RS62460B1 - Genetski konstrukt - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na genetske konstrukte i rekombinantne vektore koji sadrže takve konstrukte, kao i na upotrebu konstrukata i vektora u postupcima genske terapije za lečenje niza poremećaja, uključujući glaukom i gluvoću, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva.

[0002] Glaukom je termin koji se koristi za definisanje grupe očnih poremećaja koje karakteriše progresivna degeneracija optičkog nerva, smrt ganglijskih ćelija retine (RGC) i gubitak aksona, što rezultira ekskavacijom papile optičkog nerva i gubitkom vida. Glaukom je vodeći uzrok slepila širom sveta [1], a učestalost glaukoma dramatično raste sa godinama. Približno pola miliona ljudi u Velikoj Britaniji i više od 2.2 miliona ljudi u Severnoj Americi starih 40 godina i više ima glaukom. Štaviše, svakog sata neko oslepi od ove bolesti opasne po vid u SAD-u [2]. Kako veličina starije populacije nastavlja brzo da raste, glaukom je postao neizbežan društveni, ali i medicinski problem. Povišen intraokularni pritisak (IOP) je najvažniji faktor rizika za glaukom [3], pored starosti, i svi so sada licencirani tretmani deluju putem snižavanja IOP [4-5].

[0003] Glaukom može da se dijagnostikuje pre gubitka vida testiranjem vidnog polja i oftalmoskopskim pregledom optičkog nerva kako bi se otkrilo "udubljivanje papile". Sadašnje lečenje glaukoma zasniva se na snižavanju IOP na normalne nivoe, koji su između 10 i 21 mm Hg, korišćenjem lekova za lokalnu primenu, kako bi se sprečila dalja oštećenja optičkog nerva [6]. Prosečan IOP kod normalnih odraslih osoba je 15 do 16 mm Hg. Trenutno postoji pet glavnih klasa lekova koji se koriste za snižavanje IOP: β-adrenergički antagonisti, adrenergički agonisti, parasimpatomimetici, analozi slični prostaglandinu i inhibitori karboanhidraze [7]. Iako su relativno efikasni u smanjenju IOP kada se pravilno koriste, ovi lekovi mogu da izazovu ozbiljna sporedna dejstva kod nekih pacijenata i na taj način negativno utiču na kvalitet života pacijenta. Osim toga, pridržavanje lečenja kapima za oči koje snižavaju IOP često je loše, posebno kod starijih pacijenata koji treba da uzimaju više lekova. Procenjeno je da ga manje od 50% pacijenata kojima je propisan tretman za snižavanje IOP zaista redovno koristi prema uputstvima, sa očiglednim implikacijama na kontrolu osnovnog stanja. Ako je indikovano dodatno snižavanje IOP, ili ako lekovi ne uspeju dovoljno da snize IOP, može se koristiti laserska trabekuloplastika, ali, kod mnogih pacijenata, ovim tretmanom se ne postiže odgovarajuće sniženje IOP. Ako IOP još uvek nije adekvatno kontrolisan, može da bude indikovana inciziona operacija glaukoma. Međutim, lečenjem snižavanjem IOP kod mnogih pacijenata ne sprečava pogoršanje stanja, i glaukom je i dalje vodeći uzrok nepovratnog slepila širom sveta. Prema tome, neuroprotekcija glaukomatoznih RGC i aksona koji se od njih pružaju, koji čine optički nerv, bila bi dragocena terapijska paradigma za primenu kao dodatak konvencionalnim tretmanima za snižavanje IOP, a posebno važna kod pacijenata kod kojih dolazi do pogoršanja uprkos konvencionalnoj terapiji [8].

[0004] Izgleda da je glaukomatozna optička neuropatija rezultat specifičnih patofizioloških promena i kasnije smrti RGC i njihovih aksona. Smatra se da je proces umiranja RGC dvofazan, tj., da je primarna ozleda odgovorna za početak oštećenja, koja je praćena sporijom, sekundarnom degeneracijom koja se pripisuje neprijateljskom okruženju oko degenerišućih ćelija [9].

[0005] U eksperimentalnim životinjskim modelima glaukoma i kod humanog glaukoma pokazano je da mehanizmi smrti RGC uključuju apoptozu [10]. Iako molekularni mehanizam koji pokreće apoptozu nije identifikovan, pretpostavlja se da su mogući mehanizmi lišavanje neurotrofnih faktora, ishemija, hronično povišenje glutamata i neorganizovani metabolizam azotnog oksida [11].

[0006] Neurotrofni faktor poreklom iz mozga (BDNF), zajedno sa faktorom rasta nerava (NGF), neurotrofin-3 (NT-3) i neurotrofin-4/5 (NT-4/5) članovi su porodice trotrofičkih faktora neurotrofina [12 -13]. Neurotrofini imaju bitnu ulogu u razvoju, preživljavanju i funkcionisanju širokog spektra neurona u perifernom i centralnom nervnom sistemu, uključujući RGC. Neurotrofini stupaju u interakciju sa dva receptora na ćelijskoj površini, niskoafinitetnim receptorima p75<NTR>i visokoafinitetnom porodicom receptorskih tirozin kinaza (Trk) [12-13]. Faktor rasta nerava (NGF) prvenstveno se vezuje za TrkA, neurotrofni faktor poreklom iz mozga (BDNF) i neurotrofin-4/5 (NT4/5) vezuju se za receptorsku tropomiozin kinazu B (TrkB), a neurotrofin-3 (NT-3) za TrkC (i TrkA u manjoj meri) [12-13].

[0007] Među neurotrofinima, BDNF je najmoćniji faktor preživljavanja povređenih RGC [14-21]. BDNF je proteinski molekul koji se proizvodi u mozgu i transportuje do retine putem retrogradnog aksonskog transporta kroz optički nerv, gde podržava RGC i održava njihov opstanak [15-21]. U određenim uslovima, kao što je tokom ekscitotoksičnih insulta sa agonistima receptora za glutamat, kao što je N-metil-D-aspartat, BDNF može da bude proizveden i u RGC, iako na relativno niskim nivoima [22-23]. BDNF se normalno proizvodi kao prepro-polipeptid (tj. preproBDNF) koji sadrži kratku peptidnu signalnu sekvencu, što olakšava prelazak celog polipeptida u vezikule u cilju oslobađanja u vanćelijski prostor. Cepanje i uklanjanje signalnog peptida pretvara preproBDNF u proBDNF. N-terminalna proBDNF sekvenca se zatim cepa, ili unutarćelijski ili vanćelijski, kako bi se stvorio zreli BDNF (mBDNF) [24]. I pro-BDNF i mBDNF poseduju biološku aktivnost pri čemu pro-BDNF prvenstveno aktivira p75<NTR>receptore, a kraći mBDNF aktivira TrkB receptore [25-27]. Aktivacija receptora p75<NTR>i TrkB u retini pokazuje suprotne efekte na preživljavanje RGC, pri čemu je ovaj prvi odgovoran za apoptozu direktno putem RGC-ćelijska-tela-p75<NTR>aktivacije [25-28] ili indirektno putem aktivacije p75<NTR>na Milerovim ćelijama, čime se stimuliše oslobađanje faktora nekroze tumora-alfa (TNF-α) koji dodatno podstiče gubitak RGC [29].

[0008] Životinjski modeli glaukoma pokazali su da nakon nagnječenja nerva ili povišenog IOP postoji pomak od neurotrofnog mBDNF/TrkB signaliziranja prema pro-BDNF/p75<NTR>putevima signalizacije. Pokazani su sniženi nivoi receptora mBDNF i TrkB u retini [27, 30-31], i nasuprot tome, istovremeno povećanje relativnih nivoa receptora pro-BDNF [28] i p75<NTR>[32]. Suplementacija mBDNF putem okularnih injekcija rekombinantnog proteina kod pacova sa eksperimentalno povišenim IOP povećava preživljavanje RGC u poređenju sa netretiranim očima, čime se potvrđuje ključna neuroprotektivna uloga ovog neurotrofina [19-21].

[0009] Da bi se održali nivoi mBDNF u oku sa glaukomom, bile bi potrebne redovne injekcije mBDNF pošto se mBDNF brzo razgrađuje u oku. Da bi se prevazišla potreba za redovnim intraokularnim injekcijama mBDNF, u pokušajima da se obezbedi konstantno povišen BDNF pribeglo se upotrebi isporuke rekombinantnim vektorom na bazi adenovirusa ili adenoasociranog virusa (rAAV) transgena koji kodira BDNF u retinu da bi se odložila ili sprečila smrt RGC u životinjskim modelima glaukoma [18, 33-34]. Vektori rAAV se sastoje od jednolančanog DNK genoma. Uspešno su korišćeni kao virusni vektor za gensku terapiju u više kliničkih ispitivanja, uz istovremeno ispoljavanje ograničene toksičnosti. Dok su se intravitrealne injekcije samo rekombinantnog mBDNF ili povećanje lokalne proizvodnje BDNF pomoću genske terapije pokazale efikasnim u sprečavanju gubitka RGC u kratkom periodu nakon povišenja IOP ili drugog oštećenja optičkog nerva, pokazalo se da je blagotvorni efekat BDNF prolazan [18]. Međutim, genska terapija koja uključuje endogenu sekvencu gena BDNF takođe može da proizvodi i oslobađa pro-BDNF, kao i predviđeni mBDNF.

[0010] Genska terapija koja ima za cilj da umanji ili spreči gubitak signala TrkB putem povećane ekspresije receptora u RGC ili stalnom stimulacijom preostalih vanćelijskih receptora TrkB upotrebom antitela sa agonističkim svojstvima takođe je pokazala uspeh u sprečavanju gubitka RGC [35-36]. Međutim, smanjenje trofičke signalizacije putem mBDNF/TrkB puta dodatno se komplikuje internalizacijom mBDNF-aktiviranih TrkB receptora i zamenom ovih receptora na površini ćelije izoformama TrkB nesposobnim za unutarćelijsku signalizaciju [37-38]. Osim toga, biohemijski sistem odgovoran za deaktiviranje TrkB receptora nakon autofosforilacije dimera TrkB receptora u prisustvu mBDNF je ushodno regulisan u retinama izloženim povišenom IOP [39].

[0011] Štaviše, pored glaukoma, osovina BDNF/TrkB takođe učestvuje u neuroprotekciji komponenti unutrašnjeg uha, posebno kohlearne strukture gde insulti mogu dovesti do gubitka vlatastih ćelija što dovodi do gluvoće [40-42], kao i u regeneraciji nerava [43-44].

[0012] Stoga postoji potreba za poboljšanom genskom terapijom za lečenje glaukoma i gluvoće i za podsticanje regeneracije ili preživljavanja nerava.

[0013] Pronalazači su konstruisali novi genetski konstrukt, koji kodira receptorsku tirozin kinazu B (TrkB), i agonist receptora TrkB pod kontrolom jednog promotora. Promotor konstrukta može da se koristi da bi se osiguralo da su agonist i receptor eksprimirani samo u ganglijskim ćelijama retine (RGC), kohlearnim ili nervnim ćelijama, i da podstiču preživljavanje ovih ćelija.

[0014] Pronalazak je definisan u patentnim zahtevima.

[0015] Prema prvom aspektu pronalaska, obezbeđen je rekombinantni adeno-asocirani vektor (rAAV) koji sadrži genetski konstrukt koji uključuje, u orijentaciji 5' ka 3', promotor funkcionalno povezan sa prvom kodirajućom sekvencom, koja kodira receptorsku tirozin kinazu B (TrkB), i drugom kodirajućom sekvencom, koja kodira agonist TrkB receptora, pri čemu je agonist zreo BDNF, pri čemu druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid za agonist TrkB receptora, tako da je, kada se eksprimira, signalni peptid konjugovan sa N-terminalnim krajem zrelog BDNF, i gde genetski konstrukt sadrži sekvencu spejsera koja se nalazi između prve i druge kodirajuće sekvence, pri čemu sekvenca spejsera kodira peptidni spejser koji je konfigurisan da bude digestiran tako da proizvede receptor i agonist TrkB kao zasebne molekule.

[0016] Prema drugom aspektu, obezbeđen je rekombinantni vektor prema prvom aspektu, za upotrebu kao lek.

[0017] Prema trećem aspektu, obezbeđen je rekombinantni vektor prema prvom aspektu, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili ublažavanju poremećaja optičkog nerva, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerava, gde je opciono poremećaj optičkog nerva koji se leči bilo koje patofiziološko stanje koje rezultuje gubitkom RGC, kao što je povreda glave ili lica ili vaskularni insulti, na primer delimični ili potpuni gubitak snabdevanja krvlju očnih struktura ili delova mozga koji primaju impulse iz optičkog nerva, ili se koristi za podršku zamene RGC uvođenjem netransformisanih ili transformisanih matičnih ćelija u oko ili regije povezane sa vidom kod pacijenata, gde je opciono poremećaj optičkog nerva koji se leči glaukom.

Prema četvrtom aspektu, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni vektor prema prvom aspektu i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

Prema petom aspektu, obezbeđen je postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema četvrtom aspektu, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt rekombinantnog vektora prema prvom aspektu, sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumom.

[0018] Prema tome, prema prvom primeru, obezbeđen je genetski konstrukt koji sadrži promotor koji je funkcionalno povezan sa prvom kodirajućom sekvencom, koja kodira receptorsku tirozin kinazu B (TrkB), i drugom kodirajućom sekvencom, koja kodira agonist TrkB receptora.

[0019] Pronalazači su u primerima pokazali da je moguće kombinovati gene koji kodiraju i TrkB receptor i njegov agonist u jednom genetskom konstruktu. Ovo je bilo posebno izazovno s obzirom na njihove velike dimenzije, i nije se moglo predvideti da bi ih bilo moguće koeksprimirati u fiziološki korisnim koncentracijama. Povoljno, sa konstruktom pronalaska, nema potrebe za ubrizgavanjem rekombinantnog proteina, kao što je opisano u stanju tehnike. Štaviše, u prethodnom stanju tehnike i dalje je potrebno redovno primenjivati injekcije proteina, dok konstrukt prema pronalasku zahteva samo jednu injekciju genske terapije.

[0020] Poželjno je da se tokom upotrebe TrkB receptor aktivira agonistom kako bi se na taj način podstaklo preživljavanje ganglijskih ćelija retine (RGC), nervnih ćelija ili kohlearnih ćelija. Pogodnost predstavlja to, što konstrukt prema pronalasku prema tome može da se koristi za ciljno delovanje na RGC, nervne ćelije ili kohlearne ćelije u cilju održavanja ili poboljšanja TrkB-signalizacije u ovim ćelijama. Prema tome, konstrukt može da se koristi za maksimalnu zaštitu od patofizioloških stresora glaukoma i gluvoće, i za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerava. Dalje, konstrukt može da se koristi za obezbeđivanje dugotrajnog lečenja glaukoma ili gluvoće zahvaljujući ekspresiji TrkB receptora i agonista receptora pod kontrolom jednog ili više promotora. Shodno tome, konstrukt je prevazišao potrebu za upotrebom više alternativnih tretmana, koji čak i u kombinaciji pružaju prolazno terapijsko dejstvo. Štaviše, konstrukt pronalaska je posebno pogodan jer može da se koristi za značajno povećanje osetljivosti RGC ili kohlearnih ćelija na agoniste TrkB receptora zbog lokalizovanog povećanja TrkB receptora, kao i agonista receptora.

[0021] Poželjno, genetski konstrukt ovog otkrića sadrži ekspresionu kasetu, čiji je jedan primer prikazan na slici 1. Kao što se može videti na slici 1, konstrukt sadrži promotor, prvu nukleotidnu sekvencu koja kodira TrkB receptor, i drugu nukleotidnu sekvenca koja kodira zreli neurotrofni faktor poreklom iz mozga (mBDNF), koji deluje kao prioritetni agonist TrkB receptora. Međutim, treba razumeti da mogu da se koriste drugi agonisti, kao što je ovde razmatrano. Takođe, kao što je prikazano na slici 1, ekspresiona kaseta takođe uključuje sekvencu spejsera 2A, sekvencu koja kodira post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitisa (WHPE), sekvencu koja kodira poliA rep, i sekvence levog i desnog invertovanog terminalnog ponovka (ITR).

[0022] Prema tome, genetski konstrukt poželjno sadrži sekvencu spejsera koja se nalazi između prve i druge kodirajuće sekvence, pri čemu sekvenca spejsera kodira peptidni spejser koji je konfigurisan za digestiju ili isecanje tako da proizvodi TrkB receptor i agonist kao zasebne molekule. U primeru ilustrovanom na slici 1, kodirajuća sekvenca za TrkB receptor raspoređena je 5’ od kodirajuće sekvence za agonist receptora (BDNF) sa sekvencom spejsera između njih. Međutim, u drugom primeru, kodirajuća sekvenca za agonist receptora može biti raspoređena 5' od kodirajuće sekvence za receptor sa sekvencom spejsera između njih.

[0023] Poželjno, genetski konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WHPE), koji pojačava ekspresiju dva transgena, tj. TrkB receptora i njegovog agonista, koji je poželjno BDNF. Poželjno, sekvenca koja kodira WHPE je raspoređena 3' od sekvence koja kodira transgen.

[0024] Jedan primer izvođenja post-transkripcionog regulatornog elementa virusa hepatitisa mrmota (WHPE) dugačak je 592 bp, uključujući gama-alfa-beta elemente, i ovde je označen kao SEQ ID No: 57, kako sledi:

[0025] Poželjno, WHPE sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 57, ili njen fragment ili varijantu.

[0026] Međutim, u poželjnom primeru izvođenja, koristi se skraćeni WHPE, koji je dug 247bp zbog delecije beta elementa, i koji je ovde označen kao SEQ ID No: 58, kao što sledi:

Pogodno je to što skraćena sekvenca WHPE koja se koristi u konstruktu štedi ukupno oko 300bp bez negativnog uticaja na ekspresiju transgena. Poželjno, WHPE sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 58, ili njen fragment ili varijantu.

[0027] Poželjno, genetski konstrukt sadrži nukleotidnu sekvenca koja kodira poliA rep. Poželjno, sekvenca koja kodira poliA rep je postavljena 3’ od sekvence koja kodira transgen, i poželjno 3’ od sekvence koja kodira WHPE.

[0028] Poželjno, poliA rep sadrži poliA sekvencu majmunskog virusa 40 od 224 bp. Jedan primer izvođenja poliA repa ovde je označen kao SEQ ID No: 59, kao što sledi:

Poželjno, poliA rep sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 59, ili njen fragment ili varijantu.

[0029] Poželjno, genetski konstrukt sadrži sekvence levog i/ili desnog invertovanog terminalnog ponovka (ITR). Poželjno, svaki ITR je smešten na 5’ i/ili 3’ kraju konstrukta.

[0030] Promotor u genetskom konstruktu ovog otkrića može da bude bilo koja nukleotidna sekvenca koja može da indukuje RNK polimerazu da se veže za, i transkribuje prvu i drugu kodirajuću sekvencu. U jednom poželjnom primeru izvođenja, promotor je humani promotor za sinapsin I (SYN I). Jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence od 469 nukleotida koja kodira promotor za sinapsin I (SYN I) ovde je označen kao SEQ ID NO.1, kao što sledi:

[0031] Poželjno, prema tome, promotor može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 1, ili njen fragment ili varijantu.

[0032] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, promotor je CAG promotor. CAG promotor poželjno sadrži element ranog pojačivača citomegalovirusa, prvi egzon i prvi intron pilećeg betaaktinskog gena i akceptosko mesto za splajsovanje zečjeg beta-globinskog gena, čime se olakšava tkivno-specifična ekspresija samo u RGC i kohlearnim ćelijama. Jedan primer izvođenja nukleotidne sekvence od 1733 nukleotida koja kodira CAG promotor ovde je označen kao SEQ ID NO.2, kao što sledi:

[0033] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, promotor je skraćeni oblik CAG promotora, kao što je oblik promotora od 664 nukleotida koji je ovde označen kao SEQ ID NO.3, kao što sledi:

[0034] U sledećem poželjnom primeru izvođenja, promotor je skraćeni oblik CAG promotora, kao što je oblik promotora od 584 nukleotida koji je ovde označen kao SEQ ID NO.48, kao što sledi:

[0035] Prema tome, poželjno promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 2, 3 ili 48, ili njen fragment ili varijantu.

[0036] Mnogi bicistronski genski konstrukti prikazani u naučnoj literaturi imaju ili (i) ugrađene dualne promotore za odvojeno pokretanje ekspresije dva gena, ili (ii) koriste unutrašnja ribozomalna ulazna mesta (IRES) virusa encefalomiokarditisa (EMCV) za povezivanje dva gena transkribovana sa jednog promotora unutar rekombinantnih virusnih vektora [45-46]. Međutim, efikasnost translacije zavisne od IRES može da varira u različitim ćelijama ili tkivima i ekspresija drugog gena zavisna od IRES može da bude značajno niža od ekspresije prvog gena koja zavisi od sekvence kape u bicistronskim vektorima [47]. Osim toga, ograničenje veličine rAAV vektora (uopšteno <5kb) sprečiće ugradnju velikih genskih konstrukata, kao što je TrkB receptor zajedno sa BDNF upotrebom dualnih promotora ili IRES linkera.

[0037] U skladu sa tim, u poželjnom primeru izvođenja, genetski konstrukt sadrži sekvencu spejsera smeštenu između prve i druge kodirajuće sekvence, pri čemu sekvenca spejsera kodira peptidni spejser koji je konfigurisan da bude digestiran i tako proizvede TrkB receptor i agonist kao posebne molekule. Poželjno, sekvenca spejsera sadrži i kodira virusnu peptidnu sekvencu spejsera, poželjnije virusnu 2A peptidnu sekvencu spejsera [47]. Poželjno, 2A peptidna sekvenca povezuje prvu kodirajuću sekvencu sa drugom kodirajućom sekvencom. Ovo omogućava da konstrukt prevaziđe ograničenje veličine koje se javlja kod ekspresije u raznim vektorima i omogućava da se ekspresija svih peptida kodiranih konstruktom prema ovom otkriću odvija pod kontrolom jednog promotora, kao jedan protein.

[0038] Na taj način, nakon translacije jednog proteina koji sadrži sekvence TrkB, 2A peptida, i agonista (poželjno BDNF), dolazi do isecanja u sekvenci virusnog 2A peptida na terminalnoj vezi glicin-prolin, čime se oslobađaju dva proteina, tj. TrkB i agonist (tj. mBDNF). Genetski konstrukt je dizajniran tako da preostala kratka N-terminalna aminokiselinska sekvenca virusnog 2A peptida ostaje vezana za unutarćelijski deo TrkB receptora, otklanjajući tako rizike imunogenosti i neinterferirajući sa sposobnošću unutarćelijske signalizacije zrelog receptora. Rezidualna aminokiselina prolin sa C-terminalnog kraja virusne 2A sekvence ostaje vezana za N-terminalni signalni peptid BDNF i na kraju se uklanja sa mBDNF proteina nakon isecanja signalne sekvence sa zrelog proteina.

[0039] Pronalazači su stvorili dva primera izvođenja sekvence spejsera. Značajan deo peptidne sekvence spejsera, koji je zajednički za oba primera izvođenja koja su ovde opisana, je C-terminalni kraj. Prema tome, poželjno peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.4, ili njen fragment ili varijantu, kao što sledi: QAGDVEENPGP [SEQ ID No: 4]

[0040] Poželjno, mesto digestije ili isecanja peptidne sekvence spejsera smešteno je između terminalnog glicina i krajnjeg prolina u SEQ ID No:4.

[0041] U prvom poželjnom primeru izvođenja, sekvenca spejsera sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.5, ili njen fragment ili varijantu, kao što sledi:

GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCC TGGACCT [SEQ ID No: 5]

U ovom prvom primeru izvođenja, peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.6, ili njen fragment ili varijantu, kao što sledi:

GSGATNFSLLQAGDVEENPGP [SEQ ID No: 6]

[0042] U drugom poželjnom primeru izvođenja, sekvenca spejsera sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.7, ili njen fragment ili varijantu, kao što sledi:

AGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCC TGGACCT [SEQ ID No: 7]

U ovom drugom primeru izvođenja, peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.8, ili njen fragment ili varijantu, kao što sledi: SGATNFSLLKQAGDVEENPGP [SEQ ID No: 8]

[0043] Pronalazači su pažljivo razmotrili sekvence TrkB receptora, i proizveli nekoliko poželjnih primera izvođenja receptora koji je kodiran prvom kodirajućom sekvencom u genetskom konstruktu ovog otkrića.

[0044] U jednom poželjnom primeru izvođenja, prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humanu kanonsku izoformu TrkB. Poželjno, kanonska izoforma TrkB sadrži aminokiselinsku sekvencu (822 rezidue) koja je ovde označen kao SEQ ID NO.9, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0045] Poželjno, u ovom primeru izvođenja, prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 10, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0046] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira izoformu 4 TrkB. Poželjno, izoforma 4 TrkB sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 11, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0047] Poželjno, ovaj primer izvođenja prve kodirajuće sekvence sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 12, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0048] Pronalazači su uložili ozbiljan inovativni napor pri proučavanju sekvence TrkB receptora i shvatili da TrkB sadrži pet tirozinskih rezidua (na položajima 516, 701, 705, 706 i 816 u SEQ ID No: 9), koje su normalno fosforilisane nakon dimerizacije i autofosforilacije u prisustvu BDNF dimera. Problem sa fosforilacijom ovih pet tirozinskih rezidua je to što receptor može lako da bude deaktiviran fosfatazom, kao što je fosfataza Shp-2. Prema tome, u cilju sprečavanja fosforilacije i posledične deaktivacije receptora in vivo, poželjno jedan ili više od ovih ključnih tirozina je mutiran (poželjnije, u glutaminsku kiselinu) da bi se imitirao rezultujući fosfotirozin i proizveo receptor koji ostaje aktivan u prisustvu BDNF, i koji ne može da bude deaktiviran fosfatazom, kao što je Shp-2 fosfataza. Takvi mutantni oblici TrkB namenjeni su da proizvode aktivnost TrkB receptora koji ostaje aktivan duže vremenske periode, ili dok se receptor ne internalizuje.

[0049] DNK i aminokiselinske sekvence koje su ispod date ilustruju položaje ovih pet tirozinskih (Y) rezidua koje su mutirane u pet rezidua glutaminske kiseline (E). Treba razumeti da 1, 2, 3, 4 ili 5 od ovih rezidua mogu da budu mutirane u glutaminsku kiselinu u primerima izvođenja pronalaska. Predviđene su i različite kombinacije ovih mutacija, npr. samo položaji 516 i 701, ili samo položaji 705, 706 i 816, i tako dalje.

[0050] Prema tome, u još jednom poželjnom primeru izvođenja, prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira mutantni oblik TrkB receptora, pri čemu je jedna ili više tirozinskih rezidua na položaju 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 modifikovana ili mutirana. Poželjno, najmanje dve, tri ili četiri tirozinske rezidue na položajima 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 su modifikovane. Najpoželjnije, svih pet tirozinskih rezidua na položajima 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 su modifikovane.

[0051] Poželjno, navedena ili svaka tirozinska rezidua je modifikovana u drugu aminokiselinsku reziduu, poželjnije glutaminsku kiselinu. Prema tome, poželjno mutantni oblik TrkB receptora sadrži Y516E, Y701E, Y705E, Y706E i/ili Y816E.

[0052] Poželjno, modifikovani oblik TrkB receptora sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.13, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0053] Poželjno, u ovom primeru izvođenja, prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 14, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0054] Treba razumeti da druga kodirajuća sekvenca koja kodira agonist TrkB receptora, koji je poželjno član neurotrofinske familije trofičkih faktora. Poželjni agonisti TrkB receptora mogu prema tome da budu odabrani iz grupe agonista koja se sastoji od: neurotrofnog faktora poreklom iz mozga (BDNF); faktora rasta nerva (NGF); neurotrofina-3 (NT-3); neurotrofina-4 (NT-4); i neurotrofina-5 (NT-5); ili njihovih fragmenata.

[0055] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence svakog od ovih agonista poznate su stručnjaku u ovoj oblasti. Međutim, u smislu primera, aminokiselinska sekvenca jednog primera neurotrofina-4 (NT-4) je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.49, kao što sledi:

Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline ovog primera neurotrofina-4 (NT-4) je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.50, kao što sledi:

[0056] Aminokiselinska sekvenca signalnog peptida za NT-4 sekvencu je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.51, kao što sledi:

MLPLPSCSLPILLLFLLPSVPIES [SEQ ID No: 51]

[0057] Sekvenca nukleinske kiseline ovog signalnog peptida je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.52, kao što sledi:

[0058] Aminokiselinska sekvenca propeptida za ovu NT-4 sekvencu je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.53, kao što sledi:

QPPPSTLPPFLAPEWDLLSPRVVLSRGAPAGPPLLFLLEAGAFRESAGAPANRSRR [SEQ ID No: 53]

[0059] Sekvenca nukleinske kiseline ovog propeptida je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO. 54, kao što sledi:

[0060] Aminokiselinska sekvenca zrele proteinske sekvence za ovu NT-4 sekvencu je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.55, kao što sledi:

[0061] Kodirajuća sekvenca nukleinske kiseline ovog zrelog NT-4 proteina je suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.56, kao što sledi:

[0062] Prema tome, u jedno poželjnom primeru, druga kodirajuća sekvenca kodira neurotrofin-4 (NT-4), koji može da sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO: 49 ili 55, ili njen fragment ili varijantu. Tako, druga kodirajuća sekvenca može da sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 50 ili 56, ili njen fragment ili varijantu.

[0063] Najpoželjniji agonisti TrkB receptora, međutim, uključuju prepro-neurotrofni faktor poreklom iz mozga (pre-pro-BDNF), pro-BDNF ili zreli BDNF (mBDNF). BDNF se inicijalno sintetiše kao prekursorski protein, preproBDNF, u ribozomima na endoplazmatskom retikulumu. Postoji najmanje 17 poznatih varijanti splajsovanja kodiranih humanim preproBDNF genom (ENSG00000176697). Jednom kada preproBDNF uđe u granulirani endoplazmatski retikulum, preproBDNF se pretvara u proBDNF isecanjem signalnog peptida (tj. "pre" sekvence). proBDNF se pretvara u mBDNF isecanjem dodatne N-terminalne peptidne sekvence koja je prisutna na proBDNF. I proBDNF i mBDNF se zatim izlučuju u vanćelijski prostor, gde se vezuju i aktiviraju receptore na različitim ćelijama, uključujući RGC i kohlearne ćelije.

[0064] proBDNF prvenstveno vezuje i aktivira receptor p75<NTR>, koji, kada je aktiviran indukuje apoptozu u RGC i kohlearnim ćelijama. Na taj način, u jednom poželjnom primeru, proBDNF je agonist receptora p75<NTR>. U jednom primeru, proBDNF je kanonski proBDNF. Poželjno, kanonski proBDNF sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.15, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0065] Poželjno, u ovom primeru, druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.16, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0066] U drugom primeru, proBDNF je izoforma 2 proBDNF, koja poželjno sadrži mutaciju valina u metionion (podvučena aminokiselina). Poželjno, izoforma 2 proBDNF sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 17, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0067] U jednom primeru izvođenja, međutim, agonist nije proBDNF, ili njen fragment ili varijanta, već umesto toga druga kodirajuća sekvenca poželjno sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli BDNF. Zreli BDNF (mBDNF) prvenstveno vezuje i aktivira, TrkB, koji, kada je aktiviran, podstiče preživljavanje RGC i/ili kohlearnih ćelija. Tako, zreli BDNF je najpoželjniji agonist TrkB. Prednost konstrukta prema otkriću je to što, za razliku od drugih poznatih genetskih konstrukata, ovaj konstrukt može da proizvede zreli BDNF protein, koji nije pogrešno uvijen.

[0068] Prema tome, u jednom poželjnom primeru izvođenja, druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli BDNF. mBDNF je zajednički za svih 17 izoformi kodiranih genom. Postoji 7 različitih proteinskih sekvenci, od kojih pet imaju produžene signalne sekvence u odnosu na kanonski oblik, i jedna ima kanonsku signalnu sekvencu, ali i mutaciju valina u metionin (koja je zajednička za izoforme 2, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 i 16). Smatra se da mutacija valina u metionin redukuje oslobađanje BDNF iz ćelije.

[0069] Poželjno, zreli BDNF sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.18, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0070] Poželjno, ovaj primer izvođenja druge kodirajuće sekvence sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 19, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

[0071] U još jednom poželjnom primeru izvođenja, agonist je mBDNF sa signalnim peptidom konjugovanim na njegov N-terminalni kraj. Kao što je dole diskutovano, signalni peptid može da bude kanonski signalni peptid preproBDNF, ili signalni peptid IL-2, ili nova signalna sekvenca koju su de novo kreirali pronalazači.

[0072] Poželjno, druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid za agonist TrkB receptora, najpoželjnije signalni peptid za BDNF. U jednom poželjnom primeru izvođenja, nukleotidna sekvenca kodira kanonski signalni peptid za BDNF. Poželjno, ovaj primer izvođenja druge kodirajuće sekvence sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO.20, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

MTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 20]

[0073] Poželjno, ovaj primer izvođenja druge kodirajuće sekvence sadrži nukleotidnu sekvencu koja je ovde označena kao SEQ ID NO. 21, ili njen fragment ili varijantu, kao što je ispod prikazano:

ATGACCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 21]

[0074] Pronalazači su kreirali seriju produženih signalnih peptida. U poželjnim primerima, nukleotidna sekvenca koja kodira izoformu signalnog peptida za BDNF odabrana je iz grupe koja se sastoji od: izoforme 2, 3, 6, 5 i 4. Sekvence nukleinske kiseline i aminokiselinske sekvence za svaki od ovih produženih signalnih peptida prikazane su ispod.

Izoforma 2

[0075] MFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 22]

Izoforma 3 i 6

[0076] MQSREEEWFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 24]

Izoforma 5

[0077] MLCAISLCARVRKLRSAGRCGKFHQVRRVMTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 26]

Izoforma 4

[0078]

[0079] Prema tome, u poželjnim primerima izvođenja, druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid signalne sekvence koja je ovde označena kao bilo koja od SEQ ID NO.23, 25, 27 ili 29. Poželjno, signalni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao bilo koja od SEQ ID NO.22, 24, 26 ili 28.

[0080] Pronalazači su takođe kreirali različite primere izvođenja novih signalnih peptida za agonist, poželjno BDNF. Ovi signalni peptidi povećavaju nivo baznosti N-terminalnog odeljka (sa dodatim lizinskim (K) i argininskim (R) reziduama) i narednog hidrofobnog regiona (sa dodacima leucinskih (L) rezidua), koji povećavaju izlučivanje BDNF u poređenju sa nivoima zapaženim kod kanonske signalne sekvence divljeg tipa.

a) QTA003P (IL-2 signal)

[0081]

MYRMQLLSCIALSLALVTNS [SEQ ID No: 30] ATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAAC AGT [SEQ ID No: 31]

b) QTA004P

[0082]

MKRRVMIILFLTMVISYFGCMK [SEQ ID No: 32] ATGAAAAGAAGAGTGATGATCATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTT GCATGAAGAGCG [SEQ

ID No: 33]

c) QTA009P (modifikovani IL-2)

[0083]

MRRMQLLLLIALSLALVTNS [SEQ ID No: 34] ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAAC AGT [SEQ ID No: 35]

d) QTA010P

[0084]

MRRMQLLLLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 36] ATGAGGAGGATGCAACTCCTGCTCCTGACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATG AAGGCG [SEQ ID No: 37]

e) QTA0012P

[0085]

MRILLLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 38]

ATGAGAATCCTTCTTCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 39]

f) QTA0013P

[0086]

MRRILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID No: 40] ATGAGAAGAATCCTTTTCCTTACTATGGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG

[SEQ ID No: 41]

g) QTA0014P

[0087]

MRRFLFLLVISYFGCMKA [SEQ ID No: 42] ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTGTTATTTCATACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 43]

i) QTA0015P

[0088]

MRRFLFLLYFGCMKA [SEQ ID No: 44] ATGAGGAGGTTCCTTTTCCTTCTTTACTTCGGTTGCATGAAGGCG [SEQ ID No: 45]

[0089] Slika 6 prikazuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence za sledeće poželjne primere izvođenja signalnog peptida upotrebljene u konstrukt pronalaska za povećanje sekrecije agonista, poželjno BDNF. Druga rezidua u signalnom peptidu je treonin (T) koji je poželjno zamenjen jednom ili većim brojem baznih rezidua, kao lizin (K) ili arginin (R). Sledeći niz rezidua u signalnom peptidu koji uključuje izoleucin (I), leucin (L), fenilalanin (F) i leucin (L) poželjno je zamenjen jednom ili većim brojem hidrofobnih rezidua.

[0090] U skladu sa tim, u poželjnim primerima izvođenja, druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid signalne sekvence koja je ovde označena kao bilo koja od SEQ ID NO. 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 ili 103. Poželjno, signalni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je ovde označena kao bilo koja od SEQ ID NO.30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 ili 102.

[0091] U skladu sa tim, treba razumeti da su pronalazači modifikovali sekvencu gena BDNF uklanjanjem pro-sekvence, što takođe nikada ranije nije postignuto, što za rezultat ima generisanje ispravno savijenog zrelog BDNF, kombinovano sa uvođenjem potpuno novih signalnih peptida, što značajno povećava proizvodnju i oslobađanje BDNF iznad nivoa koji su ikada ostvareni sa endogenom sekvencom.

[0092] Poželjno, genetski konstrukt sadrži sekvence levog i/ili desnog invertovanog terminalnog ponovka (ITR). Poželjno, svaki ITR se nalazi na 5’ i/ili 3’ kraju konstrukta. ITR može da bude specifičan za serotip virusa (npr. AAV ili lentivirus), i može da bude bilo koja sekvenca, sve dok formira petlju ukosnice u svojoj sekundarnoj strukturi.

[0093] DNK sekvenca jednog primera (levi ITR iz komercijalno dostupnog AAV plazmida) ITR predstavljena je ovde kao SEQ ID No: 46, kao što sledi:

[0094] DNK sekvenca drugog primera (desni ITR iz komercijalno dostupnog AAV plazmida) ITR predstavljena je ovde kao SEQ ID No: 47, kao što sledi:

[0095] Iz gore navedenog, stručnjak u ovoj oblasti će znati nukleotidnu sekvencu primera izvođenja konstrukta ovog otkrića, kao i aminokiselinsku sekvencu kodiranog transgena. Međutim, da ne bi bilo nedoumice, kodirajuća sekvenca kodon-optimizovane sekvence od 2940 bp za mišji TrkB receptor-virusni-2A peptid-mBDNF sadržan u plazmidu QTA020P (i vektor QTA020V), ovde je označen kao SEQ ID No: 107, kao što sledi:

[0096] Kodirajuća sekvenca kodon-optimizovane sekvence od 2943 bp za humani TrkB receptor-virusni-2A peptid-mBDNF sadržana u plazmidu QTA029P (i vektor QTA029V), ovde je označena kao SEQ ID No: 108, kao što sledi:

[0097] Stoga, u najpoželjnijem primeru izvođenja, konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 107 ili 108, ili njen fragment ili varijantu.

[0098] Pronalazači su kreirali niz rekombinantnih ekspresionih vektora koji sadrže konstrukt pronalaska.

[0099] Prema tome, prema drugom primeru, obezbeđen je rekombinantni vektor koji sadrži genetski konstrukt prema ovom otkriću.

[0100] Rekombinantni vektor može da bude rekombinantni AAV (rAAV) vektor. rAAV može da bude prirodni vektor ili vektor sa hibridnim AAV serotipom. rAAV može da bude AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10, i AAV-11. Poželjno, rAAV je rAAV serotipa-2.

[0101] Pogodno, rekombinantni AAV2 izaziva minimalni imunski odgovor u organizmu domaćina i posreduje u dugotrajnoj ekspresiji transgena koji može da opstane u retini najmanje godinu dana posle primene vektora.

[0102] Pojam "rekombinantni AAV (rAAV) vektor" kako se ovde koristi označava nukleinsku kiselinu poreklom od rekombinantnog AAV koja sadrži najmanje jednu sekvencu terminalnog ponovka.

[0103] Poželjni primeri vektora prikazani su na slikama 2-5.

[0104] Konstrukti i ekspresioni vektori koji su ovde opisani mogu da se koriste za lečenje poremećaja optičkog nerva i kohlearnih poremećaja, i uopštenije za podsticanje regeneracije i preživljavanja nerva.

[0105] Stoga, prema još jednom primeru, obezbeđen je genetski konstrukt, ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću, za upotrebu kao lek ili u terapiji.

[0106] Prema još jednom primeru, obezbeđen je genetski konstrukt, ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili ublažavanju poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva.

[0107] Poželjno, genetski konstrukt ili rekombinantni vektor prema pronalasku koriste se u tehnici genske terapije. Agonist kodiran konstruktom ili vektorom aktivira TrkB koji je takođe kodiran konstruktom/vektorom kako bi time podstakao preživljavanje ganglijskih ćelija retine (RGC) ili kohlearnih ćelija.

[0108] U jednom primeru izvođenja, poremećaj optičkog nerva koji se leči može da bude glaukom, ili bilo koje drugo patofiziološko stanje koje može da rezultuje gubitkom RGC, kao što je povreda glave ili lica ili vaskularni insulti, na primer, delimični ili potpuni gubitak snabdevanja krvlju očnih struktura ili regija mozga koje primaju impulse iz optičkog nerva. Osim toga, konstrukt može takođe da se koristi za podršku zamene RGC uvođenjem netransformisanih ili transformisanih matičnih ćelija u oko ili regije povezane sa vidom kod pacijenata.

[0109] U jednom primeru, kohlearni poremećaj koji se leči može da bude gubitak sluha ili gluvoća. Konstrukti i vektori ovog otkrića značajno povećavaju osetljivost kohlearnih ćelija na agoniste TrkB receptora zbog lokalizovanog povećanja i receptora TrkB i agonista receptora. Kohlearne ćelije mogu da budu vlataste ćelije ili neuronske ćelije spiralne ganglije koje šalju zvučne signale preko svojih aksona od uha do moždanog stabla. Vlataste ćelije mogu da budu unutrašnje vlataste ćelije uha ili spoljašnje vlataste ćelije uha [42, 43,44].

[0110] U drugom primeru izvođenja, konstrukti i vektori mogu da se koriste za podsticanje regeneracije nerva i/ili preživljavanje.

[0111] Treba razumeti da genetski konstrukt, ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću može da se koristi u leku, koji se može koristiti kao monoterapija (tj. upotreba genetskog konstrukta ili vektora prema ovom otkriću), za lečenje, ublažavanje, ili prevenciju poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva. Alternativno, genetski konstrukt ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću može da se koristi kao dodatak, ili u kombinaciji sa, poznatim terapijama za lečenje, ublažavanje ili prevenciju poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva.

[0112] Genetski konstrukt prema ovom otkriću ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću može se kombinovati u kompozicijama koje imaju različite oblike, zavisno, naročito, od načina na koji će se kompozicija koristiti. Prema tome, na primer, kompozicija može da bude u obliku praha, tablete, kapsule, tečnosti, masti, kreme, gela, hidrogela, aerosola, spreja, micelarnog rastvora, transdermalnog flastera, lipozomske suspenzije ili bilo kog drugog odgovarajućeg oblika koji može da bude dat osobi ili životinji kojoj je potrebno lečenje. Treba napomenuti da vehikulum za lekove prema ovom otkriću treba da bude onaj koji dobro podnosi subjekt kome se daje.

[0113] Genetski konstrukt ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću može takođe da bude uključen u uređaj sa sporim ili odloženim oslobađanjem. Takvi uređaji mogu, na primer, da se postave na, ili ispod kože, i lek može da se oslobađa nedeljama ili čak mesecima. Uređaj može da se nalazi bar u blizini mesta tretmana. Takvi uređaji mogu biti posebno korisni kada je potrebno dugotrajno lečenje genetskim konstruktom ili rekombinantnim vektorom, i koje bi obično zahtevalo čestu primenu (npr. najmanje dnevnu injekciju).

[0114] U poželjnom primeru, lekovi prema ovom otkriću mogu da se daju subjektu injekcijom u krvotok, nerv ili direktno na mesto koje zahteva lečenje. Na primer, lek može da se ubrizga bar pored retine ili uha. Injekcije mogu biti intravenozne (bolus ili infuzija) ili potkožne (bolus ili infuzija), ili intradermalne (bolus ili infuzija).

[0115] Treba razumeti da je količina genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora koja je potrebna određena njegovom biološkom aktivnošću i bioraspoloživošću, što opet zavisi od načina primene, fiziohemijskih svojstava genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora i od toga da li se koristi kao monoterapija ili u kombinovanoj terapiji. Na učestalost primene takođe će uticati poluživot cikličnog polipeptida u telu subjekta koji se leči. Optimalne doze koje treba primeniti mogu da odrede stručnjaci u ovoj oblasti, i variraće u zavisnosti od specifičnog genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora u upotrebi, jačine farmaceutske kompozicije, načina primene i uznapredovalosti poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja. Dodatni faktori, u zavisnosti od konkretnog subjekta koji se leči, rezultovaće potrebom da se prilagode doze, uključujući starost subjekta, težinu, pol, ishranu i vreme primene.

[0116] Uopšteno, dnevna doza između 0.001 µg/kg telesne težine i 10 mg/kg telesne težine, ili između 0.01 µg/kg telesne težine i 1 mg/kg telesne težine, cikličnog polipeptida prema ovom otkriću može da se koristi za lečenje, ublažavanje ili prevenciju poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja, u zavisnosti od korišćenog genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora.

[0117] Genetski konstrukt ili rekombinantni vektor može da se primenjuje pre, tokom ili nakon početka poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja. Dnevne doze se mogu davati u jednoj primeni (npr. jedna dnevna injekcija ili inhalacija nazalnog spreja). Alternativno, može da bude potrebna primena genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora dva puta ili više puta tokom dana. Kao primer, genetski konstrukt ili rekombinantni vektor može se primeni kao dve (ili više u zavisnosti od težine poremećaja optičkog nerva ili kohlearnog poremećaja koji se leči) dnevne doze od između 0.07 µg i 700 mg (tj. uz pretpostavljenu telesnu težinu od 70 kg). Pacijent koji se leči može uzeti prvu dozu nakon buđenja, a zatim drugu dozu uveče (ako je u režimu dve doze) ili nakon toga u intervalima od 3 ili 4 sata. Alternativno, uređaj za sporo oslobađanje može da se koristi za davanje pacijentu optimalnih doza genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora prema ovom otkriću bez potrebe za davanjem ponovljenih doza.

[0118] Poznati postupci, kao što su oni koje konvencionalno koristi farmaceutska industrija (npr. eksperimenti in vivo, klinička ispitivanja itd.), mogu da se koriste za formiranje specifičnih formulacija genetskog konstrukta ili rekombinantnog vektora prema ovom otkriću i preciznih terapijih režima (kao što su dnevne doze agenasa i učestalost primene). Pronalazači veruju da su prvi koji predlažu genetski konstrukt koji kodira promotor funkcionalno povezan sa kodirajućom sekvencom TrkB receptora i agonista TrkB receptora.

[0119] Prema drugom primeru, obezbeđena je farmaceutska kompozicija koja sadrži genetski konstrukt, ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću, i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

[0120] Prema drugom primeru, obezbeđen je postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema ovom otkriću, gde postupak sadrži dovođenje u kontakt genetskog konstrukta, ili rekombinantnog vektora prema ovom otkriću, sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumom.

[0121] "Subjekat" može biti kičmenjak, sisar ili domaća životinja. Stoga, kompozicije i lekovi prema ovom otkriću mogu da se koriste za lečenje bilo kog sisara, na primer stoke (npr. konja), kućnih ljubimaca ili mogu da se koriste u drugim veterinarskim primenama. Najpoželjnije, međutim, subjekat je ljudsko biće.

[0122] "Terapijski efikasna količina" genetskog konstrukta, rekombinantnog vektora ili farmaceutske kompozicije je bilo koja količina koja je, kada se daje subjektu, količina gore navedenog koja je potrebna za lečenje glaukoma, gluvoće ili za postizanje željenog dejstva, kao što je podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva.

[0123] Na primer, terapijski efikasna količina upotrebljenog genetskog konstrukta, rekombinantnog vektora ili farmaceutske kompozicije može da bude od oko 0.01 mg do oko 800 mg, i poželjno od oko 0.01 mg do oko 500 mg. Poželjno je da količina genetskog konstrukta, rekombinantnog vektora ili farmaceutske kompozicije bude količina od oko 0.1 mg do oko 250 mg, a najpoželjnije od oko 0.1 mg do oko 20 mg.

[0124] "Farmaceutski prihvatljiv vehikulum" kao što je ovde pomenuto, je bilo koje poznato jedinjenje ili kombinacija poznatih jedinjenja, za koju je stručnjacima poznato da je korisna u formulisanju farmaceutskih kompozicija.

[0125] U jednom primeru, farmaceutski prihvatljiv vehikulum može da bude čvrsta materija, a kompozicija može da bude u obliku praha ili tablete. Čvrsti farmaceutski prihvatljivi vehikulum može da sadrži jednu ili više supstanci koje takođe mogu delovati kao arome, lubrikanti, sredstva za poboljšanje rastvorljivosti, sredstva za suspendovanje, boje, punioci, glidansi, sredstva za komprimovanje, inertna veziva, zaslađivači, konzervansi, boje, premazi ili sredstva za raspadanje tableta. Vehikulum takođe može da bude materijal za inkapsuliranje. U prahovima, vehikulum je fino usitnjena čvrsta supstanca koja je u mešavini sa fino usitnjenim aktivnim sredstvima prema ovom otkriću. U tabletama, aktivno sredstvo (npr. genetski konstrukt ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću) može da se pomeša sa vehikulumom koji ima potrebna svojstva komprimovanja u odgovarajućim proporcijama i komprimuje u željenoj formi i veličini. Poželjno prahovi i tablete sadrže do 99% aktivnih sredstava. Pogodni čvrsti vehikulumi uključuju, na primer kalcijum fosfat, magnezijum stearat, talk, šećere, laktozu, dekstrin, skrob, želatin, celulozu, polivinilpirolidin, voskove sa niskom tačkom topljenja i jonoizmenjivačke smole. U drugom primeru, farmaceutski vehikulum može da bude gel, a kompozicija može da bude u obliku kreme ili slično.

[0126] Međutim, farmaceutski vehikulum može da bude tečnost, a farmaceutska kompozicija u obliku rastvora. Tečni vehikulumi se koriste za pripremu rastvora, suspenzija, emulzija, sirupa, eliksira i kompozicija pod pritiskom. Genetski konstrukt ili rekombinantni vektor prema ovom otkriću može da se rastvori ili suspenduje u farmaceutski prihvatljivom tečnom vehikulumu kao što je voda, organski rastvarač, smeša oba ili farmaceutski prihvatljiva ulja ili masti. Tečni vehikulum može da sadrži druge pogodne farmaceutske aditive, kao što su sredstva za povećanje rastvorljivosti, emulgatori, puferi, konzervansi, zaslađivači, arome, sredstva za suspendovanje, sredstva za zgušnjavanje, boje, regulatori viskoznosti, stabilizatori ili osmo-regulatori. Pogodni primeri tečnih vehikuluma za oralnu i parenteralnu primenu uključuju vodu (delimično sadrže dodatke kao gore, npr. derivate celuloze, poželjno rastvor natrijum karboksimetil celuloze), alkohole (uključujući monohidrične alkohole i polihidrične alkohole, npr. glikole) i njihove derivate, i ulja (npr. frakcionisano kokosovo ulje i ulje kikirikija). Za parenteralnu primenu, vehikulum takođe može biti uljni estar kao što su etil oleat i izopropil miristat. Sterilni tečni vehikulumi su korisni u sterilnim tečnim kompozicijama za parenteralnu primenu. Tečni vehikulum za kompozicije pod pritiskom može biti halogenovani ugljovodonik ili drugi farmaceutski prihvatljiv propelant.

[0127] Tečne farmaceutske kompozicije, koje su sterilni rastvori ili suspenzije, mogu da se koriste, na primer, intramuskularnim, intratekalnim, epiduralnim, intraperitonealnim, intravenoznim ili posebno potkožnim ubrizgavanjem. Genetski konstrukt ili rekombinantni vektor može da se pripremi kao sterilna čvrsta kompozicija koja se može rastvoriti ili suspendovati u vreme primene koristeći sterilnu vodu, fiziološki rastvor ili drugi odgovarajući sterilni medijum za injekcije.

[0128] Genetski konstrukt, rekombinantni vektor i farmaceutska kompozicija ovog otkrića mogu se primenjivati oralno u obliku sterilnog rastvora ili suspenzije koja sadrži druge rastvore ili sredstva za suspendovanje (na primer, dovoljno fiziološkog rastvora ili glukoze da rastvor bude izotoničan), žučne soli, akaciju, želatin, sorbitan monoleat, polisorbat 80 (oleatni estri sorbitola i njegovi anhidridi kopolimerizovani sa etilen oksidom) i slično. Genetski konstrukt, rekombinantni vektor ili farmaceutska kompozicija prema ovom otkriću mogu takođe da se primene oralno u obliku tečne ili čvrste kompozicije. Kompozicije pogodne za oralnu primenu uključuju čvrste oblike, kao što su pilule, kapsule, granule, tablete i prahovi, i tečne oblike, kao što su rastvori, sirupi, eliksiri, i suspenzije. Oblici korisni za parenteralnu primenu uključuju sterilne rastvore, emulzije i suspenzije.

[0129] Treba razumeti da ovo otkriće obuhvata bilo koju nukleinsku kiselinu ili peptid ili varijantu, njen derivat ili analog, koji suštinski sadrži aminokiselinsku sekvencu ili sekvencu nukleinske kiseline bilo koje od ovde navedenih sekvenci, uključujući njene varijante ili fragmente. Pojmovi "suštinski aminokiselinska/nukleotidna/peptidna sekvenca", "varijanta" i "fragment", mogu da označavaju sekvencu koja ima najmanje 40% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom/ nukleotidnom/peptidnom sekvencom bilo koje od ovde navedenih sekvenci, na primer 40% identičnosti sekvence sa sekvencom identifikovanom kao SEQ ID No: 1-108, itd.

[0130] Aminokiselinske/polinukleotidne/polipeptidne sekvence sa identičnošću sekvence koja je veća od 65%, poželjnije veća od 70%, čak poželjnije veća od 75%, i još poželjnije veća od 80% identičnosti sekvence sa bilo kojom od navedenih sekvenci su takođe obuhvaćene. Poželjno, aminokiselinska/polinukleotidna/polipeptidna sekvenca ima najmanje 85% identičnosti sa bilo kojom od navedenih sekvenci, poželjnije najmanje 90% identičnosti, čak poželjnije najmanje 92% identičnosti, čak poželjnije najmanje 95% identičnosti, i još poželjnije najmanje 97% identičnosti, čak još poželjnije najmanje 98% identičnosti i, najpoželjnije najmanje 99% identičnosti sa bilo kojom od ovde navedenih sekvenci.

[0131] Iskusan tehničar u ovoj oblasti će znati kako da izračuna procentualnu identičnost između dve aminokiselinske/polinukleotidne/polipeptidne sekvence. Da bi se izračunala procentualna identičnost između dve aminokiselinske/polinukleotidne/polipeptidne sekvence, prvo treba da se pripremi poravnanje dve sekvence, nakon čega sledi izračunavanje vrednosti identičnosti sekvenci. Procenat identičnosti za dve sekvence može imati različite vrednosti u zavisnosti od:-(i) metode koja se koristi za poravnavanje sekvenci, za primer, ClustalW, BLAST, FASTA, Smith-Waterman (implementirano u različitim programima), ili strukturno poravnanje iz 3D poređenja; i (ii) parametara koji se koriste metodom poravnanja, na primer, lokalno nasuprot globalnom poravnanju, upotrebljena matrica uparenih rezultata (npr. BLOSUM62, PAM250, Gonnet itd.), i penali za prazninu, npr. funkcionalni oblik i konstante.

[0132] Nakon poravnanja, postoji mnogo različitih načina izračunavanja procentualne identičnosti između dve sekvence. Za primer, broj identičnosti se može podeliti sa: (i) dužinom najkraće sekvence; (ii) dužinom poravnanja; (iii) srednjom dužinom sekvence; (iv) brojem položaja bez praznina; ili (iv) brojem ekvivalentnih položaja isključujući prepuste. Osim toga, treba napomenuti da procentualna identičnost takođe veoma zavisi od dužine. Prema tome, što je par sekvenci kraći, može se očekivati veća verovatnoća da će se identičnost sekvenci slučajno pojaviti.

[0133] Zbog toga, treba shvatiti da je tačno poravnanje proteina ili DNK sekvenci složen proces. Popularni program za višestruko poravnanje ClustalW (Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22,4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882) je poželjan način za generisanje višestrukih poravnanja proteina ili DNK u skladu sa ovim otkrićem. Odgovarajući parametri za ClustalW mogu da budu kao što sledi: Za poravnanje DNK: Penal za prazninu = 15.0, Penal za dužinu praznine = 6.66, i Matrica = Identity. Za poravnanje proteina: Penal za prazninu = 10.0, Penal za dužinu praznine = 0.2, i Matrica = Gonnet. Za poravnanje DNK i proteina: ENDGAP = -1, i GAPDIST = 4. Stručnjaci u ovoj oblasti će biti svesni da postoji mogućnost da za optimalno poravnanje sekvenci bude potrebno promeniti ove i druge parametre.

[0134] Poželjno, izračunavanje procentualnih identičnosti između dve aminokiselinske /polinukleotidne/polipeptidne sekvence može se zatim obaviti iz takvog poravnanja kao (N/T)*100, gde je N broj položaja na kojima sekvence dele identičnu reziduu, a T je ukupan broj upoređenih položaja, uključujući praznine, ali isključujući prepuste. Stoga, najpoželjniji postupak za izračunavanje procentualne identičnosti između dve sekvence sadrži (i) pripremu poravnanja sekvenca pomoću programa ClustalW koristeći odgovarajući skup parametara, na primer, kako je gore navedeno; i (ii) umetanje vrednosti N i T u sledeću formulu: -Identičnost sekvenci = (N/T)*100.

[0135] Alternativni postupci za identifikaciju sličnih sekvenci biće poznati stručnjacima. Na primer, suštinski slična nukleotidna sekvenca biće kodirana sekvencom koja hibridizuje sa DNK sekvencama ili njihovim komplementima pod strogim uslovima. Pod strogim uslovima podrazumeva se nukleotid koji hibridizuje sa DNK ili RNK vezanom za filter u rastvoru 3x natrijum hlorid/natrijum citrat (SSC) na približno 45 °C, nakon čega sledi najmanje jedno ispiranje u 0.2x SSC/0.1% SDS na približno 20-65 °C. Alternativno, suštinski sličan polipeptid može se razlikovati za najmanje 1, ali manje od 5, 10, 20, 50 ili 100 aminokiselina od sekvenci prikazanih u, na primer, SEQ ID No: 3 i 5.

[0136] Zbog degeneracije genetskog koda, jasno je da bi bilo koja sekvenca nukleinske kiseline opisana ovde mogla biti varirana ili promenjena bez suštinskog uticaja na sekvencu proteina koji je njom kodiran, kako bi se obezbedila njena funkcionalna varijanta. Pogodne varijante nukleotida su one koje imaju sekvencu izmenjenu supstitucijom različitih kodona koji kodiraju istu aminokiselinu u sekvenci, proizvodeći tako tihu promenu. Druge pogodne varijante su one sa homolognim nukleotidnim sekvencama, ali koje sadrže sve ili delove sekvence, koji su izmenjeni supstitucijom različitih kodona koji kodiraju aminokiselinu sa bočnim lancem sličnih biofizičkih svojstava aminokiselini koju zamenjuju, da bi se proizvela konzervativna promena. Na primer, male nepolarne, hidrofobne aminokiseline uključuju glicin, alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, i metionin. Velike nepolarne, hidrofobne aminokiseline uključuju fenilalanin, triptofan i tirozin. Polarno neutralne aminokiseline uključuju serin, treonin, cistein, asparagin i glutamin. Pozitivno naelektrisane (bazne) aminokiseline uključuju lizin, arginin i histidin. Negativno naelektrisane (kisele) aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu. Biće prema tome jasno koje aminokiseline mogu da budu zamenjene aminokiselinom koja ima slična biofizička svojstva, a iskusan tehničar će znati nukleotidne sekvence koje kodiraju ove aminokiseline.

[0137] Prema drugom primeru, obezbeđen je genetski konstrukt koji sadrži promotor koji je funkcionalno povezan sa prvom kodirajućom sekvencom, koja kodira receptorsku tirozin kinazu B (TrkB), i drugom kodirajućom sekvencom, koja kodira agonist receptora TrkB za aktiviranje TrkB, da bi se na taj način podstaklo preživljavanje ganglijskih ćelija retine (RGC), nervnih ćelija ili kohlearnih ćelija.

[0138] Sve karakteristike koje su ovde opisane (uključujući sve prateće zahteve, apstrakt i crteže), i/ili svi koraci bilo kog postupka ili procesa koji su tako obelodanjeni, mogu da se kombinuju sa bilo kojim od gore navedenih aspekata u bilo kojoj kombinaciji, osim kombinacija u kojima se bar neke od ovih karakteristika i/ili koraka međusobno isključuju.

[0139] Radi boljeg razumevanja pronalaska, i da bi se pokazalo kako primeri izvođenja istog mogu da se realizuju, sada će se, kao primer, pozvati na priložene slike, na kojima:

Slika 1 je šematski prikaz jednog primera izvođenja genetskog konstrukta prema pronalasku;

Slika 2 je šematski crtež prvog primera izvođenja rekombinantnog vektora prema pronalasku poznatog kao "Plazmid QTA001PA" koji sadrži kanonsku signalnu sekvencu (plavo) plus proBDNF (crveno) i mBDNF (crno). Takođe uključuje -IRES-GFP-sekvencu (cijan i ljubičasta);

Slika 3 je šematski crtež drugog primera izvođenja rekombinantnog vektora prema pronalasku poznatog kao "Plazmid QTA002P" bez proBDNF (proizvodi samo mBDNF) i sa istom signalnom sekvencom (plava) kao QTA001PA. Takođe uključuje -IRES-GFP-sekvencu (cijan i ljubičasta);

Slika 4 je šematski crtež trećeg primera izvođenja rekombinantnog vektora prema pronalasku poznatog kao "Plazmid QTA003P" bez proBDNF (proizvodi samo mBDNF) i sa IL-2 signalnom sekvencom (plavo). Takođe uključuje -IRES-GFP- sekvencu (cijan i ljubičasta);

Slika 5 je šematski crtež četvrtog primera izvođenja rekombinantnog vektora prema pronalasku poznatog kao "Plazmid QTA004P" bez proBDNF (proizvodi samo mBDNF) i sa novom signalnom sekvencom (plava). Takođe uključuje -IRES-GFP- sekvencu (cijan i ljubičasta);

Slika 6 prikazuje nukleotidne i aminokiselinske sekvence za različite primere izvođenja signalnog peptida koji se koriste u konstruktu pronalaska. Druga rezidua je treonin (t) koji se može zameniti jednim ili većim brojem baznih rezidua, kao što su lizin (K) ili arginin (R). Sledeći niz rezidua, uključujući izoleucin (I), leucin (L), fenilalanin (F) i leucin (L), može da se zameni jednom ili većim brojem hidrofobnih rezidua;

Slika 7 prikazuje oslobađanje BDNF iz ćelija HEK293 korišćenjem specifičnog ELISA testa 24 sata nakon transdukcije plazmida (4 µg DNK/bunarčiću) koji sadrži gene koji kodiraju mBDNF sa različitim peptidnim signalnim sekvencama i bez kodirajuće sekvence za produženu komponentu proBDNF (Podaci prikazani kao srednja vrednost ± SEM za n = 4);

Slika 8 prikazuje rezultate testa Western blotting za ćelijske koncentracije BDNF-imunoreaktivnog materijala (proizvoljne jedinice) u HEK293 ćelijskim lizatima 24 sata nakon transdukcije plazmida (Podaci prikazani kao srednja vrednost ± SEM za n = 4); Slika 9 prikazuje BDNF-imunoreaktivnost u Western blotovima ćelijskih lizata koji pokazuju dve trake molekulske težine (32kDa i 14kDa) kada su ćelije transdukovane sa QTA001PA, naspram samo jedne trake od 14kDa kod transdukcije sa QTA002P, QTA003P i QTA004P;

Slika 10 prikazuje koncentracije proBDNF u inkubacionom medijumu HEK293 izmerene korišćenjem specifičnog ELISA testa 24 sata nakon transdukcije plazmida korišćenjem selektivnog ELISA testa za proBDNF (Podaci prikazani kao srednja vrednost ± SEM za n = 4);

Slika 11 prikazuje ekspresiju BDNF u ćelijskom lizatu HEK293 pomoću plazmida QTA002P (endogena kanonska sekvenca signalnog peptida), i QTA009P do QTA013P. Podaci su prikazani kao srednja vrednost S.E.M. ** P <0.01 u poređenju sa QTA002P;

Slika 12 prikazuje ekspresiju BDNF u medijumu za inkubaciju ćelija HEK293 pomoću plazmida QTA002P (endogena kanonska sekvenca signalnog peptida), i QTA009P do QTA013P. Podaci su prikazani kao srednja vrednost S.E.M. ** P <0.01 u poređenju sa QTA002P;

Slika 13 prikazuje Western blotove iz ćelija HEK29324 sata nakon što su transdukovane plazmidima QTA012P (koji eksprimira BDNF i eGFP odvojene IRES spejserom), QTA021P (koji eksprimira BDNF praćen sa eGFP, odvojene funkcionalnom virusnim-2A peptidnom sekvencom), QTA022P (koji eksprimira BDNF praćen sa eGFP, odvojene nefunkcionalnom virusnom-2A peptidnom sekvencom) i QTA023P (eksprimira eGFP praćen kodirajućom sekvencom za BDNF, odvojene funkcionalnom virusnom-2A peptidnom sekvencom). Podaci su prikazani kao BDNF-imunoreaktivnost (A), eGFP-imunoreaktivnost (B) i količina BDNF oslobođena iz ćelija HEK293 u medijum za inkubaciju (C). Podaci su prikazani kao srednja vrednost S.E.M gustine u trakama; Slika 14A prikazuje Western blot homogenata ćelija HEK293 48 sati nakon transfekcije vektorom QTA020V i prikazuje efikasnu obradu velikog kodirajućeg regiona prekursora koji uključuje TrkB receptor i BDNF odvojene virusnom-2A peptidnom sekvencom.

Slike 14B i 14C pokazuju da su proteini transgena proizvedeni nakon cepanja virusnog-2A peptida transportovani u ispravne unutarćelijske odeljke u ćelijama HEK293 nakon obrade (TrkB receptori na ćelijsku površinu, a BDNF u vezikule za skladištenje pre oslobađanja);

Slika 15A prikazuje ekspresiju TrkB receptora i Slika 15B prikazuje ekspresiju BDNF u homogenatu retine miša za vektor rAAV2, QTA020V. Podaci su prikazani kao srednja vrednost S.E.M gustine u Western blotu homogenata retine miša. ** P <0.01 u poređenju sa naivnim (neinjektiranim životinjama);

Slika 16 prikazuje ekspresiju transgena TrkB (A) i BDNF (B) u sloju ganglijskih ćelija retine miša, kako je prikazano imunocitohemijom nakon injekcije QTA020V, vektora rAAV2 koji sadrži kodirajuće sekvence za TrkB receptor i BDNF, odvojene virusnom-2A peptidnom sekvencom; i

Slika 17 prikazuje preživljavanje ganglijskih ćelija retine (RGC) nakon nagnječenja optičkog nerva (ONC) kod miša u odnosu na kontrolne životinje tretirane vektorom rAAV2-CAG-eGFP. Podaci su prikazani kao srednja vrednost S.E.M. za prosečan broj ganglijskih ćelija retine u celoj retini po životinji prema Brn3A-pozitivnim ćelijama u retinalnim preparatima. *** P <0.001,*P <0.05 u poređenju sa kontrolama.

Primeri

Postupci i materijali

Molekularno kloniranje i plazmidni konstrukti

[0140] Optimizacija kodona DNK sekvenci urađena je upotrebom alata dostupnog na internetu (http://www.idtdna.com/CodonOpt) i blokovi DNK su sintetisani u Integrated DNA technologies, Inc. (IDT; 9180 N. McCormick Boulevard, Skokie, IL 60076-2920, SAD) ili GenScript (860 Centennial Ave, Piscataway, NJ 08854, SAD). Kloniranje za pravljenje master plazmida QTA001PA i narednih plazmida sprovedeno je upotrebom standardnih tehnika molekularne biologije i kloniranja.

Povećanje obima proizvodnje i prečišćavanje plazmida

[0141] Povećanje obima proizvodnje DNK plazmida obavljeno je u SURE kompetentnim ćelijama (Agilent Technologies; kat. br.200238) preko noći da bi se dobilo 2.29 µg/µl plazmida nakon prečišćavanja upotrebom kompleta „maxi-prep“. Proizvodnja ostalih plazmida povećana je do obima od 500 µg i kvaliteta transdukcije sa minimalnim prisustvom endotoksina.

Kultura HEK293 i ćelijska transdukcija plazmidnom DNK

[0142] Ćelije HEK293 (400 000 ćelija) gajene su u pločama sa 6 bunarčića obloženim poli-L-lizinom (10 ug/mL, Sigma-Aldrich; kat. br. P1274) u 1.5 mL Dulbeccovog minimalnog esencijalnog medijuma (DMEM) koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS), 1% penicilina i 1% streptomicina (1% pen/strep) dol 80% konfluentnosti. Medijum je zatim zamenjen sa 2 mL DMEM (bez dodataka). Dva do tri sata kasnije, u svaki bunarčić je dodato još 0.5 ml transfekcionog medijuma koji sadrži 4 µg plazmidne DNK i 10 µL lipofektamina (4 µL/mL; Thermo Fisher Scientific; kat. br. 12566014) što je rezultovalo ukupnom zapreminom od 2.5ml tokom perioda transfekcije i za sakupljanje supernatanta.

Merenje BDNF pomoću ELISA testa

[0143] Količina BDNF koju izlučuju ćelije HEK293 merena je u medijumu ćelijske kulture 24 sata posle transfekcije. Medijum je centrifugiran kako bi se uklonio debris, i izmeren pomoću komercijalnog kompleta Human BDNF ELISA kit (Sigma-Aldrich, proizvod br. RAB0026). Koncentracija BDNF je određena poređenjem uzoraka sa sveže napravljenim standardima BDNF.

Western blotting za BDNF i receptore TrkB

[0144] Količina BDNF i TrkB-imunoreaktivnosti u ćelijama HEK293 merena je uklanjanjem inkubacionog medijuma DMEM, pranjem ćelija u hladnom fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru i dodavanjem 350 µL sveže pripremljenog pufera za lizu u bunarčiće (10 ml Lysis-M reagensa 1 tableta kompletnog mini koktela inhibitora proteaze, Roche; kat. br.04719964001, 100 µl koktela inhibitora fosfataze Halt (100X), Thermo Scientific; kat. br. 78428). Posle homogenizacije ćelija, suspenzija proteina kvantifikovana je upotrebom testa BCA (komplet za ispitivanje proteina Pierce BCA, Thermo Scientific; kat. br. 23227). Između 6 µg i 15 µg proteina ćelijskog lizata HEK293/traci analizirano je na Bis-Tris gelu (12% NuPAGE Novex; kat. br. NP0342BOX, Thermo Scientific) i ispitano Western blottingom upotrebom primarnih zečjih poliklonskih anti-BDNF antitela (Santa Cruz Biotechnology Inc; proizvod br. sc-546; u razblaženju od 1:500), zečjih poliklonskih anti-TrkB antitela (Abcam; kat. br. ab33655, upotrebljenih u razblaženju 1:2000) ili anti-eGFP antitela (Abcam proizvod br. ab-290 upotrebljenih u razblaženju 1:500) koja su inkubirana preko noći. Primarna antitela su vizualizovana pomoću HRP-konjugovanih anti-zečjih antitela (Vector Laboratories; kat. br. PI-1000, pri 1:8000) i detekcije signala pomoću ECL Prime (Amersham, GE Healthcare, UK) i sistema za snimanje Alliance Western blot imaging system (UVItec Ltd, Cambridge, UK). Za Western blotove retine miša, oči životinja tretiranih vektorom su homogenizovane u 500 µL sveže pripremljenog pufera za lizu (10 ml Lysis-M reagensa 1 tableta kompletnog mini koktela inhibitora proteaze, Roche proizvod br. 04719964001 100 µl koktela inhibitora fosfataze Halt (100X), Thermo Scientific proizvod br. 78428). Tkivo je razgrađivano 1 minut (Qiagen, TissueRuptor proizvod br. 9001273), a zatim držano na ledu dodatnih 15 minuta. Protein je analiziran Western blottingom kao što je gore opisano.

Imunocitohemija

[0145] Ćelije HEK293 (70 000) su zasejane na pokrovna stakla od 13 mm obložena poli-L-lizinom u pločama sa 4 bunarčića i inkubirana u DMEM koji sadrži 10% FBS i 1% pen/strep u 0.5 ml medijuma. Kada su ćelije dostigle 80% konfluentnosti, medijum je izmenjen sa 0.4 ml DMEM (bez dodataka) tokom 2-3 sata, a zatim je dodat još 0.1 mL transfekcionog medijuma (0.8 µg plazmidne DNK 2 µl lipofektamina) tako da je finalna zapremina dostigla 0.5 ml. Pokrovna stakla su dva puta oprana PBS-om i fiksirana 30 min u 4% paraformaldehidu u 1M fosfatno puferisanom fiziološkom rastvoru (PBS) na sobnoj temperaturi. Posle još tri pranja u PBS-u, ćelije su blokirane i permeabilizovane inkubacijom u 5% normalnom kozjem serumu (NGS), 3% goveđem serumskom albuminu (BSA) i 0.3% Triton X-100 u PBS 60 minuta na sobnoj temperaturi. Ćelije su zatim inkubirane preko noći na 4°C sa komercijalnim zečjim poliklonskim antitelima za BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc; proizvod br. sc-546; u razblaženju od 1:300) ili TrkB (Abcam proizvod br. ab33655, razblaženim 1:500) razblaženim u rastvoru za blokiranje. Bojenje je vizualizovano upotrebom sekundarnih anti-zečjih antitela konjugovanih sa alexa fluor 647 (Invitrogen, proizvod br. A21248 pri 1:1000) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nukleusi ćelija su kontrastno obojeni pomoću 1 µg/ml DAPI (Thermo Scientific, proizvod br. D1306 pri 1:8000). Ćelije su dodatno oprane tri puta pre obrade reagensom fluorSave™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, SAD) pre snimanja. Snimanje je obavljeno upotrebom objektiva 20X i epifluorescentnog mikroskopa Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemačka) ili konfokalnog mikroskopa Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Nemačka) opremljenog uljanim objektivom 63X upotrebom digitalnog zuma 3X i intervala z-koraka sekvencijalnog skeniranja od 0.5-0.8.

[0146] Za imunocitohemiju retinalnih struktura životinja tretiranih kontrolom ili vektorom, pažljivo disekovane oči fiksirane su u 4% paraformaldehidu/0.1% PBS (pH 7.4) preko noći i dehidratisane u 30% saharozi/0.1% PBS na 4°C (24 sata). Oči su zatim uronjene u silikonske kalupe koji sadrže smešu za optimalnu temperaturu sečenja (OCT) (Sakura Finetek, Zoeterwoude, Netherlands) i zamrznute na suvom ledu. Isečci od 13 µm kroz dorzalnoventralnu/superiorno-inferiornu osu retine sakupljeni su na superfrost plus predmetnim staklima (VWR proizvod br.631-0108), upotrebom kriostata Bright OTF 5000 (Bright Instruments, Huntingdon, UK). Predmetna stakla su oprana tri puta u PBS-u, i permeabilizovana u 5% normalnom kozjem serumu (NGS), 3% goveđem serumskom albuminu (BSA) i 0.3% Triton X-100 u PBS-u tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. Predmetna stakla su zatim inkubirana preko noći na 4°C sa komercijalnim zečjim poliklonskim antitelima za BDNF (Santa Cruz Biotechnology Inc; proizvod br. sc-546; 1:300) ili TrkB (Abcam proizvod br. ab33655, 1:500) razblaženim u rastvoru za blokiranje. Bojenje je vizualizovano upotrebom sekundarnih antizečjih antitela konjugovanih sa alexa fluor 647 (Invitrogen, proizvod br. A21248 pri 1:1000) tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Nukleusi ćelija su kontrastno obojeni pomoću 1 µg/ml DAPI (Thermo Scientific, proizvod br. D1306 pri 1:8000). Predmetna stakla su dodatno oprana tri puta pre obrade reagensom fluorSave™ (Calbiochem/EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, SAD) pre snimanja. Snimanje je obavljeno upotrebom objektiva 20X i epifluorescentnog mikroskopa Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) ili konfokalnog mikroskopa Leica SP5 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany) opremljenog uljanim objektivom 63X upotrebom digitalnog zuma 3X i intervala z-koraka sekvencijalnog skeniranja od 0.5-0.8.

Intravitrealne injekcije

[0147] Nakon perioda aklimatizacije od 7-10 dana, miševi su nasumično raspoređeni u različite grupe za ispitivanje. Zatim su anestezirani intraperitonealnom injekcijom ketamina (50 mg/kg) i ksilazina (5 g/kg). Kapi za oči sa 1% tetrakaina primenjene su topikalno 1. dana studije. Proširenje zenica postignuto je upotrebom kapi za oči sa 1% tropikamida. Korišćenjem operativnog mikroskopa, pomoću igle veličine 30, napravljen je otvor u beonjači koji ne prolazi celom debljinom, kako bi se olakšalo prodiranje fine metalne mikropipete prečnika 30 µm i dužine vrha od 2.5 mm kroz donje slojeve beonjače, sudovnjače i retine. Mikropipeta je zatim povezana sa staklenim špricem od 10 µl (Hamilton Co., Reno, NV) pre usisavanja 2 µl suspenzije vektora u pipetu u zavisnosti od grupe. Procedura je sprovedena pazeći da se izbegne prodor u sočivo ili oštećenje vortikoznih vena tokom intravitrealne injekcije. Mesto ubrizgavanja predviđeno je približno 3 mm posteriorno od supero-temporalnog limbusa. Injekcije su davane polako tokom 1 minuta kako bi se omogućila difuzija suspenzije vektora. Desno oko je ostalo netaknuto i služilo je kao unutrašnja kontralateralna kontrola.

Nagnječenje optičkog nerva (ONC)

[0148] Tri nedelje (21 dan) nakon primene vektora, miševi su podvrgnuti ONC proceduri, ostavljeni netretirani ili lažno tretirani. Pod binokularnim operativnim mikroskopom napravljen je mali rez makazama sa oprugom u vežnjači, koji počinje ispod očne jabučice i temporalno oko oka. Ovo je otkrilo zadnju stranu jabučice, omogućavajući vizualizaciju optičkog nerva. Izloženi optički nerv zahvaćen je otprilike 1-3 mm od jabučice krstastim forcepsom (Dumont #N7 kat. br. RS-5027; Roboz) tokom 10 s, uz pritiskanje nerva isključivo delovanjem samozatezanja. Nakon 10 s optički nerv je oslobođen, klešta su uklonjena i oko je rotacijom vraćeno na svoje mesto. Posle 7 dana nakon izvođenja ONC, životinje su selektivno žrtvovane. Oba oka iz svake grupe su fiksirana stavljanjem organa u rastvor 4% paraformaldehid/0.1% PBS (pH 7,4) preko noći. Retinalni preparati na predmetnom staklu su zatim pripremljeni nakon disekcije posteriorne strukture oka od rožnjače i uklanjanja sočiva. Retinalni preparati na predmetnom staklu su fiksirani 30 minuta u rastvoru 4% paraformaldehid/0.1% PBS i isprani u 0.5% Tritona X-100 u PBS-u. Retine su zamrznute na -80 °C 10 minuta za permeaciju nukleusne membrane i poboljšanje prodiranja antitela pre blokiranja u 10% normalnom magarećem serumu (NDS), 2% goveđem serumskom albuminu (BSA) i 2% Triton X-100 u PBS-u tokom 60 minuta na sobnoj temperaturi. RGC su kontrastno obojene antitelima protiv Brn3A (1:200 Santa Cruz, #sc-31984) i vizualizovane pod fluorescentnom mikroskopom pomoću objektiva 20X i epifluorescentnog mikroskopa Leica DM6000 (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Snimci veće rezolucije su dobijeni korišćenjem konfokalnog mikroskopa Leica SP5 (Leica Microsystems) opremljenog uljnim objektivom 40X upotrebom digitalnog zuma od 1.5X i intervala z-koraka uzastopnog skeniranja od 0.5-0.8. Broj ćelija RGC je meren pomoću ImageJ upotrebom instrumenta zasnovanog na snimcima za brojanje količine jedara (ITCN), i izražen kao gustina RGC/mm<2>.

Konstrukti i vektori

[0149] Pronalazači su napravili genetski konstrukt, kao što je prikazano na slici 1, koji može da se koristi za lečenje subjekta pogođenog patologijom optičkog nerva, kao što je glaukom, ili kohlearnom patologijom, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva. Konstrukt je konstruisan tako da održava ili povećava gustinu receptora TrkB na površini ćelija RGC i održava ili povećava prenos signala putem receptora TrkB istovremenom proizvodnjom i lokalnim oslobađanjem mBDNF.

[0150] Konstrukt sadrži transgene koji kodiraju receptor TrkB i njegov agonist, zreli neurotrofilni faktor poreklom iz mozga. Ovi transgeni su funkcionalno vezani za jedan promotor, koji je bilo promotor humanog sinapsina I (SYN I) ili CAG promotor. Pogodno, konstrukt sa slike 1 može da se smesti u vektor rAAV2 vektor, a da ga ne ometa veličina transgena koje kodira. Ovo je posledica toga što je konstrukt orjentisan tako da je prvi transgen, TrkB, vezan za sekvencu virusnog 2A peptida praćenu signalnim peptidom BDNF, a zatim zrelim proteinom. Ovakva orjentacija takođe svodi na najmanju meru imunogene rizike jer kratka N-terminalna aminokiselinska sekvenca virusnog 2A peptida ostaje vezana za unutarćelijski deo receptora TrkB i rezidualna aminokiselina prolin sa C-terminalne virusne 2A sekvence ostaje vezana za N-terminalni BDNF signalni peptid i na kraju se, nakon isecanja, uklanja sa zrelog mBDNF proteina. Vektor može da bude smešten u farmakološki prihvatljiv puferisani rastvor, koji može da se da subjektu.

[0151] Slike 2-5 prikazuju različite primere izvođenja ekspresionih vektora. Slika 2 prikazuje vektor poznat kao "Plazmid QTA001PA" koji sadrži kanonsku signalnu sekvencu (plavo) (tj. MTILFLTMVISYFGCMKA [SEQ ID NO:20]) i proBDNF (crveno) i mBDNF (crno). Slika 3 prikazuje vektor poznat kao "Plazmid QTA002P". On ne kodira proBDNF već proizvodi samo mBDNF, i kodira istu signalnu sekvencu (plavo) kao QTA001PA. Slika 4 prikazuje vektor poznat kao "Plazmid QTA003P" koji takođe ne kodira proBDNF već proizvodi samo mBDNF. Umesto kanonske signalne sekvence za mBDNF, on sadrži signalnu sekvencu IL-2 (plavo). Najzad, slika 5 prikazuje vektor poznat kao "Plazmid QTA004P". On ne kodira proBDNF, već proizvodi samo mBDNF. On takođe kodira novu signalnu sekvencu (plavo), [SEQ ID NO: 32].

[0152] Pronalazači su proizveli i ispitali konstrukt i vektor povezane sa konceptom genske terapije za glaukom polazeći od elementa zrelog BDNF (mBDNF). Oni su jasno pokazali proizvodnju i oslobađanje mBDNF iz ćelija HEK293 nakon lipofektaminske transdukcije plazmidom koji sadrži sekvencu BDNF bez kodirajućeg regiona za proBDNF (QTA002P, videti sliku 3) (videti sliku 7). mBDNF koji se oslobađa iz ćelija je predviđeni monomer od 14kDa (mereno upotrebom Western blottinga i komercijalno dostupnog antitela za BDNF) i nema dokaza za agregate proteina, kako je izvestilo nekoliko grupa istraživača koji su pokušali da generišu komercijalne količine mBDNF upotrebom kvasca i drugih pristupa proizvodnje zasnovanih na ćelijama<1>. mBDNF se prema tome oslobađa u obliku koji može da obezbedi da molekuli proteina formiraju nekovalentne dimere u cilju aktivacije receptora TrkB.

[0153] Upotrebom ELISA testa za BDNF (na osnovu koga se ne mogu razlikovati mBDNF i veći produženi protein proBDNF), pronalazači su takođe pokazali da je moguće zameniti DNK sekvencu koja kodira endogenu kanonsku sekvencu signalnog peptida od 18 aminokiselina (MTILFLTMVISYFGCMKA) novom peptidnom sekvencom (QTA004P – videti sliku 5) i osloboditi ekvivalentne nivoe BDNF u inkubacioni medijum HEK293 nakon lipofektaminske transdukcije ćelija plazmidima koji sadrže gen za BDNF (videti sliku 7).

[0154] Supstitucija endogenog signalnog peptida sekvencom koja kodira signalni peptid interleukina-2 (QTA003P - videti sliku 4) bila je manje efikasna u oslobađanju BDNF iz medijuma. Nivoi BDNF oslobođeni u medijum su trenutno oko 1 – 2 nM i koncentracije ovog agonista su dovoljne da maksimalno aktiviraju specifične receptore TrkB (IC50 od oko 0.9 nM). Nivoi oslobađanja BDNF su približno 35 puta veći (876 ± 87 ng/mL BDNF) sa plazmidom QTA001PA (videti sliku 2) koji sadrži kombinovane sekvence proBDNF i mBDNF i koji takođe uključuje kanonski signalni peptid od 18 aminokiselina u poređenju sa plazmidima QTA002P (videti sliku 3) i QTA004P (videti sliku 5).

[0155] Merenja BDNF preostalog u ćeliji kvantitativnim Western blottingom 24 sata posle lipofektaminske plazmidne transdukcije otkrila su niže preostale koncentracije BDNF sa QTA001PA od onih sa QTA002P i QTA004P (videti sliku 8).

[0156] Osim toga, oko polovine imunoreaktivnosti BDNF u lizatima ćelija transdukovanih pomoću QTA001PA bilo je u obliku proBDNF (traka molekulske težine na 32kDa), dok je traka proBDNF bila odsutna u lizatima ćelija transdukovanih pomoću QTA002P, QTA003P i QTA004P (videti sliku 9), verovatno zato što ti plazmidi ne sadrže produženu kodirajuću sekvencu za proBDNF.

[0157] Upotrebom ELISA testa specifičnog za proBDNF, pronalazači su mogli da pokažu da je oko 70 ng/mL (2.2 nM ili 3.5%) oslobođene BDNF-imunoreaktivnosti iz ćelija transdukovanih pomoću QTA001PA u obliku proBDNF dok se veći deo (96.5% ili 876 ng/mL/63 nM) oslobađa kao mBDNF (videti sliku 10). Nije bilo detektovane proBDNF-imunoreaktivnosti oslobođene iz ćelija transdukovanih pomoću QTA002P, QTA003P ili QTA004P koji ne sadrže kodirajuću sekvencu za produženi proBDNF.

[0158] U skladu sa tim, jasno je da svi plazmidi mogu da proizvedu mBDNF protein od 14kDa, ali da količine mBDNF koji se oslobađa iz ćelija HEK293 u velikoj meri zavise od efikasnosti skladištenja i pakovanja proteina u sekretorne vezikule. Produženi oblik proteina, koji sadrži kombinovane sekvence proBDNF i mBDNF, kakav se proizvodi sa plazmidom QTA001PA (slika 2) se prema tome pakuje u sekretorne vezikule i oslobađa u inkubacioni medijum mnogo efikasnije nego što je slučaj sa manjim sekvencama mBDNF koje se izgleda nakupljaju u ćeliji.

[0159] Kako je prikazano na slici 11, supstitucija kodirajuće sekvence endogenog kanonskog signalnog peptida, predstavljena u plazmidu QTA002P, novim sekvencama uključenim u plazmide QTA009P do QTA013P povećava koncentraciju BDNF u ćelijama HEK293 24 sata posle transdukcije plazmidima. Slika 12 pokazuje da supstitucija kodirajuće sekvence endogenog kanonskog signalnog peptida uključene u plazmid QTA002P novim sekvencama (plazmidi QTA009P do QTA013P) povećava oslobađanje BDNF (mereno ELISA testom) iz ćelija HEK293, mereno 24 sata posle transdukcije plazmidima.

[0160] Kako je prikazano na slici 13, dodavanje virusne-2A peptidne sekvence rezultuje efikasnom obradom kodirajuće sekvence za veliki prekursorski protein u dva transgena, eGFP i BDNF. Western blotovi prikazuju ćelije HEK293 24 sata nakon što su transducirane plazmidima: (i) QTA012P (koji eksprimira BDNF i eGFP, razdvojene IRES spejserom), (ii) QTA021P (koji eksprimira BDNF praćen sa eGFP, razdvojene funkcionalnom virusnom-2A peptidnom sekvencom), (iii) QTA022P (koji eksprimira BDNF praćen sa eGFP, razdvojene nefunkcionalnom virusnom-2A peptidnom sekvencom) i (iv) QTA023P (koji eksprimira eGFP praćen kodirajućom sekvencom za BDNF, razdvojene funkcionalnom virusnom-2A peptidnom sekvencom).

[0161] Kodirajuća sekvenca QTA021P (plazmid koji sadrži kodon-optimizovanu sekvencu za mBDNF-virusni-2A peptid-eGFP) ovde je označena kao SEQ ID No: 104, kao što sledi:

[0162] Kodirajuća sekvenca QTA022P (plazmid koji sadrži kodon-optimizovanu sekvencu za mBDNF-nefunkcionalni virusni-2A peptid-eGFP) ovde je označena kao SEQ ID No: 105, kao što sledi:

[0163] Kodirajuća sekvenca QTA023P (plazmid koji sadrži kodon-optimizovanu sekvencu za eGFP-virusni-2A peptid-mBDNF) ovde je označena kao SEQ ID No: 106, kao što sledi:

[0164] Na slici 14A prikazan je Western blot homogenata ćelija HEK293 48 sati posle transfekcije vektorom QTA020V. Rezultati analize pokazuju efikasnu obradu kodirajućeg regiona velikog prekursora koji uključuje receptor TrkB i BDNF razdvojene virusnom-2A peptidnom sekvencom. Dva TrkB i mBDNF-imunoreaktivna transgena su unutar predviđenih tačnih veličina molekulske mase. Treba uočiti nedostatak bojenja velikog prekursorskog proteina iznad trake receptora TrkB, što ukazuje na gotovo potpunu, ili potpunu, obradu prekursorskog proteina u pet ponavljanja. Slike 14B i 14C pokazuju da su proteini transgena proizvedeni nakon cepanja virusnog-2A peptida transportovani u ispravne unutarćelijske odeljke u ćelijama HEK293 nakon obrade (receptori TrkB na ćelijsku površinu, a BDNF u vezikule za skladištenje pre oslobađanja).

[0165] Slika 15 pokazuje da dodavanje virusne-2A peptidne sekvence koja razdvaja dva kodirajuća regiona za receptor TrkB i BDNF rezultuje efikasnom obradom u dva transgena u retini miša posle intravitrealne injekcije vektora rAAV2, QTA020V.

[0166] Slika 16 prikazuje ekspresiju transgena u sloju ganglijskih ćelija retine miša, što je pokazano imunocitohemijom nakon injekcije QTA020V, vektora rAAV2 koji sadrži kodirajuće sekvence za receptor TrkB i BDNF, odvojene virusnom-2A peptidnom sekvencom. Ciljna ganglijska ćelijska tela obojena su crvenom bojom antitelima na Brn3A i jedra ćelija su kontrastno obojena plavo sa DAPI kako bi se omogućilo razlikovanje retinalnih slojeva.

[0167] Na slici 17 prikazano je pred-tretiranje QTA020V (koji sadrži kodirajuće sekvence za receptor TrkB i BDNF, odvojene virusnom-2A peptidom sekvencom) putem intravitrealne injekcije (2 µl 9x10<12>vektorskih čestica/ml) pruža značajnu neuroprotektivnu efikasnost u preživljavanju ganglijskih ćelija retine nakon nagnječenja optičkog nerva kod miša u odnosu na kontrolne životinje tretirane vektorom rAAV2-CAG-eGFP. Nivo neuroprotekcije vektora QTA020V takođe je bio veći od onog koji pruža vektor koji eksprimira samo BDNF. Sve tri grupe životinja podvrgnute su postupku nagnječenja optičkog nerva i broj ganglijskih ćelija retine izmeren je 7 dana nakon povrede. Ganglijske ćelije retine smanjene su za 71% u kontrolama (crne trake) u odnosu na životinje izložene lažnom nagnječenju (podaci nisu prikazani).

Reference

[0168]

1. Quigley HA, Number of people with glaucoma worldwide. Brit. J. Ophthalmol.1996, vol. 80, PP: 389-393.

2. www.preventblindness.org

3. Goldberg I, Relationship between intraocular pressure and preservation of visual field in glaucoma. Surv. Ophthalmol.2003 vol.48 Suppl.1, PP: S3-S7.

4. Glaucoma, Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 1999, Merck Research Laboratories; Whitehouse Station, NJ, PP: 733-738.

5. Alward WL, Medical Management of Glaucoma. New Eng. J. Med., 1998; vol. 339, PP: 1298-1307

6. Coleman AL, Glaucoma. Lancet, 1999; vol.354, PP: 1803-1810.

7. Medeiros FA, and Weinreb RN, Medical Backgrounders: glaucoma. Drugs of Today 2002, vol. 38, PP: 563-570.

8. Bakalash S, Kipnis J, Yoles E, and Schwartz M, Resistance of retinal ganglion cells to an increase in intraocular pressure is immune-dependent. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2002, vol.

43, PP: 2648-2653.

9. Kipnis J, Yoles E, Porat Z, Cohen A, Mor F, Sela M, Cohen IR, and Schwartz M, T cell immunity to copolymer 1 confers neuroprotection on the damaged optic nerve: Possible therapy for optic neuropathies. Proc. Natl. Acad. Sci.2000, vol.97, PP: 7446-7451.

10. Quigley HA, Nickells RW, Kerrigan LA, Pease ME, Thibault DJ, and Zack DJ, Retinal ganglion cell death in experimental glaucoma and after axotomy occurs by apoptosis. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.1995 vol.36, PP: 774-786.

11. Weinreb RN, and Levin LA, Is neuroprotection a viable therapy for glaucoma? Arch. Ophthalmol. 1999, vol. 117, PP: 1540-1544.

12. Chao MV. Neurotrophins and their receptors: A convergence point for many signalling pathways. Nature Rev. Neurosci.2003, vol.4, PP: 299-309.

13. Dawbarn D, and Allen SJ, Neurotrophins and neurodegeneration. Neuropathol. Appl. Neurobiol. 2003, vol.29, PP: 211-230.

14. Barde Y-A, Leibrock J, Lottspeich F, Edgar D, Yancopoulos G, and Thoenen H, Brainderived neurotrophic factor 1993, US patent 05229500.

15. Mey J, and Thanos S, Intravitreal injections of neurotrophic factors support the survival of axotomized retinal ganglion cells in adult rats in vivo. Brain Res.1993, 602: 304-317.

16. Mansour-Rabaey S, Clarke DB, Wang Y-C, Bray GM, and Aguayo AJ, Effects of ocular injury and administration of brain-derived neurotrophic factor on survival and regrowth of axotomized retinal ganglion cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994, vol.91, PP: 1632-1636.

17. Peinado-Ramon P, Salvador M, Viüegas-Perez MP, and Vidal-Sanz M, Effects of axotomy and intraocular administration of NT-4, NT-3 and brain-derived neurotrophic factor on the survival of adult rat retinal ganglion cells. A quantitative in vivo study. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 1996, vol.37, PP: 489-500.

18. Di Polo A, Aigner LJ, Dunn RJ, Bray GM, and Aguayo AJ, Prolonged delivery of brainderived neurotrophic factor by adenovirus- infected Müller cells temporarily rescues injured retinal ganglion cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1998, vol.95, PP: 3978-3983.

19. Klocker N, Kermer P, Weishaupt JH, Labes M, Ankerhold R, and Bähr M, Brain-derived neurotrophic factor-mediated neuroprotection of adult rat retinal ganglion cells in vivo does not exclusively depend on phosphatidyl-inositol-3’-kinase/protein kinase B signaling. J. Neurosci.

2000, vol.20, PP: 6962-6967.

20. Ko ML, Hu DN, Ritch R, Sharma SC, and Chen CF, Patterns of retinal ganglion cell survival after brain-derived neurotrophic factor administration in hypertensive eyes of rats. Neurosci. Lett. 2001, vol.305, PP: 139-142.

21. Chen H, and Weber AJ, BDNF enhances retinal ganglion cell survival in cats with optic nerve damage. Invest Opthamol. Vis. Sci.2001, vol.42, PP: 966-974.

22. Pórez MTR, and Caminos E, Expression of brain-derived neurotrophic factor and its functional receptor in neonatal and adult rat retina. Neurosci. Lett. 1995, vol.183, PP: 96-99.

23. Vecino E, Ugarte M, Nash MS, and Osborne NN. NMDA induces BDNF expression in the albino rat retina in vivo. Neuroreport.1999 vol.10, PP: 1103-1106.

24. Mowla SJ, Farhadi HF, Pareek S, Atwal JK, Morris SJ, Seidah NG, and Murphy RA. Biosynthesis and post-translational processing of the precursor to brain-derived neurotrophic factor. J. Biol. Chem.2001 vol 276, PP: 12660-12666.

25. Gupta VK, You Y, Gupta VB, Klistorner A, and Graham SL. TrkB receptor signalling: Implications in neurodegenerative, psychiatric and proliferative disorders. Int. J. Mol. Sci.2013, vol.14, PP: 10122-10142

26. Teng,H.K., Teng,K.K., Lee,R., Wright,S., Tevar,S., Almeida,R.D., Kermani,P., Torkin,R., Chen,Z.Y., Lee,F.S., Kraemer,R.T., Nykjaer,A. and Hempstead,B.L. ProBDNF induces neuronal apoptosis via activation of a receptor complex of p75NTR and sortilin. J. Neurosci. 2005, vol.

25, PP: 5455-5463.

27. Wei Y, Zhang F, Zao J, Jiang X, Lu Q, Gao E and Wand N. Enhanced protein expression of proBDNF and proNGF in elevated intraocular pressure-induced rat retinal ischemia. Chin. Med. J. 2012, vol.125, PP: 3875-3879.

28. Woo NH, Teng HK, Siao C-J, Chiaruttini C, Pang PT, Milner TA, Hempstead BL and Lu B. Activation of p75NTR by proBDNF facilitates hippocampal long-term depression. Nature Neurosci. 2005, vol 8, PP: 1069-1077.

29. Lebrun-Julien F, Bertrand MJ, De Backer O, Stellwagen D, Morales CR, Di Polo A, and Barker PA. ProNGF induces TNFalpha-dependent death of retinal ganglion cells through a p75NTR non-cell-autonomous signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010 vol. 107, PP: 3817-3822.

30. Quigley HA, McKinnon SJ, Zack DJ, Pease ME, Kerrigan-Baumrind LA, Kerrigan DF, and Mitchell RS, Retrograde axonal transport of BDNF in retinal ganglion cells is blocked by acute IOP elevation in rats. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2000 vol.41, PP: 3460-3466.

31. Pease ME McKinnon SJ, Quigley HA, Kerrigan-Baumrind LA, and Zack DJ, Obstructed axonal transport of BDNF and its receptor TRKB in experimental glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2000, vol.41, PP: 764-774.

32. Wei Y, Wang N, Lu Q, Zhang N, Zheng D, and Li J. Enhanced protein expressions of sortilin and p75NTR in retina of rat following elevated intraocular pressure-induced retinal ischemia. Neurosci. Lett.2007, vol. 429, PP: 169-174.

33. Martin KRG, Quigley HA, Zack DJ, Levkovitch-Verbin H, Kielczewski J, Valenta D, Baumrind L, Pease ME, Klein RL, and Hauswirth WW, Gene therapy with brain-derived neurotrophic factor as a protection: Retinal ganglion cells in a rat glaucoma model. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 2003, vol.44, PP: 4357-4365.

34. Ren R, Li Y, Liu Z, Liu K, and He S, Long-term rescue of rat retinal ganglion cells and visual function by AAV-mediated BDNF expression after acute elevation of intraocular pressure. Invest. Ophthamol. Vis. Sci., 2012, vol.53, PP: 1003-1011.

35. Cheng L, Sapieha P, Kittlerova P, Hauswirth WW, Di Polo A, TrkB gene transfer protects retinal ganglion cells from axotomy-induced death in vivo. J. Neurosci., 2002, vol.22, PP: 3977-3986.

36. Bai Y, Xu J, Brahimi F, Zhuo Y, Sarunic MV, and Saragovi HU, An agonistic TrkB mAb causes sustained TrkB activation, delays RGC death, and protects the retinal structure in optic nerve axotomy and in glaucoma. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2012, vol.51, PP: 4722-4731. 37. Jelsma TN, Hyman Friedman H, Berkelaar M, Bra. GM, and Aguayo AJ, Different forms of the neurotrophin receptor trkB mRNA predominate in rat retina and optic nerve. J. Neurobiol.

1993, vol.24, PP: 1207-1214.

38. Gomes JR, Costa JT, Melo CV, Felizzi F, Monteiro P, Pinto MJ, Inácio AR, Wieloch T, Almeida RD, Grãos M, and Duarte CB, Excitotoxicity down regulates TrkB.Fl signaling and up regulates the neuroprotective truncated TrkB receptors in cultured hippocampal and striatal neurons J. Neurosci. 2012, vol.32, PP: 4610-4622.

39. Gupta VK, You Y, Klistorner A, and Graham SL. Shp-2 regulates the TrkB receptor activity in the retinal ganglion cells under glaucomatous stress. Biochimica et Biophysica Acta 2012, vol.

1822, PP: 1643-1649.

40. Khalin I, Alyautdin R, Kocherga G, Bakar MA, Targeted delivery of brain-derived neurotrophic factor for the treatment of blindness and deafness. Int. J. Nanomedicine. 2015, vol.

10, PP: 3245-3267.

41. Budenz CL, Wong HT, Swiderski DL, Shibata SB, Pfingst BE, Raphael Y, Differential effects of AAV.BDNF and AAV.Ntf3 in the deafened adult guinea pig ear. Sci. Rep.2015, vol.5 PP: 8619.

42. Havenith S, Versnel H, Klis SF, Grolman W, Local delivery of brain-derived neurotrophic factor on the perforated round window membrane in Guinea pigs: a possible clinical application. Otol Neurotol.2015, vol.36, PP:705-711.

43. Jian-Yi Zhang J-Y, Luo X-G, Xian CJ, LiuZ-H, Zhou X-F (2008) Endogenous BDNF is required for myelination and regeneration of injured sciatic nerve in rodents. Eur. J. Neurosci. Vol. 12, PP: 4171-4180.

44. Lindsey RM (1988) Nerve growth factors (NGF, BDNF) enhance axonal regeneration but are not required for survival of adult sensory neurons. J. Neurosci. vol.8, PP: 2394-2405.

45. Martinez-Salas E. Internal ribosome entry site biology and its use in expression vectors. Curr. Opin. Biotechnol. 1999, vol.10, PP: 458-464.

46. Harries M et al. Comparison of bicistronic retroviral vectors containing internal ribosome entry sites (IRES) using expression of human interleukin-12 (IL-12) as a readout. J. Gene Med.

200 vol.2, PP: 243-249.

47. Furler S, Paterna J-C, Weibel M and Bueler H Recombinant AAV vectors containing the foot and mouth disease virus 2A sequence confer efficient bicistronic gene expression in cultured cells and rat substantia nigra neurons Gene Ther.2001, vol.8, PP: 864-873.

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Rekombinantni adeno-asocirani vektor (rAAV) koji sadrži genetski konstrukt koji sadrži, u orjentaciji 5’ ka 3’, promotor funkcionalno povezan sa prvom kodirajućom sekvencom, koja kodira receptorsku tirozin kinazu B (TrkB), i drugom kodirajućom sekvencom, koja kodira agonist receptora TrkB, pri čemu je agonist zreli BDNF, gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid za agonist receptora TrkB, tako da, kada se eksprimira, signalni peptid je konjugovan za N-terminalni kraj zrelog BDNF, i pri čemu genetski konstrukt sadrži sekvencu spejsera smeštenu između prve i druge kodirajuće sekvence, gde sekvenca spejsera kodira peptidni spejser koji je konfigurisan tako da bude digestiran i tako proizvede receptor i agonist TrkB kao posebne molekule.

2. Rekombinantni vektor prema patentnom zahtevu 1, gde genetski konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira post-transkripcioni regulatorni element virusa hepatitisa mrmota (WHPE), pri čemu opciono WHPE sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 57 ili 58, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 57 ili 58, i/ili gde konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira poliA rep, pri čemu opciono poliA rep sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 59, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 59.

3. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde promotor predstavlja promotor humanog sinapsina I (SYN I), pri čemu opciono promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 1, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 1, ili gde promotor predstavlja CAG promotor, pri čemu opciono promotor sadrži sekvencu nukleinske kiseline suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 2, 3 ili 48, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 2, 3, ili 48.

4. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde sekvenca spejsera sadrži i kodira virusnu peptidnu sekvencu spejsera, poželjnije virusnu 2A peptidnu sekvencu spejsera.

5. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.

4, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 4, ili gde sekvenca spejsera sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.5, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 5, ili gde peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.

6, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 6, ili gde sekvenca spejsera sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO. 7, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 7, ili gde peptidna sekvenca spejsera sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO. 8, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 8.

6. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira humanu kanonsku izoformu TrkB, pri čemu kanonska izoforma TrkB sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u SEQ ID NO. 9, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 9, i/ili gde prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.

10, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 10, i/ili gde prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira izoformu 4 TrkB, pri čemu opciono izoforma 4 TrkB sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.11, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 11, i gde opciono prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.12, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 12.

7. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 9, pri čemu je jedna ili više tirozinskih rezidua na položajima 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 modifikovano u drugačiju aminokiselinsku reziduu, gde su opciono najmanje dve, tri ili četiri tirozinske rezidue na položajima 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 modifikovane u drugačiju aminokiselinsku reziduu, pri čemu je opciono svih pet tirozinskih rezidua na položajima 516, 701, 705, 706 i/ili 816 u SEQ ID No: 9 modifikovano u drugačiju aminokiselinsku reziduu, i pri čemu je opciono navedena ili svaka tirozinska rezidua modifikovana u glutaminsku kiselinu.

8. Rekombinantni vektor prema patentnom zahtevu 7, gde modifikovani oblik receptora TrkB sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.13, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 13, gde opciono prva kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO. 14, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 14.

9. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira zreli BDNF, pri čemu opciono zreli BDNF sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.18, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 18, i gde opciono druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO.

19, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 19.

10. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid za BDNF, pri čemu opciono nukleotidna sekvenca kodira kanonski signalni peptid za BDNF, gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira signalni peptid koji sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO. 20, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 20, ili gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID NO. 21, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No: 21.

11. Rekombinantni vektor prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid signalne sekvence suštinski kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO. 23, 25, 27 ili 29, ili gde signalni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO.22, 24, 26 ili 28, i/ili gde druga kodirajuća sekvenca sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid signalne sekvence suštinski kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO.31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101 ili 103; ili gde signalni peptid sadrži aminokiselinsku sekvencu suštinski kao što je prikazano u bilo kojoj od SEQ ID NO.30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100 ili 102, i/ili gde konstrukt sadrži nukleotidnu sekvencu suštinski kao što je prikazano u SEQ ID No: 107 ili 108, ili fragment ili varijantu sa najmanje 65% identičnosti sekvence sa SEQ ID No:107 ili 108 i/ili gde je rAAV AAV-1, AAV-2, AAV-3A, AAV-3B, AAV-4, AAV-5, AAV-6, AAV-7, AAV-8, AAV-9, AAV-10 ili AAV-11, i gde opciono rAAV predstavlja rAAV serotipa-2.

12. Rekombinantni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za upotrebu kao lek ili u terapiji.

13. Rekombinantni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili ublažavanju poremećaja optičkog nerva, ili za podsticanje regeneracije i/ili preživljavanja nerva, gde je opciono poremećaj optičkog nerva koji se leči bilo koje patofiziološko stanje koje rezultuje gubitkom RGC, kao što je povreda glave ili lica ili vaskularni insulti, na primer delimičan ili potpuni gubitak snabdevanja krvlju očnih struktura ili regija mozga koje primaju impulse iz optičkog nerva, ili se koristi kao podrška zameni RGC putem uvođenja netransformisanih ili transformisanih matičnih ćelija u oko ili regije povezane sa vidom kod pacijenata, pri čemu je opciono poremećaj optičkog nerva koji se leči glaukom.

14. Farmaceutska kompozicija koja sadrži rekombinantni vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, i farmaceutski prihvatljiv vehikulum.

15. Postupak za pripremu farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 14, pri čemu postupak obuhvata dovođenje u kontakt rekombinantnog vektora prema bilo kom od patentnih zahteva 1-11, sa farmaceutski prihvatljivim vehikulumom.