RS61945B1 - Kompozicija za upotrebu u povećanju efikasnosti prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija nakon transplantacije - Google Patents

Kompozicija za upotrebu u povećanju efikasnosti prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija nakon transplantacije

Info

Publication number
RS61945B1
RS61945B1 RS20210706A RSP20210706A RS61945B1 RS 61945 B1 RS61945 B1 RS 61945B1 RS 20210706 A RS20210706 A RS 20210706A RS P20210706 A RSP20210706 A RS P20210706A RS 61945 B1 RS61945 B1 RS 61945B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
treprostinil
forskolin
bone marrow
cell
Prior art date
Application number
RS20210706A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael Freissmuth
Eva-Maria Zebedin-Brandl
Zahra Kazemi
Original Assignee
Scipharm S A R L
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scipharm S A R L filed Critical Scipharm S A R L
Publication of RS61945B1 publication Critical patent/RS61945B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/4965—Non-condensed pyrazines
    • A61K31/497—Non-condensed pyrazines containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A61K31/522—Purines, e.g. adenine having oxo groups directly attached to the heterocyclic ring, e.g. hypoxanthine, guanine, acyclovir
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/557—Eicosanoids, e.g. leukotrienes or prostaglandins
    • A61K31/5575—Eicosanoids, e.g. leukotrienes or prostaglandins having a cyclopentane, e.g. prostaglandin E2, prostaglandin F2-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/557—Eicosanoids, e.g. leukotrienes or prostaglandins
    • A61K31/5578—Eicosanoids, e.g. leukotrienes or prostaglandins having a pentalene ring system, e.g. carbacyclin, iloprost
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0647—Haematopoietic stem cells; Uncommitted or multipotent progenitors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0669—Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K2035/124—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells the cells being hematopoietic, bone marrow derived or blood cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/01—Modulators of cAMP or cGMP, e.g. non-hydrolysable analogs, phosphodiesterase inhibitors, cholera toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/02—Compounds of the arachidonic acid pathway, e.g. prostaglandins, leukotrienes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/73—Hydrolases (EC 3.)
    • C12N2501/734—Proteases (EC 3.4.)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Description

Opis
[0001] Predstavljeni pronalazak predstavlja novu namenu formulacije koja sadrži inhibitor dipeptidil peptidaze IV (DPP-IV) vildagliptin za podsticanje i usmeravanje migracije hematopoetskih progenitorskih ćelija u primaocima transplantiranih matičnih ćelija, pri čemu su pomenute hematopoetske progenitorske ćelije pre transplantacije tretirane in vitro analogom prostaciklina treprostinilom, u svrhu poboljšanja prihvatanja kalema od strane primalaca pomenutih progenitorskih ćelija. Specifično, predtretman se vrši analogom prostaciklina i cAMP aktivatorom forskolinom pre transplantacije.
[0002] Hematopoetske matične ćelije (HSC ćelije) su primitivne ćelije sposobne da obnove sve elemente krvi tokom života pojedinca, uravnotežujući njihovo samoobnavljanje sa diferencijacijom ka potomstvu. HSC ćelije podležu promeni lokacije tokom razvoja i cirkulišu u sisarima čitavog života, ulazeći i izlazeći iz krvotoka da bi podstakle niše koštane srži na korake usmeravanja migracije i prihvatanja kalema. Usmerena migracija je proces u kome matične ćelije davaoca pronalaze svoj put do koštane srži, prihvatanje kalema matičnih ćelija podrazumeva njihov rast u koštanoj srži.
[0003] Terapeutski potencijal HSC ćelija proizilazi iz njihove sposobnosti da obnavljaju krv i imune ćelije u primaocima kalema. Dalje, HSC ćelije mogu da stvaraju ćelije za druga tkiva kao što su mozak, mišići i jetra. Humane autologne i alogene metode transplantacije koštane srži trenutno se koriste kao terapija za bolesti poput leukemije, limfoma i drugih životno ugrožavajućih bolesti. Autologna transplantacija koštane srži je standardna procedura koja se koristi za povećanje terapijskog prozora citotoksičnih lekova i na taj način omogućava primenu visokih doza hemoterapije (Aksentijevich I, Flinn I (2002) Chemotherapy and bone marrow reserve: lessons learned from autologous stem cell transplantation. Cancer Biother Radiopharm 17:399-403, Awedan AA (2002) High intensity regimens with autologous hematopoetic stem cell transplantation as treatment of multiple myeloma. Ann Transplant 7:38-43). Međutim, za ove procedure se mora izolovati velika količina koštane srži davaoca kako bi se osigurala dovoljna količina HSC ćelija za prihvatanje kalema.
[0004] Kretanje ćelija, posebno usmerena migracija HSC ćelija, regulisana je od strane nekoliko različitih intraćelijskih mehanizama.
[0005] Potreba za Gαs-transdukovanim signalom in vivo da bi se niše koštane srži nastanile HSC ćelijama je prvo opisana ((Adams GB et al., (2009) Haematopoietic stem cells depend on Gαsmediated signaling to engraft bone marrow. Nature 459:103-107). Ova otkrića potvrđuju ranije in vitro eksperimente, koji su pokazali da aktivacija Gαspromoviše preživljavanje i diferencijaciju hematopoetskih matičnih ćelija (Dexter TM et al., (1985) Inhibitors of cholera toxin-induced adenosine diphosphate ribosylation of membrane-associated proteins block stem cell differentiation. Blood 65:1544-1548, Long MW et al., (1988) Cholera toxin and phorbol diesters synergistically modulate murine hematopoietic progenitor cell proliferation Exp Hematol. 16:195-200). Gαsje α-subjedinica heterotrimernog G proteina koja vezuje guaninski nukleotid, i koja stimuliše svih 9 izoformi membranskog proteina adenilat ciklaze sisara. Gαsmože biti konstitutivno aktivirana ex vivo/in vitro tretiranjem ćelija toksinom kolere. To je zato što toksin kolere vrši APD-ribozilaciju katalitičkog ostatka arginina (R<186/187/201/202,>tačan broj zavisi od varijante splajsovanja Gαs); netaknut ostatak arginina potreban je za GTP-hidrolizu i posledičnu deaktivaciju Gαs(Freissmuth M, Gilman AG (1989) Mutations of Gsα designed to alter the reactivity of the protein with bacterial toxins. Substitutions at ARG187 result in loss of GTPase activity. J Biol Chem 264:21907-21914). Poboljšano prihvatanje kalema se zaista može uočiti nakon prethodnog tretiranja hematopoetskih matičnih ćelija toksinom kolere: bilo je skoro dvostruko više (Lin-) prekursorskih ćelija u koštanoj srži ukoliko je preparacija matičnih ćelija prethodno tretirana toksinom kolere (Adams, 2009). Drugo, HSC ćelije eksprimiraju sve četiri vrste receptora za prostaglandin E (EP1-4). Predtretman hematopoetskih matičnih ćelija (dimetiliranim) prostaglandinom E2 poboljšava prihvatanje kalema (North TE, et al., (2007) Prostaglandin E2 regulates vertebrate haematopoietic stem cell homeostasis. Nature 447:1007-1011, 8; Hoggatt J, et al., (2009) Prostaglandin E2 enhances hematopoietic stem cell homing, survival, and proliferation (Blood 113:5444-5455). Ovaj efekat je posredovan kanonskom Gαs-zavisnom signalizacijom jer cAMP indukovana aktivacija protein kinaze A (PKA) sinergiše sa Wnt-zavisnim signalima u stabilizaciji β-katenina (Goessling W et al. (2009) Genetic interaction of PGE2 and Wnt signaling regulates developmental specification of stem cells and regeneration. Cell 136:1136-1147).
[0006] Pored toga, PGE2 takođe povećava CXCR4 mRNK i površinsku ekspresiju HSC ćelija, pojačava njihovu migraciju ka faktoru izvedenom iz stromalnih ćelija-1 (SDF-1) in vitro, usmerava migraciju do koštane srži in vivo i stimuliše ulazak HSC ćelije u ćelijski ciklus i napredak u toku ćelijskog ciklusa.
[0007] Postupak za povećanje efikasnosti prihvatanja kalema HSC ćelija koristeći analog prostaciklina, opciono u kombinaciji sa forskolinom, opisan je u WO2012/095511.
[0008] SDF-1-CXCR4 osovina je takođe poznata po tome što je uključena u usmeravanje migracije ćelije. SDF-1 igra ključnu ulogu u regulaciji kretanja normalnih HSC ćelija i njihovoj usmerenoj migraciji i zadrzavanju u koštanoj srži (Kucia et al., Stem Cells, 2005).
[0009] Prema WO2009/152186 A1, inhibicija aktivnosti CD26 peptidaze (DPPIV, dipeptidilpeptidaza IV) može pojačavati migracionu aktivnost i opisana je upotreba inhibitora CD26 peptidaze za poboljšanje usmeravanja migracije i prihvatanja kalema ćelija.
[0010] WO 2012/074676 opisuje formulaciju za očuvanje jetre koja sadrži antagonist GLP-1 i DPP-IV inhibitor.
[0011] Hussain Filza et al. beleže efekat treprostinila na transplantaciju matičnih ćelija (BMC Pharmacology, vol. 11, br. Suppl 2, 2011, str. A6).
[0012] US 2008/085264 prikazuje upotrebu DPP-IV inhibitora/ inhibitora CD26 peptidaze za predtretman namenjen povećanju efikasnosti transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
[0013] Broxmeyer H. et al. sprovode istraživanje o transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija. (STEM CELLS AND DEVELOPMENT, 2013, vol. 22, suppl. 1, pp. 103-110) dalje diskutuju o upotrebi dmPGE2 u kombinaciji sa sitagliptinom (Broxmeyer H. i Pelus, L. 2014, Blood Cells, Molecules and Diseases 53, 34-38).
[0014] Schwaiger E. et al. prikazuju upotrebu DPP-IV inhibitora i prikazuju da prisustvo ovih inhibitora ne čini prihvatanje kalema koštane srži (Experimental Hematology, 2011, vol 40, no.
2, pp.97-106).
[0015] Hoggatt J. et al. izveštavaju o upotrebi PGE2 za stimulisanje hematopoetskih matičnih ćelija (BLOOD, 2009, vol.113, no.22, pp.5444-5455).
[0016] WO2012/095511 opisuje tretiranje hematopoetskih matičnih ćelija treprostinilom i forskolinom.
[0017] Farag S.S. et al. opisuju in vivo inhibiciju DPP-4 sitagliptinom, kako bi se pojačalo prihvatanje kalema jedinične transplantirane krvi pupčanika (Stem Cells & Dev., 2013, 22, 7, 1007-1015).
[0018] Focosi D. et al. objavljuju poboljšanje prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija primenom sitagliptina (Leukemia Res., 2009, 33, 178-204).
[0019] Lociranje matičnih ćelija nakon transplantacije je ključna odrednica uspešne transplantacije. Trenutno je za transplantaciju potreban veliki broj matičnih ćelija jer se teško ugrađuju u koštanu srž i sledi dug period aplazije koštane srži što dovodi do smanjenja zrelih krvnih zrnaca.
[0020] Stoga je još uvek potrebno obezbediti metode i režime lečenja koji će efikasno stimulisati HSC ćelije da bi se povećalo usmeravanje migracije, prihvatanje kalema, zadržavanje izolovanih HSC ćelija u nišama koštane srži ispitanika koji su podvrgnuti transplantaciji koštane srži i da bi se smanjio broj HSC ćelija potrebnih za transplantaciju.
Kratak opis pronalaska:
[0021] Problem je rešen primerima izvođenja ovog pronalaska, kako je definisano u priloženim patentnim zahtevima.
[0022] Pronalazak se zasniva na zapažanju da usmeravanje migracije i prihvatanje kalema hematopoetskih matičnih ćelija može biti uspešno poboljšano ex vivo prethodnim tretiranjem pomenutih matičnih i/ili progenitorskih ćelija analogom prostaciklina i najmanje jednim cAMP aktivatorom i daljom primenom inhibitora dipeptidil peptidaze IV (DPP-IV) osobi kojoj je izvršena transplantacija navedenih hematopoetskih matičnih ćelija.
[0023] Preciznije, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži vildagliptin za upotrebu u povećanju efikasnosti prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija kod primalaca kojima je izvršena transplantacija navedenim hematopoetskim matičnim ćelijama, pri čemu:
a) pre transplantacije, pomenute hematopoetske matične ćelije su prethodno in vitro tretirane treprostinilom ili njegovim farmaceutski prihvatljivim solima i forskolinom; i b) kompozicija se primenjuje tokom perioda od najmanje 1 dana nakon transplantacije pomenutih hematopoetskih matičnih ćelija.
[0024] Iznenađujuće, pronalazak je pokazao da inkubacija izolovanih hematopoetskih matičnih ćelija pre transplantacije sa treprostinilom, zajedno sa cAMP aktivatorom forskolinom i primena inhibitora DPP-IV vildagliptina neposredno pre i nakon transplantacije pomenutih ćelija pacijentu kome je to potrebno, veoma povećavaju efikasnost usmeravanja migracije i prihvatanja kalema.
[0025] Ovo je iznenađujuće jer inhibicija DPP-IV (pomoću gliptina) sama po sebi nije dovoljna za poboljšanje transplantacije koštane srži na mišjim modelima (Schwaiger E, et al., Exp Hematol. 2012 Feb; 40(2):97-106.)
[0026] Kao što je ovde opisano, hematopoetske matične ćelije se inkubiraju sa kombinacijom analoga prostaciklina, treprostinila, i jedinjenja koje može da dodatno poveća nivo cAMP-a, forskolinom ili inhibitorom razgradnje cAMP-a (fosfodiesteraznim inhibitorom) vildagliptinom. U in vivo životinjskom modelu, primena inhibitora DPP-IV, posebno vildagliptina, nakon transplantacije pomenutih ćelija značajno povećava stopu preživljavanja pomenutih primalaca hematopoetskih ćelija u poređenju sa primenom analoga prostaciklina. Suprotno tome, pri kombinovanoj primeni analoga prostaciklina, treprostinila i DPP-IV inhibitora vildagliptina, nakon transplantacije hematopoetskih ćelija prethodno tretiranih treprostinilom i forskolinom dolazi do medjusobnog antagonizma.
[0027] Predmetni pronalazak je posebno koristan za lečenje odabrane grupe pojedinaca, tj. pacijenata obolelih od bolesti koštane srži ili od bolesti povezanim sa koštanom srži, posebno od bolesti koštane srži kao što su leukemija, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativni poremećaji, aplastična anemija, srpaste anemije, poremećaji krvnih ćelija, bolesti koštane srži izazvane hemioterapijom ili zračenjem, a koji su podvrgnuti transplantaciji korišćenjem uzoraka hematopoetskih matičnih ćelija prethodno in vitro tretiranih analogom prostaciklina treprostinilom i cAMP aktivatorom forskolinom pre transplantacije.
[0028] Preciznije, bolest može biti poremećaj krvnih ćelija kao što je hemoglobinopatija ili poremećaj funkcije neutrofilnih granulocita, T- i/ili B- limfocita (npr. teska kombinovana imunodeficijencija, Brutonova agamaglobulinemija).
[0029] Prema dodatnom primeru izvođenja, DPP-IV inhibitor se dalje primenjuje najmanje 5, specifično najmanje 10, specifično najmanje 15, specifično najmanje 24 sata pre transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
[0030] U primeru izvođenja prema predmetnom pronalasku, vildagliptin se primenjuje najmanje 2 dana, najmanje 3 dana, najmanje 4 dana nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
Slike:
[0031]
Slika 1: Prethodna inkubacija matičnih i progenitorskih ćelija miša i čoveka u prisustvu treprostinila i forskolina povećava njihovu migraciju ka SDF-1/CXCL12.
Slika 2: Inhibicija SDF-1/CXCL12-indukovane migracije mišjih hematopopoetskih i progenitorskih matičnih ćelija stimulisanih prisustvom treprostinila i forskolina, u prisustvu AMD3100, antagonista CXCR4.
Slika 3: Vildagliptin pojačava migraciju hematopoetskih i progenitorskih matičnih ćelija, prethodno inkubiranih sa treprostinilom i forskolinom, ka SDF-1/CXCL12.
Slika 4: Vildagliptin i treprostinil povećavaju usmerenu migraciju hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija, prethodno inkubiranih sa treprostinilom i forskolinom, ali su međusobno antagonisti kada se kombinuju in vivo.
Slika 5: Kombinovana primena treprostinila i vildagliptina letalno ozračenim BALB/c miševima primaocima, kojima su injecirane hematopoetske matične ćelije i progenitorske ćelije prethodno tretirane in vitro kombinacijom treprostinila i forskolina, manje je efikasna u povećanju preživljavanja ovih miševa od pojedinačne in vivo primene vildagliptina ili treprostinila.
Slika 6: Ekspresija prostanoidnih receptora (A, B) u mišjim i humanim hematopoetskim matičnim i progenitorskim ćelijama (HSPC ćelije). RNK je izolovana iz mišjih (A) i humanih (B) HSPC ćelija i reverzno transkribovana. RNK pripremljena od mišjih moždanih ćelija (kombinovana kultura neurona i glija ćelija) i ljudskih ćelijskih linija PC3 i HCT116, poslužila je kao pozitivna kontrola. PCR-zavisna amplifikacija izvršena je upotrebom prajmera navedenih u Tabeli 1. Amplikoni za sve E prostanoidne receptore (EP1 do EP4), i prostanoidni receptor (IP) i D prostanoidni receptor-1 (DP1) elektroforetski su razdvojeni na agaroznom gelu i vizuelno prikazani bojenjem etidijum bromidom. Kolona sa oznakom H2O označava kontrolu, gde je amplifikacija izvršena u odsustvu prethodne reverzne transkripcije. mRNK koja kodira GAPDH bila je amplifikovana kao interna kontrola.
Slika 7: Poređenje akumulacije cAMP-a izazvane treprostinilom i dmPGE2 u humanim HSPC ćelijama.
Slika 8: Predretman mišjih i humanih HSPC ćelija treprostinilom i forskolinom ne indukuje apoptozu niti menja progresiju ili potencijal diferencijacije ćelijskog ciklusa. Ljudske HSPC ćelije su inkubirane sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina tokom jednog sata. Potom je protočnom citometrijom procenjena indukcija apoptoze (A, B) i napredovanje ćelijskog ciklusa (C, D). Prema G0/1, S i G2 fazi, nije otkrivena razlika u apoptotskim ćelijama ili distribuciji ćelija između netretiranih i tretiranih ćelija (jednosmernom ANOVA metodom) (E, F). Podaci su srednja vrednost ± SEM (n = 3).
Slika 9: In vitro predtretman sa treprostinilom i forskolinom pojačava ekspresiju CXCR4 (A i B) i CD26/DPPIV (B).
Slika 10: In vitro predtretman sa treprostinilom i forskolinom pojačava delovanje SDF-1 preko CXCR4.
Slika 11: In vivo primena CXCR4-antagonista (AMD3100) poništava pozitivan efekat treprostinila na preživljavanje miševa primalaca. Mišje HPSC ćelije su prethodno in vitro tretirane treprostinilom i forskolinom kako je navedeno u legendi Slike 4 i injecirane (2 x 105 po mišu) u letalno ozračene miševe primaoce. Oni su zatim podeljeni u dve grupe.
Miševi raspoređeni u grupu 1 (n = 10) su dalje podvrgnuti in vivo tretmanu treprostinilom (0,15 mg/kg-18h<-1>) dok su miševi iz grupe 2 (n = 10) dobili i treprostinil (0,15 mg/kg<-1>8h<-1>) i AMD3100 (3,3 mg kg-18h-1) potkožnom injekcijom na svakih 8 sati tokom 10 dana.
Razlika između dve krive preživljavanja je bila statistički značajna (P = 0,007, log-rank test).
Slika 12: In vivo lečenje miševa primalaca samo vildagliptinom i treprostinilom, ali ne i njihovom kombinacijom, povećava usmeravanje migraciju HSPC ćelija, koje su prethodno inkubirane sa treprostinilom i forskolinom.
Slika 13: In vivo primena samo inhibitora DPP-IV vildagliptina povećava pozitivan efekat in vitro tretiranja HSPC ćelija treprostinilom i forskolinom na stopu preživljavanja kod miševa primalaca.
Detaljan opis
[0032] Detaljan tehnički prikaz izložen u nastavku može u nekim aspektima prevazići prikaz pronalaska kao takvog a takođe može da pruži tehničku osnovu za srodna tehnička dostignuća. Razumeće se da dodatna obezbeđena tehnička osnova nije namenjena definisanju pronalaska kao takvog (koji je isključivo definisan priloženim patentnim zahtevima), već se može staviti i u širi tehnički kontekst. Shodno tome, razumeće se da pojmovi „primeri izvođenja“, „aspekti“, „predmet“ odražavaju specifične detalje prikaza, ali ukoliko se odnose na deo dodatne tehničke osnove, nisu namenjeni definisanju predmeta pronalaska koji spadaju u opseg patentnih zahteva.
[0033] Obezbeđivanje postupaka i sredstava za povećanje usmeravanja migracije i prihvatanja kalema HSC ćelija u okruženju koštane srži ima snažne biološke i medicinske implikacije. Lokalizacija matičnih ćelija nakon transplantacije je izuzetno važna za kliničke postupke jer je trenutno potreban veliki broj matičnih ćelija pri kliničkoj transplantaciji, što dovodi do potrebe za velikom količinom davaočevih ćelija. Ovakvi postupci su takođe veoma korisni jer značajan broj autologih kalema davaoca ne sadrži dovoljan broj matičnih ćelija ili HSC ćelija. Isto tako, pacijenti često nisu u mogućnosti da pronađu histokompatibilne davaoce, što naglašava potrebu za postupcima i kompozicijama za smanjenje broja HSC ćelija potrebnih za uspešnu transplantaciju. Sposobnost poboljšanja usmerene migracije i prihvatanja kalema HSC ćelija in vitro ili ex vivo omogućava uzimanje manjeg broja ćelija od davalaca, smanjujući time vreme i neugodnost povezanu sa uzimanjem koštane srži/perifernih matičnih ćelija i povećanje broja osoba spremnih da budu davaoci HSC ćelija.
[0034] Ovde je opisana nova upotreba inhibitora dipeptidilpeptidaze IV (DPP-IV) za lečenje pacijenata kojima se vrši transplantacija hematopoetskih matičnih progenitorskih ćelija s tim da su pomenute matične ćelije korišćene za transplantaciju bile inkubirane sa najmanje jednim analogom prostaciklina za poboljšanje prihvatanja kalema ćelija, posebno sa cAMP aktivatorom, pre primene ili vraćanja pomenutih ćelija u telo pojedinca.
[0035] Hematopoetske matične i progenitorske ćelije, specifično mišje i humane hematopoetske matične i progenitorske ćelije (HSPC ćelije) eksprimiraju nekoliko prostanoidnih receptora (npr. EP1, EP2, EP3, EP4, IP i DP1, Slika 6). Poznato je da treprostinil specifično aktivira sve Gsvezane receptore, npr. EP2, EP4, IP i DP1 receptore, dok dmPGE2 takođe stimuliše EP3receptore. Pokazano je da treprostinil aktivira cAMP u hematopoetskim progenitorskim ćelijama. U humanim hematopoetskim matičnim i progenitorskim ćelijama, kriva koncentracija-odgovor za treprostinil bila je veća od dva reda veličine između 10 i 90% odgovora. Ovo je u skladu sa aktiviranjem nekoliko stimulatornih receptora. Akumulacija cAMP-a izazvana treprostinilom može se poboljšati kombinovanjem sa forskolinom, direktnim aktivatorom adenilat-ciklaze.
[0036] Hematopoetske matične i progenitorske ćelije mogu biti izložene kombinaciji treprostinila i forskolina bez ikakvog uočljivog efekta na njihovu održivost i sposobnost da se kasnije podvrgnu asimetričnoj deobi i diferencijaciji ćelija u liniju eritroidnih ćelija i granulocita/monocita. Dakle, broj ćelija potrebnih za transplantaciju je značajno manji u poređenju sa ćelijama potrebnim za transplantaciju bez prethodnog tretmana analogom prostaciklina i forskolinom.
[0037] Prethodno tretiranje hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija kombinacijom treprostinila i forskolina poboljšava prihvatanje kalema koštane srži u ozračenim organizmima.
[0038] Dodatno tretiranje primaoca treprostinilom in vivo dalje pojačava prihvatanje kalema koštane srži.
[0039] Navedeni DPP-IV inhibitori su posebno izabrani iz grupe gliptina.
[0040] Kako se koristi ovde i u patentnim zahtevima, oblik jednine uključuje i množinu, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije.
[0041] Konkretno, analog prostaciklina je izabran iz grupe koju čine treprostinil, iloprost, beraprost i cicaprost ili njihove farmaceutski prihvatljive soli.
[0042] Treprostinil je sintetski analog prostaciklina i metabolički je stabilan. Treprostinil je registrovan kao Remodulin™. Treprostinil je mononatrijumova so (1R,2R,3aS,9aS)-[[2,3,3a,4,9,9a-heksahidro-2-hidroksi-1-[(3S)-3-hidroksioktil]-1H-benz[f]inden-5-il]-oksi] sirćetne kiseline.
[0043] Iloprost je registrovan kao "Ilomedin" i predstavlja 5-{(E)-(1S,5S,6R,7R)-7-hidroksi-6 [(E)-(3S,4RS)-3-hidroksi-4-metil-1-okten-6-inil]-bi-ciklo[3.3.0]oktan-3-iliden pentansku kiselinu.
[0044] Beraprost je 2,3,3a,8b-tetrahidro-2-hidroksi-1-(3-hidroksi-4-metil-1-okten-6-inil)-1H-ciklopenta(b)benzo-furan-5-buterna kiselina.
[0045] Cicaprost je 2-[(2E)-2-[(3aS, 4S, 5R,6aS)-5-hidroksi-4-[(3S, 4S)-3-hidroksi-4-metilnona-1,6 -diinil]-3,3a,4,5,6,6a-heksahidro-1H-pentalen-2-iliden] etoksi]-sirćetna kiselina.
[0046] Kao što se ovde koristi, izraz „analozi prostaciklina“ uključuje funkcionalne derivate i funkcionalne analoge navedenih supstanci.
[0047] Pojmovi „analog“ ili „derivat“ odnose se na hemijski molekul koji je sličan drugoj hemijskoj supstanci po strukturi i funkciji, često strukturno različit u jednom elementu ili grupi, koji se mogu razlikovati modifikovanjem više grupa (npr. 2, 3 ili 4 grupe) ako zadržava istu funkciju kao početna supstanca. Takve modifikacije su rutina za kvalifikovane osobe i uključuju, na primer, dodatak ili supstituciju hemijskih ostataka kao što su estri ili amidi kiseline, zaštitnih grupa kao što je benzilna grupa za alkohol ili tiol i terc-butoksikarbonilne grupe za amin. Takođe su uključene modifikacije bočnih lanaca alkila, kao što su alkil supstitucije (npr. metil, dimetil, etil, itd.), modifikacije nivoa zasićenja ili nezasićenja bočnih lanaca i dodavanje modifikovanih grupa kao npr. supstituisane fenil i fenoksi grupe. Derivati takođe mogu sadržati konjugate, kao što su biotin ili avidin ostaci, enzime kao što je peroksidaza rena i sl., kao i radioaktivnoobeležene, bioluminiscentne, hemoluminiscentne ili fluorescentne ostatke. Dalje, ostaci se mogu dodati agensima opisanim u ovom dokumentu, kako bi se izmenila njihova farmakokinetička svojstva, na primer kako bi se povećao poluživot ex vivo ili povećao prelazak u ćelije, između ostalih poželjnih svojstava. Takođe, uključeni su prolekovi za koje je poznato da poboljšavaju brojne poželjne kvalitete farmaceutskih proizvoda (npr. rastvorljivost, bioraspoloživost, proizvodnju itd.).
[0048] Izraz „derivat" takođe uključuje u svom opsegu i promene koje su izvršene na roditeljskom molekulu uključujući dodatke, uklanjanja i/ili zamene koje obezbeđuju funkcionalno ekvivalentne ili funkcionalno poboljšane molekule.
[0049] Derivat treprostinila može biti izabran iz grupe kiselinskih derivata, prolekova, polimorfa, anhidrovanih polimorfa ili izomera treprostinila.
[0050] Slično tome, iloprost, cicaprost ili beraprost mogu biti derivati iz grupe njihovih kiselinskih derivata, prolekova, polimorfa ili izomera.
[0051] Moguće je da se u pronalasku mogu koristiti dva, specifično tri ili više različitih analoga prostaciklina. Alternativno se mogu koristiti četiri, pet ili šest ili čak više različitih analoga prostaciklina.
[0052] Specifično, dodatno se od analoga prostaciklina može koristiti i (dimetilirani) prostaglandin E2.
[0053] 16,16-dimetil PGE2je kompetitivni inhibitor 15-hidroksi PGDH, ali nije supstrat enzima. Zbog svoje rezistencije na metabolizam pomoću 15-hidroksi PGDH, ima produženi poluživot in vivo. 16,16-dimetil PGE2deluje kao agonist na većinu podtipova EP receptora. Kdza aktivaciju izolovanih EP2receptora je oko 1 nM.316,16-dimetil PGE2se koristi za očuvanje svojstava samoobnavljanja, istovremeno sprečavajući diferencijaciju hematopoetskih matičnih ćelija u toku umnožavanja u kulturi.<4,5>
[0054] DPP-IV je neklasična serin-aminodipeptidaza vezana za membranu koja uklanja Xaa-Pro dipeptide iz amino kraja polipeptida i proteina. Unutar koštane srži, DPP-IV je lokalizovana u specijalizovanim mikrodomenima na membranama strome vezivnog tkiva. Gliptini su klasa selektivnih hipoglikemika koji inhibiraju DPP-IV i koji se uglavnom koriste u lečenju dijabetes mellitusa. Gliptini pomažu u snižavanju glukoze nakon obroka inhibirajući razgradnju glukagonu sličnog peptida-1 (GLP-1), insulinskog sekretagoga koga sintetišu ćelije zidova creva kao odgovor na hranu.
1
[0055] Gliptini su sitagliptin, vildagliptin, alogliptin, saksagliptin, linagliptin, anagliptin, teneligliptin, gemigliptin ili dutogliptin i bilo koji drugi gliptin za koji se pokazalo da je moćan inhibitor prečišćene rastvorljive ili dipeptidilpeptidaze ili dipeptidilpeptidaze ispoljene na ćelijskoj površini.
[0056] Konkretno, DPP-IV inhibitor se pojedincu može primeniti pre, tokom ili posle primene HSC ćelije, prethodno tretiranih u skladu sa pronalaskom.
[0057] Prema pronalasku, izrazi "lečenje", "predretiranje" ili "inkubacija" mogu se koristiti naizmenično. Ovi izrazi se odnose na izolovane hematopoetske matične ćelije koje su dovedene u kontakt sa analogom prostaciklina i cAMP aktivatorom .
[0058] Preciznije, to znači da se uzorak koji sadrži hematopoetske matične ćelije pomeša sa najmanje jednim analogom prostaciklina teprostinilom i najmanje jednim cAMP aktivatorom, forskolinom, da bi se dobila smeša, inkubirajući pomenutu smešu tokom određenog vremenskog perioda koji je dovoljan za stimulaciju G alfa-signalizacije u pomenutim ćelijama.
[0059] Kompozicija za upotrebu može sadržati treprostinil zajedno sa jednim od iloprosta, beraprosta ili cicaprosta i cAMP aktivatorom , forskolinom. Alternativno, treprostinil se može mešati u kombinaciji sa više njih, na primer sa dva, tri, četiri ili pet drugih analoga prostaciklina,na primer, ali bez ograničenja na iloprost, beraprost ili cicaprost ili njihove fiziološki prihvatljive soli u kombinaciji sa cAMP aktivatorom , posebno forskolinom.
[0060] Prema inovativnoj upotrebi, DPP-IV inhibitor je vildagliptin i hematopoetske matične ćelije su in vitro tretirane treprostinilom i forskolinom pre transplantacije.
[0061] Kao što je ovde opisano, aktivator cikličnog AMP-a (cAMP-a) ili, kao alternativa, ligand EP prostaglandinskog receptora se može koristiti za predtretman matičnih ćelija. Primeri cAMP aktivatora uključuju, ali nisu ograničeni na, dibutiril-cAMP (DBcAMP), forbol estar, forskolin, sklareline 8-bromo-cAMP, toksin kolere (CT), aminofilin, 2,4 dinitrofenol (DNP), noradrenalin, epinefrin, izoproterenol, izobutilmetil-ksantin (IBMX), kofein, teofilin (dimetilksantin), dopamin, rolipram, prostaglandin E1, prostaglandin E2, hipofizni polipeptid aktivator adenilat ciklaze (PACAP) i vazoaktivni crevni polipeptid (VIP), između ostalih poznatih u struci,mogu se dodati u matične ćelije ili matične ćelije/treprostinil ili matične ćelije/treprostinil, iloprost, cicaprost i/ili beraprost smešu pre inkubacije. Primeri cAMP aktivatora takođe uključuju cAMP i analoge cAMP-a, poput sp-5,6-DCI-BIMPS (BIMPS), između ostalih.
[0062] Forskolin je sadržan u kompoziciji.
[0063] Količina analoga prostaciklina treprostinila zavisi od metode za pripremu stimulisanih HSC ćelije.
[0064] Vrlo konkretno, za inventivnu primenu, efikasna koncentracija treprostinila je u opsegu od 0,1 μM do 100 μM, konkretno 1 μM do 50 μM, tačnije 5 μM do 25 μM, konkretno oko 10 μM.
[0065] Kao što je u ovom dokumentu objašnjeno, izraz "oko" uključuje odstupanje numeričke vrednosti od maksimalno 10%, specifično najviše 5%, specifičnije najviše 1%. Kao primer, izraz "oko 10 μM" definiše opseg od 9 do 11 μM, specifično 9,5 do 10,5 μM, specifičnije 9,9 do 1,1 μM.
[0066] Opseg optimalne koncentracije za analog prostaciklina odgovara vrednosti 10 do 30 puta većoj od njegove ECso za stimulaciju akumulacije cAMP-a u pomenutim ćelijama.
[0067] Odnos prostaciklinskih analoga i forskolina može biti oko 1: 3. HSC ćelije tretirane forskolinom i prostaciklinskim analozima mogu se prečistiti pre ponovne implantacije, međutim, ove HSC ćelije takođe mogu biti ponovo implantirane bez daljeg prečišćavanja pošto male količine forskolina mogu biti prisutne ali ne moraju izazvati ikakve neželjene efekte.
[0068] Prema određenom aspektu, koncentracija cAMP aktivatora, forskolina, koji se koristi za inkubaciju matičnih ćelija može biti između 1 μM i 100 μM, specifično između 10 μM i 50 μM oko 30 μM.
[0069] DPP-IV inhibitor se daje najmanje 5, specifično najmanje 10, specifično najmanje 15, specifično na najmanje 24 sata pre transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
[0070] Alternativno, DDP-IV inhibitor se može davati pacijentu preoperativno, tj.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 dana pre transplantacije i/ili postoperativno, tj. najmanje 5, specifično najmanje 10, specifično najmanje 15, specifično najmanje 24 sata nakon transplantacije, do 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više dana.
[0071] Specifično, vildagliptin se može davati pojedincu u dozi od 50 do 200 mg dnevno, specifično u dozi 75 do 150 mg dnevno, specifično u dozi oko 100 mg. dnevno.
[0072] Specifično, sitagliptin se može davati pojedincu u dozi od 50 do 200 mg, dnevno, specifično u dozi 75 do 150 mg dnevno specifično u dozi oko 100 mg dnevno
[0073] Specifično, saksagliptin se može davati pojedincu u dozi od 2,5 do 10 mg dnevno, specifično u dozi oko 5mg dnevno.
[0074] Specifično, linagliptin se može davati pojedincu u dozi od oko 2,5 do 10 mg dnevno, specifično oko 5mg dnevno.
[0075] Specifično, alogliptin se može davati pojedincu uu dozi od oko 12,5 do 50 mg dnevno, specifično oko 25mg dnevno.
[0076] U ovom dokumentu prikazane su stimulisane matične ćelije, koje se mogu direktno davati pojedincima i dalje stimulisati usmerenu migraciju i prihvatanje transplantata pomenutih ćelija.
[0077] „Pojedinac" je širok pojam koji podrazumeva bilo koju životinju, posebno sisara, posebno čoveka koji podleže transplantaciji matičnih ćelija prethodno tretiranih prema pronalasku.
[0078] HSC ćelije tretirane vildagliptinom i analogom prostaciklina Treprostinilom mogu se prečistiti pre ponovne implantacije. Međutim, ovi HSC ćelije takođe mogu biti ponovo implantirane bez daljeg prečišćavanja.
[0079] Vremenski period potreban za stimulisanje G alfa signalizacije u pomenutim ćelijama može se meriti prema poznatim postupcima, na primer, korišćenjem cAMP merenja čije brojne varijacije postoje: RIA, fluorescentni rezonantni transfer energije (FRET) sa EPAC (epac1) (Ponsiouen B. et al., EMBO reports, 5, 12, 1176-1180 (2004)), radiohemijske metode itd. Stimulisane ćelije u kojima se javlja G alfa signalizacija mogu se odabrati ili diskriminisati ili izolovati od nestimulisanih ćelija postupcima poznatim u struci kao što je cAMP reporter na bazi FRET tehnike.
[0080] Vremenski period potreban za inhibiranje aktivnosti CD26 peptidaze i efikasan za promenu migracije kao odgovora na SDF-1 u navedenim ćelijama može se meriti prema poznatim metodama, na primer fluorometrijskim određivanjem degradacije Ala-Pro-7-amidotrifluorometilkumarina. Alternativno, inhibicija degradacije prirodnih supstrata kao što su CXCL12 ili GLP-1 može se pratiti pomoću HPLC ili ELISA metode.
[0081] U jednom aspektu, vreme inkubacije navedenih ćelija je oko 30min do 24h, poželjno oko 1h i 12h, poželjno oko 1h do 4h.
[0082] Prema sledećem aspektu, vreme in vitro inkubacije za pretretman HSC ćelija prostaciklinskim analogom i cAMP aktivatorom je najmanje 10 minuta, specifično najmanje 20 minuta, najmanje 30 minuta, najmanje 40 minuta, najmanje 50 minuta, najmanje 60 minuta.
[0083] Prema daljem aspektu, najmanje 1 x 10<5>donorskih ćelija/ml se inkubira sa analogom prostaciklina i cAMP aktivatorom na oko 37°C.
[0084] Put koji zavisi od cAMP je suštinski put za promociju prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija. Pokazano je da analog prostaciklina može da pokrene povećanje cAMP u hematopoetskim matičnim ćelijama. To se postiže aktivacijom više receptora, tj. IP- i EP-receptora, što dovodi do povećane G-alfa signalizacije. Shodno tome, analozi prostaciklina poput treprostinila, iloprosta, cicaprosta ili beraprosta efikasnije podižu nivo cAMP.
[0085] Izraz „hematopoetske matične ćelije“ (HSC ćelije) ili opštiji izraz „matične ćelije“, shvataju se kao ekvivalentni pojmovi u opisu ovog pronalaska i uglavnom se odnose na pluripotentne ili multipotentne „matične ćelije“ koje podstiču stvaranje krvnih ćelija, uključujući mijeloide (npr. monocite i makrofage, neutrofile, bazofile, eozinofile, eritrocitie, megakariocite/trombocite, dendritične ćelije) i limfoidne loze (npr. T-ćelije, B-ćelije, NK-ćelije) i druge ćelije poznate u struci.
1
[0086] „Matične ćelije“ se obično odlikuju svojom sposobnošću da formiraju više tipova ćelija (da su multipotentne) i svojom sposobnošću samoobnavljanja. Međutim, mogu se uključiti i oligopotentne i unipotentne progenitorske ćelije.
[0087] Izraz „progenitorska ćelija“ uključuje biološku ćeliju koja, poput matične ćelije, ima tendenciju da se diferencira u specifičan tip ćelije, ali je već specifičniji od matične ćelije i ima usmeren je da se diferencira u svoju „ciljnu" ćeliju. Progenitorske ćelije su rani potomci matičnih ćelija koje se mogu diferencirati i formirati jednu ili više vrsta ćelija. Najvažnija razlika između matičnih ćelija i progenitorskih ćelija je u tome što se matične ćelije mogu neograničeno replikovati, dok progenitorske ćelije imaju ograničen broj deoba. Većina progenitorskih ćelija je opisana kao oligopotentna i mogu se uporediti sa zrelim matičnim ćelijama. Kaže se da su progenitorske ćelije u daljoj fazi ćelijske diferencijacije. One su u „sredini" između matičnih ćelija i potpuno diferenciranih ćelija. Vrsta potencije koju imaju zavisi od vrste njihove „roditeljske“ matične ćelije i takođe od njihove niše. Progenitor se može kretati kroz telo i migrirati prema tkivu u kome je potreban. Zrele matične ćelije i progenitorske ćelije imaju mnoge zajedničke osobine.
[0088] Progenitorske ćelije se nalaze u odraslim organizmima i deluju kao sistem za obnavljanje tela. One obnavljaju posebne ćelije, ali takođe održavaju krv, kožu i tkivo creva. Takođe se mogu naći u embrionalnom tkivu pankreasa koje je u razvoju.
[0089] „Hematopoeza" se generalno odnosi na proces ćelijske diferencijacije ili formiranja specijalizovanih krvnih zrnaca od HSC ćelije ćelija. Tokom razvoja, hematopoeza se translocira iz jetre fetusa u koštanu srž, koja zatim ostaje mesto hematopoeze tokom odraslog doba. Jednom uspostavljene u koštanoj srži, HSC ćelije se ne distribuiraju nasumično kroz koštanu šupljinu. Umesto toga, HSC ćelije se obično nalaze u neposrednoj blizini površine endosteuma. Broj zrelih matičnih ćelijea se povećava sa povećanjem udaljenosti od površine kosti.
[0090] Hematopoetska tkiva sadrže ćelije sa dugoročnim i kratkoročnim regenerativnim kapacitetom, kao i posvećene multipotentne, oligopotentne i unipotentne progenitorske ćelije.
[0091] Uzorak koji specifično sadrži HSC ćelijemože biti koštana srž.
[0092] HSC ćelije se mogu dobiti poznatim tehnikama iz bilo kog izvora za koji je poznato da sadrži HSC ćelije, posebno iz periferne krvi, pupčane vrpce ili krvi pupčane vrpce, posteljice i koštane srži. Izvori poput jetre fetusa, slezine fetusa, i aorta-gonada-mezonefrosa životinja su takodje mogući kao alternativni izvori. HSC ćelije ljudskog porekla su poželjne za postupke i kompozicije pronalaska.
[0093] Na primer, HSC ćelije se mogu naći u koštanoj srži odraslih, uključujući butne kosti, kuk, rebra, grudnu kost i druge kosti. HSC ćelije se mogu dobiti direktno uklanjanjem iz kuka pomoću igle i šprica ili iz krvi, često nakon predtretmana citokinima, kao što je G-CSF (faktor stimulacije kolonije granulocita), koji aktivira otpuštanje ćelija iz odeljka koštane srži.
[0094] HSC ćelije se mogu identifikovati prema određenim fenotipskim ili genotipskim markerima. Na primer, HSC ćelije mogu biti identifikovane po svojoj maloj veličini, nedostatku markera linije (lin), niskom bojenju (bočna populacija) vitalnim bojama poput rodamina 123 (rho10) ili Hoechst 33342, i prisustvu različitih antigenih markera na njihovoj površini, od kojih mnogi pripadaju klasterima serija diferencijacije (npr. CD5, CD11b, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, GR-1 (=Ly-6G/C), 7-4, Ter-119 i c-kit). HSC ćelije su uglavnom negativne na markere koji se obično koriste za otkrivanje opredeljenja za liniju, i stoga se često nazivaju lin(-) ćelijama. Većina humanih HSC ćelija može se okarakterisati kao CD5<+>, CD45R(B220)+ , CD11+ , GR-1+ , CD34+ , CD59+ , Thyl/CD90+ , CD38lo/~ , C-kit/CD117+ i lin(-). Međutim, nisu sve matićne ćelije obuhvaćene svim kombinacijama, jer su određene HSC ćelije CD347+ i CD38<+>. Takođe neke studije sugerišu da najranijim matičnim ćelijama možda nedostaje c-kit na površini ćelije.
[0095] Za prečišćavanje lin(-) HSC ćelija protočnom citometrijom ili FACS metodom, niz zrelih antitela-markera krvnih loza može se koristiti za iscrpljivanje lin(+) ćelija ili kasnih multipotentnih progenitorskih ćelija (MPP), uključujući, na primer, antitela na CD3ipsilon, CD5, CD45R, CD11b, CD16, GR-1, 7-4 i Ter-119, CD 13, CD32 i CD33, CD71, CD 19, CD61, Mac-1 (CDI Ib/CD18), Gr-I, 117Ra, CD3, CD4, CD5 i CD8, između ostalih poznatih u struci. Dodatne metode prečišćavanja su poznate u struci, na primer metode koje koriste određeni potpis „signalnih molekula aktivacije limfocita" (SLAM), porodice molekula ćelijske površine.
[0096] HSC ćelije, bilo iz krvi pupčane vrpce, iz koštane srži, periferne krvi ili drugog izvora, mogu se uzgajati ili razmnožavati u bilo kom pogodnom, komercijalno dostupnom ili prilagođenom medijumu, sa ili bez seruma. HSC ćelije iz ljudskog izvora su poželjni primeri izvođenja pronalaska. Na primer, u nekim primerima izvođenja, medijum bez seruma može da koristi albumin i/ili transferin. Dalje, citokini mogu biti uključeni, kao što su Flt-3 ligand, faktor matičnih ćelija (SCF) i trombopoetin (TPO), između ostalih. HSC ćelije se takođe mogu uzgajati u sudovima kao što su bioreaktori. Pogodan medijum za ex vivo ekspanziju HSC ćelije može takođe sadržati ćelije koje podstiču HSC ćelije, kao što su stromalne ćelije (npr. limforetikularne stromalne ćelije), koje mogu biti dobijene, na primer, iz razgradnje limfoidnog tkiva i za koje je pokazano da podstiču in vitro, ex vivo, i in vivo održavanje, rast i diferencijaciju HSC ćelija, kao i njihovog potomstva.
[0097] "Krv pupčanika" ili "krv iz pupčane vrpce" odnosi se generalno na relativno malu količinu krvi (do oko 180 ml) novorođene bebe koja se vraća u neonatalnu cirkulaciju. Krv iz
1
pupčanika je bogata HSC ćelijama i može se sakupljati i skladištiti za kasniju upotrebu prema postupcima poznatim u struci.
[0098] Izrazi "ex vivo" ili "in vitro" odnose se na aktivnosti koje se odvijaju van organizma, kao što su eksperimenti ili merenja izvršena u ili na živom tkivu u veštačkom okruženju van organizma, po mogućnosti sa minimumom promena prirodnih uslova. U određenim rešenjima, takva tkiva ili ćelije se mogu sakupljati i zamrzavati, a kasnije odmrznuti za ex vivo proceduru. Eksperimenti ili procedure na kulturi tkiva koji traju duže od nekoliko dana, koji koriste žive ćelije ili tkivo se obično smatraju „in vitro“, mada se ovaj izraz može koristiti naizmenično sa ex vivo. Navodi "ex vivo primena", "ex vivo tretman" ili "ex vivo terapijska upotreba", uglavnom se odnose na medicinske postupke u kojima su jedan ili više organa, ćelija ili tkiva dobijeni od živog ili nedavno preminulog subjekta, opciono prečišćeni/obogaćeni, izloženi tretmanu ili proceduri za lečenje matičnih ili rodonačelnih ćelija (npr. korak ex vivo primene koji uključuje inkubaciju ćelija sa kompozicijom iz ovog pronalaska da bi se poboljšale sposobnosti za prihvatanje kalema HSC ćelija), a zatim primenjene kod istog ili različitog pojedinca nakon tog opcionog tretmana ili postupka.
[0099] Količina DPP-IV inhibitora koja se primenjuje kod pojedinca zavisi od karakteristika tog pojedinca, kao što su opšte zdravlje, starost, pol, telesna težina i tolerancija na lekove, kao i stepen, težina i vrsta reakcije na treprostinil i/ili transplantaciju ćelija.
[0100] Pojedinci koji primaju transplantaciju matičnih ćelija mogu imati bilo koje oboljenje koštane srži, na primer bolest u kojoj je normalna arhitektura koštane srži zamenjena malignitetima, srpastu anemiju, mijelodisplastični sindrom, mijeloproliferativne poremećaje, aplastičnu anemiju ili infekcije koje dovode do smanjenja proizvodnje krvi ćelija i krvnih pločica. Navedena bolest koštane srži može biti i leukemija, poremećaj krvnih zrnaca ili potreba za transplantacijom koštane srži nakon hemoterapije ili tretmana zračenjem.
[0101] Preciznije, defekt krvnih ćelija može biti hemoglobinopatija poput talasemije, poremećaji funkcije neutrofilnih granulocita, poremećaji funkcije eutrofilnih granulocita poremećaj T- i/ili B-limfocita, npr. teška kombinovana imunodeficijencija, Brutonova agamaglobulinemija.
[0102] Primena kod lečenja pojedinaca koji pate od bolesti koštane srži, na primer koji su zbog hemioterapije ili zračenja posledično podvrgnuti transplantaciji hematopoetskih matičnih ćelija, davanjem jednog ili više DPP-IV inhibitora tokom ograničenog vremenskog perioda nakon transplantacije koštane srži obuhvaćen je ovim pronalaskom.
[0103] Najmanje jedan analog prostaciklina zajedno sa jednim ili više cAMP aktivatora za predtretman izolovanih matičnih ćelija i primena jednog ili više DPP-IV inhibitora pacijentima kojima je izvršena transplantacija, mogu se koristiti za poboljšanje prihvatanja kalema humanih HSC ćelije tokom transplantacije koštane srži ili nakon rekonstitucije koštane srži korišćenjem
1
HSC ćelija. Ubrzano prihvatanje kalema skraćuje period u kojem su ispitanici podložni potencijalno smrtonosnim infekcijama, krvarenjima i drugim ozbiljnim komplikacijama. Dakle, analog prostaciklina u kombinaciji sa gliptinom treba da bude korisna terapijska opcija za prethodno tretiranje koštane srži davaoca radi poboljšanja prihvatanja kalema koštane srži (tj. smanjenjem potrebnog broja ćelija i skraćivanjem trajanja aplazije koštane srži).
[0104] Kontinuirano lečenje ispitanika nekoliko dana nakon transplantacije koštane srži inhibitorom DPP-IV rezultira poboljšanim kliničkim ishodom poboljšanjem prihvatanja kalema (tj. smanjenjem broja potrebnih ćelija i skraćivanjem trajanja aplazije koštane srži).
[0105] Dakle, u određenom aspektu, tretman se izvodi najmanje tokom jednog dana, specifično tokom pet dana nakon transplantacije, specifičnije najmanje tokom 10 dana, specifičnije najmanje tokom 14 dana nakon transplantacije.
[0106] DPP-IV inhibitor se može primeniti na subjekat na bilo koji način koji je primenljiv i poznat u struci. Konkretnije, obezbeđuje se enteralna, intravenska ili potkožna primena.
[0107] Intravenska primena je najpoželjniji način primene.
[0108] Međutim, DPP-IV inhibitor može biti i u oralno dostupnom obliku, izabran iz grupe oblika sa modifikovanim oslobađanjem, tableta ili kapsula.
[0109] Ovde je takođe opisan kit sastavljen od delova koji sadržia) količinu najmanje jednog analoga prostaciklina i forskolina u prvom obliku jedinične doze,
b) i količinu najmanje jednog inhibitora DPP-IV odabranog od gliptina,
u obliku dve, tri, četiri ili više odvojene jedinice komponenata a) i b), posebno za upotrebu u lečenju bolesti koštane srži, posebno ako je bolest koštane srži leukemija, poremećaj krvnih zrnaca, bolesti koštane srži izazvane hemioterapijom ili zračenjem.
[0110] Dalje opisano ovde je pakovanje koje sadrži kit zajedno sa uputstvima za upotrebu.
[0111] Prethodni opis će biti potpunije razumljiv pozivajući se na sledeće primere. Takvi primeri su, međutim, samo reprezentativni primeri jedne ili vise primena ovog pronalaska i ne treba ih razumeti kao ograničavanje obima pronalaska.
Primeri:
Primer 1:
In vitro test migracije
[0112] Mišje hematopoetske progenitorske ćelije su prethodno tretirane in vitro kombinacijom 10 μM treprostinila (Trep) i 30 μM forskolina (Fsk) (Sigma Aldrich, Beč, Austrija) ili vehikuluma, tokom 1 h na 37 °C u medijumu za matične ćelije koji sadrži faktor rasta [(StemSpan™ (SFEM) (Stemcell technologies, SAD) (50 ng/ml faktora mišjih matičnih ćelija
1
(SCF), 50 ng/ml tiroidin kinaza-3 liganda sličanog fms-u (Flt3), 50 ng/mL interleukina 11 (IL11) i 150 ng/mL mišjeg interleukina 3 (mIL3)] kupljenog kod PeproTech-a (London, Ujedinjeno Kraljevstvo)). Nakon toga ćelije su isprane i resuspendovane na 2x10<6>ćelija/ml medijuma.
[0113] Suspenzija ćelija (0,1 ml koja sadrži 2x10<5>ćelija) je dodata u gornju komoru Transwell™ posude (prečnika pora 5 μm). Donja komora je praćena medijumom ili medijumom koji sadrži 100 ng/ml mišjeg faktora-1 izvedenog iz stromalnih ćelija (SDF-1 = CXCL12). Ćelijama je migracija bila omogućena u toku 4 sata na 37 °C. Posle toga, broj ćelija izolovanih iz donje komore određen je brojačem ćelija. Broj ćelija koje su migrirale izražen je kao procenat ukupnih ćelija dodatih u gornju komoru.
CD34<+>ćelije dobijene iz krvi ljudskog pupčanika održavane su u medijumu za matične ćelije [X-VIVO™ 15 (Lonza, Švajcarska) dopunjenom sa 50 ng/mL humanog Flt3, 50 ng/mL humanog trombopoetina i 50 ng/mL humanog (SCF), kupljenog kod PeproTech (London, Ujedinjeno Kraljevstvo)]. Test migracije je izveden kako je opisano za mišje ćelije, sa tim izuzetkom što je rekombinantni humani SDF-1 dodat u donju komoru. Prikazani podaci predstavljaju srednje vrednosti ± SEM iz 3 nezavisna eksperimenta izvedena u triplikatu. Statistički značajne razlike odredjene su jednosmernom ANOVA metodom, praćenom Dunnett-ovim višestrukim upoređivanjem (*, p <0,05).
[0114] Podaci su prikazani na slici 1.
Primer 2:
[0115] Inhibicija SDF-1/SXC12-indukovane migracije mišjih hematopoetskih progenitorskih ćelija antagonistom CXCR4, AMD3100, koja je stimulisana u prisustvu treprostinila i forskolina.
[0116] Hematopoetske matične ćelije i progenitorske matične ćelije su prethodno inkubirane sa treprostinilom (10 μM; T) i forskolinom (30 μM; F) tokom 1 sata na 37°C, isprane i resuspendovane do ćelijske gustine od 2x10<6>ćelija/ml. Suspenzija ćelija (2 x 10<5>ćelija/1 ml) dodata je u gornju komoru posude Transwell™, koja je sadržala medijum sa i bez 10 μM CXCR4 antagonista AMD3100 (10 μM). Medijum u donjoj komori sadržao je 100 ng/ml mišjeg SDF-1. Inkubacija je trajala 4h na 37°C; nakon toga ćelije izolovane iz donje komori prebrojane su kako je prikazano u legendi slike 1. Prikazani podaci su srednja vrednost ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta izvedena u tripletu. Statistički značajne razlike su procenjene jednostranom ANOVA metodom praćenom Dunnett-ovim višestrukim upoređivanjem (***, p <0,001).
[0117] CXCR4 antagonist AMD3100 inhibira SDF-1/CKSCL12-indukovanu migraciju mišjih hematopoetskih progenitorskih ćelija koje su stimulisane u prisustvu treprostinila i forskolina.
1
[0118] Podaci su prikazani na slici 2.
Primer 3:
[0119] Vildagliptin pojačava SDF-1/CXCL12-indukovanu migraciju hematopoetskih progenitorskih ćelija, koje su prethodno inkubirane sa treprostinilom i forskolinom.
[0120] Mišje hematopoetske progenitorske ćelije (mHPC; levo polje) i humane CD34<+>ćelije dobijene iz krvi pupčane vrpce (desno polje) prethodno su inkubirane u odsustvu ili prisustvu treprostinila (10 μM; T) i forskolina (30 μM; F) tokom 1 h. Nakon toga, suspenzija ćelija (2x10<5>ćelija u 0,1 ml) dodata je u gornje komore Transwell™ posude koje su sadržale medijum sa ili bez 30 nM vildagliptina (Vil). Medijum koji se nalazio u donjoj komori sadržao je 100 ng/ml mišjeg ili humanog SDF-1, prema potrebi. Inkubacija je trajala 4 sata na 37°C; nakon toga ćelije izolovane iz donje komore su prebrojane kao što je navedeno u legendi na slici 1. Prikazani podaci su srednje vrednosti ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta izvedena u tripletu. Statistički značajne razlike procenjene su jednostranom ANOVA metodom a zatim Dunnett-ovim višestrukim poređenjem (*, p <0,05; **, p <0,01; ***, p <0,001).
[0121] Podaci su prikazani na slici 3.
Primer 4:
In vivo test usmeravanja migracije
[0122] Vildagliptin i treprostinil povećavaju usmeravanje migraciju hematopoetskih progenitorskih ćelija, koje su prethodno inkubirane sa treprostinilom i forskolinom ali su međusobno antagonističke kada se kombinuju in vivo.
[0123] Mišje hematopoetske matične i progenitorske ćelije izolovane su od 6-8 nedelja starih BALB/c miševa davalaca (15 miševa) magnetnim sortiranjem ćelija koristeći antitela specifična za liniju koja su zadržavala ćelije mijeloidne, eritroidne, megakariocitne i limfoidne linije i MACS mikro zrnaca (Milteny Biotec, Bergisch Gladbach, Nemačka) prema uputstvu proizvođača.Sca1<+>, c-Kit<+>ćelije, negativne na liniju (Lin-) su prethodno inkubirane u odsustvu (kontrolni vehkulum = netretirane ćelije) i prisustvu kombinacije treprostinila (10 μM) i forskolina (30 μM) (= tretirane ćelije) tokom 1h.
[0124] Hematopoetske matične progenitorske ćelije (netretirane i tretirane) (1x10<6>ćelija) su naknadno injeciraneinjecirane u repnu venu letalno (9 Gy) ozračenih BALB/c miševa primalaca. Miševi primaoci nisu dobili nikakav dodatni tretman (polja označena „netretirane ćelije“ i „tretirane ćelije“) ili im je ubrizgan treprostinil (3 µg/8 h; polja označena „in vivo trep“), vildagliptin (10 mg/kg/24h; polja sa oznakom „in vivo vil“) ili kombinacija treprostinila i vildagliptina (polja obeležena „in vivo trep vil“) 24 sata pre transplantacije koštane srži.
1
Sposobnost ćelija da migriraju u koštanu srž procenjena je nakon 20h testom formiranja kolonija. Butne kosti i golenjače su isprane PBS-om da bi se sakupile ćelije koštane srži. Crvene krvne ćelije su uklonjene puferom za lizu crvenih krvnih zrnaca (Stemcell tehnologies, SAD). Preostale ćelije su resuspendovane u polučvrstom medijumu na bazi metilceluloze (MethoCult, Stemcell tehnologies SAD). Svako stanje je procenjeno u tri primerka. Dodati su specifični faktori rasta za podršku u formiranju kako jedinica koje formiraju kolonije granulocita-monocita (CFU-GM) tako i jedinica koje formiraju kolonije eritrocita (CFU-E), tj. Eritropoetin 3U/ml, IL310 ng/ml, IL7 10 ng/ml, GM-CSF 10 ng/ml. Kulture su održavane tokom 6 dana na 37°C u vlažnoj atmosferi sa 5% CO2. Nakon toga, broj kolonija se određivao pod mikroskopom. Po definiciji, ove kolonije nastale su iz onih ćelija koje su ubrizgane i migrirale u koštanu srž, jer je endogena koštana srž miševa primaoca uništena zračenjem. Prema tome, kolonije nisu dobijene u koštanoj srži ozračenih miševa kojima nisu injecirane hematopoetske progenitorske ćelije (negativna kontrola).
[0125] Očigledno je da je (i) in vitro preinkubacija sa treprostinilom i forskolinom povećala usmeravanje migracije (uporedi polja označena netretirani i tretirani),
(ii) lečenje miševa primalaca samo sa treprostinilom i/ili vildagliptinom nije promovisalo usmeravanje migracije (uporediti drugo polje „netretirani“ sa poljima od 3 do 5 sa oznakom „+ in vivo trep“, „+ in vivo vil“, „+ in vivo trep vil“),
(iii) lečenje miševa primalaca kojima su ubrizgane tretirane ćelije, bilo treprostinilom ili vildagliptinom promovisalo je usmeravanje migracije (uporediti šesto polje „netretirani“ sa poljima 7 i 8 „+ in vivo trep“, „+ in vivo vil“), ali
(iv) da je kombinacija (poslednje desno polje sa oznakom „+ in vivo trep vil“) bila manje efikasna od bilo koje komponente primenjene samostalno (polja 7 i 8 sa oznakom „+ in vivo trep“, „+ in vivo vil“). Dakle, treprostinil i vildagliptin su antagonisti ukoliko se kombinuju in vivo.
[0126] Vildagliptin i treprostinil povećavaju usmeravanje migracije hematopopoetskih progenitorskih ćelija, koje su prethodno inkubirane sa treprostinilom i forskolinom, ali su međusobno antagonisti kada se kombinuju in vivo. Podaci su prikazani na slici 4.
Primer 5:
In vivo test prihvatanja kalema
[0127] Kombinovana primena treprostinila i vildagliptina kod letalno ozračenih BALB/c miševa primalaca, kojima su ubrizgane hematopoetske progenitorske ćelije prethodno tretirane in vitro
2
kombinacijom treprostinila i forskolina je manje efikasna u poboljšanju preživljavanja ovih miševa od pojedinačne in vivo primene bilo vildagliptina ili treprostinila.
[0128] Hematopoetske progenitorske ćelije izolovane su iz koštane srži miševa davalaca (BALB/c) kako je navedeno u legendi na slici 4. Ćelije su tretirane in vitro sa 10 μM treprostinilom i 30 μM forskolinom ili vehikulumom tokom 1 sata na 37°C. Posle ispiranja, 0,2x10<6>hematopoetskih progenitorskih ćelija negativnih za liniju injecirano je kroz repnu venu u letalno ozračene (9 Gy) BALB/c miševe primaoce (10 po grupi). Ako se prethodno ne tretira in vitro kombinacijom treprostinila i forskolina, ovaj broj hematopoetskih progenitorskih ćelija je premali da bi spasio životinje primaoce. Shodno tome, grupa miševa koja je primila ćelije koje nisu prethodno tretirane, umrla je tokom prve nedelje (crna linija, CTRL). Ograničen broj hematopoetskih matičnih ćelija bio je dovoljan da spase 50% miševa, koji su primili prethodno tretirane ćelije a zatim su tretirani sa treprostinilom (3 μg/8h s.c. tokom 10 dana; crvena kriva obeležena natpisom in vitro prethodno tretirane ćelije in vivo tretman miševa primalaca sa treprostinilom). Najefikasniji režim bilo je injeciranje prethodno tretiranih hematopoetskih progenitorskih ćelija praćeno davanjem vildagliptina (10 mg/24 sata s.c.): svi miševi (tj. 10 od 10) su preživeli (kriva obeležena natpisom in vitro prethodno tretirane ćelije in vivo tretman miševa primalaca vildagliptinom). Nasuprot tome, miševi koji su dobili kombinaciju treprostinila (3mg/8h) i vildagliptina (10 mg/kg/24h) imali su najgori ishod od svih miševa koji su primili prethodno tretirane ćelije: preživela su samo dva od deset miševa (siva linija obeležena natpisom in vitro prethodno tretirane ćelije in vivo tretman miševa primalaca sa kombinacijom treprostinila i vildagliptina). Injekcije lekova (tj. primena treprostinila i/ili vildagliptina potkožnom injekcijom) započete su odmah nakon transplantacije hematopoetskih progenitorskih ćelija i nastavljene tokom 10 dana. Sve krive se međusobno značajno razlikuju (log rank test).
[0129] Kombinovana primena treprostinila i vildagliptina kod letalno ozračenih BALB/c miševa primalaca, kojima su ubrizgane hematopoetske progenitorske ćelije prethodno tretirane in vitro kombinacijom treprostinila i forskolina je manje efikasna u poboljšanju preživljavanja ovih miševa od pojedinačne in vivo primene, bilo vildagliptina ili treprostinila. Podaci su prikazani na slici 5.
Primer 6:
[0130] Istražili smo uslove pod kojima je dejstvo treprostinila i forskolina dalje pojačano. Ovo je bilo zasnovano na zapažanju da je delovanje kombinacije treprostinila i forskolina posredovano, bar delimično, indukcijom CXCR4-receptora (tj. receptora za hemokinski faktor-1 dobijen iz stromalnih ćelija = SDF-1 = CXCL12). Dodatno, uporedili smo efekat dimetil-PGE2 and treprostinila na akumulaciju cAMP-a u humanim HSPC ćelijama.
Materijali i metode
Izolacija mišjih i humanih hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija
[0131] Deset miševa (C57BL/6 ili Balb/C) je žrtvovano cervikalnom dislokacijom. Sa dugih kostiju zadnjih udova (tj. butne kosti i gležnjače) otklonjeni su mišići i vezivno tkivo i isprani RPMI medijumom pomoću šprica i 271⁄2 G igle. Iz ćelijske suspenzije je otklonjeno vidljivo vezivno tkivo, i ona je skupljena i prebačena u epruvete za centrifugu. Ćelije su sakupljene centrifugiranjem (1200 obrtaja po minuti~ 100 g tokom 5 minuta) i resuspendovane u 3 ml pufera za lizu eritrocita (0,15 M NH4Cl, 10 μM KHCO3, 0,1 mM EDTA, pH je podešen na 7,2 do 7,4). Suspenzija ćelija je inkubirana 2 min na 20°C a zatim 4 min na ledu. Posle toga, dodat je RPMI (10 ml) i ćelije su sakupljene centrifugiranjem i prebrojane. Tipičan prinos ćelija bio je 3*107 po mišu.
[0132] Ćelije su resuspendovane u ledeno hladnom PBS-u (fosfatom puferovan fiziološki rastvor) koji sadrži 2% FCS (fetalni teleći serum) pri gustini ćelija od 2,5*10<8>ćelija/ml na koju koktel biotiniliranih antitela ("Lineage Cell Depletion Kit" od Miltenyi Biotec) koja sadrže linijski specifična antitela usmerena protiv CD5, CD45R (B220), CD11b, GR-1 (= Ly-6G/C), 7-4 i Ter-119 u odnosu 0,1 ml rastvora antitela na 10<8>ćelija. Ćelije su inkubirane 20 minuta na ledu sa antitelima i peletirane centrifugiranjem. Posle resuspendovanja (3,3*10<8>ćelija/ml), druge MicroBeads perle obložene anti-biotinom (0,2 mL/10<8>ćelija, koji su dobili („Lineage Cell Depletion Kit“ Miltenyi Biotec), dodate su u ćelijsku suspenziju i smeša je inkubirana 15 minuta na ledu. Nakon toga, uzorak je razblažen u MACS-puferu (30 ml), ćelije su sakupljene centrifugiranjem i resuspendovane u 6 ml MACS pufera. Ovom suspenzijom su punjene unapred pripremljen LS kolone, koje sadrže feromagnetne perle obložene plastičnim materijalom kompatibilnim sa ćelijama. Obično su korišćene tri kolone (2 ml suspenzije ćelija/kolona). Protok je sadržao negativne ćelije za markera linije (Lin<->ćelije), dok su ćelije opredeljene linije zadržavane na koloni. Ćelije su peletirane centrifugiranjem i resuspendovan u 2 mL PBS. Tipičan prinos je bio 7 *10<5>lin- ćelija po mišu.
[0133] Ljudske hematopoetske matične i progenitorske ćelije (HSPC ćelije) sakupljene su iz pupčanih vrpci zdravih davaoca. Uzorci krvi iz pupčanika (= 50 ml) prikupljeni su tokom zdravih porođaja, ispunjenog termina CD34<+>ćelije su izolovane upotrebom magnetno aktiviranog ćelijskog sortera (MACS) CD34 kompletom za direktnu izolaciju progenitorskih ćelija (Miltenyi Biotech) i ekspanzirane kao što je opisano (3). Ukratko, pupčana krv je razblažena sa jednakom zapreminom fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS); ova suspenzija (25 ml) je naneta na LimphoPrep™ (gusti medijum dobijen pomoću Nicomed-a koji sadrži smešu natrijum triatoata i polisaharida). Epruvete su centrifugirane u rotoru sa pokretnom lopaticom 30 minuta na 355g. Sloj koji sadrži mononuklearne ćelije je sakupljen, razblažen sa PBS (na 50 ml) i centrifugiran na 400 g tokom 8 minuta da bi se uklonio zaostali LimphoPrep™. Eritrociti su uklonjeni liziranjem u puferu koji sadrži 150 μM NH4Cl, 10 μM KHCO3i 0,1 mM EDTA (pH je podešen na 7,2 do 7,4 sa HCI) tokom 10 minuta na 4°C. Određen je broj mononuklearnih ćelija i podešen na 2*10<8>ćelija/ml u MACS puferu koji je isporučen sa izolacionim kompletom. EasySep® pozitivan izbor koktel je dodat (0,1 ml/ml ćelijske suspenzije), suspenzija je inkubirana 15 minuta na sobnoj temperaturi i dodate su magnetne nanočestice EasySep® (50 μL/mL). Posle dodatne inkubacije tokom 10 minuta na sobnoj temperaturi, suspenzija ćelija je razblažena do 2,5 ml dodavanjem medijuma. Cev je postavljena u magnet na 5 min i ćelije su naknadno sakupljene. Ovaj korak je ponovljen 5 puta. Obogaćene ćelije su se razmnožavale tokom 6 dana (tj. dva dupliranja populacije) u suspenzijama kultura sa medijumom X-VIVO15 bez seruma (BioWhittaker) sa GlutaMAX-om (2,5 mM; Gibco/Invitrogen) i penicilin/streptomicinom (P/S; po 125 U/mL) i Flt3L, SCF i TPO (svaki po 50 ng/ml). Tipični prinosi su bili 9*10<5>CD34<+>ćelija po uzorku pupčane krvi, koji su umnožavani da bi se dobilo 3,5*10<6>ćelija. Svi postupci su izvedeni u skladu sa smernicama za ovu vrstu studija Odbora instituta Medicinskog univerziteta u Beču. Informisana saglasnost data je u skladu sa Helsinškom deklaracijom o ljudskim pravima.
Protočna citometrija
[0134] Procenjena je čistoća mišjih i lhumanih preparata hematopoetskih matičnih ćelija i progenitorskih ćelija (HSPC ćelije) protočnom citometrijom. Antitela koja se koriste za bojenje markera na ćelijskoj površini bila su iz sledećih izvora: antitela iz panela miševe potiču iz Becton Dickinson Biosciences (BD 559971, sadrže biotinilirane anti-CD3e, anti-CD11b, anti-CD45R, anti-Ly6G/Ly6c, anti-Ter-119), afinitetno-prečišćene pacovske anti-mišje CD16/CD32 (mišji blok Fcy II/III, BD 553142) i fluorescentna boja streptavidin alofikocijanin-Cy7 (streptavidin APC-Cy7, BD554063) takođe su bile iz Becton Dickinson Biosciences. Fikoeritrin (PE)-Cy7-obeleženi anti-mišji LyA/E (= antigen matičnih ćelija-1 = Sca1) PE-Cy7 (kataloški br.25-5981-82) i PE-Cy5 anti-mišje CD117 (c-Kit) (kataloški br.15-1171-81) bili su iz eBiosciences.
[0135] Neposredno nakon MACS, pozitivne (Lin+) i negativne (Lin-) ćelije 1*10<6>loze prenete su u FACS (sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom) epruvete i čuvane na ledu u 50 ml PBS. U međuvremenu, sledeća antitela pogodna za FACS su razblažena (1:50) i pomešana u PBS: pročišćeni anti CD16/CD32 (da blokiraju Fc-receptore), biotinilirani anti-CD3e, biotinilirani anti-CD11b, biotinilirani anti-CD45R, biotinilirani anti-Li-6G/Li-6C i biotinilirani anti-Ter-119, streptavidin-obeleženi APC-Ci7, PE-Ci7-obeleženi anti-Sca-1, PE-Ci5-obeleženi anti-c-kit.50ml ove glavne mešavine je dodato svakom uzorku, a zatim promešano laganim vorteksiranjem i
2
inkubirano na 4°C u mraku, tokom 15 minuta. Nakon toga, ćelije su sakupljene centrifugiranjem, isprane u 2 ml PBS-a i resuspendovane u PBS-u. Uzorci su analizirani u FACS Canto II (Becton Dickinson). Postupak „gating“-a bio je sledeći: kapije za žive ćelije postavljene su snimanjem rasejanja napred i u stranu. Žive ćelije su dalje diskriminisane na osnovu ekspresije linijskih markera (tj. CD11b, CD45R, Ly-6G/Ly-6C, Ter-119). To je omogućilo definisanje kapija za Lin-ćelije, koje su dalje analizirane na ekspresiju Sca-1 i c-Kit.
[0136] Protočna citometrija je takođe korišćena za praćenje ekspresije CXCR4 i CD26/DPPIV (dipeptidilpeptidaza-IV) od strane HSPC-a. Ekspresija CXCR4 i CD26/DPPIV merena je nakon tretmana sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina tokom 2h, 4h i 6h. Posle inkubacije, humane CD34<+>ćelije su isprane i obojene antitelima (eBioscience) na CXCR4 i CD26 u skladu sa uputstvima proizvođača i kvantifikovane FACS analizom. Tri nezavisna eksperimenta su izvedena odvojeno, a zatim su određene srednje vrednosti za statističku analizu. Podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM, a poređenja su izvršena korišćenjem jednosmerne ANOVA metode.
[3H] test akumulacije cAMP-a
[0137] Ljudske hematopoetske CD34 matične i progenitorske ćelije (HSPC, 4*10<5>/ml) su prvo prethodno inkubirane 16 sati u odsustvu prisustva 100 ng/ml pertusis toksina (Sigma Aldrich) u medijumu X-VIVO15 dopunjenom faktorima rasta praćenim metaboličkim obeležavanjem bazena adenin nukleotida tokom dodatnih 4 sata perioda inkubacije u [3H] adeninu (Perkin Elmer, 1 mCi/mL) u X-VIVO15 medijumu dopunjenom faktorima rasta i 10 mg/mL adenozin deaminaze (Roche). Posle toga, ćelije su izazivane sa 1 ili 10 μM treprostinila, 1 ili 10 μM dimetil-PGE2 (dmPGE2), forskolinom (30 μM) ili kombinacijom forskolina i prostanoida tokom 30 min. Ćelije su zatim peletirane (5 min na 100°C, medijum je uklonjen i pelet je liziran u ledeno hladnoj 2,5% perhlornoj kiselini (0,9 ml) koja sadrži 0,1 μM cAMP-a, držanog na ledu 1 h i neutralisanog sa 4,2 M KOH (0,1 ml). ATP i cAMP su odvojeni sekvencijalnom hromatografijom na kolonama koje sadrže Dowek AG50-X8 i neutralnu glinu (3).
Vijabilnost ćelija, raspodela ćelijskog ciklusa i stvaranje kolonija
[0138] Ljudske ili mišje HSPC ćelije inkubirane su u prisustvu vehikuluma ili kombinacije 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina na 37°C tokom 1 h i 24 h. Posle ispiranja PBS-om na 4°C, ćelije su obojene za eksternalizaciju fosfatidilserinom sa PE aneksinom-V kompletom za otkrivanje apoptoze I® prema protokolu proizvođača ili za sadržaj DNK sa PI (50 μg mL<-1>u PBS-u) tokom 40 minuta na 37°C. Podaci dobijeni protočnom citometrijom analizirani su pomoću softvera Facs Diva software®. Formiranje kolonije mišjih HSPC ćelija utvrđeno je na sledeći način: nakon inkubacije od 1 h u prisustvu 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina, ćelije su resuspendovane u MethoCult® sa GM-CSF i IL-3 (10 ng mL-1) za formiranje CFU-GM i 3 U mL-1 EPO i IL-3 za CFU-E i kultivisani na 37°C i 5% CO2 tokom 7-10 dana. Broj kolonija određen je pod svetlosnim mikroskopom.
Analiza migracije
[0139] Hematopoetske matične i progenitorske ćelije negativne na mišju liniju (HSPC ćelije) iz koštane srži BALB/c miševa davalaca i humane CD34<+>HSPC ćelije izolovane iz krvi pupčane vrpce stimulisane su kombinacijom od 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina tokom 1 sata bilo u medijumu mišjih matičnih ćelija (SFEM™; 50 ng mL<-1>svakog faktora rasta; SCF, Flt3, IL11 i 150 ng mL-<1>IL3) ili medijumu humanih matičnih ćelija (X-VIVO ™ 15, 50 ng mL<-1>svakog TPO, FL3, i SCF). Posle ispiranja, ćelijska suspenzija (2 x 106 ćelija u 0,1 ml) stavljena je u gornju komoru Transwell™-a (prečnika 6,5 mm, veličine pora 3 mm). Donja komora je napunjena sa 300 μl medijuma koji sadrži faktore rasta i 100 ng ml-1 SDF-1. Gde je naznačeno, i gornja i donja komora su dopunjene sa 30 nM vildagliptina. Hemotaksa prema SDF-1 je određena nakon 4 sata inkubacije na 37°C. HSPC, koje su migrirale u donju komoru su prebrojane u brojaču ćelija. Analize su rađene u tripletu.
Test usmerene migracije
[0140] HSPC ćelije negativne za liniju su izolovane iz celih ćelija koštane srži miševa davalaca B6.SJL-PtrcAPep3B/Boyl (CD45.1<+>) koristeći MACS mikro kuglice (vidi gore). Ćelije su in vitro tretirane sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina ili kontrole vehikuluma tokom 1 sata na 37°C. Posle ispiranja, 0,2x106 CD 45.1<+>ćelija negativnih za liniju je injecirano u letalno ozračene (10 Gy) C57BI/6 (CD45.2<+>) miševe primaoce. Miševi primaoci su takođe lečeni in vivo sa treprostinilom (0,15 mg kg 8 h-1), vildagliptinom (10 mg kg-1) ili sa kombinacijom oba leka potkožnom primenom. Kontrolnim miševima je injecirana ista količina vehikuluma. Izolovane su cele ćelije koštane srži miševa primaoca 16 h nakon transplantacije. Posle lize crvenih krvnih zrnaca, ćelije su markerima obojene za CD45.1 i CD45.2. Odnos CD45.1<+>i CD45.2<+>ćelija u koštanoj srži određen je protočnom citometrijom.
Transplantacija koštane srži
[0141] Izogeni miševi primaoci (C57BL/6 ili BALB/c) bili su podvrgnuti letalnom zračenju. Ako nisu spašeni intravenskom primenom hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija (HSPC ćelija), ovi miševi su umrli u prve dve nedelje. Lin<->(Sca1<+>i c-Kit<+>) HSPC ćelije su pripremljene
2
kako je gore navedeno i prethodno su tretirane ex vivo u odsustvu i prisustvu kombinacije 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina.
[0142] (FSK) 1 h na 37°C. Nakon toga, ćelije (1 - 5*10<5>po mišu) su injecirane u repnu venu. Broj belih krvnih zrnaca je određen FACS metodom, uzorci krvi su sakupljani svakih 3 do 5 dana počev od 9. dana (gde je broj krvnih ćelija bio~1 G/L. U nekim slučajevima, miševi (25 -30 g) su takođe tretirani sa (i) treprostinilom (0,15 mg kg 8 h<-1>) i vildagliptinom (10 mg kg<-1>12 h-1) ili kombinacijom oba, primenjenih potkožpotkožno svakih 8 h tokom 10 dana.
Izolacija RNK iz hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija i lančana polimeraza reakcija
[0143] RNK je izolovana iz mišjih humanih hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija (3*10<6>ćelija), iz mešanih kultura (tj. neuronskih i glija ćelija) pripremljenih od kore velikog mozga miševa, od ćelijske linije humanog karcinoma prostate PC3 i ćelijske linije karcinoma debelog creva HCT116 (kao pozitivnih kontrola) upotrebom 2 ml reagensa Trizol® (Invitrogen). Homogenizovani uzorci su inkubirani 5 minuta na sobnoj temperaturi da bi se omogućilo potpuno odvajanje nukleoproteinskih kompleksa. Hloroform (0,4 ml) je dodat ćelijskom lizatu i epruveta je snažno mućkana rukom tokom 15 sekundi. Posle 3 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi, uzorak je centrifugiran na 12.000 g tokom 15 minuta na 4°C. Nakon centrifugiranja, smeša je razdvojena u donju crvenu, fenolhloroformsku fazu, interfazu i bezbojnu gornju vodenu fazu. Vodena faza (RNK) je premeštena u svežu epruvetu i RNK je istaložena mešanjem sa 1 ml izopropil alkohola. Posle inkubacije na sobnoj temperaturi tokom 10 minuta, uzorak je centrifugiran na 12000 g tokom 10 minuta na 4°C. Supernatant je uklonjen i želatinozni RNK pelet je jednom ispran sa 2 ml 75% etanola. Uzorak je promešan vorteksom i centrifugiran na 7.500 g tokom 5 minuta na 4°C. RNK pelet je osušen na vazduhu 10 minuta i rastvoren u 80 ml (visoko prečišćene) vode propuštanjem rastvora nekoliko puta kroz vrh pipete i inkubacijom 10 minuta na 5°C (čuva se na -20°C).
[0144] RNK (1 μg) je reverzno transkribovana u cDNK pomoću RevertAid™ H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit-a (Fermentas) u prisustvu 1 μl oligo (dT) 18 prajmera, 4 μl 5x reakcionog pufera, 1 μl RiboLockTM inhibitora RNaze (20u/μl), 2 μl 10mM dNTP smeše, 1 μl RevertAidTM H Minus M-MuLV reverzne transkriptaze (200u/μl) i prečišćene vode dodate do ukupne zapremine od 12 μl tokom 60 minuta na 42°C, nakon čega sledi inkubacija tokom 5 minuta na 70°C.
[0145] Amplifikacija lančanom polimeraznom reakcijom (PCR) fragmenata receptora humanog prostaglandina i CXCR4 izvedena je sa 1 μl cDNK, 1 μl 10 μM dNTP, 1 μl uzvodnoog prajmera [10 μM], 1 ml reverznog prajmera [10 μM], 4 μl GoTaq® pufera [5x], 0,2 μl GoTaq® polimeraze i dodatkom prečišćene vode do ukupne zapremine od 20 μl (11,8 μl ). Smeša se prvo
2
inkubirala na 95°C tokom 5 minuta, a zatim je usledilo 40 ciklusa (45s denaturacija na 95°C, 30 s anilinga na 57°C, elongacija 45s na 72°C) i konačna elongacija5 minuta na 72°C. PCR proizvodi su odvojeni na 2% agaroznim gelovima.
Tabela 1. Prajmeri koji su korišćeni (uzvodni i reverzni)
Rezultati:
Akumulacija cAMP-a u humanim hematopoetskim matičnim i progenitorskim ćelijama izazvana treprostinilom i dmPGE2
[0146] Posle metaboličkog obeležavanja sa [3H]adeninom, humane HSPC ćelije su stimulisane treprostinilom (Trep, 10 μM), dmPGE2 (10 μM) ili forskolinom (Fsk, 30 μM), kombinacijom treprostinila (10 μM) ili dmPGE2 (10 μM) sa forskolinom (30 μM) kako je navedeno u odeljku
2
"materijali i metode". Tamo gde je naznačeno, HSPC ćelije su prethodno tretirani pertusis toksinom (PTX) 16 sati pre stimulacije. Podaci su iz tri nezavisna eksperimenta izvedena u triplikatu, trake sa greškama su označavaju s.e.m. u prisustvu 30 μM forskolina, 10 μM treprostinila je bilo efikasnije od 10 μM dmPGE2 (P = 0,03; Wilcoxon-ov test). Ova razlika je ukinuta predtretmanom pertusis toksinom (nz, nije značajna). Podaci su prikazani na slici 7.
[0147] Grupacija adeninskih nukleotida humanih CD34<+>hematopoetskih matičnih i progenitorskih ćelija (HSPC) bila je metabolički obeležena sa [3H]adeninom i ispitan je njen odgovor na treprostinil i dimetil-PGE2 (dmPGE2) u prisustvu i odsustvu 30 μM forskolina. Sa slike 7 je vidljivo da je treprostinil bio znatno efikasniji nego dmPGE2, bez obzira na to da li su ćelije stimulisane u odsustvu ili prisustvu forskolina. Ovaj diterpen se vezuje za pseudosupstrat između katalitičkih C1 i C2 domena adenilat-ciklaze i čini različite izoforme enzima reaktivnijim na stimulativni G protein Gas (5-7). Niža efikasnost dmPGE2 može biti racionalizovana uzimajući u obzir da je dmPGE2 takođe potpuni agonist na Gi-vezani EP3 receptor (8,9) i samim tim uzrokuje i Gs-zavisnu stimulaciju adenilat-ciklaze preko EP2 i EP4 receptora i istovremenu inhibiciju preko Gi-vezanog EP3-receptora. Pertusis toksin poništava interakciju Gi-vezanih receptora sa Gi(i srodnim G proteinima kao što su Goi Gt) ADP-ribozilacijom ostatka cisteina, četiri aminokiseline uklonjene sa C-kraja Gαi-subjedinica. Shodno tome, HSPC ćelije su prethodno inkubirane tokom 16 sati u prisustvu pertusis toksina. Ovaj predtretman je povećao odgovor na dmPGE2 (up. 6. i 9. polje na slici 7) tako da nije bilo značajne razlike između odgovora cAMP-a izazvanog kombinacijom treprostinil forskolin i odgovora izazvanog kombinacijom dmPGE2 forskolin (up.8. i 9. polje na slici 7). Ovo potvrđuje da postoji velika razlika u delovanju dmPGE2 i treprostinila na humane HSPC ćelije: dmPGE2 stimuliše Gi-vezani receptor, a treprostinil ne.
Predtretman HSPC ćelija sa treprostinilom i forskolinom ne menja vijabilnost ćelija, napredovanje ćelijskog ciklusa ili potencijal diferencije.
[0148] Perzistentno povišenje cAMP-a može pokrenuti apoptozu u hematopoetskim ćelijama (10). Poboljšano prihvatanje kalema HSC ćelije-a tretiranih sa dmPGE2 pripisano je efektima na opstanak ćelija, proliferaciju i usmeravanje migracije (11). treprostinil i dmPGE2 razlikuju se u sposobnosti regrutovanja G proteina: regrutovanje Giizazvano dmPE2 može biti od posebnog značaja, jer signalizacija preko Gimože dovesti do aktivacije lipidne kinaze PI3-kinaze i nizvodne kinaze AKT, koja stimuliše proliferacija i preživljavanje ćelija (12,13). Stoga smo ispitali da li je in vitro tretman humanih HSPC sa kombinacijom od 30 μM forskolina i 10 μM.
[0149] Predtretman mišjih i humanih HSPC treprostinilom i forskolinom ne indukuje apoptozu niti menja progresiju ili potencijal diferencijacije ćelijskog ciklusa. Humane HSPC ćelije su
2
inkubirane sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina tokom 1h. Potom su indukcija apoptoze (A, B) i napredovanje ćelijskog ciklusa C, D) procenjeni protočnom citometrijom. Prikazane su reprezentativne originalne slike (A, C, levo polje) i sumirani su podaci dobijeni u tri nezavisna eksperimenta (B, D, desni panel). Nije uočena razlika između netretiranih i tretiranih ćelija (jednosmernom ANOVA metodom) (E, F) u apoptotskim ćelijama ili distribuciji ćelija prema G0/1, S i G2 fazi. Mišje HSPC su izolovane iz koštane srži, prethodno tretirane i resuspendovane u medijumu metilceluloze sa faktorima rasta potrebnim za podržavanje diferencijacije i rasta jedinica koje formiraju kolonije granulo-monocita (CFU-GM) i iz linije eritrocita (BFU-E). Posle 10 dana, broj kolonija je izbrojan pod svetlo snim mikroskopom i posmatrani su oblik i izgled kolonija. Prikazane su reprezentativne fotomikrografije i kvantifikacija tri nezavisna eksperimenta. Podaci su srednje vrednosti ± SEM (n = 3).
(podaci su prikazani na slici 8).
[0150] Treprostinil je učinio ćelije podložnijim apoptozi (slike 8A i B) ili im je ometao ulazak i napredovanje u toku ćelijskog ciklusa (slika 8C & D) ili menjao sposobnost mišjih HSPC-a da daju specifične loze (slika 8E & F). Kao što je ilustrovano originalnim grafičkim prikazima tačaka (slika 8A) i sumirano na slici 8B, prisustvo održivih ranih apoptotičnih i mrtvih ćelija je bilo uporedivo i broj aneksin-V pozitivnih ćelija nije povećan tokom in vitro tretmana sa 30 μM forskolina i 10 μM treprostinila. Slično tome, distribucija ćelijskog ciklusa netretiranih humanih HSPC asinhronog rasta i HSPC održavanih u prisustvu treprostinila i forskolina bili su uporedivi, bez obzira da li su HSPC bile izložene 1 h ili 24 h (up. sl. 8C za reprezentativne originalne histograme i sl.8D za prosečne podatke). Važno je i to što nismo uspeli da otkrijemo bilo kakav efekat treprostinila i forskolina na stvaranje mieloida i eritroida kolonija: mišji HSPC su izolovani iz koštane srži, inkubirani 1 sat u prisustvu treprostinila i forskolina i resuspendovani u medijumu koji sadrži metilcelulozu sa faktorima rasta potrebnim za podršku diferencijacije i rasta jedinica koje formiraju koloniju CFU-GM i BFU-E. Nakon 10 dana, izgled (slika 8E) i broj kolonija je bio uporediv (slika 8F).
Treprostinil stimuliše migraciju humanih i mišjih HSPC ćelija prema SDF-1/CXCL-12.
[0151] Kao što je gore pomenuto, poboljšano prihvatanje kalema HSC ćelije-a tretiranih dmPGE2 pripisano je efektima na preživljavanje ćelija, proliferaciju i migraciju (10). U našim eksperimentalnim uslovima, in vitro tretman mišjih i humanih HSPC sa treprostinilom i forskolinom je poboljšao rekonstituciju koštane srži (videti nastavak i Sliku 13), ali nisu promenili održivost ćelija ili napredovanje ćelijskog ciklusa in vitro (up. sliku 8).
2
[0152] Osovina SDF-1/CXCR4 igra glavnu ulogu u usmeravanju HSC ćelijeP u prostor koštane srži. Tako smo pretpostavili da je blagotvorno delovanje treprostinila proizašlo iz pojačanog prihvatanja kalema HSPC ćelija putem SDF-1/CXCR4 posredovanog efekta.
[0153] Sledeći podaci su prikazani na slici 9: In vitro predtretman sa treprostinilom i forskolinom pojačava ekspresiju CXCR4 (A i B) i CD26/DPPIV (B). (A) RNK je izolovana iz humanih HSPC ćelija, koje su inkubirane u odsustvu (netretirane) ili prisustvu kombinacije 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina (Trep Fsk) tokom 1 h. RNK pripremljen iz humane PC3 ćelijske linije služio je kao pozitivna kontrola. Nakon reverzne transkripcije, amplifikacija zavisna od PCR-a je postignuta pomoću prajmera navedenih u Tabeli 1. Amplikoni za CXCR4 su elektroforetski rastvoreni na agaroznom gel i vizuelizovani bojenjem etidijum bromidom. mRNK koja kodira β-aktin je amplifikovana kao unutrašnja kontrola. Predstavljeni su podaci iz dva dodatna eksperimenta sa sličnim rezultatima. (B, C) Humane CD34 ćelije (B) i mHSPC ćelije su bile inkubirane sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina ili sa kontrolama vehikuluma (netretirane) tokom 2 h, 4 h i 6 h. Posle toga, uzorci su analizirani na ekspresiju CXCR4 (B) i CD26 (FiC) pomoću FACS. Prikazan je procenat pozitivnih ćelija u ≥ 3 nezavisna eksperimenta (srednja vrednost ± SEM; * P <0,05 u odnosu na netretiranu kontrolu, ANOVA metoda)
[0154] Ova pretpostavka je ispitana na sledeći način: (i) predstimulacija humanih HSPC ćelija sa treprostinilom i forskolinom povećala je mRNK nivoe CXCR4 (slika 9A). Ovo je takođe prevedeno u pojačanu ekspresiju proteina CXCR4 (sl. 9B). Zanimljivo je da je ovo praćeno i pojačanom regulacijom CD26/DPPIV (dipeptidilpeptidi-IV), enzima koji razgrađuje CXCR4 ligand SDF-1/CXCL12 (prikazan za mišje HSPC na slici 9C). (ii) Povećanje regulacije CXCR4 je rezultiralo pojačanom migracijom humanih (slika 10A) i mišjih HSPC prema SDF-1 (slika 10B), respektivno.(iii) Ova usmerena migracija bila je specifična, jer ju je blokirao selektivni CXCR4-antagonist pleriksafor/AMD3100 (Slika 10C). Isto tako, bazalna migracija (tj. nasumična migracija u odsustvu SDF-1) nije pojačana prethodnim tretiranjem HSPC sa treprostinilom i forskolinom (up. prvo i treće polje na slici 10A i B).
[0155] Slika 10 prikazuje sledeće podatke: in vitro predtretman sa treprostinilom i forskolinom pojačava delovanje SDF-1 preko CXCR4. Sveže izolovane mišje i humane HPSC ćelije su prethodno tretirane in vitro bilo vehikulumom (nešrafirani stubići) ili sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina (Trep Fsk, šrafirani stubići) tokom 1 h na 37°C, praćeno koracima ispiranja. Suspenzija (2*10<5>ćelija u 0,1 ml podloge koja sadrži faktore rasta) humanih (A) ili mišjih HSPC (B, C) je dodata u gornju Transwell™ komoru i ostavljena da migrira prema SDF-1 (100 ng/mL u donjoj komori) tokom 4 sata. Ćelije koji su migrirale kroz 5-mikrometarski filter su prebrojane. HSPC ćelije su takođe inkubirane u odsustvu i prisustvu 10 μM AMD3100 (C). Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SEM iz tri nezavisna eksperimenta izvedena u tripletu.
Statističko poređenje je izvršieno ANOVA metodom praćenom Tukejevim višestrukim upoređivanjem. (*, P <0,05; **, P <0,01; *** P <0,001).
Blokada CXCR4 otupljuje pozitivan efekat treprostinila na transplantaciju koštane srži.
[0156] Antagonizam od strane AMD3100 rekapituliran je in vivo: koštana srž letalno ozračenih miševa primalaca je rekonstituisana sa mišjim HSPC tretiranim treprostinilom i forskolinom a miševima je zatim potkožno data optimalna doza treprostinila tokom 10 dana. Istovremena primena sa AMD3100 (3,3 mg kg-18h-1) otupila su pozitivno delovanje treprostinila tako da su svi miševi primaoci na kraju podlegli neuspehu (slika 11). Dakle, uzeta zajedno, zapažanja ukazuju na mehaničku vezu između akumulacije cAMP-a izazvane treprostinilom, povećane ekspresije CXCR4 i pojačane signalizacije CXCR4 u HSPC ćelijama tretiranim treprostinilom. Dodatno, dokumentovano je da je delovanje treprostinila zavisno od CXCR4: kada je signalizacija putem CXCR4 bila blokirana, koštana srž nije prihvatila kalem i sve životinje su umrle. Inhibicija CD26/DPPIV vildagliptinom poboljšava migraciju i rekonstituciju koštane srži HPSC ćelijama samo nakon sekvencijalne, ali ne i nakon istovremene primene sa treprostinilom.
[0157] Poznato je da se nekoliko hemokina razgrađuje CD26/DPPIV (dipeptidil peptidaza-IV). Ovo takođe važi i za SDF-1/CXCL12. S obzirom na nalaze da je delovanje treprostinila posredovano, barem delimično, indukcijom CXCR4 i da zavisi od CXCR4. Shodno tome, predviđa se da će pojačano delovanje SDF-1/CXCL12 biti korisno. U ovom kontekstu, vredi uzeti u obzir da je lečenje treprostinilom i forskolinom takođe indukovalo ekspresiju CD26, koja je u osnovi bila neotkrivena u nestimulisanim HSPC ćelijama, ali je otkrivena u više od 10% HSPCS-a, koje su bile stimulisane treprostinilom i forskolinom (slika 9C). Dostupno je nekoliko inhibitora DPP-IV, njihova humana farmakologija je dobro poznata, daju se milionima pacijenata dugi niz godina u lečenju dijabetesa tipa II. Zapravo, velika većina pacijenata dobro podnosi inhibitore DPP-IV bez pojave opasnih neželjenih efekata.
[0158] S obzirom na to da inhibitori DPP-IV mogu biti pogodni za kombinovanje za treprostinilom, istražili smo da li DPP-IV inhibitor vildagliptin pojačava delovanje treprostinila. Ovo je prvo testirano u pristupu koji je merio sposobnost injeciranih HSPC ćelija da uđu u koštanu srž: HSPC ćelije skupljene iz koštane srži CD 45.1<+>miševa davalaca su injecirane u izogene CD45.2 primaoce. Životinje su usmrćene nakon 16 h i količine CD45.1<+>ćelija, koje su preuzete iz njihove koštane srži, kvantifikovane su pomoću FACS.
[0159] Ovi eksperimenti su pokazali da
(i) jedini tretman HSPC-om sa kombinacija treprostinil forskolin in vitro nije bila dovoljna da statistički značajno poboljšana migraciju (up. treće polje i prvo polje na slici 12). Slika 12 pokazuje da je in vivo tretman miševa primalaca pojedinačno vildagliptinom i
1
treprostinilom, ali ne i njihovom kombinacijom povećava migraciju HSPC-a, koji su prethodno inkubirane sa treprostinilom i forskolinom. Mišji HSPC izolovani iz koštane srži miševa davalaca CD 45.1+ prethodno su tretirani ili vehikulumom („netretirane ćelije“) ili sa treprostinilom i forskolinom („tretirane ćelije“) i transplantirane (2*10<5>ćelija po mišu) u letalno ozračene primaoce C57BI/6 (CD45.2<+>) miševe putem injekcije u repnu venu. Miševi primaoci su zatim podeljeni u 7 grupa. U grupama 1 i 2 bili su samo miševi sa netretitanim kontrolnim ćelijama, pored toga miševi iz grupe 2 su tretirani in vivo vildagliptinom (Vil,10 mg kg<-1>dnevno) Miševi raspoređeni u grupu 3 primili su samo ćelije tretirane in vitro, a oni iz grupe 4 bili su dodatno podvrgnuti in vivo treprostinilu (Trep, 0,15 mg kg-1 8h-1). Miševima dodeljenim grupi 5 davana je kombinacija in vivo tretmana sa treprostinilom (0,15 mg kg-18h-1) i AMD3100 (3,3 mg kg-18h<-1>). Miševi iz grupe 5 dobijali su in vivo i treprostinil (0,15 mg kg-18h-1) i vildagliptin (10 mg kg-1 /dan), i na kraju miševi iz grupe 6 su dobijali in vivo vildagliptin. Sposobnost CD45.1<+>ćelija da uđu u koštanu srž procenjena je nakon 16 h FACS analizom koštane srži primalaca. Podaci su izraženi kao srednje vrednosti ± SEM (n = 3). Urađena su statistička poređenja ANOVA metodom, praćenom Tukejevim višestrukim upoređivanjem. Kombinacija in vitro predtretmana in vivo vildagliptina (poslednje polje "+ in vivo (Vil)") je statistički značajanija od svih ostalih (**, p <0,01). Četvrto polje („+ in vivo Trep“) razlikuje se na statistički značajan način od prva tri, petog („+ in vivo (Trep AMD 3100“) i šestog polja („+ in vivo (Trep Vil) ") (*, p <0,05). Ranija zapažanja su pokazala da je in vitro predtretman dmPE2 poboljšao migraciju HSPC (11). Dakle, ovi nalazi ponovo ističu razliku između preinkubacije HSPC u dmPGE2 (11) i u kombinaciji treprostinila i forskolina.
(ii) predtretman HSPC sa kombinacijom treprostinil forskolin in vitro povećao je njihovo usmeravanje migracije u koštanu srž miševa primalaca pod uslovom da su i ovi miševi primaoci tretirani treprostinilom in vivo (up. četvrto polje i treće polje na slici 12).
(iii) pojačano usmeravanje usled sekvencijalnog in vitro tretiranja (sa kombinacijom treprostinil forskolin) praćeno in vivo primenom treprostinila je ukinuto ako su miševi primaoci primili CXCR4 antagonist, AMD3100/pleriksafor (up. četvrto polje i peto polje na slici 12). Ovo zapažanje je u skladu sa prethodno sumiranim nalazima i na sl.9, 10 i 11, što je pokazalo da je delovanje treprostinila uslovljeno indukcijom CXSCR4.
(iv) pojedinačna in vivo primena vildagliptina miševima primaocima, koji su primili netretirane HSPC ćelije, nije poboljšala usmeravanje migracije (uporediti drugo i prvo polje na slici 12).
2
(v) in vivo primena vildagliptina miševima primaocima, koji su primili HSPC prethodno tretirane sa kombinacijom treprostinil forskolin i kojima je treprostinil naknadno davan in vivo, poništilo je efekat usmerenja treprostinila (up. četvrto polje i šestio polje slike 12). (vi) najizraženiji porast usmeravanja migracije primećen je ukoliko su HSPC ćelije prethodno tretirane in vitro sa kombinacijom treprostinila i forskolina i miševima primaocima je primenjen vildagliptin; usmeravanje migracije nakon ovog režima nadmašilo je sve ostale režime, ostali uključujući i injekciju HSPC ćelija tretiranih treprostinilom i forskolinom praćenu primenom treprostinila in vivo (uporediti sedmo i osmo polje na slici 12) ili praćeno davanjem treprostinila i vildagliptina in vivo (up. sedmi polje i šesto polje na slici 12).
Inhibicija CD26/DPPIV vildagliptinom poboljšava rekonstituciju koštane srži HSC ćelijama tretiranim kombinacijom treprostinila i forskolina samo nakon sekvencijalne primene.
[0160] Letalno ozračeni BALB/c miševi su spašeni intravenskom injekcijom 2*10<5>Lin-, c-Kit<+>, Sca1<+>HSPC ćelija. Pod ovim uslovima, broj HSPC ćelija je ograničen tako da sve životinje kojima su ubrizgane netretirane HSPC ćelije umru (puna linija na slici 13). Suprotno tome, 60% životinja je preživelo, ako su HSPC ćelije prethodno tretirane sa kombinacijom treprostinila i forskolina in vitro, a životinjama primaocima je davan treprostinil tokom 10 dana (trouglovi/isprekidane linije na slici 13). Preživljavanje miševa primalaca je povećano na 100%, ako su HSPC ćelije prethodno tretirane sa kombinacijom treprostinila i forskolina in vitro, a životinjama primaocima je davan vildagliptin tokom 10 dana (krugovi/isprekidane linije na slici 13). Međutim, kombinovana primena treprostinila i vildagliptina rezultirala je izraženim međusobni antagonizmom: velika većina primalaca je umrla ako su im ubrizgane HSPC ćelije prethodno tretirane kombinacijom treprostinila i forskolina in vitro, a zatim su im davani treprostinil i vildagliptin (kvadrati/tačkaste linije na slici 13). Ova zapažanja su u skladu sa rezultatima testa usmerene migracije sažetim na slici 13;drugim rečima, dva nezavisna pristupa dokumentovala su međusobni antagonizam treprostinila i vildagliptina, kada se se zajedno primene in vivo, ali sinergizam kada se primenjuje u pravom vremenskom razmaku, tj. in vitro predtretman HSPC ćelija sa treprostinil forskolinom praćen in vivo davanjem vildagliptina miševima primaocima.
Blokada CXCR4 od strane AMD3100/pleriksafora antagonizuje pozitivne efekte vildagliptina na preživljavanje miševa primalaca, ali AMD3100/pleriksafor sam po sebi takođe poboljšava preživljavanje.
[0161] Radna hipoteza koja stoji u osnovi ovog projekta postavlja davanje vildagliptina miševima primaocima, koji su primili HSPC prethodno tretirane kombinacijom forskolin treprostinil, jer je razgradnja SDF-1/CXCL12 inhibirana i na taj način je signalizacija preko povećane regulisanog CKSCR4 pojačana. Ako je to bio slučaj, delovanje vildagliptina bi trebalo da se otupi istovremenom primenom AMD3100/pleriksafora. Eksperiment je izveden na sedam grupa BALB/c miševa primaoca (5 miševa po grupi). Nekoliko ovih grupa su bile interne kontrole, uključene da bi se ranije potvrdilo da su rezultati u skladu sa prethodnim nalazima. Svi miševi su primili HSPC ćelije, koje su prethodno tretirane kombinacijom treprostinila i forskolina in vitro pre injekcije kroz repnu venu. Broj HSPC ćelija je bio ograničen (2*10<5>po mišu kod BALB/c) tako da jedna injekcija prethodno tretiranih HSPC ćelija nije bila dovoljna za spasavanje primalaca. Miševi primaoci, kojima je injeciran vildagliptin su imali najbolje ishode; njihovo preživljavanje je bilo bolje nego u grupi kojoj je davan treprostinil (podaci sa slike 11, videti dole). Pored toga, životinje kojima je data kombinacija treprostinila i vildagliptina imale su loše ishode; samim tim, ova zapažanja su u skladu sa rezultatima prikazanim na slici 13. Preživljavanje primalaca koji su dobili kombinaciju vildagliptina i AMD3100/pleriksafora bila je niža nego kod životinja koje su lečene samo vildagliptinom. Tako se delovanje vildagliptina, barem delimično, može objasniti pojačanom signalizacijom SDF-1/CXCL12 putem CXCR4. Naglašava se da su svi uslovi testirani paralelno, tako da je poređenje legitimno.
Zaključci:
[0162] Glavni nalazi se mogu sažeti na sledeći način:
(i) treprostinil se razlikuje od dmPGE2, jer treprostinil aktivira Gs-vezane prostanoidne receptore u (mišjim i humanim) HSPC ćelijama, dmPGE2 takođe aktivira Gi-vezane EP3 receptore, koji su takođe prisutni na HSPC ćelijama. Prema tome, pojedinačni in vitro tretman treprostinilom (u kombinaciji sa forskolinom) ne poboljšava proliferaciju i preživljavanje HSPC ćelija in vitro (slika 8) niti njihovu migraciju do koštane srži in vivo (slika 11). Ovo se razlikuje od objavljenih podataka za dmPGE2 (11). Usmeravanje migracije je poboljšano samo ako se životinje primaoci kontinuirano leče treprostinilom in vivo (slika 12).
(ii) Delovanje treprostinila je, bar delimično, zavisno od indukcije CXCR4 (slika 9) i rezultujuće poboljšane signalizacije SDF-1/CXCL12 preko CXCR4. To je dokumentovano in vitro pokazujući pojačanu migraciju (hemotaksa) HSPC ćelija prethodno tretiranih kombinacijom treprostinila i forskolina , prema SDF1 (slika 10A, B), blokadom ovog efekta antagonistom CXCR4 AMD3100/pleriksaforom (slika 10C) i in vivo demonstriranjem inhibicije pomoću AMD3100/pleriksafor pojačanog usmeravanja migracije izazvanog
4
treprostinilom (slika 12) i prihvatanja kalema u koštanoj srži/preživljavanje miševa primalaca (slika 11).
(iii) Inhibicija CD26/DPP-IV sama po sebi ne utiče na usmeravanje migracije HSPC ćelija u koštanu srž, ali ima sinergističko dejstvo sa treprostinilom pod uslovom da su HSPC ćelije prvo izložene treprostinilu i forskolinu in vitro, a zatim vildagliptinu in vivo (slika 12). Ako se dva jedinjenja daju istovremeno in vivo, dolazi do međusobnog antagonizma. Ovaj sinergizam i međusobni antagonizam potvrđeni su u nezavisnim eksperimentima, gde je prioritet testiranja bilo prihvatanje kalema HSPC ćelija (radije nego njihovo usmeravanje migracije) tj. sposobnost HSPC ćelija da se ugrade u koštanu srž u letalno ozračenim miševima primaocima i na taj način pomognu njihovo preživljavanje (slika 13).
Slika 13 pokazuje da pojedinačna in vivo primena DPP-IV inhibitora vildagliptina povećava pozitivno dejstvo in vitro tretmana HSPC ćelija treprostinilom i forskolinom na stopu preživljavanja miševa primalaca. Mišje HPSC ćelije izolovane od BALB/c miševa davalaca tretirane su in vitro sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina ili vehikulumom (čvrsta supstanca) tokom 1h na 37°C. Posle ispiranja, 2 x 10<5>ćelija je injecirano je u letalno ozračene (10 Gy) BALB/c miševe primaoce. Grupa miševa, koja je primila HSPC ćelije tretirane vehikulumom, nije dobila nikakav dodatni tretman in vivo i služila je kao kontrola zračenju (puna linija, n = 19): svi su umrli usled otkazivanja koštane srži. Druga grupa miševa (isprekidane linije/trouglovi; n = 20) je primila HSPC ćelije prethodno tretirane sa 10 μM treprostinila i 30 μM forskolina i bila je takođe tretirana in vivo treprostinilom (0,15 mg kg-18h<-1>). Sledeća grupa miševa (tačkaste linije/kvadratići; n = 20), ponovo, je primala in vitro HSPC ćelije prethodno tretirane sa kombinacijom forskolina i treprostinila i dalje je tretirana in vivo i sa treprostinilom 0,15 mg kg-1 8h-1) i vildagliptin (10 mg/kg/24h). Konačno, grupa miševa (isprekidane linije/krugovi; n = 20) primila je in vitro HSPC ćelije pretretirane kombinacijom forskolina i treprostinila i tretirana je in vivo sa vildagliptinom (10 mg kg-1 dnevno). Lečenje in vivo vršeno je potkožnim injekcijama, započeto je neposredno nakon transplantacije i nastavljeno je tokom 10 dana. Krive preživljavanja upoređivane su testom log rank; razlika između tri uslova lečenja je statistički značajna (p <0,01). Ovo iznenađujuće otkriće je teško razumeti, ali ističe važnost sekvence signala: Gszavisni signal koje omogućava treprostinil moraju prethoditi Gi/Gq-zavisnim signalima generisan od SDF-1/CXCL12 -preko CXCR4.
(iv) AMD3100/pleriksafor in vivo antagonizira blagotvorno dejstvo i primene treprostinila i vildagliptina. Ovaj antagonizam treba predvideti, jer treprostinil indukuje CXCR4, a vildagliptin blokira enzim koji razgrađuje SDF-1/CXCL12. Tako obe manipulacije rezultuju pojačanom signalizacijom putem CXCR4, koja je blokirana od strane AMD3100/pleriksafor. Ovo zapažanje naglašava važnost primene pravog redosleda njihove primene HSPC u sekvencijalnom redosledu (vidi gornju tačku (iii)). Dodatno, prethodno smo primetili da je in vivo kriva doza-odgovor za treprostinil bila u obliku zvona, tj. veće doze su bile manje korisne u promociji ugrađivanja ćelija u koštanu srž, od standardne doze koja se koristi u aktuelnim eksperimentima. Ovo je možda zbog prisustva EP4 receptora na ćelijama koje okružuju endostealni prostor čija stimulacija može da se suprotstavi delovanju prostanoida na ugrađivanje HSPC ćelija (15). Isto tako, moguće je da SDF1/CXCL12 takođe učestvuje u složenim procesima u endostealni prostor koji ujedno mogu favorizovati i ometati rekonstituciju koštane srži u zavisnosti od signalnog konteksta.
[0163] Na osnovu ovih nalaza može se zaključiti da
(i) in vitro predtretman HSPC ćelija sa kombinacijom treprostinila i forskolina može se kombinovati sa in vivo primenom treprostinila ili vildagliptina za poboljšanje rekonstitucije koštane srži.
(ii) istovremena primene oba jedinjenja (tj. treprostinil i vildagliptin) rezultira međusobnim antagonizmom i samim tim je od manje vrednosti. Međutim, moze se očekivati da sekvencijalni režim gde se vildagliptin i treprostinil primenjuju naizmenično, može biti koristan.
Reference
[0164]
1. Aronoff DM, Peres CM, Serezani CH, Ballinger MN, Carstens JK, Coleman N, Moore BB, Peebles RS, Faccioli LH, Peters-Golden M (2007) Synthetic prostacyclin analogs differentially regulate macrophage function via distinct analog-receptor binding specificities. J. Immunol. 178:1628-1634.
2. Whittle BJ, Silverstein AM, Mottola DM, Clapp LH (2012) Binding and activity of the prostacyclin receptor (IP) agonists, Treprostinil and iloprost, at human prostanoid receptors: Treprostinil is a potent DP1 and EP2 agonist. Biochem. Pharmacol.84:68-75.
3. Taschner S, Koesters C, Platzer B, JorgI A, Ellmeier W, Benesch T, Strobl H (2007) Down regulation of RXRalpha expression is essential for neutrophil development from granulocyte/monocyte progenitors. Blood 109:971-979.
4. Johnson RA, Alvarez, R, Salomon Y (1994) Determination of adenylyl cyclase catalytic activity using single and double chromatographic procedures. Methods in Enzymology 238:31-56
5. Tesmer JJ, Sunahara RK, Gilman AG, Sprang SR (1997) Crystal structure of the catalytic domains of adenylyl cyclase in a complex with Gsα.GTPγS. Science 278:1907 -1916.
6. Sunahara RK, Dessauer CW, Gilman AG (1996) Complexity and diversity of mammalian adenylyl cyclases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.36:461-480.
7. Kudlacek O, Mitterauer T, Nanoff C, Hohenegger M, Tang WJ, Freissmuth M, Kleuss C (2001) Inhibition of adenylyl and guanylyl cyclase isoforms by the antiviral drug foscarnet. J. Biol. Chem.276:3010-3016
8. Woodward DF, Jones RL and Narumiya S (2011) International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXXIII: classification of prostanoid receptors, updating 15 years of progress. Pharmacol Rev 63:471-538.
9. Kiriyama M, Ushikubi F, Kobayashi T, Hirata M, Sugimoto Y, Narumiya S (1997) Ligand binding specificities of the eight types and subtypes of the mouse prostanoid receptors expressed in Chinese hamster ovary cells. Br. J. Pharmacol. 122:217-224
10. Insel PA, Zhang L, Murray F, Yokouchi H and Zambon AC (2012) Cyclic AMP is both a pro apoptotic and antiapoptotic second messenger. Acta Physiol (Oxf) 204:277-287.
11. Hoggatt J, Singh P, Sampath J and Pelus LM (2009) Prostaglandin E2 enhances hematopoietic stem cell homing, survival, and proliferation. Blood 113:5444-5455.
12. Jia S, Roberts TM, Zhao JJ (2009) Should individual PI3 kinase isoforms be targeted in cancer? Curr Opin Cell Biol.21:199-208.
13. Zhang J, Zou F, Tang J, Zhang Q, Gong Y, Wang Q, Shen Y, Xiong L, Breyer RM, Lazarus M, Funk CD, Yu Y (2013) Cyclooxygenase-2-derived prostaglandin E2 promotes injury-induced vascular neointimal hyperplasia through the E-prostanoid 3 receptor. Circ Res. 113:104-114.
14. Kang Y, Chen BJ, Deoliveira D, Mito J, Chao NJ (2010) Selective enhancement of donor hematopoietic cell engraftment by the CXCR4 antagonist AMD3100 in a mouse transplantation model. PLoS One 28;5(6):e11316.
15. Hoggatt J, Mohammad KS, Singh P, Hoggatt AF, Chitteti BR, Speth JM, Hu P, Poteat BA, Stilger KN, Ferraro F, Silberstein L, Wong FK, Farag SS, Czader M, Milne GL, Breyer RM, Serezani CH, Scadden DT, Guise TA, Srour EF and Pelus LM (2013) Differential stem- and progenitor-cell trafficking by prostaglandin E2. Nature 495:365-369.
<220>
agcgaccatt tggaaagatg 20
4
<211> 20
<213> Veštačka sekvenca
4
4
4

Claims (6)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija koja sadrži vildagliptin, za upotrebu u poboljšanju prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija kod primalaca kojima je izvršena transplantacija navedenim hematopoetskim matičnim ćelijama, naznačena time što
a) pre transplantacije, navedene hematopoetske matične ćelije su prethodno in vitro tretirane treprostinilom, ili njegovim farmaceutski prihvatljivim solima i forskolinom; i
(b) kompozicija se primenjuje u periodu od najmanje jednog dana nakon transplantacije navedenih hematopoetskih matičnih ćelija.
2. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, naznačena time što se vildagliptin dalje primenjuje na najmanje 5, specifično na najmanje 10, specifično najmanje 15, specifično na najmanje 24 sata pre transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
3. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačena time što se vildagliptin primenjuje tokom perioda od najmanje 2, specifično najmanje 3, specifično najmanje 4 dana nakon transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija.
4. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačena time što je primalac pojedinac koji pati od bolesti koštane srži.
5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačena time što je bolest koštane srži leukemija, poremećaj krvnih ćelija, bolest koštane srži izazvana hemioterapijom ili zračenjem.
6. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što je navedeni poremećaj krvnih ćelija hemoglobinopatija, poremećaj funkcije neutrofilnih granulocita ili poremećaj funkcije T- i/ili B-limfocita.
4
RS20210706A 2015-01-27 2016-01-27 Kompozicija za upotrebu u povećanju efikasnosti prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija nakon transplantacije RS61945B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP15152664 2015-01-27
EP16701770.6A EP3250202B1 (en) 2015-01-27 2016-01-27 Composition for use in increasing engraftment efficacy of haematopoetic stem cells after transplantation
PCT/EP2016/051672 WO2016120310A1 (en) 2015-01-27 2016-01-27 Composition for use in increasing engraftment efficacy of haematopoetic stem cells after transplantation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS61945B1 true RS61945B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=52449965

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210706A RS61945B1 (sr) 2015-01-27 2016-01-27 Kompozicija za upotrebu u povećanju efikasnosti prihvatanja kalema hematopoetskih matičnih ćelija nakon transplantacije

Country Status (25)

Country Link
US (1) US10226465B2 (sr)
EP (1) EP3250202B1 (sr)
JP (1) JP6669762B2 (sr)
KR (1) KR102577669B1 (sr)
CN (1) CN107548305A (sr)
AU (1) AU2016212090B2 (sr)
BR (1) BR112017016077A2 (sr)
CA (1) CA2973146C (sr)
CL (1) CL2017001903A1 (sr)
CY (1) CY1124317T1 (sr)
DK (1) DK3250202T3 (sr)
EA (1) EA039149B1 (sr)
ES (1) ES2872698T3 (sr)
HR (1) HRP20210930T1 (sr)
HU (1) HUE054615T2 (sr)
IL (1) IL253389B (sr)
LT (1) LT3250202T (sr)
PL (1) PL3250202T3 (sr)
PT (1) PT3250202T (sr)
RS (1) RS61945B1 (sr)
SG (1) SG11201705812SA (sr)
SI (1) SI3250202T1 (sr)
SM (1) SMT202100465T1 (sr)
UA (1) UA122488C2 (sr)
WO (1) WO2016120310A1 (sr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG11201507515YA (en) 2013-03-15 2015-10-29 Marcus Kare Torleif Larsson Cells, methods and apparatuses for umbilical cord blood collection and isolation of cells
WO2018073615A1 (en) * 2016-10-21 2018-04-26 Longboat Explorers Ab Methods and compositions for generating hematopoietic cells
US11213546B2 (en) 2017-09-07 2022-01-04 Emory University Methods to mobilize tissue resident cells for adoptive t cell therapy
WO2020047236A1 (en) * 2018-08-30 2020-03-05 The Regents Of The University Of California Mobilization and collection of peripheral blood hematopoietic stem cells from deceased donors
EP3647413A1 (en) * 2018-10-31 2020-05-06 Centro de Investigaciones Energéticas, Medioambientales y Tecnológicas O.A., M.P. (CIEMAT) Improvements for performing and facilitating the recovery after hematopoietic stem cell transplantation
US12465878B2 (en) 2019-06-20 2025-11-11 Amniotics Ab Apparatus for filtering amniotic fluid
EP4234019A3 (en) 2019-10-18 2023-09-13 Amniotics AB Processes and apparatuses for obtaining amniotic mesenchymal stem cells from amniotic fluid and cells derived thereof
EP4196260A4 (en) * 2020-08-14 2025-04-30 Navan Technologies, Inc. METHODS AND APPARATUS FOR DELIVERING BIOMOLECULES TO PRIMARY HUMAN HEMATOPOIETIC STEM CELLS USING NANOSTRAWS
US12435308B2 (en) 2020-11-06 2025-10-07 Amniotics Ab Immunomodulation by amniotic fluid mesenchymal stem cells
CN112961827B (zh) * 2021-04-25 2024-04-26 河南省肿瘤医院 佛司可林在t细胞培养中的应用
WO2025172541A1 (en) 2024-02-15 2025-08-21 Aop Orphan Pharmaceuticals Gmbh New composition for improvement of bone marrow reconstitution and peripheral recovery of neutrophil and platelet counts

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040247574A1 (en) * 2003-05-27 2004-12-09 Christopherson Kent W. Methods for enhancing stem cell engraftment during transplantation
CA2623826A1 (en) * 2005-09-30 2007-04-12 Novartis Ag Dpp iv inhibitor for use in the treatment of autoimmune diseases and graft rejection
AU2008210988B2 (en) * 2007-02-01 2012-09-06 Allocure, Inc. Potentiation of stem cell homing and treatment of organ dysfunction or organ failure
WO2009152186A1 (en) * 2008-06-09 2009-12-17 American Stem Cell, Inc. Methods for enhancing cell therapy efficacy including treatment with cd26 peptidase inhibitors
WO2012074676A2 (en) 2010-11-09 2012-06-07 Emory University Glp-1 agonists, dpp-4 inhibitors, compositions, and uses related thereto
US10213464B2 (en) * 2011-01-13 2019-02-26 Scipharm Sarl Method for enhancing engraftment of haematopoetic stem cells
EP2767549A1 (en) * 2013-02-19 2014-08-20 Adienne S.A. Anti-CD26 antibodies and uses thereof
US20140288010A1 (en) * 2013-02-22 2014-09-25 Georgia Regents Research Institute, Inc. Compositions and Methods for Increasing Stem Cell Survival

Also Published As

Publication number Publication date
IL253389B (en) 2021-02-28
KR102577669B1 (ko) 2023-09-12
HUE054615T2 (hu) 2021-09-28
EP3250202B1 (en) 2021-03-10
EA201791703A1 (ru) 2017-11-30
DK3250202T3 (da) 2021-05-31
KR20170106980A (ko) 2017-09-22
HRP20210930T1 (hr) 2021-09-03
JP6669762B2 (ja) 2020-03-18
EP3250202A1 (en) 2017-12-06
ES2872698T3 (es) 2021-11-02
US10226465B2 (en) 2019-03-12
CY1124317T1 (el) 2022-07-22
SG11201705812SA (en) 2017-08-30
WO2016120310A1 (en) 2016-08-04
UA122488C2 (uk) 2020-11-25
CA2973146C (en) 2024-01-09
SMT202100465T1 (it) 2021-09-14
BR112017016077A2 (pt) 2018-04-03
SI3250202T1 (sl) 2021-07-30
PL3250202T3 (pl) 2021-08-30
CN107548305A (zh) 2018-01-05
CA2973146A1 (en) 2016-08-04
EA039149B1 (ru) 2021-12-10
AU2016212090A1 (en) 2017-08-03
LT3250202T (lt) 2021-06-25
IL253389A0 (en) 2017-09-28
CL2017001903A1 (es) 2018-03-23
US20180008606A1 (en) 2018-01-11
AU2016212090B2 (en) 2021-05-20
PT3250202T (pt) 2021-06-17
JP2018505171A (ja) 2018-02-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3250202B1 (en) Composition for use in increasing engraftment efficacy of haematopoetic stem cells after transplantation
EP2094839B1 (en) Expansion of hematopoietic stem cells
KR101950526B1 (ko) 조혈 줄기세포의 생착을 강화하기 위한 방법
JP2022088551A (ja) 増殖造血幹細胞／前駆細胞集団の利用
US20180207202A1 (en) Methods for mobilizing hematopoietic stem cells
HK1241742B (en) Composition for use in increasing engraftment efficacy of haematopoetic stem cells after transplantation
WO2025172541A1 (en) New composition for improvement of bone marrow reconstitution and peripheral recovery of neutrophil and platelet counts
Peled et al. Role of the CXCR4/CXCL12 Axis in Hematopoietic Stem Cell Trafficking
HRP20040135A2 (en) Osteogenic growth oligopeptides as stimulants of hematoiesis
HK1186389A (en) Method for enhancing engraftment of haematopoetic stem cells
HK1186389B (en) Method for enhancing engraftment of haematopoetic stem cells
NZ612450B2 (en) Method for enhancing engraftment of haematopoetic stem cells