RS62330B1 - Antitela pro/latentnog miostatina i njihova upotreba - Google Patents

Antitela pro/latentnog miostatina i njihova upotreba

Info

Publication number
RS62330B1
RS62330B1 RS20210987A RSP20210987A RS62330B1 RS 62330 B1 RS62330 B1 RS 62330B1 RS 20210987 A RS20210987 A RS 20210987A RS P20210987 A RSP20210987 A RS P20210987A RS 62330 B1 RS62330 B1 RS 62330B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
myostatin
pro
antibodies
muscle
Prior art date
Application number
RS20210987A
Other languages
English (en)
Inventor
Gregory J Carven
Michelle Straub
Adriana Donovan
Katherine Jane Turner
Original Assignee
Scholar Rock Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Scholar Rock Inc filed Critical Scholar Rock Inc
Publication of RS62330B1 publication Critical patent/RS62330B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/06—Anabolic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/12—Antihypertensives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)

Description

Opis
POLJE PRONALASKA
[0001] Ostvarenja iz ovog pronalaska mogu uključivati modulatore aktivnosti faktora rasta. U nekim realizacijama, takvi modulatori mogu da uključuju antitela i mogu da moduliraju aktivnost člana TGF-β porodice i/ili biologiju.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Miostatin je izlučeni faktor rasta koji negativno reguliše mišić nu masu. Gubitak funkcionalnih mutacija gena miostatina, koja dovodi do hipermuskularnog fenotipa, opisano je kod goveda, ovaca, riba, pasa i ljudi. Ekspresija miostatina je generalno ograničena na skeletne mišić e, sa niskim nivoima ekspresije zabeleženim u masnom i srčanom tkivu. Inhibicija signalizacije miostatina dovodi do poveć anja veličine mišić a. Antitela koja se vezuju za miostatin poznata su u stanju tehnice, videti npr. US 2013/209489, WO 2006/116269, WO 03/027248, WO 2005/066204, WO 2004/037861, WO 2014/182676 ili R. C. Smith et al., Mol. Cane. Therap., Vol.14 (7): 1661-1670. Navedena antitela se vezuju za pro/latentni miostatin, srodne proteine (kao što je GDF11) i/ili zrele izoforme miostatina.
SUŠTINA PRONALASKA
[0003] Pronalazak je definisan patentnim zahtevima, a bilo koji drugi ovde navedeni aspekti ili realizacije koji ne spadaju u delokrug patentnih zahteva, su samo informativnog karaktera.
[0004] Aspekti pronalaska se, u nekim realizacijama, odnose na antitela koja se specifi čno vezuju za oblike miostatina (npr. promiostatin i/ili latentni miostatin). Na primer, ovde data antitela specifi čno se vezuju za jedan ili više pro-oblika i/ili latentnog oblika miostatina, kao što je promiostatin i/ili latentni miostatin. U određenim aspektima, pronalazak se zasniva na iznenađujuć em otkri ć u antitela koja su ovde data i koja se specifično vezuju za čisti ili u suštini čisti proGDF8 (koji se takođe naziva promiostatin). U nekim realizacijama, ovde data antitela inhibiraju signalizaciju miostatina. U nekim realizacijama, inhibicija signalizacije miostatina je korisna za poveć anje mi ši ć ne mase ili sprečavanje atrofije miši ć a. U nekim realizacijama, ovde data antitela vezuju se i sprečavaju cepanje miostatina proprotein konvertazom i/ili toloidnom proteazom. Sprečavanje cepanja promiostatina ili latentnog miostatina, u nekim izvođenjima, sprečava aktivaciju miostatina. Dalji aspekti pronalaska se odnose na antitela koja imaju afinitet prema antigenu koji je osetljiv na pH. U nekim realizacijama, takva pH osetljiva antitela su efikasna za uklanjanje antigena iz seruma. Dalje, u nekim realizacijama, ovde data antitela su antitela koja mogu efikasno da očiste antigene (npr. promiostatin i/ili latentni miostatin) iz seruma.
[0005] Aspekti ovog pronalaska uključuju antitelo koje sadrži promenljivi domen teškog lanca i promenljivi domen lakog lanca, u kojem promenljivi domen teškog lanca sadrži region 3 koji određuje komplementarnost (CDRH3) i sadrži sekvencu kako je navedeno u bilo kom od njih. SEK ID BR: 10-11. U nekim realizacijama, antitelo se specifično vezuje za prolatentni miostatin. U nekim realizacijama, promenljivi domen lakog lanca sadrži region 3 koji određuje komplementarnost (CDRL3) koji sadrži sekvencu kako je izloženo u bilo kojoj od SEK ID BR: 22-23. U još jednom izvođenju, navedeno antitelo sadrži šest regiona za određivanje komplementarnosti (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3, pri čemu CDRH1 sadrži sekvencu kako je izloženo u bilo kojoj od SEK ID BR: 1-3, CDRH2 sadrži sekvencu kako je navedena u bilo kojoj od SEK ID BR: 4-9, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedena u bilo kojoj od SEK ID BR: 10-11, CDRL1 sadrži sekvencu kako je navedena u bilo kojoj od SEK ID BR: 12-17, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedena u bilo kojoj od SEK ID BR: 18-21, a CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 22-23.
[0006] U nekim realizacijama, navedeni CDRH1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 1 ili 2, CDRH2 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 4 ili 5, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 10, CDRL1 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 12 ili 13, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 18 ili 19, a CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 22.
[0007] U drugoj realizaciji, navedeni CDRH1 sadrži sekvencu kako je navedena u SEK ID BR: 1 ili 3, CDRH2 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 6 ili 7, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 11, CDRL1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 14 ili 15, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 20 ili 21, a CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 23.
[0008] U drugim realizacijama, CDRH1 sadrži sekvencu kako je navedena u SEK ID BR: 1 ili 3, CDRH2 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 8 ili 9, CDRH3 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 11, CDRL1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 16 ili 17, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 20 ili 21, a CDRL3 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 23.
[0009] U sledeć oj realizaciji, navedeno antitelo sadrži sekvencu promenljivog domena teškog lanca kako je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 25-29. U nekim realizacijama, navedeno antitelo sadr ži sekvencu promenljivog domena lakog lanca kako je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 30-35.
[0010] Ostali aspekti pronalaska uključuju antitelo koje se specifično vezuje za pro/latentni miostatin i koje sadrži promenljivi domen teškog lanca i promenljivi domen lakog lanca, u kojem promenljivi domen lakog lanca obuhvata region koji određuje komplementarnost (CDRL3) koji sadrži sekvencu kako je izloženo u bilo kojoj od SEK ID BR: 22-23. U nekim realizacijama, navedeno antitelo sadr ži sekvencu promenljivog domena lakog lanca SEK ID BR: 30.
[0011] Neki aspekti pronalaska se odnose na polipeptid koji ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 24, SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 29. U nekim realizacijama, polipeptid je promenljivi domen te škog lanca. U nekim realizacijama, polipeptid je najmanje 75 % (npr. 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ili 99 %) identičan bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK ID BR: 24 , SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28, ili SEK ID BR: 29.
[0012] Neki aspekti pronalaska odnose se na polipeptid koji ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 30, SEK ID BR: 31, SEK ID BR: 32, SEK ID BR: 33, SEK ID BR: 34 i SEK ID BR: 35. U nekim realizacijama, polipeptid je promenljivi domen lakog lanca. U nekim realizacijama, polipeptid je najmanje 75 % (npr. 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ili 99 %) identičan bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK ID BR: 30 , SEK ID BR: 31, SEK ID BR: 32, SEK ID BR: 33, SEK ID BR: 34 ili SEK ID BR: 35.
[0013] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje antitelo koje se nadmeće za vezivanje za pro/latentni miostatin sa napred opisanim antitelom. U nekim realizacijama, navedeno antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin u istom epitopu kao napred opisano antitelo. U jo š jednom izvođenju, antitelo se nadmeće za vezivanje za pro/latentni miostatin sa ravnotežnom konstantom disocijacije, Kd, između antitela i pro/latentnog miostatina od manje od 10<-6>M. U drugim realizacijama, Kd navedenog antitela je u opseg od 10<-11>M do 10<-6>M.
[0014] U nekim realizacijama, antitelo je humanizovano antitelo, dijatelo, himerno antitelo, Fab fragment, F (ab’)2 fragment ili Fv fragment. U još jednom izvođenju, antitelo je humanizovano antitelo. U drugom obliku, antitelo je ljudsko antitelo. U nekim realizacijama, antitelo sadr ži okvir koji ima sekvencu ljudske linije. U još jednom izvođenju, antitelo sadrži konstantni domen teškog lanca odabran iz grupe koja se sastoji od IgG, IgG1, IgG2, IgG2A, IgG2B, IgG2C, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgM i IgE konstantnih domena. U nekim realizacijama, antitelo sadrži konstantni domen IgG4. U drugim realizacijama, antitelo sadrži konstantni domen IgG4 koji ima kičmenu supstituciju Ser-a Pro, koja proizvodi zglob sličan IgG1 i omoguć ava stvaranje međulančanih disulfidnih veza. U još jednom izvođenju, antitelo je konjugovano sa sredstvom izabranim iz grupe koju čine fluorescentni agens, luminiscentni agens, enzimski agens i radioaktivni agens.
[0015] U još jednom izvođenju, antitelo se specifično vezuje za pro/latentni miostatin u poređenju sa zrelim miostatinom. U nekim realizacijama, antitelo se specifično vezuje za pro/latentni miostatin u poređenju sa drugim članom β-porodice transformišuć eg faktora rasta. U još jednom izvođenju, navedeni DF11 ili aktivin.
[0016] Dalji aspekt pronalaska uključuje antitelo koje se specifično vezuje za pro/latentni miostatin i koje inhibira proteolitičko stvaranje zrelog miostatina pomoć u toloidne proteaze. U nekim realizacijama, navedeno antitelo inhibira proteolitičko stvaranje zrelog miostatina pomoć u toloidne proteaze sa IC50manjim od 1 µM. U nekim realizacijama, antitelo je unakrsno reaktivno sa humanim i mi šjim pro / latentnim miostatinom. U drugim realizacijama, antitelo se specifično vezuje za pro / latentni Miostatin u poređenju sa GDF11 ili Activin.
[0017] Sledeć i aspekt pronalaska obuhvata postupak smanjenja aktivacije receptora miostatina u ć elijama prisutnim u medijumu koji sadrži pro/latentni miostatin, postupak koji uključuje isporuku medijumu napred opisanog antitela u količini efikasnoj za inhibiranje proteolitičke aktivacije pro/latentnog miostatina. U nekim realizacijama, medijum dalje sadrži proprotein konvertazu. U drugim realizacijama, medijum dalje sadrži toloidnu proteazu. U još jednom izvođenju, antitelo se isporučuje u medijum u količini koja je efikasna za inhibiranje proteolitičke aktivacije pro/latentnog miostatina pomoć u toloidne proteaze. U nekim realizacijama, ć elija je in vitro. U drugim realizacijama, ć elija je in vivo.
[0018] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima miopatiju, postupak koji obuhvata davanje subjektu napred opisane efikasne količine antitela. U nekim realizacijama, miopatija je primarna miopatija. U još jednom izvođenju, primarna miopatija uključuje neupotrebljenu atrofiju. U drugim realizacijama, atrofija je povezana sa frakturom kuka, elektivnom zamenom zgloba, miopatijom kritične nege, povredom kičmene moždine ili moždanim udarom. U nekim realizacijama, miopatija je sekundarna miopatija, u kojoj je gubitak aktivnosti mi šić a sekundaran u odnosu na patologiju bolesti. U drugim realizacijama, sekundarna miopatija uključuje denervaciju, genetsku slabost mišić a ili kaheksiju. U još jednom izvođenju, sekundarna miopatija je denervacija povezana sa amiotrofi čnom lateralnom sklerozom ili spinalnom mišić nom atrofijom. U nekim realizacijama, sekundarna miopatija je genetska mišić na slabost povezana sa miši ć nom distrofijom. U drugim realizacijama, sekundarna miopatija je kaheksija povezana sa bubrežnom insuficijencijom, AIDS-om, srčanim stanjem, rakom ili starenjem.
[0019] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa starenjem. Primerne bolesti i uslovi povezani sa starenjem uključuju, bez ograničenja, sarkopeniju (gubitak mišić a povezan sa uzrastom), krhkost i nedostatak androgena.
[0020] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa diskus atrofijom/traumom. Primerne bolesti i uslovi povezani sa atrofijom/traumom uklju čuju, bez ograničenja, mišić nu slabost povezanu sa vremenom provedenim u jedinici intenzivne nege (ICU), zamenu kuka/zgloba, frakturu kuka, moždani udar, oporavak u krevetu, SCI, povredu rotatornog zgloba, zamene kolena, frakturu kostiju i opekotine.
[0021] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak za lečenje subjekta koji ima neurodegenerativnu bolest ili stanje. Primeri neurodegenerativnih bolesti ili stanja uključuju, bez ograničenja, spinalnu mišić nu atrofiju i amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS).
[0022] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa kaheksijom. Primerne bolesti i stanja povezana sa kaheksijom uključuju, bez ograničenja, rak, hroničnu srčanu insuficijenciju, sindrom stečene imunološke insuficijencije (AIDS), hroničnu opstruktivnu bolest pluć a (COPD) i hroničnu bolest bubrega (CKD).
[0023] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa retkim bolestima. Primerne retke bolesti i stanja uključuju, bez ograničenja, osteogenezu imperfecta, sporadični miozitis inkluzijskog tela i akutnu limfoblastnu leukemiju.
[0024] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa metaboličkim poremeć ajem i/ili telesnom kompozicijom. U nekim realizacijama, bolest ili stanje je gojaznost (npr. teška gojaznost), Prader-Willi, dijabetes tipa II ili anoreksija. Međutim, dodatne bolesti ili stanja u vezi sa metaboličkim poremeć ajima i/ili telesnom kompozicijom su u okviru ovog pronalaska.
[0025] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa urođenim miopatijama. Uzorne kongenitalne miopatije uključuju, bez ograničenja, miotubularnu miopatiju povezanu sa X, autosomno dominantnu centronuklearnu miopatiju, autosomno recesivnu centronuklearnu miopatiju, nemalinsku miopatiju i kongenitalnu miopatiju nesrazmernog tipa.
[0026] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa mišić nim distrofijama. Primerne miši ć ne distrofije uključuju, bez ograničenja, Duchenneove, Beckerove, facioskapulohumeralne (FSH) i Limb-Girdle mišić ne distrofije.
[0027] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa uroginekološkim bolestima, glotičke poremeć aje (stenoza), ekstraokularnu miopatiju, carpel tunel, Guillain-Barre ili osteosarkom.
[0028] U nekim realizacijama, tretman rezultira poboljšanom mišić nom snagom kod subjekta. U drugim realizacijama, tretman rezultira poboljšanim metaboličkim statusom u subjektu.
[0029] U nekim realizacijama, antitelo se daje u dozi u opsegu od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg. U još jednom izvođenju, antitelo se daje u dozi od 0,3 mg/kg do 30 mg/kg.
[0030] U nekim realizacijama, antitelo se daje subjektu intravenozno. U drugim realizacijama, antitelo se daje subjektu subkutano. U još jednom izvođenju, antitelo se daje subjektu u više navrata. U nekim realizacijama, navedene višestruke administracije se izvode najmanje jednom mesečno. U još jednom izvođenju, navedene višestruke administracije se izvode najmanje nedeljno.
[0031] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje kompoziciju koja sadrži bilo koje napred opisano antitelo i nosač. U nekim realizacijama, navedeni nosač je farmaceutski prihvatljiv nosač. U drugim realizacijama, antitelo i nosač su u liofilizovanom obliku. U još jednom izvođenju, antitelo i nosač su u rastvoru. U nekim realizacijama, antitelo i nosač su zamrznuti. U drugim realizacijama, antitelo i nosač se smrzavaju na temperaturi manjoj ili istoj od -65°C.
[0032] Ostali aspekti pronalaska uključuju izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira protein koji sadrži tri regiona za određivanje komplementarnosti (CDR): CDRH1, CDRH2 i CDRH3, u kojima CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 10 ili 11. U nekim realizacijama, navedeni CDRH1 sadrži sekvencu kako je navedena u SEK ID BR: 1, 2 ili 3. U drugim realizacijama, CDRH2 sadrži sekvencu kako je izloženo u bilo kojoj od SEK ID BR: 4-9.
[0033] Sledeć i aspekt ovog pronalaska uključuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira protein koji sadrži tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR): CDRL1, CDRL2 i CDRL3, u kojima CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 22. U u nekim realizacijama, navedeni CDRL1 sadr ži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 12-17. U drugim realizacijama, CDRL2 sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 18-21.
[0034] Dalji aspekti ovog pronalaska uključuju izolovanu nukleinsku kiselinu koja sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 38-49.
[0035] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje izolovanu ć eliju koja sadrži napred opisanu izolovanu nukleinsku kiselinu.
[0036] Ovaj pronalazak, u nekim aspektima, uključuje metode procene biološkog uzorka dobijenog od subjekta koji ima miopatiju. U nekim realizacijama, metod obuhvata: pripremu imunolo ške reakcione smeše koja sadrži protein biološkog uzorka dobijenog od subjekta i antitelo koje se specifično vezuje za pro/latentni miostatin; održavanje imunološke reakcione smeše pod uslovima koji omoguć avaju da se formiraju kompleksi vezivanja između antitela i pro/latentnog miostatina; i određivanje obima formiranja vezivnog kompleksa. U nekim realizacijama, metod obuhvata: pripremu imunolo ške reakcione smeše koja sadrži protein biološkog uzorka dobijenog od subjekta i antitelo koje se specifično vezuje za promiostatin; održavanje imunološke reakcione smeše pod uslovima koji omoguć avaju stvaranje kompleksa vezivanja između antitela i promiostatina; i određivanje obima formiranja vezivnog kompleksa. U nekim realizacijama, metod obuhvata: pripremu imunološke reakcione smeše koja sadrži protein biološkog uzorka dobijenog od subjekta i antitelo koje se specifično vezuje za latentni miostatin; održavanje imunološke reakcione smeše pod uslovima koji omoguć avaju stvaranje kompleksa vezivanja između antitela i latentnog miostatina; i određivanje obima formiranja vezivnog kompleksa. U nekim realizacijama, metod obuhvata: pripremu imunološke reakcione smeše koja sadrži protein biološkog uzorka dobijenog od subjekta i antitelo koje se specifično vezuje za zreli miostatin; održavanje imunološke reakcione smeše pod uslovima koji omoguć avaju stvaranje kompleksa vezivanja između antitela i zrelog miostatina; i određivanje obima formiranja vezivnog kompleksa.
[0037] Predmetni pronalazak obezbeđuje izolovano antitelo koje sadrži promenljivi region teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31. U jednom aspektu, antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 50. U još jednom izvođenju, antitelo sadrži laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51.
[0038] U drugom aspektu, ovde je opisano izolovano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 1, CDRH2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 6 i CDRH3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 11 ; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 14, CDRL2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 20, i CDRL3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 23.
[0039] U jednoj realizaciji, varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 26. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 32.
[0040] U jednoj realizaciji, varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 27. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 33.
[0041] U drugom aspektu, ovde je opisano izolovano antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži CDRH1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 1, CDRH2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 8 i CDRH3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 11 ; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 16, CDRL2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 20 i CDRL3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 23.
[0042] U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 28. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 34.
[0043] U jednoj realizaciji, promenljivi region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 29. U jednom aspektu, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 35.
[0044] U jednom aspektu, antitelo je ljudsko antitelo. U jednom aspektu, antitelo sadr ži IgG4 konstantni domen. U jednoj realizaciji, antitelo sadrži IgG4 konstantni domen koji ima supstituciju okosnice Ser u Pro koja proizvodi IgG1-sličan zglob i omoguć ava stvaranje međulančanih disulfidnih veza.
[0045] U jednom aspektu, antitelo se specifično vezuje za pro/latentni miostatin. U jednom aspektu, antitelo se specifično vezuje za promiostatin. U još jednom izvođenju, antitelo se specifično vezuje za latentni miostatin. U jednom aspektu, antitelo se ne vezuje za zreli miostatin.
[0046] U jednoj realizaciji, antitelo inhibira proteoliti čko stvaranje zrelog miostatina pomoć u toloidne proteaze. U jednom aspektu, antitelo inhibira proteoliti čko stvaranje zrelog miostatina pomoć u toloidne proteaze sa IC50manjim od 1 µM.
[0047] U jednoj realizaciji, antitelo je unakrsno reaktivno sa humanim i mi šjim pro/latentnim miostatinom. U još jednom izvođenju, antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin, ali se ne vezuje za GDF11 ili aktivin.
[0048] U jednom aspektu, ovde opisani postupak je smanjenje aktivacije receptora miostatina u ć elijama prisutnim u medijumu koji sadrži pro/latentni miostatin, postupak koji uključuje isporuku medijumu ovde opisanog antitela u količini efikasnoj za inhibiranje proteolitičke aktivacije pro/latentni miostatina. U jednom izvođenju, medijum sadrži proprotein konvertazu. U još jednom izvođenju, medijum sadrži toloidnu proteazu. U jednom aspektu, ć elija je in vitro. U još jednom izvođenju, ć elija je in vivo.
[0049] U drugom aspektu, ovde je opisan postupak lečenja subjekta koji ima miopatiju, postupak koji uključuje davanje subjektu efikasne količine ovde opisanog antitela.
[0050] U jednom aspektu, miopatija je primarna miopatija. U jo š jednom izvođenju, primarna miopatija je difuzna atrofija. U jednom aspektu, difuzna atrofija povezana je sa frakturom kuka, elektivnom zamenom zgloba, miopatijom kritične nege, povredom kičmene moždine i/ili moždanim udarom.
[0051] U još jednom izvođenju, miopatija je sekundarna miopatija u kojoj je gubitak funkcije mi šić a sekundarni u odnosu na patologiju bolesti. U jednom aspektu, sekundarna miopatija uklju čuje denervaciju, genetsku slabost mišić a ili kaheksiju. U još jednom izvođenju, sekundarna miopatija je denervacija povezana sa amiotrofičnom lateralnom sklerozom ili spinalnom mišić nom atrofijom. U još jednom izvođenju, sekundarna miopatija je genetska mišić na slabost povezana sa miši ć nom distrofijom. U jednom aspektu, sekundarna miopatija je kaheksija povezana sa bubre žnom insuficijencijom, AIDS-om, srčanim stanjem, rakom ili starenjem.
[0052] U jednoj realizaciji, primena rezultira poboljšanom mišić nom snagom kod subjekta. U jednom ostvarenju, davanje rezultira poboljšanim metaboličkim statusom kod subjekta.
[0053] U jednom izvođenju, antitelo se daje u dozi u opsegu od 0,1 mg/kg do 100 mg/kg. U još jednom izvođenju, antitelo se daje u dozi od 0,3 mg/kg do 30 mg/kg.
[0054] U jednom aspektu, antitelo se daje subjektu intravenozno. U jo š jednom izvođenju, antitelo se daje subjektu supkutano.
[0055] U jednom izvođenju, antitelo se daje subjektu u više navrata. U jednom aspektu, višestruke administracije se izvode najmanje jednom mesečno. U još jednom izvođenju, višestruke administracije se obavljaju najmanje nedeljno.
[0056] U drugom aspektu, ovde je opisana farmaceutska kompozicija koje sadrži ovde opisano antitelo i farmaceutski prihvatljiv nosač. U jednoj realizaciji, kompozicija je liofilizovana kompozicija. U jo š jednom izvođenju, kompozicija je tečna kompozicija. U jednom aspektu, kompozicija je zamrznuta. U jednom aspektu, kompozicija se smrzava na temperaturi manjoj od ili jednakoj - 65°C.
[0057] U drugom aspektu, ovde je opisan špric koji sadrži ovde opisanu farmaceutsku kompoziciju.
[0058] Ovaj pronalazak obezbeđuje izolovanu nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo koje sadrži region varijabilnog teškog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iz SEK ID BR: 39 i promenljivi region lakog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline iz SEK ID BR: 45.
[0059] U sledeć em aspektu, ovde je opisana izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo koje sadr ži promenljivi region teškog lanca koji sadrži CDRH1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 1, CDRH2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 6 i CDRH3 sekvencu koja sadrži SEK ID br. 11; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 14, CDRL2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 20 i CDRL3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 23.
[0060] U jednoj realizaciji, promenljivi region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 40. U jednom aspektu, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 46.
[0061] U jednoj realizaciji, promenljivi region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 41. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 47.
[0062] U drugom aspektu, ovde je opisana izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo koje sadr ži promenljivi region teškog lanca koji sadrži CDRH1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 1, CDRH2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 8 i CDRH3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 11; i varijabilni region lakog lanca koji sadrži CDRL1 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 16, CDRL2 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 20 i CDRL3 sekvencu koja sadrži SEK ID BR: 23.
[0063] U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 42. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 48.
[0064] U jednom aspektu, varijabilni region teškog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 43. U još jednom izvođenju, promenljivi region lakog lanca sadrži sekvencu SEK ID BR: 49.
[0065] U sledeć em aspektu, ovde je opisana izolovana ć elija koja sadrži ovde opisanu izolovanu nukleinsku kiselinu.
KRATAK OPIS SLIKA
[0066]
SLIKE 1A-1B prikazuju strukturu domena miostatina i sklop promiostatina.
SLIKA 1A prikazuje miostatin izlučen kao proprotein, sa inhibitornim prodomenom prać enim domenom faktora rasta C-terminalnog rasta, koji postoji kao dimer povezan sa disulfidom.
SLIKA 1B prikazuje protein prekursor sastavljen u neaktivnoj konformaciji gde prodomen (tamno siva) zatvara faktor rasta (svetlo siva) sklopom „ravne košulje“. Ova cifra predstavlja adaptaciju iz strukture latentnog TGFb1 (Shi i sar. Nature 2011).
SLIKA 2 prikazuje aktivaciju miostatina koji uključuje dva različita događaja proteaze, generišuć i tri glavne vrste miostatina. Biosintetski prekursorski protein, promiostatin, obrađuje se pomoć u dve odvojene proteaze. Cepanje promiostatin-a (i proGDF 11) vr ši se proprotein konvertazom, kao što je furin/PACE3 (upareni bazični enzim za čišć enje aminokiselina 3) ili PCSK5 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin tipa 5), koji preseca na očuvanom mestu RKSKSR između prodomena i zrelog faktora rasta. Ovo cepanje stvara latentni kompleks, u kojem je zreli faktor rasta za štić en od vezivanja za svoje receptore prodomenom. Aktivacija i oslobađanje aktivnog faktora rasta postiže se nakon cepanja dodatnom proteazom iz porodice BMP/toloid, kao što je TLL-2 (protein sličan toloidu 2) ili BMP1 (morfogenetski protein kostiju 1). Ovi događaji cepanja daju zreo oblik miostatina, koji se može označiti kao aktivni miostatin ili zreli miostatin.
SLIKE 3A-3C pokazuju da Ab1 blokira cepanje promiostatina od članova toloidne porodice proteaza. Latentni uzorci miostatina, preinkubirani sa sve već im koli činama Ab1, analizirani su u testu aktivacije miostatina. Nakon analize oslobađanja miostatina pomoć u reporterskog testa (slika 3A), uzorci su zatim obrađivani pod redukcionim uslovima i sondirani Western Blot-om sa antitelom izdignutim prema prodomenu miostatina (slika 3B). Opseg ~ 18 kDa (kutija), što odgovara ARM delu prodomena, generisanog nakon cepanja toloida, proporcionalno se smanjivao sa poveć anjem doza Ab1. Latentni i promiostatin standardi (optere ć eni 45 ng) pokazuju migraciju promiostatina na ∼ 50 kDa, a prodomena na ∼ 37 kDa. SLIKA 3C pokazuje da aktivacija miostatina uključuje dva različita događaja proteaze, generišuć i tri glavne vrste miostatina. Biosintetski prekursorski protein, promiostatin, obrađuje se pomoć u dve odvojene proteaze. Cepanje promiostatin-a (i proGDF 11) vrši se proprotein konvertazom, kao što je furin/PACE3 (upareni bazični enzim za čišć enje aminokiselina 3) ili PCSK5 (Proprotein Convertase Subtilisin/Kexin tipa 5), koji preseca na očuvanom mestu RKSKSR između prodomena i zrelog faktora rasta. Ovo cepanje stvara latentni kompleks, u kojem je zreli faktor rasta zaštić en od vezivanja za svoje receptore prodomenom. SLIKA 3B, koja ilustruje potencijalnu inhibiciju toloidne proteaze, blokirajuć i dalje cepanje promiostatina. Aktivacija i oslobađanje aktivnog faktora rasta postiže se nakon cepanja dodatnom proteazom iz porodice BMP/toloid, kao što je TLL-2 (protein sličan toloidu 2) ili BMP1 (morfogenetski protein kostiju 1).
SLIKA 4 prikazuje učinak roditeljskog antitela na Ab1 i drugih kandidata u testu antitela zasnovanog na ć elijama. Nakon reakcije proteolize preko no ć i sa enzimima iz porodica proproteinkonvertaze i toloidne proteaze, izmereno je oslobađanje zrelog faktora rasta pomoć u CAGA testa antitela u 293T ć elijama. Rezultati su upoređeni sa kontrolnim reakcijama da bi se izračunao udeo promiostatina ili proGDF11 koji je oslobođen u testu. Prikazana je standardna devijacija za prosečno 3 replike, ali nije vidljiva na grafikonu za već inu tačaka podataka zbog njihove male veličine.
SLIKA 5 grafički pokazuje da antitela Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 ne inhibiraju aktivaciju proGDF11.
SLIKA 6 prikazuje rezultate testa koji procenjuju srednji procenat promene telesne te žine. Životinje su vagane svakodnevno i izračunata je procentna promena težine u toku dana. Podaci predstavljaju grupu 6 SEM. Podaci o srednjem procentu promene za svaku grupu na 42. dan studije su analizirani korišć enjem jednosmernog ANOVA pra ć enog Holm-Sidakovim post Hoc testom u poređenju sa PBS kontrolnom grupom, ** p <0,01.
SLIKE 7A-7D pokazuju rezultate testa kojim se procenjuju težine tkiva.
SLIKA 7A prikazuje srednju težinu gastroknemija.
SLIKA 7B prikazuje srednju težinu grudnog koša.
SLIKA 7C prikazuje srednju težinu soleusa.
SLIKA 7D prikazuje srednju težinu tricepsa. Statistička procena je izvršena korišć enjem jednosmerne ANOVA prać ene Holm-Sidakovim post Hoc testom u poređenju sa kontrolnom grupom nosača (Grupa 1). Podaci predstavljaju grupu označenu sa 6 SEM. ** p <0,01. Trake označavaju grupe od 1 do 5 sa leva na desno.
SLIKE 8A-8C pokazuju rezultate testa kojim se procenjuju težine tkiva.
SLIKA 8A prikazuje srednju težinu prednjeg dela potkolenice.
SLIKA 8B prikazuje srednju težinu dijafragme.
SLIKA 8C prikazuje srednju težinu kvadricepsa. Statistička procena je izvršena korišć enjem jednosmerne ANOVA prać ene Holm-Sidakovim post Hoc testom u poređenju sa kontrolnom grupom vozila (Grupa 1). Podaci predstavljaju grupu znači 6 SEM. * p <0,05. Trake označavaju grupe od 1 do 5 sa leva na desno.
SLIKE 9A-9B prikazuju rezultate testa kojim se procenjuje srednji procenat telesne te žine i promena čiste mase.
SLIKA 9A je grafikon koji prikazuje izračunati procenat promene težine po danima kod životinja izmerenih dva puta nedeljno tokom studije.
SLIKA 9B prikazuje podvrgavanje životinja EchoMRI (QNMR) za merenje telesne kompozicije u danima -4, 7, 14, 21 i 28 i izračunata je procentna promena čiste mase po danima. Podaci predstavljaju grupu označenu sa 6 SEM i za telesnu težinu i za telesnu masu, podaci o srednjem procentu promene za svaku grupu 28. dana studije analizirani su korišć enjem jednosmernog ANOVA prać enog Holm-Sidakovim post Hoc testom u poređenju sa kontrolnom grupom IgG (grupa 2). *** p <0,0005, ** p <0,005, * p <0,05, ns (nije značajno).
SLIKE 10A-10D su grafikoni koji prikazuju rezultate testa za procenu miši ć ne težine.
SLIKA 10A prikazuje srednju težinu kvadricepsa.
SLIKA 10B prikazuje srednju težinu gastroknemije.
SLIKA 10C prikazuje srednju težinu prednjeg dela potkolenice.
SLIKA 10D prikazuje srednju težinu dijafragme. Procenat razlike u srednjoj težini mišić a grupa tretiranih sa Ab1 u poređenju sa kontrolnom grupom IgG zabeležen je iznad svake trake. Statistička procena je izvršena korišć enjem jednosmernog ANOVA pra ć enog Holm-Sidakovim post Hoc testom u poređenju sa IgG kontrolnom grupom (grupa 2). Podaci predstavljaju grupu označenu sa 6 SEM. **** p <0,0001, *** p <0,0005, ** p <0,005, * p <0,05, ns (nije značajno).
SLIKE 11A-11B prikazuju rezultate testa koji procenjuje srednji procenat telesne te žine i promene čiste mase.
SLIKA 11A prikazuje procentualnu promenu težine u odnosu na dan 0, izračunatu od životinja izmerenih dva puta nedeljno tokom studije.
SLIKA 11B Na životinjama je urađen EchoMRI (QNMR) radi merenja telesne kompozicije na dane -1, 6 i 13 i izračunata je procentna promena čiste mase u odnosu na dan -1. PBS = fiziološki rastvor u puferu sa fosfatom, Dex = deksametazon, IgG (20) = IgG kontrolno antitelo dozirano 20 mg/kg / nedeljno, Ab1 (20) = Ab1 antitelo dozirano 20 mg/kg/nedeljno i Ab1 (2) = Ab1 antitelo dozirano od 2 mg/kg/nedeljno. Podaci predstavljaju grupu označenu sa 6 SEM. Podaci o prosečnom procentu promene za svaku grupu na 14. dana (za telesnu težinu) i na 13. dan (za mršavu masu) analizirani su korišć enjem jednosmernog ANOVA pra ć enog Dunetovim testom višestrukog poređenja u odnosu na grupu 1 (**** p <0,0001 , *** p <0,0005, ** p <0,005, * p <0,05) i u odnosu na grupu 5 (++++ p <0,0001, ++ p <0,0005, + p <0,005, p <0,05 ). ns (nije značajno).
SLIKE 12A-12D su grafikoni koji prikazuju rezultate testa kojim se procenjuju težine različitih miši ć a.
SLIKA 12A prikazuje srednju težinu gastroknemije (grami).
SLIKA 12B prikazuje srednju težinu kvadricepsa (grami).
SLIKA 12C prikazuje srednji procenat promene težine gastroknemije u odnosu na kontrolne životinje tretirane sa PBS (IP) i normalnom vodom za pi ć e (grupa 1).
SLIKA 12D prikazuje srednji procenat promene težine kvadricepsa u odnosu na kontrolne životinje lečene PBS (IP) i normalnom vodom za pić e (Grupa 1). PBS = fiziološki rastvor puferiran sa fosfatom, Dex = deksametazon, IgG (20) = IgG kontrolno antitelo dozirano sa 20 mg/kg/nedeljno, Ab1 (20) = Ab1 antitelo dozirano sa 20 mg/kg/nedeljno, i Ab1 (2) = Ab1 antitelo dozirano sa 2 mg/kg/nedeljno.
SLIKE 12A-12B prikazuju trake grešaka koje predstavljaju standardnu devijaciju (SD).
SLIKE 12C-12D prikazuju trake grešaka koje predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM). Statistička procena je izvršena korišć enjem jednosmerne ANOVA pra ć ene Dunetovim testom višestrukog poređenja u odnosu na grupu 1 (**** p <0,0001, *** p <0,0005, ** p <0,005, * p <0,05) i vs grupa 5 (++++ p <0,0001, ++ p <0,0005, + p <0,005, p <0,05). ns (nije značajno). Trake označavaju sa leva na desno, PBS, voda; PBS; IgG kontrola; Ab1 (20); i Ab1 (2).
SLIKE 13A-13B pokazuju rezultate testa kojim se procenjuje srednji procenat telesne te žine i promene čiste mase.
SLIKA 13A prikazuje procentualnu promenu težine u odnosu na dan 0, izračunatu za životinje koje su vagane dva puta nedeljno tokom studije.
SLIKA 13B prikazuje procenat promene čiste mase u odnosu na dan -1 izračunat kod životinja koje su podvrgnute EchoMRI (QNMR) za merenje telesne kompozicije dana -1, 7 i 14. PBS = fiziolo ški rastvor puferisan u fosfatu, IgG (20) = IgG kontrolno antitelo dozirano na 20mg/kg/nedeljno, Ab1 (20) = Ab1 antitelo dozirano sa 20 mg/kg/nedeljno, i Ab1 (2) = Ab1 antitelo dozirano sa 2 mg/kg/nedeljno. Podaci predstavljaju grupu označenu sa 6 SEM.
SLIKE 14A-14D pokazuju rezultate testa kojim se procenjuje miši ć na težina.
SLIKA 14A prikazuje srednju težinu gastroknemije od livene noge (grami).
SLIKA 14B prikazuje srednju težinu kvadricepsa od livene noge (grami).
SLIKA 14C prikazuje srednji procenat promene težine gastroknemije u odnosu na kontrolne životinje koje su lečene PBS (IP) i nisu livene (grupa 1).
SLIKA 14D prikazuje srednji procenat promene težine kvadricepsa u odnosu na kontrolne životinje koje su lečene PBS (IP) i nisu livene (grupa 1). PBS = fiziološki rastvor u puferu sa fosfatom, IgG (20) = IgG kontrolno antitelo dozirano 20 mg/kg/nedeljno, Ab1 (20) = Ab1 antitelo dozirano 20 mg/kg/nedeljno i Ab1 (2) = Ab1 antitelo dozirano 2 mg/kg/nedeljno.
SLIKE 14A-14B prikazuju trake grešaka koje predstavljaju standardnu devijaciju (SD).
SLIKE 14C-14D prikazuju trake grešaka koje predstavljaju standardnu grešku srednje vrednosti (SEM). Statistička procena je izvedena korišć enjem jednosmerne ANOVA pra ć ene Dunetovim testom višestrukog upoređivanja u odnosu na grupu 1 (**** p <0,0001, *** p <0,0005, ** p <0,005, * p <0,05) i vs grupa 5 (++++ p <0,0001, ++ p <0,0005, + p <0,005, p <0,05). ns (nije značajno). Slike prikazuju sa leva na desno, PBS; PBS, liveni; IgG kontrola (2), livena; Ab1 (20), liveni; i Ab1 (2), liveni.
SLIKA 15 prikazuje rezultate testa kojim se procenjuje promena čiste mase 21. dana (gore desno) i dana 28 (gore levo). Takođe prikazuje procenat promene nemasne mase u tri različite doze, 20 mg/kg/nedelja (dole levo), 2 mg/kg/nedelja (dole sredina) i 0,5 mg/kg/nedelja (dole desno) testiranih antitela, PBS kontrola i IgG kontrola. Statistička procena je izvršena korišć enjem jednosmerne ANOVA prać ene Dunetovim testom višestrukog upoređivanja u odnosu na grupu 1 (**** p <0,0001, *** p <0,005, ** p <0,01, * p <0,05) i vs kontrolu IgG. Za gornja dva panela, trake sleva nadesno su: PBS; IgG Ctrl 20 mg / kg / nedeljno; Ab1 20 mg / kg / nedeljno; Ab1 2 mg / kg / nedeljno; Ab10,5 mg / kg / nedeljno; Ab220 mg / kg / nedeljno; Ab22 mg / kg / nedeljno; Ab2 0,5 mg / kg / nedeljno; Ab420 mg / kg / nedeljno; Ab42 mg / kg / nedeljno; Ab40,5 mg / kg / nedeljno; Ab620 mg / kg / nedeljno; Ab62 mg / kg / nedeljno; i Ab60,5 mg / kg / nedeljno. Za donji levi panel (20 mg / kg / nedeljno), tačke podataka koje odgovaraju danu 28 posle doziranja, odozgo prema dole, odgovaraju Ab1, Ab4, Ab2, Ab6, IgG kontroli i PBS. Za donju sredi šnju ploču (2 mg/kg/nedeljno), tačke podataka koje odgovaraju danu 28 nakon doziranja, odozgo prema dole, odgovaraju Ab2, Ab1, Ab6, Ab4, IgG kontroli i PBS. Za donji desni panel (0,5 mg/kg/nedeljno), tačke podataka, koje odgovaraju danu 28 nakon doziranja, odozgo prema dole, odgovaraju IgG kontroli Ab1, Ab2, PBS, Ab4 i Ab6.
SLIKE 16A-16B prikazuju domensku strukturu i procenu oblika prekursora miostatina.
SLIKA 16A prikazuje domensku strukturu promiostatina i latentnog miostatina, sa nazna čenim mestima cepanja proteaze.
SLIKA 16B prikazuje delimično odcepljeni promteostatin protata konvertaze na SDS PAGE gelu. Pod uslovima smanjenja, proteinske trake sastojale su se od promiostatin monoma (~ 50 kD), prodomena (~ 37 kD) i faktora rasta (12,5 kD).
SLIKE 17A-17B prikazuju emisiju Ab1 specifičnu za miostatin.
SLIKA 17A pokazuje da se Ab1 specifično vezuje za promiostatin i latentni miostatin, bez primeć ivanja vezivanja za druge članove TGFB nadporodice, naročito za odgovaraju ć e oblike GDF11. Ab1 je administriran u visokoj koncentraciji (50 ug/ml) na Forte-Bio BLI vrhove oblo žene naznačenim antigenom i izmerene su brzine uključivanja i isključivanja kako bi se dobila približna vrednost Kd. Veličina biosenzorskog odgovora, koji ukazuje na vezujuć i događaj, grafički je predstavljena crnim trakama, a izračunati Kd je označen narandžasto.
SLIKA 17B pokazuje da Ab1 blokira aktivaciju promiostatina, ali ne i proGDF 11. Posle reakcije proteolize preko noć i sa enzimima iz porodica proprotein-konvertaze i toloidne proteaze, merenje oslobađanja zrelog faktora rasta izmereno je pomoć u CAGA reporter testa u 293T ć elije. Rezultati su upoređeni sa kontrolnim reakcijama da bi se izračunao udeo promiostatina ili proGDF11 koji je oslobođen u testu.
SLIKE 18A-18C pokazuju SCID odgovor na dozu sa antitelima kandidata.
SLIKA 18A prikazuje miši ć nu težinu gastroknemije i sl.
SLIKA 18B prikazuje miši ć nu težinu kvadricepsa.
SLIKA 18C pokazuje procenat promena srednje težine miši ć a u poređenju sa PBS kontrolom.
SLIKE 18A-18B sleva nadesno su: PBS; IgG Ctrl 20 mg / kg / nedeljno; Ab120 mg / kg / nedeljno; Ab12 mg / kg / nedeljno; Ab10,5 mg / kg / nedeljno; Ab220 mg / kg / nedeljno; Ab22 mg / kg / nedeljno; Ab20,5 mg / kg / nedeljno; Ab420 mg / kg / nedeljno; Ab42 mg / kg / nedeljno; Ab4 0,5 mg / kg / nedeljno; Ab620 mg / kg / nedeljno; Ab62 mg / kg / nedeljno; i Ab60,5 mg / kg / nedeljno.
SLIKA 19 prikazuje rezultate studije trajanja delovanja u kojoj se upoređuje Ab1 sa postojeć im antitelom na miostatin (AbMio). PBS je korišć en kao negativna kontrola; IgG je koriš ć en kao pozitivna kontrola. Promena mase ispitivana je pod različitim protokolima doziranja nakon 21 dana.
SLIKA 20 je šema koja ilustruje test koji rekonstituiše aktivaciju miostatina in vitro.
SLIKE 21A-21B prikazuju teški lanac (slika 21A; SEK ID BR: 50) i laki lanac (slika 21B; SEK ID BR: 51) humanizovanog monoklonskog antitela (Ab2) podtipa IgG4 sa prolinom supstituisanim za serin. Ovo generiše sekvencu sličnu IgG1 i minimizira nepotpuno stvaranje interlančanih disulfidnih mostova što je karakteristično za IgG4. Podvučeni su regioni koji određuju komplementarnost (CDR). Podebljana NST sekvenca: N-povezano mesto konsenzusa glikozilacije u sekvenci; podebljane DP sekvence su potencijalna mesta cepanja; NKS sekvence, gde X mo že biti S, T ili G su potencijalna mesta deamidacije; podebljane DX sekvence, gde X može biti G, S, T ili SDG su potencijalna mesta izomerizacije; metionini su potencijalna mesta oksidacije metionina; podebljano X je o čekivana N-terminalna piroglutaminska kiselina.
SLIKA 22 je šema koja prikazuje smanjeni rizik od imunogenosti klijanjem. 24H4 (WT) sadrži 5 aminokiselina koje nisu klice u okvirnim regionima, kako je naznačeno u šemi.
SLIKE 23A-23C pokazuju optimizaciju Ab1. Izabrani su optimizovani kandidati koji se specifi čno vezuju za promiostatin, što je rezultiralo desetinama klonova sa poveć anim afinitetom. FACS je izveden da pokaže pove ć ano vezivanje klonova kvasca (slika 23B) u poređenju sa Ab1 (slika 23A). SLIKA 23C pokazuje da afinitetno sazrele varijante imaju i sporiji protok.
SLIKE 24A-24B prikazuju poravnanja sekvenci promenljivih teških regiona (slika 24A) i promenljivih lakih regiona (slika 24B) roditeljskog Ab1 sa varijantama optimizovanim za afinitet, Ab3 i Ab5. Identifikatori sekvence odozgo prema dole odgovaraju SEK ID BR: 24, 26, 28 (SLIKA 24A). Identifikatori sekvence odozgo prema dole odgovaraju SEK ID BR .: 30, 32, 34 (SLIKA 24B). Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani su pomoć u Kabat (podvučeno) i IMGT nomenklature (podebljano). Zamene od roditeljskog Ab1 prikazane su svetlo sivom bojom.
SLIKA 25 prikazuje ekspresiju pro/latentnog miostatina u mišić ima i plazmi kod normalnih i atrofičnih miševa.
SLIKA 26 prikazuje kvantifikaciju promena pro/latentnog miostatina u mi šić ima i plazmi. Stubovi sleva nadesno prikazuju promiostatin, latentni miostatin, promiostatin, latentni miostatin i latentni miostatin.
SLIKA 27 pokazuje da Ab2 jedinstveno prepoznaje promiostatin i latentni miostatin, vezujuć i se za glavne oblike miostatina i u serumu i u mišić ima. Western-Blot koji se ne smanjuje za domen (tamnije siva) i zreli faktor rasta (svetlija siva). Rekombinantni promiostatin (rpromiostatin) pokazuje migraciju promiostatina i miostatinskog prodomaina (latentni miostatin) na gelu, označen strelicama. U serumu se i Ab2 i AbMio vezuju za latentni miostatin (prodomena domena) i više delimično obrađenih prekursora, međutim samo Ab2 prepoznaje promiostatin (gornji opseg). U mišić ima je Ab2 taložio promiostatin, bez interakcije AbMio sa promiostatinom u mi ši ć nom tkivu.
SLIKE 28A-28B prikazuju model za protok miostatina u normalnom i atrofičnom mišić u. U normalnom mišić u (slika 28A), promiostatin se proizvodi u miši ć ima i pretvara u latentni miostatin cepanjem furin proteaze, koje se može javiti unutar ili izvan ć elije. Potom se deo frakcije latentnog miostatina u mišić ima oslobađa u cirkulaciju, formiraju ć i kružni bazen latentnog miostatina. U atrofiji mišić a (slika 28B), pove ć anje aktivnog faktora rasta miostatina uzrokovano je regulacijom nivoa promiostatina u mišić ima i pove ć anom konverzijom latentnog miostatina u aktivni faktor rasta. Kao posledica, cirkulišuć i latentni miostatin se smanjuje kako se miši ć ni fond latentnog miostatina preusmerava ka stvaranju zrelog miostatina cepanjem mTLL2.
SLIKA 29 prikazuje detekciju antitela Ab2 (gornja linija) i IgG kontrole (donja linija) u serumu doziranih pacova. Ab2 pokazuje povišene nivoe u cirkulaciji u poređenju sa IgG kontrolom, sa prosekom od 17,1 mg/ml Ab2 u serumu na kraju studije. Nivoi Ab2 određeni humanim IgG-specifičnim ELISA-om sa poznatim količinama svakog antitela korišć enog kao referentni standard. SLIKE 30A-30B pokazuje farmakodinamičke efekte Ab2 kod lečenih pacova.
SLIKA 30A pokazuje da pacovi tretirani sa Ab2 pokazuju poveć anu masu u poređenju sa životinjama tretiranim sa PBS ili IgG. Ab2 i IgG su primenjeni intravenozno u dozama od 10 mg/kg na dan 0. Čista masa izmerena qNMR (N = 8 po grupi) 7, 14, 21 i 28 dana nakon doziranja.
SLIKA 30B prikazuje kako su na kraju studije sakupljeni rektus femoris i tibilais prednji mi šić i iz svih grupa (N = 8 po grupi) i odmereni kako bi se utvrdila mišić na masa. Pacovi lečeni Ab2 pokazuju porast mase rektus femoris i tibialis anterior mišić a za 14 %, odnosno 11 %.
SLIKE 31A-31B prikazuje nivoe pro/latentnog miostatina pro/latentnog miostatina kod pacova tretiranih sa Ab2.
SLIKA 31A pokazuje da lečenje Ab2 (gornja linija) poveć ava latentni nivo miostatina u serumu pacova za oko 20 puta.
SLIKA 31B pokazuje da kod mišić a pacova (rectus femoris), lečenje Ab2 dovodi do 1,9 puta poveć anja latentnog oblika miostatina. Stubovi sa leva na desno odgovaraju promiostatinu, latentnom miostatinu, promiostatinu i latentnom miostatinu. Nije zabele žena statistički značajna promena u promiostatinu u mišić ima pacova. Ovi podaci su iz kvantitativnih zapadnjačkih analiza
1
sa n = 3 uzorka po grupi.
SLIKA 32 prikazuje tretman sa Ab2 (Ab2) ili uporednim antitelom (AbMio) koji dovodi do poveć anja čiste mase već za 7 dana nakon doziranja antitela. Pove ć anje čiste mase ekvivalentno je za Ab2 i AbMio do 21 dan nakon doziranja. Međutim, do 28 dana nakon doziranja, poveć anje čiste mase gubi se u grupi koja se leči AbMio, dok se poveć anje u grupi koja se leči Ab2 zadržava tokom celog trajanja studije. Gornja linija odgovara Ab2, srednja linija odgovara AbMio, a donja linija odgovara IgG kontroli (5 mg/kg).
SLIKA 33 pokazuje da su nakon pojedinačne, 5 mg/kg doze Ab2 (gornja linija) ili uporednog antitela (AbMio; donja linija), serumski nivoi leka izmereni upotrebom anti-humanog IgG ELISA. Lek se detektuje u serumu već 1 sat nakon doziranja, a nivoi > 1mg/ml oba antitela mogu se utvrditi tokom studije. Međutim, Ab2 pokazuje znatno duži period poluraspada i zaključeno područje ispod krive (AUCINF) od AbMio, što sugeriše da, u sličnim dozama, Ab2 pokazuje znatno već u izloženost od AbMio.
SLIKA 34 prikazuje serumski miostatin izmeren kod miševa koji su lečeni lekovima i kod kontrola pomoć u fluorescentnog Western Blot-a. Uprkos pove ć anoj izloženosti Ab2 u serumu, nivoi latentnog miostatina u serumu i kod miševa koji su lečeni sa Ab2 i od AbMio bili su slični. Ovi podaci sugerišu da su nivoi slobodnog leka u cirkulaciji dovoljno već i od nivoa cilja da pove ć ana izloženost Ab2 u serumu ne dovodi do već eg pove ć anja latentnog miostatina u cirkulaciji nego što je primeć eno u grupi AbMio. Grupe podataka sleva nadesno odgovaraju IgG, Ab2, AbMio, IgG, Ab2 i AbMio.
SLIKE 35A-35B pokazuje relativni nivo latentnog i promiostatina merenog u mi šić nim lizatima miša fluorescentnim Western Blotom.
SLIKA 35A pokazuje da je latentni miostatin povišen i u mišić ima tretiranim sa Ab2 i AbMio. Međutim, povišenje latentnog miostatina u mišić ima tretiranim sa AbMio vra ć a se na osnovno stanje do 28. dana, dok oni u mišić ima tretiranim sa Ab2 ostaju povišeni barem do ovog trenutka (P < 0,003 u odnosu na tretman sa AbMio).
SLIKA 35B pokazuje sličan trend primeć en kod promiostatina, mada razlika između grupa koje su lečene Ab2 i AbMio na dan 28 nije statistički značajna (P = 0,068).
SLIKA 36A pokazuje efekte tretmana sa Ab2 na miši ć nu masu i funkciju miševa.
SLIKA 36B prikazuje efekte tretmana sa Ab2 na maksimalno stvaranje sile kod miševa.
DETALJAN OPIS
[0067] Miostatin je član TGFb superfamilije i pripada podfamiliji koja uključuje dva člana: miostatin (takođe poznat kao GDF8) i GDF11. Poput ostalih članova superfamilije TGFb, i miostatin i GDF11 su u početku izraženi kao neaktivni polipeptidi prekursori (nazvani promiostatin, odnosno proGDF11). Struktura domena i nomenklatura prikazani su na slici 1A. Slika 1B ilustruje model crtanog filma ukupne strukture promiostatina, gde se zreli faktor rasta drži zaključan u kavezu koji se sastoji od dve alfa spirale povezane petljom nazvanom „latentni laso“.
[0068] Aktivacija i oslobađanje zrelog faktora rasta se postiže pomoć u nekoliko diskretnih događaja cepanja proteaze, opisanih na slici 2. Prvi korak cepanja promiostatina i proGDF11 izvodi se proprotein konvertaza, koja preseca na očuvanom mestu RXXR između prodomaina i zrelog faktora rasta. Ovo cepanje stvara latentni kompleks, u kojem je zreli faktor rasta zaštić en od vezivanja za svoje receptore prodomenom. Aktivacija i oslobađanje zrelog, aktivnog faktora rasta miostatina se postiže nakon cepanja dodatnom proteazom iz porodice BMP/toloid, kao što je mTLL-2 (slika 2).
[0069] Primerni proGDF8 sekvence kod čoveka, pacova, miša i cinomolgusa dati su u nastavku. U ovim sekvencama proGDF8, mesto cepanja proprotein konvertaze je označeno podebljano, a mesto toloidne proteaze je označeno podvlačenjem. U nekim realizacijama, mesto cepanja proprotein konvertaze sadr ži aminokiselinske ostatke 240 do 243 SEK ID BR: 52-55. U nekim realizacijama, mesto toloidne proteaze sadrži aminokiselinske ostatke 74-75 od SEK ID BR: 52-55. Treba imati na umu da ovde dati primeri proGDF8 sekvenci nisu ograničeni i da su dodatne sekvence proGDF8 drugih vrsta, uključujuć i bilo kakve njihove izo forme, u okviru ovog pronalaska.
proGDF8 (čovek):
proGDF8 (pacov):
proGDF8 (miš):
proGDF8 (cinomolgus):
[0070] Miostatin i GDF11 dele relativno visok stepen očuvanosti između svojih zrelih domena faktora rasta, sa devedeset procenata identiteta, ali su mnogo slabije o čuvani u svojim prodomenskim regionima sa manje od pedeset procenata identiteta aminokiselina između njih. Miostatin i GDF11 se vezuju i signaliziraju kroz iste receptore koji se sastoje od receptora tipa I (ALK4/5) u saradnji sa receptorima tipa II (ACTRIIA/B). Angažovanje miostatina sa receptorima tipa I i tipa II pokreć e signalnu kaskadu koja dovodi do SMAD fosforilacije i transkripcione aktivacije gena atrofije mi šić a. Relativno visok stepen konzervacije u zrelim faktorima rasta predstavlja izazov za identifikaciju reagensa, poput monoklonskih antitela, koji mogu razlikovati zreli mioostatin i GDF11.
[0071] U nekim realizacijama ovde su data antitela na pro/latentni miostatin koja se specifi čno vezuju za himernu konstrukciju koja sadrži domen faktora rasta i N terminalni propeptidni deo GDF11 i C terminalni deo propeptida GDF8. Ova himerna konstrukcija, kao što je dalje u tekstu, označava se kao GDF11Arm8.
Uloga miostatina u miopatijama
[0072] Skeletni mišić i čine približno 40 % telesne mase i dinamičan su organ, okre ć u ć i se brzinom od 1-2 % dnevno. Atrofija mišić a je visoko regulisani katabolički proces koji se javlja tokom perioda neaktivnosti (npr. disusna atrofija) i/ili kao odgovor na pojačano sistemsko zapaljenje (kaheksija). U slučaju atrofije usled neaktivnosti, koja se može javiti tokom dužih perioda imobilizacije, na primer tokom odmora u krevetu, gubitak aktivnosti mišić a se brzo javlja. Na primer, tokom boravka u bolnici od jedne nedelje, prosečan pacijent izgubi ∼ 1.3 kg mišić ne mase.
[0073] Atrofija mišić a uzrokuje značajan morbiditet u širokom opsegu kliničkih stanja. Kod bolesti denervacije poput amiotrofične lateralne skleroze (ALS) ili kičmene mišić ne atrofije (SMA) i genetskih oboljenja, uključujuć i miši ć ne distrofije, gubitak miši ć ne snage i funkcije veoma su onesposobljavaju ć e kliničke manifestacije za koje ne postoji adekvatan tretman. Kod sindroma kaheksije usled bubre žne insuficijencije, AIDS-a, srčanih oboljenja ili karcinoma, gubitak mišić a često podriva uspešno lečenje primarnog stanja. Gubitak mišić a takođe je prirodni proces starenja i u svom najtežem obliku kategoriziran je kao sarkopenija, rašireno stanje starijih osoba koje se sve više prepoznaje kao patologija koja opravdava intervenciju. I na kraju, glavni pokretač atrofije mišić a je neaktivnost. Imobilizacija uzrokuje brz i značajan gubitak mišić a u velikoj grupi stanja kao što su fraktura kuka, elektivna zamena zgloba, povreda kičmene moždine, miopatija od kritične nege i moždani udar. Iako su različite u svom uzroku, ove indikacije imaju karakteristiku mišić ne slabosti, što dovodi do značajne invalidnosti, dugotrajne fizičke rehabilitacije i oporavka i narušavanja kvaliteta života.
[0074] Postoji nezadovoljena medicinska potreba u uslovima atrofije mi šić a. Shodno tome, u nekim realizacijama, ovde su obezbeđeni postupci za lečenje atrofije mišić a. U nekim realizacijama, ovde dati postupci odnose se na lečenje primarne miopatije. U nekim realizacijama, ovde obezbeđeni postupci odnose se na lečenje sekundarne miopatije, kao što su, na primer, bolesti denervacije, genetska slabost mišić a i kaheksija, stanja u kojima je gubitak miši ć a sekundarni u odnosu na patologiju bolesti. U nekim realizacijama, ovde obezbeđeni postupci za lečenje primarnih miopatija, poput disusne atrofije (npr. povezane sa prelomom kuka ili povredom kičmene moždine (SCI)), dovode do poveć anja miši ć ne mase, snage i funkcije kod subjekta.
Inhibicija puta miostatina
[0075] Postoji nekoliko antagonista puta miostatina u različitim fazama kliničkog razvoja prema lečenju stanja povezanih sa mišić ima. Takvi antagonisti puta ciljaju ili zreli faktor rasta ili njegov receptor tipa II, a već ina antagonizuje signalizaciju više članova TGFb porodice. Na primer, brojni trenutni klinički kandidati blokiraju dodatne faktore rasta kao što su aktivin A, GDF11 i BMP 9 i 10, koji su regulatori reproduktivne biologije, zarastanja rana, eritropoeze i formiranja krvnih sudova. Aspekti ovog pronalaska odnose se na spoznaju da ć e blokiranje ovih faktora pored miostatina potencijalno ograni čiti populaciju pacijenata koji mogu bezbedno da se podvrgnu terapiji zbog neprihvatljivih ne željenih efekata.
[0076] Shodno tome, ovde su data antitela sposobna da se vežu za promiostatin i/ili latentni miostatin, čime inhibiraju aktivnost miostatina, i njihove upotrebe za le čenje bolesti i poremeć aja povezanih sa miopatijom. U nekim realizacijama, s obzirom na prevalenciju latentnog kompleksa u cirkulaciji, ovde su obezbeđeni tretmani koji posebno ciljaju obilnije i dugovečnije preteče miostatina, npr. promiostatin i latentni mioostatin, umesto zreli faktor rasta. Bez želje da se vezuju za bilo koju određenu teoriju, ovde navedena antitela mogu sprečiti proteolitičku aktivaciju promiostatina i/ili latentnog miostatina u zreli miostatin, koji se smatra „aktivnim“ oblikom miostatina, koji je sposoban da aktivira put miostatina, npr. vezivanjem receptora tipa I (ALK4/5) i tipa II (ACTRIIA/B).
1
[0077] Kako se ovde koristi, termin "pro/latentni miostatin" odnosi se na promiostatin, latentni miostatin ili oboje. U nekim realizacijama, antitelo protiv pro/latentnog miostatina se specifi čno vezuje za promiostatin. U nekim realizacijama, antitelo protiv pro/latentnog miostatina se specifi čno vezuje za latentni miostatin. U nekim realizacijama, antitelo protiv pro/latentnog miostatina se specifi čno vezuje i za latentni miostatin i promiostatin. Treba imati na umu da se "latentni miostatin" i "promiostatin" ovde takođe mogu nazivati "latentni GDF8", odnosno "proGDF8".
[0078] Kako se ovde koristi, termin "zreli miostatin" odnosi se na zreli, biološki aktivan oblik miostatina. U nekim realizacijama, zreli miostatin je sposoban da se veže i/ili aktivira za miostatinski receptor. Aktivacija i oslobađanje zrelog miostatina in vivo iz njegovog promiostatinskog oblika postiže se u nekoliko diskretnih aktivnosti cepanja proteaze. Za početak, „promiostatin“ se cepa proprotein konvertazom, što rezultira „latentnim miostatinom“, u kojem je zreli miostatin zaštić en od vezivanja za svoje receptore delom prodomaina. Aktivacija i oslobađanje zrelog miostatina se postiže nakon cepanja latentnog miostatina dodatnom proteazom iz porodice BMP/toloida, kao što je mTLL-2. Videti, na primer, slike 1A, 1B i 2. Kako se ovde koristi, termin "zreli miostatin" može se odnositi kako na zreli miostatin u punoj dužini, tako i na fragmente zrelog miostatina u punoj dužini koji zadržavaju biološku aktivnost. Primeri zrelih miostatinskih sekvenci, njihove varijante i postupci za generisanje zrelog miostatina dobro su poznati u tehnici i ovde su detaljnije opisani.
[0079] Termin "promiostatin", takođe poznat kao "proGDF8", odnosi se na neaktivni prekursor zrelog miostatina koji sadrži homodimer vezan za disulfid, pri čemu svaki molekul homodimera sadrži amino terminalni domen kovalentno vezan za karboksilni terminal zreli domen miostatina. U jednoj realizaciji, "promiostatin" nije cepan ni proprotein konvertazom, ni proteazom iz porodice BMP/toloid. Primerni promiostatinski nizovi, njihove varijante i postupci za generisanje promiostatina dobro su poznati u tehnici i ovde su detaljnije opisani.
[0080] Kako se ovde koristi, izraz "latentni miostatin" odnosi se na neaktivni prekursor zrelog miostatina koji sadrži homodimer vezan za disulfid, pri čemu svaki molekul homodimera sadrži amino terminalni prodomain koji nije kovalentno vezan za karboksilni terminalni zreli miostatinski domen. U jednoj realizaciji, "latentni miostatin" se generiše iz promiostatina koji je cepan proprotein konvertazom, ali koji nije cepan proteazom iz porodice BMP/toloid. U jo š jednom izvođenju, „latentni miostatin“ može da se generiše kombinovanjem prodomena i zrelog domena miostatina na karboksi terminalnom mestu in vitro i omoguć avanjem da se pravilno preklope. Videti, na primer, Sengle i sar., J. Biol. Chem., 286 (7): 5087-5099, 2011. Primeri sekvenci latentnog miostatina, njihove varijante i postupci za generisanje latentnog miostatina dobro su poznati u tehnici i ovde su detaljnije opisani.
[0081] Kako se ovde koristi, termin "pro/latentni-miostatin" odnosi se na promiostatin, latentni miostatin, ili i promiostatin i latentni miostatin. U jednom aspektu, ovde opisano antitelo se vezuje za promiostatin. U još jednom izvođenju, ovde opisano antitelo se vezuje za latentni miostatin. U jo š jednom izvođenju, ovde opisano antitelo se vezuje za promiostatin i latentni miostatin.
[0082] Kako se ovde koristi, termin "čisti promiostatin" ili "čisti pro-GDF8" odnosi se na kompoziciju koja sadrži promiostatin koji je slobodan ili u suštini slobodan od drugih oblika miostatina, kao što je latentni miostatin i zreli miostatin. U jednom aspektu, ovde opisano antitelo specifi čno se vezuje za čisti promiostatin. Drugim rečima, takvo antitelo se vezuje za promiostatin u kompoziciji kojoj nedostaju drugi oblici miostacije, latentni miostatin i zreli miostatin.
[0083] Kako se ovde koristi, termin "mesto cepanja proprotein konvertaze" odnosi se na mesto gde se promiostatin cepa proprotein konvertazom. U jednoj realizaciji, mesto cepanja proprotein konvertaze je očuvano RXXR mesto između prodomena i biološki aktivnog domena, ili zrelog miostatina. Videti, na primer, slike 1A, 1B i 2.
[0084] Kako se ovde koristi, termin "mesto cepanja familije BMP/toloidne proteaze" odnosi se na mesto gde latentni miostatin cepa član familije BMP/toloidne proteaze. U jednom aspektu, član porodice BMP/toloidne proteaze je mTLL-2. Pogledajte, na primer, slike 1A, 1B i 2.
Antitela koja se vezuju za pro/latentni miostatin
[0085] Ovaj pronalazak se, barem delimično, zasniva na iznenađujuć em otkri ć u da su određena antitela specifična za pro/latentni miostatin (npr. antitelo koje se ovde naziva Ab1) sprečila proteolitičku aktivaciju pro/latentnog miostatina u zreli mioostatin. Dalje, inhibicija aktivacije miostatina upotrebom takvih antitela bila je efikasna za poveć anje miši ć ne mase i kod deksametazona i kod modela miša izazvanog atrofijom mišić a. Aspekti pronalaska opisuju antitela (npr. antitela i fragmente koji vezuju antigen) koja se vezuju za pro/latentni miostatin i inhibiraju proteoliti čku aktivaciju pro/latentnog miostatina u zreli miostatin.
[0086] Antitelo (naizmenično korišć eno u množini) je molekul imunoglobulina sposoban da se specifično veže za cilj, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., kroz najmanje jedno mesto za prepoznavanje antigena, smešteno u promenljivoj regiji molekula imunoglobulina. Kako se ovde koristi, termin "antitelo" obuhvata ne samo netaknuta (npr. cele dužine) poliklonska ili monoklonska antitela, već i njihove fragmente koji vežu antigen (kao što su Fab, Fab', F (ab') 2, Fv), jednolančani (scFv), njegove mutante, fuzijske proteine koji sadrže deo antitela, humanizovana antitela, himerna antitela, dijatela, linearna antitela, jednolančana antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela) i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koji sadrži antigen sa mestom prepoznavanja potrebne specifičnosti, uključujuć i varijante glikozilacije antitela, varijante antitela sekvence aminokiselina i kovalentno modifikovana antitela. Antitelo uključuje antitelo bilo koje klase, kao što su IgD, IgE, IgG, IgA ili IgM (ili njihova podklasa), i antitelo ne mora biti iz bilo koje odre đene klase. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence antitela konstantnog domena njegovih te ških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a nekoliko njih se dalje može podeliti u podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina nazivaju se alfa, delta, epsilon, gama i mu, respektivno. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije razli čitih klasa imunoglobulina su dobro poznate.
[0087] „Izolovano antitelo“, kako se ovde koristi, se odnosi na antitelo koje je u su štini bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za pro/latentni miostatin u suštini je bez antitela koji se specifično vezuju za antigene koji nisu pro/latentni miostatin). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za pro/latentni miostatin može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost za druge antigene, poput molekula pro/latentnog miostatina iz drugih vrsta. Štaviše, izolovano antitelo može biti u osnovi bez drugih ć elijskih materijala i/ili hemikalija.
[0088] Termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, podrazumeva antitela koja imaju promenljive i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humanog antitela i njihovih fragmenata. Ljudska antitela iz ovog pronalaska mogu obuhvatati aminokiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humanog antitela (npr. mutacije uvedene slučajnom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo), na primer u CDR-ima i posebno CDR3. Me đutim, termin "humano antitelo", kako se ovde koristi, nije predviđen da uključuje antitela u koja su CDR sekvence izvedene iz linije druge vrste sisara, kao što je miš, nakalemljene na humane okvirne sekvence.
[0089] Izraz "epitop" uključuje bilo koju polipeptidnu odrednicu sposobnu za specifično vezivanje za imunoglobulin ili T-ć elijski receptor. U određenim realizacijama, epitopske odrednice uključuju hemijski aktivne površinske grupe molekula kao što su aminokiseline, bočni lanci šeć era, fosforil ili sulfonil, i, u određenim realizacijama, mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike i/ili specifične karakteristike punjenja. Epitop je region antigena koji je vezan antitelom. U odre đenim realizacijama se kaže da se antitelo specifično vezuje za antigen kada preferencijalno prepoznaje svoj ciljni antigen u složenoj smeši proteina i/ili makromolekula.
[0090] Ovde opisana antitela su sposobna da se vežu za pro/latentni miostatin, čime inhibiraju proteolitičku aktivaciju pro/latentnog miostatina u zreli miostatin. U nekim slučajevima, ovde opisana antitela mogu inhibirati proteolitičku aktivaciju pro/latentnog miostatina za najmanje 20 %, npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, ili više. U nekim slučajevima, ovde opisana antitela mogu inhibirati proteolitičko cepanje promiostatina pomoć u proprotein konvertaze (npr. furin) za najmanje 20 %, npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ili više. U nekim slučajevima ovde opisana antitela mogu inhibirati proteolitičko cepanje promiostatina ili latentnog miostatina pomoć u toloidne proteaze (npr. MTLL2) za najmanje 20 %, npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % , 90 %, 95 % ili više. Inhibitorna aktivnost antitela protiv pro/latentnog miostatina može se meriti rutinskim metodama, na primer, Western Blot analizom kako je opisano u Primeru 1 i na slici 3. Međutim, treba imati na umu da se mogu koristiti dodatne metode za merenje inhibitorne aktivnosti anti-pro/latentnog miostatinskog antitela na proteolitičko cepanje pro/latentnog miostatina. U nekim realizacijama, inhibicija cepanja pro/latentnog miostatina (npr. pomoć u proproteinske konvertaze i/ili toloidne proteaze) mo že se odraziti kao konstanta inhibicije (Ki), koja pruža meru potencije inhibitora, a čija je koncentracija inhibitora (npr. antitelo nasuprot pro/latentnog miostatina) potrebno za smanjenje aktivnosti proteaze (npr. konverzije proproteina ili toloidne proteaze) za pola i ne zavisi od koncentracije enzima ili supstrata.
[0091] U nekim realizacijama, proprotein konvertaza sadrži (i) katalitički domen koji hidrolizuje peptidnu vezu proteina koji sadrži mesto cepanja proprotein konvertaze i (ii) vezni džep koji se vezuje za rTGF sa mestom cepanja proprotein konvertaze . Primeri proproteinskih konvertaza za upotrebu u skladu sa ovim otkrić em uključuju, bez ograničenja, PCSK5/6, PACE4, PACE7 i PACE3 (npr. furin). Proprotein konvertaza, u nekim realizacijama, dobija se od bilo kog sisara, uključujuć i, bez ograničenja, ljude, majmune ili glodare (npr. miševe, pacove, hrčke).
[0092] U nekim realizacijama, proprotein konvertaza je homologna proprotein konvertazi izabranoj iz grupe koju čine: PCSK5/6, PACE4, PACE7 i PACE3 (npr. furin). Na primer, proprotein konvertaza mo že biti
1
najmanje 70 % identična, najmanje 80 % identična, najmanje 90 % identična, najmanje 95 % identična, najmanje 96 % identična, najmanje 97 % identična, najmanje 98 % identična, pri najmanje 99 % identična, najmanje 99,5 % identična ili najmanje oko 99,9 % identična PCSK5/6, PACE4, PACE7 ili PACE3 (npr. furin).
[0093] Mesto cepanja proprotein konvertaze, u nekim realizacijama, je amino sekvenca koja se mo že cepati proprotein konvertazom (npr. PCSK5/6, PACE4, PACE7 i PACE3). U nekim realizacijama, mesto cepanja proprotein konvertaze sadrži aminokiselinsku sekvencu R-X-X-R, gde je R arginin, a X je bilo koja aminokiselina. U nekim realizacijama, mesto cepanja proprotein konvertaze sadr ži aminokiselinsku sekvencu R-X-(K/R) -R, gde je R arginin, K je lizin i X je bilo koja aminokiselina. U nekim realizacijama, mesto cepanja proprotein konvertaze sadrži aminokiselinsku sekvencu R-V-R-R (SEK ID BR: 57), gde je R arginin, a V valin. Primer mesta cepanja proproteina konvertaze za miostatin čoveka, pacova, miša i cinomolgusa prikazana su podebljanim slovima u SEK ID BR: 52-55. U nekim realizacijama, mesto cepanja proprotein konvertaze sadrži aminokiselinsku sekvencu RSRR (SEK ID BR: 56).
[0094] U nekim realizacijama, toloidne proteaze za upotrebu u skladu sa ovim pronalaskom uključuju, bez ograničenja, BMP-1, mTLL-1 i mTLL-2. Toloidna proteaza se može dobiti od bilo kog sisara, uključujuć i, bez ograničenja, ljude, majmune ili glodare (npr. miševi, pacovi, hrčci). U nekim realizacijama, toloidna proteaza je homologna toloidnoj proteazi izabranoj iz grupe koju čine: BMP-1, mTLL-1 i mTLL-2. Na primer, toloidna proteaza može biti najmanje 70 % identična, najmanje 80 % identična, najmanje 90 % identična, najmanje 95 % identična, najmanje 96 % identična, najmanje 97 % identična, najmanje 98 % identična, pri najmanje 99 % identična, najmanje 99,5 % identična ili najmanje oko 99,9 % identična BMP-1, mTLL-1 i mTLL-2.
[0095] Mesto cepanja toloidne proteaze, u nekim realizacijama, je amino sekvenca koja se mo že cepati toloidom (npr. BMP-1, mTLL-1 i mTLL-2). Primerna mesta cepanja toloidne proteaze za miostatin čoveka, pacova, miša i cinomolgusa prikazana su, podvlačenjem, u SEK ID BR: 52-55. U nekim realizacijama, mesto cepanja toloida sadrži aminokiselinsku sekvencu QR, gde je Q glutamin, a R je arginin.
[0096] U nekim realizacijama, ovde opisana antitela su sposobna da se ve žu za pro/latentni miostatin, čime inhibiraju aktivnost miostatina. U nekim slučajevima, ovde opisana antitela mogu inhibirati signalizaciju miostatina za najmanje 20 %, npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ili više. U nekim realizacijama, inhibicija signalizacije miostatina mo že se meriti rutinskim metodama, na primer, primenom testa aktivacije miostatina kako je opisano u primeru 1. Međutim, treba imati na umu da se dodatne metode mogu koristiti za merenje aktivnosti miostatina signalizacije.
[0097] Treba imati na umu da se stepen proteolitičkog cepanja miostatina, na primer, proprotein konvertazom i/ili toloidnom proteazom, može meriti i/ili kvantifikovati bilo kojim pogodnim postupkom. U nekim realizacijama, mera proteolitičkog cepanja miostatina se meri i/ili kvantifikuje pomoć u enzimski vezanog imunosorbent testa (ELISA). Na primer, ELISA se može koristiti za merenje nivoa oslobođenog faktora rasta (npr. zreli miostatin). Kao drugi primer, antitelo koje se specifi čno vezuje za promiostatin, latentni mioostatin i/ili zreli miostatin može se koristiti u ELISA za merenje nivoa specifičnog oblika miostatina (npr. pro/latentni/zreli miostatin), da bi se kvantifikovao obim proteoliti čkog cepanja miostatina. U nekim realizacijama, mera proteolitičkog cepanja miostatina meri se i/ili kvantifikuje korišć enjem imunoprecipitacije pra ć ene SDS-PAGE ili masenom spektrometrijom tripti čnih peptida, tehnikama zasnovanim na fluorescentnoj anizotropiji, FRET testovima, masenom spektrometrijom razmene vodonika-deuterijuma i/ili NMR spektroskopijom.
[0098] U nekim realizacijama, antitela, takođe poznata kao imunoglobulini, su tetramerni glikozilirani proteini koji se sastoje od dva lagana (L) lanca od po približno 25 kDa i dva teška (H) lanca od približno 50 kDa. U antitelima se mogu nać i dve vrste lakog lanca, nazvane lambda i kapa. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teških lanaca, imunoglobulini se mogu dodeliti u pet glavnih klasa: A, D, E, G i M, a nekoliko njih se može dalje podeliti u podklase (izotipove), npr. IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1i IgA2. Svaki laki lanac obično uključuje N-terminalni promenljivi (V) domen (VL) i konstantni (C) domen (CL). Svaki teški lanac obično uključuje N-terminalni V domen (VH), tri ili četiri C domena (CH1-3) i zglobni region. CHdomen najproksimalniji od VHoznačen je kao CH1. VHi VLdomeni sastoje se od četiri regiona relativno očuvanih sekvenci nazvanih okvirni regioni (FR1, FR2, FR3 i FR4), koji čine skelu za tri regiona hipervarijabilnih sekvenci (regioni koji određuju komplementarnost, CDR). CDR sadrže već inu ostataka odgovornih za specifične interakcije antitela sa antigenom. CDR se nazivaju CDR1, CDR2 i CDR3. Shodno tome, CDR sastojci na teškom lancu nazivaju se CDRH1, CDRH2 i CDRH3, dok se CDR sastojci na lakom lancu nazivaju CDRL1, CDRL2 i CDRL3. CDR se obično odnose na Kabat CDR, kao što je opisano u Sekvencama proteina od imunološkog značaja, US Department of Health and Human Services (1991), eds. Kabat i dr. Sledeć i standard za karakterizaciju mesta vezivanja antigena je pozivanje na hipervarijabilne petlje kako je opisao Chothia. Videti, na primer, Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol.
227: 799-817; i Tomlinson i sar. (1995) EMBO J. 14: 4628-4638. Još jedan standard je definicija AbM koju koristi softver za modeliranje antitela AbM kompanije Oksford Molecular. Vidi, generalno, npr., Analiza sekvence i strukture proteina promenljivih domena antitela. U: Laboratorijski priru čnik za antitela (Ed .:
1
Duebel, S i Kontermann, R., Springer-Verlag, Heidelberg). Ostvarenja opisana u vezi sa Kabat CDR-ima mogu se alternativno primeniti koristeć i slične opisane odnose u odnosu na petlje Chothia hipervarijabilne ili petlje definisane AbM, ili kombinacije bilo koje od ovih metoda.
[0099] U nekim realizacijama, antitela protiv pro/latentnog miostatina iz ovog pronalaska i molekuli nukleinske kiseline iz ovog pronalaska koji kodiraju antitela uključuju CDR aminokiselinske sekvence prikazane su u tabeli 1.
Tabela 1.
[0100] U Tabeli 1, pojedinačne sekvence CDRH3 i CDRL3 odražavaju Kabat i IMGT.
[0101] U nekim realizacijama, sredstva koja vezuju anti-pro/latentni miostatin (npr. antitela) iz pronalaska uključuju bilo koje antitelo (uključujuć i fragmente koji vežu antigen) koje uključuje CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ili CDRL3, ili njihove kombinacije, kao što je predviđeno za bilo koje od antitela prikazanih u Tabeli 1. U nekim realizacijama, anti-pro/latentna sredstva za vezivanje miostatina uključuju CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3 bilo kog od antitela prikazanih u Tabeli 1. Pronalazak takođe uključuje bilo koju sekvencu nukleinske kiseline koja kodira molekul koji sadrži CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 ili CDRL3 kako je predviđeno za bilo koje od antitela prikazanih u tabeli 1. Domeni CDR3 teškog i lakog lanca antitela mogu igrati posebno važnu ulogu u specifičnosti vezivanja/ afinitetu antitela za antigen. Shodno tome, agensi za otkrivanje anti-pro/latentnog miostatina, ili njihovi molekuli nukleinske kiseline, mogu da uključuju najmanje CDR3 teškog i/ili lakog lanca antitela kao što je prikazano u tabeli 1.
[0102] Aspekti pronalaska se odnose na monoklonsko antitelo ili fragment koji vezuje antigen, koji se vezuje za protein pro/latentni miostatin i koji sadrži šest regiona koji određuju komplementarnost (CDR): CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i CDRL3.
[0103] U nekim realizacijama, CDRH1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 1-3. U nekim realizacijama, CDRH2 sadrži sekvencu kako je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 4-9. U nekim realizacijama, CDRH3 sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 10-11. CDRL1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 12-17. U nekim realizacijama, CDRL2 sadrži sekvencu kao što je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 18-21. U nekim realizacijama, CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u bilo kojoj od SEK ID BR: 22-23.
[0104] U nekim realizacijama (npr. kao za anti-pro/latentno antitelo na miostatin Ab1, prikazano u tabeli 1), CDRH1 sadrži sekvencu kao što je navedeno u SEK ID BR: 1 ili 2, CDRH2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 4 ili 5, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 10, CDRL1 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 12, ili 13, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR:
1
18 ili 19, a CDRL3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 22, a antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin.
[0105] U nekim realizacijama (npr. kao za anti-pro/latentno antitelo na miostatin Ab3, prikazano u tabeli 1), CDRH1 sadrži sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 1 ili 3, CDRH2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 6 ili 7, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 11, CDRL1 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 14, ili 15, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 20 ili 21, a CDRL3 sadrži sekvencu kao što je izloženo u SEK ID BR: 23, i antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin.
[0106] U nekim realizacijama (npr. kao za anti-pro/latentno-miostatinsko antitelo Ab5, prikazano u tabeli 1), CDRH1 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 1 ili 3, CDRH2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 8 ili 9, CDRH3 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 11, CDRL1 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 16, ili 17, CDRL2 sadrži sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 20 ili 21, a CDRL3 sadrži sekvencu navedenu u SEK ID BR: 23, i antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin. U nekim primerima, bilo koje sredstvo za vezivanje nasuprot pro/latentnog miostatina (npr. antitela) iz ovog pronalaska uključuje bilo koje antitelo (uključujuć i fragmente koji vežu antigen) koji ima jednu ili više CDR (npr. CDRH ili CDRL) sekvenci u suštini sličnih CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 i/ili CDRL3. Na primer, antitela mogu da uključuju jednu ili više CDR sekvenci kao što je prikazano u tabeli 1 (SEK ID BR: 1-23) koje sadrže do 5, 4, 3, 2 ili 1 varijacije ostataka aminokiselina u poređenju sa odgovarajuć im CDR regionom u bilo kojoj od SEK ID BR: 1-23. Kompletne sekvence aminokiselina i nukleinskih kiselina za varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca antitela navedenih u tabeli 1 date su u nastavku.
Varijabilni region teškog lanca - Ab1 roditeljski
Varijabilni region teškog lanca – Ab2 blizanački
1
Varijabilni region teškog lanca - Ab3 roditeljski
Varijabilni region teškog lanca – Ab4 blizanački
Varijabilni region teškog lanca - Ab5 roditeljski
1
Varijabilni region teškog lanca – Ab6 blizanački
Varijabilni region lakog lanca - Ab1 roditeljski
Varijabilni region lakog lanca – Ab2 blizanački
2
Varijabilni region lakog lanca - Ab3 roditeljski
Varijabilni region lakog lanca – Ab4 blizanački
Varijabilni region lakog lanca - Ab5 roditeljski
Varijabilni region lakog lanca – Ab6 blizanački
Teški lanac Ab2
Laki lanac Ab2
[0107] U nekim realizacijama, antitela protiv pro/latentnog miostatina iz ovog pronalaska uklju čuju bilo koje antitelo koje uključuje promenljivi domen teškog lanca bilo koje od SEK ID BR: 24-29 ili promenljivi domen lakog lanca bilo kog od SEK ID BR: 30-35. U nekim realizacijama, antitela protiv pro/latentnog miostatina iz ovog pronalska uključuju bilo koje antitelo koje uključuje promenljive parove teškog lanca i promenljive lakog lanca SEK ID BR: 24 i 30; 25 i 31; 26 i 32; 27 i 33; 28 i 34; ili 29 i 35).
[0108] Aspekti pronalska daju antitela protiv pro/latentnog miostatina koja imaju promenljivu aminokiselinsku sekvencu teškog lanca i/ili promenljivu laki lanac homologan bilo kojoj od ovde opisanih sekvenci. U nekim realizacijama, antitelo protiv pro/latentnog miostatina sadr ži promenljivu sekvencu teškog lanca ili promenljivu sekvencu lakog lanca koja je najmanje 75 % (npr. 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 %, ili 99 %) identična promenljivoj sekvenci teškog lanca bilo koje SEK ID BR: 24-29 ili promenljivoj sekvenci lakog lanca bilo koje SEK ID BR: 30-35. U nekim realizacijama, homologne varijabilne sekvence aminokiselina teškog lanca i/ili lakih lanaca ne variraju ni u jednoj ovde datoj CDR sekvenci. Na primer, u nekim realizacijama, stepen varijacije sekvence (npr. 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ili 99 %) može se desiti unutar promenljive teškog lanca i/ili promenljive sekvence lakog lanca izuzimajuć i bilo koju od ovde datih CDR sekvenci.
[0109] „Procenat identiteta“ dve aminokiselinske sekvence određuje se koriš ć enjem algoritma Karlin i Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-68, 1990, modifikovano kao u Karlin i Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-77, 1993. Takav algoritam je ugrađen u programe NBLAST i XBLAST (verzija 2.0) Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215: 403-10, 1990. Pretrage proteina BLAST mogu se izvršiti pomoć u programa XBLAST, ocena = 50, dužina reči = 3, da bi se dobili sekvence aminokiselina homologne molekulima proteina od značaja. Tamo gde postoje praznine između dve sekvence, može se koristiti Gapped BLAST kako je opisano u Altschul i sar., Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402, 1997. Kada se koriste programi BLAST i Gapped BLAST, podrazumevani parametri odgovarajuć ih programa (npr. XBLAST i NBLAST) mogu se koristiti.
[0110] U nekim realizacijama, konzervativne mutacije mogu se uvesti u CDR-ove ili okvirne sekvence na položajima gde verovatno nije verovatno da ć e ostaci biti uklju čeni u interakciju sa pro/latentnim miostatinom kako je određeno na osnovu kristalne strukture. Kako se ovde koristi, „konzervativna supstitucija aminokiselina“ odnosi se na aminokiselinsku supstituciju koja ne menja relativne karakteristike punjenja ili veličine proteina u kome se vrši supstitucija aminokiselina. Varijante se mogu pripremiti prema metodama za promenu polipeptidnih sekvenci koje su poznate prose čnom stručnjaku, a koje se mogu na ć i u referencama koje sastavljaju takve metode, npr. Molekularno kloniranje: Laboratorijski priručnik, J. Sambrook, et al., Ur., Drugo izdanje, Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, ili Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., Ur., John Vilei & Sons, Inc., New York. Konzervativne supstitucije aminokiselina uključuju supstitucije napravljene među aminokiselinama u sledeć im grupama: (a) M, I, L, V; (b) F, I, V; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) K, N; i (g) E, D.
[0111] U nekim realizacijama, ovde data antitela sadrže mutacije koja antitelima daju poželjna svojstva. Na primer, da bi se izbegle potencijalne komplikacije usled razmene Fab-ruke, za koju se zna da se de šava sa nativnim IgG4 mAb, ovde navedena antitela mogu sadržati stabiliziraju ć u „Adair“ mutaciju (Angal S., et al., „Jedna aminokiselina supstitucija ukida heterogenost himernih antitela mi š/čovek (IgG4), "Mol Immunol 30, 105-108; 1993), gde se serin 228 (EU brojanje; ostatak 241 Kabat numerisanje) pretvara u prolin što rezultira IgG1 sličnim (CPPCP (SEK ID BR: 58)) sekvencama. Shodno tome, bilo koje od antitela može da uključuje stabilizujuć u ’Adair’ mutaciju ili aminokiselinsku sekvencu CPPCP (SEK ID BR: 58).
[0112] Sredstva za vezivanje nasuprot pro/latentnog miostatina iz ovog pronalaska mogu opciono da sadrže konstantne regione antitela ili njihove delove. Na primer, VLdomen može biti vezan na svom C-terminalnom kraju za konstantni domen lakog lanca kao što je Cκ ili Cλ. Slično tome, VHdomen ili njegov deo mogu biti vezani za ceo ili deo teškog lanca poput IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, i bilo koji podtip izotipa. Antitela mogu obuhvatati pogodne konstantne regione (videti, na primer, Kabat i sar., Sekuences of Proteins of Immunological Interest, No. 91-3242, National Institutes of Health Publications, Bethesda, Md. (1991)). Prema tome, antitela u okviru ovog pronalaska mogu obuhvatati VHi VLdomene, ili njihov deo koji veže antigen, u kombinaciji sa bilo kojim pogodnim konstantnim regionima.
[0113] U određenim rešenjima, VHi/ili VLdomeni mogu da se vrate u sekvencu klica, npr. FR ovih domena mutira korišć enjem konvencionalnih tehnika molekularne biologije kako bi se podudarali sa onim koje proizvodeć elijske ć elije. Na primer, VHi/ili VLdomeni mogu biti vrać eni u sekvencu linija IgHV3-30 (SEK ID BR: 36) i/ili IgLV1-44 (SEK ID BR: 37), respektivno. Treba imati na umu da bilo koji od VHi/ili VLdomena može biti vrać en u bilo koju pogodnu sekvencu klice. U drugim realizacijama, FR sekvence ostaju odvojene od konsenzusnih sekvenci klica.
IgHV3-30
IgLV1-44
[0114] U nekim realizacijama, antitela protiv pro/latentnog miostatina ili fragmenti koji vezuju antigen mogu ili ne moraju obuhvatati okvirni region antitela prikazan u SEK ID BR: 24-35. U nekim realizacijama, antitela nasuprot pro-latentnog miostatina su mišja antitela i uključuju sekvence mišjeg okvirnog regiona.
[0115] U nekim realizacijama, antitela na pro/latentni miostatin mogu se vezati za pro/latentni miostatin sa relativno velikim afinitetom, npr. sa Kd manjim od 10-6 M, 10-7 M, 10 -8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M ili manje. Na primer, antitela protiv pro/latentnog miostatina mogu se vezati za pro/latentni miostatin sa afinitetom između 5 pM i 500 nM, npr. Između 50 pM i 100 nM, npr. Između 500 pM i 50 nM. Otkrić e takođe uključuje antitela ili fragmente za vezivanje antigena koji se takmiče sa bilo kojim ovde opisanim antitelima za vezivanje za pro/latentni miostatin i koji imaju afinitet od 50 nM ili ni ži (npr. 20 nM ili niži, 10 nM ili niži, 500 pM ili niže, 50 pM ili manje ili 5 pM ili manje). Kinetika afiniteta i vezivanja antitela
2
protiv pro/latentnog miostatina može se testirati korišć enjem bilo koje pogodne metode, uključuju ć i, ali ne ograničavajuć i se na tehnologiju biosenzora (npr. OCTET ili BIACORE).
[0116] Antitelo koje se "specifično vezuje" za ciljni antigen, veže se za ciljni antigen sa već im afinitetom, avidnošć u, lakše i/ili sa dužim trajanjem nego što se vezuje za neciljane antigene. U nekim realizacijama, ovde su data antitela koja se specifično vezuju za pro/latentni miostatin. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se na ili u blizini mesta cepanja toloida ili na ili u blizini mesta spajanja toloida pro/latentnog miostatina. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje u blizini mesta cepanja toloida ili u blizini mesta spajanja toloida ako se veže u roku od 15 ili manje aminokiselinskih ostataka mesta deljenja toloida ili mesta spajanja toloida. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka na mestu cepanja toloida ili mesto pristajanja toloida. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje na ili blizu mesta cepanja toloida GDF8. Na primer, antitelo može da veže aminokiselinsku sekvencu kako je navedeno u SEK ID BR: 62 PKAPPLRELIDQYDVQRDDSSDGSLEDDDYHAT (SEK ID BR: 62). U drugim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se na mestu razdvajanja proprotein konvertaze ili u blizini ili na mestu dokovanja mesta pro/latentnog miostatina ili blizu njega. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje u blizini mesta cepanja proprotein konvertaze ili u blizini mesta dokovanja mesta proprotein konvertaze ako se ve že unutar 15 ili manje aminokiselinskih ostataka mesta cepanja proprotein konvertaze ili mesta doka proprotein konvertaze. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka proprotein konvertaze mesto cepanja ili mesto pristajanja proprotein konvertaze. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje na mestu razdvajanja proprotein konvertaze ili blizu njega, GDF8. Na primer, antitelo može da veže aminokiselinsku sekvencu kako je izloženo u SEK ID BR: 63 GLNPFLEVKVTDTPKRSRRDFGLDCDEHSTESRC (SEK ID BR: 63).
[0117] U jednom primeru, ovde opisana antitela protiv pro/latentnog miostatina specifi čno se vezuju za pro/latentni miostatin u poređenju sa drugim oblicima miostatina i/ili drugim članovima TGFb porodice faktora rasta. Članovi porodice faktora rasta TGFb uključuju, bez ograničenja, AMH, ARTN, BMP10, BMP15, BMP2, BMP3, BMP4, BMP5, BMP6, BMP7, BMP8A, BMP8B, GDF1, GDF10, GDF11, GDF15, GDF2, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3, GDF3 GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDNF, INHA, INHBA, INHBB, INHBC, INHBE, LEFTI1, LEFTI2, NODAL, NRTN, PSPN, TGFb1, TGFb2 i TGFb3 protein. Takva antitela mogu da vežu pro/latentni miostatin sa mnogo već im afinitetom u poređenju sa drugim članovima porodice TGFb faktora rasta (npr. najmanje 2 puta, 5 puta, 10 puta, 50 puta, 100 puta, 200 puta, 500 puta ili 1000 puta više). U nekim realizacijama, takva antitela mogu da vezuju pro/latentni miostatin sa afinitetom od najmanje 1.000 već im u poređenju sa drugim članovima TGFb porodice faktora rasta. U nekim realizacijama, ovde data antitela mogu se vezati za pro/latentni miostatin sa mnogo već im afinitetom u poređenju sa jednim ili više oblika GDF11 ili zrelog miostatina (npr. najmanje 2 puta, 5 puta, 10 puta, 50 puta, 100 puta, 200 puta, 500 puta ili 1.000 puta više). U nekim realizacijama, ovde navedena antitela mogu se vezati za pro/latentni miostatin sa afinitetom od najmanje 1.000 već im u pore đenju sa jednim ili više oblika GDF11 (npr. proGDF11, latentni GDF11 ili zreli GDF11) ili sa zrelim miostatinom, ili pored toga, antitela mogu pokazivati znatno već u inhibitornu aktivnost protiv proteoliti čkog cepanja pro/latentnog miostatina (npr. pomoć u proprotein konvertaze ili toloidne proteaze) u pore đenju sa drugim članovima porodice TGFb, kao što je pro/latentni GDF11 (npr. najmanje 2 puta, 5 puta, 10 puta, 50 puta, 100 puta, 200 puta, 500 puta, 1000 puta više).
[0118] U nekim realizacijama, antitela vezuju antigen, ali ne mogu efikasno eliminisati antigen iz plazme. Prema tome, u nekim realizacijama, koncentracija antigena u plazmi mo že se poveć ati smanjenjem klirensa antigena. Međutim, u nekim realizacijama, ovde data antitela (na primer, antitela za čišćenje) imaju afinitet prema antigenu koji je osetljiv na pH. Takva antitela osetljiva na pH mogu se vezati za antigen u plazmi pri neutralnom pH i razdvojiti se od antigena u kiselom endozomu, smanjujuć i tako akumulaciju antigena posredovanu antitelima i/ili promovi šuć i klirens antigena iz plazme.
[0119] Aspekti pronalaska se odnose na pometanje antitela. Kako se ovde koristi, "pometajuć a antitela" se odnose na antitela koja imaju i pH osetljivo vezivanje antigena i najmanje grani čni nivo vezivanja za neonatalni Fc receptor (FcRn) na površini ć elije pri neutralnom ili fiziološkom pH. U nekim realizacijama, antitela se vezuju za neonatalni Fc receptor FcRn pri neutralnom pH. Na primer, pometajuć a antitela mogu se vezati za FcRn pri pH u rasponu od 7,0 do 7,6. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela mogu se vezati za antigen na mestu vezivanja antigena i vezati za ć elijski FcRn preko Fc dela antitela. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela se zatim mogu internalizovati, osloba đaju ć i antigen u kiselom endozomu, koji se može razgraditi. U nekim realizacijama, antitelo, koje više nije vezano za antigen, tada ć elija može da oslobodi (npr. egzocitozom) u serum.
[0120] U nekim realizacijama, FcRn u vaskularnom endotelu (npr. kod subjekta) produžava poluživot pometajuć eg antitela. U nekim realizacijama, vaskularne endotelne ć elije internalizuju pometaju ć a antitela, koja su u nekim realizacijama vezana za antigen kao što je miostatin (npr. promiostatin, latentni miostatin ili grundirani miostatin). U nekim realizacijama, antitelo se reciklira nazad u krvotok. U nekim realizacijama, pometajuć e antitelo ima pove ć ani poluživot (npr. u serumu subjekta) u poređenju sa svojim konvencionalnim oblikom. U nekim realizacijama, konvencionalni pandan pometajuć eg antitela odnosi se na antitelo iz kojeg je izvedeno pometenje antitela (npr. pre in ženjeringa Fc dela konvencionalnog antitela da veže FcRn sa već im afinitetom pri pH 7). U nekim realizacijama, antitelo ima polu život u serumu subjekta koji iznosi najmanje 1 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 35 %, 50 %, 75 %, 100 %, 150 %, 200 % ili 250 % duže u poređenju sa konvencionalnim oblicima.
[0121] U nekim realizacijama, Fc deo antitela vezuje FcRn. U nekim realizacijama, Fc deo pometajuć eg antitela se veže za FcRn pri pH 7,4 sa Kd u rasponu od 10<-3>M do 10<-8>M. U nekim realizacijama, pometajuć e antitelo veže se za FcRn pri pH 7,4 sa Kd u rasponu od 10<-3>M do 10<-7>M, od 10<-3>M do 10<-6>M, od 10<-3>M do 10<-5>M, od 10<-3>M do 10<-4>M, od 10<-4>M do 10<-8>M , od 10<-4>M do 10<-7>M, od 10<-4>M do 10<-6>M, od 10<-4>M do 10<-5>M, od 10<-5>M do 10<-8>M, od 10<-5>M do 10<-7>M, od 10<-5>M do 10<-6>M, od 10<-6>M do 10<-8>M, od 10<-6>M do 10<-7>M ili od 10<-7>M do 10<-8>M. U nekim realizacijama, FcRn se vezuje za CH2-CH3 zglobni region pometajuć eg antitela. U nekim realizacijama, FcRn se vezuje za isti region kao proteinA ili protein G. U nekim realizacijama, FcRn se vezuje za drugo mesto vezivanja od FciRs. U nekim realizacijama, aminokiselinski ostaci AA pometajuć eg Fc regiona antitela su potrebni za vezivanje za FcRn. U nekim realizacijama, aminokiselinski ostaci AA pometajuć eg Fc regiona antitela utiču na vezivanje za FcRn.
[0122] U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo napravljeno je da ve že FcRn sa već im afinitetom. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo napravljeno je da ve že FcRn sa već im afinitetom pri pH 7,4. U nekim realizacijama, afinitet pometajuć ih antitela prema FcRn je pove ć an kako bi se proširila njihova farmakokinetička (PK) svojstva u poređenju sa njihovim konvencionalnim oblicima. Na primer, u nekim realizacijama, pometajuć a antitela izazivaju manje ne željenih reakcija zbog svoje efikasnosti u nižim dozama. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela se daju ređe. U nekim realizacijama poveć ana je transcitoza pometanja antitela na odre đene tipove tkiva. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela poboljšavaju efikasnost trans-placentne isporuke. U nekim varijantama, metenje antitela je jeftinije za proizvodnju.
[0123] U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo napravljeno je da ve že FcRn sa nižim afinitetom. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo napravljeno je da ve že FcRn sa nižim afinitetom pri pH 7,4. U nekim realizacijama, afinitet pometajuć ih antitela prema FcRn je smanjen kako bi se skratila njihova farmakokinetička (PK) svojstva u poređenju sa njihovim konvencionalnim oblicima. Na primer, u nekim realizacijama, pometajuća antitela se brže uklanjaju za snimanje i/ili radioimunoterapiju. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela promovi šu uklanjanje endogenih patogenih antitela kao tretman za autoimune bolesti. U nekim realizacijama, uklanjanje antitela smanjuje rizik od neželjenog ishoda trudnoć e, koji može biti uzrokovan trans-placentnim transportom materijalnih antitela specifičnih za fetus.
[0124] U nekim realizacijama, pometajuć a antitela imaju smanjeni afinitet prema antigenu pri niskom pH u poređenju sa neutralnim ili fiziološkim pH (npr. PH 7,4). U nekim realizacijama, pometajuć a antitela imaju smanjeni afinitet prema antigenu pri kiselom pH (npr. PH u rasponu od 5,5 do 6,5) u pore đenju sa fiziološkim pH (npr. PH 7,4). Treba imati na umu da se bilo koje ovde dato antitelo može konstruisati da se dobije od antigena u zavisnosti od promene pH (npr. antitela osetljiva na pH). U nekim realizacijama, ovde navedena antitela su projektovana da vezuju antigen zavisno od pH. U nekim realizacijama, ovde navedena antitela napravljena su da vezuju FcRn u zavisnosti od pH. U nekim realizacijama, ovde navedena antitela internalizuju se endocitozom. U nekim realizacijama, ovde navedena pometajuć a antitela su internalizovana vezivanjem FcRn. U nekim realizacijama, endocitozirana pometaju ća antitela oslobađaju antigen u endozomu. U nekim realizacijama, pometajuća antitela se recikliraju natrag na ć elijsku površinu. U nekim realizacijama, pometaju ć a antitela ostaju vezana za ć elije. U nekim realizacijama, endocitozovana pometujuća antitela se vrać aju nazad u plazmu. Treba imati na umu da Fc deo bilo kog ovde navedenog antitela može biti konstruisan da ima različitu aktivnost vezivanja za FcRn. U nekim realizacijama, aktivnost vezivanja FcRn utiče na vreme čišć enja antigena pometaju ć im antitelom. U nekim realizacijama, pometajuć a antitela mogu biti dugotrajna ili brzo deluju ć a antitela za pometanje.
[0125] U nekim realizacijama, pretvaranje konvencionalnog terapijskog antitela u pometajuć e antitelo smanjuje efikasnu dozu. U nekim realizacijama, pretvaranje konvencionalnog terapijskog antitela u pometajuć e antitelo smanjuje efikasnu dozu za najmanje 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ili 99 %. U nekim realizacijama, pretvaranje konvencionalnog terapijskog antitela u pometajuć e antitelo smanjuje efikasnu dozu za najmanje 1,5 puta, 2 puta, 3 puta, 4 puta, 5 puta, 6 puta, 8 puta, 10 puta, 15 puta, 20 puta, 50 puta ili 100 puta.
[0126] U nekim realizacijama, odabir odgovarajuć e doze pometaju ć eg antitela za terapiju mo že se izvršiti empirijski. U nekim realizacijama, velika doza pometajuć eg antitela mo že zasititi FcRn, što rezultira antitelima koja stabilizuju antigen u serumu bez internalizacije. U nekim realizacijama, mala doza pometajuć eg antitela možda ne ć e biti terapeutski efikasna. U nekim realizacijama, pometaju ća antitela se daju jednom dnevno, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje, jednom u tri nedelje, jednom u četiri
2
nedelje, jednom u 6 nedelja, jednom u 8 nedelja, jednom u 10 nedelja, jednom u 12 nedelja , jednom u 16 nedelja, jednom u 20 nedelja ili jednom u 24 nedelje.
[0127] U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo može biti modifikovano ili napravljeno tako da pometa antitela. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo mo že da se pretvori u antitelo za pometanje korišć enjem bilo kog odgovaraju ć eg postupka. Na primer, pogodne metode za pravljenje pometajućih antitela su prethodno opisane u Igava et al., (2013) „Inženjersko oblikovano monoklonsko antitelo sa novom aktivnošć u čiš ć enja antigena in Vivo“, PLoS ONE 8 (5): e63236; i Igava i sar., „pH-zavisna antitela koja vežu antigen kao novi terapijski modalitet“, Biochimica et Biophisica Acta 1844 (2014) 1943-1950; čiji je sadržaj uključen referencom. Treba, međutim, imati na umu da metode za stvaranje pometajućih antitela kako su ovde date nisu namenjene ograničavanju. Prema tome, dodatni postupci za stvaranje pometajućih antitela su u okviru ovog pronalaska.
[0128] Neki aspekti pronalaska se zasnivaju na prepoznavanju da je afinitet (npr., izra žen kao Kd) bilo kog ovde navedenog antitela protiv pro/latentnog miostatina osetljiv na promene pH. U nekim realizacijama, ovde data antitela imaju poveć ano Kd vezivanja za pro/latentni miostatin pri relativno niskom pH (npr. PH u rasponu od 4,0-6,5) u poređenju sa relativno visokim pH (npr. PH u rasponu od 7,0-7,4). U nekim realizacijama, ovde data antitela imaju Kd vezivanja za pro/latentni miostatin u rasponu od 10<-3>M, 10<-4>M, 10<-5>M, 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M kada pH je između 4,0 i 6,5. U nekim realizacijama, ovde data antitela imaju Kd vezivanja za pro/latentni miostatin u rasponu od 10<-6>M, 10<-7>M, 10<-8>M, 10<-9>M, 10<-10>M, 10<-11>M kada pH je između 7,0 i 7,4. U nekim realizacijama, ovde data antitela imaju Kd vezivanja za pro/latentni miostatin koji je najmanje 2 puta, najmanje 10 puta, najmanje 50 puta, najmanje 100 puta, najmanje 500 puta, najmanje 1000 puta, najmanje 5000 puta ili najmanje 10000 puta već i pri pH između 4,0 i 6,5 u poređenju sa pH između 7,0 i 7,4.
[0129] U nekim realizacijama ovde su obezbeđena pro/latentna antitela na miostatin koja se ne vezuju specifično za epitop u aminokiselinskoj sekvenci navedenoj kao (SEK ID BR: 64). U nekim realizacijama, ovde data antitela na pro/latentni miostatin ne vezuju se posebno za isti epitop kao antitelo opisano u Tabeli 2a, 11a, 11b ili 13 Međunarodne objave prijave br. WO 2016/098357, koja je objavljena 23. juna 2016. godine, a koja se zasniva na međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/JP2015/006323, koja je podneta 18. decembra 2015. U nekim realizacijama ovde navedena antitela na pro/latentni miostatin se ne nadmeću ili ne ukrštaju za vezivanje za isti epitop kao antitelo opisano u Tabeli 2a, 11a, 11b ili 13 Međunarodne objave prijave br. WO 2016/098357, koja je objavljena 23. juna 2016. godine, a koja se zasniva na međunarodnoj prijavi patenta Br. PCT/JP2015/006323, koja je podneta 18. decembra 2015. U nekim realizacijama, ovde data antitela na pro/latentni miostatin ne vezuju se posebno za isti epitop kao antitelo koje sadrži VHi VLpar opisan u tabeli 2a, 11a, 11b ili 13 Međunarodne patentne prijave br. WO 2016/098357, koja je objavljena 23. juna 2016. godine, a koja se zasniva na međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/JP2015/006323, koja je podneta 18. decembra 2015. U nekim realizacijama, ovde data antitela na pro/latentni miostatin ne konkurišu ili se ne takmiče za vezivanje za isti epitop kao antitelo koje sadrži VHi VLpar opisane u Tabeli 2a, 11a, 11b ili 13 Međunarodne objave prijave patenata Br. WO 2016/098357, koja je objavljena 23. juna 2016. godine, a koja se zasniva na međunarodnoj patentnoj prijavi br. PCT/JP2015/006323, koja je podneta 18. decembra 2015. godine.
Polipeptidi
[0130] Neki aspekti pronalaska se odnose na polipeptid koji ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 24, SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28 i SEK ID BR: 29. U nekim realizacijama, polipeptid je promenljivi domen te škog lanca. U nekim realizacijama, polipeptid je najmanje 75 % (npr. 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ili 99 %) identičan bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK ID BR: 24 , SEK ID BR: 25, SEK ID BR: 26, SEK ID BR: 27, SEK ID BR: 28, ili SEK ID BR: 29.
[0131] Neki aspekti pronalaska se odnose na polipeptid koji ima sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEK ID BR: 30, SEK ID BR: 31, SEK ID BR: 32, SEK ID BR: 33, SEK ID BR: 34 i SEK ID BR: 35. U nekim realizacijama, polipeptid je promenljivi domen lakog lanca. U nekim realizacijama, polipeptid je najmanje 75 % (npr. 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ili 99 %) identičan bilo kojoj od aminokiselinskih sekvenci navedenih u SEK ID BR: 30 , SEK ID BR: 31, SEK ID BR: 32, SEK ID BR: 33, SEK ID BR: 34 ili SEK ID BR: 35 antitela koja se nadmeću sa anti-pro/latentnim antitelima na miostatin
[0132] Aspekti pronalaska se odnose na antitela koja se nadmeću ili ukrštaju sa bilo kojim ovde navedenim antitelima. Termin "nadmetati se", kako se ovde koristi u odnosu na antitelo, zna či da se prvo antitelo vezuje za epitop proteina (npr. latentni miostatin) na na čin koji je dovoljno sličan vezivanju drugog antitela, tako da rezultat vezivanja prvog antitela sa njegovim epitopom je uo čljivo smanjeno u prisustvu drugog antitela u poređenju sa vezivanjem prvog antitela u odsustvu drugog antitela. Alternativa, gde se vezivanje drugog antitela za njegov epitop takođe osetno smanjuje u prisustvu prvog antitela, može, ali ne mora biti slučaj. Drugim rečima, prvo antitelo može inhibirati vezivanje drugog
2
antitela za njegov epitop, a da drugo antitelo ne inhibira vezivanje prvog antitela za njegov odgovarajuć i epitop. Međutim, tamo gde svako antitelo detektujuć e inhibira vezivanje drugog antitela sa svojim epitopom ili ligandom, bilo u istoj, već oj ili manjoj meri, kaže se da se antitela međusobno „međusobno takmiče“ za vezivanje svog odgovarajuć eg epitopa (s). I konkurentska i unakrsna antitela su u okviru ovog pronalaska. Bez obzira na mehanizam kojim se javlja takvo nadmetanje ili unakrsna konkurencija (npr. sterička prepreka, konformaciona promena ili vezivanje za zajednički epitop ili njegov deo), stručnjak ć e ceniti da se takvo nadmetanje i/ili međusobno nadmetanje antitela su obuhvać ena i mogu biti korisna za ovde date metode i/ili kompozicije.
[0133] Aspekti pronalaska se odnose na antitela koja se nadmeću ili ukrštaju sa bilo kojim od ponuđenih antitela ovde. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje za isti epitop ili neki blizu njega kao bilo koje ovde dato antitelo. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje u blizini epitopa ako se ve že unutar 15 ili manje aminokiselinskih ostataka epitopa. U nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se unutar 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih ostataka epitopa koji je vezan bilo kojim antitelima koja su ovde data.
[0134] U još jednom izvođenju, antitelo se nadmeće ili unakrsno nadmeć e za vezivanje za bilo koji od ovde datih antigena (npr. pro/latentni miostatin) sa ravnote žnom konstantom disocijacije, Kd, između antitela i proteina manjeg od 10<-6>M. U drugim realizacijama, antitelo se nadmeće ili unakrsno nadmeć e za vezivanje za bilo koji ovde dati antigen sa Kd u opsegu od 10<-11>M do 10<-6>M.
[0135] Aspekti pronalaska se odnose na antitela koja se nadmeću za vezivanje za pro/latentni miostatin sa bilo kojim ovde navedenim antitelima. U nekim realizacijama, antitelo se vezuje za pro/latentni miostatin u istom epitopu kao i bilo koje ovde dato antitelo. Na primer, u nekim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se na ili u blizini mesta cepanja toloida ili na ili u blizini mesta spajanja toloida pro/latentnog miostatina. U drugim realizacijama, bilo koje ovde dato antitelo vezuje se na mestu razdvajanja proprotein konvertaze ili u blizini ili na mestu dokovanja mesta pro/latentnog miostatina ili blizu njega. U još jednom izvođenju, antitelo se nadmeće za vezivanje za pro/latentni miostatin sa ravnotežnom konstantom disocijacije, Kd, između antitela i pro/latentnog miostatina manje od 10<-6>M. U drugim izvođenjima, antitelo koje se nadmeće sa bilo koje ovde dato antitelo vezuje se za pro/latentni miostatin sa Kd u rasponu od 10<-11>M do 10<-6>M.
[0136] Bilo koje ovde dato antitelo može se okarakterisati bilo kojim pogodnim postupkom. Na primer, jedan metod je identifikacija epitopa za koji se vezuje antigen, ili „mapiranje epitopa“. Postoji mnogo pogodnih metoda za mapiranje i karakterizaciju lokacije epitopa na proteinima, uklju čujuć i rešavanje kristalne strukture kompleksa antitelo-antigen, testove kompeticije, testove ekspresije fragmenata gena i testove na bazi sintetičkih peptida, kako je opisano, na primer, u poglavlju 11 Harlov and Lane-a, Koristeć i antitela, Laboratorijski priručnik, Cold Spring Harbor Laboratori Press, Cold Spring Harbor, NI, 1999. U dodatnom primeru, mapiranje epitopa može se koristiti za određivanje sekvence na koju se antitelo vezuje. Epitop može biti linearni epitop, tj. sadržan u jednom delu aminokiselina, ili konformacioni epitop nastao trodimenzionalnom interakcijom aminokiselina koje ne moraju nu žno biti sadržane u jednom delu (linearna sekvenca primarne strukture). Peptidi razli čitih dužina (npr. dugi najmanje 4-6 aminokiselina) mogu se izolovati ili sintetizovati (npr. rekombinantno) i koristiti za testove vezivanja sa antitelom. U drugom primeru, epitop za koji se antitelo ve že može se odrediti na sistematskom ekranu korišć enjem preklapaju ć ih peptida izvedenih iz ciljne sekvence antigena i određivanjem vezivanja antitelom. Prema testovima ekspresije fragmenta gena, otvoreni okvir za očitavanje koji kodira ciljni antigen je fragmentiran ili slučajno ili pomoć u određenih genetskih konstrukcija i određena je reaktivnost izraženih fragmenata antigena sa antitelom koje treba testirati. Fragmenti gena mogu se, na primer, proizvesti PCR-om, a zatim transkribovati i prevesti u protein in vitro, u prisustvu radioaktivnih aminokiselina. Zatim se vezivanje antitela za radioaktivno obele žene fragmente antigena određuje imunoprecipitacijom i gel elektroforezom. Određeni epitopi se takođe mogu identifikovati korišć enjem velikih biblioteka slučajnih peptidnih sekvenci prikazanih na površini čestica faga (biblioteka faga). Alternativno, definisana biblioteka preklapajuć ih fragmenata peptida mo že se testirati na vezivanje za test antitelo u jednostavnim testovima vezivanja. U dodatnom primeru, mutageneza domena koji vezuje antigen, eksperimenti zamene domena i mutageneza skeniranja alanina mogu se izvršiti da bi se identifikovali ostaci potrebni, dovoljni i/ili neophodni za vezivanje epitopa. Na primer, eksperimenti zamene domena mogu se izvoditi pomoć u mutanta ciljnog antigena u kome su različiti fragmenti polipeptida pro/latentni miostatin zamenjeni (zamenjeni) sekvencama iz blisko srodnog, ali antigenski različitog proteina, kao što je drugi član porodice proteina TGFb (npr. GDF11). Procenom vezivanja antitela za mutirani pro/latentni miostatin, mo že se proceniti važnost određenog antigenskog fragmenta za vezivanje antitela.
[0137] Alternativno, testovi kompeticije mogu se izvoditi koristeć i druga antitela za koja je poznato da se vezuju za isti antigen da bi se utvrdilo da li se antitelo veže za isti epitop kao i druga antitela. Analize nadmetanja dobro su poznate stručnjacima u ovoj oblasti.
2
[0138] Bilo koja od pogodnih metoda, npr. metode mapiranja epitopa kako su ovde opisane, mogu se primeniti da bi se utvrdilo da li se antitelo protiv pro/latentnog miostatina vezuje za jedan ili vi še specifičnih ostataka/segmenata u pro/latentnom miostatinu kako je ovde opisano. Dalje, interakcija antitela sa jednim ili više definisanih ostataka u pro/latentnom miostatinu može se odrediti rutinskom tehnologijom. Na primer, može se odrediti kristalna struktura i rastojanja između ostataka u pro/latentnom miostatinu i jednog ili više ostataka u antitelu mogu se odrediti u skladu s tim. Na osnovu takve udaljenosti može se utvrditi da li određeni ostatak u pro/latentnom miostatinu komunicira sa jednim ili više ostataka u antitelu. Dalje, pogodne metode, kao što su testovi kompeticije i testovi ciljne mutageneze, mogu se primeniti za određivanje preferencijalnog vezanja antitela protiv pro/latentnog miostatina za pro/latentni miostatin u poređenju sa drugim ciljem kao što je mutirani pro/latentni miostatin.
Proizvodnja antitela koja vezuju pro/latentni miostatin
[0139] Brojni postupci se mogu koristiti za dobijanje antitela, ili njihovih fragmenata koji vezuju antigen, iz pronalaska. Na primer, antitela se mogu proizvesti metodama rekombinantne DNK. Monoklonska antitela se takođe mogu proizvesti generisanjem hibridoma (videti npr. Kohler i Milstein (1975) Nature, 256: 495-499) u skladu sa poznatim metodama. Hibridomi nastali na ovaj način se zatim pregledaju pomoć u standardnih metoda, kao što su enzimski povezani imunosorbentni test (ELISA) i analiza povr šinske plazmonske rezonance (npr. OCTET ili BIACORE), da bi se identifikovao jedan ili vi še hibridoma koji proizvode antitelo koje se specifično veže do određenog antigena. Bilo koji oblik navedenog antigena može se koristiti kao imunogen, npr. rekombinantni antigen, prirodni oblici, bilo koje njegove varijante ili fragmenti, kao i njihov antigeni peptid (npr. bilo koji od ovde opisanih epitopa kao linearni epitop ili unutar skela kao konformacioni epitop). Jedan primer postupka stvaranja antitela uklju čuje skrining biblioteka ekspresije proteina koje eksprimiraju antitela ili njihove fragmente (npr. ScFv), npr. biblioteke prikaza faga ili ribozoma. Prikaz faga je opisan, na primer, u Ladner et al., U.S. 5,223,409; Smith (1985) Science 228: 1315-1317; Clackson i sar. (1991) Nature, 352: 624-628; Marks i sar. (1991) J. Mol. Biol., 222: 581-597VO92 / 18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; i WO 90/02809.
[0140] Pored upotrebe navedenih biblioteka, navedeni antigen (npr. promiostatin) mo že se koristiti za imunizaciju životinje koja nije čovek, npr. glodara, npr. miša, hrčka ili pacova. U jednom aspektu, neljudski subjekt je miš. [0141] U još jednom izvođenju, monoklonsko antitelo se dobija od subjekta koji nije čovek, a zatim se modifikuje, na primer, himerno, koristeć i pogodne tehnike rekombinantne DNK.
[0141] Opisani su razni pristupi za stvaranje himernih antitela. Videti, na primer, Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81: 6851, 1985; Takeda i sar., Nature 314: 452, 1985, Cabilli i sar., U.S. 4,816,567; Boss et al., US patent br. 4,816,397; Tanaguchi i sar., Evropska patentna objava EP171496; Objava evropskog patenta 0173494, patent Ujedinjenog Kraljevstva GB 2177096B.
[0142] Za dodatne tehnike proizvodnje antitela, pogledajte Antitela: Laboratorijski priručnik, ur. Harlov i sar., Laboratorija Cold Spring Harbor, 1988. Ovaj pronalazak nije nužno ograničeno na bilo koji određeni izvor, metod proizvodnje ili druge posebne karakteristike antitela.
[0143] Neki aspekti ovog pronalaska se odnose na ć elije doma ć ina transformisane polinukleotidom ili vektorom. Ć elije doma ć ina mogu biti prokariotske ili eukariotske ć elije. Polinukleotid ili vektor koji je prisutan u ć eliji doma ć ina može biti integrisan u genom ć elije doma ć ina ili se može održavati ekstrahromozomski. Ć elija doma ć in može biti bilo koja prokariotska ili eukariotska ć elija, kao što je bakterijska, insektna, gljivična, biljna, životinjska ili ljudskać elija. U nekim realizacijama, gljivične ć elije su, na primer, ć elije iz roda Saccharomices, naročito one vrste S.cerevisiae. Izraz "prokariotski" uključuje sve bakterije koje se mogu transformisati molekulima DNK ili RNK za ekspresiju antitela ili odgovarajuć ih lanaca imunoglobulina. Prokariotski domać ini mogu uključivati gram negativne kao i gram pozitivne bakterije kao što su, na primer, E. coli, S. tiphimurium, Serratia marcescens i Bacillus subtilis . Izraz "eukariotski" uključuje kvasac, više biljke, insekte i ć elije kičmenjaka, npr. ćelije sisara, kao što su NSO i CHO ć elije. U zavisnosti od doma ć ina angažovanog u postupku rekombinantne proizvodnje, antitela ili lanci imunoglobulina kodirani polinukleotidom mogu biti glikozilirani ili neglikozilirani. Antitela ili odgovarajuć i lanci imunoglobulina mogu takođe da uključuju početni ostatak metionina aminokiseline.
[0144] U nekim realizacijama, kada se vektor ugradi u odgovarajuć eg doma ć ina, doma ć in se mo že održavati pod uslovima pogodnim za visoku ekspresiju nukleotidnih sekvenci i, po želji, sakupljanje i prečišć avanje lakih lanaca imunoglobulina, mogu slediti teški lanci, dimeri lakog/teškog lanca ili netaknuta antitela, fragmenti koji vežu antigen ili drugi oblici imunoglobulina; videti, Beichok, ć élije sinteze imunoglobulina, Akademijska štampa, NI, (1979). Dakle, polinukleotidi ili vektori se unose u ć elije koje zauzvrat proizvode antitela ili fragmente koji vezuju antigen. Dalje, transgene životinje, poželjno
2
sisari, koje sadrže napred navedene ć elije doma ć ina, mogu se koristiti za proizvodnju antitela ili njegovih fragmenata u velikom obimu.
[0145] Transformisane ć elije doma ć ina mogu se gajiti u fermentorima i kultivisati upotrebom bilo koje pogodne tehnike za postizanje optimalnog rasta ć elija. Jednom izra žena, cela antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci, drugi oblici imunoglobulina ili fragmenti koji vezuju antigen mogu se prečistiti u skladu sa standardnim postupcima u struci, uključujuć i taloženje amonijum sulfata, afinitetne kolone, hromatografiju na koloni, gel elektroforeza i slično; videti, Scopes, "Prečišć avanje proteina", Springer Verlag, NY (1982). Zatim se fragmenti antitela ili antigena koji se vezuju mogu izolovati iz medijuma za rast, ć elijskih lizata ili frakcija ć elijske membrane. Izolacija i prečiš ć avanje, na primer, mikrobiološki eksprimovanih antitela ili fragmenata koji vežu antigen mogu biti na bilo koji uobičajeni način, kao što su, na primer, preparativna hromatografska separacija i imunolo ška separacija, poput onih koja uključuju upotrebu monoklonskih ili poliklonalnih antitela usmerenih, na primer, nasuprot konstantnog regiona antitela.
[0146] Aspekti pronalaska se odnose na hibridom, koji pruža neograničeno produženi izvor monoklonskih antitela. Kao alternativa dobijanju imunoglobulina direktno iz kulture hibridoma, imortalizovane hibridne ć elije mogu se koristiti kao izvor preuređenih lokusa teškog lanca i lakog lanca za naknadnu ekspresiju i/ili genetsku manipulaciju. Preuređeni geni antitela mogu se obrnuto transkribovati iz odgovarajuć ih mRNK da bi se proizvela cDNK. U nekim realizacijama, konstantni region te škog lanca može se zameniti za onaj drugog izotipa ili ukloniti u potpunosti. Varijabilni regioni se mogu povezati za kodiranje jednolan čanih Fv regija. Višestruki Fv regioni mogu se povezati kako bi dali sposobnost vezivanja za vi še od jedne ciljne ili himerne kombinacije teških i lakih lanaca. Bilo koja odgovarajuć a metoda se može koristiti za kloniranje varijabilnih regiona antitela i stvaranje rekombinantnih antitela.
[0147] U nekim realizacijama dobija se odgovarajuć a nukleinska kiselina koja kodira promenljive regione teškog i/ili lakog lanca i ubacuje se u ekspresijske vektore koji se mogu transfektovati u standardne rekombinantne ć elije doma ć ina. Mogu se koristiti razne takve ć elije doma ć ina. U nekim realizacijama, ć elije doma ć ina sisara mogu biti korisne za efikasnu obradu i proizvodnju. Tipi čne ć elijske linije sisara korišćene u ovu svrhu uključuju CHO ć elije, 293 ć elije ili NSO ć elije. Proizvodnja antitela ili fragmenta koji vezuje antigen može se preduzeti kultivisanjem modifikovanog rekombinantnog domać ina pod uslovima kulture pogodnim za rast ć elija doma ć ina i ekspresiju kodiraju ć ih sekvenci. Antitela ili fragmenti koji se vezuju za antigen mogu se dobiti izolovanjem iz kulture. Ekspresijski sistemi mogu biti dizajnirani da uključuju signalne peptide tako da se rezultujuć a antitela izlučuju u medijum; međutim, mogu ć a je i unutarć elijska proizvodnja.
[0148] Pronalazak takođe uključuje polinukleotid koji kodira najmanje promenljivi region imunoglobulinskog lanca ovde opisanih antitela. U nekim realizacijama, varijabilni region kodiran polinukleotidom sadrži najmanje jedan region koji određuje komplementarnost (CDR) VHi/ili VLpromenljivog regiona antitela proizvedenog bilo kojim od napred opisanih hibridoma.
[0149] Polinukleotidi koji kodiraju antitela ili fragmenti koji vezuju antigen mogu biti, na primer, DNK, cDNK, RNK ili sintetički proizvedena DNK ili RNK ili rekombinantno proizvedeni molekul himerne nukleinske kiseline koji sadrži bilo koji od tih polinukletida bilo samostalno ili u kombinaciji sa nekim. U nekim realizacijama, polinukleotid je deo vektora. Takvi vektori mogu sadržati dalje gene, kao što su marker geni, koji omoguć avaju odabir vektora u pogodnoj ć eliji doma ć ina i pod pogodnim uslovima.
[0150] U nekim realizacijama, polinukleotid je operativno povezan sa sekvencama za kontrolu ekspresije omoguć avaju ć i ekspresiju u prokariotskim ili eukariotskim ć elijama. Ekspresija polinukleotida uklju čuje transkripciju polinukleotida u translabilnu mRNK. Regulatorni elementi koji obezbe đuju ekspresiju u eukariotskim ć elijama, poželjno ć elijama sisara, dobro su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Oni mogu uključivati regulatorne sekvence koje olakšavaju pokretanje transkripcije i opciono poli-A signale koji olakšavaju završetak transkripcije i stabilizaciju transkripta. Dodatni regulatorni elementi mogu uključivati pojačivače transkripcije, kao i translacione pojačivače, i/ili prirodno povezane ili heterološke promotivne regije. Moguć i regulatorni elementi koji dozvoljavaju ekspresiju u prokariotskim ć elijama domać ina uključuju, npr., PL, Lac, Trp ili Tac promotor u E. coli, a primeri regulatornih elemenata koji dozvoljavaju ekspresiju u eukariotskim ć elijama doma ć ina su AOKS1 ili GAL1 promotor u kvascu ili CMV-promotor, SV40-promotor, RSV-promoter (virus sarkoma Rous), CMV-pojačivač, SV40-pojačivač ili globin intron uć elijama sisara i drugih životinja.
[0151] Pored elemenata koji su odgovorni za iniciranje transkripcije, takvi regulatorni elementi mogu takođe da uključuju signale završetka transkripcije, kao što je mesto SV40-poli-A ili tk-poli-A mesto, nizvodno od polinukleotida. Dalje, u zavisnosti od korišć enog sistema ekspresije, vode ć e sekvence sposobne da usmere polipeptid u ć elijski region ili ga izluče u medijum mogu se dodati u kodiraju ć u sekvencu polinukleotida i prethodno su opisane. Vodeć e sekvence se sastavljaju (se) u odgovaraju ć oj fazi sa sekvencama translacije, inicijacije i terminacije, i po željno je da su vodeć e sekvence sposobne da usmere sekreciju prevedenog proteina ili njegovog dela u, na primer, vanć elijski medijum. Opciono, mo že
2
se koristiti heterologna polinukleotidna sekvenca koja kodira fuzioni protein, uklju čujuć i C- ili N-terminalni identifikacioni peptid koji daje željene karakteristike, npr. stabilizaciju ili pojednostavljeno prečišć avanje eksprimiranog rekombinantnog proizvoda.
[0152] U nekim realizacijama, polinukleotidi koji kodiraju u najmanjem promenljivi domen lakog i/ili teškog lanca mogu kodirati promenljive domene oba lanca imunoglobulina ili samo jednog. Sli čno tome, polinukleotidi mogu biti pod kontrolom istog promotora ili mogu biti odvojeno kontrolisani za ekspresiju. Dalje, neki aspekti se odnose na vektore, posebno na plazmide, kozmide, viruse i bakteriofage koji se uobičajeno koriste u genetskom inženjeringu i koji sadrže polinukleotid koji kodira promenljivi domen imunoglobulinskog lanca antitela ili fragmenta koji vezuje antigen; opciono u kombinaciji sa polinukleotidom koji kodira promenljivi domen drugog lanca imunoglobulina antitela.
[0153] U nekim realizacijama, sekvence za kontrolu ekspresije su obezbeđene kao eukariotski promotivni sistemi u vektorima sposobnim za transformaciju ili transfekciju eukariotskih ć elija doma ć ina, ali se takođe mogu koristiti kontrolne sekvence za prokariontske domać ine. Ekspresijski vektori izvedeni iz virusa kao što su retrovirusi, virus vakcinije, adeno povezani virusi, herpes virusi ili gove đi papiloma virusi koji se mogu koristiti za isporuku polinukleotida ili vektora u ciljanu populaciju ć elija (npr. za projektovanje ć elije da eksprimira antitelo ili fragment koji vezuje antigen). Za konstrukciju rekombinantnih virusnih vektora mogu se koristiti razne odgovarajuć e metode. U nekim realizacijama, polinukleotidi i vektori mogu biti rekonstituisani u lipozome za isporuku do ciljnih ć elija. Vektori koji sadrže polinukleotide (npr. teški i/ili laki promenljivi domen (i) lanaca imunoglobulinskih lanaca koji kodiraju sekvence i sekvence za kontrolu ekspresije) mogu se preneti u ć eliju doma ć ina pogodnim metodama, koje se razlikuju u zavisnosti od vrste ć elijskog doma ć ina.
Modifikacije
[0154] Antitela ili fragmenti koji vezuju antigen iz otkrića mogu se modifikovati detektivnom etiketom, uključujuć i, ali bez ograničenja, enzim, protetsku grupu, fluorescentni materijal, luminiscentni materijal, bioluminiscentni materijal, radioaktivni materijal, metal koji emituje pozitrone, neradioaktivni paramagnet metalni jon i oznaka afiniteta za detekciju i izolaciju pro/latentnog miostatina. Supstanca koja se može detektovati može biti povezana ili konjugovana bilo direktno sa polipepidima iz pronalaska ili indirektno, putem intermedijera (kao što je, na primer, linker), koristeć i pogodne tehnike. Neograničavajuć i primeri pogodnih enzima uključuju peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, b-galaktozidazu, glukozu oksidazu ili acetilholinesterazu; neograničavajuć i primeri pogodnih kompleksa protetskih grupa uključuju streptavidin/biotin i avidin/biotin; neograničavajuć i primeri pogodnih fluorescentnih materijala uključuju biotin, umbeliferon, fluorescein, fluorescein izotiocijanat, rodamin, dihlorotriazinilamin fluorescein, dansil hlorid ili fikoeritrin; primer luminiscentnog materijala uklju čuje luminol; neograničavajuć i primeri bioluminiscentnih materijala uključuju luciferazu, luciferin i aevorin; a primeri pogodnog radioaktivnog materijala uključuju radioaktivni metalni jon, npr. alfa-emiteri ili drugi radioizotopi, kao što su, na primer, jod (<131>I,<125>I,<123>I,<121>I), ugljenik (<14>C), sumpor (<35>S), tricijum (<3>H), indijum (<115>mIn,<113>mIn,<112>In,<111>In) i tehnecijum (<99>Tc,<99>mTc), talijum (<201>Ti), galijum (<68>Ga,<67>Ga), paladijum (<103>Pd), molibden (<99>Mo), ksenon (<133>Xe), fluor (<18>F),<153>Sm, Lu,<159>Gd,<149>Pm,<140>La,<175>Ib,<166>Ho,<90>I,<47>Sc,<86>R,<188>Re,<142>Pr,<105>Rh,<97>Ru,<68>Ge,<57>Co,<65>Zn,<85>Sr,<32>P,<153>Gd,<169>Ib,<51>Cr,<54>Mn,<75>Se, i kalaj (<113>Sn,<117>Sn). Supstanca koja se može detektovati može se povezati ili konjugovati bilo direktno na antitela nasuprot pro/latentnog miostatina iz pronalaska ili indirektno, putem intermedijera (kao što je, na primer, linker), koristeć i pogodne tehnike. Antitela protiv pro/latentnog miostatina konjugovana sa detektabilnom supstancom mogu se koristiti za dijagnostičke testove kako je ovde opisano.
Farmaceutske kompozicije
[0155] Jedno ili više antitela nasuprot pro/latentnog miostatina mogu se pome šati sa farmaceutski prihvatljivim nosačem (ekscipijentom), uključujuć i pufer, da bi se formirala farmaceutska kompozicija za upotrebu u ublažavanju bolesti ili poremeć aja koji su povezani sa miopatijom. „Prihvatljiv“ znači da nosač mora biti kompatibilan sa aktivnim sastojkom kompozicije (i po moguć nosti sposobnim da stabilizuje aktivni sastojak) i da nije štetan za subjekta koji se leči. Primeri farmaceutski prihvatljivih nosača (ekscipijensa), uključujuć i pufere, bili bi očigledni stručnjaku i prethodno su opisani. Videti, na primer, Remington: Nauka i praksa farmacije 20. izd. (2000) Lippincott Villiams i Vilkins, Ed. K. E. Hoover. U jednom primeru, ovde opisana farmaceutska kompozicija sadrži više od jednog antitela nasuprot pro/latentnog miostatina koji prepoznaju različite epitope/ostatke ciljnog antigena.
[0156] Farmaceutske kompozicije koje ć e se koristiti u ovim postupcima mogu sadržati farmaceutski prihvatljive nosače, pomoćne supstance ili stabilizatore u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. (Remington: Nauka i praksa farmacije 20. izd. (2000) Lippincott Villiams i Vilkins, ur. K. E.
Hoover). Prihvatljivi nosači, pomoć ne supstance ili stabilizatori nisu toksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste i mogu sadržati pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidanti, uključujuć i askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi (kao što su oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheheksanol; mpentaresol; polipeptidi niske molekularne težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što su glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin ili lizin; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati, uključujuć i glukozu, manozu ili dekstrane; helatni agensi kao što je EDTA; še ć eri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; anti-joni koji formiraju so, kao što je natrijum; metalni kompleksi (npr. Znproteinski kompleksi); i/ili nejonski surfaktanti kao što su TWEEN<TM>, PLURONICS<TM>ili polietilen glikol (PEG). Farmaceutski prihvatljivi nosači su ovde dalje opisani.
[0157] U nekim primerima, ovde opisana farmaceutska kompozicija sadrži lipozome koji sadrže antitelo nasuprot pro/latentnog miostatina, koja se mogu pripremiti bilo kojim pogodnim postupkom, kao što je opisano u Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 82: 3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77: 4030 (1980); i US br. Br. 4.485.045 i 4.544.545. Lipozomi sa poveć anim vremenom cirkulacije opisani su u U.S 5,013,556. Naročito korisni lipozomi mogu se generisati metodom isparavanja reverzne faze sa lipidnim sastavom koji sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se istiskuju kroz filtere definisane veličinom pora dajuć i lipozome željenog prečnika.
[0158] Anti-pro/latentno miostatinsko antitelo se takođe može uhvatiti u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili međufaznom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloza ili želatin-mikrokapsule i poli-(metilmetacilat) mikrokapsule, u koloidni sistemi za isporuku lekova (na primer, lipozomi, mikrosfere albumina, mikroemulzije, nanočestice i nanokapsule) ili u makroemulzijama. Primerne tehnike su prethodno opisane, videti, na primer, Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).
[0159] U drugim primerima, ovde opisana farmaceutska kompozicija može se formulisati u formatu sa produženim oslobađanjem. Poželjni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju polupropusne matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, a koje su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi ili mikrokapsule. Primeri matrica sa odlo ženim oslobađanjem uključuju poliestere, hidrogelove (na primer, poli (2-hidroksietil-metakrilat) ili poli (v-nilalkohol)), polilaktide (US patent 3,773,919), kopolimeri L-glutaminske kiseline i 7 etil -L-glutamat, nerazgradivi etilen-vinil acetat, razgradivi kopolimeri mlečne kiseline i glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOTTM (injekcione mikrosfere sastavljene od kopolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolida acetata), izobutirata saharoze acetata i poli- D - (-) - 3-hidroksimaslene kiseline.
[0160] Farmaceutske kompozicije koje se koriste za in vivo primenu moraju biti sterilne. To se lako postiže, na primer, filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Sastavi terapeutskih antitela se generalno stavljaju u posudu koji ima sterilni otvor za pristup, na primer, kesu za intravenski rastvor ili bočicu koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju.
[0161] Ovde opisane farmaceutske kompozicije mogu biti u jediničnim oblicima doziranja kao što su tablete, pilule, kapsule, praškovi, granule, rastvori ili suspenzije ili supozitorije, za oralnu, parenteralnu ili rektalnu primenu ili davanje inhalacijom ili insuflacijom.
[0162] Za pripremu čvrstih kompozicija kao što su tablete, glavni aktivni sastojak se može mešati sa farmaceutskim nosačem, npr. konvencionalni sastojci za tabletiranje kao što su kukuruzni skrob, laktoza, saharoza, sorbitol, talk, stearinska kiselina, magnezijum stearat, dikalcijum fosfata ili gume, i drugih farmaceutskih razblaživača, npr. vode, da bi se formirao čvrsti preparat za preformulaciju koji sadrži homogenu kompoziciju jedinjenja iz ovog pronalaska ili njegovu netoksičnu farmaceutski prihvatljivu so. Kada se ovi preparati za preformulaciju nazivaju homogenim, podrazumeva se da je aktivni sastojak ravnomerno raspršen u celoj kompoziciji, tako da se kompozicija može lako podeliti u podjednako efikasne jedinične dozne oblike kao što su tablete, pilule i kapsule. Ova čvrsta preformulaciona kompozicija se zatim deli na jedinične dozne oblike napred opisanog tipa koji sadrže od 0,1 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka iz ovog pronalaska. Tablete ili pilule nove kompozicije mogu biti oblo žene ili na bilo koji drugi način složene da bi se dobio oblik doziranja koji daje prednost produženog delovanja. Na primer, tableta ili pilula mogu da sadrže unutrašnju dozu i spoljašnju komponentu doziranja, pri čemu je poslednja u obliku koverte preko prve. Dve komponente mogu biti odvojene enteri čkim slojem koji služi da se odupre dezintegraciji u želucu i omoguć ava unutrašnjoj komponenti da netaknuta pređe u dvanaestopalačno crevo ili da se odloži u oslobađanju. Za takve enteričke slojeve ili obloge mogu se koristiti različiti materijali, uključujuć i materijale koji uključuju brojne polimerne kiseline i smeše polimernih kiselina sa materijalima kao što su šelak, cetil alkohol i celulozni acetat. Poželjna površinski aktivna sredstva uključuju, posebno, nejonska sredstva, kao što su polioksietilenesorbitani (npr. TweenTM 20, 40, 60, 80 ili 85) i drugi sorbitani (npr. Span TM 20, 40, 60, 80 ili 85). Kompozicije sa površinski
1
aktivnim sredstvom prikladno ć e sadržati između 0,05 i 5 % površinski aktivnog sredstva, a mogu biti između 0,1 i 2,5 %. Podrazumeva se da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer manitol ili drugi farmaceutski prihvatljivi nosači, ako je potrebno.
[0163] Poželjne emulzije mogu se pripremiti pomoć u komercijalno dostupnih emulzija masti, kao što su Intralipid<TM>, Liposin<TM>, Infonutrol<TM>, Lipofundin<TM>i Lipiphisan<TM>. Aktivni sastojak može biti rastvoren u prethodno pomešanom emulzionom sastavu ili se alternativno može rastvoriti u ulju (npr. sojino ulje, ulje šafrana, ulje semena pamuka, sezamovo ulje, kukuruzno ulje ili bademovo ulje) i emulzija koja nastaje mešanjem sa fosfolipidom (npr. fosfolipidi jaja, fosfolipidi soje ili lecitin soje) i voda. Podrazumeva se da se mogu dodati i drugi sastojci, na primer glicerol ili glukoza, da bi se podesila toni čnost emulzije. Pogodne emulzije obično sadrže do 20 % ulja, na primer između 5 i 20 %.
[0164] Emulzione smeše mogu biti one pripremljene mešanjem antitela nasuprot promiostatina sa Intralipid<TM>ili njegovim komponentama (sojino ulje, fosfolipidi jaja, glicerol i voda).
[0165] Farmaceutske kompozicije za inhalaciju ili inhalaciju uključuju rastvore i suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaračima ili njihovim smešama i prahove. Tečni ili čvrsti sastavi mogu sadržati odgovarajuć e farmaceutski prihvatljive pomo ć ne supstance kao što je napred navedeno. U nekim realizacijama, kompozicije se daju oralnim ili nazalnim respiratornim putem radi lokalnog ili sistemskog efekta. Kompozicije u poželjno sterilnim farmaceutski prihvatljivim rastvaračima mogu se raspršiti upotrebom gasova. Nebulirani rastvori se mogu udahnuti direktno iz ure đaja za nebulozu ili uređaja za magljenje koji može biti pričvršć en na masku za lice ili naizmenično na mašinu za disanje sa pozitivnim pritiskom. Sastavi rastvora, suspenzija ili praha mogu se davati, po željno oralno ili nazalno, sa uređaja koji isporučuju formulaciju na odgovarajuć i način.
Upotreba antitela anti pro/latentnog miostatina za lečenje bolesti/poremeć aja
[0166] Ovde opisana antitela anti pro/latentnog miostatina su efikasna u lečenju bolesti ili poremeć aja sa miopatijom. Kako se ovde koristi, termin "miopatija" odnosi se na mi šić nu bolest kod koje miši ć na vlakna ne funkcionišu pravilno, što obično rezultira mišić nom slaboš ć u. U miopatije spadaju miši ć ne bolesti koje su neuromuskularne ili mišić no-skeletne prirode. U nekim realizacijama, miopatija je nasledna miopatija. Nasleđene miopatije uključuju, bez ograničenja, distrofije, miotonije, kongenitalne miopatije (npr. nemalinska miopatija, multipla/minikorna miopatija i centronuklearna miopatija, mitohondrijske miopatije, porodične periodične miopatije, miopatije usled infekcije, i poremeć aj skladi štenja lipida. U nekim realizacijama, miopatija je stečena miopatija. Stečene miopatije uključuju, bez ograničenja, miopatiju izazvanu spoljašnjim supstancama (npr. miopatiju izazvanu lekovima i miopatiju glukokortikoida, alkoholnu miopatiju i miopatiju zbog drugih toksičnih sredstava), miozitis (npr. dermatomiozitis, polimitis i miozitis inkluzije tela), miozitis osificans, rabdomioliza i mioglobinurije i atrofija. U nekim realizacijama, miopatija je disusna atrofija, koja mo že biti uzrokovana frakturom kosti (npr. fraktura kuka) ili povredom nerva (npr. povreda kičmene moždine (SCI). U nekim realizacijama miopatija je povezana sa bolešć u ili poreme ć ajem kao što je amiotrofična lateralna skleroza (ALS), spinalna mišić na atrofija (SMA), sindromi kaheksije usled bubrežne insuficijencije, AIDS-a, srčanih stanja i/ili karcinoma. U nekim realizacijama miopatija je povezana sa starenjem.
[0167] Jedan aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima miopatiju, postupak koji uključuje davanje subjektu efikasne količine napred opisanog antitela. U nekim realizacijama, miopatija je primarna miopatija. U još jednom izvođenju, primarna miopatija uključuje atrofiju usled neaktivnosti. U drugim realizacijama, atrofija usled neaktivnosti povezana je sa frakturom kuka, elektivnom zamenom zgloba, miopatijom kritične nege, povredom kičmene moždine ili moždanim udarom. U nekim realizacijama, miopatija je sekundarna miopatija, u kojoj je gubitak mi šić a sekundarni u odnosu na patologiju bolesti. U drugim realizacijama, sekundarna miopatija uklju čuje denervaciju, genetsku slabost mišić a ili kaheksiju. U još jednom izvođenju, sekundarna miopatija je denervacija povezana sa amiotrofičnom lateralnom sklerozom ili spinalnom mišić nom atrofijom. U nekim realizacijama, sekundarna miopatija je genetska mišić na slabost povezana sa miši ć nom distrofijom. U drugim realizacijama, sekundarna miopatija je kaheksija povezana sa bubrežnom insuficijencijom, AIDS-om, srčanim stanjem, rakom ili starenjem.
[0168] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa starenjem. Primerne bolesti i uslovi povezani sa starenjem uključuju, bez ograničenja, sarkopeniju (gubitak mišić a povezan sa uzrastom), krhkost i nedostatak androgena.
[0169] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa disusnom atrofijom/traumom. Primerne bolesti i stanja u vezi sa atrofijom usled neaktivnosti/traume uključuju, bez ograničenja, mišić nu slabost povezanu sa vremenom provedenim u jedinici intenzivne nege (ICU), zamenom kuka/zgloba, frakturu kuka, moždani udar, dugo ležanje u krevetu, SCI, povredu rotatorne kosti, zamenom kolena, frakturom kostiju i opekotinama.
2
[0170] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima neurodegenerativnu bolest ili stanje. Primerne neurodegenerativne bolesti ili stanja uključuju, bez ograničenja, spinalnu mišić nu atrofiju i amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS).
[0171] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa kaheksijom. Primerne bolesti i stanja povezana sa kaheksijom uključuju, bez ograničenja, rak, hroničnu srčanu insuficijenciju, sindrom stečene imunološke insuficijencije (AIDS), hroničnu opstruktivnu bolest pluć a (COPD) i hroničnu bolest bubrega (CKD).
[0172] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa retkim bolestima. Primeri retke bolesti i stanja uključuju, bez ograničenja, osteogenezu imperfecta, sporadični miozitis inkluzijskog tela i akutnu limfoblastnu leukemiju.
[0173] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa metaboličkim poremeć ajem i/ili telesnom kompozicijom. U nekim realizacijama, bolest ili stanje je gojaznost (npr. teška gojaznost), Prader-Willi, dijabetes tipa II ili anoreksija. Međutim, dodatne bolesti ili stanja vezana za metaboličke poremeć aje i/ili telesnu kompoziciju bili bi očigledni stručnjaku i spadaju u delokrug ovog pronalaska.
[0174] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa urođenim miopatijama. Primeri urođenih miopatija uključuju, bez ograničenja, miotubularnu miopatiju povezanu sa X, autosomno dominantnu centronuklearnu miopatiju, autosomno recesivnu centronuklearnu miopatiju, nemalinsku miopatiju i kongenitalnu miopatiju nesrazmernog tipa.
[0175] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa mišić nim distrofijama. Uzorne miši ć ne distrofije uključuju, bez ograničenja, Duheneove, Bekerove, facioskapulohumeralne (FSH) i Limb-Girdle mišić ne distrofije.
[0176] Sledeć i aspekt pronalaska uključuje postupak lečenja subjekta koji ima bolest ili stanje povezano sa uroginekološkim bolestima, glotičke poremeć aje (stenoza), ekstraokularnu miopatiju, carpel tunel, Guillain-Barre ili osteosarkom.
[0177] Da bi se primenio ovde opisani postupak, efikasna količina napred opisane farmaceutske kompozicije može se dati subjektu (npr. čoveku) kome je potrebno lečenje pogodnim putem, kao što je intravenska primena, npr. bolusom ili kontinuiranom infuzijom tokom određenog vremenskog perioda, intramuskularnim, intraperitonealnim, intrakrerebrospinalnim, potko žnim, intraartikularnim, intrasinovijalnim, intratekalnim, oralnim, inhalacijskim ili topikalnim putem. Komercijalni raspr šivači za tečne formulacije, uključujuć i mlazne i ultrazvučne nebulizatore koji su korisni su za administraciju. Tečne formulacije se mogu direktno raspršiti, a liofilizovani prah se može raspršiti nakon rekonstitucije. Alternativno, antitela anti pro/latentnog miostatina mogu se aerosolizovati upotrebom formulacije fluorougljenika i inhalatora odmerenih doza, ili udisati kao liofilizovani i mleveni prah.
[0178] Subjekat koji se leči ovde opisanim postupcima može biti sisar, još poželjnije čovek. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, domać e životinje, životinje za sport, ku ć ne ljubimce, primate, konje, pse, mačke, miševe i pacove. Ljudski subjekt kome je potreban tretman može biti ljudski pacijent koji ima rizik, ili postoji sumnja da ima bolest/poremeć aj povezan sa miopatijom, kao što je napred navedeno. Subjekt koji ima bolest ili poremeć aj povezan sa pro/latentnim miostatinom mo že se identifikovati rutinskim medicinskim pregledom, npr. laboratorijskim testovima, funkcionalnim testovima organa, CT skeniranjem ili ultrazvukom. Subjekt za koga se sumnja da ima bilo koju od takvih bolesti/poremeć aja može pokazati jedan ili više simptoma bolesti/poremeć aja. Subjekt u riziku od bolesti/poreme ć aja može biti subjekat koji ima jednog ili više faktora rizika za tu bolest/poremeć aj.
[0179] "Efikasna količina", kako se ovde koristi, odnosi se na količinu svakog aktivnog agensa koja je potrebna da pruži terapeutski efekat subjektu, bilo samostalno ili u kombinaciji sa jednim ili vi še drugih aktivnih sredstava. Efektivne količine variraju, kako prepoznaju stručnjaci u ovoj oblasti, u zavisnosti od određenog stanja koje se leči, težine stanja, pojedinačnih parametara pacijenta, uključujuć i starost, fizičko stanje, veličinu, pol i težinu, trajanje lečenja, priroda istovremene terapije (ako postoji), specifičan način primene i slični faktori u znanju i stručnosti zdravstvenog radnika. Ovi faktori su dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti i njima se može pozabaviti samo rutinskim eksperimentisanjem. Generalno je poželjno da se koristi maksimalna doza pojedinačnih komponenata ili njihovih kombinacija, odnosno najviša sigurna doza prema zdravom medicinskom sudu. Stručnjaci iz ove oblasti razumeć e, međutim, da pacijent može insistirati na nižoj dozi ili podnošljivoj dozi iz medicinskih razloga, psiholoških razloga ili praktično iz bilo kojih drugih razloga. U nekim realizacijama, efikasna količina se odnosi na količinu antitela ili njegovog dela koji veže antigen, koja je dovoljna da smanji ili poboljša težinu i/ili trajanja poremeć aja ili jednog ili više simptoma, ili da spreči napredovanje poreme ć aja, izazove regresiju poremeć aja, sprečiti ponavljanje, razvoj, početak ili napredovanje jednog ili više simptoma povezanih sa poremeć ajem, otkrije poreme ć aj ili pojača ili poboljša profilaktički ili terapijski efekat (e) druge terapije (npr. profilaktičko ili terapeutsko sredstvo).
[0180] U nekim realizacijama, u kontekstu primene pro/latentnog antitela miostatina na subjektu, efikasna količina je količina efikasna za poveć anje mase ciljnog miši ć a kod subjekta u poređenju sa kontrolnom mišić nom masom. U nekim realizacijama, pove ć anje miši ć ne mase predstavlja pove ć anje od najmanje 1,1 puta, najmanje 1,2 puta, najmanje 1,3 puta, najmanje 1,4 puta, najmanje 1,5 puta, najmanje 1,6 puta najmanje 1,7 puta, najmanje 1,8 puta, najmanje 1,9 puta, najmanje 2 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta ili više u poređenju sa kontrolnom mišić nom masom. U nekim realizacijama, poveć anje miši ć ne mase je pove ć anje u opsegu od 1 puta do 5 puta, 2 puta do 10 puta, 1 puta do 1,5 puta, 1 puta do 2 puta, itd. u poređenju sa kontrolnom mišić nom masom.
[0181] Kako se ovde koristi, termin "kontrolna mišić na masa" odnosi se na referentni standard koristan za procenu efekata stanja (npr. lečenje pro/latentnim antitelom miostatina) na masu ciljnog mi šić a kod subjekta. U nekim realizacijama, kontrolna mišić na masa je unapred određena vrednost. U nekim realizacijama, kontrolna mišić na masa se eksperimentalno određuje. U nekim realizacijama, kontrolna mišić na masa je masa ciljnog miši ć a kod subjekta kome nije dato pro/latentno antitelo miostatina. U nekim realizacijama, kontrolna mišić na masa je masa (npr. prosečna masa) ciljnog miši ć a u populaciji subjekata na kojima nije primenjeno antitelo na pro/latentni miostatina. U nekim realizacijama, kontrolna mišić na masa je masa ciljnog miši ć a kod subjekta pre (npr. neposredno pre) davanja pro/latentnog antitela miostatina. U nekim realizacijama, kontrolna mi šić na masa je masa ciljnog miši ć a kod subjekta kome je umesto pro/latentnog miostatinskog antitela davano normalno antitelo (npr. istog izotipa kao i pro/latentno antitelo miostatina) koje je dobijeno od životinje koja nije bila izložena antigenu na koji je usmereno pro/latentno antitelo miostatina. U nekim realizacijama, kontrolna mi šić na masa je masa ciljnog mišić a kod subjekta kome je, umesto pro/latentno antitela miostatina, dat nosa č, na primer fiziološki rastvor.
[0182] U nekim realizacijama, u kontekstu primene pro/latentnog antitela miostatina na subjektu, efektivna količina je količina efikasna za poveć anje kapaciteta stvaranja sile (npr. maksimalna generacija sile utvrđena in vitro pomoć u sistema miši ć a poluga prilagođenog horizontalnom perfuzijskom kupkom) ciljnog mišić a kod subjekta u poređenju sa kapacitetom stvaranja kontrolne sile. U nekim realizacijama, poveć anje kapaciteta za stvaranje sile je pove ć anje od najmanje 1,1 puta, najmanje 1,2 puta, najmanje 1,3 puta, najmanje 1,4 puta, najmanje 1,5 puta, najmanje 1,6 puta, najmanje 1,7 puta, najmanje 1,8 puta, najmanje 1,9 puta, najmanje 2 puta, najmanje 4 puta, najmanje 5 puta ili vi še u poređenju sa kapacitetom generisanja kontrolne sile. U nekim realizacijama, poveć anje kapaciteta za stvaranje sile je poveć anje u opsegu od 1 puta do 5 puta, 2 puta do 10 puta, 1 puta do 1,5 puta, 1 puta do 2 puta, itd. u poređenju sa kapacitetom generisanja kontrolne sile.
[0183] Kako se ovde koristi, termin "stvaranje kontrolne sile kapacitet "odnosi se na referentni standard koristan za procenu efekata stanja (npr. lečenje pro/latentnim antitelom miostatina) na kapacitet stvaranja sile mišić a kod subjekta. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je unapred određena vrednost. U nekim realizacijama, eksperimentalno se određuje kapacitet stvaranja kontrolne sile. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je kapacitet stvaranja sile ciljnog mi šić a kod subjekta kome nije primenjeno pro/latentni antitelo miostatina. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je kapacitet stvaranja sile (npr. prosečni kapacitet stvaranja sile) ciljnog mišić a u populaciji subjekata na kojima nije primenjivano pro/latentno antitelo miostatina. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je kapacitet stvaranja sile ciljnog mi šić a kod subjekta pre (npr. neposredno pre) davanja pro/latentnog antitela miostatina. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je kapacitet stvaranja sile ciljnog mišić a kod subjekta kome je umesto pro/latentnog antitela miostatina davano normalno antitelo (npr. istog izotipa kao i pro/latentno antitelo miostatina) koje je dobijeno od životinje koja nije bila izložena antigenu na koji je usmereno pro/latentno antitelo miostatina. U nekim realizacijama, kapacitet stvaranja kontrolne sile je kapacitet stvaranja sile ciljnog mišić a kod subjekta kome je umesto pro/latentnog antitela miostatina davano sredstvo, na primer, fiziološki rastvor.
[0184] Empirijska razmatranja, poput faktora vremena, uglavnom ć e doprineti određivanju doze. Na primer, antitela koja su kompatibilna sa humanim imunolo škim sistemom, kao što su humanizovana antitela ili potpuno ljudska antitela, mogu se koristiti za produžavanje poluživota antitela i za sprečavanje antitela od napada imunološkog sistema domać ina. Učestalost primene može se odrediti i prilagoditi tokom terapije i uglavnom se, ali ne nužno, zasniva na lečenju i/ili suzbijanju i/ili ublažavanju i/ili odlaganju bolesti/poremeć aja povezanih sa miopatijom. Alternativno, formulacije sa kontinuiranim oslobađanjem pro/latentnog atitela miostatina mogu biti prikladne. Različite formulacije i uređaji za postizanje produženog otpuštanja bili bi očigledni stručnjaku i spadaju u opseg ovog pronalaska.
[0185] U jednom primeru, doze za pro/latentno antitelo miostatina, kao što je ovde opisano, mogu se empirijski odrediti kod pojedinaca kojima je data jedna ili vi še doza antitela. Pojedincima se daju postepene doze antagonista. Da bi se procenila efikasnost antagonista, mo že se pratiti indikator
4
bolesti/poremeć aja.
[0186] Generalno, za primenu bilo kog ovde opisanog antitela, početna doza kandidata može biti oko 2 µg/kg. U svrhu ovog pronalaska, tipična dnevna doza može se kretati od oko bilo koje od 0,1 µg/kg do 3 g/kg do 30 µg/kg do 300 mg/kg do 3 µg/kg do 30 mg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od napred navedenih faktora. Za ponovljene primene tokom nekoliko dana ili du že, u zavisnosti od stanja, tretman se održava sve dok se ne dogodi željena supresija simptoma ili dok se ne postignu dovoljni terapeutski nivoi za ublažavanje bolesti ili poremeć aja povezanih sa pro/latentnim miostatinom ili njegovog simptoma. Primer režima doziranja uključuje davanje inicijalne doze od oko 2 mg/kg, prać eno nedeljnom dozom održavanja od oko 1 µg/kg antitela, ili pra ć eno dozom održavanja od oko 1 µg/kg svake druge nedelje. Međutim, drugi režimi doziranja mogu biti korisni, u zavisnosti od obrasca farmakokinetičkog propadanja koji lekar želi da postigne. Na primer, razmatra se doziranje jednom do četiri puta nedeljno. U nekim realizacijama, doziranje u rasponu od oko 3 µg/mg do oko 2 mg/kg (kao što je oko 3 µg/mg, oko 10 µg/mg, oko 30 µg/mg, oko 100 µg/mg, oko 300 µg/mg, oko 1µg/kg i oko 2 µg/kg). U nekim realizacijama, učestalost doziranja je jednom nedeljno, svake 2 nedelje, svake 4 nedelje, svakih 5 nedelja, svakih 6 nedelja, svakih 7 nedelja, svakih 8 nedelja, svakih 9 nedelja ili svakih 10 nedelja; ili jednom mese čno, svaka 2 meseca, ili svaka 3 meseca, svaka 4 meseca, svakih 5 meseci, svakih 6 meseci, svakih 8 meseci, svakih 10 meseci, svake godine ili duže. Napredak ove terapije lako se prati konvencionalnim tehnikama i testovima. Režim doziranja (uključujuć i koriš ć ena antitela) može vremenom da varira.
[0187] U nekim realizacijama, za odraslog pacijenta normalne težine, mogu se primeniti doze u rasponu od oko 0,3 do 5,00 mg/kg. Određeni režim doziranja, npr. doza, vreme i ponavljanje, zavisić e od određenog pojedinca i istorije bolesti te osobe, kao i od svojstava pojedina čnih sredstava (kao što je poluvreme delovanja sredstva i druga relevantna razmatranja).
[0188] U svrhu ovog pronalaska, odgovarajuć a doza antitela pro/latentnog miostatina zavisi ć e od specifičnog antitela (ili njegovih sastava) koje se koriste, vrste i težine bolesti/poremeć aja, da li se antitelo primenjuje u preventivne ili terapijske svrhe, prethodnu terapiju, klini čku istoriju pacijenta i odgovor na antagonist koji dolazi. U nekim realizacijama, kliničar ć e primenjivati pro/latentna antitela miostatina, sve dok se ne postigne doza koja postiže željeni rezultat. Administracija pro/latentnog antitela miostatina može biti kontinuirana ili isprekidana, u zavisnosti, na primer, od fiziolo škog stanja primaoca, da li je svrha primene terapijska ili profilaktička, i drugih faktora poznatih veštim stručnjacima. Primena pro/latentnog antitela miostatina može biti u osnovi kontinuirana tokom unapred odabranog vremenskog perioda ili može biti u nizu razmaknutih doza, npr. bilo pre, tokom ili nakon razvoja bolesti ili poremeć aja povezanog sa pro/latentnim miostatinom.
[0189] Kako se ovde koristi, termin "lečenje" odnosi se na primenu ili primenu kompozicije koja uključuje jedno ili više aktivnih sredstava subjektu, koji ima bolest/poremeć aj povezan sa miopatijom, simptom bolesti/poremeć aja ili predispozicija ka bolesti/poreme ć aju, sa ciljem da se izleči, ublaži, promeni, poboljša ili utiče na poreme ć aj, simptom bolesti ili predispoziciju ka bolesti/poreme ć aju.
[0190] Ublažavanje bolesti/poremeć aja povezanih sa pro/latentnim miostatinom uklju čuje odlaganje razvoja ili progresije bolesti ili smanjenje težine bolesti. Ublažavanje bolesti ne zahteva nužno delotvorne rezultate. Kako se tamo koristi, „odlaganje“ razvoja bolesti/poremeć aja povezanog sa pro/latentnim miostatinom znači odlaganje, ometanje, usporavanje, usporavanje, stabilizaciju i/ili zaustavljanje napredovanja bolesti. Ovo zaustavljanje može biti različito dugo, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili pojedinaca koji se leče. Metod koji „odlaže“ ili ublažava razvoj bolesti, ili odlaže početak bolesti, je metod koji smanjuje verovatnoć u razvoja jednog ili više simptoma bolesti u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim simptoma u datom vremenskom okviru, u poređenju sa neprimenom metoda. Takva poređenja su obično zasnovana na kliničkim studijama, koristeć i određeni broj subjekata koji je dovoljan da da statistički značajan rezultat.
[0191] "Razvoj" ili "napredovanje" bolesti znači početne manifestacije i/ili posledično napredovanje bolesti. Razvoj bolesti može se otkriti i proceniti pomoć u standardnih kliničkih tehnika. Međutim, razvoj se takođe odnosi na napredovanje koje može biti neotkriveno. U svrhu ovog pronalaska, razvoj ili napredovanje odnosi se na biološki tok simptoma. „Razvoj“ uključuje pojavu, ponavljanje i početak. Kako se ovde koristi, "pojava" ili "pojava" bolesti/poremeć aja povezanih sa miopatijom uklju čuje početni početak i/ili recidiv.
[0192] U nekim realizacijama, ovde opisano pro/latentno antitelo miostatina daje se subjektu kome je potreban tretman u količini dovoljnoj da inhibira proteolitičku aktivaciju pro/latentnog miostatina na aktivni miostatin za najmanje 20 % (npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ili više) in vivo. U drugim realizacijama, antitelo se daje u količini koja efikasno smanjuje nivo pro/latentnog miostatina ili latentnog miostatina za najmanje 20 % (npr. 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % ili više).
[0193] Konvencionalni metodi, poznati prosečnom stručnjaku u medicini, mogu se koristiti za davanje farmaceutskog sastava subjektu, u zavisnosti od vrste bolesti koja se leči ili mesta bolesti. Ovaj sastav se takođe može primeniti na druge konvencionalne načine, na primer, oralno, parenteralno, sprejom za inhalaciju, lokalno, rektalno, nazalno, bukalno, vaginalno ili preko ugrađenog rezervoara. Termin "parenteralni", kako se ovde koristi, uključuje potkožne, intrakutane, intravenske, intramuskularne, intraartikularne, intraarterijske, intrasinovijalne, intrasternalne, intratekalne, intralezijske i tehnike intrakranijalnih injekcija ili infuzija. Pored toga, mo že se davati subjektu putem injekcionih depo puteva davanja, kao što je korišć enje 1-, 3- ili 6-mesečnog depoa za injekcije ili biorazgradivi materijali i metodi.
[0194] Sastavi za injekcije mogu sadržati različite nosače kao što su biljna ulja, dimetilaktamid, dimetiformamid, etil laktat, etil karbonat, izopropil miristat, etanol i polioli (glicerol, propilen glikol, tečni polietilen glikol i slično). Za intravensku injekciju, vodorastvorljiva antitela mogu se primenjivati metodom kapanja, pri čemu se ubrizgava farmaceutska formulacija koja sadrži antitelo i fiziološki prihvatljive pomoć ne supstance. Fiziološki prihvatljivi pomo ć ni sastojci mogu da uključuju, na primer, 5 % dekstroze, 0,9 % fiziološkog rastvora, Ringerov rastvor ili druge pogodne pomoć ne supstance. Intramuskularni preparati, npr. sterilna formulacija pogodnog rastvorljivog oblika soli antitela, mogu se rastvoriti i primeniti u farmaceutskoj pomoć noj supstanci kao što je voda za injekcije, 0,9 % fiziološkom rastvoru ili 5 % rastvoru glukoze.
[0195] U jednoj realizaciji, antitelo pro/latentnog miostatina daje se putem specifi čnim za lokalnu ili ciljanu tehniku lokalnog davanja. Primeri specifičnih ili ciljanih lokalnih tehnika isporuke uključuju različite implantabilne depo izvore antitela pro/latentnog miostatina ili katetere za lokalnu isporuku, kao što su infuzijski kateteri ili kateteri sa iglom, sintetički graftovi, adventistične obloge, šantovi i stentovi ili drugi uređaji za implantaciju, nosači specifični za lokaciju, direktno ubrizgavanje ili direktnu primenu. Videti, na primer, PCT publikaciju br. WO 00/53211 i U.S. 5,981,568.
[0196] Takođe se može koristiti ciljana isporuka terapijskih kompozicija koje sadrže polinukleotid ili ekspresijski vektor. Tehnike isporuke DNK posredstvom receptora opisane su, na primer, Findeis i sar., Trends Biotechnol. (1993) 11: 202; Chiou i sar., Genska terapija: metode i primene direktnog prenosa gena (J. A. Wolff, ur.) (1994); Wu i sar., J. Biol. Chem. (1988) 263: 621; Wu i sar., J. Biol. Chem. (1994) 269: 542; Proc. Natl. Acad. Sci. SAD (1990) 87: 3655; Wu i sar., J. Biol. Chem. (1991) 266: 338.
[0197] Terapeutske kompozicije koje sadrže polinukleotid (npr. one koje kodiraju ovde opisana antitela pro/latentnog miostatina) daju se u opsegu od oko 100 ng do oko 200 mg DNK za lokalnu primenu u protokolu genske terapije. U nekim realizacijama, opsezi koncentracije od oko 500 µg do oko 50 mg, oko 1 µg do oko 2 mg, oko 5 µg do oko 500 mg i oko 20 µg do oko 100 mg DNK ili više mogu se takođe koristiti tokom protokola genske terapije.
[0198] Ovde opisani terapeutski polinukleotidi i polipeptidi mogu se isporučiti pomoć u nosača za isporuku gena. Nosač za isporuku gena može biti virusnog ili nevirusnog porekla (vidi generalno, Jolli, The Generation Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5: 845; Connelli, Human Gene Therapy (1995) 1 : 185; i Kaplitt, Nature Genetics (1994) 6: 148). Ekspresija takvih kodirajuć ih sekvenci može se indukovati korišć enjem endogenih promotera i/ili pojačivača sisara ili heterologa. Izražavanje sekvence kodiranja može biti konstitutivno ili regulisano.
[0199] Poželjni vektori na virusnoj osnovi za isporuku željenog polinukleotida (npr. kodiranje antitela opisanog ovde) i ekspresija u željenoj ć eliji su u okviru ovog pronalaska. Primerni viralni nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, rekombinantne retroviruse (videti npr. PCT publikaciju br. WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; WO 91/02805; US 5,219,740 i US 4,777,127; GB patent br. 2,200,651; i EP patent br.0345242), vektori zasnovani na alfavirusu (npr. vektori virusa Sindbis, šumski virus Semliki (ATCC) VR-67; ATCC VR-1247), virus Ross River (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) i virus venecuelanskog konjskog encefalitisa (ATCC VR-923; ATCC VR-1250; ATCC VR 1249; ATCC VR-532)) , i vektori povezani sa adeno povezanim virusima (AAV) (videti, npr., PCT br. publikacije WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 i WO 95/00655). Administracija DNK povezane sa ubijenim adenovirusom, kako je opisano u Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3: 147 takođe se može angažovati.
[0200] Takođe se mogu primeniti nevirusna sredstva za isporuku i metode, uključujuć i, ali ne ograničavajuć i se na, polikaciono zgusnutu DNK povezanu ili nepovezanu samo sa ubijenim adenovirusom (videti, na primer, Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3 : 147); DNK vezana za ligand (videti, na primer, Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264: 16985); eukariotske ć elije za isporuku ć elija (videti, npr., US 5,814,482; PCT publikacija br. WO 95/07994; WO 96/17072; WO 95/30763; i WO 97/42338) i neutralizacija nukleinskog naboja ili fuzija sa ć elijom opne. Može se koristiti i gola DNK. Primeri metoda uvođenja gole DNK opisani su u PCT publikaciji br. WO 90/11092 i U.S. 5,580,859. Liposomi koji mogu delovati kao nosači gena opisani su u U.S. 5,422,120; PCT publikacija br. WO 95/13796; WO 94/23697; WO 91/14445; i EP 0524968. Dodatni pristupi su opisani u Philip, Mol. Mobilni. Biol. (1994) 14: 2411 i u Woffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91: 1581.
[0201] Određeni režim doziranja, npr. doza, vreme i ponavljanje, korišć en u ovde opisanom postupku, zavisić e od određenog subjekta i istorije bolesti tog subjekta.
[0202] U nekim realizacijama, više od jednog pro/latentnog antitela miostatina ili kombinacije antitela pro/latantog miostatina i drugog pogodnog terapijskog agensa, može se primeniti kod subjekta kome je potrebno lečenje. Antagonist može biti istog tipa ili se međusobno razlikovati. Antitelo pro/latentnog miostatina takođe se može koristiti zajedno sa drugim agensima koji služe za pojačavanje i/ili dopunu efikasnosti sredstava.
[0203] Efikasnost lečenja bolesti/poremeć aja povezan sa miopatijom može se proceniti koriš ć enjem bilo kojom od pogodnih metoda. Na primer, efikasnost lečenja bolesti/poremeć aja povezanih sa miopatijom može se ustanoviti procenom mišić ne slabosti (npr. procenom obrasca i težine slabosti), elektromiografijom, ispitivanjem hemikalija u krvi (npr. procenom elektrolita, procenom endokrinih uzroka, merenjem nivoa kreatinin kinaze, određivanje stope sedimentacije eritrocita i izvođenje antinuklearnih testova na antitela) i procena u vidu biopsije (npr. histolo škom, histohemijskom, elektronsko mikroskopskom, biohemijskom i genetskom analizom).
Kompleti za ublažavanje bolesti/poremeć aja povezanih sa miopatijom
[0204] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje komplete za upotrebu u ublažavanju bolesti/poremeć aja povezanih sa miopatijom. Takvi kompleti mogu da sadrže jedan ili više posuda koje sadrže antitelo pro/latentnog miostatina, npr., bilo koji od ovde opisanih.
[0205] U nekim realizacijama, komplet može sadržati uputstva za upotrebu u skladu sa bilo kojim od ovde opisanih postupaka. Uključena uputstva mogu sadržati opis primene antitela pro/latentnog miostatina za lečenje, odlaganje početka ili ublažavanje ciljne bolesti kao što je ovde opisano. Komplet može dalje sadržati opis izbora pojedinca pogodnog za lečenje na osnovu utvrđivanja da li taj pojedinac ima ciljnu bolest. U još nekim realizacijama, uputstva sadrže opis davanja antitela pojedincu koji ima rizik od ciljne bolesti.
[0206] Uputstva koja se odnose na upotrebu antitela pro/latentnog miostatina uglavnom uklju čuju informacije o doziranju, rasporedu doziranja i načinu davanja za planirani tretman. Posude mogu biti jedinične doze, pakovanja u rinfuzi (npr. pakovanja sa više doza) ili dozne jedinice. Uputstva koja se isporučuju u kompletu pronalaska su obično napisana na nalepnici ili ulošku paketa (npr. list papira koji se nalazi u kompletu), ali takođe su prihvatljiva i mašinski čitljiva uputstva (npr. uputstva na magnetnom ili optičkom disku za skladištenje).
[0207] Nalepnica ili uložak pakovanja označava da se kompozicija koristi za lečenje, odlaganje početka i/ili ublažavanje bolesti ili poremeć aja povezanih sa miopatijom. Mogu se dobiti uputstva za ve žbanje bilo koje od ovde opisanih metoda.
[0208] Kompleti ovog pronalaska su u odgovarajuć em pakovanju. Odgovaraju ć a ambalaža uključuje, ali nije ograničena na, bočice, boce, tegle, fleksibilnu ambalažu (npr. zatvorenu ili plastičnu kesu) i slično. Takođe se razmatraju pakovanja za upotrebu u kombinaciji sa određenim uređajem, kao što su inhalator, uređaj za nazalno davanje (npr. atomizer) ili uređaj za infuziju kao što je mini pumpa. Komplet može imati sterilni otvor za pristup (na primer, posuda može biti vreć a za intravenski rastvor ili bočica sa čepom koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Posuda takođe može imati sterilni otvor za pristup (na primer, posuda može biti vreć a za intravenski rastvor ili bočica koja ima čep koji se može probosti iglom za hipodermijsku injekciju). Najmanje jedno aktivno sredstvo u kompoziciji je antitelo pro/latentnog miostatina, kao što je ovde opisano.
[0209] Kompleti mogu opciono da obezbede dodatne komponente kao što su baferi i interpretativne informacije. Obično se komplet sastoji od posuda i nalepnice ili umetaka za ambalažu na ili povezanim sa posudom. U nekim realizacijama, pronalazak obezbeđuje proizvode koji sadrže sadržaj napred opisanih kompleta.
Analize za otkrivanje pro/latentnog miostatina
[0210] U nekim realizacijama, ovde dati postupci i kompozicije odnose se na metod za otkrivanje pro/latentnog miostatina u uzorku dobijenom od subjekta. Kako se ovde koristi, "subjekat" se odnosi na pojedinačni organizam, na primer, na pojedinačnog sisara. U nekim realizacijama, subjekat je čovek. U nekim realizacijama, subjekat je sisar koji nije čovek. U nekim realizacijama, subjekat je primat koji nije čovek. U nekim realizacijama, subjekat je glodar. U nekim realizacijama, subjekat je ovca, koza, govedo, mačka ili pas. U nekim realizacijama, subjekat je kičmenjak, vodozemac, gmizavac, riba, insekt ili muva. U nekim realizacijama, subjekt je eksperimentalna životinja. U nekim realizacijama, subjekat je genetski inženjeriran, na primer, genetski inženjerski subjekt koji nije čovek. Ispitanik može biti bilo kog pola i u bilo kojoj fazi razvoja. U nekim realizacijama, subjekat je pacijent ili zdrav dobrovoljac.
[0211] U nekim realizacijama, metod za otkrivanje pro/latentnog miostatina u uzorku dobijenom od subjekta uključuje (a) kontakt uzorka sa antitelom pro/latentnog miostatina pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela za antigen, ako je antigen prisutan u uzorku, stvarajuć i tako vezivne komplekse; i (b) određivanje nivoa antitela ili fragmenta koji vezuje antitelo za antigen (npr. odre đivanje nivoa vezivnih kompleksa).
[0212] Kako se ovde koristi, vezni kompleks se odnosi na biomolekularni kompleks antitela (uključujuć i fragmente koji vezuju antigen) vezan za antigen (npr. pro/latentni protein miostatin). Kompleksi vezivanja mogu sadržati antitela sa jednom specifičnošć u ili dva ili više antitela ili fragmente koji vezuju antigen sa različitim specifičnostima. U jednoj realizaciji, vezujuć i kompleks sadrži dva ili više antitela koja prepoznaju različita antigena mesta na istom antigenu. U nekim slučajevima, antitelo se može vezati za antigen, vežuć i za njega druge biomolekule kao što su RNK, DNK, polisaharidi ili proteini. U jednoj realizaciji, vezujuć i kompleks sadrži dva ili više antitela koja prepoznaju različite antigene. U nekim realizacijama, antitelo u vezivnom kompleksu (npr. imobilizovano antitelo vezano za antigen), mo že se i samo vezati, kao antigen za antitelo (npr. detektovano obeleženo antitelo). Dakle, kompleksi vezivanja mogu, u nekim slučajevima, sadržati više antigena i više antitela ili fragmente koji vežu antigen.
[0213] Antigeni prisutni u vezivnim kompleksima mogu ili ne moraju biti u njihovoj prirodnoj in situ konformaciji. U nekim realizacijama, vezujuć i kompleks se formira između antitela i prečiš ć enog proteinskog antigena ili izolovanih proteina koji sadrže antigen, u kojima antigen nije u svojoj prirodnoj in situ konformaciji. U nekim realizacijama, vezujuć i kompleks se formira između antitela i prečiš ć enog proteinskog antigena, u kojem antigen nije u svojoj prirodnoj in situ konformaciji i imobilisan je na čvrstom nosaču (npr. PVDF membrana). U nekim realizacijama, vezivni kompleks se formira sa antitelom i na primer, sa ć elijskim površinskim proteinom koji je prisutan in situ u nativnoj potvrdi (npr. na površini ć elije).
[0214] Antitela u vezujuć im kompleksima mogu ili ne moraju biti detektabilno obele žena. U nekim realizacijama, kompleksi za vezivanje sadrže antitela koja se mogu detektovati i neobeležena antitela. U nekim realizacijama, vezivni kompleksi sadrže detektujuć i obeleženi antigen. U nekim realizacijama, antitela, u kompleksima za vezivanje, imobilišu se na jednom ili više čvrstih nosača. U nekim realizacijama, antigeni, u kompleksima za vezivanje, imobili šu se na jednom ili više čvrstih nosača. Primerni čvrsti nosači su ovde opisani i bić e očigledni stručnjaku u ovoj oblasti. Prethodni primeri kompleksa vezivanja nisu ograničeni. Drugi primeri vezivanja kompleksa bić e očigledni stručnjaku ili prosečnom stručnjaku.
[0215] U bilo kojem od metoda otkrivanja, dijagnoze i prać enja, antitelo (uklju čuju ć i fragmente koji vežu antigen) ili antigen mogu biti konjugovani sa čvrstom površinom nosača, bilo direktno ili indirektno. Metodi konjugacije na čvrste nosače su standardni i mogu se postić i kovalentnom i nekovalentnom interakcijom. Neograničavajuć i primeri konjugacionih metoda uključuju: adsorpciju, umrežavanje, interakcije proteina A/G antitela i interakcije streptavidin-biotin. Drugi metodi konjugacije bić e lako uočljivi prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0216] U nekim aspektima, metodi otkrivanja, dijagnoze i prać enja uklju čuju poređenje nivoa antitela (uključujuć i fragmente koji vežu antigen) vezanog za antigen (npr. pro/latentni miostatin) sa jednim ili više referentnih standarda. Referentni standard može biti, na primer, nivo odgovarajuć eg pro/latentnog miostatina kod subjekta koji ima ili nema pro/latentni mioostatin. U jednoj realizaciji, referentni standard je nivo pro/latentnog miostatina je otkriven u uzorku koji ne sadr ži pro/latentni miostatin (npr. pozadinski nivo). Alternativno, nivo pozadine se može odrediti iz uzorka koji sadrži određeni pro/latentni miostatin, kontaktiranjem uzorka sa nespecifičnim antitelima (npr. antitelima dobijenim iz neimunskog seruma). Zatim, referentni standard može biti nivo pro/latentnog miostatina otkriven u uzorku koji sadrži pro/latentni miostatin (npr. pozitivna kontrola). U nekim slučajevima, referentni standard može biti niz nivoa povezanih sa različitim koncentracijama pro/latentnog miostatina u uzorku i koristan za kvantifikovanje koncentracije pro/latentnog miostatina u test uzorku. Prethodni primeri referentnih standarda nisu ograničavajuć i i drugi odgovaraju ć i referentni standard ć e biti lako uo čljiv prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti. U nekim realizacijama, nivo antitela vezan za pro/latentni miostatin upore đuje se sa nivoom zrelog miostatina. U nekim slučajevima se nivo pro/latentnog miostatina upoređuje sa zrelim miostatinom da bi se utvrdio odnos neaktivnog i aktivnog miostatina u uzorku.
[0217] Nivo pro/latentnog miostatina može se meriti, kako je ovde dato, iz biološkog uzorka. Biološki uzorak odnosi se na bilo koji biološki materijal koji se može dobiti od subjekta ili ć elije. Na primer, biološki uzorak može biti cela krv, plazma, serum, pljuvačka, cerebrospinalna tečnost, urin, ć elije (ili lizatić elija) ili tkivo (npr. normalno tkivo ili tkivo tumora). U nekim realizacijama, biolo ški uzorak je tečni uzorak. U nekim realizacijama, biološki uzorak je uzorak čvrstog tkiva. Na primer, uzorak tkiva može uključivati, bez ograničenja, skeletni mišić , srčani miši ć , masno tkivo, kao i tkivo drugih organa. U nekim realizacijama, biološki uzorak je uzorak dobijen biopsijom. U nekim realizacijama, uzorak čvrstog tkiva može se napraviti od uzorka tečnosti koristeć i rutinske metode u tehnici.
[0218] Biološki uzorak može takođe da sadrži jednu ili više ć elija ć elijske linije. U nekim realizacijama, ć elijska linija uključuje ć elije čoveka, ć elije primata (npr. vero ć elije), ć elije pacova (npr. GH3 ć elije, OC23 ć elije) ili mišje ć elije (npr. MC3T3 ć elije). Postoji čitav niz ljudskih ć elijskih linija, uključuju ć i, bez ograničenja, ć elije humanog embrionalnog bubrega (HEK), HeLa ć elije, ć elije raka iz 60 ć elijskih linija Nacionalnog instituta za rak (NCI60), DU145 (rak prostate), Lncap (prostata) ć elije karcinoma), ć elije MCF-7 (rak dojke), ć elije MDA-MB-438 (rak dojke), ć elije PC3 (rak prostate), ć elije T47D (rak dojke), ć elije THP-1 (akutna mijeloična leukemija), U87 (ć elije glioblastoma), ć elije humanog neuroblastoma SHSI5I (klonirane iz mijeloma) ić elije Saos-2 (rak kostiju).
[0219] Sledeć a realizacija odnosi se na metod za pra ć enje bolesti, stanja ili bilo kog tretmana od njih (npr. miopatija ili lečenje miopatije) kod subjekta koji ima ili rizikuje da ima bolest ili stanje koji sadr ži: (a) dobijanje biološkog uzorka od subjekta, (b) određivanje nivoa pro/latentnog miostatina u biološkom uzorku korišć enjem antitela koje detektuje pro/latentni miostatin, i (c) ponavljanje koraka (a) i (b) jednom ili više puta. Miostatin se koristi kao biomarker za atrofiju mišić a, međutim trenutno dostupne komercijalne metode i reagensi (npr. antitela koja se koriste u ELISA i Western Blots) ili nisu specifi čni za miostatin, detektuju samo zreli miostatin ili uopšte ne detektuju miostatin. Dakle, ovde su dati postupci i reagensi (npr. antitela) za detektovanje pro/latentnog miostatina u kontekstu bolesti i/ili stanja (npr. mišić ne atrofije) u dijagnostičke svrhe. Kao jedan primer, nivo pro/latentnog miostatina može se meriti kod subjekta ili njegovog biološkog uzorka da bi se otkrilo ili nadgledalo napredovanje bolesti ili stanja. Kao drugi primer, nivo pro/latentnog miostatina može se meriti kod subjekta ili njegovog biološkog uzorka kako bi se pratio odgovor na lečenje bolesti ili stanja. Treba imati na umu da se nivo pro/latentnog miostatina može pratiti tokom bilo kog odgovarajuć eg vremenskog perioda, koji se može razlikovati u zavisnosti od bolesti ili stanja, subjekta ili bilo kog režima lečenja kojem subjekat može biti podložan.
[0220] Sledeć a realizacija se odnosi na dijagnostički sastav koji sadrži bilo koje od napred opisanih antitela, fragmente koji vežu antigen, polinukleotide, vektore ili ć elije i opciono pogodna sredstva za detekciju. Antitela su, na primer, pogodna za upotrebu u imunolo škim testovima u kojima se mogu koristiti u tečnoj fazi ili vezati za nosač u čvrstoj fazi. Primeri imunoanaliza koje mogu da koriste antitela su kompetitivni i nekonkurentni imunotestovi u direktnom ili indirektnom formatu. Primeri takvih imunoanaliza su enzimski imunološki test (ELISA), radioimunološki test (RIA), sendvič (imunometrijski test), protočna citometrija, Western test, imunoprecipitacioni testovi, imunohistohemija, imunomikroskopija, imuno-hromatografski test sa bočnim protokom i proteomski nizovi. Antigeni i antitela mogu biti vezani za mnogo različitih čvrstih nosača (npr. nosači, membrana, kolone, proteomski niz, itd.). Primeri čvrstih noseć ih materijala uključuju staklo, polistiren, polivinil hlorid, poliviniliden difluorid, polipropilen, polietilen, polikarbonat, dekstran, najlon, amiloze, prirodne i modifikovane celuloze, kao što su nitroceluloza, poliakrilamidi, agaroze i magnetit. Sastav nosača može biti fiksirana ili suspendovana u rastvoru (npr. zrnca).
[0221] U daljem rešenju, ovde data antitela (uključujuć i fragmente koji vezuju antigen) mogu se takođe koristiti u metodu za procenu ekspresije pro/latentnog miostatina kod subjekta dobijanjem biolo škog uzorka od subjekta koji može biti uzorak tkiva, uzorak krvi ili bilo koji drugi odgovarajuć i uzorak telesne tečnosti. Postupak može obuhvatati kontakt uzorka krvi (cela krv, serum, plazma), uzorka tkiva ili uzorka proteina iz njega izolovanog sa antitelom, pod uslovima koji omoguć avaju stvaranje kompleksa vezivanja između antitela i antigena. Nivo takvih kompleksa vezivanja se tada mo že odrediti bilo kojim pogodnim postupkom. U nekim realizacijama, biološki uzorak se kontaktira sa antitelom pod uslovima pogodnim za vezivanje antitela za pro/latentni protein miostatin, ako je antigen prisutan u uzorku, i formiranje kompleksa vezivanja koji se sastoje od antitela, vezanih za antigen. Ovaj korak kontaktiranja se obi čno izvodi u reakcionoj komori, kao što su cev, otvor sa pločom, membransko kupatilo, posuda za ć elijske kulture, predmet za mikroskop i slično. U nekim realizacijama, antitelo je imobilisano na čvrstom nosaču. U nekim realizacijama, antigen je imobilizovan na čvrstom nosaču. U nekim realizacijama, čvrsti nosač je površina reakcione komore. U nekim realizacijama, čvrsti nosač je od polimerne membrane (npr. nitrocelulozna traka, poliviniliden difluorid (PVDF) membrana, itd.). Mogu se koristiti i drugi odgovarajuć i čvrsti nosači.
[0222] U nekim realizacijama, antitelo je imobilisano na čvrstom nosaču pre kontakta sa antigenom. U drugim realizacijama, imobilizacija antitela se izvodi nakon formiranja kompleksa za vezivanje. U jo š nekim realizacijama, antigen je imobilizovan na čvrstom nosaču pre formiranja vezivnih kompleksa. Reagens za detekciju se dodaje u reakcionu komoru da bi se otkrili imobilisani kompleksi vezivanja. U nekim realizacijama, reagens za detekciju sadrži sekundarno antitelo detektovano obeleženo usmereno protiv antigena. U nekim realizacijama, primarno antitelo je samo po sebi moguć e detektovati i reagensom za detekciju.
[0223] U jednom aspektu, metodi detekcije obuhvataju korake imobilizacije antitela na čvrstu podlogu; nanošenje uzorka (npr. biološkog uzorka ili izolovanog uzorka proteina) na čvrstu podlogu pod uslovima koji omoguć avaju vezivanje antigena za antitela, ako je prisutan u uzorku; uklanjanje vi ška uzorka sa čvrstog nosača; primena detektovano obeleženih antitela pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje detektabilno obeleženih antitela za imobilizovana antitela vezana za antigen; pranje čvrste podloge i ispitivanje prisustva na čvrstoj podlozi.
[0224] U nekim realizacijama, antigen je imobilisan na čvrstom nosaču, kao što je PVDF membrana, pre kontakta sa antitelom u reakcionoj komori (npr. membransko kupatilo). Reagens za detekciju se dodaje u reakcionu komoru da bi se detektovali imobilisani kompleksi vezivanja. U nekim realizacijama, reagens za detekciju sadrži sekundarno antitelo detektovano obeleženo i usmereno protiv antigena. U nekim realizacijama, reagens za detekciju sadrži sekundarno antitelo detektovano obeleženo i usmereno protiv primarnog antitela. Kao što je ovde opisano, detektibilna oznaka može biti, na primer, radioizotop, fluorofor, luminiscentni molekul, enzim, biotinski ostatak, epitopna oznaka ili molekul boje. U nekim realizacijama, primarno antitelo je samo po sebi moguć e detektovati pomo ću reagensa za detekciju. Pogodne nalepnice koje se mogu detektovati su ovde opisane i bić e lako uo čljive nekom od binarnih tehnika.
[0225] Shodno tome, obezbeđeni su dijagnostički kompleti, pogodni za kuć nu ili kliničku upotrebu (služba nege), koji sadrže (a) detektabilno obeležena i/ili neobeležena antitela, kao reagensi za vezivanje antigena (npr. vezivni reagensi pro/latentnog miostatina); (b) reagens za detekciju; i, opciono, (c) kompletna uputstva za upotrebu reagensa za otkrivanje antigena u uzorku. U nekim realizacijama, dijagnostički komplet uključuje antitelo i/ili pro/latentni miostatin imobilizovan na čvrstom nosaču. Bilo koji od ovde opisanih čvrstih nosača pogodan je za ugradnju u dijagnostičke komplete. U poželjnom izvođenju, čvrsti nosač je površina reakcione komore pločastog proreza. Tipično, pločasti prorez je u ploči sa više otvora i ima nekoliko otvora izabranih između: 6, 12, 24, 96, 384 i 1536, ali nije toliko ograničen. U drugim realizacijama, dijagnostički kompleti pružaju detektujuć e obeležena antitela. Dijagnostički kompleti nisu ograničeni na ove realizacije, a druge varijacije u sastavu kompleta bić e lako uo čljive prosečnom stručnjaku u ovoj oblasti.
[0226] Sledeć e specifične realizacije, prema tome, treba shvatiti kao samo ilustrativne koje na bilo koji način ne ograničavaju ostatak pronalaska.
PRIMERI
Primer 1: Stvaranje i izbor antitela
Rezime antitela
[0227] Ab2 je potpuno humano pro/latentnomiostatinsko monoklonsko antitelo IgG4/lambda izotipa koje se vezuje za humani pro/latentni miostatin sa velikim afinitetom (Kd = 3420 pM od ForteBio BLI). Antitelo je sposobno da inhibira proteolitičku aktivaciju pro/latentnog miostatina sa IC50vrednostima u opsegu od 0,5 mikromolara (što je na ili blizu granice ispitivanja). Teoretska molekulska težina polipeptida je 144.736 Da, a njegov teorijski pI je 6.7. Izvršena je optimizacija afiniteta korišć enjem prikaza antitela kako bi se identifikovale varijante višeg afiniteta Ab4 i Ab6. Varijante optimizovane za afinitet su slično konstruisane na ljudskim okvirima izotipa IgG4/lambda.
Tabela 2: Biohemijska svojstva pro/latentnih antitela miostatina
Platforma i identifikacija roditeljskog antitela
[0228] Roditeljsko antitelo Ab1 je identifikovano izborom podataka za prikaz faga, koristeć i pro/latentni miostatin kao primarni antigene za selekciju. Izbor faga i početni skrining izvedeni su korišć enjem baze podataka koja prikazuje konvencionalni scFv u formatu sličnom onom koji su opisali McCafferti i sar. (McCafferti i sar., 1990). Svaka runda selekcije sastojala se od prethodnog uklanjanja (za uklanjanje nespecifičnih antitela na fage), inkubacije sa antigenom, ispiranje, eluiranje i poja čavanje. Selekcije su vršene u više krugova, koristeć i strategiju panninga kako u čvrstoj fazi (biotinilirani antigeni obloženi na imunocevima), tako i u fazi rastvora (biotinilirani antigeni, uhvać eni pomo ć u zrna oblo ženih streptavidinom).
4
[0229] Ukupno je pregledano 10.000 pojedinačnih scFv klonova za vezivanje za pro/latentnog miostatina kroz dva odvojena programa. Prvi program je koristio pro/latentni miostatin kao antigen, dok je drugi program koristio latentni miostatin kao antigen. Sekvencirana je DNK za scFv klonove od zna čaja i identifikovano je 216 jedinstvenih klonova. Pozitivno vezivanje scFv klonova je kontra-skrining za vezivanje za proGDF11 kao i za panel nepovezanih proteina da bi se potvrdila specifi čnost za pro/latentni miostatin. Iz panela jedinstvenih scFv klonova, 101 (od 134 specifičnih klonova GDF8) pretvoreno je u IgG pune dužine (IgG1 izotip) radi dodatne karakterizacije.
[0230] IgG antitela pune dužine su dalje okarakterisana pomoć u ELISA za vezivanje za humane i mi šje oblike pro/latentnog miostatina i GDF11. Antitela su takođe pregledana za vezivanje za pro/latentni miostatin, proTGFb (čovek i miš), zreli faktor rasta miostatina, GDF11 zreli faktor rasta, faktor rasta aktivin A i proaktivin A. Ova antitela su odabrana na osnovu njihove unakrsne reaktivnosti sa pro/latentnim humanim i mišjim miostatinom, bez interakcije sa proteinima GDF11, aktivin ili TGFb.
[0231] Upotrebljena su dva oblika vezivanja epitopa. Prvo su dizajnirani i proizvedeni himerni konstrukti koji su zamenjivali delove proizvoda miostatina i GDF11. Ovi himerni proteini su ispitivani za interakciju sa skrining antitelima pomoć u ELISA. Vezivanje epitopa je izvedeno pomo ć u instrumenta ForteBio BLI, u kojem je biotinilirano pro/latentno antitelo miostatina imobilisano na biosenzorski čip obložen streptavidinom, a unakrsno blokiranje antitela je procenjeno pomoć u senzorskog odgovora. Ovi eksperimenti sa spajanjem epitopa, zajedno sa podacima iz ELISA eksperimenata za vezivanje, omoguć ili su segregaciju naših funkcionalno aktivnih antitela (vidi dole) u tri različite epitopske grupe (videti tabelu 3).
Tabela 3: Rangiranje pet antitela pro/latentnog miostatina IgG1
[0232] Da bi se procenila sposobnost antitela da se vežu i inhibiraju aktivaciju pro/latentnog miostatina, ustanovljeni su brojni biohemijski i ć elijski testovi. Kinetiku vezivanja za pro/latentni miostatin merio je ForteBio Octet, u kojem je biotinilirani supstratni protein imobilizovan na senzorskim čipovima obloženim streptavidinom. Konstante disocijacione ravnoteže kandidata iz skrininga prikazane su u tabeli 3.
[0233] Da bi se izmerila sposobnost IgG-a da inhibiraju miostatinsku signalizaciju, razvijen je test aktivacije miostatina. Proizvedeni su kondicionirani medijumi iz ć elija sa prekomernim izra žavanjem ili mT112 (toloidna proteaza potrebna za aktivaciju miostatina) ili furin (proproteinska konvertaza koja cepa zreli faktor rasta iz prodomena). Posle predinkubacije sa test antitelom, pro/latentni mioostatin ili latentni mioostatin su inkubirani bilo smešom mT112 i furin uslovljenog medija (promiostatin) ili mT112 kondicioniranim medijumom (latentni miostatin). Nakon reakcije proteolize tokom noć i, izmereno je oslobađanje zrelog faktora rasta upotrebom CAGA reporter testa u 293T ć elijama. Antitela su dalje potvrđena reakcijom na dozu, u istom testu, čiji su rezultati prikazani u tabeli 3.
[0234] Pet roditeljskih antitela (Tabela 3) pokazalo je dosledno snažnu selektivnost i aktivnost u svim napred navedenim testovima i dalje je izabrano za dalju karakterizaciju in vivo (diskutovano u Primeru 2). Radi konzistentnosti, rezimiranje vezivanja i aktivnosti ovih antitela prema pro/latentnom miostatinu, jer Ab8 ne prepoznaje latentni miostatin.
[0235] Da bi se utvrdio mehanizam delovanja kandidata na antitela, uzorci su analizirani Western Blotom koristeć i poliklonsko antitelo uzgajano prodomenom miostatina, kao što je prikazano na slici 3. Ovo je omoguć ilo pra ć enje fragmenta (upakovanog) prodomena domena miostatina koji je generisan nakon cepanja mT112. U generaciji ovog fragmenta primeć eno je smanjenje doze zavisno od pove ć anja koncentracije Ab1. Ovaj eksperiment ukazuje na to da antitela u epitopu bin 1 deluju blokirajuć i cepanje pro/latentnog miostatina od porodice toloidnih proteaza. Na osnovu aktivnosti in vitro i in vivo aktivnih antitela pro/latentnog miostatina, Ab1 je izabran kao vodeć i element za dalju optimizaciju, uklju čuju ć i sazrevanje afiniteta, klijanje i analizu proizvodljivosti.
[0236] Na osnovu aktivnosti in vitro i in vivo aktivnih pro/latentnih antitela miostatina, Ab1 je izabran kao vodeć i element za dalju optimizaciju, uključuju ć i sazrevanje afiniteta, klijanje i analizu proizvodljivosti.
Optimizacija Ab1
[0237] Antitelo Ab1 je izabrano za dalju optimizaciju. Afinitet prema pro/latentnom miostatinu optimizovan je korišć enjem prikaza kvasca. Pored toga, sekvenca Ab1 je klijana da bi se smanjila potencijalna odgovornost za imunogenost položaja aminokiselina koji nisu klice unutar okvira ljudskih promenljivih regiona.
Optimizacija afiniteta prema Ab1 prikazom kvasca
[0238] Roditeljsko antitelo Ab1 je optimizovano za vezivanje za pro/latentnog miostatina koristeć i scFv prikazni pristup zasnovan na kvascu. Ukratko, stvorene su tri različite scFv baze podataka za uvođenje tačkastih mutacija u odabrane pozicije CDR na osnovu aminokiselinske frekvencije primeć ene u repertoarima prirodnih ljudskih antitela, koristeć i duboko sekvenciranje antitela koje odgovaraju ljudskim okvirima koje koristi Ab1. Svaka baza podataka je sadržala scFv na osnovu Ab1 sekvence sa mutacijama u jednoj tački uvedene u svakom CDR tako da bi svaka varijanta rezultujuć eg te škog lanca ili lakog lanca imala ukupno tri supstitucije, po jednu u svakom CDR. Tri baze podataka su kori šć ene za sortiranje i odabir na osnovu FACS za identifikaciju skupova klonova sa već im afinitetom vezivanja za pro/latentni miostatin (slika 23). Direktno vezivanje scFv klonova eksprimiranih u kvascu korišć eno je za odabir antitela za konverziju u IgG pune dužine eksprimirane u kulturi ć elija sisara.
[0239] Mnogi od scFv klonova sa već im afinitetom identifikovani u kvasnoj kampanji sadr žali su supstituciju na položaju 28 teškog lanca. Za neke klonove, supstitucija treonina u asparagin rezultirala je ugradnjom nekanonskog motiva N-glikozilacije u CDRH1. Kako N-glikozilacija unutar promenljivog regiona antitela može biti nepoželjna, bilo koji klon koji je sadržao motiv glikozilacije je dalje zamenjen da sadrži alanin na ovom položaju. Kinetika vezivanja za pro/latentni miostatin je zatim procenjena oktetom za svaki od afinitetno optimizovanih konstrukata i upoređena sa onom roditeljskog Ab1 (razmatrano u primeru 2). Svi klonovi su pokazali značajno poveć an afinitet za vezivanje za miostatin, a dva, Ab3 i Ab5, odabrana su na osnovu selektivnog profila vezivanja preko GDF11.
Primarna sekvenca i okosnica pro/latentnog antitela miostatina
[0241] Poravnanje sekvence promenljivih regiona roditeljskog Ab 1 sa njegovim varijantama optimizovanim za afinitet je prikazano ispod. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani su pomoć u Kabat (podvučeno) i IMGT nomenklature (podebljano). Zamene roditeljskog Ab1 prikazane su malim slovima (ispod i SLIKA 24A-24B).
A. Varijabilna regija teškog lanca
[0242]
B. Promenljiva regija lakog lanca
[0243]
Inženjering antitela i obrazloženje izbora izotipa
[0244] U nekim realizacijama, antitelu korisnom za blokadu miostatina nedostajać e efektorska funkcija. Tako je za humanizovani konstrukt odabran region IgG4-Fc. Antitela izotipa IgG4 slabo vezuju komplement C1q i stoga ne aktiviraju značajno komplement. Ova antitela se takođe slabo vezuju za Fcg receptore, što dovodi do neefikasne ili odsustva ć elijski posredovane citotoksičnosti (ADCC) zavisne od antitela.
[0245] Da bi se izbegle potencijalne komplikacije usled razmene Fab-a, za koju se zna da se javlja sa nativnim IgA4 mAb, Ab1 i njegove varijante su projektovane sa stabilizirajuć om mutacijom 'Adair' (Angal, 1993), gde je se serin 228 (EU numeracija; ostatak 241 Kabat numerisanje) pretvara u prolin što rezultira sekvencom šarki sličnom IgG1 (CPPCP (SEK ID BR: 58)). Ova inženjerska Fc-sekvenca se koristi u
4
proizvodnji odobrenih antitela Keitruda, Milotarg i Tisabri, kao i u velikom broju trenutnih klini čkih kandidata za mAb u kasnoj fazi.
Procena rizika od klijanja i imunogenosti
[0246] Roditeljsko antitelo Ab1 i njegove varijante su u potpunosti humani IgG4 (S228P), lambda antitela izvedena iz prikaza faga. Fc deo antitela sadrži jednu stabilizujuć u mutaciju kako bi se sprečila razmena Fab-a (napred opisano). Ne očekuje se da IgG4 Fc ima merljivo vezivanje za Fc gama receptore (videti Primer 2).
[0247] Varijabilni okviri regiona Ab1, izolovani iz potpuno ljudskih nezrelih faga, sadr že pet aminokiselina koje nisu klice (vidi dole i SLIKU 22). Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani su pomoć u Kabat nomenklature i podvučeni. Ostaci bez zametnih linija prikazani su malim slovima.
A. Varijabilna regija teškog lanca
[0248]
B. Varijabilna regija lakog lanca
[0249]
[0250] Da bi se umanjio potencijal za imunogenost, stvorene su dodatne varijante molekula Abl koji supstituišu ostatke neklica u odgovarajuć im aminokiselinama. U nekim realizacijama, supstitucija koja se odnosi na Ab1 može se slično primeniti na Ab3 i Ab4, ili bilo koje ovde opisano antitelo za koje je pogodno.
[0251] Poravnanje promenljivih regiona Ab1 sa njegovim varijantama optimizovanim za afinitet je prikazano ispod. A.) teški lanac, B.) laki lanac. Regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani su pomoć u Kabat (podvučeno) i IMGT nomenklature (podebljano). Zamene okvirnih regiona prisutne u roditeljskom Ab1 prikazane su malim slovima.
A. Promenljiva regija teškog lanca
[0252]
4
B. Promenljiva regija lakog lanca
[0253]
[0254] Otkriveno je da su tri od pet zamena udaljene od CDR regiona zbog čega nemaju uticaj na vezivanje. Prolin na položaju 2 lakog lanca spakuje se nasuprot CDRL3 i zamena za zametnu liniju serina zapravo poboljšava vezivanje za pro/latentni miostatin stabilizacijom CDR konformacije.
[0255] Ukupna antitela su već a od 99 % humanih (izračunata kao 100 % minus % ne-klijavih AA, isključuju ć i CDRH3). Nema hemijskih konjugacija. CDRH2 sekvenca teškog lanca sadrži potencijalnu izomerizacionu odgovornost (Asp-Gli) koja je takođe prisutna u sekvenci klica IgHV3-30.
Primer 2: Farmakološka karakterizacija
In vitro farmakološki testovi
[0256] Ukupno 24 optimizovane Ab1 varijante su izražene i prečišć ene kao IgG4 i ispitivane za poboljšano vezivanje i funkcionalnu aktivnost. Promene ovih molekula uključivale su klijave mutacije roditeljskog promenljivog regiona, zajedno sa mutacijama u CDR-ovima, što je omoguć ilo pove ć ano vezivanje za pro/latentni miostatin na prikazu sazrevanja afiniteta (videti Primer 1).
[0257] Varijante Ab1 su pregledane u nekoliko različitih testova zasnovanih na ELISA, u kojima je ponovo procenjeno vezivanje za promiostatin i latentni protein miostatin (humani, mi šji i cinomolgus), zajedno sa velikim prikazom negativne kontrole proteina da bi se verifikovalo da nespecifi čno vezivanje nije uvedeno kao rezultat sazrevanja afiniteta. Negativne kontrole su uključivale proteine GDF11 (proGDF11, latentni GDF11 i zreli GDF11), proteine TGFb i proteine aktivin (proaktivin). Pored toga, antitela su procenjena na polispecifičnost (što može dovesti do brzog čišć enja) na prikazu sličnom onom objavljenom ranije ( Hotzel et al., 2012). Bilo koja antitela sa značajnim interakcijama sa proteinima negativne kontrole ili sa česticama bakulovirusa na prikazu polispecifičnosti nisu dalje razmatrana kao kandidati za razvojni program.
[0258] 24 optimizovane varijante Ab1 takođe su procenjene u testu aktivacije promiostatina kako bi se utvrdila njihova funkcionalna efikasnost, a vrednosti EC50 iz pogre šnih odgovora na dozu upoređene su sa roditeljskim antitelom Ab1. Već ina antitela imala je ekvivalentne ili pobolj šane vrednosti EC50, sa
4
nekoliko koji su pokazali smanjenu efikasnost u ovom testu. Oni sa smanjenom efikasno šć u u testu aktivnosti isključeni su iz dalje analize.
[0259] Identifikovane su tri varijante Ab1 sa poboljšanim vezivanjem za pro/latentni miostatin uz zadržavanje specifičnosti za pro/latentni miostatin. Podaci o vezivanju i aktivnosti za ove tri varijante i roditeljski molekul Ab1 sumirani su u tabelama 4-7, sekvence su prikazane u primeru 1.
4
Analize biološke aktivnosti ex vivo i in vivo na osnovu ć elija
[0260] Varijacije optimizovane za Ab1 procenjene su u testu aktivacije GDF8 u studiji odgovora na dozu. U ovim eksperimentima, 0,5 µM proMiostatin je prethodno inkubirano sa sve već im količinama ispitnog proizvoda. Nakon ovog koraka pre inkubacije, dodati su kondicionirani mediji iz ć elija HEK293 koji prekomerno eksprimiraju mT112 i furin proteaze da bi se oslobodio zreli faktor rasta iz promiostatina. Nakon inkubacije preko noć i na 30°C, materijal je dodat 293T ć elijama koje nose SMC luciferazni reporter plazmid i zabeležena je aktivnost oslobođenog materijala. Podaci su prikazani na sl. 4.
Selektivnost za miostatin u odnosu na ostale članove porodice TGFb
[0261] Selektivnost antitela kandidata je takođe procenjena i testovima vezivanja i funkcionisanjem kako bi se verifikovao nedostatak unakrsne reaktivnosti na druge članove porodice TGFb. Humani miostatin i GDF11 dele 90 % identiteta u domenu zrelog faktora rasta i 47 % identiteta u prodomenskim regionima. Iz studija mapiranja epitopa utvrđeno je da roditeljski molekul Ab1 prepoznaje epitop na prodomenu promiostatina i latentnom miostatinu, jer su ELISA testovi pokazali vezivanje ovog antitela za konstrukciju koja se sastoji od prodomena domena miostatina. Iako prodomeni miostatina i GDF11 imaju manje od 50 % identiteta i ne očekujuje se značajna unakrsnu reaktivnost, pri čemu je pažljivo procenjena specifičnost olovnih antitela.
[0262] Razvijen je osetljivi test za otkrivanje interakcija između antitela od značaja i reagensa za negativnu kontrolu. U ovom testu, biotinilirani proGDF11 ili biotinilirani promiostatin imobilizovan je na senzoru obloženog ForteBio BLI streptavidinom, koji je nanesen na proreze koje sadr že 30 µg/mL antitela. Interakcije analita sa proteinom imobilisanim na čipu mere se veličinom odgovora biosenzornog čipa. Odgovor biosenzora nakon 5 minuta udruživanja (signal zasić enja za proGDF8) upoređen je između dva antigena i izražen kao procenat odgovora na vezivanje za GDF8. Sva antitela su imala minimalne interakcije sa proGDF11, u poređenju sa robusnim događajima vezivanja izmerenim za promiostatin.
4
Tabela 8: Interakcije sa proGDF 11 pri visokim koncentracijama molekula kandidata
[0263] Kandidati za antitela su takođe ocenjeni u testu aktivacije GDF11. U ovom testu, 50 nM proGDF 11 je prethodno inkubirano sa rastuć im koncentracijama antitela. Nakon predinkubacije, kondicionirani medijum iz ć elija HEK293 koji prekomerno eksprimiraju BMP-1 (proteaza porodice toloida) i PCSK5 ( član porodice furin specifičan za GDF11) dodat je da proteolitički aktivira proGDF 11. Posle inkubacije preko noć i na 30°C, procenjuju se reakcione smeše za aktivnost GDF11 u raportnoj ć elijskoj liniji zasnovanoj na SMAD-u. Kao što je prikazano u tabeli 8, antitela miostatina ne inhibiraju aktivaciju proGDF11, dok antitelo pozitivne kontrole je zavisno od doze inhibiciju aktivacije GDF11.
[0264] Afiniteti vezivanja kandidata za antitela određeni su korišć enjem ForteBio Octet QKe sistema za umakanje i čitanje bez obeležavanja korišć enjem interferometrije biosloja. Antigeni su imobilizovani na biosenzore (biosenzori obloženi streptavidinom za proGDF8, proGDF11 i proaktivin; direktno aminsko povezivanje za sve ostale) u svakom eksperimentu i antitela/konstrukcije su predstavljene u rastvoru u visokoj koncentraciji (50 µg/mL) za merenje vezivanja interakcije.
[0265] Afiniteti vezivanja antitela su određeni pomoć u ForteBio Octet QKe sistema za umakanje i čitanje bez etikete, koristeć i bioslojnu interferometriju. Humani proGDF8, latentni GDF8, proGDF11 i proaktivin su biotinilirani i imobilizovani u biosenzore obložene streptavidinom (ForteBio). Zreli faktori rasta su imobilisani direktnim spajanjem amina na amin reaktivnih vrhova prema uputstvima proizvo đača (ForteBio). U svakom eksperimentu, antitela/konstrukti su predstavljeni u rastvoru u jednoj visokoj koncentraciji (50 µg/mL) za merenje interakcija vezivanja. Faktori rasta su kupljeni iz R&D sistema i proizvedeni su biotinilirani proteini kako je opisano.
Tabela 9a: Poređenje antitela za vezivanje za različite oblike nekoliko članova porodice TGFb.
[0266] Rezultati studije o vezivanju antigena sumirani su u Tabeli 9a. Eksperimenti bez vidljivog vezivanja beleže se znakom minus (-). Postoje neke izračunate vrednosti Kd koje su prilagođene podacima sa lošim odgovorom na vezivanje, što je u tabeli naznačeno kao slabo nespecifično vezivanje (*).
[0267] Kako je uzorak proGDF8 korišć en u Tabeli 9a sadržao približno 10-15 % latentnog GDF8, upotrebljen je zaseban eksperiment da se potvrdi specifično vezivanje proGDF8 za humane i mišje antigene GDF8. Pored toga, procenjen je i afinitet vezivanja za Ab2 i AbMio, grundiran GDF8, u kome se proGDF8 proteolitički cepa i proprotein konvertazom i toloidna proteaza. Za ove eksperimente, homogeni preparat humanog proGDF8 je prečiš ć en iz stabilno integrisanih 293 ć elija kultivisanih u prisustvu 30 µM dekanoil-RVKR-CMV. Grundirani humani GDF8 je proizveden in vitro cepanjem proGDF8 koristeć i kondicionirani
4
medijum iz mT112 ć elija koje prekomerno eksprimiraju i prečiš ć ene furin proteaze. U eksperimentima vezivanja sa ovim proteinima, korišć eno je 150 nM Ab2 ili AbMio za zasi ć enje mesta imobilizacije na vrhovima Fc čoveka (ForteBio), a procenjeno je povezivanje i disocijacija 150 nM analita.
[0268] Analiza afiniteta vezivanja za mišje proteine je takođe procenjena i prikazana je u tabeli 9b. Mišji proGDF8 protein je proizveden uklanjanjem svih zrelih i latentnih mi šjih GDF8 iz uzorka negativnom selekcijom antitelom koje čvrsto prepoznaje latentni i zreli GDF8 (AbMio2). 50 nM antitela je korišć eno za zasić enje anti-humanog vrha Fc (ForteBio). U početku su sva antitela testirana na jednu koncentraciju od 200 nM mišjeg proGDF8, mišjeg latentnog GDF8 i zrelog GDF8. Ako je primeć eno vezivanje, određena je vrednost Kd imobilizacijom antitela kako je prethodno opisano i kori šć enjem analita u titraciji od 200 do 0,82 nM trostrukim razblaženjima. Kd je određen korišć enjem globalnog uklapanja sa ForteBio softverom za analizu podataka 8.2. Za vezivanje za zreli miostatin, 5 ug/ml faktora rasta (R&D sistemi) je vezano za aminske reaktivne senzorske vrhove (ForteBio) u acetatnom puferu na pH 5. Sva antitela su u po četku testirana na 333 nM za vezivanje za ovaj senzor povezan sa miostatinom. Zatim su antitela koja su pokazala vezivanje testirana u koncentracijama u rasponu od 333 do 1,37 nM trostrukim razbla ženjima. Globalno prilagođavanje je korišć eno za određivanje Kd interakcije pomo ć u ForteBio analize podataka 8.2.
Tabela 9b: Poređenje antitela za vezivanje za različite oblike humanog i mišjeg GDF8.
[0269] Rezultati studije vezanja antigena sumirani su u Tabeli 9b. Eksperimenti bez vidljivog vezivanja beleže se znakom minus (-). Neke vrednosti, označene kao <1 E-12, imale su vrlo spore stope disocijacije, zbog čega visoki afinitet nije mogao biti kvantifikovan. Iznenađujuć e, AbMio nije uspeo da prepozna rekombinantni proGDF8, što se razlikuje od rezultata zabeleženih u Latres i sar. 2015, u kojima su autori izvestili o povezanosti AbMio sa proGDF8 u eksperimentu imuno-precipitacije iz seruma mi ševa kojima je dozirano antitelo koje je moglo proizvode artefakte. Još jedan iznenađujuć i rezultat je interakcija između Ab2 i grundiranog GDF8, kompleksa GDF8 sa prodomenom cepanom od toloida. Ovaj rezultat je neočekivan jer Ab2 blokira toloidno cepanje prodomena i sugeri še da interakcija Ab2 sa proGDF8 i latentnim GDF8 ne zahteva netaknuto mesto cepanja toloida.
Procena funkcionalnosti Fc-regiona
[0270] U nekim realizacijama terapija pro/latentnim antitelom miostatinom uklju čuje vezivanje za rastvorljivi cilj (pro/latentni miostatin) i sprečavanje proteolitičke aktivacije. U nekim realizacijama, citotoksičnost i fiksiranje komplementa, zavisno od ć elija, zavise od antitela, nisu uključeni u ovaj proces. Ab1 i njegove srodne varijante projektovane su tako da sadrže IgG4-Fc region. Podrazumeva se da IgG4 antitelima generalno nedostaje efektorska funkcija zbog slabog vezivanja za komponentu komplementa C1q i Fcg receptore.
[0271] Da bi se demonstrirao smanjeni kapacitet efektorske funkcije, Ab1 i srodna antitela su testirana na vezivanje za CD64 (FcgRI) i C1q pomoć u ELISA. Za poređenje, takođe je pripremljena IgG1 varijanta Ab1. U ovom testu, sva IgG4 antitela pokazala su znatno slabije vezivanje (10 do 20 puta) za CD64 i C1q u poređenju sa IgG1. Vrednosti relativnog vezivanja na EC50 navedene su u tabeli 10.
Tabela 10: Relativni afiniteti vezivanja Ab2 i srodnih antitela na CD64.
[0272] Očigledni afiniteti vezivanja Ab1 i njegovih srodnih varijanti za CD64 i C1q sli čni su drugim antitelima za IgG4 klinički kandidat i znatno su smanjeni u poređenju sa antitelima izotipa IgG1. Na osnovu biologije IgG4 antitela, zaključuje se da antitela pro/latentnog miostatina neć e indukovati zna čajnu efektorsku funkciju in vivo.
Efikasnost na životinjskim modelima
[0273] Na osnovu karakterizacije in vitro, izabrana su četiri antitela za ispitivanje u in vivo studiji (Ab7, Ab1, Ab8 i Ab9). Cilj studije bio je da se proceni sposobnost ova četiri kandidovana antitela da modulišu mišić nu masu miševa. Pet (5) grupa često (10) ženskih SCID miševa primalo je testni produkt intraperitonealnom (IP) injekcijom jednom nedeljno 0, 7, 14, 21, 28. i 35. dana. Pre primene testnih produkata (Dan 0), sve životinje su podvrgnute proceni snage prjanjanja. Procena snage prjanjanja izvršena je i poslednjeg dana studije (dan 42). Dana 0, krv je sakupljana putem retro-orbitalnog krvarenja radi procene kompletne krvne slike (CBC). Nakon doziranja, životinje su svakodnevno procenjivane na osnovu telesne težine i opštih zdravstvenih zapažanja. Na dan 42, nakon procene snage prjanjanja, životinje su žrtvovane predoziranjem CO2i krv je sakupljana srčanom punkcijom za procenu CBC. Dodatna krv je prikupljena za pripremu plazme. Razna tkiva su izolovana i izvagana. Prikupljeni mi šić i bili su: gastroknemius, pektoralis, soleus, triceps, tibialis anterior, kvadriceps (rectus femoris) i dijafragma. Prikupljeni organi bili su: srce, bubreg, slezina, jetra i ingvinalno belo masno tkivo. Sva tkiva su izvagana i zamrznuta, osim mišić a gastroknemije koji su fiksirani u formalinu (noga 1) i OCT (noga 2) za histolo šku analizu.
Rezime
[0274] Podaci o srednjem dnevnom procentu promene težine za životinje u studiji SCH-02 prikazani su na sl. 6. Životinje u svih pet grupa su se debljale nedeljno. Životinje lečene antitelom Ab1 imale su najveć i porast telesne težine (14,6 %) kao što je prikazano na sl. 6. Samo životinje tretirane sa Ab1 imale su statistički značajan porast srednjeg procenta promene telesne težine u poređenju sa životinjama u kontrolnoj grupi nosača (PBS) (slika 6).
[0275] Ponderi za raščlanjene mišić a prikazani su na sl. 7 i 8. Životinje tretirane sa Ab1 imale su statistički značajno poveć anje težine gastroknemije (slika 7A) i dijafragme (slika 8B) u poređenju sa životinjama tretiranim nosačima (PBS), 27,6 %, odnosno 49,8 %. Dodatni mišić i životinja tretiranih sa Ab1 pokazali su porast težine u poređenju sa PBS kontrolom, ali ove razlike nisu bile statistički značajne. Nije bilo statistički značajnih razlika između tretiranih grupa za srednje težine tkiva srca, slezine, bubrega, jetre i masnog tkiva.
Studija odgovora na dozu SCID
[0276] U in vivo studiji (napred) životinje dozirane sa Ab1 od 25 mg/kg jednom nedeljno tokom 6 nedelja pokazale su statistički značajno poveć anje telesne težine i težine miši ć a (gastroknemius i dijafragma) u poređenju sa životinjama doziranim nosačem (PBS). Ova aktivnost Ab1 za poveć anje miši ć a je dalje detaljnije istražena u studiji odgovora na dozu na SCID miševima. U ovoj studiji, da bi se veličina efekta na mišić nu masu mogla pove ć ati pove ć anjem doze Ab1 na čak 60 mg/kg/nedelja i da bi se veličina efekta na mišić nu masu mogla smanjiti smanjenjem doze ispitani su Ab1 do samo 2 mg/kg/nedelja. U ovoj studiji aktivnost Ab1 je upoređena sa još dva antitela (Ab8, koja je prvobitno testirana u studiji napred opisanoj
1
za Ab10).
[0277] Deset (10) grupa od deset (10) ženki SCID miševa primilo je primenu testiranog produkta intraperitonealnom (IP) injekcijom (10 ml/kg) dva puta nedeljno na dane 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21. i 24. Doze ispitnih produkata su sledeć e: Ab1 (30 mg/kg, 10 mg/kg, 3 mg/kg i 1 mg/kg), Ab10 (10 mg/kg i 3 mg/kg) i Ab8 (10 mg/kg i 3 mg/kg). Kontrolnim grupama su dozirane PBS i IgG-kontrola (30 mg/kg). Grupe za tretman opisane su u tabeli 11. Životinje su na početku studije imale 10 nedelja. Telesna težina je merena na dan -4 i dva puta nedeljno tokom studije, što odgovara danima doziranja. Parametri sastava telesne mase (masa masti, nemasna masa i sadržaj vode) izmereni su pomoć u Echo MRI (QNMR) dana -4, 7, 14, 21. i 28. Trideset (30) dana nakon prve doze antitela, životinje su žrtvovane preko predoziranja CO2i krv je sakupljana srčanom punkcijom za procenu CBC i pripremu plazme. Pored toga, po zavr šetku studije, različita tkiva su izolovana i izvagana. Prikupljeni mišić i su: gastroknemius, soleus, tibialis anterior, kvadriceps (rectus femoris) i dijafragma. Mišić i su secirani i na desnoj i na levoj nozi ispitivanih mi ševa. Za analizu su kombinovane težine pojedinačnih mišić a obe noge i prosečna težina miši ć a u gramima je izračunata. Ostala prikupljena tkiva su: srce, bubreg, slezina, jetra i masno tkivo. Sva tkiva su izvagana, a zatim zamrznuta, osim mišić a gastroknemije koji su fiksirani u formalinu (leva noga) i OCT (desna noga) za histološku analizu.
Tabela 11: Izgled studije
[0278] Podaci o srednjem procentu promene težine i srednjim procentima promene čiste mase za životinje lečene nosačem (PBS), IgG kontrola i različite doze Ab1 prikazani su na sl. 9. Životinje tretirane Ab1 u dozama od 20 i 60 mg/kg/nedelja imale su značajno poveć anje telesne težine 28. dana studije u poređenju sa životinjama tretiranim sa IgG kontrolom, 15,3 %, odnosno 14,4 % (slika 9A). Sve četiri grupe životinja tretirane sa Ab1 (doze od 60, 20, 6 i 2 mg/kg/nedelja) imale su statistički značajno poveć anje čiste mase 28. dana studije u poređenju sa životinjama tretiranim sa IgG kontrolom, 14,1 %, 12,4 %, 17,1 %, odnosno 15,5 % (slika 9B).
[0279] Tegovi za četiri mišić a (kvadriceps, gastroknemius, tibialis anterior i dijafragma) ucrtani su na sl.
10. Takođe je raščlanjen i soleus mišić , ali mala veličina miši ć a rezultirala je izuzetno promenljivim skupom podataka. Životinje lečene svim dozama Ab1 imale su statistički značajno poveć anje miši ć ne težine u poređenju sa kontrolnim životinjama IgG (slika 10). Srednji procenat promena u mišić noj masi u poređenju sa IgG kontrolom prikazan je iznad odgovarajuć e trake na svakom grafikonu mi ši ć a. Prosečni procenat promene težine za mišić e kvadricepsa kretao se od 20,5 % za najve ć u dozu do 10,7 % za najnižu dozu (slika 10A). Prosečni procenat promena težine za gastroknemius mišić e kretao se od 17,7 % za najveć u dozu do 15,9 % za najnižu dozu (slika 10B). Prosečni procenat promena težine za tibialis prednji mišić kretao se od 24,0 % za najvišu dozu do 18,0 % za najnižu dozu (slika 10C). Srednji procenat promene težine dijafragmalnog mišić a bio je ve ć i od 30 % za sve dozne grupe (slika 10D). Nije bilo statistički značajnih razlika između tretiranih grupa za srednje težine tkiva srca, slezine, bubrega, jetre i masnog tkiva.
Abl tretman u modelu atrofije mišić a izazvanog deksametazonom
[0280] S obzirom na sposobnost antimiostatinskog antitela Ab1 da gradi mi šić nu masu kod zdravih SCID miševa, utvrđeno je da li tretman Ab1 takođe može zaštititi životinje od tretmana koji indukuju atrofiju
2
mišić a. Utvrđen je model atrofije miši ć a izazvane kortikosteroidima tretiranjem životinja dve nedelje deksametazonom u vodi za pić e. Odabrana doza (2,5 mg/kg/dan) uspela je da izazove značajno smanjenje čiste telesne mase i mase pojedinačnih mišić a zadnjih udova. U slede ć em eksperimentu životinje su tretirane različitim dozama Ab1 da bi se utvrdilo da li se mogu zaštititi životinje od ove atrofije mišić a izazvane deksametazonom.
[0281] U ovoj studiji, osam (8) grupa od deset (10) muških miševa (C57BL/6) bilo je uključeno u studiju sa 13,5 nedelja starosti. Počev od 0 dana studije, miševi su dobivali ili normalnu vodu za pić e (grupe 1-4) ili vodu koja sadrži deksametazon (grupe 5-8). Testni produkti su davani intraperitonealnom (IP) injekcijom (10 ml/kg) dva puta nedeljno na dane 0, 3, 7 i 10. Testni produkti i doze su bili sledeć i: PBS (grupe 1 i 5), 10 mg/kg IgG Ctl (grupe 2 i 6), 10 mg/kg Ab1 (grupe 3 i 7) i 1 mg/kg Ab1 (grupe 4 i 8). Grupe za lečenje opisane su u tabeli 12. Telesna težina je merena najmanje dva puta nedeljno tokom studije. Parametri sastava telesne mase (masa masti, nemasna masa i sadržaj vode) izmereni su pomoć u Echo MRI (QNMR) dana -1, 6 i 13. Četrnaest (14) dana nakon prve doze antitela, životinje su žrtvovane predoziranjem CO2a krv je sakupljana srčanom punkcijom za pripremu plazme. Pored toga, po završetku studije, različita tkiva su izolovana i izvagana. Prikupljeni mišić i su: gastroknemius, soleus, tibialis anterior, kvadriceps (rectus femoris) i dijafragma. Mišić i su secirani i na desnoj i na levoj nozi ispitivanih mi ševa. Za analizu su kombinovane težine pojedinih mišić a i izračunata je prosečna težina miši ć a u gramima. Ostala prikupljena tkiva su: srce, bubreg, slezina, jetra i masno tkivo. Sva tkiva su izvagana, a zatim smrznuta, osim mi šić a gastrocnemiusa koji su fiksirani u formalinu (leva noga) i OCT (desna noga) za histolo šku analizu.
Tabela 12: Grupe lečenja za studiju modela atrofije izazvane deksametazonom
[0282] U ovom eksperimentu utvrđeno je da li tretiranje miševa antimiostatin antitelom Ab1 može zaštititi životinje od atrofije mišić a izazvane kortikosteroidima. Tokom studije telesna težina je merena QNMR dva puta nedeljno, a čista masa na dane -1, 6 i 13. Srednji procenat promene telesne mase i srednji procenat promene nemasne mase za životinje u nebolesnoj kontrolnoj grupi (grupa 1) i grupe tretirane deksametazonom (grupe 5-8) su prikazane na sl. 11. Nije bilo značajnih razlika u srednjem procentu promene telesne težine između bilo koje od ovih grupa za lečenje 14. dana (slika 11A). Tretman miševa deksametazonom tokom dve nedelje doveo je do značajnog smanjenja mršave telesne mase (grupe 5 i 6) u poređenju sa kontrolnom grupom (grupa 1) kojoj je data normalna voda za pić e (slika 11B). Međutim, miševi tretirani i deksametazonom i antitelom Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno (grupa 7) nisu pokazali značajnu razliku u procentima promene u mršavoj telesnoj masi 14. dana studije u poređenju sa kontrolnom grupom (grupa 1). Životinje tretirane Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno, ali ne i 2 mg/kg/nedeljno, pokazale su značajnu razliku u procentima promene u mršavoj telesnoj masi 14. dana u poređenju sa bilo kojom kontrolnom grupom tretiranom deksametazonom (grupe 5 i 6).
[0283] Na kraju dvonedeljnog tretmana deksametazonom i testnih produkata, pojedina čni mišić i su secirani i izvagani. Podaci o težini za dva mišić a (gastroknemius i kvadriceps) prikazani su na sl. 12A-12B. Životinje koje su dobile deksametazon putem vode za pić e, a takođe su dobile ili PBS ili IgG kontrolno antitelo, pokazale su značajnu atrofiju u mišić ima gastroknemija i kvadricepsa (grupe 5 i 6) u poređenju sa nebolesnom kontrolnom grupom (grupa 1). Životinje tretirane i deksametazonom i Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno (grupa 7), ali ne i 2 mg/kg/nedeljno, pokazale su značajnu razliku u težini mišić a u poređenju sa bilo kojom kontrolnom grupom tretiranom deksametazonom (grupe 5 i 6 ). Pored toga, miševi tretirani i deksametazonom i antitelom Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno (grupa 7) nisu pokazali značajnu razliku u težini gastroknemije i kvadricepsa u poređenju sa neobolelom kontrolnom grupom (grupa 1).
Srednja procentualna razlika u težini mišić a svake grupe u poređenju sa srednjom težinom miši ć a kontrolne grupe (grupa 1, PBS i voda) prikazana je na sl. 12C-12D. Procenat smanjenja mase gastroknemija izazvan tretmanom deksametazonom u grupama PBS i IgG Ctl iznosio je 16,5 %, odnosno 18,9 %. Nasuprot tome, životinje lečene i deksametazonom i 20 mg/kg/nedeljno Ab1 imale su samo 4,0 % smanjenja mišić ne mase gastroknemija, što se statistički nije razlikovalo od neobolele kontrolne grupe (grupa 1). Dok su životinje lečene i deksametazonom i 2 mg/kg/nedeljno Ab1 (grupa 8) imale samo 10 % smanjenja mišić ne mase gastrocnemiusa, smanjenje miši ć ne mase za ovu grupu nije statistički različito od smanjenja za PBS i IgG kontrolne grupe (grupe 5 i 6). Slični rezultati su viđeni za mišić e kvadricepsa (slika 12D).
Tretman Ab1 u modelu atrofije mišić a izazvanog livenjem
[0284] S obzirom na sposobnost antimiostatinskog antitela Ab1 da gradi mi šić nu masu kod zdravih SCID miševa, ispitivano je da li tretman Ab1 takođe može zaštititi životinje od tretmana koji izazivaju atrofiju mišić a. Model disusne atrofije uspostavljen je stavljanjem desne noge mi ševa tokom dve nedelje. Stavljanje desne noge u položaj plantarne fleksije za ovaj vremenski period uspeo je da izazove značajno smanjenje mase pojedinačnih mišić a zadnjih udova. U slede ć em eksperimentu životinje su tretirane različitim dozama Ab1 da bi se utvrdilo u kojoj meri štiti životinje iz ovog livenja kojima je izazvana atrofija mišić a.
Tabela 13: Grupe lečenja za ispitivanje modela atrofije izazvanog livenjem
[0285] U ovoj studiji, osam (8) grupa od deset (10) muških miševa (C57BL/6) bilo je uključeno u studiju sa 14,5 nedelja starosti. Počev od 0-og dana studije, miševi su stavljeni pod anesteziju, dok je gips stavljen na desni zadnji ugao noge u položaju plantarne fleksije (grupe 5-8). Kontrolne grupe (grupe 1-4) takođe su stavljene pod anesteziju, ali nije stavljen gips na zadnjem udu. Testni produkti su davani intraperitonealnom (IP) injekcijom (10 ml/kg) dva puta nedeljno na dane 0, 3, 7 i 10. Testni produkti i doze su bili sledeć i: PBS (grupe 1 i 5), 10 mg/kg IgG Ctl (grupe 2 i 6), 10 mg/kg Ab1 (grupe 3 i 7) i 1 mg/kg Ab1 (grupe 4 i 8). Grupe za lečenje opisane su u tabeli 13. Telesna težina je merena najmanje dva puta nedeljno tokom studije. Parametri sastava telesne mase (masa masti, nemasna masa i sadr žaj vode) izmereni su Echo MRI (QNMR) dana -1, 7 i 14. Četrnaest (14) dana nakon prve doze antitela, životinje su žrtvovane putem predoziranja CO2a krv je sakupljana srčanom punkcijom za pripremu plazme.
[0286] Pored toga, različita tkiva su izolovana i izvagana. Prikupljeni mišić i bili su: gastroknemius, soleus, plantaris, tibialis anterior i kvadriceps (rectus femoris). Za analizu su prikupljeni te žine pojedinih mišić a desnog zadnjeg udova životinja. Ostala prikupljena tkiva su: srce, masno tkivo i slezina. Sva tkiva su izvagana, a zatim naglo zamrznuta, osim mišić a gastroknemija koji su fiksirani u formalinu za histološku analizu.
Rezime
[0287] U ovom eksperimentu je ispitivano da li je lečenje miševa antimiostatinskim antitelom Ab1 moglo zaštititi miševe od atrofije mišić a izazvane livenjem desnog zadnjeg ekstremiteta. Tokom studije, telesna težina je merena dva puta nedeljno, a čista masa je merena QNMR-om na dane -1, 7 i 14. Srednji procenat promene težine i srednji procenat podataka o promeni čiste mase za životinje u nebolesnoj kontrolnoj
4
grupi (grupa 1 ) i grupe koje su livene dve nedelje (grupe 5-8) prikazane su na sl. 13. Livenje desnog zadnjeg ekstremiteta nije imalo negativnih efekata na poveć anje telesne te žine (slika 13A) i bilo kakve razlike u mršavoj masi grupa nisu bile značajne (slika 13B).
[0288] Na kraju dvonedeljnog ispitivanja pojedinačni mišić i su secirani i izvagani. Podaci o težini za dva mišić a (gastroknemius i kvadriceps) prikazani su na sl. 14A-14B. Životinje kojima je noga izlivena takođe su dobile ili PBS ili IgG kontrolno antitelo i pokazale su značajnu atrofiju u mišić ima gastroknemija i kvadricepsa (grupe 5 i 6) u poređenju sa nelivenom kontrolnom grupom (grupa 1). Životinje koje su i livene i dozirane sa Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno (grupa 7), ali ne i 2 mg/kg/nedeljno, pokazale su značajnu razliku u težini mišić a u poređenju sa bilo kojom od livenih kontrolnih grupa (grupe 5 i 6). Pored toga, liveni miševi koji su tretirani antitelom Ab1 pri 20 mg/kg/nedeljno (grupa 7) nisu pokazali značajnu razliku u težini gastroknemija i kvadricepsa u poređenju sa nelivenom kontrolnom grupom (grupa 1). Srednja procentualna razlika u težini mišić a svake grupe u poređenju sa srednjom težinom miši ć a nelivene kontrolne grupe (grupa 1) prikazana je na sl. 14C-14D. Procenat smanjenja mase gastroknemija izazvan livenjem u grupama PBS i IgG Ctl iznosio je 22,8 %, odnosno 23,5 %. Nasuprot tome, liveni mi ševi koji su lečeni sa 20 mg/kg/nedeljno Ab1 imali su samo 10,0 % smanjenja mišić ne mase gastroknemije. Utvrđeno je da se ova razlika statistički razlikuje od livenih kontrolnih grupa koje su primale PBS i IgG Ctl antitela (grupe 5 i 6). Smanjenje mišić ne mase kod livenih miševa lečenih 2 mg/kg/nedeljno Ab1 nije se statistički razlikovalo od smanjenja za PBS i IgG kontrolne grupe (grupe 5 i 6). Slični rezultati su dobijeni za mišić e kvadricepsa (slika 14D).
[0289] Struktura domena promiostatina i latentnog miostatina, sa naznačenim mestima cepanja proteaze, prikazana je na slici 16A. Primer delimično proprotein konvertaze odcepljenog promiostatina na SDS PAGE gelu prikazan je na slici 16B. Pod uslovima smanjenja, proteinske trake sastojale su se od promiostatin monoma (~ 50 kD), prodomena (~ 37 kD) i faktora rasta (12,5 kD).
[0290] Ab1 se specifično vezuje za promiostatin i latentni miostatin, bez primene vezivanja za druge članove TGFb superfamilije, naročito za odgovarajuć e oblike GDF11 (slika 17A). Ab1 je administriran u visokoj koncentraciji (50 ug/ml) na Forte-Bio BLI vrhove obložene naznačenim antigenom i mereno je uključivanje i isključivanje kako bi se dobila približna vrednost Kd. Veličina biosenzorskog odgovora, koji ukazuje na vezujuć i događaj, grafički je predstavljena crnim trakama, a izračunati Kd je označen narandžastom bojom. Dalje, Ab1 blokira aktivaciju promiostatina, ali ne i proGDF11 (slika 17B).
Studija odgovora na dozu SCID sa Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6
[0291] Prethodne studije in vivo sa Ab1 pokazale su da Ab1 može poveć ati miši ć nu masu kod zdravih životinja, kao i sprečiti gubitak mišić a na mišjim modelima atrofije miši ć a (deksametazon i atrofija izazvana livenjem). Napori inženjeringa antitela identifikovali su tri antitela sa in vitro karakteristikama koja su bila bolja od Ab1. U ovoj studiji, na SCID miševima, in vivo aktivnost ovih antitela je upoređena u tri različite doze sa već utvrđenom aktivnoš ć u Ab1.
[0292] Četrnaest (14) grupa od osam (8) ženskih SCID miševa primilo je testni produkt intraperitonealnom (IP) injekcijom (10 ml/kg) dva puta nedeljno na dane 0, 3, 7, 10, 14, 17, 21 , i 24. Doze testnih produkata su sledeć e: Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 su davani u 3 različite doze (10 mg/kg, 1 mg/kg i 0,25 mg/kg), a IgG-Ct1 antitelo je dato u dozi od 10 mg/kg. Grupe za lečenje opisane su u tabeli 14. Životinje su na početku studije imale 10 nedelja. Telesna težina je merena dva puta nedeljno tokom studije, u skladu sa danima doziranja. Parametri sastava telesne mase (masa masti, nemasna masa i sadr žaj vode) mereni su Echo MRI (QNMR) dana 0, 7, 14, 21 i 28. Dvadeset i osam (28) dana nakon prve doze antitela, životinje su žrtvovane putem predoziranja CO2i krv je sakupljana srčanom punkcijom za pripremu plazme.
[0293] Pored toga, različita tkiva su izolovana i izvagana. Prikupljeni mišić i su: gastrocnemius, soleus, tibialis anterior, kvadriceps (rectus femoris), ektensor digitorum longus i dijafragma. Mi šić i su secirani i na desnoj i na levoj nozi ispitivanih miševa. Za analizu su kombinovane težine pojedinih mišić a obe noge i izračunata je prosečna težina mišić a u gramima. Ostala prikupljena tkiva su: srce, bubreg, slezina, jetra i masno tkivo. Sva tkiva su izvagana, a zatim zamrznuta, osim levih mišić a gastroknemija, koji su fiksirani u formalinu za histološku analizu.
Tabela 14: Grupe za lečenje za ispitivanje modela odgovora na dozu
[0294] Podaci o srednjim procentima promene čiste mase (od dana 0) za životinje lečene nosačem (PBS), IgG kontrolom i različitim dozama Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 prikazani su na sl. 15. Životinje tretirane sa Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 pri nivou doze od 20 mg/kg/nedelja imale su značajno poveć anje čiste mase 21. i 28. dana studije u poređenju sa životinjama tretiranim IgG kontrolom i nosačem (PBS). Životinje tretirane Ab1 i Ab2 pri nivou doze od 2 mg/kg/nedelja takođe su imale značajne promene u nemasnoj masi 21. i 28. dana studije. Nije bilo značajnih promena u nemasnoj masi iz kontrolnih grupa za životinje tretirane sa Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 pri nivou doze od 0,5 mg/kg/nedelja.
[0295] Na kraju studije (28. dan) prikupljeni su mišić i i odmereni. Ponderi za kvadriceps (rectus femoris) i gastrocnemius mišić e prikazani su na sl. 18A i 18B. Životinje lečene Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 pri nivou doze od 20 mg/kg/nedelja imale su značajno poveć anje težine miši ć a gastroknemije i kvadricepsa (rectus femoris) u poređenju sa životinjama tretiranim nosačem (PBS). Životinje tretirane sa Ab2 i Ab4 pri nivou doze od 2 mg/kg/nedelja takođe su imale značajne promene u težini mišić a gastrocnemiusa. Životinje koje su lečene Ab2 pri nivou doze od 2 mg/kg/nedelja takođe su imale značajne promene u težini mišić a kvadricepsa (rectus femoris). Nije bilo značajnih promena u mišić noj masi u kontrolnim grupama kod životinja tretiranih sa Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 pri nivou doze od 0,5 mg/kg/nedeljna. Procenat razlike u te žini mišić a gastroknemijusa i kvadricepsa (rectus femoris) (u poređenju sa grupom nosača) životinja lečenih različitim dozama Ab1, Ab2, Ab4 i Ab6 navedeni su na sl. 18C.
Trajanje studije tretiranja sa Ab1 na SCID miševima
[0296] Testirana je sposobnost Ab1 da poveć a nemasnu masu kod SCID miševa nakon jedne doze i nakon 3 nedeljne doze. Sedam (7) grupa od osam (8) ženskih SCID miševa primilo je testni produkt intraperitonealnom (IP) injekcijom (10 mL/kg) bilo jednom na dan 0 (grupe 1-4) ili jednom nedeljno na dane 0, 7 i 14 (grupe 5-7). Videti tabelu 15. Antitela (IgG kontrola, Ab1 i AbMio) dozirana su po 10 mg/kg. Životinje su na početku studije imale 10 do 11 nedelja. Telesna težina je merena dva puta nedeljno tokom studije, u skladu sa danima doziranja. Parametri sastava telesne mase (masa masti, nemasna masa i sadržaj vode) izmereni su pomoć u Echo MRI (QNMR) dana 0, 7, 14 i 21.
Tabela 15: Grupe lečenja i učestalost doziranja.
[0297] Podaci o srednjem procentu nemasne mase za životinje lečene nosačem (PBS), IgG kontrola, Ab1, AbMyo prikazani su na sl. 19. Podaci su izraženi kao promena u nemasnoj masi od 0. dana studije. U 21 danu nakon pojedinačne doze testnog produkta, životinje tretirane sa Ab1 (grupa 3) imale su značajan porast nemasne mase (u poređenju sa IgG kontrolnim životinjama - grupa 1) koja se nisu razlikovala od promena čiste mase nakon 3 doze Ab1 (grupa 6). Ove promene u nemasnoj masi takođe su bile uporedive sa promenama primeć enim kod životinja lečenih jednom dozom (grupa 4) ili sa 3 nedeljne doze (grupa 7) AbMyo.
Primer 3: Hemija/Farmaceutske nauke
[0298] Ab2 je humanizovano monoklonsko antitelo podtipa IgG4 sa prolinom supstituisanim za serin na položaju 228. Ovo generiše sekvencu sličnu IgG1 i minimizira nepotpuno stvaranje interlančanih disulfidnih mostova što je karakteristično za IgG4. Kompletna aminokiselinska sekvenca teškog i lakog lanca Ab2 prikazana je u nastavku. Podvučeni su regioni koji određuju komplementarnost (CDR). Podebljana NST sekvenca: N-povezano mesto konsenzusa glikozilacije u sekvenci; Podebljane DP sekvence su potencijalna mesta cepanja; NX sekvence, gde X može biti S, T ili G koja su potencijalna mesta deamidacije; Podebljane DX sekvence, gde X može biti G, S, T ili SDG koje su potencijalna mesta izomerizacije; metionini su potencijalna mesta oksidacije metionina; Podebljano Q je o čekivana N-terminalna piroglutaminska kiselina (slike 21A-21B).
[0299] Molekularno modelovanje Ab1 identifikovalo je nekoliko potencijalnih mesta posttranslacionih modifikacija. Dva asparagina u lakom lancu i sedam asparagina u te škom lancu su podložna deamidaciji. Dva od ovih ostataka nalaze se u CDR regionima teškog lanca.
[0300] Nativni IgA4 mAb mogu imati nepotpuno stvaranje disulfidnih mostova među teškim lancima, pri čemu se dva polumolekula (svaki sadrži jedan teški i jedan laki lanac) održavaju u netaknutoj strukturi antitela nekovalentnim interakcijama. Molekuli IgG4 mogu biti skloni razmeni polumolekula in vitro i in vivo, a nivo polovine molekula mora biti dosledan u proizvodnim serijama. Supstitucija Ser-a u Pro u okosnici strukture IgG4 rezultira sekvencom sličnom IgG1, omoguć avaju ć i tako stvaranje međulančanih disulfidnih veza i izrazito stabilizujuć i strukturu antitela. Integritet i stabilnost zglobnog regiona nadgleda se tokom razvoja sa proširenom karakterizacijom, koristeć i takve testove kao što je neredukciona kapilarna elektroforeza i kvantitativno određivanje slobodnih sulfhidrila. Potencijal zamene lanca nadgleda se in vivo.
Rezime
[0301] Ovde je opisano antitelo specifično za pro/latentni miostatin koje blokira aktivaciju promiostatina i/ili latentnog miostatina. Primena ovog antitela za blokiranje aktivacije zdravim mi ševima poveć ava nemasnu telesnu masu i veličinu mišić a, sa samo jednom dozom koja je potrebna da bi se održao efekat jačanja mišić a tokom perioda od 1 meseca. Pored toga, primena antitela štiti zdrave miševe od atrofije mišić a u dva odvojena modela trošenja miši ć a. Podaci pokazuju da blokiranje aktivacije miostatina promoviše snažan rast miši ć a i sprečava atrofiju miši ć a in vivo i predstavlja alternativni mehanizam za terapijske intervencije trošenja mišić a.
Primer 4: Analiza pro/atentnog miostatina u atrofiji mišić a
[0302] Western Blot-ovi su izvedeni da bi se utvrdilo prisustvo pro/latentnog miostatina u mi šić nom tkivu i u cirkulaciji tokom atrofije mišić a, kao i tokom normalnih uslova. Standardni model atrofije mi ši ć a uključuje lečenje miševa sa 2,5 mg/kg/nedelja deksametazonom (doziran u vodi za pić e), a miši ć i i plazma su prikupljeni nakon 2 nedelje tretmana. Ovaj model redovno dovodi do smanjenja mi šić ne mase za 15-25 % tokom lečenja. Kontrolni mišić i plazma su istovremeno prikupljani od miševa koji nisu lečeni deksametazonom. Rectus femoris, tibialis anterior i soleus mišić i su secirani, zamrznuti u tečnom azotu i čuvani na - 80 °C dok nisu spremni za upotrebu. Mišić ni lizati su generisani praškanjem, pra ć eno lizom u T-PER puferu dopunjenom inhibitorima proteaze i fosfataze. Plazma se sakuplja standardnim metodama i čuva na -80 °C.
[0303] Višestruki uzorci koji sadrže jednake koncentracije proteina odvojeni su PAGE gelovima i Western Blot-om su upijani na PVDF membranu. Za mišić ne lizate, 10-50 ng ukupnog proteina je naneto na gel. Plazma je razblažena 1:10 u PBS i 10 ml svakog uzorka je naneto na gel. Kao standardi veličine, 0,1-1 ng rekombinantni pro/latentni miostatin su takođe stavljeni u gel. Identifikacija proteina miostatin izvr šena je korišć enjem antitela koje prepoznaje prodomen domena miostatin (AF1539, R&D Systems). Ova analiza pokazuje da je promiostatin prevladavajuć i oblik u miši ć ima, dok je latentni miostatin primarni oblik u plazmi (slika 25). Dalje, pokazano je da se kod miševa sa atrofijom mišić a indukovanom deksametazonom promiostatin poveć ava u miši ć nom tkivu, dok se latentni miostatin smanjuje u plazmi.
[0304] Da bi se potvrdili ovi rezultati, Western Blot-ovi su ponovljeni kori šć enjem fluorescentnog obeležavanja i detekcije (Azure Biosystems). Kvantifikovani su relativni nivoi svakog od oblika miostatina u plazmi i u rektusu femoris i tibiji prednjih mišić a kod normalnih miševa i miševa tretiranih deksametazonom. Ovi podaci potvrđuju napred opisane rezultate, pokazujuć i od 2 do 2,5 puta pove ć anje promiostatina u oba mišić a i 2,3 puta smanjenje latentnog miostatina u plazmi (slika 26).
[0305] Na osnovu ovih podataka dat je model za "flux" miostatina u normalnom i bolesnom mi šić u. Kao što je pokazano, u normalnom mišić u (slika 28A), promiostatin se proizvodi u miši ć ima i pretvara u latentni miostatin cepanjem furin proteaze, koje se može javiti unutar ili izvan ć elije (Anderson i sar., 2008). Potom se deo frakcije latentnog miostatina u mišić ima oslobađa u cirkulaciju, formiraju ć i kružni bazen latentnog miostatina. U atrofiji mišić a dolazi do pove ć anja aktivnog faktora rasta miostatina koji pokre ć e atrofiju mišić a. Smatra se da je ovo pove ć anje uzrokovano regulacijom nivoa promiostatina u mi ši ć ima i poveć anom konverzijom latentnog miostatina u aktivni faktor rasta (slika 28B). Podaci navedeni ovde direktno podržavaju prvi korak ovog modela, pokazujuć i pove ć an promiostatin u mi ši ć ima. Podaci takođe podržavaju drugi korak, jer je primeć eno smanjenje miši ć ne mase kod miševa tretiranih deksametazonom, što ukazuje na poveć anu proizvodnju zrelog miostatina, bez istovremenog pove ć anja latentnog miostatina u mišić ima. Shodno tome, nivo mioostatina u plazmi je smanjen, što ukazuje na pove ć anu konverziju u zreli miostatin.
Primer 5: Imunoprecipitacija iz mišjeg seruma i mišić nog tkiva
[0306] Imunoprecipitacije su izvedene da bi se utvrdilo prisustvo promiostatina u cirkulaciji i istra žilo vezivanje Ab2 i AbMyo za endogene prekursore miostatina u serumu i mi šić ima. Ab2 prepoznaje glavni oblik miostatina u mišić ima. Rezultati prikazani na slici 27 pokazuju da se skup serumskih promiostatina taloži sa Ab2, što upućuje da in vivo postoji vanć elijski promiostatin. Pored vezivanja za promiostatin, latentni miostatin i druge delimično obrađene oblike miostatina u serumu, Ab2 imunoprecipitirani promiostatin iz ekstrakata mišić a. Nasuprot tome, AbMyo se efikasno vezao za latentni miostatin i delimično obrađene prekursore u serumu, bez uočljivih interakcija sa promiostatinom u mišić u. S obzirom na to da je mišić mesto gde se javlja signalizacija miostatina, ovo bi moglo pružiti važne prednosti mehanizmu delovanja Ab2.
[0307] Homogenizovani mišić ni lizat je pripremljen na slede ć i način: smrznuti mišji kvadriceps je usitnjen u prahu koristeć i CrioPrep pulverizer (Covaris, Woburn MA). Zatim je pra škasti miši ć resuspendovan do koncentracije od 50 mg/ml u puferu M-Per (ThermoFisher Scientific) sa 1x koktel-inhibitorom proteaze i fosfataze Halt<TM>bez EDTA (ThermoFisher Scientific). Tkanina je zatim usitnjena plastičnim tučkom, Plas Cat # 4030-PB) i dalje homogenizovan ponovljenim pipetiranjem odsečenim vrhom pipete. Uzorci mišić a su zatim inkubirani 30 minuta na 4C sa rotacijom kraj-preko-kraj. Na kraju, uzorci su centrifugirani na 16.100 g tokom 10 minuta da bi se talog nerastvorljive frakcije kompeletirao. Rastvorljiva frakcija je odstranjena i korišć ena u niže navedenim eksperimentima.
[0308] Za imunoprecipitaciju, antitela Ab2, IgG Ctl ili AbMyo kovalentno su konjugovana sa zrncima agaroze korišć enjem Thermo Scientific Pierce<TM>koimunoprecipitacionog kompleta prema specifikacijama proizvođača. 75 ug svakog antitela je konjugovano sa 50 uL suspenzije zrna i 30 ug antitela je kori šć eno u svakoj imunoprecipitaciji. Imunoprecipitacija je izvedena nasuprot 3 ml objedinjenog normalnog mi šjeg seruma (Bioreclamation) ili 1,05 ml homogenizovanog rastvorljivog mišjeg kvadricepsa pripremljenog kako je napred opisano. Zrnca konjugovana sa antitelima i uzorci su inkubirani na 4C uz ljuljanje od kraja do kraja preko noć i. Posle inkubacije, zrnca su obnovljena propu štanjem celokupne zapremine uzorka kroz spin filtere uključene u komplet za koimunoprecipitaciju pomoć u vakuum kolektora QIAvac 24 Plus. (Kiagen). Zrnca su zatim isprana 3 x sa 200 uL IP pufera za lizu/pranje, i jednom sa 100 mL 1 x pufera za kondicioniranje, u skladu sa specifikacijama kompleta. Eluiranje je izvr šeno sa 50 ml pufera za eluiranje tokom pet minuta, a zatim je pomešano sa 5 ml 1M Tris, pH 9,5 u zbirnoj epruveti.
[0309] Vrste miostatina povučene test antitelima vizuelno su prikazane Western Blot-om koristeć i AF1539, (R&D sistemi) ab124721, (Abcam) Alexa Fluor® 680 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H L), (Jackson ImmunoReearch) i IRDie® 800CV Donkey IgG anti-zečji (H L) (LI-COR Biosciences) Thermo Scientific. Za blokiranje i primarne inkubacije antitela korišć en je pufer za blokiranje SEA BLOCK.
Primer 6: Poveć ana miši ć na masa i izmenjena ekspresija proteina miostatina kod pacova lečenih sa Ab2
Dizajn studije
[0310] Sedam do osam nedelja starim ženskim pacovima Sprague-Davley davana je pojedinačna intravenska doza ili Ab2 (10 mg/kg), nefunkcionalno humano IgG kontrolno antitelo (10 mg/kg) ili ekvivalentna zapremina fiziološkog rastvora puferskog fosfata (PBS). Tokom studije, serum je sakupljan od 3 pacova po grupi tokom 4 sata, 48 sati, 7 dana, 14 dana, 21 dan i 28 dana nakon doziranja. Sakupljanje je izvršeno standardnim metodama, a uzorci su čuvani na -80 °C. Čista masa izmerena je kvantitativnom nuklearnom magnetnom rezonancom (qNMR) na početku (pre doziranja dana 0) i dana 7, 14, 21 i 28 (8 pacova/grupa) i skeletnih mišić a (rectus femoris, tibialis anterior i soleus) ) su sakupljeni na kraju studije (28. dan), odmereni i brzo zamrznuti u tečnom azotu radi skladištenja na -80 °C.
Rezultati
[0311] Izloženost leku je merena u uzorcima seruma koristeć i ELISA specifičan za humani IgG sa poznatim količinama svakog leka koji se koristi kao referentni standard. Kao što je prikazano na slici 29, 4 sata nakon injekcije, i Ab2 i IgG kontrolno antitelo se detektuju u serumu pacova. Kako studija napreduje, Ab2 pokazuje povišene nivoe cirkulišuć eg leka u poređenju sa IgG kontrolom, sa prosekom od 17,1 mg/ml leka u serumu na kraju studije.
[0312] Farmakodinamički efekti lečenja Ab2 procenjeni su kako merenjem čiste mase (pomoć u qNMR) tokom studije, tako i određivanjem težine seciranog mišić a na kraju studije. Slika 30A prikazuje merenja nemasne mase tokom studije, gde pacovi tretirani sa Ab2 pokazuju jasan porast nemasne mase u poređenju sa pacovima tretiranim sa PBS ili sa humanim IgG kontrolnim antitelom. Mi šić na masa je merena prikupljanjem i vaganjem celih skeletnih mišić a na kraju studije (28 dana). Kao što je prikazano na slici 30B, pacovi tretirani sa Ab2 pokazuju porast od 14 %, odnosno 11 % u masama prednjeg mi šić a rectus femoris i tibialis. Ovi podaci zajedno ukazuju da lečenje pacova jednom dozom Ab2 dovodi do dugotrajnog pove ć anja miši ć ne mase.
[0313] Relativni nivoi pro/latentnog miostatina određeni su kvantitativnim Western Blot-om uzoraka mišić nog lizata ili seruma. Miši ć ni lizati su generisani iz zamrznutih uzoraka miši ć a pulverizacijom, prać ene lizom u T-PER puferu dopunjenom inhibitorima proteaze i fosfataze. Nakon lize, uzorci koji sadr že jednake koncentracije proteina odvojeni su PAGE gelovima i upijani na PVDF membranu sa niskom fluorescencijom. Za mišić ne lizate, 10-50 ng ukupnog proteina je naneto na gel. Plazma je razblažena 1:10 u PBS i 10 ml svakog uzorka je naneto na gel. Kao standardi veličine, 0,1-1 ng rekombinantni pro i/ili latentni miostatin su takođe stavljeni u gel. Identifikacija miostatinskog proteina je izvr šena korišć enjem antitela koje prepoznaje prodomen latentnog miostatina (AF1539, R&D Systems), prać eno detekcijom sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom. Za sve Western Blot analize, analizirana su najmanje tri uzorka po grupi.
[0314] Lečenje sa Ab2 poveć ava nivo latentnog miostatina u serumu pacova za oko 20 puta (slika 31A) u poređenju sa pacovima tretiranim sa IgG. Ovi podaci su u skladu sa efektima primeć enim kod drugih lekova protiv antitela, što odražava vezivanje ciljanog leka u cirkulaciji. Kod mišić a pacova (rectus femoris), lečenje Ab2 dovodi do porasta od 1,9 puta (u poređenju sa pacovima tretiranim IgG kontrolom) u latentnom obliku miostatina. Nije primeć ena statistički značajna promena u promiostatinu. Ovi podaci ukazuju na to da Ab2 veže svoj cilj, pro/latentni miostatin i menja obradu miostatina u mi šić ima kao i u cirkulaciji. Takođe je primeć eno da lečenje Ab2 pove ć ava latentni, ali ne i promiostatin u miši ć ima pacova (slika 31B).
Primer 7: Poveć ana miši ć na masa i promena ekspresije proteina miostatin kod miševa koji su lečeni sa Ab2 i upoređivanje sa antitelom miostatina.
Dizajn studije
[0315] Deset nedelja muškim SCID miševima je data pojedinačna intraperitonealna doza (5 mg/kg) bilo Ab2, ili nefunkcionalnog antitela za kontrolu IgG čoveka, ili uporednog antitela (AbMyo) koje deluje blokirajuć i interakciju miostatin/receptor. Tokom studije, serum i skeletni mi ši ć i su sakupljani 1 sat, 4 sata, 48 sati, 7 dana, 14 dana, 21 dan, 28 dana i 56 dana nakon doziranja. Sakupljanje seruma je izvr šeno standardnim metodama, a uzorci su čuvani na -80 °C. Skeletni mišić i (rectus femoris, tibialis anterior i soleus) su sakupljeni, izvagani i brzo zamrznuti u tečnom azotu radi skladištenja na -80 °C. Čista masa izmerena je kvantitativnom nuklearnom magnetnom rezonancom (qNMR) na po četku (pre doziranja dana 0) i nedeljno tokom čitave studije.
Rezultati
[0316] Farmakodinamički efekti lečenja Ab2 procenjeni su merenjem čiste mase (pomoć u qNMR) tokom studije. Slika 32 prikazuje merenja nemasne mase tokom studije, gde mi ševi tretirani sa Ab2 pokazuju jasan porast nemasne mase u poređenju sa miševima lečenim humanim antitelom za IgG kontrolu. Prve tri nedelje studije, miševi tretirani uporednim antitelom (AbMyo) pokazuju porast čiste mase ekvivalentan masi u grupi Ab2. Međutim, do 28 dana nakon doziranja, miševi tretirani sa AbMyo ne održavaju poveć anu nemasnu masu. Nasuprot tome, miševi u grupi koja se lečila Ab2 održavaju poveć anu mršavu masu tokom trajanja studije (56 dana). Ovi podaci sugerišu da Ab2 ima duže trajanje delovanja od AbMyo.
[0317] Izloženost leku je merena u uzorcima seruma korišć enjem ELISA specifičnog za humani IgG sa poznatim količinama svakog leka koji se koristi kao referentni standard. Kao što je prikazano na slici 33, već 1 sat nakon injekcije, i Ab2 i uporedno antitelo (AbMyo) se otkrivaju u serumu i nivoi > 1 mg/ml oba antitela mogu se otkriti tokom studije. Međutim, Ab2 pokazuje znatno duži period poluraspada i zaključeno područje ispod krive (AUCINF) od AbMyo, što sugeriše da, u sličnim dozama, Ab2 pokazuje znatno već u izloženost od AbMyo.
[0318] Relativni nivoi pro/latentnog miostatina određeni su kvantitativnim Western Blot-om uzoraka mišić nog lizata ili seruma. Miši ć ni lizati su generisani iz zamrznutih uzoraka miši ć a pulverizacijom, prać ene lizom u T-PER puferu dopunjenom inhibitorima proteaze i fosfataze. Nakon lize, uzorci koji sadr že jednake koncentracije proteina odvojeni su PAGE gelovima i upijani na PVDF membranu sa niskom fluorescencijom. Za mišić ne lizate, 10-50 ng ukupnog proteina je naneto na gel. Plazma je razblažena 1:10 u PBS i 10 ml svakog uzorka je naneto na gel. Kao standardi veličine, 0,1-1 ng rekombinantni pro i/ili latentni miostatin su takođe naneti na gel. Identifikacija proteina miostatin je izvr šena korišć enjem antitela koje prepoznaje prodomen latentnog miostatina (AF1539, R&D Systems), prać eno detekcijom sa fluorescentno obeleženim sekundarnim antitelom. Za sve Western Blot analize, analizirana su najmanje tri uzorka po grupi.
[0319] Serumski miostatin je meren kod miševa koji su lečeni lekovima i kod kontrola korišć enjem fluorescentnog Western Blot-a. Uprkos poveć anoj izloženosti Ab2 u serumu, nivoi latentnog miostatina u serumu i kod miševa koji su tretirani sa Ab2 i od AbMyo bili su slični (slika 34). Ovi podaci sugerišu da su nivoi slobodnog leka u cirkulaciji (koji nije vezan za cilj) dovoljno već i od nivoa cilja, tako da pove ć ana izloženost Ab2 u serumu ne dovodi do već ih pove ć anja latentnog miostatina u cirkulaciji od onih primeć enih kod AbMyo.
[0320] Nivoi miostatina u mišić ima (rectus femoris) takođe su procenjeni fluorescentnim Western Blot-om. Relativni nivoi pro/latentnog izmereni su u mišić nim lizatima miši ć a fluorescentnim Western Blot-om. Latentni miostatin je povišen i u mišić ima koji se leče sa Ab2 i sa AbMyo (slika 35A). Međutim, povišenje latentnog miostatina u mišić ima tretiranim sa AbMyo vra ć a se na osnovno stanje do 28. dana, dok oni u mišić ima tretiranim sa Ab2 ostaju povišeni u najmanjem do ovog trenutka (P < 0,003 u odnosu na tretman sa AbMyo). Sličan trend primeć en je i kod promiostatina (slika 35B), mada razlika nije statisti čki značajna (P = 0,068). Ovi podaci sugerišu duže trajanje delovanja Ab2 na mestu dejstva leka, skeletnom mišić u.
Primer 8: Ab2 poveć ava stvaranje miši ć ne snage.
[0321] U ovom primeru su procenjeni efekti Ab2 na stvaranje mišić ne snage. Ukratko, muškim miševima C57BL/6J su davani intraperitonealno IgG (20 mg/kg), Ab2 koji ima konstantni region izotipa IgG1 mi ša (20 mg/kg) ili PBS jednom nedeljno tokom 4 nedelje (n = 10 po grupi).
[0322] Po završetku studije miši ć i su secirani i ponderisani, a in vitro mišić ne performanse miši ć a Extensor Digitorum Longus (EDL) izmerene su in vitro sistemom mišić ne poluge od 305C (Aurora Scientific Inc., Aurora, CAN) prilagođenom horizontalnoj perfuzijskoj kupki. Mišić je stavljen u ledeno hladni fiziološki puferisani rastvor i svileni šav mu je vezan za proksimalnu tetivu. Mišić je smešten u vodoravno kupatilo sistema mišić nih poluga 305C i prepun fiziološkog pufera oksigeniranog sa 95 % O2/ 5 % CO2i držan na 37 °C.
[0323] Šavovi su bili vezani za fiksni stub na jednoj strani, a poluga na drugoj. Serija stimulacija polja od 1 Hz i 100 Hz (puls od 0,2 ms, trajanje od 100 ms) na frekvenciji 0,01 Hz isporučena je putem platinastih elektroda uz bok mišić a kako bi se osiguralo da su šavovi čvrsto zategnuti i da je maksimalna razvijena sila stabilna. Jednom stabilna, izmerena je direktna stimulacija mi šić a - snaga u odnosu na učestalost. Elektrode od platinaste žice postavljaju se proksimalno i distalno od stomačnog mišić a.
[0324] Napon trzanja je nadgledan sa impulsom od 1ms i napon se poveć avao dok se ne postigne maksimalna sila. Zatim je izvedena serija stimulacija sa rastuć om učestaloš ć u stimulacije (puls od 1ms, trajanje treninga od 250ms): 1, 10, 20, 40, 60, 80, 100, 150Hz, nakon čega sledi konačna stimulacija na 1Hz.
[0325] Kao što je prikazano na sl. 36A, nakon 4 nedelje tretmana sa Ab2, poveć ana je mi ši ć na masa i funkcija. Srednja težina EDL poveć ana je za 33 %, a prosečna težina gastroknemija i kvadricepsa pove ć ana je za 19 %.
[0326] Kao što je prikazano na sl. 36B, maksimalno stvaranje sile poraslo je za 30 % nakon 4 nedeljne doze Ab2.
[0327] Iako je ovde opisano i ilustrovano nekoliko primera ovog pronalaska, oni koji su uobičajeni u stanju tehnike lako ć e predvideti mnoštvo drugih sredstava i/ili struktura za obavljanje funkcija i/ili dobijanje rezultata i/ili jedno ili više ovde opisanih prednosti, i smatra se da je svaka od takvih varijacija i/ili modifikacija u okviru ovog pronalaska. Uopštenije, stručnjaci u ovoj oblasti lako ć e uvideti da su svi ovde opisani parametri, mere, materijali i konfiguracije namenjeni primerima i da ć e stvarni parametri, mere, materijali i/ili konfiguracije zavisiti od konkretne primene ili primera za koje se koriste znanja/zaklju čci ovog pronalaska. Stručnjaci u ovoj oblasti prepoznać e, ili ć e mo ć i da utvrde koriste ć i samo rutinsko eksperimentisanje, mnoge ekvivalente specifičnim realizacijama ovde opisanog pronalaska. Stoga treba razumeti da su prethodna ostvarenja predstavljena samo kao primer i da se, u okviru prilo ženog zahteva i njegovih ekvivalenata, pronalazak može primenjivati drugačije nego što je posebno opisano. Ovaj pronalazak je usmeren na svaku ovde opisanu osobinu, sistem, članak, materijal i/ili metodu. Pored toga, bilo koja kombinacija dve ili više takvih karakteristika, sistema, članaka, materijala i/ili metoda, ako takve osobine, sistemi, članci, materijali i/ili metode nisu međusobno neusaglašeni, uključeni su u delokrug ovog pronalaska.
[0328] Pod neodređenim članovima "a" i "an", kako su ovde upotrebljeni u specifikaciji i u patentnim zahtevima, ukoliko nije naznačeno suprotno, treba razumeti da znače "najmanje jedan".
[0329] Izraz "i/ili", kako se ovde koristi u specifikaciji i u patentnim zahtevima, treba shvatiti u zna čenju "jedan ili oba" tako povezana elementa, tj. elementi koji su u nekim slučajevima konjunktivno i disjunktivno prisutni u drugim slučajevima. Po izboru mogu biti prisutni i drugi elementi, osim elemenata koji su posebno identifikovani klauzulom "i/ili", bilo da su povezani ili nisu povezani sa onim elementima koji su posebno identifikovani, osim ako nije naznačeno suprotno. Prema tome, kao neograničavajuć i primer, referenca „A i/ili B“, kada se koriste zajedno, kao što je „sadrži“, u jednoj realizaciji može se odnositi na A bez B (opcionalno uključujuć i i elemente druge nego B); u drugoj realizaciji, do B bez A (po izboru uključujuć i i elemente koji nisu A); u još jednom izvođenju, i na A i na B (opcionalno uključuju ć i i druge elemente); itd.
[0330] Kako se ovde koristi u specifikaciji i u patentnim zahtevima, "ili" treba shvatiti da ima isto značenje kao "i/ili" kao što je napred definisano. Na primer, kada se odvajaju stavke na listi, „ili“ ili „i/ili“ tumačić e se kao obuhvatajuće, tj. uključivanje najmanje jednog, ali uključuju ć i i više od jednog broja ili liste elemenata, i, opcionalno, dodatne stavke na listi. Samo izrazi na koje se jasno ukazuje suprotno, poput „samo jedan od“ ili „tačno jedan od“ ili, kada se koriste u patentnim zahtevima, „sastoji se od“, odnosić e se na uključivanje tačno jednog elementa broja ili liste. U opštem, izraz "ili", kako se ovde koristi, tumači se tako da ukazuje na ekskluzivne alternative (tj. "jedno ili drugo, ali ne i jedno i drugo") pre nego što pređu uslovi ekskluzivnosti, kao što je "bilo,", "jedan od, „„ samo jedan od “ili„ tačno jedan od. “„ koji se u osnovi sastoje od „, kada se koristi u patentnim zahtevima, imać e svoje uobi čajeno značenje kao što se koristi u polju patentnog prava.
[0331] Kako se ovde koristi u specifikaciji i u patentnim zahtevima, izraz „najmanje jedan“, koji se odnosi na listu jednog ili više elemenata, treba da se razume kao da znači najmanje jedan element izabran iz bilo kog jednog ili više elementa na listi elemenata, ali ne nužno uključujuć i najmanje jedan od svakog elementa posebno navedenog u listi elemenata i ne isključujuć i bilo koju kombinaciju elemenata na listi elemenata. Ova definicija takođe omoguć ava da elementi mogu opciono biti prisutni osim elemenata koji su posebno identifikovani na listi elemenata na koje se odnosi fraza „najmanje jedan“,
1
bilo da su povezani ili nisu povezani sa tim elementima koji su posebno identifikovani. Prema tome, kao neograničavajuć i primer, „najmanje jedan od A i B“ (ili, što je ekvivalentno, „najmanje jedan od A ili B“, ili, što je ekvivalentno „najmanje jedan od A i/ili B“), može se odnositi, u jednoj realizaciji, na najmanje jedan, opciono uključujuć i više od jednog, A, bez prisutnog B (i opciono uključuju ć i i elemente koji nisu B); u drugoj realizaciji, na najmanje jedan, opciono uključujuć i više od jednog, B, bez prisustva A (i opciono uključujuć i i elemente koji nisu A); u još jednom izvođenju, na najmanje jedan, koji opciono uključuje više od jednog, A i najmanje jedan, koji opciono uključuje više od jednog, B (i opciono uključujuć i i druge elemente); itd.
[0332] U patentnim zahtevima, kao i u gornjoj specifikaciji, svi prelazni izrazi kao što su "sadrži", "uključuje," "nosi", "ima", "sadrži," "uključuje", "drži" odrazumeva da su opšti, tj. da podrazumevaju uključivanje, ali bez ograničenja na njih. Samo prelazne fraze „koje se sastoje od“ i „koje se u osnovi sastoje od“ bić e zatvorene, odnosno poluzatvorene prelazne fraze, kako je izloženo u Priručniku Kancelarije za patente Sjedinjenih Američkih Država za postupke ispitivanja patenata, Odeljak 2111.03.
[0333] Upotreba rednih termina kao što su „prvi,„ „drugi,„ treć i “itd. U zahtevima za modifikovanje elementa patentnih zahteva sama po sebi ne označava nikakav prioritet ili redosled jednog elementa patentnog zahteva nad drugim ili vremenski redosled u kome se izvode postupci nekog metoda, već se koriste samo kao oznake za razlikovanje jednog elementa patentnog zahteva koji ima određeno ime od drugog elementa istog imena (ali za upotrebu rednog izraza) za razlikovanje elemenata patentnih zahteva.
2
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
�
11

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje sadrži varijabilnu regiju teškog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 25 i varijabilnu regiju lakog lanca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 31, pri čemu se antitelo specifično vezuje za pro/latentni miostatin.
2. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1, pri čemu antitelo sadrži teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 50 i/ili laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 51.
3. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, pri čemu je antitelo humano antitelo.
4. Izolovano antitelo prema bilo kojem od zahteva od 1 do 3, pri čemu antitelo sadrži IgG4konstantni domen.
5. Izolovano antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu antitelo sadrži konstantni domen IgG4koji ima okosnu supstituciju Ser u Pro koja proizvodi zglob sličan IgG1i dozvoljava stvaranje disulfidnih veza između lanaca.
6. Izolovano antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu antitelo inhibira proteolitičko stvaranje zrelog miostatina pomoć u toloidne proteaze.
7. Izolovano antitelo prema patentnom zahtevu 6, pri čemu antitelo inhibira proteolitičko stvaranje zrelog miostatina pomo ć u toloidne proteaze sa IC50 manjom od 1 µM, i/ili unakrsno reaktivno sa humanim i mišjim pro/latentnom miostatinom.
8. Postupak in vitro za smanjenje aktivacije receptora miostatina u ć elijama prisutnim u medijumu koji sadrži pro/latentni miostatin, postupak obuhvata isporuku antitela medijumu prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7 u količini efikasnoj za inhibiranje proteolitičke aktivacije pro/latentnog miostatina.
9. Antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7 za upotrebu u postupku le čenja subjekta sa miopatijom, pri čemu se navedeni postupak sastoji u davanju subjektu efikasne količine navedenog antitela.
10. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži antitelo prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 7 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
11. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je kompozicija: (i) liofilizovana kompozicija, (ii) tečna kompozicija, ili (iii) zamrznuta.
12. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 11 (iii), pri čemu je kompozicija zamrznuta na temperaturi manjoj ili jednakoj -65 °C.
13. Špric koji sadrži farmaceutsku kompoziciju prema bilo kojem od patentnih zahteva od 10 do 12.
14. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira antitelo koje sadrži promenljivi region teškog lanca koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEK ID BR: 39 i varijabilnu regiju lakog lanca koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline SEK ID BR: 45.
15. Izolovanać elija koja sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 14.
RS20210987A 2015-09-15 2016-09-15 Antitela pro/latentnog miostatina i njihova upotreba RS62330B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562219094P 2015-09-15 2015-09-15
EP16774748.4A EP3350220B1 (en) 2015-09-15 2016-09-15 Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
PCT/US2016/052014 WO2017049011A1 (en) 2015-09-15 2016-09-15 Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62330B1 true RS62330B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=57043000

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20210987A RS62330B1 (sr) 2015-09-15 2016-09-15 Antitela pro/latentnog miostatina i njihova upotreba
RS20250592A RS66913B1 (sr) 2015-09-15 2016-09-15 Anti-pro/latentna antitela miostatina i njihova upotreba

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20250592A RS66913B1 (sr) 2015-09-15 2016-09-15 Anti-pro/latentna antitela miostatina i njihova upotreba

Country Status (25)

Country Link
US (3) US10751413B2 (sr)
EP (3) EP4461312A3 (sr)
JP (4) JP7107836B2 (sr)
KR (3) KR20250033313A (sr)
CN (4) CN113896790B (sr)
AU (1) AU2016323447B2 (sr)
BR (1) BR112018004981A2 (sr)
CA (1) CA3036652A1 (sr)
CO (1) CO2018002703A2 (sr)
CY (1) CY1124619T1 (sr)
DK (2) DK3922645T3 (sr)
EA (1) EA038146B1 (sr)
ES (2) ES2881642T3 (sr)
FI (1) FI3922645T3 (sr)
HR (2) HRP20211081T1 (sr)
HU (2) HUE055331T2 (sr)
IL (2) IL305148A (sr)
LT (2) LT3922645T (sr)
MX (5) MX2018003196A (sr)
PL (2) PL3350220T3 (sr)
PT (2) PT3922645T (sr)
RS (2) RS62330B1 (sr)
SI (2) SI3922645T1 (sr)
SM (2) SMT202500263T1 (sr)
WO (1) WO2017049011A1 (sr)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104761637B (zh) 2006-03-31 2021-10-15 中外制药株式会社 调控抗体血液动力学的方法
ES2595638T3 (es) 2007-09-26 2017-01-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Método para modificar el punto isoeléctrico de un anticuerpo mediante la sustitución de aminoácidos en una CDR
KR102057826B1 (ko) 2008-04-11 2019-12-20 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
EP2647706B1 (en) 2010-11-30 2023-05-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
SG10201709559PA (en) 2012-08-24 2017-12-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fcγriib-specific fc region variant
WO2014030750A1 (ja) 2012-08-24 2014-02-27 中外製薬株式会社 マウスFcγRII特異的Fc抗体
CN105246914B (zh) 2013-04-02 2021-08-27 中外制药株式会社 Fc区变体
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
HRP20211081T1 (hr) 2015-09-15 2021-10-15 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latentna miostatinska protutijela i njihove uporabe
WO2017110981A1 (en) 2015-12-25 2017-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-myostatin antibodies and methods of use
CN115814077A (zh) * 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
NZ789269A (en) 2016-06-13 2026-01-30 Scholar Rock Inc Use of myostatin inhibitors and combination therapies
EP3494991A4 (en) 2016-08-05 2020-07-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COMPOSITION FOR THE PROPHYLAXIS OR TREATMENT OF IL-8 RELATED DISEASES
EP4218817A3 (en) 2017-01-06 2023-09-06 Scholar Rock, Inc. Methods for treating metabolic diseases by inhibiting myostatin activation
PT3565592T (pt) * 2017-01-06 2023-05-31 Scholar Rock Inc Tratamento de doenças metabólicas através da inibição da ativação da miostatina
MA53125A (fr) 2018-07-11 2021-05-19 Scholar Rock Inc Inhibiteurs de tgf?1 sélectifs selon l'isoforme à affinité élevée
SI3677278T1 (sl) 2018-07-11 2022-01-31 Scholar Rock, Inc. Izoformno selektivni zaviralci TGFBETA1 in uporaba le-teh
CN113677711B (zh) * 2019-01-30 2025-05-30 供石公司 TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途
CN110429214B (zh) 2019-08-07 2021-12-07 宁德时代新能源科技股份有限公司 二次电池的盖组件及二次电池
CN114729370B (zh) * 2019-08-28 2025-03-21 中外制药株式会社 跨物种抗潜伏TGF-β1抗体和使用方法
CA3166328A1 (en) 2020-01-11 2021-07-15 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
RU2750267C1 (ru) * 2020-02-07 2021-06-25 Общество с ограниченной ответственностью «НАУЧНО-ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ ИН-ВЕТ» Рекомбинантный ростовой дифференцировочный фактор роста 11 (GDF11), способ его получения, инъекционный препарат для повышения мышечной массы млекопитающих животных и птицы, а также способ использования препарата
AU2021369471A1 (en) 2020-10-26 2023-06-15 Scholar Rock, Inc. Use of anti-pro/latent myostatin antibody for treating spinal muscular atrophy
WO2022204581A2 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and use thereof
EP4348260A2 (en) 2021-06-03 2024-04-10 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors and therapeutic use thereof
CA3221555A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Kimberly LONG A myostatin pathway inhibitor in combination with a glp-1 pathway activator for use in treating metabolic disorders
KR102840816B1 (ko) * 2021-11-25 2025-07-31 (주)네오크레마 근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도
KR102836354B1 (ko) * 2021-11-25 2025-07-22 (주)네오크레마 근아세포의 증식과 근육세포로의 분화를 촉진하는 신규 펩티드 및 이의 용도
DK4518970T3 (da) 2022-05-04 2026-04-07 Scholar Rock Inc Anvendelse af myostatinhæmmer til behandling af spinal muskelatrofi
EP4601651A1 (en) 2022-10-14 2025-08-20 Genentech, Inc. Methods for treating spinal muscular atrophy
EP4638496A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Scholar Rock, Inc. Selective and potent inhibitory antibodies of myostatin activation
WO2024187051A1 (en) 2023-03-07 2024-09-12 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for use for treating resistant or unresponsive cancer in patients
WO2025240343A1 (en) 2024-05-13 2025-11-20 Scholar Rock, Inc. Tgf-beta inhibitors for treating cancer
WO2026076383A1 (en) 2024-10-06 2026-04-09 Scholar Rock, Inc. Use of myostatin inhibitor for treating spinal muscular atrophy

Family Cites Families (141)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
JPS6147500A (ja) 1984-08-15 1986-03-07 Res Dev Corp Of Japan キメラモノクロ−ナル抗体及びその製造法
EP0173494A3 (en) 1984-08-27 1987-11-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Chimeric receptors by dna splicing and expression
GB8422238D0 (en) 1984-09-03 1984-10-10 Neuberger M S Chimeric proteins
US4777127A (en) 1985-09-30 1988-10-11 Labsystems Oy Human retrovirus-related products and methods of diagnosing and treating conditions associated with said retrovirus
GB8702816D0 (en) 1987-02-07 1987-03-11 Al Sumidaie A M K Obtaining retrovirus-containing fraction
US5219740A (en) 1987-02-13 1993-06-15 Fred Hutchinson Cancer Research Center Retroviral gene transfer into diploid fibroblasts for gene therapy
US5422120A (en) 1988-05-30 1995-06-06 Depotech Corporation Heterovesicular liposomes
AP129A (en) 1988-06-03 1991-04-17 Smithkline Biologicals S A Expression of retrovirus gag protein eukaryotic cells
EP0436597B1 (en) 1988-09-02 1997-04-02 Protein Engineering Corporation Generation and selection of recombinant varied binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
WO1990007936A1 (en) 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
CA2489769A1 (en) 1989-03-21 1990-10-04 Philip L. Felgner Expression of exogenous polynucleotide sequences in a vertebrate
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
AU648261B2 (en) 1989-08-18 1994-04-21 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Recombinant retroviruses delivering vector constructs to target cells
US5585362A (en) 1989-08-22 1996-12-17 The Regents Of The University Of Michigan Adenovirus vectors for gene therapy
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ZA911974B (en) 1990-03-21 1994-08-22 Res Dev Foundation Heterovesicular liposomes
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
DK0585287T3 (da) 1990-07-10 2000-04-17 Cambridge Antibody Tech Fremgangsmåde til fremstilling af specifikke bindingsparelementer
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
CA2095633C (en) 1990-12-03 2003-02-04 Lisa J. Garrard Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
EP1820858B1 (en) 1991-03-01 2009-08-12 Dyax Corporation Chimeric protein comprising micro-protein having two or more disulfide bonds and embodiments thereof
ATE414768T1 (de) 1991-04-10 2008-12-15 Scripps Research Inst Bibliotheken heterodimerer rezeptoren mittels phagemiden
DE4122599C2 (de) 1991-07-08 1993-11-11 Deutsches Krebsforsch Phagemid zum Screenen von Antikörpern
DE69233013T2 (de) 1991-08-20 2004-03-04 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of National Institute Of Health, Office Of Technology Transfer Adenovirus vermittelter gentransfer in den gastrointestinaltrakt
WO1993010218A1 (en) 1991-11-14 1993-05-27 The United States Government As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Vectors including foreign genes and negative selective markers
PT1024191E (pt) 1991-12-02 2008-12-22 Medical Res Council Produção de auto-anticorpos a partir de reportórios de segmentos de anticorpo e exibidos em fagos
GB9125623D0 (en) 1991-12-02 1992-01-29 Dynal As Cell modification
FR2688514A1 (fr) 1992-03-16 1993-09-17 Centre Nat Rech Scient Adenovirus recombinants defectifs exprimant des cytokines et medicaments antitumoraux les contenant.
EP0650370A4 (en) 1992-06-08 1995-11-22 Univ California METHODS AND COMPOSITIONS TARGETED ON SPECIFIC TISSUES.
CA2137361A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 W. French Anderson Vector particles resistant to inactivation by human serum
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
EP1024198A3 (en) 1992-12-03 2002-05-29 Genzyme Corporation Pseudo-adenoviral vectors for the gene therapy of haemophiliae
US5981568A (en) 1993-01-28 1999-11-09 Neorx Corporation Therapeutic inhibitor of vascular smooth muscle cells
US7566768B1 (en) 1995-10-26 2009-07-28 The Johns Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
US7393682B1 (en) 1993-03-19 2008-07-01 The Johns Hopkins University School Of Medicine Polynucleotides encoding promyostatin polypeptides
US5994618A (en) 1997-02-05 1999-11-30 Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-8 transgenic mice
DK0690873T3 (da) 1993-03-19 2003-09-29 Univ Johns Hopkins Med Vækstdifferentieringsfaktor-8
PT695169E (pt) 1993-04-22 2003-04-30 Skyepharma Inc Lipossomas multivesiculares de ciclodextrina encapsulando compostos farmacologicos e metodos para a sua utilizacao
EP0705344B8 (en) 1993-06-24 2006-05-10 Advec Inc. Adenovirus vectors for gene therapy
DK0814154T3 (da) 1993-09-15 2009-08-31 Novartis Vaccines & Diagnostic Rekombinante alfavirusvektorer
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
AU687117B2 (en) 1993-10-25 1998-02-19 Canji, Inc. Recombinant adenoviral vector and methods of use
AU686277B2 (en) 1993-11-16 1998-02-05 Pacira Pharmaceuticals, Inc. Vesicles with controlled release of actives
DE69535669T2 (de) 1994-05-09 2008-12-04 Oxford Biomedica (Uk) Ltd. Retrovirale vektoren mit verminderter rekombinationsrate
US20030167492A1 (en) 1994-07-08 2003-09-04 Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a gdf-11 dominant negative polypeptide, and methods of making and using same
EP1574577A3 (en) 1994-07-08 2006-06-14 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor-11
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
WO1997042338A1 (en) 1996-05-06 1997-11-13 Chiron Corporation Crossless retroviral vectors
US6656475B1 (en) 1997-08-01 2003-12-02 The Johns Hopkins University School Of Medicine Growth differentiation factor receptors, agonists and antagonists thereof, and methods of using same
US6891082B2 (en) 1997-08-01 2005-05-10 The Johns Hopkins University School Of Medicine Transgenic non-human animals expressing a truncated activintype II receptor
GB9722131D0 (en) 1997-10-20 1997-12-17 Medical Res Council Method
WO2000053211A2 (en) 1999-03-09 2000-09-14 University Of Southern California Method of promoting myocyte proliferation and myocardial tissue repair
CN1396904A (zh) 2000-01-28 2003-02-12 诺沃挪第克公司 新颖的化合物、它们的制备和用途
PT2281843T (pt) 2000-06-16 2017-01-02 Human Genome Sciences Inc Anticorpos que se ligam imunoespecificamente a blys
AU2011244851A1 (en) 2000-07-27 2011-11-24 The John Hopkins University School Of Medicine Promyostatin peptides and methods of using same
US7083784B2 (en) 2000-12-12 2006-08-01 Medimmune, Inc. Molecules with extended half-lives, compositions and uses thereof
US7320789B2 (en) * 2001-09-26 2008-01-22 Wyeth Antibody inhibitors of GDF-8 and uses thereof
ES2288900T3 (es) 2001-10-05 2008-02-01 Affimed Therapeutics Ag Anticuerpo de origen humano para inhibir la agregacion de trombocitos.
US8455627B2 (en) 2001-10-05 2013-06-04 Affimed Therapeutics, Ag Human antibody specific for activated state of platelet integrin receptor GPIIb/IIIa
US20040044063A1 (en) 2002-05-31 2004-03-04 Brent Stockwell SMA therapy and cell based assay for identifying therapies
WO2004009776A2 (en) 2002-07-19 2004-01-29 Abbott Biotechnology Ltd. TREATMENT OF TNFα RELATED DISORDERS
MXPA05002968A (es) 2002-09-16 2005-09-08 Univ Johns Hopkins Activacion de miostatina por metaloproteasa, y metodos de modular la actividad de miostatina.
AR047392A1 (es) 2002-10-22 2006-01-18 Wyeth Corp Neutralizacion de anticuerpos contra gdf 8 y su uso para tales fines
US7285269B2 (en) * 2002-12-02 2007-10-23 Amgen Fremont, Inc. Antibodies directed to tumor necrosis factor
BR0317538A (pt) 2002-12-20 2005-11-29 Amgen Inc Agente ligante, sequência de polinucleotìdeo, vetor de expressão, célula hospedeira, composição farmacêutica, e, métodos de inibir a atividade de miostatina, de aumentar a massa muscular magra e a razão de massa muscular magra para gordura, de tratar uma doença de emaciação muscular e um distúrbio metabólico relacionado com miostatina em um indivìduo, de detectar e medir miostatina em uma amostra, e, de diagnosticar um distúrbio relacionado com miostatina em um indivìduo
EP1699820A2 (en) * 2003-12-31 2006-09-13 Schering-Plough Ltd. Neutralizing epitope-based growth enhancing vaccine
EP3006039B1 (en) 2004-03-02 2021-01-06 Acceleron Pharma Inc. Alk7 polypeptides for use in promoting fat loss
ATE557042T1 (de) 2004-03-23 2012-05-15 Lilly Co Eli Anti-myostatin-antikörper
US7850962B2 (en) 2004-04-20 2010-12-14 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against CD20
JP2008500373A (ja) 2004-05-27 2008-01-10 アクセルロン ファーマ インコーポレーテッド ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）／ココ（Ｃｏｃｏ）誘導体およびそれらの使用
CA2575791A1 (en) 2004-08-03 2006-02-16 Dyax Corp. Hk1-binding proteins
EP2361933A3 (en) 2005-01-26 2012-05-02 Amgen Fremont Inc. Antibodies against interleukin-1 beta
US20060216279A1 (en) 2005-03-22 2006-09-28 Glass David J Myostatin inhibiting fusion polypeptides and therapeutic methods thereof
EP1877075A4 (en) 2005-04-25 2008-07-30 Pfizer ANTIBODY TO MYOSTATIN
PL2407486T3 (pl) 2005-08-19 2018-05-30 Wyeth Llc Przeciwciała antagonistyczne względem GDF-8 i zastosowania w leczeniu ALS i innych zaburzeń związanych z GDF-8
EP1951756B1 (en) 2005-10-06 2015-01-07 Eli Lilly And Company Anti-myostatin antibodies
UA92504C2 (en) * 2005-10-12 2010-11-10 Эли Лилли Энд Компани Anti-myostatin monoclonal antibody
US8067562B2 (en) * 2005-11-01 2011-11-29 Amgen Inc. Isolated nucleic acid molecule comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO:1
WO2007061995A2 (en) 2005-11-21 2007-05-31 Novartis Ag Biomarkers for statin-induced myopathy or rhabdomyolysis
KR20070105685A (ko) 2006-04-27 2007-10-31 영남대학교 산학협력단 메트포르민을 포함하는 비만치료용 조성물
US8097596B2 (en) 2006-06-30 2012-01-17 Lakewood-Amedex, Inc. Compositions and methods for the treatment of muscle wasting
CN101522707B (zh) 2006-08-03 2013-08-28 莫约斯汀医疗有限公司 肌肉生长抑制素拮抗剂
WO2008030367A2 (en) 2006-09-01 2008-03-13 The General Hospital Corporation Selective myostatin inhibitors
BRPI0716249A2 (pt) 2006-09-05 2013-09-03 Lilly Co Eli anticorpos antimiostatina
EP2097095B1 (en) 2006-11-29 2016-01-27 Nationwide Children's Hospital Myostatin inhibition for enhancing muscle and/or improving muscle function
ATE542876T1 (de) 2007-03-30 2012-02-15 Merck Patent Gmbh Doppelbrechungsschicht mit negativer optischer dispersion
WO2008150530A2 (en) 2007-06-01 2008-12-11 Biogen Idec Ma Inc. Cripto binding molecules
TW200918553A (en) 2007-09-18 2009-05-01 Amgen Inc Human GM-CSF antigen binding proteins
PE20091163A1 (es) 2007-11-01 2009-08-09 Wyeth Corp Anticuerpos para gdf8
UY32341A (es) 2008-12-19 2010-07-30 Glaxo Group Ltd Proteínas de unión antígeno novedosas
JP5841845B2 (ja) 2009-02-24 2016-01-13 ソーク・インステチュート・フォー・バイオロジカル・スタディーズＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔｕｄｉｅｓ ＴＧＦ−βスーパーファミリーのデザイナーリガンド
WO2010107768A1 (en) 2009-03-18 2010-09-23 Schering Corporation Bicyclic compounds as inhibitors of diacylglycerol acyltransferase
PE20120532A1 (es) 2009-04-27 2012-05-18 Novartis Ag ANTICUERPOS ANTI-ActRIIB
KR20120049214A (ko) 2009-06-08 2012-05-16 악셀레론 파마 인코포레이티드 발열성 지방세포를 증가시키는 방법
US8945511B2 (en) 2009-06-25 2015-02-03 Paul Weinberger Sensitive methods for detecting the presence of cancer associated with the over-expression of galectin-3 using biomarkers derived from galectin-3
NZ599604A (en) 2009-10-01 2014-07-25 Myostin Therapeutics Pty Ltd Synthetic myostatin peptide antagonists
PT3904391T (pt) 2010-03-10 2024-10-14 Genmab As Anticorpos monoclonais contra c-met
TWI667257B (zh) * 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的ＦｃＲｎ親和力之抗體
JO3340B1 (ar) 2010-05-26 2019-03-13 Regeneron Pharma مضادات حيوية لـعامل تمايز النمو 8 البشري
AR081556A1 (es) * 2010-06-03 2012-10-03 Glaxo Group Ltd Proteinas de union al antigeno humanizadas
SG187867A1 (en) * 2010-08-16 2013-03-28 Amgen Inc Antibodies that bind myostatin, compositions and methods
US8551892B2 (en) 2011-07-27 2013-10-08 Asm Japan K.K. Method for reducing dielectric constant of film using direct plasma of hydrogen
WO2013071056A2 (en) 2011-11-11 2013-05-16 Duke University Combination drug therapy for the treatment of solid tumors
DK2780368T3 (en) 2011-11-14 2018-02-05 Regeneron Pharma COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR INCREASING MUSCLE MASS AND MUSCLE STRENGTH BY SPECIFIC ANTAGONIZATION OF GDF8 AND / OR ACTIVIN A
US20130178454A1 (en) 2011-11-17 2013-07-11 Shalender Bhasin Combination of testosterone and ornithine decarboxylase (odc) inhibitors
WO2013148284A1 (en) 2012-03-29 2013-10-03 Genentech, Inc. Antibodies that bind to a pcsk9 cleavage site and methods of use
WO2013165972A2 (en) 2012-04-30 2013-11-07 Cell Signaling Technology, Inc. Anti-hepatitis b virus antibodies and use thereof
KR101704893B1 (ko) 2012-06-15 2017-02-08 화이자 인코포레이티드 Gdf-8에 대한 개선된 길항물질 항체 및 그의 용도
JP2016500704A (ja) 2012-11-06 2016-01-14 スカラー ロック インコーポレイテッドＳｃｈｏｌａｒ Ｒｏｃｋ，Ｉｎｃ． 細胞シグナル伝達を変調するための組成物及び方法
MX380973B (es) 2013-05-01 2025-03-12 Genzyme Corp Composiciones y metodos para tratar la atrofia muscular espinal.
RS61778B1 (sr) * 2013-05-06 2021-06-30 Scholar Rock Inc Kompozicije i postupci za modulaciju faktora rasta
EP2853898B1 (en) 2013-09-27 2017-01-04 Medizinische Hochschule Hannover Analysis of myostatin in serum
US10004814B2 (en) 2013-11-11 2018-06-26 Sirna Therapeutics, Inc. Systemic delivery of myostatin short interfering nucleic acids (siNA) conjugated to a lipophilic moiety
WO2015195094A1 (en) 2014-06-17 2015-12-23 Ember Therapeutics, Inc. Anti-activin and nati-myostatin antibodies and methods of using the same
EP3215175A4 (en) 2014-11-06 2018-06-27 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
WO2016073906A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Scholar Rock, Inc. Transforming growth factor-related immunoassays
KR101860280B1 (ko) 2014-12-19 2018-05-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법
KR20170135967A (ko) 2015-04-15 2017-12-08 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 Gdf8 억제제를 사용하여 강도 및 기능을 증가시키는 방법
HRP20211081T1 (hr) * 2015-09-15 2021-10-15 Scholar Rock, Inc. Anti-pro/latentna miostatinska protutijela i njihove uporabe
AR107078A1 (es) 2015-12-18 2018-03-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo antimiostatina, polipéptidos que contienen regiones fc variantes así como métodos de uso
CN115814077A (zh) 2016-01-08 2023-03-21 供石公司 抗-原肌生长抑制素/潜伏肌生长抑制素抗体及其使用方法
NZ789269A (en) 2016-06-13 2026-01-30 Scholar Rock Inc Use of myostatin inhibitors and combination therapies
JOP20190152A1 (ar) 2016-12-21 2019-06-20 Novartis Ag مضادات الميوستاتين، الآكتيفين أو مستقبلات الآكتيفين للاستخدام في علاج السمنة والحالات ذات الصلة
PT3565592T (pt) 2017-01-06 2023-05-31 Scholar Rock Inc Tratamento de doenças metabólicas através da inibição da ativação da miostatina
EP4218817A3 (en) 2017-01-06 2023-09-06 Scholar Rock, Inc. Methods for treating metabolic diseases by inhibiting myostatin activation
WO2019193204A1 (en) 2018-04-06 2019-10-10 Cyprumed Gmbh Pharmaceutical compositions for the transmucosal delivery of therapeutic peptides and proteins
CN113677711B (zh) 2019-01-30 2025-05-30 供石公司 TGFβ的LTBP复合特异性抑制剂及其用途
AU2021369471A1 (en) 2020-10-26 2023-06-15 Scholar Rock, Inc. Use of anti-pro/latent myostatin antibody for treating spinal muscular atrophy
CR20230363A (es) 2021-01-29 2024-02-20 Biocad Joint Stock Co Efecto sinérgico de smn1 y mir-23a en el tratamiento de la atrofia muscular espinal
CA3221555A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Kimberly LONG A myostatin pathway inhibitor in combination with a glp-1 pathway activator for use in treating metabolic disorders
DK4518970T3 (da) 2022-05-04 2026-04-07 Scholar Rock Inc Anvendelse af myostatinhæmmer til behandling af spinal muskelatrofi
WO2024064842A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating obesity, diabetes, and liver dysfunction
EP4638496A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Scholar Rock, Inc. Selective and potent inhibitory antibodies of myostatin activation

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018004981A2 (pt) 2018-10-09
KR20230155021A (ko) 2023-11-09
CN113896790B (zh) 2026-03-13
FI3922645T3 (fi) 2025-06-25
CN113912718B (zh) 2025-05-20
RS66913B1 (sr) 2025-07-31
PL3922645T3 (pl) 2025-09-08
MX2022005173A (es) 2022-06-08
SMT202100432T1 (it) 2021-09-14
MX2018003196A (es) 2019-05-16
EP3350220B1 (en) 2021-05-19
PT3922645T (pt) 2025-05-29
JP2024038278A (ja) 2024-03-19
US20230190929A1 (en) 2023-06-22
US11439704B2 (en) 2022-09-13
ES2881642T3 (es) 2021-11-30
PL3350220T3 (pl) 2022-01-03
JP2026035721A (ja) 2026-03-04
CN113912718A (zh) 2022-01-11
IL258121B1 (en) 2023-09-01
CN113896790A (zh) 2022-01-07
EP3350220A1 (en) 2018-07-25
JP2022137183A (ja) 2022-09-21
JP7785107B2 (ja) 2025-12-12
AU2016323447B2 (en) 2023-03-30
EA201890712A1 (ru) 2018-09-28
EP4461312A3 (en) 2025-01-22
KR102773636B1 (ko) 2025-02-27
SI3922645T1 (sl) 2025-07-31
PT3350220T (pt) 2021-08-06
EP3922645B1 (en) 2025-05-14
JP2018527000A (ja) 2018-09-20
CN108350067A (zh) 2018-07-31
EP3922645A1 (en) 2021-12-15
CA3036652A1 (en) 2017-03-23
ES3030258T3 (en) 2025-06-27
KR102596852B1 (ko) 2023-11-02
JP7107836B2 (ja) 2022-07-27
US20180344844A1 (en) 2018-12-06
LT3350220T (lt) 2021-09-27
KR20250033313A (ko) 2025-03-07
HK1258267A1 (en) 2019-11-08
AU2016323447A1 (en) 2018-04-12
MX2022005177A (es) 2022-06-08
SI3350220T1 (sl) 2021-12-31
CY1124619T1 (el) 2022-07-22
AU2023203922A1 (en) 2023-07-13
WO2017049011A1 (en) 2017-03-23
HUE072064T2 (hu) 2025-10-28
SMT202500263T1 (it) 2025-09-12
US10751413B2 (en) 2020-08-25
IL305148A (en) 2023-10-01
US12582712B2 (en) 2026-03-24
CN113896789B (zh) 2026-03-13
DK3350220T3 (da) 2021-07-12
US20210046180A1 (en) 2021-02-18
LT3922645T (lt) 2025-06-25
HRP20250666T1 (hr) 2025-08-01
JP7418508B2 (ja) 2024-01-19
IL258121B2 (en) 2024-01-01
EP4461312A2 (en) 2024-11-13
HUE055331T2 (hu) 2021-11-29
MX2022005211A (es) 2022-05-18
IL258121A (en) 2018-05-31
DK3922645T3 (da) 2025-06-16
CN113896789A (zh) 2022-01-07
CN108350067B (zh) 2021-11-05
EA038146B1 (ru) 2021-07-13
MX2022005202A (es) 2022-05-18
KR20180049075A (ko) 2018-05-10
CO2018002703A2 (es) 2018-11-22
HRP20211081T1 (hr) 2021-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12582712B2 (en) Method of making anti-pro/latent myostatin antibodies
AU2020294193B2 (en) Anti-pro/latent-Myostatin antibodies and uses thereof
AU2023203922B2 (en) Anti-pro/latent-Myostatin antibodies and uses thereof
HK40064070A (en) Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
HK40117719A (en) Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
HK40064070B (en) Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof
HK1258267B (en) Anti-pro/latent-myostatin antibodies and uses thereof