RS62040B1 - Agonist receptora glukokortikoida i njegovi imunokonjugati - Google Patents

Agonist receptora glukokortikoida i njegovi imunokonjugati

Info

Publication number
RS62040B1
RS62040B1 RS20210802A RSP20210802A RS62040B1 RS 62040 B1 RS62040 B1 RS 62040B1 RS 20210802 A RS20210802 A RS 20210802A RS P20210802 A RSP20210802 A RS P20210802A RS 62040 B1 RS62040 B1 RS 62040B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
tnf
alpha
binding
antigen
Prior art date
Application number
RS20210802A
Other languages
English (en)
Inventor
Michael J Mcpherson
Adrian D Hobson
Martin E Hayes
Christopher C Marvin
Diana Schmidt
Wendy Waegell
Christian Goess
Jason Z Oh
Jr Axel Hernandez
John T Randolph
Original Assignee
Abbvie Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=59215995&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62040(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Abbvie Inc filed Critical Abbvie Inc
Publication of RS62040B1 publication Critical patent/RS62040B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/241—Tumor Necrosis Factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6889—Conjugates wherein the antibody being the modifying agent and wherein the linker, binder or spacer confers particular properties to the conjugates, e.g. peptidic enzyme-labile linkers or acid-labile linkers, providing for an acid-labile immuno conjugate wherein the drug may be released from its antibody conjugated part in an acidic, e.g. tumoural or environment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring
    • C07J71/0026—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals
    • C07J71/0031—Oxygen-containing hetero ring cyclic ketals at positions 16, 17
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
Područje pronalaska
[0001] Polje pronalaska se generalno odnosi na imunokonjugate glukokortikoidnih receptora i metode njihovog pravljenja i upotrebe, npr. Za lečenje autoimunih ili inflamatornih bolesti.
Stanje tehnike
[0002] Faktor nekroze tumora alfa (TNFa) igra centralnu ulogu u patofiziologiji nekoliko ljudskih poremećaja, a agensi protiv TNFa (npr. Adalimumab, etanercept i infliksimab) imaju klinički potvrđenu terapijsku korisnost u lečenju autoimunih i inflamatornih poremećaji, poput reumatoidnog artritisa, psorijaze i zapaljenskih bolesti creva. Uprkos njihovom uspehu na klinici, biološka sredstva protiv TNFa i dalje su ograničena u maksimalnoj efikasnosti koju mogu postići kod pacijenata, što zahteva identifikaciju i razvoj moćnijih i efikasnijih terapeutskih sredstava. Lečeni pacijenti sa biološkim sredstvima protiv TNFa takođe može razviti imunogeni odgovor na terapiju, čime se ograničava njegova efikasnost. Stoga bi anti-TNFa terapije sa nižom imunogenošću i visokom efikasnošću bile korisne za dalju kontrolu bolesti. [0003] Agonisti sintetičkih glukokortikoidnih receptora (npr. Deksametazon, prednizolon i budezonid) su moćna klasa malih molekula koji se koriste u lečenju zapaljenskih poremećaja, ali je njihova upotreba u hroničnom lečenju bolesti ograničena zbog ozbiljnih neželjenih efekata. Nekoliko pristupa za zadržavanje antiinflamatorne efikasnosti sintetike opisano je glukokortikoida uz poštedu neželjenih toksičnosti (Rosen, J i Miner, JN Endocrine Revievs 26: 452-64 (2005)). Međutim, ove metodologije su postigle malo uspeha. U oblasti terapije autoimunih i zapaljenskih bolesti postoji potreba za razvojem terapije sa povećanom efikasnošću i dužim trajanjem delovanja u poređenju sa antitelima protiv TNF i sa minimalnim neželjenim efektima.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] Predmetni pronalazak obezbeđuje jedinjenje:
gde je n 2 ili 4, a A je antitelo koje sadrži SEK ID NO: 66 i SEK ID NO: 73 ili adalimumab. U daljim realizacijama pronalaska n je 4. U ostalim realizacijama pronalaska n je 2. U drugim realizacijama pronalaska A je adalimumab.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0005] Slika 1 prikazuje proteolitičku stabilnost ADC koji sadrži steroid i ADC koji sadrži MMAE (monometil auristatin E). Videti primer 76. Slika 2 prikazuje kinetiku gubitka stereo ADC kod miševa u vezi sa lekovima. (Videti primer 77.) Slika 3 prikazuje aktivnost pojedinačne terapijske doze odgovora anti-mTNFa steroid ADC u mišjem modelu artritis. (Videti primer 85.) Slika 4 prikazuje aktivnost anti-humanog TNFa steroida u huTNFa Tg CAIA mišjem modelu artritisa. (Videti primer 87.) Slika 5 je HIC hromatogram koji prikazuje heterogenu smešu koja sadrži antitela koja imaju nula SM-L-K-mol- prikačeni ekuli (vrh "E0"), dva prikačena SM-LK-molekula (vrh "E2"), pričvršćena četiri SM-LK-molekula (vrh "E4"), prikačeni SM-LK-ostaci (vrh "E6"), i osam prikačenih SM-LK molekula (vrh „E8“), u zavisnosti od broja redukovanih međulančanih disulfidnih veza. (SM je radikal glukokortikosteroida; L je linker, a K je heterobifunkcionalna grupa ili heterotrifunkcionalna grupa; ili K je odsutan.) (Videti primer 74.) Slika 6 je SEC hromatogram adalimumaba konjugovanog sa glukokortikosteroidom. (Videti primer 74.) Slika 7 je linijski grafikon koji prikazuje sirove MS podatke o adalimumabu konjugovanom sa glukokortikosteroidom. (Videti primer 74.) Slika 8 je linijski grafikon koji pokazuje dekonvulisane MS podatke adalimumaba konjugovanog sa glukokortikosteroidom. Crn kvadrat i krug predstavljaju ADC sa hidroksilnim i nehidrolizovanim sukcinimidom. Relativna brojnost hidrolizovanog I nehidrolizovanog ADC koristi se za određivanje konverzije hidrolize. (Videti primer 74.) Slika 9 pokazuje da je anti-TNF steroidni ADC znatno efikasniji u smanjenju upale uha kod miševa od istovremene kombinacije antitela protiv TNF i steroida ili od samog antitela protiv TNF. (Videti primer 84.) Slika 10 pokazuje da je jedna doza anti-TNF steroidnog ADC efikasna u smanjenju otoka šape kao i 21 dan dnevnog doziranja steroida. (Videti primer 85.) Slika 11 prikazuje promenu težine životinja lečenih steroidima, antitelom protiv TNF, anti TNF ADC ili izotipom ADC. (Videti primer 85.) Slika 12 pokazuje da pojedinačna doza anti-TNF steroidnog ADC može smanjiti utvrđeno oticanje šape, dok je pojedinačna doza antitela na TNF imala minimalan efekat. (Videti primer 88.) Slika 13 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na gubitak kostiju tarzusa mereno mikro kompjuterska tomografija (mCT). (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadrati ili trouglovi) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Slika 14 pokazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na upalu. (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadratići ili trouglovi) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Na slici 15 prikazan je efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na stvaranje panusa. (Pojedinačni podaci tačaka (npr. Krugovi, kvadrati ili trouglovi) predstavljaju pojedinačne životinje.). (Videti primer 88). Slika 16 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na eroziju kostiju. (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadrati ili trouglovi) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Slika 17 pokazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na oštećenje hrskavice. (Pojedinačni podaci tačke (npr. krugovi, kvadrati ili trouglovi) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Slika 18 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na bele krvne ćelije u perifernoj krvi. (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadratići ili dijamanti) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Slika 19 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na neutrofile u perifernoj krvi. (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadrati ili dijamanti) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88.) Slika 20 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na limfocite u perifernoj krvi. (Pojedinac tačaka podataka (npr. Krugovi, kvadrati ili dijamanti) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Videti primer 88). Slika 21 pokazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na monocite u perifernoj krvi. (Pojedinačne tačke podataka (npr. Krugovi, kvadrati ili dijamanti) predstavljaju pojedinačne životinje.) (Pogledajte primer 88.) Slika 22 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na eozinofile u perifernoj krvi. (Pogledajte primer 88.) Slika 23 prikazuje efekat lečenja anti-TNF steroidnim ADC na bazofile u perifernoj krvi. (Pogledajte primer 88.) Slika 24 prikazuje aktivnost anti-TNF steroidnog ADC i anti-CD 163 steroidnog ADC u artritisu izazvanom mišjim kolagenom. (Videti primer 89.)
DETALJAN OPIS PRONALASKA
I. Definicije
[0006] Da bi se olakšalo razumevanje ovog otkrića, u nastavku su definisani brojni termini i fraze.
[0007] Izraz "anti-TNF alfa protein" odnosi se na proteine koji su sposobni (i) da se vežu za TNF alfa i (ii) da inhibiraju vezivanje rastvorljivog TNF-alfa za TNF receptore na površini ćelije (p55 i / ili p75) i / ili površinsko liziranje TNF alfa ili TNF alfa receptora koji eksprimiraju ćelije in vitro u prisustvu komplementa. Anti-TNF alfa proteini uključuju, na primer, antitela na TNF ili njihove antigen-vezujuće fragmente (npr. Adalimumab ili infliksimab), kao i rastvorljive TNF receptore (npr. Etanercept).
[0008] Kako su ovde upotrebljeni, izrazi "antitelo" i "antitela" su termini umetnosti i ovde se mogu koristiti naizmenično i odnose se na molekul sa mestom za vezivanje antigena koje se specifično vezuje za antigen.
[0009] Izraz "antitelo" označava molekul imunoglobulina koji prepoznaje i specifično se vezuje za metu, kao što su protein, polipeptid, peptid, ugljeni hidrati, polinukleotid, lipid ili kombinacije prethodno navedenog kroz najmanje jedno mesto za prepoznavanje antigena unutar varijabilni region molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata netaknuta poliklonska antitela, netaknuta monoklonska antitela, himerna antitela, humanizovana antitela, humana antitela, fuzione proteine koji sadrže antitelo i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina sve dok antitela pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitelo može biti iz bilo koje pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, ili njihovih potklasa (izotipova) (npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2), na osnovu identitet njihovih konstantnih domena teškog lanca koji se nazivaju alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Različite klase imunoglobulina imaju različite i dobro poznate strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije. Antitela mogu biti gola ili konjugovana sa drugim molekulima kao što su toksini, radioizotopi itd. Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata bispecifična i multispecifična antitela.
[0010] Izraz "fragment antitela" odnosi se na deo netaknutog antitela. "Fragment koji vezuje antigen" se odnosi na deo netaknutog antitela koje se vezuje za antigen. Fragment koji vezuje antigen može da sadrži varijabilne regione netaknutog antitela koji određuju antigen. Primeri fragmenata antitela uključuju, ali nisu ograničeni na Fab, Fab ’, F (ab’) 2 i Fv fragmente, linearna antitela i jednolančana antitela. „Fragment koji veže antigen može biti bispecifični ili multispecifični fragment koji veže antigen.
[0011] Izraz "antitelo na TNF-alfa" ili "antitelo koje se vezuje za TNF-alfa" odnosi se na antitelo koje je sposobno vezivanja TNF-alfa sa dovoljnim afinitetom tako da je antitelo korisno kao dijagnostičko i / ili terapeutsko sredstvo za ciljanje TNF-alfa. Obim vezivanja antitela na TNF-alfa za nepovezan, ne-TNF-alfa protein može biti manji od oko 10% vezivanja antitela za TNF-alfa, mereno, na primer, radioimunološkim testom (RIA). U određenim realizacijama, antitelo koje se vezuje za TNF-alfa ima disocijacionu konstantu (Kd) od ≤1 mM, ≤100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM ili ≤0.1 nM.
[0012] „Monoklonsko“antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen odnosi se na homogenu populaciju antitela ili fragmenta koji vezuje antigen, uključeno u visoko specifično prepoznavanje i vezivanje jedne antigene odrednice ili epitopa. Ovo je za razliku od poliklonalnih antitela koja obično uključuju različita antitela usmerena protiv različitih antigenih determinanti. Izraz "monoklonsko" antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment obuhvata i netaknuta monoklonska antitela u punoj dužini, kao i fragmente antitela (kao što su Fab, Fab ’, F (ab’) 2, Fv), jednolančani (scFv) mutanata, fuzijski proteini koji sadrže deo antitela i bilo koji drugi modifikovani molekul imunoglobulina koji sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Dalje, "monoklonsko" antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment se odnosi na takva antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente napravljene na bilo koji način, uključujući, ali ne ograničavajući se na hibri-dom, selekciju faga, rekombinantnu ekspresiju i transgene životinje.
[0013] Izraz "humanizovano" antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment odnosi se na oblike ne-ljudi (npr. Mišji) antitela ili fragmenti koji vezuju antigen, a to su specifični lanci imunoglobulina, himerni imunoglobulini ili njihovi fragmenti koji sadrže minimalne nehumane (npr. Mišje) sekvence. Tipično, humanizovana antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti su humani imunoglobulini u kojima se ostaci iz komplementarnog određujućeg regiona (CDR) zamenjuju ostacima iz CDR-a ne-humane vrste (npr. Miš, pacov, zec, hrčak) koji imaju željenu specifičnost, afinitet i sposobnost („kalemljeni CDR“) (Jones i sar., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann i sar., Nature 35332: 323-327 (1988); Verhoeien i sar., Science 239: 1534-1536 (1988)). U nekim slučajevima, ostaci Fv okvira (FR) humanog imunoglobulina zamenjuju se odgovarajućim ostacima u antitelu ili fragmentu ne-humane vrste koja ima željenu specifičnost, afinitet i sposobnost. Humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu se dalje modifikovati supstitucijom dodatnih ostataka bilo u Fv okvirnom region i / ili unutar zamenjenih nehumanih ostataka da bi se oplemenilo i optimizovalo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment specifičnost, afinitet i / ili sposobnost. Generalno, humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment sadržaće u osnovi sve najmanje jedan, i tipično dva ili tri promenljiva domena koji sadrže sve ili suštinski sve CDR regione koji odgovaraju nehumanom imunoglobulinu, dok svi ili u suštini to su sve FR regije konsenzus sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment mogu takođe da sadrže najmanje deo konstantnog regiona ili domena imunoglobulina (Fc), tipično onog od humanog imunološkog sistema noglobulin. Primeri metoda korišćenih za stvaranje humanizovanih antitela opisani su u U.S. 5,225,539; Roguska i sar., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 (3): 969-973 (1994), i Roguska et al., Protein Eng. 9 (10): 895-904 (1996). U nekim realizacijama, "humanizovano antitelo" je obnovljeno antitelo.
[0014] „Varijabilni region“ antitela odnosi se na promenljivi region lakog lanca antitela ili promenljivi region teškog lanca antitela, bilo samostalno ili u kombinaciji. Svaka varijabilna regija teškog i lakog lanca se sastoje od četiri okvirna regiona (FR) koja su povezana sa tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR), takođe poznatim kao hipervarijabilni regioni. CDR-ovi u svakom lancu se u neposrednoj blizini drže zajedno sa FR-ovima i, zajedno sa CDR-ovima iz drugog lanca, doprinose stvaranju antigen-vezujućeg mesta antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR-a: (1) pristup zasnovan na varijabilnosti sekvence među vrstama (tj. Kabat et al. Sekvuence proteina od imunološkog interesa, (5. izdanje, 1991, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda Md .)); i (2) pristup zasnovano na kristalografskim studijama kompleksa antigen-antitela (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273: 927-948)). Pored toga, kombinacije ova dva pristupa se ponekad koriste u struci za određivanje CDR-a.
[0015] Kabat sistem numerisanja se obično koristi kada se odnosi na ostatak u promenljivom domenu (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca) (npr. Kabat et al., Sekvence od imunološkog interesa. 5-i Ed. Služba javnog zdravlja, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md. (1991). Ako nije izričito naznačeno drugačije, ovde se, kao sistem numeracije, koristi Kabatov sistem brojeva.
[0016] Numeracija položaja aminokiselina kao u Kabatu, odnosi se na sistem numerisanja koji se koristi za promenljive domene teškog lanca ili promenljive domene lakog lanca u kompilaciji antitela u Kabat et al., Sekuvence proteina od imunološkog interesa, 5-to izdanje Službe javnog zdravlja, Nacionalni institut za zdravlje, Bethesda, Md. (1991). Koristeći ovaj sistem numerisanja, stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može sadržati manje ili dodatnih aminokiselina što odgovara skraćivanju ili umetanju u FR ili CDR promenljivog domena. Na primer, promenljivi domen teškog lanca može uključivati jedan aminokiselinski umetak (ostatak 52a prema Kabatu) nakon ostatka 52 H2 i umetnuti ostaci (npr. ostaci 82a, 82b i 82c, itd. prema Kabatu) nakon teškog lanca FR ostatka 82. Kabat numerisanje ostataka se može odrediti za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" Kabat numeriranom sekvencom. Chothia se umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia i Lesk J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987)). Kraj Chothia CDR-H1 petlje kada je numerisan pomoću Kabat konvencije numerisanja varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine petlje (to je zato što Kabat numerisanje šema postavlja umetke na H35A i H35B; ako nisu prisutni ni 35A ni 35B, petlja se završava na 32; ako je samo 35A prisutno, petlja se završava na 33; ako su prisutna i 35A i 35B, petlja se završava na 34). AbM hipervarijabilni regioni predstavljaju kompromis između Kabat CDR-ova i strukturnih petlji Chothia, a koristi ih softver za modeliranje antitela AbM kompanije Okford Molecular.
[0017] U određenim aspektima, CDR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen mogu se odrediti prema shemi numerisanja Chothia, koja se odnosi na lokaciju strukturnih petlji imunoglobulina (vidi, na primer, Chothia C& Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B i sar., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C i sar., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A i sar., (1990) J Mol Biol 215 (1): 175-82; i američki patent br. 7,709,226). Tipično, kada se koristi Kabat konvencija numerisanja, Chothia CDR-H1 petlja je prisutna u aminokiselinama teškog lanca 26 do 32, 33 ili 34, Chothia CDR-H2 petlja je prisutna kod aminokiselina teškog lanca 52 do 56, a Chothia CDR-H3 petlja je prisutan u aminokiselinama teškog lanca 95 do 102, dok je petlja Chothia CDR-L1 prisutan u aminokiselinama lakog lanca 24 do 34, petlja Chothia CDR-L2 prisutna je kod aminokiselina lakog lanca 50 do 56, a petlja Chothia CDR-L3 prisutna je kod aminokiselina lakog lanca 89 do 97. Kraj petlje Chothia CDR-H1 kada je numerisan korišćenje Kabat konvencije numerisanja varira između H32 i H34 u zavisnosti od dužine petlje (to je zato što Kabat shema numerisanja postavlja umetke na H35A i H35B; ako nisu prisutni ni 35A ni 35B, petlja se završava na 32; ako samo 35A je prisutan, petlja se završava na 33; ako su prisutna i 35A i 35B, petlja se završava na 34).
[0018] U određenim aspektima, CDR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen mogu se odrediti prema IMGT sistemu numerisanja, kao što je opisano u Lefranc MP, (1999) The Immunologist 7: 132-136 i Lefranc MP et al. , (1999) Nukleinske kiseline Res 27: 209-212. Prema IMGT šemi numerisanja, VH-CDR1 je na pozicijama 26 do 35, VH-CDR2 je na pozicijama 51 do 57, VH-CDR3 je na pozicijama 93 do 102, VL-CDR1 je na pozicijama 27 do 32, VL-CDR2 je na pozicijama 50 do 52, a VL-CDR3 na pozicijama 89 do 97.
[0019] U određenim aspektima, CDR antitela ili njegovog fragmenta koji vezuje antigen mogu se odrediti prema MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. Takođe videti, na primer, Martin A. „Analiza sekvence proteina i struktura promenljivih domena antitela“, u Antitelo inženjerstvo, Kontermann i Dubel, ur., Poglavlje 31, str.422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001).
[0020] U određenim aspektima, CDR antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta mogu se odrediti prema na šemu numerisanja AbM, koja se odnosi na AbM hipervarijabilne regione koji predstavljaju kompromis između Kabat CDR-ova i strukturnih petlji Chothia, a koristi ih softver za modeliranje antitela AbM kompanije Okford Molecular (Okford Molecular Group, Inc.).
[0021] Izraz "humano" antitelo označava antitelo proizvedeno od čoveka ili antitelo koje ima aminokiselinu sekvenca koja odgovara antitelu koje je čovek proizveo upotrebom bilo koje tehnike poznate u tehnici. Ova definicija humanog antitela uključuje netaknuta ili antitela pune dužine, njihove fragmente i / ili antitela koja sadrže najmanje jedan humani polipeptid teškog i / ili lakog lanca, kao što je, na primer, antitelo koje sadrži mišji laki lanac i humani polipeptidi teškog lanca.
[0022] Izraz "himerna" antitela odnosi se na antitela u kojima je aminokiselinska sekvenca molekula imunoglobulina izvedena iz dve ili više vrsta. Tipično, promenljivi region lakog i teškog lanca odgovara promenljivom regionu antitela dobijenih od jedne vrste sisara (npr. Miš, pacov, zec, itd). Sa željenim regionom specifičnost, afinitet i sposobnost dok su konstantni regioni homologni sekvencama u antitelima koja potiču od drugog (obično čoveka) kako bi se izbeglo izazivanje imunog odgovora kod te vrste.
[0023] Termin "epitop" ili "antigena determinanta" ovde se koriste naizmenično i odnose se na onaj deo antigena koji je prepoznatljiv i specifično vezan za određeno antitelo. Kada je antigen polipeptid, epitopi se mogu formirati i od susednih aminokiselina i od nesaleživih aminokiselina, koje se rabe uzastopnim tercijarnim preklapanjem proteina. Epitopi nastali iz susednih aminokiselina obično se zadržavaju nakon denaturiranja proteina, dok epitopi nastali tercijarnim savijanjem obično se gube denaturiranjem proteina. Epitop obično uključuje najmanje 3 I još obično, najmanje 5 ili 8-10 aminokiselina u jedinstvenoj prostornoj konformaciji.
[0024] „Afinitet vezivanja“se generalno odnosi na jačinu ukupnog zbira nekovalentnih interakcija između jednog mesta vezivanja molekula (npr. Antitela) i njegovog partnera za vezivanje (npr. Antigena). Ukoliko nije drugačije naznačeno, kako se ovde koristi, "afinitet vezivanja" odnosi se na svojstveni afinitet vezivanja koji odražava interakciju 1: 1 između članova veznog para (npr. antitelo i antigen). Afinitet molekula Ks prema njegovom partneru I generalno se može predstaviti sa konstanta disocijacije (Kd). Afinitet se može meriti uobičajenim metodama poznatim u struci, uključujući ovde opisane. Antitela sa niskim afinitetom se uglavnom polako vezuju za antigen i imaju tendenciju da se lako disociraju, dok se antitela sa visokim afinitetom uglavnom brže vezuju za antigen i teže da ostanu duže vezana. U tehnici su poznati različiti postupci za merenje afiniteta vezivanja, od kojih se bilo koji može koristiti u svrhe ovog otkrića. Specifične ilustrativne realizacije opisane su u nastavku.
[0025] "Ili bolje", kada se ovde koristi za afinitet vezivanja, odnosi se na jače vezivanje između molekula i njegovog partnera za vezivanje. „Ili bolje“kada se ovde koristi odnosi se na jače vezivanje, predstavljeno manjom numeričkom vrednošću Kd. Na primer, antitelo koje ima afinitet za antigen „0,6 nM ili bolji“, afinitet antitela za antigen je <0,6 nM, tj. 0,59 nM, 0,58 nM, 0,57 nM itd. Ili bilo koju vrednost manju od 0,6 nM.
[0026] Pod „specifično vezanim“podrazumeva se da se antitelo veže za epitop preko svog domena za vezivanje antigena, i da vezivanje podrazumeva izvesnu komplementarnost između domena koji vezuje antigen i epitopa. Prema ovoj definiciji, za antitelo se kaže da se „specifično veže“ za epitop kada se veže za taj epitop, preko svog domena koji veže antigen, lakše nego što bi se povezalo za slučajni, nepovezani epitop. Termin "specifičnost" se ovde koristi da bi se kvalifikovao relativni afinitet kojim se određeno antitelo vezuje za određeni epitop. Na primer, može se smatrati da postoji antitelo „A“ imaju veću specifičnost za dati epitop od antitela "B", ili za antitelo "A" može se reći da se veže za epitop "C" sa veća specifičnost nego što je to za srodni epitop „D.“
[0027] Pod izrazom "preferencijalno vezano" podrazumeva se da se antitelo specifičnije veže za epitop lakše nego što bi se vezivalo za srodni, sličan, homologni ili analogni epitop. Prema tome, antitelo koje se „preferencijalno vezuje“ za dati epitop verovatnije bi se vezivalo za taj epitop nego za srodni epitop, iako takvo antitelo može unakrsno reagovati sa srodnim epitopom.
[0028] Za antitelo se kaže da „kompetitivno inhibira“vezivanje referentnog antitela za dati epitop ako se antitelo preferencijalno veže za taj epitop ili epitop koji se preklapa do te mere da blokira, u određenoj meri, vezivanje referentnog antitela. do epitopa. Konkurentska inhibicija može se odrediti bilo kojim postupkom poznatim u struci, na primer,takmičarski ELISA testovi. Može se reći da antitelo konkurentno inhibira vezivanje referentnog antitela za dati epitop za najmanje 90%, najmanje 80%, najmanje 70%, najmanje 60% ili najmanje 50%.
[0029] Polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je „izolovan“ je polipeptid, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koji je u obliku koji nije pronađen u prirodi. Izolovani polipeptidi, antitela, polinukleotidi, vektori, ćelije ili kompozicije uključuju one koji su prečišćeni do te mere da više nisu u obliku u kojem se nalaze u prirodi. U nekim realizacijama, antitelo, polinukleotid, vektor, ćelija ili sastav koja je izolovana je u suštini čista.
[0030] Kako se ovde koristi, „suštinski čist“ odnosi se na materijal koji je najmanje 50% čist (tj. Bez zagađivača), najmanje 90% čist, najmanje 95% čist, najmanje 98% čist ili na najmanje 99% čistoće.
[0031] Termin "imunokonjugat", "konjugat", "konjugat antitelo-lek" ili "ADC", kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenje ili njegov derivat koji je povezan sa proteinom, kao što je sredstvo za vezivanje ćelija (npr. anti-TNF-alfa antitelo ili njegov fragment) i definisano je generičkom formulom: (SM-LK) nA, gde je SM = radikal izveden iz male- Agonist glukokortikoidnih receptora od molekula, npr. Glukokortikosteroid, L = linker, K = heterobifunkcionalna grupa, hetero-trifunkcionalna grupa ili je odsutan i A = protein (npr. Antitelo ili njegov fragment koji veže antigen, anti- TNF protein, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment, rastvorljivi receptor ili rastvorljivi TNF receptor), i n = 1-10. Imunokonjugati se takođe mogu definisati generičkom formulom obrnutim redosledom: A- (K-L-SM) n. Kao ilustracija, sledeća generička formula pokazuje imunokonjugat koji ima dipeptidni (Ala-Ala) linker i heterobifunkcionalnu grupu zasnovanu na sukcinimid tioeteru:
[0032] U ovom otkriću, termin "linker" odnosi se na bilo koji hemijski deo koji je sposoban da veže protein, npr. antitelo, fragment antitela (npr. Fragmenti koji vežu antigen) ili funkcionalni ekvivalent glukokortikosteroidu. Linkeri su možda osetljivi na cepanje („cepljivi linker “), što olakšava oslobađanje glukokortikosteroida. Na primer, takvi cepljivi linkeri mogu biti podložni cepanju indukovanom kiselinom, cepanjem indukovanim foto, peptidazom indukovanim cepanjem, cepanjem indukovanim esterazom i cepanjem disulfidnih veza, pod uslovima pod kojima glukokortikosteroid i / ili antitelo ostaju aktivni. Alternativno, povezivači mogu biti u osnovi otporni na cepanje („nepovezivi povezivač“).
[0033] U ovom otkriću, necepljivi linkeri su bilo koji hemijski deo koji je sposoban da poveže glukokortikosteroid sa antitelom na stabilan, kovalentni način i ne spada u gore navedene kategorije za vezujuće vezive. Dakle, necepljivi linkeri su u suštini otporni na cepanje izazvano kiselinom, foto-indukovano cepanje, peptidaza - indukovano cepanje, cepanje indukovano esterazom i cepanje disulfidne veze. Štaviše, necepivi se odnosi na sposobnost hemijske veze u vezivu ili susednom vezivu da izdrži cepanje indukovano kiselinom, fotolabilnim sredstvo za cepanje, peptidaza, esteraza ili hemijsko ili fiziološko jedinjenje koje cepa disulfidnu vezu, pod uslovima pod kojima glukokortikosteroid i / ili antitelo ne gube svoju aktivnost.
[0034] Neki cepljivi linkeri cepaju se peptidazama („peptidazni cepljivi linkeri“). Samo se određeni peptidi lako cepaju unutar ili izvan ćelija, vidi npr. Trout et al., 79 Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 626-629 (1982) i Umemoto et al. 43 Int. J. Cancer, 677-684 (1989). Dalje, peptidi se sastoje od α-aminokiselinskih jedinica i peptidnih veza, koji su hemijski amidne veze između karboksilata jedne aminokiseline i amino grupe druge aminokiseline. Pod drugim amidnim vezama, poput veze između karboksilata i a-aminokiselinske grupe lizina, podrazumeva se da nisu peptidne veze i smatraju se da se ne mogu cepati.
[0035] Neki linkeri se cepaju esterazama ("esteraze koji se mogu cepiti"). Samo određeni estri mogu da se cepe esteraze prisutne unutar ili izvan ćelija. Estri nastaju kondenzacijom karboksilne kiseline I alkohola. Jednostavni estri su esteri proizvedeni iz jednostavnih alkohola, kao što su alifatski alkoholi, i malih cikličnih i malih aromatičnih alkohola.
[0036] U nekim realizacijama, komponenta koja se može razdvojiti može sadržati peptid koji sadrži jedan do deset aminokiselinskih ostataka. U ovim realizacijama, peptid omogućava cepljenje veznika proteazom, olakšavajući tako oslobađanje glukokortikosteroida nakon izlaganja unutarćelijskim proteazama, kao što su lizosomski enzimi (Doronina et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21: 778-784). Primeri peptida uključuju, ali nisu ograničeni na, dipeptide, tripeptide, tetrapeptide i pentapeptide. Primeri dipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, alanin-alanin (alaala), valin-citrulin (vc ili val-cit), alanin-fenilalanin (af ili ala-phe); fenilalanin-lizin (fk ili fe-liz); fenilalanin-homo-lizin (fe-homoli); i N-metil-valin-citrulin (Me-val-cit). Primeri tripeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, glicin-valin-citrulin (gli-val-cit) i glicin-glicin-glicin (gli-gli-gli).
[0037] Peptid može sadržati prirodne i / ili neprirodne aminokiselinske ostatke. Termin „aminokiselina sa prirodnim okretom“ odnosi se na Ala, Asp, Cis, Glu, Phe, Gli, His, He, Lis, Leu, Met, Asn, Pro, Gin, Arg, Ser, Thr, Val, Trp ,i Tir. „Neprirodne aminokiseline“ (tj. Aminokiseline se prirodno ne javljaju) uključuju, između ostalog, homoserin, homoarginin, citrulin, fenilglicin, taurin, jodotirozin, seleno-cistein, norleucin („Nle“), norvalin ("Nva"), betaalanin, L- ili D-naftalanin, ornitin ("Orn") i slično. Peptidi se mogu dizajnirati i optimizovati za enzimatsko cepanje određenim enzimom, na primer, tumorom povezana proteaza, katepsin B, C i D ili plazmin proteaza.
[0038] Aminokiseline takođe uključuju D-oblike prirodnih i neprirodnih aminokiselina. "D-" označava aminokiselinu koja ima "D" (dekstrorotarnu) konfiguraciju, za razliku od konfiguracije u prirodnim ("L-") aminokiselinama. Prirodne i neprirodne aminokiseline mogu se kupiti komercijalno (Sigma Chemical Co., Advanced Chemtech) ili sintetizovano korišćenjem postupaka poznatih u tehnici.
[0039] U ovom otkriću, pojam "glukokortikosteroid" se odnosi na prirodne ili sintetičke steroidne hormoni koji stupaju u interakciju sa glukokortikoidnim receptorima. Primeri glukokortikosteroida koji ne ograničavaju uključuju:
Kao primer, A-, B-, C- i D-prstenovi steroidnog skeleta su označeni za budezonid. Glukokortikosteroidi su opisani u VO 2009/069032.
[0040] "Radikal glukokortikosteroida" je izveden uklanjanjem jednog ili više atoma vodonika iz matičnog glukokortikosteroida. Uklanjanje atoma vodonika olakšava vezivanje matičnog glukokortikosteroida za linker. U jednoj realizaciji, atom vodonika se uklanja iz bilo koje pogodne -NH2 grupe matičnog glukokortikosteroida. U još jednom izvođenju, atom vodonika se uklanja iz bilo koje pogodne -OH grupe matičnog glukokortikosteroida. U još jednom izvođenju, atom vodonika se uklanja iz bilo koje pogodne -SH grupe matičnog glukokortikosteroida. U još jednom izvođenju, atom vodonika se uklanja iz bilo koje pogodne -N (H) - grupe matičnog glukokortikosteroida. U još jednom izvođenju, atom vodonika se uklanja iz bilo koje pogodne -CH3, -CH2- ili -CH = grupe matičnog glukokortikosteroida. U jednoj realizaciji, "radikal glukokortikosteroida" je monovalentni radikal izveden iz uklanjanje jednog atoma vodonika sa matičnog glukokortikosteroida.
[0041] U ovom otkriću, termin "heterobifunkcionalna grupa" ili termin "heterotrifunkcionalna grupa" odnosi se na hemijski deo koji povezuje linker i protein, na primer, antitelo. Heterobi- i trifunkcionalne grupe su okarakterisane kao da imaju različite reaktivne grupe na oba kraja hemijske grupe. Neograničavajuće primerne heterobifunkcionalne grupe uključuju:
Neograničavajući primer heterotrifunkcionalne grupe je:
[0042] Izraz "odnos antitela na lek" ili "DAR" odnosi se na broj SM (tj. Radikal izveden iz agonista glukokortikoidnog receptora malog molekula, npr. Glukokortikosteroid) vezan za A (tj. Protein, npr. antitelo ili vezivanje antigena njegovih fragmenata, anti-TNF protein, antitelo protiv TNF-alfa ili njegov fragment, rastvorljivi receptor ili rastvorljivi TNF receptor). Dakle, u imunokonjugatu koji ima generičku formulu (SM-L-K) n-A, DAR je definisan promenljivom „n“.
[0043] Kada se odnosi na jedinjenje koje ima formulu (SM-L-K) n-A koje predstavlja pojedinačni imunokonjugat, DAR se odnosi na broj SM povezanih sa pojedincem A (na primer, n je ceo broj od 1 do 10).
[0044] Kada se odnosi na jedinjenje koje ima formulu (SM-LK) nA koje predstavlja mnoštvo imunokonjugata, DAR se odnosi na prosečan broj SM povezanih sa As (npr. N je ceo broj ili udeo od 1 do 10) . Tako, kao primer, jedinjenje formule (SM-L-K) n-A koje sadrži prvi imunokonjugat sa 3 SM po A i drugi imunokonjugat sa 4 SM po A imao bi DAR (tj., „n“) 3,5.
[0045] Izraz "subjekat" odnosi se na bilo koju životinju (npr. Sisara), uključujući, ali ne ograničavajući se na ljude, ne-ljude primata, glodara i slično, što će biti primalac određenog tretmana. Pojmovi "subjekat" i "pacijent" ovde se obično koriste naizmenično u odnosu na ljudskog subjekta.
[0046] Izraz "farmaceutska formulacija" odnosi se na preparat koji je u takvom obliku koji omogućava biološku aktivnost aktivnog sastojka da bude efikasan i koji ne sadrži dodatne komponente koje su neprihvatljivo toksičan za subjekt kome bi se formulacija primenjivala. Formulacija može biti sterilna.
[0047] Pojmovi poput „lečenje“ ili „lečenje“ ili „lečenje“ ili „ublažavanje“ ili „ublažavanje“ odnose se na terapijske mere koje leče, usporavaju, umanjuju simptome i / ili zaustavljaju napredovanje dijagnostikovanog patološko stanje ili poremećaj. Dakle, oni kojima je potrebno lečenje uključuju one kojima je već dijagnostikovan ili se sumnja da imaju poremećaj. Profilaktičke ili preventivne mere odnose se na mere koje sprečavaju i / ili usporavaju razvoj ciljanog patološkog stanja ili poremećaj. Dakle, oni kojima su potrebne profilaktičke ili preventivne mere uključuju one koji su skloni da imaju poremećaj I onih kod kojih poremećaj treba sprečiti.
[0048] "Polinukleotid" ili "nukleinska kiselina", kako se ovde koristi naizmenično, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine i uključuje DNK i RNK. Nukleotidi mogu biti deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze i / ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji se može ugraditi u polimer pomoću DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može sadržati modifikovane nukleotide, kao što su metilirani nukleotidi i njihovi analogi. Ako je prisutan, modifikacija strukture nukleotida može se dati pre ili posle sastavljanja polimera. Niz nukleotida može biti prekinut ne-nukleotidnim komponentama. Polinukleotid se može dalje modifikovati nakon polimerizacije, na primer konjugacijom sa komponentom za obeležavanje. Druge vrste modifikacija uključuju, na primer, "kape", supstitucija jednog ili više nukleotida koji se javljaju u prirodi sa analognim, internukleotidnim modifikacijama, kao što su, na primer, one sa nenaelektrisanim vezama (npr. metil fosfonati, fosfotristri, fosfoamidi, kabamata, itd.) I sa naelektrisanim vezama (npr. Fosforotioati, fosforoditioati, itd.), Oni koji sadrže ostatke olovke, kao što su, na primer, proteini (npr. Nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, pli-L -lizin, itd.), oni sa interkalatorima (npr. akridin, psoralen itd.), oni koji sadrže helatore (npr. metali, radioaktivni metali, bor, oksidativni metali itd.), oni koji sadrže alkilatore, oni sa modifikovanim vezama ( npr. alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), kao i nemodifikovani oblici polinukleotida (a). Dalje, bilo koja hidroksilna grupa koja je obično prisutna u šećera može biti zamenjeno, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, zaštićenim standardnim zaštitnim grupama, ili aktiviranim za pripremu dodatnih veza sa dodatnim nukleotidima, ili mogu biti konjugovani sa čvrstim nosačima. 5 ’i 3’ terminalni OH mogu biti fosforilirani ili supstituisani aminima ili organskim poklopcima koji sadrže 1 do 20 atoma ugljenika. Ostali hidroksili se takođe mogu derivatizovati u standardne zaštitne grupe. Polinukleotidi mogu takođe da sadrže analogne oblike šećera riboze ili deoksiriboze koji su opšte poznati u struci, uključujući, na primer, 2’- O-metil-, 2'-O-alil, 2'-fluoro- ili 2'-azido-riboza, analozi karbocikličnog šećera, a-anomerni šećeri, epimerni šećeri poput arabinoze, ksiloze ili liksoze, piranozni šećeri, šećeri furanoze, sedoheptuloze, aciklični analogi i abasični nukleozidni analogi kao što je metil ribozid. Jedna ili više fosfodiesterskih veza mogu se zameniti alternativnim veznim grupama. Ove alternativne grupe za povezivanje uključuju, ali nisu ograničene na, izvođenja u kojima je fosfat zamenjen sa P (O) S ("tioat"), P (S) S ("ditioat"), "(O) NR2 (" amidat "), P (O) R, P (O) OR ', CO ili CH2 ( „formacetal“), u kojoj svaki R ili R’ je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 ° C) koji opciono sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu biti identične. Prethodni opis se odnosi na sve polinukleotide na koje se ovde odnosi, uključujući RNK i DNK.
[0049] Izraz "vektor" znači konstrukciju koja je sposobna da isporuči i opciono izrazi jedan ili više gen (i) ili sekvence (a) od interesa u ćeliji domaćina. Primeri vektora uključuju, ali nisu ograničeni na, virusne vektore, gole vektore ekspresije DNK ili RNK, plazmidne, kosmidne ili fage vektore, vektore ekspresije DNK ili RNK povezane sa kationskim kondenzacionim agensima, vektore ekspresije DNK ili RNK kapsulirane u liposome i određene eukariotske ćelije, poput ćelija proizvođača.
[0050] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" ovde se koriste naizmenično za označavanje polimera aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može biti ravan ili razgranat, može sadržati modifikovane aminokiseline, a mogu ga prekinuti ne-aminokiseline. Termini takođe uključuju aminokiselinski polimer koji je modifikovan prirodno ili intervencijom; na primer, formiranje disulfidne veze, glikozilacija, lipidiranje, acetilacija, fosforilacija ili bilo koja druga manipulacija ili modifikacija, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Takođe su uključeni u definiciju, na primer, 10 polipeptida koji sadrže jedan ili više analoga aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline, itd.), Kao i druge modifikacije poznate u tehnici. Razume se da, pošto se polipeptidi ovog otkrića zasnivaju na antitelima, u određenim rešenjima, polipeptidi se mogu pojaviti kao pojedinačni lanci ili povezani lanci.
[0051] Izrazi „identičan“ili procenat „identiteta“u kontekstu dve ili više nukleinskih kiselina ili polipeptida, odnose se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju naznačeni procenat nukleotida ili aminokiseline ostataka koji su isti, kada se uporede i poravnaju (unoseći praznine, ako je potrebno) za maksimalnu korespondenciju, ne uzimajući u obzir konzervativne zamene aminokiselina kao deo identiteta sekvence. Procenat identiteta može se meriti pomoću softvera ili algoritama za upoređivanje sekvenci ili vizuelnim pregledom. U tehnici su poznati različiti algoritmi i softver koji se mogu koristiti za dobijanje poravnanja sekvenci aminokiselina ili nukleotida. Jedan od takvih neograničavajućih primera algoritma za poravnavanje niza je algoritam opisan u Karlin et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 2264-226820 (1990), izmenjeno u Karlin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90: 5873-5877 (1993), i uključeni u programe NBLAST i KSBLAST (Altschul i sar., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1991)). U određenim rešenjima, Gapped BLAST se može koristiti kako je opisano u Altschul et al., Nucleic Acids Res.25: 3389-3402 (1997). Dodatni su BLAST-2, VU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzimologi, 266: 460-480 (1996)), ALIGN, ALIGN-2 (Genentech, South San Francisco, California) ili Megalign (DNASTAR) javno dostupni softverski programi koji se mogu koristiti za poravnanje sekvenci. U određenim rešenjima, procenat identiteta između dve nukleotidne sekvence određuje se pomoću programa GAP u softveru GCG (na primer, pomoću matrice NVSgapdna.CMP i težine praznine 40, 50, 60, 70 ili 90 i težine dužine 1 , 2, 3, 4, 5 ili 6). U određenim alternativnim rešenjima, GAP program u softverskom paketu GCG, koji uključuje algoritam Needleman-a i Vunscha (J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)), može se koristiti za određivanje procenta identiteta između dve sekvence aminokiselina (npr. korišćenjem matrice Blossum 62 ili matrice PAM250, i težine praznine od 3016, 14, 12, 10, 8, 6 ili 4 i dužine 1, 2, 3, 4, 5). Alternativno, u određenim realizacijama, procenat identiteta između nukleotidnih ili aminokiselinskih sekvenci određuje se korišćenjem algoritma Miers i Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)). Na primer, procenat identiteta može se odrediti pomoću programa ALIGN (verzija 2.0) i pomoću PAM120 sa tabelom ostataka, kaznom dužine praznine 12 i kaznom praznine 4. Odgovarajući parametri za maksimalno poravnanje pomoću određeni softver za poravnanje može odrediti stručnjak u ovoj oblasti. U određenim rešenjima, zadati parametri koristi se softvera za poravnanje. U određenim realizacijama, procentualni identitet "Ks" prve aminokiselinske sekvence sa drugom aminokiselinom u sekvenci izračunava se kao 100 k (I / Z), gde je I broj aminokiselinskih ostataka koji su zabeleženi kao identična poklapanja u poravnanju prva i druga sekvenca (poravnana vizuelnim pregledom ili određenim programom za poravnavanje sekvence) i Z je ukupan broj ostataka u drugoj sekvenci. Ako je dužina prvog sekvenca je duža od druge sekvence, procenat identiteta prve sekvence prema drugoj sekvenci biće duži od procenta identiteta druge sekvence prema prvoj sekvenci.
[0052] Kao neograničavajući primer, da li bilo koji određeni polinukleotid ima određeni procentualni identitet sekvence (npr., Da li je najmanje 80% identičan, najmanje 85% identičan, najmanje 90% identičan, au nekim realizacijama najmanje 95 %, 96%, 97%, 98% ili 99% identično) referentne sekvence može se, u određenim rešenjima, odrediti pomoću programa Bestfit (Paket za analizu sekvence u Viskonsinu, verzija 8 za Unik, Genetics Computer Group, Universiti Research 45 Park, 575 Science Drive, Madison, VI 53711). Bestfit koristi lokalni homološki algoritam Smitha i Vatermana (Ad-vances in Applied Mathematics 2: 482489 (1981)) kako bi pronašao najbolji segment homologije između dve sekvence. Kada se koristi Bestfit ili bilo koji drugi program za poravnavanje sekvence da bi se utvrdilo da li je određena sekvenca, na primer, 95% identična referentnoj sekvenci prema sadašnjem otkrivanju, parametri se postavljaju tako da procenat identiteta izračunava se u punoj dužini referentne nukleotidne sekvence i taj jaz u homologiji iznosi do 5% dozvoljeno je od ukupnog broja nukleotida u referentnoj sekvenci.
[0053] U nekim realizacijama, dve nukleinske kiseline ili polipeptidi iz ovog otkrića su u osnovi identični, što znači da imaju najmanje 70%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, a u nekim realizacije najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identiteta nukleotida ili aminokiselinskih ostataka, kada se upoređuju i poravnaju radi maksimalne korespondencije, mereno upotrebom algoritma za upoređivanje sekvenci ili vizuelnim pregledom. Identitet može postojati u regionu od sekvence čija je dužina najmanje oko 10, oko 20, oko 40-60 ostataka ili bilo koja integralna vrednost između, i može biti u dužem području od 60-80 ostataka, na primer, najmanje oko 90-100 ostataka, i u nekim realizacijama, sekvence su suštinski identične tokom cele dužine sekvenci koje se upoređuju, kao što je na primer kodni region nukleotidne sekvence.
[0054] Konzervativna supstitucija aminokiselina" je ona u kojoj je jedan aminokiselinski ostatak zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući osnovne bočne lance (npr. Lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. Asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolaran bočnih lanaca (npr. Alanin, valin, leucin, izolevcin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta razgranati bočni lanci (npr. Treonin, valin, izoleucin) i aromatični bočni lanci (npr. Tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Na primer, supstitucija fenilalanina za tirozin je konzervativna supstitucija. U nekim realizacijama, konzervativne supstitucije u sekvencama polipeptida i antitela iz otkrića ne ukidaju vezivanje antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu za antigen (e), npr. TNF-alfa na koji antitelo veza. Metode identifikovanja konzervativnih supstitucija nukleotida i aminokiselina koje ne eliminišu vezivanje antigena dobro su poznate u tehnici (videti, na primer, Brummell et al., Biochem.32: 1180-1187 (1993); Kobaiashi et al., Protein Inž.12 (10): 879-884 (1999) i Burks i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: .412-417 (1997)).
[0055] U ovom otkriću, izraz "zaštitna grupa" ili "PG" odnosi se na grupu koja blokira, tj. aminsku funkcionalnost dok se reakcije izvode na drugim funkcionalnim grupama ili delovima molekula. Oni koji su vešti stručnjak će biti upoznat sa odabirom, vezivanjem i cepanjem zaštitnih grupa amina i shvatiće da je u tehnici poznato mnogo različitih zaštitnih grupa, prikladnost jedne ili druge zaštitne grupe zavisi od određene planirane sintetičke šeme.Traktati na ovu temu dostupni su za konsultacije, poput Vuts, P. G. M .; Greene, T. V., "Greene's Protective Groups in Organic Sinthesis", 4th Ed., J. Vilei & Sons, NI, 2007. Pogodne zaštitne grupe uključuju karbobenziloksi (Cbz), terc-butiloksikarbonil (BOC), 9- fluorenilmetiloksikarbonil FMOC) i benzil (Bn) grupa. U jednom aspektu, zaštitna grupa je BOC grupa.
[0056] Ovde prikazana jedinjenja sadrže asimetrične centre i tako dovode do nastanka enantiomera, dijastereomera i drugih stereoizomernih oblika. Ovo otkriće treba da obuhvati upotrebu svih takvih mogućih oblika, kao i njihove racemične i razrešene forme i njihove smeše. Pojedinačni enantiomeri se mogu razdvojiti prema postupcima poznatim u struci s obzirom na ovo otkriće. Kada ovde opisana jedinjenja sadrže olefinske kiseline dvostrukih veza ili drugih centara geometrijske asimetrije, i ukoliko nije drugačije naznačeno, podrazumeva se da uključuju i E i Z geometrijske izomere. Svi tautomeri su takođe namenjeni da budu obuhvaćeni ovim otkrićem.
[0057] Ovo otkriće obuhvata pripremu i upotrebu solvata ovde opisanih jedinjenja. Solvati tipično ne menjaju značajno fiziološku aktivnost ili toksičnost jedinjenja, i kao takvi mogu funkcionišu kao farmakološki ekvivalenti. Termin "solvat", kako se ovde koristi, je kombinacija, fizička povezanost i / ili solvatacija jedinjenja iz ovog pronalaska sa molekulom rastvarača kao što je, npr. rastvara, monosolvata ili hemisolvata, gde je odnos molekula rastvarača prema jedinjenju iz ovog pronalaska približno 2: 1, oko 1: 1 ili oko 1: 2, respektivno. Ovo fizičko povezivanje uključuje različit stepen jonske i kovalentne veze, uključujući vezu vodonika. U određenim slučajevima, solvat se može izolovati, na primer kada je ugrađen jedan ili više molekula rastvarača u kristalnu rešetku kristalne čvrste supstance. Dakle, „solvat“ obuhvata solvate u fazi rastvora i izolujuće. Ovde prikazana jedinjenja mogu biti prisutna u solvatnim oblicima sa farmaceutski prihvatljivim rastvaračem, kao što su voda, metanol, etanol i slično, i namerava se da otkriće uključuje i solvatirane i nesolvatirane oblike ovde opisanih jedinjenja. Jedna vrsta solvata je hidrat. "Hidrat" se odnosi na određenu podgrupu solvata gde je molekul rastvarača voda. Solvati obično mogu funkcionisati kao farmakološki ekvivalenti. Priprema solvati su poznati u tehnici. Videti, na primer, M. Caira et al, J. Pharmaceut. Sci., 93 (3): 601-611 (2004), koja opisuje priprema solvata flukonazola sa etil acetatom i vodom. Sličnu pripremu solvata, hemisolvata, hidrata i slično su opisali E. C. van Tonder i sar., AAPS Pharm. Sci. Tech., 5 (1): Član 12 (2004) i A.L. Bingham et al., Chem. Commun.603-604 (2001). Uključio bi tipičan, neograničavajući postupak pripreme solvate rastvaranje ovde otkrivenog jedinjenja u željenom rastvaraču (organski, voda ili njihova smeša) na temperaturama iznad 20 ° C do oko 25 ° C, zatim hlađenje rastvora brzinom dovoljnom za formiranje kristala i izolovanje kristala poznatim metodama, npr. Filtracija. Analitičke tehnike poput infracrvene spektroskopije mogu se koristiti za potvrđivanje prisustva rastvarača u kristalu solvata.
[0058] Ovo otkriće obuhvata pripremu i upotrebu soli ovde opisanih jedinjenja, uključujući netoksične farmaceutski prihvatljive soli. Primeri farmaceutski prihvatljivih adicionih soli uključuju adicione soli neorganskih i organskih kiselina i bazne soli. Farmaceutski prihvatljive soli uključuju, ali nisu ograničene na metalne soli kao što su natrijumova so, kalijumova so, cezijumova so i slično; zemnoalkalijski metali kao što su kalcijumova so, magnezijumova so i slično; soli organskih amina kao što su trietilamin soli, piridin soli, pikolin soli, etanolamin soli, trietanolamin soli, dicikloheksilamin soli, N, N’-dibenziletilendiamin sol i slično; soli anorganske kiseline kao što su hidrohlorid, hidrobromid, fosfat, sulfat i slično; soli organskih kiselina kao što su citrat, laktat, tartarat, maleat, fumarat, mandelat, acetat, dihloroacetat, trifluoroacetat, oksalat, format i slično; sulfonati takvi kao metansulfonat, benzensulfonat, p-toluensulfonat i slično; i soli aminokiselina kao što su arginat, as-parginat, glutamat i slično.
[0059] Kisele adicione soli mogu se formirati mešanjem rastvora određenog jedinjenja otkrivenog sa rastvorom farmaceutski prihvatljive netoksične kiseline kao što je hlorovodonična kiselina, fumarna kiselina, maleinska kiselina, jantarna kiselina, sirćetna kiselina kiselina, limunska kiselina, vinska kiselina, ugljena kiselina, fosforna kiselina, oksalna kiselina, dihlorosirćetna kiselina ili slično. Osnovne soli se mogu formirati mešanjem rastvora jedinjenja iz ovog pronalaska sa rastvorom farmaceutski prihvatljive netoksične baze kao što je natrijum hidroksid, kalijum hidroksid, holin hidroksid, natrijum karbonat i slično.
[0060] Kao što se koristi u ovom otkriću i patentnim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" uključuju oblike množine, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije.
[0061] Podrazumeva se da gde god su ovde opisane realizacije sa jezikom „koji sadrži“, u suprotnom su takođe date analogne realizacije opisane u terminima „koji se sastoje od“ i / ili „koji se u osnovi sastoje od“.
[0062] Izraz "i / ili" kako se ovde koristi u frazi kao što je "A i / ili B" podrazumeva da uključuje i "A i B", "A ili B", "A" i "B. " Isto tako, termin „i / ili“ kako se koristi u frazi kao što je „A, B i / ili C“ treba da obuhvati svako od sledećih ostvarenja: A, B i C; A, B ili C; A ili C; A ili B; B ili C; A i C; A i B; B i C; A (sam); B (sam); i C (sam).
II. Proteini za vezu sa agonistima glukokortikoidnih receptora
[0063] Ovo otkriće obezbeđuje agense imunokonjugate koji sadrže agoniste glukokortikoidnog receptora povezane sa proteinima, na primer, antitelima ili njihovim fragmentima koji vezuju antigen i rastvorljivim proteinima receptora. U nekim embožentima, antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen je humano, humanizovano, himerno ili mišje. U nekim em-bodimenima, protein, npr. Antitelo, njegov fragment koji vezuje antigen ili rastvorljivi protein receptora, može da se veže za cilj na površini ćelije i postane internalizovan.
[0064] Ovo otkriće takođe obezbeđuje imunokonjugate koji sadrže agoniste glukokortikoidnog receptora povezane sa anti-TNF alfa proteinima. U određenim realizacijama, anti-TNF alfa proteini su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti. U određenim realizacijama, anti-TNF alfa proteini su antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti koji se vezuju za TNF alfa (na primer, rastvorljivi TNF alfa i / ili TNF alfa vezan za membranu). U određenim realizacijama, anti-TNF alfa proteini su rastvorljivi proteini TNF receptora, npr. Rastvorljivi proteini TNF receptora spojeni sa konstantom teškog lanca domen ili njegov fragment, kao što je Fc. U nekim realizacijama, anti-TNF alfa protein, na primer, antitelo protiv TNF, njegov fragment koji vezuje antigen ili rastvorljivi TNF receptor mogu se vezati za TNF alfa na površini ćelije i postaju internalizovani. Na primer, US 2014/0294813 otkriva anti-TNF proteine koji pokazuju ćelijsku internalizaciju nakon vezivanja za ljudski TNF ćelijske površine.
[0065] U određenim realizacijama, antitela ili njihovi antigen-vezujući fragmenti vezuju se za TNF- čoveka i / ili miša alfa. U stanju tehnike su poznata antitela i fragmenti koji se vezuju za antigen i koji se vezuju za TNF-alfa.
[0066] Sekvenca aminokiselina pune dužine za membranu vezanu za TNF alfa čoveka je: MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQ REEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDN Q LVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKP WYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL (SEQ ID NO:1). Rastvorljivi humani TNF alfa sadrži aminokiseline 77-233 iz SEK ID NO: 1. Sekvenca aminokiselina pune dužine za mišji TNF-alfa vezan za miš je: MSTESMIRDVELAEEALPQKMGGFQNSRRCLCLSLFSFLLVAGATTLFCLLNFGVIGPQRDEKF P NGLPLISSMAQTLTLRSSSQNSSDKPVAHVVANHQVEEQLEWLSQRANALLANGMDLKDNQL VV PADGLYLVYSQVLFKGQGCPDYVLLTHTVSRFAISYQEKVNLLSAVKSPCPKDTPEGAELKPW Y EPIYLGGVFQLE- KGDQLSAEVNLPKYLDFAESGQVYFGVIAL (SEQ ID NO:2). Rastvorljivi mišji TNF alfa sadrži aminokiseline 80-235 sa SEK ID NO: 2.
[0068] U nekim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji se vezuje za antigen se vezuje za mišji TNF-alfa. U nekim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji vezuje antigen je mišji.
[0069] U određenim rešenjima, antitelo na TNF-alfa ili fragment koji veže antigen ima jedan ili više sledećih efekata: neutrališe citotoksičnost humanog TNF-alfa u in vitro testu L929 sa IC50 od 1Ks10-7 M ili manje ; blokira interakciju TNF-alfa sa receptorima p55 i p75 površine ćelije; i / ili lizira površinske ćelije koje eksprimiraju TNF in vitro u prisustvu komplementa.
[0070] U određenim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili fragment koji se vezuje za antigen se ne vezuje za TNF-beta.
[0071] Anti-TNF-alfa antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen uključuju, na primer, adalimumab, infliksimab, certolizumab pegol, afelimomab, nerelimomab, ozoralizumab, plakulumab i golimumab. Dodatna antitela na TNF-alfa i fragmenti koji vezuju antigen su data, na primer, u VO 2013/087912, VO 2014/152247 i VO 2015/073884.
[0072] Adalimumab je opisan u američkom patentu br. 6,258,562. Infliksimab je opisan u američkom patentu br. 5,656,272. Certolizumab je razmatran u VO 01/94585. O afelimomabu (takođe poznatom i kao MAK195) govori se u Vincent, Int. J. Clin. Practice.54: 190-193 (2000). Ozoralizumab (poznat i kao ATN-103) je nano telo. Sadrži tri varijable teškog lanca regije spojene GliSer veznicima. Varijabilni regioni 1 i 3 su identični, a ozoralizumab ne sadrži težak lanac. O ozoralizumabu se govori u VO 2012/131053. Placulumab (takođe poznat kao CEP-37247) je domensko antitelo koje se sastoji od dimera VL-pCH1-CH2-CH3 ili [V-kappa] 2-Fc i o čemu se raspravlja u Gai et al., Mabs 2: 625-638 (2010). Golimumab (poznat i kao CNTO 148) je razmatran u VO2013 / 087912, a sekvence su date u GenBank: DI496971.1 i GenBank DI 496970.1.
[0073] Anti-TNF-alfa antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti takođe uključuju antitela i njihove antigen-vezujuće fragmente koji kompetitivno inhibiraju vezivanje adalimumaba, infliksimaba, certolizumab pegola, afelimomaba, nereli- momab, ozoralizumab, plakulumab ili golimumab u TNF-alfa. Anti-TNF-alfa antitela i njihovi fragmenti koji vezuju antigen takođe uključuju antitela i fragmente koji vezuju antigen i koji se vezuju za isti TNF-alfa epitop kao i adal- imumab, infliksimab, certolizumab pegol, afelimomab, nerelimomab, ozoralizumab, plakulumab ili golimumab.
[0074] U određenim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji vezuje antigen kompetitivno inhibira vezivanje adalimumaba za TNF-alfa. U određenim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji se vezuje za antigen vezuje se za isti epitop TNF-alfa kao i adalimumab. U određenim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji veže antigen je adalimumab ili njegov fragment koji veže antigen. U određenim rešenjima, antitela na TNF-alfa ili njegov fragment koji vezuje antigen je adalimumab.
[0075] U određenim realizacijama, antitelo na TNF-alfa ili njegov fragment koji vezuje antigen sadrži sekvence adalimumaba. Sekvence adalimumaba su date u tabelama 1-6.
Tabela 1: Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona teskog lanca
Tabela 2: Aminokiselinske sekvence varijabilnih regiona lakog lanca
Tabela 3: Varijabile aminokiselinskih sekvenci teskog lanca
Tabela 4: Varijabile aminokiselinskih sekvenci lakog lanca
Tabela 5: Kompletne aminokiselinske sekvence teskog lanca
Tabela 6: Kompletne aminokiselinske sekvence lakog lanca
[0076] Monoklonska antitela se mogu pripremiti primenom hibridomskih metoda, poput onih koje su opisali Kohler i Milstein (1975) Nature 256: 495. Korišćenjem hibridomske metode, miš, hrčak ili druga odgovarajuća životinja domaćin je imunizovan kako bi se limfocitima izazvala proizvodnja antitela koja će se specifično vezati za imunizujući antigen. Limfociti se takođe mogu imunizovati in vitro. Nakon imunizacije, limfociti su izolovani i srasli sa pogodnih ćelijskih linija mieloma koristeći, na primer, polietilen glikol, za formiranje hibridomskih ćelija koje se zatim mogu odabrati dalje od nefundiranih limfocita i ćelija mieloma. Hibridomi koji proizvode monoklonska antitela usmerena specifično na izabrani antigen, kako je određeno imunoprecipitacijom, imunoblotiranjem ili in vitro testom vezivanja (npr. Radioimunološki test (RIA); imunoorbentni test povezan enzimom (ELISA)), mogu se zatim širiti bilo u in vitro kulturi koristeći standardne metode (Goding, Monoklonska antitela: Principi i praksa, Academic Press, 1986) ili in vivo kao ascites tumora kod životinje. Monoklonska antitela se zatim mogu prečistiti iz medijuma za kulturu ili ascites tečnosti kako je opisano za poliklonska antitela.
[0077] Alternativno, monoklonska antitela se takođe mogu dobiti korišćenjem metoda rekombinantne DNK, kao što je opisano u američkom patentu 4,816,567. Polinukleotidi koji kodiraju monoklonsko antitelo izoluju se iz zrelih B-ćelija ili ćelija hibridoma, kao što je RT-PCR, koristeći oligonukleotidne početnike koji specifično pojačavaju gene koji kodiraju teško i lako lanaca antitela, a njihov redosled se određuje uobičajenim postupcima. Zatim se izolovani polinukleotidi koji kodiraju teški i laki lanac kloniraju u odgovarajuće ekspresione vektore, koji se kada se transfektiraju u ćelije domaćina kao što su ćelije E. coli, simian COS ćelije, ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) ili ćelije mieloma koje inače ne proizvode protein imunoglobulina, monoklonska antitela generišu ćelije domaćini. Takođe, rekombinantni monoklonalni antitela ili njihovi fragmenti željene vrste mogu se izolovati iz biblioteka faga za prikaz koji eksprimiraju CDR željene vrste kako je opisano (McCafferti i sar., 1990, Nature, 348: 552-554; Clackson i sar., 1991, Nature, 352: 624-628; i Marks i sar., 1991, J. Mol. Biol ., 222: 581-597).
[0078] Polinukleotid (i) koji kodiraju monoklonsko antitelo mogu se dalje modifikovati na više različitih načina korišćenjem tehnologije rekombinantne DNK za generisanje alternativnih antitela. U nekim realizacijama, konstantni domeni lakog i teškog lanca, na primer, mišjeg monoklonskog antitela mogu biti supstituisani 1) za one regione, za primer, humano antitelo za generisanje himernog antitela ili 2) za neimunoglobulin polipeptid za generisanje fuzionog antitela. U nekim realizacijama, konstantni regioni se skraćuju ili uklanjaju da bi se stvorilo željeno antitelo fragment monoklonskog antitela. Mutageneza promenljive regije usmerena na lokaciju ili visoka gustina može se koristiti za optimizaciju specifičnosti, afiniteta itd. monoklonskih antitela.
[0079] U nekim realizacijama, monoklonsko antitelo protiv TNF-alfa je humanizovano antitelo. U određenim izvođenjima, takva antitela se koriste terapeutski za smanjenje antigenosti i odgovora HAMA (humano antitelo protiv miša) kada se daju čoveku.
[0080] Postupci za inženjering, humanizaciju ili obnavljanje ne-humanih ili humanih antitela takođe se mogu koristiti i dobro su poznati u tehnici. Humanizovano, obnovljeno ili slično napravljeno antitelo može imati jednu ili više aminokiselina ostaci iz izvora koji nisu ljudi, npr., ali bez ograničenja na njih, miš, pacov, zec, primat koji nije čovek ili drugi sisar. Ovi nehumani aminokiselinski ostaci zamenjuju se ostacima koji se često nazivaju "uvoznim" ostacima, koji se obično uzimaju iz "uvozne" promenljive, konstante ili drugog domena poznate humane sekvence.
[0081] Takve uvezene sekvence mogu se koristiti za smanjenje imunogenosti ili smanjenje, pojačavanje ili modifikovanje vezivanja, afiniteta, brzine, van brzine, avidnost, specifičnost, vreme poluraspada ili bilo koja druga pogodna karakteristika, kao što je poznato u tehnici. Generalno, CDR ostaci su direktno i najznačajnije uključeni u uticaj na vezivanje TNF-alfa. Shodno tome, deo ili sve ne-humane ili humane CDR sekvence se održavaju dok su nehumane sekvence promenljive i konstante regioni se mogu zameniti ljudskim ili drugim aminokiselinama.
[0082] Antitela takođe mogu opciono biti humanizovana, preoblikovana, konstruisana ili humana antitela izrađena sa zadržavanjem visokog afiniteta za antigen, npr. TNF-alfa i druga povoljna biološka svojstva. Da bi se postigao ovaj cilj, humanizovana (ili ljudska) ili konstruisana antitela i obnovljena antitela mogu se proizvoljno pripremiti postupkom analize roditeljskih sekvenci i različitih konceptualnih humanizovanih i inženjerskih proizvoda koristeći trodimenzionalne modele roditeljskih, projektovanih i humanizovanih sekvenci. Trodimenzionalni modeli imunoglobulina su kom-dostupni I poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Dostupni su računarski programi koji ilustruju i prikazuju verovatnih trodimenzionalnih konformacionih struktura izabranih imunoglobulinskih sekvenci kandidata. Inspekcija ovih prikaza omogućava analizu verovatne uloge ostataka u funkcionisanju sekvence kandidata imunoglobulina, tj. Analizu ostataka koji utiču na sposobnost kandidata imunoglobulina da veže svoj antigen, kao što je TNF-alfa. Na ovaj način, okvirni (FR) ostaci mogu se odabrati i kombinovati iz konsenzusa i uvoznih sekvenci tako da se postigne željena karakteristika antitela, kao što je povećani afinitet za ciljni antigen (e).
[0082] Humanizacija, obnavljanje površine ili inženjerstvo antitela iz ovog otkrića može se izvršiti korišćenjem bilo kog poznatog postupka, kao što je, ali ne ograničavajući se na one opisane u Vinter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeien et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196: 901 (1987), Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89: 4285 (1992); Presta i sar., J. Immunol. 151: 2623 (1993), U.S. Brojevi 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5.763.192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6.180.370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT /: US98 / 16280; US96 / 18978; US91 / 09630; US91 / 05939; US94 / 01234; GB89 / 01334; GB91 / 01134; GB92 / 01755; VO90 / 14443; VO90 / 14424; VO90 / 14430; EP 229246; 7,557,189; 7.538.195; i 7,342,110.
[0083] Humanizacija, obnavljanje površine ili inženjerstvo antitela iz ovog otkrića može se izvršiti korišćenjem bilo kog poznatog postupka, kao što je, ali ne ograničavajući se na one opisane u Vinter (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332: 323 (1988); Verhoeien et al., Science 239: 1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol.151: 2296 (1993); Chothia i Lesk, J. Mol. Biol.196: 901 (1987), Carter i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89: 4285 (1992); Presta i sar., J. Immunol. 151: 2623 (1993), U.S. Brojevi 5,639,641, 5,723,323; 5,976,862; 5,824,514; 5,817,483; 5,814,476; 5.763.192; 5,723,323; 5,766,886; 5,714,352; 6,204,023; 6.180.370; 5,693,762; 5,530,101; 5,585,089; 5,225,539; 4,816,567; PCT /: US98 / 16280; US96 / 18978; US91 / 09630; US91 / 05939; US94 / 01234; GB89 / 01334; GB91 / 01134; GB92 / 01755; VO90 / 14443; VO90 / 14424; VO90 / 14430; EP 229246; 7,557,189; 7.538.195; i 7,342,110.
[0084] U određenim alternativnim realizacijama, antitelo (npr. Antitelo protiv TNFalpha) je ljudsko antitelo. Ljudska antitela se mogu direktno pripremiti upotrebom različitih tehnika poznatih u tehnici. Ovjekovječeni limfociti B. Može se generisati imunizovanih in vitro ili izolovanih od imunizovane osobe koja proizvodi antitelo usmereno na ciljni antigen (videti, na primer, Cole i sar., Monoklonska antitela i terapija protiv raka, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boemer i sar., 1991, J. Immunol., 147 (1): 86-95; i US patent 5,750,373). Takođe, ljudsko antitelo se može odabrati iz biblioteke faga, gde ta biblioteka faga eksprimira ljudska antitela, kao što je opisano, na primer, u Vaughan et al., 1996, Nat. Biotech., 14: 309-314, Sheets et al., 1998, Proc. Nat’l. Acad. Sci., 95: 6157-6162, Hoogenboom i Vinter, 1991, J. Mol. Biol., 227: 381, i Marks i sar., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581). Tehnike za stvaranje i upotrebu biblioteka faga antitela su takođe opisane u američkim patentima br. 5,969,108, 6,172,197, 5,885,793, 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915; 6,593,081; 6,300,064; 6,653,068; 6,706,484; i 7.264.963; i Rothe i sar., 2007, J. Mol. Bio., Doi: 10.1016 / j.jmb.2007.12.018. Strategije sazrevanja afiniteta i strategije mešanja lanaca (Marks i sar., 1992, Bio / Tech- nologi 10: 779-783) su poznati u tehnici i mogu se koristiti za generisanje humanih antitela sa visokim afinitetom.
[0085] Humanizovana antitela se takođe mogu napraviti u transgenim miševima koji sadrže lokuse humanog imunoglobulina koji su sposobni imunizacijom da proizvedu puni repertoar humanih antitela u odsustvu endogene proizvodnje imunoglobulina. Ovaj pristup je opisan u američkim patentima 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5.661.016.
[0086] U određenim realizacijama obezbeđen je fragment antitela koji, na primer, povećava prodiranje tumora. Razno su tehnike za proizvodnju fragmenata antitela. Tradicionalno, ovi fragmenti se dobijaju proteolitičkom digestijom netaknutih antitela (na primer Morimoto i sar., 1993, Journal of Biochemical and Biophisical Methods 24: 107-117; Brennan et al., 1985, Science, 229: 81). U određenim rešenjima, fragmenti antitela se proizvode rekombinantno. Fragmenti antitela Fab, Fv i scFv mogu se ekspresovati i izlučiti iz E. coli ili drugih ćelija domaćina,omogućavajući tako proizvodnju velikih količina ovih fragmenata. Takvi fragmenti antitela takođe mogu biti izolovana biblioteka faga antitela. Fragment antitela takođe može biti linearno antitelo kako je opisano u američkom patentu 5,641,870. Ostale tehnike za proizvodnju fragmenata antitela biće očigledne stručnjaku iz prakse.
[0087] U svrhu ovog otkrića, treba imati na umu da modifikovana antitela mogu sadržati bilo koji tip promenljivog regiona koji obezbeđuje povezanost antitela sa antigenom (npr. TNF alfa). S tim u vezi, varijabilni region može sadržati ili biti izveden iz bilo kog tipa sisara koji može biti indukovan da postigne humoralni odgovor i generiše imunoglobuline protiv željenog tumora povezanog antigena. Kao takav, promenljivi region modifikovanih antitela može biti, na primer, čovek, miš, ne-čovek primat (npr. Majmuni cinomolgus, makaki, itd.) Ili poreklo iz lupina. U nekim realizacijama i promenljivi i konstantni regioni modifikovanih imunoglobulina su ljudi. U drugim realizacijama, promenljivi regioni kompatibilnih antitela (obično izvedenih iz ne-humanog izvora) mogu se konstruisati ili posebno prilagoditi kako bi se poboljšala svojstva vezivanja ili smanjila imunogenost molekula. U tom pogledu, promenljivi regioni korisni u ovom otkriću mogu se humanizovati ili na drugi način izmeniti uključivanjem uvezenih aminokiselinskih sekvenci.
[0088] Anti-TNF alfa proteini uključuju rastvorljive proteine TNF receptora. Anti-TNF alfa protein može biti rastvorljivi p75 TNF receptor. Anti-TNF alfa protein može biti rastvorljivi p55 TNF receptor.
[0089] Rastvorljivi TNF receptor se može vezati i za TNF alfa i za TNF beta. Rastvorljivi TNF receptor se može vezati za TNF alfa, ali ne i za TNF beta.
[0090] Rastvorljivi TNF receptor može inhibirati vezivanje TNF alfa (i opciono TNF beta) za TNF receptore na površini ćelije.
[0091] Rastvorljivi TNF receptor može biti etanercept.
[0092] Anti-TNF alfa protein, npr. Rastvorljivi TNF receptor, može se spojiti sa konstantnim domenom teškog lanca ili njegovim fragmentom ili Fc regionom ili njegovim fragmentom. Fragment konstantnog domena teškog lanca ili Fc fragment može biti deo konstantnog domena ili Fc koji je sposoban da se veže za Fc receptor. Konstantni domen teškog lanca fragment ili Fc fragment može biti deo konstantnog domena ili Fc koji je sposoban da indukuje ćelijsku lizu in vitro in prisustvo komplementa. Fragment konstantnog domena teškog lanca ili Fc fragment može biti deo konstantnog domena ili Fc koji je sposoban da indukuje ADCC.
[0093] Konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili njegov Fc region ili njegov fragment može biti humani konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili humani Fc region ili njegov fragment. Konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili njegov Fc region ili njegov fragment može biti IgG1 konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili IgG1 Fc region ili njegov fragment. Konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili njegov Fc region ili njegov fragment može biti humani IgG1 konstantni domen teškog lanca ili njegov fragment ili humani IgG1 Fc region ili njegov fragment.
[0094] Stručnjaci u ovoj oblasti shvatiće da antitela i njihovi antigen-vezujući fragmenti iz ovog otkrića i anti-TNF proteini iz ovog otkrića uključuju antitela, njihove antigen-vezujuće fragmente i anti-TNF proteine.(npr. antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) koji sadrže jedan ili više domena konstantnog regiona, uključujući domene koji su izmenjeni tako da pružaju željene biohemijske karakteristike kao što je smanjeni poluživot u serumu u poređenju sa antitelom, njegovim antigen-vezujućim fragmentom ili anti-TNF proteinom približno iste imunogenosti koji sadrži nativni ili nepromenjeni konstantni region. U nekim realizacijama, konstantni region antitela, njegov antigen-vezujući fragment ili anti-TNF protein (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) će sadržati ljudski konstantni region. Modifikacije konstantnog regiona kompatibilne sa ovim otkrićem uključuju dodavanje, brisanje ili supstituciju jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena. Odnosno, ovde otkriveno antitelo, njegov antigenvezujući fragment ili anti-TNF proteini (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) mogu sadržati izmene ili modifikacije jednog ili više tri konstantna domena teškog lanca (CH1, CH2 ili CH3) i / ili na konstantni domen lakog lanca (CL). U nekim realizacijama se razmatraju modifikovani konstantni regioni u kojima su jedan ili više domena delimično ili u potpunosti izbrisani. U nekim realizacijama, antitela, njihovi antigenvezujući fragmenti ili anti-TNF proteini (npr. Antitela pune dužine, antigen-vezujući fragmenti antitela ili rastvorljivi proteini TNF receptora) će sadržati konstrukcije ili varijante izbrisane iz domena uklonjen je ceo CH2 domen (konstrukcije CH2). U nekim realizacijama, izostavljeni domen konstantnog regiona biće zamenjen kratkim odstojnikom aminokiselina (npr. 10 ostataka) koji obezbeđuje neku molekularnu fleksibilnost tipično dodeljenu odsutnim konstantnim regionom.
[0095] Primetiće se da u određenim realizacijama antitela, njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen ili anti-TNF proteini (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) mogu da se konstruišu da se CH3 domen spoji direktno sa zglobnim regionom odgovarajućih antitela, njihovih fragmenata koji vežu antigen ili anti-TNF proteina (npr. antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora). U drugim konstrukcijama može biti poželjno obezbediti odstojnik peptida između regiona šarke i modifikovanih CH2 i / ili CH3 domena. Na primer, mogu se izraziti kompatibilni konstrukti u kojima je CH2 domen izbrisan, a preostali CH3 domen (modifikovani ili nemodifikovani) pridružen je zglobnom području pomoću odstojnika od 5-20 aminokiselina. Takav odstojnik se može dodati, na primer, da bi se osiguralo da regulatorni elementi konstantnog domena ostanu slobodni i dostupni ili da region šarki ostane fleksibilan. Međutim, treba napomenuti da se odstojnici aminokiselina u nekim slučajevima mogu pokazati imunogenim i izazvati neželjeni imuni odgovor na konstrukt. Shodno tome, u određenim realizacijama, bilo koji odstojnik dodat konstrukciji biće relativno neimunogen ili čak uopšte izostavljen, kako bi se održali željeni biohemijski kvaliteti antitela, njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen ili proteini protiv TNF (npr. antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora).
[0096] Podrazumeva se da antitela, fragmenti koji vežu antigen i proteini anti-TNF (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) mogu biti obezbeđena u ovom otkriću. delimičnim brisanjem ili supstitucijom nekoliko ili čak jedne aminokiseline. Na primer, mutacija jedne aminokiseline u odabranim oblastima CH2 domena može biti dovoljna da značajno smanji vezivanje za Fc i samim tim povećati lokalizaciju tumora. Slično tome, moglo bi biti poželjno da se jednostavno izbriše onaj deo jednog ili više domena konstantnog regiona koji kontrolišu efektorsku funkciju (na primer, komplementarno vezivanje C1K) koji treba modulisati. Takva delimična brisanja konstantnih regiona mogu poboljšati izabrane karakteristike antitela (poluživot u serumu), dok ostale poželjne funkcije povezane sa predmetnim domenom konstantnog regiona ostaju netaknute. Štaviše, kao što je prethodno navedeno, konstantni regioni otkrivenih antitela, fragmenti koji vezuju antigen i proteini anti-TNF (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) mogu biti modifikovani kroz mutaciju ili supstituciju jedne ili više aminokiselina koja poboljšava profil rezultujućeg konstrukta. U tom pogledu to može biti moguće poremetiti aktivnost koju pruža konzervativno mesto vezivanja (npr. vezivanje Fc), dok u suštini održava konfiguraciju i imunogeni profil antitela, fragmenata koji vežu antigen i proteina anti-TNF (npr. pune dužine antitela, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora). Određena izvođenja mogu da komponuju dodavanje jedne ili više aminokiselina u konstantni region da bi se poboljšale poželjne karakteristike kao što su smanjenje ili povećanje efektorske funkcije ili obezbedilo veće vezivanje agonista za glukokortikoidni receptor. U takvim oblicima može biti poželjno ubaciti ili replicirati određene sekvence izvedene iz izabranih domena konstantnog regiona.
[0097] Podrazumevaće se da antitela, fragmenti koji vežu antigen i proteini anti-TNF (npr. antitela dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) iz ovog otkrića mogu se modifikovati da bi se smanjila imunogenost, tj. Da bi se smanjio imuni odgovor na lekove (ADA). Metode za to su otkrivene, na primer, u VO 2015/073884.
[0098] Ovo otkriće dalje obuhvata varijante i ekvivalente koji su u osnovi homologni antitelima, fragmentima koji vezuju antigen i anti-TNF proteinima (npr. Antitela pune dužine, fragmenti koji vezuju antigen) antitela ili rastvorljivih proteina TNF receptora) ovde izloženih. Oni mogu sadržati, na primer, konzervativne supstitucione mutacije, tj. Supstituciju jedne ili više aminokiselina sličnim aminokiselinama. Na primer, konzervativna supstitucija odnosi se na supstituciju aminokiseline drugom u okviru iste opšte klase, kao što je, na primer, jedna kisela aminokiselina drugom kiselom aminokiselinom, jedna bazna aminokiselina drugom baznom aminokiselinom ili jedna neutralna aminokiselina drugom neutralnom aminokiselinom. Šta je namenjeno konzervativnoj supstituciji aminokiselina dobro je poznato u struci.
[0099] Polipeptidi iz ovog otkrića mogu biti rekombinantni polipeptidi, prirodni polipeptidi ili sintetički polipeptidi antitela, njegov fragment koji vezuje antigen ili anti-TNF protein. U struci će biti prepoznato da se neke aminokiselinske sekvence otkrivanja mogu menjati bez značajnog uticaja strukture ili funkcije proteina. Prema tome, otkriće dalje uključuje varijacije polipeptida koje pokazuju značajnu aktivnost ili koje uključuju regione antitela, njegov fragment koji vezuje antigen ili anti-TNF alfa protein. Takvi mutanti uključuju deleracije, insercije, inverzije, ponavljanja i supstitucije tipa.
[0100] Polipeptidi i analozi se mogu dalje modifikovati da sadrže dodatne hemijske ostatke koji obično nisu deo proteina. Oni derivatizovani delovi mogu poboljšati rastvorljivost, biološki poluživot ili apsorpciju proteina. Komadi takođe mogu smanjiti ili eliminisati bilo kakve poželjne neželjene efekte proteina i slično. Pregled za one dijelovi se mogu naći u REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 20. izdanje, Mack Publishing Co., Easton, PA (2000).
[0101] Ovde opisani izolovani polipeptidi mogu se proizvesti bilo kojim pogodnim postupkom poznatim u struci. Takve metode se kreću od direktnih metoda sinteze proteina do konstruisanja DNK sekvence koja kodira izolovane polipeptidne sekvence i ekspresije tih sekvenci u pogodnom transformisanom domaćinu. U nekim realizacijama, DNK sekvenca je konstruisan korišćenjem rekombinantne tehnologije izolovanjem ili sintezom DNK sekvence koja kodira protein divljeg tipa od interesa. Po želji, sekvenca se može mutagenizovati mutagenezom specifičnom za mesto da bi se dobili njeni funkcionalni analogi. Videti, na primer, Zoeller et al., Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 81: 5662-5066 (1984) i U.S.4,588,585.
[0102] U nekim realizacijama DNK sekvenca koja kodira polipeptid od interesa bila bi konstruisana hemijskim sredstvima sinteza pomoću oligonukleotidnog sintetizatora. Takvi oligonukleotidi mogu biti dizajnirani na osnovu aminokiselinske sekvence željenog polipeptida i odabira onih kodona koji su favorizovani u ćeliji domaćinu u kojoj će se proizvesti rekombinantni polipeptid od interesa. Standardne metode mogu se primeniti za sintezu izolovane polinukleotidne sekvence koja kodira izolovani polipeptid od interesa. Na primer, kompletna sekvenca aminokiselina može se koristiti za konstrukciju gena prevedenog unazad. Dalje, DNK oligomer koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira određeni izolovani polipeptid može biti sintetizovan. Na primer, nekoliko malih oligonukleotida koji kodiraju delove željenog polipeptida može se sintetizovati, a zatim podvezati. Pojedinačni oligonukleotidi obično sadrže 5 ’ili 3’ nadvišenja za komplementarni sklop.
[0103] Jednom kada se sastave (sintezom, mutagenezom usmerenom na lokaciju ili nekim drugim postupkom), polinukleotidne sekvence koje kodiraju određeni izolovani polipeptid od interesa biće umetnute u ekspresijski vektor i operativno povezane sa sekvencom za kontrolu ekspresije pogodnom za ekspresiju proteina u željeni domaćin. Pravilno sklapanje može se potvrditi sekvenciranjem nukleotida, mapiranjem restrikcija i ekspresijom biološki aktivnog polipeptida u pogodnom domaćin. Kao što je dobro poznato u struci, da bi se dobio visok nivo ekspresije transfektovanog gena u domaćinu, gen mora biti operativno povezan sa transkripcionim i translacionim kontrolnim sekvencama ekspresije koje su funkcionalne u izabranom ekspresijskom domaćinu.
[0104] U određenim rešenjima, rekombinantni ekspresijski vektori se koriste za pojačavanje i ekspresiju DNK kodiranja antitela, njihovi fragmenti koji vezuju antigen ili proteini anti-TNF (npr. antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora). Vektori rekombinantne ekspresije su replicirani DNK konstrukti koji imaju sintetičke ili iz cDNK izvedene fragmente DNK koji kodiraju polipeptidni lanac antitela, njegov fragment koji veže antigen ili anti-TNF protein (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vežu antigen, ili rastvorljivi proteini TNF receptora), operativno povezani sa odgovarajućim transkripcionim ili translacionim regulatornim elementima izvedenim iz gena sisara, mikroba, virusa ili insekata. Transkripciona jedinica obično sadrži skup (1) genetskog elementa ili elemenata koji imaju regulatornu ulogu u ekspresiji gena, na primer, promotori ili pojačivači transkripcije, (2) strukturna ili kodirajuća sekvenca koja se transkribuje u mRNK i prevodi u protein, i (3) odgovarajuće sekvence započinjanja i prekida transkripcije i prevođenja. Takvi regulatorni elementi mogu da uključuju niz operatora za kontrolu transkripcije. Sposobnost replikacije u domaćinu, koja se obično dodeljuje poreklom replikacije, i selekcioni gen koji olakšava prepoznavanje transformanta mogu se dodatno uključiti. DNK regioni su operativno povezani kada su međusobno funkcionalno povezani. Na primer, DNK za signalni peptid (sekretorni vođa) operativno je povezan sa DNK za polipeptid ako je izražen kao prekursor koji učestvuje u sekreciji polipeptid; promoter je operativno vezan za kodirajuću sekvencu ako kontroliše transkripciju sekvence; ili je mesto vezivanja ribozoma operativno povezano sa kodirajućom sekvencom ako je postavljeno tako da omogućava translaciju. Strukturni elementi namenjeni za upotrebu u ekspresijskim sistemima kvasca uključuju vodeću sekvencu koja omogućava izvanstaničnu sekreciju prevedenog proteina od strane ćelije domaćina. Alternativno, tamo gde se rekombinantni protein ekspresuje bez vodeće ili transportne sekvence, on može da sadrži N-terminalni ostatak metionina. Ovaj ostatak se opciono može naknadno odvojiti od eksprimiranog rekombinantnog proteina da bi se dobio konačni proizvod.
[0105] Izbor kontrolne sekvence ekspresije i vektora ekspresije zavisiće od izbora domaćina. Može se koristiti širok spektar kombinacija domaćin / vektor ekspresije. Korisni ekspresijski vektori za eukariotske domaćine uključuju, na primer, vektore koji sadrže sekvence za kontrolu ekspresije iz SV40, goveđi papiloma virus, adenovirus i citomegalovirus. Korisni ekspresijski vektori za bakterijske domaćine uključuju poznate bakterijske plazmide, kao što su plazmidi iz Escherichia coli, uključujući pCR 1, pBR322, pMB9 i njihove derivate, šire plazmide domaćina, kao što su M13 i nitasti jednostruki DNK fagi.
[0106] Pogodne ćelije domaćina za ekspresiju antitela, njihovi fragmenti koji vezuju antigen i anti-TNF proteini (npr. Antitela pune dužine, fragmenti antitela koji vezuju antigen ili rastvorljivi proteini TNF receptora) uključuju prokariote, kvasac, insekte ili više eukariotske ćelije pod kontrolom odgovarajućih promotora. Prokarioti uključuju gram negativne ili gram pozitivni organizmi, na primer E. coli ili bacili. Više eukariotske ćelije uključuju utvrđene ćelijske linije sisara malskog porekla. Takođe se mogu koristiti i sistemi za prevođenje bez ćelija. Odgovarajući vektori kloniranja i ekspresije za upotrebu sa ćelijskim domaćinima bakterija, gljivica, kvasca i sisara opisani su od strane Pouvella i sar. (Cloning Vectors: Laboratori Manual, Elsevier, NI, 1985). Dodatne informacije u vezi sa metodama proizvodnje proteina, uključujući proizvodnju antitela, mogu se naći, na primer, u US patentnoj publikaciji br. 2008/0187954, američkim patentima br. 6,413,746 i 6,660,501, i međunarodna patentna publikacija br. VO 04009823.
[0107] Razni sistemi ćelijske kulture sisara ili insekata takođe se korisno koriste za ekspresiju rekombinantnog proteina. Ekspresija rekombinantnih proteina u ćelijama sisara može se izvršiti, jer su takvi proteini uglavnom pravilno presavijeni, odgovarajuće modifikovani i potpuno funkcionalni. Primeri pogodnih ćelijskih linija domaćina sisara uključuju HEK-293 i HEK-293T, COS-7 linije ćelija bubrega majmuna, opisao Gluzman (Cell 23: 175, 1981) i drugi ćelijske linije uključujući, na primer, L ćelije, C127, 3T3, jajnik kineskog hrčka (CHO), ćelije HeLa i BHK. Sisara ekspresijskih vektora može sadržati netranskribirane elemente kao što je poreklo replikacije, odgovarajući promotor i pojačivač povezani sa genom koji se izražava i druge 5 'ili 3' bočne netranskribirane sekvence i 5 'ili 3' neprevedene sekvence, poput kao neophodna mesta vezivanja ribozoma, mesto poliadenilacije, donor i akceptor spoja mesta i sekvence završetka transkripcije. Baculovirusni sistemi za proizvodnju heterolognih proteina u ćelijama insekata pregledaju Luckov i Summers, Bio / Technologi 6:47 (1988).
[0108] Proteini proizvedeni od transformisanog domaćina mogu se prečistiti bilo kojim pogodnim postupkom. Takve standardne metode uključuju hromatografiju (npr. Hionska razmena jona, afinitet i hromatografija na koloni za dimenzionisanje), centrifugiranje, diferencijalna rastvorljivost ili bilo kojom drugom standardnom tehnikom za prečišćavanje proteina. Oznake afiniteta kao što su heksahistidin, domen vezivanja za maltozu, sekvenca premaza gripa i glutation-S-transferaza mogu se prikačiti na protein da bi se omogućilo lako prečišćavanje prelaskom preko odgovarajuće kolone afiniteta. Izolovani proteini se takođe mogu fizički okarakterisati upotrebom tehnika kao što su proteoliza, nuklearna magnetna rezonanca i rentgenska kristalografija.
[0109] Na primer, supernatanti iz sistema koji izlučuju rekombinantni protein u medijum za kulturu mogu se prvo koncentrovati pomoću komercijalno dostupnog filtra za koncentraciju proteina, na primer, Amicon ili Millipore Pellicon ultrafiltracione jedinice. Nakon koraka koncentracije, koncentrat se može primeniti na odgovarajuću matricu za prečišćavanje. Alternativno, anjonski izmenjivačka smola se može koristiti, na primer, matrica ili podloga koja ima privesne dietilaminoetilne (DEAE) grupe. Matrice mogu biti akrilamid, agaroza, dekstran, celuloza ili druge vrste koje se obično koriste u prečišćavanju proteina. Alternativno, može se primeniti korak razmene katjona. Pogodni kationni izmenjivači uključuju različite nerastvorljive matrice koje sadrže sulfopropilne ili karboksimetilne grupe. Na kraju, jedan ili više koraka tečne hromatografije obrnute faze visokih performansi (RP-HPLC) koji koriste hidrofobni RP-HPLC medijum, npr. Silikagel sa priveskom
[0110] Rekombinantni protein proizveden u bakterijskoj kulturi može se izolovati, na primer, početnom ekstrakcijom iz ćelijskih peleta, nakon čega sledi jedan ili više koraka hromatografije koncentracije, soljenja, razmene vodenih jona ili isključenja veličine. Tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) može se koristiti za završne korake prečišćavanja. Mikrobne ćelije zaposlene u ekspresiji rekombinantnog proteina mogu se poremetiti bilo kojim pogodnim postupkom, uključujući ciklus zamrzavanja i otapanja, ultrazvučno obrađivanje, mehanički poremećaj ili upotrebu sredstava za liziranje ćelija.
[0111] Metode poznate u struci za prečišćavanje antitela, njihovih antigen-vezujućih fragmenata i anti-TNF alfa proteina takođe uključuju, na primer, one opisane u US Patent Publication No.
2008/0312425, 2008/0177048 i 2009/0187005.
III. Imunokonjugati koji sadrže agoniste glukokortikoidnih receptora
[0112] Ovde su dati imunokonjugati koji sadrže agoniste glukokortikoidnih receptora. Pronalazak obezbeđuje imunkonjugate formule:
gde je n 2 ili 4, a A je antitelo koje sadrži SEK ID NO: 66 i SEK ID NO: 73 ili adalimumab. U daljim realizacijama pronalaska n je 4. U drugim realizacijama pronalaska n je 2. U drugim realizacijama pronalaska A je adalimumab.
[0113] U još jednom izvođenju, ovde otkriveno je jedinjenje Formule VIII, ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, izabrano iz grupe koju čine:
IV. Metode dobijanja imunokonjugata i sintetičkih intermedijara
[0114] Prema ovom otkriću, agonisti glukortikoidnih receptora mogu se povezati sa antitelom, njegovim antigen-vezujućim fragmentom ili anti-TNF alfa proteinima bilo kojim postupkom i na bilo kojoj lokaciji koja ne sprečava antitelo, njegov antigen-vezujući fragment. , ili anti-TNF alfa protein iz vezujućeg antigena (npr. TNF alfa) ili sprečava aktivnost agonista glukortikoidnih receptora. O metodama za postizanje takvog povezivanja govorilo se, na primer, u Panovski i sar., MAbs 6: 34-45 (2014), Jain i sar., Pharm. Res. 32: 3526-3540 (2015), Mack et al., Seminari iz onkologije 41: 637-652 (2014), SAD objavljena prijava br.2008/0305044 i američka objavljena prijava br.2011/0097322.
[0115] Agonist glukortikoidnog receptora takođe može biti povezan sa ostatkom cisteina. Metode konjugacije putem cisteina su znati. IgG1 antitela sadrže četiri međulančane disulfidne veze, a nakon redukcije može doći do konjugacije putem cisteina od ovih veza stvara sulfidrile dostupne za konjugaciju.
[0116] Agonisti glukortikoidnih receptora mogu se povezati sa antitelom, njegovim fragmentom koji vezuje antigen ili anti-TNF alfa proteinima putem konjugacije specifične za mesto.
[0117] Jedan od metoda specifične za konjugaciju na mestu je konjugacija zasnovana na cisteinu. Primer ove metode su prijavili Junutula et al., Nat. Biotechnol 26: 925-935 (2008); videti takođe Junutula i sar., J. Immunol. Metode 332: 41-52 (2008). Koristeći ovu metodu, antitela, njihovi fragmenti koji se vezuju za antigen ili anti-TNF alfa proteini mogu se proizvesti sa dodatnim cisteinima koji obezbeđuju reaktivne tiolne grupe za konjugaciju agonista glukokortikoidnih receptora. Ove publikacije takođe pružaju smernice u vezi sa odabirom reaktivnih cisteina koji ne ometaju antigen vezivanje.
[0118] Još jedan metod konjugacije specifične za lokaciju koristi selenocistein. Selenocistein je sličan cisteinu, ali konatini su reaktivniji atom selena umesto atoma sumpora u cisteinu. Uslovi se mogu koristiti u kojima selenocisteini se selektivno aktiviraju. Hofer i sar., Biochemistri 48: 12047-12057 (2009) predstavlja primer ove tehnike.
[0119] Drugi postupak konjugacije specifične za lokaciju koristi neprirodne aminokiseline, npr. Acetilfenilalanin (pAcPhe) ili para-azido fenilalanin (pAF). Vang i sar. Proc. Natl. Acad. Sci.100: 56-61 (2003), Akup i sar., Proc. Natl. Acad. Sci. 109: 16101-16106 (2012) i Kern et al., JACS 138: 1430-1445 (2016) predstavljaju primer ove tehnike.
[0120] Drugi postupak konjugacije specifične za lokaciju koristi enzimatske pristupe, na primer, putem glikotransferaza ili transglutaminaze. Mutantne glikotransferaze se mogu koristiti za vezivanje hemijski aktivnog šećernog dela za glikozilaciju na antitelu, njegovom antigenvezujućem fragmentu ili anti-TNF alfa proteinu. Humana IgG antitela sadrže mesto N-glikozilacije na ostatku Asn-297 Fc fragmenta. Glikani vezani na ovaj ostatak mogu se degalaktozilovati tako da mutantna glikotransferaza može da se prenese u njih. Boeggeman i sar., Bioconjug. Chem.20: 1228-1236 (2009) predstavlja primer ove tehnike. Transglutaminaze, na primer, iz Streptoverticillium mobaranse, prepoznaju glutaminsku oznaku, npr. LLKG, koja se može stvoriti u anti-TNF alfa protein. Jeger i sar., Angev Chem. Int. Ed.20 engl.49: 9995-9997 (2010) predstavlja primer ove tehnike.
[0121] Takođe se može koristiti vezivanje za C-terminal putem eksprimovane ligacije proteina. Na primer, intein posredovana C-terminalna tioesterska formacija može se koristiti za hemoselektivnu ligaciju sa anti-TNF alfa proteinom koji sadrži N-temrinalni cistein peptid. Chiang i sar., J. Am. Chem. Soc.136: 3370-3373 (2014) predstavlja primer ove tehnike.
V. Metode upotrebe i farmaceutske smeše
[0122] Ovde je dat imunokonjugat agonista glukokortikoidnog receptora koji se može koristiti in vitro ili in vivo. Shodno tome, ovde su takođe obezbeđeni sastavi, na primer, farmaceutski sastavi za određene primene in vivo, koji sadrže konjugat ili agonist glukokortikoidnog receptora koji su ovde opisani, imaju željeni stepen čistoće u fiziološki prihvatljivi nosač, pomoćna supstanca ili stabilizator (Remington’s Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA). Prihvatljivi nosači, pomoćne supstance ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u primenjenim dozama i koncentracijama.
[0123] Kompozicije (npr. Farmaceutske smeše) koje se koriste za in vivo primenu mogu biti sterilne. To se lako postiže filtriranjem kroz, na primer, sterilne membrane za filtriranje. Sastavi (npr. Farmaceutski sastavi) koji se koriste za in vivo primenu mogu sadržati konzervans.
[0124] Farmaceutska kompozicija koja sadrži agonist glukokortikoidnog receptora ovde obezbeđena može biti formulisana, na primer, kao sprej za nos, inhalacioni aerosol (npr. Za oralnu inhalaciju) ili kapsula, tableta ili pilula (npr. Za oralnu primenu).
[0125] Ovde navedeni agonisti glukokortikoidnih receptora (npr. Anti-TNF ADC) su jedinjenja, gde je prosečan broj glukokortikosteroida po antitelu (DAR) u kompoziciji 2 ili 4.
[0126] Agonisti glukokortikoidnih receptora i farmaceutske smeše koje sadrže ovde opisani agonist glukokortikoidnog receptora mogu biti korisni u inhibiciji oslobađanja citokina (in vitro ili in vivo) i / ili za lečenje autoimunih ili inflamatornih bolesti. Agonisti glukokortikoidnih receptora i farmaceutske kompozicije koje sadrže glukokortikoid ovde opisani agonist receptora može se koristiti za lečenje astme (npr. bronhijalne astme), Crohnove bolesti (npr. blage do umereno aktivne Crohnove bolesti koja uključuje ileum i / ili uzlazno debelo crevo i / ili održavanje kliničke remisije blage do umerena Crohnova bolest koja uključuje ileum i / ili uzlazno debelo crevo do 3 meseca), ulcerozni kolitis (npr. za indukciju remisije kod pacijenata sa aktivnim, blagim do umerenim ulceroznim kolitisom), alergijski rinitis (npr. nazalni simptomi povezani sa sezonskim alergijski rinitis i / ili višegodišnji alergijski rinitis).
[0127] Za primenu kod ljudskih pacijenata, ovde data ukupna dnevna doza agonista glukokortikoidnih receptora je obično u opsegu od 0,001 mg do 5000 mg, ili u opsegu od 0,01 mg do 1000 mg, u zavisnosti od načina primene. Na primer, oralna primena ili intravenska, intramuskularna, intraartikularna ili periartikularna administracija mogu zahtevati ukupnu dnevnu dozu od 0,01 mg do 1000 mg ili od 0,1 mg do 100 mg. Ukupna dnevna doza se može davati u pojedinačnoj ili podeljenoj dozi.
[0128] Farmaceutska kompozicija koja sadrži konjugat ovde obezbeđen može se formulisati, na primer, za intravensku primenu ili infuziju.
[0129] Konjugati i farmaceutske smeše koje sadrže ovde opisane konjugate mogu biti korisni u liziranju ćelije koja eksprimira površinski TNF-alfa (in vitro ili in vivo), za lečenje bolesti ili poremećaja koje karakteriše povećani TNF-alfa (npr. Povećanje TNF- alfa u sinovijalnoj tečnosti), i / ili za lečenje autoimune ili upalne bolesti.
[0130] Farmaceutska kompozicija koja sadrži agonist glukokortičnog receptora ili ovde opisani konjugat koristi se za lečenje reumatoidnog artritisa (RA), juvenilnog idiopatskog artritisa (JIA), psorijatičnog artritisa (PsA), spondi-loartropatije kao što je ankilozirajući spondilitis AS) ili aksijalni spondiloartritis (akSpA), odrasla Crohnsova bolest (CD), dečja Crohnova bolest, ulcerozni kolitis (UC), psorijaza plaka (Ps), hidradenitis suppurativa (HS), uveitis, Behcetsova bolest ili psorijaza, uključujući psorijazu plaka .
[0131] Za primenu kod ljudskih pacijenata, ukupna dnevna doza konjugata ovde obezbeđena je tipično u opsegu od 0,01 mg do 100 mg po kg telesne težine i može se davati jednom ili više puta dnevno, nedeljno, mesečno ili godišnje.
[0132] Ostvarenja ovog otkrića mogu se dalje definisati pozivanjem na sledeće neograničavajuće primere, koji detaljno opisuju pripremu određenih antitela iz ovog otkrića i metode za upotrebu antitela 10 ovog otkrića. Primeri
[0133] Podrazumeva se da su ovde opisani primeri i realizacije samo u ilustrativne svrhe i da će se različitim modifikacijama ili promenama u svetlu toga predložiti stručnjacima u ovoj oblasti i da će biti uključeni u duh i delokrug ovog otkrića.
Analitičke metode za sintezu i karakterizaciju jedinjenja
[0134] Analitički podaci su obuhvaćeni donjim postupcima, ilustracijama opštih postupaka ili tabelama primera. Ako nije drugačije naznačeno, svi 1H i 13C NMR podaci su prikupljeni na Varian Mercuri Plus 400 MHz ili Bruker AVIII 300 MHz instrumentu; hemijska pomeranja navedena su u delovima na milion (ppm). Analitički podaci HPLC-a detaljno su navedeni u eksperimentalnom ili su upućeni na tabelu LC / MS i HPLC uslova, koristeći metodu iz tabele 7.
Tabela 7: Spisak LC / MS i GC / MS metoda
[0135] Skraćenice korišćene u primerima koji slede su:
Primer 2A: Sinteza (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS) -10- (4- (3-aminobenzil) fenil) -7-hidroksi-8b- (2-hidroksiacetil) - 6a, 8a-dimetil-1,2,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12bdodekahidro-4H-nafta [2 ', 1': 4,5] inde-no [ 1,2-d] [1,3] dioksol-4-on (Cpd. Br.41).
Korak 1: Sinteza 4- (bromometil) benzaldehida
[0136]
[0137] Rastvoru 4- (bromometil) benzonitrila (50 g, 255 mmol) u toluenu (1 L) dodat je kap po kap na 0 ° C diizobutilaluminijev hidrid (383 ml, 383 mmol, 1 M u toluenu). Smeša je mešana 1 sat. Postavljene su dve dodatne bočice kako je gore opisano. Sve tri reakcione smeše su spojene. Dodato je 10% vodeno rastvora HCl (1.5 L), a zatim je ekstrahovano DCM (3 Ks 1.5 L). Organski sloj je osušen preko Na2S04, filtriran i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu (eluiran petroleum etar / etil acetatom = 10/1) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (120 g, 82%) u obliku bele čvrste supstance. 'H NMR (400 MHz, CDC13) 510,01 (s, IH), 7,86 (d, J = 8,4 Hz, 2H), 7,55 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 4,51 (s, 2H).
Korak 2: Sinteza 3- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) anilina
[0138]
[0139] Rastvoru 3-bromoanilina (80 g, 465 mmol) u 1,4-dioksanu (960 ml) dodaju se 4,4,4 ', 4', 5,5,5 ', 5'-oktam -etil-2,2'-bi (1,3,2-dioksaborolan) (177 g, 698 mmol), kalijum acetat (91 g, 930 mmol), 2-dicikloheksilfosfino-2 ', 4', 6'-tri -i-propil-1,1'-bifenil (13,45 g, 23,25 mmol) i tris (dibenzilidenaceton) dipaladijum (0) (17,03 g, 18,60 mmol). Smeša je zagrevana na 80 ° C 4 sata pod azotom. Postavljene su dve dodatne bočice kako je gore opisano. Tri reakcione smeše su kombinovane, koncentrovane i ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu (eluiran petroleter / etil acetatom = 10/1) da bi se dobilo naslovno jedinjenje (150 g, 46,6%) u obliku svetlo žute čvrste supstance. 'H NMR (400 MHz, CDC13) 57,23 - 7,13 (m, 3H), 6,80 (d, J = 7,5 Hz, IH), 3,82 - 3,38 (m, 2H), 1,34 (s, 12H).
Korak 3: Sinteza terc-butil (3- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) fenil) karbamata
0140]
[0141] 3- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) anilin (50 g, 228 mmol) i di-terc-butil dikarbonat (64,8 g, 297 mmol) su pomešan u toluenu (500 ml) i smeša je mešana na 100 ° C tokom 24 sata. Postavljene su dve dodatne bočice kako je gore opisano. Tri reakcione smeše su spojene. Smeđa smeša je koncentrovana i ostatak je ispran sa PE dajući naslovljeno jedinjenje (120 g, 49.5%) u obliku bele čvrste supstance.1H NMR (400MHz, CDCI3) 87,62 (s, 2H), 7,48 (d, J = 7,5 Hz, IH), 7,35 - 7,29 (m, IH), 6,46 (br. S., IH), 1,52 (s, 9H), 1,34 (s, 12H).
Korak 4: Sinteza terc-butil (3- (4-formilbenzil) fenil) karbamata
[0142]
[0143] Smeša 4- (bromometil) benzaldehida (29,9 g, 150 mmol), 1,1'-bis (difenilfosfino) ferocendikloro paladijuma (II) (20,63 g, 28,2 mmol), terc-butila (3- (4, 4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioksaborolan-2-il) fenil) karbamata (30 g, 94 mmol) i kalijum karbonata (64,9 g, 470 mmol) u THF (600 ml) zagreva se do 80 ° C tokom 12 sati. Postavljene su tri dodatne bočice kako je gore opisano. Sve četiri reakcione smeše su spojene. Reakciona smeša je razblažena vodom (1 L). Vodeni sloj je ekstrahovan sa EtOAc (3 Ks 800 mL). Organski sloj je osušen preko Na2S04, filtriran i koncentrovan pod smanjenim pritiskom. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni na silika gelu (eluiran sa PE / EtOAc = 10/1) da bi se dobilo naslovljeno jedinjenje (35,5 g, 27,3%) u obliku bele čvrste supstance.1H NMR (400MHz, CDC13) 89,97 (s, 1H), 7,80 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,35 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,26 (s, 2H), 7,24 - 7,13 ( m, 2H), 6,84 (d, J = 7,1 Hz, IH), 6,43 (br. s., IH), 4,02 (s, 2H), 1,50 (s, 9H).
Korak 5: Sinteza (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS) -10- (4- (3-aminobenzil) fenil) -7-hidroksi-8b- (2-hidro-droksiacetil) ) -6a, 8a-dimetil-1,2,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodekahidro-4H-nafta [2 ', 1': 4,5] indeno [ 1,2-d] [1,3] dioksol-4-on.
[0144]
[0145] U rastvor (8S, 9S, 10R, 11S, 13S, 14S, 16R, 17S) -11,16,17-trihidroksi-17- (2-hidroksiacetil) -10,13-dimetil-6,7 , 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-dodekahidro-3H-ciklopenta [a] fenantren-3-on (6 g, 15,94 mmol) i terc-butil (3- (4 -formilbenzil) fenil) karbamat (4,96 g, 15,94 mmol) u MeCN (50 ml) dodavana je kap po kap hlorovodonična kiselina (4,79 ml, 80 mmol) uz održavanje unutrašnje temperature ispod 25 ° C pomoću ledenog kupatila. Posle dodavanja, smeša je mešana na 20 ° C tokom 2 sata. Postavljene su tri dodatne bočice kako je gore opisano. Sve četiri reakcione smeše su spojene. Reakciona smeša je ugašena zasićenim vodenim rastvorom NaHC03 (500 ml) i ekstrahovana dihlorometanom (3 Ks 800 ml). Organska faza je koncentrovana i ostatak je prečišćen pomoću Prep-HPLC da bi se dobio naslovljeno jedinjenje (10 g, 27,0%) kao žuta čvrsta supstanca. 1H NMR (400MHz, DMSO-d6) 87,36 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 7,31 (d, J = 10,1 Hz, 1H), 7,20 (d, J = 7,9 Hz, 2H), 6,89 (t, J = 7,9 Hz, IH), 6,39 -6,28 (m, 3H), 6,16 (dd, J = 1,5, 9,9 Hz, IH), 5,93 (s, 1H), 5,39 (s, 1H), 5,08 (t, J = 5,7 Hz, IH), 4,98 - 4,87 (m, 3H), 4,78 (d, J = 3,1 Hz, IH), 4,49 (dd, J = 6,2, 19,4 Hz, 1H), 4,29 (br. S., IH), 4,17 (dd, J = 5,5, 19,6 Hz, IH), 3,74 (s, 2H), 2,61 - 2,53 (m, IH), 2,36 - 2,26 (m, IH), 2,11 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 2,07 (s, 1H), 2,02 (d, J = 12,8 Hz, 1H), 1,83 - 1,54 (m, 5H), 1,39 (s, 3H), 1,16 -0,96 (m, 2H), 0,85 (s, 3 H). LCMS: 10 tR = 2,365 min, 98% čistoće, m / z = 570,2 (M H) LC / MS (Tabela 7, metoda).
[0146] Metoda pripremnih HPLC: Instrument: Gilson 281 polu-preparativni HPC sistem, mobilna faza: A:
CF3COOOH / H2O = 0,075% v / v; B: CH3CN, kolona: Fenomen Luna (2) C18250 ∗ 5010u, protok: 80 ml / min, monitor talasna dužina: 220 i 254 nm, vreme B%, 0,028, 20,045, 20,145, 20,2100, 30,2100, 0,328, 31,528.
Primer 34A: Sinteza 3- (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il) -N - ((S) -1 - (((S) - 1 - ((3- ( 4 -((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12as, 12bS) -7-hidroksi-8b- (2-hidroksiacetil) -6a, 8adimetil-4-okso-2,4, 6a , 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodekahidro-1H-nafto [2 ', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioksol - 10-il) benzil) fenil-amino) amino) -1-oksopropan-2-il) amino) -1-oksopropan-2-il) propanamid (Cpd. Br.88)
Korak 1: Sinteza (S) -2-aminoN - ((S) -1 - ((3- (4 - ((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS) -7- hidroksi) -8b- (2-hidroksiocetil) -6a, 8a-dimetil-4-okso-2,4,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodekahidro-1H- nafta [2 ', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioksol-10-il) benzil) fenil) amin) -1-oksopropan-2-il) propanamid
[0147]
[0148] HATU (601 mg, 1.580 mmol) i 2,6-lutidin (0.37 ml, 3.16 mmol) dodani su u rastvor (S) -2 - ((S) - 2 - ((((((9 ( fluoren-9-il) metoksi) karbonil) amin) propanamido) propanska kiselina (765 mg, 2,00 mmol), (6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS) -10- (4 - (3-aminobenzil) fenil) -7-hidroksi-8b- (2-hidroksiacetil) -6a, 8a-dimetil-6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12bdekahidro-1H -nafto [2 ', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioksol-4 (2H) -on (600 mg, 1.053 mmol) u DCM (6 ml) i DMF ( 12 ml). Posle 30 minuta, smeša je zagrejana do sobne temperature i mešavine preko noći. U reakcijsku smešu dodaje se dietilamin (2,18 ml, 21,06 mmol) i mešanje se nastavlja na sobnoj temperaturi od 3 sata, a zatim se isparčivi rastvarači uklapaju pod smanjenim pritiskom. Ostatak je rastvoren u 1: 1 DMSO: Me-OH (12 ml) i prečišćen pomoću HPLC reverzne faze na koloni od 10 mikrona Fenomen C18 (2) (250 k 50 mm). A) i 0,1% TFA u vodi (B), pri brzinama protoka od 90 ml / min (0 -5,0 min 15% A, 5,0-20 min linearni gradijent 15-85% A, zadržavanje 5 min). Kombinovane frakcije proizvoda su liofilizovane dajući nasilno jedinstvo u obliku beličaste čvrste supstance (447 mg, 0,628 mmol, unos 60%). LC-MS (Metod r, tabela 7) Rt = 0,78 min, m / z = 711,9 [M H].1H NMR (501 MHz, DMSO-d6) 810,03 (s, IH), 8,63 (d, J = 7,2 Hz, IH), 8,07 (d, J = 5,4 Hz, 3H), 7,44 - 7,38 (m, 2H), 7,38 - 7,34 (m, 2H), 7,29 (d, J = 10,1 Hz, IH), 7,23 - 7,16 ( m, 3H), 6,90 (dt, J = 7,7, 1,3 Hz, 1H), 6,14 (dd, J = 10,1, 1,9 Hz, 1H), 5,90 (t, J = 1,6 Hz, IH), 5,38 (s, IH), 4,90 (d, J = 5,3 Hz, IH), 4,52 - 4,37 (m , 2H), 4,27 (k, J = 3,3 Hz, 1H)), 4,16 (d, J =19,4 Hz, IH), 3,87 (s, 2H), 2,58 - 2,49 (m, IH), 2,28 (ddd, J = 13,4, 4,5, 2,1 Hz , IH), 2,09 (dtd, J = 17,0, 10,6, 5,0 Hz, 1H), 2,00 (dd, J = 12,2, 5,7 Hz, IH), 1,78 - 1,54 (m, 5H), 1,37 (s, 3H), 1,35 (s , 3H), 1,30 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,01 (ddd, J = 22,1, 11,9, 4,2 Hz, 2H), 0,84 (s, 3H).
Korak 2: Sinteza 3- (2,5-diokso-2,5-dihidro-1H-pirol-1-il) -N - ((S) -1 - (((S) -1 - ((3- ( 4 - ((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR, 12aS, 12bS) -7-hidroksi-8b- (2-hidroksiacetil) -6a, 8a-dimetil-4-okso-2,4, 6a , 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodekahidro-1H-nafto [2 ', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioksol - 10-il) benzil) fenil-amin) amin) -1-oksopropan-2-il) amin) -1-oksopropan-2-il) propanamid
[0149]
[0150] N, N-Diizopropiletilamin (0,33 ml, 1,875 mmol) je dodat rastvoru N-sukcinimidila na sobnoj temperature 3-maleimidopropionat (250 mg, 0,938 mmol) i (S) -2-amino-N - ((S) -1 - ((3-(4 - ((6aR, 6bS, 7S, 8aS, 8bS, 10R, 11aR , 12aS, 12bS) -7-hidroksi-8b- (2-hidroksiacetil) -6a, 8a-dimetil-4-okso-2,4,6a, 6b, 7,8,8a, 8b, 11a, 12,12a, 12b-dodekahidro-1 H-nafto [2 ', 1': 4,5] indeno [1,2-d] [1,3] dioksol-10-il) benzil) fenil) amino) -1-oksopropan- 2-il) propanamid (445 mg, 0,625 mmol) u DMF (12 ml). Posle 30 minuta na sobnoj temperaturi, isparljivi rastvarači su uklonjeni pod smanjenim pritiskom. Ostatak je razblažen sa 1: 1 DMSO: MeOH (12 ml) i prečišćen HPLC reverzne faze na koloni Phenomenek C18 (2) od 10 mikrona (kolona 250 k 50 mm). Korišćen je gradijent MeCN (A) i 0,1% TFA u vodi (B), pri brzini protoka od 90 ml / min (0-5,0 min 25% A, 5,0-20 min linearni gradijent 25-90% A, zadržavanje 5 min). Kombinovane frakcije proizvoda su liofilizovane dajući naslovljeno jedinjenje u obliku beličaste čvrste supstance (295,1 mg, 0,342 mmol, 55% prinos). LC-MS (Metod r, tabela 7) Rt = 0,85 min, m / z = 863,4 [M H].1H NMR (501 MHz, DMSO-d6) δ 9,71 (s, IH), 8,17 (d, J = 7,0 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 7,3 Hz, IH), 7,43 (dd, J = 7,8, 1,1 Hz, 2H), 7,38 - 7,32 (m, 2H), 7,29 (d, J = 10,1 Hz, IH), 7,22 - 7,15 (m, 3H), 6,96 (s, 2H), 6,88 (dt, J = 7,8, 1,3 Hz, 1H), 6,13 (dd, J = 10,1, 1,9 Hz, IH), 5,90 (t, J = 1,6 Hz, IH), 5,37 (s, 1H), 4,90 (d, J = 5,4 Hz, 1H), 4,48 (d, J = 19,4 Hz, 1H ), 4,32 (p, J = 7,1 Hz, IH), 4,27 (k, J = 3,3 Hz, IH), 4,21 (p, J = 7,1 Hz, IH), 4,16 (d, J = 19,4 Hz, IH), 3,87 (s, 2H), 3,59 (t, J = 7,3 Hz, 2H), 2,57 - 2,49 (m, IH), 2,38 (dd, J = 8,0, 6,6 Hz, 2H), 2,32 - 2,24 (m, 1H) , 2,15 - 2,04 (m, IH), 2,04 - 1,95 (m, IH), 1,80 - 1,54 (m, 5H), 1,37 (s, 3H), 1,26 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,15 (d, J = 7,1 Hz, 3H), 1,02 (ddd, J = 21,2, 12,1, 4,2 Hz , 2H), 0,84 (s, 3H).
Primer 35:
[0151] Sledeća jedinjenja su pripremljena korišćenjem gore opisanih postupaka
Primer 73: Protokoli konjugacije
Opšti protokol za konjugaciju cisteina
[0152] Približno 10 mg / ml rastvora željenog antitela pripremljeno je u PBS puferu, pH 7,4, kao I 10 mM TCEP rastvor u PBS (Pierce Bond-Breaker, kat. 77720). Antitela (anti-hTNF hIgG1 (D2E7) ili anti-mTNF mIgG2a (8C11; McRae BL et al. J Crohns Colitis 10 (1): 69-76 (2016)) su zatim delimično smanjeni dodavanjem približno dva molarna ekvivalenta od 10 mM TCEP, kratkim mešanjem i inkubacijom 60 minuta na 37 ° C. DMSO je zatim dodat delimično redukovanim antitelima u dovoljnoj količini do 15% ukupnog DMSO. Za konjugacije, 8 molarnih ekvivalenta od 10 mM D-L-maleimida rastvor (gde je SM radikal glukokortikosteroida, a L vezni link) je zatim dodat i inkubiran 30 minuta na sobnoj temperaturi. Prekomerni kombinovani sastojci i DMSO uklonjeni su zatim pomoću stubova za desaltizaciju NAP-5 (GE Cat.17-0853-02) prethodno uravnotežen sa PBS puferom, pH 7,4. Desalinirani uzorci su zatim analizirani hromatografijom za isključivanje veličine (SEC), hromatografijom hidrofobne interakcije (HIC) i smanjenom masenom spektrometrijom.
Tiosukcinimid hidroliza
[0153]
[0154] Hidroliza tiosukcinimidnog prstena ADC-a iz ovog otkrića postignuta je inkubacijom ADC-a na povišen pH. Ukratko, pripremljen je 0,7 M rastvor arginina, pH 9,0 i dodat je svakom ADC u PBS puferu da bi se ukupna koncentracija arginina dovela do 50 mM (pH ∼ 8,9). Zatim je materijal inkubiran na 25 ° C tokom 72 sata. Hidroliza sukcinimidnog prstena je zatim potvrđena redukovanom masenom spektrometrijom, nakon čega je hidroliza ugašena dodatkom 0,1 M rastvora sirćetne kiseline u 12,5 mM ukupne sirćetne kiseline (pH ∼ 7,1).
ADC Analitički Postupci
[0155] Hidrofobna interakciona hromatografija. ADC-ovi su profilisani hidrofobnom interakcionom hromatografijom (HIC) da bi se odredio stepen konjugacije i izračunali približni odnosi lekova i antitela (DAR). Ukratko, 100 mg ADC-a natovareno je na Ultimate 3000 Dual LC sistem (Thermo Scientific) opremljen sa 4,6 Ks 35 mm butil-NPR kolona (Tosoh Bioscience, kat.
14947). ADC su natovareni na kolonu uravnoteženu u 100% puferu A i eluirani pomoću linearnog gradijenta od 100% pufera A do 100% pufera B tokom 12 minuta pri 0,8 ml / min, gde je pufer A 25 mM natrijum fosfata, 1,5 M amonijum sulfata , pH 7,25 i pufer B je 25 mM natrijum fosfata, 20% izopropanola, pH 7,25. DAR je određen uzimanjem zbroja svake površine vršnog procenta pomnoženog sa njihovim odgovarajućim opterećenjem lekom i ponderisanog zbira podeljene sa 100.
[0156] Hromatografija za isključivanje veličine. Raspodela veličine ADC-a profilisana je hromatografijom za isključivanje veličine (SEC) primenom Ultimate 3000 Dual LC sistema (Thermo Scientific) opremljenog TSK-gelom 3000SVKSL kolone 7,8 Ks 300 mm (Tosoh Bioscience, kat. 08541). 20 ug svakog od ADC-a natovareno je na kolonu i eluirano preko 17 min upotrebom izokratskog gradijenta pri 1mL / min od 100 mM natrijum sulfata, 100 mM natrijum fosfata, pH 6,8 pri 0,8 ml / min.
Primer 74: Priprema adalimumaba konjugovanog sa glukokortikosteroidom da bi se dobio ADC [0157] Adalimumab MP-ala-ala steroidni ADC sa prosečnim DAR 3,5 pripremljen je dvostepenim hemijskim postupkom: redukcijom disulfida adalimumaba praćenom alkilacijom (konjugacijom) sa maleimidopropil alanin-alanin steroidom Cpd. Br.88.
[0158] U prvom koraku, ograničeni broj međulančanih disulfidnih veza adalimumaba redukuje se sa tris (2-karboks-etil) fosfinom ("TCEP") (≥ 1,8 ekvivalenta). Tada se delimično redukovani adalimumab konjuguje sa Cpd. Br.88 (≥ 5 ekvivalenata) u DMSO.
[0159] Pozivajući se na Sliku 5 koja prikazuje hromatografsku rezoluciju rezultujućeg preparata ADC, ADC je heterogena smeša koja sadrži antitela sa vezanim nula molekula veznih lekova (vrh "E0"), dva vezana molekula veznih lekova (vrh "E2"), pričvršćena četiri molekula veznih lekova (pik "E4"), šest molekula povezanih lekova ("E6 "vrh" i osam molekula vezanih lekova (vrh "E8"), u zavisnosti od broja međulančanog disulfide obveznice smanjene. Metode hromatografskog odvajanja i izolovanja homogenih vrhova E2 i E4 opisali su Hamblett i sar., Clin Cancer Res 2004; 10: 7063-7070. HIC uslovi korišćeni na slici 5 su sledeći:
[0160] Kolona je TOSOH Tskgel Butil-NPR, 4,6 mm k 3,5 cm, 2,5 m, a temperatura kolone je 30 ° C. Talasna dužina je bila 280 nm, vreme rada je bilo 22 minuta, injekcija, zapremina je bila 40 ml, brzina protoka je bila 0,5 ml / minut. Mobile Faza A: 25mM Na2HPO4, pH 7,0 i 1,5M (NH4) 2SO4, mobilna faza B: 25mM Na2HPO4, pH 7,0 / IPA = 75/25. Gradijent profil:
[0161] Metode hromatografskog razdvajanja i izolovanja homogenih vrhova E2 i E4 opisali su Hamblett i sar., Clin Cancer Res 2004; 10: 7063-7070. Ukratko, nakon hidrolize i podešavanja na pH <7,4, smeša široke distribucije obrađena je sa 3 M amonijum sulfatom / 50 mM fosfatnim puferom da bi se ukupna koncentracija rastvora amonijum sulfata dovela na približno 0,8 M. Predpakovana hidrofobna interakciona hromatografija (HIC) kolona (smola butil sefaroza HP) je pripremljena saniranjem sa 0,5 N rastvora NaOH (4 CV), ispiranjem vodom za injekcije (VFI, 0,5 CV) i uravnoteženjem sa 0,8 M amonijum sulfatom / 25 mM fosfatnim puferom (4 CV ). Rastvor puferovan sa amonijum sulfatom široke distribucije je stavljen na HIC kolonu (približno punjenje, 30 mg proteina po ml smole), praćeno 0,8 M amonijum sulfatom / 25 mM fosfatnim puferom (2,5 CV). Elucija proizvoda bila je sledeća: 0,72 M amonijum sulfata / 25 mM fosfatnog pufera (3 CV), nekonjugovani mAb; 0,56 M amonijum sulfata / 25 mM fosfatnog pufera (4,5 CV), DAR2 ADC; 0,32 M amonijum sulfata / 25 mM fosfatnog pufera (6,5 CV), DAR4 ADC. Frakcije proizvoda DAR 2 i DAR4 su zatim odvojeno koncentrovane na približno 30 mg / ml ultrafiltracijom (Millipore Ultracel, granična vrednost 30 kD), praćeno dijafiltracijom u VFI (8 CV).
[0162] Sukcinimid prečišćenog konjugata E4 je hidrolizovan da bi se obezbedilo stabilizovano vezivanje podešavanjem pH rastvora proizvoda do ≥ 9 pomoću argininskog pufera. Rastvor je držan na sobnoj temperaturi ≥ 2 dana, a tada je LC-MS analiza utvrdila da je hidroliza> 90% završena. Videti sliku 6 za deo LC-MS hromatograma. Uslovi SEC-a koji su korišćeni na slici 6 su sledeći: Kolona je bila TOSOH TSK-gel G3000SVkL, 5m, 250A, 7,8 k 300 mm, kolona je bila temperature okoline, talas- dužina je bila 214 nm, vreme rada je bilo 55 minuta, zapremina injekcije je bila 10 ml, brzina protoka je bila 0,25 ml / minut, temperatura automatskog uzorkovanja. bila je 4 ° C. Mobilna faza: 100 mM Na2HPO4 i 100 mM Na2SO4, pH 6,8 / IPA = 90/10.
[0163] Sirovi (slika 7) i dekonvoluisani (slika 8) MS podaci adalimumaba konjugovani sa MP-ala-ala-steroidom Cpd. Br. 88. Crni kvadrat i krug predstavljaju ADC sa hidroksilnim i nehidrolizovanim sukcinimidom. Ova relativna brojnost hidrolizcovanog i nehidrolizovanog ADC koristi se za određivanje konverzije hidrolize.
Primer 75: In vitro aktivnost steroida malih molekula
Analiza vezivanja za receptore glukokortikoida
[0164] Mali molekuli su testirani na vezivanje glukokortikoidnih receptora (GR) pomoću Polarscreen ™ kompleta za ispitivanje glukokortikoidnih receptora, crveni (ThermoFisher A 15898) u skladu sa protokolom proizvođača. Ukratko, jedinjenja su serijski razblažena u DMSO, a zatim su prebačena u pufer za probni komplet u razblaženju od 1:10. Jedinjenja su dalje razblažena 1: 5 u puferu za testni komplet, a 10 ml je prebačeno na ploču crnih zidova sa malim volumenom od 384 (Corning 4514).5 ml 4Ks. U svaku jažicu koja sadrži test jedinjenje dodato je 15 matičnog rastvora fluormona GS Red i 5 ul matičnog rastvora pune dužine 4k GR, a ploče su inkubirane zaštićene od svetlosti na sobnoj temperaturi tokom 4 sata. Fluorescentna polarizacija (mP) merena je za svaku ploču pomoću čitača pločica EnVision Multilabel (Perkinelmer # 2104-0010), a podaci su analizirani pomoću krivulje sa četiri parametra koja odgovara generiranju EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani u tabeli 10 dole.
Analiza mineralnih kortikoidnih receptora
[0165] Mali molekuli su testirani na aktivnost agonista mineralnih kortikoidnih receptora (MR) korišćenjem ćelijske linije PathHunter® NHRPRO CHO-K1 MR (DiscoveRk cat # 93-0451C2) prema protokolu proizvođača. Ukratko, 20.000 ćelija / jamica u medijumu za kulturu je stavljeno preko noći u pločicu sa 96 jažica (Costar mačka # 3885) na 37 ° C. Mediji su uklonjeni I 25 zamenjeno serijski razblaženim malim molekulima u mediju za ispitivanje (30 ml; 0,3% DMSO završno). Ploče su inkubirane preko noći na 37 ° C. Medijum je uklonjen, zamenjen reagensom za detekciju (DiscoveRk cat # 93-0001; 12 ml / jamici) i inkubiran na sobnoj temperaturi (RT) tokom 60 minuta. Luminescencija je merena za svaku pločicu pomoću čitača pločica EnVision Multilabel (Perkinelmer # 2104- 0010), a podaci su analizirani pomoću krivulje sa četiri parametra koja odgovara za generisanje EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani u tabeli 10 dole.
[0166] Mali molekuli su testirani na vezivanje za progersteronski receptor (PR) primenom modifikacije LanthaScreen® TR-FRET progesteronskog receptora koaktivatora (Thermofisher cat # A15903) gde je koak-obeleženi fluorescein tivator peptid je zamenjen sa fluormonom AL-Red (Thermofisher cat # PV4294) da bi se poboljšao signalni test. Ukratko, jedinjenja su serijski razblažena u DMSO, a zatim premeštena u pufer za ispitivanje (Thermofisher cat # PV4301 5mM DTT) u razblaženju od 1:10.10 ml jedinjenja je premešteno u 96 ploča sa crnim jažicama na pola površine (Corning cat # 3694) u duplikatu. U svaku jažicu je dodato 5 ml PR-LBD proteina (4nM zaliha u puferu za ispitivanje; Thermofisher cat # P2899). Pored toga, 5 ml pripremljene smeše fluormona AL-Red (12 nM) i terbijuma obeleženih anti-GST monoklonskih antitela (mAb) (20 nM; Termofisher mačka # PV3550) u puferu za ispitivanje je takođe dodat u svaku jažicu. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT) tokom 2 sata, a zatim je izmeren odnos emisije TR-FRET pomoću EnVision višeznačnog čitača ploča (Perkinelmer # 2104-0010). Podaci su analizirani korišćenjem krivulje sa četiri parametra koja odgovara generiranju EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani u tabeli 10 dole.
Test vezivanja za receptore androgena
[0167] Mali molekuli su testirani na vezivanje androgenih receptora (AR) korišćenjem modifikacije LanthaScreen® TR-FRET Androgen Receptor Coactivator Analize (Thermofisher cat # A15878) gde je koaktivator obeležen fluoresceinom peptid je zamenjen fluormonom AL-Red (Thermofisher mačka # PV4294) da bi se poboljšao signalni test. Ukratko, jedinjenja su serijski razblaženi u DMSO, a zatim premešteni u pufer za ispitivanje (Thermofisher cat # PV4295 5 mM DTT) u razblaženju od 1:10. 10 ml jedinjenja je premešteno u 96 ploča sa crnim jažicama na pola površine (Corning cat # 3694) u duplikatu. U svaku jažicu je dodato 5 ml AR-LBD proteina (5nM zaliha u puferu za ispitivanje; Thermofisher cat # 3009). Pored toga, u svaku puferu je takođe dodato 5 ml pripremljene zalihe fluormona AL-Red (20 nM) i terbijumom obeleženo anti-GST monoklonsko antitelo (mAb) (30 nM; Termofisher mačka # PV3550) u puferu za ispitivanje. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT) tokom 6 sati, zatim je izmeren odnos emisije TR-FRET pomoću čitača pločica EnVision sa više etiketa (Perkinelmer # 2104-0010). Podaci su analizirani korišćenjem krivulje sa četiri parametra koja odgovara generiranju EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani u tabeli 10 dole.
GRE Reporter Assai
[0168] K562 roditeljske GRE (pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro]) ćelije opisane u Primeru 78 stavljene su na bele ploče tretirane kulturom tkiva sa 96 jažica (Costar: 3917) sa 50.000 ćelija po jamici u 50 ml medijuma za ispitivanje ( RPMI, 1% CSFBS,1% L-glutamina, 1% Na piruvata i 1% MEAA). Jedinjenja agonista GR malih molekula su serijski razblažena u početnoj koncentraciji od 100 mM i serijski razblažena 4 puta u 100% DMSO. Jedinjenja sa malim molekulima su dalje razblažena u mediju za ispitivanje prenošenjem 2 ml serijski razređenih jedinjenja u medij za ispitivanje od 248 ml u sekundarnu ploču za razblaživanje (razređivanje 1: 125). Ćelije su zatim tretirane sa 25 ml jedinjenja razblaženog GR agonista u razmeru 1: 125 za krajnji početak koncentracija od 266,7 nM (1: 3) ili samo medijum i inkubirano 24 sata na 37 °, 5% CO2. Posle 24 sata inkubacije, ćelije su tretirane sa 75 ml sistema za analizu dvostrukog glo-luciferaze (Promega-E2920) tokom 10 minuta i analizirane su na luminiscenciju pomoću TopCount-a ili MicroBeta2 (PerkinElmer).
Analiza vezivanja receptora estrogena
[0169] Mali molekuli su testirani na vezivanje alfa estrogenskog receptora (ER) korišćenjem modifikacije LanthaScreen® TR-FRET estrogenskog receptora alfa koaktivatora (Thermofisher cat # A15885) gde je peptid koaktivatora označen fluoresceinom zamenjen fluormonom ES2 Zelena (Thermofisher mačka # PV6045) za poboljšanje signala eseja. Ukratko, jedinjenja su serijski razblažena u DMSO, a zatim premeštena u pufer za ispitivanje (Thermofisher cat # PV4295 5mM DTT) u razblaženju od 1:10.10 ml jedinjenja je premešteno u 96 ploča sa crnim jažicama na pola površine (Corning cat # 3694) u duplikatu. U svaku jažicu je dodato 5 ml ER-LBD proteina (5nM zaliha u puferu za ispitivanje; Thermofisher cat # 4542). Pored toga, u svaku jažicu je takođe dodato 5 ml pripremljene zalihe fluormona ES2 Green (12 nM) i terbijumom obeleženo anti-GST monoklonsko antitelo (mAb) (8 nM; Thermofisher cat # PV3550) u puferu za ispitivanje. Ploče su inkubirane na sobnoj temperaturi (RT) tokom 4 sata, a zatim je izmeren odnos emisije TR-FRET pomoću EnVision višeznačnog čitača ploča (Perkinelmer # 2104-0010). Podaci su analizirani korišćenjem krivulje sa četiri parametra koja odgovara generiranju EC50 vrednosti. Rezultati su prikazani u Tabela 10 dole.
st no v akti
vitroIn 0:
1 bela Ta
Analiza vezivanja receptora progesterone
Primer 76: Stabilnost imunokonjugata protiv TNF-alfa
Matrična stabilnost
[0170] Anti-TNFa steroidni ADC su testirani na njihovu podložnost prevremenom oslobađanju korisnog tereta malih molekula pod fiziološkim uslovima. U ovim eksperimentima, ADC su razblaženi u plazmi (čovek, majmun, miš ili pacov) ili puferu u duplikatu i inkubirani 6 dana na 37 ° C, 5% CO2. Svaki uzorak je ugašen u vremenu od 0 minuta i na razne vremenske tačke tokom perioda od 6 dana. Uzorci su zatim analizirani pomoću LC / MS / MS i upoređeni sa standardnim krivim za odgovarajući mali molekul. Izračunato je% maksimalnog oslobađanja korisnog tereta malih molekula tokom vremena. Rezultati su sumirani u donjoj tabeli 11.
Tabela 11: Stabilnost anti-TNFa steroidnih ADC
[0171] Ovi rezultati pokazuju da su anti-TNFa steroidni ADC stabilni u puferu i plazmi više vrsta i to minimalno oslobađanje malih molekula je očuvano.
Proteolitička stabilnost
[0172] Osetljivost steroidnih ADC-a da oslobađaju svoj teret tretmanom proteaze upoređena je sa ADC generisan upotrebom vcmcMMAE veznika leka konjugovanog sa mišjim CD-19 antitelom. ADC (prosečni DAR od 4) su inkubirani sa katepsinom B ili proteinazom K, a oslobađanje korisnog tereta analizirano je pomoću LC-MS u različitim vremenskim tačkama (0, 1, 4, 7 i 24 sata).
[0173] Rezultati su prikazani na slici 1 i pokazuju da su steroidni ADC-ovi otporni na egzogeno oslobađanje korisnog tereta katepsina iz ADC-a. Ovo je za razliku od poznatog ADC povezivača korisnog tereta (mcvcMMAE), gde MMAE se oslobađa u značajnim količinama nakon tretmana katepsinom. Ovi podaci ukazuju da su steroidni ADC mnogo manje podložni prevremenom oslobađanju korisnog tereta koji je rezultat aktivnosti katepsina u cirkulaciji od poznatih ADC-a. Zapravo, oslobađanje steroida se primećuje samo kod proteinaze K, serinske proteaze koja pokazuje široku specifičnost cepanja. To ukazuje na to da je deo antitela steroidnog ADC potrebno značajno katabolizovati pre cepanja steroidnog veznika i da se oslobađanje korisnog tereta može ograničiti na sredinu u kojoj može da prođe digestija skele antitela na ADC-u, poput lizozoma.
Katepsin B varenje
[0174] Osnovni rastvor katepsina B (Sigma) od 0,2 mg / ml pripremljen je u puferu (25 mM Tris, 50 mM NaCl i 5% glicerol). Da bi se dobio 10 mg / ml radnog rastvora katepsina B, 5 ml 0,2 mg / ml katepsina B smeše je pomešano sa 95 ml pufera za aktiviranje (50 mM natrijum acetata pH5, 1 mM EDTA i 5 mM DTT) i inkubirano na 37 ° C u trajanju od 15 minuta. Za varenje ADC, 20 ml 100 ug / ml ADC i 20 ml radnog rastvora katepsina B pomešano je sa puferom za razblaživanje od 160 ml (50 mM natrijum acetata, 1 mM EDTA). Uzorak je inkubiran na 37 ° C uz mućkanje, i dobijeno je alikvota od 40 ml uklonjen nakon 0, 1, 4, 7 i 24 sata. U svaki alikvot je dodato 160 ml rastvora za gašenje (0,1% mravlje kiseline; 1: 1 MeOH: MeCN; 100 nM karbutamida), a oslobođeni mali molekul je detektovan LC-MS / MS kako je prethodno opisano.
Proteinaza K varenje
[0175] Zalih od 5 mg / ml proteinaze K (Sigma) pripremljen je u dejonizovanoj (DI) vodi.0,25 mg / ml radnog rastvora proteinaze K je pripremljeno mešanjem 50 ml 5 mg / ml proteinaze K sa 950 ml pufera za razblaživanje (1k HBSS i 1 mM EDTA). Za varenje ADC, 20 ml 100 ug / ml ADC i 40 ml radnog rastvora proteinaze K pomešano je sa puferom za razblaživanje od 140 ml. Uzorak je inkubiran na 37 ° C uz mućkanje, a alikvoti od 40 ml uklonjeni su nakon 0, 1, 4, 7 i 24 sata. U svaki alikvot je dodato 160 ml rastvora za gašenje (0,1% mravlje kiseline; 1: 1 MeOH: MeCN; 100 nM karbutamid) i LC-MS / MS je detektovao oslobođeni mali molekul kako je prethodno opisano.
Primer 77: In vivo stabilnost imunokonjugata anti-TNF-alfa
[0176] Osetljivost steroidnog ADC na gubitak veznika leka procenjena je kod miševa. MP-Ala-Ala-steroid je konjugovan sa humanim IgG1 mAb (prosečno DAR 4) i inkubiran na pH 9 da katalizuje hidrolizu prstena koji otvara prsten. Posle neutralizacije, steroidni ADC je ubrizgan miševima, a LC-MS je tokom 7 dana nadgledala kinetiku gubitka veznika leka.
[0177] U ovim eksperimentima, ADC formulisan u fiziološkom rastvoru sa fosfatnim puferom doziran je intravenozno do 15 muških DBA / 1 miševi sa 5 mg / kg. Tri miša su žrtvovana tokom 1 h, 24 h, 72 h, 168 h i 240 h nakon doze. Prikupljena je EDTA cela krv i pripremljen serum za in vivo DAR analizu masenom spektrometrijom.
Predrazređivanje uzorka seruma
[0178] Uzorci seruma su razblaženi u konjskom serumu (Life technologies, 16050-122) na osnovu ukupnih koncentracija antitela ADC, merenih ukupnim testom vezivanja liganada antitela. Razređivanja su se zasnivala na procenama konačne koncentracije u opsegu od 10-30 mg / ml, što je pogodno za gornju granicu vezivnog kapaciteta magnetnih zrnaca.
Prečišćavanje afiniteta prema imunoafinitetu
[0179] U proteinskoj LoBind epruveti (Eppendorf Severna Amerika) dodato je 350 ml konjskog seruma u 100 ml svakog prethodno razblaženog uzorka ADC seruma do ukupne zapremine 450 ml, praćeno dodavanjem 4 mg biotin-anti- humano Fc antitelo (2 ml biotin-anti-čoveka u rastvoru od 2 mg / ml). Uzorci su inkubirani 2 sata (hr) na sobnoj temperaturi mućkanjem na 900 obrtaja u minuti na orbitalnom tresilici. Za svaki uzorak seruma, 50 ml kaše magnetnih zrna obloženih streptavidinom (Pierce, Cat 88817) uravnotežen je sa 0,1% Tveen-a u PBS puferu (PBST) u LoBind epruveti. Fiziološki rastvor puferisan fosfatom sa puferom Tveen 20 (PBST) uklonjen je pipetom nakon povlačenja magnetnih zrnaca na bočnu stranu LoBind cevi postavljanjem LoBind cevi na magnetni nosač. Uzorci seruma nakon 2 sata inkubacije sa reagensom za hvatanje protiv čoveka prebačeni su u LoBind epruvete koje sadrže uravnotežene magnetne kuglice i inkubirani na sobnoj temperaturi 1 sat pri 900 o / min na orbitalnom tresilici. Serum je uklonjen nakon magnetne inkubacije zrna, a magnetna zrnca je dobro oprana sa 500 ml PBST (3 puta), a zatim sa 500 ml 5% MeOH u MilliK vodi (3 puta). ADC oslobođen magnetnih zrnaca je oslobođen inkubacijom magnetnih zrnaca sa 100 ml 0,5% mravlje kiseline u 50% MeOH / MilliK vodi tokom 15 minuta.
Smanjenje prečišćenog ADC
[0180] Oslobođeni ADC je smanjen dodavanjem 10 ml redukujućeg reagensa (10 mM TCEP sveže pripremljenog od praha kupljenog od Thermo Scientific-a, sa 10 mM EDTA u 2M pH puferu Tris) u 100 ml uzorka i inkubirano na 37 ° C 30 minuta.
LC / MS analiza
[0181] Smanjeni uzorci (10 ml) ubrizgani su u sistem Agilent 6550 KTof LC / MS kroz CTC autosampler sa kontrolisanom temperaturom (5 ° C). Elucija uzorka je postignuta na Vaters C-4, 3,5 mm, 300 A, 2,1 k 50 mm i.d. HPLC kolona. Pokretne faze su bile: A: 0,1% mravlje kiseline u vodi i B: 0,1% mravlje kiseline u MeCN; brzina protoka bio 0,45 ml / min; a odeljak za kolonu se održava na 40 ° C.
[0182] HPLC gradijent je bio sledeći:
[0183] MS analiza visoke rezolucije smanjenog ADC izvedena je na četvorostrukom vremenu leta Agilent 6550 (Agilent Technologi, San Clara, CA) opremljenom dvostrukim izvorom jonizacije raspršivanjem mlaznog mlaza Agilent Jet Stream (ESI) koji radi u režimu pozitivnih jona. Maseni spektrometar radio je u režimu proširenog dinamičkog opsega (2G Hz) sa opsegom MS do 3.200 m / z. Primarni ESI izvor korišćen je za LC / MS analizu, a sekundarni ESI sonda za infuziju kalibracionog rastvora na 922,009798 m / z da bi se postigla MS kalibracija u realnom vremenu. Maseni spektrometar kalibrisan je svakodnevno. Tipične greške mase analita u odnosu na teorijske mase bile su manje od 65 delova na milion u svakodnevne operacije. MS podaci su obrađeni pomoću MassHunter Kual Brovser Build 5.0.
Dekonvolucija MS spectra
[0184] Metod maksimalne entropije u softverskom paketu MassHunter Bioconfirm je korišćen za dekonvoluciju masenih spektra višestruko naelektrisanih jona da bi se dobili neutralni spektri molekulske težine. Intenzitet dekonvoluiranog vrha korišćen je za izračunavanje DAR.
Izračun DAR vrednosti iz nesavršenog MS spektra
[0185] Vrednosti DAR su izračunate korišćenjem dekovolinuiranog MS vršnog intenziteta na osnovu sledećih jednačina:
LC i LC ^ su laki lanci sa nula, odnosno jedan veznik leka.
[0186] DAR vrednost iz teškog lanca (HC):
HC, HC ^, HC ^^ i HC ^^^ su teški lanci sa nula, jedan, dva i tri povezivača lekova, respektivno.
Rezultati
[0187] Rezultati su prikazani na slici 2. Ovaj primer pokazuje da se primećuje minimalan gubitak veznika leka od steroidnog ADC tokom 7 dana.
Primer 78: Generacija humanih i mišjih transmembranskih TNF-alfa GRE reporter ćelijskih linija [0188] Da bi se stvorila roditeljska ćelijska linija, ćelije K562 su posejane u posudu sa 6 jažica (Costar: 3516) sa 2 ml kompletnog medijuma za rast (RPMI, 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% Na piruvat i 1% MEM NEAA) na 500.000 ćelija po jamici tokom 24 sata na 37 °, 5% C02. Sledećeg dana 1,5 mg pGL4,36 [Luc2P / MMTV / Higro] (Promega: E316), 1,5 ug pG14,75 [hRLuc / CMV] (Promega: E639A) i 3 ml PLUS reagensa (Invitrogen: 10964- 021) razblaženi su u 244 ul Opti-MEM (Gibco: 31985-070) i inkubirani na sobnoj temperaturi 15 minuta. Vektor pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro] sadrži MMTV LTR (dugotrajno ponavljanje virusa mumarnog tumora mumarnog tumora) koji pokreće transkripciju gena reporter luciferaze luc2P kao odgovor na aktivaciju nekoliko nuklearnih receptora kao što su glukokortikoidni receptor i androgeni receptor. PGL4.75 [hRluc / CMV] Vector kodira reporter gen za luciferazu hRluc (Renilla reniformis) i dizajniran je za visoku ekspresiju i smanjenu anomalnu transkripciju. Posle inkubacije, razblaženi rastvor DNK je prethodno inkubiran sa rastvorom 1: 1 Lipofectamine LTKS (Invitrogen: 94756) (13,2 ml 256,8 ml Opti-MEM) i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta da bi se formirali kompleksi DNA-Lipofectamine LTKS. Posle inkubacije, 500 ml DNK-Lipo-fektamin kompleksa dodato je direktno u ćelije koje sadrže bušotinu. K562 ćelije su transfekovane 24 sata na 37 °, 5% C02. Posle inkubacije, ćelije su isprane sa 3 ml PBS i odabrane sa potpunim rastvornim medijumom koji sadrži 125 mg / ml higromicina B (Invitrogen: 10687-010) tokom dve nedelje. Izrađene su ćelije "K562 pGL4.36 [Luc2P / MMTV / Higro] _pGL4.75 [hR-50 Luc / CMV]".
[0189] Da bi se stvorila mišja transmembranska TNF-alfa GRE reporter ćelijska linija, roditeljske ćelije, K562pGL4.36 [Luc2P / MMTV / Higro] _pGL4.75 [hRLuc / CMV], posejane su u posudu sa 6 jažica (Costar: 3516) sa 2 ml kompletnog medijuma za rast (RPMI, 10% FBS, 1% L-glutamin, 1% Na piruvat i 1% MEM NEAA) na 500.000 ćelija po jamici tokom sata 24 na 37 °, 5% C02. Sledećeg dana, 3 mg mFL_TNFa DNK (Origene: MC208048), koja kodira neobeleženi TNF miša, i 3 ml PLUS reagensa (Invitrogen: 10964-021) razblaženo je u 244 uL Opti-MEM (Gibco: 31985-070) i inkubirano na sobnoj temperaturi 15 minuta. Posle inkubacije, razblaženi rastvor DNK je prethodno inkubiran sa rastvorom 1: 1 Lipofectamine LTKS (Invitrogen: 94756) (13,2 uL 256,8 uL Opti-MEM) i inkubiran na sobnoj temperaturi tokom 25 minuta da bi se formirali kompleksi DNA-Lipofectamine LTKS. Posle inkubacije, bilo je 500 ml kompleksa DNKlipofektamin dodati direktno u ćelije koje sadrže bunar. Roditeljske ćelije K562 pGL4.36 [Luc2P / MMTV / Higro] _pGL4.75 [hRLuc / CMV] transfektovane su 24 sata na 37 °, 5% C02. Posle inkubacije, ćelije su isprane sa 3 ml PBS i odabrane sa potpunim medijumom za rast koji sadrži 125 mg / ml higromicina B (Invitrogen: 10687-010) i 250 mg / ml G418 (Gibco: 10131-027) tokom dve nedelje. Proizvedene su ćelije "K562 miš FL-TNFa GRE (pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro])".
[0190] Da bi se stvorila humana transmembranska ćelijska linija reporter TNF-alfa GRE, roditeljske ćelije, K562 pGL4.36 [Luc2P / MMTV / Higro] _pGL4.75 [hRLuc / CMV], transfektovane su plazmidom hTNF delta 1 -12 C-Mic pcDNA3.1 (-) plazmidna konstrukcija. Ovaj plazmid je pcDNA 3.1 (Thermofisher cat # V79020) koji kodira trans-otpornost na tace membranski TNF (tj. SEK ID NO: 1 kojem nedostaju aminokiseline 77-88). (Videti Perez C i sar. Ćelija 63 (2): 251-8 (1990), raspravljajući o transmembranskom TNF-u otpornom na tace.) Ove ćelijske linije su zatim korišćene u TNF-alfa reporter testovima opisanim u sledećim primerima. Primer 79: Aktivnost anti-TNF-alfa imunokonjugata u GRE transmembranskim TNF-alfa reporter testovima
[0191] K562 roditeljske GRE (pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro]) ćelije i K562 mFL-TNF-a ili hTNF delta 1-12 GRE (pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro]) ćelije su postavljene na bele ploče tretirane kulturom tkiva sa 96 jažica (Costar: 3917) na 50.000 ćelija po jažici u 50 ml probnog medija (RPMI, 1% CSFBS, 1% L- glutamin, 1% Na piruvat i 1% MEAA). Ćelije su tretirane sa 25 ml 3k serijski razređenog mišjeg ili humanog anti-TNF-antitela konjugata leka u testnom medijumu, steroidnom jedinjenju ili medijumu i inkubirane 48 sati na 37 °, 5% CO2. Posle 48 sati inkubacije, ćelije su tretirane sa 75 ml sistema za ispitivanje luciferaze Dual-Glo (Promega-E2920) tokom 10 minuta i analizirane na luminiscenciju koristeći TopCount (PerkinElmer). Podaci su analizirani korišćenjem krivulje sa četiri parametra koja odgovara generiranju EC50 vrednosti. % maksimalne aktivacije normalizovan je na 100 nM deksametazona, što se smatralo maksimalnom aktivacijom. Rezultati koji koriste mišju TNF-alfa ćelijsku liniju prikazani su u tabeli 12 dole, a rezultati koji koriste humanu TNF-alfa ćelijsku liniju prikazani su u tabeli 13 ispod. U donjoj tabeli 12, A se odnosi na 8C11. U tabeli 13 dole, A se odnosi na adalimumab (SEK ID
NO: 66 i 73). Procenat (%) monomera određen je SEC-om kako je prethodno opisano (videti analitičke postupke ADC).
8C elotitan Fa TN noil<i>tim an a in nos od se (Atutes er ort rep E R G
Fa TN
kom ns bra em m ns tra
jemiš m ulatite an Fa TN gišje m v
proti a kov le atajug kon st vno aktiro vit :In 12 ela Tab
(A stu
rte
te
por
re
E R G
Fa
TN
om nsk
i bra
: em sm
I
tran
mo
an
hum uli a
tel
tilan i Fa
TN
ih
an
mi hu
tivlpro i va
ko
le i a
at
jug
on
stk
no
tiv
ak
vitro
n
13:I
a
bel
Ta
Primer 81: Aktivnost anti-hTNF alfa steroidnih ADC u testu oslobađanja citokina humanog PBMC stimulisanog lipopolisaharidom
[0192] Primarne mononuklearne ćelije periferne krvi čoveka (PBMC) kupljene su od kompanije Biological Specialti Corrporacije (cat 214-00-10), isprana u 50 ml PBS, ponovo suspendovana u FBS sa 5% DMSO, alikvotisana i krio-konzervirana u tečnom azotu do upotrebe. PBMC su odmrznuti, ponovo suspendovani u RPMI, dopunjen sa 2% FBS i 1% penicilin-streptomicin, i postavljeni u pločicu za ispitivanje ćelija (Costar # 3799). Ćelije su inkubirane sa različitim koncentracija anti-hTNF alfa steroidnih ADC na 37 ° C i 5% CO2 tokom 4 sata. Zatim su ćelije stimulisane sa 100 ng / ml LPS tokom noći. Sledećeg dana, ploča se vrtila pet minuta pri 1000 o / min i 100 ml supernatantnog medija je direktno prebačen na dodatnu ploču sa 96 jažica i analiziran na koncentraciju IL-6 (MSD, # K151AKB) i IL-1 beta (MSD, # K151AGB). Podaci o odgovoru na dozu su postavljeni na sigmoidnu krivu korišćenjem nelinearne regresije, a vrednosti IC50 izračunate uz pomoć GraphPad 5.0 (GraphPad Softvare, Inc.). Rezultati prikazani u tabeli 17 pokazuju da anti-hTNF alfa steroidni ADC imaju snažnu aktivnost u inhibiranju oslobađanja pro-inflamatornih citokini IL-6 i IL-1beta iz aktiviranih primarnih imunih ćelija.
Tabela 17: In vitro aktivnost anti-humanih TNF alfa ADC u testu oslobađanja citokina humanog PBMC stimulisano LPS n = 2
Primer 82: Aktivnost anti-TNF-alfa imunokonjugata u testu citotoksičnosti izazvanog TNFa u ćelijama L929
[0193] L929 je mišja aneuploidna fibrosarkomska ćelijska linija koja je senzibilisana predtretmanom sa aktinomicinom D. Lečenje TNFa inicira apoptozu i posledičnu ćelijsku smrt. L929 ćelije u log fazi su sakupljene korišćenjem tripsina 0,05%, isprane dva puta sa D-PBS i prebrojane sa CEDEKS-om. Ćelije su resuspendovane na 1E6 ćelija / ml u mediju za ispitivanje koji sadrži 4 mg / ml aktinomicina D i 50 ml je dodato u sve jažice. Anti-mišji TNF alfa steroidni ADC (anti-mišji TNF alfa 8C11 konjugovani sa Cpd 71; takođe se naziva anti-mTNF alfasteroidni ADC) i antimini mišji TNF mAb (8C11) su razblaženi do koncentracije od 43 u medijumu za ispitivanje i izvedena su serijska razblaženja u odnosu 1: 3. Mišji TNFa je razblažen do koncentracije od 4k od 600 pg / ml. Anti-mTNF steroid ADC i anti-mTNF mAb (125 ml) dodani su u mTNFa (125 ml) u šemi razblaživanja 1: 2 i ostavljeni da inkubiraju 1 sat na sobnoj temperaturi, lagano mućkanje. Smeša antitela / mTNFa (ili ADC / mTNFa) je dodata u jažice po 50 ml / jažici u tri primerka. Ploče su inkubirane tokom 20 sati na 37 ° C, 5% CO2. Da bi se kvantifikovala održivost, dodato je 10 ml VST-1 reagensa (Roche cat. 11644807001) do bunara. Ploče su inkubirane u uslovima ispitivanja tokom 3,5 sata, centrifugirane na 5003g i 75 ml supernatanta je prebačeno na ELISA ploču (Costar cat # 3369). Ploče su očitane na OD 420-600 nm pomoću čitača pločica Spectromak 190 ELISA. Podaci su analizirani i izračunate vrednosti IC50 primenom sigmoidalnog odgovora doze (promenljivi nagib) uklapaju se u GraphPad Prism 5.
[0194] Anti-mTNF alfa steroid ADC imao je uporedivu neutralizujuću snagu (IC501,9 nM) sa nekonjugovanim anti-mTNF 40 alfa mAb (IC501,5 nM).
Primer 83: Vezivanje anti-mTNF-alfa steroidnog ADC za mišje receptore Fcgamma
[0195] Za procenu je korišćen instrument Biacore T200 zasnovan na SPR (površinska plazmonska rezonanca) (GE Healthcare) vezivanje anti-mTNF-alfa steroidnog ADC (anti-mTNF 8C11 konjugovano sa Cpd 71) i anti-mTNF-alfa mAb za rekombinatne mišje FcgR (svi R&D sistemi). FcgR-ovi su direktno imobilizovani na površini protočnih ćelija dva, tri i / ili četiri CM5 tipa S Biacore čipa (a) da bi se postigla gustina od -21000-2000 RU (jedinice za rezonancu). Prazno izmenjeno površine protočne ćelije jedan od svakog Biacore čipa je korišćen kao referentna površina. Svaki eksperiment se sastojao od faza udruživanja i razdvajanja. Faza pridruživanja sastojala se od titriranja roditeljskog mAb i ADC preko svih protočnih ćelija pri protoku od 50 ul / min i koncentracijama od 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 i 0 nM za FcgRIIB i FcgRIII i 100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,13, 1,56 i 0 nM za receptore I i IV. Faza disocijacije sastojala se od kontinuiranog protoka tekućeg pufera (HBS-EP , pH 7,4, GE Healthcare) pri brzini protoka od 50 ul / min. Faze udruživanja i disocijacije praćene su po 5 min (receptori I i IV) ili 1 min (receptori II i III). Površine iverja su regenerovani sa impulsom od 5s od 100 mM HC1 pri brzini protoka od 100 ul / min nakon svakog ciklusa vezivanja. Procena Biacore-a softver je korišćen za prilagođavanje sirovih podataka modelima vezivanja 1: 1 (FcgRI i IV) ili Steadi State (receptori IIB i III). Rezultati su prikazani u tabeli 19. ka je konstanta brzine pridruživanja (1 / Ms); kd je konstanta brzine disocijacije (1 / s); KD je konstanta disocijacione ravnoteže (M).
Tabela 19: Afiniteti vezivanja anti-TNF-alfa imunokonjugata za mišje receptore Fcgamma
Primer 84: Aktivnost anti mTNF-alfa steroidnih ADC u kontaktnom modelu preosetljivosti [0196] Anti-mTNF alfa steroidni ADC su procenjeni u modelu akutne kontaktne preosetljivosti, izazivanju akutne upale kože primenom odgođenog odgovora preosetljivosti (DTH) (T-ćelijski pogon) primenom senzibilizujućeg agensa (fluorescein izotiocijanat (FITC))). Efikasnost antimTNF alfa steroidnih ADC merena je sposobnošću smanjenja otoka ušiju. Steroidni biomarkeri kortikosteron i prokolagen tipa 1 N-terminalni propeptid (P1NP) su uključeni kao očitavanja radi procene pretpostavljenog uticaja tretmana anti-mTNF alfa steroida ADC na osu hipotalamushipofiza-nadbubrežna žlezda (HPA), odnosno na koštani promet.
Oticanje ušiju
[0197] Dana 0 miševi su stavljeni u opštu anesteziju, a stomaci su obrijani. Koristeći mikropipetor, miševi su senzibilizirani epikutanom aplikacijom 400 uL FITC rastvora (1,5% rastvora u 1: 1 acetonu: DBP) na stomak. 6 dana kasnije, miševima je doziran nosač ili terapeutsko sredstvo 1 sat pre izazivanja ušiju sa FITC. Za izazivanje ušiju, miševi su stavljeni u opštu anesteziju i izazivani su sa 20 ml FITC nanešenog na desno uvo. 24 sata nakon izazivanja miševi su stavljeni u opštu anesteziju i debljina uha im se meri kaliperom. Izračunata je razlika između izazvanih i neospornih ušiju. 72 sata nakon izazivanja ušiju, miševima je ubrizgan ACTH pri 1mpk IP, a krajnja krv je završena 30 minuta nakon ACTH. Sakuplja se i analizira plazma P1NP, kortikosteron, slobodni steroidi i nivoi velikih molekula.
Kvantifikacija oslobođenog slobodnog steroida i endogenog kortikosterona
[0198] Kalibraciona kriva steroida je pripremljena u mišjoj plazmi sa krajnjim koncentracijama od 0,03 nM do 0,1 mM pri 8 različitih nivoa koncentracija. Krivulja kalibracije kortikosterona u rasponu od 0,3 nM do 1 mM konačnog kortikosterona koncentracije su pripremljene u rastvoru od 70 mg / ml goveđeg serumskog albumina u PBS puferu. Rastvor od 160 ml MeCN sa 0,1% mravlje kiseline je dodato u 40 ml ispitivanih uzoraka plazme ili kalibracionih standarda. Supernatanti su razblaženi destilovanom vodom i ubrizgano je 30 ml rastvora konačnog uzorka za LC / MS analizu.
[0199] Kvantifikacija oslobođenog slobodnog steroida i kortikosterona sprovedena je na AB Sciek 5500 trostrukom četverostrukom maseni spektrometar povezan sa Shimadzu AC20 HPLC sistemom povezan sa izvorom jonizacije elektrosprejom koji radi u pozitivnom režimu. Za hromatografiju je korišćena kolona Vaters KSBridge BEH C18, 2,1k30 mm, 3,5 mm razdvajanje. Mobilna faza A bila je 0,1% mravlja kiselina u Milli K HPLC vodi, a mobilna faza B je bila 0,1% mravlja kiselina u MeCN. Linearni gradijent od 2% mobilne faze B do 98% mobilne faze B primenjen je od 0,6 do 1,2 minuta. Ukupno vreme rada bilo je 2,6 min pri brzini protoka od 0,8 ml / min. Maseni spektrometar je radio u pozitivnom MRM režimu na temperaturi izvora od 700 ° C.
Kvantifikacija plazme P1NP
[0200] Kvantifikacija plazme P1NP je sprovedena na LC / MS platformi zasnovanoj na digestiji proteina tripsina. Uzorci plazme su delimično istaloženi i u potpunosti redukovani dodavanjem smeše MeCN / 0,1M amonijum bikarbonata / DTT. Su-pernatant je sakupljen i alkilovan dodavanjem jodooctene kiseline. Alkilovani proteini su digestirani pomoću tripsina I nastali triptični peptidi su analizirani pomoću LC / MS. Kalibraciona kriva je generisana korišćenjem sintetičkog triptičnog peptida ubačenog u konjski serum (neometajući surogat matriks). Stabilni bočni peptid obeležen izotopom (3-6 aminokiselina produženje na oba kraja triptičnog peptida) korišćen je kao unutrašnji standard dodat mešavini MeCN / DTT precipitacija proteina da bi se normalizovala efikasnost varenja i injekcija LC / MS.
[0201] Kolona Columnek Chromenta BB-C18, 2.1k150mm, 5 mm kolona je korišćena za hromatografsko razdvajanje. Ova mobilna faza A bila je 0,1% mravlja kiselina u vodi Milli K HPLC, a mobilna faza B je bila 0,1% mravlja kiselina u MeCN. Linearni gradijent od 2% mobilne faze B do 65% mobilne faze B primenjen je od 0,6 do 3 min. Ukupno vreme rada bilo je 8 min pri brzini protoka od 0,45 ml / min. Za kvantifikaciju korišćen je maseni spektrometar AB Sciek 4000Ktrap u pozitivnom MRM režimu P1NP peptidi, na izvornoj temperaturi od 700 ° C.
Kvantifikacija ukupnog ADC u plazmi
[0202] Koncentracije ukupnih antitela (ADC i kičmeni mAb) izmerene su testom vezivanja liganda koristeći platformu Mesoscale Discoveri (MSD). Mišji TNF obeležen sa biotinom korišćen je kao reagens za hvatanje za anti-mTNF alfa steroidne ADC, a za otkrivanje je korišćeno antitelo za detekciju koza konjugovanog Sulfo-TAG. Kalibraciona kriva je generisana serijskim razređivanjem molekula ADC u odgovarajućoj matrici i KC uzorci su korišćeni za kvalifikovanje testa.
Rezultati
[0203] Rezultati su prikazani u tabeli 20 ispod:
[0204] Ovi rezultati pokazuju da anti-mTNF alfa steroidni ADC mogu dobiti efikasan odgovor ekvivalentan lečenju steroidima malih molekula, istovremeno štedeći neželjene efekte na kortikosteron i P1NP.
[0205] Dodatna studija kontaktne preosetljivosti (CHS) je sprovedena da bi se pozabavilo pitanjem da li je za povećanu efikasnost potrebna konjugacija korisnog tereta steroida u anti-TNF mAb. Miševima su dozirane i.p. jednom prema gore opisanom protokolu sa bilo kojim vozilom, anti-mTNF alfa mAb (10mpk), anti-mTNF alfa steroid ADC (10mpk) (cpd br. 139) ili smeša anti-mTNF alfa mAb, koja je dozirana (istovremeno isporučena u jednoj i.p. injekciji) sa ekvivalentnom količinom steroida malih molekula kako bi se podudarala sa ADH stehiometrijom. Za dozu od 10MPk anti-mTNF alfa steroid ADC sa DAR od 4, izračunato je da je ovo 4 mg steroida sa malim molekulima (Cpd. br.42). Rezultati prikazani na slici 9 pokazuju da je lečenje ADC anti-mTNF alfa steroidima imalo značajno povećanu efikasnost u smanjenju upale uha u poređenju sa kombinacijom anti-mTNF alfa mAb i steroida malih molekula ili anti-mTNF alfa mAb.
Primer 85: Aktivnost anti-mTNF-alfa steroidnih ADC u artritisu izazvanom kolagenom
[0206] Sposobnost anti-mTNF alfa steroida ADC (Cpd. Br.137) da utiče na bolest procenjena je u modelu artritisa koji uključuje kolagen (CIA).
[0207] U ovim eksperimentima, muški miševi DBA / 1J su dobijeni od Jackson Labs (Bar Harbor, ME). Korišćeni su miševi u dobi od 6 do 12 nedelja. Sve životinje su održavane na konstantnoj temperaturi i vlažnosti pod 12-satnim svetlom / tamom ciklus i hranjeni čajem od glodara (Lab Diet 5010 PharmaServ, Framingham, MA) i vodom ad libitum. AbbVie je AAALAC (Udruženje za procenu i akreditaciju laboratorijske nege životinja) akreditovano i odobrene su sve procedure od strane Institucionalnog odbora za negu i upotrebu životinja (IACUC) i nadgleda ga veterinar koji prisustvuje. Telesne težine i stanje su praćeni, a životinje su eutanazirane ako su pokazale> 20% gubitka težine.
[0208] Muški miševi DBA / J imunizovani su intradermalno (i.d.) u dnu repa sa 100 ml emulzije sadrži 100 mg goveđeg kolagena tipa II (MD Biosciences) rastvorenog u 0,1 N sirćetne kiseline i 200 mg toplote inaktivirana Micobacterium tuberculosis H37Ra (Complete Freund’s Adjuvant, Difco, Laurence, KS). Dvadeset jedan dan nakon imunizacije kolagenom, miševima je pojačan IP sa 1 mg Zimosan-a A (Sigma, St. Louis, MO) u PBS. Sledeći poticaj, miševi su praćeni 3 do 5 puta nedeljno zbog artritisa. Korišćenjem na zadnjim šapama procenjivalo se oticanje Dier opružne čeljusti (Dier 310-115).
[0209] Miševi su upisani između 24. i 28. dana kod prvih kliničkih znakova bolesti i raspoređeni u grupe od ekvivalentna artritična težina. Rani terapijski tretman započeo je u trenutku upisa.
[0210] Životinjama su dozirane jednom oralno (po) sa steroidima (Cpd. Br. 3) (10mpk) u 0,5% HPMC / 0,02% Tveen80 nosača [v /] ili intraperitonealno (ip) sa anti-mTNF alfa mAb (10mpk) (8C11) ili anti-mTNF alfa steroid ADC (10mpk) (Cpd. Br. 137) u 0,9% fiziološkom rastvoru. Krv je sakupljana radi izlaganja antitelima repnim rezom 24 i 72 sata nakon doze. Šape su sakupljene u krajnjem vremenskom trenutku za histopatologiju. Krv je sakupljana u krajnjem vremenskom trenutku srčanom punkcijom radi kompletne krvne slike (Sismek KST-2000iV). Statistički značaj je utvrdio ANOVA.
[0211] Rezultati su prikazani na slici 3 i pokazuju da pojedinačna doza anti-mTNF alfa steroida ADC može pokazuju produženo trajanje delovanja kroz ublažavanje otoka šape tokom 6 nedelja u poređenju sa anti-mTNF alfa mAb ili samim steroidom malih molekula.
[0212] U odvojenoj studiji dizajniranoj da se pozabavi TNF-ciljanom funkcionalnošću anti-mTNF alfa steroida ADC, životinjama su dozirane jednom i.p. sa anti-mTNF alfa mAb (10mpk) ili antimTNF alfa steroid ADC (10mpk) (Cpd. No.145) ili sa izotipskim steroidnim ADC (10mpk) (Cpd. Br. 224):
koji prepoznaje protein kokošjeg jajeta ovalbumin, antigen koji se ne izražava kod miševa. Oba ADC-a imala su ekvivalentno opterećenje lekovima. Mali molekul steroid (3mpk) doziran je oralno jednom dnevno (kd). Rezultati su prikazani na slici 10 i demonstriraju da pojedinačna doza anti-mTNF alfa steroida ADC ima ekvivalentnu efikasnost od steroida malih molekula koji se doziraju dnevno tokom perioda od 21 dana. Jedna doza neciljanog izotipskog steroida ADC imala je samo delimičnu efikasnost, slično anti-mTNF mAb sam tokom istog vremenskog okvira. Procenti označavaju% inhibicije u poređenju sa nosačem. Procena telesne težine životinja tokom ove studije (slika 11) otkrila je sve lečene grupe, sa izuzetkom anti-mTNF alfa steroidne ADC grupe koja je izgubila na težini. Nasuprot tome, izloženi miševi tretirani sa anti-mTNF alfa steroidima ADC normalno povećanje telesne težine tokom 21-dnevnog ispitivanja.
Primer 86: Aktivnost različitih anti-mTNF alfa steroidnih ADC u artritisu izazvanom kolagenom [0213] Nekoliko anti-mTNF alfa steroidnih ADC-a sa različitim nosivostima steroida ili odnosom lekova i antitela (DAR) je testiran na efikasnost na mišjem modelu artritisa. Studije su sprovedene u skladu sa postupkom opisanim u primeru 85. Rezultati su prikazani u tabeli 21 dole.
Tabela 21: Efikasnost anti-TNF alfa steroidnih ADC u modelu artritisa
Primer 87: Aktivnost anti-hTNF-alfa imunokonjugata u humanom TNG transgenom Tg1278TNF modelu miša sa nokautom mišem artritisa izazvanog kolagenim antitelima
[0214] Efikasnost anti-humanih TNF alfa ADC procenjena je na humanom TNFa transgenom mišjem modelu artritisa.
[0215] Izveden je model artritisa izazvanog kolagenim antitelima (CAIA) (Moore, AR J Transl Med 12: 285 (2014)). koristeći humane TNG transgene Tg1278TNF nokautirane miševe kao što je prethodno opisano (Moore A i sar. J Transl Med 12 (1): 285 (2014). Osam mg koktela monoklonskih antitela koja ciljaju različite epitope kolagena tipa II (ArthritoMab ™) primenjeno je intraperitonealno (i.p.) miševima dan 0. Dana 3. miševima je injektirano i.p. sa 10 mg LPS za pojačavanje patologije bolesti. Životinje su svakodnevno procenjivane na artritični skor počev od dana 3 do dana 14 studije. Osam mužjaka miševa je korišćeno po grupi, a ispitni članci ili PBS nosač su davani i.p. dvaput nedelju dve nedelje.
[0216] Rezultati su prikazani na slici 4 i pokazuju da anti-humani TNF alfa ADC mogu značajno smanjiti skor bolesti u poređenju sa anti-humanim TNF alfa mAb (adalimumab).
Primer 88: Aktivnost anti-mTNF alfa steroidnih ADC na vršnom zapaljenju
[0217] Izvršen je eksperiment sa mišjim CIA da bi se utvrdila efikasnost anti-mTNF alfa steroida ADC na životinjama sa vršnom upalom. Za kasno terapijsko doziranje, miševi su bili uključeni u studiju kod prvih kliničkih znakova bolesti i dozirani su 6 dana nakon upisa. Grupa životinja je žrtvovana 7. dana bolesti da bi se obezbedilo polazište za arthritis.
promene mikro-računarskom tomografijom (mCT) i histološkom analizom u vreme doziranja svih ostalih grupa. Svim životinjama su dozirane jednom 6. dana sa nosačem (0,9% fiziološkim rastvorom), anti-mTNF alfa mAb (10mpk) (8C11) ili anti-mTNF alfa steroid ADC (10mpk) (Cpd. Br. 145) i žrtvovane 21. dana Prikupljene su artritične zadnje šape i izvršena je mCT analiza. Iste šape su zatim korišćene za histološku procenu. Na kraju eksperimenta. puna krv je sakupljana srčanom punkcijom radi procene kompletne krvne slike (CBC). Mikroračunarska tomografija (mCT)
[0218] Zadnje šape su uklonjene netaknute na golenici / fibuli i učvršćene u 10% formalinu. Šape su skenirane pomoću mCT (Scanco Medical AG, Micro-CT40) pri 55 kVp na 145 mA pri podešavanju visoke rezolucije (1000 projekcija / 180 ° pri rekonstrukciji piksela 2048k2048) koristeći izotropne voksele i vreme integracije od 300 milisekundi. Oko područja od interesa od tibiotalarnog spoja ručno je nacrtana cilindrična kontura koja se protezala u zglob za 100 kriški (1,8 mm). Procenu je izvršio softver Scanco koristeći 0.8 sigma gauss, sa gornjim pragom 1000 i donjim pragom 320.
Histološka evaluacija
[0219] Zadnje šape tretiranih miševa uronjene su fiksirane u 10% neutralnom puferisanom formalinu i delimično dekalcifikovane u rastvoru Calrite tokom 48 sati kako bi se omogućilo obrezivanje bočnih i medijalnih ivica tarzusa. Šape su zatim vraćene u Calrite na oko 48 sati da bi se završila dekalcifikacija. Uzorci su rutinski obrađivani, ugrađeni u paraffin sagitalna ravan, presečena na 5 mikrona i obojena hematoksilinom i eozinom. Slajdovi su mikroskopski procenjeni na prisustvo upale / formiranja panusa, infiltracije neutrofila, erozije kostiju i oštećenja hrskavice pomoću skale 0-4: 0 = nema, 1 = blago, 2 = umereno, 3 = označeno, 4 = ozbiljno.
[0220] Rezultati prikazani na slici 12 pokazuju da pojedinačna doza anti-mTNF alfa steroida ADC može da preokrene utvrđenu bolest i smanji oticanje šape na skoro početnu liniju. Nasuprot tome, pojedinačna doza anti-mTNF alfa mAb je imala minimalni efekat na upalu.
[0221] Efekat lečenja na gubitak kostiju tarzusa mereno mCT-om prikazan je na slici 13. Rezultati pokazuju da je pojedinačna doza anti-mTNF alfa steroida ADC primenjena na vrhuncu upale u stanju da značajno inhibira zglobnu kost posredovanu bolešću erozija u poređenju sa samo anti-mTNF alfa mAb.[0222] Rezultati histološke evaluacije zglobova tretiranih CIA miševa prikazani su na slikama 14-17. Oni dem- na osnovu toga da je pojedinačna doza anti-mTNF alfa steroida ADC primenjena u vrhuncu bolesti rezultirala značajnim smanjenjem upale, formiranjem panusa, erozijom kostiju i oštećenjem hrskavice do 21. dana u odnosu na starosne kontrole (p <0,001) i nivoe bolesti bili su ekvivalentni nivoima primećenim u kontrolama na početku (nosač d6). U dve od šest procenjenih šapa nije otkrivena nijedna bolest u zglobovima tarzusa / falangea životinja tretiranih anti-mTNF alfa steroidima ADC 21. dana u poređenju sa 100% incidencije kod miševa 6. dana (pre lečenja) i dana 21 miša tretiran u vozilu.
[0223] Nasuprot tome, pojedinačna doza anti-mTNF alfa mAb na vrhuncu bolesti nije inhibirala zapaljenje, eroziju kostiju, formiranje panusa ili uništavanje hrskavice u odnosu na starosne kontrole nosača na d21. Nivoi bolesti bili su ozbiljniji od osnovnih kontrola i primećen je blagi trend poboljšanja upale.
[0224] Cela krv je analizirana da bi se procenile promene u podskupovima perifernih krvnih ćelija sa lečenjem. Rezultati prikazano na slici 18-23 pokazuju da se povećanje broja populacija ćelija periferne krvi primećeno kod obolelih životinja može rešiti jednom dozom anti-mTNF alfa steroida ADC. Statistički značajno smanjenje ukupnih belih krvnih zrnaca, neutrofila i monocita zabeleženo je lečenjem anti-mTNF alfa steroida ADC.
Primer 89: Poređenje anti-mTNF-alfa steroidnih ADC i anti-CD 163 ADC
[0225] To demonstrate the enhanced therapeutic efficacy of an anti-TNF immunoconjugate in the treatment of inflam-matory disease, we compared its activity to an ADC targeting the hemoglobin scavenger receptor CD163, a glucocorticoid immunoconjugate approach described in the literature to have targeted anti-inflammatory functionality (PCT Int. Appl. WO2011039510A2 by Graversen NJH, et al.; Graversen JH et al., Mol. Ther. 20 (8): 1550-8 (2012)).
Generation of a mouse CD163 GRE report cell line
[0226] A parental cell line was created similar to that described in Example 78 but with CHO-K1 cells instead of K562 cells. The resulting parental cell line CHO pGL4.36[Luc2P/MMTV/Hygro]_PGL4.75[hRLuc/CMV] was then transfected with a plasmid which encodes mouse CD163 (Origene cat.no. MR216798) under conditions described in Example 78. The resulting cell line CHO mCD163 GRE (pGL4.36[luc2P/MMTV/Hygro]) was used to test the in vitro activity of both anti-mTNF-alpha and anti-mouse CD163 immunoconjugates (also referred to as anti-mCD163 immunoconjugates or anti-mCD163 steroid ADC).
Priprema imunokoljugata CD163 protiv miše
[0227] Himerno antitelo protiv miše CD163 mIGg2a / k protiv pacova je generalizovano iz VH i VL sekvence za klon 3E10B10, kao što je opisano (SEK ID NO: 87/88 iz PTC Int. Apl. VO 2011 / 039510A2). Ovo antitelo je sigurno sa Cpd. Br. 99 korišćenja uslova izostavlja u opštem protokolu za kogrukciju cisteina u Primeru 36 da bi se dobio jedan odnos leka: antitela (DAR) od 4.
Aktivnost imunokoauta protiv miše CD163 u testu miše CD163 GRE reporter
[0228] Imunokoljugat CD163 protiv miše testiran je na aktivnost na CHO mcd163 GRE (pGL4.36 [luc2P / MMTV / Higro]) Jelijskoj liniji pod uslovima opisanim u Primeru 79. Anti-MTNF Alfa Steroid No. uključena kao negativna kontrola. Rezultati u tabelama 22 pokazuju antimiši CD163 imunokoljugat (Cpd. Br.223):
pokazuje aktivnost koja zavisi od antigena razdvojena od anti-mTNF alfa steroida ADC na mišjoj CD163 GRE ćelijskoj liniji.
Tabela 22
Aktivnost imunokonjugata CD163 protiv miša u artritisu izazvanom kolagenom miša
[0229] Sposobnost imunokonjugata CD163 protiv miša da utiče na oticanje šape procenjena je u modelu artritisa izazvanog kolagenom (CIA) RA A kontrolnog anti-mTNF alfa steroida ADC (cpd 139) sa istim veznikom leka I DAR kao anti-mCD163 steroidni ADC takođe je procenjen u istoj studiji, a roditeljski mAb za oba ADC takođe su uključeni kao grupe za lečenje. Eksperiment je izveden prema proceduri opisanoj u primeru 85. Rezultati su prikazani na slici 24 i pokazuju da dok anti-mCD163 steroidni ADC u početku smanjuje oticanje šape u prvih nekoliko dana nakon tretmana jednom dozom, ovaj efekat je prolazan. U poređenju sa tim, jedna doza anti-mTNF alfa steroida ADC dovoljna je za potpuno suzbijanje upale tokom trajanja studije.

Claims (4)

  1. Patentni zahtevi 1. Jedinjenje:
    gde je n 2 ili 4, a A je antitelo koje sadrži SEK ID NO: 66 i SEK ID NO: 73 ili adalimumab.
  2. 2. Jedinjenje prema zahtevu 1, naznačeno time, što n je 4.
  3. 3. Jedinjenje prema zahtevu 1, gde n je 2.
  4. 4. Jedinjenje prema zahtevu 2 ili zahtevu 3, naznačeno time, što je A adalimumab.
RS20210802A 2016-06-02 2017-06-01 Agonist receptora glukokortikoida i njegovi imunokonjugati RS62040B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662344948P 2016-06-02 2016-06-02
US201662371134P 2016-08-04 2016-08-04
EP17733222.8A EP3464318B1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
PCT/US2017/035518 WO2017210471A1 (en) 2016-06-02 2017-06-01 Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62040B1 true RS62040B1 (sr) 2021-07-30

Family

ID=59215995

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210802A RS62040B1 (sr) 2016-06-02 2017-06-01 Agonist receptora glukokortikoida i njegovi imunokonjugati

Country Status (36)

Country Link
US (4) US20180126000A1 (sr)
EP (2) EP3901162A1 (sr)
JP (2) JP6843891B2 (sr)
KR (2) KR20220119529A (sr)
CN (1) CN109476699B (sr)
AU (2) AU2017274442B2 (sr)
BR (1) BR112018074922B1 (sr)
CA (1) CA3025377A1 (sr)
CL (1) CL2018003406A1 (sr)
CO (1) CO2018012996A2 (sr)
CR (1) CR20180594A (sr)
CY (1) CY1124293T1 (sr)
DK (1) DK3464318T3 (sr)
DO (1) DOP2018000261A (sr)
EC (1) ECSP18094857A (sr)
ES (1) ES2877548T3 (sr)
HR (1) HRP20210924T1 (sr)
HU (1) HUE054804T2 (sr)
IL (1) IL263214B2 (sr)
LT (1) LT3464318T (sr)
MA (1) MA51586A (sr)
MX (2) MX382216B (sr)
MY (1) MY194619A (sr)
PE (1) PE20190622A1 (sr)
PH (1) PH12018502539A1 (sr)
PL (1) PL3464318T3 (sr)
PT (1) PT3464318T (sr)
RS (1) RS62040B1 (sr)
RU (1) RU2745748C2 (sr)
SG (2) SG10202001787QA (sr)
SI (1) SI3464318T1 (sr)
TW (1) TWI728118B (sr)
UA (1) UA124703C2 (sr)
UY (1) UY37269A (sr)
WO (1) WO2017210471A1 (sr)
ZA (1) ZA201808623B (sr)

Families Citing this family (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20180126000A1 (en) * 2016-06-02 2018-05-10 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
ES3046537T3 (en) 2016-11-08 2025-12-02 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof
KR20200007905A (ko) 2017-05-18 2020-01-22 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 사이클로덱스트린 단백질 약물 접합체
MX2020004691A (es) 2017-11-07 2020-08-20 Regeneron Pharma Enlazadores hidrofilicos para conjugados anticuerpo-farmaco.
WO2019106608A1 (en) * 2017-12-01 2019-06-06 Abbvie Inc. Anti-cd40 antibody drug conjugates
BR112020010694A2 (pt) * 2017-12-01 2020-11-10 Abbvie Inc. agonista de receptor de glicocorticoides e imunoconjugados do mesmo
SG11202006510XA (en) * 2018-01-08 2020-08-28 Regeneron Pharma Steroids and antibody-conjugates thereof
CN110357959B (zh) * 2018-04-10 2023-02-28 鸿运华宁（杭州）生物医药有限公司 Gcgr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
CN118955710A (zh) 2018-05-09 2024-11-15 里珍纳龙药品有限公司 抗msr1抗体及其使用方法
BR112021013464A2 (pt) * 2019-01-08 2021-09-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Ligantes sem traço e conjugados de proteína dos mesmos
US20220389092A1 (en) * 2019-04-05 2022-12-08 The Regents Of The University Of California Methods and compositions involving chimeric binding polypeptides
WO2021161263A1 (en) * 2020-02-13 2021-08-19 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
EP4136118A4 (en) * 2020-04-22 2024-10-09 Immunext, Inc. ANTI-HUMAN VISTA ANTIBODIES AND USE THEREOF
US20230398233A1 (en) 2020-11-03 2023-12-14 Ads Therapeutics Llc Ocular antibody-drug conjugates
WO2022135332A1 (zh) * 2020-12-21 2022-06-30 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体偶联物
AU2022205664A1 (en) * 2021-01-07 2023-08-17 Immunext, Inc. NOVEL STEROID PAYLOADS, STEROID LINKERS, ADCs CONTAINING AND USE THEREOF
CA3207416A1 (en) 2021-02-04 2022-08-11 Lingjian ZHU Drug conjugate of glucocorticoid receptor agonist, and application thereof in medicine
WO2022171101A1 (zh) * 2021-02-10 2022-08-18 映恩生物制药（苏州）有限公司 一种甾体偶联物
TWI899455B (zh) 2021-03-23 2025-10-01 美商美國禮來大藥廠 糖皮質素受體激動劑
AR125084A1 (es) 2021-03-23 2023-06-07 Lilly Co Eli Agonistas del receptor de glucocorticoides novedosos
CN117043172A (zh) * 2021-03-23 2023-11-10 伊莱利利公司 糖皮质激素受体激动剂
AR125079A1 (es) 2021-03-23 2023-06-07 Lilly Co Eli Agonistas de receptores de glucocorticoides sustituidos con carboxi
CN117580849A (zh) * 2021-06-24 2024-02-20 江苏先声药业有限公司 甾体类化合物、其药物组合物及其应用
AU2022306974A1 (en) * 2021-07-09 2024-01-04 Bright Peak Therapeutics Ag Modified il-2 polypeptides for treatment of inflammatory and autoimmune diseases
CN120463762A (zh) * 2021-08-26 2025-08-12 映恩生物科技(上海)有限公司 一种甾体化合物及其缀合物
US20250179114A1 (en) * 2021-09-14 2025-06-05 Duality Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Anti-Inflammatory Compound and Use Thereof
US20250154242A1 (en) 2021-11-18 2025-05-15 Adafre Biosciences, Llc Anti-tnf-alpha antibodies and compositions
MX2024009080A (es) 2022-01-29 2024-07-30 Shanghai Shengdi Pharmaceutical Co Ltd Conjugado farmacologico de glucocorticoide.
WO2023186072A1 (zh) * 2022-04-01 2023-10-05 江苏先声药业有限公司 配体-药物偶联物及其用途
CA3253295A1 (en) 2022-05-13 2023-11-16 Eli Lilly And Company HUMAN ALPHA-GLUCOCORTICOID ANTIBODY ANTIBODY AGAINST TUMOR NECROSIS FACTOR
WO2023235738A1 (en) 2022-06-02 2023-12-07 Eli Lilly And Company Human interleukin-4 receptor alpha antibody glucocorticoid conjugates
KR102835682B1 (ko) 2022-06-16 2025-07-22 애브비 바이오테라퓨틱스 인크. 항-cd19 항체-약물 접합체
US20240173425A1 (en) 2022-06-22 2024-05-30 Eli Lilly And Company Human cd33 antibodies and glucocorticoid conjugates
JP2025526279A (ja) 2022-06-28 2025-08-13 アダフレ・バイオサイエンシーズ・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー 抗ＴＮＦα抗体および組成物
CN120239705A (zh) 2022-07-21 2025-07-01 萤火虫生物股份有限公司 糖皮质激素受体激动剂和其缀合物
JP2025532110A (ja) 2022-09-22 2025-09-29 イーライ リリー アンド カンパニー グルココルチコイド受容体アゴニスト
CN118236514B (zh) * 2022-12-24 2025-10-31 津药生物科技（天津）有限公司 抗体-糖皮质激素偶联物及其用途
JP2026502000A (ja) * 2022-12-28 2026-01-20 デュアリティ・バイオロジクス（シャンハイ）カンパニー・リミテッド 抗ｂｄｃａ２抗体－薬物コンジュゲートおよびその使用
TW202430226A (zh) * 2022-12-28 2024-08-01 大陸商上海盛迪醫藥有限公司 抗cd40抗體藥物偶聯物、其製備方法及其醫藥用途
EP4644417A4 (en) * 2022-12-30 2026-02-11 Abclon Inc AFFICORPS SPECIFICALLY BINDING TO CD137 AND ITS USE
TW202444433A (zh) * 2023-04-26 2024-11-16 大陸商上海邁晉生物醫藥科技有限公司 一種含有糖皮質激素受體激動劑的藥物偶聯物的醫藥組成物
CN121568722A (zh) 2023-07-28 2026-02-24 江苏恒瑞医药股份有限公司 一种含有糖皮质激素的抗体药物偶联物的药物组合物
WO2025078841A2 (en) 2023-10-11 2025-04-17 Antikor Biopharma Limited Antibodies, conjugates, and uses thereof
WO2026051856A1 (zh) * 2024-09-06 2026-03-12 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 糖皮质激素受体激动剂及其偶联物

Family Cites Families (164)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3126375A (en) 1964-03-24 Chioacyl
BE585432A (fr) 1958-12-08 1960-06-08 American Cyanamid Co Stéroïdes fluorés.
IT1057859B (it) 1972-04-28 1982-03-30 Sigma Tao Ind Farmaceutiche Sp Perivato del triamoinolone
US4588585A (en) 1982-10-19 1986-05-13 Cetus Corporation Human recombinant cysteine depleted interferon-β muteins
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US6492107B1 (en) 1986-11-20 2002-12-10 Stuart Kauffman Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
DE229046T1 (de) 1985-03-30 1987-12-17 Marc Genf/Geneve Ballivet Verfahren zum erhalten von dns, rns, peptiden, polypeptiden oder proteinen durch dns-rekombinant-verfahren.
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
DE3600905A1 (de) 1986-01-15 1987-07-16 Ant Nachrichtentech Verfahren zum dekodieren von binaersignalen sowie viterbi-dekoder und anwendungen
US5681718A (en) 1986-03-14 1997-10-28 Celltech Limited Methods for enhanced production of tissue plasminogen activator in cell culture using alkanoic acids or salts thereof
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
ATE106249T1 (de) 1987-11-05 1994-06-15 Hybritech Inc Polysaccharidmodifizierte immunglobuline mit reduziertem immunogenem potential oder verbesserter pharmakokinetik.
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5010176A (en) 1988-11-10 1991-04-23 Eli Lilly And Company Antibody-drug conjugates
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
CA2016842A1 (en) 1989-05-16 1990-11-16 Richard A. Lerner Method for tapping the immunological repertoire
AU652539B2 (en) 1989-05-16 1994-09-01 Medical Research Council Co-expression of heteromeric receptors
CA2016841C (en) 1989-05-16 1999-09-21 William D. Huse A method for producing polymers having a preselected activity
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
ATE158021T1 (de) 1990-08-29 1997-09-15 Genpharm Int Produktion und nützung nicht-menschliche transgentiere zur produktion heterologe antikörper
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
GB9109645D0 (en) 1991-05-03 1991-06-26 Celltech Ltd Recombinant antibodies
US6284471B1 (en) 1991-03-18 2001-09-04 New York University Medical Center Anti-TNFa antibodies and assays employing anti-TNFa antibodies
US7192584B2 (en) 1991-03-18 2007-03-20 Centocor, Inc. Methods of treating psoriasis with anti-TNF antibodies
US5656272A (en) 1991-03-18 1997-08-12 New York University Medical Center Methods of treating TNF-α-mediated Crohn's disease using chimeric anti-TNF antibodies
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
EP0571613B1 (en) 1991-12-13 2003-09-17 Xoma Corporation Methods and materials for preparation of modified antibody variable domains and therapeutic uses thereof
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0701565T3 (da) 1993-04-02 1999-07-12 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Nye prednisolonderivater
WO1994025478A1 (en) 1993-04-29 1994-11-10 Instytut Farmaceutyczny 16α,17α-ACETAL GLUCOCORTICOSTEROIDAL DERIVATIVES
ATE198074T1 (de) 1994-03-09 2000-12-15 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Neue silylverbindungen und ihre verwendung
JP2749778B2 (ja) 1994-09-05 1998-05-13 日清食品株式会社 トリアムシノロン誘導体
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US7264963B1 (en) 1995-08-18 2007-09-04 Morphosys Ag Protein(poly)peptide libraries
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US6090382A (en) 1996-02-09 2000-07-18 Basf Aktiengesellschaft Human antibodies that bind human TNFα
US5792758A (en) 1995-12-08 1998-08-11 G. D. Searle & Co. Steroid nitrite ester derivatives useful as anti-inflammatory drugs
MX336813B (es) 1996-02-09 2016-02-02 Abbvie Biotechnology Ltd Anticuerpos humanos que ligan el tnfa humano.
US5714352A (en) 1996-03-20 1998-02-03 Xenotech Incorporated Directed switch-mediated DNA recombination
US5824669A (en) 1996-03-22 1998-10-20 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated compounds and compositions and their use for treating respiratory disorders
DE19635498A1 (de) 1996-09-03 1998-03-26 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Verfahren zur Epimerenanreicherung
WO2000049993A2 (en) 1999-02-24 2000-08-31 Nitromed, Inc. Nitrosated and nitrosylated steroids for the treatment of cardiovascular diseases and disorders
US8383081B2 (en) 1999-05-10 2013-02-26 Immunomedics, Inc. Anti-CD74 immunoconjugates and methods of use
WO2001002588A2 (en) 1999-07-02 2001-01-11 Morphosys Ag Generation of specific binding partners binding to (poly)peptides encoded by genomic dna fragments or ests
GB0013810D0 (en) 2000-06-06 2000-07-26 Celltech Chiroscience Ltd Biological products
ES2351184T3 (es) 2000-11-10 2011-02-01 Nycomed Gmbh Procedimiento para la producción de 16,17-[(ciclohexilmetilen)bis(oxil)]-11,21-dihidroxi-pregna-1,4-dien-3,20-diona o su 21-isobutirato mediante transcetalización.
DE10055820C1 (de) 2000-11-10 2002-07-25 Byk Gulden Lomberg Chem Fab Verfahren zur Herstellung eines Glucocorticoids
CA2817619A1 (en) 2001-06-08 2002-12-08 Abbott Laboratories (Bermuda) Ltd. Methods of administering anti-tnf.alpha. antibodies
US7595378B2 (en) 2001-06-13 2009-09-29 Genmab A/S Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor (EGFR)
US20060073141A1 (en) 2001-06-28 2006-04-06 Domantis Limited Compositions and methods for treating inflammatory disorders
MXPA05000511A (es) 2001-07-12 2005-09-30 Jefferson Foote Anticuepros super humanizados.
US7091186B2 (en) 2001-09-24 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. p-Amidobenzylethers in drug delivery agents
ES2411007T3 (es) 2001-10-10 2013-07-04 Novo Nordisk A/S Remodelación y glicoconjugación de péptidos
ATE469176T1 (de) 2001-11-12 2010-06-15 Merck Patent Gmbh Modifizierter anti-tnf antikörper
US7538195B2 (en) 2002-06-14 2009-05-26 Immunogen Inc. Anti-IGF-I receptor antibody
GB0216648D0 (en) 2002-07-18 2002-08-28 Lonza Biologics Plc Method of expressing recombinant protein in CHO cells
EP1562627A4 (en) 2002-08-23 2006-11-02 Mclean Hospital Corp CORTICOSTEROID CONJUGATES AND ITS USES
MY150740A (en) 2002-10-24 2014-02-28 Abbvie Biotechnology Ltd Low dose methods for treating disorders in which tnf? activity is detrimental
AU2003301516A1 (en) 2002-10-24 2004-05-13 Goldstein, Jay A Antifungal formulations
ZA200503075B (en) 2002-11-07 2006-09-27 Immunogen Inc Anti-CD33 antibodies and method for treatment of acute myeloid leukemia using the same
EP1569925A1 (en) 2002-12-13 2005-09-07 Neurogen Corporation 2-substituted quinazolin-4-ylamine analogues as capsaicin receptor modulators
AU2004207003A1 (en) 2003-01-30 2004-08-12 Medimmune, Llc Anti-integrin alphanubeta3 antibody formulations and uses thereof
MY143936A (en) 2003-03-27 2011-07-29 Nycomed Gmbh Process for preparing crystalline ciclesonide with defined particle size
WO2005044759A2 (en) 2003-08-14 2005-05-19 Sun Pharmaceutical Industries Limited Acetalization process for preparation of steroid compounds
PT1670482E (pt) 2003-09-16 2014-03-12 Takeda Gmbh Utilização de ciclesonida para o tratamento de doenças respiratórias
WO2005028495A1 (en) 2003-09-24 2005-03-31 Glaxo Group Limited Anti-inflammatory glucocorticoids
CA2542834C (en) 2003-10-21 2012-04-24 Igf Oncology, Llc Conjugates or co-administration of igf-1 receptor ligands with anti-cancer chemotherapeutic agents
RU2348632C2 (ru) 2003-11-13 2009-03-10 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Гидроксиалкилзамещенные пиридо-7-пиримидин-7-оны
WO2005063761A1 (en) 2003-12-19 2005-07-14 Bristol-Myers Squibb Company Azabicyclic heterocycles as cannabinoid receptor modulators
WO2005063777A1 (en) 2003-12-23 2005-07-14 Corus Pharma Benzylphosphate and substituted benzylphosphate prodrugs for the treatment of pulmonary inflammation
AU2004311478A1 (en) 2003-12-31 2005-07-21 Cydex Pharmaceuticals, Inc. Inhalant formulation containing sulfoalkyl ether cyclodextrin and corticosteroid
GB0402797D0 (en) 2004-02-09 2004-03-10 Novartis Ag Organic compounds
JP4942643B2 (ja) 2004-03-02 2012-05-30 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 部分的に付加された抗体およびそれらの結合体化方法
US20080187954A1 (en) 2004-03-10 2008-08-07 Lonza Ltd. Method For Producing Antibodies
EP2471813B1 (en) 2004-07-15 2014-12-31 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
CA2581208A1 (en) 2004-08-30 2006-03-09 Lonza Biologics Plc. Affinity- plus ion exchange- chromatography for purifying antibodies
WO2006026759A2 (en) 2004-09-03 2006-03-09 Genentech, Inc. Humanized anti-beta7 antagonists and uses therefor
CA2579007A1 (en) 2004-09-10 2006-03-16 Altana Pharma Ag Ciclesonide and syk inhibitor combination and methods of use thereof
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
JP2008521828A (ja) 2004-11-29 2008-06-26 シアトル ジェネティックス， インコーポレイテッド 操作された抗体およびイムノコンジュゲート
WO2006097458A1 (en) 2005-03-15 2006-09-21 Nycomed Gmbh Novel combination
WO2006110593A2 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Macrogenics, Inc. Biological targets for the diagnosis, treatment and prevention of cancer
EP1712220A1 (en) 2005-04-15 2006-10-18 PARI GmbH Spezialisten für effektive Inhalation Pharmaceutical aerosol composition
WO2006135479A2 (en) 2005-05-10 2006-12-21 Angiotech International Ag Anti-scarring agents, therapeutic compositions, and use thereof
WO2006138212A1 (en) 2005-06-14 2006-12-28 Gilead Sciences, Inc. SUBSTITUTED PHENYLPHOSPHATES AS MUTUAL PRODRUGS OF STEROIDS AND β -AGONISTS FOR THE TREATMENT OF PULMONARY INFLAMMATION AND BRONCHOCONSTRICTION
DK1912677T3 (da) 2005-06-20 2014-01-13 Psma Dev Company L L C PSMA-antistof-lægemiddel-konjugater
WO2007054974A2 (en) 2005-09-28 2007-05-18 Arch Pharmalab Limited A green chemistry process for the preparation of pregnadiene esters
WO2007117685A2 (en) 2006-04-07 2007-10-18 Nektar Therapeutics Al, Corporation Conjugates of an anti-tnf-alpha antibody
WO2008015696A2 (en) 2006-05-23 2008-02-07 Cadila Healthcare Limited Process for preparing ciclesonide
EP2032606B1 (en) 2006-05-30 2013-11-27 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
CA2663737A1 (en) 2006-09-19 2008-03-27 Cipla Limited Processes for the preparation of ciclesonide and its crystal form
WO2008052350A1 (en) 2006-11-03 2008-05-08 Qlt Inc. Photodynamic therapy for the treatment of hidradenitis suppurativa
US7691980B2 (en) 2007-01-09 2010-04-06 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced capacity and purification of antibodies by mixed mode chromatography in the presence of aqueous-soluble nonionic organic polymers
NO331891B1 (no) 2007-03-20 2012-04-30 Clavis Pharma Asa Kjemiske forbindelser, et farmasoytisk preparat inneholdende slike forbindelser, samt anvendelse derav for behandling av kreft, inflammasjon og KOLS
UA100120C2 (en) 2007-04-03 2012-11-26 Анадис Фармасьютикалз, Инк. 5,6-dihydro-1h-pyridin-2-one compounds
CN106038481A (zh) 2007-06-28 2016-10-26 锡德克斯药物公司 皮质类固醇水溶液的鼻部和眼部给药
JP4686650B2 (ja) * 2007-11-30 2011-05-25 ファイザー・リミテッド 新規なグルココルチコイド受容体アゴニスト
EP2235035A2 (en) 2007-12-21 2010-10-06 Schering Corporation C-21 thioethers as glucocorticoid receptor agonists
WO2009085879A2 (en) 2007-12-21 2009-07-09 Schering Corporation C20-c21 substituted glucocorticoid receptor agonists
EP2238154B1 (en) 2008-01-18 2015-09-16 Bio-Rad Laboratories, Inc. Enhanced purification of phosphorylated and non-phosphorylated biomolecules by apatite chromatography
WO2009108118A1 (en) 2008-02-27 2009-09-03 Astrazeneca Ab 16 alpha, 17 alpa-acetal glucocorticosteroidal derivatives and their use
JP5470817B2 (ja) 2008-03-10 2014-04-16 日産自動車株式会社 電池用電極およびこれを用いた電池、並びにその製造方法
JP2011513469A (ja) 2008-03-13 2011-04-28 ファルマビオス ソシエタ ペル アチオニ プレグナン誘導体の製造法
TW201010707A (en) 2008-06-10 2010-03-16 Gilead Sciences Inc Corticosteroid linked beta-agonist compounds for use in therapy
CA2727278A1 (en) 2008-06-16 2010-01-21 Immunogen, Inc. Novel synergistic effects
CN102076670B (zh) 2008-06-24 2013-05-22 Irm责任有限公司 调节g蛋白偶联受体的化合物和方法
WO2010054158A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Auspex Pharmaceuticals, Inc. Steroid modulators of glucocorticoid receptor
RU2011127198A (ru) 2008-12-04 2013-01-10 Эбботт Лэборетриз Иммуноглобулины с двойными вариабельными доменами и их применение
DK2786762T3 (da) 2008-12-19 2019-05-06 Macrogenics Inc Kovalente diabodies og anvendelser deraf
WO2010075249A2 (en) 2008-12-22 2010-07-01 Genentech, Inc. A method for treating rheumatoid arthritis with b-cell antagonists
WO2010104187A1 (ja) 2009-03-09 2010-09-16 三笠製薬株式会社 ステロイド化合物
WO2010126953A1 (en) 2009-04-29 2010-11-04 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid linked beta-agonist compounds for use in therapy
WO2010132743A1 (en) 2009-05-15 2010-11-18 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid beta-agonist compounds for use in therapy
CA2760284A1 (en) 2009-05-29 2010-12-02 Pfizer Limited Novel glucocorticoid receptor agonists
GB0917044D0 (en) 2009-09-29 2009-11-18 Cytoguide As Agents, uses and methods
CN102770456B (zh) 2009-12-04 2018-04-06 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法
CN102665757A (zh) 2009-12-09 2012-09-12 免疫医疗公司 通过双特异性抗体预靶向的用于细胞毒性药物的递送系统
WO2011081937A1 (en) 2009-12-15 2011-07-07 Gilead Sciences, Inc. Corticosteroid-beta-agonist-muscarinic antagonist compounds for use in therapy
CN102167741B (zh) 2010-02-25 2014-05-14 上海百迈博制药有限公司 一种全人源抗TNF-α单克隆抗体、其制备方法及用途
KR20130010123A (ko) 2010-04-07 2013-01-25 아비에 인코포레이티드 ＴＮＦ-α 결합 단백질
KR101860963B1 (ko) 2010-04-23 2018-05-24 제넨테크, 인크. 이종다량체 단백질의 생산
US20110300150A1 (en) 2010-05-18 2011-12-08 Scott Eliasof Compositions and methods for treatment of autoimmune and other disease
EP2575884B1 (en) 2010-06-03 2018-07-18 AbbVie Biotechnology Ltd Uses and compositions for treatment of hidradenitis suppurativa (hs)
CA2803392A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 Abbvie Inc. Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof
EP2618818A4 (en) 2010-09-22 2014-10-29 Map Pharmaceuticals Inc CORTICOSTEROID PARTICLES AND METHOD FOR PRODUCING THE SAME
AR084210A1 (es) 2010-12-08 2013-05-02 Abbott Lab PROTEINAS DE UNION AL TNF-a
WO2012082947A1 (en) 2010-12-16 2012-06-21 Irm Llc Compounds and compositions as tgr5 agonists
WO2012089247A1 (en) 2010-12-29 2012-07-05 Nokia Siemens Networks Oy A method and apparatus for transmitting an identity
MX361242B (es) 2011-03-30 2018-11-30 Ablynx Nv Anticuerpos de dominio sencillo contra tnf-alfa y usos de los mismos.
JP5827511B2 (ja) 2011-07-25 2015-12-02 新日鉄住金エンジニアリング株式会社 石炭ガスの製造方法およびメタンの製造方法
PE20141545A1 (es) 2011-10-24 2014-11-26 Abbvie Inc Inmunoenlazadores dirigidos contra el tnf
RU2014121043A (ru) 2011-10-24 2015-12-10 Эббви Инк. Биспецифические иммуносвязывающие средства, направленные против tnf и il-17
US20130115269A1 (en) 2011-11-04 2013-05-09 Henry John Smith Anti-tumor necrosis factor alpha (TNF-a) antibody used as a targeting agent to treat arthritis and other diseases
EP2791170A1 (en) 2011-12-16 2014-10-22 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compounds and methods for treating inflammatory diseases
US9109005B2 (en) 2012-02-23 2015-08-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for manufacturing of ciclesonide
EP2641900A1 (en) 2012-03-20 2013-09-25 Almirall, S.A. Novel polymorphic Crystal forms of 5-(2-{[6-(2,2-difluoro-2-phenylethoxy) hexyl]amino}-1-(R)-hydroxyethyl)-8-hydroxyquinolin-2(1h)-one, heminapadisylate as agonist of the ß2 adrenergic receptor.
CN103421075B (zh) 2012-05-16 2017-07-28 上海特化医药科技有限公司 孕烷衍生物16,17‑缩醛(酮)的制备方法
EP2855745A4 (en) 2012-06-01 2016-01-20 Momenta Pharmaceuticals Inc METHODS RELATING TO ADALIMUM AB
CN104854133B (zh) 2012-10-12 2018-10-30 新加坡科技研究局 用于制备重组抗体治疗剂的最佳重链和轻链信号肽
CA2891280C (en) 2012-11-24 2018-03-20 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Hydrophilic linkers and their uses for conjugation of drugs to cell binding molecules
WO2015012904A2 (en) 2012-12-13 2015-01-29 Immunomedics, Inc. Antibody-sn-38 immunoconjugates with a cl2a linker
LT3473255T (lt) 2012-12-21 2022-03-10 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Farmacinė vaisto forma, apimanti ciklezonidą
JP6136279B2 (ja) 2013-01-15 2017-05-31 株式会社ジェイテクト 転がり軸受装置
AU2014239972A1 (en) * 2013-03-15 2015-10-08 Abbvie, Inc. Improved TNF binding proteins
TWI503850B (zh) 2013-03-22 2015-10-11 Polytronics Technology Corp 過電流保護元件
JP6444979B2 (ja) * 2013-03-27 2018-12-26 オーエルイーディーワークス ゲーエムベーハーＯＬＥＤＷｏｒｋｓ ＧｍｂＨ 改良型有機発光ダイオード（ｏｌｅｄ）の光源
WO2015047510A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Immunomedics, Inc. Anti-trop-2 antibody-drug conjugates and uses thereof
TWI510996B (zh) 2013-10-03 2015-12-01 Acer Inc 控制觸控面板的方法以及使用該方法的可攜式電腦
US20150139988A1 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
US10464955B2 (en) 2014-02-28 2019-11-05 Hangzhou Dac Biotech Co., Ltd. Charged linkers and their uses for conjugation
US10550190B2 (en) * 2014-04-04 2020-02-04 Merck Sharp & Dohme Corp. Phosphate based linkers for intracellular delivery of drug conjugates
CA2948013A1 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Immunomedics, Inc. Antibodies reactive with an epitope located in the n-terminal region of muc5ac comprising cysteine-rich subdomain 2 (cys2)
WO2016042163A2 (en) 2014-09-19 2016-03-24 Medterials, Inc. Ophthalmic drug compositions
EP3250211B1 (en) 2015-01-30 2021-12-22 Coral Drugs Pvt. Ltd. Novel process for preparation of glucocorticoid steroids
JP2016190798A (ja) 2015-03-31 2016-11-10 三笠製薬株式会社 アレルギー性鼻炎治療用局所点鼻薬
JP2017066075A (ja) 2015-09-30 2017-04-06 三笠製薬株式会社 リウマチ治療薬
US20180126000A1 (en) * 2016-06-02 2018-05-10 Abbvie Inc. Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US9816280B1 (en) 2016-11-02 2017-11-14 Matthew Reitnauer Portable floor
ES3046537T3 (en) 2016-11-08 2025-12-02 Regeneron Pharma Steroids and protein-conjugates thereof

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018074922B1 (pt) 2022-10-25
DOP2018000261A (es) 2018-12-31
ZA201808623B (en) 2019-08-28
LT3464318T (lt) 2021-06-25
ECSP18094857A (es) 2019-01-31
PL3464318T3 (pl) 2021-11-08
BR112018074922A2 (pt) 2019-03-12
MX2018014927A (es) 2019-04-09
RU2745748C2 (ru) 2021-03-31
DK3464318T3 (da) 2021-06-28
US20200338208A1 (en) 2020-10-29
UY37269A (es) 2018-01-02
TWI728118B (zh) 2021-05-21
MA51586A (fr) 2019-04-10
ES2877548T3 (es) 2021-11-17
PH12018502539A1 (en) 2019-09-30
US10668167B2 (en) 2020-06-02
CR20180594A (es) 2019-07-29
KR102435599B1 (ko) 2022-08-29
US20190262465A1 (en) 2019-08-29
WO2017210471A1 (en) 2017-12-07
KR20190014542A (ko) 2019-02-12
IL263214B2 (en) 2023-06-01
AU2021269433A1 (en) 2021-12-16
PE20190622A1 (es) 2019-04-26
CO2018012996A2 (es) 2019-01-18
EP3901162A1 (en) 2021-10-27
CN109476699A (zh) 2019-03-15
RU2018145728A3 (sr) 2020-08-04
MX382216B (es) 2025-03-13
UA124703C2 (uk) 2021-11-03
CN109476699B (zh) 2021-10-12
AU2017274442B2 (en) 2021-08-19
JP2019524645A (ja) 2019-09-05
CL2018003406A1 (es) 2019-02-15
HRP20210924T1 (hr) 2021-09-03
KR20220119529A (ko) 2022-08-29
US20220354959A1 (en) 2022-11-10
JP2021088582A (ja) 2021-06-10
JP6843891B2 (ja) 2021-03-17
SG10202001787QA (en) 2020-04-29
CA3025377A1 (en) 2017-12-07
MX2020012562A (es) 2021-02-09
RU2018145728A (ru) 2020-07-10
SI3464318T1 (sl) 2021-07-30
TW201801749A (zh) 2018-01-16
US20180126000A1 (en) 2018-05-10
IL263214A (en) 2018-12-31
CY1124293T1 (el) 2022-07-22
SG11201810678WA (en) 2018-12-28
PT3464318T (pt) 2021-07-02
AU2017274442A1 (en) 2018-12-13
MY194619A (en) 2022-12-07
EP3464318B1 (en) 2021-04-21
EP3464318A1 (en) 2019-04-10
HUE054804T2 (hu) 2021-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3464318B1 (en) Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
JP6263467B2 (ja) Ｂｃｍａ（ｃｄ２６９／ｔｎｆｒｓｆ１７）結合タンパク質
TW202308699A (zh) Ｃｄ７０結合劑、其結合物及其使用方法
KR20240162575A (ko) 엽산 수용체 알파를 표적화하는 항체-약물 접합체 및 사용 방법
TW202304524A (zh) Folr1結合劑、其結合物及使用方法
EP4366779A1 (en) Modified tnf-antibodies and uses thereof
HK40007089A (en) Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
HK40007089B (en) Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof
US12478689B2 (en) Anti-CD19 antibody drug conjugates
KR20250089528A (ko) 신규한 napi2b 항체를 함유하는 신규한 항체 약물 접합체, 치료 방법 및 이의 용도
KR20250090330A (ko) 신규한 항-tpbg 항체 및 이를 기반으로 한 항체-약물-접합체, 치료 방법 및 이의 용도
HK40104647A (zh) Cd70结合剂、其偶联物及其使用方法
HK40105064A (zh) Folr1结合剂、其偶联物及其使用方法
NZ788703A (en) Glucocorticoid receptor agonist and immunoconjugates thereof