RS62386B1 - Postupak za lečenje gljivičnih infekcija - Google Patents

Postupak za lečenje gljivičnih infekcija

Info

Publication number
RS62386B1
RS62386B1 RS20211133A RSP20211133A RS62386B1 RS 62386 B1 RS62386 B1 RS 62386B1 RS 20211133 A RS20211133 A RS 20211133A RS P20211133 A RSP20211133 A RS P20211133A RS 62386 B1 RS62386 B1 RS 62386B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
defensin
xaa
plant
amino acid
Prior art date
Application number
RS20211133A
Other languages
English (en)
Inventor
Der Weerden Nicole Louise Van
Marilyn Anne Anderson
Original Assignee
Hexima Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=55748162&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62386(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hexima Ltd filed Critical Hexima Ltd
Publication of RS62386B1 publication Critical patent/RS62386B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/168—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/135—Amines having aromatic rings, e.g. ketamine, nortriptyline
    • A61K31/137—Arylalkylamines, e.g. amphetamine, epinephrine, salbutamol, ephedrine or methadone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4196—1,2,4-Triazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/4418—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof having a carbocyclic group directly attached to the heterocyclic ring, e.g. cyproheptadine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/69—Boron compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/08—Antiseborrheics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)

Description

Opis
PODACI O PRIJAVI
[0001] Ova prijava je povezana sa i zahteva prioritet od US Privremene prijave patenta br.62/066,808, podnete 21. oktobra 2014. sa naslovom "Postupak za lečenje".
POZADINA
OBLAST
[0002] Ovo otkrivanje odnosi se na kontrolu gljivične infekcije rožnatih tvorevina koje prekrivaju dorzalne i terminalne falange kod ljudi i životinja i povezanih cerebralnih izbočina kod životinja kao i materijala koji obuhvata keratin na površinama kod ljudi i životinja. Agensi i prirodne i sintetičke formulacije i ekstrakti korisni za kontrolu gljivične infekcije ovih tvorevina i povezanih izbočina i materijala koji obuhvata keratin takođe su obuhvaćeni ovim otkrivanjem. U nekom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje opisuje lečenje gljivične infekcije noktiju, a određenije onihomikoze kod ljudi.
OPIS POVEZANE TEHNIKE
[0003] Bibliografski detalji publikacija na koje se autor poziva u ovoj specifikaciji dati su po abecednom redu na kraju ovog opisa.
[0004] Pozivanje na bilo koje prethodno stanje tehnike u ovoj specifikaciji nije, i ne treba uzeti kao, znanje ili bilo koji oblik sugestije da ovo stanje tehnike čini deo zajedničkog opšteg znanja u bilo kojoj državi.
[0005] Gljivična infekcija uključujući zarazu može dovesti do značajnih zdravstvenih problema kod ljudi i životinja.
[0006] Iako su se hemijski fungicidi pokazali uspešnim u humanoj i veterinarskoj medicini, postoji niz ekoloških i regulatornih problema sa stalnom upotrebom hemijskih agensa za kontrolu gljivične infekcije. Povećana upotreba ovih agensa takođe pruža selektivni pritisak za pojavu rezistencije kod gljivičnih vrsta. Postoji jasna potreba za razvojem alternativnih mehanizama kontrolisanja infekcije gljivičnim patogenima kod ljudi i životinja.
[0007] Posebno problematično stanje je onihomikoza, takođe poznata kao dermatofitna onihomikoza i tinea ungium (Rapini et al. (2007) Dermatology:2-volume set, St. Louis: Mosby). Ovo je gljivična infekcija nokta i drugih rožnatih tvorevina koje prekrivaju dorzalne i terminalne falange kod ljudi i životinja. Određenije, to je infekcija nokta nožnog prsta ili nokta prsta ruke uključujući bilo koju komponentu nokta uključujući matricu, sloj ili pločicu. Bolest kod ljudi nije neuobičajena, ali može biti teška za lečenje budući da je zarazna gljivica ugrađena unutar i ispod nokta. Iako nije opasna po život, onihomikoza može da uzrokuje bol, neprijatnost, abnormalnost i da izazove i fizičko i psihološko oštećenje. Efekti onihomikoze su široko rasprostranjeni i imaju značajan uticaj na kvalitet života.
[0008] Glavni patogeni koji izazivaju onihomikozu su dermatofiti Tricophyton rubrum i Trichophyton mentagrophytes, pri čemu T. rubrum broji 90% slučajeva (Sotiriou et al. (2010) Acta Derm-Venereol 9(2):216-217).
[0009] Lečenje onihomikoze zavisi od kliničkog subtipa, broja zaraženih noktiju i ozbiljnosti zahvaćenosti noktiju. Dok su oralni lekovi najefikasniji, postoji veći broj faktora koji sprečavaju njihovu upotrebu. Nuspojave, uključujući hepatotoksičnost povezanu sa sistemskim izlaganjem većem broju oralnih antifungalnih lekova, čini oralne lekove neprivlačnim. Osim toga, stariji su velika demografska grupa koja boluje od onihomikoze i neželjenih interakcija lek-lek jer česta upotreba pratećih lekova isključuje upotrebu oralnih lekova. Ovo naglašava značaj razvoja topikalnih terapija za lečenje onihomikoze.
Većina lečenja uključuje ili topikalne ili oralne antifungalne formulacije (Westerberg et al. (2013) American Family Physician 88(11):762-770). Oralni lekovi uključuju terbinafin, itrakonazol i flukonazol (Westerberg et al. (2013) supra). Ove terapije samo leče infekcije u 14-38 % slučajeva i dolazi do visokog rizika od oštećenja jetre. Topikalni lekovi uključuju ciklopiroks, klotrimazol, amorolfin, efinakonazol, tavaborol i butenafin. Ove terapije imaju stopu izlečenja od između 5 i 17% i moraju se primenjivati svakodnevno tokom najmanje 48-nedelja. Ove niske stope izlečenja su rezultat veoma lošeg prodiranja aktivnih sastojaka kroz nokte kao i fungistatičkih načina delovanja koji samo inhibiraju fungalni rast pre nego ubijaju gljivične ćelije, dozvoljavajući da rezervoar gljivica opstane i ponovo inficira nokat. Pored toga, dugi režimi lečenja rezultuju nepridržavanjem kod mnogih pacijenata. Nijedno od ovih lečenja nije u potpunosti efikasno i stanje može da opstane tokom mnogo godina.
[0010] Za topikalno lečenje onihomikoze da bi se dostiglo mesto infekcije, antifungalni agens mora da može da prodre kroz nokat. Ispitivanja prodiranja nekoliko modela antimikotičnih lekova kroz pločicu nokta kod ljudi i keratinske membrane kod kopita goveda pokazala su da se permeabilnost noktiju smanjuje sa porastom molekulske mase (Mertin i Lippold (1997) J Pharm Pharmacol 49:866-872; Kobayashi et al (2004) Eur J Pharm Sci 21:471-477). Svaki od modela ispitivanih lekova imao je molekulsku masu manju od 1000. Ova ispitivanja ukazuju da molekul sa MW > 5000 neće moći da prodre kroz nokat.
[0011] Drugo problematično stanje je gljivična infekcija dlake i nekog drugog materijala koji obuhvata keratin uključujući međupovršinu između dlake i folikule dlake. Ovo stanje je ponekad poznato kao tinea capitis ili lišaj na glavi. Lečenje može da bude u obliku oralnih lekova uključujući griseofulvin, terbinafin i itrakonazol. Topikalna lečenja uključuju šampone koji sadrže antifungalne agense kao što su ketokonazol, ciklopiroks, pirokton i cink pirition. Gljivične infekcije skalpa i kože mogu takođe da izazovu iritaciju i ljuštenje kože što dovodi do stanja kao što su seboreični dermatitis i perut. Šamponi koji sadrže antifungalne agense mogu da se koriste za lečenje peruti izazvane gljivičnom infekcijom.
[0012] Biljni defenzini su mali (45-54 aminokiselina), bazni proteini sa četiri do pet disulfidne veze (Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):8214-8222). Oni dele zajednički obrazac disulfidne veze i zajedničko strukturno savijanje, gde je trolančani, antiparalelni β-list vezan za α-heliks putem tri disulfidne veze, obrazujući cistein-stabilizovan αβ motiv. Četvrta disulfidna veza takođe spaja N- i C-krajeve što dovodi do veoma stabilne strukture. Biljni defenzini mogu da imaju mnoge biološke funkcije, uključujući anti-bakterijsku aktivnost, inhibiciju sinteze proteina, inhibiciju α-amilaze i proteaze, uloge razvoja dotoka i detekciju polena i antifungalnu aktivnost (Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194; Bloch i Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104; van der Weerden et al (2013) Fungal Biol Rev 26:121-131).
[0013] Struktura defenzina sastoji se od sedam „petlji“ definisanih kao regioni između ostataka cisteina. Petlja 1 obuhvata prvi β-list (1A) kao i veći deo fleksibilnog regiona koji povezuje ovaj β-list sa αheliksom (1B) između prva dva invarijantna ostatka cisteina. Petlje 2, 3 i početak 4 (4A) čine α-heliks, dok preostale petlje (4B - 7) čine β-listove 2 i 3, a fleksibilni region koji ih vezuje (region β-ukosnice) [van der Weerden et al. (2013) Cell Mol Life Sci 70 (19): 3545-3570]. Poznato je da je petlja 5 biljnih defenzina od suštinskog značaja za antifungalno dejstvo i značajna determinanta za mehanizam delovanja ovih proteina (Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550).
[0014] Biljni defenzini uopšteno dele osam potpuno očuvanih ostataka cisteina. Ovi ostaci se zajednički nazivaju "invarijantni ostaci cisteina", jer su njihovo prisustvo, lokacija i povezanost očuvani među defenzinima. Na osnovu sličnosti sekvenci, biljni defenzini mogu da se kategorizuju u različite grupe. Unutar svake grupe, homologija sekvenci je relativno visoka dok je međugrupna aminokiselinska sličnost mala (van der Weerden et al. (2013) Fungal Biol Rev 26:121-131). Biljni defenzini koji pripadaju različitim grupama imaju uopšteno različite biološke aktivnosti ili različite mehanizme delovanja za istu biološku aktivnost. Na primer, biljni defenzini koji pripadaju grupi peptida RsAFP2 rotkve inhibiraju fungalni rast vezivanjem za sfingolipide u ćelijskom zidu (Thevissen et al. (2012) Mol Microbiol 84(1):166-180). Za razliku od toga, biljni defenzini koji pripadaju grupi Nicotiana defenzina NaD1 inhibiraju fungalni rast ulaskom u fungalnu ćeliju i indukovanjem proizvodnje reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) koje dovode do lize ćelija (Hayes et al. (2013) Antimicrob Agensi Ch 57(8)3667-3675).
[0015] Postoje dve glavne klase biljnih defenzina. Defenzini klase I sastoje se od signalne sekvence endoplazmatičnog retikuluma (ER) praćene domenom zrelog defenzina. Defenzini klase II proizvode se kao veći prekursori sa C-terminalnim pro-domenima ili pro-peptidima (CTPP) od oko 33 aminokiselina. Većina defenzina klase II, identifikovanih do danas, otkrivena je kod Solanaceous biljnih vrsta.
[0016] Postoji potreba za razvojem protokola za efikasnijim upravljanjem gljivičnom infekcijom kod ljudi i životinja, a naročito onihomikozom kod ljudi, za koju do ovog pronalaska nisu bile dostupne bezbedne i efikasne terapije. Dok neki defenzini imaju antifungalna svojstva, njihova dejstva na različite gljivične patogene značajno variraju i većina prikazanih dejstva usmerena je na biljne gljivične patogene. Pored toga, njihova veličina (MW > 5000Da) izgleda da ograničava njihovo prodiranje u nokte.
[0017] US 8710296 se odnosi na polinukleotide defenzina i postupke za njihovu upotrebu.
WO 2014078900 odnosi se na antipatogene postupke.
[0018] Bilo koje reference u opisu postupaka za lečenje u kontekstu ovog pronalaska odnose se na jedinjenja i formulacije ovog pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje ljudskog ili životinjskog tela.
SUŠTINA
[0019] Aminokiselinske sekvence pozivaju se identifikacionim brojem sekvence (SEQ ID NO). SEQ ID NO odgovaraju brojčano identifikatorima sekvenci <400>1 (SEQ ID NO:1), <400>2 (SEQ ID NO:2), itd. Suština identifikatora sekvenci obezbeđena je u Tabeli 1. Lista sekvenci obezbeđena je nakon patentnih zahteva.
[0020] Ovo otkrivanje delimično je zasnovano na iznenađujućem određenju da, uprkos njihovoj veličini, neki defenzini mogu da efikasno prodiru kroz nokte i leče gljivičnu infekciju. Pored toga, uprkos tome što su evoluirali kako bi ciljali biljne gljivične patogene, neki biljni defenzini imaju snažno dejstvo protiv gljivičnih patogena koji izazivaju onihomikozu kao što je Trichophyton rubrum bez nespecifičnog dejstva na ćelije sisara. Još više iznenađujuće, neki biljni defenzini imaju fungicidalni režim dejstva koji omogućava da ubijaju fungalne ćelije kontaktom. Ovo otkrivanje opisuje, prema tome, postupak za inhibiciju infekcije gljivičnim patogenom u ili na rožnatoj tvorevini koja prekriva dorzalne i terminalne falange ili povezanoj cerebralnoj izbočini kod subjekta ili materijala koji obuhvata keratin na subjektu, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt tvorevine ili izbočine ili materijala koji obuhvata keratin sa nekom efektivnom količinom biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante, pri čemu biljni defenzin, derivat ili varijanta ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je odabran iz grupe koju čine HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3). Ostali ovde razmatrani defenzini odabrani su iz grupe koju čine HXL001 (SEQ ID NO:4), HXL002 (SEQ ID NO:5), HXL003 (SEQ ID NO:6), HXL004 (SEQ ID NO:7), HXL005 (SEQ ID NO:8), HXL009 (SEQ ID NO:9), HXL012 (SEQ ID NO:10), HXL013 (SEQ ID NO:11), HXL015 (SEQ ID NO:12), HXL032 (SEQ ID NO:13), HXL033 (SEQ ID NO:14), HXL034 (SEQ ID NO:15), NsD1 (SEQ ID NO:16), NsD2 (SEQ ID NO:17), NaD1 (SEQ ID NO:18), NoD173 (SEQ ID NO:19) DmAMP1 (SEQ ID NO:20), HXP4 (SEQ ID NO:21); HXP34 (SEQ ID NO:22), HXP35 (SEQ ID NO:23), i bilo koja od gore navedenih sa dodatkom N-terminalnog ostatka alanina (SEQ ID NO:25 do 47, tim redom), pri čemu biljni defenzin ima najmanje oko 80% sličnosti aminokiselinske sekvence sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47 nakon optimalnog poravnavanja. Defenzin uopšteno dolazi u kontakt sa rožnatom tvorevinom ili materijalom koji obuhvata keratin topikalnim nanošenjem tokom nekog vremena i pod uslovima dovoljnim da se iskoreni ili drugačije kontroliše fungalni rast. Tvorevina uključuje nokte prstiju ruke i nožnih prstiju kao i kandže, kopita i rogove. U nekom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje omogućava postupak za lečenje onihomikoze ili povezanog stanja kod subjekta, pri čemu taj postupak obuhvata davanje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante subjektu, gde biljni defenzin ili varijanta ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 do 3 ili bilo koja od SEQ ID NO:4 do 47 ili defenzin ima najmanje oko 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47. U određenom načinu ostvarivanja, defenzin je bilo koji od HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) ili HXL036 (SEQ ID NO:3) ili njegova funkcionalna prirodna ili sintetička varijanta uključujući defenzin koji obuhvata N-terminalni ostatak alanina (SEQ ID NO:25 do 27, tim redom).
[0021] U nekom drugom načinu ostvarivanja, materijal koji obuhvata keratin je dlaka ili krzno. U ovom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje omogućava postupak za lečenje gljivične infekcije dlake ili krzna kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante kod subjekta, gde odabrani biljni defenzin ili varijanta ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 do 3 ili bilo koja od SEQ ID NO:4 do 47 ili defenzin ima najmanje oko 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47. U određenom načinu ostvarivanja, defenzin je odabran od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3 ili njegove funkcionalne prirodne ili sintetičke varijante uključujući defenzin koji obuhvata N-terminalni ostatak alanina (SEQ ID 25 do 27, tim redom). U nekom drugom načinu ostvarivanja, materijal koji obuhvata keratin je koža. U ovom načinu ostvarivanja, ovo otkrivanje omogućava postupak za lečenje gljivične infekcije kože kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante, gde odabran biljni defenzin ili varijanta ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 do 3 ili bilo koja od SEQ ID NO:4 do 47 ili defenzin ima najmanje oko 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47. U određenom načinu ostvarivanja, defenzin je definisan sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3 ili njegovim funkcionalnim prirodnim ili sintetičkim derivatom ili varijantom uključujući defenzin koji obuhvata N-terminalni ostatak alanina (SEQ ID 25, do 27, tim redom).
[0022] Defenzini razmatrani za upotrebu u protokolu lečenja navedeni su u Tabeli 2 kao i defenzini koji imaju 80% sličnosti sa bilo kojim od defenzina navedenih u Tabeli 2 nakon optimalnog poravnavanja. Radi sažetosti, referenca za "SEQ ID NO:1 do 47" u nastavku uključuje defenzine koji imaju najmanje 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je prodirući defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijanta. Primeri sintetičkih varijanti uključuju gde PetljalB iz defenzina klase I zamenjuje PetljulB iz defenzina Solanaceous klase II. Ovo su HXP4, HXP34, i HXP35. Ostale varijante ili derivati uključuju defenzin naveden u Tabeli 2 ili koji ima najmanje 80% sličnosti sa defenzinom navedenim u Tabeli 2, pri čemu defenzin obuhvata ostatak alanina na svom N-kraju (tj., SEQ ID NO:25 do 47). Dodatak alanina na N-kraju defenzina omogućava rekombinantnu prozvodnju peptida u ekspresionom sistemu Pichia pastoris-a bez potrebe za STE13 mestom proteaze. STE13 mesto normalno omogućava efikasnu obradu signala sekrecije faktora parenja tipa α pomoću KEX2. Međutim, pod visokim ekspresionim opterećenjima, cepanje STE13 proteaze može biti neefikasno što dovodi do toga da Glu-Ala ponavljanja ostaju na N-kraju peptida. Dodatno negativno naelektrisanje dodeljeno ovim ponavljanjima može biti štetno za dejstvo biljnih defenzina. STE13 mesto proteaze može da bude zamenjeno sa alaninom da bi se sprečila nepotpuna obrada (Cabral et al., (2003) Protein Expres Purif 31(1):115-122). Prisustvo N-terminalnog alanina može takođe da smanji sposobnost defenzina da lizira crvena krvna zrnca (WO 2011/16074).
[0023] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin naveden u Tabeli 2 (SEQ ID NO:1 do 47) modifikovan je da bi se poboljšala stabilnost peptida. U nekom daljem načinu ostvarivanja, ovo se postiže zamenom aminokiselina koje su podložne deamidaciji kao što su asparagin i glutamin, ili aminokiselina koje su podložne izomerizaciji kao što je asparaginska kiselina, sa aminokiselinama koje nisu podložne modifikacijama. U određenom načinu ostvarivanja, defenzini HXL008, HXL035 ili HXL036 su modifikovani na položajima 18, 36 ili 42.
[0024] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin naveden u Tabeli 2 (SEQ ID NO:1 do 47) je modifikovan da bi se povećalo pozitivno naelektrisanje peptida. Poznato je da je pozitivno naelektrisanje značajno za dejstvo antimikrobnih peptida, uključujući biljne defenzine (Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550). U nekom načinu ostvarivanja povećanje pozitivnog naelektrisanja postiže se zamenom negativno naelektrisanog ostatka kao što je glutaminska kiselina ili asparaginska kiselina sa nekom neutralnom aminokiselinom. U nekom načinu ostvarivanja, neutralna aminokiselina je alanin ili glicin. U nekom drugom načinu ostvarivanja, povećanje pozitivnog naelektrisanja postiže se zamenom neutralne aminokiseline sa nekim pozitivno naelektrisanim ostatkom kao što je lizin ili arginin.
[0025] Ovde su takođe razmatrane konzervativne promene aminokiselina.
[0026] U nekom načinu ostvarivanja, lečenje uključuje defenzin u kombinaciji sa ne-defenzinskim peptidom, inhibitorom proteinaze, drugim defenzinom ili proteinskim ili ne-proteinskim (tj., hemijskim) fungicidom.
[0027] Gljivični patogen je onaj koji doprinosi onihomikozi ili povezanom stanju na noktima prstiju ruke ili nožnih prstiju, kandžama, kopitama ili rogovima kod subjekta.
[0028] Upućivanje na "nokat" uključuje bilo koju rožnatu tvorevinu koja prekriva dorzalne i terminalne falange kod ljudi i životinja i povezane cerebralne izbočine (tj., rogove) kod životinja. "Stanje povezano sa onihomikozom" je infekcija zanoktice oko nokta ljudi, nekog ne-humanog primata ili životinje ili infekcija u ili na kandži, kopitu ili izbočini oblika roga kod životinja. Primer povezanog stanja je tinea.
[0029] Gljivični patogeni uključuju dermatofite, kvasce i ne-dermatofitne plesni. Dermatofiti obuhvataju Trichophyton vrste, uključujući Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton interdigitale, Trichophyton violaceum, Trichophyton tonsurans i Trichophyton soudanense, Microsporum fulvum, Epidermophyton floccosum i Microsporum gypseum. Kvasci obuhvataju Candida vrste uključujući Candida albicans i Candida glabrata.
[0030] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin se topikalno nanosi na inficirano područje i prodire kroz nokat ili rožnatu strukturu da bi se nagomilao na mestu infekcije. Iznenađujuće je određeno da neki defenzini kao što su, ali neograničavajući se na, HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3), imaju visok stepen penetrabilnosti kroz nokte i snažni su gljivični inhibitori dermatofitnih patogena i ne-dermatofitnih plesni što ih čini veoma efikasnim u lečenje stanja kao što je onihomikoza. U nekom načinu ostvarivanja defenzini nemaju nespecifična dejstva na ćelije sisara ili bakterija. Dejstvo na ćelije sisara povećaće verovatnoću dermalne iritacije i drugih nuspojava. Dejstvo na bakterijske ćelije može da poremeti prirodnu, korisnu mikrofloru u području. Poznato je da urođena mikroflora ima značajnu ulogu u sprečavanju gljivičnih infekcija (Reid et al., (2011) Nature Reviews Microbiology 9: 27-38).
[0031] Ovde je dalje opisana formulacija ili ekstrakt uključujući biljni ekstrakt ili ekstrakt kvasca (npr. ekstrakt od Pichia genetički modifikovan za proizvodnju defenzina) koji obuhvata biljni defenzin odabran od SEQ ID NO:1 do 47. Formulacija ili ekstrakt može dalje da obuhvata drugi aktivni agens ili kombinaciju formulacija ili ekstrakata, pri čemu najmanje jedna formulacija ili ekstrakt obuhvata defenzin kao što je definisano ovde, koji se umešavaju pre upotrebe ili se koriste uzastopno bilo kojim redosledom. Biljni defenzini ili ekstrakti koji obuhvataju isto što je opisano ovde mogu da se koriste kao takvi u obliku biljnih formulacija i prirodnih kupki za telo ili nokte i šampona uključujući hidrantne šampone. Defenzin se uopšteno formuliše za omogućavanje prodiranja na ciljno mesto (npr. nokat ili koža ili dlaka ili pramen krzna).
[0032] Ovde je omogućena upotreba biljnog defenzina kao što je definisan sa SEQ ID NO:1 do 47 u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu gljivične infekcije rožnate tvorevine koja prekriva dorzalne i terminalne falange ili povezane cerebralne izbočine kod subjekta. Ovde je takođe obezbeđen biljni defenzin kao što je definisan sa SEQ ID NO:1 do 47 za upotrebu u lečenju ili profilaksi gljivične infekcije rožnate tvorevine koja prekriva dorzalne i terminalne falange ili povezane cerebralne izbočine kod subjekta. Ovde je omogućena upotreba biljnog defenzina kao što je definisan sa SEQ ID NO:1 do 47 u proizvodnji leka za lečenje ili profilaksu gljivične infekcije materijala koji obuhvata keratin na subjektu. Ovde je takođe obuhvaćen biljni defenzin kao što je definisan sa SEQ ID NO:1 do 47. U određenom načinu ostvarivanja, defenzin je definisan konsenzus sekvencom SEQ ID NO:24 ili njegovom funkcionalnom prirodnom ili sintetičkom varijantom. Primeri uključuju defenzine definisane sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3 kao i defenzin koji obuhvata N-terminalni ostatak alanina (SEQ ID 25 do 27, tim redom).
[0033] U nekom načinu ostvarivanja, gljivična infekcija dovodi do onihomikoze ili povezanog stanja.
[0034] Uopšteno, lečeni subjekat je čovek sa onihomikozom ili povezanim stanjem noktiju prstiju ruke ili noktiju nožnih prstiju. Međutim, ovo otkrivanje se takođe odnosi na lečenje životinjskih noktiju na gornjim i donjim ekstremitetima, kandži i, gde je to moguće, rogova, kao što je kod ne-humanih primata, domaćih životinja i rogatih životinja.
[0035] Ovde je dalje razmatran izolovani mikroorganizam modifikovan da eksprimira defenzin kao što je definisan ovde za upotrebu u proizvodnji kompozicija koje obuhvataju mikroorganizme. Primer mikroorganizma je Pichia. Takve kompozicije su korisne u lečenju ljudi i životinja. Alternativno, defenzin je obezbeđen kao ćelijski ekstrakt uključujući biljni ekstrakt ili mikrobni ekstrakt.
[0036] Ovde je takođe razmatran komplet za lečenje neke gljivične infekcije u obliku odeljka koji obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu, biljni defenzin ili varijantu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1 do 47. U nekom opcionom načinu ostvarivanja, drugi odeljak obuhvata drugi aktivni agens i opciono odvojen u nekom dodatnom odeljku ili zajedno u postojećem odeljku, farmaceutski ili veterinarski prihvatljivi razblaživač, nosač ili ekscipijens. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je definisan konsenzus aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO:24. Primeri uključuju HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3).
[0037] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin koji je razmatran za upotrebu ovde može ili ne mora da obuhvata N-terminalni ostatak alanina. Ovo je naročito slučaj sa nekim rekombinantnim defenzinima koji obuhvataju N-terminalni ostatak alanina. Ovde je definicijom "defenzin" obuhvaćena bilo koja od SEQ ID NO:1 do 23 sa N-terminalnim alaninom, tj. SEQ ID NO:25 do 47. Konsenzus aminokiselinska sekvenca, SEQ ID NO:24, ima opcioni -terminalni ostatak alanina.
TABELA 1
1
[0038] Aminokiselinske sekvence za HXL proteine navedene su u US Patentu br.6,911,577 i povezanim članovima porodice patenata.
TABELA 2
KRATAK OPIS NACRTA
[0039]
Fig.1(a) do (e) su prikazi poravnavanja aminokiselina različitih defenzina obuhvaćenih ovde.
1
Fig.2(a) do (d) su grafički prikazi koji prikazuju dejstvo biljnih defenzina NaD1 (isprekidana linija) i HXL008 (puna linija) na rast četiri klinička izolata Trichophyton rubrum in vitro. Fungalni rast je izmeren porastom optičke gustine na 595 nm (A595) koji je postignut 72 sata nakon inokulacije podloge za rast i prikazan je kao procenat rasta u odnosu na ne-proteinsku kontrolu (vertikalna osa) versus proteinska koncentracija (µg/mL, horizontalna osa).
Fig.3(a) do (e) su fotografski prikazi preživelih kolonija T. rubrum uzgajanih na agarnim pločama nakon lečenja sa 100 µM HXL008 tokom 72 h. Paneli (a) do (d) predstavljaju kliničke izolate 14-01, 14-02, 14-03 i 13-04, tim redom. Preživele kolonije označene su crnim pravougaonikom. Panel (e) predstavlja rast T. rubrum koji nije tretiran sa HXL008.
Fig.4(a) do (c) su prikazi preživelih kolonija T. rubrum nakon svakodnevnog doziranja HXL008. Fig.4a je fotografija kolonija koje su preživele na 1⁄2 Sabouraud-ovom dekstroznom agaru (SDA) nakon svakodnevnog lečenja sa 0 µg/mL (levi paneli), 10 µg/mL (srednji paneli) ili 50 µg/mL (desni paneli) HXL008. Ploče su od kultura tretiranih tokom 24 h (gornji paneli), 14 d (srednji paneli) ili 25 d (levi paneli). Fig.4b je grafički prikaz broja kolonija koje su preživele u 100 µL kulture nakon svakodnevnog lečenja sa HXL008 (50 µg/mL/dan). Fig.4c je fotografija kultura u odsustvu (levo) ili prisustvu 10 µg/mL (srednje) ili 50 µg/mL (desno) HXL008.
Fig.5 je prikaz prodiranja HXL008 (crni trouglovi, puna crna linija), NaD1 (crne zvezdice, puna crna linija), HXL004, (isprekidani krugovi, isprekidana crna linija), HXL012 (sivi kvadrat, isprekidana siva linija), tavaborola (crni romb, crna isprekidana linija), ciklopiroksa (isprekidani kvadrat, puna crna linija) i efniakonazola (sivi krugovi, puna siva linija) kroz nokte pomoću sistema adaptera za nokte sa ovlaženim-vatiranim štapićem koji deluje kao rastvor receptora ispod noktiju.
Fig.6 je prikaz rasta Escherichia coli u prisustvu različitih koncentracija biljnih defenzina NaD1(◆ tačkasta linija), HXL004 (● isprekidana linija) i HXL008 (▲ isprekidana linija). Humani antimikrobni peptid LL37 (■ tačkasta linija) korišćen je kao kontrola.
Fig.7 je prikaz permeabilizacije humanih U937 ćelija pomoću rNaD1, HXP4, HXL001, HXL002, HXL004, HXL005,HXL008, HXL009, HXL012 i HXL013 (10 µM). Permeabilizacija je izmerena praćenjem apsorpcije fluorescentne boje propidijum jodida (PI).
Fig.8 je prikaz lize crvenih krvnih zrnca indukovane sa HXL008, HXL004 i NaD1 mereno u odnosu na kontrolu sa vodom.
Fig.9 je prikaz prodiranja kroz nokat tokom vremena sa HXL008 u različitim formulacijama, voda (crni stubići) 50mM citratnog pufera pH 4.0 (prugasti stubići) i 50mM citratnog pufera pH 4.0, 20vol.% etanola, 0.5mM EDTA (sivi strubići).
Fig.10 (a) do (c) su prikazi SDS-PAGE, RP-HPLC i analize masenom spektrometrijom prečišćenog HXL008+ala. Fig.10(a) je SDS-PAGE gel prečišćenog HXL008+ala. Trake 1, 2 i 14 su markeri molekulske mase (SeeBlue® Plus 2). Trake 3 i 4 su HXL008+ala standardi (5 µg). Trake 5 do 12 su uzorci objedinjenih frakcija dobijenih razdvajanjem po veličini. Fig.10(b) je RP-HPLC trag objedinjenih elucija. Jedan pik primećen je na -7.1 min. Fig.10(c) je trag MALDI-TOF masene spektrometrije od 4 kDa do 20 kDa.
Fig.11 je prikaz aminokiselinskog poravnavanja HXL008, HXL035 i HXL036 i konsenzus sekvence generisane poravnavanjem. Identične aminokiseline su istaknute crnim Očuvane aminokiseline istaknute su sivim.
DETALJAN OPIS
[0040] U ovoj specifikaciji, osim ako kontekst ne zahteva drugačije, za reč "obuhvataju" ili varijacije kao što su "obuhvata" ili "koji obuhvata", podrazumeva se da implicira uključivanje navedenog elementa ili celog broja ili faze postupka ili grupe elemenata ili celih brojeva ili faza postupka, ali ne i isključivanje bilo kojeg elementa ili celog broja ili faze postupka ili grupe elemenata ili celih brojeva ili faza postupka.
[0041] Kao što se koristi u ovoj specifikaciji, oblici jednine "neki", "neka" i "taj" uključuju aspekte množine osim ako kontekst jasno nalaže drugačije. Tako, na primer, upućivanje na "neki defenzin" uključuje jedan defenzin, kao i dva ili više defenzina; upućivanje na "neki agens" uključuje jedan agens, kao i dva ili više agensa; upućivanje na "otkrivanje" uključuje jedan i više aspekata koje daje to otkrivanje; i tako dalje. Aspekti koji su obuhvaćeni patentnim zahtevima i omogućeni ovde obuhvaćeni su pojmom "pronalazak". Svi takvi aspekti omogućeni su u okviru opsega ovog pronalaska. Sve varijante i derivati ili različiti aspekti za koje se traži zaštita obuhvaćeni su pojmom "oblik" ovog pronalaska.
[0042] Upućivanje na neki "defenzin" znači jedan od sledećih biljnih defenzina koji zadržava antifungalno dejstvo:
(i) defenzin koji ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu kao što je navedena u SEQ ID NO:24;
(ii) defenzin odabran iz grupe koju čine HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3);
(iii) defenzin odabran iz grupe koju čine HXL001 (SEQ ID NO:4), HXL002 (SEQ ID NO:5), HXP35
(SEQ ID NO:3), HXL003 (SEQ ID NO:6), HXL004 (SEQ ID NO:7), HXL005 (SEQ ID NO:8), HXL009
(SEQ ID NO:9), HXL012 (SEQ ID NO:10), HXL013 (SEQ ID NO:11), HXL015 (SEQ ID NO:12), HXL032 (SEQ ID NO:13), HXL033 (SEQ ID NO:14), HXL034 (SEQ ID NO:15), NsD1 (SEQ ID NO:16), NsD2 (SEQ ID NO:17), NaD1 (SEQ ID NO:18), NoD173 (SEQ ID NO:19), DmAMP1 (SEQ ID NO:20), HXP4 (SEQ ID NO:21), HXP34 (SEQ ID NO:22) i HXP35 (SEQ ID NO:23);
1
(iv) funkcionalni derivat ili varijanta bilo koje od SEQ ID NO:1 do 47, koja se prirodno javlja ili je sintetička;
(v) defenzin koji ima najmanje 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47 nakon optimalnog poravnavanja;
(vi) bilo koja od SEQ ID NO:1 do 47 koja obuhvata N-terminalni ostatak alanina (tj. SEQ ID NO:25 do 47); i/ili
(vii) defenzin koji ima najmanje 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 3 ili nakon optimalnog poravnavanja. Radi praktičnosti, ovi defenzini obuhvaćeni su unutar konsenzus aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:24.
[0043] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je definisan sa SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3 ili njegovim funkcionalnim prirodnim ili sintetičkim derivatom ili varijantom uključujući neki polipeptid koji ima antifungalno dejstvo sa aminokiselinskom sekvencom od najmanje 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3 nakon optimalnog poravnavanja.
[0044] Kada se koristi drugi defenzin u kombinaciji sa prvim defenzinom, drugi defenzin može da bude bilo koji defenzin.
[0045] Ovde je opisan protokol koji se koristi da bi se olakšalo upravljanje gljivičnom infekcijom uključujući zarazu na određenim anatomskim mestima kod humanih i životinjskih subjekata. Protokol obuhvata upotrebu biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante da inhibira ili na drugačiji način kontroliše rast gljivičnog patogena na ili u rožnatim tvorevinama koje prekrivaju dorzalne ili terminalne falange kod ljudi i životinja i povezanim cerebralnim izbočinama kod rogatih životinja. U nekom načinu ostvarivanja, ta tvorevina je nokat prsta ruke ili nožnog prsta, kandža ili kopito, a cerebralna izbočina je rog. U nekom načinu ostvarivanja, gljivična infekcija dovodi do onihomikoze. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin ima snažno fungicidalno dejstvo na Trichophyton rubrum i nema dejstvo ili ima medicinski prihvatljivo minimalno dejstvo na ćelije sisara ili bakterija. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin ima dobru penetrabilnost kroz nokat kao što je defenzin sa konsenzus aminokiselinskom sekvencom navedenoj u SEQ ID NO:24. Primeri uključuju HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3) ili ove defenzine sa N-terminalnim ostatkom alanina (SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27, tim redom) U nekom opcionom načinu ostvarivanja, defenzin se koristi u sinergijskoj kombinaciji sa nekim drugim antifungalnim agensom. Drugi agens uključuje ne-defenzinski peptid, neki inhibitor proteinaze, drugi defenzin i proteinski ili neproteinski (hemijski) agens sa antifungalnim svojstvima. Protokol takođe obuhvata lečenje gljivične infekcije materijala koji obuhvata keratin kao što je koža, dlaka i krzno kao i folikula dlake i krzna.
1
[0046] Ovde je omogućen postupak za inhibiciju infekcije gljivičnim patogenom na ili u rožnatoj tvorevini koja prekriva dorzalne ili terminalne falange ili povezanim cerebralnim izbočinama na subjektu, pri čemu taj postupak obuhvata dovođenje u kontakt tvorevine sa efektivnom količinom nekog biljnog defenzina ili nekog njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante. U nekom načinu ostvarivanja, tvorevina je nokat, kandža ili kopito. Stoga, ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju rasta nekog gljivičnog patogena na ili u noktu prsta ruke ili noktu nožnog prsta ili na kandži ili kopitu životinje, pri čemu taj postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegove funkcionalne prirodne ili sintetičke varijante ili derivata na nokat ili kandžu ili kopito. Uopšteno, kontakt je za neko vreme i pod uslovima dovoljnim da se inhibira rast gljivičnog patogena.
[0047] Ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije nekim gljivičnim patogenom na ili u materijalu koji obuhvata keratin na subjektu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje na materijal neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante. U nekom načinu ostvarivanja, materijal koji obuhvata keratin je dlaka ili krzno. Stoga, ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju rasta gljivičnog patogena na ili u dlaci ili krznu ili folikuli dlake ili krzna, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegove funkcionalne prirodne ili sintetičke varijante ili derivata na dlaku ili krzno ili folikulu dlake ili krzna. Uopšteno, kontakt je za neko vreme i pod uslovima dovoljnim da se inhibira rast gljivičnog patogena.
[0048] U nekom načinu ostvarivanja, materijal koji obuhvata keratin je koža. Stoga, ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju rasta gljivičnog patogena na ili u koži, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina ili njegove funkcionalne prirodne ili sintetičke varijante ili derivata na kožu. Uopšteno, kontakt je za neko vreme i pod uslovima dovoljnim da se inhibira rast gljivičnog patogena.
[0049] "Fungalna inhibicija" uključuje i fungicidno i fungistatičko dejstvo, kao što je mereno smanjenjem fungalnog rasta (ili gubitka vijabilnosti) u odnosu na kontrolu. Fungalni rast može da se izmeri pomoću mnogih različitih postupaka poznatih u tehnici u zavisnosti od gljiva. Obično korišćen postupak za merenje rasta filamentoznih gljiva, na primer, podrazumeva klijanje spora u odgovarajućoj podlozi za rast, inkubiranje tokom vremena koje je dovoljno za postizanje merljivog rasta i merenje povećane optičke gustine u kulturi nakon određenog vremena inkubacije. Optička gustina raste sa povećanim rastom. Obično, fungalni rast je neophodan za patogenezu. Prema tome, inhibicija rasta patogena obezbeđuje pogodan indikator za zaštitu od gljivične bolesti, tj. što je veća inhibicija, efikasnija je zaštita. Osim toga, efikasnost fungicidnog ili fungistatičkog dejstva može da se odredi vizuelnim pregledom nokta, kandže, kopita ili roga ili dlake ili krzna ili folikule dlake ili krzna.
[0050] Ne postoji jasna definicija za uspešno lečenje onihomikoze. Mikološko izlečenje često se definiše kao negativan rezultat i na KOH i testove kulture (Elewski et al. (2012) Fungal diseases In: Bolognia, Jorizzo, Schaffer eds, Dermatology 3rd ed. Philadelphia, PA; Elsevier Saunders; poglavlje 77).
1
[0051] Protokol lečenja uključuje profilaksu (tj., prevenciju) subjekata koji su u riziku od infekcije.
Subjekat "u riziku" može da bude subjekat u tropskoj klimi. Stoga, "prevencija infekcije" u ovom kontekstu, znači da se humani domaćin ili domaćin životinja tretira defenzinom da bi se izbegla gljivična infekcija ili simptomi bolesti povezani sa njom ili ispoljila smanjena ili minimizirana ili ređa gljivična infekcija ili simptomi bolesti povezani sa njom, koji su prirodni ishod interakcija domaćin-gljivice u poređenju sa domaćinom koji nije izložen defenzinu. To jest, sprečeno je ili smanjeno da infekcija gljivičnim patogenom izazove bolest i/ili povezane simptome bolesti (tj. onihomikozu). Infekcija i/ili simptomi su smanjeni za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50, 60%, 70% ili 80% ili više u odnosu na domaćina koji nije tako tretiran ovde datim protokolom. Procenat smanjenja može da se odredi bilo kojim pogodnim sredstvom koje je odgovarajuće za domaćina i gljivični patogen.
[0052] Stoga, dejstvo defenzina je da inhibira rast, replikaciju, infekciju i/ili održavanje gljivičnog patogena, između ostalih inhibitornih dejstava i/ili indukuje ublažavanje simptoma gljivične infekcije ili zaraze.
[0053] U nekom načinu ostvarivanja, gljivična infekcija dovodi do ili je povezana sa onihomikozom ili povezanim stanjem.
[0054] Stoga, ovde je obezbeđen postupak za lečenje ili profilaksu onihomikoze ili povezanog stanja kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata nanošenje biljnog defenzina ili nekog njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante na inficirano mesto na subjektu za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma onihomikoze.
[0055] Upućivanje na "onihomikozu" uključuje distalnu subungvalnu onihomikozu, belu površinsku onihomikozu, proksimalnu subungvalnu onihomikozu i Candida onihomikozu. Upućivanje na "stanje povezano sa onihomikozom" uključuje tinea i infekciju tkiva zanoktice oko nokta, kandže, kopita ili roga.
[0056] U nekom načinu ostvarivanja, gljivična infekcija je tinea capitis, perut ili seboroični dermatitis.
[0057] Stoga, ovde je obezbeđen postupak za lečenje ili profilaksu tinea capitis, peruti, seboroičnog dermatitisa ili povezanog stanja kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt materijala na subjektu sa biljnim defenzinom ili njegovim funkcionalnim prirodnim ili sintetičkim derivatom ili varijantom za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma gljivične infekcije.
[0058] U nekom načinu ostvarivanja, gljivičnom infekcijom zahvaćen je materijal koji obuhvata keratin.
[0059] Stoga, ovde je obezbeđen postupak za lečenje ili profilaksu gljivične infekcije koja je zahvatila materijal koji obuhvata keratin kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt materijala na subjektu sa biljnim defenzinom ili nekim njegovim funkcionalnim prirodnim ili sintetičkim derivatom ili varijantom za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma gljivične infekcije.
1
[0060] U vezi sa drugim načinom ostvarivanja, materijal koji obuhvata keratin uključuje kožu, dlaku ili krzno ili je folikula dlake ili krzna.
[0061] Stoga, ovde je obezbeđen postupak za lečenje ili profilaksu gljivične infekcije dlake ili krzna ili folikule dlake ili krzna na čoveku, pri čemu postupak obuhvata nanošenje biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante na dlaku ili krzno ili folikulu dlake ili krzna na subjektu za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma gljivične infekcije.
[0062] "Dovođenje u kontakt" uključuje izlaganje gljivičnog patogena defenzinu nakon njegovog topikalnog nanošenja ili primene na humani ili životinjski subjekat. Kontakt može da bude sa prečišćenim biljnim defenzinom ili formulacijom koja ga sadrži, ili biljnim ekstraktom koji prirodno obuhvata defenzin ili koji je modifikovan da proizvodi defenzin. Formulacija uključuje biljne formulacije i ekstrakte kao što su lak za nokte i kupka za nokte. Ekstrakti mogu da se izoluju iz biljaka ili mikroorganizma kao što je neki kvasac (npr., Pichia). Stoga, defenzin se nanosi topikalno na površinsku oblast na humanom ili životinjskom subjektu. Upućivanje na "dovođenje u kontakt uključuje fazu nanošenja na subjekat ili na inficirano mesto na subjektu.
[0063] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je formulisan u topikalnoj formulaciji, formulaciji za nokat, kandžu, kopito ili rog ili rastvor za pranje tela i kose. Može takođe da se nanosi mikrobni ili ćelijski ekstrakt koji obuhvata defenzin. Primer je Pichia-izveden ekstrakt. Topikalne formulacije uključuju vodeni rastvor, tečnu formulaciju, rastvor, hidrantni šampon, tonik, kupku, sprej, premaz, prašak, raspršivač, formulaciju za raspršivanje, krem, mast, ruž za usne, gel, gustu suspenziju, pastu, lekoviti flaster, impregnirani zavoj i slično. Biljni ekstrakti koji obuhvataju defenzin takođe su razmatrani ovde uključujući biljni ekstrakt koji obuhvata defenzin. Uopšteno, defenzin se formuliše tako da je moguće prodiranje u ciljano mesto (npr., čestica nokta, kandže, kopita, roga ili dlake ili krzna). U nekom načinu ostvarivanja, defenzin se odabira na osnovu njegove penetrabilnosti.
[0064] Ovde je obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom u ili na rožnatoj tvorevini koja prekriva dorzalnu ili terminalnu falangu ili povezanu cerebralnu izbočinu na humanom ili životinjskom subjektu.
[0065] Ovde je dalje obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom na noktu, kandži, kopitu ili rogu na humanom ili životinjskom subjektu.
[0066] Ovde je dalje obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom povezanim sa onihomikozom kod humanog subjekta.
1
[0067] Ovde je obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom materijala koji obuhvata keratin na humanom ili životinjskom subjektu.
[0068] Ovde je dalje obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom dlake ili krzna ili folikule dlake ili krzna na humanom ili životinjskom subjektu.
[0069] Ovde je obezbeđena formulacija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu za upotrebu u inhibiciji infekcije gljivičnim patogenom povezane sa tinea capitis, peruti ili seboroičnim dermatitisom na humanom ili životinjskom subjektu.
[0070] U nekom načinu ostvarivanja, ovde je obezbeđen terapeutski komplet koji obuhvata odeljak ili je u obliku odeljka, pri čemu odeljak obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu. Drugi ili dalji odeljci mogu da obuhvataju ostale agense ili ekscipijense uključujući druge antifungalne agense. Sadržaji svakog odeljka mogu da se umešaju pre upotrebe ili da se koriste uzastopno bilo kojim redosledom. Ostali antifungalni agensi uključuju ne-defenzinske peptide, neki inhibitor proteinaze, drugi defenzin ili proteinski ili hemijski (ne-proteinski) antifungalni agens. Primeri drugih antifungalnih agensa koji mogu da se koriste u kombinaciji sa biljnim defenzinom uključuju griseofulvin, terbinafin, amorolfin, ciklopiroks, efinakonazol, tavaborol i triazol.
[0071] Upućivanje na "biljni defenzin" znači oni koji su ovde definisani pozivajući se na Tabelu 2.
Defenzin iz Tabele 2 može takođe da bude odabran na osnovu njegove penetrabilnosti kroz nokat, kandžu, kopito ili rog. Defenzin iz Tabele 2 može takođe da se odabere na osnovu njegovog snažnog fungicidalnog dejstva na T. rubrum i nedostatka dejstva ili medicinski prihvatljivog minimalnog dejstva na ćelije sisara i bakterija. Kao što je ovde definisano, defenzin uključuje defenzin koji ima najmanje oko 80% sličnosti sa SEQ ID NO:24 uključujući bilo koju od SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 ili SEQ ID NO:3 ili bilo koju od SEQ ID NO:4 do 47.80% sličnosti određeno je nakon optimalnog poravnavanja i, po potrebi, nakon korišćenja odgovarajućih razmaka za optimizovanje poravnavanja. "Najmanje 80%" ili "najmanje oko 80%" uključuje 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 i 100%. Korisni defenzin u praksi ovog pronalaska je defenzin koji prodire direktno u nokat. Posebni primeri uključuju HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3) i njihove varijante sa N-terminalnim ostatkom alanina ((SEQ ID NO:25. (SEQ ID NO:26 i (SEQ ID NO:27 tim redom).
[0072] Stoga, ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije gljivičnim patogenom na rožnatoj tvorevini koja prekriva dorzalnu ili terminalnu falangu ili povezanoj cerebralnoj izbočini ili materijalu koji obuhvata keratin ili folikuli za materijal koji obuhvata keratin na subjektu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje, na tvorevinu ili izbočinu ili materijal koji obuhvata keratin, neke efektivne količine biljnog defenzina odabranog od SEQ ID NO:1 do 47 ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante ili defenzina koji ima najmanje 80% sličnosti sa bilo kojom od SEQ ID NO:1 do 47 nakon
2
optimalnog poravnavanja ili defenzina odabranog od SEQ ID NO:25 do 47 sa N-terminalnim ostatkom alanina za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma infekcije.
[0073] Ovde je takođe obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije gljivičnim patogenom na rožnatoj tvorevini koja prekriva dorzalnu ili terminalnu falangu ili povezanoj cerebralnoj izbočini ili materijalu koji obuhvata keratin ili folikuli za materijal koji obuhvata keratin na subjektu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine defenzina koji ima konsenzus aminokiselinsku sekvencu navedenu u SEQ ID NO:24 ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante ili defenzina koji ima najmanje 80% sličnosti sa SEQ ID NO:24, opciono sa N-terminalnim ostatkom alanina, na tvorevinu ili izbočinu ili materijal koji obuhvata keratin za vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma infekcije.
[0074] Ovde je dalje obezbeđena upotreba HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) ili HXL036 (SEQ ID NO:3) za lečenje onihomikoze. Takođe je razmatrana upotreba defenzina definisanog pomoću SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 ili (SEQ ID NO:27 za lečenje onihomikoze.
[0075] Pojam "sličnost" kao što se ovde koristi uključuje tačan identitet između upoređenih sekvenci na aminokiselinskom nivou. Gde nema identiteta na aminokiselinskom nivou, "sličnost" uključuje aminokiseline koje su ipak međusobno povezane na strukturnom, funkcionalnom, biohemijskom i/ili konformacionom nivou. U nekom načinu ostvarivanja, poređenja aminokiselinskih sekvenci izvode se na nivou identiteta pre nego sličnosti.
[0076] Pojmovi korišćeni za opis veza među sekvencama između dva ili više polipeptida uključuju "referentnu sekvencu", "prozor za upoređivanje", "sličnost sekvenci", "identitet sekvenci", "procenat sličnosti sekvenci", "procenat identiteta sekvenci", "suštinski slični" i "suštinski identitet". "Referentna sekvenca" je najmanje dužine 12, ali često 15 do 18 i često najmanje 25 ili više, kao što je 30 aminokiselinskih ostataka. Zato što dva polipeptida mogu, svaki, da obuhvataju (1) sekvencu (tj., samo deo cele aminokiselinske sekvence) koja je slična između dva polipeptida, i (2) sekvencu koja se razlikuje između dva polipeptida, pri čemu se poređenja sekvenci između dva (ili više) polipeptida obično izvode poređenjem sekvenci dva polipeptida preko "prozora za upoređivanje" radi identifikovanja i poređenja lokalnih regiona sličnosti sekvenci. "Prozor za upoređivanje" odnosi se na konceptualni segment od obično 12 susednih ostataka koji se porede sa referentnom sekvencom. Prozor za upoređivanje može da obuhvata adicije ili delecije (tj. praznine) od oko 20% ili manje u odnosu na referentnu sekvencu (koja ne obuhvata adicije ili delecije) za optimalno poravnavanje dve sekvence. Optimalno poravnavanje sekvenci za poravnavanje prozora za upoređivanje može da se izvede računarskom implementacijom algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, Clustal W2 i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, WI, SAD) ili pregledom i najboljim poravnavanjem (tj. dovodeći do najvišeg procenta homologije preko prozora za upoređivanje) generisanim bilo kojim od raznih odabranih postupaka. Takođe se može uputiti na BLAST porodicu programa kao, na primer, što je opisano od strane Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res.25(17):3389-3402. Detaljni opis analize sekvenci može se naći u poglavlju 19.3 od Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. Drugi softver za poravnavanje uključuje BWA (Li i Durbin (2010) Bioinformatics 26: 589-595) i Bowtie (Langmead et al (2009) Genome Biol 10:R25 i BLAT (Kent (2002) Genome Res 12:656-664).
[0077] Pojmovi "sličnost sekvenci" i "identitet sekvenci" kao što se ovde koriste odnose se na to u kojoj su meri sekvence identične ili funkcionalno ili strukturno slične na osnovi aminokiselina-premaaminokiselina preko prozora poređenja. Prema tome, "procenat identiteta sekvenci", na primer, izračunava se poređenjem dve optimalno poravnate sekvence preko prozora poređenja, čime se određuje broj položaja u kojima se javlja identičan aminokiselinski ostatak (npr. Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys i Met) kod obe sekvence da bi se dobio broj uparenih položaja, deljenjem broja uparenih položaja sa ukupnim brojem položaja u prozoru poređenja (tj., veličina prozora), i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identiteta sekvenci. U svrhe ovog pronalaska, "identitet sekvenci" podrazumeva se da znači "procenat podudaranja" izračunat bilo kojim pogodnim postupkom ili računarskim algoritmom korišćenjem standardnih vrednosti kao što se koriste u referentnom priručniku uz softver. Slična primedba važi u vezi sa sličnošću sekvenci.
[0078] Neki ovde korišćeni defenzini mogu ovde da se odnose na defenzin "koji se prirodno javlja", "modifikovan" defenzin, "varijantni" defenzin, "mutirani" defenzin, "sintetički derivat ili varijantu" ili "himerni" defenzin, zavisno od njegovog izvora. Za praksu ovog pronalaska, takvi defenzini zadržavaju antifungalno dejstvo.
[0079] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je Solanaceous defenzin klase II. U nekom načinu ostvarivanja, defenzin je modifikovan u regionu petlje između prvog β-lanca (β-lanac 1) i α-heliksa na N-terminalnom krajnjem delu defenzina. U nekom načinu ostvarivanja, region petlje obuhvata 6 aminokiselina N-terminalnog drugog invarijantnog ostatka cisteina ili njegovog ekvivalenta. Ovaj region je definisan kao "Petlja1B". Solanaceous defenzin klase II razlikuje se od ostalih defenzina po relativno očuvanom C-terminalnom krajnjem delu zrelog domena.
[0080] Ovde je uključena upotreba veštački nastalog defenzina koji obuhvata modifikovanu kičmu Solanaceous defenzina klase II, pri čemu je region petlje između β-lanca 1 i α-heliksa na N-terminalnom krajnjem delu modifikovan putem jedne ili više aminokiselinskih supstitucija, adicije i/ili delecije da bi se generisao varijantni defenzin koji ima anti-patogeno dejstvo. U nekom načinu ostvarivanja, region petlje je PetljalB definisana sa 6 aminokiselinskih ostataka od N-terminala do drugog invarijantnog ostatka cisteina. Ovde je razmatran njegov ekvivalentni region u bilo kojem defenzinu. U nekom načinu ostvarivanja, veštački stvoreni defenzin obuhvata modifikovani defenzin klase II. Ovaj protokol ne obuhvata upotrebu NaD1 koji obuhvata svoju prirodnu aminokiselinsku sekvencu.
[0081] Primeri pogodnih defenzina uključuju one navedene u Tabeli 1. Oni obuhvataju sintetičke varijante defenzina kao što su HXP4 (SEQ ID NO:21), HXP34 (SEQ ID NO:22) i HXP35 (SEQ ID NO:23). Ovde su takođe obuhvaćena posladnja tri defenzina sa N-terminalnim ostatkom alanina (tj. SEQ ID NO:45 do 47, tim redom). Korisni defenzin je HXL008 (SEQ ID NO: 1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3) ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijanta uključuje SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27.
[0082] Ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije nekim gljivičnim patogenom, na ili u noktu, kandži, kopitu ili rogu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina odabranog iz spiska datog u Tabeli 1 ovde ili njegovog derivata ili varijante na nokat, kandžu, kopito ili rog. Uopšteno, defenzin se primenjuje za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma infekcije. U nekom načinu ostvarivanja, simptomi su povezani sa onihomikozom ili povezanim stanjem.
[0083] Ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije nekim gljivičnim patogenom, na ili u noktu, kandži, kopitu ili rogu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina odabranog iz spiska datog u Tabeli 2 ovde ili njegovog derivata ili varijante na nokat, kandžu, kopito ili rog. Defenzin može da se nanese u koncentraciji između 0.1 mas./vol. % i 10 mas./vol. %, sa učestalošću od jednom dnevno, dvaput dnevno, jednom svaka dva dana, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje ili jednom mesečno, tokom perioda od četiri nedelje, dve nedelje, jedne nedelje, tri nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca ili do 12 meseci. U nekom načinu ostvarivanja, simptomi su povezani sa onihomikozom ili povezanim stanjem.
[0084] Ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije nekim gljivičnim patogenom, na ili u koži, dlaci ili krznu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina odabranog sa spiska datog u Tabeli 1 ovde ili njegovog derivata ili varijante na kožu, dlaku ili krzno ili folikulu dlake ili krzna. Defenzin se primenjuje za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma infekcije. U nekom načinu ostvarivanja, simptomi su povezani sa gljivičnom infekcijom.
[0085] Ovde je obezbeđen postupak za inhibiciju infekcije nekim gljivičnim patogenom, na ili u koži, dlaci ili krznu, pri čemu postupak obuhvata nanošenje neke efektivne količine biljnog defenzina odabranog sa spiska datog u Tabeli 1 ovde ili njegovog derivata ili varijante na kožu, dlaku ili krzno ili folikulu dlake ili krzna. Defenzin može da se primenjuje u koncentraciji između 0.1 mas./vol. % i 10 mas./vol. %, sa učestalošću od jednom dnevno, dvaput dnevno, jednom svaka dva dana, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje ili jednom mesečno, tokom perioda od jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca ili do 12 meseci. U nekom načinu ostvarivanja, simptomi su povezani sa gljivičnom infekcijom.
[0086] U nekom opcionom načinu ostvarivanja, defenzin ili njegov derivat ili varijanta koristi se u kombinaciji sa drugim agensom kao što je neki antifungalni agens. Predlaže se da defenzin i peptid
2
deluju u sinergiji. Primeri drugih agensa uključuju ne-defenzinski antimikrobni peptid, neki inhibitor proteinaze, drugi defenzin ili proteinski ili ne-proteinski hemijski fungicid.
[0087] Hemijski antifungalni agensi za upotrebu u kombinaciji sa predmetnim defenzinom uključuju terbinafin, intrakonazol, flukonazol, ciklopiroks, klotrimazol, amorolfin butenafin, tavaborol, efinakonazol, AN2718 i NP213.
[0088] Upućivanje na sinergiju znači da je inhibitorni efekat datog defenzina ili drugog agensa samo veći kada se oba zajedno koriste u odnosu na to kada se svaki od njih sam koristi. Greco et al. (1995) Pharmacol Rev.47:331-385 definišu kategoriju sinergije na osnovu toga da upotreba dva agensa u kombinaciji ima veće dejstvo u odnosu na aditivne efekte kada se svaki sam testira. Stoga, definicija ovde prihvaćena uključuje sve takve situacije pod uslovom da je kombinovani efekat dva agensa koji zajednički deluju veći od zbira pojedinačnih agensa koji deluju sami. Osim toga, kombinacija agensa smatra se sinergijskom, kako je izraz namenjen ovde, ako postoji skup uslova, uključujući, ali neograničavajući se na koncentracije, gde je kombinovani efekat agensa koji deluju sami veći od zbira pojedinačnih komponenti koje deluju same. Richer (1987) Pestic Sci 19:309-315 opisuje matematički pristup za davanje dokaza o sinergiji. Ovaj pristup koristi Limpelovu formulu za poređenje primećenog nivoa inhibicije (Io) u kombinovanom prisustvu dva inhibitorna agensa, X i Y, sa očekivanim aditivnim efektom (Ee) koji proizilazi iz svakog X ili Y koji deluju odvojeno u istim odgovarajućim koncentracijama kao što je korišćeno za merenje njihovog kombinovanog efekta. Aditivna procentna inhibicija, Ee, izračunava se kao X Y - XY/100 gde su X i Y izraženi kao procentna inhibicija. Sinergizam izlazi gde Io > Ee.
[0089] Sinergija može da se izrazi kao skala sinergije. U nekom načinu ostvarivanja, vrednost do 14 predstavlja beznačajnu sinergiju kao što je 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ili 14; vrednost od 15 do 29 predstavlja malu sinergiju kao što je 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 ili 29; vrednost od 30 do 60 predstavlja srednju sinergiju kao što je 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59 ili 60; vrednost veća od 60 predstavlja visok stepen sinergije. "Veća od 60" uključuje od 61 do 100 uključujući 61, 70, 80, 90 i 100 i bilo koju vrednost koja je između.
[0090] Predmetni postupak koristan je u lečenju ili profilaksi subjekta koji ima infekciju ili zarazu gljivičnim patogenom rožnate tvorevine koja prekriva dorzalnu ili terminalnu falangu ili povezane cerebralne izbočine ili materijala koji obuhvata keratin kao što je koža, dlaka ili krzno. Pojam "subjekat" uključuje čoveka bilo kojih godina ili životinju kao što je domaća životinja (npr., ovca, svinja, konj, krava, magarac, kamila, lama, alpaka) ili živina (npr., kokoška, patka, ćurka, fazan, paun)), kućni ljubimac (npr., pas ili mačka), laboratorijska životinja za testove (npr., miš, pacov, zec, zamorče ili hrčak) ili zarobljena divlja životinja (npr., divokoza). "Humani" ili "životinjski" uključuje njegov deo kao što su nokti nožnih prstiju, nokti prstiju ruke, kandže, kopita, rogovi, koža, dlaka ili krzno.
[0091] Upućivanje na "gljiva" uključuje dermatofite, kvasce i ne-dermatofitne plesni (ne-dermatofiti). Dermatofiti uključuju Trichophyton vrste uključujući Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton violaceum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton soudanense i Trichophyton mentagrophytes, Microsporum fulvum, Epidermophyton floccosum i Microsporum gypseum. Kvasci obuhvataju Candida vrste uključujući Candida albicans i Candida glabrata, Gljive mogu da izazovu tinea kao što je Tinea pedis, perut ili dermatitis.
[0092] Drugi aspekt ovde obezbeđen je kompozicija koja obuhvata biljni defenzin ili njegov funkcionalni prirodni ili sintetički derivat ili varijantu sa jednim ili više farmaceutski ili veterinarski prihvatljivih nosača, razblaživača ili ekscipijenasa za upotrebu u lečenju ili prevenciji onihomikoze ili povezanog stanja. U nekom opcionom načinu ostvarivanja, biljni defenzin se koristi u kombinaciji sa defenzinom i nekim drugim antifungalnim agensom. U nekom načinu ostvarivanja, kompozicija je u obliku spreja, izmaglice, mikro- ili nano-čestica, vodenog rastvora, hidrantnog šampona, kupke, tonika, raspršivača, formulacije za raspršivanje, ruža za usne, guste suspenzije, praška, krema, masti, gela, lekovitog flastera, impregniranog zavoja, tečnosti, formulacije, premaza ili nekog drugog pogodnog medijuma za distribuciju uključujući topikalne oblike kompozicije. Defenzin može posebno da se formuliše da bi se olakšalo prodiranje kroz nokat, kandžu, kopito ili rog ili česticu dlake ili krzna.
[0093] Korisne primene uključuju rastvore, premaze, kreme, praškove, kapi, masti, šampone i hidrantne šampone za gljivičnu infekciju noktiju, kandži, kopita ili rogova ili dlake ili krzna.
[0094] Kompozicije koje obuhvataju defenzin i opciono drugi antifungalni agens opisan ovde, uopšteno uključuju nosač, ekscipijens, razblaživač, konzervans, stabilizator i/ili čvrsti ili tečni aditiv. Biljni ekstrakti koji obuhvataju defenzin mogu takođe da se koriste. Formulacija uključuje kupku za telo ili šampon ili hidrantni šampon.
[0095] Kompozicija može da ima različite oblike u zavisnosti od namenjenog postupka nanošenja.
Uopšteno, ali ne isključivo, topikalne kompozicije se koriste za humane ili životinjske subjekte. U pripremi kompozicija, mogu da se koriste obično korišćeni medijumi kao što su, na primer, voda, organske kiseline kao što su limunska kiselina ili sirćetna kiselina, glikoli kao što su etilen glikol, propilen glikol, 1,3-butilen glikol i polietilen glikol, ulja, alkoholi kao što su etanol, metanol ili izopropanol, konzervansi i/ili agensi za bojenje. Kompozicije mogu da imaju oblik tečnog preparata kao što su, na primer, suspenzije, eliksiri i rastvori. Nosači kao što su skrobovi, šećeri, mikrokristalna celuloza, razblaživači, sredstva granulacije, lubrikanti, veziva, dezintegrišući agensi i slično mogu takođe da se koriste. Kompozicija može takođe da bude u obliku premaza, praška, raspršivača, masti, krema ili kupke.
[0096] Kompozicija može da uključuje jedan ili više prihvatljivih ekscipijenasa kao što su etilendiamintetrasirćetna kiselina, ciklometikon, hidroksipropil celuloza, karboksimetil celuloza, hidroksipropil hitozan, polivinilpirolidon, etil acetat, diizopropil adipat, izopropil miristat i miristil laktat.
2
[0097] Defenzin se nanosi direktno na inficirano mesto, uopšteno za neko vreme i pod uslovima dovoljnim za ublažavanje simptoma infekcije. Ovo uključuje ublažavanje simptoma onihomikoze ili povezanog stanja.
[0098] U nekom načinu ostvarivanja, defenzin se nanosi direktno na inficirano mesto, u koncentraciji između 0.1 mas./vol. % i 10 mas./vol. %, sa učestalošću od jednom dnevno, dvaput dnevno, jednom svaka dva dana, jednom nedeljno, jednom svake dve nedelje ili jednom mesečno, tokom perioda od jedne nedelje, dve nedelje, tri nedelje, jednog meseca, dva meseca, tri meseca ili do 12 meseci.
[0099] Kada se nanosi aerosolom ili raspršivanjem, kompozicije se pripremaju prema tehnikama koje su dobro poznate u tehnici farmaceutskog formulisanja i mogu da se pripreme kao rastvori u fiziološkom rastvoru, korišćenjem benzil alkohola ili drugih pogodnih konzervanasa, promotera apsorpcije da bi se poboljšala biološka raspoloživost, fluorougljenika i/ili drugih agensa za rastvaranje ili za dispergovanje koji su poznati u tehnici.
[0100] Efikasna doza defenzina može veoma da zavisi od toga da li se koristi sam ili u određenoj kombinaciji, režima davanja, gljivičnog patogena koji se tretira i ozbiljnosti zaraze gljivičnim patogenom. Prema tome, dozni režim koji koristi defenzin odabran je u skladu sa raznim faktorima uključujući tip, vrste, starost, masu, pol i medicinsku dispoziciju subjekta; ozbiljnost stanja koje se leči; režim nanošenja; i korišćen određeni defenzin. Stručan lekar, kliničar ili veterinar može jednostavno da odredi i propiše efektivnu količinu defenzina potrebnu za sprečavanje, odbijanje ili zaustavljanje napretka zaraze gljivičnim patogenom. Ovde su takođe razmatrane formulacije sa usporenim oslobađanjem. U nekom načinu ostvarivanja, kompozicija obuhvata penetrant za olakšavanje ulaska defenzina u mesto infekcije.
[0101] U nekom načinu ostvarivanja, kompozicija sadrži molekul koji povećava prodiranje kroz nokat. Molekuli koji povećavaju prodiranje kroz nokat uključuju neorganske soli, merkaptan, glicin, cistein, ureu, peroksid, kiseline kao što su fosforna kiselina ili tioglikolna kiselina, baze kao što su natrijumhidroksid ili kalijumhidroksid, redukujuće agense (tioli, sulfiti), dimetil sulfoksid, poli glikole, glicerin, C2-5alkohol, C2-8poliol, C6-24triglicerid masne kiseline, C6-24masni alkohol, C6-24alkil sulfat, C6-
24masnu kiselinu, ;nejonski surfaktant ili njihove mešavine (Murthy et al. (2009) J Pharm Sci 98(11):4264-4271; Nair et al. (2009) J Pharm Pharmacol 61(4):413-417; Malhotra i Zatz (2002) J Pharm Sci 91(2):312-323; Khengar et al. (2007) Pharm Res 24(12):2207-2212; Murdan (2008) Expert Opin Drug Deliv 5(11):1267-1282; Reeves US Patent br.6,391,879; Willers et al. Evropski Patent br.2664327).
[0102] Drugi aspekt obezbeđuje protokol ili postupak za lečenje ili prevenciju kod životinje uključujući nekog sisara kao što je humani subjekat inficiran ili zaražen nekim gljivičnim patogenom, pri čemu protokol ili postupak obuhvata nanošenje subjektu neke efektivne količine antifungalnog patogena sastava koji obuhvata biljni defenzin na mesto koje je rožnata tvorevina koja prekriva dorzalnu ili terminalnu falangu ili povezana cerebralna izbočina ili je materijal koji obuhvata keratin.
2
[0103] Još jedan aspekt obezbeđuje protokol ili postupak za lečenje ili prevenciju onihomikoze ili gljivične infekcije kože, dlake ili krzna, pri čemu protokol ili postupak obuhvata nanošenje na nokat, kandžu, kopito, rog ili česticu dlake ili krzna ili folikulu dlake ili krzna neke efektivne količine antifungalnog patogena kompozicije koja obuhvata biljni defenzin i, opciono, neki drugi antifungalni agens. Poslednji uključuje ne-defenzinski antimikrobni peptid, neki inhibitor proteinaze, drugi defenzin i proteinski ili ne-proteinski hemijski antifungalni agens.
[0104] Pojam "nanošenje" uključuje dovođenje u kontakt i izlaganje kao i primenu na mesto. U nekom načinu ostvarivanja, nanošenje uključuje prodiranje kroz nokat, kandžu, kopito ili rog ili prodiranje kroz česticu dlake ili krzna ili folikulu dlake ili krzna.
[0105] Defenzin je koristan za suzbijanje fungalne bolesti ili infekcije rožnatih tvorevina i povezanih cerebralnih izbočina kao što su nokti, kandže, kopita i rogovi ili materijala koji obuhvata keratin kao što je koža, dlaka ili krzno. U nekom načinu ostvarivanja, predmetna specifikacija opisuje protokol za lečenje ili profilaksu onihomikoze ili povezanog stanja. U nekom načinu ostvarivanja, predmetna specifikacija opisuje protokol za lečenje ili profilaksu tinea capitis, peruti i seboroičnog dermatitisa ili povezanog stanja. Protokol ima humane i veterinarske primene.
[0106] Predmetni defenzin može da se proizvede na osnovu svoje aminokiselinske sekvence pomoću standardnog postepenog dodavanja jednog ili više aminokiselinskih ostataka korišćenjem, na primer, uređaja za sintetisanje peptida ili proteina. Alternativno, defenzin se proizvodi rekombinantnim putem. Rekombinantni defenzin može da uključuje dodatni ostatak alanina na svom N-kraju. Stoga, ovde razmatrani defenzini mogu da sadrže ostatak alanina na N-kraju.
[0107] Ovde obezbeđen drugi aspekt je postupak za proizvodnju biljnog defenzina rekombinantno. U nekom načinu ostvarivanja, biljni defenzin proizvodi se korišćenjem mikrobnog ekspresionog sistema. U nekom daljem načinu ostvarivanja, ekspresioni sistem je ekspresioni sistem na bazi kvasca kao što je Pichia pastoris. U nekom poželjnom načinu ostvarivanja, biljni defenzin eksprimira se kao fuzioni protein sa signalom za sekreciju koji cilja protein izvan ćelije. Signal za sekreciju se zatim uklanja enzimski da bi se oslobodio zreli biljni defenzin u podlogu za ekspresiju. Biljni defenzin se zatim prečišćava jonoizmenjivačkom hromatografijom. U nekom poželjnom načinu ostvarivanja, biljni defenzin se prečišćava hromatografijom sa katjonskim izmenjivačima korišćenjem smole kao što je SP-sefaroza. Biljni defenzin se zatim dalje prečišćava hromatografijom razdvajanja po veličini korišćenjem podloge pogodne za male proteine kao što je Superdex 30.
[0108] Pored toga, defenzin može da se podvrgne hemijskoj modifikaciji da bi defenzin postao hemijski analog. Takav analog defenzina, može da pokazuje veću stabilnost ili duži poluživot u trenutku kontakta sa tkivom.
[0109] Ovde razmatrani analozi uključuju, ali bez ograničenja na, modifikaciju bočnih lanaca, ugradnju neprirodnih aminokiselina i/ili njihovih derivata tokom sinteze peptida, polipeptida ili proteina i
2
upotrebu kroslinkera i ostalih postupaka koji nameću konformaciona ograničenja na molekulu defenzina. Ovaj pojam takođe ne isključuje modifikacije defenzina, na primer, glikozilacije, acetilacije, fosforilacije i slično. U okviru definicije uključeni su, na primer, defenzini koji sadrže jedan ili više analoga neke aminokiseline (uključujući, na primer, neprirodne aminokiseline) ili defenzini sa supstituisanim vezama. Takvi analozi mogu da imaju poboljšanu stabilnost i/ili penetrabilnost.
[0110] Primeri modifikacija bočnih lanaca razmatrani u ovom pronalasku uključuju modifikacije amino grupa kao što su reduktivnom alkilacijom reakcijom sa aldehidom praćenoj redukcijom sa NaBH4; amidinacijom sa metilacetimidatom; acilacijom sa anhidridom sirćetne kiseline; karbamoilacijom amino grupa sa cijanatom; trinitrobenzilacijom amino grupa sa 2, 4, 6-trinitrobenzen sulfonskom kiselinom (TNBS); acilacijom amino grupa sa anhidridom sukcinske kiseline i anhidridom tetrahidroftalne kiseline; i piridoksilacijom lizina sa piridoksal-5-fosfatom praćenoj redukcijom sa NaBH4.
[0111] Gvanidinska grupa ostataka arginina može da se modifikuje obrazovanjem heterocikličnih proizvoda kondenzacije sa reagensima kao što su 2,3-butandion, fenilglioksal i glioksal.
[0112] Karboksilna grupa može da se modifikuje aktiviranjem karbodiimida preko obrazovanja O-acilizouree praćenog naknadnom derivatizacijom, na primer, do odgovarajućeg amida.
[0113] Sulfidril grupe mogu da se modifikuju postupcima kao što su karboksimetilacija sa jodosirćetnom kiselinom ili jodoacetamidom; oksidacija permravlje kiseline do cisteinske kiseline; obrazovanje mešanih disulfida sa drugim jedinjenjima tiola; reakcija sa maleimidom, maleinskim anhidridom ili nekim drugim supstituisanim maleimidom; obrazovanje živinih derivata pomoću 4-hloromerkuribenzoata, 4-hloromerkurifenilsulfonske kiseline, fenilživa hlorida, 2-hloroživa-4-nitrofenola i ostalih živinih jedinjenja; karbamoilacija sa cijanatom u baznoj pH.
[0114] Ostaci triptofana mogu da se modifikuju, na primer, oksidacijom sa N-bromosukcinimidom ili alkilacijom indolnog prstena sa 2-hidroksi-5-nitrobenzil bromidom ili sulfenil halidima. Ostaci tirozina, s druge strane, mogu biti izmenjeni nitracijom sa tetranitrometanom da bi se obrazovao derivat 3-nitrotirozina.
[0115] Modifikacija imidazolnog prstena ostatka histidina može da se postigne alkilacijom sa derivatima jodosirćetne kiseline ili N-karbetoksilacijom sa dietilpirokarbonatom.
[0116] Primeri ugradnje neprirodnih aminokiselina i derivata tokom sinteze peptida uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu norleucina, 4-amino buterne kiseline, 4-amino-3-hidroksi-5-fenilpentanske kiseline, 6-aminoheksanske kiseline, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarkozina, 4-amino-3-hidroksi-6-metilheptanske kiseline, 2-tienil alanina i/ili D-izomera aminokiselina. Bifunkcionalni kroslinkeri kao što su bifunkcionalni imido estri koji imaju (CH2)n spejser grupe sa n = 1 do n = 6, glutaraldehidi, N-hidroksisukcinimid estri i hetero-bifunkcionalni reagensi koji obično sadrže aminoreaktivni ostatak kao što je N-hidroksisukcinimid i specifični reaktivni ostatak druge grupe kao što je maleimido ili ditio ostatak (SH) ili karbodiimid (COOH). Pored toga, peptidi mogu da budu
2
konformaciono ograničeni, na primer, ugradnjom Cα i N α-metilaminokiselina, uvođenjem dvostrukih veza između Cα i Cβ atoma aminokiselina i obrazovanjem cikličnih peptida ili analoga uvođenjem kovalentnih veza kao što je obrazovanje amidne veze između N i C krajeva, između dva bočna lanca ili između bočnog lanca i N ili C kraja.
[0117] Mimetici su druga korisna grupa analoga defenzina. Pojam treba da određuje supstancu koja ima neke hemijske sličnosti sa defenzinom i imitira njegovo anifungalno dejstvo. Mimetik peptida može da bude molekul koji sadrži peptid, koji imitira elemente sekundarne strukture proteina (Johnson et al., Peptid Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman i Hall, New York, 1993). Osnovno obrazloženje iza upotrebe mimetika peptida je da kičma peptida proteina postoji uglavnom da se orijentišu bočni lanci aminokiselina na takav način da se olakša aktivnost.
[0118] Još jedan aspekt obezbeđuje postupak za smanjenje ili kontrolu gljivične infekcije ili zaraze na humanom noktu, pri čemu postupak obuhvata topikalno nanošenje biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante i, opciono, nekog drugog antifungalnog agensa na potencijalno inficiranu regiju na čoveku. U nekom načinu ostvarivanja, lek je u obliku rastvora, praška, spreja, raspršivača, nanočestice, gela, paste, impregniranog zavoja, premaza, aerosoli, hidrantnog šampona ili neke druge tečnosti. Antifungalna formulacija može takođe da bude kompozicija sa usporenim oslobađanjem.
[0119] Još jedan aspekt obezbeđuje postupak za smanjenje ili kontrolu gljivične infekcije ili zaraze na dlaci čoveka, pri čemu postupak obuhvata topikalno nanošenje biljnog defenzina ili njegovog funkcionalnog prirodnog ili sintetičkog derivata ili varijante i, opciono, nekog drugog antifungalnog agensa na potencijalno inficiranu regiju na čoveku. U nekom načinu ostvarivanja, lek je u obliku rastvora, praška, spreja, raspršivača, nanočestice, gela, paste, impregniranog zavoja, premaza, aerosoli, hidrantnog šampona ili neke druge tečnosti. Antifungalna formulacija može takođe da bude kompozicija sa usporenim oslobađanjem.
[0120] Kao što se ovde koristi, "koji obuhvata" je sinonim za "uključujući," "koji sadrži," ili "okarakterisan sa," i inkluzivan je ili otvoren i ne isključuje dodatne, nenabrojane elemente ili faze postupka. Kao što se ovde koristi, "koji se sastoji od' isključuje bilo koji element, fazu ili sastojak koji nije specificiran u zahtevanom elementu. Kao što se ovde koristi, "koji se suštinski sastoji od' ne isključuje materijale ili faze koje materijalno utiču na osnovne i nove karakteristike patentnog zahteva. Bilo kakvo navođenje pojma "koji obuhvata", naročito u opisu komponenata kompozicije ili u opisu elemenata sredstva, podrazumeva se da obuhvata one kompozicije i postupke koji se suštinski sastoje od i sastoje od navedenih komponenata ili elemenata. Ovo otkrivanje, ilustrativno opisano ovde, može pogodno da se izvodi u odsustvu bilo kojeg elementa ili elemenata, jednog ili više ograničenja koji ovde nisu posebno opisani.
2
[0121] Kada se Markušova grupa ili ostale grupe koriste, svi pojedinačni članovi grupe i sve moguće kombinacije i podkombinacije grupe treba da budu pojedinačno uključene u ovom otkrivanju.
[0122] Kada je ovde naveden opseg, predviđeni su i svi podopsezi unutar navedenog opsega i sve celobrojne vrednosti unutar navedenog opsega, kao da je naveden svaki podopseg i celobrojna vrednost.
PRIMERI
[0123] Ovde opisani i obezbeđeni aspekti u nastavku su opisani u sledećem neograničavajućem primeru.
Postupci
Prečišćavanje defenzina iz Pichia Pastoris
[0124] Jedna kolonija pPINK-defenzinskog P. pastoris PichiaPink (žig) soja 1 korišćena je za inokulaciju 25 mL BMG podloge (opisane u Invitrogen Pichia Expression Manual) u boci od 250 mL i inkubirana je tokom 2-3 dana u tresućem inkubatoru (140 o/min) na 30°C. Kultura je korišćena za inokulaciju 200 mL BMG u bocu sa zaprečnim pregradama od 1 L, koja je postavljena u 30°C tresući inkubator (140 o/min) preko noći. Ćelije su prikupljene centrifugiranjem (1500 x g, 10 min, 4°C) i resuspendovane u 1 L BMM podloge u boci sa zaprečnim pregradama od 5 L i inkubirane u tresućem inkubatoru na 28°C tokom 3 dana (2 dana za NaD1). Kulture su indukovane u t=24 i 48h. Podloga za ekspresiju odvojena je od ćelija centrifugiranjem (6000 o/min, 20 min, 4 °C). Podloga je podešena na pH 3.0 pre nanošenja u SP-sefaroznu kolonu (1 cm x 1 cm, Amersham Biosciences), prethodno uravnotežen sa 100mM puferom kalijumfosfata, pH 6.0. Kolona je zatim isprana sa 100 mL 100mM pufera kalijumfosfata, pH 6.0 (ispiranje x 2 za HXL004). Vezani protein eluiran je u 10x10 mL 100mM pufera kalijumfosfata koji sadrži 500 mM NaCl. Tačkasti blot izveden je za identifikaciju frakcija sa najvećom koncentracijom eluiranog proteina i te frakcije su koncentrovane do 1 mL pomoću centrifugalne kolone i isprane 5x pomoću sterilne milli Q ultračiste vode. Proteinska koncentracija Pichia-eksprimiranog defenzina određena je ispitivanjem proteina bicinhoninskom kiselinom (BCA) (Pierce Chemical Co.) sa goveđim serumskim albuminom (BSA) kao proteinskim standardom.
[0125] Defenzini razmatrani za upotrebu ovde dati su u Tabelama 1 i 2 i uključuju defenzine koji imaju najmanje 80% sličnosti sa bilo kojim od navedenih defenzina nakon optimalnog poravnavanja.
[0126] Fig.1(a) do (e) obezbeđuju poravnavanje koje pokazuje sličnost između aminokiselinskih sekvenci (vidi Tabelu 1 za definicije). Fig.11 obezbeđuje poravnavanje aminokiselinskih sekvenci za HXL008 (SEQ ID NO:1), HXL035 (SEQ ID NO:2) i HXL036 (SEQ ID NO:3). Ovo poravnavanje koristi se za stvaranje konsenzus aminokiselinske sekvence navedene u SEQ ID NO:24. Bilo koje od ovih sekvenci mogu da sadrže opcioni N-terminalni ostatak alanina.
PRIMER 1
Inhibicija rasta Trichophyton rubrum i Microsporum fulvum u prisustvu biljnog defenzina
[0127] Biljni defenzini uključuju Solanaceous defenzin klase II (NaD1) i defenzine klase I (HXL001, HXL002, HXL004, HXL005, HXL008, HXL009, HXL012, HXL013, HXL015, NaD2). Vidi Tabele 1 i 2 za identifikatore sekvenci.
[0128] Inhibitorni efekti biljnih defenzina na rast Trichophyton rubrum, T. interdigitale, Microsporum fulvum i C. albicans (dobijenih od National Mycology Reference Centre, South Australia Pathology at the Women's i Children's Hospital, Adelejd, Australija) suštinski su mereni kao što je opisano od strane Broekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-59.
[0129] Spore T. rubrum, T. interdigitale i M. fulvum izolovane su iz sporulišućih gljiva uzgajanih na 1⁄2 snažnom Sabouraud-ovom dekstroznom agaru (SDA). Spore su uklonjene sa ploča dodavanjem 1⁄2 snažnog bujona dekstroze krompira (PDB). C. albicans ćelije su uzgajane u bujonu peptona kvasca (YPD) tokom 16 h. Koncentracije spora i ćelija izmerene su korišćenjem hemocitometra.
[0130] Antifungalni testovi su sprovedeni na mikrotitarskim pločama sa 96 bunarčića suštinski kao što je opisano ovde. Bunarčići su napunjeni sa 20 µL filterski sterilisanog (0.22 µm špric filtera, Millipore) defenzina (10x zaliha za svaku krajnju koncentraciju) ili vode i 80 µL 5 x 10<4>spora/mL (T. rubrum, T, interdigitale, M. fulvum) ili 5000 ćelija/mL (C. albicans) u 1⁄2 snažnom PDB. Ploče su inkubirane na 30°C. Fungalni rast je ispitivan merenjem optičke gustine na 595nm (A595) pomoću čitača mikrotitarske ploče (SpectraMax Pro M2; Molecular Devices. Rast je nastavljen sve dok optička gustina (OD) gljiva u odsustvu bilo kog testnog defenzina nije dostigla OD od 0.2. Svaki test izveden je u duplikatu.
[0131] Nakon inkubacije tokom 72 h, podloge iz bunarčića koje sadrže kliničke izolate od T.
rubrum inkubirane sa 100 g/mL HXL008 zasejane su na svežem Sabouraud-ovom dekstroznom agaru. Ploče su inkubirane na 30°C tokom 5 dana da bi se omogućio razvoj kolonija pre snimanja.
[0132] Rezultati iz ispitivanja inhibicije prikazani su u Tabeli 3. HXL005, HXL008 i HXL035 su najefektivniji biljni defenzini u celom opsegu gljivičnih patogena. HXL001 i HXL009 nisu pokazali nikakvo dejstvo u ispitivanim koncentracijama. HXL002 i NaD2 su veoma slabi inhibitori M. fulvum i C. albicans. HXL004, HXL012, HXL013 i HXL015 pokazuju srednje dejstvo u celom opsegu patogena.
[0133] Rezultati inhibicije kliničkih izolata T. rubrum sa HXL008 (puna linija) i NaD1 (isprekidana linija) prikazani su na Fig.2(a) do 2(d). Oba peptida inhibirala su fungalni rast u malim koncentracijama sa IC50 ispod 20 µg/mL protiv četiri klinička izolata. Međutim, u svim slučajevima, HXL008 inhibirao je rast pri manjoj koncentraciji u odnosu na NaD1.
1
[0134] Rezultati ispitivanja preživljavanja ćelija za kliničke izolate T. rubrum prikazani su na Fig.3(a) do 3(e). Ploče koje su inokulisane ćelijama koje nisu inkubirane sa biljnim defenzinom bile su gotovo potpuno prekrivene rastom. Za razliku od toga, ploče koje su inokulisane ćelijama koje su inkubirane u prisustvu HXL008 tokom 72 h imale su samo 1-3 kolonija što ukazuje da su skoro sve ćelije umrle.
TABELA 3
IC50protv M.
Defenzin IC50protiv T. rubrum IC50protiv T. interdigitale IC50protiv C. albicans ulvum
PRIMER 2
Inhibicija rasta Trichophyton rubrum tokom 28 dana u prisustvu HXL008
[0135] Inhibitorni efekat HXL008 na rast Trichophyton rubrum (dobijena od National Mycology Reference Centre, South Australia Pathology at the Women's i Children's Hospital, Adelejd, Australija) praćen je tokom 28 dana.
2
[0136] Spore T. rubrum su izolovane iz sporulišućih gljiva uzgajanih na 1⁄2 snažnom Sabouraud-ovom dekstroznom agaru. Spore su uklonjene sa ploča dodavanjem 1⁄2 snažnog bujona dekstroze krompira (PDB). Koncentracije spora i ćelija izmerene su korišćenjem hemocitometra.
[0137] Spore su razblažene do koncentracije od 5 x 10<4>spora/mL u 1⁄2 PBD (2 mL) koji sadrži 0, 10 ili 50 µg/mL HXL008. Kulture su inkubirane na 30 C bez mućkanja. Nakon 24 h, 100 µL svake kulture je ekstrahovano i zasejano na 1⁄2 SDA pločama. Dodatnih 100 uL 1⁄2 PDB je zatim dodato, a koji sadrži ili 0, 20 ili 100 µg HXL008. SDA ploče su zatim inkubirane na 30 C tokom 5 dana. Ovaj postupak je ponavljan svaka 24 h tokom 28 dana. Nakon 15 dana, kultura koja ne sadrži HXL008 postala je suviše gusta za pipetiranje i više nije korišćena u ispitivanju.
[0138] Rezultati ispitivanja inhibicije prikazani su na Fig.4. Kulture tretirane ili sa 10 µg/mL ili sa 50 µg/mL nisu pokazale nikakav vidljiv rast T. rubrum tokom trajanja ispitivanja. U okviru 24 h, HXL008 sa 50 µg/mL ubio je više od 80% T. rubrum ćelija, što se moglo videti kada je zasejano na 1⁄2 SDA u odsustvu HXL008. Tokom narednih 19 dana, broj preživelih kolonija nastavio je da opada. Nakon 20 dana tretiranja, ploče su imale ili 0 ili samo 1 koloniju što ukazuje na to da je više od 99.5% ćelija umrlo.
PRIMER 3
Prodiranje biljnih defenzina kroz humane nokte
[0139] Prodiranje NaD1 kroz humane nokte je izmereno prema postupku od Hui et al. (2002) J Pharm Sci 91(1):189-195. Humani nokti nožnih prstiju dobijeni su od ScienceCare (SAD) i isprani fosfatnim puferisanim fiziološkim rastvorom (detalji, PBS) pre njihovog postavljanja na kimwipe-maramice koje su potopljene u PBS tokom 3 h radi rehidratacije noktiju. Nokat je zatim postavljen u plastični adapter nokta sa područjem za doziranje od 0.5 x 0.5 cm (Permagear, SAD) i vatirani štapić nakvašen sa 75 mikrolitara PBS-a smešten je u prihvatnu komoru u kontaktu sa donjom stranom nokta.
[0140] Protein (10-30 µL 5-10 mg/mL rastvora) je nanošen na vrh nokta svaka 24 h tokom 4 dana.
Vatirani štapić u kontaktu sa donjom stranom nokta uklonjen je nakon 24 h i svaka sledeća 24 h. Protein koji je prošao kroz nokat je izdvojen sa vatiranog štapića ispiranjem dva puta sa 500 µL 0.1vol.% trifluorosirćetne kiseline. Izdvojeni protein izmeren je pomoću RP-HPLC.
[0141] Rezultati ispitivanja prodiranja kroz nokat prikazani su u Tabeli 4 i na Fig.5. Kada su se nanosili svakodnevno na površinu noktiju, biljni defenzini HXL008, NaD1 i HXL004 mogli su da prodiru kroz nokte brže i efikasnije u odnosu na aktivne sastojke trenutnih topikalnih terapija za onihomikoze (tavaborol, efinakonazol i ciklopiroks). Više HXL008 detektovano je kako prolazi kroz nokat nego NaD1 ili HXL004. Biljni defenzin HXL012 nije prodirao kroz nokat.
TABELA 4
PRIMER 4
Inhibicija rasta Escherichia coli u prisustvu biljnih defenzina
[0142] Jedna E. coli kolonija korišćena je za inokulaciju 5 ml Luria-Bertani podloga i uzgajana preko noći na 37°C. Sledećeg dana, izmerena je optička gustina kulture i E. coli je razblažena do optičke gustine na 600 nm (OD600) od 0.01 u Mueller-Hinton-ovom bujonu. Razblažene E. coli dodate su u ploče sa 96-bunarčića sa defenzinima u koncentracijama od 10 µM, 5 µM, 2.5 µM, 1.25 µM, 0.625 µM, 0.3125 µM ili
4
0.1625 µM. Ploče su očitane na OD595da bi se dobile tačke podataka nultog vremena. Ploče su inkubirane na 37°C tokom 18 sati pre ponovnog očitavanja na OD595da bi se ocenila količina E. coli rasta.
[0143] Rezultati inhibicije E. coli prikazani su na Fig.7. HXL004 inhibirao je rast E. coli na način zavisan od koncentracije, slično LL37 kontroli. NaD1 i HXL008 nisu inhibirali rast E. coli u ispitivanim koncentracijama.
PRIMER 5
Preživljavanje ćelija sisara u prisustvu biljnih defenzina
[0144] Humane ćelije monocitnog limfoma (U937) su kultivisane u O/MINI-1640 podlozi. Sve podloge za kultivisanje su obogaćene sa 5-10 vol.% fetalnog telećeg seruma, 100 U/ml penicilina i 100 µg/ml streptomicina. Ćelijske linije su kultivisane na 37°C u vlažnoj atmosferi koja sadrži 5vol.% CO2.
Adherentne ćelijske linije su odvojene iz boce dodavanjem mešavine koja sadrži 0.25vol.% tripsina i 0.5 µM EDTA.
[0145] Test apsorpcije propidijum jodida (PI) baziran na protočnoj citometriji izveden je za analizu sposobnosti biljnih defenzina da permeabilizuju U937 ćelije (suštanski kao što je opisano u Poon et al, 2014). Ukratko, ćelije su suspendovane do 1 × 10<6>ćelija/ml u 0.1vol.% BSA/O/MINI-1640 i inkubirane sa biljnim defenzinima (10 µM) na 37°C tokom 30 min. Uzorci su dodati u PBS koji sadrži krajnju koncentraciju 1 µg/ml PI i smešteni su na ledu. Uzorci su zatim analizirani neposredno pomoću BD FACSCanto II protočnog citometra i BD FACSDiva softvera v6.1.1. Dobijeni podaci iz protočne citometrije analizirani su pomoću FlowJo softvera v8.8.6. Ćelije su kontrolisane na odgovarajući način na osnovu rasejanja unapred i bočnog rasejanja, a ćelijska permeabilizacija je definisana PI-pozitivnim bojenjem.
[0146] Rezultati ispitivanja PI-apsorpcije prikazani su na Fig.7. Biljni defenzini NaD1 i HXL005 su toksični za ćelije sisara u ispitivanim uslovima. NaD1 je permeabilizovao 33% ćelija dok je HXL005 permeabilizovao skoro 25%. Biljni defenzini HXP4, HXL004 i HXL013 bili su manje toksični za ćelije sisara samo 13% (HXP4 i HXL004) ili 5% (HXL013) ćelija. Za razliku od toga, HXL001, HXL002, HXL008, HXL009 i HXL012 nisu bili značajno toksični za ćelije sisara u ispitivanim uslovima, permeabilizacija manja od 2% ćelija.
PRIMER 6
Liza humanih crvenih krvnih zrnaca u prisustvu biljnih defenzina
[0147] Humana crvena krvna zrnca (RBC) prikupljena su iz cele krvi i isprana sa 1 × PBS i peletirana pri 1000 × g tokom 10 min. RBC su razblažena 1 u 10 tokom tretiranja biljnim defenzinima (100 µM) i inkubirana tokom noći u vlažnoj atmosferi 5vol.% CO2 / 95vol.% vazduha. Nakon 24 h inkubacije, ćelije su centrifugirane tokom 10 min pri 2000 o/min, sa supernatantom razblaženim do 1 u 100 sa 1 × PBS. Oslobođeni hemoglobin kao indikativ RBC lize zatim je određen merenjem apsorbance na 412 nm.
Rezultati su normalizovani za RBC tretirane vodom (označeno kao 100% lize).
[0148] Rezultati lize crvenih krvnih zrnaca prikazani su na Fig.8. Na 100 µM, biljni defenzini NaD1 i HXL004 lizirali su 1.47 i 1.09 procenta RBC-a tim redom, dok je HXL008 lizirao samo 0.42 procenat.
Stubići greške predstavljaju standardno odstupanje.
PRIMER 7
Efekat komponenata formulacije na prodiranje HXL008 kroz humane nokte
[0149] HXL008 je rastvoren do koncentracije 10 mg/mL ili u vodi, 50 mM citratnom puferu pH 4.0 ili u 50 mM citratnom puferu pH 4.0 koji sadrži 20vol.% etanola i 0.5 mM EDTA. Prodiranje HXL008 u svakoj formulaciji kroz humane nokte je izmereno prema postupku od Hui et al. (2002) Supra. Humani nokti nožnih prstiju dobijeni su od ScienceCare (SAD) i isprani fosfatnim puferisanim fiziološkim rastvorom (PBS) pre postavljanja na kimwipe-maramicu koja je potopljena u PBS tokom 3 h radi rehidratacije nokta. Nokat je zatim postavljen u plastičnom adapteru nokta sa područjem za doziranje od 0.5 x 0.5 cm (Permagear, SAD), a vatirani štapić nakvašen sa 75 mikrolitara PBS-a smešten je u prihvatnu komoru u kontaktu sa donjom stranom nokta.
[0150] Protein u formulaciji (10 µL 10 mg/mL rastvora) nanošen je na vrh nokta svaka 24 h tokom 2 ili 3 dana. Vatirani štapić u kontaktu sa donjom stranom nokta uklonjen je nakon 24 h i svaka sledeća 24 h. Protein koji je prošao kroz nokat izdvojen je sa vatiranog štapića ispiranjem dva puta sa 500 µL 0.1vol.% trifluorosirćetne kiseline. Izdvojeni protein izmeren je pomoću RP-HPLC.
[0151] Rezultati ispitivanja prodiranja prikazani su u Tabeli 6 i na Fig.9. Kada je nanošen svakodnevno na površinu noktiju, prodiranje HXL008 kroz nokat je poboljšano u prisustvu 50mM citratnog pufera pH4.0, sa ili bez etanola i EDTA.
PRIMER 8
Rekombinantna ekspresija biljnih defenzina pomoću P. pastoris
[0152] Biljni defenzini HXL008, HXL008+ala, HXL004 i NaD1 eksprimirani su u Pichia pastoris kao što je opisano u Postupcima.
[0153] Prinos različitih biljnih defenzina iz rekombinantne ekspresije u P. pastoris prikazan je u Tabeli 7. HXL008+ala je bio najviše eksprimiran protein sa prinosom od 7.5 mg/L.
TABELA 7
PRIMER 9
Ekspresija i prečišćavanje HXL008+ala velikih razmera
[0154] Otvoreni okvir čitanja (ORF) za HXL008+ala kloniran je u Pichia ekspresionom vektoru pPIC9. ORF je umetnut u okvir sa signalom za sekreciju α-faktora i direktno nizvodno od KEX2 mesta cepanja.
Plazmid je zatim linearizovan u kaseti za selekciju HIS4 pomoću restrikcionog enzima SalI i transformisan u elektrokompetentnim GS115 Pichia pastoris ćelijama. Pozitivne kolonije odabrane su korišćenjem podloga bez histidina. Pozitivne kolonije korišćene su za inokulaciju 5mL YPD-a i inkubirane tokom 25 h na 30°C u tresućem inkubatoru. Ćelije u kulturi umešane su sa 20% glicerolom, brzo zamrznute i čuvane na -80°C.
[0155] Ćelije iz zaliha glicerola zasejane su na YPD pločama i omogućen im je rast na 30°C tokom 48 h. Ploče su zatim čuvane na 4°C do 2 nedelje.
[0156] Ćelije sa YPD ploče (pPIC9-defenzin, GS115) korišćene su za inokulaciju 500 mL BMG podloge (opisana u Invitrogen Pichia Expression Manual) u boci od 2.5 L i kultura je inkubirana tokom 2 dana u tresućem inkubatoru (120 o/min) na 28°C. Nakon 48 h, kultura je korišćena za inokulaciju 20 L podloga sa baznim solima za fermentaciju u 30 L B Braun fermentoru. Temperatura je održavana na 28°C tokom perioda fermentacije. pH je održavan na 5.0 tokom perioda fermentacije dodavanjem 25vol.% rastvora amonijaka kao odgovor na svako smanjenje pH. Rastvoreni kiseonik (DO) održavan je na 30% tokom perioda fermentacije povećanjem mešanja (minimalno 500 o/min) ili povećanjem protoka kiseonika.
[0157] U 20 L kulture uvođen je sterilni 100vol.% glicerol brzinom od 3.6 mL/min dok ćelijska gustina nije dostigla 250 - 300 g/L. U ovom trenutku, uvođenje glicerola je zaustavljeno i kultura je ostavljena da se razvija sve dok nije potrošen sav glicerol, što je dokazano skokom u DO. U kulturu je zatim uveden sterilni 100vol.% metanol koji sadrži 12 mL/L metala u tragovima. Brzina uvođenja je povećavana tokom 8 h od 0.2 do 2.18 mL/min. Brzina uvođenja od 2.18 mL/min zatim je nastavljena tokom dodatna 48 h.
[0158] Podloga za ekspresiju je prikupljena i odvojena od ćelija centrifugiranjem (6000 o/min, 20 min, 4°C). Podloga je razbistrena filtriranjem kroz membranu od 0.22 µm Podloga je razblažena 1 u 5 u 50 mM acetatnom puferu pH 5.3. Razblažena podloga zatim je naneta na SP-sefaroznu kolonu (visokih performansi) koja je prethodno uravnotežena sa 50 mM acetatnim puferom pH 5.3. Kolona je zatim isprana sa 20 kolonskih zapremina 50 mM acetatnog pufera pH 5.3. Vezani HXL008 je eluirao pomoću linearnog gradijenta od 0-100 vol.% 50 mM acetatnog pufera pH 5.3 koji sadrži 1 M NaCl. Frakcije koje sadrže protein (kao što je identifikovano apsorbancom na 280 nm) su objedinjene i koncentrovane do 200 mL pre podvrgavanja hromatografiji razdvajanja po veličini. Proteini su napunjeni na Superdex 30 kolonu od 1800 mL (5cm x 92cm XK50/100 kolona) i eluirani pomoću 50 mM pufera natrijumfosfata, 150 mM NaCl, pH 7.2 sa 15 mL/min. Proteini koji su eluirali u početnoj zapremini odbačeni su, a frakcije koje sadrže HXL008+ala identifikovane su masenom spektrometrijom. Frakcije koje sadrže HXL008 objedinjene su i zatim su im odstranjene soli u sterilnoj MilliQ vodi i koncentrovane pomoću 3000 MWCO obrtne kolone.
[0159] Dobijeni rastvor peptida je analiziran pomoću SDS-PAGE, RP-HPLC i masene spektrometrije. Krajnji prinos je određen merenjem koncentracije peptida pomoću BCA testa. Ukupno 1.436 g HXL008+ala je proizvedeno i prečišćeno do čistoće veće od 99%.
[0160] Rezultati prečišćavanja prikazani su na Fig.10. Fig.10A je SDS-PAGE gel prečišćenog HXL008+ala. Trake 1, 2 i 14 su markeri molekulske mase (SeeBlue [registrovan žig] Plus 2). Trake 3 i 4 su HXL008+ala standard (5 µg). Trake 5 do 12 su uzorci od objedinjenih frakcija iz razdvajanja po veličini. Fig.10B je RP-HPLC trag objedinjenih elucija. Jedan pik je primećen na -7.1 min, što je u skladu sa očekivanim vremenom zadržavanja za HXL008+ala. Fig. XC je trag MALDI-TOF masenom spektrometrijom od 4 kDa do 20 kDa. Primećena masa (5477 Da) odgovara očekivanoj masi za HXL008+ala sa sve četiri obrazovane disulfidne veze.
BIBLIOGRAFIJA
[0161]
Altschul et al. (1997) Nucl. Acids. Res.25:3389
Ausubel et al. (1994-1998) In: Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc Bloch and Richardson (1991) FEBS Lett 279(1):101-104
Broekaert et al. (1990) FEMS Microbiol Lett 69:55-59
Cabral et al (2003) Protein Express Purif 31(1):115-122
Colilla et al. (1990) FEBS Lett 270(1-2):191-194
Elewski et al. (2012) Fungal diseases In: Bolognia, Jorizzo, Schaffer eds, Dermatology 3rd ed. Philadelphia, PA; Elsevier Saunders; chapter 77
Greco et al. (1995) Pharmacol Rew 47:331-385
Hayes et al. (2013) Antimicrob Agents Ch 57(8)3667-3675
Hui et al (2002) J. Pharm Sci 9(11): 189-195
Janssen et al. (2003) Biochemistry 42(27):8214-8222
Johnson et al., Peptide Turn Mimetics in Biotechnology and Pharmacy, Pezzuto et al., Eds., Chapman and Hall, New York, 1993
Kent (2002) Genome Res 12: 656-664
Khengar et al. (2007) Pharm Res 24(12):2207-2212 Kobayashi et al (2004) Euro J Pharm Sci 21:471-477 Langmead et al (2009) Genome Biol 10:R25
Li and Durbin (2010) Bionformatics 26:589-595
Malhotra and Zatz (2002) J Pharm Sci 91(2):312-323
Merten and Lippold (1997) J Pharm Pharmacol 49:866-872 Murdan (2008) Expert Opin Drug Deliv 5(11):1267-1282 Murthy et al. (2009) J Pharm Sci 98(11):4264-4271
Nair et al. (2009) J Pharm Pharmacol 61(4):431-437
Rapini et al. (2007) Dermatology:2-volume set, St. Louis: Mosby Reeves US Patent No.6,391,879
Reid et al (2011) Nature Review & Microbiol 9: 27-38
Richer (1987) Pestic Sci 19:309-315
Sagaram et al., (2011) PLoS One 6.4: e18550
Sotiriou et al. (2010) Acta Derm-Venereol 9(2):216-217 Thevissen et al. (2012) Mol Microbiol 84(1):166-180
4
4
4
4
4
4
4
1
2
4

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Biljni defenzin koji ima aminokiselinsku sekvencu: Xaa Lys Val Cys Thr Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Leu Cys Gly Xaa Asp Xaa Xaa Cys Thr Xaa Ala Cys Xaa Lys Glu Gly Leu Xaa Xaa Gly Xaa Cys Gln Xaa Lys Gly Phe Xaa Asn Xaa Val Cys Val Cys Arg Lys Xaa Cys (SEQ ID NO:24); u kojoj Xaa na položaju 1 predstavlja alanin ili nema ostatka, a Xaa na položajima 17, 19, 20, 23, 26, 31, 32, 34, 37, 41, 43 i 50 je bilo koja aminokiselina, za upotrebu u postupku za inhibiciju infekcije gljivičnim patogenom na ili u noktu nožnog prsta ili prsta ruke, kandži, kopitu ili rogu na nekom subjektu, pri čemu pomenuti postupak obuhvata nanošenje efektivne količine pomenutog biljnog defenzina na nokat nožnog prsta ili prsta ruke, kandžu, kopito ili rog.
2. Defenzin za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu je infekcija povezana sa onihomikozom.
3. Defenzin za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2, pri čemu defenzin obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27.
4. Defenzin za upotrebu prema zahtevu 1 ili 2 ili 3, pri čemu se defenzin koristi u sinergijskoj kombinaciji sa antifungalnim agensom, gde antifungalni agens predstavlja neki peptid od oko 0.4 do oko 12 kD ili inhibitor proteinaze ili hemijski fungicid odabran iz grupe koju čine terbinafin, intrakonazol, flukonazol, ciklopiroks, klotrimazol, amorolfin i butenafin.
5. Defenzin za upotrebu prema bilo kojem od zahteva 1 do 4, pri čemu je gljivični patogen odabran iz grupe koju čine dermatofit, Candida vrste i ne-dermatofit.
6. Defenzin za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu dermatofit predstavlja Trichophyton vrste odabrane iz grupe koju čine Trichophyton rubrum, Trichophyton interdigitale, Trichophyton violaceum, Trichophyton tonsurans, Trichophyton soudanense i Trichophyton mentagrophytes; ili predstavlja Microsporum fulvum, Epidermophyton floccosum ili Microsporum gypseum.
7. Defenzin za upotrebu prema zahtevu 5, pri čemu je ne-dermatofit odabran iz grupe koju čine Neoscytalidium, Scopulariopsis, Acremonium i Scytalidium.
8. Topikalna formulacija ili ćelijski ili biljni ekstrakt koji obuhvata biljni defenzin koji ima aminokiselinsku sekvencu: Xaa Lys Val Cys Thr Lys Pro Ser Lys Phe Phe Lys Gly Leu Cys Gly Xaa Asp Xaa Xaa Cys Thr Xaa Ala Cys Xaa Lys Glu Gly Leu Xaa Xaa Gly Xaa Cys Gln Xaa Lys Gly Phe Xaa Asn Xaa Val Cys Val Cys Arg Lys Xaa Cys (SEQ ID NO:24); pri čemu Xaa na položaju 1 predstavlja alanin ili nema ostatka, a Xaa na položajima 17, 19, 20, 23, 26, 31, 32, 34, 37, 41, 43 i 50 je bilo koja aminokiselina; i jedan ili više farmaceutski ili veterinarski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa za upotrebu u lečenju onihomikoze.
9. Formulacija ili ćelijski ili biljni ekstrakt za upotrebu prema zahtevu 8, pri čemu je formulacija premaz, sprej, kapi, krem ili losion.
10. Formulacija ili ćelijski ili biljni ekstrakt za upotrebu prema zahtevu 8 ili 9, pri čemu defenzin obuhvata aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27.
11. Formulacija ili ćelijski ili biljni ekstrakt za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu je defenzin odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:3.
12. Formulacija ili ćelijski ili biljni ekstrakt za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu je defenzin odabran iz grupe koju čine SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 i SEQ ID NO:27.
1
RS20211133A 2014-10-21 2015-05-29 Postupak za lečenje gljivičnih infekcija RS62386B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462066808P 2014-10-21 2014-10-21
EP15852021.3A EP3209319B1 (en) 2014-10-21 2015-05-29 A method of treatment of fungal infections
PCT/AU2015/050293 WO2016061619A1 (en) 2014-10-21 2015-05-29 A method of treatment

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62386B1 true RS62386B1 (sr) 2021-10-29

Family

ID=55748162

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211133A RS62386B1 (sr) 2014-10-21 2015-05-29 Postupak za lečenje gljivičnih infekcija

Country Status (24)

Country Link
US (4) US9713632B2 (sr)
EP (2) EP3209319B1 (sr)
JP (3) JP6646662B2 (sr)
KR (1) KR102472312B1 (sr)
CN (3) CN118453831A (sr)
AU (2) AU2015336933B2 (sr)
BR (1) BR112017008211A2 (sr)
CA (1) CA2965187A1 (sr)
CY (1) CY1124640T1 (sr)
DK (1) DK3209319T3 (sr)
ES (1) ES2890461T3 (sr)
HR (1) HRP20211477T8 (sr)
HU (1) HUE056178T2 (sr)
LT (1) LT3209319T (sr)
MX (2) MX382906B (sr)
MY (1) MY186552A (sr)
NZ (1) NZ731143A (sr)
PL (1) PL3209319T3 (sr)
PT (1) PT3209319T (sr)
RS (1) RS62386B1 (sr)
SG (2) SG11201703184SA (sr)
SI (1) SI3209319T1 (sr)
SM (1) SMT202100558T1 (sr)
WO (1) WO2016061619A1 (sr)

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9573980B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 Spogen Biotech Inc. Fusion proteins and methods for stimulating plant growth, protecting plants from pathogens, and immobilizing Bacillus spores on plant roots
AU2015251501B2 (en) * 2014-04-24 2019-08-15 Hexima Limited Agents and methods of treatment
IL315468A (en) 2014-09-17 2024-11-01 Spogen Biotech Inc Fusion proteins, recombinant bacteria, and methods for using recombinant bacteria
DK3209319T3 (da) * 2014-10-21 2021-10-04 Hexima Ltd En fremgangsmåde til behandling af svampeinfektioner
SG11201708815UA (en) * 2015-05-29 2017-12-28 Hexima Ltd A method of in vivo treatment
AR113123A1 (es) 2017-09-20 2020-01-29 Spogen Biotech Inc Proteínas de fusión, bacterias recombinantes y fragmentos del exosporio para promover la salud de las plantas
US12053486B2 (en) * 2018-03-09 2024-08-06 Therazure LLC Compositions for the treatment of infections in feet

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3298368A (en) 1964-04-24 1967-01-17 Charos Peter Heated cream applicator gloves
US4087675A (en) 1977-02-07 1978-05-02 Coretta Sansonetti Heated mitten
US4241080A (en) * 1979-05-29 1980-12-23 The Dow Chemical Company Stabilized aqueous antimicrobial composition
US4267852A (en) 1979-09-17 1981-05-19 Hullinger Judith E Process for enhancing and strengthening the growth of nails
JPS5775663A (en) 1980-07-22 1982-05-12 Kiichirou Sarui Apparatus for treating dermatophytosis
US5181914A (en) 1988-08-22 1993-01-26 Zook Gerald P Medicating device for nails and adjacent tissue
US5219877A (en) 1989-09-25 1993-06-15 Bristol-Myers Squibb Company Lauryl alcohol as skin penetration enhancer for topical imidazole agents
US5098415A (en) 1990-10-09 1992-03-24 Jack Levin Device and method for using an aqueous solution containing ozone to treat foot diseases
US5156591A (en) 1990-12-13 1992-10-20 S. I. Scientific Innovations Ltd. Skin electrode construction and transdermal drug delivery device utilizing same
JPH0657323A (ja) 1992-08-06 1994-03-01 Sumitomo Metal Ind Ltd 加熱炉におけるバーナー制御方法
JPH0728521A (ja) 1993-07-09 1995-01-31 Yaskawa Electric Corp シミュレーションプログラム自動作成方法
US5449658A (en) 1993-12-07 1995-09-12 Zeneca, Inc. Biocidal compositions comprising polyhexamethylene biguanide and EDTA, and methods for treating commercial and recreational water
US5696164A (en) 1994-12-22 1997-12-09 Johnson & Johnson Consumer Products, Inc. Antifungal treatment of nails
US6245347B1 (en) 1995-07-28 2001-06-12 Zars, Inc. Methods and apparatus for improved administration of pharmaceutically active compounds
US5668084A (en) 1995-08-01 1997-09-16 Zeneca Inc. Polyhexamethylene biguanide and surfactant composition and method for preventing waterline residue
US5795314A (en) 1996-06-19 1998-08-18 Berenstein; Moshe Therapeutic fingernail treatment device
IL122732A0 (en) * 1997-01-15 1998-08-16 Akzo Nobel Nv Liquid gonadotropin-containing formulation its preparation and a device containing same
US5981698A (en) * 1997-06-03 1999-11-09 Cyberchemics, Inc. Antimicrobial polypeptides
US5993790A (en) * 1997-08-04 1999-11-30 Pedinol Pharmacal Inc. Nail evulsion compositions and method for evulsing nails and treating nail and nail bed infections
WO1999009997A1 (en) * 1997-08-26 1999-03-04 Board Of Regents, The University Of Texas System Edta and other chelators with or without antifungal antimicrobial agents for the prevention and treatment of fungal infections
US6727401B1 (en) 1998-02-12 2004-04-27 Watson Pharmaceuticals, Inc. Pressure sensitive adhesive matrix patch for the treatment of onychomycosis
US6231875B1 (en) 1998-03-31 2001-05-15 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Acidified composition for topical treatment of nail and skin conditions
US6235047B1 (en) 1998-04-06 2001-05-22 Augustine Medical, Inc. Wound treatment apparatus with a heater, a heat conductive bandage, and heat-spreading means acting between the heater and bandage
US6572580B2 (en) 1998-08-06 2003-06-03 Profoot, Inc. Set depth nail notcher with patch system and method for treating nail fungus
US6159977A (en) 1998-11-16 2000-12-12 Astan, Inc. Therapeutic anti-fungal nail preparation
US6477410B1 (en) 2000-05-31 2002-11-05 Biophoretic Therapeutic Systems, Llc Electrokinetic delivery of medicaments
AU6076200A (en) 1999-07-08 2001-01-30 Johnson & Johnson Consumer Companies, Inc. Exothermic bandage
US6528697B1 (en) 2000-01-03 2003-03-04 Augustine Medical, Inc. Modular bandage
US6281239B1 (en) 2000-04-12 2001-08-28 Bradley Pharmeaceuticals, Inc. Method of treating onychomycosis
ATE510015T1 (de) * 2001-02-08 2011-06-15 Hexima Ltd Aus pflanzen stammende moleküle und diese codierende genetische sequenzen sowie verwendungen dafür
US6585963B1 (en) 2001-02-15 2003-07-01 Watson Pharmaceuticals, Inc. Nail compositions and methods of administering same
CN1494378A (zh) 2001-06-08 2004-05-05 K・I化成株式会社 杀微生物液体除臭剂和杀灭微生物除臭的方法
WO2003000863A2 (en) * 2001-06-22 2003-01-03 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Defensin polynucleotides and methods of use
US6821508B2 (en) 2001-06-27 2004-11-23 Rutgers, The State University Composition and method for topical nail treatment
JP2003123136A (ja) 2001-10-17 2003-04-25 Toshiba Electric Appliance Co Ltd 飲料提供装置
US20030144625A1 (en) 2002-01-28 2003-07-31 Garry Sherman Method and apparatus for the treatment of infections of the nail matrix and nail plate
US6634367B2 (en) 2002-03-25 2003-10-21 Kathleen Hunter Abraham Sealing enclosure for finger tips
US6846837B2 (en) 2002-06-21 2005-01-25 Howard I. Maibach Topical administration of basic antifungal compositions to treat fungal infections of the nails
CN1678277B (zh) 2002-07-29 2010-05-05 艾克里麦德公司 治疗皮肤病的方法和组合物
US6921529B2 (en) 2002-07-29 2005-07-26 Joseph C. Maley Treatment modality and method for fungal nail infection
US20070292355A1 (en) 2002-10-25 2007-12-20 Foamix Ltd. Anti-infection augmentation foamable compositions and kit and uses thereof
US20040161452A1 (en) 2003-02-18 2004-08-19 Petit Michael G. Drug-dispensing dressing and composition for treating onychomycosis
WO2005004980A1 (en) 2003-07-14 2005-01-20 Power Paper Ltd. Method, apparatus, and kit for onychomycosis treatment using electrokinetic transport of substances
US20050261755A1 (en) 2004-05-24 2005-11-24 Bacino John E Conformable heat transfer pack
US20060013862A1 (en) 2004-07-19 2006-01-19 Held Jerry M Onychomycosis: a new process for cure
JP2006075357A (ja) 2004-09-09 2006-03-23 Institute Of Physical & Chemical Research 水虫の治療装置
EP2343304B1 (en) 2005-02-16 2015-06-10 Anacor Pharmaceuticals, Inc. Biocidal boronophthalide compounds
CA2607612A1 (en) 2005-05-18 2006-11-23 Tyrell, Inc. Treatment device and method for treating skin lesions through application of heat
US7793666B2 (en) 2005-07-28 2010-09-14 Innovation Biomedical Devices, Inc. Apparatus and method for treatment of infected nail
US20070104664A1 (en) 2005-10-26 2007-05-10 California Institute Of Technology Treatment of toenail fungus
KR20080110984A (ko) 2005-12-30 2008-12-22 아나코르 파마슈티칼스 인코포레이티드 보론함유 소분자
EP2015757A4 (en) 2006-05-02 2011-01-26 Anacor Pharmaceuticals Inc HYDROLYSERESISTENT, BOROYED THERAPEUTIC USES
EP2162182A1 (en) 2007-06-15 2010-03-17 Transport Pharmaceuticals, Inc. Method and system for mitigating current concentration in electrokinetic drug delivery
US20090048590A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Tyrell, Inc. Systems and methods for treating nail-bed fungus through application of heat
ES2324192B1 (es) * 2008-01-30 2010-06-17 PUIG BEAUTY &amp; FASHION GROUP, S.L. Derivados peptidicos utiles en el tratamiento, cuidado o limpieza de la piel, mucosa, cuero cabelludo o uñas.
FR2942716B1 (fr) * 2009-03-06 2011-04-15 Galderma Res & Dev Methode de solubilisation d'agent antifongique et compositions a haute concentration en agent antifongique applicables sur l'ongle
IT1395241B1 (it) 2009-08-07 2012-09-05 Iarrera Apparato per la germinazione controllata di semi e relativo metodo.
WO2011079234A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Nuvo Research Inc. Highly permeating terbinafine formulation
BR112013003223A2 (pt) * 2010-08-23 2016-06-07 Pioneer Hi Bred Int "polinucleotídeo isolado, cassete de expressão, célula hospedeira, micro-organismo, planta ou parte de planta, método de obtenção de uma planta transformada, composição antipatogênica, método para proteger uma planta contra um patógeno ou uso de um polinucleotídeo isolado"
KR101311196B1 (ko) * 2010-12-23 2013-09-27 중앙대학교 산학협력단 진균 감염 또는 뇌수막염 치료를 위한 ｕｐｒ 신호전달 유전자 ｉｒｅ1 및 ｈｘｌ1의 용도
KR101947126B1 (ko) * 2010-12-28 2019-02-13 카메디스 리미티드 감염의 치료 및 예방을 위한 식물 추출물
EP2664327A1 (en) 2012-05-14 2013-11-20 Almirall S.A. Topical pharmaceutical compositions comprising terbinafide and urea
AR094821A1 (es) * 2012-07-25 2015-09-02 Hanmi Pharm Ind Co Ltd Formulación líquida de un conjugado de péptido insulinotrópico de acción prolongada
AU2013260696A1 (en) * 2012-11-23 2014-06-12 Hexima Limited Use of anti-fungal defensins
JP6457945B2 (ja) * 2012-11-23 2019-01-23 ヘキシマ リミテッドＨｅｘｉｍａ Ｌｉｍｉｔｅｄ 抗病原体方法
EP2974734B1 (en) * 2013-03-12 2018-10-10 Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. Liquid aqueous composition
EP3133919A4 (en) 2014-04-23 2018-02-21 Hexima Limited Agents and methods for treatment of pathogens
AU2015251501B2 (en) 2014-04-24 2019-08-15 Hexima Limited Agents and methods of treatment
DK3209319T3 (da) * 2014-10-21 2021-10-04 Hexima Ltd En fremgangsmåde til behandling af svampeinfektioner

Also Published As

Publication number Publication date
JP2020097573A (ja) 2020-06-25
AU2021201810A1 (en) 2021-04-22
US10010576B2 (en) 2018-07-03
US20160106807A1 (en) 2016-04-21
JP2022022316A (ja) 2022-02-03
CY1124640T1 (el) 2022-07-22
AU2021201810B2 (en) 2024-08-22
US10973874B2 (en) 2021-04-13
CA2965187A1 (en) 2016-04-28
WO2016061619A1 (en) 2016-04-28
AU2015336933B2 (en) 2021-01-14
SMT202100558T1 (it) 2021-11-12
DK3209319T3 (da) 2021-10-04
US11446354B2 (en) 2022-09-20
HUE056178T2 (hu) 2022-01-28
SG10201912688YA (en) 2020-02-27
PT3209319T (pt) 2021-09-24
JP7207780B2 (ja) 2023-01-18
JP2017533210A (ja) 2017-11-09
US20170239328A1 (en) 2017-08-24
ES2890461T3 (es) 2022-01-19
HRP20211477T8 (hr) 2022-03-04
SG11201703184SA (en) 2017-05-30
US20210228678A1 (en) 2021-07-29
HRP20211477T1 (hr) 2022-01-07
SI3209319T1 (sl) 2022-01-31
US9713632B2 (en) 2017-07-25
MX2021006057A (es) 2021-07-06
CN113368215A (zh) 2021-09-10
CN118453831A (zh) 2024-08-09
LT3209319T (lt) 2021-10-25
JP6646662B2 (ja) 2020-02-14
EP3949977A1 (en) 2022-02-09
PL3209319T3 (pl) 2021-12-20
KR20170072291A (ko) 2017-06-26
EP3209319A1 (en) 2017-08-30
EP3209319B1 (en) 2021-07-14
AU2015336933A1 (en) 2017-05-11
NZ731143A (en) 2021-07-30
JP6990224B2 (ja) 2022-02-03
BR112017008211A2 (pt) 2017-12-26
CN107106647B (zh) 2021-08-10
MX382906B (es) 2025-03-13
EP3209319A4 (en) 2018-05-16
CN107106647A (zh) 2017-08-29
MY186552A (en) 2021-07-26
US20170296622A1 (en) 2017-10-19
MX2017005305A (es) 2017-08-02
KR102472312B1 (ko) 2022-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7207780B2 (ja) 治療方法
JP2020532316A (ja) 局所用組成物及び使用
EP3118216A1 (en) Cellular growth and proliferation promoting peptides, and uses thereof
US20220387283A1 (en) Hair growth agent
US20240099951A1 (en) Hair growth stimulant
WO2018171535A1 (zh) 重组人胰岛素原融合蛋白及其制备方法和用途
HK1238575B (en) A method of treatment of fungal infections
HK1238575A1 (en) A method of treatment of fungal infections
AU2015396744B2 (en) A method of in vivo treatment
NZ736735B2 (en) A method of in vivo treatment