RS61993B1

RS61993B1 - Cmv vakcine

Info

Publication number: RS61993B1
Application number: RS20210759A
Authority: RS
Inventors: Klaus Orlinger; Karen Lingnau; Thomas Monath; Farshad Guirakhoo; Gerhard Fuhrmann; Katherine Cohen; Vera Baumgartl-Strasser; Andreas Aspöck; Manuela Kainer; Bernhard Brim; Bettina Kiefmann; Elizabeth Watson; Mario Aistleithner; Katharina Bayer; Elsa Mühlbacher
Original assignee: Hookipa Biotech Gmbh
Priority date: 2013-12-03
Filing date: 2014-12-03
Publication date: 2021-07-30
Also published as: CA2932318C; HK1226440A1; JP2021061848A; CN115058452A; CA2932318A1; US11554169B2; HRP20211015T1; JP2017503482A; JP7001807B2; JP6818551B2; AU2014359276A1; US20160296619A1; CN105980570B; AU2021202541A1; EP3077519A1; DK3077519T3; CN105980570A; US10111945B2; WO2015082570A8; PL3077519T3

Description

Opis

POVEZANA REFERENCA SA SRODNOM PRIJAVOM

[0001] Predmetna prijava zahteva benefit prioriteta od U.S. privremene prijave br.61/911,135 koja je podneta 3 decembra, 2013 i U.S. privremene prijave br. 62/055,699 koja je podneta 26 septembra, 2014.

1. UVOD

[0002] Ponalazak se odnosi na genetski modifikovane arenaviruse pogodne kao vakcine za prevenciju i lečenje infekcija i reaktivacija izazvanih citomegalovirusom. Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutske kompozicije i upotrebu u postupcima za lečenje citomegalovirusne infekcije i reaktivacije. Specifično, ovde su obezbeđene farmaceutske kompozcije, vakcine kao takve, i za upotrebu u postupcima lečenja citomegalovirusne infekcije i reaktivacije.

2. STANJE TEHNIKE

2.1 Medicinska potreba

[0003] Humani citomegalovirus (HCMV) je sveprisutni beta-herpes virus koji obično uzrokuje hroničnu latentnu, asimptomatsku infekciju kod zdravih individua, sa sveukupnom seroprevalencom CMV prilagođenom starosti u razvijenom svetu iznad 50% (Bate et al., Clin. Infect. Dis., 2010, 50(11):1439; La Rosa & Diamond, Future Virol., 2012, 7(3):279). Međutim, kod imunokompromitovanih pacijenata, posebno recipijenata transplantata, pojedinaca inficiranih HIV-om, i kongenitalno inficiranih novorođenčadi, CMV uzrokuje značajan morbiditet i mortalitet i stoga predstavlja važan javni zdravstveni problem.

[0004] Infekcija HCMV je najčešći uzročnik kongenitalne virusne infekcije u razvijenom svetu. Približno 40,000 kongenitalno inficirane dece godišnje je rođeno u Sjedinjenim Državama. Kongenitalna CMV infekcija može da dovede do širokog opsega neurorazvojnih poremećaja, i predstavlja najčešći infektivni uzročnik gubitka sluha kod dece. Veliki javni zdravstveni uticaj HCMV je predstavljen činjenicom da više dece boluje od dugoročnih posledica koje su rezultat kongenitalne infekcije CMV od bilo Daunovog sindroma ili fetalnog alkoholnog sindroma (Cannon et al., BMC Public Health, 2005, 5:70).

[0005] Pored uticaja kao perinatalne infekcije, HCMV je takođe važan uzročnik infektivnih komplikacija kod transplantiranih pacijenata, uzrokujući pneumonitis, hepatitis, gastrointestinalne ulceracije, retinitis i smrt. Iako se danas ovi teški oblici krajnjih bolesti organa mogu sprečiti u većini slučajeva sa skupim, rutinskom korišćenjem preventivne terapije sa antivirusnim lekovima, kasna reaktivacija infekcije CMV i dalje predstavlja problem. Dalje, CMV podstiče indirektne efekte kao što je odbacivanje grafta, ubrzanu aterosklerozu nakon transplantacije srca ili pluća ili imunosupresiju.

[0006] Osim toga, infekcija i/ili reaktivacija CMV su takođe značajno povezani sa mortalitetom kod pacijenata inficiranih HIV-om kao što je kod pacijenata koji su primljeni u jedinice intenzivne nege.

2.2 HCMV imunitet i razvoj vakcine

[0007] Značajan javni zdravstveni uticaj kongentalnog CMV je doveo Medicinski Institut SAD da rangira razvoj vakcine protiv CMV kao glavni prioritet u njihovom nedavnom izveštaju "Vaccines for the 21st Century". Iako napori u razvoju vakcine traju nekoliko decenija; za sad ne postoji dostupna licencirana vakcina za CMV. Pokazalo se da je razvoj efikasne vakcine težak jer još uvek postoje kritične praznine vezane za razumevanje epidemiologije i transmisije CMV.

[0008] CMV retko podstiče razvoj bolesti kod imunokompetentinih domaćina, kod kojih imunitet protiv CMV obezbeđuje određeni nivo zaštite i igra esencijalnu ulogu u održavanju asimptomatske infekcije. Međutim, humani imunski sistem nije sposoban da ukloni infekciju i CMV obično uspostavlja hronične infekcije koje mogu da traju ceo život pored imuniteta domaćina. Suprotno tome, nekontrolisana viremija CMV i životno ugrožavajući simptomi brzo se pojavljuju posle imunosupresije i u nezrelom domaćinu.

[0009] Nekoliko kandidata vakcina zasnovanih na različitim tehnologijama je već ispitivano u kliničkim istraživanjima. Pokazana je parcijalna zaštita vakcinacijom sa i živim-atenuisanim i glikoproteinskim kandidatima vakcine indukovanjem CMV-specifičnih odgovora antitela. Takođe je pokazano da pasivna imunizacija antitelima obezbeđuje određeni stepen zaštite. Međutim, jednom kada se uspostavi latentna infekcija, izgleda da snažna indukcija T ćelija specifičnih za CMV postaje neophodna kako bi se kontrolisala reaktivacija i bolest.

2.3 Antigeni HCMV vakcine

[0010] Nekoliko podataka ukazuju da neutrališuća antitela inhibiraju ulaz CMV u ćelije domaćina i igraju važnu ulogu u prevenciji horizontalne i vertikalne transmisije virusa. Ispitivanja zasnovana na neutralizaciji infekcije fibroblasta definisala su glavni glikoprotein B omotača (gB) kao jednu od dominantnih meta neutrališućih antitela. Inkluzija gB u kandidata humane vakcine protiv CMV je dalje podržana podacima kliničke faze II pokazujući da je podjedinična vakcina zasnovana na gB u kombinaciji sa MF59 adjuvansom u stanju da pruži delimičnu zaštitu kod seronegativnih žena (Pass, J. Clin. Virol., 2009, 46(Suppl 4):S73; Pass et al., N. Eng. J. Med., 2009, 360(12):1191).

[0011] Iako kandidati vakcine zasnovani na rekombinantnom gB podstiču visoke titre neutrališućih antitela sprečavajući infekciju HCMV, drugi antigeni HCMV mogu podstaknuti razvoj visokih titra antitela koja inhibiraju infekciju HCMV kod određenih ćelijskih tipova, kao što su epitelne i endotelne ćelije. Strategija vakcina za efikasnu prevenciju infekcije HCMV će verovatno zavisiti od sposobnosti indukovanja snažnih neutrališućih antitela koja inhibiraju ulazak virusa u različite tipove ćelija. Nedavne studije su pokazale da je pentamerni kompleks obrazovan sa glikoproteinima gH/gL (UL75/UL115), UL128, UL130, i UL131A neophodan za ulaz HCMV u epitelne i endotelne ćelije i da je meta snažnih neutrališućih antitela kod HCMV-seropozitivnih individua (Ryckman et al., J. Virol., 2008, 82(1):60; Wang & Shenk, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2005, 102:18153; Wussow, et al., J. Virol., 2013, 87(3):1322).

[0012] Potencijalni antigen vakcine za indukciju zaštite protiv CMV bolesti posredovane sa citotoksičnim T ćelijama, je protein pp65 tegumenta koji je imunodominantni CD8+ T-ćelijski antigen (Wills et al., J. Virol., 1996, 70(11):7569). Učestalosti pp65-specifičnih CD8+ T-ćelija su povezane sa imunskom kontrolom CMV kod pacijenata koji su imali transplantacije (Pipeling et al., J. Infect. Dis., 2011, 204(11):1663) i adaptivni transfer pp65-specifičnih T ćelija izgleda deluje terapeutski kod recipijenata transplantata hematopojetskih stem ćelija (Peggs et al., Clin Infect Dis 2011, 52(1):49; Einsele et al., Blood, 2002, 99(11):3916; Micklethwaite et al., Blood, 2008, 112(10):3974). Uzeto zajedno, ova otkrića ukazuju da vakcina protiv CMV dizajnirana da spreči CMV bolest kod pacijenata koji su primili transplant zahteva uključivanje pp65.

3. SUŠTINA PRONALASKA

[0013] Predmetni pronalazak obezbeđuje virusni vektor infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija (eng. replication-deficient arenavirus) modifikovan tako da sadrži genom sa sposobnošću umnožavanja i koji eksprimira genetičku informaciju kod inficiranih ćelija, pri čemu je virusni vektor sposoban da proizvede infektivno potomstvo virusa u komplementarnim ćelijama (eng. complementing cells) ali nije sposobno da dalje proizvodi infektivne čestice potomstva kod nekomplementarnih ćelija, pri čemu otvoreni okvir čitanja arenavirusa koji kodira GP protein u S segmentu je deletiran i zamenjen je sa:

a. nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena; ili

b. nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0014] U jednom izvođenju, virusni vektor se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena.

[0015] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 772 do 906 SEQ ID NO: 3.

[0016] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 772 SEQ ID NO: 60, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 773 do 907 SEQ ID NO: 60.

[0017] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, ili SEQ ID NO: 63.

[0018] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0019] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0020] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0021] U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca kodira glikoprotein gB u kome: (i) citoplazmatski domen glikoproteina gB je deletiran; (ii) transmembranski domen glikoproteina gB je deletiran; ili (iii) citoplazmatski domen i transmembranski domen glikoproteina gB su deletirani.

[0022] U jednom izvođenju ovde je obezbeđen pomenuti virusni vektor, u kome je nukleotidna sekvenca nukleotidna sekvenca koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0023] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0024] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0025] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0026] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0027] U jednom izvođenju je virusni vektor iz pronalaska gde:

(i) arenavirus je virus limfocitnog horiomeningitisa;

(ii) genomska informacija koja kodira infektivni, arenavirusni virusni vektor kome nedostaje replikacija je dobijen iz klona 13 soja virusa limfocitnog horiomeningitisa;

(iii) virusni vektor indukuje dugotrajni imunski odgovor protiv antigena citomegalovirusnog (CMV) glikoproteina gB ili proteina pp65 tegumenta kodiranih nukleotidnom sekvencom; ili (iv) virusni vektor je pogodan za zaštitu protiv kongenitalne infekcije CMV-om.

[0028] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji iz prvog virusnog vektora i drugog virusnog vektora, pri čemu pomenuti prvi virusni vektor i pomenuti drugi virusni vektor je virusni vektor prema pronalasku, i gde pomenuti prvi i drugi virusni vektori su različiti.

[0029] U jednom izvođenju, pomenuti prvi virusni vektor sadrži virusni vektor iz pronalaska, i gde pomenuti drugi virusni vektor sadrži virusni vektor iz pronalaska.

[0030] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku ili imunogenu kompoziciju ili vakcinu koja se sastoji iz virusnog vektora iz pronalaska, ili kompoziciju iz pronalaska, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0031] U jednom izvođenju, vakcina sadrži gB protein humanog citomegalovirusa (HCMV), gde je deletiran citoplazmatski domen gHCMV, i gde gB protein HCMV gB:

(i) sadrži N-terminalne 772 aminokiseline gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60) ali ne sadrži preostale C-terminalne aminokiseline gB CMV soja Merlin;

(ii) sadrži u suštini N-terminalne 772 aminokiseline gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60);

(iii) sadrži u suštini N-terminalne 772 aminokiseline gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60) praćeno sa Arginin ostatkom na poziciji 773; ili

(iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, bar 99.5% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18.

[0032] U jednom izvođenju, pomenuti virusni vektor, pomenuta kompozicija, pomenuta farmaceutska ili imunogena kompozicija, ili pomenuta vakcina je pogodna za intramuskulano ubrizgavanje injekcijom.

[0033] Pronalazak obezbeđuje virusni vektor, ili kompoziciju, ili farmaceutsku ili imunogenu kompoziciju iz pronalaska, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije infekcije citomegalovirusom kod pacijenta.

[0034] Pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu, pri čemu nukleinska kiselina kodira arenavirusni S segment genoma u kome otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein u arenavirusnom S segmentu genoma je deletiran i zamenjen sa:

a. nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB, gde glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena; ili

[0035] Pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji se sastoji iz izolovane nukleinske kiseline iz pronalaska.

[0036] Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja se sastoji iz izolovane nukleinske kiseline ili ekspresionog vektora iz pronalaska.

[0037] Pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje infektivnog, arenavirusnog virusnog vektora kome nedostaje replikacija koji obuhvata:

a. transfekciju u ćeliju domaćina nukleinske kiseline ili ekspresionog vektora iz pronalaska; b. održavanje ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za obrazovanje virusa; i

c. sakupljanje infektivnog, arenavirusnog virusnog vektora kome nedostaje replikacija;

pri čemu ćelija domaćina eksprimira otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein.

[0038] Prema pronalasku, ovde obezbeđeni virusni vektor je infektivan, tj., sposoban je za ulazak u ili ubrizgava svoj genetski materijal u ćeliju domaćina. U određenim specifičnijim izvođenjima, virusni vektor kao što je ovde obezbeđen je infektivan, tj., sposoban je za ulaz u ili ubrizgava svoj genetski materijal u ćeliju domaćina nakon čega sledi umnožavanje i ekspresija njegove genetičke informacije u ćeliji domaćina.

[0039] U određenim izvođenjima, glikoprotein gB CMV je izabran između SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 60, i SEQ ID NO: 63. Njegov antigenski fragment može da bude dužine bar 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, ili bar 900 aminokiselina. Fragment je antigen kada je sposoban za (i) pokretanje imunskog odgovora stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela vezuju specifično za glikoprotein gB humanog CMV; i/ili (ii) pokretanje specifičnog T ćelijskog imunskog odgovora.

[0040] U određenim izvođenjima, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 772 do 906 SEQ ID NO: 3.

[0041] U određenim izvođenjima, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 772 SEQ ID NO: 60, sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 773 do 907 SEQ ID NO: 60.

[0042] U određenim izvođenjima, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 63.

[0043] U određenim izvođenjima, pp65 antigen se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa pp65 antigenom ili antigenskim fragmentom SEQ ID NO: 36. U određenim izvođenjima, antigenski fragment je dužine bar 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, ili bar 500 aminokiselina. U određenim izvođenjima, fragment je antigen kada je sposoban je da (i) pokreće imuni odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za pp65 humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0044] gH glikoprotein može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa glikoproteinom gH ili antigenskim fragmentom izabranim između SEQ ID NO: 39 i SEQ ID NO: 52. Antigenski fragment može da bude bar 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, ili bar dužine 750 aminokiselina. Fragment je antigenski kada je sposoban da (i) pokreće imunski odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za glikoprotein gH humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0045] Glikoprotein gL može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa glikoproteinom gL ili antigenskim fragmentom prema SEQ ID NO: 41. Antigenski fragment može da bude bar 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, ili bar dužine 300 aminokiselina. Fragment je antigenski kada je sposoban da (i) pokreće imunski odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za glikoprotein gL humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0046] UL128 može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa UL128 ili antigenskim fragmentom SEQ ID NO: 43. Antigenski fragment može da bude bar 10, 25, 50, 75, 100, bar dužine 150 aminokiselina. Fragment je antigenski kada je sposoban da (i) pokreće imunski odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za UL128 humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0047] UL130 može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa UL130 ili antigenskim fragmentom SEQ ID NO: 46. Antigenski fragment može da bude bar 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, bar dužine 250 aminokiselina. Fragment je antigenski kada je sposoban da (i) pokreće imunski odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za UL130 humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0048] UL131A može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 48 UL131A antigenskog fragmenta. Antigenski fragment može da bude dužine bar 10, 25, 50, 75, bar 100 aminokiselina. Fragment je antigenski kada je sposoban da (i) pokreće imunski odgovor stvaranjem antitela kod domaćina (npr., miš, zec, koza, ili magarac) gde se dobijena antitela specifično vezuju za UL131A humanog CMV; i/ili (ii) pokreću specifičan T ćelijski imunski odgovor.

[0049] Virusni vektor može da se sastoji iz najmanje dve:

a. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gH CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; b. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gL CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; c. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL128 protein ili njegovog antigenskog fragmenta; d. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL130 protein ili njegovog antigenskog fragmenta; i e. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL131A protein ili njegovog antigenskog fragmenta, gde su dve nukleotidne sekvence izabrane između a. do e. gore navedenih razdvojene sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo-cepajući peptid ili aminokiselinsku sekvencu koja vodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence pomoću "preskakanja ribozoma" ili element sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta za ulazak ribozoma".

[0050] Virusni vektor može da se sastoji iz najmanje tri:

a. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gH CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; b. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gL CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; c. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL128 protein ili njegovog antigenskog fragmenta; d. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL130 protein ili njegovog antigenskog fragmenta; i e. nukleotidne sekvence koja kodira CMV UL131A protein ili njegovog antigenskog fragmenta, gde su tri nukleotidne sekvence izabrane između a. do e. gore navedenih razdvojene sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo-cepajući peptid ili aminokiselinsku sekvencu koja vodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence pomoću "preskakanja ribozoma" ili element sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta za ulazak ribozoma“.

[0051] Virusni vektor može da se sastoji iz najmanje četiri:

a. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gH CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; b. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gL CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; c. nukleotidne sekvence koja kodira UL128 protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; d. nukleotidne sekvence koja kodira UL130 protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; i e. nukleotidne sekvence koja kodira UL131A protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta, gde su četiri nukleotidne sekvence izabrane između a. do e. gore navedenih razdvojene sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo-cepajući peptid ili aminokiselinsku sekvencu koja vodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence pomoću "preskakanja ribozoma" ili element sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta za ulazak ribozoma".

[0052] Virusni vektor može da se sastoji iz:

a. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gH CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; b. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gL CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; c. nukleotidne sekvence koja kodira UL128 protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; d. nukleotidne sekvence koja kodira UL130 protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta; i e. nukleotidne sekvence koja kodira UL131A protein CMV ili njegovog antigenskog fragmenta, gde je pet nukleotidnih sekvenci izabrano između a. do e. gore navedenih razdvojene sa nukleotidnom sekvencom koja kodira samo-cepajući peptid ili aminokiselinsku sekvencu koja vodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence pomoću "preskakanja ribozoma" ili element sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što su " unutrašnja mesta za ulazak ribozoma".

[0053] Samo-cepajući peptid (ili sekvenca za preskakanje ribozoma) može da se dobije od 2A proteina iz člana virusne familije Picornaviridae. Samo-cepajući peptid (ili sekvenca za preskakanje ribozoma) mogu da se dobiju od (ili da se izvedu od) Porcine teschovirus-12A, Thoseaasignavirus 2A, ili 2A peptida virusa bolesti stopala i usta.

[0054] U određenim izvođenjima, otvoreni okvir čitanja (ORF) arenavirusa je deletiran. U specifičnom izvođenju, ORF koji kodira glikoprotein GP arenavirusa je deletiran

[0055] U određenim izvođenjima, virusni vektor može da umnoži i eksprimira svoju genetičku informaciju u ćeliji koja je inficirana sa virusnim vektorom ali virusni vektor nije sposoban da proizvede druge infektivne čestice potomstva u ne-komplementarnoj ćeliji. U određenim izvođenjima, virusni vektor kao što je ovde opisano je infektivan, tj., sposoban da uđe u ili ubrizga svoj genetički materijal u ćeliju domaćina. U određenim specifičnijim izvođenjima, ovde obezbeđen virusni vektor je infektivan, tj., sposoban je da uđe u ili ubrizga svoj genetički materijal u ćeliju domaćina nakon čega sledi umnožavanje i eksprimiranje njegove genetičke informacije unutar ćelije domaćina.

[0056] U određenim izvođenjima, genomska informacija koja kodira infektivnu, arenavirusnu česticu kojoj nedostaje replikacija je izvedena iz virusa limfocitnog horiomeningitisa (LCMV) klona 13 soja. Nukleotidna sekvenca S segmenta i L segmenta klona 13 je predstavljena u SEQ ID NOs: 32 i 33, redom.

[0057] U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđen virusni vektor čiji je genom ili je izveden iz genoma klona 13 (SEQ ID NOs: 32 i 33) delecijom ORF genoma klona 13 (npr., ORF proteina GP) i zamenjen je sa heterolognim ORF koji kodira antigen (npr., CMV antigen) tako da je preostali LCMV genom bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identičan sa nukleotidnom sekvencom klona 13 (SEQ ID NOs: 32 i 33).

[0058] Ovde je prikazan virusni vektor čiji genom može da bude izveden iz genoma LCMV soja MP (SEQ ID NOs: 49 i 53) delecijom ORF genoma LCMV soja MP (npr., ORF GP proteina) i zamenjen je sa heterolognim ORF koji kodira antigen (npr., CMV antigen) tako da je preostali LCMV genom bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, bar 99.9% ili 100% identičan sa nukleotidnom sekvencom LCMV soja MP (SEQ ID NOs: 49 i 53).

[0059] U specifičnijem izvođenju, virusni vektor se sastoji iz segmenta genoma, pri čemu genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa sekvencom nukleotida 1639 do 3315 SEQ ID NO: 31 ili 1640 do 3316 of SEQ ID NO: 32. U određenim izvođenjima, virusni vektor se sastoji iz segmenta genoma koji se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira proizvod koji se eksprimira čija je aminokiselinska sekvenca bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom kodiranom od 1639 do 3315 SEQ ID NO: 31 ili 1640 do 3316 SEQ ID NO: 32.

[0060] Pronalazak se odnosi na infektivnu, arenavirusnu česticu kojoj nedostaje replikacija koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gB CMV-a u kome je deletiran citoplazmatski domen glikoproteina gB. U specifičnim izvođenjima, deletiran je citoplazmatski domen gB. Citoplazmatski domen gB može da bude zamenjen sa citoplazmatskim domenom heterolognog proteina. CItoplazmatski domen i transmembranski domen gB mogu da budu zamenjeni sa citoplazmatskim domenom i transmembranskim domenom heterolognog proteina. Heterologni protein može da bude G protein vezikularnog virusa stomatititisa (VSV) ili protein hemaglutinin virusa influence. Rast ili infektivnost arenavirusa nije pogođena sa heterolognim aminokiselinama. U specifičnim izvođenjima, transmembranskim domen gB proteina je deletiran.

[0061] Ovde su prikazane nukleinske kiseline koje kodiraju fuzioni protein koji se sastoji iz glikoproteina gB CMV ili njegovog fragmenta i heterolognog polipeptida. Citoplazmatski domen glikoproteina gB može da bude zamenjen sa citoplazmatskim domenom heterolognog proteina. Citoplazmatski domen i transmembranski domen gB mogu da budu zamenjeni sa citoplazmatskim domenom i transmembranskim domenom heterolognog proteina. Heterologni protein može da bude G protein VSV ili protein hemaglutinin virusa influence.

[0062] Ovde su prikazani fuzioni proteini koji se sastoje iz glikoproteina gB CMV-a ili njegovog fragmenta i heterolognog polipeptida. Citoplazmatski domen glikoproteina gB može da bude zamenjen sa citoplazmatskim domenom heterolognog proteina. Citoplazmatski domen i transmembranski domen gB mogu da budu zamenjeni sa citoplazmatskim domenom i transmembranskim domenom heterolognog proteina. Heterologni protein može biti G protein VSV ili protein hemaglutinin virusa influence. Transmembranski domen gB proteina može biti deletiran.

1

[0063] Ovde su obezbeđene izolovane nukleinske kiseline, pri čemu nukleinska kiselina kodira arenavirusni genomski segment u kome je jedan ORF od genomskog segmenta deletiran i gde se genomski segment sastoji iz jedne od:

a. nukleotidne sekvence koja kodira glikoprotein gB CMV ili

b. nukleotidne sekvence koja kodira protein pp65 tegumenta CMV ili njegov antigenski fragment.

[0064] U određenim izvođenjima, genomski segment kodiran sa izolovanom nukleinskom kiselinom je kratak segment, pri čemu je ORF koji kodira GP deletiran. U određenim izvođenjima, genomski segment se sastoji iz glikoproteina gB CMV-a. U određenim izvođenjima, citoplazmatski domen glikoproteina gB je deletiran.

[0065] U jednom aspektu, ovde su obezbeđeni postupci za dobijanje infektivne, arenavirusne čestice kojoj nedostaje replikacija koji obuhvataju:

a. transfekciju u ćeliju domaćina ovde opisane nukleinske kiseline;

b. održavanja ćelije domaćina pod uslovima koji su pogodni za obrazovanje virusa; i

c. sakupljanja infektivne, arenavirusne čestice koja je deficijentna za replikaciju;

gde ćelija domaćina eksprimira ORF koji je deletiran na genomskom segmentu. U određenim izvođenjima, bilo koje dodatne nukleinske kiseline koje su potrebne za oporavak virusne čestice su takođe transfektovane u ćeliju domaćina u koraku pod a. Takve dodatne nukleinske kiseline mogu da budu: cDNK drugog arenavirusnog segmenta genoma, nukleinska kiselina koja kodira L ORF, i/ili nukleinska kiselina koja kodira NPORF.

[0066] U drugom aspektu, ovde su obezbeđene kompozicije, npr., farmaceutska, imunogena ili kompozicije vakcine, koje se sastoje iz ovde opisanog virusnog vektora i farmaceutski prihvatljivog nosača. Takođe, ovde su obezbeđene kompozicije (npr., kompozicije vakcine) koje se sastoje iz dva ili više različitih ovde opisanih virusnih vektora (tj., gde virusni vektori kodiraju različite antigene CMV). U određenim izvođenjima, farmaceutska kompozicija sadrži ovde opisanu nukleinsku kiselinu.

[0067] U daljem aspektu, ovde su obezbeđeni virusni vektor, farmaceutska kompozicija, imunogena kompozicija, ili vakcina koja je ovde obezbeđena za upotrebu u postupcima lečenja ili prevencije CMV infekcije ili reaktivacije kod pacijenta. U još drugom aspektu, ovde je obezbeđena upotreba virusnog vektora, farmaceutske kompozicije, imunogene kompozicije, ili ovde obezbeđena vakcina za lečenje ili prevenciju CMV infekcije ili reaktivacije kod pacijenta. U određenim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija eksprimira antigen CMV ili njegov fragment je sposoban da spreči transmisiju i/ili infekciju CMV sa majke na nerođeno dete. U određenim izvođenjima, jedan ili više infektivnih, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen ili njegov fragment su sposobni da spreče transmisiju i/ili infekciju CMV sa majke na nerođeno dete.

[0068] U određenim izvođenjima, davanje pacijentu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment indukuje dugotrajan imuni odgovor.

[0069] U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđen arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment za upotrebu u postupcima lečenja ili prevencije CMV infekcije ili reaktivacije kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu dva ili više arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen ili njegov fragment. U specifičnijem izvođenju, svaki arenavirus kome nedostaje replikacija eksprimira različit antigen CMV ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, svaki arenavirus kome nedostaje replikacija eksprimira antigen CMV ili njegov derivat. U nekim izvođenjima njegov derivat je antigenski fragment CMV. U drugom, ovde obezbeđenom izvođenju su kompozicije koje se sastoje iz dva ili više arenavirusa kojima nedostaje replikacija gde svaki eksprimira različit anitigen CMV ili njegov fragment.

3.1 Konvencije i skraćenice

[0070]

4. OPIS LISTE SEKVENCI

[0071] Sledeće sekvence su date kao primer aminokiselinskih sekvenci i nukleotidnih sekvenci koje se mogu koristiti sa ovde opisanim postupcima i kompozicijama. U nekim slučajevima DNK sekvenca je korišćena da se opiše sekvenca RNK segmenta virusnog genoma. RNK sekvenca se može brzo odrediti sa DNK sekvence.

SEQ ID NO: 1 je nukleotidna sekvenca segmenta genoma HK1-HgB(FL). Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 1 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 1 za uridine ("U") obezbeđuje RNK sekvencu.

SEQ ID NO: 2 je nukleotidna sekvenca za HgB(FL) cDNK.

SEQ ID NO: 3 je aminokiselinska sekvenca za HgB(FL).

SEQ ID NO: 4 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(dTM) genomski segment. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 4 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 4 za uridine ("U") obezbeđuje RNK sekvencu.

SEQ ID NO: 5 je nukleotidna sekvenca za HgB(dTM) cDNK.

SEQ ID NO: 6 je nukleotidna sekvenca za HgB(dTM).

SEQ ID NO: 7 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(1-706) genomski segment. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:7 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:7 za uridine ("U") obezbeđuje RNK sekvencu.

SEQ ID NO: 8 je nukleotidna sekvenca za HgB(1-706) cDNK.

SEQ ID NO: 9 je nukleotidna sekvenca za HgB(1-706).

SEQ ID NO: 10 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(1-691) genomski segment. Segment genoma je je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:10 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 10 za uridine ("U") obezbeđuje RNK sekvencu.

SEQ ID NO: 11 je nukleotidna sekvenca za r HgB(1-691) cDNK.

SEQ ID NO: 12 je aminokiselinska sekvenca za HgB(1-691).

SEQ ID NO: 13 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(1-447) genomski segment. Segment genoma je je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 13 je prikazana u DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 13 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 14 je nukleotidna sekvenca za HgB(1-447) cDNK.

SEQ ID NO: 15 je aminokiselinska sekvenca za HgB(1-447).

SEQ ID NO: 16 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(dCt) genomski segment. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:16 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:16 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 17 je nukleotidna sekvenca za HgB(dCt) cDNK.

SEQ ID NO: 18 je aminokiselinska sekvenca za HgB(dCt).

SEQ ID NO: 19 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(VSV-G-1) genomski segment. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:19 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:19 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 20 je nukleotidna sekvenca za HgB(VSV-G-1) cDNK.

SEQ ID NO: 21 je aminokiselinska sekvenca za HgB(VSV-G-1).

SEQ ID NO: 22 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(VSV-G-2) genomski segment. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:22 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:22 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

1

SEQ ID NO: 23 je nukleotidna sekvenca za HgB(VSV-G-2) cDNK.

SEQ ID NO: 24 je aminokiselinska sekvenca za HgB(VSV-G-2).

SEQ ID NO: 25 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(H3-1) genomski segment. Segment genoma je je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 25 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 25 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 26 je nukleotidna sekvenca za HgB(H3-1) cDNK.

SEQ ID NO: 27 je aminokiselinska sekvenca za HgB(H3-1).

SEQ ID NO: 28 je nukleotidna sekvenca za HK1-HgB(H3-2) genomski segment. Segment genoma je je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 28 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 28 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 29 je nukleotidna sekvenca za HgB(H3-2) cDNK.

SEQ ID NO: 30 je aminokiselinska sekvenca za HgB(H3-2).

SEQ ID NO: 31 je potpuna sekvenca segmenta 5 virusa limfocitnog horiomeningitisa. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 31 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:31 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 32 je potpuna sekvenca segmenta S klona 13 virusa limfocitnog horiomeningitisa, (GenBank: DQ361065.2). Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 32 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 32 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK. SEQ ID NO: 33 je potpuna sekvenca segmenta L klona 13 virusa limfocitnog horiomeningitisa, (GenBank: DQ361066.1). Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 33 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 33 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK. SEQ ID NO: 34 je nukleotidna sekvenca HK1-Hpp65 genomskog segmenta. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 34 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 34 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 35 je nukleotidna sekvenca za cDNK Hpp65.

SEQ ID NO: 36 je aminokiselinska sekvenca za Hpp65.

SEQ ID NO: 37 je nukleotidna sekvenca HK1-HgH genomskog segmenta. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 37 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 37 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 38 je nukleotidna sekvenca za cDNK HgH.

SEQ ID NO: 39 je aminokiselinska sekvenca za HgH.

SEQ ID NO: 40 je nukleotidna sekvenca za cDNK HgL.

SEQ ID NO: 41 je aminokiselinska sekvenca za HgL.

SEQ ID NO: 42 je nukleotidna sekvenca za cDNK HUL128.

SEQ ID NO: 43 je aminokiselinska sekvenca za HUL128.

SEQ ID NO: 44 je nukleotidna sekvenca za HK1-HUL130 genomskog segmenta. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 44 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 44 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 45 je nukleotidna sekvenca za HUL130 cDNK.

SEQ ID NO: 46 je aminokiselinska sekvenca za HUL130.

SEQ ID NO: 47 je nukleotidna sekvenca za HUL131A cDNK.

SEQ ID NO: 48 je aminokiselinska sekvenca za HUL131A.

SEQ ID NO: 49 je segment L soja MP limfocitnog horiomeningitis virusa, potpuna sekvenca. Genomski segment je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:49 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO:49 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 50 je nukleotidna sekvenca segmenta genoma HK1-HgH(dTM). Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:50 je prikazana za DNK; međutim, zamenom svih timidina ("T") u SEQ ID NO:50 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 51 je nukleotidna sekvenca za cDNK HgH(dTM).

SEQ ID NO: 52 je aminokiselinska sekvenca za HgH(dTM).

SEQ ID NO: 53 je potpuna sekvenca segmenta S soja MP virusa limfocitnog horiomeningitisa. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO:53 je prikazana za DNK; međutim, zamenom svih timidina ("T") u SEQ ID NO:53 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 54 je aminokiselinska sekvenca NP proteina MP soja LCMV.

SEQ ID NO: 55 je aminokiselinska sekvenca GP proteina MP soja LCMV.

SEQ ID NO: 56 je aminokiselinska sekvenca L proteina MP soja LCMV.

SEQ ID NO: 57 je aminokiselinska sekvenca Z proteina MP soja LCMV.

SEQ ID NO: 58 je sekvenca LCMV klona 13 S-Segmenta koji kodira HCMV soj Merlin gB; divlji tip, pune dužine. Segment genoma je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 58 je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 58 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK.

SEQ ID NO: 59 je cDNK sekvenca HCMV soja Merlin gB(FL) ORF.

SEQ ID NO: 60 je aminokiselinska sekvenca HCMV soja Merlin gB(FL).

SEQ ID NO: 61 je sekvenca LCMV klona 13 S-Segmenta koji kodira HCMV soj Merlin gB sekvencu; delecija transmembranskog regiona (dTM). Genomski segment je RNK, sekvenca u SEQ ID NO: 61

1

je prikazana za DNK; međutim, zamena svih timidina ("T") u SEQ ID NO: 61 za uridine ("U") obezbeđuje sekvencu RNK sekvencu.

SEQ ID NO: 62 je cDNK sekvenca HCMV soja Merlin gB(dTM) ORF.

SEQ ID NO: 63 je aminokiselinska sekvenca HCMV soja Merlin gB(dTM).

5. KRATAK OPIS NACRTA

[0072]

Sl.1: Genom arenavirusa divljeg tipa se sastoji iz kratkog (1; ∼3.4 kb) i dužeg (2; ∼7.2 kb) segmenta RNK. Kratak segment nosi ORF koji kodiraju nukleoprotein (3) i glikoprotein (4). Duži segment kodira RNK-zavisnu RNK polimerazu L (5) i matriksni protein Z (6). Arenavirusi divljeg tipa mogu se prikazati vektorima vakcine koji su deficijentni za replikaciju uklanjanjem gena koji kodira za glikoprotein i insercijom, umesto gena koji kodira za glikoprotein, antigena iz izbora (7) protiv kojih je potrebno indukovati imunske odgovore.

Sl.2: (Prilagođeno prema Pötzsch, et al., 2011) Antigena mesta gB proteina eksprimirana u različitim rLCMV-gB vektorima; AS-1/5 se odnosi na antigenska mesta 1-5 glikoproteina B. TM ukazuje na transmembranski domen gB. Precrtane makaze označavaju mutaciju u mestu cepanja furinom lociranu unutar ektodomena gB. "H" u vektorskim imenima (npr. HK1-HgB(FL)) označava gB sekvence humanog; "GP" u vektorskim imenima (npr. HK1-GPgB(FL)) označava gB sekvence CMV zamorca.

Sl. 3A: Različiti vektori rLCMV-PC su dobijeni za ekspresiju usidrenih u membrani (divlji tip) ili neusidrenih u membrani (deletiran transmembranski domen) oblika ili čitavog pentamernog komleksa ili samo njegovih delova. Strelice u zasebnim bojama označvaju 2A samo-cepajuće sekvence. 2A nukleotidna sekvenca je bila „wobbled“ da bi se izbegla homologna rekombinacija dok se plazmid klonira ili u kontekstu vektorske okosnice.

Sl. 3B: Različiti vektori rLCMV-PC su dobijeni za ekspresiju usidrenih u membrani (divlji tip) ili neusidrenih u membrani (deletiran transmembranski domen) oblika ili čitavog pentamernog komleksa ili samo njegovih delova. 2A samo-cepajuće sekvence koje razdvajaju zasebne komponente PC bile su „wobbled“ iz gore navedenih razloga. Alternativo, IRES sekvenca je postavljena između dva otvorena okvira čitanja (ORF) dovodeći do translacije nishodnog ORF. Dalje, proteinski obeleživač (V5) je spojen sa proteinima zasebnog pentamernog kompleksa da bi se olakšala detekcija kod „Western“ blotovanja.

2A*: 2A peptid dobijen iz 2A proteina iz člana familije virusa Picornaviridae (npr., Porcine teschovirus-1 2A, Thosea asigna virus 2A). ;Sl. 4: Suspenzije kulture HEK 293 koje eksprimiraju LCMV GP su inficirane sa rLCMV vektorima HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(706), HK1-HgB(691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1) i HK1-HgB(H3-2) (MOI od 0.001). Odgovarajući rLCMV vektor koji eksprimira zeleni fluorescenti protein (HK1-GFP) je korišćen kao kontrola. (A) Virusna infekcija je praćena testom obrazovanja jedinica fokusa (FFU) bojenjem obojenih fokusa posle 72h ili 96h inkubacije. Rezultati koji su korišćeni za određivanje virusnog titra računanjem broja jedinica koje obrazuju fokus po mililitru (FFU/ml). (B) Da bi se ispitala infektivnost virusne čestice, vektorska RNK je izolovaa iz štoka preparata i količina genomskih ekvivalenata je određena korišćenjem kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu (qPCR). Odgovarajući rezultati su stavljeni u korelaciju sa titrima FFU uspostavljenim pod (A) da bi se izračunala specifična infektivnost vektorskih konstrukata. ;;;1 ;Sl.5: Da bi se analizirala umnožavanje vektora, izvedene su krive rasta korišćenjem suspenzije HEK 293 ćelija koje eksprimiraju LCMV GP. Odgovarajuće ćelije su zasejane u ćelijskog gustini od 3x10<5>ćelija/ml i inficirane su sa individualnim vektorima (HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(H3-2) i HK1-HgB(691)) na MOI 0.001. Uzorci su sakupljeni svakih 24 h i analizirani su sa testom FFU. Svi testirani vektori su ispoljili slične kinetike rasta i maksimalne vrednosti titra u poređenju sa HK1-GFP što ukazuje da gB transgeni nisu interferirali sa umnožavanjem vektora u većem obimu u odnosu na mali reporterski gen GFP. ;Sl.6: HEK 293 ćelije koje eksprimiraju LCMV GP su inficirane sa zasebnim konstruktima rLCMV-gB (HK1-HgB(VSVG- 1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM)) na multiplicitetu infekcije od (MOI) 0.001. Ćelije su analizirane 96h nakon inficiranja. Proteini su razdvojeni na SDS gelovima, preneti su na nitrocelulozne membrane i ekspresija gB proteina je detektovana sa primarnim specifičnim za transgen (Mišje monoklonsko antitelo prema humanom gB CMV) i odgovarajućim sekundarnim antitelom. Očekivano je da se necepani prekursori gB pune dužine razviju na ∼160kDa dok cepani gB sadrži površinsku komponentu sa procenjenom molekulskom masom od 116 kDa koja je povezana disulfidnim vezama za transmembransku komponentu sa procenjenom molekulskom masom od 55 kDa. Međutim, zbog korišćenja monoklonalnog primarnog antitela samo dve trake predstavljaju necepani gB protein i manji proizvod cepanja gB su očekivani da budu vidljivi na blotu. Kao što je očekivano, gB pune dužine (traka 7) se razvio na ∼160 kDa, dok su preostali konstrukti pokazali trake manje veličine što se može objasniti delecijom ili izmenom bar dela citoplazmatskog domena gB. Analogno, transmembranski deo pune dužine gB (traka 7) se razvio na ∼60kDa (blago više od očekivanog) i svi derivati gB su prikazali proizvode cepanja niže veličine. Generalno HK1-gB(FL) i HK1-gB(dTM) su ispoljili slabije trake gB u poređenju sa svim drugim vektorima. ;;4 Sl.7: C57BL/6 miševi su subkutanozno imunizovani 3 puta u danima 0, 21 i 42 eksperimenta sa 6.7x10 FFU/dozi svakog od HK1-GPgB-dTM, HK1-GPgB-dTMuc, HK1-GPgB-FL i sa 9.2x10<5>FFU/dozi HK1-GFP. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42 i 63 eksperimenta i titri anti-GPgB IgG antitela su određeni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;Sl. 8A i B: C57BL/6 miševi su subkutanozno imunizovani 3 puta u danima 0, 21 i 42 eksperimenta ili preko intramuskularnog načina (Sl. 8A) ili subkutanoznim ubrizgavanjem (Sl. 8B) sa različitim 1 3 ;koncentracijama (7.4x10 , 2.2x10 , 6.7x10<4>i 2x10<6>FFU/dozi) HK1-GPgB-dTM. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42 i 63 eksperimenta i titri anti-GPgB IgG antitela su određeni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;Sl. 8C: C57BL/6 miševi su imunizovani sa 5,6x10<5>(grupe 1 i 3) ili 3,2x10<3>(grupe 2 i 4) FFU/dozi HK1-HgB(dCt) u danima 0 i 28 preko intramuskularnog (Grupe 1 i 2) ili intradermalnog (Grupe 3 i 4) načina davanja. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 28, 56 i 70 i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA testom. Prikazane su koncentracije ekvivalenta monoklonskog antitela (µg/ml); monoklonsko anti-gB antitelo (mIgG1) je korišćeno za dobijanje standardne krive. ;Sl.8D: C57BL/6 miševi su imunizovani sa 6,7x10<5>(Grupe 1 and 3) ili 3,5x10<3>(Grupe 2 i 4) FFU/dozi HK1-Hpp65 u danima 0 i 28 preko transmuskularnog (Grupe 1 i 2) ili intradermalnog (Grupe 3 i 4) načina davanja. CD8+ T ćelijski odgovori su analizirani protočnom citometrijom restimulacijom ćelija slezine sa ukupnim peptidima koji su dobijeni na osnovu Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14) u danu 38. Kontrolne ćelije su stimulisane samo sa medijumom. Posle inkubacije sa medijumom (trake 1 - 4) ili sa specifičnim peptidima (trake 5 - 8) ćelije su bojne za analizu CD8+ T ćelija protočnom citometrijom. Analizirana je ekspresija IL-2, IFN-g i TNF. ;;;1 ;Sl.9: C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(dTM) i rekombinantnim gB / adjuvansom u danima 0 i 21. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 0, 21, 42, 63, 84 i 105 eksperimenta i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;Sl. 10: C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(dTM) rekombinantnim gB / adjuvansom u danima 0 i 21. Serumi koji su sakupljeni u danu 42 su pomešani sa medijumom koji sadrži komplement zamorca (finalna koncentracija: 5%) i GFP-obeleženi HCMV soj TS15-rN. Smeše seruma/medijuma su inkubirane 60 min na 37°C, i nakon toga su prenete u buariće na ploči sa 384-bunarića koja sadrži ARPE-19 ćelije. Reprezentativni mikrografi su napravljeni u danu 4 i GFP je kvantifikovan u danu 7 posle infekcije. Vrednosti GFP su prikazane grafikonom u odnosu na koncentraciju seruma i analizirani su za uklapanje krive sa četiri parametra da bi se odredila približna razblaženja koja će za rezultat imati 50% inhibiciju. Logaritamski titri recipročne neutralizacije su predstavljeni (IC50). ;Sl. 11: C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi HK1-HgB(691), HK1-HgB(706), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(dTM) i rekombinantnim gB / adjuvansom u danima 0 i 21. Serumi koji su sakupljeni u danu 42 su analizirani sa HCMVgB-specifičnom podklasom IgG ELISA. Procenat HCMVgB-specifične podklase IgG je izračunat kao odnos individualnih podklasa Titar krajnje tačke GMT podeljen sa ukupnim titrom krajnje tačke GMT za sve podklase. ;Sl. 12: Hartley zamorci (4 životinje / grupi) su imunizovani intramuskularno sa različitm koncentracijama (1.54x107 , 1.54x106 , 1.54x10<5>i 1.54x10<4>FFU/dozi) HK1-GPgB-dTM u danima 0, 21 i 42. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danima 0, 21, 42 i 63 eksperimenta i titri anti-gB antitela su analizirani sa GPgB-specifičnih IgG ELISA. Prikazane su krajnje tačke GMTs. Usamljeni krug označava GPCMV pozitivni kontolni serum. ;Sl. 13: Hartley zamorci (4 životinje / grupi) su imunizovani intramuskularno sa različitm koncentracijama (1.54x107 , 1.54x106 , 1.54x10<5>i 1.54x10<4>FFU/dozi) HK1-GPgB-dTM u danima 0, 21 i 42. Neutrališuća aktivnost anti-GPgB antitela u serumima imunizovanih životinja koji su sakupljeni u danu 63 eksperimenta je analizirana testom redukcije plaka. ;Sl. 14: Suspenzija ćelija HEK 293 koje eksprimiraju LCMV GP je inficirana sa rLCMV vektorom HK1-Hpp65 (MOI = 0.001). rLCMV vektor koji eksprimira GFP (HK1-GFP) je korišćen kao kontrola. Uzorci su povučeni u naznačenim vremenskim tačkama i analizirani su sa FFU testom (A) da bi se izračunao broj jedinica koji obrazuje fokuse (FFU) po zapremini jedinice uzorka (FFU/ml) i sa qPCR da bi se izračunala specifična infektivnost vektorskih konstrukata (B). ;Sl.15: Suspenzija ćelija koje eksprimiraju HEK 293 LCMV GP je inficirana sa HK1-Hpp65 ili negativnim kontrolnim vektorom HK1-GFP, sakupljene su i lizirane 96h posle infekcije, razdvojene na SDS gelovima, prenete na nitrocelulozne membrane i testirane sa anti-pp65 primarnim i odgovarajućim sekundarnom antitelom konjugovanim sa alkalnom fosfatazom. Očekivano je da pp65 protein humanog CMV razvije traku u 65 kDa, koji odgovara glavnoj traci HK1-Hpp65 u „Western“ blotu. ;Sl. 16: (A) i (B) Grupe 15 C57BL/6 miševe su intramuskularno vakcinisane (100µL/mišu ukupno; 50µL/butini) sa ciljanom dozom 1x10<4>HK1-Hpp65 (Grupa 1) ili HK3-Hpp65 (Grupa 2). Ne-vakcinisani miševi (Grupa 7) su korišćeni kao kontrola. Za određivanje T ćelijskih odgovora citokini su analizirani protočnom citometrijom. U danu 10 posle imunizacije, 5 miševa/grupi je žrtvovano i jednoćelijske ;;;1 ;suspenzije ćelija slezine su restimulisane sa ukupnim peptidima dobijenim na osnovu Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14). 5 h nakon vremena stimulacije ćelije su bojene za analizu CD4+ i CD8+ T ćelija protočnim citometrom. Ćelije su bojene za površinski marker CD3, CD4 i CD8. Nakon 30 min površinskog bojenja, ćelije su permeabilizovane sa 2% PFA (15min) i tretirane su saponinom da se osigura da ćelijska površina ostane permeabilna. Nakon 30min intraćlijskog bojenja (IL-2, IFN-g i TNF-a) uzorci su isprani i mereni sa FACS Gallios. Prijavljena je učestalost CD4+ (A) ili CD8+ T (B) ćelija koje eksprimiraju citokine. (C) Grupe 10 C57BL/6 miševa su vakcinisane intramuskularnim načinom davanja sa ciljanom dozom 1x10<4>HK1-HgB(dTM) u danima 0 i 28 eksperimenta. U danu 56 eksperimenta miševi su intramuskularno vakcinisani sa ciljnom dozom 1x10<4>HK1-Hpp65 (Grupa 3) ili HK3-Hpp65 (Grupa 4). Ne-vakinisani miševi (Grupa 7) su korišćeni kao kontrola. U danu 66 eksperimenta T ćelijski odgovori su analizirani merenjem citokina protočnim citomerom. Jednoćelijska suspenzija ćelija slezine iz žrtvovanih miševa (5/grupi) su restimulisani sa istim kupom peptida. Nakom 5h vremena stimulacije ćelije su bojene za analizu CD8+ T ćelija protočnim citometrom. Ćelije su bojene za površinski marker CD3, CD4 i CD8. Nakon 30min površinskog bojenja, ćelije su permeabilizovane sa 2% PFA (15min) i tretirane saponinom da se osigura da ćelijska površina ostane permeabilna. Nakon 30min unutarćelijskog bojenja (IL-2, IFN-g i TNF-a) uzorci su isprani i mereni sa FACS Gallios. Prijavljena je učestalost CD8+ T ćelija koje eksprimiraju citokine. ;;Sl.17: C57BL/6 miševi su vakcinisani intramuskularno (100µL/mišu ukupno; 50µL/butini) u danima 0 i 28 eksperimenta sa ciljnom dozom 1x10<4>HK1-GPgB(dTM) i HK3-GPgB(dTM). Serumi iz individualnih životinja su generisane pre svake doze vakcine (dani 0, 28) kao i četiri nedelje (dan 56) nakon poslednje (druge) injekcije. Svi serumi su ispitani za nivo GPgB-specifičnih IgG antitela sa ELISA; ELISA podaci su eksprimirani kao srednja geometrijska vrednost GPgB-specifičnog krajnjeg titra IgG. ;;Sl.18: C57BL/6 miševi su vakcinisani intramuskularno (100µL/ mišu ukupno; 50µL/ butini) u danima 0 i 28 eksperimenta sa ciljnom dozom 1x10<4>HK1-HgB(dTM) i HK3-HgB(dTM). Serumi iz individualnih životinja su generisane pre svake doze vakcine (su generisane pre svake doze vakcine 0, 28) kao i četiri nedelje (dan 56) nakon poslednje (druge) injekcije. Svi serumi su ispitani za nivo HgB-specifičnih IgG antitela sa ELISA; ELISA ELISA podaci su eksprimirani kao srednja geometrijska vrednost krajnjeg titra HgB-specifičnog IgG. ;;Sl.19: HEK 293T ćelije su zasejane u M6 bunarićima pločama za kulturu u gustini od 500,000 ćelija po bunariću. Sledećeg dana, ćelije su inficirane sa različitim sojevina LCMV u multiplicitetu infekcije od 0.05. Supernatant je sakupljen u naznačenim vremenskim tačkama i virusni titri su određivani imunofokusnim testom. Simboli predstavljaju srednju vrednost dve ćelije. ;;Sl.20: Grupe od 5 Novozelandskih beli zečeva su imunizovani sa različitim dozama (2.0x102 , 4.4x10<4>i 4.5x10<6>FFU/dozi) HK1-HgB(dCt) u danima 0 i 28. Serumi su sakupljeni u danima 0, 28 i 42 i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;;Fig. 21A: C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1) i rekombinantnim gB / adjuvansom u danima 0, 21 and 42. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42, 63, 91, 119, 147 i 175 i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;;Fig. 21B: C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(dCt) i rekombinantnim gB / adjuvansom u danima 0, 21 i 105. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42, 63, 84, 105 i 126 i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA testom. Prikazane su krajnje tačke GMTs. ;;;1 ;Sl. 22: Grupe 10 C57BL/6 miševa su imunizovane intramuskularno sa 9x10<4>FFU/dozi HK1-HgB(dCt) zasebno ili 9x10<4>FFU/dozi HK1-Hpp65 zasebno ili sa 9x10<4>FFU/dozi svakog HK1-HgB(dCt) i HK1-Hpp65 zajedno u danima 0 i 28. (A) Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danu 49 i titri anti-HCMVgB IgG antitela su mereni sa ELISA. (B) Za određivanje T ćelijskih odgovora citokini su analizirani protočnim citometrom. U danu 49 posle imunizacije, miševi su žrtvovani i jednoćelijska suspenzija ćelija slezine su restimulisane sa ukupnim peptidima dobijenim na osnovu Shedlock D. et al (Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012; 8:11, 1-14). Kontrolne ćelije su stimulisane samo sa medijumom. Posle inkubacije sa medijumom (trake 1 i 2) ili sa specifičnim peptidima (trake 3 i 4) ćelije su bojene za analizu CD8+ T ćelija protočnim citometrom. Analizirana je ekspresija IL-2, IFN-g i TNF ;;Sl.23: Hartley zamorci (11 životinja / grupi) su imunizovani intramuskularno tri puta (u danima 0, 21 i 42) sa 1.54x10<6>FFU/dozi ili HK1-GPgB-dTM ili HK1-GPpp65 pre parenja. Kontrolne životinje (10 / grupi) su primile pufer umesto rLCMV vektorskih konstrukata. Životinje su parene u danu 63+ eksperimenta. ∼45 dana nakon gestacije zamorci su izazvani subkutanozno sa 1x10<5>pfu CMV specifičnog za zamorca. Mortalitet mladunaca je meren na porođaju i stope zaštite su određivane poređenjem grupa koje su primile tretman za viremiju i stope smrti mladunaca, * označava značajnu (p<0.05) redukciju.

Sl.24: AG129 miševi kojima nedostaju IFN α/β i γ receptori (A) kao i RAG-/- miševi kojima nedostaju T i B ćelije su inokulisani cerebralno sa 7.65x10<5>kao i 7.65x10<3>FFU/dozi ili HK3-Hpp65 ili mišjeg analoga HK3-Mpp65 u danu 0. Kontrolne grupe miševa su primile ili 100 FFU/dozi divljeg tipa LCMV ili samo razblaživača. Miševi su zatim praćeni za ispoljavanje bolesti i tkivo mozga je sakupljeno u naznačenim danima i analizirano je za prisustvo infektivnog virusa.

Sl.25: Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani intramuskularno sa 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPgB(dCt) (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 2), ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 3) u danima 0, 31 i 72 (grupa 1) / dani 0, 31 i 70 (grupa 2) / dani 0, 34 i 70 (grupa 3) eksperimenta. Dodatno, Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani subkutanozno sa 50 µg subjedinice gB proteina, formulisanog u potpunom Freund-ovom adjuvansu (grupa 4) u danima 0, 46 i 76. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danima 0, 28, 52, 103 i 155 eksperimenta i titri anti-gB antitela su analizirani sa GPgB-specifičnim IgG ELISA korišćenjem ukupnog seruma sa dodeljenim titrom anti-gB antitela kao referentnim standardom.

Sl.26: Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani intramuskularno sa 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPgB(dCt) (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 2), ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 3) u danima 0, 31 i 72 (grupa 1) / dani 0, 31 i 70 (grupa 2) / dani 0, 34 i 70 (grupa 3). Dodatno, Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani subkutanozno sa µg subjedinice gB proteina, formulisanog u potpunom Freund-ovom adjuvansu (grupa 4) u danima 0, 46 i 76. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danu 103 i analizirana je neutrališuća aktivnost seruma eksperimenta. Isprekidana linija označava granicu detekcije. Uzorcima seruma koji nisu dostigli granicu detekcije u testu je proizvoljno dodeljena vrednost 20 za predstavljanje grafikom i statističkim izračunom.

Sl. 27: Splenociti su izolovani iz Hartley zamoraca imunizovanih intramuskularno sa 8x10<5>FFU/dozi HK1-GFP (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 2) ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 3) i analizirani su sa ELISPOT testom. Tri životinje iz svake grupe koja je primila vakcinu su žrtvovane nakon 2 doze vakcine i tri dodatne životinje iz svake grupe koja je primila vakcinu su žrtvovane nakon 3 doze vakcina. Veličina pp65-specifičnog odgovora splenocita za svaku životinju je izračunata korišćenjem Prism6 kao "površine ispod krive" gore za DMSO kontrolu odgovora svake životinje prema svim ukupnim pp65 peptidima. (A) Srednji broj tačaka po životinji je predstavljen

2

tačkama podataka za ili 2 doze (krugovi) ili 3 doze (boksovi) vakcine (Stupci predstavljaju srednju vrednost grupe i ±SEM). (B) Srednji broj tačaka po životinji je predstavljen tačkama podataka za ili HK1-GFP (krugovi), HK1-GPpp65 (kvadrati), ili HK1-GPgB(dCt) / HK1-GPpp65 (trouglovi) vakcinisanih životinja (Stupci predstavljaju srednju vrednost grupe i ±SEM). Prikazane P-vrednosti na slici su izračunate korišćenjem Mann-Whitney U-testa (Wilcoxon, Biometrics Bulletin, 1945, 1: 80-83; Mann & Whitney, Annals of mathematical Statistics, 1947, 18: 50-60).

Fig.28 : Hartley zamorci su imunizovani intramuskularno tri puta sa 8x10<5>FFU/dozi ili HK1-GFP (grupa 1), HK1-GPgB(dCt) (grupa 2), HK1-GPpp65 (grupa 3) ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 u kombinaciji (grupa 4) pre parenja. Oko jednog meseca nakon poslednje doze vakcine životinjama je omogućeno parenje. Trudnoće kod ženki zamoraca su potvrđene i praćene su palpitacijom. Gravidne ženke su izazvane u trećem gestacijskom tromesečju sa 10<5>jedinica koje obrazuju plak CMV zamorca koji prolazi kroz pljuvačne žlezde i nakon toga su praćeni do porođaja. Mortalitet mladunaca je meren na porođaju i stope zaštite su određivane poređenjem grupa koje su primile tretman za stope mortaliteta mladunaca.

6. DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0073] Predmetni pronalazak obezbeđuje infektivan, arenavirusni virusni vektor kome nedostaje replikacija koji je modifikovan da sadrži genom sa sposobnošću umnožavanja i eksprimiranja svoje genetičke informacije u inficiranim ćelijama, pri čemu je virusni vektor sposoban da proizvodi infektivno potomstvo virusa u komplementarnim ćelijama ali nije sposoban da dalje proizvodi infektivno potomstvo čestica u ne-komplementarnim ćelijama, pri čemu arenavirusni otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein unutar S segmenta je deletiran i zamenjen je sa:

[0074] U jednom izvođenju, virusni vektor se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira citomegalovirsni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena.

[0075] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 772 do 906 SEQ ID NO: 3.

[0076] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa aminokiselinama 1 do 772 SEQ ID NO: 60, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 773 do 907 SEQ ID NO: 60.

[0077] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 18, ili SEQ ID NO: 63.

[0078] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0079] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0080] U jednom izvođenju, glikoprotein gB se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0081] U jednom izvođenju, nukleotidna sekvenca kodira glikoprotein gB gde je : (i) citoplazmatski domen glikoproteina gB deletiran; (ii) transmembranski domen glikoproteina gB deletiran; ili (iii) citoplazmatski domen i transmembranski domen glikoproteina gB su deletirani.

[0082] U jednom izvođenju ovde je obezbeđen pomenuti virusni vektor, gde je nukleotidna sekvenca nukleotidna sekvenca koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0083] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0084] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je bar 90%, bar 95%, ili bar 98% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0085] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0086] U jednom izvođenju, protein pp65 tegumenta se sastoji iz antigenske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

[0087] U jednom izvođenju je virusni vektor iz pronalaska gde:

(i) arenavirus je virus limfocitnog horiomeningitisa;

(ii) genomska informacija koja kodira infektivan, arenavirusni virusni vektor kome nedostaje replikacija je izvedena iz virusa limfocitnog horiomeningitisa klona 13 soja;

(iii) virusni vektor indukuje dugotrajan imunski odgovor protiv antigena citomegalovirusnog (CMV) glikoproteina gB ili proteina pp65 tegumenta kodiranih sa nukleotidnom sekvencom; ili

(iv) virusni vektor je pogodan za zaštitu protiv kongenitalne infekcije CMV.

[0088] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja se sastoji iz prvog virusnog vektora i pomenutog drguog virusnog vektora, gde pomenuti prvi virusni vektor i pomenuti drugi virusni vektor je virusni vektor prema pronalasku, i gde se pomenuti prvi i drugi virusni vektori razlikuju.

[0089] U jednom izvođenju, pomenuti prvi virusni vektor obuhvata virusni vektor iz pronalaska, i gde pomenuti drugi virusni vektor obuhvata virusni vektor iz pronalaska.

[0090] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku ili imunogenu kompoziciju ili vakcinu koja se sastoji iz virusnog vektora iz pronalaska, ili kompozicije iz pronalaska, i farmaceutski prihvatljivog nosača.

[0091] U jednom izvođenju, vakcina se sastoji iz gB proteina humanog citomegalovirusa (HCMV), pri čemu je citoplazmatski domen HCMV gB deletiran, i pri čemu HCMV gB protein:

(ii) sastoji se u suštini iz N-terminalnih 772 aminokiselina gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60); (iii) sastoji se u suštini iz N-terminalnih 772 aminokiselina gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60) koju prati ostatak arginina na poziciji 773; ili

(iv) sastoji se iz aminokiselinske sekvence koja je bar 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, bar 99.5% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom predstavljenom u SEQ ID NO: 18.

[0092] U jednom izvođenju, pomenuti virusni vektor, pomenuta kompozicija, pomenuta farmaceutska ili imunogena kompozicija, ili pomenuta vakcina je pogodna za intramuskularnu injekciju.

[0093] Pronalazak obezbeđuje virusni vektor, ili kompoziciju, ili farmaceutsku ili imunogenu kompoziciju iz pronalaska, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije citomegalovirusne infekcije kod pacijenta.

[0094] Pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu, gde nukleinska kiselina kodira arenavirusni genomski S segment pri čemu otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein u arenavirusnom genomskom S segmentu je deletiran i zamenjen je sa:

[0095] Pronalazak obezbeđuje ekspresioni vektor koji se sastoji iz izolovane nukleinske kiseline iz pronalaska.

[0096] Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja se sastoji iz izolovane nukleinske kiseline ili ekspresionog vektora iz pronalaska.

[0097] Pronalazak obezbeđuje postupak za dobijanje infektivnog, arenavirusnog virusnog vektora kome nedostaje za replikaciju se sastoji iz:

a. transfekcije u ćeliju domaćina nukleinske kiseline ili ekspresionog vektora iz pronalaska; b. održavanja ćelije domaćina pod uslovima pogodnim za obrazovanje virusa; i

c. sakupljanja infektivnog, arenavirusnog virusnog vektora kome nedostaje replikacija; pri čemu ćelija domaćina eksprimira otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein.

[0098] Ovde su obezbeđene kompozicije za upotrebu u lečenju ili prevenciji infekcije subjekta sa CMV, ili kod reaktivacije CMV kod subjekta. Određenije, ovde su obezbeđeni infektivni, arenavirusi koji su

2

deficijentni za replikaciju koji se sastoje iz nukleotidne sekvence koja kodira antigen CMV. Ovi virusi mogu da se daju subjektu za lečenje ili prevenciju CMV infekcije ili reaktivacije. Dobijanje infektivnih, arenavirusni vektora deficijentnih za replikaciju za upotrebu sa predmetnim pronalaskom je detaljnije opisano u Odeljku 6.3.

[0099] Ovde je opisan genetički modifikovani arenavirus, pri čemu je arenavirus:

● infektivan;

● ne može da obrazuje infektivno potomstvo virusa u ne-komplementarnog ćeliji (tj., ćelija koja ne eksprimira funkcionalnost koja nedostaje u arenavirusu deficijentnom za replikaciju i uzrokuje da bude deficijentan za replikaciju);

● je sposoban da replicira svoj genom i eksprimira svoju genetičku informaciju; i

● kodira antigen CMV ili njegov fragment.

[0100] Ovde opisani genetički modifikovani arenavirus je infektivan, tj., može da se veže za ćeliju domaćina i oslobodi svoj genetski materijal u ćeliji domaćina. Ovde opisan genetski modifikovan arenavirus je deficijentan za replikaciju, tj., arenavirus nije sposoban dalje da proizvodi infektivno potomstvo čestica u ne-komplementarnoj ćeliji. Posebno, genom arenavirusa je modifikovan (npr., delecijom ili funkcionalnom inaktivacijom ORF) tako da virus koji nosi modifikovani genom više ne može da proizvodi infektivno potomstvo virusa. Ne-komplementarna ćelija je ćelija koja ne obezbeđuje funkcionalnost koja je eliminisana iz arenavirusa kome nedostaje replikacija modifikacijom virusnog genoma (npr., ORF koji kodira GP protein je deletiran ili funkcionalno inaktivisan, ne-komplementarna ćelija ne obezbeđuje GP protein). Međutim, ovde obezbeđeni genetski modifikovani arenavirus je sposoban da proizvede infektivno potomstvo virusa u komplementarnim ćelijama. Komplementarne ćelije su ćelije koje obezbeđuju (in trans) funkcionalnost koja je eliminisana iz arenavirusa (kome nedostaje) deficijentnog za replikaciju modifikacijom virusnog genoma (npr., ukoliko ORF koji kodira GP protein je deletiran ili je funkcionalno inaktivisan, komplementarna ćelija obezbeđuje GP protein). Ekspresija funkcionalnosti koja dopunjuje (npr., GP protein) može da se postigne bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike (npr., prolazna ili stabilna ekspresija). Ovde opisani genetski modifikovani arenavirus može da se umnoži i eksprimira njegovu genetičku informaciju u ćeliji koja je inficirana virusom. Genetički modifikovani arenavirus može da se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira CMV antigen kao što je ali nije ograničeno na CMV antigene opisane u Odeljku 6.2.

[0101] U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđen genetski modifikovani arenavirus u kome je ORF (ORF) arenavirusnog genoma deletiran tako da dobijeni virus ne može da proizvodi dalje infektivno potomstvo virusnih čestica u ne-komplementarnim ćelijama. Arenavirusna čestica koja se sastoji iz genetički modifikovanog genoma u kome ORF deletiran može se proizvesti u komplementarnim ćelijama (tj., u ćelijama koje eksprimiraju arenavirusni ORF koji je bio deletiran ili funkcionalno inaktiviran) (videti Odeljak 6.3). Genetički materijal nastalih arenavirusnih čestica može da se transfektuje nakon infekcije ćelije domaćina u ćeliju domaćina, pri čemu genetički materijal može da se eksprimira i umnoži. Dodatno, genom ovde obezbeđenih genetički modifikovanih arenavirusnih čestica kodira antigen CMV koji se može eksprimirati u ćeliji domaćina.

[0102] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira gen glikoproteina (GP) arenavirusa je deletiran da se dobije arenavirus kome nedostaje replikacija iz predmetnog pronalaska. U specifičnom izvođenju, arenavirus kome nedostaje replikacija sadrži genomski segment koji se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira antigen CMV. Prema tome, u određenim izvođenjima, čestica genetski modifikovanog arenavirusa koja je ovde obezbeđena obuhvata genomski segment koji a) ima deleciju ORF koji je prisutan u divljem tipu oblika genomskog segmenta; i b) kodira (ili u sens ili antisens) antigen CMV (videti Odeljak 6.3).

[0103] U određenim izvođenjima, antigen kodiran nukleinskom kiselinom koja je insertovana u genom arenavirusa kome nedostaje replikacija:

a. CMV glikoprotein gB ili

b. CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0104] Detaljan opis ovde opisanih antigena je obezbeđen u Odeljku 6.2.

[0105] U određenim izvođenjima, arenavirusi koji su korišćeni prema postupku koji se ovde opisuje mogu biti virusi Starog sveta, na primer, virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV). Detaljniji opis ovde opisanih arenavirusa je obezbeđen u Odeljku 6.1.

[0106] Ovde su obezbeđene nukleinske kiseline koje kodiraju genom takvih arenavirusa kojima nedostaje replikacija. Infektivna, čestica arenavirusa kojoj nedostaje replikacija može da obuhvati genomski segment koji se sastoji iz nukleotidne sekvence SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 44, ili SEQ ID NO: 49, ili SEQ ID NO: 50.

[0107] Ovde je opisan ekspresioni plazmid koji kodira jednu ili više komponenti neophodnih za dobijanje virusnog vektora. Ovde je obezbeđen ekspresioni vektor koji kodira LCMV S segment pri čemu je ORF za GP protein deletiran sa S segmenta i zamenjen je sa ORF humanog CMV glikoproteina gB sa skraćenim karboksi krajem (npr., ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 18 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 18).

[0108] Ovde su prikazani kompleti koji obuhvataju jedan ili dva ovde opisana vektorska plazmida. Komplet obuhvata a) ekspresioni plazmid koji kodira S segment LCMV vektora; b) ekspresioni plazmid koji kodira L segment LCMV vektora; i c) ekspresioni plazmid koji kodira dopunjujuću funkcionalnost. Komplet može da obuhvati a) ekspresioni vektor koji kodira LCMV S segment pri čemu je ORF za GP protein deletiran sa S segmenta i zamenjen je sa ORF humanog CMV glikoproteina gB sa skraćenim karboksi krajem (npr., ima aminokiselinsku sekvencu koja je predstavljena u SEQ ID NO: 18 ili aminokiselinsku sekvencu koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 18); b) ekspresioni plazmid koji kodira L segment LCMV vektora; i c) ekspresioni plazmid koji kodira LCMV GP protein (ili ćelijsku liniju koja eksprimira LCMV GP protein).

[0109] Ovde su takođe prikazane ćelijske linije, kulture i postupci kultivisanja ćelija koje su inficirane sa ovde obezbeđenim nukleinskim kiselinama, vektorima, i kompozicijama. Detaljniji opis ovde opisanih nukleinskih kiselina, vektorskih sistema i ćelijskih linija je obezbeđen u Odeljku 6.4.

[0110] Pronalazak koji se odnosi na taj način genetički modifikovane arenaviruse kojima nedostaje replikacija koji su pogodni kao vakcine i takvi arenavirusi za upotrebu u vakciniaciji i tretmanu ili prevenciji infekcija sa CMV ili reaktivaciji CMV. Detaljniji opis takvih arenavirusa koji su ovde opisani za upotrebu je obezbeđen u Odeljku 6.5.

[0111] U određenim izvođenjima, imunizacija sa infektivnim, arenavirusom kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegov fragment, kao što je ovde opisano obezbeđuje dugotrajan imunski odgovor. U određenim izvođenjima, maksimalni nivoi antitela se mogu razviti nakon dve imunizacije. U drugom izvođenju, treća imuinizacija se može primeniti za efekat pojačanja. Ovde su

2

prikazani rasporedi davanja korišćenjem infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija u vakcinaciji za lečenje i/ili prevenciju infekcija sa CMV ili reaktivaciji CMV. Detaljniji opis rasporeda davanja korišćenjem infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija kao što je ovde opisano je obezbeđen u Odeljku 6.5.

[0112] U određenim izvođenjima, primena seronegativnom subjektu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano indukuje detektabilan titar antitela za minimum od bar 4 nedelje. U drugom izvođenju, primena na subjektu inficiranom sa CMV infekcijom infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%. U određenim izvođenjima, primarno izlaganje antigenu pokreće funkcionalni, (neutrališući) i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz inficiranih imunih humanih subjekata. U specifičnijim izvođenjima, srednja geometrijska vrednost titra primarnih neutrališućih antitela se povećava do maksimuma vrednosti od najmanje 1:50, najmanje 1:100, najmanje 1:200, ili najmanje 1:1000 tokom najmanje 4 nedelja posle imunizacije. U drugom izvođenju, imunizacija sa infektivnim, arenavirusom kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano proizvodi visoke titre antitela koji traju najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, ili najmanje 5 godina posle imunizacije nakon jednog davanja vakcine.

[0113] U još drugom izvođenju, izlaganje sekundarnom antitelu povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%. U drugom izvođenju, izlaganje sekundarnom antitelu pokreće funkcionalni, (neutrališući) i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz inficiranih imunih humanih subjekata. U specifičnijim izvođenjima, srednja geometrijska vrednost titra sekundarnih neutrališućih antitela se povećava do maksimuma vrednosti od najmanje najmanje 1:50, najmanje 1:100, najmanje 1:200, ili najmanje 1:1000 tokom najmanje 4 nedelja posle imunizacije. U drugom izvođenju, druga imunizacija sa infektivnim, arenavirusom kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano proizvodi visoke titre antitela koji traju najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, ili najmanje 5 godina posle imunizacije.

[0114] U još drugom izvođenju, treća imunizacija za pojačanje povećava titar antitela za najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000%. U drugom izvođenju, imuizacija za pojačanje pokreće funkcionalni, (neutrališući) i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz inficiranih imunih humanih subjekata. U specifičnijim izvođenjima, treća imunizacija pojačanja pokreće funkcionalni, (neutrališući), i minimalni titar antitela od najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 300%, najmanje 400%, najmanje 500%, ili najmanje 1000% srednje vrednosti kontrolnog seruma iz inficiranih imunih humanih subjekata. U drugom izvođenju, a treća imunizacija pojačanja produžuje titar antitela za najmanje 4 nedelje, najmanje 8 nedelja, najmanje 12 nedelja, najmanje 6 meseci, najmanje 12 meseci, najmanje 2 godine, najmanje 3 godine, najmanje 4 godine, ili najmanje 5 godina posle imunizacije.

[0115] U određenim izvođenjima, infektivni arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegov fragment, pokreće odgovor koji je nezavisan od T ćelija ili je zavisan od T ćelija. U drugim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, pokreće T ćelijski odgovor. U drugim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome

2

nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano pokreće odgovor koji je posredovan pomoćničkim T ćelijama. U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano pokreće Th1-usmereni odgovor ili Th2-usmeren odgovor.

[0116] U specifičnijim izvođenjima, Th1-usmereni odgovor je naznačen predominantno sa IgG1 antitelima u odnosu na IgG2. U drugim izvođenjima odnos IgG1 :IgG2 je veći od 1:1, veći od 2:1, veći od 3:1, ili je veći od 4:1. U drugom izvođenju infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV antigen ili njegov fragment, kao što je ovde opisano je naznačen predominantno sa IgG3 antitelima.

[0117] U nekim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegov fragment pokreće CD8+ T ćelijski odgovor. U drugim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment pokreće odgovor regulatornih T ćelija. U specifičnijim izvođenjima, odgovor regulatornih T ćelija održava imunsku toleranciju. U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment pokreće oba odgovora CD4+ i CD8+ T ćelija.

[0118] U određenim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegov fragment, kao što je ovde opisano pokreće visoke titre neutrališućih antitela.

[0119] Dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV pokreću visoke titre neutrališućih antitela. Dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen pokreću visoke titre neutrališućih antitela u odnosu na infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira jedan antigen CMV ili njegov fragment.

[0120] Infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira dva, tri, četiri, pet, ili više antigena CMV pokreće visoke titre neutrališućih antitela u odnosu na infektivni arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira jedan CMV antigen ili njegov fragment.

6.1 Infektivni, arenavirusni vektori kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV [0121] Arenavirusi za upotrebu u postupcima i kompozicijama prema pronalasku mogu biti virusi Starog sveta, na primer Lassa virus, virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV), Mobala virus, Mopeia virus, ili Ippy virus, ili virusi Novog sveta, na primer Amapari virus, Flexal virus, Guanarito virus, Junin virus, Latino virus, Machupo virus, Oliveros virus, Parana virus, Pichinde virus, Pirital virus, Sabia virus, Tacaribe virus, Tamiami virus, Bear Canyon virus, ili Whitewater Arroyo virus. Genetički modifikovani virusi se mogu dobiti kao što je opisano u Odeljku 6.3.

[0122] Genom arenavirusa divljeg tipa se sastoji iz kratkog (∼3.4 kb) i velikog ( ∼7.2 kb) segmenta RNK. Kratak segment nosi ORF-a koji kodiraju gene za nukleoprotein NP i glikoprotein GP. Veliki segment kodira gene za RNK-zavisnu RNK polimerazu L i protein matriksa Z. Arenavirusi divljeg tipa se mogu održavati tako da imaju nedostatak u replikaciji da bi se generisali vektori vakcina supstitucijom gena za glikoproteni za jedan ili više antigena CMV, protiv kojih je potrebno indukovati imunske odgovore.

[0123] Infektivni, vektori arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV, ili kombinacija antigena CMV kao što je ovde opisano, mogu biti korišćeni za imunizaiju (na preparativni način) ili lečenje (na imunoterapeutski način) subjekata protiv CMV infekcije ili reaktivacije. U specifičnom izvođenju, korišćena je kombinacija gB i pp65.

2

[0124] Poznato je da arenavirusna bolest i imunska supresija kod infekcije arenavirusom divljeg tipa dovodi do neproverene virusne replikacije. Ukidanjem replikacije, tj., sposobnosti da se proizvede infektivno potomstvo virusnih čestica, arenavirusa delecijom iz njihovog genoma, npr., Z gena koji je neophodan za oslobađanje čestica, ili GP gena koji je neophodan za infekciju ciljanih ćelija, ukupan broj inficiranih ćelija može biti ograničen sa primenjenim inokulumom, npr., recipijentu vakcine, ili slučajno prenet osoblju koje je uključeno u medicinsku ili biotehnološku primenu, ili životinjama. Prema tome, ukidanje replikacije arenavirusnih vektora sprečava patogenezu kao rezultata namerne ili slučajne transmisije vektorskih čestica. U ovom pronalasku, jedan važan aspekt se sastoji u korišćenju gore navdene potrebe za ukidanjem replikacije na koristan način za svrhu ekspresije CMV antigena. U određenim izvođenjima, arenavirusna čestica se održava da bude sa nedostatkom replikacije genetičkom modifikacijom njegovog genoma. Takve modifikacije genoma mogu uključiti:

● deleciju ORF (npr., ORF koji kodira GP, NP, L, ili Z protein);

● funkcionalnu inaktivaciju ORF (npr., ORF koji kodira GP, NP, L, ili Z protein). Na primer, ovo se može postići uvođenjem mutacije sa pogrešnim smislom ili bez smisla (eng. missense ili nonsense);

● izmenom sekvence ORF (npr., razmenom SIP mesta cepanja sa mestom cepanja druge proteaze);

● mutagenezom jednog od 5’ ili 3’ kraja jednog od genomskih segmenata;

● mutagenezom intergenskog regiona (tj., L ili S genomskog segmenta).

[0125] U određenim izvođenjima, infektivni, ovde opisani arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV je virus limfocitnog horiomeningitisa (LCMV) pri čemu je S segment virusa modifikovan sa supstitucijom ORF koji kodira GP protein sa ORF koji kodira CMV antigen.

[0126] U određenim izvođenjima, genom vektora arenavirusa divljeg tipa (SL.1) može biti modifikovan tako da sadrži bar esencijalne regulatorne elemente na 5’ i 3’ netranslatirajućim regionima (UTRs) oba segmenta, i/ili takođe intergenske regione (IGRs). Bez želje za vezivanjem za teoriju, minimalni faktori za gensku ekspresiju sa trans delovanjem u inficiranim ćelijama ostaju u vektorskom genomu kao ORFs koji se mogu eksprimirati, koji se mogu postaviti drugačije u genomu i mogu se naći pod kontrolom različitog promotora u odnosu na prirodni, ili se mogu eksprimirati sa unutrašnjih mesta za ulazak ribozoma. U određenim izvođenjima, nukleinska kiselina koja kodira CMV antigen je transkribovana (tj. prepisana) sa jednog od endogenih arenavirusnih promotora (tj., 5’ UTR, 3’ UTR S segmenta, 5’ UTR, 3’ UTR L segmenta). U drugim izvođenjima, nukleinska kiselina koja kodira CMV antigen je eksprimirana sa heterolognih uvedenih sekvenci promotora koje se mogu čitati sa virusnom RNK-zavisnom RNK polimerazom, ćelijskom RNK polimerazom I, RNK polimerazom II ili RNK polimerazom III, kao što se duplikacije sekvenci virusnih promotora koji se prirodno nalaze u virusnim UTRs, promotoru 28S riboomalne RNK, promotoru beta-aktina ili promotoru 5S ribozomalne RNK, redom. U određenim izvođenjima ribonukleinske kiseline koje kodiraju CMV antigene se prepisuju i prevode translacijom u proteine ili samostalno ili kroz čitanje spajanjem sa ORF-a arenavirusnih proteina, i ekspresija proteina u ćeliji domaćina može da se pojača uvođenjem u virusni transkript sekvence na odgovarajućem mestu(ima) jednog ili više, npr., dva, tri ili četiri, unutrašnja mesta za ulazak ribozoma.

[0127] U određenim izvođenjima, vektor koji je generisan da kodira jedan ili više CMV antigena može da se zasniva na specifičnom soju LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP soj, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316, 810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihove derivate. U određenim izvođenjima, vektor koji je generisan da kodira jedan ili više CMV antigena može se zasnovati na LCMV Klonu 13. Vektor koji je generisan da kodira jedan ili više CMV antigena može biti zasnovan na LCMV MP soju. Sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je navedena kao SEQ ID NO: 32. U određenim izvođenjima, sekvenca S segmenta LCMV Klona 13 je sekvenca predstavljena u SEQ ID NO: 31. Sekvenca

2

L segmenta LCMV Klona 13 je navedena kao SEQ ID NO: 33. Sekvenca S segmenta LCMV soja MP je navedena kao SEQ ID NO: 53. Sekvenca L segmenta LCMV soja MP je navedena kao SEQ ID NO: 49.

[0128] Ovde je prikazana, infektivna čestica arenavirusa kojoj nedostaje replikacija koja se sastoji iz nukleotidne sekvence ili njenog fragmenta izabrane od SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 53, ili njihove kombinacije.

[0129] U određenim izvođenjima, ovde je opisana infektivna, čestica arenavirusa kojoj nedostaje replikacija koja se sastoji iz nukleotidne sekvence, ili kombinacije nukleotidnih sekvenci, izabranih iz grupe koja obuhvata :

● nukleotidnu sekvencu koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB ili;

● nukleotidnu sekvencu koja kodira citomegalovirusni tegument protein pp65 ili njegov antigenski fragment.

6.2 CMV Antigeni

[0130] Ovde su obezbeđeni CMV antigeni za upotrebu u postupcima prema pronalasku i za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama.

[0131] ORF-i koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više ovde opisanih CMV antigena mogu da se prepišu kao jedan transkript. ORF-i koji kodiraju CMV antigene na tom transkriptu mogu biti razdvojeni sa nukleinskom kiselinom koja kodira samocepajući peptid ili sekvencu za preskakanje ribozoma. Samocepajući peptid (ili sekvenca za preskakanje ribozoma) može se dobiti iz 2A proteina T iz člana familije virusa Picornaviridae. Samocepajući peptid se može dobiti iz (ili je izveden iz) Porcine teschovirus-12A, Thoseaasignavirus 2A, „Foot-and-mouth“ bolesti virusa 2A peptida, peptida 2A virusa konjskog rinitisa A.2A peptid koji je dobijen iz (ili je izveden iz) svinjskog teschovirus-12A ima najveću efikasnost cepanja. 2A peptid ima visoku efikasnost cepanja u kombinaciji sa ovde opisanim CMV antigenima uzvodno ili nizvodno u odnosu na 2A peptid.

[0132] ORF-i koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više CMV antigena mogu da budu razdvojeni sa sekvencom za preskakanje ribozoma. Sekvenca za preskakanje ribozoma je sekvenca hidrolaznog elementa sa cis-delovanjem.

[0133] ORF-i koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više CMV antigena mogu da budu razdvojeni sa samocepajućom proteazom dobijenom iz (ili koja je poreklom iz) tobacco etch virusa (TEVs) familije Potyviridae.

[0134] Gly-Ser-Gly linker može biti insertovan na N-kraju i C-kraju 2A peptida. Gly-Ser-Gly linker može biti insertovan na N-kraju 2A peptida. Gly-Ser-Gly linker može biti insertovan na C-kraju 2A peptida. Gly-Ser-Gly linker može da unapredi efikasnost cepanja 2A peptidom.

[0135] ORF-i koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više CMV antigena mogu biti razdvojeni sa unutrašnjim mestom za ulazak ribozoma. Unutrašnja mesta za ulazak ribozoma funkcionišu pod kontrolom uzvodnog promotora. Unutrašnje mesto za ulazak ribozoma može se dobiti od (ili izvesti od) virusa encefalomiokarditisa.

[0136] ORF koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet, ili više antigena CMV mogu biti razdvojeni sa 2A peptidom i mestom cepanja furinom.2A peptid može biti ograničen sa mestom cepanja furinom. Mesto cepanja furinom može biti locirano između ORF koji kodira antigen CMV i 2A peptida. Mesto cepanja furinom može biti dodato uzvodno od 2A peptida. Mesto cepanja furinom može biti dodato nizvodno od 2A

2

peptida. Mesto cepanja furinom može biti locitano u vektoru sa ORF koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet, ili više antigena CMV, samo-cepajući peptid, i njihove kombinacije. Konsenzusna sekvenca mesta cepanja furinom može biti R-X-K-/R-R. Mesto cepanja furinom je cepano sa maythe furin proteinom u trans goldži mreži. Mesto cepanja furinom može ukloniti 2A peptidnu sekvencu. Mesto cepanja furinom može ukloniti sekvencu samocepajućeg peptida na C-kraju. Na primer, videti Fang et al., Molecular Therapy.2007; 15(6):1153-1159.

[0137] ORF koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet, ili više ili više antigena CMV mogu biti razdvojeni sa 2A peptidom i obeleživačem. Obeleživač može biti vezan za 2A peptid. Obeleživač može biti locitan između 2A peptida i mesta cepanja furinom. Obeleživač može biti lociran u C-kraju ili N-kraju nishodnog ORF koji kodira antigen CMV. Obeleživač može biti lociran u C-kraju ili N-kraju uzvodnog ORF koji kodira antigen CMV. Obeleživač može biti lociran u vektoru sa ORFs koji kodiraju dva, tri, četiri, ili više CMV antigena, 2A peptid, mesto cepanja furinom, ili njihovu kombinaciju. Obeleživač može biti peptidni obeleživač. Obeleživač može biti V5 aminokiselinski obeleživač.

[0138] ORF koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više antigena CMV mogu biti razdvojeni sa 2A peptidom i sekvecom za odvajanje. Sekvenca za odvajanje može biti locirana uzvodno od 2A peptida. Sekvenca za odvajanje može biti locirana između ORFs koji kodira antigene CMV. Sekvenca za odvajanje može biti locirana između uzvodnog 2A peptida i obeleživača. Sekvenca za odvajanje može biti locirana između uzvodnog 2A peptida i nizvodnog mesta cepanja furinom. Sekvenca za odvajanje može biti locirana u vektoru sa ORFs koji kodiraju antigene CMV, samo-cepajući peptid, mesto cepanja furinom, obeleživač ili njihova kombinacija. Sekvenca za odvajanje povećava efikasnost cepanja.

[0139] ORFs koji kodiraju dva, tri, četiri, ili pet, ili više antigena CMV mogu biti razdvojeni nukleotidnom sekvencom koja kodira: samo-cepajući peptid, aminokiselinsku sekvencu koja dovodi do oslobađanja uzovdne aminokiselinske sekvence "preskakanjem ribozoma" ili elementom sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nizvodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta uslaska ribozoma" (IRES).

[0140] Bilo koji soj humanog CMV ili bilo koji klinički izolat CMV mogu biti korišćeni u predmetnom pronalasku da se dobiju antigeni za generisanje ovde opisanih arenavirusnih vektora. Takvi CMV sojevi uključuju AD-169, Merlin, C327A (GenBank M60929), C076A (GenBank M85228), i C194A (GenBank 60926). Drugi humani CMV sojevi i antigenske sekvence humanog CMV koje mogu biti korišćene sa predmetnim prikazanim kompozicijama su navedeni u Meyer-Koenig et al.1998, J Infect Dis 177:1162-1169; Shedlock et al.2012, Human Vaccines & Immunotherapuetics 8:1-14; i Chou and Dennison 1991, J Infect Dis 163:1229-34. Sekvence i sojevi su navedeni u Meyer-Koenig et al. 1998, J Infect Dis 177:1162-1169; Shedlock et al. 2012, Human Vaccines & Immunotherapuetics 8:1-14; and Chou i Dennison 1991, J Infect Dis 163:1229-34.

[0141] Antigen CMV može biti ortolog antigena CMV, npr., sisarski (tj., ne-humani primat, svinja, pas, mačka, ili konj) antigen CMV.

(a) gB antigeni

[0142] U određenim izvođenjima, antigen je glavni glikoprotein gB omotača CMV. Antigen može biti fragment od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 ili više aminokiselina glavnog glikoproteina gB omotača CMV. U određenim izvođenjima, transmembranski domen gB je deletiran. U nekim izvođenjima, citoplazmatski domen gB je deletiran. U određenim izvođenjima, citoplazmatski i transmembranski domeni glikoproteina gB su deletirani.

[0143] U specifičnim izvođenjima, antigen obuhvata gB antigenska mesta AS-2, AS-5 i AS-4. (Videti SL.

2). U određenim izvođenjima, gB antigen obuhvata antigenska mesta AS-2, AS-5, AS-4, i AS-1. U određenim izvođenjima, antigen obuhvata gB transmembranski domen. U određenim izvođenjima, antigen obuhvata gB antigenska mesta AS-2, AS-5, AS-4, i AS-1, kao i gB transmembranski domain. U određenim izvođenjima, antigen obuhvata gB ektodomen.

[0144] Antigen mož biti fuzioni protein između glikoproteina gB CMV ili njegovog fragmenta i heterolognog peptida. Antigen može biti najmanje 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, ili najmanje 900 aminokiselina dužine. Jedan ili više domena gB mogu biti supstituisani sa jednim ili više domena heterolognog proteina. Citoplazmatski domen gB može biti supstituisan sa citoplazmatskim domenom heterolognog proteina. Citoplazmatski domen i transmembranski domeni gB mogu biti supstituisani sa citoplazmatskim domenom heterolognog proteina. Citoplazmatski i transmembranski domeni gB mogu biti supstituisani sa citoplazmatskim i transmembranskim domenima heterolognog proteina. Citoplazmatski domena gB može biti supstituisan sa citoplazmatskim i transmembranskim domenima heterolognog proteina. Heterologni protein može biti glikoprotein iz RNK virusa. Heterologni protein može biti glikoprotein iz VSV. Heterologni protein može biti VSV-G. Heterologni protein može biti VSV-G protein divljeg tipa VSV. Heterologni protein može biti VSV-G protein VSV soja AV1 ili AV2. Heterologni protein može biti e VSV-G protein ili VSV Serotipa Indiana. Heterologni protein može biti VSV-G protein VSV soja MARM U, MARM M, MRr ili MRb. Antigen može biti kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 23. Antigen može sadržati sekvencu aminokiselina koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 21 ili SEQ ID NO: 24.

[0145] Antigen može sadržati gB antigenska mesta AS-2, AS-5 i AS-4 i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. Antigen može sadržati gB antigenska mesta AS-2, AS-5, AS-4, i AS-1 i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. T Antigen može sadržati gB antigenska mesta AS-2, AS-5, AS-4, AS-1, i AS-3 i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. Antigen može sadržati gB transmembranski domen i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. T Antigen može sadržati gB citoplazmatski domen i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. Antigen može sadržati gB antigenska mesta AS-2, AS-5, AS- 4, i AS-1, kao i gB transmembranski domen i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. Antigen može sadržati gB antigenska mesta AS-2, AS-5, AS-4, AS-1, i AS-3, kao i gB transmembranski domen a i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G. Antigen može sadržati gB ektodomen i heterologni transmembranski i citoplazmatski region koji je dobijen iz VSV-G.

[0146] Antigen može biti fuzioni protein između CMV glikoproteina gB ili njegovog fragmenta i heterolognog polipeptida. Antigen može da bude dužine bar 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800, ili 900 aminokiselina. Jedan ili više domena gB mogu biti supstituisani sa jednim ili više domena heterolognog proteina. Heterologni protein može biti glikoprotein virusa influence. Heterologni protein može biti protein hemaglutinin virusa influence (Flu-HA). Heterologni protein može biti hemaglutinin protein virusa influence A. Heterologni protein može biti hemaglutinin influenca B virusa. Heterologni protein može biti protein hemaglutinin influenca C virusa. Antigen može da bude kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 26 ili SEQ ID NO: 29. Antigen može da se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 27 ili SEQ ID NO: 30.

1

[0147] Antigen može da se sastoji iz gB antigenskih mesta AS-2, AS-5 i AS-4 i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB antigenskih mesta AS-2, AS-5, AS-4, i AS-1 i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji je dobijen iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB antigenskih mesta AS-2, AS-5, AS-4, AS-1, i AS-3 i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB transmembranskog domena i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB citoplazmatskog domena i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB antigenskih mesta AS-2, AS-5, AS- 4, i AS-1, kao i gB transmembranskog domena i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz gB antigenskih mesta AS-2, AS-5, AS-4, AS-1, i AS-3, kao i gB transmembranskog domena i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA. Antigen može da se sastoji iz ektodomena gB i heterolognog transmembranskog i citoplazmatskog regiona koji su dobijeni iz Flu-HA.

[0148] gB protein je iz CMV soj Merlin. Sekvence koje su date kao primer mogu se koristiti sa kompozicijama virusnog vektora i njihove upotrebe kao što je ovde prikazano su predstavljene u SEQ ID NO: 58 do 63. U određenim izvođenjima, antigen se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 60 ili SEQ ID NO: 63.

(b) Skraćeni gB antigeni

[0149] U određenim izvođenjima, karboksi kraj gB proteina je prekinut. U određenim izvođenjima, prekid u karboksi kraju gB proteina može biti dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 aminokiselina. U drugom izvođenju, prekid u karboksi kraju gB proteina može biti dužine 1-10, 10-20, 25-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, ili 120-134 aminokiselina. U drugim izvođenjima, prekid u karboksi kraju gB proteina može biti dužine 10-134, 20-134, 30-134, 40-134, 50-134, 60-134, 70-134, 80-134, 90-134, 100-134, 110-134, ili 120-134 aminokiselina.

[0150] U određenim izvođenjima, gB protein sa prekidom u karboksi kraju se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 3 preko čitave dužine prekinutog gB proteina. U specifičnijim izvođenjima, gB protein ima skraćenje (tj.prekid) između aminokiselina 772 do 906, i sastoji se iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 3 preko čitave dužine prekinutog gB proteina. U drugim izvođenjima, gB protein sa prekidom u karboksi-kraju se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

[0151] U određenim izvođenjima, gB protein ima deleciju na karboksi-kraju. U određenim izvođenjima delecija u karboksi kraju može biti dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123,

2

124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, ili 133 aminokiselina . U određenom izvođenju, delecija u karboksi kraju gB proteina može biti dužine 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-70, 70-80, 80-90, 90-100, 100-110, 110-120, 120-130, ili 130-133 aminokiselina. U drugim izvođenjima, delecija u karboksi kraju gB proteina može biti dužine 10-133, 20-133, 30-133, 40-133, 50-133, 60-133, 70-133, 80-133, 90-133, 100-133, 110-133, ili 120-133 aminokiselina.

[0152] U određenim izvođenjima, gB protein sa prekidom u karboksi kraju je još uvek usidren u membrani virona CMV.

(c) pp65 antigeni

[0153] U određenim izvođenjima, antigen je CMV protein pp65 tegumenta ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 ili više aminokiselina CMV proteina pp65 tegumenta ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, antigen je antigenski fragment pp65. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sa nukleinskom sekvencom koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 35. U određenim izvođenjima, antigen se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 36.

(d) Pentamerni kompleks antigena

[0154] Izvođenja koja su navedena u ovom odeljku (d) ne obrazuju deo izvođenja.

[0155] U određenim izvođenjima, antigen je glikoprotein gH CMV ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je fragment od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 ili više aminokiselina glikoproteina gH CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, gH nedostaje transmembranski domen. U određenim izvođenjima, antigen sadrži samo gH ektodomen. U određenim izvođenjima, antigen je antigenski fragment gH. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identičan sa SEQ ID NO: 38. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 51.

[0156] U određenim izvođenjima, antigen je derivat fragmenta gH glikoproteina. U određenim izvođenjima antigen je antigenski fragment gH sa delecijom C-terminalne sekvence sidrenja u membrani, gH(dTM).

[0157] U određenim izvođenjima, antigen je gL glikoprotein CMV ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je fragment od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 ili viđe aminokiselina gL CMV glikoproteina ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, antigen je fragment gL antigena. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sa sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 40.

[0158] U određenim izvođenjima, antigen je protein pentamernog kompleksa ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena koji kodira protein pentamernog kompleksa CMV ili njegov fragment. U određenim specifičnijim izvođenjima, protein pentamerog kompleksa je CMV UL128 ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je antigenski fragment UL128. U određenim specifičnijim izvođenjima, protein pentamernog kompleksa je CMV UL130 ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je antigenski fragment UL130. U određenim specifičnijim izvođenjima, protein pentamernog kompleksa je CMV UL131A ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, antigen je antigenski fragment UL131A. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 42. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 45. U određenim izvođenjima, antigen je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 47.

[0159] Sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen CMV antigen mogu se uvesti u genom infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju supstituisanjem sekvence nukleinske kiseline ORF (ORF) glikoproteina GP, matriksnog proteina Z, nukleoproteina NP, ili polimeraznog proteina L. U drugim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CMV antigen je spojena sa ORF (ORF) glikoproteina GP, proteina matriksa Z, nukleoproteina NP, ili polimeraznog proteina L. Nukleotidna sekvenca koja kodira CMV antigen, kada je jednom insertovana u genom infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, može se prepisati i/ili eksprimirati pod kontrolom četiri promotora arenavirusa (5’ UTR i 3’ UTR S segmenta, i 5’ UTR i 3’ UTR L segmenta), kao i ribonukleinske kiseline koje mogu biti insertovane sa regulatornim elementima koji se mogu čitati od strane virusne RNK-zavisne RNK polimeraze, ćelijske RNK polimeraze I, RNK polimeraze II ili RNK polimeraze III, kao što su duplikacije sekvenci virusnih promotora koje se prirodno mogu naći u virusnim UTR-a, promotoru 28S ribozomske RNK, promotoru beta-aktina ili promotoru 5S ribozomske RNK, redom. Nukleinske kiseline koje kodiraju CMV antigen se mogu prepisati i/ili eksprimirati ili same ili putem čitanja kao fuzije sa arenavirusnim ORF-a i genima, redom, i/ili u kombinaciji sa jednim ili više, npr., dva, tri ili četiri, unutrašnja mesta za ulazak u ribozom.

[0160] U jednom izvođenju, antigen je onaj koji je koristan za prevenciju infektivne bolesti. U specifičnom izvođenju, antigen je izveden iz CMV. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH ili gL. U specifičnijim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira gH i gL su razdvojene sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira 2A peptid. U drugim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira gH i gL su razdvojene sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira 2A peptid i grupu za odvajanje. U specifičnijim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju gH i gL su razdvojene sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira 2A peptid i mesto cepanja furina. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju gH i gL su razdvojene sa 2A peptidom koji je spojen sa obeleživačem (eng. tag), kao što je, V5 aminokiselinski obeleživač i cepanje furinom locirano uzvodno od 2A peptida. U određenim izvođenjima, sekvenca nukleinskih kiselina koje kodiraju gH i gL je razdvojena sa 2A peptidom, mestom cepanja furinom spojenim sa obeleživačem, kao što je, V5 aminokiselinski obeleživač, i grupu za odvajanje. U specifičnim izvođenjima grupa za odvajanje je uzvodno od 2A peptida. U još specifičnijim izvođenjima grupa za odvajanje je uzvodno od 2A peptida između 2A peptida i obeleživača.

[0161] U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju glikoprotein gH (dTM) i glikoprotein gL su razdvojene sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira samocepajući peptid. U određenim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira glikoprotein gH (dTM) i glikoprotein gL su razdvojene sa 2A peptidom. U određenim izvođenjima sekvenca nukleinske kiseline koja kodira glikoprotein gH (dTM) i glikoprotein gL su povezane sa 2A peptidom koji je spojen sa obeleživačem, kao što je V5.

4

[0162] U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više CMV pentamernih proteinskih kompleksa su razdvojeni sa samocepajućim peptidom. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CMV proteine pentamernog kompleksa su spojene sa 2A peptidom. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CMV proteine pentamernog kompleksa su spojene sa 2A peptidom spojenim sa obeleživačem. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju CMV proteine pentamernog kompleksa su spojene sa 2A peptidom spojenim sa V5 aminokiselinskim obeleživačem.

[0163] U određenim izvođenjima, sekvence nukelinskih kiseline koje kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više proteina pentamernog kompleksa CMV su razdvojeni sa samo cepajućem peptidom, aminokiselinska sekvenca koja dovodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence sa "preskakanjem ribozoma", ili elementom sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nizvodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta ulaska ribozoma" (IRES). U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više proteina pentamernog kompleksa CMV su razdvojeni sa samocepajućim peptidom, aminokiselinskom sekvencom koja dovodi do oslobađanja uzvodne aminokiselinske sekvence sa "preskakanjem ribozoma", ili elementom sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nizvodne sekvence kao što su "unutrašnja mesta za ulaz ribozoma" (IRES).

[0164] U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više proteina pentamernog kompleksa CMV su razdvojene sa samocepajućim peptidom i mestom cepanja furina. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju dva, tri, četiri, ili pet ili više proteina pentamernog kompleksa CMV su razdvojeni sa samocepajućim peptidom spojenim sa obeleživačem, kao što je, V5 aminokiselinski obeleživač, i mestom cepanja furina. U određenim izvođenjima, sekvence nukleinskih kiselina koje kodiraju proteine pentamernog kompleksa CMV su razdvojene sa samo-cepajućim peptidom spojenim sa obeleživačem, kao što je, V5 aminokiselinski obeleživač, mesto cepanja furinom, i grupa za odvajanje. U specifičnim izvođenjima grupa za odvajanje je uzvodno od samocepajućeg peptida.

(e) Supstitucija ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa

[0165] Izvođenja kojа su navedena u ovom odeljku (e) ne čine deo pronalaska.

[0166] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira jedan, dva, tri, četiri, ili pet ili više ovde opisanih CMV antigena. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira dva, tri, četiri, ili pet ili više ovde opisanih CMV antigena, koje su razdvojeni sa samocepajućim peptidima ili sekvencama za preskakanje ribozoma. U određenim izvođenjima, samocepajući peptid (ili sekvenca za preskakanje ribozoma) može se dobiti od 2A proteina iz člana familije virusa Picornaviridae. U određenim specifičnim izvođenjima, samocepajući peptid (ili sekvenca za preskakanje ribozoma) je dobijen od (ili je izveden od) Porcine teschovirus-12A, Thoseaasignavirus 2A, ili bolesti „Foot-and-mouth“ virusnog 2A peptida.

[0167] U jednom izvođenju, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koja kodira CMV antigen. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za glavni glikoprotein gB omotača CMV ili njegov fragment. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigenski fragment gB. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na glavni glikoprotein gB omotača ili fragment gB.

[0168] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigen koji je fuzioni protein između gB i VSV-G. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, ili najmanje 700 aminokiselina dužine. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 20 ili SEQ ID NO: 23. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira za aminokiselinu koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 21 ili 24.

[0169] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigen koji je fuzioni protein između gB i hemaglutinina virusa influence. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, ili najmanje 700 aminokiselina dužine. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 26 ili 29. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira aminokiselinu koja je 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 27 ili 30.

[0170] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigen koji je fragment od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za protein pp65 tegumenta CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigenski fragment pp65. U određenim izvođenjima, ORF toji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na pp65 ili fragment pp65.

[0171] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 500, 600, 700 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za glikoprotein gH CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigenski fragment gH. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na gH ili fragment gH.

[0172] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za glikoprotein gL CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigenski fragment gL. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na gL ili fragment gL.

[0173] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za pentamerni kompleks proteina UL128 CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigenski fragment UL128. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na UL128 ili fragment UL128.

[0174] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za UL130 CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigenski fragment UL130. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na UL130 ili fragment UL130.

[0175] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigen koji je fragment od bar najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 ili više aminokiselina genskog proizvoda gena za protein pentamernog kompleksa UL131A CMV ili njegovog fragmenta. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein virusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigenski fragment UL131A. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencama nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene uključujući, ali bez ograničenja na UL131A ili fragment UL131A.

[0176] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira dva, tri, četiri, ili pet proteina pentamernog kompleksa ili fragmenata od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 ili više njihovih aminokiselina, razdvojenih sa samocepajućim peptidom ili sekvencama za preskakanje ribozoma ili elementom sekvence koja dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U specifičnim izvođenjima, samocepajući peptidi ili sekvence za preskakanje ribozoma su peptidi Teschovirus 2A (T2A).

[0177] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH, gL, UL128, UL130, i UL131A. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH i gL. U određenim izvođenjima, ORF U određenim izvođenjima gH, gL, UL128, UL130, i UL131A, su razdvojeni sa samo-cepajućim peptidom ili sekvencom za preskakanje ribozoma ili elementom sekvence koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH, gL, UL128, UL130, i UL131A, odvojenom sa T2A. U određenim izvođenjima, otvoreni okvir čitanja koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH i gL sa T2A.

[0178] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira ektodomen gH, gL, UL128, UL130, i UL131A. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira ektodomen gH i gL. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira ektodomen gH, gL, UL128, UL130, i UL131A, koji su razdvojeni sa samocepajućim peptidom ili sekvencom za preskakanje ribozoma ili sekvencom elementa koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira gH i gL, koja je razdvojena sa T2A. U određenim izvođenjima ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira ektodomen gH i gL, razdvojenom sa T2A.

[0179] U određenim drugim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira dva, tri, četiri, pet, šest, ili sedam CMV antigena, fuzionih proteina CMV antigena sa heterolognim sekvencama ili fragmentima od najmanje 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150 ili više njihovih aminokiselina, koji su razdvojeni sa samocepajućim peptidima ili sekvencama za preskakanje ribozoma ili sekvencom elementa koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U specifičnim izvođenjima, samocepajući peptidi su peptidi Teschovirus 2A (T2A).

[0180] U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više od gB ili njegov antigenski fragment, pp65 ili njegov antigenski fragment, gH ili njegov antigenski fragment, gL ili njegov antigenski fragment, UL128 ili njegov antigenski fragment, UL130 ili njegov antigenski fragment, i UL131A ili njegov antigenski fragment. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više od gB ili njegov antigenski fragment, pp65 ili njegov antigenski fragment, gH ili njegov antigenski fragment, gL ili njegov antigenski fragment, UL128 ili njegov antgenski fragment, UL130 ili njegov antigenski fragment, i UL131A ili njegov antigenski fragment, razdvojeni sa samocepajućim peptidom ili sekvencom za preskakanje ribozoma ili sekvencom elementa koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira jedan ili više od gB ili njegov antigenski fragment, pp65 ili njegov antigenski fragment, gH ili njegov antigenski fragment, gL ili njegov antigenski fragment, UL128 ili njegov antigenski fragment, UL130 ili njegov antigenski fragment, i UL131A ili njegov antigenski fragment, koji su razdvojeni sa T2A. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira više od jedne kopije ovde navedenih CMV antigena. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira više od jedne kopije ovde navedenih CMV antigena, koji su razdvojeni sa samocepajućim peptidom ili sekvencom za preskakanje ribozoma ili sekvencom elementa koji dovodi do vezivanja ribozoma i translacije nishodne sekvence kao što je IRES. U određenim izvođenjima, ORF koji kodira glikoprotein arenavirusa je supstituisan sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira više od jedne kopije ovde navedenih CMV antigena, koji je razdvojen sa T2A.

6.3 Generisanje infektivnog, arenavirusa sa nedostatkom replikacije koji eksprimira CMV antigen [0181] Generalno, čestice arenavirusa se mogu rekombinantno proizvesti standardnim postupcima reverznom genetikom kao što je opisano za LCMV (L. Flatz, A. Bergthaler, J. C. de la Torre, i D. D. Pinschewer, Proc Natl Acad Sci USA 103:4663-4668, 2006; A. B. Sanchez i J. C. de la Torre, Virology 350:370, 2006; E. Ortiz-Riano, B.Y. Cheng, J. C. de la Torre, L. Martinez-Sobrido. J Gen Virol.94:1175-88, 2013). Da bi se generisali infektivni, arenavirusi kojima nedostaje replikacija za upotrebu sa predmentnim pronalaskom mogu se koristiti ovi postupci, međutim, genom dobijeni virus je modifikovan kao što je opisano u Odeljku 6.1. Ovde modifikacije mogu biti: i) jedna ili više, npr., dve, tri ili četiri, od četiri arenavirusna ORF-a (glikoprotein (GP); nukleoprotein (NP); matriksni protein Z; RNK-zavisna RNK polimeraza L) su deletirani ili su funkcionalno inaktivirani da bi se sprečilo obrazovanje infektivnih čestica kod normalnih ćelija iako se i dalje omogućava genska ekspresija kod ćelija domaćina koji su inficirani sa arenavirusnim vektorom; i ii) nukleinske kiseline koje kodiraju za CMV antigene mogu biti uvedene. Infektivni, ovde opisani virusi kojima nedostaje replikacija mogu se proizvesti kao što je opisano u objavi međunarodne prijave patenta br. WO 2009/083210 (prijavni broj PCT/EP2008/010994).

[0182] Jednom kada su generisani iz cDNK, infektivni, ovde obezbeđeni arenavirusi kojima nedostaje replikacija mogu se propagirati u komplementarnim ćelijama. Komplementarne ćelije koje obezbeđuju funkcionalnost koja je bila eliminisana iz arenavirusa kome nedostaje za replikaciju modifikovanjem njegovog genoma (npr., ORF koji kodira za GP protein je deletiran ili je funkcionalno inaktiviran, komplementarna ćelija obezbeđuje GP protein).

[0183] Zahvaljujući uklanjanju ili funkcionalnoj inaktivaciji jednog ili više virusnih gena u arenavirusnim vektorima (ovde delecija glikoproteina, GP, će biti uzeta kao primer), arenavirusni vektori se mogu generisati i proširiti u ćelijama obezbeđujući in trans deletirane virusne gen(e), npr., GP u predmetnom primeru. Takva komplementarna ćelijska linija, koja je ovde naznačena sa C-ćelije, je generisana transfekcijom sisarske ćelijske linije kao što je BHK-21, HEK 293, VERO ili druge (ovde će se BHK-21 uzeti za primer) sa jednim ili više plazmidom(a) za ekspresiju virusnih gen(a) od interesa (komplementaran plazmid, naznačen sa C-plazmid). C-plazmid(i) koji eksprimiraju virusne gen(e) deletirane u arenavirusnom vektoru koji se treba generisati da bude pod kontrolom jedne ili više ekspresionih kaseta pogodnih za ekspresiju kod sisarskih ćelja, npr., promotor sisarske polimeraze II kao što je CMV ili EF1alfa promotor sa signalnom za poliadenilaciju. Dodatno, komplementarni plazmid obuhvata sisarski marker selekcije, npr., rezistenciju na puromicin, pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za gensku ekspresiju kod sisarskih ćelija, npr., ekspresiona kaseta polimeraze II kao što je navedeno gore u tekstu, ili virusni genski transkript(i) su praćeni sa unutrašnjim mestom ulaska ribozoma, kao što je kod virusa encefalomiokarditisa, praćeno sa sisarskim markerom rezistencije. Za proizvodnju kod E. coli, plazmid dodatno obuhvata bakterijski selekcioni marker, kao što je kaseta rezistencije na ampicilin.

[0184] Ćelije koje se mogu koristiti, npr., BHK-21, HEK 293, MC57G ili druge, su održavane u kulturi i transfektovane su sa komplementarnim plazmidom(ima) korišćenjem bilo koje od uobičajeno korišćenih strategija kao što je kalcijum fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektroporacija. Nekoliko dana kasnije pogodan marker selekcije, npr., puromicin, je dodat u titriranim koncentracijama. Preživeli klonovi su izolovani and subklonirani prateći standardne procedure, C-ćelijski klonovi sa visokom ekspresijom su identifikovani korišćenjem postupaka „Western blot“ ili protočne citometrije sa antitelima koja su usmerena protiv virusnih protein(a) od interesa. Kao alternativa korišćenju stabilno transfektovanih C-ćelija prolazna transfekcija normalnih ćelija može komplementirati virusne gen(e) koji nedostaju u svakom od koraka ispod u kojima će se koristiti C-ćelije. Dodatno, pomoćnički virus se može koristiti da bi se obezbedila nedostajuća funkcionalnost in trans.

[0185] Plazmidi koji se mogu koristiti mogu biti dva tipa: i) Dva plazmida, naznačena sa TF-plazmidi za za intraćelijsko eksprimiranje u C-ćelijama minimalnih faktora arenavirusa sa trans delovanjem, su izvedeni iz npr., NP i L proteina LCMV u predmetnom primeru; i ii) Plazmidi, naznačeni sa GS-plazmidi, za intraćelijsko eksprimiranje u C-ćelijama segmenata genoma arenavirusnog vektora, npr., segmenata sa dizajniranim modifikacijama. TF-plazmidi eksprimiraju NP i L proteine odgovarajućeg arenavirusnog vektora pod kontrolom ekspresione kasete koja je pogodna za ekspresiju proteina kod sisarskih ćelija, uobičajeno npr., promotora sisarske polimeraze II kao što je CMV ili EF1alfa promotor, bilo koji od njih preferencijalno u kombinaciji sa signalnom za poliadenilaciju. GS-plazmidi eksprimiraju male (S) i velike (L) genomske segmente vektora. Obično se mogu koristiti ekspresione kasete vođene polimerazom I ili ekspresione kasete vođene RNK polimerazom bakteriofaga T7, pri čemu je poslednja preferancijalno sa 3’-terminalnim ribozimom za obradu primarnog transkripta da se dobije ispravan kraj. U slučaju korišćenja sistema zasnovanog na T7, ekspresija T7 u C-ćelijama mora biti obezbeđena ili uključivanjem u postupak oporavka dodatnog ekspresionog plazmida, konstruisanog analogno sa TF-plazmidima, obezbeđivanjem T7, ili su C-ćelije konstruisane da dodatno eksprimiraju T7 na stabilan način. U određenim izvođenjima, TF i GS plazmidi mogu biti isti, tj. genomska sekvenca i faktori sa trans delovanjem se mogu transkribovati od strane T7, poll i polII promotora sa jednog plazmida.

[0186] Za dobijanje arenavirusnog vektora, mogu se koristiti sledeći postupci. Prvi dan: C-ćelije, uobičajeno 80% konfluentne u bunarićima M6 ploča, su transfektovane sa smešom dva TF-plazmida plus dva GS-plazmida. U određenim izvođenjima, TF i GS plazmidi mogu biti isti, tj. genomske sekvence i faktori sa transdelovanjem mogu se prepisati sa promotora T7, poll i polII jednog plazmida. Za ovo se može koristiti bilo koja od uobičajeno korišćenih strategija kao što je kalcijum fosfat, protokoli koji su zasnovani na lipozomu ili elektroporacija.

[0187] 3-5 dana kasnije: Supernatant iz kulture (preparat arenavirusnog vektora) je sakupljen, podeljen u alikvote i skladišten na 4°C, -20°C ili -80°C u zavisnosti od toga koliko dugo arenavirusni vektor treba da se skladišti pre korišćenja. Nakon toga se infektivni titar arenavirusnog vektorskog preparata ispituje sa testom imunofokusiranja na C-ćelijama.

[0188] Ćelijska kultura može biti inficirana sa infektivnim, arenavirusom kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen. Kada se koriste za ekspresiju antigena CMV u kultivisanim ćelijama, sledeća dva postupka se mogu koristiti:

i) Ćelijski tip od interesa je inficiran sa ovde opisanim preparatom arenavirusnog vektora kod višestruke infekcije (MOI) od jedan ili više, npr., dva, tri ili četiri, dovodeći do proizvodnje antigena CMV u svim ćelijama ubrzo nakon infekcije.

ii) Alternativno, može se koristiti niži MOI i individualni ćelijski klonovi mogu biti izabrani za njihov nivo virusom vođene ekspresije CMV antigena. Zatim se pojedinačni klonovi mogu beskonačno proširiti zahvaljujući ne-citolitičke prirode arenavirusnih vektora. Bez obzira na pristup, CMV antigen može nakon toga da se sakupi (i prečisti) ili iz supernatanta kulture ili iz samih ćelija, u zavisnosti od svojstava proizvedenog antigena CMV. Međutim, pronalazak nije ograničen na ove dve strategije, i mogu se uzeti u obzir drugi načini pokretanja ekspresije CMV antigena korišćenjem infektivnih, arenavirusa kojima nedostaje replikacija kao vektora.

6.4 Nukleinske kiseline, vektorski sistemi i ćelijske linije

[0189] Ovde je prikazana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira veliki genomski segment (L segment) infektivnog, ovde opisanog arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, u kome je ORF genomskog segmenta deletiran ili je funkcionalno inaktivisan, i genomski segment se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira CMV antigen.

[0190] U jednom izvođenju, ovde je opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, u kome jedan ORF genomskog segmenta je deletiran i u kome kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira CMV antigen. U drugom izvođenju, ovde je opisana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, u kome je ORF gena za glikoprotein deletiran is deleted i u kome kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira CMV antigen. U određenim, specifičnijim izvođenjima, CMV antigen je antigen koji se opisuje u Odeljku 6.2.

[0191] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene sekvence nukleinske kiseline se mogu dobiti od određenog soja LCMV. Sojevi LCMV uključuju Klon 13, MP soj, Arm CA 1371, Arm E-250, WE, UBC, Traub, Pasteur, 810885, CH-5692, Marseille #12, HP65-2009, 200501927, 810362, 811316, 810316,

4

810366, 20112714, Douglas, GR01, SN05, CABN i njihovi derivati. U specifičnim izvođenjima, nukleinska kiselina je dobijena od LCMV klona 13. U određenim specifičnim izvođenjima, nukleinska kiselina je dobijena od LCMV MP soja.

[0192] Nukleinska kiselina koja kodira arenavirusni genomski segment može da se sastoji iz sekvence koja je bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa sekvencom SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 25, OR SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 44, ili SEQ ID NO: 50. U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena nukelinska kiselina koja kodira arenavirusni genomski segment koji se sastoji iz (i) nukleotidne sekvence koja je bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa sekvencom nukleotida 1639 do 3315 SEQ ID NO: 31; i (ii) nukleotidna sekvenca koja kodira CMV antigen.

[0193] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena nukleinska kiselina koja kodira arenavirusni genomski segment koji se sastoji iz (i) nukleotidne sekvence koja kodira proizvod ekspresije čija je aminokiselinska sekvenca bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom koja je kodirana sa 1639 do 3315 SEQ ID NO: 31; i (ii) nukleotidna sekvenca koja kodira CMV antigen.

[0194] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena nukleinska kiselina koja kodira arenavirusni genomski segment koji se sastoji iz (i) nukleotidne sekvence koja je bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa sekvencom nukleotida 1640 do 3316 of SEQ ID NO: 32; i (ii) nukleotidnom sekvencom koja kodira CMV antigen.

[0195] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena nukleinska kiselina koja kodira arenavirusni genomski segment koji se sastoji iz (i) nukleotidne sekvence koja kodira proizvod ekspresije čija je aminokiselinska sekvenca bar 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, bar 99%, ili 100% identična sa sekvencom nukleotida 1640 do 3316 SEQ ID NO: 32; i (ii) nukleotidnom sekvencom koja kodira CMV antigen

[0196] Nukleinske kiseline mogu kodirati arenavirusni genomski segment koji se sastoji iz (i) nukleotidne sekvence koja kodira bar jedan samo-cepajući peptid (ili sekvencu za preskakanje ribozoma); i (ii) nukleotidne sekvence koja kodira dve, tri, četiri, pet, ili više CMV antigena. Nukleotidna sekvenca koja kodira samo-cepajući peptid može kodirati Teschovirus 2A. Nukleinske kiseline mogu kodirati dva, tri, četiri, ili pet pentamernih kompleksa proteina razdvojenih sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju samo-cepajuće peptide (ili sekvence za preskakanje ribozoma) (npr., T2A). Nukleinske kiseline mogu kodirati jedan ili više gB proteina ili njihovih fragmenata i jedan ili više drugih CMV antigena, razdvojenih sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju samocepajuće peptide (ili sekvence za preskakanje ribozoma). Nukleinske kiseline mogu kodirati jedan ili više pp65 proteina ili njihovih fragmenata i jedan ili više drugih CMV antigena, razdvojenih sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju samo-cepajuće peptide (ili sekvence za preskakanje ribozoma). Nukleinske kiseline mogu kodirati jedan ili više pentamernih proteina ili njihovih fragmenata i jedan ili više drugih CMV antigena, razdvojenih sa jednom ili više nukleotidnih sekvenci koje kodiraju samo-cepajuće peptide (ili sekvence za preskakanje ribozoma).

[0197] Ovde je prikazan vektorski sistem koji se sastoji iz jednog ili više vektora koji zajedno kodiraju genom ovde opisane infektivne, arenavirusne čestice koja je deficijentna za replikaciju. Specifično, ovde je prikazan vektorski sistem gde jedan ili više vektora kodiraju dva arenavirusna genomska segmenta, to jest L segment i S segment, infektivnog, ovde opisanog arenavirusa kome nedostaje za replikaciju. Takav vektorski sistem može da kodira (na jednom ili više odvojenih molekula DNK):

[0198] S genomski segment arenavirusa koji je modifikovan tako da arenavirusna čestica koja nosi ovaj modifikovani S genomski segment ne može da proizvodi infektivno potomstvo virusnih čestica i L genomski segment arenavirusa koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira (u sens ili antisens) CMV antigen;

[0199] L genomski segment arenavirusa koji je modifikovan tako da arenavirusna čestica koja nosi ovaj modifikovani L genomski segment ne može da proizvodi infektivno potomstvo virusnih čestica i S genomski segment arenavirusa koji sadrži nukelotidnu sekvencu koja kodira (u sens ili antisens) CMV antigen;

[0200] S genomski segment arenavirusa koji je modifikovan tako da arenavirusna čestica koja nosi ovaj modifikovani S genomski segment ne može da proizvodi infektivno potomstvo virusnih čestica i pri čemu S genomski segment arenavirusa sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira (u sens ili antisensu) CMV antigen i L genomski segment divljeg tipa arenavirusa; ili

[0201] L genomski segment arenavirusa koji je modifikovan tako da arenavirusna čestica nosi ovaj modifikovani L genomski segment ne može da proizvede infektivne čestice potomstva virusa i pri čemu L genomski segment arenavirusa se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira (u sens ili antisens) CMV antigen i divlji tip S genomskog segmenta arenavirusa.

[0202] U određenim izvođenjima, sekvenca nukleinske kiseline kodira genomski segment arenavirusa (npr., LCMV) u kome je ORF koji kodira GP S genomskog segmenta supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment;

• nukleotidna sekvenca koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment;

[0203] Ovde je prikazana sekvenca nukleinske kiseline koja kodira arenavirus (npr., LCMV) genomski segment u kome ORF koji kodira GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira jednu ili više antigenskih sekvenci CMV-a (npr., jednu ili više od onih koje su navedene u gornjem paragrafu), razdvojene sa nukleotidnim sekvencama koje kodiraju za peptid koji se sam cepa (ili sekvence za preskakanje ribozoma). Nukleotidne sekvence koje kodiraju za samocepajući peptid mogu kodirati Teschovirus 2A.

[0204] U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena ćelija pri čemu ćelija sadrži nukleinsku kiselinu ili vektorski sistem koji je opisan gore u ovom odeljku. Ćelijske linije dobijene iz takvih ćelija, kulture koje se sastoje iz takvih ćelija, i postupci za kultivisanje inficiranih ćelija su ovde takođe obezbeđeni. Ćelija može da sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira veliki genomski segment (L segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, u kome je jedan ORF u genomskom segmentu deletiran ili je funkcionalno inaktiviran, i genomski segment se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira CMV antigen.

[0205] U drugim izvođenjima, ovde je obezbeđena ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF genomskog segmenta deletiran i gde kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antigen gB CMV-a ili njegov antigenski fragment.

[0206] Ovde je prikazana ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF iz genomskog segmenta deletiran ili funkcionalno inaktiviran i u kome kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira spojeni protein koji se sastoji iz bar jednog domena od antigena gB CMV-a i heterolognog domena iz VSV-G.

[0207] Ovde je prikazana ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) infektivnog, ovde opisanog arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF u segmentu genoma deletiran ili je funkcionalno inaktiviran i u kome kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira spojeni protein koji se sastoji iz bar jednog domena iz gB antigena CMV-a i heterolognog domena iz Flu-HA.

[0208] U drugim izvođenjima, ovde je obezbeđena ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) infektivnog, ovde opisanog arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF u segmentu genoma deletiran i u kome kratak segment genoma sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira antigen pp65 CMV ili njegov antigenski fragment.

[0209] Ovde je prikazana ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF segmenta genoma deletiran ili je funkcionalno inaktiviran i pri čemu kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više CMV antigena gH, gL, UL128, UL130, UL131A, ili njihovih antigenskih fragmenata. Genomski segment može da se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira jedan ili više od grupe antigena CMV koja obuhvata gH, gL, UL128, UL130, UL131A, ili njihove antigenske fragmente, razdvojene sa jednim ili više samo-cepajućih peptida (ili sekvencama za preskakanje ribozoma). Jedan ili više samo-cepajućih peptida mogu biti T2A peptidi.

[0210] Ovde je prikazana ćelija pri čemu ćelija sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira kratak genomski segment (S segment) ovde opisanog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija, u kome je jedan ORF segmenta genoma deletiran ili je funkcionalno inaktiviran a i pri čemu kratak genomski segment sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više CMV antigena razdvojenih sa jednim ili više samo-cepajućim peptidima (ili sekvencama za preskakanje ribozoma). Jedan ili više samo-cepajućih peptida mogu biti T2A peptidi.

[0211] U drugom izvođenju, je ćelija pri čemu ćelija sadrži dve nukleinske kiseline ili ovde opisana vektorska sistema. Ćelijske linije koje su dobijene iz takvih ćelija, kulture koje se sastoje iz takvih ćelija, i postupci za kultivaciju takvih inficiranih ćelija su ovde takođe prikazani.

[0212] Ovde je prikazana nukleinska kiselina koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična sa SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 53. Ovde je prikazan ekspresioni vektor koji se sastoji iz nukleotidne sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 53. Ovde je prikazana ćelija domaćina koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 49 ili SEQ ID NO: 53.

[0213] Ovde je prikazana nukleinska kiselina koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57. Ovde je prikazan ekspresioni vektor koji se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57. Ovde je prikazana ćelija domaćina koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu koja je

4

najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57.

[0214] Ovde je prikazan izolovani protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57. Ovde je prikazana ćelija domaćina koja eksprimira protein koji se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična T mogu biti SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57. Ćelija domaćina može biti kultivisana u medijumu za ćelijsku kulturu.

[0215] U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđen ekspresioni vektor koji se sastoji iz nukleotidne sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 33. U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđena ćelija domaćina koja se sastoji iz nukleotidne sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 32 ili SEQ ID NO: 33.

6.5 Upotreba u postupcima

[0216] U jednom izvođenju, ovde su obezbeđeni jedan ili više infektivnih, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde obezbeđeno ili njegova kompozicija za upotrebu u postupcima za lečenje infekcije kod subjekta koji obuhvataju davanje subjektu jednog ili više infektivnog arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano ili njihove kompozicije. U specifičnom izvođenju, pomenuti ovde opisani postupak za lečenje infekcije obuhvata davanje subjektu kome je potrebno efikasne količine jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano ili njihove kompozicije. Subjekat može biti sisar, kao što je ali bez ograničenja na humano biće, miš, pacov, zamorac, domaća životinja, kao što je, ali bez ograničenja, krava, konj, ovca, svinja, koza, mačka, pas, hrčak, magarac. U specifičnom izvođenju, subjekat je čovek.

[0217] U drugom izvođenju, pomenuti postupci su za indukovanje imunsko odgovora protiv CMV kod subjekta koji obuhvataju davanje subjektu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegove kompozicije.

[0218] U drugom izvođenju, subjekti kojima je davan infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV koji se ovde opisuje ili njegova kompozicija ima, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije CMV infekciju ili reaktivaciju. U drugom specifičnom izvođenju, subjekti kojima se daje infektivno, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV koji se ovde opisuje ili njegova kompozicija su inficirani sa, podložni su da razviju, ili se nalaze u riziku da dobiju, infekciju sa CMV ili reaktivaciju sa CMV.

[0219] U drugom izvođenju, subjekti kojima se daje infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija pate od, ili su podložni da razviju, ili su u riziku da dobiju, infekciju sa CMV u plućnom sistemu, centralnom nervnom sistemu, limfnom sitemu, gastrointestinalnom sistemu, cirkulatornom sistemu, među ostalim. U specifičnom izvođenju, subjekti kojima se daje infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegovu kompozicija pate od, podložni su da razviju, ili se nalaze u riziku da dobiju, infekciju sa CMV u jednom ili više organa u telu, uključujući ali bez ograničenja na mozak, jetru, pluća, oči, uši, creva, jedinjak, ili pljuvačne žlezde.

[0220] U drugom izvođenju, subjekti kojima se daje infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija pate od simptoma uključujući ali bez ograničenja na groznicu, noćna preznojavanja, umor, malaksalost, nelagodnost, upale grla, otečenih žlezda, bola u zglobovima, bola u mišićima, gubitka apetita, gubitka težine, dijareje, gastrointestinalnih čireva, gastrointestinalnog krvarenja, otežanog disanja, pneumonije, čireva u ustima, problema sa vidom, hepatitisa, žutice, encefalitisa, napada, komu, ili gubitak sluha.

[0221] U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija je davana subjektu bilo koje starosne grupe koji pati od, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju sa CMV. U specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija su davani subjektu koji ima kompromitovan imunski sistem, trudnom subjektu, subjektu koji je u procesu transplantacije organa ili kostne srži, subjektu koji uzima imunosupresivne lekove, subjektu koji prolazi kroz hemodijalizu, subjektu koji ima kancer, ili subjektu koji pati od, ili je podložan da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV. U specifičnijem izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija su davani subjektu koji ima kompromitovan imunski sistem zbog infekcije HIV-om, koji pati od, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju CMV ili reaktivaciju CMV. Dalje, u drugom specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija su davani subjektu koji je dete starosti 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina koje pati od, podložno je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju CMV ili reaktivaciju CMV. Dalje, u drugom specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija su davani subjektu koji je infant koji pati od, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV. Dalje, u drugom specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija su davani subjektu koji je infant 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci starosti koji pati od, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju CMV ili reaktivaciju CMV. Dalje, u drugom specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija su davani starijem subjektu koji pati od, podložan je da razvije, ili se nalazi u riziku da dobije, infekciju CMV ili reaktivaciju CMV.

[0222] U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija je davan subjektima sa povećanim rizikom dobijanja diseminovane infekcije CMV. U specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija je davan subjektima u neonatalnom periodu koji imaju nezreli neonatalni imunski sistem.

[0223] U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija je davan subjektima koji imaju dormantnu infekciju CMV. U specifičnom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegova kompozicija je davan subjektu koji ima dormantnu infekciju CMV, koja se može reaktivirati po kompromitovanju imunskog sistema. U jednom izvođenju pomenuti postupak je za prevenciju reaktivacije CMV.

[0224] U drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija je davan subjektima inficiranim sa jednim ili više sojeva CMV. U određenim izvođenjima, jedan ili više ovih sojeva uključuju AD169, Towne, Merlin, Toledo, FIX, PH, TR, Davis, TB40/E, 3157, 6397, 711, 5234, ili druge sojeve.

4

[0225] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegove kompozicije subjektima koji imaju ćelijski posredovan imunitet (CMI) protiv infekcije CMV ili reaktivacije CMV. Bez želje za vezivanjem za teoriju, u drugom izvođenju, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegova kompozicija inficira i eksprimira antigene od interesa u antigen prezentujućim ćelijama (APĆ) domaćina (npr., makrofagima) za direktno prezentovanje antigena u klasi I i II glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirus akome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano ili njegove kompozicije subjektima indukuje plurifunkcionalne CMV-specifične CD4+ i CD8+ T ćelijske odgovore za zajedničkom proizvodnjom IFN-γ i TNF-α (IFN-γ je proizveden od strane CD4+ i CD8+ T ćelija i TNF-α je proizveden od strane CD4+ T ćelija) velike jačine za lečenje ili prevenciju infekcije CMV ili reaktivaciju CMV.

[0226] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegove kompozicije redukuje rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa rizikom razvijanja infekcije sa CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0227] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegove kompozicije redukuje simptome infekcije CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma infekcije sa CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0228] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegovu kompoziciju subjektima nezrelim neonatalnim imunskim sistemom indukuje ćelijski posredovani odgovor (CMI) protiv infekcije sa CMV ili reaktivacije CMV za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa odgovorom ćelijski posredovanog imuniteta (CMI) protiv infekcije sa CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0229] U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegovu kompozicija smanjuje broj inkluzionih tela koji se detektuju u pljuvačnim žlezdama ili drugom histološkom uzorku. U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegovu kompoziciju smanjuje broj anti-CMV antitela koji su detektovani u uzorku krvi pacijenta. U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegove kompozicije redukuje količinu antigena CMV pp65 koja je detektovana u leukocitima periferne krvi preko CMV pp65 antigenemia testa. U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegovu kompoziciju redukuje količinu CMV detektovanog u urinu, salivi, krvi, suzama, semenoj tečnosti, ili mleku iz grudi. U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegove kompozicije redukujuje nivo kultivisanog virusa iz urina, brisa grla, bronhijalne lavaže, ili uzorka tkiva. U određenim izvođenjima, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV ili njegove kompozicije smanjuje nivo virusa koji se detektuje preko kvantitativnih ili kvalitativnih PCR testova.

4

[0230] Promene u funkciji odgovora ćelijski posredovane imunosti (CMI) protiv infekcije sa CMV ili reaktivacije CMV indukovane davanjem infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigenCMV ili njegove kompozicije kod subjekata može se meriti bilo kojim postupkom koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike uključujući, ali bez ograničenja na protočnu citometriju (videti, npr., Perfetto S.P. et al., Nat Rev Immun.2004; 4(8):648-55), testovi proliferacije limfocita (videti, npr., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol.2008; 101:101-4; i Hicks M.J. et al., Am J Clin Pathol.

1983; 80:159-63), testove za merenje aktivacije limfocita uključujući određivanje promena u ekspresiji površinskog markera nakon aktivacije merenjem citokina T limfocita (videti, npr., Caruso A. et al., Cytometry. 1997;27:71-6), ELISPOT testovi (videti, npr., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods.

1983; 65:109-121; i Hutchings P.R. Et al., J Immunol Methods.1989; 120:1-8), ili testovi citotoksičnosti prirodnih ćelija ubica (videti, npr., Bonilla F.A. et al., Ann Allergy Asthma Immunol. 2005 May; 94(5 Suppl 1):S1-63).

[0231] Ovde je prikazan postupak upotrebe sa infektivnim, arenavirusom kome nedostaje replikacija (npr., LCMV) koji eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano u kome ORF koji kodira GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira:

a. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment;

b. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment; c. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV glikoprotein gH ili njegov antigenski fragment;

d. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV glikoprotein gL ili njegov antigenski fragment;

e. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV UL128 protein ili njegov antigenski fragment;

f. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV UL130 protein ili njegov antigenski fragment; or g. nukleotidna sekvenca koja kodira CMV UL131A protein ili njegov antigenski fragment.

[0232] U drugom izvođenju, postupci su za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete koji obuhvataju davanje subjektu koji je u reproduktivnom dobu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano. Videti odeljak 6.2. U specifičnim izvođenjima, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje seronegativom subjektu koji je u reproduktivnom dobu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV antigen kao što je ovde opisano. U još drugom izvođenju postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje subjektu koji je u reproduktivnom dobu sa namerom umnožavanja infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV antigen kao što je ovde opisano.

[0233] U drugom izvođenju, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje subjektu koji je u reproduktivnom dobu jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. Videti odeljak 6.2. U specifičnim izvođenjima, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje seronegativnom subjektu koji je u reproduktivnom dobu jednog ili više infektivnih, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. U još drugom izvođenju, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje subjektu koji je u reproduktivnom dobu sa namerom

4

umnožavanja jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano.

[0234] U drugom izvođenju, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje trudnom subjektu infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano. U specifičnim izvođenjima, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje trudnom subjektu efikasne količine infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano.

[0235] U drugom izvođenju, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje trudnom subjektu jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. U specifičnim izvođenjima, postupci za prevenciju transmisije i/ili infekcije CMV sa majke na nerođeno dete obuhvataju davanje trudnom subjektu efikasne količine jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano.

[0236] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV redukuje simptomatsku kongenitalnu infekciju CMV. U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV redukuje asimptomatsku kongenitalnu infekciju CMV.

[0237] U drugom izvođenju, davanje jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV antigen redukuje simptomatsku infekciju CMV. U drugom izvođenju, davanje jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV redukuje asimptomatsku kongenitalnu infekciju CMV.

[0238] U drugom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV redukuje ispoljavanja kongenitalne infekcije CMV za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili više. U drugom specifičnom izvođenju, davanje infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV redukuje mortalitet novorođenčadi sa kongenitalnom infekcijom CMV.

[0239] U drugom izvođenju, davanje jednog ili više infektivnog, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV redukuje ispoljavanja kongenitalne infekcije CMV za najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 35%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje 80%, najmanje 90%, ili više. U drugom specifičnom izvođenju, davanje jednog ili više infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV redukuje mortalitet novorođenčadi sa kongenitalnom infekcijom CMV.

[0240] Takva ispoljavanja kongenitalnog CMV uključuju ali nisu ograničeni na mentalnu retradaciju, slepilo i senzorinervnu gluvoću, mikrocefaliju, horioretinitis, intrakranijalne kalcifikacije, hepatosplenomegaliju, hepatitis, žuticu, direktinu hiperbilirubinemiju, trombocitopeniju, petehije, oligohidramnini, polihidramnioni, prevremeno rođenje, zaostajanje intrauterinog rasta, neimunski hidrops, fetalni asciti, hipotonija, i anemija.

4

6.6 Kompozicije, davanje i doziranje

[0241] Pronalazak se dalje odnosi na vakcine, imunogene kompozicije, i farmaceutske kompozcije koje obuhvataju genetički modifikovani arenavirus kao što je ovde obezbeđen. Takve vakcine i farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa standardnim postupcima iz oblasti tehnike.

[0242] U drugom izvođenju, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz ovde obezbeđenog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija. Takve kompozicije se mogu koristiti u postupcima lečenja i prevencije bolesti. U specifičnom izvođenju, ovde obezbeđene kompozicije su korišćene u lečenju subjekata inficiranih sa, koji su podložni da razviju, infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV. U drugom specifičnom izvođenju, ovde obezbeđene imunogene kompozicije mogu se koristiti za indukovanje imunskog odgovora u domaćinu kome se kompozicija primenjuje. Ovde obezbeđene imunogene kompozicije mogu se koristiti kao vakcine i mogu se u skladu sa time formulisati kao farmaceutske kompozicije. U specifičnom izvođenju, ovde obezbeđene imunogene kompozicije su korišćene u prevenciji infekcije subjekata (npr., humanih subjekata) sa CMV ili reaktivacijom CMV kod subjekata (npr., humanih subjekata).

[0243] U određenim izvođenjima, imunogene kompozicije sadrže arenavirusni vektor (ili kombinaciju različitih arenavirusnih vektora) kao što je ovde obezbeđeno. U određenim izvođenjima, kao što je imunogena kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijent. U određenim izvođenjima, takva imunogena kompozicija dalje sadrži adjuvans. Adjuvans za davanje u kombinaciji sa ovde obezbeđenom kompozicijom može da se daje pre, istovremeno sa, ili posle davanja pomenute kompozicije. U nekim izvođenjima, izraz "adjuvans" se odnosi na jedinjenje koje kada se daje zajedno sa ili kao deo ovde opisane kompozicije uvećava, poboljšava i/ili pojačava imunski odgovor prema infektivnoj, čestici arenavirusa kojoj nedostaje replikacija, ali kada se jedinjenje daje samostalno ne generiše imunski odgovor prema infektivnoj, čestici arenavirusa kojoj nedostaje replikacija. U nekim izvođenjima, adjuvans generiše imunski odgovor prema infektivnoj, čestici arenavirusa kojoj nedostaje replikacija i ne produkuje alergiju ili drugu neželjenu reakciju. Adjuvansi mogu pojačati imunski odgovor pomoću nekoliko mehanizama uključujući, npr., regrutovanje limfocita, stimulaciju B i/ili T ćelija, i stimulaciju makrofaga. Kada vakcina ili imunogena kompozicija iz pronalaska sadrži adjuvanse ili se daje zajedno sa jednim ili više adjuvanasa, adjuvansi koji se mogu koristiti uključuju, ali nisu ograničeni na, adjuvanse mineralnih soli ili gel adjuvanse mineralnih soli, čestične adjuvanse, mikročestične adjuvanse, mukozne adjuvanse, i imunostimulatorne adjuvanse. Primeri adjuvanasa uključuju, ali nisu ograničeni na, aluminijumove soli (alum) (kao što je aluminijum hidroksid, aluminijum fosfat, i aluminijum sulfat), 3 De-O-acilovani monofosforil lipid A (MPL) (videti GB 2220211), MF59 (Novartis), AS03 (GlaxoSmithKline), AS04 (GlaxoSmithKline), polisorbat 80 (Tween 80; ICL Americas, Inc.), jedinjenja imidazopiridina (videti međunarodnu prijavu br. PCT/US2007/064857, objavljenu pod Međunarodnim br. objave WO2007/109812), jedinjenja imidazohinoksalina (videti Međunarodni prijavni br. PCT/US2007/064858, objavljen pod Međunarodnim br. objave WO2007/109813) i saponini, kao što su QS21 (videti Kensil et al., in Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman, Plenum Press, NY, 1995); U.S. Pat. No. 5,057,540). U nekim izvođenjima, adjuvans je Freund-ov adjuvans (kompletni ili nekompletni). Drugi adjuvansi su emulzije ulja u vodi (kao što je skvalen ili ulje kikirikija), po potrebi u kombinaciji sa imunskim stimulansima, kao što je monofosforil lipid A (videti Stoute et al., N. Engl. J. Med.336, 86-91 (1997)).

[0244] Ovde su obezbeđene kompozicije koje sadrže infektivne, arenaviruse kojima nedostaje replikacija zasebno ili zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem. Mogu se koristiti suspenzije ili dispenzije genetički modifikovanih arenavirusa, posebno izotonične vodene suspenzije ili disperzije. Farmaceutske kompozicije mogu biti sterilizovane i/ili mogu sadržati ekscipijense, npr., konzervanse, stabilizatore, sredstva za vlaženje i/ili emulgatore, solubilizatore, soli za regulisanje osmotskog pritiska

4

i/ili pufere i pripremaju se na način koji je poznat po sebi, na primer pomoću konvencionalnih postupaka disperzije i suspenzije. U određenim izvođenjima, takve disperzije i suspenzije mogu da sadrže sredstva za regulisanje viskoziteta. Suspenzije ili disperzije su držane na temperaturama oko 2-8°C, ili preferencijalno za duže skladištenje mogu se zamrznuti i zatim otopiti neposredno pre upotrebe. Za injekciju, vakcina ili imunogeni preparati mogu se formulisati u vodenim rastvorima, poželjno u fiziološki prihvatljivim puferima kao što je Hank-ov rastvor, Ringerov rastvor, ili pufer fiziološkog slanog rastvora. Rastvor može sadržati sredstva za formulaciju kao što su sredstva za suspendovanje, stabilizovanje i/ili dispergovanje.

[0245] U određenim izvođenjima, ovde obezbeđene kompozicije dodatno sadrže konzervans, npr., derivat žive timerosal. U specifičnom izvođenju, ovde obezbeđena farmaceutska kompozicija sadrži 0.001% do 0.01% timerosala. U drugim izvođenjima, ovde obezbeđena farmaceutska kompozicija ne sadrži konzervans.

[0246] Farmaceutska kompozicija sadrži od oko 10<3>do oko 10<11>jedinica koje obrazuju fokuse genetički modifikovanih arenavirusa. Jedinični dozni oblici za parentalno davanje su, na primer, ampule ili bočice, npr., bočice koje sadrže od oko 10<3>do 10<10>jedinica koje obrazuju fokus ili 10<5>do 10<15>fizičkih čestica genski modifikovanih arenavirusa.

[0247] U drugom izvođenju, ovde obezbeđena vakcina ili imunogena kompozicija je davana subjektu sa, uključujući ali bez ograničenja na, oralne, intradermalne, intramuskularne, intraperitonealne, intravenozne, topikalne, subktanozne, perkutanozne, intranazalne i inhalacione načine davanja, i putem skarifikacije (grebanjem kroz gornje slojeve kože, npr., korišćenjem igle podeljene na dva dela). Specifično, mogu se koristiti subkutanozni i intravenozni načini davanja.

[0248] Za davanje intranazalno ili inhalacijom, preparat za upotrebu prema predmetnom pronalasku može pogodno biti isporučen u obliku aerosolnog srpreja pakovanja pod pritiskom ili nebulizatora, sa korišćenjem odgovarajućeg propelanta, npr., dihlorodifluorometana, trihlorofluorometana, dihlorotetrafluoroetana, ugljen dioksida ili drugog pogodnog gasa. U slučaju aerosola pod pritiskom jedinična doza može biti određena obezbeđivanjem ventila za isporuku odmerene količine. Kapsule i ketridži, npr., želatin za upotrebu u inhalatoru ili insuflatorima može da bude formulisan da sadrži mešavinu praha jedinjenje i odgovarajuće baze praha kao što je laktoza ili skrob.

[0249] Doziranje aktivnog sastojka zavisi od vrste vakcinacije i od subjekta, njegovog godišta, težine, individualnog stanja, individualnih farmakokinetičkih podataka, i načina davanja.

[0250] Ovde su prikazani postupci i upotrebe genetički modifikovanih arenavirusa za dobijanje vakcina u obliku farmaceutskih preparata, koji obuhvataju genetički modifikovane arenaviruse kao aktivni sastojak. Farmaceutske kompozicije iz predmetnog pronalaska su dobijene na način koji je poznat po sebi, na primer pomoću konvencionalnih postupaka mešanja i/ili dispergovanja.

6.7 Optimizovano dobijanje vektora LCMV

[0251] Zbog uklanjanja ili funkcionalne inaktivacije jednog ili više virusnih gena u arenavirusnim vektorima (ovde navedena delecija glikoproteina, GP, će se uzeti kao primer) arenavirusni vektori se mogu generisati i proširiti u ćelijama da bi se obezbedili deletirani ili funkcionalno inaktivisani virusni gen(i) (npr., koji je infektivan ali nije sposoban dalje da proizvodi infektivne čestice potomstva u nekomplementarnim ćelijama zbog nedostatka deletiranog ili funkcionalno inaktivisanog virusnog gen(a) (npr., GP). Komplementarne ćelije mogu obezbediti funkcionalnost koja nedostaje ili stabilnom transfekcijom, prolaznom transfekcijom, ili infekcijom sa pomoćničkim virusom koji eksprimira funkcionalnost koja nedostaje.

[0252] U određenim izvođenjima, komplementarna ćelija obezbeđuje virusni gen koji je deletiran ili funkcionalno inaktivisan iz genoma arenavirusnog vektora. U specifičnom izvođenju, komplementarna ćelija obezbeđuje virusni gen iz soja virusa koji je isti kao soj virusa koji je korišćen za dobijanje genoma arenavirusnog vektora. U drugom izvođenju, komplementarna ćelija obezbeđuje virusni gen iz soja virusa koji je različit od soja virusa koji je korišćen za dobijanje genoma arenavirusnog vektora. Virusni gen koji je obezbeđen u komplementarnoj ćeliji može se dobiti iz MP soja LCMV i kodira protein koji ima aminokiselinsku sekvencu predstavljenu u SEQ ID NO: 54, 55, 56, ili 57.

[0253] Komplementarna ćelija može obezbediti GP MP sija LCMV i arenavirusni vektor koji sadrži ORF antigena humanog CMV kao što je ovde opisano umesto ORF koji kodira GP protein. Komplementarna ćelija može obezbediti GP MP soja LCMV i arenavirusni vektor je dobijen iz LCMV klona 13 i sadrži ORF antigena humanog CMV kao što je ovde opisano umesto ORF koji kodira GP protein. GP protein može biti najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, najmanje 99%, ili 100% identičan sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 55.

6.8 Kombinovana terapija

6.8 (a) Postupci

[0254] U jednom izvođenju, ovde su obezbeđena dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV antigen kao što je ovde opisano za upotrebu u postupcima lečenja i/ili prevencije infekcije CMV kod subjekta koji obuhvataju davanje subjekti dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju antigen CMV antigen kao što je ovde opisano. Videti, npr., Odeljak 6.2. U specifičnim izvođenjima, postupak lečenja i/ili prevencije infekcije CMV obuhvata davanje prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano, npr., u kome ORF koji kodiraja GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira antigen CMV, pri čemu antigen CMV može biti ali nije ograničen na:

a) CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment; ili

b) CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

i davanje drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV antigen kao što je ovde opisano, npr., u kome ORF koji kodira GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira antigen CMV, pri čemu antigen CMV antigen može biti ali nije ograničen na:

a) CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment or

b) CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0255] U određenim izvođenjima, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije obuhvataju davanje dva konstrukta arenavirusnih vektora koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. U specifičnom izvođenju, dva konstrukta arenavirusnih vektora eksprimiraju različiti antigen CMV.

[0256] U određenim izvođenjima, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije obuhvataju davanje dva ili više konstrukta arenavirusnih vektora koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. U specifičnom izvođenju, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije obuhvataju davanje tri ili više konstrukta arenavirusnih vektora koji eksprimiraju antigen CMV kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije obuhvataju davanje četiri ili više konstrukta arenavirusnih vektora koji eksprimiraju antigen CMV, pet ili više konstrukata arenavirusnih vektora, šest ili više konstrukata arenavirusnih vektora ili 7 konstrukata arenavirusnih vektora gde svaki

1

eksprimira antigen CMV kao što je ovde opisano. U određenim izvođenjima, konstrukt arenavirusnog vektora može biti LCMV.

[0257] U određenim izvođenjima, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije obuhvataju davanje dva arenavirusna vektorska konstrukta pri čemu svaki eksprimira različiti antigen CMV kao što je ovde opisano. Postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije mogu obuhvatiti davanje tri ili više arenavirusna vektorska konstrukta, gde svaki eskprimira različit antigen CMV kao što je ovde opisano. Postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije mogu obuhvatiti davanje četiri ili više arenavirusna vektorska konstrukta, pet ili više arenavirusnih vektorskih konstrukata, šest ili više arenavirusnih vektorskih konstrukata, ili 7 arenavirusnih vektorskih konstrukata gde svaki eksprimira različiti antigen CMV kao što je ovde opisano. Arenavirusni vektorski konstrukt može biti LCMV.

[0258] Antigen može biti glikoprotein gB omotača CMV ili njegov fragment. (Videti, npr., Odeljak 6.2(a)). U specifičnim izvođenjima, antigen je glikoprotein gB omotača CMV sa skraćenim karboksi krajem. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b)).

[0259] U određenim izvođenjima, antigen je CMV tegument protein pp65 ili njegov fragment. (Videti, npr., Odeljak 6.2(c)).

[0260] Antigen može biti pentamerni kompleksi protein CMV. Antigen pentamernog kompleksnnog proteina CMV može biti gH, gH (dTM), gL, UL128, UL131A, ili UL130 ili njihove kombinacije. (Videti, npr., Odeljak 6.2(d)).

[0261] Antigeni CMV mogu biti razdvojeni različitim linkerima, grupama za odvajanje, i mestima cepanja kao što je ovde opisano.

[0262] U drugom izvođenju, vektor koji je generisan da kodira jedan ili više antigena CMV kao što je ovde opisano prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija je zasnovan na LCMV klonu 13. (Videti, npr., Odeljak 7.1).

[0263] U drugom izvođenju, vektor koji je generisan da kodira jedan ili više antigena CMV kao što je ovde opisano prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija je zasnovan na LCMV klonu 13. (Videti, npr., Odeljak 7.1).

[0264] Postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije kod subjekta mogu obuhvatiti davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV tegument protein pp65 ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment.

[0265] Postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije kod subjekta mogu obuhvatiti sekvencijalno davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment.

[0266] Postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije kod subjekta mogu obuhvatiti istovremeno davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment.

[0267] Arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment može biti primarni antigen vakcine i drugi infektivni, arenavirus kome nedostaje

2

replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov antigenski fragment može biti sekundarni antigen vakcine.

[0268] U specifičnom izvođenju, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije CMV kod subjekta obuhvata davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine).

[0269] U specifičnom izvođenju, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije CMV kod subjekta obuhvata sekvencijalno davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine).

[0270] U specifičnom izvođenju, postupci za lečenje i/ili prevenciju infekcije CMV kod subjekta obuhvata istovremeno davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine).

[0271] U drugom izvođenju, prvi infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment je primarni antigen vakcine i drugi infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem je sekundarni antigen vakcine.

[0272] Davanje prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta obezbeđuje bolji zaštitni efekat prema CMV nakon vakcinacije od davanja jednog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen , npr., koji eksprimira samo glikoprotein gB (ili njegov fragment) ili samo tegument protein pp65. U drugim izvođenjima, davanje prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV tegument protein pp65 pokreće veći imunski odgovor od davanja jednog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen npr., eksprimiranjem samo glikoproteina gB (ili njegovog fragmenta) ili samo tegument proteina pp65. U drugom izvođenju, davanje prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment, ili CMV protein pp65 tegumenta pokreće veći CD8+ T ćelijski odgovor od davanja jednog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen npr., koji eksprimira samo glikoprotein gB (ili njegov fragment) ili samo tegument protein pp65. U drugim izvođenjima, davanje prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB ili njegov fragment ili CMV protein pp65 tegumenta pokreće veće titire neutrališućih antitela od davanja jednog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen npr., koji eksprimira samo glikoprotein gB (ili njegov fragment) ili samo tegument protein pp65.

[0273] U određenim izvođenjima, infektivni arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem (videti Odeljak 6.2(b)) obezbeđuje bolji zaštitni efekat prema CMV nakon vakcinacije od infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB, pri čemu je transmembranski domen gB deletiran, kao što je testirano ELISA, testom neutrališućih antitela, i životinjskim modelima. Videti Odeljak 6.9. U drugim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem pokreće veći imunski odgovor od infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB, pri čemu je transmembranski domen gB deletiran. U određenim izvođenjima, infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem pokreće veći CD8+ T ćelijski odgovor od infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB, pri čemu je transmembranski domen gB deletiran. U drugim izvođenjima arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem pokreće veće titre neutrališućih antitela od infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB, pri čemu je transmembranski domen gB deletiran. (Videti npr., Sl-e.12, 13 i 25, 26).

[0274] U još drugom izvođenju, je kombinovana upotreba arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira antigen CMV koji je ovde opisan i jedan ili više virusnih vektora kojima nedostaje replikacija. U specifičnijem izvođenju virusni vektor kome nedostaje replikacija je izabran iz grupe koja obuhvata poksviruse, adenoviruse, alfaviruse, herpes simpleks viruse, paramiksoviruse, rabdoviruse, poliovirus, adeno-povezani virus, i sendai virus, i njihove mešavine. U specifičnom izvođenju, poksvirus je modifikovana vakcina Ankara.

[0275] U još drugom izvođenju, je kombinovana upotreba arenavirusa deficijentnog za replikaciju koji eksprimira ovde opisani CMV i jedan ili više virusnih vektora deficijentnih za replikaciju koji eksprimiraju CMV antigen. U specifičnijem izvođenju virusni vektor kome nedostaje sposobnost replikacije je izabran iz grupe koja se sastoji iz virusa malih boginja, adenovirusa, alfavirusa, herpes simpleks virusa, paramiksovirusa, rabdovirusesa, poliovirusa, adeno-povezanih virusa, i sendai virusa, i njihovih mešavina. U specifičnom izvođenju, virus malih boginja je modifikovana vakcina Ankara.

[0276] U drugom izvođenju, prvi infektivni, arenavirus kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano je davan pre ili posle drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano. Na primer prvi infektivni, arenavirus kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen je davan oko 30-60 minuta pre ili nakon prvog davanja drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju.

[0277] U drugom izvođenju, prvi infektivni, arenavirus kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen je davan pre drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira antigen vakcine. U određenim izvođenjima je period od oko 1 sat, 2 sata, 3 sata, 6 sati, 12 sati, 1 dana, 2 dana, 3 dana, 5 dana, 1 nedelje, 2 nedelje, 1 meseca, 2 meseca, 3 meseca, 4 meseci, 5 meseci, 6 meseci, 7 meseci, 8 meseci, 9 meseci, 10 meseci, 11 meseci, 1 godinu između davanja prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju i drugog infektivnog arenavirusa kome nedostaje za replikaciju.

[0278] U drugom izvođenju, dva infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju su davana u režimu tretmana u molarnim odnosima koji su u opsegu od oko 1:1 do 1:1000, posebno uključujući: 1:1 odnos, 1:2 odnos, 1:5 odnos, 1:10 odnos, 1:20 odnos, 1:50 odnos, 1:100 odnos, 1:200 odnos, 1:300 odnos, 1:400 odnos, 1:500 odnos, 1:600 odnos, 1:700 odnos, 1:800 odnos, 1:900 odnos, 1:1000 odnos.

[0279] U drugom izvođenju, subjekti kojima su davani dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen imaju, podložni su, ili se nalaze u riziku da

4

dobiju infekciju CMV ili reaktivaciju. U drugom izvođenju, subjekti kojima su davani dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koja eksprimiraju CMV antigen su inficirana sa, su podložna, ili su u riziku da dobiju, infekciju sa CMV ili reaktivaciju sa CMV.

[0280] U drugom izvođenju, subjekti kojima su davani istovremeno dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koja eksprimiraju CMV antigen, imајu, podložni su, ili su u riziku da dobiju infekciju CMV ili reaktivaciju. U drugom izvođenju, subjekti kojima su davani istovremeno dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koja eksprimiraju CMV antigen su inficirani sa, podložni su, ili su u riziku da dobiju, infekciju sa CMV ili reaktivaciju sa CMV.

[0281] U drugom izvođenju, subjekti kojima su davani istovremeno dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koja eksprimiraju CMV antigen, imaju, podložni su, ili su u riziku da dobiju CMV infekciju ili reaktivaciju. U drugom izvođenju, t subjekti kojima su davani uzastopno dva ili više ovde opisana infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koja eksprimiraju CMV antigen inficirani su sa, podložni su, ili su u riziku da dobiju, infekciju CMV ili reaktivaciju sa CMV.

[0282] U drugom izvođenju, pomenuta dva ili više infektivna, arenavirusa koji su deficijentni za replikaciju koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano su dalje davani u kombinaciji sa bar jednim drugim lekom za lečenje i/ili prevenciju CMV. Terapeutski lekovi za lečenje i/ili prevenciju CMV uključuju, ali nisu ograničeni na Valganciklovir, Ganciklovir, Foscarnet, Cidofovir, ili Maribavir.

[0283] U drugom izvođenju, pomenuta dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano su dalje davani u kombinaciji sa bar jednim drugim imunomodulatorom. U specifičnijem izvođenju, pomenuta dva ili više infektivna, arenavirusa koja su deficijentna za replikaciju koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano su dalje davani u kombinaciji sa bar jednim Th1-specifičnim adjuvansom. U specifičnijem izvođenju Th-1 specifčni adjuvans je Bacillus Calmette-Guerin (BCG).

[0284] U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje subjektu sa simptomima drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano. U još drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje subjektu koji ima kompromitovan imunski sistem, posebno pacijentima koji su primili transplant, HIV-inficiranim osobama, subjektu koji je u drugom stanju, subjektu koji ima kancer, drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, dva ili više infektivna, arenavirusa koji su deficijentni za replikaciju koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano su davani subjektu koji je dete od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina starosti koje boluje od ili je podložno da razvije, ili je u riziku da dobije, infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV.

[0285] U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje subjektu koji je dete, prvog arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen, i davanje istom subjektu koji je adolescent drugog arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen. U specifičnom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje subjektu koji je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina starosti prvog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano, i istom subjektu koji je 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 godina starosti drugog infektivnog arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen.

[0286] U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje prepubertetskom subjektu drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen. U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje muškom adolescentu, starosti 12 do 18 godina drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje ženi, starosti 12 do 18 godina drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen.

[0287] U drugom izvođenju, davanje dva ili više infektivna, arenavira kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen smanjuje rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma infekcijom sa CMV ili reaktivacijom CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0288] U drugom izvođenju, davanje dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen, kada se primenjuju odvojeno, smanjuje rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma infekcije CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0289] U drugom izvođenju, davanje dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen, kada se daju uzastopno, smanjuje rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma infekcije CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

6.8 (b) Kompozicije

[0290] Pronalazak se dalje odnosi na vakcine, imunogene kompozicije, i farmaceutske kompozicije koje se sastoje iz genetički modifikovanog arenavirusa kao što je ovde opisano. Takve vakcine i farmaceutske kompozicije mogu biti formulisane u skladu sa standardnim postupcima iz oblasti tehnike.

[0291] U jednom izvođenju, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano. Videti, npr., Odeljak 6.2. U specifičnim izvođenjima, ovde opisane kompozicije obuhvataju davanje subjektu prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisanu, npr., u kome ORF koji kodira GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira CMV antigen. CMV antigen može biti:

a) glikoprotein gB CMV ili

b) CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment

i drugu infektivnu, kompoziciju arenavirusa kome nedostaje replikacija koja eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano, npr., u kome ORF koji kodira GP S genomskog segmenta je supstituisan sa nukleotidnom sekvencom koja kodira CMV antigen. CMV antigen može biti:

a) glikoprotein gB CMV ili

b) CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

[0292] U određenim izvođenjima, ovde su obezbeđene kompozicije koje su pogodne za postupak lečenja i/ili prevencije infekcije CMV koji se sastoji iz primene dva arenavirusna konstrukta koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano. U specifičnom izvođenju, dva arenavirusna vektorska konstrukta eksprimiraju CMV antigen.

[0293] U određenim izvođenjima, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz dva ili više arenavirusnih vektorskih konstrukata koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano. U specifičnim izvođenjima, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz tri ili više arenavirusna vektorska konstrukta koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, ovde su obezbeđene kompozicije koje se sastoje iz četiri ili više arenavirusna vektorska konstrukta koji eksprimiraju CMV antigen, pet ili više arenavirusna vektorska konstrukta koji eksprimiraju CMV antigen, šest ili više arenavirusna vektorska konstrukta koji eskprimiraju CMV antigen ili 7 arenavirusnih vektorskih konstrukata koji svaki eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano ili njihovu kombinaciju. U određenim izvođenjima, arenavirus može biti LCMV.

[0294] U specifičnim izvođenjima, antigen je glavni glikoprotein gB omotača CMV sa skraćenjem u karboksi kraju. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine).

[0295] U određenim izvođenjima, antigen je CMV protein pp65 tegumenta ili njegov fragment. (Videti, npr., Odeljak 6.2(c)).

[0296] Antigen može biti CMV pentamerni kompleksni protein. CMV pentamerni kompleksni antigen može biti gH, gH (dTM), gL, UL128, UL131A, ili UL130 ili njihove kombinacije. (Videti, npr., Odeljak 6.2(d)).

[0297] Vektor koji je generisan za kodiranje jednog ili više CMV antigena kao što je ovde opisano može da sadrži jednu ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju CMV antigen i njihove kombinacije kao što je opisano. CMV antigeni mogu da budu razdvojeni raznim linkerima, grupama za vezivanje, i mestima cepanja kao što je ovde opisano.

[0298] Vektor koji je generisan za kodiranje jednog ili više CMV antigena kao što je ovde opisano za prvi infektivni arenavirus kome nedostaje za replikaciju je zasnovan na LCMV Klonu 13. (videti, npr., Odeljak 7.1).

[0299] Vektor koji je generisan za kodiranje jednog ili više CMV su antigeni kao što je ovde opisani drugi infektivni, arenavirus kome nedostaje za replikaciju je zasnovan na LCMV Klonu 13. (Videti, npr., Odeljak 7.1).

[0300] U specifičnom izvođenju, ovde je obezbeđena kompozicija koja sadrži prvu infektivnu kompoziciju arenavirusa kome nedostaje za replikaciju, koja eksprimira CMV protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment i drugu infektivnu kompoziciju, arenavirusa kome nedostaje za replikaciju koji eksprimira CMV glikoprotein sa skraćenim karboksi-krajem. (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine).

[0301] U još drugom izvođenju, prikazana je kombinovana upotreba arenavirusnih kompozija arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano i jedna ili više kompozicija virusnog vektora kome nedostaje replikacija. U specifičnijem izvođenju kompozicija virusnog vektora kome nedostaje replikacija može biti ali nije ograničena na: poxviruse, adenoviruse, alfaviruse, herpes simpleks viruse, paramiksoviruse, rabdoviruse, poliovirus, adeno-povezani virus, i Sendai virus, i njihove smeše. U specifičnom izvođenju, poksvirus je modifikovana vakcina Ankara.

[0302] U drugom izvođenju, kompozicije dva infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija su u molarnim odnosima opsega od oko 1:1 do 1:1000, posebno uključujući: 1:1 odnos, 1:2 odnos, 1:5 odnos, 1:10 odnos, 1:20 odnos, 1:50 odnos, 1:100 odnos, 1:200 odnos, 1:300 odnos, 1:400 odnos, 1:500 odnos, 1:600 odnos, 1:700 odnos, 1:800 odnos, 1:900 odnos, 1:1000 odnos.

[0303] U drugom izvođenju, kompozicije su pogodne za davanje subjektima koji imaju, koji su podložni, ili se nalaze u riziku da razviju infekciju CMV ili reaktivaciju. U drugom izvođenju, subjekti kojima kompozicije dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji ispoljavaju CMV antigen koji su ovde opisani ili je dana njihova kompozicija su inficirani sa, su podložni za, ili se nalaze u riziku da razviju, infekciju CMV ili reaktivaciju sa CMV.

[0304] U drugom izvođenju, pomenute dve ili više kompozicije infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija dalje sadrže najmanje jedan drugi lek za lečenje i/ili prevenciju infekcije CMV ili reaktivaciju CMV. Terapeutski lekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, Valganciklovir, Ganciklovir, Foscarnet, Cidofovir, ili Maribavir.

[0305] U drugom izvođenju, kompozicije su pogodne za davanje simptomatskom subjektu kompozicije drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen ili njegov fragment kao što je ovde opisano. U još drugom izvođenju, kompozicije su pogodne za davanje subjektu sa kompromitovanim imunskim sistemom, posebno kod transplatiranih pacijenata, osoba inficiranih HIV-om, trudnog subjekta, ili subjekta koji ima kancer, kompozicije drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen koji je ovde opisan ili njegov fragment. U drugom izvođenju, kompozicije dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen kao što je ovde opisano ili njihov fragment su pogodni za davanje subjektu koji je dete od 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina starosti koje boluje od ili je podložno, ili je u riziku da razvije, infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV.

[0306] U drugom izvođenju, kompozicije su pogodne za davanje subjektu koji je dete, prvog arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen, i davanje istom subjekti koji je adolescent drugog arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen. U specifičnom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje subjektu koji je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, ili 17 godina starosti prvog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimiraj CMV antigen kao što je ovde opisano, i istom subjektu koji je 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 godina starosti drugog infektivnog arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen.

[0307] U drugom izvođenju, kompozicije su pogodne za davanje prepubertetskom subjektu drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen. U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje adolescentnom muškarcu, starosti 12 do 18 godina drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen kao što je ovde opisano. U drugom izvođenju, režim davanja može uključiti davanje osobi ženskog pola, starosti 12 do 18 godina drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV antigen.

[0308] U drugom izvođenju, kompozicije dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen ili njegov fragment, kao što je ovde opisano smanjuju rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma kod infekcije CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0309] U drugom izvođenju, kompozicije dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen ili njegov fragment, kao što je ovde opisano, kada su davane odvojeno, smanjuju rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV za najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma kod infekcije CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0310] U drugom izvođenju, kompozicije dva ili više infektivna, arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen ili njegov fragment, kao što je ovde opisano, kada su davane sekvencijalno, smanjuju rizik da će individua razviti infekciju sa CMV ili reaktivaciju CMV by najmanje 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 25%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90%, ili više, u poređenju sa ispoljavanjem simptoma kod infekcije CMV ili reaktivacije CMV u odsustvu takvog tretmana.

[0311] U drugom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju vakcine koja se sastoji iz sinergističke kombinacije dva ili više arenavirusa kojima nedostaje replikacija koji eksprimiraju CMV antigen.

[0312] U specifičnim izvođenjima, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksikrajem Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine). U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena farmaceutska kompozicija koja sadrži prvi infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem ili CMV protein pp65 tegumenta i drugi infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi-krajem ili CMV proteinom pp65 tegumenta.

[0313] U drugim izvođenjima, farmaceutska kompozicija sadrži infektivni, arenavirus kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem koji može biti 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3. U specifičnom izvođenju, skraćenim gB protein se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je predstavljena u SEQ ID NO: 18.

[0314] U određenim izvođenjima, skraćeni glikoprotein gB može biti dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 aminokiselina. Videti odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine.

[0315] U određenim izvođenjima, ovde je obezbeđena imunogena kompozicija koja se sastoji iz infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem (Videti, npr., Odeljak 6.2(b) za skraćene gB proteine). U drugom izvođenju, ovde je obezbeđena imunogena kompozicija koja se sastoji iz prvog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi-krajem ili CMV proteinom pp65 tegumenta i drugog infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira CMV glikoprotein gB sa skraćenim karboksi krajem ili CMV proteinom pp65 tegumenta.

[0316] U drugim izvođenjima, imunogena kompozicija sadrži polipeptid koji može biti 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identičan sa aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3. Dalje, u drugim specifičnim izvođenjima skraćenje ili delecija u glikoproteinu gB može biti dužine 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 , 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 29, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, ili 134 aminokiselina. U određenim izvođenjima, imunogena kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

6.9 Testovi

[0317] Testovi za merenje infektivnosti arenavirusnog vektora Bilo koji test poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može se koristiti za merenje infektivnosti preparata arenavirusnog vektora. Na primer, određivanje titra virusa/vektora može se izvesti sa "test obrazovanja jedinica fokusa" (FFU test). Ukratko, komplementarne ćelije, npr. HEK 293 ćelije koje eksprimiraju LCMV GP protein, su zasejane i inokulisane su sa različitim razblaženjima uzorka virusa/vektora. Posle perioda inkubacije, ćelijama je omogućeno da obrazuju monosloj i virus se zakačio na ćelije, monosloj je pokriven sa metilcelulozom. Kada su ploče dalje inkubirane, originalno inficirane ćelije oslobađaju virusno potomstvo. Zbog pokrivanja sa metilcelulozom širenje novih virusa je ograničeno na susedne ćelije. Prema tome, svaka infektivna čestica stvara kružnu zonu inficiranih ćelija koja je nazvana fokus. Na taj način dobijeni fokusi mogu postati vidljivi i samim tim se mogu izbrojiti korišćenjem antitela protiv LCMV-NP i bojene reakcije zasnovane na HRP. Titat virusa / vektora se može izračunati u jedinicama koje obrazuju fokus po mililitru (FFU/mL).

[0318] Da bi se odredio infektivni titar (FFU/mL) vektor koji nosi transgen u ovom testu je modifikovan korišćenjem odgovarajućeg antitela specifičnog za transgen umesto anti-LCMV-NP antitela.

[0319] Određivanje ELISA seruma humoralnog imunog odgovora nakon vakcinacije životinja (npr. miševa, zamoraca) se može izvesti pomoću antigen-specifičnog ELISA seruma (enzimski imunosorbentni test). Ukratko, ploče su obložene antigenom (npr. rekombinantni protein), blokirane su kako bi se izbeglo nespecifično vezivanje antitela i inkubirane su sa serijskim razblaženjima seruma. Posle inkubacije, mogu se detektovati vezana antitela iz seruma, npr., korišćenjem enzimom kuplovanih anti-vrsta (npr. miš, zamorac)-specifičnog antitela (detekcija ukupnih IgG ili podklasa IgG) i nakon toga bojene reakcije. Titri antitela mogu biti određeni kao, npr., krajnja točka geometrijske srednje vrednosti titra.

[0320] Test neutralizovanja u ARPE-19 ćelijama Određivanje neutrališuće aktivnosti indukovanih antitela u serumima je izvedeno sa sledećim ćelijskim testom korišćenjem ARPE-19 ćelija iz ATCC i a GFP-obeleženog virusa. Dodatno je korišćen dopunski serum zamorca kao izvor egzogenog komplementa. Test je započet zasejavanjem 6.5x10<3>ćelija/bunariću (50 µl/bunariću) u ploču sa 384 bunarića jednom ili dva dana pre korišćenja za neutralizovanje. Neutralizacija je izvedena u sterilnim pločama za kulturu tkiva sa 96-bunarića bez ćelija u trajanju od 1h na 37°C. Posle neutralizacije korak inkubacije smeše je dodat u ćelije i inkubirane su dodatnih 4 dana za detekciju GFP sa čitačem ploča. Pozitivni neutrališući humani serum je korišćen kao pozitvna kontrola testa na svakoj ploči za proveru pouzdanosti svih rezultata. Titri (EC50) su određivani korišćenjem uklapanja logističke krive sa 4 parametra. Kao dodatno ispitivanje bunarići su provereni sa fluorescentnim mikroskopom.

[0321] Test redukcije plaka Ukratko, testovi redukcije plaka (neutralizacija) za citomegalovirus zamorca su izvedeni upotrebom izolata GPCMV obeleženog sa zelenim fluorescentnim proteinom, 5% serum zeca je korišćen kao izvor egzogenog komplementa, i plakovi su numerisani fuorescentnim mikroskopom. Titri neutralizacije su definisani kao najveća razblaženja seruma koja dovode do 50% redukcije plaka, u poređenju sa onom u kontrolnim (pre-imunskim) uzorcima seruma.

[0322] Test neutralizacije kod ćelija fibroblasta pluća u zamorcima (GPL) Ukratko, serijska razblaženja ispitivanih i kontrolnih (pre-vakcinacije) seruma su pripremljena u GPL potpunom medijumu sa dopunskim zečjim serumom (1%) kao izvorom egzogenog komplementa. Serije razblaženja su bile 1:40 preko 1:5120. Serumska razblaženja su inkubirana sa eGFP obeleženim virusom (100-200 pfu po bunariću) tokom 30 min na 37°C, i nakon toga su preneta u ploče sa 12-bunarića koje sadrže konfluentne GPL ćelije. Uzorci su obrađeni u triplikatu. Nakon 2 h inkubacije na 37°C ćelije su isprane sa PBS, ponovo im je dodat GPL potpuni medijum i inkubirane su na 37°C / 5% CO2u trajanju od 5 dana. Plakovi su vizuelizovani fluorescentnim mikroskopom, izbrojani, i upoređeni su sa kontrolnim bunarićima. Razblaženje seruma je dovelo do 50% redukcije u broju plaka u poređenju sa kontrolama je dizajnirano kao neutrališući titar.

[0323] qPCR LCMV RNK genomi su izolovani korišćenjem QIAamp Virusnog RNK mini Kompleta (QIAGEN), u skladu sa protokolom obezbeđenim od strane proizvođača. Ekvivalenti LCMV RNK genoma su detaktovani sa kvantitativnom PCR-om izvedenim na StepOnePlus PCR Sistemu u realnom vremenu (Applied Biosystems) sa SuperScript® III Platinum® One-Step qRT-PCR kompletom (Invitrogen) i prajmerima i probama (FAM reporter i NFQ-MGB prigušivač) specifičnim za deo kodirajućeg regiona NP LCMV. Temperaturni profil reakcije je : 30 min na 60°C, 2 min na 95°C, zatim 45 ciklusa 15 s na 95°C, 30 s na 56°C. RNK je kvantifikovana poređenjem rezultata uzorka sa standardnom krivom dobijenom iz log10 serija razblaženja spektrofotometrijski kvantifikovanog, in vitro-prepisanog fragmenta RNK, koji odgovara fragmentu LCMV NP kodirajuće sekvence koja sadrži mesta vezivanja prajmera i proba.

[0324] „Western“ Blotovanje Inficirane ćelije koje su gajene u balonima za kulturu tkiva ili u suspenziji su lizirane u naznačenim vremenskim tačkama posle infekcije korišćenjem RIPA pufera (Thermo Scientific) ili su korišćene direktno bez ćelijske lize. Uzorci su zagrejani do 99°C tokom 10 minuta sa redukcionim sredstvom i NuPage LDS puferom uzorka (NOVEX) i ohlađeni su do sobne temperature pre nalivanja na 4-12% SDS-gelove za elektroforezu. Proteini su blotovani na membrane korišćenjem Invitrogens iBlot Gel sprave za transfer i vizualizovani su sa Ponceau bojenjem. Konačno, preparati su ispitani sa primarnim antitelima koji su usmereni protiv proteina od interesa i sekundarnim antitelima konjugovanim sa alkalnom fosfatazom nakon čega sledi bojenje sa 1-korakom rastvora NBT/BCIP (INVITROGEN).

[0325] Test bojenja multimera MHC-Peptida za detekciju proliferacije antigen specifičnih CD8+ T-ćelija Za ispitivanje antigen-specifičnih odgovora CD8+ T-ćelija može se koristiti bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike. Na primer, može se koristiti test bojenja tetramera MHC-peptida (videti, npr., Altman J.D. et al., Science.1996; 274:94-96; i Murali-Krishna K. et al., Immunity.1998; 8:177-187). Ukratko, test se sastoji iz sledećih koraka, test tetramera je korišćen za detekciju prisustva antigen specifičnih T-ćelija. Kako bi T-ćelija mogla da detektuje peptid za koji je specifična, mora prepoznati oba i peptid i tetramer molekula MHC koji su prilagođeni za antigen specifične T-ćelije (obično fluorescentno obeleženi). Tetramer se nakon toga detektuje protočnom citometrijom pomoću fluorescentnog obeleživača.

[0326] ELISPOT test za detekciju proliferacije antigen-specifičnih CD4+T-ćelija Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike se može koristiti za ispitivanje odgovora antigen-specifičnih CD4+ T-ćelija. Na primer, može se koristiti ELISPOT test (videti, npr., Czerkinsky C.C. et al., J Immunol Methods. 1983; 65:109-121; i Hutchings P.R. Et al., J Immunol Methods.1989; 120:1-8). Ukratko, test se sastoji iz sledećih koraka: Imunospot ploča je obložena sa anti-citokinskim antitelom. Ćelije su inkubirane u imunospot ploči. Ćelije sekretuju citokine i nakon toga su isprane. Ploče su zatim obložene sa drugim biotinilovanim-anticitokinskim antitelom i vizuelizovane su pomoću sistema avidin-HRP.

[0327] Unutarćelijski citokinski test za detekciju funkcionalnosti CD8+ i CD4+ T-ćelijskih odgovora Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike može se koristiti za ispitivanje funkcionalnosti CD8+

1

i CD4+ T ćelijskih odgovora. Na primer, može se koristiti unutarćelijski citokinski test kombinovan sa protočnom citometrijom (videti, npr., Suni M.A. et al., J Immunol Methods.1998; 212:89-98; Nomura L.E. et al., Cytometry. 2000; 40:60-68; i Ghanekar S.A. et al., Clinical i Diagnostic Laboratory Immunology. 2001; 8:628-63). Ukratko, test obuhvata sledeće korake: aktivaciju ćelija preko specifičnih peptida ili proteina, inhibiciju proteinskog transporta (npr., brefeldinA) je dodat da bi se citokini zadržali unutar ćelije. Nakon ispiranja, u ćelije se mogu dodati antitela koja su specifična za druge ćelijske markere. Ćelije su nakon toga fiksirane i permeabilizovane. Dodato je anti-citokinsko antitelo i ćelije se mogu analizirati sa protočnom citometrijom.

[0328] Test za potvrđivanje nedostatka replikacije kod virusnih vektora Bilo koji test koji je poznat stručnjaku iz oblasti tehnike koji određuje koncentraciju infektivnih i virusnih čestica kompetentnih za replikaciju se takođe može koristiti za merenje virusnih čestica u uzorku kojima nedostaje replikacija. Na primer, za ovu svrhu se mogu koristiti FFU testovi (kao što je opisano u [00225]) sa nekomplementarnim ćelijama.

[0329] Dalje, testovi zasnovani na plakovima su standardni postupak koji se korisit za određivanje virusne koncentracije u terminima jedinica za obrazovanje plakova (PFU) u virusnom uzorku. Specifično, konfluentni monosloj ne-komplementarnih ćelija domaćina je inficiran sa virusom u različitim razblaženjima i pokriven je sa polu-čvrstim medijumom, kao što je agar da bi se sprečilo neselektivno širenje infekcije virusom. Virusni plak se obrazuje kada virus uspešno inficira i umnoži se u ćeliji u okviru fiksnog ćelijskog monosloja (videti, npr., Kaufmann, S.H.; Kabelitz, D. (2002). Methods in Microbiology Vol.32:Immunology of Infection. Academic Press. ISBN 0-12-521532-0). Obrazovanje plaka traje 3-14 dana, u zavisnosti od virusa koji se analizira. Plakovi se generalno ručno broje i rezultati, u kombinaciji sa faktorom razblaženja korišćenim za pripremu ploče, su korišćeni za računanje broja jedinica koje obrazuju plak po jedinici zapremine uzorka (PFU/mL). PFU/mL rezultat predstavlja broj infektivnik čestica kompetentnih za replikaciju u uzorku.

[0330] Test za ekspresiju virusnog antigena Bilo koji test koji je poznat strulnjaku iz oblasti tehnike se može koristiti za merenje ekspresije virusnih antigena. Na primer, mogu se izvesti FFU testovi (kao što je opisano u [00225]). Za detekciju, korišćeni su mono- ili poliklonski preparat(i) antitela protiv odgovarajućih virusnih antigena (FFU specifičan za transgen).

[0331] Dalje, može se izvesti „Western“ blotovanje (kao što je opisano u [00231]).

[0332] Životinjski modeli Bezbednost, tolerancija i imunogena efikasnost vakcina koje se sastoje iz infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji eksprimira ovde opisani CMV antigen ili njegova kompozicija mogu se testirati u životinjskim modelima. U određenim izvođenjima, životinjski modeli koji se mogu koristiti za ispitivanje bezbednosti, tolerancije i imunogene efikasnosti vakcina i njihovih kompozicija koje su ovde korišćene uključuju miša, zamorca, pacova, i majmuna. U poželjnom izvođenju, životinjski modeli koji se mogu koristiti za ispitivanje bezbednosti, tolerancije i imunogene efikasnosti vakcina i njihovih kompozicija koje su ovde koriščene uključuju miša.

[0333] Model zamorac (eng. gunea pig) Preklinička procena imunogenosti i efikasnosti HCMV vakcina otežava specifičnost CMV prema vrstama. Međutim, u zamorcima, CMV zmaorca (GPCMV) prolazi kroz placentu uzrokujući kongenitalnu infekciju sličnu humanoj infekciji (Bourne N et al, JID 1996; Schleiss M et al, JID 2003). Dalje, struktura placente kao i period trudnoće sličan tromesečju kod zamoraca je sličan onom kod ljudi. Dodatno, kao i kod ljudi, dešava se transplacentalni prolazak majčinih antitela. Zasnovano na ovim karakteristikama model zamorca je uobičajeno korišćen za procenu strategija vakcina.

2

[0334] Da bi se ispitala zaštitna efikasnost protiv kongenitalne infekcije CMV, Hartley zamorci se mogu imunizovati sa kandidatima vakcina koje se ispituju i imunizovanim zamorcima je zatim omogućeno parenje. Trudnoće kod ženki zamoraca mogu se potvrditi i pratiti palpacijom. Trudne ženke mogu se izazvati sa GPCMV i može se izmeriti smrtnost mladunaca i odrediti stepeni zaštite na porođaju.

[0335] Uključivanje heterolognih domena iz drugih virusa u humani CMV antigen može za rezultat imati indukovanje viših nivoa antitela. Da bi se ispitalo dobijanje neutrališućih antitela, test se može izvsti prema sledećem: ženke zamoraca su imunizovane tri puta u danima 0, 21 i 42. Dve nedelje nakon poslednje doze vakcina, imunizovanim zamorcima je omogućeno parenje. Gravidni zamorci su izazvani tokom 40-50 dana gestacije sa GPCMV. Serumi vakcinisanih životinja će biti analizirani sa ELISA i testovima neutralizacije i uzorci krvi će se dobiti nakon izazova za detekciju viremije sa PCR-om u realnom vremenu. Ženke će biti praćene sve do porođaja, i preživljavanje i stanje potomstva će detaljno biti analizirano.

[0336] Uključivanje heterolognih domena iz drugih virusa u antigen humanog CMV može za rezultat imati indukovanje većih nivoa antitela.

7. PRIMERI

7.1 Dizajn genoma arenavirusnog vektora / Konstrukcija vektora

[0337] U skladu sa uspostavljenim pristupima (U.S. Patent Application Publication No. US 2010/0297172 A1; i Flatz L. et al., Nat Med.2010 March; 16(3): 339-345), dizajnirani su rLCMV vektori vakcine koji eksprimiraju odgovarajuće CMV antigene ili njihove određene domene (SL.1).

[0338] Dizajn rLCMV vektora koji eksprimiraju CMV gB Za dobijanje vektora rLCMV vakcine koji eksprimiraju gB antigen CMV dizajnirani su različiti vektorski konstrukti rLCMV-gB (SL.2) koji kodiraju odabrane delove gB proteina. Odgovarajući konstrukti uključuju rLCMV vektore koji kodiraju:

● divlji tip gB pune dužine (HK1-HgB(FL), SEQ ID NO: 1),

● deletirani transmembranski region (dTM) gB u kome su aminokiseline 1-698 spojene sa aminokiselinama 775-906 (HK1-HgB(dTM), SEQ ID NO: 4),

● C-terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalnih 706 aminokiselina gB (HK1-HgB(1-706), SEQ ID NO: 7),

● C-terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalnih 691 aminokiselina gB (HK1-HgB(1-691), SEQ ID NO: 10)

● C-terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalih 447 aminokiselina gB (HK1-HgB(1-447), SEQ ID NO: 13),

● C- terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalnih 772 aminokiselina gB, koji kodira ektodomen i transmembranski region gB, kojeg prati veštački ostatak arginina na poziciji 773 (HK1-HgB(dCt), SEQ ID NO: 16),

● gB konstrukt koji se sastoji iz N-terminalnih 751 aminokiselina gB kojeg prati C-terminalnih 49 aminokiselina proteina G vezikularnog virusa stomatitisa (HK1-HgB(VSVG-1), SEQ ID NO: 19), ● gB konstrukt koji se sastoji iz N-terminalnih 706 aminokiselina gB kojeg prati C-terminalnih 49 aminokiselina proteina G vezikularnog virusa stomatitisa (HK1-HgB(VSVG-2), SEQ ID NO: 22), ● C-terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalnih 751 aminokiselina gB kojeg prati C-terminalnih 37 aminokiselina hemaglutinina H3 influence (HK1-HgB(H3-1), SEQ ID NO: 25), ● C- terminalno skraćeni gB koji se sastoji iz N-terminalnih 706 aminokiselina gB kojeg prati C-terminalnih 37 aminokiselina hemaglutinina H3 influence (HK1-HgB(H3-2), SEQ ID NO: 28).

[0339] Kako specifičnost prema vrsti CMV sprečava ispitivanja efikasnosti na životinjama vakcina koje eksprimiraju humane antigene CMV, nisu dobijeni samo rLCMV vektori koji kodiraju sekvencu gB humanog CMV (HCMV), već takođe odgovarajući vektori koji eksprimiraju analogne sekvence CMV zamorca (GPCMV) za neke konstrukte, npr. HK1- GPgB(FL), HK1-GPgB(FLuc), HK1-GPgB(dTM), HK1-GPgB(dTMuc), HK1-GPgB(1-706), HK1-GPgB(1-691), HK1-GPgB(1-447), HK1-GPgB(dCt). HK1-GPgB(FLuc) je dizajniran analogno sa HK1-GPgB(FL) osim toga što je mesto cepanja furinom locirano u ektodomenu gB je inaktivirano mutacijom. HK1-GPgB(dTMuc) je dizajniran analogno sa HK1-GPgB(dTM) osim toga što je mesto cepanja furinom locirano u ektodomenu gB je inaktivirano mutacijom gB. Vektoski konstrukti koji kodiraju za GPCMV antigene omogućuju pre-klinička ispitivanja imungenosti i efikasnosti u modelima zamorca što predstavlja zlatni standard razvoja CMV vakcine. Slično tome, konstrukti koji eksprimiraju analogne sekvence mišjeg CMV gB su dobijeni da omoguće brzinu i efikasnost u odnosu na trošak pretraživanja individualnog dizajna vektora.

[0340] Analogno, rLCMV vektor je konstruisan tako da eksprimira T-ćelijski antigen pp65 pune dužine iz humanog CMV (HK1-Hpp65, SEQ ID NO: 34). Dodatno, generisan je odgovarajući vektor koji eksprimira analogne sekvence CMV (GPCMV) zamorca (HK1-GPpp65).

[0341] Dodatno, dizajnirani su rLCMV vektori za ekspresiju različitih delova pentamernog kompleksa (PC) CMV, koji obrazuju glikoproteini gH/gL, UL128, UL130, i UL131A. Da bi se generisao rLCMV vektor koji eksprimira puni kompleks, dizajniran je poliproteinski vektor koji kodira pet proteina koji su razdvojeni sa sekvencama Teschovirus 2A peptida (T2A) (SL.3) (Donnelly MLL et al 2001, Gao SY et al 2012, Kim JH et al 2011). Samo-cepajući 2A peptidi su izabrani zbog toga što su relativno male veličine i pokazuju visoku efikasnost cepanja između gena koji se nalaze uzvodno i nizvodno od 2A peptida (Donnelly MLL et al 2001, Gao SY et al 2012, Kim JH et al 2011).

[0342] Odgovarajući konstrukti sadrže

● Vektor koji kodira samo glikoprotein gH (HK1-HgH, SEQ ID NO: 37)

● Vektor koji kodira deletiranu verziju transmembranskog domena glikoproteina gH (HK1-HgH(dTM), SEQ ID NO: 50).

[0343] Dobijanje rLCMV vektorskih konstrukata rLCMV vektora može se razlikovati u LCMV soju iz kojeg su dobijene sekvence cDNK i korišćenog plazmidnog sistema za njihovo dobijanje. Klon 13 ili MP soj LCMV su dva moguća soja korišćena u dobijanju vektora. Ispitivanja za poređenje efekata okosnice rLCMV vektora, Klona 13 i MP, na indukciju imunskih odgovora su procenjena korišćenjem Hpp65, HgBdTM i GPgBdTM kao transgena prikazanih na slici 16 - 18. Četiri različita pristupa/plazmidna sistema mogu se koristiti za dobijanje vektora. U jednom pristupu, prepisivanje kratkih (S) i dugih (L) genomskih segmenata virusnog vektora je kontrolisano sa promotorom i terminatorom RNK polimeraze I specifičnim za miša. Polimeraza i NP proteini su eksprimirani sa individualnih konstrukata pod kontrolom promotora polimeraze II. Supstitucija GP-a sa CMV antigenom u sistemu cDNK nakon transfekcije četiri plazmida u mišjim ćelijama koji obezbeđuju LCMV GP protein in trans dovodi do

4

obrazovanja vektorskih čestica koje se mogu sakupiti iz supernatanta transfektovanih ćelija. Ovaj pristup je korišćen kod Flatz, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103:4663.

[0344] U drugom sistemu, prepisivanje S (uključujući CMV antigen) i L segmenta je pod kontrolom T7 promotora, što uvodi potrebu uvođenja petog plazmida koji kodira T7 polimerazu da se pokrene ekspresija sa T7 promotora. Virusni faktori sa delovanjem na daljinu (eng. trans-acting factors) (NP i L) su ponovo koeksprimirani sa različitih plazmida korišćenjem promotora za RNK polimerazu II. Ovaj sistem je prilagođen od Sanchez & de la Torre, Virology 2006 July, 350(2):370.

[0345] U trećem sistemu, prepisivanje kratkih (S) i dugih (L) genomskih segmenata virusnog vektora je kontrolisano sa promotorom humane RNK polimeraze I i odgovarajućim terminatorom. Virusni faktori sa delovanjem na daljinu (NP i L) su ponovo ko-eksprimirani sa različitih plazmida korišćenjem promotora za RNK polimerazu II.

[0346] U četvrtom sistemu, prepisivanje kratkih (S) i dugih (L) genomskih segmenata virusnog vektora je kontrolisano sa promotorom humane RNK polimeraze I i odgovarajućeg terminatora. Na istom plazmidu, prepisivanje virusnih faktora koji deluju na daljinu je vođeno sa promotorom polimeraze II koji je dizajniran da bude usmeren u suprotnom pravcu da bi pokrenuo prepisivanje pozitivnog lanca RNK sa NP i L ORF-a sa iste matrice. Takav pristup je prethodno korišćen da bi se dobili rekombinantni virusi influence i opisan je kod Hoffmann E et al 2000. Svi gore opisani rLCMV vektori se mogu proizvesti prema uspostavljenoj metodologiji (U.S. Patent Application Publication No. US 2010/0297172 A1; i Flatz L. et al., Nat Med.2010 March; 16(3): 339-345). Drugi postupci mogu takođe biti korišćeni; npr., različiti plazmidni sistemi, različite ćelije i različiti postupci transfekcije mogu biti korišćeni za dobijanje ovde obezbeđenih arenavirusnih vektora.

7.2 Karakterizacija vektora

[0347] karakterizacija rLCMV vektora koji eksprimiraju CMV gB Karakterizacija dobijenih vektorskih konstrukata uključuje analizu virusne replikacije i specifične infektivnosti ćelija domaćina (SL.4).

[0348] Slika 4 pokazuje virusne titre i infektivnost vektorskih konstrukata HK1-HgB(FL), HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(706), HK1-HgB(691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2), HK1-HgB(H3-1) and HK1-HgB(H3-2). Odgovarajući vektorski konstrukti su pokazali slične maksimalne vrednsoti titra i infektivnosti u poređenju sa kontrolnim LCMV vektorom koji eksprimira eleni fluorescentni protein (HK1-GFP), što ukazuje da nije bilo negativnog uticaja na proizvodnju vektora zbog veličine i prirode antigena.

[0349] Da bi se analizirana replikacija vektora, izvedene su krive rasta korišćenjem suspenzije HEK 293 ćelija koje eksprimiraju LCMV GP. Odgovarajuće ćelije su zasejane u gustini ćelija od 3x10<5>ćelija/ml i inficirane su sa individualnim vektorima (HK1- HgB(dTM), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(H3-2) i HK1-HgB(691)) na MOI 0.001. Uzorci su uzimani 24 h i analizirani su FFU testom (SL.5). Svi ispitivnai vektori su ispoljili slične kinetike rasta i maksimalne vrednosti titra u poređenju sa HK1-GFP ukazujući da individualni gB transgeni nisu interferirali sa replikacijom vektora u većem obimu u odnosu na mali reporterski gen GFP.

[0350] Eksprimenti „Western“ blot-a su korišćeni za potvrđivanje prisustva gB antigena kod svih ispitivanih konstrukata, primeri podataka su predstavljeni na Slici 6. Očekivano je da prekursori gB pune dužine koji nisu cepani razviju traku na ∼160kDa pri čemu se cepani gB sastoji iz poovršinske komponente sa procenjenom molekulskom masnom 116 kDa koja je vezana disulfidnim vezama sa transmembranskom komponentom sa procenjenom molekulskom masom od 55 kDa. Međutim, zbog korišćenja monoklonalnog primarnog antitela očekivano je da na blotu budu vidljive samo dve trake predstavljaju necepani gB protein i manji proizvod cepanja gB. gB pune dužine (traka 7) sa rasponom u očekivanom opsegu ∼ 160 kDa, proi čemu su svi preostali konstrukti pokazali trake manje veličine što se može objasniti delecijom ili izmenom najmanje dela citoplazmatskog domena gB. Analogno tome, transmembranski deo pune dužine gB (traka 7) raspona ∼60kDa (malo više od očekivanog) i svi derivati gB ispoljavaju proizvode cepanja manje veličine. Uopšteno HK1-gB(FL) i HK1-gB(dTM) ispoljavaju slabije trake gB u poređenju sa svim drugim vektorima.

[0351] Poređenje imunogenosti HK1-GPgB(FL), HK1-GPgB(dTM) i HK1-GPgB(dTMuc) Sledeće, imunogenost HK1-GPgB(FL), HK1-GPgB(dTM) i HK1-GPgB(dTMuc) je analizirana i upoređena kod miševa (SL.7). C57BL/6 miševi su imuizovani subkutanozno sa 6.7x10<4>FFU/dozi odgovarajućeg vektora u danima 0, 21 i 42 izvođenja eksperimenta. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42 i 63 eksperimenta i titiri anti-gB antitela su mereni sa ELISA. Analogni rLCMV vektor koji eksprimira zeleni fluorecentni protein (HK1-GFP) je korišćen kao kontrola. Kontrolni vektor je koriščen u koncentraciji 9.2x10<5>FFU po injekciji.

[0352] HK1-GPgB(dTM) i HK1-GPgB(dTMuc) su indukovali značajno više titre antitela u odnosu na HK1-GPgB(FL) posle subkutanozne injekcije kod miševa.

[0353] Poređenje imunogenosti HK1-GPgB(dTM) vektora vakcine davanog intramuskularnim ili subkutanoznim načinom u različitim koncentracijama Sledeće, imunogenost HK1-GPgB-dTM, kada se primenjuje u različitim dozama i različitim načinima davanja injekcije, je analizirana sistematski (SL.8A i B).

[0354] Ove analize su pokazale da je HK1-GPgB-dTM indukovao više titre odgovora antitela nako intramuskularne injekcije (SL.8A) u poređenju sa subkutanoznim davanjem. Među ispitivanim dozama imunizacije, doze vacina od 2x10<6>i 6.7x10<4>FFU/dozi rezultovale su u uporedivo višim titrima antitela.

[0355] Poređenje intramuskularnog i intradermalnog načina imunizacije. Uvođenje humaoralnih kao i CD8+ T ćelijskih odgovora je analizirano posle imunizacije sa različitim koncentracijama ili HK1-HgB(dCt) (FIG. 8C) ili HK1-Hpp65 (FIG. 8D) korišćenjem intramuskularnog i intradermalnog načina davanja. Odgovarajući rezultati pokazuju da su pokrenuti značajno viši titri antigen specifičnih antitela intramuskularnim u poređenju sa intradermalnim načinom davanja u dozi od 5.6x10<5>FFU (SL.8C, grupe 1 i 3) što ukazuje da se nije mogao postići efekat uštede doze kada je vakcina davana preko intradermalnog načina davanja. Slično tome, viši odgovori CD8+ T ćelija su uočeni nakon intramuskularne injekcije u poređenju sa intradermalnom imunizacijom u dozi od 6,7x10<5>FFU (SL.8D grupe 1 i 3).

[0356] Kod miševa je analizirano poređenje imunogenosti HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2) i rekombinantnog gB proteina pomešanog sa adjuvansom Imunogenost HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(dCt), HK1-HgB(H3-1), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HK1-HgB(VSVG-2) i rekombinantnog gB proteina pomešanog sa adjuvansom. C57BL/6 miševi su imunizovani intramuskularno sa 1x10<5>FFU/dozi odgovarajućih vektora ili 5µg rekombinannog gB proteina pomešanog u odnosu 1:1 sa adjuvansom u danima eksperimenta 0 i 21. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni pre doze svake vakcine u danima 0, 21 kao i u intervalima od tri nedelje u danima eksperimenta 42, 63, 84 i 105. Dobijeni serumi su ispitivani za nivo anti-HCMVgB IgG antitela sa ELISA testom i za prisustvo neutrališućih antitela sa testom neutralizacije kod ARPE-19 ćelija.

[0357] Statististička analiza respektivnih ELISA podataka (SL.9) otkrila je uporedivu indukciju antitela rekombinantnog gB proteina (pomešanog sa adjuvansom) i svih ispitivanih konstrukata rLCMV-gB.

Dodatno, generisani rezultati ukazuju na to da dugotrajni imunski odgovori mogu već da se postignu nakon dve imunizacije kako nivoi antitela dostižu plato nakon druge imunizacije.

[0358] Funkcionalnost indukovanih antitela Da bi se ispitala funkcionalnost indukovanih antitela, serumi vakinisanih životinja su dalje analizirani sa testom neutralizacije kod ARPE-19 ćelija. Neutrališuća aktivnost indukovanih antitela, prisutna u serumima imuizovanih miševa, koji su sakupljeni u danu 42, je merena u epitelnim ARPE-19 ćelijama (L.10). Odgovarajući rezultati ukazuju da svi ispitivani konstrukti rLCMV-gB indukuju više nivoe neutrališućih antitela HCMV u odnosu na rekombinantni podjedinični gB protein koji je pomešan sa adjuvansom. Međutim, HgB(dTM) je indukovao značajno niže nivoe HCMV neutrališućih antitela u odnosu na druge ispitivane rLCMV-gB vektore.

[0359] Analize individualnih podklasa IgG Serumi odabranih eksperimentalnih grupa (vakcinisanih sa HK1-HgB(dTM), HK1-HgB(1-706), HK1-HgB(1-691), HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), i rekombinantnog gB proteina pomešanog sa adjuvansom), sakupljenih u danu 42, su analizirani ELISA-om sa HCMVgB-specifičnom podklasom IgG (L. 11). Odgovarajuća analiza je otkrila predominantnu indukciju IgG2c sa rLCMV-gB konstruktima pri čemu je rekombinantni gB protein pomešan sa adjuvansom uglavnom indukovao IgG1. Ovi podaci ukazuju na indukciju tipa 1 usmerenog imunskog odgovora sa rLCMV-gB vektorima koji se izgleda značajno razlikuje od indukovanog tipa 2 usmerenog imunskog odgovora indukovanog sa podjedinicom gB proteina.

[0360] Imunogenost HK1-GPgB(dTM) kod zamoraca Hartley zamorci su imunizovani sa 7 6<5>4 intramuskularnom injekcijom sa različitim koncentracijama (1.54x10 , 1.54x10 , 1.54x10 i 1.54x10 FFU/dozi) HK1-GPgB-dTM u danima eksperimenta 0, 21 i 42. za svrhe kontrole jedna životinja nije primila vakcinu ili pufer. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danima eksperimenta 0, 21, 42 i 63 i titri anti-GPgB antitela su analizirani sa GPgB-specifičnim IgG ELISA. GPCMV pozitivan serum je korišćen kao kontrola.

[0361] Podaci iz ELISA testa pokazuju da već nakon jedne intramuskularne imunizacije (prajmovanje), HK1-GPgB(dTM) indukuje odgovore anti-GPgB antitela značajne veličine na način koji je zavisan od doze (SL.12). Ovi odgovori bi se mogli efikasno uvećati kada se isti vektor ponovo daje tri nedelje posle prajemovanja i dostigli su plato odgovora IgG posle dve injekcije za tri najveće doze (1.54x107 , 1.54x106 , 1.54x105) HK1-GPgB(dTM). Dostignute vrednosti su slične sa korišćenim kontrolnim serumom (generisano 30dpi sa 1x10<5>pfu GPCMV). Značajno niži odgovor je indukovan kod grupe koje 4

je primila najnižu dozu (1.54x10 ).

[0362] Odgovarajući serumi su dalje analizirani za prisustvo antitela koja neutralizuju virus korišćenjem testa redukcije plaka (SL. 13). Rezultati su pokazali indukovanje neutrališućih antitela kod zamoraca nakon imunizacije sa HK1-GPgB(dTM). Odgovarajući podaci ukazuju na minimum doze u opsegu ≥1.54x10<5>HK1-GpgB(dTM) koja je potrebn za pokretanje jakih neutrališućih antitela. Zasnovano na dostupnim podacima doza od 1.54x10<6>FFU je izabrana za proučavanje zaštitnog efekta HK1-GpgB(dTM) i kongenitalnom modelu infekcije GPCMV (uporediti SL.23).

[0363] Karakterizacija rLCMV vektora koji eksprimiraju CMV pp65 Da bi se karakterisale kinetike rasta i infektivnost generisanog HK1-Hpp65 vektora, HEK 293 ćelije u suspenziji koje eksprimiraju LCMV GP bile su inficirane sa HK1-Hpp65 na MOI = 0.001. U definisanim vremenskim tačakama (2h, 24h, 48h, 72h i 96h) nakon infekcije uzorci ćelijskog supernatanta su povučeni i analizirani su sa FFU testom i qPCR-om (SL.14).

[0364] Podaci na Slici 14 pokazuju uporedive kinetike replikacije, maksimalne vrednosti titra i infektivnost vektorskog konstrukta HK1-Hpp65 i kontrolnog vektora HK1-GFP, ukazujući da pp65 antigen nema negativni uticaj na vektorski rast ili infektivnost. Niži odnosi infektivnosti čestica su uočeni u kasnijim vremenskim tačkama.

[0365] Da bi se potvrdila ekspresija pp65 antigena, HEK 293 ćelije u suspenziji koje eksprimiraju LCMV GP bile su inficirane sa HK1-Hpp65 ili vektorom HK1-GFP negativne kontrole i sakupljene su i lizirane 96h nakon infekcije i potom su analizirane sa „Western“ blotovanjem korišćenjem monoklonskog anti HCMV pp65 primarnog antitela i odgovarajućeg sekundarnog antitela konjugovanog sa alkalnom fosfatazom (SL.15).

[0366] Sledeće, analizirana je imunogenost HK1-Hpp65 i HK3-Hpp65 kod C57BL/6 miševa da bi se ispitao efekat različitih okosnica LCMV vektora (HK1 (klon13), HK3 (MP)). C57BL/6 miševi su vakcinisani i.m. (50µL/butini; ukupno 100µL/mišu) sa ciljnom dozom od 1x10<4>FFU HK1-Hpp65 (Grupa 1) ili HK3-Hpp65 (Grupa 2). Ne-vakcinisani miševi su korišćeni kao kontrola (Grupa 7). Indukovanje ćelijskih imunskih odgovora je određeno protočnim citometrom u danu 10 nakon injekcije, analiziranjem proizvodnje citokina (IL-2, IFN-g, TNF-a) CD4+ i CD8+ T ćelija. Za ponovnu stimulaciju splenocita je korišćen Hpp65 peptidni skup (zasnovano na Shedlock D.J. et al; Human Vaccines & Immunotherapeutics 2012).

[0367] Nakon jedne intramuskularne injekcije HK1-Hpp65 i HK3-Hpp65 indukovali su HCMV-specifične CD8+ (i CD4+) T ćelijske odgovore značajne veličine. Učestalost CD8+ T ćelijskih odgovora, analizirana 10 dana nakon jedne injekcije, bila je veća od uočene za CD4+ T ćelijske odgovore (SL.16 A i B, redom). Na osnovu vektorske okosnice (HK1 ili HK3) nije bilo uočene razlike u indukovanju CD4+ T ćelija. Suprotno tome, veći odgovori CD8+ T ćelija su indukovani sa HK1-pp65 u poređenju sa HK3-Hpp65. (C) HCMV-specifični odgovori CD8+T ćelija slične veličine su uočeni 10 dana (dana 66 eksperimenta) nakon jedne intramuskularne injekcije (dan 56 eksperimenta) sa HK1-Hpp65 (Grupa 3) i HK3-Hpp65 (Grupa 4) kod miševa koji su prethodno bili imunizovani dva puta (8 i 4 nedelja pre; tj. dani 0 i 28 eksperimenta) sa HK1-HgB(dTM). Odgovarajući rezultati ukazuju na to da indukcija antigen-specifičnih CD8+T ćelijskih odgovora nije bila narušena vektorskim imunitetom zbog prethodne imunizacije sa istom vektorskom okosnicom.

[0368] Efekat rLCMV vektorske okosnice, HK1 (Klona 13) ili HK3 (MP), na indukciju imunskog odgovora je takođe bio procenjen korišćenjem GPgBdTM (FIG.17) i HgBdTM (FIG.18) kao transgena.

[0369] Da bi se ispitao efekat različitih okosnica vektora na imunogenost GPgB-dTM konstrukta, C57BL/6 miševi su vakcinisani i.m. u danima 0 i 28 sa ciljnom dozom 1x10<4>FFU odgovarajućih vektora. Dobijeni su serumi iz individualnih životinja pre svake doze vakcine (dani 0, 28) kao i četiri nedelje (dan 56) nakon poslednje (druge) injekcije. Svi serumi su ispitivani za GPgB-specifična IgG antitela sa ELISA; Podaci iz ELISA testa su eksprimirani kao geometrijska srednja vrednost GPgB-specifičnog krajnjeg titra IgG. Statistička analiza podataka koji su predstavljeni na Slici 17 ukazuju da je odgovor indukovan sa HK1-GPgB(dTM) superioran u odnosu na HK3-GPgB(dTM).

[0370] Da bi se ispitao efekat različitih okosnica vektora na imunogenost HgB-dTM konstrukta, C57BL/6

4

miševi su vakcinisani i.m. u danima 0 i 28 sa ciljnom dozom 1x10 FFU odgovarajućih vektora. Dobijeni su serumi iz individualnih životinja pre svake doze vakcine (dani 0, 28) kao i četiri nedelje (dan 56) nakon poslednje (druge) injekcije. Svi serumi su ispitivani za nivo HgB-specifičnih IgG antitela sa ELISA; Podaci iz ELISA testa su eksprimirani kao geometrijska srednja vrednost PgB-specifičnog krajnjeg titra IgG. Statistička analiza podataka koji su predstavljeni na Slici 18 ukazuju da se odgovor indukovan sa HK1-HgB(dTM) i HK3-HgB(dTM) nije značajno razlikovao.

[0371] Da bi se odredio optimalan LCMV soj za korišćenje sa HEK 293 T ćelijama, kao što je prikazano na Slici 19, HEK 293T ćelije su zasejane u ploče za kulturu sa M6 bunarića na gustini od 500,000 ćelija po bunariću. Sledećeg dana, inficirani su na multiplicitetu infekcij 0.05 od MP, Pasteur, Klon 13 i sojevima WE54. Supernatant je sakupljen u naznačenim vremenskim tačkama i virusni titri su određeni korišćenjem testa imunofokusiranja. Simboli predstavljaju srednje vrednosti iz dva bunarića.

[0372] Imunogenost HK1-HgB(dCt) kod zečeva Novozelandski beli zečevi su imunizovani sa 2

intramuskularnom injekcijom sa različitim koncentracijama (2.0x10 , 4.4x10<4>i 4.5x10<6>FFU/dozi) HK1-HgB(dCt) u danima 0 i 28 eksperimenta. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danima 0, 28 i 42 eksperimenta i titri anti-HgB antitela su analizirani HgB-specifičnim IgG ELISA.

[0373] ELISA podaci pokazuju da već nakon jedne intramuskularne imunizacije (prajming) više doze (4.4x10<4>i 4.5x10<6>FFU/doi) HK1-HgB(dCt) su indukovale odgovore anti-HgB antitela značajn veličine na nači koji zavisi od doze (SL.20). Ovi odgovori bi se mogi efikasno unaprediti kada se isti vektor ponovo primenjuje četiri nedelje posle prajmovanja. Injekcija 4.5x10<6>FFU/dozi HK1-HgB(dCt) indukovala je statistički značajno veće odgovore antitela u odnosu na 4.4x10<4>FFU/dozi u danima 28 i 42.

[0374] Trajanje odgovora antitela i poređenje različitih rasporeda imunizovanja Različiti rasporedi davanja injekcija su poređeni u pogledu nivoa kao i trajanja odgovora antitela, koji je indukovan nakon imunizacije sa HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), i rekombinantnim gB proteinom pomešanim sa adjuvansom (Sl.21A) ili HK1-HgB(H3-2), HK1-HgB(VSVG-1), HgB(dTM), HK1-HgB(dCt) i rekombinantnim gB proteinom pomešanim sa adjuvansom (Sl.21B). C57BL/6 miševi su intramuskularno imunizovani sa 1x10<5>FFU/dozi odgovarajućih vektora ili 5 µg rekombinantnog gB proteina pomešanog 1:1 sa adjuvansom u danima 0, 21 i 42 (SL. 21A) ili u danima 0, 21 i 105 (SL. 21B) eksperimenta. Serumi imunizovanih miševa su sakupljeni u danima 21, 42, 63, 91, 119, 147 i 175 (SL.21A) ili u danima 21, 42, 63, 84, 105 i 126 (SL.21B) eksperimenta. Dobijeni serumi su ispitivani za nivo anti-HCMVgB IgG antitela sa ELISA. Odgovarajući ELISA podaci ukazuju da se maksimalni nivoi antitela mogu postići kroz dve imunizacije i da su indukovani humoralni imunski odgovori veoma dugotrajni.

[0375] Bez negativnih smetnji istovremenim ubrizgavanjem dva vektora Da bi se ispitale potencijalne smetnje različitih vektorskih konstrukata LCMV, indukcija B i CD8+ T ćelijskih odgovora je analizirana nakon imunizovanja samo sa HK1-HgB(dCt), samo sa HK1-Hpp65 ili istovremenim ubrizgavanjem HK1-HgB(dCt) i HK1-Hpp65. C57BL/6 miševi su intramuskularno imunizovani sa 9x10<4>FFU/dozi samog HK1-

4

HgB(dCt), 9x10<4>FFU/dozi HK1-Hpp65 samog ili 9x10 FFU/dozi svakog HK1-HgB(dCt) i HK1-Hpp65 zajedno u danima 0 i 28. Indukovanje anti-HCMVgB antitela (SL. 22A) ili pp65-specifičnih CD8+ T ćelijskih odgovora (SL.22B) je praćena 49 dana nakon prvog ubrizgavanja. Nisu uočene značajne razlike u nivoima anti-HCMVgB antitela (SL.22A) ili pp65-specifičnim CD8+ T ćelijskim odgovorima (SL.22B) mogu biti uočeni između monovalentne (HK1-HgB(dCt) ili samo HK1-Hpp65) i bivalentne (HK1-HgB(dCt) i HK1-Hpp65) vakcine što ukazuje na izostanak negativnih smetnji kada su dva vektora rLCMV mešana i zajedno ubrizgana.

[0376] LCMV vektori štite mladunčad protiv kongenitalne infekcije CMV u modelu zamorca Prekliničko ispitivanje zaštitne efikasnosti protiv kongenitalne CMV infekcije HCMV vakcina je otežan zbog specifičnosti CMV prema vrsti. Međutim, CMV zamorca (GPCMV) prolazi kroz placentu uzrokujući kongenitalnu infekciju koja slična humanoj infekciji (Bourne N et al, JID 1996; Schleiss M et al, JID 2003). Dodatno, struktura placente kao i period trudnoće sličan tromesečju i tranplancentalni prolazak majčinih antitela su slični kod zamoraca i ljudi. Zasnovano na ovim karakteristima model zamoraca je najbolji dostupni animalni model za ispitivanje efikasnosti vakcine CMV protiv kongenitalne infekcije.

[0377] Hartley zamorci su intramuskularno imunizovani tri puta u danima 0, 21 i 42 sa HK1-GPgB(dTM), HK1-GPpp65 ili puferom (kontrolna grupa). Oko dve nedelje nakon poslednje doze vakcine, imunizovanim zamorcima je omogućeno parenje. Gravidni zamorci su izazvani oko ∼45 dana gestacije sa GPCMV i nakon toga su praćeni do porođaja. Analiza preživljavanja potomstva je otkrila značajno smanjenje u mortalitetu mladunčadi kod ženki imunizovanih sa HK1-GPgB(dTM) (p=0.026) ili HK1-GPpp65 (p=0.032) samim pre parenja (SL.23). Mogu se očekivati veće stope zaštite nakon vakcinacije sa kombinacijom vektorskih konstrukata rLCMV koji eksprimiraju gB i pp65. Videti npr., Sl 28.

[0378] Da bi se odredila bezbednost (virulenca i virusna repikacija) rLCMV vektora, specifični miševi, koji su visoko podložni infekciji LCMV, su inokulisani intracerebralno u danu 0 sa HK3-Hpp65 ili HK3-Mpp65, LCMV vektorom kome nedostaje replikacija koji je dobijen iz MP soja LCMV koji eksprimira pp65 antigen iz mišjeg CMV. Miševi su naknadno praćeni za znakove bolesti. Prisustvo replikujućeg virusa je analizirano u tkivima mozga sakupljenim u danu 28 ili ranije u slučaju bolesti.

[0379] Kod AG129 miševa kojima nedostaju IFN α/β i y receptori nisu uočeni znakovi bolesti ili virusne replikacije, i prema tome visoko su podložni infekciji LCMV, 28 dana nakon cerebralne inokulacije različitih doza HK3-Hpp65 ili HK3-Mpp65 (SL.24A). Suprotno tome, AG129 miševi koji su inokulisani sa divljim tipom LCMV su pokazali znakove bolesti i stoga su morali biti eutanizovani u danu 7.

[0380] Slično tome, virusna replikacija se nije mogla uočiti kod RAG-/- miševa koji su deficijentni za T i B ćelije, koji su visoko podložni infekciji LCMV, 28 dana nakon intracerebralne inokulacije različitih doza HK3-Hpp65 ili HK3-Mpp65 (LSL.24B). Visoke doze replikujućeg virusa se mogu uočiti kod RAG-/- miševa inokulisanih sa divljim tipom LCMV.

Imunogenost HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 kod zamoraca

5

[0381] Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani intramuskularnom injekcijom sa 8x10 FFU/dozi HK1-GPgB(dCt) (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 2), ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 3) u danima 0,31 i 72 (grupa 1) / dani 0, 31 i 70 (grupa 2) / danima 0, 34 i 70 (grupa 3) eksperimenta. Dodatno, Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su imunizovani subkutanoznom injekcijom 50 µg subjedinice gB proteina, koji je formulisan u potpunom Freund-ovom adjuvansu (grupa 4) u danima 0, 46 i 76. Serumi imunizovanih životinja su sakupljeni u danima 0, 28, 52, 103 i 155 eksperimenta i titri anti-GPgB antitela su analizirani sa GPgB-specifičnim IgG ELISA korišenjem ukupnog seruma sa dodeljeim titrom anti-gB antitela kao referentnim standardnom.

[0382] ELISA podaci pokazuju da je već nakon jedne imunizacije sa HK1-GPgB(dCt) indukovao odgovore anti-GPgB antitela značajne veličine (SL. 25). Ovi odgovori bi se mogli efikasno povećati kada je isti vektor ponovo davan jedan mesec nakon prvog davanja. Odgovori Anti-GPgB antitela indukovanih imuizacijom samo sa HK1-GPgB(dCt) su bili u sličnom opsegu kao oni koji su indukovani nakon vakcinacije sa HK1-GPgB(dCt) u kombinaciji sa HK1-GPpp65. Važnije, značajno veći nivoi anti-GPgB antitela su stimulisani nakon imunizacije sa HK1-GPgB(dCt) o odnosu na vakcinaciju sa podjedinicom gB proteina formulisanog u potpunom Freund-ovom Adjuvansu.

Podaci neutralizovanja

[0383] Odgovarajući serumi su dalje analizirani za prisustvo virusnih neutrališućih antitela korišćenjem testa neutalizacije u GPL ćelijama (SL. 26). Rezultati su pokazali indukciju neutrališućih antitela kod zamoraca nakon imunizacije samo sa HK1-GPgB(dCt) (grupa 1) ili HK1-GPgB(dCt) u kombinaciji sa HK1-GPpp65 (grupa 3). U skladu sa podacima iz ELISA testa (SL.25) HK1-GPgB(dCt) je indukovano značajno (P<0.0001, neupareni t test) više nivoe neutrališućih antitela od subjedinice gB proteina formulisane u potpunom Freund-ovom Adjuvansu. Neočekivano, kombinacija HK1-GPgB(dCt) sa HK1-GPpp65 (Grupa 3) je pokrenula značajno (P=0.0003, neupareni t test) snažniji netralizujući serum od samog HK1-GPgB(dCt) (Grupa 1).

T ćelijski podaci

[0384] Da bi se analizirala idukcija pp65-specifičnih T ćelijskih odgovora kod vakcinisanih životinja, splenociti su izolovani iz Hartley zamoraca imunizovanih intramuskularno sa 8x10<5>FFU/dozi HK1-GFP (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 2) ili 8x10<5>FFU/dose svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 3). Tri životinje iz svake grupe koja dobija vakcinu (grupa 1, grupa 2, i grupa 3) su žrtvovane nakon 2 doze vakcina (životinje su žrtvovane 43, 40, i 37 dana nakon druge doze vakcine, redom). Tri dodatne životinje su žrtvovane iz svake grupe koja prima vakcinu 7 dana nakon davanja doze 3 da bi se analiziralo da li treća doza vakcine dalje uvećava pp65-specifičan T ćelijski odgovor, u poređenju sa dve doze vakcina.

[0385] Izolovani splenociti su analizirani sa ELISPOT testom korišenjem ukupnih pp65 peptida za restimulaciju. Odgovarajući peptidi (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) su dizajirani do raspona pp65 u fragmente dužine 9 aminokiselina sa preklapanjem u 5 aminokiselina (140 ukupnih peptida). Peptidi su raspoređeni u grupe koje sadrže 11 ili 12 peptida. Veličina odgovora svake životinje je kumulativna razlika ("površina ispod krive") između splenocita restimulisanih peptidima i splenocita restimulisanih sa DMSO (nosač) kontrola, za svaku peptidnu grupu.

[0386] Kao što je prikazano na Sl.27 A, splenociti koji proizvode pp65-specifičan IFN-γ su indukovani kod životinja koje su vakcinisane samo sa HK1-GPpp65 (grupa 2) kao i kod životinja koje su vakcinisane sa HK1-GPpp65 u kombinaciji sa HK1-GPgB(dCt) (grupa 3). U obe grupe koje su primile vakcinu, veći srednji brojevi splenocita koji proizvode pp65-specifičan IFN-γ su uočeni nakon tri doze vakcine u poređenju sa dve doze.

[0387] Dok mala veličina grupe (n=3) sprečava direktno statstičko poređenje između grupa koje primaju vakcine posle ili 2 ili 3 doze vakcine, statistička poređenja se mogu napraviti između kombinovanih vakcinacionih grupa, tj., kombinovanjem podataka 2 dozne grupe i 3 dozne grupe zajedno sa (grupa 1, grupa 2, i grupa 3) (SL.27 B). Respektivna analiza je otkrila da životinje koje su vakcinisane sa HK1-GPpp65 (grupa 2) imale značajno povećane brojeve pp65-specifičnih splenocita po životinji u poređenju sa HK1-GFP kontrolama (grupa 1). Slično tome, HK1-GPgB(dCt) / HK1-GPpp65 grupa vakcine (grupa 3) je takođe imala broj pp65-specifičnih splenocita u poređenju sa HK1-GFP kontrolama (grupa 1). Nije uočena statistički značajna razlika između grupa 2 i 3 koje su primile vakcinu što ukazuje na to da prisustvo gB nije interferiralo sa odgovorom pp65.

Podaci o zaštiti

[0388] LCMV vektori štite mladunčad protiv kongenitalne infekcije CMV u životinjskom modelu zamorca. Prekliničko ispitivanje efikasnosti zaštite protiv kongenitalne infekcije CMV HCMV vakcina je otežana postojanjem CMV koji je specifičan za vrstu. Međutim, CMV zamorca (GPCMV) prolazi kroz placentu i time uzrokuje kongenitalnu infekciju koja je slična humanoj infekciji (Bourne N et al, JID 1996; Schleiss M et al, JID 2003). Dodatno, struktura placente kao i period trudnoće koji je sličan tromesečju i transplacentalni prolazak majčinih antitela imaju sličnosti kod zamoraca i ljudi. Na osnovu ovih karakteristika model zamorca je najbolji dostupan životinjski model za procenu efikasnosti CMV vakcine protiv kongenitalne infekcije.

1

[0389] Hartley zamorci (18 životinja / grupi) su intramuskularno imunizovani tri puta (u danima 0, -30 i ∼70) sa 8x10<5>FFU/dozi HK1-GFP (grupa 1), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPgB(dCt) (grupa 2), 8x10<5>FFU/dozi HK1-GPpp65 (grupa 3) ili 8x10<5>FFU/dozi svakog HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65 (grupa 4). Približno jedan mesec nakon poslednje doze vakcine, imunizovanim zamorcima je omogućeno parenje. Trudnoće kod ženki zamoraca su potvrđene i praćene palpitacijom. Trudne ženke su izazvane u trećem tromesečju gestacije sa GPCMV i zatim su praćene do porođaja. Analiza preživljavanja potomstva (SL.28) je otkrila smanjenje u mortalitetu mladunaca kod ženki imunizovanih sa HK1-GPgB(dCt) ili samim HK1-GPpp65 u poređenju sa kontrolnom grupom. Vakcinacija sa HK1-GPgB(dCt) je potvrdila bolju zaštitu u odnosu na HK1-GPpp65. Mogu se čak uočiti veće stope zaštite nakon vakcinacije sa kombinacijom HK1-GPgB(dCt) i HK1-GPpp65. Visoka stopa mortaliteta u kontrolnoj grupi (grupa 1) ukazuje na stroge uslove izazova.

2

�

1

2

�

1

�

4

1

11

12

�

��

1

�

1

�

11

��

12

��

12

��

12

1

11

��

1

��

�

1

�

1

�

��

14

��

1

11

��

1

14

1

�

1

11

��

�

��

�

1

�

1

�

11

��

�

14

�

1

�

1

�

11

��

�

��

�

1

11

��

�

14

�

1

�

21

22

�

��

2

�

2

�

21

Claims

Patentni zahtevi

1. Infektivni, virusni vektor arenavirusa kome nedostaje replikacija koji je modifikovan da sadrži genom sa sposobnošću umnožavanja i eksprimiranja svoje genetičke informacije u inficiranim ćelijama, pri čemu je virusni vektor sposoban da proizvodi infektivno potomstvo virusa u komplementarnim ćelijama ali nije sposoban da dalje proizvodi infektivno potomstvo čestica u ne-komplementarnim ćelijama, gde je otvoreni okvir čitanja arenavirusa koji kodira GP protein unutar S segmenta uklonjen i zamenjen je sa:

a nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena; ili b. nukleotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni tegument protein pp65 ili njegov antigenski fragment.

2. Virusni vektor prema zahtevu 1, pri čemu nukleotidna sekvenca je nukleotidna sekvenca koja kodira citomegalnovirusni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena.

3. Virusni vektor prema zahtevu 2, čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 1 do 771 SEQ ID NO: 3, , i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 772 do 906 SEQ ID NO: 3.

4. Virusni vektor prema zahtevu 2, čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična aminokiselinama 1 do 772 SEQ ID NO: 60, i sadrži deleciju citoplazmatskog domena između aminokiselina 773 do 907 SEQ ID NO: 60.

5. Virusni vektor prema zahtevu 2, čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:18 ,ili SEQ ID NO:63.

6. Virusni vektor prema zahtevu 2, čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična SEQ ID NO: 18.

7. Virusni vektor prema zahtevu 2, pri čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

8. Virusni vektor prema zahtevu 2, pri čemu se glikoprotein gB sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična sa SEQ ID NO: 18.

9. Virusni vektor prema zahtevu 2, pri čemu nukleotidna sekvenca kodira glikoprotein gB u kome:

(i) citoplazmatski domen glikoproteina gB je deletiran; (ii) transmembranski domen glikoproteina gB je deletiran; ili su (iii) citoplazmatski domen i transmembranski domen glikoproteina gB deletirani.

10. Virusni vektor prema zahtevu 1, pri čemu nukleotidna sekvenca je nukleotidna sekvenca koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

11. Virusni vektor prema zahtevu 10, pri čemu protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična SEQ ID NO: 36.

12. Virusni vektor prema zahtevu 10, pri čemu protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 90%, najmanje 95%, ili najmanje 98% identična SEQ ID NO: 36.

13. Virusni vektor prema zahtevu 10, pri čemu protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je najmanje 100% identična SEQ ID NO: 36.

14. Virusni vektor prema zahtevu 10, pri čemu protein pp65 tegumenta se sastoji iz aminokiselinske sekvence koja je 100% identična SEQ ID NO: 36.

15. Virusni vektor prema bilo kom od prethodnih zahteva zahtevu pri čemu:

(i) arenavirus je virus limfocitinog horiomeningitisa ;

(ii) genomska informacija koja kodira infektivni, virusni vektor arenavirusa kome nedostaje replikacija je dobijena iz Klona 13 soja virusa limfocitinog horiomeningitisa;

(iii) virusni vektor indukuje dugotrajni imunski odgovor protiv citomegalovirusnog (CMV) glikoproteina gB ili antigena proteina pp65 tegumenta kodiranog nukleotidnom sekvencom; ili

(iv) virusni vektor je pogodan za zaštitu protiv kongnitalne infekcije CMV.

16. Kompozicija koja sadrži prvi virusni vektor i drugi virusni vektor, pri čemu pomenuti prvi virusni vektor i pomenuti drugi virusni vektor je virusni vektor prema zahtevu 1, i pri čemu su pomenuti prvi i drugi virusni vektori različiti.

17. Kompozicija prema zahtevu 16, pri čemu pomenuti prvi virusni vektor sadrži virusni vektor prema bilo kom od zahteva 2-9, i pri čemu pomenuti drugi virusni vektor sadrži virusni vektor prema bilo kom od zahteva 10-14.

18. Farmaceutska ili imunogena kompozicija ili vakcina koja sadrži virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 15, ili kompozicija prema zahtevu 16 ili 17, i farmaceutski prihvatljiv nosač.

19. Vakcina prema zahtevu 18, koja sadrži gB protein humanog citomegalovirusa (HCMV), pri čemu je deletiran citoplazmatski domen gB HCMV, i pri čemu gB protein HCMV:

(ii) sastoji se u suštini od N-terminalnih 772 aminokiselina gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60); (iii) sastoji se u suštini od N-terminalnih 772 aminokiselina gB CMV soja Merlin (SEQ ID NO: 60) praćen ostatkom Arginina na poziciji 773; ili

(iv) sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, najmanje 99.5% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 18.

20. Virusni vektor prema bilo kom od zahteva 1 do 15, ili kompozicija prema zahtevu 16 ili 17, ili farmaceutska imunogena kompozicija ili vakcina prema zahtevu 18 ili 19, pri čemu pomenuti virusni vektor, pomenuta kompozicija, pomenuta farmaceutska ili imunogena kompozicija, ili pomenuta vakcina je pogodna za intramuskularnu injekciju.

21. Virusni vektor prema bilo bilo kom od zahteva 1 do 15 i 20, ili kompozicija prema zahtevima 16, 17 i 20, ili farmaceutska ili imunogena kompozicija ili vakcina prema bilo kom od zahteva 18 do 20, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije citomegalovirusne infekcije kod pacijenta.

22. Izolovana nukleinska kiselina, pri čemu nukleinska kiselina kodira S genomski segment arenavirusa u kome otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein u S genomskom segmentu arenavirusa je uklonjen i zamenjen je sa:

a. nukelotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni glikoprotein gB, pri čemu glikoprotein gB ima deleciju citoplazmatskog domena i/ili transmembranskog domena; ili b. nukelotidnom sekvencom koja kodira citomegalovirusni protein pp65 tegumenta ili njegov antigenski fragment.

23. Ekspresioni vektor koji se sastoji iz izolovane nukleinske kiseline prema zahtevu 22.

24. Ćelija koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 22 ili ekspresioni vektor prema zahtevu 23.

25. Postupak za dobijanje virusnog vektora infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija koji se sastoji iz:

a. transfekcije u ćeliju domaćina nukleinske kiseline prema zahtevu 22 ili ekspresionog vektora prema zahtevu 23;

b. održavanja ćelije domaćina u uslovima koji su odgovarajući za obrazovanje virusa; i c. sakupljanja virusnog vektora infektivnog, arenavirusa kome nedostaje replikacija; gde ćelija domaćina eksprimira otvoreni okvir čitanja koji kodira GP protein.