RS62090B1 - Cu1 soj za lečenje i/ili prevenciju hroničnog inflamatornog reumatizma - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak je u polju inflamatornih bolesti. Naročito se odnosi na upotrebu probiotičkog soja za lečenje i / ili prevenciju hroničnih inflamatornih bolesti, naročito hroničnog inflamatornog reumatizma.

STANJE TEHNIKE

[0002] Zapaljenje je odbrambeni mehanizam organizma kao odgovor na endogenu ili egzogenu agresiju na ljudsko telo. Fizički, hemijski ili zarazni uzroci mogu biti izvor egzogenih agenasa upale. Uzroci metabolizma, problemi sa vaskularizacijom ili abnormalni imunolo ški odgovor mogu biti izvor endogenih agenasa upale. U prisustvu jednog od ovih sredstava, mehanizam upale reagovać e nizom uzastopnih koraka:

- vaskulo-eksudativna reakcija sa aktivnom zagušenošć u, inflamatornim edemom i iscrpljivanjem leukocita,

-ć elijska reakcija koja se sastoji od stvaranja upalnog granuloma,

-deterzija i popravka i zarastanje povređenog područja.

[0003] Međutim, zapaljenje ponekad može biti štetno, zbog postojanosti patogena ili endogenog agensa, kao što je autoimunitet kod reumatoidnog artritisa. Tada ć e se šteta naneta telu i dalje razvijati što dovodi do nekontrolisanog imunološkog odgovora i hronične upale sa uništavanjem tkiva kao što je vezivno tkivo.

[0004] Reumatoidni artritis je hronična inflamatorna autoimuna bolest koja simetrično pogađa zglobove i rezultuje bolom, oticanjem i ukočenošć u zglobova nakon buđenja. Kaže se da je progresivan, jer u već ini slučajeva napreduje upalnim napadima prošaranim sa 30 više ili manje dugih perioda smirenja.

[0005] Može se javiti i u drugim tkivima i ove vanzglobne manifestacije mogu biti opasne po život.

[0006] Reumatoidni artritis pogađa oko 1% populacije, pretežno žene, tri slučaja naspram jednog kod muškaraca, znajuć i da se incidencija pove ć ava sa godinama.

[0007] Prvi simptomi se javljaju u malim zglobovima prstiju ili stopala. Vremenom, hronična upala dovodi do uništavanja kostiju i hrskavice i progresivnog invaliditeta. Ako zapaljenje potraje, mo že da uništi hrskavicu, okolno koštano tkivo, tetive i periartikularne ligamente. Tako, bolest često dovodi do deformiteta zglobova i invaliditeta.

[0008] Reumatoidni artritis se karakteriše naročito upalom sinovijalne membrane zglobova što dovodi do abnormalne infiltracije inflamatornih ć elija u sinovijalnu te čnost.

[0009] U početku postoji abnormalna proliferacija krvnih sudova što omoguć ava priliv proinflamatornih ć elija (limfociti uključuju ć i CD4, monocite, polinukleare, neutrofile) u sinovijum i intraartikularni prostor.

[0010] Hiperplazija sinovijalnih fibroblasta i infiltracija limfocita (T, CD4 i B) i makrofaga rezultirali su formiranjem sinovijalnog panusa, što se prevodi u zapaljenje sinovijalne membrane, koja se takođe naziva sinovitis. Ove različite ć elije se nenormalno razmnožavaju, napadaju kosti i hrskavicu, proizvode velike količine pro-inflamatornih citokina i metaloproteinaza i pokreć u stvaranje i aktivaciju osteoklasta. Proinflamatorni citokini kojih ima posebno u izobilju su: TNF-(faktor nekroze tumora), IL-1, IL-6, IL-12 i IL17, a termin IL označava interleukin.

[0011] Uništavanje zglobova je sekundarno u odnosu na eroziju kostiju i degeneraciju hrskavice. Eroziju promoviše citokin RANKL, dok hondrolizu enzim metaloproteinaza. Ova dva molekula proizvodeć elije koje čine sinovijum pod dejstvom TNF- i IL-1.

[0012] Ć elije ć e zatim pokušati da se suprotstave ovoj degradaciji, ali osteoklasti čija je uloga da proizvode kosti, proizvešć e je na anarhičan način, proizvode ć i tako deformaciju i okoštavanje zglobova.

[0013] Lečenje reumatoidnog artritisa treba započeti što je pre moguć e nakon otkri ć a bolesti radi suzbijanja zapaljenog procesa kako bi se sprečilo ošteć enje i deformacija zglobova.

[0014] Tradicionalni tretmani sastoje se od antiinflamatornih lekova za suzbijanje upale zglobova i proizvodnju citokina. Takođe se koriste imunološki modulirajuć i lekovi za imuni sistem.

[0015] Trenutne nove terapije uključuju agense za blokiranje TNF- ili IL-1 kao što su Etanercept, Inflikimab, Adalimumab, Certolizumab pegol

[0016] Odgovori na lečenje se razlikuju među pojedincima i u različitim fazama bolesti. Kao rezultat, potraga za alternativnim tretmanima je važna kako bi se pružila nova rešenja za pacijente otporne na postojeć e tretmane

[0017] Pored toga, lečenje reumatoidnog artritisa ima visoke troškove za društvo zbog veoma skupih antiinflamatornih tretmana i invaliditeta pacijenta koji mogu proisteć i iz njih. Zapravo, tretmani inflamatatornih bolesti se mora davati dugoročno da bi se postigli rezultati, tj. da bi se zaustavilo napredovanje bolesti, zapaljenje, stabilizovala i održavala bolest u stanju remisije.

[0018] Slično tome, produžena upotreba antiinflamatornih lekova od strane pacijenta mo že imati negativne efekte kao što su debljanje, gastrointestinalni poremeć aji i / ili pove ć ani rizici od osteoporoze i hipertenzije.

[0019] U tom pogledu, probiotici mogu biti zanimljiva alternativa.

[0020] Termin "probiotik" koristi se za definisanje živih mikroorganizama koji, kada se integrišu u dovoljnu količinu, vrše pozitivan efekat na zdravlje, udobnost i blagostanje, mimo tradicionalnih hranljivih efekata

[0021] Dokument WO 2007/133188 opisuje upotrebu antimikotične bakterijske kompozicije koja sadrži najmanje jednu bakteriju odabranu iz Bacillus subtilis, Bacillus coagulans i Enterococcus faecalis, za podsticanje antifungalnog odgovora i za lečenje širokog spektra stanja, u rasponu od autizma do vaginalne infekcije, do endometrioze, a među kojima se navodi i reumatoidni artritis. Ovaj dokument ne opisuje određene sojeve bakterija koji se mogu koristiti u antimikotičnom sastavu.

[0022] Dokument WO 2007/064741 opisuje upotrebu soja Bacillus subtilis, PB6, za lečenje i / ili prevenciju dijareje usled antibiotske terapije, infekcija digestivnog trakta zbog Clostridium difficile, gastrointestinalnih bolesti i sindroma iritabilnog creva.

[0023] WO 2005/019417 opisuje bakterijsku zajedničku kulturu koja sadrži prvi soj Bacillus licheniformis PA i drugi soj Bacillus subtilis HE i može se koristiti kao probiotik u lečenju gastrointestinalnih bolesti i drugih bolesti kao što je reumatoidni artritis.

[0024] Na primer, WO2009/026306 opisuje kompoziciju koja sadrži tri soja bakterija, a to su Bacillus subtilis, Bacillus coagulans i Enterococcus faecium ili faecalis, za prevenciju i / ili lečenje 30 različitih patologija, od autizma do vaginalnih infekcija, do endometrioze i me đu kojima se navodi reumatoidni artritis. Ovaj dokument ne opisuje određene sojeve bakterija koji se mogu koristiti u sastavu.

[0025] Međutim, poznato je da je probiotički efekat datog soja, bilo da se radi o soju kvasca ili bakterijskom soju, specifičan za ovaj soj, a ne za rod ili čak vrste koje se razmatraju.

[0026] Takođe, još uvek postoji potreba za pronalaženjem novih tretmana za prevenciju i / ili lečenje hroničnih inflamatornih bolesti, alternativnih postojeć im, jeftinijih i sa manje ne željenih neželjenih efekata.

[0027] Predmet ovog pronalaska je prema tome bakterijski probiotički soj za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog upalnog reumatizma. Pronalazači su zaista na iznenađujuć i način otkrili da soj Bacillus subtilis CU1 ima blagotvorno dejstvo u lečenju i / ili prevenciji određenih hroničnih inflamatornih bolesti.

[0028] Soj Bacillus subtilis CU1 deponovan je pod brojem I-274525. oktobra 2[001. godine u CNCM, Collection Nationale de Cultures de Microorganismes de l'Institut Pasteur, 25 rue du Docteur Rouk, F-75725 Paris Cedek 15.

[0029] Soj Bacillus subtilis CU1 prvi put je opisan u FR 2 837 835. Ovaj dokument opisuje soj Bacillus subtilis CU1 kao imunomodulirajuć i agens imunološkog sistema i njegovu upotrebu u proizvodnji žive rekombinantne vakcine protiv H. pilori

[0030] "Soj" se odnosi na relativno homogenu populaciju ć elija. Konkretno, soj se dobija izolacijom klona, klon je populacija ć elija dobijenih iz jedne ć elije.

[0032] Termini "soj Bacillus subtilis CU1", "probiotički soj CU1", "soj Bacillus subtilis I-2745" i "soj CU1" su sinonimi.

[0033] Predmetni pronalazak stoga ima za cilj soj Bacillus subtilis CU1 deponovan u CNCM-u pod brojem I-2745 25. oktobra 2[001. godine za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatarnog reumatizma.

[0034] Predmetni pronalazak se takođe odnosi na ć elije dobijene kultivisanjem soja Bacillus subtilis CU1 podnetog CNCM-u pod brojem I-2745, 25. oktobra 2[001. godine, za njihovu upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatarnog reumatizma.

[0035] Sledeć i predmet ovog pronalaska je kompozicija koja sadrži ć elije dobijene kultivacijom soja Bacillus subtilis CU1 deponovanog u CNCM pod brojem I-2745 25. oktobra 2[001. godine, za njegovu upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatarnog reumatizma.

[0036] Izrazi „ć elije dobijene kultivisanjem soja Bacillus subtilis CU1 deponovane u CNCM pod brojem I-2745 25. oktobra 2[001. godine“, „biomasa CU1“, „ć elije dobijene kultivisanjem soja CU1“ ili „ć elije CU1“ ovde su sinonimi .

[0037] Ć elije soja CU1 i CU1 dobijene kultivisanjem navedenog soja su alternativni tretman za prevenciju i / ili lečenje hroničnog inflamatornog reumatizma, koji je jeftiniji i nema sporedne efekte konvencionalnih tretmana.

[0038] Hronični inflamatorni reumatizam je hronična inflamatorna bolest, kao što su psorijaza, hronični pankreatitis, celijakija, Hashimotov tiroiditis, Crohnova bolest, lupus eritematozus, skleroderma, primarna bilijarna ciroza, sklerozirajuć i holangitis, autoimunski hepatitis i vaskulitis.

[0039] „Lečenje bolesti“ je definisano kao lečenje bolesti radi postizanja izlečenja, ublažavanja njenih simptoma ili tegoba, na primer smanjenjem intenziteta upale ili stabilizovanjem bolesti da bi se održalo u stanju remisije.

[0040] Interval između dve upale se naziva stanjem remisije

[0041] Prevencija bolesti znači izbegavanje pojave bolesti, na primer kod subjekta sa rizikom od razvoja bolesti, ili odlaganje inflamatornog rasplamsavanja bolesti kada je bolest već prisutna.

[0042] Pod „hroničnim inflamatornim reumatizmom“ podrazumeva se bolest izabrana iz grupe koju čine reumatoidni artritis, psorijatični artritis, spondiloartropatije, sistemski eritemski lupus, Gougerot-Sjogrenov sindrom, Behcet-ova bolest, skleroderma, juvenilni idiopatski artritis i hroni čni atrofi polihondritis.

[0043] U poželjnoj realizaciji, ovaj pronalazak se odnosi na soj Bacillus subtilis CU1 ili ć elije dobijene kultivisanjem pomenutog soja ili na sastav koji sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja, za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji reumatoidnog artritisa.

[0044] Pronalazači su zaista otkrili na iznenađuju ć i način da upotreba probiotičkog soja Bacillus subtilis CU1 probiotički soj, a posebno ć elija dobijenih gajenjem navedenog soja, omogu ć ava:

- smanjenje proizvodnje pro-inflamatornih citokina kao što su TNF-α, IL-1, IL-12, IL-17, kao što je pokazano u primerima 1 i 2;

- stimulaciju proizvodne antiinflamatornih citokina kao što je IL-10, kao što je prikazano u primeru 2;

- odlaganje i / ili smanjenje makroskopskih simptoma kao što su težina upale ili broj zglobova pogođenih reumatoidnim artritisom, kao što je prikazano u primeru 1;

- smanjenje infiltracije imunih ć elija u sinovijalnoj tečnosti, kao što je prikazano u primeru 1; - smanjenje ošteć enja zglobova što dovodi do uništenja hrskavice i kostiju i deformacije zgloba, kao što je prikazano u primeru 1.

[0045] Zaista, TNF-α i interleukini IL-1, IL-12 i IL-17 su pro-inflamatorni citokini koji igraju esencijalnu ulogu u inflamatornim bolestima. Njihovo prekomerno lučenje dovešć e do hroničnog zapaljenja koje ć e, u slučaju reumatoidnog artritisa, prouzrokovati nepovratna o šte ć enja i deformacije zglobova.

[0046] „Makroskopski simptomi“ podrazumevaju simptome vidljive golim okom kao što su težina upale, broj zglobova pogođenih upalom i deformacija zgloba, prema revidiranim kriterijumima Američkog koledža za reumatologiju (ACR) iz 1987. godine (up. Arnett FC et al, Arthritis Rheum., 1988; 31: 315-24).

[0047] Pod "imunskim ć elijama" podrazumevaju se makrofagi, limfociti, kružni polinuklearni i mononuklearni leukociti.

[0048] Infiltracija imunih ć elija u zglob, tačnije u sinovijalnu membranu proizve ć e sinovijalni panus uključen u uništavanje hrskavice i okolnog koštanog tkiva.

[0049] Stoga su pronalazači otkrili da je primena CU1 ć elija uticala na smanjenje i sprečavanje stvaranja sinovijalnog panusa kako je opisano u Primeru 1. Pod „o šteć enjem zgloba“ podrazumeva se progresivno uništavanje hrskavice gubitkom proteoglikana matrice hrskavice i kostiju zglobova kao i progresivna deformacija pomenutih zglobova. Deformacija zglobova je posledica anarhi čnog okoštavanja zgloba osteoklastima. Ova deformacija može imati značajne posledice koje mogu dovesti do gubitka autonomije i invaliditeta pacijenta.

[0050] Upotreba soja Bacillus subtilis CU1 ili ć elija dobijenih kultivisanjem navedenog soja ili kompozicije koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma može se okarakterisati tako što indukuje smanjenje proizvodnje najmanje jednog pro-inflamatornog citokina i / ili poveć anje proizvodnje najmanje jednog antiinflamatornog citokina.

[0051] Proinflamatorni citokin čiju proizvodnju smanjuje soj Bacillus subtilis CU1 ili ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja ili kompozicija koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja, izabran je iz grupe koju čine TNF-α, interleukin IL- 1, interleukin IL-12 ili interleukin IL-17.

[0052] Protivupalni citokin čija je proizvodnja poveć ana sojem Bacillus subtilis CU1 ili ć elijama dobijenim kultivisanjem pomenutog soja ili kompozicijom koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja, je na primer interleukin IL-10.

[0053] Upotreba soja Bacillus subtilis CU1 ili ć elija dobijenih kultivisanjem navedenog soja ili kompozicije koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma može se okarakterisati tako što indukuje smanjenje proizvodnje najmanje dva, poželjno najmanje tri pro-inflamatorna citokina i / ili poveć anje proizvodnje najmanje jednog antiinflamatornog citokina, kao što je IL-10.

[0054] Poželjno je da upotreba soja Bacillus subtilis CU1 ili ć elija dobijenih kultivisanjem navedenog soja ili kompozicije koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma može biti okarakterisana tako što indukuje smanjenje proizvodnja TNF-α, interleukin IL-1, interleukin IL-12 i interleukin IL-17 i poveć anje proizvodnje interleukin IL-10.

[0055] Upotreba soja Bacillus subtilis CU1 ili ć elija dobijenih kultivisanjem pomenutog soja ili kompozicije koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma može se okarakterisati po tome što je za ljudsku i / ili veterinarsku upotrebu.

[0056] Veterinarska upotreba odnosi se i na domać e životinje kao što su svinje, krave, ovce ili koze, ali i na domać e životinje kao što su mačke, psi, konji ili zečevi.

[0057] Konkretno, upotreba soja Bacillus subtilis CU1 ili ć elija dobijenih kultivisanjem pomenutog soja ili kompozicije koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem navedenog soja u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, karakteriše se time što je namenjena ljudskoj upotrebi.

[0058] Ć elije CU1 su tako dobijene kultivisanjem soja Bacillus subtilis CU1 u medijumu za kulturu, prema postupcima dobro poznatim stručnjacima, kao što je na primer opisano u knjizi Biotechnologi, 5. izdanje, R. Scriban, Edition Tec. I dokument, 1999, ISBN: 2-7430-0309-Ks.

[0059] Tipično, postupak za proizvodnju ć elija CU1 kultivisanjem soja CU1 obuhvata korake:

- zasejavanje medijuma za kulturu sa inokulacijom soja CU1,

- kultura u aerobnim uslovima, da bi se dobilo umnožavanjeć elija,

- odvajanje biomase od njenog medijuma za kulturu, da bi se dobile ć elije CU1.

[0060] Tako dobijene ć elije CU1 su uglavnom u vegetativnom obliku.

[0061] "Vegetativni oblik" bakterije odnosi se na oblik bakterije smešten pod povoljnim uslovima [0062] Izraz "pretežno u vegetativnom obliku" znači da je najmanje 70% ć elija u vegetativnom obliku, poželjno najmanje 80%, a poželjnije najmanje 90%.

[0063] Primer povoljnih uslova je neograničavajuć i medijum za kulturu na temperaturi i pH povoljnom za razmnožavanje bakterija

[0064] Neograničavajuć i medijum za kulturu sadrži sve hranljive sastojke neophodne za razmnožavanjeć elija.

[0065] Postupak za proizvodnju ć elija CU1 može takođe da sadrži međufazu, između koraka kultivacije u aerobnim uslovima i koraka odvajanja biomase od njenog medijuma za kulturu, stavljanja ć elija u nepovoljne uslove. Ć elije CU1 dobijene na kraju procesa su tada uglavnom u obliku spora. Bakterije u „obliku spora“ odnosi se na oblik bakterije smešten u nepovoljne uslove.

[0066] Izraz "pretežno formiranje spora" znači da najmanje 70% ć elija stvara spore, poželjno najmanje 80%, a poželjnije najmanje 90%.

[0067] Oblik spora je dakle oblik otpora koji omoguć ava ć elijama da izdrže teško okruženje kao što je nedostatak hranljivih sastojaka, tj. ograničavajuć i hranljivi ambijent, vodeni stres, značajne razlike u pH ili temperaturi ili čak prolazak kroz digestivni trakt.

[0068] Nepovoljno stanje ć elija CU1 dobija se, na primer: neobnavljanjem medijuma za kulturu bakterija, zaustavljanjem dovoda medijuma za kulturu, upotrebom ograni čavajuć ih medijuma za kulturu, promenom temperature, promenom pH, kontrolom aeracije i / ili me šanje kako bi se održao pritisak O2 već i od 20% u medijumu za kulturu i pritisak CO2 manji od 1,5% u izlaznim gasovima, ili njihova kombinacija.

[0069] Takođe je moguć e dobiti ć elije CU1 pretežno u obliku spora dodavanjem glutaminske kiseline u medijum za kulturu u količini od oko 0,75 g / L.

[0070] Predmetni pronalazak tako takođe ima za cilj ć elije dobijene kultivisanjem soja CU1 ili kompozicije koja sadrži pomenute ć elije, za njihovu upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, naznačena time što su ć elije u obliku spora i / ili u vegetativnom obliku.

[0071] U poželjnom rešenju,ć elije CU1 su pretežno u obliku spora.

[0072] Postupak za proizvodnju CU1 ć elija može takođe da uključuje slede ć i korak sušenja CU1 ć elija, da bi se dobili CU1 ć elije u suvom obliku.

[0073] Sušenje je, na primer, sušenje liofilizacijom, sušenje u fluidizovanom sloju ili sušenje raspršivanjem.

[0074] Cilj je ovog pronalaska da obezbedi ć elije dobijene kultivisanjem soja CU1 ili kompoziciju koja sadrži pomenute ć elije, za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, naznačeno time što su pomenuteć elije u suvom obliku.

[0075] „Ć elije u suvom obliku“ znače da biomasa dobijena u procesu proizvodnje ć elija CU1 sadrži više od 90% suve materije, poželjno više od 95% suve materije.

[0076] Dnevna doza zavisi od vrste životinje, njene težine, načina primene i vrste kurativnog ili preventivnog tretmana.

[0077] Ć elije ili kompozicija kako je gore definisano mogu se koristiti svakodnevno u količini od 1,108 CFU do 1,1011 CFU kada su namenjeni za upotrebu u ljudima, poželjno 5,108 CFU do 1,1010 CFU.

[0078] Ć elije ili kompozicija kako je gore definisano mogu se koristiti svakodnevno u količini od 1.105 CFU do 1.1011 CFU kada su namenjeni za veterinarsku upotrebu, poželjno 1.107 CFU do 1.1010 CFU. po moguć nosti 1.107 CFU do 1.1010 CFU.

[0079] Termin CFU odnosi se na jedinicu za formiranje kolonija.

[0080] Sledeć i cilj ovog pronalaska je da obezbedi kompoziciju kako je gore definisana, za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog upalnog reumatizma, naznačen time što je kompozicija sastav hrane, dodatak hrani ili farmaceutski sastav.

[0081] Sastav hrane odnosi se na bilo koju hranu, pić e ili poslasticu.

[0082] Sastav hrane može biti, na primer, napitak, pločica sa žitaricama, žvaka, mlečni proizvod, kao što je fermentisani mlečni proizvod, ili poslastica.

[0083] „Dijetetski dodatak“ je namirnica koja je namenjena kao dodatak uobi čajene dijete i koja je koncentrovani izvor hranljivih sastojaka ili drugih supstanci sa hranljivim ili fiziolo škim efektom, sama ili u kombinaciji.

[0084] Dodatak ishrani se prodaje u obliku doziranja, na primer, oblici kao što su kapsule, pastile, tablete, pilule i drugi slični oblici, paketić i praha, ampule tečnosti, bočice sa kapaljkom i drugi slični oblici tečnosti ili praha preparati namenjeni za uzimanje u izmerenim jedinicama male količine.

[0085] Farmaceutska kompozicija dalje sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0086] Predmetni pronalazak je takođe usmeren na kompoziciju kako je gore definisana, za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, naznačen time što je preparat za oralnu ili lokalnu primenu, poželjno oralno.

[0087] Predmetni pronalazak stoga ima za cilj kompoziciju kako je gore definisana, za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, naznačena time što je kompozicija u obliku kapsule, pastile, pilule, tablete, praha, suspenzije, tečnog rastvora, granule, gel ili krema.

[0088] Predmetni pronalazak takođe ima kompoziciju kako je gore definisana za upotrebu u lečenju i / ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, naznačen time što sadrži još jedan aktivni sastojak.

[0089] Drugi aktivni sastojak je poželjno izabran iz grupe aktivnih sastojaka koji imaju antiinflamatorno delovanje, imunomodulirajuć u aktivnost i / ili analgetsko delovanje.

[0090] Poželjno je da drugi aktivni sastojak nije soj Bacillus subtilis, poželjno nije soj bakterija, još poželjnije nije probiotički soj.Poželjno je da kompozicija prema pronalasku sadrži ć elije dobijene kultivisanjem soja CU1, izuzimajuć i bilo koji drugi soj bakterija.

[0092] Poželjno je da kompozicija prema pronalasku sadržić elije dobijene kultivisanjem soja CU1, izuzimajuć i bilo koji drugi soj kvasca ili bakterija.

[0093] Takođe poželjno da kompozicija prema pronalasku sadrži ć elije dobijene kultivisanjem soja CU1 kao jedini aktivni sastojak.

[0094] Takođe je ovde opisan postupak lečenja i / ili sprečavanja hronične inflamatorne bolesti kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pomenutom pacijentu efektivne koli čine ć elija dobijenih kultivisanjem soja CU1 ili kompozicije koja sadrži pomenute ć elije.

[0095] Postupak lečenja i / ili sprečavanja hronične inflamatorne bolesti kod pacijenta, koji se sastoji od davanja navedenom pacijentu efikasnu količinuć elija dobijenih kultivisanjem soja CU1 ili kompozicije koja sadrži pomenute ć elije, naznačena je time što je navedena hronična inflamatorna bolest, bolest hroničnog inflamatornog reumatizma.

[0096] Poželjno je da je cilj ovog pronalaska da obezbedi postupak lečenja i / ili sprečavanja reumatoidnog artritisa kod pacijenta, koji se sastoji od davanja pomenutom pacijentu efektivne količineć elija dobijenih kultivisanjem soja CU1 ili kompozicije koja sadrži pomenute ć elije.

[0097] Ovaj pronalazak ć e sada biti ilustrovan uz pomo ć slede ć ih primera i slika, koji su dati kao ilustracija, i ni na koji način nisu ograničavajuć i.

KRATAK OPIS SLIKA

[0098]

Slika 1: Kumulativni klinički rezultati svih pacova po grupi tokom 50 dana studije prema ispitivanju br. 1.

Slika 2: Evolucija srednjih vrednosti kliničkih rezultata pacova u grupama G2 i G4 tokom ispitivanja 2 i od prve imunizacije na D 7.

Slika 3: Kumulativni klinički rezultati svih pacova po grupama tokom 43 dana studije prema ispitivanju br.2.

Slika 4: Kumulativni klinički rezultati svih pacova prema grupi tokom 50 dana studije prema ispitivanju br.3.

Slika 5: Određivanje TNF-αlfa (u pg / ml) u serumu pacova u svakoj grupi prema ispitivanju 2.

Slika 6: Određivanje TNF-αlfa (u pg / ml) u serumu pacova u svakoj grupi prema ispitivanju 3.

Slika 7: Određivanje interleukina Il-17 (u pg / ml) u serumu pacova u svakoj grupi prema ispitivanju 2.

Slika 8: Određivanje interleukina Il-17 (u pg / ml) u serumu pacova u svakoj grupi prema ispitivanju 3.

Slika 9: Analiza TNF-α (u pg / ml) u supernatantima svake grupe, oporavljenom nakon stimulacije humanog PBMC sa Micobacterium butiricum.

Slika 10: Određivanje interleukina 1 (u pg / ml) u supernatantima svake grupe, oporavljenom nakon stimulacije humanog PBMC sa Micobacterium butiricum.

Slika 11: Određivanje interleukina 12 (u pg / ml) u supernatantima svake grupe, oporavljenom nakon stimulacije humanog PBMC sa Micobacterium butiricum.

Slika 12: Određivanje interleukina 10 (u pg / ml) u supernatantima svake grupe, oporavljenom nakon stimulacije humanog PBMC sa Micobacterium butiricum.

PRIMERI

Primer 1: Efekti Bacillus subtilis CU1 na eksperimentalnom modelu indukovanog artritisa kod pacova

Materijali i metode

1. Životinjski modeli

[0099] Koriste se ženke pacova Levis šest nedelja stare. Artritis se indukuje davanjem emulzije Micobacterium butiricum (Mb) u uljnom rastvoru kao pomoć no sredstvo.

[0100] Tako dobijeni model relativno je sličan ljudskom poliartritisu u pogledu kliničkih znakova: simetrija u zahvać enim zglobovima, periferni zglobovi su preferencijalno pogođeni, sinovijalna hiperplazija, infiltracija inflamatornih ć elija, marginalne erozije zglobova i bolja podlo žnost bolesti kod žena . Postoji i imuno-inflamatorna kaskada koja se javlja in situ na mestima upale.

[0101] Micobacterium butiricum (Difco, SAD) kupuju se u liofilizovanom i toplotno inaktiviranom obliku. Zatim se emulguje brzinom od 180 ng ubijenih Mb po mililitru uljnog rastvora vazelina, Tveen 80 i PBS pufera.

2 - Korišć en uzorak

[0102]Ć elije Bacillus subtilis CU1 (u daljem tekstu CU1) koje se testiraju koriste se u obliku spora i liofilizovanom obliku. Ć elije se suspenduju u fiziološkoj vodi za testiranje, a pacovima se daju dnevne doze od 5,109 bakterija dnevno.

3- Tretman / protokol

[0103] Probe su bile raspoređene u periodu od 50 dana i izvodili su se u triplikatu: prva dve probe sa serijama od 5 pacova i treć a sa serijom od 12 pacova tretiranih sa CU1, tri probe su raspore đene u vremenu.

Planiranje:

[0104]

D0: pacovi su odvojeni u nekoliko serija:

→ Grupa 1 (G1): negativne kontrole, zdravi pacovi

→ Grupa 2 (G2): pacovi sa eksperimentalnim artritisom bez lečenja CU1;

→ Grupa 3 (G3): zdravi pacovi koji su primali dnevnu dozu CU1 pomoću sonde počevši od D0 i tokom studije;

→ Grupa 4 (G4): pacovi sa eksperimentalnim artritisom koji su primali dnevnu dozu CU1 davanjem pomoću sonde počevši od D0 i nastavljajuć i tokom čitavog ispitivanja.

- D 7: pacovi grupe G2 i G4 se imunizuju prvom intradermalnom injekcijom od 3 [00 ml inaktivirane Mb emulzije u dnu repa.

- D 14: pacovi grupe G2 i G4 se imunizuju po drugi put, pod istim uslovima.

Rezultati kliničke upale:

[0105] Prvi klinički znaci pojavljuju se kod D 23 kod pacova kod kojih je indukovan artritis. Pacovi brzo razvijaju znake artritisa u perifernim zglobovima (uglavnom zadnjim nogama) sa jakom inflamatornom reakcijom u sinovijalnoj šupljini koja rezultira skoro paralizom pogođenog zgloba i destruktivnom erozijom koštanog tkiva. Kao u mnogim patološkim modelima, životinja trpi snažan gubitak težine.

[0106] Inflamatorni simptomi se „boduju“ prema unapred utvrđenom kliničkom rezultatu rezimiranom u tabeli 1.

Tabela 1.

[0107] Pacovi se svakodnevno mere i boduju.

Histološki protokol

[0108] Noge su fiksirane u 4% formaldehidu, a zatim dekalcifikovane elektroforezom u puferu za dekalcifikaciju (Baier Diagnostics, Francuska) tokom 3 sata. Zatim se noge impregniraju kerozinom i mikrotomom se dobijaju histološki preseci.

[0109] Preseci od 5 mm su obojeni pomoć u rutinskih protokola.

[0110] Histološki delovi dobijeni za svaku grupu obojeni su sa dve različite boje:

1

- Hematoksilin - eozin (HE) bojenje, boja koja boji kolagen u svetlo ružičastu, mišić e u tamno ružičastu, acetobelu citoplazmu u crvenu, bazofilnu citoplazmu u ljubičastu, jezgro u plavu i eritrocite u jarko crvenu.

- Mallorijevo anilinsko plavo bojenje ili Mallorijevo trostruko bojenje (MA) koje isti če vezivno tkivo: kolagenska vlakna u plavoj boji, mišić na vlakna u crvenoj boji, elastinska vlakna u ružičastoj ili žutoj boji.

[0111] Preseci se posmatraju pod svetlosnim mikroskopom pri uveć anju od k1[00 i k4[00.

Protokoli za određivanje inflamatornih citokina

[0112] Test citokina vrši se pomoću ELISA kompleta antitela i standarda koje obezbeđuje eBioscience (San Diego, Ca, USA) i protokola naznačenih od dobavljača (Rat IL-17A ELISA Readi-SET-Go; Rat TNF alfa ELISA Readi- SET-Go).

Rezultati

1- Inflamatorni simptomi: ocena kliničke upale

[0113] Zdravi pacovi koji primaju ili ne primaju probiotički soj (G1 i G3) ne razvijaju upalne simptome, tako da su njihovi klinički rezultati nula i nisu predstavljeni na krivi.

Isptivanje br. 1:

[0114] Pacovi grupe 2 razvili su eksperimentalni artritis već 19. dana nakon prve imunizacije (D 26) sa Mb. Njihov klinički rezultat je zatim evoluirao u proseku od 3 do 4, samo 10 dana nakon pojave prvih kliničkih znakova (D 33). Ovaj rezultat je zatim ostao stabilan i visok tokom studije.

[0115] Suprotno tome, pacovi u grupi 4 koji primaju ć elije CU1 ne razvijaju simptome zapaljenja ili ih razvijaju kasnije od grupe 2. Pored toga, klinički rezultati grupe 4 su znatno niži; a težina i broj pogođenih nogu ostaju niži od grupe 2.

[0116] Prema slici 1, primeć eno je da pacovi grupe 2 dostižu ukupan kumulativni rezultat od 426 naspram 231 za pacove grupe 4 tretirane ćeilijama CU1. Dakle, CU1 smanjuje značaj patoloških znakova za 46%.

Isptivanje br. 2:

[0117] Pacovi grupe 2 razvili su eksperimentalni artritis već 25. dana nakon prve imunizacije (D 32) sa Mb. Njihov klinički rezultat je zatim brzo evoluirao do prosečne vrednosti od 3 samo 15 dana nakon pojave prvih kliničkih znakova (D 38). Ovaj rezultat je zatim ostao stabilan i visok tokom studije.

[0118] Pacovi u grupi 4 koji su primali CU1 takođe su razvili inflamatorne simptome, ali kasnije, 28. dana (D 35) i to na mnogo slabiji način. Na 33. danu nakon prve imunizacije (D 40) simptomi su se smanjili i ostali stabilni do kraja studije.

[0119] Iako upaljeni, težina i broj pogođenih nogu ostali su niži nego u grupi 2.

[0120] Stoga se može uočiti značajna razlika u pojavi i težini simptoma upale (slika 2).

[0121] Prema slici 3, primeć eno je da pacovi u grupi 2 postižu ukupan kumulativni rezultat od 176 u poređenju sa 31 kod pacova u grupi 4 tretiranih ćeilijama CU1. Dakle, CU1 smanjuje značaj patoloških znakova za 82%.

Isptivanje br. 3:

[0122] U grupi 4, pod nazivom a i b, koriste se dve serije od 6 pacova.

[0123] Prema slici 4, postoji značajna razlika između kumulativnih rezultaza u grupama 2 i 4a / b. Šest pacova u grupi 2 postiže ukupan kumulativni rezultat od 251 u poređenju sa 98 za 6 pacova tretiranih ćeilijama CU1 (G4a) i 80 za 6 pacova tretiranih ćeilijama CU1 (G4b). Dakle, CU1 je smanjio značaj patoloških znakova za 61% (G4a) i 68% (G4b).

2- Vizuelna analiza zadnjih nogu pacova

[0124] Vizuelna analiza se izvodi vizuelnim posmatranjem prisustva upale na zadnjim nogama pacova različitih grupa.

[0125] Šape neobrađenih pacova grupe 1 ne pokazuju upalu. Šape pacova u grupi 2 pokazuju značajno vidljivo zapaljenje. Šape pacova grupe 4 ne pokazuju nikakvo ili mnogo manje zapaljenje od grupe 2.

3- Histološka analiza zadnjih nogu pacova

[0126] Delovi grupe 2 u HE bojanju pokazuju destrukciju zglobnog tkiva kao i snažnu infiltraciju imunih ć elija u zglobu u poređenju sa grupama 1 i 3. Posmatranje delova grupe 4 u HE bojanju nam omoguć ava da se uoči manja infiltracija imunih ć elija u zglobu i da je ukupno zglobno tkivo manje izmenjeno.

[0127] Delovi grupe 2 kod AM bojenja pokazuju invaziju vezivnog tkiva u zglobnom prostoru, kao i snažnu infiltraciju leukocita vidljivih pri uveć anju x4[00, gubitak zglobne arhitekture i eroziju kostiju. Posmatranje delova grupe 4 u MA bojenju omoguć ava da se utvrdi da neke životinje ne predstavljaju ili gotovo da nemaju lezije na nivou zglobova, a ako postoje lezije, one su manjeg intenziteta u poređenju sa lezijama primeć enim na životinjama pogođeni grupom 2. Dakle, sprečeno je stvaranje panusa, zapaljenje sinovije, uništavanje hrskavice i deformacija zgloba. 4- Određivanje inflamatornih citokina u serumu pacova

TNF-α test:

[0128] Slike 5 i 6 predstavljaju rezultate testa TNF-α u serumu pacova u svakoj grupi za ispitivanja 2, odnosno 3. Serum svake životinje se ispituje u duplikatu, a zatim je predstavljen ukupan prosek svih životinja u odgovarajuć oj grupi.

[0129] Analiza TNF-α izražena je u pikogramima po mililitru.

[0130] Ispitivanje 2: Prema slici 5, grupe 1 i 3 imaju nizak nivo TNF-α, blizu 2[00 pg / ml. Serum pacova grupe 2 ima nivo TNF-α od oko 2[000 pg / ml. Serum pacova grupe 4 ima sadržaj TNF- α od oko 5[00 pg / ml, 4 puta niži od grupe 2.

[0131] Ispitivanje 3: Prema slici 6, grupa 1 ima nivo TNF-α od oko 6[00 pg / ml i oko 1[000 pg / ml za grupu 3. Takođe se primeć uje da grupa 4 ima nizak nivo TNF-α u poređenju sa za grupe 1 i 3, oko 14[00 pg / ml, dok grupa 2 ima visok nivo TNF-α od oko 44[00 pg / ml, tri puta već i od grupe 4. Test Interleukin 11-17:

[0132] Slike 7 i 8 prikazuju rezultate testa Il-17 u serumu pacova u svakoj grupi za ispitivanja 2 i 3.

[0133] Određivanje Il-17 izraženo je u pikogramima po mililitru.

[0134] Test 2: Prema slici 7, pacovi u grupama 1 i 3 imaju nizak prosečni nivo Il-17, blizu granice detekcije opreme (50 pg / ml). Može se primetiti da je srednji nivo Il-17 grupe 2 visok, oko 625 pg / ml, dok je srednji nivo Il-17 grupe 3 nizak, oko 50 pg / ml. dok je prosečni nivo Il-17 u grupi 4 nizak, oko 1[00 pg / ml.

[0135] Test 3: Prema slici 8, pacovi grupe 1 i 3 imaju nizak prosečni nivo Il-17, blizu granice detekcije opreme (50 pg / ml). Može se primetiti da je prosečni nivo Il-17 u grupi 2 visok, iznad 2[000 pg / ml, dok je prosečni nivo Il-17 u grupi 4 nizak u obe serije, blizu granice detekcije opreme.

Zaključak

[0136] Korišć eni model indukcije artritisa pokazao je da je CU1 u stanju da spre či indukciju bolesti ili vrlo značajno smanji njene efekte.

[0137] S jedne strane, može se vizuelno primetiti da šape pacova ne pokazuju upalu ili pokazuju nisku ocenu zapaljenja. Primena CU1 stoga smanjuje značaj navedenih patoloških znakova.

[0138] S druge strane, histološka analiza šapa pacova otkriva da artritični pacovi lečeni CU1 (G4) pokazuju znatno manje ošteć enje zglobova, malu eroziju kostiju i smanjenje ili nestanak infiltracije imunih ć elija u zglobovima u poređenju sa pacovima koji nisu lečeni CU1 (G2).

[0139] Pored toga, primena CU1 artritičnim pacovima (G4) značajno je smanjila prisustvo proinflamatornih citokina (TNF-α i IL17).

Primer 2: Efekti Bacillus subtilis CU1 na humane imunske ć elije ekstrahovane iz zdrave donatorske krvi (PBMC) stimulisane Micobacterium butiricum.

Materijal i metoda

1- Korišć eni ć elijski model

[0140] PBMC (mononuklearna ć elija periferne krvi) se koristi kao model u ovom primeru.

[0141] Krv je uzeta od 4 zdrava dobrovoljna davaoca, prethodno testiranih na odsustvo HIV-a ili infekcije hepatitisom (EFS Akuitaine, Bordeauk Blood Bank). Izoluju se centrifugiranjem u Ficoll ™ gradijentu. Nakon pranja, ć elije se resuspenduju u koncentraciji od 1 x 10<6>PMBC / ml u kompletnom RPMI medijumu.

[0142] Stupaju u kontakt sa Micobacterium butiricum (Mb) (Difco, SAD) da bi izazvali inflamatorni odgovor.

[0143] Osnovni rastvor Mb se priprema razređivanjem liofilizata iz Primera 1 u PBS puferu do koncentracije od 1 mg / ml u PBS. Zatim se broj Mb ć elija u osnovnom rastvoru broji pod mikroskopom koristeć i Malassez ć eliju tako da se za stimulaciju PBMC koristi odnos od 10 Mb po imunoj ć eliji (MOI 10: 1). Izraz MOI (Multiplicity Of Infection) označava mnoštvo infekcija.

2- Uzorak koji se koristi

[0144] Ć elije Bacillus subtilis CU1 (u daljem tekstu CU1) koje se testiraju koriste se u obliku spore (CUsp) ili vegetativnom (CUv). Koristi se radni rastvor 2x10<8>CFU / ml u sterilnoj fiziološkoj vodi. 3- Stimulacija PBMC

[0145] Stimulacioni eksperimenti se izvode ko-kultivisanjem soja PBMC i CU1 u odnosu od 10 bakterija po imunološkoj ć eliji. Lipopolisaharid (LPS) je koriš ć en kao pozitivna kontrola za stimulaciju PBMC za proizvodnju citokina. Svi eksperimenti su izvedeni u triplikatu. Supernatanti kulture sakupljeni nakon 18 sati kontakta su centrifugirani i čuvani na -80 ° C do ispitivanja citokina (IL-1, TNF-α, IL12 i IL-10).

4- Priprema različitih ispitivanih grupa:

- Grupa 1 (G1): prisustvo samo PBMC;

- Grupa 2 (G2): PBMC su u kontaktu sa CU1 u obliku spora;

- Grupa 3 (G3): PBMC su u kontaktu sa CU1 u vegetativnom obliku;

1

- Grupa 4 (G4): PBMC stupaju u kontakt sa Mb;

- Grupa 5 (G5): PBMC se dovode u kontakt sa CU1 u obliku spora i Mb;

- Grupa 6 (G6): PBMC se dovode u kontakt sa CU1 u vegetativnom obliku i Mb;

- Grupa 7 (G7): PBMC se preinkubiraju 1 sat sa CU1 u obliku spora pre dodavanja Mb;

- Grupa 8 (G8): PBMC se preinkubiraju 1 sat sa CU1 u vegetativnom obliku pre dodavanja Mb.

[0147] Test citokina je izvršen ELISA-om koristeć i setove, antitela i standarde koje je obezbedio eBioscience (San Diego, Ca, USA) i protokole naznačene od dobavljača.

Rezultati

TNF-α test:

[0148] Slika 9 prikazuje TNF-α test u pg / ml u supernatantu izdvojenom iz PBMC za svaku od gore navedenih grupa

[0149] U grupi 4 je primeć en nivo TNF-α od oko 2000 pg / ml, dok je u grupama izloženim CU1 (G5 i G6) količina TNF-α prepolovljena. Štaviše, primećeno je da je predinkubacija sa CU1 (G7 i G8) 1 sat pre dodavanja Mb efikasnija kada je CU1 u obliku spora (G7) što snižava nivo TNF-α na oko 500 pg / ml (četvorostruko niži).

2- Analiza interleukina IL-1

[0150] Slika 10 prikazuje određivanje IL-1 u pg / ml u supernatantu izdvojenom iz PBMC za svaku od gore navedenih grupa.

[0151] U grupi 4 je primeć en nivo IL-1 od oko 1250 pg / ml, dok u grupi 5 nivo iznosi oko 400 pg / ml (3 puta manje), kao i u grupi 6. 400 pg / ml (3 puta manje). Nije primeć eno pobolj šanje u slučaju predinkubacija sa CU1 (G7 i G8) pre dodavanja Mb.

3- Analiza Interleukin IL-12

[0152] Slika 11 prikazuje određivanje IL-12 u pg / ml u supernatantu izdvojenom iz PBMC za svaku od gore navedenih grupa

[0153] U grupi 4 je primeć en nivo IL-12 od oko 32 pg / ml, dok je u grupama 5 i 6, kada je izložen CU1, primeć en značajan pad IL-12, ispod 12 pg / ml. Štaviše, prime ć ujemo da predinkubacija sa CU1 (G7 i G8) pre dodavanja Mb dalje smanjuje nivo IL-12 u poređenju sa grupama 5 i 6.

4- Analiza Interleukin IL-10

[0154] Slika 12 prikazuje određivanje antiinflamatornog citokina IL-10 u pg / ml u supernatantu izdvojenom iz PBMC za svaku od gore navedenih grupa.

[0155] Zabeležen je nivo IL-10 od oko 55 pg / ml u grupi Mb, dok je u grupama 5 i 6, kada je izložen CU1, porast proizvodnje ovog antiinflamatornog citokina od otprilike u kontaktu sa CU1, poveć anje proizvodnje ovog antiinflamatornog citokina reda veli čine 120 pg / ml (2 puta više). Štaviše, primeć eno je da pre-inkubacija sa CU1 (G7 i G8) pre dodavanja Mb ne deluje efikasno, jer su nivoi IL-10 niži (75 i 95 pg / ml) od onih u grupama 5 i 6.

Zaključak

[0156] Dobijeni rezultati uopšte pokazuju da primena ć elija Bacillus subtilis CU1 smanjuje proizvodnju proupalnih citokina i poveć ava proizvodnju antiinflamatornog citokina IL-10.

[0156] Dobijeni rezultati uopšte pokazuju da primena ć elija Bacillus subtilis CU1 smanjuje proizvodnju pro-inflamatornih citokina i poveć ava proizvodnju antiinflamatornog citokina IL-10.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Soj Bacillus subtilis CU1 deponovan kod CNCM-a pod brojem 1-2745 dana 25. oktobra 2001. godine, za njegovu upotrebu u lečenju i/ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma.

2. Ć elije dobijene kultivisanjem soja Bacillus subtilis CU1 deponovanog kod CNCM-a pod brojem 1-2745 dana 25. oktobra 2001. godine, za njihovu upotrebu u lečenju i/ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma.

3. Kompozicija za upotrebu u lečenju i/ili prevenciji hroničnog inflamatornog reumatizma, kompozicija koja sadrži ć elije dobijene kultivisanjem soja Bacillus subtilis CU1, deponovanog kod CNCM-a pod brojem 1-2745 dana 25. oktobra 2001. godine, isključujuć i bilo koji drugi bakterijski soj.

4. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time da je kompozicija oblik hrane, dodatak ishrani ili farmaceutska kompozicija.

5. Kompozicija za upotrebu prema patentnim zahtevima 3 ili 4, naznačeno time da je kompozicija namenjena za oralnu ili lokalnu administraciju.

6. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od zahteva od 3 do 5, naznačeno time da je kompozicija u obliku gel kapsule, pilule, pastile, tablete, kapsule, praha, suspenzije, te čnog rastvora, granule, gela ili kreme.

7. Kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih od zahteva od 3 do 6, naznačeno time da nadalje sadrži još jedan aktivni sastojak.

8.Ć elije za upotrebu prema patentnom zahtevu 2, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 3 do 7, naznačeno time da su navedene ć elije u obliku spora i/ili vegetativnom obliku.

9. Ć elije za upotrebu prema patentnim zahtevima 2 ili 8, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 3 do 8, naznačeno time da su navedeneć elije u suvom obliku.

10. Soj za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, ili ć elije za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva 2, 8 i 9, ili kompozicija za upotrebu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 3 do 9, naznačeno time da je hronični inflamatorni reumatizam reumatoidni artritis.