti i ekson koji svaki ima sekvencu od najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu drugom, trećem i četvrtom eksonu koji se pojavljuje u SEQ ID NO:5.
[0119] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan uklјučuje a Lag-3 gen koji ima drugi, treći i četvrti ekson, svaki od kojih ima sekvencu koja je u osnovi identičnu ili identičnu drugom, trećem i četvrtom eksonu koji se pojavlјuju u SEQ ID NO:5.
[0120] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen , kako je ovde opisan, sadrži sekvencu najmanje 50% (npr. 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sa SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10 ili SEQ ID NO:11.
[0121] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži sekvencu koja je u osnovi identična ili identična sa SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10 ili SEQ ID NO:11.
[0122] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan jeste ili sadrži SEQ ID NO:10.
[0123] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan jeste ili sadrži SEQ ID NO:11.
[0124] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži eksone 1, 5, 6, 7 i 8 nehumanog Lag-3 gena, na primer, endogeni Lag-3 gen ne-humane životinje.
[0125] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži prvi, peti, šesti, sedmi i osmi ekson, od kojih svaki ima sekvencu najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu prvom, petom, šestom, sedmom i osmom eksonu koji se pojavlјuju u SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3.
[0126] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži prvi, peti, šesti, sedmi i osmi ekson, od kojih svaki ima sekvencu koja je u osnovi identična ili identična prvom, petom, šestom, sedmom i osmom eksonu koji se pojavlјuju u SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3.
[0127] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži 5’ neprevedeni region i 3’ neprevedeni region nehumanog Lag-3 gena, na primer, endogeni Lag-3 gen nehumane životinje.
[0128] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži 5’ neprevedeni region i 3’ neprevedeni region, od kojih svaki ima sekvencu najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu 5’ neprevedenom regionu i 3’ neprevedenom regionu koji se pojavlјuju u SEQ ID NO:1 ili SEQ ID NO:3.
[0129] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži 5’ neprevedeni region i 3’ neprevedeni region, od kojih svaki ima sekvencu koja je u osnovi identična ili identična 5’ neprevedenom regionu i 3' neprevedenom regionu koji se pojavlјuju u SEQ ID NO: 1 ili SEQ ID NO:3.
[0130] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. sekvencu cDNK) koja je najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci koji se pojavlјuje u SEQ ID NO:7.
[0131] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan sadrži nukleotidnu kodirajuću sekvencu (npr. sekvencu cDNK) koja je u osnovi identična ili identična nukleotidnoj kodirajućoj sekvenci koja se pojavlјuje u SEQ ID NO:7.
[0132] U različitim aspektima, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan kodira Lag-3 polipeptid koji ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sekvenci amino-kiselina koja se pojavljuje u SEQ ID NO:8.
[0133] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan kodira Lag-3 polipeptid koji ima sekvencu amino-kiselina koja je u osnovi identična ili identična sekvenci amino-kiselina koja se pojavlјuje u SEQ ID NO:8.
[0134] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipepitd proizveden od strane ne-humane životinje kako je ovde opisana ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50% (npr.
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična amino-kiselinskim ostacima 29-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
[0135] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara, kako je ovde opisano, ima vanćelijski deo koji je u osnovi identičan vanćelijskom delu (npr. vanćelijski deo koji sadrži prva dva Ig-slična domena) humanog LAG-3 polipeptida. U nekim realizacijama, vanćelijski deo humanog LAG-3 polipeptida predstavlјen je amino ostacima 21-260, 23-260 ili 29-260 humanog LAG-3 polipeptida, kao što je humani LAG-3 polipeptid kako je izložen u SEQ ID NO: 6.
[0136] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od životinje koja nije glodar, kao što je ovde opisano, ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je u osnovi identična ili identična ostacima amino-kiselina 29-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
[0137] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od strane ne-humane životinje kako je ovde opisana ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50% (npr.
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična amino-kiselinskim ostacima 23-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
1
[0138] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara, kao što je ovde opisano, ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je u osnovi identična ili identična ostacima amino-kiselina 23-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
[0139] U različitim aspektima, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od strane ne-humane životinje kako je ovde opisana ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je najmanje 50% (npr.
50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identična amino-kiselinskim ostacima 21-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
[0140] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara kako je ovde opisano ima vanćelijski deo, a vanćelijski deo sadrži sekvencu amino-kiselina koja je u osnovi identična ili identična ostacima amino-kiselina 21-260 iz SEQ ID NO:6 ili SEQ ID NO:8.
[0141] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara, kako je ovde opisano, ima transmembranski deo i citoplazmatski deo endogenog Lag-3 polipeptida, na primer, transmembranski i citoplazmatski domeni endogenog Lag-3 polipeptida glodara. U nekim realizacijama, sekvence transmembranskog i citoplazmatskog domena endogenog polipeptida Lag-3 su one prikazane na slici 8. U nekim realizacijama, humanizovani polipeptid Lag-3 proizveden od glodara, kao što je ovde opisano, takođe ima vanćelijski deo koji sadrži poslednja dva Ig-slična domena nehumanog Lag-3 polipeptida.
[0142] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od strane glodara kako je ovde opisan ima sekvencu amino-kiseline najmanje 50% (npr.50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više) identičnu sekvenci amino-kiseline iz SEQ ID NO:8.
[0143] U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid proizveden od glodara, kako je ovde opisano, ima sekvencu amino-kiselina koja je u osnovi identična ili identična sekvenci amino-kiselina iz SEQ ID NO:8.
[0144] Kompozicije i postupci za pravljenje glodara koji eksprimuju humanizovani Lag-3 polipeptid, uključujući specifične polimorfne oblike, alelne varijante (npr. pojedinačne razlike u amino-kiselinama) ili alternativno splajsovane izoforme, su obezbeđeni uključujući kompozicije i postupke za pravljenje glodara koji eksprimuju takve polipeptide iz humanog promotora i humane regulatorne sekvence. U nekim realizacijama, takođe su obezbeđene kompozicije i postupci za pravljenje glodara koji eksprimuju takve proteine iz ne-humanog promotora i ne-humane regulatorne sekvence. U nekim realizacijama, takođe su obezbeđene kompozicije i postupci za pravljenje glodara koji eksprimuju takve proteine iz endogenog promotora i endogene regulatorne sekvence. U nekim određenim realizacijama, endogeni promotori i endogene regulatorne sekvence su endogeni promotori glodara i endogene regulatorne sekvence glodara. Postupci uključuju ubacivanje genetskog materijala koji kodira humani Lag-3 polipeptid u celini ili delimično na preciznu lokaciju u genom glodara a koji odgovara endogenom Lag-3 genu, stvarajući na taj način humanizovani Lag-3 gen koji eksprimuje Lag-3 protein koji je humani u celini ili delimično. U nekim realizacijama, postupci uključuju ubacivanje genomske DNK koja odgovara eksonima 2, 3 i 4 humanog LAG-3 gena u endogeni Lag-3 gena glodara stvarajući tako humanizovani gen koji kodira Lag-3 polipeptid koji sadrži humani deo koji sadrži amino-kiseline koje su kodirane insertovanim eksonima.
[0145] Po potrebi, kodirajuća oblast genetskog materijala ili polinukleotidne sekvence koja kodira humani (ili humanizovani) Lag-3 polipeptid u celini ili delimično može biti modifikovana tako da uključi kodone koji su optimizovani za ekspresiju iz ćelija ne-humane životinje (npr. vidi američki patent br.5,670,356 i 5,874,304). Kodon optimizovane sekvence su sintetičke sekvence i poželjno kodiraju identični polipeptid (ili biološki aktivni fragment polipeptida pune dužine koji ima u osnovi istu aktivnost kao i polpeptid pune dužine) kodiran nekodonski optimizovanim roditeljskim polinukleotidom. U nekim realizacijama, kodirajuća oblast genetskog materijala koji kodira humani (ili humanizovani) Lag-3 polipeptid, u celini ili delimično, može da sadrži izmenjenu sekvencu za optimizaciju upotrebe kodona za određenu vrstu ćelije (npr. ćelije glodara). Na primer, kodoni genomske DNK koji odgovaraju eksonima 2, 3 i 4 humanog LAG-3 gena koji će biti insertovan u endogeni Lag-3 gen glodara mogu biti optimizovani za eksprimovanje u ćeliji glodara. Takva sekvenca se može opisati kao kodon optimizovana sekvenca.
[0146] Postupci za stvaranje transgenih glodara, uklјučujući izbacivanja i ubacivanja, dobro su poznati u tehnici (videti, npr. Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc. (2000)). Na primer, generisanje transgenih glodara može opciono da uklјučuje poremećaj genetičkih lokusa jednog ili više endogenih gena glodara (ili segmenata gena) i uvođenje jednog ili više heterolognih gena (ili Lag-3 kodirajućih sekvenci) u genom glodara, u nekim realizacijama, na istoj lokaciji kao i endogeni gen glodara (ili segmenti gena).
[0147] U nekim realizacijama, heterologni (ili humanizovani) Lag-3 geni ili heterologne sekvence koje kodiraju Lag-3, kao što je ovde opisano, uvode se u endogeni Lag-3 gen u genomu glodara; u nekim određenim realizacijama, endogeni Lag-3 genski lokus je izmenjen, modifikovan ili napravlјen tako da sadrži humane Lag-3 sekvence (ili fragmente gena) operativno povezane sa jednom ili više nehumanih Lag-3 sekvenci (ili fragmenata gena).
[0148] Pristup humanizovanog Lag-3 gena koristi relativno minimalnu modifikaciju endogenih proteinskih interakcija i signala i rezultira transdukcijom signala posredovanog prirodnim Lag-3 kod glodara, u različitim realizacijama, jer su genomske sekvence Lag-3 sekvenci modifikovane u jednom fragmentu i stoga zadržavaju normalnu funkcionalnost uključivanjem potrebnih regulatornih sekvenci. Stoga, u takvim realizacijama, modifikacija Lag-3 gena ne utiče na druge okolne gene ili druge endogene gene koji stupaju u interakciju sa Lag-3 (npr. MHC klasa II molekuli). Dalje, u različitim realizacijama, modifikacija ne utiče na sastavljanje funkcionalnog Lag-3 transmembranskog polipeptida na ćelijskoj membrani i održava normalne efektorske funkcije vezivanjem i naknadnom transdukcijom signala kroz citoplazmatski deo polipeptida, na koji modifikacija ne utiče.
[0149] Shematska ilustracija (ne u skali) genomske organizacije endogenog mišjeg Lag-3 gena i humanog LAG-3 gena data je na slici 1. Primer postupka za humanizaciju endogenog mišjeg Lag-3 gena korišćenjem genomskog fragmenta koji sadrži eksone 2, 3 i 4 i deo introna 4 (npr. oko 68 bp) humanog LAG-3 gena dat je na slici 3. Kao
1
što je prikazano, 1,741 bp fragment genomske DNK koji odgovara eksonima 2, 3 i 4 i delu introna 4 humanog LAG-3 gena ubačen je na mesto 1,750 bp sekvence endogenog lokusa mišjeg Lag-3 gena pomoću ciljajućeg konstrukta. Fragment humane DNK od 1,741 bp može biti kloniran direktno iz humane DNK ili sintetizovan iz izvorne sekvence (npr. Genbank pristupni br. NM_002286.5, SEQ ID NO:9). Ova genomska DNK uklјučuje deo gena koji kodira najmanje ostatke amino-kiselina 29-260 (ili 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida odgovornog za vezivanje liganda.
[0150] Glodar (npr. miš) koja ima humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu može se napraviti bilo kojim postupkom poznatim u tehnici. Na primer, može se napraviti ciljajući vektor koji uvodi humani Lag-3 gen u celini ili delimično sa selektivnim marker genima. Slika 3 ilustruje ciljajući vektor koji sadrži endogeni Lag-3 lokus mišjeg genoma koji sadrži inserciju fragmenta humane DNK od 1,741 bp koji uključuje eksone 2-4 i prvih 68 bp eksona 4 humanog LAG-3 gena. Kao što je prikazano, ciljajući konstrukt sadrži 5’ krak homologije koji sadrži sekvencu ushodno od eksona 2 (tj. eksona 1, itd.) endogenog mišjeg Lag-3 gena (∼46 Kb), praćen fragmentom sintetičke DNK od 1.741 bp, kertridžom za odabir leka (npr. gen za rezistenciju na neomicin, obostrano okružen loxP sekvencama; ∼5 Kb) i 3’ krak homologije koji sadrži preostalu sekvencu endogenih mišjih eksona 5-8 endogenog mišjeg Lag-3 gena (∼53 Kb). Ciljajući konstrukt sadrži samo-brišući kertridž za izbor leka (npr. gen za otpornost na neomicin sa obe strane okružen loxP sekvencama; vidi američki patent br.8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Posle elektroporacije u embrionalnim matičnim ćelijama, nastaje modifikovani endogeni Lag-3 gen koji zamenjuje 1,741 bp humanog LAG-3 gena (tj. eksone 2-4 i prvih 68 bp introna 4) na mestu 1,750 bp endogenog divljeg tipa Lag-3 gena koji je sadržan u ciljajućem vektoru. Humanizovani Lag-3 gen se dobija i rezultuje u ćeliji ili ne-humanoj životinji a koja eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid koji sadrži amino-kiseline kodirane fragmentom sintetičke DNK od 1,741 bp (tj. eksonom 2-4 i prvih 68 bp introna 4 humanog LAG-3 gena). Kertridž za izbor lekova uklanja se na način zavisan od razvoja, to jest, tj. potomstvo dobijeno od miševa čije će gonocitne ćelijske linije koje sadrže humanizovani Lag-3 gen opisan gore, izbaciti selektirajući marker iz diferenciranih ćelija tokom razvoja (videti dno slike 3).
[0151] U nekim realizacijama, glodar koji ima humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan može se okarakterisati kao transgeni za humanizovani Lag-3 gen ili transgeni Lag-3 glodar. Takvi se opisi ovde koriste naizmenično i odnose se na sve glodare koji se ne pojavlјuju u prirodi u kojima jedna ili više ćelija glodara sadrže heterolognu Lag-3 sekvencu nukleinske kiseline i/ili sekvence koje kodira juLag-3, u celini ili delimično, kako je ovde opisano. U nekim realizacijama, heterologna Lag-3 sekvenca nukleinske kiseline i/ili sekvenca koja kodira Lag-3, u celini ili delimično, uvodi se u ćeliju, direktno ili indirektno unošenjem u ćeliju prekursora, namernom genetskom manipulacijom, na primer mikroinjekcijom ili infekcijom rekombinantnim virusom. U takvim realizacijama, genetska manipulacija ne uklјučuje klasične tehnike uzgoja, već je usmerena na uvođenje rekombinantnih molekula DNK koji sadrže heterolognu Lag-3 sekvencu nukleinske kiseline i/ili sekvencu koja kodira Lag-3, u celini ili delimično, kako je ovde opisano. Takav molekul može biti integrisan u hromozom ili može biti ekstrahromosomsko replicirajuća DNK. Kao što je ovde opisano, transgeni glodari uklјučuju glodare koji su heterozigotni ili homozigotni za heterolognu Lag-3 sekvencu nukleinske kiseline i/ili sekvencu koja kodira Lag-3, u celini ili delimično, i/ili glodari koji imaju jednu ili više kopija heterologne Lag-3 sekvence nukleinske kiseline i/ili sekvence koja kodira Lag-3, u celini ili delimično, kako je ovde opisano.
[0152] Transgeni glodar osnova može se identifikovati na osnovu prisustva humanizovanog Lag-3 gena u njegovom genomu i/ili eksprimovanja Lag-3 polipeptida koji sadrže amino-kiseline kodirane umetnutim genetskim materijalom u tkivima ili ćelijama glodara. Transgeni glodar osnova tada se može koristiti za uzgajanje dodatnih glodara koji nose humanizovani Lag-3 gen stvarajući tako niz glodara od kojih svaki nosi jednu ili više kopija humanizovanog Lag-3 gena. Štaviše, transgeni glodari koji nose humanizovani Lag-3 gen mogu se dalјe uzgajati sa drugim transgenim glodarima koji nose druge transgene (npr. gene humanog imunoglobulina) po želјi.
[0153] Transgeni glodari mogu se takođe proizvesti da sadrže izabrane sisteme koji omogućavaju regulisanu ili usmerenu ekspresiju humanizovanog Lag-3 gena (ili humanizovanog Lag-3 transgena). Primerni sistemi uklјučuju Cre/loxP rekombinazni sistem bakteriofaga PI (vidi, npr. Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
89:6232-6236) i FLP / Frt recombinase system S. cerevisiae (O’Gorman, S. et al, 1991, Science 251:1351-1355). Takve životinje se mogu dobiti konstrukcijom „dvostrukih“ transgenih životinja, na primer, parenjem dve transgene životinje, jedna koja sadrži izabranu modifikaciju (npr. humanizovani Lag-3 gen ili transgen), a druga koja sadrži transgen koji kodira rekombinazu (npr. Cre rekombinazu).
[0154] Glodari kako su ovde opisani mogu se pripremiti kako je gore opisano, ili koristeći postupke poznate u struci, da sadrže dodatne humane ili humanizovane gene, često u zavisnosti od nameravane upotrebe glodara. Genetski materijal takvih dodatnih humanih ili humanizovanih gena može se uvesti dalјom izmenom genoma ćelija (npr. embrionalnih matičnih ćelija) koje imaju genetske modifikacije kako je gore opisano ili tehnikama oplemenjivanja poznatim u tehnici sa drugim genetski modifikovanim sojevima po želji. U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani su pripremlјeni da dalјe sadrže jedan ili više humanih ili humanizovanih gena izabranih iz proteina programirane ćelijske smrti 1 (PD-1), liganda programirane smrti 1 (PD-L1) i citotoksičnog proteina 4 povezanog sa T-limfocitima (CTLA-4). U nekim realizacijama, glodari kao što su ovde opisani mogu se pripremiti uvođenjem ciljajućeg vektora, kako je ovde opisano, u ćeliju iz modifikovanog soja. U nekim realizacijama, glodari, kao što su ovde opisani, pripremlјeni su da dalјe sadrže humani ili humanizovani protein programirane ćelijske smrti1 (Pdcd1) gena. U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani sadrže humanizovane Lag-3 gen, kako je ovde opisano, i genetski materijal od heterolognih vrsta (npr. lјudi), pri čemu genetski materijal kodira, u celini ili delimično, jedan ili više heteroloških proteina odabranih iz proteina programirane ćelijske smrti 1 (PD-1), liganda programirane smrti 1 (PD-L1) i citotoksičnog proteina 4 povezanog sa T-limfocitima (CTLA-4). U nekim određenim realizacijama, glodari kao što su ovde opisani sadrže humanizovani (Lag-3 )gen kako je ovde opisan i genetski materijal heterolognih vrsta (npr. ljudi), pri čemu genetski materijal delimično kodira, u celini ili delimično,
2
heterologni (npr. humani) PD-1 polipeptid. U nekim određenim realizacijama, glodari kako su ovde opisani dalјe sadrže Pdcd1 gen koji sadrži endogeni deo i humani deo (npr. ekson 2 i ekson 3, u celini ili delimično, humanog PDCD1 gena), pri čemu humani deo kodira u osnovi ceo vanćelijski domen humanog polipeptida PD-1 (npr. amino-kiseline koji odgovaraju ostacima 27-169 ili 26-169 humanog polipeptida PD-1), a endogeni deo kodira unutarćelijski domen endogenog PD-1 polipeptida; u nekim realizacijama, humani deo i endogeni deo su operativno povezani sa endogenim Pdcd1 promotorom. U nekim određenim rešenjima, glodari kako su ovde opisani dalјe sadrže a Pdcd1 gen koji uklјučuje genetski materijal koji kodira u osnovi sav vanćelijski domen humanog polipeptida PD-1 (npr. genetski materijal koji kodira amino-kiseline koje odgovaraju ostacima 27-169 ili 26-169 humanog polipeptida PD-1; vidi, npr. SEQ ID NO: 23 iz PCT/US15/36649, podnete 19. juna 2015. i objavljene kao WO2015196051, i/ili SEQ ID NO:23 iz U.S. Patentne prijave br.14/744,592, podnete 19. juna 2015. I objavljene kao US 2015-0366174 A1). GenBank pristupni br. NM_005018.2 i NP_005009.2 i UniProt ID Q15116 pružaju reprezentativne izvorne sekvence humanog PDCD1 gena i humanog PD-1 polipeptida iz kojeg se može dobiti želјeni humani deo.
[0155] Na primer, kao što je ovde opisano, ne-humane životinje koje sadrže humanizovani Lag-3 gen kao što je ovde opisan mogu dalјe sadržati (npr. strategijama ukrštanja ili višestrukog cilјanja gena) jednu ili više modifikacija kao što je opisano u patentu PCT/US15/36649, prijavljenom 19. juna 2015 i objavljenom kao WO2015196051, i U.S. patentnoj prijavi br.14/744,592, prijavljenoj 19. juna 2015. i objavljenoj kao US 2015-0366174 A1. Glodar koji se sastoji od humanizovanog Lag-3 gena kako je ovde opisan može se ukrstiti sa glodarom koji sadrži humanizovani Pdcd1 gen (npr. ekson 2 i deo eksona 3 humanog PDCD1 gena koji je operativno povezan sa eksonima 1, delom eksona 3, 4 i 5 endogenog Pdcd1 gena glodara tako da humanizovani Pdcd1 gen kodira PD-1 polipeptid uklјučuje vanćelijski deo humanog PD-1 polipeptida (npr. odgovara ostacima amino-kiselina 27-169 ili 26-169) i unutarćelijski deo PD-1 polipeptidnog proteina glodara (vidi, npr. SEQ ID NO: 5 i 6 iz PCT/US15/36649, podnete 19. juna 2015. i objavlјene kao WO2015196051, i/ili SEQ ID NO: 5 i 6 iz U.S. Patentne prijave br.
14/744,592, podnete 19. juna 2015. i objavlјene kao US 2015-0366174 A1). Glodar koji sadrži humanizovani Lag-3 gen kako je ovde opisan može se ukrstiti sa glodarom koji sadrži humanizovani Pdcd1 gen, a humanizovani Pdcd1 gen uklјučuje genetski materijal koji kodira vanćelijski domen humanog PD-1 polipeptida (npr. genetski materijal koji kodira amino-kiseline koji odgovaraju ostacima 27-169 ili 26-169 humanog polipeptida PD-1; vidi, na primer, SEQ ID NO: 23 iz PCT/US15/36649, podnete 19. juna 2015. i objavlјene kao WO2015196051, i/ili SEQ ID NO: 23 iz U.S. Patentne prijave br. 14/744,592, podnete 19. juna 2015. i objavlјene kao US 2015-0366174 A1.
[0156] U nekim realizacijama, humanizovani Pdcd1 gen sadrži nehumani (npr. glodarski) Pdcd1 ekson 1, humani PDCD1 ekson 2, ekson 3 (koji sadrži deo eksona 3 humanog PDCD1 gena i deo eksona 3 nehumanog (npr. glodarskog) Pdcd1 gena), i eksoni 4-5 nehumanog (npr. glodarskog) Pdcd1 gena, i pri čemu u nekim realizacijama deo eksona 3 humanog PDCD1 gena je 5’ deo humanog eksona 3 koji kodira amino-kiseline kao deo vanćelijskog domena humanog PD-1 polipeptida, kao što su amino-kiseline sekvence PD-1 stabla, i deo eksona 3 nehumanog Pdcd1 gena je 3’ deo neumanog eksona 3 koji kodira amino-kiseline kao deo transmembranskog domena nehumanog PD-1 polipeptida. U specifičnim realizacijama, humanizovani Pdcd1 gen kodira humanizovani PD-1 polipeptid koji uklјučuje vanćelijski domen koji je u suštini identičan vanćelijskom domenu humanog PD-1 polipeptida, transmembranski domen koji je u suštini identičan transmembranskom domenu PD-1 polipeptida glodara i unutarćelijski domen PD-1 polipeptida glodara.
[0157] Iako su realizacije koji koriste humanizovani Lag-3 gen u mišu (tj. miš sa Lag-3 genom koji kodira Lag-3 polipeptid koji uključuje humani deo i deo miša) ovde su detaljno razmotreni, pacovi koji sadrži humanizovani Lag-3 gen su takođe obezbeđeni. U nekim realizacijama, takvi glodari sadrže humanizovani Lag-3 gen koji je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara. U nekim realizacijama, takvi glodari sadrže humanizovani Lag-3 gen koji je operativno povezan sa endogenim Lag-3 promotorom; u nekim realizacijama, endogenim Lag-3 promotorom glodara. U nekim realizacijama, takvi glodari eksprimuju humanizovani Lag-3 polipeptid iz endogenog lokusa, pri čemu humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži ostatke amino-kiselina 29-260 (npr. 29-260, 23-260 ili 21-260) humanog LAG-3 polipeptida. Takvi glodari su miševi ili pacovi. Za one ne-humane životinje za koje pogodne genetski modifikovane ES ćelije nisu lako dostupne, koriste se drugi postupci da se napravi glodar koji sadrži genetsku modifikaciju. Takvi postupci uključuju, na primer, modifikaciju ne-ES ćelijskog genoma (npr. fibroblast ili indukovanu pluripotentnu ćeliju) i korišćenje nuklearnog prenosa somatske ćelije (SCNT) za prenos genetski modifikovanog genoma u odgovarajuću ćeliju, npr. enukleani oocit, i gestaciju modifikovane ćelije (npr. modifikovanog oocita) u glodara, pod pogodnim uslovima da se formira embrion.
[0158] Postupci za modifikovanje genoma glodara uklјučuju, na primer, primenu nukleaze cinkovog prsta (ZFN), efektorske nukleaze nalik aktivatoru transkripcije (TALEN) ili Cas proteina (tj. sistema CRISPR / Cas) za modifikovanje genoma da bi se uključio humanizovani Lag-3 i/ili humanizovani Pdcd1 gen.
Postupci koji koriste glodare sa humanizovanim Lag-3 genima
[0159] Korišćenje humanizovanih miševa za biomedicinska istraživanja unapredilo je razumevanje različitih aspekata funkcije humanih ćelija, posebno humanih imunih ćelija. Zaista, upotreba različitih imunokompromitovanih sojeva pružila je dragocene in vivo sisteme za ispitivanje imunih ćelija čoveka. Međutim, nisu bez ograničenja. Na primer, upotreba ovih modela istakla je jasne razlike u biologiji sisara, posebno imunologiji sisara. Upotreba imunokompromitovanih miševa za procenu cilјne imunomodulacije nije idealna, jer poremećena imunološka funkcija primećena kod takvih miševa često komplikuje razumevanje prikazanih fenotipova. Ovo je posebno tačno u kontekstu imunološkog odgovora na tumore. Do nedavno, ispitivanje imunološkog odgovora na tumore (npr. odgovora T ćelija) kod miševa zbunjivala je, između ostalog, neusklađenost HLA zbog različitih izvora (tj. donora) ugrađenih humanih ćelija (Shultz, L.D. et al., 2010, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A.107(29):13022-7).
[0160] Tumorske ćelije mogu izbeći imunološko prepoznavanje i efektorski odgovor promenom kostimulacionih putanja u T ćelijama. Kostimulacione putanje posreduju u ravnoteži između aktivacije T ćelija, tolerancije i imunološki posredovanog oštećenja tkiva regulisanjem veličine i trajanja imunološkog odgovora u okruženju antigene stimulacije. Gen za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3) je negativni regulator aktivnosti T ćelija i kontroliše veličinu memorijskog fonda T ćelija (Workman, C.J. et al., 2004, J. Immunol. 172: 5450-5). Prijavljena je funkcionalna uloga Lag-3 na CD4+ i CD8+ T ćelije sa iskustvom sa antigenima, a povišena regulacija Lag-3 na tim ćelijama nakon angažovanja receptora T ćelija (TCR) dovodi do negativnih efekata na proliferaciju, aktivaciju T ćelija i proizvodnju proinflamatornih citokina (Huard, B. et al., 1994, Eur. J. Immunol.24(12):3216-21; Huard, B. et al., 1994, Immunogenetics 39(3):213-7; Macon-Lemaitre, L. and F. Triebel, 2005, Immunol.115:170-8; Goldberg, M.V. and C.G. Drake, 2011, Curr. Top. Microbiol. Immunol.344:269-78). Prijavljeno je da blokada Lag-3 pojačava antitumorski odgovor u T ćelijama (Grosso, J.F. et al., 2007, J. Clin. Invest. 117:3383-92). Ostali inhibitorski receptori koji učestvuju u negativnoj regulaciji aktivnosti T ćelija uklјučuju protein programirane ćelijske smrti 1 (PD-1) i citotoksični protein 4 povezan sa T-limfocitima (CTLA-4). Zajedno sa svojim ligandima, ligan programirane smrti 1 (PD-L1, B7-H1 ili CD274) i PD-L2 (B7-DC ili CD273), PD-1 daje signal kontrolne tačke kritičan za uspostavlјanje i održavanje imune tolerancije na životnu sredinu i samoantigene (Francisco, L.M. et al., 2010, Immunol. Rev.
236:219-42). Prijavljeno je da PD-1, poput Lag-3, igra ulogu u izbegavanju antitumorskog imuniteta omogućavajući tumorskim ćelijama da izbegnu imunološki nadzor imunološkog sistema domaćina (Zou, C. 2008, Nat. Rev. Immunol.8:467-77).
[0161] Predmetni pronalazak se, između ostalog, zasniva na prepoznavanju da je eksprimovanje ovih inhibitornih receptora povezano sa ugroženom antigen-specifičnom funkcijom T ćelija u kontekstu raka. Predmetni pronalazak se, takođe, zasniva na prepoznavanju da se stvaranje in vivo sistema koji koristi imunološke kontrolne tačke može napraviti koristeći humanizovani Lag-3 gen i/ili humanizovani Pdcd1 gen kako je ovde opisano. Tako pobolјšan in vivo sistem omogućava razvoj antiimunskih kontrolnih tačaka terapeutskih sredstava i/ili terapijskih režima koji se fokusiraju na stimulisanje antitumorskog imuniteta kod pacijenata sa rakom. Dalјe, tako pobolјšan in vivo sistem, takođe, omogućava razvoj terapeutskih sredstava i/ili terapijskih režima koji se fokusiraju na povećanje aktivnosti T ćelija kod zaraznih i/ili autoimunih bolesti.
[0162] Ovde opisani glodari obezbeđuju poboljšani in vivo sistem i izvor bioloških materijala (npr. ćelija) koji eksprimuju humani (ili humanizovani) Lag-3 koji su korisni za razne testove. U različitim realizacijama, glodari kako su ovde opisani koriste se za razvoj terapeutskih sredstava koja cilјaju Lag-3 i/ili moduliraju Lag-3 signalizaciju (npr. narušavanje interakcija sa veznim partnerima Lag-3, kao što su molekuli MHC klase II). U različitim realizacijama, glodari, kao što su ovde opisani, koriste se za ispitivanje i razvoj terapeutskih sredstava (npr. antitela) koja blokiraju interakciju humanog Lag-3 sa humanim molekulom MHC klase II. U različitim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje profila vezivanja antagonista i/ili agonista humanizovanog Lag-3 na površini ćelije glodara kako je ovde opisano; u nekim realizacijama, glodari iz ovog pronalaska se koriste za određivanje epitopa ili više epitopa jednog ili više kandidatnih terapijskih antitela koja vezuju humani Lag-3.
[0163] U različitim realizacijama, glodari kao što su ovde opisani se koriste za određivanje farmakokinetičkih profila anti-Lag-3 antitela. U različitim realizacijama, jedan ili više glodara kao što su ovde opisani i jedan ili više kontrolnih ili referentnih glodara su izloženi jednom ili više potencijalnih terapijskih anti-Lag-3 antitela u različitim dozama (npr.0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ili 50 mg/kg ili više). Kandidatska terapijska antitela se mogu dozirati na bilo koji željeni način davanja, uključujući parenteralne i neparterteralne puteve primene. Parenteralni putevi uključuju, na primer, intravenske, intraarterijske, intraportalne, intramuskularne, supkutane, intraperitonealne, intraspinalne, intratekalne, intracerebroventrikularne, intrakranijalne, intrapleuralne ili druge načine ubrizgavanja. Neparenteralni putevi uključuju, na primer, oralni, nazalni, transdermalni, plućni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Davanje može biti i kontinuiranom infuzijom, lokalnom administracijom, neprekidnim oslobađanjem iz implantata (gelovi, membrane ili slično) i/ili intravenskom injekcijom. Krv je izolovana iz ne-humanih životinja koje (humanizovane i kontrolisane) u različitim vremenskim tačkama (npr.0 h, 6 h, 1 dan, 2 dana, 3 dana, 4 dana, 5 dana, 6 dana, 7 dana, 8 dana, 9 dana, 10 dana, 11 dana, ili do 30 ili više dana). Mogu se izvesti različiti testovi za određivanje farmakokinetičkih profila primenjenih kandidatskih terapijskih antitela korišćenjem uzoraka dobijenih od ne-humanih životinja kao što je ovde opisano, uključujući, ali ne ograničavajući se na, ukupni IgG, antiterapeutski odgovor antitela, aglutinaciju, itd.
[0164] U različitim realizacijama, glodari kao što su ovde opisani, koriste se za merenje terapeutskog efekta blokiranja ili modulacije signalizacije Lag-3 i efekta na ekspresiju gena kao rezultata ćelijskih promena. U različitim realizacijama, glodar kao što je ovde opisan ili ćelije izolovane od njih izložene su kandidatskoj terapiji koja vezuje humanizovani Lag-3 polipeptid (ili humani deo Lag-3 polipeptida) na površinu ćelije glodara i posle nekog perioda analizirane su na efekte na procese zavisne od Lag-3, na primer, adheziju, apoptozu, proizvodnju citokina, upale, proliferaciju, samotoleranciju i virusnu infekcija (ili odgovore na njih).
[0165] Glodari kao što su ovde opisani eksprimuju humanizovani Lag-3 polipeptid, tako ćelije, ćelijske linije i ćelijske kulture mogu biti generisane da služe kao izvor humanizovanog Lag-3 za upotrebu u vezujućim i funkcionalnim testovima, npr. za ispitivanje vezivanja ili funkcija Lag-3 antagonista ili agonista, posebno gde je antagonist ili agonist specifičan za humanu Lag-3 sekvencu ili epitop ili, alternativno, specifičan za humanu Lag-3 sekvencu iz ili epitop koji se povezuje sa MHC klasa II molekula. U različitim realizacijama, Lag-3 epitopi vezani za potencijalna terapijska antitela mogu se odrediti korišćenjem ćelija izolovanih iz glodara koji su ovde opisani. U različitim realizacijama, humanizovani Lag-3 polipeptid eksprimovan glodarom kao što je ovde opisan, može da sadrži varijantu sekvence amino-kiselina. U različitim realizacijama, glodari kao što su ovde opisani eksprimuju varijantu humanizovanog Lag-3 polipeptida. U različitim realizacijama, varijanta je polimorfna na poziciji aminokiseline povezane sa vezanjem liganda. U različitim aspektima, glodari kao što su ovde opisani, koriste se za određivanje efekta vezivanja liganda putem interakcije sa polimorfnom varijantom humanog Lag-3.
[0166] Ovde opisane ćelije iz glodara mogu se izolovati i koristiti ad hoc, ili se mogu održavati u kulturi tokom mnogih generacija. U različitim realizacijama, ovde opisane ćelije iz glodara su učinjene besmrtnim (npr. upotrebom virusa) i održavane u kulturi neograničeno (npr.u serijskim kulturama).
[0167] U različitim realizacijama, ćelije i/ili glodari ovde opisani, koriste se u različitim režimima imunizacije za određivanje Lag-3 posredovanih funkcija u imunološkom odgovoru na antigen. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog (ili humanizovanog) Lag-3 su karakteristični kod glodara koji su ovde opisani. Pogodna merenja uključuju različite ćelijske testove, testove proliferacije, analizu serumskog imunoglobulina (npr. titar antitela), analize citotoksičnosti i imunoprecipitacijske testove (npr. karakterizaciju interakcija ligand -receptor). U nekim realizacijama, ovde opisani glodari, koriste se za karakterizaciju funkcija posredovanih Lag-3 koje regulišu imuni odgovor na antigen. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa autoimunom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa upalnom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa rakom ili novotvorinom (npr. HPV, HCV, HIV, EBV, HHV-8, HTLV-1, MCV, itd.). U nekim realizacijama, antigen je testni antigen (npr. ovalbumin ili OVA). U nekim realizacijama, antigen je meta povezana sa bolešću ili stanjem od koga pati jedan ili više ljudskih pacijenata kojima je potrebno lečenje.
[0168] U različitim realizacijama, ovde opisani glodari se koriste u serumskom ispitivanju za određivanje titra proizvodnje autoantitela za testiranje farmako-toksikoloških aspekata kandidata za terapeutike koji ciljaju humani Lag-3. U nekim realizacijama, proizvodnja autoantitela kod glodara ovde opisanih proizilazi iz jedne ili više autoimunih bolesti, poremećaja ili stanja izazvanih kod glodara.
[0169] U različitim realizacijama, ovde opisani glodari se koriste za testiranje jednog ili više antigena za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije imunog odgovora, zavisne od Lag-3, uključujući ali bez ograničenja na, specifične odgovore zavisne od T ćelija na određeni antigen.
[0170] U različitim realizacijama, ćelije i/ili glodari koji su ovde opisani se koriste u testu preživljavanja i/ili proliferacije (npr. korišćenjem B ili T ćelija) za ispitivanje i razvoj kandidata za terapeutike koji moduliraju signalizaciju humanog Lag-3. Aktivacija ili gubitak Lag-3 igra važnu ulogu u regulaciji odgovora T ćelija, a regulacija samotolerancije pomoću Lag-3 može biti rezultat aktiviranja specifičnih epitopa vanćelijskog domena Lag-3, dakle, kandidatski Lag-3 modulatori (npr. antagonisti ili agonisti) mogu biti identifikovani, okarakterisani i razvijeni upotrebom ćelija glodara iz predmetnog pronalaska a koje su ovde opisane i/ili ovde opisanih glodara. U nekim realizacijama, ćelije i/ili glodari ovde opisani koriste se u testu preživljavanja ili smrti kako bi se odredio efekat na proliferaciju ili apoptozu određene ćelije(a) (npr. ćelija raka) u prisustvu i odsustvu Lag-3.
[0171] U različitim realizacijama, ćelije i/ili glodari ovde opisani koriste se u ksenotransplantaciji heteroloških (npr. humanih) ćelija ili tkiva za određivanje Lag-3 posredovanih funkcija u fiziološkom (npr. imunološkom) odgovoru na presađene ćelije ili tkiva čoveka. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju koji vezuju ili blokiraju jednu ili više funkcija humanog LAG-3 su karakteristični za glodara koji je ovde opisan. Pogodna merenja uključuju različite ćelijske testove, testove proliferacije, analizu serumskog imunoglobulina (npr. titar antitela), analize citotoksičnosti i karakterizaciju interakcija ligand -receptor (imunoprecipitacijski testovi). U nekim realizacijama, glodari kao ovde opisani, koriste se za karakterizaciju funkcija posredovanih Lag-3 koje regulišu imuni odgovor na antigen. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa neoplazmom. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa autoimunom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa upalnom bolešću, poremećajem ili stanjem. U nekim realizacijama, antigen je povezan sa kancerom ili neoplazmom. U nekim realizacijama, antigen je meta povezana sa bolešću ili stanjem od koga pati jedan ili više ljudskih pacijenata kojima je potrebno lečenje.
[0172] U različitim realizacijama, glodari kao ovde opisani koriste se u transplantacijskim ili usvajajućim eksperimentima prenosa kako bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od Lag-3 novih limfocita i njihove imune funkcije. U različitim realizacijama, glodari kako su ovde opisani transplantiraju se sa humanim T ćelijama; u nekim realizacijama, nativnim T ćelijama; u nekim realizacijama, aktiviranim T ćelijama; u nekim realizacijama, regulatornim T ćelijama (Tregs); u nekim realizacijama, memorijskim T ćelijama.
[0173] U različitim realizacijama, ćelije glodara kao ovde opisanih se koriste u T ćelijskim ispitivanjima da bi se odredio terapeutski potencijal jedinjenja ili bioloških agenasa da moduliraju Lag-3 zavisnu regulaciju odgovora i funkcije zavisne od T ćelije. Primeri testova T ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, ELISpot, bojenje unutarćelijskog citokina, ograničenja glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), ispitivanja supresije virusa, ispitivanja citotoksičnosti, testovi proliferacije i regulatorni testovi supresije T ćelije.
[0174] U različitim realizacijama, ćelije glodara kao ovde opisanih koriste se u ispitivanju ćelijske transmigracije za testiranje i razvoj kandidata za terapeutike koji moduliraju humani Lag-3. Ćelijska transmigracija uključuje migraciju ćelija preko endotela, a testovi transmigracije omogućavaju merenje interakcija i transmigraciju endotela leukocitima ili ćelijama tumora.
[0175] U različitim realiazcijama, ćelije glodara kao ovde opisanih koriste se za ispitivanje rasta tumorskih ćelija (ili proliferaciju) za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od Lag-3 i/ili apoptoze tumorskih ćelija.
[0176] U različitim realizacijama ćelije glodara kao ovde opisanih se koriste u testovima proizvodnje citokina za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od Lag-3 oslobađanja citokina iz T ćelija. U nekim realizacijama ćelije glodara kao ovde opisanih koriste se za otkrivanje (i/ili merenje) intracelularnog oslobađanja citokina koji je rezultat interakcije humanizovanog LAG-3 sa lekom koji cilja humani LAG-3 ili veznog partnera Lag-3 (npr. MHC klase II).
2
[0177] U različitim realizacijama, autoimuna bolest, poremećaj ili stanje se indukuje kod jednog ili više glodara koji su ovde opisani da bi se dobio in vivo sistem za određivanje terapijskog potencijala jedinjenja ili bioloških agenasa za modulaciju regulacije zavisne od Lag-3 jedne ili više funkcija autoimune bolesti, poremećaja ili stanja. Autoimune bolesti, poremećaji ili stanja mogu se indukovati kod jednog ili više glodara kako je ovde opisano, praćeno davanjem jednog ili više jedinjenja ili bioloških sredstava po želјi.
[0178] Glodari kako su ovde opisani obezbeđuju in vivo sistem za analizu i ispitivanje leka ili vakcine. U različitim realizacijama kandidatski lek ili vakcina mogu se isporučiti jednom ili više glodara ovde opisanih, praćeno monitoringom ne-humanih životinja radi utvrđivanja jednog ili više imunoloških odgovora na lek ili vakcinu, sigurnosnog profila leka ili vakcine, ili efekta na bolest ili stanje. U nekim realizacijama vakcina cilja virus poput npr. virusa humane imunodeficijencije (HIV) ili virusa hepatitisa (npr. HCV). Primeri postupaka koji se koriste za određivanje profila sigurnosti uključuju merenja toksičnosti, optimalne koncentraciju doze, efikasnosti leka ili vakcine i moguće faktore rizika. Takvi lekovi ili vakcine mogu se poboljšati i/ili razviti u takvim glodarima.
[0179] Ovde opisani glodari pružaju in vivo sistem za procenu farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani LAG-3. U različitim realizacijama, lek koji cilja humani LAG-3 može biti isporučen ili dat jednom ili više glodara koji su ovde opisani, praćeno monitoringom ili obavljanjem jednog ili više ispitivanja na glodarima (ili ćelijama izolovanim od njih) za određivanje efekta leka na glodara. Farmakokinetička svojstva uključuju, ali nisu ograničena na, kako životinja prerađuje lek u različite metabolite (ili otkrivanje prisustva ili odsustva jednog ili više metabolita leka, uključujući, toksične metabolite), poluživot leka, nivo cirkulacije leka nakon davanja (npr. koncentracija leka u serumu), protivodgovor na lekove (npr. antitela protiv lekova), apsorpcija i distribucija leka, put primene, putevi izlučivanja i/ili pražnjenja leka. U nekim realizacijama, farmakokinetička i farmakodinamička svojstva lekova (npr. PD-1 modulatori) se prate kod ili kroz upotrebu glodara ovde opisanih.
[0180] U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje određivanje efekta na fenotip i/ili genotip glodara, kojem se lek daje. U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje određivanje varijabilnosti serije do serije za Lag-3 modulator (npr. antagonist ili agonist). U nekim realizacijama, obavljanje testa uključuje utvrđivanje razlike između efekata leka koji cilja Lag-3 koji se daje glodaru kako je ovde opisan i referentnom glodaru. U različitim realizacijama, referentni glodari mogu imati modifikaciju kao što je ovde opisano, modifikaciju koja je drugačija nego što je ovde opisano (npr. jedan može imati disrupciju, deleciju ili na drugi način nefunkcionalni Lag-3 gen i/ili Pdcd1 gen, ili humanizaciju Pdcd1 gena) ili nemati modifikaciju (tj. glodar divljeg tipa).
[0181] Primeri parametara koji se mogu meriti kod glodara (ili u i/ili upotrebom ćelija izolovanih od njih) za procenu farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani LAG-3 uključuju, ali nisu ograničeni na aglutinaciju, autofagiju, deljenje ćelija, ćelijsku smrt, hemolizu posredovanu komplementom, integritet DNK, titar antitela specifičnih za lekove, metabolizam leka, nizove ekspresije gena, metaboličku aktivnost, mitohondrijsku aktivnost, oksidativni stres, fagocitozu, biosintezu proteina, degradaciju proteina, izlučivanje proteina, reakciju na stres, koncentraciju lekova u ciljnom tkivu, koncentraciju lekova u neciljanom tkivu, transkripcionu aktivnost i slično. U različitim aspektima, glodari kako su ovde opisani koriste se za određivanje farmaceutski efikasne doze Lag-3 modulatora.
[0182] Ovde opisani glodari obezbeđuju poboljšani in vivo sistem za razvoj i karakterizaciju kandidata za terapeutike za upotrebu kod raka. U različitim realizacijama, glodarima kako su ovde opisani može biti implantiran tumor, posle čega sledi primena jednog ili više terapeutskih preparata. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da sadrže multi-specifično antitelo (npr. bi-specifično antitelo) ili koktel antitela; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje mono-specifičnih antitela doziranih sekvencijalno ili istovremeno. Tumor može da ima dovoljno vremena da se utvrdi na jednoj ili više lokacija unutar glodara. Proliferacija, rast, preživljavanje ćelija tumora, itd., mogu se meriti pre i posle davanja kandidata za terapiju. Citoksičnost kandidata za terapiju takođe se može meriti u glodaru, po želji.
[0183] Ovde opisani glodari mogu se koristiti za razvoj jednog ili više modela bolesti za procenu kandidata za terapeutike i/ili terapijskih režima (npr. monoterapija, kombinovana terapija, ispitivanje raspona doza, itd.) za efikasno lečenje bolesti, poremećaja ili stanja koji utiču na ljude. U glodarima kako su ovde opisani mogu se uspostaviti različita stanja bolesti, praćena primenom jednog ili više molekula kandidata (npr. lekova koji ciljaju Lag-3) tako da se može utvrditi efikasnost jednog ili više molekula kandidata u stanju bolesti. U nekim realizacijama, modeli bolesti uključuju autoimune, upalne i/ili neoplastične bolesti, poremećaje ili stanja.
[0184] Da bismo dali samo jedan primer, glodari kako su ovde opisani, obezbeđuju poboljšani životinjski model za profilaktički i/ili terapeutski tretman tumora ili tumorskih ćelija. U različitim realizacijama, glodarima kako su ovde opisani mogu biti implantirane jedna ili više ćelija tumora, posle čega sledi primena jednog ili više kandidata za terapeutike (npr. antitela). U nekim realizacijama, primena jednog ili više kandidata za terapeutike se vrši posle (npr. minuta ili sati, ali obično istog dana kada) implantacije jedne ili više tumorskih ćelija i jedan ili više kandidata za terapeutike se procenjuju na glodarima opisanim ovde za efikasnost u sprečavanju uspostavljanja čvrstog tumora i/ili rasta tumorskih ćelija kod navedenih glodara. U nekim realizacijama, primena jednog ili više kandidata za terapeutike se vrši posle (npr. danima posle) implantacije jedne ili više tumorskih ćelija i, u nekim određenim aspektima, nakon dovoljno vremena da jedna ili više implantiranih ćelija tumora dostignu unapred određene veličine (npr. zapreminu) kod glodara ovde opisanih; i jedan ili više kandidata za terapeutike ocenjuju se na efikasnost u lečenju jednog ili više utvrđenih tumora. Glodari mogu biti smešteni u različite grupe za lečenje prema dozi tako da se može odrediti optimalna doza ili raspon doza koji je u korelaciji sa efikasnim lečenjem utvrđenog tumora.
[0185] Glodari kako su ovde opisani pružaju in vivo sistem za razvoj i/ili karakterizaciju kombinovane terapije, uklјučujući lekove koji cilјaju Lag-3 i PD-1 za upotrebu kod raka. U različitim realizacijama, glodarima, kao što je ovde opisano, može se implantirati jedna ili više tumorskih ćelija, nakon čega sledi davanje lekova (npr. antitela) koji cilјaju humani LAG-3 i humani PD-1. U nekim realizacijama, primena lekova koji cilјaju humani Lag-3 i humani PD-1 vrši se nakon (npr. minuta, sati ili dana nakon) implantacije jedne ili više tumorskih ćelija i kombinovana terapija se procenjuje kod ne-humanih životinja kako je opisano ovde za efikasnost u sprečavanju uspostavlјanja čvrstog tumora i/ili rasta tumorskih ćelija kod datih glodara. U nekim realizacijama, primena lekova koji cilјaju humani LAG-3 i humani PD-1 izvodi se nakon dovolјno vremena tako da su jedna ili više implantiranih tumorskih ćelija dostigle unapred određenu veličinu (npr. zapreminu) kod glodara kako je ovde opisano; i kombinovana terapija se procenjuje na efikasnost u lečenju jednog ili više utvrđenih tumora. Glodari se mogu smestiti u različite grupe za tretiranje (uklјučujući grupe za monoterapiju), tako da se može odrediti optimalni režim lečenja koji korelira sa efikasnim lečenjem utvrđenog tumora.
[0186] U glodarima kao su ovde opisani mogu se uspostaviti različita stanja bolesti, praćena primenom jednog ili više molekula kandidata (npr. lekova koji ciljaju Lag-3) tako da se može utvrditi efikasnost jednog ili više molekula kandidata u stanju bolesti. U nekim realizacijama, modeli bolesti uključuju autoimune, upalne i/ili neoplastične bolesti, poremećaje ili stanja.
[0187] Kandidatski molekuli mogu se primeniti na modelima bolesti kod glodara koristeći bilo koji način primene, uključujući parenteralni i neparenteralni način primene. Parenteralni putevi uključuju, na primer, intravenske, intraarterijske, intraportalne, intramuskularne, supkutane, intraperitonealne, intraspinalne, intratekalne, intracerebroventrikularne, intrakranijalne, intrapleuralne ili druge načine ubrizgavanja. Neparenteralni putevi uključuju, na primer, oralni, nazalni, transdermalni, plućni, rektalni, bukalni, vaginalni, okularni. Davanje može biti i kontinuiranom infuzijom, lokalnom administracijom, neprekidnim oslobađanjem iz implantata (gelovi, membrane ili slično) i/ili intravenskom injekcijom. Kada se kombinovana terapija procenjuje na glodarima ovde opisanim, kandidatski molekuli mogu se davati istim putem ili drugim načinima primene. Kada se režim doziranja procenjuje na glodarima ovde opisanim, kandidatski molekuli mogu se davati dvomesečno, mesečno, na tri nedelje, dvonedeljno, nedeljno, dnevno, u različitim intervalima i/ili u rastućoj koncentraciji kako bi se odredio režim doziranja koji pokazuje željeni terapeutski ili profilaktički efekat kod glodara kod kojeg je uspostavljen jedan ili više modela bolesti.
[0188] Ovde opisani glodar obezbeđuju poboljšani in vivo sistem za razvoj i karakterizaciju kandidata za terapeutike za upotrebu kod zaraznih bolesti. U različitim aspektima, glodari kako su ovde opisani mogu biti inficirani injekcijom sa virusom (npr. MHV, HIV, HCV, EBV itd.) ili patogenom (npr. bakterijama), praćeno davanjem jednog ili više terapeutskih sredstava. U nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da uključe multi specifično antitelo (npr. bi-specifično antitelo) ili koktel antitela; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju uključuju kombinovanu terapiju kao što je, na primer, davanje mono-specifičnih antitela doziranih sekvencijalno ili istovremeno; u nekim realizacijama, kandidati za terapiju mogu da sadrže vakcinu. Virusu ili patogenu može se omogućiti dovoljno vremena da se utvrdi na jednoj ili više lokacija ili ćelija unutar glodara, tako da se kod glodara razvije jedan ili više simptoma povezanih sa infekcijom virusa ili patogena. Proliferacija i rast T ćelija može se meriti pre i posle primene kandidata za terapeutike. Dalje, preživljavanje, serumska i/ili intracelularna citokinska analiza, histopatologija jetre i/ili slezine mogu se meriti kod glodara koji su zaraženi virusom ili patogenom. U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani koriste se za određivanje stepena oštećenja organa povezanih sa virusnom infekcijom. U nekim realizacijama, glodari kako su ovde opisani se koriste za određivanje profila ekspresije citokina u različitim organima ne-humanih životinja, inficiranih određenim virusom.
[0189] Ovde opisani glodari mogu se koristiti za procenu efikasnosti terapijskog leka koji cilja humane ćelije. U različitim realizacijama, glodaru kako je ovde opisan transplantiraju se humane ćelije, a takvom glodaru se daje kandidat za lek koji cilјa takve humane ćelije. Terapeutska efikasnost leka se zatim određuje nadgledanjem humanih ćelija kod glodara nakon primene leka. Lekovi koji se mogu testirati na glodarima uključuju i jedinjenja malih molekula, tj. jedinjenja molekulske težine manjih od 1500 kD, 1200 kD, 1000 kD ili 800 daltona, i velika molekularna jedinjenja (kao što su proteini, npr. antitela), koja imaju namenjene terapeutske efekte za lečenje ljudskih bolesti i stanja targetiranjem (npr. vezivanjem i/ili dejstvom na) humane ćelije.
[0190] U nekim realizacijama, lek je lek protiv raka, a humane ćelije su ćelije raka, koje mogu biti ćelije primarnog raka ili ćelije ćelijskih linija uspostavljenih iz primarnog raka. U nekim realizacijama, glodaru kako je ovde opisan transplantiraju ćelije humanog raka, a glodaru se daje lek protiv raka. Efikasnost leka može se utvrditi procenom da li se rast ili metastaza ćelija raka čoveka kod glodara inhibira kao posledica primene leka.
[0191] U specifičnim realizacijama, lek protiv raka je molekul antitela, koji vezuje antigen na humanim ćelijama raka. U određenim realizacijama, lek protiv raka je bi-specifično antitelo koje se vezuje za antigen na humanim ćelijama raka i za antigen na drugim humanim ćelijama, na primer, ćelijama humanog imunog sistema (ili „ljudske imune ćelije“) kao što su T ćelije i B ćelije.
Kompleti
[0192] Predmetni pronalazak dalјe obezbeđuje pakovanje ili komplet koji sadrži jedan ili više kontejnera ispunjenih sa najmanje jednim glodarom i/ili ćelijom glodara, komplet može dalјe sadržati najmanje jedan fragment DNK (ili konstrukt) i/ili ciljajući vektor kako je ovde opisano. Kompleti se mogu koristiti u bilo kom primenlјivom postupku (npr. istraživačka metoda). Uz takve kontejnere može se opciono dodati obaveštenje u obliku koje propisuje vladina agencija koja reguliše proizvodnju, upotrebu ili prodaju farmaceutskih ili bioloških proizvoda, a obaveštenje odražava (a) odobrenje agencije za proizvodnju, upotrebu ili prodaju za humanu primenu, (b) uputstva za upotrebu, ili oboje, ili ugovor koji uređuje prenos materijala i/ili bioloških proizvoda (npr. ćelija glodara ili glodara kako je ovde opisano) između dva ili više entiteta.
[0193] Ostale karakteristike pronalaska postaće očigledne tokom sledećih opisa primera realizacija koji su dati za ilustraciju pronalaska i čija namera nije da ga ograniče.
2
PRIMERI
[0194] Sledeći primeri su dati kako bi se opisalo onima koji su prosečni stručnjaci u tehnici kako da naprave i koriste opisane postupke i kompozicije pronalaska, i nisu namenjeni da ograniče obim onoga što su pronalazači smatrali za svoj pronalazak. Ako nije drugačije naznačeno, temperatura je prikazana u Celzijusu, a pritisak jeste ili je blizu atmosferskog.
Primer 1. Humanizacija endogenog gena za aktivaciju limfocita 3
[0195] Ovaj primer prikazuje primerne postupka humanizacije endogenog gena za aktivaciju limfocita 3 (Lag-3) kod sisara koji nije čovek, poput glodara (npr. miša). Postupci opisani u ovom primeru mogu se koristiti za humanizaciju endogenog Lag-3 gena ne-humane životinje koristeći bilo koju humanu sekvencu ili kombinaciju humanih sekvenci (ili fragmenata sekvenci) po želji. U ovom primeru, fragment humane 1,741 bp DNK koji sadrži eksone 2, 3 i 4 humanog LAG3 gena koji se pojavljuje u GenBank pristupu NM_002286.5 (SEQ ID NO:9) koristi se za humanizaciju mišjeg endogenog Lag-3 gena. Poravnavanje mišjeg, humanog i primernog humanizovanog proteina ovde generisanog, sa podvučenim humanizovanim regionom, prikazano je na slici 2. Slika 3 prikazuje ciljajući vektor za humanizaciju genetskog materijala koji kodira amino-kiseline 21-260 glodara Lag-3 polipeptida koji je konstruisan korišćenjem VELOCIGENE® tehnologije (videti npr. US patent br.6,586,251 i Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech.21(6):652-659).
[0196] Ukratko, mišji bakterijski veštački hromozom (BAC), klon bMQ-400O17 (Invitrogen) je modifikovan tako da se izbriše sekvenca koja sadrži eksone 2-4 (1,750 bp) endogenog Lag-3 gena i insertuje eksone 2, 3 i 4 humanog LAG-3 gena koristeći fragment sintetičke DNK od 1,741 bp, koji kodira amino-kiseline 21-260 humanog LAG-3 polipeptida. Endogena DNK koja sadrži eksone 1, 5, 6, 7 i 8 kao i neprevedene regije (UTR) 5’ i 3’ je zadržana. Analiza sekvence sintetičkog fragmenta DNK od 1.741 bp (tj. koji odgovara eksonima 2-4 humanog LAG3 gena) potvrdio sve humane LAG-3 eksone i splajsne signale. Analiza sekvenci otkrila je da sekvenca odgovara referentnom genomu i LAG-3 transkriptu NM_002286.5.
[0197] Sintetički fragmenta DNK od 1.741 bp je sintetizovan od strane Genescript Inc. (Piscataway, NJ) i kloniran u plazmidni vektor rezistentan na ampicilin. Jedinstvena mesta za prepoznavanje restrikcionih enzima korišćena su za ligaciju samo-brišuće kasete neomicina od ∼4,996 bp, okružena mestima za prepoznavanje rekombinaze (loxP-hUb1-em7-Neo-pA-mPrm1-Crei-loxP; vidi U.S. Patent br. 8,697,851, 8,518,392 i 8,354,389). Sledeća selekcija je koristila neomicin. Ciljajući vektor je linearizovan pre homologne rekombinacije sa mišjim BAC klonom bMK-400O17. Po dizajnu, spoj između humanog LAG-3 fragmenta od 1,741 bp i mišjeg nizvodno 509 bp uklјučivao je deo introna 4 humanog LAG-3 gena (slika 3). Dobijeni ciljajući vektor sadržao je, od 5’ do 3’, 5’ krak homologije koji je sadržao ∼46 kb mišje genomske DNK iz BAC klona bMQ-400O17, 1.741 bp sintetički fragment DNK (koji odgovara eksonima 2-4 i delu introna 4 humanog LAG-3 gena), samo-uklanjajući neomicinski kertridž obavijen loxP mestima i ∼53 kb genomske DNK miša iz BAC klona bMQ-400O17.
[0198] Modifikovani klon modified bMQ-400O17 BAC, opisan gore, korišćen je za elektroporaciju mišjih embrionalnih matičnih (ES) ćelija za stvaranje modifikovanih ES ćelija koje sadrže endogeni Lag-3 gen koji je humanizovan od eksona 2 kroz ekson 4 uključujući deo introna 4 ( tj. delecijom 1,750 bp endogenog Lag-3 gena i insercijom 1,741 bp humane LAG-3 sekvence). Pozitivno ciljane ES ćelije koje sadrže humanizovani Lag-3 gen identifikovane su testom (Valenzuela et al., supra) koji je otkrio prisustvo humanih LAG-3 sekvenci (npr. eksone 2-4) i potvrdio gubitak i/ili zadržavanje mišjih Lag-3 sekvenci (npr. eksona 2-4 i/ili eksona 1, 4, 5, 6, 7 i 8). Tabela 1 prikazuje primere i sonde koji su korišćeni za potvrđivanje humanizacije endogenog Lag-3 gena kao što je opisano gore (Slika 4).
[0199] Nukleotidna sekvenca preko ushodne tačke insercije obuhvatala je sledeće, što ukazuje na endogenu mišju sekvencu (sadržanu u zagradama u daljem tekstu) koja se nastavlja na humanu LAG-3 genomsku sekvencu na tački insercije: (CATGATGTTT CTTTCTTAGG AAAGCCAGGG CATTTCTCTA TTCTCCAATC TCTTGGCTCA ATGCCCTTGG CCTCTCTTTT GTTCCACTAG) TGAAGCCTCT CCAGCCAGGG GCTGAGGTC CCGGTGGTG TGGGCCCAG GAGGGGGCTC CTGCCCAGCT CCC (SEQ ID NO:12) (Slika 9A).
[0200] Nukleotidna sekvenca na 5' kraju samobrišućeg neomicinskog ketridža obuhvatala je sledeće, što ukazuje na humanu LAG-3 genomsku sekvencu susednom sa sekvencom kasete (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu sa SalI-Xhol kompatibilnim krajem u kurzivu i loxP sekvencom podebljanim slovima) nishodno od tačke insercije: (SEQ ID NO: 13) (Slika 9B).
[0201] Nukleotidna sekvenca preko nishodne tačke insercije na 3' kraju samobrišućeg neomicinskog kertridža obuhvatala je sledeće, što označava sekvencu kasete (koja se nalazi u zagradama u daljem tekstu sa loxP mestom zadebljanim slovima, i I-Ceul mestom prepoznavanja podvučenim slovima i Nhel mestom prepoznavanja u kurzivu) koja se nastavlja sa mišjom Lag-3 genomskom sekvencom: (TTTCACTGCAT TCTAGTTGTG GTTTGTCCAA ACTCATCAAT GTATCTTATC ATGTCTGGA ATAACTTCGT ATAATGTATG CTATACGAAG TTAT GCTAGTAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG A GCTAGC) GACCCCCAAA ACTTTCTCAG CTGCGTGTGG TCTCACTCCA CATCACTTTG TTTCAGTGTC CAAACCATTT TCTCTCTGGG CATCTTTTAG (SEQ ID NO:14) (Slika 9C).
[0202] Nukleotidna sekvenca preko uzvodne tačke insercije nakon brisanja neomicinskog kertridža (77 bp preostalih u intronu 4) obuhvatala je sledeće, što ukazuje na to da su mišje i humane genomske sekvence umetnute u odnosu na preostalu sekvencu kertridža lokP sekvencu (sadržanu u zagradama u daljem tekstu sa SalI-XhoI kompatibilnim krajem u kurzivu, a loxP mesto podeblјano, podvučeno I-CeuI mesto restrikcije, a NheI mesto restrikcije u kurzivu): ACGTCTCCAT CATGTATAAC CTCACTGTTC TGGGTAACT CCCCCACTCT
2
GCTTCACATT TGACCACAAC TCCTTCCTGC CCCCCTTGTC ACCTCCCCT AAC (GTCGAG ATAACTTCGTA TAATGTATGC TATACGAAGT TAT GCTAGTA ACTATAACGG TCCTAAGGTA GCGA GCTAGC) GACCCCCAAA ACTTTCTCAG CTGCGTGTGG TCTCACTCCA CATCACTTTG TTTCAGTGTC CAAACCATTT TCTCTCTGG GCATCTTTTA GCTGCTGTCTC (SEQ ID NO:15) (Slika 9D).
[0203] Pozitivni klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa metodom VELOCIMOUSE® (videti npr. U.S. Pat. No. 7,294,754 i Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) da bi se generisalo leglo mladunaca koji sadrže inserciju humanog LAG-3 eksona 2-4 i dela humanog LAG-3 introna 4 u endogeni Lag-3 gen miša. Miševi koji nose humanizaciju eksona 2-4 (tj. fragment sintetičke DNK od 1,741 bp) endogenog Lag-3 gena ponovo su potvrđeni i identifikovani genotipizacijom DNK izolovane iz repnih resica korišćenjem test modifikacije alela (Valenzuela et ah, supra) koji je otkrio prisustvo humanih LAG-3 genskih sekvenci (Slika 4). Mladunci su genotipizirani, a kohorte životinja heterozigotnih za humanizovani konstrukt Lag-3 gena odabrane su za karakterizaciju.
TABELA 1
Naziv Primer/Proba Sekvenca (5’-3’)
Prednji GAGGCTGCTGACGGTCAAG (SEQ ID NO:16) 7184 mTU Proba TTAGGCAGGTTAACTTTATCCTCAAAGCA (SEQ ID NO:17)
Reverzni GCCACGAAGAAGATGCACTCAAG (SEQ ID NO:18)
Prednji GTCCCGGGTCTCTTGGAGAT (SEQ ID NO:19) 7184 mTD Proba CCACCCATAAACATCCCCAGGTTTCA (SEQ ID NO:20)
Reverzni CCGCTCATTCCAAGTCAGTTC (SEQ ID NO:21)
Prednji CGGTTGGTGGTCAAGAGAAC (SEQ ID NO:22) 7184 hTU Proba CGGGCTTTCTCATCCTCAACGGG (SEQ ID NO:23)
Reverzni GGCGGGAAAGAGAATGGAGTTG (SEQ ID NO:24)
Prednji AGCCCTGCTGTGTTGGGAAA (SEQ ID NO:25) 7184 hTD Proba TGTTTCCAGTGGGCTGATGAAGTC (SEQ ID NO:26)
Reverzni TGGCAGTCACTGTGCAAG (SEQ ID NO:27)
Primer 2. Ekspresija humanizovanog Lag-3 na aktiviranim T . elijama
[0204] Ovaj primer demonstrira da ne-humane životinje (npr. glodare) modifikovane tako da sadrže humanizovani Lag-3 gen u skladu sa Primerom 1 eksprimuju humanizovani Lag-3 polipeptid na površini aktiviranih limfocita. Posebno, aktivirane T ćelije miševa divlјeg tipa i miševa homozigota za humanizaciju Lag-3 (kako je gore opisano) obojeni su anti-Lag-3 antitelima da bi se odredila ekspresija LAG-3 u T ćelijama stimulisanim antitelima protiv CD3 / anti-CD28. Dalјe, ekspresija PD-1 i LAG-3 ispitivana je na T ćelijama humanizovanih Lag-3 miševa koji su dalјe sadržali humanizovani Pdcd1 (PD-1) gen (dvostruko humanizovani Lag3xPD1 miševi).
[0205] Prvo su generisane dvostruko humanizovane Lag3xPD1 mišje embrionalne matične ćelije (ES) pomoću Lag-3 ciljajućeg vektora opisanog gore (videti Primer 1) u humanizovanim Pdcd1 mišjim ES ćelijama (za humanizovane PD-1 mišje i embrionalne matične ćelije vidi U.S. Patentnu prijavu br.14/744,592, podnetu 19. juna 2015. i objavlјenu kao US 2015-0366174 A1 (uklјučujući naročito Primer 1 u njemu) i Međunarodnu patentnu prijavu br. PCT/US15036649, podnetu 19. juna 2015. i objavlјenu kao WO2015196051). Dvostruko humanizovane ES ćelije miša stvorene su elektroporacijom ciljajućeg vektora Lag-3 kako je opisano u Primeru 1 u C57BL/6N mišje embrionalne matične ćelije koje su sadržale humanizovani Pdcd1 gen koji je kodirao PD-1 polipeptid koji ima humani deo i mišji deo, a humani deo je obuhvatio vanćelijski domen humanog PD-1 polipeptida. Duplo humanizovani klonovi ES ćelija su zatim korišćeni za implantaciju ženki miševa metodom VELOCIMOUSE® (videti npr. U.S. Pat. No. 7,294,754 i Poueymirou et al., 2007, Nature Biotech. 25(1):91-99) da bi se generisalo leglo mladunaca koji sadrže oba humanizovana gena (tj. Lag-3 i Pdcd1). Kolonija miša proširena je ukrštanjem.
[0206] Ukratko, slezina je sakuplјena i obrađena od divlјeg tipa, humanizovanih Lag-3 miševa napravlјenih prema Primeru 1, humanizovanih PD-1 miševa i dvostruko humanizovanih Lag3xPD1 miševa (gore opisanih) u suspenzije pojedinačnih ćelija mehaničkom disocijacijom. Ćelije su isprane u medijumu (RPMI dopunjen 10% FBS) i ponovo suspendovane na 1x106/mL i 200 mL (200,000 ćelija) je posuto u pločice sa 96 ležišta. Ćelije u odabranim ležištima su stimulisane sa antitelima protiv CD3 i protiv CD28 (oba pri 1 mg/mL) tokom 72 sata. Ćelije su obojene za FACS prema specifikacijama proizvođača antitelima koja prepoznaju CD4 i CD8, antitelom konjugovanim BV421 (Brilliant Violet 421 TM) na humani PD-1 (klon EH12.2H7, Biolegend), antitelom konjugovanim BV421 na mišji PD-1 ( klon J43, BD Biosciences), alofikocijanin-konjugovano antitelo na humani LAG-3 (klon 3DS223H, eBioscience), alofikocijanin-konjugovano antitelo na mišji Lag-3 (klon C9B7W, Biolegend) ili odgovarajuće kontrole izotipa. Obojene ćelije su analizirane na LSRII protočnom citometru, a podaci su analizirani pomoću Flowjo softvera. CD4+
2
T ćelije su zatvorene (CD19-CD4+) za ekspresiju humanog i mišjeg Lag-3. Reprezentativni rezultati prikazani su na slici 5.
[0207] Kao što je prikazano na slici 5, aktivirane CD4+ T ćelije miša divlјeg tipa (slika 5, leva kolona) pokazuju snažno eksprimovanje mišjeg PD-1 (dole levo) i mišjeg Lag-3 (2. odozgo levo), ali potpuni nedostatak humanog PD-1 i humanog LAG- 3 eksprimovanja. Ovo je pokazalo da anti-humana PD-1 i anti-humana LAG-3 antitela ne reaguju unakrsnom reakcijom sa mišjim PD-1 i mišjim Lag-3 proteinima. Aktivirane CD4+ T ćelije pojedinačnih humanizovanih Lag-3 miševa detektuju ekspresiju humanizovanog Lag-3 i mišjeg PD-1, ali ne i mišjeg Lag-3 i humanog PD-1 (slika 5, druga kolona levo). Shodno tome, aktivirane CD4+ T ćelije iz pojedinačno humanizovanih Pdcd1 miševa eksprimuju humanizovani PD-1 i mišji Lag-3, ali im nedostaje bilo kakvo eksprimovanje mišjeg PD-1 i humanog LAG-3 (slika 5, treća kolona levo). Dvostruko humanizovani Lag3xPD1 miševi pokazali su ekspresiju humanih, ali ne i mišjih PD-1 i Lag-3 proteina, što je potvrdilo da PD-1 i Lag-3 polipeptidi pune dužine nisu proizvedeni kod ovih miševa.
[0208] Uzeti zajedno, ovaj Primer pokazuje da miševi koji nose humanizovani Lag-3 gen opisan u Primeru 1 eksprimuju Lag-3 polipeptid koji sadrži humani deo i endogeni deo miša, čiji se humani deo detektibilno eksprimuje prepoznavanjem od antitela koje prepoznaje humani LAG-3 polipeptid. Ovaj primer, takođe, pokazuje da dvostruko humanizovani Lag3xPD1 miševi koji eksprimuju i humanizovane PD-1 i humanizovane Lag-3 polipeptide daju in vivo sistem za ispitivanje efikasnosti anti-Lag-3 i/ili anti-PDl antitela.
Primer 3. In vivo efikasnost LAG3 i PD1 modulatora
[0209] Ovaj primer pokazuje da ne-humane životinje (npr. glodari) modifikovane tako da sadrže humanizovani Lag-3 gen u skladu sa primerom 1 mogu da se koriste u in vivo ispitivanju za skrining i Lag-3 i PD-1 modulatora (npr. anti- Lag-3 i anti-PD-1 antitela) i određivanje različitih karakteristika kao što su, na primer, inhibicija rasta tumora i/ili ubijanje ćelija tumora. U ovom primeru, anti-Lag-3 i anti-PD-1 antitela se pretražuju kod miševa homozigotnih za humanizaciju endogenog Lag-3 gena kako je opisano u Primeru 1 i homozigotnih za humanizaciju endogenog Pdcd1 gena za određivanje efikasnosti mono- i kombinovane terapije korišćenjem anti-Lag-3 i anti-PDl antitela.
[0210] MC38, ćelijska linija adenokarcinoma miša, poreklom iz soja miša C57BL/6, dobijena je iz depozita Nacionalnog zdravstvenog instituta. MC38.Ova ćelijska linija projektovana je stabilnom lentivirusnom transdukcijom da bi se eskprimovao transmembranski pileći ovalbuminski antigen (Ova) za povećanje imunogenosti tumora. Ćelijske linije su testirane na patogene za lјude i glodare pre implantacije u miševe. Ćelije su suspendovane u 100 ml RPMI medija bez seruma i supkutano implantirane u bok miša.
[0211] Ukratko, in vivo efikasnost anti-Lag-3 i anti-PD-1 antitela samih i u kombinaciji ispitana je korišćenjem MC38.Ova tumora ugrađenih u dvostruko humanizovane Lag3xPD1 miševe. Miševima su supkutano implantirane MC38.Ova ćelije 0. dana i nasumično su podeljeni u četiri grupe za tretiranje (n = 7-12 za svaku grupu za tretiranje). Miševima su davana kontrolna antitela (n = 7, 25 mg/kg), anti-Lag-3 (n = 12, 25 mg/kg), anti-PD-1 (n = 12, 10 mg/kg), ili kombinacija anti-Lag-3 i anti-PD-1 antitela (n = 12, 25 mg/kg, odnosno 10 mg/kg) intraperitonealnom injekcijom 3, 7, 10, 14. i 17. dana. Zapremina tumora praćena je šestarskim merenjem dva puta nedelјno tokom eksperimenta (32 dana), a životinje bez tumora praćene su na odsustvo recidiva tumora do 80 dana. Reprezentativni rezultati prikazani su na slici 6.
[0212] Kao što je prikazano na Slici 6, monoterapija anti-PD-1 rezultirala je inhibicijom rasta tumora, regresijom tumora kod 2 od 12 (17%) životinja, dok mono-terapija anti-Lag-3 nije bila značajno efikasna u ovom eksperimentu. Regresija tumora primećena je kod 1 od 12 miševa lečenih anti-Lag-3 antitelom. Nije bilo miševa bez tumora 32. dana za kontrolnu grupu. Suprotno tome, kombinovana terapija sa anti-Lag-3 i anti-PD-1 pokazala je snažnu inhibiciju rasta MC38.Ova, što je rezultiralo sa 5 od 12 (42%) miševa bez tumora do kraja eksperimenta (slika 6). Nijedan od miševa bez tumora nije pokazao recidiv tumora tokom 80 dana nakon implantacije, što je ukazivalo na dugotrajne efekte kombinovane imunoterapije.
[0213] U odvojenom eksperimentu, dvostruko humanizovani Lag3xPD1 miševi inokulirani su MC38.Ova tumorskim ćelijama supkutano 0. dana. 10. dana miševi sa prosečnom zapreminom tumora od 100 mm3 su izabrani i nasumično podeljeni u četiri grupe za tretiranje. Miševima su davana anti-Lag-3 antitela (n = 9, 25 mg/kg), anti-PD-1 antitela (n = 10, 10 mg/kg), kombinacija anti-Lag-3 antitela i anti-PD-1 antitela (N = 11, 25 mg/kg i 10 mg/kg, respektivno) ili kontrolno antitelo (n = 7, 25 mg/kg) IP injekcijom u danima 10, 14, 17, 22. Zapremine tumora praćene su tokom 28 dana nakon implantacije tumora.
[0214] Kao što je prikazano na slici 7, lečenje humanizovanih miševa koji nose tumore MC38.ova (utvrđeni tumori) kombinacijom anti-hPD-1 i anti-hLAG-3 antitela pokrenulo je aktivaciju intratumoralnih i perifernih T ćelija. Kombinacija anti-hPD-1 i anti-hLAG-3 antitela pokazala je snažnu inhibiciju rasta MC38.Ova tumora. Kombinovana terapija kod ovih miševa takođe je rezultirala značajnim povećanjem preživlјavanja životinja, kao i trajanja preživlјavanja (podaci nisu prikazani).
[0215] Uzeto zajedno, ovaj primer pokazuje da se ovde opisane ne-humane životinje mogu koristiti za procenu in vivo efikasnosti lekova (npr. jednog ili više antitela) koji ciljaju Lag-3 i/ili PD-1, a takve životinje su korisne u opažanju razlika terapeutskih efekata anti-Lag-3 monoterapije i/ili kombinovanoj terapiji upotrebom anti-PD-1 antitela. Pored toga, ne-humane životinje ovde opisane mogu se koristiti za procenu u kojoj meri lekovi koji ciljaju Lag-3 ili PD-1 mogu inhibirati rast tumora i/ili posredovati ubijanju ćelija tumora.
EKVIVALENTI
2
[0216] Opisavši tako nekoliko aspekata najmanje jedne realizacije ovog pronalaska, stručnjaci u tehnici će ceniti da će stručnjaci u ovoj oblasti lako doći do različitih promena, modifikacija i pobolјšanja. Takve izmene, modifikacije i pobolјšanja treba da budu deo ovog pronalaska. Shodno tome, prethodni opis i crtež su samo kao primer i pronalazak je detalјno opisan patentnim zahtevima koji slede.
[0217] Upotreba rednih izraza kao što su „prvi“, „drugi“, „treći“, itd., u zahtevima za modifikovanje elementa zahteva sama po sebi ne označava nikakav prioritet, presedan ili redosled jednog elementa zahteva nad drugim ili vremenski redosled kojim se izvode postupci neke metode, ali se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa istog imena (ali za upotrebu rednog izraza) za razlikovanje elemenata zahteva.
[0218] Članovi „a“ i „an“ kako su ovde upotreblјeni u opisu i u zahtevima, ukoliko nije jasno naznačeno suprotno, trebalo bi razumeti da uklјučuju množinske reference. Tvrdnje ili opisi koji uklјučuju „ili“ između jednog ili više članova grupe smatraju se zadovolјenim ako je jedan, više njih ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način evidentno iz konteksta. Pronalazak uklјučuje realizacije u kojima je tačno jedan član grupe prisutan, uključen ili je na neki drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Pronalazak, takođe, uklјučuje realizacije u kojima je više od jednog ili su svi članovi grupe prisutni, uključeni ili su na neki drugi način relevantni za dati proizvod ili postupak. Dalјe, treba razumeti da pronalazak obuhvata sve varijacije, kombinacije i permutacije u kojima se jedno ili više ograničenja, elemenata, klauzula, opisnih termina, itd., iz jednog ili više navedenih zahteva, uvodi u drugi zahtev zavistan od istog osnovnog zahteva (ili, prema potrebi, bilo koji drugi zahtev), ukoliko nije drugačije naznačeno ili ukoliko stručnjaku u ovoj oblasti ne bi bilo očigledno da bi moglo doći do kontradikcije ili nedoslednosti.Tamo gde su elementi predstavlјeni kao liste (npr. u Markush grupi ili sličnom formatu), podrazumeva se da je obelodanjena i svaka podgrupa elemenata i bilo koji element(i) mogu biti uklonjeni iz grupe. Treba razumeti da se, generalno, tamo gde se pronalazak ili aspekti pronalaska odnose na određene elemente, karakteristike itd., određene realizacije pronalaska ili aspekti pronalaska sastoje se, ili se u osnovi sastoje od, takvih elemenata, karakteristika, itd. Radi jednostavnosti, ove realizacije nisu u svakom slučaju posebno navedene u toliko reči ovde. Takođe, treba razumeti da se bilo koja realizacija ili aspekt pronalaska može izričito izuzeti iz zahteva, bez obzira na to da li je određeno izuzeće navedeno u specifikaciji.
[0219] Stručnjaci u tehnici će ceniti uobičajene standarde odstupanja ili greške koji se pripisuju vrednostima dobijenim u testovima ili drugim ovde opisanim postupcima.
Publikacije, veb stranice i drugi referentni materijali koji se ovde navode opisuju stanje tehnike pronalaska i pružaju dodatne detalјe u vezi sa njegovom praksom.
2
1
�
4
4
4
4
�
�
4
4
1
�
�
1
2

Claims (17)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Glodar čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu, naznačen time što dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna domena slična imunoglobulinu (Ig) humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva domena slična Ig endogenog polipeptida Lag-3; transmembranski domen endogenog polipeptida Lag-3; i unutarćelijski domen endogenog polipeptida Lag-3; i naznačen time, što je dati glodar miš ili pacov.
2. Glodar čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu, naznačen time, što dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida; naznačen time, što humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; i naznačen time, što je dati glodar miš ili pacov.
3. Glodar prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time, što:
(a) humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži amino-kiseline 29-260 humanog LAG-3 polipeptida; i/ili (b) glodar dalјe eksprimuje humanizovani PD-1 polipeptid, a humanizovani PD-1 polipeptid sadrži vanćelijski deo humanog PD-1 polipeptida i unutarćelijski deo endogenog PD-1 polipeptida, i opciono humanizovani PD-1 polipeptid dalјe sadrži transmembranski deo endogenog PD-1 polipeptida; i/ili humanizovani PD-1 polipeptid sadrži amino-kiseline 35-145 datog humanog PD-1 polipeptida.
4. Glodar prema zahtevu 1 ili zahtevu 2, naznačen time što je humanizovani Lag-3 gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara, pri čemu opciono:
promotor Lag-3 glodara je endogeni promotor Lag-3 glodara; i/ili
humanizovani Lag-3 gen sadrži eksone 2-4 humanog LAG-3 gena.
5. Glodar prema zahtevu 4, naznačen time što genom glodara dalјe sadrži humanizovani Pdcd1 gen koji je operativno vezan za Pdcd1 promotor glodara i kodira dati humanizovani PD-1 polipeptid, pri čemu opciono:
(a) Pdcd1 promotor glodara je endogeni Pdcd1 promotor; i/ili
(b) humanizovani Pdcd1 gen sadrži endogene Pdcd1 eksone 1, 4 i 5 i sadrži endogeni Pdcd1 ekson 3 u celini ili delimično.
6. Glodar prema zahtevu 5, naznačen time što humani deo humanizovanog Pdcd1 gena sadrži ekson 2 humanog PDCD1 gena, opciono humanizovani Pdcd1 gen dalјe sadrži humani PDCD1 ekson 3 u celini ili delimično.
7. Humanizovani polipeptid Lag-3, proizveden od glodara, prema bilo kom od zahteva 1-6.
8. Izolovana ćelija ili tkivo glodara prema bilo kom od zahteva 1-6.
9. Matična ćelija embriona glodara (ES) čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu koji kodira humanizovani Lag-3 polipeptid, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva Ig-slična domena endogenog Lag-3 polipeptida; transmembranski domen endogenog polipeptida Lag-3; i unutarćelijski domen endogenog polipeptida Lag-3 glodara; pri čemu humanizovani Lag-3 gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara, i pri čemu je data ES ćelija glodara ES ćelija miša ili pacova.
10. Matična ćelija embriona glodara (ES) čiji genom sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu koji kodira humanizovani Lag-3 polipeptid, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: prva dva N-terminalna Igslična domena humanog LAG-3 polipeptida; pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; pri čemu humanizovani Lag-3 gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara; i pri čemu je data ES ćelija glodara ES ćelija miša ili pacova.
11. Embrion glodara generisan iz ES ćelije prema zahtevu 9 ili zahtevu 10.
12. Postupak izrade glodara, koji uključuje:
modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu a humanizovani gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara, čineći tako datog glodara, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: vanćelijski deo koji sadrži prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida i poslednja dva Ig-slična domena endogenog Lag-3 polipeptida; transmembranski domen endogenog polipeptida Lag-3; i unutarćelijski domen endogenog Lag-3 polipeptida; i pri čemu je dati glodar miš ili pacov.
13. Postupak izrade glodara, koji uključuje:
modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani Lag-3 gen na endogenom Lag-3 lokusu a humanizovani gen je operativno povezan sa Lag-3 promotorom glodara, čineći tako pomenutog glodara, pri čemu dati glodar eksprimuje humanizovani Lag-3 polipeptid iz datog humanizovanog Lag-3 gena, a humanizovani Lag-3 polipeptid sadrži: prva dva N-terminalna Ig-slična domena humanog LAG-3 polipeptida; i pri čemu humanizovani Lag-3 gen sadrži endogene Lag-3 eksone 1, 5, 6, 7 i 8; i pri čemu je dati glodar miš ili pacov.
14. Postupak prema zahtevu 12 ili zahtevu 13, naznačen time što je Lag-3 promotor glodar a endogeni Lag-3 promotor glodara.
15. Postupak prema bilo kom od zahteva 12-14, naznačen time što postupak obuhvata:
a) integrisanje genomskog fragmenta u endogeni Lag-3 gen u ES ćeliji glodara, dati genomski fragment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira prva dva N-terminalna Ig-slična domena datog humanog LAG-3 polipeptida, čime se dobija genetski modifikovana matična ćelija embriona glodara; i,
b) stvaranje glodara pomoću genetski modifikovane ES ćelije glodara iz (a).
16. Postupak prema bilo kom od zahteva 12-15, naznačen time, što:
(a) humanizovani Lag-3 gen sadrži eksone 2-4 humanog LAG-3 gena; ili humanizovani Lag-3 gen kodira najmanje amino-kiseline 29-260 datog humanog LAG-3 polipeptida; i/ili
(b) postupak dalјe obuhvata modifikovanje genoma glodara tako da sadrži humanizovani Pdcd1 gen koji kodira humanizovani PD-1 polipeptid koji sadrži vanćelijski deo humanog PD-1 polipeptida i unutarćelijski deo endogenog PD-1 polipeptida.
17. Postupak procene antitumorske efikasnosti farmakokinetičkih svojstava leka koji cilja humani LAG-3, koji obuhvata korake:
davanje leka glodaru prema bilo kom od zahteva 1-6; i
obavljanje testa za određivanje jednog ili više antitumorskih svojstava leka koji cilja humani LAG-3, pri čemu je opcionalno:
(a) lek koji cilјa humani LAG-3 je anti-Lag-3 antitelo; i/ili
(b) lek koji cilјa humani LAG-3 daje se glodaru intravenozno, intraperitonealno ili supkutano.
4
RS20210623A 2015-11-20 2016-11-18 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3 RS61866B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562258181P 2015-11-20 2015-11-20
US201662370430P 2016-08-03 2016-08-03
PCT/US2016/062733 WO2017087780A1 (en) 2015-11-20 2016-11-18 Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
EP16810152.5A EP3376857B1 (en) 2015-11-20 2016-11-18 Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61866B1 true RS61866B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=57543170

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210623A RS61866B1 (sr) 2015-11-20 2016-11-18 Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen za aktivaciju limfocita 3

Country Status (26)

Country Link
US (4) US10306874B2 (sr)
EP (1) EP3376857B1 (sr)
JP (1) JP6997708B2 (sr)
KR (1) KR102454546B1 (sr)
CN (1) CN108366548B (sr)
AU (1) AU2016358101B2 (sr)
BR (1) BR112018010158A2 (sr)
CA (1) CA3003786C (sr)
CY (1) CY1124171T1 (sr)
DK (1) DK3376857T3 (sr)
ES (1) ES2872799T3 (sr)
HR (1) HRP20210824T1 (sr)
HU (1) HUE054612T2 (sr)
IL (1) IL258841B (sr)
LT (1) LT3376857T (sr)
MX (1) MX2018005389A (sr)
NZ (1) NZ742447A (sr)
PL (1) PL3376857T3 (sr)
PT (1) PT3376857T (sr)
RS (1) RS61866B1 (sr)
RU (1) RU2745403C2 (sr)
SG (1) SG11201803409UA (sr)
SI (1) SI3376857T1 (sr)
SM (1) SMT202100299T1 (sr)
WO (1) WO2017087780A1 (sr)
ZA (1) ZA201802717B (sr)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107257624B (zh) 2014-12-09 2021-07-13 瑞泽恩制药公司 具有人源化分化簇274基因的非人动物
PT3376857T (pt) 2015-11-20 2021-05-27 Regeneron Pharma Animais não humanos com um gene humanizado 3 de ativação de linfócitos
DK3422845T3 (da) 2016-02-29 2021-08-30 Regeneron Pharma Gnavere med et humaniseret tmprss-gen
EP3476865B1 (en) 2016-06-28 2023-09-13 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Method for constructing pd-1 gene-modified humanized animal model and use thereof
CN107815468B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN108070613B (zh) 2016-11-11 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018086583A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric lag-3
IL319209A (en) * 2017-06-27 2025-04-01 Regeneron Pharma Non-human animals containing a humanized ASGR1 locus
CA3067872A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Cas-transgenic mouse embryonic stem cells and mice and uses thereof
SG11201912236YA (en) 2017-07-31 2020-01-30 Regeneron Pharma Crispr reporter non-human animals and uses thereof
SG11202000771UA (en) 2017-09-29 2020-04-29 Regeneron Pharma Non-human animals comprising a humanized ttr locus and methods of use
WO2019072241A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Beijing Biocytogen Co., Ltd NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC
CN109666701B (zh) * 2017-10-13 2021-08-24 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
JP7361031B2 (ja) 2017-11-30 2023-10-13 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｔｒｋｂ遺伝子座を含む非ヒト動物
CN111885915B (zh) 2018-03-19 2023-04-28 瑞泽恩制药公司 使用crispr/cas系统对动物进行转录调制
SG11202008620VA (en) 2018-03-26 2020-10-29 Regeneron Pharma Humanized rodents for testing therapeutic agents
JP7634994B2 (ja) 2018-07-16 2025-02-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｄｉｔｒａの非ヒト動物モデルおよびその使用
WO2020125763A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric lag3
CN109929875B (zh) * 2019-03-12 2021-02-19 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种lag3基因人源化动物模型的构建方法及其应用
ES2966625T3 (es) 2019-04-04 2024-04-23 Regeneron Pharma Roedores que comprenden un locus del factor de coagulación 12 humanizado
AU2020286382B2 (en) 2019-06-04 2026-03-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
JP7698587B2 (ja) 2019-06-07 2025-06-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化アルブミン遺伝子座を含む非ヒト動物
KR20220133248A (ko) 2020-01-28 2022-10-04 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화 pnpla3 좌위를 포함하는 비-인간 동물 및 사용 방법
JP7765403B2 (ja) * 2020-04-21 2025-11-06 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ｃｘｃｌ１３遺伝子を有する非ヒト動物
CA3238939A1 (en) 2021-12-08 2023-06-15 Gaurang Patel Mutant myocilin disease model and uses thereof
WO2025163140A1 (en) * 2024-02-02 2025-08-07 Vacara Ab Physiologic humanized mice for studies of mhc class ii function

Family Cites Families (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT758383E (pt) * 1994-05-06 2007-05-31 Roussy Inst Gustave Fracções polipeptídicas solúveis da ptroteína lag-3; processo de produção; composição terapêutica; anticorpos anti-idiotipo
US5670356A (en) 1994-12-12 1997-09-23 Promega Corporation Modified luciferase
US5874304A (en) 1996-01-18 1999-02-23 University Of Florida Research Foundation, Inc. Humanized green fluorescent protein genes and methods
US6586251B2 (en) 2000-10-31 2003-07-01 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
PL1897548T5 (pl) * 2003-02-28 2025-03-17 The Johns Hopkins University Regulacja komórek T
AU2005295269B2 (en) 2004-10-19 2010-05-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method for generating an animal homozygous for a genetic modification
AR072999A1 (es) * 2008-08-11 2010-10-06 Medarex Inc Anticuerpos humanos que se unen al gen 3 de activacion linfocitaria (lag-3) y los usos de estos
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
US8354389B2 (en) 2009-08-14 2013-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. miRNA-regulated differentiation-dependent self-deleting cassette
DK3056082T3 (en) 2009-10-06 2018-12-17 Regeneron Pharma RE-MODIFIED MICE AND INPUT
US20130061340A1 (en) * 2011-09-02 2013-03-07 Stem Centrx, Inc. Identification and Enrichment of Cell Subpopulations
EP2675271B1 (en) 2011-02-15 2018-06-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized m-csf mice
KR101964776B1 (ko) * 2011-10-28 2019-04-04 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 유전자 변형된 ｔ 세포 수용체 마우스
PT2818478T (pt) 2011-10-28 2017-05-12 Regeneron Pharma Il-6 e recetor de il-6 humanizados
PT2770821T (pt) 2011-10-28 2017-12-18 Regeneron Pharma Ratinhos de complexo principal de histocompatibilidade principal modificados geneticamente
PT3272214T (pt) 2011-10-28 2020-03-04 Regeneron Pharma Ratinhos geneticamente modificados que expressam moléculas quiméricas de complexo principal de histocompatibilidade (mhc) ii
UY34887A (es) * 2012-07-02 2013-12-31 Bristol Myers Squibb Company Una Corporacion Del Estado De Delaware Optimización de anticuerpos que se fijan al gen de activación de linfocitos 3 (lag-3) y sus usos
AU2013312359B8 (en) 2012-09-07 2019-08-15 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
US9872909B2 (en) * 2012-09-17 2018-01-23 Galeotin Therapeutics, Inc. Method for enhancing specific immunotherapies in cancer treatment
SG11201502685XA (en) 2012-11-05 2015-05-28 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
SI2958938T1 (sl) 2013-02-20 2019-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Miši, ki izražajo humanizirane koreceptorje za celice T
RS57963B1 (sr) 2013-02-22 2019-01-31 Regeneron Pharma Miševi koji eksprimiraju humanizovani glavni kompleks histokompatibilnosti
US20150342163A1 (en) 2013-02-22 2015-12-03 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex mice
SI2986729T1 (sl) 2013-04-16 2019-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ciljana sprememba genoma podgane
SMT201900067T1 (it) 2013-09-23 2019-02-28 Regeneron Pharma Animali non umani aventi un gene di proteina regolatoria del segnale umanizzato
BR112016011003A2 (pt) 2013-11-19 2017-12-05 Regeneron Pharma animal roedor geneticamente modificado, célula tronco embrionária de camundongo, embrião de camundongo, e, métodos para fabricar um animal roedor e para enxertar células humanas em um camundongo
JP6652931B2 (ja) 2014-04-08 2020-02-26 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． ヒト化Ｆｃγ受容体を有する非ヒト動物
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
SG10202002187WA (en) 2014-05-19 2020-04-29 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals expressing human epo
US10390522B2 (en) 2014-06-19 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized programmed cell death 1 gene
MA50679A (fr) 2014-11-24 2021-03-17 Regeneron Pharma Animaux non humains exprimant un complexe cd3 humanisé
RU2728412C2 (ru) 2014-12-05 2020-07-29 Регенерон Фармасьютикалз, Инк. Животные, отличные от человека, имеющие гуманизированный ген кластера дифференцировки 47
CN107257624B (zh) 2014-12-09 2021-07-13 瑞泽恩制药公司 具有人源化分化簇274基因的非人动物
FI3280257T3 (fi) 2015-04-06 2023-09-07 Regeneron Pharma Humanisoituja t-soluvälitteisiä immuunivasteita ei-ihmiseläimillä
PT3376857T (pt) 2015-11-20 2021-05-27 Regeneron Pharma Animais não humanos com um gene humanizado 3 de ativação de linfócitos

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180083381A (ko) 2018-07-20
US20190320632A1 (en) 2019-10-24
SG11201803409UA (en) 2018-05-30
PL3376857T3 (pl) 2021-09-13
KR102454546B1 (ko) 2022-10-14
RU2018117944A3 (sr) 2020-04-06
RU2018117944A (ru) 2019-12-20
DK3376857T3 (da) 2021-05-25
HUE054612T2 (hu) 2021-09-28
US11102961B2 (en) 2021-08-31
BR112018010158A2 (pt) 2018-11-21
RU2745403C2 (ru) 2021-03-24
SI3376857T1 (sl) 2021-09-30
CA3003786A1 (en) 2017-05-26
LT3376857T (lt) 2021-06-25
CN108366548B (zh) 2021-10-08
JP2018533963A (ja) 2018-11-22
NZ742447A (en) 2022-12-23
CY1124171T1 (el) 2022-05-27
US12096754B2 (en) 2024-09-24
US20170142943A1 (en) 2017-05-25
PT3376857T (pt) 2021-05-27
MX2018005389A (es) 2018-09-05
ES2872799T3 (es) 2021-11-02
US20210360908A1 (en) 2021-11-25
HK1253683A1 (en) 2019-06-28
HRP20210824T1 (hr) 2021-07-09
ZA201802717B (en) 2023-05-31
CA3003786C (en) 2023-09-12
AU2016358101A1 (en) 2018-05-31
IL258841A (en) 2018-06-28
US10306874B2 (en) 2019-06-04
WO2017087780A1 (en) 2017-05-26
IL258841B (en) 2021-04-29
US20240397919A1 (en) 2024-12-05
EP3376857A1 (en) 2018-09-26
CN108366548A (zh) 2018-08-03
AU2016358101B2 (en) 2022-12-01
EP3376857B1 (en) 2021-02-24
SMT202100299T1 (it) 2021-07-12
JP6997708B2 (ja) 2022-02-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12096754B2 (en) Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
US12089575B2 (en) Genetically modified mouse that expresses humanized PD1 and PD-L1 proteins
RS60097B1 (sr) Ne-humane životinje koje imaju humanizovani gen za programiranu ćelijsku smrt 1
HK40108429A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
HK40040582A (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
HK40040582B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
HK1253683B (en) Non-human animals having a humanized lymphocyte-activation gene 3
HK1238254B (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene
HK1238254A1 (en) Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 274 gene