RS62171B1 - Rekombinantni glikoproteini i njihova primena - Google Patents

Rekombinantni glikoproteini i njihova primena

Info

Publication number
RS62171B1
RS62171B1 RS20210960A RSP20210960A RS62171B1 RS 62171 B1 RS62171 B1 RS 62171B1 RS 20210960 A RS20210960 A RS 20210960A RS P20210960 A RSP20210960 A RS P20210960A RS 62171 B1 RS62171 B1 RS 62171B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
protein
oligosaccharides
galactosidase
percentage
linked
Prior art date
Application number
RS20210960A
Other languages
English (en)
Inventor
Karen Lee
Christopher Hwang
Christine Demaria
Original Assignee
Genzyme Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Genzyme Corp filed Critical Genzyme Corp
Publication of RS62171B1 publication Critical patent/RS62171B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2465—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on alpha-galactose-glycoside bonds, e.g. alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70592—CD52
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/005—Glycopeptides, glycoproteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01022—Alpha-galactosidase (3.2.1.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)

Description

Opis
POZIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE
[0001] Ova prijava polaže pravo na prioritet nad SAD provizornom patentnom prijavom pod serijskim brojem 61/894,879, koja je podneta 23. oktobra 2013, i SAD provizornom patentnom prijavom pod serijskim brojem 61/901,942, koja je podneta 8. novembra 2013.
OBLAST
[0002] Ova prijava se odnosi na oblast biotehnologije, i tačnije, na proizvodnju rekombinantnih glikoproteina (npr. ljudski rekombinantni α-galaktozidaza-A) i tretman lizozomskih bolesti skladištenja (npr. Fabrijeva bolest) kod pacijenta.
STANJE TEHNIKE
[0003] Lizozomske bolesti skladištenja su grupa od preko 40 poremećaja koji su rezultat defekata gena koji kodiraju enzime koji razgrađuju glikolipidne ili polisaharidne otpadne proizvode unutar lizozoma ćelija. Enzimski proizvodi, npr. šećeri i lipidi, se zatim recikliraju u nove proizvode. Svaki od ovih poremećaja potiče od nasledne autosomne ili X-vezane recesivne osobine koja utiče na nivo enzima u lizozomu. Generalno, postoji smanjena ili nema biološke ili funkcionalne aktivnosti ovih enzima u ćelijama i tkivima pogođenih pojedinaca. Spisak primernih bolesti lizozomskog skladištenja i pridruženi nedostaci enzima prikazani su na Slici 1 i opisani su u Tabeli 1 od SAD patenta br.6,066,626. Kod takvih bolesti, nedostatak funkcije enzima stvara progresivno sistemsko taloženje lipidnog ili ugljenohidratnog supstrata u lizozomima ćelija u telu, na kraju uzrokujući gubitak funkcije organa i smrt.
[0004] Fabrijeva bolest je lizozomska bolest skladištenja uzrokovana nedostatkom lizozomskog enzima α-galaktozidaza-A. Nedostatak ove lizozomske hidrolaze rezultuje progresivnim taloženjem glikosfingolipidnog globotrijazilkeramida (GL3) i srodnih lipida u većini telesnih tkiva. Naslage GL3 se prvenstveno nalaze u vaskularnom endotelu. Progresivna endotelna akumulacija GL3 dovodi do ishemije i infarkta u organima, poput bubrega, srca ili mozga, uzrokujući nesnosan bol, otkazivanje bubrega i srčane i cerebrovaskularne bolesti. Prosečni životni vek Fabrijevog pacijenta koji se ne tretira enzimskom terapijom, od bubrežnih, srčanih i/ili cerebralnih komplikacija od vaskularnih bolesti, je 50 godina za muškarce i 70 godina za žene (Lidove i dr., Int. J. Clin. Pract.61:293-302, 2007).
[0005] Rekombinantni proteini za upotrebu u medicinskom tretmanu često se proizvode postupcima ćelijskih kultura koje uključuju upotrebu tečnog medijuma koji uključuje krvni proizvod (npr. serum ili plazma životinje koji nije čovek). Kontaminacija farmaceutskih proizvoda koji sadrže rekombinantne proteine predstavljala je problem u biotehnološkoj industriji (Nims, BioProcessing J.10:4-10, 2011; Plavsic i dr., BioProcessing J.9:6-12, 2011; Plavsic i dr., Dev. Biol. Stand 99:95-109, 1999). Na primer, prisustvo velikog broja različitih virusa u takvim farmaceutskim proizvodima se u nekim slučajevima pripisuje proizvodu od krvi (npr. serum ili plazma životinje koji nije čovek) koji se nalazi u tečnom medijumu koji se koristi za kultivaciju ćelija koje proizvode rekombinantni protein. Ovde su opisani primeri zagađivača koji su pronađeni u ćelijskim kulturama za proizvodnju rekombinantnih proteina i za koje se smatra da su uzrokovani upotrebom životinjskih proizvoda (npr. životinjski serum, životinjska plazma ili proteini životinjskog seruma). Upotreba medijuma bez seruma ili medijuma bez životinjskih proizvoda u kulturi ćelija za proizvodnju rekombinantnih proteina je korisna jer je medijum kulture bolje definisan i pojednostavljen, ima smanjeni stepen zagađivača, eliminiše ili smanjuje rizik od zagađenja ili nivoa zagađivača u kulturi ćelija za proizvodnju rekombinantnih proteina i rezultuje nižim troškovima proizvodnje rekombinantnog proteina korišćenjem ćelijske kulture.
SAŽETAK
[0006] Predmetni pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.
[0007] Predmetni pronalazak zasnovan je, barem delimično, na otkriću da se proteini (npr. enzimi, npr. α-galaktozidaza-A) sa izmenjenim (npr. poboljšanim) profilom glikozilacije mogu proizvesti upotrebom ovde opisanih postupaka. Shodno tome, ovde su obelodanjeni proteini αgalaktozidaze-A sa smanjenom varijabilnošću glikoformi, sa smanjenim rizikom ili nivoom kontaminacije (npr. smanjeni rizik ili nivo virusne kontaminacije) i/ili izmenjenim i poboljšanim profilima glikozilacije (npr. u poređenju sa prethodno proizvedenim enzimima za enzimsku terapiju), farmaceutski sastavi i kompleti koji uključuju jedan ili više tih proteina αgalaktozidaze-A (npr. farmaceutski sastavi koji imaju smanjenu varijabilnost glikoformi i/ili smanjeni rizik ili nivo kontaminacije (npr. smanjeni rizik ili nivo virusne kontaminacije)), postupci generisanja ćelije sisara korisnih za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina (npr. α-galaktozidaza-A), postupci za proizvodnju rekombinantnog glikoproteina (npr. αgalaktozidaza-A), postupci tretmana Fabrijeve bolesti i postupci smanjenja serumskog nivoa globotriaosilkeramida kod pacijenta i postupci povećanja nivoa α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara (npr. ćelija in vitro ili ćelija kod pacijenta). Takođe su obelodanjeni vektori eksprimiranja koji uključuju kodiranje sekvenci proteina α-galaktozidaze-A.
[0008] Ovde su obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A (rhAGA) koji imaju jednu ili obe strukturne karakteristike: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi između 0,1% i oko 1,5%; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi koji je veći od oko 9%. Na primer, ovde obelodanjeni rhAGA protein može imati strukturne karakteristike: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji je između oko 0,1% i oko 1,5%; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi koji je veći od oko 9%. U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji je između oko 0,1% i oko 1,3% (npr. između oko 0,1% i oko 1,0%, ili između oko 0,1% i oko 0,7%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi koji je veći od oko 8,5% (npr. veći od oko 9,0%).
[0009] Ovde obelodanjeni rhAGA proteini mogu dalje da imaju jednu ili više strukturnih karakteristika izabranih iz grupe: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je veći od oko 13,5%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 koji je veći od oko 2,0%; i odnos molekula/mola sijalinske kiseline/proteina veći od oko 3,0. Na primer, ovde obelodanjeni rhAGA protein može dalje imati strukturne karakteristike: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je veći od oko 13,5%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 koji je veći od oko 2,0%; i odnos molekula/mola sijalinske kiseline/proteina veći od oko 3,0. U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je veći od oko 13,8% (npr. veći od oko 14,0%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 koji je veći od oko 4% (npr. veći od oko 6%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima mol/mol odnos sijalinske kiseline/proteina veći od oko 3,2 (npr. veći od oko 3,4).
[0010] Ovde obelodanjeni rhAGA proteini mogu dalje imati jednu ili više strukturnih karakteristika izabranih iz grupe: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi koji je između 0,1% i oko 3,9%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je između oko 0,1% i oko 3,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji je između oko 0,1% i oko 5,3%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 koji je između oko 0,1% i oko 9,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi koji je između oko 1% i oko 7,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 14,8%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi koji je veći od oko 4,9%; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 8,2%. Na primer, ovde opisan rhAGA protein može imati četiri ili više strukturnih karakteristika izabranih iz grupe: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi koji je između 0,1% i oko 3,9%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je između oko 0,1% i oko 3,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji je između oko 0,1% i oko 5,3%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 koji je između oko 0,1% i oko 9,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi koji je između oko 1% i oko 7,0%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 14,8%; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi koji je veći od oko 4,9%; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 8,2%. U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi koji je između oko 0,1% i oko 3,0% (npr. između oko 0,1% i oko 2,0%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu i koji je između oko 1,0% i oko 2,0% (npr. između oko 1,5% i oko 2,0%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji je između oko 3,0% i oko 5,0% (npr. između oko 4,0% i oko 5,0%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 koji je između oko 0,5% i oko 8,0% (npr. između oko 0,5% i oko 5,0%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi, koji je između oko 4% i oko 6,9% (npr. između oko 5% i oko 6,8%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 15% (npr. veći od oko 16%). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi koji je veći od oko 6%. U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, rhAGA protein ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi koji je veći od oko 8,5% (npr. veći od oko 9,0%).
[0011] Ovde pruženi rhAGA proteini mogu imati jedno ili oba od narednih svojstava: (i) povećana endocitoza ćelijom sisara koja eksprimira protein receptora manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®; i (ii) povećan afinitet prema proteinu receptora manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®. Na primer, ovde pruženi rhAGA proteini mogu imati (i) povećanu endocitozu ćelijom sisara koja eksprimira protein receptora manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®; i (ii) povećan afinitet prema proteinu receptora manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®.
[0012] Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može da nema primetan nivo ili da nema protein, lipid, ugljene hidrate, nukleinsku kiselinu i zagađivač (npr. bilo koji od ovde opisanih zagađivača) prisutan u životinjskim proizvodima (npr. u serumu životinje, životinjskoj plazmi, ili proizvodu životinjske krvi).
[0013] Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijuma kulture odabranu iz grupe hemijski definisanog medijuma bez proteina i seruma. Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijum bez proteina i/ili hemijski definisan medijum. Bilo koji od ovde predstavljenih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijume za kulturu odabrane iz grupe koja se sastoji od hemijski definisanog medijuma bez proteina i seruma i izolovan integrisanim i kontinuiranim postupkom. U nekim otelotvorenjima, integrisani i kontinuirani postupak uključuje korake: (a) pružanja tečnog medijuma kulture, uključujući ovde predstavljeni rhAGA protein, koji je u suštini bez ćelija, gde se tečni medijum kulture uvodi u prvi sistem multihromatografije. (MCCS1); (b) hvatanje rhAGA proteina u tečnom medijumu pomoću MCCS1, gde se eluat MCCS 1 koji sadrži rekombinantni terapeutski protein kontinuirano ubacuje u drugi sistem hromatografije sa više kolona (MCCS2); i (c) prečišćavanje i poliranje rekombinantnog terapijskog proteina upotrebom MCCS2, gde eluat iz MCCS2 jeste rhAGA supstanca leka, i gde je proces integrisan i kontinuirano teče od tečnog medijuma kulture do eluata iz MCCS2 koji je rhAGA supstanca leka. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 i/ili MCCS2 izvodi dve različite jedinstvene operacije. U nekim otelotvorenjima, upotreba MCCS1 ili MCCS2, ili oba, uključuje prebacivanje kolona. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 izvodi jedinstvene operacije hvatanja rekombinantnog proteina i inaktivacije virusa. U nekim otelotvorenjima, MCCS2 izvodi jedinstvene operacije prečišćavanja i poliranja rekombinantnog terapijskog proteina. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 i/ili MCCS2 koristi najmanje dve hromatografske kolone. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 je prvi periodični sistem hromatografije kontra struje (PCCS1), npr. PCCS1 koji uključuje PCCS sa četiri kolone. U nekim otelotvorenjima, tri od četiri kolone u PCCS sa četiri kolone (u otelotvorenju PCCS1) izvode jedinstveno hvatanje rekombinantnog terapijskog proteina iz tečnog medijuma kulture. U nekim otelotvorenjima, eluat koji sadrži ovde rhAGA protein pružen ovde iz tri od četiri kolone u PCC1 sa četiri kolone (u jednom otelotvorenju PCCS1) ubacuje se u četvrtu kolonu od PCCS sa četiri kolone. U nekim otelotvorenjima, četvrta kolona PCCS sa četiri kolone (u otelotvorenju PCCS1) izvodi jedinstvenu operaciju inaktivacije virusa držanjem eluata koji sadrži rekombinantni terapeutski protein na niskom pH radi virusne inaktivacije. U nekim otelotvorenjima, sadrži podešavanje pH eluata iz četvrte kolone PCCS sa četiri kolone pomoću linijskog rezervoara za podešavanje pufera pre nego što se eluat iz četvrte kolone PCCS sa četiri kolone uvede u PCCS2. U nekim otelotvorenjima, PCCS2 sadrži tri hromatografske kolone i hromatografsku membranu. U nekim otelotvorenjima, tri hromatografske kolone u PCCS2 izvode jedinstvenu operaciju prečišćavanja ovde pruženog rhAGA od eluata PCCS1 putem hromatografije razmene katjona ili anjona. U nekim otelotvorenjima, eluat iz tri hromatografske kolone u PCCS2 se dovodi u hromatografsku membranu u PCCS2. U nekim otelotvorenjima, hromatografska membrana u PCCS2 izvodi jedinstvenu operaciju poliranja ovde pruženog rhAGA proteina u eluatu iz tri hromatografske kolone u PCCS2 putem hromatografije razmene katjona ili anjona. U nekim otelotvorenjima, hromatografska membrana u PCCS2 izvodi jedinstvenu operaciju poliranja putem katjonske razmene. U nekim otelotvorenjima, protok i ispiranje hromatografske membrane u PCCS2 je rhAGA supstanca leka.
[0014] Takođe su obelodanjeni farmaceutski sastavi koji sadrže bilo koji od ovde opisanih rhAGA proteina i farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, farmaceutski sastav može biti formulisan za intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intradermalnu, potkožnu ili intraperitonealnu primenu. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav sadrži koncentraciju rhAGA od oko 4 mg/mL do oko 6 mg/mL (npr. oko 5 mg/mL). U nekim primerima, farmaceutski sastav je sterilni, liofilizovani prah. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski prihvatljiv nosač može biti jedno ili više agenasa izabranih iz grupe: manitol, monobazni natrijum fosfat, monohidrat, dvobazni natrijum fosfat i heptahidrat.
[0015] Bilo koji ovde pružena farmaceutski sastav može da nema primetan nivo ili da nema protein, lipid, ugljene hidrate, nukleinsku kiselinu i zagađivač (npr. bilo koji od ovde opisanih zagađivača) prisutan u životinjskim proizvodima (npr. u serumu životinje, životinjskoj plazmi, ili proizvodu životinjske krvi).
[0016] Bilo koji ovde obelodanjen farmaceutski sastav može da sadrži ovde obelodanjeni rhAGA protein, koji je proizveden u ćelijskoj kulturi koja je koristila samo medijume za kulturu odabrane iz grupe hemijski definisanog medijuma bez proteina i seruma. Bilo koji ovde obelodanjen farmaceutski sastav može da sadrži ovde obelodanjeni rhAGA protein, koji je proizveden u ćelijskoj kulturi koja je koristila samo medijum kulture bez proteina i/ili hemijski definisan medijum kulture. Bilo koji ovde obelodanjen farmaceutski sastav može da sadrži ovde obelodanjeni rhAGA protein, koji je proizveden iz ćelijske kulture koja je koristila samo medijume za kulturu odabrane iz grupe hemijski definisanog medijuma kulture bez proteina i seruma, i izolovana korišćenjem integrisanog i kontinuiranog procesa (npr. korišćenjem bilo kog od ovde opisanih primernih integrisanih i kontinuiranih procesa).
[0017] Takođe su obelodanjeni vektori eksprimiranja koji sadrže naredno: sekvenca koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A; promoterska sekvenca operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski protein α-galaktozidaze-A; sekvenca koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski protein α-galaktozidaze-A; i sekvencu koja kodira poli(A) mesto za prepoznavanje operativno povezano sa 3' krajem sekvence koja kodira ljudski protein αgalaktozidaze-A. U nekim otelotvorenjima, promoterska sekvenca je izabrana iz grupe: rpS21 promoter hrčka, promoter β-aktina hrčka i SV40 rani promoter; i sekvenca koja kodira poli(A) mesto prepoznavanja je SV40 sekvenca ranog poli(A) prepoznavanja. U nekim otelotvorenjima, vektor eksprimiranja dalje sadrži sekvencu koja kodira glutamin sintetazu ili dihidrofolat reduktazu čoveka ili psa. U nekim otelotvorenjima, 5' kraj sekvence koja kodira glutamin sintetazu čoveka ili psa operativno je povezan sa SV40 ranim promoterom, i 3' kraj sekvence koja kodira glutamin sintetazu čoveka ili psa, ili je dihidrofolat reduktaza operativno povezana sa SV40 ranim intronom i poli(A) signalnom sekvencom.
[0018] Takođe su obelodanjeni postupci generisanja ćelijske linije sisara korisni za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina koji uključuju: (a) pružanje imortalizovane ćelijske linije sisara zavisne od seruma; (b) sekvencijalna kultivacija ćelijske linije sisara u: (1) medijumu ćelijske kulture koji sadrži prvu koncentraciju (IX) životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 10 dana; (2) medijum ćelijske kulture koji sadrži oko 0,2X do oko 0,3X koncentracije životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 10 dana; i (3) medijum ćelijske kulture koji sadrži oko 0,01X do oko 0,08X životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 10 dana; (c) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz kulture nakon (b); (d) odabir podklona iz (c) koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, rast ćelija u medijumu kulture bez seruma i eksprimiranje rekombinantnih proteina; (d) kultivaciju izabranog pod-klona iz (d) u hemijski definisanom medijumu bez proteina i seruma, oko 5 dana do oko 30 dana (npr. oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, ili oko 5 dana do oko 10 dana); (e) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz kulture nakon (d); i (f) odabir pod-klona iz (e) koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, vršnu gustinu ćelija, svojstva rasta, volumetrijsku stopu produktivnosti (VPR) i profil glikozilacije za glikoprotein, gde je izabrani pod-klon iz (f) koristan za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina. Takođe su obelodanjeni postupci generisanja ćelijske linije sisara korisni za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina koji uključuju: (a) pružanje imortalizovane ćelijske linije sisara zavisne od seruma; (b) sekvencijalna kultivacija ćelijske linije sisara u: (1) medijumu ćelijske kulture koji sadrži prvu koncentraciju (IX) životinjskog seruma tokom oko 1 dana do oko 10 dana (npr. oko 3 dana); (2) medijumu ćelijske kulture koji sadrži oko 0,2X do oko 0,6X koncentracije (npr.
0,5X) životinjskog seruma tokom oko 1 dana do oko 10 dana (npr. oko 3 dana); i (3) medijumu ćelijske kulture koji sadrži 0X do oko 0.10X životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 10 dana (npr. oko 8 dana); (c) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz kulture nakon (b); (d) odabir pod-klona iz (c) koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, rast ćelija u medijumu kulture bez seruma i eksprimiranje rekombinantnih proteina; (e) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz izabranog pod-klona iz (d); i (f) odabir pod-klona iz (e) koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, vršnu gustinu ćelija, svojstva rasta, volumetrijsku stopu produktivnosti (VPR) i eksprimiranje rekombinantnog proteina, gde je izabrani pod-klon iz (f) koristan za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina.
[0019] U nekim primerima, imortalizovana ćelijska linija sisara zavisna od seruma je ćelijska linija jajnika kineskog hrčka. U nekim otelotvorenjima, imortalizovana ćelijska linija sisara zavisna od seruma ne eksprimira endogeno dihidrofolat reduktazu. U nekim otelotvorenjima, izabrani pod-klon (f) raste u suspenziji. U nekim otelotvorenjima, eksprimiranje rekombinantnog proteina je eksprimiranje jednog od antitela i enzima (npr. ljudski protein αgalaktozidaze-A). Takođe su obelodanjene ćelije sisara korisne za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina proizvedenog bilo kojim od ovde opisanih postupaka.
[0020] Takođe su obelodanjeni postupci za proizvodnju rekombinantnog glikoproteina koji uključuju: pružanje ćelija sisara korisnih za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina proizvedenog bilo kojim od ovde opisanih postupaka; uvođenje u ćeliju vektora eksprimiranja koji sadrži sekvencu koja kodira glikoprotein; gajenje ćelije u medijumu za rast kulture bez seruma pod uslovima dovoljnim za proizvodnju glikoproteina; i sakupljanje glikoproteina iz ćelije ili medijuma za rast. U nekim primerima, kultivacija se vrši pomoću suspenzione ćelijske kulture. U nekim otelotvorenjima, kultivacija se izvodi pomoću bioreaktora. U nekim otelotvorenjima, kultivacija se izvodi pomoću hemijski definisanog medijuma bez proteina i bez seruma (na primer, kultivacija ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO) korišćenjem hemijski definisanog medijuma bez proteina i bez seruma). U nekim otelotvorenjima, CHO ćelija endogeno ne eksprimira dihidrofolat reduktazu. U nekim otelotvorenjima, rekombinantni glikoprotein je enzim (npr. ljudski protein α-galaktozidaze-A). U nekim otelotvorenjima, sekvenca koja kodira glikoprotein je najmanje 90% identična SEQ ID NO: 1. U nekim otelotvorenjima, vektor eksprimiranja dalje sadrži naredno: promoterska sekvenca operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira glikoprotein; sekvenca koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom koji je operativno povezan sa 5' krajem sekvence koja kodira glikoprotein; i sekvencu koja kodira mesto za prepoznavanje poli(A) operativno povezano sa 3' krajem sekvence koja kodira glikoprotein. U nekim otelotvorenjima, promoterska sekvenca je izabrana iz grupe koju čine: rpS21 promoter hrčka, promoter β-aktina hrčak i SV40 rani promoter; i sekvenca koja kodira poli(A) mesto prepoznavanja je poli(A) sekvenca ranog prepoznavanja SV40. U nekim otelotvorenjima, vektor eksprimiranja dalje
1
sadrži sekvencu koja kodira glutamin sintetazu ili dihidrofolat reduktazu čoveka ili psa. U nekim otelotvorenjima, 5' kraj sekvence koja kodira glutamin sintetazu ili dihidrofolat reduktazu čoveka ili psa, operativno je povezan sa SV40 ranim promoterom i 3' kraj sekvence koja kodira glutamin sintetazu ili dihidrofolat reduktazu čoveka ili psa je operativno povezan sa SV40 ranom intronom i poli(A) signalnom sekvencom. U nekim primerima, glikoprotein se prikuplja iz ćelije. U nekim primerima, glikoprotein se prikuplja iz medijuma ćelijske kulture. Takođe su obelodanjeni rekombinantni glikoproteini (npr. ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A) proizvedeni bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Takođe su obelodanjeni farmaceutski sastavi koji sadrže rekombinantni glikoprotein proizveden bilo kojim od ovde opisanih postupaka i farmaceutski prihvatljiv nosač. Na primer, farmaceutski sastav može biti formulisan za intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intradermalnu, potkožnu ili intraperitonealnu primenu. U nekim otelotvorenjima, glikoprotein je ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A i farmaceutski sastav sadrži koncentraciju od oko 4 mg/mL do oko 6 mg/mL (npr. oko 5 mg/mL) ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A. U nekim otelotvorenjima, farmaceutski sastav je sterilni, liofilizovani prah.
[0021] Takođe su obelodanjeni postupci tretmana Fabrijeve bolesti kod pacijenta koji uključuju primenu pacijentu koji ima Fabrijevu bolest terapeutski efikasne količine bilo kog od ovde obelodanjenih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A (rhAGA). U nekim otelotvorenjima, primena je sistemska primena (npr. intravenska primena). U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuje rhAGA pri dozi od oko 0,5 mg/kg telesne težine do oko 2,0 mg/kg telesne težine (npr. oko 1,0 mg/kg telesne težine). U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuju dve ili više doza rhAGA proteina. Na primer, najmanje dve ili više doza rhAGA proteina mogu se primenjivati u razmaku od oko dve nedelje. Neka otelotvorenja dalje uključuju primenu pacijentu jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa izabranih iz grupe: analgetici, antikoagulanti, inhibitori acetilholinesteraze, β-blokatori i inhibitori glukozilcermid sintaze. U nekim otelotvorenjima, pacijent je ljudski pacijent. U nekim otelotvorenjima, pacijentu je dijagnostikovana Fabrijeva bolest.
[0022] Takođe su obelodanjeni postupci povećanja nivoa proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara koji uključuje dovođenje u dodir ćelije sisara sa efikasnom količinom bilo kog od ovde obelodanjenih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A (rhAGA). U nekim otelotvorenjima ćelija je in vitro (npr. in vitro ćelija čoveka). U nekim otelotvorenjima, ćelija je kod pacijenta (npr. čoveku). U nekim otelotvorenjima, pacijentu je dijagnostikovana Fabrijeva bolest. U nekim primerima, dovođenje u dodir se vrši sistemskom primenom rhAGA pacijentu. Na primer, sistemska primena može biti intravenska primena. U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuje rhAGA pri dozi od oko 0,5 mg/kg telesne težine do oko 2,0 mg/kg telesne težine (npr. oko 1,0 mg/kg telesne težine). U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuju dve ili više doza rhAGA proteina. Na primer, najmanje dve od dve ili više doza rhAGA proteina mogu se primeniti u razmaku od oko dve nedelje.
[0023] Takođe su obelodanjeni postupci smanjenja nivoa globotriaosilkeramida u serumu pacijenta koji uključuju primenu pacijentu kome je to potrebno terapeutski efikasne količine bilo kog odovde obelodanjenih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A (rhAGA). U nekim otelotvorenjima, pacijent ima nivo globotrijazooilceramda u serumu veći od 8 Tg/ml. U nekim primerima, pacijentu je dijagnostikovana Fabrijeva bolest. U nekim otelotvorenjima, primena je sistemska primena (npr. intravenska primena). U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuje rhAGA pri dozi od oko 0,5 mg/kg telesne težine do oko 2,0 mg/kg telesne težine (npr. oko 1,0 mg/kg telesne težine). U nekim otelotvorenjima, pacijentu se mogu primenjivati dve ili više doza rhAGA proteina. Na primer, najmanje dve od dve ili više doza rhAGA proteina mogu se primeniti u razmaku od oko dve nedelje. Neka otelotvorenja dalje uključuju primenu pacijentu jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa izabranih iz grupe: analgetici, antikoagulanti, inhibitori acetilholinesteraze, β-blokatori i inhibitori glukozilcermid sintaze. U nekim otelotvorenjima, pacijent je čovek.
[0024] Pod pojmom „izolovan“ podrazumeva se molekul koji je odvojen od najmanje jednog zagađivača (npr. proteina, nukleinske kiseline, lipida ili ugljenih hidrata ili njihove kombinacije). U neograničavajućim primerima, izolovani protein α-galaktozidaze-A ili drugi glikoprotein je najmanje 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% čist po težini.
[0025] Izraz „tečni medijum kulture“ označava tečnost koja sadrži dovoljno hranljivih sastojaka da ćeliji sisara omogući rast ili razmnožavanje in vitro. Na primer, tečni medijum kulture može da sadrži jednu ili više od: aminokiseline (npr. 20 aminokiselina), purin (npr. hipoksantin), pirimidin (npr. timidin), holin, inositol, tiamin, folna kiselina, biotin, kalcijum, niacinamid, piridoksin, riboflavin, timidin, cijanokobalamin, piruvat, lipoinska kiselina, magnezijum, glukoza, natrijum, kalijum, gvožđe, bakar, cink i natrijum bikarbonat. U nekim otelotvorenjima, tečni medijum kulture može da sadrži serum sisara. U nekim otelotvorenjima, tečni medijum kulture ne uključuje serum ili drugi ekstrakt sisara (definisani tečni medijum kulture). U nekim otelotvorenjima, tečni medijum kulture može da sadrži metale u tragovima, hormon rasta sisara i/ili faktor rasta sisara. Još jedan primer tečnog medijuma kulture je minimalan medijum (npr. medijum koji uključuje samo neorganske soli, izvor ugljenika i vodu). Ovde su opisani neograničavajući primeri tečnog medijuma kulture. Dodatni primeri tečnog medijuma kulture poznati su u struci i dostupni su na tržištu. Tečni medijum kulture može da sadrži bilo koju gustinu ćelija sisara. Na primer, kako se ovde koristi, zapremina tečnog medijuma kulture uklonjena iz bioreaktora može u osnovi biti bez ćelija sisara.
[0026] Izraz „tečni medijum kulture bez seruma“ označava tečni medijum kulture koji ne uključuje serum sisara.
[0027] Izraz „tečni medijum kulture koji sadrži serum“ označava tečni medijum kulture koji uključuje serum sisara.
[0028] Izraz „hemijski definisan tečni medijum kulture“ je izraz u struci i označava tečni medijum kulture u kome su poznate sve hemijske komponente. Na primer, hemijski definisan tečni medijum kulture ne uključuje fetalni goveđi serum, goveđi serumski albumin ili ljudski serumski albumin, jer ovi preparati obično uključuju složenu mešavinu albumina i lipida.
[0029] Izraz „tečni medijum kulture bez proteina“ označava tečni medijum kulture koji ne uključuje ni jedan protein (npr. nijedan protein se ne može detektovati).
[0030] Izraz „integrisani proces“ označava postupak koji se izvodi koristeći strukturne elemente koji zajednički funkcionišu kako bi se postigao određeni rezultat (npr. stvaranje supstance leka terapijskog proteina (npr. što uključuje ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) iz tečnog medijuma kulture).
[0031] Izraz „kontinuirani proces“ označava postupak koji kontinuirano napaja tečnost kroz najmanje deo sistema za proizvodnju supstance leka (npr. supstanca leka koja sadrži rekombinantni protein) iz medijuma koji sadrži rekombinantni protein (npr. bilo koji od ovde opisanih rekombinantnih proteina). Na primer, tečni medijum kulture koji uključuje rekombinantni terapeutski protein (na primer, ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) neprekidno se unosi u sistem dok je u funkciji, i terapijska proteinska supstanca leka se unosi
1
van sistema. Neograničavajući primeri takvih sistema koji se mogu koristiti za izvođenje kontinuiranog procesa opisani su u SAD provizornim patentnim prijavama br. 61/856,930 i 61/775,060.
[0032] Izraz „sistem hromatografije sa više kolona“ ili „MCCS“ označava sistem dve ili više međusobno povezanih ili promenljivih hromatografskih kolona i/ili hromatografskih membrana. Jedan primer hromatografskog sistema sa više kolona je periodični sistem hromatografije kontra struje (PCC) koji uključuje dve ili više međusobno povezanih ili promenljivih hromatografskih kolona i/ili hromatografskih membrana. Dodatni primeri sistema sa više kolona hromatografije poznati su u struci.
[0033] Izraz „izlučeni protein“ ili „izlučeni rekombinantni protein“ dobro je poznat u struci i podrazumeva protein (npr. rekombinantni protein) koji se bar delimično izlučuje iz ćelije sisara barem u vanćelijski prostor (npr. u tečni medijum kulture). Stručnjaci će shvatiti da se „izlučeni“ protein ne mora potpuno odvojiti od ćelije kako bi se smatrao izlučenim proteinom.
[0034] Izraz „perfuziona kultivacija“ podrazumeva gajenje više ćelija (npr. ćelija sisara) u prvom tečnom medijumu kulture, gde kultivacija uključuje periodično ili kontinuirano uklanjanje prvog tečnog medijuma kulture i, istovremeno ili nedugo nakon, dodavanje suštinski iste zapremine drugog tečnog medijuma kulture u posudu (npr. bioreaktor). U nekim primerima dolazi do postepene promene (npr. povećanja ili smanjenja) zapremine prvog tečnog medijuma kulture koji se uklanja i dodaje tokom inkrementalnih perioda (npr. period od oko 24 sata, period između oko 1 minuta i oko 24 sata ili period duži od 24 sata tokom perioda kultivacije (npr. svakodnevna stopa obnavljanja medijuma kulture). Deo medijuma koji se uklanja i zamenjuje svakog dana može da varira u zavisnosti od određenih ćelija koje se gaje, početne gustine sejanja i gustine ćelija u određeno vreme. „RV“ ili „zapremina reaktora“ označava zapreminu medijuma kulture koja je prisutna na početku postupka kultivacije (npr. ukupna zapremina medijuma kulture koja je prisutna nakon sejanja). U praksi su poznati bioreaktori koji se mogu koristiti za izvođenje perfuzionog kultivacije. Stručnjaci će razumeti da se bioreaktor može prilagoditi za upotrebu u perfuzionoj kultivaciji (na primer, prilagođen da bude perfuzioni bioreaktor).
[0035] Izraz „kultivacija serijskim dodavanjem“ je pojam u struci i podrazumeva negovanje više ćelija (npr. ćelija sisara) u prvom tečnom medijumu kulture, gde gajenje ćelija prisutnih u kontejneru (npr. bioreaktor) uključuje periodično ili kontinuirano dodavanje drugog tečnog medijuma kulture u prvi tečni medijum kulture bez značajnog ili primetnog uklanjanja prvog tečnog medijuma kulture ili drugog tečnog medijuma kulture iz ćelijske kulture. Drugi tečni medijum kulture može biti isti kao i prvi tečni medijum kulture. U nekim primerima kultivacije serijskim dodavanjem, drugi tečni medijum kulture je koncentrovani oblik prvog tečnog medijuma kulture. U nekim primerima kultivacije serijskim dodavanjem, drugi tečni medijum kulture je dodat u obliku suvog praha. Stručnjaci će razumeti da se bioreaktor može prilagoditi za upotrebu u kultivaciji serijskim dodavanjem (na primer, prilagođen da bude serijski bioreaktor).
[0036] „Specifična stopa produktivnosti“ ili „SPR“ je pojam u struci i, kako se ovde koristi, odnosi se na masu ili enzimatsku aktivnost rekombinantnog terapijskog proteina proizvedenog po ćeliji sisara dnevno. SPR za rekombinantno terapijsko antitelo obično se meri kao masa/ćelija/dan. SPR za rekombinantni terapijski enzim obično se meri kao jedinica/ćelija/dan ili (jedinica/masa)/ćelija/dan.
[0037] „Stopa zapreminske produktivnosti“ ili „VPR“ je pojam u struci i, kako se ovde koristi, odnosi se na masu ili enzimatsku aktivnost rekombinantnog terapijskog proteina proizvedenog po zapremini kulture (npr. po L zapremine bioreaktora, posude ili epruvete) dnevno. VPR za rekombinantno terapijsko antitelo obično se meri kao masa/L/dan. VPR za rekombinantni terapijski enzim obično se meri kao jedinica/L/dan ili masa/L/dan.
[0038] Ukoliko nije drugačije definisano, svi ovde korišćeni tehnički i naučni izrazi imaju isto značenje kao što je uobičajeno za razumevanje stručnjaka u oblasti kojoj predmetni pronalazak pripada. Ovde su opisani postupci i materijali za upotrebu u predmetnom pronalasku; mogu se koristiti i drugi pogodni postupci i materijali poznati u struci. Materijali, postupci i primeri su samo ilustrativni i nisu namenjeni ograničavanju. U slučaju sukoba, predmetna specifikacija, uključujući definicije, će imati prednost.
[0039] Detalji jednog ili više otelotvorenja pronalaska navedeni su u pratećim crtežima i opisu u nastavku. Ostale karakteristike, predmeti i prednosti pronalaska biće očigledne iz opisa i crteža i iz patentnih zahteva.
1
OPIS CRTEŽA
[0040]
Slika 1 je lista bolesti lizozomskog skladištenja i odgovarajući enzimski defekt za svaku bolest.
Slika 2 je cDNK sekvenca koja kodira ljudski prekursor protein α-galaktozidaze-A i aminokiselinska sekvenca ljudskog prekursor proteina α-galaktozidaze-A (SEQ ID NOS: 1 i 2, respektivno) i aminokiselinska sekvenca zrelog ljudskog proteina αgalaktozidaze-A (SEQ ID NO: 3).
Slika 3 je mapa pGZ629-2GFZ vektora koja uključuje cDNK sekvencu koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (2GFZ).
Slika 4 je mapa vektora koji se može koristiti za eksprimiranje ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A.
Slika 5 je dijagram toka koji prikazuje korake korišćene za generisanje roditeljske ćelijske linije optimizovane za eksprimiranje rekombinantnog glikoproteina.
Slika 6 je hromatogram koji prikazuje eluiranje Fabrazyme® i Replagal® iz kolone za izuzeće veličine.
Slika 7A je masa-do-naelektrisanja matrično-navođena laserska desorpciona/jonizujuća vreme-leta masna spektrometrija (MALDI-TOF MS) profila Fabrazyme®.
Slika 7B je MALTI-TOF MS masena spektrometrija profila Replagal®.
Slika 8 je skup od tri masa-do-naelektrisanja MALDI-TOF masene spektrometrije profila Fabrazyme® (gore) i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A (FZ2G) (sredina i dole).
Slika 9 je slika natrijum-dodecil sulfat poliakrilamidnog gela za Fabrazyme® i Replagal®.
Slika 10 je primer hromatografskog profila eluiranja N-vezanih oligosaharida derivatizovanih sa 2-antranilnom kiselinom (AA-označena), koji pokazuje strukture N-vezanih oligosaharida koje odgovaraju svakom vrhu. Uložak pokazuje dve triantenarne, trisijalinizovane oligosaharidne strukture, gde jedna od dve strukture odgovara vrhu 6 (oblik 1), a druga od dve strukture odgovara vrhu 6' (oblik 2) u profilu hromatografskog eluiranja N-vezanih oligosaharida derivatizovanih sa 2-AA.
Slika 11 je hromatografski profil eluiranja AA-označenih N-vezanih oligosaharida za Fabrazyme® (plava) i Replagal® (crvena).
Slika 12 je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (vrh 1), monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (vrh 2), monosijalinizovani oligosaharidi (vrh 3), bisijalinizovani
1
oligosaharidi koji sadrže fukozu (vrh 4), bisijalinizovani oligosaharidi (vrh 5), triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi (oblik 1; vrh 6), triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi (oblik 2; vrh 6'), manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 7), monofosforilizovani oligosaharidi (vrh 8), tetrasijalinizovani oligosaharidi (vrh 9), monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi (vrh 10) i bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 11) (sa leva na desno) za Fabrazyme® (leva traka u svakom setu od dve trake) i Replagal® (desna traka u svakom setu od dve trake).
Slika 13 je grafikon koji prikazuje distribuciju N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn108 za Fabrazyme® i Replagal®, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 14 je grafikon koji prikazuje raspodelu N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn161 za Fabrazyme® i Replagal®, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 15 je grafikon koji prikazuje distribuciju N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn184 za Fabrazyme® i Replagal®, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 16 je grafikon koji prikazuje distribuciju N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn108 za Fabrazyme® i FZ2G, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 17 je primerni grafikon koji prikazuje strukturu N-vezanih oligosaharida prisutnih u svakom vrhu nakon LCMS analize N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn108 za Fabrazyme® i FZ2G.
Slika 18 je grafikon koji prikazuje distribuciju N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn161 za Fabrazyme® i FZ2G, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 19 je grafikon koji prikazuje raspodelu N-vezanih oligosaharida prisutnih na aminokiselinskom ostatku Asn184 za Fabrazyme® i FZ2G, kako je utvrđeno LCMS analizom svakog enzimski digestiranog proteina.
Slika 20 je hromatografski profil eluiranja AA-označenih N-vezanih oligosaharida za Fabrazyme® i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G).
Slika 21A je grafikon koji pokazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (vrh 1) za Fabrazyme® i u ovde ljudskom rekombinantnom proteinu α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je utvrđeno
1
hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharidi.
Slika 21B je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani, minus fukozni oligosaharidi za Fabrazyme® i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 21C je grafikon koji pokazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (vrh 2) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 22A je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (vrh 4) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 22B je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (vrh 5) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je utvrđeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 22C je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi (oblik 1; vrh 6) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 23A je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi (oblik 2; vrh 6') za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 23B je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 7) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 23C je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (vrh 8) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je utvrđeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 24A je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su
1
tetrasijalinizovani oligosaharidi (vrh 9) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je utvrđeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 24B je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi (vrh 10) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je utvrđeno hromatografskim analiza N-vezanih oligosaharida označenih sa AA.
Slika 24C je grafikon koji prikazuje procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 11) za Fabrazyme® (FZ) i za ovde pružen rekombinantni ljudski protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno hromatografskom analizom AA-označenih N-vezanih oligosaharida.
Slika 25A je grafikon koji pokazuje mol-mol odnos manoza-6-fosfata prema proteinu (vrh) Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženom ljudskom rekombinantnom proteinu αgalaktozidaze-A (FZ2G).
Slika 25B je grafikon koji pokazuje mol-mol odnos N-acetilneuraminske kiseline (NANA) prema proteinu Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženom ljudskom rekombinantnom proteinu α-galaktozidaze-A (FZ2G).
Slika 26 je grafikon koji prikazuje podatke površinske plazmonske rezonance (Biacore) o vezivanju rastvorljivog katjonski nezavisnog manoza-6-fosfatnog receptora za Fabrazyme® (FZ) (crvena) i Replagal® (zelena).
Slika 27 je grafikon koji prikazuje podatke površinske plazmonske rezonance (Biacore) o vezivanju rastvorljivog katjonski nezavisnog manoza-6-fosfatnog receptora za Fabrazyme® (FZ) (crvena) i Replagal® (zelena).
Slika 28 je grafikon koji pokazuje relativno vezivanje rastvorljivog katjonski nezavisnog manoza-6-fosfatnog receptora za i ovde pružen ljudski Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G), kako je određeno površinskom plazmonskom rezonancom (Biacore).
Slika 29 je grafikon koji prikazuje relativni procenat Fabrazyme® (FZ) i Replagal® eluiranih iz afinitetne kolone receptora manoza-6-fosfata sa rastućim koncentracijama manoza-6-fosfata.
Slika 30 je grafikon koji prikazuje relativni procenat Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji se eluira iz afinitetne kolone za receptor manoza-6-fosfata sa rastućim koncentracijama manoza-6-fosfata. Slika 31 je slika vrha profila kapilarnog izoelektričnog fokusiranja (icIEF) za
1
Fabrazyme® i Replagal®.
Slika 32A je grafikon koji pokazuje procenat Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji su prisutni u vrhovima 1-5 ciIEF.
Slika 32B je grafikon koji prikazuje procenat Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji su prisutni u vrhovima 6-11 ciIEF.
Slika 32C je grafikon koji pokazuje procenat Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji su prisutni u vrhovima 12-14 ciIEF.
Slika 33 je grafikon Kmza Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženi ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) određen pomoću sintetičkog pNP supstrata.
Slika 34 je grafikon Vmaxza Fabrazyme® (FZ) i ovde pruženi ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) određen pomoću sintetičkog pNP supstrata.
Slika 35 je profil eluiranja za Fabrazyme® (plavi) i Replagal® (zeleni) iz tečne hromatografije sa povratnom fazom visokog pritiska (RP-HPLC).
Slika 36 je grafikon koji prikazuje količinu GL3 u tkivu jetre (ng GL3/mg tkiva jetre) u Fabrijevom modelu miša 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 0,1 mg/kg Fabrazyme®, ili 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 0,1 mg/kg ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) ili u Fabrijevom modelu miša intravenozno primenom jedne doze nosača. Jedan uzorak je isključen iz analize, jer je izračunat kao odstupanje prema Grubsovom testu (p <0,01) (grupa označena sa „a“ na grafikonu).
Slika 37 je grafikon koji prikazuje količinu GL3 u tkivu slezine (ng GL3/mg tkiva slezine) u Fabrijevom modelu miša 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 0,1 mg/kg Fabrazyme®, ili 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 0,1 mg/kg ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) ili u Fabrijevom modelu miša intravenozno primenom jedne doze nosača. Slika 38 je grafikon koji prikazuje količinu GL3 u srčanom tkivu (ng GL3/mg srčanog tkiva) u Fabrijevom modelu miša 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 1,0 mg/kg Fabrazyme®, ili 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 1,0 mg/kg ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) ili u Fabrijevom modelu miša intravenozno primenom jedne doze nosača. Slika 39 je grafikon koji prikazuje količinu GL3 u bubrežnom tkivu (ng GL3/mg
2
bubrežnog tkiva) u Fabrijevom modelu miša 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 1,0 mg/kg Fabrazyme®, ili 3 dana ili 14 dana nakon jednokratne intravenske primene 1,0 mg/kg ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A (FZ2G) ili u Fabrijevom modelu miša intravenozno primenom jedne doze nosača.
Slika 40 je grafikon koji prikazuje aktivnost enzima tokom vremena na Fabrijevom modelu miša nakon pojedinačne intravenske primene 1 mg/kg Fabrazyme® (krugovi; 5 miševa u svakoj vremenskoj tački) ili 1 mg/kg ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (kvadrati; 8 miševa u svakoj vremenskoj tački).
DETALJAN OPIS
[0041] Ovde je obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A koji ima izmenjeni profil glikozilacije u poređenju sa Fabrazyme®, i sastavi, farmaceutski sastavi i kompleti koji sadrže najmanje jedan od ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A. Trenutno pruženi rekombinantni glikoproteini i sastavi koje sadrže trenutno pružene rekombinantne glikoproteine imaju, na primer, naredne prednosti: manju varijabilnost glikoformi i/ili niži rizik ili nivo kontaminacije (npr. manji rizik ili nivo virusne kontaminacije). Trenutno pruženi rekombinantni glikoproteini mogu takođe imati jednu ili više narednih neograničavajućih prednosti: smanjeno nespecifično ciljanje na jetru (vezivanjem za asijaloglikoproteinski receptor eksprimiran na površini hepatocita nakon primene rekombinantnog glikoproteina pacijentu, npr. ljudskom pacijentu), povećana stopa endocitoze rekombinantnog glikoproteina od strane ćelije sisara (npr. ljudske ćelije) koja na svojoj površini eksprimira protein receptora manoza-6-fosfata, povećan afinitet prema proteinu receptora manoza-6-fosfata, povećan poluživot u serumu i smanjena efektivna doza, u bilo kojoj kombinaciji, u poređenju sa Fabrazyme®. Takođe su obelodanjeni postupci generisanja ćelije sisara korisni za rekombinantno eksprimiranje rekombinantnog glikoproteina (npr. ljudski protein α-galaktozidaze-A) i postupci za proizvodnju rekombinantnog glikoproteina (npr. ljudski protein α-galaktozidaze-A). Takođe su obelodanjeni postupci tretmana Fabrijeve bolesti, postupci smanjenja nivoa globotriaosilkermida u serumu pacijenta i postupci povećanja nivoa α-galaktozidaza-A u liozosomu u ćeliji sisara (npr. ćelija in vitro ili ćelija kod pacijenta). Takođe su obelodanjeni vektori eksprimiranja koji uključuju sekvencu koja kodira ljudski protein α-galaktozidaze-A.
Alfα-galaktozidaza-A
[0042] Ljudska α-galaktozidaza-A (α-D-galaktozid galaktohidrolaza; α-gal A; EC 3.2.1.22) je lizozomska egzoglikozidaza kodirana genom na Xq22. Zrela ljudska α-galaktozidaza-A je homodimer sastavljen od dve nekovalentno povezane podjedinice od 398 aminokiselina (približno 51 kD), od kojih svaka uključuje aktivno mesto i moguća tri N-vezana mesta glikozilacije (N139, N192 i N215). Aktivno mesto na proteinu α-galaktozidaze-A ima dva ostatka aspartanske kiseline (D170 i D231) koji su kritični za katalitičku aktivnost. Trodimenzionalna kristalna struktura protein α-galaktozidaze-A objavljena je 1996. godine (Munier-Lehmann i dr., J. Biol. Chem. 271:15166-15174, 1996). Alfα-galaktozidaza-A katalizuje hidrolizu globotriaosilkeramida (GL-3) i drugih α-galaktil-okončanih neutralnih glikosfingolipida, kao što su galabiosilkeramid i supstance krvne grupe B za keramid diheksozid i galaktozu. Specifična aktivnost rekombinantnog oblika α-galaktozidaza-A se može testirati koristeći sintetički supstrat, npr. p-nitrofenil-α-D-galaktopiranozid (pNP).
[0043] Glikozilacija ljudskog proteina α-galaktozidaze-A omogućava njegovo ciljanje na lizozom u ljudskim ćelijama. Kratak sažetak ćelijskih puteva koji se koriste za glikozilovanje ljudskog proteina α-galaktozidaze-A i drugih ljudskih glikoproteina dati su u nastavku.
[0044] Ljudski protein α-galaktozidaze-A se sintetiše u endoplazmatičnom retikulumu. Nakon sinteze, svaki monomer ljudskog proteina α-galaktozidaze-A prolazi kroz modifikaciju nakon translacije u Goldžijevom aparatu. Kao što je gore napomenuto, svaki monomer ljudskog proteina α-galaktozidaze-A ima tri moguća mesta N-glikozilacije (N139, N192 i N215). Postoji nekoliko fizioloških glikoforma ljudskog proteina α-galaktozidaze-A. Ostatak N139 povezuje složene ugljene hidrate, dok ostaci N192 i N215 povezuju oligosaharide bogate manozom i stoga učestvuju u ciljanju enzima za unošenje u lizozom. Nakon sinteze u endoplazmatičnom retikulumu, prekursori lizozomskih enzima se prenose u Goldžijev aparat. Post-translacione modifikacije i, posebno, dodavanje ostataka manoza-6-fosfata (M6P) javljaju se u cis-Goldžiju. M6P-enzim kompleks vezuje se za M6P receptor i oslobađa se iz trans-Goldžijeve mreže, odakle se transportuje u prelizozomske/endozomske odeljke. Jednom u odeljku za endozome, kiseli pH dovodi do razdvajanja enzima od receptora. Zatim se podvrgava defosforilaciji kako bi proizveo zreli i funkcionalni enzim. Zatim se receptor reciklira do trans-Goldžija radi regrutovanja drugih enzima ili se premešta u plazmatsku membranu gde može sakupljati endogeni enzim (Sly i dr., J. Cell Biochem.18:67-85, 1982; Helenius i dr., Ann. Rev. Biochem.
32:1-100, 1997).
[0045] Biosinteza svih eukariotskih N-glikana započinje na citoplazmatičnom licu membrane endoplazmatičnog retikuluma (ER) prenosom GlcNAc-P iz UDP-GlcNAc u lipidno-slični prekursor dolikol fosfat (Dol-P) kako bi se dobio dolikol pirofosfat N-acetilglukozamin (Dol-PP-GlcNAc). Četrnaest šećera se sekvencijalno dodaje u Dol-P kako bi se dobio glikan od Glc3Man9GlcNAc2 pre prenosa celokupnog glikana u asparagin u sekvenci Asn-X-Ser/Thr u proteinu u ER pomoću proteina oligosakariltransferaze. N-glikan vezan za proteine se naknadno preuređuje u ER i Goldžijevom aparatu složenim nizom reakcija katalizovanih membranski vezanim glikozidazama i glikoziltransferazama. Nakon kovalentnog vezivanja 14-šećernog oligomanoznog glikana za Asn-X-Ser/Thr, koristi se niz reakcija za uklanjanje tri šećera iz Glc3Man9GlcNAc2 u ER. Ovi koraci obrezivanja sačuvani su kod svih eukariota. Obrezivanje Glc3Man9GlcNAc2 započinje sekvencijalnim uklanjanjem ostataka glukoze za αglikozidaze I i II. Obe glukozidaze funkcionišu u lumenu ER, gde α-glikozidaza I deluje na terminalni α1-2Glc, a α-glukozidaza II sekvencijalno uklanja dva unutrašnja α1-3Glc ostatka. Pre izlaska iz ER, na mnoge glikoproteine deluje ER α-mannozidaza I, koja posebno uklanja terminalni α1-2Man sa centralnog kraka Man9GlcNAc2 dajući Man8GlcNAc2 izomer. Većina glikoproteina koji izlaze iz ER na putu do Goldžijevog aparata imaju N-glikane sa osam ili devet ostataka manoze (u zavisnosti od toga da li je na njih delovala ER α-manozidaza I). Za većinu glikoproteina, dodatni ostaci manoze uklanjaju se u cis odeljku Goldžijevog aparata dok se ne generiše Man5GlcNAc2.
[0046] Biosinteza hibridnih i složenih N-glikana pokreće se u medijalnom Goldžijevom aparatu dejstvom N-acetilglukozaminiltransferaze zvane GlcNAcT-1. GlcNAcT-1 dodaje ostatak N-acetil-glukozamina C-2 manozi α1-3 u jezgru Man5GlcNAc2, što inicira prvu granu N-glikana. Jednom kada se dogodi ovaj korak, većina N-glikana se obrezuje od strane α-manozidaze II, koja uklanja terminalne α1-3Man i α1-6Man ostatke iz GlcNAcMan5GlcNAc2 kako bi se formirao GlcNAcMan3GlcNAc2. Kada se uklone dva ostatka manoze, drugi N-acetilglukozamin se dodaje u C-2 od manoze α1-6 pomoću GlcNAcT-II kako bi se dobio prekursor za sve dvostepene, složene N-glikane. Dobijeni glikan ima dve antene ili grane koje su pokrenute dodavanjem dva krajnja N-acetilglukozamin ostatka. Dodatne grane mogu se pokrenuti na C-4 od jezgra manoze α1-3 (pomoću GlcNAcT-IV) i C-6 od jezgra manoze α1-6 (pomoću GlcNAcT-V) kako bi se dobili tri- i tetra-antenski N-glikani. Drugi enzim, nazvan GlyNAcT-IX ili GlcNAcT-Vb, katalizuje istu reakciju kao GlcNAcT-V na C-6 od jezgra manoze α1-6, ali za razliku od GlcNAcT-V, GlnNAcT-IX/Vb takođe može preneti N-
2
acetilglukozamin u C-6 od jezgra manoze α1-3. Druga grana se može inicirati na C-4 od jezgra manoze α1-3 od GlcNAcT-VI.
[0047] Kompleksni i hibridni N-glikani mogu da nose bisecirajući ostatak N-acetilglukozamina, koji je vezan za β-manozu jezgra pomoću GlcNAcT-III. Bi-, tri- i tetraantenski kompleksnih N-glikana sa bisecirajućim N-acetilglukozmainom sintetiše se kada GlcNAcT-III deluje posle α-manozidaza II i pokretanja grana pomoću GlcNAcT-II, GlcNAcT-IV i GlcNAcT-V.
[0048] Dalji dodaci šećera, koji se uglavnom javljaju u trans Goldžijevom aparatu, pretvaraju hibridne i razgranate N-glikane u opsežni niz zrelih, složenih N-glikana. Šećer se može dodati u jezgro, razgranati ostaci N-acetilglukozamina mogu se izdužiti dodacima šećera, a izdužene grane se mogu poklopiti ili dekorisati. Na primer, proizvod GlcNAcT-II je dvostepeni N-glikan koji se može proširiti dodavanjem fukoze, galaktoze i sijalinske kiseline kako bi se stvorio složeni N-glikan sa dve grane. Kompleksni N-glikani mogu, na primer, da imaju mnogo dodatnih šećera, uključujući one koji su vezani za jezgro N-glikana, dodatne grane, grane produžene poli-N-acetilaktozamin jedinicama i različite strukture pokrivanja. Oligosaharidi složenog tipa se sintetišu u Goldžijevom aparatu iz oligosaharida koji sadrže manoza-3, na primer, dodavanjem ostataka N-acetilglikozamina, galaktoze i sijalinske kiseline.
[0049] Modifikacija jezgra je često dodavanje fukoze u α1-6 vezi sa N-acetilglukozaminom u blizini asparagina u jezgru glikana. Fukoziltransferaze koje su uključene u prenos fukoze u ovo jezgro N-acetilglukozamina zahtevaju prethodno dejstvo GlcNAcT-1. Većina složenih i hibridnih N-glikana ima izdužene grane koje nastaju dodavanjem β-vezanog ostatka galaktoze inicirajućem N-acetilglukozaminu kako bi se dobio sveprisutni gradivni blok Galβ1-4GlcNAc, koji se naziva N-acetilaktosamin tipa 2. Antene se mogu dalje izdužiti sekvencijalnim dodavanjem ostataka N-acetilglukozamina i galaktoze, što rezultuje tandemskim ponavljanjima LacNAc (-3Galβ1-4GlcNAcβ1-)n, koji se naziva poli-N-acetilaktozamin. U drugom primeru, β-vezana galaktoza se dodaje u C-3 od N-acetilglukozamina kako bi se dobio Galβ1-3GlcNAc, koji se naziva sekvencom N-acetilaktozamina tipa-1. U nekim proteinima, β-vezan N-acetilgalaktozamin se dodaje N-acetilglukozaminu umesto β-vezane galaktoze, dajući antene sa produžetkom GalNAcβ1-4GlcNAc. Reakcije poklapanja ili dekorisanja uključuju dodavanje sijalinske kiseline, fukoze, galaktoze, N-acetilgalaktozamina i sulfata na grane. Najčešći su šećeri α-vezani i zbog toga se protežu dalje od β-vezanih vrpca sličnih grana poli-Nacetilaktozamina.
[0050] Lizozomski enzimi mogu da steknu GlcNAc-1-P na C-6 od ostataka manoze na oligomanoznim N-glikanima u cis Goldžijevom aparatu. N-acetil-glukozamin se zatim uklanja u trans Goldžijevom aparatu glikozidazom, izlažući na taj način ostatke Man-6-P koje prepoznaje Man-6-P receptor i usmerava ih u zakiseljeni prelizozomski odeljak.
[0051] Oligosaharidi hibridnog tipa sintetišu se na Goldžiju iz jezgarnih struktura manoza-3 i manoza-5 dodatkom, na primer, ostataka N-acetilglikozamina, galaktoze i sijalinske kiseline. Hibridni N-glikani nastaju ako na GlcNAcMan5GlcNAc2 glikan ne deluje α-manozidaza II, ostavljajući periferne α1-3Man i α1-6Man ostatke netaknutim i nepromenjenim u zrelom glikoproteinu. Nepotpuna akcija α-manozidaza II može rezultovati GlcNAcMan4GlcNAc2 hibridima. Još jedna manolidaza Goldžijevog aparata, α-manozidaza IIX, takođe deluje na GlnNAcMan5GlcNAc2 generisane GlcNAcT-1.
[0052] Detaljan pregled biosintetskih puteva i enzima koji se koriste za generisanje N-vezanih glikana (npr. oligosaharidi visokog tipa manoze) opisani su kod Stanley i dr., „N-Glycans“ in Essentials of Glycobiology, Ed. Varki, Cummings, and Eskho, Cold Spring Harbor Press, 2009. Kao što je gore navedeno, post-translaciona glikozilacija ljudskog rekombinantnog αgalaktozidaza-A je važna za pravilan promet proteina. Na primer, zamena serinskog ostatka na položaju aminokiselina 215 dovodi do oštećenja prometa enzima do lizozoma (Munier-Lehmann i dr., J. Biol. Chem.271:15166-15174, 1996; Wildt i dr., Nat. Rev. Microbiol.3:119-128, 2005). Studija koja opisuje različite glikoforme ljudskog proteina α-galaktozidaze-A eksprimirane u CHO ćeliji opisana je kod Matsuura i dr., Glycobiology 8:329-339, 1998.
[0053] Primeri prekursora i zrelih sekvenci ljudskog proteina α-galaktozidaze-A prikazani su na Slici 2 (SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno). Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze, kako je ovde opisan, može sadržati sekvencu koja je najmanje 95% identična (npr. najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična) sa SEQ ID NO: 1 ili 2. Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može da ima (npr. sastoji se od) sekvencu koja je najmanje 95% identična (npr., najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična) sa SEQ ID NO: 1 ili 2. U drugim primerima, ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može da sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2 sa 1 do 30 aminokiselina (npr. 1 do 25 aminokiselina, 1 do 20 aminokiselina, 1 do 15 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 5 aminokiselina, 1 do 3 aminokiseline, 1 ili 2
2
aminokiseline, 20 do 25 aminokiselina, 15 do 25 aminokiselina, 10 do 25 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 8 aminokiselina i 5 do 15 aminokiselina) uklonjenih sa N-terminusa i/ili 1 do 30 aminokiselina uklonjenih sa C-terminusa (npr. 1 do 25 aminokiselina, 1 do 20 aminokiselina, 1 do 15 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 5 aminokiselina, 1 do 3 aminokiselina, 1 ili 2 aminokiseline, 20 do 25 aminokiselina, 15 do 25 aminokiselina, 10 do 25 aminokiselina, 1 do 10 aminokiseline, 1 do 8 aminokiselina i 5 do 15 aminokiselina).
[0054] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može biti kovalentno vezan za heterolognu sekvencu ili oznaku aminokiseline. Neograničavajući primeri heterologne aminokiselinske sekvence koja se može vezati za ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze uključuju: poli-His oznaku, protein koji vezuje hitin, protein koji vezuje maltozu, glutation-S-transferazu i streptavidin. Bilo koja vrsta oznake može biti kovalentno vezana za ljudski protein α-galaktozidaze-A (npr. fluorescentna grupa, radionukleotid i fluorescentni protein). Dodatni primeri molekula koji se mogu kovalentno vezati za ljudski protein α-galaktozidaze-A uključuju polimer, npr. polietilen glikol, polivinil, poliester, polilaktid, poliglikolid, polikaprolakton i njihove kopolimere.
[0055] Primeri prekursora i zrelih sekvenci ljudskog proteina α-galaktozidaze-A prikazani su na Slici 2 (SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno). Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze, kako je ovde opisan, može sadržati sekvencu koja je najmanje 95% identična (npr. najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična) sa SEQ ID NO: 1 ili 2. Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može da ima (npr. sastoji se od) sekvencu koja je najmanje 95% identična (npr., najmanje 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identična) sa SEQ ID NO: 1 ili 2. U drugim primerima, ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može da sadrži sekvencu SEQ ID NO: 2 sa 1 do 30 aminokiselina (npr. 1 do 25 aminokiselina, 1 do 20 aminokiselina, 1 do 15 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 5 aminokiselina, 1 do 3 aminokiseline, 1 ili 2 aminokiseline, 20 do 25 aminokiselina, 15 do 25 aminokiselina, 10 do 25 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 8 aminokiselina i 5 do 15 aminokiselina) uklonjenih sa N-terminusa i/ili 1 do 30 aminokiselina uklonjenih sa C-terminusa (npr. 1 do 25 aminokiselina, 1 do 20 aminokiselina, 1 do 15 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 5 aminokiselina, 1 do 3 aminokiseline, 1 ili 2 aminokiseline, 20 do 25 aminokiselina, 15 do 25 aminokiselina, 10 do 25 aminokiselina, 1 do 10 aminokiselina, 1 do 8 aminokiselina i 5 do 15 aminokiselina).
[0056] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može biti kovalentno vezan za
2
heterolognu sekvencu ili oznaku aminokiseline. Neograničavajući primeri heterologne aminokiselinske sekvence koja se može vezati za ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze uključuje: poli-His oznaku, protein koji vezuje hitin, protein koji vezuje maltozu, glutation-S-transferazu i streptavidin. Bilo koja vrsta oznake može biti kovalentno vezana za ljudski protein α-galaktozidaze-A (npr. fluorescentna grupa, radionukleotid i fluorescentni protein). Dodatni primeri molekula koji se mogu kovalentno vezati za ljudski protein α-galaktozidaze-A uključuje polimer, npr. polietilen glikol, polivinil, poliester, polilaktid, poliglikolid, polikaprolakton i njihove kopolimere.
[0057] Primer nukleinske kiseline (npr. cDNK) koja kodira ljudski protein α-galaktozidaze-A prikazan je na Slici 2 (SEQ ID NO: 1).
[0058] U nekim primerima, bilo koja od ovde opisanih nukleinskih kiselina (npr. cDNK) može biti kovalentno vezana za jednu od više fluorescentnih oznaka i za gasioca. U drugim primerima, bilo koja nukleinska kiselina (npr. cDNK) može da uključuje ili dalje uključuje najmanje jedan nukleotid koji uključuje radioizotop (npr. P<32>, P<33>, i/ili S<35>).
Izmenjeni glikoformi proteina α-galaktozidaze-A
[0059] Ova specifikacija obelodanjuje ljudskog rekombinantnog proteine α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji su izmenili (npr. poboljšali) glikozilaciju u poređenju sa Fabrayzme®. Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A imaju, na primer, povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (u poređenju sa Fabrazyme®) što rezultuje povećanim vezivanjem za manoza-6-fosfat receptor, što zauzvrat može da poveća brzinu endocitoze rekombinantnog proteina od strane ćelije sisara (npr. ljudske ćelije) koja na svojoj površini eksprimira protein receptora manoza-6-fosfata (u poređenju sa Fabrazyme®). Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze A takođe mogu imati jedan ili oba od smanjenog procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi i povećanog procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi u poređenju sa Fabrazyme®, što može rezultovati smanjenjem nespecifičnog ciljanja rekombinantnog proteina na jetru (vezivanjem za asijaloglikoproteinski receptor eksprimiran na površini hepatocita nakon primene ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A kod pacijenta, npr. pacijenta koji je čovek) i povećani poluživot u serumu, u poređenju sa Fabrazyme®.
2
[0060] Ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, na primer, pokazuje manju varijabilnost u svom sastavu (npr. manju varijabilnost glikoformi) i/ili je sigurniji proizvod (npr. smanjeni rizik ili nivo kontaminacije sa jednim ili više bakteriofaga, bakterija, mikobakterija, i virusa (npr. enterovirusi (npr. ljudski ili životinjski enterovirusi), rinovirusi (npr. životinjski ili ljudski rinovirusi), životinjski ili ljudski pikobirnavirusi, kobuvirusi, zarazni goveđi rinotraheitis, goveđi virus dijareje, goveđi reovirus-3, kalicivirus, poliovirusi, rotavirusi (npr. životinjski ili ljudski rotavirus), goveđi spumavirusi, svinjski endogeni retrovirus, virus goveđe imunodeficijencije, virusi hepatitisa, vesivirusi (npr. vesivirus 2117), norovirusi (npr. životinjski ili ljudski norovirusi), astrovirusi (npr. ljudski ili životinjski astrovirusi), životinjski ili ljudski parainfluenza ili metapneumovirusi, anelovirusi, koronavirusi, flebovirusi, goveđi šmalenbergov virus, kalicivirus, ciklovirusi, cirkovirusi (npr. svinjski ili goveđi cirkovirus), kosavirusi, koksaki virus, kubavirus, pestivirus, poliomi virusi (npr. virus goveđeg polioma), goveđi papiloma virus, novi papiloma glodara tipa 2 SV40, parvovirusi (npr. svinjski, glodarski, ljudski ili goveđi parvovirus), kardiovirusi (npr. EMCV), paramiksovirusi, virus vezikularnog stomatitisa, girovirusi, kosavirus, virus Seneka doline, koronavirus, zarazna anemija konja, ljudski adenovirus, mačji kalicivirus, adenovirus tipa 2, goveđi adenovirus tipa 3, virus pseudobesnila, virus goveđe dijareje, parainfluenca tipa 3, infektivni goveđi rinotraheitis, virus plavog jezika, virus mačje leukemije, minutni virus miševa, goveđi parvovirus, virus keš doline, reovirus (npr. reovirus životinja ili čoveka), adenovirus pasa, virus SV-40, virus encefalomiokarditisa, svinjski PRRSV, virus goveđeg herpesa 4 ili bolest stopala i usta)).
[0061] Ranije se pokazalo da Fabrazyme® ima značajno drugačiji obrazac glikozilacije u poređenju sa Replagal® (Lee i dr., Glycobiology 13:305-313, 2003). Smatra se da su značajne razlike u obrascu glikozilacije Fabrazyme® i Replagal® delom posledica različitih ćelijskih linija koje se koriste za proizvodnju ovih proteina (npr. Fabrazyme® proizvodi CHO ćelijska linija, a Replagal® proizvodi ljudska ćelijska linija).
[0062] Fabrazyme® je rekombinantni oblik ljudskog proteina α-galaktozidaze-A koji proizvodi i prodaje kompanija Genzyme. Fabrazyme® i postupci pravljenja Fabrazyme® opisani su, na primer, u SAD patentima br. 5,356,804. Replagal® je rekombinantni oblik ljudski protein αgalaktozidaze-A koji proizvodi i prodaje kompanija Shire. Replagal® i načini izrade Replagal® opisani su, na primer, u SAD patentima br.6,083,725; 6,458,574; 6,395,884; i 7,133,354.
2
[0063] Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze (FZ2G) imaju dve ili više (npr. 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12) od bilo kojih strukturnih karakteristika (npr. u bilo kojoj kombinaciji) (i) do (xii) kako je navedeno u nastavku. Bilo koji raspon vrednosti naveden u nastavku za svaki od jednog ili više parametara od (i) do (xii) može biti prisutan u ovde obelodanjenom ljudskom rekombinantnom proteinu α-galaktozidaze-A. Pored toga, bilo koji od ovde pruženih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A mogu imati jedno ili više (npr. jedno, dva ili tri) primernih funkcionalnih svojstava opisanih u ovom odeljku. Svaka kombinacija fizičkih karakteristika i/ili funkcionalnih svojstava ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A može se kombinovati na bilo koji način. U nastavku su opisane primerne kombinacije strukturnih karakteristika ovde obelodanjenih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A.
[0064] Pored toga, ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati manju varijabilnost u strukturi (npr. manju varijabilnost glikoformi) i/ili smanjeni rizik ili nivo kontaminacije (npr. smanjeni rizik ili nivo kontaminacija).
[0065] Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može da nema primetni nivo ili da nema protein, lipid, ugljene hidrate, nukleinsku kiselinu i zagađivače (npr. bilo koji od ovde opisanih zagađivača) prisutne u životinjskim proizvodima (npr. serum životinje, životinjska plazma, ili proizvod životinjske krvi). Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijum kulture odabran iz grupe hemijski definisanog medijuma bez proteina i seruma. Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijum bez proteina i/ili hemijski definisan medijum. Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijume za kulturu odabrane iz grupe koja se sastoji od hemijski definisanog medijuma bez seruma i proteina i izolovan korišćenjem integrisanog i kontinuiranog procesa (npr. bilo koji integrisani i kontinuirani procesi koji su opisani ovde ili u WO 14/137903). Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein koji ima poboljšani sigurnosni profil (npr. smanjeni rizik od kontaminacije (npr. bilo koji od ovde opisanih ili poznatih primera zagađivača), u poređenju sa ovde pruženim rhAGA proteinom koji se proizvodi postupkom koji uključuje upotrebu medijuma kulture koji sadrži životinjski proizvod (npr. životinjski serum, životinjsku plazmu ili faktor životinjske krvi ili protein).
2
Biofizička svojstva
I. N-vezani monosijalinizovani oligosaharidi
[0066] Ovde opisani ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi u poređenju sa Fabrazyme®. Ovde opisani ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati približno isti ili malo smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu u poređenju sa Fabrazyme®. Ova karakteristika je korisna jer monosijalinizovani oligosaharidi mogu sadržati izložene ostatke galaktoze koji se vezuju za asijaloglikoproteinski receptor eksprimiran na hepatocitima u jetri. Jetra nije ciljano tkivo za ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A i prema tome, smatra se da smanjenje količine monosijalinizovanih oligosaharida smanjuje neproduktivno ciljanje ovog enzima u ljudskom telu.
[0067] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 3 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 1,7% do oko 3,2%. Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini αgalaktozidaze-A (FZ2G) mogu imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 3 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 1,6% (npr., između oko 0,1% i oko 1,5%, između oko 0,1% i oko 1,4%, između oko 0,1% i oko 1,3%, između oko 0,1% i oko 1,2%, između oko 0,1% i oko 1,1%, između oko 0,1% i oko 1,0%, između oko 0,1% i oko 0,9%, između oko 0,1% i oko 0,8%, između oko 0,1% i oko 0,7%, između oko 0,1% i oko 0,6%, između oko 0,1% i oko 0,5%, između oko 0,1% i oko 0,4%, između oko 0,2% i oko 1,4%, između oko 0,2% i oko 1,3%, između oko 0,2% i oko 1,2%, između oko 0,2% i oko 1,0%, između oko 0,2% i oko 0,9%, između oko 0,2% i oko 0,8%, između oko 0,2% i oko 0,7%, između oko 0,3% i oko 1,4%, između oko 0,3% i oko 1,3%, između oko 0,3% i oko 1,3%, između oko 0,3% i oko 1,2%, između oko 0,3% i oko 1,2%, između oko 0,3% i oko 1,1%, između oko 0,3% i oko 1,0%, između oko 0,3% i oko 0,9%, između oko 0,3% i oko 0,8%, između oko 0,3% i oko 0,7%, između oko 0,4% i oko 1,4%, između oko 0,4% i oko 1,3%, između oko 0,4% i oko 1,2%, između oko 0,4% i oko 1,1%, između oko 0,4% i oko 1,0%, između oko 0,4% i oko 0,9%, između oko 0,4% i oko 0,8%, između oko 0,4% i oko 0,7%, između oko 0,5% i oko 1,4%, između oko 0,5% i oko 1,3%, između oko 0,5% i oko 1,2%, između oko 0,5% i oko 1,1%, između oko 0,5% i oko 1,0%, između oko 0,5% i oko 0,9%, ili između oko 0,6% i oko 1,2%).
[0068] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 2 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 2,0% i oko 5,7%. Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A (FZ2G) mogu imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 2 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i 3,0% (npr., između oko 0,1% i oko 2,9%, između oko 0,1% i oko 2,8%, između oko 0,1% i oko 2,7%, između oko 0,1% i oko 2,6%, između oko 0,1% i oko 2,5%, između oko 0,1% i oko 2,4%, između oko 0,1% i oko 2,3%, između oko 0,1% i oko 2,2%, između oko 0,1% i oko 2,1%, između oko 0,1% i oko 2,0%, između oko 0,1% i oko 1,9%, između oko 0,1% i oko 1,8%, između oko 0,1% i oko 1,7%, između oko 0,1% i oko 1,6%, između oko 0,1% i oko 1,5%, između oko 0,1% i oko 1,4%, između oko 0,1% i oko 1,3%, između oko 0,1% i oko 1,2%, između oko 0,3% i oko 3,0%, između oko 0,3% i oko 2,9%, između oko 0,3% i oko 2,8%, između oko 0,3% i oko 2,7%, između oko 0,3% i oko 2,6%, između oko 0,3% i oko 2,5%, između oko 0,3% i oko 2,4%, između oko 0,3% i oko 2,3%, između oko 0,3% i oko 2,2%, između oko 0,3% i oko 2,1%, između oko 0,3% i oko 2,0, između oko 0,3% i oko 1,9%, između oko 0,3% i oko 1,8%, između oko 0,3% i oko 1,7%, između oko 0,3% i oko 1,6%, između oko 0,3% i oko 1,5%, između oko 0,3% i oko 1,4%, između oko 0,3% i oko 1,3%, ili između oko 0,3% i oko 1,2%).
[0069] Primeri postupaka za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi ili monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu opisani su u primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
II. N-vezani bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi
[0070] Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Povećani nivo bis-manoza-6-fosfatnih oligosaharida rezultuje povećanim ciljanjem na ćelije koje eksprimiraju receptor manoza-6-fosfata na svojoj plazmatskoj membrani. Vezivanje za receptor manoza-6-fosfata pokreće endocitozu enzima u ćeliju i prebacivanje enzima u ćelijski lizozom.
[0071] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-
1
fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 4,0% i oko 7,0%. Na primer, ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 7,5% (npr., veći od oko 7,6%, veći od oko 7,7%, veći od oko 7,8%, veći od oko 7,9%, veći od oko 8,0%, veći od oko 8,1%, veći od oko 8,2%, veći od oko 8,2%, veći od oko 8,3%, veći od oko 8,4%, veći od oko 8,5%, veći od oko 8,6%, veći od oko 8,7%, veći od oko 8,8%, veći od oko 8,9%, veći od oko 8,9%, veći od oko 9,0%, veći od oko 9,1%, veći od oko 9,2%, veći od oko 9,3%, veći od oko 9,4%, veći od oko 9,5%, veći od oko 9,6%, veći od oko 9,7%, veći od oko 9,8%, veći od oko 9,9%, veći od oko 10,0%, veći od oko 10,1%, veći od oko 10,2%, veći od oko 10,3%, veći od oko 10,4%, veći od oko 10,5%, veći od oko 10,6%, veći od oko 10,7%, veći od oko 10,8%, veći od oko 10,9%, ili veći od oko 11%). Na primer, ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bismanoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koja je između oko 7,0% i oko 13%, između oko 8,0% i oko 12,0%, ili između oko 9,0% i oko 11,0%.
[0072] Primeri postupaka za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bismanoza-6-fosfatni oligosaharidi opisani su u primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
III. N-vezani bisijalinizovani oligosaharidi i N-vezani bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu
[0073] Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati približno isti ili povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 5 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Smatra se da povećani nivo oligosaharida koji sadrže bisijalinizovane fukoze povećava poluživot proteina in vivo i/ili in vitro (npr. u serumu kod pacijenta ili u farmaceutskom sastavu).
[0074] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani
2
oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 11,0% i oko 14,2%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 13,0% (npr., veći od oko 13,1%, veći od oko 13,2%, veći od oko 13,3%, veći od oko 13,4%, veći od oko 13,5%, veći od oko 13,6%, veći od oko 13,7%, veći od oko 13,8%, veći od oko 13,9%, veći od oko 14,0%, veći od oko 14,1%, veći od oko 14,2%, veći od oko 14,3%, veći od oko 14,4%, veći od oko 14,5%, veći od oko 14,6%, veći od oko 14,7%, veći od oko 14,8%, veći od oko 14,9%, ili veći od 15,0%). Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 13,0% do oko 15,0%, između oko 13,5% do oko 15,5%, između oko 14,0% do oko 16,0%, ili između oko 14,5% i oko 16,5%.
[0075] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 5 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 5,6% i oko 7,1%. Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini αgalaktozidaze-A mogu imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 5 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 5,3% (npr., između oko 0,1% i oko 5,2%, između oko 0,1% i oko 5,1%, između oko 0,1% i oko 5,0%, između oko 0,1% i oko 4,9%, između oko 0,1% i oko 4,8%, između oko 0,1% i oko 4,7%, između oko 0,1% i oko 4,6%, između oko 0,1% i oko 4,5%, između oko 0,1% i oko 4,4%, između oko 0,1% i oko 4,3%, između oko 0,1% i oko 4,2%, između oko 0,1% i oko 4,1%, između oko 0,1% i oko 4,0%, između oko 0,1% i oko 3,9%, između oko 0,1% i oko 3,8%, oko 0,1% i oko 3,7%, između oko 0,1% i oko 3,6%, između oko 0,1% i oko 3,5%, između oko 0,1% i oko 3,4%, između oko 0,1% i oko 3,3%, između oko 0,1% i oko 3,2%, između oko 0,1% i oko 3,1%, između oko 0,1% i oko 3,0%, između oko 0,1% i oko 2,9%, između oko 0,1% i oko 2,8%, između oko 0,1% i oko 2,7%, između oko 0,1% i oko 2,6%, između oko 0,1% i oko 2,5%, između oko 0,3% i oko 5,2%, između oko 0,3% i oko 5,1%, između oko 0,3% i oko 5,0%, između oko 0,3% i oko 4,9%, između oko 0,3% i oko 4,8%, između oko 0,3% i oko 4,7%, između oko 0,3% i oko 4,6%, između oko 0,3% i oko 4,5%, između oko 0,3% i oko 4,4%, između oko 0,3% i oko 4,3%, između oko 0,3% i oko 4,2%, između oko 0,3% i oko 4,1%, između oko 0,3% i oko 4,0%, između oko 0,3% i oko 3,9%, između oko 0,3% i oko 3,8%, između oko 0,3% i oko 3,7%, između oko 0,3% i oko 3,6%, između oko 0,3% i oko 3,5%, između oko 0,3% i oko 3,5%, između oko 0,3% i oko 3,4%, između oko 0,3% i oko 3,3%, između oko 0,3% i oko 3,2%, između oko 0,3% i oko 3,1%, između oko 0,3% i oko 3,0%, između oko 0,3% i oko 2,9%, između oko 0,3% i oko 2,8%, između oko 0,3% i oko 2,7%, između oko 0,3% i oko 2,6%, ili između oko 0,3% i oko 2,5%).
[0076] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi i bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu opisani su u primerima. U struci su poznati i dodatni.
IV N-vezani trisijalinizovani oligosaharidi
[0077] Ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A koji su ovde obelodanjeni mogu imati povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (tj., vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini αgalaktozidaze-A mogu imati smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 (npr. vrh 6 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Umetak na Slici 10 prikazuje dve triantenarne, trisijalinizovane oligosaharidne strukture, gde jedna od dve strukture odgovara vrhu 6 (oblik 1), a druga od dve strukture odgovara vrhu 6' (oblik 2) u hromatografskom profilu eluiranja N-vezanih oligosaharida derivatizovanih sa 2-AA.. Smatra se da povećani nivo trisijalinizovanih oligosaharida koji sadrže fukozu povećava poluživot proteina in vivo i/ili in vitro (npr. u serumu kod pacijenta ili u farmaceutskom sastavu).
[0078] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (npr. vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,5% i oko 1,2%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može da ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (npr. vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od 2,0% (npr., veći od 2,1%, veći od 2,2%, veći od 2,3%, veći od 2,4%, veći od 2,5%, veći od 2,6%, veći od 2,7%, veći od 2,8%, veći od 2,9%, veći od 3,0%, veći od 3,1%, veći od 3,2%, veći od 3,3%, veći od 3,4%, veći od 3,5%, veći od 3,6%, veći od 3,7%, veći od 3,8%, veći od 3,9%, veći od
4
4,0%, veći od 4,1%, veći od 4,2%, veći od 4,3%, veći od 4,4%, veći od 4,5%, veći od 4,6%, veći od 4,7%, veći od 4,8%, veći od 4,9%, veći od 5,0%, veći od 5,1%, veći od 5,2%, veći od 5,3%, veći od 5,4%, veći od 5,5%, veći od 5,6%, veći od 5,7%, veći od 5,8%, veći od 5,9%, veći od 6,0%, veći od 6,1%, veći od 6,2%, veći od 6,3%, veći od 6,4%, veći od 6,5%, veći od 6,7%, veći od 6,8%, veći od 6,9%, veći od 7,0%, ili veći od 7,1%). Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može da ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (npr. vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 5,0% i oko 9,0%, između oko 5,5% i oko 8,5%, između oko 6,0% i oko 8,0%, ili između oko 6,5% i oko 7,5%.
[0079] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 (npr. vrh 6 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 9,5% i oko 13%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 (npr. vrh 6 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 0,1% i oko 9,0% (npr., između oko 0,1% i oko 8,9%, između oko 0,1% i oko 8,8%, između oko 0,1% i oko 8,7%, između oko 0,1% i oko 8,6%, između oko 0,1% i oko 8,5%, između oko 0,1% i oko 8,4%, između oko 0,1% i oko 8,3%, između oko 0,1% i oko 8,2%, između oko 0,1% i oko 8,1%, između oko 0,1% i oko 8,0%, između oko 0,1% i oko 7,9%, između oko 0,1% i oko 7,8%, između oko 0,1% i oko 7,7%, između oko 0,1% i oko 7,6%, između oko 0,1% i oko 7,5%, između oko 0,1% i oko 7,4%, između oko 0,1% i oko 7,3%, između oko 0,1% i oko 7,2%, između oko 0,1% i oko 7,1%, između oko 0,1% i oko 7,0%, između oko 0,1% i oko 6,9%, između oko 0,1% i oko 6,8%, između oko 0,1% i oko 6,7%, između oko 0,1% i oko 6,6%, između oko 0,1% i oko 6,5%, između oko 0,1% i oko 6,4%, između oko 0,1% i oko 6,3%, između oko 0,1% i oko 6,2%, između oko 0,1% i oko 6,1%, između oko 0,1% i oko 6,0%, između oko 0,1% i oko 5,9%, između oko 0,1% i oko 5,8%, između oko 0,1% i oko 5,7%, između oko 0,1% i oko 5,6%, između oko 0,1% i oko 5,5%, između oko 0,1% i oko 5,4%, između oko 0,1% i oko 5,3%, između oko 0,1% i oko 5,2%, između oko 0,1% i oko 5,1%, između oko 0,1% i oko 5,0%, između oko 0,1% i oko 4,9%, između oko 0,1% i oko 4,8%, između oko 0,1% i oko 4,7%, između oko 0,1% i oko 4,6%, između oko 0,1% i oko 4,5%, između oko 0,1% i oko 4,4%, između oko 0,1% i oko 4,3%, između oko 0,1% i oko 4,2%, između oko 0,1% i oko 4,1%, između oko 0,1% i oko 4,0%, između oko 0,1% i oko 3,9%, između oko 0,1% i oko 3,8%, između oko 0,1% i oko 3,7%, između oko 0,1% i oko 3,6%, između oko 0,1% i oko 3,5%, između oko 0,1% i oko 3,4%, između oko 0,1% i oko 3,3%, između oko 0,1% i oko 3,2%, između oko 0,1% i oko 3,1%, ili između oko 0,1% i oko 3,0%).
[0080] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su trisijalinizovani oligosaharidi opisani su u primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
V. Mol/mol odnos sijalinske kiseline/proteina
[0081] Ovde pružen ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati mol prema molu odnos sijalinske kiseline i proteina koji je približno isti ili veći nego kod Fabrazyme®. Smatra se da povećani broj molekula sijalinske kiseline prisutnih u oligosaharidima povećava poluživot proteina in vitro i/ili in vivo (npr. u farmaceutskom sastavu i u serumu sisara).
[0082] Fabrazyme® ima mol prema molu odnos sijalinske kiseline i proteina od oko 2,6 do oko 3,3. Fabrazyme® takođe ima mol prema molu odnos sijalinske kiseline i manoza-6-fosfata veći od 1,5. Na primer, ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati mol/mol odnos sijalinske kiseline prema proteinu veći od 3,0 (npr., veći od 3,1, veći od 3,2, veći od 3,3, veći od 3,4, veći od 3,5, veći od 3,6, veći od 3,7, veći od 3,8, veći od 3,9, veći od 4,0, veći od 4,1, veći od 4,2, veći od 4,3, veći od 4,4, veći od 4,5, veći od 4,6, veći od 4,7, veći od 4,8, veći od 4,9, ili veći od 5,0).
[0083] Primerni postupci za određivanje mol/mol odnosa sijalinske kiseline prema proteinu opisani su u primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
VI. N-vezani neutralno naelektrisani oligosaharidi
[0084] Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®.
[0085] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su N-vezani neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 4,0% do oko 7,1%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 0,1% i oko 3,9% (npr., između oko 0,1% i oko 3,8%, između oko 0,1% i oko 3,7%, između oko 0,1% i oko 3,6%, između oko 0,1% i oko 3,5%, između oko 0,1% i oko 3,4%, između oko 0,1% i oko 3,3%, između oko 0,1% i oko 3,2%, između oko 0,1% i oko 3,1%, između oko 0,1% i oko 3,0%, između oko 0,1% i oko 2,9%, između oko 0,1% i oko 2,8%, između oko 0,1% i oko 2,7%, između oko 0,1% i oko 2,6%, između oko 0,1% i oko 2,5%, između oko 0,1% i oko 2,4%, između oko 0,1% i oko 2,3%, između oko 0,1% i oko 2,2%, između oko 0,1% i oko 2,1%, između oko 0,1% i oko 2,0%, između oko 0,1% i oko 1,9%, između oko 0,1% i oko 1,8%, između oko 0,1% i oko 1,7%, između oko 0,1% i oko 1,6%, između oko 0,1% i oko 1,5%, između oko 0,1% i oko 1,4%, između oko 0,1% i oko 1,3%, između oko 0,1% i oko 1,2%, između oko 0,1% i oko 1,1%, između oko 0,1% i 1,0%, između oko 0,3% i oko 3,9%, između oko 0,3% i oko 3,8%, između oko 0,3% i oko 3,7%, između oko 0,3% i oko 3,6%, između oko 0,3% i oko 3,5%, između oko 0,3% i oko 3,4%, između oko 0,3% i oko 3,3%, između oko 0,3% i oko 3,2%, između oko 0,3% i oko 3,1%, između oko 0,3% i oko 3,0%, između oko 0,3% i oko 2,9%, između oko 0,3% i oko 2,8%, između oko 0,3% i oko 2,7%, između oko 0,3% i oko 2,6%, između oko 0,3% i oko 2,5%, između oko 0,3% i oko 2,4%, između oko 0,3% i oko 2,3%, između oko 0,3% i oko 2,2%, između oko 0,3% i oko 2,1%, između oko 0,3% i oko 2,0%, između oko 0,3% i oko 1,9%, između oko 0,3% i oko 1,8%, između oko 0,3% i oko 1,7%, između oko 0,3% i oko 1,6%, između oko 0,3% i oko 1,5%, između oko 0,3% i oko 1,4%, između oko 0,3% i oko 1,3%, između oko 0,3% i oko 1,2%, između oko 0,3% i oko 1,1%, ili između oko 0,3% i oko 1,0%).
[0086] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom obeleženim profilima) opisani su u Primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
VII. N-vezani manoza-6-fosfatni oligosaharidi
[0087] Obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati približno isti ili malo smanjeni procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi u poređenju sa Fabrazyme®.
[0088] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su N-vezani manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 5,5% do oko 10,0%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 0,1% do oko 7,0% (npr., između oko 0,1% do oko 6,9%, između oko 0,1% do oko 6,8%, između oko 0,1% do oko 6,7%, između oko 0,1% do oko 6,6%, između oko 0,1% do oko 6,5%, između oko 0,1% do oko 6,4%, između oko 0,1% do oko 6,3%, između oko 0,1% do oko 6,2%, između oko 0,1% do oko 6,1%, između oko 0,1% do oko 6,0%, između oko 0,1% do oko 5,9%, između oko 0,1% do oko 5,8%, između oko 0,1% do oko 5,7%, između oko 0,1% do oko 5,6%, između oko 0,1% do oko 5,5%, između oko 0,1% do oko 5,4%, između oko 0,1% do oko 5,3%, između oko 0,1% do oko 5,2%, između oko 0,1% do oko 5,1%, ili između oko 0,1% do oko 5,0%). Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 5,0% i oko 7,0%.
[0089] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) opisani su u Primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
VIII. N-vezani monofosforilizovani oligosaharidi
[0090] Obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi u poređenju sa Fabrazyme®.
[0091] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su N-vezani monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 10,9% do oko 14,7%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 14,8% (npr., veći od oko 14,9%, veći od 15,0%, veći od oko 15,1%, veći od oko 15,2%, veći od oko 15,3%, veći od oko 15,4%, veći od oko 15,5%, veći od oko 15,6%, veći od oko 15,7%, veći od oko 15,8%, veći od oko 15,9%, veći od oko 16,0%, veći od oko 16,1%, veći od oko 16,2%, veći od oko 16,3% veći od oko 16,4%, veći od oko 16,5%, veći od oko 16,6%, veći od oko 16,7%, veći od oko 16,8%, veći od oko 16,9%, veći od oko 17,0%, veći od oko 17,1%, veći od oko 17,2%, veći od oko 17,3%, veći od oko 17,4%, veći od oko 17,5%, veći od oko 17,6%, veći od oko 17,7%, veći od oko 17,8%, veći od oko 17,9%, veći od oko 18,0%, veći od oko 18,1%, veći od oko 18,2%, veći od oko 18,3%, veći od oko 18,4%, veći od oko 18,5%, veći od oko 18,6%, veći od oko 18,7%, veći od oko 18,8%, veći od oko 18,9%, veći od oko 19,0%, veći od oko 19,1%, veći od oko 19,2%, veći od oko 19,3%, veći od oko 19,4%, veći od oko 19,5%, veći od oko 19,6%, veći od oko 19,7%, veći od oko 19,8%, veći od oko 19,9%, veći od oko 20,0%, veći od oko 20,1%, veći od oko 20,2%, veći od oko 20,3%, veći od oko 20,4%, veći od oko 20,5%, veći od oko 20,6%, veći od oko 20,7%, veći od oko 20,8%, veći od oko 20,9%, veći od oko 21,0%, veći od oko 21,1%, veći od oko 21,2%, veći od oko 21,3%, veći od oko 21,4%, veći od oko 21,5%, veći od oko 21,6%, veći od oko 21,7%, veći od oko 21,8%, veći od oko 21,9%, veći od oko 22,0%, veći od oko 22,1%, veći od oko 22,2%, veći od oko 22,3%, veći od oko 22,4%, veći od oko 22,5%, veći od oko 22,6%, veći od oko 22,7%, veći od oko 22,8%, veći od oko 22,9%, ili veći od oko 23,0%). Na primer, ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) može da ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 15,5% i oko 17,5%, između oko 16,0% i oko 18,0%, ili između oko 16,5% i oko 18,5%.
[0092] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) opisani su u Primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
IX. N-vezani tetrasijalinizovani oligosaharidi
[0093] Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) u poređenju sa Fabrazyme®. Smatra se da povećani nivo tetrasijalinizovanih oligosaharida povećava poluživot proteina in vivo i/ili in vitro (npr. u serumu kod pacijenta ili u farmaceutskom sastavu).
[0094] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 2,3% do oko 4,8%. Na primer, ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 4,9% (npr., veći od oko 5,0%, veći od oko 5,1%, veći od oko 5,2%, veći od oko 5,3%, veći od oko 5,4%, veći od oko 5,5%, veći od oko 5,6%, veći od oko 5,7%, veći od oko 5,8%, veći od oko 5,9%, veći od oko 6,0%, veći od oko 6,1%, veći od oko 6,2%, veći od oko 6,3%, veći od oko 6,4%, veći od oko 6,5%, veći od oko 6,6%, veći od oko 6,7%, veći od oko 6,8%, veći od oko 6,9%, veći od oko 7,0%, veći od oko 7,1%, veći od oko 7,2%, veći od oko 7,3%, veći od oko 7,4%, veći od oko 7,5%, veći od oko 7,6%, veći od oko 7,7%, veći od oko 7,8%, veći od oko 7,9%, ili veći od oko 8,0%). Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 6,0% do oko 8,0%, između oko 6,5% do oko 8,5%, između oko 6,0% i oko 9,0%, ili između oko 7,0% i oko 9,0%.
[0095] Primerni postupci za izvođenje i određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) opisani su u Primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
X. N-vezane hibridne strukture povezane koje su monosijalinizovane i monofosforilizovane [0096] Obelodanjeni ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati povećani procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovane, monofosforilizovane, hibridne strukture u poređenju sa Fabrazyme®.
[0097] Fabrazyme® ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani, monofosforilizovani, hibridni oligosaharidi (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 6,0% do oko 8,1%. Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može imati procenat ukupnih N-vezanih hibridnih oligosaharida koji su monosijalinizovani, monofosforilizovani hibridni oligosaharidi (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 8,2% (npr., veći od oko 8,3%, veći od oko 8,4%, veći od oko 8,5%, veći od oko 8,6%, veći od oko 8,7%, veći od oko 8,8%, veći od oko 8,9%, veći od oko 9,0%, veći od oko 9,1%, veći od oko 9,2%, veći od oko 9,3%, veći od oko 9,4%, veći od oko 9,5%, veći od oko 9,6%,
4
veći od oko 9,7%, veći od oko 9,8%, veći od oko 9,9%, veći od oko 10,0%, veći od oko 10,1%, veći od oko 10,2%, veći od oko 10,3%, veći od oko 10,4%, veći od oko 10,5%, veći od oko 10,6%, veći od oko 10,7%, veći od oko 10,8%, veći od oko 10,9%, veći od oko 11,0%, veći od oko 11,1%, veći od oko 11,2%, veći od oko 11,3%, veći od oko 11,4%, ili veći od oko 11,5%). Na primer, ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može imati procenat ukupnih N-vezanih hibridnih oligosaharida koji su monosijalinizovani, monofosforilizovani hibridni oligosaharidi (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 8,5% i 10,5%, između oko 9,0% i oko 11,0%, ili između oko 8,5% i oko 9,5%.
[0098] Primerni postupci za određivanje procenta ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) opisani su u Primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
XI. Izoelektrična tačka
[0099] Ovde pruženi ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A takođe imaju pomerenu izoelektričnu tačku u poređenju sa Fabrazyme® kada se analiziraju snimljenim kapilarnim izoelektričnim fokusiranjem (icIEF) (pogledati Primer 3 i Tabelu 3).
[0100] Primeri za određivanje izoelektrične tačke polipeptida opisani su u primerima. Dodatni postupci za određivanje izoelektrične tačke polipeptida (npr. izoelektrični gelovi za fokusiranje) poznati su u struci.
XII. Mol/mol odnos manoza-6-fosfata/proteina
[0101] Ovde pruženi ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati mol prema molu odnos manoza-6-fosfata prema proteinu koji je približno isti ili veći nego kod Fabrazyme®. Smatra se da povećani mol prema molu odnos manoza-6-fosfata prema proteinu povećava ćelijsko ažuriranje proteina ćelijama koje eksprimiraju receptor manoza-6-fosfata u plazmatskoj membrani.
[0102] Fabrazyme® ima mol prema molu odnos manoza-6-fosfata i proteina od oko 1,7 do oko 3,1. Na primer, ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati mol/mol odnos manoza-6-fosfata prema proteinu koji je u suštinski isti kao za Fabrazyme® ili veći od 1,7 (npr., veći od 1,8, veći od 1,9, veći od 2,0, veći od 2,1, veći od 2,2, veći od 2,3, veći od 2,4, veći od 2,5, veći od 2,6, veći od 2,7, veći od 2,8, veći od 2,9, veći od 3,0, veći od 3,1, veći od 3,2, veći od 3,3, veći od 3,4, ili veći od 3,5). Na primer, ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) može imati mol/mol odnos manoza-6-fosfata prema proteinu koji je između oko 1,8 i oko 3,5 (npr., između oko 1,8 do oko 3,4, između oko 1,8 do oko 3,3, između oko 1,8 i oko 3,2, između oko 1,8 i oko 3,1, između oko 1,8 i oko 3,0, između oko 1,8 i oko 2,9, između oko 1,8 i oko 2,8, između oko 1,8 i oko 2,7, između oko 1,8 i oko 2,6, između oko 1,8 i oko 2,5, 1,8 i oko 2,4, između oko 1,8 i oko 2,3, između oko 1,8 i oko 2,2, između oko 1,8 i oko 2,1, između oko 1,8 i oko 2,0, između oko 1,9 i oko 3,5, između oko 1,9 i oko 3,4, između oko 1,9 i oko 3,3, između oko 1,9 i oko 3,2, između oko 1,9 i oko 3,1, između oko 1,9 i oko 3,0, između oko 1,9 i oko 2,9, između oko 1,9 i oko 2,8, između oko 1,9 i oko 2,7, između oko 1,9 i oko 2,6, između oko 1,9 i oko 2,5, između oko 1,9 i oko 2,5, između oko 1,9 i oko 2,4, između oko 1,9 i oko 2,3, između oko 1,9 i oko 2,2, između oko 1,9 i oko 2,1, između oko 2,0 i oko 3,5, između oko 2,0 i oko 3,4, između oko 2,0 i oko 3,3, između oko 2,0 i oko 3,2, između oko 2,0 i oko 3,1, između oko 2,0 i oko 3,0, između oko 2,0 i oko 2,9, između oko 2,0 i oko 2,8, između oko 2,0 i oko 2,7, između oko 2,0 i oko 2,6, između oko 2,0 i oko 2,5, između oko 2,0 i oko 2,4, između oko 2,0 i oko 2,3, između oko 2,0 i oko 2,2, između oko 2,1 i oko 3,5, između oko 2,1 i oko 3,4, između oko 2,1 i oko 3,3, između oko 2,1 i oko 3,2, između oko 2,1 i oko 3,1, između oko 2,1 i oko 3,0, između oko 2,1 i oko 2,9, između oko 2,1 i oko 2,8, između oko 2,1 i oko 2,7, između oko 2,1 i oko 2,6, između oko 2,1 i oko 2,5, između oko 2,1 i oko 2,4, između oko 2,1 i oko 2,3, između oko 2,2 i oko 3,5, između oko 2,2 i oko 3,4, između oko 2,2 i oko 3,3, između oko 2,2 i oko 3,2, između oko 2,2 i oko 3,1, između oko 2,2 i oko 3,0, između oko 2,2 i oko 2,9, između oko 2,2 i oko 2,8, između oko 2,2 i oko 2,7, između oko 2,2 i oko 2,6, između oko 2,2 i oko 2,5, između oko 2,2 i oko 2,4, između oko 2,3 i oko 3,5, između oko 2,3 i oko 3,4, između oko 2,3 i oko 3,3, između oko 2,3 i oko 3,2, između oko 2,3 i oko 3,1, između oko 2,3 i oko 3,0, između oko 2,3 i oko 2,9, između oko 2,3 i oko 2,8, između oko 2,3 i oko 2,7, između oko 2,3 i oko 2,6, između oko 2,3 i oko 2,5, između oko 2,4 i oko 3,5, između oko 2,4 i oko 2,9, između oko 2,4 i oko 2,8, između oko 2,4 i oko 2,7, između oko 2,4 i oko 2,6, između oko 2,5 i oko 3,5, između oko 2,5 i oko 3,4, između oko 2,5 i oko 3,3, između oko 2,5 i oko 3,2, između oko 2,5 i oko 3,1, između oko 2,5 i oko 3,0, između oko 2,5 i oko 2,9, između oko 2,5 i oko 2,8, između oko 2,5 i oko 2,7, između oko 2,6 i oko 3,5, između oko 2,6 i oko 3,4, između oko 2,6 i oko 3,3, između oko 2,6 i oko 3,2, između oko 2,6 i oko 3,1, između oko 2,6 i oko 3,0, između oko 2,6 i oko 2,9, između oko 2,6 i oko 2,8, između oko 2,7 i oko 3,5, između oko 2,7 i oko 3,4, između oko 2,7 i oko 3,3, između oko 2,7 i oko 3,2, između oko 2,7 i oko 3,1, između oko 2,7 i oko 3,0, između oko 2,7 i oko 2,9, između oko 2,8 i oko 3,5, između oko 2,8 i oko 3,4, između oko 2,8 i oko 3,3, između oko 2,8 i oko 3,2, između oko 2,8 i oko 3,1, između oko 2,8 i oko 3,0, između oko 2,9 i oko 3,5, između oko 2,9 i oko 3,4, između oko 2,9 i oko 3,3, između oko 2,9 i oko 3,2, između oko 2,9 i oko 3,1, između oko 3,0 i oko 3,5, između oko 3,0 i oko 3,4, između oko 3,0 i oko 3,3, između oko 3,0 i oko 3,2, između oko 3,1 i oko 3,5, između oko 3,1 i oko 3,4, između oko 3,1 i oko 3,3, između oko 3,2 i oko 3,5, između oko 3,4 i oko 3,4, ili između oko 3,3 i oko 3,5).
[0103] Primeri postupaka za određivanje odnosa mola/mola manoza-6-fosfata prema proteinu opisani su u primerima. U struci su poznati dodatni postupci.
Funkcionalna svojstva
[0104] Ovde pruženi ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A mogu imati jednu ili više (npr. jednu, dve ili tri) narednih funkcionalnih karakteristika: povećana endocitoza (npr. povećana brzina endocitoze) od strane ćelije sisara koji eksprimira receptor manoza-6-fosfata, smanjeno vezivanje za asijaloglikoproteinski receptor i povećan afinitet za receptor manoza-6-fosfata, sve u poređenju sa Fabrazyme®.
[0105] Postupci za određivanje endocitoze (npr. brzine endocitoze) ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A u ćeliji sisara koji eksprimira manoza-6-fosfat su poznati u struci (npr. Osborne i dr., Curr. Protoc. Cell Biol, Chapter 11, Unit 11.18, 2005). Neograničavajući primeri ćelija sisara koji eksprimiraju receptor manoza-6-fosfata uključuju fibroblaste i epitelne ćelije. Kao što je poznato u struci, endocitoza ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A može se detektovati smanjenjem nivoa proteina u medijumu za kultivacija tkiva (ili serumu sisara), povećanjem lizozomskih ili unutarćelijskih nivoa ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A u ćeliji sisara koji eksprimira receptor manoza-6-fosfata, ili indirektno, npr., kao smanjenje akumulacije glikosfingolipida sa ostacima terminalnog α-galaktozila, kao što je globotriaoscilkeramid (GL-3), u dodirnutoj ćeliji sisara ili u medijumu kulture tkiva (ili serumu sisara). Smanjenje nivoa ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A u medijumu kulture tkiva (ili serumu sisara) može se odrediti, na primer, korišćenjem testa na bazi antitela (npr. enzimski imunološki test) ili testa aktivnosti (npr. test aktivnosti koristeći pNP ili 4MU kao supstrate). Primeri antitela koja se vezuju za ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A su dostupni od Millipore, LifeSpan
4
BioSciences, Inc., Thermo Scientific Pierce Antibodies, Acris Antibodies GmbH, u R & D Systems. Postupci za određivanje lizozomskih ili unutarćelijskih nivoa ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A mogu da uključuju, na primer, upotrebu imunofluorescentne mikroskopije, permeabilizaciju ćelija i imunobloting i/ili masenu spektrometriju ćelijskog ili lizozomskog lizata. Smanjenje akumulacije globotriaoscilkeramida (GL-3) može se utvrditi, na primer, detektovanjem nivoa GL-3 u medijumu kulture tkiva ili u serumu sisara tokom vremena pomoću masene spektrometrije (npr. Kim i dr., Korean J. Intern. Med. 25:415-421, 2010) ili testa zasnovanog na antitelima (npr. SAD patentne prijave br.
2012/0178105). U svakom slučaju, endocitoza ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A se može uporediti sa Fabrazyme®.
[0106] Postupci za određivanje sposobnosti proteina (npr. ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A) za vezivanje za asijaloglikoproteinski receptor poznati su u struci. Na primer, test za određivanje vezivanja ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za asijaloglikoproteinski receptor može da uključuje korak dovođenja u dodir sa ćelijom (npr. hepatocita) koja eksprimira asijaloglikoprotein. Vezivanje ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za asijaloglikoproteinski receptor se takođe može odrediti pomoću površinske plazmonske rezonance (npr. Biacore tehnologija) (pogledati, npr., Stokmaier i dr., Bioorg. Med. Chem. 17:7254-7264, 2009) ili testa vezivanja za fluoroscentni polarizacioni asijaloglikoproteinski receptor opisan kod Kornilova i dr. (Anal. Biochem. 425:43-46, 2012). U svakom slučaju, vezivanje ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za receptor asijaloglikoproteina može se uporediti sa Fabrazyme®.
[0107] Postupci za određivanje vezivanja rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za receptor manoza-6-fosfata može se izvršiti pomoću testova koji uključuju korak dovođenja u dodir sa rekombinantnim proteinom α-galaktozidaze-A ćeliji (npr. fibroblast ili endotelna ćelija) koji eksprimira receptor manoza-6-fosfata. U drugim primerima, vezivanje rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za receptor manoza-6-fosfata može se odrediti površinskom plazmonskom rezonancom (npr. Biacore tehnologija) ili postupcima afinitetne hromatografije. Vezivanje ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za receptor manoza-6-fosfata se može uporediti sa Fabrazyme®.
Primeri ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A koji su ovde obelodanjeni [0108] Ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 3 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 1,6% (npr. između oko 0,1 % i oko 1,3% ili između oko 0,1% i oko 1,0%) i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) veći od oko 7,5% (npr. veći od oko 8,5%, veći od oko 9,0% ili veći od oko 9,5%). Ovde obelodanjeni ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može dalje imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) veći od oko 13,0% (npr. veći od oko 13,5%, veći od oko 14,0%, veći od oko 14,5%, veći od oko 15,0%, veći od oko 15,5% ili veći od oko 16,0%) i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (npr. vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) veći od oko 2,0% (npr., veći od oko 2,5%, veći od oko 3,0%, veći od oko 3,5%, veći od oko 4,0%, veći od oko 4,5%, veći od oko 5,0%, veći od oko 5,5%, veći od oko 6,0%, veći od oko 6,5%, ili veći od oko 7,0%).
[0109] Ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može dalje da ima jednu ili više (npr. dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam ili devet) narednih fizičkih karakteristika: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 3,9% (npr. između oko 0,1% i oko 3,5%, između 0,1% i oko 3,0%, između oko 0,1% i oko 2,5%, ili između oko 0,1% i oko 2,0%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 2 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 3,0% (npr. između oko 0,1% i oko 2,5%, ili između oko 0,1% i oko 2,0%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 5 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) između oko 0,1% i oko 5,3% (npr. između oko 0,1% i oko 5,0%, između oko 0,1 % i oko 4,5%, između oko 0,1% i oko 4,0%, između oko 0,1% i oko 3,5%, između oko 0,1% i oko 3,0%, ili između oko 0,1% i oko 2,5%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 (npr. vrh 6 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 0,1% i oko 9,0% (npr., između oko 0,1% i oko 8,5%, između oko 0,1% i oko 8,0%, između oko 0,1% i oko 7,5%, između oko 0,1% i oko 7,0%, između oko 0,1% i oko 6,5%, između oko 0,1% i oko 6,0%, između oko 0,1% i oko 5,5%, između oko 0,1% i oko 5,0%,
4
između oko 0,1% i oko 4,5%, između oko 0,1% i oko 4,0%, između oko 0,1% i oko 3,5%, između oko 0,1% i oko 3,0%, između oko 0,1% i oko 2,5%, ili između oko 0,1% i oko 2,0%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je između oko 0,1% i oko 7,0% (npr. između oko 0,1% i oko 6,5%, između oko 0,1% i oko 6,0%, između oko 0,1% i oko 5,5%, između oko 0,1% i oko 5,0%, između oko 0,1% i oko 4,5%, ili između oko 0,1% i oko 4,0%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) veći od oko 14,8% (npr., veći od oko 15,0%, veći od oko 15,5%, veći od oko 16,0%, veći od oko 16,5%, veći od oko 17,0%, veći od oko 17,5%, veći od oko 18,0%, veći od oko 18,5%, veći od oko 19,0%, veći od oko 19,5%, veći od oko 20,0%, veći od oko 20,5%, veći od oko 21,0%, veći od oko 21,5%, veći od oko 22,0%, veći od oko 22,5%, ili veći od oko 23,0%); procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 4,9% (npr. veći od oko 5,0%, veći od oko 5,5%, veći više od oko 6,0%, veći od oko 6,5%, veći od oko 7,0%, veći od oko 7,5% ili veći od oko 8,0%); i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani, monofosforilizovani hibridni oligosaharidi (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći od oko 8,2% (npr. veći od oko 8,5%, veći od oko 9,0%, veći od oko 9,5% ili veći od oko 10,0%).
[0110] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A takođe može da ima jednu ili više narednih funkcionalnih karakteristika: povećana endocitoza (npr. povećana brzina endocitoze) od strane ćelije sisara koja eksprimira receptor manoza-6-fosfata, smanjeno vezivanje za asijaloglikoproteinski receptor i povećan afinitet za receptor manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®.
[0111] U drugim ovde prikazanim primerima, ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A ima procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 3 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je manji nego za Fabrazyme®, i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 11 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom obeleženim profiliranjem) veći nego za Fabrazyme®. Ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A takođe može imati procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 4 u profilima
4
N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je približno isti ili veći nego za Fabrazyme®, i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 (npr. vrh 6' u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je veći nego za Fabrazyme®.
[0112] Ovde obelodanjen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A takođe može imati jednu ili više narednih strukturnih karakteristika: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (npr. vrh 1 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom)) koji je manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (npr. vrh 2 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je približno isti ili manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bisijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 5 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom obeleženim) koji je manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 (npr. vrh 6 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (npr. vrh 7 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom) koji je približno isti ili manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (npr. vrh 8 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom obeleženom) koji je veći nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (npr. vrh 9 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom označenih profila) koji je veći nego za Fabrazyme®; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovane, monofosforilizovane hibridne strukture (npr. vrh 10 u profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom obeleženom) koji je veći nego za Fabrazyme®. Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A takođe može imati jednu ili više narednih funkcionalnih karakteristika: povećana endocitoza (npr. povećana brzina endocitoze) od strane ćelije sisara koja eksprimira receptor manoza-6-fosfata, smanjeno vezivanje za asijaloglikoproteinski receptor i povećan afinitet za receptor manoza-6-fosfata, svaki u poređenju sa Fabrazyme®.
Vektori eksprimiranja
[0113] Takođe su ovde obelodanjeni vektori eksprimiranja koji sadrže sekvencu (npr. cDNK)
4
koja kodira ljudskog rekombinantnog proteine α-galaktozidaze-A ovog pronalaska. Na primer, vektor eksprimiranja može da sadrži sekvencu (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A koji je najmanje 90% identičan (npr. najmanje 90%, 92%, 94%, 96%, 98 %, 99% ili 100% identičan) sa SEQ ID NO: 1. Pored te sekvence, vektori eksprimiranja mogu da uključuju promoter (i opciono jednu ili više pojačivačkih sekvenci) operativno vezanih za 5' kraj sekvence (npr., cDNK) koji kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A. Vektori eksprimiranja mogu da uključuju sekvencu koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom koji je operativno povezan sa 5' krajem sekvence (npr. cDNK) koji kodira rekombinantni protein i sekvencu koja kodira mesto za prepoznavanje poli(A) povezano sa 3' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira rekombinantni protein. Vektori eksprimiranja mogu da uključuju sekvencu (npr. cDNK) koja kodira selekcioni marker sisara (npr. protein sintetaze čoveka ili psa) i promoter sekvencu koja je operativno povezana sa 5' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira selekcioni marker sisara, i opciono, SV40 rane intronske sekvence i poli(A) signalne sekvence koje su operativno povezane sa 3' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira selekcioni gen sisara. Vektori eksprimiranja mogu da uključuju jednu ili više (npr. dve ili tri) od: prokariotske promoterske sekvence koja je operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira prokariotski selekcioni gen (npr. Gen za rezistenciju na ampicilin), prokariotskog porekla replikacione sekvence i eukariotskog porekla replikacione sekvence.
[0114] Neograničavajući primeri promoterskih sekvenci (i opciono jedne ili više pojačivačkih sekvenci) koje se mogu operativno povezati sa sekvencom (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A uključuju: rani promoter simian virusa 40 (SV40), promoter ribozomskog proteina 21 (rpS21), promoter β-aktina hrčka, promoter citomegalovirusa (CMV) (npr. CMV neposredni rani promoter (pogledati, npr., Teschendorf i dr., Anticancer Res. 22:3325-3330, 2002), promoter ubikvitina C (UBC), promoter faktora produženja 1-α (EF1A), promoter fosfoenolpiruvat karboksikinaze (PCK), IE2 promoter/pojačivač iz mišjeg CMV (pogledati, npr., Chatellard i dr., Biotechnol. Bioeng.
96:106-117, 2007), i pileći promoter β-aktina. Dodatni neograničavajući primeri promotera ljudskog gena koji se mogu koristiti u bilo kom od ovde opisanih vektora eksprimiranja opisani su u bazi podataka promotera sisara (Wistar Institute vebsajt na mrpombdb.wister.upenn.edu). Dodatni primeri promoter sekvenci sisara koji se mogu koristiti u vektorima eksprimiranja poznati su u struci. Jedan neograničavajući primer promotera i pojačivača koji se može koristiti u plazmidu eksprimiranja je pileći β-aktinski promoter sa CMV pojačivačem (poznat u struci kao CAGG promoter). Ovde obelodanjeni vektori eksprimiranja mogu da uključuju promoter
4
rpS21, promoter β-aktina hrčka ili SV40 ranu promoter sekvencu koja je operativno povezana sa 5' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, i sekvencu koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom koji je operativno povezan sa 5' krajem nukleinske kiseline (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (npr. bilo koja od nukleinskih kiselina koja kodira ovde opisan ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) i sekvencu koja sadrži mesto prepoznavanja poli(A) operativno povezano sa 3' krajem sekvence nukleinske kiseline koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A.
[0115] Neograničavajući primeri sekvenci mesta za prepoznavanje poli(A) su mesto prepoznavanja poli(A) goveđeg hormona rasta. Strukturne karakteristike ljudskog mesta za prepoznavanje poli(A) opisane su kod Nunes i dr., EMBO J. 29:1523-1536, 2010. Dodatna mesta za prepoznavanje poli(A) dobro su poznata u struci.
[0116] U nekim primerima, vektor eksprimiranja uključuje promoter β-aktina hrčka i sekvencu koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom, oba operativno povezana sa 5' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A i SV40 ranom sekvencom za prepoznavanje introna i poli(A) operativno povezan sa 3' krajem sekvence (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A.
[0117] Neki vektori eksprimiranja mogu da uključuju sekvencu koja kodira selekcioni gen sisara. Neograničavajući primeri selekcionih gena sisara uključuju: gen za dihidrofolat reduktazu, gene za rezistenciju na hidromicin, gene za rezistenciju na neomicin, gene za rezistenciju na blasticidin, gene za rezistenciju na zeocin, gene za glutamin sintetazu, gene za rezistenciju na dihidrofolate i gene za hipoksantin-gvanin fosforiboziltransferazu. Primeri sekvenci koje kodiraju ove selekcione gene sisara su poznati u struci. 5' kraj sekvence koja kodira gen za selekciju sisara može biti operativno povezan sa promoterom (npr. bilo kojim ovde opisanim ili poznatim u struci primernim promoterima).
[0118] Neki vektori eksprimiranja (npr. bilo koji od ovde opisanih vektora eksprimiranja) mogu da uključuju poreklo replikacione sekvence sisara i/ili prokariotsko poreklo replikacione sekvence. Poreklo replikacionih sekvenci sisara je poznato u struci (npr. Todorovic i dr., Front. Biosci.4:D859-D568, 1999; Aladjem, Front. Biosci. 9:2540-2547, 2004; Hamlin, Bioessays
4
14:651-659, 1992). Prokariotsko poreklo replikacionih sekvenci je takođe poznato u struci (npr. Marczynski i dr., Curr. Opin. Genet. Dev.3:775-782, 1993).
[0119] Neograničavajući primer vektora je plazmid. Neograničavajući primeri ovde obelodanjenih plazmida prikazani su na Slikama 3 i 4. Slika 3 prikazuje plazmid koji kodira naredne elemente: nukleinska kiselina (npr. cDNK) koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, promoter (npr. promoter β-aktina hrčka) povezan sa 5' krajem nukleinske kiseline koja kodira ljudski protein α-galaktozidaze-A, sekvenca koja kodira peptid ljudskog CD52 koji ima TTG početni kodon koji je operativno povezan sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski rekombinantni proteina α-galaktozidaze-A, poli(A) sekvenca prepoznavanja (npr. SV40 rana poli(A) sekvenca prepoznavanja) koja je operativno povezana sa 3' krajem druge koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira selekcioni gen sisara (marker) (npr. gen dihidrofolat reduktaze ili gen glutamin sintetaze čoveka ili psa) i promoterska sekvenca (npr. SV40 rani promoter) operativno povezana sa 5' krajem sekvenca nukleinske kiseline koja kodira selekcioni gen sisara (marker). Slika 4 prikazuje plazmid eksprimiranja koji uključuje: sekvencu koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, promoter sekvencu (npr. CMV promoter i intron) operativno povezanu sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A , poli(A) sekvenca prepoznavanja (npr. SV40 rana poli(A) sekvenca prepoznavanja) operativno povezana sa 3' krajem sekvence koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, sekvenca koja kodira selekcioni gen sisara (marker) (npr. glutamin sintetaza), promoterska sekvenca (npr., SV40 promoter) operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira selekcioni gen sisara (marker), prokariotsko poreklo replikacione sekvence, sekvenca koja kodira selekcioni gen prokariota (marker) (npr. gen za rezistenciju na ampicilin), sekvencu prokariotskog promotera koja je operativno povezana sa 5' krajem selekcionog gena prokariota (marker) i eukariotsko poreklo replikacione sekvence.
[0120] Vektor eksprimiranja može biti virusni vektor. Neograničavajući primeri virusnih vektora uključuju adenovirusne vektore, herpes virusne vektore, bakulovirusne vektore i retrovirusne vektore. vektor eksprimiranja takođe može biti plazmid ili kosmid.
Ćelije domaćini
[0121] Ovde su takođe obelodanjene ćelije domaćini koje uključuju sekvencu koja kodira ovde opisani ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A. Sekvenca se može operativno povezati sa promoterskom sekvencom (npr. bilo koja ovde obelodanjen primerna promoterska sekvenca ili bilo koja virusna ili sisarska promoterska sekvenca poznata u struci). Na primer, sekvenca koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A i sekvenca promoterske sekvence operativno povezane sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A mogu biti integrisani u hromozom u ćeliji domaćina. U drugim primerima, sekvenca koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A i promoterska sekvenca koja je operativno povezana sa 5' krajem sekvence koja kodira ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A prisutni su u vektoru eksprimiranja (npr. bilo koji od ovde opisanih vektora eksprimiranja) u ćeliji domaćina.
[0122] Postupci za uvođenje nukleinskih kiselina (npr. bilo koje od ovde opisanih nukleinskih kiselina ili vektora eksprimiranja) u ćeliju (npr. ćeliju domaćina sisara) poznati su u struci. Na primer, nukleinska kiselina se može uvesti u ćeliju pomoću lipofekcije, elektroporacije, transfekcije posredovane kalcijum-fosfatom, transdukcije virusom (npr. retrovirusom), transfekcije ćelija posredovand DEAE-dekstranom, transfekcije posredovane dendrimerom, sono-poracije, optičke transfekcije, impalefekcije, hidrodinamičke isporuke, magnetofekcije ili balističke transfekcije.
[0123] Ćelija domaćin može biti bilo koja vrsta ćelije sisara. Na primer, ćelija domaćin može biti ćelijska linija, npr. ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO) (npr. CHO DG44 ćelije, CHO-K1s ćelije, C02.31 klonske ćelije, A14.13 klonske ćelije, C02.57 klonske ćelije i F05.43 klonske ćelije), Sp2.0, ćelije mijeloma (npr. NS/0), B-ćelije, ćelije hibridoma, T-ćelije, ljudske embrionalne ćelije bubrega (HEK) (npr. HEK 293E i HEK 293F), epitelne ćelije bubrega afričkih zelenih majmuna (Vero) ili epitelne ćelije bubrega Madin-Darby pasa (koker španijel) (MDCK). Dodatne ćelije sisara koje se mogu kultivisati korišćenjem ovde opisanih postupaka su poznate u struci. Ćelija domaćina može biti, na primer, epitelna ćelija, endotelna ćelija, limfocit, ćelija bubrega, plućna ćelija, T-ćelija, ćelija mijeloma ili B-ćelija. Neke ćelije domaćina mogu se kultivisati u suspenzivnoj ćelijskoj kulturi ili u adhezivnoj ćelijskoj kulturi.
Postupci generisanja ćelijske linije sisara
[0124] Ovde su takođe obelodanjeni postupci generisanja ćelijske linije sisara korisni za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina (npr. ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A, bilo koji drugi enzim naveden u Tabeli 1, ili bilo koji drugi glikoproteini poznati u struci). Slika 5 je dijagram toka koji prikazuje korake koji se mogu koristiti za
1
generisanje roditeljske ćelijske linije optimizovane za eksprimiranje rekombinantnog glikoproteina. Ovi postupci mogu da uključuju pružanje imortalizovane ćelijske linije zavisne od seruma i sekvencijalna kultivacija ćelijske linije sisara u: (1) medijumu ćelijske kulture koji uključuje prvu koncentraciju (IX) životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 30 dana (npr., oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, oko 5 dana do oko 12 dana, oko 5 dana do oko 11 dana, oko 5 dana do oko 10 dana, oko 5 dana do oko 9 dana, oko 5 dana do oko 8 dana, ili oko 5 dana do oko 7 dana); (2) medijumu ćelijske kulture koji uključuje oko 0,2X do oko 0,4X (npr. oko 0,2X do oko 0,3X) koncentracije životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 30 dana (npr., oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, oko 5 dana do oko 12 dana, oko 5 dana do oko 11 dana, oko 5 dana do oko 10 dana, oko 5 dana do oko 9 dana, oko 5 dana do oko 8 dana, ili oko 5 dana do oko 7 dana); i (3) medijumu ćelijske kulture koji uključuje oko 0,01X do oko 0,25X (npr., oko 0,01X do oko 0,20X, oko 0,01X do oko 0,15X, ili oko 0,01X do oko 0,08X) životinjskog seruma tokom oko 5 dana do oko 30 dana (npr., oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, oko 5 dana do oko 12 dana, oko 5 dana do oko 11 dana, oko 5 dana do oko 10 dana, oko 5 dana do oko 9 dana, oko 5 dana do oko 8 dana, ili oko 5 dana do oko 7 dana), generišući jednoćelijske kulture pod-klona iz kulture nakon sekvencijalne kultivacije i odabir pod-klona koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, rast ćelija u medijumu kulture bez seruma i eksprimiranje rekombinantnih proteina; i kultivaciju odabranog pod-klona u hemijski definisanom medijumu bez proteina, bez seruma, oko 5 dana do oko 30 dana (npr., oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, oko 5 dana do oko 12 dana, oko 5 dana do oko 11 dana, oko 5 dana do oko 10 dana, oko 5 dana do oko 9 dana, oko 5 dana do oko 8 dana, ili oko 5 dana do oko 7 dana); generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz kulture nakon kultivacije u hemijski definisanom medijumu bez proteina i bez seruma; i odabir pod-klona koji ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, vršnu gustinu ćelija, svojstva rasta, volumetrijsku stopu produktivnosti (VPR) i profil glikozilacije za glikoprotein, gde je izabrani pod-klon iz (f) koristan za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina.
[0125] Takođe su obelodanjeni postupci generisanja ćelijske linije sisara korisni za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina (npr. bilo koji od ovde opisanih ili poznatih rekombinantnih proteina) koji uključuju: (a) pružanje imortalizovane ćelijske linije zavisne od seruma i sekvencijalno gajenje ćelijske linija sisara u: (1) medijumu ćelijske kulture koji uključuje prvu koncentraciju (IX) (npr. oko 5%) životinjskog seruma (npr. fetalni goveđi
2
serum) tokom oko 1 dana do oko 30 dana (npr., oko 2 dana do oko 25 dana, oko 2 dana do oko 20 dana, oko 2 dana do oko 15 dana, oko 2 dana do oko 12 dana, oko 2 dana do oko 11 dana, oko 2 dana do oko 10 dana, oko 2 dana do oko 9 dana, oko 2 dana do oko 8 dana, ili oko 2 dana do oko 7 dana); (2) medijumu ćelijske kulture koji uključuje oko 0,2X do oko 0,6X (npr. oko 0,2X do oko 0,5X) koncentracije životinjskog seruma (npr. fetalni goveđi serum) tokom oko 1 dana do oko 30 dana (npr., oko 2 dana do oko 25 dana, oko 2 dana do oko 20 dana, oko 2 dana do oko 15 dana, oko 2 dana do oko 12 dana, oko 2 dana do oko 11 dana, oko 2 dana do oko 10 dana, oko 2 dana do oko 9 dana, oko 2 dana do oko 8 dana, ili oko 2 dana do oko 7 dana); i (3) medijumu ćelijske kulture koji uključuje oko 0X do oko 0,20X (npr. oko 0X do oko 0,15X, oko 0X do oko 0,10X ili oko 0X do oko 0,05X) životinjskog seruma (npr. fetalni goveđi serum) tokom oko 5 dana do oko 30 dana (npr., oko 5 dana do oko 25 dana, oko 5 dana do oko 20 dana, oko 5 dana do oko 15 dana, oko 5 dana do oko 12 dana, oko 5 dana do oko 11 dana, oko 5 dana do oko 10 dana, oko 5 dana do oko 9 dana, oko 5 dana do oko 8 dana, ili oko 5 dana do oko 7 dana); (b) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz kulture nakon sekvencijalne kultivacije i odabir kulture pod-klona koja ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, rast ćelija u medijumu kulture bez seruma i eksprimiranje rekombinantnih proteina (npr. odabir kulture podklona koja ima najbolju efikasnost transfekcije, rast ćelija i eksprimiranje rekombinantnih proteina u poređenju sa drugim testiranim kulturama pod-klona); (c) generisanje jednoćelijskih kultura pod-klona iz izabrane kulture pod-klona u (b); i (d) odabir jednoćelijske kulture podklona generisane u (c) koja ima prihvatljivu efikasnost transfekcije, vršnu gustinu ćelija (npr. vršnu gustinu ćelija u medijumu bez seruma), svojstva rasta (npr. rast u medijumu bez seruma), volumetrijsku stopu produktivnosti (VPR) i eksprimiranje rekombinantnog proteina, gde je izabrani pod-klon iz (d) koristan za rekombinantno eksprimiranje glikoproteina (npr. kultura pod-klona koja ima najbolju efikasnost transfekcije, vršnu gustinu ćelija, svojstva rasta, VPR i eksprimiranje rekombinantnog proteina) u poređenju sa drugim testiranim kulturama podklona).
[0126] Ovde su takođe obelodanjene ćelije sisara ili ćelijske linije sisara proizvedene bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Neograničavajući primeri imortalizovanih ćelijskih linija zavisnih od seruma koje se mogu koristiti u bilo kom od ovde opisanih postupaka uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), ćelije mijeloma, B-ćelije, ćelija hibridoma, T-ćelije, ljudske embrionalne ćelije bubrega (HEK), epitelne ćelije bubrega afričkih zelenih majmuna (Vero) i epitelne ćelija bubrega Madin-Darby pasa (koker španijel) (MDCK). Druge imortalizovane ćelijske linije zavisne od seruma koje se mogu koristiti u bilo kom od ovde opisanih postupaka su poznate u struci. Na primer, imortalizovana ćelijska linija zavisna od seruma može biti epitelna ćelijska linija, endotelna ćelijska linija, limfocitna ćelijska linija, bubrežna ćelijska linija, plućna ćelijska linija, T-ćelijska linija, ćelija mijeloma ili B-ćelijska linija. U nekim primerima, imortalizovana ćelijska linija zavisna od seruma raste u suspenziji. U drugim primerima, imortalizovana ćelijska linija zavisna od seruma raste u adherentnoj ćelijskoj kulturi.
[0127] U nekim primerima, imortalizovana ćelijska linija zavisna od seruma endogeno ne eksprimira dihidrofolat reduktazu. Izabrani pod-klon (ili prvi ili drugi pod-klon odabran u postupcima) može se kultivisati u suspenziji.
[0128] Postupci za kultivaciju imortalizovane ćelijske linije sisara poznati su u struci. Postupci za određivanje efikasnosti transfekcije, rasta ćelija u medijumu kulture bez seruma, eksprimiranja rekombinantnog proteina, vršne gustine ćelija (npr. vršna održiva gustina ćelija), svojstva rasta ćelija, zapreminske produktivnosti i profila glikozilacije proizvedenog rekombinantnog proteina su dobro poznati u struci. Na primer, efikasnost transfekcije može se odrediti detektovanjem nivoa eksprimiranja reporter gena u plazmidu eksprimiranja transficiranom u ćeliju (npr. eksprimiranje takvog reporter gena može se detektovati pomoću sortiranja ćelija potpomognutog fluorescencijom). Eksprimiranje rekombinantnog proteina može se, na primer, odrediti detektovanjem nivoa rekombinantnog proteina prisutnog u medijumu kulture tkiva ili u ćeliji korišćenjem antitela koje se specifično vezuje za rekombinantni protein. eksprimiranje rekombinantnog proteina može biti, na primer, jedno ili oba od antitela ili enzima (npr. ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A ili bilo koji od enzima navedenih na Slici 1). Vršna gustina ćelija i rast ćelija mogu se proceniti, na primer, merenjem gustine ćelija (npr., održive gustine ćelija) tokom vremena u ćelijskoj kulturi (na primer, korišćenjem hemocitometra ili drugih komercijalno dostupnih automatizovanih brojača ćelija). Zapreminska stopa produktivnosti ćelije može se odrediti korišćenjem postupaka poznatih u struci procenom nivoa rekombinantnih proteina prisutnih u medijumu ćelijske kulture ili unutar ćelije tokom vremena. Profil glikozilacije rekombinantnog glikoproteina proizvedenog u ćeliji može se odrediti, na primer, korišćenjem bilo kog postupka opisanog u odeljku Primeri ove specifikacije (npr. derivatizacija 2-amino benzoeve kiseline (AA) i kapilarna elektroforeza sa laserom-indukovanim fluorescentnim detektovanjem).
[0129] Kao što je dobro poznato u struci, ćelijska linija sisara proizvedena ovde opisanim
4
postupcima može se čuvati na niskoj temperaturi (npr. ispod -20°C, ispod -30°C, ispod -40°C, ispod -50°C, ispod -60°C, ispod -70°C ili ispod -80°C) za buduću upotrebu. Postupci za pripremu zaliha ćelijske linije sisara za skladištenje na niskim temperaturama opisani su, na primer, kod Hewitt, Methods Mol. Biol. 640:83-105, 2010, and Phelan, Curr. Protoc. Hum. Genet. Apendix 3:3G, 2006). U nekim primerima, ćelijske linije sisara proizvedene ovde opisanim postupcima nisu izložene medijumu kulture koji sadrži serum i/ili sadrži serum (npr. pre skladištenja i/ili nakon skladištenja). U nekim primerima, ćelijske linije sisara proizvedene ovde opisanim postupcima kultivišu se samo u medijumu kulture bez sastojaka životinjskog porekla (ADC). U nekim primerima, ćelijske linije sisara proizvedene ovde opisanim postupcima kultivišu se samo u hemijski definisanom medijumu za rast bez seruma, bez proteina.
Postupci dobijanja rekombinantnog glikoproteina
[0130] Ovde su takođe obelodanjeni postupci za proizvodnju rekombinantnog glikoproteina (npr. ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, bilo koji enzim naveden na Slici 1 ili bilo koji rekombinantni glikoprotein poznat u struci). Ovi postupci uključuju pružanje ćelije sisara proizvedene bilo kojim od ovde opisanih postupaka, uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju (npr. vektor eksprimiranja) koja uključuje sekvencu koja kodira glikoprotein (npr. ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, bilo koji enzim opisan na Slici 1, i bilo koji drugi glikoprotein poznat u struci), kultivaciju ćelije u medijumu kulture bez seruma pod uslovima dovoljnim za proizvodnju glikoproteina i sakupljanje glikoproteina iz ćelije ili medijuma za rast. Takođe su pruženi rekombinantni glikoproteini (npr. ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A) proizvedeni bilo kojim od ovde opisanih postupaka.
[0131] U nekim slučajevima, nukleinska kiselina koja uključuje sekvencu koja kodira glikoprotein je vektor eksprimiranja (npr., bilo koji od ovde opisanih vektora eksprimiranja). U drugim primerima, nukleinska kiselina koja uključuje sekvencu koja kodira glikoprotein je integrisana u hromozom ćelije sisara.
[0132] U nekim primerima, kultivacija se vrši korišćenjem suspenzije kulture ćelija. U drugim primerima, kultivacija se izvodi pomoću više mikronosača koji imaju površinu koja omogućava vezivanje i rast ćelije sisara. Mnoštvo mikronosača može imati prosečni prečnik, npr., između oko 20 µm do oko 1 mm (npr., između oko 20 µm do oko 1 mm (npr., između oko 20 µm i oko 250 µm, između oko 100 µm do oko 250 µm, između oko 150 µm do oko 250 µm, između oko 250 µm i 500 µm, između oko 200 µm do oko 300 µm, između oko 750 µm i 1 mm, između oko 200 µm do oko 800 µm, između oko 200 µm i oko 500 µm, ili između oko 500 µm i oko 800 µm), gde mikronosači imaju površinu koja je permisivna ili pospešuje vezivanje ćelije sisara (npr. bilo koja od ćelija sisara ovde opisanih ili poznatih u struci). U nekim primerima, mikronosač može da sadrži jednu ili više pora (npr. jednu ili više pora sa prosečnim prečnikom od oko 10 µm do oko 100 µm). U nekim slučajevima, površine mikronosača i/ili površina jedne ili više pora u mnoštvu mikronosača presvučene su sredstvom koje pospešuje vezivanje ćelije sisara za mikronosač (npr. vezivanje za spoljnu površinu mikronosača i/ili površinu pora u mikronosaču). Mikronosači mogu biti približno sfernog ili elipsoidnog oblika. U nekim otelotvorenjima, mikronosači imaju spoljnu površinu i/ili pore mikronosača imaju površinu koja je pozitivno naelektrisana (npr. pozitivno naelektrisana zbog prisustva N,N-dietilaminoetil grupa). Neograničavajući primer mikronosača koji se mogu koristiti u bilo kom od ovde opisanih postupaka uključuju CytoPoreTM 1 i CytoPoreTM 2 (dostupni od GE Healthcare, Life Sciences, Piscataway, New Jersey). Dodatni primeri mikronosača koji se mogu koristiti za kultivaciju su javno dostupni i poznati u struci.
[0133] U nekim primerima kultivacija se vrši pomoću bioreaktora. Bioreaktor može imati zapreminu, na primer, između oko 1 L do oko 10,000 L (npr., između oko 1 L do oko 50 L, između oko 50 L do oko 500 L, između oko 500 L do oko 1000 L, između 500 L do oko 5000L, između oko 500 L do oko 10,000 L, između oko 5000 L do oko 10,000 L, između oko 1 L i oko 10,000 L, između oko 1L i oko 8,000 L, između oko 1 L i oko 6,000 L, između oko 1 L i oko 5,000 L, između oko 100 L i oko 5,000 L, između oko 10 L i oko 100 L, između oko 10 L i oko 4,000 L, između oko 10 L i oko 3,000 L, između oko 10 L i oko 2,000 L, ili između oko 10 L i oko 1,000 L). Količina tečnog medijuma kulture prisutna u bioreaktoru može biti, na primer, između oko 0,5 L do oko 5,000 L (npr., između oko 0,5 L do oko 25 L, između oko 25 L do oko 250 L, između oko 250 L do oko 500 L, između 250 L do oko 2500 L, između oko 250 L do oko 5,000 L, između oko 2500 L do oko 5,000 L, između oko 0,5 L i oko 5,000 L, između oko 0,5 L i oko 4,000 L, između oko 0,5 L i oko 3,000 L, između oko 0,5 L i oko 2,500 L, između oko 50 L i oko 2,500 L, između oko 5 L i oko 50 L, između oko 5 L i oko 2,000 L, između oko 5 L i oko 1,500 L, između oko 5 L i oko 1,000 L, ili između oko 5 L i oko 500 L). Kultivacija ćelija može se izvesti, na primer, korišćenjem bioreaktora sa serijskim hranjenjem ili perfuzionog bioreaktora. Kultura se može izvoditi kultivacijom serijskim hranjenjem ili perfuzionom kulturom (npr. u bioreaktoru).
[0134] Unutrašnja površina bilo kog ovde opisanog bioreaktora može imati najmanje jednu prevlaku (npr. najmanje jednu prevlaku od želatina, kolagena, poli-L-ornitina, polistirena i laminina), i kao što je poznato u struci, jedan ili više izlaza za posipanje O2, CO2, i N2u tečni medijum kulture, i mehanizam za mešanje za mešanje tečnog medijuma kulture. Bioreaktor može inkubirati ćelijsku kulturu u kontrolisanoj vlažnoj atmosferi (npr. pri vlažnosti većoj od 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ili 95%, ili vlažnost od 100%). Bioreaktor takođe može biti opremljen mehaničkim uređajem koji je sposoban da ukloni zapreminu tečnog medijuma kulture iz bioreaktora i opciono, filterom u mehaničkom uređaju koji uklanja ćelije iz tečnog medijuma kulture tokom procesa prenosa tečnosti medijuma kulture van bioreaktora (npr. sistem naizmeničnog tangencijalnog protoka (ATF) ili sistem za filtriranje tangencijalnog protoka (TFF)). Kultura može da uključuje izlaganje tečnog medijuma kulture u bioreaktoru atmosferi koja uključuje najviše ili oko 15% CO2(npr., najviše ili oko 14% CO2, 12% CO2, 10% CO2, 8% CO2, 6% CO2, 5% CO2, 4% CO2, 3% CO2, 2% CO2, ili najviše ili oko 1% CO2).
[0135] Kultura se može izvoditi na temperaturi od oko 31°C do oko 40°C. Stručnjaci će razumeti da se temperatura može promeniti u određenim vremenskim tačkama tokom kultivacije, na primer, svakog sata ili svakog dana. Na primer, temperatura se može promeniti ili izmeniti (npr. povećati ili smanjiti) otprilike jedan dan, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, sedam dana, osam dana, devet dana, deset dana, jedanaest dana, dvanaest dana, četrnaest dana, petnaest dana, šesnaest dana, sedamnaest dana, osamnaest dana, devetnaest dana ili dvadeset dana ili više nakon početnog sejanja bioreaktora ćelijom sisara). Na primer, temperatura se može pomerati prema gore (npr., promena do ili oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili do ili oko 20°C). Na primer, temperatura se može pomerati prema dole (npr., promena veća od 0,05°C ili oko 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili do ili oko 20°C).
[0136] Kultivacija se može izvesti pomoću hemijski definisanog medijuma bez proteina i bez seruma. Neograničavajući primeri takvih medijuma poznati su u struci i komercijalno su dostupni. Neograničavajući primeri korisnog medijuma kulture uključuju, na primer, CD CHO, Opti CHO i Forti CHO (svi dostupni od Life Technologies; Grand Island, NY), Hycell CHO medijum (Thermo Fisher Scientific, Inc.; Waltham, MA), Ex-cell CD-CHO fuzioni medijum (Sigma-Aldrich Co.; St. Louis, MO) i PowerCHO medijum (Lonza Group, Ltd.; Basel, Switzerland).
[0137] Ćelija sisara može biti bilo koja od ovde opisanih ćelija sisara. Na primer, ćelija sisara može biti CHO ćelija. Ćelija sisara može biti ćelija koja endogeno ne eksprimira dihidrofolat reduktazu (npr. CHO ćelija koja endogeno ne eksprimira dihidrofolat reduktazu).
[0138] Rekombinantni glikoprotein može biti enzim (na primer, ljudski protein αgalaktozidaze-A, bilo koji od proteina navedenih na Slici 1 ili bilo koji drugi glikoprotein poznat u struci) ili antitelo ili njegov fragment koji vezuje antigen. U nekim primerima nukleinska kiselina (npr. vektor eksprimiranja) uključuje sekvencu koja je najmanje 90% (npr. najmanje 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%) identična sa SEQ ID NO: 1. Nukleinska kiselina (npr. vektor eksprimiranja) može sadržati promoter sekvencu operativno povezanu sa 5' krajem nukleinske kiseline koja kodira glikoprotein, sekvencu koja kodira peptid ljudskog CD52 proteina sa TTG početnim kodonom koji je operativno povezan sa 5' krajem nukleinske kiseline koja kodira glikoprotein, i sekvencom koja kodira mesto za prepoznavanje poli(A) operativno povezano sa 3' krajem nukleinske kiseline koja kodira glikoprotein. Na primer, sekvenca promotera može biti izabrana iz grupe koju čine: rpS21 promoter hrčka, promoter β-aktina hrčka i SV40 rani promoter. Sekvenca koja kodira poli(A) mesto prepoznavanja može biti SV40 poli(A) sekvenca ranog prepoznavanja. U nekim primerima, promoterska sekvenca može biti β-aktin promoter hrčka, i poli(A) sekvenca prepoznavanja je SV40 rana poli(A) sekvenca prepoznavanja. U nekim primerima nukleinska kiselina dalje uključuje sekvencu koja kodira glutamin sintetazu čoveka ili psa (na primer, gde je 5' kraj nukleinske kiseline koja kodira glutamin sintetazu čoveka ili psa operativno povezan sa SV40 ranim promoterom i 3' krajem nukleinske kiseline koja kodira glutamin sintetazu čoveka ili psa operativno je povezana sa SV40 ranim intronom i poli(A) signalnom sekvencom). U nekim primerima nukleinska kiselina dalje uključuje sekvencu koja kodira dihidrofolat reduktazu (DHFR) (npr. DHFR čoveka ili miša) (npr. gde je 5' kraj nukleinske kiseline koja kodira dihidrofolat reduktazu operativno povezan sa SV40 ranim promoterom, a 3' kraj nukleinske kiseline koja kodira dihidrofolat reduktazu je operativno povezan sa SV40 ranim intronom i poli(A) signalnom sekvencom).
[0139] Kultivacija se može izvesti pomoću perfuzionog bioreaktora. Kultivacija perfuzijom dobro je poznata u struci i uključuje uklanjanje iz bioreaktora prve zapremine prvog tečnog medijuma kulture (npr. koja uključuje bilo koju koncentraciju ćelija sisara, npr. prvu zapreminu prvog tečnog medijuma kulture koja je u osnovi bez ćelija) i dodavanje u prvi tečni medijum kulture druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture. Uklanjanje i dodavanje mogu se izvoditi istovremeno ili uzastopno, ili kao kombinacija oba. Dalje, uklanjanje i dodavanje mogu se izvoditi kontinuirano (npr. brzinom koja uklanja i zamenjuje zapreminu između 0,1 % do 800% (npr., između 1% i 700%, između 1% i 600%, između 1% i 500%, između 1% i 400%, između 1% i 350%, između 1% i 300%, između 1% i 250%, između 1% i 100%, između 100% i 200%, između 5% i 150%, između 10% i 50%, između 15% i 40%, između 8% i 80%, i između 4% i 30%) zapremine bioreaktora ili prve zapremine tečnog medijuma kulture u bilo kom datom vremenskom periodu (npr., tokom perioda od 24 sata, tokom vremenskog perioda od približno 1 sata do oko 24 sata, ili tokom vremenskog perioda od više od 24 sata)) ili periodično (npr. jednom svakog trećeg dana, jednom svakog drugog dana, jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno, četiri puta dnevno ili pet puta dnevno), ili bilo koju njihovu kombinaciju. Kada se periodično izvodi, zapremina koja se uklanja ili zamenjuje (npr. u roku od oko 24 sata, u inkrementalnom vremenskom periodu od oko 1 sata do oko 24 sata ili u inkrementalnom vremenskom periodu dužem od 24 sata) npr. između 0,1% do 800% (npr., između 1% i 700%, između 1% i 600%, između 1% i 500%, između 1% i 400%, između 1% i 300%, između 1% i 200%, između 1% i 100%, između 100% i 200%, između 5% i 150%, između 10% i 50%, između 15% i 40%, između 8% i 80%, i između 4% i 30%) zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture. Prva zapremina prvog uklonjenog tečnog medijuma kulture i druga zapremina dodatog drugog tečnog medijuma kulture mogu se u nekim slučajevima zadržati približno na istom nivou tokom svakog 24-časovnog perioda (ili, alternativno, u inkrementalnom vremenskom periodu od oko 1 sata do oko 24 sata ili inkrementalni vremenski period duži od 24 sata) tokom celog ili dela perioda kultivacije. Kao što je poznato u struci, brzina uklanjanja prve zapremine prvog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vremena) i brzina dodavanja druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vreme) mogu biti različite. Brzina uklanjanja prve zapremine prvog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vremena) i brzina dodavanja druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vremena) mogu biti približno iste ili mogu biti različite.
[0140] Alternativno, zapremina uklonjena i dodata može se menjati (npr. postepeno povećavati) tokom svakog 24-časovnog perioda (ili alternativno, inkrementalni vremenski period između 1 sata i oko 24 sata ili inkrementalni vremenski period veći od 24 sata) tokom perioda kultivacije.
Na primer, zapremina prvog uklonjenog tečnog medijuma kulture i zapremina drugog medijuma tečnog medijuma kulture dodatog u svakom 24-časovnom periodu (ili alternativno, inkrementalni vremenski period između oko 1 sata i više od 24 sata ili inkrementalni vremenski period duži od 24 sata) tokom perioda kultivacije može se povećati (npr. postepeno ili inkrementalno) tokom perioda kultivacije sa zapremine koja je između 0,5% do oko 20% zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture na oko 25% do oko 150% zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture.
[0141] Stručnjaci će shvatiti da prvi tečni medijum kulture i drugi tečni medijum kulture mogu biti ista vrsta medijuma (npr. hemijski definisani medijum bez seruma ili bez seruma i bez proteina). U drugim slučajevima, prvi tečni medijum kulture i drugi tečni medijum kulture mogu se razlikovati.
[0142] Prva zapremina prvog tečnog medijuma kulture može se ukloniti, na primer, korišćenjem mehaničkog sistema i/ili proticanjem ili gravitacionim protokom zapremine kroz sterilnu membranu sa graničnom molekularnom težinom koja isključuje ćelije sisara prisutne u zapremini.
[0143] Drugi zapremina drugog tečnog medijuma kulture može se dodati u prvi tečni medijum kulture na automatizovan način, na primer, pomoću perfuzione pumpe. U nekim slučajevima, uklanjanje prve zapremine prvog tečnog medijuma kulture (npr. prva zapremina prvog tečnog medijuma kulture koja je u suštini bez ćelija sisara) i dodavanje prvom tečnom medijumu kulture druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture se ne javlja unutar najmanje 1 sata (npr., unutar 2 sata, unutar 3 sata, unutar 4 sata, unutar 5 sati, unutar 6 sati, unutar 7 sati, unutar 8 sati, unutar 9 sati, unutar 10 sati, unutar 12 sati, unutar 14 sata, unutar 16 sati, unutar 18 sati, unutar 24 sata, unutar 36 sati, unutar 48 sati, unutar 72 sati, unutar 96 sati, ili nakon 96 sati) od sejanja bioreaktora sa ćelijom sisara.
[0144] Alternativno ili kao dodatak, kultivacija se može izvesti pomoću bioreaktora sa serijskim hranjenjem. Takva kultivacija je poznato u struci i uključuje, tokom većeg dela perioda kultivacije, dodavanje (npr. periodično ili kontinuirano dodavanje) prvom tečnom medijumu kulture druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture. Dodavanje drugog tečnog medijuma kulture može se izvoditi kontinuirano (npr. brzinom koja dodaje zapreminu između 0,1% do 300% (npr., između 1% i 250%, između 1% i 100%, između 100% i 200%, između 5% i 150%, između 10% i 50%, između 15% i 40%, između 8% i 80%, i između 4% i 30%) zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture tokom bilo kog datog vremenskog perioda (npr. tokom perioda od 24 sata, tokom inkrementalnog vremenskog perioda od oko 1 sata do oko 24 sata ili tokom inkrementalnog vremenskog perioda dužeg od 24 sata)) ili periodično (npr. jednom svakog trećeg dana, jednom svakog drugog dana, jednom dnevno, dva puta dnevno, tri puta dnevno, četiri puta dnevno ili pet puta dnevno), ili bilo kojom njihovom kombinacijom. Kada se periodično izvodi, zapremina koja se dodaje (npr. unutar oko 24 sata, u inkrementalnom vremenskom periodu od oko 1 sata do oko 24 sata ili u inkrementalnom vremenskom periodu dužem od 24 sata) može biti, npr., između 0,1% do 300% (npr., između 1% i 200%, između 1% i 100%, između 100% i 200%, između 5% i 150%, između 10% i 50%, između 15% i 40%, između 8% i 80%, i između 4% i 30%) zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture. Drugi zapremina drugog dodatog tečnog medijuma kulture može se u nekim slučajevima držati približno ista tokom svakog 24-časovnog perioda (ili, alternativno, u inkrementalnom vremenskom periodu od oko 1 sata do oko 24 sata ili u inkrementalnom vremenskom periodu većem od 24 sata) tokom čitavog ili dela perioda kultivacije. Kao što je poznato u struci, brzina dodavanja druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vremena) može da varira tokom celog ili dela perioda kultivacije. Na primer, zapremina drugog dodatog tečnog medijuma kulture može se menjati (npr., postepeno povećavati) tokom svakog 24-časovnog perioda (ili alternativno, vremenskog perioda od 1 sata do oko 24 sata ili vremenskog perioda od više od 24 sata) tokom perioda kultivacije. Na primer, zapremina drugog tečnog medijuma kulture koja se dodaje tokom svakog 24-časovnog perioda (ili alternativno, inkrementalnog vremenskog perioda između oko 1 sata i više od 24 sata ili inkrementalnog vremenskog perioda većeg od 24 sata) tokom perioda kultivacije može se povećati (npr. postepeno ili inkrementalno) tokom perioda kultivacije od zapremine koja je između 0,5% do oko 20% zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture do oko 25% do oko 150% zapremine bioreaktora ili zapremine prvog tečnog medijuma kulture. Brzina dodavanja druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture (zapremina/jedinica vremena) može biti približno ista tokom celog ili dela perioda kultivacije.
[0145] Stručnjaci će razumeti da prvi tečni medijum kulture i drugi tečni medijum kulture mogu biti ista vrsta medijuma (npr. medijum kulture bez proteina ili hemijski definisan medijum bez seruma i proteina). U drugim slučajevima, prvi tečni medijum kulture može biti tipa koji se razlikuje od drugog tečnog medijuma kulture. Zapremina drugog tečnog medijuma kulture može se automatski dodati prvom tečnom medijumu kulture, na primer, pomoću perfuzione
1
pumpe.
[0146] U nekim slučajevima, dodavanje prvom tečnom medijumu kulture druge zapremine drugog tečnog medijuma kulture se dešava najmanje 1 sat posle, ali ne više od 7 dana nakon sejanja bioreaktora ćelijom sisara (npr. do najmanje 2 sata, unutar 3 sata, unutar 4 sata, unutar 5 sati, unutar 6 sati, unutar 7 sati, unutar 8 sati, unutar 9 sati, unutar 10 sati, unutar 12 sata, unutar 14 sata, unutar 16 sati, unutar 18 sati, unutar 24 sata, unutar 36 sati, unutar 48 sati, unutar 72 sata, unutar 96 sati, ali ne više od 7 daba nakon sejanja bioreaktora ćelijom sisara). Medijum ćelijske kulture u serijski hranjenim kulturama obično se prikuplja na kraju perioda kulture, međutim, podloga ćelijske kulture u serijski hranjenim kulturama takođe se može sakupljati u jednom ili više vremenskih tačaka tokom perioda kultivacije.
[0147] Stručnjaci će razumeti da se bilo koji od ovde navedenih različitih parametara za kultivaciju (npr. bioreaktor, zapremine, brzine ili frekvencije zamene zapremina kulture, mešanje, temperature, medijuma kulture i/ili CO2koncentracije) mogu koristiti u bilo kojoj kombinaciji za izvođenje ovih postupaka.
[0148] Može se izvršiti dodatni korak izolovanja rekombinantnog glikoproteina. Kao što je dobro poznato u struci, takvi postupci se razlikuju u zavisnosti od fizičkih svojstava i aktivnosti glikoproteina. Na primer, parametre kao što su specifičnost vezivanja glikoproteina (npr. aktivnost supstrata ili antigena), neto naelektrisanje i/ili veličina treba uzeti u obzir prilikom dizajniranja koraka za izolovanje rekombinantnog glikoproteina (npr. iz medijuma kulture ili iz ćelija). Jedan ili više od bilo kog od narednih postupaka može se koristiti za izolovanje rekombinantnog glikoproteina (npr. rekombinantni glikoprotein proizveden bilo kojim od ovde opisanih postupaka): afinitetna hromatografija na koloni, hromatografija na koloni jonske (npr. katjonske ili anjonske) razmene, hromatografija na koloni isključenja veličina, hromatografija na koloni sa obrnutom fazom, filtracija i taloženje. Neograničavajući postupci za izolovanje ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A opisani su u primerima.
[0149] U nekim primerima, izolovanje rekombinantnog glikoproteina iz tečnog medijuma kulture može se izvršiti korišćenjem integrisanog, kontinuiranog postupka (npr. postupak koji uključuje upotrebu najmanje dva sistema sa više kolona hromatografije (MCCS)). Neograničavajući primeri integrisanih, kontinuiranih procesa za izolaciju rekombinantnog glikoproteina opisani su u SAD provizornim patentnim prijavama br.61/775,060 i 61/856,390,
2
i WO 14/137903. Neograničavajući primeri integrisanih i kontinuiranih procesa izolacije rhAGA koji su ovde pruženi iz tečnog medijuma kulture opisani su u nastavku.
[0150] Ovde opisani postupci mogu dalje da uključuju formulisanje izolovanog rekombinantnog glikoproteina u farmaceutski prihvatljiv ekscipijent ili pufer (npr. za primenu pacijentu). Ovi postupci mogu dalje da uključuju sterilno filtriranje, inaktivaciju virusa, UV zračenje i/ili liofilizaciju, ili bilo koju njihovu kombinaciju.
Integrisani i kontinuirani procesi za izolaciju rhAGA proteina
[0151] Ovde pruženi rhAGA mogu se izolovati pomoću integrisanog i kontinuiranog procesa. Postupci za izolovanje rekombinantnog proteina korišćenjem integrisanog i kontinuiranog postupka i detalji u vezi sa koracima takvih procesa poznati su u struci. Pogledati WO 14/137903 i SAD patentne prijave br.2014/0225994. Dodatno, WO 14/137903 takođe opisuje sisteme i opremu koji se mogu koristiti za izvođenje ovih integrisanih i kontinuiranih procesa.
[0152] Na primer, ovde pružen integrisani i kontinuirani postupak za izolaciju rhAGA proteina može da uključuje: (a) pružanje tečnog medijuma kulture koji uključuje ovde pruženi rhAGA protein, koji je u suštini bez ćelija, gde se tečni medijum kulture uvodi u prvi sistem hromatografije sa više kolona (MCCS1); (b) hvatanje ovde pruženog rhAGA proteina u tečnom medijumu kulture pomoću MCCS1, gde se eluat MCCS 1 koji sadrži ovde pruženi rhAGA protein kontinuirano ubacuje u drugi sistem hromatografije sa više kolona (MCCS2); i (c) prečišćavanje i poliranje ovde pruženog rhAGA proteina pomoću MCCS2, gde je eluat iz MCCS2 ovde izolovani rhAGA protein ili je rhAGA supstanca leka proteina, i postupak je integrisan i kontinuirano teče iz navedenog tečnog medijuma kulture na eluat iz MCCS2 koji je ovde izolovani rhAGA protein ili rhAGA supstanca leka proteina.
[0153] MCCS1 i/ili MCCS2 mogu, na primer, da izvrše najmanje dve jedinice operacije. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 ili MCCS2, ili oboje, uključuju prebacivanje kolona. U nekim otelotvorenjima, MCCS1 vrši jedinstvene operacije hvatanja ovde pruženog rhAGA proteina i inaktivacije virusa. U nekim otelotvorenjima, MCCS2 izvodi jedinstvene operacije prečišćavanja i poliranja rhAGA proteina ovde pruženih.
[0154] MCCS1 i/ili MCCS2 mogu da koriste, na primer, najmanje dve hromatografske kolone. MCCS1 i/ili MCCS2 mogu da koriste, na primer, najmanje dve hromatografske membrane.
MCCS1 i/ili MCCS2 mogu da koriste, na primer, najmanje jednu hromatografsku kolonu i najmanje jednu hromatografsku membranu.
[0155] MCCS1 može biti, na primer, periodični sistem hromatografije kontra struje (PCCS1). PCCS1 može biti, na primer, PCCS sa četiri kolone. U nekim otelotvorenjima, četiri kolone u PCCS sa četiri kolone mogu da izvrše jedinstvenu operaciju hvatanja ovde pruženog rhAGA proteina iz tečnog medijuma kulture. Hvatanje se može izvršiti korišćenjem, na primer, afinitetne hromatografije, hromatografije razmene katjona, hromatografije razmene anjona ili hromatografije molekularnog sita. Afinitetna hromatografija se može izvesti sa mehanizmom za hvatanje koji je izabran između, na primer, mehanizma za hvatanje vezanja za protein A, mehanizma za hvatanje za supstrat, mehanizma za hvatanje antitela ili fragmenta antitela, mehanizma za hvatanje za aptamer i kofaktora. Eluat koji sadrži ovde pruženi rhAGA protein iz tri od četiri kolone u PCCS sa četiri kolone može se uneti u četvrtu kolonu sa PCCS sa četiri kolone. Četvrta kolona PCCS sa četiri kolone može da izvrši jedinstvenu operaciju, na primer, inaktivacije virusa držanjem eluata koji sadrži ovde pruženi rhAGA protein na niskom pH za virusnu inaktivaciju. Na primer, četvrta kolona PCCS sa četiri kolone može da drži eluat koji sadrži ovde pruženi rhAGA protein pri niskom pH za virusnu inaktivaciju tokom perioda od oko 10 minuta do oko 1,5 sata.
[0156] U nekim otelotvorenjima, MCCS2 može biti, na primer, periodični sistem hromatografije kontra struje (PCCS2). U nekim primerima, postupak dalje uključuje korak podešavanja pH eluata iz četvrte kolone PCCS sa četiri kolone pomoću linijskog rezervoara za podešavanje pufera pre nego što se doda eluat iz četvrte kolone PCCS sa četiri kolone u PCCS2.
[0157] PCCS2 može, na primer, da uključuje tri hromatografske kolone i hromatografsku membranu. Tri hromatografske kolone u PCCS2 mogu da izvrše, na primer, jedinstvenu operaciju prečišćavanja ovde pruženog rhAGA proteina (na primer, hromatografijom razmene katjona ili anjona). Eluat iz tri kolone u PCCS2 može se unositi, na primer, u hromatografsku membranu u PCCS2. Hromatografska membrana u PCCS2 može, na primer, da izvede jedinstvenu operaciju poliranja ovde pruženog rhAGA proteina u eluatu tri hromatografske kolone u PCCS2 (na primer, hromatografijom razmene katjona ili anjona). Protok i ispiranje hromatografske membrane može biti ovde izolovani rhAGA protein ili rhAGA supstanca leka proteina.
4
[0158] Neki primeri dalje uključuju podešavanje jonske koncentracije eluata iz tri kolone u PCCS2 pomoću linijskog podešavanja pufera pre nego što se eluat iz tri kolone u PCCS2 uvede u hromatografsku membranu u PCCS2. Neka otelotvorenja dalje uključuju upotrebu rezervoara za prekid između PCCS1 i PCCS2. Neki primeri dalje uključuju filtriranje eluata iz PCCS1 pre nego što se doda u PCCS2. Neka otelotvorenja dalje uključuju filtriranje tečnog medijuma kulture pre nego što se doda u MCCS1.
Farmaceutski sastavi i kompleti
[0159] Takođe su ovde pruženi farmaceutski sastavi koji uključuju najmanje jedan (na primer, jedan, dva, tri ili četiri) ovde pruženih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A. Dva ili više (npr. dva, tri ili četiri) bilo kog od ovde pruženih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A mogu biti prisutni u farmaceutskom sastavu u bilo kojoj kombinaciji. Ovde su takođe pruženi farmaceutski sastavi koji sadrže ili se sastoje od ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A i farmaceutski prihvatljivog nosača.
[0160] Bilo koji od ovde pruženih farmaceutskih sastava može da nema primetni nivo ili da nema protein, lipid, ugljene hidrate, nukleinsku kiselinu i zagađivače (npr. bilo koji od ovde opisanih zagađivača) prisutne u životinjskim proizvodima (npr. serum životinje, životinjska plazma, ili proizvod životinjske krvi).
[0161] Bilo koji od ovde pruženih farmaceutskih sastava može da uključuje ovde pružen rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijum kulture odabran iz grupe hemijski definisanog medijuma bez proteina i seruma. Bilo koji od ovde pruženih rhAGA proteina može biti rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijum bez proteina i/ili hemijski definisan medijum. Bilo koji od ovde pruženih farmaceutskih sastava može da uključuje ovde pružen rhAGA protein proizveden u ćelijskoj kulturi koji je koristio samo medijume za kulturu odabrane iz grupe koja se sastoji od hemijski definisanog medijuma bez seruma i proteina i izolovan korišćenjem integrisanog i kontinuiranog procesa (npr. bilo koji integrisani i kontinuirani procesi koji su opisani ovde ili u WO 14/137903).
[0162] Bilo koji od ovde pruženih farmaceutskih sastava može da uključuje ovde pružen rhAGA protein koji ima poboljšani sigurnosni profil (npr. smanjeni rizik od kontaminacije (npr. bilo koji od ovde opisanih ili poznatih primera zagađivača), u poređenju sa ovde pruženim rhAGA proteinom koji se proizvodi postupkom koji uključuje upotrebu medijuma kulture koji sadrži životinjski proizvod (npr. životinjski serum, životinjsku plazmu ili faktor životinjske krvi ili protein).
[0163] Farmaceutski sastavi mogu se formulisati na bilo koji način poznat u struci. Ovde pruženi farmaceutski sastavi su korisni jer imaju smanjeni rizik ili nivo kontaminacije (npr. Smanjeni rizik ili nivo virusne kontaminacije) i/ili imaju smanjenu heterogenost u glikoformima koji su prisutni u smeši.
[0164] Farmaceutski sastavi su formulisani tako da budu kompatibilni sa svojim predviđenim načinom primene (npr. intravenozno, intraarterijski, intramuskularno, intradermalno, potkožno ili intraperitonealno). Sastavi mogu da uključuju farmaceutski prihvatljiv nosač, npr. sterilni razblaživač (npr. sterilna voda ili fiziološki rastvor), fiksirano ulje, polietilen glikol, glicerin, propilen glikol ili drugi sintetički rastvarači, antibakterijski ili antimikotični agensi, kao što su benzil alkohol ili metil parabeni, hlorobutanol, fenol, askorbinska kiselina, timerosal i slično, antioksidansi, kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit, helatni agensi, kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina, puferi, poput acetata, citrata ili fosfata, i izotonični agensi, kao što su kao šećeri (npr. dekstroza), polialkoholi (npr. manitol ili sorbitol) ili soli (npr. natrijum hlorid) ili bilo koja njihova kombinacija. Lipozomske suspenzije se takođe mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači (pogledati, npr., SAD patent br. 4,522,811). Pripreme sastava mogu se formulisati i zatvoriti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili bočice sa više doza. Tamo gde je potrebno (kao u, na primer, formulacijama za injekcije), odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom obloge, kao što je lecitin ili surfaktant. Apsorpcija ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A može se produžiti uključivanjem agensa koji odlaže apsorpciju (npr. aluminijum monostearat i želatin). Alternativno, kontrolisano oslobađanje može se postići implantatima i mikrokapsuliranim sistemima za isporuku, koji mogu uključivati biorazgradive, biokompatibilne polimere (npr. etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliorthoesteri i polilaktična kiselina; Alza Corporation i Nova Pharmaceutical, Inc.).
[0165] Sastavi koji uključuju jedan ili više bilo kog od ljudskih rekombinantnih proteina αgalaktozidaze-A mogu se formulisati za parenteralnu (npr. intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intradermalnu, potkožnu ili intraperitonealnu) primenu u obliku jedinične doze (tj. fizički diskretne jedinice koji sadrže unapred određenu količinu aktivnog proteina radi lakšeg primene i ujednačenosti doziranja).
[0166] Toksičnost i terapijska efikasnost sastava mogu se odrediti standardnim farmaceutskim postupcima u ćelijskim kulturama ili eksperimentalnim životinjama (npr. majmunima). Može se, na primer, odrediti LD50(doza smrtonosna za 50% populacije) i ED50(doza terapeutski efikasna kod 50% populacije): terapeutski indeks je odnos LD50:ED50. Poželjni su agensi koji pokazuju visoke terapijske indekse. Tamo gde agens pokazuje neželjeni efekat, treba voditi računa da se potencijalna šteta minimizuje (tj. smanji neželjeni efekat). Toksičnost i terapijska efikasnost mogu se utvrditi drugim standardnim farmaceutskim postupcima.
[0167] Podaci dobijeni iz testova ćelijske kulture i studija na životinjama mogu se koristiti u formulisanju odgovarajuće doze bilo kog datog rekombinantnog glikoproteina (npr. bilo kog od ovde opisanih rekombinantnih glikoproteina) za upotrebu kod pacijenta (npr. čoveka). Terapeutski efikasna količina jednog ili više (npr. jednog, dva, tri ili četiri) ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A (npr. Bilo koji od ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A) biće količina koji tretira Fabrijevu bolest kod pacijenta (npr. smanjuje rizik od razvoja ili sprečava razvoj Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. ljudski pacijent za koji je utvrđeno da ima povećan rizik od razvoja Fabrijeve bolesti)), smanjuje ozbiljnost, učestalost, i/ili trajanje jednog ili više simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. čoveka) (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo, ili sa istim pacijentom pre tretmana) smanjuje akumulirane nivoe glikosfingolipida sa terminalnim α-galaktozilnim ostacima, kao što je globotriaoscilkeramid kod pacijenta (npr. čoveka) koji ima Fabrijevu bolest (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolesti, ali, na primer, ne prima tretman, prima drugačiji tretman, ili prima placebo, ili sa istim pacijentom pre tretmana)). Efikasnost i doziranje bilo kog od ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A može da utvrdi zdravstveni radnik ili veterinar koristeći postupci poznate u struci, kao i posmatranjem jednog ili više simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. čoveku). Određeni faktori mogu uticati na doziranje i vreme potrebno za efikasan tretman pacijenta (npr. težina bolesti ili poremećaja, prethodni tretmani, opšte zdravlje i/ili starost pacijenta i prisustvo drugih bolesti).
[0168] Bilo koji ovde obelodanjen farmaceutski sastav može dalje da uključuje jedan ili više (npr. dva, tri, četiri ili pet) dodatnih terapijskih agenasa. Neograničavajući primeri dodatnih terapijskih agenasa koji mogu biti uključeni u bilo koji od ovde opisanih farmaceutskih sastava uključuju: antikonvulzive (npr. fenitoin, karbamazepin, fenobarbital, metilfenobarbital, barbeksaklon, benzodiazepin, klobozan, klonazepam, klorazepat, diazepam, midazolam, lorazepam, nitrazepam, temazepam, nimetazepam, felbamat, karbamazepin, okskarbazepin, eslikarbazepin acetat, vigabatrin, progabid, tiagabin, topiramat, gabapentin, pregabalin, etoin, fenitoin, mefenitoin, fosfenitoin, parametadion, trimetadion, etadion, beklamid, primidon, brivaracetam, levetiracetam, seletracetam, etosuksimid, fensuksimid, mesuksimid, acetazolamid, sultiam, metazolamid, zonisamid, lamotrigin, feneturid, fenacemid, valpromid i valnoktamid) i antiemike (npr. metoklopramid, prohlorperazin, alizaprietsetron, acetazolamid, olanzapin, droperidol, haloperidol, hlorpromazin, prohlorperazin, aprepitant i kasopitant).
[0169] Primeri doza uključuju količine miligrama ili mikrograma bilo kog ovde opisanog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A po kilogramu težine pacijenta (npr., oko 50 µg/kg do oko 3 mg/kg; oko 100 µg/kg do oko 2,5 mg/kg; oko 100 µg/kg do oko 2,0 mg/kg; oko 500 µg/kg do oko 1,5 mg/kg; oko 500 µg/kg do oko 1,5 mg/kg; ili oko 800 µg/kg do oko 1,2 mg/kg). Primerne doze mogu takođe uključivati miligramske ili mikrogramske količine jednog ili više bilo kog od ovde opisanih jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa po kilogramu težine pacijenta (npr. oko 1 µg/kg do oko 500 mg/kg; oko 100 µg/kg do oko 500 mg/kg; oko 100 µg/kg do oko 50 mg/kg; oko 10 µg/kg do oko 5 mg/kg; oko 10 µg/kg do oko 0,5 mg/kg; ili oko 1 µg/kg do oko 50 µg/kg za svakog primenjenog dodatnog terapijskog agensa). Iako ove doze pokrivaju širok raspon, stručnjak će razumeti da se terapeutski agensi, uključujući rekombinantni protein α-galaktozidaze-A i dodatni ovde obelodanjeni terapijski agensi, razlikuju u svojoj snazi i efikasne količine se mogu odrediti postupcima poznatim u struci. Tipično se u početku primenjuju relativno niske doze, a lekar ili veterinar (u slučaju terapijske primene) ili istraživač (dok još uvek radi u fazi razvoja) mogu naknadno i postepeno povećavati dozu dok ne dobije odgovarajući odgovor. Pored toga, podrazumeva se da će specifični nivo doze za bilo kog pacijenta zavisiti od niza faktora, uključujući aktivnost određenog jedinjenja koje se koristi, uzrast, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu pacijenta, vreme primene, način primene, brzinu izlučivanja i vreme poluraspada rekombinantnog glikoproteina (npr. ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) ili dodatnih terapijskih agenasa in vivo. Farmaceutski sastavi mogu biti uključeni u kontejner, pakovanje ili dozator zajedno sa uputstvima za primenu.
[0170] Na primer, jedan ili više ovde pruženih ljudskih rekombinantnih proteina αgalaktozidaze-A mogu biti upakovani u sterilnu bočicu kao liofilizovani prah ili kolač, za kasniju rekonstituciju i primenu. Liofilizovani prah ili kolač koji uključuje ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A može sadržati jedan ili više agenasa za stabilizaciju (npr.jedan ili više od manitola, natrijum fosfat monobaznog monohidrata i natrijum fosfat dvobaznog heptahidrata). Primer liofilizovane snage ili kolača koji uključuje ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A uključuje: 37 mg ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A, 222 mg manitola, 20,4 mg natrijum fosfat monobaznog monohidrata i 59,2 mg natrijum fosfat dvobaznog heptahidrata. Pre upotrebe ili primene ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze, liofilizovani prah ili kolač se rekonstituiše ubrizgavanjem u bočicu 7,2 mL sterilne vode za injekcije, USP, dajući rastvor od 5,0 mg ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A po mL. Ovaj rekonstituisani rastvor se može dalje razblažiti sa 0,9% injekcijom natrijum hlorida, USP, do konačne zapremine od 500 ml, pre intravenske primene pacijentu pri dozi od oko 1 mg/kg. Takođe su uključeni kompleti koji uključuju bočicu sa liofilizovanim kolačem ili prahom ljudske rekombinantne α-galaktozidaze (kako je opisano u ovom paragrafu), uputstva za rekonstituciju kolača ili praha (kako je opisano u ovom paragrafu) i uputstva za dvonedeljnu intravensku primenu rekonstituisanog rastvora pacijentu pri dozi od oko 1,0 mg/kg.
[0171] Još jedan primer liofilizovanog praha ili kolača koji uključuje ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A uključuje: 5,5 mg ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A, 33,0 mg manitola, 3,0 mg natrijum fosfat monobaznog monohidrata i 8,8 mg natrijum fosfat dvobaznog heptahidrata. Pre upotrebe ili primene ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze, liofilizovani prah ili kolač se rekonstituiše ubrizgavanjem 1,1 ml sterilne vode za injekcije USP u bočicu, dajući rastvor od 5,0 mg ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A po mL. Ovaj rekonstituisani rastvor se može dalje razblažiti sa 0,9% injekcijom natrijum hlorida, USP, do konačne zapremine od 500 ml, pre intravenske primene pacijentu pri dozi od oko 1 mg/kg. Takođe su uključeni kompleti koji uključuju bočicu sa liofilizovanim kolačem ili prahom ljudske rekombinantne α-galaktozidaze (kako je opisano u ovom paragrafu), uputstva za rekonstituciju kolača ili praha (kako je opisano u ovom paragrafu) i uputstva za dvonedeljnu intravensku primenu rekonstituisanog rastvora pacijentu pri dozi od oko 1,0 mg/kg.
[0172] Ovde su takođe obelodanjeni kompleti koji uključuju najmanje jednu dozu bilo kog ovde opisanog farmaceutskog sastava. U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, kompleti mogu dalje da sadrže predmet za upotrebu u primeni farmaceutskog sastava (npr. bilo kog ovde opisanog farmaceutskog sastava) sisaru (npr. ćoveku) (npr. špric, npr. prethodno napunjen špric). Neki primeri kompleta uključuju jednu ili više doza (npr. najmanje dve, tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet, deset, jedanaest, dvanaest, trinaest, četrnaest, dvadeset, trideset ili četrdeset doza) (npr. intravenske, potkožne ili intraperitonealne doze) bilo kog ovde opisanog farmaceutskog sastava. U nekim primerima, komplet dalje uključuje uputstva za primenu farmaceutskog sastava (ili doze farmaceutskog sastava) sisaru (npr. čoveku koji ima Fabrijevu bolest).
[0173] U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, kompleti uključuju sastav koji uključuje najmanje jedan od ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A i sastav koji sadrži najmanje jedan dodatni terapijski agens (npr. bilo koju kombinaciju ovde opisanog jednog ili više dodatnih terapijskih agenasa). U nekim obelodanjenim otelotvorenjima, komplet dalje sadrži uputstva za izvođenje bilo koje od ovde opisanih postupaka.
Fabrijeva bolest
[0174] Fabrijeva bolest je X-vezana recesivna lizozomska bolest skladištenja koju karakteriše nedostatak α-galaktozidaze-A, poznat kao keramid triheksosidaza, što dovodi do vaskularnih i drugih manifestacija bolesti akumulacijom glikosfingolipida sa terminalnim ostacima αgalaktosila, poput globotriaoscilkeramida (GL-3). Neograničavajući simptomi Fabrijeve bolesti uključuju anhidrozu, bolne prste, hipertrofiju leve komore, bubrežne manifestacije i ishemijske moždane udare. Ozbiljnost simptoma dramatično varira (pogledati, Grewal i dr., J. Neurol.
241:153-156, 1994). Prepoznata je varijanta sa manifestacijama ograničenim na srce i njena učestalost može biti rasprostranjenija nego što se nekada verovalo (pogledati, Nakao, N. Eng. J. Med. 333:288-293, 1995). Prepoznavanje neobičnih varijanti može se odložiti do prilično kasno u životu, iako je dijagnoza u detinjstvu moguća uz kliničku budnost (Ko i dr., Arch. Pathol. Lab. Med. 120:86-89, 1996; Mendez i dr., Dement. Geriatr. Cogn. Disord.8:252-257, 1997; Shelley i dr., Pediatric Derm. 12:215-219, 1995). Prosečan uzrast dijagnoze Fabrijeve bolesti je 29 godina.
Postupci tretmana Fabrijeve bolesti, povećanje nivoa α-galaktozidaze u lizozomu ćelije sisara i smanjenje nivoa globotriaosilkeramida kod pacijenta
[0175] Ovde su takođe obelodanjeni postupci tretmana Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. čoveka) koji uključuju primenu pacijentu sastava koji sadrži terapeutski efikasnu količinu najmanje jednog od ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A ili ovde opisanih farmaceutskih sastava. Ovde opisani ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A posreduju u tretmanu Fabrijeve bolesti povećanjem koncentracije α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara kod pacijenta. Uspešan tretman Fabrijeve bolesti kod pacijenta može odrediti zdravstveni radnik (npr. medicinska sestra, lekar ili lekarski pomoćnik). Na primer, uspešan tretman može rezultovati smanjenjem broja, težine i/ili učestalosti jednog ili više simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. anhidroza, bolni prsti, hipertrofija leve komore, bubrežne manifestacije, ishemijski moždani udari i povećani nivoi globotriaosilkeramida u serumu pacijenta) (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana). Pored toga, uspešan tretman se može utvrditi posmatranjem smanjenja nivoa globotriaosilkeramida u serumu ili tkivu (npr. bubregu) osobe tokom vremena (npr. u poređenju sa pacijentom koji ima Fabrijevu bolest koji prima drugačiji tretman, na tretmanu placebom ili ne prima tretman ili u poređenju sa istim pacijentom pre tretmana). Dodatni postupci za određivanje uspešnog tretmana Fabrijeve bolesti kod pacijenta su ovde opisani i poznati su u struci.
[0176] Takođe su obelodanjeni postupci za povećanje nivoa proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara (npr. ćelija in vitro ili ćelija sisara, kao što je čovek) koji uključuju dovođenje u dodir ćelije sa najmanje jednim od ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A ili sa barem jednim od ovde opisanih farmaceutskih sastava u količini dovoljnoj da poveća nivoe proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji. Ćelija sisara može biti ćelija koja eksprimira receptor manoza-6-fosfata. Nivoi α-galaktozidaze-A u lizozomu ćelije sisara mogu se odrediti primenom imunofluorescentne mikroskopije koja koristi antitelo koje se specifično vezuje za ljudski protein α-galaktozidaze-A. Nivoi proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu ćelije sisara takođe se mogu odrediti izolovanjem lizozoma iz ćelije sisara i određivanjem nivoa proteina α-galaktozidaze-A u izolovanim lizozomima, na primer, upotrebom antitela koje se specifično vezuje za protein α-galaktozidaze-A ili izvođenjem testa aktivnosti proteina α-galaktozidaze-A korišćenjem lizata iz izolovanih lizozoma. Primer testa za protein α-galaktozidaze-A je test koji koristi O-nitrofenil α-D-galaktozid kao supstrat. U ovom testu, O-nitrofenil α-D-galaktozid se pretvara u proizvode O-nitrofenola i D-galaktoze. Još jedan primer testa za detektovanje aktivnosti proteina α-galaktozidaze-A koristi fluorogeni supstrat, a-D-galaktopiranozid (Shi i dr., Anal. Bioanal. Chem.394:1903-1909, 2009). Porast nivoa proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu ćelije kod pacijenta (npr. čoveka) može se indirektno detektovat posmatranjem smanjenja broja simptoma Fabrijeve bolesti kod kojih pacijent doživljava (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na
1
primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana), primećeno je smanjenje stope pojave novih simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana), smanjenje ozbiljnosti jednog ili više simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana), ili smanjenje pogoršanja jednog ili više simptoma Fabrijeve bolesti kod pacijenta (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali npr. nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana). Alternativno ili pored toga, povećanje nivoa proteina αgalaktozidaze-A u lizozomu ćelije može se, na primer, detektovati posmatranjem smanjenja nivoa globotriaosilkeramida u serumu pacijenta (npr. u poređenju sa kontrolnim pacijentom koji ima istu bolest, ali, na primer, nije na tretmanu, prima drugačiji tretman, ili prima placebo ili sa istim pacijentom pre tretmana). Nivo proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara posle tretmana ovde opisanim rekombinantnim proteinom može se uporediti sa nivoom αgalaktozidaze-A u lizozomu netretirane ćelije sisara (npr. iste vrste ćelija).
[0177] Takođe su obelodanjeni postupci za smanjenje nivoa globotriaosilkeramida u serumu ili tkivu (npr. bubreg) pacijenta (npr. čoveka) koji uključuju primenu najmanje jednog od ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A ili najmanje jednog ovde opisanih farmaceutskih sastava pacijentu. Nivo globotriaosilkeramida u serumu pacijenta može se odrediti, npr., primenom masene spektrometrije (Kim i dr., Korean J. Intern. Med.25:415-421, 2010) ili test sendviča antitela (npr. testovi opisani u SAD patentnoj prijavi br. 2012/0178105). Nivo globotriaosilkeramida u serumu ili tkivu pacijenta nakon primene najmanje jednog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A ili ovde pruženog farmaceutskog sastava može se uporediti sa nivoom globotriaosilkeramida u serumu ili tkivu pacijenta koji ima Fabrijevu bolest ali ne prima nikakav tretman ili prima drugačiji tretman, ili sa nivo globotriaosilkeramida kod pacijenta pre primene bar jednog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A ili ovde pruženog farmaceutskog sastava.
[0178] U nekim otelotvorenjima, pacijentu (npr. čoveku) je prethodno dijagnostikovana ili se sumnja da ima Fabrijevu bolest. U nekim otelotvorenjima identifikovano je da sisar ima povećani rizik od razvoja Fabrijeve bolesti (npr. povećani genetski rizik od razvoja Fabrijeve bolesti). Sisar može biti žensko ili muško, i može biti i odrastao ili maloletan (npr. novorođenče
2
ili dete). U nekim slučajevima je pacijent čovek. Tamo gde je sisar maloletan, on može biti uzrasta između 1 dana i 18 godina, uključujući (npr. između 1 dana i 17 godina, između 1 dana i 16 godina, između 1 dana i 15 godina, između 1 dana i 14 godina, između 1 dana i 13 godina, između 1 dana i 12 godina, između 1 dana i 11 godina, između 1 dana i 10 godina, između 1 dana i 9 godina, između 1 dana i 8 godina, između 1 dana i 7 godina, između 1 dana i 6 godina, između 1 dana i 5 godina, između 1 dana i 4 godine, između 1 dana i 3 godine, između 1 dana i 2 godine, između 1 dana i 1 godine, između 1 dana i 6 meseci, između 6 meseci i 4 godine, između 1 meseca i 5 godina, između 3 i 13 godina ili između 13 i 18 godina). Tamo gde je sisar odrasla osoba, sisar može biti uzrasta, na primer, između 18 i 20 godina uključujući, ili najmanje ili oko 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ili najmanje ili oko 100 godina.
[0179] Zdravstveni radnik može da dijagnostikuje da pacijent ima Fabrijevu bolest posmatranjem jednog ili više simptoma kod pacijenta (npr. jedan ili više bilo kojih od ovde opisanih ili poznatih simptoma Fabrijeve bolesti). U nekim primerima, pacijent je možda već na tretmanu od Fabrijeve bolesti. Kod drugih je prethodni tretman Fabrijeve bolesti bio neuspešan.
[0180] Rekombinantni proteini ili ovde opisani farmaceutski sastavi mogu se primenjivati intravenoznom, intraarterijskom, potkožnom, intraperitonealnom, interlimfnom, intramuskularnom, okularnom ili intratekalnom primenom. Dalje, rekombinantni proteini i farmaceutski sastavi mogu se formulisati koristeći bilo koje tehnike poznate u struci i/ili kako su ovde opisane (npr. formulisane za potkožnu, intravensku, intraarterijsku, interlimfnu, intramuskularnu, perimuskularnu ili intratekalnu primenu i/ili formulisani u lipozom ili nanočesticu).
[0181] Ovde opisane ljudske rekombinantne proteine α-galaktozidaze-A ili farmaceutske sastave mogu da primenjuju medicinari (npr. lekar, lekarski pomoćnik, medicinska sestra, medicinska sestra ili laboratorijski tehničar) ili veterinarski stručnjak. Alternativno ili pored toga, rekombinantni protein ili farmaceutski sastav može sam da primenjuje čovek, npr. sam pacijent. Primena se može dogoditi, na primer, u bolnici, klinici ili ustanovi primarne zdravstvene zaštite (npr. starački dom) ili bilo kojoj njihovoj kombinaciji.
[0182] U nekim otelotvorenjima, sisaru se primenjuje doza između 1 mg i 400 mg bilo kog od ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A ili bilo kog ovde opisanog farmaceutskog sastava (npr., između 1 mg do 300 mg, između 1 mg do 250 mg, između 1 mg i 200 mg, između 1 mg i 150 mg, između 1 mg i 100 mg, između 1 mg i 80 mg, između 1 mg i 70 mg, između 1 mg i 60 mg, između 1 mg i 50 mg, između 1 mg i 40 mg, između 1 mg i 30 mg, između 1 mg i 20 mg, između 1 mg i 10 mg, između 20 mg i 120 mg, između 30 mg i 90 mg, ili između 40 mg i 80 mg). U nekim primerima, pacijentu se primenjuje doza ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A od oko 0,1 mg/kg do oko 4,0 mg/kg (npr., između oko 0,1 mg/kg i oko 3,5 mg/kg, između oko 0,1 mg/kg i oko 3,0 mg/kg, između oko 0,1 mg/kg i oko 2,5 mg/kg, između oko 0,1 mg/kg i oko 2,0 mg/kg, između oko 0,1 mg/kg i oko 1,5 mg/kg, između oko 0,5 mg/kg i oko 1,5 mg/kg, ili između oko 0,7 mg/kg i oko 1,3 mg/kg).
[0183] U nekim otelotvorenjima, pacijentu se dalje primenjuje dodatni terapeutski agens (npr. bilo koji od ovde opisanih dodatnih terapeutskih agenasa). Dodatni terapeutski agens može se primeniti pacijentu u suštini istovremeno kada se primenjuje rekombinantni protein ili farmaceutski sastav i/ili u jednoj ili više drugih vremenskih tačaka. U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je formulisano zajedno sa najmanje jednim rekombinantnim ljudskim proteinom α-galaktozidaze-A (npr., koristeći bilo koji od ovde opisanih primera formulacija i sastava).
[0184] U nekim otelotvorenjima, dodatni terapeutski agens je formulisan u prvom doznom obliku, i najmanje jedan ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A je formulisan u drugom doznom obliku. Tamo gde je dodatni terapeutski agens formulisan u prvom doznom obliku, i najmanje jedan ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A u drugom doznom obliku, prvi dozni oblik i drugi dozni oblik mogu se formulisati, npr. za isti način primene (npr. oralno, potkožno, intramuskularno, intravenozno, intaarterijalno, intratekalno, interlimfno ili intraperitonealno) ili za različite načine primene (npr. prvi dozni oblik formulisan za oralnu primenu a drugi dozni oblik formulisan za potkožnu, intravensku, intraarterijsku ili intramuskularnu primenu). Kombinacije takvih režima tretmana su jasno predviđene u predmetnom pronalasku.
[0185] Kao što je opisano iznad, količina najmanje jednog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (i opciono, dodatnog terapijskog agensa) koja se primenjuje zavisiće od toga da li je primena lokalna (npr., intramuskularna) ili sistemska. U nekim otelotvorenjima, pacijentu (npr. čoveku) se primenjuje više od jedne doze najmanje jednog ljudskog
4
rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A ili najmanje jednog farmaceutskog sastava. U nekim otelotvorenjima, pacijentu (npr. čoveku) se primenjuje više od jedne doze (npr. dve ili više doza) bilo kog ovde opisanog sastava. U nekim otelotvorenjima, pacijentu se primenjuje doza najmanje jednog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A ili najmanje jednog farmaceutskog sastava najmanje jednom mesečno (npr. najmanje dva puta mesečno, najmanje tri puta mesečno, najmanje četiri puta mesečno, najmanje jednom nedeljno, najmanje dva puta nedeljno, tri puta nedeljno, jednom dnevno ili dva puta dnevno). Na primer, pacijentu se mogu primenjivati dve ili više doza bilo kog farmaceutskog sastava ili jedan ili više ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A u frekvenciji od najmanje jedne doze svaka dva meseca (npr. najmanje jedna doza svakog meseca, najmanje jedna doza nedeljno, najmanje jedna doza svake dve nedelje ili najmanje jedna doza dnevno).
[0186] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A ili farmaceutski sastav mogu se hronično primenjivati pacijentu. Hronični tretmani uključuju bilo koji oblik ponovljene primene tokom dužeg vremenskog perioda, kao što je ponovljena primena tokom jednog ili više meseci, između meseca i godine, jedne ili više godina, više od pet godina, više od 10 godina, više od 15 godine, više od 20 godina, više od 25 godina, više od 30 godina, više od 35 godina, više od 40 godina, više od 45 godina ili duže. Alternativno ili pored toga, mogu se primeniti hronični tretmani. Hronični tretmani mogu da uključuju redovne primene, na primer jedan ili više puta dnevno, jedan ili više puta nedeljno ili jedan ili više puta mesečno. Na primer, hronični tretman može da uključuje primenu (npr. intravensku primenu) otprilike svake dve nedelje (npr. između otprilike svakih 10 do 18 dana). Pogodna doza može biti količina ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A koja je najniža doza efikasna da proizvede željeni terapeutski efekat. Takva efikasna doza će generalno zavisiti od ovde opisanih faktora. Ako se želi, efektivna dnevna doza ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A ili farmaceutskog sastava može se primeniti u dve, tri, četiri, pet ili šest ili više pod-doza koje se primenjuju odvojeno u odgovarajućim intervalima tokom dana, opciono, u jediničnim doznim oblicima.
[0187] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A ili farmaceutski sastav mogu biti formulisani za produženo oslobađanje (npr. formulisani u biorazgradivom polimeru ili nanočesticama), i u nekim slučajevima se mogu primeniti direktno u mišićno tkivo, potkožno tkivo ili peritonealnu šupljinu pacijenta (intramuskularna, intraperitonealna ili potkožna depo primena). Alternativno ili pored toga, formulacija sa produženim oslobađanjem može se primenjivati sistemski (npr. oralna, intravenska, intaarterijska, intraperitonealna, interlimfna ili potkožna primena). U nekim slučajevima, ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A ili farmaceutski sastav mogu se formulisati za oralnu, intraglandularnu, periglandularnu, potkožnu, interduktalnu, intramuskularnu, perimuskularnu, intraperitonealnu, intramuskularnu, intraarterijsku, transdermalnu, interlimfnu ili intravensku primenu.
PRIMERI
[0188] Pronalazak je dalje opisan u narednim primerima, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisan u patentnim zahtevima.
Primer 1. Proizvodnja rekombinantne ćelijske linije za proizvodnju glikoproteina [0189] Izvedeni su eksperimenti za razvoj ćelijske linije korisne za rekombinantnu proizvodnju glikoproteina. U ovim eksperimentima početna serumska ćelijska linija CHO (DXB11) serijski je kultivisana u medijumu kulture tkiva koji uključuje 5% fetalnog goveđeg seruma tokom tri dana, kultivisana u medijumu kulture tkiva koji uključuje 2,5% fetalnog goveđeg seruma tokom tri dana, i kultivisana u medijumu kulture tkiva koji ne sadrži fetalni goveđi serum tokom osam dana. Na kraju ovog perioda kultivacije, rezultujuća CHO ćelijska kultura je razblažena i alikvotisana kako bi se stvorila pod-populacija bez seruma, ili zbirne suspenzijske kulture. Nakon procena ekspanzije i rasta, grupe bez seruma su alikvotisane kako bi se stvorile kulture jednoćelijskih klonova. Svaki jednoćelijski klon testiran je na rast svojih ćelija u medijumu kulture bez seruma, i podskup klonova je potom testiran na efikasnost transfekcije elektroporacijom vektora eksprimiranja koji kodira crveni fluorescentni protein (RFP) pod kontrolom promotera β-aktina hrčka, sa RFP eksprimiranjem analiziranim protočnom citometrijom na 2 dana nakon transfekcije. Klonovi koji ispunjavaju kriterijume za vreme udvostručavanja (< 35 sati) i efikasnost transfekcije (> 30% RFP pozitivno sa > 75% održivosti kulture) procenjeni su na eksprimiranje rekombinantnih proteina nakon stabilne transfekcije vektorima eksprimiranja koji kodiraju gene od interesa pod kontrolom promotera β-aktina hrčka i kodiranjem DHFR gena pod kontrolom promotera SV40. Nakon transfekcije, odabrane su stabilno transficirane grupe koristeći metotreksat (MTX), i nakon odabira, grupe su procenjene na produktivnost rekombinantnih proteina sejanjem ćelija u serijski nenahranjene kulture dodavanjem i analiziranjem sejanja bistrih medijuma na nivoe rekombinantnog proteina. Na osnovu preživljavanja MTX selekcije i nivoa proizvodnje rekombinantnih proteina u stabilno transficiranim grupama, identifikovan je vodeći roditeljski klon bez seruma.
[0190] Vodeći roditeljski klon bez seruma je pod-kloniran i dalje kultivisan u proteinima, komponentama životinjskog porekla (ADC) i hemijski definisanom medijumu (CD DG44 medijum kompanije Invitrogen), i pod-klonovi su sačuvani. Otprilike 27 generacija ćelija u medijumu bez ADC prošlo je od koraka pod-kloniranja jedne ćelije do početne banke zamrznutih ćelija. Jednoćelijski klonovi su testirani na naredno: efikasnost transfekcije (elektroporacijom sa gore opisanim vektorom RFP kodiranja), svojstva rasta ćelija (u CD DG44 medijumu kompanije Invitrogen) i stabilne transformacije za proizvodnju rekombinantnih proteina. Procena stabilno transficiranih grupa (koristeći CD CHO medijum kompanije Invitrogen) obuhvatala je procene MTX selekcije, vršne gustine ćelija, svojstava rasta i zapreminske stope produktivnosti (VPR). Produktivnost rekombinantnih proteina testirana je kako je gore opisano.
[0191] Pojedinačna klonska roditeljska ćelijska linija, nakon svih gore opisanih koraka kultivacije, identifikovana je kao da ima najbolju efikasnost transfekcije i najbolju MTX selekciju, vršnu gustinu ćelija, svojstva rasta ćelija i stopu volumetrijske produktivnosti (VPR) stabilno transficiranih grupa. Ova roditeljska ćelijska linija je razmnožena i zamrznuta u alikvote za upotrebu u budućim eksperimentima.
Primer 2. Proizvodnja ljudske rekombinantne α-galaktozidaze-A
[0192] Bočica sa ćelijama koje proizvode (i izlučuju) ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A odmrznuta je u hemijski definisan medijum ćelijske kulture bez sastojaka životinjskog porekla (ADC) u mućkalicama. Smeša je razmnožavana sve dok dovoljna količina ćelija nije bila dostupna za sejanje perfuzionih bioreaktora. Kultura je puštena da raste dok nije postignuta ciljana visoka održiva gustina ćelija, i u toj tački je započeta kontrola gustine ćelija. Kontinuirana perfuzija započeta je jedan dan nakon inokulacije, i zatim je postupno povećavana do fiksne brzine perfuzije pri ciljanoj visokoj gustini ćelija u perfuzionom bioreaktoru. Pročišćena tečnost za hvatanje (koja sadrži ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) direktno je napunjena na kolonu za hvatanje koristeći integrisani sistem hromatografije za kontinuirano hvatanje. Uhvaćeni eluat (koji sadrži ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A) je zatim dalje prečišćen kroz hromatografsku smolu razmene anjona (ANX) kako bi se uklonili DNK, protein ćelije domaćina i druge nečistoće. ANX eluat (koji sadrži ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) je dalje prečišćen kroz imobilizovanu smolu hromatografije metalnog afiniteta. Eluat hromatografije metalnog afiniteta (koji sadrži ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A) koncentrovan je do ciljane koncentracije ljudskog rekombinantnog α-galaktozidaze-A, i zatim je pufer zamenjen u pufer supstance leka pomoću tangencijalne membrane za filtriranje. Rekombinantna supstanca leka ljudske α-galaktozidaze-A podvrgnuta je analitičkoj karakterizaciji (kao što je opisano u primerima). U pripremi za PK/PD studiju na životinjama (Primer 5), rekombinantna supstanca ljudske proteina αgalaktozidaze-A je zatim formulisana dodavanjem manitola i zatim filtrirana kroz 0,22 cm<2>apsolutni filter.
Primer 3. Fizička karakterizacija ljudskog rekombinantnog α-galaktozidaze-A
[0193] Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A, proizveden i prečišćen u Primeru 2, fizički je okarakterisan korišćenjem različitih biofizičkih tehnika i upoređen sa Fabrazyme® i Replagal®. Svaka od proučenih strukturnih i funkcionalnih karakteristika ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A razmotrena je u nastavku, zajedno sa postupcima koje se koriste za određivanje svake strukturne i funkcionalne osobine.
Molekularna veličina
[0194] Molekularna veličina Fabrazyme®, Replagal® i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) procenjena je pomoću hromatografije za isključivanje veličine, MALDI-TOF MS i elektroforeze gela.
SEC
[0195] Analiza hromatografije isključivanja veličine (SEC) izvedena je korišćenjem Agilent 1200 HPLC primenom TSK-Gel G3000SVXL kolone (Tosoh, 7,8 mm x 30 cm). Injektirano je pedeset µL uzorka i izvršena je hromatografija na koloni pri protoku od 0,5 ml/minut. Eluirani proteini su detektovani na 280 nm.
MALDI-TOF MS
[0196] MS MALDI-TOF je izveden prvo razređivanjem uzoraka (1:5) u 0,1% vodenoj mravljoj kiselini. BSA je razblažen na 2 mg/ml u 0,1% vodenoj mravljoj kiselini. Razblaženi uzorci su primećeni u tri primerka na MALDI cilju od nerđajućeg čelika sa zasićenom sinapinskom kiselinom u vodenom 0,1% TFA, 50% acetonitrila pri odnosu od 1 uL/1 uL. Deset spektara je generisano iz svake tačke na različitim lokacijama i sa različitim intenzitetom lasera, i zatim je uprosečeno. Podešavanja instrumenta navedena su u Tabeli 1. Spektri su kalibrisani na jednostruko i dvostruko naelektrisane m/z vrhove BSA. Neobrađeni podaci su izglađeni koristeći podrazumevanu rutinu zaglađivanja pri maksimalnoj rezoluciji od 200. Vršne vrednosti iz trostrukih merenja su uprosečene i utvrđena je standardna devijacija.
Tabela 1. Parametri instrumenta za Fabrazyme MALDI-MS analizu
SDS-PAGE
[0197] Deset µg svakog uzorka opterećeno je na 4-20% Tris glicin gela (Invitrogen) u puferu za punjenje uzorka sa ditioltreitolom (DTT). Napon od 150 primenjen je na gel tokom 1 sata i 25 minuta. Po završetku, gel je obojen rastvorom za bojenje Coomassie R-250 tokom 30 minuta. Višak mrlja uklonjen je rastvorom za uklanjanje boje tokom 30 minuta.
Rezultati
[0198] Analiza hromatografije isključivanja veličine (SEC) pokazuje da Fabrazyme® eluira ranije i sa pratećim ramenom u poređenju sa Replagal® (Slika 6). Ovi rezultati sugerišu da je Fabrazyme® heterogen i da može imati veću molekularnu težinu u poređenju sa Replagal®. MALDI-TOF MS spektri na Slikama 7A-7B pokazuju da je odnos m/z glavnih vrsta uočenih za Fabrazyme® i Replagal® uporediv. Fabrazyme® takođe sadrži vrste rekombinatne ljudske α-galaktozidaze-A niže molekularne težine koje nisu primećene za Replagal®. MALDI-TOF MS spektri na Slici 8 pokazuju da je odnos m/z glavnih vrsta uočenih za Fabrazyme® i FZ2G uporediv. Fabrazyme® sadrži vrste niže molekularne težine koje nisu primećene u FZ2G MALDI-TOF MS spektrima. SDS-PAGE pokretljivost Fabrazyme® i Replagal® su uporedive. Manja vrsta sa većom pokretljivošću (manja prividna molekulska težina) primećena je kod Fabrazyme®, ali ne i kod Replagal® (Slika 9).
Profil glikozilacije
[0199] N-vezani profili glikozilacije za Fabrazyme®, Replagal® i FZ2G određeni su pomoću derivatizacije 2-antranilne kiseline (AA) i tečne hromatografije u normalnoj fazi sa detektovanjem fluorescencije, kako je uopšteno opisano kod Kamoda i dr., J. Chromatography A 1133:332-339, 2006).
Analiza glikana specifična za određenu lokaciju
[0200] Analiza glikozilacije za određenu lokaciju za Fabrazyme®, Replagal® i FZ2G izvedena je korišćenjem hibridnog linearnog jonska zamka-Orbitrap masenog spektrometra (LTQ-Orbitrap, Thermo Fisher Scientific) u kombinaciji sa sistemom tečne hromatografije (nanoAcquity LC, Waters). U ovom postupku, enzimski digesti su pripremljeni tako što su prvo redukovali 100 µg proteina ditioltreitolom, a zatim alkilovali jodooctenom kiselinom. Uzorci su naknadno zamenjeni u Tris-Cl, pH 8,0, koristeći Biospin30 kolona (Bio-Rad), nakon čega je usledila 18-satna digestija endoproteinazom Lys-C i 2-časovna digestija tripsinom. Nakon razblaživanja mravljom kiselinom radi zaustavljanja digestije, injektirano je 200 ng svakog uzorka digestije 75 µm x 10 cm C-18 u kolonu (Picofrit, New Objectives). Peptidi su eluirani u stepenastom gradijentu 2-95% acetonitrila u 0,1% mravlje kiseline. raspon m/z je skeniran od 325-1800 pomoću FTMS pri rezoluciji 60.000 sa CID skeniranjem zavisnim od podataka najviših 5 intenziteta. MS podaci su integrisani i obrađeni pomoću RefinerMS V 7.6 softvera (Genedata) za kvantifikaciju, i CID spektri su prikupljeni za potvrdu sastava glikoforma.
Rezultati
[0201] Slika 10 prikazuje tipični hromatogram N-vezanih oligosaharida derivatizovanih za Fabrazyme® AA, prikazujući specifičnu vrstu N-vezanih oligosaharida prisutnih u svakom od vrhova. Identiteti vrsta glikana uočeni u AA-označenim profilima glikana utvrđeni su LCMS analizom. Hromatogrami koji pokazuju eluiranje različitih tipova AA derivatizovanih N-vezanih oligosaharida za Fabrazyme® i Replagal® prikazani su na Slici 11. Procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji odgovaraju svakoj vrsti N-vezanih oligosaharida za Fabrazyme® i Replagal® prikazani su na Slici 12. Relativni procenat svake vrste glikana primećen na Asn108, Asn161 i Asn184 Fabrazyme® i Replagal® prikazani su na Slikama 13, 14 i 15, respektivno. Relativni procenat svake vrste glikana primećen na Asn108, Asn161 i Asn184 za Fabrazyme® i FZ2G prikazani su na Slikama 16, 17, 18 i 19, respektivno.
[0202] AA-označeni profili za Fabrazyme® i FZ2G prikazani su na Slici 20. Procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji odgovaraju neutralno naelektrisanim oligosaharidima (vrh 1), monoalilizovanim oligosaharidima koji sadrže fukozu (vrh 2) i monoalilizovanim oligosaharidima (vrh 3) za Fabrazyme® i FZ2G prikazani su na slikama 21A-C. Procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji odgovaraju bisijalinizovanim oligosaharidima koji sadrže fukozu (pik 4), bisijalinizovanim oligosaharidima (vrh 5) i triantenarnim, trisijalinizovanim oligosaharidima oblika 1 (vrh 6) za Fabrazyme® i u FZ2G prikazani su na Slikama 22A-C. Prikazan je procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji odgovaraju triantenarnim, trisijalinizovanim oligosaharidima oblika 2 (vrh 6'), olizosaharidima manoza-6-fosfata (vrh 7) i monofosforilizovanim oligosaharidima (vrh 8) za Fabrazyme® i u FZ2G na Slikama 23A-C. Procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji odgovaraju tetrasijalinizovanim oligosaharidima (vrh 9), monosijalinizovanim ili monofosforilizovanim oligosaharidima (vrh 10) i bis-manoza-6-fosfatnim oligosaharidima (vrh 11) za Fabrazyme® i za FZ2G prikazani su na Slikama 24A-C.
[0203] Ovi podaci otkrivaju da predmetno pruženi ljudski rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) ima bitno drugačiji obrazac glikozilacije u poređenju sa Fabrazyme®. Na primer, ovde pruženi ljudski rekombinantni proteini α-galaktozidaze-A (FZ2G) imaju: procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi (vrh 1) manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu (vrh 2) manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 7) koji je približno isti ili manji nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monofosforilizovani oligosaharidi (vrh 8) veći nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi (vrh 9) veći nego za Fabrazyme®; procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani (vrh 10) veći nego za Fabrazyme®; i procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida koji su bis-manoza-6-fosfatni oligosaharidi (vrh 11) veći nego za Fabrazyme®. Izmenjeni obrazac glikozilacije ovde opisanih ljudskih rekombinantnih proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) (npr. u poređenju sa Fabrazyme®) pruža nekoliko prednosti, na primer, jedno ili više od: smanjenje nespecifičnog ciljanja ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A za jetru (smanjenim vezivanja za asijaloglikoproteinski receptor eksprimiran na površini hepatocita nakon primene ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A pacijentu, npr. čoveku), povećana stopa endocitoze ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze od strane ćelije sisara (npr. ljudske ćelije) koja na površini eksprimira protein receptora manoza-6-fosfata, povećan afinitet za protein receptora manoza-6-fosfata i povećan poluživot u serumu, u poređenju sa
1
Fabrazyme®.
Odnosi manoza-6-fosfata i N-acetilneuraminske kiseline prema proteinu
[0204] Izvršen je dodatni niz eksperimenata kako bi se utvrdio molarni odnos manoza-6-fosfata prema proteinu i molarni odnos N-acetilneuraminske kiseline prema proteinu za ovde opisan ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) i za Fabrazyme®.
[0205] Podaci pokazuju da ovde pruženi rekombinantni protein ljudske α-galaktozidaze-A (FZ2G) ima molarni odnos manoza-6-fosfata prema proteinu koji je približno isti kao Fabrazyme® i povišeni molarni odnos N-acetilneuraminske kiseline prema proteinu u poređenju sa Fabrazyme® (slike 25A-B).
Izoelektrična tačka
[0206] Slikano kapilarno izoelektrično fokusiranje (icIEF) je korišćeno za procenu naelektrisanja proteina svakog testiranog proteina. Elektroferogram za Fabrazyme® i Replagal® prikazan je na Slici 31. Relativni procenti niskog, srednjeg i visokog raspona pI elektroferograma određeni su za ovde rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) i Fabrazyme® i prikazani su na Slikama 32A-C.
Hromatografija sa obrnutom fazom
[0207] U drugom nizu eksperimenata, Fabrazyme® i Replagal® su analizirani upotrebom tečne hromatografije visokog pritiska sa obrnutom fazom (RP-HPLC). Uzorci su injektirani u YMC Octyl kolonu (Waters, 2,0 x 100 mm) i eluirani upotrebom linearnog TFA/acetonitrilnog gradijenta pri protoku od 0,25 ml/minut. Eluirani proteini su obelodanjeni na 215 nm. Analize su izvedene primenom Agilent 1200 HPLC.
[0208] Podaci pokazuju da Replagal® eluira iz RP-HPLC kolone u ranijoj vremenskoj tački od Fabrazyme® (Slika 35).
Primer 4. Funkcionalna karakterizacija ljudske rekombinantne α-galaktozidaze-A
Aktivnost vezivanja katjon-nezavisnog receptora manoza-6-fosfata
[0209] Izvršen je niz Biacore eksperimenata kako bi se ispitala sposobnost ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A, Fabrazyme® i Replagal® da se vezuju
2
za katjon-nezavisni receptor manoza-6-fosfata (CIMPR).
[0210] Biacore senzogrami za Fabrazyme® i Replagal® prikazani su na Slici 26. Krive vezivanja iz ovih senzorgrama za Fabrazyme® i Replagal® prikazane su na Slici 27. Grafikon koji rezimira aktivnost vezivanja CIMPR za ovde pružen rekombinantni protein αgalaktozidaze-A (FZ2G) i Fabrazyme® prikazani su na Slici 28. Poređenje ovih podataka pokazuje da ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) povećava aktivnost vezivanja za CIMPR u poređenju sa Fabrazyme®.
[0211] Sposobnost ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G), Fabrazyme® i Replagal® da se vezuju za receptor manoza-6-fosfata je takođe ispitana primenom afinitetne hromatografije na koloni. Kolone receptora za manoza-6-fosfat su eluirane sa manoza-6-fosfatom, i procenat ukupno opterećenog rekombinantnog proteina koji se eluira iz kolone u svakom fragmentu eluiranja prikazan je na Slikama 29 i 30). Podaci ukazuju da ovde pružen rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) ima niži relativni procenat nevezanih i veći procenat vrsta visokog afiniteta u poređenju sa Fabrazyme® i Replagal®.
Kmi Vmax
[0212] Ovde su takođe određeni Kmi Vmaxza ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) i Fabrazyme®.
[0213] Podaci pokazuju da ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) ima smanjeni ili približno isti Kmu poređenju sa Fabrazyme® (Slika 33) i ima približno isti ili malo smanjeni Vmaxu poređenju sa Fabrazyme® (Slika 34).
[0214] Ukratko, ovde pruženi podaci pokazuju da ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) ima izmenjen obrazac glikozilacije i poboljšanu aktivnost vezivanja receptora manoza-6-fosfata u poređenju sa Fabrazyme®.
Primer 5. Studije na životinjama
[0215] Izvedene su dve studije na životinjskim modelima kako bi se procenio efekat ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A na GL-3 klirens i farmakokinetičke parametre.
[0216] Prva studija je sprovedena kako bi se ispitali efekti ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (u poređenju sa Fabrazyme®) na klirens GL-3 iz tkiva nakon pojedinačne intravenske (IV) primene od 0,1 mg/kg i 1 mg/kg kod Fabrijevih miševa. U ovoj studiji, 90 Fabrijevih miševa (46M/44F) podeljeno je u 5 grupa (pogledati Tabelu 2 u nastavku).
Životinjama iz Grupe 1 (n=10, 6M/4F) primenjena je jedna IV primena nosača. Životinjama u grupama 2 i 3 (n=20 po grupi, 10M/10F) je data pojedinačna IV primena Fabrazyme® pri dozi od 0,1 mg/kg, odnosno 1,0 mg/kg. Životinjama iz Grupa 4 i 5 (n=20 po grupi, 10M/10F) data je pojedinačna IV primena ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A (FZ2G) pri dozi od 0,1 mg/kg i 1,0 mg/kg, respektivno. Životinja divljeg tipa iz Grupe 6 (n=1M) nije tretirana i poslužila je kao kontrola za kalibraciju GL-3. Životinje su eutanazirane 3 dana nakon doze (grupe 2-5, n=10, 5M/5F po grupi) i 14 dana nakon doze (Grupa 1 i Grupe 2-5, n=10, 5M/5F po grupi). Analiza GL-3 sprovedena je na narednim tkivima: srce i bubreg (grupe 1, 3 i 5) i slezina i jetra (grupe 1, 2 i 4).
Tabela 2. Dizajn studije za klirens GL-3
4
[0217] Sažetak nekih funkcionalnih i strukturnih karakteristika ovde opisanog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) koji je primenjivan Fabrijevim miševima u studijama na životinjama opisanim u ovom primeru, dat je u Tabeli 3 u nastavku.
[0218] Podaci pokazuju da se slično smanjenje akumulacije GL-3 u jetri, slezini, srcu i bubrezima kod mišjeg modela Fabrijeve bolesti postiže nakon intravenske primene jedne doze Fabrazyme® ili jedne doze ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina αgalaktozidaze-A (FZ2G) (pogledati Slike 36, 37, 38, 39, respektivno). Ukratko, podaci pokazuju da ne postoji statistički značajna razlika u klirensu GL-3 na mišjem modelu Fabrijeve bolesti nakon pojedinačne intravenski primenjene doze Fabrazyme® ili pojedinačne doze ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A koja se primenjuje intravenski (FZ2G).
Tabela 3. Podgrupa fizičkih i strukturnih karakteristika FZ2G koji se koristi u studijama na životinjama
[0219] Druga studija je sprovedena kako bi se okarakterisali i uporedili farmakokinetički parametri za Fabrazyme® i ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) na Fabrijevim miševima nakon pojedinačne primene od 1 mg/kg (IV). U ovoj studiji, 20 Fabrijevih miševa (12M/8F) podeljeno je u 2 grupe (pogledati Tabelu 4 u nastavku).
Životinjama iz Grupa 1 i 2 (n=10 po grupi, 6M/4F) primenjuje se pojedinačna IV primena Fabrazyme® i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) pri dozi od 1,0 mg/kg. Uzorci krvi se uzimaju 2, 15, 30, 60, 120, 240 i 480 minuta nakon doze za enzimsku analizu na osušenim mrljama krvi. Farmakokinetičke analize se sprovode pomoću Phoenix WinNonlin® (Pharsight Corporation, Mountain View, CA).
Tabela 4. Dizajn studije farmakokinetike
[0220] Podaci pokazuju da je farmakokinetika za Fabrazyme® i ovde pružen ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (FZ2G) u analiziranim vremenskim tačkama (Slika 40) slična. Kako su uzorci sakupljani kao osušene mrlje krvi, aktivnost enzima, a ne koncentracija, izračunavata je u svakoj vremenskoj tački. Ukratko, podaci pokazuju sličnu enzimsku aktivnost između enzima nakon pojedinačne intravenske primene Fabrazyme® i ovde pruženog ljudskog rekombinantnog proteina α-galaktozidaze-A (FZ2G) u analiziranim vremenskim tačkama.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Ljudski rekombinantni protein α-galaktozidaze-A (rhAGA) koji ima:
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 11 koji su bis-manoza-6-fosforilizovani oligosaharidi veći od 9%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 3 koji su monosijalinizovani, minus fukozni oligosaharidi između 0,1% i 1,6%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 4 koji su bisijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu veći od 13,5%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 6' koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 2 veći od 2,0%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 1 koji su neutralno naelektrisani oligosaharidi između 0,1% i 3,9%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 2 koji su monosijalinizovani oligosaharidi koji sadrže fukozu između 0,1% i 3,0%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 5 koji su bisijalinizovani oligosaharidi između 0,1% i 5,3%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 6 koji su triantenarni, trisijalinizovani oligosaharidi oblika 1 između 0,1% i 9,0%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 7 koji su manoza-6-fosforilizovani oligosaharidi između 1% i 7,0%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 8 koji su monofosforilizovani oligosaharidi veći od 14,8%;
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 9 koji su tetrasijalinizovani oligosaharidi veći od 4,9%; i
procenat ukupnih N-vezanih oligosaharida pri vrhu 10 koji su monosijalinizovani i monofosforilizovani oligosaharidi veći od 8,2%;
gde se vrhovi određuju profilima N-vezanih oligosaharida označenih antranilnom kiselinom.
2. Farmaceutski sastav koji sadrži rhAGA protein prema patentnom zahtevu 1, i farmaceutski prihvatljiv nosač.
3. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 2, gde je sastav formulisan za intravensku, intraarterijsku, intramuskularnu, intradermalnu, potkožnu ili intraperitonealnu primenu.
4. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 3, gde farmaceutski sastav sadrži koncentraciju rhAGA od 4 mg/ml do 6 mg/ml.
5. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 4, gde farmaceutski sastav sadrži koncentraciju rhAGA od 5 mg/ml.
6. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 2, gde je farmaceutski sastav sterilni, liofilizovani prah.
7. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 6, gde je farmaceutski prihvatljiv nosač jedan ili više od agenasa izabranih iz grupe koju čine: manitol, natrijum fosfat monobazni monohidrat i natrijum fosfat dibazni heptahidrat.
8. rhAGA protein prema patentnom zahtevu 1, za primenu u tretmanu Fabrijeve bolesti.
9. rhAGA protein za primenu prema patentnom zahtevu 8, gde je navedena primena u postupku za povećanje nivoa proteina α-galaktozidaze-A u lizozomu u ćeliji sisara kod pacijenta, gde se ćelija sisara dovodi u dodir sa rhAGA proteinom.
10. rhAGA protein za primenu prema patentnom zahtevu 8, gde je navedena primena u postupku za smanjenje nivoa globotriaosilkeramida u serumu pacijenta.
11. rhAGA protein za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 8-10, gde se rhAGA protein primenjuje intravenozno.
12. rhAGA protein za primenu prema patentnom zahtevu 11, gde se rhAGA protein primenjuje pri dozi od 0,5 mg/kg telesne težine do 2,0 mg/kg telesne težine.
13. rhAGA protein za primenu prema patentnom zahtevu 12, gde se rhAGA protein primenjuje pri dozi od 1,0 mg/kg telesne težine.
14. rhAGA protein za primenu prema bilo kom patentnom zahtevu 8-10, gde se primenjuju dve ili više doza rhAGA proteina, gde se najmanje dve od dve ili više doza rhAGA proteina primenjuju u razmaku od dve nedelje.
RS20210960A 2013-10-23 2014-10-22 Rekombinantni glikoproteini i njihova primena RS62171B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361894879P 2013-10-23 2013-10-23
US201361901942P 2013-11-08 2013-11-08
PCT/US2014/061789 WO2015061464A2 (en) 2013-10-23 2014-10-22 Recombinant glycoproteins and uses thereof
EP14796346.6A EP3060660B1 (en) 2013-10-23 2014-10-22 Recombinant glycoproteins and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62171B1 true RS62171B1 (sr) 2021-08-31

Family

ID=51871299

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210960A RS62171B1 (sr) 2013-10-23 2014-10-22 Rekombinantni glikoproteini i njihova primena

Country Status (33)

Country Link
US (2) US11208644B2 (sr)
EP (2) EP3060660B1 (sr)
JP (2) JP6837334B2 (sr)
KR (2) KR102479886B1 (sr)
CN (3) CN112852784A (sr)
AU (2) AU2014340152A1 (sr)
BR (1) BR112016008086A2 (sr)
CA (1) CA2927852A1 (sr)
CL (1) CL2016000961A1 (sr)
CR (1) CR20160225A (sr)
DK (1) DK3060660T3 (sr)
DO (1) DOP2016000079A (sr)
EA (1) EA034515B1 (sr)
ES (1) ES2882562T3 (sr)
HR (1) HRP20211197T1 (sr)
HU (1) HUE055236T2 (sr)
IL (2) IL245255B (sr)
LT (1) LT3060660T (sr)
MX (1) MX392532B (sr)
MY (2) MY178632A (sr)
NZ (1) NZ720384A (sr)
PE (1) PE20160723A1 (sr)
PH (1) PH12016500708B1 (sr)
PL (1) PL3060660T3 (sr)
PT (1) PT3060660T (sr)
RS (1) RS62171B1 (sr)
SG (2) SG10201803366PA (sr)
SI (1) SI3060660T1 (sr)
TN (1) TN2016000140A1 (sr)
TW (3) TWI642782B (sr)
UA (1) UA119857C2 (sr)
UY (1) UY35794A (sr)
WO (1) WO2015061464A2 (sr)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
EP3896164A1 (en) * 2016-05-18 2021-10-20 ModernaTX, Inc. Polynucleotides encoding alpha-galactosidase a for the treatment of fabry disease
CN110022904B (zh) 2016-10-20 2024-04-19 桑格摩生物治疗股份有限公司 用于治疗法布里病的方法和组合物
TW201829770A (zh) 2017-01-10 2018-08-16 美商阿米庫斯醫療股份有限公司 用於治療fabry氏病之重組α-半乳糖苷酶A
WO2025092951A1 (en) * 2023-11-03 2025-05-08 Shanghai Vitalgen Biopharma Co., Ltd. Recombinant adeno-associated viral vectors for treating fabry disease

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US5356804A (en) * 1990-10-24 1994-10-18 Mount Sinai School Of Medicine Of The City Of New York Cloning and expression of biologically active human α-galactosidase A
US5401650A (en) * 1990-10-24 1995-03-28 The Mount Sinai School Of Medicine Of The City University Of New York Cloning and expression of biologically active α-galactosidase A
US6458574B1 (en) 1996-09-12 2002-10-01 Transkaryotic Therapies, Inc. Treatment of a α-galactosidase a deficiency
US6083725A (en) * 1996-09-13 2000-07-04 Transkaryotic Therapies, Inc. Tranfected human cells expressing human α-galactosidase A protein
PT1538202E (pt) * 1996-09-13 2014-04-22 Shire Human Genetic Therapies Produção de alga-galactosidase a humana
US6066626A (en) 1997-10-29 2000-05-23 Genzyme Corporation Compositions and method for treating lysosomal storage disease
US20020081654A1 (en) * 2000-04-07 2002-06-27 Sandrin Mauro Sergio Targeting hydrolase enzymes
US7138262B1 (en) * 2000-08-18 2006-11-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. High mannose proteins and methods of making high mannose proteins
US7133354B2 (en) 2002-08-26 2006-11-07 Qualcomm Incorporated Synchronization techniques for a wireless system
US7332303B2 (en) * 2002-12-23 2008-02-19 Bristol-Myers Squibb Company Product quality enhancement in mammalian cell culture processes for protein production
CN100522988C (zh) * 2003-04-09 2009-08-05 诺和诺德公司 糖peg化方法及由该方法生产的蛋白质/肽
EP2134853B1 (en) * 2007-04-03 2018-07-18 Oxyrane UK Limited Glycosylation of molecules
CA2697091A1 (en) * 2007-08-31 2009-03-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Glycosylation profile analysis
CN102803292A (zh) * 2009-04-20 2012-11-28 辉瑞公司 蛋白质糖基化的控制及其相关组合物和方法
DK2865751T3 (en) * 2010-03-02 2017-01-09 Protalix Ltd Stabilized alpha-galactosidase and uses thereof
US20120178105A1 (en) 2011-01-10 2012-07-12 Genzyme Corporation Detection of globotriaosylceramide (glc) in human urine samples using an antibody sandwich
RS60129B1 (sr) * 2011-01-20 2020-05-29 Protalix Ltd Kompozicije alfa-galaktozidaze
CN103958676A (zh) * 2011-10-12 2014-07-30 辛那杰瓦生物制药股份有限公司 重组人naglu蛋白质及其用途
EP2620506A1 (en) 2012-01-25 2013-07-31 Arla Foods Amba Method of producing a galacto-oligosaccharide-containing composition
TWI528785B (zh) 2013-02-08 2016-04-01 瑞昱半導體股份有限公司 立體影像的調整裝置及其方法
CN118388581A (zh) 2013-03-08 2024-07-26 建新公司 治疗性蛋白药物物质的整合连续制造

Also Published As

Publication number Publication date
JP6837334B2 (ja) 2021-03-03
SG10201803366PA (en) 2018-05-30
CN114606217A (zh) 2022-06-10
US20220064617A1 (en) 2022-03-03
WO2015061464A3 (en) 2015-09-03
WO2015061464A2 (en) 2015-04-30
DK3060660T3 (da) 2021-09-13
KR102298080B1 (ko) 2021-09-06
IL272609B (en) 2022-03-01
PL3060660T3 (pl) 2021-12-06
PT3060660T (pt) 2021-08-06
EA201690826A1 (ru) 2016-08-31
UA119857C2 (uk) 2019-08-27
MX2016005321A (es) 2017-01-05
CL2016000961A1 (es) 2017-02-03
IL245255A0 (en) 2016-06-30
CR20160225A (es) 2016-06-24
PH12016500708A1 (en) 2016-05-30
CA2927852A1 (en) 2015-04-30
TWI642782B (zh) 2018-12-01
MY197247A (en) 2023-06-08
NZ720384A (en) 2022-04-29
UY35794A (es) 2015-05-29
EA034515B1 (ru) 2020-02-14
EP3060660A2 (en) 2016-08-31
KR20210111880A (ko) 2021-09-13
JP7296327B2 (ja) 2023-06-22
HRP20211197T1 (hr) 2021-11-12
CN112852784A (zh) 2021-05-28
EP3778884A1 (en) 2021-02-17
KR102479886B1 (ko) 2022-12-20
MX392532B (es) 2025-03-24
TW202332774A (zh) 2023-08-16
MY178632A (en) 2020-10-19
EP3060660B1 (en) 2021-06-23
US11208644B2 (en) 2021-12-28
DOP2016000079A (es) 2016-05-30
SI3060660T1 (sl) 2021-09-30
PE20160723A1 (es) 2016-08-01
HUE055236T2 (hu) 2021-11-29
US20160264953A1 (en) 2016-09-15
LT3060660T (lt) 2021-07-26
TW201610163A (zh) 2016-03-16
TN2016000140A1 (en) 2017-10-06
KR20160066550A (ko) 2016-06-10
SG11201602932WA (en) 2016-05-30
CN105916984A (zh) 2016-08-31
ES2882562T3 (es) 2021-12-02
IL272609A (en) 2020-03-31
PH12016500708B1 (en) 2023-03-01
JP2020089379A (ja) 2020-06-11
IL245255B (en) 2020-02-27
BR112016008086A2 (pt) 2017-10-03
TW201900873A (zh) 2019-01-01
TWI793159B (zh) 2023-02-21
AU2020294173A1 (en) 2021-02-11
JP2016538840A (ja) 2016-12-15
AU2014340152A1 (en) 2016-06-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7296327B2 (ja) 組み換え糖タンパク質及びその使用
US11357834B2 (en) Recombinant α-galactosidase A for treatment of Fabry disease
AU2006324163B2 (en) Improved production of glycoproteins using manganese
HU228743B1 (en) Treatment of alpha-galactosidase a deficiency
JP2017035091A (ja) 促進されたプロセシングを備えた修飾された酸性アルファグルコシダーゼ
KR20220145918A (ko) 고 m6p 재조합 단백질의 선택 방법
HK40047362A (en) Recombinant glycoproteins and uses thereof
HK1226444B (en) Recombinant glycoproteins and uses thereof
OA17690A (en) Recombinant glycoproteins and uses thereof.
US20220119471A1 (en) Glycoprotein with reduced acetylation rate of sialic acid residues
EP2247604A2 (en) Biologically active recombinant human saposin c and psap