RS62103B1

RS62103B1 - Tečna kompozicija humanog fibrinogena

Info

Publication number: RS62103B1
Application number: RS20210796A
Authority: RS
Inventors: Clémence Debraize
Original assignee: Lab Francais Du Fractionnement
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2021-08-31
Also published as: CY1124609T1; WO2018115800A1; HRP20210984T1; MX2019007608A; LT3558381T; CN117180406A; US20200093896A1; CN110087689A; FR3061020B1; SI3558381T1; MX2021001361A; PL3558381T3; CN110087689B; HUE055246T2; DK3558381T3; ES2877848T3; EP3558381A1; MX379566B; EP3558381B1; FR3061020A1

Description

Opis

[0001] Pronalazak se odnosi na formulaciju humanog fibrinogena, korisnu za lečenje.

[0002] Trenutno se brojne patologije leče kompozicijama koje sadrže fibrinogen. Na primer, možemo navesti hipofibrinogenemije, disfibrinogenemije ili afibrinogenemije kod pacijenata sa spontanim ili posttraumatskim krvarenjem, dopunsko lečenje kod upravljanja teškom nekontrolisanom hemoragijom u okviru stečene hipofibrinogenemije, itd.

[0003] U lečenju nekih patologija, upotreba kompozicija koje sadrže fibrinogen stabilan pri čuvanju i spremne su za upotrebu može da bude posebno korisna. Ovaj način primene zapravo nudi medicinskom osoblju veću fleksibilnost i brzinu primene, što poboljšava hitnu negu pacijenata sa krvarenjem. U tu svrhu, razvijene su kompozicije koje sadrže liofilizovani fibrinogen, stabilne tokom čuvanja i prilagođene za brzo rekonstituisanje. Međutim, za rekonstituisanje takvih liofilizovanih kompozicija potrebno je nekoliko minuta. Pored toga, rekonstituisanje treba izvesti pažljivo kako bi se omogućilo kompletno rastvaranje liofilizata, koje garantuje koncentraciju proizvoda, i to bez stvaranja pene, zamućenja ili taloga, što bi dovelo do toga da se kompozicija teško primenjuje, ili ne može da se primeni. Korišćenje takvih liofilizovanih proizvoda dakle nije optimalno u smislu urgentnog lečenja u bolnici ili izvan bolnice, kada je svaki minut važan za lečenje krvarenja.

[0004] Do danas, kompozicije koje sadrže fibrinogen nisu u potpunosti zadovoljavajuće, posebno u pogledu stabilnosti tečnosti.

[0005] U tom smislu, i dalje postoji potreba za tečnim kompozicijama koje sadrže fibrinogen jednostavnim za primenu.

Sažetak pronalaska:

[0006] Radeći na problemima stabilnosti svojstvenim kompozicijama koje sadrže fibrinogen, stranka koja podnosi patent razvila je posebnu formulaciju, kombinujući fibrinogen, arginin i glutamat, u posebnim odnosima koji doprinose stabilnosti u tečnom obliku pomenute formulacije tokom vremena. Na iznenađujući i povoljan način, stranka koja podnosi patent pokazala je da je moguće dobiti kompozicije koje sadrže fibrinogen naročito stabilne tokom vremena u tečnom obliku, koristeći ekvivalentne količine arginina i glutamata. Dakle, nije neophodno da se liofilizuju kompozicije koje sadrže fibrinogen da bi se obezbedila dugoročna stabilnost. Pored toga, stranka koja podnosi patent uspela je da razvije kompozicije koje sadrže fibrinogen posebno prilagođene za injekcije, na primer, intravenskim putem, smanjujući broj i količinu ekscipijenasa. Pronalazak generalno omogućava racionalizaciju i pojednostavljenje procesa proizvodnje ovih različitih kompozicija, što dovodi do uštede u vremenu i znatnog smanjenja troškova proizvodnje. Pogodno, pomenute kompozicije mogu da budu bez drugih ekscipijenasa, naročito ekscipijenasa za koje se zna da imaju osobine konzerviranja liofilizata, da bi se garantovala stabilnost tokom čuvanja u tečnom obliku spremnom za upotrebu. Predmet pronalaska je dakle tečna farmaceutska kompozicija koja sadrži:

od 10 do 30 g/l fibrinogena;

od 10 do 300 mM arginina; i

od 10 do 300 mM glutamata.

pri čemu je pH kompozicije u opsegu od 6 do 8.

[0007] U posebnom otelotvorenju, kompozicija se sastoji samo od fibrinogena, arginina i glutamata.

[0008] Kompozicija prema pronalasku sadrži od 10 g/l do 30 g/l fibrinogena, poželjno od 15 g/l do 25 g/l fibrinogena, još poželjnije od 15 g/l do 20 g/l fibrinogena, i još poželjnije 15 g/l ili 20 g/l ili 25 g/l fibrinogena.

[0009] Prema poželjnom otelotvorenju, fibrinogen je humani fibrinogen, posebno koji se dobija iz plazme.

[0010] Koncentracija arginina i koncentracija glutamata je u opsegu od 10 do 300 mM, poželjno u opsegu od 20 do 200 mM, poželjnije u opsegu od 30 do 100 mM, još poželjnije u opsegu od 50 do 80 mM.

[0011] U posebnom otelotvorenju, koncentracija arginina i koncentracija glutamata je od 10-80 mM. Takva koncentracija arginina i glutamata je posebno prilagođena za kompozicije koje sadrže fibrinogen namenjene za injekciju intravenskim putem.

[0012] U posebnom otelotvorenju, koncentracija arginina je u opsegu od 10 do 300 mM, poželjno u opsegu od 20 do 250 mM, poželjnije u opsegu od 50 do 250 mM.

[0013] U drugom posebnom otelotvorenju, koncentracija arginina je pogodno manja od 300 mM, poželjno manja od 250 mM, poželjno manja od 200 mM, još poželjnije manja od 150 mM. Takva koncentracija arginina je posebno prilagođena da se izbegne preveliko povećanje osmolaliteta.

[0014] U posebnom otelotvorenju, koncentracija glutamata je pogodno manja od 80 mM, poželjno manja od 70 mM, poželjno manja od 60 mM, još poželjnije manja od 50 mM. Takva koncentracija glutamata je posebno prilagođena kompozicijama koje sadrže fibrinogen namenjenim za injekciju intravenskim putem, kako bi se smanjili sekundarni efekti kod pacijenata.

[0015] U drugom pogodnom otelotvorenju, koncentracija glutamata je u opsegu od 10 do 80 mM, poželjno u opsegu od 20 do 70 mM, poželjnije u opsegu od 30 do 60 mM. Takva koncentracija glutamata je posebno prilagođena kompozicijama koje sadrže fibrinogen namenjenim za intravensku injekciju, kako bi se smanjili sekundarni efekti kod pacijenata.

[0016] U pogodnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži najmanje jednu aminokiselinu odabranu od alanina, asparagina, aspartata, cisteina, glutamina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina, valina, samu ili u kombinaciji, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0017] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži aminokiselinu pogodno odabranu od serina, prolina i/ili izoleucina, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0018] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži polarnu aminokiselinu kao što je serin, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0019] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži hidrofobnu aminokiselinu kao što je prolin ili izoleucin, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0020] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži surfaktant, poželjno Pluronic®F68, polisorbat 80 ili polisorbat 20 ili alkil šećere, poželjno u koncentraciji od oko 1-500 ppm.

[0021] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži trinatrijum citrat, poželjno u koncentraciji od oko 1-15 mM

[0022] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži albumin, u koncentraciji od 5-1000 ppm, poželjno u koncentraciji od 5-500 mM.

[0023] Kompozicija prema pronalasku je pogodno tečna kompozicija spremna za upotrebu.

[0024] Kompozicija prema pronalasku je pogodno u obliku prilagođenom za okularnu, nazalnu, intraaurikularnu, oralnu, sublingvalnu, pulmonarnu, intraperitonealnu, intravensku, topikalnu, perkutanu, supkutanu, intradermalnu, intramuskularnu, transmukoznu, vaginalnu, rektalnu primenu, poželjno za intravensku primenu.

Detaljan opis:

Definicije

[0025] U okviru pronalaska, „fibrinogen“ je humani fibrinogen. To može da biti funkcionalni humani fibrinogen, sa sekvencom sličnom ili identičnom sekvenci normalnog humanog fibrinogena, i svakom intermedijernom frakcijom dobijenom tokom postupka za proizvodnju kompozicije koja sadrži fibrinogen.

[0026] Fibrinogen je protein koji se sastoji od dimera tri polipeptidna lanca koji se nazivaju alfa, beta i gama. Fibrinogen je dakle dimer, i svaki monomer se sastoji od tri lanca (alfa, beta, gama). Glavni oblik fibrinogena ima molekulsku masu (Mm) od 340 kDa. Fibrinogen je sastavljen od dve identične podjedinice povezane disulfidnim mostovima, koji molekulu daju oblik vlakna koje sadrži 3 globule: jednu centralnu (domen E) i dve distalne (domeni D). Ceo molekul sadrži 2964 aminokiseline: 610 aminokiselina za alfa (α) lanac, 461 aminokiselinu za beta (β) lanac, i 411 aminokiselina za lanac gama (y). Fibrinogen je uključen u primarnu hemostazu, kao i u koagulaciju. Najčešće se propisuje za lečenje komplikacija povezanih sa konstitucionalnom ili teškom afibrinogenemijom i sindromima krvarenja ili rizikom od krvarenja povezanim sa hipofibrinogenemijom.

[0027] Prema pronalasku, može da se koristi više izvora sirovine koja sadrži fibrinogen. Kompozicija prema pronalasku koja sadrži fibrinogen tako koristi kompoziciju fibrinogena, posebno iz različitih izvora. Kompozicija fibrinogena tako može biti dobijena od krvne plazme, supernatanta ćelijske kulture, ili mleka transgenih životinja.

[0028] U posebnom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku je frakcija plazme, poželjno frakcija plazme dobijena od prethodno prečišćene krvne plazme.

[0029] „Frakcija plazme dobijena od prethodno prečišćene krvne plazme“ je svaka frakcija ili podfrakcija humane krvne plazme, koja je prošla kroz jedan ili više koraka prečišćavanja. Pomenute frakcije plazme tako uključuju kriosupernatant, krioprecipitat plazme (ponovo suspendovan), frakciju I dobijenu frakcionisanjem pomoću etanola (prema postupku Kona, ili Kistlera i Ničmana), hromatografske eluate i frakcije neadsorbovane na hromatografskoj koloni, uključujući višekolonsku hromatografiju, i filtrate.

[0030] U poželjnom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku je dobijena od hromatografskog eluata ili frakcije neadsorbovane na hromatografskoj koloni, uključujući višekolonsku hromatografiju.

[0031] Tako, u poželjnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku je dobijena od frakcije plazme dobijene od kriosupernatanta ili ponovo suspendovanog krioprecipitata.

[0032] Prema pronalasku, „kriosupernatant“ odgovara tečnoj fazi dobijenoj posle otapanja zamrznute plazme (krioprecipitacija). Posebno, kriosupernatant može da se dobije zamrzavanjem krvne plazme na temperaturi u opsegu od -10°C do - 40°C, zatim blagim otapanjem na temperaturi u opsegu od 0°C do 6°C, poželjno od 0°C do 1°C, a zatim centrifugiranjem odmrznute plazme radi razdvajanja krioprecipitata i kriosupernatanta.

Krioprecipitat je koncentrat fibrinogena, fibronektina, fon Vilebrandovog faktora i faktora VIII, dok kriosupernatant sadrži faktore komplementa, faktore koji zavise od vitamina K, kao što su protein C, protein S, protein Z, faktor II, faktor VII, faktor IX i faktor X, fibrinogen, imunoglobulini i albumin.

[0033] U poželjnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku može biti dobijena prema postupku koji je opisala stranka koja podnosi patent u zahtevu EP1739093 ili u zahtevu WO2015/136217.

[0034] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku se dobija od mleka transgenih životinja, na primer, dobijena je prema postupku opisanom u WO00/17234 ili WO00/17239.

[0035] U jednom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku se može dobiti prema postupku koji obuhvata sledeće faze:

- faza prečišćavanja afinitetnom hromatografijom;

- najmanje jedna faza biološkog obezbeđivanja; i

- faza formulacije u tečnom obliku.

[0036] U posebnom otelotvorenju pronalaska, faza prečišćavanja afinitetnom hromatografijom se izvodi putem afinitetne hromatografije koristeći afinitetne ligande odabrane od antitela, fragmenata antitela, derivata antitela, ili hemijskih liganda, kao što su peptidi, mimetički peptidi, peptoidi, nanofitini ili još oligonukleotidni ligandi, kao što su aptameri.

[0037] U posebnom otelotvorenju pronalaska, stabilna tečna kompozicija, koja sadrži fibrinogen, dobija se prema postupku koji obuhvata sledeće faze:

- dobijanje frakcije kriosupernatanta od krvne plazme,

- taloženje kriosupernatanta sa 8% etanola da bi se dobila frakcija obogaćena fibrinogenom,

- prečišćavanje frakcije krvne plazme obogaćene fibrinogenom nakon ponovnog suspendovanja, separacijom na gelu za afinitetnu hromatografiju koristeći prvenstveno afinitetne ligande odabrane od antitela, fragmenata antitela, derivata antitela, ili hemijskih liganda, kao što su peptidi, mimetički peptidi, peptoidi, nanofitini ili još oligonukleotidni ligandi, kao što su aptameri,

- prikupljanje prečišćene adsorbovane frakcije koja sadrži fibrinogen,

- eventualno, dodavanje farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

[0038] U posebnom otelotvorenju, postupak pored toga sadrži fazu čuvanja tokom najmanje 3 meseca na 5°C.

[0039] U posebnom otelotvorenju pronalaska, korišćena afinitetna hromatografija koja se koristi je afinitetna matrica sa ligandima tipa fragmenata dobijenih od antitela lame, kao što je matrica za fibrinogen CaptureSelect (Life Technologies).

[0040] Na naročito pogodan način, kompozicija prema pronalasku ne sadrži proteaze i/ili aktivatore fibrinolize.

[0041] Pod „kompozicijom fibrinogena koja ne sadrži proteaze i/ili aktivatore fibrinolize“ podrazumeva se da je kompozicija fibrinogena prošla kroz jednu ili više faza koje omogućavaju eliminaciju proteaza kao što je trombin, protrombin, plazmin, plazminogen, tako da je preostala količina proteaza i/ili aktivatora:

- veoma smanjena u poređenju sa rastvorom fibrinogena prethodno prečišćenog pre faze hromatografije, i/ili

- nula, i/ili

- manja od praga detekcije metoda koje obično koriste stručnjaci.

[0042] Na pogodan način, nivo preostalog protrombina je manji od 5 µUI/mg fibrinogena, nivo preostalog plazminogena je manji od 15 ng/mg fibrinogena.

[0043] U posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku dakle ne sadrži proteaze kao što je trombin i/ili plazmin i/ili njihove proenzime protrombin (faktor II koagulacije) i/ili plazminogen, koji su zimogeni koji potencijalno mogu da se aktiviraju.

[0044] Pod „kompozicijom koja sadrži fibrinogen“ podrazumeva se kompozicija koja sadrži - humani fibrinogen

- eventualno jedan ili više proteina, zajedno prečišćenih ili pratećih

- farmaceutski prihvatljive ekscipijense.

[0045] Prema pronalasku, zajedno prečišćeni proteini ili oni koji prate fibrinogen mogu da se sastoje od jednog ili više proteina plazme. Pod „proteinima plazme“ prema pronalasku se podrazumevaju svi proteini, a naročito svi proteini od interesa za industriju ili lečenje, koji su sadržani u krvnoj plazmi. Proteini krvne plazme obuhvataju albumin, alfa/makroglobulin, antihimotripsin, antitrombin, antitripsin, Apo A, Apo B, Apo C, Apo D, Apo E, Apo F, Apo G, beta XIIa, C 1-inhibitor, C-reaktivni protein, C7, C1r, C1s, C2 C3, C4, C4bP, C5, C6, C1q, C8, C9, karboksipeptidazu N, ceruloplazmin, faktor B, faktor D, faktor H, faktor I, faktor IX, faktor V, faktor VII, faktor VIIa, faktor VIII, faktor X, faktor XI, faktor XII, faktor XIII, fibrinogen, fibronektin, haptoglobin, hemopeksin, heparinski kofaktor II, GP bogat histidinom, IgA, IgD, IgE, IgG, ITI, IgM, kininazu II, kininogen HPM, lizozim, PAI 2, PAI I, PCI, plazmin, inhibitor plazmina, plazminogen, prealbumin, prekalikrein, properdin, proteaza neksin INH, protein C, protein S, protein Z, protrombin, serumski protein amiloid (SAP), TFPI, tiol-proteinazu, trombomodulin, tkivni faktor (TF), TPA, transkobalamin II, transkortin, transferin, vitronektin, i Vilebrandov faktor. Naročito, proteini plazme obuhvataju koagulacione proteine, odnosno proteine plazme uključene u lanac kaskadnih reakcija koje dovode do stvaranja krvnog ugruška. Koagulacioni proteini obuhvataju faktor I (fibrinogen), faktor II (protrombin), faktor V (proakcelerin), faktor VII (prokonvertin), faktor VIII (antihemofilijski faktor A), faktor IX (antihemofilijski faktor B), faktor X (Stjuartov faktor), faktor XI (Rozentalov faktor ili PTA), faktor XII (Hagemanov faktor), faktor XIII (stabilizujući faktor fibrina ili FSF), PK (prekalikrein) KHPM (kininogen velike molekulske mase), faktor III (tromboplastin ili tkivni faktor), kofaktor II heparina (HCII), protein C (PC), trombomodulin (TM), protein S (PS), Vilebrandov faktor (Wf) i inhibitor puta tkivnog faktora (TFPI), ili još tkivne faktore.

[0046] U nekim otelotvorenjima, protein plazme se sastoji od koagulacionog proteina sa enzimskom aktivnošću. Koagulacioni proteini sa enzimskom aktivnošću obuhvataju aktivirane oblike faktora II (protrombin), faktora VII (prokonvertin), faktora IX (antihemofilijski faktor B), faktora X (Stjuartov faktor), faktora XI (Rozentalov faktor ili PTA), faktora XII (Hagemanov faktor), faktora XIII (stabilizujući faktor fibrina ili FSF) i PK (prekalikrein).

[0047] Termin „ farmaceutski prihvatljiv ekscipijens“ odgovara svakom ekscipijensu koji se povoljno koristi za formulaciju humanih proteina, posebno supstancama odabranim od soli, aminokiselina, šećera, surfaktanta ili bilo kog drugog ekscipijensa.

[0048] Termin „ekvimolarni“ odnosi se na identičnu ili ekvivalentu količinu u molovima/l ili milimolovima/l (M ili mM) više ekscipijenasa, konkretno dva ekscipijensa, sa odnosom dva ekscipijensa u opsegu od 0,8 do 1,2, poželjno od 0,9 do 1,1, još poželjnije otprilike jednakim 1,0. Konkretno, kompozicija prema pronalasku pogodno sadrži ekvimolarnu količinu arginina i glutamata, sa odnosom arginin/glutamat u opsegu od 0,8 do 1,2, poželjno od 0,9 do 1,1, još poželjnije otprilike jednakim 1,0; ili sa odnosom glutamat/arginin u opsegu od 0,8 do 1,2, poželjno od 0,9 do 1,1, još poželjnije otprilike jednakim 1,0.

[0049] Termin „stabilan“ odgovara fizičkoj i/ili hemijskoj stabilnosti kompozicije koja sadrži fibrinogen. Termin „fizička stabilnost“ odnosi se na smanjenje ili odsustvo nastajanja nerastvornih ili rastvornih agregata u dimernom, oligomernom ili polimernom obliku fibrinogena, na smanjenje ili odsustvo nastajanja taloga, kao i na smanjenje ili odsustvo bilo kakve strukturne denaturacije molekula.

[0050] Termin „hemijska stabilnost“ odnosi se na smanjenje ili odsustvo bilo kakve hemijske modifikacije kompozicije koja sadrži fibrinogen tokom čuvanja, u tečnom stanju, pod ubrzanim uslovima.

[0051] Stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen može da se proceni različitim postupcima, naročito postupcima za ubrzano ispitivanje stabilnosti ili postupcima za dugoročnu stabilnost.

[0052] Postupci za ubrzano ispitivanje stabilnosti posebno sadrže testove za mehanički stres putem zagrevanja.

[0053] U jednom otelotvorenju, stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen određuje se nakon toplotnog stresa (stres putem zagrevanja), zagrevanjem u termostatiranom kupatilu na

1

37°C, na primer za merenje u terminima T0, T+7 dana i T+14 dana. Zatim se merenje čestica u rastvoru veličine veće od praga detekcije posmatrano ljudskim okom (oko 50 µm) vrši posebno vizuelnim pregledom, na primer pomoću optičkog uređaja iz Evropske farmakopeje (opalescencija, formiranje čestica), merenjem zamućenja pomoću spektrofotometra koji meri apsorbancu ili optičku gustinu na 400 nm.

[0054] Test dugoročne stabilnosti može da se izvede pod različitim uslovima temperature, vlažnosti vazduha i osvetljenja. Poželjno, u okviru predmetnog pronalaska, test stabilnosti može da traje najmanje 1 nedelju, poželjno najmanje 1 mesec, poželjno najmanje 2 meseca, poželjno najmanje 3 meseca, poželjno najmanje 4 meseca, poželjno najmanje 5 meseci, poželjno najmanje 6 meseci.

[0055] Tipično, merenje parametara stabilnosti, kao što su napred definisani, obavlja se

- pre stavljanja na test stabilnosti kompozicije koja sadrži fibrinogen; takođe može da se govori o početnom nivou; i

- tokom, ili na kraju pomenutog testa stabilnosti,

pri čemu se podrazumeva da pomenuti test stabilnosti može da traje najmanje 1 nedelju, poželjno najmanje 1 mesec, poželjno najmanje 2 meseca, poželjno najmanje 3 meseca, poželjno najmanje 4 meseca, poželjno najmanje 5 meseci, poželjno najmanje 6 meseci.

[0056] Analitički postupci nakon stavljanja na dugoročnu stabilnost posebno sadrže analizu vizuelnim pregledom, posebno pomoću optičkog uređaja iz Evropske farmakopeje (opalescencija, formiranje čestica), merenjem zamućenja pomoću spektrofotometra koji meri apsorbancu ili optičku gustinu na 400 nm, koja omogućava procenu prisustva ili odsustva razlaganja proizvoda detektovanjem zamućenja u rastvoru.

[0057] U jednom otelotvorenju, stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen definisana je putem merenja nivoa monomera sačuvanih tokom testa stabilnosti pomoću metode hromatografije pod visokim pritiskom na molekulskim sitima (HPSEC). Ti postupci su dobro poznati stručnjacima.

[0058] Kompozicija fibrinogena se pogodno smatra stabilnom ako je količina monomera fibrinogena sačuvanih tokom postavljanja na test stabilnosti veća od 50%, poželjno veća od 60%, poželjno veća od 70%, poželjno veća od 80%, poželjno veća od 90%, poželjno veća od 95% početnog nivoa monomera fibrinogena.

[0059] Poželjnije, količina monomera fibrinogena sačuvanih tokom postavljanja na test stabilnosti veća je od 70% početnog nivoa monomera fibrinogena.

[0060] Pod „početnim nivoom monomera fibrinogena“ podrazumeva se nivo monomera određen pre postavljanja na test stabilnosti. Tipično, količina monomera fibrinogena se meri pre postavljanja na test stabilnosti, i tokom, ili na kraju pomenutog testa stabilnosti.

[0061] Alternativno, kompozicija fibrinogena se smatra stabilnom ako je varijacija količine monomera fibrinogena tokom testa stabilnosti manja od 20%, poželjno manja od 10%, poželjno manja od 5%, poželjno manja od 1%.

[0062] U drugom otelotvorenju, stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen definisana je putem merenja nivoa polimera fibrinogena formiranih tokom postavljanja na test stabilnosti pomoću HPSEC. Polimeri fibrinogena su polimeri koji sadrže najmanje 2 polipeptidna lanca alfa, 2 polipeptidna lanca beta i 2 polipeptidna lanca gama fibrinogena. Ovaj termin takođe obuhvata trimere fibrinogena.

[0063] Kompozicija fibrinogena se pogodno smatra stabilnom ako je količina polimera fibrinogena formiranih tokom postavljanja na test stabilnosti manja od 10%, poželjno manja od 20%, poželjno manja od 30%, poželjno manja od 40%, poželjno manja od 50% u odnosu na početni nivo polimera fibrinogena. Tipično, početni nivo polimera fibrinogena odgovara svim polimernim oblicima fibrinogena (trimeri i veći) pre postavljanja na test stabilnosti.

[0064] Poželjnije, količina polimera fibrinogena formiranih tokom postavljanja na test stabilnosti manja je od 30%. Tipično, količina polimera fibrinogena se meri pre postavljanja na test stabilnosti, i tokom, ili na kraju pomenutog testa stabilnosti.

[0065] Alternativno, kompozicija fibrinogena se smatra stabilnom ako je varijacija količine polimera fibrinogena tokom testa stabilnosti manja od 20%, poželjno manja od 10%, poželjno manja od 5%, poželjno manja od 1%.

[0066] U drugom otelotvorenju, stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen određuje se putem merenja koagulabilne aktivnosti fibrinogena u odnosu na merenje antigenosti fibrinogena (zove se i specifična aktivnost). Na posebno povoljan način, stabilna kompozicija fibrinogena predstavlja odnos koagulabilnog fibrinogena/antigenskog fibrinogena veći od 0,5; poželjno veći od 0,6; veći od 0,7; veći od 0,8; veći od 0,9; još poželjnije otprilike jednak 1,0.

[0067] Pod „koagulabilnim fibrinogenom“ podrazumeva se merenje funkcionalnog fibrinogena tehnikom koagulacije, određeno prema Klausovoj metodi. Koagulabilna aktivnost je izražena u g/l rastvora fibrinogena. Ta tehnika je poznata stručnjacima, i može se videti u publikaciji Von Clauss, A. (1957) Gerinnungsphysiologische schnellmethode zur bestimmung des fibrinogens. Acta Haematologica, 17, 237-246.

[0068] Pod „antigenskim fibrinogenom“ podrazumeva se količina fibrinogena, bilo da je aktivan ili ne, određena nefelometrijskom metodom. Količina antigenskog fibrinogena se izražava u g/l.

[0069] Stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen određuje se takođe putem merenja na SDS PAGE očuvanja alfa, beta i gama lanaca fibrinogena, poželjno pre i posle testa stabilnosti, kao što je definisano u okviru predmetnog pronalaska. Tako, kompozicija fibrinogena se pogodno smatra stabilnom ako:

- svi alfa lanci su očuvani najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvani oko 100%, i/ili

- svi beta lanci su očuvani najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvani oko 100%, i/ili

- svi gama lanci su očuvani najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvani oko 100%.

[0070] Stabilnost kompozicije koja sadrži fibrinogen takođe je definisana merenjem zamućenja pomoću UV spektrofotometrije na 400 nm. Zapravo, zamućenje odražava količinu materije koja zamućuje rastvor. Kompozicija fibrinogena se pogodno smatra stabilnom ako je

1

zamućenje izmereno posle testa stabilnosti kao što je definisano u predmetnom pronalasku uporedivo sa zamućenjem izmerenim pre stabilnosti.

[0071] Pogodno, zamućenje izmereno posle postavljanja testa stabilnosti iznosi manje od 130%, manje od 120%, manje od 110%, pogodno iznosi 100% zamućenja izmerenog pre stabilnosti.

[0072] U pogodnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija koja sadrži fibrinogen stabilna je najmanje 1 mesec, najmanje 2 meseca, najmanje 3 meseca, najmanje 4 meseca, najmanje 5 meseci, najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C.

[0073] U pogodnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija koja sadrži fibrinogen stabilna je 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C.

[0074] Pod „kompozicijom fibrinogena u tečnom obliku“ podrazumeva se kompozicija koja sadrži fibrinogen u rastvoru, poželjno koji nije podvrgnut fazi liofilizacije, desikacije, dehidratacije, atomizacije ili sušenja, i koji ne treba da se rekonstituiše pre upotrebe.

[0075] U smislu pronalaska, izraz „u opsegu od x do y“ znači da su vrednosti x i y uključene.

Formulacije:

[0076] Kompozicija prema pronalasku sadrži od 10 g/l do 30 g/l fibrinogena (navedena u nastavku kao kompozicija fibrinogena sa 10-30 g/l), poželjno od 15 g/l do 25 g/l fibrinogena, još poželjno od 15 g/l do 20 g/l fibrinogena, i još poželjnije 15 g/l ili 20 g/l ili 25 g/l fibrinogena.

[0077] U smislu predmetnog pronalaska, podrazumevaju se koncentracije na nivou finalne kompozicije, spremne za upotrebu. Koncentracije su određene u odnosu na kompozicije u tečnom obliku.

[0078] Na posebno povoljan način, stranka koja podnosi patent pokazala je da je moguće dobiti tečne kompozicije koje sadrže 10-30 g/l fibrinogena naročito stabilne tokom vremena, koristeći minimalne količine ekscipijenasa. Tako, prema pronalasku, tečne kompozicije fibrinogena sa 10-30 g/l pogodno sadrže od 10 do 300 mM arginina, na poželjan način od 20 do 200 mM, i od 10 do 300 mM glutamata, na poželjan način od 20 do 200 mM.

[0079] U posebnom otelotvorenju, koncentracija arginina je u opsegu od 10 do 300 mM, poželjno u opsegu od 20 do 250 mM, poželjnije u opsegu od 50 do 250 mM.

[0080] U drugom posebnom otelotvorenju, koncentracija arginina je pogodno manja od 300 mM, poželjno manja od 250 mM, poželjno manja od 200 mM, još poželjnije manja od 150 mM. Takva koncentracija arginina je posebno prilagođena da se izbegne preveliko povećanje osmolaliteta.

[0081] U posebnom otelotvorenju, koncentracija glutamata je pogodno manja od 80 mM, poželjno manja od 70 mM, poželjno manja od 60 mM, još poželjnije manja od 50 mM. Takva koncentracija glutamata je posebno prilagođena kompozicijama koje sadrže fibrinogen namenjenim za injekciju intravenskim putem, kako bi se smanjili sekundarni efekti kod pacijenata.

[0082] U drugom pogodnom otelotvorenju, koncentracija glutamata je u opsegu od 10 do 80 mM, poželjno u opsegu od 20 do 70 mM, poželjnije u opsegu od 30 do 60 mM. Takva koncentracija glutamata je posebno prilagođena kompozicijama koje sadrže fibrinogen namenjenim za intravensku injekciju, kako bi se smanjili sekundarni efekti kod pacijenata.

[0083] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, tečna kompozicija fibrinogena sa 10-30 g/l sadrži arginin i glutamat u ekvimolarnim količinama. Stranka koja podnosi patent pokazala je na neočekivani način da dodavanje glutamata i arginina u ekvimolarnim količinama pogodno dozvoljava stabilizaciju formulacije u tečnom obliku uz održavanje dobre podnošljivosti za pacijente. Efekat stabilizacije je srazmeran povećanju količina glutamata i arginina. Stranka koja podnosi patent dokazala je optimalni efekat između 10 i 80 mM, zapravo, ispod 80 mM, međutim, kompozicija, iako je stabilna, predstavlja nivo glutamata koji može da izazove sekundarne efekte kod pacijenata.

[0084] Slično tome, u jednom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija fibrinogena sa 10-30 g/l pogodno sadrži od 1 do 500 ppm surfaktanta, poželjno od 20 do 400 ppm surfaktanta, još poželjno od 50 do 400 ppm surfaktanta, poželjnije od 150 do 250 ppm.

1

Surfaktant koji se koristi u kompoziciji prema pronalasku pogodno je odabran od nejonskih surfaktanata, poželjno polisorbata i posebno od polisorbata 80 (ili Tween®80, koji je polioksietilen sorbitan monooleat), i polisorbata 20 (ili Tween®20, koji je polioksietilen sorbitan monolaurat). Eventualno, surfaktant može biti odabran od poloksamera, polioksietilen alkil etara, blok kopolimera etilen/polipropilen, alkil glukozida ili alkil šećera, i Pluronic®F68 (polietilen polipropilen glikol). Surfaktanti takođe mogu međusobno da se kombinuju. Na pogodan način, surfaktant omogućava stabilizaciju interakcije između molekula u tečnom obliku.

[0085] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija dodatno sadrži najmanje jednu aminokiselinu odabranu od alanina, asparagina, aspartata, cisteina, glutamina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina, valina, samu ili u kombinaciji, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0086] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija dodatno sadrži aminokiselinu pogodno odabranu od serina, prolina i/ili izoleucina, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM. Na pogodan način, aminokiselina stabilizuje kompoziciju prema pronalasku u tečnom obliku.

[0087] U posebnom otelotvorenju, kompozicija dodatno sadrži polarnu aminokiselinu kao što je serin, poželjno u koncentraciji od oko 1-300 mM.

[0088] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija takođe sadrži najmanje jednu hidrofobnu aminokiselinu odabranu od leucina, alanina, fenilalanina, triptofana, valina, metionina, izoleucina, prolina, cisteina i/ili glicina. Na poželjan način, hidrofobna aminokiselina je odabrana od prolina i/ili izoleucina. Na pogodan način, hidrofobna aminokiselina stabilizuje kompoziciju prema pronalasku u tečnom obliku.

[0089] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija takođe sadrži pufer, konkretno histidinski pufer, fosfatni pufer, Tris-HCl ili trinatrijum citrat, poželjno trinatrijum citrat, poželjno u koncentraciji u opsegu od 1 do 15 mM, poželjnije u koncentraciji u opsegu od 7 do 10 mM, još poželjnije u koncentraciji u opsegu od 8 do 9 mM.

1

[0090] Prema posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija takođe sadrži albumin, u koncentraciji u opsegu od 5 do 1000 ppm, poželjno u koncentraciji u opsegu od 5 do 500 mM. Na pogodan način, albumin prisutan u kompoziciji prema pronalasku je humani albumin iz plazme, ili rekombinantni.

[0091] Na pogodan način, stranka koja podnosi patent pokazala je da takve kompozicije imaju osmolalitet posebno prilagođen primeni putem injekcije, posebno intravenskim putem, i to bez dodavanja većeg broja i/ili veće količine ekscipijensa. Takođe, pronalazak predlaže kompoziciju fibrinogena sa 15-25 g/l ili 15-20 g/l koja ima izmereni osmolalitet u opsegu od oko 250 do 550 mOsm/kg. U smislu pronalaska, i ako nije drugačije naglašeno, pod osmolalitetom kompozicije podrazumeva se osmolalitet izmeren u pomenutoj kompoziciji.

[0092] Osmolalitet se pogodno meri pomoću osmometra kalibrisanog pomoću standardnih rastvora, i posebno prema metodi koju je odobrila Evropska farmakopeja (Evropska farmakopeja 5.0 iz 2005. -01/2005:2.2.35.). Naravno, može da se koristi svaka druga metoda za merenje osmolaliteta.

[0093] U posebnom otelotvorenju pronalaska, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin i glutamat. Takva formulacija omogućava dobru stabilizaciju tečne kompozicije fibrinogena i skraćenje trajanja i smanjenje troškova pripreme na industrijskoj skali zahvaljujući prisustvu minimalnog efikasnog broja i minimalne efikasne količine ekscipijenasa. Pogodno, takva kompozicija ima osmolalitet kompatibilan sa primenom putem injekcije, posebno intravenskim putem.

[0094] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat i surfaktant.

[0095] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat, i najmanje jedna dodatna aminokiselina.

[0096] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat, i najmanje jedna hidrofobna aminokiselina.

1

[0097] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat, surfaktant, i najmanje jedna dodatna aminokiselina.

[0098] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat, surfaktant, i najmanje jedna hidrofobna aminokiselina.

[0099] U drugom posebnom otelotvorenju, jedini ekscipijensi u kompoziciji fibrinogena prema pronalasku su arginin, glutamat i humani albumin.

[0100] U posebnom otelotvorenju, kompozicija se suštinski sastoji od fibrinogena, arginina, glutamata, u smislu da je svaki drugi ekscipijens koji može biti prisutan, prisutan samo u tragovima.

[0101] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku nema dvovalentne jone, posebno dvovalentne jone metala, posebno kalcijum i/ili natrijum.

[0102] Na posebno povoljan način, kompozicija prema pronalasku nema ekscipijense za koje je poznato da imaju ulogu u stabilizaciji liofilizata, kao što je natrijum hlorid i/ili karboksimetil dekstran (CMD).

[0103] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku nema albumin.

[0104] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku nema šećere.

[0105] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija fibrinogena prema pronalasku nema inhibitore proteaza i/ili antifibrinolitike.

[0106] Pod terminom „inhibitori proteaza i/ili antifibrinolitici“ podrazumeva se svaki molekul sa antiproteaznom aktivnošću, posebno svaki molekul sa inhibitorskom aktivnošću, posebno svaki molekul sa inhibitorskom aktivnošću serin proteaze i/ili antifibrinolitika, posebno svaki molekul sa inhibitorskom aktivnošću trombina i/ili antiplazmina, posebno hirudin, benzamidin, aprotinin, fenil metil sulfonil fluorid (PMSF), pepstatin, leupeptin, antitrombin

1

III vezan ili nevezan za heparin, alfa 2 makroglobulin, alfa 1 antitripsin, heksanska kiselina ili epsilon aminokaproinska kiselina, traneksaminska kiselina, alfa 2 antiplazmin, diizopropil fluorfosfat (DSP), antihimotripsin.

[0107] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija fibrinogena prema pronalasku nema hirudin i/ili benzamidin i/ili aprotinin i/ili PMSF i/ili pepstatin i/ili leupeptin i/ili antitrombin III vezan ili nevezan za heparin i/ili alfa 2 makroglobulin i/ili alfa 1 antitripsin i/ili heksansku kiselinu i/ili epsilon aminokaproinsku kiselinu i/ili traneksaminsku kiselinu i/ili alfa 2 antiplazmin.

[0108] U posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku ne sadrži druge zajedno prečišćene proteine, pogodno ne sadrži FXIII i/ili fibronektin.

[0109] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija fibrinogena prema pronalasku takođe može da sadrži jedan ili više pratećih proteina, eventualno zajedno prečišćene. U posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija prema pronalasku pogodno ne sadrži FXIII.

[0110] Pogodno, kompozicija prema pronalasku nema fibrin.

[0111] U drugom posebnom otelotvorenju pronalaska, kompozicija se suštinski sastoji od fibrinogena, arginina, glutamata, eventualno surfaktanta, poželjno tween 80, eventualno hidrofobne aminokiseline, poželjno prolina i/ili izoleucina, i eventualno pufera kao što je trinatrijum citrat, u smislu da je svaki drugi ekscipijens koji može biti prisutan, prisutan samo u tragovima.

[0112] Prema pronalasku, finalni pH kompozicije je pogodno u opsegu od 6 do 8. Poželjno, pH je oko 6,0-7,5, još poželjnije od 6,0-7,0. pH od 6,0-7,0 zapravo daje posebno zadovoljavajuće rezultate u smislu stabilnosti tečnosti tokom vremena i istovremeno omogućava da se ograniči pojava agregacije i degradacije. Finalni pH se odnosi na pH kompozicije nakon formulacije, odnosno kompozicije spremne za upotrebu. Ako nije drugačije naglašeno, u predmetnom opisu, pH kompozicije označava finalni pH.

[0113] Poželjna kompozicija fibrinogena sa 10-30 g/l prema pronalasku sadrži:

1

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- eventualno 1-15 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

- eventualno 1-300 mM druge aminokiseline, konkretno 1-300 mM prolina i/ili 1-300 mM izoleucina i/ili 1-300 mM serina

- eventualno 1-500 ppm surfaktanta, poželjno 20-400 ppm, na još poželjniji način 150-250 ppm

- eventualno 5-1000 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0114] Poželjna kompozicija fibrinogena sa 10-30 g/l prema pronalasku sadrži:

- 20-200 mM arginina

- 20-200 mM glutamata

- eventualno 7-10 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

- eventualno 1-100 mM druge aminokiseline, konkretno 1-100 mM prolina i/ili 1-100 mM izoleucina i/ili 1-100 mM serina

- eventualno 20-400 ppm surfaktanta

- eventualno 5-500 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0115] Poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

- 150 mM arginina

- 80 mM glutamata

- 8,5 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

- 200 ppm surfaktanta, poželjno polisorbata80, polisorbata20 ili Pluronic®F68 - eventualno 1-100 mM druge aminokiseline, konkretno 1-100 mM prolina i/ili 1-100 mM izoleucina i/ili 1-100 mM serina

- eventualno 5-500 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-7,0.

[0116] Poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

2

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0117] Poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0118] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-15 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0119] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-15 mM trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0120] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM druge aminokiseline

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0121] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži: - 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM hidrofobne aminokiseline

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0122] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM druge aminokiseline

- 1-15 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0123] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM hidrofobne aminokiseline

- 1-15 mM trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0124] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-25 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM prolina i/ili izoleucina i/ili serina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0125] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM prolina i/ili izoleucina i/ili serina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0126] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM prolina i/ili izoleucina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0127] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-500 ppm surfaktanta, poželjno 50-400 ppm, na još poželjniji način 150-250 ppm pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0128] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-500 ppm surfaktanta, poželjno 50-400 ppm, na još poželjniji način 150-250 ppm - 1-15 mM trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0129] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-500 ppm polisorbata 80, poželjno 50-400 ppm, na još poželjniji način 150-250 ppm pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0130] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

2

- 1-300 mM hidrofobne aminokiseline

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0131] Druga poželjna kompozicija fibrinogena sa 15-20 g/l prema pronalasku sadrži:

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- 1-300 mM prolina i/ili izoleucina

- 1-500 ppm polisorbata 80, poželjno 50-400 ppm, na još poželjniji način 150-250 ppm - eventualno 1-15 mM trinatrijum citrata

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

[0132] Osmolalitet ove kompozicije fibrinogena pogodno je oko 225-715 mOsm/kg.

[0133] Na iznenađujući i povoljan način, stranka koja podnosi patent pokazala je da je koncentracija arginina od oko 10-80 mM, /- 10% kombinovana sa koncentracijom glutamata od oko 10-80 mM, /- 10%, dovoljna za održavanje stabilnosti tečne kompozicije fibrinogena sa 15-20 g/l uz održavanje osmolaliteta u opsegu od 225 do 500 mOsm/kg u kompoziciji, dok bi bilo očekivano da veće koncentracije garantuju stabilnost tečnosti, paralelno povećavajući osmolalitet pomenutih kompozicija. Međutim, preveliki osmolalitet može da izazove dehidrataciju ćelija (izlazak intracelularne vode u ekstracelularnu sredinu).

[0134] Na pogodan način, kompozicija prema pronalasku ima čistoću veću ili jednaku 70%, na poželjan način veću ili jednaku 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.

[0135] Kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima količinu monomera fibrinogena sačuvanih tokom postavljanja na test stabilnosti veću od 50%, poželjno veću od 60%, poželjno veću od 70%, poželjno veću od 80%, poželjno veću od 90%, poželjno veću od 95% početnog nivoa monomera fibrinogena.

[0136] Poželjnije, kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 5°C ± 3°C pogodno ima količinu monomera fibrinogena sačuvanih tokom postavljanja na test stabilnosti veću od 70% početnog nivoa monomera fibrinogena.

[0137] Alternativno, kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku, pogodno ima varijaciju količine monomera fibrinogena tokom testa stabilnosti manju od 20%, poželjno manju od 10%, poželjno manju od 5%, poželjno manju od 1%.

[0138] Kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima količinu polimera fibrinogena formiranih tokom postavljanja na test stabilnosti manju od 10%, poželjno manju od 20%, poželjno manju od 30%, poželjno manju od 40%, poželjno manju od 50%, u odnosu na početni nivo polimera fibrinogena. Tipično, početni nivo polimera fibrinogena odgovara svim polimernim oblicima fibrinogena (trimeri i veći) pre postavljanja na test stabilnosti.

[0139] Poželjnije, kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima količinu polimera fibrinogena formiranih tokom postavljanja na test stabilnosti manju od 30%.

Tipično, količina polimera fibrinogena se meri pre postavljanja na test stabilnosti, i tokom, ili na kraju pomenutog testa stabilnosti. Alternativno, kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku, pogodno ima varijaciju količine polimera fibrinogena tokom testa stabilnosti manju od 20%, poželjno manju od 10%, poželjno manju od 5%, poželjno manju od 1%.

[0140] Kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima odnos koagulabilnog fibrinogena/antigenskog fibrinogena veći od 0,5; poželjno veći od 0,6; veći od 0,7; veći od 0,8; veći od 0,9; još poželjnije otprilike jednak 1,0.

[0141] Kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima

- sve alfa lance očuvane najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvane oko 100%, i/ili

2

- sve beta lance očuvane najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvane oko 100%, i/ili

- sve gama lance očuvane najmanje 50%, poželjno najmanje 60%, poželjno najmanje 70%, poželjno najmanje 80%, poželjno najmanje 90%, poželjnije očuvane oko 100%.

[0142] Kompozicija fibrinogena prema pronalasku, u tečnom obliku i nakon čuvanja tokom najmanje 6 meseci na temperaturi od 2°C do 8°C pogodno ima zamućenje izmereno nakon postavljanja na test stabilnosti manje od 130%, manje od 120%, manje od 110%, pogodno iznosi 100% zamućenja izmerenog pre stabilnosti.

[0143] Kompozicije iz pronalaska mogu biti farmaceutske kompozicije, odnosno prilagođene za upotrebu u lečenju. Farmaceutske kompozicije iz pronalaska su korisne kao lekovi, posebno za lečenje konstitucionalne hipofibrinogenemije, disfibrinogenemije ili afibrinogenemije kod pacijenata sa spontanim ili posttraumatskim krvarenjem, ili kao dopunsko lečenje kod upravljanja teškom nekontrolisanom hemoragijom u okviru stečene hipofibrinogenemije.

[0144] Prema pronalasku, može da se koristi više izvora sirovine koja sadrži fibrinogen. Kompozicija fibrinogena tako može biti dobijena od krvne plazme, drugačije nazvana frakcije plazme, od supernatanta ćelijske kulture, ili mleka transgenih životinja.

[0145] U poželjnom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku nije podvrgnuta nijednoj prethodnoj fazi liofilizacije, desikacije, dehidratacije ili sušenja.

[0146] U poželjnom otelotvorenju, kompozicija prema pronalasku nije podvrgnuta nijednoj prethodnoj fazi rekonstitucije liofilizata.

[0147] Kompozicije prema pronalasku povoljno mogu biti podvrgnute najmanje jednom postupku za uklanjanje ili inaktivaciju infektivnih agensa

[0148] Inaktivacija virusa često obuhvata tretman hemijskim proizvodima, na primer rastvaračem i/ili deterdžentom i/ili toplotom (pasterizacija i/ili toplotna sterilizacija) i/ili zračenjem (gama i/ili putem UVC) i/ili tretman pomoću pH (tretman kiselim pH).

2

[0149] Poželjno, inaktivacija virusa sastoji se od faze tretmana zagrevanjem, ili tretmana rastvaračem i deterdžentom. Tretman rastvaračem i deterdžentom (generalno se zove tretman rastvarač/deterdžent, ili S/D) posebno obuhvata tretman tri-n-butil fosfatom (TnBP) i/ili deterdžentom odabranim od Triton X-100, Tween (poželjno Tween 80), natrijum holatom i 2-[4-(2,4,4-trimetilpentan-2-il)fenoksi]etanolom (Octoxinol).

[0150] Poželjno, faza eliminacije virusa sastoji se od nanofiltracije koja može da se koristi za uklanjanje infektivnih agensa, posebno virusa i nekonvencionalnih prenosivih agensa (ATNC). U slučaju proteina plazme, nanofiltracija se generalno odnosi na filtraciju koncentrata željenih proteina kroz filter veličine pora manje od 80 nm. Dostupni filteri su, na primer, filteri Planova BioEx, Planova® 75N, Planova® 35N, Planova® 20N ili Planova® 15N (Asahi corporation), Pegasus SV4, Ultipor DV 50 ili DV 20 (Pall corporation), Virosart CPV, Virosart HC ili Virosart HF (Sartorius), Viresolve® NFR, Pro ili NFP (Millipore). Nanofiltracija pogodno može da se izvodi na jednom filteru ili na više filtera identične ili opadajuće poroznosti.

[0151] Uklanjanje infektivnih agensa takođe može da se ostvari pomoću dubinske filtracije. Dostupni filteri su, na primer, filteri od regenerisane celuloze, u koje mogu da se dodaju adjuvansi za filtraciju (kao što je celit, perlit ili dijatomejska zemlja), koje prodaje kompanija Cuno (filteri Zeta+ VR serije), Pall-Seitz (dubinski filteri P-serije) ili Sartorius (dubinski filteri Virosart CPV, Sartoclear P).

[0152] Nakon prečišćavanja i najmanje jedne faze eliminacije ili inaktivacije infektivnih agensa, kompozicija prema pronalasku se direktno podvrgava fazama farmaceutske formulacije u tečnom obliku: formulacija, sterilna filtracija i raspodela u sudove (bočice ili drugo sredstvo za čuvanje/primenu).

[0153] Na posebno povoljan način, kompozicija prema pronalasku se ne podvrgava nijednoj fazi liofilizacije, desikacije, dehidratacije ili sušenja.

[0154] Na posebno povoljan način, kompozicija prema pronalasku je dakle u tečnom obliku bez podvrgavanja fazi rekonstitucije liofilizata.

[0155] Sledeći primeri ilustruju pronalazak ne ograničavajući njegov obim.

2

Primeri:

Primer 1: Stabilna tečna kompozicija fibrinogena

[0156] Fibrinogen je dobijen prema postupku opisanom u patentu FR 0506640.

[0157] Finalni proizvod je dijaliziran u odnosu na 8,5 mM pufer od trinatrijum citrat dihidrata: (0,175 mM limunska kiselina 8,325 mM natrijum citrat) na pH 7,0 ± 0,2 da bi se dobio deformulisani fibrinogen.

Primer 2: Stabilna tečna kompozicija fibrinogena

Materijali i metode

Frakcija plazme

[0158] Početna sirovina je objedinjena humana plazma prethodno podvrgnuta fazi krioprecipitacije, a zatim fazi taloženja sa 8% etanolom.

[0159] Tako dobijeni rastvor prethodno prečišćenog fibrinogena iz plazme razblažen je sa 2 zapremine ekvilibracionog pufera za silika gel pre injektovanja na hromatografsku kolonu prethodno ekvilibrisanu prema pH i provodljivosti.

[0160] Odlike frakcije plazme: antigenski fibrinogen razblaživanjem podešen na 4,7-4,8 g/l.

Puferski rastvori

[0161] Kompozicija puferskih rastvora korišćenih u različitim fazama hromatografskog postupka sažeta je u tabeli 1 u nastavku.

Tabela 1: Puferski rastvori za afinitetnu hromatografiju.

2

Gel za afinitetnu hromatografiju

[0162] Za afinitetnu hromatografiju koristi se afinitetni gel CaptureSelect Fibrinogen (Life Technologies ref. 191291050, serije 171013-01 i 171013-05).

Kolone

[0163] Kolona prečnika 50 mm (Reference XK 50/30 GE Healthcare), upotrebljena je zapremina spakovanog gela od 67 ml; za visinu kolone od 3,4 cm

Afinitetno prečišćavanje

[0164] Rastvor fibrinogena podešen na oko 5 g/l injektovan je bez dodatnih podešavanja na ekvilibrisanu afinitetnu kolonu CaptureSelect Fibrinogen. Naneto je oko 10 g/l.

[0165] Hromatografski eluat je zatim ultrafiltriran i preformulisan na membrani sa granicom od 100 kDa (reference Pall Oméga OS100C10)

[0166] Na kraju postupka, dobijeni proizvod ima koncentraciju koagulabilnog fibrinogena od 15,2 g/l i antigenskog fibrinogena od 15,2 mg/ml.

Primer 3: stabilnost tečne kompozicije fibrinogena određena ubrzanim testom stabilnosti

Kompozicije fibrinogena

[0167] Kompozicija dobijena u primeru 1 ili primeru 2 formulisana je sa različitim ekscipijensima.

[0168] Formulacije su sažete u tabeli 2 u nastavku:

2

Analitički protokol

[0169] Kompozicije su podvrgnute termičkom stresu (toplotni stres) zagrevanjem u termostatiranom kućištu na 37°C, a zatim su izvađene iz termostatiranog kućišta radi analize u terminima T0, T+7 dana i T+14 dana.

[0170] Izvršene su sledeće različite analize:

Vizuelni pregled: opalescencija i formiranje vidljivih čestica određeni su vizuelnim pregledom izvršenim pomoću optičkog uređaja iz Evropske farmakopeje

Zamućenje

Analiza različitih lanaca fibrinogena pomoću SDS PAGE

Analiza dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)

Antigenski fibrinogen i aktivnost koagulabilnog fibrinogena

Rezultati

[0171] Dobijeni su sledeći rezultati:

Tabela 3: Vizuelni pregled i zamućenje pre i posle termičkog stresa

1

Tabela 4a i 4b: rezultati SDS PAGE za T0

2

Tabela 5a i 5b: rezultati SDS PAGE za T+7 dana

Tabela 6a i 6b: rezultati SDS PAGE za T+14 dana

4

Tabela 7: rezultati DLS u terminima T0, T+ 7 dana i T+14 dana

Tabela 8: rezultati antigenskog fibrinogena i aktivnosti koagulabilnog fibrinogena u terminima T0, T+ 7 dana i T+14 dana

[0172] Rezultati pokazuju da su formulacije F1-F13 na pH 7,0 koje sadrže od 10 do 300 mM arginina i glutamata, posebno u ekvimolarnim količinama, stabilne.

Primer 4: stabilnost tečne kompozicije fibrinogena određena dugoročnim testom stabilnosti

Kompozicija fibrinogena

[0173] Kompozicije su iste kao u primeru 3.

Stabilnost kompozicije fibrinogena

[0174] Kompozicija je postavljena na stabilnost na 5°C na vazduhu.

[0175] Uzeti su uzorci za analizu u terminima T0, T+1 mesec, T+2 meseca, T+3 meseca i T+6 meseci.

Tabele 9 i 10: poređenje formulacija F14 i F15 koje pokazuju efekat surfaktanta

V

a

Za

(DO

Os

Koa

fib

An

fib

Od

koa

SD

V

Primer 5: stabilnost tečne kompozicije fibrinogena određena ubrzanim testom stabilnosti

Kompozicije fibrinogena

Kompozicija dobijena u primeru 1 formulisana je sa različitim ekscipijensima.

[0176] Formulacije su sažete u tabeli 11 u nastavku:

Analitički protokol

[0177] Kompozicije su podvrgnute termičkom stresu (toplotni stres) zagrevanjem u termostatiranom kućištu na 37°C, a zatim su izvađene iz termostatiranog kućišta radi analize u terminima T0, T+7 dana i T+14 dana.

[0178] Izvršene su sledeće različite analize:

Vizuelni pregled: opalescencija i formiranje vidljivih čestica određeni su vizuelnim pregledom izvršenim pomoću optičkog uređaja iz Evropske farmakopeje Zamućenje

pH

Osmolalitet

Analiza različitih lanaca fibrinogena pomoću SDS PAGE

Analiza dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)

Rezultati

[0179] Dobijeni su sledeći rezultati:

• Vizuelni pregled:

4

Zamućenje

Praćenje pH

Osmolalitet

Analiza DLS

4

[0180] A T0

[0181] A T+7d

4

[0182] A T+14d

4

�

[0183] Rezultati pokazuju da su formulacije F16-F26 na pH 6,0-8,0 koje sadrže od 50 do 200 mM arginina i glutamata, stabilne.

Primer 6: stabilnost tečne kompozicije fibrinogena određena dugoročnim testom stabilnosti

Kompozicije fibrinogena

[0184] Kompozicija dobijena u primeru 2 formulisana je sa različitim ekscipijensima.

[0185] Formulacije su sažete u tabeli 11 u nastavku:

Analitički protokol

[0186] Kompozicije su čuvane u termostatiranom kućištu na 5°C, 25°C i 37°C, a zatim su izvađene iz termostatiranog kućišta radi analize u terminima T0, T+14 dana i T+1 mesec.

[0187] Izvršene su sledeće različite analize:

Zamućenje

pH

Osmolalitet

Analiza dinamičkog rasipanja svetlosti (DLS)

Koagulabilni fibrinogen i antigenski fibrinogen

[0188] Analiza različitih lanaca fibrinogena pomoću SDS PAGE

Rezultati

[0189] Dobijeni su sledeći rezultati:

• Vizuelni pregled:

4

Zamućenje

pH i osmolalitet

4

Analiza DLS

Koagulabilni fibrinogen i antigenski fibrinogen

Analiza različitih lanaca fibrinogena pomoću SDS PAGE u redukcionim uslovima

1

[0190] Rezultati pokazuju da su formulacije F27-F28 na pH 6,0-7,0 koje sadrže 80 mM glutamata i 150 mM arginina, u prisustvu surfaktanta, pufera i dodatne aminokiseline, stabilne.

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Tečna farmaceutska kompozicija koja sadrži humani fibrinogen, naznačena time, što sadrži:

- od 10 do 300 mM arginina

- od 10 do 300 mM glutamata

pri čemu je pH kompozicije u opsegu od 6 do 8.

2. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, naznačena time, što je koncentracija arginina i koncentracija glutamata u opsegu od 10 do 300 mM, poželjno od 20 do 200 mM, poželjnije od 30 do 100 mM, još poželjnije od 50 do 80 mM.

3. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 1, naznačena time, što je koncentracija arginina i koncentracija glutamata u opsegu od 10 do 80 mM, poželjno u opsegu od 20 do 70 mM, poželjnije u opsegu od 30 do 60 mM.

4. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je koncentracija glutamata manja od 80 mM, poželjno manja od 70 mM, poželjnije manja od 60 mM, još poželjnije manja od 50 mM.

5. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je koncentracija glutamata u opsegu od 10 do 80 mM, poželjno u opsegu od 20 do 70 mM, poželjnije u opsegu od 30 do 60 mM.

6. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je koncentracija arginina u opsegu od 10 do 300 mM, poželjno u opsegu od 20 do 250 mM, poželjnije u opsegu od 50 do 250 mM.

7. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što su arginin i glutamat prisutni u ekvimolarnim količinama u opsegu od 0,8 do 1,2, poželjno od 0,9 do 1,1, još poželjnije otprilike jednakim 1,0.

8. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je koncentracija fibrinogena u opsegu od 10 do 30 g/l, poželjno od 15 do 25 g/l, još poželjnije od 15 do 20 g/l.

9. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što takođe sadrži najmanje jednu aminokiselinu odabranu od alanina, asparagina, aspartata, cisteina, glutamina, glicina, histidina, izoleucina, leucina, lizina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptofana, tirozina, ili njihovu kombinaciju.

10. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što takođe sadrži najmanje jednu hidrofobnu aminokiselinu odabranu od leucina, alanina, fenilalanina, triptofana, valina, metionina, izoleucina, prolina, cisteina i/ili glicina, ili njihovu kombinaciju.

11. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 10, naznačena time, što je aminokiselina odabrana od prolina i/ili izoleucina i/ili serina.

12. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 do 11, naznačena time, što je koncentracija aminokiseline u opsegu od 1 do 300 mM, poželjno od 10 do 200 mM, poželjnije od 20 do 100 mM.

13. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što takođe sadrži surfaktant, poželjno polisorbat 80 ili polisorbat 20 ili Pluronic®F68.

14. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 13, naznačena time, što je koncentracija surfaktanta u opsegu od 1 do 500 ppm, poželjno od 50 do 400 ppm, poželjnije od 150 do 250 ppm.

15. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što takođe sadrži pufer.

16. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 15, naznačena time, što se pufer sastoji od trinatrijum citrata.

4

17. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 16, naznačena time, što je koncentracija trinatrijum citrata u opsegu od 1 do 15 mM, poželjno od 7 do 10 mM.

18. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što je pH u opsegu od 6 do 7,5, poželjnije u opsegu od 6 do 7.

19. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što nema natrijum hlorid i/ili albumin.

20. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što ima osmolalitet u opsegu od 250 do 650 mOsm/kg, poželjno od 300 do 550 mOsm/kg.

21. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što sadrži:

- 10-30 g/l fibrinogena

- 10-300 mM arginina

- 10-300 mM glutamata

- eventualno 1-15 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

- eventualno 5-1000 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

22. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što sadrži:

- 10-30 g/l fibrinogena

- 20-200 mM arginina

- 20-200 mM glutamata

- eventualno 7-10 mM pufera, konkretno trinatrijum citrata

- eventualno 20-400 ppm surfaktanta

- eventualno 5-500 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-8,0.

23. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što sadrži:

- 15-25 g/l fibrinogena

- 150 mM arginina

- 80 mM glutamata

- 8,5 mM trinatrijum citrata

- 200 ppm surfaktanta, poželjno polisorbata80, polisorbata20 ili Pluronic®F68

- eventualno 5-1000 ppm humanog albumina

pri čemu je pH kompozicije 6,0-7,0.

24. Farmaceutska kompozicija prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time, što se fibrinogen dobija frakcionisanjem krvne plazme.

Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5