RS61869B1

RS61869B1 - Kontrastna sredstva za magnetnu rezonancu na bazi mangana

Info

Publication number: RS61869B1
Application number: RS20210636A
Authority: RS
Inventors: Peter Caravan; Eirc M Gale; Galen S Loving; Shreya Mukherjee; Jiang Zhu
Original assignee: Massachusetts Gen Hospital
Priority date: 2013-01-07
Filing date: 2014-01-07
Publication date: 2021-06-30
Also published as: CN105492449A; US20150336996A1; WO2014107722A1; PT2941434T; EP2941434A4; CN105492449B; US9944668B2; PL2941434T3; SI2941434T1; HUE054111T2; EP2941434A1; ES2871852T3; EP2941434B1; HK1223622A1; DK2941434T3; CY1124501T1; US20150336997A1; SMT202100304T1; LT2941434T; HRP20210723T1

Description

Opis

OSNOVA PRONALASKA

1. Oblast pronalaska

[0001] Pronalazak se odnosi na kontrastna sredstva za magnetnu rezonancu. Pronalazak se takođe odnosi na metode za pripremu kontrastnih sredstava.

2. Opis srodne tehnike

[0002] Kada je supstanca poput ljudskog tkiva izložena jednoličnom magnetnom polju (polarizaciono polje B0), pojedinačni magnetni momenti pobuđenih nukleusa u tkivu pokušavaju da se poravnaju sa ovim polarizacionim poljem, ali nasumično precesiraju na svojoj karakterističnoj Larmorovoj frekvenciji. Ako se supstanca ili tkivo podvrgnu magnetnom polju (ekscitaciono polje B1) koje se nalazi u ravni x-y i koje je blisko Larmorovoj frekvenciji, neto poravnati moment, Mz, može da se rotira ili „nagne“ u ravni x-y dajući neto transverzalni magnetni moment Mt. Signal emituju pobuđena jezgra ili „spinovi“ nakon završetka ekscitacionog signala B1, a ovaj signal može da se primi i obradi, dajući sliku.

[0003] U sistemima za magnetnu rezonancu (MR), pobuđeni spinovi indukuju oscilujući signal sinusnog talasa u prijemnom kalemu. Frekvencija ovog signala je bliska Larmorovoj frekvenciji, a njegova početna amplituda je određena veličinom transverzalnog magnetnog momenta Mt. Amplituda A emitovanog NMR signala eksponencijalno opada sa vremenom, t. Konstanta raspada 1/T*2zavisi od homogenosti magnetnog polja i od T2, koja se naziva konstantom „spin-spin relaksacije“ ili konstantom „transverzalne relaksacije“. Konstanta T2je obrnuto proporcionalna eksponencijalnoj brzini kojom bi se usklađena precesija spinova defazirala nakon uklanjanja ekscitacionog signala B1u savršeno homogenom polju. Praktična vrednost konstante T2je što tkiva imaju različitu vrednost T2, i to se može iskoristiti kao sredstvo za pojačavanje kontrasta između takvih tkiva.

[0004] Drugi važan faktor koji doprinosi amplitudi A NMR signala naziva se proces relaksacije spin-rešetke, koji je okarakterisan vremenskom konstantom T1. Ona opisuje povratak neto magnetnog momenta M na ravnotežnu vrednost duž ose magnetne polarizacije (z). Relaksacija T2je povezana sa smanjenjem koherentnosti spina, a relaksacija T1nastaje usled paramagnetnog pomaka na mestu sonde i naknadne razmene vezanih protona sa okolnom masom vode. Vremenska konstanta T1, koja se naziva konstanta „relaksacije spin-rešetke“ ili konstanta „longitudinalne relaksacije“, duža je od T2, mnogo duža kod većine supstanci od medicinskog interesa. Kao i kod konstante T2, razlika T1između tkiva se može iskoristiti kako bi se dobio kontrast slike.

[0005] Recipročne vrednosti ovih konstanti vremena relaksacije nazivaju se brzinom relaksacije, i označavaju sa R1i R2, gde je R1= 1/T1i R2= 1/T2.

[0006] Kontrastni agensi su egzogeni molekuli ili supstance koji mogu da promene svojstva relaksacije tkiva i da izazovu kontrast slike. Kontrastni agensi su obično paramagnetske, superparamagnetske ili feromagnetske supstance. Kontrastna sredstva se ponekad nazivaju i sondama za snimanje.

[0007] Obim u kome određeno kontrastno sredstvo može da promeni brzinu relaksacije naziva se relaksivnost. Relaksivnost je definisana kao razlika brzine relaksacije uzorka izmerene sa kontrastnim sredstvom i bez kontrastnog sredstva. Ta razlika brzine relaksacije se zatim normalizuje na koncentraciju kontrastnog sredstva. Relaksivnost se izražava malim slovom „r“ sa indeksom „1“ ili „2“ koji se odnosi na longitudinalnu, odnosno transverzalnu relaksivnost. Na primer, longitudinalna relaksivnost, r1, definisana je kao r1= (R1-R1<0>)/C, gde je R1brzina relaksacije u s<-1>merena u prisustvu kontrastnog sredstva, R1<0>je brzina relaksacije u s<-1>merena u odsustvu kontrastnog sredstva, a C je koncentracija kontrastnog sredstva u mM. Jedinica za relaksivnost je mM<-1>s<-1>. Za kontrastna sredstva koja sadrže više od jednog jona metala, relaksivnost se može izraziti preko koncentracije jona metala („po jonu“ ili „jonska relaksivnost“) ili preko molekulske koncentracije („po molekulu“ ili „molekulska relaksivnost“). Relaksivnost je svojstvena osobina kontrastnih sredstava.

[0008] U nastojanju da se postigne klinički željeni kontrast, razvijena su MR kontrastna sredstva koja su predviđena da utiču na periode relaksacije. Nije iznenađujuće što postoje kontrastna sredstva koja se klinički koriste za podešavanje T1kontrasta, i ona koje se klinički koriste za podešavanje T2kontrasta.

[0009] T1-ponderisano (T1w) snimanje obezbeđuje kontrast slike tamo gde su tkiva ili regioni slike svetli (povećani intenzitet signala) kada je T1vode u tom regionu kratko. Jedan od načina za povećanje kontrasta slike je primena paramagnetskog kompleksa ili supstance na bazi gadolinijuma (Gd), mangana (Mn) ili gvožđa. Ovo paramagnetsko kontrastno sredstvo skraćuje T1molekula vode s kojima se susreće, i daje pozitivni kontrast slike. Stepen do koga određena koncentracija kontrastnog sredstva može da promeni T1je relaksivnost, kao što je gore navedeno. Jedinjenja koja imaju veću relaksivnost daju veće pojačanje signala T1w od jedinjenja sa malom relaksivnošću; alternativno, jedinjenje velike relaksivnosti može da obezbedi ekvivalentno pojačanje signala kao jedinjenje male relaksivnosti, ali u nižoj koncentraciji nego jedinjenje male relaksivnosti. Zato su poželjna jedinjenja velike relaksivnosti, jer omogućavaju veće pojačanje lezija i poboljšavaju dijagnostičku pouzdanost; alternativno, mogu se koristiti u manjim dozama i na taj način poboljšati bezbednost kontrastnog sredstva.

[0010] Većina kontrastnih sredstava za magnetnu rezonancu u kliničkoj upotrebi koristi jon gadolinijuma u oksidacionom stanju 3. Jon mangana u oksidacionom stanju 2 takođe može poslužiti kao T1relaksaciono sredstvo. Mangafodipir (prodaje se pod robnom markom Teslascan kao mangafodipir trinatrijum) predstavlja kontrastno sredstvo koje se daje intravenski kako bi se pojačao kontrast kod magnetne rezonance (MR) jetre. On sadrži paramagnetne jone mangana (II) i helatno sredstvo fodipir (dipiridoksil difosfat). Mangan skraćuje vreme longitudinalne relaksacije (T1), čineći da normalno tkivo izgleda svetlije na snimku magnetne rezonance. Takođe su opisani agensi na bazi Mn koji imaju relaksativnost visoku kao kontrastna sredstva na bazi Gd (videti, npr., Inorg Chem 43: 6313-23, 2004).

[0011] Jedan nedostatak kontrastnih sredstava za magnetnu rezonancu sa gadolinijumom je taj što je jon gadolinijuma stabilan samo u oksidacionom stanju 3 pod fiziološkim uslovima. Pored toga, postoji dobro utvrđena veza između upotrebe kontrastnih sredstava na bazi gadolinijuma kod pacijenata sa oštećenjem bubrega i retkog, ali ozbiljnog fibrotičnog poremećaja nazvanog nefrogena sistemska fibroza (NSF).

[0012] Dalji napredak kontrastnih sredstava za magnetnu rezonancu na bazi mangana bio bi od velike koristi kod primene sa pojačanim kontrastom. Mangan može da ima brojna oksidaciona stanja u fiziološkim uslovima, pri čemu je oksidaciono stanje 2 najprikladnije za T1i T2kontrast. To može biti korisno u neinvazivnom proučavanju redoks dinamike tkiva. Kontrastna sredstva na bazi mangana takođe mogu predstavljati održivu alternativu gadolinijumu u grupama pacijenata sa povećanim rizikom od NSF.

[0013] EP 0 308 983 se odnosi na pojačani T1i T2relaksacioni NMR sa nehelatnim Mn(II) koordinacionim kompleksima, odnosno Mn(II) koordinacionim kompleksima sa aminokiselinama rastvorljivim u vodi.

SAŽETAK PRONALASKA

[0014] I intracelularno i ekstracelularno redoks okruženje čvrsto je regulisano u zdravim tkivima i usko je povezano sa fiziološkim stanjem ćelije. Međutim, ova regulacija se često poremeti tokom perioda ćelijskog stresa, oštećenja ili ćelijske smrti. Iako dinamika lokalnog redoks statusa igra važnu ulogu u posredovanju različitih bioloških procesa poput progresije ćelijskog ciklusa, imunološkog odgovora i zarastanja rana, uporna disregulacija ekstracelularnog redoks okruženja povezana je sa nizom patologija, uključujući hroničnu upalu, neoplastični rast i agresivnost ćelija raka. Zapravo, uloga redoksa u biologiji tumora i dalje predstavlja područje aktivnih istraživanja, i u fokusu je mnogih redoks-aktiviranih prolekova koji se trenutno razvijaju. Nove metode snimanja sigurno će olakšati ove napore, i pri tome će dalje unaprediti naše osnovno razumevanje redoks dinamike vezano za bolest.

[0015] Prijavljeno je nekoliko redoks-aktiviranih molekulskih sondi za snimanje, od kojih svaka koristi jedinstveni mehanizam aktivacije za rešavanje određenih aspekata redoks okruženja. Neke od ovih sondi ciljaju tkiva koja su hipoksična (mali napon kiseonika), što može nastati kao rezultat poremećaja snabdevanja krvlju zahvaćenog područja ili neadekvatne vaskularizacije, što se ponekad događa kod tumora. Sonde za pozitronsku emisionu tomografiju<18>F-fluorizonidazol (<18>F-MISO) i<64>Cu-diacetil-bis(N<4>-metiltio semikarbazon) (<64>CU-ATSM) korišćene su klinički za prikaz hipoksije tumora. Sonde za elektronsku paramagnetsku rezonancu (EPR) i spektroskopiju na bazi redoks osetljivih nitroksida pokazale su se efikasnim u otkrivanju relativne zastupljenosti tiola, kao i drugih redukcionih vrsta. Takođe su zabeležene sonde za magnetnu rezonancu (MR). Primeri uključuju Gd(III) komplekse u kojima su ligandi sposobni da formiraju reverzibilne disulfidne veze sa bočnim lancima cisteina ekstracelularnih proteina, čime daju indirektan uvid u lokalne redoks uslove, Mn(III)-porfirin koji podleže redukciji do Mn(II) vrste sa većom relaksivnošću u hipoksičnim uslovima, a odnedavno i par Eu(III) kompleksa koji mogu da se aktiviraju u prisustvu β-NADH redukcijom visećih krakova liganda.

[0016] MR predstavlja atraktivan modalitet za prikaz redoks dinamike jer omogućava ispitivanje netaknutih, neprozirnih organizama u tri dimenzije pri ćelijskoj rezoluciji (-10 µm) na sistemima visokih polja i submilimetarskoj rezoluciji na kliničkim skenerima. Duboka penetracija u tkiva i visoka rezolucija MR-a omogućavaju direktno prevođenje nalaza sa ćelija na miševe na ljude.

[0017] Jedan pristup redoks osetljivoj MR sondi je primena redoks-aktivnog jona metala. Gd (III), koji se koristi u većini MR sondi, ima samo jedno stabilno oksidaciono stanje u vodenom medijumu. Međutim, mangan može stabilno da postoji u brojnim oksidacionim stanjima, u zavisnosti od polja liganda. Kompleksi Mn(II) sa visokim spinom mogu takođe dati relaksivnosti koje se mogu uporediti sa najboljim kompleksima Gd(III), a nedavno se radilo i na kompleksima Mn(II) kao MR sondama. Ovde predlažemo novu klasu redoks-aktiviranih MR sondi zasnovanih na redoks paru Mn(II)/Mn(III).

[0018] Joni mangana mogu postojati stabilno ili metastabilno u različitim oksidacionim stanjima. Prepoznali smo prednost sposobnosti mangana da postoji u različitim oksidacionim stanjima. Pokazali smo da je moguće stvoriti ligande koji se vezuju za mangan i stabilizuju oksidaciona stanja 2 i 3. Relaksivnost kompleksa Mn(II) mnogo je veća nego kod analoga Mn(III). Takođe smo pokazali da je moguće modifikovati Mn-vezujući ligand na načine koji dovode do favorizovanja jednog oksidacionog stanja. Prednost takvih redoks aktivnih kompleksa je njihova sposobnost da deluju kao senzori. Na primer, pokazali smo da se kompleks Mn(III) može redukovati do kompleksa Mn(II) pomoću fizioloških koncentracija glutationa, što zauzvrat dovodi do povećanja signala magnetne rezonance. Dakle, ovi kompleksi mogu delovati kao senzori za glutation ili druge biološke reduktanse.

[0019] Takođe smo pokazali da određeni kompleksi mangana mogu promeniti svoju relaksivnost sa promenom pH. I fenolat-O i sulfonamid-N ligandi disosuju u kiselinama i modulišu interakciju mangana sa masom vode, što utiče na relaksivnost. U našim primerima, relaksivnost raste sa opadanjem pH, pa tako ova jedinjenja mogu delovati kao senzori za pH i acidozu. pKavrednosti donora fenolata i sulfonamida su veoma modularne i podložne sintetičkom finom podešavanju. Nizak ekstracelularni pH predstavlja zaštitni znak ishemije tkiva (npr. moždani udar, ishemijska bolest srca, ishemija bubrega) i mnogih tumora.

[0020] Takođe smo razvili novi ligand pod nazivom CyP3A. Ovaj ligand je osmišljen tako da helira Mn (II) na termodinamički stabilan i kinetički inertan način, dok omogućava direktnu interakciju Mn(II) sa vodom. Kinetički podaci ukazuju da je manganski kompleks CyP3A inertniji prema transmetalaciji Zn(II) nego Mn(II) kompleks CDTA (cikloheksan diamin tetrasirćetna kiselina), što predstavlja literaturni presedan koji pokazuje optimalnu ravnotežu gorepomenutih karakteristika. Donor piridil-N CyP3A je modularan, i obezbeđuje lak način za vezivanje drugog donora liganda sposobnog za reverzibilno zauzimanje koordinacionog mesta zauzetog vodom. Ova konstrukcija je idealna za potencijalne primene za detekciju pH.

[0021] Pored toga, pripremili smo multimer velike molekulske mase (Mm>2000) koji sadrži šest helatora Mn(II). Velika molekulska masa dovodi do sporijeg raspadanja molekula u rastvoru, i može jako da poboljša relaksivnost Mn(II).

[0022] Dalja prednost kontrastnih sredstava na bazi Mn je postojanje izotopa mangana koji emituju pozitron (Mn-51 i Mn-52) koji omogućavaju upotrebu ovih kompleksa kao agensa za pozitronsku emisionu tomografiju (PET). Pored toga, zamenom prirodnog Mn-55 za PET izotop, moguće je lako pripremiti dvostruke MR-PET sonde. Takve sonde bi mogle da se koriste u novim hibridnim MR-PET skenerima, gde bi se sonda mogla detektovati pomoću oba načina. Prednost takvog pristupa bila bi sposobnost za preciznije, kvantitativno merenje fizioloških parametara, kao što je pH, redukcioni potencijal ili jonski fluks.

[0023] Ove i druge karakteristike, aspekti i prednosti predmetnog pronalaska postaće bolje razumljivi nakon razmatranja sledećeg detaljnog opisa, crteža i priloženih patentnih zahteva.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0024]

Slika 1 pokazuje da struktura liganda jako utiče na redoks potencijal para Mn<III>/Mn<II>. Konverzija karboksilatnih u fenolatne donore pomera potencijal polućelije za 649 mV u korist višeg oksidacionog stanja.

Slika 2 prikazuje: pod (a) ciklični voltamogram na 100 mV/s za Mn<II>-HBET (25 mM) u 25 mM TRIS puferu (pH = 7,4), 500 mM KNO3, kao pomoćnom elektrolitu. Potencijali su u odnosu na K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6; i pod (b), Kotrelov dijagram para Mn<2>/Mn<3>- ia, (opadajuća linija) i ic(rastuća linija) u odnosu na √v, gde v = brzina skeniranja.

Slika 3 prikazuje: Levo: T1-ponderisani MR snimak na 4,7 T cevi koje sadrže čistu vodu, 0,5 mM Mn<III>-HBET i 0,5 mM Mn<II>-HBET u TRIS puferu pH 7,4. Desno: relaksivnosti izmerene na sobnoj temperaturi na 4,7 T.

Slika 4 prikazuje (a) Redukcija 0,5 mM Mn<III>-HBET u Mn<II>-HBET pomoću 10 mM GSH u TRIS puferu (pH 7,4, 37 °C) dovodi do povećane brzine relaksacije protona (1/T1, leva osa) i istovremenog smanjenja molskog udela Mn<III>-HBET (desna osa), određeno pomoću karakteristične UV apsorbance na 375 nm. (b) Redukcija 0,5 mM Mn<III>-HBET pomoću 1 mM GSH na 26 °C praćena pomoću LC-MS. U procesu redukcije nisu uočeni dugovečni intermedijeri.

Slika 5 prikazuje kontrastna sredstva Mn<2>/Mn<3+>u oksidacionom i redukcionom okruženju.

Slika 6 prikazuje šemu za potpunu sintezu 2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksibenzil)amino)etil)azandiil)disirćetne kiseline (HBET) (3), 2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-metoksibenzil)amino)etil)azandiil)disirćetne kiseline (HBET-OMe) (8) i 2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-nitrobenzil)amino)etil)azandiil)disirćetne kiseline (HBET-NO2) (12).

Slika 7 prikazuje (a) Analitičke LC-MS tragove liganda HBET (3) gde trag na 220 nm (crna linija A) ukazuje na visoku čistoću uzorka, a ekstrahovani jon za m/z = 341 je prikazan crvenom linijom B koja se preklapa sa gornjim tragom; i (b) ESI-MS za 3 koji prikazuje m/z = 341 koji odgovara [M+H]<+>.

Slika 8 prikazuje analitičke LC-MS tragove (a) Mn<II>HBET (4) i (b) Mn<III>HBET (5) na reverzno faznoj koloni C18; gde trag na 220 nm (crna linija A) ukazuje na visoku čistoću uzorka, a ekstrahovani jon za m/z = 394 i 393 je prikazan crvenom linijom B.

Slika 9 prikazuje (a) UV spektar Mn"HBET (4) u vodi; i (b) ESI-MS za Mn<II>HBET (4) prikazuje m/z = 394 koji odgovara [M+3H]<+>.

Slika 10 prikazuje (a) UV spektar Mn<III>HBET (5) u vodi; i (b) ESI-MS za Mn<III>HBET (5) prikazuje m/z = 393 koji odgovara [M+2H]<+>.

Slika 11 prikazuje relaksivnost (a) Na [Mn<III>HBET] (5) i (b) Na2[Mn<II>HBET] (4) u TRIS puferu. 1/T1u odnosu na [Mn] za (4) i (5) izmereno u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 12 prikazuje ciklični voltamogram Mn<II>HBET (25 mM) u TRIS puferu (pH = 7,4) koji sadrži KNO3kao pomoćni elektrolit pri različitim brzinama skeniranja u rasponu od 50–600 mV/s.

Slika 13 prikazuje konverziju Mn<III>-HBET u Mn<II>-HBET u prisustvu glutationa, mereno smanjenjem apsorbance na 375 nm (isprekidana linija). Puna linija prikazuje uklapanje dobijenih podataka u jednačinu brzine prvog reda u odnosu na Mn<III>pod uslovima pseudo prvog reda (videti jednačinu S1 dole).

Slika 14 prikazuje da se u prisustvu velikog viška redukovanog glutationa, redoks reakcija ponaša prema pseudo prvom redu u odnosu na [Mn<III>-HBET]. Nagib svake prave jednak je -k • [GSH] (videti jednačinu S1 dole). a.) Koncentracija glutationa je varirala u svakoj reakciji, dok početna koncentracija Mn<III>-HBET (0,6 mM) nije. b.) Početna koncentracija Mn<III>-HBET je varirala, dok je koncentracija glutationa (10 mM) održavana konstantnom.

Slika 15 prikazuje grafikon početne brzine redukcije Mn<III>HBET u funkciji koncentracije Mn<III>HBET za tri različite koncentracije glutationa. Nagib svake prave (kobs) jednak je -k • [GSH] (videti jednačinu S1 dole).

Slika 16 prikazuje međusobnu konverziju između dva oksidaciona stanja sa redukcionim sredstvom (GSH) i oksidacionim sredstvom (H2O2).

Slika 17 prikazuje pod (a), oksidaciju 0,5 mM Mn<II>-HBET u Mn<III>-HBET pomoću 1 mM H2O2u TRIS puferu (pH 7,4, 37 °C), praćenu merenjem relaksivnosti (leva osa) i UV-Vis spektroskopijom, gde porast UV apsorbance na 375 nm ukazuje na stvaranje Mn<III>HBET u funkciji vremena (desna osa); i pod (b), oksidaciju 0,5 mM Mn<II>-HBET pomoću 1 mM H2O2na 26 °C praćenu LC-MS analizom.

Slika 18 prikazuje reprezentativne grafikone intenziteta signala u odnosu na vreme inverzije (TI) za (a) 0,5 mM Mn"HBET i (b) 0,5 mM Mn<III>HBET u TRIS puferu (pH = 7,4). Obratite pažnju na brži oporavak signala za Mn<II>-HBET koji označava kraći T1i veću relaksivnost od Mn<III>-HBET.

Slika 19 prikazuje put sinteze za jedinjenja serije cyHBET kontrastnih sredstava iz pronalaska.

Slika 20A prikazuje relaksivnost (a) Na2[Mn<II>HBET] (4) i (b) Na[Mn<III>HBET] (5) u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 20B prikazuje relaksivnost Na2[Mn<II>HBET-OMe] (9) u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 20C prikazuje relaksivnost Na2[Mn<II>HBET-NO2] (13) i Na[Mn<III>HBET-NO2] (14) u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 20D prikazuje relaksivnost Na2[Mn<II>cycHBET] (30) u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 20E prikazuje relaksivnost Na2[Mn<II>cycHBET] (2) i Na[Mn<II>cycHBET-NO2] (25) u TRIS puferu na pH 7,4, 37 °C. Nagib prave daje relaksivnost.

Slika 21 prikazuje krive pH-titracije za ligande i njihove odgovarajuće komplekse mangana: (a) HBET, (b) HBET-OMe i (c) HBET-NO2.

Slika 22 prikazuje: (a) UV spektar Na2[Mn<II>HBET] (4) praćen u zavisnosti od pH. (b) Grafikon apsorbance na 288 nm u zavisnosti od pH. Povećanje apsorbance odgovara deprotonovanju fenola, i to može biti pogodno za dobijanje pKaod 7,64 za ovu jonizaciju fenola.

Slika 23 prikazuje: (a) UV spektar Na2[Mn<II>HBET-OMe] (9) praćen u zavisnosti od pH. (b) Grafikon apsorbance na 308 nm u zavisnosti od pH. Povećanje apsorbance odgovara deprotonovanju fenola, i to može biti pogodno za dobijanje pKaod 7,91 za ovu jonizaciju fenola.

Slika 24 prikazuje: (a) UV spektar 1:1 Mn<II>:HBET-NO2praćen u zavisnosti od pH. (b) Grafikon apsorbance na 396 nm u zavisnosti od pH. Povećanje apsorbance odgovara deprotonovanju fenola, i to može biti pogodno za dobijanje pKaod 4,84 za ovu jonizaciju fenola.

Slika 25 prikazuje promenu relaksivnosti za titraciju Mn<2+>:ligand 1:1 predstavljenu u funkciji pH za (a) HBET, (b) HBET-OMe i (c) HBET-NO2.

Slika 26 prikazuje (a) ciklični voltamogram na 100 mV/s za Mn<II>-HBET u 25 mM TRIS puferu (pH = 7,4), 500 mM KNO3kao pomoćnom elektrolitu. Potencijali su u odnosu na K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6. (b) Kotrelov dijagram para Mn<2+>/Mn<3+>- ia(opadajuća linija) i ic(rastuća linija) u odnosu na √v, gde v = brzina skeniranja.

Slika 27 prikazuje pod (a) UV spektar Na2[Mn<II>cycHBET] (20) praćen u zavisnosti od pH; i pod (b) Grafikon apsorbance na 296 nm u zavisnosti od pH. Povećanje apsorbance

1

odgovara deprotonovanju fenola, i to može biti pogodno za dobijanje pKaod 7,95 za ovu jonizaciju fenola.

Slika 28 prikazuje pod (a) UV spektar Na[Mn(cycHBET-NO2)] (26) praćen u zavisnosti od pH; i pod (b) Grafikon apsorbance na 396 nm u zavisnosti od pH. Povećanje apsorbance odgovara deprotonovanju fenola, i to može biti pogodno za dobijanje pKaod 5,01 za ovu jonizaciju fenola.

Slika 29 prikazuje ciklični voltamogram Na2[Mn<II>HBET] (4) na pH 7,4; potencijal polućelije je 379 mV u odnosu na normalnu vodoničnu elektrodu (NHE).

Slika 30 prikazuje ciklični voltamogram Na2[Mn<II>HBET-OMe] (9) na pH 7,4; potencijal polućelije je 344 mV u odnosu na NHE.

Slika 31 prikazuje ciklični voltamogram Na[Mn(HBET-NO2) (14) na pH 7,4; potencijal polućelije je 476 mV u odnosu na NHE.

Slika 32 prikazuje ciklični voltamogram Na[Mn(CycBET)] (21) na pH 7,4; potencijal polućelije je 365 mV u odnosu na NHE.

Slika 33 prikazuje ciklični voltamogram Na[Mn(cycHBET-NO2)] (31) na pH 7,4; potencijal polućelije je 488 mV u odnosu na NHE.

Slika 34 prikazuje šemu za sintezu N-Tos-DTTA (33).

Slika 35 prikazuje T2ucrtano u funkciji odnosa 33: Mn<2>na pH 7,40.

Na slici 36 prikazana je konverzija između 35<1->i 35<2->aktivirana pomoću pH.

Slika 37 prikazuje pH zavisnost vrednosti r1za 34<2->/34<1->na 20 MHz (A) i 60 MHz (B) na 37 °C.

Slika 38 prikazuje sintezu helatora Mn(II) (40) kontrastnih sredstava prema pronalasku. Slika 39 prikazuje sintezu helatora Mn(II) (45) kontrastnih sredstava prema pronalasku. Slika 40 prikazuje sintezu liganda heksamera (55) kontrastnih sredstava iz pronalaska. Slika 41 je blok dijagram primera sistema za magnetnu rezonancu (MR) za upotrebu sa kontrastnim sredstvom iz predmetnog otkrića.

Slika 42 je blok dijagram primera sistema za emisionu tomografiju pogodnog za upotrebu sa kontrastnim sredstvom iz predmetnog otkrića.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0025] Postoji nekoliko zahteva za korisnu redoks-aktiviranu MR sondu:

(1) polućelijski redoks potencijal koji je dostupan biološki relevantnim redukcionim agensima poput glutationa (GSH); (2) ligand koji stabilizuje oba oksidaciona stanja tako da redukcija ili oksidacija ne dovodi do razlaganja; (3) jako poboljšanje signala nakon aktivacije; (4) povećana promena signala u prisustvu patologije, tj. uključivanja sonde; i (5) brza kinetika u odnosu na vremenski okvir slike.

[0026] Ključna karakteristika dizajna redoks-aktivne sonde je identifikacija liganda koji stabilizuje oba oksidaciona stanja. EDTA (etilendiamin tetrasirćetna kiselina) gradi vrlo stabilan 7-koordinatni Mn(II)kompleks sa jednim koordinisanim vodenim koligandom, a oksidaciono stanje 2+ je izrazito favorizovano, videti sliku 1. Nasuprot tome, promena dva donora karboksilata u donore fenolata kao u HBED (N,N'-di(2-hidroksibenzil)etilendiamin-N, N'-disirćetnoj kiselini) ili EHPG (N,N'-etilen bis [2(o-hidroksifenil)]glicinu) izrazito favorizuje komplekse Mn(III) sa koordinacionim brojem 6, videti sliku 1.

[0027] Pretpostavili smo da HBET (hidroksibenzil etilendiamin trisirćetna kiselina) (slika 1) sa ligandnom strukturom koja je intermedijer između EDTA i HBED – i sadrži samo jedan donor fenolata – može potencijalno da pokaže metastabilnost prema bilo kom oksidacionom stanju. Stoga bi poželjno oksidaciono stanje takve vrste bilo vrlo osetljivo na promene u redoks okruženju. Da bismo testirali ovu hipotezu, pripremili smo manganske komplekse HBED, HBET i EDTA, kako bismo ispitali kako broj fenolatnih grupa doprinosi polućelijskom potencijalu redoks para Mn(III)/Mn(II). Ciklična voltametrija Mn"-HBET u TRIS puferu (videti sliku 2) pokazuje reverzibilni oksidacioni pik na 0,356 V (u odnosu na K4Fe(CN)6/K3Fe(CN)6), ukazujući na mogućnost upotrebe ovog molekula kao redoks sonde. Anodna (ia) i katodna struja (ic) su linearne sa kvadratnim korenom brzine skeniranja (v) u rasponu od 50–600 mV/s (videti sliku 2b), što ukazuje da je ovo postupak kontrolisan difuzijom. S druge strane, Mn<II>-EDTA i Mn<III>-HBED prikazuju ireverzibilnu oksidaciju i kvazireverzibilne redukcione pikove sa polućelijskim potencijalom (Mn<II>/Mn<III>) od 0,633 V, odnosno 0,016 V.

[0028] HBET (hidroksibenzil etilendiamin trisirćetna kiselina) sintetisan je reduktivnom aminacijom mono BOC-zaštićenog etilen diamina sa salicil aldehidom, a zatim alkilovanjem sa t-butil bromsirćetnom kiselinom, i deprotekcijom kiseline kako bi se dobio slobodni ligand u ukupnom prinosu od 45%. Reakcija jednog ekvivalenta liganda sa MnCl2dala je Mn<II>-HBET u izolovanom prinosu od 84%. Kompleks Mn<III>-HBET sintetisan je u prinosu od 38% oksidacijom MnCl2na vazduhu u prisustvu jednog ekvivalenta liganda pod baznim uslovima, a zatim prečišćavanjem pomoću RP-HPLC. HBET ligand stabilizuje oba oksidaciona stanja do te mere da Mn<II>-HBET i Mn<III>-HBET lako mogu da se odvoje i izoluju u čistom obliku pomoću standardnog RP-HPLC sistema. Oba kompleksa su takođe stabilna u fosfatnom i karbonatnom puferu.

[0029] Relaksivnost T1kompleksa Mn"-HBET i Mn<III>-HBET izmerena je nezavisno na 1,4 T u fiziološkom rastvoru sa Tris puferom (TBS: pH 7,4, 37 °C) i vrednosti su iznosile 2,76 mM<-1>s<-1>, odnosno 1,05 mM<-1>s<-1>. Ova razlika u relaksivnosti je velika, s obzirom na to da stanje Mn<III>još uvek ima četiri nesparena elektrona. Na slici 3 prikazujemo T1-ponderisani MR snimak na 4,7 T epruveta koje sadrže čistu vodu ili ekvimolarni Mn<III>-HBET ili M<II>-HBET. Prisustvo paramagnetskog kompleksa daje veći intenzitet signala u odnosu na čistu vodu. Veća relaksivnost Mn<II>-HBET se vidi po svetlijoj slici. Merenja T1na 4,7 T otkrila su 3,3 puta veću relaksivnost redukovanog oblika Mn<II>-HBET, videti sliku 3.

[0030] Kompleks Mn<III>-HBET se lako redukuje u Mn<II>stanje u prisustvu glutationa. Izgleda da ova konverzija ide direktno do proizvoda bez akumulacije bilo kojih dugotrajnih reakcionih intermedijera ili stvaranja nusproizvoda. To pokazuje eksperiment vremenskog toka prikazan na slici 4b, gde se nastajanje kompleksa Mn<II>-HBET dešava istovremeno sa potrošnjom Mn<III>-HBET. Napredovanje ove reakcije može se u realnom vremenu pratiti i relaksometrijom (videti sliku 4a) koristeći uslove relevantne za kliničko snimanje (1,4 T, 37 °C). Budući da je relaksivnost kompleksa Mn(II) veća od relaksivnosti kompleksa Mn(III), brzina longitudinalne relaksivnosti protona iz vode (1/T1) porašće proporcionalno koncentraciji Mn<II>-HBET u reakciji. Direktna konverzija kompleksa Mn(III) u kompleks Mn(II) dalje se dokazuje zapažanjem da je brzina nastajanja Mn<III>-HBET efektivno ekvivalentna brzini potrošnje oksidovanog oblika, mereno putem UV apsorbance (videti sliku 4a).

[0031] Izvedena je serija kinetičkih eksperimenata na 37 °C (pH 7,4) kako bi se odredio empirijski zakon brzine za redukciju Mn<III>-HBET glutationom. Kompleks Mn<III>-HBET ima jaku apsorpcionu traku na 375 nm (ε = 1,38 x 10<3>M<-1>cm<-1>) u vodi koja nije prisutna u UV spektru kompleksa Mn<II>-HBET. Ova karakteristika nam je omogućila da lako pratimo redukciju Mn<III>-HBET tokom vremena. Izmerili smo početne brzine reakcije sa tri različite koncentracije glutationa (5 mM, 10 mM i 20 mM). Za svaku koncentraciju glutationa, reakcija je izvedena sa četiri različite početne koncentracije M<III>-HBET (0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM i 0,6 mM). Na osnovu ovih eksperimenata, utvrdili smo da je reakcija bila prvog reda i za [GSH] i za [Mn<III>-HBET] sa ukupnom konstantom brzine drugog reda od (3,8 ± 0,3) x 10<-1>M<-1>s<-1>.

1

[0032] Kinetička svojstva bilo koje aktivirajuće sonde izuzetno su važna kada se razmatra njena primena u biomedicinskom snimanju. U slučaju redoks-aktivirane sonde, prelazak u aktivirano stanje mora efikasno da se odigra u fiziološki relevantnom redoks opsegu, a takođe treba da bude brz s obzirom na brzinu ispiranja sonde. Koncentracija redukovanog glutationa u ćeliji je obično 1–10 mM. U tom opsegu, poluživot kompleksa Mn<III>-HBET je otprilike 3 do 30 minuta. Kao poređenje, poluživot u krvnoj plazmi – gde je nivo glutationa približno tri reda veličine niži – bio bi veći od jedne nedelje. Zato očekujemo da će aktivacija sonde biti prvenstveno ograničena na regione u kojima su normalni mehanizmi odgovorni za regulaciju ekstracelularnog redoks potencijala ozbiljno oštećeni ili preopterećeni.

[0033] Kao zaključak, redoks par Mn<III>/Mn<II>-HBET zadovoljava brojne ključne kriterijume potrebne za korisnu sondu za redoks snimanje. Redoks potencijal polućelije dostupan je biološki relevantnim redukcionim sredstvima poput glutationa; on prikazuje dobro poboljšanje signala nakon konverzije u MR aktivno stanje; a kinetika aktivacije je brza s obzirom na vremenski okvir snimanja. Kinetičke studije glutationa potvrđuju da je redukcija brza u prisustvu fizioloških koncentracija glutationa. Ovaj sistem se izuzetno dobro ponaša, a međusobna konverzija između dva oksidaciona stanja se odvija jednostavnim i reverzibilnim procesom koji uključuje jedan elektron. Ciklična voltametrija potvrđuje da je ovo reverzibilan proces. Nadalje, primećujemo da se HBET ligand može lako modifikovati odgovarajućim aril supstituentima kako bi se prilagodio redoks potencijal, ili kako bi se uključio ostatak koji obezbeđuje specifično biološko ciljanje, otvarajući nove puteve u molekulskom MR snimanju.

[0034] U jednom otelotvorenju pronalaska, kontrastno sredstvo se koristi u tehnici dijagnostičkog snimanja, kao što je magnetna rezonanca (MR), i/ili istovremena MR i pozitronska emisiona tomografija (PET). „Ispitanik“ je sisar, po mogućnosti čovek.

[0035] Oblik u kome se kontrastno sredstvo daje ispitaniku nije kritičan. Na primer, kontrastno sredstvo prema pronalasku se može primeniti direktno na tkivo koje se dijagnostički snima, u telesnu tečnost koja je u kontaktu sa tkivom, ili na mesto na telu sa koga kontrastno sredstvo može da difunduje ili da se transportuje u tkivo koje se dijagnostički snima.

[0036] Kontrastno sredstvo se može davati samostalno ili kao deo farmaceutski prihvatljive kompozicije. Relativne količine kontrastnog sredstva iz pronalaska, farmaceutski prihvatljivog nosača i bilo kojih dodatnih aktivnih sastojaka u farmaceutskoj kompoziciji iz pronalaska će varirati, u zavisnosti od identiteta, veličine i stanja ispitanika koji se leči, i dalje u zavisnosti od načina na koji se daje kontrastno sredstvo. Kontrastno sredstvo može da sadrži ciljajući ostatak, koji može da cilja željeno područje u ispitaniku. Ciljajući ostatak se može odabrati od proteina, enzima, peptida, antitela i lekova. Kontrastno sredstvo prema pronalasku, koje opciono sadrži druga farmaceutski aktivna jedinjenja, može se dati ispitaniku parenteralno, na primer, intravenski, intramuskularno, supkutano, intracerebralno ili intratekalno.

[0037] Jedan neograničavajući primer otelotvorenja je kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu. Kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id):

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja, naznačeno time što R1je odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena i dialkilen heteroarena, naznačeno time što R2je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, halo, cijano, nitro, hidroksi i alkoksi grupe, naznačeno time što n je 2 ili 3, i naznačeno time što jedinjenje po želji uključuje vodu koordinisanu za Mn kada je n jednako 2.

[0038] U jednom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (II):

1

[0039] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (III):

[0040] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (IV):

[0041] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (V):

1

[0042] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (Va):

[0043] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (Vb):

1

[0044] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, R<1>je etilen. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, R<2>je metoksi. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, R<2>je nitro. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, R<1>je cikloheksilen. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, najmanje jedan od R<1>i R<2>sadrži ciljajući ostatak koji može da cilja željeni region u ispitaniku. Ciljajući ostatak se može odabrati od proteina, enzima, peptida, antitela i lekova. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, Mn je izotop mangana koji emituje pozitron. U primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, kontrastno sredstvo ima veću relaksivnost kada je n = 2. Jedinjenje može biti konvertibilno in vivo pomoću biološkog redukcionog sredstva (npr. glutation) iz formule (I) u kojoj je n = 3, u formulu (I) u kojoj je n = 2. Alternativno, kontrastno sredstvo može biti uključeno u farmaceutski prihvatljiv nosač koji takođe uključuje redukciono sredstvo za redukciju jedinjenja iz formule (I) u kojoj je n = 3, u formulu (I) u kojoj je n = 2.

[0045] Još jedan neograničavajući primer otelotvorenja pronalaska je kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu. Kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (VIa), (VIb) i (VIc):

1

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja, naznačeno time što je R1odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena i dialkilen heteroarena, naznačeno time što je R<3>odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena i dialkilen heteroarena, naznačeno time što je R<4>odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, halo, cijano, nitro, hidroksi i alkoksi grupe, naznačeno time što X predstavlja N ili NH, naznačeno time što jedinjenje po izboru uključuje vodu koordinisanu sa Mn kada X predstavlja NH, i naznačeno time što je X koordinisano sa Mn kada X predstavlja N.

[0046] U primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (VII):

1

[0047] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (VIII):

[0048] Kada je kontrastno sredstvo izloženo okolini sa promenljivim pH, relaksivnost se povećava sa opadanjem pH. U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, najmanje jedan od R<1>i R<4>sadrži ciljajući ostatak koji može da cilja željeni region u ispitaniku. Ciljajući ostatak se može odabrati od proteina, enzima, peptida, antitela i lekova. Mn može biti izotop mangana koji emituje pozitron.

[0049] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (IX):

2

Mn može biti izotop mangana koji emituje pozitron.

[0050] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (X):

ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja, naznačeno time što R<5>predstavlja strukturu jezgra, i naznačeno time što je n ceo broj od 1 do 12. Struktura jezgra može biti bilo koji atom ili grupa atoma sposobnih da formiraju jednu ili više etarskih grupa sa strukturom u () formule (X). R<5>može biti ciklični skelet. R<5>može biti fosfazen. U jednom otelotvorenju, R<5>je N3P3. U jednom otelotvorenju, n je 6. Mn može biti izotop mangana koji emituje pozitron.

[0051] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (XI):

[0052] U drugom primeru otelotvorenja kontrastnog sredstva, jedinjenje ima formulu (XII):

ili farmaceutski prihvatljiva so jedinjenja. Mn može biti izotop mangana koji emituje pozitron.

[0053] Bilo koje jedinjenje formule (I) do (XII) može imati relaksivnost permanganatnog jona r1veću od 0,3 mM<-1>s<-1>, ili veću od 0,5 mM<-1>s<-1>, ili veću od 1,0 mM<-1>s<-1>, ili veću od 1,5 mM<-1>s<-1>, ili veću od 2,0 mM<-1>s<-1>, ili veću od 2,5 mM<-1>s<-1>, ili veću od 3 mM<-1>s<-1>, ili veću od 4 mM<-1>s<-1>, ili veću od 5 mM<-1>s<-1>, ili veću od 6 mM<-1>s<-1>, ili veću od 7 mM<-1>s<-1>, ili veću od 8 mM<-1>s<-1>, ili veću od 9 mM<-1>s<-1>, ili veću od 10 mM<-1>s<-1>određenu na pH 7,4, 37 °C i 1,4 tesla.

[0054] Pronalazak takođe obezbeđuje kontrastno sredstvo koje sadrži jedinjenje bilo koje od formula (I) do (XII) za upotrebu u postupku za in vivo snimanje ispitanika. Čeka se vreme dovoljno da omogući kontrastnom sredstvu da se akumulira na mestu tkiva ili ćelije koje se snima; i ćelije ili tkiva se snimaju neinvazivnom tehnikom snimanja. Molekuli ispitanika koji su izloženi kontrastnom sredstvu imaju modifikovani period longitudinalne relaksacije koji se odražava na snimku. Neinvazivna tehnika snimanja može biti magnetna rezonanca, ili pozitronska emisiona tomografija sa magnetnom rezonancom. Kada je neinvazivna tehnika snimanja pozitronska emisiona tomografija sa magnetnom rezonancom, daje se kontrastno sredstvo koje sadrži izotop mangana koji emituje pozitron.

[0055] Pronalazak obezbeđuje kontrastno sredstvo koje sadrži jedinjenje bilo koje od formula (I) do (XII) za upotrebu u postupku snimanja željenog područja ispitanika. Ispitanik je smešten u magnetni sistem konfigurisan da stvara polarizaciono magnetno polje barem oko dela ispitanika. Mnoštvo gradijentnih kalemova konfigurisanih za primenu gradijentnog polja na polarizaciono magnetno polje je pod naponom. Radiofrekventnim (RF) sistemom konfigurisanim za primenu ekscitacionog polja na ispitanika upravlja se da bi se od njega dobijali podaci za snimak magnetne rezonance (MR), i snimak željenog područja se rekonstruiše iz podataka MR snimka. Kada kontrastno sredstvo ima izotop mangana koji emituje pozitron, takođe može da se koristi veći broj detektora za detekciju gama zraka emitovanih od ispitanika i za komunikaciju signala koji odgovaraju detektovanim gama zracima. Niz medicinskih snimaka željenog područja ispitanika se rekonstruiše iz signala.

[0056] Pronalazak takođe obezbeđuje kontrastno sredstvo koje sadrži jedinjenje bilo koje od formula (I) do (Vb) u kojoj je n 3 (tj., Mn je u oksidacionom stanju 3+) za upotrebu u postupku za otkrivanje biološkog reduktansa kod ispitanika. Čeka se vreme dovoljno da omogući kontrastnom sredstvu da se akumulira na mestu tkiva ili ćelije koje se snima; i ćelije ili tkiva se snimaju neinvazivnom tehnikom snimanja. Ćelije ili tkiva, uključujući biološki reduktans (npr., glutation), koji su izloženi kontrastnom sredstvu, imaju modifikovani period longitudinalne relaksacije koji se odražava na snimku.

[0057] Pronalazak takođe obezbeđuje kontrastno sredstvo koje sadrži jedinjenje bilo koje od formula (I) do (IX) za upotrebu u postupku za otkrivanje željenih područja koja imaju različite nivoe pH kod ispitanika. Čeka se vreme dovoljno da omogući kontrastnom sredstvu da se akumulira na mestu tkiva ili ćelije koje se snima; i ćelije ili tkiva se snimaju neinvazivnom tehnikom snimanja. Željena područja kod ispitanika koja imaju različite nivoe pH koji su izloženi kontrastnom sredstvu imaju modifikovani period longitudinalne relaksacije koji se odražava na snimku. Kada je kontrastno sredstvo izloženo okolini sa promenljivim pH, relaksivnost se povećava sa opadanjem pH.

[0058] Pozivajući se na sliku 41, bilo koje od kontrastnih sredstava formule (I) do (XII) može se koristiti sa sistemom 100 za magnetnu rezonancu („MR“). MR sistem 100 uključuje radnu

2

stanicu 102 koja ima ekran 104 i tastaturu 106. Radna stanica 102 uključuje procesor 108, kao što je komercijalno dostupna programabilna mašina koja pokreće komercijalno dostupni operativni sistem. Radna stanica 102 obezbeđuje interfejs za operatera koji omogućava unos recepata za skeniranje u MR sistem 100. Radna stanica 102 je povezana sa četiri servera: serverom za impulsnu sekvencu 110; serverom za prikupljanje podataka 112; serverom za obradu podataka 114 i serverom za čuvanje podataka 116. Radna stanica 102 i svaki server 110, 112, 114 i 116 povezani su radi međusobne komunikacije.

[0059] Server impulsne sekvence 110 funkcioniše kao odgovor na uputstva preuzeta sa radne stanice 102 za upravljanje gradijentnim sistemom 118 i sistemom radiofrekvencije („RF“) 120. Gradijentni talasni oblici neophodni za izvođenje propisanog skeniranja proizvode se i primenjuju na gradijentni sistem 118, koji pobuđuje gradijentne kalemove u sklopu 122, da bi stvorio gradijente magnetnog polja Gx, Gy i Gz koji se koriste za kodiranje MR signala. Sklop gradijentnih kalemova 122 čini deo sklopa magneta 124 koji se proteže oko otvora 125 koja je tamo formiran, i uključuje polarizacioni magnet 126 i RF kalem 128 za celo telo.

[0060] Talasni oblici RF ekscitacije primenjuju se na RF kalem 128, ili na posebni lokalni kalem (nije prikazan), od strane RF sistema 120 da bi se izvršila propisana impulsna sekvenca magnetne rezonance. Odzivne MR signale koje detektuje RF kalem 128 ili odvojeni lokalni kalem (nije prikazan), RF sistem 120 prima, pojačava, demoduliše, filtrira i digitalizuje prema komandama koje daje server impulsne sekvence 110. RF sistem 120 obuhvata RF odašiljač za proizvodnju širokog spektra RF impulsa koji se koriste u impulsnim sekvencama MR. RF odašiljač reaguje na recept za skeniranje i usmeravanje od servera impulsne sekvence 110 kako bi proizveo RF impulse željene frekvencije, faze i amplitude impulsa talasnog oblika. Generisani RF impulsi mogu da se primene na RF kalem za celo telo 128 ili na jedan ili više lokalnih kalemova ili nizova kalemova.

[0061] RF sistem 120 takođe obuhvata jedan ili više RF prijemnih kanala. Svaki RF prijemni kanal obuhvata RF pojačalo koje pojačava MR signal koji prima kalem 128 na koji je povezan, i detektor koji detektuje i digitalizuje I i Q komponente kvadrature primljenog MR signala. Veličina primljenog MR signala se tako može odrediti u bilo kojoj uzorkovanoj tački preko kvadratnog korena zbira kvadrata I i Q komponente:

a faza primljenog MR signala se takođe može odrediti:

[0062] Server impulsne sekvence 110 takođe opciono prima podatke o pacijentu od kontrolera za fiziološku akviziciju 130. Kontroler 130 prima signale od brojnih različitih senzora povezanih sa pacijentom, poput signala elektrokardiografa („EKG“) od elektroda, ili respiratornih signala od meha ili drugog uređaja za praćenje disanja. Takve signale obično koristi server impulsne sekvence 110 za sinhronizaciju, ili „gejtovanje“, performanse skeniranja sa otkucajima srca ili disanjem ispitanika.

[0063] Digitalizovane uzorke MR signala proizvedene RF sistemom 120 prima server za prikupljanje podataka 112. Server za prikupljanje podataka 112 deluje kao odgovor na uputstva preuzeta s radne stanice 102 za primanje MR podataka u stvarnom vremenu i obezbeđuje prihvatnu memoriju, tako da se podaci ne gube pri prekoračenju obima podataka. U nekim snimanjima, server za prikupljanje podataka 112 radi jedva nešto više od prosleđivanja stečenih MR podataka serveru za obradu podataka 114. Međutim, u snimanjima koja zahtevaju informacije izvedene iz prikupljenih MR podataka za kontrolu daljih performansi snimka, server za prikupljanje podataka 112 programiran je da proizvede takve informacije i prenese ih na server za impulsnu sekvencu 110. Na primer, tokom predsnimanja, MR podaci se prikupljaju i koriste za kalibraciju impulsne sekvence koju izvodi server impulsne sekvence 110.

[0064] Server za obradu podataka 114 prima MR podatke od servera za prikupljanje podataka 112 i obrađuje ih u skladu sa uputstvima preuzetim sa radne stanice 102. Slike koje rekonstruiše server za obradu podataka 114 prenose se natrag na radnu stanicu 102, gde se čuvaju. Slike u stvarnom vremenu čuvaju se u međumemoriji baze podataka (nije prikazana), odakle se mogu prikazati na ekranu operatera 112 ili na ekranu 136 koji se nalazi u blizini sklopa magneta 124 za upotrebu od strane nadležnog lekara. Slike grupnog režima ili odabrane slike u stvarnom vremenu čuvaju se u bazi podataka domaćina na disk memoriji 138. Kada se takve slike rekonstruišu i prenesu u memoriju, server za obradu podataka 114 obaveštava server za čuvanje podataka 116 na radnoj stanici 102. Operater može koristiti radnu stanicu 102 za arhiviranje slika, proizvodnju filmova, ili slanje slika putem mreže u druge objekte.

2

[0065] Slika 42 prikazuje PET sistem 200 koji se može koristiti zajedno sa MR sistemom 100. PET sistem 200 uključuje hardverski sistem za snimanje 210 koji uključuje sklop prstena detektora 212 oko centralne ose, ili otvora 214. Operaterska radna stanica 216 koja uključuje komercijalno dostupni procesor koji pokreće komercijalno dostupni operativni sistem komunicira putem komunikacione veze 218 sa kontrolerom pokretnog postolja 220 za kontrolu rada hardverskog sistema za snimanje 210.

[0066] Sklop detektorskog prstena 212 formiran je od mnoštva jedinica za detektovanje zračenja 222 koje proizvode signal koji reaguje na detekciju fotona na komunikacionoj liniji 224 kada se desi neki događaj. Skup akvizicionih kola 226 prima signale i proizvodi signale koji ukazuju na koordinate događaja (x, y) i ukupnu energiju povezanu sa fotonima koji su izazvali događaj. Ti signali se šalju preko kabla 228 do kola lokatora događaja 230. Svaki sklop za akviziciju 226 takođe proizvodi impuls za detekciju događaja koji pokazuje tačan trenutak kada se interakcija dogodila. Ostali sistemi koriste prefinjenu digitalnu elektroniku koja takođe može dobiti ove informacije u vezi sa tačnim trenutkom u kome se događaj desio iz istih signala koji se koriste za dobijanje energije i koordinata događaja.

[0067] Kola lokatora događaja 230 u nekim implementacijama čine deo sistema za obradu akvizicije podataka 232 koji povremeno uzorkuje signale koje proizvode akviziciona kola 226. Sistem za obradu akvizicije podataka 232 obuhvata opšti kontroler 234 koji kontroliše komunikacije na sabirnici zadnje ploče 236 i na opštoj komunikacionoj mreži 218. Kola lokatora događaja 230 sakupljaju informacije o svakom važećem događaju u skup brojeva koji tačno pokazuju kada se događaj desio i položaj u kome je događaj detektovan. Ovaj paket podataka o događaju prenosi se na detektor slučajnosti 238 koji je takođe deo sistema za obradu akvizicije podataka 232.

[0068] Detektor slučajnosti 238 prihvata pakete podataka o događajima iz kola lokatora događaja 230 i određuje da li se bilo koja dva od njih podudaraju. Slučajnost je određena nizom faktora. Prvo, vremenski markeri u svakom paketu podataka o događajima moraju biti u unapred određenom vremenskom okviru, na primer 0,5 nanosekundi ili čak do pikosekundi. Drugo, lokacije označene sa dva paketa podataka o događajima moraju ležati na ravnoj liniji koja prolazi kroz vidno polje u otvoru skenera 214. Događaje koji se ne mogu upariti detektor slučajnosti 238 odbacuje iz razmatranja, ali se parovi slučajnih događaja pronalaze i beleže kao

2

paket podataka o slučajnosti. Ovi paketi podataka o slučajnosti dostavljaju se sorteru 240. Funkcija sortera u mnogim tradicionalnim sistemima za PET snimanje je prijem paketa podataka o slučajnosti i generisanje memorijskih adresa iz paketa podataka o slučajnosti radi efikasnog skladištenja podataka o slučajnosti. U tom kontekstu, skup svih projekcionih zrakova koji pokazuju u istom smeru (θ) i prolaze kroz vidno polje skenera (FOV) predstavlja kompletnu projekciju ili „prikaz“. Udaljenost (R) između određenog projekcionog zraka i centra FOV locira taj projekcioni zrak u FOV. Sorter 240 broji sve događaje koji se dešavaju na datom projekcionom zraku (R, θ) tokom skeniranja sortiranjem paketa podataka o slučajnosti koji ukazuju na događaj na dva detektora koji leže na ovom projekcionom zraku. Brojevi slučajnosti su, na primer, organizovani kao skup dvodimenzionalnih nizova, po jedan za svaku aksijalnu ravan slike, i svaki kao jednu dimenziju ima ugao projekcije θ, a kao drugu dimenziju rastojanje R. Ova mapa izmerenih događaja θ u zavisnosti od R naziva se histogram ili, češće, niz sinograma. Ovi sinogrami se obrađuju radi rekonstrukcije slika koje ukazuju na broj događaja koji su se desili na svakoj lokaciji piksela slike tokom skeniranja. Sorter 240 broji sve događaje koji se dešavaju duž svakog zraka projekcije (R, θ) i organizuje ih u niz podataka slike.

[0069] Sorter 240 obezbeđuje skupove podataka slike sistemu za obradu/rekonstrukciju slike 242, na primer, putem komunikacione veze 244, koji se čuvaju u nizu slika 246. Nizovi slika 246 sadrže odgovarajuće skupove podataka kojima pristupa procesor slika 248 koji rekonstruiše slike. Sistem za obradu/rekonstrukciju slike 242 može da komunicira i/ili da bude integrisan sa radnom stanicom 216 ili drugim udaljenim radnim stanicama.

[0070] Pronalazak je dalje ilustrovan u sledećim primerima koji su predstavljeni u svrhu ilustracije, a ne ograničenja.

PRIMERI

Primer 1

Eksperimentalno

Generalno

2

[0071] Materijali i instrumenti. Sve hemikalije i rastvarači su nabavljeni na tržištu i korišćeni bez daljeg prečišćavanja. NMR spektri su zabeleženi na Varian spektrometrima od 500 MHz ili 400 MHz. Hemijski pomaci su zabeleženi u δ (ppm). Kod<1>H i<13>C NMR spektara, rezidualni pikovi rastvarača su korišćeni kao interna referenca, osim za<13>C NMR liganda, gde je tercbutanol korišćen kao interna referenca.

[0072] Tečna hromatografija-elektrosprej masena spektrometrija (LC-MS) izvedena je korišćenjem aparata serije Agilent 1100 sa LC/MSD zamkom i Daly konverzionim dinodnim detektorom sa UV detekcijom na 220, 254 i 280 nm. Metode koje se koriste na ovom sistemu su sledeće: (a) kolona Luna C18 (100 x 2 mm); eluent A: H2O/0,1% mravlja kiselina, B: MeCN/0,1% mravlja kiselina; gradijent: 5% B do 95% B tokom 9 minuta; protok 0,8 ml/min (koristi se za karakterizaciju organskih jedinjenja) i (b) kolona Kromasil C18 (250 x 4,6 mm); eluent C: 95% MeCN/5% 10 mM amonijum acetata, D: 10 mM amonijum acetat; gradijent od 5% C do 8% C tokom 14 minuta; protok 0,8 ml/min (koristi se za karakterizaciju kompleksa mangana). Semipreparativno reverzno fazno prečišćavanje je izvedeno na HPLC sistemu Rainin Dynamax sa UV detekcijom na 254 nm, koristeći kolonu Polaris C18. Metoda koja se koristi za prečišćavanje je sledeća: Mobilna faza A je 50 mM amonijum acetatni pufer, pH 6,5, a mobilna faza B smeša 5% 50 mM amonijum acetatnog pufera, pH 6,5/95% MeCN. Počevši od 5% B, frakcija B povećala se na 8% tokom 23 minuta. Kolona je ispirana sa 100% B tokom 2 minuta, a zatim prebačena na 5% B. Sistem je ponovo ekvilibrisan na 5% B tokom 3 minuta. Merenja relaksivnosti izvršena su na Bruker mq60 Minispec na 1,4 T i 37 °C. Koncentracija mangana određena je pomoću ICP-MS sistema Agilent 7500a. Svi uzorci su razređeni sa 0,1% Triton X-100 u 5% azotnoj kiselini koja sadrži 20 ppb Lu (kao interni standard). Odnos Mn (54,94)/Lu (174,97) korišćen je za kvantifikaciju koncentracije mangana. Linearna kalibraciona kriva u rasponu od 0,1 ppb do 200 ppb generisana je svakodnevno za kvantifikaciju. UV-Vis spektri su snimljeni na spektrofotometru SpectraMax M2 upotrebom kvarcne kivete dužine puta od 1 cm. Ciklična voltametrija Mn"HBET, Mn"EDTA i Mn<III>HBET je zabeležena pomoću Nuvant EZstat pro potenciostata u TRIS puferu (pH = 7,4), koji sadrži 0,5M KNO3kao noseći elektrolit, pri brzini skeniranja od 100 mVs-1. Kao radna elektroda korišćena je staklasta ugljenična elektroda, Ag/AgCl je bila referentna elektroda, a Pt žica pomoćna elektroda. Par K4FeCN6/K3FeCN6korišćen je kao interni standard.

[0073] Relaksometrijska studija. T1je izmeren sa sekvencom inverznog oporavka impulsa, uzimajući 10 vremena inverzije. Relaksivnost je određena sa nagiba dijagrama zavisnosti 1/T1

2

u odnosu na koncentraciju u TRIS puferu, pH = 7,4 na 37 °C. Koncentracija mangana u svakom osnovnom rastvoru određena je pomoću ICP-MS.

[0074] Mn: Stehiometrija liganda: Kompozicija TFA vrste liganda i količina liganda potrebna za potpuno heliranje svih Mn(II) u rastvoru određena je u skladu sa sledećim primerom: na 500 µl uzorka 0,91 mM MnCl2u puferu pH 7,40 (25 mM TRIS) (0,45 µmol u svakom), dodavane su rastuće količine 1,45 mM 34 (0 do 675 µl u koracima od 75 µl; 1,09 µmol u svakih 75 µl). Vrednost T2svakog uzorka je naknadno izmerena, i relaksivnost je predstavljena kao odnos liganda i metala (slika 35). Tačka kompletne potrošnje Mn određena je tačkom gde r2prestaje da opada pri dodatku liganda.

[0075] Za ispitivanje specijacije kompleksa mangana u rastvoru, izvedene su pH titracije Mn<2>:ligand 1:1 upotrebom 1 N NaOH pod atmosferom N2(slika 21).

[0076] Da bi se utvrdila vrsta koja postoji u ova dva raspona pH, praćen je UV spektar u funkciji pH (videti slike 22–24). Deprotonovanje fenolnog ostatka i stvaranje fenoksidnog jona daje karakteristične UV trake, što ukazuje da se Mn-HBET i Mn-HBET-OMe protonuju pri nižem pH, i protonovanje se događa na fenolu. Kako se pH povećava, fenol se deprotonuje i koordinira sa centrom mangana.

[0077] Specijacija u rastvoru je takođe praćena merenjem relaksivnosti protona vode na 1,4 T. Slika 24 prikazuje promenu relaksivnosti u odnosu na pH za tri sistema liganda. Promena relaksivnosti je konzistentna sa pH zavisnom specijacijom, kako je uočeno u UV studijama.

[0078] Kinetički eksperimenti za reakciju redukcije. Ova serija kinetičkih eksperimenata izvedena je na 37 °C (pH 7,4) da bi se odredio empirijski zakon brzine za redukciju Mn<III>-HBET pomoću glutationa. Kompleks Mn<III>HBET poseduje jaku apsorpcionu traku na 375 nm (ε = 1,38 × 103 M<-1>cm<-1>) u vodi koja nije prisutna u UV spektru kompleksa Mn<II>-HBET. Ova karakteristika je korišćena za praćenje redukcije Mn<III>-HBET tokom vremena. Početne brzine reakcije izmerene su na tri različite koncentracije glutationa (5 mM, 10 mM i 20 mM). Uz to, za svaku koncentraciju glutationa reakcija je izvedena sa četiri različite početne koncentracije Mn<III>-HBET (0,3 mM, 0,4 mM, 0,5 mM i 0,6 mM). Korišćenjem velikog viška glutationa u ovim eksperimentima, otkrili smo da se reakcija ponaša kao da je pseudo prvog reda u odnosu na kompleks Mn<III>-HBET, kako je izraženo u jednačini S1.

2

[0079] Ovde je posmatrana konstanta brzine (kobs) jednostavno proizvod stvarne konstante brzine (k) i [GSH], t je vreme, a indeksi „t“ i „o“ odnose se na koncentraciju u trenutku „t“, odnosno na početnu koncentraciju. Slika 14 prikazuje dva skupa kinetičkih eksperimenata u kojima smo predstavili prirodni log [Mn<III>-HBET]t u funkciji vremena. Na taj način, nagib svake prave je jednak - k [GSH] i odsečak je ln[MnIII-HBET]o. Na osnovu ovih eksperimenata, utvrdili smo da je reakcija bila prvog reda i za [GSH] i za [Mn<III>-HBET] sa ukupnom konstantom brzine drugog reda od (3,8 ± 0,3) × 10<-1>m<-1>s<-1>.

[0080] Oksidacija Mn"HBET vodonik peroksidom. Oksidacija Mn"HBET pomoću H2O2(1 mM) u TRIS puferu (pH = 7,4) praćena je pomoću UV-Vis spektroskopije, merenja relaksivnosti, i LC-MS. Za razliku od redukcije Mn<III>HBET pomoću glutationa, izgleda da reakcija oksidacije dostiže ravnotežu nakon 70% konverzije u Mn<III>HBET, kao što je izračunato iz podataka LC-MS.

[0081] MR snimanje. MR snimanje je izvedeno pomoću sistema Bruker Biospec 4.7T. Tri uzorka (-500 µl) stavljena su u ručno izrađeni držač za uzorke i snimljena pomoću zapreminskog kalema. Matrica akvizicije = 64x256 za 0,234x0,312 mm<2>rezolucije u ravni; debljina reza = 5 mm. T1-ponderisane slike su dobijene brzom sekvencom eho gradijenta snimka malog ugla (FLASH): TR/TE/FA= 20/5.44/40° sa 8 prosečnih vrednosti. T1je utvrđen pomoću 2D sekvence inverznog oporavka brze akvizicije refokusiranog ehoa (RARE): TR = 3200 ms, TE = 9,7 ms. Vreme inverzije (TI): 5, 45, 85, 165, 325, 645, 1285, 1925 i 3205 ms. T1je dobijen iz nelinearnog uklapanja najmanjih kvadrata intenziteta signala (SI(t)) u odnosu na TI krivu, gde su T1, SI (0) i a podesivi parametri, jednačina S2.

[0082] Stabilnost kompleksa Mn"HBET i Mn<III>HBET Stabilnost kompleksa mangana izmerena je u različitim puferima koristeći koncentracije slične onima koje se nalaze u krvnoj plazmi (1 mM fosfatni pufer, 25 mM natrijum bikarbonatni pufer i 0,1 mM citratni pufer).0,5 mM rastvor kompleksa mangana inkubiran je u odgovarajućim puferima na 37 °C (pH = 7,4), a zatim su vrste kvantifikovane pomoću LC-MS upotrebom prethodno opisane metode. Kompleksi mangana (0,5 mM) takođe su tretirani pomoću EDTA (0,5 mM) u TRIS puferu (pH = 7,4) i inkubirani na 37 °C tokom 1 sata. Vrste su zatim kvantifikovane na LC-MS upotrebom prethodno opisane metode.

[0083] Kinetika transmetalacije Zn(II). Premeštanje Mn(II) pomoću Zn(II) izmereno je praćenjem razvoja koncentracije slobodnog Mn(II) pomoću T2-relaksometrije.1 mM kompleks Mn(II) izazvan je sa 25 mM Zn(OTf)2u 50 mM MES puferu (pH 6,00). Podaci za r2su odgovarali donjoj jednačini

Sinteza

[0084] Materijali i instrumenti. Sve hemikalije i rastvarači su nabavljeni na tržištu i korišćeni bez daljeg prečišćavanja. NMR spektri zabeleženi su na Varian spektrometrima od 500 MHz ili 400 MHz. Hemijski pomaci su zabeleženi u δ (ppm). Kod<1>H i<13>C NMR spektara, rezidualni pikovi rastvarača su korišćeni kao interna referenca, osim kod<13>C NMR liganda, gde je tercijarni butanol korišćen kao interna referenca. Tečna hromatografija-elektrosprej masena spektrometrija (LC-MS) izvedena je korišćenjem aparata serije Agilent 1100 sa LC/MSD zamkom i Daly konverzionim dinodnim detektorom sa UV detekcijom na 220, 254 i 280 nm. Metode koje se koriste na ovom sistemu su sledeće: (a) kolona Luna C18 (100 x 2 mm); eluent A: H2O/0,1% mravlja kiselina, B: MeCN/0,1% mravlja kiselina; gradijent: 5% B do 95% B tokom 9 minuta; protok 0,8 ml/min (koristi se za karakterizaciju organskih jedinjenja) i (b) kolona Kromasil C18 (250 x 4,6 mm); eluent C: 95% MeCN/5% 10 mM amonijum acetata, D: 10 mM amonijum acetat; gradijent od 5% C do 8% C tokom 14 minuta; protok 0,8 ml/min (koristi se za karakterizaciju kompleksa mangana). Semipreparativno reverzno fazno prečišćavanje je izvedeno na HPLC sistemu Rainin Dynamax sa UV detekcijom na 254 nm, koristeći kolonu Polaris C18. Metoda koja se koristi za prečišćavanje je sledeća: Mobilna faza A je 50 mM amonijum acetatni pufer, pH 6,5, a mobilna faza B smeša 5% 50 mM amonijum acetatnog pufera, pH 6,5/95% MeCN. Počevši od 5% B, frakcija B povećala se na 8% tokom 23 minuta. Kolona je ispirana sa 100% B tokom 2 minuta, a zatim prebačena na 5% B. Sistem je ponovo ekvilibrisan na 5% B tokom 3 minuta. Merenja relaksivnosti izvršena su na Bruker mq60 Minispec na 1,4 T i 37 °C. Koncentracija mangana određena je pomoću ICP-MS sistema Agilent 7500a. Svi uzorci su razređeni sa 0,1% Triton X-100 u 5% azotnoj kiselini koja sadrži 20 ppb Lu (kao interni standard). Odnos Mn (54,94)/Lu (174,97) korišćen je za kvantifikaciju

1

koncentracije mangana. Linearna kalibraciona kriva u rasponu od 0,1 ppb do 200 ppb generisana je svakodnevno za kvantifikaciju. UV-Vis spektri snimljeni su na spektrofotometru SpectraMax M2 upotrebom kvarcne kivete dužine puta od 1 cm. pH je izmeren pomoću pH-metra ThermoOrion povezanog sa staklenom elektrodom VWR Symphony.

[0085] Sinteza 2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksibenzil)amino)etil)azandiil)disirćetne kiseline (HBET) (3) prikazana je na slici 6.

[0086] terc-Butil (2-((2-hidroksibenzil)amino)etil)karbamat (1): U rastvor salicilaldehida (12 mmol, 1,465 g) u 90 ml metanola dodat je rastvor terc-butil N-(2-aminoetil)karbamata (12 mmol, 1,923 g) u metanolu (30 ml), i rastvor je mešan 1 sat. U ovaj rastvor uz mešanje je dodat čvrsti NaBH<4>(24 mmol, 0,908 g). Uočeno je brzo razvijanje gasa, i rastvor je od bledožute postao bezbojan. Nakon 3 sata mešanja, sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, i dobijena je bela čvrsta supstanca. Ostatak je rastvoren u 200 ml CH2Cl2i ekstrahovan sa 200 ml zasićenog rastvora NaHCO3. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(2 x 100 ml). Sve organske supstance su spojene, isprane zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušene iznad bezvodnog MgSO4. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom, dajući 1 kao bledožutu čvrstu supstancu (2,116 g, 97%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.16 (t, J = 7.65 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.48 Hz, 1H) 6.83 (d, J= 8.13 Hz, 1H), 6.77 (t, J = 7.41 Hz, 1 H), 4.01 (s, 2H), 3.30 (m, 2H2.79 (t, J= 5.82 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm): 157.9,156.2, 128.5, 128.3, 122.4, 118.9, 116.1, 79.2, 52.1, 48.2, 39.8, 28.3 Molekulska masa C14H22N2O3: 266,34. MS (ESI) m/z:Izračunato: 267,17 (M+H)<+>nađeno: 267,1.

[0087] di-terc-butil 2,2'(2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-((terc-butil dimetilsilil)oksi)-benzil)amino)etil)azandiil)diacetat (2): Jedinjenje 1 (7,94 mmol, 2 116 g) rastvoreno je u CH2Cl2(100 ml), a zatim je dodato 50 ml trifluorsirćetne kiseline. Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući kvantitativno slobodni amin u obliku bele čvrste supstance, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

[0088] Balon s okruglim dnom koji sadrži amin napunjen je azotom, dodat je suvi CH2Cl2(80 ml), i ohlađen je u ledenom kupatilu. Uz protok argona, dodat je N,N-diizopropiletilamin

2

(39,70 mmol, 6,91 ml), a zatim terc-butildimetilsilil hlorid (8,73 mmol, 1,315 g) kao rastvor u CH2Cl2(10 ml). Rastvor je ostavljen da se zagreje na sobnu temperaturu i mešan 5 sati. Reakcija je ohlađena na 0 °C i u kapima je dodat terc-butil brom acetat (24,61 mmol, 3,63 ml), i reakcija je mešana 18 sati u atmosferi azota. Rastvor je razblažen dodatkom CH2Cl2(200 ml) i ispran zasićenim rastvorom NaHCO3(3 x 200 ml), zasićenim rastvorom soli (1 x 200 ml). Sve organske supstance su spojene i osušene iznad bezvodnog magnezijum sulfata, i uparene pod sniženim pritiskom dajući sirovo žuto ulje. Proizvod je prečišćen kao bezbojno ulje (1,234 g, 25%) pomoću hromatografije na koloni (eluent – heksan/etil acetat, 9:1).<1>H NMR (400 MHz, CDCl2) δ (ppm): 7.43 (dd, J1= 1.31 Hz, J2= 7.57, 1 H), 7.04 (dt, J1= 1.71 Hz, J2= 7.80, 1 H), 6.88 (t, J = 7.51 Hz, 1 H), 6.72 (d, J = 7.93 Hz, 1 H), 3.76 (s, 2H), 3.40 (s, 4H), 3.29 (s, 2H), 2.81 (m, 4H), 1.41 (s, 9H), 1.40 (s, 18H), 0.98 (s, 9H), 0.18 (s, 6H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl2) δ (ppm): 171.1, 170.7, 153.7, 130.1, 129.8, 127.4, 121.1, 118.4, 80.6, 80.4, 56.1, 55.9, 52, 52.4, 28.2, 25.9, 18.3, 4.1. Molekulska masa C33H58SN207Si: 622,91. MS (ESI) m/z: Izračunato: 623.41 (M+H)<+>nađeno: 623.4.

[0089] 2,2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksibenzil)amino)etil)azandiil)disirćetna kiselina (HBET) (3): Jedinjenje 2 (1,98 mmol, 1,234 g) rastvoreno je u trifluorsirćetnoj kiselini (40 ml), pa je dodat triizopropilsilan (2,35 ml), 1-dodekantiol (2,35 ml) i voda (2,35 ml). Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml), i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana dajući kvantitativno (3) u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (500 MHz, D20) δ (ppm): 7.44 (m, 2H, Ar-H), 7.03 (m, 2H) 4.57 (s, 2H), 4.04 (s, 2H), 3.66 (s, 4H), 3.54 (t, J = 6.09 Hz, 2H), 3.35 (t, J = 5.9 Hz, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, D20) δ (ppm): 174.1, 169.9, 156.3, 133.6, 133.0, 121.5, 116.6, 116.3, 55.6, 54.8, 52.0, 49.9. Molekulska masa C15H20N2O7: 340,33. MS (ESI) m/z: Izračunato: 341.13 (M+H)<+>; nađeno: 341.1.

[0090] Na2[Mn<II>HBET] (4): Jedinjenje 3 (0,26 mmol, 0,089 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,26 mmol, 0,051 g), i pH je pažljivo podešen na 5. Reakcija je mešana 1 sat, filtrirana i liofilizovana, dajući belu čvrstu supstancu. Kompleks je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i obesoljen upotrebom ranije opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 4 kao belu čvrstu supstancu (0,095 g, 84%). Molekulska masa C15H18MnN2O7: 393,25. MS (ESI) m/z: Izračunato: 394.26 (M+3H)<+>nađeno: 394.1.

[0091] Na[Mn<III>HBET] (5): Jedinjenje 3 (0,15 mmol, 0,05 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,15 mmol, 0,030 g) i pH je podešen na 12. Rastvor je ostavljen da se meša 1 sat. Rastvor je zatim filtriran kroz filter od 0,45 µm da bi se uklonio MnO2, pH je podešen na 11, i rastvor je mešan 18 sati. Reakcija je praćena pomoću analitičke LC-MS, i reakcija je zaustavljena kada je uočeno 70% konverzije u Mn<III>. Smeša je injektovana na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i prečišćena upotrebom ranije opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 5 kao smeđu čvrstu supstancu (0,023 g, 38%). Molekulska masa C15H17MnN2O7: 392,24. MS (ESI) m/z: Izračunato: 393.25 (M+2H)<+>nađeno: 393.1.

[0092] terc-Butil (2-((2-hidroksi-5-metoksibenzil)aminoetil)karbamat (6): U rastvor 2-hidroksi-5-metoksibenzaldehida (12 mmol, 1,826 g) u 90 ml metanola, dodat je rastvor tercbutil N-(2-aminoetil)karbamata (12 mmol, 1,923 g) u metanolu (30 ml), i rastvor je mešan 1 sat. U ovaj rastvor uz mešanje je dodat čvrsti NaBH<4>(24 mmol, 0,908 g). Uočeno je brzo razvijanje gasa, i rastvor je od bledožute postao bezbojan. Nakon 3 sata mešanja, sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, i dobijena je bela čvrsta supstanca. Ostatak je rastvoren u 200 ml CH2Cl2i ekstrahovan sa 200 ml zasićenog rastvora NaHCO3. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(2 x 100 ml). Sve organske supstance su spojene, isprane zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušene iznad bezvodnog MgSO4. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom, dajući 6 kao bledožutu čvrstu supstancu (3,485 g, 98%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6.76 (m, 1H) 6.72 (m, 1H), 6.57 (d, J = 2.91 Hz, 1 H), 5.30 (s, 1 H), 3.97 (s, 2H), 3.73 (s, 3H), 3.28 (m, 2H), 2.78 (t, J = 5.72 Hz, 2H), 1.44 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl2) δ (ppm): 156.2, 152.3, 151.7, 123.1, 116.5, 114.2, 113.5, 79.3, 55.6, 52.2, 48.3, 39.9, 28.. Molekulska masa C15H24N2O4: 296,36. MS (ESI) m/z: Izračunato: 297.37 (M+H)<+>; nađeno: 297.4.

[0093] di-terc-butil 2,2'-((2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-((terc-butil dimetilsilil) oksi)-5-metoksibenzil)amino)etil)azandiil)diacetat (7): Jedinjenje 6 (8,00 mmol, 2,371 g) rastvoreno je u CH2Cl2(100 ml), a zatim je dodato 50 ml trifluorsirćetne kiseline. Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući kvantitativno slobodni amin u obliku bledožute čvrste supstance, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

4

[0094] Balon s okruglim dnom koji sadrži amin napunjen je azotom, dodat je suvi CH2Cl2(80 ml), i ohlađen je u ledenom kupatilu. Uz protok argona, dodat je N,N-diizopropiletilamin (40,00 mmol, 6,97 ml), a zatim terc-butildimetilsilil hlorid (8,80 mmol, 1,326 g) kao rastvor u CH2Cl2(10 ml). Rastvor je ostavljen da se zagreje na sobnu temperaturu i mešan 5 sati. Reakcija je ohlađena na 0 °C i u kapima je dodat terc-butil brom acetat (24,80 mmol, 3,66 ml), i reakcija je mešana 18 sati u atmosferi azota. Rastvor je razblažen dodatkom CH2Cl2(200 ml) i ispran zasićenim rastvorom NaHCO3(3 x 200 ml), zasićenim rastvorom soli (1 x 200 ml). Sve organske supstance su spojene i osušene iznad bezvodnog magnezijum sulfata, i uparene pod sniženim pritiskom dajući sirovo žuto ulje. Proizvod je prečišćen kao bezbojno ulje (1,462 g, 28%) pomoću hromatografije na koloni (eluent – heksan/etil acetat, 9:1).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.04 (d, J = 3.26 Hz, 1 H), 6.62 (m, 1 H), 6.57 (m, 1 H), 3.71 (s, 2H), 3.70 (s, 3H), 3.40 (s, 4H,), 3.27 (s, 2H), 2.79 (m, 4H), 1.40 (s, 9H), 1.37 (s, 18H), 0.94 (s, 9H), 0.13 (s, 6H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl2) δ (ppm): 171., 170.8, 154.1, 147.4, 130.8, 119.2, 114.7, 113.0, 80.8, 80.6, 56.3, 56.1, 55.6, 53.1, 52.8, 52.7, 28.3, 28.2, 26.0, 18.4. Molekulska masa C34H60N2O8Si: 652,93. MS (ESI) m/z: Izračunato: 653.94 (M+H)<+>; nađeno: 653.9.

[0095] 2,2'-(2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-metoksibenzil)amino)etil)azandiil)disirćetna kiselina (HBET-OMe) (8): Jedinjenje 7 (2,24 mmol, 1,462 g) rastvoreno je u trifluorsirćetnoj kiselini (40 ml), a zatim je dodat triizopropilsilan (2,35 ml), 1-dodekantiol (2,35 ml) i voda (2,35 ml). Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana dajući kvantitativno 8 u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm): 7.02 (m, 2H) 6.95 (m, 1H) 4.52 (5, 2H), 4.09 (s, 2H), 3.80 (s, 3H), 3.58 (s, 4H), 3.48 (m, 2H), 3.26 (m, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, D2O) δ (ppm): 173.6, 169.0, 152.5, 149.6, 117.9, 117.6, 117.0, 116.4, 55.9, 54.8, 51.5, 49.0. Molekulska masa C16H22N2O8: 370,35. MS (ESI)m/z: Izračunato: 37136 (M+H)<+>nađeno: 371.4.

[0096] Na2[Mn<II>HBET-OMe] (9): Jedinjenje 8 (0,23 mmol, 0,085 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,23 mmol, 0,046 g), i pH je pažljivo podešen na 5. Reakcija je mešana 1 sat, filtrirana i liofilizovana, dajući belu čvrstu supstancu. Kompleks je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i obesoljen upotrebom ranije opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 9 kao belu čvrstu supstancu (0,090 g, 81%). Molekulska masa C16H22MnN2O8: 423,28. MS (ESI) m/z: Izračunato: 424.28 (M+3H)<+>; nađeno: 424.3.

[0097] terc-Butil (2-((2-hidroksi-5-nitrobenzil)amino)etil)karbamat (10): U rastvor 2-hidroksi-5-nitrobenzaldehida (3,51 mmol, 0,587 g) u 60 ml metanola, dodat je rastvor tercbutil N-(2-aminoetil)karbamata (3,51 mmol, 0,562 g) u metanolu (30 ml), i rastvor je mešan 1 sat. U ovaj rastvor uz mešanje je dodat čvrsti NaBH4(7,02 mmol, 0,266 g). Uočeno je brzo razvijanje gasa, i rastvor je od bledožute postao bezbojan. Nakon 3 sata mešanja, sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, i dobijena je bela čvrsta supstanca. Ostatak je rastvoren u smeši rastvarača od 10 ml metanola i 200 ml CH2Cl2i ekstrahovan sa 200 ml zasićenog rastvora NaHCO3. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(2 x 100 ml). Sve organske supstance su spojene, isprane zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušene iznad bezvodnog MgSO4. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom dajući 10 kao žutu čvrstu supstancu (1,01 g, 93%).<1>H NMR (500 MHz, (CD3)2SO) δ (ppm): 8.01 (d, J = 3.0 Hz, 1 H) 7.92 (dd, J1= 3.00 Hz, J2= 9.2 Hz, 1 H), 6.92 (t, J = 5.8 Hz, 1 H), 6.46 (d, J = 9.2 Hz, 1 H), 3.93 (s, 2H), 3.14 (m, 2H), 2.75 (t, J = 6.3 Hz, 2H), 1.38 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm): 172.1, 155.7, 133.6, 126.1, 126.0, 121.9, 117.3, 77.9, 48.7, 46.7, 37.9, 28.2. Molekulska masa C14H21N3O5: 311,33. MS (ESI) m/z: Izračunato: 312.34 (M+H)<+>; nađeno: 312.4.

[0098] di-terc-butil 2,2'-((2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-((terc-butil dimetilsilil)oksi)-5-nitrobenzil)amino)etil)azandiil)diacetat (11): Jedinjenje 10 (3,24 mmol, 1,01 g) rastvoreno je u CH2Cl2(100 ml), a zatim je dodato 50 ml trifluorsirćetne kiseline. Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući kvantitativno slobodni amin u obliku bledožute čvrste supstance, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

[0099] Balon s okruglim dnom koji sadrži amin napunjen je azotom, dodat je suvi dimetilformamid (40 ml), i ohlađen je u ledenom kupatilu. Uz protok argona, dodat je N, N-diizopropiletilamin (16,2 mmol, 2,82 ml), a zatim terc-butildifenilsilil hlorid (3,56 mmol, 0,979 g) kao rastvor u dimetilformamidu (5 ml). Rastvor je ostavljen da se zagreje na sobnu temperaturu i mešan 5 sati. Reakcija je ohlađena na 0 °C i u kapima je dodat terc-butil brom acetat (10,04 mmol, 1,48 ml), i reakcija je mešana 18 sati u atmosferi azota. Rastvor je razblažen dodatkom CH2Cl2(200 ml) i ispran zasićenim rastvorom NaHCO3(3 x 200 ml), zasićenim rastvorom soli (1 x 200 ml). Sve organske supstance su spojene i osušene iznad bezvodnog magnezijum sulfata, i uparene pod sniženim pritiskom dajući sirovo žuto ulje. Proizvod je prečišćen kao bezbojno ulje (0,615 g, 24%) pomoću hromatografije na koloni (eluent – heksan/etil acetat, 9:1).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ (ppm): 8.50 (d , J = 2.9 Hz, 1 H), 7.67 (m, 5H), 7.45 (m, 1H), 7.39 (m, 5H), 6.40 (d , 2H, J = 2.9 Hz, 1 H), 4.08 (s, 2H), 3.48 (s, 4H), 3.44 (s, 2H), 2.93 (s, 4H), 1.48 (s, 9H), 1.43 (s, 18H), 1.1194 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (100 MHz, CDCl3) δ (ppm): 170.8, 159.0, 142.1, 135.3, 131.4, 130.5, 128.2, 125.6, 123.3, 118.7, 81.1, 81.0, 56.5, 56.2, 53.0, 52.8, 52.7, 28.2, 26.5, 19.7. Molekulska masa C43H61N3O9Si: 792,04. MS (ESI) m/z:Izračunato: 793.05 (M+H)<+>, nađeno: 793.1.

[0100] 2,2-((2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-nitrobenzil)amino)etil)azandiil)disirćetna kiselina (HBET-NO2) (12): Jedinjenje 11 (0,776 mmol, 0,615 g) rastvoreno je u trifluorsirćetnoj kiselini (40 ml), a zatim je dodat triizopropilsilan (2,35 ml), 1-dodekantiol (2,35 ml) i voda (2,35 ml). Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana dajući kvantitativno 12 u obliku bele čvrste supstance.<1>H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm): 8.33 (m, 1H), 8.22 (m, 1H), 7.06 (d, J = 9.0 Hz, 1 H), 4.57 (s, 2H), 4.07 (s, 2H), 3.60 (s, 4H), 3.49 (m, 2H), 3.27 (m, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, D2O) δ (ppm): 173.5, 169.1, 162.2, 140.1, 129.1, 128.0, 116.7, 116.0, 54.8, 54.0, 51.9, 49.2. Molekulska masa C15H19N3O9: 385,33. MS (ESI) m/z:Izračunato: 386.33 (M+H)<+>; nađeno: 386.4.

[0101] Na2[Mn<II>HBET-NO2] (13): Jedinjenje 12 (0,25 mmol, 0,096 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,25 mmol, 0,049 g), i pH je pažljivo podešen na 5. Reakcija je mešana 1 sat, filtrirana i liofilizovana, dajući belu čvrstu supstancu. Kompleks je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i obesoljen upotrebom ranije opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 13 kao svetložutu čvrstu supstancu (0,102 g, 82%). Molekulska masa C15H17MnN3O9: 438,25. MS (ESI) m/z: Izračunato: 439.26 (M+3H)<+>; nađeno: 439.4.

[0102] Na[Mn<III>HBET-NO2] (14): MnF3(0,006 g, 0,054 mmol) dodat je u 12 (0,021 g, 0,054 mmol) uz mešanje u 5 ml H2O na pH 8. Dobijeni crvenonarandžasti rastvor je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i prečišćen upotrebom ranije opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 14 kao smeđu čvrstu supstancu (0,012 g, 0,026 mmol, 48%).

Molekulska masa C19H21MnN3O9: 436,23. MS (ESI) m/z: Izračunato: 436.02 (M)-; nađeno: 436

[0103] trans-1,2 diaminocikloheksanaminijum hlorid (15): U rastvor trans-1,2 diaminocikloheksana (48 mmol, 5,523 g) u 200 ml etra u kapima je dodato 20,4 ml 2 M HCl u etru uz protok azota. Reakcija je mešana 2 sata, a za to vreme proizvod je nastao kao beli talog. Talog je sakupljen i ispran velikom količinom etra. Prinos: 97% (7,05 g).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 2.67 (m), 2.04 (m, 2H1.78 (m, 2H), 1.35 (m, 4H). Molekulska masa C6H14N2: 114,19. MS (ESI) m/z:Izračunato: 115.2 (M+H)<+>; nađeno: 115.4.<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 56.1, 33.7, 25.6. Molekulska masa C6H14N2: 114,19. MS (ESI) m/z: Izračunato: 115.2 (M+H)<+>; nađeno: 115.4.

[0104] trans-2-((terc-butoksikarbonil)amino)cikloheksanaminijum hlorid (16) (videti sl.

19): U rastvor jedinjenja 15 (10 mmol, 1,507 g) u 90 ml metanola, u kapima je dodat rastvor di-terc-butil dikarbonata (9,1 mmol, 1,986 g) u metanolu (30 ml) tokom 1 sata. Nakon 18 sati mešanja, sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, i proizvod je dobijen kao žućkastobela čvrsta supstanca. Čvrsta supstanca je isprana velikom količinom dihlormetana kako bi se uklonila neizreagovala polazna supstanca. Prinos: 97% (2,21 g).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 3.07 (s, 1H), 2.40 (s, 1H), 1.91 (m, 2H), 1.70 ((m, 2H), 1.44 (s, 9H), 1.28 (m, 2H), 1.19 (m, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, CD3OD) δ (ppm): 156.7, 79.3, 54.3, 52.4, 31.6, 29.7, 27.4, 24., 23.6. Molekulska masa C11H22N2O2: 214,30. MS (ESI) m/z: Izračunato: 215.3 (M+H)<+>; nađeno: 215.4.Molekulska masa C11H22N2O2: 214,30. MS (ESI) m/z: Izračunato: 215.3 (M+H)<+>; nađeno: 215.4.

[0105] terc-Butil (trans-2-((2-hidroksibenzil)amino)cikloheksil)karbamat (17): U rastvor jedinjenja 16 (3,99 mmol, 1,001 g) u 90 ml MeOH, dodat je NEt3(4,39 mmol, 0,6 ml), i reakcija je mešana 30 minuta. U gornju smešu dodat je rastvor salicilaldehida (3,99 mmol, 0,487 g) u metanolu (30 ml). Nakon 1 sata mešanja, dodat je čvrsti NaBH<4>(8,38 mmol, 0,317 g), i reakcija je mešana 3 sata. Sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, dajući bledožutu čvrstu supstancu. Ostatak je rastvoren u 200 ml CH2Cl2i ekstrahovan sa 200 ml zasićenog rastvora NaHCO3. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(2 x 100 ml). Sve organske supstance su spojene, isprane zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušene iznad bezvodnog MgSO4. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom, dajući 17 kao bledožutu čvrstu supstancu (1,231 g, 96%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 7.15 (m, 1H), 6.96 (m, 1H), 6.81 (m, 1H), 6.75 (m, 1H), 4.43 (s, 1H), 4.05 (d, 1 H), 3.93 (d, 1H), 3.41 (s, 1H), 2.31 (m, 1H) 2.17 (m, 1 H), 1.99 (m, 1H), 1.70 (m, 2H), 1.46 (s, 9H), 1.31 (m, 1 H), 1.17 (m, 2H).

<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, CDCl3) δ (ppm): 158.3, 156.0, 128.4, 128.0, 123.1, 118.7, 116.3, 79.4, 60.9, 53.9, 49.8, 33.0, 31.2, 28.3, 24.9, 24.5. Molekulska masa C18H28N2O3: 320,43. MS (ESI) m/z: Izračunato: 321.43 (M+H)<+>; nađeno: 321.5.

[0106] di-terc-butil 2,2'-((trans-2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-hidroksibenzil)amino)cikloheksil)azandiil)diacetat (18) Jedinjenje 17 (3,15 mmol, 1,01 g) rastvoreno je u CH2Cl2(100 ml), a zatim je dodato 50 ml trifluorsirćetne kiseline. Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući kvantitativno slobodni amin u obliku bledožute čvrste supstance, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

[0107] U balon s okruglim dnom koji sadrži amin dodat je KI (6,3 mmol, 1,04 g), i sistem je pročišćen azotom. Uz protok azota, dodat je suvi dimetil formamid (2 ml), a zatim N,N diizopropil etilamin (15,75 mmol, 2,74 ml), i ukapan je terc-butil brom acetat (9,765 mmol, 1,90 g). Reakcija je mešana 18 sati, a zatim je podeljena između zasićenog NaHCO3 (vod.)i Et2O. Sloj Et2O je odvojen i ispran sa nekoliko izmena H2O da se ukloni DMF pre sušenja iznad Na2SO4i koncentrovan do 1,0 g žutog ulja. Molekulska masa C31H50N2O7: 562,74. MS (ESI) m/z: Izračunato: 563.75 (M+H)<+>; nađeno: 563.8. Sirovi proizvod je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

[0108] 2,2'-((trans-2-((karboksimetil)(2-hidroksibenzil)amino)cikloheksil)azandiil)disirćetna kiselina (19): Sirovi proizvod (17) iz prethodnog koraka rastvoren je u trifluorsirćetnoj kiselini (40 ml), a zatim je dodat triizopropilsilan (2,35 ml).1-dodekantiol (2,35 ml) i voda (2,35 ml). Reakcija je mešana 5 sati, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući sirovo jedinjenje 19.

Proizvod je zatim prečišćen preparativnom HPLC upotrebom kolone Polaris C18; eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 5% do 50% B tokom 25 minuta; protok: 15 ml/min. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 19 kao belu čvrstu supstancu (0,510 g, 72%).<1>H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm): 7.45 (m, 1 H), 7.37 (m, 1H), 6.98 (m, 2H), 4.42 (s, 2H), 4.17 (d, 1H), 3.90 (d, 1H), 3.51 (br, 2H), 3.35 (br, 1 H), 3.24 (br, 1 H), 3.00 (br, 1 H), 2.91 (br, 1 H), 2.33 - 1.12 (8H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, D2O) δ (ppm): 174.5, 170.4, 156.1, 133.3, 132.9, 121.9, 117.1, 116.6, 62.0, 59.6, 53.8, 52.3, 51.0, 48.3, 24.4. Molekulska masa C19H26N2O7: 394,42. MS (ESI) m/z: Izračunato: 395.43 (M+H)<+>; nađeno: 395.5.

[0109] Na2[Mn<II>cycHBET] (20): Jedinjenje 19 (0,26 mmol, 0,103 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,26 mmol, 0,051 g), i pH je pažljivo podešen na 5. Reakcija je mešana 1 sat, filtrirana i liofilizovana, dajući belu čvrstu supstancu. Kompleks je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i obesoljen pomoću gore opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 20 kao belu čvrstu supstancu (0,106 g, 80%). Molekulska masa C19H24MnN2O7447,34. MS (ESI) m/z: Izračunato: 448.35 (M+3H)<+>; Nađeno: 448.4.

[0110] Na[Mn<III>cycHBET] (21): Jedinjenje 18 (0,15 mmol, 0,06 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,15 mmol, 0,030 g) i pH je podešen na 12. Rastvor je ostavljen da se meša 1 sat. Rastvor je zatim filtriran kroz filter od 0,45 µm da bi se uklonio MnO2, pH je podešen na 11, i rastvor je mešan 18 sati. Reakcija je praćena pomoću analitičke LC-MS, i reakcija je zaustavljena kada je uočeno 70% konverzije u Mn<III>. Smeša je prečišćena preprarativnom HPLC, kako je gore opisano. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 21 kao smeđu čvrstu supstancu (0,023 g, 31%). Molekulska masa C19H23MnN2O7: 446,33. MS (ESI) m/z: Izračunato: 447.34 (M+2H)<+>; nađeno: 447.4.

[0111] terc-Butil (2-((2-hidroksi-5-metoksibenziliden)amino)cikloheksil)karbamat (22): trans-2-((terc-butoksikarbonil)amino)cikloheksan (1,30 mmol, 0,279 g) i 2-hidroksi-5-metoksibenzaldehid (1,35 mmol, 0,206 g) mešani su zajedno u 12 ml MeOH na sobnoj temperaturi. U roku od nekoliko minuta, obilni talog je pao iz jarkožutog rastvora. Nakon 90 min mešanja, 30 ml H2O je dodato u smešu, i 0,342 g (0,98 mmol, 76%) 22 je izolovano filtracijom.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 12.78 (s, 1H), 8.28 (s, 1H), 6.90 (d, 1H), 6.76 (d), 4.63 (s, 1H), 3.73 (s, 3H) 3.57 (s, 1H), 3.03 (s, 1H), 2.06 (m, 1H), 1.90 (m, 3H), 1.76 (t, 2H), 1.68 (q, 1H), 1.41 (m, 2H), 1.30 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHz, CDCl3) δ (ppm): 163.3, 155.4, 155.3, 151.9, 119.3, 118.5, 117.8, 115.0, 79.3, 72.7, 56.1, 54.2, 33.3, 31.6, 28.2, 24.8, 24.0. Molekulska masa C19H28N2O4: 348,44. MS (ESI) m/z: Izračunato: 349.21 (M+H)<+>; nađeno: 349.2

4

[0112] terc-Butil trans(2-((2-hidroksi-5-metoksibenzil)amino)cikloheksil)karbamat (23) (videti sl. 19): NaBH<4>(51 mg, 1,35 mmol) dodat je u porcijama u 22 (0,342 g, 0,98 mmol) uz mešanje, u 20 ml MeOH na sobnoj temperaturi. Za nekoliko minuta, žuta boja rastvora je pobledela do bledobež boje. Nakon 2 sata, rastvor je koncentrovan do suva, prenet u CH2Cl2i temeljno ispran pomoću H2O i zasićenog rastvora soli. Organski deo je ispran, osušen iznad MgSO4i koncentrovan do 23, izolovan kao bež čvrsta supstanca (0,179 g, 0,51 mmol, 52%).

<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6.72 (m, 2H), 6.54 (s, 1H), 4.53 (br s, 1H), 3.94 (dd, 2H), 3.38 (br s, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.13 (m, 1H), 1.97 (m ,1H), 1.69 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.31-1.15 (m, 4H). Molekulska masa C19H30N2O4: 350,22. MS (ESI) m/z: Izračunato: 351.23 (M+H)<+>; nađeno: 351.3.

[0113] 2-(((trans-2-aminocikloheksil)amino)metil)-4-metoksifenol (24): Jedinjenje 23 (0,179 g, 0,51 mmol) rastvoreno je u 5 ml svakog od rastvarača CH2Cl2/TFA tokom 5 sati. Rastvor je zatim koncentrovan do suva, rastvoren u 50 ml CH2Cl2i mešan iznad viška K2CO3(s)tokom 12 sati. K2CO3je uklonjen filtracijom, i matični lug je koncentrovan do 24 kao bledožuto ulje u kvantitativnom prinosu.<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 6.70 (m, 2H), 6.56 (s, 1H), 3.91 (dd, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.39 (br t, 1H), 2.10 (m, 2H), 1.79 (m, 1H), 1.66 (m, 2H), 1.28-1.06 (m, 4H)<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHz, CDCl3) δ (ppm): 152.4, 152.0, 124.5, 116.7, 114.0, 113.3, 63.8, 55.9, 55.8, 50.3, 37.0, 30.9, 25.3, 24.9. Molekulska masa C14H22N2O2: 250,34. MS (ESI) m/z: Izračunato: 251.37 (M+H)<+>; nađeno: 251.1.

[0114] 2,2'-((trans-2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-hidroksi-5-metoksibenzil)amino)cikloheksil)azandiil)diacetat (25): U jedinjenje 24 (0,161 g, 0,64 mmol) mešano u 3 ml DMF sa kalijum jodidom (0,078 g, 0,47 mmol) i diizopropil etilaminom (0,432 g, 3,34 mmol) dodat je<t>Bu brom acetat (0,399 g, 2,05 mmol) na sobnoj temperaturi. Iz bledosmeđeg rastvora brzo je nastao beli talog. Nakon 4 sata mešanja, rastvor je razblažen sa 100 ml Et2O, ispran rastvorom Na2CO3 (vod.), većom količinom H2O i zasićenim rastvorom soli. Organski sloj je koncentrovan do suva i prečišćen na reverzno faznoj koloni C18 (Polaris): eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 60% do 95% B tokom 25 minuta; protok: 20 ml/min. Frakcije su liofilizovane, nakon čega su prenete u 50 ml CH2Cl2i mešane iznad K2CO3 (s)tokom 6 h. Filtrat je koncentrovan, dajući 25. (0,095 g, 0,17 mmol, 26%).<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) δ (ppm): 9.53 (br s, 1H), 6.73 (m, 2H), 6.57 (d, 1H), 4.21 (d, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.67 (d, 1H), 3.44 (m, 5H), 3.24 (d, 1H), 2.77 (t, 1H), 2.59 (t, 1H), 2.03 (m, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.44 (2 s, 18H i 9H), 1.23 (m, 1H), 1.03 (m, 3H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHz, CDCl3) δ (ppm): 171.7, 171.3, 152.2, 151.9, 123.5, 116.7, 115.6, 113.7, 81.4, 80.8, 63.7, 59.6, 55.8, 55.5, 52.8, 28.2, 28.1, 25.8, 25.6 (U ovim spektrima nije moguće naći jedan C, verovatno se podudara sa drugim pikom). Molekulska masa C32H52N2O8: 592,76. MS (ESI) m/z: Izračunato: 593.4 (M+H)<+>; nađeno: 593.5.

[0115] 2,2'-((2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-metoksibenzil)amino)cikloheksil)azandiil)disirćetna kiselina (26): Jedinjenje 25 (0,095 g, 0,224 mmol) rastvoreno je u 3 ml svakog od rastvarača CH2Cl2:TFA. Nakon 6 h mešanja, reakciona smeša je koncentrovana dajući 26 kao belu čvrstu supstancu. Molekulska masa C20H28N2O8: 424,44 MS (ESI) m/z: Izračunato: 425.19 (M+H)<+>; nađeno: 425.2.

[0116] terc-butil (trans-2-((2-nitrobenzil)amino)cikloheksil)karbamat (27): U rastvor jedinjenja 16 (3,99 mmol, 1,001 g) u 90 ml MeOH, dodat je NEt3(4,39 mmol, 0,6 ml), i reakcija je mešana 30 minuta. U gornju smešu je dodat rastvor 2-hidroksi-5-nitrobenzaldehida (3,99 mmol, 0,667 g) u metanolu (30 ml). Nakon mešanja tokom 1 h, dodat je čvrsti NaBH<4>(8,38 mmol, 0,317 g) i reakcija je mešana 3 sata. Sve isparljive supstance su uklonjene pod sniženim pritiskom, dajući bledožutu čvrstu supstancu. Ostatak je rastvoren u 200 ml CH2Cl2i ekstrahovan sa 200 ml zasićenog rastvora NaHCO3. Vodeni sloj je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(2 x 100 ml). Sve organske supstance su spojene, isprane zasićenim rastvorom soli (200 ml) i osušene iznad bezvodnog MgSO4. Rastvarač je uparen pod sniženim pritiskom, dajući 27 kao bledožutu čvrstu supstancu (1,231 g, 96%).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ (ppm): 8.05 (m, 1H), 7.91 (m, 1H), 6.81 (m, 1H), 4.48 (d, 1H), 4.08 (m, 2H), 3.42 (d, 1H), 2.31 (m, 1H), 2.13 (m, 1H), 1.98 (m, 1H), 1.75 (m, 2H), 1.45 (s, 9H), 1.17 (m, 3H). Molekulska masa C18H27N3O5: 365,42. MS (ESI) m/z: Izračunato: 366.42 (M+H)<+>; nađeno: 366.5.

[0117] di-terc-butil 2,2'-((trans-2-((2-(terc-butoksi)-2-oksoetil)(2-hidroksi-5-nitrobenzil)amino)cikloheksil)azandiil)diacetat (28) (videti sl. 19): Jedinjenje 27 (3,15 mmol, 1,15 g) rastvoreno je u CH2Cl2(100 ml), a zatim je dodato 50 ml trifluorsirćetne kiseline. Reakcija je mešana 5 h, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući kvantitativno slobodni amin u obliku bledožute čvrste supstance, koja je korišćena u narednoj reakciji bez daljeg prečišćavanja.

[0118] U balon s okruglim dnom koji sadrži amin dodat je Kl (6,3 mmol, 1,04 g), i sistem je pročišćen azotom. Uz protok azota, dodat je suvi dimetil formamid (2 ml), a zatim N,N diizopropil etilamin (15,75 mmol, 2,74 ml) i ukapan je terc-butil brom acetat (9,765 mmol, 1,90 g). Reakcija je mešana 18 sati, a zatim je podeljena između zasićenog NaHCO3 (vod.)i Et2O. Sloj Et2O je odvojen i ispran sa nekoliko izmena H2O da se ukloni DMF pre sušenja iznad Na2SO4i koncentrovan do 0,73 g žutog ulja. Molekulska masa C31H49N3O9: 607,74. MS (ESI) m/z: Izračunato: 608.74 (M+H)<+>; nađeno: 608.9. Sirovi proizvod je prenet u sledeći korak bez daljeg prečišćavanja.

[0119] 2.2'-((trans-2-((karboksimetil)(2-hidroksi-5-nitrobenzil)amino)cikloheksil)azandiil)disirćetna kiselina (29): Sirovi proizvod (28) iz prethodnog koraka rastvoren je u trifluorsirćetnoj kiselini (40 ml), a zatim je dodat triizopropilsilan (2,35 ml), 1-dodekantiol (2,35 ml) i voda (2,35 ml). Reakcija je mešana 5 h, a zatim su isparljive supstance uklonjene pod sniženim pritiskom. Ostatak je rastvoren u vodi (40 ml) i ispran etrom (3 x 40 ml). Vodena frakcija je liofilizovana, dajući sirovo jedinjenje 29. Proizvod je zatim prečišćen preparativnom HPLC upotrebom kolone Polaris C18; eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 5% do 50% B tokom 25 minuta; protok: 15 ml/min. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 24 kao belu čvrstu supstancu (0,497 g, 70%).<1>H NMR (500 MHz, D2O) δ (ppm): 8.37 (d, J = 2.58 Hz, 1H), 8.20 (m, 1H), 7.06 (d, J = 9.10 Hz, 1H), 4.40 (s, 2H), 4.10 (d, 1H), 3.84 (d, 1H), (d, 1H), 3.56 (br, 1H), 3.44 (br, 1H), 3.19 (br, 2H), 3.04 (br, 2H), 2.35 (m, 1H), 1.89 (m, 1H), 1.78 (m, 1H), 1.53 (m, 1H), 1.24 (br, 4H).<13>C{<1>H} NMR (125 MHz, D2O) δ (ppm): 173.8, 171.4, 162.8, 141.1, 129.8, 128.5, 119.0, 117.1, 72.1, 71.7, 63.3, 60.0, 55.0, 43.2, 24.7, 24.5, 24.3. Molekulska masa C19H25N3O9: 439,42. MS (ESI) m/z: Izračunato: 440.42 (M+H)<+>; nađeno: 440.5.

[0120] Na2[Mn<II>cycHBET-NO2)] (30): Jedinjenje 29 (0,26 mmol, 0,114 g) rastvoreno je u 5 ml vode. pH je podešen na 8 pomoću 1 N rastvora natrijum hidroksida. Zatim je u rastvor dodat MnCl24H2O (0,26 mmol, 0,051 g), i pH je pažljivo podešen na 5. Reakcija je mešana 1 h, filtrirana i liofilizovana, dajući belu čvrstu supstancu. Kompleks je injektovan na reverzno faznu kolonu C18 (Polaris) i obesoljen pomoću gore opisane metode. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 30 kao belu čvrstu supstancu (0,102 g, 80%). Molekulska masa C19H23MnN3O9: 493,35. MS (ESI) m/z: Izračunato: 494.35 (M+3H)<+>; nađeno: 494.4.

4

[0121] Na[Mn<III>cycHBET-NO2] (31): MnF3(0,011 g, 0,08 mmol) dodat je u 24 (0,043 g, 0,08 mmol) uz mešanje u 5 ml H2O na pH 8. Dobijeni crvenonarandžasti rastvor je prečišćen na reverzno faznoj koloni C18 (Polaris): eluent A: H2O (10 mM amonijum acetat), B: MeCN; gradijent 5% do 60% B tokom 25 minuta; protok: 20 ml/min. Frakcije su sakupljene i liofilizovane, dajući 26 kao smeđu čvrstu supstancu (0,024 g, 0,05 mmol, 62%). Molekulska masa C19H21MnN3O9: 490,32. MS (ESI) m/z: Izračunato: 490.07 (M)-; nađeno: 490.2.

Tabela 1. Relaksivnost kompleksa mangana na pH 7,4, 37 °C, 1,4 tesla.

Primer 2

Sinteza

[0122] Sintetska šema za primer 2 nalazi se na slici 34.

[0123] N-tozil dietilen triamin (32). U šaržu od 8,480 g (81,71 mmol) dietilen triamina uz mešanje u 120 ml MeCN na 0 °C dodato je 1,768 g (9,27 mmol) p-toluensulfonil hlorida. Odmah nastaje beli heterogeni rastvor, i rastvor je zagrejan na sobnu temperaturu i ostavljen da se meša tokom 16 h. Rastvor je zatim koncentrovan do belog ulja, prebačen u 30 ml H2O, pH podešen na> 10 i ispran 2x pomoću Et2O. Vodeni sloj je zatim koncentrovan do belog ostatka putem liofilizacije. Dobijeni ostatak je prenet u 30 ml H2O i pH je podešen na 7 pažljivim dodavanjem trifluorsirćetne kiseline (TFA). Proizvod je zatim prečišćen preparativnom HPLC upotrebom kolone Restek ultra Aqueous C18 (10 mm x 250 mm); eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 5% do 95% B tokom 23 minuta; protok: 5 ml/min. Frakcije koje sadrže proizvod su objedinjene, i MeCN i TFA su uklonjeni rotacionim uparavanjem. Dobijeni vodeni rastvor je zatim podešen na pH 9 pažljivom titracijom 1 M NaOH(aq); ovaj korak je izveden kako bi se dobio slobodni amin iz malih količina dietilen triamina (veliki višak, bez UV detekcije) koji se može eluirati sa proizvodom, a preostale količine u tragovima će ispariti tokom liofilizacije. Vodeni rastvor je koncentrovan liofilizacijom do 3,142 g (5,94 mmol, 64%) žutog ulja koje se sastojalo od 32 2 ekv. natrijum trifluoracetata. Proizvod je nakon toga podvrgnut reakciji bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHZ, D2O, δ iz protijumskog rastvarača): 7.78 (d , 2H), 7.59 (d, 2H), 3.08-2.02 (m, 4H), 2.87 (t, 2H), 2.73 (t, 2H), 2.45 (s, 3H).<13>C{<1>H} (125.7 MHz, D2O, δ iz tBuOH): 145.77, 135.60, 130.77, 127.40, 47.84, 45.92, 42.27, 39.10, 21.32. ESI-MS: m/z 258.1 (M+H)<+>; izračunato.

258.4.

[0124] N-tozil-N',N",N"-dietilen triamin tri<t>butilacetat (33): U šaržu od 2,876 g (5,43 mmol) jedinjenja 21 2 ekv. natrijum trifluoracetata, 6,615 g (51,18 mmol) diizopropil etilamina i 1,739 g (10,48 mmol) kalijum jodida u 20 ml DMF, na sobnoj temperaturi uz mešanje ukapavano je 5,038 g (23,83 mmol)<t>butil brom acetata u 5 ml DMF tokom 20 minuta. Reakciona smeša je ostavljena da se meša 16 h pre raspodele između zas. NaHCO3 (vod.)i Et2O. Sloj Et2O je odvojen i ispran sa nekoliko izmena H2O da se ukloni DMF pre sušenja iznad Na2SO4i koncentrovanja do 4,535 g smeđeg ulja. Hromatografija na silika gelu, heksan:etil acetat 4:1 do heksan:etil acetat 2:1, dala je 2,346 g (3,91 mmol, 72%) jedinjenja 33 kao svetložutog ulja.<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.80 (d, 2H), 7.27 (d, 2H), 6.63 (br, t, NH), 3.42 (s, 4H), 3.16 (s, H), 2.91 (q, 2H), 2.75-2.70 (m, 6H), 2.41 (s, 3H), 1.46 (s, 18H), 1.43 (s, 9H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.17, 170.69, 142.79, 137.63, 129.53, 127.44, 81.35, 81.16, 55.73, 52.61, 52.12, 5177, 41 .41, 28.32, 28.28, 21.60, 20.80. ESI-MS: m/z 600.8 [M+H]<+>; izračunato.: 600.3.

[0125] N-tozil-N',N",N"-dietilentriamintriacetat 2TFA (N-tos-DTTA 2TFA) (34). Šarža od 0,957 g (1,60 mmol) jedinjenja 33 mešana je u 40 ml 85:5:5:5 TFA:n-dodekan tiol:triizopropil silan: H2O tokom 16 sati. Reakciona smeša je nakon toga koncentrovana do suva, preneta u H2O i isprana pomoću Et2O. Vodeni sloj je prečišćen u porcijama pomoću preparativne HPLC na reverzno faznoj koloni Kromasil 100-10-C4 (21,2 mm x 250 mm); eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 5% do 70% B tokom 17 minuta; protok: 20 ml/min. Frakcije koje sadrže proizvod su objedinjene i koncentrovane do 0,894 g (1,29 mmol, 81%) jedinjenja 23 kao bele čvrste supstance.<1>H NMR (500 MHZ, D2O, δ iz protijumskog rastvarača): 7.80 (d, 2H), 7.50 (d, 2H), 3.98 (s, 2H), 3.82 (s, 4H), 3.51 (t, 2H), 3.43 (t, 2H), 3.36 (t, 2H), 3.31 (t, 2H), 2.46 (s, 3H).<13>C{<1>H} (125.7 MHz, D2O, δ iz<t>BuOH): 173.98, 170.31, 146.48, 135.05, 131.10, 127.76, 56.27, 55.54, 54.80, 53.31, 50.78, 38.62, 21.37. ESI-MS: m/z 432.2 [M+H]<+>; izračunato.: 432.5.

[0126] Na[Mn(N-tos-DTTA)] (35). Šarža od 81,5 mg (0,12 mmol) jedinjenja 34 rastvorena je u 2 ml H2O, i pH je podešen na 6,40 pažljivim dodavanjem 1 M NaOH. Tome je dodato 23,5

4

mg (0,12 mmol) MnCl2kao čvrsta supstanca, i pH je pažljivo podešen na 6,60. Dobijeni rastvor je liofilizovan do belog praha pre prečišćavanja pomoću preparativne HPLC koristeći kolonu Restek Ultra Aqueous C18 (10 mm x 250 mm); eluent A: 50 mM amonijum acetat u vodi, B: MeCN; gradijent od 5% do 95% B tokom 20 minuta; protok: 5 ml/min. Delovi koji sadrže proizvod su više puta liofilizovani kako bi se uklonio preostali amonijum acetat, dajući na kraju prinos jedinjenja 35 kao 63 mg (0,12 mmol, 100%) bele čvrste supstance. ESI-MS: m/z 484,0 [M-Na-H2O)-; izrač.483,4.

[0127] Odnos vezivanja 34 za Mn<2>od 1:1 utvrđen je na sledeći način: U uzorke od 500 µl 0,91 mM MnCl2u puferu pH 7,30 (25 mM TRIS) (0,45 µmol u svakom), dodavane su sve veće porcije 1,45 mM 34 (0 do 675 µl u koracima od 75 µl; 1,09 µmol prisutno u svakoj porciji od 75 µl). Vrednost T2svakog uzorka je naknadno izmerena, i relaksivnost je predstavljena kao odnos liganda i metala (videti sliku 28). Tačka kompletne potrošnje Mn određena je tačkom gde r2prestaje da opada pri dodatku liganda. Koncentracija svakog uzorka je određena putem ICP-MS.

Primer 3

Sinteza

[0128] Sintetske sheme za primer 3 nalaze se na slikama 38 i 39.

[0129] N-benzil-1,2-diaminocikloheksan (36). U šaržu od 7,113 g (62,29 mmol) 1,2-diaminocikloheksana u 50 ml MeCN ukapano je 1,093 g (6,39 mmol) benzil bromida u 10 ml MeCN na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Nakon 16 sati, nastali beli, heterogeni rastvor je koncentrovan do suva i podeljen između CH2Cl2i zas. Na2CO3(vod). Slojevi su odvojeni, i organska faza je ponovo isprana zas. Na2CO3(vod) zatim zasićenim rastvorom soli, osušena iznad Na2SO4i koncentrovana do 1,280 g (6,26 mmol, 98%) jedinjenja 36 kao svetložutog ulja.

<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3, δ iz TMS-a): 7.36-7.22 (m, 5H), 3.94 (d, 1H), 3.69 (d, 1H), 2.38 (m, 1H), 2.09 (m, 2H), 1.90 (m, 1H), 1.73 (m, 2H), 1.32.-1.09 (m, 4H). ESI-MS: m/z = 205 [M+H]<+>; izračunato.: 205.3.

[0130] N'-benzil-N',N",N"-tritbutilacetat-1,2-cikloheksilen diamin (37): U 1,133 g (5,55 mmol) jedinjenja 36, 4,194 g (32,35 mmol) diizopropiletilamina i 0,966 g (5,82 mmol) kalijum jodida u 5 ml DMF-a dodato je 5,340 g (27,38 mmol)<t>butil bromacetata na sobnoj temperaturi.

4

Dobijeni heterogeni rastvor bledosmeđe boje mešan je 6 sati, razblažen dodatkom Et2O, a zatim ispran pomoću zas. K2CO3 (vod.), nekoliko izmena vode i zasićenog rastvora soli, osušen iznad Na2SO4i koncentrovan do 5,468 g smeđeg ulja. Fleš hromatografija (silika gel, heksan:EtOAc 19:1 do 4:1) dala je čisto jedinjenje 36 kao 1,949 g (3,57 mmol, 64%) svetložutog ulja.<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3, δ iz TMS-a): 7.45 (d, 1H), 7.30 (t, 1H), 7.23 (d, 1H), 4.0 (d, 1H), 3.69 (d, 1H), 3.47-3.38 (m, 5H), 3.28 (d, 1H), 2.71 (t, 1H), 2.55 (t, 1H), 2.04 (t, 2H), 1.68 (m, 2H), 1.44 (s, 18H), 1.42 (s, 9H), 1.31-1.25 (m, 4H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.95, 171.66, 139.91, 129.35, 128.05, 126.82, 80.30, 63.39, 59.95, 54.79, 53.18, 52.62, 29.41, 28.14, 28.12, 25.83, 25.68. ESI: m/z = 547.0 [M+H]<+>; izračunato.: 547.4.

[0131] N,N,N'-trans-1,2-diaminocikloheksan-tri-terc-butilacetat (38) Jedinjenje 37 (0,757 g, 1,38 mmol) mešano je iznad Pd/C (96 mg, 13% mas.) u MeOH pod 1 atm H2(g). Nakon 16 h, Pd/C je uklonjen filtracijom, i matični lug je koncentrovan do jedinjenja 38 (601 mg, 1,32 mmol, 95%) u obliku bež ulja. Ovaj proizvod je prenet u naredne korake bez daljeg prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3, δ iz TMS-a): 3.49-3.23 (m, 7H), 2.35 (m, 2H), 2.00 (m, 1H), 1.93 (m, 1H), 1.72 (m, 1H), 1.65 (m, 1H), 1.44 (s, 27H), 1.18-1.00 (m, 4H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.7 (dva podudarna C), 80.6, 80.5, 67.3, 57.6, 52.8, 48.7, 31.4, 28.3, 28.2, 27.1, 25.9, 24.5. ESI: m/z = 457.3 [M+H]<+>; izračunato.: 457.3.

[0132] N'-(2-pikolil)-N',N",N"-tritbutilacetat-1,2-cikloheksilendiamin (39): Pikolil hlorid hidrohlorid (0,079 g, 0,48 mmol) dodat je u jedinjenje 38 (0,250 g, 0,55 mmol), kalijum jodid (0,076 g, 0,48 mmol) i diizopropil etilamin (0,320 g, 2,48 mmol) u 3 ml DMF uz mešanje. Nakon 16 sati mešanja, bledožut i zamućen rastvor je razblažen dodatkom 50 ml Et2O, ispran zas. K2CO3 (vod.), velikom količinom vode i zasićenim rastvorom soli, osušen iznad Na2SO4 i koncentrovan do 0,303 g ulja bledosmeđe boje. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom (silika gel, 9:1 heksan:EtOAc sa 1% TEA) dajući jedinjenje 39 (0,150 g, 0,27 mmol, 50%) u obliku bezbojnog ulja.<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3iz TMS-a): 8.46 (d, 1H), 7.86 (d, 1H), 7.64 (t, 1H), 7.11 (m, 1H), 4.11 (d, 1H), 3.79 (d, 1H), 3.48-3.32 (m, 5H), 3.29 (d, 1H), 2.71 (m, 1H), 2.61-2.52 (m, 2H), 2.06 (m, 2H), 1.69 (m, 2H), 1.40 (s, 27H), 1.32-1.24 (m, 3H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.8, 166.2, 162.5, 146.8, 137.3, 127.0, 123.5, 80.4 (dva podudarna signala), 66.6, 63.3, 62.8, 59.0, 37.4, 291, 28.3, 28.1, 26.0, 24.9, 22.7. ESI: m/z = 548.4 [M+H]<+>; , δ izračunato.: 548.4.

4

[0133] N'-pikolil-N',N",N"-trans-1,2-cikloheksilen diamin triacetat (40): Jedinjenje 39 (150 mg, 0,27 mmol) mešano je u 5 ml svakog od rastvarača CH2Cl2/TFA. Nakon 12 h, rastvor je koncentrovan do jedinjenja 40•3TFA (0,15 mmol, 56%) kao 104 mg bele čvrste supstance.

<1>H NMR (500 MHZ, D2O, δ iz protijumskog rastvarača): 8.80 (br s, 1H), 8.59 (s, 1H), 8.07 (br s, 1H), 8.02 (br s, 1H), 4.49-2.94 (m, 10 H), 2.32-2.19 (m, 2H), 1.91 (m, 2H), 1.53-1.28 (m, 4H). ESI: m/z = 380.2 [M+H]<+>; izračunato.379.2.

[0134] [Mn(CyP3A)] (41): Jedinjenje 40 vezuje Mn<II>u odnosu 1:1. Ovaj kompleks je pripremljen i okarakterisan in situ. Mn<II>je pažljivo titrisan do jedinjenja 40 i stehiometrija Mn:40 je praćena pomoću LC-MS ili T2-relaksometrije, kako je gore opisano. Rastvori 41 su u neograničenom periodu stabilni na sobnoj temperaturi. m/z = 433,1 [M+2H]<+>; izrač.433,1.

[0135] N'-((6-(metilen)piridin-2-il)metil)izoindolin-1,3-dion)-N',N",N"-tri<t>butilacetat-1,2-cikloheksilen diamin (42). Šarža od 468 mg (0,86 mmol) jedinjenja 37 i 62 mg 10% Pd na ugljeniku (13% mas.) mešana je pod 1 atm H2(g)tokom 16 sati, nakon čega je kompletna konverzija u N",N",N"-terc-butilacetat-1,2-cikloheksilen diamin (42) potvrđena pomoću LC-MS analize (ESI: m/z = 457,0 [M+H]<+>; izrač.: 457,3). Paladijumov katalizator je uklonjen filtracijom, i matični lug je koncentrovan pod vakuumom. Dobijeni ostatak je odmah prenet u 3 ml DMF-a, i tome je dodato 186 mg (15,20 mmol) diizopropil etilamina, a zatim 275 mg (0,83 mmol) 2-((6-(brommetil)piridin-2-il)metil)izoindolin-1,3-diona (videti J. Org. Chem.

1997, 62, 5156). Nakon 6 sati, reakciona smeša je razblažena sa Et2O, a zatim isprana pomoću zas. NaHCO3(aq), nekoliko izmena vode i zasićenim rastvorom soli, i osušena iznad Na2SO4. Nakon uklanjanja Na2SO4filtracijom, rastvor je koncentrovan do suva i trituriran sa heksanom, ostavljajući 241 mg bledožutog ulja. Fleš hromatografija (silikagel, 100% CH2Cl2do 100% MeOH) dala je čisto jedinjenje 42 kao 77 mg (0,11 mmol, 13%) belog ostatka.<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3, δ iz TMS-a): 7.88 (m, 2H), 7.72 (m, 3H), 7.58 (t, 1H), 7.03 (d, br, 1H), 4.98 (s, 2H) 3.97 (d, 1H), 3.70 (d, 1H), 3.41 (m, 5H), 3.24 (d, 1H), 2.65 (t, br, 1H), 2.53 (t, br, 1H), 1.99 (m, 2H), 1.636 (m, 2H), 1.40 (s, 27H), 1.37 (m, 4H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.87, 171.79, 168.21, 161.15, 153.97, 137.15, 134.12, 132.36, 123.53122.71, 118.99, 80.48, 80.34, 77.36, 63.50, 61.57, 56.18, 53.77, 53.26, 43.11, 28.22 (dva podudarna), 25.97, 25.73. ESI: m/z = 707.0 [M+H]+; izračunato.: 707.4.

[0136] N'-6-(aminometil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-tritbutilacetat-1,2-cikloheksilen diamin (43). Šarža od 77 mg (0,11 mmol) jedinjenja 42 i 68 mg hidrazin monohidrata (1,70

4

mmol) refluktovana je u 8 ml EtOH. Nakon 90 minuta, reakciona smeša je koncentrovana do suva, preneta u CH2Cl2i isprana pomoću NaHCO3(vod.)i zasićenog rastvora soli, osušena iznad Na2SO4i koncentrovana do 65 mg (0,11 mmol, 100%) jedinjenja 43 kao bledog bezbojnog ulja.

<1>H NMR (500 MHZ, CDCl3, δ iz TMS-a): 7.67 (d, 2H), 7.60 (t, 1H), 7.08 (d, 1H, 4.09 (d, 1H) 3.92 (s, 2H), 3.81 (d, 1H), 3.54-3.43 (m, 5H), 3.30 (d, 1H), 2.71 (t, br, 1H), 2.60 (t, br, 1H), 2.17 (d, 2H), 1.89 (m, 2H), 1.43 (s, 18H), 1.43 (s, 9H), 1.26 (m, 4H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ fiz TMS-a): 172.0 (dva podudarna signala), 171.8, 160.7, 137.0, 122.0, 119.3, 80.51, 80.50, 63.6, 61.6, 56.5, 53.7, 53.3, 47.9, 28.3 (dva podudarna signala), 26.0, 25.89. ESI: m/z = 577.0 [M+H]<+>; izračunato.: 577.4

[0137] N-6-((4-nitrofenilsulfonamido)metil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-tri<t>butilacetat-1,2-cikloheksilen diamin (44). U 65 mg (0,11 mmol) jedinjenja 43 i 33 mg (0,32 mmol) trietilamina uz mešanje u 5 ml CH2Cl2dodato je 28 mg (0,13 mmol) 4-nitrobenzen sulfonil hlorida na 0 °C tokom 30 minuta. Nakon 16 sati, reakciona smeša je isprana pomoću NaHCO3

(vod.)i zasićenog rastvora soli, osušena iznad Na2SO4i koncentrovana do suva. Analiza pomoću LC-MS otkrila je odgovarajući amino bis sulfon kao glavni proizvod. Čisto jedinjenje 44 izolovano je kao 4 mg (0,05 mmol, 5%) uljastog ostatka nakon preparativne HPLC upotrebom Phenomenex C18 kolone (10 mm x 250 mm); eluent A: H2O/0,1% TFA, B: MeCN/0,1% TFA; gradijent 5% do 70% B tokom 27 minuta; protok: 5 ml/min. ESI: m/z = 762,0 [M+H]<+>; izrač.: 762,4.

[0138] N-6-((4-nitrofenilsulfonamido)metil)piridin-2-il)metil-N',N",N"-triacetat-1,2-cidoheksilel diamin (45). Mešanje 2 mg (2,63 µmol) jedinjenja 44 u TFA pokazalo je kompletnu konverziju u jedinjenje 45 bez nusproizvoda koji bi se detektovali pomoću LC-MS analize. ESI: m/z = 594,0 [M+H]<+>; izrač.: 594,2.

Tabela 2. Relaksivnost (r1u mM<-1>s<-1>) jedinjenja formule (IX) na 37 °C u Tris puferu pH 7,4

Tabela 3. Brzina (s<-1>) i t1/2, (s<-1>) premeštanja Mn(II) (1mM) pomoću 25 mM. Zn(II) iz jedinjenja formule (IX) i [Mn(CDTA)]<2->na 37 °C u MES puferu pH 6,0.

4

Primer 4

Sinteza

[0139] Sintetska šema za primer 4 nalazi se na slici 40.

[0140] Fmoc-Ty(OBn)-CONH2: (46): Na 0 °C, izobutil hloroform (1,52 g, 11,2 mmol) dodat je u smešu Fmoc-Ty(OBzl)-COOH (4,93 g, 10,0 mmol), N-metilmorfolina (NMM, 2,10 g, 20 mmol) u THF-u (100 ml) i mešan je na 0 °C tokom 0,5 sata. Dodat je vodeni rastvor amonijaka (30%, 1,2 ml) i reakciona smeša je mešana 1 sat na 0 °C (reakcioni rastvor je mutan). Talog (proizvod i soli NMM•HCl) je odvojen filtracijom, i u filtrat je dodato još 1,2 ml vodenog rastvora amonijaka, uz mešanje još 0,5 sata na sobnoj temperaturi. Sakupljene čvrste supstance su suspendovane u EtOAc (200 ml) i refluktovane 10 minuta. Nerastvorne čvrste supstance su filtrirane, i filtrat je koncentrovan pod vakuumom dok se rastvor nije zamutio. Zatim je dodat n-heksan (50 ml) da se istaloži jedinjenje 40 kao 2,48 g bele čvrste supstance. U filtrat je onda dodat n-heksan (80 ml) da se istaloži još 2,04 g proizvoda (ukupno 4,52 g, 92%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.54 (t, J = 8.1 Hz, 2H), 7.41-7.36 (m, 5H), 7.35 - 7.29 (m, 3H), 7.12 (s, br, 2H), 6.91 (d, J = 7.7 Hz, 2H), 5.56 (s,br, 1H), 5.29 (s, br, 2H), 5.02 (s, 2H), 4.45-4.39 (m, 2H), 4.19 (t, J = 6.4 Hz, 1H), 3.07 -2.99(m, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 172.96, 157.93, 143.69, 143.64, 141.32, 136.86, 130.36, 128.58, 128.00, 127.75, 127.48, 127.09, 124.98, 120.00, 115.12, 77.26, 77.00, 76.75, 70.02, 66.91, 53.61, 47.19, 37.54. ESI: m/z 493.4 [M+H]<+>; izračunato.: 493.2.

[0141] NH2-Ty(OBn)-CONH2 (47): Jedinjenje 46 (3,60 g, 7,3 mmol) rastvoreno je u rastvoru 20% piperidina u DMF-u (40 ml) i mešano na sobnoj temperaturi 2 sata. Rastvarač je uklonjen pod vakuumom, a ostatak je ponovo rastvoren u EtOAc i istaložen dodavanjem n-heksana da se dobije bela čvrsta supstanca: 1,9 g (99%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.43-7.31 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.08(s, 1H), 6.94 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.37 (s, 1H), 5.05 (s, 1H), 3.58 (dd, J = 9.3, 4.1 Hz, 1H), 3.19 (dd, J = 13.9, 4.0 Hz, 1H), 2.69 (dd, J = 13.9, 9.3 Hz, 1H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 177.33, 157.82, 136.98, 130.32, 129.95, 128.60, 127.99, 127.46, 115.12, 70.05, 56.56, 40.07. ESI: m/z 271.3 [M+H]<+>; izračunato.: 271.1.

[0142] NH2-Ty(OBn)-amin (48): Jedinjenje 47 (1,86 g, 6,88 mmol) suspendovano je u suvom THF-u (10 ml) i dodat je BH3•THF (1,0 M, 26 ml). Reakcioni rastvor je refluktovan 12 sati u atmosferi azota. Rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu i polako je dodat metanol da se reakcija zaustavi. Nakon uklanjanja rastvarača uparavanjem, žuti ostatak je ponovo rastvoren u HCl (1,0 M, 40 ml) i Et2O (50 ml) i mešan je na sobnoj temperaturi 1 sat. Nakon uklanjanja organskog sloja, vodeni rastvor je stavljen u ledeno kupatilo, i pH je povećan na 12 dodatkom NaOH. Ovaj osnovni rastvor je ekstrahovan pomoću CH2Cl2(3 X 50 ml) i CH2Cl2je zatim uparen, dajući svetložutu čvrstu supstancu (1,39 g, 79%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.44-7.31 (m, 5H), 7.11 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.92 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.05 (s, 2H), 2.96 - 2.88 (m, 1H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.53-2.43 (m, 2H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 157.36, 137.10, 131.51, 130.14, 128.56, 127.92, 127.45, 114.87, 70.05, 55.25, 48.21, 41.41. ESI: m/z 257.3 [M+H]<+>; izračunato.: 257.4.

[0143] N,N,N',N'-3-(4-(benziloksi)fenil)propan-1,2-diamin-tetra-terc-butil acetat (49): U smešu 48 (1,39 g, 5,46 mmol), KI (906 mg, 5,46 mmol) i DIPEA (5,64 g, 43,7 mmol) u suvom DMF-u (30 ml) dodat je terc-butil bromacetat (8,52 g, 43,7 mmol), a zatim je mešan tokom 42 sata na 50 °C, uz praćenje reakcije pomoću LC-MS. Nakon hlađenja, DMF je uklonjen pod vakuumom, i u ostatak su dodati H2O (40 ml) i EtOAc (80 ml). Organski sloj je odvojen, ispran vodom i zasićenim rastvorom soli i uparen. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (SiO2, 1% Et3N u heksanu/EtOAc = 2/1) dajući proizvod u obliku bledožutog ulja (3,65 g, 93%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.41 - 7.22 (m, 5H), 7.06 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 6.80 (m, 2H), 4.95 (s, 2H), 4.66 (s, 1H), 4.52 (m, 1H), 3.43 (s, 4H), 3.36 (s, 4H), 3.23 (m, 1H), 3.02 (m, 1H), 2.78 (m, 1H), 2.51 (m, 1H), 1.44 - 1.27 (m, 36H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δiz TMS-a): 171.72, 170.80, 154.25, 131.20, 130.1, 115.35, 81.20, 81.05, 63.40, 56.30, 55.20, 53.65, 35.65, 28.20. ESI: m/z 713.5 [M+H]<+>; izračunato.: 713.4.

[0144] N,N,N',N'-4-(2,3-diaminopropil)fenol-tetra-terc-butil acetat (50): Pd/C (10%, 250 mg) dodat je u rastvor 49 (600 mg, 0,84 mmol) u MeOH (20 ml). Reakciona smeša je tri puta degasirana pomoću balona sa H2i mešana na sobnoj temperaturi 2 sata uz praćenje reakcije pomoću LC-MS. Smeša je filtrirana, i filtrat je koncentrovan dajući svetložuto ulje koje je dalje

1

prečišćeno hromatografijom na koloni: DCM/EtOAc (1% Et3N, 0-20%, v/v). Bezbojno ulje: 460 mg (74%).%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 6.71 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 4.02 (s, 1H), 3.49 (d, J = 3.1 Hz, 4H), 3.43 (d, J = 3.3 Hz, 4H), 3.12 - 3.03 (m, zH), 2.89 (dd, J = 13.4, 7.2 Hz, 2H), 2.82 (dd, J = 13.8, 5.6 Hz, 2H), 2.62 - 2.51 (m, 2H), 1.45 (s, 18H), 1.41 (s, 18H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.39, 170.95, 153.78, 132.35, 130.31, 115.07, 82.56, 80.69, 63.38, 56.27, 55.20, 53.59, 35.97, 28.14. ESI: m/z 623.4 [M+H]<+>; izračunato.: 623.4.

[0145] N,N,N',N'-4-(2,3-diaminopropil)fenol-tetraacetat (51): Jedinjenje 50 (200 mg, 0,32 mmol) rastvoreno je u smeši TFA, vode i triizopropil silana (TIPS) u odnosu 92,5:2,5:5, i reakcija je mešana 2 sata uz praćenje pomoću LC-MS. Rastvarač je uklonjen pod sniženim pritiskom, a ostatak je prečišćen preparativnom HPLC, dajući belu čvrstu supstancu (100 mg, 78%).<1>H NMR (500 MHZ, D2O, δ): 7.02 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 6.73 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 3.78-3.42 (m, 9H), 3.10 (m, 2H), 2.91 (m, 1H), 2.49 (m, 1H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, D2O, δ): 173.25, 170.85, 154.43, 130.40, 128.09, 115.72, 60.83, 55.29, 54.46, 52.54, 31.64. ESI: m/z 399.3 [M+H]<+>; izračunato.: 399.2.

[0146] Na[Mn(TyOH-EDTA)] (52): Ovaj kompleks je pripremljen in situ. Prvo, rastvor 51 (8,3 mg) u 2,0 ml HEPES pufera (100 mM, pH = 7,4) pripremljen je uz 4,19 mM rastvor MnCl2u HEPES-u. Ovi rastvori su mešani u različitim odnosima, i T2 rastvarača vode izmeren je na 1,4 T. Sa dijagrama zavisnosti 1/T2u odnosu na [Mn], utvrđena je tačna koncentracija liganda. Na ovom dijagramu, 1/T2linearno raste sa [Mn] do [Mn] = [ligand], a zatim se nagib povećava za faktor 10. U ovom primeru, [ligand] je 2,16 mM. Zatim je alikvot ovog standardnog rastvora liganda pomešan sa 0,95 ekv. MnCl2u HEPES puferu, i koncentracija izmerena pomoću ICP-MS.

[0147] terc-butil protektovani N3P3-(TyOH-EDTA)6 (53): Jedinjenje 51 (547 mg, 0,83 mmol) i cezijum karbonat (318 mg, 0,97 mmol) dodati su na 0 °C u rastvor heksahlor ciklotrifosfazena (45,6 mg, 0,131 mmol) u svežem suvom acetonitrilu (20 ml) pod N2. Reakciona smeša je mešana na 45 °C tokom 2 dana, i<1>H NMR (prisustvo orto pika H na δ = 6,90 za proizvod u odnosu na δ = 6,73 za polaznu supstancu) i<31>P NMR (izgled δ = 7,81 pika) korišćeni su za praćenje reakcije. Nakon hlađenja smeše na sobnu temperaturu, soli su uklonjene centrifugiranjem, a bistar rastvor koncentrovan pod sniženim pritiskom i podvrgnut fleš hromatografiji (1% Et3N, DCM/EtOAc) dajući heksamerni terc-butil estar kao bledožuto

2

ulje (420 mg, 82%).<1>H NMR (500 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 7.07 (d, J = 8.3 Hz, 12H), 6.90 (d, J = 8.6 Hz, 12H), 3.47 (d, J = 8.3 Hz, 24H), 3.43 (d, J = 4.9 Hz, 24H), 3.11-3.07 (m, 6H), 2.93-2.83 (m, 12H), 2.63-2.53 (m, 12H), 1.43 (s, 108H), 1.39 (s, 108H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, CD3Cl, δ iz TMS-a): 171.31, 170.94, 130.15, 120.69, 80.66, 80.56, 63.42, 56.35, 55.40, 53.65, 28.26, 28.24.<31>P NMR (202 MHZ, CD3Cl, δ): 7.81. ESI: m/z 1934.0 [M+2H]<2+>; izračunato.: 1933.6.

[0148] N3P3-(TyOH-EDTA)6 (54): Jedinjenje 53 (410 mg, 0,11 mmol) rastvoreno je u smeši TFA, vode, tioanizola, fenola i etanditiola u odnosu 82,5:5:5, i reakcioni rastvor je mešan 12 sati na sobnoj temperaturi uz praćenje reakcije pomoću LC-MS. Rastvor je ohlađen u ledenom kupatilu, i dodat je hladni dietil etar (50 ml) da se istaloži proizvod. Istaloženi proizvod je izolovan centrifugiranjem i ispran tri puta etrom, dajući belu čvrstu supstancu (195 mg, 77%).

<1>H NMR (500 MHZ, D2O, δ): 7.15 (d, J = 8.2 Hz, 12H), 6.84 (d, J = 8.2 Hz, 12H), 3.69 (d, J = 16.7 Hz, 12H), 3.55 (m, 24H), 3.45 (d, J = 16.7 Hz, 12H), 3.29 (m, 6H), 3.11 (m, 12H), 2.78 - 2.60 (m, 6H).<13>C{<1>H} NMR (125.7 MHZ, D2O, δ): 174.12, 171.36, 163.06, 162.78, 148.66, 133.63, 130.78, 121.30, 117.43, 115.11, 61.16, 57.08, 54.88, 54.61, 31.71.<31>P NMR (202 MHZ, D2O, δ): 8.57.

[0149] Mn6[N3Str3- (TyOH-EDTA)6] (55): Ovaj kompleks je pripremljen in situ. Prvo, rastvor 54 (11,3 mg) u 2,0 ml HEPES pufera (100 mM, pH = 7,4) pripremljen je uz 4,19 mM rastvor MnCl2u HEPES-u. Ovi rastvori su mešani u različitim odnosima, i T2rastvarača vode izmeren je na 1,4 T da bi se odredila koncentracija heksamernog liganda, kako je opisano za jedinjenje 48. Budući da heksamerni ligand sadrži 6 ostataka EDTA, jedan heksamerni ligand će vezati 6 ekvivalenata Mn. Na osnovu ovog rezultata, 60 mg heksamernog liganda je zatim pomešano sa 24,3 mg MnCl2• 4H2O u 2,0 ml dejonizovane vode, i pH je pažljivo podešen na 7,4 dodavanjem 0,2 M NaOH. To predstavlja mali višak MnCl2(2%), kako bi se obezbedila kompletna helacija. Višak Mn<2+>je odvojen od anjonskog heksamernog kompleksa propuštanjem rastvora kroz kolonu za katjonsku izmenu (Alltech, IC-Na) radi uklanjanja viška Mn<2+>. Finalni proizvod je dobijen liofilizacijom u obliku bele čvrste supstance (60 mg, 85%).

[0150] Relaksivnost jedinjenja za formule (XI) i (XII) određena je pri različitim jačinama polja na 37 °C u HEPES puferu pH 7,4. Relaksivnost je dobijena iz nagiba dijagrama zavisnosti 1/T1u odnosu na [Mn] za različite koncentracije Mn. Budući da formula (XI) sadrži 6 Mn po molekulu, dole je data jonska (po Mn) i molekulska (po molekulu) relaksivnost.

Tabela 4. Relaksivnost (r1u mM<-1>s<-1>) jedinjenja formula (XI) i (XII) određena pri različitim jačinama polja na 37 °C u HEPES puferu pH 7,4.

[0151] Dakle, pronalazak obezbeđuje kontrastna sredstva za magnetnu rezonancu i metode za pripremu kontrastnih sredstava.

[0152] Iako je ovaj pronalazak detaljno opisan preko određenih otelotvorenja, stručnjak za ovu oblast će shvatiti da ovaj pronalazak može biti primenjen i na drugačija otelotvorenja od ovde opisanih, koja su predstavljena u svrhu ilustracije, a ne radi ograničenja. Zato opseg priloženih patentnih zahteva ne treba da bude ograničen na opis ovde sadržanih otelotvorenja.

4

Claims

Patentni zahtevi 1. Kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu, pri čemu kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id):

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja, naznačeno time što R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena, i dialkilen heteroarena, naznačeno time što R<2>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, halo, cijano, nitro, hidroksi i alkoksi grupe, naznačeno time što n je 2 ili 3, i naznačeno time što jedinjenje opciono uključuje vodu koordinisanu na Mn kada je n jednako 2.
2. Kontrastno sredstvo prema zahtevu 1, naznačeno time što jedinjenje ima formulu (II):

ili jedinjenje ima formulu (III):

ili jedinjenje ima formulu (IV):

ili jedinjenje ima formulu (V):

ili jedinjenje ima formulu (Va):

ili jedinjenje ima formulu (Vb):
3. Kontrastno sredstvo prema zahtevu 1, naznačeno time što R<1>je etilen ili cikloheksilen.
4. Kontrastno sredstvo prema zahtevu 1, naznačeno time što R<2>je metoksi ili nitro.
5. Kontrastno sredstvo prema zahtevu 1, naznačeno time što najmanje jedan od R<1>i R<2>sadrži ciljajući ostatak koji može da cilja željeni region u ispitaniku, gde je ciljajući ostatak, poželjno, odabran od proteina, enzima, peptida, antitela i lekova.
6. Kontrastno sredstvo prema bilo kom od zahteva 1–5, naznačeno time što kontrastno sredstvo ima veću relaksivnost kada je n = 2.
7. Kontrastno sredstvo prema bilo kom od zahteva 1–6 naznačeno time što jedinjenje može da se konvertuje in vivo iz formule (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id) u kojoj je n = 3, u formulu (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id), naznačeno time što je n = 2, ili naznačeno time što jedinjenje može da se konvertuje in vivo pomoću biološkog redukcionog sredstva iz formule (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id) naznačeno time što je n = 3, u formulu (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id) naznačeno time što je n = 2.
8. Kontrastno sredstvo prema bilo kom od zahteva 1–7, koje nadalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač, uključujući redukciono sredstvo za redukciju jedinjenja iz formule (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id) naznačeno time što je n = 3, u formulu (Ia), (Ib), (Ic) ili (Id) naznačeno time što je n = 2.
9. Kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu, pri čemu kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (VIa), (VIb) ili (VIc):

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja, naznačeno time što R<1>je odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena, i dialkilen heteroarena, naznačeno time što R<3>je odabran iz grupe koja se sastoji od nesupstituisanog alkilena, nesupstituisanog cikloalkilena, nesupstituisanog heterocikloalkilena, nesupstituisanog arilena, nesupstituisanog heteroarilena, dialkilen arena, i dialkilen heteroarena, naznačeno time što R<4>je odabran iz grupe koja se sastoji od vodonika, alkil, alkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, halo, cijano, nitro, hidroksi i alkoksi grupe, naznačeno time što X je N ili NH, naznačeno time što jedinjenje opciono uključuje vodu koordinisanu sa Mn kada X predstavlja NH, i naznačeno time što je X koordinisano sa Mn kada X predstavlja N.
10. Kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu, pri čemu kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (IX):
11. Kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu, pri čemu kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (X):

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja, naznačeno time što R<5>je osnovna struktura, i naznačeno time što n je ceo broj od 1 do 12.
12. Kontrastno sredstvo za magnetnu rezonancu, pri čemu kontrastno sredstvo sadrži jedinjenje formule (XII):

ili farmaceutski prihvatljivu so jedinjenja.