RS61888B1

RS61888B1 - Proces za tretman ćelijskih zidova kvasca sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu

Info

Publication number: RS61888B1
Application number: RS20210647A
Authority: RS
Inventors: Peter Philip Lankhorst; Ellen Speetjens
Original assignee: Dsm Ip Assets Bv
Priority date: 2014-03-21
Filing date: 2015-03-20
Publication date: 2021-06-30
Also published as: US20190352685A1; WO2015140318A1; US10858683B2; EP3119901B1; US10392639B2; JP2017511122A; JP6759506B2; DK3119901T3; CA2941422A1; PL3119901T3; US20170107547A1; CN106103727A; CA2941422C; EP3119901A1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na postupak za tretman sastava koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane, gde postupak uključuje dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu.

Stanje tehnike

[0002] β-glukani su porodica polisaharida koja je heterogena u smislu veličine, rastvorljivosti i molekulske strukture. β-glukani su polimeri glukoze i veze mogu biti 1,3, 1,4 i 1,6. Lanci glukoze u β-glukan polimeru mogu biti linearni ili razgranati, sa jednim tipom veza (npr.1,3) ili mešavinom dva ili više (npr.1,3-1,4 ili 1,3-1,6 ). Struktura β-glukana veoma utiče na fizička i hemijska svojstva.

[0003] Najpoznatiji polisaharidi koji se sastoje od glukoze su skrob i celuloza. Skrob se sastoji od amiloze koja je linearni polisaharid sa α-1,4 vezama i amilopektina koji je polisaharid sa α-1,4 vezama i granama koje imaju α-1,6 veze. Celuloza je linearni β-glukan samo sa β-1,4 vezama.

[0004] Ostali poznati polisaharidi su nerastvorljivi β-1,3 glukani pahiman i kurdlan. Pahiman je β-1,3-glukan izveden iz sklerocije od Poria cocos (a Basidiomycetes sp.), i kurdlan proizvodi Alcaligenes faecalis var. myxogenes 10C3K. Laminarin je glukan za skladištenje koji se nalazi u smeđim algama i linearni je polisaharid koji se sastoji od 1,3-glukana sa 1,6 vezama. Odnos 1,3 prema 1,6 je 3:1 (Wikipedia - http://en.wikipedia.org/wiki/Laminarin).

[0005] Β-glukani ovsa i ječma su dve glavne žitarice u pogledu industrijske ponude βglukana. Ovseni β-glukan je rastvorljiv u vodi i opsežno je proučavan zbog svog zdravstvenog efekta. Vlakno je građeno od β-1,3 i β-1,4 veza. Glikan ječma sadrži iste veze i takođe je rastvorljiv u vodi.

[0006] Struktura β-glukana kvasca razlikuje se od β-glukana žitarica i to rezultuje različitim karakteristikama. Umesto lanaca od 1,3 i 1,4 povezane jedinice glukoze, β-glukan kvasca sastoji se od 1,3 i 1,6 povezanih monomera. Glukan kvasca nalazi se prvenstveno u ćelijskom zidu kvasca. Ćelijski zid kvasca doprinosi 15-30% ukupne suve težine ćelije.

[0007] Glavne komponente ćelijskog zida kvasca su polisaharidi, proteini i nešto hitina. Polisaharidi se mogu podeliti na β-glukane i manane, sastavljene od monomera manoze. Izgradnja ćelijskog zida organizovana je u slojevima. Otprilike, zid možemo podeliti na tri sloja (Klis, F.M., Cell Wall Assembly in Yeast, Yeast 10, 851-869, 1994). Prvi sloj je površina ćelije i sastoji se uglavnom od manoproteina. Ispod prvog sloja nalazi se unutrašnji sloj između površine i plazmatske membrane koji se sastoji od dva sloja. Unutrašnji sloj najbliži plazmatskoj membrani je fibrilarni sloj formiran od β-1,3-glukana, a spoljni sloj koji vezuje unutrašnji sloj i površinu je amorfniji sloj i obogaćen je lancima β-1,6-glukana kako bi se formirala mreža. Ove komponente su umrežene na različite načine kako bi formirale komplekse višeg reda. Kovalentne veze su prisutne između svake od ovih komponenti. β-1,3-glukan je organizovan u spiralama, formiranim od 1 ili 3 lanca β-glukana. U mreži postoji samo nekoliko tačaka grananja (β-1,6-veza). Spirale dodatno smanjuju rastvorljivost slabo rastvorljivog glukana. Prisutna je i mala količina hitina što doprinosi nerastvorljivosti vlakana.

[0008] Za razgradnju različitih polisaharida koji se javljaju u prirodi identifikovano je mnogo različitih enzima. Ove takozvane glikozidaze ili glikozidne hidrolaze (EC 3.2.1.x) formiraju veliku grupu enzima koji katalizuju hidrolizu glikozidnih veza u oligo- i polisaharidima. Na www.cazy.org nalazi se neprekidno ažurirana baza podataka sa svim enzimima aktivnim na ugljene hidrate koji su sada kategorisani u 131 porodicu glikozid hidrolaze - pogledati Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B (2009) The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res 37:D233-238 [PMID: 18838391].

[0009] Enzimska razgradnja ćelija kvasca i ćelijskih zidova kvasca se već dugo istražuje.

Litičke enzime proizvode bakterije, mikobakterije, streptomiceti i plesni. Nekoliko komercijalno dostupnih enzimskih proizvoda (koji često sadrže mešavinu enzimskih aktivnosti) široko se koriste za genetiku kvasca, za spajanje ili transformaciju ćelija kvasca i za generisanje protoplasta. Enzimski proizvod Zymolyase® od Amsbio i prečišćen oblik tečnosti za kulturu od Arthrobacter luteus sadrži β-1,3-glukan-laminaripentaohidrolazu kao esencijalnu aktivnost. Glucanex® od Novozymes je još jedan proizvod koji se koristi za izradu protoplasta kvasca, kao i Lyticase od Sigme. Sva tri proizvoda pored glukanaze sadrže i druge aktivnosti kao što su aktivnost proteaze i mananaze. Detaljnije, ovi proizvodi ne vrše samo endo-hidrolizu glukana već i egzo-hidrolizu koja rezultuje potpunim raspadanjem glukana na oligosaharide i glukozu.

[0010] Glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu (LPHaza) je β-1,3-glukanaza koja oslobađa laminaripentaozu kao glavni proizvod iz polisaharida kao što su laminarin, pahiman ili kurdlan. Vrsanská et al (1977, Zeitschrift für Allgemeine Mikrobiologie, 17 (6), 465-480) su pokazali da glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu (glukanazu I) iz Arthrobacter GJM-1 jeste jedan od enzima litičkog sistema kvasca. Inkubacija izolovanih ćelijskih zidova kvasca sa glukanazom I rezultuje potpunom solubilizacijom ćelijskih zidova kvasca uz stvaranje samo laminaripentaoze.

[0011] U JP6192589 (1986 - Dainippon Ink & Chemicals), obelodanjena je β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu (LPHaza) iz Streptomyces matensis DIC-108. Enzim se koristi u procesu za proizvodnju laminaripentaoze iz polisaharida kurdlana, pahimana i/ili laminarina. Proizvodnja glukanaze iz Streptomyces matensis DIC-108 je obelodanjena u JP8173153. JP9262090 i Nakabayashi et al (1998 - J.Ferm.Bioeng. 85(5), 459-464)) obelodanjuju kloniranje i sekvenciranje gena koji kodira glukanazu iz Streptomyces matensis DIC-108. Autori su takođe izveli aminokiselinsku sekvencu iz gena. Čini se da je LPHaza iz Streptomyces matensis DIC-108 jedinstveni enzim, jer pokazuje samo malu sličnost aminokiselinske sekvence (~60%) sa dve druge β-1,3-glukanaze iz Arthrobacter sp.YCWD3 i Oerskovia xanthineolytica koji su bili 99% identični jedni drugima na nivou proteina (Shen et al. (1991) J. Biol. Chem 266(2) pp.1058-1063 i tamo navedene reference). Kristalna struktura LPHaze rešena je pri rezoluciji 1,62 Å i ispostavilo se da LPHaza pripada porodici glikozid hidrolaze 64 (Wu et al. J. Biol. Chem.284 (39),.26708-26715 „Structure, Mechanistic Action, and Essential Residues of a GH-64 Enzyme, Laminaripentaoseproducing β-1,3-Glucanase“). U nedavnoj studiji, Shresta et al su odredili esencijalne aminokiseline u enzimu za katalizu (Protein Engineering, Design & Selection vol.24 No.8 pp. 617-625, 2011 - Characterization and identification of essential residues of the glycoside hydrolase family 64 laminaripentaose-producing-β-1,3-glucanase).

[0012] Doi, K. & Doi, A.: „Cloning and Expression in Escherichia coli of the Gene for an Arthrobacter beta (1,3)-glucanase“, Journal of Bacteriology, vol.168, No.3. decembar 1986, strane 1272-1276, obelodanjuje tretman glukana kvasca prečišćenom glukanazom I iz Arhtrobacter sp. soja YCWD3, što rezultuje proizvodnjom laminaripentaoze. Navedeno je da glukanaza I brzo rastvara glukan kvasca uz istovremeno oslobađanje laminaripentaoze, ali ne može da napadne laminaridekstrine kratkog lanca. Za razliku od glukanze I, drugi enzim, glukanaza II može da napada laminaridekstrine kratkog lanca i pretvara ih u laminaribiozu i glukozu, ali samo delimično rastvara glukan kvasca.

[0013] Netaknuti β-glukani (kao deo dijetarnih vlakana) imaju zanimljiva zdravstvena svojstva, poput stimulacije imunog sistema kod sisara. β-glukani se ne vare od strane enzimima sisara kada se oralno primenjuju, i uzimaju se u tankom crevu gde stimulišu imunitet sluzokože i sistema aktiviranjem i urođenih i adaptivnih imuniteta. Prva glavna prijavljena funkcija β-glukana bila je antitumorska aktivnost. Kasnije prijavljene biološke aktivnosti uključuju antimikotične, antiinfektivne, radioprotektivne, smanjenje holesterola i metaboličke aktivnosti glukoze posle obroka.

[0014] Potentnost bioloških aktivnosti čestica β-glukana rastvorljivih u vodi je kontroverzna, međutim nedavno je objavljeno da β-glukani u obliku čestica imaju jače imunostimulišuće aktivnosti od β-glukana rastvorljivih u vodi. Dalje, potpuna razgradnja glukana ćelijskih zidova kvasca bilo mešavinama enzima čime se dobijaju glukoza i oligosaharida, ili glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu, čime se dobija laminaripentaoza, ima nedostatak u gubitku zdravstvenih svojstava.

[0015] Predmetni pronalazači otkrili su da netaknuti β-glukani koji su još uvek prisutni u matrici ćelijskog zida kvasca imaju samo ograničenu bioraspoloživost za sisare kada se vare u gastrointestinalnom traktu. Stoga dugo postoji potreba da se, sa jedne strane, poveća bioraspoloživost β-glukana u ćelijskom zidu kvasca, i sa druge strane da se što više sačuvaju zdravstvena svojstva kao što je stimulacija imunog sistema. Predmetni pronalazak pruža postupak pri kom se β-glukani u ćelijskim zidovima kvasca samo delimično razgrađuju β-1,3glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu, povećavajući na taj način sa jedne strane bioraspoloživost β-glukana, dok sa druge strane čuvaju zdravstvena svojstva kao što je stimulacija imunog sistema.

Detaljan opis pronalaska

[0016] U prvom aspektu, pronalazak pruža postupak za tretman sastava koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-glukane, koji su nerastvorljivi kada se ekstrahuju vodom i <15% ukupnih β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca je rastvorljivo kada se ekstrahuje sa DMSO, gde postupak uključuje dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu i deaktivaciju β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu kako bi se dobio sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca u kojima βglukani imaju poboljšanu rastvorljivost u DMSO i odnos ukupnih β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2.

[0017] Prednost postupka prema pronalasku je u tome što se poboljšanjem rastvorljivosti βglukana u DMSO prisutnih u ćelijskim zidovima kvasca poboljšava bioraspoloživost što rezultuje poboljšanim zdravljem životinja kada se životinjama kao ishrana daju ćelijski zidovi kvasca tretirani u skladu sa postupkom pronalaska. Stoga su predmetni pronalazači iznenađujuće pokazali da je stepen rastvorljivosti DMSO u kombinaciji sa odnosom βglukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom prediktivan za bioraspoloživost βglukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca.

[0018] Ovde je definisana β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu kao glukanaza koja oslobađa laminaripentaozu kao pretežni proizvod iz polisaharida kao što su laminarin, pahiman ili kurdlan, kao i iz glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca - pogledati na primer Nakabayashi et al. (1998). β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu razlikuje se od ostalih β-1,3-glukanaza kao što je laminarinaza, jer ove β-1,3-glukanaze proizvode različite oligosaharide kao proizvode.

[0019] Delimično rastvorljiv kada se ekstrahuje sa DMSO kako se koristi u predmetnom kontekstu, definisan je kao <15% ukupnih β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca rastvorljivih u DMSO.

[0020] Poboljšana rastvorljivost u DMSO kako se koristi u predmetnom kontekstu definisana je kao više od 15% ukupnih β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca rastvorljivih u DMSO.

[0021] β-glukani, kako se koriste u ovom kontekstu, definisani su kao polisaharidi monomera D-glukoze povezani β-glikozidnim vezama, koji sadrže najmanje 10 monomera D-glukoze.

[0022] Dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu, kako se koristi u ovom kontekstu, je poželjno dovođenje u dodir ili inkubacija pomenutog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu tokom vremenskog perioda koji je dovoljan da rezultuje sastavom koji sadrži ćelijske zidove kvasca u kom β-1,3-glukani ili β-glukani imaju poboljšanu rastvorljivost u DMSO i odnos ukupnih β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2.

[0023] U poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na postupak za tretman sastava koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane koji su nerastvorljivi kada se ekstrahuju vodom i delimično rastvorljivi (<15% prisutnih β-glukana u ćelijskom zidu kvasca) kada se ekstrahuju sa DMSO, gde postupak uključuje dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu, što rezultuje sastavom koji sadrži ćelijske zidove kvasca, gde β-1,3-glukani imaju poboljšanu rastvorljivost u DMSO (više od 15% β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca rastvorljivo je u DMSO) i odnos glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2. Poželjno je da ovaj proces prati deaktiviranje β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu kako bi se izbeglo stvaranje laminaripentaoze.

[0024] Poželjno je da ovaj postupak uključuje dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu i deaktivaciju β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu kako bi se dobio sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca u kojima β-1,3-glukani imaju poboljšanu rastvorljivost u DMSO (više od 15% β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca rastvorljivo je u DMSO) i odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2, gde je količina laminaripentaoze koju proizvodi β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu manja od 30%, još poželjnije manja od 20%, najpoželjnije manja od 10% (tež./tež.) ili manja od 7,5% (tež./tež.) ukupnih glukoznih jedinica prisutnih u sastavu.

[0025] U predmetnom postupku, stepen hidrolize β-glukana je takav da se poboljša rastvorljivost β-glukana u DMSO, međutim, kada β-glukani nisu, ili suštinski nisu, razgrađeni na šećere kao što je laminaripentaoza. Poželjno je da se u ovom procesu prisutna β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu deaktivira pre nego što se proizvedu oligomeri glukoze poput laminaripentaoze. Predmetni pronalazači otkrili su da delimična hidroliza βglukana povećava korisna zdravstvena svojstva kao što je stimulacija imunog sistema.

[0026] U poželjnom otelotvorenju, predmetni korak deaktiviranja β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu obuhvata zagrevanje predmetnog rezultujućeg sastava na temperaturu iznad 70°C tokom vremena dovoljnog da deaktivira β-1,3-glukanazu koja proizvodi laminaripentaozu. Još poželjnije je da se dobijena smeša zagreva na temperaturi iznad 80°C, poželjnije iznad 85°C, još poželjnije iznad 90°C ili 95°C, najpoželjnije iznad 100°C, tokom vremena dovoljnog da deaktivira β-1,3-glukanazu koja proizvodi laminaripentaozu.

[0027] U poželjnom otelotvorenju, prisutna β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 i SEQ ID No.7 ili aminokiselinske sekvence 60% ili više identične ovim sekvencama.

[0028] Poželjno je da postupak prema pronalasku rezultuje smešom koja sadrži ćelijske zidove kvasca u kojima je više od 20% ili više od 25% β-glukana prisutnih u ćelijskim zidovima kvasca rastvorljivo u DMSO, poželjnije više od 30%, još poželjnije više od 35%, poželjnije više od 40%, najpoželjnije više od 45% β-glukana prisutnih u ćelijskim zidovima kvasca je rastvorljivo u DMSO.

[0029] Istovremeno, odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2, poželjno veći od ili jednak 3, veći od ili jednak 4, veći od ili jednak 5, veći od ili jednak 10, veći od ili jednak 50, veći od ili jednak 100, veći od ili jednak 500, veći od ili jednak 1000, veći od ili jednak 5000, veći od ili jednak 10000.

[0030] Umesto odnosa β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom, za definisanje pronalaska može se koristiti i obrnuti odnos. Odnos β-glukana rastvorljivih u vodi u poređenju sa DMSO je manji od ili jednak 0,5, poželjno manji od ili jednak 1/3, manji od ili jednak 0,25, manji od ili jednak 0,2, manji od ili jednak 0,1, manji od ili jednak 0,02, manji od ili jednak 0,01, manji od ili jednak 0,001, manji od ili jednak 0,0005. Najpoželjniji odnos β-glukana rastvorljivih u vodi u poređenju sa DMSO je blizu nule ili jeste nule.

[0031] U poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.1 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.1.

[0032] U drugom poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.2 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.2.

[0033] U drugoj poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.3 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.3.

[0034] U drugom poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.4 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.4.

[0035] U drugom poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID No.5 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.5.

[0036] U drugom poželjnom otelotvorenju, β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži dve ili više aminokiselinskih sekvenci iz grupe koju čine SEQ ID No.1, SEQ ID No.

2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5 ili aminokiselinska sekvenca 60% ili više identična ovim sekvencama. Poželjna otelotvorenja su β-1,3-glukanaze koje sadrže naredne kombinacije aminokiselinskih sekvenci: SEQ ID No: 1+2, SEQ ID No: 1+3, SEQ ID No: 1+4, SEQ ID No: 1+5, SEQ ID No: 2+3, SEQ ID No: 2+4 ,SEQ ID No: 2+5, SEQ ID No: 3+4, SEQ ID No: 3+5, SEQ ID No: 4+5 , SEQ ID No: 1+2+3, SEQ ID No: 1+2+4, SEQ ID No: 1+2+5, SEQ ID No: 1+3+4, SEQ ID No: 1+3+5, SEQ ID No: 2+3+4, SEQ ID No:

2+3+5, SEQ ID No: 3+4+5, SEQ ID No: 1+2+3+4, SEQ ID No: 2+3+4+5, SEQ ID No: 1+2+3+4+5.

[0037] Još jedno poželjno otelotvorenje je β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3 koja ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID no.6 ili na slici 2, ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85 % ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.6 ili slikom 2.

[0038] Dalje poželjno otelotvorenje je β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces matensis DIC-108 koja ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID no.7 ili na slici 3, ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više, poželjno 65% ili više, poželjno 70% ili više, poželjno 75% ili više, poželjno 85% ili više, poželjno 90% ili više, poželjno 95% ili više identična sa SEQ ID: No.7 ili slikom 3.

[0039] Identičnost između dve poravnate sekvence definisana je kao broj odgovarajućih položaja u poravnanju koji pokazuju identičnu aminokiselinu u obe sekvence podeljeno ukupnom dužinom poravnanja nakon oduzimanja ukupnog broja praznina u poravnanju. Identičnost definisana kao ovde može se dobiti koristeći računarski program NEEDLE pomoću opcije NOBRIEF i u izlazu programa je označena kao „longest-identity“. Za potrebe pronalaska nivo identičnosti (homologije) između dve sekvence (aminokiselinske ili nukleotidne) izračunava se prema definiciji „longest-identity“, što se može izvršiti upotrebom NEEDLE (NEEDLE program iz EMBOSS paketa - verzija 2.8,0 ili noviji, EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite (2000) Rice,P. Longden,I. i Bleasby,A. Trends u Genetics 16, (6) pp276-277, http://emboss.bioinformatics.nl/).

[0040] Postupak prema pronalasku poželjno se izvodi na pH i na temperaturama gde je β-1,3-glukanaza koja stvara laminaripentaozu, kako je ovde prethodno definisano, sposobna da katalizuje postupak prema pronalasku i tretira glukane kako je prethodno definisano. pH je poželjno 2 ili veći, poželjnije 3 ili veći, poželjnije 4 ili veći i najpoželjnije 5 ili veći, dok je istovremeno pH poželjno 9 ili niži, poželjno 8 ili niži, poželjno 7 i najpoželjnije 6 ili niži. Poželjni rasponi pH su između 2 i 9, poželjnije između 3 i 8, još poželjnije između 4 i 7 i

1

najpoželjnije između 5 i 6.

[0041] Temperatura tokom dovođenja u dodir predmetnog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu poželjno je 20°C ili više, poželjnije 30°C ili viša, poželjnije 40°C ili viša i najpoželjnije 50°C ili viša dok je istovremeno temperatura poželjno 90°C ili niža, poželjnije 80°C ili niža, poželjnije 70°C ili niža i najpoželjnije 60°C ili niža. Poželjni temperaturni rasponi su između 20°C i 90°C, poželjnije između 30°C i 80°C, još poželjnije između 40°C i 70°C i najpoželjnije između 50°C i 60°C.

[0042] Opšte je poznato u struci da optimalni pH i temperatura za reakciju katalizovanu enzimima, i samim tim i za postupak prema pronalasku zavise od vrste korišćene β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu. Vreme reakcije može lako odrediti stručna osoba i zavisiće od pripreme ćelijskih zidova kvasca, vrste i doze korišćene β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu, pH i temperature, kao i željenog tretmana β-1,3-glukana kako bi se dobila željena solubilizacija u DMSO. Stručnjak je u stanju, bez nepotrebnog opterećenja, da odredi uslove procesa tako da se za pripremu ćelijskog zida kvasca maksimizuje DMSO-rastvorljivost glukana u ćelijskim zidovima kvasca, dok se minimizuje rastvorljivost u vodi glukana u ćelijskom zidu kvasca u vodi sa pH od 6-7.

[0043] Sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji se koristi u procesu prvog aspekta pronalaska može biti bilo kog porekla. Ćelijski zidovi kvasca komercijalno su dostupni od različitih izvora, posebno od Saccharomyces cerevisiae. Ćelijski zidovi kvasca mogu biti bočni tok komercijalnog ekstrakta kvasca koji se proizvodi u industrijskim razmerama.

Kvasac iz kojeg su izvedeni ćelijski zidovi kvasca može biti bilo koji odgovarajući kvasac. Pogodni kvasci su svi kvasci namenjeni za ishranu (pogledati Bekatorou et al 2006, Food Technol. Biotechnol. 44 (3), 407-415) na primer kvasci iz rodova Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida i drugi. Saccharomyces, naročito Saccharomyces cerevisiae često se koristi za proizvodnju ekstrakta kvasca.

[0044] U drugom aspektu, pronalazak pruža sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane, gde je više od 15% β-glukana rastvorljivo u DMSO i odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa rastvorljivim u vodi je veći od ili jednak 2. Poželjno je da se sastav dobije postupkom iz prvog aspekta pronalaska. Poželjno je da pronalazak pruža sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane, gde je više od 25% βglukana prisutnih u ćelijskim zidovima kvasca rastvorljivo u DMSO, poželjnije više od 30%, još poželjnije više više od 35%, poželjnije više od 40%, najpoželjnije više od 45% β-glukana prisutnih u ćelijskim zidovima kvasca rastvorljivo je u DMSO. Istovremeno, odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2, poželjno veći od ili jednak 3, veći od ili jednak 4, veći od ili jednak 5, veći od ili jednako 10, veći od ili jednak 50, veći od ili jednak 100, veći od ili jednak 500, veći od ili jednak 1000, veći od ili jednak 5000, veći od ili jednak 10000. Umesto odnosa β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom, za definisanje pronalaska može se koristiti i obrnuti odnos. Odnos β-glukana rastvorljivih u vodi u poređenju sa DMSO je manji od ili jednak 0,5, poželjno manji od ili jednak 1/3, manji od ili jednak 0,25, manji od ili jednak 0,2, manji od ili jednak 0,1, manji od ili jednak 0,02, manji od ili jednak 0,01, manji od ili jednak 0,001, manji od ili jednak 0,0005. Najpoželjniji odnos glukana rastvorljivih u vodi u poređenju sa DMSO je blizu nule ili je nula.

[0045] Poželjno je da ovaj sastav sadrži manje od 30%, još poželjnije manje od 20%, najpoželjnije manje od 10% ili manje od 7,5% laminaripentaoze u (tež./tež.) ukupnih glukoznih jedinica prisutnih u smeši. Još poželjnije da ovaj sastav ne sadrži laminaripentaozu ili ne sadrži značajne količine laminaripentaoze. Povoljno je ako nema laminaripentaoze jer je količina delimično razgrađenih β-glukana veća, i samim tim se povećavaju i biološki korisni efekti.

[0046] Dalje, predmetni pronalazak se odnosi na početnu ishranu koja sadrži predmetni sastav, gde početna ishrana dalje sadrži 10 do 30% (tež./tež.) proteina. Početna ishrana je korisna jer pruža pravilnu ishranu za životinje koje rastu poput pilića. Obično se početnom ishranom hrane životinje uzrasta od 0 do 10 nedelja. Poželjno je da takva početna ishrana sadrži sastav predmetnog pronalaska koji sadrži β-glukane rastvorljive u DMSO, 10 do 20% (tež./tež.) proteina, 30 do 40% (tež./tež.) skroba, kalcijuma i/ili fosfora. Količina β-glukana prisutnih u sastavu predmetnog pronalaska u početnoj ishrani je poželjno u rasponu od 1 do 500 mg po kg početne ishrane, još poželjnije 1 do 200 mg po kg početne ishrane, najpoželjnije 1 do 50 mg po kg početne ishrane. Predmetni pronalazači su otkrili da upotreba početne ishrane predmetnog pronalaska pruža poboljšani odnos konverzije hrane i smanjenu smrtnost.

[0047] S obzirom na korisna biološka zdravstvena svojstva prisutnih β-glukana, pronalazak se, prema trećem aspektu, odnosi na upotrebu predmetnog sastava ili početne ishrane drugog aspekta pronalaska, i poželjno se dobija postupkom prvog aspekta pronalaska kao ishrana ili sastojak ishrane.

[0048] U poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu predmetnog sastava ili upotrebu predmetne početne ishrane za poboljšanje odnosa konverzije hrane, poželjno kod domaćih životinja, još poželjnije kod svinja ili pilića kao što su brojler pilići. Predmetni pronalazači su otkrili da glukani koji imaju povećanu rastvorljivost u DMSO pružaju blagotvorne efekte na rast brojler pilića smanjenjem odnosa konverzije hrane. Dalje, pronalazači su otkrili da hranjenjem predmetnog sastava koji sadrži glukane koji imaju povećanu rastvorljivost u DMSO smanjuje smrtnost kod brojler pilića. Prema tome, u poželjnom otelotvorenju, predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu predmetnog sastava za smanjenje smrtnosti brojler pilića, još poželjnije za smanjenje smrtnosti brojler pilića tokom prvih 35 dana rasta nakon rođenja.

[0049] Prema drugom aspektu, predmetni pronalazak se odnosi na predmetni sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane, gde je više od 15% β-1,3-glukana rastvorljivo u DMSO i odnos β-1,3-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa rastvorljivim u vodi je veći od ili jednak 2, za upotrebu kao lek.

predmetno obelodanjenje se odnosi na predmetni sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-1,3-glukane, gde je više od 15% β-1,3-glukana rastvorljivo u DMSO i odnos β-1,3- glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa rastvorljivim u vodi je veći od ili jednak 2, za podsticanje rasta životinja i/ili za podsticanje imunog sistema kod životinja. Poželjne životinje su svinje ili pilići kao što su brojler pilići. Poželjno je da se predmetni pronalazak odnosi na predmetni sastav za povećanje ili indukciju sekrecije IL-6 i IL-10 kod svinja.

Poželjno je da se predmetni pronalazak odnosi na predmetni sastav za povećanje ili indukciju sekrecije IgM i IgG, poželjno za povećanje ili indukciju sekrecije IgM i/ili IgG kod pilića. predmetno obelodanjenje se odnosi na predmetni sastav za podsticanje rasta životinja i/ili za podsticanje imunog sistema životinja, gde se sastav daje kao ishrana životinjama u vremenskom periodu od najviše 15 ili najviše 10 nedelja nakon rođenja, još poželjnije za vremenski period od najviše 5 nedelja nakon rođenja, još poželjnije za vremenski period od najviše 3 nedelje ili najviše 2 nedelje nakon rođenja.

[0050] Poželjnije je da se predmetni sastav za podsticanje rasta životinja i/ili za podsticanje

1

imunog sistema životinja dodaje početnoj ishrani u količini od 1 do 500 mg β-glukana po kg početne ishrane, još poželjnije 1 do 200 mg β-glukana po kg početne ishrane, najpoželjnije 1 do 50 mg β-glukana po kg početne ishrane.

LEGENDA ZA SLIKE

[0051]

Slika 1 - NMR spektar

• 1A - gornji panel - NMR spektar u D2O. t = terminalne jedinice; 1,3 = β-1,3-glukan;

1,6 = β-1,6-glukan

• 1B - donji panel - NMR spektar u DMSO. t = terminalne jedinice; 1,3 = β-1,3-glukan;

1,6 = β-1,6-glukan; b = jedinice grananja

Za dalje objašnjenje pogledati Materijale i postupke pod glukanom rastvorljivim u DMSO, odnosno glukanom rastvorljivim u vodi.

Slika 2 - SEQ ID No.6; β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3.

Slika 3 - SEQ ID No.7; β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces matensis DIC-108.

Slika 4 - Proizvodnja IL 6 nakon stimulacije sa 20 ili 200 µg/ml β-glukana iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca iz Primera 2 (netretirani), tretiranih ćelijskih zidova kvasca (kiselinom) pri pH 3 iz Primera 2, inkubacija 2 i negativna kontrola (neg kontrola). Relativni odgovor izračunava se na osnovu maksimalnog odgovora dobijenog sa ćelijskim zidovima kvasca tretiranih kiselinom pri 20 µg/ml (svinja 1). Slika 5 - Proizvodnja IL 10 nakon stimulacije sa 20 ili 200 µg/ml β-glukana iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca iz Primera 2 (netretirani), tretiranih ćelijskih zidova kvasca (kiselinom) pri pH 3 iz Primera 2, inkubacija 2 i negativna kontrola (neg kontrola). Relativni odgovor izračunava se na osnovu maksimalnog odgovora dobijenog sa ćelijskim zidovima kvasca tretiranim kiselinom pri 20 µg/ml (svinja 1). Slika 6 - Relativna ROS proizvodnja neutrofila izolovanih od svinje (svinja 1), izražena u odnosu na maksimalnu vrednost koja je izmerena nakon dodavanja kiselnim tretiranih ćelijskih zidova kvasca u dozi od 200 µg/ml, za četiri različite doze negativne kontrole (neg kontrola), ćelijski zid tretiran kiselinom (kiselina), ćelijski zidovi tretirani enzimom (enzim) i koncentrat pšeničnog kvasca (WYC). Slika 7 - Relativna ROS proizvodnja neutrofila izolovanih od svinje (svinja 2), izražena u odnosu na maksimalnu vrednost koja je izmerena nakon dodavanja kiselinom tretiranih ćelijskih zidova kvasca u dozi od 200 µg/ml, za četiri različita doziranja negativna kontrola (neg kontrola), ćelijski zid tretiran kiselinom (kiselina), ćelijski zidovi tretirani enzimima (enzim) i koncentrat pšeničnog kvasca (WYC). Slika 8 - Relativna ROS proizvodnja monocita izolovanih od svinje (svinja 1), izražena u odnosu na maksimalnu vrednost koja je izmerena nakon dodavanja kiselinom tretiranih ćelijskih zidova kvasca u dozi od 12,5 µg/ml, za četiri različite doze negativne kontrole (neg kontrola), ćelijski zid tretiran kiselinom (kiselina), ćelijski zidovi tretirani enzimima (enzim) i koncentrat pšeničnog kvasca (WYC). Slika 9 - Relativna ROS proizvodnja monocita izolovanih od svinje (svinja 2), izražena u odnosu na maksimalnu vrednost koja je izmerena nakon dodavanja kiselinom tretiranih ćelijskih zidova kvasca u dozi od 200 µg/ml, za četiri različite doze negativne kontrole (nega kontrola), ćelijski zid tretiran kiselinom (kiselina), ćelijski zidovi tretirani enzimima (enzim) i koncentrat pšeničnog kvasca (WYC).

Materijali i postupci

Denazim Gel-L1

[0052] Denazim Gel-L1 Lot br. T2 dobijen je od Nagase ChemTeX Corporation (Kjoto, Japan). Prema tehničkom listu proizvođača, Denazim Gel-L1 je prečišćeni tečni preparat glukanaze proizveden podvodnom fermentacijom roda Streptomyces. Prema dole opisanom ispitivanju enzima β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu, aktivnost denazim Gel-L1 Lot br. T2 je ~1300 jedinica/ml.

Laminarinaza

[0053] Laminarinaza je kupljena od kompanije Sigma-Aldrich (L9259). Prašak je rastvoren kako bi se dobio rastvor od ~1300 jedinica/ml.

Enzimski test za aktivnost β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu

[0054] Rastvir kurdlana - Napravljeno je 100 ml rastvora 0,5% tež./zap. kurdlana (Sigma C7821, lot 042M4040V) rastvaranjem kurdlana u 1M puferu natrijum acetata pH-5 i inkubacijom tokom 1 sata na sobnoj temperaturi (približno 20°C) praćeno sa 15 minuta inkubacije na 60°C uz neprekidno mešanje pomoću magnetne mešalice. Kako bi se dalje homogenizovala suspenzija, tretirana je 60 sekundi pri 9500 o/min sa IKA T-25 ultra-turrax tip S25-25F (zubni stator 12, rotor 8).

[0055] Hofmanov reagens - Rastvoriti u približno 900 ml vode u 1 l volumetrijskoj boci: 1,17 g kalijum heksacijanoferata (III) (analitički reagens), praćeno sa 19,5 g bezvodnog natrijum

1

karbonata (analitički reagens). Dopuniti vodom do zapremine i mešati. Uvek koristiti sveže pripremljen rastvor.

[0056] Enzimska analiza - 2 ml rastvora kurdlana zagrevano je u vodenom kupatilu na 37°C, nakon čega je dodato 1 ml razblaženog (u 100 mM puferu natrijum acetata pH 5) enzimskog rastvora. Smeša je inkubirana 30 minuta nakon čega je reakcija zaustavljena dodavanjem 2 ml 1 M NaOH, praćeno dodavanjem 4 ml Hofmanovog reagensa. Smeša je inkubirana tokom 15 minuta u ključaloj vodenoj kadi. Nakon hlađenja na sobnu temperaturu, nerastvorljivi kurdlan je uklonjen centrifugiranjem i izmerena je optička gustina supernatanta na 420 nm. Prazni uzorci se koriste za korekciju apsorpcije odgovarajućeg uzorka; određuju se na isti način kao što je gore opisano za uzorke, s tim što se dodaje prvo zaustavni reagens, a zatim uzorak. Pripremljena je kalibraciona kriva sa razblaženjima između 0,3 i 1,4 mM glukoze kako bi se odredila koncentracija redukujućih šećera u probnoj smeši na isti način kao što je gore opisano za uzorke enzima. Voda umesto razređenih rastvora glukoze korišćena je kao prazan prostor za kalibracionu liniju.

[0057] Rastvor enzima dodat smeši za ispitivanje mora da ima između približno 0,25 do 0,5 jedinica/ml ako bi bio u linearnom rasponu enazimske analize.

[0058] Jedna jedinica β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu ovde je definisana kao količina enzima neophodna za oslobađanje količine redukujućih šećera ekvivalentne 1 µmolu glukoze po minuti u uslovima testa kao što je gore opisano (0,5% kurdlan, pH=5, 37°C).

Simanova hidroliza

[0059] Ćelijski zidovi su hidrolizovani prema modifikovanoj Simanovoj hidrolizi (J.F.

Saeman, W.E. Moore, R.L. Mitchell, M.A. Millett (1954) Tappi, 37(8), 336-343). Oko 12 mg izolovanih ćelijskih zidova kvasca tačno je izmereno i 0,300 ml 72% (tež./tež.) D2SO4je dodato uzorku. Uzorak je čuvan 48 sati na 4°C u frižideru (primarna hidroliza). Dalje 1,700 ml D2O je dodato i 1,000 ml osnovnog rastvora maleinske kiseline u D2O. Nakon dobrog mešanja pipetirano je 0,500 ml rastvora i 0,500 ml D2O je dodato. Nerastvorljivi sastojci su uklonjeni centrifugiranjem, i bistri supernatant je prebačen u NMR epruvetu. NMR epruveta je stavljena u ključalu vodu na 100 minuta (sekundarna hidroliza).

[0060] NMR spektri su zabeleženi na Bruker Avancelll NMR spektrometru od 600 MHz,

1

opremljenom sa 5 mm krio sondom. Temperatura uzorka je bila 280K. Vreme akvizicije je bilo 2 sekunde i izabrano je interpulsno kašnjenje od 30 sekundi. Prosečno je bilo 16 skenova, i spektar je pažljivo faziran i osnovica je prilagođena. Integrisani su signali maleinske kiseline (6,5 ppm), α- i β-glukoze (5,22 i 4,62 ppm) i α- i β-manoze (5,18 i 4,90 ppm), i količina manana i glukana izračunata je prema kvantitativnom NMR (qNMR), pogledati jednačinu 1:

Ax

= Integral vrha proizvoda.

Ast

= Integral internog standardnog vrha

nst

= broj protona koji odgovara internom standardnom vrhu

nx

= broj protona koji odgovara vrhu proizvoda

MWx

= molekulska težina proizvoda, 162 za jedinice glukoze i manoze

MWst

= interni standard molekulske težine

Wst

= interni standard težine

Wx

= uzorak težine

Pst

= interni standard čistoće

[0061] Korišćen je korekcioni faktor za razgradnju monomerne glukoze (0,984) i monomerne manoze (0,966).

DMSO rastvorljivi glukan

[0062] Otprilike 100 mg uzorka izmereno je tačno (sa tačnošću od 0,01 mg). Pripremljen je osnovni rastvor DMSO-d6 koji sadrži tačno izmerenu količinu maleinske kiseline i na ćelijske zidove je dodato 1,000 ml ovog rastvora. Suspenzija je stavljena u vodenu kadu na

1

50°C tokom 30 minuta. Nerastvorljivi sastojci su uklonjeni centrifugiranjem. 50 µl D2O je dodato bistrom supernatantu kako bi se osigurala razmena OH protona, i NMR spektri su snimljeni na Bruker Avance III 600 MHz spektrometru, opremljenom 5 mm krio sondom. Temperatura uzorka je bila 320K. Vreme akvizicije je bilo 1,7 sekundi, i izabrano je interpulsno kašnjenje od 10 sekundi. Prosečna su 32 skeniranja, i nakon pažljivog faznog i podešavanja osnovice integrisani su signali β- (1,3) glukana na 4,57 ppm, β-(1,6) glukana na 4,31 ppm, terminalni ostaci na 5,02 i 4,44 ppm, jedinice grananja na 4,50 i 4,42 ppm (pogledati Sliku 1B) i maleinska kiseline pri 6,1 ppm. Sadržaj oslobođenog glukana (zbir svih vrsta) izračunat je iz odnosa integrala i poznatih molekularnih težina i težina uzoraka primenom standardnog qNMR postupka (jednačina 1).

[0063] DMSO rastvorljivi glukani su prijavljeni na suvoj materiji (tež./tež.% na sm).

Relativni sadržaj glukona rastvorljivog u DMSO definisan je kao% ukupnih glukana i izračunat prema jednačini 2:

Glukan rastvorljiv u vodi

[0064] Svi uzorci (15 mg) su rastvoreni u 0,5 ml D2O i 0,5 ml D2O sa 10,91 mg/ml jabučne kiseline, praćeno podešavanjem pH dodavanjem 200 µl 1M fosfatnog pufera sa pH 8,5.

Dobijeni pH je u rasponu 6-7, u zavisnosti od, na primer, serije ćelija kvasca.

[0065] Uzorci su centrifugirani 10 minuta i analiziran je supernatant. Spektri su snimljeni na 280K. NMR spektri su zabeleženi na Bruker Avance III 600 MHz spektrometru, opremljenom 5 mm krio sondom. Temperatura uzorka bila je 280K. Vreme akvizicije je bilo 2 sekunde i izabrano je interpulsno kašnjenje od 30 sekundi. Prosečno je bilo 16 skeniranja. Nakon pažljive faze i korekcije bazne linije, integrisan je signal maleinske kiseline pri 6,1 ppm. Količina glukana procenjena je iz signalnih područja β (1,3) glukana na 4,82-4,70 ppm, terminalnih ostataka na 5,23 i 4,67 ppm i β(1,6) glukana na 4,58-4,51 ppm. Svi integrali prikazani na Slici 1A su dodati kako bi se dobila suma u glukana rastvorljivog u vodi. Sadržaj glukana rastvorljivog u vodi izračunat je iz odnosa integrala i poznatih molekulskih masa i težina uzoraka primenom standardnih qNMR postupaka (jednačina 1).

[0066] Glukani rastvorljivi u vodi primećeni su na suvoj materiji (tež./tež.% na sm). Relativni sadržaj glukana rastvorljivog u vodi definiše se kao % ukupnih glukana i izračunava prema jednačini 3:

In-vitro testovi

1

Proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) sa neutrofilima ili monocitima

[0067] Imunomodulirajući efekat β-glukana iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca, ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom, ćelijskih zidova kvasca tretiranih enzimima i koncentrata pšeničnog kvasca (tržišna referenca) testiran je na neutrofilima i monocitima izolovanim od dve svinje sposobne da proizvode reaktivne kiseoničke vrste ROS). Proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) nakon dodavanja uzoraka u ćelijski medijum u različitim koncentracijama je mera nespecifične odbrane od patogena. Količina ROS je izmerena korišćenjem hemiluminisencijskog testa kako je opisano kod Donne et al., 2005, Vet.

Microbiol. 107, 205-214. Henksov uravnoteženi rastvor soli (HBSS) je korišćen kao negativna kontrola. kako bi se testirala proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika, ćelije su stimulisane forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA). Neutrofili ili monociti su presvučeni na plastičnoj površini odvojenih komorica mikrotitarske ploče. Nakon inkubacije tokom 2 sata na 37°C u CO2atmosferi, supernatant je uklonjen i dodat je luminol. Posle 5 minuta izvršeno je merenje pozadine i dodati su β-glukani u različitim koncentracijama, kao i negativna kontrola. ROS proizvodnja je izmerena tokom 120 minuta. ROS proizvodnja je izražena kao relativna vrednost odgovora koji se odnosi na maksimalnu vrednost koja je izražena kao 100%.

Proizvodnja pro-upalnih (interleukin (IL)-6) i protiv-upalnih (IL-10) citokina

[0068] Izolovane mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) (makrofagi, monociti, B i T ćelije) od 2 svinje inkubirane su u medijumu, uključujući β-glukane iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca ili ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom. Merenjem eksprimiranja IL-6 i IL-10 analizira se efekat dve različite koncentracije β-glukana (20 µg/ml i 200 µg/ml) na ćelije. Koncentracije IL-6 i IL-10 izmerene su pomoću komercijalno dostupnih ELISA kompleta (R&D Systems Inc.; Minneapolis, MN, SAD) prema protokolima preporučenim od proizvođača.

In vivo studija sa brojler pilićima

[0069] Izvršena je in vivo studija sa nekoliko grupa brojler pilića kako bi se utvrdila prosečna težina pilića (jednačina 4), odnos konverzije hrane 1500 g (jednačina 5), imunološki odgovor (Elisa) i smrtnost (jednačina 6) brojler pilića. Tokom ispitivanja pilići su hranjeni standardnom početnom ishranom (kontrola) i standardnom početnom ishranom koja sadrži βglukane (Tabela hemijskog sastava 1). Početna ishrana koja sadrži β-glukane sastojala se od kontrolne početne ishrane sa dodatkom 50 mg β-glukana po kg hrane. Ovi β-glukani potiču iz kombinacije β-glukana (25 mg) iz standardnog koncentrata pšeničnog kvasca i β-glukana (25

1

mg) iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom. Početna ishrana koja sadrži β-glukane davana je samo tokom početka ispitivanja ishrane (početnih 10 dana). Probna ishrana nastavljena je 35 dana.

[0070] Na kraju ispitivanja ishrane (posle 35 dana) utvrđeno je povećanje mase brojler pilića i potrošena hrana za izračunavanje odnosa konverzije hrane za životinje 1500 g (jednačina 5). Smrtnost je izračunata na osnovu razlike održivih brojler pilića na početku ispitivanja ishrane i na kraju ispitivanja ishrane (jednačina 6). Uzeti su uzorci krvi i analiziran je serum na odgovor prirodnog imunog sistema pomoću ELISA (koncentracije IgM i IgG).

[0071] Prosečna težina piletine prema jednačini 4:

[0072] Koeficijent konverzije hrane 1500 g (OKH 1500 g) definisan je sa svakih 25 g težine pilića iznad 1500 g, što smanjuje odnos konverzije hrane za 0,01 i izračunato prema jednačini 5:

[0073] Smrtnost prema jednačini 6:

Standardni sastav početne ishrane za brojler piliće

[0074] Hemijski sastav standardne početne ishrane za brojler piliće (kontrola) i početne ishrane koja sadrži β-glukane primenjene tokom početnih 10 dana ispitivanja ishrane in vivo predstavljeni su u tabeli 1:

Tabela 1: Hemijski sastav ishrane za brojler piliće

ELISA test

2

[0075] Svi uzorci krvne plazme su istog dana analizirani na antitela protiv Keyhole Limpet hemocijanina (KLH) pomoću enzimski-povezanog imunosorbentnog testa (ELISA).

Mikrotitarske ploče (96 komorica) presvučene su sa KLH u koncentraciji od 4 µg/ml u 0,1 M puferu natrijum karbonata, pH 9,6, tokom 1,5 sata na sobnoj temperaturi ili preko noći na rashlađenoj temperaturi. Mikrotitarske ploče su isprane sa viškom vode i osušene.

Odgovarajuća razblaženja uzoraka krvne plazme pripremljena su u fosfatnom puferu sa slanim rastvorom soli (PBS) sa 0,5% konjskog seruma i 0,05% Tween-20. Primer: razblaženja 1/40, 1/160, 1/640 itd. U komorice pipetirati 100 µl pripremljenih rastvora (n=10 ili n=20) i takođe dodati na svaku ploču poznate standarde. Inkubirati mikrotitarsku ploču 1,5 sata na sobnoj temperaturi. Oprati ploču sa viškom vode i osušiti ploču. Razblažiti konjugat (Pileći Ig G-Fc HRP ili Pileći Ig M HRP) u tečnosti za razblaživanje: 1/40.000 ili 1/20.000, i pipetirati 100 µl konjugata u svaku komoricu. Inkubirati mikrotitarsku ploču 1,5 sata na sobnoj temperaturi. Isprati ploču sa viškom vode da bi se uklonila nevezana HRP obeležena antitela i osušiti. Na kraju se u svaku komoricu doda 100 µl hromogenog supstrata koji sadrži tetrametilbenzidin (TMB) i inkubira tokom 10 minuta. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 50 µl 1,25 M rastvora sumporne kiseline u svaku komoricu. Ploče su merene koristeći Elisa Reader na talasnoj dužini od 450 nm. Interpretacija podataka se zasnivala na izmerenim vrednostima različitih razblaženja svakog uzorka.

Primeri

Primer 1

Aminokiselinska sekvenca β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu prisutne u denazimu Gel-L1.

1.1 Varenje β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu prisutne u denazimu Gel-L1 sa tripsinom.

[0076] Protein prisutan u denazimu GEL-L1 je taložen sa TCA (trihlorosirćetna kiselina) razblaživanjem 1:1 sa 20% TCA. Smeša je inkubirana tokom 30 minuta na 4°C i protein je sakupljen centrifugiranjem. Proteinska kuglica je isprana ledeno hladnim acetonom, ponovo sakupljena centrifugiranjem i rastvorena u maloj zapremini 50 mM natrijum hidroksida. Rastvor proteina je razblažen 10 puta sa 100 mM amonijum bikarbonata. Mostovi disulfida smanjeni su dodavanjem 5 mM konačne koncentracije ditiotreitola i 30-ominutnom inkubacijom na 25°C. Cisteini su alkilovani dodavanjem 5,5 mM jodoacetamida krajnje koncentracije i 30-ominutnom inkubacijom na 25°C u mraku. Alkilacija je ugašena izlaganjem uzorka svetlosti, pre varenja tripsinom. Tripsin je dodat u molarnom odnosu 1:100 u supstratu i varenje je izvršeno inkubacijom na 37°C preko noći.

1.2 LC-MS/MS analiza i identifikacija proteina

[0077] Varenje proteina je analizirano pomoću LC-MS/MS i dobijeni podaci su pretraženi u Uniprot bazi podataka kako je opisano kod Nitsche et al. BMC Genomics 2012, 13:380. Aminokiselinska sekvenca β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu od Streptomyces coelicolor A3 (NCBI genbank pristupni broj CAC_16439) bila je najbolji pogodak kada su prikupljeni podaci o MS i MS/MS upareni sa Uniprot bazom podataka.

[0078] Tabela 2 sumira molekulsku težinu 20 peptida, njihovu aminokiselinsku sekvencu (jednoslovni kod) koja je izvedena iz NCBI genbank i položaj aminokiselina peptida u aminokiselinskoj sekvenci β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3.20 peptida se poklapaju. Ukupno se od 20 peptida može napraviti 5 jedinstvenih peptida - pogledati tabelu 3. Pet jedinstvenih peptida je uključeno u spisak sekvenci kao SEQ ID no: 1 do 5, respektivno.

[0079] Tabela 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu Streptomyces coelicolor A3 koja je preuzeta od NCBI genbank (pristupni broj CAC_16439). Podvučeni deo aminokiselinske sekvence predstavlja signalnu sekvencu (33 aminokiseline) kako je obelodanio Nakabayashi et al. (1998) za homolognu β-1,3-glukanazu koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces matensis DIC-108 (u J. Ferm. Bioeng. 85(5), 459-464 "Structure of the Gene Encoding Laminaripentaose-Producing beta-1,3-glucanase (LPHase) of Streptomyces matensis DIC-108). Istaknuti peptidi (siva pozadina) su 5 jedinstvenih peptida pronađenih u β-1,3-glukanazi koja proizvodi laminaripentaozu, izolovanoj iz denazima GEL-L1. Na osnovu savršenog uklapanja ovih 5 pepetida sa aminokiselinskom sekvencom Streptomyces coelicolor A3 β-1,3-glukanaze, može se pretpostaviti da β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu izolovana iz denazima GEL-L1 ima istu aminokiselinsku sekvencu kao i Streptomyces coelicolor A3 β-1,3-glukanaza.

[0080] Tabela 2: Peptidi dobijeni iz varenja denazima-L1 tripsinom.

• Leva kolona „Težina“ pokazuje molekulsku težinu peptida u Daltonima.

• Srednja kolona „Peptid“ pokazuje aminokiselinsku sekvencu odgovarajućeg peptida kako je izvedena iz NCBI genbank.

• Desna kolona prikazuje položaje aminokiselina u sekvenci β-1,3-glukanaze od Streptomyces coelicolor A3 gde se nalazi peptid druge kolone.

Tabela 3

2

Tabela 4 - Aminokiselinska sekvenca β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3.

[0081] Istaknute sekvence predstavljaju 5 jedinstvenih peptidnih sekvenci iz gornje tabele 3.

[0082] Podvučeni deo je pretpostavljena signalna sekvenca na osnovu studija sa homolognom β-1,3-glukanazom iz Streptomyces matensis DIC-108 (Nakanayashi et al. (1998), J.

Fermentation and Bioengineering 85 (5), 459-464). Stoga bi aminokiselinska sekvenca zrelog enzima započela sa Ala na položaju 34. Istaknute aminokiseline predstavljaju 5 peptida kako je prikazano u Tabeli 3.

Tabela 5; Poravnanje aminokiselinske sekvence β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3 sa β-1,3-glukanazom iz Streptomyces matensis DIC-108

[0083] Poravnanje β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3 sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces matensis DIC-10 otkriva da su sekvence 76,3% identične na osnovu dužine 401 ostataka. U aminokiselinskoj sekvenci β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A33 praznine su uvedene.

2

Primer 2

Solubilizacija glukana iz ćelijskog zida kvasca kiselinom i alkalijem

[0084] Izolovani ćelijski zidovi kvasca komercijalno su dostupni od različitih dobavljača. Za ovaj primer, izolovani ćelijski zidovi kvasca su dobijeni kao sporedni proizvod proizvodnje ekstrakta kvasca. Ćelijski zidovi kvasca sadržali su 31,7% glukana na osnovu suve materije.

[0085] Ćelijski zidovi kvasca inkubirani su tokom 16 sati na 95°C i na pH vrednosti naznačenoj u tabeli u nastavku. Nakon inkubacije, uzorak je zagrevan tokom 15 minuta na 100°C, i nakon liofilizacije, ćelijski zidovi kvasca rastvoreni su u D2O ili DMSO kako je opisano u Materijalima i postupcima.

Tabela 6

[0086] Rezultati u Tabeli 6 pokazuju da β-glukani ćelijskog zida kvasca ne mogu biti solubilizovani u vodi na pH 5,5 ili na alkalnom pH od 10 ili 12. Solubilizacija pod kiselim uslovima solubilizira glukane za manji deo: 2,8-5,3 % ukupnih glukana u ćelijskim zidovima kvasca može se rastvoriti.

[0087] U netretiranim ćelijskim zidovima kvasca 13,2% ukupnih β-glukana je rastvoreno u DMSO. Rastvorljivost u kiselim uslovima je znatno povećala količinu u β-glukana rastvorljivih u DMSO (21 i 30%). Pri pH 5,5 i 10,0, udeo β-glukana rastvorljivih u DMSO se nije promenio ili se čak malo smanjio. Solubilizacija u alkalnim uslovima pri pH 12 nije rezultovala solubilizovanim β-glukanima.

Primer 3

2

Rastvorljivost glukana ćelijskog zida kvasca upotrebom β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu

[0088] Izolovani ćelijski zidovi kvasca inkubirani su tokom 16 sati na 55°C i na pH=5,5 sa ili bez naznačenih količina denazima GEL-L1 (% težine sm znači „težinski procenat“ rastvora enzima na bazi suve materije ćelijskog zida kvasca - na primer, 0,01 % težine sm je jednako 0,1 mg rastvora denazima po gramu suvih ćelijskih zidova kvasca). Nakon inkubacije, uzorak je zagrevan tokom 15 minuta na 100°C, i nakon liofilizacije, ćelijski zidovi kvasca rastvoreni su u D2O ili DMSO kako je opisano u Materijalima i postupcima. Nakon inkubacije tokom 30 minuta na 50°C, uzorci su centrifugirani tokom 10 minuta i supernatant je analiziran pomoću NMR kako je opisano u Materijalima i postupcima.

Tabela 7

[0089] Rezultati u Tabeli 7 pokazuju da inkubacija ćelijskih zidova kvasca sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu (denazim GEL-L1) značajno povećava rastvorljivost fragmenta β-glukana u DMSO, dok se rastvorljivost u vodi povećava samo sa najvećom koncentracijom enzima.

Uporedni primer 4

Rastvorljivost glukana ćelijskog zida kvasca upotrebom laminarinaze

[0090] Izolovani ćelijski zidovi kvasca inkubirani su tokom 16 sati na 55°C i na pH=5,3 sa ili bez naznačenih količina laminarinaze (% težine sm znači „težinski procenat“ rastvora enzima na bazi suve materije ćelijskog zida kvasca - na primer, 0,01% težine sm jednako je 0,1 mg rastvora laminarinaze po gramu suvih ćelija zidova kvasca). Nakon inkubacije, uzorak je

2

zagrevan tokom 15 minuta na 100°C, i nakon liofilizacije, ćelijski zidovi kvasca rastvoreni su u D2O ili DMSO kako je opisano u Materijalima i postupcima.

[0091] Nakon inkubacije tokom 30 minuta na 50°C, uzorci su centrifugirani tokom 10 minuta i supernatant je analiziran pomoću NMR kako je opisano u Materijalima i postupcima.

Ćelijski zidovi kvasca sadržavali su 37% glukana.

Tabela 8

[0092] Rezultati u Tabeli 8 jasno pokazuju da laminarinaza nije u stanju da rastvori glukane prisutne u ćelijskim zidovima kvasca.

Primer 5

In vitro studija o sekreciji IL-6 i IL-10

[0093] Izolovane mononuklearne ćelije periferne krvi (PMBC) (makrofagi, monociti, B i T ćelije) od 2 svinje inkubirane su u medijumu, uključujući β-glukane iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca ili ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom dobijene iz primera 2. IL-6 je pro-upalni citokin koji se oslobađa na početku imunog odgovora, dok je IL-10 protiv-upalni citokin.

[0094] Slike 4 i 5 pokazuju da postoji stimulativni efekat na sekreciju IL 6 i IL 10 nakon dodavanja β-glukana iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom pri pH 3 iz Primera 2, inkubacija 2 u poređenju sa β-glukanima iz netretiranih ćelijskih zidova kvasca iz primera 2 (kontrola).

Primer 6

In vitro studija o proizvodnji reaktivnih vrsta kiseonika

[0095] Imunomodulirajući efekat β-glukana iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom iz

2

Primera 2, enzimski tretiranih ćelijskih zidova Primera 3, inkubacije br.7 i komercijalnog koncentrata pšeničnog kvasca (tržišna referenca) testiran je na neutrofilima i na monocitima izolovanim od dve svinje sposobne za proizvodnju reaktivnih vrsta kiseonika (ROS).

Proizvodnja reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) nakon dodavanja uzoraka u ćelijski medijum u različitim koncentracijama je mera nespecifične odbrane od patogena. Henksov uravnoteženi rastvor soli (HBSS) je korišćen kao negativna kontrola.

[0096] Podaci na Slikama 6 i 7 jasno pokazuju da je identifikovan odgovor na dozu za sve primenjene uzorke koji sadrže β-glukan. Ćelijski zidovi kvasca tretirani kiselinom iz primera 2, enzimi obrađeni ćelijski zidovi kvasca iz primera 3, inkubacija br.7 i komercijalni koncentrat pšeničnog kvasca (tržišna referenca) pokrenuli su proizvodnju ROS u neutrofilima pri koncentraciji β-glukana od 50 i 200 µg/ml.

[0097] Ćelijski zidovi kvasca tretirani kiselinom iz primera 2 i enzimi tretirani ćelijski zidovi kvasca iz primera 3, inkubacija br.7 pokazali su poboljšani stimulativni efekat na proizvodnju O-radikala u poređenju sa komercijalnim koncentratom pšeničnog kvasca (tržišna referenca).

[0098] Slike 8 i 9 jasno pokazuju da β-glukan prisutan u komercijalnom koncentratu pšeničnog kvasca nije pokrenuo proizvodnju ROS od strane monocita u ispitivanim koncentracijama. β-glukan prisutan u ćelijskim zidovima kvasca tretiranim kiselinom u Primeru 2 i enzimima tretiranim ćelijskim zidovima kvasca iz Primera 3, inkubacija br.7 su pokazali pokretanje proizvodnje O-radikala. Međutim, efekat odgovora na dozu se razlikovao kod obe svinje.

Primer 7

In vivo studija na brojler pilićima

[0099] Tokom in vivo studije sa nekoliko grupa od 3000 brojler pilića utvrđeni su naredni parametri nakon hranjenja brojler pilića sa standardnom početnom ishranom bez dodavanja β-glukana (kontrola) ili sa standardnom početnom ishranom koja sadrži 50 mg β-glukana po kg hrane (test). Ovih 50 mg β-glukana potiče iz kombinacije β-glukana iz standardnog koncentrata pšeničnog kvasca (25 mg) i β-glukana iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom (25 mg). Početna ishrana koja sadrži 50 mg β-glukana davana je samo tokom početka ispitivanja ishrane, tj. tokom prvih 10 dana. Ispitivanje ishrane nastavljeno je 35 dana

2

sa standardnom početnom ishranom za obe grupe (kontrola i test). Na kraju ispitivanja ishrane utvrđeni su naredni parametri: ukupna potrošena hrana (kg), ukupno meso na kraju ispitivanja ishrane (kg), prosečna težina po piletu (g), odnos konverzije hrane 1500 g, uzorci krvi su uzeti i serum je analiziran na prirodni odgovor imunog sistema putem ELISA (IgM i IgG koncentracije).

Tabela 9

[0100] Rezultati u Tabeli 9 jasno su pokazali da su brojler pilići, hranjeni standardnom početnom ishranom koja sadrži β-glukane delimično poreklom iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom, posle 35-odnevnog ispitivanja ishrane pokazali poboljšanu prosečnu težinu pileta, poboljšani odnos konverzije hrane 1500 g (OKH 1500 g) i povećan imunološki odgovor za IgM i IgG.

Primer 8

In vivo studija na brojler pilićima

[0101] In-vivo studija sa nekoliko grupa od približno 34000 brojler pilića koji su hranjeni standardnom početnom ishranom koja sadrži dodate β-glukane tokom prvih 10 dana ispitivanja. Kontrolna grupa od 35000 brojler pilića hranjena je samo standardnom početnom ishranom. Standardna početna ishrana koja sadrži dodate β-glukane sadržala je 50 mg βglukana po kg hrane koja potiče od kombinacije β-glukana iz standardnog koncentrata pšeničnog kvasca (25 mg) i β-glukana iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom (25 mg). Na kraju ispitivanja ishrane za piliće (nakon 35 dana) utvrđeni su naredni parametri: ukupna potrošena hrana (kg), ukupno meso na kraju ispitivanja ishrane (kg), prosečna težina po piletu (g), odnos konverzije hrane 1500 g i zabeležena je smrtnost brojler pilića.

Tabela 10

[0102] Rezultati u Tabeli 10 jasno su pokazali da su brojler pilići, hranjeni standardnom

1

početnom ishranom koja sadrži 50 mg β-glukana delimično poreklom iz ćelijskih zidova kvasca tretiranih kiselinom, imali povećanu prosečnu masu, odnos konverzije hrane 1500 g poboljšan i, konačno, smrtnost je jasno smanjena.

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Postupak za tretman sastava koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrže β-glukane koji su nerastvorljivi kada se ekstrahuju sa vodom, a <15% ukupnih β-glukana prisutnih u ćelijskom zidu kvasca su rastvorljivi kada se ekstrahuju sa DMSO, gde postupak uključuje dovođenje u dodir navedenog sastava sa β-1,3-glukanazom koja proizvodi laminaripentaozu i deaktiviranje β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu kako bi se dobio sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca, gde β-glukani imaju poboljšanu rastvorljivost u DMSO, a odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa vodom je veći od ili jednak 2.

2. Postupak prema patentnom zahtevu 1, gde deaktivacija uključuje zagrevanje navedenog sastava na temperaturu iznad 70°C tokom vremena dovoljnog za deaktivaciju β-1,3-glukanaze koja proizvodi laminaripentaozu.

3. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID No.1, SEQ ID No.2, SEQ ID No.3, SEQ ID No.4, SEQ ID No.5, SEQ ID No.6 i SEQ ID No.7 ili aminokiselinska sekvenca 60% ili više identična ovim sekvencama.

4. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces coelicolor A3 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID No.6 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više identična sa SEQ ID: No 6.

5. Postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, gde je β-1,3-glukanaza koja proizvodi laminaripentaozu iz Streptomyces matensis DIC-108 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID no.7 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 60% ili više identična sa SEQ ID: No 7.

6. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se postupak prema pronalasku izvodi pri pH između 2 i 9.

7. Postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde se postupak prema pronalasku izvodi na temperaturi između 20°C i 90°C.

8. Sastav koji sadrži ćelijske zidove kvasca koji sadrži β-1,3-glukane naznačene time da je više od 15% β-glukana rastvorljivo u DMSO, dok je odnos β-glukana rastvorljivih u DMSO u poređenju sa rastvorljivim u vodi veći od ili jednak 2, i sastav se može dobiti postupkom kako je definisano u bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.

9. Početna ishrana koja sadrži sastav kako je definisan u patentnom zahtevu 8, koji dalje sadrži 10 do 30% (tež./tež.) proteina.

10. Upotreba sastava kako je definisan u patentnom zahtevu 8, kao sastojka ishrane u početnoj ishrani.

11. Upotreba prema patentnom zahtevu 10, za poboljšanje odnosa konverzije hrane za životinje, poželjno za svinje i piliće.

12. Sastav, kako je definisan u patentnom zahtevu 8, za upotrebu kao lek.

4