RS61907B1 - Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena - Google Patents

Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena

Info

Publication number
RS61907B1
RS61907B1 RS20210529A RSP20210529A RS61907B1 RS 61907 B1 RS61907 B1 RS 61907B1 RS 20210529 A RS20210529 A RS 20210529A RS P20210529 A RSP20210529 A RS P20210529A RS 61907 B1 RS61907 B1 RS 61907B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
dbdpp
target
amino acid
seq
cell
Prior art date
Application number
RS20210529A
Other languages
English (en)
Inventor
David William Lafleur
David M Hilbert
Original Assignee
Subdomain Llc
Arcellx Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Subdomain Llc, Arcellx Inc filed Critical Subdomain Llc
Publication of RS61907B1 publication Critical patent/RS61907B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4211—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/421—Immunoglobulin superfamily
    • A61K40/4212—CD22, BL-CAM, siglec-2 or sialic acid binding Ig-related lectin 2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K40/4214—Receptors for cytokines
    • A61K40/4217—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70575—NGF/TNF-superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C07K16/10—RNA viruses
    • C07K16/11—Paramyxoviridae (F); Pneumoviridae (F), e.g. respiratory syncytial virus [RSV]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3007—Carcino-embryonic Antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/5758—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumours, cancers or neoplasias, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides or metabolites
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K40/00 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/567—Framework region [FR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/41—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a Myc-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C07K2319/43—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation containing a FLAG-tag
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
POVEZANI SLUČAJI
[0001] Ova prijava ima prvenstvo u odnosu na Privremenu prijavu Sjedinjenih Američkih Država serijski br.: 62/143,772, koja je podneta 6. aprila 2015.
REFERENCA NA LISTU SEKVENCI
[0002] Predmetna prijava se podnosi uz listu sekvenci u elektronskom formatu.
POZADINA
[0003] Reagensi na bazi antititela su ubrzali tempo biološkog istraživanja i razvoja. Kompozicije antitela predstavljaju jednu od najvažnijih i najuspešnijih klasa terapeutskih i dijagnostičkih agensa koji se koriste u farmaceutskoj industriji. Međutim, trošak, vreme i delotvornost podstakli su razvoj alternativnih afinitetnih reagenasa.
[0004] Pojavili su se različiti formati koji ne vezuju antitelo za primene za koje su se u prošlosti koristila antitela. Iako su zabeleženi mnogi uspesi za nestrukturisane, linearne peptide, robusniji rezultati su ostvareni nametanjem strukturnog ograničenja na peptidnoj sekvenci, uobičajeno putem uvođenja disulfidne veze. Ovo ograničenje pruža veći afinitet i veću specifičnost kroz povoljniju termodinamiku komplementarnosti fiksnog oblika i površinske prezentacije ostataka (npr. hidrofobne aminokiseline) koji bi u suprotnom mogli biti zaklonjeni, te stoga ne okrenuti ka cilju (Ladner, Trends in Biotech.13(10):426-430, 1995). Nasuprot tome, formati koji sadrže disulfidne veze obično su skloni neispravnom sparivanju cisteina, bilo unutar domena ili između domena, što može dovesti do manje ekspresije, prinosa proizvoda i kvaliteta proizvoda.
[0005] Struktura koja se nalazi u poddomenima proteina pruža još jedan izvor strukturnog ograničenja. Strukture kao što su ponavljanja fibronektina tipa III (adnektini), z-proteini (afitela), inhibitorski čvorovi cistina, lipokalini (antikalini) i ankirinska ponavljanja (DARPini) razvijene su sa afinitetom sličnim antitelu na raznovrsne ciljeve (Hey et al. Trends in Biotech.
23(10):514-422, 2005). Ti domeni obično sadrže dve karakteristike koje su analogne okvirima i regionima za određivanje komplementarnosti (CDR) koji se nalaze u varijabilnim domenima antitela: strukturni skelet koji daje veliku termodinamičku stabilnost i ostaci ili petlje koji grade osnovu varijabilnosti biblioteke prikaza.
SAŽETAK
[0006] Uopšteno, ostaje značajna neispunjena potreba za novim agensima i kompozicijama koji vezuju cilj, a naročito za takvim agensima koji sadrže alternativne vezujuće skelete (npr. skeleti ne-antitela). U nekoliko otelotvorenja, agensi od posebnog interesa, na primer, mogu biti okarakterisani značajno smanjenim troškovima proizvodnje i/ili uporedivim ili superiornim svojstvima reagensa, sredstva za dijagnozu i/ili lečenje u poređenju sa antitelima. Predmetno otkriće pruža takve željene agense u nekoliko otelotvorenja. Na primer, u nekoliko otelotvorenja, predmetno otkriće pruža određene polipeptidne agense koji su okarakterisani velikim afinitetom vezivanja za cilj i strukturnim skeletom koji nije antitelo. Kao alternativa ili dodatak tome, u nekoliko otelotvorenja, agensi koji vezuju cilj, kao što su ovde otkriveni polipeptidi, na primer, dobijeni iz ovde otkrivenih postupaka proizvodnje imaju prednosti koje uključuju, na primer, vezivanje u velikoj meri specifično za cilj. U nekim otelotvorenjima, to može pogodno da se koristi da se terapeutska sredstva (npr. imunske ćelije) usmere na određene ćelije (npr. bolesne ćelije), što smanjuje ili eliminiše dejstvo van cilja. U nekim otelotvorenjima, ovde obezbeđeni agensi, kao što su polipeptidi specifični za cilj, mogu da se koriste kao proteinski terapeutici za vezivanje ćelija ili rastvorljivih faktora uključenih u bolest. U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni agensi mogu da se koriste za prečišćavanje ciljeva (npr. proteina ili drugih ciljeva) sa velikim stepenom specifičnosti, što može, na primer, dovesti do veće čistoće i/ili manje naknadne obrade radi prečišćavanja cilja.
[0007] Nekoliko otelotvorenja ovde otkrivenih pronalazaka odnosi se na agense koji specifično vezuju željene ciljeve, kao što su polipeptidi (DBDpp) koji sadrže de novo vezujući domen (DBD) koji su ovde otkriveni. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori i ćelije domaćini koji sadrže nukleinske kiseline, kao i biblioteke DBDpp i postupci za proizvodnju i pretragu takvih biblioteka i DBDpp identifikovanog iz takvih biblioteka i/ili pretraga. Obezbeđeni su i DBDpp uključujući fuzione proteine DBDpp, kao i postupci za proizvodnju i korišćenje DBDpp. Neograničavajući primeri takvog korišćenja uključuju, ali nisu ograničeni na, afinitetno prečišćavanje, analizu cilja, dijagnostičke i/ili terapeutske primene.
Konkretno, predmetni pronalazak obezbeđuje polipeptid koji vezuje cilj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
pri čemu
(a) Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina;
(b) Z1i Z2sadrže od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina;
(c) polipeptid koji vezuje cilj specifično vezuje željeni cilj, pri čemu je specifično vezivanje polipeptida koji vezuje cilj za željeni cilj veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za željeni cilj; i
(d) polipeptid koji vezuje cilj ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50.
Predmetni pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 6, i dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač. Pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji sadrži polipeptid koji se vezuje za cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 6. U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji se vezuje za cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4.
U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 9, i opciono dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju polipeptida koji vezuje cilj koji kodira molekul nukleinske kiseline, ili ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 9 ili vektor iz zahteva 10.
U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje himerni receptor antigena (chimeric antigen receptor, CAR), pri čemu CAR sadrži (a) ciljajući domen, (b) transmembranski domen, i (c) domen intracelularne signalizacije, pri čemu ciljajući domen sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4.
U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14.
U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14, opciono, pri čemu je ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK) i, opciono, pri čemu ćelija ispoljava antitumorski imunitet kada se polipeptid koji vezuje cilj vezuje za njegov odgovarajući tumorski antigen.
U dodatnom aspektu, pronalazak obezbeđuje imunsku ćeliju koja sadrži CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14 za upotrebu u lečenju kancera, opciono pri čemu je imunska ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).
Dodatni aspekti pronalaska obezbeđuju polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji sadrži tri antiparalelne alfa spirale povezane linkerskim peptidima, pri čemu (a) DBDpp je sintetički peptid dobijen iz modifikacija aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, pri čemu se modifikacija sastoji od 1 do 30 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija izabranih od pozicija 1-6, 8-10, 12, 13, 15-17, 19, 20-27, 29, 30, 32-34, 36, 37, 39-41, 43-52, 54, 55, 57-59, 61, 62, 64-66 i 68-73 SEQ ID NO: 1; (b) DBDpp specifično vezuje cilj od interesa, pri čemu je specifično vezivanje DBDpp za cilj od interesa veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za cilj od interesa; i (c) DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50 niti fuzioni protein koji sadrži prvi i drugi DBDpp prema bilo kom od zahteva 18-21, pri čemu prvi i drugi DBDpp ispoljavaju specifičnost vezivanja za ciljni tumor, opciono pri čemu prvi i drugi DBDpp ispoljavaju specifičnost vezivanja za različite ciljne tumore. Dalji aspekti pronalaska obezbeđuju farmaceutsku kompoziciju koja sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 21, 23 i 24, ili fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 22 do 24, i dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač ili komplet koji sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 21, 23 i 24, ili fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 22 do 24.
Još dalji aspekti pronalaska obezbeđuju izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, ili fuzioni protein iz zahteva 22 ili vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 27 i opciono dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju DBDpp, ili fuzioni protein kodiran od strane molekula nukleinske kiseline ili ćeliju domaćina koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 27, ili vektor iz zahteva 28 ili ćelijsku liniju koja sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, ili fuzioni protein iz zahteva 22.
Dodatni aspekt pronalaska obezbeđuje himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR sadrži (a) ciljajući domen, (b) transmembranski domen, i (c) domen intracelularne signalizacije, pri čemu ciljajući domen sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, ili fuzioni protein iz zahteva 22.
Pronalazak takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32 ili ćeliju koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32, opciono pri čemu je ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK), i opciono pri čemu ćelija ispoljava antitumorski imunitet kada se DBDpp ili fuzioni protein vezuje za njegov odgovarajući tumorski antigen ili imunsku ćeliju koja sadrži CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32 za upotrebu u lečenju kancera, opciono pri čemu je imunska ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK) ili T ćelija koja sadrži himerni receptor antigena (CAR) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu CAR sadrži:
(a) domen koji vezuje cilj koji sadrži polipeptid koji vezuje cilj koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37
FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:6), pri čemu, Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina, pri čemu, Xnnije cisteinski niti prolinski ostatak, pri čemu se polipeptid koji vezuje cilj specifično vezuje za cilj od interesa eksprimiran od strane ćelije kancera, i pri čemu je specifično vezivanje polipeptida koji vezuje cilj za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa,
(b) transmembranski domen izabran od 41BB i CD28, i
(c) intracelularni domen, pri čemu intracelularni domen sadrži domen za signalizaciju izabran od alfa, beza ili zeta lanca T ćelijskog receptora.
[0008] Dodatni aspekt pronalaska obezbeđuje postupak za transformaciju referentnog polipeptida u polipeptid koji vezuje cilj sposoban za specifično vezivanje za cilj od interesa, pri čemu postupak obuhvata:
(a) modifikovanje većeg broja aminokiselinskih ostataka iz referentnog polipeptida da bi se dobio veći broj potencijalnih polipeptida koji vezuju cilj; pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj uključuju varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže tri antiparalelne alfa spirale spojene linkerskim peptidima, pri čemu su modifikovani aminokiselinski ostaci dostupni ili nedostupni rastvaraču, i pri čemu modifikacija obuhvata jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, i ne obuhvata supstituciju cisteinom ili prolinom;
(b) pakovanje većeg broja kandidata za polipeptide koji vezuju cilj u više vektora radi stvaranja biblioteke kandidata; i
(c) pretraživanje biblioteke kandidata radi kandidata za polipeptide koji vezuju cilj koji ispoljavaju specifično
vezivanje za cilj od interesa;
pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NP EVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina, i Z1i Z2sadrže od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina.
Konačni aspekt pronalaska obezbeđuje čestice slične virusu (VLP) koje sadrže fuzioni polipeptid koji sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, pri čemu su VLP pogodni za upotrebu kao imunogeni za stvaranje antitela, pri čemu su navedena antitela usmerena na DBDpp.
Opseg pronalaska je definisan zahtevima. Materija izvan opsega zahteva je obezbeđena radi informacija.
[0009] U nekoliko primera, polipeptid ima sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 pošto su određene odabrane aminokiselinske pozicije modifikovane. U nekim otelotvorenjima, modifikacije uključuju supstitucije. U nekoliko primera, supstitucije su konzervativne supstitucije, dok su u nekim otelotvorenjima supstitucije nekonzervativne supstitucije. U još nekim primerima, koriste se kombinacije konzervativnih i nekonzervativnih supstitucija. U nekim primerima, supstitucije ne uključuju supstituciju cisteinom (npr. sekvenci se ne dodaje cistein). U nekim primerima, supstitucije ne uključuju supstituciju prolinom (npr. sekvenci se ne dodaje prolin). U nekim primerima, ni cistein ni prolin nisu supstituisani u sekvencu polipeptida.
[0010] Ovde otkriveni agensi mogu da vezuju različite ciljeve od interesa. Na primer, u nekoliko otelotvorenja, cilj od interesa specifično vezan polipeptidom je antigen kancera. U nekim otelotvorenjima, antigen kancera specifično vezan polipeptidom je PD-L1. U nekoliko takvih otelotvorenja, polipeptid koji vezuje cilj sadrži aminokiselinsku sekvencu, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43 i SEQ ID NO:44. U nekim otelotvorenjima, antigen kancera specifično vezan polipeptidom je CD137. U jednom takvom otelotvorenju, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:19. U nekim otelotvorenjima, antigen kancera specifično vezan polipeptidom je CD123. U nekim takvim otelotvorenjima, polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane od SEQ ID NO: 92-127. U nekim otelotvorenjima, ciljana je kombinacija antigena kancera, na primer, putem kuplovanja ili kombinovanja na drugi način različitih polipeptida koji vezuju cilj. U nekim otelotvorenjima, ciljana su dva, tri, četiri ili više različitih antigena kancera. U nekim otelotvorenjima, polipeptidi koji vezuju više ciljeva se koriste za pojačavanje sposobnosti i/ili kapaciteta za vezivanje pojedinačnog cilja (npr. dimeri, trimeri, itd.)
[0011] 2. Obezbeđen je postupak za transformaciju referentnog polipeptida u polipeptid koji vezuje cilj sposoban za specifično vezivanje za cilj od interesa, pri čemu postupak obuhvata:
(a) modifikovanje većeg broja aminokiselinskih ostataka iz referentnog polipeptida da bi se dobio veći broj potencijalnih polipeptida koji vezuju cilj; pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj uključuju varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže tri antiparalelne alfa spirale spojene linkerskim peptidima, pri čemu su modifikovani aminokiselinski ostaci dostupni ili nedostupni rastvaraču, i pri čemu modifikacija obuhvata jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, i ne obuhvata supstituciju cisteinom ili prolinom;
(b) pakovanje većeg broja kandidata za polipeptide koji vezuju cilj u više vektora radi stvaranja biblioteke kandidata; i
(c) pretraživanje biblioteke kandidata radi kandidata za polipeptide koji vezuju cilj koji ispoljavaju specifično vezivanje za cilj od interesa;
pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
1
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NP EVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina, i Z1i Z2sadrže od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina.
[0012] U nekoliko otelotvorenja, postupak dalje obuhvata identifikovanje potencijalno imunogenih aminokiselinskih ostataka u kandidatima za vezujuće polipeptide i modifikaciju najmanje jednog od potencijalno imunogenih aminokiselinskih ostataka (npr. radi smanjenja potencijalne imunogenosti nastalih polipeptida koji vezuju cilj od interesa). U nekoliko otelotvorenja, modifikacija za smanjenje imunogenosti obuhvata aminokiselinsku supstituciju (npr. konzervativnu i/ili nekonzervativnu supstituciju).
[0013] Obezbeđen je polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji sadrži tri antiparalelne alfa spirale spojene linkerskim peptidima, pri čemu
(a) DBDpp je sintetički peptid dobijen iz modifikacija aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, pri čemu se modifikacije sastoje od 1 do 30 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija izabranih od pozicija 1-6, 8-10, 12, 13, 15-17, 19, 20-27, 29, 30, 32-34, 36, 37, 39-41, 43-52, 54, 55, 57-59, 61, 62, 64-66 i 68-73 SEQ ID NO: 1;
(b) DBDpp specifično vezuje željeni cilj, pri čemu je specifično vezivanje DBDpp za željeni cilj veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za željeni cilj; i
(c) DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50.
U nekoliko otelotvorenja, obezbeđen je polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji sadrži ili se suštinski sastoji od tri antiparalelne alfa spirale, gde je DBDpp varijanta sintetičkog polipeptida, pri čemu se DBDpp imunospecifično vezuje za protein koji je najmanje 95% identičan sa CD123. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp ima konstantu disocijacije (KD) od oko 10<-4>M do oko 10<-12>M. U nekim otelotvorenjima, cilj za koji se DBDpp imunospecifično vezuje sadrži aminokiseline 19-305 iz CD123 (SEQ ID NO: 187). Ovde je takođe obezbeđen DBDpp koji ima aminokiselinsku sekvencu MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNP EVE X55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), i pri čemu je Xnprirodna ili neprirodna aminokiselina. Štaviše, takođe je predviđen i DBDpp koji ima aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od SEQ ID NO:60 - SEQ ID NO: 136. Još dalja otelotvorenja predviđaju fuzioni protein koji se vezuje za CD123 (ili druge ciljeve od interesa koji su ovde otkriveni) i dalje sadrži jedan ili više dodatnih DBDpp koji ispoljavaju specifičnost vezivanja za ciljni tumor.
[0014] U nekoliko otelotvorenja, agens koji vezuje cilj (npr. polipeptid sa specifičnošću za cilj od interesa) je obeležen. U zavisnosti od otelotvorenja, mogu se koristiti različite oznake, uključujući, bez ograničenja, enzimsku oznaku, fluorescentnu oznaku, luminescentnu oznaku i bioluminescentnu oznaku. U nekim otelotvorenjima, oznaka je biotinski ostatak. U nekoliko otelotvorenja, može da se koristi streptavidinski ostatak. U nekim otelotvorenjima, koristi se His-oznaka, FLAG-oznaka ili druga oznaka. U nekim otelotvorenjima, oznaka je luciferaza, zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, ili drugi slični agens.
[0015] U nekoliko otelotvorenja, agens koji vezuje cilj (npr. polipeptid) konjugovan je sa terapeutskim ili citotoksičnim agensom (npr. hemoterapeutski agens, radioterapeutski agens, itd.). U zavisnosti od otelotvorenja, agens koji vezuje cilj može opciono da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0016] U nekoliko otelotvorenja, obezbeđeni su kompleti koji sadrže bilo koji od ovde otkrivenih agensa koji vezuju cilj (npr. terapeutski komplet, dijagnostički komplet, komplet za istraživačku upotrebu, itd.).
[0017] Nekoliko otelotvorenja takođe obezbeđuje izolovane molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji od ovde otkrivenih polipeptida koji vezuju cilj. Još neka otelotvorenja obezbeđuju vektor (npr. plazmid, virusni vektor ili nevirusni vektor) koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline. Nekoliko takvih otelotvorenja može takođe da uključuje standardne komponente za ekspresiju proteina kodiranog nukleinskom kiselinom (npr. promoteri, komponente za pakovanje, itd.). Na primer, u nekoliko otelotvorenja, vektor dalje sadrži dodatnu nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju polipeptida kodiranog molekulom nukleinske kiseline. U nekoliko otelotvorenja, dodatna sekvenca nukleinske kiseline je inducibilni promoter.
[0018] U nekoliko otelotvorenja su dalje predviđene ćelije domaćini koje sadrže molekule nukleinske kiseline koji kodiraju bilo koji od ovde otkrivenih polipeptida koji vezuju cilj. U nekoliko takvih otelotvorenja, ćelija domaćin (npr. ćelijska linija) konstruisana je da eksprimira polipeptide koji vezuju cilj koji su ovde opisani. U nekim otelotvorenjima, ekspresija polipeptida koji vezuju cilj od strane ćelija domaćina omogućava proizvodnju i izolovanje polipeptida koji vezuju cilj. U nekim otelotvorenjima, ekspresija dovodi do polipeptida koji vezuju cilj eksprimiranih na površini i/ili integrisanih u membranu ćelija.
[0019] Ovde su takođe predviđeni polipeptidi sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji se takmiče sa ovde opisanim polipeptidima u vezivanju za CD123 (ili druge ciljeve od interesa). U nekoliko otelotvorenja, takođe su obezbeđeni polipeptidi koji se takmiče sa onima koji su ovde opisani u vezivanju za druge ciljeve od interesa, uključujući CD123, PD-L1, CD19, CD22 i slično (ili druge ovde otkrivene ciljeve). Konkurenti koji su predviđeni uključuju potpune ili parcijalne agoniste, potpune ili parcijalne antagoniste, i slično. Oni agensi koji se takmiče u vezivanju za cilj od interesa (za isti epitop, preklapajući epitop ili nepreklapajući epitop, što
1
dovodi do sternih ili drugih smetnji kod agensa koji vezuje cilj od interesa) mogu da se identifikuju testovima konkurentskog vezivanja.
[0020] Ovde su takođe obezbeđeni polipeptidi (samostalno ili eksprimirani od strane ćelije) koji se vezuju za tumor. U nekoliko otelotvorenja, vezivanje je zasnovano na tome što je polipeptid stvoren i identifikovan da se specifično vezuje za jedan ili više markera koje eksprimira tumor. U zavisnosti od otelotvorenja, tumor može biti suspenzioni tumor ili čvrsti tumor.
[0021] Nekoliko otelotvorenja takođe obezbeđuje himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR uključuje ciljajući domen, transmembranski domen i domen za intracelularnu signalizaciju. U nekoliko otelotvorenja, ciljajući domen je sačinjen, barem delimično, od polipeptida koji vezuje cilj kako je ovde otkriven. U nekoliko otelotvorenja, domen za intracelularnu signalizaciju je izabran iz grupe koja se sastoji od humanog CD3 zeta domena, 41BB domena, CD28 domena, i bilo koje njihove kombinacije. U zavisnosti od otelotvorenja, region kostimulatorne signalizacije sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula izabran iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, antigena-1 povezanog sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda koji se specifično vezuje za CD83, i bilo koje njihove kombinacije. U nekoliko otelotvorenja, CAR sadrži fuzioni protein koji uključuje dodatni polipeptid koji vezuje cilj. Takođe su predviđene izolovane sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju CAR koje uključuju polipeptide koji vezuju cilj kao deo (ili celinu) ciljajućeg regiona.
[0022] Ovde su dalje predviđene ćelije koje sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CAR, pri čemu CAR sadrži antigen vezujući domen sačinjen, barem delimično, od polipeptida koji vezuje cilj od interesa, transmembranskog domena i domena za signalizaciju. U nekoliko otelotvorenja, polipeptid se specifično vezuje za antigen tumora (te tako funkcioniše za isporuku ćelije koja eksprimira CAR do tumora. U nekoliko otelotvorenja, antigen tumora je povezan sa hematološkim malignitetom. U dodatnim otelotvorenjima, antigen tumora je povezan sa čvrstim tumorom. I čvrsti i hematološki tumori mogu istovremeno biti ciljani u nekim otelotvorenjima. U nekoliko otelotvorenja, antigen tumora je izabran iz grupe koja se sastoji od CD137, PD-L1, CD123, CTLA4, CD47, KIR, DR5, TIM3, PD1, EGFR, TCR, CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelina, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipida F77, EGFRvIII, GD2, NY-ESO- 1, MAGE A3, i njihovih kombinacija. U zavisnosti od otelotvorenja, ćelija koja eksprimira CAR može biti T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK). U nekoliko otelotvorenja, ćelija (bilo T ćelija, NK ćelija ili druga vrsta ćelije) ispoljava antitumorski imunitet kada se polipeptid vezuje za svoj odgovarajući tumorski antigen.
[0023] Još dalja otelotvorenja predviđaju aminokiseline koje imaju sekvencu SEQ ID 4, pri čemu Xnnije cistein niti prolin.
[0024] U nekoliko otelotvorenja su takođe predviđene ćelije sisara koje stvaraju čestice slične virusu (VLP) vezane za membranu, pri čemu je ćelija sisara konstruisana da eksprimira fuzioni protein koji sadrži polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) fuzionisan sa himernim receptorom antigena (CAR), pri čemu je fuzioni protein eksprimiran na stvorenim VLP (npr. kao transmembranski proteini). U zavisnosti od otelotvorenja, VLP koje proizvode ćelije sisara su pogodni za upotrebu kao imunogeni za stvaranje antitela. U nekim takvim otelotvorenjima, antitela su usmerena na polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) (npr. antitela se vezuju za DBDpp i mogu da se koriste za detekciju DBDpp, izolovanje DBDpp, itd.
[0025] Ovde otkriveni polipeptidi koji vezuju cilj su takođe korisni u terapeutskom kontekstu, npr. za lečenje i/ili dijagnozu bolesti, kao što je kancer (npr. čvrsti ili hematološki malignitet). Dakle, u nekoliko otelotvorenja su obezbeđeni postupci za lečenje ispitanika koji ima kancer, koji obuhvataju primenu na ispitaniku imunske ćelije koja sadrži himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR sadrži domen koji vezuje cilj, pri čemu domen koji vezuje cilj sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži: MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNP EVE X55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), transmembranski domen, i intracelularni domen (koji sadrži domen za signalizaciju). Nakon primene na ispitaniku koji ima kancer, domen koji vezuje cilj se specifično vezuje za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i vezivanje za cilj od interesa podstiče imunske ćelije da stvaraju citotoksične signale koji dovode do citotoksičnih efekata na ćeliju kancera, čime se kancer leči. U nekoliko otelotvorenja, polipeptid ima sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 (npr. polipeptid nastaje modifikovanjem aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1). Kao rezultat različite sekvence, specifično vezivanje polipeptida za cilj od interesa je veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa.
1
[0026] U zavisnosti od primera, imunska ćelija može biti T ćelija. U nekim otelotvorenjima, imunska ćelija je NK ćelija. Opciono mogu da se koriste druge imunske ćelije i/ili kombinacije različitih vrsta imunskih ćelija. U nekim primerima, kombinacije tipova ćelija (npr. NK ćelije i T ćelije) korisne su jer deluju sinergijski u lečenju kancera. Kada se koriste kombinacije, različite vrste ćelija mogu da ciljaju iste ili različite (ili preklapajuće) tumorske antigene.
[0027] U nekoliko primera u kojima se koriste T ćelije, vezivanje cilja od interesa stimuliše T ćeliju da inicira intracelularnu signalizaciju, proizvodi citokine i degranuliše, što dovodi do citotoksičnih efekata na ćeliju kancera. Pored toga, u nekoliko otelotvorenja, T ćelija se umnožava kao odgovor na vezivanje cilja od interesa. Aktivnost T ćelije, međutim, pogodno ne dovodi do toga da T ćelija ispoljava fenotip povezan sa iscrpljivanjem T ćelije. U nekoliko primera u kojima se koriste T ćelije, transmembranski domen CAR sadrži 41BB ili CD28, a citoplazmatski domen sadrži alfa, beta ili zeta lanac T ćelijskog receptora.
[0028] U nekoliko primera u kojima se koriste NK ćelije, transmembranski domen sadrži CD28, a citoplazmatski domen sadrži zeta lanac T ćelijskog receptora.
[0029] U nekoliko primera, imunske ćelije koje sadrže CAR su konstruisane da se vezuju za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, kao što je tumorski antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD137, PD-L1, CD123, CTLA4, CD47, KIR, DR5, TIM3, PD1, EGFR, TCR, CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelina, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipida F77, EGFRvIII, GD2, NY-ESO- 1, MAGE A3, i njihove kombinacije.
[0030] U nekoliko primera, CAR dalje sadrži drugi polipeptid koji ima aminokiselinu SEQ ID NO:4, pri čemu polipeptid može specifično da se vezuje za drugi antigen od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu je specifično vezivanje drugog polipeptida za drugi cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za drugi cilj od interesa. U nekoliko otelotvorenja, stvaranje polipeptida koji čini najmanje deo ciljajućeg domena CAR ne obuhvata supstituciju cisteina niti prolina u SEQ ID NO: 1.
[0031] U nekoliko primera, primena imunskih ćelija sa CAR je intravenska, mada se drugi načini primene, kao što je intraarterijski, intramuskularni, lokalni, ili drugi prihvatljivi način primene, mogu koristiti za dati scenario lečenja.
1
[0032] U nekoliko primera su takođe opisani postupci lečenja ispitanika koji ima kancer, koji obuhvataju primenu na ispitaniku imunske ćelije koja sadrži himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR sadrži domen koji vezuje cilj, pri čemu domen koji vezuje cilj sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu nijedan ostatak cisteina niti prolina nije supstituisan ni u jedan od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu polipeptid specifično vezuje cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu je specifično vezivanje polipeptida za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa, transmembranski domen i intracelularni domen, pri čemu intracelularni domen sadrži domen za signalizaciju, pri čemu, nakon primene na ispitaniku koji ima kancer, domen koji vezuje cilj se specifično vezuje za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu vezivanje cilja od interesa podstiče imunsku ćeliju da stvara citotoksične signale koji dovode do citotoksičnog efekta na ćeliju kancera, čime se kancer leči. Kao što je prethodno razmotreno, u zavisnosti od primera, imunska ćelija može biti T ćelija, NK ćelija, ili druga vrsta imunske ćelije (ili kombinacija različitih vrsta). U jednom otelotvorenju, transmembranski domen sadrži 41BB ili CD28, pri čemu citoplazmatski domen sadrži alfa, beta ili zeta lanac T ćelijskog receptora, i pri čemu je imunska ćelija T ćelija. U nekim takvim primerima, nakon vezivanja cilja od interesa, T ćelija se stimuliše radi iniciranja intracelularne signalizacije, proizvodnje citokina, proliferacije i degranulacije, što dovodi do citotoksičnog dejstva na ćeliju kancera, pri čemu T ćelije ne ispoljavaju fenotip povezan sa iscrpljivanjem T ćelije.
[0033] Dalje opisani primeri obezbeđuju postupak lečenja ispitanika koji ima kancer, pri čemu postupak obuhvata intravensku primenu na ispitaniku imunske ćelije koja sadrži himerni receptor antigena (CAR) eksprimiran na T ćeliji, pri čemu CAR sadrži domen koji vezuje cilj koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži, polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:6, međutim, nijedan ostatak cisteina niti prolina nije supstituisan ni u jedan od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 ili SEQ ID NO:6, polipeptid koji je sposoban za specifično vezivanje cilja od interesa koji eksprimira ćelija kancera sa vezivanjem za cilj od interesa koje je veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa, transmembranski domen izabran od 41BB i CD28 i intracelularni domen, pri čemu intracelularni domen sadrži domen za signalizaciju izabran od alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora, pri čemu, nakon primene na ispitaniku koji ima kancer, domen koji vezuje
1
cilj se specifično vezuje za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu vezivanje cilja od interesa podstiče T ćeliju da stvori citotoksične signale koji dovode do citotoksičnih efekata na ćeliju kancera. U nekoliko primera, citotoksični efekti su rezultat degranulacije T ćelija. Pogodno, u nekoliko primera, aktivacija i citotoksična aktivnost T ćelija nije povezana sa time što T ćelije eksprimiraju fenotip povezan sa iscrpljivanjem T ćelije. U nekoliko otelotvorenja, CAR opciono dalje sadrži drugi domen koji vezuje cilj koji sadrži drugi polipeptid koji ima različit cilj od domena koji vezuje cilj. U još daljim primerima, dodatni ciljajući domeni mogu opciono da se uključe da pojačaju kapacitet vezivanja za marker, ili daju specifičnost vezivanja za druge markere.
[0034] U nekoliko primera je dodatno predviđena upotreba imunske ćelije koja sadrži himerni receptor antigena (CAR) za lečenje kancera, pri čemu CAR sadrži domen koji vezuje cilj koji sadrži polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži, polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu nijedan ostatak cisteina niti prolina nije supstituisan ni u jedan od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu se polipeptid specifično vezuje za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu je specifično vezivanje polipeptida za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa, transmembranski domen izabran od 41BB i CD28 i intracelularni domen, pri čemu intracelularni domen sadrži domen za signalizaciju izabran od alfa, beta ili zeta lanca T ćelijskog receptora, pri čemu, nakon primene na ispitaniku koji ima kancer, domen koji vezuje cilj se specifično vezuje za cilj od interesa koji eksprimira ćelija kancera, i pri čemu vezivanje cilja od interesa podstiče imunsku ćeliju da stvori citotoksične signale koji dovode do citotoksičnih efekata na ćeliju kancera. U zavisnosti od primera, imunska ćelija može biti T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).
[0035] Pored kompozicija vezujućeg domena, postupaka za njihovo stvaranje, pretragu i upotrebu, opisani su i postupci za prečišćavanje ciljeva od interesa. Tako, opisan je postupak za prečišćavanje cilja od interesa koji obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži cilj od interesa sa kompozicijom koja sadrži polipeptidni agens povezan sa čvrstom podlogom, pri čemu polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNP EVE X55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1, pri čemu se polipeptid specifično
1
vezuje za cilj od interesa, pri čemu je specifično vezivanje polipeptida za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa, a dovođenje u kontakt se vrši u uslovima koji dopuštaju vezivanje kompozicije za cilj od interesa, i uklanjanje dela uzorka koji nije vezan za kompoziciju. U nekoliko primera postupak dalje obuhvata disocijaciju kompozicije od cilja od interesa i izolovanje cilja od interesa. U nekoliko primera, cilj od interesa može da se eluira iz kompozicije, čime se cilj od interesa prečišćava (u potpunosti ili delimično).
[0036] U zavisnosti od primera, čvrsta podloga može biti perlica, staklena pločica, čip, želatin ili agaroza. Kombinacije podloga mogu da se koriste u određenim otelotvorenjima. U nekoliko otelotvorenja, polipeptidni agens je kuplovan sa čvrstom podlogom putem nekovalentnog vezivanja, dok je u drugim primerima polipeptidni agens kuplovan sa čvrstom podlogom putem kovalentnog vezivanja. U zavisnosti od otelotvorenja, podloge i cilja od interesa, mogu se koristiti i kombinacije kovalentnog i nekovalentnog vezivanja.
[0037] U nekoliko primera, polipeptidni agens iz kompozicije dalje sadrži peptidnu oznaku, pri čemu peptidna oznaka sadrži heksahistidinski ostatak ili FLAG oznaku. U nekim primerima, polipeptidni agens iz kompozicije dalje sadrži streptavidinski ostatak. Mogu se koristiti i druge vrste oznaka, npr. enzimi, kolorimetrijske, bioluminescentne i/ili fluorescentne oznake, u zavisnosti od primera.
[0038] U nekim primerima, čvrsta podloga obuhvata perlicu, i kompozicija je pogodna za upotrebu u afinitetnoj hromatografiji za prečišćavanje cilja od interesa.
[0039] U nekoliko primera, molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid je upakovan u ekspresioni vektor koji se koristi za transdukciju ćelijske linije kako bi izazvao ćelijsku liniju da eksprimira polipeptid. Takvi primeri omogućavaju proizvodnju polipeptida u većem obimu za upotrebu u prečišćavanju proteina.
[0040] Takođe je opisan postupak za prečišćavanje cilja od interesa koji obuhvata dovođenja u kontakt uzorka koji sadrži cilj od interesa sa kompozicijom koja sadrži česticu sličnu virusu kuplovanu sa čvrstom podlogom, pri čemu čestica slična virusu eksprimira polipeptid kao membranski protein, polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu
1
polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1, pri čemu polipeptid specifično vezuje cilj od interesa, pri čemu je specifično vezivanje polipeptida za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa; i dovođenje u kontakt se vrši u uslovima koji omogućavaju vezivanje kompozicije za cilj od interesa; i uklanjanje dela uzorka koji nije vezan za kompoziciju. U nekoliko otelotvorenja, pri čemu nijedan ostatak cisteina ili prolina nije supstituisan ni u jedan od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6 prilikom stvaranja polipeptida.
[0041] U nekoliko primera, čvrsta podloga sadrži jednu ili više podloga odabranih od perlice, staklene pločice, čipa, želatina ili agaroze. U nekoliko primera, polipeptid iz kompozicije dalje sadrži peptidnu oznaku, pri čemu peptidna oznaka sadrži heksahistidinski ostatak ili FLAG oznaku. Kao što je ovde razmotreno, druge vrste oznaka mogu da se koriste u dodatnim primerima.
[0042] U nekim primerima, odbacuje se deo uzorka koji nije vezan za kompoziciju. U nekim otelotvorenjima, deo uzorka koji nije vezan za kompoziciju se dovodi u kontakt sa kompozicijom drugi put radi hvatanja dodatnog cilja od interesa, čime se poboljšava ukupni prinos prečišćavanja.
[0043] U nekoliko primera, postupak dalje obuhvata dovođenje u kontakt dela uzorka koji nije vezan za kompoziciju sa antitelom koje je usmereno na polipeptid iz kompozicije, pri čemu je antitelo stvoreno od čestica sličnih virusu (VLP) vezanih za membranu koje eksprimiraju polipeptid oslobođen iz ćelije sisara konstruisano da eksprimira fuzioni protein koji sadrži polipeptid fuzionisan sa himernim receptorom antigena (CAR), i fuzioni protein se eksprimira na stvorenim VLP, pri čemu su antitela pogodna za upotrebu u testu za detekciju rezidualnih polipeptida otkačenih od čvrste podloge.
[0044] Ne samo da su opisani postupci za prečišćavanje cilja (npr. uklanjanje cilja iz većeg uzorka), već nekoliko opisanih primera predviđa postupak za uklanjanje jednog ili više zagađivača iz uzorka koji sadrži cilj od interesa, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži cilj od interesa sa kompozicijom koja sadrži česticu sličnu virusu kuplovanu sa čvrstom podlogom, pri čemu čestica slična virusu eksprimira polipeptid kao membranski protein, i polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri
2
čemu nijedan ostatak cisteina ni prolina nije supstituisan ni u jedan od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 i SEQ ID NO:6, pri čemu polipeptid ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1, pri čemu polipeptid specifično vezuje jedan ili više zagađivača koji treba da se uklone iz uzorka koji sadrži cilj od interesa, pri čemu je specifično vezivanje polipeptida za jedan ili više zagađivača veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za jedan ili više zagađivača; dovođenje u kontakt se obavlja u uslovima koji dopuštaju vezivanje kompozicije za jedan ili više zagađivača; i sakupljanje dela uzorka koji nije vezan za kompoziciju. Kao što je prethodno razmotreno, u nekoliko primera, polipeptid iz kompozicije dalje sadrži oznaku, kao što je peptidna oznaka. U nekoliko primera, peptidna oznaka sadrži heksahistidinski ostatak ili FLAG oznaku. U zavisnosti od primera, čvrsta podloga može da obuhvata perlicu, staklenu pločicu, čip, želatin ili agarozu, i čestice slične virusu su kuplovane sa čvrstom podlogom putem nekovalentnog vezivanja. U nekim primerima, deo uzorka koji je sakupljen je drugi put doveden u kontakt sa kompozicijom radi uklanjanja dodatnih zagađivača iz uzorka.
[0045] Takođe su opisane kompozicije za upotrebu u prečišćavanju proteina. U nekoliko primera je obezbeđena afinitetna smola koja sadrži polipeptidni agens koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPE VEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), kao i njihovih kombinacija, i pri čemu aminokiselinska sekvenca nije SEQ ID NO:1.
[0046] U bilo kojoj od prethodno navedenih sekvenci, bilo koja od pozicija X (npr. „Xn“) može biti prirodna ili neprirodna aminokiselina; pri čemu je svako Xnista ili različita prirodna ili neprirodna aminokiselina. Uz to, u nekoliko primera, Z1i/ili Z2mogu da sadrže od oko 2 do oko 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina.
[0047] U nekoliko primera, polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 usled aminokiselinske supstitucije na jednom ili više ostataka. U zavisnosti od otelotvorenja, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka može da obuhvata konzervativnu supstituciju ili nekonzervativnu supstituciju. Kombinacije konzervativnih i nekonzervativnih supstitucija mogu takođe da se koriste, u nekoliko otelotvorenja. Uz to, u nekoliko primera, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka obuhvata supstituciju na ostatku koji je dostupan rastvaraču. U nekim primerima, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka obuhvata supstituciju na ostatku koji je nedostupan rastvaraču. U nekim primerima, supstitucije (bilo konzervativne ili nekonzervativne) mogu se opciono izvršiti i na ostacima koji su dostupni rastvaraču, i na onima koji su nedostupni rastvaraču. U nekoliko otelotvorenja, polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 po deleciji aminokiselina na jednom ili više ostataka.
[0048] U nekoliko opisanih primera, obezbeđen je postupak za proizvodnju afinitetne smole koji obuhvata vezivanje za čvrstu podlogu polipeptidnog agensa koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPE VEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11) i njihovih kombinacija; pri čemu aminokiselinska sekvenca nije SEQ ID NO:1. U nekoliko primera, X pozicije sekvenci (npr. „Xn“) mogu da sadrže prirodnu ili neprirodnu aminokiselinu; pri čemu je svaki Xnista ili različita prirodna ili neprirodna amininokiselina; i/ili pri čemu Z1i/ili Z2predstavlja od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina. U nekoliko otelotvorenja, polipeptidni agens je vezan za čvrstu podlogu kovalentnim vezivanjem, nekovalentnim vezivanjem, ili njihovom kombinacijom. U nekoliko otelotvorenja, čvrsta podloga obuhvata jednu ili više podloga odabranih od perlice, staklene pločice, čipa, želatina ili agaroze.
2
[0049] U nekoliko primera, za prečišćavanje proteina je dalje opisana kompozicija koja sadrži čvrstu podlogu kuplovanu sa polipeptidnim agensom koji ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPE VEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11) i njihovih kombinacija; pri čemu aminokiselinska sekvenca nije SEQ ID NO:1. U nekoliko primera, Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina; pri čemu je svako Xnista ili različita prirodna ili neprirodna aminokiselina; i/ili Z1i/ili Z2predstavlja od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina. U nekoliko primera, polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 usled aminokiselinske supstitucije na jednom ili više ostataka.
[0050] U zavisnosti od primera, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka može da obuhvata konzervativnu supstituciju, ili može da obuhvata nekonzervativnu supstituciju. Kombinacije konzervativnih i nekonzervativnih supstitucija mogu takođe da se koriste, u određenim otelotvorenjima. U nekoliko primerima, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka obuhvata supstituciju na ostatku koji je dostupan rastvaraču. U nekoliko primera, aminokiselinska supstitucija na jednom ili više ostataka obuhvata supstituciju na ostatku koji je nedostupan rastvaraču. Neki primeri koriste supstitucije i na ostacima koji su dostupni, i na onima koji su nedostupni rastvaraču. U nekoliko primera, polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO:1 usled delecije aminokiselina na jednom ili više ostataka. U zavisnosti od primera, čvrsta podloga može da obuhvata jednu ili više podloga odabranih od perlice, staklene pločice, čipa, želatina ili agaroze.
[0051] U nekoliko primera, ovde otkriveni polipeptidi mogu da se koriste u analitici proteina, recimo da deluju kao detektabilni agensi ili oznake. Tako, ovde je u nekoliko otelotvorenja obezbeđena kompozicija koja sadrži polipeptidni agens konjugovan sa detektabilnim agensom i/ili oznakom, pri čemu polipeptidni agens ima aminokiselinsku sekvencu koja sadrži sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od:
2
MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPE VEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11) i njihovih kombinacija; pri čemu aminokiselinska sekvenca nije SEQ ID NO:1. U nekoliko primera, Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina; pri čemu je svako Xnista ili različita prirodna ili neprirodna aminokiselina; i/ili pri čemu Z1i/ili Z2predstavlja od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina.
[0052] U nekoliko primera, detektabilni agens sadrži hromogen. U nekoliko otelotvorenja, detektabilni agens sadrži fluorescentnu boju. U nekoliko primera, detektibilni agens sadrži radionuklid. U takvim primerima, detektabilni agens može da se kvantifikuje.
[0053] U nekoliko primera kompozicije, polipeptidni agens je konjugovan sa hromatografskom perlicom, smolom, staklenom pločicom, čipom, želatinom ili agarozom. U nekoliko primera, oznaka sadrži polihistidil oznaku, myc oznaku ili FLAG oznaku. Kombinacije oznaka takođe mogu da se koriste u nekoliko otelotvorenja. U nekoliko otelotvorenja, polipeptidni agens je konjugovan sa detektabilnim agensom ili oznakom putem kovalentne veze. U nekoliko primera kompozicije, polipeptidni agens je fuzioni protein. U nekoliko primera, polipeptidni agens je multimeran.
[0054] Obezbeđeni su polipeptidi (DBDpp) koji sadrže de novo vezujući domen (DBD) kao što su definisani u zahtevu 18 koji specifično vezuju ciljeve od interesa, kao i nukleinske kiseline koje kodiraju obezbeđeni DBDpp, vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. Takođe su opisane biblioteke DBDpp, postupci za proizvodnju i pretragu takvih biblioteka i DBDpp identifikovan iz takvih biblioteka i pretraga. Obezbeđeni su i DBDpp kao što su DBDpp fuzioni proteini, kao i postupci za
2
proizvodnju i korišćenje DBDpp. Takva primena uključuje, ali nije ograničena na, afinitetno prečišćavanje, i dijagnostičke i terapeutske primene.
[0055] U jednom primeru, obezbeđen je DBDpp čija se aminokiselinska sekvenca razlikuje (npr. usled modifikacija aminokiselina) od sekvence referentnog skeleta koji ima sekvencu SEQ ID NO:1. Referentni skelet je varijanta referentnog polipeptida antiparalelnog snopa tri spirale koji se ne javlja u prirodi i nema cilj (npr. prema saznanju podnosioca prijave, nijedan cilj nije trenutno poznat) koji je prvobitno konstruisan kao vežba u savijanju proteina (vidite Walsh et al. PNAS 96:5486-5491 (1999)). Otkriveno je, i ovde je prikazano u nekoliko primera, da su polipeptidi koji sadrže modifikacije referentnog skeleta bez cilja sa istom aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:1 sposobni da se specifično vezuju za cilj od interesa. Mada ne želimo da se ograničimo teorijom, veruje se da prilikom konstruisanja DBD, strukturna ograničenja površinski otkrivenih ostataka (koji mogu da se modifikuju) daju površinski otkrivenim ostacima sposobnost da specifično vezuju cilj od interesa.
[0056] Pronalazak obezbeđuje polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji sadrži tri antiparalelne alfa spirale povezanu linkerskim peptidima, pri čemu (a) DBDpp je sintetički peptid dobijen iz modifikacija aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, pri čemu se modifikacija sastoji od 1 do 30 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija izabranih od pozicija 1-6, 8-10, 12, 13, 15-17, 19, 20-27, 29, 30, 32-34, 36, 37, 39-41, 43-52, 54, 55, 57-59, 61, 62, 64-66 i 68-73 SEQ ID NO: 1; (b) DBDpp specifično vezuje željeni cilj, pri čemu je specifično vezivanje DBDpp za željeni cilj veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za željeni cilj; i (c) DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50. Prema nekim otelotvorenjima, agensi koji vezuju cilj (npr. DBDpp) koji su ovde obezbeđeni specifično se vezuju za cilj od interesa (kao što je marker povezan sa kancerom ili tumorom, poput CD123, CD137, PD-L1, CD19, CD22, NY-ESO, MAGE A3, u vidu neograničavajućih otelotvorenja). U nekim otelotvorenjima, obezbeđeni agens koji vezuje cilj (npr. DBDpp) sadrži ukupno 5 do 25, ili 5 do 30 aminokiselinskih ostataka koji su modifikovani u poređenju sa SEQ ID NO:1; i pri čemu agens specifično vezuje cilj od interesa. Modifikovani aminokiselinski ostaci su supstitucije. U drugom otelotvorenju, 5 do 25, ili 5 do 30 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem otelotvorenju, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 modifikacija
2
aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim otelotvorenjima, 1 do 30 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem otelotvorenju, 1 do 20 ili 1 do 30 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U opcionom daljem otelotvorenju, DBDpp opciono dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu, pri čemu je 1 do 5, 1 do 10, 1 do 15, 5 do 10 ili 5 do 15 ostataka koji odgovaraju ostacima koji su nedostupni rastvaraču aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu, pri čemu je supstituisano oko 1 do oko 5, oko 1 do oko 10, oko 1 do oko 15, oko 5 do oko 10, oko 5 do oko 15 (ili više) ostataka koji odgovaraju ostacima koji su dostupni ili nedostupni rastvaraču aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1. U nekoliko otelotvorenja, supstitucija dostupnih i nedostupnih ostataka daje veći stepen specifičnosti prema cilju u poređenju sa supstitucijom samo dostupnih ili samo nedostupnih ostataka. U daljem opcionom otelotvorenju, supstituisani ostaci koji odgovaraju ostatku SEQ ID NO:1 koji je nedostupan rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: F7, L11, 114, L18, L28, F31, I35, F38, L42, V53, L56, A60,163 i L67 i Y70. U dodatnom otelotvorenju, L21 i Y45 su takođe uključeni u grupu supstituisanih ostataka koji su nedostupni rastvaraču. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein (npr. DBDpp je fuzionisan, konjugovan, ili na drugi način povezan sa drugim molekulom, direktno ili indirektno, kao što je terapeutski ili dijagnostički agens). U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, antigena specifičnog za tumor (TSA), antigena specifičnog za kancer (CSA) i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično
2
vezuje cilj koji je ovde otkriven. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U dodatnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. Takođe su obezbeđene biblioteke koje sadrže mnoštvo DBDpp.
[0057] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIA AFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X55, X58, X59, X62, X65i/ili X66je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:2), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X33, X34, X37, X40, X41i/ili X44je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAA FX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:3), pri čemu, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X57, X58, X61, X64, X65i/ili X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43A YKGKGNPEVEX55LRX58X59AA X62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:5), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X55, X58, X59, X62, X65i/ili X66je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:6), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X30, X33, X34, X37, X40, X41, X44, X57, X58, X61, X64, X65i/ili X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4 i SEQ ID NO:5. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U još daljim otelotvorenjima, Xnje delecija aminokiseline (npr. opciono prazna pozicija u sekvenci). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U drugom
2
otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom otelotvorenju, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija (npr. B-ćelija, T-ćelija, T-ćelija ubica, pomoćnička T-ćelija, regulatorna T-ćelija, ćelija koja prezentuje antigen, ćelija prirodni ubica, i slično) koja eksprimira jedan ili više DBDpp fuzionih proteina na svojoj površini. U jednom otelotvorenju, DBDpp je zakačen za čvrstu podlogu. U daljem otelotvorenju, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, drugih supstanci na bazi stakla ili plastike (npr. filter ili filter uređaj), materijala za filtraciju (npr. stakleno vlakno, čelična vuna, polietarsulfon, itd.), čipa, želatina i agaroze, i njihovih kombinacija.
[0058] Takođe je opisan izolovani DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAF EKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:9), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X50, X53, X54, X57, X60i/iliX61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i/ili Z2predstavlja od 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:7), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X28, X31, X32, X35, X38, X39i/ili X42je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i Z1i/ili Z2predstavlja od 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVE ALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:8), pri čemu, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X52, X53, X56, X59, X60i/ili X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i/ili Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:10), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X50, X53, X54, X57, X60i/ili X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i/ili Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEAL X52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X28, X31, X32, X35, X38, X39, X42, X52, X53, X56, X59, X60i/ili X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i/ili Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekoliko primera, DBDpp sadrži, sastoji se od, ili se suštinski sastoji od aminokiselinske sekvence izabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10 i SEQ ID NO:11. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U još daljim primerima, Xnje delecija aminokiseline (npr. opciono prazna pozicija u sekvenci). U još nekim primerima, Z1i/ili Z2su delecije aminokiselina (npr. opciono prazne pozicije u sekvenci). U dodatnom primeru, DBDpp je fuzioni protein. U drugom primeru, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini, uključujući virusne čestice, koje sadrže nukleinske kiseline. U nekim primerima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U dodatnim primerima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
1
[0059] Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, poput DBDpp fuzionog proteina. Dodatno su obezbeđeni vektori koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp (npr. DBDpp fuzione proteine) i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim primerima, ćelija domaćin je virusna čestica ili ćelija bakterije, kvasca, gljivice ili biljke. U određenom otelotvorenju, ćelija domaćin je ćelija sisara. U drugom primeru, ćelija sisara je imunska ćelija. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp kao fuzioni protein na ćelijskoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja prikazuje DBDpp na ćelijskoj površini. Ovde su dodatno obezbeđene biblioteke vektora koje sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju mnoštvo DBDpp.
[0060] Takođe je obezbeđena biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. U jednom primeru, biblioteka DBDpp sadrži mnoštvo DBDpp koji sadrže različite aminokiselinske sekvence i koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano ukupno 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih); i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) modifikovanih aminokiselinskih ostataka su supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem otelotvorenju, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije, a 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) supstitucija su na jednom ili više aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 izabranih iz grupe koja se sastoji od: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem otelotvorenju, 1 do 20,
2
1 do 30 ili 1 do 40 (uključujući bilo koji broj između prethodno navedenih) supstitucija su na jednom ili više aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 izabranih iz grupe koja se sastoji od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U drugom otelotvorenju, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1000 (uključujući bilo koji raspon između navedenih brojeva, poput 2-10, 5-25, 50-100, 250-1000, itd.) različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve (ili DBDpp koji imaju različitu specifičnost za dati cilj). U daljem otelotvorenju, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1000 (uključujući bilo koji raspon između navedenih brojeva, poput 2-10, 5-25, 50-100, 250-1000, itd.) različitih DBDpp koji specifično vezuju protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500, ili 1000 (uključujući bilo koji raspon između navedenih brojeva, poput 2-10, 5-25, 50-100, 250-1000, itd.) različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka je biblioteka vektora ili biblioteka ćelija domaćina. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je biblioteka ćelija domaćina. U drugom primeru, biblioteka ćelija domaćina sadrži mnoštvo ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop cilja; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3 različite sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju istu sekvencu DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0061] Takođe je opisana biblioteka vektora koja sadrži mnoštvo različitih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano ukupno 1 do 5, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih); i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, 1 do 5, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 modifikovanih aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih) kodirano sekvencama nukleinske kiseline su supstitucije. U drugom primeru, 1 do 5, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih) su konzervativne supstitucije. U drugom primeru, 1 do 5, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 kodiranih modifikovanih aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih) su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 1 do 5, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 modifikacija kodiranih aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih) su konzervativne supstitucije, a 1 do 5, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 modifikacija kodiranih aminokiselinskih ostataka (ili bilo koji broj između navedenih) su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 1 do 5, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 kodiranih supstitucija (ili bilo koji broj između navedenih) je na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od jednog ili više od: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem primeru, 1 do 20, 1 do 30 ili 1 do 40 kodiranih supstitucija (ili bilo koji broj između navedenih) je na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od jednog ili više od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U daljem primeru, nukleinske kiseline opciono kodiraju DBDpp koji dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu u kojoj je 1 do 5, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 (ili bilo koji broj između navedenih) ostataka koji odgovaraju ostacima koji su nedostupni rastvaračima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve (ili imaju različiti afinitet prema istom cilju). U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili
4
1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je sadržana u ćeliji domaćinu (npr. virusne čestice). U drugom primeru, biblioteka sadrži mnoštvo ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop cilja; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3 različite sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju istu sekvencu DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0062] U jednom primeru, biblioteka vektora sadrži mnoštvo različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp, pri čemu kodirani DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELA AFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X55, X58, X59, X62, X65i/ili X66, je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGG SEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRH N (SEQ ID NO:2), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X33, X34, X37, X40, X41i/ili X44je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEA LGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:3), pri čemu, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X57, X58, X61, X64, X65i/ili X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVE X55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:5), pri čemu, X8, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X55, X58, X59, X62, X65, i/ili X66je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:6), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X30, X33, X34, X37, X40, X41, X44, X57, X58, X61, X64, X65 i/ili X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U još daljim primerima, Xnje delecija aminokiseline (npr. opciono prazna pozicija u sekvenci). U dodatnom primeru, mnoštvo vektora u biblioteci kodira DBDpp fuzioni protein. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem otelotvorenju, različiti ciljevi vezani putem DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, više vektora iz biblioteke vektora je sadržano u ćelijama domaćinima (npr. virusne čestice kao što je fag), E. coli, kvascu i ćelijama sisara. U drugom primeru, ćelije domaćini prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop cilja; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3 različite sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju istu sekvencu DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0063] U jednom opisanom primeru, biblioteka vektora sadrži više nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVE X50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:9), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X50, X53, X54, X57, X60i/ili X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LA X13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAA IRDELQAYRHN (SEQ ID NO:7), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X28, X31, X32, X35, X38, X39i/ili X42je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAEL AAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:8), pri čemu, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X52, X53, X56, X59, X60i/ili X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:10), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X50, X53, X54, X57, X60i/ili X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RL X19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X28, X31, X32, X35, X38, X39, X42, X52, X53, X56, X59, X60i/ili X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2 predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U još daljim otelotvorenjima, Xnje delecija aminokiseline (npr. opciono prazna pozicija u sekvenci). U dodatnom primeru, mnoštvo vektora u biblioteci kodira DBDpp fuzioni protein. U drugom otelotvorenju, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, više vektora iz biblioteke vektora je sadržano u ćelijama domaćinima. U drugom primeru, ćelije domaćini (npr. virusne čestice) prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, ćelije domaćini su ćelije sisara. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop cilja; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3 različite sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju istu sekvencu DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0064] Prema nekoliko ovde obezbeđenih otelotvorenja, DBDpp poseduje aktivnosti koje uključuju, ali nisu ograničene na, vezivanje cilja, sposobnost vezivanja, povezivanja i/ili udruživanja na drugi način sa ciljem od interesa (npr. cilj prečišćavanja, terapeutski cilj, dijagnostički cilj, peptidna oznaka, i serumski protein, kao što je albumin humanog seruma (HSA) ili imunoglobulin) in vitro ili in vivo i sposobnost da služi kao reaktivno mesto za povezivanje ili udruživanje proteina kao što su DBDpp fuzioni proteini sa dodatnim ostacima (npr. čvrsta podloga) i/ili drugim modifikacijama. Ovde obezbeđeni DBDpp takođe može imati dodatna poželjna svojstva i/ili funkcionalnosti korisne u proizvodnji, prečišćavanju, formulaciji i biološkim, dijagnostičkim i terapeutskim primenama.
[0065] U nekim otelotvorenjima, DBDpp se koristi za vezivanje, detekciju, kvantifikaciju, uklanjanje i/ili prečišćavanje cilja od interesa u uzorku koji sadrži cilj.
[0066] Jedan opisani primer obezbeđuje postupak za detekciju cilja od interesa u uzorku, što obuhvata: (a) dovođenje u kontakt uzorka sa DBDpp koji specifično vezuje cilj, u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje DBDpp za cilj, radi nastanka kompleksa cilj/DBDpp, i (b) detekciju prisustva kompleksa i/ili uhvaćenog cilja. U jednom primeru, DBDpp je imobilisan na čvrstoj podlozi.
[0067] Takođe je opisan postupak za kvantifikaciju cilja od interesa u uzorku koji sadrži cilj, a koji obuhvata: (a) dovođenje u kontakt uzorka sa DBDpp koji specifično vezuje cilj i koji je imobilisan na čvrstoj podlozi, u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje DBDpp za cilj, radi nastanka kompleksa cilj/DBDpp i (b) detekciju prisustva kompleksa cilj/DBDpp i/ili uhvaćenog cilja, pri čemu kvantitativna detekcija proizvoda pokazuje količinu cilja u uzorku, ili se na drugi način može dovesti u vezu sa njom.
[0068] Neki opisani primeri obezbeđuju postupke za prečišćavanje cilja od interesa iz uzorka koji sadrži cilj, koji obuhvataju: (a) dovođenje u kontakt uzorka koji sadrži cilj od interesa sa DBDpp koji specifično vezuje cilj, u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje DBDpp za cilj i (b) izolovanje vezanog cilja. U nekim primerima, cilj se izoluje elucijom. U jednom primeru, DBDpp je imobilisan na čvrstoj podlozi. U daljem primeru, elucija vezanog cilja se prati apsorpcijom ultraljubičastog svetla ili drugom tehnikom vizuelizacije ili detekcije na bazi hemije. U nekim primerima, obezbeđeni su postupci za uklanjanje neželjenog cilja od interesa iz uzorka, pri čemu se vezani neželjeni cilj odbacuje direktno ili se eluira (ili na drugi način sakuplja ili odvaja) i zatim odbacuje.
[0069] Dodatni primer obezbeđuje postupak za pregledanje biblioteke DBDpp za DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa, što obuhvata: (a) dobijanje većeg broja ćelija domaćina (npr. virusne čestice, fag, bakterije i/ili ćelije sisara) koje prikazuju biblioteku DBDpp na svojoj površini; (b) dovođenje u kontakt više ćelija domaćina sa ciljem od interesa u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje cilja za DBDpp; i (c) određivanje vezivanja cilja za DBDpp. U jednom otelotvorenju, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini.
[0070] Opisani su i postupci korišćenja DBDpp u dijagnostičkim i terapeutskim primenama. Jedan opisani primer obezbeđuje postupak lečenja bolesti ili poremećaja koji obuhvata primenu terapeutski delotvorne količine DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) koji specifično vezuje terapeutski cilj od interesa, na ispitaniku kome je to potrebno. U nekim primerima, bolest ili poremećaj je kancer, bolest ili poremećaj imunološkog sistema ili infekcija. Takođe su opisani postupci lečenja bolesti ili poremećaja koji obuhvataju zajedničku primenu dodatnog terapeutskog agensa sa DBDpp.
[0071] Dodatno su opisani postupci za lečenje ili prevenciju kancera koji obuhvataju primenu DBDpp-CAR T limfocita na pacijentu (npr. kod kog postoje predispozicije ili ima kancer) koji eksprimira tumorski antigen na površini ciljnih ćelija, i pri čemu DBDpp specifično vezuje antigen.
[0072] Određeni opisani postupci koji su prethodno sažeti i detaljnije prikazani u nastavku opisuju određene radnje koje preduzima lekar; međutim, treba razumeti da takođe mogu da obuhvataju te radnje po uputstvu druge stranke. Prema tome, radnje poput „primene T ćelije koja sadrži vezujući polipeptid specifičan za cilj-CAR“ uključuju „nalaganje primene T ćelije koja sadrži vezujući polipeptid specifičan za cilj-CAR“.
KRATAK OPIS SLIKA
[0073]
SL. 1A-B. Šematski prikazuju model homologosti DBDpp dobijen iz SEQ ID NO:1. Poprečni prikaz koji prikazuje spirale i tri strane domena (SL.1A). Uzdužni prikaz koji prikazuje poziciju ostatka E19, N-terminusa (NT) i C-terminusa (CT) (SL.1B).
SL. 2A-J. Šematski prikaz različitih modela homologosti DBDpp na osnovu referentnog skeleta SEQ ID NO:1. Ostaci ciljani za modifikaciju u bibliotekama strana (F1, F2 i F3) i kombinovanim bibliotekama (C1 i C2) DBDpp tamno su osenčeni. Prikazi uzdužne i poprečne perspektive biblioteke F1 su prikazani na SL.2A, odnosno SL. 2B. Prikazi uzdužne i poprečne perspektive biblioteke F2 su prikazani na SL.2C, odnosno SL. 2D. Prikazi uzdužne i poprečne perspektive biblioteke F3 su prikazani na SL. 2E, odnosno SL. 2F. Prikazi uzdužne i poprečne perspektive biblioteke C1 su prikazani na SL. 2G, odnosno SL. 2H. Prikazi uzdužne i poprečne perspektive biblioteke C2 su prikazani na SL.2I, odnosno SL.2J. Označeni su N-terminus (NT) i C-terminus (CT) za svaki model.
SL. 3A-D. SL. 3A. Šematski prikaz konstrukta displeja faga za upotrebu u skladu sa nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja. SL.3B. Prikazuje linearnu vektorsku mapu za pComb fagemidni vektor korišćen za stvaranje ovde otkrivenih bibilioteka. Biblioteke su stvorene Kunkelovom mutagenezom, koristeći oligo koji sadrže NNK ili trimer kodone. Peptidne sekvence DBDpp varijante su eksprimirane u okviru, između sekvence FLAG peptidne oznake i M13 gena pIII. DBDpp su eksprimirani kao N-terminalna pIII genska fuzija, pod kontrolom DsbA signalnog peptida. SL. 3C. Prikazuje linearnu vektorsku mapu za pComb fagemidni vektor korišćen za stvaranje bibilioteka DBDpp opisanih u primerima. DBDpp su eksprimirani u okviru, između
4
DsbA signalnog peptida i M13 gena pIII. Modifikovani pComb fagemidni vektor je isti kao onaj prikazan na SL.3B, ali sa izostankom sekvence FLAG peptidne oznake, što je u skladu sa određenim otelotvorenjima koja su ovde otkrivena (pri čemu je FLAG oznaka opciono uklonjena ili zamenjena drugom vrstom oznake). SL. 3D prikazuje podatke iz uporednog testa vezivanja. Fuzije N-terminalne FLAG oznake su eksprimirane i prečišćene iz kultura E.coli. Procena vezivanja na bazi ELISA je pokazala da se prečišćeni FLAG-pb04 (koji cilja PD-L1) vezuje na način zavisan od doze za mikrotitarske bunarčiće premazane sa PD-L1-Fc, dok FLAG-α3D (referentna sekvenca SEQ ID 49, sa N-terminalnom FLAG oznakom) ne ispoljava promenu u vezivanju.
SL. 4A-D. DBDpp imaju nove specifičnosti vezivanja i prenose te nove specifičnosti vezivanja na drugi molekul (npr. antitelo) kao deo fuzionog proteina (npr. fuzioni protein antitelo-DBDpp). Šematski prikazuje rekombinantnu fuziju DBDpp (prikazan kao krug) sa C-terminusom (SL. 4A) i N-terminusom (SL. 4B) teškog lanca antitela. Fuzije DBDpp - antitelo su stvorene koristeći RSV-specifično antitelo (SYN) i peptid bez cilja SEQ ID NO:1 (DBD) ili CD137-specifični DBDpp (bb10). DBDpp su fuzionisani sa N-terminusom (bb10-SYN i DBD-SYN) ili C-terminusom (SYN-bb10 i SYN-DBD). Sve četiri fuzije antitela vezuju se za RSV (SL.4C). Međutim, fuzija bb10 sa N-terminusom (bb10-SYN) ili sa C-terminusom (SYN-bb10) teškog lanca antitela daje novu specifičnost vezivanja CD137 inače monospecifičnom antitelu (SL.4D). SL. 5A-5C. SL.5A. Prikazuje šematski prikaz fuzionih proteina DBDpp-CAR u skladu sa nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja. Predstavljeno je šest različitih formata DBDpp-CAR, kao primer, i treba ih shvatiti kao ilustraciju, a ne kao ograničenje. Ekstracelularni DBDpp domeni mogu biti specifični za jedan cilj (npr. DBDpp „A“) ili za više od jednog cilja ili epitopa (npr. DBDpp „A“ i DBDpp „B“). Prikazani su neograničavajući primeri transmembranskih (TM) domena, kao i neograničavajući primeri intracelularnih domena dobijenih od CD3, CD28 i 41BB. Domeni su opciono povezani putem peptidnih linkera (prikazano senčenjem). SL.5B. Prikazuje dalju šemu membranski vezane (npr. ekstracelularne) fuzije DBDpp-CAR. SL.5C. Prikazuje šemu za rastvorljivi DBDpp.
SL. 6A-C. Multispecifične fuzije DBDpp prepoznaju ciljeve na ćelijskoj površini. FACS analiza pokazuje da se bb10-SYN i SYNbb10 bispecifična antitela vezuju (osenčeni histogram) za aktiviranu CEM ćeliju sa nivoima većim nego samo SYN (crni obris). Slabije vezivanje uočeno sa bb10 N-terminalnom fuzijom (SL.6A) u poređenju sa C-terminalnom fuzijom (SL. 6B) konzistentno je sa prethodnim ELISA podacima. URE1 je rekombinantno antitelo konstruisano formirano od varijabilnih domena urelumaba fuzionisanog sa IgG skeletom, koji cilja CD137. Vezivanje CEM ćelija je izvršeno nakon aktivacije sa PMA (50 ng/ml) i jonomicinom (500 ng/ml) tokom 48 h. Detekcija vezanog antitela je obavljena sa anti-IgGl Fc (FITC-A).
SL. 7A-D. DBDpp daje novu biološku aktivnost fuzionom proteinu antitelo-DBDpp. Aktivacija CD137 ligandom ili agonističkim antitelima, poput urelumaba, indukuje signalnu kaskadu koja dovodi do proizvodnje citokina, ekspresije antiapoptotičkih molekula i pojačanog imunskog odgovora. Agonistički potencijal DBDpp koji cilja CD137, bb10, procenjen je merenjem sposobnosti bb10-SYN i SYN-bb10 da indukuju otpuštanje citokina iz PBMC. Fuzije bb10 su testirane u rastvorljivom formatu i formatu premazanih plastičnih bunarčića. PBMC u kompletnom RPMI medijumu su dodate pločama i inkubirane preko noći. Supernatanti ćelijske kulture su zatim izmereni na TNFa i IL8 koristeći ELISA. Za dve donorske populacije PBMC, fuzije bb10 indukuju sekreciju IL8 i TNF alfa sa nivoima koji su jednaki ili veći nego kod agonističkog anti-CD137 monoklonskog antitela, URE1.
SL. 8. In vivo stabilnost je presudna za kliničku efikasnost većine bioterapeutskih sredstava. Farmakokinetička merenja fuzija bb10 obavljena su radi procene relativne stabilnosti DBDpp u poređenju sa antitelom fuzionim partnerom. In vivo stabilnost je određena analizom RSV i CD137 vezivanja bispecifičnog antitela prisutnog u serumu CD1 miševa koji su dobili jednu intravensku injekciju (1 mg/kg) fuzije. Uzorci seruma su sakupljeni nakon 15 minuta i 48 sati, i testirani su pomoću ELISA. I N-terminalni i C-terminalni DBDpp fuzioni proteini pokazuju održanu stabilnost in vivo. Kao što je detaljnije razmotreno u nastavku, nekoliko otelotvorenja uključuju DBDpp fuzije sa produženom stabilnošću (npr. nakon 24 sata, 48 sati, 72 sata, 96 sati, 6 dana, 8 dana, 10 dana, ili više, uključujući vremena između navedenih).
SL. 9. SL.9 prikazuje HPLC prečišćavanje DBDpp dobijenih u skladu sa nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja.
SL. 10. SL. 10 prikazuje SDS-PAGE analizu prečišćenog DBDpp dobijenog u skladu sa nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja. Traka 1 je marker molekulske mase, traka 2 odgovara prečišćenom DBDpp SEQ ID NO: 58, a trake 3-9 odgovaraju prečišćenom DBDpp SEQ ID NO: 51-57.
SL. 11. SL. 11 prikazuje spektar dekonvoluirane masene spektrometrije elektrosprej jonizacijom (ESI-MS) SEQ ID NO.54.
SL. 12A-12P. SL.12A-12P prikazuju podatke koji se odnose na vezivanje DBDpp koji cilja CD137 sa CD137 koji je imobilisan na čvrstoj površini. SL. 12A, 12C, 12E, 12G, 12I, 12K, 12M i 12O su senzorgrami za DBDpp SEQ ID NO: 51 (12A), 52 (12C), 53 (12E), 54 (12G), 55 (121), 56 (12K), 57 (12M) i 58 (120). SL. 12B, 12D, 12F, 12H, 12J, 12L, 12N i 12P prikazuju odgovarajuće vezujuće podatke stabilnog stanja DBDpp SEQ ID 51 (12B), 52 (12D), 53 (12F), 54 (12H), 55 (12J), 56 (12L), 57 (12N) i 58 (12P).
SL. 13. SL. 13 prikazuje hromatografske podatke za prečišćavanje CD137 proteina iz supernatanta ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO).
SL. 14A-14B. Analiza proteina prečišćenih pomoću DBDpp. SL. 14A prikazuje Kumasi obojeni gel napunjen prečišćenim frakcijama sa kolona za prečišćavanje DBDpp. Traka 1 je marker molekulske mase. Traka 2 je CD137 protein prečišćen pomoću IMAC, a trake 3-8 su eluati sa kolona sa različitim DBDpp u skladu sa nekoliko ovde datih otelotvorenja. SL.14B je vestern blot analiza sa uzorcima koji odgovaraju onima prikazanim na SL.14A.
SL. 15A-15D. Termalna stabilnost DBDpp. SL.15A prikazuje procenu vezivanja DR5 scFv za PD-L1PD-L1-Fc premazane bunarčiće mikroploče nakon izlaganja različitim povišenim temperaturama. SL.15B prikazuje podatke koji pokazuju korelaciju između povišene temperature i smanjenog vezivanja PDL1 od strane PD-L1PD-L1-usmerenog scFv. SL. 15C pokazuje da je DBDpp, u skladu sa jednim ovde otkrivenim otelotvorenjem (pb04 DBDpp), zadržao afinitet vezivanja prema PD-L1PD-L1 nakon što je izlagan rastućoj temperaturi, do 100°C. SL.15D prikazuje dodatni DBDpp (pb06 DBDpp) koji takođe pokazuje termalnu stabilnost, i može da vezuje PD-L1PD-L1 nakon izlaganja temperaturi do 100°C.
SL. 16A-16B. Unakrsna reaktivnost DBDpp. SL. 16A prikazuje podatke vezane za sposobnost DBDpp da vezuje ciljeve među različitim vrstama. Konkretno, SL. 16A pokazuje da rastvorljivi DBDpp usmeren na PD-L1 može da se vezuje za humani PD-L1 (gornja oznaka) kao i za PD-L1 cinomolgusa (donji trag) sa sličnim afinitetima vezivanja. SL. 16B prikazuje podatke protočne citometrije koji potvrđuju da prilikom ekspresije u T ćeliji, naročito T ćeliji himernog receptora antigena, T ćelija može da prepozna i veže se za PD-L1 čoveka i cinomolgusa.
SL. 17. Procena ekspresije i vezivanja cilja DBDpp-CAR. SL. 17 prikazuje podatke vezane za ekspresiju DBDpp-CAR i vezivanje CD-123-Fc različitih kandidatskih DBDpp-CAR HEK-293T ćelija.
4
SL. 18. DBDpp posreduje u transdukciji signala. SL. 18 prikazuje podatke vezane za ekspresiju i sposobnost DBDpp-CAR Jurkatovih ćelija da funkcionišu kroz puteve intracelularne signalizacije.
SL. 19A-19B. CD123-DBDpp-CAR T ćelije proizvode citokine kao odgovor na vezivanje cilja. SL. 19A prikazuje podatke vezane za proizvodnju interferona gama (IFNγ) od strane T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji ciljaju CD123. SL.19B prikazuje slične podatke koji mere proizvodnju interleukina 2 (IL2) od strane DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju CD123.
SL. 20A-20B. PD-L1-DBDpp-CAR T ćelije proizvode citokine kao odgovor na vezivanje cilja. SL. 20A prikazuje podatke vezane za proizvodnju interferona gama (IFNγ) od strane T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji ciljaju PD-L1. SL.20B prikazuje slične podatke koji mere proizvodnju interleukina 2 (IL2) od strane DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju PD-L1.
SL. 21. CD123-DBDpp-CAR T ćelije proliferišu kao odgovor na vezivanje cilja. SL.
21 prikazuje podatke vezane za proliferaciju DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju CD123 u poređenju sa kontrolom i scFv koji ciljaju CD123.
SL. 22. PD-L1-DBDpp-CAR T ćelije proliferišu kao odgovor na vezivanje cilja. SL.
22 prikazuje podatke vezane za proliferaciju DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju PD-L1 u poređenju sa lažnim uslovima.
SL. 23A-23B. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR ne podležu preteranom iscrpljivanju u većoj meri od scFv. SL. 23A prikazuje ekspresiju tri markera iscrpljivanja (LAG-3, PD-1 i TIM3) na T ćelijama koje eksprimiraju različite DBDpp-CAR sa sličnim nivoom ekspresije tih markera na scFv. SL. 23B prikazuje podatke protočne citometrije koji prikazuju sličnu ekspresiju markera iscrpljivanja na DBDpp-CAR T ćelijama (koje eksprimiraju cg06 DBDpp koji cilja CD123) u poređenju sa CAR T ćelijama koje eksprimiraju CD123-specifični scFv (32716).
SL. 24A-24D. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR se degranulišu kao odgovor na vezivanje cilja. SL. 24A prikazuje proizvodnju CD107 (kao marker degranulacije DBDpp-CAR T ćelija) kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju CD123 samostalno uzgajaju. SL. 24B prikazuje proizvodnju CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije uzgajaju zajedno sa CD123 negativnim K562 tumorskim ćelijama. SL.24C prikazuje CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju DC123 uzgajaju zajedno sa CD123 pozitivnim BDCM ćelijama. SL.24D prikazuje podatke iz eksperimentalnih replikata kokulture DBDpp-CAR T koje ciljaju CD123 sa CD123 pozitivnim BDCM ćelijama.
SL. 25A-25D. T ćelije koje eksprimiraju PD-L1-DBDpp-CAR se degranulišu kao odgovor na vezivanje cilja. SL. 25A prikazuje ekspresiju CD107a (kao markera degranulacije DBDpp-CAR T ćelija) kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju PD-L1 uzgajaju samostalno, npr. neaktivirane. SL. 25B prikazuje merenje CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije uzgajaju zajedno sa PD-L1 negativnim K562 ćelijama tumora. SL. 25C prikazuje povećani CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju PD-L1 uzgajaju zajedno sa PD-L1 pozitivnim SUDHL1 ćelijama. SL.25D prikazuje podatke iz eksperimentalnih replikata kokulture DBDpp-CAT T koje ciljaju PD-L1 sa PD-L1 pozitivnim SUDHL1 ćelijama.
SL. 26A-26D. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR posreduju u tumorskoj citotoksičnosti specifičnoj za cilj. SL. 26A prikazuje podatke vezane za procenat ubijanja DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju CD123 K562 tumorskih ćelija koje su negativne na CD123. SL. 26B prikazuje procente ubijanja kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju CD123 uzgajaju zajedno sa CD123 pozitivnim BDCM ćelijama. Podaci sa SL.26A i 26B su dobijeni koristeći T ćelije iz uzorka krvi prvog donora. SL.
26C i 26D prikazuju slične podatke za T ćelije sakupljene od drugog donora.
SL. 27A-27F. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR posreduju u tumorskoj citotoksičnosti specifičnoj za cilj. SL. 27A prikazuje podatke vezane za procenat ubijanja DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju PD-L1 K562 tumorskih ćelija koje su negativne na PD-L1. CAR T ćelije koje eksprimiraju različite DBDpp koji ciljaju PD-L1 su pokazivale manju stopu ubijanja od lažnih kontrola. Slični podaci su prikazani na SL.27C i 27E za dva dodatna donora. SL.27B prikazuje povećane procente ubijanja kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju PD-L1 uzgajaju zajedno sa PD-L1 pozitivnim SUDHL1 ćelijama. Slični podaci su prikazani na SL.27D i 27F za dva dodatna donora. SL. 28A-28D. DBDpp sa smanjenim potencijalom imunogenosti. Budući da su DBDpp kako su ovde otkriveni sintetički, izvršena je analiza kako bi se identifikovali potencijalno imunogeni epitopi. Trodimenzionalni model DBDpp (cg06) prikazan je na SL. 28A. SL. 28B prikazuje cg06 sa jednim (od tri) potencijalno imunogena epitopa modifikovanim da bude manje potencijalno imunogen. SL.28C prikazuje cg06 sa dva (od tri) potencijalno imunogena epitopa modifikovana. SL.28D prikazuje cg06 sa sva tri potencijalno imunogena epitopa modifikovana.
SL. 29A-29B. DBDpp sa modifikovanim epitopima zadržavaju funkcionalnost. SL.
29A prikazuje podatke vezane za CAR T ćelije koje eksprimiraju varijante DBDpp koji cilja CD123 (cg06). Čak i sa sva tri potencijalno imunogena epitopa uklonjena iz
4
sekvence DBDpp, varijante zadržavaju sposobnost da posreduju u transdukciji signala (aktivirajući Jurkatove ćelije konstruisane za ekspresiju luciferaze) nakon vezivanja za CD123 pozitivne BDCM ciljne ćelije (nemodifikovani cg06 označen strelicom). SL.
29B prikazuje sličnu efikasnost kada se modifikovane varijante vezuju za CD123 pozitivne KG-1a ćelije (nemodifikovani cg06 označen strelicom).
SL. 30A-30B. Ekspresija dvostrukog markera na ćelijama tumora. SL. 30A prikazuje podatke protočne citometrije za ekspresiju CD123 na K562 ćelijama, KG1a ćelijama, BDCM ćelijama, SUDHL ćelijama ili H460 ćelijama. SL. 30B prikazuje podatke protočne citometrije za ekspresiju PD-L1 na istim ćelijskim linijama.
SL. 31A-31E. Bispecifične DBDpp-CAR T ćelije. SL.31A prikazuje procenat T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji ciljaju CD123. SL.31B prikazuje procenat T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji ciljaju PD-L1. SL.31C prikazuje procenat T ćelija koje eksprimiraju bispecifične DBDpp-CAR koji ciljaju CD123-PD-L1 (eksprimirane sa cg06 DBDpp distalno na T ćelijsku membranu u odnosu na pb04 DBDpp). SL.31D prikazuje procenat T ćelija koje eksprimiraju bispecifične DBDpp-CAR koji ciljaju PD-L1-CD123 (eksprimirane sa pb04 DBDpp distalno na T ćelijsku membranu u odnosu na cg06 DBDpp). SL. 31E prikazuje podatke vezane za povećanu intracelularnu signalizaciju bispecifičnog DBDpp.
SL. 32. Test konkurentskog vezivanja DBDpp. SL. 32 pokazuje jedno otelotvorenje testa konkurentskog vezivanja koji može da se koristi za identifikaciju BDBpp koji prikazuju vezivanje zajedničkog epitopa iako testirani DBDpp ima različite sekvence primarnih aminokiselina.
DETALJAN OPIS
[0074] Naslovi odeljaka koji se ovde koriste služe samo u organizacione svrhe, i ne treba ih tumačiti kao ograničenje opisanog predmeta na bilo koji način.
Definicija termina
[0075] Podrazumeva se da, gde god su otelotvorenja ovde opisana rečju „sadrži“, obezbeđena su i analogna otelotvorenja opisana terminima „sastoji se od“ i/ili „suštinski se sastoji od“. Međutim, kada se koriste u zahtevima kao tranzicione fraze, svaku od njih treba tumačiti odvojeno i u odgovarajućem pravnom i činjeničnom kontekstu (npr. „sadrži“ se smatra
4
otvorenijom frazom, dok je „sastoji se od“ u većoj meri isključivo, a „suštinski se sastoji od“ predstavlja sredinu).
[0076] Kako se ovde koristi, oblici za jedninu uključuju i reference u množini, ako nije drugačije naznačeno.
[0077] Termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A i/ili B“, ovde treba da uključuje i A i B; A ili B; (samo) A; i (samo) B. Isto tako, termin „i/ili“, kako se koristi u frazi poput „A, B i/ili C“, treba da obuhvata svako od sledećih otelotvorenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; (samo) A; (samo) B; i (samo) C.
[0078] Termini „protein“ i „polipeptid“ se ovde koriste naizmenično da označe biološki polimer koji sadrži jedinice dobijene od aminokiselina povezanih putem peptidnih veza; protein može biti sastavljen od dva ili više polipeptidnih lanaca.
[0079] Termini „antitelo“ ili „imunoglobulin“, kako se ovde naizmenično koriste, uključuju cela antitela i fragmente antitela, uključujući bilo koji funkcionalni domen antitela kao što su antigen-vezujući fragment ili njegovi pojedinačni lanci, efektorski domen, epitop vezivanja receptora spasa, ili njegov deo. Tipično antitelo sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana disulfidnim vezama. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Konstantni region teškog lanca se sastoji od tri domena, CH1, CH2 i CH3. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. Konstantni region lakog lanca se sastoji od jednog domena, Cl. VH i VL regioni mogu dalje da se podele na regione hipervarijabilnosti, koji se nazivaju regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), koji su prošarani regionima koji su u većoj meri očuvani, a koji se nazivaju regioni okvira (FW). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR i četiri FW, koji su poređani od amino-terminusa do karboksi-terminusa prema sledećem redosledu: FW1, CDR1, FW2, CDR2, FW3, CDR3, FW4. Varijabilni regioni teškog i lakog lanca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu da posreduju u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (C1q) klasičnog sistema komplementa. Neograničavajuće vrste antitela iz predmetnog otkrića uključuju uobičajena antitela, scFv, i njihove kombinacije kada je, na primer, DBDpp kovalentno vezan (npr. putem peptidnih veza ili putem hemijskog
4
linkera) za N-terminus teškog lanca i/ili lakog lanca uobičajenog celog antitela (kompletne dužine), ili umetnut u H lanac i/ili L lanac celog antitela.
[0080] Termin „fragment antitela“ odnosi se na deo netaknutog antitela i označava svaki funkcionalni domen antitela, kao što je antigen-vezujući fragment ili njegovi pojedinačni lanci, efektorski domen ili njegov deo, i epitop vezivanja receptora spasa ili njegov deo. Primeri za fragmente antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2 i Fv fragmente, linearna antitela, jednolančana antitela, i multispecifična antitela nastala od fragmenata antitela. „Fragment antitela“, kako se ovde koristi, sadrži antigen-vezujuće mesto ili mesto vezivanja epitopa. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži efektorski domen ili njegov deo. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži epitop vezivanja receptora spasa ili njegov deo.
[0081] Kako se ovde koristi, termin „Fc region“ ili samo „Fc“ znači karboksi-terminalni deo konstantnog regiona lanca imunoglobulina, poželjno konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina, ili njegov deo. Na primer, Fc region imunoglobulina može da sadrži (1) CH1 domen, CH2 domen i CH3 domen, (2) CH1 domen i CH2 domen, (3) CH1 domen i CH3 domen, 4) CH2 domen i CH3 domen ili (5) kombinaciju dva ili više domena i regiona šarke imunoglobulina. U poželjnom otelotvorenju, Fc region imunoglobulina sadrži najmanje region šarke imunoglobulina, CH2 domen i CH3 domen, i poželjno nema CH1 domen. U jednom otelotvorenju, klasa imunoglobulina iz koje se dobija konstantni region teškog lanca je IgG (Igy) (γ potklase 1, 2, 3 ili 4). Mogu da se koriste druge klase imunoglobulina, IgA (Igα), IgD (Igδ), IgE (Igε) i IgM (Igµ). Izbor odgovarajućeg konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina je detaljno razmotren u U.S. pat. br.5,541,087 i 5,726,044, od kojih je svaki ovde u celini uključen putem reference. Smatra se da je izbor određenih sekvenci konstantnog regiona teškog lanca imunoglobulina iz određenih klasa i potklasa imunoglobulina za postizanje određenog rezultata na nivou stručnosti u ovoj oblasti. Deo DNK konstrukta koji kodira Fc region imunoglobulina poželjno sadrži najmanje deo regiona šarke, i poželjno najmanje deo CH3 domena Fc gama ili homologih domena u bilo kom od IgA, IgD, IgE ili IgM. Dalje se razmatra da supstitucija ili delecija aminokiselina u konstantnim regionima teškog lanca imunoglobulina može biti korisna u praktikovanju ovde otkrivenih postupaka i kompozicija. Jedan od primera bio bi uvođenje aminokiselinske supstitucije u gornji CH2 region radi stvaranja Fc varijante sa smanjenim afinitetom prema Fc receptorima (Cole, J. Immunol. 159:3613 (1997)).
4
[0082] „Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela“ ili „ADCC“ odnosi se na ćelijski posredovanu reakciju u kojoj nespecifične citotoksične ćelije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR) (npr. ćelije prirodne ubice (NK), neutrofili i makrofagi) prepoznaju vezano antitelo na ciljnoj ćeliji i posledično izazivaju lizu (ili druga citotoksična dejstva) ciljne ćelije. Za procenu ADCC aktivnosti molekula od interesa može da se koristi bilo koji in vitro ADCC test poznat u struci, kao što je onaj opisan u U.S. pat. br. 5,500,362 ili 5,821,337. Korisne efektorske ćelije za takve testove uključuju, ali nisu ograničene na, mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC) i ćelije prirodne ubice (NK). Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se proceni in vivo, npr. na životinjskom modelu kao što je onaj otkriven u Clynes et al. PNAS 95:652-656 (1998).
[0083] Termini „jednolančani varijabilni fragment(i)“ ili „scFv“ antitela, kako se ovde koriste, odnose se na oblike antitela (npr. fragmente antitela) koji sadrže varijabilne regione samo teških i lakih lanaca, povezane putem linkerskog peptida. U jednom otelotvorenju, fuzioni protein DBDpp sadrži DBDpp i scFv.
[0084] Termin „linker“ se odnosi na peptid ili drugu hemijsku vezu lociranu između DBDpp i drugog polipeptida fuzionog proteina DBDpp. Pogodni linkeri za kuplovanje dva ili više povezanih DBDpp biće poznati osobama sa znanjem u struci, i ovde su opisani neograničavajući primeri.
[0085] Termin „operativno vezan“, kako se ovde koristi, pokazuje da su dva molekula povezana tako da svaki zadržava barem neki nivo funkcionalne aktivnosti koju je svaki molekul samostalno imao (pod pretpostavkom da je svaki molekul imao funkcionalnu aktivnost). U otelotvorenjima kada je jedan molekul bio bez funkcionalne aktivnosti, on je operativno vezan sa drugim molekulom ako drugi molekul zadržava barem neki nivo svoje funkcionalne aktivnosti. „Operativno vezan“ može takođe da se odnosi na vezu dva nefunkcionalna molekula. Dva molekula mogu biti „operativno vezana“ bilo da su vezani direktno ili indirektno (npr. putem linkera).
[0086] Termini „specifično vezuje“ ili „ima selektivni afinitet prema“ znače da vezujući agens kao što je DBDpp reaguje ili se povezuje češće, brže, sa dužim trajanjem, sa većim afinitetom, ili neka od kombinacija prethodnog, sa epitopom, proteinom ili ciljnim molekulom nego sa
4
alternativnim supstancama, uključujući proteine koji su nepovezani sa ciljnim epitopom. Zbog identičnosti sekvence između homologih proteina u različitim vrstama, specifično vezivanje može, u nekoliko otelotvorenja, da uključuje vezujući agens koji prepoznaje protein ili cilj kod više od jedne vrste. Isto tako, zbog homologije u određenim regionima polipeptidnih sekvenci različitih proteina, specifično vezivanje može da uključuje vezujući agens koji prepoznaje više od jednog proteina ili cilja. Podrazumeva se da, u određenim otelotvorenjima, vezujući agens koji specifično vezuje prvi cilj može ili ne mora specifično da vezuje drugi cilj. Tako, „specifično vezivanje“ ne zahteva nužno (mada može da uključuje) isključivo vezivanje, npr. vezivanje za jedan cilj. Dakle, vezujući agens može, u određenim otelotvorenjima, specifično da vezuje više od jednog cilja. U određenim otelotvorenjima, više ciljeva može biti vezano istim antigen-vezujućim mestom na vezujućem agensu.
[0087] „Cilj“ se odnosi na bilo koji molekul ili kombinaciju molekula koju može da veže DBDpp, kao što je fuzioni protein DBDpp, ili druga komponenta fuzionog proteina DBDpp, kao što je antitelo ili fragment varijabilnog domena antitela.
[0088] Termini „epitop“ i „antigenska determinanta“ ovde se koriste naizmenično, i odnose se na deo bilo kog molekula (npr. cilja od interesa) sposoban da ga prepozna i specifično veže određeni vezujući agens (npr. DBDpp ili antitelo). Kada je prepoznati molekul polipeptid, epitopi mogu da se formiraju od uzastopnih aminokiselina i neuzastopnih aminokiselina i/ili drugih hemijski aktivnih površinskih grupa molekula (kao što su ugljeni hidrati) poređanih tercijarnim savijanjem proteina. Epitopi nastali od uzastopnih aminokiselina se obično zadržavaju nakon denaturacije proteina, dok se epitopi nastali tercijarnim savijanjem uobičajeno gube nakon denaturacije proteina. Epitop obično uključuje najmanje 3 aminokiseline, i češće, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0089] „Peptidna oznaka“, kako se ovde koristi, odnosi se na peptidnu sekvencu koja je deo drugog proteina ili je vezana za njega (na primer, putem genetskog inženjerstva), da bi se obezbedila funkcija nastaloj fuziji. Peptidne oznake su obično relativno kratke u odnosu na protein sa kojim su fuzionisane; na primer, peptidne oznake su, u nekoliko otelotvorenja, dužine četiri ili više aminokiselina, recimo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ili 25 ii više aminokiselina. U nekim otelotvorenjima, DBDpp je fuzioni protein koji sadrži peptidnu oznaku. U drugim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje peptidnu oznaku. Brojne peptidne oznake koje se koriste kako je ovde dato su poznate u struci. Primeri peptidnih oznaka koje mogu biti komponenta fuzionog proteina DBDpp ili cilj koji vezuje DBDpp (npr. fuzioni protein DBDpp). Primeri peptidnih oznaka koje mogu biti komponenta DBDpp fuzionog proteina ili cilj koji vezuje DBDpp (npr. fuzioni protein DBDpp) uključuju, ali nisu ograničeni na, HA (hemaglutinin), c-myc, glikoprotein D (gD) virusa herpes simpleks, T7, GST, GFP, MBP, Strep-oznake, His-oznake, Myc-oznake, TAP-oznake i FLAG® oznaku (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.) Slično tome, antitela na epitop oznake omogućavaju detekciju i lokalizaciju fuzionog proteina, na primer, u afinitetnom prečišćavanju, vestern blotu, ELISA testovima i imunobojenju ćelija.
[0090] Termin „koji se javljaju u prirodi“, kada se koristi u vezi sa biološkim supstancama kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi i ćelije domaćini, odnosi se na one koji se nalaze u prirodi i nije ih modifikovao čovek. Nasuprot tome, „neprirodni“ ili „sintetički“, kada se koristi u vezi sa biološkim supstancama, odnosi se na one kojih nema u prirodi i koje je čovek modifikovao.
[0091] Kako se ovde koristi, „modifikacije“ u pogledu sekvence referentnog skeleta SEQ ID NO:1 (ili u pogledu drugih sekvenci) uključuju supstitucije, delecije, insercije i/ili adicije sekvence odgovarajuće aminokiselinske pozicije SEQ ID NO:1 (ili u pogledu odgovarajuće pozicije druge sekvence).
[0092] „Supstitucija“ se, u pogledu sekvence referentnog skeleta SEQ ID NO:1 (ili u pogledu drugih sekvenci), odnosi na zamenu određenog aminokiselinskog ostatka različitim aminokiselinskim ostatkom na odgovarajućoj pozicije aminokiseline SEQ ID NO:1 (ili u pogledu odgovarajuće pozicije druge sekvence).
[0093] „Konzervativna“ aminokiselinska supstitucije je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u struci, uključujući bazne bočne lance (npr. lizin (K), arginin (R), histidin (H)), kisele bočne lance (npr. asparaginska kiselina (D) , glutaminska kiselina (E)), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin (G), asparagin (N), glutamin (Q), serin (S), treonin (T), tirozin (Y), cistein (C)), nepolarne bočne lance (npr. alanin (A), valin (V), leucin (L), izoleucin (I), prolin (P), fenilalanin (F), metionin (M), triptofan (W), beta-razgranate bočne lance (npr. treonin (T), valin
1
(V), izoleucin (I)) i aromatične bočne lance (npr. tirozin (Y), fenilalanin (F), triptofan (W), histidin (H)). Na primer, supstitucija fenilalanina tirozinom je konzervativna supstitucija. U jednom otelotvorenju, konzervativne supstitucije u sekvencama DBDpp dovode do specifičnog vezivanja DBDpp koji sadrži supstituciju za cilj od interesa za koji se vezuje. U jednom otelotvorenju, konzervativne supstitucije u sekvencama DBDpp ne ukidaju vezivanje DBDpp koji sadrži supstituciju za cilj od interesa za koji se vezuje. Postupci identifikovanja konzervativnih supstitucija nukleotida i aminokiselina i nekonzervativnih supstitucija koje daju, izmenjuju ili održavaju selektivni afinitet vezivanja poznati su u struci (vidite, npr. Brummell, Biochem. 32:1180-1187 (1993); Kobayashi, Protein Eng. 12(10):879-884 (1999); i Burks, PNAS 94:412-417 (1997)).
[0094] „Nekonzervativna“ aminokiselinska supstitucije je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima različit bočni lanac. U jednom otelotvorenju, nekonzervativne supstitucije u sekvencama DBDpp dovode do specifičnog vezivanja DBDpp koji sadrži supstituciju za cilj od interesa za koji se vezuje. U jednom otelotvorenju, nekonzervativne supstitucije u sekvencama DBDpp ne ukidaju vezivanje DBDpp koji sadrži supstituciju za cilj od interesa za koji se vezuje.
[0095] „Neprirodne aminokiseline“, „analozi aminokiselina“ i „nestandardni aminokiselinski ostaci“ se ovde koriste naizmenično. Neprirodne aminokiseline koje mogu da se supstituišu u DBDpp, kako je ovde obezbeđeno, poznate su u struci. U jednom otelotvorenju, neprirodna aminokiselina je 4-hidroksiprolin koji može da supstituiše prolin, 5-hidroksilizin koji može da supstituiše lizin; 3-metilhistidin koji može da supstituiše histidin; homoserin koji može da supstituiše serin; i ornitin koji može da supstituše lizin. Dodatni primeri neprirodnih aminokiselina koje mogu da se supstituišu u DBDpp uključuju, ali nisu ograničeni na molekule kao što su: D-izomeri uobičajenih aminokiselina, 2,4-diaminobuterna kiselina, alfa-amino izobuterna kiselina, A-aminobuterna kiselina, Abu, 2-aminobuterna kiselina, gama-Abu, epsilon-Ahx, 6-amino heksanska kiselina, Aib, 2-amino izobuterna kiselina, 3-amino propionska kiselina, ornitin, norleucin, norvalin, hidroksiprolin, sarkozin, citrulin, homocitrulin, cisteinska kiselina, t-butilglicin, t-butilalanin, fenilglicin, cikloheksilalanin, betaalanin, lantionin, dehidroalanin, γ-aminobuterna kiselina, selenocistein i pirolizin fluoraminokiseline, konstruisane aminokiseline kao što su beta-metil aminokiseline, C alfa-metil aminokiseline i N alfa-metil aminokiseline, ili kombinacije neprirodnih aminokiselina. Još neke neprirodne aminokiseline mogu da uključuju 4-amino buternu kiselinu, 4-amino-3-
2
hidroksi-5-fenilpentansku kiselinu, 4-amino-3-hidroksi-6-metilheptansku kiselinu, 2-tienil alanin i/ili D-izomere aminokiselina. Kao što je ovde razmotreno, u nekoliko otelotvorenja neprirodne aminokiseline ili analozi aminokiselina mogu da uključuju deleciju jedne ili više aminokiselina iz sekvence.
[0096] Termini „polinukleotid“ i „nukleinska kiselina“, koji se ovde koriste naizmenično, odnose se na polimerni oblik nukleotida bilo koje dužine, bilo ribonukleotida ili dezoksiribonukleotida. Ovi pojmovi uključuju, ali nisu ograničeni na, DNK, RNK, kDNK (komplementarna DNK), iRNK (informaciona RNK), rRNK (ribozomska RNK), shRNK (mala ukosnica RNK), snRNK (mala nuklearna RNK), snoRNK (kratka nuklearna RNK), miRNK (mikroRNK), genomsku DNK, sintetičku DNK, sintetičku RNK i/ili tRNK.
[0097] Termin „gola DNK“, kako se ovde koristi, odnosi se na DNK (npr. DNK bez histona) koja kodira protein kao što je DBDpp (npr. CAR) koja je DNK klonirana u odgovarajući ekspresioni vektor sa ispravnom orijentacijom za ekspresiju (npr. plazmid). Virusni vektori koji mogu da se koriste uključuju, ali nisu ograničeni na, SIN lentivirusne vektore, retrovirusne vektore, vektore penastih virusa, vektore adenovirusa, vektore adenoasociranog virusa (AAV), hibridne vektore i/ili plazmidne transpozome (na primer sistem transpozona uspavana lepotica) ili vektorske sisteme na bazi integraze. Ostali vektori koji mogu da se koriste u vezi sa proizvodnjom i korišćenjem DBDpp su ovde opisani ili su inače poznati u struci.
[0098] Termini „vektor“, „klonirajući vektor“ i „ekspresioni vektor“, kako se ovde koriste, odnose se na vehikulum putem kog sekvenca nukleinske kiseline (npr. kodirajuća sekvenca DBDpp) može da se održava ili amplifikuje u ćeliji domaćinu (npr. klonirajući vektor) ili uvede u ćeliju domaćina, tako da transformiše domaćina i promoviše ekspresiju (npr. transkripciju i translaciju) uvedene sekvence. Vektori uključuju plazmide, fage, viruse, itd.
[0099] „Ćelija domaćin“ uključuje pojedinačnu ćeliju ili ćelijsku kulturu koja može da bude ili je bila primalac nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp. Ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, virusne čestice, fagemide, bakterije, ćelije kvasca, biljaka, životinja i sisara. Ćelije domaćini uključuju potomstvo jedne ćelije domaćina, a potomstvo ne mora nužno biti potpuno identično (po morfologiji ili po ukupnom DNK komplementu) sa originalnom matičnom ćelijom usled prirodnih, slučajnih ili namernih mutacija i/ili promena. Ćelija domaćin uključuje ćelije transficirane ili inficirane in vivo, in vitro ili ex vivo nukleinskim kiselinama koje kodiraju DBDpp. U nekim primerima, ćelija domaćin može da eksprimira i prikazuje DBDpp na svojoj površini, kao što je, na primer, displej faga. „Ekspresija“ uključuje transkripciju i/ili translaciju.
[0100] „Biblioteka“ BDBpp odnosi se na više jedinstvenih DBDpp, i opciono uključuje više DBDpp koji se vezuju za isti cilj, ali sa različitim mestima vezivanja i/ili specifičnostima.
[0101] „Biblioteka vektora“ DBDpp odnosi se na više jedinstvenih nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp (kao i gore, opciono uključujući nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp koji se vezuju za isti cilj, ali sa različitim mestima vezivanja i/ili specifičnostima).
[0102] Kako se ovde koriste, termini „čvrsta podloga“, „podloga“, „matrice“ i „smole“ koriste se naizmenično i označavaju, bez ograničenja, bilo koju kolonu (ili materijal kolone), perlicu, test epruvetu, mikrotitarsku posudu, čvrstu česticu (na primer, agaroza ili sefaroza), mikročip (na primer, silicijumski, od silicijumskog stakla ili zlatni čip) ili membranu (npr. biološka ili filter membrana) za koju DBDpp, antitelo ili drugi protein mogu da se vežu (npr. kupluju, povežu ili zalepe), bilo direktno ili indirektno (na primer, putem drugih intermedijera partnera u vezivanju, kao što su druga antitela ili protein A), ili u koju DBDpp ili antitelo mogu da se umetnu (na primer, putem receptora ili kanala). Reagensi i tehnike za vezivanje polipeptida za čvrste nosače (npr. matrice, smole, plastika, itd.) dobro su poznati u struci. Prikladni čvrsti nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, hromatografsku smolu ili matricu (npr. SEPHAROSE-4 FF perlice agaroze), zid ili dno bunarčića u plastičnoj mikrotitarskoj ploči, biočip na bazi silicijum dioksida, poliakrilamid, agarozu, silicijum dioksid, nitrocelulozu, papir, plastiku, najlon, metal, i njihove kombinacije. DBDpp i druge kompozicije mogu da se vezu za supstancu nosača putem nekovalentnog vezivanja ili kovalentnog vezivanja, koristeći reagense i tehnike poznate u struci. U jednom otelotvorenju, DBDpp je kuplovan sa hromatografskom supstancom koristeći linker.
[0103] Kako se ovde koriste, termini „farmaceutski prihvatljive“ ili „fiziološki podnošljive“ i njihove gramatičke varijacije, kada se odnose na kompozicije, nosače, razblaživače i reagense, koriste se naizmenično i pokazuju da su supstance sposobne za primenu na ljudskom biću bez nastanka terapeutski preteranih neželjenih fizioloških dejstava, kao što su mučnina, vrtoglavica, stomačne tegobe, i slično.
4
[0104] „Modulisati“ znači prilagoditi ili regulisati amplitudu, frekvenciju, stepen ili aktivnost. U drugom povezanom aspektu, takva modulacija može biti pozitivno modulisana (npr., povećanje frekvencije, stepena ili aktivnosti) ili negativno modulisana (npr., smanjenje frekvencije, stepena ili aktivnosti). U nekoliko otelotvorenja, modulacija u pozitivnom ili negativnom smeru se pominje u odnosu na ćeliju, tkivo ili funkciju organa pre primene terapeutskog sredstva. U dodatnim otelotvorenjima, modulacija u pozitivnom ili negativnom smeru se pominje u odnosu na normalnu, zdravu ćeliju, tkivo ili organ.
[0105] „Delotvorna količina“ DBDpp, kao što je fuzioni protein DBDpp kako je ovde obezbeđen, predstavlja količinu dovoljnu da obavi specifično navedenu svrhu, kao što je postizanje uočljive promene nivoa jedne ili više bioloških aktivnosti povezanih sa ciljem za koji se vezuje DBDpp (npr. fuzioni protein DBDpp). U određenim otelotvorenjima, promena povećava nivo ciljne aktivnosti. U drugim otelotvorenjima, promena smanjuje nivo ciljne aktivnosti. „Delotvorna količina“ može da se utvrdi empirijski i na rutinski način, u vezi sa navedenom svrhom. Termin „terapeutski delotvorna količina“ odnosi se na količinu DBDpp, kao što je fuzioni protein DBDpp, ili drugog terapeutskog agensa delotvornu za „lečenje“ (npr. smanjenje simptoma) bolesti ili poremećaja kod ispitanika (sisara). „Profilaktički delotvorna količina“ odnosi se na količinu koja je delotvorna, u dozama i neophodnim vremenskim periodima, za postizanje željenog profilaktičkog rezultata.
[0106] „Pacijent“, „ispitanik“, „životinja“ i „sisar“ se koriste naizmenično, i označavaju sisare kao što su ljudski pacijenti i primati koji nisu ljudi, kao i eksperimentalne životinje, kao što su zečevi, pacovi i miševi, i druge životinje. Životinje uključuju sve kičmenjake, npr. sisare i životinje koje nisu sisari, kao što su kokoške, vodozemci i gmizavci. „Sisar“, kako se ovde koristi, odnosi se na bilo kog člana klase Mammalia, uključujući, bez ograničenja, ljude i primate koji nisu ljudi, kao što su šimpanze i druge vrste čovekolikih majmuna i majmuna; poljoprivredne životinje, kao što je stoka, ovce, svinje, koze i konji; domaće sisare, kao što su psi i mačke; laboratorijske životinje, uključujući glodare, kao što su miševi, pacovi i zamorci, i slično. U određenom otelotvorenju, pacijent je čovek. Termin ne označava određenu starost ili pol. Dakle, odrasli i novorođeni ispitanici, kao i embrioni i fetusi, bilo muški ili ženski, treba da budu obuhvaćeni ovim terminom.
[0107] Termini „lečiti“ i „lečenje“, kako se ovde koriste, označavaju i terapeutsko lečenje i profilaktičke ili preventivne mere, pri čemu je cilj prevencija ili usporavanje (smanjenje ili odlaganje) simptoma, komplikacija ili biohemijskih indikacija bolesti, stanja ili poremećaja, ublažavanje simptoma ili zaustavljanje ili inhibicija daljeg razvoja bolesti, stanja ili poremećaja. Lečenje može biti profilaktičko (radi sprečavanja ili odlaganja pojave bolesti, ili radi sprečavanja manifestacije njenih kliničkih ili subkliničkih simptoma) ili terapeutsko potiskivanje ili ublažavanje simptoma nakon manifestacije bolesti, stanja ili poremećaja ciljanog patološkog stanja, prevencija patološkog stanja, težnja ka korisnim rezultatima ili njihovo ostvarenje, ili manje šanse da pojedinac razvije stanje čak i ako je lečenje na kraju neuspešno. Oni kojima je potrebno lečenje uključuju one koji već imaju stanje, kao i one koji imaju predispozicije za stanje, ili one kod kojih stanje treba sprečiti. Lečenje može biti fuzionim proteinom DBDpp, samostalno ili u kombinaciji sa dodatnim terapeutskim agensom.
[0108] „Kancer“, „tumor“ ili „malignitet“ se koriste kao sinonimi, i odnose se na bilo koji broj bolesti koje su okarakterisane nekontrolisanom, abnormalnom proliferacijom ćelija, sposobnošću pogođenih ćelija da se šire lokalno ili kroz krvotok i limfni sistem u druge delove tela (metastaziraju), kao i bilo kojim brojem karakterističnih strukturnih i/ili molekulskih svojstava. „Tumor“, kako se ovde koristi, odnosi se na svaki neoplastični ćelijski rast i proliferaciju, bilo maligni ili benigni, i na sve prekancerozne i kancerozne ćelije i tkiva. „Kancerozni tumor“ ili „maligna ćelija“ je ćelija koja ima specifična strukturna svojstva, nedostaje joj diferencijacija, i sposobna je za invaziju i metastazu. Kanceri koji mogu da se leče koristeći fuzione proteine DBDpp koji su ovde dati uključuju, bez ograničenja, kancer dojke, pluća, mozga, kostiju, jetre, bubrega, debelog creva, glave i vrata, jajnika, hematopoetski kancer (npr. leukemija) i kancer prostate. Ostale vrste kancera i tumora koji mogu da se leče koristeći antitela koja sadrže DBDpp su opisani ovde ili inače poznati u struci.
[0109] Termini tumorski antigen ili kancerski antigen se ovde koriste naizmenično. Tumorski ili kancerski antigen može biti antigen specifičan za tumor (TSA), antigen specifičan za kancer (CSA), antigen povezan sa tumorom (TAA), ili antigen povezan sa kancerom (CAA). TSA je antigen koji je jedinstven za tumorske ćelije, i ne javlja se u drugim ćelijama u telu. TAA je antigen koji se nalazi i na tumoru i na nekim normalnim ćelijama. Usled dinamične prirode tumora, tumorske ćelije u nekim slučajevima mogu da eksprimiraju jedinstvene antigene u određenim stadijumima, a u drugima eksprimiraju i antigene koji su takođe eksprimirani na netumorskim ćelijama. Stoga, uključivanje određenog markera kao TAA ne sprečava da se on smatra za TSA. Primeri za TAA i TSA koje DBDpp može specifično da vezuje uključuju, ali nisu ograničeni na: CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelin, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipid F77, EGFRvIII, GD2, NY-ESO- 1TCR, MAGE A3 TCR MARTI, gp100 (Pmel 17), tirozinazu, TRP1, TRP2, MAGE1, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, pi5, CEA; p53, Ras, HER-2/neu; BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, 1GH-IGK, MYL-RAR; EBVA, HPV antigene E6 i E7, TSP-180, MAGE4, MAGE5, MAGE6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB3, nm-23Hl, PSA, CA 19-9, CA72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenin, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4(791Tgp72) alfa-fetoprotem, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA195, CA242, CA50, CAM43, CD68\I, CO-029, FGF5, G250, Ga733VEpCAM, HTgp-175, M344, MA50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA90\Mac-2, TAAL6, TAG72, TLP i TPS.
[0110] Termin „ciljna ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije koje su uključene u bolest, i mogu da se ciljaju kompozicijama koje sadrže DBDpp. Ostale ciljne ćelije uključuju bilo koju ćeliju u ispitaniku (npr. čovek ili životinja) koju DBDpp iz pronalaska može da cilja. Ciljna ćelija može biti ćelija koja eksprimira ili prekomerno eksprimira cilj koji specifično vezuje fuzioni protein DBDpp.
[0111] Termin „efektorske ćelije“ su leukociti koji eksprimiraju jedan ili više FcR i obavljaju efektorske funkcije. Ćelije poželjno eksprimiraju barem Fc(RIII i obavljaju ADCC efektorsku funkciju. Primeri humanih leukocita koji posreduju u ADCC uključuju mononuklearne ćelije periferne krvi (PBMC), ćelije prirodne ubice (NK), monocite, citotoksične T ćelije i neutrofile; gde su PBMC i NK ćelije poželjne u određenim otelotvorenjima. Efektorske ćelije mogu da se izoluju iz svog prirodnog izvora, npr. iz krvi ili PBMC, kako je ovde opisano ili inače poznato u struci. U specifičnom otelotvorenju, efektorske ćelije su humane efektorske ćelije.
[0112] Termin „efektorska funkcija“ se odnosi na specijalizovanu imunsku funkciju diferencirane ćelije. Na primer, efektorska funkcija T-ćelije može biti citolitička aktivnost ili pomoćna aktivnost, uključujući sekreciju citokina.
[0113] Termini „T-ćelija“ i „T-limfocit“ su sinonimi, i ovde se koriste naizmenično. Primeri uključuju, ali nisu ograničeni na, naivne T ćelije, T ćelije centralne memorije, T ćelije efektorske memorije, ili njihove kombinacije.
[0114] Termin „imunska ćelija“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije imunskog sistema sisara, uključujući, ali bez ograničenja, ćelije koje prezentuju antigen, B-ćelije, bazofile, citotoksične T-ćelije, dendritske ćelije, eozinofile, granulocite, pomoćničke T-ćelije, leukocite, limfocite, makrofage, mastocite, memorijske ćelije, monocite, ćelije prirodne ubice, neutrofile, fagocite, ćelije plazme i T-ćelije.
[0115] Termin „imunski odogovor“, kako se ovde koristi, odnosi se na imunitete koji uključuju, ali nisu ograničeni na, urođeni imunitet, humoralni imunitet, ćelijski imunitet, imunitet, inflamatorni odogovor, stečeni (adaptivni) imunitet, autoimunitet i/ili prekomerno aktivni imunitet.
[0116] Termin „transdukcija“, kako se ovde koristi, odnosi se na uvođenje strane nukleinske kiseline u ćeliju koristeći virusni vektor. „Transfekcija“, kako se ovde koristi, odnosi se na uvođenje strane nukleinske kiseline u ćeliju koristeći tehnologiju rekombinantne DNK. Termin „transformacija“ znači uvođenje „strane“ (npr. spoljašnje, ekstracelularne ili na drugi način neendogene) sekvence nukleinske kiseline (DNK ili RNK) u ćeliju domaćina, tako da ćelija domaćin eksprimira uvedenu nukleinsku kiselinu radi proizvodnje željene supstance, kao što je protein ili enzim kodiran uvedenom kodirajućom sekvencom. Uvedena sekvenca nukleinske kiseline može da se naziva i „klonirani“ ili „strani“ gen ili sekvenca, može da uključuje regulatorne ili kontrolne sekvence, kao što je početna, zaustavna, promoterska, signalna, sekreciona, ili druge sekvence koje koristi genetski mehanizam ćelije. Sekvenca nukleinske kiseline može da uključuje nefunkcionalne sekvence ili sekvence koje nemaju poznatu funkciju. Ćelija domaćin koja prima i eksprimira uvedenu nukleinsku kiselinu (npr. DNK ili RNK) je „transformisana“, i ona je „transformant“ ili „klon“. DNK ili RNK uvedena u ćeliju domaćina može biti iz bilo kog izvora, uključujući ćelije istog roda ili vrste kao ćelija domaćin, ili ćelije različitih rodova ili vrsta, ili može biti ona koja se ne javlja u prirodi.
[0117] „Receptor ćelijske površine“ odnosi se na molekule i komplekse molekula koji su sposobni za prijem signala i transmisiju takvih signala duž membrane plazme ćelije. Primer ovde obezbeđenog receptora ćelijske površine je aktivirani integrinski receptor, na primer, aktivirani αvβ3 integrinski receptor na metastatskoj ćeliji. Kako se ovde koristi, „receptor ćelijske površine“ takođe uključuje molekul eksprimiran na ćelijskoj površini koji sadrži DBDpp sposoban da vezuje cilj od interesa. Termin „receptor“ označava protein povezan sa ćelijom koji se vezuje za molekul, ili na drugi način interaguje sa njim (npr. ligand) i posreduje u dejstvu liganda na ćeliju. U nekoliko otelotvorenja, molekul koji interaguje sa receptorom je bioaktivni molekul. Receptori ćelijske površine vezani za membranu su okarakterisani višedomenskom strukturom koja sadrži ekstracelularni domen koji vezuje ligand, domen koji premošćava membrane i intracelularni efektorski domen koji je uobičajeno uključen u transdukciju signala.
[0118] „Himerni receptor antigena“ ili „CAR“, kako se ovde koristi, odnosi se na konstruisane receptore koji graftuju antigen ili cilj specifično na ćelije (na primer, T ćelije kao što su naivne T ćelije, T ćelije centralne memorije, T ćelije efektorske memorije; NK ćelije, NKT ćelije, ili njihovu kombinaciju). CAR su takođe poznati kao veštački T-ćelijski receptori, himerni T-ćelijski receptori ili himerni imunoreceptori.
De novo vezujući domen polipeptida
[0119] Termini „de novo vezujući domen“ i DBD ovde se koriste naizmenično za opisivanje sekvence koja vezuje cilj, koja deli određenu sekvencu i određena strukturna svojstva referentne sekvence skeleta: MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALR KEAA AIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:1). Termini DBDpp i DBD polipeptidi uključuju reference za jedninu (tj. DBD polipeptid) i množinu (tj. DBD polipeptidi), ako nije drugačije naznačeno, izričito ili putem konteksta. DBDpp je polipeptid koji može specifično (nenasumično) da se vezuje za ciljni molekul.
[0120] Otkriveno je i ovde prikazano u nekoliko otelotvorenja da antiparalelni snop od tri spirale koji se ne javlja u prirodi i nema cilj (podnosilac prijave ne zna za cilj koji može da se veže) koji ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 može da se koristi kao platforma za referentni skelet za proizvodnju polipeptida (DBDpp) koji sadrže de novo vezujući domen (DBD) koji se vezuju za cilj od interesa, i za stvaranje biblioteka DBDpp koje mogu da se pretražuju za DBDpp koji ima željene funkcionalne i/ili biološke aktivnosti. Shodno tome, u nekim aspektima, otkriće se odnosi na upotrebu DBDpp u postupcima za proizvodnju DBDpp koji imaju željena svojstva, kao što je sposobnost vezivanja cilja od interesa; postupke proizvodnje biblioteka DBDpp; bibilioteke DBDpp proizvedene takvim postupcima; postupke za pretragu takvih biblioteka DBDpp na željene biološke aktivnosti; i DBDpp identifikovane iz takvih biblioteka.
[0121] Ako nije drugačije naznačeno, praksa otkrivenih kompozicija i postupaka koristi standardne tehnike molekularne biologije (uključujući rekombinantne tehnike, kulturu tkiva i transformaciju ćelija), mikrobiologije, ćelijske biologije, biohemije i imunologije, koje su u okviru znanja u struci. Takve tehnike se obično vrše u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kako se uobičajeno postiže koristeći ili rutinski modifikujući poznate procedure, kao što su one prikazane u Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)); PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, N.Y., 1992); Oligonucleotide Synthesis (Gait, ed., 1984); Animal Cell Culture (Freshney, ed., 1987); Handbook of Experimental Immunology (Weir et al. eds.; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Miller, ed., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel., ed., 1987); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis, ed., Academic Press, San Diego, Calif., 1990); Mattila, et al. Nucleic Acids Res. 19:967 (1991); Eckert, et al. PCR Methods and Applications 1:17 (1991); PCR (McPherson, ed., IRL Press, Oxford); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, ed., 1994); Harlow, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. izd. 1988) i Kontermann, ed., "The Antibody Engineering Lab Manual" (Springer Verlag, Heidelberg/New York, 2000); Current Protocols in Immunology (Coligan, ed., 1991); The Immunoassay Handbook (Wild, ed., Stockton Press NY, 1994); i Methods of Immunological Analysis (Masseyeff., ed., Weinheim: VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993); i Gennaro, et al. 2000, Remington: the Science and Practice of Pharmacy, 20. izd. Lipincott Williams i Wilkins: Baltimore, Md., ili kako je ovde opisano. Ako nisu date specifične definicije, laboratorijske procedure i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije opisane ovde, i nomenklatura koja se koristi u vezi sa njima, uobičajeno se koriste u struci. Pored toga, standardne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, rekombinantnu proizvodnju, prečišćavanje, farmaceutsku pripremu, formulaciju, isporuku i lečenje pacijenata.
[0122] U jednom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od prirodnog ćelijskog liganda iz javnih zapisa (od podnošenja Privremene prijave Sjedinjenih Američkih Država serijski br: 62/143,772, podnete 6. aprila 2015. i koliko podnosilac prijave zna). U drugom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od antigen vezujućeg domena dobijenog od imunoglobulina, ili drugog domena antitela kao što je konstantni region, varijabilni region, region za određivanje komplementarnosti (CDR), region okvira, Fc domen ili region šarke. U drugom otelotvorenju, DBDpp ne sadrži tri CDR-a. U drugom otelotvorenju, DBDpp ne sadrži CDR1 i CDR2. U još jednom otelotvorenju, DBDpp ne sadrži CDR1. U još jednom otelotvorenju, DBDpp ne sadrži CDR2. U drugom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od proteina A. U drugom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od prirodnog bakterijskog receptora. U drugom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od fibronektina. U drugom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od domena fibronektina tipa III. U još jednom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od proteina inhibitorskih čvorova cistina. U još jednom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od lipokalina. U još jednom otelotvorenju, DBDpp nije dobijen od afitela.
Karakteristike sekvence
[0123] Kao što je prethodno naznačeno, polipeptid referentnog skeleta SEQ ID NO:1 sadrži tri antiparalelne alfa spirale, i on je varijanta polipeptidne sekvence koja se ne javlja u prirodi i nema cilj, koja je prvobitno konstruisana kao vežba u savijanju proteina. Ovde su obezbeđeni DBDpp koji sadrže određene modifikacije aminokiselinskih ostataka u sekvenci polipeptida referentnog skeleta SEQ ID NO:1 koje daju sposobnost DBDpp da vezuje cilj od interesa, i upotreba DBDpp kao agensa za vezivanje cilja i ciljanje.
[0124] U jednom otelotvorenju, pojedinačni DBDpp ima dužinu od oko 65 do 150 aminokiselina, oko 65 do 125 aminokiselina, oko 65 do 100 aminokiselina, oko 65 do 90 aminokiselina, oko 65 do 80 aminokiselina, oko 65 do 70 aminokiselina. U nekim otelotvorenjima se takođe razmatra da DBDpp ima dužinu od oko 75 do 150 aminokiselina, oko 75 do 125 aminokiselina, oko 75 do 100 aminokiselina, oko 75 do 90 aminokiselina, oko 75 do 80 aminokiselina. DBDpp može biti go ili konjugovan sa drugim molekulima, uključujući, bez ograničenja, toksine i radioizotope. U još nekim otelotvorenjima, koriste se duži DBDpp, na primer, DBDpp sa rasponom dužina od oko 150 do oko 160 aminokiselina, oko 160 do oko 170 aminokiselina, oko 170 do oko 180 aminokiselina, oko 180 do oko 190 aminokiselina, oko 190 do oko 200 aminokiselina, ili bilo koje dužine između navedenih (uključujući krajnje tačke).
[0125] Za poznate vezujuće proteine, specifični ostaci koji čine region vezivanja molekula bili su (ili teoretski mogu biti) eksperimentalno utvrđeni. Prirodni vezujući proteini (npr. antitela ili protein A) imaju ostatke koji mogu da se identifikuju koji promovišu vezivanje za njihove poznate ciljeve. Međutim, za razliku od prirodnih liganda i vezujućih proteina, nije poznato da se konstruisani protein α3d (SEQ ID NO: 49) ili referentna sekvenca skeleta SEQ ID NO: 1
1
specifično vezuju za drugi protein (npr. cilj). Stoga endogeni vezujući ostaci ne mogu da se koriste kao vodič za konstruisanje nove specifičnosti vezivanja. U konstrukciji DBDpp koji se vezuje za cilj, ostaci su razmatrani za mutaciju (npr. randomizacija u biblioteci) ako su bili površinski izloženi - ispoljavajući značajnu dostupnost rastvaraču. Relativna dostupnost ostataka u domenu (oblast D) u odnosu na izolovano stanje (područje I) predstavljena je kao procentualna vrednost (%A). Smatra se da su amino ostaci SEQ ID NO:1 koji imaju vrednosti %A manje od oko 10% do 11% (npr. ostaci koji odgovaraju F7, L11, 114, L18, L21, S24, L28, F31, 135, F38, L42, Y45, G49, V53, L56, A60, 163 i L67 SEQ ID NO:1) nedostupni spoljašnjem rastvaraču, i smatraju se ostacima unutrašnjeg jezgra strukture SEQ ID NO:1. Nasuprot tome, smatra se da aminokiselinski ostaci SEQ ID NO:1 sa vrednostima %A većim od oko 10% do 11% zauzimaju pozicije koje imaju veći potencijal za interakciju sa ciljem od interesa. Vezujuće površine proteina su obično sastavljene od nekoliko aminokiselinskih ostataka koji su ili susedni ili u neposrednoj blizini jedni drugih u trodimenzionalnom prostoru. Prema tome, sekundarno razmatranje u konstrukciji biblioteka, u skladu sa nekoliko otelotvorenja ovde, bila je relativna blizina ovih odabranih ostataka u predviđenoj sekundarnoj i tercijarnoj strukturi DBDpp.
[0126] Sekundarna struktura proteina, poput alfa spirale, može da se menja u zavisnosti od promenljivih okruženja, kao što su temperatura, matrica ili puferska kompozicija i koncentracija. Predviđa se da će sekundarne strukture alfa spirale referentne polipeptidne sekvence SEQ ID NO:1 biti sastavljene od ostataka G2-A20 za spiralu 1, ostataka L28-A44 za spiralu 2 i ostataka E52-Y70 za spiralu 3. U dodatnim primerima, predviđa se da će sekundarne strukture alfa spirale referentne polipeptidne sekvence SEQ ID NO:1 biti sastavljene od ostataka W4-L21 za spiralu 1, ostataka E25-Y45 za spiralu 2 i ostataka P51-Y70 za spiralu 3. Aminokiselinske pozicije referentnog skeleta koje odgovaraju ostacima alfa spirale sa malom dostupnošću rastvaraču su: F7, L11, 114, L18, L21, L28, F31, 135, F38, L42, Y45, V53, L56, A60, 163 i L67 SEQ ID NO:1. Aminokiselinske pozicije referentnog skeleta koje odgovaraju ostacima alfa spirale dostupnim rastvaraču su: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70 SEQ ID NO:1. Aminokiselinske pozicije referentnog skeleta koje odgovaraju ostacima koji ne pripadaju alfa spirali su sledeće: M1, G22, G23, S24, E25, A26, E27, K46, G47, K48, G49, N50, P51, R71, H72 i N73 SEQ ID NO:1.
2
[0127] U jednom otelotvorenju, DBDpp su definisani kao polipeptidi koji vezuju cilj sastavljeni od SEQ ID NO:1 sa jednom ili više aminokiselinskih supstitucija, kako je definisano u zahtevu 18. U jednom otelotvorenju, poravnanje sekvence DBDpp sa SEQ ID NO:1 otkrilo bi identičnost sekvence veću od 90%. U drugim otelotvorenjima, poravnanje sekvence DBDpp sa SEQ ID NO:1 otkrilo bi identičnost sekvence veću od 80%. U drugim otelotvorenjima, poravnanje sekvence DBDpp sa SEQ ID NO:1 otkrilo bi identičnost sekvence veću od 70%. U drugim otelotvorenjima, poravnanje sekvence DBDpp sa SEQ ID NO:1 otkrilo bi identičnost sekvence veću od 60%. U drugim otelotvorenjima, poravnanje sekvence DBDpp sa SEQ ID NO:1 otkrilo bi identičnost sekvence veću od 50%.
[0128] U nekim otelotvorenjima, ostaci DBDpp sa vrednostima %A koje su manje od 10% ostali bi konstantni, ili bi bili supstituisani konzervativnom zamenom aminokiseline. U određenim otelotvorenjima, ostatak DBDpp koji je dostupan rastvaraču (tj. %A veći od 10) ima aminokiselinsku sekvencu koja je modifikovana podvrgnutu mutagenezi, bio bi lociran u regionima polipeptida povezanim sa sekundarnom strukturom alfa spirale. Pozicije alfa spirale sekvence SEQ ID NO:1 koje imaju ostatke nepristupačne rastvaraču odgovaraju F7, L11, 114, L18, L21, L28, F31, 135, F38, L42, Y45, V53, L56, A60, 163 i L67 iz SEQ ID NO:1. Aminokiselinske supstitucije na ovim pozicijama su poželjno konzervativne prirode, i mogu da uključuju nekonvencionalne ili neprirodne aminokiseline. U nekim otelotvorenjima, izbor prirodnih aminokiselinskih supstitucija uključuje L, I, V, A i F (i W, Y, M). U nekim DBDpp, ostaci DBD nepristupačni rastvaraču sadržani u DBDpp su više nego 60%, 70%, 80% ili 90%, ili su 100% identični odgovarajućim ostacima u SEQ ID NO:1. F7, L11, I14, L18, L21, L28, F31, I35, F38, L42, Y45, V53, L56, A60,163 i L67 SEQ ID NO:1.
[0129] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano ukupno 5 do 25, ili 5 do 30 aminokiselinskih ostataka; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. Modifikovani aminokiselinski ostaci su supstitucije. U drugom otelotvorenju, 5 do 25, ili 5 do 30 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U drugom otelotvorenju, 5 do 25, ili 5 do 30 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije, i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim otelotvorenjima, 1 do 25 ili 1 do 30 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U dodatnim otelotvorenjima, 1 do 25 ili 1 do 30 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem otelotvorenju, 1 do 20 ili 1 do 30 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koja se sastoji od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U opcionom daljem primeru, DBDpp opciono dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu, pri čemu je 1 do 5, 1 do 10, 1 do 15, 5 do 10 ili 5 do 15 ostataka koji odgovaraju ostacima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 koji su nedostupni rastvaraču supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U daljem opcionom primeru, supstituisani ostaci koji odgovaraju ostatku SEQ ID NO:1 koji je nedostupan rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: F7, L11, 114, L18, L28, F31, 135, F38, L42, V53, L56, A60, 163 i L67 i Y70. U nekim primerima, supstituisani ostaci koji odgovaraju ostatku SEQ ID NO:1 koji je nedostupan rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: F7, L11, I14, L18, L21, L28, F31, I35, F38, L42, Y45, V53, L56, A60, 163 i L67 i Y70. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U jednom opisanom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U dodatnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj
4
površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. Takođe su obezbeđene biblioteke koje sadrže mnoštvo DBDpp.
[0130] U jednom otelotvorenju, izolovani DBDpp sadrži varijaciju aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, pri čemu je supstituisano 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 pristupačnih rastvaraču, i pri čemu je 1 do 5, 1 do 10, 1 do 15, 5 do 10 ili 5 do 15 ostataka SEQ ID NO:1 nepristupačnih rastvaraču opciono supstituisano konzervativnom aminokiselinskom supstitucijom, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekim otelotvorenjima, supstituisani aminokiselinski ostaci SEQ ID NO:1 pristupačni rastvaraču imaju %A veći od 10. U nekim otelotvorenjima, supstituisani aminokiselinski ostaci SEQ ID NO:1 nepristupačni rastvaraču imaju %A manji od 10. U jednom otelotvorenju, supstituisani aminokiselinski ostaci SEQ ID NO:1 pristupačni rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U nekim otelotvorenjima, supstituisano je najmanje 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili 30 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili 30 aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 3, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 ili 30 aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein ni prolin. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, supstituisano je 1 do 5, 1 do 10, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25 ili 5 do 30 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču. U nekim primerima, supstituisano je 5 do 41, 10 do 41, 15 do 41, 20 do 41, 25 do 41, 30 do 41 ili 35 do 41 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču. U nekim primerima, 5 do 35 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 5 do 35 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 25 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 25 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U opcionom daljem primeru, DBDpp opciono dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu, pri čemu je 1 do 5, 1 do 10, 1 do 15, 5 do 10 ili 5 do 15 ostataka koji odgovaraju ostacima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 koji su nedostupni rastvaraču supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U daljem opcionom otelotvorenju, supstituisani ostaci koji odgovaraju ostatku SEQ ID NO:1 koji je nedostupan rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: F7, L11, I14, L18, L28, F31, I35, F38, L42, V53, L56, A60,163 i L67 i Y70. U daljem opcionom primeru, supstituisani ostaci koji odgovaraju ostatku SEQ ID NO:1 koji je nedostupan rastvaraču izabrani su iz grupe koja se sastoji od: F7, L11, 114, L18, L21, L28, F31, 135, F38, L42, Y45, V53, L56, A60, 163 i L67 i Y70. U dodatnom primeru, DBDpp je fuzioni protein. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U dodatnim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. Takođe su obezbeđene biblioteke koje sadrže mnoštvo DBDpp.
[0131] Termin „petlja“ odnosi se na sekvencu u DBD koja odgovara petlji koja se nalazi, na primer, između spirale 1 i spirale 2 referentnog skeleta SEQ ID NO:1 (npr. pozicije 22-24 SEQ ID NO:2-6, i Z1SEQ ID NO:7-11) i/ili petlji koja se nalazi između spirale 2 i spirale 3 referentnog skeleta SEQ ID NO:1, npr. pozicije 46-48 SEQ ID NO:2-6 i Z2SEQ ID NO:7-11). U određenim otelotvorenjima, jedna ili obe petlje Z1i Z2su aminokiselinske sekvence koje se sastoje od 2 do 5, 2 do 10, 2 do 15, 2 do 20, 2 do 25 ili 2 do 30 aminokiselinskih ostataka (uključujući krajnje tačke i bilo koji broj između navedenih). U nekim otelotvorenjima, jedna ili obe petlje Z1i Z2su aminokiselinske sekvence koje se sastoje od 1, 2, 3, 4, 5, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, ili više od 20 aminokiselinskih ostataka (uključujući krajnje tačke i bilo koji broj između navedenih). U daljem otelotvorenju, najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% aminokiselinskih ostataka Z1i/ili Z2petlje su glicin ili serin. U dodatnim otelotvorenjima, najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% aminokiselinskih ostataka petlje Z1i/ili Z2je izabrano iz grupe koja se sastoji od glicina, serina, treonina, alanina, prolina, histidina, asparagina, asparaginske kiseline, glutamina, glutaminske kiseline, lizina i arginina. U jednom otelotvorenju, petlja Z1ima aminokiselinsku sekvencu GGS. U jednom otelotvorenju, petlja Z2ima aminokiselinsku sekvencu KGKG.
[0132] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX4
4YKG KGNPE VEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:2), pri čemu je X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X33, X34, X37, X40, X41i X44ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim otelotvorenjima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom otelotvorenju, opisana je biblioteka koja sadrži više DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem otelotvorenju, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0133] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWAEFK QRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:3), pri čemu je X32, X33, X36, X39, X40, X43, X57, X58, X61, X64, X65i X68ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim otelotvorenjima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0134] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5E FX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LR X58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu je X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X55, X58, X59, X62, X65i X66ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U posebnom otelotvorenju, DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim otelotvorenjima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0135] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5X6F KX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKGNPEV EX55L RX58X59AAX62IRX65X66LQA YRHN (SEQ ID NO:5), pri čemu je X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X55, X58, X59, X62, X65i X66ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim otelotvorenjima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0136] U jednom otelotvorenju, DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWXsE FX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGN PEVEA LX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:6), pri čemu je X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X30, X33, X34, X37, X40, X41, X44, X57, X58, X61, X64, X65i X68ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem otelotvorenju, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih
1
aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim otelotvorenjima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim otelotvorenjima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim otelotvorenjima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim otelotvorenjima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama, i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom otelotvorenju, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0137] Takođe je opisan izolovani DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42Y Z2NPE VEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:7), pri čemu je X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X28, X31, X32, X35, X38, X39i X42ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, pri čemu Z1i Z2predstavljaju 2 do 30 ostataka prirodnih i/ili neprirodnih aminokiselina, i pri čemu
2
DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U posebnom primeru, DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom otelotvorenju, DBDpp je fuzioni protein. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim otelotvorenjima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim primerima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim primerima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom primeru, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim primerima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0138] Takođe je opisan izolovani DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu: MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVE ALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:8), pri čemu je X30, X31, X34, X37, X38, X41, X52, X53, X56, X59, X60i X63ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, pri čemu Z1i Z2predstavljaju 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U posebnom primeru, DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom primeru, DBDpp je fuzioni protein. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim primerima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim primerima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom primeru, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim primerima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj
4
površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0139] Takođe je obezbeđen izolovani DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSW X5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEV EX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:10), pri čemu je X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X50, X53, X54, X57, X60i X61ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, pri čemu Z1i Z2predstavljaju 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U posebnom primeru, DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom primeru, DBDpp je fuzioni protein. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim primerima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim primerima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom primeru, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim primerima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0140] Takođe je obezbeđen izolovani DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42Y Z2NPE VEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu je X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X28, X31, X32, X35, X38, X39, X42, X52, X53, X56, X59, X60i X63ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, pri čemu Z1i Z2predstavljaju 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U posebnom primeru, DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50). U dodatnom primeru, DBDpp je fuzioni protein. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 supstituisanih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano konzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 prethodnih aminokiselinskih ostataka SEQ ID NO:1 je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže prolin. U nekim primerima, aminokiselinske supstitucije ne sadrže cistein. U nekim primerima, ni prolin ni cistein nisu uključeni u aminokiselinske supstitucije. U nekim primerima, supstitucije aminokiselinskih ostataka uključuju najviše jedan cistein. U nekim primerima, 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano konzervativnim supstitucijama i 1 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama, ili je 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču supstituisano konzervativnim supstitucijama i 5 do 12 aminokiselinskih ostataka pristupačnih rastvaraču je supstituisano nekonzervativnim supstitucijama. U drugom primeru, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. U dodatnom primeru, obezbeđena je biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp i vektori koji sadrže nukleinske kiseline. Obezbeđene su i ćelije domaćini (uključujući virusne čestice) koje sadrže nukleinske kiseline i vektore. U nekim primerima, ćelija domaćin je prokariota ili eukariota koja prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, ćelija domaćin prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelija domaćin je humana imunska ćelija koja eksprimira DBDpp fuzioni protein na svojoj površini. U jednom primeru, DBDpp je vezan za čvrstu podlogu. U daljem primeru, čvrsta podloga je izabrana iz grupe koja se sastoji od: perlice, staklene pločice, čipa, želatina i agaroze.
[0141] U nekim otelotvorenjima, DBDpp sadrži supstituciju na odgovarajućoj poziciji u sekvenci SEQ ID NO:1 izabranu iz grupe koja se sastoji od: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp sadrži supstitucije na najmanje 1, 5, 10, 15, 20 ili 30 prethodnih pozicija u sekvenci SEQ ID NO:1. Te supstitucije mogu biti konzervativne, nekonzervativne, ili mešavina konzervativnih i nekonzervativnih supstitucija. U nekim otelotvorenjima, supstitucije ne uključuju adiciju prolina ni cisteina. U nekim otelotvorenjima, supstitucije uključuju najviše jedan cistein. U nekim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 90% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 80% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 70% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 60% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 50% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 40% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci mogu biti više od 30% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci su više od 20% identični sa SEQ ID NO:1. U drugim DBDpp, ovi ostaci su više od 10% identični sa SEQ ID NO:1.
[0142] U nekim otelotvorenjima, DBDpp sadrži supstituciju na poziciji u sekvenci SEQ ID NO:1 izabranoj iz grupe koja se sastoji od: M1, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, R71, H72 i N73.
[0143] Ovde su dodatno opisani DBDpp u kojima su aminokiselinski ostaci izbrisani na amino terminusu, karboksi terminusu, ili i na amino i na karboksi terminusu odgovarajuće sekvence SEQ ID NO:1. U nekim primerima, DBDpp sadrži sekvencu sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa amino terminusa sekvence DBDpp koja odgovara sekvenci SEQ ID NO:1. U nekim primerima, DBDpp sadrži sekvencu sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa karboksi terminusa sekvence DBDpp koja odgovara sekvenci SEQ ID NO:1. U nekim primerima, DBDpp sadrži sekvencu sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa amino terminusa odgovarajuće sekvence SEQ ID NO:1 i sekvencu sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa karboksi terminusa koji odgovara sekvenci SEQ ID NO:1. U dodatnim primerima, DBDpp sadrži sekvencu sa 1-5, 1-10 ili 1 do 15 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa karboksi terminusa sekvence koja odgovara SEQ ID NO:1. U nekim primerima, DBDpp sadrži sekvencu sa 1-5, 1-10 ili 1 do 15 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa amino terminusa sekvence koja odgovara SEQ ID NO:1 i sekvencu sa 1-5, 1-10 ili 1 do 15 aminokiselinskih ostataka izbrisanih sa karboksi terminusa sekvence koja odgovara SEQ ID NO:1.
[0144] U nekim primerima, DBDpp sadrži sekvencu koja se razlikuje od odgovarajuće sekvence u referenci SEQ ID NO:1 u 2 ili više kategorija modifikacija sekvence (tj. supstitucije, delecije, insercije i adicije). Na primer, DBDpp može da uključuje kombinacije aminokiselinskih delecija, insercija i supstitucija u poređenju sa odgovarajućom sekvencom u referentnoj sekvenci polipeptida. U nekim primerima, DBDpp sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 aminokiselinskih delecija u referentnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO:1. U nekim primerima, DBDpp sadrži 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 aminokiselinskih insercija u referentnoj sekvenci prikazanoj u SEQ ID NO:1.
DBDpp se vezuju za ciljeve od interesa
[0145] DBDpp se vezuje za cilj od interesa. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp nema uočljiv uticaj na funkciju cilja. Alternativno, u nekoliko otelotvorenja, DBDpp može da se vezuje za cilj od interesa i u potpunosti ili delimično inhibira, antagonizuje, agonizuje, blokira, povećava, stimuliše ili ometa biološku aktivnost tog cilja. Vezivanje može da se identifikuje kao agonističko ili antagonističko i da se odredi koristeći ili rutinski modifikujući testove, biotestove i/ili životinjske modele koji su poznati u struci za procenu takve aktivnosti.
[0146] DBDpp agonist se odnosi na DBDpp koji na neki način povećava ili pojačava biološku aktivnost DBDpp cilja ili ima biološku aktivnost uporedivu sa poznatim agonistom DBDpp cilja. U drugom otelotvorenju, DBDpp je antagonist cilja koji vezuje. DBDpp antagonist se odnosi na DBDpp koji u potpunosti ili delimično blokira ili na neki način ometa biološku aktivnost DBDpp ciljnog proteina ili ima biološku aktivnost uporedivu sa poznatim antagonistom ili inhibitorom DBDpp ciljnog proteina.
[0147] Termini kao što su „afinitet vezivanja za cilj“, „vezivanje za cilj“ i slično označavaju svojstvo polipeptida koje može neposredno da se izmeri utvrđivanjem konstanti afiniteta, npr. količinu DBDpp koja se vezuje i disocira pri datoj koncentraciji antigena. Za karakterizaciju molekulske interakcije mogu da se koriste različiti postupci, kao što su, bez ograničenja, kompetitivna analiza, ravnotežna analiza i mikrokalorimetrijska analiza, i analiza interakcije u realnom vremenu na osnovu interakcije površinske plazmonske rezonance (na primer, koristeći instrument Biacore®). Ovi postupci su dobro poznati stručnjaku i opisani su, na primer, u Neri D et al. (1996) Tibtech 14:465-470 i Jansson M et al. (1997) J Biol Chem 272:8189-8197.
[0148] Afinitetni zahtevi za dati događaj vezivanja DBDpp zavise od faktora koji uključuju, ali nisu ograničeni na, sastav i složenost matrice vezivanja, valencu i gustinu DBDpp i ciljnih molekula, i funkcionalne primene DBDpp. U jednom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa sa konstantom disocijacije (KD) koja je manja ili jednaka 5×10<-3>M, 10<-3>M, 5×10<-4>M, 10<-4>M, 5×10<-5>M ili 10<-5>M. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa sa KD manjom ili jednakom 5×10<-6>M, 10<-6>M, 5×10<-7>M, 10<-7>M, 5×10<-8>M ili 10<-8>M. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp vezuje cilj od interesa sa KD manjom ili jednakom 5×10<-9>M, 10<-9>M, 5×10<-10>M, 10<-10>M, 5×10<-11>M, 10<-11>M, 5×10<-12>M, 10<-12>M, 5×10<-13>M, 10<-13>M, 5×10<-14>M, 10<-14>M, 5×10<-15>M ili 10<-15>M. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp dobijen postupcima koji su ovde otkriveni ima konstantu disocijacije izabranu iz grupe koja se sastoji od između 10<-4>M i 10<-5>M, između 10<-5>M i 10<-6>M, između 10<-6>M i 10<-7>M, između 10<-7>M i 10<-8>M, između 10<-8>M i 10<-9>M, između 10<-9>M i 10<-10>M, između 10<-10>M i 10<-11>M i između 10<-11>M i 10<-12>M.
[0149] U jednom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa u aktivnom obliku. U jednom otelotvorenju, DBDpp reverzibilno vezuje cilj od interesa u aktivnom obliku, i takođe otpušta vezani cilj u aktivnom obliku. U jednom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa u nativnom obliku. U specifičnim otelotvorenjima, DBDpp vezuje ciljeve od interesa sa brzinom disocijacije ili Koffvećom ili jednakom 10<-10>s<-1>, 5×10<-9>s<-1>, 10<-9>s<-1>, 5×10<-8>s<-1>, 10<-8>s<-1>, 5×10<-7>s<-1>, 10<-7>s<-1>, 5×10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5×10<-5>s<-1>, 10<-5>s<-1>, 5×10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5×10<-3>s<-1>, 10<-3>s<-1>, 5×10<-2>s<-1>, 10<-2>s<-1>, 5×10<-1>s<-1>ili 10<-1>s<-1>.
[0150] Eksperimenti vezivanja za određivanje KD i brzine disocijacije mogu da se obave u brojnim uslovima uključujući, bez ograničenja, [pH 6,0, 0,01% Tween 20], [pH 6,0, 0,1% želatina], [pH 5,0, 0,01% Tween 20], [pH 9,0, 0,1% Tween 20], [pH 6,0, 15% etilen glikol, 0,01% Tween 20], [pH 5,0, 15% etilen glikol, 0,01% Tween 20] i [pH 9,0, 15% etilen glikol, 0,01% Tween 20]. Pufere u kojima se mogu praviti ovi rastvori stručnjak može lako da utvrdi, i zavise u velikoj meri od željenog pH finalnog rastvora. Rastvori sa niskim pH (<pH 5,5) mogu da se naprave, na primer, u citratnom puferu, glicin-HCl puferu ili sukcinatnom puferu. Rastvori sa visokim pH mogu da se naprave, na primer, u Tris-HCl, fosfatnom puferu ili natrijum bikarbonatnom puferu. Brojni uslovi mogu da se koriste za određivanja KD i brzine disocijacije u svrhu utvrđivanja, na primer, optimalnog pH i/ili koncentracije soli.
[0151] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa sa KOffu rasponu od 0,1 do 10<-7>s<-1>, 10<-2>do 10<-7>s<-1>ili 0,5 X 10<-2>do 10<-7>s<-1>. U određenom otelotvorenju, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) vezuje cilj od interesa sa brzinom disocijacije (KOff) manjom od 5 X 10<-2>s<-1>, 10<-2>s<-1>, 5 X 10<-3>s<-1>ili 10<-3>s<-1>. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa sa brzinom disocijacije (KOff) manjom od 5 X 10<-4>s<-1>, 10<-4>s<-1>, 5 X 10<-5>s<-1>ili 10<-5>s<-1>, 5 X10<-6>s<-1>, 10<-6>s<-1>, 5 X 10<-7>s<-1>ili 10<-7>s<-1>.
[0152] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa sa KOnu rasponu od 10<3>do 10<7>M<-1>s<-1>, 10<3>do 10<6>M<-1>s<-1>ili 10<3>do 10<5>M<-1>s<-1>. U drugim specifičnim otelotvorenjima, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) vezuje svoj cilj od interesa sa brzinom asocijacije (KOn) većom od 10<3>M<-1>s<-1>, 5 X 10<3>M<-1>s<-1>, 10<4>M<-1>s<-1>ili5 X 10<4>M<-1>s<-1>. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp vezuje cilj od interesa sa Kon većom od 10<5>M<-1>s<-1>, 5 X 10<5>M<-1>s<-1>, 10<6>M<-1>s<-1>ili 5 X 10<6>M<-1>s<-1>ili 10<7>M<-1>s<-1>.
DBDpp ciljevi od interesa
[0153] Cilj od interesa koji DBDpp specifično vezuje može biti bilo koji molekul za koji je poželjno da ga DBDpp veže. Na primer, ciljevi koje DBDpp specifično vezuje mogu biti bilo koji cilj koji je relevantan ili od koristi za prečišćavanje, proizvodnju, formulaciju, lečenje, dijagnostikovanje ili prognoziranje. Brojni primeri ciljeva su ovde dati, u vidu primera, i treba ih tumačiti kao ilustrativne, a ne ograničavajuće. Cilj od interesa može biti prirodni ili sintetički. Cilj od interesa može biti ekstracelularna komponenta ili intracelularna komponenta, rastvorljivi faktor (npr. enzim, hormon, citokin i faktor rasta, toksin, otrov, zagađivač, itd.) ili transmembranski protein (npr. receptor ćelijske površine). U jednom otelotvorenju, cilj od interesa koji DBDpp specifično vezuje je sam DBDpp sa različitom sekvencom.
[0154] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein specifično vezuje cilj od interesa na površini ciljne ćelije. U daljem otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein specifično vezuje receptor ćelijske površine. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein specifično vezuje cilj od interesa koji je član familije izabrane od: receptora faktora rasta, receptora tirozin kinaze, receptora familije TNF, receptora kuplovanog sa G-proteinom i receptora hemokina. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein vezuje više članova iste familije (npr. TNF receptori TRAILR1 i TRAILR2). U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein vezuje članove različitih familija. Tako se, na primer, u nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein može vezati za receptor faktora rasta i TNF receptor ili receptor kuplovan sa G-proteinom i receptor hemokina.
[0155] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje serumski protein ili terapeutski protein, kao što je antitelo ili fragment antitela. U nekim otelotvorenjima, cilj od interesa koji DBDpp vezuje (npr. DBDpp fuzioni protein) humani je protein. U jednom otelotvorenju, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) vezuje ciljni humani protein od interesa i njegov ortolog majmuna (npr. majmuna cinomolgus), miša, zeca, hrčka i/ili zeca.
[0156] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa koji je serumski protein. U jednom otelotvorenju, otelotvorenje DBDpp specifično vezuje serumski protein izabran od: serumskog albumina (npr. albumin ljudskog seruma (HSA)), tiroksin-vezujućeg proteina, transferina, fibrinogena i imunoglobulina (npr. IgG, IgE i IgM). Bez ograničavanja na teoriju, veruje se da vezivanje DBDpp za noseći protein daje DBDpp (ili njegovoj fuziji) unapređeni farmakodinamički profil što uključuje, ali nije ograničeno na, poboljšano ciljanje tumora, penetraciju tumora, difuziju u tumoru i pojačanu terapeutsku aktivnost u poređenju sa
1
DBDpp fuzionim proteinom u kome nedostaje vezujuća sekvenca nosećeg proteina (vidite, npr. WO 01/45746, čiji je sadržaj ovde u celini obuhvaćen referencom).
[0157] U jednom otelotvorenju, cilj od interesa koji DBDpp specifično vezuje je antigen povezan sa bolešću. Antigen može biti antigen karakterističan za kancer i/ili određenu vrstu ćelija (npr. hiperproliferativne ćelije) i/ili za patogen (npr. bakterijska ćelija (npr. tuberkuloza, boginje i antraks), virus (npr. HIV), parazit (npr. malarija i lišmanijaza), gljivičnu infekciju, plesan, mikoplazmu, prionski antigen, ili antigen povezan sa poremećajem imunskog sistema.
[0158] U dodatnom otelotvorenju, cilj od interesa koji DBDpp vezuje (npr. DBDpp fuzioni protein) je bakterijski antigen, virusni antigen, gljivični antigen, mikoplazmatski antigen, prionski antigen ili parazitski antigen (npr. koji inficira sisara). U jednom otelotvorenju, cilj DBDpp je antraks, hepatitis b, besnilo, virus Nipah, virus Zapadnog Nila, virus meningitisa ili CMV. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje patogen.
[0159] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje kancerski cilj. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje TSA ili TAA. U nekim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje cilj izabran iz grupe koja se sastoji od PTGER4, ITGA4, CD37, CD52, CD62L (L-selektin), CXCR4, CD69, EVI2B (CD361), SLC39A8, MICB, LRRC70, CLELC2B, HMHA1, LST1 i CMTM6 (CKLFSF6).
[0160] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CD19 (B-CLL, B-ALL, leukemija, limfom, NNHL/CLL, ALL post-HCST, B limfoidni maligniteti, maligniteti B linije), CD20 (limfom ćelija plašta/indolentni B-NHL), PMSA (kancer prostate), CEA (kancer dojke, kolorektalni kancer), Her2/neu (kancer pluća, osteosarkom, glioblastom), kapa laki lanac (B-NHL i B-CLL).
[0161] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj izabran iz grupe koja se sastoji od CD47, CTLA4, DR5, KIR, LAG3, OX40, PD-L1 i TIM3.
[0162] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: PDGFRA, PDGFRB, PDGFA, PDGFB, PDGFCC, PDGFC, PDGFD, VEGFR1, VEGFR2, VEGFR3, VEGFC, VEGFD, neuropilina 2 (NRP2), betacelulina, PLGF, RET (preuređen tokom transfekcije), TIE1, TIE2 (TEK), CA125, CD3, CD4, CD7, CD10, CD13,
2
CD19, CD22, CD25, CD30, CD32, CD32b, CD33, CD38, FRSF5 (CD40), CD44 (npr. CD44v6), CD47, CD49e (integrin alfa 5), CD52, CD54 (ICAM), CD55, CD64, CD74, CD80, CD90, CD117 (cKit), CD133, CD200, (prominin 1), CD147, CD166, CD200, ESA, SHH, DHH, IHH, PTCH1 (patched 1), SMO (smoothened), WNT1, WNT2B, WNT3A, WNT4. WNT4A, WNT5A, WNT5B, WNT7B, WNT8A, WNT10A, WNT10B, WNT16B, LKP5, LRP5, LRP6, FZD1, FZD2, FZD4, FZD5, FZD6, FZD7, FZD8, Notch, Notch1, Notch3, Notch4, DLL4, Jagged, Jagged1, Jagged2, Jagged3, TNFSF1 (TNFb, LTa), TNFRSF1A (TNFR1, p55, p60), TNFRSF1B (TNFR2), TNFSF6 (Fas ligand), TNFRSF6 (Fas, CD95), TNFRSF6B (DcR3), TNFSF4 (OX40 ligand), TNFSF5 (CD40 ligand), TNFSF7 (CD27 ligand, CD70), TNFRSF7 (CD27), TNFSF8 (CD30 ligand), TNFSF9 (41BB ligand), TNFRSF8 (CD30), TNFSF11 (RANKL), TNFRSF10A (TRAILR1, DR4), TNFRSF10B (TRAILR2, DR5), TNFRSF4 (OX40), TNFRSF11A (RANK), TNFSF12 (TWEAK), TNFRSF12 (TWEAKR), TNFSF13 (APRIL), TNFSF13B (BLYS), TNFRSF 13B (TACI), TNFRSF13C (BAFFR), TNFSF15 (TL1A), TNFRSF17 (BCMA), TNFRSF19L (KELT), TNFRSF19 (TROY), TNFRSF21 (DR6), TNFRSF25 (DR3), ANG1 (ANGPT1), ANG2 (ANGPT2), ANG3 (ANGPTL1), ANG4 (ANGPT4), TIE2, IL1 alfa, IL1 beta, ILIRI, 1L1R2, IL2 IL2R, IL5, IL5R, IL6, IL6R, 1L8, 1L8R, IL10, IL10R, IL12, IL12R, IL13, IL13R, IL15, IL15R, IL18, IL18R, IL19, IL19R, IL21, IL21R, IL23, IL23R, mif, XAG1, XAG3, REGIV, FGF1, FGF2, FGF3, FGF4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, ALK, ALK1, ALK7, ALCAM, Artemina, Axl, TGFb, TGFb2, TGFb3, TGFBR1, IGFIIR, BMP2, BMP5, BMP6, BMPRI, GDF3, GDF8, GDF9, N-kadherina, E-kadherina, VE-kadherina, EPCAM (EGP2), NCAM, LI CAM (GDI 71), gangliozida GM2, gangliozida GD2, kalcitonina, PSGR, DCC, CDCP1, CXCR2, CXCR7, CCR3, CCR4, CCR5, CCR7, CCR10, CXCR4, CXCL1, CXCL5, CXCL6, CXCL8, CXCL12, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL11, Claudin1, Claudin2, Claudin3, Claudin4, TMEFF2, neuregulina, MCSF, CSF, CSFR (fms), GCSF, GCSFR, BCAM, HPV, hCG, SR1F, PSA, FOLR2 (folatni receptor beta), BRCA1, BRCA2, HLA-DR, ABCC3, ABCB5, HM 1.24, LFA1, LYNX, S100A8, S100A9, SCF, fon Vilebrandovog faktora, Luisovog Y6 receptora, Luisovog Y, CA G250 (CA9), CRYPTO, VLA5, CTLA4, HLA-DR, MUCl, MUCl 8, mucin CanAg, gangliozida GD3, EGFL7, PDGFRa, IL21, IGF1, IGF2, HGF, PSMA, SLAMF7, karcinoembrionskog antigena (CEA), FAP, integrina avb3, integrina α5β aktivina B1 alfa, leukotrienskog B4 receptora (LTB4R), neurotenzinskog NT receptora (NTR), 5T4 onkofetalnog antigena, tenascina C, MMP, MMP2, MMP7, MMP9, MMP12, MMP14, MMP26, katepsina G, katepsina H, katepsina L, SULF1, SULF2, MET, UP A, MHCL MN (CA9), TAG-72, TM4SF1, heparanaze (HPSE), sindekana (SDCl), efrina B2, efrina B4, T neuropilina 1 (NRP1), TEM1, mezotelina, TGFbeta 1, TGFBRII, FcRn , fosfatidil serina, folatnog receptora alfa (FOLR1) i relaksina2. Prethodno navedeni ciljevi, i oni koji su inače ovde opisani, služe u svrhu ilustracije, a ne kao ograničenje.
[0163] U jednom otelotvorenju, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) specifično vezuje cilj od interesa izabran od: VEGF, VEGFA, VEGFR1, VEGFR2, IGF1R, integrina, cMet, EGFR, ErbB2 (Her2), CD20, faktora rasta nerava (NGR), receptora faktora rasta hepatocita, ErbB3 (Her3), ErbB4, antigena membrane specifične za prostatu.
[0164] U jednom otelotvorenju, cilj od interesa specifično vezan sa DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) je antigen povezan sa autoimunskim poremećajem, inflamatornim ili drugim poremećajem imunskog sistema, ili povezan sa regulacijom imunskog odgovora.
[0165] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa koji je imunoinhibitorski cilj. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje imunoinhibitorski cilj, izabran od: IL1, IL1b, IL1Ra, IL5, IL6, IL6R, CD26L, CD28, CD80, FcRn ili FcGama RIIB. U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje imunostimulatorni cilj izabran od: CD25, CD28, CTLA4, PD1, B7-H1 (PD-L1), B7-H4, IL10, TGFbeta, TNFSF4 (OX40 ligand), TNFRSF4 (OX40), TNFSF5 (CD40 ligand), TNFRSF5 (CD40), TNFSF9 (41BB ligand), TNFRSF9 (41BB, CD137), TNFSF14 (LIGHT, HVEM ligand), TNFRSF14 (HVEM), TNFSF15 (TL1A), TNFRSF25 (DR3), TNFSF18 (GITR ligand) i TNFRSF18 (GITR).
[0166] U dodatnom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran od: IL1Rb, IL2, IL3, IL4, IL7, IL11, IL15, IL16, IL17, IL17A, IL17F, IL18, IL19, IL25, IL32, IL33, interferona beta, SCF, BCA1/CXCL13, CXCL1, CXCL2, CXCL6, CXCL13, CXCL16, C3AR, C5AR, CXCR1, CXCR2, CCR1, CCR3, CCR7, CCR8, CCR9, CCR10, ChemR23, CCL3, CCL5, CCL11, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL21, CCL22, CCL24, CCL25, CCL26, CCL27, MPL, GP130, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR7, TLR8, TLR9, TREM1, TREM2, onkostatina M, limfotoksina alfa (LTa), podjedinice integrina beta 7, CD49a (integrin alfa 1), integrina a5b3, MIF, ESM1, WIF1, katepsina B, katepsina D, katepsina K, katepsina S, TNFSF2 (TNFa), TNFSF3 (LTb), TNFRSF3 (LTBR), TNFSF6 (Fas ligand), TNFRSF6 (Fas, CD95), TNFRSF6B (DcR3), TNFSF8 (CD30 ligand), TNFRSF8 (CD30), TNFSF11 (RANKL), TNFRSF11A (RANK), TNFRSF16 (NGFR), TNFRSF19L (RELT), TNFRSF19 (TROY), TNFRSF21 (DR6), CD14, CD23 CD36, CD36L, CD39, CD52, CD91, CD137,
4
CD153, CD164, CD200, CD200R, BTLA, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7h, B7-DC (PDL2), ICOS, ICOSL, MHC, CD, B7-H2, B7-H3, B7x, SLAM, KIM-1, SLAMF2, SLAMF3, SLAMF4, SLAMF5, SLAMF6, i SLAMF7, TNFSF1A (TNF-alfa), TNFRSF1A (TNFR1, p55, p60), TNFRSF1B (TNFR2), TNFSF7 (CD27 ligand, CD70), TNFRSF7 (CD27), TNFSF13B (BLYS), TNFSF13 (APRIL), TNFRSF13B (TACI), TNFRSF13C (BAFFR), TNFRSF17 (BCMA), TNFSF12 (TWEAK), TNFRSF12 (TWEAKR), TNFRSF5 (CD40), IL1, IL1b, IL1R, IL2R, IL4-Ra, IL5, IL5R, IL6, IL6R, IL9, IL12, IL13, IL14, IL15, IL15R, IL17f, IL17R, IL17Rb, IL17RC, IL20, IL21, IL22RA, IL23, IL23R, IL31, TSLP, TSLPR, interferona alfa, interferona gama, B7RP1, cKit, GMCSF, GMCSFR, CTLA4, CD2, CD3, CD4, CD11a, CD18, CD20, CD22, CD30, CD40, CD86, CXCR3, CXCR4, CCR2, CCR4, CCR5, CCR8, CCL2, CXCL10, PlGF, podjedinice alfa4 integrina, A4B7 integrina, C5, RhD, IgE i Rh.
[0167] U drugom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran od: amiloida beta (Abeta), beta amiloida, faktora komplementa D, PLP, ROBO4, ROBO, GDNF, NGF, LINGO, miostatina, oksidovanog LDL, gpIIB, gpIIIa, PCSK9, faktora VIII, integrina a2bB3, AOC3, mezotelina, DKK1, osteopontina, katepsina K, TNFRSF19L (RELT), TNFRSF19 (TROY) i sklerostina.
[0168] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: CD137, CD47, CTLA4, DR5, KIR, PD-L1, PD1 i TIM3.
[0169] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CD137. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CD137 i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od: (a) MGSWVEFGHRLWAIDQRLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEK LRQRAAFIRFRLQAYRHN (SEQ ID NO:12), (b) MGSWVEFANRLWAIDQRLFALGGS EAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEHLRDQAAFIRHKLQAYRHN (SEQ ID NO:13), (c) MGSWYEFRHRLWAIDQRLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGK GNPEVEGLREAAAFIRAKLQAYRHN (SEQ ID NO:14), (d) MGSWYEFSMRLWAIDQ RLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALRAKAAYIRWKLQAYRH
N (SEQ ID NO:15), (e) MGSWFEFNHRLWAINERLYALGGSEAELAAFEKEIAA FESELQAYKGKGNPEVERLRSMAAFIRYKLQAYRHN (SEQ ID NO:16), (f) MGSWY EFGHRLWAIDQRLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEYLRETAA HIRTRLQAYRHN (SEQ ID NO:17), (g) MGSWYEFHYRLHAIDQRLYALGGSEAELAA FEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEELRIKAAFIRDRLQAYRHN (SEQ ID NO:18) i (h) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFLGEIWAFEMELAAYKGKGNPEV
[0170] EALGREAAAIRMELQAYRHN (SEQ ID NO:19). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično (npr. preklapanje sa epitopom) vezuju za isti epitop CD137 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su i DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za CD137. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0171] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CD47. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CD47 i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od (a) MGSWYEFDLRLHAIYDRLVALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEIL RDNAAYIRQMLQAYRHN (SEQ ID NO:20), (b) MGSWVEFANRLWAIDQRLFALGGS EAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEHLRDQAAFIRHKLQAYRHN (SEQ ID NO:21), (c) MGSWTEFTYRLSAIEWRLWALGGSEAELAWFEQKIAFFEDFLQYYKGK GNPEVEALKHEAGAILNELMAYRHN (SEQ ID NO:22), (d) MGSWAEFDHRLHAIRE RLHALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEILRGNAAYIRALLQAYRHN
(SEQ ID NO:23) i (e) MGSWTEFVGRLAAIEFRLWALGGSEAELAWFEAHIAFFE DYLQWYKGKGNPEVEALREEAGAIMEELKAYRHN (SEQ ID NO:24). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop CD47 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su i DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za CD47. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0172] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CTLA4. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje CTLA4 i sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWH EFHDRLQAIHERLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVESLRIAAAHI RQVLQAYRHN (SEQ ID NO:25). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop CTLA4 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za CTLA4. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0173] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje DR5. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje DR5 i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od (a) MG SWNYFKDHLAWIKNSLEALGGSEAELAHFETAIASFERQLQEYKGKGNPEVEALRK EAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:26), (b) MGSWLYFKEHLAHIKAWLEALGGS EAELAHFELAIADFEYHLQEYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:27), (c) MGSWTEFTYRLSAIEWRLWALGGSEAELAWFEQKIAFFEDFLQYYKGK GNPEVEALKHEAGAILNELMAYRHN (SEQ ID NO:28), (d) MGSWFYFKQHLAWIKS YLEALGGSEAELAHFERAIAAFEQHLQMYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYR HN (SEQ ID NO:29), (e) MGSWHYFKDHLAEIKGLLEALGGSEAELAHFEMAIAD FEHNLQYYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:30), (f) MGSWH YFKGHLAEIKNHLEALGGSEAELAHFERAIAAFERSLQWYKGKGNPEVEALRKEAA AIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:31), (g) MGSWIYFKEHLAYIKKELEALGGSEAE LAHFESAIAVFESTLQYYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:32), (h) MGSWTYFKEHLAEIKYMLEALGGSEAELAHFEVAIADFEKMLQYYK GKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:33) i (i) MGSWWLFKDHL AEIKTALEALGGSEAELAHFEMAIAAFEKQLQYYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDEL QAYRHN (SEQ ID NO:34). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop DR5 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za DR5. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0174] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje KIR. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje KIR i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od (a) MG SWSEFYNRLDAIESRLLALGGSEAELALFEIQIARFEKVLQAYKGKGNPEVEALR GEARAIFAELYAYRHN (SEQ ID NO:35), (b) MGSWYEFYNRLYAIEIRLYALGGSEA ELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVERLRVRAAKIRVILQAYRHN (SEQ ID NO:36) i (c) MGSWLWFKIFLAEIKYFLEALGGSEAELAAFDFEIHAFHVELFAYKG KGNPEVEVLREVAAEIRWDLQAYRHN (SEQ ID NO:37). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop KIR kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za KIR. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0175] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje PD-L1. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje PD-L1 i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od (a) MGSWTEFQSRLDAIHSRLRALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVELLR DDAAFIRHFLQAYRHN (SEQ ID NO:38), (b) MGSWQEFDDRLNAIKARLQALGGSEA ELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEDLRDDAAFIRRFLQAYRHN (SEQ ID NO:39), (c) MGSWYEFQNRLHAIHERLNALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGK GNPEVELLRDDAAFIRHFLQAYRHN (SEQ ID NO:40), (d) MGSWFEFQDRLTAINER LSALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVETLRSDAAFIRRFLQAYRHN
(SEQ ID NO:41), (e) MGSWYEFESRLDAIHERLHALGGSEAELAAFEKEIAAFESE LQAYKGKGNPEVENLRGDAAFIRHFLQAYRHN (SEQ ID NO:42), (f) MGSWYEFNHR LDAISKRLNALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEELRGDAAFIRHFL QAYRHN (SEQ ID NO:43) i (g) MGSWFEFENRLHAIVHRLGALGGSEAELAAFE KEIAAFESELQAYKGKGNPEVETLRADAAFIRHYLQAYRHN (SEQ ID NO:44). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop PD-L1 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa DBDpp u vezivanju za PD-L1. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0176] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje PD1. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje PD1 i sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od (a) MGSWTIFKEWLAFIKTDLEALGGSEAELAFFEGWIASFEMELQKYKGKGNPEVEAL RKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:46), (b) MGSWVMFKWLLADIKSHLEALGG SEAELAFFEGFIAAFETHLQVYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:47) i (c) MGSWYAFKDYLADIKGWLEALGGSEAELAFFEIFIARFELELQAY KGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRHN (SEQ ID NO:48). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop PD1 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su i DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa gornjim DBDpp u vezivanju za PD1. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0177] U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje TIM3. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje TIM3 i sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWHEFHD RLQAIHERLYALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVESLRIAAAHIRQV LQAYRHN (SEQ ID NO:45). Obezbeđeni su drugi DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično vezuju za isti epitop TIM3 kao gornji DBDpp. Pored toga, obezbeđeni su DBDpp i polipeptidi koji se u potpunosti ili delimično takmiče sa DBDpp u vezivanju za TIM3. Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, kao i vektori koji sadrže nukleinske kiseline i ćelije domaćini koje sadrže nukleinske kiseline i vektore.
[0178] U drugom otelotvorenju, DBDpp vezuje peptidnu oznaku prisutnu na cilju od interesa. Takve peptidne oznake pružaju korisno sredstvo za prečišćavanje, detekciju i/ili vezivanje ciljeva od interesa koji sadrže peptidne oznake. U jednom otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje peptidnu oznaku izabranu iz grupe: heksahistidil (His6) oznake, myc oznake ili FLAG oznake. Ostale peptidne oznake su opisane ovde ili su inače poznate u struci.
[0179] U drugom otelotvorenju, cilj za koji se DBDpp vezuje je predmet prečišćavanja iz smeše kontaminanata. U jednom otelotvorenju, cilj može biti prirodno ili rekombinantno eksprimirani protein koji zahteva selektivnu izolaciju iz ćelijskog lizata ili supernatanta ćelijske kulture.
DBDpp fuzioni proteini
[0180] „Fuzioni polipeptid“, „fuzioni protein“, „himerni polipeptid“, „himerni protein“, „himerni antigen“ je polipeptid koji se sastoji od najmanje dva polipeptida i opciono linkera za operativno povezivanje dva polipeptida u jedan kontinualni polipeptid proizveden, npr. rekombinantnim procesima. Dva polipeptida mogu da budu operativno povezana direktno ili indirektno.
[0181] „DBDpp fuzioni protein“ sadrži najmanje jedan DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni proteini sadrže više od jednog DBDpp, pri čemu dva ili više DBDpp imaju iste ili različite specifičnosti. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein se sastoji od tandemskog ponavljanja istog ili različitog DBDpp koje omogućava DBDpp fuzionom proteinu da vezuje više ciljeva i/ili ponavljajućih epitopa na istom cilju. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži DBDpp i polipeptidnu sekvencu koja sadrži dodatni domen. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži DBDpp i član izabran od: antitela, fragmenta antitela (npr. antigen vezujući domen ili njegov deo (npr. ScFv), efektorski domen ili njegov deo, FcRn vezujući domen ili njegov deo, i Fc ili njegov deo), serumskog proteina (npr. albumin ili njegov deo), citokina, faktora rasta, hormona, agensa za snimanje, agensa za obeležavanje i peptidne oznake. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži Fc domen imunoglobulina (npr. humani Fc domen) ili njegov deo. U daljim otelotvorenjima, Fc domen je varijanta humanog Fc domena.
[0182] Ovde obezbeđeni DBDpp uključuje DBDpp fuzione proteine. DBDpp i bilo koji polipeptid od interesa mogu operativno da se vežu kako bi formirali DBDpp fuzioni protein. Dakle, u nekim otelotvorenjima, DBDpp je uključen u veći, multidomenski molekulski kompleks (npr. monomerni ili multimerni DBDpp fuzioni protein) čime daje funkcionalna svojstva uključenog DBDpp nastalom fuzionom proteinu. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni proteini sadrže DBDpp i polipeptidnu sekvencu antitela, fragmenta antitela, serumskog proteina (npr. albumin humanog seruma) ili fragmenta serumskog proteina, ili receptor ćelijske površine, alfa lanac T ćelijskog receptora (TCR), beta lanac T ćelijskog receptora, citokin, faktor rasta, hormon, ili enzim, ili njegov fragment. Inkorporacija DBD u multidomenske i/ili multifunkcionalne komplekse može rutinski da se ostvari pomoću rekombinantne fuzije sa drugim polipeptidom, vezivanjem za drugi hemijski ostatak i kovalentnom hemijskom vezom sa drugim polipeptidom (ili drugim željenim hemijskim jedinjenjem) koristeći tehnike koje su poznate u struci. DBDpp fuzioni proteini mogu dodatno da sadrže druge opciono komponente kao što su linkeri i druge ovde opisane komponente.
DBDpp multimeri
[0183] U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži jedan DBDpp. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje 2, 3, 4 ili 5, ili više od 5 DBDpp. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži 1-3, 1-4, 1-5, ili više od 5 različitih DBDpp. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje 2, 3, 4 ili 5, ili više od 5 različitih DBDpp. Dakle, DBDpp fuzioni protein može biti monomerni DBDpp (tj. sadrži jedan DBDpp) ili multimerni DBDpp (tj. sadrži više od jednog DBDpp u tandemu opciono operativno povezanom linkerom). Neograničavajuća otelotvorenja takvih multimernih DBDpp su prikazana na SL.5A. U nekoliko otelotvorenja, upotreba multimernih DBDpp obezbeđuje pojačano (npr. sinergijsko) vezivanje cilja. U dodatnim otelotvorenjima, multimerni DBDpp omogućava ciljanje više od jednog cilja koristeći jedan konstrukt DBDpp (npr. bi-, trispecifičan, itd.).
[0184] Multimerni DBDpp fuzioni protein može biti homomultimerni DBDpp (tj. sadrži više od jednog istog DBDpp u tandemu opciono povezanom linkerom (npr. homodimeri, homotrimeri, homotetrameri, itd.) ili heteromultimerni DBDpp (tj. sadrži dva ili više DBDpp u kojima ima najmanje dva različita DBDpp proteina. Broj monomernih DBDpp uključenih u multimernu kompoziciju može da varira, u zavisnosti od otelotvorenja, i može biti definisan, barem delimično, ekspresionim sistemom u kome se DBDpp proizvodi. Međutim, u nekoliko otelotvorenja, fuzioni proteini mogu da sadrže multimere od oko 5 do oko 10 DBDpp podjedinica, oko 10 do oko 15 podjedinica, oko 15 do oko 20 podjedinica, oko 20 do oko 25 podjedinica ili oko 25 do oko 30 podjedinica (uključujući brojeve između navedenih, kao i krajnje tačke). Štaviše, više tandemskih komponenata DBDpp fuzionog proteina može da sadrži isti ili različiti DBDpp. U nekim DBDpp fuzijama, DBDpp je prisutan kao monomer, ili u homomultimerima ili heteromerima, kao što su homodimeri ili heterodimeri, homotrimeri ili heterotrimeri, homotetrameri ili heterotetrameri.
[0185] U jednom otelotvorenju, dva ili više DBDpp je operativno fuzionisano tako da grade DBDpp fuzioni protein. U jednom otelotvorenju, fuzioni partner DBDpp je identični DBDpp. Vezivanje dva ili više identičnih DBDpp dovodi do multivalentnog molekula koji daje uočljive prednosti (npr. povećana avidnost vezivanja, grupisanje cilja i aktivacija receptora) u odnosu na monomernu kompoziciju. U drugom otelotvorenju, fuzioni partner DBDpp je neidentični DBDpp. Povezivanje dva ili više neidentičnih DBDpp dovodi do multivalentnog i multispecifičnog molekula koji ima potencijal da vezuje više od jednog ciljnog antigena, bilo nezavisno ili istovremeno.
[0186] DBDpp fuzioni protein može biti „monospecifičan“ ili „multispecifičan“. DBDpp fuzioni protein koji je „multispecifičan“ (npr. bispecifičan, trispecifičan ili veće multispecifičnosti) prepoznaje i vezuje se za dva ili više različitih epitopa prisutnih na jednom ili više različitih molekula (npr. proteini, strukture čvrste podloge, itd.).
1
[0187] U jednom otelotvorenju, multispecifični DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje dva DBDpp koji se vezuju za najmanje dva različita epitopa na jednom cilju od interesa. U dodatnim otelotvorenjima, multispecifični DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje jedan DBDpp koji specifično vezuje jedan epitop na cilju od interesa i najmanje jedan drugi domen ili sekvencu koji daje funkciju (npr. fragment antitela ili domen kao što je scFv) koji se specifično vezuje za različiti epitop na istom cilju od interesa. U jednom otelotvorenju, multispecifični DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje jedan DBDpp koji se specifično vezuje za epitop na cilju od interesa i najmanje jedan domen ili sekvencu koja daje funkciju, npr. fragment antitela ili domen (npr. scFv), koji se specifično vezuje za epitop na različitom cilju od interesa. U drugim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje jedan DBDpp i najmanje jedan drugi DBDpp ili sekvencu domena koja daje funkciju, npr. fragment antitela ili domen, koji se specifično vezuje za čvrstu podlogu.
[0188] U daljem otelotvorenju, multimerne DBDpp fuzije sa 2 ili više DBDpp su zauzvrat fuzionisane sa drugim heterologim proteinima (ili njihovim poddomenima), čime se multivalentna i multispecifična svojstva prenose na fuzionog partnera. Primeri fuzionih partnera DBDpp uključuju, ali nisu ograničeni na, antitela, poddomene antitela (npr. scFv ili Fc domeni), serumski albumin, poddomene serumskog albumina, receptore ćelijske površine, alfa lanac T ćelijskog receptora (TCR), beta lanac T ćelijskog receptora, poddomene receptora ćelijske površine, peptide, peptidne oznake (npr. FLAG ili myc), ponavljanja fibronektina tipa III, z-domene, polipeptide slične elastinu. Broj i lokacija DBDpp i njihove pozicije u fuzionom proteinu mogu da variraju. Na primer, DBDpp može biti lociran na jednom ili svim terminusima fuzionog partnera i/ili raštrkan u heterologim podjedinicama u fuzionom partneru DBDpp.
[0189] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija je bispecifična i specifično se vezuje za dva različita cilja eksprimirana na površini dve različite vrste ćelija. U jednom otelotvorenju, bispecifični DBDpp fuzioni protein se specifično vezuje za ciljnu ćeliju kancera i ciljnu imunsku efektorsku ćeliju. U jednom otelotvorenju, bispecifični DBDpp fuzioni protein specifično vezuje cilj eksprimiran na ćeliji kancera (npr. CD19) i cilj eksprimiran na površini T limfocita (npr. CD3).
DBDpp kao fuzije sa antitelima i fragmentima antitela
2
[0190] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži celo antitelo ili fragment ili domen antitela (npr. IgG1 antitelo, IgG3 antitelo, varijabilni region antitela, CDR3, ScFv, Fc, FcRn vezujući domen, i drugi domeni antitela). DBDpp i DBDpp fuzioni proteini mogu biti operativno vezani međusobno i/ili sa jednim ili više terminusa antitela, lancem antitela, fragmentom antitela ili domenom antitela.
[0191] Komponenta antitela DBDpp fuzionog proteina može biti bilo koji odgovarajući celi imunoglobulin ili fragment antitela (npr. antigen vezujući domen i/ili efektorski domen) ili njegov fragment. U jednom otelotvorenju, fuzioni protein DBDpp-antitelo zadržava strukturna i funkcionalna svojstva tradicionalnog monoklonskog antitela. Dakle, u nekim otelotvorenjima, fuzioni protein DBDpp-antitelo zadržava svojstva vezivanja epitopa, ali pogodno takođe uključuje, putem fuzije DBDpp, jednu ili više dodatnih specifičnosti za vezivanje cilja. Antitela koja mogu da se koriste u fuzijama DBDpp uključuju, ali nisu ograničena na, monoklonska, multispecifična, humana, humanizovana, primatizovana i himerna antitela. Ovde obezbeđeni molekuli imunoglobulina ili antitela mogu biti bilo koje vrste (npr. IgG, IgE, IgM, IgD, IgA i IgY), klase (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2) ili potklase molekula imunoglobulina. U specifičnim otelotvorenjima, antitela su Fc optimizovana antitela. Antitela mogu biti poreklom ili dobijena od bilo koje životinje, uključujući ptice i sisare, ili generisana sintetički. Komponenta antitela fuzionog proteina DBDpp-antitelo može biti prirodno dobijena, ili rezultat rekombinantnog konstruisanja (npr. displej faga, xenomouse i sintetički). U određenim otelotvorenjima, komponenta antitela fuzija DBDpp-antitelo poboljšava poluživot i povećava ili smanjuje aktivnost ćelijske citotoksičnosti zavisne od antitela (ADCC) i/ili citotoksičnosti zavisne od komplementa (CDC). U nekim otelotvorenjima, antitela su antitela čoveka, miša, magarca, zeca, koze, zamorca, kamile, lame, konja ili kokoške. U specifičnim otelotvorenjima, antitela su humana.
[0192] U jednom otelotvorenju, DBDpp je operativno vezan za fragment ili poddomen antitela (npr. scFv, dijatelo, EP 404,097; WO 93/111161; WO 2014/028776; i Holliger et al. PNAS 90:6444-6448 (1993), koji su svi ovde u celini obuhvaćeni referencom). Fragment ili poddomen antitela može biti bilo koji fragment ili domen antitela. Vidite, na primer, WO 04/058820, WO 99/42077 i WO 05/017148, koji su svi ovde u celini obuhvaćeni referencom. Na primer, DBDpp fuzioni protein može da sadrži efektorski domen antitela ili derivat efektorskog domena antitela koji daje jednu ili više efektorskih funkcija DBDpp i/ili daje DBDpp fuzionom proteinu sposobnost da se vezuje za jedan ili više Fc receptora. U nekim otelotvorenjima, fuzioni protein DBDpp-antitelo sadrži antigen-vezujući fragment antitela ili njegov fragment. U dodatnim otelotvorenjima, fuzioni protein DBDpp-antitelo sadrži efektorski domen imunoglobulina koji sadrži jedan ili više CH2 i ili CH3 domena antitela kome efektorsku funkciju obezbeđuju CH2 i CH3 domeni. Ostale sekvence u DBDpp fuziji koje obezbeđuju efektorsku funkciju i koje su obuhvaćene pronalaskom biće jasne stručnjacima, i rutinski mogu da se izaberu i konstruišu u ovde obuhvaćeni DBDpp fuzioni protein na osnovu željenih efektorskih funkcija.
[0193] U jednom otelotvorenju, komponenta antitela ovde obezbeđene fuzije antitelo-DBDpp je modifikovana da poveća ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC) (vidite, npr. Bruhns et al. Blood 113:3716-3725 (2009); Shields et al. J. Biol. Chem.276:6591-6604 (2001); Lazar et al. PNAS 103:4005-4010 (2006); Stavenhagen et al. Cancer Res., 67:8882-8890 (2007); Horton et al. Cancer Res. 68:8049-8057 (2008); Zalevsky et al. Blood 113:3735-3743 (2009); Bruckheimer, Neoplasia 11:509-517 (2009); WO2006/0201 14; Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i WO2004/074455, koji su svi ovde u celini obuhvaćeni referencom). Primeri modifikacija za konstruisanje Fc sekvence koje su obuhvaćene u komponenti antitela fuzionih proteina DBDpp-antitelo koje povećavaju ADCC uključuju jednu ili više modifikacija koje odgovaraju: IgGl- S298A, E333A, K334A; IgGl-S239D, I332E; IgGl-S239D, A330L, I332E; IgGl-P247I, A339D ili Q; IgGl-D280H, K290S sa ili bez S298D ili V; IgGl-F243L, R292P, Y300L; IgGl-F243L, R292P, Y300L, P396L; i IgGl-F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L; pri čemu je numeracija ostataka u Fc regionu prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991, peto izdanje).
[0194] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži celo antitelo ili fragment antitela koji je antigen-vezujući fragment. U daljem otelotvorenju, antitelo ili fragment antitela vezuje antigen povezan sa bolešću. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži antitelo ili fragment antitela koji specifično vezuje antigen kancera. U drugom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži antitelo ili fragment antitela koji specifično vezuje određeni patogen (npr. bakterijska ćelija (npr. tuberkuloza, boginje, antraks)), virus (npr. HIV), parazita (npr. malarija, lišmanijaza), gljivičnu infekciju, plesan, mikoplazmu, prionski antigen. U drugom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži antitelo ili fragment antitela koji specifično vezuje određeni patogen (npr. bakterijska ćelija (npr. tuberkuloza, boginje, antraks)), virus (npr. HIV), parazita (npr. malarija, lišmanijaza), gljivičnu infekciju, plesan, mikoplazmu, ili prionski
4
antigen. U drugom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži antitelo ili fragment antitela koji specifično vezuje antigen povezan sa bolešću ili poremećajem imunskog sistema.
[0195] U poželjnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein koji sadrži fragment ili domen antitela zadržava aktivnosti matičnog antitela. Dakle, u određenim otelotvorenjima, DBDpp protein koji sadrži domen ili fragment antitela je sposoban da indukuje citotoksičnost zavisnu od komplementa. U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein koji sadrži fragment ili domen antitela je sposoban da indukuje ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC).
[0196] Shodno tome, u nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži fragment antitela koji DBDpp fuzionom proteinu daje biološku ili biohemijsku karakteristiku imunoglobulina. U nekim otelotvorenjima, fragment antitela daje karakteristiku izabranu od: sposobnosti nekovalentne dimerizacije, sposobnosti lokalizacije na mestu tumora i produženog poluživota u serumu u poređenju sa DBDpp fuzionim proteinom iz koga je izbačen jedan ili više od pomenutih DBDpp. U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein je stabilan barem kao odgovarajuće antitelo bez vezanog DBDpp. U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein je stabilniji nego odgovarajuće antitelo bez vezanog DBDpp. Stabilnost DBDpp fuzionog proteina može da se izmeri koristeći utvrđene postupke, uključujući, na primer, ELISA tehnike. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein je stabilan u punoj krvi (in vivo ili ex vivo) na 37°C tokom najmanje oko 10 sati, najmanje oko 15 sati, najmanje oko 20 sati, najmanje oko 24 sata, najmanje oko 25 sati, najmanje oko 30 sati, najmanje oko 35 sati, najmanje oko 40 sati, najmanje oko 45 sati, najmanje oko 48 sati, najmanje oko 50 sati, najmanje oko 55 sati, najmanje oko 60 sati, najmanje oko 65 sati, najmanje oko 70 sati, najmanje oko 72 sata, najmanje oko 75 sati, najmanje oko 80 sati, najmanje oko 85 sati, najmanje oko 90 sati, najmanje oko 95 sati, ili najmanje oko 100 sati (uključujući bilo koje vreme između navedenih). U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži efektorski domen imunoglobulina ili domen koji utiče na poluživot koji odgovara domenu ili fragmentu imunoglobulina u kome je najmanje deo jednog ili više domena konstantnih regiona izmenjen tako da obezbeđuje željene biohemijske karakteristike kao što su smanjene ili povećane efektorske funkcije, sposobnost nekovalentne dimerizacije, povećana sposobnost lokalizacije na mestu tumora, redukovan poluživot u serumu, ili produženi poluživot u serumu, u poređenju sa fragmentom imunoglobulina koji ima odgovarajuću neizmenjenu sekvencu imunoglobulina. Te izmene domena konstantnog regiona mogu biti aminokiselinske supstitucije, insercije ili delecije.
[0197] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu efektorskog domena imunoglobulina ili derivat efektorskog domena imunoglobulina koji DBDpp fuzionom proteinu daju ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela (ADCC). U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da povećava ADCC (vidite, npr. Bruhns, Blood 113:3716-3725 (2009); Shields, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001); Lazar, PNAS 103:4005-4010 (2006); Stavenhagen, Cancer Res.67:8882-8890 (2007); Horton, Cancer Res.
68:8049-8057 (2008); Zalevsky, Blood 113:3735-3743 (2009); Bruckheimer, Neoplasia 11:509-517 (2009); WO 06/020114; Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i WO 04/074455, čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Primeri modifikacija za konstruisanje fragmenta imunoglobulina koje su sadržane u aminokiselinskoj sekvenci u DBDpp fuzionom proteinu koje povećavaju ADCC uključuju sekvence efektorskog domena imunoglobulina sa jednom ili više modifikacija koje odgovaraju: IgG1-S298A, E333A, K334A; IgG1-S239D, I332E; IgG1-S239D, A330L, I332E; IgG1-P247I, A339D ili Q; IgG1-D280H, K290S sa ili bez S298D ili V; IgG1-F243L, R292P, Y300L; IgG1-F243L, R292P, Y300L, P396L; i IgG1-F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L; pri čemu je numeracija ostataka u Fc regionu prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0198] U drugim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da smanjuje ADCC (vidite, npr. Idusogie et al. J. Immunol. 166:2571-2575 (2001); Sazinsky et al. PNAS 105:20167-20172 (2008); Davis et al. J. Rheumatol.34:2204-2210 (2007); Bolt et al. Eur. J. Immunol. 23:403-411 (1993); Alegre et al. Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al. Cell Immunol.200:16-26 (2000); Cole et al. Transplantation 68:563-571 (1999); Hutchins et al. PNAS 92:11980-11984 (1995); Reddy et al. J. Immunol.164:1925-1933 (2000); WO 97/11971; WO 07/106585; US 2007/0148167A1; McEarchern et al. Blood 109:1185-1192 (2007); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i Kumagai et al. J. Clin. Pharmacol.47:1489-1497 (2007), čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Primeri modifikacija za konstruisanje sekvence fragmenta imunoglobulina sadržane u aminokiselinskoj sekvenci u DBDpp fuzionom proteinu koje smanjuju ADCC uključuju sekvence efektorskog domena imunoglobulina sa jednom ili više modifikacija koje odgovaraju: IgG1-K326W, E333S; IgG2-E333S; IgG1-N297A; IgG1-L234A, L235A; IgG2-V234A, G237A; IgG4-L235A, G237A, E318A; IgG4-S228P, L236E; IgG2- 118-260; IgG4- 261-447; IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG1-C220S, C226S, C229S, P238S; IgG1-C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; ili IgG1-L234F, L235E, P331S; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0199] U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu efektorskog domena imunoglobulina ili derivat efektorskog domena imunoglobulina koji DBDpp fuzionom proteinu daju ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP). U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da poveća ćelijsku fagocitozu zavisnu od antitela (ADCP); (vidite, npr. Shields et al. J. Biol. Chem.276:6591-6604 (2001); Lazar et al. PNAS 103:4005-4010 (2006); Stavenhagen et al. Cancer Res., 67:8882-8890 (2007); Richards et al. Mol. Cancer Ther.
7:2517-2527 (2008); Horton et al. Cancer Res. 68:8049-8057 (2008), Zalevsky et al. Blood 113:3735-3743 (2009); Bruckheimer et al. Neoplasia 11:509-517 (2009); WO 06/020114; Strohl, Curr. Op. Biotechnol.20:685-691 (2009); i WO 04/074455, čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Primeri modifikacija za konstruisanje fragmenta imunoglobulina koje su sadržane u aminokiselinskoj sekvenci u DBDpp fuzionom proteinu koje povećavaju ADCP uključuju sekvence efektorskog domena imunoglobulina sa jednom ili više modifikacija koje odgovaraju: IgG1-S298A, E333A, K334A; IgG1-S239D, I332E; IgG1-S239D, A330L, I332E; IgG1-P247I, A339D ili Q; IgG1-D280H, K290S sa ili bez S298D ili V; IgG1-F243L, R292P, Y300L; IgG1-F243L, R292P, Y300L, P396L; IgG1-F243L, R292P, Y300L, V305I, P396L; i IgG1-G236A, S239D, I332E; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0200] U drugim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da smanjuje ADCP (vidite, npr. Sazinsky et al. PNAS 105:20167-20172 (2008); Davis et al. J. Rheumatol. 34:2204-2210 (2007); Bolt et al. Eur. J. Immunol. 23:403-411 (1993); Alegre et al. Transplantation 57:1537-1543 (1994); Xu et al. Cell Immunol. 200:16-20 (2000); Cole et al. Transplantation 68:563-571 (1999); Hutchins et al. PNAS 92:11980-11984 (1995); Reddy et al. J. Immunol. 164:1925-1933 (2000); WO 97/11971; WO 07/106585; US 2007/0148167A1; McEarchern et al. Blood 109:1185-1192 (2007); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i Kumagai et al. J. Clin. Pharmacol.
47:1489-1497 (2007), čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Na primer, DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže fragment ili domen antitela koji sadrži jednu ili više od sledećih modifikacija koje smanjuju ADCC: IgG1-N297A; IgG1-L234A, L235A; IgG2-V234A, G237A; IgG4-L235A, G237A, E318A; IgG4-S228P, L236E; IgG2 EU sekvenca 118-260; IgG4-EU sekvenca 261-447; IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG1-C220S, C226S, C229S, P238S; IgG1-C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; i IgG1-L234F, L235E, P331S; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0201] U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu efektorskog domena imunoglobulina ili derivat efektorskog domena imunoglobulina koji DBDpp fuzionom proteinu daju citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da poveća citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC) (vidite, npr. Idusogie et al. J. Immunol. 166:2571-2575 (2001); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i Natsume et al. Cancer Res. 68:3863-3872 (2008), čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Na primer, DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže fragment ili domen antitela koji sadrži jednu ili više od sledećih modifikacija koje povećavaju CDC: IgG1-K326A, E333A; IgG1-K326W, E333S, IgG2-E333S; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0202] U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu efektorskog domena imunoglobulina ili derivat efektorskog domena imunoglobulina, koji daju sposobnost vezivanja FcgamaRIIb receptora sa DBDpp fuzijom. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da poveća inhibitorsko vezivanje za FcgamaRIIb receptor (vidite, npr. Chu et al. Mol. Immunol. 45:3926-3933 (2008)). Primer modifikacije za konstruisanje fragmenta imunoglobulina koja je sadržana u aminokiselinskoj sekvenci u DBDpp fuzionom proteinu koja povećava vezivanje za inhibitorski FcgamaRIIb receptor je IgG1-S267E, L328F.
[0203] U drugim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da smanjuje CDC (vidite, npr. WO 97/11971; WO 07/106585; US 2007/0148167A1; McEarchern et al. Blood 109:1185-1192 (2007); Hayden-Ledbetter et al. Clin. Cancer 15:2739-2746 (2009); Lazar et al. PNAS 103:4005-4010 (2006); Bruckheimer et al. Neoplasia 11:509-517 (2009); Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i Sazinsky et al. PNAS 105:20167-20172 (2008); čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Na primer, DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže fragment ili domen antitela koji sadrži jednu ili više od sledećih modifikacija koje smanjuju CDC: IgG1-S239D, A330L, I332E; IgG2- 118-260; IgG4- 261-447; IgG2-H268Q, V309L, A330S, A331S; IgG1-C226S, C229S, E233P, L234V, L235A; IgG1-L234F, L235E, P331S; i IgG1-C226S, P230S; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0204] Poluživot IgG je posredovan njegovim pH-zavisnim vezivanjem za neonatalni receptor FcRn. U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu efektorskog domena imunoglobulina ili derivat efektorskog domena imunoglobulina koji daju sposobnost vezivanja neonatalnog receptora FcRn sa DBDpp fuzijom. U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu FcRn vezujućeg domena imunoglobulina koja je modifikovana da poveća vezivanje za FcRn (vidite, npr. Petkova et al. Int. Immunol. 18:1759-1769 (2006); Dall'Acqua et al. J. Immunol.169:5171-5180 (2002); Oganesyan et al. Mol. Immunol. 46:1750-1755 (2009); Dall'Acqua et al. J. Biol. Chem.
281:23514-23524 (2006), Hinton et al. J. Immunol. 176:346-356 (2006); Datta-Mannan et al. Drug Metab. Dispos. 35:86-94 (2007); Datta-Mannan et al. J. Biol. Chem. 282:1709-1717 (2007); WO 06/130834; Strohl, Curr. Op. Biotechnol. 20:685-691 (2009); i Yeung et al. J. Immunol. 182:7663-7671 (2009) čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom).
[0205] U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da ima selektivni afinitet prema FcRn na pH 6,0, ali ne na pH 7,4. Na primer, DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže fragment ili domen antitela koji sadrži jednu ili više od sledećih modifikacija koje produžavaju poluživot: IgG1-M252Y, S254T, T256E; IgG1-T250Q, M428L; IgG1-H433K, N434Y; IgG1-N434A; i IgG1-T307A, E380A, N434A; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0206] U drugim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je modifikovana da smanji vezivanje za FcRn (vidite, npr. Petkova et al. Int. Immunol.18:1759-1769 (2006); Datta-Mannan et al. Drug Metab. Dispos.35:86-94 (2007); Datta-Mannan et al. J. Biol. Chem. 282:1709-1717 (2007); Strohl, Curr. Op. Biotechnol.
20:685-691 (2009); i Vaccaro et al. Nat. Biotechnol.23:1283-1288 (2005), čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom). Na primer, DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže fragment ili domen antitela koji sadrži jednu ili više od sledećih modifikacija koje smanjuju poluživot: IgG1-M252Y, S254T, T256E; H433K, N434F, 436H; IgG1-I253A; i IgG1-P257I, N434H i D376V, N434H; pri čemu je numeracija ostataka prema EU indeksu čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom).
[0207] Prema drugom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži aminokiselinsku sekvencu koja odgovara efektorskom domenu imunoglobulina koji je modifikovan da sadrži najmanje jednu supstituciju u svojoj sekvenci koja odgovara poziciji Fc regiona (npr. FC gama) izabranoj iz grupe koja se sastoji od: 238, 239, 246, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 i 439, pri čemu je numeracija ostataka u Fc regionu prema EU sistemu numeracije čiji su autori Kabat i sar. (Kabat et al. Sequences of proteins of Immunological Interest, 1991 peto izdanje, ovde uključeno referencom). U specifičnom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu derivata efektorskog domena imunoglobulina u kojoj je najmanje jedan ostatak koji odgovara poziciji 434 izabran iz grupe koja se sastoji od: A, W, Y, F i H. Prema drugom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu derivata efektorskog fragmenta imunoglobulina koja ima sledeće supstitucije S298A/E333A/K334A. U dodatnom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži derivat efektorskog domena imunoglobulina koji ima supstituciju koja odgovara K322A. U još jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu derivata efektorskog domena imunoglobulina koja ima jednu od sledećih supstitucija: K246H, H268D, E283L, S324G, S239D i I332E, ili bilo koju njihovu kombinaciju. Prema još jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu derivata efektorskog domena imunoglobulina koja ima supstitucije koje odgovaraju D265A/N297A.
1
[0208] U određenim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži sekvencu efektorskog domena imunoglobulina koja je glikokonstruisana ili mutirana da poveća efektorsku funkciju koristeći tehnike poznate u struci. Na primer, inaktivacija (putem tačkastih mutacija ili drugih sredstava) sekvence domena konstantnog regiona sadržanog u DBDpp može da smanji vezivanje Fc receptora cirkulišućeg DBDpp fuzionog proteina, čime se povećava lokalizacija tumora. U drugim slučajevima može biti da modifikacije konstantnog regiona u skladu sa određenim otelotvorenjima predmetnog pronalaska ograničavaju komplementno vezivanje, te tako smanjuju poluživot u serumu i nespecifično vezivanje konjugovanog citotoksina. Još neke modifikacije konstantnog regiona mogu da se koriste za modifikovanje disulfidnih veza ili oligosaharidnih ostataka, što omogućava pojačanu lokalizaciju usled povećane antigenske specifičnosti ili fleksibilnosti antitela. Nastali fiziološki profil, bioraspoloživost i druga biohemijska dejstva modifikacija, kao što su lokalizacija tumora, biodistribucija i poluživot u serumu, lako mogu da se izmere i kvantifikuju koristeći dobro poznate imunološke tehnike bez nepotrebnog eksperimentisanja.
[0209] U nekim otelotvorenjima, imunska efektorska ćelija sadrži receptor ćelijske površine za imunoglobulin ili drugi molekul koji vezuje peptide, kao što je receptor za konstantni region imunoglobulina, i uključuje klasu receptora koji se uobičajeno nazivaju „Fc receptori“ („FcR“). Brojni FcR su strukturno i/ili funkcionalno okarakterisani i poznati su u struci, uključujući FcR sa specifičnim sposobnostima za interakciju sa ograničenim podskupom izotipova teškog lanca imunoglobulina, ili koji interaguju sa Fc domenima sa različitim afinitetima, i/ili koji mogu biti eksprimirani na ograničenom podskupu imunskih efektorskih ćelija u određenim uslovima (npr. Kijimoto-Ochichai et al., Cell Mol. Life. Sci.59:648 (2002); Davis et al. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 266:85 (2002); Pawankar, Curr. Opin. Allerg. Clin. Immunol.1:3 (2001); Radaev et al., Mol. Immunol. 38:1073 (2002); Wurzburg et al., Mol. Immunol.38:1063 (2002); Sulica et al, Int. Rev. Immunol. 20:371 (2001); Underhill et al., Ann. Rev. Immunol. 20:825 (2002); Coggeshall, Curr. Dir. Autoimm.5:1 (2002); Mimura et al. Adv. Exp. Med. Biol.495:49 (2001); Baumann et al. Adv. Exp. Med. Biol.495:219 (2001); Santoso et al. Ital. Heart J.2:811 (2001); Novak et al. Curr. Opin. Immunol. 13:721 (2001); Fossati et al. Eur. J. Clin. Invest. 31:821 (2001)), od kojih je svaki ovde u celini obuhvaćen referencom.
[0210] Ćelije koje su sposobne da posreduju ADCC su primeri imunskih efektorskih ćelija. Druge imunske efektorske ćelije uključuju ćelije prirodne ubice, T limfocite koji infiltriraju tumor (TIL), citotoksične T limfocite i granulocitne ćelije, kao što su ćelije koje sadrže
1 1
mehanizme alergijskog odgovora. Imunske efektorske ćelije tako uključuju, ali nisu ograničene na, ćelije hematopoetskog porekla, uključujući ćelije u različitim stadijumima diferencijacije u mijeloidnim ili limfoidnim linijama i koje mogu (ali ne moraju) da eksprimiraju jednu ili više vrsta funkcionalnih FcR ćelijske površine, kao što su T limfociti, B limfociti, NK ćelije, monociti, makrofagi, dendritske ćelije, neutrofili, bazofili, eozinofili, mastociti, trombociti, eritrociti i prekursori, progenitori (npr. hematopoetske matične ćelije), kao i mirujući, aktivirani i zreli oblici takvih ćelija. Ostale imunske efektorske ćelije mogu da uključuju ćelije nehematopoetskog porekla koje su sposobne da posreduju imunske funkcije, na primer, endotelne ćelije, keratinociti, fibroblasti, osteoklasti, epitelne ćelije, i druge ćelije. Imunske efektorske ćelije takođe mogu da uključuju ćelije koje posreduju citotoksične ili citostatične događaje, ili endocitne, fagocitne ili pinocitotične događaje, ili koje utiču na indukciju apoptoze, ili koje utiču na mikrobni imunitet ili neutralizaciju mikrobne infekcije, ili ćelije koje posreduju u alergijskim, inflamatornim, hipersenzitivnim i/ili autoimunskim reakcijama.
DBDpp kao albuminske fuzije
[0211] Ovde su obuhvaćeni i molekuli nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine DBDpp-albumin, kao i vektori koji sadrže te nukleinske kiseline, ćelije domaćini koje sadrže te vektore nukleinskih kiselina, i postupci za proizvodnju fuzionih proteina DBDpp-albumin i korišćenje tih nukleinskih kiselina, vektora i/ili ćelija domaćina. Pronalazak takođe obuhvata farmaceutske formulacije koje sadrže fuzioni protein DBDpp-albumin i farmaceutski prihvatljivi razblaživač ili nosač. Takve formulacije mogu da se koriste u postupcima lečenja, prevencije, ublažavanja ili dijagnostikovanja bolesti ili simptoma bolesti kod pacijenta, poželjno sisara, najpoželjnije čoveka, koji obuhvataju korak primene farmaceutske formulacije na pacijentu.
DBDpp kao himerni receptori
[0212] Pored ugradnje DBD u rastvorljive multidomenske proteine, predmetni pronalazak obezbeđuje sredstva za stvaranje DBDpp povezanog sa ćelijom koji obuhvata najmanje jedan DBDpp namenjen za prenos specifičnosti vezivanja fuzionom proteinu vezanom membranom. DBDpp-receptore može da eksprimira bilo koja vrsta ćelije.
1 2
[0213] U jednom otelotvorenju, fuzioni protein DBDpp-receptor sadrži himerni receptor antigena (CAR) ili DBDpp-CAR sačinjen od sledećih elemenata: ekstracelularni ciljajući domen, transmembranski domen i citoplazmatski domen, pri čemu citoplazmatski domen sadrži domen za signalizaciju. U drugom otelotvorenju, DBDpp-CAR je sastavljen od ekstracelularnog ciljajućeg domena i transmembranskog domena. U daljem otelotvorenju, DBDpp-CAR je sastavljen od ekstracelularnog domena sačinjenog od jednog ili više DBDpp u kome svaki DBDpp čini vezujući domen specifičan za cilj sa istim ili različitim specifičnostima. U nekoliko otelotvorenja, domen specifičan za cilj je usmeren na jedan (ili više) antigena kancera ili tumora koji su ovde otkriveni, kao što su, u vidu neograničavajućih primera, CD123, CD137, PD-L1, CD19, CD22, NY-ESO, ili MAGE A3. U jednom otelotvorenju, intracelularni domen (npr. citoplazmatski domen) DBDpp-CAR sadrži intracelularni domen zeta lanca CD3. U drugom otelotvorenju, domen intracelularne signalizacije DBDpp je sastavljen od dela intracelularnog domena zeta lanca CD3. U daljem otelotvorenju, intracelularni domen DBDpp-CAR sadrži intracelularni domen zeta lanca CD3 i kostimulatorni signalni region. Kostimulatorni signalni region odnosi se na deo DBDpp-CAR koji sadrži celinu ili deo intracelularnog domena kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekuli su molekuli ćelijske površine koji nisu receptori antigena ili njihovi ligandi, koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen. Kostimulatorni molekuli i delovi tih molekula koji su sposobni da daju kostimulatorna svojstva CAR-u su poznati u struci, i rutinski mogu da se inkorporiraju u DBDpp-CAR. Pored toga, skraćivanje ili mutacija ovih intracelularnih signalnih i kostimulatornih domena može da se uključi radi daljeg pojačavanja ili smanjenja receptorske signalizacije. U poželjnim otelotvorenjima, T ćelija je genetski modifikovana da stabilno eksprimira DBD-pp-CAR. U takvim otelotvorenjima, citoplazmatski domen DBDpp-CAR može da se konstruiše da sadrži signalni domen CD28 i/ili 4-1BB samostalno ili u kombinaciji sa drugim željenim citoplazmatskim domenima korisnim u kontekstu pronalaska. U jednom otelotvorenju, citoplazmatski domen DBDpp-CAR može da se konstruiše da dalje sadrži signalni domen CD3-zeta. Na primer, kako je šematski prikazano na SL. 5B, u jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR sadrži ekstracelularni ciljajući domen, ekstracelularni proteinski linker sa transmembranskim domenom koji prolazi kroz ćelijsku membranu (kao što se može naći kod T ćelija ili NK ćelija), i citoplazmatski domen, opciono sa više signalnih modula. U nekoliko otelotvorenja, DBDpp-CAR može da sadrži i epitopsku oznaku. U nekoliko otelotvorenja, citoplazmatski domen DBDpp-CAR može da uključuje, ali nije ograničen na, signalne module CD3-zeta, 4-1BB i CD28 i njihove kombinacije.
1
Ekstracelularni domen
[0214] U zavisnosti od željenog antigena koji se cilja, DBDpp-CAR može da se konstruiše da obuhvata odgovarajući antigen vezujući DBDpp koji je specifičan za željeni antigenski cilj. Na primer, ako je CD19 željeni antigen koji se cilja, jedan ili više CD19-vezujućih DBDpp može biti inkorporisano u vezujući domen DBDpp-CAR koji je specifičan za cilj. Alternativno, DBDpp-CAR može da uključuje više od jednog DBDpp, što daje multispecifičnost ili multivalentnost DBDpp-CAR.
[0215] Izbor DBDpp inkorporisanog u ekstracelularni domen DBDpp receptora (npr. DBDpp-CAR) zavisi od identiteta ćelije ili ćelija koje se ciljaju. Na primer, DBDpp-CAR može specifično da se vezuje za proteine ćelijske površine, kao što je receptor na istoj ćeliji ili drugoj ćeliji. U drugim otelotvorenjima, DBDpp-CAR se specifično vezuje za rastvorljivi molekul, kao što je imunoglobulin. U drugim otelotvorenjima, ciljevi od interesa vezani sa DBDpp-CAR uključuju one povezane sa virusnim, bakterijskim i parazitskim infekcijama, bolestima i poremećajima imunskog sistema (npr. autoimunske bolesti).
[0216] U drugim otelotvorenjima, DBDpp-CAR se može izabrati da prepoznaje ligand koji deluje kao marker ćelijske površine na ciljnim ćelijama povezanim sa kancerom. U nekim otelotvorenjima, DBDpp-CAR može da cilja i vezuje tumorski antigen (npr. TAA ili drugi tumorski antigen opisan ovde ili inače poznat u struci. Shodno tome, ovde su obezbeđeni postupci za proizvodnju DBDpp-CAR, njihova upotreba u stvaranju himernih ćelija, kao što su humane T ćelije i ćelije prirodne ubice, i upotreba tih himernih T ćelija u adoptivnoj imunoterapiji.
[0217] U kontekstu koji je ovde dat, „tumorski antigen“ se odnosi na antigene koji su zajednički za specifične hiperproliferativne poremećaje kao što je kancer. Ovde su otkriveni tumorski antigeni koje DBDpp u DBDpp-CAR može specifično da vezuje. U jednom otelotvorenju, DBDpp u DBDpp-CAR specifično vezuje antigen specifičan za tumor (TSA) ili antigen povezan sa tumorom (TAA). TSA je jedinstven za tumorske ćelije, i ne javlja se na drugim ćelijama u telu. TAA povezani antigen nije jedinstven za tumorsku ćeliju, već se eksprimira i na normalnim ćelijama u uslovima koji ne uspevaju da indukuju stanje imunološke tolerancije na antigen. Ekspresija antigena na tumoru može da se javi u uslovima koji omogućavaju imunskom sistemu da odgovori na antigen. TAA mogu biti antigeni koji se eksprimiraju na
1 4
normalnim ćelijama tokom razvoja fetusa kada je imunski sistem nezreo i ne može da reaguje, ili mogu biti antigeni koji su uobičajeno prisutni sa izuzetno niskim nivoima na normalnim ćelijama, ali koji se eksprimiraju sa mnogo višim nivoima na tumorskim ćelijama. Neograničavajući primeri TSA ili TAA antigena koje specifično može da vezuje DBDpp u DBDpp-CAR uključuju član izabran od: diferencijacionog antigena kao što je MARTl/MelanA (MARTI), gp100 (Pmel 17), tirozinaza, TRP1, TRP2; multilinijskog antigena specifičnog za tumor, kao što je MAGE1, MAGE3, BAGE, GAGE1, GAGE2, pi5; prekomerno eksprimiranog embrionskog antigena kao što je CEA; i prekomerno eksprimiranog onkogena ili mutiranog gena koji potiskuje tumor, kao što je p53, Ras, HER-2/neu; jedinstvenog tumorskog antigena nastalog translokacijom hromozoma, kao što je BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, 1GH-IGK, MYL-RAR; virusnog antigena kao što su EBVA antigeni Epštajn-Barovog virusa i E6 i E7 antigeni humanog papilomavirusa (HPV); TSP-180, MAGE4, MAGE5, MAGE6, RAGE, NY-ESO, pl85erbB2, pl80erbB3, cmet, nm-23H1, PSA, TAG72, CA 19-9, CA72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, beta-katenina, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4(791Tgp72) alfa-fetoprotema, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA125, CA 15-3\CA 27.29\BCAA, CA195, CA242, CA50, CAM43, CD68\I, CO-029, FGF5, G250, Ga733VEpCAM, HTgp-175, M344, MA50, MG7-Ag, MOV 18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA90\Mac-2, TAAL6, TAG72, TLP i TPS; antigena povezanog sa gliomom, karcinoembrionskog antigena (CEA), β-humanog horionskog gonadotropina, alfafetoproteina (AFP), lektin-reaktivnog AFP, tiroglobulina, RAGE-1, MN-CA IX, humane telomeraza reverzne transkriptaze, RU1, RU2 (AS), intestinalne karboksilesteraze, mut hsp70-2, MCSF, prostaze, antigena specifičnog za prostatu (PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-la, p53, prosteina, PSMA, Her2/neu, survivina i telomeraze, tumorskog antigena karcinoma prostate- 1 (PCTA1), MAGE, ELF2M, neutrofilne elastaze, ephrinB2, TACI (CD267), BAFF-R (CD268), BCMA (CD269), TLR4, insulinskog faktora rasta (IGF)I, IGFII, IGFI receptora i mezotelina.
[0218] U posebnom otelotvorenju, DBDpp je deo antigen vezujućeg ostatka DBDpp-CAR koji specifično vezuje cilj izabran od: CD123, HVEM, BTLA, DR3, CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelina, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipida F77, EGFRvIII, GD2, MY-ESO-1TCR, CD133, CD47 i MAGE A3 TCR. U drugom poželjnom otelotvorenju, DBDpp je deo antigen vezujućeg ostatka DBDpp-CAR koji specifično vezuje sve klase imunoglobulina ili specifičnih izotipova, alotipova ili idiotipova.
1
[0219] U jednom otelotvorenju, DBDpp u DBDpp-CAR specifično vezuje tumorski antigen povezan sa malignim tumorom. Maligni tumori eksprimiraju brojne tumorske antigene koje DBDpp-CAR može biti konstruisan da vezuje. U jednom otelotvorenju, DBDpp iz DBDpp-CAR se vezuje za antigen izabran od: antigena specifičnog za tkivo kao što je MART-1, tirozinaza i GP 100 kod melanoma i prostatične kisele fosfataze (PAP) i antigena specifičnog za prostatu (PSA) kod kancera prostate; molekula povezanog sa transformacijom kao što je onkogen HER2/Neu ErbB2; onkofetalnog antigena kao što je karcinoembrionski antigen (CEA); imunoglobulina idiotipa specifičnog za B-ćelijski limfom; antigena za diferencijaciju B-ćelija kao što je CD19, CD20 i CD37; TSLPR i IL-7R na mijeloidnim ćelijama i antigenima kancera testisa (CT) (npr. NY-ESO-1, LAGE-1a), CS-1, CD38, CD138, MUC1, HM1.24, CYP1B1, SP17, PRAME, Vilmsovog tumora 1 (WT1) i proteina toplotnog šoka gp96 na više ćelija mijeloma.
Transmembranski domen
[0220] „Transmembranski domen“ (TMD), kako se ovde koristi, odnosi se na region DBDpp fuzionog proteina koji eksprimira ćelijska površina kao što je DBDpp-CAR, koji prolazi kroz membranu plazme. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen DBDpp-CAR je transmembranski region transmembranskog proteina (na primer, transmembranski proteini tip I), veštačka hidrofobna sekvenca ili njihova kombinacija. Drugi transmembranski domeni biće očigledni stručnjacima, i mogu da se koriste u vezi sa alternativnim otelotvorenjima pronalaska.
[0221] DBDpp receptor (npr. DBDpp-CAR) može biti konstruisan da sadrži transmembranski domen koji je fuzionisan sa ekstracelularnim domenom DBDpp receptora. Kao što je gore opisano, fuzija ekstracelularnih i transmembranskih domena može da se postigne sa linkerom ili bez njega. U jednom otelotvorenju, koristi se transmembranski domen koji je prirodno povezan sa jednim od domena u DBDpp-CAR. U specifičnom otelotvorenju, transmembranski domen u DBDpp-CAR je transmembranski domen CD8. U nekim slučajevima, transmembranski domen DBDpp-CAR sadrži domen šarke CD8. U nekim otelotvorenjima, transmembranski domen je izabran ili modifikovan aminokiselinskom supstitucijom radi promovisanja ili inhibicije asocijacije sa drugim proteinima površinske membrane.
[0222] Transmembranski domen može da se dobije iz prirodnog ili iz sintetičkog izvora. Kada je izvor prirodni, domen može da se dobije od bilo kog proteina koji je vezan za membranu ili
1
je transmembranski. Transmembranski regioni koji se naročito koriste za predmetne svrhe mogu se dobiti od (tj. sadrže barem transmembranske regione) člana izabranog iz grupe: alfa, beta ili zeta lanca T-ćelijskog receptora; CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 i CD154. Alternativno, transmembranski domen može biti sintetički, u kom slučaju će transmembranski domen DBDpp-CAR sadržati pretežno hidrofobne ostatke, kao što je leucin i valin. U daljim otelotvorenjima, transmembranski domen sadrži triplet fenilalanina, triptofana i valina na svakom kraju sintetičkog transmembranskog domena.
[0223] „Ekstracelularni spejserski domen“ (ESD), kako se ovde koristi, odnosi se na hidrofilni region koji je između antigen-specifičnog ciljajućeg regiona i transmembranskog domena. U nekim otelotvorenjima, DBDpp-CAR sadrži ekstracelularni spejserski domen. U drugim otelotvorenjima, DBDpp-CAR ne sadrži ekstracelularni spejserski domen. Ekstracelularni spejserski domeni uključuju, ali nisu ograničeni na Fc fragmente antitela ili njihove fragmente ili derivate, regione šarke antitela ili njihove fragmente ili derivate, CH2 regione antitela, CH3 regione antitela, sekvence veštačkog spejsera, ili njihovu kombinaciju. Dodatni primeri ekstracelularnih spejserskih domena uključuju, ali nisu ograničeni na, šarku CD8a i veštačke spejsere načinjene od polipeptida koji mogu biti mali kao, na primer, Gly3 ili CHI i CH3 domeni IgG (kao što je humani IgG4). U nekim otelotvorenjima, ekstracelularni spejserski domen je jedan ili više od (i) šarke, CH2 i CH3 regiona IgG4, (ii) regiona šarke IgG4, (iii) šarke i CH2 IgG4, (iv) regiona šarke CD8a, (v) šarke, CH2 i CH3 regiona IgG1, (vi) regiona šarke IgGI ili (vi) šarke i CH2 regiona IgG1. Drugi ekstracelularni spejserski domeni biće jasni stručnjacima, i mogu da se koriste u vezi sa alternativnim otelotvorenjima koja su ovde obezbeđena.
[0224] U nekim otelotvorenjima, kratki oligo- ili polipeptidni linker, dužine od oko 1 do 100 aminokiselina, koristi se za povezivanje bilo kojih domena DBDpp-CAR. Linkeri mogu da se sastoje od fleksibilnih ostataka poput glicina i serina (ili bilo koje druge aminokiseline) tako da susedni domeni proteina mogu da se kreću jedni u odnosu na druge. Kompozicija aminokiselinske sekvence linkera može da se izabere da se minimizuje potencijalna imunogenost DBDpp-CAR ili DBDpp fuzionog proteina. Duži linkeri mogu da se koriste kada je poželjno da se osigura da se dva susedna domena međusobno sterno ne ometaju. U nekim otelotvorenjima, poželjno dužina od 2 do 10 aminokiselina gradi vezu između transmembranskog domena i citoplazmatskog domena signalizacije DBDpp-CAR. U daljim
1
otelotvorenjima, linker ima dužinu od 10 do 15 aminokiselina, ili dužinu od 15 do 20, ili od 20 do 30, ili od 30 do 60, ili od 60 do 100 aminokiselina (ili bilo koji raspon između navedenih). U daljim otelotvorenjima, linker je sekvenca dubleta glicin-serin. Dalja otelotvorenja koriste fragment regiona šarke dobijen od CD8 alfa-lanca humanog T-ćelijskog površinskog glikoproteina (na primer, u rasponu od aminokiselinskih pozicija 138 do 182 CD8 alfa lanca; Swiss-Prot pristupni broj P01732). Dalja otelotvorenja koriste fragment CD8 regiona šarke koji je dalje modifikovan, pomoću aminokiselinskih supstitucija, da poboljša funkciju ekspresije ili imunogenosti. Dalja otelotvorenja koriste fragment ekstracelularnog regiona dobijenog od humanog CD28. Dalja otelotvorenja koriste fragment ekstracelularnog regiona CD28 koji je dalje modifikovan, pomoću aminokiselinskih supstitucija, da poboljša funkciju ekspresije ili imunogenosti.
Intracelularni domen
[0225] „Intracelularni signalni domen“ (ISD) ili „citoplazmatski domen“, kako se ovde koristi, odnosi se na deo DBDpp-CAR koji transdukuje signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da obavi svoju specijalizovanu funkciju. Citoplazmatski domen (tj. intracelularni signalni domen) DBDpp-CAR je odgovoran za aktivaciju najmanje jedne od uobičajenih efektorskih funkcija imunske ćelije konstruisane da eksprimira DBDpp-CAR. Termin „efektorska funkcija“ odnosi se na specijalizovanu funkciju ćelije. Efektorska funkcija T ćelije, na primer, uključuje citolitičku aktivnost i pomoćnu aktivnost, uključujući sekreciju citokina. Tako, termin „intracelularni signalni domen“ odnosi se na deo DBDpp-CAR proteina koji transdukuje signal efektorske funkcije i usmerava ćeliju da obavi specijalizovanu funkciju. Iako obično može da se koristi ceo intracelularni signalni domen koji odgovara receptoru koji se javlja u prirodi, u mnogo slučajeva nije neophodno koristiti ceo lanac. U meri u kojoj se koristi skraćeni deo intracelularnog signalnog domena, takav skraćeni deo može da se koristi umesto netaknutog lanca sve dok transdukuje signal efektorske funkcije. Termin intracelularni signalni domen tako treba da označava svaki skraćeni deo intracelularnog signalnog domena dovoljan da transdukuje signal efektorske funkcije. U jednom otelotvorenju, intracelularni signalni domen u DBDpp-CAR uključuje citoplazmatske sekvence T ćelijskog receptora (TCR) kao i sekvencu koreceptora koji deluju zajedno da iniciraju transdukciju signala nakon angažovanja antigenskog receptora, ili bilo koji derivat ili varijantu ovih sekvenci koji ima funkcionalnu sposobnost. Primeri domena koji transdukuju signal efektorske funkcije uključuju, ali nisu ograničeni na, ζ lanac kompleksa T-ćelijskog receptora ili bilo koji od njegovih homologa (npr.
1
η lanac, FcsRly i β lanci, MB 1 (Iga) lanac, B29 (Ig) lanac, itd.), zeta lanac humanog CD3, CD3 polipeptide (Δ, δ i ε), syk familiju tirozinskih kinaza (Syk, ZAP 70, itd.), src familiju tirozinskih kinaza (Lck, Fyn, Lyn, itd.) i druge molekule uključene u T-ćelijsku transdukciju, kao što su CD2, CD5 i CD28.
[0226] Poznato je da su signali stvoreni samo putem TCR nedovoljni za potpunu aktivaciju T ćelije, i da je potreban i sekundarni ili kostimulatorni signal. Tako, može se reći da je T ćelijska aktivacija posredovana putem dve različite klase citoplazmatske signalne sekvence: onih koje iniciraju antigen-zavisnu primarnu aktivaciju putem TCR (primarne citoplazmatske signalne sekvence) i onih koje deluju na način zavisan od antigena da obezbede sekundarni ili kostimulatorni signal (sekundarne citoplazmatske signalne sekvence).
[0227] Primarne citoplazmatske signalne sekvence regulišu primarnu aktivaciju TCR kompleksa ili na stimulatorni način, ili na inhibitorski način. Primarne citoplazmatske signalne sekvence koje deluju na stimulatorni način mogu da sadrže signalne motive koji su poznati kao aktivacioni motivi na bazi imunoreceptorskog tirozina (ITAM).
[0228] Primeri za ITAM koji sadrži primarnu citoplazmatsku signalnu sekvencu koji su od posebne koristi u pronalasku uključuju one dobijene od TCR zeta, FcR gama, FcR beta, CD3 gama, CD3 delta, CD3 epsilon, CD22, CD79a, CD79b i CD66d. Naročito je poželjno da citoplazmatski signalni molekul u CAR sadrži citoplazmatsku signalnu sekvencu dobijenu od CD3 zeta.
[0229] „Kostimulatorni domen“ (CSD), kako se ovde koristi, odnosi se na deo CAR ili DBDpp-CAR koji pojačava proliferaciju, preživljavanje i/ili razvoj memorijskih ćelija. DBDpp-CAR može da sadrži jedan ili više kostimulatornih domena. Svaki kostimulatorni domen sadrži kostimulatorni domen jednog ili više, na primer, članova superfamilije TNFR, izabran od CD28, CD137 (4-1BB), CD134 (OX40), Dap10, CD27, CD2, CD5, ICAM-1, LFA-1(CD1 la/CD18), Lck, TNFR-I, TNFR-II, Fas, CD30 i CD40 ili njihove kombinacije. Drugi kostimulatorni domeni (npr. iz drugih proteina) biće očigledni stručnjacima, i mogu da se koriste u vezi sa alternativnim otelotvorenjima pronalaska.
[0230] U poželjnom otelotvorenju, citoplazmatski domen DBDpp-CAR sadrži CD3-zeta signalni domen samostalno ili u kombinaciji sa bilo kojim drugim željenim citoplazmatskim
1
domenima korisnim u kontekstu DBDpp-CAR. Na primer, citoplazmatski domen DBDpp-CAR može da sadrži deo CD3 zeta lanca i kostimulatorni signalni region. Kostimulatorni signalni region odnosi se na deo CAR koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula. Kostimulatorni molekul je molekul ćelijske površine koji nije receptor antigena ili njihovi ligandi koji su potrebni za efikasan odgovor limfocita na antigen. Primeri takvih molekula uključuju CD27, CD28, 4-1BB (CD 137), OX40, CD30, CD40, PD1, ICOS, antigen povezan sa funkcijom limfocita-1 (LFA1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7H3, TIM1 i LAG-3.
[0231] Polipeptidni linkeri mogu da se pozicioniraju između susednih elemenata DBDpp-CAR. Na primer, linkeri mogu da se pozicioniraju između susednih DBDpp, ili između DBDpp i transmembranskog domena, ili između transmembranskog domena i citoplazmatskog domena, ili između susednih citoplazmatskih domena. Citoplazmatske signalne sekvence u citoplazmatskom signalnom delu DBDpp-CAR mogu biti povezane međusobno po nasumičnom ili određenom redosledu. Opciono, kratki linker, poželjno dužine od 2 do 10 aminokiselina, može da gradi vezu. Dublet glicin-serin obezbeđuje posebno pogodan linker.
Epitopska oznaka
[0232] U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein sadrži peptidnu epitopsku oznaku. U nekim otelotvorenjima, peptidna oznaka je izabrana iz grupe koja se sastoji od heksahistidilne (His6) oznake, myc oznake i FLAG oznake. U dodatnim otelotvorenjima, peptidne oznake uključuju, ali nisu ograničene na, avitag (omogućava biotinilovanje oznake i izolovanje streptavidinom), kalmodulin, E-oznaku, hemaglutinin (HA), S-oznaku, SBP-oznaku, softag 1, streptavidin, tetra ili poli-cistein, V5, VSV i Xpress oznaku. Dodatno mogu da se koriste polihistidilne oznake (osim 6 ostataka). U dodatnim otelotvorenjima, mogu da se koriste kovalentne peptidne oznake, proteinske oznake, i slično. Kovalentne peptidne oznake uključuju, ali nisu ograničene na, izopeptag (kovalentno vezuje pilinC protein), Spytag (kovalentno se vezuje za SpyCatcher protein) i Snooptag (kovalentno se vezuje za SnoopCatcher protein). U još nekim otelotvorenjima, opciono mogu da se koriste proteinske oznake uključujući, bez ograničenja, biotinski karboksilni protein nosača (BCCP), glutation-stransferazu, zeleni fluorescentni protein (ili drugi fluorofor), halo oznaku, Nus oznaku, tioredoksin i Fc oznaku. U još nekim otelotvorenjima, može se koristiti više vrsta oznaka. U još nekim otelotvorenjima, ne koristi se nijedna oznaka. Može da se koristi bilo koja
11
kombinacija ovde otkrivenih ekstracelularnih, transmembranskih i intracelularnih domena, u zavisnosti od otelotvorenja.
Linkeri
[0233] Termini „linker“ i spejser ovde se koriste naizmenično da označe peptid ili drugu hemijsku vezu čija je funkcija da povezuje inače nezavisne funkcionalne domene. U jednom otelotvorenju, linker u DBDpp je lociran između DBDpp i druge polipeptidne komponente koja sadrži inače nezavisni funkcionalni domen. Odgovarajući linkeri za kuplovanje dva ili više povezanih DBDpp biće jasni stručnjaku, i uopšteno mogu biti bilo koji linker koji se koristi u struci za povezivanje peptida, proteina ili drugih organskih molekula. U određenim otelotvorenjima, takav linker je pogodan za konstruisanje proteina ili polipeptida koji su namenjeni za farmaceutsku primenu.
[0234] Prikladni linkeri za operativno povezivanje DBDpp i dodatne komponente DBDpp fuzionog proteina u jednolančanoj aminokiselinskoj sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na, polipeptidne linkere kao što su glicinski linkeri, serinski linkeri, mešoviti glicinski/serinski linkeri, linkeri bogate glicinom i serinom, ili linkeri sastavljeni uglavnom od polarnih polipeptidnih fragmenata.
[0235] U jednom otelotvorenju, linker je sačinjen većinom od aminokiselina izabranih od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. U jednom otelotvorenju, linker je sačinjen većinom od aminokiselina izabranih od glicina, alanina, prolina, asparagina, asparaginske kiseline, treonina, glutamina i lizina. U jednom otelotvorenju, linker DBDpp fuzionog proteina je sačinjen od jedne ili više aminokiselina izabranih od glicina, alanina, prolina, asparagina, glutamina i lizina. U jednom otelotvorenju, linker DBDpp fuzionog proteina je sačinjen od jedne ili više aminokiselina izabranih od glicina, alanina, prolina, asparagina, asparaginske kiseline, treonina, glutamina i lizina. U još jednom otelotvorenju, linker DBDpp fuzionog proteina je sačinjen većinom od aminokiselina koje su sterno neometane. U drugom otelotvorenju, linker u kome je većina aminokiselina glicin, serin i/ili alanin. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker je izabran od poliglicina (kao što su (Gly)5 i (Gly)8, poli(Gly-Ala) i polialanina. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker sadrži sekvencu Gly-Gly-Gly-Gly-Thr-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. U nekim otelotvorenjima, peptidni linker sadrži sekvencu Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Gly-Gly-Gly-Gly-Ser.
[0236] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži DBDpp neposredno vezan (tj. bez linkera) sa drugom komponentom DBDpp fuzionog proteina. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži najmanje 2, najmanje 3, najmanje 4 DBDpp neposredno vezana za drugu komponentu DBDpp fuzije.
[0237] U drugom otelotvorenju, DBDpp može biti operativno vezan sa drugom komponentom DBDpp fuzionog proteina putem linkera. DBDpp fuzioni proteini mogu da sadrže jedan linker, više linkera, ili nijedan linker. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži DBDpp operativno vezan sa drugom komponentom DBDpp fuzionog proteina putem linkerskog peptida. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija sadrži najmanje 2, 3, 4 ili 5 DBD operativno vezanih sa drugom komponentom DBDpp fuzionog proteina putem linkerskog peptida.
[0238] Linkeri mogu biti bilo koje veličine ili kompozicije sve dok su sposobni da operativno vezuju DBDpp na način koji omogućava DBDpp da vezuje cilj od interesa. U nekim otelotvorenjima, linkeri su oko 1 do oko 100 aminokiselina, oko 1 do oko 50 aminokiselina, oko 1 do 20 aminokiselina, oko 1 do 15 aminokiselina, oko 1 do 10 aminokiselina, oko 1 do 5 aminokiselina, oko 2 do 20 aminokiselina, oko 2 do 15 aminokiselina, oko 2 do 10 aminokiselina ili oko 2 do 5 aminokiselina. Trebalo bi da je jasno da dužina, stepen fleksibilnosti i/ili druga svojstva linkera mogu da imaju određeni uticaj na svojstva finalnog polipeptida iz pronalaska, uključujući, bez ograničenja, afinitet, specifičnost ili avidnost prema cilju od interesa, ili prema jednom ili više drugih ciljnih proteina od interesa. Kada se dva ili više linkera koriste u DBDpp fuzionim proteinima, ti linkeri mogu biti isti ili različiti. U ovde datom kontekstu i otkriću, stručnjak će moći rutinski da utvrdi optimalnu kompoziciju i dužinu linkera za svrhe operativnog vezivanja DBDpp i drugih komponenata DBDpp fuzionog proteina.
[0239] Linker takođe može biti nepeptidni linker, kao što je alkil linker ili PEG linker. Na primer, mogu da se koriste alkil linkeri kao što je -NH-(CH2)s-C(0)-, pri čemu je s=2-20. Ovi alkil linkeri mogu dalje da se supstituišu bilo kojom grupom bez sternih smetnji, kao što je niža alkil, npr. C1 C6), niža acil, halogen (npr. Cl, Br), CN, NH2, fenil, itd. Primer nepeptidnog linkera je PEG linker. U određenim otelotvorenjima, PEG linker ima molekulsku masu od oko 100 do 5000 kDa, ili oko 100 do 500 kDa.
[0240] Pogodni linkeri za kuplovanje DBDpp i komponenata DBDpp fuzionog proteina hemijskom biokonjugacijom uključuju, ali nisu ograničeni na, homo-bifunkcionalna hemijska biokonjugujuća jedinjenja kao što je glutaraldehid, imidoestre kao što su dimetil adipimidat (DMA), dimetil suberimidat (DMS) i dimetil pimelimidat (DMP), ili N-hidroksi sukcinimidne (NHS) estre kao što su ditiobis(sukcinimidil propionat) (DSP) i ditiobis (sulfosukcinimidil propionat) (DTSSP). Primeri za pogodne linkere za kuplovanje DBDpp i komponente DBDpp fuzionog proteina heterobifunkcionalnih reagensa za biokonjugaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, biokonjugatore sa jednim aminoreaktivnim krajem i sulfhidril-reaktivnim ostatkom na drugom kraju, ili sa NHS estrom na jednom kraju i SH-reaktivnom grupom (npr. maleimid ili piridil).
[0241] U dodatnim otelotvorenjima, jedan ili više linkera u DBDpp fuzionom proteinu može da se otcepi. Primeri linkera koji mogu da se otcepe uključuju, bez ograničenja, peptidnu sekvencu koju prepoznaju proteaze (in vitro ili in vivo) različitih vrsti, kao što su Tev, trombin, faktor Xa, plazmin (proteaze krvi), metaloproteaze, katepsini (npr. GFLG, itd.) i proteaze koje se mogu naći u drugim delovima tela.
[0242] U jednom otelotvorenju, linker je „linker koji može da se otcepi“ koji olakšava otpuštanje DBDpp ili citotoksičnog agensa u ćeliji. Na primer, kiselo labilni linker (npr. hidrazon), linker osetljiv na proteazu (npr. osetljiv na peptidazu), fotolabilni linker, dimetil linker ili linker koji sadrži disulfid (Chari, Can. Res.52:127-131 (1992); U.S. pat. br.5,208,020; U.S. Appl. Pub. br.20090110753; sve u celini obuhvaćeno referencom) može da se koristi kada je poželjno da kovalentna veza između DBDpp ili citotoksičnog agensa i fuzionog partnera bude intracelularno otcepljena kada se kompozicija internalizuje u ćeliji. Termini „intracelularno raskinut“ i „intracelularno cepanje“ odnose se na metabolički proces ili reakciju u ćeliji na konjugatu DBDpp lek kada je kovalenta veza, tj. veza putem linkera između DBDpp i citotoksičnog agensa, DBDpp i fuzionog partnera ili između dva DBDpp raskinuta, što dovodi do slobodnog DBDpp i/ili citotoksičnog agensa disociranog u ćeliji.
[0243] Optimizacija linkera može da se proceni koristeći tehnike koje su ovde opisane i/ili su inače poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, linkeri ne ometaju sposobnost DBDpp da vezuje ciljni molekul i/ili drugu komponentu DBDpp fuzionog proteina kao što je domen ili fragment antitela za vezivanje antigena.
11
DBDpp kao hemijski konjugati
[0244] DBDpp koji promovišu specifično vezivanje za ciljeve od interesa mogu biti hemijski konjugovani sa različitim jedinjenjima kao što su fluorescentne boje, radioizotopi, hromatografske kompozicije (npr. perlice, smole, gelovi, itd.) i hemoterapeutski agensi. DBDpp konjugati imaju namene koje uključuju, ali nisu ograničene na, prečišćavanje, dijagnostičku, analitičku, proizvodnu i terapeutsku primenu.
[0245] Urođeni nedostatak cisteina u sekvenci DBD pruža priliku za uvođenje jedinstvenih cisteina u svrhu konjugacije specifične za mesto.
[0246] U nekim otelotvorenjima, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) sadrži najmanje jedan reaktivni ostatak. Reaktivni ostaci su korisni, na primer, kao mesta za vezivanje konjugata, poput hemoterapeutskih lekova. Reaktivni ostatak može biti, na primer, cistein, lizin, ili drugi reaktivni ostatak. Dakle, cistein se može dodati u DBDpp na N ili C terminusu, ili unutar sekvence DBDpp. Cistein može da se supstituiše umesto druge aminokiseline u sekvenci DBDpp. Pored toga, lizin može da se doda u DBDpp na bilo kom kraju ili unutar sekvence DBDpp i/ili lizin može da se supstituiše umesto druge aminokiseline u sekvenci DBDpp. U jednom otelotvorenju, reaktivni ostatak (npr. cistein, lizin, itd.) lociran je u sekvenci petlje DBD (npr. Z1i Z2SEQ ID NO:7-11). U jednom otelotvorenju, reaktivni ostatak je lociran između komponenata DBDpp fuzije, npr. u linkeru lociranom između DBDpp i druge komponente DBDpp fuzionog proteina. Reaktivni ostatak (npr. cistein, lizin, itd.) takođe može biti lociran unutar sekvence DBDpp ili druge komponente DBDpp fuzionog proteina. U jednom otelotvorenju, DBDpp ili DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje jedan, najmanje dva, najmanje tri reaktivna ostatka. U jednom otelotvorenju, DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein sadrži najmanje jedan, najmanje dva, ili najmanje tri cisteinska ostatka.
Proizvodnja DBDpp
[0247] Proizvodnja DBDpp, korisna u praktikovanju datih postupaka, može da se sprovede koristeći različite standardne tehnike za hemijsku sintezu, polusintetičke postupke i rekombinantne metodologije DNK koje su poznate u struci. Takođe je obezbeđen postupak za proizvodnju DBDpp, pojedinačno ili u okviru multidomenskog fuzionog proteina, kao rastvorljivih agensa i proteina povezanih sa ćelijom.
[0248] U nekoliko otelotvorenja, ukupna proizvodna šema za DBDpp obuhvata dobijanje skeleta referentnog proteina i identifikaciju više ostataka u skeletu za modifikacije. U zavisnosti od otelotvorenja, referentni skelet može da sadrži proteinsku strukturu sa jednim ili više regiona alfa spirale, ili drugu tercijarnu strukturu. Nakon identifikacije, više ostataka može da se modifikuje, na primer, supstitucijom aminokiseline. U nekim otelotvorenjima, supstitucija je konzervativna, dok su u drugim otelotvorenjima načinjene nekonzervativne supstitucije. U nekim otelotvorenjima, prirodna aminokiselina (npr. jedna od alanina, arginina, asparagina, asparaginske kiseline, cisteina, glutamina, glutaminske kiseline, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina ili valina) supstituisana je u referentni skelet na ciljanoj poziciji za modifikaciju. U određenim otelotvorenjima, modifikacije ne uključuju supstituciju cisteinom niti prolinom. Nakon što su načinjene modifikacije na svim identifikovanim pozicijama željenim u određenom otelotvorenju, nastali modifikovani polipeptidi (npr. kandidat za DBDpp) mogu se rekombinantno eksprimirati, na primer u plazmidu, bakteriji, fagu, ili drugom vektoru (npr. radi povećanja broja svakog od modifikovanih polipeptida). Modifikovani polipeptidi zatim mogu da se prečiste i ispitaju kako bi se identifikovali oni modifikovani polipeptidi koji imaju specifično vezivanje za određeni cilj od interesa. U nekoliko otelotvorenja, određeni modifikovani polipeptidi će pokazati poboljšanu specifičnost vezivanja za cilj od interesa u odnosu na referentni skelet, koji u nekim otelotvorenjima može da pokazuje malo ili nepostojeće vezivanje za dati cilj od interesa. U dodatnim otelotvorenjima, u zavisnosti od cilja od interesa, referentni skelet može da pokazuje određenu interakciju (npr. nespecifičnu interakciju) sa ciljem od interesa, dok će određeni modifikovani polipeptidi pokazivati najmanje oko dva puta, najmanje oko pet puta, najmanje oko 10 puta, najmanje oko 20 puta, najmanje oko 50 puta, ili najmanje oko 100 puta (ili više) veću specifičnost vezivanja za cilj od interesa. Opciono, referentna sekvenca i/ili modifikovani polipeptidi (npr. DBDpp) mogu biti deimunizovani. Na primer, ostaci ili motivi koji su potencijalno imunogeni mogu biti identifikovani i modifikovani kako bi se smanjili ili eliminisali potencijalni imunski odgovori na DBDpp. Dodatni podaci vezani za različita otelotvorenja proizvodnje, selekcije i izolovanja DBDpp su detaljnije obezbeđeni u nastavku.
Rekombinantna ekspresija DBDpp
11
[0249] U nekim otelotvorenjima, DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein je „rekombinantno proizveden“ (tj. proizveden koristeći tehnologiju rekombinantne DNK). Primeri rekombinantnih postupaka koji su dostupni za sintezu DBDpp fuzionih proteina uključuju, ali nisu ograničeni na, sintezu na osnovu lančane reakcije polimeraze (PCR), konkatemerizaciju, precizno kloniranje i rekurzivnu usmerenu ligaciju (RLD) (vidite, npr. Meyer et al. Biomacromolecules 3:357-367 (2002), Kurihara et al. Biotechnol. Lett. 27:665-670 (2005), Haider et al. Mol. Pharm.2:139-150 (2005); i McMillan et al.32:3643-3646 (1999), čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom).
[0250] Takođe su obezbeđene nukleinske kiseline koje sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira DBDpp. Takvi polinukleotidi opciono dalje sadrže jedan ili više elemenata za kontrolu ekspresije. Na primer, polinukleotid može da sadrži jedan ili više promotera ili pojačavača transkripcije, mesta vezivanja ribozoma, signala za prekid transkripcije i poliadenilacionih signala, kao elemente za kontrolu ekspresije. Polinukleotid može da se ubaci u bilo koji odgovarajući vektor koji može da se nalazi u bilo kojoj odgovarajućoj ćeliji domaćinu za ekspresiju.
[0251] Ekspresija nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp se obično postiže operativnim povezivanjem nukleinske kiseline koja kodira DBDpp sa promoterom u ekspresionom vektoru. Uobičajeni ekspresioni vektori sadrže terminatore transkripcije i translacije, inicirajuće sekvence i promotere korisne za regulaciju ekspresije željene sekvence nukleinske kiseline. Postupci koji su poznati u struci mogu da se koriste za rutinsko konstruisanje ekspresionih vektora koji sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira DBDpp zajedno sa odgovarajućim kontrolnim signalima za transkripciju/translaciju. Ovi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, in vitro tehnike rekombinantne DNK, sintetičke tehnike i in vivo rekombinaciju/genetsku rekombinaciju. Ekspresija polinukleotida može da se ostvari u bilo kom pogodnom ekspresionom domaćinu koji je poznat u struci, uključujući, bez ograničenja, bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekata, biljne ćelije ili ćelije sisara. U jednom otelotvorenju, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira DBDpp je operativno vezana za odgovarajuću sekvencu promotera tako da je sekvenca nukleinske kiseline transkribovana i/ili prevedena u DBDpp u domaćinu. Promoteri koji su korisni za ekspresiju u E. coli uključuju, ali nisu ograničeni na, T7 promoter.
11
[0252] U jednom otelotvorenju, vektor koji sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira DBDpp je uveden u ćeliju domaćina (npr. fagemid) za ekspresiju DBDpp. Vektor može ostati epizomski ili postati hromozomski integrisan, sve dok terapeutski agens koji kodira insert može da se transkribuje. Vektori mogu da se konstruišu standardnom tehnologijom rekombinantne DNK. Vektori mogu biti plazmidi, fagi, kozmidi, fagemidi, virusi, ili bilo koje druge vrste poznate u struci koje se koriste za replikaciju i ekspresiju u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama. Stručnjaku će biti jasno da širok dijapazon komponenata koje su poznate u struci (kao što su elementi za kontrolu ekspresije) može biti uključen u takve vektore, uključujući širok dijapazon transkripcionih signala, kao što su promoteri i druge sekvence koje regulišu vezivanje RNK polimeraze za promoter. Bilo koji promotor za koji je poznato ili je dokazano da je efikasan u ćelijama u kojima će se vektor eksprimirati može da se koristi za pokretanje ekspresije DBDpp. Prikladni promoteri mogu biti inducibilni (npr. regulisani) ili konstitutivni. Neograničavajući primeri pogodnih promotera uključuju region ranog promotera SV40, promoter sadržan u 3' dugačkom terminalnom ponavljanju Rausovog virusa sarkoma, promoter timidin kinaze HSV-1 (herpes simpleks virus-1), regulatorne sekvence gena metalotioneina, itd., kao i sledeće regione kontrole transkripcije životinja, koji pokazuju specifičnost tkiva i korišćeni su kod transgenih životinja: region za kontrolu gena elastaze I koji je aktivan u acinarnim ćelijama pankreasa; region za kontrolu gena insulina koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa, region za kontrolu virusa mišjeg tumora mlečnih žlezda koji je aktivan u ćelijama testisa, dojke, limfoidnim ćelijama i mastocitima, region za kontrolu gena albumina koji je aktivan u jetri, region za kontrolu alfa-fetoproteina koji je aktivan u jetri, region za kontrolu gena alfa 1-antitripsina koji je aktivan u jetri, region za kontrolu gena beta-globina koji je aktivan u eritroidnim ćelijama, region za kontrolu mijelinskog baznog proteinskog gena koji je aktivan u ćelijama oligodendrocita u mozgu, region za kontrolu gena lakog lanca-2 miozina koji je aktivan u skeletnim mišićima, i region za kontrolu gena gonadotropin-oslobađajućeg hormona koji je aktivan u hipotalamusu. U posebnom otelotvorenju, promoter je region za kontrolu gena imunoglobulina koji je aktivan u limfoidnim ćelijama.
[0253] U jednom otelotvorenju, jedna ili nekoliko nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp je eksprimirana pod kontrolom konstitutivnog promotera ili, alternativno, regulisanog ekspresionog sistema. Prikladni regulisani ekspresioni sistemi uključuju, ali nisu ograničeni na, ekspresioni sistem regulisan tetraciklinom, ekspresioni sistem inducibilan ekdizonom, lacswitch ekspresioni sistem, glukokortikoinducibilni ekspresioni sistem, promoterski sistem inducibilan temperaturom i metalotioneinski metalinducibilni ekspresioni sistem. Ako je u
11
sistemu ćelije domaćina sadržano nekoliko različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp, neke od nukleinskih kiselina mogu da se eksprimiraju pod kontrolom konstitutivnog promotera, dok druge mogu da se eksprimiraju pod kontrolom regulisanog promotera. Nivoi ekspresije mogu da se odrede postupcima koji su poznati u struci, uključujući vestern blot analizu i nortern blot analizu.
[0254] Različiti sistemi domaćin-ekspresioni vektor mogu da se koriste za ekspresiju nukleinske kiseline koja kodira DBDpp. Vektori koji sadrže nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp (npr. pojedinačne podjedinice DBDpp fuzija) ili njihove fragmente ili delove uključuju plazmidne vektore, jednolančane i dvolančane vektore faga, kao i virusne vektore jednolančane i dvolančane RNK ili DNK. Fagi i virusni vektori mogu takođe da se uvedu u ćelije domaćine u obliku upakovanog ili enkapsuliranog virusa koristeći poznate tehnike za infekciju i transdukciju. Štaviše, virusni vektori mogu biti sposobni za replikaciju ili, pak, sa nedostatkom replikacije. Alternativno, sistemi za translaciju bez ćelija mogu takođe da se koriste za proizvodnju proteina koristeći RNK dobijene od ekspresionih konstrukata DNK (vidite, npr. WO86/05807 i WO89/01036; i U.S. pat. br. 5,122,464, svaki je ovde u celosti obuhvaćen referencom).
[0255] Uopšteno, bilo koja vrsta ćelija ili uzgajane ćelijske linije mogu da se koriste za ekspresiju ovde obezbeđenog DBDpp. U nekim otelotvorenjima, osnovna ćelijska linija koja se koristi za stvaranje konstruisane ćelije domaćina je fag, bakterijska ćelija, ćelija kvasca ili ćelija sisara. Različiti sistemi domaćin-ekspresioni vektor mogu da se koriste za ekspresiju kodirajuće sekvence DBDpp fuzionog proteina. Ćelije sisara mogu da se koriste kao sistemi ćelija domaćina transficirani ekspresionim vektorima rekombinantne plazmidne DNK ili kozmidne DNK koji sadrže kodirajuću sekvencu cilja od interesa i kodirajuću sekvencu fuzionog polipeptida.
[0256] Ćelije mogu biti primarni izolati iz organizama (uključujući čoveka), kulture, ili ćelijske linije transformisanog ili transgenog karaktera. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ljudska ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je ljudska T ćelija. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin je dobijena od ljudskog pacijenta.
[0257] Korisne ćelije domaćini uključuju, ali nisu ograničene na, mikroorganizme kao što su bakterije (npr. E. coli, B. subtilis) transformisane ekspresionim vektorima rekombinantne DNK
11
bakteriofaga, plazmidne DNK ili kozmidne DNK koji sadrže sekvence koje kodiraju DBDpp; kvasac (npr. Saccharomyces, Pichia) transformisan rekombinantnim ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže sekvence koje kodiraju DBDpp; sistemi ćelija insekata inficirani rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvence koje kodiraju DBDpp; sistemi ćelija biljaka inficirani rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisani rekombinantnim ekspresionim vektorima plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvence za kodiranje DBDpp. U određenim otelotvorenjima, za proizvodnju DBDpp se koriste sistemi ćelija sisara. Sistemi ćelija sisara obično koriste rekombinantne ekspresione konstrukte koji sadrže promotere dobijene iz genoma ćelija sisara (npr. metalotioneinski promoter) ili iz virusa sisara (npr. kasni promoter adenovirusa, 7.5K promoter virusa vakcinija).
[0258] Prokarioti korisni kao ćelije domaćini u proizvodnji DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein, uključuju gram negativne ili gram pozitivne organizme, kao što su E. coli i B. subtilis. Ekspresioni vektori za upotrebu u prokariotskim ćelijama domaćinima obično sadrže jedan ili više fenotipski selektabilnih marker gena (npr. geni koji kodiraju proteine koji daju otpornost na antibiotike ili koji ispunjavaju autotrofni zahtev). Primeri korisnih ekspresionih vektora prokariotskog domaćina uključuju pKK223-3 (Pharmacia, Uppsala, Švedska), pGEM1 (Promega, Wis., SAD), pET (Novagen, Wis., SAD) i pRSET (Invitrogen, Calif., SAD) serije vektora (vidite, npr. Studier, J. Mol. Biol. 219:37 (1991) i Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). Primeri sekvenci promotera koji se često koriste u ekspresionim vektorima prokariotske ćelije domaćina uključuju T7, (Rosenberg et al. Gene 56:125-135 (1987)), beta-laktamazu (penicilinaza), laktozni promoterski sistem (Chang et al. Nature 275:615 (1978)); i Goeddel et al. Nature 281:544 (1979)), triptofanski (trp) promoterski sistem (Goeddel et al. Nucl. Acids Res. 8:4057, (1980)), i tac promoter (Sambrook et al.1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. izd. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.).
[0259] U jednom otelotvorenju, koriste se sistemi eukariotskih ćelija domaćina, uključujući ćelije kvasca transformisane ekspresionim vektorima kvasca koji sadrže kodirajuće sekvence DBDpp, kao što su ekspresioni sistemi razmatrani u U.S. Appl. br.60/344,169 i WO03/056914 (postupci za proizvodnju glikoproteina nalik na humani u nehumanoj eukariotskoj ćeliji domaćinu) (sadržaj oba je u celini obuhvaćen referencom). Primer kvasca koji može da se koristi za proizvodnju kompozicija iz pronalaska, kao što je DBD, uključuje kvasac iz roda Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes i Kluyveromyces. Vektori kvasca obično sadrže
11
sekvencu porekla replikacije iz 2mu plazmida kvasca, autonomno replikujuću sekvencu (ARS), region promotera, sekvence za poliadenilaciju, sekvence za terminaciju transkripcije i selektabilni marker gen. Primeri sekvenci promotera u ekspresionim konstruktima kvasca uključuju promotere iz metalotioneina, 3-fosfoglicerat kinaze (Hitzeman, J. Biol. Chem.
255:2073 (1980)) i drugih glikolitičkih enzima, kao što su enolaza, gliceraldehid-3 -fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfo glicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza. Dodatni prikladni vektori i promotori za upotrebu u protokolima za ekspresiju kvasca, kao i za transformaciju kvasca, poznati su u struci. Vidite, npr. Fleer, Gene 107:285-195 (1991) i Hinnen, PNAS 75:1929 (1978).
[0260] Sistemi za uzgajanje ćelija domaćina insekta i biljke su takođe korisni za proizvodnju kompozicija iz pronalaska. Takvi sistemi ćelija domaćina uključuju, na primer, sisteme ćelija insekata inficirane ekspresionim vektorima rekombinantnog virusa (npr. bakulovirus) koji sadrže sekvencu za kodiranje DBD; sisteme ćelija biljaka inficirane rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. virus mozaika karfiola, CaMV; virus mozaika duvana, TMV) ili transformisane rekombinantnim ekspresionim vektorima plazmida (npr. Ti plazmid) koji sadrže sekvencu za kodiranje DBD, uključujući, bez ograničenja, ekspresione sisteme razmotrene u U.S. pat. br. 6,815,184; U.S. publ. br. 60/365,769 i 60/368,047; i WO2004/057002, WO2004/024927 i WO2003/078614, čiji sadržaj je ovde u celini obuhvaćen referencom.
[0261] U dodatnom otelotvorenju, mogu da se koriste sistemi ćelija domaćina, uključujući sisteme životinjskih ćelija inficirane rekombinantnim ekspresionim vektorima virusa (npr. adenovirusi, retrovirusi, adenoasocirani virusi, virusi herpesa, lentivirusi), uključujući ćelijske linije konstruisane da sadrže više kopija DNK koja kodira DBDpp stabilno amplifikovan (CHO/dhfr) ili nestabilno amplifikovan u dvostruko minijaturne hromozome (npr. mišje ćelijske linije). U jednom otelotvorenju, vektor koji sadrži polinukleotid(e) koji kodira DBDpp je policistronski. Primeri ćelija sisara koje su korisne za proizvodnju ovih kompozicija uključuju 293 ćelije (npr.293T i 293F), CHO ćelije, BHK ćelije, NS0 ćelije, SP2/0 ćelije, YO ćelije mijeloma, P3X63 ćelije mišjeg mijeloma, PER ćelije, PER.C6 (Crucell, Holandija) ćelije VERY, Hela ćelije, COS ćelije, MDCK ćelije, 3T3 ćelije, W138 ćelije, BT483 ćelije, Hs578T ćelije, HTB2 ćelije, BT20 ćelije, T47D ćelije, CRL7O30 ćelije, HsS78Bst ćelije, ćelije hibridoma, i druge ćelije sisara. Dodatni primeri sisarskih ćelija domaćina koje su korisne u
12
praktikovanju pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, T ćelije. Neki primeri ekspresionih sistema i postupaka selekcije su opisani u sledećim referencama, i referencama navedenim u njima: Borth et al. Biotechnol. Bioen. 71(4):266-73 (2000), u Werner et al. Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8):870-80 (1998), Andersen et al. Curr. Op. Biotechnol.
13:117-123 (2002), Chadd et al. Curr. Op, Biotechnol. 12:188-194 (2001), i Giddings, Curr. Op. Biotechnol.12:450-454 (2001). Dodatni primeri ekspresionih sistema i postupaka selekcije su opisani u Logan et al. PNAS 81:355-359 (1984), Birtner et al. Methods Enzymol.153:51-544 (1987)). Transkripcione i translacione kontrolne sekvence za ekspresione vektore sisarskih ćelija domaćina često se dobijaju od virusnih genoma. Uobičajeno korišćene promoterske sekvence i pojačavačke sekvence u ekspresionim vektorima sisara uključuju sekvence dobijene od poliomavirusa, adenovirusa 2, Simijan virusa 40 (SV40) i humanog citomegalovirusa (CMV). Primeri komercijalno dostupnih ekspresionih vektora za upotrebu u sisarskim ćelijama domaćinima uključuju pCEP4 (Invitrogen) i pcDNA3 (Invitrogen).
[0262] Fizički postupci za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju domaćina (npr. sisarsku ćeliju domaćina) uključuju taloženje kalcijum fosfata, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjekciju, elektroporaciju i slično. Postupci za proizvodnju ćelija koje sadrže vektore i/ili egzogene nukleinske kiseline dobro su poznati u struci. Vidite, na primer, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York).
[0263] Biološki postupci za uvođenje polinukleotida od interesa u ćeliju domaćina uključuju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori, a posebno retrovirusni vektori, postali su najčešće korišćeni postupak za inserciju gena u ćelije sisara (npr. čoveka). Ostali virusni vektori mogu da se dobiju od lentivirusa, virusa boginja, herpes simpleks virusa I, adenovirusa i adenoasociranih virusa i slično. Vidite, na primer, U.S. pat. br.5,350,674 i 5,585,362, čiji je sadržaj u celini ovde obuhvaćen referencom.
[0264] Postupci uvođenja DNK i RNK polinukleotida od interesa u ćeliju domaćina uključuju elektroporaciju ćelija, kada se električno polje nanosi na ćelije kako bi se povećala propustljivost ćelijske membrane, što omogućava uvođenje hemikalija, lekova ili polinukleotida u ćeliju. DBDpp koji sadrži DNK ili RNK konstrukte može da se uvede u sisarsku ili prokariotsku ćeliju koristeći elektroporaciju.
[0265] U poželjnom otelotvorenju, elektroporacija ćelija dovodi do ekspresije DBDpp-CAR na površini T ćelija, NK ćelija, NKT ćelija. Takva ekspresija može biti prolazna ili stabilna tokom života ćelije. Elektroporacija može da se postigne postupcima koji su poznati u struci uključujući MaxCyte GT® i STX® sisteme transfekcije (MaxCyte, Gaithersburg, MD, SAD).
[0266] Hemijska sredstva za uvođenje polinukleotida u ćeliju domaćina uključuju koloidne disperzione sisteme, kao što su makromolekulski kompleksi, nanokapsule, mikrosfere, perlice, i sistemi na bazi sistema uključujući emulzije ulje-u-vodi, micele, mešovite micele i lipozome. Primer koloidnog sistema za upotrebu kao vehikulum za isporuku in vitro i in vivo je lipozom (npr. veštačka membranska vezikula). U slučaju kada se koristi nevirusni sistem za dostavu, primer vehikuluma za isporuku je lipozom. Upotreba lipidnih formulacija se razmatra za uvođenje nukleinskih kiselina u ćeliju domaćina (in vitro, ex vivo ili in vivo). U drugom aspektu, nukleinska kiselina može biti povezana sa lipidom. Nukleinska kiselina povezana sa lipidom može biti inkapsulirana u vodenoj unutrašnjosti lipozoma, raštrkana u lipidnom dvostrukom sloju lipozoma, vezana za lipozom putem vezujućeg molekula koji je povezan i sa lipozomom i sa oligonukleotidom, obuhvaćena u lipozomu, kompleksirana sa lipozomom, dispergovana u rastvoru koji sadrži lipid, pomešana sa lipidom, kombinovana sa lipidom, sadržana kao suspenzija u lipidu, sadržana ili kompleksirana sa micelom ili na drugi način povezana sa lipidom. Kompozicije povezane sa lipidom, lipidom/DNK ili lipidom/ekspresionim vektorom nisu ograničene ni na jednu određenu strukturu u rastvoru. Na primer, mogu biti prisutne u dvoslojnoj strukturi, kao micele ili sa „urušenom“ strukturom. Takođe mogu jednostavno biti raštrkane u rastvoru, pri čemu mogu da grade agregate koji nisu uniformne veličine ili oblika. Lipidi su masne supstance koje mogu biti prirodni ili sintetički lipidi. Na primer, lipidi uključuju masne kapljice koje se prirodno javljaju u citoplazmi, kao i klasu jedinjenja koja sadrže alifatične ugljovodonike sa dugačkim lancem i njihove derivate, kao što su masne kiseline, alkoholi, amini, amino alkoholi i aldehidi.
[0267] Lipidi pogodni za upotrebu mogu se dobiti iz komercijalnih izvora. Na primer, dimiristoil fosfatidilholin („DMPC“) može se nabaviti od kompanije Sigma, St. Louis, MO; dicetil fosfat („DCP“) može se nabaviti od kompanije K & K Laboratories (Plainview, NY); holesterol („Choi“) može se nabaviti od kompanije Calbiochem-Behring; dimiristoil fosfatidilglicerol („DMPG“) i drugi lipidi mogu se nabaviti od kompanije Avanti Polar Lipids, Inc. (Birmingham, AL). Osnovni rastvori lipida u hloroformu ili hloroformu/metanolu mogu da se čuvaju na oko -20°C. Hloroform može da se koristi kao jedini rastvarač pošto se lakše uparava nego metanol. „Lipozom“ je generički termin koji obuhvata različite pojedinačne i multilamelarne lipidne vehikulume nastale stvaranjem obuhvaćenih lipidnih dvostrukih slojeva ili agregata. Lipozomi mogu da se okarakterišu kao vezikularne strukture sa dvoslojnom fosfolipidnom membranom i unutrašnjim vodenim medijumom. Multilamelarni lipozomi imaju višestruke slojeve lipida razdvojene vodenim medijumom. Spontano nastaju kada se fosfolipidi suspenduju u previše vodenog rastvora. Komponente lipida podvrgavaju se samopreuređivanju pre stvaranja zatvorenih struktura i hvataju vodu i rastvorene supstance između lipidnih dvoslojeva (Ghosh et al. Glycobiology 5:505-510 (1991)). Međutim, obuhvaćene su i kompozicije koje imaju različite strukture u rastvoru od normalne vezikularne strukture. Na primer, lipidi mogu da poprime micelarnu strukturu ili jednostavno postoje kao neuniformni agregati lipidnih molekula. Takođe se razmatraju kompleksi lipofektaminnukleinska kiselina.
[0268] Bez obzira na postupak koji se koristi za uvođenje egzogenih nukleinskih kiselina u ćeliju domaćina, ili prisustvo sekvence rekombinantne nukleinske kiseline u ćeliji domaćinu može da se potvrdi različitim testovima koji su poznati u struci. Takvi testovi uključuju, na primer, „molekulske biološke“ testove koji su poznati u struci, kao što su sautern i nortern blot, RT-PCR i PCR, „biohemijske“ testove, kao što su detekcija prisustva ili odsustva određenog peptida, npr. putem imunoloških sredstava (ELISA i vestern blot) ili putem testova koji su ovde opisani za identifikovanje agenasa koji spadaju u opseg pronalaska.
[0269] Reporterski geni se koriste za identifikovanje potencijalno transficiranih ćelija i za procenu funkcionalnosti regulatornih sekvenci. Uopšteno, reporterski gen je gen koji nije prisutan u ili eksprimiran od strane organizma, tkiva ili ćelije primaoca i koji kodira polipeptid čija ekspresija se manifestuje nekim svojstvom koje se lako može identifikovati, npr. enzimskom aktivnošću. Ekspresija reporterskog gena se ispituje u odgovarajućem trenutku nakon što je DNK uvedena u ćelije primaoce. Neograničavajući spisak odgovarajućih reporterskih gena može da uključuje gene koji kodiraju luciferazu, beta-galaktozidazu, hloramfenikol acetil transferazu, izlučenu alkalnu fosfatazu ili gen zelenog fluorescentnog proteina (npr. Ui-Tei et al. FEBS Lett. 479:79-82 (2000)). Prikladni ekspresioni sistemi su poznati u struci i mogu da se pripreme koristeći poznate tehnike ili da se nabave komercijalnim putem. Uopšteno, konstrukt sa minimalnim 5' bočnim regionom koji pokazuje najviši nivo ekspresije reporterskog gena je identifikovan kao promoter. Takvi promoterski regioni mogu
12
rutinski da se povežu sa reporterskim genom i koriste za procenu agenasa na njihovu sposobnost da moduliraju transkripciju koju pokreće promoter.
[0270] Brojni selekcioni sistemi mogu da se koriste u ekspresionim sistemima domaćin sisarvektor, uključujući, bez ograničenja, timidin kinaze virusa herpes simpleks, gene hipoksantinguanin fosforiboziltransferazu i adenin fosforiboziltransferazu (Lowy et al. Cell 22:817 (1980)) koji mogu da se koriste u tk-, hgprt-, odnosno aprt<->ćelijama. Pored toga, rezistencija na antimetabolite može da se koristi kao osnova za odabir npr. dhfr, gpt, neo, hygro, trpB, hisD, ODC (ornitin dekarboksilaza) i sistema glutamin sintaze.
Prečišćavanje DBDpp
[0271] Nakon što je DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein proizveden putem rekombinantne ekspresije, on može da se prečisti bilo kojim postupkom koji je poznat u struci za prečišćavanje rekombinantnog proteina, na primer, putem hromatografije (npr. jonoizmenjivačka, afinitetna i hromatografija na molekulskim sitima), centrifugiranja, diferencijalne rastvorljivosti ili putem bilo koje druge standardne tehnike za prečišćavanje proteina. U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp su opciono fuzionisani sa sekvencama heterologih polipeptida koje su ovde opisane ili su inače poznate u struci radi olakšavanja prečišćavanja. Konkretnije, predviđeno je da ligandi (npr. antitela i druge afinitetne matrice) za DBDpp afinitetne kolone za afinitetno prečišćavanje i opciono, DBDpp ili druge komponente DBDpp fuzione kompozicije koje su vezane ovim ligandima su uklonjene iz kompozicije pre finalne pripreme DBDpp koristeći tehnike poznate u struci.
Ekspresija DBDpp povezanog sa ćelijom
[0272] U drugom otelotvorenju pronalaska, proizvodnja DBDpp daje DBDpp kompozicije povezane sa ćelijom. Na primer, ekspresija rekombinantnih vektora koji kodiraju DBDpp koji je operativno vezan sa sidrom ćelijske membrane ili transmembranskim domenom ima potencijal da ostane povezana sa ćelijom. DBDpp koji sadrži himerne receptore antigena namerno su povezani sa ćelijama i koriste se u kontekstu ćelije u kojoj se eksprimiraju. Jedno posebno otelotvorenje se odnosi na strategiju adoptivnog ćelijskog transfera T ćelija koje su transdukovane da eksprimiraju DBDpp himerni receptor antigena (CAR). Ćelija poželjno može biti genetski modifikovana da stabilno eksprimira DBDpp na svojoj površini, što daje novu specifičnost za cilj koja je nezavisna od MHC.
[0273] Različiti vektori dobijeni od virusa mogu da se koriste u primenama u kojima se virusi koriste za transfekciju i integraciju u genom ćelije sisara. Virusi koji su korisni kao vektori uključuju, ali nisu ograničeni na, retroviruse, adenoviruse, adeno-asocirane viruse, herpes viruse i lentiviruse. Lentivirusni vektori su posebno pogodni za postizanje dugoročnog transfera gena (npr. adoptivna imunoterapija T ćelijama) jer omogućavaju dugoročnu, stabilnu integraciju transgena i njegovo širenje u ćelijama ćerkama. Lentivirusni vektori imaju dodatnu prednost u odnosu na vektore dobijene od onko-retrovirusa, poput virusa mišje leukemije, u tome što mogu da transdukuju neproliferirajuće ćelije, poput hepatocita. Oni takođe imaju dodatnu prednost male imunogenosti. Uopšteno, pogodan vektor sadrži poreklo replikacije funkcionalno u najmanje jednom organizmu, promotersku sekvencu, odgovarajuća mesta restrikcione endonukleaze i jedan ili više selektabilnih markera (npr. WO 01/96584 i WO 01/29058; i U.S. pat. br.6,326,193). Nekoliko vektorskih promoterskih sekvenci je dostupno za ekspresiju transgena. Jedan od primera pogodnog promotera je neposredna sekvenca promotera ranog citomegalovirusa (CMV). Ova promoterska sekvenca je snažna konstitutivna promoterska sekvenca sposobna da pokreće visok nivo ekspresije bilo koje polinukleotidne sekvence koja je operativno povezana sa njom. Drugi primer pogodnog promotera je EF-1a. Međutim, mogu se koristiti i druge konstitutivne sekvence promotera, uključujući, ali bez ograničenja, rani promoter simijan virusa 40 (SV40), virus tumora mlečne žlezde miša (MMTV), promotor dugačkog terminalnog ponavljanja (LTR) virusa humane imunodeficijencije (HIV), MoMuLV promoter, promoter virusa ptičje leukemije, neposredni rani promoter Epštajn-Barovog virusa, promoter virusa Rausovog sarkoma, kao i promotere humanog gena kao što su, bez ograničenja, promoter aktina, promoter miozina, promoter hemoglobina i promoter kreatinske kinaze. Inducibilni promoteri uključuju, ali nisu ograničeni na promoter metalotioneina, promoter glukokortikoida, promoter progesterona i promoter tetraciklina.
[0274] Da bi se procenila ekspresija DBDpp-CAR polipeptida ili njegovih delova, ekspresioni vektor koji se uvodi u ćeliju može takođe da sadrži ili selektabilni marker gen ili reporterski gen ili oba kako bi se olakšala identifikacija i odabir ekspresionih ćelija iz populacije ćelija za koje se želi da se transficiraju ili inficiraju virusnim vektorima, u drugim aspektima, selektabilni marker može da se nosi na zasebnom delu DNK i koristi u postupku kotransfekcije.
12
I selektabilni markeri i reporterski geni mogu biti okruženi odgovarajućim regulatornim sekvencama kako bi se omogućila ekspresija u ćelijama domaćinima. Korisni selektabilni markeri uključuju, na primer, gene otpornosti na antibiotike kao što je neo i slično.
[0275] Pre ekspanzije i genetske modifikacije T ćelija iz pronalaska, izvor T ćelija se dobija od ispitanika. T ćelije mogu da se dobiju iz brojnih izvora, uključujući mononuklearne ćelije periferne krvi, koštanu srž, tkivo limfnih čvorova, pupčanu krv , tkivo timusa, tkivo sa mesta infekcije, ascites, pleuralnu efuziju, tkivo slezine i tumore. U određenim otelotvorenjima koja su ovde data, može da se koristi bilo koji broj linija T ćelija dostupan u struci.
[0276] Potpuna rasprava o postupcima izolacije, uzgajanja, aktivacije i ekspanzije T ćelija može se naći u WO 2012079000, čiji je sadržaj ovde u celosti uključen referencom.
[0277] Uz to je obezbeđena i ćelija domaćin koja sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju ovde opisani DBDpp. Dalje je obezbeđena kompozicija koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira DBDpp.
[0278] „Koekspresija“, kako se ovde koristi, odnosi se na istovremenu ekspresiju dve ili više sekvenci koje kodiraju protein. Kodirajuće sekvence mogu biti nukleinske kiseline koje kodiraju, na primer, jedan protein ili himerni protein kao jedan polipeptidni lanac.
Hemijska sinteza DBDpp
[0279] Pored rekombinantnih postupaka, proizvodnja DBDpp takođe može da se sprovede koristeći organsku hemijsku sintezu željenog polipeptida koristeći različite hemijske procese tečne i čvrste faze koji su poznati u struci. Različiti automatski sintetizatori komercijalno su dostupni i mogu da se koriste u skladu sa poznatim protokolima. Vidite, na primer, Tam et al. J. Am. Chem. Soc, 105:6442 (1983); Merrifield, Science 232:341-347 (1986); Barany i Merrifield, The Peptides, Gross i Meienhofer, izdav., Academic Press, New York, 1- 284; Barany et al. Int. J. Pep. Protein Res., 30:705739 (1987); Kelley et al. u Genetic Engineering Principles and Methods, Setlow, J. K., ed. Plenum Press, NY. 1990, sveska 12, str. 1-19; Stewart et al. Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, 1989. Jedna od prednosti ovih metodologija je što omogućavaju ugradnju neprirodnih aminokiselinskih ostataka u sekvencu DBDpp.
12
[0280] DBDpp koji se koriste u postupcima predmetnog pronalaska mogu da se modifikuju tokom sinteze ili translacije ili nakon nje, npr. glikozilacijom, acetilovanjem, benzilovanjem, fosforilacijom, amidacijom, pegilacijom, formilovanjem, derivatizacijom poznatim zaštitnim/blokirajućim grupama, proteolitičkim cepanjem, vezivanjem sa molekulom antitela, hidroksilacijom, jodovanjem, metilacijom, miristoilacijom, oksidacijom, pegilovanjem, proteolitičkom obradom, fosforilacijom, prenilacijom, racemizacijom, selenovanjem, sulfacijom, ubikvitinacijom, itd. (vidite, npr. Creighton, Proteins: Structures and Molecular Properties, 2. izd. (W.H. Freeman and Co., N.Y., 1992); Postranslational Covalent Modification of Proteins, Johnson, ed. (Academic Press, New York, 1983), str.1-12; Seifter, Meth. Enzymol., 182:626-646 (1990); Rattan, Ann. NY Acad. Sci., 663:48-62 (1992).) U specifičnim otelotvorenjima, peptidi su acetilovani na N-terminusu i/ili amidovani na C-terminusu.
[0281] Bilo koja od brojnih hemijskih modifikacija može da se izvrši poznatim tehnikama, uključujući, ali ne ograničavajući se na acetilovanje, formilovanje, itd. Pored toga, derivat može da sadrži jednu ili više neklasičnih aminokiselina.
Populacije DBDpp mogu biti predstavljene bibliotekama polipeptida
[0282] „Biblioteka“ DBDpp odnosi se na više jedinstvenih DBDpp. „Vektorska biblioteka“ DBDpp odnosi se na više jedinstvenih nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp. Ove biblioteke DBDpp mogu da se koriste za odabir i identifikaciju sekvenci koje promovišu vezivanje za specifične unapred određene ciljeve.
[0283] U jednom primeru, DBDpp su predstavljeni mešovitom populacijom ili bibliotekom različitih molekula DBDpp. Biblioteka DBDpp ne podrazumeva nikakva posebna ograničenja broja jedinstvenih molekula polipeptida. Biblioteka može da sadrži samo 3, 5, 6, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75 ili 100 jedinstvenih DBDpp, a može imati opseg veći od 1020 različitih DBDpp. U nekim primerima, biblioteka ima do oko 10<4>, 10<5>, 10<6>, 10<7>ili 10<8>jedinstvenih DBDpp. U daljim primerima, biblioteka ima do oko 10<12>različitih DBDpp.
[0284] U jednom primeru, populacija varijanti polipeptida se zasniva na sekvenci ostataka jezgra i varijanti ostataka. Na primer, varijante ostataka SEQ ID NO:3 su označene sa X, pri
12
čemu X može biti bilo koji ostatak aminokiseline nezavisno od identiteta bilo kog drugog ostatka označenog sa X u sekvenci. U određenim primerima, X može da sadrži praznu poziciju (npr. nema aminokiseline na tom mestu). U aminokiselinskoj sekvenci skele, različite aminokiseline X mogu da se izaberu od svih 20 aminokiselinskih ostataka koji se javljaju u prirodi na takav način da bilo koji od ovih 20 aminokiselinskih ostataka koji se javljaju u prirodi može biti prisutan na odgovarajućoj poziciji X u bilo kojoj datoj varijanti. Izbor aminokiselinskih ostataka na svakoj poziciji je manje ili više randomizovan, u zavisnosti od primera. Takođe je moguće ograničiti grupu iz koje se različiti raznovrsni aminokiselinski ostaci biraju na 19, 18, 17, 16 ili manje od 20 aminokiselinskih ostataka koji se javljaju u prirodi. Na primer, u nekim primerima, varijante ostataka nisu zamenjene cisteinom i/ili prolinom. Varijabilnost na različitim pozicijama može da se prilagodi pojedinačno, između jedne, što znači da nema randomizacije, do svih 20 aminokiselina. Nasumično uvođenje manjeg podskupa aminokiselina može da se ostvari pažljivim odabirom uvedenih baza dezoksiribonukleotida, na primer, T(A/C)C kodoni mogu da se uvedu radi dobijanja nasumičnog uvođenja serina ili tirozina na datoj poziciji u polipeptidnom lancu. Slično tome, (T/C/A/G)CC kodoni mogu da se uvedu radi dobijanja nasumičnog uvođenja fenilalanina, leucina, alanina i valina na datoj poziciji u polipeptidnom lancu. Kao što će biti jasno stručnjaku, brojne alternative kombinacija dezoksiribonukleotidne baze mogu da se koriste za dobijanje različitih kombinacija aminokiselina na datoj poziciji u polipeptidnom lancu. Skup aminokiselina koje mogu da se pojave na datoj poziciji u polipeptidnom lancu takođe može da se odredi uvođenjem trinukleotida tokom sinteze oligonukleotida, umesto po jedne dezoksiribonukleotidne baze.
[0285] Takođe je opisana biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. U nekim primerima, DBDpp biblioteka sadrži mnoštvo različitih DBDpp koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su supstitucije. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije, i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili
12
5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem primeru, 1 do 20, 1 do 30 ili 1 do 40 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U drugom primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži sekvencu oznake. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka je biblioteka vektora ili biblioteka ćelija domaćina. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je biblioteka ćelija domaćina. U drugom primeru, biblioteka ćelija domaćina sadrži mnoštvo ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini.
[0286] U nekim primerima, biblioteka DBDpp sadrži: (a) 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju od interesa; (d) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; ili (e) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj.
12
[0287] Takođe je opisana biblioteka koja sadrži mnoštvo DBDpp. U nekim primerima, DBDpp biblioteka sadrži mnoštvo različitih DBDpp koji sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su supstitucije. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U nekim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije, i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem primeru, 1 do 20, 1 do 30 ili 1 do 40 supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U drugom primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka je biblioteka vektora ili ćelija domaćina [uključujući virusne čestice]. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je biblioteka ćelija domaćina. U drugom primeru, biblioteka ćelija domaćina sadrži mnoštvo
1
ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini.
[0288] U nekim primerima, biblioteka DBDpp sadrži: (a) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju od interesa; (d) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; ili (e) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj.
[0289] U dodatnom primeru, biblioteka DBDpp sadrži više različitih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano ukupno 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 modifikovanih aminokiselinskih ostataka kodiranih sekvencama nukleinske kiseline su supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 kodiranih modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 kodiranih modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 kodiranih modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 kodiranih supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem primeru, 1 do 20, 1 do 30 ili 1 do 40 kodiranih supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U daljem primeru, nukleinske kiseline opciono kodiraju DBDpp koji dalje sadrži aminokiselinsku
1 1
sekvencu u kojoj je 1 do 5, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 ostataka koji odgovaraju ostacima koji su nedostupni rastvaračima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je sadržana u ćeliji domaćinu (npr. virusne čestice). U drugom primeru, biblioteka sadrži mnoštvo ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka DBDpp sadrži: (a) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju; (d) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; ili (e) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj.
[0290] Obezbeđene su i nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp, poput DBDpp fuzionih proteina. U nekim otelotvorenjima, ćelija domaćin koja sadrži nukleinske kiseline je ćelija bakterije, kvasca, gljivica ili sisara. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je imunska ćelija. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin je humana imunska ćelija. U daljem otelotvorenju, humana imunska ćelija eksprimira DBDpp na svojoj ćelijskoj površini. U određenim otelotvorenjima, nukleinska kiselina kodira DBDpp fuzioni protein. U daljem otelotvorenju, ćelija domaćin eksprimira DBDpp kao fuzioni protein na ćelijskoj površini. Ovde su dodatno obezbeđene biblioteke vektora koje sadrže više nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp.
1 2
[0291] U jednom primeru, biblioteka vektora sadrži mnoštvo različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp, pri čemu kodirani DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RL X19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66L QAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X55, X58, X59, X62, X65i X66je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LA X13IKX16X17LEALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALRK EAAAIRDELQAYR HN (SEQ ID NO:2), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X33, X34, X37, X40, X41i X44je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALGGSEAELAAFX32X33EIX36AFX39X40ELX43AYKGKG NPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:3), pri čemu, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X57, X58, X61, X64, X65i X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, i; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALGGSEAELAAFX32X33EIX36A FX39X40ELX43AYKGKGNPEVEX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:5), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X32, X33, X36, X39, X40, X43, X55, X58, X59, X62, X65i X66je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AI X15X16RLX19ALGGSEAELAX30FEX33X34IAX37FEX40X41LQX44YKGKGNPEVEALX57X58EAX61AIX64X65ELX68AYRHN (SEQ ID NO:6), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X30, X33, X34, X37, X40, X41, X44, X57, X58, X61, X64, X65i X68je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U dodatnom primeru, mnoštvo vektora u biblioteci kodira DBDpp fuzioni protein. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, više vektora iz biblioteke vektora je sadržano u ćelijama domaćinima (npr.
1
virusne čestice kao što je fag), E. coli, kvascu i ćelijama sisara. U drugom primeru, ćelije domaćini prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju isti DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0292] U jednom primeru, biblioteka vektora sadrži više nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGS WX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LR X53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:9), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X50, X53, X54, X57, X60i X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LA X13IKX16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAA IRDELQAYRHN (SEQ ID NO:7), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X28, X31, X32, X35, X38, X39i X42je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2 predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1EAEL AAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X6oELX63AYRHN (SEQ ID NO:8), pri čemu, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X52, X53, X56, X59, X60i X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:10), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X50, X53, X54, X57, X60i X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RL
1 4
X19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X28, X31, X32, X35, X38, X39, X42, X52, X53, X56, X59, X60i X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U dodatnom primeru, mnoštvo vektora u biblioteci kodira DBDpp fuzioni protein. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, više vektora iz biblioteke vektora je sadržano u ćelijama domaćinima. U drugom primeru, ćelije domaćini (npr. virusne čestice) prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 različitih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju istu sekvencu DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0293] U nekim primerima, 4, 5, 10 ili više DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci specifično vezuju različite ciljeve.
1
[0294] U jednom primeru, biblioteka vektora sadrži više različitih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1, pri čemu je modifikovano ukupno 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 aminokiselinskih ostataka; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 modifikovanih aminokiselinskih ostataka kodiranih sekvencama nukleinske kiseline su supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 modifikovanih aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije. U drugom primeru, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45 ili 5 do 50 kodiranih modifikovanih aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U daljem primeru, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, ili 5 do 45 kodiranih modifikacija aminokiselinskih ostataka su konzervativne supstitucije i 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 kodiranih modifikacija aminokiselinskih ostataka su nekonzervativne supstitucije. U dodatnim primerima, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40, 5 do 45, 5 do 50, 5 do 55 ili 5 do 60 kodiranih supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: M1, G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, Y70, R71, H72, i N73. U daljem primeru, 1 do 20, 1 do 30 ili 1 do 40 kodiranih supstitucija su na aminokiselinskim ostacima SEQ ID NO:1 izabranim iz grupe koju čine: G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70. U daljem primeru, nukleinske kiseline opciono kodiraju DBDpp koji dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu u kojoj je 1 do 5, 5 do 15, 5 do 20, 5 do 25, 5 do 30, 5 do 35, 5 do 40 ili 5 do 45 ostataka koji odgovaraju ostacima koji su nedostupni rastvaračima aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1 supstituisano, i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona,
1
serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, biblioteka vektora je sadržana u ćeliji domaćinu (npr. virusne čestice). U drugom primeru, biblioteka sadrži mnoštvo ćelija domaćina koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj; ili (f) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 različitih nukleinskih kiselina koje kodiraju isti DBDpp. Obezbeđene su i ćelije domaćini koje sadrže vektore.
[0295] U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve od interesa; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj od interesa; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju od interesa; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja od interesa; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj od interesa; ili (f) 3 različite sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju istu sekvencu DBDpp.
[0296] U jednom primeru, biblioteka vektora sadrži više nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp koji sadrži aminokiselinu izabranu iz grupe koja se sastoji od: (a) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAAFEKEIAAFESELQAYZ2NPEVEX50LRX53X54AA X571RX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:9), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X50, X53, X54, X57, X60i X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do
1
30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (b) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IK X16X17LEALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALRKEAAAIRDE LQAYRHN (SEQ ID NO:7), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X28, X31, X32, X35, X38, X39i X42je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (c) MGSWAEFKQRLAAIKTRLEALZ1E AELAAFX30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYR HN (SEQ ID NO:8), pri čemu, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X52, X53, X56, X59, X60i X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; (d) MGSWX5X6FKX9X10LAX13IKX16X17LEALZ1EAELAAF X30X31EIX34AFX37X38ELX41AYZ2NPEVEX50LRX53X54AAX57IRX60X61LQAYRHN (SEQ ID NO:10), pri čemu, X5, X6, X9, X10, X13, X16, X17, X30, X31, X34, X37, X38, X41, X50, X53, X54, X57, X60i X61je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i (e) MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RL X19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42YZ2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60E LX63A YRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu, X5, X8, X9, X12, X15, X16, X19, X28, X31, X32, X35, X38, X39, X42, X52, X53, X56, X59, X60i X63je ostatak prirodne i/ili neprirodne aminokiseline, a Z1i Z2predstavlja 2 do 30 ostataka prirodne i/ili neprirodne aminokiseline; i pri čemu DBDpp specifično vezuje cilj od interesa. U dodatnom primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline. U daljem primeru, Xnje ostatak prirodne aminokiseline koji nije cistein niti prolin. U dodatnom primeru, mnoštvo vektora u biblioteci kodira DBDpp fuzioni protein. U drugom primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju različite ciljeve. U daljem primeru, različiti ciljevi vezani putem DBDpp kodiranih nukleinskim kiselinama u biblioteci su izabrani iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine, i malog organskog molekula. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju proteinski cilj izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, biblioteka sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 25, 50, 75, 100, 250, 500 ili 1000 različitih DBDpp koji specifično vezuju ovde otkriveni cilj. U dodatnom primeru, više vektora iz biblioteke vektora je sadržano u ćelijama domaćinima (uključujući virusne čestice). U drugom primeru, ćelije domaćini (npr. virusne čestice) prikazuju DBDpp na svojoj površini. U daljem primeru, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini.
1
U nekim primerima, najmanje dva, tri, četiri, pet ili deset DBDpp kodiranih u biblioteci vektora specifično vezuju različite ciljeve. U nekim primerima, DBDpp vezuje cilj od interesa izabran iz grupe koja se sastoji od: nukleinske kiseline, oligosaharida, peptida, proteina, antigena ćelijske površine i malog organskog molekula. U daljem primeru, DBDpp cilj od interesa je protein izabran iz grupe koja se sastoji od: imunoglobulina, enzima, hormona, serumskog proteina, proteina ćelijske površine, terapeutskog proteina, TSA, CSA, i proteina koji sadrži peptidnu oznaku. U daljem primeru, DBDpp specifično vezuje cilj koji je ovde otkriven. Takođe je obezbeđena biblioteka ćelija domaćina (npr. virusne čestice) koja sadrži biblioteku vektora. U nekim primerima, biblioteka sadrže više ćelija domaćina (npr. virusne čestice) koje prikazuju DBDpp na svojoj površini. U određenim primerima, ćelije domaćini su fag koji prikazuje DBDpp na svojoj površini. U nekim primerima, biblioteka vektora sadrži: (a) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji se specifično vezuju za različite ciljeve od interesa; (b) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp koji imaju različite sekvence koji se specifično vezuju za isti cilj od interesa; (c) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za isti epitop na cilju od interesa; (d) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se specifično vezuju za različite epitope cilja od interesa; (e) nukleinske kiseline koje kodiraju 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 DBDpp sa različitim sekvencama koji se takmiče u vezivanju za isti cilj od interesa; ili (f) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više od 10 različitih sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju istu sekvencu DBDpp.
[0297] Predviđeno je da DBDpp može da se modifikuje radi prilagođavanja polipeptida specifičnoj nameravanoj upotrebi, bez napuštanja ovde obezbeđenog opsega. Takve modifikacije mogu da sadrže dodatne aminokiseline na N- ili C-terminusu DBDpp i/ili oznake ili dodatne terapeutske agense koji su hemijski konjugovani ili na drugi način vezani za DBDpp. Prethodno razmotreni dodatni aminokiselinski ostaci mogu takođe da čine jedan ili više polipeptidnih domena sa bilo kom željenom funkcijom, kao što je druga funkcija vezivanja, ili enzimska funkcija, ili funkcija heliranja metalnog jona, ili fluorescentna funkcija ili njihova mešavina.
Odabir, izolacija i identifikacija DBDpp
1
[0298] Takođe su obezbeđeni postupci za odabir, izolaciju i identifikaciju DBDpp koji specifično vezuju cilj od interesa od više DBDpp, kao što su oni u biblioteci. U jednom otelotvorenju, postupak pretrage biblioteke DBDpp za vezivanje sa vezujućim partnerom obuhvata: (a) dobijanje populacije koja prikazuje biblioteku DBDpp; (b) dovođenje populacije u kontakt sa ciljem od interesa u uslovima koji su pogodni za vezivanje; i (c) identifikaciju onih DBDpp koji se vezuju za cilj. Dva primera procesa odabira DBDpp displeja uključuju panovanje i odabir na bazi ćelijskog skrininga.
[0299] U ovde obezbeđenim ilustrativnim primerima, biblioteke displeja DBDpp faga su pripremljene i pretražene radi DBDpp koji imaju željena svojstva, uključujući sposobnost da specifično vezuju brojne potvrđene terapeutske i dijagnostičke ciljeve. Reprezentativni DBDpp identifikovani u ovim pretragama su dalje okarakterisani i pokazano je da prikazuju željena svojstva korisna u, na primer, prečišćavanju, dijagnostičkim i terapeutskim primenama.
Biblioteka displeja
[0300] Kao što je ovde opisano, supstitucije u referentnom skeletu SEQ ID NO:1 obezbeđuju svestranu platformu za molekulsko prepoznavanje. Takav DBDpp može da se koristi u postupcima za pripremu biblioteka DBDpp koje mogu da se pretraže naspram ciljeva od interesa. Takvi postupci skrininga mogu da se koriste za identifikaciju DBDpp sa željenim svojstvima kao što je sposobnost vezivanja cilja od interesa. Populacija DBDpp koja je korišćena u odabiru DBDpp specifičnih za cilj može biti u različitim oblicima i može biti, bez ograničenja, biblioteke proteina, biblioteke nukleinske kiseline, biblioteke vektora i biblioteke ćelija domaćina.
[0301] Različiti postupci poznati u struci za pripremu modifikacija nukleinske kiseline mogu da se koriste za pripremu (kodiranje) DBDpp koji ima modifikaciju u jednom ili više aminokiselinskih ostataka u poređenju sa drugim DBDpp i/ili referentnim skeletom SEQ ID NO:1 kako je definisano u zahtevima. Nukleinske kiseline koje kodiraju DBDpp mogu da se dobiju koristeći standardne postupke iz struke, kao što je hemijska sinteza, rekombinantni postupci i/ili da se dobiju iz bioloških izvora. Nukleinska kiselina od interesa može da se stavi pod kontrolu jednog ili više elemenata neophodnih za njihovu ekspresiju u bilo kojoj određenoj ćeliji domaćinu. Dostupne su različite ćelije domaćini za propagiranje nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp i postupci prikazivanja koji mogu da se koriste u displeju DBDpp na njihovoj
14
površini su poznati u struci i opisani ovde. Postupci displeja uključuju, bez ograničenja, displej faga, bakterijski displej, displej kvasca, displej ribozoma i displej mRNK.
[0302] U nekim primerima, stvaranje (delimično) randomizovane biblioteke DBDpp zahteva (delimičnu) randomizaciju specifičnih pozicija u sekvenci referentnog skeleta SEQ ID NO:1. U dodatnim primerima, druge referentne sekvence mogu da se koriste i modifikuju u skladu sa ovde otkrivenim postupcima. U jednom primeru, biblioteka DBDpp za upotrebu u uvode obezbeđenim postupcima je stvorena tehnikama rekombinantne DNK. Konkretno, biblioteke sekvenci nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp, a svaka se razlikuje u sekvenci na određenim pozicijama aminokiselina, mogu da se dobiju mutagenezom usmerenom na mesto ili nasumičnom mutagenezom šablonske sekvence. Nasumični aminokiselinski ostaci mogu da se uvedu na određenim pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci koristeći tehnike poznate u struci kao što je odabir (uvođenje) 'NNK' ili 'NNS' kodona na odgovarajućim pozicijama u sekvenci nukleotida koji kodira navedenu aminokiselinsku sekvencu. Postupci za proizvodnju takvih biblioteka su poznati u struci i dostupne su komercijalne usluge za stvaranje takvih biblioteka. Nukleotidi koji određuju relevantne aminokiselinske ostatke na poziciji od interesa su mutirani na različite načine kako bi se dobila biblioteka sekvenci koje kodiraju različite DBDpp.
[0303] Biblioteke se opciono stvaraju selektivnom ili nasumičnom mutacijom specifičnih aminokiselinskih pozicija koje su izložene rastvaraču u DBD.
[0304] U nekim primerima, broj supstituisanih pozicija aminokiselinskih ostataka u bibliotekama DBDpp koje su ovde obezbeđene je u rasponu od 5 do 20 pozicija aminokiselinskih ostataka. Dakle, definisani skup supstituisanih pozicija aminokiselinskih ostataka u ovde obezbeđenoj biblioteci DBDpp sadrži 5 do 20 definisanih supstituisanih pozicija aminokiselinskih ostataka, recimo 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20, definisanih supstituisanih pozicija aminokiselinskih ostataka. U nekoliko primera, supstituisani aminokiselinski ostaci su prirodne ili neprirodne aminokiseline. U nekoliko primera može da se koristi bilo koja od 20 prirodnih aminokiselina. Međutim, u nekim primerima, supstitucije ne dovode do zamene bilo koje od aminokiselina cisteinom i/ili prolinom.
[0305] Biblioteka DBDpp može da sadrži bilo koji prikladan broj različitih sekvenci DBDpp. U nekim otelotvorenjima, biblioteka DBDpp sadrži najmanje 2, najmanje 5, najmanje 10, najmanje 50, najmanje 100, najmanje 1000, najmanje 10.000, najmanje 105, najmanje 106, najmanje 107, najmanje 108, najmanje 109 ili više različitih sekvenci DBDpp (npr. DBDpp fuzioni proteini).
[0306] Pojam „supstituisana pozicija aminokiselinskih ostataka“, kada se odnosi na biblioteku sekvenci različitih DBDpp, odnosi se na poziciju aminokiselinskog ostataka na kojoj su locirana najmanje dve vrste aminokiselinskog ostatka kada se najmanje dve aminokiselinske sekvence različitih DBDpp iz biblioteke DBDpp međusobno pomere.
[0307] U jednom primeru, otkriće obuhvata postupke proizvodnje biblioteke (npr. kolekcije ili mnoštva) DBDpp koji se međusobno razlikuju u najmanje jednoj od definisanog skupa od 5 do 20 supstituisanih pozicija aminokiselinskih ostataka. Stoga se sekvence unutar biblioteke DBDpp međusobno razlikuju na jednoj ili više određenih aminokiselinskih pozicija koje su obuhvaćene u odabranom, definisanom ili nasumičnom skupu. Shodno tome, termin „različite sekvence“ ili „različite sekvence DBDpp“ odnosi se na pojavu varijacija sekvence ili razlika u sekvenci u definisanom skupu pozicija aminokiselinskih ostataka između dva ili više DBDpp u biblioteci.
Vehikulum za displej
[0308] Populacija ili biblioteka molekula je prikazana na uobičajenom vehikulumu za displej (npr. bakteriofag, E.coli, ribozom) koji omogućava kuplovanje fenotipa sa genotipom.
[0309] U nekim primerima, DBDpp iz biblioteke su prikazani na površini čestice faga, ribozoma, bakterije, ćelije kvasca, ćelije sisara ili bilo kog drugog pogodnog (mikro)organizma, tako da se olakšava skrining ili selekcija za izolaciju željenih sekvenci DBDpp koje imaju uočljivi afinitet prema, ili uočljivu in vitro aktivnost na cilju od interesa. Glavna prednost ove tehnologije je kuplovanje genotipa (tj. inkapsulirane DNK koja kodira prikazani protein) i fenotipa (tj. prikazani protein, kao što je ovde obezbeđeni DBDpp), što omogućava odabir na bazi afiniteta iz biblioteka sa milionima do trilionima varijanti polipeptida u relativno jednostavnom in vitro testu.
[0310] Prikladni postupci, tehnike i organizmi domaćina za prikazivanje i odabir ili pregled biblioteke supstituisanih DBDpp sekvenci ili nukleotidnih sekvenci koje kodiraju takve supstituisane DBDpp sekvence, a koji su primenljivi na DBDpp sa željenim karakteristikama, poznati su stručnjaku u ovoj oblasti. Takvi postupci su opisani, na primer, u Georgiou, Nat. Biotechnol. 15:29-34 (1997); Wittrup, Curr. Opin. Biotechnol.12:395-399 (2001); Lipovsek i Pluckthun, J Immunol Methods 290:51-67 (2004); Reiersen, Nucl Acids Res, 33:e10, 2005; Levin, Mol BioSyst, 2:49-57 (2006); Bratkovic, Cell. Mol. Life. Sci. 67:749-767 (2010). Na primer, tehnologija displeja biblioteke faga i odabir pomoću tehnike displeja faga mogu da se odaberu kao postupak za visokopropusnu identifikaciju vezivača specifičnih za proteine, jer je to jedna od najsnažnijih i najsvestranijih dostupnih tehnika odabira (Scott, Science 249:386-390 (1990); Bratkovic, Cell. Mol. Life Sci.67:749-767 (2010)).
[0311] Uz to, tehnologija displeja može da se koristi za izmenu, npr. poboljšanje svojstava vezivanja DBDpp. Vidite, na primer, Scott, Science 249: 386 (1990); Devlin, Science 249: 404 (1990); U.S. pat. br.5,223,409, 5,733,731, 5,498,530, 5,432,018, 5,338,665, i 5,922,545; WO 96/40987 i WO 98/15833, čiji je sadržaj ovde u celini obuhvaćen referencom. U bibliotekama displeja peptidnih faga, sekvence peptida koje se javljaju i/ili se ne javljaju u prirodi mogu da se prikazuju fuzijom sa proteinima omotača filamentnog faga. Prikazani peptidi mogu po želji da se afinitetno eluiraju naspram cilja od interesa. Zadržani fag može da se obogati uzastopnim krugovima afinitetnog prečišćavanja i ponovne propagacije. DBDpp sa najboljim vezivanjem može da se sekvencira radi identifikacije ključnih ostataka i biblioteke mutageneze mogu da se kreiraju i pretraže radi dalje optimizacije sekvence najboljih vezivača. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.26: 401-24 (1997).
Displej faga
[0312] Uobičajeni protokol za displej faga uključuje upotrebu sistema površinske ekspresije filamentnog faga (fagemid), proizvodnju čestica faga u bakterijskom domaćinu gde svaka čestica prikazuje genski proizvod jednog člana biblioteke gena kao fuziju sa jednom vrstom njenih proteina omotača (gIII ili gVIII proteini). Biblioteka čestica faga se sprovodi kroz proces odabira za vezivanje za imobilisani ciljni molekul („biopanovanje“) koji obuhvata vezivanje jedne biblioteke faga za cilj, korake ispiranja radi uklanjanja nevezanog DBDpp faga i eluciju vezanih čestica. Obično je potrebno nekoliko krugova panovanja za odabir molekula sa
14
željenim karakteristikama, uključujući ponovnu amplifikaciju eluiranog faga u bakterijskom domaćinu i selekciju na imobilisanom cilju.
[0313] Na primer, koristeći displej fagemida (Kay et al. Phage Display of Peptides and Proteins. A Laboratory Manual, B.K. Kay et al. 1996) data biblioteka DBDpp može biti predstavljena kolekcijom fagemida, od kojih svaki kodira fuzioni protein koji sadrži član biblioteke DBDpp fuzionisan sa manjim proteinom omotača pIII. Ovi fagemidi mogu da se uvedu u odgovarajuće ćelije E. coli (npr. TG1) elektroporacijom ili drugim sredstvima. Koristeći infekciju pomoćničkim fagom, proizveden je fag (uz pakovanje i genoma fagemida) koji prikazuje DBDpp-fuzioni protein. Ovaj fag može da se koristi za odabir vezivača za dati cilj i odabrani fag može da se propagira inficiranjem E. coli TG1 (Stratagene).
[0314] Dakle, u određenim primerima, biblioteke DBDpp su obezbeđene kao biblioteka faga i vezujući DBDpp su identifikovani dovođenjem u kontakt faga sa označenim ciljem od interesa, nakon čega se vezujući fazi vraćaju detekcijom ili selektivnim sakupljanjem označenog, vezanog cilja. U jednom primeru se koristi biotinilovani cilj, pri čemu se fag koji stvara DBDpp koji se specifično vezuje za cilj hvata pomoću streptavidinom premazane podloge (npr. magnetne perlice). U nekim primerima, koraci odabira postupaka za proizvodnju jednog ili više DBDpp koji imaju uočljivi afinitet vezivanja prema cilju od interesa mogu da obuhvataju (dalje) obogaćivanje biblioteke DBDpp ili mešavine biblioteka DBDpp radi DBDpp koji imaju uočljivi afinitet vezivanja prema cilju od interesa iterativnim izvođenjem koraka dovođenja u kontakt cilja od interesa sa bibliotekom DBDpp ili sa mešavinom biblioteka DBDpp (koje uključuju više DBDpp) iz pronalaska, a zatim identifikacije iz biblioteke DBDpp ili mešavine biblioteka DBDpp koje se dovode u kontakt sa proteinom jednog ili više DBDpp koji imaju uočljivi afinitet vezivanja prema cilju od interesa. Korak odabira DBDpp koji ima uočljivu in vitro aktivnost interakcijom sa ciljnim od interesa može da obuhvata: (a) dovođenje u kontakt biblioteke DBDpp ili mešavine biblioteka DBDpp iz pronalaska sa citokinom ili faktorom rasta ili receptorom citokina ili faktora rasta od interesa, i (b) identifikaciju iz biblioteke DBDpp ili mešavine biblioteka DBDpp jednog ili više DBDpp koji imaju uočljivu in vitro aktivnost na cilj od interesa.
[0315] U ilustrativnim primerima koji su ovde otkriveni u Primerima, postupci displeja faga se koriste za prikazivanje i pretragu DBDpp na sposobnost da specifično vezuje cilj od interesa
[0316] Ovde je pokazano da domen DBD može da se prikaže i odabere na površini faga. Različite biblioteke DBDpp, zasnovane na konstrukciji SEQ ID NO:1, i ovde opisane u primerima, pripremljene su i podvrgnute postupcima displeja faga kako bi se pokazalo da može da se proizvede DBDpp koji se specifično vezuje za različite ciljeve od interesa, uključujući CD137, CD47, CTLA4, DR5, KIR, PD-L1, PD1 i TIM3.
Displej ćelije
[0317] U nekim primerima, tehnike pregleda biblioteke uključuju sistem displeja ćelijske površine. Sistem displeja ćelijske površine može da obuhvata prokariotske ćelije, kao što su Gram+ ćelije, ili eukariotske ćelije, kao što su ćelije kvasca. Brojni sistemi displeja ćelijske površine su poznati u struci i rutinski mogu da se prilagode za skrining biblioteka DBDpp. Prokariotske sisteme su, na primer, opisali Francisco et al. PNAS 90:10444-10448 (1993) i Lee et al. Trends Biotechnol 21:45-52 (2003). Eukariotske sistemi su opisali, na primer, Boder et al. Nat. Biotechnol.15:553-557 (1997) i Gai et al. Curr. Opin. Struct. Biol.17:467-473 (2007). Ovde su obuhvaćeni i postupci „displeja E. coli“ kao što je fuzija peptidoglikan-povezanog lipoproteina (PAL). Na primer, DBDpp peptid može da se fuzioniše sa karboksi terminusom lac represora i da se eksprimira u E. coli.
[0318] Tehnologije displeja bakterija i displeja kvasca koje su poznate u struci omogućavaju ekspresiju rekombinantnih proteina na površini ćelija kvasca S. cerevisiae (Boder, Nat. Biotechnol. 15:553-557 (1997) ili bakterije (E. coli, Staphylococcus carnosus) (Daugherty., 1998, Wernerus, Appl. Environ. Microbiol.69(9):5328-5335 (2003)) kao fuzija sa receptorom adhezije kvasca a-aglutinin, odnosno sa proteinom spoljašnje membrane (OMP).
[0319] U nekim primerima, eksprimirani fuzioni proteini takođe sadrže peptidnu oznaku koja omogućava kvantifikaciju biblioteke površinske ekspresije protočnom citometrijom. U kombinaciji sa indirektnim fluorescentnim obeležavanjem liganda, obeležavanje anti-oznakom omogućava sortiranje ćelija putem FACS (sortiranje fluorescentno aktiviranih ćelija) i utvrđivanje afiniteta vezivanja interakcija (Feldhaus et al. Nat. Biotechnol. 21:163-70 (2003); Wernerus et al. Appl. Environ. Microbiol.69(9):5328-35 (2003)).
In vitro displej
14
[0320] Postupci in vitro (poznat i kao besćelijski ili acelularni) displeja mogu takođe da se koriste za odabir, izolaciju i identifikaciju DBDpp koji vezuju cilj od interesa. U jednom primeru, translacija nasumične RNK je obustavljena pre otpuštanja ribozoma, što daje biblioteku polipeptida pri čemu su sa njima asocirane RNK i dalje povezane. Ovaj i srodni postupci se zbirno nazivaju „displej ribozoma“. Drugi poznati postupci koriste hemijsku vezu peptida sa RNK. Vidite, na primer, Roberts et al. PNAS 94:12297-303 (1997). Ovaj i srodni postupci se zbirno nazivaju „skrining RNK-peptida, displej RNK i displej mRNK“. Alternativno, in vitro postupci displeja mogu da koriste DNK kao genetsku komponentu za koju se eksprimirani polipeptid kupluje. Postupak poznat kao cis-displej daje in vitro odabir peptida iz biblioteka kompleksa protein-DNK i opisan je u US7842476 B2. Razvijene su biblioteke hemijski dobijenih peptida u kojima su peptidi imobilisani na stabilnim, nebiološkim supstancama, kao što su polietilenski štapići ili smole propustljive za rastvarač. Druga biblioteka hemijski dobijenih peptida koristi fotolitografiju za skeniranje peptida imobilisanih na staklenim pločicama. Ovi i srodni postupci se zbirno nazivaju „hemijski skrining peptida“. Hemijski skrining peptida može biti koristan jer omogućava korišćenje D-aminokiselina i drugih neprirodnih analoga, kao i nepeptidnih elemenata. Pregled bioloških i hemijskih postupaka je dat u Wells, Curr. Opin. Biotechnol.3:355-362 (1992).
Odabir DBDpp
[0321] Biopanovanje je poznati postupak iterativnog odabira i skrininga za obogaćivanje prvobitne populacije različitih molekula (kao što je biblioteka DBDpp) radi molekula koji imaju afinitet prema odabranom cilju. Članovima biblioteke koji imaju afinitet prema cilju je dozvoljeno vezivanje. Nespecifično ili slabo vezani članovi ispiraju se sa podloge. Vezani članovi biblioteke se zatim izoluju (npr. elucijom) sa podloge. Izolovani članovi biblioteke su sakupljeni za dalju analizu (npr. skrining) ili objedinjeni za dodatni krug odabira.
[0322] U jednom primeru, cilj je nakon inkubacije bibliotekom faga uhvaćen na čvrstoj podlozi. Imobilizacija cilja može da se obavi brojnim različitim postupcima koji su poznati u struci. Primeri čvrste podloge su mikrotitarske ploče ili epruvete (npr. Maxisorp ploče, Maxisorp epruvete, Nunc) ili magnetne perlice (Dynabead®, Invitrogen). Cilj može direktno da se nanese na plastiku ili perlice (površinski aktivirane perlice Dynabeads, npr. Dynabeads M270 Epoxy, Invitrogen) ili pomoću streptavidina kada je cilj biotinilovan (npr. Dynabeads MyOne Streptavidin T1, Invitrogen).
14
[0323] Pored toga, cilj može biti nekovalentno vezan za perlicu putem intermedijernog afinitetnog molekula kao što je antitelo ili protein A usmerenog na cilj ili peptidnu oznaku povezanu sa ciljem. Peptidne oznake kao što su His-oznake ili, alternativno, antitelo usmereno na cilj, takođe mogu da se koriste za hvatanje cilja na podlozi. Ove alternativne peptidne oznake su takođe kompatibilne sa Dynabeads (Dynabeads His-tag izolacija i obaranje) i Dynabeads kuplovanim sa proteinom A i proteinom G (Dynabeads-Protein A/G, Invitrogen). Da bi se cilj imobilisao na magnetnim perlicama, preporuke proizvođača su praćene za svaku posebnu vrstu perlica.
[0324] Korak hvatanja se tada može sastojati od hvatanja mete na obloženim magnetnim perlicama, čime se indirektno hvata fag vezan za cilj. Interakcija cilj-fag se obavlja u rastvoru. Da bi nevezujući fag mogao da se ispere, cilj mora biti imobilisan na čvrstoj podlozi. Imobilizacija cilja u postupku rastvorljivog biopanovanja je identična mogućnostima imobilizacije u protokolima za direktno biopanovanje.
[0325] Klasični protokol za biopanovanje sastoji se od 2, 3 do 5 ili više ciklusa odabira, u zavisnosti od vrste cilja i biblioteke. Svaki ciklus odabira uobičajeno se sastoji od različitih koraka: (1) imobilizacija željenog cilja na podlozi. Ovaj korak nije obavezan, pošto biopanovanje takođe može da se obavi u formatu u kome cilj nije imobilisan već se nalazi u rastvoru (u slučaju rastvorljivog cilja) ili ostaje usidren na ćeliji (u slučaju, npr. membranski usidrenog cilja, kao što je receptor), (2) inkubacija biblioteke sa ciljem, (3) koraci ispiranja za eliminaciju nespecifičnih vezivača, (4) opciona elucija vezivača i (5) amplifikacija eluiranih vezivača iz koraka (4) ili koraka (3) (u slučaju da je korak (4) izostavljen u uzastopnim ciklusima skrininga). Koraci od 1 do 5 će se ponoviti dva, tri, četiri ili više puta radi izolacije od prvobitnih vezivača specifičnih za cilj iz biblioteke. Nakon biopanovanja, specifičnost za cilj vezivača izolovanih iz različitih ciklusa odabira se uobičajeno analizira u ELISA testovima ili sličnim testovima.
[0326] U jednom primeru, postupak skrininga za DBDpp koji specifično vezuju cilj od interesa obuhvata sledeće korake: (a) dovođenje u kontakt cilja od interesa sa više DBDpp; i (b) identifikacija DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa. Korak dovođenja u kontakt cilja od interesa sa više DBDpp može se obaviti na bilo koji način poznat u struci. U jednom primeru, cilj od interesa je imobilisan na čvrstoj podlozi i dovodi u kontakt rastvor koji sadrži više
14
molekula DBDpp sa imobilisanim ciljem od interesa. Takav postupak je sličan procesu afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna matrica sastavljena od imobilisanih ciljeva od interesa. DBDpp koji ima selektivni afinitet prema cilju od interesa zatim može da se prečisti koristeći tehnike poznate u struci, kao što je afinitetna selekcija. Kompozicija čvrste podloge, proces vezivanja cilja od interesa za čvrstu podlogu i reagensi, uslovi i postupci skrininga za izolaciju DBDpp sa specifičnim afinitetom prema cilju od interesa su u velikoj meri uobičajeni i poznati osobama sa uobičajenim znanjem u oblasti. U određenim situacijama može biti poželjno da se isperu bilo svi nevezani DBDpp iz smeše cilja od interesa i/ili jedan ili više DBDpp vezanih za cilj od interesa pre pokušaja da se utvrdi ili detektuje prisustvo interakcije selektivnog afiniteta. Takav korak ispiranja može biti naročito poželjan kada je cilj od interesa vezan za čvrstu podlogu.
[0327] Biće jasno da se korak odabira iz ovde opisanih postupaka može obaviti putem postupka koji je uobičajeno poznat kao postupak selekcije ili putem postupka koji je uobičajeno poznat kao postupak skrininga. Oba postupka predviđaju identifikaciju, a zatim izolaciju (npr. korak odabira) željenih komponenti (npr. članovi biblioteke DBDpp) iz prvobitnog sastava koji obuhvata i poželjne i nepoželjne komponente (npr. biblioteka DBDpp). U slučaju postupka selekcije, članovi biblioteke će se uobičajeno izolovati korakom u kome se željeno svojstvo primenjuje za ostvarenje željenog cilja; u takvom slučaju, željeno svojstvo je uobičajeno ograničeno na svojstvo velikog afiniteta prema datom cilju od interesa. Takav postupak je uopšteno poznat kao postupak afinitetne selekcije, i takav postupak afinitetne selekcije će se primenjivati na biblioteku DBDpp radi odabira DBDpp koji imaju veliki afinitet prema cilju od interesa. U dodatnim primerima, biblioteka je pretraženi DBDpp koji ima željena kinetička svojstva, kao što je velika brzina asocijacije sa datim ciljem od interesa ili mala brzina disocijacije za članove biblioteke koji su vezani za navedeni cilj putem prilagođavanja odgovarajućih uslova odabira (npr. kratko vreme inkubacije ili dugački ciklusi ispiranja, ili drugi uslovi poznati osobi koja poznaje tehnike odabira biblioteke). Alternativno, u slučaju postupka skrininga, članovi biblioteke se obično izoluju korakom u kome se svi članovi biblioteke, ili barem značajna kolekcija članova biblioteke, pojedinačno ispituju u pogledu datog željenog svojstva, i pri čemu se članovi koji imaju takvo željeno svojstvo zadržavaju, dok se članovi koji nemaju takvo željeno svojstvo odbacuju; u tom slučaju, i u ovde obezbeđenom kontekstu, željena svojstva mogu da se odnose na veliki afinitet prema cilju od interesa, ili na funkcionalnu aktivnost, kao što je inhibicija, redukcija i/ili prevencija aktivnosti cilja od interesa. Shodno tome, tvrdi se da korak odabira iz postupaka može da se ostvari bilo
14
tehnikom (afinitetne) selekcije ili tehnikom funkcionalnog skrininga na bazi afiniteta ili na bazi aktivnosti, pri čemu obe tehnike dovode do odabira jednog ili više DBDpp sa pogodnim (povoljnim, poželjnim, superiornim) svojstvima afiniteta ili aktivnosti u poređenju sa neselektovanim DBDpp iz DBDpp.
Skrining DBDpp
[0328] Nakon odabira, identifikovani članovi biblioteke mogu pojedinačno da se izoluju i ispitaju.
[0329] Skrining se razlikuje od selekcije po tome što je skrining okarakterisan analizom članova biblioteke pojedinačno (ili objedinjeno), dok je selekcija okarakterisana analizom članova biblioteke koji su odvojeni od drugih članova tokom procesa (npr., zadržani, eluirani ili uklonjeni ispiranjem). U jednom primeru, skup članova biblioteke se neposredno pretražuje, bez prolaženja koraka odabira. Ovaj pristup, na primer, može da se koristi tokom protokola afinitetnog sazrevanja koji su poznati i mogu rutinski da se primenjuju.
[0330] Sposobnost DBDpp da specifično vezuje cilj od interesa može da se odredi koristeći ili rutinski modifikujući testove i druge metodologije koje su ovde opisane ili su inače poznate u struci. Na primer, interakcija DBDpp-cilj može da se testira kako je opisano u Primerima u nastavku ili, alternativno, koristeći testove in vitro ili in vivo vezivanja kao što su vestern blot, radioimunološki testovi, ELISA (test sa imunosorbentom vezanim za enzim), „sendvič“ imunološki testovi, testovi imunoprecipitacije, fluorescentni imunološki testovi, protein A imunološki testovi, imunohistohemija (IHC) i BIAcore analiza. Slično tome, sposobnost DBDpp da specifično vezuje cilj od interesa i da menja biološku aktivnost cilja može da se odredi koristeći ili rutinski modifikujući testove i druge metodologije koje su ovde opisane ili su inače poznate u struci. Testovi koji procenjuju sposobnost DBDpp da funkcionalno utiče na svoj cilj (npr. testovi za merenje signalizacije, proliferacije, migracije, itd.) takođe mogu da se koriste za indirektnu procenu interakcije DBDpp-cilj. Pored toga, DBDpp mogu da se identifikuju na bazi njihovog dejstva u testovima koji mere određene puteve ili aktivnosti. Na primer, testovi koji mere puteve signalizacije (npr. studije fosforilacije ili multimerizacije), fluks jonskih kanala, intracelularni nivoi cAMP, ćelijske aktivnosti kao što je migracija, prianjanje, proliferacija ili apoptoza i virusni ulaz, replikacija, pupanje ili integracija mogu da se koriste za identifikaciju, karakterizaciju i poboljšanje željenih svojstava
14
DBDpp. Sposobnost DBDpp da konkurentski inhibira drugu sekvencu koja sadrži DBDpp može da se utvrdi koristeći tehnike koje su poznate u struci, uključujući ELISA i BIAcore analizu.
Identifikacija DBDpp
[0331] Kada je kandidat za DBDpp sadržan u biblioteci DBDpp prikazan na odgovarajućoj ćeliji ili fagu ili čestici, kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline može da se izoluje i rutinski odredi. Iz pomenute ćelije ili faga ili čestice moguće je izolovati nukleotidnu sekvencu koja kodira sekvencu DBDpp. Na taj način, nukleotidna sekvenca odabranih članova biblioteke DBDpp može da se utvrdi postupcima rutinskog sekvenciranja.
[0332] Članovi DBDpp biblioteke koji su specifični za cilj mogu da se okarakterišu sekvenciranjem nukleinske kiseline. Informacije o sekvenci se koriste za klasifikaciju članova i uklanjanje suvišnih članova (tj. članova koji kodiraju taj isti DBDpp). Biblioteke DBDpp i članovi biblioteke (uključujući neke članove u kojima su dodate epitopske oznake) u skladu sa nekoliko primera uključuju, bez ograničenja, one identifikovane u nastavku u Tabeli 1. Dodatno su uključeni oni DBDpp koji odgovaraju bilo kojem od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11, pri čemu je jedna ili više pozicija Xnsupstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom. U nekim primerima, DBDpp koji odgovaraju bilo kojem od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili 11 ne uključuju cisteinske i/ili prolinske ostatke koji su supstituisani na poziciji Xn.
Tabela 1 - Neograničavajući primeri biblioteka DBDpp i članova biblioteke
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
11
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
12
1
14
1 SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
1 SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
11 SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
12
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
14 SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
1
1
1 SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
1
SEQ Sekvenca Cilj Biblioteka
11
12
[0333] U drugim primerima, pronalazak obuhvata jednu ili više sekvenci sa 60-70%, 70-75%, 75-80%, 80-85%, 85-90%, 95-99% homologosti (i preklapajući rasponi) sa sekvencama koje su identifikovane u Tabeli 1. U nekoliko otelotvorenja, sekvence koje imaju takvu homologost su funkcionalno slične ili identične u poređenju sa odgovarajućom sekvencom identifikovanom u tabeli 1. U nekoliko primera, primer obuhvata jedan ili više polipeptida koji se takmiče (u potpunosti ili delimično) sa jednom ili više sekvenci u Tabeli 1 za odgovarajući cilj. U nekoliko primera, takmičenje može da se proceni standardnim testom konkurentskog vezivanja. U nekim primerima, takmičenje ne zahteva da se konkurentski polipeptid takmiči za isti specifični cilj kao polipeptidi iz Tabele 1, već radije mogu da se takmiče vezivanjem sterno ometajućeg epitopa, preklapajućeg epitopa, itd.
Afinitetno sazrevanje DBDpp
1
[0334] Strategije afinitetnog sazrevanja mogu da se koriste za stvaranje DBDpp velikog afiniteta koji mogu da se koriste u ovde opisanim DBDpp fuzionim proteinima.
[0335] Biblioteke mutageneze mogu da se stvore i pretraže radi dalje optimizacije sekvence najboljih vezivača. Lowman, Ann. Rev. Biophys. Biomol. Struct.26: 401-24 (1997).
[0336] Unapređeni DBDpp koji specifično vezuje željeni cilj takođe može da se pripremi na osnovu poznate sekvence DBDpp. Na primer, najmanje jedna, dve, tri, četiri, pet ili više aminokiselinskih mutacija (npr. konzervativne ili nekonzervativne supstitucije), delecija ili insercija može da se uvede u poznatu sekvencu DBDpp, i nastali DBDpp može da se pretraži na vezivanje za željeni cilj i biološku aktivnost, kao što je sposobnost antagonizovanja biološke aktivnosti cilja ili agonizovanja biološke aktivnosti cilja.
Proizvodi
[0337] Ovde su obezbeđeni proizvodi, uključujući komplete. Proizvod može da obuhvata ambalažu i etiketu ili uputstvo za upotrebu na ambalaži ili povezano sa njom. Odgovarajuća ambalaža uključuje, na primer, boce, bočice ili špriceve. Ambalaža mogu biti načinjena od različitih materijala, kao što su staklo ili plastika. Ambalaža sadrži jedan ili više DBDpp, nukleinskih kiselina koje kodiraju DBDpp i/ili vektora ili ćelija domaćina iz predmetnog otkrića. Etiketa ili uputstvo za upotrebu mogu da uključuju smernice za obavljanje skrininga na bazi afiniteta, detekcije i/ili prečišćavanja.
[0338] Takođe su obezbeđeni kompleti koji sadrže DBDpp. Takvi kompleti imaju upotrebu koja uključuje, ali nije ograničena na, detekciju ili izolaciju cilja od interesa za koji se DBDpp specifično vezuje. Takav komplet za testiranje može biti koristan u skriningu za prisustvo cilja od interesa i/ili kvantifikaciju koncentracija cilja od interesa u tečnosti, kao što je biološka tečnost (npr. krv, serum ili sinovijalna tečnost).
[0339] U jednom otelotvorenju, razmatra se DBDpp komplet za testiranje koji sadrži jednu ili više ambalaža DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa i, opciono, sredstvo za detekciju za utvrđivanje prisustva ili odsustva interakcije cilj/DBDpp ili njenog odsustva. Komplet dalje opciono sadrži protein cilja od interesa koji može da se koristi, na primer, kao kontrola ili
1 4
standard. DBDpp može biti slobodan, ili eksprimiran na površini ćelije domaćina ili na površini bakteriofaga. U određenom otelotvorenju, DBDpp ili cilj od interesa obezbeđeni u kompletu su obeleženi. Može se koristiti bilo koja oznaka poznata u struci. U nekim otelotvorenjima, oznaka je izabrana iz grupe koja se sastoji od biotina, fluorogena, enzima, epitopa, hromogena ili radionuklida. U nekim primerima, DBDpp je imobilisan na čvrstoj podlozi. Sredstva za detekciju koja se koriste za detekciju oznake će zavisiti od prirode oznake, i mogu biti bilo koje poznate u struci, npr. film za detekciju radionuklida; enzimski supstrat koji stvara ili amplifikuje detektabilni signal za detekciju prisustva cilja od interesa.
[0340] Opisani komplet dalje sadrži čvrstu podlogu za DBDpp koja može biti obezbeđena kao zasebni element, ili na kojoj je imobilisan DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa. Dakle, DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa u kompletu može biti imobilisan na čvrstoj podlozi ili oni mogu biti imobilisani na takvoj podlozi koja je priložena sa kompletom ili je obezbeđena zasebno od kompleta. DBDpp je poželjno premazan na mikrotitarskoj ploči. U nekim primerima, detekcija uključuje molekul koji pojačava signal. Kada je molekul koji pojačava signal enzim, komplet opciono dalje uključuje supstrate i kofaktore koji su potrebni enzimu, i molekul za pojačavanje je fluorofor. Komplet opciono dalje sadrži prekursor boje koji obezbeđuje detektabilni hromofor.
[0341] Komplet može takođe da sadrži uputstvo za obavljanje testa, kao i druge aditive kao što su stabilizatori, puferi za ispiranje i inkubaciju, i slično. Komponente kompleta će biti obezbeđene u unapred utvrđenom odnosu, pri čemu su relativne količine različitih reagensa pogodno varirane kako bi se obezbedile koncentracije u rastvoru reagensa koje značajno maksimizuju osetljivost testa i/ili sposobnost prečišćavanja cilja od interesa. Konkretno, reagensi mogu da se obezbede u vidu suvih praškova, obično liofilizovanih, uključujući ekscipijense koji će po rastvaranju obezbediti rastvor reagensa sa odgovarajućom koncentracijom za kombinovanje sa uzorkom koji se testira.
[0342] U struci su poznati različiti formati i tehnike za testove vezivanja koji mogu da se koriste i oni uključuju, ali nisu ograničeni na, imobilizaciju na filterima kao što su najlon ili nitroceluloza; dvodimenzionalne čipove, test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), radioimunološki test (RIA), testove konkurentskog vezivanja, direktne i indirektne sendvič testove, testove imunoprecipitacije, tehnologiju testa fluorimetrijske mikrozapremine (FMATTM), testove sistema LuminexTM, fluorescentno rezonantni energetski transfer
1
(FRET), bioluminescentno rezonantni energetski transfer (BRET), elektroimunološke testove, AlphaScreenTM, tehnike dobijene od nanočestica, i površinsku plazmonsku rezonancu (SPR).
[0343] Testovi vezivanja mogu biti homogeni ili poluhomogeni. Homogeni test je test u kome su sve komponente pomešane, inkubirane i zatim analizirane. Poluhomogeni test je onaj u kome se veći deo reakcije odvija u kompleksnoj smeši, ali je korak ispiranja neophodan pre dodatka finalnog reagensa i analize, nasuprot uobičajenom sendvič testu sa dodavanjem u koracima u kome se svaka komponenta dodaje i zatim ispira pre dodavanja sledeće komponente. U nekim otelotvorenjima, test je imunološki test. U određenim otelotvorenjima, test je poluhomogeni enzimski imunološki test (EIA).
Primene
[0344] DBDpp, bilo samostalno, kao fuzioni proteini, kao hemijski konjugati ili kao druga otelotvorenja koja su ovde opisana, ima različite primene. U nekim otelotvorenjima, DBDpp se koriste kao detekcioni reagensi, reagensi za hvatanje, reagensi za odvajanje, dijagnostički reagensi ili analitički reagensi. Neke otelotvorenja imaju in vivo, in vitro i/ili ex vivo primene. Postupci koji koriste DBDpp in vitro mogu da se vrše u različitim formatima, kao što su mikrotitarske ploče, u proteinskim čipovima, na biosenzorskim površinama, na sekcijama tkiva, i u dodatnim formatima koji će biti jasni stručnjaku. Slično tome, postupci koji koriste DBDpp in vivo mogu da se koriste u različitim formatima koji uključuju, ali nisu ograničeni na, DBDpp-Fc fuzione proteine, CAR ćelije i DBDpp multispecifična antitela. U određenim otelotvorenjima, DBDpp kao što su DBDpp fuzioni proteini, koriste se kao terapeutski agens.
Analitičke i dijagnostičke primene
[0345] Bilo samostalno, kao fuzioni proteini, kao hemijski konjugati ili kao druga otelotvorenja koja su ovde opisana, DBDpp imaju različite primene. U nekim otelotvorenjima, DBDpp se koriste kao detekcioni reagensi ciljeva od interesa u raznovrsnim različitim vrstama uzorka.
[0346] U jednom otelotvorenju, DBDpp se koriste za detekciju ciljeva od interesa u rastvorima koji su uključeni u procese proizvodnje, kao što su ekspresija i prečišćavanje proteina. Uzorci mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, vodu, pufere, uzorke za prečišćavanje tokom procesa, ukupnu supstancu leka i konačni proizvedeni lek. U još daljim otelotvorenjima, DBDpp može
1
da se koristi za detekciju i/ili uklanjanje nečistoća ili zagađivača iz uzorka, kao što je izvor snabdevanja vodom ili voda (ili druga tečnost) korišćena u proizvodnji.
[0347] U drugom otelotvorenju, DBDpp se koriste za detekciju ciljeva od interesa u dijagnostičkim uzorcima. Uzorci mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, homogenate tkiva, ćelijske ekstrakte, uzorke biopsije, serume, plazmu, limfu, krv, frakcije krvi, urin, sinovijalnu tečnost, spinalnu tečnost, pljuvačku, sluzokožu, sputum, pleuralnu tečnost, aspirate bradavica, tečnost respiratornog, intestinalnog i genitourinarnog trakta, suze, majčino mleko, tečnost iz limfatičnog sistema, spermu, cerebrospinalnu tečnost, tečnost intraorganskog sistema, ascitnu tečnost, tečnost tumorske ciste, amnionsku tečnost, i medijume ili lizate iz uzgajanih ćelija.
[0348] U jednom otelotvorenju, DBDpp su korisni za detekciju prisustva faktora ili više faktora (npr. antigeni ili organizmi) u biološkom uzorku. Termin „detekcija“, kako se ovde koristi, obuhvata kvantitativnu ili kvalitativnu detekciju. U određenim otelotvorenjima, biološki uzorak sadrži ćeliju, tkivo ili tečnost. U određenim otelotvorenjima, takva tkiva uključuju normalna i/ili kancerozna tkiva.
[0349] U struci su poznati različiti formati i tehnike za detekciju, i oni uključuju, ali nisu ograničeni na vestern blot analizu, imunohistohemiju, ELISA, FACS analizu, enzimske testove, autoradiografiju, i bilo koji od ovde navedenih testova vezivanja.
[0350] U jednom opisanom primeru, obezbeđen je postupak za detekciju cilja od interesa u rastvoru koji sadrži cilj koji obuhvata: (a) dovođenje u kontakt rastvora sa DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje DBDpp za cilj i (b) detekciju vezivanja DBDpp i cilja. DBDpp može biti slobodan ili imobilisan. Ostavljeno je dovoljno vremena da se omogući vezivanje između cilja od interesa i DBDpp. i nevezujuće komponente u rastvoru ili smeši su uklonjene ili isprane. Tada može da se detektuje nastanak kompleksa vezivanja između DBDpp i cilja od interesa, na primer, detekcijom signala sa oznake na DBDpp, koji je jedna komponenta kompleksa vezivanja. Oznaka može biti bilo koja oznaka koja stvara signal koji može da se detektuje standardnim postupcima, kao što je fluorescentna oznaka, radioaktivno jedinjenje ili enzim koji reaguje sa supstratom radi stvaranja detektabilnog signala. Primeri prikladnih oznaka za takve svrhe su opisani ovde i/ili su inače poznati u struci.
1
[0351] DBDpp koji se vezuju za cilj od interesa mogu detektabilno da se obeleže upotrebom radioizotopa, afinitetnih oznaka (kao što je biotin, avidin, itd.), enzimskih oznaka (kao što je peroksidaza rena, alkalna fosfataza, itd.) koristeći postupke poznate u struci, kao što su oni opisani u WO 00/70023 i (Harlow i Lane (1989) Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory, str. 1-726).
[0352] Detektabilni marker ili oznaka može biti svaki koji je sposoban da proizvede, direktno ili indirektno, merljivi signal, kao što je radioaktivni, hromogeni, luminescentni ili fluorescentni signal, koji može da se koristi za kvantifikaciju vezanog detektabilnog ostatka ili oznake u uzorku. Detektabilne oznake poznate u struci uključuju radioizotope, kao što su 3H, 14C, 32P, 35S ili 125I, elektrohemiluminescentne oznake (kao što je katalizator na bazi rutenijuma (RU) u konjunkciji sa supstratima, itd.) luminescentne ili bioluminescentne oznake (npr. evropijum, vanadijum), fluorescentna ili hemiluminescentna jedinjenja, kao što su fluorescein izotiocijanat, rodamin ili luciferin, enzime (npr. enzim kao što je alkalna fosfataza, beta-galaktozidaza ili peroksidaza rena), kolorimetrijske oznake kao što su koloidno zlato, obojeno staklo ili plastične perlice (npr. polistiren, polipropilen, lateks, itd.), paramagnetne atome ili magnetne agense, elektronski nepropusne reagense, nano- ili mikroperlicu koja sadrži fluorescentnu boju, nanokristale, kvantnu tačku, nanooznaku, dendrimere sa fluorescentnom oznakom, mikrotransponder, molekul ili molekulska struktura donor elektrona ili česticu koja reflektuje svetlosti, pri čemu mikročestice mogu biti nanokristali ili kvantne tačke. Nanokristali su supstance koje apsorbuju svetlosne fotone, zatim ponovo emituju fotone na različitoj talasnoj dužini (fluorofori). Pored toga, dodatne fluorescentne oznake ili sekundarna antitela mogu biti konjugovane sa nanokristalima. Nanokristali su komercijalno dostupni od izvora kao što su Invitrogen i Evident Technologies (Troy, N.Y.). Ostale oznake uključuju E)-5-[2-(metoksikarbonil)etenil]citidin koji je nefluorescentni molekul koji nakon izlaganju ultraljubičastom (UV) zračenju daje proizvod, 3 beta-D-ribofuranozil-2,7-dioksopirido[2,3-d]pirimidin, koji pokazuje snažni fluorescentni signal.
[0353] Konkurentska inhibicija može da se odredi bilo kojim postupkom koji je poznat u struci, na primer, konkurentskim ELISA testom. Za DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein (npr. DBDpp-Fc, DBDpp-CAR, DBDpp-scFv) ili drugi molekul kaže se da „konkurentski inhibira“ vezivanje referentnog molekula za dati epitop ako se vezuje za taj epitop u meri da blokira, do određenog stepena, vezivanje referentnog molekula za epitop. Kako se ovde koristi, za DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) ili drugi molekul može se reći da konkurentski
1
inhibira vezivanje referentnog molekula za dati epitop, na primer, za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60%, najmanje 50%, za najmanje 40%, najmanje 30% ili najmanje 20%. Termini „takmiči se“, „sposobnost da se takmiči“ i „takmiči se sa“ su relativni termini koji se koriste za opisivanje DBDpp, kao što je DBDpp fuzioni protein, koji proizvode najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40% ili najmanje 50% inhibicije vezivanja referentnog molekula za cilj putem DBDpp kao što je DBDpp fuzioni protein (npr. DBDpp-Fc, DBDpp CAR, DBDpp-scFv i DBDpp koji sadrži antitelo) kako je utvrđeno u standardnom testu konkurentnosti kao što je ovde opisano ili inače poznato u struci, uključujući, bez ograničenja, sisteme testova konkurentnosti koristeći tehnike kao što su radioimunološki testovi (RIA), enzimski imunološki testovi (EIA), poželjno test sa imunosorbentom vezanim za enzim (ELISA), „sendvič“ imunološki testovi, imunoradiometrijski testovi, fluorescentni imunološki testovi, luminescentni, elektrohemijski luminescentni i testovi imunoelektroforezom. Postupci za utvrđivanje vezivanja i afiniteta kandidata za vezujuće molekule su poznati u struci i uključuju, ali nisu ograničeni na, afinitetnu hromatografiju, hromatografiju na molekulskim sitima, ravnotežnu dijalizu, premeštanje fluorescentne sonde i rezonancu plazme.
Afinitetno prečišćavanje
[0354] Kod prečišćavanja na bazi afinitetne hromatografije, ciljni proteini su selektivno izolovani prema njihovoj sposobnosti da se specifično i reverzibilno vezuju za ligand koji je obično kovalentno kuplovan sa hromatografskom matricom. U jednom otelotvorenju, DBDpp mogu da se koriste kao reagensi za afinitetno prečišćavanje ciljeva od interesa iz rekombinantnih izvora ili prirodnih izvora, kao što su biološki uzorci (npr. serum).
[0355] U drugom opisanom primeru, obezbeđen je postupak za izolaciju cilja od interesa iz rastvora koji sadrži cilj od interesa. Takav postupak uključuje: (a) dovođenje u kontakt rastvora sa DBDpp u uslovima koji dopuštaju vezivanje DBDpp za cilj od interesa; i (b) izolovanje cilja od interesa. U još jednom otelotvorenju, obezbeđen je postupak za izolaciju cilja od interesa iz rastvora koji sadrži cilj od interesa koji obuhvata: (a) dovođenje u kontakt rastvora sa DBDpp u uslovima koji su pogodni za specifično vezivanje DBDpp za cilj; i (b) razdvajanje kompleksa koje grade cilj od interesa i/ili DBDpp od drugih komponenata rastvora. U daljem otelotvorenju, postupak dalje obuhvata korake: (c) disocijacije DBDpp sa cilja od interesa, i (d) izolacije disociranog cilja od interesa.
1
[0356] U nekim primerima, DBDpp koji specifično vezuje cilj od interesa se imobiliše na perlicama i zatim se koristi za afinitetno prečišćavanje ciljnog proteina.
[0357] Postupci kovalentnog kuplovanja proteina za površinu su poznati stručnjacima, i peptidne oznake koje mogu da se koriste za povezivanje DBDpp za čvrstu površinu su poznate stručnjacima. Dalje, DBDpp može biti povezan (tj. kuplovan, vezan ili zalepljen) za čvrstu površinu koristeći bilo koje reagense ili tehnike poznate u struci. U nekim otelotvorenjima, čvrsta podloga je izabrana od: perlica, stakla, pločica, čipova i želatina. Tako, serija DBDpp može da se koristi da se načini niz na čvrstoj površini koristeći tehnike koje su poznate u struci. Na primer, U.S. publ. br.2004/0009530 otkriva postupke za pripremu nizova.
[0358] U drugom primeru, DBDpp se koristi za izolaciju cilja od interesa putem afinitetne hromatografije. Može da se koristi bilo koji konvencionalni postupak hromatografije. U nekim otelotvorenjima, DBDpp je imobilisan na čvrstoj podlozi. DBDpp može biti imobilisan na čvrstoj podlozi koristeći tehnike i reagense koji su ovde opisani ili su inače poznati u struci. Odgovarajuće čvrste podloge su opisane ovde ili su inače poznate u struci, i u specifičnim otelotvorenjima su pogodne za pakovanje hromatografske kolone. Imobilisani DBDpp zatim može da se nanese ili dovede u kontakt sa rastvorom u uslovima koji su pogodni za nastanak kompleksa između DBDpp i cilja od interesa. Nevezujuće supstance mogu da se uklone ispiranjem. Stručnjak lako može da odredi odgovarajuće uslove za ispiranje. Primeri odgovarajućih uslova za ispiranje uključuju, ali nisu ograničeni na, PBS/0,01% Tween 20, pH 7,2 i 1 M NaCl/10 mM Tris, pH 7,5. Tris puferi za ispiranje mogu biti poželjni pošto fosfati mogu da se talože u 50% etilen glikola. Uopšteno, neograničavajući uslovi, puferi za ispiranje su pH 7,0, opciono sadrže 0,0 od 1,5 M NaCl, poželjnije 1 M NaCl. Pored toga, puferi za ispiranje mogu opciono da sadrže blagi deterdžent, kao što je Tween 20, Tween 80 ili NP-80. Cilj od interesa može da se eluira iz DBDpp vezujućeg kompleksa putem uvođenja uslova rastvora koji pogoduju disocijaciji kompleksa vezivanja. Stručnjak jednostavno može da odredi odgovarajuće elucione rastvore, i oni uključuju, ali nisu ograničeni na 50% etilen glikol/10 mM NaOAc. Kao neograničavajući primer, korisni elucioni puferi sadrže 40-60% etilen glikola, poželjno 50% etilen glikola; i 50-100 mM NaOAc sa pH u opsegu od pH 4-7, poželjnije, pH 4-6, a najpoželjnije pH 4,5-5,5. Poželjno, tehnike afinitetne hromatografije sa brzim protokom se koristi za vezivanje DBDpp za cilj od interesa, iz koga se eluira prečišćeni cilj od interesa.
1
[0359] Alternativno, hromatografija može da se obavi mešanjem rastvora koji sadrži cilj od interesa i DBDpp, zatim izolacijom kompleksa cilja od interesa i DBDpp. Poznati su mnogi postupci koji mogu rutinski da se koriste za ovu vrstu razdvajanja. Na primer, DBDpp mogu da se imobilišu na čvrstoj podlozi kao što su perlice, zatim da se filtracijom odvoje iz rastvora zajedno sa ciljem od interesa. U drugom primeru, DBDpp može biti fuzioni protein koji sadrži peptidnu oznaku kao što je poli-HIS rep ili region vezivanja streptavidina koji može da se koristi za izolaciju DBDpp nakon što su kompleksi nastali koristeći imobilisanu metalnu smolu za afinitetnu hromatografiju ili supstrat obložen streptavidinom. Nakon odvajanja, cilj od interesa može da se otpusti iz DBDpp u elucionim uslovima i izoluje u prečišćenom obliku.
Terapeutski agensi
[0360] Ovde opisani DBD su korisni u različitim primenama uključujući, bez ograničenja, postupke terapeutskog lečenja, koji mogu biti in vitro, ex vivo ili in vivo postupci.
[0361] Primena u vidu terapeutskog entiteta je posledica specifičnosti vezivanja cilja DBDpp. Uključivanje DBDpp u različite molekulske kompozicije (npr. fuzije DBD-antitelo, konjugati DBD-lek i DBD-himerni receptori) omogućava primenu u različitim terapeutskim indikacijama i modalitetima, što uključuje, bez ograničenja, rastvorljive i sa ćelijom povezane kompozicije.
[0362] U jednom otelotvorenju, DBDpp je rastvorljivi fuzioni protein (šematski prikazan na SL. 5C i sačinjen od opcione epitopske oznake 10 i ciljajućeg domena 20) koji se vezuje za cilj koji je povezan sa bolešću ili poremećajem metaboličkog, kardiovaskularnog, muskuloskeletnog, neurološkog ili skeletnog sistema. U drugim otelotvorenjima, DBDpp je rastvorljivi fuzioni protein koji se vezuje za cilj od interesa povezan sa gljivičnom, virusnom ili bakterijskom infekcijom ili bolešću. U nekim otelotvorenjima, DBDpp je rastvorljivi fuzioni protein koji se vezuje za cilj koji je povezan sa bolešću ili poremećajem imunskog sistema.
[0363] Takođe su obezbeđene terapeutske kompozicije korisne za praktikovanje ovde opisanih terapeutskih postupaka. U jednom otelotvorenju, ovde obezbeđene terapeutske kompozicije sadrže fiziološki podnošljiv nosač zajedno sa najmanje jednom vrstom DBDpp fuzije, kako je ovde opisano, rastvoren ili dispergovan u njima kao aktivni sastojak. U drugom otelotvorenju, ovde obezbeđene terapeutske kompozicije sadrže fiziološki podnošljiv nosač zajedno sa
1 1
najmanje jednom vrstom DBDpp, kako je ovde opisano, rastvoren ili dispergovan u njima kao aktivni sastojak. U poželjnom otelotvorenju, terapeutska kompozicija nije imunogena kada se primenjuje na ljudskom pacijentu u terapeutske svrhe.
[0364] Priprema farmakološke kompozicije koja u sebi sadrži rastvorene ili dispergovane aktivne sastojke dobro je poznata u struci. Takve kompozicije se uobičajeno pripremaju kao sterilne injektabilne supstance bilo kao tečni rastvori ili suspenzije, vodeni ili nevodeni. Međutim, mogu se pripremiti i čvrsti oblici pogodni za rastvor, ili suspenzije, u tečnosti pre upotrebe. Preparat se takođe može emulgovati. Tako, kompozicija koja sadrži DBDpp može imati oblik rastvora, suspenzije, tablete, kapsule, formulacije ili praška sa produženim otpuštanjem, ili druge oblike za kompoziciju. U nekim otelotvorenjima, kompozicije DBDpp (npr. DBDpp fuzioni proteini) formulisane su da omoguće ili optimizuju distribuciju in vivo. Na primer, krvno-moždana barijera (BBB) isključuje mnoga veoma hidrofilna jedinjenja i, ako je to poželjno, kompozicije su pripremljene tako da povećavaju transfer kroz krvno-moždanu barijeru, na primer, formulacijom u lipozomima. Za postupke proizvodnje lipozoma, vidite, npr. U.S. pat. br. 4,522,811, 5,374,548, i 5,399,331. Lipozomi mogu da sadrže jedan ili više ostataka koji su selektivno transportovani u specifične ćelije ili organe, čime se povećava isporuka ciljanog leka (vidite, npr. Ranade, Clin. Pharmacol.29:685 (1989)).
[0365] DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) može da se pomeša sa drugim aktivnim sastojcima i/ili ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom u količinama odgovarajućim za upotrebu u ovde opisanim terapeutskim postupcima. Pogodni ekscipijensi su, na primer, voda, fiziološki rastvor, dekstroza, glicerol, etanol, i slično, i njihove kombinacije. Pored toga, po želji, kompozicija može da sadrži manje količine pomoćnih supstanci, kao što su kvašljivci ili emulgatori, pH puferujući agensi i slično, koje mogu da povećaju delotvornost aktivnog sastojka.
[0366] Terapeutski DBDpp može da uključuje farmaceutski prihvatljive soli njegovih komponenti. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju kisele adicione soli (nastale sa slobodnim amino grupama polipeptida) koje su nastale sa neorganskim kiselinama kao što su, na primer, hlorovodonična ili fosforna kiselina, ili sa organskim kiselinama kao što su sirćetna, vinska, mandelinska, i slično. Soli nastale sa slobodnim karboksilnim grupama mogu biti dobijene i od neorganskih baza kao što su, na primer, natrijum, kalijum, amonijum, kalcijum ili gvožđe
1 2
hidroksidi, i od organskih baza, kao što su izopropilamin, trimetilamin, 2- etilamino etanol, histidin, prokain, i slično.
[0367] U struci su poznati fiziološki podnošljivi nosači. Primeri za tečne nosače su sterilni vodeni rastvori koji ne sadrže druge supstance osim aktivnih sastojaka i vode, ili sadrže pufer kao što je natrijum fosfat sa fiziološkom pH vrednošću, fiziološki rastvor ili oba, kao što je fiziološki rastvor puferovan fosfatom. Dalje, vodeni nosači mogu da sadrže više od jedne puferske soli, kao i soli kao što je natrijum i kalijum hlorid, dekstrozu, propilen glikol, polietilen glikol, i druge rastvorene supstance.
[0368] Tečne kompozicije mogu da sadrže i tečne faze kao dodatak vodi, ili umesto nje. Primeri takvih dodatnih tečnih faza su glicerin, biljna ulja, kao što je ulje pamučnog semena, organski estri, kao što je etil oleat, i emulzije voda-ulje.
[0369] U jednom otelotvorenju, terapeutska kompozicija sadrži DBDpp fuzioni protein, obično u količini od najmanje 0,1 maseni procenat DBDpp fuzionog proteina u odnosu na masu ukupne terapeutske kompozicije. Maseni procenat je maseni odnos DBDpp fuzije prema ukupnoj kompoziciji. Tako, na primer, 0,1 maseni procenat je 0,1 gram DBDpp na 100 grama ukupne kompozicije.
[0370] Terapeutska kompozicija koja sadrži DBDpp fuzioni protein obično sadrži oko 10 mikrograma (µg) po mililitru (ml) do oko 100 miligrama (mg) po ml DBDpp fuzionog proteina kao aktivnog sastojka po zapremini kompozicije, a poželjnije sadrži oko 1 mg/ml do oko 10 mg/ml (tj. oko 0,1 do 1 maseni procenat).
[0371] Dozni rasponi za primenu DBDpp (npr. DBDpp fuzionog proteina) su oni dovoljno veliki da proizvedu željeno dejstvo kojim se ublažavaju simptomi bolesti posredovani ciljnim molekulom. Doza ne treba da bude toliko velika da izaziva neželjena dejstva, kao što su sindromi hiperviskoznosti, edem pluća, kongestivno zatajenje srca, i slično. Uopšteno, doza će se menjati sa starošću, stanjem, polom i opsegom bolesti kod pacijenta, i stručnjak može da je odredi. Lekar može da prilagodi dozu u slučaju bilo koje komplikacije.
[0372] DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) može da se primeni parenteralno putem injekcije ili postepene infuzije tokom vremena. Iako se ciljnom molekulu obično može pristupiti u telu
1
sistemskom primenom, i stoga se najčešće leči intravenskom primenom terapeutskih kompozicija, razmatrana su i druga tkiva i načini isporuke kada postoji verovatnoća da ciljano tkivo sadrži ciljni molekul. Dakle, DBDpp može da se primeni intravenski, intraperitonealno, intramuskularno, supkutano, intrakavitaciono, transdermalno, i može da se isporuči peristaltičkim sredstvom. DBDpp fuzioni proteini takođe mogu da se isporuče u disajne puteve i pluća putem aerosola.
[0373] Terapeutske kompozicije koje sadrže DBDpp mogu konvencionalno da se primenjuju intravenski, na primer, injekcijom u vidu jedinične doze. Termin „jedinična doza“, kada se koristi u odnosu na ovde obezbeđenu terapeutsku kompoziciju, odnosi se na fizički diskretne jedinice pogodne za unitarnu dozu za ispitanika, pri čemu svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivne supstance izračunatu da proizvede željeno terapeutsko dejstvo zajedno sa potrebnim razblaživačem; npr. nosačem ili vehikulumom. U specifičnom otelotvorenju, terapeutske kompozicije koje sadrže DBDpp se primenjuju supkutano.
[0374] U nekim otelotvorenjima, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) primenjuje se na način koji je kompatibilan sa doznom formulacijom, i u terapeutski delotvornoj količini. Količina koja se primenjuje će zavisiti od ispitanika koji se leči, sposobnosti ispitanikovog sistema da koristi aktivni sastojak, i nivoa željenog terapeutskog dejstva. Precizne količine aktivnog sastojka potrebne za primenu zavisiće od procene lekara, i posebne su za svakog pojedinca. Međutim, prikladni dozni rasponi za sistemsku primenu su prikazani ovde, i zavise od načina primene. Odgovarajući režimi primene su takođe promenljivi, ali ih karakteriše inicijalna primena praćena ponovljenim dozama u intervalima od jednog ili više sati putem narednih injekcija ili druge primene. Alternativno se razmatra neprekidna intravenska infuzija dovoljna za održavanje koncentracija u krvi u rasponima koji su naznačeni za in vivo terapije.
[0375] Kompozicije DBDpp se formulišu, doziraju i primenjuju na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom. Faktori koje treba razmotriti u ovom kontekstu uključuju konkretni poremećaj koji se leči, konkretnog sisara koji se leči, kliničko stanje pojedinačnog pacijenta, uzrok poremećaja, mesto isporuke agensa, postupak primene, raspored primene, i druge faktore koji su poznati zdravstvenim radnicima. Dozni rasponi za primenu DBDpp su oni koji su dovoljno veliki da proizvedu željeno dejstvo kojim se ublažavaju simptomi bolesti posredovani ciljnim molekulom. Doza ne treba da bude toliko velika da izaziva neželjena dejstva, kao što su sindromi hiperviskoznosti, edem pluća, kongestivno zatajenje srca, i slično.
1 4
Uopšteno, doza će se menjati sa starošću, stanjem, polom i opsegom bolesti kod pacijenta, i stručnjak može da je odredi. Lekar može da prilagodi dozu u slučaju bilo koje komplikacije.
[0376] Raspored doziranja i količine koje su delotvorne za terapeutske i profilaktičke primene, tj. „dozni režim“, zavisiće od različitih faktora, uključujući uzrok, stadijum i težinu bolesti ili poremećaja, zdravlje, fizičko stanje, starost sisara koji se leči, i mesto i način isporuke DBD. Terapeutska delotvornost i toksičnost kompleksa i formiranje mogu da se odrede standardnim farmaceutskim, farmakološkim i toksikološkim procedurama u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama. Podaci dobijeni ovim procedurama mogu isto tako da se koriste u formulaciji raspona doza za ljudsku upotrebu. Štaviše, terapeutski indeks (tj. doza terapeutski delotvorna kod 50 posto populacije podeljena sa dozom smrtonosnom za 50 posto populacije (ED50/LD50)) može se jednostavno odrediti koristeći poznate procedure. Doza je poželjno u rasponu koncentracija koji uključuje ED50 sa malom ili nepostojećom toksičnošću i može da varira u ovom rasponu u zavisnosti od doznog oblika koji se koristi, osetljivosti pacijenta i načina primene.
[0377] Dozni režim takođe uzima u razmatranje farmakokinetičke parametre koji su poznati u struci, kao što je brzina apsorpcije leka, bioraspoloživost, metabolizam i klirens (vidite, npr. Hidalgo-Aragones, J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 58:611-617 (1996); Groning et al. Pharmazie 51:337-341 (1996); Fotherby, Contraception 54:59-69 (1996); i Johnson et al. J. Pharm. Sci. 84:1144-1146 (1995)). Kliničar može na osnovu struke da odredi dozni režim za svakog ispitanika koji se leči. Štaviše, može da se primenjuje pojedinačna ili višestruka primena kompozicije DBDpp u zavisnosti od doze i učestalosti u skladu sa potrebama i tolerancijom ispitanika. Trajanje profilaktičkog i terapeutskog lečenja će zavisiti od konkretne bolesti ili stanja koje se leči. Neke bolesti su podložne akutnom lečenju, dok druge zahtevaju dugoročnu, hroničnu terapiju. DBDpp može da se primenjuje serijski ili istovremeno sa dodatnim terapeutskim agensom.
[0378] U nekim otelotvorenjima, DBDpp se primenjuje sa oko 1 mg/kg do oko 50 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 25 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 15 mg/kg, oko 1 mg/kg do oko 10 mg/kg ili oko 1 mg/kg do oko 5 mg/kg.
[0379] U drugom otelotvorenju, DBDpp se primenjuje u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih terapeutskih agensa.
1
[0380] Terapeutski delotvorna količina DBDpp, kao što je DBDpp fuzioni protein, može biti takva količina da je kada se primenjuje u fiziološki podnošljivoj kompoziciji dovoljna za postizanje koncentracije u plazmi od oko 0,1 mikrograma (µg) po mililitru (ml) do oko 100 µg/ml, poželjno od oko 1 µg/ml do oko 5 µg/ml, a obično oko 5 µg/ml. Drugačije rečeno, doza može da varira od oko 0,1 mg/kg do oko 300 mg/kg, poželjno od oko 0,2 mg/kg do oko 200 mg/kg, najpoželjnije od oko 0,5 mg/kg do oko 20 mg/kg, u jednoj ili više dnevnih primena doze, tokom jednog ili nekoliko dana.
[0381] U jednom otelotvorenju, bolest ili poremećaj je bolest ili poremećaj imunskog sistema, kao što je inflamacija ili autoimunska bolest.
[0382] U nekim otelotvorenjima, DBDpp je rastvorljivi protein koji se specifično vezuje za cilj koji je povezan sa bolešću ili poremećajem metaboličkog, kardiovaskularnog, muskuloskeletnog, neurološkog ili skeletnog sistema.
[0383] U drugim otelotvorenjima, DBDpp je rastvorljivi protein koji se specifično vezuje za cilj koji je povezan sa infekcijom kvascima, gljivičnom, virusnom ili bakterijskom infekcijom ili bolešću. U nekim otelotvorenjima, DBDpp je rastvorljivi protein koji se specifično vezuje za cilj koji je povezan sa bolešću ili poremećajem imunskog sistema.
[0384] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni proteini su korisni za inhibiciju rasta tumora, smanjenje neovaskularizacije, smanjenje angiogeneze, indukovanje diferencijacije, smanjenje zapremine tumora i/ili smanjenje tumorogenosti tumora.
[0385] U nekim otelotvorenjima, ovde opisani DBDpp su korisni u lečenju kancera. Prema tome, neki opisani postupci lečenja kancera obuhvataju primenu terapeutski delotvorne količine DBDpp (npr. DBDpp fuzija) na pacijentu.
[0386] Kanceri koji mogu da se leče uključuju tumore koji nisu vaskularizovani, ili nisu još značajno vaskularizovani, kao i vaskularizovane tumore. Kancer može da obuhvata tumore koji nisu čvrsti (kao što su hematološki tumori, na primer, leukemije i limfomi) ili može da obuhvata čvrste tumore. Vrste kancera koji se leče pomoću DBDpp uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, blastom i sarkom i određene leukemije i limfoidne malignitete, benigne i maligne
1
tumore i malignitete, npr. sarkome, karcinome i melanome. Uključeni su i tumor/kancer odraslih i pedijatrijski tumori/kanceri.
[0387] Primeri čvrstih tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, uključuju fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteosarkom i druge sarkome, sinoviom, mezoteliom, Juingov tumor, lejomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, limfoidni malignitet, kancer pankreasa, kancer dojke, kancere pluća, kancer jajnika, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, medularni tiroidni karcinom, papilarni tiroidni karcinom, karcinom feohromocitoma lojne žlezde, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, Vilmsov tumor, kancer grlića materice, testikularni tumor, seminom, karcinom bešike, melanom i tumore CNS (kao što je gliom (kao što su gliom moždanog stabla i mešoviti gliomi), glioblastom (poznat i kao glioblastom multiforme) astrocitom, limfom CNS, germinom, meduloblastom, švanom kraniofaringiom, ependimom, pineajom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom, retinoblastom i moždane metastaze).
[0388] U drugom otelotvorenju, DBDpp koji su ovde opisani su korisni za lečenje pacijenta koji ima hematološke kancere. Primeri hematoloških (ili hematogenih) kancera uključuju leukemije, uključujući akutne leukemije (kao što je akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija i mijeloblasti, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija), hronične leukemije (kao što je hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija, hronična mijelogena leukemija i hronična limfocitna leukemija), policitemiju vera, Hodžkinovu bolest, ne-Hodžkinov limfom (indolentni i oblici visokog stadijuma), multipli mijelom, Valdenstromovu makroglobulinemiju, bolest teškog lanca, mijelodisplastični sindrom, leukemiju vlasastih ćelija i mijelodisplaziju.
[0389] U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein vezuje (1) cilj na ćeliji ili tkivu od interesa (npr. tumorski antigen na tumorskoj ćeliji) i (2) cilj na efektorskoj ćeliji, kao što je molekul T-ćelijskog receptora. Prema jednom otelotvorenju, vezivanje jednog ili više ciljeva pomoću DBDpp fuzionog proteina se koristi za usmeravanje imunskog odgovora na infektivni agens, ćeliju, tkivo ili drugu lokaciju od interesa u pacijentu. Na primer, u nekim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje cilj na površini efektorske ćelije. Dakle, u nekim
1
otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje cilj na površini T ćelije. U određenim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje CD3. U drugim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje CD2. U daljem otelotvorenju, DBDpp specifično vezuje T-ćelijski receptor (TCR). Prema dodatnim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje cilj na površini ćelije prirodnog ubice. Tako, u nekim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje receptor NKG2D (prirodni ubica grupa 2D). U dodatnim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje CD16 (tj. Fc gama RIII) CD64 (tj. Fc gama RI) ili CD32 (tj. Fc gama RII).
[0390] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein vezuje cilj na leukocitu i tumorski antigen na tumorskoj ćeliji. U nekim otelotvorenjima, DBDpp fuzioni protein vezuje NKG2D. U daljem otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein vezuje NKG2D i cilj izabran od ErbB2, EGFR, IGF1R, CD19, CD20, CD80 i EPCAM. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein vezuje CD3. U određenim otelotvorenjima, DBDpp specifično vezuje CD3 epsilon. U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein vezuje CD4.
[0391] U jednom otelotvorenju, DBDpp fuzija je bispecifična i specifično se vezuje za dva različita cilja eksprimirana na površini dve različite vrste ćelija. U jednom otelotvorenju, bispecifični DBDpp fuzioni protein se specifično vezuje za ciljnu ćeliju kancera i ciljnu imunsku efektorsku ćeliju. U jednom otelotvorenju, bispecifični DBDpp fuzioni protein specifično vezuje cilj eksprimiran na ćeliji kancera (npr. CD19) i cilj eksprimiran na površini T limfocita (npr. CD3).
[0392] U nekim otelotvorenjima, DBDpp može da imitira vezivanje liganda. U određenim otelotvorenjima, DBDpp može da imitira biološku aktivnost liganda (agonist DBDpp) ili da inhibira bioaktivnost liganda (antagonist DBDpp), npr. putem konkurentskog vezivanja. DBDpp u DBDpp fuzionim proteinima takođe može da utiče na ciljeve na druge načine, npr. neutralisanjem, blokiranjem, stabilizacijom, agregacijom ili umrežavanjem DBDpp cilja.
Konjugati DBDpp i leka
[0393] U daljem otelotvorenju, DBDpp fuzioni protein može biti povezan sa drugim organskim ili neorganskim molekulima ili supstratima koristeći hemijsku konjugaciju. U jednom otelotvorenju, konjugati DBDpp-lek namenjeni su olakšavanju lokalne isporuke citotoksičnih agenasa putem ciljajuće specifičnosti DBDpp. Ova kombinacija ciljajuće specifičnosti i
1
citotoksičnog agensa omogućava ciljanu isporuku leka do tumora i njihovu intracelularnu akumulaciju, gde sistemska primena ovih nekonjugovanih lekovitih agensa može dovesti do neprihvatljivih nivoa toksičnosti za normalne ćelije kao i ćelije tumora koje treba da se uklone (Baldwin et al. Lancet strane 603-05 (1986); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic agents In Cancer Therapy: A Review," in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, A. Pinchera et al. (ed.s), str.475-506) (1985)).
[0394] Citotoksični agensi uključuju hemoterapeutske agense, agense za inhibiciju rasta, toksine (npr. enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili njegovi fragmenti), radioaktivne izotope (tj. radiokonjugat), itd. Hemoterapeutski agensi korisni u stvaranju takvih imunokonjugata uključuju, na primer, metotreksat, adriamicin, doksorubicin, melfalan, mitomicin C, hlorambucil, daunorubicin, ili druge interkalirajuće agense. Hemoterapeutski agensi korisni u stvaranju takvih imunokonjugata uključuju i antitubulinske lekove, kao što su auristatini, uključujući monometil auristatin E (MMAE) i monometil auristatin F (MMAF). Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji se mogu koristiti prema pronalasku uključuju A lanac difterije, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, A lanac egzotoksina, A lanac ricina, A lanac abrina, A lanac modecina, alfa-sarcin, proteine drveta tung, proteine diantina, proteine vinobojke (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor iz gorke dinje, kurcin, krotin, inhibitor iz sapunjače, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin i trikotecene.
[0395] U jednom otelotvorenju, DBDpp (npr. DBDpp fuzioni protein) konjugovan je sa radioizotopom. U daljem otelotvorenju, DBDpp je konjugovan sa izotopom izabranim od 90Y, 125I, 131I, 123I, 111In, 105Rh, 153Sm, 67Cu, 67Ga, 166Ho, 177Lu, 186Re i 188Re koristeći bilo koji od brojnih poznatih helatora ili direktnih oznaka. U drugim otelotvorenjima, DBDpp je kuplovan sa lekovima, prolekovima ili limfokinima poput interferona. Konjugati DBDpp i citotoksina mogu rutinski da se prave koristeći različite bifunkcionalne agense za kuplovanje proteina, kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridiiditiol) propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivni estri (kao što je disukcinimidil suberat), aldehidi (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis(p-azidobenzoil) heksandiamin), derivate bis-diazonijuma (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanati (kao što je tolien 2,6-diizocijanat) i bis-aktivna jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). U specifičnom otelotvorenju, toksin je konjugovan sa DBDpp fuzionim proteinom putem linkerskog sistema koji se cepa
1
enzimom (npr. kao onaj prisutan u SGN-35). Mogu da se koriste i konjugati DBDpp i jednog ili više toksina malog molekula, kao što su kaliheamicin, majtanzinoidi i trihoten, i CC1065, i derivati ovih toksina koji imaju toksinsku aktivnost.
[0396] U nekim otelotvorenjima, citotoksični agens je kovalentno povezan sa DBDpp putem linkera. U nekim otelotvorenjima, linker koji povezuje DBDpp i citotoksični agens može da se cepa proteazom.
Terapeutska upotreba u vidu receptora povezanog sa ćelijom
[0397] U jednom otelotvorenju pronalaska, DBDpp-CAR se koriste za svrhe preusmeravanja transdukovanih T ćelija na tumorski cilj definisan vezujućom specifičnošću DBDpp-CAR. U jednom primeru, primarne T ćelije su transdukovane lentivirusnim vektorom koji kodira CAR koji kombinuje DBD domen koji vezuje cilj sa transmembranskim domenom i intracelularnim domenom CD3-zeta, CD28, 4-1BB. Nastala populacija transdukovanih T ćelija može stoga da izazove DBDpp-CAR-posredovani T ćelijski odgovor. U jednom otelotvorenju, T ćelije su genetski modifikovane da eksprimiraju DBDpp-CAR i DBDpp-CAR T ćelija je infuzijom data primaocu kome je to potrebno. Infuzirana ćelija je sposobna da ubija tumorske ćelije u primaocu. Nekoliko otelotvorenja pronalaska je posebno korisno, pošto uključuju jednu, nekoliko ili sve sledeće prednosti: (i) specifičnost vezivanja cilja, (ii) povećanu terepeutsku delotvornost, (iii) smanjena neželjena dejstva van cilja, (iv) mogućnost prilagođavanja za markere određenog pacijenta ili populacije pacijenata, (v) povećanu stabilnost tokom proizvodnje i obrade i (vi) sposobnost ciljanja jednog, dva ili više specifičnih ciljeva radi pojačane terapije usmerene na cilj.
[0398] „Genetski modifikovane ćelije“, „preusmerene ćelije“, „genetski konstruisane ćelije“ ili „modifikovane ćelije“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije koje eksprimiraju ovde obezbeđeni DBDpp. U određenom otelotvorenju, genetski modifikovane ćelije eksprimiraju DBDpp fuzioni protein kao što je DBDpp-CAR. U daljem otelotvorenju, genetski modifikovane ćelije eksprimiraju i prikazuju DBDpp-CAR na ćelijskoj površini.
[0399] „Bolest koju ciljaju genetski modifikovane ćelije“, kako se ovde koristi, obuhvata ciljanje genetski modifikovanim ćelijama bilo koje ćelije koja je na bilo koji način povezana sa bilo kojom bolešću, bez obzira na to da li genetski modifikovane ćelije ciljaju bolesne ćelije
1
ili zdrave ćelije radi postizanja terapeutski korisnog rezultata. Genetski modifikovane ćelije uključuju, ali nisu ograničene na, genetski modifikovane T-ćelije, NK ćelije, hematopoetske matične ćelije, pluripotentne embrionske matične ćelije ili embrionske matične ćelije. Genetski modifikovane ćelije eksprimiraju DBDpp-CAR koji može da cilja bilo koji od antigena eksprimiranih na površini ciljnih ćelija.
[0400] U jednom otelotvorenju, DBDpp deo DBDpp-CAR je konstruisan za lečenje konkretnog kancera. Kanceri koji mogu da se leče uključuju tumore koji nisu vaskularizovani, ili nisu još značajno vaskularizovani, kao i vaskularizovane tumore. Kancer može da obuhvata tumore koji nisu čvrsti (kao što su hematološki tumori, na primer, leukemije i limfomi) ili može da obuhvata čvrste tumore. Vrste kancera koji se leče pomoću DBDpp-CAR uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, blastom i sarkom, i određene leukemije i limfoidne malignitete, benigne i maligne tumore i malignitete, npr. sarkome, karcinome i melanome. Uključeni su i tumor/kancer odraslih i pedijatrijski tumori/kanceri.
[0401] Primeri hematoloških (ili hematogenih) kancera uključuju leukemije, uključujući akutne leukemije (kao što je akutna limfocitna leukemija, akutna mijelocitna leukemija, akutna mijelogena leukemija i mijeloblasti, promijelocitna, mijelomonocitna, monocitna i eritroleukemija), hronične leukemije (kao što je hronična mijelocitna (granulocitna) leukemija, hronična mijelogena leukemija i hronična limfocitna leukemija), policitemiju vera, Hodžkinovu bolest, ne-Hodžkinov limfom (indolentni i oblici visokog stadijuma), multipli mijelom, Valdenstromovu makroglobulinemiju, bolest teškog lanca, mijelodisplastični sindrom, leukemiju vlasastih ćelija i mijelodisplaziju.
[0402] Primeri čvrstih tumora, kao što su sarkomi i karcinomi, uključuju fibrosarkom, miksosarkom, liposarkom, hondrosarkom, osteosarkom i druge sarkome, sinoviom, mezoteliom, Juingov tumor, lejomiosarkom, rabdomiosarkom, karcinom debelog creva, limfoidni malignitet, kancer pankreasa, kancer dojke, kancere pluća, kancer jajnika, kancer prostate, hepatocelularni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija, karcinom bazalnih ćelija, adenokarcinom, karcinom znojne žlezde, medularni tiroidni karcinom, papilarni tiroidni karcinom, karcinom feohromocitoma lojne žlezde, papilarni karcinom, papilarni adenokarcinomi, medularni karcinom, bronhogeni karcinom, karcinom bubrežnih ćelija, hepatom, karcinom žučnog kanala, horiokarcinom, Vilmsov tumor, kancer grlića materice, testikularni tumor, seminom, karcinom bešike, melanom i tumore CNS (kao što je gliom (kao
1 1
što su gliom moždanog stabla i mešoviti gliomi), glioblastom (poznat i kao glioblastom multiforme) astrocitom, limfom CNS, germinom, meduloblastom, švanom kraniofaringiom, ependimom, pineajom, hemangioblastom, akustični neurom, oligodendrogliom, menangiom, neuroblastom, retinoblastom i moždane metastaze).
[0403] U jednom otelotvorenju, kanceri i poremećaji mogu da se leče koristeći ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji cilja CD19, CD20, CD22 i ROR1. U jednom specifičnom otelotvorenju, DBD-CAR može da se konstruiše da cilja CD22 radi lečenja B-ćelijskog limfoma. U drugom otelotvorenju, ćelija koja eksprimira DBDpp-CAR sadrži DBDpp konstruisan da cilja CD19 može da se koristi za lečenje kancera i poremećaja uključujući, bez ograničenja, pre-B ALL (pedijatrijska indikacija), ALL odraslih, limfom ćelija plašta, difuzni limfom velikih B-ćelija, spas nakon alogene transplantacije koštane srži i slično.
[0404] „Bolesti povezane sa B ćelijama“, kako se ovde koristi, uključuju B-ćelijske imunodeficijencije, autoimunske bolesti i/ili prekomernu/nekontrolisanu ćelijsku proliferaciju povezanu sa B-ćelijama (uključujući limfome i/ili leukemije). Primeri takvih bolesti kod kojih DBDpp-CAR može da se koristi za terapeutske pristupe uključuju, ali nisu ograničeni na, sistemski eritemski lupus (SLE), dijabetes, reumatoidni artritis (RA), reaktivni artritis, multiplu sklerozu (MS), pemphigus vulgaris, celijačnu bolest, Kronovu bolest, inflamatornu bolest creva, ulcerozni kolitis, autoimunsku tiroidnu bolest, X-povezane agamaglobulinemije, pre-B akutnu limfoblastnu leukemiju, sistemski eritemski lupus, uobičajenu varijabilnu imunodeficijenciju, hroničnu limfocitnu leukemiju, bolesti povezane sa selektivnim nedostatkom potklase IgA i/ili IgG, limfome B loze (Hodžkinov limfom i/ili non-Hodžkinov limfom), imunodeficijenciju sa timomom, prolaznu hipogamaglobulinemiju i/ili sindrom hiper IgM, kao i virusno posredovane B-ćelijske bolesti kao što je EBV posredovana limfoproliferativna bolest, i hronične infekcije kod kojih B-ćelije učestvuju u patofiziologiji.
[0405] U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja mezotelin radi lečenja mezotelioma, kancera pankreasa, kancera jajnika, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja CD33/IL3Ra radi lečenja akutne mijelogene leukemije, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja c-Met radi lečenja trostruko negativnog kancera dojke, nemikrocelularnog kancera pluća, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja PSMA radi lečenja kancera prostate, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja
1 2
glikolipid F77 radi lečenja kancera prostate, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja EGFRvIlI radi lečenja glioblastoma, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja GD-2 radi lečenja neuroblastoma, melanoma, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja NY-ESO-1 radi lečenja mijeloma, sarkoma, melanoma, i slično. U jednom otelotvorenju, DBDpp-CAR može da se konstruiše da cilja MAGE A3 radi lečenja mijeloma, sarkoma, melanoma, i slično. Pronalazak treba tumačiti tako da uključuje svaki antigeni cilj koji je povezan sa bolešću, kada DBDpp-CAR, kako je definisan u zahtevima, može da se koristi za lečenje bolesti.
[0406] U opisanom primeru, DBDpp-CAR se eksprimira u T ćeliji i obezbeđuje postupak za lečenje ili prevenciju kancera, koji obuhvata primenu ćelija domaćina koje eksprimiraju DBDpp-CAR na pacijentu sa kancerom kod koga ćelija kancera eksprimira tumorski antigen na svojoj površini, i pri čemu DBDpp specifično vezuje ciljni antigen. Primeri ciljnih antigena koje vezuju DBDpp i DBDpp-CAR uključuju, ali nisu ograničeni na, CD19, CD123, TSLPR i CD267.
[0407] T-ćelije modifikovane sa DBDpp-CAR mogu takođe da posluže kao vrsta vakcine za ex vivo imunizaciju i/ili in vivo terapiju kod sisara. Sisar je poželjno čovek.
[0408] Ovde obezbeđene T ćelije modifikovane sa DBDpp-CAR mogu da se primenjuju samostalno ili kao farmaceutska kompozicija u kombinaciji sa razblaživačima i/ili sa drugim komponentama, kao što su hemoterapeutski agensi, antitela, citokini ili populacije ćelija. Ovde obezbeđene kompozicije poželjno su formulisane za intravensku primenu koja može da se primenjuje jednom ili više puta.
[0409] „Varijante izbegavanja gubitka antigena“, kako se ovde koristi, odnosi se na ćelije koje pokazuju smanjenje ili gubitak ekspresije ciljnog antigena, što su antigeni koje cilja ovde obezbeđeni CAR.
[0410] Različita otelotvorenja pronalaska će sada biti ilustrovana kroz opis eksperimenata koji su sprovedeni u skladu sa tim. Primeri koji slede obezbeđeni su da olakšaju praktikovanje otkrivenih otelotvorenja i ne treba ih tumačiti kao ograničenje na bilo koji način ostatka otkrića. U primerima su načinjene reference na priložene slike.
1
PRIMERI
Primer 1. Procena imunogenosti DBDpp
[0411] Sekvence DBDpp, naročito one koje se primenjuju na ispitaniku i/ili se koriste u prečišćavanju kompozicije koja se primenjuje na ispitaniku, poželjno nisu antigene u pogledu ispitanika (npr. čoveka). U nekim otelotvorenjima, sekvenca DBDpp ne sadrži humani HLA-DR vezujući motiv niti mesta cepanja za proteozome i imunske proteazome. U određenim otelotvorenjima, sekvenca DBDpp ne sadrži antigensku sekvencu kako je utvrđeno verzijom kompjuterskog modela predviđanja koja postoji na datum podnošenja ove specifikacije. U određenim otelotvorenjima, sekvenca DBDpp ne sadrži sekvencu mesta vezivanja MHC (klasa I ili klasa II) kako je predviđeno algoritmom izabranim od ProPred (vidite, npr., Singh, Bioinformatics 17(12):1236-1237 (2001)), ProPred1 (Singh, Bioinformatics 19(8):1009-14 (2003)), SYFPEITHI (vidite, npr. Schuler, Immunoinf. Meth. u Mol. Biol. 409(1):75-93 (2007)), SMM-align (vidite, npr. Nielsen, BMC Bioinformatics 8:238 (2007)), RANKPEP (vidite, npr. Reche, Hum Immunol 63: 701-709. (2004)) ili TEPITOPE (vidite, Sturniolo, Nat Biotechnol 17:555-561 (1999)), pri čemu verzija algoritma i primenjene baze podataka postoje na datum podnošenja ove prijave.
[0412] Analiza kompjuterskom simulacijom aminokiselinske sekvence alpha3D (MGSWAEFKQRLAAIKT RLQALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYKGKGNPEVEALRKEAAAIRDELQAYRH
N (SEQ ID NO:49) otkrila je sekvencu 9 aminokiselina (tj. LAAIKTRLQ (SEQ ID NO:50)) koja deli karakteristike sa T ćelijskim epitopima (Singh, Bioinformatics 17:1236-1237, 2001) koji imaju veliki afinitet (prag vezivanja manji od 6%) i promiskuitetni su (prisutni u više od 50% relevantnih alela). Ovaj epitop se nalazi u invarijantnom regionu nekih biblioteka DBDpp. Zato je, sa ciljem smanjenja potencijala za imunogenost, u SEQ ID NO:49 uvedena supstitucija Q19E. Malo je verovatno da ova konzervirana i površinski izložena supstitucija značajno poremeti hidrofobno jezgro (vidite, npr. SL. 1B). Analiza nastale sekvence (SEQ ID NO:1) kompjuterskom simulacijom dala je manje rezultate imunogenosti.
Primer 2. Dizajn, konstruisanje i skrining biblioteke DBDpp
1 4
[0413] Za razliku od prirodnih liganda i vezujućih proteina, sekvenca sintetičke konstrukcije DBD (tj. SEQ ID NO:1) nema poznatog partnera za vezivanje. U konstrukciji DBDpp koji se vezuju za ciljeve, ostaci su razmatrani za mutaciju (tj. randomizaciju u biblioteci) ako se smatralo da su površinski izloženi - ispoljavaju značajnu dostupnost rastvaraču. Dostupni su različiti postupci za procenu dostupnosti definisanih molekulskih struktura rastvaraču. Na primer, PyMOL je softverski paket otvorenog koda razvijen za molekulsku vizuelizaciju i analizu, i može da se koristi za izračunavanje površine oblasti dostupne rastvaraču koristeći postupak čiji su autori Lee i Richards (Lee et al. J. Mol. Biol.55:379-400 (1971)). Specifičnije, koristeći PyMOL (verzija 1.4.1) sa „tačkastim rastvaračem“ postavljenim na 1, „poluprečnikom rastvarača“ na 1,4 Å i „gustinom tačke“ postavljenom na 4, površina oblasti dostupne rastvaraču može da se izračuna za svaku aminokiselinu modela homologije SEQ ID NO:1 na osnovu šablona, PDB 2A3D. Tabela 2 navodi izračunatu površinu (u kvadratnim angstremima) za svaki ostatak, kako je izmereno u kontektstu domena (oblast D) i kao izolovana aminokiselina, nezavisno od sternih smetnji koje uzrokuju susedni ostaci (oblast I). Relativna dostupnost ostataka u domenu (oblast D) u odnosu na izolovano stanje (područje I) predstavljena je kao procentualna vrednost (%A).
Tabela 2. Dostupnost rastvaraču sekvence referentne konstrukcije (SEQ ID NO:1)
1
pozicija aa Oblast I Oblast D % A pozicija aa Oblast I Oblast D % A
1
[0414] Ostaci domena sa vrednostima %A koje su manje od 10% do 11% (npr. F7, L11, I14, L18, L21, S24, L28, F31, 135, F38, L42, Y45, G49, V53, L56, A60, I63 i L67 SEQ ID NO:1; Tabela 2A) smatrani su relativno nedostupnim rastvaraču, te su stoga smatrani ostacima unutrašnjeg jezgra DBD. Nasuprot tome, predviđa se da će ostaci sa vrednostima %A koje su veće od 10% do 11% (npr. G2, S3, W4, A5, E6, K8, Q9, R10, A12, A13, K15, T16, R17, E19, A20, A29, A30, E32, K33, E34, A36, A37, E39, S40, E41, Q43, A44, E52, E54, A55, R57, K58, E59, A61, A62, R64, D65, E66, Q68, A69, i Y70 SEQ ID NO:1) biti locirani u regionima polipeptida koji su povezani sa sekundarnom strukturom alfa-spirale, i da zauzimaju pozicije koje imaju veći potencijal za interakciju sa makromolekulskim ciljevima od interesa. Ti ostaci alfa spirale dostupni rastvaraču smatrani su kandidatima za najveći stepen supstitucione raznovrsnosti (uključujući konzervirane i nekonzervirane supstitucije) u biblioteci.
[0415] Ostaci sekvence referentne konstrukcije koji nemaju alfa spiralu odgovaraju, u nekoliko otelotvorenja, pozicijama M1, L21, G22, G23, S24, E25, A26, E27, Y45, K46, G47, K48, G49, N50, P51, R71, H72 i N73 SEQ ID NO:1. U dodatnim otelotvorenjima, ostaci sekvence referentne konstrukcije koji nemaju alfa spiralu odgovaraju pozicijama M1, G22, G23, S24, E25, A26, E27, K46, G47, K48, G49, N50, P51, R71, H72 i N73 SEQ ID NO:1. Ovi ostaci su isto tako razmatrani kao kandidati za konzervirane i nekonzervirane supstitucije u biblioteci.
[0416] Neke biblioteke DBDpp su stvorene putem selektivne ili nasumične mutacije specifičnih, rastvaraču dostupnih pozicija aminokiselinske sekvence DBDpp. U jednom nizu eksperimenata, biblioteke, koje se ovde nazivaju biblioteke „pročelja“ ili „F biblioteke“, konstruisane su tako da su supstituisani ostaci strukture referentne konstrukcije polipeptida SEQ ID NO:1 grupisani na jednom pročelju domena i radi stvaranja jedne, neprekinute vezujuće površine. Biblioteke pročelja su konstruisane za sva tri pročelja (F1, F2 i F3) strukture polipeptida SEQ ID NO:1. Usled asimetrije strukture domena, svaki par alfa spirala, te stoga i svako pročelje, gradi jedinstvenu geometrijsku topologiju (SL.1 i 2). Kao što je modelovano u referentnoj konstrukciji, veliki broj ciljanih ostataka odgovara neprekinutoj površinskoj oblasti većoj od 1400 kvadratnih angstrema, što je znatno veće nego vezujuće površine
1
izmerene za pregled konstrukcija koje ne vezuju antitela. (Gilbreth et al. Curr. Opin. Struct. Biol. 22:413-420 (2012)).
[0417] U drugom skupu eksperimenata, biblioteke koje se ovde nazivaju „kombinovane“ biblioteke ili „C biblioteke“ konstruisane su za identifikaciju DBDpp koji potencijalno ispoljavaju višestrano vezivanje za cilj od interesa (Tabela 3 i SL. 1 i 2). Kombinovane biblioteke (C1 i C2) konstruisane su kombinacijom ostataka iz svake od tri spirale korišćene u F seriji biblioteka.
[0418] U ovim eksperimentima, ukupno 32 pozicije ostataka je podvrgnuto mutagenezi. Svaka mutagenizovana pozicija je prisutna u najmanje 2 biblioteke. Nadalje, svaka mutagenizovana pozicija je predstavljena u obe „arhitekture“ biblioteke; F i C.
Tabela 3. Profili sekvence biblioteke DBDpp
1
DBDpp F2NNKKonstrukcija biblioteka
[0419] Konstruisana je F2 biblioteka koja cilja 12 površinski izloženih ostataka na pročelju 2 (spirale 2 i 3) (Tabela 3 i SL.2C i 2D). Ova biblioteka, nazvana F2NNK, stvorena je pomoću Kunkelove mutageneze, koristeći oligo koji sadrže NNK kodone. Biblioteke su konstruisane koristeći modifikovani fagmidni vektor u kome su DBDpp fuzionisani na C-terminusu sa N-terminusom M13 pIII. Ovi DBDpp su također fuzionisani na svom N-terminusu sa C-terminusom FLAG epitopske oznake. Ceo DBDpp fuzioni protein je pod sekretornom kontrolom DsbA signalnog peptida (SL.3B).
1
Konstrukcija biblioteke DBDpp trinukleotid fosforamidita
[0420] Kasnije biblioteke su konstruisane putem Kunkelove mutageneze u istom modifikovanom pComb fagemidnom vektoru kao biblioteka F2NNK. U nekoliko otelotvorenja, FLAG oznaka je opciona (vidite, npr. SL. 3C) ili može da se zameni drugom oznakom. Te biblioteke su konstruisane koristeći smeše trinukleotid fosforamidita (kodon). Ove smeše su konstruisane da isključe terminaciju, cisteinske i prolinske kodone, i obezbeđuju jednaku zastupljenost preostalih aminokiselina. Biblioteke su izgrađene koristeći svih pet profila sekvenci (F1, F2, F3, C1 i C2), kako je prikazano u Tabeli 3.
Odabir pomoću biblioteke F2NNK
[0421] Biblioteka F2NNKDBD je korišćena u pet ciklusa selekcije na rekombinantni, biotinilovani, humani 4-1BB/TNFRSF9/CD137-Fc. ELISA skrining izolovanog faga otkrio je da je 89 od 95 klonova vezivalo 4-1BB/CD137 sa prosečnim OD 5,3 puta većim od kontrole (IgG Fc). Raspodela vezivanja (vrednosti apsorbance ELISA testa) za 89 klonova: CD137 0,353 (0,134 - 0,617), kontrola 0,067 (0,056 - 0,125). Sekvenciranje pojedinačnog faga pokazalo je da je svih 89 klonova identično na nukleotidnom nivou. Značajno je da ovaj klon, nazvan bb10, sadrži supstitucije samo u 8 (podebljane u sekvenci u nastavku) od 12 randomizovanih pozicija sekvence SEQ ID NO: 1 koje su podvučene u sekvenci:
Odabir koristeći F1, F2, F3, C1 i C2 biblioteke trinukleotid fosforamidita
[0422] Selekcije su takođe obavljene koristeći F1, F2, F3, C1 i C2 biblioteke trinukleotid fosforamidita. U većini slučajeva, biblioteke su objedinjene pre upotrebe u odabiru. Kombinacijom jednakih zapremina pojedinačnih biblioteka stvorene su grupa F (biblioteke F1, F2 i F3) i grupa C (biblioteke C1 i C2). Te biblioteke su korišćene u odabiru DBDpp vezivača za 4-1BB/CD137, i kao veći panel prečišćenih rekombinantnih „ciljnih“-Fc proteina, uključujući CD47, CTLA4, DR5, KIR, LAG3, OX40, PD1, PD-L1 i TIM3. (Mnogi od ovih ciljeva se smatraju imunoregulatornim faktorima (Pardoll et al. Nat. Rev. Cancer 12:252-264 (2012)). Nakon inkubacije cilja sa grupama biblioteka DBDpp faga, vezani kompleksi fag-cilj
2
su uhvaćeni i razdvojeni od nevezanog faga sa protein A perlicama (ciljni proteini su bili Fc fuzije). Nakon tri ciklusa odabira, izolovani klonovi faga su pretraženi pomoću ELISA testa na vezivanje za odabrani cilj.
[0423] Za svaki cilj, približno 90 klonova DBDpp faga je pretraženo pomoću ELISA testa na vezivanje za ciljni protein, i kao nespecifična kontrola (npr. IgG1-Fc). Sekvenciranje je izvedeno na pojedinačnim DBDpp klonovima koji su pokazali vezujući signal specifičan za cilj koji je bio 3 puta veći nego nespecifična kontrola. U nekim slučajevima, kod ELISA skrining ploče na kojoj je većina DBDpp klonova bila pozitivna, cela ploča je sekvencirana. Rezultati sekvence pokazali su da je ukupno približno 70% DBDpp klonova u ispravnom okviru za čitanje, i u skladu sa jednim od pet predviđenih profila sekvenci biblioteke (Tabela 3). Sekvence koje nisu u skladu sa očekivanim profilom obično su se sastojale od neuspelih čitanja sekvenciranja, mutacija pomicanja okvira, skraćivanja, konkatemerizacija, ili drugih artefakata kloniranja.
DBDpp se vezuju za različite ciljeve
[0424] Tabela 4 prikazuje distribuciju klonova za svaku od biblioteka u funkciji cilja i vezujućih podataka. Tri dela tabele prikazuju raspodelu za sve sekvence (gore) i one sa odnosima vezivanja specifičnim za cilj koji su veći ili jednaki 2 (sredina) ili 3 (dole). (Kada su sekvence predstavljene sa više od jednog klona, koristi se prosečna vrednost vezivanja.) Od ukupno 794 sekvence, 330 su jedinstveni klonovi, od kojih je 278 dalo ELISA signal 3 puta veći od osnovnog.
Tabela 4. Distribucija DBDpp klonova i jedinstvenih sekvenci
2 1
22 t
t
2
24
[0425] Tabela 5 navodi primere sekvenci dobijene iz prethodno opisanih eksperimenata. Za svaku sekvencu su naznačeni cilj, biblioteka porekla (Bibl.), broj pojava u skriningu (Broj) i odnos cilja prema osnovnoj vrednosti (ELISA odnos). U nekoliko otelotvorenja, DBDpp sa najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 95% ili najmanje 98% homologosti sa onima koji su opisani prethodno (i na drugim mestima u ovom tekstu)
2
zadržavaju značajnu funkcionalnu ekvivalenciju. U nekoliko otelotvorenja, to je pogodno jer neslaganje u homologiji može pružiti određene prednosti, kao što je smanjena imunogenost, povećana unakrsna reaktivnost, povećana specifičnost, itd.
Tabela 5: Sekvence klonova biblioteke DBDpp izolovanih iz pretraženih biblioteka
2
SEQ
ELISA ID Sekvenca Cilj Bibl. Broj
odnos
2
SEQ
ELISA ID Sekvenca Cilj Bibl. Broj
odnos
2
SEQ
ELISA ID Sekvenca Cilj Bibl. Broj
odnos
2
SEQ
ELISA ID Sekvenca Cilj Bibl. Broj
odnos
[0426] Fuzije N-terminalne FLAG oznake pb04 (SEQ ID NO: 182) i α3D (SEQ ID NO: 49) eksprimirane su i prečišćene iz kultura E.coli. U ELISA testu, prečišćeni FLAG-pb04 se vezuje za mikrotitarske ploče premazane sa PD-L1-Fc na način zavisan od doze. Suprotno tome, FLAG-a3D ne pokazuje uočljivo vezivanje za ciljni protein PD-L1-Fc (SL. 3D). Rezultati pokazuju da je modifikacija sekvence referentne konstrukcije (SEQ ID NO:1) delotvorna u pružanju robusnog izvora DBDpp koji mogu da vezuju, sa novom specifičnošću, raznovrsni skup ciljeva od interesa.
Primer 3. DBDpp fuzioni proteini
21
[0427] Da bi se ispitala modularna priroda DBDpp kao vezujućeg elementa, DBDpp CD137-vezivač, bb10 (SEQ ID NO:19), reformatiran je kao fuzija sa N ili C terminusom teškog lanca antitela dobijenog od sekvence RSV-specifičnog monoklonskog antitela palivizumaba (SYNAGIS®) (šematski prikazano na SL.4A, odnosno 4B). Za poređenje su stvorene fuzije koristeći DBDpp matičnu sekvencu (SEQ ID NO:1), za koju nije poznato da pokazuje bilo kakvu specifičnost vezivanja. Proteini su proizvedeni u HEK293F suspenzionim ćelijama koje su prolazno transficirane ekvimolarnim odnosima nezavisne fuzije teški lanac-bb10 i ekspresionim konstruktima kDNK lakog lanca, i prečišćeni su putem konvencionalnih afinitetnih postupaka na proteinu A. Razdvajanje prečišćenih uzoraka pomoću SDS-PAGE pokazalo je da je migracija fuzionih proteina teški lanac-bb10 (DBDpp) srazmerna predviđanjima na osnovu molekulske mase (podaci nisu prikazani).
[0428] Analiza pomoću SEC je pokazala da se fuzije bb10 DBDpp antitela nisu agregirale i migrirale kako je predviđeno u odnosu na standarde veličine (podaci nisu prikazani). Fuzije SYN-bb10 i bb10-SYN pokazuju međusobno sličnu migraciju, obe su se kretale brže od matičnog antitela SYNAGIS®.
[0429] Bispecifična antitela, SYN-bb10 i bb10-SYN, pokazuju vezivanje i za CD137 i za RSV (SL. 4C-D; zatvoreni kvadrati su bb10-SYN, zatvoreni krugovi su SYN-bb10)), pokazujući da je nova aktivnost vezivanja preneta na matičnu DBD sekvencu, i funkcija DBDpp je zadržana kao N i C-terminalna fuzija. Nasuprot tome, fuzije između besciljne proteinske konstrukcije alfa spirale i SYN (DBD-SYN za N-terminalnu fuziju, otvoreni krugovi; SYN-DBD za C-terminalnu fuziju, otvoreni kvadrati) pokazale su vezivanje samo za RSV, ali nije preneto i vezivanje za CD137.
[0430] Vezivanje DBDpp, bb10 za CD137 prikazano je pomoću dva različita eksperimentalna postupka: ELISA (SL. 4C-D) i FACS (SL. 6A-C). U ovim testovima, ciljni antigen je predstavljen i na kraju prepoznat u tri različita formata: direktno vezan za plastiku (SL.4C-D) ili in situ, kao deo ćelijske membrane (SL.6A-C).
[0431] Tretman PBMC sa SYN-bb10 i bb10-SYN pokazuje da su, osim što se vezuju, oba fuziona proteina sposobna da indukuju nishodni biološki odgovor u ciljnim ćelijama (SL.7A-D).
[0432] In vivo stabilnost je presudna za kliničku efikasnost većine bioterapeutskih sredstava. Farmakokinetička merenja fuzija bb10 (SYN-bb10 i bb10-SYN) obavljena su radi procene relativne stabilnosti DBDpp u poređenju sa mAb fuzionim partnerom (SL.8). In vivo stabilnost je određena analizom RSV i CD137 vezivanja bispecifičnih antitela prisutnih u serumu CD1 miševa koji su dobili jednu intravensku injekciju (1 mg/kg) fuzionih proteina. Uzorci seruma su sakupljeni nakon 15 minuta i 48 sati, i testirani su pomoću ELISA. I N-terminalni i C-terminalni DBDpp fuzioni proteini pokazuju produženu stabilnost in vivo.
Primer 4. Upotreba DBDpp u afinitetnom prečišćavanju
[0433] Osam CD137 vezujućih DBDpp liganda (SEQ ID NO:12-19) ponovo je formatirano kao N-terminalni heksahistidinski fuzioni proteini. Njihove označene sekvence i odgovarajuće matične sekvence su prikazane u Tabeli 5.
Matični
Novi
SEQ ID Sekvenca his-fuzionog proteina
Seq ID
[0434] Svaka fuzija je posebno eksprimirana u ćelijama E. coli BL21 (DE3). Nakon lize i prečišćavanja ćelija koristeći hromatografiju imobilisanih jona metala, svaki od CD137 vezujućih DBDpp liganda je ponovo prečišćen koristeći reversno fazni HPLC. HPLC kolone (20 x 100 mm C-4, Western Analytical) eluirane su sa 0,1% TFA:acetonitril (88:12 tokom 2 minuta, zatim linearni gradijent do 58:42 tokom 15 minuta). Glavni pik nakon približno 12 minuta odgovarao je ciljnom ligandu (vidite strelicu na slici 9). Prečišćeni ligandi su liofilizovani pre dalje upotrebe.
[0435] Identitet i čistoća svakog liganda potvrđeni su pomoću elektrosprej masene spektrometrije (Tabela 6) i SDS-PAGE (Slika 10). Tabela 6 prikazuje izračunatu molekulsku masu za svaki DBDpp koji cilja CD137, na osnovu njihove sekvence. Tabela 6 takođe prikazuje očekivanu molekulsku masu za svaki DBDpp nakon zamene N-terminalnog metionina heksahistidinskom oznakom. Tabela 6 takođe pokazuje uočene molekulske mase. Za svaki DBDpp koji cilja CD137, sa izuzetkom SEQ ID NO.54, uočena molekulska masa u velikoj meri je bila u korelaciji sa očekivanom molekulskom masom, što pokazuje da dominantne vrste u prečišćenom uzorku uključuju heksahistidinsku oznaku. Za SEQ ID NO: 54, vrsta koja je sadržala metionin bila je glavna vrsta.
21
Tabela 6 - Poređenje očekivane molekulske mase i uočene molekulske mase za 8 proteina SEQ ID 51-58.
[0436] SL. 10 prikazuje Kumasi plavo obojenu SDS-PAGE analizu svakog od DBDpp koji ciljaju CD137 sa heksahistidinskom oznakom. Traka 1 je skala molekulske mase (kilodaltoni), traka 2 je SEQ ID NO: 58, a trake 3-9 odgovaraju SEQ ID NO: 51-57. Svaka traka pokazuje čist i precizan opseg bez razmazivanja ili postojanja manjih opsega koji bi ukazivali na raspad DBDpp.
[0437] SL. 11 prikazuje dekonvoluirani elektrosprej maseni spektar DBDpp prema SEQ ID NO: 54, u kojem je razjašnjeno da dominantna vrsta u uzorku ostaje protein sa N-terminalnim metioninom, za razliku od oznake His6.
[0438] U skladu sa nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja, postupci proizvodnje koji su ovde otkriveni za proizvodnju označenog DBDpp dovode do toga da su dominantne vrste (npr. više od 50%, više od 60%, više od 70%, više od 80%, itd.) date proizvodne serije označene vrste. Kao što je prethodno razmotreno, mogu da se koriste i oznake osim His6, u zavisnosti od otelotvorenja.
[0439] Ciljni protein, CD137, konstruisan je kao fuzioni protein CD137-Fc-His6. Himera (Leu24- Gln186)/rHumani Fc (Lys100-Lys329) (SEQ ID: 59) sa heksahistidinskom oznakom pripremljena je prolaznom transfekcijom ćelija HEK293, i prečišćena iz izbistrenog ćelijskog supernatanta koristeći hromatografiju imobilisanih jona metala (IMAC), a zatim izmenjena u PBS puferu. Ova supstanca se ponašala identično kao autentični protein kupljen iz komercijalnih izvora (RnD systems) i korišćena je kao pozitivna kontrola za CD137.
[0440] SEQ ID: 59 je prikazan ispod:
[0441] Vezivanje osam his-označenih DBDpp liganda (SEQ ID NO:51-58) za ciljni protein CD137 procenjeno je koristeći interferometriju biosloja (ForteBio, Menlo Park, CA) u skladu sa postojećim postupcima. Test vezanja je konstruisan imobilizacijom CD137-Fc-His6 putem proteina A, a zatim inkubacijom u rastvorima svakog DBDpp liganda tokom 5 minuta radi merenja faze asocijacije (vezivanja). Senzori su zatim stavljeni u pufer radi praćenja faze disocijacije, i kompletni senzorgrami (vreme u sekundama na X-osi i nm na Y-osi) prikazani su na slici 12A, 12C, 12E, 12G, 12I, 12K, 12M i 12O za DBDpp SEQ ID NO: 51-58. Podaci su prilagođeni analizom stanja mirovanja, koja je prikazana na svakoj od slika 12D, 12D, 12F, 12H, 12J, 12L, 12N i 12P za odgovarajući DBDpp. Podaci su otkrili konstante afiniteta prinosa za CD137 u rasponu od 140 nM - 1,7 µM (Tabela 7).
Tabela 7 Izračunate konstante afiniteta za 8 liganda SEQ ID 51-59.
21
[0442] Četiri od osam his-fuzionih proteina kuplovano je sa NHS-aktiviranom Sepharose 4 Fast Flow (GE Healthcare Life Sciences) koristeći proizvođačeve smernice tokom 4 sata na sobnoj temperaturi, i zatim isprano pre testiranja gustine liganda (Tabela 8).
Tabela 8. Izmerena gustina liganda afinitetnih smola
[0443] Za svaku od smola deo isprane smole je spakovan u staklenu kolonu od 3 x 25 mm (Omnifit) i postavljen na BioLogic hromatograf (Bio-Rad). Smole su uravnotežene sa 1 ml fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS) sa protokom od 0,5 ml/min. Uzorak supernatanta ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) koji sadrži CD137 (koji je dodat do koncentracije od 0,25 mg/ml) nanet je na kolonu (550 ug CD137-Fc-His pri 0,2 ml/min), nakon čega sledi ispiranje (7,5 ml sa PBS-om sa 0,5 ml/min) i elucija (2 ml sa 50 mM Na acetat pH 3 pri 0,2 ml/min). Pre procene vezivanja drugog uzorka, smole su regenerisane sa 1 ml sa 6M gvanidin-HCl pri 0,5 ml/min i ponovno ekvilibrisane sa 25 zapremina kolone PBS-a pri 0,5 ml/min.
[0444] SL.13 prikazuje hromatogramski oblik prečišćavanja CD137-Fc-His6 proteina iz CHO supernatanta. Pik eluiran na 8-9 ml odgovara eluiranom proteinu CD137-Fc-His6. Ovi podaci pokazuju da se ovde otkriveni DBDpp može uspešno koristiti za hvatanje ciljnog proteina iz
21
uzorka sa velikim stepenom specifičnosti, čak i kada se ulazni uzorak sastoji od složene smeše bioloških proteina koji mogu da ometaju interakcije cilj-vezivač.
[0445] Da bi se dalje procenila specifičnost vezivanja, frakcije iz faze eluiranja su procenjene pomoću SDS-PAGE kako bi se potvrdilo da afinitetna smola može da prečisti CD137, istovremeno omogućavajući uklanjanje značajnog dela proteina ćelije domaćina. SL. 14A prikazuje Kumasi plavo obojeni gel sa skalom molekulske mase u traci 1 (kilodaltoni). Traka 2 pokazuje IMAC-prečišćeni CD137 protein za pozitivnu kontrolu. Traka 3 prikazuje negativnu kontrolu koja je CD137-Fc-His6 dodat u supernatant CHO u koncentraciji od 0,25 mg/ml, što predstavlja nedostatak prečišćavanja CD137 iz supernatanta. Traka 4 je eluat nakon prečišćavanja sa DBDpp SEQ ID NO.58, traka 5 je eluat nakon prečišćavanja sa DBDpp SEQ ID NO. 51, traka 6 je eluat nakon prečišćavanja sa DBDpp SEQ ID NO. 52, traka 7 je eluat nakon prečišćavanja sa DBDpp SEQ ID NO. 57, a traka 8 je eluat nakon prečišćavanja sa DBDpp SEQ ID NO. 57. Ovi podaci pokazuju da DBDpp specifično prečišćavaju ciljne proteine, čiji je neograničavajući primer CD137. Traka 3 jasno pokazuje dodatnu proteinsku supstancu u traci, što je rezultat proteinskih komponenata ćelijskog supernatanta CHO. Nasuprot tome, trake 4-8 pokazuju čiste opsege, sa malo ili nimalo drugih vrsta proteina, što je slično IMAC prečišćenim CD137 za pozitivnu kontrolu.
[0446] Uz to, vestern blot analiza prikazana na SL. 14B dalje potvrđuje sposobnost ovde opisanog DBDpp da izoluje specifični ciljani protein iz složenog uzorka koji sadrži protein. Izgled traka je isti kao što je prethodno opisano za SL.14A. Za detekciju je korišćen anti-penta-His-HRP konjugat antitela (Qiagen). Kao što je u početku sugerisano Kumasi bojenjem, vestern blot analiza potvrđuje da ovde opisani DBDpp mogu uspešno da vezuju ciljni protein sa specifičnošću, a zatim da se koriste za specifično izolovanje tog proteina iz složenog polaznog uzorka. Svaki DBDpp koji cilja CD137 u trakama 4-8 pokazuje sposobnost da prečišćava CD137 podjednako dobro, ako ne i bolje, od hromatografije imobilisanim jonima metala (uporedite trake 4-8 sa trakom 2). Kako je CD137 samo jedno, neograničavajuće otelotvorenje, ovde otkriveni DBDpp, prema dodatnim otelotvorenjima, mogu da se koriste za prečišćavanje širokog spektra ciljnih proteina iz različitih polaznih uzoraka. U nekim otelotvorenjima, početni uzorak je biološka tečnost, dok u drugim otelotvorenjima druge vrste tečnih ili gasnih uzoraka čine početnu supstancu iz koje se ciljni protein hvata i prečišćava.
Primer 5. Karakterizacija stabilnosti DBDpp
21
[0447] Prikazani primer je izveden radi procene stabilnosti DBDpp prema ovde otkrivenim otelotvorenjima.
[0448] Fuzije DBDpp-6xHIS (pb04 i pb06) i fuzije scFv-6xHIS izražene su reakcijama transkripcije i translacije in vitro (NEB, PureExpress). Uzorci su razblaženi u ELISA puferu za blokiranje (Thermo Fisher) 30 puta. Pojedinačni uzorci su zatim inkubirani na 25°C, 40°C, 55°C, 70°C ili 100°C tokom 2 minuta, a zatim su brzo vraćeni na sobnu temperaturu. Porast temperature, praćen brzim hlađenjem, može da prouzrokuje denaturaciju proteina ili drugi raspad trodimenzionalne strukture proteina koji smanjuju interakciju i/ili vezivanje sa ciljem. Sposobnost proteina da se vezuju za ligand, kao što je ciljni tumorski antigen, nakon izlaganja uslovima denaturacije ukazuje ili na povećanu stabilnost tokom izlaganja povišenoj temperaturi, ili na sposobnost ponovnog presavijanja i održavanja funkcije nakon izlaganja. U svakom slučaju, povećana termalna stabilnost čini takve proteine atraktivnim kandidatima za održavanje funkcije tokom i posle teških uslova proizvodnje, skladištenja, otapanja i kliničke upotrebe.
[0449] Uzorci izloženi toploti serijski su razblaženi u ELISA puferu i izmereni na vezivanje za PD-L1-Fc u ELISA. Vezani proteini su detektovani HRP-konjugovanim zečjim anti-6xHIS poliklonskim antitelom (Abcam). SL. 15A prikazuje vezivanje DR5 scFv za ćelije koje eksprimiraju PD-L1. Budući da ovaj konkretni scFv nije konfigurisan da vezuje PD-L1, on služi kao negativna kontrola, i, kao što je očekivano, nije otkriveno vezivanje ni za jedan od DR5 scFv, bez obzira na temperaturu kojoj su bili izloženi. SL. 15B pokazuje da će se scFv usmereni na PD-L1 uspešno vezati za svoj cilj nakon izlaganja povišenoj temperaturi, do oko 55°C. Međutim, izlaganje temperaturi od 70°C pokazuje smanjenje sposobnosti scFv da se uspešno vezuje za PD-L1, što ukazuje na toplotno labilnu prirodu scFv. Nakon zagrevanja scFv na 100°C, vezivanje ciljnog PD-L1 je u potpunosti eliminisano.
[0450] Nasuprot tome, DBDpp pokazuju poboljšanu termalnu stabilnost. SL. 15C prikazuje podatke koji pokazuju sposobnost DBDpp (pb04 u ovom neograničavajućem otelotvorenju) da se vezuju za ciljni PD-L1, čak i nakon što su izloženi povišenim temperaturama od 100°C. SL.
15D prikazuje slične podatke za različito, neograničavajuće otelotvorenje DBDpp (pb06). Opet, DBDpp zadržava sposobnost vezivanja svog cilja nakon izlaganja temperaturama do 100°C.
21
[0451] Ovi podaci ukazuju na to da DBDpp, prema nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja, imaju sposobnost da se odupru denaturaciji i/ili ponovo presaviju nakon izlaganja povišenim temperaturama, pri čemu i dalje zadržavaju sposobnost vezivanja željenog cilja. Kao što je prethodno razmotreno, to čini DBDpp atraktivnim ciljajućim ostatkom, jer njihova povećana termalna stabilnost ukazuje na to da su dovoljno otporni da podnesu proizvodne procese (ili druge protokole proizvodnje/obrade), koji mogu da uključuju povišenu temperaturu, bolje nego druge vrste ciljajućih ostataka, poput scFv.
Primer 6. Unakrsna reaktivnost DBDpp između vrsta
[0452] Ovaj primer je izveden kako bi se utvrdila specifičnost DBDpp za vrstu kako je ovde otkriveno.
[0453] SL.16A pokazuje da rastvorljivi DBDpp odabran za vezivanje za humani PD-L1 (pb04 u ovom neograničavajućem otelotvorenju) može da vezuje i PD-L1 cinomolgusa (Macaca fascicularis), kako je utvrđeno pomoću ELISA testa. Humani PD-L1 ili PD-L1 cinomolgusa je imobilisan u odvojenim bunarčićima ELISA ploče. Rastvorljivi DBDpp (označen pomoću FLAG) usmeren na PD-L1 inkubiran je u odgovarajućim pločama radi procene stepena vezivanja za PD-L1 svake vrste. Kao što je prikazano, pb04 DBDpp vezuje se za PD-L1 i čoveka i cinomolgusa. SL.16B dalje pokazuje da je PD-L1 poreklom od čoveka i cinomolgusa vezan putem CAR koji sadrži DBDpp (pb04 u ovom neograničavajućem otelotvorenju) eksprimiran na površini humanih T ćelija. Kao što pokazuju podaci protočne citometrije, DBDpp CAR T ćelije usmerene na PD-L1 mogu da vezuju rastvorljivi humani PD-L1 i PD-L1 cinomolgusa (97,7% za humani i 97,1% za cinomolgusov).
Primer 7. CAR T ćelije koje eksprimiraju DBDpp vezuju ciljne molekule
[0454] Predmetni primer je izveden da bi se utvrdila sposobnost prolazno eksprimiranih CAR koji sadrže DBDpp, u ovom neograničavajućem primeru, da vezuju tumorski cilj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 95% identična ostacima 19-305 iz SEQ ID NO: 187 (CD123).
[0455] 293T ćelije su prolazno transficirane pcDNA3 ekspresionim vektorima koji kodiraju CAR koji sadrže DBDpp koristeći (vidite, npr. SL. 5B) Lipofectamine 3000 (Life
21
Technologies). Nakon 24 sata, ćelije su sakupljene pomoću CellStripper™. Ćelije su ispitane na ekspresiju CAR koristeći fluorescentno obeleženo anti-FLAG antitelo. Merenje vezivanja CAR koji sadrže DBDpp za CD123 je izmereno inkubacijom ćelija sa Fc-fuzionom proteinom koji sadrži ekstracelularni domen CD123 fuzionisan sa humanim IgG1 Fc u medijumu za uzgajanje ćelija na 37° tokom 30 minuta, ispiranjem i zatim detekcijom sa PE antihumanim IgG antitelom. Vezivanje CD123 i ekspresija CAR (FLAG oznaka) analizirani su protočnom citometrijom. Podaci su prikazani na SL. 17, a svaka vrednost podataka pokazuje prosečnu ekspresiju FLAG i vezivanje CD123 za svaki od DBDpp-CAR iz više eksperimenata.
[0456] SL.17 sažima podatke protočne citometrije koji pokazuju da CAR koji sadrže scFv koji vezuje CD123 (32716) ili DBDpp eksprimiran u humanim T ćelijama vezuju rastvorljivi CD123, kao neograničavajuće otelotvorenje cilja od interesa. X-osa je mera ekspresije CAR na humanim T ćelijama. Y-osa predstavlja vezivanje Fc-CD123 sa CAR.
Primer 8. T ćelije koje eksprimiraju CAR koji sadrže DBDpp (DBDpp-CAR) indukuju intraćelijsku signalizaciju
[0457] Kako bi se procenila sposobnost CAR koji sadrže DBDpp (DBDpp-CAR) da iniciraju transdukciju signala, linija Jurkatovih reporterskih ćelija, koja sadrži pojačavač nuklearnog faktora aktiviranih T ćelija (NFAT) kuplovan sa reporterskim genom luciferaze, stabilno je eksprimirana u Jurkatovim ćelijama. Različiti konstrukti CAR su elektroporirani u liniju Jurkatovih reporterskih ćelija. 24 sata nakon elektroporacije, ekspresija CAR je procenjena detekcijom sa fluorescentno obeleženim anti-FLAG monoklonskim antitelom. Jurkatove ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR zatim su uzgajane zajedno sa CD123+ (BDCM, akutna mijelogena leukemija, kao neograničavajuće otelotvorenje) tumorskim ćelijama tokom 6 sati, nakon čega je NFAT posredovana signalizacija izmerena dodavanjem test reagensa luciferaze (Promega) u ćelije i kvantifikacijom relativnih jedinica luminescencije (RLU), kako je prikazano na SL.18.
[0458] Ovi podaci pokazuju da se u ovom neograničavajućem otelotvorenju DBDpp-CAR eksprimiraju na ćelijama (npr. humanim T ćelijama) i, kada se tako eksprimiraju, mogu da iniciraju intracelularnu signalnu kaskadu nakon izlaganja cilju (Fc-CD123 u ovom neograničavajućem otelotvorenju) vezanom putem DBDpp.
22
Primer 9. DBDpp-CAR eksprimirani u humanim T ćelijama proizvode citokine nakon vezivanja cilja
[0459] Angažovanje cilja od strane T ćelije koja eksprimira CAR može dovesti do sekrecije citokina.
[0460] Shodno tome, 293T ćelije su prolazno transficirane 3. generacijom lentivirusnih vektora za pakovanje (pRSV-REV, pMDLg/pRRE i pMD2.G) sa pELNS vektorima koji kodiraju DBDpp-CAR koristeći Lipofectamine 3000. Šest sati nakon transfekcije, medijum je zamenjen, zatim su medijumi koji sadrže lentivirus sakupljeni 30 sati i 54 sata nakon transfekcije, objedinjeni, zatim centrifugirani radi uklanjanja ćelijskog otpada. Lentivirus je zatim alikvotiran i čuvan na -80°C dok nije upotrebljen za virusnu transdukciju. Transdukcija humanih T-ćelija sa CAR lentivirusom izvedena je upotrebom ukupnih humanih PBMC aktiviranih αCD3/CD28 T-ćelijskim aktivacionim perlicama u medijumu za uzgajanje sa dodatkom 40 U/ml IL-2. Nakon 24 sata, 2 x 10<6>PBMC po bunarčiću je zasejano na ploču za uzgajanje tkiva sa 6 bunarčića, sa 1 ml medijuma za uzgajanje i 3 ml medijuma koji sadrži lentivirus sa dodatkom 40 U/ml IL-2 i protamin sulfata. Ploče su zatim centrifugirane 2 sata na 1000 × g na 32°C, a zatim inkubirane preko noći na 37°C. Sledećeg dana, postupak transdukcije lentivirusa je ponovljen sa svežim medijumom za uzgajanje i medijumom koji sadrži lentivirus.
72 sata nakon prvobitne aktivacije ćelija, perlice za aktivaciju T ćelija su uklonjene, zatim su T ćelije uzgajane radi ekspanzije sa ∼0,25-0,5×10<6>T ćelija/ml u svežem medijumu sa dodatkom 100 U/ml IL-2. Svaka 2-3 dana T-ćelije su dopunjavane dodatnim T ćelijskim medijumom i IL-2, sve dok nisu korišćene za citokinske testove (opisani u nastavku) 7-10 dana nakon prvobitne aktivacije.
[0461] Proizvodnja citokina kao odgovor na ekspresiju ciljnog antigena (CD123 u ovom neograničavajućem otelotvorenju) procenjena je kultivisanjem 25.000 transdukovanih T ćelija (7 dana nakon aktivacije) sa 25.000 neciljnih (K562, CD123-) ili ciljnih (BDCM, CD123+) tumorskih ćelija po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Nakon 24 sata, supernatanti za uzgajanje su sakupljeni, i proizvodnja citokina je procenjena putem ELISA testa. Supernatanti za uzgajanje su razblaženi 1:5 pre ELISA testa. Slično tome, procenjena je proizvodnja citokina kao odgovor na ekspresiju ciljnog antigena PD-L1 uzgajanjem 25.000 transdukovanih T-ćelija (7 dana nakon aktivacije) sa 25.000 neciljnih (K562, PD-L1-) ili ciljnih (SUDHL-1, PD-L1+) tumorskih ćelija po bunarčiću u pločama sa 96 bunarčića. Nakon 24 sata, supernatanti za uzgajanje su sakupljeni, i proizvodnja citokina je procenjena putem ELISA testa. Supernatanti za uzgajanje su razblaženi 1:5 pre ELISA testa.
[0462] SL. 19A pokazuje da T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji vezuju CD123 proizvode interferon gama (IFNγ) nakon stimulacije CD123+ BDCM ćelijama, ali ne i CD123-ćelijskom linijom K562. SL. 19B pokazuje da T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji vezuju CD123 proizvode interleukin 2 (IL2) nakon stimulacije CD123+ BDCM ćelijama, ali ne i CD123- ćelijskom linijom K562. SL.20A pokazuje da T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji vezuju PD-L1 proizvode interferon gama (IFNγ) nakon stimulacije PD-L1+ SUDHL-1 ćelijama, ali ne i PD-L1- ćelijskom linijom K562. SL.20B pokazuje da T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji vezuju PD-L1 proizvode interleukin 2 (IL2) nakon stimulacije PD-L1+ SUDHL-1 ćelijama, ali ne i PD-L1- ćelijskom linijom K562.
Primer 10. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR se množe kada se uzgajaju zajedno sa tumorskim ćelijama koje eksprimiraju cilj
[0463] T ćelije koje eksprimiraju CAR koji vezuju cilj mogu da se množe nakon angažovanja rastvorljivog cilja ili tumorskih ćelija koje eksprimiraju cilj.
[0464] Proliferacija DBDpp-CAR transdukovanih T ćelija kao odgovor na tumorske ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen (čiji je CD123 neograničavajući primer) procenjena je uzgajanjem transdukovanih T ćelija (1×10<5>, 10. dan nakon aktivacije) sa 1×105 tumorskih ćelija prethodno tretiranih mitomicinom-C na pločama sa 24 bunarčića. Tumorske ćelije su uključivale K562 (CD123-) koji ne eksprimiraju cilj, intermedijerne linije KGla i MOLM-13 (CD123-intermedijer) koje eksprimiraju cilj i BDCM (CD123-visoki). Transdukovane T ćelije su sakupljene i prebrojane nakon 96 sati zajedničkog uzgajanja sa tumorskim ćelijama. Ovaj pristup je takođe korišćen u proceni proliferacije T-ćelija kao odgovor na tumorske ćelije koje eksprimiraju ciljni antigen PD-L1. Tumorske ćelije su uključivale K562 (PD-L1-) koji ne eksprimira cilj, intermedijerne linije BDCM i H460 (PD-L1-intermedijer) koje eksprimiraju cilj i SUDHL-1 (PD-L1-visoki). Ćelije su sakupljene i prebrojane nakon uzgajanja tokom 96 sati. Podaci iz ovih eksperimenata proliferacije prikazani su na SL.21, odnosno SL.22.
[0465] Trake histograma na SL. 21 predstavljaju (idući sleva nadesno): uzgajanje samo DBDpp-CAR T ćelija, zajedničko uzgajanje sa CD123 negativnim K562 ćelijama, zajedničko uzgajanje sa KGla ćelijama koje eksprimiraju nizak nivo CD123, zajedničko uzgajanje sa MOLM-13 ćelijama koje eksprimiraju nizak nivo CD123, i zajedničko uzgajanje sa BDCM ćelijama koje eksprimiraju visok nivo CD123. Kao što je naznačeno visinom traka histograma, kada se inkubiraju sa ćelijama koje eksprimiraju CD123 (sa srednjim ili visokim nivoima), dolazi do odgovarajućeg porasta proliferacije T ćelija. Ovi podaci pokazuju da se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju CD123 umnožavaju kao odgovor na vezivanje CD123 slično kao, ili u nekim otelotvorenjima do većeg stepena nego, scFv koji ciljaju CD123. Slično tome, na SL.
22, trake histograma predstavljaju (idući sleva nadesno): uzgajanje samo PD-L1-DBDpp-CAR T ćelija, zajedničko uzgajanje sa
[0466] PD-L1 negativnim K562 ćelijama, zajedničko uzgajanje sa BDCM ćelijama koje eksprimiraju srednji nivo PD-L1, zajedničko uzgajanje sa SUDHL-1 ćelijama koje eksprimiraju visoki nivo PDL2, i zajedničko uzgajanje sa H460 ćelijama koje eksprimiraju srednji nivo PD-L1. Ovi podaci pokazuju specifičnost odgovora T ćelija na cilj DBDpp (npr. dolazi do ograničenog ili nepostojećeg odgovora kada cilj nije prisutan). Stoga, kao i u prethodnom delu teksta, ovi podaci pokazuju da se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju PD-L1 specifično umnožavaju kao odgovor na vezivanje PD-L1. Kao što je prethodno razmotreno, CD137, CD123 i PD-L1 su samo neograničavajući primeri ciljeva koje DBDpp mogu specifično da vezuju, i tako mogu (zajedno sa CAR u T ćeliji, NK ćeliji, itd.) da indukuju funkciju imunske ćelije specifične za cilj.
Primer 11. DBDpp-CAR transdukovane T ćelije ne prikazuju fenotipove povezane sa iscrpljivanjem T ćelija
[0467] Dugoročno izlaganje T ćelija antigenu i/ili inflamatornim signalima može dovesti do „iscrpljivanja“ T ćelije, koje karakteriše gubitak efektorske funkcije i ekspresija više inhibitorskih receptora, poput LAG-3, PD-1 i TIM-3. Takvo iscrpljivanje takođe može biti rezultat spontane stimulacije T ćelija putem mehanizama nezavisnih od antigena koji agregiraju T ćelijske receptore. Posledica iscrpljivanja T ćelija može biti smanjena kontrola tumora, pa je izbegavanje prekomernog iscrpljivanja poželjna osobina u imunoterapiji kancera korišćenjem T ćelija.
[0468] Da bi se procenilo potencijalno iscrpljivanje T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR nezavisno od antigena, transdukovane T ćelije (10. dana nakon aktivacije) obojene su
22
antitelima na CD3 i markerima iscrpljivanja T ćelija (LAG3, PD1 i TIM3). SL. 23A sažima podatke iz pojedinačnih eksperimenata za nekoliko donora T ćelija. Podaci pokazuju da ekspresija markera iscrpljivanja nije pojačana u različitim DBDpp-CAR T ćelijama koje vezuju CD123. SL.23B prikazuje reprezentativne podatke protočne citometrije za ekspresiju LAG-3, PD1 i TIM-3 u T-ćelijama transdukovanim sa CAR koji sadrži scFv (gornji red) ili DBDpp-CAR (u ovom konkretnom eksperimentu cg06 koji cilja CD123) 10 dana nakon prvobitne aktivacije T ćelija. Sličnost ovih podataka ponovo pokazuje da DBDpp-CAR T ćelije ne povećavaju ekspresiju markera iscrpljivanja, što daje dodatnu potporu njihovoj delotvornosti u imunoterapiji kancera.
Primer 12. T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR prikazuju degranulaciju i citotoksičnost specifičnu za cilj
[0469] Degranulacija T ćelija, NK ćelija i mnogih ćelija monocitnog porekla (sve navedeno može da se koristi u zavisnosti od otelotvorenja). Degranulacija može dovesti do otpuštanja, u zavisnosti od vrste ćelije, antimikrobnih, citotoksičnih ili drugih molekula iz sekretornih granula u imunskoj ćeliji. Molekuli poput perforina (citotoksin koji stvara pore) ili granzima (serinske proteaze koje indukuju apoptozu u ciljnoj ćeliji) pomažu T ćelijama i NK ćelijama u ubijanju tumorskih ćelija (ili drugih vrsta ćelija).
[0470] Za procenu degranulacije T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR, 1×10<5>transdukovanih T ćelija (9. dan nakon aktivacije) uzgajano je u T ćelijskom medijumu tokom 4 sata u prisustvu monensina i PE-konjugovanog CD107a/LAMP1. T-ćelije su uzgajane samostalno ili u prisustvu 2×10<5>neciljnih tumorskih ćelija (K562, koje su CD123-) ili tumorskih ćelija koje eksprimiraju cilj (BDCM, CD123+), zatim isprane i obojene radi ekspresije CD3. Degranulacija T ćelija je zatim procenjena protočnom citometrijom, uz prvo gejtovanje CD3+SSC-niskih ćelija (netumorske), zatim CD3+CD107a+ ćelija. Simboli predstavljaju uzorke iz pojedinačnih eksperimenata koji koriste više donora.
[0471] SL. 24A-24D sažimaju ove podatke. SL. 24A prikazuje proizvodnju CD107a (kao marker degranulacije DBDpp-CAR T ćelija) ekvivalentnu negativnim kontrolama kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju CD123 samostalno uzgajaju. SL.24B prikazuje ograničenu ekspresiju CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije uzgajaju zajedno sa CD123 negativnim K562 tumorskim ćelijama. SL.24C pokazuje značajnu ekspresiju CD107a kada se DBDpp-CAR T ćelije koje ciljaju CD123 uzgajaju zajedno sa CD123 pozitivnim BDCM ćelijama, što pokazuje da su T ćelije aktivirane, podležu signalizaciji i podležu degranulaciji, što će dovesti do uklanjanja tumora. SL.24D prikazuje podatke iz eksperimentalnih replikata kokulture DBDpp-CAR T koje ciljaju CD123 sa CD123 pozitivnim BDCM ćelijama. SL. 25A-25D pokazuju slične podatke koji se odnose na degranulaciju T ćelija koje eksprimiraju PD-L1-DBDpp-CAR. Ne samo da ovi podaci pokazuju da se DBDpp-CAR T ćelije efikasno degranulišu, već podaci pružaju dalju potporu aktivaciji zavisnoj od cilja T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR.
Primer 13. Tumorska citotoksičnost posredovana putem DBDpp-CAR je specifična za cilj
[0472] Funkcija humanih T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR specifična za cilj proširena je da obuhvati in vitro citotoksičnost tumorske ćelije, kako je opisano na SL.26 i 27. U ovim eksperimentima su korišćene CD123+ (BDCM, akutna mijelogena leukemija) i CD123- (K562, hronična mijelogena leukemija) tumorske ćelije koje su prethodno napunjene ligandom koji pojačava fluorescenciju (BATDA). CD123-usmerene T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR su uzgajane sa tumorskim ćelijama tokom 2 sata sa različitim odnosima efektora prema cilju (E:T). Lažna kokultura i kokultura sa CD123-usmerenim scFv-CAR korišćeni su kao kontrole. U dodatnoj grupi eksperimenata, PD-L1+ (SU-DHL-1, limfom velikih ćelija) i PD-L1- (K562, hronična mijelogena leukemija) tumorske ćelije su prethodno napunjene sa BATDA. PD-L1-usmerene T ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR su uzgajane sa tumorskim ćelijama tokom 2 sata sa različitim odnosima E:T. Kao kontrola su korišćene lažne kokulture. BATDA ligand se oslobađa kao rezultat citolize ciljnih ćelija, a nakon dodavanja rastvora evropijuma (Eu) formira fluorescentni i stabilni helat, koji je izmeren koristeći Synergy 2 (Biotek) vremenski razloženi fluorimetar.
[0473] SL.26A-26D i 27A-27F sažimaju podatke iz ovih eksperimenata. SL.26A pokazuje da kokultura DBDpp-CAR T ćelija koje ciljaju CD123 sa K562 ćelijama (nema ekspresije CD123) daje procenat ubijanja manji nego kontrole sa lažnom kokulturom. Nasuprot tome, SL. 26B pokazuje da svaka od grupa T ćelija koje eksprimiraju DBDpp-CAR koji ciljaju CD123 ubija CD123 pozitivne tumorske ćelije efikasnije od kontrola sa lažnom kokulturom, i, za neke DBDpp, u poređenju sa T ćelijama usmerenim na CD123 sa scFv. SL. 26C i 26D pokazuju slične podatke sa ćelijama odvojenog donora.
22
[0474] Kao dalji primer, SL. 27A-27F pokazuju procenat ubijanja za PD-L1-usmerene DBDpp-CAR T ćelije. Kao što je prethodno razmotreno, kada se uzgajaju zajedno sa ćelijama koje ne eksprimiraju PD-L1, detektovana je ograničena citotoksičnost, ili nije detektovana (27A, 27C, 27E). Međutim, kada se uzgajaju sa ćelijama koje eksprimiraju ciljni marker PD-L1, postoji izmerena citotoksičnost koja daleko premašuje citotoksičnost detektovanu u kontrolama sa lažnom kokulturom (27B, 27D, 27F). Ovi podaci proširuju funkcionalne atribute T ćelija koje eksprimiraju DBDpp da uključuju ubijanje tumorskih ćelija specifično za cilj.
Primer 14. DBDpp domeni mogu da se deimunizuju i da zadrže funkciju
[0475] Mnogi terapeutski agensi mogu da izazovu neželjena dejstva dok pri tom pružaju delotvornu terapiju. U nekim slučajevima, pacijenti mogu imati imunološku reakciju na terapeutski agens (na bazi leka ili ćelije). Budući da su ovde otkriveni DBDpp nehumani proteini, obavljene su analize kompjuterskom simulacijom kako bi se potencijalno imunogeni epitopi identifikovali i eliminisali bez ugrožavanja funkcionalnih svojstava DBDpp.
[0476] Analiza kompjuterskom simulacijom aminokiselinske sekvence cg06 (SEQ ID NO: 99) identifikovala je tri sekvence od 9 aminokiselina koje dele karakteristike sa T ćelijskim epitopima (Singh, Bioinformatics 17:1236-1237, 2012) koji imaju veliki afinitet (prag vezivanja manji od 6%) i promiskuitetni su (prisutni u više od 50% relevantnih alela). Za specifične supstitucije aminokiselina u cg06 identifikovano je da smanjuju broj predviđenih epitopa T ćelija. Odgovarajuće tačkaste mutacije su uvedene u cg06, bilo pojedinačno ili u kombinaciji, što je dovelo do serija „deimunizovanih“ DBDpp-CAR.
[0477] Trodimenzionalni model DBDpp (cg06) prikazan je na SL. 28A. SL. 28B prikazuje cg06 sa jednim (od tri) potencijalno imunogena epitopa modifikovanim da bude manje potencijalno imunogen. SL.28C prikazuje cg06 sa dva (od tri) potencijalno imunogena epitopa modifikovana. SL. 28D prikazuje cg06 sa sva tri potencijalno imunogena epitopa modifikovana.
[0478] Jurkatove reporterske ćelije su elektroporisane sa ovim deimunizovanim DBDpp-CAR. Nakon 24 sata u kulturi, ekspresija CAR na Jurkatovim ćelijama je procenjena bojenjem anti-FLAG monoklonskim antitelom. Ćelije su uzgajane zajedno tokom 6 sati sa CD123+ ciljnim tumorskim ćelijama (KG1a sa niskim nivoom ekspresije CD123 i BDCM sa visokim nivoom
22
ekspresije CD123). NFAT posredovana signalizacija je izmerena dodavanjem ćelija test reagensa luciferaze (Promega) i kvantifikacijom relativnih jedinica luminescencije (RLU).
[0479] Podaci iz ovih eksperimenata prikazani su na SL. 29A-29B. SL. 29A pokazuje da deimunizovani DBDpp-CAR koji vezuju CD123 (cg06-1 do cg06-6) indukuju NFAT signalizaciju kada se uzgajaju zajedno sa CD123-pozitivnim BDCM ćelijama. SL.29B dalje pokazuje da DBDpp-CAR koji vezuju CD123 takođe indukuju NFAT signalizaciju kada se uzgajaju zajedno sa ćelijama sa nižom ekspresijom CD123 (KG1a) - uočite snižene nivoe RLU u poređenju sa SL. 29A. Ovi podaci zajedno pokazuju da imunogeni potencijal DBDpp koji vezuje cilj može biti smanjen specifičnim supstitucijama aminokiselinskih ostataka u DBDpp koje ne menjaju funkciju DBDpp ili zavisnost ciljne gustine CAR-posredovane intracelularne signalizacije - što je veći stepen prisutnosti cilja, to je veći stepen odgovora. Ovi podaci takođe ukazuju na to da DBDpp prema nekoliko ovde otkrivenih otelotvorenja može da se koristi kao terapeutski agens i, po potrebi, može da se modifikuje da smanji potencijal za imunske odgovore na ćelije koje sadrže DBDpp-CAR (npr. T ćelije, NK ćelije, itd.).
Primer 15. Bispecifični DBDpp
[0480] U nekim slučajevima, ciljne ćelije (npr. tumorske ćelije) mogu da eksprimiraju više od jednog markera. U nekim otelotvorenjima, DBD-CAR ciljaju jedan marker (npr. jedinstveni marker ćelija kancera) na ciljnoj ćeliji. Međutim, u nekim otelotvorenjima, određeni markeri nisu jedinstveni za ćelije kancera, već su prisutni i na normalnim ćelijama (mada možda sa različitim nivoima). Prema tome, u nekoliko otelotvorenja, ciljanje dva markera pruža priliku za povećanje specifičnosti imunoterapeutskog agensa putem konstruisanja CAR za ekspresiju bispecifičnog DBDpp. U takvim otelotvorenjima, ciljne ćelije koje se najefikasnije ubijaju bile bi one koje eksprimiraju oba markera koje cilja DBDpp (mada svejedno može doći do ubijanja ćelija koje eksprimiraju jedan ili drugi marker). Da bi se testirao ovaj pristup, bispecifični DBDpp-CAR eksprimirani su na Jurkatovim ćelijama, i izmerena je intracelularna signalizacija kao odgovor na ćelijsku ekspresiju jednog ili oba cilja.
[0481] SL. 30A-30B definišu ekspresiju CD123, odnosno PD-L1 na ćelijskoj površini na ćelijskim linijama K562 (CML); KG-1a (AML); BDCM (AML); SU-DHL-1 (LCL) i H460 (karcinom pluća). K562 ne eksprimira nijedan cilj dok KGla i BDCM eksprimiraju CD123 i niske nivoe PD-L1 u odnosu na visoku ekspresiju PD-L1 uočenu na CD123 negativnim
22
ćelijama, SU-DHL i H460. Ove ćelijske linije pružaju priliku da se utvrdi može li intracelularna signalizacija DBDpp-CAR koji vezuju CD123 (cg06) da se poveća putem bispecifičnog CAR koji sadrži cg06 (anti-CD123) fuzionisan sa drugim DBDpp sa specifičnošću prema PD-L1 (pb04). SL.31A pokazuje da DBDpp-CAR koji sadrže samo cg06, (SL.31A), samo pb04 (SL.
31B), cg06 fuzionisan sa N-terminusom pb04 (cg06-pb04, SL. 31C) i pb04 fuzionisan sa N-terminusom cg06 9pb-04-cg06, SL. 31D) mogu da se transdukuju i eksprimiraju u liniji Jurkatovog NFAT reporterskih ćelija, kako je procenjeno putem vezivanja anti-FLAF mAb za CAR. Sposobnost monospecifičnih i bispecifičnih CAR da aktiviraju NFAT put procenjena je zajedničkim uzgajanjem različitih CAR sa ćelijama tumora sa različitim nivoom ekspresije CD123 i/ili PD-L1. Ćelije su 6 sati uzgajane zajedno sa ciljnim ćelijama. NFAT posredovana signalizacija je izmerena dodavanjem test reagensa luciferaze (Promega) u ćelije, i kvantifikacijom relativnih jedinica luminescencije (RLU) kao mere indukovane intracelularne signalizacije.
[0482] SL. 31E prikazuje rezultate ovog eksperimenta. Krajnje leva grupa traka i histogram pokazuju relativno dejstvo ubijanja cg06 DBDpp na različite vrste ćelija. Signalni odgovor nakon zajedničkog uzgajanja sa visokim CD123+ BDCM bio je najveći sa ovim DBDpp-CAR. Sledeća grupa nadesno daje podatke koji pokazuju intracelularnu signalizaciju nakon zajedničkog uzgajanja pb04 DBDpp na iste vrste ćelija. Signalizacija je bila najviša kod BDCM, zatim kod SUHDL1 i H460 (pozivajući se na SL.30A-30B, ovo su ćelijske linije koje najviše eksprimiraju CD123 i PD-L1). Sledeća grupa nadesno daje podatke koji prikazuju intracelularnu signalizaciju bispecifičnog cg06-pb04 DBDpp (cg06 distalniji u odnosu na membranu T ćelije u poređenju sa pb04). Konačno, krajnja desna grupa pokazuje intracelularnu signalizaciju drugog bispecifičnog DBDpp (pb04-cg06 DBDpp, gde je pb04 distalniji u odnosu na membranu T ćelije u poređenju sa cg06). Ove dve grupe pokazuju da bispecifični DBDpp-CAR deluju u cilju promocije intracelularne signalizacije. U skladu sa nekoliko otelotvorenja, bispecifični DBDpp-CAR pokazuju pojačanu aktivnost (veličina intracelularne signalizacije u grupi pb04-cg06 sa BDCM ćelijama je veća nego što može da se objasni samo preko pb04 DBDpp). Prema tome, u nekoliko otelotvorenja, DBDpp-CAR koji sadrže dva DBDpp mogu da sarađuju kako bi poboljšali funkciju T ćelija. U nekoliko otelotvorenja, postoji sinergija između različitih DBDpp koji se koriste u bispecifičnom (ili drugom multimernom) DBDpp-CAR.
Primer 16. DBDpp posredovana imunoterapija tumora in vivo
22
[0483] U nekoliko otelotvorenja, ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR su delotvorne u stvaranju tumorske citotoksičnosti in vivo. Biće obavljeni eksperimenti u kojima su DBDpp-CAR specifični za marker kancera eksprimirani na površini T ćelija (ili, u drugim eksperimentima, NK ćelija). Koristiće se model miša, u kome su miševi genetski konstruisani da eksprimiraju solidni tumor ili suspenzioni tumor, u kome tumorske ćelije eksprimiraju marker kancera na koji su usmereni specifični DBDpp-CAR. Kontrolni miševi sa tumorom koji ne eksprimira ciljani marker biće korišćeni kao kontrola, kao što će biti slučaj i sa miševima koji dobijaju placebo T-ćelijski terapeutski agens.
[0484] DBDpp-CAR ćelije će se primeniti na miševima, i opterećenje tumorom biće procenjeno tokom vremena za miševe koji dobijaju različite DBDpp-CAR. Opterećenje tumora biće procenjeno poznatim postupcima (npr. in vivo snimanjem), i mortalitet će biti procenjen tokom vremena.
[0485] Kao rezultat primanja DBD-pp-CAR ćelija specifičnih za cilj, opterećenje tumorom će se smanjiti kod miševa koji eksprimiraju marker koji je specifično ciljan putem DBDpp. Smanjenje će biti značajno u poređenju sa onim miševima koji su primali placebo. Isto tako, smanjenje će biti značajno u poređenju sa onim miševima koji imaju tumorske ćelije koje ne eksprimiraju marker koji je specifično ciljan putem DBDpp. Dalje, mortalitet će biti smanjen kod miševa koji primaju DBDpp-CAR specifične za cilj u poređenju sa placebo grupom i grupom miševa sa tumorima koji ne eksprimiraju marker specifičan za cilj. Rezultati ovog eksperimenta će pokazati da su imunske ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR delotvorni terapeutski agensi i stvaraju citotoksičnost specifičnu za cilj tumorskih ćelija in vivo.
Primer 17. DBDpp posredovana imunoterapija tumora in vivo
[0486] Kao što je prethodno razmotreno, DBDpp-CAR ćelije su delotvorne u stvaranju tumorske citotoksičnosti in vivo. Biće obavljeni eksperimenti u kojima su DBDpp-CAR specifični za marker kancera eksprimirani na površini T ćelija (ili, u drugim eksperimentima, NK ćelija). Klinička ispitivanja će pokazati bezbednost DBDpp-CAR ćelija. Biće obavljena dodatna ispitivanja za primenu DBDpp-CAR ćelija na ljudima koji imaju tumor koji eksprimira marker, koji DBDpp specifično cilja.
22
[0487] DBDpp-CAR ćelije će se primenjivati prema rasporedu koji će biti utvrđen prema uobičajenim veštinama u struci. Progresija tumora, opterećenje tumorom i mortalitet biće procenjeni tokom vremena.
[0488] Kao rezultat primanja DBDpp-CAR ćelija specifičnih za cilj, progresija tumora će biti usporena, i ukupno opterećenje tumora će se smanjiti. Smanjenje će biti značajno u poređenju sa istorijskim podacima koji koriste konvencionalne antikancerogene tehnike poput hemoterapije ili radijacione terapije. Mortalitet će se takođe smanjiti u poređenju sa takvim terapijama. Postojaće ograničeni citotoksični efekti izvan cilja. Rezultati ovog ispitivanja će pokazati da su imunske ćelije koje eksprimiraju DBDpp-CAR delotvorni terapeutski agensi i stvaraju citotoksičnost specifičnu za cilj tumorskih ćelija in vivo.
Primer 18: Analiza konkurentske inhibicije za određivanje specifičnosti za ciljni epitop DBDpp koji sadrži različite sekvence aminokiselina
[0489] DBDpp mogu da se definišu različitim strukturnim i funkcionalnim svojstvima uključujući, bez ograničenja, primarnu sekvencu aminokiselina, pI, tačku topljenja, specifičnost za cilj, afinitet vezivanja i specifičnost za ciljni epitop. Specifičnost za ciljni epitop prvog DBDpp može da se uporedi sa specifičnošću drugog DBDpp koristeći format kompetitivnog testa u kome se vezivanje fiksne koncentracije prvog DBDpp za cilj obavlja u prisustvu rastućih koncentracija drugog DBDpp. Ako se prvi i drugi DBDpp vezuju za isti epitop, ili delimično preklapajući epitop, kako je definisano aminokiselinskom sekvencom ili prostorno, tada će drugi DBDpp da inhibira (npr. nadmetaće se) vezivanje prvog DBDpp za cilj. Međutim, ako drugi epitop ne inhibira vezivanje prvog DBDpp, tada se DBDpp vezuju za posebne epitope. Ovaj format testa je korišćen za procenu sposobnosti PD-L1 vezujućeg DBDpp, pb04, da inhibira vezivanje fiksne koncentracije (11,1 pmol/bunarčiću) drugog PD-L1 vezujućeg DBDpp, pb06. SL. 32 prikazuje inhibiciju vezivanja zavisnu od koncentracije rastvorljivog FLAG-označenog pb06 za FC-PD-L1 putem rastvorljivog pb04 sa IC50 koncentracijom pb04 od 19 pmol/bunarčiću. Dakle, pb04 i pb06 pokazuju zajedničko vezivanje epitopa, iako se njihove primarne aminokiselinske sekvence razlikuju (SEQ ID NO:182 i 184). Ovaj format testa se lako prilagođava da karakteriše sposobnost DBDpp da inhibira vezivanje liganda za cilj DBDpp.
Primer 19: Stvaranje i odabir CD123-ciljajućih DBDpp
2
[0490] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 6. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD123 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 60-69.
[0491] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 2. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD123 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 70-91.
[0492] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD123 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 92-127.
[0493] U bilo kojoj od biblioteka stvorenih prema ovde otkrivenim postupcima, bilo koja Xnpozicija u sekvencama biblioteke može biti supstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom, u zavisnosti od otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, cistein i/ili prolin se ne koriste za takve supstitucije.
Primer 20: Stvaranje i odabir deimunizovanih CD123-ciljajućih DBDpp
[0494] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. U skladu sa postupcima koji su ovde otkriveni, odabrani članovi biblioteke su identifikovani i deimunizovani identifikacijom i modifikovanjem potencijalno imunogenih ostataka. U ovom eksperimentu, DBDpp SEQ ID NO: 99 je modifikovan supstitucijom S65E, dajući SEQ ID NO: 130 koji pokazuje smanjenu imunogenost.
Primer 21: Deimunizacija CD123-ciljajućih DBDpp
[0495] DBDpp SEQ ID NO: 99 je stvoren i identifikovan u skladu sa ovde otkrivenim postupcima. Načinjene su dalje modifikacije kako bi se smanjila potencijalna imunogenost
2 1
DBDpp. U ovom eksperimentu, načinjena je supstitucija R17Q radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 128. Pored toga, načinjena je supstitucija S24E radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 129. Takođe, u skladu sa nekoliko otelotvorenja, mogu se načiniti višestruke deimunizacione supstitucije. Na primer, SEQ ID NO: 99 je modifikovan (i) supstitucijom R17Q, S24E radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 131, (ii) supstitucijom R17Q, S24T radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 132, (iii) supstitucijom R17Q, S24G radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 133, (iv) supstitucijom R17Q, S24E, S65E radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 134, (v) supstitucijom R17Q, S24T, S65E radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 135 i supstitucijom R17Q, S24G, S65E radi dobijanja DBDpp SEQ ID NO: 136.
Primer 22: Stvaranje i odabir CD19-ciljajućih DBDpp
[0496] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 6. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD19 predstavljeni su sekvencom SEQ ID NO: 137.
[0497] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD19 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 138-166.
[0498] U bilo kojoj od biblioteka stvorenih prema ovde otkrivenim postupcima, bilo koja Xnpozicija u sekvencama biblioteke može biti supstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom, u zavisnosti od otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, cistein i/ili prolin se ne koriste za takve supstitucije.
Primer 23: Stvaranje i odabir CD22-ciljajućih DBDpp
[0499] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 2. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD22 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 167-168.
2 2
[0500] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za CD22 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 169-176.
[0501] U bilo kojoj od biblioteka stvorenih prema ovde otkrivenim postupcima, bilo koja Xnpozicija u sekvencama biblioteke može biti supstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom, u zavisnosti od otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, cistein i/ili prolin se ne koriste za takve supstitucije.
Primer 24: Stvaranje i odabir DR5-ciljajućih DBDpp
[0502] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 6. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za DR5 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 177-178.
[0503] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 2. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za DR5 predstavljeni su sekvencom SEQ ID NO: 179.
[0504] U dodatnom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za DR5 predstavljeni su sekvencom SEQ ID NO: 180.
[0505] U bilo kojoj od biblioteka stvorenih prema ovde otkrivenim postupcima, bilo koja Xnpozicija u sekvencama biblioteke može biti supstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom, u zavisnosti od otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, cistein i/ili prolin se ne koriste za takve supstitucije.
Primer 25: Stvaranje i odabir PD-L1-ciljajućih DBDpp
2
[0506] U skladu sa nekoliko otelotvorenja prethodno otkrivenih postupaka, referentna sekvenca SEQ ID NO: 1 je modifikovana na više pozicija. U jednom eksperimentu, modifikacije su dale biblioteku DBDpp koja odgovara SEQ ID NO: 4. Neograničavajući primeri DBDpp koji pokazuju specifičnost za PD-L1 predstavljeni su sekvencama SEQ ID NO: 181-186.
[0507] U bilo kojoj od biblioteka stvorenih prema ovde otkrivenim postupcima, bilo koja Xnpozicija u sekvencama biblioteke može biti supstituisana prirodnom ili neprirodnom aminokiselinom, u zavisnosti od otelotvorenja. U nekim otelotvorenjima, cistein i/ili prolin se ne koriste za takve supstitucije.
[0508] Sve navedene publikacije, patenti, patentne prijave, internet stranice i pristupni brojevi/baze podataka sekvenci (uključujući polinukleotidne i polipeptidne sekvence) ovde su u celini uključene referencom u sve svrhe u istoj meri kao da je svaka pojedinačna publikacija, patent, patentna prijava, veb stranica ili pristupni broj/baza podataka sekvenci specifično i pojedinačno naznačen da bude tako uključen referencom.
[0509] Razmatrano je da se mogu napraviti različite kombinacije ili potkombinacije specifičnih karakteristika i aspekata prethodno otkrivenih otelotvorenja i one i dalje spadaju u jedan ili više pronalaska. Dalje, otkrivanje u ovom tekstu bilo kog određenog svojstva, aspekta, postupka, osobine, karakteristike, kvaliteta, atributa, elementa ili slično u vezi sa otelotvorenjem može da se koristi u svim ostalim ovde prikazanim otelotvorenjima. U skladu sa tim, treba shvatiti da se različite karakteristike i aspekti otkrivenih otelotvorenja mogu međusobno kombinovati ili supstituisati kako bi nastali različiti oblici otkrivenih pronalazaka. Dakle, namera je da obim ovde otkrivenih predmetnih pronalazaka ne bude ograničen konkretno otkrivenim otelotvorenjima koja su prethodno opisana. Štaviše, iako je pronalazak podložan različitim modifikacijama i alternativnim oblicima, njegovi specifični primeri su prikazani na crtežima i ovde su detaljno opisani. Međutim, treba shvatiti da pronalazak nije ograničen na konkretne oblike ili postupke koji su otkriveni, već, nasuprot tome, pronalazak pokriva sve modifikacije, ekvivalente i alternative koji spadaju u duh i obim različitih otelotvorenja koja su opisana i priloženih zahteva. Bilo koji postupci koji su ovde otkriveni ne moraju da se obavljaju navedenim redosledom. Ovde otkriveni postupci uključuju određene radnje koje praktikant obavlja; međutim, oni takođe mogu da uključuju bilo koje uputstvo treće strane o tim radnjama, bilo izričito ili implicitno. Na primer, radnje kao što je „primena T ćelije koja sadrži DBDpp-
2 4
CAR“ uključuju „davanje uputstva za primenu T ćelije koja sadrži DBDpp-CAR“. Pored toga, kada su karakteristike ili aspekti otkrića opisani u terminima Markuševih grupa, stručnjaci će prepoznati da je otkriće time opisano u terminima bilo kog pojedinačnog člana ili podgrupe članova Markuševe grupe.
[0510] Ovde otkriveni rasponi takođe obuhvataju bilo koja i sva preklapanja, podraspone i njihove kombinacije. Izrazi poput „do“, „najmanje“, „više od“, „manje od“, „između“, i slično, uključuju navedene brojeve. Brojevi kojima prethodi termin kao što je „oko“ ili „približno“ uključuju navedene brojeve. Na primer, „oko 10 nanometara“ uključuje „10 nanometara“.
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
�
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
�

Claims (40)

  1. Patentni zahtevi 1. Polipeptid koji vezuje cilj koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
    pri čemu (a) Xnje prirodna ili neprirodna aminokiselina; (b) Z1i Z2sadrže od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina; (c) polipeptid koji vezuje cilj specifično vezuje željeni cilj, pri čemu je specifično vezivanje polipeptida koji vezuje cilj za željeni cilj veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za željeni cilj; i (d) polipeptid koji vezuje cilj ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50.
  2. 2. Polipeptid koji vezuje cilj iz zahteva 1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4.
  3. 3. Polipeptid koji vezuje cilj iz zahteva 1 ili zahteva 2, pri čemu Xn nije cistein ni prolin.
  4. 4. Polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 3, pri čemu je cilj od interesa antigen kancera, opciono, pri čemu je antigen kancera PD-L1, CD137 ili CD123, i, opciono, pri čemu (a) cilj od interesa je PD-L1, i polipeptid koji vezuje cilj sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:38, SEQ ID NO:39, SEQ ID NO:40, SEQ ID NO:41, SEQ ID NO:42, SEQ ID NO: 43 i SEQ ID NO:44; (b) cilj od interesa je CD137, i polipeptid koji vezuje cilj sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 i SEQ ID NO:19; (c) cilj od interesa je CD123, i polipeptid koji vezuje cilj sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 92-126 i SEQ ID NO:127; ili (d) cilj od interesa je CD123, i polipeptid koji vezuje cilj takmiči se sa polipeptidom koji vezuje cilj iz (c) u vezivanju za CD123.
  5. 5. Polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4, pri čemu je polipeptid koji vezuje cilj obeležen i opciono, pri čemu je oznaka biotinski ostatak ili je izabran iz grupe koja se sastoji od enzimske oznake, fluorescentne oznake, luminescentne oznake i bioluminescentne oznake.
  6. 6. Polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 5, pri čemu je polipeptid koji vezuje cilj konjugovan sa terapeutskim ili citotoksičnim agensom.
  7. 7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 6 i dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač.
  8. 8. Komplet koji sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 6.
  9. 9. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4. 1
  10. 10. Vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 9, i opciono dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju polipeptida koji vezuje cilj koji je kodiran molekulom nukleinske kiseline.
  11. 11. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 9 ili vektor iz zahteva 10.
  12. 12. Ćelijska linija koja sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4.
  13. 13. Himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR sadrži (a) ciljajući domen, (b) transmembranski domen, i (c) domen za intracelularnu signalizaciju, pri čemu ciljajući domen sadrži polipeptid koji vezuje cilj iz bilo kog od zahteva 1 do 4.
  14. 14. CAR iz zahteva 13, koji je okarakterisan jednim ili više od sledećeg (a) domen za intracelularnu signalizaciju je izabran iz grupe koja se sastoji od humanog CD3 zeta domena, 41BB domena, CD28 domena, i bilo koje njihove kombinacije, (b) polipeptid koji vezuje cilj se vezuje za tumorski antigen povezan sa hematološkim malignitetom ili solidnim tumorom, (c) polipeptid koji vezuje cilj se vezuje za tumorski antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD137, PD-L1, CD123, CTLA4, CD47, KIR, DR5, TIM3, PD1, EGFR, TCR, CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelina, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipida F77, EGFRvIII, GD2, NY-ESO- 1, MAGE A3 i njihovih kombinacija, (d) domen za intracelularnu signalizaciju sadrži region kostimulatorne signalizacije, i (e) domen za intracelularnu signalizaciju sadrži region kostimulatorne signalizacije koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula izabran iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, antigena-1 povezanog sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda koji se specifično vezuje za CD83, i bilo koje njihove kombinacije.
  15. 15. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14. 2
  16. 16. Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14, opciono, pri čemu je ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK) i, opciono, pri čemu ćelija ispoljava antitumorski imunitet kada se polipeptid koji vezuje cilj vezuje za njegov odgovarajući tumorski antigen.
  17. 17. Imunska ćelija koja sadrži CAR iz zahteva 13 ili zahteva 14 za upotrebu u lečenju kancera, opciono pri čemu je imunska ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).
  18. 18. Polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) koji sadrži tri antiparalelne alfa spirale spojene linkerskim peptidima, pri čemu (a) DBDpp je sintetički peptid dobijen iz modifikacija aminokiselinske sekvence SEQ ID NO:1, pri čemu se modifikacije sastoje od 1 do 30 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija izabranih od pozicija 1-6, 8-10, 12, 13, 15-17, 19, 20-27, 29, 30, 32-34, 36, 37, 39-41, 43-52, 54, 55, 57-59, 61, 62, 64-66 i 68-73 SEQ ID NO: 1; (b) DBDpp specifično vezuje željeni cilj, pri čemu je specifično vezivanje DBDpp za željeni cilj veće od vezivanja referentnog polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:1 za željeni cilj; i (c) DBDpp ne sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:50.
  19. 19. Polipeptid sa de novo vezujućim domenom (DBDpp) iz zahteva 18, pri čemu se modifikacije sastoje od 1 do 30 konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija izabranih od pozicija 2-6, 8-10, 12, 13, 15-17, 19, 20, 29, 30, 32-34, 36, 37, 39-41, 43, 44, 52, 54, 55, 57-59, 61, 62, 64-66, 68, 69 i 70 SEQ ID NO: 1.
  20. 20. DBDpp iz zahteva 18 ili zahteva 19 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
    21 pri čemu je Xnprirodna ili neprirodna aminokiselina.
  21. 21. DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 20 koji se specifično vezuje za protein koji sadrži aminokiseline 19-305 CD123 (SEQ ID NO: 187) ili protein koji je najmanje 95% identičan sa CD123, pri čemu je DBDpp opciono okarakterisan jednim ili više od sledećeg (a) DBDpp se vezuje za protein koji sadrži aminokiseline 19-305 CD123 (SEQ ID NO: 187) ili protein koji je najmanje 95% identičan sa CD123 sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-4>M do 10<-12>M, (b) DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYK GKGNPEV EX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu je Xnprirodna ili neprirodna aminokiselina, (c) DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALGGSEAELAAFEKEIAAFESELQAYK GKGNPEV EX55LRX58X59AAX62IRX65X66LQAYRHN (SEQ ID NO:4), pri čemu je Xnprirodna ili neprirodna aminokiselina, i pri čemu Xnnije cistein ni prolin, i (d) DBDpp sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 85% identičnu sa aminokiselinskom sekvencom bilo kog od SEQ ID NO:60 - SEQ ID NO: 136, i (e) DBDpp je sposoban da se vezuje za tumor.
  22. 22. Fuzioni protein koji sadrži prvi i drugi DBDpp prema bilo kom od zahteva 18-21, pri čemu prvi i drugi DBDpp pokazuju specifičnost vezivanja za tumorski cilj, pri čemu opciono prvi i drugi DBDpp pokazuju specifičnost vezivanja za različite tumorske ciljeve.
  23. 23. DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21 ili fuzioni protein iz zahteva 22, pri čemu je DBDpp ili fuzioni protein obeležen i pri čemu je oznaka opciono biotinski ostatak ili je izabrana iz grupe koja se sastoji od enzimske oznake, fluorescentne oznake, luminescentne oznake i bioluminescentne oznake.
  24. 24. DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 21 i 23, ili fuzioni protein iz zahteva 22 ili zahteva 23, pri čemu je polipeptid koji vezuje cilj, DBDpp, ili fuzioni protein konjugovan sa terapeutskim ili citotoksičnim agensom. 22
  25. 25. Farmaceutska kompozicija koja sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 21, 23 i 24, ili fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 22 do 24, i dalje sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač.
  26. 26. Komplet koji sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18 do 21, 23 i 24, ili fuzioni protein iz bilo kog od zahteva 22 do 24.
  27. 27. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, ili fuzioni protein iz zahteva 22.
  28. 28. Vektor koji sadrži izolovani molekul nukleinske kiseline iz zahteva 27, i opciono dalje sadrži nukleotidnu sekvencu koja reguliše ekspresiju DBDpp, ili fuzioni protein kodiran molekulom nukleinske kiseline.
  29. 29. Ćelija domaćin koja sadrži molekul nukleinske kiseline iz zahteva 27 ili vektor iz zahteva 28.
  30. 30. Ćelijska linija koja sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21 ili fuzioni protein iz zahteva 22.
  31. 31. Himerni receptor antigena (CAR), pri čemu CAR sadrži (a) ciljajući domen, (b) transmembranski domen, i (c) domen za intracelularnu signalizaciju, pri čemu ciljajući domen sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21 ili fuzioni protein iz zahteva 22.
  32. 32. CAR iz zahteva 32, koji je okarakterisan jednim ili više od sledećeg (a) domen za intracelularnu signalizaciju je izabran iz grupe koja se sastoji od humanog CD3 zeta domena, 41BB domena, CD28 domena, i bilo koje njihove kombinacije, (b) DBDpp ili fuzioni protein se vezuje za tumorski antigen povezan sa hematološkim malignitetom ili čvrstim tumorom, (c) DBDpp ili fuzioni protein se vezuje za tumorski antigen izabran iz grupe koja se sastoji od CD137, PD-L1, CD123, CTLA4, CD47, KIR, DR5, TIM3, PD1, EGFR, TCR, 2 CD19, CD20, CD22, ROR 1, mezotelina, CD33/lL3Ra, cMet, PSMA, glikolipida F77, EGFRvIII, GD2, NY-ESO- 1, MAGE A3 i njihovih kombinacija, (d) domen za intracelularnu signalizaciju sadrži region kostimulatorne signalizacije, i (e) domen za intracelularnu signalizaciju sadrži region kostimulatorne signalizacije koji sadrži intracelularni domen kostimulatornog molekula izabran iz grupe koja se sastoji od CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, antigena-1 povezanog sa funkcijom limfocita (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, liganda koji se specifično vezuje za CD83, i bilo koje njihove kombinacije.
  33. 33. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32.
  34. 34. Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline koji sadrži sekvencu koja kodira CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32, opciono, pri čemu je ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK) i, opciono, pri čemu ćelija ispoljava antitumorski imunitet kada se DBDpp ili fuzioni protein vezuje za njegov odgovarajući tumorski antigen.
  35. 35. Imunska ćelija koja sadrži CAR iz zahteva 31 ili zahteva 32 za upotrebu u lečenju kancera, opciono pri čemu je imunska ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).
  36. 36. T ćelija koja sadrži himerni receptor antigena (CAR) za upotrebu u lečenju kancera, pri čemu CAR sadrži: (a) domen koji vezuje cilj koji sadrži polipeptid koji vezuje cilj koji ima aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od
    24
    pri čemu je Xn prirodna ili neprirodna aminokiselina, pri čemu Xn nije cisteinski niti prolinski ostatak, pri čemu se polipeptid koji vezuje cilj specifično vezuje za cilj od interesa eksprimiran od strane ćelije kancera, i pri čemu je specifično vezivanje polipeptida koji vezuje cilj za cilj od interesa veće nego vezivanje polipeptida prema SEQ ID NO:1 za cilj od interesa, (b) transmembranski domen izabran od 41BB i CD28, i (c) intracelularni domen, pri čemu intracelularni domen sadrži domen za signalizaciju izabran od alfa, beza ili zeta lanca T ćelijskog receptora.
  37. 37. Imunska ćelija prema zahtevu 36, pri čemu je imunska ćelija T ćelija ili ćelija prirodni ubica (NK).
  38. 38. Postupak za transformaciju referentnog polipeptida u polipeptid koji vezuje cilj sposoban za specifično vezivanje za cilj od interesa, pri čemu postupak obuhvata: (a) modifikovanje većeg broja aminokiselinskih ostataka iz referentnog polipeptida da bi se dobio veći broj potencijalnih polipeptida koji vezuju cilj; pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj uključuju varijantu aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 1, pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže tri antiparalelne alfa spirale spojene linkerskim peptidima, pri čemu su modifikovani aminokiselinski ostaci dostupni ili nedostupni rastvaraču, i pri čemu modifikacija obuhvata jednu ili više konzervativnih ili nekonzervativnih aminokiselinskih supstitucija, i ne obuhvata supstituciju cisteinom ili prolinom; (b) pakovanje većeg broja kandidata za polipeptide koji vezuju cilj u više vektora radi stvaranja biblioteke kandidata; i (c) pretraživanje biblioteke kandidata radi kandidata za polipeptide koji vezuju cilj koji ispoljavaju specifično vezivanje za cilj od interesa; pri čemu kandidati za polipeptide koji vezuju cilj sadrže aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od 2
    MGSWX5EFX8X9RLX12AIX15X16RLX19ALZ1EAELAX28FEX31X32IAX35FEX38X39LQX42Y Z2NPEVEALX52X53EAX56AIX59X60ELX63AYRHN (SEQ ID NO:11), pri čemu je Xnprirodna ili neprirodna aminokiselina, i Z1i Z2sadrže od 2 do 30 prirodnih ili neprirodnih aminokiselina.
  39. 39. Postupak iz zahteva 38, pri čemu postupak dalje obuhvata identifikaciju potencijalno imunogenih aminokiselinskih ostataka u kandidatu za polipeptid koji vezuje cilj i modifikaciju najmanje jednog od potencijalno imunogenih aminokiselinskih ostataka u kandidatu za polipeptid koji vezuje cilj, pri čemu modifikacija obuhvata aminokiselinsku supstituciju.
  40. 40. Čestice slične virusu (VLP) koje sadrže fuzioni polipeptid koji sadrži DBDpp iz bilo kog od zahteva 18-21, pri čemu su VLP pogodni za upotrebu kao imunogeni za stvaranje antitela, pri čemu su navedena antitela usmerena na DBDpp. 2
RS20210529A 2015-04-06 2016-04-04 Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena RS61907B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562143772P 2015-04-06 2015-04-06
PCT/US2016/025868 WO2016164305A1 (en) 2015-04-06 2016-04-04 De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof
EP16777107.0A EP3280432B8 (en) 2015-04-06 2016-04-04 De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61907B1 true RS61907B1 (sr) 2021-06-30

Family

ID=57072017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210529A RS61907B1 (sr) 2015-04-06 2016-04-04 Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena

Country Status (26)

Country Link
US (9) US10647775B2 (sr)
EP (3) EP3903804A1 (sr)
JP (5) JP6871232B2 (sr)
KR (2) KR20250048140A (sr)
CN (4) CN115160438A (sr)
AU (4) AU2016246426B2 (sr)
BR (1) BR112017021308A2 (sr)
CA (2) CA2981616C (sr)
CY (1) CY1124453T1 (sr)
DK (2) DK3280433T3 (sr)
EA (1) EA201792226A1 (sr)
ES (2) ES2901273T3 (sr)
HR (1) HRP20210498T1 (sr)
HU (1) HUE054435T2 (sr)
IL (2) IL254907B (sr)
LT (1) LT3280432T (sr)
MX (2) MX387517B (sr)
PH (1) PH12017501834B1 (sr)
PL (1) PL3280432T3 (sr)
PT (1) PT3280432T (sr)
RS (1) RS61907B1 (sr)
SG (2) SG11201708257UA (sr)
SI (1) SI3280432T1 (sr)
SM (1) SMT202100285T1 (sr)
WO (3) WO2016164308A1 (sr)
ZA (1) ZA201706875B (sr)

Families Citing this family (66)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9340799B2 (en) 2013-09-06 2016-05-17 President And Fellows Of Harvard College MRNA-sensing switchable gRNAs
RS61907B1 (sr) 2015-04-06 2021-06-30 Subdomain Llc Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena
WO2018075586A1 (en) * 2016-10-18 2018-04-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antigen-binding proteins targeting melanoma differentiation antigens and uses thereof
SG11201907299XA (en) 2017-02-08 2019-09-27 Dragonfly Therapeutics Inc Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CA3053275A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding psma, nkg2d and cd16
MA47465A (fr) * 2017-02-10 2019-12-18 Dragonfly Therapeutics Inc Protéines fixant le bcma, le nkg2d et le cd16
IL268755B2 (en) 2017-02-20 2025-12-01 Dragonfly Therapeutics Inc Proteins that bind her2, nkg2d, and cd16
JP2020510038A (ja) 2017-03-09 2020-04-02 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ がんワクチン
EP3592853A1 (en) 2017-03-09 2020-01-15 President and Fellows of Harvard College Suppression of pain by gene editing
JP2020510439A (ja) 2017-03-10 2020-04-09 プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ シトシンからグアニンへの塩基編集因子
CN121343934A (zh) 2017-05-10 2026-01-16 制药五有限责任公司 对补体灭活作用具有抗性的用于治疗癌症的包膜病毒
CN107216395B (zh) * 2017-07-03 2018-07-20 上海科医联创生物科技有限公司 一种tm4sf1特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2019023680A1 (en) 2017-07-28 2019-01-31 President And Fellows Of Harvard College METHODS AND COMPOSITIONS FOR EVOLUTION OF BASIC EDITORS USING PHAGE-ASSISTED CONTINUOUS EVOLUTION (PACE)
US11555072B2 (en) * 2017-09-23 2023-01-17 Memorial Sloan Kettering Cancer Center A33 antibody compositions and methods of using the same in radioimmunotherapy
US20190231690A1 (en) 2017-11-08 2019-08-01 L.E.A.F. Holdings Group Llc Platinum complexes and uses thereof
TWI701259B (zh) 2017-11-09 2020-08-11 大陸商上海懷越生物科技有限公司 ４﹘１ｂｂ抗體及其製備方法和應用
US11464803B2 (en) 2017-11-14 2022-10-11 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
IL274677B2 (en) 2017-11-14 2025-01-01 Arcellx Inc Therapies with multifunctional immune system cells
AU2018369639C1 (en) * 2017-11-14 2025-04-03 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
WO2019118949A1 (en) 2017-12-15 2019-06-20 The Broad Institute, Inc. Systems and methods for predicting repair outcomes in genetic engineering
WO2019157123A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated aminopterin and uses thereof
US12246015B2 (en) 2018-02-07 2025-03-11 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated raltitrexed and uses thereof
JP7491573B2 (ja) 2018-02-07 2024-05-28 エル．イー．エー．エフ． ホールディングス グループ エルエルシー アルファポリグルタミン酸化メトトレキセートおよびその使用
WO2019157129A1 (en) 2018-02-07 2019-08-15 L.E.A.F. Holdings Group Llc Alpha polyglutamated pralatrexate and uses thereof
US12239734B2 (en) 2018-02-07 2025-03-04 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated raltitrexed and uses thereof
EA202091887A1 (ru) 2018-02-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Комбинированная терапия рака с применением мультиспецифических связывающих белков, которые активируют естественные клетки-киллеры
DK3749346T3 (da) 2018-02-08 2024-09-09 Dragonfly Therapeutics Inc Antistof variable domænekombinationer rettet mod nkg2d-receptoren
EP3752156A4 (en) 2018-02-14 2021-10-27 L.E.A.F Holdings Group LLC GAMMA-POLYGLUTAMIZED PRALATREXATE AND USES THEREOF
WO2019160732A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 L.E.A.F. Holdings Group Llc Gamma polyglutamated aminopterin and uses thereof
EP3752157A4 (en) 2018-02-14 2022-07-06 L.E.A.F Holdings Group LLC GAMMA-POLYGLUTAMATED LOMETREXOLE AND USES THEREOF
CN111936145A (zh) 2018-02-14 2020-11-13 L.E.A.F.控股集团公司 γ聚谷氨酸化氨甲蝶呤及其用途
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
US20210017248A1 (en) * 2018-03-16 2021-01-21 The Regents Of The University Of California Cellular signaling domain engineering in chimeric antigen receptor-modified regulatory t cells
MA52571A (fr) 2018-05-08 2021-03-17 Amgen Inc Anticorps bispécifiques ayant des étiquettes appairées à des charges c-terminales clivables
US12522807B2 (en) 2018-07-09 2026-01-13 The Broad Institute, Inc. RNA programmable epigenetic RNA modifiers and uses thereof
US12378318B2 (en) 2018-08-08 2025-08-05 Dragonfly Therapeutics, Inc. Proteins binding NKG2D, CD16 and a tumor-associated antigen
EA202091888A1 (ru) 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
WO2020033630A1 (en) 2018-08-08 2020-02-13 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind bcma, nkg2d and cd16, and methods of use
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
US12351837B2 (en) 2019-01-23 2025-07-08 The Broad Institute, Inc. Supernegatively charged proteins and uses thereof
GB201903479D0 (en) 2019-03-14 2019-05-01 Univ Oxford Innovation Ltd Polypeptide with enchanced rate of spontaneous isopeptide bond formation with it's peptide tag partner and uses thereof
JP7657726B2 (ja) 2019-03-19 2025-04-07 ザ ブロード インスティテュート，インコーポレーテッド 編集ヌクレオチド配列を編集するための方法および組成物
WO2020205836A1 (en) * 2019-04-02 2020-10-08 Eli Lilly And Company Methods of selecting and detecting binding peptides
US12473543B2 (en) 2019-04-17 2025-11-18 The Broad Institute, Inc. Adenine base editors with reduced off-target effects
CN111848733B (zh) * 2019-04-30 2024-03-12 上海细胞治疗集团有限公司 一种多肽组合物及疫苗
WO2020242988A2 (en) * 2019-05-24 2020-12-03 Avitide, Inc. Affinity agents
EP3976083A4 (en) * 2019-05-31 2023-07-12 iBio, Inc. MACHINE LEARNING BASED DEVICE FOR THE DEVELOPMENT OF MESO-SCALE PEPTIDES, AND METHOD AND SYSTEM THEREOF
CA3149914A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 L.E.A.F. Holdings Group Llc Processes of preparing polyglutamated antifolates and uses of their compositions
JPWO2021100585A1 (sr) * 2019-11-20 2021-05-27
WO2021115333A1 (zh) * 2019-12-10 2021-06-17 苏州克睿基因生物科技有限公司 一种融合蛋白及表达此蛋白的工程化免疫细胞及其应用
MX2022013944A (es) 2020-05-06 2022-11-30 Dragonfly Therapeutics Inc Proteinas que se unen al receptor activador de celulas asesinas naturales grupo 2 miembro d (nkg2d), cumulo de diferenciacion (cd16) y miembro a de la familia de dominios de lectina tipo c 12 (clec12a).
CN111560391B (zh) * 2020-05-21 2022-02-11 北京大学 一种蛋白质异质索烃的生物合成方法
CN111732635B (zh) * 2020-06-22 2022-03-22 中国医学科学院基础医学研究所 与cd123蛋白特异性结合的多肽、多肽复合物、共递送系统及其制备方法与应用
AU2021299573A1 (en) * 2020-07-03 2023-02-23 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Polyfunctional orthogonal protein chimeras
CN114380907B (zh) * 2020-10-16 2024-06-18 中国科学院上海药物研究所 靶向cmtm6的纳米抗体及其制备方法和应用
WO2022157500A1 (en) * 2021-01-20 2022-07-28 Coding Bio Limited Methods for high throughput screening of chimeric antigen receptors
JP2024508894A (ja) 2021-03-03 2024-02-28 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６、及び腫瘍関連抗原に結合する多特異性結合タンパク質を使用して癌を治療する方法
CA3212948A1 (en) * 2021-03-26 2022-09-29 David M. Hilbert Multifunctional immune cell therapies
MX2024005673A (es) * 2021-11-15 2024-07-09 Arcellx Inc Polipeptidos que contienen el dominio d y usos de los mismos.
US20250170182A1 (en) * 2022-02-18 2025-05-29 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Epitope engineering of cell-surface receptors
EP4493582A4 (en) * 2022-03-17 2026-04-08 Singular Immune Inc COMPOSITION AND METHOD OF USING A RECOMBINANT FUSION PROTEIN TO GENERATE IMMUNE CELLS BECAUSE
WO2023212602A2 (en) * 2022-04-27 2023-11-02 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd30 hinge and/or transmembrane domain-based chimeric antigen receptors
CN115028689B (zh) * 2022-06-15 2023-05-30 浙江东方基因生物制品股份有限公司 特异性检测hpv6和hpv11的双特异性检测试剂盒
CN116380854B (zh) * 2023-03-06 2025-05-30 上海电力大学 一种基于荧光光谱快速检测水中微塑料污染的方法
WO2024254346A1 (en) * 2023-06-07 2024-12-12 The Broad Institute, Inc. Engineered viral like particles (evlps) for the selective transduction of target cells
WO2025122460A1 (en) * 2023-12-04 2025-06-12 Mayo Foundation For Medical Education And Research Methods and materials for treating cancer

Family Cites Families (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
AU584417B2 (en) 1985-04-01 1989-05-25 Lonza Group Ag Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US5374548A (en) 1986-05-02 1994-12-20 Genentech, Inc. Methods and compositions for the attachment of proteins to liposomes using a glycophospholipid anchor
MX9203291A (es) 1985-06-26 1992-08-01 Liposome Co Inc Metodo para acoplamiento de liposomas.
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
EP1400536A1 (en) 1991-06-14 2004-03-24 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
US5733731A (en) 1991-10-16 1998-03-31 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
DE69232137T2 (de) 1991-11-25 2002-05-29 Enzon Inc Multivalente antigen-bindende proteine
US5350674A (en) 1992-09-04 1994-09-27 Becton, Dickinson And Company Intrinsic factor - horse peroxidase conjugates and a method for increasing the stability thereof
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
SE9400088D0 (sv) 1994-01-14 1994-01-14 Kabi Pharmacia Ab Bacterial receptor structures
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
AU7378096A (en) 1995-09-28 1997-04-17 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Porcine cell interaction proteins
EP0934526B1 (en) 1996-10-08 2003-01-08 U-BISys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
US7763258B2 (en) 1997-05-20 2010-07-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Virus-like particles (VLPs) comprising heterologous multiple membrane spanning proteins
DE19802708A1 (de) 1998-01-24 1999-07-29 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Verwendung von hydroxypyridon-haltigen Puderzubereitungen zur Behandlung von Unterschenkel- und Druckgeschwüren
AU3295299A (en) 1998-02-19 1999-09-06 Xcyte Therapies, Inc. Compositions and methods for regulating lymphocyte activation
US7425541B2 (en) 1998-12-11 2008-09-16 Medarex, Inc. Enzyme-cleavable prodrug compounds
DK2067788T3 (da) 1999-05-18 2015-10-19 Dyax Corp Fab-fragmentbiblioteker og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CA2386270A1 (en) 1999-10-15 2001-04-26 University Of Massachusetts Rna interference pathway genes as tools for targeted genetic interference
US6326193B1 (en) 1999-11-05 2001-12-04 Cambria Biosciences, Llc Insect control agent
EP2180054A1 (en) 1999-12-24 2010-04-28 Genentech, Inc. Methods and compositions for prolonging elimination half-times of bioactive compounds
AU2001275474A1 (en) 2000-06-12 2001-12-24 Akkadix Corporation Materials and methods for the control of nematodes
EP1305437B1 (en) 2000-07-31 2010-09-01 Biolex Therapeutics, Inc. Expression of biologically active polypeptides in duckweed
US7829084B2 (en) 2001-01-17 2010-11-09 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding constructs and methods for use thereof
JP4820055B2 (ja) 2001-12-27 2011-11-24 グライコフィ， インコーポレイテッド 哺乳動物型糖質構造を操作するための方法
AU2003209272A1 (en) 2002-01-16 2003-09-02 Zyomyx, Inc. Engineered binding proteins
US20040002587A1 (en) 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US7314974B2 (en) * 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
KR101070518B1 (ko) 2002-03-19 2011-10-05 스티칭 디엔스트 랜드보위쿤디그 온데조에크 식물에서의 ｇｎｔⅲ 발현
JP4664677B2 (ja) 2002-09-06 2011-04-06 イソゲニカ リミテッド イン・ビトロでのペプチド発現ライブラリー
DE60333201D1 (de) 2002-09-12 2010-08-12 Greenovation Biotech Gmbh Verfahren zur herstellung von proteinen
US7781197B2 (en) 2002-12-20 2010-08-24 Greenovation Biotech Gmbh Transformed bryophyte cell having disrupted endogenous alpha 1,3-fucosyl and beta 1,2-xylosyl transferase encoding nucleotide sequences for the production of heterologous glycosylated proteins
GB0230203D0 (en) 2002-12-27 2003-02-05 Domantis Ltd Fc fusion
EP1452868A2 (en) 2003-02-27 2004-09-01 Pepscan Systems B.V. Method for selecting a candidate drug compound
CN1871252A (zh) 2003-09-05 2006-11-29 Gtc生物治疗学公司 在转基因哺乳动物奶中生产融合蛋白的方法
EP1675607B1 (en) 2003-09-05 2015-10-21 Oregon Health & Science University Monomeric recombinant mhc molecules useful for manipulation of antigen-specific t cells
DK1737971T3 (da) 2004-01-20 2017-11-13 Merus Nv Blandinger af bindingsproteiner
PL1776384T3 (pl) 2004-08-04 2013-10-31 Mentrik Biotech Llc WARIANTY REGIONÓW Fc
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
WO2006130834A2 (en) 2005-05-31 2006-12-07 Board Of Regents, The University Of Texas System IGGl ANTIBODIES WITH MUTATED FC PORTION FOR INCREASED BINDING TO FCRN RECEPTOR AND USES THEREOF
CN101287503A (zh) * 2005-08-03 2008-10-15 Rq生物科技有限公司 用于诊断IgA和IgM介导的肾脏疾病的方法和组合物
PL3167888T3 (pl) 2006-03-15 2024-08-26 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Leczenie pacjentów z napadową nocną hemoglobinurią za pomocą inhibitora dopełniacza
WO2008052043A2 (en) 2006-10-24 2008-05-02 Cogenesys, Inc. Opioid receptor agonist fusion proteins
GB0907251D0 (en) 2009-04-28 2009-06-10 Univ Leiden Coplymers
WO2011034947A2 (en) 2009-09-15 2011-03-24 University Of Washington Reagents and methods for modulating cone photoreceptor activity
WO2012044999A2 (en) * 2010-10-01 2012-04-05 Ludwig Institute For Cancer Research Ltd. Reversible protein multimers, methods for their production and use
PH12013501201A1 (en) 2010-12-09 2013-07-29 Univ Pennsylvania Use of chimeric antigen receptor-modified t cells to treat cancer
WO2012167109A2 (en) 2011-06-03 2012-12-06 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Rpgrip1 gene therapy for leber congenital amaurosis
WO2014028776A1 (en) 2012-08-15 2014-02-20 Zyngenia, Inc. Monovalent and multivalent multispecific complexes and uses thereof
WO2014046278A1 (ja) * 2012-09-21 2014-03-27 株式会社カネカ アフィニティー分離マトリックス用タンパク質リガンド
WO2014159947A1 (en) * 2013-03-14 2014-10-02 University Of Washington Through Its Center For Commercialization High affinity digoxigenin binding proteins
US20160031996A1 (en) * 2013-03-14 2016-02-04 Csl Limited Anti il-3r alpha agents and uses thereof
US9657105B2 (en) * 2013-03-15 2017-05-23 City Of Hope CD123-specific chimeric antigen receptor redirected T cells and methods of their use
GB201306634D0 (en) 2013-04-11 2013-05-29 Univ Bristol Cage-like particles
US9045545B1 (en) 2014-07-15 2015-06-02 Kymab Limited Precision medicine by targeting PD-L1 variants for treatment of cancer
IL248102B (en) 2014-05-02 2022-07-01 Genzyme Corp aav vectors for gene therapy of the central nervous system and retina
US10201606B2 (en) 2014-11-26 2019-02-12 Miltenyi Biotec Gmbh Combination immunotherapy of antigen-recognizing receptors and hematopoietic cells for the treatment of diseases
WO2016154621A1 (en) 2015-03-26 2016-09-29 The California Institute For Biomedical Research SWITCHABLE NON-scFv CHIMERIC RECEPTORS, SWITCHES, AND USES THEREOF
RS61907B1 (sr) * 2015-04-06 2021-06-30 Subdomain Llc Polipeptidi koji sadrže de novo vezujući domen i njihova primena
KR20160126340A (ko) 2015-04-23 2016-11-02 삼성전자주식회사 3중-나선 다발 단백질 및 이의 용도
CA3005042A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-bcma polypeptides and proteins
AU2017355218B2 (en) 2016-11-02 2024-02-22 Universität Basel Immunologically discernible cell surface variants for use in cell therapy
CN107254447B (zh) 2017-06-01 2020-10-16 刘未斌 Anti AFP CAR-T细胞及其制备方法和应用
AU2018369639C1 (en) 2017-11-14 2025-04-03 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
US11464803B2 (en) 2017-11-14 2022-10-11 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof
IL274677B2 (en) 2017-11-14 2025-01-01 Arcellx Inc Therapies with multifunctional immune system cells
CA3212948A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 David M. Hilbert Multifunctional immune cell therapies
MX2024005673A (es) 2021-11-15 2024-07-09 Arcellx Inc Polipeptidos que contienen el dominio d y usos de los mismos.
AU2023406036A1 (en) 2022-11-29 2025-07-10 Arcellx, Inc. D-domain containing polypeptides and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
CY1124453T1 (el) 2022-07-22
BR112017021308A2 (pt) 2018-09-25
KR20180012747A (ko) 2018-02-06
EP3280432A1 (en) 2018-02-14
EP3280432B8 (en) 2021-04-14
CA2981616A1 (en) 2016-10-13
CN107708720A (zh) 2018-02-16
JP6873101B2 (ja) 2021-05-19
US20210002381A1 (en) 2021-01-07
PL3280432T3 (pl) 2021-09-27
KR20250048140A (ko) 2025-04-07
US20250353920A1 (en) 2025-11-20
US20180209983A1 (en) 2018-07-26
CN107921090A (zh) 2018-04-17
KR102788389B1 (ko) 2025-03-31
JP2018513212A (ja) 2018-05-24
HUE054435T2 (hu) 2021-09-28
IL282704A (en) 2021-06-30
EP3280433A1 (en) 2018-02-14
JP7244567B2 (ja) 2023-03-22
AU2021200810A1 (en) 2021-03-04
CA2981616C (en) 2025-06-17
US20200223934A1 (en) 2020-07-16
MX2021013161A (es) 2021-12-10
AU2023219820A1 (en) 2023-09-07
PT3280432T (pt) 2021-04-22
MX2017012679A (es) 2018-02-09
EP3903804A1 (en) 2021-11-03
ES2901273T3 (es) 2022-03-21
JP2023052563A (ja) 2023-04-11
EA201792226A1 (ru) 2018-08-31
ZA201706875B (en) 2021-10-27
SI3280432T1 (sl) 2021-09-30
AU2016246426B2 (en) 2020-11-12
JP2024075751A (ja) 2024-06-04
EP3280432B1 (en) 2021-03-10
US12528872B2 (en) 2026-01-20
US10662248B2 (en) 2020-05-26
ES2866202T3 (es) 2021-10-19
JP6871232B2 (ja) 2021-05-12
JP2018516092A (ja) 2018-06-21
US10647775B2 (en) 2020-05-12
US20240043550A1 (en) 2024-02-08
US12358995B2 (en) 2025-07-15
US11008397B2 (en) 2021-05-18
AU2023219820B2 (en) 2025-01-30
US20180251521A1 (en) 2018-09-06
JP2021106605A (ja) 2021-07-29
WO2016164369A3 (en) 2016-11-17
WO2016164308A1 (en) 2016-10-13
IL254907B (en) 2021-05-31
SMT202100285T1 (it) 2021-07-12
NZ736022A (en) 2024-02-23
IL254907A0 (en) 2017-12-31
MX387517B (es) 2025-03-18
LT3280432T (lt) 2021-06-25
DK3280432T3 (da) 2021-04-26
CN115160438A (zh) 2022-10-11
NZ774195A (en) 2024-09-27
DK3280433T3 (da) 2021-11-15
EP3280433A4 (en) 2018-10-31
CA2981711A1 (en) 2016-10-13
HK1249422A1 (en) 2018-11-02
CN120424177A (zh) 2025-08-05
US20200362046A1 (en) 2020-11-19
PH12017501834A1 (en) 2018-04-23
SG10202007987QA (en) 2020-09-29
US20180251563A1 (en) 2018-09-06
HK1249421A1 (en) 2018-11-02
PH12017501834B1 (en) 2024-01-17
EP3280433B1 (en) 2021-09-15
AU2016246426A1 (en) 2017-10-26
SG11201708257UA (en) 2017-11-29
AU2021200810B2 (en) 2023-05-25
AU2025202871A1 (en) 2025-05-15
HRP20210498T1 (hr) 2021-06-25
US20210230288A1 (en) 2021-07-29
WO2016164369A2 (en) 2016-10-13
EP3280432A4 (en) 2018-11-07
WO2016164305A1 (en) 2016-10-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12358995B2 (en) De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof
HK40061784A (en) De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof
EA043883B1 (ru) Полипептиды, содержащие de novo связывающий домен, и их применение
HK1249421B (en) De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof
HK1249422B (en) De novo binding domain containing polypeptides and uses thereof