RS62341B1

RS62341B1 - Fuzioni proteini za lečenje metaboličkih poremećaja

Info

Publication number: RS62341B1
Application number: RS20211120A
Authority: RS
Inventors: Brian R Boettcher; Shari L Caplan; Douglas S Daniels; Norio Hamamatsu; Stuart Licht; Stephen Craig Weldon
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2011-09-26
Filing date: 2012-09-26
Publication date: 2021-10-29
Also published as: NZ622998A; PL3321276T3; CN103945871B; IN2014DN02043A; GT201400055A; IL231533B; CU24206B1; CN103945871A; DK2760475T3; CO6920257A2; SMT202100595T1; EP3321276A3; ES2895080T3; PL2760475T3; TN2014000109A1; CN107266579B; SG11201400538QA; CY1124697T1; HUE039857T2; PE20141551A1

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nove fuzione proteine koji sadrže faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21) za koje se zna da poboljšavaju metaboličke profile kod subjekata kod kojih su primenjeni.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Familiju faktora rasta fibroblasta (FGF) odlikuju 22 genetički različita, homologa liganda, koji su grupisani u sedam podfamilija. FGF-21 je najsrodniji, i obrazuje podfamiliju, sa FGF-19 i FGF-23. Ova podfamilija FGF, za razliku od uobičajenih FGF, reguliše različite fiziološke procese, naime homeostazu energije i žučnih kiselina, metabolizam glukoze i lipida i homeostazu fosfata, kao i vitamina D. Osim toga, za razliku od drugih FGF, ova podfamilija ima endokrini način delovanja. (Moore, D.D. (2007) Science 316, 1436-8)(Beenken et al. (2009) Nature Reviews Drug Discovery 8, 235).

[0003] FGF21 je polipeptid dužine 209 aminokiselina koji sadrži lidersku sekvencu od 28 aminokiselina (SEQ ID NO:5). Humani FGF21 ima oko 79% identičnih aminokiselina sa mišjim FGF21 i oko 80% identičnih aminokiselina sa pacovskim FGF21. Faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21) je opisan kao sredstvo za lečenje ishemične vaskularne bolesti, zarastanje rana, i bolesti povezanih sa gubitkom funkcije plućnih, bronhijalnih ili alveolarnih ćelija. (Nishimura et al. (2000) Biochimica et Biophysica Acta, 1492:203-206; patentna objava WO01/36640; i patentna objava WO01/18172). Iako FGF-21 aktivira FGF receptore i nishodne signalne molekule, uključujući FRS2a i ERK, nije otkrivena neposredna interakcija FGFR i FGF-21. Ispitivanja su identifikovala β-kloto, koji je visoko eksprimiran u jetri, adipocitima i pankreasu, kao determinantu ćelijskog odgovora na FGF-21 i kofaktor koji posreduje u prenosu signala FGF-21 preko FGFR (Kurosu, H. et al. (2007) J Biol Chem 282, 26687-95). FGF21 je snažan agonist FGFR1(IIIc), FGFR2(IIIc) i FGFR3(IIIc) β-kloto signalnih kompleksa.

[0004] Pokazano je da FGF-21 indukuje preuzimanje glukoze nezavisno od insulina. Pokazano je i da FGF-21 olakšava hiperglikemiju u nizu glodarskih modela dijabetesa. Pored toga, otkriveno je da su transgeni miševi koji prekomerno eksprimiraju FGF-21 otporni na metaboličke abnormalnosti indukovane dijetom, i pokazuju sniženu telesnu težinu i masu masnoće, i poboljšanja u osetljivosti na insulin (Badman, M.K. et al. (2007) Cell Metab 5, 426-37). Primena FGF-21 kod nehumanih primata sa dijabetesom izazvala je opadanje nivoa glukoze, triglicerida, insulina i glukagona u plazmi u uslovima gladovanja, i dovela do značajnih poboljšanja u profilima lipoproteina uključujući porast od gotovo 80% HDL holesterola (Kharitonenkov, A. et al. (2007) Endocrinology 148, 774-81). Nedavne studije koje su ispitivale molekularne mehanizme delovanja FGF21 identifikovale su FGF21 kao važan endokrini hormon koji pomaže u kontroli adaptacije na stanje gladovanja. (Badman et al. (2009) Endocrinology 150, 4931) (Inagaki et al. (2007) Cell Metabolism 5, 415). Ovo čini prethodno nedostajuću vezu nishodno od PPARα, kojom jetra komunicira sa ostatkom tela pri regulaciji biologije homeostaze energije. (Galman et al. (2008) Cell Metabolism 8, 169) (Lundasen et al. (2007) Biochemical and Biophysical Research Communications 360, 437).

[0005] FGF21 reguliše homeostazu adipocita putem aktivacije puta AMPK/SIRT1/PGC1α za inhibiciju ekspresije PPARγ i povećanje funkcije mitohondrija. (Chau et al. (2010) PNAS 107, 12553) FGF21 povećava i preuzimanje glukoze u skeletnim mišićima pri merenju u kultivisanim humanim miotubama i izolovanom mišjem tkivu. Tretman ćelija insulocita glodara sa FGF21 vodi poboljšanju funkcije i preživljavanja putem aktivacije puteva ERK1/2 i Akt. (Wente et al. (2006) Diabetes 55, 2470). Tretman sa FGF21 takodje rezultuje u izmeni genske ekspresije za enzime lipogeneze i oksidacije masnih kiselina u jetri glodara, verovatno putem signalizacije HNF4α i Foxa2. WO2010/129503 A1 opisuje mutantne polipeptide FGF21 i postupke za lečenje metaboličkih poremećaja, kao što je dijabetes, upotrebom takvih polipeptida.

[0006] Teškoća povezana sa neposrednom upotrebom FGF-21 kao bioterapeutika je u tome što je njegov polu-život veoma kratak. (Kharitonenkov, A. et al. (2005) Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635). Kod miševa, polu-život humanog FGF21 je 0.5 do 1 čas, a kod cinomolgus majmuna, polu-život je 2 do 3 časa. FGF21 može da se koristi kao sterilna farmaceutska formulacija za višekratnu upotrebu. Medjutim, utvrdjeno je da konzervansi, tj., m-krezol, imaju neželjeno dejstvo na njegovu stabilnost pod ovim uslovima.

[0007] Pri razvoju FGF21 proteina za upotrebu kao terapeutika u lečenju dijabetesa melitusa tipa 1 i tipa 2 i drugih metaboličkih stanja, bilo bi poželjno povećanje njegovog polu-života i stabilnosti. FGF21 proteini koji imaju poboljšani polu-život i stabilnost omogućili bi manju učestalost doziranja kod pacijenata kod kojih se protein primenjuje. Jasno je da postoji potreba za razvijanjem stabilne vodene formulacije proteina za terapijski protein FGF21.

[0008] Osim toga, značajan izazov u razvoju FGF21 kao proteinskih farmaceutika, predstavlja prevazilaženje njegove fizičke i hemijske nestabilnosti. Raznovrsnost sastava i svojstava proteina definiše specifična ponašanja kao što je savijanje, konformaciona stabilnost, i odvijanje/denaturacija proteina. Ovakva svojstva treba imati na umu kada se ima za cilj stabilizacija proteina tokom razvoja uslova farmaceutske formulacije upotrebom vodenih rastvora proteina (Wang, W., Int. J. of Pharmaceutics, 18, (1999)). Željeni efekat stabilizacije terapijskih proteina od interesa, npr., proteina prema predmetnom pronalasku, predstavlja povećanje otpornosti na proteolizu i enzimsku degradaciju, čime se poboljšava stabilnost proteina i smanjuje agregacija proteina.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0009] Pronalazak se odnosi na identifikaciju novih fuzionih proteina koji sadrže faktor rasta fibroblasta 21 (FGF21) i koji imaju poboljšana farmaceutska svojstva u odnosu na divlji tip FGF21 i njegove varijante pod uslovima farmaceutske formulacije, npr., stabilniji su, poseduju sposobnost poboljšanja metaboličkih parametara kod subjekata kod kojih su primenjeni, manje su podložni proteolizi i enzimskoj degradaciji, i imaju manju verovatnoću da agregiraju i obrazuju komplekse. Fuzioni proteini prema pronalasku su opisani u patentnom zahtevu 1.

[0010] Fuzioni proteini prema pronalasku prevazilaze značajne prepreke fizičke nestabilnosti povezane sa proteinskom terapijom, uključujući, na primer, one koji se javljaju kod primene divljeg tipa FGF21, predstavljajući proteine koji su stabilniji, manje podložni proteolizi i enzimskoj degradaciji, i za koje je manje verovatno da će agregirati i obrazovati komplekse, nego divlji tip FGF21 u uslovima farmaceutske formulacije.

[0011] U prvom aspektu, pronalazak obezbedjuje fuzione proteine faktora rasta fibroblasta 21 (FGF21) koji sadrže protein FGF21 divljeg tipa i Fc region, pri čemu je Fc region fuzionisan sa N-terminalnim krajem proteina FGF21 preko aminokiselinskog linkera sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od GS i GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6), i pri čemu fuzioni protein ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7 ili SEQ ID NO:8 navedenu u tabeli 1, i dodatno opisanu u ovom dokumentu.

[0012] Navedene fuzije ostvarene su izmedju varijanti sekvenci FGF21 i drugih molekula (deo koji nije FGF21). Deo molekula koji nije FGF21 predstavlja Fc region.

[0013] Drugi primeri izvodjenja se odnose na polinukleotide koji kodiraju fuzione proteine prema pronalasku, vektor koji sadrži navedene polinukleotide i ćeliju-domaćina koja nosi navedeni vektor.

[0014] Ovde su obezbedjeni postupci koji se koriste za stvaranje fuzionih proteina prema pronalasku, pri čemu takvi postupci obuhvataju modifikaciju divljeg tipa FGF21 proteina, putem npr., mestospecifične ugradnje aminokiselina na pozicijama od interesa u divljem tipu FGF21 proteina, kao i fuziju izmedju dela molekula FGF21 sa drugim molekulima, npr., konstantnim domenom IgG ili njegovim fragmentom (npr., Fc regionom), humanim serumskim albuminom (HSA), ili polipeptidima koji vezuju albumin. Navedene modifikacije i fuzije poboljšavaju biološka svojstva fuzionih proteina prema pronalasku u odnosu na verzije divljeg tipa proteina, a, u nekim slučajevima, služe i kao tačke vezivanja za, npr., obeleživače i sredstva za produžavanje polu-života proteina, i u svrhu pričvršćivanja navedenih varijanti za površinu čvrste podloge. Povezani primeri izvodjenja prema pronalasku su postupci za proizvodnju ćelija sposobnih za proizvodnju navedenih proteina prema pronalasku, i za proizvodnju vektora koji sadrže DNK koja kodira navedene varijante i fuzije.

[0015] Fuzioni proteini prema pronalasku koji su ovde otkriveni mogu da budu kovalentno vezani za jedan ili više polimera, kao što su polietilen glikol (PEG) ili polisijalinska kiselina, ili na poziciji mesto-specifičnih aminokiselinskih modifikacija izvedenih u odnosu na divlji tip FGF21, ili na poziciji aminokiselina koje se uobičajeno dele sa verzijama divljeg tipa ovih proteina. PEG grupa je vezana na taj način da poboljšava, i/ili ne interferira sa biološkom funkcijom konstitutivnih delova fuzionih proteina prema pronalasku, npr., varijantama FGF21 proteina. U primerima izvodjenja prema pronalasku, polipeptidi prema pronalasku su fuzionisani sa heterologim aminokiselinskim sekvencama, preko linkera, kao što je GS, GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6). Heterologa aminokiselinska sekvenca je konstantni domen IgG ili njegov fragment (npr., Fc region). Opisani su i humani serumski albumin (HSA), ili polipeptidi koji vezuju albumin. Takvi fuzioni proteini koji su ovde opisani mogu takodje da obrazuju multimere.

[0016] U primerima izvodjenja, heterologa aminokiselinska sekvenca (Fc) je fuzionisana sa aminoterminalnim krajem fuzionih proteina pronalaska. Takođe je opisano i da je fuziona heterologa aminokiselinska sekvenca (npr., HSA, Fc, itd.) fuzionisana sa karboksil-terminalnim krajem fuzionog proteina.

[0017] Još jedan primer izvodjenja se odnosi na fuzione proteine prema pronalasku za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa FGF21, odabranih iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetes melitusa tipa 2, dijabetes melitusa tipa 1, pankreatitisa, dislipidemije, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), insulinske rezistencije, hiperinsulinemije, intolerancije glukoze, hiperglikemije, metaboličkog sindroma, akutnog infarkta miokarda, hipertenzije, kardiovaskularne bolesti, ateroskleroze, periferne arterijske bolesti, moždanog udara, srčane insuficijencije, koronarne bolesti srca, bubrežne bolesti, komplikacija dijabetesa, neuropatije, gastropareze, poremećaja povezanih sa inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru, i drugim metaboličkim poremećajima, koja obuhvata primenu kod pacijenta kome je takvo lečenje potrebno, terapijski efikasne količine jednog ili više proteina prema pronalasku ili njihove farmaceutske kompozicije.

[0018] Pronalazak takodje obezbedjuje farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzione proteine prema ovde opisanom pronalasku i farmaceutski prihvatljivo sredstvo za formulaciju. Takve farmaceutske kompozicije mogu da se upotrebe u lečenju metaboličkog poremećaja, i upotreba obuhvata primenu farmaceutske kompozicije prema pronalasku kod humanog pacijenta kome je to potrebno. Neograničavajući primeri metaboličkih poremećaja koji mogu da se leče uključuju dijabetes melitus tipa 1 i tipa 2 i gojaznost.

[0019] Ovi i drugi aspekti prema pronalasku biće razjašnjeni u detaljnom opisu pronalaska koji sledi.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0020]

Slike 1A-1D prikazuju da V188 ima poboljšanu efikasnost u ob/ob mišjem modelu dijabetesa u odnosu na V76. V188 pokazuje nadmoćne rezultate kada se primeni u dozi od 1 miligrama po kilogramu (mpk), u poredjenju sa dozom od 5 miligrama po kilogramu u kojoj je primenjen V76. Slika 1A prikazuje očitavanje glukoze u plazmi nakon obroka (kružići predstavljaju vehikulum (PBS – fosfatno puferisani fiziološki rastvor), kvadratići predstavljaju V76 pri 5 mpk, i trouglovi predstavljaju V188 pri 1 mpk. Slika 1B prikazuje očitavanje insulina u plazmi nakon obroka (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V188 pri 1 mpk). Slika 1C prikazuje očitavanje telesne težine (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V188 pri 1 mpk). Slika 1D prikazuje očitavanje sadržaja lipida u jetri (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V188 pri 1 mpk).

Slike 2A-2D prikazuju da V101 ima poboljšanu efikasnost u ob/ob mišjem modelu dijabetesa u odnosu na V76. V101 pokazuje nadmoćne rezultate kada se primeni u dozi od 1 miligrama po kilogramu (mpk), u poredjenju sa dozom od 5 miligrama po kilogramu u kojoj je primenjen V76. Slika 2A prikazuje očitavanje glukoze u plazmi nakon obroka (kružići predstavljaju vehikulum (PBS – fosfatno puferisani fiziološki rastvor), kvadratići predstavljaju V76 pri 5 mpk, i trouglovi predstavljaju V101 pri 1 mpk. Slika 2B prikazuje očitavanje insulina u plazmi nakon obroka (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V101 pri 1 mpk). Slika 2C prikazuje očitavanje telesne težine (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V101 pri 1 mpk). Slika 2D prikazuje očitavanje sadržaja lipida u jetri (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V101 pri 1 mpk).

Slike 3A-3D prikazuju da V103 ima poboljšanu efikasnost u ob/ob mišjem modelu dijabetesa u odnosu na V76. V103 pokazuje nadmoćne rezultate kada se primeni u dozi od 1 miligrama po kilogramu (mpk), u poredjenju sa dozom od 5 miligrama po kilogramu u kojoj je primenjen V76. Slika 3A prikazuje očitavanje glukoze u plazmi nakon obroka (kružići predstavljaju vehikulum (PBS – fosfatno puferisani fiziološki rastvor), kvadratići predstavljaju V76 pri 5 mpk, i trouglovi predstavljaju V103 pri 1 mpk. Slika 3B prikazuje očitavanje insulina u plazmi nakon obroka (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V103 pri 1 mpk). Slika 3C prikazuje očitavanje telesne težine (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V103 pri 1 mpk). Slika 3D prikazuje očitavanje sadržaja lipida u jetri (s leva na desno: vehikulum, V76 pri 5 mpk, i V103 pri 1 mpk).

Slike 4A-4D prikazuje superiorna farmakokinetička i termodinamička svojstva koja poseduju fuzioni proteini prema pronalasku u odnosu na FGF21 fuzione proteine iz stanja tehnike.

Slika 4A prikazuje koncentracije fuzionih proteina pronalaska u plazmi u PCT objavi WO10/129600 opisane kao Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G) i Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E), nakon IV injekcije navedenih fuzionih proteina kod miševa. Slika 4B prikazuje farmakokinetička svojstva fuzionih proteina prema pronalasku (V101, V103 i V188) nakon jedne IV doze kod miša ispitano testom anti-Fc-ELISA u poredjenju sa farmakokinetičkim podacima dobijenim kod miša za V76 u prethodnom ispitivanju upotrebom ELISA metode sa anti-FGF21 antitelom. Slika 4C prikazuje tačkastu proveru fuzionih proteina prema pronalasku metodom anti-FGF21 Western blot, konzistentnu sa podacima dobijenim metodom anti-Fc-ELISA na 120 časova i 15 dana. Uzorci u blot metodi su kao što sledi: A predstavlja V101, B predstavlja V103 i C predstavlja V188. Kontrola je V101 i serum. Slika 4D pokazuje značajno povećanje termodinamičke stabilnosti fuzionih proteina prema pronalasku u poredjenju sa V76. Od vrha ka dole, slika predstavlja V101, V103 i V188, od kojih svi imaju poboljšane temperature topljenja (Tm) u poredjenju sa V76 (Tm< 50 ̊C (nije prikazano)) i divljim tipom FGF21 (Tm= 46.5 ̊C±0.3 (nije prikazano)).

DETALJAN OPIS PRONALASKA

[0021] Fuzioni proteini predmetnog pronalaska predstavljaju modifikovane verzije, divljeg tipa FGF21 polipeptida cele dužine, kao što je poznato u stanju tehnike. Sekvenca divljeg tipa FGF21 će služiti kao referentna sekvenca (SEQ ID NO:1), na primer, kada su neophodna poredjenja izmedju sekvence divljeg tipa FGF21 i proteinskih varijanti. Sekvenca divljeg tipa FGF21 ima broj NCBI referentne sekvence NP_061986.1, i može da se nadje u objavljenim patentima kao, npr., US 6,716,626B1, korporacije Chiron Corporation (SEQ ID NO:1).

[0022] Odgovarajuća sekvenca iRNK koja kodira FGF21 polipeptid cele dužine (broj NCBI referentne sekvence NM_019113.2) prikazana je ispod (SEQ ID NO:2)

[0023] Zreloj sekvenci FGF21 nedostaje liderska sekvenca i može da uključuje i druge modifikacije polipeptida kao što je proteolitička obrada amino terminalnog kraja (sa ili bez liderske sekvence) i/ili karboksilnog terminalnog kraja, isecanje manjeg polipeptida iz većeg prekursora, N-vezana i/ili O-vezana glikozilacija, i druge post-translacione modifikacije poznate stručnjacima u odgovarajućoj oblasti. Reprezentativni primer zrele sekvence FGF21 ima sledeću sekvencu (SEQ ID NO:3, koja predstavlja aminokiselinske pozicije 29-209 cele dužine proteinske sekvence FGF21 (broj NCBI referentne sekvence NP_061986.1)):

[0024] Odgovarajuća cDNK sekvenca koja kodira zreli FGF21 polipeptid (SEQ ID NO:3) prikazana je ispod (SEQ ID NO:4):

[0025] Opisani su i fuzioni proteini koji sadrže varijante FGF21. Kako se ovde koristi, izrazi “proteinska varijanta”, “humana varijanta”, “polipeptidna ili proteinska varijanta”, “varijanta”, “mutant”, kao i bilo koji slični izrazi ili njihove specifične verzije (npr., “varijanta FGF21 proteina”, “varijanta”, “FGF21 mutant”, itd.) definišu proteinske ili polipeptidne sekvence koje sadrže modifikacije, skraćivanja, druge varijante prirodnih (tj., divljeg tipa) ekvivalenata proteina ili polipeptida ili odgovarajućih nativnih sekvenci. “Varijanta FGF21” ili “FGF21 mutant”, na primer, opisan je u odnosu na divlji tip (tj., prirodni) FGF21 proteina, kao što je ovde opisano.

[0026] Sekvence fuzionog proteina predmetnog otkrića navedene su u tabeli 1. Sekvence fuzionog proteina predmetnog pronalaska opisane su u SEQ ID NO:7 i 8. Opisi fuzija uključuju varijantu FGF21 i, gde je primenljivo, linker. Izmene ili supstitucije uključene u varijantu FGF21 su numerisane i opisane u odnosu na divlji tip FGF21. U smislu primera, “varijanta 101 (V101)” (SEQ ID NO:10) je Fc-FGF21 fuzija sa linkerom od dve aminokiseline i sledećim supstitucijama uvedenim u odnosu na divlji tip FGF21: Q55C, A109T, G148C, K150R, P158S, P174L, S195A, P199G, G202A.

Tabela 1: Varijante FGF21 Fc fuzionih proteina

1

[0027] Varijante ili mutanti upotrebljeni u fuzionim proteinima, npr., varijante divljeg tipa FGF21, su kao što je dato u patentnom zahtevu 1. Uopšteno, varijanta ima neko modifikovano svojstvo, strukturno ili funkcionalno, divljeg tipa proteina. Na primer, varijanta može da ima povećanu ili poboljšanu fizičku stabilnost u koncentrovanim rastvorima (npr., manje agregacije posredovane hidrofobnošću), povećanu ili poboljšanu stabilnost u plazmi kada se inkubira sa krvnom plazmom ili povećanu ili poboljšanu bioaktivnost dok pritom zadržava poželjni profil bioaktivnosti.

[0028] Prihvatljive aminokiselinske supstitucije i modifikacije koje čine razliku izmedju delova fuzionih proteina prema pronalasku i njihovih uporednih proteina divljeg tipa su one sa sekvencama 7-8 u tabeli 1.

[0029] Stručnjak u oblasti ekspresije proteina će prepoznati da metionin ili sekvenca metionin-arginin može da se uvede na N-terminalnom kraju bilo kog od fuzionih proteina prema pronalasku, za ekspresiju u E. coli, što je obuhvaćeno kontekstom ovog pronalaska.

[0030] Fuzioni proteini prema pronalasku mogu da imaju povećanu kompatibilnost sa farmaceutskim konzervansima (npr., m-krezol, fenol, benzil alkohol), omogućavajući tako pripremu konzervirane farmaceutske formulacije koja održava fizikohemijska svojstva i biološku aktivnost proteina tokom skladištenja. Prema tome, varijante sa poboljšanom farmaceutskom stabilnošću u odnosu na divlji tip, imaju poboljšanu fizičku stabilnost u koncentrovanim rastvorima i u fiziološkim uslovima, i u uslovima konzervisane farmaceutske formulacije, uz očuvanje biološke aktivnosti. U smislu neograničavajućeg primera, fuzioni proteini prema pronalasku mogu da budu otporniji na proteolizu i enzimsku razgradnju; mogu da imaju poboljšanu stabilnost; i manju verovatnoću da će agregirati, nego njihovi ekvivalenti divljeg tipa ili odgovarajuća nativna sekvenca. Kako se ovde koriste, ovi izrazi nisu medjusobno isključivi ili ograničavajući, sasvim je moguće da odredjena varijanta ima jednu ili više modifikovanih osobina divljeg tipa proteina.

[0031] Pronalazak takodje obuhvata molekule nukleinske kiseline koji kodiraju fuzione proteine prema pronalasku, koji sadrže, na primer, aminokiselinsku sekvencu FGF21 koja je najmanje oko 95% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:3, ali gde specifične rezidue koje daju željeno svojstvo varijanti proteina FGF21, npr., poboljšanu potencu FGF21-receptora, otpornost na proteolizu, produženi polu-život ili svojstva koja smanjuju agregaciju i njihove kombinacije, nisu dodatno modifikovane. Drugim rečima, sa izuzetkom rezidua u mutantnoj sekvenci FGF21 koje su modifikovane kako bi obezbedile rezistenciju na proteolizu, smanjenje agregacije, ili druga svojstva, oko 5% (alternativno 4%, alternativno 3%, alternativno 2%, alternativno 1%) svih ostalih aminokiselinskih rezidua u mutantnoj sekvenci FGF21 može da bude modifikovano. Takvi mutanti FGF21 poseduju najmanje jednu aktivnost polipeptida FGF21 divljeg tipa.

[0032] Pronalazak takodje obuhvata molekul nukleinske kiseline koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja je najmanje oko 85%, identična, i poželjnije, najmanje oko 90 do 95% identična nukleotidnoj sekvenci SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:4, ali gde nukleotidi koji kodiraju aminokiselinske rezidue koje obezbeđuju rezistenciju na proteolizu, smanjenje agregacije ili druga svojstva kodiranog proteina nisu dodatno modifikovani. Drugim rečima, sa izuzetkom nukleotida koji kodiraju rezidue u mutantnim sekvencama FGF21 koje su modifikovane kako bi obezbedile rezistenciju na proteolizu, smanjenje agregacije, ili druga svojstva, oko 15%, i poželjnije oko 10 do 5% svih ostalih nukleotida u mutantnoj sekvenci može da bude modifikovano. Takvi molekuli nukleinske kiseline kodiraju proteine koji imaju najmanje jednu aktivnost svojih ekvivalenata divljeg tipa.

[0033] Ovde su dati postupci korišćeni za dobijanje fuzionih proteina prema pronalasku, pri čemu takvi postupci uključuju mesto-specifičnu modifikaciju i ne-mesto-specifičnu modifikaciju verzija divljeg tipa proteina (npr., divlji tip FGF21 proteina kao što je ovde opisano), npr., skraćivanja divljeg tipa proteina, i mesto-specifična ugradnja aminokiselina na pozicijama od interesa u divljem tipu proteina. Navedene modifikacije poboljšavaju biološka svojstva fuzionih proteina prema pronalasku u odnosu na divlji tip proteina, i, u nekim slučajevima, služe kao tačke vezivanja za, npr., obeleživače i sredstva za produživanje polu-života proteina, i u svrhu pričvršćivanja navedenih varijanti za površinu čvrste podloge. Srodni primeri izvodjenja prema pronalasku su postupci za dobijane ćelija sposobnih da proizvode navedene fuzione proteine prema pronalasku, i da proizvode vektore koji sadrže DNK koja kodira za navedene varijante.

1

[0034] Takve modifikacije, npr., mesto-specifične modifikacije, koriste se, npr., za vezivanje konjugata, npr., PEG grupa za proteine, polipeptide i/ili peptide pronalaska, u svrhu, npr., produžavanja polu-života ili drugačijeg poboljšavanja bioloških svojstava navedenih proteina, polipeptida i/ili peptida. Navedene tehnike su ovde dodatno opisane.

[0035] Zatim, takve modifikacije, npr., mesto-specifične modifikacije, koriste se, npr., za spajanje drugih polimera, malih molekula i rekombinantnih proteinskih sekvenci koje produžavaju polu-život proteina prema pronalasku. To obuhvata povezivanje masnih kiselina ili specifičnih albuminvezujućih jedinjenja sa proteinima, polipeptidima i/ili peptidima. Dalje, modifikacije su, npr., izvedene na odredjenom tipu aminokiselina i mogu da budu pripojene na jednom ili više mesta u proteinu.

[0036] Dalje, takve modifikacije, npr., mesto-specifične modifikacije, koriste se, npr., kao sredstvo za povezivanje za proizvodnju multimera divljeg tipa i/ili varijante, npr., dimera (homodimera ili heterodimera) ili trimera ili tetramera. Ovi multimerni proteinski molekuli mogu dodatno da imaju grupe kao što su PEG, šećeri, i/ili konjugati PEG-holesterol vezane ili fuzionisane bilo aminoterminalno ili karboksi-terminalno sa drugim proteinima kao Fc, humani serumski albumin (HSA), itd.

[0037] Dalje, takve mesto-specifične modifikacije koriste se, npr., za proizvodnju proteina, polipeptida i/ili peptida pri čemu pozicija mesto-specifično ugradjenog pirolizina ili analoga pirolizina ili neprirodnih aminokiselina (para-acetil-Phe, para-azido-Phe) omogućava kontrolisanu orjentaciju i vezivanje takvih proteina, polipeptida i/ili peptida na površinu čvrste podloge ili za vezivanje grupa kao što su PEG, šećeri i/ili konjugati PEG-holesterol.

[0038] Dalje, takve mesto-specifične modifikacije koriste se, npr., za mesto-specifično unakrsno povezivanje proteina, polipeptida i/ili peptida čime se obrazuju hetero-oligomeri uključujući, ali bez ograničenja, heterodimere i heterotrimere. Dalje, takve mesto-specifične modifikacije koriste se, npr., za mesto-specifično unakrsno povezivanje proteina, polipeptida i/ili peptida čime se obrazuju proteinprotein konjugati, protein-polipeptid konjugati, protein-peptid konjugati, polipeptid-polipeptid konjugati, polipeptid-peptid konjugati, ili peptid-peptid konjugati. Zatim, mesto-specifična modifikacija može da uključuje tačku grananja da bi se omogućilo da više od jednog tipa molekula bude spojeno na jednom mestu u proteinu, polipeptidu ili peptidu.

[0039] Zatim, modifikacije koje su ovde navedene mogu da se izvedu na način koji nije mestospecifičan i rezultuju u protein-protein konjugatima, protein-polipeptid konjugatima, protein-peptid konjugatima, polipeptid-polipeptid konjugatima, polipeptid-peptid konjugatima, ili peptid-peptid konjugatima prema pronalasku.

Definicije

[0040] U ovom dokumentu se koriste razne definicije. Većina reči ima značenje koje bi stručnjak u odgovarajućoj oblasti pripisao ovim rečima. Reči koje su posebno definisane u nastavku teksta ili negde drugde u ovom dokumentu imaju značenje dato u kontekstu predmetnog pronalaska kao celine i tipično ih razume stručnjak u odgovarajućoj oblasti.

[0041] Kako se ovde koristi, pojam “FGF21” se odnosi na člana familije proteina faktora rasta fibroblasta (FGF). Aminokiselinska sekvenca FGF21 (GenBank pristupni br. NP_061986.1) prikazana je u sekvenci SEQ ID NO:1, čija je odgovarajuća polinukleotidna sekvenca prikazana kao SEQ ID NO:2 (broj NCBI referentne sekvence NM_019113.2). “Varijanta FGF21”, “FGF21 mutant”, i slični izrazi opisuju modifikovanu verziju FGF21 proteina, npr., sa sastavnim aminokiselinskim reziduama koje su deletirane, dodate, modifikovane, ili supstituisane.

[0042] Kako se ovde koristi, pojam “FGF21 receptor” se odnosi na receptor za FGF21 (Kharitonenkov, A, et al. (2008) Journal of Cellular Physiology 215:1-7; Kurosu, Het al. (2007) JBC 282:26687-26695; Ogawa, Yet al. (2007) PNAS 104:7432-7437).

[0043] Pojam “FGF21 polipeptid” se odnosi na prirodni polipeptid koji se eksprimira kod ljudi. U svrhu ovog otkrića, pojam “FGF21 polipeptid” može da se koristi medjusobno zamenljivo da označi celu dužinu FGF21 polipeptida, npr., SEQ ID NO:1, koja se sastoji od 209 aminokiselinskih rezidua i koja je kodirana nukleotidnom sekvencom SEQ ID NO:2; bilo koji zreli oblik polipeptida, koji se sastoji od 181 aminokiselinske rezidue, i u kome je 28 aminokiselinskih rezidua na aminoterminalnom kraju cele dužine FGF21 polipeptida (tj., koji čine signalni peptid) uklonjeno.

[0044] “Varijanta 76”, kako se ovde koristi, je varijanta FGF21 proteina, koja ima granati PEG od 40 kDa spojen preko Cys154, i osam tačkastih mutacija u odnosu na 177 aminokiselina dug divlji tip proteina. Sinteza varijante je ovde detaljnije opisana, i proteinska sekvenca je predstavljena u tabeli 1 i SEQ ID NO:9.

[0045] Pojam “izolovani molekul nukleinske kiseline” se odnosi na molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska koji (1) je razdvojen od najmanje oko 50 procenata proteina, lipida, ugljenih hidrata, ili drugih materijala sa kojima se nalazi u prirodi kada je ukupna nukleinska kiselina izolovana iz ćelija kao izvora, (2) nije vezan za ceo ili deo polinukleotida sa kojim je “izolovani molekul nukleinske kiseline” vezan u prirodi, (3) funkcionalno je vezan za polinukleotid za koji nije vezan u prirodi, ili (4) ne javlja se u prirodi kao deo veće polinukleotidne sekvence. Poželjno, izolovani molekul nukleinske kiseline predmetnog pronalaska je suštinski bez bilo kojih drugih kontaminirajućih molekula nukleinske kiseline ili drugih kontaminanata koji se javljaju u njegovom prirodnom okruženju koji bi interferirali sa njegovom upotrebom u proizvodnji polipeptida ili njegovoj terapijskoj, dijagnostičkoj, profilaktičkoj ili istraživačkoj upotrebi.

[0046] Pojam “vektor” se koristi da označi bilo koji molekul (npr., nukleinsku kiselinu, plazmid, ili virus) koji se koristi za prenos kodirajuće informacije u ćeliju-domaćina.

[0047] Pojam “ekspresioni vektor” se odnosi na vektor koji je pogodan za transformaciju ćelijedomaćina i sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja usmerava i/ili kontroliše ekspresiju ubačenih

1

heterologih sekvenci nukleinske kiseline. Ekspresija obuhvata, ali nije ograničena na procese kao što su transkripcija, translacija, i obrada RNK transkripta, ukoliko su introni prisutni.

[0048] Pojam “funkcionalno vezan” se ovde koristi da označi uredjenje bočnih sekvenci pri čemu su tako opisane bočne sekvence konfigurisane ili sklopljene tako da sprovode svoju uobičajenu funkciju. Elementi fuzije proteina mogu da budu funkcionalno vezani jedan za drugi tako da se omogući da fuzioni protein funkcioniše kao da je prirodni, endogeni protein, i/ili da se kombinuju različiti elementi navedenih fuzionih proteina na sinergistički način.

[0049] Na nivou nukleotida, bočna sekvenca koja je funkcionalno vezana za kodirajuću sekvencu može da utiče na replikaciju, transkripciju i/ili translaciju kodirajuće sekvence. Na primer, kodirajuća sekvenca je funkcionalno vezana za promotor kada je promotor sposoban da upravlja transkripcijom te kodirajuće sekvence. Bočna sekvenca ne mora da se graniči sa kodirajućom sekvencom, sve dok ispravno funkcioniše. Prema tome, na primer, umetnute netranslatirane, ali transkribovane sekvence mogu da budu prisutne izmedju promotorske sekvence i kodirajuće sekvence i promotorska sekvenca i dalje može da se smatra “funkcionalno vezanom” za kodirajuću sekvencu.

[0050] Pojam “ćelija-domaćin” se koristi da označi ćeliju koja je transformisana, ili je sposobna da bude transformisana sekvencom nukleinske kiseline i da zatim eksprimira odabrani gen od interesa. Pojam obuhvata potomstvo parentalne ćelije, bilo da potomstvo jeste ili nije morfološki ili genetski identično originalnoj parentalnoj ćeliji, sve dok je odabrani gen prisutan.

[0051] Pojam “aminokiselina,” kako se ovde koristi, odnosi se na prirodne aminokiseline, neprirodne aminokiseline, analoge aminokiselina i mimetike aminokiselina koji funkcionišu na način sličan prirodnim aminokiselinama, sve u obliku njihovih D i L stereoizomera, ako njihova struktura dozvoljava takve stereoizomerne oblike. Aminokiseline su ovde označene bilo svojim nazivima, svojim opšte poznatim simbolima od tri slova ili simbolima od jednog slova preporučenim od strane komisije za biohemijsku nomenklaturu IUPAC-IUB.

[0052] Pojam “prirodni” kada se koristi u vezi sa biološkim materijalima kao što su molekuli nukleinske kiseline, polipeptidi, ćelije-domaćini, i slično, odnosi se na materijale koji se nalaze u prirodi i kojima čovek nije manipulisao. Slično, “neprirodni”, kako se ovde koristi, odnosi se na materijal koji se ne nalazi u prirodi ili koji je strukturno modifikovao ili sintetisao čovek. Kada se koristi u vezi sa nukleotidima, pojam “prirodni” se odnosi na baze adenin (A), citozin (C), guanin (G), timin (T) i uracil (U). Kada se koristi u vezi sa aminokiselinama, pojam “prirodni” se odnosi na 20 uobičajenih aminokiselina (tj., alanin (A), cistein (C), asparaginsku kiselinu (D), glutaminski kiselinu (E), fenilalanin (F), glicin (G), histidin (H), izoleucin (I), lizin (K), leucin (L), metionin (M), asparagin (N), prolin (P), glutamin (Q), arginin (R), serin (S), treonin (T), valin (V), triptofan (W) i tirozin (Y)), kao i selenocistein, pirolizin (Pyl, ili O) i pirolin-karboksi-lizin (Pcl, ili Z).

1

[0053] Pirolizin (Pyl) je aminokiselina koja se u prirodi nalazi u metilamin-metiltransferazama metanogenih arheja familije Methanosarcina. Pirolizin je analog lizina ko-translaciono ugradjen u kodone u okviru čitanja u odgovarajućoj iRNK, i smatra se 22. prirodnom aminokiselinom.

[0054] Kao što je opisano bar u PCT patentnoj objavi WO2010/48582 (podnosilac IRM, LLC), pokušaji biosinteze pirolizina (Pyl) u E. coli rezultovali su u obrazovanju “demetilisanog pirolizina”, ovde pomenutog kao pirolin-karboksi-lizin, ili Pcl. “Pcl”, kako se ovde koristi, odnosi se ili na Pcl-A ili na Pcl-B.

[0055] Pojmovi “aminokiselina koja nije prirodna” i “neprirodna aminokiselina,” kako se ovde koriste, su medjusobno zamenljivi i namenjeni da predstavljaju strukture aminokiselina koje ne mogu da se dobiju biosintetički u bilo kom organizmu upotrebom nemodifikovanih ili modifikovanih gena iz bilo kog organizma, bilo istog ili različitog. Pojmovi se odnose na aminokiselinsku reziduu koja nije prisutna u prirodnoj sekvenci (divljeg tipa) FGF21 proteina ili sekvencama predmetnog pronalaska. Oni uključuju, ali nisu ograničeni na modifikovane aminokiseline i/ili analoge aminokiselina koje nisu jedna od 20 prirodnih aminokiselina, selenocistein, pirolizin (Pyl), ili pirolin-karboksi-lizin (Pcl, npr., kao što je opisano u PCT patentnoj objavi WO2010/48582). Takve aminokiselinske rezidue koje nisu prirodne mogu da se uvedu supstitucijom prirodnih aminokiselina, i/ili insercijom aminokiselina koje nisu prirodne u prirodnu sekvencu (divljeg tipa) FGF21 proteina ili sekvence prema pronalasku. Aminokiselinska rezidua koja nije prirodna takodje može da se ugradi tako da se željena funkcionalnost prenese na FGF21 molekul, na primer, sposobnost da se veže funkcionalni fragment (npr., PEG). Kada se koristi u vezi sa aminokiselinama, simbol “U” će značiti “aminokiselina koja nije prirodna” i “neprirodna aminokiselina,” kako se ovde koristi.

[0056] Dodatno, podrazumeva se da takve “neprirodne aminokiseline” zahtevaju modifikovane tRNK i modifikovanu tRNK sintetazu (RS) za ugradnju u protein. Ovi “selektovani” ortogonalni tRNK/RS parovi se stvaraju postupkom selekcije koji su razvili Schultz et al., ili nasumičnom ili ciljanom mutacijom. Kao primer, pirolin-karboksi-lizin je “prirodna aminokiselina” budući da je stvorena biosintetički pomoću gena prenetih iz jednog organizma u ćelije-domaćine i budući da je ugradjena u proteine upotrebom prirodnih gena za tRNK i tRNK sintetazu, dok je p-aminofenilalanin (videti, Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9) “neprirodna aminokiselina” jer, iako je stvorena biosintetički, ugradjena je u proteine pomoću “selektovanog” ortogonalnog para tRNK/tRNK sintetaza.

[0057] Modifikovane kodirane aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, O-fosfoserin, azetidinekarboksilnu kiselinu, 2-aminoadipinsku kiselinu, 3-aminoadipinsku kiselinu, beta-alanin, aminopropionsku kiselinu, 2-aminobuternu kiselinu, 4-aminobuternu kiselinu, 6-aminokaproinsku kiselinu, 2-aminoheptanoinsku kiselinu, 2-aminoizobuternu kiselinu, 3-aminoizobuternu kiselinu, 2-aminopimelindku kiselinu, tercijarni-

1

butilglicin, 2,4-diaminoizobuternu kiselinu, desmozin, 2,2’-diaminopimelinsku kiselinu, 2,3-diaminoproprionsku kiselinu, N-etilglicin, N-metilglicin, N-etilasparagin, homoprolin, hidroksilizin, alo-hidroksilizin, 3-hidroksiprolin, 4-hidroksiprolin, izodesmozin, alo-izoleucin, N-metilalanin, N-metilglicin, N-metilizoleucin, N-metilpentilglicin, N-metilvalin, naftalanin, norvalin, norleucin, ornitin, pentilglicin, pipekolnu kiselinu i tioprolin. Pojam “aminokiselina” takodje obuhvata prirodne aminokiseline koje su metaboliti u izvesnim organizmima, ali koje nisu kodirane genetskim kodom za ugradnju u proteine. Takve aminokiseline uključuju, ali nisu ograničene na ornitin, D-ornitin i D-arginin.

[0058] Pojam “analog aminokiseline”, kako se ovde koristi, odnosi se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna aminokiselina, samo u smislu primera, α-ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu. Aminokiselinski analozi uključuju prirodne i neprirodne aminokiseline koje su hemijski blokirane, reverzibilno ili ireverzibilno, ili su njihove C-terminalne karboksi grupe, njihove N-terminalne amino grupe i/ili njihove bočne funkcionalne grupe hemijski modifikovane. Takvi analozi uključuju, ali nisu ograničeni na metionin sulfoksid, metionin sulfon, S-(karboksimetil)-cistein, S-(karboksimetil)-cistein sulfoksid, S-(karboksimetil)-cistein sulfon, asparaginska kiselina-(beta-metil estar), N-etilglicin, alanin karboksamid, homoserin, norleucin i metionin metil sulfonijum.

[0059] Pojam “mimetici aminokiselina”, kako se ovde koristi, odnosi se na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu koja je različita od opšte hemijske strukcture aminokiselina, ali funkcionišu na način koji je sličan prirodnoj aminokiselini.

[0060] Pojam “biološki aktivna varijanta” se odnosi na bilo koju varijantu polipeptida korišćenu u fuzionim proteinima prema pronalasku, npr., kao proteinski član fuzije, koja poseduje aktivnost njenog ekvivalenta divljeg tipa (npr., prirodnog) proteina ili polipeptida, kao što je sposobnost modulisanja nivoa glukoze, HbA1c, insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; povećanja funkcije pankreasa; smanjenja nivoa lipida u jetri; smanjenja telesne težine; i poboljšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije, ili osetljivosti na insulin, bez obzira na tip ili broj modifikacija koje su uvedene u varijantu polipeptida. Polipeptidne varijante koje imaju nešto snižen nivo aktivnosti u odnosu na njihovu verziju divljeg tipa mogu se ipak smatrati biološki aktivnim polipeptidnim varijantama. Neograničavajući reprezentativni primer biološki aktivne polipeptidne varijante prema pronalasku je varijanta FGF21, koja je modifikovana naknadno, i poseduje slična ili poboljšana biološka svojstva u odnosu na divlji tip FGF21.

[0061] Pojmovi “efikasna količina” i “terapijski efikasna količina” odnose se na količinu fuzionog proteina prema pronalasku koja se koristi da podrži primetan nivo jedne ili više bioloških aktivnosti ekvivalenata divljeg tipa polipeptida ili proteina, kao što su sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida ili holesterola u krvi; smanjenja nivoa triglicerida ili lipida u jetri; smanjenja telesne težine; ili poboljšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije, ili osetljivosti na insulin. Na

1

primer, “terapijski efikasna količina” primenjena kod pacijenta koji ispoljava, pati, ili ima sklonost da pati od poremećaja povezanih sa FGF21 (takvih kao dijabetes melitus tipa 1 ili tipa 2, gojaznost, ili metabolički sindrom), je takva količina koja indukuje, poboljšava ili drugačije dovodi do poboljšanja patoloških simptoma, progresije bolesti, fiziološkog stanja povezanog sa gore pomenutim poremećajima, ili otpornosti na podleganje gore pomenutim poremećajima. U svrhu predmetnog pronalaska “subjekat” ili “pacijent” je poželjno čovek, ali može da bude i životinja, konkretnije, kućni ljubimac (npr., psi, mačke, i slično), životinje sa farme (npr., krave, ovce, svinje, konji, i slično) i laboratorijske životinje (npr., pacovi, miševi, zamorci, i slično).

[0062] Pojam “farmaceutski prihvatljiv nosač” ili “fiziološki prihvatljiv nosač”, kako se ovde koristi, odnosi se na jednu ili više formulacija materijala pogodnih za postizanje ili poboljšanje isporuke fuzionog proteina prema pronalasku.

[0063] Pojam “antigen” se odnosi na molekul ili deo molekula koji je sposoban da bude vezan antitelom, i koji je dodatno sposoban da bude iskorišćen u životinji za proizvodnju antitela koja mogu da se vežu za epitop tog antigena. Antigen može da ima jedan ili više epitopa.

[0064] Pojam “nativni Fc” se odnosi na molekul ili sekvencu koji sadrže sekvencu fragmenta koji nije antigen-vezujući, nastao digestijom celog antitela ili proizveden na drugi način, bilo u monomernom ili multimernom obliku, i može da sadrži region zgloba. Izvor porekla nativnog Fc imunoglobulina je poželjno humani, i može da bude bilo koji od imunoglobulina, mada je poželjno da to budu IgG1 i IgG2. Nativni Fc molekuli su sačinjeni od monomernih polipeptida koji mogu da budu povezani u dimerne ili multimerne oblike kovalentnim (tj., disulfidnnim vezama) i nekovalentnim spajanjem. Broj intermolekularnih disulfidnih veza izmedju monomernih podjedinica nativnih Fc molekula nalazi se u opsegu od 1 do 4 u zavisnosti od klase (npr., IgG, IgA, i IgE) ili podklase (npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgA1, i IgGA2). Jedan primer nativnog Fc je dimer vezan disulfidnom vezom nastao digestijom IgG pomoću papaina (videti Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res.10: 4071-9). Pojam “nativni Fc” kako se ovde koristi je generički za monomerne, dimerne i multimerne oblike.

[0065] Pojam “Fc varijanta” se odnosi na molekul ili sekvencu koja predstavlja modifikovani nativni Fc, ali i dalje sadrži vezujuće mesto za receptor za spasavanje, FcRn (neonatalni Fc receptor). Medjunarodne objave br. WO 97/34631 i WO 96/32478 opisuju primere Fc varijanti, kao i interakciju sa receptorom za spasavanje, i ovde su inkorporirane referencom. Prema tome, pojam “Fc varijanta” može da obuhvata molekul ili sekvencu koja je humanizovana iz nehumanog nativnog Fc. Osim toga, nativni Fc sadrži regione koji mogu da se uklone jer obezbedjuju strukturna svojstva ili biološku aktivnost koja nije potrebna za fuzione molekule fuzionih proteina prema pronalasku. Tako, pojam “Fc varijanta” obuhvata molekul ili sekvencu kojoj nedostaje jedno ili više nativnih Fc mesta ili rezidua, ili u kojoj je jedno ili više Fc mesta ili rezidua modifikovano, koja utiču na, ili su uključena u: (1) obrazovanje disulfidne veze, (2) inkompatibilnost sa odabranom ćelijom-domaćinom, (3) N-terminalnu heterogenost nakon ekspresije u odabranoj ćeliji-domaćinu, (4) glikozilaciju, (5)

1

interakciju sa komplementom, (6) vezivanje za Fc receptor koji nije receptor za spasavanje, ili (7) ćelijsku citotksičnost zavisnu od antitela (ADCC). Fc varijante su detaljnije opisane u nastavku teksta.

[0066] Pojam “Fc domen” obuhvata nativni Fc i Fc varijante i sekvence kao što je gore definisano. Kao i kod varijanti Fc i nativnih Fc molekula, pojam “Fc domen” obuhvata molekule u monomernom ili multimernom obliku, bilo da su dobijeni digestijom celog antitela ili proizvedeni na drugi način. U predmetnom pronalasku, Fc domen je fuzionisan sa mutantom FGF21, kao što je prikazano u tabeli 1. Takvi fuzioni proteini mogu da obrazuju multimere putem udruživanja Fc domena, i ovi fuzioni proteini, kao i njihovi multimeri predstavljaju aspekt predmetnog pronalaska.

[0067] Pojam "modifikovani Fc fragment", kako se ovde koristi, označavaće Fc fragment antitela koji sadrži modifikovanu sekvencu. Fc fragment je deo antitela koji sadrži CH2, CH3 i deo regiona zgloba. Modifikovani Fc fragment može da bude izveden iz, na primer, IgGl, IgG2, IgG3, ili IgG4. FcLALA je modifikovani Fc fragment sa LALA mutacijom (L234A, L235A), koji izaziva ADCC sa sniženom efikasnošću, i slabo vezuje i aktivira humani komplement. Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104. Dodatne modifikacije Fc fragmenta opisane su u, na primer, SAD patentu br.7,217,798.

[0068] Pojam "heterologi" označava da ti domeni nisu u prirodi udruženi sa konstantnim regionima antitela. Konkretno, takvi heterologi vezujući domeni nemaju tipičnu strukturu varijabilnog domena antitela koja se sastoji od 4 okvirna regiona, FR1, FR2, FR3 i FR4 i 3 regiona koja odredjuju komplementarnost (CDRs) izmedju njih. Svaka ručica fuzionog antitela stoga sadrži prvi jednolančani polipeptid koji sadrži prvi vezujući domen kovalentno vezan na N-terminalnom delu konstantnog regiona teškog lanca CH1 antitela, i drugi jednolančani polipeptid koji sadrži drugi vezujući domen kovalentno vezana na N-terminalnom delu konstantnog regiona lakog lanca CLantitela. Kovalentna veza može da bude direktna, na primer preko peptidne veze ili indirektna, preko linkera, na primer, peptidnog linkera. Dva heterodimera fuzionog antitela su kovalentno vezana, na primer, najmanje jednim disulfidnim mostom u regionu zgloba, poput strukture antitela. Primeri molekula sa strukturom fuzionog antitela opisani su u stanju tehnike, posebno, fuziona antitela koja sadrže region vezivanja liganda heterodimernog receptora (videti na primer medjunarodne patentne objave WO01/46261 i WO11/076781).

[0069] Pojam “polietilen glikol” ili “PEG” se odnosi na jedinjenje polialkilen glikola ili njegov derivat, sa ili bez sredstava za kuplovanje ili derivatizacije sa fragmentima za kuplovanje ili aktivirajućim fragmentima.

[0070] Pojam “poremećaji povezani sa FGF21” i slični izrazi koji se ovde koriste, obuhvataju gojaznost, dijabetes melitus tipa 1 i tipa 2, pankreatitis, dislipidemiju, nealkoholnu bolest masne jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), insulinsku rezistenciju, hiperinsulinemiju, intoleranciju glukoze, hiperglikemiju, metabolički sindrom, akutni infarkt miokarda, hipertenziju, kardiovaskularnu bolest, aterosklerozu, perifernu arterijsku bolest, moždani udar, srčanu insuficijenciju, koronarnu bolest srca, bubrežnu bolest, komplikacije dijabetesa, neuropatiju,

2

gastroparezu, poremećaje povezane sa ozbiljnim inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru, i druge metaboličke poremećaje.

[0071] Pojam “poremećaji povezani sa ozbiljnim inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru” i slični izrazi koji se ovde koriste, opisuju stanja kod subjekata pogodjenih mutacijama u insulinskom receptoru (ili mogućim proteinima neposredno nishodno od njega) koje izazivaju ozbiljnu insulinsku rezistenciju, ali se često (mada ne uvek) sreću bez gojaznosti koja je uobičajena kod dijabetes melitusa tipa 2. Na mnogo načina, subjekti pogodjeni ovim stanjima ispoljavaju hibridne simptome dijabetes melitusa tipa 1 i dijabetes melitusa tipa 2. Subjekti koji su pogodjeni ovime nalaze se u nekoliko kategorija koje karakteriše ozbiljnost koja se naglo povećava, uključujući: insulinsku rezistenciju tipa A, insulinsku rezistenciju tipa C (sindrom AKA HAIR-AN), Rabson-Mendenholov sindrom i najzad sindrom Donahju ili leprehaunizam. Ovi poremećaji su povezani sa veoma visokim endogenim nivoima insulina, i veoma često, hiperglikemijom. Subjekti koji su pogodjeni njima takodje imaju različite kliničke karakteristike udružene sa “insulinskom toksičnošću” uključujući hiperandrogenizam, sindrom policističnih jajnika (PCOS), hirsuitizam i akantozu (prekomeran rast i pigmentacija) u naborima kože.

[0072] “Dijabetes melitus tipa 2” je stanje koje se odlikuje prekomernom proizvodnjom glukoze uprkos dostupnosti insulina, i nivoi glukoze u cirkulaciji ostaju izrazito visoki kao rezultat neadekvatnog klirensa glukoze.

[0073] “Dijabetes melitus tipa 1” je stanje koje se odlikuje visokim nivoima glukoze u krvi izazvanim potpunim nedostatkom insulina. Do ovoga dolazi kada imuni sistem tela napadne beta ćelije koje proizvode insulin u pankreasu i uništava ih. Pankreas tada proizvodi malo ili nimalo insulina.

[0074] “Intolerancija glukoze” ili poremećena tolerancija glukoze (IGT) je pre-dijabetičko stanje disglikemije koje je povezano sa povećanim rizikom od kardiovaskularne patologije. Pre-dijabetičko stanje sprečava efikasno premeštanje glukoze u ćelije kod subjekta i njeno korišćenje kao efikasnog izvora energije, što vodi povišenim nivoima glukoze u krvi i odredjenom nivou insulinske rezistencije.

[0075] “Hiperglikemija” se definiše kao prekomerni šećer (glukoza) u krvi.

[0076] “Hipoglikemija”, nazvana takodje niskim nivoom šećera u krvi, javlja se kada nivo glukoze u krvi čoveka padne tako nisko da ne može da obezbedi dovoljno energije za aktivnosti organizma čoveka.

[0077] “Hiperinsulinemija” se definiše kao nivo insulina u krvi viši od normalnog.

[0078] “Insulinska rezistencija” se definiše kao stanje u kome normalna količina insulina proizvodi biološki odgovor koji je niži od normalnog.

[0079] “Gojaznost” u smislu humanog subjekta, može da se definiše kao telesna težina koja je preko 20 procenata iznad idealne telesne težine za datu populaciju (R. H. Williams, Textbook of Endocrinology, 1974, p.904-916).

[0080] “Dijabetičke komplikacije” su problemi, uzrokovani visokim nivoima glukoze u krvi, sa drugim funkcijama organizma, kao što su funkcije bubrega, nerava (neuropatije), stopala (ulkus stopala i slaba cirkulacija) i očiju (npr. retinopatije). Dijabetes takodje povećava rizik od srčanih bolesti i poremećaja kostiju i zglobova. Ostale dugoročne komplikacije dijabetesa uključuju probleme sa kožom, digestivne probleme, seksualnu disfunkciju i probleme sa zubima i desnima.

[0081] “Metabolički sindrom” može da se definiše kao grupa od najmanje tri od sledećih znakova: abdominalna masnoća kod većine muškaraca, obim struka od 101,6 cm ili više; visok nivo šećera u krvi - najmanje 110 miligrama po decilitru (mg/dl) nakon gladovanja; visok nivo triglicerida -najmanje 150 mg/dL u krvotoku; nizak HDL – manje od 40 mg/dl; i, krvni pritisak od 130/85 mmHg ili viši.

[0082] “Pankreatitis” je zapaljenje pankreasa.

[0083] “Dislipidemija” je poremećaj metabolizma lipoproteina, uključujući prekomernu proizvodnju ili nedostatak lipoproteina. Dislipidemije mogu da se ispoljavaju povišenim koncentracijama ukupnog holesterola, lipoproteina niske gustine (LDL) holesterola i triglicerida, i padom koncentracije lipoproteina visoke gustine (HDL) holesterola u krvi.

[0084] “Nealkoholna bolest masne jetre (NAFLD)” je bolest jetre, koja nije povezana sa konzumiranjem alkohola, okarakterisana masnim promenama hepatocita.

[0085] “Nealkoholni steatohepatitis (NASH)” je bolest jetre, koja nije povezana sa konzumiranjem alkohola, okarakterisana masnim promenama hepatocita, praćena intralobularnim zapaljenjem i fibrozom.

[0086] “Hipertenzija” ili visok krvni pritisak koji je prolazni ili neprekidni porast sistemskog arterijskog krvnog pritiska do nivoa za koji je verovatno da će izazvati kardiovaskularno oštećenje ili druge neželjene posledice. Hipertenzija je bila arbitrarno definisana kao sistolni krvni pritisak iznad 140 mmHg ili dijastolni krvni pritisak iznad 90 mmHg.

[0087] “Kardiovaskularne bolesti” su bolesti povezane sa srcem ili krvnim sudovima.

[0088] “Akutni infarkt miokarda” se dogadja kada postoji prekid snabdevanja krvlju u delu srca. Rezultujuća ishemija i nedostatak kiseonika, ako ostane nelečen tokom dovoljnog perioda vremena, može da izazove oštećenje ili smrt (infarkt) srčanog mišićnog tkiva (miokardijum).

[0089] “Periferna arterijska bolest” se dogadja kada se stvore plake u arterijama koje nose krv do glave, organa i ekstremiteta. Tokom vremena, plake mogu da očvrsnu i suze arterije što ograničava protok krvi bogate kiseonikom do organa i drugih delova tela.

[0090] “Ateroskleroza” je vaskularna bolest koja se odlikuje nepravilno rasporedjenim naslagama lipida u sloju intime velikih i srednjih arterija, koje izazivaju sužavanje šupljine arterija i vode na kraju do fibroze i kalcifikacije. Lezije su obično fokalne i napreduju polako i periodično. Ograničenje protoka krvi odgovorno je za većinu kliničkih manifestacija, koje variraju sa rasporedom i ozbiljnošću lezija.

[0091] “Moždani udar” je bilo koji akutni klinički dogadjaj, povezan sa oštećenjem cerebralne cirkulacije, koji traje duže od 24 časa. Moždani udar uključuje nepovratno oštećenje mozga, pri čemu tip i ozbiljnost simptoma zavise od mesta i obima moždanog tkiva čija je cirkulacija bila ugrožena.

[0092] “Srčana insuficijencija”, takodje nazvana kongestivna srčana insuficijencija, predstavlja stanje u kome srce ne može više da pumpa dovoljno krvi u ostatak tela.

[0093] “Koronarna srčana bolest”, takodje nazvana koronarna arterijska bolest, predstavlja sužavanje malih krvnih sudova koji snabdevaju srce krvlju i kiseonikom.

[0094] “Bolest bubrega” ili nefropatija je bilo koja bolest bubrega. Dijabetička nefropatija je glavni uzrok morbiditeta i mortaliteta ljudi obolelih od dijabetes melitusa tipa 1 ili tipa 2.

[0095] “Neuroapatije” su bilo koje bolesti koje uključuju kranijalne nerve ili periferni ili autonomni nervni sistem.

[0096] “Gastropareza” je slabost peristaltike želuca, koja rezultuje odloženim pražnjenjem creva.

[0097] Kritično oboleli pacijenti obuhvaćeni predmetnim pronalaskom uopšteno doživljavaju nestabilno hipermetaboličko stanje. Ovo nestabilno hipermetaboličko stanje je posledica promena u metabolizmu supstrata, koje mogu da vode relativnoj deficijenciji nekih nutrijenata. Uopšteno postoji povećana oksidacija masti i mišića.

[0098] Osim toga, kritično oboleli pacijenti su poželjno pacijenti koji dožive sindrom sistemskog zapaljenskog odgovora ili respiratorni distres. Redukcija morbiditeta označava smanjenje verovatnoće da će kritično oboleli pacijent razviti dodatna oboljenja, stanja, ili simptome, ili smanjenje ozbiljnosti dodatnih oboljenja, stanja, ili simptoma. Na primer redukcija morbiditeta može da odgovara smanjenju incidence bakteremije ili sepse ili komplikacija povezanih sa višestrukim otkazivanjem organa.

[0099] Kako se ovde koristi, oblici jednine uključuju množinu osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, navodjenje „antitela“ uključuje smešu dva ili više takvih antitela.

[0100] Kako se ovde koristi, pojam “oko” se odnosi na /- 20%, poželjnije, /- 10%, ili još poželjnije, /- 5% vrednosti.

[0101] Pojmovi “polipeptid” i “protein”, koriste se medjusobno zamenljivo i odnose se na polimerni oblik aminokiselina bilo koje dužine, koji može da uključuje kodirane i nekodirane aminokiseline, prirodne i aminokiseline koje nisu prirodne, hemijski ili biohemijski modifikovane ili derivatizovane aminokiseline, i polipeptide koji imaju modifikovane peptidne skelete. Pojam obuhvata fuzione proteine, uključujući, ali bez ograničenja, fuzione proteine sa heterologom aminokiselinskom sekvencom, fuzije sa heterologim i homologim liderskim sekvencama, sa ili bez N-terminalnih metioninskih rezidua; imunološki obeležene proteine; i slično.

[0102] Pojmovi “pojedinac”, “subjekat”, “domaćin” i “pacijent” se koriste medjusobno zamenljivo i odnose se na bilo koji subjekat kod koga je poželjna dijagnoza, lečenje, ili terapija, naročito ljude. Drugi subjekti mogu da uključuju stoku, pse, mačke, zamorce, zečeve, pacove, miševe, konje, i slično. U nekim poželjnim primerima izvodjenja subjekat je čovek.

2

[0103] Kako se ovde koristi, pojam “uzorak” se odnosi na biološki materijal uzet od pacijent. Uzorak ispitivan prema predmetnom pronalasku nije ograničen na bilo koji odredjeni tip. Uzorci uključuju, kao neograničavajući primer, pojedinačne ćelije, više ćelija, tkiva, tumore, biološke fluide, biološke molekule, ili supernatante ili ekstrakte bilo čega od gore navedenog. Primeri uključuju tkivo uklonjeno biopsijom, tkivo uklonjeno tokom resekcije, krv, urin, limfno tkivo, limfnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, mukus i uzorke stolice. Uzorak koji se koristi će varirati u zavisnosti od oblika ogleda, metode detekcije i prirode tumora, tkiva, ćelija ili ekstrakta koji se ispituju. Postupci za pripremu uzoraka su dobro poznati u stanju tehnike i mogu lako da se prilagode u cilju dobijanja uzorka koji je kompatibilan sa korišćenim postupkom.

[0104] Kako se ovde koristi, pojam “biološki molekul” obuhvata, ali nije ograničen na polipeptide, nukleinske kiseline i saharide.

[0105] Kako se ovde koristi, pojam “modulacija” se odnosi na promenu u kvalitetu ili kvantitetu gena, proteina, ili bilo kog molekula koji se nalazi unutar, izvan, ili na površini ćelije. Promena može da bude povećanje ili smanjenje ekspresije ili nivoa molekula. Pojam “moduliše” takodje obuhvata promenu u kvalitetu ili kvantitetu biološke funkcije/aktivnosti uključujući, bez ograničenja, sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; snižavanja nivoa lipida ili triglicerida u jetri; smanjenja telesne težine; i poboljšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije, ili osetljivosti na insulin.

[0106] Kako se ovde koristi, pojam “modulator” se odnosi na kompoziciju koja moduliše jedan ili više fizioloških ili biohemijskih procesa udruženih sa poremećajem povezanim sa FGF21, kao što je dijabetes melitus tipa 1 ili tipa 2 ili metaboličko stanje kao gojaznost. Navedeni procesi uključuju, ali nisu ograničeni na sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; snižavanja nivoa lipida ili triglicerida u jetri; smanjenja telesne težine; i poboljšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije, ili osetljivosti na insulin.

[0107] “Proizvod gena” je biopolimerni proizvod koji se eksprimira ili proizvodi od strane gena. Proizvod gena može da bude, na primer, nesplajsovana RNK, iRNK, splajsovana varijanta iRNK, polipeptid, post-translaciono modifikovani polipeptid, splajsovana varijanta polipeptida, itd. Takodje su ovim izrazom obuhvaćeni biopolimerni proizvodi koji su napravljeni korišćenjem proizvoda gena -RNK kao matrice (tj. cDNK od RNK). Proizvod gena može da se napravi enzimski, rekombinantno, hemijski, ili u ćeliji za koju je gen nativan. U nekim primerima izvodjenja, ako je proizvod gena proteinski, on ispoljava biološku aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, ako je proizvod gena nukleinska kiselina, ona može da bude translatirana u proteinski genski proizvod koji ispoljava biološku aktivnost.

[0108] “Modulacija aktivnosti FGF21”, kako se ovde koristi, odnosi se na povećanje ili smanjenje aktivnosti FGF21 koje može da bude rezultat, na primer, interakcije sredstva sa FGF21 polinukleotidom ili polipeptidom, inhibicije transkripcije i/ili translacije FGF21 (npr., kroz antisens ili siRNK interakciju sa genom FGF21 ili transkriptom FGF21, kroz modulaciju transkripcionih faktora koji olakšavaju ekspresiju FGF21), i slično. Na primer, modulacija biološke aktivnosti se odnosi na povećanje ili smanjenje biološke aktivnosti. Aktivnost FGF21 može da se proceni pomoću, uključujući, bez ograničenja, odredjivanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi kod subjekta, odredjivanja nivoa polipeptida FGF21, ili odredjivanja nivoa transkripcije FGF21. Poredjenja aktivnosti FGF21 mogu takodje da se postignu, npr., merenjem nivoa nishodnih biomarkera FGF21, i merenjem povećanja prenosa signala putem FGF21. Aktivnost FGF21 može takodje da se proceni merenjem: ćelijske signalizacije; aktivnosti kinaze; preuzimanja glukoze u adipocite; fluktuacija nivoa insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; promena nivoa lipida ili triglicerida u jetri; interakcija izmedju FGF21 i receptora za FGF21; ili fosforilacije receptora za FGF21. U nekim primerima izvodjenja fosforilacija receptora za FGF21 može da bude fosforilacija tirozina. U nekim primerima izvodjenja modulacija aktivnosti FGF21 može da izazove modulaciju fenotipa povezanog sa FGF21.

[0109] Poredjenja aktivnosti FGF21 mogu takodje da se postignu, npr., merenjem nivoa nishodnog biomarkera FGF21, i merenjem povećanja prenosa signala putem FGF21. Aktivnost FGF21 može takodje da se proceni merenjem: ćelijske signalizacije; aktivnosti kinaze; preuzimanja glukoze u adipocite; fluktuacija nivoa insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; promena nivoa lipida ili triglicerida u jetri; interakcija izmedju FGF21 i receptora (FGFR-1c, FGFR-2c, ili FGFR-3c); ili fosforilacije receptora za FGF21. U nekim primerima izvodjenja fosforilacija receptora za FGF21 može da bude fosforilacija tirozina. U nekim primerima izvodjenja modulacija aktivnosti FGF21 može da izazove modulaciju fenotipa povezanog sa FGF21.

[0110] “Nishodni biomarker FGF21”, kako se ovde koristi, je gen ili proizvod gena, ili merljiva indikacija gena ili proizvoda gena. U nekim primerima izvodjenja, gen ili aktivnost koja je nishodni marker FGF21 ispoljava izmenjeni nivo ekspresije, ili u vaskularnom tkivu. U nekim primerima izvodjenja, aktivnost nishodnog markera je izmenjena u prisustvu modulatora FGF21. U nekim primerima izvodjenja, nishodni markeri ispoljavaju izmenjene nivoe ekspresije kada se FGF21 poremeti modulatorom FGF21 prema predmetnom pronalaska. Nishodni markeri FGF21 uključuju, bez ograničenja, preuzimanje glukoze ili 2-deoksi-glukoze, pERK i druge fosforilisane ili acetilisane proteine ili nivoe NAD.

[0111] Kako se ovde koristi, pojam “ushodno reguliše” se odnosi na povećanje, aktivaciju ili stimulaciju aktivnosti ili količine. Na primer, u kontekstu predmetnog pronalaska, modulatori FGF21 mogu da povećaju aktivnost FGF21 receptora. U jednom primeru izvodjenja, jedan ili više FGFR-1c, FGFR-2c, ili FGFR-3c mogu da budu ushodno regulisani kao odgovor na FGF21 modulator. Ushodna regulacija može takodje da se odnosi na aktivnost povezanu sa FGF21, kao npr., sposobnost snižavanja nivoa glukoze, insulina, triglicerida, ili holesterola u krvi; smanjenja nivoa lipida ili triglicerida u jetri; smanjenja telesne težine; poboljšanja tolerancije na glukozu, potrošnje energije, ili

2

osetljivosti na insulin; ili izazivanje fosforilacije FGF21 receptora; ili povećanja nishodnog markera FGF21. FGFR21 receptor može da bude jedan ili više od FGFR-1c, FGFR-2c, ili FGFR-3c. Ushodna regulacija može da bude najmanje 25%, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 100%, najmanje 150%, najmanje 200%, najmanje 250%, najmanje 400%, ili najmanje 500% u poredjenju sa kontrolom.

[0112] Kako se ovde koristi, pojam “N-terminalni kraj” se odnosi na najmanje prvih 20 aminokiselina proteina.

[0113] Kako se ovde koriste, pojmovi “N-terminalni domen” i “N-terminalni region” se koriste medjusobno zamenljivo i odnose na fragment proteina koji počinje na prvoj aminokiselini proteina i završava se na bilo kojoj aminokiselini na N-terminalnoj polovini proteina. Na primer, N-terminalni domen FGF21 je od aminokiseline 1 u SEQ ID NO:1 do bilo koje aminokiseline izmedju oko aminokiseline 10 i 105 u SEQ ID NO:1.

[0114] Kako se ovde koristi, pojam “C-terminalni kraj” se odnosi na najmanje poslednjih 20 aminokiselina proteina.

[0115] Kako se ovde koriste, pojmovi “C-terminalni domen” i “C-terminalni region” se koriste medjusobno zamenljivo i odnose na fragment proteina koji počinje na bilo kojoj aminokiselini u C-terminalnoj polovini proteina i završava na poslednjoj aminokiselini proteina. Na primer, C-terminalni domen FGF21 počinje na bilo kojoj aminokiselini od aminokiseline 105 do oko aminokiseline 200 u SEQ ID NO:1 i završava na aminokiselini 209 u SEQ ID NO:1.

[0116] Pojam “domen”, kako se ovde koristi se odnosi na strukturni deo biomolekula koji doprinosi poznatoj ili pretpostavljenoj funkciji biomolekula. Domeni mogu da se pružaju u istim regionima ili njihovim delovima i mogu takodje da uključuju deo biomolekula koji je odvojen od odredjenog regiona, uz dodatak celog ili dela tog regiona.

[0117] Kako se ovde koristi, pojam “signalni domen” (takodje nazvan “signalna sekvenca” ili “signalni peptid”) se odnosi na peptidni domen koji se nalazi u uzastopnom nizu aminokiselinske sekvence u N-terminalnom regionu prekursorskog proteina (često vezan za membranu ili sekretovani protein) i uključen je u post-translacioni transport proteina. U mnogim slučajevima signalni domen se uklanja iz proteina cele dužine specijalizovanim signalnim peptidazama nakon što je proces sortiranja završen. Svaki signalni domen odredjuje konkretnu destinaciju u ćeliji za prekursorski protein. Signalni domen FGF21 predstavljaju aminokiseline 1-28 u SEQ ID NO:1.

[0118] Kako se ovde koristi, pojam “receptor-vezujući domen” se odnosi na bilo koji deo ili region proteina koji dolazi u kontakt sa receptorskim proteinom vezanim za membranu, rezultujući ćelijskim odgovorom, kao što je signalni dogadjaj.

[0119] Kako se ovde koristi, pojam “ligand-vezujući domen” se odnosi na bilo koji deo ili region fuzionog proteina prema pronalasku koji zadržava najmanje jednu kvalitativnu vezujuću aktivnost odgovarajuće nativne sekvence.

2

[0120] Pojam “region” se odnosi na fizički susedni deo primarne strukture biomolekula. U slučaju proteina, region je definisan susednim delom aminokiselinske sekvence tog proteina. U nekim primerima izvodjenja “region” je povezan sa funkcijom biomolekula.

[0121] Pojam “fragment” kako se ovde koristi se odnosi na fizički susedni deo primarne strukture biomolekula. U slučaju proteina, deo je definisan susednim delom aminokiselinske sekvence tog proteina i odnosi se na najmanje 3-5 aminokiselina, najmanje 8-10 aminokiselina, najmanje 11-15 aminokiselina, najmanje 17-24 aminokiselina, najmanje 25-30 aminokiselina, i najmanje 30-45 aminokiselina. U slučaju oligonukleotida, deo je definisan susednim delom sekvence nukleinske kiseline tog oligonukleotida i odnosi se na najmanje 9-15 nukleotida, najmanje 18-30 nukleotida, najmanje 33-45 nukleotida, najmanje 48-72 nukleotida, najmanje 75-90 nukleotida, i najmanje 90-130 nukleotida. U nekim primerima izvodjenja, delovi biomolekula imaju biološku aktivnost. U kontekstu predmetnog pronalaska, fragmenti polipeptida FGF21 ne sadrže celu polipeptidnu sekvencu FGF21 prikazanu u SEQ ID NO:1.

[0122] “Nativna sekvenca” polipeptida je ona koja ima istu aminokiselinsku sekvencu kao polipeptid dobijen iz prirode. Takve nativne sekvence polipeptida mogu da budu izolovane iz prirode ili mogu da budu proizvedene rekombinantnim ili sintetskim putevima. Tako, nativna sekvenca polipeptida može da ima aminokiselinsku sekvencu prirodnog humanog polipeptida, mišjeg polipeptida, ili polipeptida bilo koje druge vrste sisara.

[0123] Kako se ovde koriste, izrazi “homologa nukleotidna sekvenca”, ili “homologa aminokiselina sekvenca”, ili njihove varijacije, odnose se na sekvence koje se odlikuju homologijom najmanje odredjenog procenta, na nukleotidnom nivou ili aminokiselinskom nivou, i koriste se medjusobno zamenljivo sa “identičnost sekvence”. Homologe nukleotidne sekvence uključuju one sekvence koje kodiraju izoforme proteina. Takve izoforme mogu da se eksprimiraju u različitim tkivima istog organizma kao rezultat, na primer, alternativnog splajsinga RNK. Alternativno, izoforme mogu da budu kodirane različitim genima. Homologe nukleotidne sekvence uključuju nukleotidne sekvence koje kodiraju protein vrsta različitih od humane, uključujući, ali bez ograničenja, sisare. Homologe nukleotidne sekvence takodje uključuju, ali nisu ograničene na, prirodne alelne varijacije i mutacije nukleotidne sekvence koja je ovde prikazana. Homologe aminokiselinske sekvence uključuju one aminokiselinske sekvence koje sadrže konzervativne aminokiselinske supstitucije i čiji polipeptidi ispoljavaju isto vezivanje i/ili aktivnost. U nekim primerima izvodjenja, nukleotidna ili aminokiselinska sekvenca je homologa ako ima najmanje 60% ili više, sve do 99%, identičnosti sa uporednom sekvencom. U nekim primerima izvodjenja, nukleotidna ili aminokiselinska sekvenca je homologa ako deli jedan ili više, sve do 60, nukleotidnih/aminokiselinskih supstitucija, adicija, ili delecija sa uporednom sekvencom. U nekim primerima izvodjenja, homologa aminokiselinska sekvenca nema više od 5 ili ne više od 3 konzervativne aminokiselinske supstitucije.

2

[0124] Procenat homologije ili identičnosti može da bude odredjen, na primer, pomoću programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for UNIX, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison WI), uz korišćenje podrazumevanih postavki, koji koristi algoritam autora Smith i Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482-489). U nekim primerima izvodjenja, homologija izmedju probe i ciljne sekvence je izmedju oko 75% do oko 85%. U nekim primerima izvodjenja, nukleinske kiseline imaju nukleotide koji su najmanje oko 95%, oko 97%, oko 98%, oko 99% i oko 100% homologi sa SEQ ID NO:2, ili njenim delom.

[0125] Homologija može da postoji i na nivou polipeptida. U nekim primerima izvodjenja, polipeptidi konstituenti fuzionih proteina pronalaska mogu da budu najmanje 95% homologi svojim ekvivalentima cele dužine divljeg tipa ili odgovarajućim nativnim sekvencama, ili njihovim delovima. Stepen ili procenat identičnosti fuzionih proteina pronalaska, ili njihovih delova, i različite aminokiselinske sekvence izračunava se kao broj preciznih podudaranja u poravnanju dve sekvence podeljen dužinom "sekvence pronalaska" ili "strane sekvence", šta god da je kraće. Rezultat se izražava kao procenat identičnosti.

[0126] Kako se ovde koristi, pojam “mešanje” se odnosi na postupak kombinovanja jednog ili više jedinjenja, ćelija, molekula, i slično zajedno na istom prostoru. Ovo može da se izvede, na primer, u epruveti, Petri šolji, ili bilo kojoj posudi koja omogućava da se jedno ili više jedinjenja, ćelija, ili molekula, pomešaju.

[0127] Kako se ovde koristi, pojam “suštinski prečišćeno” se odnosi na jedinjenje (npr., polinukleotid ili polipeptid ili antitelo) koje je uklonjeno iz svog prirodnog okruženja i najmanje 60% je slobodno, najmanje 75% slobodno, i najmanje 90% slobodno od drugih komponenata sa kojima je prirodno povezano.

[0128] Pojam “farmaceutski prihvatljiv nosač” se odnosi na nosač za primenu terapijskog sredstva, kao što su antitela ili polipeptidi, geni, i druga terapijska sredstva. Pojam se odnosi na bilo koji farmaceutski nosač koji ne dovodi do proizvodnje antitela štetnih za pojedinca koji prima kompoziciju, i koji može da se primeni bez nepotrebne toksičnosti. Pogodni nosači mogu da budu veliki makromolekuli koji se sporo metabolišu kao što su proteinu, polisaharidi, polilaktične kiseline, poliglikolne kiseline, polimerne aminokiseline, kopolimeri aminokiselina, lipidni agregirati i neaktivne virusne čestice. Takvi nosači su dobro poznati stručnjacima u odgovarajućoj oblasti. Farmaceutski prihvatljivi nosači u terapijskim kompozicijama mogu da uključuju tečnosti kao što je voda, fiziološki rastvor, glicerol i etanol. Pomoćne supstance, kao što su sredstva za kvašenje ili emulgatori, pH puferske supstance, i slično, mogu takodje da budu prisutne u takvim vehikulumima.

Povećanje fizičke stabilnosti fuzionih proteina prema pronalasku

[0129] Prirodne disulfidne veze, omogućene cisteinskim reziduama, uopšteno povećavaju termodinamičku stabilnost proteina. Uspešni primeri povećanja termodinamičke stabilnosti, mereno

2

povećanjem temperature topljenja, su mutanti sa višestrukim disulfidnim vezama enzima lizozima T4 (Matsumuraet al., PNAS 86:6562-6566 (1989)) i barnaze (Johnson et al., J. Mol. Biol. 268:198-208 (1997)). Aspekt predmetnog pronalaska je poboljšanje fizičke stabilnosti FGF21 u prisustvu konzervansa, koje se postiže postojanjem disulfidnih veza u varijanti, koje ograničavaju fleksibilnost FGF21 divljeg tipa i time ograničavaju pristup konzervansa hidrofobnom jezgru proteina.

[0130] Predmetno otkriće obezbedjuje varijante humanog FGF21, ili njegov biološki aktivan peptid, sa poboljšanom farmaceutskom stabilnošću koja proizilazi iz ugradnje dodatnih disulfidnih veza. Stručnjak u odgovarajućoj oblasti će znati da nativni cisteini, cistein 103 i cistein 121, mogu da se koriste kao položaji za uvodjenje nove disulfidne veze koja može da dovede do poboljšanja svojstava, pored predloženih primera izvodjenja koji su ovde opisani.

Poboljšanja fuzionih proteina prema pronalasku u odonsu na uporedne proteine divljeg tipa i njihove varijante

[0131] U stanju tehnike je dobro poznato da značajan izazov u razvoju proteinskih farmaceutika predstavlja suočavanje sa fizičkom i hemijskom nestabilnošću proteina. Ovo je još očiglednije kada je proteinska farmaceutska formulacija namenjena za višestruku upotrebu, injektabilnu formulaciju koja zahteva stabilan, koncentrovan i konzervisan rastvor, uz održavanje povoljnog profila bioaktivnosti. Biofizičkom karakterizacijom FGF21 divljeg tipa u literaturi ustanovljeno je da izlaganje koncentrovanog proteinskog rastvora (>5 mg/ml), uslovima stresa, kao što je visoka temperatura ili nizak pH, dovodi do ubrzane asocijacije i agregacije (tj., pokazuje lošu fizičku stabilnost i biofarmaceutska svojstva). Izlaganje koncentrovanog proteinskog rastvora FGF21 farmaceutskim konzervansima (npr., m-krezolu) takodje ima negativan uticaj na fizičku stabilnost.

[0132] Prema tome, primer izvodjenja predmetnog pronalaska je poboljšanje fizičke stabilnosti koncentrovanih rastvora, uz održanje hemijske stabilnosti i biološke aktivnosti, i u fiziološkim uslovima i u uslovima formulacije sa konzervansom. Podrazumevano je da asocijacija i agregacija mogu da rezultuju iz hidrofobnih interakcija, budući da, na datoj proteinskoj koncentraciji, temperaturi, i jonskoj snazi imaju značajan uticaj na fizičku stabilnost. U većini slučajeva, bez prisustva konzervansa, ciljno je delovano na aminokiselinske rezidue za koje je pretpostavljeno da su površinski izložene. Ispitivano je lokalno okruženje ovih rezidua, i one koje nisu smatrane strukturno važnim su odabrane za mutagenezu. Jedan postupak za započinjanje specifičnih promena je dalje smanjenje pI proteina uvodjenjem rezidue glutaminske kiseline (“skeniranje glutaminskom kiselinom”). Pretpostavljeno je da će uvodjenje naelektrisanih zamena inhibirati agregaciju posredovanu hidrofobnošću putem odbijanja naelektrisanje-naelektrisanje i potencijalno poboljšati kompatibilnost konzervansa. Dodatno, stručnjak u odgovarajućoj oblasti će takodje prepoznati da pri dovoljnom stepenu mutageneze pI može da se premesti u opseg baznog pH uvodjenjem pozitivnog

2

naelektrisanja sa, ili bez istovremenog smanjenja negativnog naelektrisanja, čime se omogućava odbijanje naelektrisanje-naelektrisanje.

[0133] Dodatna teškoća povezana sa terapijskim primenama FGF21 divljeg tipa kao bioterapeutika, na primer, je to što je njegov polu-život veoma kratak in vivo (reda veličine 0.5 odnosno 2 časa, kod miša i primata). Stoga postoji potreba za razvojem sledećih jedinjenja koja su efikasnija bilo zahvaljujući većoj aktivnosti ili dužem polu-životu. Fuzioni proteini prema pronalasku su razvijeni kao način za postizanje željenih dejstava lečenja sa FGF21 pri većoj aktivnosti i u formulaciji sa produženim polu-životom.

[0134] Kako je ovde dalje opisano, fuzioni proteini prema pronalasku imaju polu-život od više od dve nedelje kod miša, u poredjenju sa mnogo kraćim polu-životom FGF21 divljeg tipa i polu-životom od 17 časova fuzionog proteina Fc-L(15)-FGF21 (L98R, P171G, A180E) u PCT objavi WO10/129600. Fuzioni proteini prema pronalasku takodje pokazuju poboljšan polu-život i farmakokinetička svojstva u poredjenju sa PEG-ilovanim V76, kao što je opisano ovde i u SAD patentnoj prijavi 61/415,476, podnetoj 19. novembra 2010.

[0135] Osim toga, fuzioni proteini Fc-FGF21 prema pronalasku efikasniji su pri 1 mpk od V76 pri 5 mpk u snižavanju glukoze, insulina, telesne težine i lipida jetre. U 12-dnevnom ispitivanju tretmana ob/ob miševa, fuzioni proteini prikazuju sledeće % promena u odnosu na vehikulum (sve fuzije su primenjene u dozi od 1.0 mg/kg, a V76 je primenjen u dozi od 5.0 mg/kg).

[0136] Slično, in vitro testovi pokazuju isto petostruku ili veću aktivnost fuzionih proteina prema pronalasku u odnosu na V76.

[0137] Iako se primeri izvodjenja predmetnog pronalaska odnose na fizičku i hemijsku stabilnost i u fiziološkim uslovima i u uslovima farmaceutske formulacije sa konzervansom, očuvanje biološke aktivnosti fuzionih proteina prema pronalasku u poredjenju sa, npr., FGF21 divljeg tipa je takodje važan faktor za razmatranje. Prema tome, biološka aktivnost proteina predmetnog pronalaska je definisana sposobnošću proteina da utiču na preuzimanje glukoze i/ili snižavanje nivoa glukoze u plazmi, kao što je ovde prikazano u primerima.

[0138] Fuzioni proteini prema pronalasku primenjeni prema ovom pronalasku mogu da budu napravljeni i/ili izolovani na bilo koji način poznat u stanju tehnike. Najpoželjniji postupak za proizvodnju varijante predstavlja metodu rekombinantne DNK i dobro je poznat stručnjacima u odgovarajućoj oblasti. Takvi postupci su opisani u Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc.).

[0139] Dalje je opisan biološki aktivan peptid poreklom od varijante koja je ovde opisana. Takav peptid sadržaće najmanje jednu od opisanih supstitucija i varijanta će posedovati biološku aktivnost. Peptid može da bude proizveden na bilo koji i svaki način poznat stručnjacima u ovoj oblasti, čiji primeri uključuju, ali nisu ograničeni na enzimsku digestiju, hemijsku sintezu ili metodologije rekombinantne DNK.

[0140] U stanju tehnike je poznato da su fragmenti peptida odredjenih faktora rasta fibroblasta biološki aktivni. Videti na primer, Baird et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 85:2324-2328 (1988), i J. Cell. Phys. Suppl. 5:101-106 (1987). Prema tome, izbor fragmenata ili peptida varijante zasnovan je na kriterijumima koji su poznati u stanju tehnike. Na primer, poznato je da dipeptidil peptidaza IV (DPP-IV, ili DPP-4) predstavlja serinski tip proteaze uključen u inaktivaciju neuropeptida, endokrinih peptida i citokina (Damme et al. Chem. Immunol. 72: 42-56, (1999)). N-terminalni kraj FGF21 (HisProIlePro) sadrži dva dipeptida koji bi potencijalno mogli da budu supstrati za DPP-IV, rezultujući u skraćivanju fragmenta FGF21 na N-terminalnom kraju za 4 aminokiseline. Neočekivano, pokazalo se da ovaj fragment FGF21 divljeg tipa zadržava biološku aktivnost, tako da su proteini predmetnog pronalaska skraćeni na N-terminalnom kraju za 4 aminokiseline predstavljaju primer izvodjenja predmetnog pronalaska.

[0141] Pronalazak takodje obuhvata polinukleotide koji kodiraju prethodno opisane varijante koji mogu da budu u obliku RNK ili u obliku DNK, pri čemu DNK obuhvata cDNK, genomsku DNK i sintetsku DNK. DNK može da bude dvolančana ili jednolančana. Kodirajuće sekvence koje kodiraju proteine predmetnog pronalaska mogu da variraju kao rezultat redundantnosti ili degeneracije genetskog koda.

[0142] Polinukleotidi koji kodiraju fuzione proteine prema pronalasku mogu da uključuju sledeće: samo sekvencu koja kodira varijantu, sekvencu koja kodira varijantu i dodatnu kodirajuću sekvencu takvu kao funkcionalni polipeptid, ili lidersku ili sekretornu sekvencu ili pro-proteinsku sekvencu; sekvencu koja kodira varijantu i nekodirajuću sekvencu, takvu kao introni ili nekodirajuću sekvencu 5’ i/ili 3’ od sekvence koja kodira varijantu. Prema tome pojam “polinukleotid koji kodira varijantu” obuhvata polinukleotid koji može da uključuje ne samo kodirajuću sekvencu za varijantu već i polinukleotid, koji obuhvata dodatnu kodirajuću i/ili nekodirajuću sekvencu.

[0143] Polinukleotidi prema pronalasku će biti eksprimirani u domaćinima nakon što sekvence budu funkcionalno vezane za (tj., smeštene u položaju koji osigurava funkcionisanje) sekvencu koja kontroliše ekspresiju. Ovi ekspresioni vektori tipično mogu da se replikuju u organizmima domaćinima bilo kao epizomi ili kao integralni deo hromozomske DNK domaćina. Obično, ekspresioni vektori će sadržati selekcione markere, npr., tetraciklin, neomicin i dihidrofolat reduktazu, da omoguće detektovanje onih ćelija koje su transformisane željenom DNK sekvencom. Varijanta FGF21 može da bude eksprimirana u ćelijama sisara, insekata, kvasca, bakterija ili drugim ćelijama pod kontrolom odgovarajućih promotora. Bezćelijski translacioni sistemi mogu takodje da se koriste za proizvodnju takvih proteina upotrebom RNK izvedenih iz DNK konstrukata predmetnog pronalaska.

[0144] E. coli je prokariotski domaćin koji je naročito koristan za kloniranje polinukleotida predmetnog pronalaska. Ostali mikroorganizmi koji su pogodni za upotrebu kao domaćini uključuju Bacillus subtilus, Salmonella typhimurium, i različite vrste Serratia, Pseudomonas, Streptococcus, i

1

Staphylococcus, mada i drugi mikroorganizmi mogu da se koriste po izboru. U ovim prokariotskim domaćinima, mogu se takodje napraviti i ekspresioni vektori, koji će tipično sadržati sekvence za kontrolu ekspresije kompatibilne sa ćelijom-domaćinom (npr., mesto početka replikacije). Dodatno, može da bude prisutan bilo koji broj dobro poznatih promotora, kao što je promotorski sistem za laktozu, promotorski sistem za triptofan (Trp), promotorski sistem za beta-laktamazu, ili promotorski sistem iz lambda ili T7 faga. Promotori će tipično kontrolisati ekspresiju, opciono sa operatorskom sekvencom, i imaju sekvencu koja sadrži mesto za vezivanje ribozoma i slično, za započinjanje i završavanje transkripcije i translacije.

[0145] Stručnjak u oblasti ekspresije proteina će znati da metionin ili sekvenca metionin-arginin može da bude uvedena na N-terminalnom kraju zrele sekvence (SEQ ID NO: 3) za ekspresiju E. coli i obuhvaćene su kontekstom pronalaska. Prema tome, osim ako nije drugačije navedeno, proteini predmetnog pronalaska eksprimirani u E. coli imaju metioninsku sekvencu uvedenu na N-terminalnom kraju.

[0146] Drugi mikroorganizmi, kao kvasci ili gljive, mogu takodje da se upotrebe za ekspresiju. Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe i Pichia angusta su primeri poželjnih kvasaca kao domaćina, sa pogodnim vektorima koji imaju sekvence za kontrolu ekspresije, takve kao promotori, uključujući 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, i mesto početka replikacije, terminacione sekvence i slično po želji. Aspergillus niger, Trichoderma reesei; i Schizophyllum commune, su primeri gljiva-domaćina, mada i drugi mogu da se koriste po izboru.

[0147] Ćelijska kultura sisarskog tkiva može takodje da se koristi za ekspresiju i proizvodnju polipeptida predmetnog pronalaska. Eukariotske ćelije su poželjne, zbog brojnih pogodnih ćelijskih linija-domaćina sposobnih da sekretuju intaktne varijante koje su razvijene u stanju tehnike, i uključuju CHO ćelijske linije, različite COS ćelijske linije, NSO ćelije, ćelijske linije ovarijuma sirijskog hrčka, HeLa ćelije, ili ćelijske linije humanog embrionskog bubrega (tj. HEK293, HEK293EBNA).

[0148] Ekspresioni vektori za ove ćelije mogu da uključuju sekvence za kontrolu ekspresije, kao što je mesto početka replikacije, promotor, pojačivač, i mesta neophodna za obradu informacija, kao što su mesta za vezivanje ribozoma, mesta splajsovanja RNK, poliadenilaciona mesta, i transkripcione terminatorske sekvence. Poželjne sekvence za kontrolu ekspresije su promotori izvedeni iz SV40, adenovirusa, govedjeg papiloma virusa, citomegalovirusa, Rausovog sarkoma virusa, i slično. Poželjna poliadenilaciona mesta uključuju sekvence izvedene iz SV40 i govedjeg hormona rasta.

[0149] Vektori koji sadrže polinukleotidne sekvence od interesa (npr., fuzione proteine prema pronalasku i sekvence za kontrolu ekspresije) mogu da budu preneti u ćelije-domaćine dobro poznatim metodama, koje variraju u zavisnosti od vrste ćelije-domaćina. Na primer, transfekcija kalcijum hloridom se uobičajeno korisiti za prokariotske ćelije, dok obrada kalcijum fosfatom ili elektroporacija može da se koristi za druge ćelijske domaćine.

2

[0150] Različiti postupci za prečišćavanje proteina mogu da se koriste i takvi postupci su poznati u stanju tehnike i opisani, na primer, kod Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-9 (1990) i Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, NY (1982). Odabrani korak/koraci prečišćavanja će zavisiti, na primer, od prirode proizvodnog postupka koji je korišćen za dobijanje fuzionih proteina prema pronalasku.

[0151] Proteini, polipeptidi i/ili peptidi prema pronalasku, npr., fuzioni proteini prema pronalasku sa dvojnom aktivnošću, treba da budu formulisani i dozirani na način koji je u skladu sa dobrom medicinskom praksom, uzimajući u obzir kliničko stanje pacijenta, mesto isporuke kompozicija proteina, način primene, raspored primene, i druge faktore poznate praktičarima u datoj oblasti. “Terapijski efikasna količina” fuzionih proteina prema pronalasku za ovu svrhu stoga se odredjuju takvim razmatranjima.

[0152] Farmaceutske kompozicije proteina predmetnog pronalaska mogu da se primene na bilo koji način kojim se postiže uopšteno predvidjena svrha: za lečenje dijabetes melitusa tipa 1 i tipa 2, gojaznosti, metaboličkog sindroma, ili kritično bolesnih pacijenta. Neograničavajući dopušteni načini primene uključuju, na primer, pomoću inhalacije ili supozitorija ili preko mukoznog tkiva kao što je ispiranje vaginalnog, rektalnog, uretralnog, bukalnog i sublingualnog tkiva, oralno, nazalno, topikalno, intranazalno, intraperitonealno, parenteralno, intravenski, intramuskularno, intrasternalno, intraartikularnom injekcijom, intralimfatično, intersticijalno, intra-arterijalno, subkutano, intrasinovijalno, transepitelijalno i transdermalno. U nekim primerima izvodjenja, farmaceutske kompozicije se primenjuju ispiranjem, oralno ili inter-arterijalno. Drugi pogodni postupci uvodjenja mogu takodje da uključuju uredjaje koji su punjivi ili biorazgradivi i polimerne uredjaje sa sporim ili produženim oslobadjanjem. Farmaceutske kompozicije ovog pronalaska mogu takodje da se primene kao deo kombinovane terapije sa drugim poznatim metaboličkim sredstvima.

[0153] Primenjena doza će zavisiti od starosti, zdravlja, i težine primaoca, vrste istovremenog tretmana, ako ga ima, učestalosti lečenja, i prirode željenog dejstva. Kompozicije koje pripadaju obimu pronalasku uključuju sve kompozicije u kojima je varijanta FGF21 prisutna u količini koja je efikasna u postizanju željenog medicinskog dejstva za lečenje dijabetes melitusa tipa 1 ili tipa 2, gojaznosti, ili metaboličkog sindroma. Dok individualne potrebe mogu da variraju od jednog pacijenta do drugog, odredjivanje optimalnih opsega efikasnih količina svih komponenata je u okviru kompetencije kliničara uobičajene stručnosti.

[0154] Proteini predmetnog pronalaska mogu da budu formulisani prema poznatim postupcima za pripremanje farmaceutski korisnih kompozicija. Željena formulacija bi bila ona koja predstavlja stabilan liofilizovani proizvod koji se rekonstituiše sa odgovarajućim razblaživačem ili vodenim rastvorom visoke čistoće sa opcionim farmaceutski prihvatljivim nosačima, konzervansima, ekscipijensima ili stabilizatorima [Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition (1980)]. Proteini predmetnog pronalaska mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim puferom, sa pH vrednošću podešenom da obezbedi prihvatljivu stabilnost, i pH vrednošću prihvatljivom za primenu.

[0155] Za parenteralnu primenu, u jednom primeru izvodjenja, fuzioni proteini prema pronalasku se formulišu uopšteno mešanjem jednog ili više od njih na željenom stepenu čistoće, u jedinični dozni injektabilni oblik (rastvor, suspenzija, ili emulzija), sa farmaceutski prihvatljivim nosačem, tj., onim koji je netoksičan za primaoca pri korišćenim dozama i koncentracijama i kompatibilan je sa drugim sastojcima formulacije. Poželjno, može da se doda jedno ili više farmaceutski prihvatljivih antimikrobnih sredstava. Fenol, m-krezol i benzil alkohol su poželjna farmaceutski prihvatljiva antimikrobna sredstva.

[0156] Opciono, jedna ili više farmaceutski prihvatljivih soli može da se doda da bi se podesila jonska snaga ili toničnost. Jedan ili više ekscipijenasa mogu da se dodaju da bi se dodatno podesila izotoničnost formulacije. Glicerin, natrijum hlorid i manitol su primeri ekscipijensa za podešavanje izotoničnosti.

[0157] Stručnjaci u odgovarajućoj oblasti mogu lako da optimizuju farmaceutski efikasne doze i režime primene za terapijske kompozicije koje sadrže proteine prema pronalasku, kao što je odredjeno dobrom medicinskom praksom i kliničkim stanjem pojedinog pacijenta. Tipičan dozni opseg za proteine predmetnog pronalaska će biti od oko 0.01 mg dnevno do oko 1000 mg dnevno (ili oko 0.05 mg nedeljno do oko 5000 mg nedeljno, primenjeno jednom nedeljno) za odraslu osobu. Poželjno, dozni opsezi od oko 0.1 mg dnevno do oko 100 mg dnevno (ili oko 0.5 mg nedeljno do oko 500 mg nedeljno, primenjeno jednom nedeljno), poželjnije od oko 1.0 mg/dan do oko 10 mg/dan (ili oko 5 mg nedeljno do oko 50 mg nedeljno primenjeno jednom nedeljno). Najpoželjnije, doza je oko 1-5 mg/dan (ili oko 5 mg nedeljno do oko 25 mg nedeljno primenjeno jednom nedeljno). Odgovarajuća primenjena doza varijante FGF21 će rezultovati u snižavanju nivoa glukoze u krvi i povećanju potrošnje energije bržim i efikasnijim iskorišćavanjem glukoze, i stoga je korisna za lečenje dijabetes melitusa tipa 1 i tipa 2, gojaznosti i metaboličkog sindroma.

[0158] Pored toga, budući da su hiperglikemija i otpornost na insulin uobičajene kod kritično obolelih pacijenata koji primaju enteralnu ishranu, neke jedinice intenzivne nege primenjuju insulin za lečenje prekomerne hiperglikemije pri hranjenju kritično obolelih pacijenata. Zapravo, nedavna ispitivanja su dokumentovala da upotreba egzogenog insulina za održavanje glukoze u krvi na nivou koji nije viši od 110 mg po decilitru redukuje morbiditet i mortalitet medju kritično obolelim pacijentima u jedinici za intenzivnu negu hirurgije, bez obzira na to da li oni imaju istoriju dijabetesa (Van den Bergheet al. N Engl J Med., 345(19):1359, (2001)). Prema tome, proteini predmetnog pronalaska su jedinstveno pogodni da pomognu u ponovnom uspostavljanju metaboličke stabilnosti kod metabolički nestabilnih kritično obolelih pacijenata. Proteini prema pronalasku kao oni koji sadrže varijante FGF21 su jedinstveni po tome što stimulišu preuzimanje glukoze i poboljšavaju osetljivost na insulin, ali ne indukuju hipoglikemiju.

4

[0159] U drugom aspektu predmetnog pronalaska, razmatraju se proteini prema pronalasku za upotrebu kao lek za lečenje gojaznosti, dijabetes melitusa tipa 1 i tipa 2, pankreatitisa, dislipidemije, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), insulinske rezistencije, hiperinsulinemije, intolerancije glukoze, hiperglikemije, metaboličkog sindroma, akutnog infarkta miokarda, stanja povezanih sa ozbiljnim inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru i drugih metaboličkih poremećaja.

Mesto-specifični mutanti FGF21

[0160] Dalje su opisani sledeći dodaci na monomernoj ili dimernoj verziji fuzije za produžavanje vremena polu-života: HSA-vezujući lipid ili mali molekul ili micela.

[0161] Drugi dodaci mogu da se dodaju proteinima prema pronalasku, da bi se postiglo produžavanje vremena polu-života i druga poboljšana biološka svojstva. Oni mogu da uključuju dodavanje konjugata PEG-holesterol (uključujući micele i lipozome) proteinima prema pronalasku, i/ili dodavanje šećera (glikozilat) proteinima prema pronalasku. Slične tehnike mogu da se koriste za dodavanje konjugata, npr., polisijalnske kiseline (PSA), hidroksietil skroba (HES), albumin-vezujućih liganda, ili ugljenohidratnih štitova proteinima, polipeptidima i/ili peptidima.

[0162] U tehnici HES-ilacije na primer, obavlja se sprezanje razgranatih lanaca hidroksietilskroba (HES) (60 kDa ili 100 kDa, visoko razgranati amilopektinski fragmenti iz skroba kukuruza) sa proteinom, polipeptidima, i/ili peptidima putem reduktivne alkilacije. Polisijalizacijom se konjuguju proteini, polipeptidi, i/ili peptidi od interesa sa polimerima polisijalinske kiseline (PSA) na način koji je sličan PEG-ilaciji. PSA polimeri su negativno naelektrisani, neimunogeni polimeri koji se prirodno javljaju u telu i dostupni su u molekulskim težinama od 10-50 kD.

[0163] Drugi dodaci ili modifikacije mogu da se vežu sa proteinima prema pronalasku, da bi se postiglo produžavanje vremena polu-života i druga poboljšana biološka svojstva. Ona uključuju postupak stvaranja rekombinantnih PEG (rPEG) grupa, i njihovo vezivanje za proteine prema pronalasku, koji je razvila kompanija Amunix, Inc. Tehnologija rPEG se zasniva na proteinskim sekvencama sa svojstvima sličnim PEG koje su genetski fuzionisane sa biofarmaceuticima, čime se izbegava dodatni korak hemijske konjugacije. rPEG su eksenatidni konstrukti sa produženim poluživotom koji sadrže dug nestrukturisani rep hidrofilnih aminokiselina, i sposobni su da produže poluživot proteina ili peptida u serumu, kao i da uspore brzinu njegove apsorpcije, smanjujući na taj način značajno odnos najveće koncentracije i koncentracije neposredno pre primene doze. rPEGs imaju povećani hidrodinamički radijus i pokazuju prividnu molekulsku težinu koja je oko 15 puta veća od njihove prave molekulske težine, imitirajući način na koji PEG-ilacija ostvaruje dug serumski poluživot.

Skraćeni FGF21 polipeptidi

[0164] Jedan primer izvodjenja predmetnog otkrića je usmeren na skraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida (SEQ ID NO:3) prema patentnom zahtevu 1. Ovaj primer izvodjenja predmetnog otkrića, proizašao je iz pokušaja da se identifikuju skraćeni FGF21 polipeptidi koji mogu da obezbede aktivnost koja je slična, i u nekim slučajevima veća od aktivnosti oblika zrelog FGF21 polipeptida koji nisu skraćeni.

[0165] Kako se ovde koristi, pojam “skraćeni FGF21 polipeptid” se odnosi na FGF21 polipeptid u kome su aminokiselinske rezidue uklonjene sa amino-terminalnog (ili N-terminalnog) kraja FGF21 polipeptida, aminokiselinske rezidue uklonjene sa karboksil-terminalnog (ili C-terminalnog) kraja FGF21 polipeptida, ili aminokiselinske rezidue uklonjene i sa amino-terminalnog i sa karboksilterminalnog kraja FGF21 polipeptida. Različita skraćivanja koja su ovde opisana su izvedena kao što je ovde opisano.

[0166] Aktivnost N-terminalno skraćenih FGF21 polipeptidh i C-terminalno skraćenih FGF21 polipeptida može da se proceni upotrebom in vitro ogleda fosfo-ERK. Konkretni detalji in vitro ogleda koji mogu da se koriste za ispitivanje aktivnosti skraćenih FGF21 polipeptida mogu da se nadju u primerima.

[0167] Aktivnost skraćenih FGF21 polipeptida predmetnog pronalaska može takodje da se proceni u in vivo ogledu, na primer na ob/ob miševima. Uopšteno, za procenu in vivo aktivnosti skraćenog FGF21 polipeptida, skraćeni FGF21 polipeptid može da se primeni kod oglednih životinja intraperitonealno. Nakon željenog perioda inkubacije (npr., jedan čas ili više), može da se uzme uzorak krvi, i nivoi glukoze u krvi mogu da se izmere.

a. N-Terminalna skraćenja

[0168] Skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju N-terminalna skraćenja manja od 9 aminokiselinskih rezidua zadržavaju sposobnost zrelog FGF21 polipeptida da snizi glukozu u krvi kod pojedinca. Prema tome, predmetno otkriće obuhvata fuzione proteine prema patentnom zahtevu 1 koji sadrže skraćene oblike zrelog FGF21 polipeptida ili varijante proteina FGF21 koje imaju N-terminalna skraćenja.

b. C-Terminalna skraćenja

[0169] Dalje su opisana C-terminalna skraćenja koja sadrže 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ili 12 aminokiselinskih rezidua sa C-terminalnog kraja zrelog polipeptida FGF21. Skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju C-terminalna skraćenja manja od 13 aminokiselinskih rezidua ispoljavaju efikasnost od najmanje 50% efikasnosti divljeg tipa FGF21 u in vitro ogledu ELK-luciferaze (Yie J. et al. FEBS Letts 583:19-24 (2009)), što ukazuje na to da ovi mutanti FGF21 zadržavaju sposobnost zrelog FGF21 polipeptida da snizi glukozu u krvi kod pojedinca.

c. N-Terminalna i C-Terminalna skraćenja

[0170] Dalje, skraćeni FGF21 polipeptidi mogu da imaju kombinaciju N-terminalnih i C-terminalnih skraćenja. Skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju kombinaciju N-terminalnih i C-terminalnih skraćenja poseduju aktivnost kao i odgovarajući skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju samo N-terminalno ili samo C-terminalno skraćenje. Drugim rečima, skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju N-terminalna skraćenja manja od 9 aminokiselinskih rezidua i C-terminalna skraćenja manja od 13 aminokiselinskih rezidua poseduju sličnu ili veću aktivnost snižavanja glukoze u krvi kao skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju N-terminalna skraćenja manja od 9 aminokiselinskih rezidua ili skraćeni FGF21 polipeptidi koji imaju C-terminalna skraćenja manja od 13 aminokiselinskih rezidua.

[0171] Kao i sve varijante FGF21 predmetnog otkrića, skraćeni polipeptidi FGF21 mogu opciono da sadrže amino-terminalnu metioninsku reziduu, koja može da bude uvedena usmerenom mutacijom ili kao rezultat procesa bakterijske ekspresije.

[0172] Skraćeni FGF21 polipeptidi predmetnog otkrića mogu da se pripreme kao što je opisano u primerima koji su ovde opisani. Stručnjaci u odgovarajućoj oblasti, upoznati sa standardnim tehnikama molekularne biologije, mogu da koriste to znanje, spregnuto sa predmetnim otkrićem, da naprave i koriste skraćene FGF21 polipeptide predmetnog pronalaska. Standardne tehnike mogu da se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida, kulturu tkiva, i transformaciju (npr., elektroporacija, lipofekcija). Videti, npr., Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra, koji je ovde inkorporisan po referenci u bilo koju svrhu. Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja mogu da se izvedu prema specifikacijama proizvodjača, kao što se obično sprovodi u stanju tehnike, ili kao što je ovde opisano. Osim ako specifične definicije nisu date, nomenklature koje se koriste, i laboratorijski postupci i tehnike analitičke hemije, sintetičke organske hemije, i medicinske i farmaceutske hemije koji su ovde opisani su dobro poznati i uobičajeno se koriste u ovoj oblasti. Standardne tehnike mogu da se koriste za hemijske sinteze; hemijske analize; farmaceutske preparacije, formulaciju, i isporuku; i lečenje pacijenata.

[0173] Skraćeni polipeptidi FGF21 predmetnog otkrića su fuzionisani sa drugim entitetom, koji može da obezbedi dodatna svojstva skraćenom polipeptidu FGF21. U jednom primeru izvodjenja predmetnog pronalaska, skraćeni polipeptid FGF21 je fuzionisan sa konstantnim domenom IgG ili njegovim fragmentom (Fc region). Takva fuzija može da se postigne upotrebom poznatih metoda molekularne biologije i/ili prema ovde navedenim smernicama. Ovde se detaljno razmatraju prednosti takvih fuzionih polipeptida, kao i postupci za pravljenje takvih fuzionih polipeptida.

FGF21 Fuzioni proteini

[0174] Kako se ovde koristi, pojam “FGF21 fuzioni polipeptid” ili “FGF21 fuzioni protein” se odnosi na fuziju jedne ili više aminokiselinskih rezidua (kao što je heterologi protein ili peptid) na N-terminalnom kraju ili C-terminalnom kraju bilo koje varijante FGF21 proteina koja je ovde opisana.

[0175] FGF21 fuzioni proteini mogu da se naprave fuzijom heterologih sekvenci ili na N-terminalnom ili na C-terminalnom kraju, na primer, varijante FGF21 proteina, kao što je ovde definisano. Kao je ovde opisano, heterologa sekvenca može da bude aminokiselinska sekvenca ili polimer koji ne sadrži aminokiseline. Heterologe sekvence mogu da budu fuzionisane bilo direktno za varijantu FGF21 proteina ili preko linkera ili molekula adaptera. Linker ili molekul adaptera može da predstavlja jednu ili više aminokiselinskih rezidua (ili -mera), npr., 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili 9 rezidua (ili -mera), poželjno od 10 do 50 aminokiselinskih rezidua (ili -mera), npr., 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, ili 50 rezidua (ili -mera), i poželjnije od 15 do 35 aminokiselinskih rezidua (ili -mera). Linker ili molekul adaptera može takodje da bude konstruisan sa mestom isecanja za DNK restrikcionu endonukleazu ili za proteazu kako bi se omogućilo razdvajanje fuzionisanih delova.

[0176] Heterologi peptidi i polipeptidi uključuju, ali nisu ograničeni na epitop za omogućavanje detekcije i/ili izdvajanja varijante proteina FGF21; transmembranski receptorski protein ili njegov deo, kao što je vanćelijski domen ili transmembranski i unutarćelijski domen; ligand ili njegov deo koji se vezuje za transmembranski receptorski protein; enzim ili njegov deo koji je katalitički aktivan; polipeptid ili peptid koji podstiče oligomerizaciju, kao što je domen leucinskog rajsferšlusa; polipeptid ili peptid koji povećava stabilnost, kao što je konstantni region imunoglobulina; funkcionalno ili nefunkcionalno antitelo, ili njegov teški ili laki lanac; i polipeptid koji ima aktivnost, kao što je terapijska aktivnost, drugačiju od varijanti FGF21 proteina predmetnog pronalaska. Opisani su i mutanti FGF21 fuzionisani sa humanim serumskim albuminom (HSA).

a. Fc fuzije

[0177] U jednom primeru izvodjenja predmetnog pronalaska, varijanta FGF21 proteina je fuzionisana sa domenom Fc regiona humanog IgG. Antitela sadrže dva funkcionalno nezavisna dela, varijabilni domen poznat kao “Fab”, koji vezuje antigen, i konstantni domen poznat kao “Fc”, koji je uključen u efektorske funkcije takve kao što je aktivacija komplementa i napad fagocitnim ćelijama. Fc ima dug serumski polu-život, dok je Fab kratko živeći (Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31). Kada je spojen sa terapijskim proteinom, Fc domen može da omogući duži polu-život ili da omogući takve funkcije kao što je vezivanje receptora za Fc, vezivanje proteina A, fiksacija komplementa, a možda čak i prenošenje kroz placentu (Capon et al., 1989).

[0178] U ovom otkriću, Fc-FGF21 se odnosi na fuzioni protein u kome je Fc sekvenca fuzionisana sa N-terminalnim krajem FGF21. Slično, kroz predmetno otkriće, FGF21-Fc se odnosi na fuzioni protein u kome je Fc sekvenca fuzionisana sa C-terminalnim krajem FGF21.

[0179] Poželjni primeri izvodjenja pronalaska su Fc-FGF21 fuzioni proteini koji sadrže varijante FGF21 kao što je ovde definisano.

[0180] Fuzioni protein može da bude prečišćen, na primer, upotrebom afinitetne kolone za protein A. Nadjeno je da peptidi i proteini fuzionisani sa Fc regionom ispoljavaju suštinski duži polu-život in vivo od svog ekvivalenta koji nije fuzionisan. Takodje, fuzija sa Fc regionom omogućava dimerizaciju/multimerizaciju fuzionog polipeptida. Fc region može da bude prirodni Fc region, ili može da bude izmenjen kako bi se odredjeni kvaliteti poboljšali, takvi kao terapijski kvaliteti, vreme cirkulacije, ili smanjena agregacija.

[0181] Korisne modifikacije proteinskih terapijskih sredstava fuzijom sa “Fc” domenom antitela se detaljno razmatraju u PCT objavi br. WO 00/024782. Ovaj dokument razmatra vezivanje za “vehikulum” kao što je polietilen glikol (PEG), dekstran, ili Fc region.

b. Linkeri fuzionih proteina

[0182] Kada se obrazuju fuzioni proteini predmetnog pronalaska, koristi se linker. Hemijska struktura linkera ne mora da bude od presudnog značaja, budući da služi prvenstveno kao element za razmicanje. Linker je napravljen od aminokiselina povezanih peptidnim vezama. Linkeri uključeni u predmetni pronalazak dati su u patentnom zahtevu 1.

Hemijski modifikovani fuzioni proteini

[0183] Hemijski modifikovani oblici fuzionih proteina koji su ovde opisani, uključujući, npr., skraćene oblike i oblike varijanti FGF21 fuzija koji su ovde opisani, stručnjak u odgovarajućoj oblasti može da pripremi, uzevši u obzir otkrića koja su ovde opisana. Takvi hemijski modifikovani fuzioni proteini su izmenjeni tako da je hemijski modifikovan mutant različit od mutanta koji nije modifikovan, bilo po vrsti ili lokaciji molekula koji su prirodno vezani za mutant. Hemijski modifikovani mutanti mogu da uključuju molekule obrazovane delecijom jedne ili više prirodno vezanih hemijskih grupa.

[0184] Proteini predmetnog pronalaska mogu da budu modifikovani kovalentnim vezivanjem jednog ili više polimera. Na primer, odabrani polimer je tipično rastvorljiv u vodi tako da protein za koji je vezan ne precipitira u vodenom okruženju, kao što je fiziološko okruženje. Smeša polimera pripada obimu pogodnih polimera. Poželjno, za terapijsku upotrebu preparata krajnjeg proizvoda, polimer će biti farmaceutski prihvatljiv. Polimeri koji nisu rastvorljivi u vodi konjugovani sa proteinima predmetnog pronalaska su takodje opisani.

[0185] Primeri polimera mogu da budu bilo koje molekulske težine i mogu da budu razgranati ili nerazgranati. Svaki od polimera tipično ima prosečnu molekulsku težinu od izmedju oko 2 kDa do oko 100 kDa (pojam “oko” ukazuje na to da u preparatima polimera rastvorljivog u vodi, neki molekuli će imati veću težinu, a neki manju nego što je naznačena molekulska težina). Prosečna molekulska težina svakog polimera je poželjno izmedju oko 5 kDa i oko 50 kDa, poželjnije izmedju oko 12 kDa i oko 40 kDa, i najpoželjnije izmedju oko 20 kDa i oko 35 kDa.

[0186] Pogodni polimeri rastvorljivi u vodi ili njihove smeše uključuju, ali nisu ograničeni na, N-vezane ili O-vezane ugljene hidrate, šećere, fosfate, polietilen glikol (PEG) (uključujući oblike PEG koji su korišćeni za derivatizaciju proteina, uključujući mono-(C1-C10), alkoksi-, ili ariloksi-polietilen glikol), monometoksi-polietilen glikol, dekstran (kao što je dekstran male molekulske težine od, na primer, oko 6 kD), celulozu, ili druge polimere na bazi ugljenih hidrata, poli-(N-vinil pirolidon) polietilen glikol, propilen glikol homopolimere, ko-polimere polipropilen oksid/etilen oksid, polioksietilisane poliole (npr., glicerol) i polivinil alkohol. Opisani su i bifunkcionalni umreženi molekuli koji mogu da se koriste za pripremu kovalentno vezanih multimera varijanti FGF21 proteina. FGF21 mutanti koji su kovalentno vezani za polisijalnsku kiselinu su takodje opisani.

[0187] Polisaharidni polimeri su još jedna vrsta polimera rastvorljivih u vodi koji mogu da se koriste za modifikaciju proteina. Prema tome, opisani su fuzioni proteini prema pronalasku fuzionisani sa polisaharidnim polimerom. Dekstrani su polisaharidni polimeri sačinjeni od pojedinačnih subjedinica glukoze vezanih prvenstveno alfa 1-6 vezama. Dekstran je sam po sebi dostupan u mnogo opsega molekulskih težina, lako je dostupan u molekulskim težinama od oko 1 kD do oko 70 kD. Dekstran je pogodan polimer rastvorljiv u vodi za upotrebu kao vehikulum, samostalno ili u kombinaciji sa drugim vehikulumom (npr., Fc). Videti, npr., medjunarodnu objavu br. WO 96/11953. Upotreba dekstrana konjugovanog sa terapijskim ili dijagnostičkim imunoglobulinima je prijavljena. Videti, npr., evropsku patentnu objavu br. 0 315 456, koja je ovde obuhvaćena referencom. Predmetni pronalazak takodje opisuje upotrebu dekstrana od oko 1 kD do oko 20 kD.

[0188] Uopšteno, hemijska modifikacija može da se izvede pod pogodnim uslovima korišćenim u reakciji proteina sa aktiviranim polimernim molekulom. Postupci za pripremu hemijski modifikovanih polipeptida će uopšteno obuhvatati korake: (a) reakcije polipeptida sa aktiviranim polimernim molekulom (kao što je reaktivni estarski ili aldehidni derivat polimernog molekula) pod uslovima u kojima varijanta FGF21 proteina postaje vezana za jedan ili više polimernih molekula, i (b) dobijanja reakcionih proizvoda. Optimalni uslovi reakcije biće odredjeni na osnovu poznatih parametara i željenog rezultata. Na primer, što je veći odnos polimernih molekula prema proteinu, veći je procenat vezanih polimernih molekula. Na primer, hemijski modifikovani mutanti FGF21 mogu da imaju jedan fragment polimernog molekula na amino-terminalnom kraju (videti, npr., U.S. Pat. No.5,234,784).

[0189] Dalje, proteini prema pronalasku mogu da budu hemijski spregnuti sa biotinom. Kompleksu biotin/proteini prema pronalasku se zatim dopušta da se veže za avidin, čime nastaje tetravalentni kompleks avidin/biotin/proteini prema pronalasku. Proteini prema pronalasku mogu takodje da budu kovalentno spregnuti sa dinitrofenolom (DNP) ili trinitrofenolom (TNP) i rezultujući konjugati precipitirani sa anti-DNP ili anti-TNP-IgM da bi se obrazovali dekamerni konjugati sa valencom 10.

4

[0190] Uopšteno, stanja koja mogu da se ublaže ili moduliraju primenom predmetnih hemijski modifikovanih FGF21 mutanata uključuju ona koja su ovde opisana za proteine prema pronalasku. Ipak, hemijski modifikovani FGF21 mutanti koji su ovde opisani mogu da imaju dodatne aktivnosti, poboljšanu ili smanjenu biološku aktivnost, ili druga svojstva, kao što je povećanje ili smanjenje trajanja polu-života, u poredjenju sa FGF21 mutantima koji nisu modifikovani.

Terapijske kompozicije fuzionih proteina i njihova primena

[0191] Predmetni pronalazak takodje obezbedjuje terapijske kompozicije koje sadrže jedan ili više fuzionih proteina prema pronalasku ovde opisanih i u smeši sa farmaceutski ili fiziološki prihvatljivim sredstvom za formulaciju ili farmaceutski prihvatljivim nosačem odabranim tako da je pogodan za dati način primene. Kompozicije su specifično razmatrane u svetlu, npr., identifikacije fuzija proteina koje ispoljavaju poboljšana svojstva.

[0192] U nekim primerima izvodjenja terapijske kompozicije su pripremljene kao injektabilne kompozicije, kao tečni rastvori ili suspenzije; čvrsti oblici pogodni za rastvaranje, ili suspendovanje u tečnim vehikulumima pre injektovanja mogu takodje da se pripreme. Lipozomi su uključeni u definiciju farmaceutski prihvatljivog nosača. Farmaceutski prihvatljive soli mogu takodje da budu prisutne u farmaceutskoj kompoziciji, npr., mineralne kisele soli kao što su hidrohloridi, hidrobromidi, fosfati, sulfati, i slično; i soli organskih kiselina kao što su acetati, propionati, malonati, benzoati, i slično. Temeljno razmatranje farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa dostupno je u Remington: The Science and Practice of Pharmacy (1995) Alfonso Gennaro, Lippincott, Williams, & Wilkins.

[0193] Prihvatljivi materijali za formulaciju poželjno su netoksični za primaoce u dozama i koncentracijama koje se koriste.

[0194] Farmaceutska kompozicija može da sadrži materijale za formulaciju za modifikovanje, održavanje, ili konzerviranje, na primer, pH vrednosti, osmolarnosti, viskoznosti, bistrine, boje, izotoničnosti, mirisa, sterilnosti, stabilnosti, brzine rastvaranja ili oslobadjanja, adsorpcije, ili prodiranja kompozicija. Pogodni materijali za formulaciju uključuju, ali nisu ograničeni na, aminokiseline (kao što su glicin, glutamin, asparagin, arginin, ili lizin), antimikrobna sredstva, antioksidanse (kao što su askorbinska kiselina, natrijum sulfit, ili natrijum hidrogen-sulfit), pufere (kao što su borat, bikarbonat, Tris-HCl, citrati, fosfati, ili druge organske kiseline), sredstva za povećanje zapremine (kao što su manitol ili glicin), helirajuća sredstva (kao što su etilendiamin tetrasirćetna kiselina (EDTA)), kompleksirajuća sredstva (kao što su kofein, polivinilpirolidon, beta-ciklodekstrin, ili hidroksipropil-beta-ciklodekstrin), punioce, monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate (kao što su glukoza, manoza, ili dekstrini), proteine (kao što su serum albumin, želatin, ili imunoglobulini), sredstva za bojenje, davanje arome i razblaživanje, emulgatore, hidrofilne polimere (kao što je polivinilpirolidon), polipeptide niske molekulske težine, protiv-jone koji obrazuju soli (kao što je natrijum), konzervanse (kao što su benzalkonijum hlorid, benzojeva kiselina, salicilna kiselina, timerosal, fenetil alkohol, metilparaben, propilparaben, hlorheksidin, sorbinska kiselina, ili vodonik peroksid), rastvarače (kao što su glicerin, propilen glikol, ili polietilen glikol), šećerne alkohole (kao što su manitol ili sorbitol), sredstva za suspendovanje, surfaktante ili sredstva za kvašenje (kao što su pluronici; PEG; sorbitan estri; polisorbati kao što su polisorbat 20 ili polisorbat 80; triton; trometamin; lecitin; holesterol ili tiloksapal), sredstva za povećanje stabilnosti (kao što su saharoza ili sorbitol), sredstva za povećanje toničnost (kao što su halidi alkalnih metala; poželjno natrijum ili kalijum hlorid; ili manitol sorbitol), vehikulume za isporuku, razblaživače, ekscipijense i/ili farmaceutske adjuvanse (videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences (18th Ed., A. R. Gennaro, ed., Mack Publishing Company 1990), i sledeća izdanja iste, ovde obuhvaćenu referencom u bilo koju svrhu.

[0195] Optimalnu farmaceutsku kompoziciju će odrediti stručnjak u odgovarajućoj oblasti u zavisnosti od, na primer, predvidjenog puta primene, formata isporuke, i željene doze (videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra). Takve kompozicije mogu da utiču na fizičko stanje, stabilnost, brzinu oslobadjanja in vivo, i in vivo brzinu klirensa fuzionog proteina prema pronalasku.

[0196] Primarni vehikulum ili nosač u farmaceutskoj kompoziciji može da bude po svojoj prirodi vodeni ili ne-vodeni. Na primer, pogodni vehikulum ili nosač za injekciju može da bude voda, fiziološki slani rastvor, ili veštački cerebrospinalni fluid, po mogućstvu obogaćen drugim materijalima uobičajenim u kompozicijama za parenteralnu primenu. Neutralni puferisani slani rastvor ili slani rastvor pomešan sa serumskim albuminom su dodatni primeri vehikuluma. Drugi primeri farmaceutskih kompozicija sadrže Tris pufer od oko pH 7.0-8.5, ili acetatni pufer od oko pH 4.0-5.5, koji može dalje da uključuje sorbitol ili pogodnu zamenu. U jednom primeru izvodjenja predmetnog pronalaska, farmaceutske kompozicije sa dvostrukom funkcijom mogu da se pripreme za skladištenje mešanjem odabrane kompozicije koja ima željeni stepen čistoće sa sredstvima za formulaciju po izboru (Remington’s Pharmaceutical Sciences, supra) u obliku liofilizovanog kolača ili kao vodeni rastvor. Dodatno, proteinski proizvod sa dvostrukom funkcijom može da bude formulisan kao liofilizat upotrebom odgovarajućih ekscipijenasa kao što je saharoza.

[0197] Farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzione proteine prema pronalasku mogu da budu odabrane za parenteralnu isporuku. Alternativno, kompozicije mogu da budu odabrane za inhalaciju ili za dostavu putem digestivnog trakta, na primer oralno. Preparat takvih farmaceutski prihvatljivih kompozicija je u okviru kompetencija stručnjaka u odgovarajućoj oblasti.

[0198] Komponente formulacije su prisutne u koncentracijama koje su prihvatljive za mesto primene. Na primer, puferi se koriste za održavanje kompozicije na fiziološkom pH ili na malo nižem pH, tipično u opsegu pH od oko 5 do oko 8.

[0199] Kada se razmatra parenteralna primena, terapijske kompozicije za upotrebu u ovom pronalasku mogu da budu u obliku parenteralno prihvatljivog vodenog rastvora bez pirogena, koji sadrži željeni protein sa dvostrukom funkcijom u farmaceutski prihvatljivom vehikulumu. Naročito pogodan vehikulum za parenteralnu injekciju je sterilna destilovana voda u kojoj je protein sa dvostrukom funkcijom formulisan kao sterilan, izotoničan rastvor, ispravno konzervisan. Još jedan preparat može da uključuje formulaciju željenog molekula sa sredstvom, kao što su injektabilne mikrosfere, bio-razgradive čestice, polimerna jedinjenja (kao što su polilaktična kiselina ili poliglikolna kiselina), perle, ili lipozomi, koji obezbedjuju kontrolisano ili produženo oslobadjanje proizvoda koji tada može da bude isporučen putem depo-injekcije. Hijaluronska kiselina takodje može da se korsti, i ona može da ima dejstvo podsticanja produženog trajanja u cirkulaciji. Druga pogodna sredstva za uvodjenje željenog molekula uključuju uredjaje za isporuku leka koji mogu da se impalntiraju.

[0200] U jednom primeru izvodjenja, farmaceutska kompozicija može da bude formulisana za inhalaciju. Na primer, protein sa dvostrukom funkcijom prema pronalasku može da bude formulisan kao suvi prah za inhalaciju. Inhalacioni rastvori proteina sa dvostrukom funkcijom mogu takodje da budu formulisani sa propelantom za isporuku putem aerosola. U još jednom primeru izvodjenja, rastvori mogu da budu nebulizovani. Pulmonalna primena je dalje opisana u medjunarodnoj objavi br. WO 94/20069, koja opisuje pulmonalnu isporuku hemijski modifikovanih proteina.

[0201] Takodje je predvidjeno da izvesne formulacije mogu da se primene oralno. U jednom primeru izvodjenja predmetnog pronalaska, fuzioni proteini prema pronalasku koji se primenjuju na ovaj način mogu da budu formulisani sa ili bez onih nosača koji se obično koriste u sastavljanju čvrstih doznih oblika kao što su tablete i kapsule. Na primer, kapsula može da bude konstruisana da oslobadja aktivni deo formulacije u gastrointestinalnom traktu u trenutku kada je bioraspoloživost najveća, a presistemska razgradnja najmanja. Dodatna sredstva mogu da budu uključena da olakšaju apsorpciju fuzionih proteina prema pronalasku. Mogu da se koriste i razblaživači, sredstva za davanje arome, voskovi sa niskom tačkom topljenja, biljna ulja, sredstva za podmazivanje, sredstva za suspendovanje, sredstva za raspadanje tablete i vezivna sredstva.

[0202] Još jedna farmaceutska kompozicija može da uključuje efikasnu količinu fuzionih proteina prema pronalasku u smeši sa netoksičnim ekscipijensima koji su pogodni za proizvodnju tableta. Rastvaranjem tableta u sterilnoj vodi, ili drugom pogodnom vehikulumu, rastvori mogu da se pripreme u obliku jedinične doze. Pogodni ekscipijensi uključuju, ali nisu ograničeni na, inertne razblaživače, kao što su kalcijum karbonat, natrijum karbonat ili bikarbonat, laktozu, ili kalcijum fosfat; ili vezujuća sredstva, kao što su skrob, želatin, ili akacija; ili sredstva za podmazivanje kao što su magnezijum stearat, stearinska kiselina, ili talk.

[0203] Dodatne farmaceutske kompozicije koje sadrže fuzione proteine prema pronalasku biće očigledne stručnjacima u odgovarajućoj oblasti, uključujući formulacije koje uključuju fuzione proteine prema pronalasku u formulacijama sa produženim ili kontrolisanim oslobadjanjem. Tehnike za formulisanje različitih drugih sredstava za produženo ili kontrolisano oslobadjanje, kao što su lipozomski nosači, bio-razgradive mikročestice ili porozne perle i depo-injekcije, takodje su poznate stručnjacima u odgovarajućoj oblasti (videti, npr., medjunarodnu objavu br. WO 93/15722, koja

4

opisuje kontrolisano oslobadjanje poroznih polimernih mikročestica za isporuku farmaceutskih kompozicija, i Wischke & Schwendeman, 2008, Int. J Pharm. 364: 298-327, i Freiberg & Zhu, 2004, Int. J Pharm.282: 1-18, koje razmatraju pripremu i upotrebu mikrosfera/mikročestica).

[0204] Dodatni primeri preparata sa produženim oslobadjanjem uključuju polupropustljive polimerne matrice u vidu oblikovanih proizvoda, npr. filmova, ili mikrokapsula. Matrice sa produženim oslobadjanjem mogu da uključuju poliestre, hidrogelove, polilaktide (SAD pat. br. 3,773,919 i evropski patent br. 0058481), kopolimere L-glutaminske kiseline i gama etil-L-glutamata (Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-56), poli(2-hidroksietil-metakrilat) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 i Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105), etilen vinil acetat (Langer et al., supra) ili poli-D-3-hidroksibuternu kiselinu (evropski patent br. 0 133 988). Kompozicije sa produženim oslobadjanjem mogu takodje da uključuju lipozome, koji mogu da se pripreme bilo kojim od nekoliko postupaka poznatih u stanju tehnike. Videti, npr., Epstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.82: 3688-92; i evropske patente br.0036676, 0088046 i 0143949.

[0205] Farmaceutske kompozicije prema pronalasku za upotrebu primenom in vivo tipično moraju da budu sterilne. Ovo može da se postigne filtracijom kroz sterilne filtracione membrane. Tamo gde je kompozicija liofilizovana, sterilizacija upotrebom ovog postupka može da se izvede ili pre, ili nakon, liofilizacije i rekonstitucije. Kompozicija za parenteralnu primenu može da se skladišti u liofilizovanom obliku ili u rastvoru. Pored toga, parenteralne kompozicije uopšteno se smeštaju u kontejner koji ima sterilan pristupni priključak, na primer, vreća za intravenski rastvor ili fiola sa zapušačem koji može da se probije iglom za hipodermalne injekcije.

[0206] Kada je farmaceutska kompozicija formulisana, može da se skladišti u sterilnim fiolama kao rastvor, suspenzija, gel, emulzija, čvrsta supstanca, ili kao dehidratisani ili liofilizovani prah. Takve formulacije mogu da se skladište ili u obliku spremnom za upotrebu ili u obliku (npr., liofilizovanom) koji treba da se rekonstituiše neposredno pre primene.

[0207] Dalje su opisani kompleti za proizvodnju pojedinačnih doza za primenu. Svaki komplet može da obuhvata prvi kontejner koji sadrži osušeni protein i drugi kontejner koji sadrži vodenu formulaciju. Dalje su opisani kompleti koji sadrže pojedinačne i prethodno napunjene špriceve sa više komora (npr., špricevi sa tečnošću i liošpricevi).

Doze fuzionih proteina i njihova primena

[0208] Efikasna količina farmaceutske kompozicije prema pronalasku za terapijsku upotrebu će zavisiti, na primer, od terapijskog konteksta i ciljeva. Stručnjak u odgovarajućoj oblasti će znati da će odgovarajući dozni nivoi za lečenje prema tome zavisiti, delom, od molekula koji se isporučuje, indikacije za koju se varijanta fuzionog proteina koristi, puta primene, i veličine (telesne težine, površine tela, ili veličine organa) i stanja (starosti i opšteg zdravlja) pacijenta. Prema tome, kliničar može da titrira dozu i modifikuje put primene da bi dobio optimalno terapijsko dejstvo. Tipična doza može da bude u opsegu od oko 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg ili više, u zavisnosti od prethodno navedenih činilaca. U drugim primerima izvodjenja, doza može da bude u opsegu od 0.1 µg/kg do oko 100 mg/kg; ili 1 µg/kg do oko 100 mg/kg.

[0209] Učestalost doziranja će zavisiti od farmakokinetičkih parametara proteina sa dvostrukom funkcijom u formulaciji koja se koristi. Tipično, kliničar će primenjivati kompoziciju dok se ne dostigne doza koja postiže željeno dejstvo. Kompozicija može prema tome da se primeni kao pojedinačna doza, kao dve ili više doza (koje mogu, ali ne moraju da sadrže istu količinu željenog molekula) tokom vremena, ili kao neprekidnu infuziju putem implantacionog uredjaja ili katetera. Dalje podešavanje odgovarajuće doze rutinski rade stručnjaci u odgovarajućoj oblasti i nalazi se u sklopu zadataka koje oni rutinski obavljaju. Odgovarajuće doze mogu da se utvrde upotrebom pogodnih podataka o zavisnosti doza-odgovor.

[0210] Put primene farmaceutske kompozicije je u skladu sa poznatim postupcima, npr., oralno; putem intravenske injekcije, intraperitonealnim, intracerebralnim (intraparenhimalnim), intracerebroventrikularnim, intramuskularnim, intraarterijalnim, intraportalnim, ili intralezionalnim putevima; sistemima za produženo oslobadjanje (koja takodje mogu da budu injektovana); ili implantacionim uredjajima. Kada je poželjno, kompozicije mogu da se primene bolus injekcijom ili kontinuiranom infuzijom, ili implantacionim uredjajem.

[0211] Alternativno ili dodatno, kompozicija može da se primeni lokalno putem implantacije membrane, sundjera, ili drugog pogodnog materijala u kome je željeni molekul apsorbovan ili inkapsuliran. Kada se koristi implantacioni uredjaj, uredjaj može da bude implantiran u bilo koje pogodno tkivo ili organ, i isporuka željenog molekula može da se odvija putem difuzije, bolusa sa vremenskim oslobadjanjem, ili kontinuiranom primenom.

Terapijske upotrebe fuzionih proteina

[0212] Proteini prema pronalasku mogu da se koriste za lečenje, dijagnostiku, poboljšanje, ili sprečavanje brojnih bolesti, poremećaja, ili stanja, uključujući, ali bez ograničenja, metaboličke poremećaje. U jednom primeru izvodjenja, metabolički poremećaj koji treba da se leči je dijabetes, npr., dijabetes melitus tipa 2. U drugom primeru izvodjenja, metabolički poremećaj je gojaznost. Drugi primeri izvodjenja uključuju metabolička stanja ili poremećaje kao što su dijabetes melitus tipa 1, pankreatitis, dislipidemija, nealkoholna bolest masne jetre (NAFLD), nealkoholni steatohepatitis (NASH), insulinska rezistencija, hiperinsulinemija, intolerancija glukoze, hiperglikemija, metabolički sindrom, hipertenzija, kardiovaskularna bolest, akutni infarkt miokarda, ateroskleroza, periferna arterijska bolest, moždani udar, srčana insuficijencija, koronarna bolest srca, bubrežna bolest, komplikacije dijabetesa, neuropatija, poremećaji povezani sa ozbiljnim inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru, gastropareza i drugi metabolički poremećaji.

4

[0213] U prijavi, poremećaj ili stanje kao što su dijabetes melitus tipa 1 ili tipa 2 ili gojaznost mogu da se leče primenom varijante proteina FGF21, kao što je ovde opisano, kod pacijenta kome je to potrebno u količini terapijski efikasne doze. Primena može da se sprovede kao što je ovde opisano, kao što su je IV injekcijom, intraperitonealnom injekcijom, intramuskularnom injekcijom, ili oralno u obliku tablete ili tečne formulacije. U većini slučajeva, željenu dozu može da odredi kliničar, kao što je ovde opisano, i ona može da predstavlja terapijski efikasnu dozu mutantnog polipeptida FGF21. Stručnjacima u odgovarajućih oblasti biće jasno da će terapijski efikasna doza mutantnog polipeptida FGF21 zavisiti, izmedju ostalog, od rasporeda primene, primenjene jedinične doze antigena, od toga da li se molekul nukleinske kiseline ili polipeptida primenjuje u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvima, imunskog statusa i zdravlja primaoca. Pojam “terapijski efikasna doza”, kako se ovde koristi, označava količinu mutantnog polipeptida FGF21 koja izaziva biološki ili medicinski odgovor u sistemu tkiva, životinji, ili čoveku zapažen od strane stručnjaka, doktora medicine, ili drugog kliničara, koji obuhvata ublažavanje simptoma bolesti ili poremećaja koji se leči.

[0214] Sada, kada je predmetni pronalazak detaljno opisan, on će biti još jasniji kada se uzmu u obzir primeri koji slede, koji su ovde uključeni samo u svrhu ilustracije i nisu namenjeni da ograničavaju pronalazak.

[0215] Praktično izvodjenje predmetnog pronalaska će uključivati, osim ako nije drugačije navedeno, uobičajene metode hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u oblasti tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, npr., Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Edition (Easton, Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1990); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); i Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir i C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Edition, 1989).

PRIMERI

Primer 1: Priprema varijanti proteina FGF21

[0216] Ekspresioni konstrukt za FGF21 V76: Varijante FGF21 su klonirane u modifikovani E.coli ekspresioni vektor pET30a, opisan kod Achmuller et al. (2007) (Nature Methods 4:1037-1043), da bi se stvorile fuzije u okviru čitanja sa heksa-histidinskom oznakom praćene N<pro>-EDDIE oznakom na N-terminalnom kraju FGF21 (ak 33-209).

[0217] Ekspresija i prečišćavanje FGF21 V76: Ekspresionim plazmidom pET30a-His-N<pro>-EDDIE-FGF21 transformisane su E. coli BL21 Star (DE3) kompetentne ćelije (Invitrogen). Prekonoćni rast iz pojedinačne kolonije sveže transformisanih ćelija izveden je u 50 mL medijuma Terrific Broth (TB) koji sadrži 50 µg/mL kanamicina na 37°C. Predkultura je preneta u 1 L TB medijuma sa kanamicinom i kultivisana u bocama sa žlebom na 37°C uz mućkanje na 250 obr./min. Posle 6 časova kultivacije,

4

ekspresija FGF21 je indukovana dodatkom IPTG u finalnoj koncentraciji od 1 mM, i kulture su gajene preko noći na 37°C. Ćelije su zatim sakupljene i resuspendovane u 50 mL ledeno hladnog pufera za lizu; 50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, a nakon toga lizirane upotrebom uredjaja Microfluidizer™.

[0218] Inkluziona telašca (IB) su staložena centrifugiranjem na 30000 x g tokom 1 časa na 4°C. IB su oprana sa 50 mM Tris-HCl, pH 8, 150 mM NaCl i zatim rastvorena u 30 mL pufera za rastvaranje; 10 mM Tris-HCl,pH8, 100 mM NaH2PO4, 6 M GnHCl. Rastvorena IB su prečišćena centrifugiranjem na 30000 x g tokom 1 časa na 25°C. Rastvor IB je nanet na kolonu od 5 mL Ni-NTA smole visokih performansi (GE Healthcare) uravnoteženu puferom za rastvaranje. Proteini koji su se vezali za smolu eluirani su snižavanjem pH do 4.5. Eluat je modifikovan podešavanjem pH i dodavanjem ditiotreitola (DTT) u koncentraciji od 20 mM. Modifikovani eluat je polako razblažen u 1 L pufera za ponovno sklapanje proteina; 50 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M arginina, 20 mM DTT, što je praćeno inkubacijom tokom 2 dana na 4°C. Razblaženi uzorak je koncentrovan i pufer je izmenjen u 20 mM Tris-HCl, pH 9 upotrebom postupka ultrafiltracije. Koncentrovani uzorak je nanet na kolonu od 10 mL Q-sefarozne smole sa brzim protokom (GE Healthcare) uravnoteženu sa 20 mM Tri-HCl (pH9).

[0219] Posle pranja smole puferom za uravnotežavanje, proteini vezani za smolu su eluirani sa 20 mM Tris-HCl, pH 9, 500 mM NaCl. Za uklanjanje isečenog fuzionog fragmenta His-N<pro>i bilo kog neisečenog fuzionog proteina sa ponovo savijenog FGF21 proteina, eluat je nanet na kolonu od 5 mL Ni-NTA smole visokih performansi uravnotežene sa 20 mM Tris, pH 8.0, 50 mM imidazola, i sakupljena je frakcija koja je protekla kroz kolonu koja sadrži FGF21. Da bi se smanjili nivoi endotoksina, frakcija FGF21 je obradjena HD smolom EndoTrap (Hyglos) uravnoteženom sa 10 mM Tris, pH 8, 50 mM imidazola, 500 mM NaCl, 1 mM CaCl2. Uzorak sa niskim nivoom endotoksina je podvrgnut dijalizi sa PBS, a zatim sterilizovan filtracijom kroz filter promera 0.22 μm. Prečišćeni FGF21 protein je naglo smrznut u tečnom azotu i uskladišten na -80°C. Koncentracija proteina je odredjena pomoću apsorbance na 280 nm upotrebom 9362 M-1 cm-1 kao molarnog ekstinkcionog koeficijenta za FGF21. Čistoća i celovitost proteina odredjene su pomoću metoda HPLC, SDS-PAGE i tečne hromatografije-masene spektrometrije.

[0220] PEG-ilacija varijante FGF21 pomoću cisteina: Varijanta FGF21 V76 (R154C) ima tendenciju da dimerizuje preko ugradjenog cisteina; stoga, pre PEG-ilacije rastvor proteina (tipično 5 mg/mL u Tris puferu) je blago redukovan sa 5 mM merkaptoetilamina tokom 30 minuta na ledu i odmah odsoljen u 20 mM Tris, pH 7. Sveže redukovani protein (tipično 3 mg/mL) je odmah zatim PEG-ilovan sa 1.5 ekvivalentom razgranatog maleimido-PEG reagensa od 40 kDa (NOF, kat. br. GL2-400MA proizvodjača Sunbright series) u toku 3 časa na ledu. PEG-ilovani protein je na kraju prečišćen anjonskom jonoizmenjivačkom hromatografijom (MonoQ) sa ukupnim prinosom od oko 25%.

4

[0221] Ekspresioni konstrukti za varijante fuzije Fc-FGF21: cDNK za humane varijante FGF21 koje kodiraju aminokiseline 33-209 klonirane su u sisarski ekspresioni vektor nishodno od promotora citomegalovirusa (CMV) u okviru čitanja sa N-terminalnim sekvencama uključujući liderski peptid (imunoglobulinski kapa-lanac) za upravljane sekrecijom proteina, praćen Fc domenom i kratkim linkerom.

[0222] Ekspresija i prečišćavanje varijanti Fc-FGF21: Proteini varijante Fc-FGF21 su eksprimirani u ćelijama HEK293T (američka kolekcija kulture tkiva). Ćelije su gajene u suspenziji na 37°C, 8% CO2, u medijumu za ekspresiju Freestyle 293 (Invitrogen, kat. br.12338-018) do dana transfekcije. Ćelije su centrifugirane na 1000xg tokom 7 minuta u rotoru sa promenljivim položajem kiveta i izbrojane upotrebom automatskog brojača ćelija. Ćelije su razblažene u 900 mL medijuma Freestyle 293 do krajnje koncentracije od 1.4x10<6>ćelija/mL i smeštene u bocu bez žlebova zapremine 3 L (Corning, kat. br.431252). Ćelije su transficirane upotrebom smeše polietilenimina (PEI) i plazmida kao što sledi. Tri mL sterilnog štoka koncentracije 1 mg/mL linearnog, M.T. 25000, PEI (Alfa Aesar, kat.br. 43896) dodato je u 50 mL medijuma Freestyle 293, pažljivo promešano i inkubirano na 25°C tokom 5 minuta. U isto vreme, 1 mg plazmida bez endotoksina dodat je u 50 mL medijuma Freestyle 293 i sterilno filtriran upotrebom filtera promera 0.22 uM. Smeša PEI je zatim dodata u sterilno filtriranu DNK, pažljivo promešana i ostavljena da se inkubira na 25°C tokom 10 minuta. Smeša PEI-plazmid je zatim dodata u bocu od 3 L koja sadrži razblažene ćelije HEK 293T i smeštena u inkubator sa mućkanjem na 125 obr./min, 37°C, 8% CO2.

[0223] Ćelije su centrifugirane 6. dana posle transfekcije na 2000xg tokom 10 minuta i supernantant je sakupljen. Supernatant je dalje prečišćen filtracijom kroz filter 0.8/0.2 uM (Pall Corporation, kat. br.

4628).

[0224] Prečišćavanje serije FGF21 proteina je uradjeno dodavanjem 1 mL sefaroze Fast Flow (GE, kat. br.17-5138-03) sa rekombinantnim proteinom A, na 20 mg očekivanog proteina za prečišćavanje, neposredno u prečišćeni supernatant i inkubiranjem 1 čas na 4°C uz pažljivo okretanje. Smeša supernatanta je zatim prelivena preko hromatografske kolone za jednokratnu upotrebu Poly-Prep (Bio-Rad, kat. br. 731-1550) i frakcija koja je protekla kroz kolonu je odbačena. Zadržane perle su oprane sa 5 zapremina kolone DPBS, pH7.4 (Invitrogen, kat. br.14190-144). Elucija proteina sa perli proteina A je uradjena dodavanjem 20 zapremina kolone 50 mM natrijum citratnog pufera, pH 3.0. Elucioni pufer je neutralizovan dodavanjem 20% Tris-HCL pufera, pH 9.0. Kao drugi korak dodatnog prečišćavanja, izvedena je ekskluziona hromatagrafija propuštanjem serije prečišćenog materijala na proteinu A preko kolone High Load 26/600 Superdex 200 pg (GE, kat. br. 28-9893-36). Prinos prečišćenog proteina kvantitativno je odredjen pomoću A280. SDS-Page je izvedena da bi se potvrdila čistoća i molekulska težina. Nivo endotoksina je kvantitativno odredjen upotrebom sistema Endosafe PTS (Charles River Labs).

4

Primer 2: Merenje preuzimanja 2-deoksiglukoze (2-DOG) zavisnog od FGF21

[0225] Pokazano je da FGF21 stimuliše preuzimanje glukoze u adipocitima 3T3-L1 miša u prisustvu i odsustvu insulina, i da snižava nivoe glukoze, triglicerida i glukagona u krvi nakon obroka i u stanju gladovanja, kod ob/ob i db/db miševa i 8 nedelja starih ZDF pacova na dozno-zavisan način, što obezbedjuje, na taj način, osnovu za upotrebu FGF21 kao terapije za lečenje dijabetesa i gojaznosti (videti npr., patentnu objavu WO03/011213, i Kharitonenkov et al., (2005) Jour. of Clinical Invest.

115:1627-1635). Takodje, primećeno je da FGF21 stimuliše fosforilaciju tirozina u FGFR-1 i FGFR-2 u adipocitima 3T3-L1.

[0226] Fibroblasti 3T3-L1 su nabavljeni iz ATCC (kat. br. CL173). Ćelije su gajene do konfluentnosti u Petri-šoljama od 150 cm i održavane u DMEM sa visokim sadržajem glukoze (Invitrogen, kat. br. 11995065) obogaćenim sa 10% fetalnog govedjeg seruma i 1% penicilinastreptomicina tokom dodatna 4 dana. Ćelije su zatim diferencirale u gore navedenom medijumu obogaćenom sa 4 µg/mL insulina (Sigma, kat. br. I-5500), 115 µg/mL IBMX (Sigma, kat. br. I5879) i 0.0975 µg/mL deksametazona (Sigma, kat. br. D1756) tokom 3 dana nakon čega je medijum za diferencijaciju zamenjen kompletnim DMEM. Jedna ploča diferenciranih adipocita 3T3-L1 je zasejana u četiri ploče sa 96 bunarčića dan nakon zamene medijuma.

[0227] Adipociti su zatim obradjeni sa divljim tipom FGF21 i varijantom FGF21 proteina (videti tabelu 2 za listu varijanti; tipičan opseg koncentracija koji je korišćen bio je 30 pM do 100 nM) preko noći u kompletnom medijumu. Uzorci adipocita obradjenih sa FGF21 su izgladnjivani bez seruma u 50 µL po bunarčiću KRH pufera (0.75% NaCl; 0.038% KCl; 0.0196% CaCl2; 0.032% MgSO4; 0.025M HEPES, pH 7.5; 0.5% BSA; 2 mM natrijum piruvata) tokom 2 časa. U bunarčiće za slepu probu dodat je 1 µL (finalna koncentracija 5 µg/ml) citohalazina B tokom 15 minuta. [3H]-2-DOG (20.6 mCi/mmoL, 1 mCi/mL) je razblažen u odnosu 1:20 u 5.1 mM hladnog 2-DOG, i 1 µL razblaženog 2-DOG je dodato po bunarčiću i ćelije su inkubirane 5 minuta. Ćelije su oprane sa 100 µL/bunarčiću KRH pufera tri puta. Ćelijama je dodato 40 µL/bunarčiću 1% SDS i ćelije su mućkane najmanje 10 minuta. Dodato je 200 µL/ bunarčiću scintilacionog fluida i ploče su mućkane preko noći i očitane u čitaču beta-mikroploča. Izračunate su prosečne vrednosti za vrednosti dobijene iz cele kolone/reda, obradjenog sa citohalazinom B, i oduzete od svih drugih vrednosti. Podaci su analizirani kompjuterskim programom GraphPad Prism, i rezultati su rezimirani u tabeli 2. Varijante V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21 su superiorne u odnosu na PEG-ilovanu varijantu V76 FGF21 u indukciji preuzimanja 2-deoksiglukoze u adipocitima miša 3T3L1.

Primer 3: pERK u Western-testu na ćelijama (ICW)

[0228] Ćelije HEK293 stabilno transficirane sa humanim β-kloto, kultivisane u DMEM sa visokim sadržajem glukoze, 10% FBS, 1% PS i 600 ng/mL G418, zasejane su u ploče sa 96 bunarčića obložene

4

sa poli-D-lizinom (BD bioscience, kat. br. 356640) pri gustini od 30 000 ćelija po bunarčiću preko noći. Ćelije su izgladnjivane bez seruma u DMEM sa visokim sadržajem glukoze, 0.5 % BSA i 10 mM HEPES tokom 4 časa. Divlji tip FGF21 i varijante FGF21 (videti tabelu 3 za listu varijanti) su razblažene do različitih koncentracija (tipičan opseg korišćenih koncentracija je 100 pM do 300 nM) u medijumu za izgladnjivanje. Ćelije su stimulisane sa FGF21 tokom 10 minuta. Nakon stimulacije sa FGF21 ili varijantom FGF21 proteina, medijum je aspiriran iz bunarčića i ćelije su oprane jednom sa 100 μL hladnog PBS i zatim fiksirane sa 100 μl 4% formaldehida 15 minuta na sobnoj temperaturi i zatim dodatno inkubirane 10 minuta sa 100 μL ledeno hladnog metanola.

[0229] Posle fiksacije, ćelije su oprane sa 0.3% Triton X-100 u PBS četiri puta, po 5 minuta za svako pranje. Permeabilizovanim ćelijama je dodato 150 μL pufera za blokiranje Odyssey na sobnoj temperaturi tokom 1.5 časa. Antitelo protiv fosfo-ERK (pERK) je razblaženo do koncentracije od 0.17 μg/mL (razblaženje 1:200, ili naznačena razblaženja), i antitelo protiv ukupnog-ERK (tERK) je razblaženo do koncentracije od 2.2 μg/mL (razblaženje 1:200, ili naznačena razblaženja) u puferu za blokiranje Odyssey. U svaki bunarčić je dodato po 50 μL, preskačući kolonu koja je obradjena samo sa sekundarnim antitelom za normalizovanje pozadinskog šuma. Ploča je pokrivena vlažnim papirnim ubrusom i poklopcem da bi se sprečilo isparavanje i zatim inkubirana na 4°C preko noći.

[0230] Nakon toga, primarno antitelo je aspirirano i ćelije su oprane četiri puta sa 0.3% Tween 20 u PBS tokom 5 minuta za svako pranje. Tokom pranja, pripremljena je reakciona smeša sa sekundarnim antitelom u puferu za blokiranje Odyssey koja sadrži kozje anti-mišje Alexa 680 antitelo razblaženo u odnosu 1:1000 (ili u naznačenim razblaženjima) i IRDye800 kozje anti-zečije antitelo razblaženo u odnosu 1:1000 (ili u naznačenim razblaženjima). Kada je pranje završeno, u svaki bunarčić je dodato 40 μL reakcione smeše. Ploče su pokrivene crnim poklopcem da bi se sekundarno antitelo zaštitilo od svetla, i inkubirane na sobnoj temperaturi 1 čas na šejkeru. Najzad, ćelije su ponovo oprane četiri puta sa 0.3% Tween 20 u PBS tokom 5 minuta za svako pranje, a zatim su skenirane na infracrvenom sistemu za snimanje LI-COR Bioscience Odyssey (Li-Cor Biosciences, Lincoln, NE) na kanalima od 700 nm (crveno) i 800 nm (teleno). Antitelo Alexa 680 je bojilo tERK fluorescencijom u dalekom crvenom opsegu (talasna dužina emisije 668 nm), dok su antitela IRDye800 bojila pERK fluorescencijom u zelenom opsegu (talasna dužina emisije 800 nm). Za eliminaciju pozadinskog šuma fluorescencije, odredjene su prosečne vrednosti za vrednosti dobijene iz cele kolone/reda, koje su obradjene samo sekundarnim antitelom, i oduzete od svih ostalih vrednosti dobijenih za ploču. Za normalizaciju količine pERK prisutne u svakom uzorku, vrednosti za pERK u svakom bunarčiću podeljene su sa vrednostima za tERK. Podaci su analizirani kompjuterskim programom GraphPad Prism, i rezultati su rezimirani u tabeli 2. Varijante V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21 su superiorne u odnosu na PEG-ilovanu varijantu V76 FGF21 u ovom testu fosforilacije ERK.

Tabela 2: Pregled rezultata za ERK u Western-testu na ćelijama i rezultata testa preuzimanja glukoze u adipocitima 3T3L1 miša

Primer 4: In vivo ispitivanja varijanti FGF21

[0231] Miš ob/ob je mišji model za dijabetes tipa 2. Miševima nedostaje funkcionalni leptin i odlikuju se hipergikemijom, insulinskom rezistencijom, hiperfagijom, hepatičnom steatozom i gojaznošću. Mužjaci ob/ob miševa (starosti 10-13 nedelja) korišćeni su za mernje dejstva na glukozu u krvi sledećih PEG-ilovanih varijanti FGF21 V76 i varijanti V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21.

[0232] Varijante FGF21 ili PBS vehikulum su primenjeni s.c. u dozi od 1 mg/kg (V101, V103 i V188) ili s.c u dozi od 5 mg/kg (V76), dvaput nedeljno tokom 12 dana (4 doze ukupno). Prvog dana ispitivanja, izmerena je glukoza u krvi iz repa i telesna težina, i miševi su razmešteni u različite grupe (n=8 po grupi) sa podudarnom srednjom vrednošću glukoze i telesne težine izmedju grupa. Glukoza u krvi je merena upotrebom glukometra (OneTouch). Insulin u plazmi je meren 1. dana pre davanja doze i 12. dana, 24 časa posle poslednje doze. Rezultati ovih ispitivanja su prikazani u tabeli 5.

[0233] Rezultati ovih ispitivanja su prikazani u tabeli 3 i na slikama 1-3. Varijante V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21 su superiorne u odnosu na PEG-ilovanu varijantu FGF21 V76 u svakoj ciljnoj tački merenja u ovim ispitivanjima i pri pet puta nižoj dozi.

Tabela 3. % promene glukoze i insulina u plazmi, dobitka telesne težine (TT), TG/lipida u jetri pomoću varijanti FGF21 nasuprot vehikulumu tokom 12-dnevnih ispitivanja na ob/ob miševima.

Primer 5: Farmakokinetika varijanti fuzije FGF21 kod miševa

1

[0234] Da bi se odredio farmakokinetički profil varijanti V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21, miševi C57BL/6J su injektirani IV sa 1 mg/kg ispitivanog proizvoda i krv im je uzimana u različitim vremenskim tačkama sve do 16. dana (384 časa). Uzorci krvi su sakupljani iz submandibularnog ili retro-orbitalnog pleksusa u mikrotajner epruvete obložene sa EDTA. Približno 50 μL krvi je sakupljeno u svakoj vremenskoj tački, dajući ~25 μL plazme.

[0235] Za merenje koncentracije ispitivane supstance u plazmi pomoću ELISA metode, ploče sa 384 bunarčića su obložene preko noći na sobnoj temperaturi (RT) sa 2 μg/mL anti-humanog Fc-gama kozjeg poliklonskog antitela (30 μL/bunarčiću), a zatim blokirane sa razblaživačem na bazi kazeina 2 časa na RT (100 μL/bunarčiću). Razblaženi uzorci, standardi i kontrole su dodate ploči (30 μL/bunarčiću) i inkubirane 2 časa na RT. Posle uklanjanja uzoraka, bunarčići su oprani 3 puta rastvorom za pranje na bazi fosfata (100 μL/bunarčiću). Antitelo za detekciju, verzija “hvatajućeg” antitela obeležena sa HRP, dodato je u ploču i inkubirano 1 čas na RT (30 μL/bunarčiću). Nakon što je ploča ponovo oprana 3 puta rastvorom za pranje na bazi fosfata (100 μL/bunarčiću), dodat je hemiluminescentni supstrat (30 μL/bunarčiću) i luminescencija ploče je očitana u okviru 5 minuta upotrebom odgovarajućeg čitača ploča. Kao što je prikazano na slikama 4A i 4B varijante fuzije Fc-FGF21 su imale značajno produžen polu-život u plazmi u odnosu na fuzije Fc-FGF21 poznate u stanju tehnike (slika 4A) i u odnosu na PEG-ilovanu varijantu FGF21 V76 (slika 4B).

[0236] Serumski nivoi ispitivanih supstanci Fc-FGF21 su validirani testom Western blot za poredjenje sa nivoina izmerenim pomoću ELISA metode da bi se osiguralo da je varijanta Fc-FGF21 cele dužine, a ne samo sam Fc, detektovana ELISA metodom. Dva uL mišjeg seruma je kombinovano sa 2.5 uL 4X pufera za nanošenje uzoraka, 1 uL 10X sredstva za denaturaciju i 4 uL dH2O, zagrevano do 95 ºC tokom 5 minuta i naneto na gradijent 4-12% poliakrilamidnog gela i podvrgnuto elektroforezi tokom 1 časa na 100 volti (konstantnog napona). Uzorci su preneti na nitrocelulozni filter papir pomoću Western blot metode upotrebom sistema iblot (Invitrogen, kat. br. IB1001, vreme prenosa 7 minuta). Nitrocelulozni filteri su blokirani sa 30 mL rastvora za blokiranje Rockland (kat. br. MB-070), obradjeni prema protokolu sistema snap iblot sa primarnim kozjim anti-FGF21 antitelom u razblaženju od 1:2000 (R&D systems, kat. br. BAF2539) i fluorescentno obeleženi streptavidinom kao sekundarnim reagensom u razblaženju od 1:10000 (Licor, kat. br. 926-68031). Nivoi proteina su vizuelizirani sistemom Licor Odyssey na 700 nm i uporedjeni sa kretanjem 2 nM kontrole V101 na istom gelu. Kao što je prikazano na slici 4C, varijante V101, V103 i V188 cele dužine Fc-FGF21 su detektabilne pomoću Western Blot metode upotrebom anti-FGF21 antitela do 15 dana u mišjem serumu iz farmakokinetičkog ispitivanja.

Primer 6: Varijante V101, V103 i V188 fuzije Fc-FGF21 su izuzetno termodinamički stabilne

2

4

1

�

Claims

PATENTNI ZAHTEVI

1. Fuzioni protein koji sadrži protein FGF21 divljeg tipa i Fc region, naznačen time, što je Fc region fuzionisan sa N-terminalnim krajem proteina FGF21 preko aminokiselinskog linkera sa aminokiselinskom sekvencom odabranom od GS i GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO:6), i pri čemu fuzioni protein ima aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7 ili SEQ ID NO:8.

2. Fuzioni protein kao što je definisano u patentnom zahtevu 1 za upotrebu u lečenju poremećaja povezanih sa FGF21, odabranih iz grupe koja se sastoji od gojaznosti, dijabetes melitusa tipa 1 i tipa 2, pankreatitisa, dislipidemije, nealkoholne bolesti masne jetre (NAFLD), nealkoholnog steatohepatitisa (NASH), insulinske rezistencije, hiperinsulinemije, intolerancije glukoze, hiperglikemije, metaboličkog sindroma, akutnog infarkta miokarda, hipertenzije, kardiovaskularne bolesti, ateroskleroze, periferne arterijske bolesti, moždanog udara, srčane insuficijencije, koronarne bolesti srca, bubrežne bolesti, komplikacija dijabetesa, neuropatije, gastropareze i poremećaja povezanih sa ozbiljnim inaktivacionim mutacijama u insulinskom receptoru.

3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljivo sredstvo za formulaciju.

4. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 3 za upotrebu u lečenju metaboličkog poremećaja.

5. Polinukleotid koji kodira fuzioni protein prema patentnom zahtevu 1.

6. Vektor koji sadrži polinukleotid prema patentnom zahtevu 5.

7. Ćelija-domaćin koja nosi vektor prema patentnom zahtevu 6 ili polinukleotid prema patentnom zahtevu 5.