RS62502B1 - Kompozicije protiv infekcija kandide - Google Patents

Kompozicije protiv infekcija kandide

Info

Publication number
RS62502B1
RS62502B1 RS20211328A RSP20211328A RS62502B1 RS 62502 B1 RS62502 B1 RS 62502B1 RS 20211328 A RS20211328 A RS 20211328A RS P20211328 A RSP20211328 A RS P20211328A RS 62502 B1 RS62502 B1 RS 62502B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
miconazole
treatment
composition according
infection
bromide
Prior art date
Application number
RS20211328A
Other languages
English (en)
Inventor
Bruno Cammue
Karin Thevissen
Cremer Kaat De
Paul Cos
Original Assignee
Univ Leuven Kath
Univ Antwerpen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GBGB1711512.2A external-priority patent/GB201711512D0/en
Application filed by Univ Leuven Kath, Univ Antwerpen filed Critical Univ Leuven Kath
Publication of RS62502B1 publication Critical patent/RS62502B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/14—Quaternary ammonium compounds, e.g. edrophonium, choline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4174—Arylalkylimidazoles, e.g. oxymetazolin, naphazoline, miconazole
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/186—Quaternary ammonium compounds, e.g. benzalkonium chloride or cetrimide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/44—Oils, fats or waxes according to two or more groups of A61K47/02-A61K47/42; Natural or modified natural oils, fats or waxes, e.g. castor oil, polyethoxylated castor oil, montan wax, lignite, shellac, rosin, beeswax or lanolin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0034—Urogenital system, e.g. vagina, uterus, cervix, penis, scrotum, urethra, bladder; Personal lubricants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/06—Ointments; Bases therefor; Other semi-solid forms, e.g. creams, sticks, gels
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska.
[0001] Prikazani pronalazak se odnosi na farmaceutske kompozicije mikonazola i kvaterarne amonijum soli protiv infekcija Candida, naročito vaginalnih kandidijaza koje se vraćaju.
Apstrakt
[0002] Veoma su uobičajene gljivične infekcije u vezi sa biofilmom sluzokože i značajano je javljanje ponovljenih oralnih i vulvovaginalnih kandidijaza.
[0003] Različita antifungicidna jedinjenja su opisana u borbi sa infekcijama Candida. Dobro poznata kompozicija za lečenje vulvovaginalnih kandidijaza se sastoji od mikonazol nitrata kao aktivnog sastojka koji je prodavan pod trgovačkim nazivom Gyno Daktarin. Kompozicija se sastoji od polietilen glikola (PEG-6 i PEG-32) glikol stearata, oleoil makrogol glicerida, tečnog parafina, butilhidroksianizola, benzojeve kiseline.
[0004] EP0832649 opisuje sinergijski efekat mikonazola i kvaterarnih amonijum soli na kulture Candida albicans, Staphylococcus aureus i brojne vrste Trichopython.
[0005] US4091090 opisuje lokalna antigljivična dejstva domifen bromida.
[0006] Infekcije Candida koje se vraćaju su u porastu i potrebne su alternativne efikasnije farmaceutske kompozicije.
Suština pronalaska
[0007] Prikazani pronalazak identifikuje novu kombinaciju mikonazola (MC) i kvaterarne amonijum soli domifen bromida koja je naročito efikasna protiv Candida sp. na in vitro kulturama kao i u eksperimentalnom okruženju koristeći model pacova sa vaginalnom infekcijom kandide.
[0008] Prikazani pronalazak ilustruje da domifen bromid i mikonazol pokazuju sinergijsku aktivnost protiv biofilma, zasnovanu na određivanju indeksa frakcione inhibitorne koncentracije. Korišćenje bojenja sa propidijum jodidom u realnom vremenu, domifen bromid kombinovan sa mikonazolom , doveo je do ubijanja ćelija biofilma 2h posle tretmana i obezbeđuje smanjenje > 3 LOG jedinice cfu (jedinice koje obrazuju kolonije) u tretiranim biofilmova posle 24 h.
[0009] Pronalazak je ukratko prikazan sledećim iskazima:
1. Kompozicija za lokalnu upotrebu mikonazola ili njegove soli i domifen bromida kao aktivnih sastojaka za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije.
Kompozicija prema iskazu 1 za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije u kojoj je gljivična infekcija infekcija Candida sp.
Kompozicija prema iskazu 1 ili 2 za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije u kojoj je gljivična infekcija infekcija Candida albicans ili Candida glabrata.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 3, za upotrebu u lečenju biofilma obrazovanog Candida sp.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 4, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju vulvovaginalne infekcije.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 5, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju gljivične infekcije, koja je formulisana kao krema.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 6, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju gljivične infekcije, koja dalje sadrži mukoadheziv.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 7, za upotrebu u lečenju ili spečavanju gljivične infekcije, gde je molarni višak mikonazola ili soli i odnosu na domifen bromid između 2 i 4.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 8, za upotrebu u lečenju ili spečavanju gljivične infekcije, gde je molarni višak mikonazola ili soli i odnosu na domifen bromid između 2 i 5 % (mas./mas.).
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 9, za upotrebu u lečenju ili spečavanju gljivične infekcije, gde je molarni višak mikonazola ili soli i odnosu na domifen bromid između 2 i 4.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 10, za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije gde je koncentracija mikonazol nitrata oko 2% (mas./mas) i molarni višak mikonazol nitrata u odnosu na domifen bromid je oko 3.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 1 do 11, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju gljivične infekcije, gde se kompozicija primenjuje u toku perioda od 14 dana.
Farmaceutska kompozicija koja sadrži fiziološki prihvatljiv nosač i sadrži aktivne antigljivične sastojke mikonazola ili njegove soli i domifen bromid.
Kompozicija prema iskazu 13, koja sadrži mikonazol nitrat.
Kompozicija prema iskazu 13 ili 14, koja je krema sa viskoznošću između 300 cp i 300 cp na 180 oum.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 12 do 15, koja ima pH između 2,7 i 3,5.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 12 do 16, gde je molarni višak mikonazola ili njegove soli u odnosu na domifen bromid između 2 i 4.
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 12 do 17, gde je koncentracija mikonazola ili njegove soli u pomenutoj kompoziciji je između 2 i 5 %(mas./ mas.)
Kompozicija prema bilo kom od iskaza 12 do 18, koja sadrži još i mukoadheziv.
20. Kompozicija prema bilo kom od iskaza 12 do 19, koja je spakovana u aplikator za vaginalno davanje.
21. Postupak lečenje ili prevenciju gljivične infekcije koji obuhvata korak davanja efikasne količine mikonazola ili njegove soli i domifen bromida.
22. Postupak prema iskazu 21 , u kome je gljivična infekcija infekcija Candida sp.
23. Postupak prema iskazu 21 ili 21 , u kome je gljivična infekcija vulvovaginalna gljivična infekcija.
Detaljni opis pronalaska
Kratak opis slika nacrta
[0010] Skraćenice korišćene na slikama su: MCZ: mikonazol; DM: domifen bromid; BKC: benzalkonijum hlorid; DC: dekvalinijum bromid; TB; tetraetilamonijum bromid; BTC: bezetonijum hlorid.
Slika 1. Kombinovano lečenje dimofen bromid-mikonazolom smanjuje metaboličku aktivnost ćelija biofilma C. albicans Vrednosti predstavljaju srednju metaboličku aktivnost 4 nezavisna biološka replikata određena vijabilošću CTB bojenjem.
Slika 2 Metabolička aktivnost ćelija biofilma C. albicans posle kombinovanog lečenja mikonazolom sa kvaterarnim amonijum jedinjenjima Vrednosti predstavljaju srednju metaboličku aktivnost 4 nezavisna biološka replikata određena vijabilošću CTB bojenjem.
2A: mikonazol (MCZ) i benzalkonijum hlorid (BKC)
2A: mikonazol (MCZ) i tetraetilamonijum bromid (TB)
2C: mikonazol (MCZ) i dekvalinijum hlorid (DC)
Slika 3 PI fluorescencija u ćelijama biofilma C. albicans posle kombinovanog lečenja mikonazolom i kvaterarnim amonijum jedinjenjima PI fluorescencija je merena svakih 15 minuta u toku 17h u ćelijama biofilna C. albicans posle lečenja mikonazolom i dimifen bromidom, benzalkonijum hloridom, bezetonijum hloridom ili dekvalinijum hloridom.
3A : mikonazol i benzalkonijum hlorid
3B : mikonazol i domifen bromid
3C : mikonazol i bezetonijum hlorid
3D : mikonazol i dekvalinijum hlorid
Slika 4. Preživljavanje ćelija biofilma C. albicans posle kombinovanog lečenja mikonazolom i kvaterarnim amonijum jedinjenjima Srednje Log CFU, vrednosti ±, SD, su prikazane za bar 4 biološka replikata. Statistička analiza je izvedena da se procene značajne razlike između pojedinačnog lečenja sa ili tetraetilamonijum bromidom (50 µM), bezetonijum hloridom (50 µM), dekvalinijum hloridom (12.5 µM), benzalkonijum hloridom (50 µM) i domifen bromidom (50 µM) ili kombinacijama sa mikonazolom. Testovi dvosmerne ANOVA i Sidak-ovo višestrukog upoređivanje su primenjeni i prikazane su značajne P-vrednosti.
Slika 5. Intravaginalno glivično opterećenje svih grupa u različitim vremenskim tačkama p.i.
Opterećenje je prikazano kao log jedinica koje obrazuju kolonije (cfu) prisutnih u vaginalnom brisu. Stupci sa greškama prikazuju SEM. G: Lečena grupa.
Slika 6: Intravaginalno gljivično opterećenje svih grupa.
Opterećenje je prikazano kao površina ispod krive (AUC) u poređenju sa kontrolnom grupom (G1) (=100%). prikazani kao log jedinica koje obrazuju kolonije (cfu) prisutnih u vaginalnom brisu . Stupci sa greškama prikazuju SEM. G: Lečena grupa.
Slika 7 prikazuje intravaginalno gljivično opterećenje svih grupa različitim danima p.i.
Slika 8 prikazuje intravaginalno gljivično opterećenje svih grupa. Opterećenje je prikazano kao površina ispod krive (AUC).
Slika 9 ukratko prikazuje rezultate intravaginalnog opterećenja različitih formulacija dana 4, 9 i 14 posle infekcije.
Slika 10 prikazuje preživljavanje ćelija C. glabrata biofilma posle jednog ili kombinovanog lečenja sa MCZ i DB.
Slika 11 prikazuje preživljavanje ćelija C. glabrata biofilma posle jednog ili kombinovanog lečenja sa antimikotikom i domifen bromidom.
Slika 12 pokazuje da kombinovano MCZ-DB lečenje smanjuje MIC vrednosti u poređenju sa mono lečenjem MCZ protiv plaktonskih kultura C. glabrata.
Definicije:
[0011] Oko je korišćen da opiše devijaciju 10% ispod i iznad izvesne vrednosti. Prema tome primer "oko 10" označava između 9 i 11, "oko 50" označava između 45 i 55.
[0012] Mikonazol (((RS)-1-[2-(2,4-dihlorofenil)-2-[(2,4-dihlorofenl) metoksi] etil] imidazol) je antigljivično jedinjenje koje ometa metabolizam ergosterola kvasca u ćelijama membrane. Jedinjenje je tipično formulisano kao njegov nitrat.
[0013] Domifen bromid [N,N-dimetil-N-(2-fenoksietil)-, bromid] je kvaterarna amonijum so sa antiseptičkim osobinama.
[0014] Viskoznost u kontekstu prikazanog pronalaska se odnosi na otpornost na postepenu deformaciju smicanjem. Viskoznost može biti merena npr. Brookfield -ovim HA viskozimetrom.
[0015] Gljivična infekcija odnosi se na bolest izazvanu sa jednim ili više iz liste koju čine Candida spp., Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Pneumocystis spp., Zygomyces spp., Dermatophytes, Blastomyces spp., Histoplasma spp., Coccidoides spp., Sporothrix spp.. Microsporidia spp., Malassezia spp. i Bazidomicete.
[0016] Tipično infekcija je izazvana sa Candida sp. kao što su Candida albicans i Candida glabrata.
[0017] Biofilm odnosi se na način mikrobiotskog rasta koji obuhvata sesilne ćelije, uglavnom između kompleksa i visoko heterogenih matriksa ekstracelularnih polimera, i karakterisanih sa smanjenom osetljivošću na antigljivična sredstva. biofilmovi mogu sadržati pojedinačne vrste (npr. gljive/kvasce kao što je C. albicans) ili raznovrste vrste mikroorganizama (kao što su C. albicans, C. glabrata i drugi mikroorganizmi, poželjno kvasci i/ili gljive ili čak prokariote). U poželjnom izvođenju pomenuti mikrofilm je gljivični mikrofilm, poželjnije biofilm vrsta Candida, koji sadrži jednu ili više C. albicans, C. glabrata, i/ili C. cruse. Biofilmovi mogu takođe sadržati ili se sastojati od vrsta biofilma Aspergillus (npr.
A. flavus, A. fumigatus, A. clavatus) ili vrsta Fusarium (npr. F. oxysporum, F. culmorum). U kontekstu prikazanog pronalaska biofilm se tipično odnosi na biofilm Candida albicans .
[0018] Kompozicije prema prikazanom pronalasku generalno sadrže mikonazol i domifen bromid u koncentracijama koje obezbeđuju sinergijski efekat. Sinergija se javlja kada su postignute FICU vrednosti 0,5 ili manje (manje od 0,45 ili manje od 0,4) . Merenje FCI vrednosti je objašnjeno u odeljku sa primerima.
[0019] Kompozicije prema prikazanom pronalasku mogu se naneti kao gelovi ili krem. Kreme su poznate u stanju tehnike kao emulzije ulje u vodi (o/w) ili voda u ulju (w/o) . One tipično sadrže emulgator i sredstvo za zgušnjavanje.
[0020] Gelovi su poznati u stanju tehnike kao transparenti preparati koji sadrže celulozne etre ili karbomer u vodi ili smeši vode-alkohola.
[0021] Lečenje u kontekstu prikazanog pronalaska se odnosi na potpuno ili parcijalno smanjenje gljivica i/ili redukciju simptoma gljivične infekcije kao što je svrab, pečenje pri mokrenju, i vaginalni iscedak.
[0022] Ove formulacije dozvoljavaju sa jedne strane lako uklanjanje kompozicije iz tube ili šprica, a sa druge strane osiguravaju da kompozicija ostane na mestu primene.
[0023] Kompozicije prema prikazanom pronalasku su generalno za lokalnu upotrebu formulisane da budu kompatibilne sa specifičnim mestom primerne (koža, nokti, kosa). Za vulvovaginalne primene kompozicija je formulisana kao kisela kompozicija sa pH između 2,75 i 3,5. Upotreba benzojeve kiseline je dobro poznata u stanju tehnike. Drugi pogodni puferi koji mogu biti korišćeni u farmaceutskim kompozicijama da se dobiju kiseli pH su npr. HCl i mlečna kiselina.
[0024] S obzirom da je domifen bromid visoko rastvoran u vodi, a mikonazol i njegove soli su nerastvorni u vodi, kompozicije prema prikazanom pronalasku su poželjno krema sa emulgacionim sredstvom, jer mikonazol i mikonazol nitrat su nerastvorni u vodi, a domifen bromid je visoko rastvoran u vodi.
[0025] Različite emulzije ulja u vodi su poznate u stanju tehnike. U formulacijama prema prikazanom pronalasku tečni parafin i laurol makrogol-6 gliceridi su tipično korišćeni kao uljane faze.
[0026] Da bi se se stabilizovala emulzija mogu biti korišćeni emulgatori kao što je na primer smeša polietilen glikola-6, palmitostearata, etilen glikol stereata i PEG-32.
[0027] Da bi se povećala viskoznost emulzije, mogu biti korišćena sredstva za zgušnjavanje kao što je cetostearil.
[0028] Za optimalno vezivanje za mesto primerne formulacije mogu sadržati još mukoahezive. Pogodni mukoadhezivi za vulvovaginalnu primenu uključuju polimere koji su u stanju da obrazuju hidrogelove kao što su sintetički polikarbofil, hitosan, celulozni derivati (hirdroksietilceluloza, hidrokspropilceluloza i hidroksipropilmetilceluloza), pektin, derivati hijaluronske kiseline, poliakrilati, tragakant, karagenan i natrijum alginat, tiolovane polimere.
[0029] Farmaceutske primene mogu biti korisne u profilaksi, ali su tipično korišćeni posle znakova gljivične infekcije. Primena farmaceutske kompozicije na zaraženu oblast može biti izvođena npr. svaka dva dana, dnevno ili dva tri puta dnevno u toku perioda od npr. bar 7, 14 ili 21 dan ili dok znaci infekcije ne izčeznu.
[0030] Kompozicije prema prikazanom pronalasku su jednako pogodne za lečenje vulvovaginalne kandidijaze koja se vraća (tj. bar četiri specifične epizode koje se javljaju u jednoj godini ili bar tri epizode koje nisu u vezi sa antibiotskom terapijom, a javljaju se u toku jedne godine). Kompozicije prema prikazanom pronalasku su pogodne za infekcije C. albicans koje se vraćaju i naročito su pogodne za infekcije C. tropicalis ili C. glabrata koje se vraćaju, koje su manje osetljive na monoterapiju mikonazola.
[0031] Farmaceutske kompozicije prema prikazanom pronalasku sadrže između oko 1 % (mas./mas) do oko 5% (mas./mas) mikonazola ili njegove soli (tipično nitrata). Specifična izvođenja se odnose na oko 1% (mas./mas), oko 1,5 % (mas./mas), oko 2% (mas./mas), oko 2,5 % (mas./mas) oko 3 % (mas./mas), oko 4%, ili oko 5% (mas./mas) mikonazol nitrata.
[0032] Količina mikonazola ili njegove soli u farmaceutskim kompozicijama prema prikazanom pronalasku je u molarnom višku od oko 2, oko 2,5, oko 3, oko 3,5 ili oko 4, u odnosu na količinu domifen bromida.
[0033] Prema tome farmaceutska kompozicija sa 3-strukim molarnim viškom sadrži 10 milimolarni domifen bromid koji sadrži 30 milimolarnog mikonazol nitrata.
[0034] Bilo koja kombinacija gore pomenutih koncentracija mikonazola ili soli i gore pomenutih vrednosti molarnog viška su ovde opisane u okviru Specifičnih izvođenja odnosi se na farmaceutske kompozicije sa oko 2 % (mas/mas) mikonazol nitrata sa 3 strukim molarnim viškom domifen bromida.
Primeri
Primer 1: Materijali i postupci
[0035] Sojevi i hemikalije. C. albicans soj SC5314 je gajen rutinski u YPD (1% ekstrakt gljivica, 2% pepton (International Medical Products, Belgium)) i 2% glukozi (Sigma-Aldrich, USA)) pločama od agara na 30°C. Štok rastvori mikonazola (MCZ) (Sigma-Aldrich) su dobijeni u DMSO (VWR International, Belgium). RPMI 1640 medijum (pH 7.0) sa L-glutaminom i bez natrijum bikarbonata je nabavljen kod Sigma-Aldrich i puferisan sa MOPS (Sigma-Aldrich). Domifen bromid je nabavljen kod Selleck Chemicals a benzalkonijum hlorid, bezetonijum hlorid, tetraetilamonijum hlorid kod TCI Europe (Belgium).
[0036] Test za odabir antibiofilma. Kultura C. albicans SC5314 preko noći gajena u YPD, je razblažena do optičke gustine od 0.1 (približno 10<6>ćelija/mL) u RPMI medijumu i dodato je 100 μL suspenzije u bunarčiće sa okruglim dnom mikroploče (TPP Techno Plastic Products AG, Switzerland) (30, 31). Posle 1 h adhezije na 37°C, medijum je aspiriran i biofilmovi su isprani sa 100 μL rastvorom soli puferisanim fosfatima (PBS) da bi se uklonile ćelije koje ne prijanjaju, praćeno dodavanjem 100 μL RPMI 1640 medijuma. Omogućeno je da biofilmovi rastu u roku 24 h na 37°C. Posle toga, dodato je 10 μM mikonazola u kombinaciji sa 25 μM jedinjenja iz Pharmakon 1600 biblioteka (2 mM štok rastvora u DMSO) u RPMI, dajući pozadinu 1.1 % DMSO . Biofilmovi su inkubirani u toku dodatnih 24 h na 37°C. Na kraju, biofilmovi su isprani i kvantifikovani sa Cell-Titre Blue (CTB; Promega, USA) (32) dodavanjem 100 μL CTB razblaženog 1/10 u PBS u svaki bunarčić. Posle 1 h inkubacije u mraku na 37°C, fluorescencija je merena sa spektrometrom fluorescencije (Synergy Mx multi-mode čitačem mikroploča, BioTek, USA) na λex535 nm i λem590nm. Vrednosti fluorescencije uzoraka su korigovane oduzimanjem srednje vrednosti fluorescencije CTB neinokulisanih bunarčića (slepe probe). Procenat metabolički aktivnih ćelija biofilmova je izračunat u odnosu na kontrolni tretman (1.1 % DMSO). Jedinjenja su razmatrana za ponovno testiranje kada je njihova primena u prisustvu 10 μM mikonazola dovela do manje od 60% zaostale metaboličke aktivnosti ćelija C. albicans biofilma u odnosu na kontrolu mikonazola. Ovaj eksperiment potvrde je izveden dva puta i uključena su samo kontrolna jedinjenja.
[0037] „Checkerboard“ test biofilma. U cilju određivanje mogućih sinergijskih interakcija između antigljivičnih sredstava sa jedne strane i identifikovanih potencijatora sa druge strane, korišćen je „checkerboard“ test . Kombinacija antigljivičnih jedinjenja (mikonazola, flukonazola, kaspofungina ili amfotericina B) i potencijatora, dvostrukog razblaženja duž odgovarajućih redova i kolona mikroploče, dodati su u gajene biofilmove C. albicans kako je gore opisano (DMSO pozadina 0.6 %). Posle 24h inkubacija na 37°C, biofilmovi su kvantifikovani CTB postupkom kako je gore opisano. Sinergizam je određen pomoću FICI ( indeksa frakcione inhibitorne koncentracije) izračunavanja .
[0038] FICI je izračunavan formulom FICI=[C(BEC-2A)/ BEC-2A]+[C(BEC-2B)/BEC-2B], u kojoj C(BEC-2A) i C(BEC-2B) su BEC-2 vrednosti antigljivičnih lekova u kombinaciji, i BEC-2Ai BEC-2Bsu BEC-2 vrednosti samih antigljivičnih lekova A i B. BEC-2 označava iskorenjavanje biofilma koncentracije 2 koja je minimalna koncentracija jedinjenja koja izaziva 2-struki pad u metaboličkoj aktivnosti biofilma.
[0039] Interakcija je definisana kao sinergijska za vrednost FICI≤0.5, indiferentna za 0.5<FICI<4 i antagonistička za FICI≥4.
[0040] PI test i CFU određivanje. Biofilmovi su gajeni kao što je gore opisano i tretirani sa izabranim dozama mikonazola i ili domifen bromida, benzalkonijum hlorida, bezetonijum hlorida, dekvalinijum hlorida ili tetraetilamonijum bromida. Da bi se dobilo kintetičko PI očitavanje, biofilmovi su inkubirani, u prisustvu 3% PI, u multimodnom čitaču (Syngergy MX, Biotek) koji meri fluorescenciju svakih 15 min u toku 17h (talasna dužina emisije: 535nm i talasna dužina ekscitacije: 617 nm). CFU određivanje je izvedeno na biofilmovima 24 h posle tretiranja. U tom cilju, biofilmovi su isprani sa PBS i potpuno odstranjeni sa dna ploče. Serijska razblaženja su zasejana na YPD ploče od agara i inkubirana u toku 48h na 30°C pre brojanja kolonija.
Primer 2: Odabir potencijatora mikonazola protiv biofilmova C. albicans
[0041] Testiran je kapacitet domifen bromida (DB), da smanji metaboličku aktivnost biofilma C. albicans više od 50 % u kombinaciji sa subinhibitornom dozom mikonazola i njegov profil toksičnosti na humane ćelije .
Primer 3: Kvaterarna amonijum jedinjenja deluju sinergijski sa mikonazolom protiv biofilmova C. albicans
[0042] Da bi se odredilo da li domifen bromid deluje sinergijski sa mikonazolom protiv biofilmova C. albicans, „checkerboard“ eksperimenti (Slika 1) i FICI izračunavanja su izvedeni (Tabela 1). „Checkerboard“ podaci pokazuju da, u prisustvu domifen bromida, niže koncentracije mikonazola mogu biti korišćene da smanje metaboličku aktivnost biofilmova C. albicans , indikativnu za smanjeno preživljavanje ćelija biofilma (Slika 1). Zatim, izveli smo koncentraciju oba mikonazola i domifen bromida neophodnu da iskoreni biofilm-2 C. albicans sa 50 % ili 2-struko (Koncentracija iskorenjenja biofilma-2, BEC-2), da se omogući FICI izračunavanje (Tabela 1).
Tabela 1. Sinergijske kombinacije mikonazol-domifen bromida protiv biofilmova C. albicans
[0043] Prema našem interesu, prethodno smo detektovali druga kvaterarna amonijum jedinjenja kao potencijalne potencijatore mikonazola, naime benzalkonijum hlorid (BKC) i bezetonijum hlorid (BTC) (neobjavljeni podaci). Međutim, njihova aktivnost u kombinaciji sa mikonazolom nije nikad procenjivana „checkerboard“ analizama. Prema tome, u ovom ispitivanju, mi smo procenili potencijalne sinergijske interakcije između mikonazola i različitih kvaternarnih amonijum jedinjenja, uključujući benzalkonijum hlorid, bezetonijum hlorid, dekvalinijum hlorid (DC) i tetraetilamonijum bromid (TB) (Slika 2).
[0044] Ustanovili smo da bezalkonijum hlorid, bezetonijum hlorid i dekvalinijum hlorid deluju sinergijski sa mikonazolom (FICI<0.5), dok ovo nije slučaj sa tetraetilamonijum bromidom (FICI>0.5). Ovi podaci sugerišu da sinergijsko dejsto mikonazola je karakteristika različitih kvaterarnih amonijum jedinjenja, podrazumevajući da je aktivnost verovatno pripisivana hemijskoj strukturi jezgra ove familije.
Primer 4: Kombinacije domifen bromida-mikonazola i benzalkonijum hlorida pokazuju izraženu fungicidnu aktivnost protiv biofilmova C. albicans
[0045] Smanjenje metaboličke aktivnosti, kako je primećeno u prethodnim eksperimentima, ne znači nužno da su ćelije biofilma mrtve. Vrlo je moguće da je njihov ćelijski metabolizam ugušen u prisustvu jedinjenja, ali da oživljavaju kada se stres ukloni. Da bi se procenilo koliko je u stvari štete naneto ćelijama i u kom vremenskom okviru, mi smo izveli eksperiment u vremenskom toku na biofilmovima C. albicans tretiranim sa kombinacijom domifen bromida, benzalkonijum hlorida, bezetonijum hlorida ili dekvalinijum hlorida (25 μM ili 50 μM) i mikonazola (75 μM ili 150 μM) (što dovodi do 1/3 odnosa) ili pojedinačnih jedinjenja, u prisustvu propidijum jodida (PI) (slika 3). Koncentracije jedinjenja su izabrane na osnovu posmatranja na Slici 1 da 25 μM domifen bromida u kombinaciji sa 500, 250, 125 ili 62.5 μM mikonazola je dovelo do smanjenja metaboličke aktivnosti biofilma C. albicans ispod 25 % (pravouganonik na slici 1).
[0046] PI je poznato da prolazi kroz membranu oštećenih ćelija i njegovo preuzimanje je pokazatelj ćelijske smrti. Mi smo primetili samo blagi porast PI fluorescencije kada su ćelije tretirane sa 150 μM mikonazola posle 16 h tretiranja. Među pojedinačnim tretmanima sa kvaterarnim amonijum jedinjenjima, samo domifen bromid i benzalkonijum hlorid su pokazali značajan porast u PI fluorescenciji 5-10 h posle tretmana sa 50 μM. Međutim, najbrži efekat je primećen sa kombinacijom mikonazola sa ili 50 μM domifen bromida, benzalkonijum hlorida ili bezetonijum hlorida, sa PI vrednosti koje počinju da rastu već 2-3 h posle tretmana. Značajno, ne može se primetiti dodatni porast u PI fluorescenciji za kombinacije mikonazola i dekvalinijum hlorida (Slika 3). Značajno, nije primećen porast za dekvalinijum hlorit, ali kombinacije sa 50 μM nedostaju.
[0047] Kapacitet ubijanja kvaterarnih amonijum jedinjenja u prisustvu ili odsustvu mikonazola je dalje potvrđen brojanjem CFU za izabrane doze jedinjenja (Slika 4).
[0048] Terapeutski interesantno smanjenje u CFUs (> 3 Log jedinica) je samo primećeno za kombinacije 150 μM mikonazola sa 50 μM benzalkonijum hlorida i 50 μM domifen bromida (Slika 4). Interesanto, u nekoliko slučajeva, kompletna sterilnost površine je primećena posle tretiranja sa ovim kombinacijama.
Primer 5: Primećena sinergija između kvaterarnih amonijum jedinjenja i mikonazola je mikonazol specifična
[0049] Procenili smo da li kvaterarno amonijum jedinjenje može takođe povećati aktivnost flukonazola protiv biofilmova C. albicans . Flukonazol nije pokazao značajnu aktivnost protiv biofilma ni sam ni u kombinaciji sa 25 μM domifen bromida, benzalkonijum hlorida, bezetonjium hlorida ili dekvalinijum hlorida (BEC-2 > 500 µM) (podaci nisu prikazani).
Primer 6: formulacije za vulvovaginalnu primenu
[0050] Primeri prikazuju dobijanje različitih farmaceutskih kompozicija koje sadrže domifen bromid i/ili mikonazol .
Tabela 2: fomulacija kompozicija domifen bromida i/ili mikonazola.
[0051] U F5 mikonazol nitrat je u 3-strukom molarnom višku u odnosu na domifen bromid.
Primeri 7: životinjski model za vaginalnu infekciju Candida
[0052] Gornja F5 formulacija je preparat mikonazol nitrat-domifen bromida sa in vitro sinergijskim efektom (3-struki molarni višak domifen bromida u odnosu na mikonazol nitrat (F2 i F3) i domifen bromid (F4).
[0053] F1 do F4 su kontrole bez aktivnog sastojka (F1) mikonazol nitrata (F2 i F3) i domifen bromida (F4).
[0054] Ženski Wistar pacovi (180-200 g ) su držani u grupama od 4 životinje. Hrana i voda su dostupni ad libitum. Uslovi smeštanja su bili: sobna temperatura 22°C, vlažnost 60% i ciklus dan -noć 12h svetlo/ 12 h mrak.
Predkondicioniranje
[0055] Pacoviima su izvađeni jajnici 2 do 3 nedelje pre infekcije pod inhalacionom anestezijom sa izofuranom. U toku oporavka, pacovi su stavljeni pod IR-lampu u toku 30 minuta. Tri dana pre infekcije, životinje su primile 1 mg oestradiolbenzoata u 0.1 ml PEG400 SC i 200 μg progesterona u 0.1 ml PBS SC da izazova veštački estrus (dat kao 1 injekcija). Ova injekcija je ponovljena u toku dva puta u toku eksperimenta.
Pripremanje inokuluma i postupak infekcije
[0056] Candida albicans B2630-krioštok je korišćen za infekciju. Svaka fiola je sadržala 1 ml RPMI sa 10% glicerola sa inokulumom veličine 5.108 cfu/ml. Razblaženje 1/5 u sterilnoj vodi je napravljeno pre infekcije. Životinje su inficirane sa 1.107 cfu u 100 μl korišćenjem mikropipete sa jednokratnim vrhovima. Kraj vrha je umetnut u vaginu i pacovi su držani malo gore za rep u toku oko jedne minute posle instalacije.
Lečene grupe.
[0057] Lokalan b.i.d. tretman je počeo ujutru posle infekcije (D1) u toku 4 dana (200 μl/životinji, primenjeno umetanjem vrha 1 ml šprica u vaginu). Sledeće formulacije su korišćene. (detalji ovih formulacija su prikazani gore u tabeli 2).
G1a:Formulacija 1a ili inficirana kontrola tretirana nosačem (VICa): b.i.d. (200 μL) (#2)
G1b:Formulacija 1b ili inficirana kontrola tretirana nosačem (VICa): b.i.d. (200 μL) (#2)
G2: Formulacija 2 (mikonazol nitrat): b.i.d. Vrh 2% u toku 4 dana (200 μL) (#4)
G3: Formulacija 3 (mikonazol nitrat): b.i.d. Vrh 4% u toku 4 dana (200 μL) (#4)
G4: Formulacija 4 (Domifen bromid): b.i.d. Vrh u toku 4 dana (200 μL) (#4)
G5: Formulacija 5 (Mikonazol nitrat/Domifen bromid): b.i.d.4 dana (200 μL) (#4)
Parametri evaluacije
[0058] Kontrola estrusa: dana 4, 9 i 14, vaginalni brisevi su uzeti sa vlažnim brisom i obojeni sa Giemsa da bi se proverio veštački estrus (mikroskopski broj rožnatih epitelijalnih ćelija). Dana 2 i 7 hormonske injekcije su ponovljene u cilju održavanja kontinuiteta estrusa.
[0059] Telesna masa: praćenje telesne mase (BW) i izračunavanje procentnog dobitka ili gubitka u poređenju sa BW pre infekcije (dan 0).
[0060] Vaginalno gljivično opterećenje: vaginalni uzorci su sakupljeni dana 4, 9 i 14. Sterilni bris je ovlažen u sterilnoj vodi, umetnut u vaginu i dva puta rotiran. Bris je zatim stavljen u epruvetu sa 1 ml sterilne vode i stavljen na vortex mešalicu u toku 40 sekundi. Desetostruko razblaženje ovog rastvora je pripremljeno i zasejano na Sabouraud agaru. Posle 24-48h inkubacije na 37°C, kolonije su brojane i broj cfu/ml je izračunavan kao mera za ukupno intravaginalno opterećenje. Rezultati su izraženi kao LOG funkcija broja cfu koja je nađena na brisu (osim kada nema kolonija, kada je rezultat=0)
Rezultati
[0061] Pošto nije bilo razlika između obe kontrolne grupe sa nosačem 1a i 1b, obe grupe su kombinovane i prikazane kao grupa 1.
Kontrola estrusa
[0062] Visoki nivoi rožnatih epitelijalnih ćelija su primećeni u toku eksperimenta (Tabela 3), potvrđujući permanentni estrus.
Tabela 3: Procenti rožnatih epitelijalnih ćelija primećeni u toku eksperimenta nekoliko dana p.i.
G: Lečena grupa. R: broj životinja
(nastavak)
Telesna masa
[0062] Standardna devijacija srednje vrednosti telesne mase po životinji ostala je konstantna u toku infekcije (Tabela 4), koja ukazuje da nije došlo do ozbilnijeg gubitka mase.
Tabela 4: Procenjivanje telesne mase živih pacova posle vaginalne infekcije sa Candida albicans
(nastavak)
Vaginalno opterećenje gljivicama
[0064] Infekcija je merenja brojanjem intravaginalnog opterećenja glivicama svakog brisa (Slika 5) i izračunavanjem površine ispod krive (AUC) (Slika 6). Ovaj postupak dozvoljava upoređivanje ukupne infekcije nekoliko lečenih grupa sa kontrolnom grupom, dok broj cfu dozvoljava upoređivanje u nekoliko vremenskih tačaka p.i. AUC jasno pokazuje da 2% mikonazola ne utiče na ishod infekcije, dok 4% mikonazola ima pozitivan efekat (33% smanjenja u AUC). Sam potencijator DOM ne utiče na ishod infekcije, dok kombinacija 2% MIC+DOM smanjuje AUC infekcije za 66%.
[0065] Pod navedenim eksperimentalnim uslovima, antigljivični efekat mikonazola kada je korišćen kao 4% može biti pokazan. Nije primećen antigljivični efekat za mikonazol kada je 2%, ali je značajan efekat viđen kada je dodat potecijator domifen bromid, mada sam domifen bromid ne utiče na ishod infekcije.
Primer 8: vaginalna infekcija Candida (II)
[0066] Životinje, prekondicioniranje, dobijanje inokuluma i postupak infekcije su kao što je opisano u primeru 7.
Lečene grupe.
[0067] Lokalno b.i.d. lečenje je započelo trećeg jutra posle infekcije (D1) u toku 4 dana (200 μl/životinji naneto umetanjem vrha šprica od 1 μl u vaginu)
G1: Formulacija 1 ili inficirana kontrola tretirana nosačem (VIC): b.i.d. (200 μL) (#4)
G2: Formulacija 2 (mikonazol nitrat): b.i.d. Vrh 2% u toku 4 dana (200 μL) (#9)
G3: Formulacija 5 (Mikonazol nitrat/ 1/3 Domifen bromid): b.i.d.4 dana (200 μL) (#10)
G4: Formulacija 4 (1/3 Domifen bromid): b.i.d.4 dana (200 μL) (#4)
Parametri evaluacije
[0068] Kontrola estrusa, telesna masa i vaginalno opterećenje gljivicama su određeni kako je gore opisano
Kontrola estrusa
[0069] Visoki nivoi rožnatih epitelinih ćelija su primećeni u toku eksperimenta (Tabela 5 koja se odnosni na estrus. Treba primetiti, da se za neke životinje u grupi 3, orožnjavanje izgleda smanjuje oko 4. dana. Ovo je verovatno usled načina uzorkovanja, koji je bilo modifikovan za dan 9, pokazujući da je orožnjavanje još uvek u toku.
Tabela 5: Procenti orožnatih epitelnih ćelija
(nastavak)
Telesna masa
[0062] Standardna devijacija srednje vrednosti telesne mase po životinji ostala je konstantna u toku infekcije (Tabela 6), što ukazuje da nije došlo do ozbilnijeg gubitka mase.
Tabela 6: telesna masa (u g) pacova za nekoliko dana p.i.
(nastavak)
Vaginalno opterećenje gljivicama
[0071] Infekcija je merena brojanjem intravaginalnog opterećenja glivicama svakog brisa (Slika 7) i i izračunavanjem površine ispod krive (AUC) (Slika 8). Ovaj postupak dozvoljava upoređivanje ukupne infekcije nekoliko lečenih grupa sa kontrolnom grupom, dok broj cfu dozvoljava upoređivanje u nekoliko vremenskih tačaka p.i..
[0072] AUC pokazuje jasan efekat mikonazola od 2%, koji se slaže sa prethodnim rezultatima, koji smanjuju infekciju za 65%. Takođe se slaže sa prethodnim rezultatima, kombinacija 2% mikonazola potencijator smanjuje AUC, ali postoji samo jasna korist dana 4 kada se upoređuje sa 2% mikonazolom. Slaganje sa prvim eksperimentom (eksp. 2017-1146), sam domifen ne smanjuje infekciju. Za ovaj eksperiment, nije primećeno posebno odstupanje izvesnih grupa, nasuprot prethodnim rezultatima.
Tabela 7: Intravaginalno opterećenje infekcijom
[0073] Slika 7 prikazuje intravaginalno glivično opterećenje svih grupa različitim danima p.i. Opterećenje je prikazano kao log jedinica koje obrazuju kolonije (cfu) prisutnih u vaginalnom brisu. Stupci sa greškama prikazuju SEM. Slika 8 prikazuje intravaginalno gljivično opterećenje svih grupa. Opterećenje je prikazano kao površina ispod krive (AUC) u poređenju sa kontrolnom grupom (G1) (=100%). je prikazano kao log jedinica koje obrazuju kolonije (cfu) prisutnih u vaginalnom brisu. Stupci sa greškama prikazuju SEM. G: Lečena grupa.
[0074] Oba, mikonzol 2% i mikonazol 2% kombinovan sa domifenom smanjuju infekciju. Dana 4, postoji dodatan efekat domifena, ali ovaj efekat ne može biti primećen dana 9 i 14.
[0075] Slika 9 ukratko prikazuje rezultate 3 eksperimenta dobijene sa 12 pacova kao kontrolom, 17 pacova lečenih sa 2% mcz, 8 pacova samo sa domifen bromidom, 18 pacova lečenih sa 2% MCZ 1/3 DB, 6 pacova lečenih sa 2% MCZ 1/6 DB.
Primer 9 Potecijacija mikonazola sa domifen bromidom protiv biofilma Candida glabrata
Materijali i postupci
[0076] Sojevi i hemikalije. Soj C. glabrata BG2 je gajen u YPD (1% ekstrakt gljivica, 2% bakteriološki pepton (LabM, UK) i 2% glukozu (Sigma-Aldrich, USA)) na pločama od agara na 30°C. Štok rastvori mikonazola (MCZ) (Sigma-Aldrich) su dobijeni u DMSO (VWR International, Belgium). RPMI 1640 medijum (pH 7.0) sa L-glutaminom i bez natrijum bikarbonata je nabavljen kod Sigma-Aldrich i puferisan sa MOPS (Sigma-Aldrich). Domifen bromid (DB) je dobijen od Purna Pharmaceuticals i radni rastvor od 1% tritona (Sigma-Aldrich) je dobijen u rastvoru soli puferisanom fosfatom (PBS).
[0077] „Checkboard“ test biofilma sa određivanjem CFU . Kultura C. glabrata BG2 preko noći gajena na YPD na 30°C, je razblažena do optičke gustine od 0.1 (približno 10<6>ćelija/mL) u RPMI medijumu i dodato je 100 μl suspenzije u bunarčiće sa okruglim dnom mikroploče (TPP Techno Plastic Products AG, Switzerland) . Posle 1 h adhezije na 37°C, medijum je aspiriran i biofilmovi su isprani sa 100 μL PBS bi se uklonije ćelije koje ne prijanjaju, praćeno dodavanjem 100 μL RPMI 1640 medijuma. Dozvoljeno je da biofilm raste u toku 24h na 37°C. Da bi se odredila moguća potencijacija MCZ sa DB, korišćen je test sa šahovskom pločom. Kombinacija MCZ i DB, dvostruko odgovarajuće razblaženje duž redova i kolona mikroploče, je dodato u biofilmove C. glabrata (DMSO pozadina 1%). Posle 38 h posle inkubacije na 37°C, određivanje CFU je izvedeno na tretiranim biofilmovima. U tom cilju, biofilmovi su isprani sa PBS i potpuno odstranjeni sa dna ploče i rastvoreni u 100 μl tritona (1%). Serijska razblaženja (10<-2>, 10<-3>i 10<-4>) su zasejana na YPD pločama od agara, što je prećeno inkubacijom u periodu od 24 h na 37°C i naknadnim brojanjem kolonija.
Rezultati i diskusija
Domifen bromid potencira mikonazol protiv biofilmova C. albicans
[0078] Kvaterarna amonijum jedinjenja, kao DB, su potencijatori MCZ protiv biofilmova C. albicans . U cilju određivanja da li je DB takođe potencijator MCZ protiv biofilma C.glabrata izvedeni su „checkboard“ eksperimenti Slika 10 pokazuje preživljavanje ćelija biofilma C. glabrata posle pojedinačnog ili kombinovanog lečenja MCZ i DB. Srednje Log CFU vrednosti+/-, SEM, su prikazane za 6 bioloških replikata. Statistička analiza je izvedena da se procene značajne razlike između pojedinačnih tretmana sa MCZ (150 μM) i DB (37,5 μM) i kombinacije. Testovi dvosmerne ANOVA i Tukey višestrukog upoređivanja su izvedeni i prikazane su značajne razlike.
[0079] Koncentracione serije oba jedinjenja su testirane i značajno smanjenje u CFUs je samo primećeno za kombinaciju 500 mM MCZ sa 37,5 μM DB u poređenju sa tretmanom pojedinačnim jedinjenjem.
Primećena potencijacija MCZ sa DB izgleda da je MCZ-specifična
[0080] Procenili smo da DB može takođe povećati aktivnost posakonazola protiv biofilmova C. glabrata. Posakonazol je nije pokazao značajnu aktivnost protiv biofilma sam niti u kombinaciji sa DB (podaci nisu prikazani).
Primer 10 Potecijacija azola sa domifen bromidom protiv biofilma Candida albicans
[0081] Sojevi i hemikalije. Oba,C. albicans soj SC5314 i soj B59630, ljubazno dobijeni iz laboratorije za mikrobiologiju, parazitologiju i higijenu od prof. Paul Cos, su gajeni u YPD (1% ekstrakt gljivice, 2% bakteriološki pepton (LabM, UK) i 2% glukoze (Sigma-Aldrich, USA)) na pločama od agara na 30°C. Štok rastvori mikonazola (MCZ) (Sigma-Aldrich), ketokonazola (TCI Europe, Belgium), klotrimazola (Sigma-Aldrich), itrakonazola (TCI) i flukonazola (MP Biomedicals, France) su dobijeni u DMSO (VWR International, Belgium). Posakonazol (Noxafil) je kupljen kod MSD. RPMI 1640 medijum (pH 7.0) sa L-glutaminom i bez natrijum bikarbonata je nabavljen kod Sigma-Aldrich i puferisan sa MOPS (Sigma-Aldrich). Domifen bromid (DB) je dobijen od Purna Pharmaceuticals i radni rastvor od 1% tritona (Sigma-Aldrich) je dobijen u rastvoru soli puferisanom fosfatom (PBS).
[0082] „Checkboard“ test biofilma sa određivanjem CFU . Kultura C. albicans preko noći gajena u YPD na 30°C, je razblažena do optičke gustine od 0.1 (približno 10<6>ćelija/mL) u RPMI medijumu i 100 μl ove suspenzije je dodato u bunarčiće sa okruglim dnom mikroploče (TPP Techno Plastic Products AG, Switzerland) . Posle 1 h adhezije na 37°C, medijum je aspiriran i biofilmovi su isprani sa 100 μL PBS da bi se uklonije ćelije koje ne prijanjaju, praćeno dodavanjem 100 μL RPMI 1640 medijuma. Dozvoljeno je da biofilm raste u toku 24h na 37°C. Da bi se odredila moguća potencijacija MCZ sa DB, korišćeni su „checkboard“ testovi. Kombinacija antigljivičnog jedinjenja, ili imidazola (MCZ, ketokonazola ili klotrimazola) ili triazola (flukonazola, itrakonazola ili posakonazola), i DB, odgovarajuća dvostruka razblaženja duž redova i kolona mikroploče, su dodata u biofilmove C. albicans . Posle 24 h posle inkubacije na 37°C, izvedeno je određivanje CFU na tretiranim biofilmovima. U tom cilju, biofilmovi su isprani sa PBS i potpuno odstranjeni sa dna ploče i rastvoreni u 100 μl tritona (1%). Serijska razblaženja (10<-1>, 10<-2>i 10<-3>) su zasejana na YPD pločama od agara, prećeno inkubacijom u periodu od 24h na 37°C i naknadnim brojanjem kolonija.
Rezultati i diskusija
[0083] Kvaterarna amonijum jedinjenja, kao DB, su potencijatori MCZ protiv biofilmova C. albicans . Imidazoli, na primer MCZ i triazoli, kao flukonazol, su dve grupe azola, karakterisane sa 2- i 3 azotova atoma u odgovarajućem azolnom prstenu (Cleary et al. (1990). DICP, Annals of Pharmacother. ,24: 148-152; Troyer et al. (2013). J.chem. ,2013: 1-23). Azoli inhibiraju biosintezu ergosterola i mikonazol ima dodatni efekat na mitohondrije ćelija (Cleary etal.(1990).DICP,AnnalsofPharmacother.,24:148-152 ;Ghannoum& Rice (1999).Clinicalmicrobial. reviews, 12(4): 501-517; Portillo & Gancedo (1984) Eur. J Biochem, 143(2): 273-276; Swamy et al. (1974). Antimicrob. Agents Chemother.5(4): 420-425). U cilju određivanja da li DB takođe potencira ostale imidazole i triazole protiv bioflmova C. albicans , izvedeni su „checkboard“ eksperimenti (slika 11).
[0084] Slika 11 prikazuje preživljavanje ćelija biofilma C. albicans posle pojedinačnog ili kombinovanog lečenja sa antimikotikom i DB. (paneli A-D) Preživljavanje ćelija biofilma C. albicans soja B59630 ili soja SC5314 posle pojedinačnog ili kombinovanog lečenja sa imidazolom i DB. Srednje Log CFU vrednosti /-, SEM, su prikazane za bar 3 biološka replikata. Statistička analiza je izvedena za procenjivanje značajnih razlika između oba pojedinačna tretmana sa DB i ili mikonazolom (A i C) (150 μM), ketokonazolom (panel B) (300 mM) ili klotrimazolom (panel D) (150 mM) i kombinacijama (DMSO pozadina 1%). Testovi dvosmerne ANOVA i Tukey višestrukog upoređivanja su izvedeni i prikazane su značajne razlike.
[0085] (E-G) Preživljavanje ćelija biofilma C. albicans SC5314 posle pojedničnih ili kombinovanih lečenja sa antimikotikom i DB. Srednje Log CFU vrednosti /-, SEM, su prikazane za bar 2 biološka replikata. Statističke analize su izvedene za procenu značajnih razlika između oba pojedinačna tretmana sa DB i sa ili flukonazolom (panel E) (150 μM), itrakonazolom (panel F) (75 μM) ili posakonazolom (panel G) (285 μM) i kombinacijama (odgovarajuća DMSO pozadina 1%, 2% i 0,5% ). Testovi dvosmerne ANOVA i Tukey višestrukog upoređivanja su izvedeni i prikazane su P-vrednosti.
[0086] Koncentracione serije oba azola i DB su testirane i kombinacija, dajući najznačajnije smanjenje CFU, koje je prikazano na slici 11. Značajno smanjenje u CFUs je samo primećeno za kombinacije DB sa imidazolima koje je poređeno sa pojedinačnim tretmanima jedinjenja . Kombinacija MCZ i DB dovela je do značajnog smanjenja CFUs u poređenju sa tretmanima pojedinačnog jedinjenja za oba soja C. albicans SC5314 i soja B59630. U nekoliko slučajeva, lečenje sa ovim kombinacijama je doveo do potpune sterilnosti površine. Triazoli nisu pokazali značajnu aktivnost protiv biofilma ni sami ni u kombinaciji sa DB, ukazujući da primećena potencijacija imidazola sa DB je specifična za imidazol.
Primer 11. Potecijacija mikonazola sa domifen bromidom protiv biofilma C.glabrata
Materijali i postupci
[0087] Sojevi i hemikalije. C. glabrata soj BG2 je gajen na YPD (1% ekstrakt gljivica, 2% pepton (LabM, UK) i 2% glukoza (Sigma-Aldrich, USA)) pločama od agara na 30°C. Štok rastvori mikonazola (MCZ) (Sigma-Aldrich) su pripremljeni u DMSO. RPMI 1640 medijum (pH 7.0) sa L-glutaminom i bez natrijum bikarbonata je nabavljen kod Sigma-Aldrich i puferisan sa MOPS (Sigma-Aldrich). Domifen bromid (DB) je dobijen od Purna Pharmaceuticals.
[0088] „Checkboard“ test sa određivanjem minimalne inhibitorne koncentracije (MIC). Kultura C. glabrata BG2 preko noći gajena u YPD, je razblažena do optičke gustine od 0.1 (približno 10<6>ćelija/mL) u RPMI medijumu, prethodno zagrejana na 37°C.90 μL ćelijske suspenzije je dodato u bunarčiće ploče sa 96 bunarčića, koja sadrži 10 μL kombinacije MCZ i DB, odgovarajuće dvostrukog razblaženja duž redova i kolona (DMSO pozadina 2%). Posle obe inkubacije 24 h i 48 h na 37°C, merena je apsorbanca na 490 nm sa višemodnim čitačem (Synergy Mx multi-mode microplate reader, BioTek, USA).
Mikonazol je potenciran sa DB protiv planktonskih kultura C. glabrata
[0089] Domifen bromid (DB) je potencijator mikonazola protiv biofilmova C. glabrata . Da se odredi da li DB takođe potencira mikonazol protiv planktonskih kultura C. glabrata , minimalna inhibitorna koncentracija (MIC), koncentracija mikonazola koja vodi do smanjenja vidljivog rasta od 50% je određena pomoću „checkboard“ testa (slika 12). MIC vrednosti su odeđene pomoću Graphpad Prism 6 (tabela 8).
[0090] Slika 12 pokazuje da kombinovano lečenje MCZ-DB, smanjuje MIC vrednosti u poređenju sa pojedinačnim lečenjem MCZ protiv plaktonskih kultura C. glabrata . Vrednosti predstavljaju srednju vrednost vidljivog rasta 3 biološka ponavljanja (A) kao procenat kontolnog tretmana (2% DMSO) i (B) kao procenat pojedinačnog tretmana sa odgovarajućom koncentracijom DB. Za različite koncentracije DB, krive doza-odgovor mikonazola su prikazane u raličitim bojama (0 μM plava ; 0,78 μM crvena ; 1,56 μM zelena i 3,125 μM ljubičasta). Koncentraciona serija MCZ, u opsegu od 0,0075 μM do 1 mM je testirana. Merena je apsorbanca 24h posle tretiranja.
Tabela 8. MIC vrednosti za tretman od 24h kombinacijom MCZ-DB protiv planktonskih kultura C. glabrata . MIC vrednosti, značajno smanjene u poređenju sa pojedinačnim tretmanom sa MCZ, su označene zeleno sa ##. Graphpad Prism 6 je korišćena za izračunavanje MIC vrednosti
[0091] „Checkboard“ podaci pokazuju da, u prisustvu DB, mogu biti korišćene značajno manje koncentracije MCZ da smanji vidljivi rast 50% u poređenju sa pojedinačnim tretmanom mikonazola. Značajno smanjenje MIC vrednosti je primećeno za 3,125 μM DB.
[0092] Pored toga, benzalkonijum hlorid (BKC), još jedno kvaterarno amonijum jedinjenje, nije moglo potencirati MCZ protiv plaktonskih C. glabrata kultura (videti sliku 12C).

Claims (15)

  1. Patentni zahtevi
    1 Kompozicija za lokalnu upotrebu koja sadrži mikonazol ili njegovu so i domifen bromid kao aktivne sastojke za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije.
  2. 2. Kompozicija prema zahtevu 1, za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije, pri čemu je gljivična infekcija infekcija Candida sp.
  3. 3. Kompozicija prema zahtevu 1 ili 2 za upotrebu u lečenju ili prevenciji gljivične infekcije, u kojoj je gljivična infekcija infekcija Candida albicans ili Candida glabrata.
  4. 4. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za upotrebu u lečenju biofilma obrazovanog od Candida sp.
  5. 5. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 4, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju vulvovaginalne infekcije.
  6. 6. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 5, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju gljivične infekcije, koja je formulisana kao krema.
  7. 7. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 6, za upotrebu u lečenju ili sprečavanju gljivične infekcije, koja dalje sadrži mukoadheziv.
  8. 8. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, za upotrebu u lečenju ili spečavanju gljivične infekcije, gde molarni višak mikonazola ili njegove soli u odnosu na domifen bromid je između 2 i 4, ili gde je koncentracija mikonazola ili njegove soli u pomenutoj kompoziciji između 2 i 5% (mas/mas).
  9. 9. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fiziološki prihvatljiv nosač i sadrži kao aktivne antigljivične sastojke smešu mikonazola ili njegove soli i domifen bromida.
  10. 10. Kompozicija prema zahtevu 9, koja sadrži mikonazol nitrat.
  11. 11. Kompozicija prema zahtevu 9 ili 10, koja je krema sa viskoznošću između 300 cp i 300 cp na 180 oum.
  12. 12. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 do 11, koja ima pH između 2,7 i 3,5.
  13. 13. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 do 12, gde je molarni višak mikonazola ili njegove soli u odnosu na domifen bromid između 2 i 4, ili gde je koncentracija mikonazola ili njegove soli u pomenutoj kompoziciji između 2 i 5% (mas/mas).
  14. 14. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 do 13, koja dalje sadrži mukoadheziv.
  15. 15. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 9 do 14, koja je spakovana u aplikator za vaginalno davanje.
RS20211328A 2017-07-18 2018-07-05 Kompozicije protiv infekcija kandide RS62502B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1711512.2A GB201711512D0 (en) 2017-07-18 2017-07-18 Compositions against candida infections
LU100445 2017-09-20
EP18745504.3A EP3654973B1 (en) 2017-07-18 2018-07-05 Compositions against candida infections
PCT/EP2018/068192 WO2019015975A1 (en) 2017-07-18 2018-07-05 COMPOSITIONS AGAINST CANDIDA INFECTIONS

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62502B1 true RS62502B1 (sr) 2021-11-30

Family

ID=63012980

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211328A RS62502B1 (sr) 2017-07-18 2018-07-05 Kompozicije protiv infekcija kandide

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11793790B2 (sr)
EP (2) EP3949962B1 (sr)
CY (1) CY1125444T1 (sr)
DK (1) DK3654973T3 (sr)
ES (2) ES2960745T3 (sr)
HR (1) HRP20211731T1 (sr)
HU (1) HUE056271T2 (sr)
LT (1) LT3654973T (sr)
PL (2) PL3949962T3 (sr)
PT (1) PT3654973T (sr)
RS (1) RS62502B1 (sr)
SI (1) SI3654973T1 (sr)
WO (1) WO2019015975A1 (sr)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116077499B (zh) * 2022-11-28 2024-10-29 徐州医科大学 一种抗耐唑型烟曲霉的药物组合物及其应用
KR20260049629A (ko) * 2023-08-08 2026-04-14 카톨리에케 유니버시테이트 루벤 세균성 질염 치료에 사용하기 위한 조성물
WO2026027529A1 (en) 2024-07-29 2026-02-05 Fhp Bv Compositions for treating vaginal candida (biofilm) infections with improved relapse prevention

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU513753B2 (en) * 1974-07-08 1980-12-18 Johnson & Johnson Antimicrobial composition
ATE70158T1 (de) * 1985-09-24 1991-12-15 Ss Pharmaceutical Co Fungizides mittel.
AU701554B2 (en) * 1995-06-07 1999-01-28 Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. Antifungal compositions
US7868162B2 (en) * 1998-12-30 2011-01-11 Lakewood-Amedex, Inc. Antimicrobial and antiviral compounds and methods for their use
IL143477A (en) * 2001-05-31 2009-07-20 Finetech Pharmaceutical Ltd Process for the preparation of 17-phenyl-18,19,20-trinor-pgf2?? and its derivatives
JP2004512317A (ja) * 2000-10-26 2004-04-22 メルク　エンド　カムパニー　インコーポレーテッド タキキニン受容体拮抗薬の哺乳動物の代謝産物
EP3089750A2 (en) * 2014-01-02 2016-11-09 Cook Medical Technologies LLC Compositions, devices and methods for treating infections
US9782333B2 (en) * 2015-01-21 2017-10-10 Chattem Inc. Oral composition for xerostomia

Also Published As

Publication number Publication date
HRP20211731T1 (hr) 2022-02-18
LT3654973T (lt) 2021-11-25
WO2019015975A1 (en) 2019-01-24
EP3949962A1 (en) 2022-02-09
PL3949962T3 (pl) 2024-03-18
PT3654973T (pt) 2021-10-15
EP3654973B1 (en) 2021-08-18
US12329743B2 (en) 2025-06-17
US11793790B2 (en) 2023-10-24
ES2895653T3 (es) 2022-02-22
US20230414570A1 (en) 2023-12-28
EP3654973A1 (en) 2020-05-27
EP3949962C0 (en) 2023-09-13
EP3949962B1 (en) 2023-09-13
HUE056271T2 (hu) 2022-02-28
US20200138786A1 (en) 2020-05-07
ES2960745T3 (es) 2024-03-06
PL3654973T3 (pl) 2022-01-17
SI3654973T1 (sl) 2021-12-31
CY1125444T1 (el) 2023-03-24
DK3654973T3 (da) 2021-11-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12329743B2 (en) Compositions against Candida infections
JP6182141B2 (ja) 抗真菌剤の効果を高めるアルギネートオリゴマーの使用
JP7322259B2 (ja) 真菌感染の処置のための投薬レジメン
Sogut et al. Erdosteine prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats
Sun et al. Caffeic acid phenethyl ester synergistically enhances the antifungal activity of fluconazole against resistant Candida albicans
KR20170036058A (ko) 코 적용을 위한 시네올-함유 조성물
EP3192507A1 (de) Verwendung von kombinationspräparaten, umfassend antimykotika
CN115120602A (zh) 一种抗真菌药物增效剂
Scorzoni et al. Antifungal and anti-biofilm effect of the calcium channel blocker verapamil on non-albicans Candida species
Lima et al. Antifungal effect of hydroethanolic extract of Fridericia chica (Bonpl.) LG Lohmann leaves and its therapeutic use in a vulvovaginal candidosis model
TWI805600B (zh) 在酸性ph值下具有經增強活性之抗真菌劑
WO2011115585A1 (en) Pharmaceutical combination of acetylsalicylic acid and antifungal compound for destroying or growth inhibition and reproduction of fungi
Joseph et al. Antifungal therapy in eye infections: new drugs, new trends
HK40069643A (en) Compositions against candida infections
JP6714597B2 (ja) 真菌症（ｍｙｃｏｓｉｓ）の治療のための医薬組成物
CN102724977B (zh) 富里酸与氟康唑或两性霉素b组合用于真菌感染的治疗
US20040092588A1 (en) Antiseptic for wounds and mucous membranes
RU2337689C1 (ru) Средство для лечения поверхностных микозов
EP3769622A1 (en) Antimycotic
US8192750B2 (en) Pharmaceutical composition for the treatment of otomycosis
de Almeida Teixeira et al. Fungicidal and antibiofilm activities of 2-Bromo-N-phenylacetamide against fluconazole-resistant Candida spp.: A promising antifungal agent
WO2011119119A2 (en) The combination of antifungal compound and modifier of proton homeostasis for destroying or growth inhibition and reproduction of fungi
RU2783649C2 (ru) Жидкая фармацевтическая композиция нафтифина
WO2026027529A1 (en) Compositions for treating vaginal candida (biofilm) infections with improved relapse prevention
Müller Biofilm formation and its impact on antifungal therapy