RS62373B1 - Anti-ccl17 antitela - Google Patents

Anti-ccl17 antitela

Info

Publication number
RS62373B1
RS62373B1 RS20211062A RSP20211062A RS62373B1 RS 62373 B1 RS62373 B1 RS 62373B1 RS 20211062 A RS20211062 A RS 20211062A RS P20211062 A RSP20211062 A RS P20211062A RS 62373 B1 RS62373 B1 RS 62373B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
ccl17
antibodies
seq
human
Prior art date
Application number
RS20211062A
Other languages
English (en)
Inventor
Ken Boakye
Vecchio Alfred Del
John Kehoe
Eilyn Lacy
Lynne Murray
Mary Ryan
Sandra Santulli-Marotto
John Wheeler
Brian Whitaker
Alexey Teplyakov
Original Assignee
Janssen Biotech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Janssen Biotech Inc filed Critical Janssen Biotech Inc
Publication of RS62373B1 publication Critical patent/RS62373B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55522—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na antitela koja specifično vezuju CCL17, polinukleotide koji kodiraju antitela ili fragmente, i postupke za pravljenje i upotrebu prethodno navedenog.
Osnova pronalaska
[0002] Homeostatski hemokin, CCL17 (TARC, hemokin (C-C motiv) ligand 17) je potentni hemoatrakant limfocita. CCL17 je ligand za CCR4, GPCR za koji se smatra da je važan za funkciju T ćelija i hemotaksiju i migraciju imunih ćelija na mesta inflamacije. CCR4 je pretežno eksprimiran na Th2 limfocitima, ćelijama prirodnim ubicama i iNKT ćelijama.
[0003] CCL17 je povezan sa humanim bolestima koje pogađaju različite organe kao što su ulcerativni kolitis (UC), atopijski dermatitis (AD), idiopatska pulmonalna fibroza (IPF) i astma (Belperio et al., J Immunol, 173: 4692-469, 2004; Christophi et al., Inflamm Bowel Dis. doi: 10.1002/ibd.2295; Inoue et al., Eur Respir J, 24: 49-56, 2004; Kakinuma et al., J Allergy Clin Immunol, 107: 535-541, 2001; Saeki and Tamaki, J Dermatol Sci, 43: 75-84, 2006; Tamaki et al., J Dermatol, 33: 300-302, 2006). Kod miševa, CCL17 je povezan sa različitim inflamatornim stanjima i infekcijama kao što je hronična pulmonalna inflamacija prisutna u modelima fibroze i astme, kolitisa i šistosomize, verovatno preko indukovanja Th2 odgovora kroz regrutovanje CCR4+ imunih ćelija. Neutralizacija CCL17 ublažava uticaje bolesti i kod A. fumigatus i ovalbumin (OVA) modela astme, i oštećenja jetre u P. acnes mišjem modelu indukovane povrede jetre blokiranjem influksa T ćelija (Carpenter and Hogamoam Infect Immun, 73:7198-7207, 2005; Heiseke et al., Gastroenterology, 142:335-345; Hogamoam et al., Med Mycol, 43 Suppl 1, S197-202, 2005; Ismailoglu et al., Therapeutic targeting of CCL17 via the systemic administration of a monoclonal antibody ameliorates experimental fungal asthma. Paper presented at theAm J Respir Crit Care Med, 2011; Jakubzick et al., Am J Pathol, 165:1211-122, 2004; Kawasaki et al., J Immunol, 166:2055-2062, 2001; Yoneyama et al., J Clin Invest, 102:1933-1941, 1998).
[0004] CCL22 (MDC) je drugi ligand za CCR4. CCR4 interakcija sa svakim hemokinom proizvodi različite ishode (Allen et al., Annu Rev Immunol 25:787-820, 2007; Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998), kojima verovatno doprinose razlike u afinitetima vezivanja dva liganda za CCR4. CCL22 vezuje CCR4 sa većim afinitetom i indukuje internalizaciju receptora lakše od CCL17 (Baatar et al., J Immunol 179:1996-2004, 2007; Imai et al., J Biol Chem 273:1764-1768, 1998; Mariani et al., Eur J Immunol 34:231-240, 2004), i lakše promoviše ćelijsku adheziju od CCL17 (D’Ambrosio et al., J Immunol 169:2303-2312, 2002). CCL22 pokazuje ograničeniju ekspresiju sa proizvodnjom koja je ograničena na imune ćelije, dok je CCL17 eksprimiran i izlučivan od strane mnogih različitih ćelijskih tipova uključujući neimune ćelije (Alferink et al.,J Exp Med 197:585-599, 2003; Berin et al., Am J Respir Cell Mol Biol 24:382-389, 2001; Godiska et al., J Exp Med 185:1595-1604, 1997; Imai et al., J Biol Chem 271:21514-21521, 1996; Saeki and Tamaki, J Bermatol Sci 43:75-84, 2006). U mišjem modelu eksperimentalne sepse sa cekalnom ligacijom i punkturom (CLP), CCL22 je promovisao urođeni imunitet dok je CCL17 izgleda ometao i u nekim slučajevima doprinosio oštećenju organa (Matsukawa et al., Rev Immunogenet 2:339-358, 2000). U mišjem modelu pulmonalne invazivne aspergiloze, CCL22 je igrao protektivnu ulogu u urođenom anti-fungalnom odgovoru dok je CCL17 igrao ulogu supresora (Carpenter and Hogaboam, Infect Immun 73:7198-7207, 2005). Ova dva hemokina mogu igrati suprotne uloge u ustanovljavanju lokalizovane inflamacije usled diferencijalnih efekata na Treg homeostazu po tome što je Treg regrutacija favorizovana od strane CCL22 ali ne CCL17 (Heiseke et al., Gastroenterology 142:335-345,2011; Montane et al., J Clin Invest, 121:3024-30, 2011; Weber et al., J Clin Invest 121:2898-2910, 2011).
[0005] U životinjskom modelu kontaktne hipersenzitivnosti, CCL17 je glavni faktor u inicijaciji inflamatornog odgovora koji dovodi do konaktne hipersenzitivnosti (CHS) na provokaciju sa ili FITC ili DNFB, i CCL17 nokaut kod ovih miševa je poboljšavao preživljavanje srčanih alograftova u poređenju sa heterozigotnim miševima koji imaju jedan funkcionalni CCL17 alel (Alferink et al., J Exp Med 197:585-599, 2003).
[0006] CCR4 antagonisti mogu biti neselektivni i inhibirati i CCL17 i CCL22 funkcije. Stoga, postoji potreba za anti-CCL17 antitelima za potencijalni tretman različitih CCL17-posredovanih bolesti uključujući astmu.
[0007] Santulli-Marotto et al. (Monoclon Antib Immunodiagn Immunother 32(3):162-71, 2013) razmatraju antitela koja se vezuju za i inhibiraju CCL17-posredovanu mobilizaciju kalcijuma. Ismailoglu et al. (Am J Respir Crit Care Med 183:A4504, 2011) razmatraju targeting CCL17 sa antitelima u mišjem modelu ustanovljene fungalne astme. Int. Pat. Publ. No. WO 2012/047584 razmatra polipeptide koji se mogu dobiti ekspresijom polinukleotida koji kodiraju M. fascicularis.
Rezime pronalaska
[0008] Pronalazak obezbeđuje anti-hemokin (C-C motiv) ligand 17 (CCL17) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) od SEQ ID NO: 46 i varijabilni region lakog lanca (VL) SEQ ID NO: 62.
[0009] Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0010] Pronalazak takođe obezbeđuje jedan ili više polinukleotida koji kodiraju VH i VL antitela prema pronalasku.
[0011] Pronalazak takođe obezbeđuje jedan ili više vektora koji sadrže jedan ili više polinukleotida prema pronalasku.
[0012] Pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju domaćina za proizvodnju izolovanog antitela koje sadrži jedan ili više vektora prema pronalasku.
[0013] Pronalazak takođe obezbeđuje postupak proizvodnje antitela, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku u uslovima u kojima se antitelo proizvodi.
[0014] Pronalazak dalje obezbeđuje antitelo ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u terapiji.
[0015] Konačno, pronalazak obezbeđuje antitelo ili farmaceutsku kompoziciju prema pronalasku za upotrebu u lečenju inflamatorne bolesti, astme, ulceroznog kolitisa (UC), atopijskog dermatitisa (AD) ili idiopatske plućne fibroze (IPF), posebno astme ili hiperreaktivnosti disajnih puteva.
Rezime otkrića
[0016] Ovde je opisano izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje za humani CCL17 sa antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52.
[0017] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 sa sekvencom SEQ ID NO: 1, pri čemu se antitelo vezuje za ljudski CCL17 najmanje unutar aminokiselinskih ostataka CCL1721-23, 44-45 i 60-68.
[0018] U jednom aspektu pronalaska, izolovano antitelo prema pronalasku blokira interakciju CCL17/CCR4, na primer gde antitelo vezuje humani CCL17 sa konstantom afiniteta (KD.) od oko 1x10<-10>M ili manje, kada se KDmeri pomoću afiniteta rastvora u ravnoteži u puferu soli na bazi TRIS koji sadrži 0.05% Tween-20 nakon koinkubacije antitela i humanog CCL17 tokom 48 sati na 4 ° C.
[0019] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 koje sadrži određene HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence.
[0020] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 koje sadrži određene VH i VL sekvence.
[0021] Jedan primer izvođenja pronalaska je izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 koje sadrži VH SEQ ID NO: 46 i VL SEQ ID NO: 62.
[0022] Sledeći primer izvođenja pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0023] Sledeći primer izvođenja pronalaska je izolovani polinukleotid koji kodira VH ili VL pronalaska.
[0024] Sledeći primer izvođenja pronalaska je vektor koji sadrži polinukleotid pronalaska.
[0025] Sledeći primer izvođenja pronalaska je ćelija domaćin koja sadrži vektor pronalaska.
[0026] Sledeći primer izvođenja pronalaska je postupak proizvodnje antitela prema pronalasku, koji obuhvata kultivisanje ćelije domaćina prema pronalasku u uslovima u kojima se antitelo proizvodi.
[0027] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo pronalaska za upotrebu u terapiji, na primer za upotrebu u postupku lečenja bolesti posredovane CCL17.
[0028] Sledeći primer izvođenja pronalaska je antitelo pronalaska za upotrebu u postupku lečenja astme ili hiperreaktivnosti disajnih puteva.
Kratak opis crteža
[0029]
Slika 1A prikazuje inhibiciju hemotaksije sa anti-CCL17 antitelom B302 indukovanim 1 nM humanim CCL17 u ćelijama CCRF-CEM. B302 je C17B302.
Slika 1B prikazuje inhibiciju hemotaksije sa anti-CCL17 antitelom B311 indukovanim 1 nM humanim CCL17 u CCRF-CEM ćelijama. B311 je C17B311.
Slika 1C prikazuje efekat kontrolnog izotipa IgG2 na hemotaksiju indukovanu 1 nM humanim CCL17 u ćelijama CCRF-CEM.
Slika 1D prikazuje efekat kontrolnog izotipa IgG4 na hemotaksiju indukovanu 1 nM humanim CCL17 u ćelijama CCRF-CEM.
Slika 2A prikazuje inhibiciju hemotaksije sa anti-CCL17 antitelom B302 indukovanim 1 nM cyno CCL17 u HSC-F ćelijama. B302 je C17B302.
Slika 2B prikazuje inhibiciju hemotaksije sa anti-CCL17 antitelom B311 indukovanim 1 nM cyno CCL17 u HSC-F ćelijama. B311 je C17B311.
Slika 2C prikazuje efekat kontrolnog izotipa IgG2 na hemotaksiju indukovanu 1 nM cyno CCL17 u HSC-F ćelijama.
Slika 2D prikazuje efekat kontrole izotipa IgG4 na hemotaksiju indukovanu 1 nM cyno CCL17 u HSC-F ćelijama.
Slika 3 prikazuje VH sekvence anti-CCL17 antitela koja se vezuju za humani CCL17 sa KDod 100 nM ili manjom.
Slika 4 prikazuje konsenzusne VH i HCDR sekvence anti-CCL17 antitela prikazanih na Slici 3 koje se vezuju za humani CCL17 sa KDod 100 nM ili manje.
Slika 5 prikazuje VL sekvence antitela na CCL17 koja se vezuju za humani CCL17 sa KDod 100 nM ili manje.
Slika 6A prikazuje konsenzusnu VL sekvencu anti-CCL17 antitela prikazanih na Slici 5 koja se vezuju za humani CCL17 sa KDod 100 nM ili manjom.
Slika 6B prikazuje konsenzusne LCDR sekvence anti-CCL17 antitela prikazanih na Slici 5 koje se vezuju za humani CCL17 sa KD.od 100 nM ili manjom.
Na slici 7 prikazani su ostaci epitopa i paratopa antitela C17B236. Ostaci paratopa VH i VL su uokvireni, a ostaci epitopa CCL17 zaokruženi. Numerisanje ostataka je prema SEQ ID NO: 45 (VH), SEQ ID NO: 52 (VL), SEQ ID NO: 1 (CCL17).
Detaljan opis otkrića
[0030] Podrazumeva se da se ovde korišćena terminologija koristi samo za opisivanje pojedinih primera i nije namera da je ograničava. Osim ako nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni izrazi koji se ovde koriste imaju isto značenje koji su poznati stručnjaku u oblasti tehnike na koju se pronalazak odnosi.
[0031] Iako se svi postupci i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu koristiti u praksi za testiranje ovog pronalaska, ovde su opisani primeri materijala i postupaka. U opisivanju i traženju zaštite za ovaj pronalazak, koristiće se sledeća terminologija.
[0032] "Specifično vezivanje" ili "specifično vezivanje" ili "vezivanje" kako se ovde koristi odnosi se na vezivanje antitela za predeterminisani antigen sa većim afinitetom nego za druge antigene. Obično se antitelo vezuje za predeterminisani antigen sa konstantom disocijacije (KD) od oko 1x10<-7>M ili manje, na primer oko 1x10<-8>M ili manje, oko 1x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-10>M ili manje, oko 1x10<-11>M ili manje, oko 1x10<-12>M ili manje, oko 1x10<-13>M ili manje ili oko 1x10<-14>M ili manje, tipično sa KDkoja je najmanje deset puta manja od njegovog KDza vezivanje za nespecifični antigen ili epitop (npr. BSA, kazein). Konstanta disocijacije može se meriti standardnim procedurama. Antitela koja se specifično vezuju za predeterminisani antigen mogu, međutim, imati unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, na primer sa istim predeterminisani antigenom iz drugih vrsta (homolozi), kao što su ljudi ili majmuni, na primer Macaca fascicularis (makaki) ili Pan troglodites (šimpanza).
[0033] "Monoklonsko antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17" odnosi se na antitela koja se specifično vezuju za zreli humani CCL17 sa sekvencom prikazanom u SEQ ID NO: 1.
[0034] "Neutralizacija" ili "neutrališe" ili "neutralizujuće antitelo" ili "antagonist antitela" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo ili fragment antitela koji delimično ili potpuno inhibira bilo kojim mehanizmom biološku aktivnost CCL17. Neutralizujuća antitela mogu se identifikovati korišćenjem testova za biološku aktivnost CCL17, kao što je dole opisano. Neutralizujuće antitelo CCL17 može inhibirati izmerenu biološku aktivnost CCL17 za 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99% ili 100%.
[0035] "Humani CCL17" ili "huCCL17", koji se ovde koriste naizmenično, odnosi se na humani CCL17 protein koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 1. Sekvenca CCL17 pune dužine uključujući signalnu sekvencu dostupna je u GenBank; Pristupni broj NP_002978.
[0036] "Cyno CCL17" ili "cCCL17" koji se ovde koriste naizmenično se odnosi na Macaca fascicularis (cyno) protein CCL17 koji ima aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO: 2.
[0037] "Antitela", kako se ovde koristi, podrazumevaju se u širem smislu i uključuju molekule imunoglobulina, uključujući monoklonska antitela, uključujući mišja, ljudska, humanizovana i himerna antitela, fragmente antitela, bispecifična ili multispecifična antitela nastala od najmanje dva intaktna antitela ili fragmenata antitela, dimerna, tetramerna ili multimerna antitela, jednolančana antitela i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena potrebne specifičnosti.
[0038] Imunoglobulini se mogu podeliti u pet glavnih klasa, naime IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, u zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teškog lanca. IgA i IgG se dalje podklasifikuju na IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3i IgG4izotipove. Laki lanci antitela bilo koje vrste kičmenjaka mogu se pripisati jednom od dva jasno različita tipa, naime kapa (κ) i lambda (λ), na osnovu sekvenci aminokiselina njihovih konstantnih domena.
[0039] Izraz "fragmenti antitela" odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji zadržava vezujuće mesto za teški lanac i/ili laki lanac, kao što su regioni za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) 1, 2 i 3, regioni za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) 1, 2 i 3, varijabilni region teškog lanca (VH) ili varijabilni region lakog lanca (VL). Fragmenti antitela uključuju Fab fragment, monovalentni fragment koji se sastoji od VL ili VH; F (ab)2fragment, dvovalentni fragment koji se sastoji od dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu; Fd fragment koji se sastoji od VH i CHI domena; Fv fragment koji se sastoji od VL i VH domena jedne ručice antitela; fragment dAb (Vard et al., Nature 341: 544-546, 1989), koji se sastoji od VH domena. VH i VL domeni mogu biti konstruisani i povezani zajedno putem sintetičkog linkera da bi se formirali različiti tipovi jednolančanih antitela gde se VH/VL domeni spajaju intramolekulski ili intermolekulski u onim slučajevima kada su domeni VH i VL eksprimirani od strane zasebnih jednolančanih konstrukata antitela, za formiranje monovalentnog mesta za vezivanje antigena, kao što je jednolančani Fv (scFv) ili diatelo; opisano na primer u Int. Pat. Publ. Ne. WO1998/44001, Int. Pat. Publ. No. WO1988/01649; Int. Pat. Publ. No. WO1994/13804; Int. Pat. Publ. No. WO1992/01047. Ovi fragmenti antitela se dobijaju dobro poznatim tehnikama, a fragmenti se karakterišu na isti način kao i intaktna antitela.
[0040] Izraz "izolovano antitelo" odnosi se na antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigenske specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 je u suštini bez antitela koja se specifično vezuju za druge antigene osim za humane CCL17). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 može, međutim, imati unakrsnu reaktivnost na druge antigene, kao što su ortolozi humanog CCL17, kao što je Macaca fascicularis (makaki) CCL17. Štaviše, izolovano antitelo može biti u suštini bez drugih ćelijskih materijala i/ili hemikalija.
[0041] Varijabilni region antitela sastoji se od "okvirnog" regiona prekinutog sa tri "mesta za vezivanje antigena". Mesta vezivanja antigena su definisana različitim terminima: (i) Regioni za određivanje komplementarnosti (CDR), tri u VH (HCDR1, HCDR2, HCDR3) i tri u VL (LCDR1, LCDR2, LCDR3) zasnovani su na varijabilnosti sekvence (Wu and Kabat, J Exp Med 132:211-50, 1970; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991). (ii) "Hipervarijabilni regioni", "HVR", ili "HV", tri u VH (H1, H2, H3) i tri u VL (L1, L2, L3) odnose se na regione varijabilnih domena antitela koji imaju hipervarijabilnu strukturu kao što je definisano od strane Chothia i Lesk (Chothia and Lesk Mol Biol 196:901-17, 1987). Drugi termini uključuju "IMGT-CDRs" (Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003) i "Upotreba ostataka koja određuje specifičnost" (SDRU) (Almagro Mol Recognit, 17:132-43, 2004). Međunarodna baza podataka ImMunoGeneTics (IMGT) (http:// www_imgt_org) obezbeđuje standardizovano numerisanje i definiciju antigen-vezujućih mesta. Korespondencija između CDRs, HVs i IMGT granica je opisana u Lefranc et al., Dev Comparat Immunol 27:55-77, 2003.
[0042] "Chothia ostaci" kao što je ovde korišćeno su VL i VH osatci antitela numerisani prema Al-Lazikani (Al-Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48, 1997).
[0043] "Okvirne" ili "okvirne sekvence" su preostale sekvence varijabilnog regiona, osim onih sekvenci koje su definisane kao mesto za vezivanje antigena. Pošto se mesto vezivanja antigena može definisati različitim terminima kao što je gore opisano, tačna aminokiselinska sekvenca okvira zavisi od toga kako je definisano mesto vezivanja antigena.
[0044] "Humanizovano antitelo" se odnosi na antitelo u kome je mesto vezivanja antigena izvedeno iz nehumanih vrsta, a okviri varijabilnog regiona izvedeni su iz sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovana antitela mogu uključivati supstitucije u okvirnim regionima tako da okvir možda neće biti tačna kopija eksprimiranih humanih imunoglobulina ili sekvenci gena klicine linije.
[0045] "Humano antitelo" se odnosi na antitelo koje ima varijabilne regione teškog i lakog lanca u kojima su i okvir i regioni mesta vezivanja antigena izvedeni iz sekvenci humanog porekla. Ako antitelo sadrži konstantan region, konstantni region je takođe izveden iz sekvenci humanog porekla.
[0046] Humano antitelo sadrži varijabilne regione teškog ili lakog lanca koji su "izvedeni iz" sekvenci humanog porekla ako su varijabilni regioni antitela dobijeni iz sistema koji koristi humane imunoglobuline klicine linije ili rearanžirane gene imunoglobulina. Takvi sistemi uključuju biblioteke gena humanog imunoglobulina, na primer biblioteke fagnog prikaza, i transgene ne-humane životinje, kao što su miševi koji nose lokuse humanog imunoglobulina, kao što je ovde opisano. "Ljudsko antitelo" može sadržati aminokiselinske razlike u poređenju sa humanom klicinom linijom ili rearanžiranim sekvencama imunoglobulina usled, na primer, prirodnih somatskih mutacija ili namernog uvođenja supstitucija. Obično je "humano antitelo" najmanje oko 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identično u aminokiselinskoj sekvenci sa aminokiselinskom sekvencom koju kodira humana klicina linija ili rearanžirani gen imunoglobulina. U nekim slučajevima, "ljudsko antitelo" može sadržati konsenzusne okvirne sekvence izvedene iz analiza sekvenci humanog okvira, na primer kako je opisano u Knappik et al., J Mol Biol 296: 57-86, 2000), ili sintetički HCDR3 ugrađen u biblioteke gena humanog imunoglobulina prikazane na fagu, na primer kako je opisano u Shi et la., J Mol Biol 397: 385-96, 2010 i Int. Pat. Publ. Ne. WO2009/08546).
[0047] Izolovana humanizovana antitela mogu biti sintetička. Humana antitela, iako izvedena iz sekvenci humanog imunoglobulina, mogu se generisati korišćenjem sistema kao što je fagni prikaz koji uključuje sintetičke CDR-ove i/ili sintetičke okvire, ili se mogu podvrgnuti in vitro mutagenezi radi poboljšanja svojstava antitela, što rezultira antitelima koja prirodno ne postoje u repertoaru klicinih linija humanih antitela in vivo.
[0048] Humana antitela mogu uključivati supstitucije u okviru ili na mestu vezivanja antigena, tako da ne moraju biti tačne kopije eksprimiranih humanih imunoglobulina ili sekvenci gena klicine linije. Međutim, antitela u kojima su mesta vezivanja antigena izvedena iz nehumane vrste nisu uključena u definiciju "humanog antitela".
[0049] Izraz "rekombinantno antitelo", kako se ovde koristi, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim putem, kao što su antitela izolovana od životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomska za gene humanog imunoglobulina ili od njih pripremljeni hibridomi (opisani dalje u nastavku), antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisana da eksprimiraju antitelo, antitela izolovana iz rekombinantne, biblioteke kombinatornih antitela, i antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsing sekvence gena humanog imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama.
[0050] Izraz "monoklonsko antitelo", kako se ovde koristi, odnosi se na pripremu kompozicije jednog molekula antitela.
[0051] Izraz "suštinski identičan" kako se ovde koristi znači da su dve aminokiselinske sekvence varijabilnog regiona antitela koje se upoređuju identične ili imaju "neznatne razlike". Suštinske razlike su zamene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselina u sekvenci varijabilnog regiona antitela koje ne utiču negativno na svojstva antitela. Takođe su otkrivene aminokiselinske sekvence koje su u suštini identične sekvencama varijabilnog regiona koje su ovde otkrivene. Identitet sekvence može biti oko 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili veći. Procenat identiteta može se odrediti, na primer, poravnavanjem u paru koristeći podrazumevane postavke modula AlignKs u Vector NTI v.9.0.0 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Proteinske sekvence ovog pronalaska mogu se koristiti kao sekvenca za upit za obavljanje pretrage prema javnim ili patentnim bazama podataka, na primer, za identifikaciju srodnih sekvenci. Primeri programa koji se koriste za takvo pretraživanje su programi KSBLAST ili BLASTP (http _ // vvv_ncbi_nlm/nih_gov) ili paket GenomeKuest ™ (GenomeKuest, Vestborough, MA) koji koristi podrazumevane postavke.
[0052] Izraz "epitop", kako se ovde koristi, označava deo antigena za koji se antitelo specifično vezuje. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih delova (kao što su polarne, nepolarne ili hidrofobne) površinskih grupa kao što su aminokiseline ili polisaharidni bočni lanci i mogu imati specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitop može biti sastavljen od susednih i/ili diskontinuiranih aminokiselina koje čine konformacionu prostornu jedinicu. Za diskontinuirani epitop, aminokiseline iz različitih delova linearne sekvence antigena dolaze u neposrednu blizinu u trodimenzionalni prostor kroz savijanje proteinskog molekula.
[0053] "Bispecifičan" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo ili molekul koji vezuje dva različita antigena ili dva različita epitopa unutar antigena.
[0054] "Monospecifični" kako se ovde koristi odnosi se na antitelo koje vezuje jedan antigen ili jedan epitop.
[0055] Izraz "u kombinaciji sa", kako se ovde koristi, znači da se opisani agensi mogu davati životinji zajedno u smeši, istovremeno kao pojedinačni agensi ili uzastopno kao pojedinačni agensi u bilo kom redosledu.
[0056] Izraz "vektor" označava neprirodni polinukleotid koji se može duplirati unutar biološkog sistema ili koji se može kretati između takvih sistema. Vektorski polinukleotidi obično sadrže cDNK koja kodira protein od interesa i dodatne elemente, kao što su oridžin replikacije, signal poliadenilacije ili selekcioni markeri, koji funkcionišu tako da olakšaju duplikaciju ili održavanje ovih polinukleotida u biološkom sistemu. Primeri takvih bioloških sistema mogu uključivati ćelijske, virusne, životinjske, biljne i rekonstituisane biološke sisteme koji koriste biološke komponente sposobne da dupliraju vektor. Polinukleotid koji sadrži vektor može biti DNK ili RNK molekuli ili njihov hibrid.
[0057] Izraz "ekspresioni vektor" označava vektor koji se može koristiti u biološkom sistemu ili u rekonstituisanom biološkom sistemu za usmeravanje translacije polipeptida kodiranog polinukleotidnom sekvencom prisutnom u ekspresionom vektoru.
[0058] Izraz "polinukleotid" označava molekul koji sadrži lanac nukleotida kovalentno povezanih okosnicom šećer-fosfat ili drugom ekvivalentnom kovalentnom hemijom. Dvolančane i jednolančane DNK i RNK tipični su primeri polinukleotida.
[0059] "Komplementarna DNK" ili "cDNK" odnosi se na dobro poznati sintetički polinukleotid kojima je zajednički raspored elemenata sekvence koji se nalaze u izvornim zrelim vrstama iRNK sa susednim egzonima, pri čemu se uklanjaju introni prisutni u genomskoj DNK. Kodoni koji kodiraju inicijatorni metionin mogu ili ne moraju biti prisutni u cDNK. cDNA se može sintetisati, na primer, reverznom transkripcijom ili sintetičkim genskim sklapanjem.
[0060] "Sintetički" ili "neprirodni" kako se ovde koristi odnosi se na polinukleotid ili molekul polipeptida koji nije prisutan u prirodi.
[0061] Izraz "polipeptid" ili "protein" označava molekul koji sadrži najmanje dva aminokiselinska ostatka povezana peptidnom vezom da formira polipeptid. Mali polipeptidi sa manje od 50 aminokiselina mogu se nazvati "peptidi".
[0062] Ovde se koriste konvencionalni jedno- i troslovni kodovi aminokiselina, kao što je prikazano u Tabeli 1.
Tabela 1.
Kompozicije materije
[0063] Ovde su otkrivena monoklonska antitela koja specifično vezuju humani CCL17. Antitela prema pronalasku inhibiraju biološku aktivnost CCL17 u ćeliji, i mogu opciono da unakrsno reaguju sa cyno CCL17. Ovaj pronalazak obezbeđuje sintetičke polinukleotide koji kodiraju antitela prema pronalasku i njihove fragmente, vektore i ćelije domaćine, i postupke pravljenja i upotrebe antitela prema pronalasku.
[0064] Ovde je otkriveno izolovano antitelo koje specifično vezuje humani CCL17.
[0065] Ovde je otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 koji sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) i varijabilni region lakog lanca (VL), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje za humani CCL17 sa antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52. Antitelo prema ovom pronalasku može biti u kompeticiji za vezivanje za humanim CCL17 sa antitelom koje sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52.
[0066] Kompeticija između specifičnog vezivanja za humani CCL17 sa antitelima prema pronalasku može se analizirati in vitro koristeći dobro poznate metode. Na primer, vezivanje antitela obeleženog MSD Sulfo-Tag ™ NHS-estrom za humani CCL17 u prisustvu neobeleženog antitela može se proveriti pomoću ELISA-e, ili se Biacore analiza ili protočna citometrija mogu koristiti za dokazivanje kompeticije sa antitelima prema predmetnom pronalasku. Sposobnost test antitela da inhibira vezivanje antitela koje sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52 za humani CCL17 pokazuje da testirano antitelo može biti u kompeticiji sa ovim antitelima za vezivanje za humani CCL17.
[0067] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 sa sekvencom SEQ ID NO: 1, pri čemu se antitelo vezuje za humani CCL17 najmanje unutar CCL17 aminokiselinskih ostataka 21-23, 44-45 i 60-68. "Najmanje unutar humanih CCL17 aminokiselinskih ostataka 21-23, 44-45 i 60-68" znači da se anti-CCL17 antitelo vezuje za najmanje jedan ostatak koji se nalazi unutar aminokiselinskog dela ostataka 21-23 SEQ ID NO: 1, i najmanje jedan ostatak koji ostaje unutar aminokiselinskog dela ostataka 44-45 SEQ ID NO: 1, i najmanje jedan ostatak koji ostaje unutar aminokiselinskog dela ostataka 60-68 SEQ ID NO: 1. Antitelo može vezivati više od jednog ostatka unutar ostataka 21-23, 44-45 i 60-68, i dodatnih ostataka izvan ostataka 21-23, 44-45 i 60-68 SEQ ID NO: 1.
[0068] U nekim izvođenjima, antitelo prema pronalasku vezuje humani CCL17 najmanje za ostatke R22 i K23 SEQ ID NO: 1.
[0069] U nekim primerima izvođenjima, antitelo prema pronalasku vezuje humani CCL17 najmanje za ostatke L21, R22, K23, V44, K45, N60, I64, S67 i L68 SEQ ID NO: 1.
[0070] Ovde je otkriven primer antitela koje vezuje humani CCL17 unutar aminokiselinskih ostataka CCL1721-23, 44-45 i 60-68 SEQ ID NO: 1 je C17B236 koji ima VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52. Na osnovu analiza kristalne strukture, glavni ostaci epitopa vezani C17B236 su R22 i K23 iz CCL17 SEQ ID NO: 1, na osnovu broja kontakata između ovih ostataka i VH ostataka antitela.
[0071] Drugi ovde predstavljeni primerni antitela koja vezuju humani CCL17 unutar aminokiselinskih ostataka CCL17 21-23, 44-45 i 60-68 su varijante C17B236, koja su izvedena iz serije sazrevanja prema afinitetu istog roditeljskog antitela. VH i VL sekvence primera antitela prikazane su na Slici 3 i Slici 5. Antitelo prema ovom pronalasku može da se veže za humani CCL17 unutar CCL17 aminokiselinskih ostataka 21-23, 44-45 i 60-68.
[0072] Sazrevanje prema afinitetu antitela tipično uključuje supstitucije aminokiselina u CDR-ima ili u Vernier-ovoj zoni (okvirni regioni koji naglašavaju CDR-ove). Sazrele varijante se biraju pomeranjem kombinatornih biblioteka koje mogu da sadrže do 10<8>mutanata. Ograničenje veličine biblioteke ograničava broj promenljivih položaja na 6-7 ako je dozvoljeno svih 20 aminokiselina u svakoj poziciji. Većina ostataka paratopa sačuvana je u svakoj kombinatornoj biblioteci, što osigurava očuvanje i vezujućeg epitopa. Nekoliko kristalografskih studija roditeljskih i sazrelih antitela pokazalo je da je epitop uvek očuvan tokom sazrevanja prema afinitetu (npr. Fransson et al., J. Mol. Biol. 2010, 398: 214-231; Gustchina et al., PLoS Pathog.
2010, 6: e1001182; La Porte et al., MAbs 2014; 6: 1059-1068).
[0073] Antitela na CCL17 koja vezuju humani CCL17 unutar aminokiselinskih ostataka CCL17 21-23, 44-45 i 60-68 vezuju humani CCL17 sa visokim afinitetom, tipično sa KDmanjom od 1x10<-10>M.
[0074] Antitela koja vezuju humani CCL17 unutar aminokiselinskih ostataka CCL1721-23, 44-45 i 60-68 mogu se napraviti, na primer imunizacijom miševa sa CCL17 himernim proteinom koji ima humane CCL17 sekvence na pozicijama ostataka 21-23, 44-45 i 60 -68, ili biblioteke za fagni prikaz za pomicanje sa humanim CCL17 divljeg tipa, i unakrsnim skriningom dobijenih pogodaka sa varijantama CCL17 koje imaju zamene na svakom ili nekoliko pozicija ostataka unutar ostataka 21-23, 44-45 i 60-68 humanog CCL17 koristeći ovde opisane metode.
[0075] U nekim izvođenjima pronalaska, antitelo koje specifično vezuje humani CCL17 prema pronalasku blokira interakciju CCL17/CCR4.
[0076] Antitela se mogu testirati na njihovu sposobnost da blokiraju interakciju CCL17/CCR4 standardnom protočnom citometrijom. Na primer, ćelije koje eksprimiraju CCR4 inkubiraju se sa fluorescentno obeleženim ljudskim CCL17 i test antitelom, nakon čega se vezivanje fluorescentno obeleženog humanog CCL17 na ćelije koje eksprimiraju CCR4 procenjuje standardnim metodama. Antitela koja "blokiraju interakciju CCL17/CCR4" ili "inhibiraju interakciju CCL17/CCR4" mogu inhibirati vezivanje CCL17 za ćelije koje eksprimiraju CCR4 za 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% u poređenju sa vezivanjem CCL17 u odsustvu antitela.
[0077] U drugom izvođenju pronalaska, izolovano antitelo prema pronalasku vezuje humani CCL17 sa konstantom afiniteta (KD) od oko 1x10<-7>M ili manje, od oko 1x10<-8>M ili manje, oko 1x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-10>M ili manje, oko 1x10<-11>M ili manje, oko 1x10<-12>M ili manje, oko 1x10<-13>M ili manje, ili oko 1x10<-14>M ili manje, kada se KDmeri pomoću afiniteta rastvora u ravnoteži u puferu soli na bazi TRIS koji sadrži 0.05% Tveen-20 nakon koinkubacije antitela i humanog CCL17 tokom 48 sati na 4 ° C.
[0078] U nekim izvođenjima, antitelo prema pronalasku vezuje humani CCL17 sa konstantom afiniteta (KD) od oko 1x10<-10>M ili manje, kada se KDmeri pomoću afiniteta rastvora u ravnoteži u puferu soli na bazi TRIS koji sadrži 0.05% Tveen-20 nakon koinkubacije antitela i humanog CCL17 tokom 48 sati na 4 ° C.
[0079] U nekim izvođenjima, antitelo prema pronalasku vezuje humani CCL17 sa KDpribližno 5x10<-12>M ili manje.
[0080] U drugom izvođenju, antitelo pronalaska se specifično vezuje za humani CCL17 Macaca fascicularis (cyno) CCL17 sa konstantom afiniteta (KD) od oko 1x10<-6>M ili manje, oko 1x10<-7>M ili manje, oko 1x10<-8>M ili manje, oko 1x10<-9>M ili manje, oko 1x10<-10>M ili manje, oko 1x10<-11>M ili manje ili oko 1x10<-12>M ili manje, kada se KDmeri pomoću afiniteta rastvora u ravnoteži u puferu soli na bazi TRIS koji sadrži 0.05% Tveen-20 nakon koinkubacije antitela i cyno CCL17 tokom 48 sati na 4 ° C.
[0081] U nekim izvođenjima, antitelo prema pronalasku se vezuje za Macaca fascicularis (cyno) CCL17 sa KDpribližno 1x10<-8>M ili manje, kada se KDmeri pomoću afiniteta rastvora u ravnoteži u puferu soli na bazi TRIS koji sadrži 0.05% Tveen-20 nakon koinkubacije antitela i cyno CCL17 tokom 48 sati na 4 ° C.
[0082] Afinitet antitela za humani CCL17 koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1 ili cyno CCL17 koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2 može se meriti eksperimentalno korišćenjem bilo kog pogodnog postupka. Takvi postupci mogu koristiti Proteon, Biacore ili KinExA instrumente, kao što su ProteOn XPR36 ili Biacore 3000, afinitet rastvora u ravnoteži (SEA), ELISA ili testove kompetitivnog vezivanja koji su poznati stručnjacima. Primeri postupaka su oni opisani u Primeru 3. Mereni afinitet određene interakcije antitela/ CCL17 može varirati ako se meri pod različitim uslovima (npr. osmolarnost, pH, pufer, koncentracija deterdženta). Stoga, merenja afiniteta i drugi parametri vezivanja (npr. KD, Kon, Koff) poželjno su napravljeni sa standardizovanim uslovima i standardizovanim puferom, kao što je ovde opisan pufer. Stručnjak u ovoj oblasti će shvatiti da interna greška za merenje afiniteta, na primer korišćenjem afiniteta rastvora u ravnoteži, Biacore 3000 ili ProteOn (mereno kao standardna devijacija, SD) može tipično biti unutar 5-33% za merenja unutar tipičnih granica detekcije. Stoga izraz "oko" odražava tipičnu standardnu devijaciju u testu. Na primer, tipična SD za KD1x10<-9>M je do ± 0.33x10<-9>M.
[0083] U drugom izvođenju, izolovano antitelo prema pronalasku inhibira biološku aktivnost CCL17.
[0084] "Biološka aktivnost CCL17", kako se ovde koristi, odnosi se na bilo koju aktivnost koja se javlja kao rezultat vezivanja CCL17 za svoj receptor CCR4. Izuzetna biološka aktivnost CCL17 dovodi do intracelularne mobilizacije kalcijuma ili hemotaksije ćelija, na primer CCRF-CEM ćelija (T limfoblastna ćelijska linija od pacijenata sa akutnom leukemijom). Antitela prema pronalasku mogu se testirati u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju biološku aktivnost CCL17 korišćenjem standardnih postupaka i onih koji su ovde opisani. Na primer, sposobnost antitela prema pronalasku da inhibiraju CCL17-zavisnu intracelularnu mobilizaciju kalcijuma može se ispitati merenjem efekta antitela na CCL17-indukovanu mobilizaciju kalcijuma koristeći fluorescentne boje kao što su Fluo-8 NV, Fluo-4 AM ili Fluo- 3 AM. Sposobnost antitela prema pronalasku da inhibiraju hemotaksiju izazvanu CCL17 može se meriti merenjem migracije CCRF-CEM ćelija kroz polupropusni filter od 5 pM u sistemu sa dve komore, i merenjem održivosti ćelija migriranih kroz filter. Antitela prema pronalasku mogu inhibirati biološku aktivnost CCL17 za oko 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%.
[0085] U drugom izvođenju, antitelo prema pronalasku inhibira 10 ng/ml humane CCL17-indukovane mobilizacije kalcijuma u ćelijama CCRF-CEM merene korišćenjem Fluo-8 NV sa IC50vrednošću od oko 1x10<-7>M manje, oko 1x10<-8>M ili manje, ili oko 1x10<-9>M ili manje.
[0086] Ovde je otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži regione za određivanje komplementarnosti teškog lanca (HCDR) 1 (HCDR1), 2 (HCDR2) i 3 (HCDR3) i regione za određivanje komplementarnosti lakog lanca (LCDR) 1 (LCDR1), 2 (LCDR2) i 3 (LCDR3), pri čemu HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sadrže aminokiselinske sekvence SEQ ID NO: 4, 5, 71, 72, 73 i 74, respektivno .
[0087] Antitela koja sadrže HCDR i LCDR sekvence SEQ ID NO: 4, 5, 71, 72, 73 i 74 vezuju humani CCL17 sa KD1x10<-10>ili manje.
HCDR1: SYWIG (SEQ ID NO: 4)
HCDR2: IIDPSDSDTRYSPSFQG (SEQ ID NO: 5)
HCDR3 konsenzusna sekvenca
VGPADVWDX1FDY (SEQ ID NO: 71),
gde
X1je S, A ili T.
LCDR1 konsenzusna sekvenca:
KSSQSVLX1SX2X3NX4NX5LA (SEQ ID NO: 72),
gde
X1je L, Y, S ili N;
X2je F, P, H ili I;
X3je D, Y, W, T ili V;
X4je I, F, S, T, Y, N, K ili V; i
X5je K, A, Q, T ili D.
LCDR2 konsenzusna sekvenca:
X1ASTRE (SEQ ID NO: 73),
gde
X1je N, H, G, E, T ili D.
LCDR3 konsenzusna sekvenca
QQX1X2X3X4PX5T (SEQ ID NO: 74);
gde
X1je F, Y, T ili H;
X2je Y, L, N ili W;
X3je S, A, L, I, T, Q ili H;
X4je V, T, I, Y, L ili D; i
X5je S, F, A ili L.
[0088] HCDR1 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 4, HCDR2 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 5, a HCDR3 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 6, 42, 43 ili 44 u ovde otkrivenim antitelima.
[0089] Ovde su otkrivena antitela u kojima HCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 4, HCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 5, a HCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6, 42 ili 43.
[0090] Ovde su otkrivena antitela u kojima LCDR1 sadrži sekvencu SEQ ID NO: 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ili 18; LCDR2 sadrži niz SEQ ID NO: 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 39, 40 ili 41; i LCDR3 sadrži niz SEQ ID NO: 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37 ili 38.
[0091] Ovde su otkrivena antitela u kojima LCDR1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 8, 9, 10, 13, 14, 15, 17 ili 18, LCDR2 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 20, 21, 22, 24, 25 i 26, a LCDR3 sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 28, 29, 30, 33, 34, 35, 37 ili 38.
[0092] Ovde takođe otkriveno, antitelo koje se specifično vezuje za CCL17 sadrži VH SEQ ID NO: 75 i VL SEQ ID NO: 76.
VH konsenzusna sekvenca (SEQ ID NO: 75)
gde
X1je S, A ili T.
VL konsenzusna sekvenca (SEQ ID NO: 76):
gde
X1je L, Y, S ili N;
X2je F, P, H ili I;
X3je D, Y, W, T ili V;
X4je I, F, S, T, Y, N, K ili V;
X5je K, A, Q, T ili D;
X6je N, H, G, E, T ili D;
X7je F, Y, T ili H;
X8je Y, L, N ili W;
X9je S, A, L, I, T, Q ili H;
X10je V, T, I, Y, L ili D; i
X11je S, F, A ili L.
[0093] Ovde je takođe otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za CCL17 i sadrži VH SEQ ID NO: 45, 46, 47 ili 48.
[0094] Ovde je takođe otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za CCL17 i sadrži VL SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 ili 66.
[0095] Ovde je takođe otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za CCL17 i sadrži VH koje sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 45, 46 ili 47.
[0096] Ovde je takođe otkriveno antitelo koje se specifično vezuje za CCL17 i sadrži VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59, 60 ili 62.
[0097] Dodatno je ovde otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, gde antitelo sadrži HCDR1, HCDR2, HCDR3, LCDR1, LCDR2 i LCDR3 sekvence
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 7, 19 i 27, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 20 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 9, 21 i 29, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 10, 22 i 30, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 11, 23 i 31, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 12, 24 i 32, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 13, 21 i 33, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 14, 20 i 34, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 15, 25 i 35, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 16, 21 i 36, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 17, 25 i 37, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 18, 26 i 38, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 39 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 24 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 22 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 40 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 26 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 6, 8, 41 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 42, 8, 24 i 28, respektivno;
SEQ ID NO: 4, 5, 43, 8, 24 i 28, respektivno; ili
SEQ ID NO: 4, 5, 44, 8, 24 i 28, respektivno.
[0098] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, gde antitelo sadrži
VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 ili 66;
VH i VL SEQ ID NO: 46 i 62, respektivno;
VH i VL SEQ ID NO: 47 i 62, respektivno; ili
VH i VL SEQ ID NO: 48 i 62, respektivno.
[0099] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, gde antitelo sadrži
VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 50, 51, 52, 55, 56, 57, 59 ili 60;
VH i VL SEQ ID NO: 46 i 62, respektivno; ili
VH i VL SEQ ID NO: 47 i 62, respektivno.
[0100] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 50.
[0101] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 51.
[0102] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 52.
[0103] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 55.
[0104] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 56.
[0105] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 57.
[0106] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 59.
[0107] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 45 i VL SEQ ID NO: 60.
[0108] Izolovano antitelo koje specifično vezuje CCL17 prema pronalasku sadrži VH SEQ ID NO: 46 i VL SEQ ID NO: 62.
[0109] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH SEQ ID NO: 47 i VL SEQ ID NO: 62.
[0110] Ovde je takođe otkriveno izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CCL17, pri čemu antitelo sadrži VH koje sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu VH SEQ ID NO: 46 i VL koji sadrži aminokiselinsku sekvencu najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnu VL SEQ ID NO: 62.
[0111] Takva antitela su antitela prikazana u Tabeli 9.
[0112] Antitela čije se CDR teškog lanca, CDR lakog lanca, VH ili VL aminokiselinske sekvence neznatno razlikuju od onih prikazanih u Tabelama 3, 4, 6, 7 i 9, takođe su ovde otkrivena. Tipično, ovo uključuje jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih supstitucija sa aminokiselinom sa sličnim naelektrisanjem, hidrofobnim ili stereohemijskim karakteristikama na mestu vezivanja za antigen ili u okviru bez nepovoljnih promena svojstava antitela. Takođe se mogu izvršiti konzervativne supstitucije radi poboljšanja svojstava antitela, na primer stabilnosti ili afiniteta. Mogu se izvršiti 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ili 15 aminokiselinskih supstitucija u VH ili VL sekvenci. Na primer, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" može uključivati supstituciju nativnog aminokiselinskog ostatka sa ne-nativnim ostatkom tako da ima mali ili nikakav efekat na polaritet ili naelektrisanje aminokiselinskog ostatka na tom položaju. Dodatno, svaki nativni ostatak u polipeptidu može takođe biti zamenjen alaninom, kao što je ranije opisano za alanin skenirajuću mutagenezu (MacLennan et al (1998) Act Phisiol. Scand. Suppl. 643: 55-67; Sasaki et al (1998) Adv. Biopsy’s. 35: 1-24). Stručnjaci u oblasti tehnike mogu odrediti željenu supstituciju aminokiselina u vreme kada su takve supstitucije poželjne. Na primer, supstitucije aminokiselina mogu se koristiti za identifikaciju važnih ostataka sekvence molekula, ili za povećanje ili smanjenje afiniteta molekula opisanih ovde. Sledećih osam grupa sadrže aminokiseline koje su konzervativne supstitucije aminokiselina jedna sa drugom: 1) Alanin (A), Glicin (G); 2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); 3) Asparagin (N), Glutamin (Q); 4) arginin (R), lizin (K); 5) izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); 6) fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W); 7) serin (S), treonin (T); i 8) cistein (C), metionin (M) (videti, npr. Creighton, Proteins (1984)).
[0113] Zamene aminokiselina mogu se izvršiti, na primer, PCR mutagenezom (US Pat. No.
4,683,195). Biblioteke varijanti mogu se generisati dobro poznatim metodama, na primer korišćenjem slučajnih (NNK) ili ne-slučajnih kodona, na primer DVK kodona, koji kodiraju 11 aminokiselina (Ala, Cis, Asp, Glu, Gly, Lys, Asn, Arg , Ser, Tyr, Trp) i skriningom biblioteka za varijante sa željenim svojstvima.
[0114] Iako antitela ilustrovana u primerima sadrže parove varijabilnih regiona, jedan iz teškog lanca i jedan iz lakog lanca, iskusan stručnjak će prepoznati da alternativna antitela mogu sadržati pojedinačne promenljive regione teškog ili lakog lanca. Pojedinačni varijabilni region može se koristiti za skrining varijabilnih domena sposobnih za formiranje fragmenta koji vezuje antigen za dva domena koji je sposoban, na primer, da se veže za humani CCL17 koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1. Skrining se može postići postupcima skrininga fagnog prikaza koristeći na primer hijerarhijski dvostruki kombinatorni pristup otkriven u Int. Pat. Publ. No. WO1992/01047. U ovom pristupu, pojedinačna kolonija koja sadrži klon H ili L lanca koristi se za infekciju kompletne biblioteke klonova koji kodiraju drugi lanac (L ili H), a rezultujući dvolančani specifični domen za vezivanje antigena se bira u skladu sa tehnikama fagnog prikaza kako je opisano. Stoga su pojedinačni VH i VL polipeptidni lanci korisni u identifikaciji dodatnih antitela koja se specifično vezuju za humani CCL17 koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1 koristeći metode otkrivene u Int. Pat. Publ. No. WO1992/01047.
[0115] Antitela prema pronalasku mogu se napraviti korišćenjem različitih tehnologija za stvaranje monoklonskih antitela. Na primer, može se koristiti postupak hibridoma Kohler i Milstein, Nature 256: 495, 1975. U postupku hibridoma, miš ili druga životinja domaćin, poput hrčka, pacova ili majmuna, imunizovana je humanim proteinom CCL17 i/ili cyno CCL17 ili fragmentima ovih proteina, kao što je ekstracelularni deo humanog CCL17, nakon čega sledi fuzija ćelija slezine imuniziranih životinja sa ćelijama mijeloma koristeći standardne metode za formiranje ćelija hibridoma (Gooding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Kolonije proizašle iz pojedinačnih besmrtnih ćelija hibridoma se testiraju u odnosu na proizvodnju antitela sa željenim svojstvima, kao što su specifičnost vezivanja, unakrsna reaktivnost ili nedostatak istih, i afinitet za antigen.
[0116] Za proizvodnju antitela na humani CCL17 mogu se koristiti različite životinje domaćini. Na primer, miševi Balb/c mogu se koristiti za stvaranje mišjih anti-humanih antitela na CCL17. Antitela napravljena u miševima Blab/c i drugim životinjama koje nisu ljudi mogu se humanizovati korišćenjem različitih tehnologija za stvaranje sekvenci više sličnih humanim. Primeri tehnika humanizacije, uključujući izbor humanih akceptorskih okvira, poznati su stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju CDR graftovanje (U.S. Pat. No. 5,225,539), SDR graftovanje (U.S. Pat. No. 6,818,749), resurfacing tehnike (Palin, Mol Immunol 28: 489-499, 1991), resurfacing tehnike ostataka koji određuju specifičnost (US Pat. Publ. No.2010/0261620), prilagođavanje čoveku (ili prilagođavanje humanog okvira) (US Pat. Publ. No. US2009/0118127), super humanizacija (U.S. Pat. No. 7,709, 226) i vođeni izbor (Osborn et al., Metode 36: 61-68, 2005; U.S. Pat. No.5,565,332).
[0117] Humanizovana antitela mogu se dalje optimizovati kako bi se poboljšala njihova selektivnost ili afinitet prema željenom antigenu uključivanjem izmenjenih ostataka osnove okvira za očuvanje afiniteta vezivanja (povratne mutacije) tehnikama kao što su one otkrivene kao što je opisano u Int. Pat. Publ. No. WO1990/007861 i u Int. Pat. Publ. No. WO1992/22653.
[0118] Transgeni miševi koji u svom genomu nose lokuse humanog imunoglobulina mogu se koristiti za generisanje humanih antitela protiv ciljnog proteina i opisani su na primer u Int. Pat. Publ. No. WO1990/04036, U.S. Pat. No.6,150,584, Int. Pat. Publ. No. WO1999/45962, Int. Pat. Publ. No. WO2002/066630, Int. Pat. Publ. No. WO2002/43478, Loner et al., Nature 368: 856-9, 1994; Green et al., Nature Genet. 7: 13-21, 1994; Green & Jakobovits Exp Med 188: 483-95, 1998; Lonberg i Huszar Int Rev Immunol 13: 65-93, 1995; Bruggemann et al., Eur J Immunol 21: 1323-1326, 1991; Fishvild et al., Nat Biotechnol 14: 845-851, 1996; Mendez et al., Nat Genet 15: 146-156, 1997; Green, J Immunol Methods 231: 11-23, 1999; Iang et al., Cancer Res 59: 1236-1243, 1999; Bruggemann i Taussig Curr Opin Biotechnol 8: 455-458, 1997; Int. Pat. Publ. No. WO2002/043478). Endogeni imunoglobulinski lokusi kod takvih miševa mogu biti poremećeni ili izbrisani, a najmanje jedan potpuni ili delimični lokus humanog imunoglobulina može biti umetnut u genom miša korišćenjem homologne ili nehomologne rekombinacije, korišćenjem transhromozoma ili upotrebom minigena. Kompanije kao što su Regeneron (http: // _ vvv_regeneron_com), Harbour Antibodies (http: // _ vvv_harbourantibodies_com), Open Monoclonal Technology, Inc. (OMT) (http: // _ vvv_omtinc_net), KyMab (http: // _ vvv_kimab_com), Trianni ( http: //_vvv.trianni_com) i Ablekis (http: // _ vvv_ablekis_com) mogu biti angažovani da obezbede ljudska antitela usmerena protiv izabranog antigena korišćenjem gore opisane tehnologije.
[0119] Humana antitela se mogu izabrati iz biblioteke fagnog prikaza, gde je fag konstruisan da eksprimira humane imunoglobuline ili njihove delove, kao što su Fabs, antitela sa jednim lancem (scFv), ili uparen ili upareni promenljivi regioni antitela (Knappik et al., J Mol Biol 296: 57-86, 2000; Krebs et al., J Immunol Meth 254: 67-84, 2001; Vaughan et al., Nature Biotechnology 14: 309-314, 1996; Sheets et al., PITAS (SAD) 95: 6157-6162, 1998; Hoogenboom i Vinter, J Mol Biol 227: 381, 1991; Marks et al., J Mol Biol 222: 581, 1991). Antitela prema pronalasku mogu se izolovati, na primer, iz biblioteke fagnog prikaza koji eksprimira varijabilne regione teških i lakih lanaca antitela kao fuzione proteine sa proteinom pIX omotača bakteriofaga, kao što je opisano u Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010 i Int. Pat. Publ. No. WO2009/085462). Biblioteke antitela su pregledane u odnosu na vezivanje za humani CCL17 ekstracelularni domen i dobijeni pozitivni klonovi su dalje okarakterisani, Fabs izolovani iz klonskih lizata i eksprimirani kao IgG pune dužine. Takvi postupci prikazivanja faga za izolaciju humanih antitela su uspostavljeni u tehnici. Pogledati na primer: U.S. Patent Nos.5,223,409; 5,403,484; i 5,571,698 od Ladner et al.; U.S. Patent Nos. 5,427,908 i 5, 580,717 od Dower et al.; U.S. Patent Nos. 5,969,108 i 6,172,197 od McCafferty et al.; i U.S. Patent Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,915 i 6,593,081 od Griffiths et al.
[0120] Priprema imunogenih antigena i proizvodnja monoklonskih antitela mogu se izvesti bilo kojom pogodnom tehnikom, kao što je proizvodnja rekombinantnih proteina. Imunogeni antigeni se mogu davati životinji u obliku prečišćenog proteina ili smeša proteina, uključujući cele ćelije ili ekstrakte ćelija ili tkiva, ili se može formirati antigen de novo u telu životinje iz nukleinskih kiselina koje kodiraju navedeni antigen ili njegov deo.
[0121] Antitela prema pronalasku mogu biti humana ili humanizovana.
[0122] Antitela prema pronalasku mogu biti sintetička ili rekombinantna.
[0123] Antitela prema pronalasku mogu biti tipa IgA, IgD, IgE, IgG ili IgM. Antitela prema pronalasku mogu biti izotipa IgG1, IgG2, IgG3, IgG4.
[0124] Imuna efektorska svojstva antitela prema pronalasku mogu se poboljšati ili utišati modifikacijama Fc sa tehnikama poznatim stručnjacima. Na primer, efektorske funkcije Fc, kao što je vezivanje C1k, citotoksičnost zavisna od komplementa (CDC), ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela (ADCC), fagocitoza, nishodna regulacija receptora ćelijske površine (npr. receptor B ćelije; BCR) itd. mogu se modulirati modifikacijom ostataka u Fc koji su odgovorni za ove aktivnosti. Farmakokinetička svojstva se takođe mogu poboljšati mutirajućim ostacima u Fc domenu koji produžavaju poluvreme eliminacije antitela. Primeri modifikacija Fc su IgG4 S228P/L234A/L235A, IgG2 M252I/S254T/T256E (Dall'Ackua et al., J Biol Chem 281: 23514-24, 2006; ili IgG2 V234A/G237A/P238S, V234A/G237A/H268K, H268A/V309L/A330S/P331 ili V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S na IgG2 (Intl. WO2011/066501) ili one opisane u US. Pat. No.6,737,056 (numerisanje prema numeraciji EU).
[0125] U nekim izvođenjima, antitelo koje se specifično vezuje za humani CCL17 pronalaska sadrži supstituciju u Fc regionu.
[0126] U nekim rešenjima, supstitucija obuhvata V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S ili P331S supstituciju na IgG2, ili S228P, L234A ili L235A supstituciju na IgG4, pri čemu je numerisanje ostataka prema Indeksu EU.
[0127] Dodatno, antitela prema pronalasku mogu biti posttranslaciono modifikovana procesima kao što su glikozilacija, izomerizacija, deglikozilacija ili kovalentna modifikacija koja se ne javlja u prirodi, kao što je dodavanje polietilen glikolnih delova (pegilacija) i lipidacija. Do takvih modifikacija može doći in vivo ili in vitro. Na primer, antitela prema pronalasku mogu biti konjugovana sa polietilen glikolom (PEG-ilovana) radi poboljšanja njihovih farmakokinetičkih profila. Konjugacija se može izvesti tehnikama poznatim stručnjacima. Pokazalo se da konjugacija terapijskih antitela sa PEG pojačava farmakodinamiku, a da pritom ne ometa funkciju (Knight et al., Plateles 15: 409-418, 2004; Leong et al., Cytokine 16: 106-119, 2001; Iang et al., Protein Eng 16: 761-770, 2003).
[0128] Antitela prema pronalasku ili njihovi fragmenti mogu se modifikovati radi poboljšanja stabilnosti, selektivnosti, unakrsne reaktivnosti, afiniteta, imunogenosti ili drugih poželjnih bioloških ili biofizičkih svojstava. Na stabilnost antitela utiču brojni faktori, uključujući (1) pakovanje jezgra pojedinačnih domena koje utiče na njihovu unutrašnju stabilnost, (2) interakcije između interfejsa protein/protein koje utiču na uparivanje HC i LC, (3) sakrivanje polarnih i naelektrisanih ostataka, (4) H-vezana mreža za polarne i naelektrisane ostatke; i (5) površinsko naelektrisanje i raspodelu polarnih ostataka među ostalim intra- i inter-molekularskim silama (Vorn and Pluckthun, J Mol Biol 305: 989-1010, 2001). Potencijalni ostaci koji destabilizuju strukturu mogu se identifikovati na osnovu kristalne strukture antitela ili molekularnim modelovanjem u određenim slučajevima, a uticaj ostataka na stabilnost antitela može se testirati generisanjem i procenom varijanti koje sadrže mutacije u identifikovanim ostacima. Jedan od načina za povećanje stabilnosti antitela je podizanje srednje tačke termičke tranzicije (Tm) mereno diferencijalnom skenirajućom kalorimetrijom (DSC). Generalno, protein Tmje u korelaciji sa njegovom stabilnošću i obrnuto u vezi sa njenom podložnošću raspakivanju i denaturaciji u rastvoru i procesima razgradnje koji zavise od sklonosti proteina da se raspakuje (Remmele et al., Pharm Res 15: 200-208, 1997). Brojna istraživanja su otkrila korelaciju između rangiranja fizičke stabilnosti formulacija merene kao toplotna stabilnost pomoću DSC i fizičke stabilnosti merene drugim metodama (Bedu-Addo et al., Pharm Res 21: 1353-1361, 2004; Gupta i Kaisheva, AAPS PharSci, 5E8, 2003; Maa i Hsu, Int J Pharm 140: 155-168, 1996; Remmele et al., Pharm Res 15: 200-208, 1997; Zhang et al., J Pharm Sci 93: 3076-3089, 2004). Studije formulacije sugerišu da Fab Tmima implikacije za dugoročnu fizičku stabilnost odgovarajućeg mAb. Razlike u aminokiselinama u bilo kom okviru ili unutar CDR mogle bi imati značajne efekte na termičku stabilnost Fab domena (Iasui et al., FEBS Lett 353: 143-146, 1994).
[0129] Antitela prema pronalasku mogu se pretvoriti u bispecifična antitela. VL i VH regioni antitela prema pronalasku mogu se primeniti objavljenim postupcima u jednolančana bispecifična antitela kao strukture kao što su TandAb® dizajni (Int. Pat. Publ. No. WO1999/57150; US Pat. Publ. No. US2011/0206672) ili u bispecifične scFV kao strukture poput onih opisanih u U.S. Pat. No.5,869,620; Int. Pat. Publ. No. WO1995/15388, Int. Pat. Publ. No. WO1997/14719 ili Int. Pat. Publ. Ne WO2011/036460.
[0130] VL i VH regioni antitela prema pronalasku mogu se pretvoriti u bispecifična antitela pune dužine, pri čemu svaki krak antitela vezuje poseban antigen ili epitop. Takva bispecifična antitela se tipično proizvode moduliranjem CH3 interakcija između dva teška lanca antitela da formiraju bispecifična antitela koristeći tehnologije kao što su one opisane u U.S. Pat. No. 7,695,936; Int. Pat. Publ. No. WO2004/111233; US Pat. Publ. No. US2010/0015133; US Pat. Publ. No. US2007/0287170; Int. Pat. Publ. No. WO2008/119353; US Pat. Publ. No. US2009/0182127; US Pat. Publ. No. US2010/0286374; US Pat. Publ. No. US2011/0123532; Int. Pat. Publ. No. WO2011/131746; Int. Pat. Publ. No. WO2011/143545; ili US patent br. Publ. No. US2012/0149876. Dodatne bispecifične strukture u koje se mogu uključiti VL i VH regioni antitela prema pronalasku su, na primer, imunoglobulini sa dvostrukim promenljivim domenom (Int. Pat. Publ. No. WO2009/134776), ili strukture koje uključuju različite domene dimerizacije za povezivanje dve ručice antitela sa različitim specifičnostima, kao što su leucinski zatvarač ili domeni dimerizacije kolagena (Int. Pat. Publ. No. WO2012/022811, U.S. Pat. No. 5,932,448; U.S. Pat. No.6,833,441).
[0131] Sledeći primer izvođenja pronalaska je izolovani polinukleotid koji kodira varijabilne regione teškog lanca antitela i varijabilne regione lakog lanca antitela antitela prema pronalasku. Određeni primeri polinukleotida su ovde otkriveni, međutim, drugi polinukleotidi koji, s obzirom na degeneraciju genetskog koda ili preferencija kodona u datom sistemu ekspresije, kodiraju antitela prema pronalasku su doddatni primeri izvođenja prema pronalasku. Polinukleotidne sekvence koje kodiraju VH ili VL antitela prema pronalasku ili njegov fragment mogu se operativno povezati sa jednim ili više regulatornih elemenata, kao što su promotor i pojačivač, koji omogućavaju ekspresiju nukleotidne sekvence u predviđenoj ćeliji domaćina. Polinukleotid može biti cDNK.
[0132] Sledeći primer izvođenja pronalaska je vektor koji sadrži polinukleotid pronalaska. Takvi vektori mogu biti plazmidni vektori, virusni vektori, vektori za ekspresiju bakulovirusa, vektori zasnovani na transpozonu ili bilo koji drugi vektor pogodan za unošenje polinukleotida pronalaska u dati organizam ili genetsku osnovu na bilo koji način. Na primer, polinukleotidi koji kodiraju varijabilne regione lakih i teških lanaca antitela prema pronalasku, opciono povezani sa konstantnim regionima, umetnuti su u ekspresione vektore. Laki i teški lanci mogu se klonirati u istim ili različitim vektorima ekspresije. Segmenti DNK koji kodiraju lance imunoglobulina su operativno povezani sa kontrolnim sekvencama u vektorima ekspresije koji obezbeđuju ekspresiju polipeptida imunoglobulina. Takve kontrolne sekvence uključuju signalne sekvence, promotore (npr. prirodno povezane ili heterologne promotore), pojačivačke elemente i sekvence za završetak transkripcije, i izabrane su da budu kompatibilne sa ćelijom domaćinom izabranom za ekspresiju antitela. Nakon što je vektor inkorporisan u odgovarajućeg domaćina, domaćin se održava pod uslovima pogodnim za ekspresiju proteina kodiranih inkorporisanim polinukleotidima na visokom nivou.
[0133] Pogodni ekspresioni vektori se tipično mogu replicirati u organizmima domaćina bilo kao epizomi ili kao sastavni deo hromozomske DNK domaćina. Obično vektori ekspresije sadrže selekcione markere kao što su rezistencija na ampicilin, rezistencija na higromicin, rezistencija na tetraciklin, rezistencija na kanamicin ili neomicin kako bi se omogućilo otkrivanje onih ćelija transformisanih sa željenim sekvencama DNK.
[0134] Odgovarajući elementi promotora i pojačivača poznati su u tehnici. Za ekspresiju u bakterijskoj ćeliji, primerni promotori uključuju lacl, lacZ, T3, T7, gpt, lambda P i trc. Za ekspresiju u eukariotskoj ćeliji, primeri promotora uključuju laki i/ili teški lanac imunoglobulinskog gena promotora i elemenata pojačivača; citomegalovirus neposredni rani promotor; promotor timidin kinaze virusa herpes simpleksa; rani i kasni promotori SV40; promotor prisutan u dugim terminalnim ponovcima iz retrovirusa; mišji promotor metalotionein-I; i različiti tkivno specifični promotori poznati u tehnici. Za ekspresiju u ćeliji kvasca, primer promotora je konstitutivni promotor kao što je ADH1 promotor, PGK1 promotor, ENO promotor, PYK1 promotor i slično; ili promotor koji se može regulisati, kao što je GAL1 promotor, GAL10 promotor, ADH2 promotor, PH05 promotor, CUP1 promotor, GAL7 promotor, MET25 promotor, MET3 promotor, CIC1 promotor, HIS3 promotor, ADH1 promotor, PGK promotor, GAPDH promotor, ADC1 promotor, TRP1 promotor, URA3 promotor, LEU2 promotor, ENO promotor, TP1 promotor i AOKS1 (npr. za upotrebu u Pichia). Izbor odgovarajućeg vektora i promotora je u granicama uobičajenog znanja u ovoj oblasti.
[0135] Stručnjacima je poznat veliki broj odgovarajućih vektora i promotora; mnogi su komercijalno dostupni za generisanje predmetnih rekombinantnih konstrukata. Sledeći vektori su dati kao primer. Bakterijski: pBs, fagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBs KS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene, La Jolla, Kalifornija, SAD); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540 i pRIT5 (Pharmacia, Uppsala, Švedska). Eukariotski: pVLneo, pSV2cat, pOG44, PXR1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG i pSVL (Pharmacia).
[0136] Sledeći primer izvođenja pronalaska je ćelija domaćin koja sadrži vektor pronalaska. Izraz "ćelija domaćin" odnosi se na ćeliju u koju je uveden vektor. Podrazumeva se da se izraz ćelija domaćin ne odnosi samo na određenu ćeliju subjekta, već i na potomstvo takve ćelije. Budući da se određene modifikacije mogu dogoditi u narednim generacijama zbog mutacije ili uticaja okoline, takvo potomstvo možda nije identično matičnoj ćeliji, ali je i dalje uključeno u izraz "ćelija domaćin" koji se ovde koristi. Takve ćelije domaćini mogu biti eukariotske ćelije, prokariotske ćelije, ćelije biljaka ili arhealne ćelije.
[0137] Escherichia coli, bacili, poput Bacillus subtilis, i druge enterobakterije, kao što su Salmonella, Serratia i razne vrste Pseudomonas su primeri prokariotskih ćelija domaćina. Drugi mikrobi, poput kvasca, takođe su korisni za ekspresiju. Saccharomices (npr. S. cerevisiae) i Pichia su primeri odgovarajućih ćelija domaćina kvasca. Primeri eukariotskih ćelija mogu biti poreklom iz sisara, insekata, ptica ili drugih životinja. Eukariotske ćelije sisara uključuju imortalizovane ćelijske linije kao što su hibridomi ili ćelijske linije mijeloma kao što je SP2/0 (American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, CRL-1581), NS0 (European Collection of Cell Cultures (ECACC), Salisbury, Viltshire, UK, ECACC br. 85110503), mišje ćelijske linije FO (ATCC CRL-1646) i Ag653 (ATCC CRL-1580). Primer ćelijske linije humanog mijeloma je U266 (ATTC CRL-TIB-196). Druge korisne ćelijske linije uključuju one izvedene iz ćelija jajnika kineskog hrčka (CHO), kao što su CHO-K1SV (Lonza Biologics, Walkersville, MD), CHO-K1 (ATCC CRL-61) ili DG44.
[0138] Sledeća varijanta pronalaska je postupak proizvodnje antitela prema pronalasku koji se sastoji od uzgoja ćelije domaćina prema pronalasku i rekuperacije antitela koje proizvodi ćelija domaćin. Postupci stvaranja antitela i njihovog prečišćavanja su dobro poznati u tehnici. Kada se jednom sintetišu (hemijski ili rekombinantno), cela antitela, njihovi dimeri, pojedinačni laki i teški lanci ili drugi fragmenti antitela, kao što su VH ili VL, mogu se prečistiti prema standardnim postupcima u ovoj oblasti, uključujući taloženje amonijum sulfata, afinitetnu kolonu, hromatografiju na koloni, prečišćavanje tečnom hromatografijom visokih performansi (HPLC), elektroforezu na gelu i slično (videti generalno Scopes, Protein Purification (SpringerVerlag, N.I., (1982)). Predmetno antitelo može biti u suštini čisto, npr. najmanje oko 80% do 85% čistoće, najmanje oko 85% do 90% čistoće, najmanje oko 90% do 95% čistoće ili najmanje oko 98% do 99%, ili više, čisto, na primer, bez zagađivača kao što su ostaci ćelija, makromolekuli koji nisu predmetno antitelo itd.
[0139] Polinukleotidi koji kodiraju određene VH ili VL sekvence pronalaska su ugrađeni u vektore korišćenjem standardnih postupaka molekularne biologije. Transformacija ćelija domaćina, kultura, ekspresija antitela i prečišćavanje se vrše dobro poznatim postupcima.
Terapeutska upotreba
[0140] Antitela prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje ili sprečavanje spektra stanja posredovanih CCL17.
[0141] Izraz "stanje posredovano CCL17", kako se ovde koristi, obuhvata sve bolesti i medicinska stanja u kojima CCL17 igra ulogu, bilo direktno ili indirektno, u bolesti ili medicinskom stanju, uključujući uzročnost, razvoj, napredak, perzistentnost ili patologiju bolesti ili stanja.
[0142] Izraz "inflamatorno stanje posredovano CCL17", kako se ovde koristi, odnosi se na inflamatorno stanje koje je bar delimično rezultat biološke aktivnosti CCL17. Primeri inflamatornih stanja posredovanih CCL17 su astma i alergije.
[0143] Antitela prema pronalasku mogu se koristiti za lečenje životinjskog pacijenta koji pripada bilo kojoj klasifikaciji. Primeri takvih životinja uključuju sisare kao što su ljudi, glodari, psi, mačke i domaće životinje. Na primer, antitela prema pronalasku mogu se koristiti za profilaksu i lečenje stanja izazvanih CCL17, kao što su astma i respiratorne alergijske bolesti kao što su alergijska astma, alergijski rinitis, hronična opstruktivna plućna bolest (COPD), idiopatska plućna fibroza (IPF), bolesti preosetljivosti pluća i slično, alergijske bolesti poput sistemske anafilaksije ili reakcije preosetljivosti, alergije na lekove, alergijska bronhopulmonalna aspergiloza (ABPA), alergije na ubode insekata i alergije na hranu, inflamatorne bolesti creva kao što su Crohn-ova bolest, ulcerozni kolitis, ileitis i enteritis, vaginitis, psorijaza i inflamatorne dermatoze kao što su dermatitis, ekcem, atopijski dermatitis, alergijski kontaktni dermatitis, urtikarija i pruritus, vaskulitis, spondiloartropatije, sklerodermija, autoimune bolesti, poput artritisa (uključujući reumatoidni i psorijatični), multipla skleroza, sistemski lupus , dijabetes tipa I, glomerulonefritis i slično, odbacivanje transplantata (uključujući odbacivanje transplantata i bolest transplantata protiv domaćina) i druge bolesti kod kojih treba sprečiti neželjene inflamatorne reakcije, kao što su ateroskleroza, miozitis, neurodegenerativne bolesti posredovane T-ćelijama, multipla skleroza, encefalitis, meningitis, hepatitis, nefritis, sepsa, sarkoidoza, alergijski konjunktivitis, otitis, Castleman-ova bolest, sinuzitis, endotoksični šok izazvan LPS-om, Behcet-ov sindrom i giht,
[0144] Drugi aspekt pronalaska su antitela prema pronalasku za upotrebu u terapiji.
[0145] Antitela prema ovom pronalasku mogu biti namenjena za upotrebu kod životinja i pacijenata koji imaju ili su u riziku za razvoj bilo koje bolesti ili stanja povezanog sa ekspresijom CCL17 ili biološkom aktivnošću ili u kojima CCL17 igra biološku ulogu.
[0146] Bez vezivanja za bilo koju teoriju, antitela prema pronalasku mogu obezbediti svoj efikasan efekat u različitim inflamatornim bolestima direktnom inhibicijom regrutovanja Th2 ćelija i stoga istovremenom inhibicijom više Th2 citokina. Antitela prema pronalasku mogu obezbediti poboljšani bezbednosni profil u poređenju sa antitelima na CCR4 selektivnom blokadom samo CCL17. Antitela neće stupiti u interakciju sa trombocitima, koji eksprimiraju CCR4. Osim toga, antitela neće blokirati korisne urođene imunološke efekte CCL22 na CCR4 (Matsukava et al., I. Immunol 164: 5382-8, 2000).
[0147] "Inflamatorno stanje" kako se ovde koristi odnosi se na akutne ili hronične lokalizovane ili sistemske reakcije na štetne nadražaje, kao što su patogeni, oštećene ćelije, fizičke povrede ili iritanti, koji su delimično posredovani aktivnošću citokina, hemokina ili inflamatornih ćelija (npr., neutrofili, monociti, limfociti, makrofagi, mastociti, dendritične ćelije, neutrofili) i karakteriše se u većini slučajeva bolom, crvenilom, otokom i oštećenjem funkcije tkiva.
[0148] Inflamatorno plućno stanje primer je inflamatornog stanja posredovanog CCL17. Primeri inflamatornih plućnih stanja uključuju plućna stanja izazvana infekcijom, uključujući ona povezana sa virusnim, bakterijskim, gljivičnim, parazitskim ili prionskim infekcijama; plućna stanja izazvana alergenom; plućna stanja izazvana zagađivačima, kao što su azbestoza, silikoza ili berilioza; plućna stanja izazvana želudačnom aspiracijom, imunološka disregulacija, inflamatorna stanja sa genetskom predispozicijom, poput cistične fibroze, i plućna stanja izazvana fizičkom traumom, kao što je povreda usled upotrebe ventilatora. Ova inflamatorna stanja takođe uključuju astmu, emfizem, bronhitis, hroničnu opstruktivnu plućnu bolest (COPD), sarkoidozu, histiocitozu, limfangiomiomatozu, akutnu povredu pluća, akutni respiratorni distres sindrom, hroničnu bolest pluća, bronhopulmonalnu displaziju, pneumoniju stečenu u zajednici, bolničku pneumoniju, pneumoniju povezanu sa upotrebom ventilatora, sepsu, virusnu pneumoniju, infekciju gripom, infekciju parainfluencom, rotavirusnu infekciju, infekciju humanim metapneumovirusom, respiratornu sincicijalnu virusnu infekciju i Aspergillus ili druge gljivične infekcije. Primeri upalnih bolesti povezanih sa infekcijom mogu uključivati virusnu ili bakterijsku upalu pluća, uključujući tešku upalu pluća, cističnu fibrozu, bronhitis, egzacerbacije disajnih puteva i sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS). Takva stanja povezana sa infekcijom mogu uključivati više infekcija, kao što su primarne virusne infekcije i sekundarne bakterijske infekcije.
[0149] Astma je upalna bolest pluća koju karakteriše hiperreaktivnost disajnih puteva („AHR“), bronhokonstrikcija, šištanje, eozinofilna ili neutrofilna upala, hipersekrecija sluzi, subepitelna fibroza i povišeni nivoi IgE. Pacijenti sa astmom doživljavaju „egzacerbacije“, pogoršanje simptoma, najčešće zbog mikrobnih infekcija respiratornog trakta (npr. rinovirus, virus gripa, Haemophilus influenza itd.). Astmatični napadi mogu biti izazvani faktorima životne sredine (na primer. askaridi, insekti, životinje (npr., mačke, psi, zečevi, miševi, pacovi, hrčci, zamorci i ptice), gljivice, zagađivači vazduha (npr., duvanski dim), nadražujući gasovi, isparenja, pare, aerosoli, hemikalije, polen, vežbanje ili hladan vazduh. Osim astme, nekoliko hroničnih inflamatornih bolesti koje pogađaju pluća karakteriše infiltracija neutrofila u disajne puteve, na primer hronična opstruktivna plućna bolest (KOPB), bakterijska upala pluća i cistična fibroza (Linden et al., Eur Respir J 15: 973-7, 2000; Rahman et al., Clin Immunol 115: 268-76, 2005), a bolesti kao što su COPD, alergijski rinitis i cistična fibroza karakterišu hiperreaktivnost disajnih puteva (Fahi i O'Birne Am J Respir Crit Care Med 163: 822-3, 2001).
[0150] Kod alergijske astme, prisustvo visokog nivoa alergen-specifičnog IgE odraz je aberantnog imunološkog odgovora Th2 ćelija na uobičajeno inhalirane alergene iz okoline. Alergene su T ćelijama prikazani od strane dendritičnih ćelija (DC) koje neprekidno uzorkuju dolazne strane antigene. Nakon pravilne aktivacije pomoću DC-a, alergen specifični limfociti prisutni u obolelim disajnim putevima proizvode Th2 citokine interleukin (IL) -4, IL-5 i IL-13 koji dalje kontrolišu ekstravazaciju leukocita, hiperplaziju peharastih ćelija i bronhijalnu hiperreaktivnost (BHR). CCL17 proizveden od strane DC indukuje selektivnu migraciju Th2 ćelija, ali ne i Th1 ćelija kroz aktiviranje CCR4. U mišjim modelima astme, lečenje anti-CCL17 antitelima smanjilo je broj CD4+ T ćelija i eozinofila u tečnosti bronhoalveolarne lavaže (BAL), proizvodnju Th2 citokina i hiperreaktivnost disajnih puteva nakon izazivanja alergena, što sugeriše da je neutralizacija CCL17 izvodljiva strategija za inhibiranje alergijske inflamacije kod ljudi.
[0151] Uobičajeno korišćeni životinjski modeli za astmu i zapaljenje disajnih puteva uključuju model provokacije sa ovalbuminom, modele senzibilizacije sa metaholinom i senzibilizaciju sa Aspergillus fumigatus (Hessel et al., Eur J Pharmacol 293: 401-12, 1995). Inhibicija proizvodnje citokina i hemokina iz kultivisanih epitelnih ćelija bronhija čoveka, bronhijalnih fibroblasta ili ćelija glatkih mišića disajnih puteva takođe se mogu koristiti kao in vitro modeli. Primena antitela prema pronalasku na bilo koji od ovih modela može se koristiti za procenu efikasnosti za ublažavanje simptoma i promenu toka astme, upale disajnih puteva, HOBP i slično.
[0152] Atopijski dermatitis je primer inflamatornog stanja posredovanog CCL17.
[0153] Jedan aspekt pronalaska su antitela pronalaska za upotrebu u lečenju bolesti posredovane CCL17.
[0154] U nekim rešenjima, bolest posredovana CCL17 je inflamatorna bolest.
[0155] U nekim izvođenjima, inflamatorna bolest je astma, ulcerozni kolitis (UC), atopijski dermatitis (AD) ili idiopatska plućna fibroza (IPF).
[0156] Jedna varijanta pronalaska su antitela pronalaska za upotrebu u lečenju astme.
[0157] Jedna varijanta pronalaska su antitela pronalaska za upotrebu u lečenju ulceroznog kolitisa.
[0158] Jedna varijanta pronalaska su antitela pronalaska za upotrebu u lečenju atopijskog dermatitisa.
[0159] Jedna varijanta pronalaska su antitela pronalaska za upotrebu u lečenju idiopatske plućne fibroze.
Primena/farmaceutske kompozicije
[0160] Pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže antitela koja se specifično vezuju za CCL17 pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač. Za terapeutsku upotrebu, antitela koja se specifično vezuju za CCL17 pronalaska mogu se pripremiti kao farmaceutske kompozicije koje sadrže efikasnu količinu domena, molekula ili antitela kao aktivnog sastojka u farmaceutski prihvatljivom nosaču. Izraz "nosač" se odnosi na razblaživač, adjuvans, pomoćnu supstancu ili nosač sa kojim se daje aktivno jedinjenje. Takvi vehikulumi mogu biti tečnosti, poput vode i ulja, uključujući ona poreklom od naftne, životinjskog, biljnog ili sintetičkog porekla, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, mineralno ulje, susamovo ulje i slično. Na primer, može se koristiti 0,4% fiziološki rastvor i 0,3% glicina. Ovi rastvori su sterilni i uglavnom ne sadrže čestice. Mogu se sterilizovati konvencionalnim, dobro poznatim tehnikama sterilizacije (npr., filtriranje). Kompozicije mogu sadržati farmaceutski prihvatljive pomoćne supstance koje su potrebne za postizanje približnio fizioloških uslova, kao što su sredstva za podešavanje pH i puferisanje, stabilizatori, sredstva za povećanje gustine, lubrikanti i boje itd. Koncentracija antitela prema pronalasku u takvoj farmaceutskoj formulaciji može varirati u velikoj meri, tj. od manje od oko 0.5%, obično na ili najmanje oko 1% do čak 15 ili 20% po težini i biće izabrano prvenstveno na osnovu potrebne doze, zapremine tečnosti, viskoznosti itd., u skladu sa posebnim načinom izabrane primene. Pogodni nosači i formulacije, uključujući i druge humane proteine, npr. humani serum albumin, opisani su, na primer, u npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, videti naročito pp.958-989.
[0161] Način primene za terapeutsku upotrebu antitela koja se specifično vezuju za CCL17 pronalaska može biti bilo koji pogodan put kojim se sredstvo isporučuje domaćinu, kao što je parenteralna primena, npr. intradermalna, intramuskularna, intraperitonealna, intravenozna ili potkožna, plućna; transmukozno (oralni, intranazalni, intravaginalni, rektalni); korišćenje formulacije u tableti, kapsuli, rastvoru, prahu, gelu, česticama; i sadržano u špricu, implantiranom uređaju, osmotskoj pumpi, kertridžu, mikro pumpi; ili na drugi način poznat stručnjaku, kao što je dobro poznato u tehnici. Primena specifična za mesto može se postići, na primer, intrartikularnom, intrabronhijalnom, intraabdominalnom, intrakapsularnom, intrakartikularnom, intrakavitalnom, intracelijalnom, intracerebelarnom, intracerebroventrikularnom, intrakoličnom, intracervikalnom, intragastričnom, intrahepatičnom, intrakardijalnom, intraostealnom, intrapelvičkom, intraperikardijalnom, intraperitonealno, intrapleuralno, intraprostatičko, intrapulomonalnom intrarektalno, intrarenalno, intraretinalno, intraspinalno, intrasinovijalno, intratorakalno, intrauterino, intravaskularno, intravezikularno, intralezionalno, vaginalno, rektalno, bukalno, sublingvalno, intranazalno ili transdermalno dopremanje.
[0162] Stoga se farmaceutski preparat prema pronalasku za intramuskularnu injekciju može pripremiti tako da sadrži 1 ml sterilne puferisane vode i između oko 1 ng do oko 100 mg/kg, npr., oko 50 ng do oko 30 mg/kg ili još poželjnije, oko 5 mg do oko 25 mg/kg, antitela koja se specifično vezuju za CCL17 prema pronalasku.
[0163] Doza koja se daje pacijentu koji ima stanje posredovano CCL17 dovoljna je za ublažavanje simptoma ili lečenje stanja posredovanog CCL17 ("terapeutski efikasna količina") i ponekad iznosi 0,1 do 10 mg/kg telesne težine, na primer 1, 2, 3 , 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 mg/kg, ali može biti i veća, na primer 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ili 100 mg/kg. Takođe se može dati fiksna jedinična doza, na primer, 50, 100, 200, 500 ili 1000 mg, ili doza može biti zasnovana na površini pacijenta, na primer, 400, 300, 250, 200 ili 10 mg/m<2>. Obično se primenjuje između 1 i 8 doza (npr.1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8), ali se može dati 10, 12, 20 ili više doza. Primena antitela koja specifično vezuju CCL17 prema pronalasku može se ponoviti nakon jednog dana, dva dana, tri dana, četiri dana, pet dana, šest dana, jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, mesec, pet nedelja, šest nedelja, sedam nedelja, dva meseca, tri meseca, četiri meseca, pet meseci, šest meseci ili duže. Mogući su i ponovljeni kursevi lečenja, kao i hronična primena. Ponovljena primena može biti u istoj dozi ili u različitoj dozi.
[0164] Doziranje CCL17 antitela prema pronalasku koje će biti efikasno u lečenju inflamatornih bolesti kao što je astma može se odrediti davanjem CCL17 antitela na relevantne životinjske modele dobro poznate u tehnici i kako je ovde opisano.
[0165] In vitro testovi se izborno mogu koristiti kao pomoć u identifikaciji optimalnih opsega doziranja. Može se odrediti izbor određene efikasne doze (npr., putem kliničkih ispitivanja) od strane stručnjaka u ovoj oblasti na osnovu razmatranja nekoliko faktora. Takvi faktori uključuju bolest koju treba lečiti ili sprečiti, uključene simptome, telesnu težinu pacijenta, imunološki status pacijenta i druge faktore poznate stručnjaku. Tačna doza koja će se koristiti u formulaciji takođe će zavisiti od načina primene i težine bolesti, a trebalo bi da se odredi prema proceni lekara i okolnostima za svakog pacijenta. Efektivne doze se mogu ekstrapolirati iz krivih dozaodgovor izvedenih iz in vitro ili sistema za ispitivanje životinjskog modela. Antitela prema pronalasku mogu se testirati na efikasnost i efektivnu dozu koristeći bilo koji od modela opisanih ovde.
[0166] Na primer, farmaceutska kompozicija koja sadrži antitela koja specifično vezuju CCL17 prema pronalasku za intravensku infuziju može biti sastavljena tako da sadrži oko 200 ml sterilnog Ringerovog rastvora i oko 8 mg do oko 2400 mg, oko 400 mg do oko 1600 mg, ili oko 400 mg do oko 800 mg antitela koja specifično vezuju CCL17 prema pronalasku za primenu na pacijenta od 80 kg. Postupci za pripremu preparata za parenteralnu primenu dobro su poznati i detaljnije su opisani u, na primer, "Remington's Pharmaceutical Science", 15th. edition, Mack Publishing Company, Easton, PA.
[0167] Antitela koja se specifično vezuju za CCL17 pronalaska mogu se liofilizovati za skladištenje i rekonstituisati u odgovarajućem nosaču pre upotrebe. Ova tehnika se pokazala efikasnom sa konvencionalnim proteinskim preparatima i mogu se koristiti tehnike liofilizacije i rekonstitucije poznate u tehnici.
[0168] Antitela koja specifično vezuju CCL17 prema pronalasku mogu se primenjivati u kombinaciji sa drugim terapijskim sredstvom istovremeno, sekvencijalno ili odvojeno.
Primer 1. Generisanje CCL17 neutralizujućih antitela
[0169] Humani CCL17 vezujući Fab su izabrani iz de novo pIX biblioteke fagnog prikaza opisane u Shi et al., J. Mol. Biol. 397: 385-396, 2010; Int. Pat. Publ. No. WO2009/085462; US Pat. Publ. No. US2010/0021477; US Pat. Publ. No. US2012/0108795. Ukratko, biblioteke su nastale diverzifikacijom humanih potpornih delova gde su VH geni klicine linije IGHV1-69*01, IGHV3-23*01 i IGHV5-51*01 rekombinovani sa humanim minigenom IGHJ-4 preko H3 petlje i humani VL kapa geni humane klicine linije 012 (IGKV1-39*01), L6 (IGKV3-11*01), A27 (IGKV3-20*01) i B3 (IGKV4-1*01) rekombinovani su sa IGKJ-1 minigenom za sastavljanje kompletnih VH i VL domena. Položaji u varijabilnim regionima teškog i lakog lanca oko petlji H1, H2, L1, L2 i L3 koji odgovaraju položajima za koje je utvrđeno da su često u kontaktu sa proteinskim i peptidnim antigenima izabrani su radi diverzifikacije. Raznolikost sekvenci na izabranim pozicijama bila je ograničena na ostatke koji se pojavljuju na svakoj poziciji u familijama gena IGHV ili IGLV klicine linije odgovarajućih IGHV ili IGLV gena. Raznolikost u petlji H3 nastala je korišćenjem sintetičkih petlji kratke do srednje veličine dužine 7-14 aminokiselina. Distribucija aminokiselina u H3 je dizajnirana da imitira uočenu varijaciju aminokiselina u humanim antitelima. Dizajn biblioteke je detaljno opisan u Shi et al., J Mol Biol 397: 385-96, 2010. Potporni delovi koje se koriste za generisanje biblioteka nazvani su prema njihovom poreklu gena klicine linije VH i VL. Tri biblioteke teških lanaca su kombinovane sa četiri laka lanca klicine linija ili biblioteka lakih lanaca klicinih linija da bi se generisale 24 jedinstvene VH: VL kombinacije za skrining. Sve 24 kombinacije VH: VL biblioteke su korišćene u eksperimentima paniniga faga protiv humanog CCL17.
[0170] Biblioteke su panovane korišćenjem humanog CCL17 iz SEQ ID NO: 1. Ukratko, ljudski CCL17 je biotinilovan standardnim postupcima, a biotinilovani humani CCL17 (Bt-huCCL17) je uhvaćen na magnetnim perlicama obloženim streptavidinom (Dinal, M280) i Fab-pIX biblioteke faga dodate su perlicama. Koncentracije Bt-huCCL17 su bile 100 nM za runde 1 i 2 i 10 mM za runde 3 i 4). Skrining je izvršen ELISA testom na Fab vezivanje za humani CCL17 protein. Za paninig, magnetne perlice obložene bt-huCCL17 su isprane i blokirane sa PBST-M (BPS sa 0,05% Tveen-20 i 3% nemasnog suvog mleka). Blokirani fag iz biblioteka je dodat u perlice i rotiran na sobnoj temperaturi tokom prve runde. Perlice su isprane i zatim inkubirane u kulturi log faze E. coli, (MC1061F') ćelije i zaražene E coli su uzgajane na LB agaru ploče preko noći na 37 ° C. Sledećeg jutra kulture su sastrugane sa ploča u 2 ml 2kIT (20% glicerola) po ploči, 50 µL bakterijske suspenzije je dodato u 50 ml 2kIT (ugljeni hidrat) i uzgajano na 37°C uz mućkanje do 2 h. Helper fag je dodat u kulture srednje faze i kulture su inkubirane na 37°C tokom 30 minuta. Kanamicin i IPTG su dodati u svaku kulturu do krajnjih koncentracija od 35 pg/mL, odnosno 1 mM, i uzgajani preko noći na 30°C uz mućkanje. Amplifikovani fag iz bakterijskog medijuma je istaložen upotrebom PEG/NaCl i ponovo suspendovan u 1 mL PBS.
200 µL je upotrebljeno za sledeću rundu paninga.
[0171] Posle tri runde paninga, fagemidna DNK je izolovana iz zaraženih ćelija MC1061F' i digestirana sa restrikcionim enzimima da bi se uklonila sekvenca koja kodira pIX, a linearizovana plazmidna DNK je izrezana i prečišćena iz agaroznih gelova. Zatim je izvršena autoligacija DNK sa T4 DNK ligazom. Ligatirana DNK je elektroporisana u ćelije MC1061F' i stavljena na LB (Carb/Glucose) agar ploče. Kolonije iz ove elektroporacije su odabrane za ELISA skrining i procenu Fab ekspresije. Fab sadrže infra-His oznaku na C-kraju teškog lanca. Od inicijalnog skrininga, 24 Fab su delimično pročišćena preko C-terminalnog His pomoću standardnih metoda i dalje okarakterisani.
[0172] Fabs su okarakterisani u odnosu na njihovo vezivanje za humani CCL17 (SEQ ID NO: 1), cyno CCL17 (SEQ ID NO: 2) i cyno CCL22 (SEQ ID NO: 3) u ELISA testu. Ukratko, Maxisorp ploče sa 96 bunarčića su obložene sa 1 ug/ml kozjeg anti-humanog kapa (Southern Biotech). Polu-prečišćeni Fab je dodat u svaku ploču. Biotinilovani huCCL17, cCCL17 ili cCCL22 su dodati u svaki Fab-uhvaćeni bunarčić. Proteini vezani za uhvaćene Fabs detektovani su pomoću Streptavidina: HRP. Za sazrevanje prema afinitetu odabrano je pet Fab (F21, F24, F34, F43 i F44) koji su vezani i za humani i za cyno CCL17, ali ne i za cyno CCL22.
Primer 2. Sazrevanje prema afinitetu anti-CCL17 antitela
[0173] Pet Fab je odabrano za sazrevanje prema afinitetu na osnovu njihovog početnog profila karakterizacije. Fabs su sazreli prema afinitetu diverzifikovanjem lakih lanaca koristeći linijsku tehnologiju sazrevanja opisanu u Shi et al. (Shi et al., J Mol Biol 397: 385-396, 2010) i zadržavajući teški lanac nepromenljivim. Teški lanac u Fabs bio je VH3-23 ili VH5-51. Biblioteke sazrevanja prema afinitetu F24 proizvele su poboljšana veziva CCL17.
[0174] Ukratko, F24 je sazreo sa afinitetom pomoću biblioteke lakog lanca B3. Šema diverzifikacije biblioteke B3 prikazana je u Tabeli 2. Položaji su označeni kao Kabat numeracija.
Tabela 2.
[0175] VH regioni Fab klonirani su u fagemid LC biblioteke što je rezultovalo potpunom ponovnom diverzifikacijom LC za svaki Fab. VH regioni su izolovani restrikcionom digestijom DNK minipreparata koristeći NcoI i ApaI. VH regioni su izolovani gelom i vezani u slično digestovanu DNK LC biblioteke. Ligacije su prečišćene i transformisane u ćelije MC1061F'. Ćelije su uzgajane u 2kIT (Carb) do postizanja log faze rasta (OD600nm≈0,6). Dodat je helper fag i kulture su inkubirane na 37°C tokom 30 minuta. Kanamicin i IPTG su dodati u svaku kulturu do krajnjih koncentracija od 35 ug/mL, odnosno 1 mM, i uzgajani preko noći na 30 ° C uz mućkanje. Fag iz bakterijskog medijuma je istaložen upotrebom PEG/NaCl i ponovo suspendovan u PBS.
[0176] Za paning sazrevanja prema afinitetu, Bt-CCL17 je uhvaćen na 50 µl magnetnih perlica obloženih SA. Koncentracije antigena su bile 100 nM za 1 rundu, 10 nM za 2 rundui 10 nM za 3 rundu. Perlice su podvrgnute 6 ispiranja sa PBST i jednim ispiranjem sa PBS, nakon čega je usledila infekcija E. coli, kako je gore opisano. Izolacija Fab ekspresionih plazmida i ekspresija Fabs su izvedeni kako je opisano.
[0177] Izvršen je skrining afinitetno sazrelih Fabs u ELISA testu na vezivanje za huCCL17 (SEQ ID NO: 1), cCCL17 (SEQ ID NO: 2) i cCCL22 (SEQ ID NO: 3) kao što je prethodno opisano za vezivanje za huCCL17. Identifikovani klonovi su sekvencirani, konvertovani u cela IgG1 antitela i njihovo vezivanje za huCCL17, cCCL17 i cCCL22 je potvrđeno korišćenjem MSD-SEA.
[0178] CDR sekvence roditeljskog i afinitetno sazrelog antitela prikazane su u Tabeli 3 i Tabeli 4 za CDR teškog i lakog lanca.
Tabela 3.
Tabela 4.
Primer 3. Vezivanje afinitetno sazrelih anti-CCL17 antitela za humane i cyno CCL17
[0179] Antitela su procenjena u odnosu na njihovo vezivanje za humani CCL17 i cyno CCL17 koristeći afinitet rastvora u ravnoteži (SEA). Postupak za ove eksperimente bio je sličan onom koji su koristili Haenel et al (Haenel et al., Anal Biochem 339: 182-184, 2005). Da bi se pripremili kompleksi antigen-antitelo, humani CCL17 ili cyno CCL17 su serijski razblaženi u puferu sa fiziološkim rastvorom na bazi TRIS koji sadrži 0,05% Tveen-20, TBST, (Thermo Scientific) u odnosu 1: 6 počevši od koncentracije od 2,000,000 pM u polipropilenske ploče sa 96 dubokih bunarčića. Jednake zapremine anti-hCCL17 mAbs na 40 pM ili 200 pM dodate su svakom razblaženju hemokina da se dobiju smeše koje sadrže serijsko razblaživanje hemokina počevši od krajnje koncentracije od 1 µM i konstantne koncentracije (20 pM ili 100 pM) antitela protiv CCL17. Smeše su pripremljene u duplikatu i inkubirane na 4°C tokom 48 h da bi se postigla ravnoteža. Slobodno antitelo je otkriveno pomoću instrumenta SECTOR Imager 6000 (Meso Scale Discovery). Dobijene krive vezivanja su podešene da se dobije konstanta ravnoteže disocijacije (KD) korišćenjem softvera GraphPad Prism (v 5.01) koristeći model vezivanja 1: 1 za izvođenje nelinearne regresione analize podataka sa najmanjim kvadratom. Tabela 5 prikazuje afinitete antitela na humane i cyno CCL17. Afiniteti su se kretali od oko 2 pM do oko 700 pM za humani CCL17 i od oko 200 pM do oko 9500 pM do cyno CCL17. Proizvedena antitela vezuju humani CCL17 sa oko 2 do 150 puta većim afinitetima u poređenju sa vezivanjem za cyno CCL17.
Tabela 5.
Primer 4. Optimizacija CCL17 antitela
[0180] C17B234 i C17B240 antitela protiv CCL17 sadržala su potencijalno mesto glikozilacije vezano za N na početku LCDR2 ("NAS"). Ostatak asparagina (N) na položaju ostatka 50 (numeracija Kabat) C17B234 je mutiran na šest različitih aminokiselina (A, D, G, S, T i I).
[0181] Potencijalni motiv izomerizacije asparaginske kiseline, "DS" je identifikovan u HCDR3 u roditeljskom C17F24 i svim njegovim varijantama afinitetnog sazrevanja. Da bi se testirao efekat supstitucija na ovoj poziciji, serinski ostatak na položaju 100c (Kabat numeracija) je mutiran na A, T ili S ili je D na položaju 100b mutiran na E u teškom lancu mAb C17B234. Dobijeni teški lanci su upareni sa lakim lancem mAb C17B258.
[0182] Antitela su izražena kao IgG1 i meren je njihov afinitet prema humanom i cyno CCL17. Tabela 6 i
[0183] Tabela 7 prikazuju teške i lake lance CDR sekvence optimizovanih antitela. Tabela 8 prikazuje afinitet antitela za humane i cyno CCL17. Mutageneza N50 u lakom lancu rezultirala je poboljšanim vezivanjem 2 do 100 puta.
Tabela 6.
Tabela 7.
Tabela 8.
[0184] Ostatak triptofana u HCDR3 na položaju 100a (Kabat numeracija) u mAb C17B236 identifikovan je kao verovatno mesto neželjene post-translacione oksidacije. Ovaj ostatak je mutiran na 17 drugih aminokiselina (sve osim C i M) u Fab roditeljskom C17B236, C17F319 koje je ovo mAb. Kunkel-ova mutageneza je izvedena sa "NNK" ili definisanim kodonskim oligonukleotidima da bi se proizveo ovaj panel. Zatim je izvršen skrining ovih Fab korišćenjem ELISA za rangiranje za vezivanje i za bt-humani i za bt-cino CCL17. Pet varijanti (W → R, Y, F, T, I) pokazalo je određeno vezivanje u ELISA za vezivanje za Fab (Tabela 5). Najbolja tri su konvertovana u mAb (M17B288, C17B289, C17B290) za ekspresiju i MSD-SEA (Tabela 6). Većina varijanti je pokazala smanjeni afinitet prema humanom i cyno CCL17.
[0185] VH i VL sekvence antitela prikazane su u Tabeli 9.
Tabela 9.
Primer 5. Izbor konstantnih regiona
[0186] Odabrana antitela su klonirana kao IgG2 ili IgG4 sa sledećim supstitucijama: IgG4 S228P/L234A/L235A ili IgG2 V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S korišćenjem standardnih postupaka. Tabela 10 prikazuje dobijena antitela
Tabela 10.
[0187] Teški i laki lanci određenih antitela prikazani su u nastavku:
CB302 HC (SEQ ID NO: 67)
CB301 HC (SEQ ID NO: 69)
Primer 6. Karakterizacija anti-CCL17 antitela
[0188] Odabrana antitela na CCL17 okarakterisana su u fluksu kalcijuma, reporterskim testovima β-arestina i u testu hemotaksije kako bi se procenila njihova sposobnost da inhibiraju biološke aktivnosti CCL17.
[0189] Analiza fluksa kalcijuma. Test mobilizacije kalcijuma je korišćen za ispitivanje sposobnosti hibridomskih mAbs da neutrališu CCL17 signalizaciju. CCRF-CEM ćelije (ATCC® CCL-119 ™) su kultivisane u RPMI sa GlutaMAX; 10% FBS; 10 mM Hepes, 1 mM natrijum piruvat, 4500 mg/L glukoze i 1500 mg/ml natrijum bikarbonata na 37°C u inkubatoru sa 5% CO2zasićenja. Ćelije su obeležene bojom pomoću Fluo-8 NV kompleta za ispitivanje kalcijuma bez ispiranja (#36315) iz ABD Bioquest, Inc. Test antitela i 10 ng/mL humanog CCL17 ili 5 ng/mL cyno CCL17 su prethodno inkubirani sa test antitelima i smeša je dodata ćelijama. Fluorescentni signal je detektovan korišćenjem FDSS 6000 (Hamamatsu, Bridgewater, NJ) do primene ekscitacije od 490 nm i emisije od 525 nm.
[0190] Reporterski test β-arestina. Test β-arestina je korišćen za procenu sposobnosti antitela na CCL17 da neutrališu funkciju CCL17. Test je izveden korišćenjem PathHunter eXpress testa β-arestina (DiscoveRx). Ukratko, sposobnost anti-CCL17 antitela da inhibiraju regrutovanje beta-arestina izazvanog sa CCL17 procenjena je u Hek293 ćelijama koje ko-eksprimiraju CCR4 spojene u okviru sa malim fragmentom enzima ProLink ™ i fuzionim proteinom β-arestina i N-terminalnom delecijom mutant β-gal (naziva se akceptor enzima ili EA). Antitela na CCL17 u različitim koncentracijama (0,15 nM-1 pM) su kombinovana sa 20 nM CCL17 i smeša je inkubirana na 37°C 20-30 minuta pre dodavanja kompleksa antitelo-CCL17 u ćelije. Smeša je zatim naneta na ćelije i inkubirana na 37°C (95% O2/5% CO2) 90 minuta. Dodato je 55 µl reagensa za detekciju po bunarčiću i inkubirano 60 min na sobnoj temperaturi. Uzorci su očitani na standardnom čitaču luminescentnih ploča i izračunate su IC50vrednosti.
[0191] Test hemotaksije: Test hemotaksije je korišćen da se pokaže da antitela na CCL17 inhibiraju funkciju CCL17. Migracija HSC-F ćelija (HSC-F ćelije su dobijene pomoću NIH Nonhuman Primate Reagent Resource) ili CCRF-CEM ćelija (ATCC® CCL-119 ™) procenjena je korišćenjem komore za hemotaksiju sa 96 bunarčića pomoću 5µm polikarbonatnog filtera prema protokolu opisanom u Imai et al. 1997; Imai et al. 1999. Ukratko, donje komore su napunjene sa 320 µl RPMI/BSA 0,1% i 1 nM humanog ili cyno CCL17 bez ili sa različitim koncentracijama antitela (0,125, 0,25, 0,5 1 i 10 pg/ml), a zatim su pažljivo prekrivene sa polikarbonatnom membranom. Ćelije su isprane sa PBS i suspendovane u RPMI/BSA 0.1% na 0.5x10<6>ćelija/ml, a ćelijska suspenzija je dodata u gornje komore. Komore su inkubirane 60 minuta u 5% CO2-humidifikovanom inkubatoru na 37°C, a ćelije koje migriraju preko membrane u donju komoru su određene pomoću Cell Titer-Glo Luminescence Cell Viability.
[0192] Tabela 11 prikazuje vrednosti IC50 za ispitivanje fluksa kalcijuma. Podaci su prosek tri nezavisna eksperimenta. Svako mAb je potpuno neutralizovalo fluks kalcijuma indukovan humanim ili cyno CCL17 korišćenjem ili 10 ng/ml (1.25nM) humanog CCL17 ili 5 ng/ml (0.625 nM) cyno CCL17 i kao što je prikazano u Tabeli 11, IC50vrednosti su bile približno ekvivalentne za svako od antitela protiv humanog i cyno proteina.
Tabela 11.
[0193] Tabela 12 prikazuje IC50vrednosti za β-arestin test. Podaci su prosek tri nezavisna eksperimenta. Sva mAb su bila u stanju da potpuno inhibiraju regrutovanje β-arestina izazvano humanim ili cyno CCL17 indukovanim na 20 nM i zavisno od doze inhibiraju regrutovanje βarestina izazvano humanim ili cyno CCL17 sa ekvivalentnom snagom.
Tabela 12.
[0194] Slike 1 i 2 prikazuju inhibiciju hemotaksije sa odabranim antitelima u ljudskim i cyno ćelijama, respektivno. Sva testirana antitela inhibirala su i hemotaksiju CCRF-CEM ćelija izazvanu humanim CCL17 na nivou inhibicije od oko 50% pri koncentraciji antitela od 0,5 pg/ml. C17B302 i C17B311 su inhibirali hemotaksiju cyno HSC-F ćelija indukovanu cyno CCL17 na nivou inhibicije od oko 50% pri koncentraciji antitela od 0,5 pg/ml.
Primer 7. Mapiranje epitopa anti-CCL17 antitela C17B236
[0195] Vezujući epitop antitela C17B236 (VH: SEQ ID NO: 45; VL: SEQ ID NO: 52) određen je rendgenskom kristalografijom.
[0196] Humani CCL17 je eksprimiran u E. coli, izolovan iz inkluzionih tela i ponovo spakovan. Fab fragment mAb C17B236 je eksprimiran u ćelijama HEK293F. Kompleks CCL17: C17B236 je pripremljen mešanjem u molarnom odnosu 1,6: 1 sa viškom CCL17. Kompleks je zatim prečišćen ekskluzionom hromatografijom. Kompleks je kristalizovan metodom difuzije pare iz rastvora koji sadrži 20% PEG 3350 i 0,2 M K/Na tartarat. Podaci o difrakciji rentgenskih zraka prikupljeni su do rezolucije 1,9 A. Struktura je određena molekularnom zamenom i prečišćena do R-faktora od 18,0%.
[0197] C17B236 epitop je konformacioni i obuhvata 3 segmenta molekula CCL17, odnosno dve petlje (ostaci 21-23 i 44-45) i C-terminalnu spiralu (ostaci 60-68). Ključne interakcije uključuju osnovne ostatke Arg22 i Lis23 iz CCL17 i grupu kiselih ostataka u HCDR2 uključujući Asp52, Asp55 i Asp57. Pored ovih elektrostatičkih interakcija, van-der-Vaalsovi kontakti u centru epitopa javljaju se između Trp33 i Trp105 iz VH i Arg22 iz CCL17. S obzirom na broj kontakata, ključni ostatak epitopa je Arg22, koji se slaže sa Trp33 VH i ostvaruje brojne kontakte sa HCDR3. Ostaci paratopa i epitopa prikazani su na slici 7.
[0198] Paratop (ostaci antitela uključeni u vezivanje CCL17) uključuju 18 ostataka koji pripadaju 5 od 6 CDR -a (svi osim LCDR2).
Epitop C17B236 nalazi se na suprotnoj strani monomera CCL17 od njegove površine dimerizacije. C17B236 tako ne blokira dimerizaciju CCL17. Neutralizaconi efekat C17B236 rezultat je kompeticije sa CCR4 za preklapajuće epitope.
Sekvence:
[0199]

Claims (13)

Patentni zahtevi
1. Anti-hemokin (C-C motiv) ligand 17 (CCL17) antitelo koje sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) iz SEQ ID NO: 46 i varijabilni region lakog lanca (VL) iz SEQ ID NO: 62.
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da težak lanac sadrži SEQ ID NO: 67 i laki lanac sadrži SEQ ID NO: 68.
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo je IgG2 izotipa, i pri čemu antitelo sadrži V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S ili P331S supstituciju na IgG2, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Index.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 3, naznačeno time da antitelo sadrži V234A, G237A, P238S, H268A, V309L, A330S i P331S supstituciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Index.
5. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo je IgG4 izotipa, i pri čemu antitelo sadrži S228P, L234A ili L235A supstituciju na IgG4, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Index.
6. Antitelo prema patentnom zahtevu 5, naznačeno time da antitelo sadrži S228P, L234A i L235A supstituciju, pri čemu je numerisanje ostataka prema EU Index.
7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač.
8. Jedan ili više izolovanih polinukleotida koji kodiraju VH i VL antitela definisanih u bilo kom od patentnih zahteva 1-6.
9. Jedan ili više vektora koji sadrže jedan ili više polinukleotida iz patentnog zahteva 8.
10. Ćelija domaćin za proizvodnju izolovanog antitela koja sadrži jedan ili više vektora iz patentnog zahteva 9.
11. Postupak za proizvodnju antitela, koji sadrži kultivisanje ćelije domaćina iz patentnog zahteva 10 u takvim uslovima da se proizvodi antitelo.
12. Antitelo definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija definisana u patentnom zahtevu 7 za upotrebu u terapiji.
13. Antitelo definisano u bilo kom od patentnih zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija definisana u patentnom zahtevu 7 za upotrebu u tretiranju inflamatorne bolesti, astme, ulcerativnog kolitisa (UC), atopijskog dermatitisa (AD) ili idiopatske pulmonalne fibroze (IPF), naročito astme ili hiper-reaktivnosti vazdušnih puteva.
RS20211062A 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antitela RS62373B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361900596P 2013-11-06 2013-11-06
EP14860331.9A EP3065774B1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antibodies
PCT/US2014/064302 WO2015069865A1 (en) 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antibodies

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62373B1 true RS62373B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=53007215

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211062A RS62373B1 (sr) 2013-11-06 2014-11-06 Anti-ccl17 antitela

Country Status (33)

Country Link
US (4) US9944697B2 (sr)
EP (2) EP3466445A1 (sr)
JP (1) JP6556742B2 (sr)
KR (1) KR102331054B1 (sr)
CN (1) CN105722531B (sr)
AU (1) AU2014346770B2 (sr)
BR (1) BR112016010071A2 (sr)
CA (1) CA2929166C (sr)
CL (1) CL2016001081A1 (sr)
CR (1) CR20160187A (sr)
CY (1) CY1124445T1 (sr)
DK (1) DK3065774T3 (sr)
DO (1) DOP2016000105A (sr)
EA (1) EA034655B1 (sr)
ES (1) ES2884255T3 (sr)
HR (1) HRP20211234T1 (sr)
HU (1) HUE058272T2 (sr)
IL (1) IL245488B (sr)
LT (1) LT3065774T (sr)
MA (1) MA39090B2 (sr)
MX (1) MX2016005982A (sr)
MY (1) MY192757A (sr)
NZ (2) NZ719506A (sr)
PE (1) PE20160856A1 (sr)
PH (1) PH12016500826B1 (sr)
PL (1) PL3065774T3 (sr)
PT (1) PT3065774T (sr)
RS (1) RS62373B1 (sr)
SG (1) SG11201603231XA (sr)
SI (1) SI3065774T1 (sr)
SM (1) SMT202100473T1 (sr)
UA (1) UA119973C2 (sr)
WO (1) WO2015069865A1 (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MY192757A (en) * 2013-11-06 2022-09-07 Janssen Biotech Inc Anti-ccl17 antibodies
WO2017065203A1 (ja) * 2015-10-14 2017-04-20 日本全薬工業株式会社 イヌアトピー性皮膚炎の治療及び診断のために用いる抗イヌｔａｒｃ抗体
WO2017079369A2 (en) * 2015-11-03 2017-05-11 Glaxosmithkline Llc Novel antibodies
MA43308A (fr) * 2015-11-25 2018-10-03 Visterra Inc Molécules d'anticorps se liant à april et leurs utilisations
CN108250290B (zh) 2018-02-23 2024-03-12 上海捌加壹医药科技有限公司 Ccr4的n端重组蛋白及其用途
US20230266337A1 (en) * 2020-07-10 2023-08-24 Sekisui Medical Co., Ltd. Composition containing tarc, and method for improving storage stability of tarc
TWI899280B (zh) * 2020-07-10 2025-10-01 日商積水醫療股份有限公司 含有tarc之組成物及tarc之保存穩定性之提升方法
WO2024127277A1 (en) 2022-12-16 2024-06-20 Glaxosmithkline Intellectual Property Development Limited Method of treating pain with an anti-ccl17 antibody

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7709A (en) 1850-10-08 Chas S Gaylord Improved spring-grapple
US226A (en) 1837-06-03 Samuel goss
US4683985A (en) 1985-01-04 1987-08-04 Dresser Industries, Inc. Lubrication system for a vertical gear unit
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
WO1988001649A1 (en) 1986-09-02 1988-03-10 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
IL162181A (en) 1988-12-28 2006-04-10 Pdl Biopharma Inc A method of producing humanized immunoglubulin, and polynucleotides encoding the same
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US6172197B1 (en) 1991-07-10 2001-01-09 Medical Research Council Methods for producing members of specific binding pairs
US6255458B1 (en) 1990-08-29 2001-07-03 Genpharm International High affinity human antibodies and human antibodies against digoxin
EP0940468A1 (en) 1991-06-14 1999-09-08 Genentech, Inc. Humanized antibody variable domain
ES2136092T3 (es) 1991-09-23 1999-11-16 Medical Res Council Procedimientos para la produccion de anticuerpos humanizados.
US5932448A (en) 1991-11-29 1999-08-03 Protein Design Labs., Inc. Bispecific antibody heterodimers
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
DK0672142T3 (da) 1992-12-04 2001-06-18 Medical Res Council Multivalente og multispecifikke bindingsproteiner samt fremstilling og anvendelse af disse
EP0731842A1 (en) 1993-12-03 1996-09-18 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
AUPO591797A0 (en) 1997-03-27 1997-04-24 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation High avidity polyvalent and polyspecific reagents
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
AU2246597A (en) 1996-02-12 1997-08-28 Schering Corporation Mammalian dendritic cell chemokine reagents
DE19819846B4 (de) 1998-05-05 2016-11-24 Deutsches Krebsforschungszentrum Stiftung des öffentlichen Rechts Multivalente Antikörper-Konstrukte
US6818749B1 (en) 1998-10-31 2004-11-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Variants of humanized anti carcinoma monoclonal antibody cc49
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
WO2002006633A1 (en) 2000-07-18 2002-01-24 The Charles Machine Works, Inc. Remote control for a drilling machine
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
IL166244A0 (en) 2001-07-12 2006-01-15 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US6833441B2 (en) 2001-08-01 2004-12-21 Abmaxis, Inc. Compositions and methods for generating chimeric heteromultimers
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
TWI671403B (zh) 2005-03-31 2019-09-11 中外製藥股份有限公司 控制組裝之多肽的製造方法
ES2395969T3 (es) 2006-03-24 2013-02-18 Merck Patent Gmbh Dominios de proteínas heterodiméricas genéticamente modificados
EP2035456A1 (en) 2006-06-22 2009-03-18 Novo Nordisk A/S Production of bispecific antibodies
EP2139924B1 (en) 2007-03-29 2016-07-06 Genmab A/S Bispecific antibodies and methods for production thereof
JP4341704B2 (ja) 2007-07-12 2009-10-07 トヨタ自動車株式会社 ハイブリッド車両およびハイブリッド車両の制御方法
GB0718167D0 (en) * 2007-09-18 2007-10-31 Cancer Rec Tech Ltd Cancer marker and therapeutic target
US8748356B2 (en) 2007-10-19 2014-06-10 Janssen Biotech, Inc. Methods for use in human-adapting monoclonal antibodies
ES2564523T3 (es) 2007-12-19 2016-03-23 Janssen Biotech, Inc. Diseño y generación de bibliotecas de presentación en fago por pIX de novo humanas mediante fusión con pIX o pVII, vectores, anticuerpos y métodos
SI2235064T1 (sl) 2008-01-07 2016-04-29 Amgen Inc. Metoda za izdelavo heterodimernih molekul - protitelesa fc z uporabo elektrostatičnih usmerjevalnih učinkov
SI2274008T1 (sl) * 2008-03-27 2014-08-29 Zymogenetics, Inc. Sestavki in metode za zaviranje PDGFRBETA in VEGF-A
JP5646457B2 (ja) 2008-04-29 2014-12-24 アッヴィ・インコーポレイテッド 二重可変ドメイン免疫グロブリン及びその使用
WO2010045340A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Centocor Ortho Biotech Inc. Methods of humanizing and affinity-maturing antibodies
CN102459346B (zh) 2009-04-27 2016-10-26 昂考梅德药品有限公司 制造异源多聚体分子的方法
GB201005063D0 (en) 2010-03-25 2010-05-12 Ucb Pharma Sa Biological products
EP2496600A1 (en) * 2009-11-04 2012-09-12 Fabrus LLC Methods for affinity maturation-based antibody optimization
PL2506871T3 (pl) 2009-11-30 2017-03-31 Janssen Biotech, Inc Przeciwciała ze zmutowanymi regionami Fc i utraconymi funkcjami efektorowymi
US20110206672A1 (en) 2010-02-25 2011-08-25 Melvyn Little Antigen-Binding Molecule And Uses Thereof
PL2560993T3 (pl) 2010-04-20 2024-11-04 Genmab A/S Heterodimeryczne białka zawierające region FC przeciwciała i sposoby ich wytwarzania
CA2797981C (en) 2010-05-14 2019-04-23 Rinat Neuroscience Corporation Heterodimeric proteins and methods for producing and purifying them
EP2420253A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Leadartis, S.L. Engineering multifunctional and multivalent molecules with collagen XV trimerization domain
TW201215405A (en) * 2010-08-25 2012-04-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-18R1 and uses thereof
WO2012047584A2 (en) 2010-09-27 2012-04-12 Janssen Biotech, Inc. Macaca fascicularis ccl17
JP6126991B2 (ja) 2010-09-27 2017-05-10 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒトｉｉ型コラーゲンに結合する抗体
AU2011325833C1 (en) 2010-11-05 2017-07-13 Zymeworks Bc Inc. Stable heterodimeric antibody design with mutations in the Fc domain
JP6013915B2 (ja) * 2010-11-17 2016-10-25 中外製薬株式会社 血液凝固第ｖｉｉｉ因子の機能を代替する機能を有する多重特異性抗原結合分子
US8790651B2 (en) * 2011-07-21 2014-07-29 Zoetis Llc Interleukin-31 monoclonal antibody
US20130171659A1 (en) * 2011-12-28 2013-07-04 Abbott Japan Co., Ltd. Methods of prognosis and diagnosis of rheumatoid arthritis
MY192757A (en) * 2013-11-06 2022-09-07 Janssen Biotech Inc Anti-ccl17 antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
SI3065774T1 (sl) 2021-11-30
US20180171007A1 (en) 2018-06-21
CY1124445T1 (el) 2022-07-22
IL245488B (en) 2020-03-31
EP3065774A4 (en) 2017-06-21
IL245488A0 (en) 2016-06-30
HRP20211234T1 (hr) 2021-11-26
EP3466445A1 (en) 2019-04-10
PH12016500826A1 (en) 2016-06-13
ES2884255T3 (es) 2021-12-10
US9944697B2 (en) 2018-04-17
EP3065774B1 (en) 2021-05-26
AU2014346770B2 (en) 2020-05-21
CN105722531B (zh) 2020-03-06
BR112016010071A2 (pt) 2017-12-05
CL2016001081A1 (es) 2016-10-21
CR20160187A (es) 2016-08-04
EA201690942A1 (ru) 2016-09-30
DK3065774T3 (da) 2021-08-23
SMT202100473T1 (it) 2021-09-14
CA2929166A1 (en) 2015-05-14
US11414484B2 (en) 2022-08-16
KR20160077198A (ko) 2016-07-01
PT3065774T (pt) 2021-08-31
JP6556742B2 (ja) 2019-08-07
KR102331054B1 (ko) 2021-11-24
CA2929166C (en) 2023-08-22
PE20160856A1 (es) 2016-09-03
US20150125458A1 (en) 2015-05-07
US20210017267A1 (en) 2021-01-21
EA034655B1 (ru) 2020-03-03
MY192757A (en) 2022-09-07
HUE058272T2 (hu) 2022-07-28
EP3065774A1 (en) 2016-09-14
US20220348647A1 (en) 2022-11-03
PL3065774T3 (pl) 2021-12-13
LT3065774T (lt) 2021-09-10
CN105722531A (zh) 2016-06-29
SG11201603231XA (en) 2016-05-30
MX2016005982A (es) 2016-08-11
MA39090B2 (fr) 2021-10-29
WO2015069865A1 (en) 2015-05-14
NZ719506A (en) 2022-09-30
UA119973C2 (uk) 2019-09-10
MA39090A1 (fr) 2018-03-30
NZ758354A (en) 2022-09-30
US10829549B2 (en) 2020-11-10
DOP2016000105A (es) 2016-10-31
PH12016500826B1 (en) 2021-09-10
JP2016537024A (ja) 2016-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11414484B2 (en) Anti-CCL17 antibodies
US20260022166A1 (en) Antibody capable of binding to thymic stromal lymphopoietin and use therof
AU2017202610B2 (en) ST2L antagonists and methods of use
AU2014346770A1 (en) Anti-CCL17 antibodies
WO2015057906A1 (en) Cd200 receptor 1 agonists
KR20230015957A (ko) 이중특이적 항체 및 이의 용도
KR20230010691A (ko) St2 항원 결합 단백질
IL262111B2 (en) Monovalent inhibitors of hutnfr1 interaction
CN114846026A (zh) 对人il-13和il-17具有结合特异性的多特异性抗体
KR20230087552A (ko) Cd45를 다량체화하는 결합 분자
HK40005948A (en) Anti-ccl17 antibodies
RU2827946C1 (ru) Мультиспецифическое антитело со специфичностью связывания il-13 и il-17 человека
HK1227716A1 (en) Anti-ccl17 antibodies
HK1227716B (en) Anti-ccl17 antibodies
US12577309B2 (en) Anti-CSF1R molecules and use thereof
AU2023379451A1 (en) Anti-fgfr3 antibodies and antigen-binding fragments and methods of use thereof
HK40069078A (en) Multi-specific antibody with binding specificity for human il-13 and il-17