RS62375B1 - Čestice polimera i njihova upotreba - Google Patents

Čestice polimera i njihova upotreba

Info

Publication number
RS62375B1
RS62375B1 RS20211112A RSP20211112A RS62375B1 RS 62375 B1 RS62375 B1 RS 62375B1 RS 20211112 A RS20211112 A RS 20211112A RS P20211112 A RSP20211112 A RS P20211112A RS 62375 B1 RS62375 B1 RS 62375B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antigen
binding
binding domain
domain capable
rv3615c
Prior art date
Application number
RS20211112A
Other languages
English (en)
Inventor
Bernd Helmut Adam Rehm
Original Assignee
Polybatics Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53778236&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62375(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Polybatics Ltd filed Critical Polybatics Ltd
Publication of RS62375B1 publication Critical patent/RS62375B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/44—Oxidoreductases (1)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/45—Transferases (2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/51—Lyases (4)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0006—Skin tests, e.g. intradermal testing, test strips, delayed hypersensitivity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/35—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G01N2333/57—IFN-gamma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/26—Infectious diseases, e.g. generalised sepsis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na rekombinantne proteine i srodne konstrukte i metode, kao i na čestice polimera i njihovu upotrebu. Ovaj pronalazak se naročito odnosi na funkcionalizovane čestice polimera, procese proizvodnje i njihovu upotrebu u izazivanju imunolo škog odgovora i u dijagnostici ili lečenju tuberkuloze.
POZADINA PRONALASKA
[0002] Sledeće uključuje informacije koje su korisne za razumevanje ovog pronalaska. Ne priznaje se da bilo koja od ovde navedenih informacija predstavlja prethodno stanje tehnike ili da je relevantna za ovde opisane ili izume na koje se polaže pravo, niti da bilo koja publikacija ili dokument na koji se izričito ili implicitno poziva predstavlja prethodno stanje tehnike.
[0003] Poznato je da patogeni, uključujući intracelularne i ekstracelularne patogene, izazivaju brojne opasne bolesti kod ljudi, uključujući, na primer, tuberkulozu, hepatitis, grip, lepru, listeriozu, tifusnu groznicu, dizenteriju, kugu, upalu pluća, tifus, hlamidiju, bolest antraks i meningitis, između ostalog. Ovde su obuhvaćene i sposobnost generisanja snažnog ćelijski posredovanog imunološkog odgovora i humoralni odgovor, izazvan tradicionalnim strategijama vakcinacije.
[0004] Procenjuje se da tuberkuloza (TB), na primer, ubija preko 2 miliona ljudi svake godine. Sada šnje metode za lečenje ili prevenciju tuberkuloze dovode se u pitanje pojavom sojeva bakterija Mycobacterium tuberculosis rezistentnih na više lekova (Anderson, 2007; Mustafa, 2001). Tuberkuloza je takođe značajan problem u stočarstvu. Identifikaciju, lečenje ili prevenciju tuberkuloze komplikuje nedostupnost intracelularnih bakterija imunološkom sistemu domaćina.
[0005] Bilo bi poželjno razviti siguran, efikasan i tačan metod za identifikaciju pojedinaca koji su bili izloženi ili pate od tuberkuloze i koji prevazilazi mnoge nedostatke konvencionalnih dijagnosti čkih sistema. Nedostaci uključuju troškove i poteškoće u sprovođenju trenutnih dijagnostičkih testova, zajedno sa niskom osetljivošću/specifičnošću.
[0006] Postoji potreba za kompozicijama sposobnim da izazovu snažan imunološki odgovor koji je lako detektibilan, senzitivan i specifičan.
[0007] Svojstva polihidroksialkil karboksilata, posebno polihidroksi alkanoata (PHA) su ispitana za njihovu primenu u bioplastici, pored njihove upotrebe kao matriksa za transport lekova i drugih aktivnih agenasa u medicinskoj, farmaceutskoj i prehrambenoj industriji . Bioin ženjeringom PHA molekula, kompozicije i ekspresija PHA molekula se mogu manipulisati tako da odgovaraju određenoj funkciji.
[0008] Cilj ovog pronalaska je da obezbedi čestice polimera za upotrebu u dijagnostici tuberkuloze i identifikaciji bakterija koje izazivaju tuberkulozu, uključujući, na primer, imunološkim testovima, da obezbedi metode i kompozicije za izazivanje efikasnog imunolo škog odgovora kod subjekata kojima je to potrebno, ili bar da se javnosti pruži koristan izbor.
KRATAK REZIME
[0009] Pronalasci koji su ovde opisani i na koje se polaže pravo imaju mnogo atributa i realizacija uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji su izneti ili opisani ili na koje se upućuje u ovom kratkom rezimeu. Ne namerava se da bude sveobuhvatan i pronalasci koji su ovde opisani i na koje se polaže pravo nisu ograničeni ni karakteristikama ili neograničavajućim realizacijama navedenim u ovom kratkom rezimeu, koji je uključen samo radi ilustracije, a ne kao ograničavanje.
[0010] U prvom aspektu ovog pronalaska, obezbeđena je čestica polimerakoja sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida, pri čemu jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži
(A) protein koji formira čestice i dve ili više grupa koje sadrže.
a. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen,
b. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
c. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, i
d. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, ili
(B) protein koji formira čestice i tri ili više grupe koja sadrži
a. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
b. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
c. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen,
d. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, i
e. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen, ili
(C) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen, ili
(D) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen, pri čemu pomenuti fuzioni polipeptid ima najmanje oko 95% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEK ID BR: 10, ili
(E) protein koji formira čestice i
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen; i
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen; i
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, i
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, ili
(F) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen, Rv3615c antigen i Rv3020c antigen.
[0011] U jednom aspektu, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen. Na primer, jedan ili vi še fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen, pri čemu navedeni fuzioni polipeptid ima najmanje oko 95% identiteta sekvence u odnosu na aminokiselinsku sekvencu zavisnu od SEK ID BR: 10.
[0012] U jednom aspektu, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice i
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen; i
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen; i
iii. antigen Rv3615c ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, i
iv. antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen.
[0013] U jednom aspektu, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen, Rv3615c antigen i Rv3020c antigen.
[0014] U različitim realizacijama, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži Rv2346c antigen. U jednom primeru, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice i tri ili više grupa koje sadrže
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen.
[0015] U jednoj realizaciji, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen, Rv3615c antigen, Rv3020c antigen i Rv2346c antigen.
[0016] U jednoj realizaciji čestica polimera sadrži dva ili više različitih fuzionih polipeptida. U jednom aspektu, čestica polimera sadrži najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i dve ili više grupe koja sadrži
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c;
iv. Rv3020 antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c; i
v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv2346c; i najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i jednu ili više grupa koje sadrže vi. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
vii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
viii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
ix. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
x. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen.
[0017] U jednoj realizaciji, jedan ili više antigena iz grupe (vi) do (x) su različiti od dva ili više antigena grupe (i) do (v). U jednoj realizaciji, fuzioni polipeptid koji sadr ži jedan ili više antigena iz grupe (vi) do (x) je različit od fuzionog polipeptida koji sadrži dva ili više antigena iz grupe (i) do (v).
[0018] U jednoj realizaciji, čestica polimera sadrži najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i tri ili više grupa koje sadrže
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen; i
iv. antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c; i najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i antigen Rv2346c.
[0019] U jednoj realizaciji čestica polimera sadrži dva ili više različitih fuzionih polipeptida na površini čestice polimera.
[0020] U jednoj realizaciji čestica polimeradalje sadrži najmanje jednu supstancu vezanu za ili integrisanu u polimernu česticu, ili njihovu kombinaciju.
[0021] U jednoj realizaciji supstanca je antigen, ili adjuvans, ili imunostimulatorni molekul.
[0022] U jednoj realizaciji supstanca je vezana umrežavanjem.
[0023] U jednoj realizaciji, antigen ESAT6 sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 1. Na primer, ESAT6 antigen sadrži 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više ili 30 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 1. U jednoj posebno razmatranoj realizaciji, ESAT6 antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1.
[0024] U jednoj realizaciji, CFP10 antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2. Na primer, antigen CFP10 sadrži 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više ili 30 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2. U jednom posebno razmatranom aspektu, CFP10 antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 2.
[0025] U jednoj realizaciji, antigen Rv3615c sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 3. Na primer, antigen Rv3615c sadrži 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više ili 30 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 3. U jednom posebno razmatranom aspektu, antigen Rv3615c sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 3.
[0026] U jednoj realizaciji, antigen Rv3020c sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 4. Na primer, antigen Rv3020c sadrži 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više ili 30 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 4. U jednom posebno razmatranom aspektu, antigen Rv3020c sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4.
[0027] U jednoj realizaciji, antigen Rv2346c sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 5. Na primer, antigen Rv2346c sadrži 15 ili više, 20 ili više, 25 ili više ili 30 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 5. U jednoj posebno razmatranoj realizaciji, antigen Rv2346c sadrži aminokiselinsku sekvencu iz SEK ID BR: 5.
[0028] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na kompoziciju koja sadrži jednu ili više čestica polimera iz ovog pronalaska i farmaceutski prihvatljiv nosač.
[0029] U jednoj realizaciji, kompozicija sadrži jednu ili više čestica polimera koje sadrže jedan ili više fuzionih polipeptida, pri čemu jedan ili više fuzionih polipeptida sadrže protein koji formira čestice i dve ili više grupa koje sadrže
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, i
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen.
[0030] U jednoj realizaciji, kompozicija sadrži jednu ili više čestica polimera koje sadrže jedan ili više fuzionih polipeptida, pri čemu jedan ili više fuzionih polipeptida sadrže protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen.
[0031] U različitim realizacijama, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži Rv2346c antigen. U jednom primeru, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice i tri ili više grupe koja sadrži
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen.
[0032] U jednom aspektu, jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen, Rv3615c antigen, Rv3020c antigen i Rv2346c antigen.
[0033] U jednom aspektu, kompozicija sadrži dva ili više fuzionih polipeptida, pri čemu jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži protein koji formira čestice i dva ili više iz grupe koja sadrži
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c;
v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv2346c; i najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i jedno ili više iz grupe koju čini vi. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
vii. ili CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
viii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
ix. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
x. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen.
[0034] U jednoj realizaciji, fuzioni polipeptid koji sadrži jedan ili više antigena iz grupe (vi) do (x) se razlikuje od fuzionog polipeptida koji sadrži dva ili više antigena iz grupe (i) do (v).
[0035] U jednoj realizaciji, kompozicija sadrži dve ili više populacija čestica polimera, pri čemu jedna populacija čestica polimera sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida koji sadrže protein koji formira čestice i dve ili više grupa koje sadrže
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
v. Rv234c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen; i jedna populacija čestica polimera sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida koji sadrže protein koji formira čestice i jedan ili više iz grupe koju čini
vi. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
vii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
viii.Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
ix. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
x. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen;
pri čemu su fuzioni polipeptidi različiti jedan od drugog, na primer, pri čemu se jedan ili više fuzionih polipeptida prisutnih u jednoj populaciji čestica polimera razlikuje od jednog ili više fuzionih polipeptida prisutnih u drugoj populaciji čestica polimera.
[0036] U jednom primeru, raspored antigena se razlikuje između fuzionih polipeptida. U jednom aspektu, kompozicija antigena se razlikuje između fuzionih polipeptida.
[0037] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na kompoziciju čestica polimera, pri čemu se čestice polimera proizvode prema postupku iz pronalaska.
[0038] U različitim realizacijama, kompozicija je kompozicija vakcine. U različitim realizacijama, kompozicija vakcine dodatno sadrži jedan ili više adjuvansa ili imunostimulatornih molekula.
[0039] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na dijagnostički reagens koji sadrži jednu ili više čestica polimera prema pronalasku, ili koji sadrži kompoziciju čestica polimeraiz pronalaska.
[0040] U jednoj realizaciji, dijagnostički reagens je za topikalnu primenu.
[0041] U jednoj realizaciji, dijagnostički reagens je formulisan da obezbedi manje od 10 µg ukupnog antigena po dozi. Na primer, dijagnostički reagens sadrži manje od 9 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 8 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 7 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 6 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 5 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 4 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 3 µg ukupnog antigena po dozi, manje od 2 µg ukupnog antigena po dozi ili manje od 1 µg ukupnog antigena po dozi.
[0042] U jednom aspektu dijagnostički reagens je formulisan da obezbedi manje od 5 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi. Na primer, dijagnostički reagens sadrži manje od 5 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 4 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 3 µg jednog ili više prisutnih antigena po doze, manje od 2 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, ili manje od 1 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi.
[0043] U jednoj realizaciji, dijagnostički reagens je formulisan da obezbedi manje od 5 µg svakog prisutnog antigena po dozi. Na primer, dijagnostički reagens sadrži manje od 5 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 4 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 3 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 2 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 1 µg svakog prisutnog antigena po dozi.
[0044] U jednoj realizaciji dijagnostički reagens je formulisan da obezbedi manje od 0.9 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi. Na primer, dijagnostički reagens sadrži manje od 0.9 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.8 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.7 µg jednog ili više prisutnih antigena po doza, manje od 0.6 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.5 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.4 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.3 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, manje od 0.2 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, ili manje od 0.1 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi.
[0045] U posebno razmatranim realizacijama, dijagnostički reagens sadrži manje od 0.9 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.8 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.7 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.6 µg svaki prisutni antigen po dozi, manje od 0.5 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.4 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.3 µg svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 0.2 µg svakog prisutnog antigena po dozi, ili manje od 0.1 µg svakog prisutnog antigena po dozi.
[0046] Na primer, u jednom primeru izvođenja dijagnostički reagens sadrži 0.3 µg ESAT6 antigena, 0.3 µg antigena CFP10 i 0.3 µg antigena Rv3615c, po dozi.
[0047] U različitim realizacijama, dijagnostički reagens je za kontaktiranje uzorka dobijenog od subjekta.
[0048] U drugim realizacijama koje su posebno razmatrane, dijagnostički reagens je formulisan tako da obezbedi manje od 50 ng svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 40 ng svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 30 ng svakog prisutnog antigena po dozi, manje manje od 20 ng svakog prisutnog antigena po dozi, manje od 10 ng svakog prisutnog antigena po dozi, ili manje od 5 ng svakog prisutnog antigena po dozi. U drugim primerima, dijagnostički reagens je formulisan da obezbedi manje od 50 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 40 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 30 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 20 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 10 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 7.5 ng ukupnog antigena po dozi, manje od 6 ng ukupnog antigena po dozi, ili manje od 5 ng ukupnog antigena po dozi.
[0049] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na dijagnostički komplet koji sadrži kompoziciju čestica polimeraiz pronalaska i opciono uputstvo za upotrebu.
[0050] U jednoj realizaciji, kompozicija sadrži homogenu populaciju čestica polimera.
[0051] U jednoj realizaciji, kompozicija sadrži mešovitu populaciju čestica polimera.
[0052] U jednoj realizaciji, kompozicija dodatno sadrži jedno ili više od sledećeg:
jedan ili više antigena M. tuberculosis ili M. bovis,
jedan ili više vezujućih domena sposobnih za vezivanje jednog ili više antigena M. tuberculosis ili M. bovis,
jedan ili više adjuvansa, ili
jedan ili više imunomodulatornih agenasa ili molekula.
[0053] U jednom aspektu, otkriće se odnosi na metod dijagnostikovanja tuberkuloze kod subjekta, metoda koji obuhvata davanje subjektu efikasne količine od najmanje jedne čestice polimera iz pronalaska i detektovanje imunološkog odgovora kod subjekta, pri čemu prisustvo imunološkog odgovora ukazuje na tuberkulozu.
[0054] U jednom aspektu, otkriće se odnosi na metodu detektovanja M. tuberculosis ili M. bovis kod subjekta, metoda koji se sastoji u administriranju subjektu efikasne količine od najmanje jedne čestice polimera iz pronalaska, i detektovanju imunog odgovora kod subjekta, pri čemu je prisustvo imunološkog odgovora indikativno za tuberkulozu.
[0055] U jednom aspektu, administracija je topicalna, na primer, ubodom kroz kožu.
[0056] U različitim aspektima, efikasna količina najmanje jedne čestice polimera iz pronalaska je prisutna u dijagnostičkom reagensu kako je ovde opisano. Prema tome, u jednoj realizaciji, metoda obuhvata administriranje subjektu dijagnostičkog reagensa prema ovom pronalasku.
[0057] Na primer, u jednom aspektu, metoda obuhvata administriranje subjektu dijagnosti čkog reagensa iz ovog pronalaska, pri čemu dijagnostički reagens sadrži manje od 5 µg svakog prisutnog antigena po dozi, i otkrivanje imunološkog odgovora kod subjekta, pri čemu je prisustvo imunološkog odgovora indikacija za tuberkulozu.
[0058] U jednom aspektu, administracija je davanje dijagnostičkog reagensa iz ovog pronalaska, pri čemu dijagnostički reagens sadrži manje od 5 µg ukupnog antigena po dozi.
[0059] U jednom aspektu, administracija je davanje dijagnostičkog reagensa iz ovog pronalaska, pri čemu dijagnostički reagens sadrži manje od 1 µg svakog prisutnog antigena po dozi.
[0060] U jednom aspektu, administracija je davanje dijagnostičkog reagensa iz ovog pronalaska, pri čemu dijagnostički reagens sadrži manje od 0.5 µg svakog prisutnog antigena po dozi.
[0061] U jednom aspektu imunološki odgovor indikativan za tuberkulozu je odloženi tip reakcije hipersenzitivnosti.
[0062] U jednom aspektu, metoda je sposobna da pravi razliku između subjekta izloženog M. tuberculosis ili M. bovis ili obolelog od tuberkuloze, i subjekta imunizovanog protiv tuberkuloze, na primer sa BCG.
[0063] U različitim realizacijama, pozitivan kožni test je sledeći: (i) SICCT odgovor se smatra pozitivnim ako je promena u (Δ) debljini kože za PPD-B-PPD-A> 4 mm, ili (ii) > 2 mm (strict United Kingdom test); (iii) SIT odgovor se smatra pozitivnim ako je Δ debljina kože za PPD-B ≥4 mm; i (iv) odgovori za čestice polimera iz pronalaska se smatraju pozitivnim ako je Δ debljina kože > 1 mm.
[0064] Na primer, pozitivan kožni test sa dijagnostičkim reagensom prema ovom pronalasku ili metodi iz pronalaska, uključujući, na primer, metodu koja obuhvata primenu dijagnostičkog reagensa koji sadrži manje od 1 µg svakog prisutnog antigena po dozi, Δ debljina kože je ≥1 mm.
[0065] U jednoj realizaciji, pronalazak se odnosi na metodu otkrivanja M. tuberculosis ili M. bovis kod subjekta, pri čemu se metoda sastoji od
uzimanja uzorka od subjekta,
dovođenja u kontakt uzorka sa najmanje jednom česticom polimera iz pronalaska, i detektovanje odgovora koji ukazuje na prisustvo jednog ili više antigena M. tuberculosis u uzorku, pri čemu je odgovor koji je indikativan za prisustvo jednog ili više antigena M. tuberculosis ili M. bovis indikativan i za M. tuberculosis ili M. bovis kod subjekta.
[0066] U jednoj realizaciji, odgovor koji je indikativan za prisustvo jednog ili vi še M. tuberculosis ili M. bovis antigena je detektovanje prisustva antitela na M. tuberculosis ili M. bovis u navedenom uzorku.
[0067] U jednoj realizaciji, odgovor koji je indikativan za prisustvo jednog ili vi še M. tuberculosis ili M. bovis antigena je otkrivanje prisustva imunske ćelije koja je responsivna na M. tuberculosis ili M. bovis u navedenom uzorku.
[0068] U jednoj realizaciji detekcija je imunotestom.
[0069] U jednoj realizaciji detekcija se vrši pomoću ELISA testa, radioimunološkog testa ili Western Blot-a.
[0070] U jednoj realizaciji, detekcija je citokinskim testom. U jednoj realizaciji, detekcija je detekcija interferona-gama.
[0071] U jednoj realizaciji, prisustvo imunske ćelije koja je responsivna na Micobacterium tuberculosis ili M. bovis se detektuje testom proliferacije ćelija, testom sortiranja ćelija uključujući FACS, ili testom in situ hibridizacije.
[0072] U jednom aspektu, metoda se odnosi na metodu imunizacije subjekta protiv tuberkuloze, pri čemu se metoda sastoji u administriranju subjektu kome je to potrebno, efikasne koli čine od najmanje jedne čestice polimera iz pronalaska.
[0073] U drugom aspektu, predstavljeno otkriće obezbeđuje metodu za proizvodnju čestica polimera, koja se sastoji od obezbeđivanja ćelije domaćina koja sadrži najmanje jedan konstrukt ekspresije, najmanje jedan ekspresioni konstrukt koji sadrži:
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira formiranje čestica proteina; i dve ili više sekvenci nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ES AT6 antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban za vezivanje antigena CFP10, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3615c i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposobna da veže antigen Rv3615c, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3020c i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c;
održavanje ćelije domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju ekspresionog konstrukta; i separaciju čestica polimera od ćelija domaćina.
[0074] U jednoj realizaciji, najmanje jedan ekspresioni konstrukt sadrži: najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice; i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže ESAT6 antigen; i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže CFP10 antigen; i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Rv3615c antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c.
[0075] U jednoj realizaciji, najmanje jedan ekspresioni konstrukt sadrži
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Rv3615c antigen.
[0076] U jednoj realizaciji, najmanje jedan ekspresioni konstrukt sadrži
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Rv3615c antigen; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Rv3020c antigen.
[0077] U jednoj realizaciji protein koji formira čestice je sintaza polimer.
[0078] U jednoj realizaciji ekspresioni konstrukt je u vektoru sa velikim brojem kopija.
[0079] U jednoj realizaciji, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, je operativno povezana sa jakim promoterom.
[0080] U jednoj realizaciji, snažni promoter je virusni promoter ili promoter faga.
[0081] U jednoj realizaciji promoter je promoter faga, na primer T7 fag promoter.
[0082] U jednoj realizaciji ćelija domaćin se održava u prisustvu supstrata polimer sintaze, poželjno supstrata polimer sintaze kada je prisutan ili smeše supstrata, uključujući monomerni supstrat, ili prekursor supstrata koji može biti metabolisan pomoću ćelije domaćina da se formira supstrat proteina koji formira čestice.
[0083] U jednoj realizaciji ćelija domaćin sadrži najmanje dva različita ekspresiona konstrukta.
[0084] U nekim realizacijama u kojima ćelija domaćin sadrži najmanje dva različita ekspresiona konstrukta, najmanje jedan od ekspresionih konstrukata je izabran iz grupe koju čine:
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, i najmanje jedan antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFP10 i Rv3615c, ili ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, i vezujući domen sposoban da veže najmanje jedan antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c, ili
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira adjuvans.
[0085] U drugim realizacijama u kojima ćelija domaćin sadrži najmanje dva različita ekspresiona konstrukta, jedan od ekspresionih konstrukata je izabran iz grupe koju čine:
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, ili
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, ili
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji određuje veličinu čestica, ili
ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira regulator polimera.
[0086] U jednoj realizaciji ćelija domaćin sadrži mešovitu populaciju ekspresionih konstrukata gde svaki ekspresioni konstrukt sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni polipeptid, fuzioni polipeptid sadrži:
najmanje jedan protein koji formira čestice, ili
najmanje jedan antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO, Rv3615c i Rv3020c, ili najmanje jedan vezujući domen sposoban da veže najmanje jedan antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO, Rv3615c i Rv3020c.
[0087] U različitim realizacijama, fuzioni polipeptid sadrži dva ili više antigena izabrana iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO i Rv3615c, na primer fuzioni polipeptid sadrži svaki od antigena iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO i Rv3615c.
[0088] U različitim realizacijama, fuzioni polipeptid sadrži dva ili više antigena izabrana iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO, Rv3615c i Rv3020c, na primer fuzioni polipeptid sadrži svaki od antigena iz grupe koju čine ESAT6, CFPIO, Rv3615c, i Rv3020c.
[0089] Drugi aspekt ovog otkrića se odnosi na izolovanu nukleinsku kiselinu ili ekspresioni konstrukt, izolovanu nukleinsku kiselinu ili ekspresioni konstrukt koji sadrži:
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji stvara čestice; i dve ili više sekvenci nukleinske kiseline izabrane iz grupe koju čine sekvenca nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže ESAT6 antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira CFPIO antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže CFPIO antigen, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3615c, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže antigen Rv3615c, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3020c i sekvenca nukleinske kiseline koja kodira vezuju ć i domen sposoban da veže antigen Rv3020c.
[0090] U jednoj realizaciji, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice i dve ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju antigen(e) ili vezujuće domen(e) su prisutne kao jedan otvoreni okvir čitanja.
[0091] U jednoj realizaciji, najmanje jedna sekvenca nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice je operativno povezana sa jakim promoterom.
[0092] U različitim realizacijama, najmanje jedna nukleinska kiselina sadrži 20 ili više susednih nukleinskih kiselina izabranih iz jedne od SEK ID BR: 11 - 21. Izolovane sekvence nukleinskih kiselina koje sadrže 20 ili više susednih nukleinskih kiselina izabranih iz jedne od SEK ID BR: 11-15, uključujući sekvence koje kodiraju dva ili više antigena i protein koji formira čestice su posebno razmatrane.
[0093] U jednoj realizaciji, najmanje jedna nukleinska kiselina sadrži sekvencu nukleinske kiseline jedne od sekvenci SEK ID BR: 11-21 iz ovog teksta.
[0094] Probe ili prajmeri koji sadrže 20 ili više susednih nukleinskih kiselina jedne od sekvenci SEK ID BR: 11 - 15, naročito probe ili prajmeri koji sadrže sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju dva ili više antigena i protein koji formira čestice su posebno razmatrani.
[0095] U jednoj realizaciji, ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dodatni polipeptid.
[0096] U jednoj realizaciji, ekspresioni konstrukt sadrži:
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira fuzioni polipeptid koji sadr ži protein koji formira čestice, i najmanje jedan vezujući domen sposoban da veže antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c; i
najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dodatni polipeptid koji vezuje vezuju ći domen sposoban da veže antigen izabran iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c.
[0097] U jednoj realizaciji, dodatni polipeptid je fuzioni polipeptid koji sadr ži protein koji formira čestice, i najmanje jedan antigen M. tuberculosis ili M. bovis.
[0098] U jednoj realizaciji, konstrukt dodatno sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira
i. najmanje jednu tiolazu, ili
ii. najmanje jedna reduktaza, ili
iii. i (i) i (ii).
[0099] U jednoj realizaciji, konstrukt sadrži nukleinsku kiselinu koja kodira
i. najmanje jednu tiolazu,
ii. najmanje jednu reduktazu,
iii. najmanje jednu polimer sintazu;
iv. najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen, ili
v. najmanje jedan vezujući domen sposoban da veže najmanje jedan antigen M. tuberculosis ili M. bovis,
vi. fuzioni protein koji sadrži jedno ili više od gore navedenog i) do v),
vii. bilo koju kombinaciju gore navedenog i) do vi).
[0100] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na vektor koji sadrži ekspresioni konstrukt iz pronalaska.
[0101] U jednoj realizaciji vektor je vektor sa velikim brojem kopija.
[0102] U jednoj realizaciji vektor je vektor sa malim brojem kopija.
[0103] Drugi aspekt ovog pronalaska se odnosi na ćeliju domaćina koja sadrži ekspresioni konstrukt ili vektor kako je gore definisano.
[0104] U jednoj realizaciji ćelija domaćin sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže ESAT6 antigen, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže CFP10 antigen, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c.
[0105] U drugoj realizaciji ćelija domaćin sadrži ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže ESAT6 antigen i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezuju ći domen sposoban da veže CFP10 antigen, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira Rv3615c antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c, i najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen Rv3020c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c.
[0106] Bilo koja od ovde opisanih realizacija, uključujući i one koje slede, mogu se odnositi na bilo koji od aspekata koji su ovde opisani.
[0107] U različitim realizacijama, protein koji formira čestice je polimer sintaza.
[0108] U različitim realizacijama, čestica polimera sadrži polimer izabran između poli-betaaminokiselina, polilaktata, polioestra i poliestara. Najpoželjnije je da polimer sadrži polihidroksialkanoat (PHA), poželjno poli(3-hidroksibutirat) (PHB).
[0109] U različitim realizacijama, čestica polimera sadrži česticu polimera inkapsuliranu fosfolipidnim monoslojem.
[0110] U različitim realizacijama, čestica polimera sadrži dva ili više različitih fuzionih polipeptida.
[0111] U različitim realizacijama, čestica polimera sadrži dva ili više različitih fuzionih polipeptida na površini čestice polimera.
[0112] U različitim realizacijama, čestica polimera sadrži tri ili više različitih fuzionih polipeptida, kao što su tri ili više različitih fuzionih polipeptida na površini čestice polimera.
[0113] U različitim realizacijama, čestica polimeradalje sadrži najmanje jednu supstancu vezanu za ili integrisanu u polimernu česticu, ili njihovu kombinaciju.
[0114] U različitim realizacijama, supstanca je antigen, adjuvans ili imunostimulatorni molekul.
[0115] U različitim realizacijama, supstanca je vezana za polimernu česticu umrežavanjem.
[0116] U različitim realizacijama, polimer sintaza je vezana za polimernu česticu ili za fosfolipidni monosloj ili je vezana za oboje.
[0117] U različitim realizacijama, polimer sintaza je kovalentno ili nekovalentno vezana za polimernu česticu koju formira.
[0118] U različitim realizacijama polimer sintaza je PHA sintaza iz klase 1 rodova Acinetobacter, Vibrio, Aeromonas, Chromobacterium, Pseudomonas, Zoogloea, Alcaligenes, Delftia, Burkholderia, Ralstonia, Rhodococcus, Gordonia, Rhodobacter, Rhodobacter, Rhodobacter, Metilobakterija, Azorhizobium, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Rickettsia, Crenarchaeota, Sinechocistis, Ectothiorhodospira, Thiocapsa, Thiocistis i Allochromatium, rodova klase 2 Burkholderia i Pseudomonas ili rodova klase 4 Bacillus, poželjnije iz grupe koju čine klasa 1 Acinetobacter sp. RA3849, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemoliticus, Aeromonas punctata FA440, Aeromonas hidrophila, Chromobacterium violaceum, Pseudomonas sp. 61-3, Zoogloea ramigera, Alcaligenes latus, Alcaligenes sp. SH-69, Delftia acidovorans, Burkholderia sp. DSMZ9242, Ralstonia eutrophia H16, Burkholderia cepacia, Rhodococcus rubber PP2, Gordonia rubripertinctus, Rickettsia provazekii, Sinechocistis sp. PCC6803, Ectothiorhodospira shaposhnikovii N1, Thiocapsa pfennigii 9111, Allochromatium vinosum D, Thiocistis violacea 2311, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Caulobacterus caresbacus, Sinorhizobium meliloti 41, Rhodospirillum rubrum HA i Rhodospirillum rubrum ATCC25903, klase 2 Burkholderia cariophilli, Pseudomonas chloraphis, Pseudomonas sp. 61-3, Pseudomonas putida U, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas pseudolcaligenes, Pseudomonas putida BM01, Pseudomonas nitroreducins, Pseudomonas chloraphis, i klasa 4 Bacillus megaterium i Bacillus sp. INT005.
[0119] U drugim rešenjima, polimerna sintaza je PHA polimerna sintaza iz gram-negativnih i grampozitivnih eubakterija, ili iz arheja.
[0120] U različitim primerima, polimerna sintaza može sadržati PHA polimer sintazu iz C. necator, P. aeruginosa, A. vinosum, B. megaterium, H. marismortui, P. aureofaciens ili P. putida, koje imaju pristupne brojeve AY836680, AE004091, AB205104, AF109909, YP137339, AB049413 i AF150670, respektivno.
[0121] Druge polimerne sintaze koje se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju polimerne sintaze, od kojih je svaka identifikovana svojim pristupnim brojem, iz sledećih organizama: R. eutropha (A34341), T. pfennigii (X93599), A. punctata (032472), Pseudomonas sp. 61-3 (AB014757 i AB014758), R. sphaeroides (AAA72004), C. violaceum (AAC69615), A. borkumensis SK2 (CAL17662), A. borkumensis SK2 (CAL16866), R. sphaeroides KD131 (ACM01571 i YP002526072), R. opacus B4 (BAH51880 i YP002780825), B. multivorans ATCC 17616 (YP001946215 i BAG43679), A. borkumensis SK2 (YP693934 i YP693138), R. rubrum (AAD53179), gamma proteobacterium HTCC5015 (ZP05061661 i EDY86606), Azoarcus sp. BH72 (YP932525), C. violaceum ATCC 12472 (NP902459), Limnobacter sp. MED105 (ZP01915838 i EDM82867), M. algicola DG893 (ZP01895922 i EDM46004), R. sphaeroides (CAA65833), C. violaceum ATCC 12472 (AAQ60457), A. latus (AAD10274, AAD01209 i AAC83658), S. maltophilia K279a (CAQ46418 i YP001972712), R. solanacearum IPO1609 (CAQ59975 i YP002258080), B. multivorans ATCC 17616 (YP001941448 i BAG47458), Pseudomonas sp. g113 (ACJ02400), Pseudomonas sp. g106 (ACJ02399), Pseudomonas sp. g101 (ACJ02398), R. sp. gl32 (ACJ02397), R. leguminosarum bv. viciae 3841 (CAK10329 i YP770390), Azoarcus sp. BH72 (CAL93638), Pseudomonas sp. LDC-5 (AAV36510), L. nitroferrum 2002 (ZP03698179), Thauera sp. MZ1T (YP002890098 i ACR01721), M. radiotolerans JCM 2831 (YP001755078 i ACB24395), Methylobacterium sp. 4-46 (YP001767769 i ACA15335), L. nitroferrum 2002 (EEG08921), P. denitrificans (BAA77257), M. gryphiswaldense (ABG23018), Pseudomonas sp. USM4-55 (ABX64435 i ABX64434), A. hydrophila (AAT77261 and AAT77258), Bacillus sp. INT005 (BAC45232 i BAC45230), P. putida (AAM63409 i AAM63407), G. rubripertinctus (AAB94058), B. megaterium (AAD05260), D. acidovorans (BAA33155), P. seriniphilus (ACM68662), Pseudomonas sp. 14-3 (CAK18904), Pseudomonas sp. LDC-5 (AAX18690), Pseudomonas sp. PC17 (ABV25706), Pseudomonas sp. 3Y2 (AAV35431, AAV35429 i AAV35426), P. mendocina (AAM10546 i AAM10544), P. nitroreducens (AAK19608), P. pseudoalcaligenes (AAK19605), P. resinovorans (AAD26367 i AAD26365), Pseudomonas sp. USM7-7 (ACM90523 i ACM90522), P. fluorescens (AAP58480) i ostale ne kultivisane bakterije (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE0286, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 i BAE06852).
[0122] U različitim realizacijama, polimerna sintaza se može koristiti za in vitro proizvodnju čestica polimera polimerizacijom ili olakšavanje polimerizacije supstrata (R)-Hidroksiacil-CoA ili drugog CoA tioestra ili njegovih derivata.
[0123] U različitim aspektima supstrat ili smeša supstrata sadrže najmanje jednu opciono supstituisanu aminokiselinu, laktat, estar ili zasićenu ili nezasićenu masnu kiselinu, poželjno acetil-CoA.
[0124] U različitim realizacijama, ekspresioni konstrukt je u vektoru sa velikim brojem kopija.
[0125] U različitim realizacijama, ekspresioni konstrukt sadrži najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira dodatni polipeptid.
[0126] U različitim realizacijama sekvenca nukleinske kiseline koja kodira fuzioni polipeptid sadr ži: sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban za vezivanje ESAT6 antigena, ili koja kodira antigen CFP10 ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže CFP10 antigen, ili koju kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili koju kodira antigen Rv3020c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji mo že da veže Rv3020c antigen, susednu sa 5 'ili 3' krajem sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu, ili
sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da ve že CFP10 antigen, ili koja kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili koja kodira antigen Rv3020c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen koji može da veže Rv3020c antigen, indirektno fuzionisanu sa 5 'ili 3' krajem sekvence nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu, preko polinukleotidne linker ili spejser sekvence željene dužine; ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jednu sekvencu ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili koja kodira antigen CFP10 ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji može da veže antigen CFP10, ili koja kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili koja kodira Rv3020c antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže antigen Rv3020c, koji je umetnut u sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu, opciono preko polinukleotidnog linker ili spejser sekvence željene dužine; ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira mesto cepanja proteaze raspoređenu između sekvence nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji može da veže ESAT6 antigen, ili koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da veže CFP10 antigen ili koja kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji može da veže antigen Rv3615c, ili koja kodira antigen Rv3020c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji može da veže antigen Rv3020c, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu; ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira element za samo-splajsovanje raspoređenu između sekvence nukleinske kiseline koja kodira ESAT6 antigen ili najmanje jedne sekvence nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen koji može da veže ESAT6 antigen, ili koja kodira CFP10 antigen ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban za vezivanje antigena CFP10, ili koja kodira antigen Rv3615c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujući domen koji može da veže antigen Rv3615c, ili koja kodira antigen Rv3020c ili najmanje jednu sekvencu nukleinske kiseline koja kodira vezujuć i domen sposoban da ve že Rv3020c antigen, i sekvencu nukleinske kiseline koja kodira protein koji stvara čestice, poželjno polimer sintazu; ili bilo koju kombinaciju dva ili više njih.
[0127] U različitim realizacijama, najmanje jedan fuzioni polipeptid sadr ži:
aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili CFP10 antigen ili vezujući domen koji može da veže CFP10 antigen, ili antigen Rv3615c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, susedan sa N- ili C-terminalnim krajem aminokiselinske sekvence koja sadrži protein za formiranje čestica, poželjno polimerne sintaze; ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen, ili Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c , ili antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, indirektno fuzionisan sa N- ili C-krajem aminokiselinske sekvence koja sadr ži protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu, preko peptidne linker ili spejser sekvence željene dužine; ili
aminokiselinsku sekvencu koja sadrži ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen, ili Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, ili antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, koji je umetnut u aminokiselinsku sekvencu koja sadrži protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu, preko peptidne linker ili spejser sekvence željene dužine; ili
aminokiselinsku sekvencu koja sadrži mesto cepanja proteaze između aminokiselinske sekvence koja sadrži ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili CFP10 antigen ili vezujući domen koji može da veže CFP10 antigen, ili Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, i aminokiselinske sekvence koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu; ili aminokiselinsku sekvencu koja sadrži samo-splajsujući element između aminokiselinske sekvence koja sadrži ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, ili CFP10 antigen ili vezujući domen koji može da veže CFP10 antigen, ili antigen Rv3615c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c, ili antigen Rv3020c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, i aminokiselinske sekvence koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu; ili bilo koju kombinaciju dve ili više njih.
[0128] U određenim realizacijama, kao što su one koje su ovde date kao primeri, jedna ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže ESAT6, CFP10, Rv3615c ili Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c antigen je N-terminalna za aminokiselinsku sekvencu koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu i jednu ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže ESAT6, CFP10, Rv3615c ili Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6, CFP10, Rv3615c, a Rv3020c antigen je C-terminalni za aminokiselinsku sekvencu koja kodira protein koji formira čestice, poželjno polimernu sintazu.
[0129] U različitim realizacijama, ekspresioni konstrukt sadrži konstitutivni ili regulabilni sistem promotera.
[0130] U različitim realizacijama, sistem promotera koji se može regulisati je indukcioni ili represivni sistem promotera.
[0131] U različitim realizacijama, sistem regulatora koji se može regulisati je izabran od LacI, Trp, faga γ i RNK faga polimeraze.
[0132] U jednoj realizaciji promoter je bilo koji snažan promoter poznat stručnjacima u ovoj oblasti. Pogodni jaki promoteri obuhvataju adenovirusne promotere, kao što je adenovirusni glavni kasni promoter; ili heterologni promoteri, kao što je promoter citomegalovirusa (CMV); promoter respiratornog sincicijalnog virusa (RSV); promoter simian virusa 40 (SV40); inducibilni promoterie, kao što je MMT promoter, metalotionein promoter; promoteri toplotnog šoka; promoter albumina; apoAI promoter; promoteri humanog globina; promoteri virusne timidin kinaze, kao što je promoter timidin kinaze Herpes simpleksa; retrovirusni LTR; promoter b-aktina; promoteri humanog hormona rasta; fag promoteri kao što su promoteri T7, SP6 i T3 RNK polimeraze i promoter mozaika karfiola 35S (CaMV 35S).
[0133] U različitim realizacijama, promoter je promoter T7 RNK polimeraze, kao što je promoter T7 RNK polimeraze, kako je opisano u PCT/NZ2006/000251, objavljenom kao WO 2007/037706.
[0134] U različitim realizacijama ćelija sadrži dva ili više različitih ekspresionih konstrukta od kojih svaki kodira različiti fuzioni polipeptid.
[0135] U različitim realizacijama, antigen sposoban da izazove ćelijski imunološki odgovor je antigen izveden iz intraćelijskog patogena.
[0136] U različitim realizacijama, vezujući domen sposoban da veže antigen koji može da izazove imunološki odgovor, kao što je vezujući domen sposoban da veže antigen koji može da izazove ćelijskiposredovan imunološki odgovor je izabran od proteina, fragmenta proteina, vezujućeg domena, domena koji se vezuje za metu, vezujućeg proteina, fragmenta vezujućeg proteina, antitela, fragmenta antitela, teškog lanca antitela, lakog lanca antitela, jednolančanog antitela, jednodomenskog antitela (na primer VHH), Fab fragmenta antitela, Fc fragmenta antitela, Fv fragmenta antitela, F(ab')2 fragmenta antitela, Fab'fragmenta antitela, Fv (scFv) fragmenta antitela sa jednim lancem, receptora T-ćelija, molekula MHC Klase I, molekula MHC Klase II ili njihovih kombinacija.
[0137] Na primer, u različitim realizacijama, antigen-vezujući domen M. tuberculosis ili M. bovis je izabran od proteina, fragmenta proteina, vezujućeg domena, domena koji se vezuje za metu, vezujućeg proteina, fragmenta vezujućeg proteina, antitela, fragmenta antitela, te škog lanca antitela, lakog lanca antitela, jednolančanog antitela, jednodomenskog antitela (na primer VHH), Fab fragmenta antitela, Fc fragmenta antitela, Fv fragmenta antitela, F(ab')2 fragmenta antitela, Fab'fragmenta antitela, Fv (scFv) fragmenta jednolančanog antitela, T-ćelijskog receptora, molekula MHC Klase I, molekula MHC Klase II ili njihovih kombinacija.
[0138] U različitim realizacijama, imunološki odgovor je ćelijski posredovani imunološki odgovor, kao što je onaj koji ukazuje na IFN-γ odgovor, u odsustvu značajnog IgA odgovora, ili u odsustvu značajnog IgE odgovora, ili u odsustvu značajnog IgG odgovora, uključujući odsustvo značajnog IgG1 odgovora, ili odsustvo značajnog IgG2 odgovora, ili u odsustvu značajnog IgM odgovora.
[0139] U drugom primeru, imunološki odgovor je humoralni odgovor bez značajnog ćelijskiposredovanog odgovora.
[0140] Namera je da pozivanje na opseg brojeva koji su ovde navedeni (na primer, 1 do 10) tako đe uključuje sve racionalne brojeve u tom opsegu (na primer, 1, 1.1, 2, 3, 3.9, 4, 5, 6, 6.5, 7, 8, 9 i 10), kao i bilo koji opseg racionalnih brojeva unutar tog opsega (na primer, 2 do 8, 1.5 do 5.5 i 3.1 do 4.7), i prema tome, svi podopsezi svih opsega koji su ovde izričito navedeni ovim se izričito navode. Ovo su samo primeri onoga što je posebno nameravano, a sve moguće kombinacije numeričkih vrednosti između najniže vrijednosti i najveće navedene vrednosti treba smatrati izričito navedenim u ovoj prijavi na sličan način.
[0141] U ovoj specifikaciji, kada se upućuje na patentne specifikacije, druge spoljne dokumente ili druge izvore informacija, ovo je generalno u svrhu pružanja konteksta za diskusiju o karakteristikama pronalaska. Osim ako nije drugačije naznačeno, pozivanje na takve spoljne dokumente ne treba tumačiti kao priznanje da takvi dokumenti ili takvi izvori informacija, u bilo kojoj jurisdikciji predstavljaju stanje tehnike ili da su deo opšteg znanja u ovoj oblasti.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0142] Dalji aspekti ovog pronalaska će postati jasni iz sledećeg opisa koji je dat samo kao primer i uz pozivanje na priložene crteže.
Slika 1 je šematski prikaz hibridnih gena čiji su fuzioni proteini posredovali produkciju poliestarskih čestica koje ispoljavaju TB antigene.
Slika 2 prikazuje mikrofotografije fluorescentne mikroskopije rekombinantnog E.coli BL21 (DE3), koji sadrži pMCS69 i različite fuzione proteine koji kodiraju ekspresione vektore pET obojene Nil crvenom bojom. (A) pET-14b phaC; (B) pET-14b cfp10-phaC; (C) pET-14b rv3615c-phaC; (D) pET-14b esat6-phaC; (E) pET-14b cfp10-rv3615c-phaC-esat6.
Slika 3 prikazuje TEM analizu rekombinantne E. coli koja sadrži različite plazmide (AE) i izolovanih čestice poliestara koje pokazuju mikobakterijske antigene (F-J). (A i F) pET-14b phaC; (B i G) pET-14b cfp10-phaC; (C i H) pET-14b rv3615c-phaC, (D i I) pET-14b esat6-phaC; (E i J) pET-14b cfp10-rv3615c-phaC-esat6.
Slika 4 prikazuje proteinske profile čestica poliestara izolovanih iz rekombinantne E. coli koja sadrži različite plazmide sa i bez tretmana inhibitorom proteaze. Fuzioni proteini u frakcijama poliestarskih kuglica su analizirani pomoću SDS-PAGE na sledeći način: Trake 1-6, uzorci bez tretmana inhibitorom proteaze i Trake 7-10 sa tretmanom inhibitora proteaze. Trake 1 i 7, marker molekulske težine (Mark 12, Invitrogen); Trake 2 i 8, PhaC (VT, 63 kDa); Traka 3, Rv3615c-PhaC (75,2 kDa); Traka 4, ESAT6-PhaC (74.3 kDa); Trake 5 i 9, CFP10-PhaC (75.2 kDa); Trake 6 i 10, CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 (98.1 kDa). Prisustvo fuzionih proteina PhaC-TB antigena je potvrđeno uzimanjem otiska prsta triptičkog peptida pomoću MALDI-TOF/MS (Tabela 3).
Slika 5 je model poliestarske čestice koja ispoljava trostruki TB antigen iz ovog pronalaska proizveden pomoću rekombinantne E. coli.
Slika 6 je grafi
ki prikaz procene reaktivnosti TB antigena in vitro. ELISA test je opisan u delu Materijali i metode. Sva merenja su sprovedena u triplikatu. Prosečna reaktivnost TB antigena na specifično antitelo je navedena vrednost ± SD.
(A) Reaktivnost TB antigena na površini čestica poliestara. WT (čestice) je negativna kontrola. Rekombinantni TB antigeni (CFP10, Rv3615c, ESAT6 i smeša CFP10, Rv3615c i ESAT6) su korišćeni kao pozitivne kontrole. Ispitni uzorci su imobilizovani antigeni tuberkuloze (kuglica-CFPIO, kuglica-Rv3615c, kuglicaESAT6 i kuglica-CFP10-Rv3615c-ESAT6). Anti-CFPIO i anti-ESAT6 su mišja monoklonska antitela, a poliklonsko antitelo anti-RV3615C je proizvedeno kod zeca.* značajno veće od pojedinačnog antigena (P <0.05) ;(B) Kontrolni eksperiment; zečji preimunski serum je korišćen da zameni tri specifična antitela kao što je prikazano na Slici B. ;(C) Unakrsna reaktivnost specifičnih antitela sa druga dva TB antigena. Ukupna koncentracija proteina kontrolnih čestica, čestica TB antigena i slobodnih rekombinantnih antigena na ovoj slici je bila 1 mg/ml, 1 mg/ml i 0.125 mg/ml, respektivno.* Značajno veća od svih ostalih čestica (P <0.05)
Slika 7 je grafički prikaz odgovora na TB kožni test. Četiri dijagnostička reagensa, ptičje PPD (PPD-A), goveđe PPD (PPD-B), čestice koje pokazuju tri TB antigena i kontrolne čestice su korišćene za testiranje kože goveda. Rezultat je bio pozitivan ako je povećanje debljine kože ≥ 1 mm. (A) Goveda eksperimentalno zaražena M. bovis. (B) Neinficirana goveda koja su prirodno izložena ekološkim mikobakterijama. Traka označava medijanu.
Slika 8 je grafi
ki prikaz konstrukcije plazmida koji kodira česticu 4 antigen polimera prema pronalasku, pET-14b cfp10-linker-rv3615c-phaC-linker-esat6-linker-rv3020c, kako je ovde opisano u Primeru 2.
Slika 9 prikazuje Coomassie brilliant blue-bojenu SDS-PAGE analizu (LifeTechnologies Bolt 10% Bis-Tris, 165V x 35 minuta) različitih uzoraka iz pripreme i prečišćavanja čestica polimera 4-antigena opisanih ovde u Primeru 2, kako sledi: Traka 1- Marker; Traka 2 - Lizat; Traka 3 - pranje Deterdžentom 1 (DV1); Traka 4 - DV2; Traka 5 - Kaustično Pranje; Traka 6 - Pre tangencijalna protočna filtracija (Pre TFF); Traka 7 - Post TFF 1; Traka 8 - Post TFF 2; Traka 9 - kraj TFF-a; Traka 10 - Sirovi Produkt.
Slika 10 je grafički prikaz podataka medijana debljine kože (mm) u odgovoru na dozu kod šest subjekata, kako je opisano ovde u Primeru 3. Goveda - PPDB kontrola, Avijarna - PPDA kontrola, BB - nerazblažene tetravalentne čestice polimera koje sadrže antigen TB (TTPP), 3 µg - TTPP obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, 3 µg - TTPP obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, 3 µg - TTPP obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, 1 µg - TTPP obezbeđuje 1 µg ukupnih antigena, 0.33 µg - TTPP obezbeđuje 0.33 µg ukupnih antigena, 0.11 µg - TTPP obezbeđuje 0.11 µg ukupnih antigena, 0.4 µg - TTPP obezbeđuje 0.4 µg ukupnih antigena, 0.1 µg - TTPP obezbeđuje 0.1 µg ukupnih antigena. Slika 11 je grafički prikaz podataka o srednjoj vrednosti i medijanu debljine kože (mm) odgovora kod šest subjekata u testu delovanja formulacije, kao što je ovde opisano u Primeru 3. Goveda -kontrola PPDB, Avijarna - PPDA kontrola, Cl -TTPP u PBS/dextran koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, C2 -TTPP u PBS/Dextran koji obezbeđuje 0.11 µg ukupnih antigena, C3 -TTPP u PBS/ Dextran koji obezbeđuje 0.012 µg ukupnih antigena, C4 -TTPP u 2% etanolu koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, C5 -TTPP u 2% etanolu koji obezbeđuje 0.11 µg ukupnih antigena, C6 -TTPP u 2% etanolu koji obezbeđuje 0.012 µg ukupnih antigena, C7 -TTPP u 10 mM Tris (pH 8.5) koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, C8 -TTPP u 10 mM Tris (pH 8.5) koji obezbeđuje 0.11 µg ukupnih antigena, C9 -TTPP u 10 mM Tris (pH 8.5) koji obezbeđuje 0.012 µg ukupnih antigena.
Slika 12 je grafički prikaz podataka medijana debljine kože (mm) odgovora kod šest subjekata koji testiraju stabilnost i agregaciju, kako je opisano ovde u Primeru 3. Goveda - kontrola PPDB, Avijarna - PPDA kontrola, BB - nerazblažene čestice polimera koje sadrže tetravalentni TB antigen (TTPP), 4 Deg - TTPP koje obezbeđuju 3 µg ukupnih antigena uskladištenih 6 meseci na 4 ° C, 25 stepeni - TTPP koji obezbeđuju 3 µg ukupnih antigena uskladištenih 6 meseci na 25 °C, 37 Deg -TTPP sa 3 µg ukupnih antigena uskladištenih 6 meseci na 37 °C, 80 µm - TTPP u 2% etanolu sa 3 µg ukupnih antigena sa prosečnom veličinom čestica 80 mm, 20 µm - TTPP u 2% etanolu sa 3 µg ukupnih antigena sa prosečnom veličinom čestica od 20 mm, 16 mm - TTPP u 2% etanolu obezbeđujući 3 µg ukupnih antigena sa prosečnom veličinom čestica od 16 mm.
Slika 13 je grafički prikaz raspodele prosečne veličine čestica kompozicija koje sadrže TTPP, korišćenih ovde u Primeru 3. Slika 13A: DS627 A1 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u PBS/Dextran koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 C4 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 C7 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 10 mM Tris (pH 8.5) koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 B4 -TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica od 16 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 B5 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica od 20 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 B6 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica 80 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena. Slika 13B: DS627 B4 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica 16 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 B5 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica od 20 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, DS627 B6 - TTPP proizveden u seriji DS627 i formulisan u 2% etanolu sa prosečnom veličinom čestica od 80 µm i koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena.
Slika 14 je grafički prikaz podataka medijana debljine kože (mm) odgovora na dozu kod šest subjekata koji su testirali varijabilnost serije, kako je opisano ovde u Primeru 3. Goveda - PPDB kontrola, Avijarna - PPDA kontrola, D1 - TTPP proizveden u seriji DS498 i formulisan u PBS/Dekstranu koji obezbeđuje 3 µg ukupnih antigena, D2 -TTPP proizveden u seriji DS504 i formulisan u PBS/Dextran koji daje 3 µg ukupnih antigena, D3 - TTPP proizveden u seriji DS507 i formulisan u PBS/Dekstran koji daje 3 µg ukupnih antigena, D4 -TTPP proizveden u seriji DS560 i formulisan u PBS/Dekstran koji daje 3 µg ukupnih antigena, D5 -TTPP proizveden u seriji DS585 i formulisan u PBS/Dekstran koji daje 3 µg ukupnih antigena, D6 -TTPP proizveden u seriji DS625 i formulisan u PBS/Dekstran koji daje 3 µg ukupnih antigena.
Slika 15 je grafički prikaz podataka IFN-γ (apsorbanca na 450 nm) iz 12 serija TB infektiranih subjekata, kako je ovde opisano u Primeru 4. N-PBS kontrola, A - PPDA kontrola, B - PPDB kontrola, EC - solubilni ESAT6/CFP10ESAT6/CFP10 antigen (4 mg u bunarčiću), WT - PhaC- samo čestice kontrole, Ag 41 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu, koji obezbeđuje 0.38 µg ukupnih antigena, Ag 4 1/4 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu koji obezbeđuje 0.1 µg ukupnih antigena, Ag 4 1/16 -TTPP proizveden u LPS+ domaćinu koji obezbeđuje 25 ng ukupnih antigena, Ag 4 1/64 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu koji obezbeđuje 6 ng ukupnih antigena, Ag 41/256 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu koji obezbeđuje 1.5 ng ukupnih antigena, clear coli 1 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 0.38 µg ukupnih antigena, clear coli 1/4 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 0.1 µg ukupnih antigena, clear coli 1/16 - TTPP proizveden u LPSdomaćinu koji obezbeđuje 25 ng ukupnih antigena, clear coli 1/64 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 6 ng ukupnih antigena, clear coli 1/256 - TTPP proizveden u LPS -domaćinu koji obezbeđuje 1.5 ng ukupnih antigena.
Slika 16 je grafički prikaz podataka IFN-γ (apsorbanca na 450 nm) iz 10 serija neinficiranih subjekata, kao što je ovde opisano u Primeru 4. N - PBS kontrola, A - PPDA kontrola, B - PPDB kontrola, EC – solubilni ESAT6/CFP10 antigen (4 µg u bunarčiću), WT - PhaC samo čestice kontrole, Ag 4 1 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu, koji obezbeđuje 0.38 µg ukupno antigena, Ag 4 1/4 -TTPP proizveden u LPS+domaćinu obezbeđuje 0.1 µg ukupnih antigena, Ag 4 1/16 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu obezbeđuje 25 ng ukupnih antigena, Ag 4 1/64 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu obezbeđuje 6 ng ukupnih antigena, Ag 41/256 - TTPP proizveden u LPS+ domaćinu koji daje 1.5 ng ukupnih antigena, clear coli 1 - TTPP proizveden u LPS- domaćinu koji obezbeđuje 0.38 µg ukupnih antigena, clear coli 1/4 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 0.1 µg ukupnih antigena, clear coli 1/16 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji daje 25 ng ukupnih antigena, clear coli 1/64 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 6 ng ukupnih antigena, clear coli 1/256 - TTPP proizveden u LPS-domaćinu koji obezbeđuje 1.5 ng ukupnih antigena.
DETALjAN OPIS
[0143] Ovaj pronalazak se odnosi na čestice polimera i njihovu upotrebu. Ovaj pronalazak se naročito odnosi na funkcionalizovane čestice polimera, na primer, na procese proizvodnje funkcionalizovanih čestica polimera, i njihove upotrebe u dijagnostici, lečenju ili prevenciji tuberkuloze.
[0144] Funkcionalizovane čestice polimera iz ovog pronalaska mogu sadržati jedan ili više površinski vezanih fuzionih polipeptida, a takođe mogu sadržati jednu ili više supstanci inkorporiranih ili adsorbovanih u jezgru čestica polimera, jednu ili više supstanci vezanih za površinski vezane fuzione polipeptide, ili njihovu kombinaciju.
1. Definicije
[0145] Izraz "kodirajući region" ili "otvoreni okvir čitanja" (ORF) se odnosi na smisleni lanac genomske DNK sekvence ili sekvence cDNK koja je sposobna da produkuje proizvod transkripcije i/ili polipeptid pod kontrolom odgovarajućih regulatornih sekvenci. Kodirajuća sekvenca je identifikovana prisustvom 5' translacionog start kodona i 3' translacionog zaustavnog kodona. Kada se ubaci u genetski konstrukt, "kodirajuća sekvenca "može da bude eksprimirana kada je operativno povezana sa promoterskim i terminacionim sekvencama.
[0146] Izraz "koji sadrži" kako se koristi u ovoj specifikaciji znači "sastoji se barem delimično od". Prilikom tumačenja svake izjave u ovoj specifikaciji koja uključuje izraz "koji sadrži", mogu biti prisutne i druge karakteristike osim ove ili one koje izrazu prethode. Povezani pojmovi, kao što su "obuhvataju" i "obuhvata" se tumače na isti način.
[0147] Izraz "reagens za kuplovanje" kako se ovde koristi, odnosi se na neorgansko ili organsko jedinjenje koje je pogodno za vezivanje najmanje jedne supstance ili dodatnog reagensa za kuplovanje koji je pogodan za vezivanje reagensa za kuplovanje sa jedne strane i bar jedne supstance na drugoj strani. Primeri odgovarajućih reagensa za kuplovanje, kao i primeri metoda za njihovu upotrebu, uključujući metode pogodne za hemijsku modifikaciju čestica ili fuzionih proteina iz ovog pronalaska, predstavljeni su u PCT/DE2003/002799, objavljenom kao WO 2004/020623 (Bernd Rehm), ovde uključenom referencom u celini.
[0148] Izraz "ekspresioni konstrukt" se odnosi na genetski konstrukt koji uključuje elemente koji dozvoljavaju transkripciju inserta molekula polinukleotida i, opciono, transliranje transkripta u polipeptid. Ekspresioni konstrukt tipično sadrži u smeru 5' do 3':
(1) promoter, funkcionalan u ćeliji domaćinu u koju će konstrukt biti uveden,
(2) polinukleotid koji treba eksprimirati i
(3) terminator funkcionalan u ćelija domaćinu u koju će konstrukt biti uveden.
[0149] Ekspresioni konstrukti iz pronalaska se ubacuju u replikabilni vektor za kloniranje ili za ekspresiju, ili se inkorporiraju u genom domaćina.
[0150] Primeri ekspresionih konstrukata koji se mogu prilagoditi za upotrebu u ovom pronalasku su dati u PCT/DE2003/002799 objavljenom kao WO 2004/020623 (Bernd Rehm) i PCT/NZ2006/000251 objavljenom kao WO 2007/037706 (Bernd Rehm) koji su ovde referencom uključeni u celini.
[0151] Izrazi "formiraju česticu polimera" i "formiranje čestica polimera", kako se ovde koristi, odnosi se na aktivnost proteina koji formira čestice kako je ovde razmatrano.
[0152] "Fragment" polipeptida je podsekvenca polipeptida koja obavlja funkciju koja je potrebna za enzimsku ili vezujuću aktivnost i/ili obezbeđuje trodimenzionalnu strukturu polipeptida.
[0153] Izraz "fuzioni polipeptid", kako se ovde koristi, se odnosi na polipeptid koji sadrži dve ili aminokiselinske sekvence, na primer dva ili više polipeptidnih domena, fuzionisanih preko odgovarajućih amino i karboksilnih ostataka peptidnom vezom da formiraju jedan kontinualni polipeptid. Razume se da dve ili više aminokiselinskih sekvenci mogu biti ili direktno spojene ili indirektno spojene preko njihovih odgovarajućih amino i karboksilnih krajeva preko linkera ili spejsera ili dodatnog polipeptida.
[0154] U jednoj realizaciji, jedna od aminokiselinskih sekvenci koja sadrži fuzioni polipeptid sadrži protein koji formira čestice.
[0155] U posebno razmatranim realizacijama pronalaska, dve ili više aminokiselinskih sekvenci koje sadrže fuzioni polipeptid sadrže antigen M. tuberculosis odabran iz grupe koja sadrži ESAT6 antigen, vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, CFP10 antigen, vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen, antigen Rv3615c, vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c ili fuzioni partner.
[0156] U drugim posebno razmatranim realizacijama pronalaska, tri ili vi še aminokiselinskih sekvenci koje sadrže fuzioni polipeptid sadrže antigen M. tuberculosis odabran iz grupe koja sadrži ESAT6 antigen, vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen, CFP10 antigen, vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen, Rv3615c antigen, vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, Rv3020c antigen, vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen ili fuzioni partner.
[0157] Izraz "fuzioni partner", kako se ovde koristi, odnosi se na polipeptid kao što je protein, fragment proteina, vezujući domen, domen koji se vezuje za metu, vezujući protein, fragment vezujućeg proteina, antitelo, fragment antitela, te ški lanac antitela, laki lanac antitela, jednolančano antitelo, jednodomensko antitelo (na primer VHH), Fab fragment antitela, Fc fragment antitela, Fv fragment antitela, F(ab')2 fragment antitela, Fab' fragment antitela, fragment antitela jednolan čanog Fv (scFv), vezujući domen antitela (na primer ZZ domen), antigen, antigenska determinanta, epitop, hapten, imunogen, imunogenski fragment, biotin, derivat biotina, avidin, streptavidin, supstrat, enzim, abzim, ko-faktor, receptor, fragment receptora, receptorska podjedinica, fragment receptorske podjedinice, ligand, inhibitor, hormon, lektin, polihistidin, domen za kuplovanje, domen za vezivanje DNK, FLAG epitop, ostatak cisteina, peptid iz biblioteke peptida, reporterski peptid, peptid za afinitetno prečišćavanje, ili bilo koju kombinaciju bilo koja dva ili više njih.
[0158] Treba razumeti da dva ili više gore navedenih polipeptida mogu formirati fuzioni partner.
[0159] U jednoj reallizaciji, aminokiselinske sekvence fuzionog polipeptida su indirektno fuzionisane preko linkera ili spejsera, aminokiselinske sekvence pomenutog fuzionog polipeptida raspoređene po redosledu polimer sintaza-linker-antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, ili antigen sposoban da izazove imunološki odgovor-linker-polimer sintaza, ili polimer sintaza-linker-vezujući domen antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, ili vezujući domen antigena sposoban da izazove imunološki odgovor-linker-polimer sintaza, na primer. U drugim realizacijama, aminokiselinske sekvence fuzionog polipeptida su indirektno fuzionisane preko ili sadrže dodatni polipeptid raspoređen po redosledu polipeptid-antigen polimer-sintaza-dodatni polipeptid-antigen sposoban da izazove imunolo ški odgovor ili polimer-sintaza-dodatni polipeptid-vezujući domen antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, ili polimer sintaza-linker-antigen sposoban da izazove imunološki odgovor-dodatni polipeptid ili polimer sintaza linker-vezujući domen antigen sposoban da izazove imunološki odgovor-dodatni polipeptid. Opet, N-terminalne ekstenzije polimer sintaze su ovde naročito razmatrane.
[0160] Imunološki odgovori uključuju ćelijski posredovane i humoralne imunološke odgovore.
[0161] U jednoj ealizaciji, aminokiselinske sekvence fuzionog polipeptida su indirektno fuzionisane preko linkera ili spejsera, aminokiselinske sekvence pomenutog fuzionog polipeptida su raspoređene po redosledu polimer sintaza-linker-M tuberculosis ili M. bovis antigen ili M tuberculosis ili M. bovis antigen-linker-polimer sintaza, ili polimer sintaza-linker M tuberculosis ili M. bovis antigen vezujući domen ili M. tuberculosis ili M. bovis antigen vezujući domen-linker-polimer sintaza, na primer. U drugim realizacijama, aminokiselinske sekvence fuzionog polipeptida su indirektno fuzionisane ili sadrže dodatni polipeptid raspoređen po redosledu polimer sintaza-dodatni polipeptid- M. tuberculosis ili M. bovis antigen ili polimer sintaza-dodatni polipeptid-M. tuberculosis ili M. bovis antigen vezujući domen, ili polimer sintaza-linker-M. tuberculosis ili M. bovis antigen-dodatni polipeptid ili polimer sintaze-linker- M. tuberculosis ili M. bovis antigen vezujući domen-dodatni polipeptid. Opet, N-terminalne ekstenzije polimer sintaze su ovde naročito razmatrane.
[0162] Fuzioni polipeptid prema pronalasku takođe može sadržati jednu ili više polipeptidnih sekvenci umetnutih u sekvencu drugog polipeptida. Na primer, polipeptidna sekvenca, poput sekvence za prepoznavanje proteaze, je umetnuta u varijabilni region proteina koji sadr ži domen za vezivanje čestica.
[0163] Pogodno, fuzioni polipeptid prema pronalasku je kodiran sekvencom sa jednom nukleinskom kiselinom, pri čemu sekvenca nukleinske kiseline sadrži najmanje dve podsekvence od kojih svaka kodira polipeptid ili polipeptidni domen. U određenim realizacijama, najmanje dve podsekvence će biti prisutne "u okviru" tako da sadrže jedan otvoreni okvir čitanja i na taj način će kodirati fuzioni polipeptid kako je ovde predviđeno. U drugim realizacijama, najmanje dve podsekvence su prisutne "izvan okvira" i razdvojene su ribozomskim “frameshifting” mestom ili drugom sekvencom koja promoviše promenu okvira čitanja tako da se pri translaciji formira fuzioni polipeptid. U određenim realizacijama, najmanje dve podsekvence su susedne. U drugim realizacijama, poput onih o kojima je gore diskutovano, gde su najmanje dva polipeptida ili polipeptidna domena indirektno fuzionisana kroz dodatni polipeptid, najmanje dve podsekvence nisu susedne.
[0164] Pozivanje na "vezujući domen" ili "domen sposoban za vezivanje" treba da znači jednu polovinu komplementarnog vezujućeg para i može uključivati vezujuće parove sa gornje liste. Na primer, parovi antitelo-antigen, vezujući domen antitela-antitelo, biotin-streptavidin, receptor-ligand, enziminhibitor. Domen koji se vezuje za metu će vezati ciljni molekul u uzorku i predstavlja antitelo ili fragment antitela, na primer. Domen koji se vezuje za polipeptid će vezati polipeptid i predstavlja antitelo ili fragment antitela, ili vezujući domen iz receptora ili signalnog proteina, na primer.
[0165] Primeri supstanci koje vezuje vezujući domen uključuju protein, fragment proteina, peptid, polipeptid, fragment polipeptida, antitelo, fragment antitela, vezuju ći domen antitela, antigen, fragment antigena, antigensku determinantu, epitop, hapten, imunogen, imunogenski fragment, farmaceutski aktivno sredstvo, biološki aktivno sredstvo, adjuvans ili bilo koju kombinaciju bilo koje dve ili više njih. Takve supstance su „ciljne komponente“ u uzorku koji se analizira prema postupku iz pronalaska.
[0166] Prema tome, "domen sposoban za vezivanje [antigena]" i gramatički ekvivalenti će se odnositi na jednu komponentu u komplementarnom vezujućem paru, pri čemu je druga komponenta navedeni antigen.
[0167] Prema tome, "antigen-vezujući domen M. tuberculosis" je domen koji je u stanju da veže jedan ili više M. tuberculosis antigena.
[0168] "Antigen M. tuberculosis" kako se ovde koristi je antigen izveden iz M. tuberculosis. Slično, i drugi antigeni su identifikovani od strane organizama iz kojih potiču.
[0169] Izraz "antigen sposoban da izazove imunološki odgovor" se odnosi na antigen koji, kada je u kontaktu sa jednim ili više agenasa imunog sistema, kao što je jedno ili više antitela ili jedna ili više ćelija, može da izazove ili ushodno reguliše responzivnost imunološkog sistema, kao što je, na primer, ushodna regulacija u jednoj ili više populacija T ćelija, kao što je na primer povećana aktivnost ili broj CD8+ T-ćelija ili CD4+ T ćelija, ili ushodna regulacija u jednoj ili više populacija B ćelija, kao što je jedna ili više populacija B ćelija sposobnih za proizvodnju antitela specifičnih za antigen ili sposobnih za vezivanje antigena, ili povećanje količine ili aktivnosti jedne ili više populacija antitela.
[0170] Fraza "antigen sposoban da izazove ćelijski posredovani odgovor" se odnosi na antigen koji, kada je u kontaktu sa jednom ili više ćelija imunog sistema, može da izazove ili ushodno reguliše responsivnost imunološkog sistema, kao što je, na primer, ushodna regulacija u jednoj ili vi še populacija T ćelija, kao što je na primer povećana aktivnost ili broj CD8+ T-ćelija ili CD4+ T ćelija.
[0171] Izraz "genetski konstrukt" se odnosi na polinukleotidni molekul, obično dvolančanu DNK, koji može u sebi imati ubačen još jedan polinukleotidni molekul (umetnutog polinukleotidni molekul) kao što je, ali bez ograničenja, molekul cDNK. Genetski konstrukt može sadržati neophodne elemente koji dozvoljavaju transkripciju polinukleotidnog molekula inserta i, opciono, transliranje transkripta u polipeptid. Polinukleotidni molekul inserta je dobijen iz ćelije domaćina, ili je dobijen iz druge ćelije ili organizma i/ili je rekombinantni polinukleotid. Kada uđe u ćeliju domaćina, genetski konstrukt postaje integrisan u hromozomsku DNK domaćina. U jednom primeru genetski konstrukt je povezan sa vektorom.
[0172] Izraz "ćelija domaćin" se odnosi na bakterijsku ćeliju, ćeliju gljiva, ćeliju kvasca, biljnu ćeliju, ćeliju insekta ili životinjsku ćeliju, kao što je ćelija domaćina sisara koja je ili 1) ćelija domaćin koja proizvodi prirodnu PHA česticu, ili 2) ćelija domaćin koja nosi ekspresioni konstrukt koji sadrži sekvence nukleinske kiseline koje kodiraju najmanje tiolazu i reduktazu i opciono fazin. Koji geni su potrebni za povećanje onoga što ćeliji domaćinu nedostaje za formiranje čestica polimera će zavisiti od genetskog sastava ćelije domaćina i supstrata koji se nalaze u medijumu kulture.
[0173] Izraz "linker ili spejser" kako se ovde koristi se odnosi na aminokiselinsku ili nukleotidnu sekvencu koja indirektno spaja dva ili više polipeptida ili dve ili više sekvenci nukleinske kiseline koje kodiraju dva ili više polipeptida. U nekim realizacijama linker ili spejser je u dužini oko 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili oko 100 aminokiselina ili nukleotida. U drugim realizacijama, linker ili spejser je dužine oko 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 ili oko 1000 aminokiselina ili nukleotida. U još nekim realizacijama, linker ili spejser je dužine od oko 1 do oko 1000 aminokiselina ili nukleotida, od oko 10 do oko 1000, od oko 50 do oko 1000, od oko 100 do oko 1000, od oko 200 do oko 1000, od oko 300 do oko 1000, od oko 400 do oko 1000, od oko 500 do oko 1000, od oko 600 do oko 1000, od oko 700 do oko 1000, od oko 800 do oko 1000, ili od oko 900 do oko 1000 amino kiselina ili nukleotida po dužini.
[0174] U jednoj realizaciji, linker ili spejser mogu sadržati mesto prepoznavanja restrikcionog enzima. U drugoj realizaciji, linker ili spejser mogu sadržati sekvencu prepoznavanja cepanja proteaze, poput enterokinaze, trombina ili sekvence prepoznavanja Faktora Xa, ili samo-splajsuju ći element, kao što je intein. U drugoj realizaciji, linker ili spejser omogućavaju nezavisno savijanje fuzionih polipeptida.
[0175] Izraz "mešovita populacija", kako se ovde koristi, odnosi se na dve ili vi še populacija entiteta, pri čemu se svaka populacija entiteta u okviru mešovite populacije u određenom pogledu razlikuje od druge populacije entiteta unutar mešovite populacije. Na primer, kada se koristi u odnosu na me šovitu populaciju ekspresionih konstrukata, on se odnosi na dve ili vi še populacija ekspresionih konstrukata gde se svaka populacija ekspresionog konstrukta razlikuje u pogledu fuzionog polipeptida koji kodiraju članovi te populacije, ili u pogledu nekog drugog aspekta konstrukta, kao što je na primer identitet promotera prisutnog u konstruktu. Alternativno, kada se koristi u odnosu na me šovitu populaciju fuzionih polipeptida, on se odnosi na dve ili više populacija fuzionih polipeptida gde se svaka populacija fuzionih polipeptida razlikuje u pogledu polipepetida, kao što je polimer sintaza, antigen sposoban da izazove ćelijski-posredovani imunološki odgovor, ili vezujući domen sposoban da veže antigen sposoban da izazove ćelijski imunološki odgovor, članova te populacije. Na primer, u kontekstu upotrebe u lečenju tuberkuloze, mešovita populacija fuzionih polipeptida se odnosi na dve ili vi še populacija fuzionih polipeptida gde se svaka populacija fuzionih polipeptida razlikuje u pogledu polipepetida, kao što su polimer sintaza, M. tuberculosis antigeni ili domeni koji vezuju M. tuberculosis antigen, članove koje ta populacija sadrži. Dalje, kada se koristi u odnosu na mešovitu populaciju čestica polimera, on se odnosi na dve ili više populacija čestica polimera gde se svaka populacija čestica polimera razlikuje u odnosu na fuzioni polipeptid ili fuzione polipeptide koje nose članovi te populacije.
[0176] Izraz "nukleinska kiselina", kako se ovde koristi, odnosi se na jedno- ili dvolančani polimer deoksiribonukleotida, baze ribonukleotida ili poznate analoge prirodnih nukleotida, ili njihove mešavine. Izraz uključuje upućivanje na određenu sekvencu, kao i na sekvencu koja joj je komplementarna, osim ako nije drugačije naznačeno. Termini "nukleinska kiselina" i "polinukleotid" se ovde koriste naizmenično.
[0177] "Operativno povezano" znači da je sekvenca koja se eksprimira stavljena pod kontrolu regulatornih elemenata koji uključuju promotere, tkivno-specifične regulatorne elemente, temporalne regulatorne elemente, enhancere, represore i terminatore.
[0178] Izraz "prekomerna ekspresija" se generalno odnosi na produkciju genskog produkta u ćeliji domaćina koji premašuje nivoe produkcije u normalnim ili ne-transformisanim ćelijama domaćinima. Izraz "prekomerna ekspresija", kada se koristi u odnosu na nivoe RNK glasnika, poželjno ukazuje na nivo ekspresije barem oko 3 puta veći od onog koji se tipično uočava u ćeliji domaćinu u kontrolnoj ili netransformisanoj ćeliji. Poželjnije je da je nivo ekspresije barem oko 5 puta veći, oko 10 puta veći, oko 15 puta veći, oko 20 puta veći, oko 25 puta veći, oko 30 puta veći, oko 35 puta više, oko 40 puta više, oko 45 puta više, oko 50 puta veći, oko 55 puta veći, oko 60 puta veći, oko 65 puta veći, oko 70 puta veći, oko 75 puta veći, oko 80 puta veći, oko 85 puta veći, oko 90 puta veći, oko 95 puta veći, ili oko 100 puta veći ili iznad, u odnosu na onaj koji se obično uočava u kontrolnoj ćeliji domaćinu ili u netransformisanoj ćeliji.
[0179] Nivoi mRNK se mere korišćenjem bilo koje od brojnih tehnika poznatih stručnjacima, uključujući, ali bez ograničenja, Northern blot analizu i RT-PCR, uključujući kvantitativni RT-PCR.
[0180] Izraz "protein koji formira čestice", kako se ovde koristi, odnosi se na proteine uključene u formiranje čestice. On može, na primer, biti izabran iz grupe proteina koja sadrži polimer depolimerazu, polimerni regulator, polimer sintazu i protein koji određuje veličinu čestica. Poželjno je da protein koji formira čestice bude izabran iz grupe koja sadrži tiolazu, reduktazu, polimer sintazu i fazin. Protein koji formira čestice, poput sintaze, može katalizovati stvaranje čestice polimera polimerizacijom supstrata ili derivata supstrata da bi se formirala čestica polimera. Alternativno, protein koji formira čestice, poput tiolaze, reduktaze ili fazina, može olakšati formaciju čestice polimera olakšavanjem polimerizacije. Na primer, tiolaza ili reduktaza mogu katalizovati proizvodnju odgovarajućih supstrata za polimerazu. Fazin može kontrolisati veličinu formirane čestice polimera. Poželjno, protein koji formira čestice sadrži domen za vezivanje čestica i domen za formiranje čestica.
[0181] Kako se ovde koristi, izraz "reakciona smeša za formiranje čestica" se odnosi bar na supstrat polimer sintaze ako ćelija domaćin ili ekspresioni konstrukt sadrži katalitički domen sintaze ili polimer sintazu i njen supstrat ako ćelija domaćin ili ekspresioni konstrukt sadrži drugi protein koji formira čestice ili domen za vezivanje čestica koji nije katalitički domen polimer sintaze.
[0182] "Protein za određivanje veličine čestica" se odnosi na protein koji kontroliše veličinu čestica polimera. Na primer, može se izvesti iz porodice proteina sličnih fazinu, poželjno izabran iz onih iz rodova Ralstonia, Alcaligenes i Pseudomonas, poželjnije gena fazina phaP iz Ralstonia eutropha i gena fazina phaF iz Pseudomonas oleovorans. Fazini su amfifilni proteini molekulske mase 14 do 28 kDa koji se čvrsto vezuju za hidrofobnu površinu čestica polimera. Takođe može sadržati i druge proteine ćelije domaćina koji vezuju čestice i utiču na veličinu čestica.
[0183] Treba imati u vidu da su patogeni obično specifični za domaćina. Shodno tome, metode i kompozicije prema pronalasku se mogu koristiti u određenoj vrsti domaćina protiv određenog patogena, uključujući i protiv patogena specifičnog za vrstu. Na primer, realizacije za humane subjekte, na primer za upotrebu u otkrivanju patogena tuberkuloze specifi čnih za ljude, obično će se fokusirati na Micobacterium tuberculosis.
[0184] U drugim primerima, realizacije za upotrebu sa subjektima goveda, jelena i ovaca obi čno će ciljati Micobacterium spp., uključujući, na primer, npr. M. bovis, M. tuberculosis, M. leprae, M. kansasii, M. avium, M. avium paratuberculosis i druge Micobacterium spp.
[0185] Prema tome, "subjekt" je životinja, poput sisara, uključujući sisara životinju pratioca ili čoveka. Reprezentativne životinje pratioci uključuju mačke, konje i pse. Reprezentativne poljoprivredne životinje uključuju goveda, ovce, jelene i svinje. U jednom aspektu, čovek je odrasla osoba, dete ili odojče, uključujući odraslu osobu, dete ili odojče sa oslabljenim imunološkim sistemom, ili odrasla osoba, dete ili odojče koje je vakcinisano, zaraženo, izloženo ili izloženo riziku od infekcije ili izloženosti patogenu.
[0186] Izraz "tretirati" i njegovi derivati (uključujući "tretman”
[0187] Izraz "lečenje" i njegovi derivati (uključujuć i "lečenje") treba tumačiti u njihovom najširem moguć em kontekstu. Izraz ne treba uzeti u obzir da podrazumeva da se subjekt leči do potpunog oporavka. Shodno tome, „tretirajte“ široko
uključuje poboljšanje i/ili sprečavanje pojave simptoma ili ozbiljnosti određenog stanja.
[0187] "Polimerni regulator" kako se ovde koristi se odnosi na protein koji reguliše transkripciju gena phaA, phaB i phaC uključenih u formiranje polimernih čestica. Povlači se iz regulacije transkripcije vezivanjem za površinu čestica. Jedan primer takvog regulatora je represor fazina (phaR) iz R. eutropha IP_725943, koji se veže za promoter fazinu-sličnog gena, čiji produkt ekspresije reguliše veličinu polimernih čestica i sprečava da gen bude porčitan. Pošto je represor fazina vezan za površinu formiranih polimernih čestica, ovo mesto na promoteru se oslobađa i može početi transkripcija osnovnog gena. "Polimer sintaza", kako se ovde koristi, se odnosi na protein koji je sposoban da katalizuje formiranje polimerne čestice polimerizacijom supstrata ili derivata supstrata da formira polimernu česticu. Dobijene su nukleotidne sekvence 88 gena PHA sintaze iz > 45 različitih bakterija, koje se razlikuju po primarnoj strukturi, specifičnosti supstrata i sastavu podjedinica (Rehm, 2007).
[0188] Polimer sintaza sadrži bar katalitički domen sintaze na C-kraju proteina sintaze koji posreduje polimerizaciju polimera i vezivanje proteina sintaze za jezgro čestica. Polimerne sintaze za upotrebu u ovom pronalasku detaljno su opisane u Rehm, 2003, koja je ovde uključena referencom u celini. Na primer, polimer sintaza je PHA sintaza iz klase 1 rodova Acinetobacter, Vibrio, Aeromonas, Chromobacterium, Pseudomonas, Zoogloea, Alcaligenes, Delftia, Burkholderia, Ralstonia, Rhodococcus, Gordonia, Rhodobacter, Paracoccus, Rickettsia, Caulobacter, Methylobacterium, Azorhizobium, Agrobacterium, Rhizobium, Sinorhizobium, Rickettsia, Crenarchaeota, Synechocystis, Ectothiorhodospira, Thiocapsa, Thyocystis i Allochromatium, klase 2 rodova Burkholderia i Pseudomonas, ili klase 4 roda Bacillus, još poželjnije iz grupe koju čine klasa 1 Acinetobacter sp. RA3849, Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus, Aeromonas punctata FA440, Aeromonas hydrophila, Chromobacterium violaceum, Pseudomonas sp. 61-3, Zoogloea ramigera, Alcaligenes latus, Alcaligenes sp. SH-69, Delftia acidovorans, Burkholderia sp. DSMZ9242, Ralstonia eutrophia H16, Burkholderia cepacia, Rhodococcus rubber PP2, Gordonia rubripertinctus, Rickettsia prowazekii, Synechocystis sp. PCC6803, Ectothiorhodospira shaposhnikovii Nl, Thiocapsa pfennigii 9111, Allochromatium vinosum D, Thyocystis violacea 2311, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus denitrificans, Rhodobacter capsulatus, Caulobacter crescentus, Methylobacterium extorquens, Azorhizobium caulinodans, Agrobacterium tumefaciens, Sinorhizobium meliloti 41, Rhodospirillum rubrum HA, i Rhodospirillum rubrum ATCC25903, klasa 2 Burkholderia caryophylli, Pseudomonas chloraphis, Pseudomonas sp. 61-3, Pseudomonas putida U, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas resinovorans, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas pseudolcaligenes, Pseudomonas putida BM01, Pseudomonas nitroreducins, Pseudomonas chloraphis, i klasa 4 Bacillus megaterium i Bacillus sp.INT005.
[0189] Druge polimerne sintaze koje se mogu koristiti u ovom pronalasku uključuju polimerne sintaze, od kojih je svaka identifikovana svojim pristupnim brojem, od sledećih organizama: C. necator (AY836680), P. aeruginosa (AE004091), A. vinosum (AB205104), B. megaterium (AF109909), H. marismortui (YP137339), P. aureofaciens (AB049413), P. putida (AF150670), R. eutropha (A34341), T. pfennigii (X93599), A. punctata (032472), Pseudomonas sp. 61-3 (AB014757 i AB014758), R. sphaeroides (AAA72004, C. violaceum (AAC69615), A. borkumensis SK2 (CAL17662), A. borkumensis SK2 (CAL16866), R. sphaeroides KD131 (ACM01571 i YP002526072), R. opacus B4 (BAH51880 I YP002780825), B. multivorans ATCC 17616 (YP001946215 i BAG43679), A. borkumensis SK2 (YP693934 i YP693138), R. rubrum (AAD53179), gamma proteobacterium HTCC5015 (ZP05061661 i EDY86606), Azoarcus sp. BH72 (YP932525), C. violaceum ATCC 12472 (NP902459), Limnobacter sp. MED105 (ZP01915838 i EDM82867), M. algicola DG893 (ZP01895922 i EDM46004), R. sphaeroides (CAA65833), C. violaceum ATCC 12472 (AAQ60457), A. latus (AAD10274, AAD01209 i AAC83658), S. maltophilia K279a (CAQ46418 i YP001972712), R. solanacearum IPO1609 (CAQ59975 i YP002258080), B. multivorans ATCC 17616 (YP001941448 i BAG47458), Pseudomonas sp. g113 (ACJ02400), Pseudomonas sp. g106 (ACJ02399), Pseudomonas sp. g101 (ACJ02398), R. sp. gl32 (ACJ02397), R. leguminosarum bv. viciae 3841 (CAK10329 i YP770390), Azoarcus sp. BH72 (CAL93638), Pseudomonas sp. LDC-5 (AAV36510), L. nitroferrum 2002 (ZP03698179), Thauera sp. MZ1T (YP002890098 i ACR01721), M. radiotolerans JCM 2831 (YP001755078 i ACB24395), Methylobacterium sp. 4-46 (YP001767769 i ACA15335), L. nitroferrum 2002 (EEG08921), P. denitrificans (BAA77257), M. gryphiswaldense (ABG23018), Pseudomonas sp. USM4-55 (ABX64435 i ABX64434), A. hydrophila (AAT77261 i AAT77258), Bacillus sp. INT005 (BAC45232 i BAC45230), P. putida (AAM63409 i AAM63407), G. rubripertinctus (AAB94058), B. megaterium (AAD05260), D. acidovorans (BAA33155), P. seriniphilus (ACM68662), Pseudomonas sp. 14-3 (CAK18904), Pseudomonas sp. LDC-5 (AAX18690), Pseudomonas sp. PC17 (ABV25706), Pseudomonas sp. 3Y2 (AAV35431, AAV35429 i AAV35426), P. mendocina (AAM10546 i AAM10544), P. nitroreducens (AAK19608), P. pseudoalcaligenes (AAK19605), P. resinovorans (AAD26367 i AAD26365), Pseudomonas sp. USM7-7 (ACM90523 i ACM90522), P. fluorescens (AAP58480) i druge nekultivisane bakterije (BAE02881, BAE02880, BAE02879, BAE02878, BAE02877, BAE02876, BAE02875, BAE02874, BAE02873, BAE02872, BAE02871, BAE02870, BAE02869, BAE02868, BAE02867, BAE0286, BAE02865, BAE02864, BAE02863, BAE02862, BAE02861, BAE02860, BAE02859, BAE02858, BAE02857, BAE07146, BAE07145, BAE07144, BAE07143, BAE07142, BAE07141, BAE07140, BAE07139, BAE07138, BAE07137, BAE07136, BAE07135, BAE07134, BAE07133, BAE07132, BAE07131, BAE07130, BAE07129, BAE07128, BAE07127, BAE07126, BAE07125, BAE07124, BAE07123, BAE07122, BAE07121, BAE07120, BAE07119, BAE07118, BAE07117, BAE07116, BAE07115, BAE07114, BAE07113, BAE07112, BAE07111, BAE07110, BAE07109, BAE07108, BAE07107, BAE07106, BAE07105, BAE07104, BAE07103, BAE07102, BAE07101, BAE07100, BAE07099, BAE07098, BAE07097, BAE07096, BAE07095, BAE07094, BAE07093, BAE07092, BAE07091, BAE07090, BAE07089, BAE07088, BAE07053, BAE07052, BAE07051, BAE07050, BAE07049, BAE07048, BAE07047, BAE07046, BAE07045, BAE07044, BAE07043, BAE07042, BAE07041, BAE07040, BAE07039, BAE07038, BAE07037, BAE07036, BAE07035, BAE07034, BAE07033, BAE07032, BAE07031, BAE07030, BAE07029, BAE07028, BAE07027, BAE07026, BAE07025, BAE07024, BAE07023, BAE07022, BAE07021, BAE07020, BAE07019, BAE07018, BAE07017, BAE07016, BAE07015, BAE07014, BAE07013, BAE07012, BAE07011, BAE07010, BAE07009, BAE07008, BAE07007, BAE07006, BAE07005, BAE07004, BAE07003, BAE07002, BAE07001, BAE07000, BAE06999, BAE06998, BAE06997, BAE06996, BAE06995, BAE06994, BAE06993, BAE06992, BAE06991, BAE06990, BAE06989, BAE06988, BAE06987, BAE06986, BAE06985, BAE06984, BAE06983, BAE06982, BAE06981, BAE06980, BAE06979, BAE06978, BAE06977, BAE06976, BAE06975, BAE06974, BAE06973, BAE06972, BAE06971, BAE06970, BAE06969, BAE06968, BAE06967, BAE06966, BAE06965, BAE06964, BAE06963, BAE06962, BAE06961, BAE06960, BAE06959, BAE06958, BAE06957, BAE06956, BAE06955, BAE06954, BAE06953, BAE06952, BAE06951, BAE06950, BAE06949, BAE06948, BAE06947, BAE06946, BAE06945, BAE06944, BAE06943, BAE06942, BAE06941, BAE06940, BAE06939, BAE06938, BAE06937, BAE06936, BAE06935, BAE06934, BAE06933, BAE06932, BAE06931, BAE06930, BAE06929, BAE06928, BAE06927, BAE06926, BAE06925, BAE06924, BAE06923, BAE06922, BAE06921, BAE06920, BAE06919, BAE06918, BAE06917, BAE06916, BAE06915, BAE06914, BAE06913, BAE06912, BAE06911, BAE06910, BAE06909, BAE06908, BAE06907, BAE06906, BAE06905, BAE06904, BAE06903, BAE06902, BAE06901, BAE06900, BAE06899, BAE06898, BAE06897, BAE06896, BAE06895, BAE06894, BAE06893, BAE06892, BAE06891, BAE06890, BAE06889, BAE06888, BAE06887, BAE06886, BAE06885, BAE06884, BAE06883, BAE06882, BAE06881, BAE06880, BAE06879, BAE06878, BAE06877, BAE06876, BAE06875, BAE06874, BAE06873, BAE06872, BAE06871, BAE06870, BAE06869, BAE06868, BAE06867, BAE06866, BAE06865, BAE06864, BAE06863, BAE06862, BAE06861, BAE06860, BAE06859, BAE06858, BAE06857, BAE06856, BAE06855, BAE06854, BAE06853 i BAE06852).
[0190] N-terminalni fragment proteina PHA sintaze (aminokiselina oko 1 do 200, ili 1 do 150, ili 1 do 100) je visoko varijabilan i u nekim primerima se briše ili zamenjuje antigenom, domenom za vezivanje antigena, ili drugim fuzionim partnerom bez inaktiviranja enzima ili spre čavanja kovalentnog vezivanja sintaze preko domena vezivanja čestica polimera (tj. C-terminalnog fragmenta) za polimerno jezgro. Domen za vezivanje čestica polimera koji može da veže sintazu sadrži najmanje katalitički domen proteina sintaze koji posreduje polimerizaciju polimera i formiranje čestica polimera.
[0191] U nekim realizacijama, C-terminalni fragment proteina PHA sintaze je modifikovan, delimi čno izbrisan ili delimično zamenjen antigenom sposobnim da izazove imunološki odgovor, vezujućim domenom sposobnim da veže antigen koji može da izazove imunološki odgovor, ili drugim fuzionim partnerom bez inaktiviranja enzima ili sprečavanja kovalentnog vezivanja sintaze za polimernu česticu.
[0192] U nekim slučajevima, antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, vezujući domen sposoban da veže antigen koji može da izazove imunološki odgovor, ili drugi fuzioni partner su fuzionisani sa N-terminusom ili sa C-terminusom proteina PHA sintaze bez inaktiviranja enzima ili spre čavanja kovalentnog vezivanja sintaze za polimernu česticu. Slično, u drugim slučajevima antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, vezujući domen sposoban da veže antigen sposoban da izazove imunološki odgovor, ili drugi fuzioni partner je umetnut unutar proteina PHA sintaze, ili ba š unutar proteina koji formira čestice. Primeri fuzija PhaC su poznati u tehnici i ovde su predstavljeni.
[0193] U jednom primeru, N-terminalni fragment proteina PHA sintaze (aminokiselina oko 1 do 200, ili 1 do 150, ili 1 do 100) je veoma promenljiv i briše se ili zamenjuje sa M. tuberculosis ili M. bovis antigenom, vezujućim domenom za M. tuberculosis ili M. bovis ili drugim fuzionim partnerom bez inaktiviranja enzima ili sprečavanja kovalentnog vezivanja (kovalentno vezivanje se javlja kroz aktivno mesto iz kojeg štrči nascentni poliestar) sintaze preko vezujućeg domena čestice polimera (tj. C-terminalni fragment (ovaj domen se vezuje hidrofobnom interakcijom)) sa česticom polimera. Vezujući domen čestica polimera sintaze sadrži najmanje katalitički domen proteina sintaze koji posreduje u polimerizaciji čestice polimera i formiranju čestica polimera.
[0194] C-terminalni fragment proteina PHA sintaze takođe može biti modifikovan, delimično izbrisan ili delimično supstituisan, na primer ovde opisanim antigenima M. tuberculosis ili M. bovis, ili vezivanjem za M. tuberculosis ili M. bovis domen kako je ovde predviđeno, ili drugim fuzionim partnerom bez inaktiviranja enzima ili sprečavanja kovalentnog vezivanja sintaze za polimernu česticu.
[0195] U određenim slučajevima, M. tuberculosis ili M. bovis antigen (i) ili M. tuberculosis ili M bovis antigen-vezujući domen(i) ili drugi fuzioni partner(i) su fuzionisani sa N-krajem ili sa C-krajem proteina PHA sintaze bez inaktiviranja enzima ili sprečavanja kovalentnog vezivanja sintaze za polimernu česticu. Slično, u drugim slučajevima M. tuberculosis ili M. bovis antigen(i), M. tuberculosis ili M. bovis antigen vezujući domen(i) ili drugi fuzioni partneri su umetnuti unutar proteina PHA sintaze, ili ba š unutar proteina koji formira čestice. Primeri fuzija PhaC su poznati u tehnici i ovde su predstavljeni.
[0196] "Polimerna depolimeraza" kako se ovde koristi se odnosi na protein koji je sposoban da hidrolizuje postojeći polimer, poput onog koji se nalazi u čestici polimera, na monomere i oligomere rastvorljive u vodi. Primeri polimernih depolimeraza se javljaju u velikom broju bakterija i gljivica koje razgrađuju PHA, i uključuju ekstracelularne depolimmeraze PhaZ1 - PhaZ7 iz Paucimonas lemoignei, PhaZ depolimeraze iz Acidovorax sp., A. faecalis (sojevi AE122 i Tl), Delftia (Comanas) acidovorans soj IM1069, Comamonas testosteroni, Comamonas sp., Leptothrik sp. soj HS, Pseudomonas sp. soj GM101 (Pristupni br. AF293347), P. fluorescens soj GK13, P. stutzeri, R. pickettii (sojevi A1 i K1, Pristupni br. JO4223, D25315), S. ekfoliatus K10 i Streptomices higroscopicus (videti Jendrossek D. i Handrick, R., Microbial Degredation of Polyhidroxialkanoates, Annual Review of Microbiology, 2002, 56: 403-32).
[0197] Izraz "polipeptid", kako se ovde koristi, obuhvata aminokiselinske lance bilo koje dužine, ali poželjno najmanje 5 aminokiselina, uključujući proteine pune dužine, u kojima su aminokiselinski ostaci povezani kovalentnim peptidnim vezama. Polipeptidi iz ovog pronalaska su pre čišćeni prirodni proizvodi ili su delimično ili u potpunosti proizvedeni rekombinantnim ili sinteti čkim tehnikama. Izraz se može odnositi na polipeptid, agregat polipeptida kao što je dimer ili drugi multimer, fuzioni polipeptid, njegovu varijantu polipeptida ili njegov derivat.
[0198] Izraz "promoter" se odnosi na ne transkribovane cis-regulatorne elemente uzvodno od kodirajućeg regiona koji regulišu transkripciju gena. Promoteri sadrže cis-inicijatorske elemente koji određuju mesto iniciranja transkripcije i očuvane boksove kao što je TATA boks, i motive koji su vezani faktorima transkripcije.
[0199] Izraz "terminator" se odnosi na sekvence koje prekidaju transkripciju, koje se nalaze u 3' ne transliranim krajevima gena nizvodno od translirane sekvence. Terminatori su va žne determinante stabilnosti mRNA i u nekim slučajevima je utvrđeno da imaju prostorne regulatorne funkcije.
[0200] Izraz "supstanca" kada se pominje u vezi sa vezivanjem za polimernu česticu, apsorpcijom na nju ili inkorporiranjem u nju treba da označi supstancu koja je vezana fuzionim partnerom ili supstancu koja se može biti apsorbovana na ili inkorporirana u polimernu česticu.
[0201] Izraz "varijanta" kako se ovde koristi se odnosi na polinukleotidne ili polipeptidne sekvence različite od specifično identifikovanih sekvenci, pri čemu se jedan ili više nukleotida ili aminokiselinskih ostataka briše, supstituiše ili dodaje. Varijante su prirodne alelne varijante ili varijante koje se ne javljaju u prirodi. Varijante su iz iste ili druge vrste i mogu obuhvatiti homologe, paraloge i ortologe. U nekim realizacijama, varijante polinukleotida i polipeptida poseduju biolo ške aktivnosti koje su iste ili slične onima kod polinukleotida ili polipeptida divljeg tipa. Izraz "varijanta" u odnosu na polinukleotide i polipeptide obuhvata sve oblike polinukleotida i polipeptida kako su ovde definisani.
Varijante polinukleotida i polipeptida
[0202] Izraz "polinukleotid(i)", kako se ovde koristi, označava jednolsnčani ili dvolančani deoksiribonukleotidni ili ribonukleotidni polimer bilo koje dužine, ali poželjno od najmanje 15 nukleotida, i uključuje kao neograničavajuće primere kodirajuće i nekodirajuće sekvence gena, smislene i antisense sekvence, komplekse, egzone, introne, genomsku DNK, cDNK, pre-mRNK, mRNK, rRNK, siRNK, miRNK, tRNK, ribozime, rekombinantne polipeptide, izolovanu i pre čišćenu DNK ili RNK sekvence koje se prirodno javljaju, sintetičke RNK i DNK sekvence, probe nukleinskih kiselina, prajmere i fragmente. Brojni analozi nukleinskih kiselina su dobro poznati u tehnici i takođe se razmatraju.
[0203] "Fragment" polinukleotidne sekvence koja je ovde navedena je podsekvenca susednih nukleotida koja je poželjno dužine najmanje 15 nukleotida. Fragmenti iz pronalaska poželjno sadrže najmanje 20 nukleotida, poželjnije najmanje 30 nukleotida, poželjnije najmanje 40 nukleotida, poželjnije najmanje 50 nukleotida i najpoželjnije najmanje 60 susednih nukleotida polinukleotida prema pronalasku. Fragment polinukleotidne sekvence se može koristiti u antisens tehnologiji, utišavanju gena, tehnologiji trostrukog heliksa ili ribozima, ili kao prajmer, proba, uključena u “microarray” tehniku, ili se može koristiti u metodama selekcije zasnovanim na polinukleotidima.
[0204] Izraz "fragment" u vezi sa promoterskim polinukleotidnim sekvencama treba da uključi sekvence koje sadrže cis-elemente i regione promoterske polinukleotidne sekvence sposobne da reguli šu ekspresiju polinukleotidne sekvence za koju je fragment operativno vezan.
[0205] Poželjno, fragmenti promoterskih polinukleotidnih sekvenci prema pronalasku sadr že najmanje 20, poželjnije najmanje 30, poželjnije najmanje 40, poželjnije najmanje 50, poželjnije najmanje 100, poželjnije najmanje 200, poželjnije u najmanje 300, poželjnije najmanje 400, poželjnije najmanje 500, poželjnije najmanje 600, poželjnije najmanje 700, poželjnije najmanje 800, poželjnije najmanje 900 i najpoželjnije najmanje 1000 susednih nukleotida promoterskog polinukleotida iz pronalaska.
[0206] Izraz "prajmer" se odnosi na kratki polinukleotid, koji obično ima slobodnu 3'OH grupu, koja je hibridizovana kao uzorak i koristi se za početnu polimerizaciju polinukleotida komplementarnog uzorku. Takav prajmer ima dužinu poželjno najmanje 5, poželjnije najmanje 6, poželjnije najmanje 7, poželjnije najmanje 9, poželjnije najmanje 10, poželjnije najmanje 11, poželjnije najmanje 12, poželjnije najmanje 13 poželjnije najmanje 14, poželjnije najmanje 15, poželjnije najmanje 16, poželjnije najmanje 17, poželjnije najmanje 18, poželjnije najmanje 19, poželjnije najmanje 20 nukleotida.
[0207] Izraz "proba" se odnosi na kratki polinukleotid koji se koristi za detekciju polinukleotidne sekvence koja je komplementarna sa probom, u testu na bazi hibridizacije. Proba se mo že sastojati od "fragmenta" polinukleotida kako je ovde definisano. Po moguć nosti takva proba je du žine najmanje 5, poželjnije najmanje 10, poželjnije najmanje 20, poželjnije najmanje 30, poželjnije najmanje 40, poželjnije najmanje 50, poželjnije najmanje 100, poželjnije najmanje 200, poželjnije najmanje 300, poželjnije najmanje 400 i najpoželjnije najmanje 500 nukleotida.
[0208] Izraz "varijanta" kako se ovde koristi se odnosi na polinukleotidne ili polipeptidne sekvence različite od specifično identifikovanih sekvenci, pri čemu se jedan ili više nukleotida ili aminokiselinskih ostataka briše, supstituiše ili dodaje. Varijante su prirodne alelne varijante ili varijante koje se ne javljaju u prirodi. Varijante su iz iste ili druge vrste i mogu obuhvatiti homologe, paraloge i ortologe. U nekim realizacijama, varijante polinukleotida i polipeptida poseduju biolo ške aktivnosti koje su iste ili slične onima kod polinukleotida ili polipeptida divljeg tipa. Izraz "varijanta" u odnosu na polinukleotide i polipeptide obuhvata sve oblike polinukleotida i polipeptida kako su ovde definisani.
Varijante polinukleotida
[0209] Varijantne polinukleotidne sekvence poželjno pokazuju najmanje 50%, poželjnije najmanje 51%, najmanje 52%, najmanje 53%, najmanje 54%, najmanje 55%, najmanje 56%, najmanje 57 %, najmanje 58%, najmanje 59%, najmanje 60%, najmanje 61%, najmanje 62%, najmanje 63%, najmanje 64%, najmanje 65%, najmanje 66%, najmanje 67 %, najmanje 68%, najmanje 69%, najmanje 70%, najmanje 71%, najmanje 72%, najmanje 73%, najmanje 74%, najmanje 75%, najmanje 76%, najmanje 77%, najmanje 78%, najmanje 79%, najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, pri najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, pri najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa određenom polinukleotidnom sekvencom. Identitet se nalazi u prozoru za upoređivanje od najmanje 20 nukleotidnih pozicija, poželjno najmanje 50 nukleotidnih pozicija, najmanje 100 nukleotidnih pozicija ili na celoj du žini navedene polinukleotidne sekvence.
[0210] Identitet polinukleotidne sekvence se može odrediti na sledeći način. Predmetna polinukleotidna sekvenca se upoređuje sa polinukleotidnom sekvencom kandidata koristeći BLASTN (iz BLAST paketa programa, verzija 2.2. 10 [Oktobar 2004]) u bl2seq (Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden (1999), "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247-250), koji je javno dostupan od NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Podrazumevani parametri bl2seq se koriste s tim što je potrebno isključiti filtriranje delova niske složenosti.
[0211] Identitet polinukleotidnih sekvenci se može ispitati pomoću sledećih unix parametara komandne linije: bl2seq -i nucleotideseql -j nucleotideseq2 -F F -p blastn.
[0212] Parametar -F F isključuje filtriranje sekcija male složenosti. Parametar -p bira odgovarajući algoritam za par sekvenci. Program bl2seq izveštava o identitetu sekvence kao o broju i procentu identičnih nukleotida u liniji "Identities =".
[0213] Identitet polinukleotidne sekvence se može takođe izračunati po celoj dužini preklapanja između polinukleotidnih sekvenci kandidata i subjekta koristeći globalne programe za poravnavanje sekvenci (npr. Needleman, S.B. i Wunsch, C.D. (1970) J. Mol. Biol. 48, 443-453). Potpuna implementacija Needleman-Wunsch algoritma za globalno poravnavanje se nalazi u “needle” programu u paketu EMBOSS (Rice, P. Longden, I. i Bleasby, A. EMBOSS: Otvoreni programski paket za evropsku molekularnu biologiju, Trendovi u genetici, Jun 2000, tom. 16, br. 6. str.276-277) koji se mogu dobiti na http://www.hgmp.mrc.ac.uk/Softvare/EMBOSS/. Server Evropskog instituta za bioinformatiku takođe pruža mogućnost izvođenja EMBOSS-needle globalnog poravnavanja između dve sekvence na mreži na adresi http:/www.ebi.ac.uk/emboss/ align/.
[0214] Alternativno, može se koristiti program GAP koji izračunava optimalno globalno poravnanje dve sekvence bez kažnjavanja terminalnih praznina. GAP je opisan u sledećem radu: Huang, X. (1994) On Global Sequence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.
[0215] Varijante polinukleotida iz ovog pronalaska takođe obuhvataju one koje pokazuju sličnost sa jednom ili više specifično identifikovanih sekvenci za koje je verovatno da će očuvati funkcionalnu ekvivalentnost tih sekvenci i za koje se razumno nije moglo očekivati da su se dogodile slučajno. Takva sličnost sekvence u odnosu na polipeptide je utvrđena pomoću javno dostupnog programa bl2seq iz paketa programa BLAST (verzija 2.2.10 [Oktobar 2004]) od NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/).
[0216] Sličnost polinukleotidnih sekvenci se može ispitati pomoću sledećih unix parametara komandne linije: bl2seq -i nucleotideseq1 -j nucleotideseq2 -F F -p TBlastx
[0217] Parametar -F F isključuje filtriranje sekcija male složenosti. Parametar -p bira odgovarajući algoritam za par sekvenci. Ovaj program pronalazi regione sličnosti između sekvenci i za svaki takav region prijavljuje "E vrednost" što je očekivani broj puta koji se može očekivati da se slučajno vidi takvo podudaranje u bazi podataka fiksne referentne veličine koja sadrži nasumične sekvence. Veličina ove baze podataka je podrazumevano podešena u programu bl2seq. Za male vrednosti E, mnogo manje od jedne, E vrednost je približno verovatnoća takvog slučajnog podudaranja.
[0218] Varijantne polinukleotidne sekvence poželjno pokazuju E vrednost manju od 1 x 10<-10>, poželjnije manje od 1 x 10<-20>, manje od 1 x 10<-30>, manje od 1 x 10<-40>, manje od 1 x 10<-50>, manje od 1 x 10<-60>, manje od 1 x 10<-70>, manje od 1 x 10<-80>, manje od 1 x 10<-90>, manje od 1 x 10<-100>, manje od 1 x 10<-110>, manje od 1 x 10<-120>ili manje od 1 x 10<-123>u poređenju sa bilo kojom od specifično identifikovanih sekvenci.
[0219] Alternativno, varijantni polinukleotidi iz ovog pronalaska hibridizuju sa navedenom polinukleotidnom sekvencom, ili njenim komplementima pod strogim uslovima.
[0220] Izraz "hibridizovati pod strogim uslovima", i njihovi gramatički ekvivalenti, se odnosi na sposobnost polinukleotidnog molekula da hibridizuje sa ciljnim polinukleotidnim molekulom (kao što je ciljni polinukleotidni molekul imobilizovan na DNK ili RNK blotu, kao što je Southern blot ili Northern blot) pod definisanim uslovima temperature i koncentracije soli. Sposobnost hibridizacije pod strogim uslovima hibridizacije se može odrediti početnom hibridizacijom pod manje strogim uslovima, a zatim povećanjem strogosti do željene strogosti.
[0221] U vezi polinukleotidnih molekula dužine veće od oko 100 baza, tipični strogi uslovi hibridizacije nisu više 25 do 30 °C (na primer, 10 °C) ispod temperature topljenja (Tm) nativnog dupleksa (vidi uopšte, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing,). Tm za molekule polinukleotida veće od oko 100 baza se može izračunati formulom Tm = 81. 5 0.41% (G C-log (Na ). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton i McCarthy, 1962, PNAS 84: 1390). Tipični strogi uslovi za polinukleotide dužine veće od 100 baza bili bi uslovi hibridizacije, kao što je prethodno pranje u rastvoru 6X SSC, 0.2% SDS; hibridizacija na 65 °C, 6X SSC, 0.2% SDS preko noći; zatim dva ispiranja po 30 minuta u 1X SSC, 0.1% SDS na 65 °C i dva ispiranja po 30 minuta u 0.2X SSC, 0.1% SDS na 65 °C.
[0222] Što se tiče molekula polinukleotida čija je dužina manja od 100 baza, primeri strogih uslova hibridizacije su 5 do 10 °C ispod Tm. U proseku, Tm polinukleotidnog molekula dužine manje od 100 bp se smanjuje za približno (500/dužina oligonukleotida) °C.
[0223] Što se tiče imitacija DNK poznatih kao peptidne nukleinske kiseline (PNA) (Nielsen et al., Science. 1991, 6. Decembar; 254 (5037):1497-500) Tm vrednosti su veće od onih za DNK-DNK ili DNK-RNK hibride i mogu se izračunati prema formuli opisanoj u Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1998, 1. Novembar; 26(21):5004-6. Primeri strogih uslova hibridizacije za DNK-PNA hibrid čija je dužina manja od 100 baza su 5 do 10 °C ispod Tm.
[0224] Varijantni polinukleotidi iz ovog pronalaska takođe obuhvataju polinukleotide koji se razlikuju od sekvenci iz pronalaska, ali koji, kao posledica degeneracije genetskog koda, kodiraju polipeptid koji ima sličnu aktivnost kao polipeptid kodiran polinukleotidom iz ovog pronalaska. Promena sekvence koja ne menja aminokiselinsku sekvencu polipeptida je "tiha varijacija". Osim ATG-a (metionina) i TGG-a (triptofana), u nekim primerima drugi kodoni za istu aminokiselinu se menjaju tehnikama priznatim u struci, na primer, radi optimizacije ekspresije kodona u određenom organizmu domaćinu.
[0225] Promene sekvence polinukleotida koje rezultiraju konzervativnim supstitucijama jedne ili vi še aminokiselina u kodiranoj sekvenci polipeptida bez značajne promene njegove biološke aktivnosti su takođe uključene u pronalazak. Stručnjak će biti svestan metoda za pravljenje fenotipski tihih supstitucija aminokiselina (vidi, npr. Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).
[0226] Varijantni polinukleotidi zbog tihih varijacija i konzervativnih supstitucija u kodiranoj polipeptidnoj sekvenci se mogu se odrediti pomoću javno dostupnog programa bl2seq iz paketa programa BLAST (verzija 2.2.10 [Oktobar 2004]) iz NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) preko TBlastx algoritma kao što je prethodno opisano.
Varijante polipeptida
[0227] Izraz "varijanta" u odnosu na polipeptide obuhvata one koji se prirodno javljaju, rekombinantne i sintetički proizvedene polipeptide. Varijantne polipeptidne sekvence po željno pokazuju najmanje 50%, poželjnije najmanje 51%, najmanje 52%, najmanje 53%, najmanje 54%, najmanje 55%, najmanje 56%, najmanje 57%, najmanje 58 %, najmanje 59%, najmanje 60%, najmanje 61%, najmanje 62%, najmanje 63%, najmanje 64%, najmanje 65%, najmanje 66%, najmanje 67%, najmanje 68%, najmanje 69%, najmanje 70%, najmanje 71%, najmanje 72%, najmanje 73%, najmanje 74%, najmanje 75%, najmanje 76%, najmanje%, najmanje 77%, najmanje 78%, najmanje 79%, najmanje 80%, najmanje 81%, najmanje 82%, najmanje 83%, najmanje 84%, najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98% ili najmanje 99% identiteta sa sekvencom iz ovog pronalaska. Identitet se nalazi preko prozora za upoređivanje od najmanje 20 pozicija aminokiselina, poželjno najmanje 50 pozicija aminokiselina, najmanje 100 pozicija aminokiselina ili preko cele dužine polipeptida prema pronalasku.
[0228] Identitet polipeptidne sekvence se može odrediti na sledeći način. Predmetna polipeptidna sekvenca se upoređuje sa polipeptidnom sekvencom kandidata korišćenjem BLASTP (iz paketa programa BLAST, verzija 2.2.10 [Oktobar 2004]) u bl2seq, koji je javno dostupan od NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Podrazumevani parametri bl2seq se koriste s tim što bi trebalo isključiti filtriranje regiona niske složenosti.
[0229] Identitet polipeptidne sekvence se takođe može izračunati po celoj dužini preklapanja između polinukleotidnih sekvenci kandidata i subjekta koristeći programe za poravnanje globalnih sekvenci. EMBOSS-needle (dostupan na http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/) i GAP (Huang, X. (1994) On Global Sekuence Alignment. Computer Applications in the Biosciences 10, 227-235.) kako je gore razmatrano su takođe pogodni globalni programi za poravnavanje sekvenci za izračunavanje identiteta polipeptidne sekvence.
[0230] Polipeptidne varijante iz ovog pronalaska takođe obuhvataju one koje pokazuju sličnost sa jednom ili više specifično identifikovanih sekvenci za koje je verovatno da će očuvati funkcionalnu ekvivalentnost tih sekvenci i za koje se razumno nije moglo očekivati da su se dogodile slučajno. Takva sličnost sekvence u odnosu na polypeptide se može utvrditi korišćenjem javno dostupnog programa bl2seq iz paketa programa BLAST (verzija 2.2.10 [Oktobar 2004]) iz NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/). Sličnost polipeptidnih sekvenci se može ispitati pomoću sledećih unix parametara komandne linije: bl2seq -i peptideseql -j peptideseq2 -F F -p blastp
[0231] Varijantne polipeptidne sekvence poželjno pokazuju E vrednost manju od 1 x 10<-10>, poželjnije manje od 1 x 10<-20>, manje od 1 x 10<-30>, manje od 1 x 10<-40>, manje od 1 x 10<-50>, manje od 1 x 10<-60>, manje od 1 x 10<-70>, manje od 1 x 10<-80>, manje od 1 x 10<-90>, manje od 1 x10<-100>, manje od 1 x 10<-110>, manje od 1 x 10<-120>ili manje od 1 x 10<-123>u poređenju sa bilo kojom od specifično identifikovanih sekvenci.
[0232] Parametar -F F isključuje filtriranje sekcija niske složenosti. Parametar -p bira odgovarajući algoritam za par sekvenci. Ovaj program pronalazi regije sličnosti između sekvenci i za svaki takav region prijavljuje "E vrednost" koja je očekivani broj puta koji se može očekivati da se slučajno vidi takvo podudaranje u bazi podataka fiksne referentne veličine koja sadrži nasumične sekvence. Za male E vrednosti, mnogo manje od jedan, ovo je otprilike verovatnoća takvog slučajnog podudaranja.
[0233] Konzervativne supstitucije jedne ili više aminokiselina opisane polipeptidne sekvence bez značajne promene njihove biološke aktivnosti su takođe uključene u pronalazak. Etručnjak će znati metode za stvaranje fenotipski tihih zamena aminokiselina (videti, na primer, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).
[0234] Polipeptidna varijanta iz ovog pronalaska takođe obuhvata onu koja se proizvodi od nukleinske kiseline koja kodira polipeptid, ali se razlikuje od polipeptida divljeg tipa po tome što se drugačije procesira tako da ima izmenjenu aminokiselinsku sekvencu. Na primer, varijanta se proizvodi alternativnim obrascem splajsovanja primarnog RNK transkripta u odnosu na onaj koji proizvodi polipeptid divljeg tipa.
[0235] Izraz "vektor" " se odnosi na polinukleotidni molekul, obično dvolančane DNK, koji se koristi za transport genskog konstrukta u ćeliju domaćina. U određenim primerima, vektor je sposoban za replikaciju u najmanje jednom dodatnom sistemu domaćina, kao što je E. coli.
2. Tuberkuloza
[0236] Treba imati u vidu da su čestice polimera, postupci i kompozicije iz ovog pronalaska delimično usmereni na identifikaciju, prevenciju ili lečenje tuberkuloze.
[0237] Tuberkuloza je ozbiljna globalna zdravstvena briga, koja rezultira sa preko 2 miliona ljudskih smrti godišnje, širom sveta. Bolest kod ljudi je uzrokovana bakterijom M. tuberculosis. Bakterija obično invadira pluća, udisanjem, izazivajući infekciju u plućima, koja se na kraju može proširiti na druge delove tela, uključujući centralni nervni sistem, limfni sistem, krvotok, genitourinarni sistem, gastrointestinalni sistem, kosti, zglobove i kožu (Dietrich, 2006; Mustafa, 2001). Razni oblici tuberkuloze kod poljoprivrednih životinja, poput tuberkuloze goveda (tipično uzrokovane od M. bovis) i Johnove bolesti (tipično uzrokovane od M. paratuberculosis), takođe imaju značajan negativan uticaj na proizvodnju. Micobacterium je rod Actinobacteria. Rod uključuje patogene za koje se zna da izazivaju ozbiljne bolesti kod sisara, uključujući tuberkulozu i gubu. Primeri vrsta patogena uključuju M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum, M. microti; M. leprae (lepra), M. avium paratuberculosis (povezana sa Kronovom bolešću kod ljudi i Johne bolešću kod ovaca).
[0238] Širenje infekcije bakterijom M. tuberculosis ili M. bovis je ograničeno imunološkim sistemom. Mnogi pojedinci pokazuju samo neke simptome pored kašlja i groznice. Međutim, približno 30% pojedinaca nije u stanju da dovoljno kontroliše infekciju i razvija primarnu bolest. Uprkos tome, bolest može da miruje kod pojedinaca, inficirajući ih ponovo godinama ili čak decenijama kasnije. Iz tog razloga, M. tuberculosis i M. bovis su neuobičajene među zaraznim bakterijama, jer mogu izbeći imunološki odgovor i preživeti u refraktornoj fazi koja se ne replicira ili sporo replicira tokom du žeg vremenskog perioda.
[0239] Tuberkulozna infekcija se ispoljava u tri faze. Prva akutna faza je identifikovana proliferacijom bakterija u telesnim organima. Brzo sledi imunološki odgovor koji kontroliše infekciju i na kraju rezultira smanjenjem bakterijskog opterećenja. Nakon akutne faze, uspostavlja se druga latentna faza. Tokom ove druge faze, bakterijsko opterećenje se održava na stabilnom i niskom nivou. M. tuberculosis ili M bovis prelaze iz aktivnog stanja razmnožavanja u akutnoj fazi u stanje mirovanja u latentnoj fazi. Može doći do treće faze reaktivacije pri kojoj bakterije ponovo počinju da se razmnožavaju. Faktori koji utiču na ovu treću fazu još uvek nisu poznati (Barnes i Cave, 2003).
[0240] Smatralo se da se promene u antigenskoj specifičnosti imunološkog odgovora javljaju u različitim fazama infekcije, jer je bakterija sposobna da modulira ekspresiju gena tokom prelaska iz aktivne replikacije u stanje mirovanja.
2.1 Trenutne strategije lečenja
[0241] Trenutne strategije lečenja za zaštitu od tuberkuloze uključuju specifične vakcine protiv poznatih antigena, ili lečenje antibioticima kod pacijenata inficiranih intracelularnim bakterijskim patogenima.
[0242] Nedostatak odgovarajućih vakcina za zaštitu od reaktivacije intraćelijskih patogena, profilaktički pre infekcije ili terapeutski nakon početka infekcije, doveo je do potrebe za novim i poboljšanim strategijama lečenja protiv intraćelijskih patogena.
[0243] Na primer, jedina trenutno dostupna vakcina protiv tuberkuloze je Bacille Calmette-Geurin (BCG), koja sadrži žive oslabljene sojeve Micobacterium bovis. Efikasnost BCG-a u kontroli tuberkulozne infekcije je ograničena. Iako se čini da vakcina štiti decu od primarne bolesti, njena zaštitna efikasnost u odnosu na odrasli oblik bolesti (reaktivacija nakon latentnosti) je smanjena (Svetska Zdravstvena Organizacija - http://www.who.int). Takođe je zabeleženo da je efikasnost BCG-a ograničena u mnogim zemljama trećeg sveta gde je tuberkuloza rasprostranjena. Osim toga, budući da je BCG vakcina živa vakcina, nije pogodna za primenu kod imuno-kompromitovanih pacijenata. Iako BCG vakcina navodno smanjuje širenje M. tuberculosis u slezinu (i druge organe), ona ne sprečava rast bakterija u plućima.
[0244] Nedostatak odgovarajuće vakcine za zaštitu od reaktivacije, profilaktički pre infekcije, ili terapeutski nakon početka infekcije, zajedno sa drugim problemima povezanim sa živim vakcinama, doveo je do potrebe za novom i poboljšanom strategijom dijagnoze i lečenja tuberkuloze.
3. Imunološki odgovor
3.1. Ćelijski posredovani odgovor
[0245] Ćelijski posredovani imunitet je prvenstveno posredovan od T-limfocita. Patogeni antigeni se eksprimiraju na površini ćelija koje predstavljaju antigen (kao što su makrofagi, B-limfociti i dendritične ćelije), vezanih za bilo koji od histokompatibilnih molekula MHC Klase I ili molekula MHC Klase II. Prezentacija patogenog antigena vezanog za MHC Klase II aktivira odgovor pomo ćnih (CD4+) T-ćelija. Nakon vezivanja T-ćelije za antigen-MHC II kompleks, CD4+ T-ćelije se razmnožavaju, oslobađajući citokine, uključujući interferon-gama (IFN-γ) i interleukin 2 (IL-2), IL-4, IL-7, i IL-12.
[0246] Prezentacija patogenih antigena vezanih za molekule MHC Klase I aktivira citotoksi čni (CD8+) odgovor T-ćelija. Nakon vezivanja T-ćelije za antigen-MHC I kompleks, ćelije CD8+ luče perforin, što dovodi do lize, otoka i smrti ćelija patogena. Alternativno, CD8+ ćelije izazivaju programiranu ćelijsku smrt ili apoptozu. Aktivacija CD8+ T-ćelija se pojačava oslobađanjem specifičnih citokina od strane CD4+ T-ćelija.
[0247] Veruje se da je ćelijski posredovani imunološki odgovor centralni za imunitet protiv različitih patogena, uključujući intraćelijske patogene kao što je M. tuberculosis.
[0248] Postupci za procenu i praćenje početka ili progresije ćelijski posredovanog odgovora kod subjekta su dobro poznati u struci. Pogodni primeri metoda uključuju one u kojima se procenjuje prisustvo ili nivo jednog ili više citokina povezanih sa ćelijski posredovanim odgovorom, kao što su oni koji su ovde identifikovani, uključujući, na primer, interferongamma. Slično, ćelijske metode za procenu ili praćenje početka i progresije ćelijski posredovanog odgovora se mogu koristiti u ovom pronalasku, i mogu uključivati testove proliferacije ili aktivacije ćelija, uključujući testove usmerene na identifikaciju aktivacije ili ekspanzije jedne ili vi še populacija imunih ćelija, kao što su T-limfociti.
[0249] U određenim realizacijama su poželjne metode iz pronalaska koje izazivaju i ćelijski posredovani imunološki odgovor i humoralni odgovor.
[0250] U drugim realizacijama, poželjni su postupci iz pronalaska koji izazivaju pretežno ćelijski posredovan odgovor. Takve metode mogu uključivati one koje izazivaju ćelijski posredovan imunološki odgovor bez značajnog humoralnog odgovora, ili bez ikakvog detektovanog humoralnog odgovora. U jednom primeru, imuni odgovor je ćelijski posredovan imunološki odgovor, kao što je onaj indikovan IFN-γ odgovorom, u odsustvu značajnijeg IgA odgovora, ili u odsustvu značajnijeg IgE odgovora, ili u odsustvu značajnijeg IgG odgovora, uključujući odsustvo značajnijeg IgG1 odgovora, ili odsustvo značajnijeg IgG2 odgovora, ili u odsustvu značajnijeg IgM odgovora.
3.2. Humoralni odgovor
[0251] Humoralni imunološki odgovor je posredovan izlučenim antitelima koja proizvode B ćelije. Izlučena antitela se vezuju za antigene prisutne na povr šini invazivnih patogena, označavajući ih za distrukciju.
[0252] Predloženo je da bi kombinovani ćelijski posredovani i humoralni odgovor (poput onog koji je posledica iniciranog ćelijski posredovanog odgovora) bio koristan za postizanje još senzitivnijeg imunološkog odgovora ili na povećanje nivoa zaštite od intracelularnih patogena.
[0253] Opet, metode za procenu i praćenje početka ili progresije humoralnog odgovora su dobro poznate u tehnici. Ovo uključuje testove vezivanja antitela, ELISA, testove uboda kože i slično.
4. Antigeni Tuberkuloze
[0254] Treba imati u vidu da je okarakterisano mnogo antigena M. tuberculosis i M. bovis. Primeri M. tuberculosis i M. bovis antigena su rani sekretorni antigen (ESAT) -6, Ag85A, Ag85B (MPT59), Ag85B, Ag85C, MPT32, MPT51, MPT59, MPT63, MPT64, MPT83, MPB5, MPB59, MPB64, MTC28, MTB2, MTB8.4, MTB9.9, MTB32A, MTB39, MTB41, TB10.4, TB10C, TB11B, TB12.5, TB13A, TB14, TB15, TB15A, TB16, TB16A, TB17, TB18, TB21, TB20.6, TB24, TB27B, TB32, TB32A, TB33, TB38, TB40.8, TB51, TB54, TB64, CFP6, CFP7, CFP7A, CFP7B, CFP8A, CFP8B, CFP9, CFP10, CFP11, CFP16, CFP17, CFP19, CFP19A, CFP19B, CFP20, CFP21, CFP22, CFP22A, CFP23, CFP23A, CFP23B, CFP25, CFP25A, CFP27, CFP28, CFP28B, CFP29, CFP30A, CFP30B, CFP50, CWP32, hspX (alfa-kristalni), APA, prečišćeni proteinski derivat tuberkulina (PPD), ST-CF, PPE68, LppX, PstS-1, PstS-2, PstS-3, HBHA, GroEL, GroEL2, GrpES, LHP, 19kDa lipoprotein, 71kDa, RD1-ORF2, RD1-ORF3, RD1-ORF4, RD1-ORF5, RD1-ORF8, RD1-ORF9A, RD1-ORF9B, Rv1984c, Rv0577, Rv1827, BfrB, Tpx. Rv1352, Rv1810, PpiA, Cut2, FbpB, FbpA, FbpC, DnaK, FecB, Ssb, Rp1L, FixA, FixB, AhpC2, Rv2626c, Rv1211, Mdh, Rv1626, Adk, C1pP, SucD (Belisle et al, 2005; US 7,037,510; US 2004/0057963; US 2008/0199493; US 2008/0267990), ili najmanje jedan antigenski deo ili epitop T-ćelija bilo kog od gore navedenih antigena.
[0255] Međutim, aplikanti su utvrdili da je kombinacija antigena izabranih iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c posebno efikasna u ovom pronalasku.
[0256] Aminokiselinska sekvenca ESAT6 antigena je sledeća:
[0257] Aminokiselinska sekvenca antigena CFP10 je sledeća:
[0258] Aminokiselinska sekvenca antigena Rv3615c je sledeća:
[0259] Aminokiselinska sekvenca antigena Rv3020c je sledeća:
[0260] Aminokiselinska sekvenca antigena Rv2346c je sledeća:
[0261] U različitim primerima, dva ili više antigena, na primer tri, četiri ili svih pet antigena izabrana iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c, Rv3020c i Rv2346c, ili dva ili više vezujućih domena sposobnih za vezivanje navedenih antigena, ili bilo koja njihova kombinacija, se proizvode kao fuzioni proteini, koji u nekim realizacijama dodatno sadrže polipeptid koji formira čestice. U nekim realizacijama se mogu dodatno koristiti drugi antigeni M. tuberculosis ili M. bovis, uključujući druge M. tuberculosis ili M. bovis antigene izabrane od gore navedenih antigena.
[0262] Na primer, u jednoj realizaciji, dva ili više antigena sadrže ESAT6-Rv3020c fuziju, na primer za fuziju u okviru na C-kraju polimer sintaze, kao što je phaC, koja sadrži aminokiselinsku sekvencu:
[0263] U drugom primeru, dva ili više antigena sadrže CFP10, Rv3615c i ESAT6, na primer kao fuzioni polipeptid koji dodatno sadrži polimer sintazu, kao što je PhaC. Na primer, fuzioni polipeptid sadrži CFP10 i Rv3615c kondenzovane sa N-krajem PhaC, sa ESAT6 kondenzovanim sa C-krajem, kao što je polipeptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu ovde kao SEK ID BR: 10.
[0264] U drugim realizacijama, fuzioni polipeptidi prema pronalasku sadrže fuzije antigena kako je ovde opisano u primerima, uključujući, na primer, fuzione polipeptide koji sadrže amino-kiselinsku sekvencu bilo koje od SEK ID BR: 7 do 10, uključujući one kodirane nukleotidnim sekvencama bilo koje od SEK ID BR: 11 do 15.
[0265] Treba imati u vidu da fuzioni polipeptidi koji sadrže dva ili više antigena za upotrebu u ovom pronalasku mogu biti kodirani sekvencama nukleinskih kiselina pogodnim za ekspresiju, uklju čujući i one optimizovane za ekspresiju u različitim ćelijama domaćina. Na primer, fuzioni polipeptid ESAT6-Rv3020c prikazan ovde kao SEK ID BR: 6 može biti kodiran nukleotidnom sekvencom optimizovanom za ekspresiju u E. coli, korišćenjem optimizacije kodona, kao što je nukleotidna sekvenca:
[0266] U drugoj realizaciji kodirajuće sekvence nukleinske kiseline optimizovane za ekspresiju u određenom domaćinu, fuzioni polipeptid CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu prikazanu ovde kao SEK ID BR: 10 je korišćenjem optimizacije kodona kodiran nukleotidnom sekvencom optimizovanom za ekspresiju u E. coli, kao što je nukleotidna sekvenca:
[0267] U drugim realizacijama, fuzioni polipeptidi prema pronalasku uključuju one kodirane nukleotidnim sekvencama bilo koje od SEK ID BR: 11 do 15.
Ekspresioni konstrukti
[0268] Procesi za proizvodnju i upotrebu ekspresioniih konstrukta za ekspresiju fuzionih polipeptida u mikroorganizmima, biljnim ćelijama ili životinjskim ćelijama (ćelijski ekspresioni sistemi) ili u ekspresionim sistemima bez ćelija, a ćelije domaćini koje sadrže ekspresione konstrukte korisne za formiranje čestica polimera za upotrebu u pronalasku su dobro poznate u tehnici (npr. Sambrook et al., 1987; Ausubel et al., 1987).
[0269] Ekspresioni konstrukti za upotrebu u postupcima iz pronalaska su u jednoj realizaciji umetnuti u replikabilni vektor za kloniranje ili za ekspresiju, ili su u drugoj realizaciji inkorporirani u genom domaćina. Razni vektori su javno dostupni. Vektor je, na primer, u obliku plazmida, kozmida, virusne čestice ili faga. Odgovarajuća sekvenca nukleinske kiseline se može umetnuti u vektor različitim postupcima. Generalno, DNK se ubacuje na odgovarajuće mesto(a) restrikcione endonukleaze koristeći tehnike poznate u struci. Vektorske komponente generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jednu ili više signalnih sekvenci, mesto početka replikacije, jedan ili više selektabilnih gen markera, enhancerski element, promoter i sekvencu za prekid transkripcije. Konstrukcija odgovaraju ćih vektora koji sadrže jednu ili više ovih komponenti koristi standardne tehnike ligacije poznate u tehnici.
[0270] I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina. Takve sekvence su dobro poznate za razne bakterije, kvasce i viruse.
[0271] U jednoj realizaciji ekspresioni konstrukt je prisutan na vektoru sa velikim brojem kopija.
[0272] U jednoj realizaciji, vektor sa velikim brojem kopija je izabran od onih koji su prisutni sa 20 do 3000 kopija po ćeliji domaćina.
[0273] U jednoj realizaciji, vektor sa velikim brojem kopija sadrži izvor replikacije sa velikim brojem kopija (ori), kao što je ColE1 ili izvor replikacije izveden iz ColE1. Na primer, izvor replikacije izveden iz ColE-1 može da sadrži izvor replikacije pUC19.
[0274] Brojni izvori replikacije sa velikim brojem kopija pogodni za upotrebu u vektorima iz ovog pronalaska su poznati stručnjacima u ovoj oblasti. Ona uključuju izvore replikacije ColEl-izvedene iz pBR322 i njihove derivate, kao i druge izvore replikacije sa velikim brojem kopija, poput M13 FR ori ili p15A ori. 2µ plazmidni izvor replikacije je pogodan za kvasac, a razni viralni izvori replikacije (SV40, poliom, adenovirus, VSV ili BPV) su korisni za kloniranje vektora u ćelijama sisara.
[0275] Poželjno, izvor replikacije sa velikim brojem kopija obuhvata mesto početka replikacije pUC19 izvedeno iz ColEl.
[0276] Restrikciono mesto je pozicionirano u izvor replikacije tako da će kloniranje inserta u restrikciono mesto inaktivirati izvor replikacije, čineći ga nesposobnim da usmeri replikaciju vektora. Alternativno, najmanje jedno restrikciono mesto je postavljeno unutar izvora replikacije tako da će kloniranje inserta u restrikciono mesto njega učiniti sposobnim da podrži samo replikaciju vektora sa malim brojem ili jednom kopijom.
[0277] Ekspresioni i klonirajući vektori će tipično sadržati gen za selekciju, takođe označen kao selekcioni marker za otkrivanje prisustva vektora u transformisanoj ćeliji domaćina. Tipični selekcioni geni kodiraju protein koji pruža (a) otpornost na antibiotike ili druge toksine, npr. Ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) komplement auksotrofne deficijencije, ili (c) snabdevaju kriti čne hranljive materije koje nisu dostupne iz složenih medija, npr. gen koji kodira D-alanin racemazu za Bacilli.
[0278] Selektabilni markeri koji se obično koriste u biljnoj transformaciji uključuju gen neomicin fosfotransferaze II (NPT II) koji daje rezistenciju na kanamicin, gen aadA, koji daje otpornost na spektinomicin i streptomicin, fosfinotricin acetil transferazu (bar gen) za Ignite (AgrEvo) i Basta (Hoechst) rezistenciju i gen za higromicin fosfotransferazu (hpt) za otpornost na higromicin.
[0279] Primeri pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija sposobnih da preuzmu ekspresione konstrukte, kao što je DHFR ili timidin kinaza. Odgovarajuća ćelija domaćin kada se koristi DHFR divljeg tipa je CHO ćelijska linija sa nedostatkom DHFR aktivnosti, pripremljena i razmnožena kako je opisano u Urlaub et al., 1980. Pogodan selekcioni gen za upotrebu u kvascu je trp1 gen prisutan u plazmidu kvasca IRp7 (Stinchcomb et al., 1979; Kingsman et al., 1979; Tschemper et al., 1980). Trp1 gen pruža selekcioni marker za mutirani soj kvasca koji nema sposobnost rasta u triptofanu, na primer, ATCC br. 44076 ili PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:12 (1977)].
[0280] Ekspresioni konstrukt koristan za formiranje čestica polimera poželjno uključuje promoter koji kontroliše ekspresiju najmanje jedne nukleinske kiseline koja kodira polimer sintazu, protein koji formira čestice ili fuzioni polipeptid.
[0281] Promoteri prepoznati po nizu potencijalnih ćelija domaćina su dobro poznati. Promoteri pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju sisteme promotera β-laktamaze i laktoze [Chang et al., 1978; Goeddel et al., 1979), alkalna fosfataza, sistem promotera triptofana (trp) [Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], i hibridni promoteri kao što je tac promoter [deBoer et al., 1983). Promoteri za upotrebu u bakterijskim sistemima će takođe sadržavati Shine-Dalgarno (SD) sekvencu operativno povezanu sa nukleinskom kiselinom koja kodira polimer sintazu, protein koji formira čestice ili fuzioni polipeptid.
[0282] Primeri pogodnih promotivnih sekvenci za upotrebu sa kvascima domaćinima uključuju promotere za 3-fosfoglicerat kinazu [Hitzeman et al., 1980) ili druge glikolitičke enzime [Hess et al., 1968; Holland, 1978), kao što je enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triosefosfat izomeraza, fosfoglukozna izomeraza i glukokinaza.
[0283] Drugi promoteri kvasca, koji su inducibilni promoteri koji imaju dodatnu prednost transkripcije kontrolisanu uslovima rasta, su regioni promotera za alkohol dehidrogenazu 2, izocitohrom C, kiselu fosfatazu, razgradive enzime povezane sa metabolizmom azota, metalotionein, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu i enzime odgovorne za iskorišćavanje maltoze i galaktoze.
[0284] Primeri pogodnih promotera za upotrebu u biljnim ćelijama domaćinima, uključujući tkivo ili organ monokotilne ili dikotilne biljke, uključuju promotere specifične za ćelije, tkiva i organe, specifične promotere ćelijskog ciklusa, temporalne promotere, inducibilne promotere, konstitutivne promotere koji su aktivni u većini biljnih tkiva i rekombinantne promotere. Izbor promotera će zavisiti od temporalne i prostorne ekspresije kloniranog polinukleotida, tako poželjnog. Promoteri su oni iz ćelije domaćina, ili promoteri koji su izvedeni iz gena drugih biljaka, virusa i biljnih patogenih bakterija i gljivica. Stručnjaci u ovoj oblasti će bez nepotrebnih eksperimenata moći da izaberu promotere koji su pogodni za upotrebu u modifikovanju i moduliranju ekspresionih konstrukata korišćenjem genskih konstrukata koji sadrže polinukleotidne sekvence iz pronalaska. Primeri konstitutivnih biljnih promotera uključuju CaMV 35S promoter, promoter nopalin sintaze i promoter oktopan-sintaze i promoter Ubi 1 iz kukuruza. Biljni promoteri koji su aktivni u specifi čnim tkivima, reaguju na unutrašnje razvojne signale ili spoljašnje abiotičke ili biotičke stresove su opisani u naučnoj literaturi. Primeri promotera su opisani, na primer, u WO 02/00894, koji je ovde uključen referencom.
[0285] Primeri pogodnih promotera za upotrebu u ćelijama domaćina sisara obuhvataju one dobijene iz genoma virusa kao što je polioma virus, virus boginja, adenovirus (kao što je adenovirus 2), goveđi papiloma virus, virus ptičjeg sarkoma, citomegalovirus, retrovirus, hepatitis-B virus i Simian Virus 40 (SV40), od heterolognih promotera sisara, npr. promotera aktina ili promotera imunoglobulina, i od promotera toplotnog šoka, pod uslovom da su takvi promoteri kompatibilni sa sistemima ćelija domaćina.
[0286] Transkripcija ekspresionog konstrukta od viših eukariota je u nekim primerima povećana umetanjem sekvence pojačivača u vektor. Pojačivači su cis-delujući elementi DNK, obično od 10 do 300 bp koji deluju na promoter kako bi povećali njegovu transkripciju. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Obično će se, međutim, koristiti pojačivač iz virusa eukariotskih ćelija. Primeri uključuju pojačivač SV40 na kasnoj strani izvora replikacije (bp 100-270), pojačivač ranog promotera citomegalovirusa, pojačivač polioma na kasnoj strani izvora replikacije i adenovirusne pojačivače. Obično je pojačivač splajsovan u vektor na poziciji 5' ili 3' u odnosu na polimer sintazu, protein koji formira čestice ili fuzioni polipeptid koji kodira sekvencu, ali se poželjno nalazi na mestu 5' od promotera.
[0287] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasac, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudi ili ćelije sa jedrom iz drugih višećelijskih organizama) će takođe sadržati sekvence neophodne za prekidanje transkripcije i za stabilizaciju mRNK. Takve sekvence su obi čno dostupne iz 5' i, povremeno 3', netransliranih regiona eukariotskih ili virusnih DNK ili cDNK. Ovi regioni sadrže nukleotidne segmente transkribovane kao poliadenilovani fragmenti u netransliranom delu mRNK koji kodira polimer sintazu, protein koji formira čestice ili fuzioni polipeptid.
[0288] U jednoj realizaciji, ekspresioni konstrukt sadrži uzvodno inducibilni promoter, kao što je BAD promoter, koji je indukovan arabinozom.
[0289] U jednoj realizaciji ekspresioni konstrukt sadrži konstitutivni ili regulabilni sistem promotera.
[0290] U jednoj realizaciji, sistem promotera koji se može regulisati je indukcibilni ili represibilni sistem promotera.
[0291] Iako je poželjno koristiti jake promotere u proizvodnji rekombinantnih proteina, regulacija ovih promotera je od suštinskog značaja jer konstitutivna hiperprodukcija heterolognih proteina dovodi do smanjenja brzine rasta, stabilnosti plazmida i održivosti kulture.
[0292] Određeni broj promotera je regulisan interakcijom proteina represora sa operatorom (region nizvodno od promotera). Najpoznatiji operatori su oni iz lac operona i bakteriofaga A. Pregled regulisanih promotera u E. coli dat je u Tabeli 1 Friehs & Reardon, 1991.
[0293] Glavna razlika između standardnih kultivacija bakterija i onih koje uključuju rekombinantnu E. coli je razdvajanje faza rasta i produkcije ili faze indukcije. Proizvodnja rekombinantnih proteina često koristi prednosti regulisanih promotera da bi se postigla velika gustina ćelija u fazi rasta (kada je promoter „isključen“, a metaboličko opterećenje ćelije domaćina malo), a zatim visoke stope produkcije heterolognih proteina u fazi indukcije (nakon indukcije za uklju čivanje promotera).
[0294] U jednoj realizaciji, regulabilni promoterski sistem je izabran od LacI, Trp, fag γ i faga RNK-polimeraze.
[0295] U jednoj realizaciji, sistem promotera je izabran između lac ili Ptac promotera i lacI represora, ili trp promotera i TrpR represora.
[0296] U jednom aspektu, LacI represor se inaktivira dodavanjem izopropil-β-D-tiogalaktopiranozida (IPTG) koji se vezuje za aktivni represor izaziva disocijaciju od operatora, dozvoljavaju ći ekspresiju.
[0297] U jednoj realizaciji, sistem trp promotera koristi sintetički medijum sa definisanom koncentracijom triptofana, tako da kada koncentracija padne ispod grani čnog nivoa, sistem postaje samoinducibilan. U jednoj realizaciji, 3-β-indol-akrilna kiselina je dodata da bi se deaktivirao TrpR represor.
[0298] U jednoj realizaciji, sistem promotera može da koristi bakteriofag γ represor cI. Ovaj represor koristi γ profag i sprečava ekspresiju svih litičkih gena interakcijom sa dva operatora koji se zovu OL i OR. Ovi operatori se preklapaju sa dva jaka promotera PL i PR. U prisustvu cI represora se spre čava vezivanje RNK polimeraze. CI represor se može deaktivirati UV zračenjem ili tretiranjem ćelija mitomicinom C. Pogodniji način da se omogući ekspresija rekombinantnog polipeptida je primena temperaturno-senzitivne verzije cI represora cI857. Ćelije domaćini koje nose γ-baziran ekspresioni sistem se mogu gajiti do srednje eksponencijalne faze na niskoj temperaturi, a zatim preneti na visoku temperaturu da se izazove ekspresija rekombinantnog polipeptida.
[0299] Široko korišćen ekspresioni sistem koristi fagnu T7 RNK polimerazu koja prepoznaje samo promotere koji se nalaze na T7 DNK, a ne i promotere prisutne na hromozomu ćelije domaćina. Prema tome, ekspresioni konstrukt može sadržati jedan od T7 promotera (obično je promoter prisutan ispred gena 10) na koji će rekombinantni gen biti vezan. Gen koji kodira T7 RNK polimerazu je ili prisutan na ekspresionom konstruktu, na drugom kompatibilnom ekspresionom konstruktu ili je integrisan u hromozom ćelije domaćina. U sva tri slučaja, gen je spojen sa inducibilnim promoterom omogućavajući njegovu transkripciju i translaciju tokom faze ekspresije.
[0300] Sojevi E. coli BL21 (DE3) i BL21 (DE3) pLysS (Invitrogen, CA) su primeri ćelija domaćina koje nose gen T7 RNK polimeraze (postoji još nekoliko veoma pogodnih i komercijalno dostupnih sojeva E. coli koji sadrže gen polimeraze T7RNK kao što je npr. KRX i XJ (autolizing). Drugi ćelijski sojevi koji nose gen T7 RNK polimeraze su poznati u tehnici, kao što je Pseudomonas aeruginosa ADD1976 koji sadrži gen T7 RNK polimeraze integrisan u genom (Brunschvig & Darzins, 1992) i Cupriavidus necator (ranije Ralstonia eutropha) koji sadrži gen T7 RNK polimeraze integrisan u genom pod kontrolom phaP promotera (Barnard et al. 2004).
[0301] T7 RNK polimeraza nudi tri prednosti u odnosu na enzime ćelije domaćina: prvo, sastoji se od samo jedne podjedinice, drugo ima veću procesivnost, i treće insenzitivna je na rifampicin. Ova druga karakteristika se može posebno koristiti za povećanje količine fuzionog polipeptida dodavanjem ovog antibiotika oko 10 minuta nakon indukcije gena koji kodira T7 RNK polimerazu. Za to vreme, sintetizuje se dovoljno polimeraze da omogući visok nivo ekspresije fuzionog polipeptida, a inhibicija enzima ćelije domaćina sprečava dalju ekspresiju svih ostalih gena prisutnih i na plazmidu i na hromozomu. U tehnici su poznati i drugi antibiotici koji inhibiraju bakterijsku RNK polimerazu, ali ne i T7 RNK polimerazu, kao što su streptolidigin i streptovaricin.
[0302] Pošto su svi sistemi promotera propusni, niska ekspresija gena koji kodira T7 RNK polimerazu može biti štetna za ćeliju u onim slučajevima kada rekombinantni polipeptid kodira toksičan protein. Ovi molekuli polimeraze prisutni tokom faze rasta mogu biti inhibirani ekspresijom T7 kodiranog gena za lizozim. Ovaj enzim je bifunkcionalni protein koji preseca vezu u ćelijskom zidu ćelije domaćina i selektivno inhibira T7 RNK polimerazu vezujući se za nju, mehanizmom povratne sprege koji osigurava kontrolisani nalet transkripcije tokom T7 infekcije. Soj E. coli BL21 (DE3) pLisS je primer ćelije domaćina koja nosi plazmid pLisS koji konstitutivno eksprimira T7 lizozim.
[0303] U jednom aspektu, sistem promotera koristi promotere kao što su API ili APR koji su indukovani ili "uključeni" da iniciraju ciklus indukcije temperaturnim pomakom, na primer podizanjem temperature sa oko 30-37 °C na 42 °C da bi inicirali indukcioni ciklus.
[0304] Jak promoter može povećati gustinu fuzionog polipeptida na površini čestice tokom in-vivo proizvodnje.
[0305] Primeri fuzionih polipeptida sadrže: polimer sintazu i bilo koja dva ili više od sledećeg
(i) ESAT6 antigen,
(ii) vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen,
(iii) CFP10 antigen,
(iv) vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
(v) antigen Rv3615c,
(vi) vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c
(vii)antigen Rv3020c,
(viii) vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c.
[0306] Drugi primeri fuzionih polipeptida obuhvataju:
polimer sintazu i bilo koja dva ili više od sledećeg
(ix) ESAT6 antigen,
(x) vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen,
(xi) antigen CFP10,
(xii) vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
(xiii) antigen Rv3615c,
(xiv) vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c
(xv)antigen Rv3020c,
(xvi) vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3020c, i
(xvii) antigen Rv2346c
(xviii) vezujući domen sposoban da veže antigen Rv2346c.
[0307] Nakon ekspresije, fuzioni polipeptid je u stanju da formira ili olak ša stvaranje čestice polimera.
[0308] U jednoj realizaciji, sekvenca nukleinske kiseline koja kodira najmanje polimer sintazu je indirektno spojena sa drugim sekvencama nukleinske kiseline preko polinukleotidne linker ili spejser sekvence željene dužine.
[0309] U jednoj realizaciji, aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida koja sadr ži antigen(e) ili vezujući domen(e) je susedna sa C-krajem aminokiselinske sekvence koja sadrži polimer sintazu.
[0310] U jednoj realizaciji, aminokiselinska sekvenca fuzionog proteina koji sadr ži antigen(e) ili vezujući domen(e) je indirektno spojena sa N-krajem aminokiselinske sekvence koja sadr ži fragment polimer sintaze preko peptidnog linkera ili spejsera željene dužine koja omogućava nezavisno savijanje fuzionih polipeptida.
[0311] U jednoj realizaciji, aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida, antigen (i) ili vezuju ći domen(i) su susedni sa N-krajem aminokiselinske sekvence koja sadrži protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu, ili C-terminalni fragment sintaze.
[0312] U jednoj realizaciji, aminokiselinska sekvenca fuzionog proteina antigen(i) ili vezuju ći domen(i) je indirektno spojen sa C-krajem aminokiselinske sekvence koja sadrži protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu, ili N-terminalni fragment polimer sintaze preko peptidnog linkera ili spejsera željene dužine kako bi se olakšalo nezavisno savijanje fuzionih polipeptida.
[0313] U jednoj realizaciji, aminokiselinska sekvenca fuzionog polipeptida antigen(i) ili vezuju ći domen(i) je susedni sa N-krajem aminokiselinske sekvence koja kodira depolimerazu, ili C-terminalni depolimerazni fragment.
[0314] Jedna prednost fuzionih polipeptida prema ovom pronalasku je ta što modifikacija proteina koji se vezuju za površinu čestica polimera ne utiče na funkcionalnost proteina uključenih u formiranje čestica polimera. Na primer, funkcionalnost polimer sintaze se zadržava ako se rekombinantni polipeptid spoji sa njegovim N-terminalnim krajem, što rezultira produkcijom rekombinantnog polipeptida na površini čestice. Ako bi fuzija ipak poremetila funkcionalnost proteina, ovaj nedostatak se kompenzuje prisustvom dodatnog proteina koji formira čestice koji obavlja istu funkciju i prisutan je u aktivnom stanju.
[0315] Na ovaj način, moguće je obezbediti stabilnu vezu rekombinantnog polipeptida vezanog za čestice polimera preko proteina koji stvaraju čestice.
[0316] Treba imati na umu da raspored proteina u fuzionom polipeptidu zavisi od redosleda sekvenci gena u nukleinskoj kiselini sadržanoj u plazmidu.
[0317] Na primer, može biti poželjno da se proizvede fuzioni polipeptid u kome je antigen M. tuberculosis indirektno spojen sa polimer sintazom. Izraz "indirektno spojen" se odnosi na fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu i najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen ili vezujući domen koji može da veže najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen koji su odvojeni dodatnim proteinom koji može biti bilo koji protein koji trba da se eksprimira u fuzionom polipeptidu.
[0318] Kada se koristi u kontekstu čestica za upotrebu u dijagnostici ili lečenju tuberkuloze, može biti poželjno proizvesti fuzioni polipeptid u kome su antigen(i) M. tuberculosis ili M. bovis ili najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis vezujući domen je indirektno spojen sa polimer sintazom.
[0319] U jednoj realizaciji, dodatni protein je izabran od proteina koji formira čestice ili fuzionog polipeptida ili linkera ili spejsera kako bi se olakšalo nezavisno savijanje fuzionih polipeptida, kao što je gore razmatrano. U ovoj realizaciji bi bilo neophodno naru čiti sekvencu gena u plazmidu takvu da odražava željeni raspored fuzionog polipeptida.
[0320] U drugim realizacijama, M. tuberculosis ili M. bovis antigen(i) ili vezujući domen(i) koji mogu da vežu najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen su direktno spojeni za polimer sintazom. Izraz "direktno spojen" se ovde koristi da označi dva ili više peptida spojena putem peptidnih veza.
[0321] Takođe je moguće formirati česticu pri čemu čestica sadrži najmanje dva različita fuziona polipeptida koji su vezani za polimernu česticu. Na primer, prvi fuzioni polipeptid koji sadrži M. tuberculosis ili M. bovis antigen ili vezujući domen sposoban da veže najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen spojen sa polimer sintazom bi mogao biti vezan za česticu polimera. Kada se koristi u kontekstu čestica za upotrebu u lečenju tuberkuloze, primerna čestica sadrži prvi fuzioni polipeptid koji sadrži M. tuberculosis ili M. bovis antigen, na primer, ili najmanje jedan vezujući domen za M. tuberculosis ili M. bovis fuzionisan sa polimer sintazom vezanom za česticu polimera.
[0322] U jednoj realizaciji ekspresioni konstrukt se eksprimira in vivo. Poželjno, ekspresioni konstrukt je plazmid koji je eksprimiran u mikroorganizmu, poželjno Escherichia coli.
[0323] U jednoj realizaciji ekspresioni konstrukt se eksprimira in vitro. Poželjno je da se ekspresioni konstrukt eksprimira in vitro korišćenjem bezćelijskog sistema za ekspresiju.
[0324] U jednoj realizaciji, jedan ili više gena može biti umetnuto u jedan ekspresioni konstrukt, ili jedan ili više gena može biti integrisano u genom ćelije domaćina. U svim slučajevima ekspresija se može kontrolisati putem promotera kako je gore opisano.
[0325] U jednoj realizaciji, ekspresioni konstrukt dalje kodira najmanje jedan dodatni fuzioni polipeptid koji sadrži M. tuberculosis ili M. bovis antigen ili najmanje jedan vezujući domen M. tuberculosis ili M. bovis antigena i protein koji formira čestice kao što je gore razmatrano.
[0326] Plazmidi koji su ovde korisni prikazani su u primerima i detaljno su opisani u PCT/DE2003/002799 objavljenom kao WO 2004/020623 (Bernd Rehm) i PCT/NZ2006/000251 objavljenom kao WO 2007/037706 (Bernd Rehm) koji ovde uključeni referencom u celini.
[0327] Treba imati u vidu da je vezujući domen koji je sposoban da veže najmanje jedan M. tuberculosis ili M. bovis antigen, sposoban da veže M. tuberculosis ili M. bovis antigen prisutan kod subjekta kojem se administrira vezujući domen ili u kojem treba izazvati imunološki odgovor.
[0328] Dakle, u kontekstu upotrebe za dijagnozu ili lečenje tuberkuloze, biće cenjeno da su vezujući domeni M. tuberculosis ili M. bovis antigena sposobni da vežu najmanje jedan antigen M. tuberculosis ili M. bovis, na primer M. tuberculosis ili M. bovis antigen prisutan kod subjekta kome je administriran vezujući domen M. tuberculosis ili M. bovis antigena ili kod koga treba izazvati imunološki odgovor.
6. Domaćini za proizvodnju čestica
[0329] Čestice iz ovog pronalaska se pogodno proizvode u ćeliji domaćinu, koristeći jedan ili više ekspresionih konstrukata kao što je ovde opisano. Čestice polimera prema pronalasku se mogu proizvesti omogućavanjem ćeliji domaćinu da eksprimira ekspresioni konstrukt. Ovo se može postići tako što se prvo ekspresioni konstrukt uvede u ćeliju domaćina ili progenitor ćelije domaćina, na primer transformacijom ili transfekcijom ćelije domaćina ili progenitora ćelije domaćina sa ekspresionim konstruktom, ili na drugi način osiguravajući da je ekspresioni konstrukt prisutan u ćeliji domaćina.
[0330] Nakon transformacije, transformisana ćelija domaćin se održava u uslovima pogodnim za ekspresiju fuzionih polipeptida iz ekspresionih konstrukata i za formiranje čestica polimera. Takvi uslovi obuhvataju one pogodne za ekspresiju izabranog ekspresionog konstrukta, kao što je plazmid u odgovarajućem organizmu, koji su poznati u tehnici. Na primer, a naročito kada se želi visok prinos ili prekomerna ekspresija, obezbeđivanje odgovarajućeg supstrata u medijumu za kulturu omogućava da proteinska komponenta fuzionog polipeptida koja formira čestice formira česticu polimera.
[0331] Prema tome, ovaj pronalazak obezbeđuje metodu za proizvodnju čestica polimera, koja obuhvata:
obezbeđivanje ćelije domaćina koja sadrži najmanje jedan ekspresioni konstrukt prema ovom pronalasku,
održavanje ćelije domaćina u uslovima pogodnim za ekspresiju ekspresionog konstrukta i za formiranje čestica polimera; i
odvajanje čestica polimera od ćelija domaćina.
[0332] Poželjno, ćelija domaćin je, na primer, bakterijska ćelija, ćelija gljivica, ćelija kvasca, biljna ćelija, ćelija insekata ili životinje, poželjno izolovana ili ne-humana ćelija domaćin. Ćelije domaćini korisne u metodama dobro poznatim u tehnici (npr. Sambrook et al., 1987; Ausubel et al., 1987) za proizvodnju rekombinantnih čestica polimera često su pogodne za upotrebu u postupcima iz ovog pronalaska, imajući u vidu razmatranja koja su ovde izneta.
[0333] Pogodne prokariotske ćelije domaćini obuhvataju, na primer, eubakterije, kao što su gramnegativni ili gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao što je E. coli. Javno su dostupni različiti sojevi E. coli, poput E. coli K12 soja MM294 (ATCC 31,446); E. coli Ks1776 (ATCC 31,537); Soj E. coli W3110 (ATCC 27,325) i K5 772 (ATCC 53,635). Druge pogodne prokariotske ćelije domaćini uključuju druge Enterobacteriaceae kao što su Escherichia spp., Enterobacter, Ervinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella tiphimurium, Serratia, npr. Serratia marcescans i Shigella, kao i Bacilli kao što su B. subtilis i B licheniformis, Pseudomonas kao što je P. aeruginosa i Actinomicetes kao što su Streptomyces, Rhodococcus, Corynebacterium i Mycobaterium.
[0334] U nekim realizacijama, na primer, E. coli soj W3110 se može koristiti pošto je to uobičajen soj domaćina za fermentaciju rekombinantnog DNK proizvoda. Poželjno, ćelija domaćin luči minimalne količine proteolitičkih enzima. Na primer, soj W3110 može biti modifikovan da izazove genetsku mutaciju u genima koji kodiraju proteine endogene za domaćina, sa primerima takvih domaćina uključujući E. coli W3110 soj 1A2, koji ima kompletan genotip tonA; E. coli W3110 soj 9E4, koji ima kompletan genotip tonA ptr3; Soj E. coli W311027C7 (ATCC 55,244), koji ima kompletan genotip tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr; E. coli W3110 soj 37D6, koji ima kompletan genotip tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kanr; E. coli W3110 soj 40B4, koji je soj 37D6 sa mutacijom delecije degP koja nije otporna na kanamicin.
[0335] U nekim poželjnim realizacijama, na primer, mogu se koristiti sojevi Lactococcus lactis koji ne proizvode lipopolisaharidne endotoksine. Primeri sojeva Lactococcus lactis uključuju MG1363 i Lactococcus lactis podvrste cremoris NZ9000.
[0336] Pored prokariota, eukariotski mikrobi, poput filamentoznih gljivica ili kvasaca, pogodni su klonirajući ili ekspresioni domaćini za upotrebu u metodama iz pronalaska, na primer. Primeri uključuju Saccharomices cerevisiae, uobičajeno korišćeni niži eukariotski mikroorganizam domaćin. Drugi primeri uključuju Schizosaccharomices pombe (Beach i Nurse, 1981; EP 139,383), domaćine Kluiveromices (US Patent No. 4,943,529; Fleer et al., 1991) kao što je, na primer, K. lactis (MV98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., 1983), K. fragilis (ATCC 12, 424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906; Van den Berg et al, 1990), K. thermotolerans i K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al., 1988); Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa (Case et al., 1979); Schwanniomyces kao što je Schwanniomyces occidentalis (EP 394,538 objavljen 31. Oktobra 1990); i filamentozne gljive kao što su, na primer, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357 objavljen 10. Januara 1991), i Aspergillus domaćini kao što je A. nidulans (Ballance et al., 1983; Tilburn et al., 1983; Yelton et al., 1984) i A. niger (Kelly i Hynes, 1985). Metilotropni kvasci su ovde pogodni i sadrže kvasac sposoban da raste na metanolu izabranom iz rodova koje čine Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomices, Torulopsis i Rhodotorula . Lista specifičnih vrsta koje su primeri ove klase kvasaca se mogu naći u Anthony, 1982.
[0337] Primeri ćelija domaćina beskičmenjaka uključuju ćelije insekata kao što su Drosophila S2 i Spodoptera Sf9, kao i ćelije biljaka, kao što su ćelijske kulture pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza i duvana. Identifikovani su brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovaraju će dozvoljene ćelije domaćina insekata od domaćina kao što su Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegypti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (plodna muva) i Bombyx mori. Javno su dostupni različiti sojevi virusa za transfekciju, npr. L-1 varijanta Autographa californica NPV i Bm-5 soj Bombyx mori NPV, i takvi virusi se mogu ovde koristiti kao virusi prema ovom pronalasku, posebno za transfekciju ćelija Spodoptera fritgiperda.
[0338] Primeri korisnih sisara ćelijskih linija domaćina su CV1 linija bubrega majmuna transformisana pomoću SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linija embrionalnog bubrega čoveka (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u suspenzija kulturi, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega beba hrčka (BHK, ATCC CCL 10); Ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., 1980); ćelije sertoli miša (TM4, Mather, 1980); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); Ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre buffalo pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije jetre čoveka (Hep G2, HB 8065); tumor dojke miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., 1982);
elije MRC 5; ćelije FS4; i linija humanog hepatoma (Hep G2).
[0339] Eukariotske ćelijske linije, a posebno ćelijske linije sisara, biće poželjne kada, na primer, antigen sposoban da izazove ćelijski posredovani imunološki odgovor ili vezujući domen sposoban da veže antigen sposoban da izazove ćelijski posredovani imunološki odgovor ili M. tuberculosis ili M. bovis antigen ili vezujući domen M. tuberculosis ili M. bovis antigena zahteva jednu ili više posttranslacionih modifikacija, kao što je, na primer, glikacija. Na primer, jedan ili vi še antigena sposobnih da izazovu ćelijski imunološki odgovor može zahtevati da posttranslaciona modifikacija bude imunogena ili optimalno imunogena, i stoga mogu biti korisno eksprimirane u ekspresionom doma ćinu sposobnom za takve post-translacione modifikacije.
[0340] U jednoj realizaciji ćelija domaćin je ćelija sa oksidacionim citosolom, na primer soja E. coli Origami (Novagen).
[0341] U drugoj realizaciji ćelija domaćin je ćelija sa redukcionim citosolom, poželjno E. coli.
[0342] Ćelija domaćin, na primer, može biti izabrana iz rodova koji sadrže Ralstonia, Acaligenes, Pseudomonas i Halobiforma. Poželjno je da se upotrebljeni mikroorganizam bira iz grupe koju čine, na primer, Ralstonia eutropha, Alcaligenes latus, Escherichia coli, Pseudomonas fragi, Pseudomonas putida, Pseudomonas oleovorans, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, and Halobiforma haloterrestris. Ova grupa uključuje oba i mikroorganizme koji su prirodno sposobni da proizvode biokompatibilne, biorazgradive čestice i mikroorganizme, kao što je na primer E. coli, koji zbog svog genetskog sastava nisu sposobni za to. Geni potrebni za omogućavanje navedenih mikroorganizama da proizvedu čestice se uvode kako je gore opisano.
[0343] Ekstremno halofilne arheje proizvode čestice polimera sa nižim nivoima nespecifičnog vezivanja proteina, omogućavajući lakšu izolaciju i prečišćavanje čestica iz ćelija.
[0344] U principu, bilo koja kulturabilna host ćelija se može koristiti za proizvodnju čestica polimera gore opisanim postupkom, čak i ako ćelija domaćin ne može da proizvede supstrate potrebne za formiranje čestica polimera zbog različitog metabolizma. U takvim slučajevima, neophodni supstrati se dodaju u medijum za kulturu, a zatim se pretvaraju u čestice polimera pomoću proteina koji su eksprimirani genima koji su uneti u ćeliju.
[0345] Geni koji se koriste da bi se omogućilo poslednje navedenim ć elijam doma ć inima da produkuju čestice polimera uključuju, na primer, tiolazu, reduktazu ili polimer sintazu, kao što su phaA tiolaza, phaB ketoacil reduktaza ili phaC sintaza iz Ralstonia eutropha. Koji će se geni koristiti za povećanje onoga što ćeliji domaćinu nedostaje za formiranje čestica polimera, zavisiće od genetskog sastava ćelije domaćina i supstrata koji se nalaze u medijumu za kulturu.
[0346] Geni i proteini uključeni u formiranje čestica polihidroksialkanoata (PHA), i opšta razmatranja o formiranju čestica su objavljena u Madison, et al, 1999; objavljena PCT Međunarodna Prijava WO 2004/020623 (Bernd Rehm); i Rehm, 2003; Brockelbank JA. et al., 2006; Peters i Rehm, 2006; Backstromet al, (2006) i Rehm, (2006), koji su svi ovde uključeni referencom.
[0347] Polimer sintaza, sama se može koristiti u bilo kojoj ćeliji domaćinu sa (R)-Hidroksiacil-CoA ili drugim CoA tioesterom ili njihovim derivatima kao supstratom.
[0348] Čestice polimera se takođe mogu formirati in vitro. Poželjno je, na primer, da se koristi bezćelijski sistem za eksprimiranje. U takvim sistemima je obezbeđena polimer sintaza. Prečišćena polimer sintaza, kao što je ona koja se može dobiti rekombinantnom proizvodnjom, ili u bezćelijskim sistemima sposobnim za translaciju proteina, poželjno je da se dobije u samom bezćelijskom sistemu uvođenjem ekspresionog konstrukta koji kodira polimer sintazu. Da bi se proizvelo okruženje koje omogućava stvaranje čestica in vitro, neophodne supstrate za formiranje čestica polimera treba uključiti u medijum.
[0349] Polimer sintaza se može koristiti za in vitro proizvodnju funkcionalizovanih čestica polimera npr. korišćenjem (R)-hidroksiacil-CoA ili drugog CoA tioestra kao supstrata.
[0350] Fuzioni polipeptidi se mogu prečistiti iz liziranih ćelija pomoću sortirnika ćelija, centrifugiranja, filtriranja ili afinitetne hromatografije pre upotrebe u in vitro proizvodnji čestica polimera.
[0351] In vitro formiranje čestica polimera omogućava optimalnu kontrolu sastava površine, uključujući nivo pokrivenosti fuzionim polipeptidom, fosfolipidni sastav i tako dalje.
[0352] Treba imati u vidu da se na karakteristike čestice polimera može uticati ili kontrolisati kontrolom uslova u kojima se čestica polimera proizvodi. Ovo može uključivati, na primer, genetski sastav ćelije domaćina, npr. mutanti ćelijske deobe koji proizvode velike granule, kako je objašnjeno u Peters i Rehm, 2005. Uslovi u kojima se održava ćelija domaćina, na primer temperatura, prisustvo supstrata, prisustvo jednog ili više proteina koji formiraju čestice, kao što je protein koji određuje veličinu čestica, prisustvo regulatora polimera i slično.
[0353] U jednoj realizaciji, poželjna karakteristika čestice polimera je da je postojana. Izraz "perzistentan" se odnosi na sposobnost čestice polimera da odoli razgradnji u odabranom okruženju. Dodatna poželjna karakteristika čestice polimera je da se formira od polimer sintaze ili proteina koji formira čestice i veže se za C- ili N-kraj polimer sintaze ili proteina koji formira čestice tokom sklapanja čestica.
[0354] U nekim realizacijama pronalaska poželjno je postići prekomernu ekspresiju ekspresionih konstrukata u ćeliji domaćinu. Mehanizmi za prekomernu ekspresiju određenog ekspresionog konstrukta su dobro su poznati u struci i zavisiće od samog konstrukta, domaćina u kome će biti eksprimirani i drugih faktora, uključujući stepen prekomerne ekspresije koji je poželjan ili potreban. Na primer, prekomerna ekspresija se može postići i) upotrebom jakog sistema promotera, na primer sistem promotera T7 RNK polimeraze u prokariotskim domaćinima; ii) upotrebom plazmida sa velikim brojem kopija, na primer plazmida koji sadrži colEl izvor replikacije ili iii) stabilizacijom informacione RNK, na primer upotrebom fuzionih sekvenci, ili iv) optimizacijom translacije, na primer, optimizacijom upotrebe kodona, mesta vezivanja ribozoma ili mesta prekidanja i slično. Prednosti prekomerne ekspresije mogu omogućiti produkciju manjih čestica po želji i produkciju većeg broja čestica polimera.
[0355] Sastav polimera koji formiraju čestice polimera može uticati na mehanička ili fiziohemijska svojstva čestica polimera. Na primer, čestice polimera koje se razlikuju po svom sastavu se mogu razlikovati u poluživotu ili mogu oslobađati biološki aktivne supstance, posebno farmaceutski aktivne sastojke, različitim brzinama. Na primer, čestice polimera sastavljene od C6-C14 3-hidroksi masnih kiselina pokazuju veću brzinu degradacije polimera zbog niske kristaliničnosti polimera. Povećanje molarnog odnosa konstituenata polimera sa relativno velikim bočnim lancima na polimernoj okosnici obično smanjuje kristaliničnost i rezultira izraženijim elastomernim svojstvima. Kontrolisanjem sastava polimera u skladu sa postupkom opisanim u pronalasku, prema tome, moguć e je uticati na biorazgradivost polimernih čestica i na taj način uticati na trajanje čestica polimera (i kada je prisutan jedan ili više antigena koji mogu izazvati ć elijski posredovani imunološki odgovor ili vezujući domeni antigena na čestici sposobni da izazovu ć elijski-posredovan imunološki odgovor ili jedan ili više M. tuberculosis ili M. bovis antigena ili M. tuberculosis ili M. bovis vezujuć ih domena antigena na čestici, se održavaju, na primer, u subjektu kome su administrirani, ili da utiču na brzinu oslobađanja biološki aktivnih supstanci prisutnih na ili u polimernim česticama, posebno farmaceutski aktivnih agenasa ili sastojaka za negu kože.
[0356] Poželjno je da se najmanje jedna masna kiselina sa funkcionalnim bočnim grupama unese u medijum za kulturu kao supstrat za formiranje čestica polimera, sa najmanje jednom hidroksi masnom kiselinom i/ili najmanje jednom merkapto masnom kiselinom i/ili je poželjno da bude uvedena najmanje jedna β-amino masna kiselina. "Masne kiseline sa funkcionalnim bočnim grupama" treba uzeti u obzir kao zasićene ili nezasićene masne kiseline. One takođe uključuju masne kiseline koje sadrže funkcionalne bočne grupe koje su izabrane iz grupe koja sadrži metil grupe, alkil grupe, hidroksilne grupe, fenil grupe, sulfhidril grupe, primarne, sekundarne i tercijarne amino grupe, aldehidne grupe, keto grupe, etarske grupe, karboksilne grupe , O-estarske grupe, tioestarske grupe, amidne grupe karboksilne kiseline, hemi-acetalne grupe, acetalne grupe, fosfat monoestar grupe i fosfat diestar grupe. Upotreba supstrata je određena željenim sastavom i željenim svojstvima čestice polimera.
[0357] Supstrat ili smeša supstrata može sadržati najmanje jednu opciono supstituisanu aminokiselinu, laktat, estar ili zasićenu ili nezasićenu masnu kiselinu, poželjno acetil-CoA.
[0358] U jednom aspektu, adjuvans, imunomodulatorno sredstvo ili molekul, kao što je imunostimulatorno sredstvo ili molekul, ili drugo jedinjenje korisno u pripremi vakcina, nalazi se u smeši supstrata i inkorporira se u česticu polimera tokom formiranja čestica polimera, ili može difundovati u česticu polimera.
[0359] Čestice polimera mogu sadržati polimer izabran između poli-beta-aminokiselina, polilaktata, polioestara i poliestra, na primer. Najpoželjnije je da polimer sadrži polihidroksi-alkanoat (PHA), poželjno poli (3-hidroksibutirat) (PHB).
[0360] Polimer sintaza ili čestica polimera poželjno sadrži fosfolipidni mono-sloj koji enkapsulira polimernu česticu. Poželjno je da pomenuti proteini koji formiraju čestice obuhvataju pomenuti lipidni mono-sloj.
[0361] Polimer sintaza ili protein koji formira čestice je poželjno vezan za polimernu česticu ili za fosfolipidni monosloj ili je vezan za oboje.
[0362] Protein koji formira čestice je poželjno kovalentno ili nekovalentno vezan za polimernu česticu koju formira.
[0363] Poželjno najmanje oko 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55 %, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% ili 100% površine čestice polimera je prekriveno fuzionim polipeptidima.
[0364] U određenim okolnostima može biti poželjno kontrolisati veličinu čestica proizvedenih u postupcima iz pronalaska, na primer za proizvodnju čestica posebno pogodnih za datu primenu. Na primer, može biti poželjno proizvesti čestice polimera koje sadrže jedan ili više antigena sposobnih da izazovu ćelijski posredovan imunološki odgovor relativno velike jačine, na primer da izazove robustan ćelijski posredovani imunološki odgovor. Na primer, u kontekstu čestica koje se koriste u lečenju tuberkuloze, može biti poželjno proizvesti čestice polimera koje sadrže jedan ili više M. tuberculosis ili M. bovis antigena relativno velike dimenzije, na primer da se izazove robustan ćelijski-posredovan imunološki odgovor. Postupci za kontrolu veličine čestica polimera su opisani u PCT/DE2003/002799 objavljenom kao WO 2004/020623, i PCT/NZ2006/000251 objavljenom kao WO 2007/037706.
[0365] U nekim realizacijama, veličina čestica se kontroliše kontrolom ekspresije proteina koji formira čestice, ili kontrolom ekspresije proteina za određivanje veličine čestica ako postoji, na primer.
[0366] U drugim realizacijama ovog pronalaska, na primer, kontrola veličine čestica se može postići kontrolom dostupnosti supstrata, na primer dostupnosti supstrata u medijumu za kulturu. U nekim primerima, supstrat se može dodati u medijum za kulturu u količini koja je dovoljna da se osigura kontrola veličine čestica polimera.
[0367] Treba imati na umu da se može koristiti kombinacija takvih metoda, dopuštajući mogućnost za još efikasniju kontrolu veličine čestica.
[0368] U različitim realizacijama, na primer, veličina čestica može da se kontroliše da bi se dobile čestice prečnika od oko 10 nm do 3 µm, poželjno od oko 10 nm do oko 900 nm, od oko 10 nm do oko 800 nm, od oko 10 nm do oko 700 nm, od oko 10 nm do oko 600 nm, od oko 10 nm do oko 500 nm, od oko 10 nm do oko 400 nm, od oko 10 nm do oko 300 nm, od oko 10 nm do približno 200 nm, a naročito poželjno od oko 10 nm do oko 100 nm.
[0369] U drugim realizacijama, na primer, veličina čestica može da se kontroliše da bi se proizvele čestice prečnika od oko 10 nm do oko 90 nm, od oko 10 nm do oko 80 nm, od oko 10 nm do oko 70 nm, od oko 10 nm do oko 60 nm, od oko 10 nm do oko 50 nm, od oko 10 nm do oko 40 nm, od oko 10 nm do oko 30 nm, ili od oko 10 nm do oko 20 nm.
[0370] Drugi opsezi prosečne veličine polimera, na primer, uključujući opsege unutar gore navedenih opsega, posebno se razmatraju, na primer čestice polimera prečnika od oko 50 do oko 500 nm, od oko 150 do oko 250 nm, ili od oko 100 do oko 500 nm, itd.
[0371] U različitim realizacijama, na primer, 90 % proizvedenih čestica ima prečnik od oko 200 nm ili manji, 80 % ima prečnik oko 150 nm ili manji, 60 % ima prečnik oko 100 nm ili manji, 45 % ima prečnik oko 80 nm ili manji, 40 % ima prečnik oko 60 nm ili manji, 25 % ima prečnik oko 50 nm ili manji, a 5 % ima prečnik oko 35 nm ili manji.
[0372] U različitim realizacijama, na primer, metoda proizvodi čestice polimera prosečnog prečnika manjeg od oko 200 nm, manje od oko 150 nm ili manje od oko 110 nm.
7. Kompozicije i formulacije
[0373] Čestice polimera prema pronalasku se mogu formulisati kao kompozicije pogodne za upotrebu u metodama iz pronalaska za brojne različite primene, na primer, formulisane za administraciju određenim putem ili formulisane za skladištenje, mogu se stabilno održavati kao čestice izvan ćelije domaćina koja ih je proizvela, i da ove čestice mogu biti dizajnirane tako da odgovaraju brojnim primenama.
[0374] U jednom aspektu, na primer, kompozicije koje su ovde korisne su formulisane tako da omogućavaju administraciju subjektu bilo kojim izabranim putem, uključujući, ali bez ograničenja, oralnu ili parenteralnu (uključujući lokalnu, subkutanu, intramuskularnu i intravenoznu) administraciju.
[0375] Tako, na primer, korisna farmaceutska kompozicija prema ovom pronalasku može biti formulisana sa odgovarajućim farmaceutski prihvatljivim nosačem (uključujući ekscipijente, diluente, pomoćne supstance i njihove kombinacije) odabranim s obzirom na predviđeni način administracije i standardnu farmaceutsku praksu. Na primer, farmaceutski preparati namenjeni za vakcinaciju mogu sadržati jedan ili više adjuvansa ili imunostimulatora, koji su dobro poznati u tehnici. Na primer, kompozicija korisna prema ovom pronalasku se može administrirati oralno kao prah, tečnost, tableta ili kapsula, ili lokalno kao mast, krema ili losion. Odgovarajuće formulacije mogu po potrebi sadržati dodatna sredstva, uključujući emulgatore, antioksidanse, arome ili boje, i mogu se prilagoditi za trenutno, odloženo, modifikovano, produženo, impulsno ili kontrolisano oslobađanje.
[0376] Dakle, pronalazak je takođe usmeren na doze, oblike doziranja, formulacije, kompozicije i/ili uređaje koji sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska, uključujući one koje su ovde otkrivene, korisne za dijagnozu ili terapiju bolesti, poremećaja i/ ili stanja kod ljudi i drugih sisara i drugih poremećaja koji su ovde otkriveni. Upotreba ovih oblika doziranja, formulacija i/ili ure đaja koji sadrže jednu ili više čestica polimera prema pronalasku omogućava efikasnu identifikaciju i/ili lečenje ovih stanja. Pronalazak obezbeđuje, na primer, oblike doziranja, formulacije, uređaje i/ili kompozicije koje sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska. Oblici doziranja, formulacije, uređaji i/ili kompozicije prema pronalasku mogu biti formulisani za optimizaciju bioraspolo živosti, imunogenosti ili za održavanje koncentracije u plazmi, krvi ili tkivu unutar imunogenog, dijagnosti čkog ili terapijskog opsega, uključujući produžene periode. Preparati za kontrolisanu isporuku se takođe mogu koristiti za optimizaciju koncentracije antigena na mestu delovanja, na primer.
[0377] Oblici doziranja, formulacije, uređaji i/ili smeše prema pronalasku su u nekim realizacijama formulisane za periodičnu administraciju, na primer da obezbede kontinuirano izlaganje jednoj ili vi še čestica polimera iz pronalaska. Strategije za izazivanje korisnog imunolo škog odgovora, na primer one koje primenjuju jednu ili više buster vakcinacija su dobro poznate u tehnici, i takve strategije se mogu usvojiti u praksi ovog pronalaska.
[0378] Dijagnostičke kompozicije iz ovog pronalaska su u nekim realizacijama formulisane za lokalnu primenu, na primer formulisane za upotrebu u testovima uboda kože.
[0379] Farmaceutske kompozicije i oblici doziranja se mogu administrirati parenteralnim putem, a ovaj način će biti poželjan za izvesna izvođenja metoda izazivanja imunološkog odgovora, kao što su oni koji su ovde opisani. Primeri parenteralnih oblika doziranja uključuju vodene rastvore, izotonični slani ili 5% glukozni rastvor aktivnog sredstva, ili druge dobro poznate farmaceutski prihvatljive pomo ćne supstance. Ciklodekstrini, na primer, ili drugi rastvorljivi agensi dobro poznati stru čnjacima se mogu koristiti kao farmaceutski ekscipijenti za isporuku terapijskog sredstva.
[0380] Primeri oblika doziranja pogodnih za oralnu primenu uključuju, ali nisu ograničeni na tablete, kapsule, pastile ili slične oblike, ili bilo koje tečne oblike kao što su sirupi, vodeni rastvori, emulzije i slično, sposobni da obezbede terapeutski efikasnu količinu čestica polimera prema pronalasku. Kapsule mogu sadržati bilo koji standardni farmaceutski prihvatljiv materijal, poput želatina ili celuloze. Tablete se mogu formulisati u skladu sa konvencionalnim procedurama komprimovanjem sme ša aktivnih sastojaka sa čvrstim nosačem i lubrikantom. Primeri čvrstih nosača uključuju skrob i šećerni bentonit. Aktivni sastojci se takođe mogu davati u obliku tablete sa tvrdom ljuskom ili kapsule koja sadrži vezivo, npr. Laktozu ili manitol, konvencionalno punilo i sredstvo za tabletiranje.
[0381] Primeri oblika doziranja pogodnih za transdermalnu administraciju uključuju, ali nisu ograničeni na, transdermalne flastere, transdermalne zavoje i slično. Primeri oblika doziranja pogodnih za lokalnu primenu kompozicija i formulacija iz pronalaska su bilo koji losion, štapić, sprej, mast, pasta, krema, gel itd., bilo da se nanose direktno na kožu ili preko posrednika, kao što je jastučić, flaster ili slično.
[0382] Primeri oblika doziranja pogodnih za supozitornu administraciju kompozicija i formulacija prema pronalasku uključuju bilo koji čvrsti oblik doziranja umetnut u telesni otvor, naročito one koji su umetnuti rektalno, vaginalno i uretralno.
[0383] Primeri oblika doziranja pogodnih za ubrizgavanje kompozicija i formulacija prema pronalasku uključuju administraciju putem bolusa, kao što je jednokratna ili višekratna administracija intravenoznom injekcijom, subkutano, subdermalno i intramuskularno ili oralna administracija.
[0384] Primeri doznih oblika pogodnih za depo administraciju kompozicija i formulacija iz pronalaska uključuju pelete ili male cilindre čestica polimera iz pronalaska ili čvrste oblike u kojima su čestice polimera iz pronalaska zarobljene u matriksu biorazgradivih polimera, mikroemulzija, lipozoma ili su mikrokapsulirane.
[0385] Primeri infuzionih uređaja za kompozicije i formulacije prema pronalasku uključuju infuzione pumpe koje sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska u željenoj količini za željeni broj doza ili stacionarnu primenu, i uključuju implantabilne pumpe za lekove.
[0386] Primeri implantabilnih infuzionih uređaja za kompozicije i formulacije prema ovom pronalasku uključuju bilo koji čvrsti oblik u kojem su čestice polimera iz pronalaska inkapsulirane unutar ili dispergovane u biorazgradivom polimeru ili sintetičkom, polimeru poput silikona, silikonske gume, silastičnog ili sličnog polimera.
[0387] Primeri oblika doziranja pogodnih za transmukoznu isporuku kompozicija i formulacija iz pronalaska uključuju depozitne rastvore za klistire, pesare, tampone, kreme, gelove, paste, pene, nebulizovane rastvore, praškove i slične formulacije koje pored aktivnih sastojaka sadrže i takve nosače za koje je u struci poznato da su odgovarajući. Posebno se razmatraju dozni oblici pogodni za inhalaciju ili insuflaciju kompozicija i formulacija iz pronalaska, uključujući kompozicije koje sadrže rastvore i/ili suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvara čima, ili njihovim smešama i/ili prahovi. Transmukozna administracija kompozicija i formulacija prema pronalasku mo že koristiti bilo koju sluznicu, ali obično se koriste nosna, bukalna, vaginalna i rektalna tkiva. Formulacije pogodne za nazalnu administraciju kompozicija i formulacija iz pronalaska se mogu administrirati u tečnom obliku, na primer, sprej za nos, kapi za nos, ili aerosolnom administracijom pomoću nebulizatora, uključujući vodene ili uljne rastvore čestica polimera. Formulacije za nazalnu administraciju, u kojima je nosač čvrsta supstanca, uključuju grubi prah koji ima veličinu čestica, na primer, manje od oko 100 mikrona, poželjno manje, najpoželjnije manje od oko 50 mikrona, koji se administrira slično kao burmut, tj. brzim udisanjem kroz nazalni prolaz iz posude sa prahom koja se drži blizu nosa. Formulacije iz pronalaska se mogu pripremiti kao vodeni rastvori, na primer u slanom rastvoru, rastvorima koji koriste benzil alkohol ili druge pogodne konzervanse, promotere apsorpcije za poboljšanje biološke dostupnosti, fluorougljenike i/ili druga sredstva za rastvaranje ili dispergovanje poznata u tehnici.
[0388] Primeri doznih oblika pogodnih za bukalnu administraciju kompozicija i formulacija prema pronalasku uključuju pastile, tablete i slično, kompozicije koje sadrže rastvore i/ili suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaračima, ili njihovim smešama i/ili prahove.
[0389] Primeri doznih oblika pogodnih za sublingvalnu administraciju kompozicija i formulacija iz pronalaska uključuju pastile, tablete i slično, kompozicije koje sadrže rastvore i/ili suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaračima, ili njihovim smešama i/ili prahove.
[0390] Primeri doznih oblika pogodnih za oftalmičku primenu kompozicija i formulacija prema pronalasku uključuju inserte i/ili kompozicije koje sadrže rastvore i/ili suspenzije u farmaceutski prihvatljivim, vodenim ili organskim rastvaračima.
[0391] Primeri formulacija kompozicija, uključujući vakcine i kontrolisane formulacije lekova, korisne za isporuku kompozicija i formulacija prema pronalasku se nalaze u, npr. Sweetman, S. C. (Ed.). Martindale. The Complete Drug Reference, 33rd Edition, Pharmaceutical Press, Chicago, 2002, 2483 pp.; Aulton, M. E. (Ed.) Pharmaceutics. The Science of Dosage Form Design. Churchill Livingstone, Edinburgh, 2000, 734 pp.; and, Ansel, H. C., Allen, L. V. i Popovich, N. G. Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7th Ed., Lippincott 1999, 676 pp. Ekscipijenti korišćeni u proizvodnji sistema za isporuku lijekova su opisani u različitim publikacijama poznatim stručnjacima, uključujući, na primer, Kibbe, E. H. Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Ed., American Pharmaceutical Association, Washington, 2000, 665 pp. USP takođe nudi primere oralnih doznih oblika sa modifikovanim oslobađanjem, uključujući one formulisane kao tablete ili kapsule. Videti, na primer, The United States Pharmacopeia 23/National Formulary 18, The United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville MD, 1995 (u daljem tekstu "USP"), koji takođe opisuje specifične testove za utvrđivanje sposobnosti oslobađanja leka kod tableta i kapsula sa produženim oslobađanjem i odloženim oslobađanjem. USP test za oslobađanje leka za proizvode sa produženim i odloženim oslobađanjem se zasniva na rastvaranju leka iz dozne jedinice u odnosu na proteklo vreme. Opisi različitih ispitnih aparata i metoda se mogu naći u USP-u. Dodatne smernice u vezi sa analizom doznih oblika sa produženim oslobađanjem je dala FDA (Vidi Smernice za industriju. Oralni dozni oblici sa produ ženim oslobađanjem: razvoj, procena i primena korelacija in vitro/in vivo. Rockville, MD: Centar za procenu i istraživanje lekova, Uprava za hranu i lekove, 1997).
[0392] Dalji primeri doznih oblika prema pronalasku uključuju, ali nisu ograničeni na, dozne oblike sa modifikovanim oslobađanjem (MR) uključujući oblike sa odloženim oslobađanjem (DR); oblici sa produženim delovanjem (PA); oblici sa kontrolisanim oslobađanjem (CR); oblici sa produženim oslobađanjem (ER); oblici sa vremenskim oslobađanjem (TR); i oblici sa dugotrajnim delovanjem (LA). Uglavnom se ovi izrazi koriste za opisivanje oralno administriranih oblika doziranja, me đutim ovi izrazi mogu biti primenljivi na bilo koji od doznih oblika, formulacija, kompozicija i/ili ure đaja koji su ovde opisani. Ove formulacije utiču na odloženo potpuno oslobađanje leka neko vreme nakon primene leka, i/ili oslobađanje leka u malim alikvotima naizmenično nakon primene, i/ili oslobađanje leka polako kontrolisanom brzinom koju reguliše sistem isporuke, i/ili oslobađanje leka konstantnom brzinom koja ne varira, i/ili oslobađanje leka za znatno duži period od uobičajenih formulacija.
[0393] U nekim realizacijama, dijagnostički ili terapeutski efikasna količina jedne ili više čestica polimera iz pronalaska ili jednog ili više antigena koji sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska je od oko 1 ug/kg do oko 1 g/kg. Primeri dijagnostičkih ili terapeutski efikasnih raspona doza uključuju, na primer, od oko 1 µg/kg do oko 500 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 400 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 300 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 200 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 100 mg/kg, 1 µg/kg do oko 90 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 80 mg/kg, od oko 1 µg/kg to about 70 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 60 mg/kg, od oko 1 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 5 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 10 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 50 µg/kg do oko 50 mg/kg kg, od oko 100 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 200 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 300 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 400 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 500 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 600 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 700 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 800 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 900 µg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 5 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 10 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 15 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 20 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 25 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 30 mg/kg do oko 50 mg/kg kg, od oko 35 mg/kg do oko 50 mg/kg, od oko 40 mg/kg do oko 50 mg/kg, ili od oko 45 mg/kg do oko 50 mg/kg.
[0394] Drugi dijagnostički ili terapeutski efikasni rasponi doza uključuju, na primer, od oko 1 mg/kg do oko 1 g/kg, od oko 1,5 mg/kg do oko 950 mg/kg, oko 2 mg/kg do oko 900 mg /kg, oko 3 mg/kg do oko 850 mg/kg, oko 4 mg/kg do oko 800 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 750 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 700 mg/kg, 5 mg/kg do oko 600 mg/kg, oko 5 mg/kg do oko 500 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 400 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 300 mg/kg, oko 10 mg /kg do oko 200 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 250 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 200 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 200 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 150 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 100 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 75 mg/kg, oko 10 mg/kg do oko 50 mg/kg, ili oko 15 mg/kg do oko 35 mg/kg.
[0395] U nekim realizacijama pronalaska koje ciljaju na humane subjekte, dijagnosti čki ili terapeutski efikasna količina jedne ili više čestica polimera prema pronalasku ili jednog ili više antigena koji sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska je, na primer, od oko 10 mg do oko 10 g po dozi. Drugi dijagnostički ili terapeutski efikasni rasponi doza uključuju, na primer, od oko 20 mg do oko 9 g, od oko 30 mg do oko 8 g, od oko 40 mg do oko 7 g, od oko 50 mg do oko 6 g, od oko 60 mg do oko 5 g, od oko 70 mg do oko 4 g, oko 80 mg do oko 3 g, oko 100 mg do oko 2 g, oko 100 mg do oko 1,5 g, oko 200 mg do oko 1400 mg, oko 200 mg do oko 1300 mg, oko 200 mg do oko 1200 mg, oko 200 mg do oko 1100 mg, oko 200 mg do oko 1000 mg, oko 300 mg do oko 900 mg, oko 300 mg do oko 800, oko 300 mg do oko 700 mg ili oko 300 mg do oko 600 mg po dozi.
[0396] Pronalazak takođe delimično obezbeđuje kompozicije, formulacije i uređaje u malim dozama koje sadrže jednu ili više jedne ili više čestica polimera iz pronalaska. Na primer, kompozicije niske doze, formulacije i slično, daju se u količini dovoljnoj da obezbede, na primer, doze od oko 0.001 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0,01 mg/kg do oko 4.5 mg/kg, oko 0.02 mg/kg do oko 4 mg/kg, oko 0.02 do oko 3.5 mg/kg, oko 0.02 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 0.05 mg/kg do oko 2.5 mg/kg, oko 0.05 mg/kg do oko 2 mg/kg, oko 0.05-0,1 mg/kg do oko 5 mg/kg, oko 0.05-0.1 mg/kg do oko 4 mg/kg, oko 0.05-0.1 mg/kg do oko 3 mg/kg, oko 0.05-0.1 mg/kg do oko 2 mg/kg, oko 0.05-0.1 mg/kg do oko 1mg/kg, i/ili bilo koje druge doze ili rasponi doza unutar ovde navedenih opsega, jedne ili vi še čestica polimera prema pronalasku ili jednog ili više antigena koji sadrže jednu ili više čestica polimera iz pronalaska.
[0397] Ovde opisane doze se mogu primeniti u jednoj dozi ili u više doza ili u podeljenim dozama. Na primer, doze se mogu primeniti, jednom, dva, tri, četiri ili više puta tokom režima lečenja, što je dobro poznato u imunologiji.
[0398] Efikasnost kompozicije korisne prema ovom pronalasku se može proceniti i in vitro i in vivo. Pogledajte, na primer, donje primere. Ukratko, kompozicija se može testirati in vitro ili in vivo za njenu sposobnost da indukuje ćelijski posredovani imunološki odgovor. Za in vivo studije, kompozicija se može dati u hrani ili ubrizgati u životinju (npr. miša), a zatim se procenjuju njeni efekti za izazivanje imunološkog odgovora. Na osnovu rezultata, tada se određuje odgovarajući raspon doziranja i način primene.
[0399] U nekim realizacijama pronalaska, dijagnostički ili terapeutski efikasna količina je količina efikasna za izazivanje imunološkog odgovora, kao što je, na primer, koncentracija IFN-gama u krvi od oko 0.5 ng/mL do oko 20 ng/mL, oko 0.5 ng/mL do oko 15 ng/mL, oko 0.5 ng/mL do oko 10 ng/mL, oko 0.5 ng/mL do oko 9 ng/mL, oko 1 ng/mL do oko 8 ng/mL, oko 2 ng/mL do oko 7 ng/mL ili oko 3 ng/mL do oko 6 ng/mL.
[0400] U nekim okolnostima, uključujući post infekciju ili tokom produžene infekcije, primećuju se povišene koncentracije IFN-gama u krvi, a takve povišene koncentracije treba uzeti u obzir pri proceni bazne vrednosti u odnosu na koju treba oceniti izazivanje efikasnog imunolo škog odgovora polimernim česticama iz pronalaska.
8. Primeri upotrebe čestica polimera prema pronalasku
[0401] Otkriveno je da se čestice polimera, npr. čestice polihidroksialkilnog polimera, mogu stabilno održavati kao čestice izvan ćelije domaćina koja ih je proizvela, i da se te čestice mogu dizajnirati da odgovaraju brojnim primenama.
[0402] Funkcionalzovane čestice polimera mogu sadržati jedan ili više površinski vezanih antigena sposobnih da izazovu ćelijski-posredovan ili drugi imunološki odgovor, jednu ili više supstanci vezanih za vezujuće domene antigena sposobne da izazovu ćelijski ili drugi imunološki odgovor, ili njihovu kombinaciju.
[0403] U jednoj realizaciji, na primer, supstanca je imobilizovana na povr šini čestice tokom formiranja čestica, vezana za vezujući domen sposoban da veže antigen sposoban da izazove ćelijski posredovan imunološki odgovor, ili integrisana u česticu punjenjem, difuzijom ili inkorporacijom.
[0404] U kontekstu upotrebe u dijagnostici ili lečenju npr. tuberkuloze, primeri čestica polimera sadrže jedan ili više površinski vezanih M. tuberculosis ili M. bovis antigena, i opciono jednu ili više supstanci vezanih za vezujuće domene M. tuberculosis ili M. bovis antigena, ili njihova kombinacija.
[0405] U jednoj realizaciji, supstanca može biti imobilisana na površini čestice tokom formiranja čestica, vezana, na primer, za vezujuće domene M. tuberculosis ili M. bovis antigena, ili integrisana u česticu punjenjem, difuzijom ili inkorporacijom. Kovalentno vezivanje za povr šinu čestice polimera, npr. umrežavanjem se takođe posebno razmatra.
[0406] U jednom aspektu, supstanca je izabrana sa liste koja sadrži, na primer, protein ili fragment proteina, peptid, polipeptid, antitelo ili fragment antitela, domen za vezivanje antitela, antigen, antigensku determinantu, epitop, imunogen ili njegov fragment, ili bilo koju kombinacijua bilo koja dva ili više njih.
[0407] U jednoj realizaciji DNK iz intraćelijskog patogena može biti fragmentisana i umetnuta u ekspresione konstrukte koji kodiraju fuzione polipeptide koji sadrže polimer sintazu. Na ovaj način, čestice polimera koje ispoljavaju intraćelijske patogene antigenske determinante mogu biti proizvedene i podvrgnute skriningu pomoću seruma od zaraženih pacijenata i čestice koje ispoljavaju antigen mogu biti identifikovane, izolovane i reprodukovane kori šćenjem dobro poznatih i skalabilnih sistema za proizvodnju bakterija.
[0408] U jednoj realizaciji, više antigena sposobnih da izazovu ćelijski-posredovan (ili drugi) imunološki odgovor je imobilisano na površini čestica polimera.
[0409] U jednoj realizaciji, DNK iz bakterije M. tuberculosis ili M. bovis, na primer, može biti fragmentirana i umetnuta u ekspresione konstrukte koji kodiraju fuzione polipeptide koji sadr že polimer sintazu. Na ovaj način, čestice polimera koje pokazuju antigenske determinante M. tuberculosis ili M. bovis, na primer, mogu se proizvesti i pregledati pomoću seruma zaraženih pacijenata i čestica koje predstavljaju antigen, koje su identifikovane, izolovane i reprodukovane korišćenjem dobro poznatih i skalabilnih sistema za proizvodnju bakterija.
[0410] U jednoj realizaciji, na primer, višestruki M. tuberculosis ili M. bovis ili drugi antigeni su imobilizovani na površini čestica polimera.
[0411] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na sposobnost čestica polimera koje nose jedan ili više antigena da izazovu imunološki odgovor. U jednom aspektu, čestice polimera sadrže najmanje jedan antigen sposoban da izazove ćelijski posredovani ili drugi imunološki odgovor spojen sa polimernom česticom. Čestice polimernog polimera pokazuju najmanje jedan antigen sposoban da izazove ćelijski ili drugi imunološki odgovor na njihovoj površini da stimuliše optimalan imunološki odgovor na antigenske ostatke.
[0412] U jednoj realizaciji, čestice polimera koje nose jedan ili više antigena izazivaju imunološki odgovor. U jednom aspektu, čestice polimera sadrže najmanje jedan antigen M. tuberculosis, na primer, spojen sa polimernom česticom. Čestice polimernog polimera pokazuju na površini najmanje jedan antigen M. tuberculosis, na primer, da bi stimulisale optimalan imunolo ški odgovor na antigene ostatke.
[0413] U jednoj realizaciji, na primer, više od jednog antigena ili kombinacije antigena i adjuvansa ili drugog imunomodulatornog sredstva ili molekula, kao što je imunostimulatorno sredstvo ili molekul, su prisutni u ili na čestici ili su prisutni u kompoziciji. Tipično, prisustvo kombinacije antigena, adjuvansa ili drugih imunomodulatornih agenasa ili molekula će dodatno pojačati imunološki odgovor.
[0414] Ovo otkriće se takođe odnosi na metodu izazivanja imunološkog odgovora kod subjekta, pri čemu se metoda sastoji od administriranja subjektu kome je to potrebno, čestice polimera koja sadrži protein koji formira čestice, poželjno polimer sintazu, na primer, spojenu za jedan ili vi še vezujućih domena sposobnih da vežu antigen izabran između ESAT6, CFP10, Rv3615c ili Rv3020c antigena. U ovoj realizaciji, pri administraciji subjektu, vezujući domen(i) sposobnih da vežu navedene antigene vezuju endogeni antigen, olakšavajući time imunološki odgovor.
[0415] Na primer, antigeni sposobni da izazovu ćelijski posredovan imunološki odgovor koji je prisutan u subjektu pre primene čestice koja sadrži najmanje jedan domen za vezivanje M. tuberculosis antigena, na primer, ali nije u stanju da izazove efikasan imunološki odgovor u subjektu, vezivanjem za česticu može izazvati efikasan imunološki odgovor ili je efikasan za jačanje imunološkog odgovora subjekta.
[0416] U jednoj realizaciji, otkriće obezbeđuje metodu izazivanja imunološkog odgovora kod subjekta inficiranog tuberkulozom, na primer, ili prethodno imunizovanog protiv tuberkuloze, na primer, pri čemu metoda sadrži davanje subjektu kome je to potrebno, čestice polimera koji sadrži protein koji formira čestice spojen sa vezujućim domenom za antigen M. tuberculosis ili M. bovis.
[0417] U ovoj realizaciji, na primer, pri aministraciji subjektu, vezujućeg domena antigena M. tuberculosis ili M. bovis može da se veže za endogeni antigen M. tuberculosis ili M. bovis. Biće uvaženo da vezivanje čestice polimera koja sadrži domen vezivanja za M. tuberculosis ili M. bovis antigen za endogenu M. tuberculosis ili M. bovis antigen, na primer, može da izazove ili pojača imunološki odgovor subjekta.
[0418] Na primer, M. tuberculosis ili M. bovis antigen koji je prisutan u subjektu pre primene čestice koja sadrži najmanje jedan vezujući domen antigena M. tuberculosis ili M. bovis, ali nije u stanju da izazove efikasan imunološki odgovor subjekta, vezuje se za česticu koja može izazvati efikasan imunološki odgovor ili je efikasna za jačanje imunološkog odgovora subjekta.
[0419] Treba imati na umu da ovo otkriće obezbeđuje čestice, kompozicije i postupke koji izazivaju imunološki odgovor kod subjekata kojima se administriraju. Poželjno, magnituda imunološkog odgovora izazvanog u odgovoru na jedan ili više antigena ispoljenih subjektu korišćenjem čestica, kompozicija i metoda iz pronalaska je veća od one koja je izazvana kao odgovor na sam antigen (to jest, u odsustvu čestica ili kompozicija iz pronalaska ili predstavljeni metodom koja nije ovde navedena). Postupci za kvantifikovanje magnitude imunološkog odgovora, a posebno ćelijski posredovanog imunološkog odgovora, dobro su poznati u struci.
[0420] Posebno razmatrani postupci izazivanja imunološkog odgovora, na primer u dijagnostici tuberkuloze, obuhvataju kožne testove. Najčešći formati testa za goveda su test kaudalnog nabora (CFT), pojedinačni intradermalni cervikalni tuberkulinski test (SIT) i pojedinačni intradermalni uporedni test cervikalnog tuberkulina (SICCT) (Monaghan et al. (1994) Vet. Microbiol, vol.40 pp 111-24).
[0421] Ovi formati ispitivanja koriste prečišćeni proteinski derivat tuberkulina (PPD) pripremljen iz kulture M. bovis (PPDB) kao primarni dijagnostički antigen. Pored toga, test SICCT pokušava da reši senzibilizaciju okruženja upotrebom PPD-a dobijenog iz M. avium (PPD-A). Ovde navedeni kožni testovi mogu biti bilo koji od CFT, SIT ili SICCT testa, kako je opisano u Office International des Epizooties (OIE) Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2009 (ISBN-10:92-9044-718-4; http://www.oie.int/fileadmin/Home/eng/Health standards/tahm/2008/pdf/2.04.07 BOVINE TB.pdf, pristupljeno 8. Novembra 2013, posebno Poglavlje 2.4.7. U njemu su navedeni pozitivni kriterijumi testa i biće dobro razumljivi stručnjaku.
[0422] Prema tome, kada čestice polimera i dijagnostički reagensi iz pronalaska izazivaju pozitivan rezultat kada se primene u kožnom testu, ovaj rezultat se određuje, na primer, otkrivanjem povećane debljine i/ili induracijom kože na mestu administracije (npr. injekcije). Kao što je navedeno u priručniku, na primer, koriste se kalibri ili drugi merni uređaji. U nekim realizacijama, debljina kože se određuje pre primene/injekcije, i ponovo nakon jednog ili vi še od, na primer, oko 24, 36, 48, 72, 96 ili oko 120 sati nakon primene/injekcije. Tipično je određivanje debljine kože oko 72 sata nakon injekcije, kao što je ovde navedeno.
[0423] Dodatne posebno razmatrane metode dijagnostikovanja tuberkuloze obuhvataju dijagnosti čke testove kao što su citokini ili ćelijski testovi, uključujući, na primer, testove ćelijski posredovanog imuniteta, u kojima je uzorak dobijen od subjekta u kontaktu sa polimernom česticom iz pronalaska. Tipično, uzorak će sadržati populaciju ćelija, uključujući imunološke ćelije poput T ćelija, sposobne da posreduju ili moduliraju imunološki odgovor. Posebno razmatrani testovi uključuju testove interferongama, kao što je interferon-gama ELISA. U posebnim primerima, odgovor u testu, kao što je interferongama ELISA, može da razlikuje subjekte koji boluju od tuberkuloze i subjekte imunizovane protiv tuberkuloze, na primer sa BCG.
9. Modulatori imunološkog odgovora
[0424] U određenim okolnostima biće poželjno proizvesti čestice polimera koje prikazuju fuzioni protein koji sadrži dva ili više antigena iz grupe koju čine ESAT6, CFP10, Rv3615c i Rv3020c. Alternativno, fuzioni protein koji sadrži najmanje jedan ili više ovih antigena sa adjuvansom ili drugim modulatorom imunološkog odgovora je poželjan za izazivanje imunološkog odgovora.
[0425] U jednom primeru, čestica polimera prema pronalasku sadrži jedan ili više antigena zajedno sa jednim ili više toličnih receptora, uključujući jedan ili više toličnih receptora koji mogu da vezuju jednu ili više grupa liganda koji sadrže LPS, lipoproteine, lipopeptide, flagelin, dvolančanu RNK, nemetilovana CpG ostrva ili bakterijsku ili virusnu DNK ili RNK. Slično, kompozicija prema pronalasku može sadržati populaciju čestica polimera koje sadrže jedan ili više TB antigena, i populaciju čestica polimera koje sadrže jedan ili više imunomodulatornih molekula, kao što je jedan ili više toličnih receptora.
[0426] Prisustvo jednog ili više imunomodulatornih molekula može biti korisno u izazivanju humoralno specifičnog imunološkog odgovora, ili ćelijski posredovanog imunološkog odgovora, ili u izazivanju imunološkog odgovora koji sadrži kombinaciju humoralnog i ćelijski posredovanog odgovora.
[0427] Pronalazak se sastoji od gore navedenog i takođe predviđa konstrukcije od kojih sledeće daju samo primere.
PRIMERI
Primer 1 - Konstrukcija plazmida i produkcija čestica polimera PHA
[0428] Ovaj primer opisuje pripremu čestica polimera prema pronalasku, i njihovu procenu kao dijagnostičkih reagensa za tuberkulozu.
Uvod
[0429] Tri specifična TB antigena, 6-kDa rana sekretorna antigenska meta (ESAT6), 10 kDa protein filtrata kulture (CFP10) i Rv3615c su eksprimirani od strane članova patogenog kompleksa M.tuberculosis koji uključuje M. bovis, ali nisu eksprimirani od većine nepatogenih ekoloških mikobakterija i soja BCG vakcine (Millington, 2011; Waters et al, 2004). Ovi imunodominantni proteini su prethodno procenjivani u testovima interferona-y (IFN-γ) za dijagnozu tuberkuloze kod goveda (Buddle et al, 1999). Nedavno je ispitivanje kože goveda pomoću kombinacije ova tri proteina pokazalo da imaju visoku osetljivost za otkrivanje životinja zaraženih sa M. bovis pri čemu diferenciraju one vakcinisane BCG-om (Whelan et al, 2010; Casal et al, 2012). Ovaj primer opisuje istraživanje funkcionalnog prikaza ova tri antigena na česticama poliestara i njihove performanse u testovima kože za tuberkulozu kod goveda.
MATERIJALI I METODE
[0430] Sojevi bakterija i uslovi rasta. Sojevi bakterija korišćeni u ovoj studiji su navedeni u Tabeli 1. Soj E.coli korišćen za kloniranje, XL1-blue (Stratagene) transformisan ekspresionim plazmidima, je gajen je u Luria broth (Difco, Detroit, MI) dopunjenoj tetraciklinom (12.5 µg/ml) i ampicilinom (75 µg/ml). Medijum za rast E. coli BL21 (DE3) korišćen za proizvodnju čestica poliestara je sadržao hloramfenikol (50 µg/ml) umesto tetraciklina.
[0431] Plazmidi, oligonukleotidi i stvaranje plazmida za proizvodnju biočestica koje ispoljavaju mikobakterijske antigene. Plazmidi i prajmeri koji se koriste u ovoj studiji navedeni su u Tabelama 1, i 2. Opšte procedure molekularnog kloniranja su sprovedene kao što je opisano na drugom mestu (Sambrook et al, 1989). DNK sekvence novih plazmidnih konstrukata su verifikovane sekvenciranjem DNK. Biosinteza poliestara zahteva, pored gena poliestar sintaze (phaC), i enzime PhaA i PhaB za sintezu prekursora, a ti enzimi su kodirani na plazmidu pMCS69 (Amara et al, 2003).
TABELA 2. Prajmeri
Ime ra mera Mesto restrikci e odvučeno Sekvence od 5’ do 3’ SEK ID BR:
[0432] Za ispoljavanje TB gena na površinama čestica poliestara, geni koji kodiraju aminokiselinske sekvence ESAT-6 (vidi Tabelu 3, SEK ID BR: 1]), CFP-10 (vidi Tabelu 3, SEQ ID No. 2 i RV3615c (vidi Tabelu 3, SEK. ID No. 3) su sintetizovani pomoć u DNK2.0 (CA, USA) pomo ć u PCR prajmera identifikovanih u Tabeli 2, optimizovanih za upotrebu sa kodonom E. coli. NdeI restrikciono mesto je umetnuto na oba kraja i 5' i 3' svakog gena.
Tabela 3 Aminokiselinske sekvence antigena tuberkuloze
Anti en AA sekvence SEK ID BR:
[0433] Odgovarajuć i sintetizovani NdeI fragmenti koji kodiraju CFP-10, ESAT-6 ili Rv3615c su umetnuti u plazmid pHAS-Ag85A-ESAT-6 (Parlane et al, 2009) nakon hidrolize sa NdeI, što je rezultiralo plazmidima pET-14b cfp10-phaC, pET-14b Rv3615c-phaC i pET-14b Esat-6-PhaC, respektivno. Kodon-optimizovane nukleotidne sekvence koje kodiraju fuzioni polipeptid CFP10-PhaC, fuzioni polipeptid Rv3615c-PhaC i fuzioni polipeptid ESAT6-PhaC su predstavljene kao SEK ID BR: 12, SEK ID BR: 13 i SEK ID BR: 14, respektivno.
[0434] Plazmidni konstrukt, pET-14b cfp10-linker-rv3615c-faC-esat6, koji kodira tri gena TB antigena je napravljen na sledeći način. Kodon-optimizovana nukleotidna sekvenca koja kodira fuzioni polipeptid CFP10-linker-Rv3615c-PhaC-ESAT6 ovde je predstavljena kao SEK ID BR: 15.
[0435] XhoI-BamHI fragment koji kodira esat6 gen je sub-kloniran u pET-14b cfp10-linker-rv3615cphaCMa1E hidrolizovan sa XhoI-BamHI da bi se proizveo konačni plazmid, pET-14b cfp10-linker-rv3615cphaC-esat6, koji je sadržao tri gena za antigen tuberkuloze.
[0436] Šematski prikaz plazmida koji se koriste za ispoljavanje TB antigena na povr šini čestica poliestara prikazan je na Slici 1. DNK konstrukti koji sadrže jedan TB gen, pET-14b cfp10-phaC (Slika 1A), pET-14b rv3615cphaC (Sl. 1B), i pET-14b esat6-faC (Slika 1C) i tri TB gena, pET-14b cfp10-linkerrv3615c-faC-esat6 (Sl. 1D) su prikazani. Aminokiselinska sekvenca polipeptida koja sadrži ova tri TB antigena kodirana sa pET14b cfp10-linker-rv3615c-phaC-esat6 je prikazana je u Tabeli 4 ispod kao SEK ID BR: 10.
[0437] Proizvodnja i izolacija čestica poliestara. Čestice poliestara koje ispoljavaju mikobakterijske proteine ili same kontrolne čestice su proizvedene u E. coliBL21 (DE3) kako je prethodno opisano (Parlane et al, 2009).
[0438] Ukratko, mrlje E. Coli su gajene na 37 °C u LB i indukovane sa 1 mM izopropil-β-D-tiogalaktopiranozidom da indukuju protein i kultivisane su jo š 48 sati na 25 °C. Prisustvo poliestarskih inkluzija je uočeno bojenjem ćelija fluorescentnom lipofilnom bojom Nile Red i korišćenjem fluorescentne mikroskopije (Spiekermann et al, 1999). Za procenu oblika i veličine uključivanja poliestera, kao i broja po ćeliji je korišćena transmisiona elektronska mikroskopija (TEM). Granule poliestara su izolovane kao što je prethodno opisano (Peters et al, 2008). Po potrebi su dodavani inhibitori proteaze (Roche, SAD). Da bi se potvrdila funkcionalnost PhaC enzima, sadr žaj poliestara u ćelijama je kvantitativno određen gasnom hromatografijom-masenom spektroskopijom (GC-MS) (Bramd et al. 1988).
[0439] Analiza proteina vezanih za čestice poliestara. Proteini vezani za poliesterske čestice su odvojeni pomoću SDS-PAGE korišćenjem 8% poliakrilamidnih gelova i bojeni sa Coomassie blue. Proteini od interesa su ekscizovani iz gelova i podvrgnuti uzimanju otiska prsta tripti čkog peptida primenom matrično potpomognute laserske desorpcione jonizacione masene spektrometrije vremena leta (MALDI-TOF/MS) (Jahns et al, 2009).
[0440] Enzimski vezan imunosorbentni test (ELISA). Specifična aktivnost čestica koje pokazuju TB antigene određena je ELISA testom kao što je prethodno opisano (Parlane et al, 2009). Ukratko, mikrotitarska ploča sa visokim kapacitetom vezivanja (Greiner bio-one) prevučena je preko noći na 4 °C sa 100 µl prečišćenih PHB čestica koje ispoljavaju TB proteine ili kontrolnim česticama, razblažene u puferu za prevlačenje karbonat-bikarbonata, pH 9.6 (Sigma-Aldrich) pri koncentracijama proteina u rasponu od 100 µg/ml do 0.05 µg/ml u serijskim razblaženjima. Kao pozitivne kontrole, mikrotitarske ploče su takođe prevučene preko noći na 4 °C sa 100 µl pojedinačnih ili mešavinom tri pojedinačna antigena bez TB, obezbeđena ljubaznošću Dr H.M. 183 Vordermeier (AHVLA, UK), razblažene u karbonatno-bikarbonatnom puferu za prevlačenje, pri koncentracijama proteina u rasponu od 1 µg/ml do 0.125 µg/ml. Ploče su isprane fiziološkim rastvorom puferisanim fosfatom (PBS) koji sadrži 0.05 % (vol/vol) Tween 20 (PBST) i blokiran sa 3 % (tež./vol.) goveđim serumskim albuminom za (BSA) tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBST i inkubirane sa mišjim monoklonskim antitelom za CFP-10 ili ESAT-6 (oba antitela su iz Abcam-a, Cambridge-a, UK) ili poliklonskim zečjim serumom proizvedenim protiv rekombinantnog Rv3615c (AgResearch, Hamilton, NZ) ili pre-imunim ze čim serumom 1 sat na sobnoj temperaturi. Zečji antiserum protiv Rv3615c je proizveden imunizacijom zeca sa 100 µg Rv3615c pomešanog u nepotpunom Freundovom adjuvansu (Sigma) i revakcinacijom zeca dva puta u intervalima od 3 nedelje. Nakon ispiranja sa PBST, ploče su inkubirane 1 sat sa konjugatom antimišji IgG-peroksidaza rena (HRP) ili anti-zečjim HRP- konjugatom HRP. Nakon pranja, dodat je supstrat o-feilendiamina (OPD) (Abbott Diagnostics, IL, USA) i inkubiran 15 minuta na sobnoj t. Reakcija je zaustavljena sa 0.5N H2SO4, i apsorbanca izmerena na 490 nm na ultra-mikrotitarskom čitaču ploča ELx808iu (BIO-TEK Instruments Inc., SAD) (Jahns et al, 2008). Rezultati su izraženi kao jedinice optičke gustine na 490 nm.
[0441] TK kožni test goveda. Deset, 15-mesečnih goveda Frizijskih-ukrštenih goveda je eksperimentalno inficirano dozom od približno 5 x 10<3>jedinica koje formiraju kolonije M. bovis intratrahealno kao što je prethodno opisano (Buddle et al, 1995). Ove životinje su držane na pašnjaku u izolacionoj jedinici koja je bila potpuno odvojena od pa šnjaka gde je paslo 14 goveda iste starosti i rase. Sva goveda su nabavljena iz stada bez tuberkuloze i locirana su u regionima Novog Zelanda bez tuberkuloze. Pre M. bovis inokulacije, goveda su bila negativna u interferon-gama testu (BOVIGAM™ test; Prionics, Švajcarska) za goveđu tuberkulozu, a kontrolna goveda su bila negativna u ovom testu tokom cele studije koristeći standardnu interpretaciju kako je ranije opisano (Buddle et al, 2009). 27 nedelja nakon M. bovis infekcije, zaražena i kontrolna goveda testirana su u uporednom testu kože grlića materice upoređujući odgovore za čestice trostrukog antigena TB polimera i čestice kontrolnog polimera sa onima za PPD iz M. bovis (PPD-B; 5.000 IU/0.1 m1 injekcija) i M. avium (PPD-A; 2,500 IU/0.1 ml injekcija; AsureQuality, Upper Hutt, Novi Zeland)). 0.1 ml inokuluma reagensa poliestarskih čestica TB je sadržao 3.3 µg fuzionog proteina, koji se sastojao od 0.9 µg proteina mikobakterija i 2.4 µg proteina PhaC, pomešanog u PBS, dok su čestice kontrolnog poliestera sadržale 3.3 µg PhaC proteina u PBS. Debljina kože na mestu ubrizgavanja je merena kalibrom neposredno pre injekcije i 72 sata kasnije, a rezultati su izraženi kao promena debljine kože (mm). Životinje zaražene sa M. bovis su ubijene i obdukovane 28 nedelja nakon infekcije. Tuberkulozne lezije tipi čne za one koje su pronađene kod prirodno zaraženih životinja su identifikovane u plućima i/ili plućnim limfnim čvorovima životinja, a M. bovis je kultivisan iz lezija svih ovih životinja korišćenjem BACTEC metode i potvrdom od strane AccuProbe. Sve procedure za životinje je odobrio eti
ki komitet za rad sa životinjama AgResearch Grasslands.
[0442] Statističke analize. Kruskall-Vallisov test je korišćen za poređenje in vitro ELISA odgovora za antigensku aktivnost na česticama i analize unakrsne reaktivnosti antiseruma sa heterolognim antigenima. Odgovori kožnih testova za PPD-B i čestice trostrukog TB antigena su upoređeni pomoću ANOVA. Korelacija između odgovora kožnog testa za goveđi PPB i čestice trostrukog antigena kod eksperimentalno inficiranog goveda je utvrđena pomoću testa Spirmanove korelacije ranga. Statističke analize su sprovedene pomoću paketa "agricolae" u R.3.0.1. a statistička značajnost je na nivou P <0.05.
REZULTATI
[0443] Proizvodnja i karakterizacija čestica poliestara koji ispoljavaju mikobakterijske antigene.
Plazmidi koji kodiraju PhaC i koji sadrže ili esat-6, cfp-10 ili Rv3615c ili su sva tri mikobakterijska gena konstruisana kako je opisano u Materijali i metode. Modularni sastavi različitih hibridnih gena i kodiranih fuzionih proteina su prikazani na Slici 1. Hibridni geni su konstruisani tako da kodiraju fuzione proteine koji posreduju u intraćelijskoj proizvodnji čestica poliestara koje ili ispoljavaju pojedinačne TB antigene ili sva tri TB antigena. Odgovarajući plazmidi su uneti u ćelije E. coli koje sadrže plazmid pMCS69 koji posreduje u obezbeđivanju prekursora za sintezu poliestara. Ćelije E. coli koje sadrže različite plazmide su kultivisane da proizvedu poliestarske čestice koje ispoljavaju pojedinačne TB antigene ili sva tri TB antigena. Prisustvo intraćelijskih poliestarskih čestica u ćelijama E. coli je pokazano fluorescentnom mikroskopijom pomoću Nile Red bojenja (Slika 2). Transmisiona elektronska mikroskopija je pokazala stvaranje poliestarskih čestica posredovanih odgovarajućim fuzionim proteinom unutar rekombinantne E. coli (slika 3). GC-MS analiza je pokazala da su ćelije akumulirale poliestar, polihidroksibutirat, doprinoseći 31.5%, 10%, 30%, 14.3% i 40% ćelijske suve težine kada su bili prisutni geni koji kodiraju PhaC, CFP10-PhaC, Rv3615c-PhaC, ESAT6-PhaC i CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6.
[0444] Ispoljavanje rekombinantnog PhaC antigenskog fuzionog proteina na česticama poliestra. Da bi se proverilo da li su rekombinantni fuzioni proteini imobilizovani na poliesterske čestice i da li su proteini podložni proteolitičkoj degradaciji, izvedena je SDS-PAGE za analizu profila proteina čestice poliestra. Uočene su dominantne proteinske trake koje odgovaraju proteinima oretinske molekularne mase 63 kDa za PhaC, 69kDa za PhaC-ESAT-6 fuziju, 73kDa za CFP10-PhaC, 74kDa za PhaC-Rv3615c i 90kDa za CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 (slika 4). Osim toga, ova četiri fuziona proteina (CFP10-PhaC (SEK ID BR: 7), Rv3615c-PhaC (SEK ID BR: 8), PhaC-ESAT6 (SEK ID BR: 9), i CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 (SEK ID BR: 10)) su identifikovani uzimanjem otiska prsta triptičkog peptida pomoću MALDI-TOF/MS (Tabela 4). Denzitometrijska analiza SDS-PAGE je pokazala da je PhaC činio 20% ukupnog proteina u PhaC frakciji; CFP10-PhaC, Rv3615c-PhaC, PhaC-ESAT6 i CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 činili su oko 26% ukupnog proteina u odgovarajućoj frakciji čestica.
Tabela 4. Identifikovani peptidni fragmenti fuzionog proteina TB analizirani pomoću MALDI-TOF/MS
Protein/proteinska sekvenca Peptidni fragmenti dodeljeni različitim roteinskim re ionima
RV3615C-PhaC (MW: 75.2 kDa)
CFP10-RV3615C-PhaC-ESAT6 MW: 98.1 kDa CFP10: A2-R20, T27-R57, 78-R85
CFP10-RV3615C-PhaC-ESAT6 (MW: 98.1 kDa)
[0445] Takođe je procenjena degradacija proteina. Kao što je prikazano na Slici 4, uzorci na levom panelu nisu tretirani inhibitorom proteaze tokom izdvajanja čestica. Fuzioni proteini Rv3615c-PhaC i PhaC-ESAT6 su bili stabilni i nisu pokazali razgradnju (Trake 3 i 4). Međutim, došlo je do povećanog stepena degradacije proteina u fuzionim proteinima CFP10-PhaC i CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6 (Trake 5 i 6). Uzorci na desnom panelu su tretirani inhibitorom proteaze tokom ekstrakcije čestica. Degradaciju ova dva rekombinantna fuziona proteina koji sadrže CFP10 značajno je inhibirao inhibitor proteaze (Trake 9 i 10). Ovo sugeriše da su rekombinantni fuzioni proteini koji sadrže CFP10 bili senzitivni na digestiju proteaza tokom izolacije i prečišćavanja čestica (Slika 4). Shematski prikaz čestica poliestara sa trostrukim antigenom je prikazan na Slici 5.
Procena reaktivnosti TB antigena in vitro.
[0446] Procenjena je upotreba poliestarskih čestica koje ispoljavaju jedan ili više TB antigena kao dijagnostičkih reagenasa za TB. ELISA je korišćena za ispitivanje dostupnosti i strukturnog integriteta TB antigena prikazanih na površini poliestarskih čestica in vitro (Slika 6).
[0447] U testu reaktivnosti za imobilizovane TB antigene (Slika 6A) negativna kontrola su bile poliestarske čestice koje nose samo PhaC. Pozitivne kontrole su bile pojedinačni i mešavina tri antigena bez (CFP10, Rv3615c i ESAT6). Analizirane su čestice koje nose različite TB antigene. Uočeno je veoma malo vezivanje antitela negativne kontrole, što je pokazalo da čestice poliestra bez ispoljenog TB antigena nemaju mesta vezivanja za tri antitela (anti-CFP10, anti-Rv3615c i anti-ESAT6). Nasuprot tome, došlo je do dramatičnog povećanja vezivanja antitela pozitivnih kontrola. Naročito je bilo, znatno veće vezivanje antitela imobilisanih trostrukih TB antigena od onog za ispoljene pojedina čne antigene; ovo je takođe primećeno kod solubilnih trostrukih i solubilnih pojedinačnih TB antigena (Slika 6A, P <0.05).
[0448] Osim toga, eksperiment sa negativnom kontrolom koji je koristio zečji pre-imunske serume umesto tri specifična antitela je pokazao da svi uzorci imaju slabo vezivanje antitela za serum negativne kontrole (Slika 6B). Štaviše, test unakrsne reaktivnosti je pokazao da je vezivanje antitela za TB antigene specifično, a vezivanje antitela za TB antigene je bilo znatno veće kada je primenjeno odgovarajuće antitelo u poređenju sa onim za heterologne antigene (Slika 6C, P <0.05).
Procena reaktivnosti TB antigena in vivo.
[0449] Da bi se testirala imunogenost i specifičnost čestica koje ispoljavaju trostruki TB antigen in vivo, odgovarajuće čestice su intradermalno injektirane u goveda. Četiri reagensa, čestice koje ispoljavaju trostruke TB antigene, kontrolne čestice, PPD-B i PPD-A su administrirane za kožne testove tuberkuloze (Slika 7). Sve eksperimentalno infektirane životinje su pozitivno reagovale u kožnom testu (≥1 mm povećanje debljine kožnog testa) za PPD-B sam, a osim toga, svi odgovori za PPD-B su bili veći od odgovora za PPD-A.
[0450] Odgovori na 0.9 µg/injekciji fuzionih proteina TB antigena ispoljenih na česticama poliestra su takođe bili pozitivni za sve životinje i nije bilo značajnih razlika u odgovorima između čestica poliestara PPD-B i TB (P> 0.05). Dve životinje su imale slab odgovor (povećanje debljine kože za 2.5 mm na kontrolne čestice poliestra. Nasuprot tome, pri testiranju ovih reagensa za ispitivanje ko že na 14 goveda ekvivalentne starosti, prirodno senzitizovanih na mikobakterije iz okru ženja, nijedno nije pozitivno odgovorilo na poliestarsku česticu TB reagensa, dok je 11 pozitivno reagovalo na PPD-A i tri na PPD-B. Odgovori kožnog testa na PPD-Band čestice trostrukog antigena su upoređene kod goveda eksperimentalno infektiranog sa M. bovis. Iako su sva goveda reagovala na dva različita preparata antigena, nije bilo korelacije između veličine ovih odgovora za pojedinačne životinje.
DISKUSIJA
[0451] Cilj ove studije je bio da se proizvedu fuzioni proteini koji posreduju u stvaranju čestica poliestera koje ispoljavaju odabrane TB antigene (CFP10, ESAT6, Rv3615c) pogodne za primene za kožne testove na tuberkulozu. Podnosioci predstavke očekuju da će ispoljavanje odabranih antigena tuberkuloze na površini imunogenih čestica poliestera biti važno za senzitivnost i specifičnost kožnog testa na tuberkulozu.
[0452] Kao što je prikazano na Slici 1, konstruisani su različiti hibridni geni koji kodiraju enzim koji formira čestice poliestara PhaC, fuzionisan sa pojedinačnim i sa tri TB antigena. Sva četiri hibridna gena su posredovala u proizvodnji čestica poliestara u rekombinantnoj E. coli kako je procenjeno fluorescentnom mikroskopijom (Slika 2), TEM (Slika 3) i GC-MS. Ovi podaci sugeri šu da je PhaC domen ostao aktivan u svim fuzionim proteinima, katalizujući sintezu poliestara i posredujući u formiranju čestica. Identitet fuzionih proteina je dobijen SDS-PAGE analizom u kombinaciji sa analizom otiska prsta triptičnog peptida korišćenjem MALDI-TOF/MS (Jahns et al, 2009) (Slike 4 i 5, Tabela 3). Utvrđeno je da su fuzioni proteini vezani za površinu čestica poliestara koji su sadržali antigen CFP10 podložni degradaciji proteaze, što se moglo izbeći dodavanjem inhibitora proteaze tokom izolacije čestica (Slika 4).
[0453] Površinsko ispoljavanje čestica poliestara odgovarajućeg TB antigena fuzionisanog sa PhaC je ispitivano korišćenjem antitela specifičnih za TB antigen u kombinaciji sa ELISA (Slika 6A). Procena unakrsne reaktivnosti antitela specifičnih za anti-TB antigen, kao i procena mogućeg nespecifičnog vezivanja antitela pomoću pre-imunih seruma su sugerisali da su antitela za TB antigen bila visoko specifična i da se čestice koje ispoljavaju antigen nisu nespecifično vezivale za antitela (Slika 6B, C).
[0454] Za različite čestice je otkriveno da ispoljavaju odgovarajući antigen(e) tuberkuloze. Zanimljivo je da su čestice koje ispoljavaju trostruki TB antigen pokazale veću reaktivnost sa specifičnim antitelima u poređenju sa odgovarajućim česticama koje ispoljavaju pojedinačni TB antigen. To nije bilo zbog različitih nivoa ekspresije jer su slične količine fuzionog proteina otkrivene po masi čestice (Slika 4). Prema tome, podnosioci prijave veruju, bez želje da se vezuju za bilo kakvu teoriju, da je različit raspored antigena u trostrukom antigen fuzionom proteinu mogao doprineti pobolj šanju dostupnosti dotičnog specifičnog antitela. Visoka reaktivnost reagensa koji sadrži tri imobilizovana TB antigena takođe nije uzrokovana unakrsnom reaktivnošću antitela. Svako antitelo je samo specifično interagovalo sa odgovarajućim TB antigenom (Slika 6C).
[0455] Čestica poliestra koja sadrži trostruke TB antigene je ocenjena kao reagens za kožni test tuberkuloze zbog visoke reaktivnosti sa specifičnim antitelima. Osim toga, podnosioci prijave veruju, bez želje da se vezuju za bilo kakvu teoriju, da će proizvodnja samo jednog tipa poliestarskih čestica sa više antigena biti isplativa strategija za proizvodnju nekoliko pojedina čnih čestica antigena. Takođe postoji potražnja za specifičnim dijagnostičkim reagensom koji razlikuje TB-infektirane od pojedinaca senzitizovanih na soj iz okoline ili BCG-vakcinisanih pojedinaca.
[0456] Uporedni cervikalni kožni test se koristi u mnogim zemljama za dijagnozu goveđe tuberkuloze pošto i PPD-A i PPD-B sadrže antigene zajedničke mnogim mikobakterijama iz okoline i jači odgovor na PPD-B u poređenju sa onim za PPD-A ukazuje na infekciju sa M. bovis (Monaghan et a(Monaghan et al, 1994). TB antigeni, CFP10, Rv5c i ESAT6 (27) se nalaze u pripadnicima patogenog kompleksa M. tuberculosis koji uključuje M. bovis i stoga bi odgovori na ove antigene ukazivali na specifičniji odgovor u poređenju sa odgovorom za PPD-B, koji sadrži sirovu mešavinu antigena.
[0457] U ovoj studiji TB kožnog testa (Slika 7), sva tri reagensa (TB antigeni), PPD-A, PPD-B, i reagens sa trostrukim TB antigen česticama, mogli su da identifikuju goveda inficirana tuberkulozom sa visokom osetljivošću (slika 7A). Međutim, reagens u obliku čestica koji sadrži trostruke TB antigene je bio najprecizniji u identifikaciji nezaraženih goveda, prirodno izloženih mikobakterijama iz okoline, dok su PPD-A i PPD-B dali lažno pozitivne rezultate (Slika 7).
[0458] Na osnovu ovih rezultata podnosioci prijave veruju da CFP10-Rv3615c-ESAT6 imobilizovan na površini čestica poliestra pruža osetljiviji, specifičniji i ekonomičniji dijagnostički reagens u poređenju sa drugim testovima, uključujući slobodne antigene.
[0459] Podnosioci dalje veruju, opet bez želje da se vezuju za bilo kakvu teoriju, da trostruki TB antigen koji ispoljavaju čestice poliestara takođe ima korisnost u dijagnostici humane tuberkuloze, uglavnom uzrokovane od M. tuberculosis. Zaista, CFP10, ESAT6 i Rv3615c iz M. tuberculosis snažno uzajamno reaguju sa ortolognim proteinima u M. bovis, uzročnikom goveđe tuberkuloze (Millington et al, 2011; Vaters et al, 2004), a ovi antigeni su imododominantni i kod aktivnih i kod latentnih TBC infekcija kod ljudi (Millington et al, 2011; Sidders et al, 2008).
[0460] Ovaj TB dijagnostički reagens od poliestarskih čestica koji sadrži trostruke antigene ima visoku specifičnost i osetljivost, omogućavajući brz i precizan skrining subjekata zaraženih tuberkulozom. Osim toga, TB kožni test na bazi poliesterskih čestica ima potencijal da napravi razliku između zaraženih i BCG vakcinisanih subjekata
[0461] Ovaj primer pokazuje da su čestice bakterijskog poliestra pripremljene za istovremeno ispoljavanje tri specifična antigena za TB i da te rekombinantne čestice pokazuju specifične i senzitivne performanse kao reagensi za kožni TB test. Ovaj poboljšani kožni test je pokazao manje lažno pozitivnih rezultata kod subjekata u poređenju sa komercijalnim reagensima za kožni test, što zauzvrat smanjuje značajan ekonomski gubitak za krajnjeg korisnika.
Primer 2 - Proizvodnja čestica polimernog tetravalentnog antigena
[0462] Ovaj primer opisuje pripremu čestica tetravalentnog polimera prema pronalasku koji sadrži 4 TB antigena za upotrebu kao dijagnostički reagens za tuberkulozu, uključujući konstrukciju i ekspresiju plazmida, pET-14b cfp10-linker-rv3615c-phaC-linker-esat6-linker-rv3020c.
MATERIJALI I METODE
[0463] Konstrukcija pET-14b cfp10-linker-rv3615c-phaC-linker-esat6-linker-rv3020c prikazana je na Slici 8. Ukratko, fragment DNK koji kodira esat6-rv3020c je izolovan iz pUC57-esat6- rv3020c restrikcionom digestijom sa XhoI i BamHI, praćenom separacijom fragmenata DNK elektroforezom u agaroznom gelu i prečišćavanjem gela. Gen esat6-rv3020c (SEK ID BR: 11) je ligiran u linearizovani vektor pET-14b cfp10-rv3615c-phaC-linker, generisan restrikcionom digestijom sa XhoI i BamHI, koristeći T4 DNA ligazu za generisanje konačnog plazmida, pET-14b cfpl0-rv3615c-phaC-esat6-rv3020c.
Ekspresija in vivo
[0464] Plazmid pET-14b cfp10-rv3615c-phaC-esat6-rv3020c je eksprimiran kao što je gore opisano u Primeru 1. Izvršena je SDSPAGE analiza sirovog lizata, zajedno sa uzorcima uzetim iz različitih koraka u prečišćavanju čestica polimera kako je prethodno opisano (Peters et al, 2008). Ponovo, MALDI-TOF analiza je korišćena da se potvrdi prisustvo svake od različitih proteinskih komponenti u eksprimiranom fuzionom polipeptidu.
REZULTATI
[0465] Slika 9 prikazuje SDS-PAGE analizu sirovog lizata, zajedno sa uzorcima uzetim iz različitih koraka u prečišćavanju čestica polimera. Uočena molekulska težina se dobro slaže sa izračunatom molekulskom težinom.
[0466] Rezultati uzimanja otisaka prsta triptičkih peptida pomoću MALDI-TOF/MS su prikazani u donjoj Tabeli 5. Kako je tamo prikazano, svaki od pet komponentnih proteina koji sadr že fuzioni polipeptid CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6-Rv3020c (SEK ID BR: 22) je identifikovan, kao što je podvučeno.
Tabela 5. Identifikovani peptidni fragmenti rekombinantnog fuzionog proteina koji sadrži četiri TB antigena analizirani pomoću MALDI-TOF/MS
Protein/Proteinska sekvenca Peptidni fragmenti dodeljeni različitim regionima proteina
CFP10-Rv3615c-PhaC-ESAT6-Rv3020c MW: 109.4 kDa
DISKUSIJA
[0467] Ovaj primer je utvrdio da su čestice polimera koje sadrže viševalentni TB antigen iz pronalaska mogle biti uspešno pripremljene ekspresijom fuzionog polipeptida koji sadrži polipeptid koji formira čestice фузионисаn sa 4 različita TB antigena. Osim toga, tetravalentne čestice su prečišćene za upotrebu u pronalasku.
Primer 3 - Procena tetravalentnih PHA polimernih čestica kao dijagnostičkih reagensa
[0468] Ovaj primer opisuje procenu tetravalentnih polimernih čestica iz pronalaska kao dijagnostičkih reagensa za tuberkulozu. Stabilnost i efikasnost čestica polimera koje sadrže tetravalentni TB antigen (TTPP) opisane u gore navedenom primeru 2 su procenjene u kožnim testovima tuberkuloze goveda.
MATERIJALI I METODE
[0469] Materijali i metode koje su korišćene u ovoj studiji su bile opisane u gore navedenim primerima 1 i 2, uz dodatak sledećeg.
Intradermalni testovi - dizajn studije in vivo
[0470] TTPP kompozicije pripremljene za intradermalnu procenu u različitim in vivo studijama predstavljenim u ovom Primeru su prikazane u Tabelama 6 - 10 ispod.
Intradermalna administracija
[0471] TTPP kompozicije su administrirane intradermalno prema sledećem protokolu.
[0472] Injekcije 0.1 ml su napravljene intradermalno. Špricevi su kalibrisani na 0.1 ml, a igla šprica je bila dimenzija 22-26 i duga 3-4 mm. Špricevi su održavani čisto i sterilisano. Izbegnuta je kontaminacija šprica dezinfekcionim sredstvima ili alkoholom, koja može ometati testiranje, i vodilo se računa da se spreči kontaminacija bočica.
Poželjno mesto ubrizgavanja:
[0473]
Goveče: kaudalni nabor za pojedinačni intradermalni test i cervikalno mesto za komparativni cervikalni test (CCT);
Jelen: srednji cervikalni položaj i za pojedinaččni i za CCT. Prilikom korišćenja cervikalnih mesta, , bila je potrebna briga da se pre ubrizgavanja dlaka ravnomerno o šiša do blizu površine kože (srednja dužina 2 mm ili manje). Preporučena veličina ošišane površine je bila 10 x 10 cm za svako mesto ubrizgavanja.
Tumačenje testa:
[0474] Test je očitan u roku od 72 sata nakon injekcije.
[0475] Reakcije kožnih testova su klasifikovane u skladu sa zahtevima New Zealand Animal Health Board i National Pest Management Strategy for Bovine TB.
REZULTATI
In vivo funkcionalna karakterizacija tetravalentnih poliestarskih čestica
[0476] Odgovor na dozu. TTPP je bio efikasan u izazivanju imunološkog odgovora pri niskim dozama od 0.11 ug, kao što je prikazano u Tabeli 11 ispod i na Slici 10.
[0478] Stabilnost/agregacija. TTPP je bio efikasan u izazivanju imunološkog odgovora čak i nakon 6 meseci skladištenja na 4 °C, na 25 °C i na 37 °C (videti Tabelu 13 i Sliku 12). Osim toga, agregacija nije uticala na imunološku efikasnost (80 um, 20 um, 16 um) kao što je prikazano u Tabeli 13 ispod i na Slici 12.
[0479] Veličina čestica. Ovde je procenjena efikasnost TTPP-a prisutnog pri prosečnim veličinama čestica od um16 um do 80 um u različitim kompozicijama, kao što je prikazano na Slikama 13A i 13B. Nije primećen značajan uticaj veličine čestica na senzitivnost ili specifičnost.
[0480] Varijabilnost serije. Imunološka efikasnost TTPP-a je bila veoma konzistentna i pokazala je male varijacije u serijama, kao što je prikazano u Tabeli 14 ispod i na Slici 14.
DISKUSIJA
[0481] Ovaj primer je pokazao da su čestice polimera iz pronalaska koje sadrže tetravalentni TB antigen bile efikasne u izazivanju dijagnostički informativnih kožnih odgovora kod životinja kada su prisutne u kompozicijama različitih formulacija, u vrlo malim dozama, a na efikasnost u velikoj meri nije uticala veličina čestica ili agregacija, niti proizvodna serija.
Primer 4 - Procena čestica tetravalentnog PHA polimera kao dijagnostičkih reagensa
[0482] Ovaj primer opisuje dalju procenu TTPP iz ovog pronalaska kao dijagnostičkih reagensa za tuberkulozu. Senzitivnost i selektivnost TTPP iz ovog pronalaska su procenjeni u testovima goveđeg interferona-gama.
MATERIJALI I METODE
[0483] Materijali i metode koji su korišćeni u ovoj studiji su bili opisani u gornjem Primeru 3, uz dodatak sledećeg.
[0484] E. coli bez lipopolisaharida (ClearColi®, Lucigen) je korišćen kao dodatni proizvodni domaćin za pripremu TTPP.
Procena reaktivnosti TB antigena - IFN-γ testovi.
[0485] Da bi se testirala senzitivnost i specifičnost TTPP-a, uzorci krvi su uzeti od goveda inficiranog tuberkulozom i neinficiranog goveda, i analizirani korišćenjem IFN-γ specifičnog ELISA testa u pločama sa više bunarčića i apsorbancom merenom na 450 nm.
[0486] Analizirani su sledeći reagensi: različita razblaženja kompozicija koje sadrže TTPP eksprimirane u LPS+ i E. coli bez LPS (nerazblažena, 1/4, 1/16, 1/64 i 1/256 razblaženja, dajući 0.38 µg, 0.1 µg, 25 ng, 6 ng, odnosno 1.5 ng ukupnog antigena u bunarčiću, respektivno), kontrolne čestice samo sa PhaC (1/4 razblaženja, obezbeđujući istu količinu proteina PhaC unutar-kao i nerazređene tetravalentne čestice polimera), ispitivan je rastvorljivi ESAT6/CFP10 peptid (4 µg proteina u bunarčiću), PPDB (20 µg proteina u bunarčiću), PPDA (20 µg proteina u bunarčiću) i kontrola samo PBS puffer su ispitivani.
Priprema uzoraka krvi i IFN-γ test
[0487] IFN-γ testovi korišćeni u ovom primeru su sprovedeni upotrebom sterilnog potrošnog materijala u aseptičnim uslovima, na nehlađenim uzorcima krvi, kako sledi.
1. Lagano mešajte krv inverzijom 10 puta.
2. Dodajte 1 ml sveže krvi (<6 h nakon prikupljanja) u sterilnu ploču sa 48 bunarčića. 3. Dodajte 70 ml tetravalentnih čestica TB-antigena (∼6 ng ukupnog antigena po mL, ili ako se koristi 4-puta razblaženje ∼1,5 ng/mL), ili kontrole (PBS, dH2O, PPDA, PPDB, itd.).
4. Inkubirajte 20 sati na 37 °C u vlažnom vazduhu sa 5% CO2.
5. Centrifugirajte i sakupite plazmu.
6. Izmerite nivoe IFN-γ pomoću sendvič ELISA kompleta (Bovigam (Prionics AG)).
REZULTATI
[0488] Kao što se može videti u Tabeli 15 ispod i na Slici 15, uočeni su značajni IFN-γ odgovori u uzorcima krvi zaraženih životinja koje su primile samo 1.5 ng ukupnog antigena kada su ispoljeni na TTPP iz pronalaska. Ovaj odgovor je bio visoko selektivan, pošto su negativni odgovori primećeni sa TTPP uopšte, osim u najvećim koncentracijama u uzorcima krvi nezaraženog goveda, kao što je prikazano u Tabeli 15 i Slici 16. Slični rezultati su dobijeni bez obzira na to da li je TTPP iz pronalaska bio eksprimiran u LPS+ ili LPS- proizvodnim domaćinima.
DISKUSIJA
[0489] Ovaj primer je pokazao da je TTPP prema pronalasku visoko osetljiv u analizama krvi IFN-γ, izazivajući dijagnostički informativne odgovore u uzorcima zaraženih životinja kada su prisutni u ekstremno niskim koncentracijama (6 ng i 1.5 ng ukupnog antigena), i veoma specifi čan bez odgovora ili sa malim odgovorima u uzorcima neinficiranih životinja.
[0490] Tetravalentne čestice iz pronalaska su bile dijagnostički informativne pri koncentracijama redova veličine nižim od kontrolnih reagensa, kao što su PPDA i PPDB.
Primer 5 - Procena tetravalentnih čestica polimeraPHA - ispitivanje senzibilizacije
[0491] Ovaj primer opisuje studiju kojom se testira senzibilizacija na TTPP iz ovog pronalaska.
MATERIJALI I METODE
[0492] Studija senzibilizacije zamoraca nakon ubrizgavanja TTPP (DS498)) sprovedena je prema metodi EU Pharmacopeia. Ispitnoj grupi "imunizovanih" životinja intradermalno su ubrizgane tetravalentne čestice polimera koje su davale 3 µg ukupnog antigena (0.1 ml) na dan nula, dan 5 i dan 10. "Imunizovana" testna grupa i kontrolna grupa su zatim intradermalno injektirane sa tetravalentnim polimernim česticama koje su obezbeđivale 3 µg ukupnog antigena (0.1 mL) na dane 25 do 31. Sve životinje su posmatrane zbog eritema i induracije 24 sata nakon injekcije..
REZULTATI
[0493] Nisu primećene razlike između kontrolisanih i "imunizovanih" životinja, što pokazuje da su "imunizacija" tetravalentnim polimernim česticama (3 ug ukupnog antigena) i naknadna ispitivanja kože pokazala da zamorci nisu postali senzitizovani. To znači da su životinje pokazale imunološke reakcije kada su više puta injektirane česticama tetravalentnog polimera.
[0494] Otekline su primećene na mestima ubrizgavanja; međutim, odsustvo senzitizacije pokazuje da čestice četvorovalentnog polimera prema pronalasku ne stvaraju memorijski imunolo ški odgovor koji bi mogao da utiče na ponovljeni režim testiranja.
Primer 6 - Procena tetravalentnih čestica polimera PHA - studija na terenu
[0495] Ovaj primer opisuje procenu čestica tetravalentnog polimera prema pronalasku kao dijagnostičkih reagensa za tuberkulozu. Specifičnost TTPP opisana u gore navedenom Primeru 2 procenjena je u velikim terenskim studijama na govedima i jelenima kori šćenjem ispitivanja kožnog testa.
MATERIJALI I METODE
[0496] Materijali i metode koji su korišćeni u ovoj studiji bili su opisani u gore navedenim Primerima 1 i 2, uz dodatak sledećeg.
Terensko ispitivanje
[0497] TTPP i komercijalno dostupan reagens za ispitivanje kožne tuberkuloze intradermalnom primenom je administriran za 4628 goveda i 4265 jelena, na sledeći način.
Intradermalna administracija
[0498] Komercijalno dostupan kožni test na tuberkulozu je administriran prema uputstvima proizvođača. TTPP kompozicije su administrirane intradermalno prema sledećem protokolu.
[0499] Injekcije od 0.1 mL (3 µg ukupnog antigena) su napravljene intradermalno. Špricevi su kalibrisani na 0.1 ml, a igla šprica je bila dimenzija 22-26 i dužine 3-4 mm. Špricevi su održavani čisto i sterilisani su. Izbegnuta je kontaminacija šprica dezinfekcionim sredstvima ili alkoholom, koja može ometati testiranje, i vodilo se računa da se spreči kontaminacija bočica.
Poželjno mesto ubrizgavanja:
[0500]
Goveda: Kaudalni nabor za pojedinačni intradermalni test i cervikalno mesto za uporedni cervikalni test (CCT);
Jeleni: srednji cervikalni položaj i za pojedinačni i za CCT. Prilikom korišćenja cervikalnih mesta, pre ubrizgavanja, bila je potrebna briga da se kosa ravnomerno o šiša blizu površine kože (srednje dužine 2 mm ili manje). Preporučena veličina ošišane površine je bila 10 x 10 cm za svako mesto ubrizgavanja.
Tumačenje testa:
[0501]
Debljina kože je izmerena 72 sata nakon injekcije.
Reakcije kožnih testova klasifikovane su u skladu sa zahtevima New Zealand Animal Health Board i National Pest Management Strategy for Bovine TB.
Pozitivni reaktori su verifikovani IFN-γ testom, kulturom i PCR testovima.
REZULTATI
[0502] Jeleni. 4265 životinja je dobilo ID broj od 1 do 4265. 63 životinje su identifikovane kao pozitivne na tuberkulozu pomoću komercijalno dostupnog kožnog testa na tuberkulozu ('Observe'), dok je 18 životinja identifikovano kao pozitivno na TB pomoću TTPP prema ovom pronalasku.
§ 'Observe': posmatrajte rezultat sa vrednošću 1 (n = 63) i 0 (n = 4202)
§ TTPP:TTPP rezultat sa vrednošću 1 (n = 18) i 0 (n = 4247).
Tabela 16 - Upareni T -test i CI: b_TB, Posmatrajte - Jeleni
N Srednja vrednost StDev SE srednja vredn.
TTPP 4265 0.00422 0.06483 0.00099 Posmatrano 4265 0.01477 0.12065 0.00185 Razlika 4265 -0.01055 0.10668 0.00163
95% CI za srednju razliku: (-0.01375, -0.00735)
T-test srednje razlike = 0 (vs ≠ 0): T-vrednost = -6.46
P-vrednost = 0.000
Post-Hoc Snaga Uparenog t Testa
[0503]
Testiranje srednje uparene razlike = 0 (u odnosu na = 0)
Proračunska snaga za srednju uparenu razliku = razlika α = 0.05 Pretpostavljena standardna devijacija uparenih razlika = 0.107
[0504] Razlika od 0.01 za veličinu uzorka od 4265 daje snagu za gornji test od 0.999983.
[0505] Goveda. 4628 životinja je dobilo ID broj od 1 do 4628. 76 životinja je identifikovano kao pozitivno na TB pomoću testa 'Observe', dok su 3 životinje identifikovane kao pozitivne na TB pomoću TTPP iz pronalaska.
§ Observe: observe rezultat sa vrednošću 1 (n = 76) i 0 (n = 4552)
§ TTPP: TTPP rezultat sa vrednošću 1 (n = 3) i 0 (n = 4625).
§
Tabela 17 - Upareni T-test i CI: b_TB, Observe – Goveda
N Srednja vrednost StDev SE srednja vrednost TTPP 4628 0.00065 0.02545 0.00037 Posmatrano 4628 0.01642 0.12710 0.00187 Razlika 4628 -0.01577 0.12803 0.00188
95% CI za srednju razliku: (-0.01946, -0.01208)
T-test srednje razlike = 0 (vs ≠ 0): T-vrednost = -8.38
P-vrednost = 0.000
Post Hoc snaga uparenog t testa
[0506]
Testiranje srednje uparene razlike = 0 (u odnosu na = 0)
Proračunska snaga za srednju uparenu razliku = razlika
α = 0.05 Pretpostavljena standardna devijacija uparenih razlika = 0,128
[0507] Razlika od 0.016 za veličinu uzorka od 4628 daje snagu za gornji test od 1.0.
DISKUSIJA
[0508] Visoko statistički značajni rezultati predstavljeni u ovom primeru su utvrdili da su dijagnosti čki testovi koji koriste TTPP prema pronalasku visoko specifični, da daju tačne dijagnostičke informacije i da mogu da razaznaju lažno pozitivne rezultate identifikovane korišćenjem standardnih metoda.
[0509] Osim toga, testovi predstavljeni u Primerima 3-6 su utvrdili da su TTPP iz pronalaska dijagnostički informativni čak i u količinama koje obezbeđuju vrlo niske ukupne doze TB antigena, pokazujući da su TTPP iz pronalaska visoko senzibilni, pored toga što su visoko selektivni.
INDUSTRIJSKA PRIMENA
[0510] Aspekti pronalaska koji su ovde opisani, uključujući metode, čestice polimera i fuzione proteine, imaju korisnost u dijagnostici, terapiji i prevenciji tuberkuloze.
[0511] Osobe sa iskustvom u tehnici će razumeti da je gornji opis dat samo kao ilustracija i da pronalazak nije ograničen na njega.
Publikacije
[0512]
Amara AA, Rehm BHA. 2003. Replacement of the catalytic nucleophile 533 cysteine-296 by serine in class II polyhydroxyalkanoate synthase from Pseudomonas 534 aeruginosa-mediated synthesis of a new polyester: identification of catalytic residues. 535 Biochem. J. 374:413-421.
Anderson, P. "Tuberculosis vaccines - an update" Nature (2007) 5: 484-487
Barnard et al. "High level recombinant protein expression in Ralstonia eutropha using T7 RNK polymerase based amplification" Protein Expr Puri (2004) 38: 264-71
Barnes i Cave "Current concepts:molecular epidemiology of tuberculosis" New England Journal of Medicine (2003) 349: 1149-1156
Beach, D. i Nurse. P. "High-frequency transformation of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe" Nature 290: 140-1421981
Belisle, J.T. et al. "Tuberculosis and the Tubercle Bacillus" ASM Press, Washington D.C. (2005) Bowie, J.U. et al "Deciphering the message in protein sequences: tolerance to amino acid substitutions Science (1990) 247: 1306-1310
Brockelbank J.A.. et al. "Recombinant Escherichia coli Strain Produces a ZZ Domain Displaying Biopolyester Granules Suitable for Immunoglobulin G Purification" Applied and Environmental Microbiology (2006) 72: 7394-7397 Brunschwig, E i Darzins, A. "A two-component T7 system for the overexpression of genes in Pseudomonas aeruginosa" Gene (1992) 111: 35-41
Buddle BM, Keen D, Thomson A, Jowett G, McCarthy AR, Heslop J, Delisle GW, Stanford JL, Aldwell FE.1995. N Mean StDev SE Mean Difference 4628 -0.015770.128030.00188
Protection of cattle from bovin tuberculosis by vaccination with BCG by the respiratory or subcutaneous route, but not by vaccination with killed Mycobacterium-vaccae Res. Vet. Sci. 59:10-16.
Buddle BM, Livingstone PG, Lisle GWd. 2009. Advances in ante-mortem diagnosis of tuberculosis in cattle. New Zealand Veterinary Journal 57:173-180.
Buddle BM, Parlane NA, Keen DL, Aldwell FE, Pollock JM, LighTBody K, Andersen P. 1999. Differentiation between Mycobacterium bovis BCG-vaccinated and M-bovis-infected cattle by using recombinant mycobacterial antigens. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 6:1-5.
Casal C, Bezos J, Diez-Guerrier A, Alvarez J, Romero B, de Juan L, 449 Rodriguez-Campos S, Vordermeier M, Whelan A, Hewinson RG, Mateos A, 450 Dominguez L, Aranaz A. 2012. Evaluation of two cocktails containing ESAT-6, 451 CFP-10 i Rv-3615c in the intradermal test and the interferongamma assay for 452 diagnosis of bovine tuberculosis. Prev. Vet. Med. 105:149-Case et al., Proceedings of the National Academy of Science USA (1979) 76: 5259-5263
Chang et al., Nature, 275: 615 (1978)
DeBoer et al., "The tac promoter: a functional hybrid derived from the trp lac promoters" Proceedings of the National Academy of Science USA (1983) 80: 21-25
Fleer, R. et al., "Stable multicopy vectors for high-level secretion of recombinant human serum albumin in Kluyveromyces yeasts" Bio/Technology 9: 968-975
Friehs & Reardon "Parameters Influencing the Productivity of Recombinant E. coli Cultivations". Advances in Biochemical Engineering Technology Vol 48 Springer Verlag (1991)
Goeddel, D.V. et al. "Direct expression in Escherichia coli of a DNA sequence coding for human growth hormone" (1979) Nature 281: 544-548
Goeddel, D.V. "Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli" Nucleic Acids Research (1980) 8: 4057-4074
Hess, B. et al. "Cooperation of glycolytic enzymes" Advances in Enzyme Regulation (1968) 7: 149-167.
Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]
Holland, M.J. i Holland, J.P. "Isolation and identification of yeast messenger ribonucleic acids coding for enolase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and phosphoglycerate kinase" Biochemistry (1978) 17: 4900-4907
Huang, X. "On global sequence alignment" Computer Application in the Biosciences (1994) 10: 227-235
Jahns AC, Rehm BHA. 2009. Tolerance of the Ralstonia eutropha Class I polyhydroxyalkanoate synthase for translational fusions to its C terminus reveals a new mode of functional display. Appl. Environ. Microbiol.75:5461-5466.
Kelly, J.M. i Hynes, M.J. "Transformation of Aspergillus niger by the amdS 22 gene of Aspergillus nidulans" EMBO Journal (1985) 4:475-479
Kingsman, A.J. et al., "Replication in Saccharomyces cerevisiae of plasmid pBR313 carrying DNA from the yeast trpl region" Gene (1979) 7:141-152
Louvencourt et al. "Transformation of Kluyveromyces lactis by killer plasmid DNA" Journal of Bacteriology (1983) 154:737-742
Madison, L. L. et al, "Metabolic Engineering of Poly(3-hydroxyalkanoates): From DNA to Plastic", Microbiology and Molecular Biology Reviews (1999) 63: 21-53
Mather,J.P. "Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines" Biology of Reproduction (1980) 23: 243-251
Mather, J.P. et al. "Culture of Testicular Cells in Hormone-Supplemented Serum-Free Medium" Annals of the N.Y. Academy of Science (1982) 383:44-68
Millington KA, Fortune SM, Low J, Garces A, Hingley-Wilson SM, Wickremasinghe M, Kon OM, Lalvani A. 2011.
Rv3615c is a highly immunodominant RD1 (Region of Difference 1)-dependent secreted antigen specific for Mycobacterium tuberculosisinfection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108:5730-5735.
Monaghan ML, Doherty ML, Collins JD, Kazda JF, Quinn PJ. 1994. The tuberculin test Veterinary Microbiology 40:111-124.
Mustafa, A.S. "Biotechnology in the development of new vaccines and diagnostic reagents against tuberculosis" Current Pharmaceutical Biotechnology (2001) 2: 157-173
Parlane NA, Wedlock DN, Buddle BM, Rehm BHA. 2009. Bacterial polyester inclusions engineered to display vaccine candidate antigens for use as a novel class of safe and efficient vaccine delivery agents. Appl. Environ. Microbiol. 50375:7739-7744.
Peters, V. i Rehm, B.H.A. "In vivo enzyme immobilization by use of engineered polyhydroxyalkanoate synthase" Applied and Environmental Microbiology (2006) 72:1777-83 Peters V, Rehm BHA. 2008. Protein engineering of streptavidin for in vivo assembly of streptavidin beads. Journal of Biotechn ology 134:266-274
Rehm, B.H.A. "Polyester synthesis; natural catalysts for plastics" Biochemical Journal (2003) 376: 15-33
Rehm, B.H.A. "Biopolyester particles produced by microbes or using polyester synthases: selfassembly and potential applications" Microbial Biotechnology: biological self-assembly systems and biopolymer-based nanostructures Horizon Bioscience (2006)
Sambrook, et al "Molecular Cloning; a Laboratory Manual" (2nd ed) Cold Spring Harbor Press (1987) Sambrook J. Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USA.
Sidders B, Pirson C, Hogarth PJ, Hewinson RG, Stoker NG, Vordermeier HM, Ewer K. 2008. Screening of highly expressed mycobacterial genes identifies Rv3615c as a useful differential diagnostic antigen for the Mycobacterium tuberculosis complex. Infectin and Immunity 76:3932-3939.
Spiekermann P, Rehm BHA, Kalscheuer R, Baumeister D, Steinbuchel A. 1999. A sensitive, viablecolony staining method using Nile red for direct screening of bacteria that accumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage compounds. Arch. Microbiol. 171:73-80. Sreekrishna K et al. "High level expression of heterologous proteins in methylotropic yeast Pichia pastoris" Journal of Basic Microbiology (1988) 28: 265-278
Stinchcomb, D. T. et al. "Isolation and characterisation of a yeast chromosomal replicator" Nature (1979) 282: 39-43
Tilburn, J. et al. "Transformation by integration in Aspergillus nidulans" Gene (1983) 26: 205-221 Tschemper, G i Carbon, J. "Sequence of a yeast DNA fragment containing a chromosomal replicator and the TRP1 gene" Gene (1980) 10:157-166
Urlaub, G. i Chasin, L.A. "Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity" Proceedings of the National Academy of Science USA (1980) 77:4216-4220.
Van den Berg, G. et al. "Kluyveromyces as a host for heterologous gene expression: expression and secretion of procliymosin" Bio/Technology (1990) 8: 135-139.
Vordermeier HM, Whelan A, Cockle PJ, Farrant L, Palmer N, Hewinson RG. 2001. Use of synthetic peptides derived from the antigens ESAT-6 and CFP-10 for differential diagnosis of bovine tuberculosis in cattle. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 8:571-578.526
Waters WR, Nonnecke BJ, Palmer MV, Robbe-Austermann S, Bannantine JP, Stabel JR, Whipple DL, Payeur JB, Estes DM, Pitzer JE, Minion FC. 2004. Use of recombinant ESAT-6 : CFP-10 fusion protein for differentiation of infections of cattle by Mycobacterium bovisand by M. avium subsp aviumand M. avium subsp paratuberculosis. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology 11:729-735.
Whelan AO, Clifford D, Upadhyay B, Breadon EL, McNair J, Hewinson GR, 445 Vordermeier MH.
2010. Development of a skin test for bovine tuberculosis for differentiating infected from vaccinated animals. Journal of Clinical Microbiology 48:3176-3181.
Yelton, M.M. et al. "Transformation of Aspergillus nidulans by using a trpC plasmid" Proceedings of the National Academy of Science USA (1984) 81: 1470-1474
[0513] Sve karakteristike otkrivene u ovoj specifikaciji se mogu kombinovati u bilo kojoj kombinaciji. Prema tome, osim ako nije izričito navedeno drugačije, svaka objavljena karakteristika je samo primer generičke serije ekvivalentnih ili sličnih karakteristika. Stručnjaku će biti očigledno da se mogu izvršiti različite supstitucije i modifikacije ovde otkrivenog pronalaska bez odstupanja od obima i duha pronalaska. Pronalazak koji je ovde ilustrativno opisan na odgovarajući način se može primeniti u odsustvu bilo kojeg elementa ili elemenata, ili ograničenja, koji ovde nisu posebno obelodanjeni kao bitni. Tako, na primer, u svakoj instanci ovde, u neograničavajućim realizacijama ili primerima ovog pronalaska, izrazi "koji sadrži", "uključujući", "sadrže" itd. treba čitati opširno i bez ograničenja. Metode i postupci koji su ovde ilustrativno opisani se na odgovaraju ći način mogu praktikovati u različitim redosledima koraka, i nisu nužno ograničeni na redosled koraka navedenih ovde ili u patentnim zahtevima.
[0514] Upotrebljeni termini i izrazi se koriste kao opisni termini, a ne kao ograni čenja, i ne postoji namera u upotrebi takvih termina i izraza da se isključi bilo koji ekvivalent prikazanih i opisanih karakteristika ili njihovih delova, ali prepoznato je da su moguće različite modifikacije u okviru pronalaska kako se tvrdi. Tako će se razumeti da iako je ovaj pronalazak posebno otkriven u različitim neograničavajućim realizacijama i/ili poželjnim neograničavajućim realizacijama i opcionim karakteristikama, smatra se da su sve izmene i varijacije ovde otkrivenih koncepata kojima mogu pribeći stručnjaci u ovoj oblasti obuhvaćene ovim pronalaskom, kako je definisano priloženim patentnim zahtevima.
[0515] Pronalazak je ovde široko i uopšteno opisan. Svaka od užih vrsta i podgeneričkih grupa koje spadaju u generičko otkriće takođe čine deo pronalaska. Ovo uključuje generički opis pronalaska sa uslovnim ili negativnim ograničenjem za uklanjanje bilo kog subjekta iz roda, bez obzira na to da li je isečeni materijal ovde posebno citiran.
[0516] Takođe se podrazumeva da, kako se ovde koristi i u priloženim zahtevima, oblici u jednini "neki", "jedan" i "taj" uključuju referencu u množini, osim ako kontekst jasno nalaže drugačije, izraz "X i/ili Y" znači "X" ili "Y" ili oba "X" i "Y", a slovo "s" koje sledi iza imenice označava i oblike u množini i u jednini te imenice. Osim toga, kada su karakteristike ili aspekti pronalaska opisani u smislu Markush grupa, namerava se, a stručnjaci u ovoj oblasti će shvatiti da pronalazak obuhvata i na taj način se opisuje u pogledu bilo kojeg pojedinačnog člana i bilo koje podgrupe članova grupe Markush, a podnosioci prijave zadržavaju pravo da revidiraju prijavu ili patentne zahteve tako da se odnose konkretno na bilo koji pojedinačni član ili bilo koju podgrupu članova Markush grupe.

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Čestica polimera koja sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida, pri čemu jedan ili više fuzionih polipeptida sadrži
(A) protein koji formira čestice i dve ili više grupa koje sadrže
a. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen,
b. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
c. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen, i
d. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, ili
(B) protein koji formira čestice i tri ili više grupa koje sadrže
a. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
b. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen,
c. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen,
d. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, i
e. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen, ili
(C) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen, ili
(D) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen i Rv3615c antigen, naznačeno time što pomenuti fuzioni polipeptid ima najmanje oko 95% identiteta sekvence sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u SEK ID BR: 10, ili
(E) protein koji formira čestice i
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen; i
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen; i
iii. antigen Rv3615c ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv3615c, i
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen, ili
(F) protein koji formira čestice, ESAT6 antigen, CFP10 antigen, Rv3615c antigen i Rv3020c antigen.
2. Čestica polimera prema patentnom zahtevu 1, pri čemu čestica polimera sadrži najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i dva ili više iz grupe koja sadrži
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen; i najmanje jedan fuzioni polipeptid koji sadrži protein koji formira čestice i jednu ili više grupa koje sadrže
vi. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
vii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
viii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
ix. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i
x. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen.
3. Čestica polimera prema patentnom zahtevu 2, pri čemu se fuzioni polipeptid koji sadrži jedan ili više antigena iz grupe (vi) do (x) razlikuje od fuzionog polipeptida koji sadr ži dva ili više antigena iz grupe (i) do (v).
4. Čestica polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu kada je prisutan, ESAT6 antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 1, i kada je prisutan, CFP10 antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 2, i kada je prisutan, Rv3615c antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 3, i kada je prisutan, Rv3020c antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 4, i kada je prisutan, Rv2346c antigen sadrži 10 ili više susednih aminokiselina iz aminokiselinske sekvence SEK ID BR: 5.
5. Čestica polimera prema patentnom zahtevu 4, pri čemu kada je prisutan ESAT6 antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 1, i kada je prisutan CFP10 antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 2, i kada je prisutan Rv3615c antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 3, i kada je prisutan Rv3020c antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 4, i kada je prisutan Rv2346c antigen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEK ID BR: 5.
6. Kompozicija koja sadrži jednu ili više čestica polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5 i nosač.
7. Kompozicija prema patentnom zahtevu 6, pri čemu kompozicija sadrži dve ili više populacije čestica polimera, pri čemu jedna populacija čestica polimera sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida koji sadrže protein koji formira čestice i dve ili više grupa koje sadrže
i. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
ii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
iii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
iv. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i v. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže antigen Rv2346c; i jednu populaciju čestica polimerakoja sadrži jedan ili više fuzionih polipeptida koji sadrže protein koji formira čestice i jedno ili više iz grupe koju čine
vi. ESAT6 antigen ili vezujući domen sposoban da veže ESAT6 antigen;
vii. CFP10 antigen ili vezujući domen sposoban da veže CFP10 antigen;
viii. Rv3615c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3615c antigen;
ix. Rv3020c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv3020c antigen; i x. Rv2346c antigen ili vezujući domen sposoban da veže Rv2346c antigen;
pri čemu se jedan ili više fuzionih polipeptida prisutnih u jednoj populaciji čestica polimera razlikuje od jednog ili više fuzionih polipeptida prisutnih u drugoj populaciji čestica polimera.
8. Dijagnostički reagens koji sadrži jednu ili više čestica polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5 ili kompoziciju prema patentnom zahtevu 6 ili 7, je po željno za topikalnu administraciju.
9. Dijagnostički reagens prema patentnom zahtevu 8, pri čemu dijagnostički reagens
(A) je formulisan tako da obezbedi manje od 10 µg ukupnog antigena po dozi,
(B) sadrži manje od 5 µg ukupnog antigena po dozi,
(C) je formulisan tako da obezbedi manje od 5 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, (D) je formulisan tako da obezbedi manje od 1 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi, (E) je formulisan tako da obezbedi manje od 5 µg svakog prisutnog antigena po dozi,
(F) sadrži manje od 5 µg svakog prisutnog antigena po dozi,
(G) sadrži manje od 1 µg svakog prisutnog antigena po dozi,
(H) sadrži manje od 0.5 µg jednog ili više prisutnih antigena po dozi,
(I) sadrži manje od 0.5 µg svakog prisutnog antigena po dozi,
(J) sadrži manje od 50 ng svakog prisutnog antigena po dozi,
(K) je formulisan da obezbedi manje od 50 ng ukupnog antigena po dozi, ili
(L) je formulisan da obezbedi manje od 10 ng ukupnog antigena po dozi.
10. Najmanje jedna čestica polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, kompozicija prema patentnom zahtevu 6 ili 7, ili reagens prema patentnom zahtevu 8 ili 9, za upotrebu u postupku dijagnostikovanja tuberkuloze kod subjekta, metod koji se sastoji od administriranja subjektu efikasne količine najmanje jedne čestice polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva 1 do 5, kompozicije prema patentnom zahtevu 6 ili 7, ili reagensa prema patentnom zahtevu 8 ili 9, i detektovanje imunološkog odgovora kod subjekta, pri čemu je prisustvo imunološkog odgovora indikativno za tuberkulozu.
11. Najmanje jedna čestica polimera, kompozicija ili reagens za upotrebu prema patentnom zahtevu 10, pri čemu je administracija lokalna, poželjno kožnim ubodom.
12. Metod otkrivanja M. tuberculosis ili M. bovis u uzorku subjekta, metod koji sadrži
uzimanje uzorka od subjekta,
dovođenje u kontakt uzorka sa najmanje jednom česticom polimera prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, kompozicijom prema patentnom zahtevu 6 ili 7, ili reagensom prema patentnom zahtevu 8 ili 9, i detaktovanje odgovora indikativnog za prisustvo jednog ili vi še antigena M. tuberculosis u uzorku,
pri čemu je odgovor koji je indikativan za prisustvo jednog ili vi še M. tuberculosis ili M. bovis antigena indikativan i za M. tuberculosis ili M. bovis kod subjekta.
13. Metod prema patentnom zahtevu 12, pri čemu odgovor koji je indikativan za prisustvo jednog ili više antigena M. tuberculosis ili M. bovis predstavlja
(A) detekcija prisustva antitela na M. tuberculosis ili M. bovis u navedenom uzorku , ili
(B) detekcija prisustva imunske ćelije koja je responsivna na M. tuberculosis ili M. bovis u navedenom uzorku.
14. Metod prema patentnom zahtevu 12 ili 13, pri čemu se detekcija vrši imunotestom, ELISA testom, radioimunotestom ili Western Blot-om, citokinskim ili interferon-gama testom.
15. Metod prema patentnom zahtevu 13, pri čemu se prisustvo imunske ćelije koja je responsivna na Micobacterium tuberculosis ili M. bovis detektuje testom proliferacije ćelija, testom sortiranja ćelija uključujući FACS, ili testom in situ hibridizacije.
RS20211112A 2014-02-04 2015-02-04 Čestice polimera i njihova upotreba RS62375B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NZ62068214 2014-02-04
PCT/NZ2015/050008 WO2015119512A1 (en) 2014-02-04 2015-02-04 Polymer particles and uses thereof
EP15746012.2A EP3102613B1 (en) 2014-02-04 2015-02-04 Polymer particles and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62375B1 true RS62375B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=53778236

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211112A RS62375B1 (sr) 2014-02-04 2015-02-04 Čestice polimera i njihova upotreba

Country Status (14)

Country Link
US (1) US10501505B2 (sr)
EP (1) EP3102613B1 (sr)
CY (1) CY1124491T1 (sr)
DK (1) DK3102613T3 (sr)
ES (1) ES2891973T3 (sr)
HK (1) HK1232241A1 (sr)
HR (1) HRP20211418T1 (sr)
HU (1) HUE056108T2 (sr)
LT (1) LT3102613T (sr)
PL (1) PL3102613T3 (sr)
RS (1) RS62375B1 (sr)
SI (1) SI3102613T1 (sr)
SM (1) SMT202100585T1 (sr)
WO (1) WO2015119512A1 (sr)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10684275B2 (en) 2016-12-14 2020-06-16 Becton, Dickinson And Company Methods and compositions for obtaining a tuberculosis assessment in a subject
CN109776662B (zh) * 2019-03-13 2022-05-17 中国动物卫生与流行病学中心 一种用于牛结核病变态反应检测的鸡尾酒抗原
CN109776661B (zh) * 2019-03-13 2022-08-09 中国动物卫生与流行病学中心 一种牛结核病γ-干扰素ELISA检测用鸡尾酒刺激抗原
CN109813576B (zh) * 2019-03-25 2021-04-02 中国动物卫生与流行病学中心 一种牛结核病刺激上清制备用采血器
CN109813884A (zh) * 2019-03-25 2019-05-28 中国动物卫生与流行病学中心 一种牛结核病γ-干扰素快速检测制品
CN111269297B (zh) * 2020-01-23 2021-11-30 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法
WO2021207531A2 (en) * 2020-04-08 2021-10-14 Nanopin Technologies, Inc. Monoclonal antibodies and uses thereof
CN119823286B (zh) * 2025-01-16 2026-02-06 中国动物卫生与流行病学中心 一种重组蛋白抗原及其在制备用于检测牛伽马干扰素试剂盒中的应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4722840A (en) 1984-09-12 1988-02-02 Chiron Corporation Hybrid particle immunogens
US7037510B2 (en) 1997-04-18 2006-05-02 Statens Serum Institut Hybrids of M. tuberculosis antigens
US20060024332A1 (en) 2004-08-02 2006-02-02 Waters Wade R Recombinant ESAT-6:CFP-10 fusion protein useful for specific diagnosis of tuberculosis
AU2006295515A1 (en) 2005-09-27 2007-04-05 Polybatics Limited Polymer particles and uses thereof
KR20140015127A (ko) 2009-07-29 2014-02-06 베른드 헬무트 아담 렘 폴리머 입자 및 이의 용도
WO2012104791A1 (en) 2011-02-01 2012-08-09 Bernd Helmut Adam Rehm Fusion polypeptides and uses thereof
WO2014009439A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Nec Europe Ltd. Reporting user related information in a mobile communication network

Also Published As

Publication number Publication date
SI3102613T1 (sl) 2021-11-30
US10501505B2 (en) 2019-12-10
LT3102613T (lt) 2021-09-27
ES2891973T3 (es) 2022-02-01
HUE056108T2 (hu) 2022-01-28
CY1124491T1 (el) 2022-07-22
HRP20211418T1 (hr) 2021-12-24
HK1232241A1 (zh) 2018-01-05
PL3102613T3 (pl) 2021-12-13
SMT202100585T1 (it) 2021-11-12
WO2015119512A1 (en) 2015-08-13
EP3102613A4 (en) 2017-12-20
US20170008938A1 (en) 2017-01-12
EP3102613A1 (en) 2016-12-14
EP3102613B1 (en) 2021-06-09
DK3102613T3 (da) 2021-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3102613B1 (en) Polymer particles and uses thereof
CN102573891B (zh) 聚合物微粒及其用途
Parlane et al. Vaccines displaying mycobacterial proteins on biopolyester beads stimulate cellular immunity and induce protection against tuberculosis
Chen et al. New skin test for detection of bovine tuberculosis on the basis of antigen-displaying polyester inclusions produced by recombinant Escherichia coli
US20160145654A1 (en) Polymer particles and uses thereof
Parlane et al. Bacterial polyester inclusions engineered to display vaccine candidate antigens for use as a novel class of safe and efficient vaccine delivery agents
CN105307673A (zh) 用于稳健的体液及细胞免疫应答的亚单位疫苗递送平台
Lee et al. Engineering mycobacteria for the production of self-assembling biopolyesters displaying mycobacterial antigens for use as a tuberculosis vaccine
Sam et al. Synthetic particulate subunit vaccines for the prevention of Q fever
Mao et al. Enhanced immunogenicity of the tuberculosis subunit Rv0572c vaccine delivered in DMT liposome adjuvant as a BCG-booster
Niu et al. Construction and evaluation of a novel multi-antigenic Mycobacterium tuberculosis subunit vaccine candidate BfrB-GrpE/DPC
EP2758069A2 (en) Method to predict the presence of inflammation or itaconic acid, irg1 and/or protein irg1 in a subject and pharmaceutical composition for treating or preventing inflammation
Liang et al. CFP10–loaded PLGA nanoparticles as a booster vaccine confer protective immunity against Mycobacterium bovis
AU2012357637A1 (en) Prevention and treatment of Mycobacterium infection
Mustafa et al. Recovery of recombinant Mycobacterium tuberculosis antigens fused with cell wall-anchoring motif (LysM) from inclusion bodies using non-denaturing reagent (N-laurylsarcosine)
Ozeki et al. Recombinant mycobacterial DNA-binding protein 1 with post-translational modifications boosts IFN-gamma production from BCG-vaccinated individuals’ blood cells in combination with CpG-DNA
Aghababa et al. Production and purification of mycolyl transferase B of Mycobacterium tuberculosis
Yamamoto et al. Yuriko Ozeki 1Ε, Akira Yokoyama, Akihito Nishiyama, Yutaka Yoshida, Yukiko Ohara, Tsukasa Mashima 3, Chikako Tomiyama 4, Amina K. Shaban, Atsuki Takeishi, Mayuko Osada‑Oka 5, Takehiro Yamaguchi 6, Yoshitaka Tateishi, Jun‑ichi Maeyama, Mariko Hakamata, Hiroshi Moro 8, Toshiaki Kikuchi 8, Daisuke Hayashi 9, Fumiko Suzuki 10
RU2824195C1 (ru) Мультиэпитопный полипептид для иммунизации против Mycobacterium tuberculosis
CA3099495A1 (en) Nucleic acid for treating mite allergy
Karyal Development of an Oral Vaccine against Clostridioides difficile
KR20250058640A (ko) 세포 표면 가수분해효소를 이용하여 SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 에피토프를 유산균의 세포 표면에 고정시키는 방법
Khosravani Purification, formulation and characterisation of the adenylate cyclase toxin of Bordetella pertussis
Smith Characterizing Exosome Biogenesis and Function in Stimulating the Immune Response during a Mycobacterium Infection