RS62530B1 - Sastavi za sekvenciranje nukleinskih kiselina - Google Patents

Description

Opis

STANJE TEHNIKE

[0001] Detektovanje analita, poput sekvenci nukleinskih kiselina prisutnih u biološkom uzorku, korišćeno je kao postupak za identifikaciju i klasifikaciju mikroorganizama, dijagnostikovanje zaraznih bolesti, detektovanje i karakterizaciju genetskih abnormalnosti, identifikovanje genetskih promena povezanih sa rakom, proučavanje genetske podložnosti bolesti, i merenje odgovora na različite vrste tretmana. Uobičajena tehnika za detektovanje analita kao što su sekvence nukleinske kiseline u biološkom uzorku, je sekvenciranje nukleinskih kiselina.

[0002] Metodologija sekvenciranja nukleinskih kiselina značajno je evoluirala od postupaka hemijske degradacije koje su koristili Maxam i Gilbert, i od postupaka produženja lanaca koje je koristio Sanger. Danas se koristi nekoliko metodologija sekvenciranja koje omogućavaju paralelnu obradu hiljada nukleinskih kiselina, sve u jednom nizu sekvenciranja. Instrumenti koji izvode takve postupke su obično veliki i skupi jer se današnji postupci obično oslanjaju na velike količine skupih reagensa i više setova optičkih filtera za snimanje inkorporisanja nukleinske kiseline u reakcije sekvenciranja.

[0003] Postalo je jasno da će potreba za visokopropusnom, manjom, jeftinijom tehnologijom sekvenciranja DNK biti korisna za potpuno iskorišćavanje sekvenciranja genoma.

Personalizovana zdravstvena zaštita napreduje i imaće koristi od takvih tehnologija; sekvenciranje genoma pojedinca radi identifikacije potencijalnih mutacija i abnormalnosti biće od ključnog značaja za identifikaciju da li osoba ima određenu bolest, nakon čega slede naknadne terapije prilagođene toj osobi. Kako bi se prilagodilo tako agresivnom poduhvatu, sekvenciranje bi trebalo da napreduje i otvori se tehnologijama velike propusnosti, ne samo zbog svojih visokih mogućnosti propusnosti, već i u smislu jednostavnosti upotrebe, vremenske i troškovne efikasnosti, te pristupa kliničara instrumentima i reagensima.

[0004] WO2009/097368 se odnosi na postupak sekvenciranja ligacijom i predlaže razliku između četiri moguća nukleotida koristeći manje od četiri jedinstvene oznake, npr. korišćenjem dve različite oznake, gde se jedan nukleotid detektuje kombinacijom dve oznake, a drugi se detektuje usled odsustva oznake.

SAŽETAK

[0005] Pronalazak je definisan opsegom priloženih patentnih zahteva.

[0006] Postojeće reakcije sekvenciranja zasnovane na fluorescenciji razlikuju uključivanje različitih nukleotida u rastući lanac nukleinske kiseline pričvršćivanjem fluorescentnog dela na svaki od četiri nukleotida, A T C i G. Obično se svaki od fluorescentnih delova pobuđuje i emituje na različitim talasnim dužinama, i tako se određuje ciljana sekvenca. Nasuprot tome, predmetno obelodanjenje predviđa određivanje sekvence, na primer sekvence nukleinske kiseline, koristeći minimalni set boja, minimalne pobuđivačke izvore svetlosti i minimalne optičke emisione filtere, dok i dalje omogućava razlikovanje inkorporisanja sva četiri nukleotida u reakciji sekvenciranja. Predmetno obelodanjenje pruža postupke i sastave pogodne za bilo koji fluorescentni sistem gde se želi više od jednog analita za detektovanje. Međutim, posebne prednosti se nalaze pri primeni ovde navedenih postupaka na metodologije sekvenciranja, kao što je sekvenciranje putem sinteze.

[0007] Instrumenti i sistemi za detektovanje fluorescentnog sekvenciranja u četiri boje su veliki i skupi za rad, ne samo po ceni instrumenta, već i po reagensima, pa stoga nisu baš privlačni za manje sredine sa ograničenjima kapitala. Postupci i sastavi koji bi smanjili troškove i/ili veličinu povezane sa detektovanjem fluorescencije u četiri boje, na primer za sekvenciranje genoma, istraživačima bi dale efikasnije alate u smislu vremenske efikasnosti, manje upotrebe reagensa, manjih i jeftinijih instrumenata i slično, za upotrebu u njihovim istraživačkim poduhvatima.

[0008] Otelotvorenja predmetnog obelodanjenja pružaju te opcije tako što istraživačima pružaju postupke i sastave za određivanje sekvence polimera, na primer sekvence nukleinske kiseline, koja se sastoji od upotrebe minimalnog seta boja, minimalnih izvora svetlosti i minimalnih filtera za pobuđivanje/emitovanje, dok još uvek dozvoljava diferencijacija monomernih tipova (npr. različitih nukleotida) uključenih u reakciju sekvenciranja.

[0009] Ovde opisani aspekti predviđaju određivanje sekvence nukleinske kiseline na osnovu vremenskog rasporeda događaja i memorisanje tih događaja u „vreme-prostoru“. Predmetno obelodanjenje pruža otelotvorenja za upotrebu jedne boje, ili više boja istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja, ili dve ili više boja različitih spektara fluorescencije, za određivanje prisustva analita, na primer nukleotida, u uzorku, koristeći događaje snimanja zasnovane na vreme-prostoru. Kao što je ovde opisano, reakcije sekvenciranja u vremeprostoru koriste jednu ili više hemija i snimanja događaja ili koraka za razlikovanje mnoštva analita, na primer četiri nukleotida, koji su inkorporisani u rastući lanac nukleinske kiseline tokom reakcije sekvenciranja.

[0010] U nekim otelotvorenjima, manje od četiri različite boje mogu se detektovati u smeši koja ima četiri različita nukleotida, a da ipak rezultuje određivanjem četiri različita nukleotida, na primer u reakciji sekvenciranja. Kao prvi primer, par tipova nukleotida može se detektovati na istoj talasnoj dužini, ali razlikovati ih na osnovu razlike u intenzitetu za jednog člana para u odnosu na drugog ili na osnovu promene na jednog člana para (npr. putem hemijske modifikacije, fotohemijske modifikacije ili fizičke modifikacije) koja uzrokuje pojavljivanje ili nestanak prividnog signala u poređenju sa signalom detektovanim za drugog člana para. Kao drugi primer, tri od četiri različita tipa nukleotida mogu se detektovati pod određenim uslovima, dok četvrtom nukleotidnom tipu nedostaje oznaka koja se može detektovati pod tim uslovima, ili je minimalno detektovana u tim uslovima (npr. minimalno detektovanje zbog pozadinske fluorescencije itd.). Uključivanje prva tri tipa nukleotida u nukleinsku kiselinu može se odrediti na osnovu prisustva njihovih odgovarajućih signala, i uključivanje četvrtog tipa nukleotida u nukleinsku kiselinu može se utvrditi na osnovu odsustva ili minimalnog detektovanja bilo kog signala. Kao treći primer, jedan tip nukleotida može uključivati oznake koje su detektovane u dva različita kanala, dok se drugi tipovi nukleotida detektuju u najviše jednom od kanala.

[0011] Gore navedene tri primerne konfiguracije ne smatraju se međusobno isključivim i mogu se koristiti u različitim kombinacijama. Primer otelotvorenja koji kombinuje sva tri primera je SBS postupak na bazi fluorescencije koji koristi prvi tip nukleotida koji je detektovan u prvom kanalu (npr. DATP ima oznaku koja se detektuje u prvom kanalu kada je pobuđena prvom talasnom dužinom pobuđivanja), drugi tip nukleotida koji se detektuje u drugom kanalu (npr. dCTP sa oznakom koja se detektuje u drugom kanalu kada se pobuđuje drugom talasnom dužinom pobuđivanja), treći tip nukleotida koji se detektuje i u prvom i u drugom kanalu (npr. dTTP koji ima najmanje jednu oznaku koja se detektuje u oba kanala kada je pobuđena prvom i/ili drugom talasnom dužinom pobuđivanja) i četvrti tip nukleotida kom nedostaje oznaka koja nije, ili je minimalno, detektovana u oba kanala (npr. dGTP koji nema oznaku).

[0012] U ovom primeru, niz karakteristika nukleinske kiseline može se tretirati sa sva četiri tipa nukleotida tako da se događaj proširenja javlja u suštini na svim karakteristikama pre događaja detektovanja, i karakteristike se detektuju u samo jednom događaju snimanja, u samo dva događaja snimanja tokom detektovanja. Prva slika dobijena upotrebom prve talasne dužine pobuđivanja i emitovanja u prvom kanalu može detektovati i pokazati karakteristike koje uključuju prvi i/ili treći tip nukleotida (npr. A i/ili T). Druga slika dobijena korišćenjem druge talasne dužine pobuđivanja i emitovanja u drugom kanalu može detektovati i pokazati karakteristike koje uključuju drugu i/ili treću vrstu nukleotida (npr. C i/ili T). Nedvosmislena identifikacija tipa nukleotida inkorporisanog u svaku karakteristiku može se odrediti, na primer, upoređivanjem dve slike kako bi se došlo do narednog: karakteristike koje se javljaju (tj. detektuju) maksimalno u prvom kanalu koji sadrži prvi tip nukleotida (npr. A), karakteristike koje se maksimalno javljaju u drugom kanalu koji uključuje drugi tip nukleotida (npr. C), karakteristike koje se javljaju u oba kanala uključujući treći tip nukleotida (npr. T) i karakteristike koje se ne javljaju, ili su minimalno detektovane, u oba kanala koji sadrže četvrti tip nukleotida (npr. G).

[0013] Alternativno, inkorporisanje četiri nukleotida može se odrediti koristeći samo jedan kombinovani događaj snimanja. Na primer, inkorporisanje označenih tipova nukleotida može se odrediti izlaganjem inkorporisanih nukleotida dvema talasnim dužinama pobuđivanja u isto vreme (npr. istovremeno) i hvatanjem spektra emitovanja na jednoj kombinovanoj slici. Nedvosmislena identifikacija inkorporisanih tipova nukleotida mogla bi se utvrditi kao što je prethodno navedeno; karakteristike koje se javljaju u jednom kanalu kombinovane slike ukazivale bi na inkorporisanje tog označenog tipa nukleotida (npr. A), karakteristike koje se javljaju u drugom kanalu kombinovane slike ukazivale bi na inkorporisanje tog označenog tipa nukleotida (npr. C) i karakteristike koje se javljaju u oba kanala ukazuju na inkorporisanje trećeg nukleotidnog tipa (npr. T). Pošto jedan od tipova nukleotida nije označen (npr. G), inkorporisanje je određena odsustvom ili minimalno merljivim karakteristikama u oba kanala za taj neoznačeni nukleotid. Treba imati na umu da se mesta karakteristika koje sadrže G u ovom primeru može odrediti iz drugih ciklusa (gde je inkorporisan najmanje jedan od preostala tri tipa nukleotida).

[0014] U jednom otelotvorenja predmetnog obelodanjenja, pruženi su postupci za određivanje sekvence polinukleotida koji se sastoje od detektovanja u reakciji sekvenciranja inkorporisanja tri različite vrste detektovanih konjugata nukleotida u polinukleotid i određivanja inkorporisanja četvrtog tipa nukleotida na osnovu obrasca detektovanja tri različite vrste nukleotida koji se mogu detektovati u polinukleotid, čime se određuje sekvenca polinukleotida, gde se inkorporisanje tri različite vrste detektovanih nukleotidnih konjugata detektuje iz signalnog stanja i gde se utvrđuje inkorporisanje četvrtog tipa nukleotida iz mračnog stanja.

[0015] U narednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje pruža postupke za određivanje sekvence polinukleotida koji se sastoje od nanošenja na uzorak polinukleotida za sekvenciranje rastvora koji sadrži četiri modifikovana tipa nukleotida gde su tri modifikovana tipa nukleotida konjugovana na jedan ili više detekcionih delova i jedan ili više veznika pozicioniranih između nukleotida i jednog ili više detekcionih delova, i gde četvrtom nukleotidnom tipu nedostaje detekcioni deo, obrazac detektovanja inkorporisanja navedenih modifikovanih nukleotida u reakciji sekvenciranja, čime se hvata prvi obrazac koji se može detektovati, primenjujući jedan ili više sastava na reakciju sekvenciranja menjajući tako prvi obrazac detektovanja, detektujući drugi obrazac detektovanja i određujući sekvencu polinukleotidnog uzorka na osnovu obrazaca detektovanja.

[0016] U nekim otelotvorenjima, polinukleotid za sekvenciranje sadrži jednu ili više dezoksiribonukleinskih kiselina, modifikovanih dezoksiribonukleinskih kiselina, ribonukleinskih kiselina i modifikovanih ribonukleinskih kiselina. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid za sekvenciranje je priprema genomske DNK biblioteke. U nekim otelotvorenjima, nukleotidni konjugat sadrži nukleotidne tipove izabrane iz grupe koju čine dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP ili njihovi neprirodni nukleotidni analozi. U nekim otelotvorenjima, neprirodni nukleotidni analog sadrži reverzibilni terminatorski deo i izabran je iz grupe koju čine rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP i rbGTP. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje nukleotida je sekvenca sintezom, sekvenca ligacijom i sekvenca hibridizacijom ili njihova kombinacija. U nekim otelotvorenjima, tri konjugata nukleotidnog tipa su detektovana detektovanjem fluorescentnog dela. U nekim otelotvorenjima, fluorescentni deo je isti za tri nukleotidna konjugata, dok je u drugim otelotvorenjima fluorescentni deo jedan ili više različitih fluorescentnih delova. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više različitih fluorescentnih delova se detektuju istim emisionim filterom. U nekim otelotvorenjima, fluorescentni deo sadrži deo sistema za prenos energije fluorescentne rezonance. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje četvrtog nukleotida je određena nedostatkom detektovanja. U nekim otelotvorenjima, detektovani konjugati nukleinske kiseline se detektuju fluorescencijom. U nekim otelotvorenjima, fluorescencija se detektuje prvim i drugim događajem snimanja, u daljim otelotvorenjima prvi i drugi događaj snimanja su vremenski razdvojeni. U nekim otelotvorenjima, prvi događaj snimanja detektuje obrazac fluorescencije koji se razlikuje od obrasca fluorescencije koji je detektovao drugi događaj snimanja. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje jednog ili više nukleotida je određena razlikom u obrascu fluorescencije između prvog i drugog događaja snimanja. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više konjugata nukleotidnog tipa dalje sadrže jednu ili više vezničkih sekvenci, u daljim otelotvorenjima jedna ili više vezničkih sekvenci sadrže jedan ili više razdvojivih veznika i odstojnika. U nekim otelotvorenjima, razdvojivi veznik sadrži jednu ili više grupa razdvojivih veza izabranih iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar, dok u poželjnim otelotvorenjima grupa razdvojive veze jeste disulfid. U nekim otelotvorenjima, odstojnik je jedan ili više od polietilen glikola ili njihovih konkatamera i 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više odstojnika dalje sadrže jednu ili više grupa razdvojivih veza, gde je grupa razdvojivih veza odabrana iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar. U nekim otelotvorenjima, odstojnik je polietilen glikol ili njegovi konkatameri, dok u drugim otelotvorenjima odstojnik jeste 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetna kiselina. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrže polietilen glikolni veznik i veznik 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline koji može ali ne mora dalje da sadrži hapten i fluorescentni deo. U nekim otelotvorenjima, hapten je izabran iz grupe koju čine biotin, digoksigenin i dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži konjugat streptavidin-fluorescentnog dela, dok u drugim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži konjugat anti-hapten antitelo-fluorescentni deo izabran iz grupe koju čine anti-digoksigenin i anti-dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, nukleotidni konjugat koji sadrži polietilen glikolni veznik i veznik 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline dalje sadrži dva fluorescentna dela. U nekim otelotvorenjima, dva fluorescentna dela čine sistem prenosa energije fluorescentnom rezonancom.

[0017] Dodatno otelotvorenje predmetnog obelodanjenja pruža sastav za sekvenciranje nukleinske kiseline koji sadrži tri modifikovana tipa nukleotida koji se mogu detektovati fluorescentnim delom i četvrti modifikovani tip nukleotida, gde navedeni četvrti modifikovani tip nukleotida nije detektovan fluorescentnim delom i gde je inkorporisanje četiri modifikovana tipa nukleotida u sastavu u reakciju sekvenciranja određena fluorescentnim detektovanjem tri detektovana modifikovana tipa nukleotida u sastavu. U nekim otelotvorenjima, nukleinska kiselina sastava sadrži DNK iz preparata DNK biblioteke. U nekim otelotvorenjima, modifikovani tip nukleotida sadrži reverzibilni terminatorski deo i izabran je iz grupe koju čine rbATP, rbTTP, rbUTP, rbCTP i rbGTP. U nekim otelotvorenjima, reakcija sekvenciranja je sekvenca sintezom, sekvenca ligacijom ili sekvenca hibridizacijom. U nekim otelotvorenjima, fluorescentni deo je isti za tri modifikovana nukleotida. U nekim otelotvorenjima, fluorescentni deo je jedan ili više različitih fluorescentnih delova koje je poželjno detektovati istim emisionim filterom. U nekim otelotvorenjima, uključivanje tri modifikovana tipa nukleotida je određeno prvim uzorkom fluorescentnog snimanja i drugim uzorkom fluorescentnog snimanja. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje četvrtog nukleotidnog tipa određena je obrascima fluorescentnog snimanja ostala tri tipa nukleotida. U nekim otelotvorenjima, ovde opisani sastavi koji sadrže jedan ili više modifikovanih tipova nukleotida dalje sadrže jednu ili više vezničkih sekvenci. U nekim otelotvorenjima, jedna ili više vezničkih sekvenci sadrže jedan ili više razdvojivih veznika i odstojnik, gde razdvojivi veznik sadrži jednu ili više grupa razdvojivih veza izabranih iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar, poželjno je da je grupa razdvojivih veznika disulfid. U nekim otelotvorenjima, odstojnik je jedan ili više od polietilen glikola ili njihovih konkatamera i 2-{2-[3-(2-aminoetilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline, gde su ponekad poželjni konkatameri polietilen glikola koji uključuju između četiri i dvanaest molekula polietilen glikola. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više odstojnika dalje sadrže jednu ili više grupa razdvojivih veza, kako je prethodno opisano. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više od tri modifikovana tipa nukleotida sadrže polietilen glikolni veznik i veznik 2-{2-[3-(2-aminoetilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline, dok neka poželjna otelotvorenja dalje sadrže hapten i fluorescentni deo. U nekim otelotvorenjima, hapten je izabran iz grupe koju čine biotin, digoksigenin i dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, hapten se detektuje pomoću hapten vezujući partner-fluorescentni deo konjugata ili antihapten antitelo-fluorescentni deo konjugata. U nekim otelotvorenjima, anti-hapten antitelo je odabrano od anti-digoksigenina i anti-dinitrofenola. U nekim otelotvorenjima, navedeni hapten vezujući partner je streptavidin. U nekim otelotvorenjima, navedeni modifikovani tipovi nukleotida koji se mogu detektovati fluorescentnim delom su konjugovani sa jednim ili više razdvojivih veznika i odstojnika ili njihove kombinacije, gde je veznik konjugovan sa fluorescentnim delom ili haptenom, i gde modifikovani nukleotid koji se ne može detektovati fluorescentnim delom nije tako konjugovan.

[0018] Dodatno otelotvorenje kao što je ovde obelodanjeno pruža postupak za određivanje mnoštva sekvenci nukleinskih kiselina, koji obuhvata pružanje uzorka koji sadrži mnoštvo različitih nukleinskih kiselina, od kojih svaka nukleinska kiselina sadrži obrazac i prajmer; izvođenje ciklusa reakcije sekvenciranja, gde ciklus obuhvata proširivanje prajmera za nukleinske kiseline u uzorku kako bi se formiralo mnoštvo proširenih prajmera koji imaju najmanje četiri različita tipa nukleotida, čime se formira prošireni uzorak, prikupivši prvu zbirku signala iz proširenog uzorka, gde nisu više od tri različita tipa nukleotida u proširenim prajmerima u signalnom stanju i gde je najmanje jedan od različitih tipova nukleotida u proširenim prajmerima u tamnom stanju; tretiranje proširenog uzorka modifikacionim reagensom, gde je najmanje jedan od različitih tipova nukleotida u proširenim prajmerima modifikovan, čime se proizvodi modifikovani uzorak i dobija druga zbirka signala iz modifikovanog uzorka, gde se najmanje jedan od različitih tipova nukleotida nalazi u različitom stanju u prvoj zbirci signala u poređenju sa drugom zbirkom signala; i određivanje sekvenci za mnoštvo različitih nukleinskih kiselina procenom prve zbirke signala i druge zbirke signala iz ciklusa. U nekim otelotvorenjima, mnoštvo različitih nukleinskih kiselina je vezano za supstrat. U nekim otelotvorenjima, proširivanje prajmera obuhvata dodavanje različitih tipova nukleotida katalizovano polimerazom. U nekim otelotvorenjima, različiti tipovi nukleotida obuhvataju reverzibilne blokirajuće delove, gde se po jedan tip nukleotida dodaje svakom od proširenih prajmera u svakom od ciklusa. U nekim otelotvorenjima, proširivanje prajmera obuhvata dodavanje oligonukleotida katalizovano ligazom, koje sadrži različite tipove nukleotida. U nekim otelotvorenjima, ne više od dva različita tipa nukleotida u proširenim prajmerima su u signalnom stanju tokom prikupljanja prve zbirke signala iz proširenog uzorka, dok su u drugim otelotvorenjima najmanje dva različita tipa nukleotida u proširenim prajmerima u tamnom stanju tokom prikupljanja prve zbirke signala iz proširenog uzorka. U nekim otelotvorenjima, jedan od različitih tipova nukleotida u proširenim prajmerima je u tamnom stanju tokom prikupljanja prve zbirke signala iz proširenog uzorka. U nekim otelotvorenjima, tretiranje proširenog uzorka modifikujućim reagensom obuhvata uklanjanje oznake sa nukleotidnog tipa ili dodavanje oznake nukleotidnom tipu. U nekim otelotvorenjima, najmanje dva različita tipa nukleotida u proširenim prajmerima su modifikovana tretiranjem proširenog uzorka reagensom za modifikaciju, dok su u drugim otelotvorenjima ne više od 3 različita tipa nukleotida u proširenim prajmerima modifikovana tretiranjem proširenog uzorka modifikujućim reagensom. U nekim otelotvorenjima proširivanje prajmera za nukleinske kiseline u uzorku čini mnoštvo proširenih prajmera koji nemaju više od četiri različita tipa nukleotida, dok u drugim otelotvorenjima proširivanje prajmera za nukleinske kiseline u uzorku čini mnoštvo proširenih prajmera koji imaju najmanje pet različitih tipova nukleotida. U nekim otelotvorenjima, dva različita tipa nukleotida nadopunjuju isti nukleotid u nukleinskoj kiselini, gde je prvi od dva različita tipa nukleotida u signalnom stanju tokom akvizicije prve zbirke signala, i gde je drugi od dva različita tipa nukleotida u mračnom stanju tokom prikupljanja prve zbirke signala. U nekim otelotvorenjima, prvi od dva različita tipa nukleotida je u tamnom stanju tokom prikupljanja druge zbirke signala. U nekim otelotvorenjima, drugi od dva različita tipa nukleotida je u signalnom stanju tokom akvizicije druge zbirke signala. U poželjnim otelotvorenjima, reakcioni ciklus sekvenciranja, kako je prethodno opisano, ponavlja se jedan ili više puta.

[0019] U narednom otelotvorenju, predmetno obelodanjenje pruža postupak za određivanje sekvence polinukleotida koji se sastoji od detektovanja događaja snimanjem inkorporisanja tri različite vrste detektovanih nukleotidnih konjugata u polinukleotid i određivanja inkorporisanja četvrtog tipa nukleotida na osnovu obrasca detektovanja tri različita tipa nukleotida koji se mogu detektovati u polinukleotid, gde detektovanje obuhvata manje događaja snimanja nego različite vrste detektovanih nukleotidnih konjugata. U nekim otelotvorenjima, polinukleotid sadrži jednu ili više dezoksiribonukleinskih kiselina, modifikovanih dezoksiribonukleinskih kiselina, ribonukleinskih kiselina ili modifikovanih ribonukleinskih kiselina. U nekim otelotvorenjima, nukleotidni konjugat sadrži nukleotidne tipove izabrane iz grupe koju čine dATP, dTTP, dUTP, dCTP, dGTP ili njihovi neprirodni nukleotidni analozi, gde analog neprirodnog nukleotida sadrži reverzibilni terminatorski deo i izabran je iz grupe koji se sastoji od rbATP, rbTTP, rbCTP, rbUTP i rbGTP. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje nukleotida je sekvenca sintezom, sekvenca ligacijom ili sekvenca hibridizacijom. U nekim otelotvorenjima, tri konjugata nukleotidnog tipa su detektovana detektovanjem fluorescentnog dela, gde je fluorescentni deo isti za tri nukleotidna konjugata ili gde je fluorescentni deo jedan ili više različitih fluorescentnih delova. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više različitih fluorescentnih delova se detektuju

1

istim emisionim filterom. U nekim otelotvorenjima, fluorescentni deo sadrži deo sistema za prenos energije fluorescentne rezonance. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje četvrtog nukleotida je određena nedostatkom detektovanja. U nekim otelotvorenjima, detektovani konjugati nukleinske kiseline se detektuju fluorescencijom, gde se fluorescencija detektuje događajima snimanja. U nekim otelotvorenjima, događaji snimanja obuhvataju prvi i drugi događaj snimanja, na primer, koji su vremenski razdvojeni. U nekim otelotvorenjima, prvi događaj snimanja detektuje obrazac fluorescencije koji se razlikuje od obrasca fluorescencije koji je detektovao drugi događaj snimanja. U nekim otelotvorenjima, inkorporisanje jednog ili više nukleotida je određena razlikom u obrascu fluorescencije između prvog i drugog događaja snimanja. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više konjugata nukleotidnog tipa dalje sadrže jednu ili više vezničkih sekvenci koje sadrže jedan ili više razdvojivih veznika i odstojnika. U nekim otelotvorenjima, razdvojivi veznik sadrži jednu ili više grupa razdvojivih veza izabranih iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar, poželjno je da grupa razdvojivih veza jeste disulfid. U nekim otelotvorenjima, odstojnik je jedan ili više od polietilen glikola ili njihovih konkatamera i 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više odstojnika dalje sadrže jednu ili više grupa razdvojivih veza, gde je grupa razdvojivih veza odabrana iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar. U nekim otelotvorenjima, odstojnik je polietilen glikol ili njegovi konkatameri ili 2-{2-[3-(2-aminoetilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetna kiselina ili oboje. U nekim otelotvorenjima, nukleotidni konjugat koji sadrži polietilen glikolni veznik i veznik 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetne kiseline dalje sadrži hapten i fluorescentni deo u kom je hapten izabran iz grupe koju čine biotin, digoksigenin i dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži streptavidin-fluorescentni deo konjugat. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži anti-hapten antitelo-fluorescentni deo konjugat izabran iz grupe koju čine anti-digoksigenin i anti-dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, nukleotidni konjugat koji sadrži polietilen glikolni veznik i veznik 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azidoetoksi}-etoksi-sirćetne kiseline dalje sadrži dva fluorescentna dela. U nekim otelotvorenjima, dva fluorescentna dela čine sistem prenosa energije fluorescentnom rezonancom. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata dalje sadrže hapten ili fluorescentni deo, gde je hapten izabran iz grupe koju čine biotin, digoksigenin i dinitrofenol. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži streptavidin-fluorescentni deo konjugata. U nekim otelotvorenjima, jedan ili više nukleotidnih konjugata sadrži anti-hapten antitelo-fluorescentni deo konjugata izabran iz grupe koju čine anti-digoksigenin i antidinitrofenol.

SLIKE

[0020]

Slika 1 prikazuje primerne toplotne mape tipa oblaka ili grafikone oblaka za cikluse u reakciji sekvenciranja. Grafikoni predstavljaju kompozit slike 1 (x osa) i slike 2 (y osa), tako da grafikoni predstavljaju sliku fluorescencije nakon potpunog ciklusa. Položaj A, C, G i T na grafikonu oblaka prikazan je na donjoj mapi oblaka.

Slika 2 prikazuje primere grafikona koji prikazuju procenat grešaka u procentima (Y osa) (gore) i prazne osnovne pozive (dole) u reakciji sekvenciranja na ciklus po ciklus bazi (X osa).

Slika 3 prikazuje A) spektre emitovanja za dve primerne boje i B) primerni grafikon oblaka za ciklus sekvenciranja kada se izvodi upotreba dve boje različitih spektara fluorescencije za sekvenciranje.

Slika 4 prikazuje A) spektre emitovanja za dva uzorna seta boja i B) primerni grafikon oblaka za ciklus sekvenciranja kada se izvodi korišćenje dva seta boja različitih spektara emitovanja za sekvenciranje.

Slika 5 prikazuje A) stopu grešaka osnovnih poziva za eksperiment koji koristi jednu boju u reakciji sekvenciranja, B) uzorne fluorescentne obrasce za svaki od modifikovanih nukleotida u prvom događaju snimanja (Slika 1) koristeći samo jednu boju, C) primer fluorescentnih obrazaca za svaki od modifikovanih nukleotida u drugom događaju snimanja (Slika 2) koristeći samo jednu boju, i D) grafikon oblaka koji kombinuje prvi i drugi događaj snimanja iz reakcije sekvenciranja gde se za razlikovanje koriste samo jedna boja i dva događaja snimanja između četiri različita nukleotida prisutna za inkorporisanje tokom reakcije sekvenciranja.

DETALJAN OPIS

[0021] Trenutne tehnologije zasnovane na fluorescenciji koje se koriste za razlikovanje različitih analita u uzorku, kao što se vidi u tehnologijama sekvenciranja (tj. tehnologijama fluorescentnog sekvenciranja), zasnovane su, na primer, na kvalitetu signala koji generiše ostatak detektovanja koji je povezan sa određenom vrstom nukleotida. Na primer, tradicionalne tehnologije fluorescentnog sekvenciranja koriste prepoznatljivo različite fluorescentnog dela, od kojih je svaka vezana za jedan od četiri nukleotida A, T, C i G koji se koriste u reakciji sekvenciranja. Fluorescentno označeni nukleotidi koji se koriste tokom reakcije sekvenciranja, bez obzira na njihov način upotrebe, obično se pobuđuju i mere pomoću jednog od četiri optička filtera (tj. po jedan za svaku različitu boju) u instrumentu za fluorescentno sekvenciranje. Tehnologija sekvenciranja sintezom (SBS), kao i tehnologija sekvenciranja terminatora boje koja koristi didezoksinukleotide, primeri su četvorokanalnih tehnologija sekvenciranja zasnovanih na fluorescenciji. Instrumenti za sekvenciranje zasnovano na fluorescenciji su obično veliki, skupi i neprivlačni za manje i kapitalno ograničenije sredine. Nove tehnologije sekvenciranja obično koriste inovativne postupke, sisteme i sastave kako bi napredovale u postizanju preciznosti (tj. manje grešaka), sa većom propusnom sposobnošću (tj. više genomskih sekvenci u datom vremenskom periodu) i/ili smanjenju troškova (tj. < $10,000/genom) i poželjno je da otisak ne prelazi mali prostor na radnoj površini ispitivača.

[0022] Predmetno obelodanjenje pruža rešenja za unapređenje polja sekvenciranja nukleinskih kiselina. Otelotvorenja obelodanjuju postupke i sastave koje koriste minimalne detekcione delove, na primer poželjno jednu boju, ili više boja sa sličnim karakteristikama detektovanja, pri detektovanju i razlikovanju više različitih analita, kao što su različiti tipovi nukleotida, u uzorku, na primer za sekvenciranje uzoraka. Dalje, predmetno obelodanjenje pruža postupke za određivanje inkorporisanja četiri nukleotida u reakciju sekvenciranja koristeći manje od četiri filtera za detektovanje i manje koraka snimanja. Upotreba manje od četiri filtera, pa samim tim i manje koraka snimanja, omogućava da se sekvenciranje izvodi na manjim formatima jer mora biti prisutno manje filtera pobuđivanja i emitovanja.

Predviđeno je da ovde opisani postupci i sistemi smanjuju hardverske potrebe instrumenta, smanjuju veličinu instrumenta, potrošnju reagensa i troškove, uz povećanje izlaznih podataka.

[0023] U određenim otelotvorenjima, pruženi su postupci za određivanje sekvence monomernih podjedinica u polimeru. Postupci su ovde dati primerom u pogledu polimera nukleinskih kiselina i njihovih nukleotidnih podjedinica, ali se mogu izvesti za druge polimere i njihove podjedinice. Iako se postupci mogu koristiti za uzorke koji imaju jednu polimernu sekvencu, postupci pružaju posebne prednosti kada se koriste za razlikovanje nekoliko različitih tipova podjedinica u uzorku koji ima polimere sa mnogo različitih sekvenci (tj. uzorak višestrukog polimera). Na primer, u nekim otelotvorenjima postupci pružaju mogućnost razlikovanja više različitih tipova podjedinica u uzorku koji je veći od

1

broja različitih tipova signala koji se dobijaju iz uzorka. U slučaju uzorka nukleinske kiseline, može se izvršiti korak prikupljanja podataka na uzorku kako bi se prikupila zbirka od manje od četiri različita tipa signala, a ipak se mesta sekvence za sve četiri različite vrste nukleotida može odrediti za uzorak.

[0024] Nekoliko aspekata postupaka, pojedinačno ili u kombinaciji, pružaju mogućnost razlikovanja niza različitih tipova podjedinica (npr. različitih tipova nukleotida, različitih tipova didezoksinukleotida, modifikovanih tipova didezoksinukleotida, reverzibilno vezanih modifikovanih tipova nukleotida itd.) u uzorku polimera koji je veći od broja različitih tipova signala dobijenih iz uzorka polimera. Aspekti mogu uključivati, ali nisu ograničeni na, korelaciju jedne ili više vrsta monomernih podjedinica sa tamnim stanjem, korelaciju jedne ili više vrsta monomernih podjedinica sa signalnim stanjem, korelaciju jedne ili više vrsta monomernih podjedinica sa sivim stanjem ili korelaciju jedne ili više monomernih vrsta podjedinica za promenu stanja između tamnog stanja, sivog stanja ili signalnog stanja.

„Signalno stanje“, kada se koristi u odnosu na događaj detektovanja, znači stanje u kom se u događaju detektovanja proizvodi određeni signal. Na primer, nukleotidna podjedinica može biti u signalnom stanju i detektovati se kada je pričvršćena za fluorescentnu oznaku koja je detektovana u koraku detektovanja fluorescencije pobuđivanjem i emitovanjem te fluorescentne oznake u postupku sekvenciranja. Izraz „tamno stanje“, kada se koristi u odnosu na događaj detektovanja, označava stanje u kom se određeni događaj ne proizvodi u događaju detektovanja. Na primer, nukleotidna podjedinica može biti u tamnom stanju kada nukleotidu nedostaje fluorescentna oznaka i/ili ne emituje fluorescenciju koja je specifično detektovana u koraku fluorescentnog detektovanja postupka sekvenciranja. Detektovanje tamnog stanja takođe može uključivati bilo koju pozadinsku fluorescenciju koja može biti prisutna bez fluorescentne oznake. Na primer, neke reakcione komponente mogu pokazati minimalnu fluorescenciju kada su pobuđene na određenim talasnim dužinama. Stoga, iako ne postoji fluorescentni deo, može postojati pozadinska fluorescencija od takvih komponenti. Dalje, pozadinska fluorescencija može biti posledica raspršenja svetlosti, na primer iz susednih reakcija sekvenciranja, koje može detektovati detektor. Stoga, „tamno stanje“ može uključivati takvu pozadinsku fluorescenciju kao kada fluorescentni deo nije posebno uključen, na primer kada se nukleotid koji nema fluorescentnu oznaku koristi u ovde opisanim postupcima. Međutim, smatra se da se takva pozadinska fluorescencija može razlikovati od signalnog stanja i još uvek se može primetiti nukleotidna inkorporisanje neoznačenog nukleotida (ili „tamnog“ nukleotida) kao takva. Izraz „sivo stanje“, kada se koristi u odnosu na događaj detektovanja, označava stanje u kom se u događaju detektovanja proizvodi oslabljeni signal. Na primer, populacija nukleotida određenog tipa može biti u sivom stanju kada je prva subpopulacija nukleotida vezana za fluorescentnu oznaku koja se detektuje u koraku detektovanja fluorescencije postupkom sekvenciranja, dok drugoj subpopulaciji nukleotida nedostaje fluorescentna oznaka i ne emituje se fluorescencija koja je posebno detektovana u koraku fluorescentne detektovanja.

[0025] U određenim otelotvorenjima, postupak za sekvenciranje polimera izvodi se u ciklusima, gde pojedinačni ciklus uključuje jedan ili više koraka koji se koriste za razlikovanje monomera na određenom položaju u polimeru. U nekim otelotvorenjima ciklus može sadržati događaj detektovanja. Međutim, ciklus sekvenciranja ne mora uključivati događaj detektovanja, na primer, ako se detektovanje izvodi nakon izvedenih koraka za razlikovanje jednog ili više monomera u polimeru. Na primer, događaj detektovanja se može dogoditi na pola ciklusa, na kraju jednog ciklusa, na kraju 1 1⁄2 ciklusa, na kraju dva ciklusa, na kraju 2 1⁄2 ciklusa, na kraju tri ciklusa, itd. Dalji aspekt postupaka koji može pružiti mogućnost razlikovanja niza različitih tipova podjedinica u uzorku polimera koji je veći od broja različitih tipova signala dobijenih iz uzorka polimera je upotreba dva ili više koraka akvizicija signala i najmanje jedan korak modifikacije nukleotida tokom pojedinačnog ciklusa sekvenciranja. Kao takav, postupak sekvenciranja može uključivati nekoliko ciklusa dodavanja nukleotida, i ciklusi mogu uključivati ortogonalne korake prikupljanja signala iz uzorka za sekvenciranje, zatim modifikovanje jednog ili više nukleotida u uzorku za sekvenciranje kako bi se promenilo njihovo stanje (npr. između signalnog stanja, tamnog stanja ili sivog stanja), i zatim prikupljanje drugog seta signala iz uzorka za sekvenciranje. Nekoliko primera je dalje detaljno prikazano u nastavku, gde su određene vrste nukleotida u signalnom stanju zbog pričvršćene fluorescentne oznake, određene vrste nukleotida su u tamnom stanju zbog odsustva oznake, određeni nukleotidi se pretvaraju iz signalnog stanja do tamnog stanja razdvajanjem veznika koji pričvršćuje fluorescentnu oznaku i/ili se pojedini nukleotidi pretvaraju iz tamnog u signalno stanje vezivanjem receptora (npr. antitela ili streptavidina) koji regrutuje fluorescentnu oznaku za nukleotid koji drugačije nije imao oznaku.

[0026] Umesto detektovanja razlika u kvalitetu fluorescentnog signala, na primer kako se praktikuje za neke tehnologije fluorescentnog sekvenciranja, predmetno obelodanjenje predviđa detektovanje više različitih analita (tj. nukleotida, proteina ili njihovih fragmenata) u

1

reakciji praveći razliku između razlike u detektovanju jedne fluorescentnog dela, ili dve fluorescentnog dela istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja (tj. pobuđene istim laserom i emitovanja snimljene istim optičkim filterom), u različito vreme tokom reakcije, na primer pre i posle promene uslova reakcije. U nekim otelotvorenjima, postupci za detektovanje i određivanje analita obuhvataju detektovanje fluorescentnog izlaza u dva različita vremena tokom ciklusa reakcije.

[0027] Obično će se reakcioni ciklus izvesti isporukom najmanje četiri tipa nukleotida uzorku nukleinske kiseline u prisustvu polimeraze, na primer DNK ili RNK polimeraze, tokom reakcije proširenja prajmera. Prisustvo najmanje četiri tipa nukleotida daje prednost povećanja pouzdanosti polimeraze u poređenju sa upotrebom manje od četiri tipa nukleotida. Upotreba ortogonalnih koraka za pretvaranje jednog ili više inkorporisanih tipova nukleotida iz jednog stanja u drugo omogućava istovremenu prisutnost više vrsta nukleotida tokom reakcije proširenja polimeraze, čime se povećava pouzdanost, i istovremeno omogućava detektovanje jedne vrste oznake u svakom ciklusu, koji služi za pružanje pojednostavljene optike. Upotreba pojednostavljene optike ima prednost u poređenju sa sistemima koji se oslanjaju na složeniju optiku za snimanje izlaza sa više različitih oznaka kako bi razlikovali različite tipove nukleotida koji su istovremeno prisutni u reakciji proširenja. Dalje se razmatra da u nekim otelotvorenjima manje od četiri različite vrste nukleotida mogu biti prisutne tokom reakcije proširenja polimeraze.

[0028] Određena ilustrativna otelotvorenja su opisana u nastavku. Sastavi i njihovi postupci upotrebe nisu ograničeni na ova otelotvorenja.

[0029] U nekim otelotvorenjima, postupci za sekvenciranje nukleinske kiseline obuhvataju upotrebu jednog fluorescentnog dela za direktno ili indirektno detektovanje tri različita tipa nukleotida i jednog tipa nukleotida koji se ne detektuje prisustvom fluorescentnog signala, već se detektuje nedostatkom ili odsustvo fluorescentnog signala. U nekim otelotvorenjima, postupci za sekvenciranje nukleinske kiseline obuhvataju upotrebu dva ili više različitih fluorescentnih delova koji sadrže isti ili sličan spektar pobuđivanja/emitovanja za direktno ili indirektno detektovanje tri različita tipa nukleotida i jednog tipa nukleotida koji nije detektovan prisustvom fluorescentnog signala, već se detektuje nedostatkom ili odsustvom fluorescentnog signala. Isti ili slični spektri pobuđivanja i emitovanja su takvi da laser pobuđuje dva ili više različitih fluorescentnih delova i optički filter hvata njihove emitovane

1

fluorescentne signale. Detektovanje fluorescencije radi određivanja sekvence uzorka nukleinske kiseline vrši se u vreme-prostoru, na primer u različito vreme tokom reakcije sekvenciranja (tj. pre i posle promene uslova reakcije kao što je enzimsko razdvajanje, promena pH okoline, dodavanje dodatnih reagenasa), koji pružaju obrasce fluorescencije, kao što su obrasci prelaza fluorescencije, čiji kumulativni obrasci određuju sekvencu mete nukleinske kiseline. Stoga, ovde opisani postupci su vremenski i troškovno efikasni i omogućavaju pojednostavljenje povezanih instrumenata za sekvenciranje.

[0030] Primerna primena razlika u obrascima fluorescencije u vreme-prostoru za određivanje ciljane sekvence nukleinske kiseline je metodologija i tehnologija sinteze (SBS). Stoga, otelotvorenja koja su ovde opisane imaju posebnu vrednost u fluorescentnim primenama sekvenci sintezom. Iako su ovde opisane otelotvorenja primer inovativnih postupaka fluorescentnog sekvenciranja, obelodanjena otelotvorenja takođe imaju upotrebnu vrednost za različite druge primene gde je poželjno detektovanje više od jednog analita (tj. nukleotida, proteina ili njihov fragmenata) u uzorku.

[0031] U razvijanju otelotvorenja za sekvenciranje koristeći minimalni set boja, eksperiment je otkrio alternativne strategije za razlikovanje nukleotidnih inkorporisanje koristeći samo jedan ili dva fluorescentna dela. Ove strategije predviđaju da sve četiri vrste nukleotida budu istovremeno prisutne u ciklusu sekvence, i za upotrebu minimalnih boja i setova optičkih filtera. U nekim otelotvorenjima, ne koriste se više od tri fluorescentna dela za određivanje inkorporisanja sva četiri tipa nukleotida koji su prisutni tokom reakcije, koristeći jedan ili dva filtera za pobuđivanje i emitovanje. U poželjnim otelotvorenjima, ne koristi se više od jednog fluorescentnog dela (ili dva ili tri ista ili slična spektra pobuđivanja/emitovanja) za određivanje inkorporisanja sva četiri tipa nukleotida koji su svi prisutni tokom reakcije, koristeći jedan raspon pobuđivanja svetlosti i jedan filter za detektovanje emitovanja.

Razumeće se da se u nekim otelotvorenjima može koristiti više od jednog fluorescentnog dela (ili delova više od jednog raspona pobuđivanja ili raspona emitovanja).

[0032] U nekim otelotvorenjima, sekvenciranje pomoću minimalnog seta boje vrši se na podlozi, kao što su staklo, plastika, poluprovodnički čip ili podloga izvedena od kompozita. U nekim otelotvorenjima, jedna vrsta nukleinske kiseline je pružena na supstratu, na primer za sekvenciranje jednog cilja. U drugim otelotvorenjima, sekvenciranje takođe može biti u multipleks formatu, gde se više ciljeva nukleinske kiseline detektuje i sekvencira paralelno,

1

na primer u obliku protočne ćelije ili niza. Ovde opisani aspekti su naročito povoljni kada se praktikuje paralelno sekvenciranje ili masivno paralelno sekvenciranje. Platforme koje praktikuju fluorescentno paralelno sekvenciranje uključuju, ali nisu ograničene na, one koje nude Illumina, Inc. (npr. HiSeq, Genome Analyzer, MiSeq, iScan platforme), Life Technologies (npr. SOLiD), Helicos Biosciences (npr. Heliscope), 454/Roche Life Sciences (Branford, CT) i Pacific Biosciences (npr. SMART). Protočne ćelije, čipovi i druge vrste površina koje mogu da prime više vrsta nukleinskih kiselina su primeri supstrata koji se koriste za paralelno sekvenciranje. U multipleks formatima u kojima se više vrsta nukleinskih kiselina paralelno sekvencira, klonski amplifikovane ciljane sekvence (npr. putem emulzionog PCR (cmPCR) ili amplifikacije mosta) se tipično kovalentno imobilizuju na podlozi. Na primer, kada se primenjuje emulzioni PCR, cilj od interesa je imobilisan na zrnu, dok su klonski amplifikovani ciljevi imobilisani u kanalima protočne ćelije ili na određenim mestama na nizu ili čipu.

[0033] Protočne ćelije za upotrebu sa sastavima i postupcima kako je ovde opisano mogu se koristiti u sekvenciranju na više načina. Na primer, DNK uzorak, kao što je DNK biblioteka, može se primeniti na protočnu ćeliju ili fluidni uređaj koji sadrži jedan ili više urezanih protočnih kanala, gde protočnih ćelija može dalje obuhvatiti populaciju molekula sonde kovalentno vezanih za njenu površinu. Sonde pričvršćene u kanalima protočne ćelije povoljno se nalaze na različitim adresabilnim mestima u kanalu, a molekuli DNK biblioteke mogu se dodati kanalima protočne ćelije gde se komplementarne sekvence mogu vezati (kao što je ovde opisano, dalje kako je opisano u provizornoj SAD patentnoj prijavi 61/431,425). Drugi primer protočnih ćelija za upotrebu u ovoj prijavi sadrži CMOS protočnu ćeliju kako je opisano u provizornoj SAD patentnoj prijavi 61/625,051. Amplifikacija mosta se može izvesti kako je ovde opisano, i zatim sledi sekvenciranje postupcima sinteze i sastavima kako je ovde opisano. Postupci za kreiranje i korišćenje protočnih ćelija za sekvenciranje su poznati struci; i na njih su ovde date reference. Predviđeno je da ovde opisani postupci i sastavi nisu ograničeni na bilo koju posebnu metodologiju proizvodnje ili postupaka sekvenciranja usmeren na protočne ćelije.

[0034] Sekvenciranje korišćenjem ovde opisanih postupaka i sastava može se takođe izvesti u mikrotitarskoj ploči, na primer u reakcionim pločama ili pločama velike gustine (Margulies et al., 2005, Nature 437(7057): 376-380). Na primer, genomski ciljevi mogu se pripremiti pomoću emPCR tehnologija. Reakcione ploče ili klizači mogu biti napravljeni od materijala

1

sa optičkim vlaknima koji može da uhvati i zabeleži svetlost nastalu reakcijom, na primer iz fluorescentne ili luminiscentne reakcije. Materijal jezgra može se nagrizati kako bi se dobile diskretne reakcione komorice sposobne da drže najmanje jednu emPCR reakcionu kuglicu. Takvi slajdovi/ploče mogu sadržati preko 1,6 miliona komorica. Na kreirane slajdove/ploče mogu se staviti emPCR kuglice za reakciju sekvenciranja cilja i montirati na instrument gde su pruženi reagensi za sekvenciranje i dolazi do sekvenciranja.

[0035] Primer raspoređenih supstrata za sekvenciranje ciljeva korišćenjem sastava i postupaka koji su ovde obelodanjeni pružen je kada se koriste supstrati sa obrascem koji sadrže DNK nano kuglice na čipu ili slajdu, kako ih izvodi Complete Genomics (Mountain View, CA). Kao što je opisano kod Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81, silicijumska ploča može imati slojeve silicijum dioksida i titanijuma i naknadno joj se napraviti obrasci korišćenjem fotolitografije i tehnike suvog nagrizanja. Ploča se može tretirati sa HMDSi premazati slojem fotootpornika kako bi se definisale diskretne oblasti za silanizaciju i naknadno kovalentno vezivanje DNK nano kuglica za sekvenciranje. Stručnjak će uvideti da postoje mnogi postupci za stvaranje slajdova/čipova sa diskretnim mestima za imobilizaciju nukleinskih kiselina za upotrebu u metodologijama sekvenciranja, a predmetni postupci nisu ograničeni postupkom u kom je supstrat pripremljen za sekvenciranje.

[0036] Radi ilustracije, a ne sa namerom da se ograniče otelotvorenja kako su ovde opisana, ciklus sekvenciranja opšte strategije može se opisati nizom koraka. Naredni primer se zasniva na reakciji sekvenciranja sintezom, međutim, postupci koji su ovde opisane nisu ograničeni na bilo koju posebnu metodologiju reakcije sekvenciranja.

[0037] Četiri nukleotidna tipa A, C, T i G, tipično modifikovani nukleotidi dizajnirani za reakcije sekvenciranja, kao što su reverzibilno blokirani (rb) nukleotidi (npr. rbA, rbT, rbC, rbG) gde su tri od četiri tipa fluorescentno označena, istovremeno dodata, zajedno sa drugim reakcionim komponentama, na mesto na kom se nalazi obrazac od interesa i odakle dolazi do reakcije sekvenciranja (npr. protočna ćelija, čip, klizač itd.). Nakon inkorporisanja nukleotida u lanac nukleinske kiseline u rastućoj sekvenci na osnovu ciljane sekvence, reakcija je izložena svetlosti, i fluorescencija se posmatra i beleži; ovo predstavlja prvi događaj snimanja i prvi obrazac detektovanja fluorescencije. Nakon prvog događaja snimanja, jedan ili više dodatnih hemijskih reagensa može se dodati u reakciju sekvenciranja, gde dodani reagensi mogu promeniti intenzitet fluorescencije ili neki drugi hemijski aspekt prve reakcije koji

1

izaziva prepoznatljivu i merljivu promenu fluorescencije (tj. promena tranzicije fluorescencije). Mesto reakcije je ponovo osvetljeno i svaka promena fluorescencije se beleži; što čini drugi događaj snimanja (tj. drugi obrazac detektovanja fluorescencije). Blokatori prisutni na inkorporisanim nukleotidima se uklanjaju i ispiraju zajedno sa ostalim reagensima prisutnim nakon drugog događaja snimanja u pripremi za naredni ciklus sekvenciranja.

Primeri hemijskih reagensa uključuju, ali nisu ograničeni na, reagense razdvajanja, vezujući partner-fluorescentni deo konjugate ili druge reagense koji mogu direktno ili indirektno izazvati prepoznatljivu i merljivu promenu fluorescencije od prvog događaja snimanja do drugog događaja snimanja. Uzorci fluorescencije iz dva događaja snimanja upoređuju se i inkorporiše se nukleotid, pa se na taj način određuje sekvenca ciljane nukleinske kiseline za taj određeni ciklus. Primer ciklusa opšte strategije koristi poželjno jedan fluorescentni deo (ili više od istog ili sličnog pobuđivanja/emitovanja) i jedan filter za detektovanje emitovanja kako bi se utvrdilo uključivanje četiri različita tipa nukleotida u reakciju sekvenciranja.

[0038] Jedan način razlikovanja različitih strategija za detektovanje inkorporisanja nukleotida u reakciji sekvenciranja pomoću jedne fluorescentne boje (ili dve ili više boja istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) je karakterisanje inkorporisanje u smislu prisustva ili relativnog odsustva, ili nivoa između, tranzicije fluorescencije koja se javlja tokom ciklusa sekvenciranja. Stoga, strategije sekvenciranja mogu biti ilustrovane svojim fluorescentnim profilom za ciklus sekvenciranja. Za ovde opisane strategije, „1“ i „0“ označava fluorescentno stanje u kom je nukleotid u signalnom stanju (npr. detektuje se fluorescencijom) (1), ili da li je nukleotid u tamnom stanju (npr. nije detektovan ili minimalno detektovan u koraku snimanja) (0). Stanje „0“ ne mora se nužno odnositi na potpuni nedostatak ili odsustvo signala. Iako u nekim otelotvorenjima može postojati potpuni nedostatak ili odsustvo signala (npr. fluorescencija). Predviđeno je da se minimalni ili smanjeni signal fluorescencije (npr. pozadinski signal) uključi u raspon stanja „0“ sve dok se promena fluorescencije od prve do druge slike (ili obrnuto) može pouzdano razlikovati.

[0039] U jednom otelotvorenju, primerena strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciju sekvenciranja korišćenjem jedne fluorescentne boje (ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) i dva događaja snimanja ilustrovana je narednim mrežama i tabelama. Mreže predstavljaju teoretski prostorni prikaz podataka o sekvenciranju prikazanih na toplotnoj mapi ili grafikonu oblaka, na primer kao što je prikazano na Slici 1.

2

[0040] U nekim otelotvorenjima sekvenciranja sintezom (SBS), četiri modifikovana tipa nukleotid trifosfata, u ovom slučaju reverzibilno blokirani nukleotid trifosfati (rbNTP), istovremeno se dodaju u SBS reakciju. rbNTP se nadmeću za inkorporisanje u rastući lanac nukleinske kiseline tokom proširenja prajmera usmerenog na obrazac. Razmatra se da kompetitivno proširenje u prisustvu dovoljnog broja vrsta nukleotida kako bi upotpunilo sve tipove nukleotida u šablonskoj nukleinskoj kiselini poboljšava pouzdanost inkorporisanja u poređenju sa dodavanjem nukleotida jedan po jedan u reakciju sekvenciranja. Četiri tipa rbNTP poseduju 3'-terminator koji na položaju uzorka 3'riboze sadrži i alkoksi i azido funkcionalnost koja se može ukloniti razdvajanjem sa fosfinskim reagensom, stvarajući tako nukleotid koji je reverzibilno blokiran i ponovo funkcionalan za dalje proširenje (tj. potpuno funkcionalno ili ff). Potpuno funkcionalni nukleotidi, ffNTP, komercijalno su dostupni od Illumina, Inc. i primer su reverzibilno blokiranih nukleotida ili rbNTP. U poželjnim otelotvorenjima, tri od četiri rbNTP sadrže fluorescentne oznake povezane preko veznika. Veznici mogu da sadrže jednu ili više grupa razdvajanja, ili da nemaju grupe razdvajanja. Na primer, veznik koji vezuje jedan ili više rbNTP za fluorofor može sadržati azidnu i/ili alkoksi grupu, na primer na istom ugljeniku, tako da se veznici mogu razdvojiti nakon svakog ciklusa inkorporisanja pomoću fosfinskog reagensa kao što je ranije bilo referenciran, čime se oslobađa fluorescentni deo za dalje proširenje sekvence.

[0041] Na primer, početni rbNTP timin, (rbTTP) može biti fluorescentno označen preko veznika gde veznik sadrži azid/alkoksi mesto razdvajanja. Još jedan inicijalno fluorescentno označen rbNTP, na primer adenin ili rbATP, sadrži veznik koji pored alkoksi/azidne grupe dalje sadrži drugo mesto razdvajanja poput disulfidne grupe koja se nalazi između, na primer, alkoksi/azidne grupe i fluorescentne oznake. Fluorescentna oznaka povezana sa rbATP može biti ista kao fluorescentna oznaka povezana sa rbTTP, ili može biti slična fluorescentna oznaka po tome što deli slične spektralne karakteristike pobuđivanja i emitovanja. Treći rbNTP, na primer citozin ili rbCTP, sadrži haptenski deo, kao što je biotin, na kraju veznika koji sadrži alkoksi/azid. U ovom primeru početni rbCTP nije fluorescentno označen i stoga ne fluorescira pri prvom događaju snimanja. Međutim, naknadna obrada fluorescentno označenog streptavidina izaziva vezivanje streptavidin-fluorescentnog dela konjugata za biotinski deo na rbCTP konjugatu i nakon takvog tretmana mesta na kojima je rbCTP inkorporisan fluoresciraju kada su izloženi odgovarajućoj talasnoj dužini svetlosti i fluorescencija se beleži tokom drugog događaja snimanja. Četvrtom rbNTP, u ovom slučaju gvaninu ili rbGTP, nedostaje fluorescentni deo i može ali ne mora biti konjugovan sa veznikom, i smatra se „tamnim“ rbNTP i ne fluorescira, ili ima smanjenu ili minimalnu fluorescenciju, u oba događaja snimanja.

[0042] Gore navedena primerna strategija može se dalje opisati prema rbNTP konstruktu, na primer:

rbTTP-veznik CS1-FM

rbATP-veznik CS1-CS2-FM

rbCTP-veznik-CS1-B

rbGTP

gde je CS1 prvo mesto razdvajanja (npr. azid/alkoksi), CS2 je drugo mesto razdvajanja (npr. SS veza), FM je fluorescentni deo i B je biotin. Smatra se da je jedno od mesta razdvajanja opciono. Opciono mesto razdvajanja (npr. dva mesta razdvajanja prisutna u vezniku) može pružiti dodatnu funkcionalnost ciklusu sekvenciranja uključujući, ali bez ograničenja, razdvajanje svih fluorescentnih delova u narednom ciklusu, naizmenične reakcije razdvajanja u narednim ciklusima sekvenciranja i/ili kombinovanje reakcija razdvajanja u jednom ili više ciklusa sekvenciranja, ili njihove kombinacije.

[0043] Primerna šema detektovanja za ciklus sekvenciranja za analizu sekvence u realnom vremenu putem sinteze nukleotida koji uključuje gore navedenu strategiju sadrži dva događaja snimanja, a u određenim otelotvorenjima ne više od dva događaja snimanja.

Konjugovani rbNTP, rbTTP, rbATP i rbCTP i nekonjugovani (ili možda konjugovani samo sa veznikom) rbGTP dodaju se istovremeno na početku ciklusa sekvenciranja. Talasna dužina svetlosti pobuđivanja za fluorescentni deo primenjuje se na reakciju sekvenciranja i snima se prva slika (slika 1). Prva slika beleži fluorescenciju (1) za inkorporisanja rbATP i rbTTP, ali nema fluorescencije ili ima minimalnu fluorescenciju za inkorporisanje rbCTP ili rbGTP. Nakon prvog događaja snimanja, DTT se, na primer, dodaje reakciji koja razdvaja CS2 (disulfidnu vezu) u vezniku od rbATP, čime se oslobađa FM i rbATP prelazi iz detektibilnog (1) u nedetektabilni (0) za drugi događaj snimanja. Razdvajanje rbATP i rezultujući korak fluorescentne tranzicije omogućava diferencijaciju rbATP od ostalih događaja inkorporisanja rbNTP tokom ciklusa sekvenciranja. Dodatno, nakon prvog koraka snimanja, u reakciju se dodaje streptavidin (SA)-FM. SA vezuje B od rbCTP sastava i na taj način rbCTP prelazi iz nedetektabilnog (0) u detektibilni (1) i omogućava detektovanje mesta na kojima je rbCTP uključen u reakciju i pruža diferencijaciju događaja inkorporisanja rbCTP tokom ciklusa sekvenciranja. U ovom primeru nema promena prelaza ni za rbTTP ni za rbGTP. Stoga, nakon primene primera DTT i SA-FM, uzima se druga slika ciklusa sekvenciranja koja rezultuje fluorescentnim signalima za inkorporisanja rbTTP i rbCTP, a nema fluorescencije za rbATP i rbGTP inkorporisanja. Nakon druge slike, fluorescentni prelazi ili njihov nedostatak se koriste da se odredi koji je nukleotid inkorporisan na kom mestu u sekvenci reakcijom sinteze. Svaki naredni ciklus sledi isti obrazac proširenje polimeraze-slika 1-hemijski tretman-slika 2-naredni ciklus sve dok se sekvenciranje ne završi. Ciklus može opciono uključivati korak određivanja nukleotida. Dodatno ili alternativno, do određivanja nukleotida ili sekvence nukleotida može doći nakon što se završi jedan ili više ciklusa. Drugi ciklusi takođe mogu biti uključeni po ciklusu uključujući, ali bez ograničenja, deblokiranje, ispiranje i/ili dodatne korake koji se koriste u sinteza-po-sinteza postupcima poznatim struci.

[0044] Predviđeno je da se bilo koji broj potencijalnih mesta razdvajanja i njihovih jedinjenja razdvajanja može koristiti u gore navedenoj strategiji, i ona koja su navedena su data samo kao primer. Na primer, redukujući agensi osim DTT (npr. TCEP, BME, itd.) ili reagensi koji učestvuju u reakcijama tiol-disulfid razmene mogu se koristiti za oslobađanje fluorescentnog dela kao što je gore opisano. Dalje, hapten vezujuć partneri osim biotin-streptavidina (npr. digoksigenin, dinitrofenol i antitela za njih) takođe se mogu koristiti. Dalje, može se koristiti bilo koji ili više fluorescentnih delova. Međutim, ako se koriste dva ili više, poželjno je da imaju isti ili sličan spektar apsorpcije i emitovanja. Poželjna otelotvorenja koriste jedan fluorescentni detekcioni deo svih inkorporisanih nukleotida, ili jedan optički filter koji detektuje emitovanje iz više fluorescentnih delova.

[0045] Predviđeno je da se reakcioni reagensi (tj. reagensi razdvajanja, reagensi za

2

označavanje itd.) koji se dodaju između događaja snimanja mogu dati odvojeno, na primer sekvencijalno ili kombinovano i dodati kao jedan potpuni reagens (npr. glavna smeša koja sadrži sve potrebne hemikalije za potpuno razdvajanje, označavanje itd.). Poželjna otelotvorenja obuhvataju dodavanje potpunog rastvora reagensa ili glavne smeše između koraka snimanja.

[0046] U drugom primernom otelotvorenju, druga strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciju sekvenciranja, koja koristi jednu fluorescentnu boju (ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) i dva događaja snimanja, ilustrovana je narednom mrežom i tabelom detektovanja.

[0047] Za drugu strategiju, kao što je prikazano u prvoj, sva četiri potpuno funkcionalna sastava nukleotid trifosfata (rbNTP) se istovremeno dodaju u SBS reakciju. rbNTP se nadmeću za inkorporisanje u rastući lanac nukleinske kiseline. rbNTP poseduju 3'-terminator koji sadrži i alkoksi i azido funkcionalnosti koje se mogu ukloniti razdvajanjem sa fosfinskim reagensom čime se stvara nukleotid koji je ponovo funkcionalan za dalje proširenje. U poželjnim otelotvorenjima, tri od četiri rbNTP sadrže fluorescentne oznake pričvršćene preko veznika. Veznici mogu sadržati jedno ili više mesta razdvajanja. Na primer, veznik koji vezuje jedan ili više rbNTP za fluorofor može sadržati azidnu i/ili alkoksi grupu, na primer na istom ugljeniku, tako da se veznici mogu razdvojiti nakon svakog ciklusa inkorporisanja pomoću fosfinskog reagensa, čime se oslobađa fluorescentni deo za dalje proširenje sekvence.

[0048] U drugoj strategiji, početna grupa rbNTP timina sadrži smešu rbTTP molekula. Na primer, grupa rbTTP sadrži 2:1 odnos fluorescentno označenog rbTTP (tj. preko veznika) i ne-fluorescentno označenog rbTTP (tj. tamnog rbTTP). Smatra se da se može koristiti bilo koji odnos fluorescentnog:nefluorescentnog rbNTP. Na primer, odnosi 2:1, 1:0,5, 0,5:1 i 1:2 bi takođe funkcionisali, a njihova razlika bi promenila izlaz intenziteta slike bez promene sposobnosti detektovanja i razlikovanja inkorporisanja nukleotida. Fluorescentno označeni rbATP, neoznačeni ili tamni rbGTP i biotinom označen rbCTP upotpunjuju mešavinu nukleotida. Naknadni tretman fluorescentno označenim streptavidinom izaziva vezivanje streptavidin-fluorescentnog dela za deo biotina na rbCTP konjugatu i nakon takvog tretmana mesta na kojima je rbCTP inkorporisan fluoresciraju kada su izložena odgovarajućoj talasnoj dužini svetlosti, i fluorescencija se snima tokom drugog događaja snimanja.

[0049] Gore navedena primerna strategija može sadržati rbNTP konstrukte:

rbTTP-veznik FM/rbTTP-taman

rbATP-veznik-FM

rbCTP-veznik-B

rbGTP-taman

[0050] Primeri šeme detektovanja za ciklus sekvenciranja za analizu sekvence u realnom vremenu pomoću sinteze nukleotida inkorporisanjem koristeći gore navedenu strategiju sadrži dva događaja snimanja, a u određenim otelotvorenjima ne više od dva događaja snimanja. Sva četiri tipa rbNTP se dodaju istovremeno na početku ciklusa sekvenciranja. Talasna dužina svetlosti pobuđivanja za fluorescentni deo primenjuje se na reakciju sekvenciranja i snima se prva slika (slika 1). Prva slika uključuje fluorescenciju (1) za rbATP i rbTTP inkorporisanja (pri 50% intenzitetu fluorescencije), ali nema fluorescencije za rbCTP, rbGTP i 1/2 od rbTTP inkorporisanje. Nakon prvog koraka snimanja, u reakciju se dodaje fluorofor SA-FM označen streptavidinom. SA vezuje B od rbCTP sastava, čime rbCTP prelazi sa nedetektibilnog (0) na detektibilan (1) tokom drugog događaja snimanja i omogućava detektovanje mesta na kojima je rbCTP inkorporisan u reakciju i pruža diferencijaciju događaja inkorporisanja rbCTP tokom ciklusa sekvenciranja. U ovom primeru nema promena prelaza za rbTTP, rbATP ili rbGTP. Nakon druge slike, fluorescentni prelazi ili njihov nedostatak se koriste za određivanje koji je nukleotid inkorporisan na kom mestu u sekvenci reakcijom sinteze i identifikuju sekvencu od interesa. Svaki naredni ciklus prati isti obrazac proširenje polimeraze-slika 1-tretman-slika 2-naredni ciklus, sve dok se potpuno sekvenciranje željene mete ne završi. Ciklus može opciono uključivati korak određivanja

2

nukleotida. Dodatno ili alternativno, do određivanja nukleotida ili sekvence nukleotida može doći nakon što se završi jedan ili više ciklusa. Drugi koraci takođe mogu biti uključeni po ciklusu uključujući, ali bez ograničenja, deblokiranje, ispiranje i/ili dodatne korake koji se koriste u postupcima sinteze sekvenci poznatim struci.

[0051] U drugom otelotvorenju, treća strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciju sekvenciranja korišćenjem jedne fluorescentne boje (ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) i dva koraka snimanja ilustrovana je narednom mrežom i tabelom detektovanja.

[0052] Kao što je prikazano u prvom i drugom, sva četiri potpuno funkcionalna sastave nukleotid trifosfata (rbNTP) se istovremeno dodaju u SBS reakciju. rbNTP se nadmeću za inkorporisanje u rastući lanac nukleinske kiseline. rbNTP poseduju 3'-terminator koji se može ukloniti, stvarajući tako nukleotid koji je ponovo funkcionalan za dalje proširenje. Treća strategija se razlikuje od prethodnih primerenih strategija uključivanjem, na primer, konjugovanjem rbNTP na razgranati veznik. U poželjnim otelotvorenjima, dva od četiri rbNTP sadrže fluorescentne oznake pričvršćene preko veznika. Veznici mogu sadržati jedno ili više mesta razdvajanja. Na primer, veznik koji vezuje jedan ili više rbNTP za fluorofor može sadržati azidnu i/ili alkoksi grupu, na primer na istom ugljeniku, tako da se veznici mogu razdvojiti nakon svakog ciklusa inkorporisanja pomoću fosfinskog reagensa kako je ranije opisano, oslobađajući tako fluorescentni deo za dalje proširenje sekvence.

2

[0053] U trećoj primernoj strategiji, rbATP i rbCTP kompleksi sadrže razgranate veznike. Na primer, rbATP sadrži razgranati veznik gde jedna grana završava fluorescentnim delom, a druga grana se završava biotinom. U ovom primeru, rbCTP je takođe kompleksiran sa razgranatim veznikom i svaka od dve grane završava se biotinom. rbCTP u ovom primeru u početku nema oznaku. Fluorescentno označeni rbTTP i neoznačeni ili tamni rbGTP upotpunjuju mešavinu nukleotida. Naknadni tretman sa fluorescentno označenim streptavidinom izaziva vrlo snažno vezivanje streptavidin-boje za biotinske delove na C i A nukleotidima, i nakon takvog tretmana mesta na kojima su rbCTP i rbATP inkorporisani fluoresciraju kada su izložena odgovarajućoj talasnoj dužini svetlosti, i fluorescencija koja je rezultat B-SA interakcije se beleži tokom drugog koraka snimanja.

[0054] Gore navedena primerna strategija kao takva može da sadrži:

rbATP-razgranati veznik FM i B

rbTTP-FM

rbCTP-razgranati veznik-(B)2

rbGTP-taman

[0055] Primerna šema detektovanja za ciklus sekvenciranja za analizu sekvence u realnom vremenu putem sinteze nukleotida pomoću inkorporisanja koristeći gore navedenu strategiju sadrži dva koraka snimanja, a u određenim otelotvorenjima ne više od dva događaja snimanja. Svi rbNTP se dodaju istovremeno na početku ciklusa sekvenciranja. Talasna dužina svetlosti pobuđivanja za fluorescentni deo primenjuje se na reakciju sekvenciranja i snima se prva slika (slika 1). Prva slika uključuje fluorescenciju (1) za inkorporisanje rbATP i rbTTP, ali nema fluorescencije (0) za inkorporisanja rbCTP i rbGTP. Nakon prvog koraka snimanja, u reakciju se dodaje streptavidin označen fluoroforom SA-FM. SA vezuje dva biotina (B<2>) od rbCTP konjugata čime rbCTP prelazi iz nedetektabilnog (0) u detektibilni (1), i B na bifurkovanom vezniku od rbATP, čime se efikasno povećava fluorescencija (2) inkorporisanja rbATP sa slike 1 i omogućava detektovanje mesta na kojima je rbCTP inkorporisan, i diferencirajući inkorporisanje rbATP, u rastućem lancu nukleinske kiseline. U ovom primeru nema promena tranzicije za rbTTP ili rbGTP. Nakon druge slike, fluorescentni prelazi ili njihov nedostatak se koriste za određivanje koji nukleotid je inkorporisan na kom mestu u sekvenci reakcijom sinteze i identifikuje se sekvenca od interesa. Svaki naredni ciklus sledi isti obrazac, proširenje polimeraze-slika 1-tretman-slika 2-naredni ciklus, sve dok se sekvenciranje željene mete ne završi. Ciklus može opciono uključivati korak određivanja

2

nukleotida. Dodatno ili alternativno, do određivanja nukleotida ili sekvence nukleotida može doći nakon što se završi jedan ili više ciklusa. Drugi koraci takođe mogu biti uključeni po ciklusu uključujući, ali bez ograničenja, deblokiranje, ispiranje i/ili druge u struci poznate korake koji se koriste u postupcima sinteze sekvenci.

[0056] U drugom otelotvorenju, četvrta primerna strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciji sekvenciranja koristi jednu fluorescentnu boju (ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) i samo jedan korak snimanja, kao što je prikazano narednom mrežom i tabelom detektovanja.

[0057] Gore navedeno primerno otelotvorenje može sadržati samo jednu boju ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja gde se koncentracija boje menja za svaku od tri označene rbNTP. Tamno stanje označava uključivanje, u ovom slučaju, rbGTP na osnovu tumačenja merenja fluorescencije iz tri fluorescentno označene rbNTP.

[0058] Gore navedena primerna strategija kao takva može da sadrži:

rbATP-FM (0,33X koncentracija)

rbTTP-FM (1,0X koncentracija)

rbCTP-FM (0,66X koncentracija)

rbGTP-taman

[0059] Alternativna varijanta koja sadrži jednu boju (ili dve boje istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) i jedan događaj slikanja je kako sledi:

2

[0060] Gore navedena primerna strategija kao takva može da sadrži:

rbATP-FM (0,50X koncentracija)

rbTTP-FM (1,0X koncentracija)

rbCTP-FM (0,75X koncentracija)

rbGTP-FM (0,25X koncentracija)

[0061] Gore navedena primerna otelotvorenja mogu da sadrže jednu boju ili dve boje sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja, tako da je svaki od četiri rbNTP označen različitim koncentracijama boje. U otelotvorenjima u kojima je svaki od četiri različita rbNTP vezan za različitu koncentraciju jedne boje (ili dve boje sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja) samo se jedna slika snima po ciklusu kako bi se odredila inkorporisanje nukleotida. Primer ciklusa sekvence koji koristi postupke jedna boja/jedan događaj slikanja bio bi proširenje polimerazeslika 1-naredni ciklus.

[0062] Primer šeme detektovanja za ciklus sekvenciranja za sekvencu jedna boja/jedan događaj slikanja sintezom nukleotida pomoću gore navedenih strategija obuhvata jedan korak snimanja. Svi rbNTP se dodaju istovremeno na početku ciklusa sekvenciranja. Talasna dužina svetlosti pobuđivanja za fluorescentni deo primenjuje se na reakciju sekvenciranja i snima se prva slika (slika 1). Nakon prvog koraka snimanja, naredni ciklus dodavanja reagensa, proširivanja polimeraze i akvizicije slike se izvodi sve dok se ne završi željeni broj

2

ciklusa. Nakon prve slike, intenzitet fluorescencije može biti u korelaciji sa različitim koncentracijama boje koriste se za određivanje koji je nukleotid inkorporisan na kom mestu u sekvenci reakcijom sinteze i identifikovana je sekvenca od interesa. Svaki naredni ciklus sledi isti obrazac proširenje polimeraze-slika 1-naredni ciklus dok se ne završi sekvenciranje željenog cilja. Ciklus može opciono uključivati korak određivanja nukleotida. Dodatno ili alternativno, do određivanja nukleotida ili sekvence nukleotida može doći nakon što se završi jedan ili više ciklusa. Drugi koraci takođe mogu biti uključeni po ciklusu uključujući, ali bez ograničenja, deblokiranje, ispiranje i/ili druge u struci poznate korake koji se koriste u postupcima sinteze sekvenci.

[0063] U otelotvorenjima koje izvode jedna boja/jedan događaj slikanja sekvenciranje, predviđene su koncentracije boje koje omogućavaju diferencijaciju inkorporisanja označenih i/ili neoznačenih nukleotida. Dalje, kada se izvodi reakcija sekvenciranja jedne boje/jedne slike kao što je gore navedeno, dodatni hemijski tretman nije neophodan kao što je prethodno opisano za otelotvorenja za jednu strategiju sekvenciranja boje/dve slike.

[0064] U drugom primeru otelotvorenja, dodatna strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciji sekvenciranja obuhvata upotrebu dve fluorescentne boje različitog spektra pobuđivanja i emitovanja i bilo 1) jedan događaj snimanja koji sadrži dva spektra emitovanja ili 2) dva događaja uzastopnog snimanja.

[0065] Za potrebe primera, Slika 3A prikazuje dve primerne boje, boju koja emituje oko 590 λmax(DEG527) i boju koja emituje oko 720 λmax(Dy681). Na primer, napravljene su naredne konjugacije rbNTP-boje:

rbATP-DEG527

rbCTP-Dy681

rbTTP-DEG527/Dy681

rbGTP-taman

[0066] Kao takav, procenat svakog inkorporisanog nukleotida konjugovan je sa određenim fluoroforom. U ovom primeru konjugacije su:

[0067] Na primer, prateći standardne SBS protokole, sva četiri nukleotida se dodaju istovremeno u SBS reakciju. rbNTP se nadmeću za inkorporisanje u rastući lanac nukleinske kiseline. Kao što je prethodno opisano, rbNTP poseduju 3' terminator koji se može ukloniti razdvajanjem radi daljeg proširenja. Nakon inkubacije koja omogućava uključivanje odgovarajućeg nukleotida u rastući lanac nukleinske kiseline, reakcija se izlaže odgovarajućoj talasnoj dužini svetlosti u zavisnosti od toga koja slika je poželjna, istovremena ili sekvencijalna. Na primer, reakcija se može istovremeno izložiti talasnoj dužini pobuđivanja obe fluorescentne boje (u ovom primeru, DEG527 se pobuđuje na približno 532 nm, i Dy681 se pobuđuje na približno 660 nm), uzrokujući istovremeno emitovanje dve fluorescentne boje, čija emisija može mogu biti detektovana istovremeno pomoću dva različita filtera za detektovanje i optike za snimanje. U takvom istovremenom sistemu u kome se vrši samo 1 događaj snimanja za dva različita kanala detektovanja istovremeno, stanja slike za svaki kanal detektovanja bi bila:

[0068] Alternativno, nakon inkorporisanja odgovarajućeg označenog nukleotida u rastući lanac nukleinske kiseline, dve fluorescentne boje mogu se pobuđivati korak po korak, kao što je prvo pobuđivanje jednog fluorofora, nakon čega sledi prvi događaj snimanja, a zatim drugog fluorofora, nakon čega sledi drugi događaj snimanja. U takvom sistemu za korak po korak snimanje, izvode se dva događaja snimanja i tabela detektovanja će biti, na primer, ako se prvo pobudi DEG527, a zatim sledi Dy681 (npr., obrnuto ako se prvo emituje crvena fluorescentna emisija, a zatim zelena fluorescencija), stanje slike za svaki događaj slikanja bila bi:

1

[0069] U oba slučaja, inkorporisanje od A bi se detektovala određenim intenzitetom samo u zelenom kanalu, inkorporisanje C bi se detektovala određenim intenzitetom samo u crvenom kanalu, inkorporisanje T bi se detektovala i u zelenom i u crvenom kanalu pri polovini intenziteta A i C, a G bi se detektovao minimalno ili se ne bi detektovao ni u zelenom ni u crvenim kanalu (Slika 3B). Prateći korak ili korake snimanja, fluorescentna boja i 3' terminator se razdvajaju i izvodi se naredni ciklus sekvenciranja.

[0070] Ovaj primer nije ograničen na bilo koje dve boje ili kombinacije konjugata, i bilo koje dve boje različitog spektra fluorescencije mogu se koristiti u sistemu za sekvenciranje sa dve boje, u bilo kojoj kombinaciji rbNTP-boja konjugata. Na primer, boje prikazane u primeru iznad emituju u crvenoj i zelenoj talasnoj dužini. Međutim, postupci i sistemi nisu ograničeni talasnim dužinama pobuđivanja ili emitovanja (na primer, spektar fluorescencije) bilo koje određene boje, jer takve boje koje se razlikuju po spektrima fluorescencije mogu biti potencijalno korisne. Dalje, primer opisuje određene rbNTP-boja konjugate; međutim konjugati nisu ograničeni na te posebne kombinacije. Na primer, bilo koji od tri rbNTP može biti potencijalno konjugovan sa bilo kojom od navedenih boja (jedan nukleotid ostaje nekonjugovan ili taman). Primeri boja i njihovih derivata korisni u otelotvorenjima opisanim ovde uključuju, ali nisu ograničeni na, one opisane u nastavku.

[0071] Dodatno, jedan ili više konjugata nukleotidnog tipa opisanih u strategiji iznad mogu dalje sadržati jedan ili više veznika kako je opisano u alternativnim otelotvorenjima i strategijama. Stoga, jedna ili više hemijskih reakcija ili reakcija modifikovanja mogu biti uključene u reakciju sekvenciranja u kombinaciji sa strategijom u kojoj su dve boje različitih spektara fluorescencije konjugovane na različite tipove nukleotida. Prema tome, konjugati tipa nukleotida u ovom primeru mogu se dalje modifikovati na bilo načina kako je ovde opisano bez umanjivanja otelotvorenja gde se dve boje različitih spektara fluorescencije mogu koristiti za određivanje sekvence nukleinske kiseline.

2

[0072] U drugom primeru otelotvorenja, dodatna strategija za detektovanje i određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciju sekvenciranja sastoji se od upotrebe dva seta fluorescentnih boja, gde svaki set boja sadrži dve boje sličnog spektra emitovanja fluorescencije ili sa emisionim λmaxodstupanjem od, na primer, 100 nm, gde jedna od dve boje emituje primetno jači intenzitet od druge boje u setu, i gde se dva seta fluorescentnih boja razlikuju po spektru fluorescentnog emitovanja. U poželjnim otelotvorenjima, boja u setu boja koje je primetno većeg intenziteta od druge boje u setu je najmanje 0,5X, najmanje 0,75X, najmanje 1X, najmanje 2X intenzivnija od boje nižeg intenziteta. Kada se izvode dva seta fluorescentnih boja, kako je ovde opisano, određivanje sekvence može biti putem jednog događaja snimanja ili dva događaja snimanja.

[0073] Za potrebe primera, Slika 4A prikazuje dva primerna seta boja; i DEG527 i Atto532 mogu se detektovati zajedno (emisija fluorescencije od približno λmax555-595nm) i Dy681 i SO7181 mogu se detektovati zajedno (emisija fluorescencije od približno λmax670-715nm). Na primer, napravljene su naredne konjugacije rbNTP-boje:

rbATP-DEG527

rbCTP-Dy681

rbTTP-Atto532/SO7181

rbGTP-taman

[0074] Kao takav, procenat svakog inkorporisanog nukleotida konjugovanog sa određenim fluoroforom u ovom primeru je:

[0075] Na primer, prateći standardne SBS protokole, sva četiri nukleotida se dodaju istovremeno u SBS reakciju. rbNTP se nadmeću za inkorporisanje u rastući lanac nukleinske kiseline. Kao što je prethodno opisano, rbNTP poseduju 3' terminator koji se može ukloniti razdvajanjem radi daljeg proširenja. Nakon inkubacije koja omogućava uključivanje odgovarajućeg nukleotida u rastući lanac nukleinske kiseline, reakcija se izlaže prvoj talasnoj dužini svetlosti, izvodi se prvi događaj snimanja, zatim se reakcija izlaže drugoj talasnoj dužini svetlosti i izvodi se drugi događaj snimanja.

[0076] Na primer, nakon inkorporisanja odgovarajućeg označenog nukleotida u rastući lanac nukleinske kiseline, dva seta fluorescentnih boja mogu se pobuđivati korak po korak, kao što je prvo pobuđivanje jednog seta fluorofora, nakon čega sledi prvi događaj snimanja, a zatim pobuđivanje drugog set fluorofora praćeno drugim događajem snimanja. Na primer, ako se prvo pobudi DEG527/Atto532, i zatim sledi Dy681/SO7181 (npr., obrnuto ako se prvo snima emisija crvene fluorescencije, i zatim zelena fluorescencija), stanje slike za svaki događaj slikanja će biti:

[0077] Stanja slike za T su navedena kao >1 za svaki događaj slikanja. Oznaka >1 pretpostavlja da je boja većeg intenziteta barem jačeg intenziteta od boje nižeg intenziteta u paru boja.

[0078] Alternativno, reakcija se može izložiti istovremeno talasnoj dužini pobuđivanja obe fluorescentne boje, uzrokujući istovremeno emitovanje dve fluorescentne boje, čija se emisija može istovremeno detektovati pomoću dva različita filtera za detektovanje i optike za snimanje. U takvom istovremenom sistemu u kome se vrši samo 1 događaj snimanja za dva različita kanala detektovanja istovremeno, stanja slike za svaki kanal detektovanja bi bila:

[0079] U oba slučaja, inkorporisanje A bi se detektovala određenim intenzitetom samo u

4

zelenom kanalu, a inkorporisanje C bi se detektovala određenim intenzitetom samo u crvenom kanalu. Međutim, zbog povećanog intenziteta boja koje su konjugovane sa rbTTP u poređenju sa bojama nižeg intenziteta konjugovanim sa rbATP i rbCTP, pretpostavlja se kako bi se inkorporisanje T detektovala i u zelenom i u crvenom kanalu pri jednakom ili većem intenzitetu od A i C. Još jednom, u ovom primeru bi inkorporisanje G bila minimalna ili ne bi bila detektovana ni u zelenom ni u crvenom kanalu.

[0080] Slika 4B prikazuje toplotnu mapu u vidu oblaka koja pokazuje detektovanje inkorporisanog rbTTP u poređenju sa rbCTP i rbATP kada se izvode opisana dva seta boja, gde je jedna boja jačeg intenziteta od druge boje u setu. Nakon koraka snimanja, fluorescentna boja i 3' terminator se razdvajaju i izvodi se naredni ciklus sekvenciranja.

[0081] Dodatno, jedan ili više konjugata nukleotidnog tipa opisanih u ovom primeru mogu dalje sadržati jedan ili više veznika kako je opisano u alternativnim otelotvorenjima. Stoga, jedna ili više hemijskih reakcija ili reakcija modifikovanja mogu biti uključene u reakciju sekvenciranja u kombinaciji sa strategijom u kojoj se dva seta boja različitih spektara emitovanja konjuguju sa različitim tipovima nukleotida. Prema tome, konjugati tipa nukleotida u ovom primeru mogu se dalje modifikovati na bilo koji način kako je ovde opisano bez umanjivanja otelotvorenja gde se dva seta boja različitih spektara emitovanja mogu koristiti za određivanje sekvence nukleinske kiseline.

[0082] Dodatno, ovaj primer nije ograničen na neki određen set boja ili kombinacije konjugata, i mogu se koristiti bilo koja dva seta boja različitog spektra emitovanja, u bilo kojoj kombinaciji kombinacije rbNTP-boje konjugata, dok se sledi strategija za konjugaciju kao što je ovde obelodanjeno (npr. dva tipa nukleotida su konjugovana sa različitim bojama nižeg intenziteta, a jedan tip nukleotida sa dve boje jačeg intenziteta). Primer koji opisuje upotrebu dva seta boja za postupke sekvenciranja nije ograničen na neke određene setove dve boje i bilo koji setovi boja različitih spektara fluorescencije mogu se koristiti u sistemu sekvenciranja, kako je ovde opisano. Dodatni setovi boja sadrže one koji imaju λmaxodstupanje emitovanja od najmanje 60nm, najmanje 70nm, najmanje 80nm, najmanje 90nm, najmanje 100nm, poželjno najmanje 100nm. Primeri setova boja uključuju, ali nisu ograničeni na, Atto465, 488, 495/Atto514, 520, 532, 550, 565; Atto 520, 532, 550/Atto565, 590, 594, Rho11, Rho 12, Rho 13; Atto 647, 655, 665/Atto 680, 700, 725; Alexa 647, 660, Cy5/Alexa 680, 700, Cy5,5; Alexa532, Cy3/Alexa555, 556, 578, 590, Cy3,5; Alexa 488/Alexa532, 555, 556, 578; Dy 647, 648, 649, 650, 651, 652, 654/Dy675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 700, 701, 703, 704; Dy490, 495, 505/Dy530, 547, 548, 549, 550, 554,555, 556, 560; Dy530, 547, 548, 549, 550, 554,555, 556, 560/Dy590, 591, 594, 605, 610, 615.

[0083] Gore navedene strategije su po svojoj prirodi primerne, opisuju samo nekoliko od mnogih potencijalnih strategija i služe kao vodič za inovativne postupke i sastave koji su ovde obelodanjeni za korišćenje jednog fluorescentnog dela, ili više fluorescentnih delova istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja, za sekvenciranje nukleinske kiseline.

Stručnjak će razumeti da različite strategije služe kao vodič za kreiranje dodatnih strategija korišćenjem jednog fluorescentnog dela, ili mnoštva fluorescentnih delova istog ili sličnog spektra pobuđivanja/emitovanja, za sekvenciranje nukleinske kiseline, i da i dalje budu u opsegu postupaka koji su ovde obelodanjeni.

[0084] U jednom aspektu, rbNTP konjugat kako je ovde opisano sadrži

detekcioni deo/delove

veznik/veznike

bazu

gde detekcioni deo jeste jedan ili više fluorescentnih delova, hapten ili njihove kombinacije, gde je veznik jedan ili više odstojnika, veznik sa jednim ili više mesta razdvajanja ili njihove kombinacije, gde je baza jedan od tri modifikovana nukleotida (npr. rbNTP) gde je X monofosfat, difosfat ili trifosfat i gde R<1>predstavlja -H, -OH, -OCH2N3ili bilo koju grupu koja se može transformisati u -OH, uključujući karbonil kovalentno vezan za 3' ugljenik.

[0085] U nekim otelotvorenjima, detekcioni deo je fluorescentni deo. U nekim otelotvorenjima, detekcioni deo je hapten koji se može detektovati preko vezujući partnerfluorescentni deo konjugata. U nekim otelotvorenjima, rbNTP konjugat sadrži jedan ili oba fluorescentna dela i hapten povezan sa rbNTP preko jednog ili više veznika. U nekim otelotvorenjima hapten je biotin, digoksigenin (DIG) ili dinitrofenol (DNP). U nekim otelotvorenjima, hapten se detektuje pomoću vezujući partner-fluorescentni deo konjugata. U nekim otelotvorenjima, vezujući partner je mali molekul ili antitelo ili njegov fragment, na primer streptavidin, anti-DIG ili anti DNP.

[0086] Primeri fluorescentnih delova, ili njihovi derivati, za upotrebu kao fluorescentni delovi prema obelodanjenim otelotvorenjima uključuju, ali nisu ograničeni na, fluorescein i derivate fluoresceina, kao što su karboksifluorescein, tetrahlorofluorescein, heksahlorofluorescein, karboksinaftofluorescein, fluorescein izocijanat, NHS-fluorescein, jodoacetamidofluorescein, fluorescein, fluorescetoin maleimid, SAMSA-fluorescein, fluorescein tiosemikarbazid, karbohidrazinometiltioacetil-amino fluorescein, rodamin i derivati rodamina, kao što su TRITC, TMR, lisamin rodamin, Texas Red, rodamin B, rodamin 6G, rodamin 10, NHS-rodamin, TRM-jodoacetamid, lisamin rodamin B sulfonil hidrazin, Texas Red sulfonil hlorid, Texas Red hidrazid, kumarin i derivati kumarina kao što su AMCA, AMCA-NHS, AMCA-sulfo-NHS, AMCA-HPDP, DCIA, AMCE-hidrazid, BODIPY i derivati kao što su kao BODIPY FL C3-SE, BODIPY 530/550 C3, BODIPY 530/550 C3-SE, BODIPY 530/550 C3 hidrazid, BODIPY 493/503 C3 hidrazid, BODIPY FL C3 hidrazid, BODIPY FL IA, BODIPY 530/551 IA, Br-BODIPY 493/503, Cascade Blue i derivati kao što je Cascade Blue acetil azid, Cascade Blue kadverin, Cascade Blue etilendiamin, Cascade Blue hidrazid, Lucifer Yellow i derivati kao što su Lucifer Yellow jodoacetamid, Lucifer Yellow CH, cijanin i derivati kao što su cijaninske boje na bazi indolijuma, cijaninske boje na bazi benzo-indolijuma, cijaninske boje na bazi tiozolijuma, cijaninske boje na bazi hinolinijuma, cijaninske boje na bazi imadizolijuma, Cy 3, Cy5, lantanidni helati i derivati kao što su BCPDA, TBP, TMT, BHHCT, BCOT, evropijumovi helati, terbijumovi helati, Alexa Fluor boje, DyLight boje, Atto boje, LightCycler Red boje, CAL Flour boje, JOE i njihovi derivati, Oregon Green boje, WellRED boje, IRD boje, fikoeritrin i fikobilin boje, Malacit zelena, stilbene, DEG boje (na primer, one opisane u US2010/0009353), NR boje, skoro infracrvene boje i druge poznate u struci, poput onih opisanih kod Haugland, Molecular Probes Handbook, (Eugene, OR) 6th Edition; The Synthegen catalog (Houston, TX.), Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd Ed., Plenum Press New York (1999), Hermanson, Bioconjugatc Techniques, 2nd Edition, US2010/0009353 ili WO 98/59066.

[0087] U nekim otelotvorenjima, detekcioni deo je konjugovan sa rbNTP preko veznika. U nekim otelotvorenjima rbNTP konjugat sadrži jedan ili više od jednog veznika. U nekim otelotvorenjima, veznik je odstojnik koji je konjugovan na jednom kraju sa rbNTP, i na drugom sa detekcionim delom. U nekim otelotvorenjima, odstojnik sadrži jednu ili više grupa razdvajanja. Nasuprot tome, u nekim otelotvorenjima odstojnik ne sadrži grupu razdvajanja. U jednom otelotvorenju, odstojnik (npr. sa ili bez grupe razdvajanja) je molekul polietilen glikola (PEG) ili njegovi konkatameri. Na primer, u nekim otelotvorenjima, odstojnik sadrži konkatamere od najmanje dva, od najmanje tri, od najmanje četiri, od najmanje pet, od najmanje šest, od najmanje sedam, od najmanje osam, od najmanje deset ili najmanje dvanaest PEG molekula.

[0088] U poželjnim otelotvorenjima, odstojnici koji se koriste za konjugovanje rbNTP sa detekcionim delom, na primer fluorescentnim delom ili haptenom, sadrže najmanje četiri do dvanaest konkatamera od PEG (tj. PEG4, PEG 8, PEG 12). U nekim otelotvorenjima, odstojnik sadrži 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetnu kiselinu. U nekim otelotvorenjima, odstojnik koji sadrži 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetnu kiselinu sadrži jednu ili više grupa razdvajanja. U nekim otelotvorenjima, rbNTP je vezan za dva odstojnika (na primer, zasebni veznici konstrukta bifurkovanog veznika), koji mogu biti isti ili različiti, od kojih svaki završava detekcionim delom. U nekim otelotvorenjima, dva odstojnika sadrže PEG i 2-{2-[3-(2-amino-etilkarbomil)-fenoksil-1-azido-etoksi}-etoksi-sirćetnu kiselinu, od kojih jedan ili oba mogu ali ne moraju da sadrže jednu ili više grupa razdvajanja, koje završavaju detekcionim delom. U nekim otelotvorenjima, dva odstojnika mogu biti dva PEG veznika koji mogu biti jednakih ili nejednakih dužina (npr. jedan PEG4, i drugi PEG 12), gde svaki od PEG veznika završava u detekcionom delu, dalje sa ili bez grupe razdvajanja.

[0089] Primeri veznika mogu se naći, na primer, u SAD patentima 7,816,503, 7,771,973, i patentnoj prijavi 2010/00317531. Postupci i sastavi kao što je ovde opisano nisu ograničeni bilo kojim posebnim odstojnikom, i alternative će biti očigledne stručnjaku i razmatraju se u okviru predmetnog obelodanjenja.

[0090] U nekim otelotvorenjima, odstojnik sadrži jednu ili više grupa razdvajanja. Grupe razdvajanja za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani mogu uključivati, ali nisu ograničene na disulfidne grupe, kiselinski labilne grupe, Sieberove grupe, indolne grupe, tbutil Sieberove grupe, elektrofilno razdvojive grupe, nukleofilno razdvojive grupe, grupe koje se mogu fotorazdvojiti, grupe razdvajanja koje se razdvajaju pod redukcionim uslovima, oksidativnim uslovima, razdvajanje upotrebom sigurnosnih grupa, razdvajanje pomoću eliminacionog mehanizma i grupe sa metalnim razdvajanjem. Kako se ovde koristi, izraz „razdvojivi veznik“ smatra se ekvivalentnim odstojnikom koji sadrži jednu ili više grupa razdvajanja. Diskusiju o veznicima može se pronaći, na primer, kod Guiller et al, 2000, Chem. Rev. 100:2091-2157 i kako je dato u SAD patentnu 7,771,973. Postupci i sastavi kao što je ovde opisano nisu ograničeni bilo kojom posebnom grupom razdvajanja, i alternative će biti očigledne stručnjaku i razmatraju se u okviru predmetnog obelodanjenja.

[0091] U nekim otelotvorenjima, reverzibilno blokirani modifikovani nukleotidi, kako je ovde opisano, su vezani za mali molekul preko veznika. U nekim otelotvorenjima, veznik sadrži jednu ili više grupa koje se mogu odvojiti i može se nazvati veznikom koji se može razdvojiti. Razdvojive grupe uključuju, ali nisu ograničene na, disulfid, diol, diazo, estar, sulfon azid, alil i silil etar, azidne i alkoksi grupe. U poželjnim otelotvorenjima, jedna ili više od azid, alkoksi i disulfid grupa su povezane sa reverzibilno blokiranim nukleotidom (rbNTP) sa drugim molekulom, na primer haptenom ili detekcionim delom, ili oba, za upotrebu u postupcima koji su ovde opisani. Uključivanje disulfidne veze u veznik, kao što je ovde opisano, može se postići na više načina, na primer kako je ovde navedeno, kako je pronađeno u SAD patentu 7,771,973, ili kako je opisano kod Hermanson, Bioconjugate Techniques, Second Edition, Academic Press.

[0092] U nekim otelotvorenjima, sastav koji sadrži agens za razdvajanje je dodat u reakciju sekvenciranja radi razdvajanja grupe razdvajanja u odstojniku rbNTP konjugata. Dodat agens za razdvajanje zavisi od prisutne grupe razdvajanja. Na primer, razdvajanje disulfidnih veza ili drugih reduktivnih grupa razdvajanja postiže se redukcionim agensom. Smanjenje disulfidne veze rezultuje oslobađanjem rbNTP iz povezanog molekula, na primer haptena, haptenskog konjugata i/ili detekcionog dela, kao što je fluorescentni deo. Redukujući agensi koji su korisni u praktičnim otelotvorenjima kao što je ovde opisano uključuju, ali nisu ograničeni na, jedinjenja fosfina, fosfine rastvorljive u vodi, fosfine koji sadrže azot i njihove soli i njihove derivate, ditioeritritol (DTE), ditiotreitol (DTT) (cis i trans izomere, respektivno, 2,3-dihidroksi-1,4-ditiolbutan), 2-merkaptoetanol ili β-merkaptoetanol (BME), 2-merkaptoetanol ili aminoetantiol, glutation, tioglikolat ili tioglikolna kiselina, 2,3-dimerkaptopropanol i tris (2-karboksimetil)fosfin (TCEP), tris(hidroksimetil)fosfin (THP) i β-[tris(hidroksimetil)fosfin] propionska kiselina (THPP). U nekim otelotvorenjima, redukcioni agens koje se koristi za razdvajanje disulfidne veze u vezniku kao što je ovde opisano je DTT. U nekim otelotvorenjima, koncentracija redukcionog reagensa, na primer DTT, upotrebljena za razdvajanje disulfidne veze iznosi najmanje 1 do 1000 mM, najmanje 20 do 800 mM, najmanje 40 do 500 mM, poželjno najmanje 50 do 200 mM. U nekim otelotvorenjima, redukcioni agens koji se koristi za razdvajanje disulfidne veze u vezniku, kako je ovde opisano, je fosfinski reagens, fosfinski reagens rastvorljiv u vodi, fosfinski reagens koji sadrži azot i njegove soli i derivati. Primeri reagensa fosfina uključuju, ali nisu ograničeni na, TCEP, THP i one obelodanjene u SAD patentnoj publikaciji 2009/0325172 kao što su triaril fosfini, trialkil fosfini, fosfoni koji sadrže sulfonate i karboksilate, i derivatizovani fosfini rastvorljivi u vodi. U nekim otelotvorenjima, koncentracija fosfina koja se koristi za razdvajanje disulfidne veze iznosi najmanje 0,5-500 mM, najmanje 5 do 50 mM, i poželjno najmanje 10 do 40 mM. Postupci i sastavi kao što je ovde opisano nisu ograničeni bilo kojom posebnom grupom razdvajanja, i alternative će biti očigledne stručnjaku i razmatraju se u okviru predmetnog obelodanjenja.

[0093] U nekim otelotvorenjima, veznik kao što je ovde opisano, koji može ali ne mora da sadrži mesto razdvajanja, povezuje rbNTP sa fluorescentnim delom i prelaznim obrazac fluorescencije za detektovanje inkorporisanja nukleotida u SBS reakciju se ostvaruje dodavanjem boje za gašenje u ciklus sekvenciranja. Na primer, rbNTP konjugovan sa fluorescentnim delom preko veznika (gde veznik može ali ne mora da sadrži mesto razdvajanja) dodaje se u reakciju sekvenciranja. Snima se prva slika čime se uspostavlja prvi obrazac detektovanja. Tokom intermedijarnog reakcionog koraka, reakciji se dodaje boja za gašenje (npr. umesto FRET partnera uklonjenog iz reakcije putem koraka razdvajanja), gde boja za gašenje dovoljno gasi fluorescenciju gore navedenog fluorescentnog dela što rezultuje detektibilnom promenom obrasca fluorescencije (npr. fluorescencija nestaje ili prelazi u minimalnu fluorescenciju) pri narednom koraku snimanja za taj nukleotid. Ovo otelotvorenje je alternativa FRET sistemu donora/akceptora kako je ovde opisano, gde kombinacija dve boje dovodi do fluorescencije, i uklanjanje jedne od boja, na primer reakcijom razdvajanja, dovodi do gubitka fluorescencije.

[0094] Boje za gašenje, kako je ovde predviđeno, uključuju, ali nisu ograničene na, one supstance koje apsorbuju energiju pobuđivanja fluorofora, efikasno gaseći fluorescenciju ciljanog fluorofora, međutim, same po sebi nisu fluorescentne. Primeri boja za gašenje uključuju, ali nisu ograničeni na tamne gasioce kao što su DABCIL (upija u zelenom

4

spektru), Iowa black FQ (upija u zeleno-žutom spektru), Iowa black RQ (upija u narandžastocrvenom spektru), IRDye QC-1 (upija u rasponu 500-900 nm) i Black Hole Quencher™ boje (upija u rasponu 500-700 nm). Na primer, DABCIL se često koristi za gašenje fluorescencije fluoresceina, a Black Hole Quencher™ boje se koriste za gašenje fluorescencije od FAM, TET, HEX, JOE, TAMRA, ROX i CY boja u zavisnosti od karakteristika (npr. maksimum upijanja) određenog Black Hole Quencher™. U dodatnim otelotvorenjima, takvi tamni gasioci se mogu koristiti u FRET sistemu, gde razdvajanje tamnog gasioca tokom srednjeg koraka dovodi do promene stanja fluorescencije iz ugašene fluorescencije u fluorescenciju, čime se uspostavlja obrazac detektovanja za inkorporisanje nukleotida u SBS reakcioni ciklus.

[0095] Predviđeno je korišćenje otelotvorenja za gašenje boje, kako je ovde opisano, u permutacijama i kombinacijama za detektovanje inkorporisanja nukleotida u SBS ciklus, kako će razumeti stručnjaci. Na primer, rbNTP može biti povezan sa fluorescentnim delom u kom se boja za gašenje koristi za određivanje inkorporisanja nukleotida, drugi rbNTP može biti povezan sa biotinom gde se dodavanje SA-fluorescentnog dela koristi za određivanje inkorporisanja nukleotida, a treća boja moće biti povezana sa fluorescentnim delom u kom se za određivanje inkorporisanja nukleotida koristi reakcija razdvajanja. Postupci koji su ovde opisane nisu ograničeni time koji je nukleotid konjugovan na koji određeni sistem detektovanja, osim njihove kombinacije koja omogućava određivanje inkorporisanja nukleotida u reakciju sekvenciranja.

[0096] U nekim otelotvorenjima, fluorescentni detekcioni deo je modifikovan tako da pruži uočljivu razliku fluorescencije između slike 1 i slike 2. Na primer, fluorescentni deo koji je direktno ili indirektno vezan za rbNTP može se snimiti tokom prvog događaja snimanja. Između prvog i drugog događaja snimanja, reakciji sekvenciranja može se dodati hemikalija, mali molekul itd., tako da se struktura fluorofora modifikuje, čime se fluorescentni deo čini nedetektabilnim ili minimalno detektabilnim tokom drugog događaja snimanja. Na primer, može se dodati agens za razdvajanje koje cilja jednu ili više veza i/ili strukturnih celina fluorescentnog dela koji može uništiti fluorescentnu prirodu fluorescentnog dela i na taj način omogućiti detektovanje stanja slike indikativnih za uključivanje vezanog rbNTP. Stoga, modifikacije samog fluorescentnog dela mogu pružiti detektabilne promene u stanju snimanja koje mogu biti korisne u postupcima koji su ovde opisani.

[0097] U nekim otelotvorenjima predmetnog obelodanjenja, tip nukleotida za upotrebu u reakciji sekvenciranja je rbNTP konjugat koji sadrži bazu, na primer prirodnu ili modifikovanu bazu. U poželjnim otelotvorenjima, baza je modifikovana baza. U poželjnim otelotvorenjima, modifikovana baza sadrži tri fosfatne grupe izvan šećerne kičme, kao što je trifosfat, kako je označeno sa NTP. U poželjnim otelotvorenjima, modifikovana baza je reverzibilno blokirana gde NTP sadrži reverzibilnu terminator 3' blokirajuću grupu koja, nakon što se ukloni, omogućava nastavak proširenja u sekvenci reakcijom sekvenciranja sinteze. U nekim otelotvorenjima, 3'blokirajuća grupa sadrži azido i/ili alkoksi grupu i može se ukloniti razdvajanjem sa fosfinskim reagensom. Takvi nukleotidi se nazivaju „reverzibilno blokirani“ ili „rb“, čiji je tip „potpuno funkcionalan“ ili „ff“ NTP (komercijalno dostupan od Illumina, Inc.). Dalje rasprave o rbNTP nalaze se, na primer, u SAD patentima 7,816,503 i 7,771,903 i publikaciji SAD patentnih prijava US2010/00317531.

[0098] Obelodanjeni postupci za detektovanje nukleinskih kiselina imaju posebnu vrednost kada se koriste u sekvenciranju, na primer sekvenciranje pomoću tehnologije sinteze (SBS). Sekvenciranje sintezom generalno obuhvata sekvencijalno dodavanje jednog ili više fluorescentno označenih nukleotida rastućem polinukleotidnom lancu u smeru 5' do 3' pomoću polimeraze. Prošireni polinukleotidni lanac komplementaran je obrascu nukleinske kiseline pričvršćenom na supstrat (npr. protočna ćelija, čip, slajd itd.), ciljanoj sekvenci. U nekim otelotvorenjima, identitet inkorporisanog nukleotida u proširenom lancu se određuje nakon dva koraka snimanja, čime se dobijaju podaci o inkorporisanju sekvenci u realnom vremenu.

[0099] Obelodanjen postupak za detektovanje nukleinske kiseline takođe može biti od koristi kada se koristi u sekvenciranju ligacijom, sekvenciranju hibridizacijom i drugim tehnologijama sekvenciranja gde se koriste šeme modifikacije „tamnih“ nukleotida i/ili ortogonalnih nukleotida.

[0100] Sekvenciranje ligacijom je postupak sekvenciranja gde se prajmer za sekvenciranje produžava na ciljanoj sekvenci ligacijom sonde koja sadrži tip nukleotida (npr. A, T, C ili G), gde je sonda koja je vezana indikativna za sekvencu narednog nukleotida u nizu ciljanih nukleotida. Sekvenciranje pomoću sondi za ligaciju može sadržati mesta razdvajanja koja se mogu razdvojiti nakon događaja ligacije, tako da se može izvršiti još jedno dodavanje okrugle sonde, ligacija i određivanje inkorporisanja nukleotida. Primer sekvence prema metodologiji ligacije je di-bazno kodiranje (npr. sekvenciranje prostora u boji) koje koristi SOLiD™ sistem za sekvenciranje kompanije Applied Biosystems. Dvobazno kodiranje ili sekvenciranje „prostora u boji“ koristi sonde za ispitivanje koje se sastoje od 2 baze specifične za sondu (npr. sastavljene od svih mogućih kombinacija četiri različita tipa nukleotida) praćeno sa tri degenerisane baze i šest univerzalnih baza, gde je svaka od sondi ispitivanja povezana sa jednom od četiri različite fluorescentne boje. Sonde se dodaju u reakciju sekvenciranja koja sadrži cilj i prajmer za sekvenciranje i termostabilna ligaza vrši ligaciju di-bazne sondu komplementarno sa tim sekvencama susednim prajmeru za sekvenciranje kako se nalazi na obrascu. Fluorescencija se detektuje snimanjem u četiri boje, ligacije se razdvajaju kako bi se uklonila fluorescentna boja i regenerisao 5' fosfat za dodatne krugove ligacije i detektovanja. Svaki obrazac se dva puta ispituje. Nakon nekoliko rundi vezivanja i detektovanja jednog prajmera za sekvenciranje, sintetički lanac se denaturiše, dodaje se novi prajmer za sekvenciranje i proces detektovanja ligacije počinje iznova.

Dikodirani fluorescentni delovi podataka o prostoru u boji su poravnati, primenjeni na mrežu genoma referentnog prostora u boji i određena je sekvenca (Voelkerding et al., 2009, Clin Chem 55:641-658).

[0101] Modifikovani nukleotidi koji su ovde obelodanjeni mogu se koristiti u sekvenci pomoću tehnologija ligacije. Na primer, sonde iz šeme kodiranja sa dve baze u kojoj su četiri dinukleotidne sekvence povezane sa jednom bojom, na primer AA, CC, GG i TT mogu biti povezane sa plavom fluorescentnom bojom, druge četiri dinukleotidne sekvence su povezane sa crvenom bojom, još četiri detektovanja zelene boje se pomoću sistema za snimanje u četiri boje mogu modifikovati kao što je ovde opisano. Uključivanje manje od četiri boje, na primer jedne boje ili dve ili više boja sličnog pobuđivanja/emitovanja, dok se praktikuju hemijske i/ili enzimske manipulacije, omogućilo bi manje događaja snimanja, što bi pojednostavilo optiku instrumenta. Na primer, sonda koja sadrži četiri dinukleotidne sekvence kao što su AA, CC, GG i TT, koja dalje sadrži broj ili degenerisane i/ili univerzalne nukleotide (opciono), mogla bi dalje da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja (na primer azid ili alkoksi mesto razdvajanja) povezujući dinukleotid sa fluorescentnim delom. Sonda koja sadrži drugi set od četiri dinukleotida, na primer TA, GC, CG i AT, koji dalje sadrži broj ili degenerisane i/ili univerzalne nukleotide (opciono), mogla bi dalje da sadrži veznik koji sadrži dva mesta razdvajanja (drugo mesto razdvajanja različito od prvog, na primer SS veza) koja povezuje dinukleotid sa fluorescentnim delom. Set sondi koji sadrži treći set od četiri dinukleotida, na primer CA, AC, GT i TG, koji dalje sadrži broj ili degenerisane i/ili

4

univerzalne nukleotide (opciono), mogao bi dalje da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja koje povezuje dinukleotid sa haptenskim delom (na primer biotin). Četvrti set sondi od četiri dinukleotida mogao bi sadržati dodatne nukleotide, veznike itd., međutim nedostajao bi fluorescentni deo. Sonde se mogu dodati u sekvenciranje reakcijom ligacije, vezati u obrazac i prva slika se može snimiti kako bi se uhvatilo prvo signalno stanje.

Reakciji se može dodati reagens razdvajanja kako bi razdvojio drugo mesto razdvajanja (npr. SS veza), čime se oslobađa fluorescentni deo, mogao bi se dodati hapten vezujući partner (na primer streptavidin) konjugovan sa fluorescentnim delom, i druga slika bi se mogla snimiti kako bi uhvatila drugo signalno stanje. Agens za razdvajanje na prvom mestu razdvajanja (npr. azid/alkoksi) se može dodati u reakciju kako bi se oslobodili svi fluorescentni delovi i može se izvršiti naredna runda sekvenciranja ligacijom. Signalna stanja se mogu poravnati i odrediti sekvence.

[0102] Sekvenca hibridizacijom obuhvata upotrebu niza kratkih sekvenci nukleotidnih sondi kojima se dodaje fragmentisana, označena ciljana DNK (Drmanac et al., 2002, Adv Biochem Eng Biotechnol 77:75-101; Lizardi et al., 2008, Nat Biotech 26:649-650). Fragmenti se hibridizuju u svoju komplementarnu sondu na nizu i hibridizacija se hvata pričvršćenom oznakom, poput fluorescentne boje, čime se određuje sekvenca cilja. Neke primene sekvenci hibridizacijom koriste sonde koje sadrže univerzalne (na primer, analoge nukleotida) i označene nukleotide i nazivaju se sonde sa razmacima, čija upotreba povećava osetljivost hibridizacije i na taj način detektuje test sekvenciranja (SAD patent 7,071,324). Dalja poboljšanja sekvence hibridizacijom mogu se naći u, na primer, publikacijama SAD patentnih prijava 2007/0178516, 2010/0063264 i 2006/0287833. Međutim, bez obzira na postupak, često su potrebni složeni optički sistemi za snimanje događaja hibridizacije.

[0103] Modifikovani nukleotidi koji su ovde obelodanjeni mogu se koristiti u sekvenci pomoću tehnologija hibridizacije. Sonde nukleinske kiseline iz više različitih uzoraka za određivanje sekvence koje su hibridizirane u nizove sondi mogu se modifikovati tako da sadrže atribute koji su ovde obelodanjeni za upotrebu u minimalnom sekvenciranju boje, čime se omogućava manje složena optika sa istovremenim određivanjem sekvence više različitih ispitivanih uzoraka. Na primer, sonda za ispitivani uzorak (npr. fragmentisane ispitivane nukleinske kiseline) se može modifikovati tako da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja (na primer mesto azidnog ili alkoksi razdvajanja) koje povezuje sondu sa fluorescentnim delom. Drugi set sondi se može modifikovati tako da sadrži veznik koji sadrži dva mesta razdvajanja (drugo mesto razdvajanja različito od prvog, na primer SS veza) koje povezuje drugu sondu sa fluorescentnim delom. Treći set sondi mogao bi da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja koje povezuje sondu nukleinske kiseline sa delom haptena (na primer biotin). Sonde se mogu dodati u sekvencu prema tipu hibridizacije, sprovode se reakcije hibridizacije modifikovanih test sondi sa imobilisanim sondama na nizu, i snima se prva sliku za hvatanje prvog signalnog stanja. Reakciji se može dodati reagens razdvajanja kako bi se razdvojilo drugo mesto razdvajanja (npr. SS veza), oslobađajući tako fluorescentni deo, mogao bi se dodati hapten vezujući partner (na primer streptavidin) konjugovan sa fluorescentnim delom i snima se drugu sliku kako bi se uhvatilo drugo signalno stanje. Moglo bi se odrediti signalno stanje, gde se mreža stanja dva signala slike može koristiti za određivanje mesta, i time i za sekvencu više različitih hibridizovanih ispitivanih sondi.

[0104] Pristupi sekvenciranja koji kombinuju biohemiju hibridizacije i ligacije su razvijeni i komercijalizovani, poput tehnologije genomskog sekvenciranja koju primenjuje Complete Genomics, Mountain View, CA). Na primer, kombinatorna ligacija sonde-sidro ili cPAL™ (Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81) koristi biohemiju ligacije dok koristi prednosti sekvence hibridizacijom. Ukratko, sekvenciranje ciljanih DNK nano kuglica obuhvata detektovanje proizvoda ligacije koji nastaju oligonukleotid sidrom koji je hibridiziran u adaptersku sekvencu koja se zatim vezuje za fluorescentno označenu degenerisanu sondu za sekvenciranje koja sadrži jedan od četiri navedena nukleotida na mestu ispitivanja. Do ligacije dolazi kada je nukleotid na mestu ispitivanja komplementaran nukleotidu na mestu detektovanja unutar ciljane DNK nano kuglice. Rezultujući stabilan proizvod vezivanja sonde/sidra se fluorescentno detektuje. Nakon očitavanja, čitav kompleks sidra/sonde se oslobađa, naredne sidro se hibridizuje sa metom DNK, i proces se ponavlja. Kao i kod mnogih reakcija sekvenciranja, koriste se četiri različite boje koje se mogu detektovati, po jedna za svaki navedeni ispitivani nukleotid A, C, G i T koristeći više optika za detektovanje.

[0105] Modifikovani nukleotidi koji su ovde obelodanjeni mogu se koristiti u kombinovanim tehnologijama sekvenciranja vezivanja sonda-sidro. Uključivanje manje od četiri boje omogućilo bi manje događaja snimanja. Na primer, sonda koja sadrži broj ili degenerisane nukleotide mogla bi dalje da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja (na primer mesto azidnog ili alkoksi razdvajanja) koji povezuje ispitivani nukleotid sa fluorescentnim delom. Sonda koja sadrži drugi set degenerisanih nukleotida mogla bi dalje da sadrži veznik koji

4

sadrži dva mesta razdvajanja koja povezuju ispitivani nukleotid sa fluorescentnim delom. Set sondi koji sadrži treći set degenerisanih nukleotida mogao bi dalje da sadrži veznik koji sadrži mesto razdvajanja koje povezuje nukleotid za ispitivanje sa hapten delom (na primer biotin). Četvrti set sondi degenerisanih nukleotida mogao bi da sadrži dodatne nukleotide, veznike itd., međutim nedostajao bi fluorescentni deo. Sonde se mogu dodati cPAL™ reakciji, vezati za sidro/adapter i prva slika se može snimiti za snimanje prvog signalnog stanja. Reakciji za razdvajanje može se dodati reakcija za razdvajanje drugog mesta razdvajanja (npr. SS veza), čime se oslobađa fluorescentni deo, može se dodati hapten vezujući partner (na primer streptavidin) konjugovan za fluorescentni deo, i može se dodati i druga slika snimljeno za snimanje drugog signalnog stanja. Agens za razdvajanje za prvo mesto razdvajanja (npr. azid/alkoksi) se može dodati u reakciju kako bi se oslobodili svi fluorescentni delovi i mogla bi se sprovesti naredna runda cPAL™. Signalna stanja se mogu poravnati i odrediti sekvence.

[0106] Nukleinske kiseline ili polinukleotidi za sekvenciranje uključuju, ali nisu ograničeni na, nukleinske kiseline kao što su DNK, RNK ili PNK (peptidna nukleinska kiselina), njihove varijante ili fragmente i/ili njihove konkatamere. Polinukleotidi mogu biti poznate ili nepoznate sekvence, prirodne ili veštačke, i mogu biti bilo kog izvora (npr. eukariotski ili prokariotski). Polinukleotidi mogu biti prirodno izvedeni, rekombinantno proizvedeni ili hemijski sintetisani. Konkatamerizovani polinukleotidi mogu sadržati podjedinice ili njihove analoge koji se mogu ali ne moraju javljati u prirodi, ili modifikovane podjedinice. Ovde opisani postupci mogu se koristiti za određivanje sekvence polinukleotida. Dužina ciljane nukleinske kiseline za sekvenciranje može varirati. Na primer, nukleinska kiselina za sekvenciranje može da sadrži najmanje 10, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 40, najmanje 50, najmanje 100, najmanje 200, najmanje 500, najmanje 1.000, najmanje 10.000, najmanje 100.000, najmanje 1.000.000, najmanje 10.000.000 nukleotida. Polinukleotid za sekvenciranje može biti genomskog porekla, ili njegovi fragmenati ili varijante. Lanac nukleinske kiseline za sekvenciranje može biti jednolančan i može ali ne mora biti izveden iz dvolančanog molekula nukleinske kiseline. Jednolančani molekuli se takođe mogu proizvesti, na primer, hemijskim ili in vitro postupcima i tehnologijama sinteze. Otelotvorenja kao što su ovde opisana nisu ograničena postupcima pripreme nukleinskih kiselina i stručnjak može da izvede bilo koji postupak kako bi dobio sastav za upotrebu u detektovanim postupcima. Na primer, postupkom sinteze u sekvenci se često generiše biblioteka koja sadrži ciljane nukleinske kiseline, i zatim se sekvencira deo DNK biblioteke.

4

[0107] Izolovana DNK iz uzoraka, na primer uzorci koji sadrže genomsku DNK, tipično se modifikuje pre karakterizacije, na primer sekvenciranjem koristeći postupke kako je ovde opisano. Stvaraju se biblioteke genomske DNK koje se mogu sekvencirati izvođenjem postupaka koji su ovde opisani. Biblioteka se proizvodi, na primer, primenom postupaka opisanih u Nextera™ DNA Sample Prep Kit (Epicentre® Biotechnologies, Madison WI), SOLiD™ Library Preparation Kits (Applied Biosystems™ Life Technologies, Carlsbad CA), i slično. Uzorak DNK biblioteke može se dodatno pojačati za sekvenciranje, na primer, tehnikama amplifikacije sa višestrukim odstupanjem (MDA).

[0108] Za sekvenciranje nakon MDA, pojačana biblioteka uzoraka se, na primer, priprema stvaranjem DNK biblioteke kako je opisano u Mate Pair Library Prep kompletu, Genomic DNA Sample Prep kompletima ili TruSeq™ Sample Preparation i Exome Enrichment kompletima (Illumina®, Inc., San Diego CA).

[0109] DNK biblioteke se mogu imobilizovati na protočnoj ćeliji i amplifikacija mosta izvedena na imobilisanim polinukleotidima pre sekvenciranja, na primer sekvenciranja pomoću metodologija sinteze. U amplifikaciji mosta, imobilisani polinukleotid (npr. iz DNK biblioteke) je hibridizovan u imobilisani oligonukleotidni prajmer. 3' kraj imobilisanog molekula polinukleotida pruža šablon za polimerazom katalizovanu šablonom usmerenu reakciju izdužavanja (npr. proširenje prajmera) koja se proteže od imobilisanog oligonukleotidnog prajmera. Dobijeni dvolančani proizvod „premošćuje“ dva prajmera i oba lanca su kovalentno pričvršćena za nosač. U narednom ciklusu, nakon denaturacije koja daje par pojedinačnih lanaca (imobilisani šablon i prošireni prajmer) imobilisanih na čvrstu podlogu, oba imobilisana lanca mogu poslužiti kao šabloni za novo proširenje prajmera. Tako se prvi i drugi deo mogu pojačati kako bi se proizveo veći broj grupa. Grupe i kolonije se koriste naizmenično i odnose se na mnoštvo kopija sekvence nukleinske kiseline i/ili njenih komplemenata vezanih za površinu. Tipično, klaster sadrži mnoštvo kopija sekvence nukleinske kiseline i/ili njenih komplemenata, pričvršćenih preko njihovih 5' završetaka na površinu. Primeri metodologije pojačavanja mosta i grupisanja opisani su, na primer, u PCT patent publ. br. WO00/18957 i WO98/44151, SAD patentu br.5,641,658; SAD patent publ. br. 2002/0055100; SAD patentu br.7,115,400; SAD patent publ. br.2004/0096853; SAD patent publ. br.2005/0100900, SAD patent publ. br.2004/0002090; SAD patent publ. br. 2007/0128624; i SAD patent publ. br.2008/0009420. Sastavi i postupci koji su ovde opisani

4

posebno su korisni za sekvence metodologijama sinteze koje koriste protočnu ćeliju koja sadrži klastere.

[0110] Postupci PCR emulzije za amplifikaciju nukleinskih kiselina pre sekvenciranja takođe se mogu koristiti u kombinaciji sa postupcima i sastavima kako je ovde opisano. PCR emulzija obuhvata PCR amplifikaciju adapterske DNK biblioteke u voda-u-ulju emulziji. PCR je PCR sa više šablona; koristi se samo jedan par prajmera. Jedan od PCR prajmera je vezan za površinu (5' pričvršćenih) zrna mikroskalka. Niska koncentracija šablona dovodi do toga da većina emulzionih mikrovezikula koje sadrže zrna nemaju ili imaju jedan molekul šablona. U produktivnim emulzionim mikrovezikulama (emulziona mikrovezikula u kojoj su prisutna i zrna i molekul šablona), PCR amplikoni se mogu uhvatiti na površini zrna. Nakon razbijanja emulzije, zrna sa proizvodima amplifikacije mogu se selektivno obogatiti. Svako zrno sa klonskom amplifikacijom će na svojoj površini nositi PCR proizvode koji odgovaraju amplifikaciji jednog molekula iz biblioteke šablona. Različita otelotvorenja postupka PCR emulzije postavljena su kod Dressman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8817-8822 (2003), PCT patent publ. br. WO 05/010145, U.S. patent publ. br.2005/0130173, 2005/0064460, i US2005/0042648.

[0111] DNK nano kuglice se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa postupcima i sastavima kako je ovde opisano. Postupci za stvaranje i korišćenje DNK nano kuglice za genomsko sekvenciranje mogu se pronaći, na primer, u SAD patentima i publikacijama 7,910,354, 2009/0264299, 2009/0011943, 2009/0005252, 2009/0155781, 2009/0118488 i kako je opisano kod Drmanac et al., 2010, Science 327(5961): 78-81. Ukratko, nakon fragmentacije genomske DNK, uzastopni krugovi povezivanja adaptera, amplifikacije i digestije rezultuju sa glava-do-repa konkatatorima višestrukih kopija kružnog genomskog DNK šablona/adapterskih sekvenci koje se cirkulišu u jednolančanu DNK ligacijom sa kružnom ligazom i pojačanim kotrljajućim krugom (kako je opisano kod Lizardi et al., Nat. Genet. 19:225-232 (1998) i US 2007/0099208 A1). Adapterska struktura konkatamera promoviše namotavanje jednolančane DNK stvarajući tako kompaktne DNK nano kuglice. DNK nano kuglice se mogu uhvatiti na podloge, poželjno za stvaranje uređenog niza sa uzorcima tako da se održava rastojanje između svake nano kuglice, čime se omogućava sekvenciranje odvojenih DNK nano kuglica.

[0112] Stručnjak će prepoznati dodatne postupke i tehnologije za amplifikaciju nukleinskih

4

kiselina koje se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa postupcima i sastavima opisanim ovde. Ovde opisane varijante nisu ograničene na bilo koji postupak amplifikacije DNK.

[0113] Postupci koji su ovde opisani nisu ograničeni bilo kojim posebnim postupkom pripreme uzorka za sekvenciranje, i alternative će biti očigledne stručnjaku i razmatraju se u okviru predmetnog obelodanjenja. Međutim, posebna korisnost postoji kada se ovde navedeni postupci primenjuju na uređaje za sekvenciranje, kao što su protočne ćelije ili nizovi za izvodinje sekvenci pomoću metodologija sinteze ili drugih srodnih tehnologija sekvenciranja, poput onih koje primenjuje jedna ili više tehnologija sekvenciranja polonija (Dover Systems), sekvenciranje pomoću hibridizacione fluorescentne platforme (Complete Genomics), sTOP tehnologija (Industrial Technology Research Institute) i sekvenciranje sintezom (Illumina, Life Technologies).

[0114] U nekim otelotvorenjima, ovde navedeni postupci mogu se koristiti u izmenjenoj verziji protokola proizvođača na sistemu kao što su oni koje pruža Illumina®, Inc. (HiSeq 1000, HiSeq 2000, Genome Analyzers, MiSeq, HiScan, iScan, BeadExpress systems), Applied Biosystems™ Life Technologies (ABI PRISM® Sequence detection systems, SOLiD™ System), ili drugi instrument za sekvenciranje zasnovan na fluorescenciji, kao što je dalje opisano u, na primer, SAD patentima i patentnim prijavama 5,888,737, 6,175,002, 5,695,934, 6,140,489, 5,863,722, 2007/007991, 2009/0247414, 2010/0111768 i PCT prijav WO2007/123744, i SAD patentnim rpijavama br.61/431,425, 61/431,440, 61/431,439, 61/431,429, 61/438,486. Modifikacije komercijalnih postupaka mogu uključivati, ali nisu ograničene na, promenu upotrebljenih oznaka i dodavanje koraka za promenu stanja oznaka kako je ovde navedeno.

[0115] Izlazni podaci sa instrumenta za sekvenciranje mogu biti bilo koje vrste. Na primer, trenutna tehnologija obično koristi čitljiv izlaz koji generiše svetlost, kao što su fluorescencija ili luminiscencija, međutim ovi postupci nisu ograničeni na vrstu čitljivog izlaza sve dok su razlike u izlaznom signalu za određeni niz od interesa potencijalno utvrdive. Primeri softvera za analizu koji se mogu koristiti za karakterizaciju rezultata izvedenih iz izvođenja postupka kako je ovde opisano uključuju, ali nisu ograničeni na, Pipeline, CASAVA i GenomeStudio softver za analizu podataka (Illumina®, Inc.), SOLiD™, DNASTAR® SeqMan® NGen® i Partek® Genomics Suite™ softver za analizu podataka (Life Technologies), Feature Extraction iAgilent Genomics Workbench softver za analizu podataka (Agilent

4

Technologies), Genotiping Console™, Chromosome Analysis Suite softver za analizu podataka (Affymetrix®).

[0116] Stručnjak će znati za dodatne brojne komercijalno i akademski dostupne softverske alternative za analizu podataka za sekvenciranje generisanih rezultata. Ovde opisana otelotvorenja nisu ograničena na bilo koji postupak analize podataka.

PRIMERI

[0117] Naredni primeri su dati kako bi se demonstrirali i dodatno ilustrovali određena otelotvorenja i aspekte predmetnog obelodanjenja, i ne treba ih tumačiti kao ograničenje njihovog opsega.

Primer 1-Sinteza rbATP-LN3-DEG527-PEG4-biotina

[0118] Razgranati biotinilovani i fluorescentno označeni, reverzibilno blokirani adeninski konstrukt za upotrebu u SBS sintetisan je na naredni način:

Lys-DEG527

[0119] U rastvor DEG527 (11 mg, 14,6 µmol) u suvom DMA (2 ml) dodat je TSTU (5,3 mg, 17,5 µmol) i diizopropiletilamin (6,3 µl, 36,5 µmol). Smeša je mešana 30 minuta na sobnoj temperaturi do potpune aktivacije kiseline. Reakcionoj smeši je dodat rastvor Boc-lizina (18 mg, 73 μmol) u TEAB 0,1M (0,2 ml). Smeša je mešana 3 sata sve dok TCL nije pokazao potpunu potrošnju aktiviranog estra. Isparljive supstance su isparene pod sniženim pritiskom, i ostatak je rastvoren u trifluorosirćetnoj kiselini (0,1 ml), DCM (0,9 ml) i MeOH (0,1 ml).

Rastvor je mešan na sobnoj temperaturi tokom 1 sata sve dok TLC nije pokazao punu potrošnju početnog materijala. Rastvor je koncentrovan do suvoće, ponovo rastvoren u TEAB 0,1 M (5 ml) i prečišćen pomoću RP-HPLC.

Lys-DEG527-PEG4-biotin

[0120] U rastvor Lys-DEG527 (14 µmol) i diizopropiletilamina (15 µl, 84 µmol) u suvom DMA (5 ml), dodat je PEG4-biotin-NHS (41 mg, 70 µmol). Smeša je sonifikovana nekoliko minuta, i zatim je neprestano mešana nekoliko sati. TCL je pokazao potpunu potrošnju Lys-DEG527. Isparljive materije su isparene pod sniženim pritiskom. Ostatak je ponovo rastvoren u TEAB 0,1 M (5 ml) i prečišćen RP-HPLC.

rbATP-LN3-DEG527-PEG4-biotin

[0121] U rastvor Lys-DEG527-PEG4-biotina (9 µmol) u suvom DMA (2 ml), dodati su TSTU (3,3 mg, 10,8 µmol) i diizopropiletilamin (4 µl, 22,5 µmol). Smeša je mešana 30 minuta na sobnoj temperaturi do potpune aktivacije kiseline. Reakcionoj smeši je dodat rastvor LN3-pppA (18 µmol) u TEAB 0,1M (0,2 ml). Smeša je mešana 5 sati sve dok TCL nije pokazao potpunu potrošnju aktiviranog estra. Reakcija je ugašena sa TEAB puferom (0,1 M, 10 ml) i stavljena na DEAE Sephadex kolonu (2x5 cm). Kolona je eluirana sa gradijentom od 0,1 M do 1 M TEAB pufera tokom 30 minuta pri 25 ml/minut. Fragmenti koji sadrže proizvod su spojeni, ispareni i prečišćeni pomoću HPLC.

Primer 2-Sinteza rbCTP-LN3-PEG4-biotina

[0122] Biotinilovan, reverzibilno blokiran citozinski konstrukt za upotrebu u SBS je sintetisan na naredni način:

1

rbCTP-LN3-PEG4-Biotin

[0123] U rastvor PEG4-biotin-NHS (17,7 mg, 30 µmol) i diizopropiletilamina (8,7 µl, 50 µmol) u suvom DMA (3 ml), dodat je rastvor LN3-pppC (10 µmol) u TEAB 0,1 M (0,3 ml). Smeša je mešana na sobnoj temperaturi tokom 5 sati. Napredovanje reakcije je praćeno pomoću RP-HPLC do potpune potrošnje LN3-pppC. Reakcija je ugašena sa TEAB puferom (0,1 M, 10 ml) i stavljena na DEAE Sephadex kolonu (2k5 cm). Kolona je eluirana sa gradijentom od 0,1M do 1M TEAB pufera tokom 30 minuta pri 25 ml/minut. Fragmenti koji sadrže proizvod su spojeni, ispareni i prečišćeni pomoću HPLC.

Primer 3-Sinteza rbATP-LN3-SS-DEG527

[0124] Fluorescentno označen, potpuno funkcionalan adeninski konstrukt koji sadrži razdvojivi veznik za upotrebu u SBS sintetisan je na naredni način:

DEG527-SS-veznik

[0125] U rastvor DEG527 (12,5 mg, 16 µmol) u suvom DMA (2 ml), dodati su TSTU (6 mg, 20 µmol) i diizopropiletilamin (7 µl, 40 µmol). Smeša je mešana 30 minuta na sobnoj temperaturi do potpune aktivacije kiseline. Reakcionoj smeši je dodat rastvor SS-veznika (9 mg, 50 umol) u TEAB 0,1M (0,2 ml). Smeša je mešana 3 sata sve dok TCL nije pokazao

2

potpunu potrošnju aktiviranog estra. Isparljive supstance su uparene pod sniženim pritiskom, i ostatak je rastvoren u TEAB 0,1M (5 ml) i prečišćen pomoću RP-HPLC.

rbATP-LN3-SS-DEG527

[0126] U rastvor DEG527-SS-veznika (5,9 µmol) u suvom DMA (2 ml), dodati su TSTU (2,1 mg, 7,1 µmol) i diizopropiletilamin (2,6 µl, 14,8 µmol). Smeša je mešana 30 minuta na sobnoj temperaturi do potpune aktivacije kiseline. Reakcionoj smeši je dodat rastvor LN3-pppA (17,7 µmol) u TEAB 0,1M (0,2 ml). Smeša je mešana 5 sati sve dok TCL nije pokazao potpunu potrošnju aktiviranog estra. Reakcija je ugašena sa TEAB puferom (0,1 M, 10 ml) i stavljena na DEAE Sephadex kolonu (2x5 cm). Kolona je eluirana sa gradijentom od 0,1 M do 1 M TEAB pufera tokom 30 minuta pri 25 ml/minut. Fragmenti koji sadrže proizvod su spojeni, ispareni i prečišćeni pomoću HPLC.

Primer 4- detektovanje inkorporisanja nukleotida korišćenjem biotin konjugovanog nukleotidnog konstrukta

[0127] Izvedeni su eksperimenti kako bi se pokazala upotreba nukleotida konjugovanog sa biotinom u reakcijama sekvenciranja. Potpis vreme-prostora eksperimenata sledio je obrazac snimanja vreme-prostora

[0128] Eksperimenti su izvedeni na Genome Analyzer IIx konfigurisanom u režimu sa jednom trakom. Praćena je standardna program sekvence sinteze uključivanja enzimologijom korišćenjem reverzibilno blokirane mešavine nukleotida, uključujući neoznačen rbGTP, fluorescentno označen rbTTP-LN3-NR550, biotinilovani rbCTP-LN3-PEG4-biotin i rbATP sa razdvojivim disulfidnim (SS) veznikom rbATP -SS-DEG527. Prikupljanje i analiza podataka razlikovali su se od standardne SBS hemije sa 4 boje. Ukratko, nakon koraka inkorporisanja nukleotida, klasteri su laserski pobuđeni i dobijena je fluorescentna slika. Dodatne reakcione komponente su dodate u reakciju radi selektivnog razdvajanja SS veze rbATP-LN3-SS-DEG527 i SA-NR555 je dodat u selektivno označavanje rbCTP-LN3-biotina kako bi se stvorio rbCTP-LN3-biotin-SA-NR555. Grupe su laserski pobuđene drugi put kada je snimljena druga fluorescentna slika. Dakle, inkorporisanje svake od četiri baze je pomoću promena, ili nedostatka promena, stanja fluorescentnog intenziteta korišćenjem boja koje pobuđuju i emituju na istoj talasnoj dužini.

[0129] Genomske DNK biblioteka je stvorena za upotrebu u sekvenci pojedinačnog čitanja na Genome Analyzer IIx (Illumina, Inc.). Nakon pripreme biblioteke, protočna ćelija sekvenciranja sa ciljanim grupama za sekvenciranje je stvorena pomoću TruSeq SR Cluster Kit v2 na Illumina® cBot prema protokolu proizvođača za jedno čitanje sekvenciranja. Nakon generisanja klastera, protočna ćelija je stavljena u Genome Analyzer IIx i uzorak je sekvenciran korišćenjem reagensa iz TruSeq SBS Reagent Kit v5 (Illumina®, Inc.).

[0130] Pripremljeni su osnovni rastvori reverzibilno blokiranih nukleotida za upotrebu u reakciji sekvenciranja; 100 μM rastvora tamnog ili neoznačenog rbGTP, rbATP-LN3-SS-DEG527, rbCTP-PEG4-biotina i rbTTP-LN3-NR550. Osnovni rastvor streptavidina-NR555 (SA-NR555 pri 1 mg/ml) pripremljen je u puferu za vezivanje i ispiranje (5 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl).

[0131] Za Genome Analizer IIx, položaji reagensa instrumenta su ponovo konfigurisani za sekvencu sintezom jednu boje. Jedna traka je izabrana za sekvenciranje, a druge trake su isključene, čime je osigurano da se reagensi provuku kroz jednu traku za sekvenciranje i da ne dođe do ukrštanja bilo koje tečnosti iz druge trake. Reagensi su stavljeni na Genome Analyzer IIx (GAIIx) na naredni način:

4

[0132] Reagensi su pripremljeni za test sekvenciranja od 150 ciklusa. Iz TruSeq SBS Reagent Kit v5, reagensi CLM, SMX i PR2 su korišćeni prema uputstvima. Za IMX reagens koji sadrži reverzibilno blokirane nukleotide, u 20,1 ml IMX pufera je dodato 1 ml rbATP-SS-DEG527 (konačna koncentracija 4 µM), 0,5 ml rbGTP (konačna koncentracija 2 µM), 2,5 ml rbCTP-PEG4-biotina (konačna koncentracija 10 µM) i 0,25 ml rbTTP-LN3-NR550 (konačna koncentracija 1 µM). Rastvor rbNTP je filtriran i dodato je 0,6 ml polimeraze visoke gustine (HDP, konačna koncentracija 15 µg/ml). U puferu za vezivanje i ispiranje napravljeno je razblaživanje SA-NR555 u razmeri 1: 200.

[0133] Reagensi su napunjeni na Genome Analyzer IIx i pokrenut je protokol sekvenciranja. Ukratko, nakon standardnog koraka inkorporisanja (tj. FirstBase) usledilo je snimanje kako je opisano u protokolu proizvođača. Snimanje je odmah praćeno disulfidnim razdvajanjem (dodavanjem CLM) i vezivanjem SA-NR555 (dodavanje 1:200 razblaženja SA-NR555) i naknadnim drugim snimanjem, nakon čega je usledio standardni korak deblokiranja i inkorporisanja (tj. CompleteCycle). Razdvajanje disulfidnih veza koje je dovelo do promene stanja intenziteta za rbATP sa 1 na 0 bilo je selektivno i odvijalo se brzinom od < 5 sekundi na sobnoj temperaturi. Vezivanje biotina/streptavidina se takođe brzo dešava brzinom <25 sekundi na sobnoj temperaturi, što dovodi do promene stanja intenziteta za rbCTP od 0 do 1.

[0134] Ukupno vreme ciklusa bez snimanja bilo je oko 9,3 minuta. Cikliranje je ponovljeno za preostale cikluse. Opšti tok je kako sledi:

[0135] Primeri rezultata mogu se naći na Slikama 1 i 2 i u Tabeli 1. Slika 1 prikazuje toplotnu mapu u stilu oblaka snimljenu u različitim ciklusima tokom cele sekvence. Mape oblaka pokazuju da je diferencijacija četiri nukleotida bila uspešna (donja izolovana i nukleotidom označena mapa oblaka orijentiše položaje četiri nukleotida unutar mape oblaka). Slika 2 prikazuje primerno praćenje procenata grešaka procenata inkorporisanja nukleotida tokom 100 ciklusa sekvenciranja za izabranu traku 4, ploča 4. Zabeležena je stopa greške od, 0,4% tokom 100 ciklusa za traku 4, ploča 4 na protočnoj ćeliji, dok Slika 2 pokazuje da nije bilo praznih osnovnih poziva tokom ciklusa od 100 ciklusa za tu traku i ploču. Faziranje je prijavljeno na 0,27%, a predfaziranje na 0,43%. Tabela 1 prikazuje rezultate sa trake 4, ploče 1-6.

Tabela 1

Primer 5- Detektovanje inkorporisanja nukleotida pomoću jedne boje

[0136] Eksperimenti su izvedeni kako bi se pokazalo da se jedna boja može koristiti za određivanje sekvence nukleinske kiseline.

[0137] U ovom eksperimentu korišćeni su nukleotidi:

rbATP-LN3-SS-NR550C4

rbTTP-LN3-NR550C4

rbCTP-(LN3)<2>-Biotin

rbGTP-bez oznake

[0138] Sve koncentracije nukleotida su uskladištene na 100 uM u 10 mM Tris puferu (pH 8,0). Fluorescentni deo koji je korišćen za označavanje nukleotida bio je NR550C4. Dva reprezentativna spektra emitovanja boje za rbATP i rbTTP prikazana su na Slici 5B. RbGTP nije označen i stoga se smatrao „tamnim“ nukleotidom. Za određivanje inkorporisanja citozina u rastućem lancu nukleinske kiseline, u reakciju je dodata glavna smeša koja je uključivala streptavidin-NR550C4 konjugat kao što je detaljno opisano u nastavku.

[0139] Sinteza sastava NR550C4-SS-veznika izvedena je kao što je prethodno opisano za sastav DEG527-SS-veznika, osim što je umesto fluorofora DEG527 korišćen fluorescentni deo NR550C4. Sinteza sastava rbATP-LN3-SS-NR550C4 izvedena je kao što je prethodno opisano za rbATP-LN3-SS-DEG527, međutim, sastav NR550C4-SS-veznika je korišćen umesto sastava DEG527-SS-veznika. Sinteza sastava rbTTP-LN3-NR550C4 izvedena je kako je opisano za rbATP-LN3-SS-550C4, međutim rbTTP-LN3 je korišćen umesto rbATP-LN3 i NR550C4 je korišćen umesto NR550C4-SS-veznika. Sinteza rbCTP-(LN3)<2>-Biotina je izvedena kao što je ranije opisano za rbCTP-LN3-PEG4-biotin, osim što je LN3-biotin korišćen umesto biotina tokom reakcije spajanja amida.

[0140] Streptavidin je konjugovan sa NR550C4 postupcima poznatim struci, i osnovni rastvor Strep-NR550C4 (SA-NR550C4) u količini od 1 mg/ml pripremljen je u puferu od 5 mM Tris pH 7,5, 0,5 mM EDTA i 1M NaCl.

[0141] U IMX reagens dodani su osnovni rastvori nukleotidnih sastava kako bi se dobile konačne koncentracije od 2 µM rbATP-LN3-SS-NR550C4, 10 µM rbCTP-(LN3)2-Biotin, 1 µM rbTTP-LN3-NR550C4 i 2 µM rbGTP-tamno. Dodatno, 15 μg/ml polimeraze visoke gustine dodato je u IMX/nukleotidni reagens. Reagensi CLM, SMX i PR2 su bili kao što je prethodno opisano. Glavna smeša, SA-NR550C4-smeša za razdvajanje, pripremljena je razblaživanjem SA-NR550C4 do krajnje koncentracije od 5 μg/ml u 2mM THP, 5mM Tris pH 7,4, 1M NaCl, 0,5mM EDTA i 0,005% Tween.

[0142] Eksperimenti sekvenciranja jedne boje izvedeni su na MiSeq™ instrumentu za sekvenciranje (Illumina, Inc.). Položaj reagensa na instrumentu je bio:

1-IMX

2-SRE (miks za skeniranje)

3-PR2

4-CLM

18-SA-NR550C4-smeša za razdvajanje

[0143] Instrument je postavljen na 60 ° C na početku eksperimenata sekvenciranja i svi koraci sekvenciranja, uključujući korake snimanja, izvedeni su na ovoj temperaturi za izotermičko sekvenciranje. Izotermičko sekvenciranje izvedeno je uporedivo sa sekvenciranjem izvedenim na GAIIx kao što je prethodno opisano, gde se snimanje odvijalo na 22°C.

[0144] Za MiSeq™ sekvenciranje, ukupno vreme SBS hemijskog ciklusa za jedan ciklus inkorporisanja (isključujući cikluse snimanja) bilo je 3,37 minuta (SBS 1 boje bilo je 2,70 minuta, a SA označavanje i razdvajanje 0,67 sekundi). Ciklusi sekvenciranja su se u osnovi ponavljali kao što je opisano u nastavku:

[0145] Rezultati eksperimenta sa sekvenciranjem jedne boje mogu se naći na slikama 5A i D i u Tabeli 2. Faziranje je prijavljeno na 0,17%, a predfaziranje na 0,36%. Tabela 2 prikazuje rezultate sa trake 1, ploče 1-4.

Tabela 2

[0146] Slika 5A prikazuje primer praćenja procenata stope grešaka osnovnih poziva tokom sekvenciranja od 150 ciklusa za ploču. Uočena je stopa grešaka od približno 2,12% tokom 150 ciklusa. Na osnovu eksperimentalnog dizajna, Slike 5B i C prikazuju primere slikovnih događaja obrazaca detektovanja koji bi trebalo da rezultuju za različite modifikovane nukleotide za svaki događaj snimanja. Na primer, Slika 5B Slika 1 pokazuje da prvi događaj slikanja ne treba da zabeleži nikakvu ili minimalnu fluorescenciju za rbGTP ili rbCTP-(LN3)<2>-Biotin jer nisu povezani sa bilo kojim fluorescentnim delom pre prvog događaja snimanja i fluorescencijom za rbATP i rbTTP označene nukleotide jer su povezani sa fluorescentnim delom pre prvog događaja snimanja. Slika 6C Slika 2 pokazuje da nakon dodavanja mešavine razdvajanja SA-NR550C4 ne bi trebalo da postoji, ili je minimalna, fluorescencija iz rbATP modifikovanog nukleotida jer disulfid u sastavu rbATP-LN3-SS-NR550C4 treba da se razdvoji oslobađajući tako vezani fluorofor i inkorporisanje rbCTP u rastući lanac nukleinske kiseline bi se mogla detektovati zbog vezivanja SA-NR550C4 sastava za biotin na rbCTP-(LN3)<2>-Biotin konjugatu. RbGTP i rbTTP-LN3-NR550C4 fluorescentni obrasci treba da ostanu isti od Slike 1 do Slike 2 kada prate eksperimentalni dizajn opisan u ovom primeru.

[0147] Slika 5D prikazuje grafikon oblaka koji pokazuje da je, iznenađujuće, obrazac detektovanja fluorescencije sledio predloženi obrazac slike i da se svaki od nukleotida može razlikovati jedan od drugog kada se uključi u rastući niz nukleotida koristeći samo jednu boju i dva događaja snimanja u eksperimentu sekvenciranja.

[0148] Ovi rezultati objavljeni u predmetnom obelodanjenju pokazuju da se sekvenciranje nukleinske kiseline može postići upotrebom samo jedne fluorescentne boje i manje od četiri događaja snimanja kako bi se razlikovala inkorporisanje sve četiri različite nukleinske kiseline u ciklusu sekvenciranja.

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Sastav za određivanje sekvence polinukleotida u fluorescentnom sekvenciranju postupkom sinteze, koji sadrži:

a) prvi rbNTP - prvi konjugat fluorescentne boje koji se može detektovati u prvom kanalu; b) drugi rbNTP - drugi konjugat fluorescentne boje koji se može detektovati u drugom kanalu;

c) treći rbNTP konjugat, koji se može detektovati i u prvom kanalu i drugom kanalu, gde je treći rbNTP konjugat mešavina trećeg rbNTP - treći fluorescentni konjugat boje koji se može detektovati u prvom kanalu, i trećeg rbNTP - četvrti fluorescentni konjugat boje koji se može detektovati u drugom kanalu; i

d) četvrti rbNTP kom nedostaje fluorescentni deo;

gde četiri fluorescentne boje sadrže različite fluorescentne delove;

gde prva i treća fluorescentna boja imaju slične spektre emitovanja fluorescencije i formiraju prvi set fluorescentnih boja, a druga i četvrta fluorescentna boja imaju slične spektre emitovanja fluorescencije i formiraju drugi set fluorescentnih boja; i

gde dva seta fluorescentnih boja imaju različite spektre emitovanja fluorescencije; i gde jedna od dve fluorescentne boje u svakom setu fluorescentnih boja emituje primetno veći intenzitet od druge fluorescentne boje u setu fluorescentnih boja.

2. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde spektri emitovanja prve i treće fluorescentne boje imaju λmaxodstupanje do 100 nm.

3. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde spektri emitovanja druge i četvrte fluorescentne boje imaju λmaxodstupanje do 100 nm.

4. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde spektri emitovanja dva različita seta fluorescentnih boja imaju λmaxodstupanje od najmanje 100 nm.

5. Sastav prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde je jedna fluorescentna boja u setu fluorescentnih boja najmanje 0,5X, najmanje 0,75X, najmanje 1X ili najmanje 2X intenzivna kao druga fluorescentna boja u setu fluorescentnih boja.

6. Sastav prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, gde jedan ili više rbNTP konjugata dalje sadrže jednu ili više vezničkih sekvenci.

7. Sastav prema patentnom zahtevu 6, gde jedna ili više vezničkih sekvenci sadrže razdvojivi veznik i odstojnik.

8. Sastav prema patentnom zahtevu 7, gde razdvojiti veznik sadrži jednu ili više grupa razdvojivih veza, izabrane iz grupe koju čine disulfid, diol, diazo, estar, sulfon, azid, alil i silil etar.

9. Sastav prema patentnom zahtevu 1, gde četiri rbNTP sadrže modifikovanu bazu i reverzibilnu terminator 3' blokirajuću grupu.

10. Sastav prema patentnom zahtevu 9, gde 3' blokirajuća grupa sadrži azido grupu i/ili alkoksi grupu koja se može ukloniti razdvajanjem sa fosfinskim reagensom.

1