RS62582B1 - Rnk za lečenje autoimunih bolesti - Google Patents

Rnk za lečenje autoimunih bolesti

Info

Publication number
RS62582B1
RS62582B1 RS20211224A RSP20211224A RS62582B1 RS 62582 B1 RS62582 B1 RS 62582B1 RS 20211224 A RS20211224 A RS 20211224A RS P20211224 A RSP20211224 A RS P20211224A RS 62582 B1 RS62582 B1 RS 62582B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
immunogenic
mrna
rna
cell
Prior art date
Application number
RS20211224A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Sebastian Kreiter
Christina Krienke
Jutta Petschenka
Lena Mareen Kranz
Mustafa Diken
Original Assignee
BioNTech SE
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BioNTech SE, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical BioNTech SE
Publication of RS62582B1 publication Critical patent/RS62582B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A61K48/0025—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid
    • A61K48/0033—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition wherein the non-active part clearly interacts with the delivered nucleic acid the non-active part being non-polymeric
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Synthetic bilayered vehicles, e.g. liposomes or liposomes with cholesterol as the only non-phosphatidyl surfactant
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers
    • A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes or liposomes coated or grafted with polymers comprising non-phosphatidyl surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids or non-phosphatidyl liposomes coated or grafted with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C12N15/101—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers by chromatography, e.g. electrophoresis, ion-exchange, reverse phase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/117—Nucleic acids having immunomodulatory properties, e.g. containing CpG-motifs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6018—Lipids, e.g. in lipopeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak opisuje neimunogenu RNK. Ova RNK čini osnov za razvoj terapijskih agenasa za indukovanje tolerancije prema autoantigenu i, prema tome, za lečenje autoimunih bolesti.
Poznato stanje tehnike
[0002] Rezultat evolucije imunskog sistema kod kičmenjaka je u visoko efektivnoj mreži koja se zasniva na dve vrste odbrane: urođenom i adaptivnom imunitetu. Za razliku od evolutivno drevnog urođenog imunskog sistema koji se oslanja na nepromenljive receptore koji prepoznaju zajedničke molekulske obrasce povezane sa patogenima, adaptivni imunitet se zasniva na visoko specifičnim receptorima za antigene na B-ćelijama (B limfocitima) i T-ćelijama (T limfocitima) i na klonalnoj selekciji. Dok zahvaljujući B-ćelijama nastaju humoralni imunski odgovori, izlučivanjem antitela, T-ćelije posreduju u ćelijskim imunskim odgovorima koji dovode do uništavanja prepoznatih ćelija i sa centralnom su ulogom u imunitetu posredovanom ćelijama kod ljudi i životinja.
[0003] Zrele T-ćelije prepoznaju i odgovaraju na antigen putem svojih receptora specifičnih za antigen (TCR), koji interaguju sa imunogenim peptidima (epitopima), vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i time prezentovanim na površini ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T-ćelije odgovaraju na antigen koji je prezentovan zajedno sa MHC-I proteinima. Pomoćne T-ćelije prepoznaju antigen prezentovan sa MHC-II proteinima. Najneposrednija posledica aktivacije TCR je inicijacija signalnih puteva koji dovode do klonalne ekspanzije T-ćelija, pozitivne regulacije markera aktivacije na ćelijskoj površini, diferencijacije u efektorske ćelije, indukcije citotoksičnosti ili sekrecije citokina i indukcije apoptoze. TCR je deo složene signalne mašinerije, koja uključuje heterodimerni kompleks α-i β-lanaca TCR-a, koreceptor CD4 ili CD8 i modul transdukcije signala, CD3. Dok CD3 lanci prenose signal aktivacije unutar ćelije, TCR α/β heterodimer je jedini odgovoran za prepoznavanje antigena.
[0004] Pored ključnih uloga koje T-ćelije imaju u imunskom odgovoru, dendritične ćelije (DC) su podjednako važne. DC su profesionalne antigen-prezentujuće ćelije i sa ključnom su regulatornom ulogom u održavanju tolerancije na spostvene antigene i u aktivaciji urođenog i adaptivnog imuniteta na strane antigene.
[0005] Imunski sistem može prouzrokovati i neželjene efekte. Na primer, autoimune poremećaje karakterišu gubitak tolerancije na autoantigene (spostvene antigene), aktivacija limfocita reaktivnih na autoantigene i patološko oštećenje u ciljnim organima.
[0006] Trenutne terapije za autoimune poremećaje uglavnom su koncentrisane na simptomatski odgovor i na slabljenje aktivnosti imunskog sistema u celini. Terapija specifična za antigen se nedavno pojavila kao potencijalna terapija za autoimune poremećaje, ali je izazivanje odgovarajućih imunskih odgovora bilo praćeno nizom teškoća i ove terapije su postigle ograničen uspeh.
[0007] Na primer, Lobell i saradnici, 2003 (J. Immunol. 170, 1806-13) opisuju da DNK vakcina koja kodira autoantigen izveden iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina(MOG), označen kao MOG91-108, suprimira kliničke znake eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa (EAE) kod pacova, pojačavanjem odgovora sličnog Th1. WO 2013/120626 A1 se odnosi na nukleinske kiseline, uključujući RNK, koje sadrže najmanje jednu histonsku strukturu tipa ukosnice. Andries i saradnici, 2015 (J. Control.Release 217, 337-344) pokazuju da prisustvo 1-metilpseudourina čini RNK koja koridira luciferazu manje imunogenom i povećava njenu ekspresiju in vivo.
[0008] U pogledu prethodnog stanja tehnike, i dalje postoji potreba za efektivnom terapijom autoimunih bolesti.
[0009] Cilj predmetnog opisa je bio da se obezbede agensi za terapiju autoimunih bolesti. Prema navodima glavnog predmeta patentnih zahteva, ovaj cilj je postignut.
[0010] Predmetni opis obuhvata kompozicije, postupke i upotrebe za indukovanje tolerancije na autoantigen. Prema opisu, autoantigeni koji indukuju imunski odgovor karakterističan za autoimunske bolesti, primenjuju se u obliku neimunogene RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta. RNK koja se primenjuje u jednom poželjnom primeru izvođenja, postaje neimunogena ugradnjom modifikovanih nuklotida u RNK, čime se suprimira aktivacija receptora urođenog imuniteta posredovana sa RNK i uklanja dvolančana RNK (dsRNK). Prema opisu, pokazano je i da je imunizacija miševa sa neimunogenom RNK u potpunosti blokirala bilo koji od znaka autoimune bolesti. Pokazano je takođe da primena jednog jedinog epitopa koji izaziva bolest može biti dovoljna.
[0011] Jedan aspekt opisa se odnosi na postupak lečenja autoimunih bolesti kod subjekta, koji obuhvata primenu subjektu neimunogene RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen, ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta.
[0012] U jednom primeru izvođenja, autoimuna bolest je autoimuna bolest posredovana T-ćelijama.
[0013] Jedan aspekt opisa se odnosi na postupak indukovanja tolerancije na autoreaktivne T-ćelije kod subjekta, pri čemu postupak obuhvata primenu subjektu neimunogene RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta.
[0014] U jednom primeru izvođenja, subjekat ima autoimunu bolest. U jednom primeru izvođenja, autoimuna bolest je autoimuna bolest posredovana T-ćelijama. U jednom primeru izvođenja, T-ćelije su autoreaktivne na autoantigen ili ćelije koje eksprimiraju, i poželjno, prezentuju autoantigen.
[0015] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoimuna bolest je autoimuna bolest CNS-a. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoimuna bolest je multipla skleroza.
[0016] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, kada se primenjuje, neimunogena RNK ne dovodi do aktivacije dendritičnih ćelija, aktivacije T-ćelija i/ili sekrecije IFN-alfa.
[0017] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK postaje neimunogena ugradnjom modifikovanih nukleotida i uklanjanjem dsRNK. U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotidi suprimiraju aktivaciju receptora urođenog imuniteta posredovanu sa RNK. U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotidi uključuju i zamenu jednog ili više uridina sa nukleozidom koji sadrži modifikovanu nukleobazu. U jednom primeru izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil. U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je izabran iz grupe koju čine 3-metil-uridin (m3U), 5-metoksiuridin (mo5U), 5-aza-uridin, 6-aza-uridin, 2-tio-5-aza-uridin, 2-tio-uridin (s2U), 4-tio-uridin (s4U), 4-tio-pseudouridin, 2-tio-pseudouridin, 5-hidroksi-uridin (ho5U), 5-aminoalil-uridin, 5-halo-uridin (npr. 5-jodo-uridin ili 5-bromo-uridin), uridin 5-oksisirćetna kiselina (cmo5U), metil estar 5-oksisirćetne kiseline (mcmo5U), 5-karboksimetil-uridin (cm5U), 1-karboksimetilpseudouridin, 5-karboksihidroksimetil-uridin (chm5U), metil estar 5-karboksihidroksimetiluridina (mchm5U), 5-metoksikarbonilmetil-uridin (mcm5U), 5-metoksikarbonilmetil-2-tio-2-uridin (mcm5s2U), 5-aminometili-2-tio-uridin (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridin (mnm5U), 1-etil-pseudouridin, 5-metilaminometil-2-tio-uridin (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-selenouridin (mnm5se2U), 5-karbamoilmetil-uridin (ncm5U), 5-karboksimetilaminometil-uridin (cmnm5U), 5-karboksimetilaminometil-2-tio-uridin (cmnm5s2U), 5-propinil-uridin, 1-propinilpseudouridin, 5-taurinometil-uridin (τm5U), 1-taurinometil-pseudouridin, 5-taurinometil-2-tiouridin (τm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 5-metil-2-tio-uridin (m5s2U), 1-metil-4-tiopseudouridin (m1s4ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m3ψ), 2-tio-1-metilpseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidrouridin (D), dihidropseudouridin, 5,6-dihidrouridin, 5-metil-dihidrouridin (m5D), 2-tio-dihidrouridin, 2tio-dihidropseuduridin, 2-metoksi-uridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp3 ψ), 5-(izopentenilaminometil)uridin (inm5U), 5-(izopentenilaminometil)-2-tio-uridin (inm5s2U), α-tiouridin, 2'-O-metil-uridin (Um), 5,2'-O-dimetil-uridin (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridin (ψm), 2-tio-2'-O-metil-uridin (s2Um), 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metil-uridin (mcm5Um), 5-karbamoilmetil-2'-O-metil-uridin (ncm5Um), 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metil-uridin (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridin (m3Um), 5-(izopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridin (inm5Um), 1-tio-uridin, dezoksitimidin, 2'-F-ara-uridin, 2'-F-uridin, 2'-OH-ara-uridin, 5-(2-karbometoksivinil)uridin i 5-[3-(1-E-propenilamino)uridin. U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je pseudouridin (ψ), N1-metil-pseudouridin (m<1>ψ) ili 5-metil-uridin (m<5>U). U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je 1-metil-pseudouridin.
[0018] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK je iRNK. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK je in vitro transkribovana RNK.
[0019] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoantigen je povezan sa autoimunom bolešću. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoantigen je T-ćelijski antigen. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoantigen je poreklom iz CNS-a. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoantigen je mijelinski antigen. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, autoantigen je mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (MOG). U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, sadrži aminokiseline 35 do 55 iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina (MOG).
[0020] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK se tranzijentno eksprimira u ćelijama subjekta.
[0021] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK se isporučuje dendritičnim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, dendritične ćelije su nezrele dendritične ćelije.
[0022] U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK je forumulisana u nosač za isporuku. U jednom primeru izvođenja, nosač za isporuku sadrži čestice. U jednom primeru izvođenja, nosač za isporuku sadrži lipid. U jednom primeru izvođenja, lipid sadrži katjonski lipid. U jednom primeru izvođenja, lipid obrazuje kompleks sa i/ili inkapsulira neimunogenu RNK. U jednom primeru izvođenja postupaka opisa, neimunogena RNK je forumulisana u lipozome.
[0023] Jedan aspekt opisa se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koji sadrži neimunogenu RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta.
[0024] U jednom primeru izvođenja, neimunogena RNK prilikom primene ne dovodi do aktivacije dendritičnih ćelija, aktivacije T-ćelija i/ili sekrecije IFN-alfa.
[0025] U jednom primeru izvođenja, neimunogena RNK postaje neimunogena ugradnjom modifikovanih nukleotida i uklanjanjem dsRNK. U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotidi suprimiraju aktivaciju receptora urođenog imuniteta posredovanu sa RNK. U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotidi uključuju i zamenu jednog ili više uridina sa nukleozidom koji sadrži modifikovanu nukleobazu. U jednom primeru izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil. U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je izabran iz grupe koju čine 3-metil-uridin (m3U), 5-metoksi-uridin (mo5U), 5-aza-uridin, 6-aza-uridin, 2-tio-5-aza-uridin, 2-tio-uridin (s2U), 4-tio-uridin (s4U), 4-tio-pseudouridin, 2-tio-pseudouridin, 5-hidroksi-uridin (ho5U), 5-aminoalil-uridin, 5-halo-uridin (npr. 5-jodo-uridin ili 5-bromo-uridin), uridin 5-oksisirćetna kiselina (cmo5U), metil estar 5-oksisirćetne kiseline (mcmo5U), 5-karboksimetil-uridin (cm5U), 1-karboksimetil-pseudouridin, 5-karboksihidroksimetil-uridin (chm5U), metil estar 5-karboksihidroksimetil-uridina (mchm5U), 5-metoksikarbonilmetil-uridin (mcm5U), 5-metoksikarbonilmetil-2-tio-2-uridin (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridin (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridin (mnm5U), 1-etil-pseudouridin, 5-metilaminometil-2-tio-uridin (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridin (mnm5se2U), 5-karbamoilmetil-uridin (ncm5U), 5-karboksimetilaminometil-uridin (cmnm5U), 5-karboksimetilaminometil-2-tio-uridin (cmnm5s2U), 5-propinil-uridin, 1-propinil-pseudouridin, 5-taurinometil-uridin (τm5U), 1-taurinometil-pseudouridin, 5-taurinometil-2-tio-uridin (τm5s2U), 1-taurinometil-4-tio-pseudouridin, 5-metil-2-tio-uridin (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m1s4ψ), 4-tio-1-metil-pseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m3ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deaza-pseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deaza-pseudouridin, dihidrouridin (D), dihidropseudouridin, 5,6-dihidrouridin, 5-metil-dihidrouridin (m5D), 2-tio-dihidrouridin, 2-tiodihidropseuduridin, 2-metoksi-uridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp3 ψ), 5-(izopentenilaminometil)uridin (inm5U), 5-(izopentenilaminometil)-2-tio-uridin (inm5s2U), α-tiouridin, 2'-O-metil-uridin (Um), 5,2’-O-dimetil-uridin (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridin (ψm), 2-tio-2'-O-metil-uridin (s2Um), 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metil-uridin (mcm5Um), 5-karbamoilmetil-2'-O-metil-uridin (ncm5Um), 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metil-uridin (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridin (m3Um), 5-(izopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridin (inm5Um), 1-tio-uridin, dezoksitimidin, 2'-F-ara-uridin, 2'-F-uridin, 2'-OH-ara-uridin, 5-(2-karbometoksivinil)uridin i 5-[3-(1-E-propenilamino) uridin. U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je pseudouridin (ψ), N1-metil-pseudouridin (m<1>ψ) ili 5-metil-uridin (m<5>U). U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je 1-metil-pseudouridin.
[0026] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK je iRNK. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK je in vitro transkribovana RNK.
[0027] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, autoantigen je povezan sa autoimunom bolešću. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, autoantigen je T-ćelijski antigen. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, autoantigen je poreklom iz CNS-a. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, autoantigen je mijelinski antigen. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, autoantigen je mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (MOG). U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, sadrži aminokiseline 35 do 55 iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina (MOG).
[0028] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK se tranzijentno eksprimira u ćelijama subjekta kome se primenjuje farmaceutska kompozicija.
[0029] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK se isporučuje dendritičnim ćelijama subjekta kome se primenjuje farmaceutska kompozicija. U jednom primeru izvođenja, dendritične ćelije su nezrele dendritične ćelije.
[0030] U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK je forumulisana u nosač za isporuku. U jednom primeru izvođenja, nosač za isporuku sadrži čestice. U jednom primeru izvođenja, nosač za isporuku sadrži lipid. U jednom primeru izvođenja, lipid sadrži katjonski lipid. U jednom primeru izvođenja, lipid obrazuje kompleks sa i/ili inkapsulira neimunogenu RNK. U jednom primeru izvođenja farmaceutske kompozicije opisa, neimunogena RNK je forumulisana u lipozome.
[0031] Jedan aspekt opisa se odnosi na farmaceutsku kompoziciju opisa za upotrebu u postupcima opisa.
[0032] Ostale karakteristike i prednosti predmetnog opisa će postati očigledne iz detaljnog opisa i patentnih zahteva koji slede.
Detaljan opis pronalaska
[0033] Predmetni pronalazak je usmeren na predmet naveden u priloženim patentnim zahtevima.
[0034] Iako je predmetni opis u nastavku teksta detaljno opisan, podrazumeva se da ovaj opis nije ograničen na konkretne metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani, pošto se oni mogu menjati. Podrazumeva se takođe da je svrha terminologije koja je ovde upotrebljavana isključivo opis konkretnih primera izvođenja i da nije predviđeno da ograničava obim predmetnog opisa, koji će biti ograničen samo priloženim patetnim zahtevima. Ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljavani, sa istim su značenjima koji se i uobičajeno podrazumevaju od strane prosečno iskusnih stručnjaka iz oblasti tehnike.
[0035] U nastavku teksta će biti opisani elementi predmetnog opisa. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, podrazumeva se i da se oni mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kom broju da bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Raznovrsne opisane primere i poželjne primere izvođenja ne treba tumačiti kao da ograničavaju predmetni opis na samo eksplicitno opisane primere izvođenja. Opis bi stoga trebalao smatrati onim koji podržava i obuhvata primere izvođenja koji se mogu kombinovati sa eksplicitno opisanim primerima izvođenja i sa bilo kojim brojem opisanih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, bilo koje permutacije i kombinacije svih elemenata koji su opisani u ovoj prijavi, trebalo bi smatrati prijavljenima od strane opisa predmetne prijave, ukoliko kontekst ne ukazuje na drugačije.
[0036] Poželjno je da su termini koji su ovde upotrebljavani, definisani kao što je opisano u „A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendatjons)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel i H. Kölbl, ur., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH4010 Basel, Švajcarska.
[0037] Primena predmetnog opisa u praksi će koristiti, ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke biohemije, ćelijske biologije, imunologije i tehnika rekombinantne DNK, koje su objašnjene u literaturi iz oblasti (pogledati npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. idanje, J. Sambrook saradnici, ur., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0038] Kroz ovu specifikaciju i u patentnim zahtevima koji slede, ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč „obuhvatiti” i varijacije poput „obuhvata” i „obuhvataju” podrazumevaće uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne i isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, iako u pojedinim primerima izvođenja, takav drugi član, ceo broj ili korak, ili grupa članova, celih brojeva ili koraka mogu biti isključeni, tj. predmet pronalaska podrazumeva uključivanja navedenog člana, celog broja ili koraka, ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Odrednicu pojma u vidu njegovog broja upotrebljenog u kontekstu opisa predmente prijave (posebno u kontekstu patentnih zahteva), tipa jednine i sličnog, treba tumačiti tako da podrazumeva i jedninu i množinu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili jasno u suprotnosti sa kontekstom. Ovde je takođe predviđeno i da navođenje opsega vrednosti posluži kao skraćeni postupak navođenja svake od pojedinačnih vrednosti koje pripadaju opsegu. Ukoliko ovde nije drugačije naznačeno, svaka pojedinačna vrednost je uključena u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.
[0039] Svi postupci koji su ovde opisani mogu biti izvedeni po bilo kom pogodnom redosledu, osim ukoliko ovde nije drugačije naznačeno ili na drugi način jasno u suptrotnosti sa kontekstom. Predviđeno je i da upotreba bilo kog i svih primera, ili jezičkih odrednica za primer (npr. „kao što je"), koji su ovde obezbeđeni, samo bolje ilustruje opis i ne postavlja ograničenje obima opisa za koji se inače zahteva patentna zaštita. Nijedan jezički pojam u specifikaciji ne treba tumačiti kao onaj koji ukazuje na bilo koji element koji nije naveden u patentnim zahtevima a od suštinske je važnosti za primenu opisa u praksi.
[0040] U tekstu ove specifikacije je citirano nekoliko dokumenata. Ipak, ništa ovde ne treba tumačiti kao da je priznanje da opis nema pravo da unapred objavi takav opis na osnovu prethodnog stanja tehnike.
[0041] Predmetnim opisom je predviđeno lečenje ili prevencija autoimunih bolesti, indukovanjem tolerancije imunskog sistema na autoantigen povezan sa autoimunom bolešću. Tolerancija na autoantigen se indukuje primenom neimunogene RNK. Neimunogena RNK sadrži sekvence koje kodiraju peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, koji suprimiraju imunski odgovor na navedeni autoantigen, kada se primenjuju subjektu.
[0042] U raznim primerima izvođenja, ovde opisana neimunogena RNK je dužine između 200 do 20000 nukleotida, 500 do 5000 nukleotida, 500 do 2500 nukleotida, posebno 600 do 2500 nukleotida ili 800 do 2000 nukleotida.
[0043] Prema opisu, poželjno je primenjivati neimunogenu RNK koja je ovde opisana, formulisanu u nosačima ili medijumima za isporuku, kao što je to formulacija sa nanočesticama, posebno lipopleksna formulacija. Shodno navedenom, molekuli neimunogene RNK koji su ovde opisani mogu biti prisutni kao formulisani u nosačima ili medijumima za isporuku, kao što su to nanočestice ili nanočestične formulacije, posebno lipopleksne formulacije, kao što je ovde opisano.
[0044] Prema jednom primeru izvođenja, mogu biti upotrebljeni nosači za isporuku koji isporučuju molekule neimunogene RNK u antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendritične ćelije (DC) u slezini, nakon sistemske primene. Na primer, nanočestične formulacije RNK sa definisanom veličinom čestica, gde je neto naelektrisanje čestica blisko nuli ili negativno, kao što su elektro-neutralni ili negativno naelektrisani lipopleksi RNK i lipozoma, npr. lipopleksi koji sadrže DOTMA i DOPE ili DOTMA i holesterol, dovode do značajne isporuke RNK u DC slezine, nakon sistemske primene. Prema opisu, posebno je poželjna nanočestična formulacija RNK u kojoj je odnos nelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja prema negativnim naelektrisanjima, u nanočesticama 1,4:1 ili manji i/ili je zeta potencijal nanočestica 0 ili manji. U jednom primeru izvođenja, odnos pozitivnih naelektrisanja i negativnih naelektrisanja u nanočesticama je između 1,4:1 i 1:8, poželjno između 1,2:1 i 1:4, npr. između 1:1 i 1:3, kao što je između 1:1,2 i 1:2, 1:1,2 i 1:1,8, 1:1,3 i 1:1,7, posebno između 1:1,4 i 1:1,6, kao što je oko 1:1,5. U jednom primeru izvođenja, zeta potencijal nanočestica je -5 ili manje, -10 ili manje, -15 ili manje, -20 ili manje ili -25 ili manje. U raznim primerima izvođenja, zeta potencijal nanočestica je -35 ili viši, -30 ili viši ili -25 ili viši. U jednom primeru izvođenja, nanočestice su sa zeta potencijalom od 0 mV do -50 mV, poželjno 0 mV do -40 mV ili -10 mV do -30 mV. U jednom primeru izvođenja, pozitivnim naelektrisanjima doprinosi najmanje jedan katjonski lipid koji je prisutan u nanočesticama, a negativnim naelektrisanjima doprinosi RNK. U jednom primeru izvođenja, nanočestice sadrže najmanje jedan pomoćni lipid. Pomoćni lipid može biti neutralan ili anjonski lipid.
[0045] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTMA i DOPE u molarnom odnosu od 10:0 do 1:9, poželjno 8:2 do 3:7 i još poželjnije od 7:3 do 5:5, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,8:2 do 0,8:2, poželjnije 1,6:2 do 1:2, još poželjnije 1,4:2 do 1,1:2 i još poželjnije oko 1,2:2.
[0046] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTMA i holesterol u molarnom odnosu od 10:0 do 1:9, poželjno 8:2 do 3:7 i još poželjnije od 7:3 do 5:5, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,8:2 do 0,8:2, poželjnije 1,6:2 do 1:2, još poželjnije 1,4:2 do 1,1:2 i još poželjnije oko 1,2:2.
[0047] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTAP i DOPE u molarnom odnosu od 10:0 do 1:9, poželjno 8:2 do 3:7 i još poželjnije od 7:3 do 5:5, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,8:2 do 0,8:2, poželjnije 1,6:2 do 1:2, još poželjnije 1,4:2 do 1,1:2 i još poželjnije oko 1,2:2.
[0048] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTMA i DOPE u molarnom odnosu od 2:1 do 1:2, poželjno 2:1 do 1:1, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,4:1 ili manje.
[0049] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTMA i holesterol u molarnom odnosu od 2:1 do 1:2, poželjno 2:1 do 1:1, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,4:1 ili manje.
[0050] U jednom primeru izvođenja, nanočestice su lipopleksi koji sadrže DOTAP i DOPE u molarnom odnosu od 2:1 do 1:2, poželjno 2:1 do 1:1, pri čemu odnos naelektrisanja, pozitivnih naelektrisanja u DOTMA i negativnih naelektrisanja u RNK, iznosi 1,4:1 ili manje.
[0051] U jednom primeru izvođenja, neimunogena RNK prema opisu je formulisana u F12 ili F5 lipozomima, poželjno F12 lipozomima.
[0052] Prema opisu, termin „F12” označava lipozome koji sadrže DOTMA i DOPE u molarnom odnosu od 2:1 i lipoplekse sa RNK koji se obrazuju upotrebom takvih lipozoma.
[0053] Prema opisu, termin „F5” označava lipozome koji sadrže DOTMA i holesterol u molarnom odnosu od 1:1 i lipoplekse sa RNK koji se obrazuju upotrebom takvih lipozoma.
[0054] Kao što se ovde upotrebljava, termin „nanočestica” se odnosi na bilo koju česticu čiji prečnik čini česticu pogodnom za sistemsku, posebno parenteralnu primenu, prevashodno, nukleinskih kiselina, a obično je prečnika manjeg od 1000 nanometara (nm). U pojedinim primerima izvođenja, nanočestica je prečnika manjeg od 600 nm. U pojedinim primerima izvođenja, nanočestica je prečnika manjeg od 400 nm. U pojedinim primerima izvođenja, nanočestica je sa prosečnim prečnikom opsega od oko 50 nm do oko 1000 nm, poželjno od oko 50 nm do oko 400 nm, poželjno oko 100 nm do oko 300 nm, kao što je oko 150 nm do oko 200 nm. U pojedinim primerima izvođenja, nanočestica je prečnika u opsegu od oko 200 do oko 700 nm, oko 200 do oko 600 nm, poželjno oko 250 do oko 550 nm, posebno oko 300 do oko 500 nm ili oko 200 do oko 400 nm.
[0055] Kao što se ovde upotrebljava, termin „nanočestična formulacija” ili slični termini se odnose na bilo koju supstancu koja sadrži najmanje jednu nanočesticu. U pojedinim primerima izvođenja, nanočestična formulacija je uniformna kolekcija nanočestica. U pojedinim primerima izvođenja, nanočestične formulacije su disperzije ili emulzije. U principu, disperzija ili emulzija se obrazuju kada se spoje najmanje dva materijala koji se ne mešaju.
[0056] Termin „lipopleks” ili „lipopleks nukleinske kiseline", posebno „lipopleks RNK", se odnosi na kompleks lipida i nukleinskih kiselina, posebno RNK. Lipopleksi se obrazuju spontano, kada se katjonski lipozomi, koji često takođe sadrže neutralne „pomoćne” lipide, pomešaju sa nukleinskim kiselinama.
[0057] Ukoliko se u predmetnom opisu navodi naelektrisanje, poput pozitivnog naelektrisanja, negativnog naelektrisanja ili neutralnog naelektrisanja, ili katjonsko jedinjenje, negativno jedinjenje ili neutralno jedinjenje, navedeno uglavnom označava da je naelektrisanje koje je pomenuto prisutno kao takvo na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Na primer, termin „katjonski lipid” označava lipid koji je sa neto pozitivnim naelektrisanjem na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Termin „neutralni lipid” označava lipid koji nema neto pozitivno ili negativno naelektrisanje i koji može biti prisutan u vidu nenaelektrisanog ili neutralnog amfoternog jona na odabranom pH, kao što je fiziološki pH. Pod „fiziološkim pH” ovde se podrazumeva pH od oko 7,5.
[0058] Nosači nanočestica, kao što su lipidni nosači čija se upotreba razmatra predmetnim opisom, obuhvataju bilo koje supstance ili nosače sa kojima nukleinska kiselina, kao što je RNK, može biti udružena, npr. one koji mogu obrazovati kompleks sa nukleinskom kiselinom ili one koji obrazuju vezikule u kojima je nukleinska kiselina „zatvorena” ili inkapsulirana. Rezultat navedenog može biti povećana stabilnosti nukleinske kiseline u poređenju sa „golom” nukleinskom kiselinom. Preciznije, može biti povećana stabilnost nukleinske kiseline u krvi.
[0059] Katjonski lipidi, katjonski polimeri i druge supstance sa pozitivnim naelektrisanjem, mogu obrazovati komplekse sa negativno naelektrisanim nukleinskim kiselinama. Ovakvi katjonski molekuli mogu biti upotrebljeni za obrazovanje kompleksa nukleinskim kiselinama, čime nastaju npr. takozvani lipopleksi ili polipleksi, tim redom, a pokazano je i da ovi kompleksi isporučuju nukleinske kiseline u ćelije.
[0060] Preparati nukleinskih kiselina u vidu nanočestica za upotrebu u predmetnom opisu, mogu biti dobijeni raznim protokolima i iz raznih jedinjenja koja obrazuju komplekse sa nukleinskim kiselinama. Lipidi, polimeri, oligomeri ili amfipili su uobičajeni agensi za obrazovanje komplekasa. U jednom primeru izvođenja, jedinjenje za obrazovanje kompleksa sadrži najmanje jedan agens izabran iz grupe koja se sastoji od protamina, polietilenimina, poli-L-lizina, poli-L-arginina ili histona.
[0061] Prema opisu, protamin je od koristi kao agens tipa katjonskog nosača. Termin „protamin” se odnosi na bilo koji od raznih veoma baznih proteina relativno niske molekulske težine koji su bogati argininom i za koje je utvrđeno da se povezuju posebno sa DNK, umesto somatskih histona, u ćelijama sperme raznih životinja (kao što su ribe). Preciznije, termin „protamin” se odnosi na proteine koji se mogu pronaći u spermi riba, a koji su izrazito bazni i rastvorljivi u vodi, a do čije koagulacije ne dolazi pod dejstvom toplote i od kojih nakon hidrolize ugavnom nastaje arginin. U prečišćenom obliku, upotrebljavaju se u dugodelujućim formulacijama insulina i za neutralizaciju antikoagulantnih efekata heparina. Prema opisu, podrazumeva se da termin „protamin", kako se ovde upotrebljava, obuhvata bilo koju protaminsku aminokiselinsku sekvencu koja je dobijena ili izvedena iz prirodnih ili bioloških izvora, uključujući njene fragmente, kao i multimerne oblike navedene aminokiselinske sekvence ili njenog fragmenta. Štaviše, termin obuhvata (sintetisane) polipeptide koji su veštački i posebno dizajnirani za specifične svrhe, a koji ne mogu biti izolovani iz prirodnih ili bioloških izvora. Protamin koji se upotrebljava prema predmetnom opisu, može biti sulfatni protamin ili hidrohlorid protamin. U poželjnom primeru izvođenja, izvor protamina upotrebljenog za proizvodnju ovde opisanih nanočestica je protamin 5000, koji sadrži protamin od više od 10 mg/ml (5000 jedinica za neutralisanje heparina po ml) u izotoničnom rastvoru soli.
[0062] Lipozomi su mikroskopske lipidne vezikule koje često imaju jedan ili više dvostrukih slojeva lipida koji obrazuje vezikule, poput fosfolipida, i sposobni su da inkapsuliraju lek. U kontekstu predmetnog opisa, mogu se koristiti različite vrste lipozoma, uključujući, ali ne ograničavajući se na, multilamelarne vezikule (MLV), male unilamelarne vezikule (SUV), velike unilamelarne vezikule (LUV), sterno stabilizovane lipozome (SSL), multivezikularne vezikule (MV) i velike multivezikularne vezikule (LMV), kao i druge dvoslojne oblike koji su poznati u oblasti tehnike. Veličina i lamelarnost lipozoma će zavisiti od načina pripreme, a izbor vrste vezikula koja će biti upotrebljena zavisiće od poželjnog načina primene. Postoji nekoliko drugih oblika supramolekulske organizacije u kojima lipidi mogu biti prisutni u vodenom medijumu, a koji obuhvataju lamelarne faze, heksagonalne i inverzno heksagonalne faze, kubne faze, micele, reverzne micele sastavljene od jednog sloja. Ovakve faze mogu biti dobijene i u kombinaciji sa DNK ili RNK, a interakcija sa RNK i DNK može značajno uticati na fazno stanje. Opisane faze mogu biti prisutne u nanočestičnim formulacijama nukleinskih kiselina predmetnog opisa.
[0063] Za obrazovanje lipopleksa nukleinskih kiselina od nukleinske kiseline i lipozoma, može biti upotrebljen bilo koji pogodan postupak obrazovanja lipozoma, sve dok isti obezbeđuje predviđene lipoplekse nukleinskih kiselina. Lipozomi mogu biti obrazovani upotrebom standardnih postupaka, kao što su to postupak reveznog uparavanja (REV), postupak sa injeciranjem etanola, postupak dehidratacije-rehidratacije (DRV), sonikacija ili drugi pogodni postupci.
[0064] Nakon obrazovanja lipozoma, dimenzije lipozoma mogu biti prilagođene tako da se dobije populacija lipozoma sa rasponom veličina koji je suštinski homogen.
[0065] Lipidi koji obrazuju dvosloje obično imaju dva ugljovodonična lanca, prevashodno acilna lanca, i grupu koja predstavlja „glavu”, bilo polarnu ili nepolarnu. Lipidi koji obrazuju dvosloje su sastavljeni bilo od lipida koji se javljaju u prirodi ili onih koji su sintetičkog porekla, uključujući fosfolipide poput fosfatidilholina, fosfatidiltanolamina, fosfatidne kiseline, fosfatidilinozitola i sfingomijelina, pri čemu su dva ugljovodonična lanca obično dužine između oko 14-22 atoma ugljenika i sa različitim su stepenima nezasićenosti. Drugi pogodni lipidi za upotrebu u kompoziciji predmetnog opisa uključuju glikolipide i sterole, kao što su holesterol i njegovi razni analozi, koji takođe mogu biti upotrebljeni u lipozomima.
[0066] Katjonski lipidi obično imaju lipofilni deo, kao što je sterolni, acilni ili diacilni lanac, i sa ukupnim su neto pozitivnim naelektrisanjem. Grupa „glave” lipida obično nosi pozitivno naelektrisanje. Poželjno je da katjonski lipid ima pozitivno naelektrisanje reda veličine od 1 do 10 valenci, a poželjnije pozitivno naelektrisanje reda veličine od 1 do 3 valenci i još poželjnije pozitivno naelektrisanje reda veličine od 1 valence. Primeri katjonskih lipida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-O-oktadecenil-3-trimetilamonijum propan (DOTMA); dimetildioktadecilamonijum (DDAB); 1,2-dioleoil-3-trimetilamonijum-propan (DOTAP); 1,2-dioleoil-3-dimetilamonijum-propan (DODAP); 1,2-diaciloksi-3-dimetilamonijum propane; 1,2-dialkiloksi-3-dimetilamonijum propane; dioktadecildimetil amonijum hlorid (DODAC), 1,2-dimiristoiloksipropil-1,3-dimetilhidroksietil amonijum (DMRIE) i 2,3-dioleoiloksi-N-[2(spermin karboksamid)etil]-N,N-dimetil-1-propanamijum trifluoroacetat (DOSPA). Poželjni su DOTMA, DOTAP, DODAC i DOSPA. Najpoželjniji je DOTMA.
[0067] Pored navedenog, nanočestice koje su ovde opisane poželjno dalje uključuju neutralni lipid s obzirom na strukturnu stabilnost i slično. Neutralni lipid može biti odgovarajuće izabran u kontekstu efikasnosti isporuke kompleksa nukleinske kiseline i lipida. Primeri neutralnih lipida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, 1,2-di-(9Z-oktadecenoil)-sn-glicero-3-fosfoetanolamin (DOPE), 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoholin (DOPC), diacilfosfatidil holin, diacilfosfatidil etanol amin, ceramid, sfingoemijelin, cefalin, sterol i cerebrozid. Poželjni su DOPE i/ili DOPC. Najpoželjniji je DOPE. U slučaju kada katjonski lipozom uključuje i katjonski lipid i neutralni lipid, molarni odnos katjonskog lipida prema neutralnom lipidu može biti utvrđen na odgovarajući način u pogledu stabilnosti lipozoma i sličnog.
[0068] Prema jednom primeru izvođenja, nanočestice koje su ovde opisane mogu sadržavati fosfolipide. Fosfolipidi mogu biti glicerofosfolipidi. Primeri glicerofosfolipida obuhvataju, ali nisu ograničeni na, tri vrste lipida: (i) cviterjonske fosfolipide, koji obuhvataju, na primer, fosfatidilholin (PC), fosfatidilholin iz žumanceta jajeta, PC dobijen iz soje u prirodnom, delimično hidrogenizovanom ili potpuno hidrogenizovanom obliku, dimiristoil fosfatidilholin (DMPC) sfingomijelin (SM); (ii) negativno naelektrisane fosfolipide: koji obuhvataju, na primer, fosfatidilserin (PS), fosfatidilinozitol (PI), fosfatidnu kiselinu (PA), fosfatidilglicerol (PG) dipalmipoil PG, dimiristoil fosfatidilglicerol (DMPG); sintetičke derivate u kojima konjugat obzebeđuje cviterjonskom fosfolipidu negativno naelektrisanje, kao što je slučaj sa metoksipolietilenom, glikol-distearoil fosfatidiletanolaminom (mPEG-DSPE); i (iii) katjonske fosfolipide, koji obuhvataju, na primer, fosfatidilholin ili sfingomijelin od kojih je fosfomonoestar O-metilisan da bi obrazovao katjonske lipide.
[0069] Do povezivanja nukleinske kiseline sa lipidnim nosačem može doći, na primer, ispunjavanjem itersticijalnih prostora nosača sa nukleinskom kiselinom, a tako da nosač fizički „zarobljava” nukleinsku kiselinu, ili kovalentnim, jonskim ili vodoničnim vezivanjem ili putem adsorpcije nespecifičnim vezama.
[0070] Termin „imunski odgovor” se odnosi na reakciju imunskog sistema, poželjno na antigen, a poželjno je i da se odnosi na ćelijski imunski odgovor, humoralni imunski odgovor ili na oba. Prema opisu, termin „imunski odgovor na” ili „imunski odgovor protiv” se u pogledu mesta ciljnog delovanja kao što je antigen, ćelija ili tkivo, odnosi na imunski odgovor usmeren upravo na mestu ciljnog delovanja.
[0071] Imunski sistem je podeljen na dva dela, urođeni i adaptivni sistem. Adaptivni imunski odgovor zavisi od B- i T-limfocita koji su specifični za određene antigene. Urođeni imunski sistem odgovara na uobičajene strukture koje su zajedničke velikoj većini „pretnji”. Ove zajedničke strukture se nazivaju molekulskim obrascima povezanim sa patogenima, ili PAMP, i prepoznaju ih receptori slični toll-receptorima, ili TLR. Pored ćelijskih TLR, važan deo urođenog imunskog sistema je i humoralni sistem komplementa koji opsonizuje i ubija patogene putem mehanizma prepoznavanja PAMP. Ovi visoko očuvani solubilni i za membranu vezani proteini se zajedički nazivaju receptorima za prepoznavanje obrazaca (PRR), a interakcija PAMP/PRR pokreće urođeni imunski sistem.
[0072] TLR su transmembranski proteini koje eksprimiraju ćelije urođenog imunskog sistema, a koji prepoznaju mikrobe koji napadaju organizam i aktiviraju signalne puteve koji pokreću imunske i inflamatorne odgovore da bi uništili napadače. Različiti TLR služe kao receptori za različite ligande, uključujući komponente ćelijskog zida bakterija, virusnu dvolančanu RNK i antivirusna ili imunomodulatorna jedinjenja tipa malih molekula. Kod ljudi, TLR3, 7, 8 i 9 prvenstveno reaguju na PAMP-ove zasnovane na nukleinskim kiselinama iz virusa i bakterija.
[0073] Termini „ćelijski imunski odgovor", „ćelijski odgovor", „imunitet posredovan ćelijama” ili slični termini, podrazumevaju uključivanje ćelijskog odgovora usmerenog na ćelije koje karakteriše ekspresija antigena i/ili prezentacija antigena sa MHC klase I ili klase II. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije koje se nazivaju T-ćelije ili T limfociti, a koje deluju bilo kao „pomagači” ili kao „ubice". Pomoćne T-ćelije (takođe označene kao CD4<+>T-ćelije) imaju centralnu ulogu u regulisanju imunskog odgovara, dok ćelije „ubice” (označene i kao citotoksične T-ćelije, citolitičke T-ćelije, CD8<+>T-ćelije ili CTL) ubijaju ćelije poput obolelih ćelija.
[0074] Termin „humoralni imunski odgovor” se odnosi na proces u živim organizmima u kome se antitela proizvode kao odgovor na agense i organizme, pri čemu ih ista konačno i neutrališu i/ili eliminišu. Specifičnost odgovora antitelima je posredovana T- i/ili B-ćelijama putem receptora koji su udruženi sa membranom i vezuju antigen jedne specifičnosti. Nakon vezivanja odgovarajućeg antigena i prijema raznih drugih aktivirajućih signala, B limfociti se dele, čime se proizvode memorijske B-ćelije, kao i klonovi plazma ćelija koje luče antitela, pri čemu svaki klon proizvodi antitela koja prepoznaju identičan antigenski epitop kao onaj koji je prepoznao njegov antigenski receptor. Memorijski B limfociti ostaju uspavani sve dok ih naknadno ne aktivira njihov specifičan antigen. Ovi limfociti obezbeđuju ćelijsku osnovu memorije i rezultujuću eskalaciju u odgovoru antitela prilikom ponovnog izlaganja specifičnom antigenu.
[0075] Termin „antitelo", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na imunoglobulinski molekul, koji je u stanju da se specifično veže za epitop na antigenu. Preciznije, termin „antitelo” se odnosi na glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca, međusobno povezane disulfidnim vezama. Termin „antitelo” obuhvata monoklonska antitela, rekombinantna antitela, humana antitela, humanizovana antitela, himerna antitela i kombinacije bilo kojih od prethodno navedenih. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i konstantnog regiona teškog lanca (CH). Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (VL) i konstantnog regiona lakog lanca (CL). Varijabilni regioni i konstantni regioni se ovde takođe označavaju kao varijabilni domeni i konstantni domeni, tim redom. VH i VL regioni mogu biti dalje podeljeni na regione hipervarijabilnosti, označene kao regioni koji određuju komplementarnost, a koji se smenjuju sa regionima koji su više evolutivno očuvani i označeni kao uokvirujući regioni (FR). Svaki VH i VL se sastoji od tri CDR-a i četiri FR-a, raspoređenih od amino-kraja ka karboksilnom kraju po sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. CDR iz VH su označeni kao HCDR1, HCDR2 i HCDR3, dok su CDR iz VL označeni kao LCDR1, LCDR2 i LCDR3. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela obuhvataju konstantne regione teških lanaca (CH) i konstantne regione lakih lanaca (CL), pri čemu CH može dalje biti podeljen na konstantan domen CH1, zglobni region i konstantne domene CH2 i CH3 (raspoređene od amino-kraja ka karboksilnom kraju po sledećem redosledu: CH1, CH2, CH3). Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući razne ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa. Antitela mogu biti intaktni imunoglobulini izvedeni iz prirodnih izvora ili rekombinantnih izvora, a mogu biti i imunoaktivni delovi intaktnih imunoglobulina. Antitela su obično tetrameri imunoglobulinskih molekula. Antitela mogu postojati u raznovrsnim oblicima uključujući, na primer, poliklonska antitela, monoklonska antitela, Fv, Fab i F(ab)2, kao i jednolančana antitela i humanizovana antitela.
[0076] Antitela koja su ovde opisana obuhvataju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM i IgD antitela. U raznim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, preciznije IgG1 kapa ili IgG1 lambda izotipa (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ)
[0077] Termin „imunoglobulin” se odnosi na proteine imunoglobulinske superfamilije, poželjno na receptore za antigene kao što su antitela ili B-ćelijski receptor (BCR). Imunoglobuline karakteriše specifičan strukturni domen, tj. imunoglobulinski domen, koji je karakterističnog imunoglobulinskog (Ig) tipa uvijanja. Termin obuhvata imunoglobuline vezane za membranu, kao i solubilne imunoglobuline. Imunoglobulini vezani za membranu se takođe označavaju kao površinski imunoglobulini ili membranski imunoglobulini, a koji uglavnom predstavljaju deo BCR. Solubilni imunoglobulini se uglavnom označavaju kao antitela. Imunoglobulini se generalno sastoje od nekoliko lanaca, obično dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani disulfidnim vezama. Ovi lanci se prvenstveno sastoje od imunoglobulinskih domena, kao što su VL domen (varijabilni lakog lanca), CL domen (konstantni lakog lanca), VH domen (varijabilni teškog lanca) i CH domeni CH1, CH2, CH3, i CH4 (konstantni teškog lanca). Postoji pet tipova imunoglobulinskih teških lanaca sisara, tj. α, δ, ε, γ i µ koji određuju i različite klase antitela, tj. IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Za razliku od teških lanaca solubilnih imunoglobulina, teški lanci membranskih ili površinskih imunoglobulina sadrže i transmembranski domen i kratak citoplazmatski domen na svom karboksilnom kraju. Kod sisara postoje dve vrste lakih lanaca, tj. lambda i kapa. Imunoglobulinski lanci sadrže varijabilni i konstantan region. Konstantan region je suštinski evolutivno očuvan unutar različitih izotipova imunoglobulina, dok je varijabilni deo visoko različit i bitan je za prepoznavanje antigena.
[0078] Prema opisu, termin „antigen” ili „imunogen” obuhvata bilo koju supstancu, poželjno peptid ili protein, koji je mesto ciljanog delovanja za imunski odgovor i/ili koji će indukovati imunski odgovor. Preciznije, „antigen” se odnosi na bilo koju supstancu koja specifično reaguje sa antitelima ili T-limfocitima (T-ćelijama). Prema predmetnom opisu, termin „antigen” obuhvata bilo koji molekul koji sadrži najmanje jedan epitop, kao što je B-ćelijski ili T-ćelijski epitop. U kontekstu predmetnog opisa, poželjno je da je antigen molekul koji, izborno nakon obrade, indukuje imunsku reakciju koja je poželjno specifična za antigen ili ćelije koje eksprimiraju antigen. Antigeni mogu uključivati ili mogu biti izvedeni iz alergena, virusa, bakterija, gljivica, parazita i drugih infektivnih agenasa i patogena, ili antigen takođe može biti tumorski antigen.
[0079] „Sopstveni antigen” ili „autoantigen” je antigen izveden iz organizma, koga imunski sistem tog organizma u normalnim okolnostima ne prepoznaje, ali koji može postati meta imunskog napada što dalje rezultuje autoimunom bolešću.
[0080] U poželjnom primeru izvođenja, autoantigen je povezan sa autoimunom bolešću. Termin „autoantigen povezan sa autoimunom bolešću” se odnosi na autoantigen koji je od patološkog značaja za autoimunu bolest. U jednom primeru izvođenja, autoantigen povezan sa autoimunom bolešću je molekul koji sadrži najmanje jedan epitop na koga je usmerena imunska reakcija kod pacijenta sa autoimunom bolešću.
[0081] Peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, a koji je prema opisu obezbeđen primenom neimunogene RNK koja kodira peptid ili polipeptid subjektu, trebao bi da dovede do smanjenja imunskog odgovora na autoantigen.
Prema tome, opisom obezbeđen peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, može odgovarati ili sadržavati autoantigen povezan sa autoimunom bolešću, ili njegovu varijantu (uključujući fragmente autoantigena i njihove varijante). U jednom primeru izvođenja, takvi fragmenti ili varijante su imunološki ekvivalentni autoantigenu povezanom sa autoimunom bolešću po tome što - slično autoantigenu - njihovo obezbeđivanje dovodi do tolerancije na autoreaktivne T-ćelije koje ciljano deluju na autoantigen ili ćeliju koja eksprimira autoantigen, a koje izborno i prezentuju autoantigen u kontekst MHC molekula. Prema tome, opisom obezbeđen peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, može biti identičan autoantigenu povezanom sa autoimunom bolešću, može sadržavati autoantigen povezan sa autoimunom bolešću ili njegov deo ili fragment, ili može sadržavati antigen koji je homolog autoantigenu povezanom sa autoimunom bolešću, ili njegovom delu ili fragmentu. Ukoliko peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta obezbeđenih opisom, sadrži njegov deo ili fragment autoantigena povezan sa autoimunom bolešću, ili deo ili fragment antigena koji je homolog autoantigenu povezanom sa autoimunom bolešću, navedeni deo ili fragment može sadržavati epitop autoantigena povezanog sa autoimunom bolešću, posebno epitop autoantigena povezanog sa autoimunom bolešću na koga ciljano deluju autoreaktivne T-ćelije. Prema opisu, peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, može stoga sadržavati imunogeni fragment autoantigena povezanog sa autoimunom bolešću, kao što je peptidni fragment autoantigena povezanog sa autoimunom bolešću. „Imunogeni fragment autoantigena” prema opisu se poželjno odnosi na deo ili fragment autoantigena koji je sposoban da stimuliše T-ćelijski odgovor. Navedeni deo ili fragment, kada je obezbeđen prema opisu, takođe može biti sposoban da izazove toleranciju na autoreaktivne T-ćelije. Peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta obezbeđenih opisom, može biti rekombinantan peptid ili polipeptid i/ili neimunogena RNK koja ih kodira, prema opisu, može biti rekombinantna RNK.
[0082] Termin „imunološki ekvivalentan” označava da imunološki ekvivalentan molekul, kao što je imunološki ekvivalentna aminokiselinska sekvenca, ispoljava iste ili suštinski iste imunološke osobine i/ili ostvaruje iste ili suštinski iste imunološke efekte, npr. u pogledu vrste imunološkog efekta. U kontekstu predmetnog opisa, poželjno je da se termin „imunološki ekvivalent” upotrebljava uzimajući u obzir imunološke efekte ili osobine antigena ili antigenih varijanti.
[0083] U jednom primeru izvođenja opisa, peptid ili polipeptid koji je, prema opisu, obezbeđen primenom neimunogene RNK, sadrži najmanje jedan epitop iz autoantigena, koji je poželjno autoantigen koji se prepoznaje u stanju autoimune bolesti, kao što je stanje autoimune bolesti koje je ovde opisano. U jednom primeru izvođenja, opisom obezbeđen peptid ili polipeptid sadrži epitop na koga je subjekat autoreaktivan.
[0084] Termin „epitop” se odnosi na antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. na deo u ili na fragment molekula koga imunski sistem prepoznaje, tj. vezuje, na primer, onaj koji biva prepoznat od strane antitela ili T-ćelijskog receptora. Na primer, epitopi su diskretna, trodimenzionalna mesta na antigenu koja prepoznaje imunski sistem. Epitopi se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupacija molekula, kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, a obično su sa specifičnim trodimenzionalnim strukturnim karakteristikama, kao i sa specifičnim karakteristikama naelektrisanja. Konformacioni i nekonformacioni epitopi se razlikuju po tome što se vezivanje za prve, ali ne i za drugonavedene, gubi u prisustvu denaturišućih rastvarača. Poželjno je da se termin odnosi na imunogeni deo antigena koji sadrži epitop. Epitop proteina poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je dužine između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30, najpoželjnije između 10 i 25 aminokiselina, na primer, poželjno je da je epitop dužine od 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ili 25 aminokiselina. U kontekstu predmetnog opisa, poželjno je i da epitop bude T-ćelijski epitop.
[0085] Kao što se ovde upotrebljava, termin „T-ćelijski epitop” se odnosi na peptid koji se vezuje za MHC molekul u konfiguraciji koju prepoznaje T-ćelijski receptor. Obično su T-ćelijski epitopi prezentovani na površini antigen-prezentujućih ćelija. Poželjno je da su T-ćelijski epitopi peptidi prezentovani sa MHC klase I i/ili klase II. Poželjno je i da T-ćelijski epitopi sadrže aminokiselinsku sekvencu koja značajno odgovara aminokiselinskoj sekvenci fragmenta antigena. Poželjno je takođe da je navedni fragment antigena peptid prezentovan sa MHC molekulima klase I i/ili klase II. Peptid koji je pogodan za vezivanje sa MHC molekulom, posebno MHC molekulom klase I, poželjno je dužine od 7-20 aminokiselina, poželjnije dužine od 7-12 aminokiselina, poželjnije dužine od 8-11 aminokiselina, a posebno dužine od 9 ili 10 aminokiselina. U jednom primeru izvođenja, T-ćelijski epitop, kada je prezentovan u kontekstu MHC, kao što je MHC antigen-prezentujuće ćelije, biva prepoznat od strane T-ćelijskog receptora. T-ćelijski epitop, ukoliko ga prepozna T-ćelijski receptor, može biti u stanju da indukuje, u prisustvu odgovarajućih kostimulatornih signala, klonalnu ekspanziju T-ćelije koje nosi T-ćelijski receptor koji specifično prepoznaje T-ćelijski epitop.
[0086] Prema opisu, epitop, kao što je T-ćelijski epitop autoantigena, može biti prisutan u peptidu ili polipeptidu koji je prema opisu obezbeđen neimunogenom RNK, kao deo većeg entiteta, poput sekvence koja sadrži veći deo autoantigena od samo epitopa i/ili poput polipeptida koji sadrži više od jednog epitopa bilo jednog ili više od jednog autoantigena. Prezentovani peptid ili T-ćelijski epitop se proizvodi nakon pogodne obrade. Takođe, T-ćelijski epitopi mogu biti modifikovani na jednom ili na više ostataka koji nisu suštinski bitni za prepoznavanje od strane TCR ili za vezivanje za MHC. Takvi modifikovani T-ćelijski epitopi se mogu smatrati imunološki ekvivalentnima.
[0087] Neimunogena RNK koja je ovde opisana može biti prilagođena za razna oboljenja koja zahtevaju imunsku toleranciju, kao što su autoimune bolesti, a takođe može biti prilagođena za pojedinačne pacijente. Postoje razne imunološke analize za utvrđivanje da li imunske ćelije koje cirkulišu u krvi datog pacijenta razvijaju imunski odgovor na određene ispitivane peptide. Alternativno, izabrani antigeni ili epitopi mogu biti zasnovani na najuobičajenoj reaktivnosti koja se sreće u klasi pacijenata.
[0088] „Ćelijska površina” se upotrebljava u skladu sa svojim uobičajenim značenjem u oblasti tehnike i uključuje stoga spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje sa proteinima i drugim molekulima. Antigen se eksprimira na površini ćelija ukoliko se nalazi na površini navedenih ćelija i dostupan je za vezivanje od strane npr. antitela specifičnih za antigen koja su dodata ćelijama. U jednom primeru izvođenja, antigen eksprimiran na površini ćelija je integralni membranski protein koji ima vanćelijski deo.
[0089] Termin „vanćelijski deo” ili „egzodomen”, u kontekstu predmetnog opisa se odnosi na deo molekula poput proteina, koji je okrenut prema vanćelijskom prostoru ćelije i poželjno je dostupan sa spoljne strane navedene ćelije, npr. za vezivanje molekula poput antitela, koja se nalaze izvan ćelije. Poželjno je da se termin odnosi na jednu ili na više vanćelijskih petlji ili domena ili njihov fragment.
[0090] Termini „porcija” ili „deo” se ovde upotrebljavaju naizmenično i odnose se na kontinuirani ili diskontinuirani element strukture kao što je aminokiselinska sekvenca. Termin „fragment” se odnosi na kontinuirani element strukture kao što je aminokiselinska sekvenca. Porciju, deo ili fragment strukture poželjno karakterišu jedna ili više funkcionalnih osobina navedene strukture, npr. antigenske, imunske i/ili osobine vezivanja. Porcija ili deo proteinske sekvence poželjno sadrži najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50 ili najmanje 100 uzastopnih i/ili aminokiselina proteinske sekvence koje nisu uzastopne. Fragment proteinske sekvence poželjno sadrži najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50 ili najmanje 100 uzastopnih aminokiselina proteinske sekvence.
[0091] Termin „imunogenost” se odnosi na relativnu efektivnost antigena da indukuje imunsku reakciju.
[0092] Termin „imunostimulatorno” se ovde upotrebljava za označavanje povećanja sveukupnog imunskog odgovora.
[0093] „Imunska tolerancija", „imunološka tolerancija” ili jednostavno „tolerancija” opisuju stanje nereagovanja imunskog sistema na supstance ili tkiva koje imaju sposobnost da izazovu imunski odgovor. Imunska tolerancija, koja sprečava razvoj imunogenog odgovora nakon prepoznavanja sopstvenog, posredovana je sa nekoliko mehanizama, koji prvenstveno uključuju prezentaciju „sopstvenih” peptida CD4+ ili CD8+ T-ćelijama, na način koji dovodi do eliminacije, inhibicije ili konverzije autoreaktivnih T-ćelija koje bi inače potencijalno napale ćelije i tkiva koja su izvor autoantigena, i/ili koji pak uključuju podršku proizvodnje antitela B-ćelijama koja reaguju protiv ovih autoantigena. Mehanizmi kojima se uspostavlja tolerancija su jasno različiti, ali je rezultujući efekat sličan. Nedovoljna indukcija tolerancije na sopstvene antigene iz određenih tkiva je glavni uzrok autoimunih bolesti specifičnih za tkiva. U normalnim uslovima, spostveni antigeni koji su specifični za tkivo, prezentuju se ćelijama koje indukuju toleranciju (tolerogenim ćelijama) i programiraju bilo koje reaktivne T-ćelije da se podvrgnu ćelijskoj smrti, nereaktivnosti ili konverziju u tip Treg. Kod autoimunih bolesti, ovakvi isti sopstveni antigeni ili nisu dovoljno prezentovani, što ograničava usmereno angažovanje autoreaktivnih T-ćelija, ili su nepravilno prezentovani, čime specifične T-ćelije usmeravaju tako da se uspostavi imunski odgovor umesto da se antigeni tolerišu kao sopstveni. Terapije specifične za antigen kojima se ovakvi spostveni antigeni isporučuju moćnim tolerogenim ćelijama, sistematski ili preko sluzokože, delimično su u stanju da ponovo uspostave toleranciju, delom i putem stvaranja supresorskih T-ćelija sposobnih da se suprotstave nepravilno aktiviranim patogenim T-ćelijama.
[0094] Termin „mesto ciljanog delovanja” će označavati agens, poput ćelije, koji je mesto ciljanog delovanja imunskog odgovora. Mesta ciljanog delovanja obuhvataju ćelije koje prezentuju antigen ili antigenski epitop, tj. peptidni fragment izveden iz antigena putem obrade antigena.
[0095] „Obrada antigena” se odnosi na razgradnju antigena u produkte obrade, što su zapravo fragmenti navedenog antigena (npr. dobijeni razgradnjom proteina u peptide), kao i udruživanje jednog ili više od ovih fragmenata (npr. vezivanjem) sa MHC molekulima radi prezentacije od strane ćelija, poželjno antigen-prezentujućih ćelija, specifičnim T-ćelijama.
[0096] Antigen-prezentujuća ćelija (APC) je ćelija koja na svojoj površini prikazuje antigen zajedno sa molekulima glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC). T-ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks upotrebom svojih T-ćelijskih receptora (TCR). Antigen-prezentujuće ćelije obrađuju antigene i prezentuju ih T-ćelijama. Antigen-prezentujuće ćelije obuhvataju, ali nisu ograničene na, monocite/makrofage, B-ćelije i dendritične ćelije (DC). Prema opisu, termin „antigen-prezentujuća ćelija” uključuje profesionalne antigen-prezentujuće ćelije i antigenprezentujuće ćelije koje nisu profesionalne.
[0097] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom ili endocitozom posredovanom receptorima, a zatim i u prikazivanju fragmenta antigena na svojoj membrani i tako da je vezan za MHC molekul klase II. T-ćelija prepoznaje i stupa u interakciju sa kompleksom antigena i MHC molekula klase II na membrani antigenprezentujuće ćelije. Antigen-prezentujuća ćelija zatim proizvodi dodatni kostimulatorni signal, što vodi aktivaciji T-ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je definišuća odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija.
[0098] Glavne vrste profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritične ćelije koje imaju najširi raspon prezentacije antigena i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, dok su ostale makrofagi, B-ćelije i određene aktivirane epitelne ćelije.
[0099] Antigen-prezentujuće ćelije koje nisu profesionalne zapravo ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II koji su potrebni za interakciju sa naivnim T-ćelijama; oni se eksprimiraju samo nakon stimulacije antigen-prezentujućih ćelija koje nisu profesionalne sa određenim citokinima kao što je IFNγ.
[0100] Dendritične ćelije (DC) su populacije leukocita koje T-ćelijama prezentuju antigene uhvaćene u perifernim tkivima, posredstvom puteva prezentacije antigena, kako sa MHC molekulima klase II, tako i klase I. Dobro je poznato da su dendritične ćelije snažni induktori imunskih odgovora i da je aktivacija ovih ćelija ključan korak za indukciju imuniteta.
[0101] Dendritične ćelije su konvencionalno kategorisane kao „nezrele” i „zrele” ćelije, što može biti upotrebljeno kao jednostavan način za razlikovanje dva dobro okarakterisana fenotipa. Ipak, ovu nomenklaturu ne treba tumačiti kao da isključuje sve moguće međufaze diferencijacije.
[0102] Nezrele dendritične ćelije su okarakterisane kao ćelije koje prezentuju antigen sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i manoznog receptora. Zreli fenotip obično karakteriše niža ekspresija ovih markera, ali visoka ekspresija molekula na ćelijskoj površini koji su odgovorni za aktivaciju T-ćelija, kao što su MHC molekuli klase I i klase II, adhezioni molekuli (npr. CD54 i CD11) i kostimulatorni molekuli (npr. CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).
[0103] Sazrevanje dendritičnih ćelija se označava kao status aktivacije dendritičnih ćelija u kome takve antigen-prezentujuće ćelije dovode do senzibilizacije T-ćelija, dok prezentacija od strane nezrelih dendritičnih ćelija dovodi do tolerancije. Sazrevanje dendritičnih ćelija je uglavnom prouzrokovano biomolekulima sa mikrobnim karakteristikama, a koje detektuju receptori urođenog imuniteta (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin itd.), kao i sa proinflamatornim citokinima (TNF, IL-1, IFN), ligacijom CD40 na površini dendritičnih ćelija sa CD40L i supstancama oslobođenim iz ćelija koje su podvrgnute stresnoj ćelijskoj smrti. Dendritične ćelije mogu biti dobijene kultivisanjem ćelija kosne srži in vitro sa citokinima, kao što su to faktor stimulacije rasta kolonije granulocitno-makrofagne loze (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.
[0104] Pod „ćelija koju karakteriše prezentacija antigena” ili „ćelija koja prezentuje antigen” ili sličnim izrazima, podrazumeva se ćelija kao što je antigen-prezentujuća ćelija koja prezentuje antigen ili fragment izveden iz navedenog antigena, npr. obradom antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično navedenom, termini „bolest koju karakteriše prezentacija antigena” označavaju bolest koja uključuje ćelije koje karakteriše prezentacija antigena, posebno sa MHC molekulima klase I.
[0105] Termin „imunoreaktivna ćelija” ili „efektorska ćelija” se u kontekstu predmetnog opisa odnosi na ćeliju koja ostvaruje efektorske funkcije tokom imunske reakcije. „Imunoreaktivna ćelija” je poželjno sposobna da vezuje antigen ili ćeliju koju karakteriše ekspresija i/ili prezentacija antigena ili epitopa, kao i onu koja posreduje u imunskom odgovoru. Na primer, takve ćelije luče citokine i/ili hemokine, ubijaju mikrobe, luče antitela, prepoznaju inficirane ili kancerske ćelije i izborno eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije obuhvataju T-ćelije (citotoksične T-ćelije, pomoćne T-ćelije, T-ćelije infiltrirane u tumor), B-ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage i dendritične ćelije.
[0106] Poželjno je da „imunoreaktivna ćelija” prepoznaje antigen ili epitop sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula, kao što je na površini ćelija koje prezentuju antigen. Poželjno je i da navedeno prepoznavanje omogući ćeliji koja prepoznaje antigen ili epitop, da odgovori ili da bude reaktivna. Ukoliko je ćelija pomoćna T-ćelija (CD4<+>T-ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili epitop u kontekstu MHC molekula klase II, takvo odgovoranje ili reaktivnost mogu uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ukoliko je ćelija CTL, takvo odgovoranje ili reaktivnost mogu uključivati eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, tj. ćelija koje karakteriše prezentacija antigena sa MHC molekulima klase I, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom. Prema opisu, odgovaranje CTL može uključivati kontinuirani fluks kalcijuma, ćelijsku deobu, proizvodnju citokina poput IFN-γ i TNF-α, pozitivnu regulaciju markera aktivacije poput CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen. Odgovoranje CTL može takođe biti određeno upotrebom veštačkih reportera koji tačno ukazuju na CTL odgovor. Takav CTL koji prepoznaje antigen ili epitop i koji odgovara ili je reaktivan, takođe se označava kao „CTL koji reaguje na antigen". Ukoliko je ćelija B-ćelija, takva reaktivnost može uključivati oslobađanje imunoglobulina.
[0107] Termin „T-ćelija” ili „T limfocit” se odnosi na ćelije poreklom iz timusa koje učestvuju u raznovrsnim imunskim reakcijama posredovanim ćelijama i obuhvataju pomoćne T-ćelije (CD4+ T-ćelije) i citotoksične T-ćelije (CTL, CD8+ T-ćelije) koje obuhvataju i citolitičke T-ćelije.
[0108] T-ćelije pripadaju grupi belih krvnih ćelija poznatoj kao limfociti i sa centralnom su ulogom u imunitetu posredovanom ćelijama. Mogu se razlikovati od ostalih vrsta limfocita, kao što su B-ćelije i ćelije prirodne ubice, po prisustvu posebnog receptora na njihovoj ćelijskoj površini koji se naziva T-ćelijski receptor (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za sazrevanje T-ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podgrupa T-ćelija, od kojih je svaka sa jasno različitom funkcijom.
[0109] Pomoćne T-ćelije pomažu drugim belim krvnim ćelijama u imunološkim procesima, uključujući sazrevanje B-ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T-ćelija i makrofaga, između ostalih funkcija. Ove ćelije su poznate i kao CD4+ T-ćelije, pošto eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Pomoćne T-ćelije postaju aktvirane kada im se prezentuje peptidni antigen sa MHC molekulima klase II koji se eksprimiraju na površini antigen-prezentujućih ćelija (APC). Jednom aktivirane, one se brzo dele i luče male proteine koji se nazivaju citokinima, a koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru.
[0110] Citotoksične T-ćelije uništavaju ćelije koje su inficirane virusima i tumorske ćelije, a pokazano je i da su verovatno uključene u odbacivanje transplantata. Ove ćelije su poznate i kao CD8+ T-ćelije pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljne molekule vezivanjem za antigen koji je povezan sa MHC molekulom klase I, a koji je prisutan na površini skoro svake ćelije u telu.
[0111] Većina T-ćelija ima T-ćelijski receptor (TCR), koji postoji kao kompleks od nekoliko proteina. Akuelni T-ćelijski receptor se sastoji od dva odvojena peptidna lanca koji se proizvode sa nezavisnih gena za alfa i beta T-ćelijski receptor (TCRα i TCRβ) i nazivaju se α- i β-TCR lanci. γδ T-ćelije (gama delta T-ćelije) predstavljaju malu podgrupu T-ćelija koje na svojoj površini poseduju poseban T-ćelijski receptor (TCR). Naime, TCR se u γδ T-ćelijama sastoji od jednog γlanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T-ćelija je mnogo ređa (2% ukupnih T-ćelija) u odnosu na αβ T-ćelije.
[0112] Struktura T-ćelijskog receptora je vrlo slična imunoglobulinskim Fab fragmentima, koji su regioni definisani kao spojeni laki i teški lanci kraka antitela. Svaki lanac TCR-a je član imunoglobulinske superfamilije i poseduje jedan N-terminalni imunoglobulinski (Ig)-varijabilni (V) domen, jedan Ig-konstantan (C) domen, region koji je transmembranski/proteže se kroz ćelijsku membranu i kratak citoplazmatski rep na C-terminalnom kraju. Varijabilni domen i TCR α-lanca i β-lanca sadrži tri hipervarijabilna ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), dok varijabilni region β-lanca sadrži dodatno područje hipervarijabilnosti (HV4) koje normalno ne stupa u kontakt sa antigenom i stoga se ne smatra CDR-om. CDR3 je glavni CDR odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, iako je takođe pokazano da CDR1 α-lanaca stupa u interakciju sa N-terminalnim delom antigenskog peptida, dok CDR1 β-lanca stupa u interakciju sa C-terminalnim delom peptida. Smatra se takođe da CDR2 prepoznaje MHC. Ne smatra se, međutim, da CDR4 β-lanca učestvuje u prepoznavanju antigena, ali je pokazano da stupa u interakciju sa superantigenima. Konstantan domen TCR domena se sastoji od kratkih povezujućih sekvenci u kojima cisteinski ostatak obrazuje disulfidne veze, koje dalje obrazuju vezu između dva lanca.
[0113] Termin „B-ćelija” ili „B-limfocit” se odnosi na vrstu belih krvnih ćelija limfocitnog podtipa koje funkcionišu u okviru humoralnog imuniteta, izlučivanjem antitela. Dodatno, B-ćelije prezentuju antigen i klasifikovane su kao profesionalne antigen-prezentujuće ćelije (APC), a izlučuju i citokine. B-ćelije eksprimiraju B-ćelijske receptore (BCR) na svojoj ćelijskoj membrani. BCR omogućavaju B-ćeliji da se vezuje za specifičan antigen, na koga će se dalje inicirati odgovor antitela. B-ćelijski receptor se sastoji od dva dela, imunoglobulinskog molekula jednog izotipa (IgD, IgM, IgA, IgG ili IgE) koji je vezan za membranu i koji je, sa izuzetkom prisustva integralnog membranskog domena, identičan sa svojim oblicima koji se izlučuju, kao i deo za transdukciju signala: heterodimer koji se naziva Ig-α/Ig-β (CD79), a koji su disulfidnim mostovima povezani zajedno. Svaki član dimera se proteže kroz membanu i ima citoplazmatski rep sa imunoreceptorskim motivom za aktivaciju zasnovanu na tirozinu (ITAM).
[0114] Aktivacija B-ćelija se odvija u sekundarnim limfoidnim organima, kao što su slezina i limfni čvorovi. Nakon što B-ćelije sazrevaju u kosnoj srži, one migriraju putem krvi do sekundarnih limfoidnih organa, koji dobijaju konstantno snabdevanje antigenom putem cirkulišuće limfe. Aktivacija B-ćelija započinje kada se B-ćelija veže za antigen preko svog BCR. Različite podgrupe B-ćelija podležu aktivaciji zavisnoj od T-ćelija ili aktivaciji nezavisnoj od T-ćelija.
[0115] Termin „glavni kompleks histokompatibilnosti” i skraćenica „MHC” podrazumevaju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnose se na kompleks gena koji se javlja kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i ćelija koje prezentuju antigen ili obolelih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih da bi mogli biti prepoznati od strane T-ćelijskih receptora. Proteini koje kodira MHC se eksprimiraju na površini ćelija i prikazuju T-ćelijama i sopstvene antigene (fragmente peptida iz same ćelije) i antigene koji nisu sopstveni (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama).
[0116] MHC region je podeljen u tri podgrupe, klasu I, klasu II i klasu III. MHC proteini klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (nisu deo MHC kodiranog hromozomom 15). Oni prezentuju fragmente antigena citotoksičnim T-ćelijama. Na većini ćelija imunskog sistema, posebno na antigen-prezentujućim ćelijama, MHC proteini klase II sadrže α- i β-lance i prezentuju antigene fragmente pomoćnim T-ćelijama. MHC region klase III kodira druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa, a kodira i pojedine citokine.
[0117] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju antigen-prezentujuće proteine na ćelijskoj površini, označavaju se kao geni humanog leukocitnog antigena (HLA). Ipak, skraćenica MHC se često upotrebljava za označavanje proizvoda HLA gena. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA i HLA-DRB1,
[0118] U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata opisa, MHC molekul je HLA molekul.
[0119] Termin „imunske efektorske funkcije” ili „efektorske funkcije”, u kontekstu predmetnog opisa, obuhvataju bilo koje funkcije koje su posredovane komponentama imunskog sistema, a čiji je rezultat, na primer, ubijanje ćelija. Poželjno je da su imunske efektorske funkcije, u kontekstu predmetnog opisa, efektorske funkcije posredovane T-ćelijama. Takve funkcije obuhvataju, u slučaju pomoćne T-ćelije (CD4<+>T-ćelije), prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II, pomoću T-ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, a u slučaju CTL i prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase I pomoću T-ćelijskih receptora, eliminaciju ćelija prezentovanih u kontekstu MHC molekula klase I, odnosno ćelije koje karakteriše prezentacija antigena sa MHC klase I, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom, a dalje i proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0120] Termin „receptor sličan toll receptoru” ili „TLR” se odnosi na klasu proteina koji su sa ključnom ulogom u urođenom imunskom sistemu. Oni su pojedinačni, nekatalitički receptori koji prolaze kroz membranu i obično se eksprimiraju u ćelijama „stražarima”, poput makrofaga i dendritičnih ćelija, a koji prepoznaju strukturno očuvane molekule izvedene iz mikroba. Jednom kada ovi mikrobi probiju fizičke barijere, poput kože ili sluzokože crevnog trakta, prepoznaju ih TLR, koji dalje aktiviraju ćelijske imunske odgovore.
[0121] U jednom primeru izvođenja opisa, subjektu se primenjuju neimunogena RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta. Translacioni proizvod RNK može biti obrazovan u ćelijama subjekta i proizvod se može prikazati imunskom sistemu radi indukovanja tolerancije na autoreaktivne T-ćelije koje ciljano deluju na autoantigen.
[0122] Alternativno, predmetnim opisom su predviđeni primeri izvođenja u kojima se neimunogena RNK koja eksprimira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta, uvodi u ćelije, kao što su antigen-prezentujuće ćelije ex vivo, npr. u antigen-prezentujuće ćelije uzete iz pacijenta, nakon čega se ćelije, izborno klonalno umnožene ex vivo, transplantiraju natrag istom pacijentu. Transfektovane ćelije mogu biti ponovo uvedene u pacijenta upotrebom bilo kog načina koji je poznat u oblasti tehnike, a poželjno u sterilnom obliku intravenskim, intrakavitarnim ili intraperitonealnim načinom primene.
Pogodne ćelije obuhvataju antigen-prezentujuće ćelije. Antigen-prezentujuća ćelija poželjno je dendritična ćelija, makrofag, B-ćelija, mezenhimska stromalna ćelija, epitelna ćelija, endotelna ćelija i fibroblasna ćelija, a najpoželjnije je dendritična ćelija. Opis stoga takođe uključuje postupak za lečenje autoimune bolesti koji obuhvata primenu izolovanih antigen-prezentujućih ćelija koje eksprimiraju neimunogenu RNK koja je ovde opisana, subjektu kome je to potrebno. Ćelije mogu biti autologne, alogene, singene ili heterologne za subjekta.
[0123] Predviđeno je da termin „nukleinska kiselina", kako se ovde upotrebljava, uključuje dezoksiribonukleinsku kiselinu (DNK) ili ribonukleinsku kiselinu (RNK), kao što su cDNK, iRNK, rekombinantno proizvedeni i hemijski sintetisani molekuli. Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. Prema opisu, RNK obuhvata in vitro transkribovanu RNK (IVT RNK) ili sintetičku RNK. Prema opisu, nukleinska kiselina je poželjno izolovana nukleinska kiselina. Štaviše, nukleinske kiseline koje su ovde opisane, mogu biti rekombinantni molekuli.
[0124] Termin „izolovana nukleinska kiselina” označava, prema opisu, da je nukleinska kiselina (i) umnožena in vitro, na primer, putem lančane reakcije polimeraze (PCR), (ii) proizvedena rekombinantno, kloniranjem, (iii) prečišćena, na primer, cepanjem i razdvajanjem putem elektroforeze u gelu, ili (iv) sintetisana, na primer, hemijskom sintezom. Nukleinski materijal se može upotrebljavati i za uvođenje u, tj. transfekciju, ćelija, na primer, u obliku RNK koja može biti pripremljena in vitro transkripcijom na osnovu DNK matrice. Štaviše, RNK može biti modifikovana pre primene, stabilizacijom sekvenci, dodavanjem „kape” i poliadenilacijom.
[0125] U kontekstu predmetnog opisa, termin „DNK” se odnosi na molekul koji sadrži dezoksiribonukleotidne ostatke i poželjno je u celosti ili u velikoj meri sastavljen od dezoksiribonukleotidnih ostataka. „Dezoksiribonukleotid” se odnosi na nukleotid kome nedostaje hidroksilna grupa na 2'-poziciji β-D-ribofuranozilne grupe. Termin „DNK” obuhvata izolovanu DNK, kao što je delimično ili potpuno prečišćena DNK, suštinski čista DNK, sintetička DNK i rekombinantno generisana DNK, a uključuje i modifikovanu DNK koja se razlikuje od DNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati dodavanje ne-nukleotidnog materijala, kao što je dodavanja na kraj(eve) DNK ili u unutrašnjost molekula, na primer, na jedan ili više nukleotida DNK. Nukleotidi u molekulima DNK mogu takođe sadržavati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili nukleotidi koji su hemijski sintetisani. Ovakve izmenjene DNK se mogu označavati kao analozi ili analozi DNK koja se javljaju u prirodi.
[0126] U kontekstu predmetnog opisa, termin „RNK” se odnosi na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i poželjno je u celini ili u velikoj meri sastavljen od ribonukleotidnih ostataka. „Ribonukleotid” se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2'-poziciji β-D-ribofuranozilne grupe. Termin obuhvata dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK, kao što je delimično ili potpuno prečišćena RNK, suštinski čistu RNK, sintetičku RNK, rekombinantno proizvedenu RNK, kao i modifikovanu RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve promene mogu uključivati dodavanje ne-nukleotidnog materijala, na primer na kraj(eve) RNK ili u unutrašnjosti molekula, na primer, na jedan ili na više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK mogu takođe sadržavati nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ovako izmenjene RNK se mogu označavati analozima ili analozima RNK koja se javlja u prirodi. Prema predmetnom opisu, termin „RNK” uključuje i poželjno se odnosi na „iRNK” što označava „informacionu RNK”, a koja se odnosi na transkript koji može biti proizveden upotrebom DNK kao matrice i koji kodira peptid ili protein. iRNK obično sadrži 5' netranslatirajući region (5'-UTR), region koji kodira protein ili peptid i 3' netranslatirajući region (3'-UTR). iRNK je sa ograničenim polu-životom u ćelijama i in vitro. Poželjno je da se iRNK proizvodi in vitro transkripcijom, upotrebom DNK matrice. U jednom primeru izvođenja opisa, RNK se dobija in vitro transkripcijom ili hemijskom sintezom. Metodologija in vitro transkripcije je poznata stručnjaku. Na primer, postoji niz kompleta za in vitro transkripciju koji su komercijalno dostupni.
[0127] Prema opisu, stabilnost i efikasnost translacije RNK mogu biti modifikovani prema potrebi. Na primer, RNK može biti stabilizovana i njena translacija povećana sa jednom ili sa više modifikacija koje imaju stabilišuće efekte i/ili povećavaju efikasnost translacije RNK. Da bi se povećala ekspresija RNK koja se upotrebljava prema predmetnom opisu, ona može biti modifikovana unutar kodirajućeg regiona, odnosno sekvence koja kodira eksprimirani peptid ili protein, a poželjno bez izmene sekvence eksprimiranog peptida ili proteina, i tako da se poveća GC sadržaj radi povećanje stabilnosti iRNK i da bi se izvršila optimizacija kodona, a na taj način i pojačala translacija u ćelijama.
[0128] Termin „modifikacija” obuhvata, u kontekstu RNK koji se upotrebljava u predmetnom opisu, bilo koju modifikaciju RNK koja nije prirodno prisutna u navedenoj RNK.
[0129] U jednom primeru izvođenja opisa, RNK koja se upotrebljava prema opisu, ne sadrži 5'-trifosfate koji ne predstavljaju strukture kape. Uklanjanje takvih 5'-trifosfata koji ne predstavljaju strukture kape može biti postignuto tretiranjem RNK sa fosfatazom.
[0130] RNK opisa može sadržavati modifikovane ribonukleotide, da bi se povećala njena stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava prema opisu, 5-metilcitidin je supstituisan sa citidinom, delimično ili u potpunosti, poželjno u potpunosti. Alternativno ili dodatno, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava prema opisu, pseudouridin je supstituisan sa uridinom, delimično ili u potpunosti, poželjno u potpunosti.
[0131] U jednom primeru izvođenja, termin „modifikacija” se odnosi na obezbeđivanje RNK sa strukturom 5'-kape ili analogom 5'-kape. Termin „5'-kapa” se odnosi na strukturu kape koja se nalazi na 5'-kraju molekula iRNK i generalno se sastoji od guanozinskog nukleotida koji je povezan sa iRNK putem neobične 5'-5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovakav guanozin je metilisan na poziciji 7. Termin „konvencionalna 5'-kapa” se odnosi na 5'-kapu RNK koja se javlja u prirodi, poželjno na 7-metilguanozinsku kapu (m<7>G). U kontekstu predmetnog opisa, termin „5'-kapa” uključuje analoga 5'-kape koji podseća na strukturu kape RNK i modifikovan je tako da poseduje sposobnost da stabilizuje RNK i/ili pojača translaciju RNK ukoliko je za nju vezan, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.
[0132] RNK može sadržavati dodatne modifikacije. Na primer, dalja modifikacija RNK koja se upotrebljava u predmetnom opisu, može biti produženje ili skraćivanje poli(A) repa koji se javlja u prirodi ili izmena 5'- ili 3'-netranslatirajućih regiona (UTR), kao što je uvođenje UTR koji nije srodan kodirajućem regionu navedene RNK, na primer, izmenom postojećeg 3'-UTR sa ili insercijom jedne ili više, poželjno dve kopije 3'-UTR izvedenog iz globinskog gena, kao što je to iz alfa2-globina, alfa1-globina, beta-globina, poželjno beta-globina, a poželjnije iz humanog betaglobina.
[0133] RNK koja sadrži poli-A sekvencu koja nije maskirana, prevodi se translacijom efektivnije od RNK koja sadrži maskiranu poli-A sekvencu. Termin „poli (A) rep” ili „poli-A sekvenca” se odnosi na sekvencu adenilnih (A) ostataka koja se obično nalazi na 3'-kraju molekula RNK, dok „nemaskirana poli-A sekvenca” označava da se poli-A sekvenca na 3 'kraju molekula RNK završava sa A iz poli-A sekvence i da nakon nje ne slede nukleotidi drugačiji od A koji se nalazi na 3' kraju, tj. nizvodno od poli-A sekvence. Štaviše, duga poli-A sekvenca od oko 120 parova baza dovodi do optimalne stabilnosti transkripta i efikasne translacije RNK.
[0134] Shodno navedenom, da bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se upotrebljava prema predmetnom opisu, ona može biti modifikovana tako da bude prisutna zajedno sa poli-A sekvencom, poželjno dužine od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i posebno dužine od 100 do 150 adenozinskih ostataka. U posebno poželjnom primeru izvođenja, poli-A sekvenca je dužine od približno 120 adenozinskih ostataka. Da bi se dodatno povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se upotrebljava prema opisu, poli-A sekvenca može biti demaskirana.
[0135] Termin „stabilnost” RNK se odnosi na „poluživot” RNK. „Poluživot” se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine ili broja molekula. U kontekstu predmetnog opisa, poluživot RNK ukazuje na stabilnost navedene RNK. Poluživot RNK može uticati na „trajanje ekspresije” RNK. Može se očekivati i da će RNK sa dugim poluživotom biti eksprimirana tokom dužeg vremenskog perioda.
[0136] Naravno, ukoliko je prema predmetnom opisu poželjno da se smanji stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK, moguće je modifikovati RNK tako da se poremeti funkcija prethodno opisanih elemenata koji povećavaju stabilnost i/ili efikasnost translacije RNK.
[0137] RNK koja će biti primenjenja u skladu sa opisom je neimunogena. Termin „neimunogena RNK", kako se ovde upotrebljava, odnosi se na RNK koja ne indukuje odgovor imunskog sistema nakon primene, npr. kod sisara, ili koja indukuje slabiji odgovor nego što bi isti bio indukovan sa istom RNK koja se razlikuje samo po tome što nije bila podvrgnuta modifikacijama i tretmanima koji čine neimunogenu RNK neimunogenom. U jednom poželjnom primeru izvođenja, neimunogena RNK postaje neimunogena ugrađivanjem u RNK modifikovanih nukleotida koji suprimiraju aktivaciju receptora urođenog imuniteta posredovanu sa RNK, kao i uklanjanjem dvolančane RNK (dsRNK).
[0138] Da bi se neimunogena RNK učinila neimunogenom ugradnjom modifikovanih nukleotida, može biti upotrebljen bilo koji modifikovani nukleotid, sve dok on snižava ili suprimiraju imunogenost RNK. Posebno su poželjni modifikovani nukleotidi koji suprimiraju aktivaciju receptora urođenog imuniteta posredovanu sa RNK. U jednom primeru izvođenja, modifikovani nukleotidi sadrže zamenu jednog ili više uridina sa nukleozidom koji sadrži modifikovanu nukleobazu. U jednom primeru izvođenja, modifikovana nukleobaza je modifikovani uracil. U jednom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je izabran iz grupe koju čine 3-metil-uridin (m3U), 5-metoksi-uridin (mo5U), 5-aza-uridin, 6-aza-uridin, 2-tio-5-azauridin, 2-tio-uridin (s2U), 4-tio-uridin (s4U), 4-tio-pseudouridin, 2-tio-pseudouridin, 5-hidroksiuridin (ho5U), 5-aminoalil-uridin, 5-halo-uridin (npr.5-jodo-uridin ili 5-bromo-uridin), uridin 5-oksisirćetna kiselina (cmo5U), metil estar 5-oksisirćetne kiseline (mcmo5U), 5-karboksimetiluridin (cm5U), 1-karboksimetil-pseudouridin, 5-karboksihidroksimetil-uridin (chm5U), metil estar 5-karboksihidroksimetil-uridina (mchm5U), 5-metoksikarbonilmetil-uridin (mcm5U), 5-metoksikarbonilmetil-2-tio-2-uridin (mcm5s2U), 5-aminometil-2-tio-uridin (nm5s2U), 5-metilaminometil-uridin (mnm5U), 1-etil-pseudouridin, 5-metilaminometil-2-tio-uridin (mnm5s2U), 5-metilaminometil-2-seleno-uridin (mnm5se2U), 5-karbamoilmetil-uridin (ncm5U), 5-karboksimetilaminometil-uridin (cmnm5U), 5-karboksimetilaminometil-2-tio-uridin (cmnm5s2U), 5-propinil-uridin, 1-propinil-pseudouridin, 5-taurinometil-uridin (τm5U), 1-taurinometil-pseudouridin, 5-taurinometil-2-tio-uridin (τm5s2U), 1-taurinometil-4-tiopseudouridin, 5-metil-2-tio-uridin (m5s2U), 1-metil-4-tio-pseudouridin (m1s4ψ), 4-tio-1-metilpseudouridin, 3-metil-pseudouridin (m3ψ), 2-tio-1-metil-pseudouridin, 1-metil-1-deazapseudouridin, 2-tio-1-metil-1-deazapseudouridin, dihidrouridin (D), dihidropseudouridin, 5,6-dihidrouridin, 5-metil-dihidrouridin (m5D), 2-tio-dihidrouridin, 2-tio-dihidropseuduridin, 2-metoksi-uridin, 2-metoksi-4-tio-uridin, 4-metoksi-pseudouridin, 4-metoksi-2-tio-pseudouridin, N1-metil-pseudouridin, 3-(3-amino-3-karboksipropil)uridin (acp3U), 1-metil-3-(3-amino-3-karboksipropil)pseudouridin (acp3 ψ), 5-(izopentenilaminometil)uridin (inm5U), 5-(izopentenilaminometil)-2-tio-uridin (inm5s2U), α-tio-uridin, 2'-O-metil-uridin (Um), 5,2'-O-dimetil-uridin (m5Um), 2'-O-metil-pseudouridin (ψm), 2-tio-2'-O-metil-uridin (s2Um), 5-metoksikarbonilmetil-2'-O-metil-uridin (mcm5Um), 5-karbamoilmetil-2'-O-metil-uridin (ncm5Um), 5-karboksimetilaminometil-2'-O-metil-uridin (cmnm5Um), 3,2'-O-dimetil-uridin (m3Um), 5-(izopentenilaminometil)-2'-O-metil-uridin (inm5Um), 1-tio-uridin, dezoksitimidin, 2'-F-ara-uridin, 2'-F-uridin, 2'-OH-ara-uridin, 5-(2-karbometoksivinil) uridin i 5-[3-(1-E-propenilamino) uridin. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja, nukleozid koji sadrži modifikovanu nukleobazu je pseudouridin (ψ), Nl-metil-pseudouridin (m1ψ) ili 5-metil-uridin (m5U), posebno 1-metil-pseudouridin.
[0139] Struktura nukleozida koji sadrži modifikovanu nukleobazu za primer je 1-metilpseudouridin m1Ψ:
U jednom primeru izvođenja, zamena jednog ili više uridina sa nukleozidom koji sadrži modifikovanu nukleobazu podrazumeva zamenu najmanje 1%, najmanje 2%, najmanje 3%, najmanje 4%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 25%, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% uridina.
[0140] Tokom sinteze iRNK in vitro transkripcijom (IVT) upotrebom T7 RNK polimeraze, nastaju značajne količine aberantnih proizvoda, uključujući dvolančanu RNK (dsRNK), usled nekonvencionalne aktivnosti enzima. Ova dsRNK indukuje inflamatorne citokine i aktivira efektorske enzime, što dovodi do inhibicije sinteze proteina. dsRNK može biti uklonjena iz RNK, kao što je IVT RNK, na primer, upotrebom reverzno-faznog HPLC postupka sa jonskim parovima i neporoznim ili poroznim C-18 polistiren-divinilbenzenskim (PS-DVB) matriksom. Alternativno, može biti upotrebljen postupak zasnovan na enzimskoj aktivnosti, upotrebom RNazeIII iz E. coli koja specifično hidrolizuje dsRNK, ali ne i ssRNK, čime se eliminišu kontaminirajuće dsRNK iz preparata IVT RNK. Dodatno, dsRNK može biti razdvojena od ssRNK upotrebom celuloznog materijala. U jednom primeru izvođenja, RNK preparat se dovodi u kontakt sa celuloznim materijalom, pri čemu se ssRNK odvaja od celuloznog materijala pod uslovima koji dozvoljavaju vezivanje dsRNK za celulozni materijal, a ne dozvoljavaju vezivanje ssRNK za celulozni materijal.
[0141] Kao što se termin ovde upotrebljava, „ukloniti” ili „uklanjanje” se odnosi na karakterističnu populaciju prvih supstanci, poput neimunogene RNK, koje se odvajaju od blizine populacije drugih supstanci, kao što je dsRNK, pri čemu populacija prvih supstanci nije nužno lišena druge supstance i populacija drugih supstanci nije nužno lišena prve supstance. Ipak, populacija prvih supstanci koju karakteriše uklanjanje populacije drugih supstanci ima merljivo niži sadržaj drugih supstanci u poređenju sa smešom prve i druge supstance koja nije razdvajana.
[0142] Nukleinske kiseline mogu biti prenete u ćeliju domaćina fizičkim, hemijskim ili biološkim putem.
[0143] Fizički postupci za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju domaćina obuhvataju precipitaciju sa kalcijum fosfatom, lipofekciju, bombardovanje česticama, mikroinjeciranje, elektroporaciju i slično.
[0144] Biološki postupci za uvođenje nukleinske kiseline od interesa u ćeliju domaćina obuhvataju upotrebu DNK i RNK vektora. Virusni vektori, a posebno retrovirusni vektori, postali su najšire upotrebljavan postupak za insertovanje gena u sisarske, npr. humane ćelije. Ostali virusni vektori mogu biti izvedeni iz lentivirusa, poksvirusa, herpes simpleks virusa I, adenovirusa i adenoasociranih virusa i sličnih.
[0145] Hemijski načini za uvođenje nukleinske kiseline u ćeliju domaćina obuhvataju koloidne disperzione sisteme, kao što su makromolekulski kompleksi, nanokapsule, mikrosfere, mikroglobule i sistemi na bazi lipida, uključujući emulzije tipa ulje-u-vodi, micele, pomešane micele i lipozome. Poželjan koloidni sistem za upotrebu u vidu nosača za isporuku in vitro i in vivo je lipozom (tj. vezikula sa veštačkom membranom). Priprema i upotreba takvih sistema je dobro poznata u oblasti tehnike.
[0146] „Kodiranje” se odnosi na inherentno svojstvo specifičnih sekvenci nukleotida u nukleinskoj kiselini da posluže kao matrice za sintezu drugih polimera i makromolekula u biološkim procesima, a koji su bilo sa definisanom sekvencom nukleotida ili sa definisanom sekvencom aminokiselina. Prema tome, nukleinska kiselina kodira protein ukoliko ekspresija (translacija i po izboru transkripcija) nukleinske kiseline proizvodi protein u ćeliji ili drugom biološkom sistemu.
[0147] Termin „ekspresija” se prema opisu upotrebljava u svom najopštijem značenju i obuhvata proizvodnju RNK i/ili peptida ili polipeptida, npr. transkripcijom i/ili translacijom. U pogledu RNK, termin „ekspresija” ili „translacija” se konkretno odnosi na proizvodnju peptida ili polipeptida. Obuhvaćena je i delimična ekspresija nukleinskih kiselina. Štaviše, ekspresija može biti tranzijentna ili stabilna.
[0148] U kontekstu predmetnog opisa, termin „transkripcija” se odnosi na proces u kome se genetički kod u DNK sekvenci prepisuje u RNK. Nakon toga, RNK se može translatirati u protein. Prema predmetnom opisu, termin „transkripcija” obuhvata „in vitro transkripciju”, pri čemu se termin „in vitro transkripcija” odnosi na proces u kome je RNK, posebno iRNK, sintetisana in vitro u sistemu bez ćelija, poželjno upotrebom odgovarajućih ćelijskih ekstrakata. Poželjno je da se za generisanje transkripata primenjuju vektori za kloniranje. Ovakvi vektori za kloniranje su generalno označeni kao transkripcioni vektori, a prema predmetnom opisu, obuhvaćeni su terminom „vektor". Prema predmetnom opisu, poželjno je da RNK koji se upotrebljava u predmetnom opisu bude in vitro transkribovana RNK (IVT-RNK) i da se može dobiti in vitro transkripcijom odgovarajuće DNK matrice. Promotor za kontrolu transkripcije može biti bilo koji promotor za bilo koju RNK polimerazu. Posebni primeri RNK polimeraza su T7, T3 i SP6 RNK polimeraze. Poželjno je i da je in vitro transkripciju prema opisu pod kontrolom T7 ili SP6 promotora. DNK matrica za in vitro transkripciju može biti dobijena kloniranjem nukleinske kiseline, posebno cDNK, i njenim uvođenjem u odgovarajući vektor za in vitro transkripciju. cDNK se može dobiti reveznom transkripcijom RNK.
[0149] Termin „translacija” se, prema opisu, odnosi na proces u ribozomima ćelije, a kojim se na osnovu lanca informacione RNK usmerava udruživanja aminokiselina u sekvencu da bi nastao peptid ili polipeptid.
[0150] Prema opisu, poželjno je da nukleinska kiselina, kao što je RNK koja kodira peptid ili protein, kada se jednom preuzme od strane ćelije ili u nju uvede, npr. transfekciom ili transdukcijom, pri čemu ćelija može biti prisutna in vitro ili kod subjekta, dovede do ekspresije navedenog peptida ili proteina. Ćelija može eksprimirati kodirani peptid ili protein unutar ćelije (npr. u citoplazmi i/ili u jedru), može izlučivati kodirani peptid ili protein ili ga može eksprimirati na površini.
[0151] Prema opisu, termini kao što su „ekspresija nukleinske kiseline” i „kodiranje nukleinske kiseline” ili slični termini, upotrebljavaju se ovde naizmenično i u kontekstu određenog pepetida ili polipeptida označavaju da nukleinska kiselina, ukoliko je prisutna u odgovarajućoj sredini, a poželjno unutar ćelije, može biti eksprimirana tako da se proizvodi navedeni peptid ili polipeptid.
[0152] Termini kao što su „prenos", „uvođenje", „transfekcija” ili „transdukcija” ovde se koriste naizmenično i odnose se na uvođenje nukleinskih kiselina, posebno egzogenih ili heterolognih nukleinskih kiselina, kao što je RNK, u ćeliju. Prema predmetnom opisu, ćelija može biti prisutna in vitro ili in vivo, npr. ćelija može činiti deo organa, tkiva i/ili organizma. Prema opisu, transfekcija može biti tranzijentna ili stabilna. Za pojedine primene transfekcije, dovoljno je ukoliko je transfektovani genetički materijal samo tranzijentno eksprimiran. Pošto nukleinska kiselina koja se uvodi procesom transfekcije obično nije integrisana u genom jedra, strana nukleinska kiselina će biti razblažena mitozom ili će se razgrađivati. Ćelijske linije koje omogućavaju epizomalno umnožavanje nukleinskih kiselina u velikoj meri smanjuju stopu razblaživanja. Ukoliko je poželjno da transfektovana nukleinska kiselina zaista ostane u genomu ćelije i njenim "„ćerkama” ćelijama, mora se ostvariti stabilna transfekcija. RNK može biti transfektovana u ćelije radi tranzijentne ekspresije proteina koga kodira.
[0153] Prema predmetnom opisu, termin „peptid” se odnosi na supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 ili više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, a posebno 100 aminokiselina kovalentno povezanih peptidnim vezama.
[0154] Termin „protein” se odnosi na velike peptide, odnosno polipeptide, poželjno na peptide sa više od 100 aminokiselinskih ostataka, ali su termini „peptid", „polipeptid” i „protein” generalno sinonimi i ovde se upotrebljavaju naizmenično.
[0155] Predmetni opis takođe uključuje „varijante” peptida, proteina ili aminokiselinskih sekvenci, kao što su to varijatne autoantigena koji su ovde opisani.
[0156] Za potrebe predmetnog opisa, „varijante” aminokiselinske sekvence sadrže varijante sa aminokiselinskim insercijama, varijante sa aminokiselinskim delecijama i/ili varijante sa aminokiselinskim supstitucijama.
[0157] Varijante sa aminokiselinskim insercijama podrazumevaju insercije jedne ili dve ili više aminokiselina u određenu aminokiselinsku sekvencu. U slučaju da varijante aminokiselinske sekvence sadrže inserciju, jedan ili više aminokiselinskih ostataka se insertuje na određeno mesto u aminokiselinskoj sekvenci, iako je moguća i nasumična insercija uz odgovarajući skrining dobijenih proizvoda.
[0158] Varijante sa aminokiselinskim adicijama podrazumevaju fuzije jedne ili više aminokiselina, kao što je to 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina, sa amino ili karboksilnim krajem.
[0159] Varijante sa aminokiselinskim delecijama karakteriše uklanjanje jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je to uklanjanje 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50 ili više aminokiselina. Delecije mogu biti na bilo kojoj poziciji u proteinu. Varijante sa aminokiselinskim delecijama koje obuhvataju deleciju na N-terminalnom i/ili C-terminalnom kraju proteina, takođe se nazivaju skraćenim varijantama (na N-kraju i/ili C-kraju).
[0160] Varijante sa aminokiselinskim supstitucijama karakteriše da je najmanje jedan ostatak u sekvenci bio uklonjen i da je na njegovo mesto insertovan drugi ostatak. Prednost se daje modifikacijama koje se uvode na pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci koje nisu evolutivno očuvane među homolognim proteinim ili peptidima i/ili zamenama aminokiselina sa drugima sličnih osobina. Poželjno je da promene aminokiselina u varijantama proteina budu konzervativne promene aminokiselina, tj. supstitucije sa aminokiselinama sličnog naelektrisanja ili onika koje su bez naelektrisanja. Konzervativna promena aminokiselina podrazumeva supstituciju jedne aminokiseline sa drugom koja joj je srodna u pogledu bočnih lanaca. Aminokisline koje se javljaju u prirodi u principu se dele u četiri familije: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan) i nenaelektrisane polarne aminokiseline (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin). Fenilalanin, triptofan i tirozin se ponekad zajedno klasifikuju kao aromatične aminokiseline.
[0161] Poželjno je da stepen sličnosti, a poželjno identičnosti, između date aminokiselinske sekvence i aminokiselinske sekvence koja je varijanta navedene date aminokiselinske sekvence iznosi najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti se poželjno navodi za region aminokiselina koji predstavlja najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% celokupne dužine referentne aminokiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna aminokiselinska sekvenca sastoji od 200 aminokiselina, stepen sličnosti ili identičnosti se poželjno navodi za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180 ili oko 200 aminokiselina, poželjno kontinuiranih aminokiselina. Stepen sličnosti ili identičnosti se poželjno navodi za segment od najmanje 80, najmanje 100, najmanje 120, najmanje 150, najmanje 180, najmanje 200 ili najmanje 250 aminokiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti je dat za celu dužinu referentne aminokiselinske sekvence. Poravnavanje radi utvrđivanja sličnosti sekvence, poželjno identičnosti sekvenci, može biti sprovedeno alatima koji su poznati u oblasti tehnike, poželjno upotrebom najboljeg poravnavanja sekvenci, na primer, upotrebom Aligh programa i njegovih standardnih podešavanja, poželjno parametara EMBOSS::igla, Matrica: Blosum62, penali praznine 10,0, dužina praznine 0,5.
[0162] „Sličnost sekvenci” označava procenat aminokiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne aminokiselinske supstitucije. „Identičnost sekvence” između dve aminokiselinske sekvence ukazuje na procenat aminokiselina koje su identične između sekvenci.
[0163] Predviđeno je da se termin „% identičnosti” odnosi prevashodno na procenat aminokiselinskih ostataka koji su identični u optimalnom poravnavanju između dve sekvence koje je potrebno uporediti, pri čemu je navedeni procenat čisto statistički, a razlike između dve sekvence mogu biti nasumično raspoređene duž celokupne dužine sekvence, odnosno sekvenca za upoređivanje može sadržavati adicije ili delecije u poređenju sa referentnom sekvencom, a da bi se postiglo optimalno poravnavanje između dve sekvence. Poređenja dve sekvence se obično sprovode poređenjem navedenih sekvenci, nakon optimalnog poravnavanja, u odnosu na segment ili „prozor za poređenje", da bi se identifikovali lokalni regioni odgovarajućih sekvenci. Optimalno poravnavanje radi poređenja se može izvršiti ručno ili uz pomoć lokalnog algoritma homologije autora Smith i Waterman, 1981, Ads App. Math. 2, 482, lokalnog algoritma homologije autora Neddleman i Wunsch, 1970, J. Mol. Biol.48, 443, kao i uz pomoć algoritma za pretraživanje sličnosti autora Pearson i Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444 ili uz pomoć računarskih programa koji koriste navedene algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0164] Procenat identičnosti se dobija određivanjem broja identičnih pozicija u kojima sekvence koje se upoređuju odgovaraju jedna drugoj i dalje deljenjem ovog broja sa brojem upoređenih pozicija i množenjem ovog rezultata sa 100.
[0165] Homologne aminokiselinske sekvence karakteriše, prema opisu, identičnost u najmanje 40%, posebno u najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98 ili najmanje 99% aminokiselinskih ostataka.
[0166] Prema opisu, varijanta, fragment, deo ili porcija aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina, poželjno je sa funkcionalnim osobinama koje karakterišu aminokiselinsku sekvencu, peptid ili protein, tim redom, iz kojih je izveden, tj. funkcionalan je ekvivalent. U jednom primeru izvođenja, varijanta, fragment, deo ili porcija aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunološki ekvivalentan aminokiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu iz koga je izveden. U jednom primeru izvođenja, funkcionalna osobina je imunološka osobina.
[0167] Opis obuhvata i derivate pepetida i proteina koji su ovde opisani i koji su obuhvaćeni terminima „peptid” i „protein". Prema opisu, „derivati” proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju bilo koju hemijsku modifikaciju i obuhvataju pojedinačne ili višestruke supstitucije, delecije i/ili adicije bilo kojih od molekula koji su povezani sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. U jednom primeru izvođenja, „derivati” proteina ili peptida uključuju one modifikovane analoge koji su rezultat glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristoilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, uvođenja zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog cepanja ili vezivanja za antitelo ili za neki drugi ćelijski ligand. Terminom „derivat” su šire obuhvaćeni i svi funkcionalni hemijski ekvivalenti navedenih proteina i peptida. Poželjno je da modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i/ili povećanu imunogenost.
[0168] Termin „izveden” označava prema opisu da je određeni entitet, posebno određena sekvenca, prisutan u objektu iz koga potiče, posebno organizma ili molekula. U slučaju sekvenci aminokiselina ili nukleinskih kiselina, posebno sekvenci određenih regiona, „izvedeno” posebno označava da je relevantna aminokiselinska sekvenca ili sekvenca nukleinske kiseline izvedena iz aminokiselinske sekvence ili sekvence nukleinske kiseline u kojoj je prisutna.
[0169] Termin „ćelija” ili „ćelija domaćin” poželjno je intaktna ćelija, tj. ćelija sa intaktnom membranom koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele ili genetički materijal. Intaktna ćelija je poželjno vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno je da se navedeni termin opisa odnosi na bilo koju ćeliju koja se može transformisati ili transfektovati sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Termin „ćelija” obuhvata, prema opisu, prokariotske ćelije (npr. E. coli) ili eukariotske ćelije (npr. dendritične ćelije, B-ćelije, CHO ćelije, COS ćelije, K562 elije, HEK293 ćelije, HELA ćelije, ćelije kvasca i ćelije insekata). Egzogena nukleinska kiselina se može pronaći unutar ćelije (i) slobodno dispergovana kao takva, (ii) ugrađena u rekombinantni vektor, ili (iii) integrisana u genom ćelije domaćina ili u mitohondrijsku DNK. Ćelije sisara su posebno poželjne, kao što su ćelije ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza i primata. Ćelije mogu biti izvedene iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije.
[0170] Ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu, npr. koja je transfektovana sa nukleinskom kiselinom, poželjno eksprimira peptid ili protein kodiran nukleinskom kiselinom.
[0171] Termin „ekspanzija” se odnosi na proces u kome se određeni entitet umnožava. U jednom primeru izvođenja predmetnog opisa, termin se upotrebljava u kontekstu imunskog odgovora u kome proliferišu limfociti stimulisani antigenom, čime se specifični limfociti koji prepoznaju navedeni antigen zapravo umnožavaju. Poželjno je da klonalna ekspanzija vodi diferencijaciji limfocita.
[0172] Predviđeno je i da „izolovan", kako se ovde upotrebljava, označava molekul koji je suštinski oslobođen od drugih molekula, poput drugih ćelijskih materijala.
[0173] Termin „rekombinantan” u kontekstu predmetnog opisa označava „napravljen putem postupaka genetičkog inženjeringa". Poželjno je da se „rekombinantan objekat”, kao što je rekombinantna ćelija ili nukleinska kiselina, u kontekstu predmetnog opisa, ne javlja u prirodi.
[0174] Termin „koji se javlja u prirodi”, kako se ovde upotrebljava, odnosi se na činjenicu da se pojedini objekti mogu naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koji su prisutni u organizmu (uključujući viruse) i koji mogu biti izolovani iz izvora u prirodi, a koje čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, smatraju se onima koji se javljaju u prirodi.
[0175] Termini kao što su „smanjenje", „inhibiranje” ili „umanjenje” odnose se na sposobnost da se prouzrokuje smanjenje sveukupnog nivoa, poželjno za 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije za 50% ili više, i najpoželjnije za 75% ili više. Ovi termini obuhvataju potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, odnosno smanjenje do nule ili suštinski do nule.
[0176] Termini kao što su „povećavanje“, „poboljšanje“, „pospešivanje“, „stimulisanje” ili „indukovanje” odnose se na sposobnost da se prouzrokuje povećanje ukupnog nivoa, poželjno za 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, 50% ili više, 75% ili više, 100% ili više, 200% ili više ili 500% ili više. Ovi termini se mogu odnositi na povećanje, poboljšanje, pospešivanje, stimulaciju ili indukovanje od nule ili od nivoa koji se ne mogu izmeriti ili detektovati, do nivoa koji je viši od nule ili od nivoa koji se može izmeriti ili detektovati. Alternativno, ovi termini mogu takođe označavati da je postojao određeni nivo pre povećanja, poboljšanja, pospešivanja, stimulacije ili indukcije, a da je nakon povećanja, poboljšanja, pospešivanja, stimulacije ili indukcije nivo veći.
[0177] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani, korisni su u postupcima supresije imunskog odgovora kod sisara radi lečenja ili prevencije autoimune bolesti. Preciznije, agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu biti upotrebljeni za lečenje subjekta sa autoimunom bolešću koju karakteriše prisustvo imunske reakcije na autoantigen. Prema opisu, subjektu se primenjuje neimunogena RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragmenta.
[0178] Termin „bolest” se odnosi na abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao zdravstveno stanje povezano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti prouzrokovana faktorima koji su originalno iz spoljnog izvora, kao što je infektivna bolest, ili može biti prouzrokovana unutrašnjim poremećajim funkcija, kao što su autoimune bolesti. Kod ljudi, „bolest” se često upotrebljava šire da bi se označilo bilo koje stanje koje prouzrokuje bol, disfunkciju, nepovoljnu situaciju, socijalne probleme ili smrt obolelog pojedinca, ili slične probleme za one koji su u kontaktu sa pojedincem. U ovom širem smislu, ponekada bolest uključuje povrede, invaliditet, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja i atipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i u druge svrhe isti mogu smatrati zasebnim kategorijama. Bolesti obično pogađaju pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, pošto prihvatanje i život sa mnogim bolestima može promeniti nečiji pogled na život i njegovu ličnost. Prema opisu, termin „bolest” uključuje autoimune bolesti.
[0179] Bolest koju je prema opisu potrebno lečiti, poželjno je bolest koja uključuje autoantigen ili činjenica da je povezana sa autoantigenom.
[0180] Termin „autoimuna bolest” ili „autoimuni poremećaj” se odnosi na bilo koju bolest/poremećaj u kome telo proizvodi imunogeni odgovor (tj. odgovor imunskog sistema) na neki sastojak njegovog sopstvenog tkiva. Drugim rečima, imunski sistem gubi sposobnost da prepozna neko tkivo ili sistem unutar tela kao sopstveni i ciljano deluje i napada ga kao da je strani. Autoimunske bolesti mogu biti klasifikovane na one u kojima je prevashodno zahvaćen jedan organ (npr. kao što su hemolitička anemija i anti-imunski tiroiditis), i na one u kojima je proces autoimune bolesti difuzno rasprostranjen u mnogim tkivima (npr. sistemski eritematozni lupus). Na primer, smatra se da je multipla skleroza prouzrokovana T-ćelijama koje napadaju omotače koji obavijaju nervna vlakna mozga i kičmene moždine. To dovodi do gubitka koordinacije, slabosti i zamagljenog vida. Primeri autoimunih bolesti uključuju, ali nisu ograničeni na, Adisionovu bolest, alopeciju areatu, ankilozni spondilitis, autoimuni hepatitis, autoimuni parotitis, Kronovu bolest, dijabetes (tipa I), distrofičnu buloznu epidermolizu, epididimitis, glomerulonefritis, Gravesovu bolest, Žilijen-Barov sindrom, Hašimotovu bolest, hemolitičku anemiju, sistemski eritematozni lupus, multiplu sklerozu, mijasteniju gravis, pemfigus vulgaris, psorijazu, reumatsku groznicu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, sklerodermu, Sjogrenov sindrom, spondiloartropatije, tiroiditis, vaskulitis, vitiligo, miksedem, pernicioznu anemiju, ulcerozni kolitis i dijabetes melitus tipa I, između ostalih.
[0181] U tekstu koji sledi je lista antigena za koje je poznato da su povezani sa određenim autoimunim bolestima. Epitopi iz ovih antigena mogu biti uključeni u peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen ili njegov fragment, ili varijantu autoantigena ili fragment opisa.
Multipla skleroza (MS) / (+ životinjski model EAE (eksperimentalnog autoimunog encefalomijelitisa))
[0182] Mogući kandidati za autoantigene u MS uključuju mijelinske antigene, neuronske antigene i antigene izvedene iz astrocita. Proteinske komponente mijelinskih proteina, kao što su mijelin bazni protein (MBP) (npr. MBP84-102, MBP83-99, MBP13-32, MBP144-163, MBP143-168, MBP151-170), proteolipidni protein (PLP) (npr. PLP139-151), mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (MOG), glikoprotein povezan sa mijelinom (MAG), oligodendrocitni bazni protein povezan sa mijelinom (MOBP), CNPaza (3'-fosfodiesteraza 2', 3'-cikličnog-nukleotida), protein S100β i transaldolaza H su od posebnog interesa za upotrebu prema opisu.
Reumatoidni artritis (RA)
[0183] Mogući kandidati za autoantigene u RA uključuju kolagen tipa II, humani glikoprotein-39 hrskavice i agrekan G1.
Dijabetes tipa 1
[0184] Mogući kandidati za autoantigene u dijabetesu tipa 1 uključuju insulin, proinsulin, dekarboksilazu glutaminske kiseline od 65 kDa (GAD65), protein povezan sa insulinomom tipa 2 (IA-2), protein povezan sa insulinomom tipa 2 beta (IA-2beta), autoantigen ćelija ostrvaca pankreasa (HSP), glima 38, autoantigen ćelija ostrvaca pankreasa (ICA69), p52, transporter cinka tipa 8 (ZnT8), protein srodan katalitičkoj subjedinici glukozo-6-fosfataze, specifičan za ostrvca pankreasa (IGRP) i hromogranin A.
Mijastenija gravis
[0185] Mogući kandidati za autoantigene u mijasteniji gravis uključuju nAChR, MuSK i LRP4.
[0186] Prema opisu, razmatra se upotreba i drugih autoantigena, u bolestima kao što su MS, RA, dijabetes tipa 1, mijastenija gravis, IBD i psorijaza, od kojih su neki ovde navedeni, ali i ostalih koji su takođe poznati u oblasti tehnike. Broj poznatih autoantigena i autoimunih epitopa raste. Svi takvi antigeni i epitopi koji postanu poznati u budućnosti takođe mogu razmatrati u kontekstu upotrebe u predmetnom opisu.
[0187] Termin „bolest povezana sa autoantigenom” ili „bolest koja uključuje autoantigen” odnosi se na bilo koju bolest koja ukazuje na učešće autoantigena, npr. na bolest koju karakteriše prisustvo imunske reakcije na autoantigen ili ćelije koje eksprimiraju autoantigen.
[0188] Termin „lečenje” ili „terapijsko lečenje” odnosi se na bilo koji tretman koji poboljšava zdravstveno stanje i/ili produžava (povećava) životni vek pojedinca. Navedeno lečenje može ukloniti bolest kod pojedinca, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod pojedinca i/ili smanjiti ponovnu pojavu oboljenja kod pojedinca koji trenutno boluje ili je prethodno bolovao od datog oboljenja.
[0189] Termini „profilaktičko lečenje” ili „preventivno lečenje” odnose se na bilo koji tretman za koga je predviđeno da sprečava pojavu bolesti kod pojedinca, posebno kod pojedinca koji je sa rizikom da oboli. Termini „profilaktičko lečenje” ili „preventivno lečenje” se ovde upotrebljavaju naizmenično.
[0190] Izraz „koji je pod rizikom” podrazumeva subjekta, odnosno pacijenta, za koga je identifikovano da ima veće šansu da razvije oblest od one koja je normalna za opštu populaciju. Pored toga, subjekat koji je bolovao ili koji trenutno boluje od date bolesti je subjekat koji ima povećan rizik za razvoj bolesti, pošto takav subjekat može nastaviti da razvija bolest.
[0191] Termin „in vivo” se odnosi na situaciju u subjektu.
[0192] Termin „pojedinac” ili „subjekat” se odnosi na kičmenjake, posebno sisare. Na primer, u kontekstu predmetnog opisa, sisari su ljudi, primati koji nisu ljudi, pripitomljeni sisari kao što su psi, mačke, ovce, goveda, koze, svinje, konji itd., laboratorijske životinje kao što su miševi, pacovi, zečevi, zamorci svinje itd., kao i životinje u zatočeništvu kao što su životinje iz zooloških vrtova. Termin „subjekat” se takođe odnosi na kičmenjake koji nisu sisari, poput ptica (posebno pripitomljenih ptica kao što su živina, patke, guske, ćurke) i riba (posebno riba koje se gaje, npr. na lososa ili soma). Termin „životinja”, kako se ovde upotrebljava, obuhvata i ljude. Poželjno je da se „pacijent” odnosi na bolesnu osobu.
[0193] Termin „autologni” se upotrebljava za opisivanje svega što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, „autologna transplantacija” se odnosi na transplantaciju tkiva ili organa izvedenih iz istog subjekta. Prednost ovakvih procedura je što se prevazilaze imunološke barijere koje bi inače dovele do odbacivanja.
[0194] Termin „alogeno” se upotrebljava za opisivanje svega što potiče iz različitih jedinki iste vrste. Za dve ili više jedinki se kaže da su međusobno alogene kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.
[0195] Termin „singeno” se upotrebljava za opisivanje svega što potiče iz pojedinaca ili tkiva sa identičnim genotipovima, odnosno iz identičnih blizanaca ili životinja istog inbred soja, ili njihovih tkiva.
[0196] Termin „heterologni” se upotrebljava za opisivanje nečega što se sastoji od višesturkih različitih elemenata. Na primer, transfer kosne srži jedne osobe u drugu jedinku predstavlja heterolognu transplantaciju. Heterologni gen je gen izveden iz izvora koji je drugačiji od subjekta.
[0197] Agensi koji su ovde opisani mogu biti primenjivani u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije. Termin „farmaceutska kompozicija” se odnosi na formulaciju koja sadrži terapijski efektivan agens ili njegovu so, poželjno zajedno sa farmaceutskim ekscipijensima kao što su puferi, konzervansi i modifikatori toničnosti. Navedena farmaceutska kompozicija je korisna za lečenje ili prevenciju bolesti ili poremećaja, primenom navedene farmaceutske kompozicije pojedincu. Farmaceutska kompozicija je takođe poznata u oblasti tehnike kao farmaceutska formulacija. Farmaceutska kompozicija može biti primenjena lokalno ili sistemski.
[0198] Termin „sistemska primena” se odnosi na primenu terapijski efektivnog agensa tako da se agens široko distribuira u telu pojedinca u značajnim količinama i da razvija biološki efekat. Prema predmetnom opisu, poželjno je da se primena vrši parenteralnom primenom.
[0199] Termin „parenteralna primena” se odnosi na primenu terapijski efektivnog agensa tako da agens ne prolazi kroz creva. Termin „parenteralna primena” uključuje intravensku primenu, subkutanu primenu, intradermalnu primenu ili intraarterijsku primenu, ali nije na nih i ograničena.
[0200] Poželjno je i da postupci opisa obuhvataju dalje snabdevanje subjekta jedinjenjem koje inhibira imunski sistem. Ukoliko je jedinjenje koje inhibira imunski sistem peptid ili polipeptid, ono može biti obezbeđeno subjektu primenom jedinjenja koje inhibira imunski sistem, ili nukleinske kiseline kao što je RNK, posebno neimunogene RNK, kao što je RNK koja je ovde opisana koja kodira jedinjenje koje inhibira imunski sistem. Jedinjenje koje inhibira imunski sistem može biti izabrano iz grupe koju čine transformišući faktor rasta beta (TGF-β), interleukin 10 (IL-10), antagonista interleukinskog 1 receptora (IL-1RA), interleukin 4 (IL-4), interleukin 27 (IL-27), interleukin 35 (IL-35), ligand programirane smrti 1 (PD-L1), inducibilni T-ćelijski kostimulatorni ligand (ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamin 2,3-dioksigenaza 1 (IDO1), indolamin 2,3-dioksigenaza 2 (IDO2), acetaldehid dehidrogenaza 1 (ALDHl)/retinaldehid dehidrogenaza (RALDH), arginaza 1 (ARG1), arginaza 2 (ARG2), sintaza azot oksida (NOS2), galektin-1, galektin-9, semaforin 4A i bilo koja od njihova kombinacija. Štaviše, kompozicije koje su ovde opisane mogu sadržavati takvo jedinjenje koje inhibira imunski sistem ili nukleinsku kiselinu kao što je RNK koja kodira takvo jedinjenje koje inhibira imunski sistem.
[0201] Farmaceutska kompozicija prema predmetnom opisu se generalno primenjuje u „farmaceutski efektivnoj količini” i u „farmaceutski prihvatljivom preparatu".
[0202] Termin „farmaceutski efektivna količina” se odnosi na količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat, samostalno ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Navedeno obuhvata usporavanje progresije bolesti i, posebno, prekidanje ili poništavanje progresije bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti takođe može biti odlaganje početka ili prevencija pojave navedene bolesti ili navedenog stanja. Efektivna količina kompozicija koje su ovde opisane zavisiće od stanja koje se leči, ozbiljnosti kliničke slike bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, kao i od trajanje tretmana, vrste pridružene terapije (ukoliko postoji), spefičnog načina primene i sličnih faktora. Shodno navedenom, primenjene doze kompozicija koje su ovde opisane mogu zavisiti od različitosti takvih parametara. U slučaju da reakcija kod pacijenta nije dovoljna sa početnom dozom, mogu biti upotrebljene veće doze (ili efektivno veće doze postignute drugačijim, lokalizovanijim načinom primene).
[0203] Termin „farmaceutski prihvatljiv” se odnosi na netoksičnost materijala, odnosno da materijal zapravo ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0204] Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa mogu sadržavati soli, pufere, konzervanse, nosače i izborno druge terapijske agense. Poželjno je da farmaceutske kompozicije predmetnog opisa sadrže jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača i/ili ekscipijenasa.
[0205] Predviđeno je da termin „eksipijens” označava sve supstance u farmaceutskoj kompoziciji koje nisu aktivni sastojci, kao što su povezivači, lubrikanti, zgušnjivači, površinski aktivi agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, arome ili boje.
[0206] Termin „razblaživač” se odnosi na agens za razblaživanje i/ili razređivanje. Štaviše, termin „razblaživač” uključuje bilo koju jednu ili više od tečnih, tečnih ili čvrstih suspenzija i/ili medijima za mešanje.
[0207] Termin „nosač” se odnosi na jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih ispunjivača ili razblaživača, koji su pogodni za primenu čoveku. Termin „nosač” se odnosi na prirodnu ili sintetičku organsku ili neorgansku komponentu koja se kombinuje sa aktivnom komponentom da bi se olakšala primena aktivne komponente. Poželjno je da su komponente nosača sterilne tečnosti poput vode ili ulja, uključujući i one dobijene iz mineralnog ulja, životinja ili biljaka, kao što su ulje od kikirikija, sojino ulje, susamovo ulje, suncokretovo ulje itd. Rastvori soli i vodeni rastvori dekstroze i glicerina mogu takođe biti upotrebljeni kao vodeni nosači jedinjenja.
[0208] Farmaceutski prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapijsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj oblasti tehnike i opisani su, na primer, u Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R Gennaro, ur., 1985). Primeri pogodnih nosača obuhvataju, na primer, magnezijum karbonat, magnezijum stearat, talk, šećer, laktozu, pektin, dekstrin, skrob, želatin, tragakant, metilcelulozu, natrijum karboksimetilcelulozu, vosak niske tačke topljenja, kakao puter i slične. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu.
[0209] Farmaceutski nosači, eksipijensi ili razblaživači mogu biti izabrani shodno načinu primene koji se planira i u skladu sa standardnom farmaceutskom praksom. Farmaceutske kompozicije predmetnog opisa mogu sadržavati kao, ili kao dodatak, nosač(e), eksipijens(e) ili razređivač(e) bilo koji pogodan(pogodne) povezujući(povežujuće) agens(e), lubrikant(e), agens(e) za resuspendovanje, agens(e) za oblaganje i/ili agens(e) za solubilizaciju. Primeri pogodnih povezujućih agenasa uključuju skrob, želatin, prirodne šećere kao što su glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza slobodnog toka, beta-laktoza, zaslađivači kukuruza, prirodne i sintetičke gume, kao što su gel akacije, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celuloza i polietilen glikol. Primeri pogodnih lubrikanata uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. U farmaceutskoj kompoziciji mogu biti obezbeđeni i konzervansi, stabilizatori, boje, pa čak i arome. Primeri konzervanasa uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzoeve kiseline. Mogu biti upotrebljeni i antioksidansi i agensi za resuspendovanje.
[0210] U jednom primeru izvođenja, kompozicija je vodena kompozicija. Vodena kompozicija može po izboru sadržavati rastvorene supstance, npr. soli. U jednom primeru izvođenja, kompozicija je u obliku kompozicije osušene smrzavanjem. Liofilizirana kompozicija se može dobiti sušenjem zamrzavanjem odgovarajuće vodene kompozicije.
[0211] Predmetni opis je dodatno ilustrovan slikama i primerima koji slede, a koje ne treba tumačiti ograničavajućima za obim opisa.
SLIKE
[0212]
Slika 1: Aktivacija imunskih ćelija slezine, oslobađanje citokina i ekspresija proteina nakon primene RNK za luciferaze u kompleksu sa F12 lipozomima. BALB/c miševima (n = 7) je intravenski injecirano10 µg neimunogene LUC iRNK-LPX, u retro-orbitalni pleksus, a nakon 24 stat, miševi su analizirani da bi se utvrdio (A) status zrelosti dendritičnih ćelija (n = 3) (praćeno pozitivnom regulacijom CD86), T-ćelija, B-ćelija i NK ćelija (praćeno pozitivnom regulacijom CD69). Šest sati nakon injeciranja iRNK-LPX u BALB/c miševe, ispitana je (B) serumska koncentracija IFNα. (C) Određivanje aktivnosti luciferaze in vivo 6, 24, 48 i 72 h nakon injeciranja luciferazne RNK putem iRNK-LPX u BALB/c miševe (n = 4), snimanjem bioluminiscencije in vivo. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 3 miša/grupi. LLOD = donja granica detekcije.
Slika 2: Dotblot analiza neimunogene MOG35-55 iRNK prečišćene bilo tretmanom sa celulozom ili HPLC prečišćavanjem. Vreme ekspozicije 20 sek.
Slika 3: Prezentovanje MOG35-55 antigena od strane DC indukuje toleranciju na EAE. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (dana 0) i pertusis toksinom (0. i 2. dana). Neimunogena iRNK koja kodira MOG35-55 je prečišćena bilo celuloznim ili HPLC postupkom, nakon čega je injecirana intravenski u retro-orbitalni pleksus, 7. i 10. dana nakon indukcije EAE. Kontrolni miševi su primali 150 mM NaCl. Podaci su prikazani kao srednja vrednost. n = 6 miševa/grupi.
Slika 4: Prezentovanje MOG35-55 antigena od strane APC indukuje proliferaciju T-ćelija specifičnu za antigen. Naivne Thy1,1<+>2D2<+>CD4<+>T-ćelije obeležene ljubičastim ćelijskim trejserom (CTV) bile su adoptivno prebačene u Thy1,2<+>C57BL/6 kontrolne miševe. Sledećeg dana, miševi su imunizovani sa 10, 20 ili 40 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55. Kontrolni miševi su tretirani sa 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK. Druga kontrolna grupa je i dalje primala 150 mM NaCl. Miševi su žrtvovani 4 dana kasnije i u slezini je analizirana proliferacija Thy1,1<+>ćelija. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 3 miša/grupi.
Slika 5: In vitro supresija proliferacije T-ćelija sa MOG35-55 sa indukovanim antigenspecifičnim Treg ćelijama. (A, B) 2D2 Foxp3-eGFP miševi su imunizovani 4 puta (d0, d3, d6, d9) sa neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55. Kontrolni miševi su bili tretirani imunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 ili neimunogenom irelevantnom kontrolnom iRNK. Treća kontrolna grupa je dodatno primala 150 mM NaCl. Miševi su žrtvovani 4 dana nakon poslednjeg tretmana sa RNK i analizirana je ekspresija Foxp3-eGFP u CD4<+>ćelijama specifičnim za MOG35-55 (C). Ćelije svake tretirane grupe (supresori) su zajedno kultivisane sa 2D2 CD4<+>T-ćelijama netretiranih naivnih miševa obeleženih sa CTV (ćelije koje odgovaraju), a koje su ponovo stimulisane in vitro tokom 72 h sa BMDC ispunjenim sa MOG35-55 peptidima. Proliferacija ćelija odgovora je određivana na osnovu razblaživanja CTV, FACS postupkom (prag je postavljen za CTV<+>ćelije). Inhibitorni kapacitet supresorskih ćelija je meren za 4 različita odnosa ćelijama koje odgovaraju. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza učestalosti CD4<+>Foxp3<+>ćelija rađena je upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja, *** p ≤ 0,001, Slika 6: Prezentovanje MOG35-55 antigena od strane DC indukuje toleranciju na EAE. EAE je aktivno indukovan u C57BL/6 miševima, imunizacijom sa MOG35-55-CFA (0. dana) i sa pertusis toksinom (0. dana i 2). Neimunogena iRNK koja kodira MOG35-55, kao i neimunogena irelevantna iRNK su injecirane intravenski u retro-orbitalni pleksus, 7. i 10. dana nakon indukcije EAE. Kontrolni miševi su primali 150 mM NaCl. Podaci su prikazani kao srednja vrednost za n = 6-8 miševa/grupi. Statistička analiza maksimalnog EAE skora za svakog miša po grupi rađena je upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja. Površina ispod krive (AUC) je upotrebljavna za određivanje statističke značajnosti različitosti kriva razvoja EAE bolesti, upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 7: Prezentovanje MOG35-55 antigena od strane DC indukuje toleranciju na EAE u stvarnoj terapijskoj postavci. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. dana i 2). Neimunogena iRNK koja kodira MOG35-55, kao i neimunogena irelevantna iRNK su injecirane intravenski, u retro-orbitalni pleksus, nakon što su miševi dostigli EAE skor od 1-2. Kontrolni miševi su primali 150 mM NaCl. Podaci su prikazani kao srednja vrednost za n = 6-9 miševa/grupi. Statistička analiza maksimalnog EAE skora za svakog miša po grupi rađena je upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja. Površina ispod krive (AUC) je upotrebljavana za određivanje statističke značajnosti različitosti kriva razvoja EAE bolesti, upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 8: Prezentovanje antigena od strane DC indukuje toleranciju na EAE. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA, a miševi su tretirani 7. i 10. dan nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 ili sa 150 mM NaCl. Nakon 16 dana od indukcije, iz miševa pogođenih sa EAE i onih tretiranih sa iRNK su uzeti organi i kultivisani su u prisustvu MOG35-55 peptida tokom 6 h u prisustvu i Brefeldina A. Ekspresija CD40L je ispitivana unutarćelijskim boljenje citokina u CD4<+>CD44<+>T-ćelijama. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza CD4<+>Teff ćelije je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja, *p ≤ 0,05.
Slika 9: Th1 i Th17 ćelije specifične za MOG35-55 peptid su značajno smanjene kod terapijski tretiranih miševa (7. dan/10. dan). EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA, a miševi su tretirani 7. i 10. dan nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 ili sa 150 mM NaCl. Nakon 16 dana od indukcije EAE, prikupljeni su mozak i kičmena moždina i ćelije su ponovo stimulirane in vitro u prisustvu MOG35-55 peptida, tokom 6 h i u prisustvu Brefeldina A. U CD4<+>T-ćelijama su zatim analizirani ekspresija IPNγ i IL-17A, bojenjem unutar ćelija, i izračunati su procenti IFNγ<+>i IL-17A<+>CD4<+>T-ćelija. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja, *p ≤ 0,05.
Slika 10: Aktivacija imunskih ćelija slezine i oslobađanje citokina nakon primene različitih mešavina MOG35-55-iRNK, odnosno neimunogene (m1Y) i imunogene (U) iRNK u kompleksu sa F12 lipozomima. C57BL/6 miševima je u retro-orbitalni pleksus intravenski injecirano 20 µg ukupnog MOG35-55 iRNK-LPX i 24 sata kasnije je ispitan status zrelosti dendritičnih ćelija (praćeno pozitivnom regulacijom CD86), T-ćelija i NK ćelija (praćeno pozitivnom regulacijom CD69). Nakon 6 sati od injeciranja iRNK-LPX u C57BL/6 miševe, ispitana je i serumska koncentracija IFNα. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 3 miša/grupi.
Slika 11: Dotblot analiza različitih mešavina MOG35-55-iRNK, odnosno neimunogene i imunogene iRNK. Vreme ekspozicije 20 sek. Isprekidana linija je postavljena kao vrednost intenziteta signala od 100%, a koja je dobijena za 320 pg dsRNK.
Slika 12: Neimunogena iRNK za MOG35-55 indukuje potpunu toleranciju na EAE. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. dana i 2). Različite mešavine neimunogenih (m1Y) i imunogenih (U) iRNK koje kodiraju MOG35-55 su injecirane intravenski, u retro-orbitalni pleksus, 7. i 10. dana nakon indukcije EAE. Kontrolni miševi su primali 150 mM NaCl. Podaci su prikazani kao srednja vrednost za n = 6-8 miševa/grupi. Statistička analiza maksimalnog EAE skora za svakog miša po grupi rađena je upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja, ** p ≤ 0,01,
Slika 13: Nukleozidna modifikacija ne indukuje samostalno gubitak prepoznavanja. Aktivacija imunskih ćelija slezine i oslobađanje citokina nakon primene različitih iRNK sa modifikovanim nukleozidima u kompleksu sa F12 lipozomima. C57BL/6 miševima je u retro-orbitalni pleksus intravenski injecirano 10 µg ukupne iRNK-LPX i 24 sata kasnije je ispitan status zrelosti dendritičnih ćelija (praćeno pozitivnom regulacijom CD86), T-ćelija i NK ćelija (praćeno pozitivnom regulacijom CD69. Nakon 6 sati od injeciranja iRNK-LPX u C57BL/6 miševe, ispitana je serumska koncentracija IFNa. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 3 miša/grupi.
Slika 14: Tretman LPX-om neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 ne dovodi do ekspanzije CD4<+>efektorskih ćelija specifičnih za antigen. Naivni C57BL/6 miševi su tretirani 0., 3., 7. i 10. dana sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55. Kontrolni miševi su tretirani sa 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK. Druga kontrolna grupa je primala 150 mM NaCl. Nakon 13 dana od prvog tretmana sa iRNK, miševi su žrtvovani i analizirana je sekrecija pro- i antiinflamatornih citokina iz splenocita upotrebom ELISpot postupka za IFNγ (A), dok je za detekciju citokina u supernatantu ćelija koje su ponovo stimulisane sa MOG35-55 peptidima upotrebljen Multipleks ELISA postupak (B i C). Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4-5 miševa/grupi.
Slika 15: Ko-inhibitorni molekuli su pozitivno regulisani nakon tretmana sa LPX-om neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55. Naivni C57BL/6 miševi su tretirani 0., 3., 7. i 10. dana sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55. Kontrolni miševi su tretirani sa 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK. Štaviše, druga kontrolna grupa je primala 150 mM NaCl. Nakon 13 dana od prvog tretmana sa iRNK, miševi su žrtvovani i analizirana je pozitivna regulacija ko-inhibitornih molekula u MOG35-55 CD4<+>T-ćelijama slezine, protočnom citometrijom. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4-5 miševa/grupi. Statistička analiza je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 16: Terapijska vakcinacija sa LPX-om neimunogene iRNK za MOG35-55 smanjuje infiltraciju limfocita u CNS. Naive Thy1,1<+>2D2 CD4<+>T-ćelije su adoptivno prebačene u Thy1,2<+>C57BL/6 miševe Dana 1. EAE je aktivno indukovan dan kasnije, imunizacijom sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. dana i 2), a miševi su tretirani 7. i 10. dan nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa 150 mM NaCl. Nakon 16 dana od indukovanja bolesti, iz različito tretiranih miševa su uzeti organi. Ispitivana je zatim infiltracija Thy1,1<+>CD4<+>ćelija specifičnih za MOG35-55, a ukupan broj infiltriranih ćelija je određen protočnom citometrijom upotrebom Trucount™ epruveta. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza infiltriranih CD4<+>Teff ćelija je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 17: Th1 i Th17 ćelije specifične za MOG35-55 su značajno smanjene kod terapijski tretiranih miševa (dan 7/dan 10). EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana), a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa 150 mM NaCl. Mozak i kičmena moždina su prikupljeni 16. dana nakon indukcije EAE, a ćelije su ponovo stimulirane in vitro u prisustvu MOG35-55 peptida tokom 6 h i u prisustvu Brefeldina A. U CD4<+>T-ćelijama je zatim unutarćelijskim boljenjem citokina analizirana ekspresija IFNγ i IL-17A, protočnom citometrijom, nakon čega su izračunati procenti IFNγ<+>i IL-17A<+>CD4<+>T-ćelija. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 18: Ko-inhibitorni molekuli su pojačano regulisani na CD4<+>T-ćelijama specifičnim za MOG35-55 nakon uspešnog tretmana sa LPX-om neimunogene iRNK specifične za MOG35-55. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana), a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa 150 mM NaCl. Nakon 16 dana od indukcije bolesti, iz različito tretiranih grupa su disekovane slezine. CD4<+>T-ćelije specifične za MOG35-55 su izolovane upotrebom MACS specifičnog za tetramere i fenotipski su analizirane protočnom citometrijom bojenjem tetramera. Podaci su prikazani kao srednja vrednost ± SD za n = 4 miša/grupi. Statistička analiza je rađena upotrebom jednofaktorske ANOVA i Tukijevog testa za višestruka poređenja.
Slika 19: PD-1 i CTLA-4 su potrebni za održavanje tolerancije specifične za antigen koja je indukovana neimunogenom iRNK. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana), a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije EAE sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 ili 20 µg neimunogene irelevantne iRNK (n = 8 miševa/ grupi). Miševi tretirani sa iRNK su tretirani istovremeno sa anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 blokirajućim antitelima ili sa odgovarajućim IgG kontrolama. Dnevno praćenje zdravstvenog stanja je korišćeno za procenu razvoja EAE. EAE površina ispod krive (AUC) je upotrebljavana za određivanje statističke značajnosti različitosti kriva razvoja bolesti putem jednosmerne ANOVA i Tukijevog testa višestrukog poređenja. Slika 20: Indukcija tolerancije specifične za antigen nakon tretmana sa neimunogenom iRNK specifičnom za antigen je nezavisna od EAE modela bolesti. (A) Terapijska vakcinacija sa LPX-om neimunogene iRNK koja kodira PLP139-151, indukuje toleranciju na recidivnoremitentni EAE. EAE je aktivno indukovan imunizacijom SJL miševa sa PLP139-151-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana). Injecirano je zatim 20 µg neimunogene iRNK koja kodira PLP139-151, kao i neimunogene irelevantne iRNK, i.v. u retro-orbitalni pleksus, 2x nedeljno počevši od 7. i 10. dana nakon indukcije EAE. (B) Terapijska vakcinacija sa LPX-om neimunogene iRNK koja kodira više epitopa, indukuje toleranciju u kompleksnom EAE. EAE je aktivno indukovan imunizacijom F1 hibrida dobijenih ukršatnjem C57BL/6 i SJL/JRj sa MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191, MBP84-104 i MOBP15-36-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana). Injecirano je zatim 40 µg neimunogene iRNK koja kodira više epitopa, 20 µg neimunogene iRNK za MOG35-55 i 20 µg neimunogene irelevantne iRNK, i.v. u retroorbitalni pleksus, 2x nedeljno počevši od 7. i 10. dana nakon indukcije EAE. Dnevno praćenje zdravstvenog stanja je korišćeno za procenu razvoja EAE. Podaci su prikazani kao srednja vrednost za n = 6-8 miševa/grupi. EAE površina ispod krive (AUC) je upotrebljavana za određivanje statističke značajnosti različitosti kriva razvoja bolesti sa jednosmernom ANOVA i Tukijevim testom višestrukog poređenja.
Slika 21: Istovremena isporuka citokina neimunogenom iRNK poboljšava tolerogenu potenciju tretmana sa LPX-om neimunogene iRNK specifične za antigen u EAE modelu. EAE je aktivno indukovan imunizacijom C57BL/6 miševa sa MOG35-55-CFA (0. dana) i pertusis toksinom (0. i 2. dana), a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije EAE sa 5 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 zajedno sa 15 µg neimunogene iRNK koja kodira mIL-10 (A) ili mIL-27 (B), tim redom. Kontrolni miševi su primili 5 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 zajedno sa 15 µg neimunogene irelevantne iRNK, 15 µg neimunogene iRNK koja kodira citokin ili 20 µg neimunogene irelevantne iRNK. Dnevno praćenje zdravstvenog stanja je korišćeno za procenu razvoja EAE. Podaci su prikazani kao srednja vrednost za n = 6-8 miševa/grupi. EAE površina ispod krive (AUC) je upotrebljavana za određivanje statističke značajnosti različitosti kriva razvoja bolesti putem jednosmerne ANOVA i Tukijevog testa višestrukog poređenja.
PRIMERI
Primer 1: Materijal i metode
Životinje
[0213] C57BL/6, BALB/c, SJL/JRj miševi divljeg tipa i F1 hibridni miševi dobijeni ukrštanjem C57BL/6 i SJL/JRj su nabavljeni od kompanije ENVIGO RMS gmbH, Holandija i Janvier Laboratories, Francuska, tim redom. Thy1,1<+>2D2 TCR MOG transgeni C57BL/6 miševi koji eksprimiraju T-ćelijski receptor, koji prepoznaje MOG35-55 u kontekstu MHC klase II (I-A<b>), kao i Thy1,1<+>2D2 Foxp3-eGFP TCR MOG transgeni C57BL/6 miševi koji dodatno sadrže i knock-in Foxp3-eGFP, obezbeđeni su ljubaznošću laboratorije prof. Dr Ari Waisman-a. Tokom eksperimenata su upotrebljavane životinje podudarnog uzrasta i pola, a miševi su održavani u specifičnim uslovima bez patogena (SPF) u vivarijumu kompanije BioNTech AG Mainz.
RNK konstrukti i in vitro transkripcija
[0214] In vitro transkripcija LUC-iRNK je bila zasnovana na pST1-hAg-CDS-FI-A30LA70 okosnici plazmida, koja je sadržavala 5' UTR humanog alfa globina (hAg), 3' FI element i poli (A) rep od 100 nukleotida, sa linkerom nakon 30 nukleotida. LUC-konstrukt je sadržavao gen luciferaze svica. Konstrukti MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 i MBP84-104 su bili dizajnirani na bazi iste plazmidne okosnice (pST1-hAg-FI-A30LA70) i dodatno su sadržavali mmsec(opt) i mmMITD(opt) sekvence, pre i nakon MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 i MBP84-104 kodirajućih sekvenci (pST1-hAg-mmsec(opt)-CDS-mmMITD(opt)-A30LA70), tim redom. Dodavanje liderskog peptida i signala za unutarćelijski transport MHC-a (MITD) snažno je poboljšalo prezentaciju antigena od strane APC (Kreiter S i saradnici, 2007, J. Immunol. 180, 309-318). Sve sekvence antigena su sadržavale dodatnih sedam bočnih aminokiselina pre i nakon epitopa relevantnog za bolest, da bi se olakšala prezentacija antigena. Antigenska sekvenca mijelin oligodentrocitnog glikoproteina (MOG) je bila peptidne sekvence: MOG27-63: SPGKNATGMEVGWYRSPFSRVVHLYRNGKDQDAEAQP. Za mišji mijelinski peptid Proteolipidni protein PLP139-151 takođe je dodato sedam bočnih aminokiselina radi bolje prezentaciju peptida ((PLP131-159: AHSLERVCHCLGKWLGHPDKFVGITYALT). Proteolipidni protein PLP178-191 je uključivao aminokiseline PLP170-199: AVPVYIYFNTWTTCQSIAFPSKTSASIGSL, dok je mijelin bazni protein (MBP) 84-104 uključivao aminokiseline MBP76-112: RTQDENPVVHFFKNIVTPRTPPPSQGKGRGLSLSRFS. Za kontrolnu imunizaciju sa iRNK, korišćen je prazan vektor, koji nije kodirao specifičnu antigensku sekvencu (pST2-hAgmmsec(opt)-emtpy-mmMITD(opt)-2hBg-A30LA70). iRNK koje kodiraju citokine za mišji interleukin 10 (mIL-10) i mišji interleukin 27 (mIL-27) takođe su sintetisane na bazi okosnice plazmida pST1-hAg-CDS-FI-A30LA70. RNK je generisana in vitro transkripcijom, kao što je opisano u Kreiter i saradnici, 2007 (Cancer Immunol. Immunother. 56, 1577-87). Prečišćena iRNK je eluirana u H2O i čuvana na -80°C do dalje upotrebe. In vitro transkripciju svih opisanih konstrukata iRNK je uradila kompanija BioNTech RNK Pharmaceuticals GmbH
Generisanje neimunogene iRNK
[0215] Za generisanje upotrebljavane neimunogene iRNK, tokom in vitro transkripcije je, umesto normalnog nukleozida Uridina, upotrebljavan 1-metil-pseudouridin, a iRNK je dalje prečišćena HPLC postupkom ili tretmanom sa celulozom. Za HPLC prečišćavanje je prilagođen protokol iz publikacije Weissman i saradnici, 2013 (Methods Mol Bio.969, 43-43), a elucija iRNK je rađena upotrebom gradijenta od 38% -70% pufera B. Za sve generisane iRNK su bile urađene kontrole kvaliteta (Bioanalyser i DotBlot analiza) da bi se osigurali čistoća i integritet iRNK.
Za generisanje upotrebljavane imunogene iRNK, tokom in vitro transkripcije je upotrebljavan normalan nukleozid Uridin, a iRNK nisu dalje prečišćavane HPLC postukom ili tretmanom sa celulozom.
Za ispitivanje uticaja prečišćavanja HPLC postupkom, ili tretmanom sa celulozom, na aktivaciju splenocita, upotrebljena je iRNK modifikovana sa pseudouridinom (pU-iRNK), koja je ili podvrgavana dodatnom HPLC prečišćavanju (pU-HPLC iRNK) ili nije. Odgovarajuća iRNK je generisana kao što je već opisano.
Dotblot analiza za kontrolu kvaliteta IVT iRNK
[0216] Sadržaj dvolančane iRNK (dsRNK) u in vitro transkribovanoj, modifikovanoj i HPLC postupkom prečišćenoj iRNK, analiziran je upotrebom Dotblot postupka. Po 1 µg različitih konstrukata iRNK je nanet na NYTRAN SPC membranu (GE Healthcare), koja je zatim blokirana i dalje inkubirana sa J2 antitelom (SCICONS English and Scientific Consulting) radi detekcije dsRNK. Kao sekundarno antitelo je upotrebljavano anti-mišje HRP antitelo (Jackson ImmunoResearch), nakon čega su membrane analizirane na BioRad ChemiDoc aparatu.
Priprema i injeciranje RNK-lipopleksa
[0217] RNK-lipopleksi (RNK-LPX) su pripremani u sterilnim i uslovima oslobođenim od RNaze. Za razblaživanje RNK do koncentracije od 1 mg/ml upotrebljavana je smeša HEPES (10 mM)/EDTA (0,1 mM). U određenu zapreminu RNK je zatim dodat 1,5 M NaCl (iz konc. rastvora od 5 M NaCl; Ambion) da bi se dobila finalna koncentracija od 150 mM NaCl. Nakon kratkog vorteksovanja, dodata je određena zapremina F12 lipozoma, pa je RNK-lipozomska smeša (RNK-LPX) ponovo kratko vorteksovana i konačno inkubirana tokom 10 minuta na ST, da bi se omogućilo obrazovanje RNK-LPX (Kranz i saradnici, 2016, Nature. 16, 396-401). Po mišu je injecirano 200 µl RNK-LPX rastvora, intravenski, u retro-orbitalni pleksus miševa.
Analiza protočnom citometrijom
[0218] Površinska i unutarćelijska antitela za sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS), nabavljena su od kompanije eBioscience ili BD Pharmingen, a upotrebljavana su prema protokolu proizvođača. Upotrebljavana su sledeća antitela: CD11b, CD11c, CD19, CD25, CD4, CD44, CD40L, CD49b, CD69, CD8, CD86, CD90.1, Foxp3. ICOS, IPNγ, IL-17A, Lag-3, PD-1, TIGIT i Tim-3.
Jednoćelijske suspenzije iz različitih organa su bojene na vanćelijske markere tokom 30 minuta na 4 °C. Za unutarćelijsko bojenje citokina IFNγ, IL-17A i CD40L, ćelije su izolovane kao što je opisano, nakon čega su dodatno stimulisane u medijumu za kulturu koji je sadržavao MOG35-55 peptid (konc. 15 µg/ml), Monensin (GolgiStop, BD-Bioscience) i Brefeldin A, tokom 6 h na 37 °C i sa 5% CO2. Nakon bojenja živih i mrtvih ćelija (boja za vijabilnost, eFluor® 506, eBioscience) i bojenja markera ćelijske površine, ćelije su fiksirane i permeabilizovane upotrebom Citofix/Cytoperm i Perm/Wash pufera kompanije BD Biosciences, prema protokolu proizvođača. Ćelije su dalje inkubirane sa antitelima za unutarćelijske komponente, tokom 30 minuta na 4°C, pa su pre FACS analize isprane dva puta u Perm/Wash puferu. Uzorci su snimani na BD LSR Fortessa ili BD FACS Canto II apartima i analizirani su upotrebom FlowJo 7.6.5 ili FlowJo 10,4 softvera (Tree Star).
Za unutarćelijsko bojenje Foxp3, za fiksaciju i permeabilizaciju je upotrebljavan komplet za bojenje Foxp3 transkripcionog faktora (Thermo Fisher Scientific). Svi koraci su izvođeni prema preporuci proizvođača, nakon vanćelijskog bojenja.
CD4<+>T-ćelije specifične za MOG35-55 su detektovane tetramerskim bojenjem. APC-konjugovani tetramer pMHC klase II specifičan za MOG35-55 je dobijen od Tetramer Core Facility Nacionalnog instituta za zdravlje. Jednoćelijske suspenzije mišjih splenocita su inkubirane sa MOG35-55 APC-konjugovanim tetramerom 1 sat na sobnoj temperaturi, u kompletnom DC medijumu (za sastav medijuma pogledati „Generation of bone marrow-derived DCs (BMDCs)”). Ćelije su potom isprane i urađeno je anti-APC bojenje, a dalje i MACS postupak. Ćelije su inkubirane sa antitelima za vanćelijske ili unutarćelijske komponente kao što je prethodno opisano. Za određivanje apsolutnog broja CD4<+>ćelija specifičnih za MOG35-55 (Thy1,1<+>2D2 CD4<+>T-ćelija) u slezini, mozgu i kičmenoj moždini, korišćene su Trucount™ epruvete (BD Biosciences). Jednoćelijske suspenzije su bojene kao što je prethodno opisano, nakon čega su prebačene u Trucount™ epruvete i apsolutan broj ćelija je određen protočnom citometrijom.
Snimanje bioluminiscencije in vivo (BLI)
[0219] Efikasnost translacije neimunogene iRNK u ćelijama slezine je ispitivana upotrebom sistema za in vivo snimanje, Xenogen IVIS Spectrum (Caliper Life Sciences). Nakon 6 h, 24 h, 48 h i 72 h od imunizacije sa neimunogenom LUC-iRNK RNK-LPX, miševima je i.p. injeciran vodeni rastvor D-luciferina (250 µl, 1,6 mg u PBS) (BD Biosciences). Nakon 5 minuta, intenzitet signala iz slezine je definisan i izmeren upotrebom in vivo bioluminiscencije u regionima od interesa (ROI), kao i kvantifikacijom u vidu ukupnog protoka (fotoni/sek) upotrebom IVIS Living Image 4.0 softvera. Vreme akvizicije je iznosilo 1 minut pri binovanju od 4. Tokom bioluminiscentnog snimanja živih miševa, miševi su anestezirani dozom od 2,5% smeše izoflurana i kiseonika. Intenzitet LUC signala emitovanih fotona kod živih životinja prikazan je kao crnobela slika, gde crna boja predstavlja najmanji intenitet, dok je bela najintenzivniji signal bioluminiscencije. Slike miševa su analizirane upotrebom IVIS Living Image softera.
Magnetno aktivirano sortiranje ćelija (MACS)
[0220] Thy1,1<+>2D2 CD4<+>T-ćelije Thy1,1<+>2D2 TCR MOG transgenih C57BL/6 miševa ili Thy1,1<+>2D2 Foxp3-eGFP TCR MOG transgenih C57BL/6 miševa, izolovane su iz slezine i limfnog čvora pozitivnom selekcijom, upotrebom MACS (Miltenyi Biotec) prema uputstvu proizvođača. CD4<+>T-ćelije su prečišćene upotrebom CD4 (L3T4) mikroglobula.
CD4<+>T-ćelije specifične za MOG35-55 su obogaćene tetramernim bojenjem APC-konjugovanih molekula pMHC klase koji su specifični za MOG35-55, upotrebom anti-APC mikroglobula. Obogaćivanje je rađeno prema protokolu proizvođača.
Generisanje DC poreklom iz kosne srži (BMDC)
[0221] Ćelije kosne srži (BM) su ekstrahovane iz femura i tibije C57BL/6 miševa, nakon čega su gajene u flaskovima za kulturu tkiva na 37°C u RPMI 1640 GlutaMAX-I medijumu (Gibco) u koji je bilo dodato 10% FBS-a (Biochrom), 1% natrijuma piruvata 100x (Gibco), 1% MEM NEAA 100x (Gibco), 0,5% penicilin-streptomicina (Gibco), 50 µM 2-merkaptoetanola (Life Technologies) i 1000 U/ml faktora diferencijacije dendritičnih ćelija (DC) koji je bio faktor stimulacje rasta granulocitno/makrofagnih kolonija (GM-CSF) (Peprotech). Šestog dana, 2x10<6>DC/ml je najpre inkubirano oko 3 sata na 37°C sa MOG35-55 peptidom (15 µg/ml), nakon čega su DC kultivisane zajedno sa T-ćelijama u ukupnoj zapremini od 200 µl medijuma, u ploči sa 96 bunarića.
In vitro analiza supresije Treg
[0222] Za in vitro studije supresije Treg, zajedno su kultivisane naivne CD4<+>2D2 transgene (Thy1,1<+>) T-ćelije obeležene sa CTV (CellTrace Violet cell proliferation komplet, Thermo Fisher Scientific) (3x10<4>ćelije po bunariću) sa izolovanim i CFSE obeleženim (5 μM) CD4<+>2D2-Foxp3-eGFP transgenim ćelijama iz ponavljano imunizavanih miševa u različitim odnosima supresorskih i reaktivnih 2D2 T-ćelija (1:1, 2:1, 4:1, 8:1). Miševima 2D2-Foxp3-eGFP su intravenski injecirane u retro-orbitalni pleksus, 0. dana, 3. dana, 6. dana i 9. dana, neimunogene i imunogene MOG35-55 iRNK, kao i neimunogena irelevantna iRNK i fiziološki rastvor. Proliferacija 2D2 T-ćelija obeleženih sa CTV je analizirana protočnom citometrijom 72 sata nakon ponovne stimulacija sa BMDC ispunjenim sa MOG35-55 peptidom (finalna koncentracija 15 µg/ml MOG35-55 peptida).
Adoptivni transfer T-ćelija i in vivo analiza proliferacije
[0223] Za studije proliferacije, obogaćene CD4<+>2D2 transgene (Thy1,1<+>) T-ćelije su obeležene sa CTV (CellTrace Violet cell proliferation komplet, Thermo Fisher Scientific) prema uputstvu proizvođača, nakon čega su ćelije prebrojane i po 7x 10<6>ćelija je i.v. injecirano naivnim C57BL/6 (Thy1,2<+>) miševima primaocima pod anestezijom, u retro-orbitalni pleksus, u 200 µl PBS-a. Sledećeg dana, C57BL/6 miševi su imunizovani sa 10, 20 ili 40 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 epitop. Kontrolni miševi su primali ili 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili fiziološki rastvor. Nakon 4 dana od transfera, miševi su žrtvovani i proliferacija ćelija je analizirana protočnom citometrijom.
Za određivanje apsolutnog broja CD4<+>T-ćelija specifičnih za MOG35-55 u slezini, mozgu i kičmenoj moždini, kao i za fenotipsku analizu ovih ćelija nakon uspešnog tretmana EAE miševa sa iRNK 7. i 10. dana, izolovane su CD4<+>2D2 transgene (Thy1,1<+>) T-ćelije iz Thy1,1<+>2D2 TCR MOG transgenih C57BL/6 miševa, koje su dalje obogaćene CD4 ćelijama MACS postupkom, nakon čega je po 7x 10<6>ćelija i.v. injecirano naivnim C57BL/6 (Thy1,2<+>) miševima primaocima u retro-orbitalni pleksus, u 200 µl PBS-a i pod anestezijom, upotrebom vaporizatora za smešu kiseonika i izoflurana (2,5% izofluran/kiseonik). Dan kasnije, EAE je aktivno indukovan kod C57BL/6 miševa.
ELISA
[0224] Detekcija mišjeg IFN-α je rađena ELISA postukom (PBL) u mišjim serumima, 6 sati nakon imunizacije sa RNK, upotrebom standardnog ELISA postupka, prema uputstvima proizvođača. Th1/Th2/Th9/Th17/Th22 i Treg citokini prisutni u supernatantima ćelijskih kultura ponovno stimuliranih splenocita iz miševa koji su ponavljano tretirani sa iRNK, kvantifikovani su upotrebom 17 pleks kompleta za ELISA analizu kod miševa (Thermo Fisher Scientific). Jednoćelijske suspenzije splenocita (5x10<5>ćelija) koje su bile izolovane iz miševa, stimulisane su tokom 72 h sa 0, 5, 10, 20 ili 100 µg/ml MOG35-55 peptida, nakon čega je u supernatantima analiziran sadržaj citokina.
Imunski spot test sa vezanim enzimom (ELISpot) za IFNγ
[0225] Učestalost T-ćelija koje odgovaraju na MOG35-55 ispitivane su upotrebom ELISpot postupka za Interferon γ (IFNγ). Miševi su tretirani 0., 3., 7. i 10. dana sa neimunogenom MOG3555 iRNK, neimunogenom irelevantnom iRNK ili fiziološkim rastvorom. Nakon 13 dana od prvog tretmana, slezine različitih grupa tretmana su izolovane i pripremljene su jednoćelijske suspenzije. CD4<+>T-ćelije su prečišćene upotrebom MACS postupka i CD4 (L3T4) mikroglobula. Kvantifikacija IPNγ u odgovorajućim T-ćelijama specifičnim za antigen, izvedena je nakon ponovne stimulacije sa MOG35-55 peptidom, upotrebom ELISpot kompleta. ELISpot ploče sa 96 bunarića (MultiScreenHTS IP Filter Plate, Merck Millipore) oblagane su preko noći sa antitelima za „hvatanje” koja su bila specifična za IFNγ (anti-mišje IFNγ antitelo, Mabtech). Nakon blokiranja sa kompletnim medijumom, ploče su isprane i zasejano je po 5x10<5>CD4<+>T-ćelija zajedno sa 1x10<5>BMDC ispunjenih MOG35-55 peptidom (koncentracija peptida 15 µg/ml). Kao kontrola su poslužile CD4<+>T-ćelije koje su bile inkubirane sa BMDC ispunjenim irelevantnim peptidima. Sve ćelije su kultivisane tokom 16 h na 37°C, u vlažnom inkubatoru sa 5% CO2. Ćelije su dalje isprane i inkubirane 2 sata na 37°C, i sa 5% CO2, sa biotiniziranim anti-IFNγ antitelom za detekciju (anti-mišje IFNγ biotinizirano antitelo, Mabtech). Ovo sekundarno antitelo je vizualizovano dodavanjem ExtrAvidin-alkalne fosfataze (Sigma), a nakon inkubacije tokom 1 h, dodat je BCIP/NBT tečni supstrat (Sigma) i reakcija je zaustavljena nakon 1-3 min, ispiranjem ploče pod tekućom vodom. Kvantifikacija spotova je urađena na ELISpot čitaču (S6 Macro Analyzer; CTL).
Indukcija EAE i lečenje miševa sa iRNK
[0226] EAE je aktivno indukovan kod ženki C57BL/6 miševa starih osam do deset nedelja, sa 50 µg MOG35-55 peptida (aminokiselinska sekvenca: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK), a koji je bio emulgovan u CFA (Difco Laboratories) i u koji je bilo dodato 10 mg/ml toplotom inaktivirane Micobacterium tuberculosis H37RA (Difco Laboratories), subkutanom (sc) primenom u osnovu repa. Miševi su intraperitonealno (i.p.) primili i 150 ng pertusis toksina (List Biological Laboratories, INC, Campbell, CA), na dan imunizacije i 2 dana kasnije. Miševima je svakodnevno merena telesna težina i ocenjivani su počevši od 10. dana nakon imunizacije, prema sledećim kriterijumima: 0, bez bolesti; 1, smanjen tonus repa; 2, poremećen refleks ispravljanja; 3, delimična paraliza zadnjih udova; 4, potpuna paraliza zadnjih udova; 5, paraliza zadnjih udova sa delimičnom paralizom prednjih ekstremiteta; i 6, morbund ili mrtva.
[0227] EAE je dalje aktivno indukovan kod ženki SJL/JRj miševa (8-10 nedelja) sa 200 µg PLP139-151 peptida (aminokiselinska sekvenca: HSLGKWLGHPDKF) koji je bio emulgovan u CFA i u koji je bilo dodato 10 mg/ml toplotom inaktivirane Micobacterium tuberculosis H37RA, s.c. primenom u osnovu repa. Miševi su zatim primili 200 ng PTX i.p., na dan imunizacije i 2 dana kasnije. Miševima je svakodnevno merena telesna težina i ocenjivani su počevši od 8. dana nakon imunizacije, prema već opisanim kriterijumima bodovanja.
Složeni EAE je aktivno indukovan i kod ženki F1 hibridnih miševa dobijenih ukrštanjem C57BL/6 i SJL/JRj (8-10 nedelja) sa 250 µg smeša peptida MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 (aminokiselinska sekvenca: NTWTTCQSIAFPSK), MBP84-104 (aminokiselinska sekvenca: VHFFKNIVTPRTPPPSQGKGR), MOBP15-36 (aminokiselinska sekvenca: QKFSEHFSIHCCPPFTFLNSKR)). Od svakog peptida je korišćeno po 50 µg. Peptidna mešavina je emulgovana u CFA koji je sadržavao 10 mg/ml toplotom inaktivirane Micobacterium tuberculosis H37RA i injecirana je s.c. u osnovu repa. Miševi su primili 200 ng PTX i.p., na dan imunizacije i 2 dana kasnije. Miševima je svakodnevno merena telesna težina i ocenjivani su počevši od 8. dana nakon imunizacije, prema već opisanim kriterijumima bodovanja.
[0228] Da bi se odredio zaštitni imunitet kod C57BL/6miševa, miševi su tretirani 7. i 10. dana ili kada je EAE skor iznosio 1-2 nakon indukcije bolesti, sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK ili sa fiziološkim rastvorom.
Terapijski tretman relapsirajuće-remitentnog EAE-a kod SJL miševa je urađen sa 20 µg neimunogene iRNK za PLP139-151, 2x nedeljno počevši od 7. i 10. dana nakon indukovanja EAE. Kontrolni miševi su primali 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK.
U eksperimentima u kojima su upoređivali tretman neimunogenom iRNK sa jednim epitopom sa tretmanom neimunogenom iRNK sa više epitopa, miševi sa kompleksnim EAE su tretirani sa 40 µg neimunogene iRNK koja kodira više epitopa (upotrebljavano je po 10 µg svake neimunogene iRNK koja kodira epitop (MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191, MBP84-104)), 20 µg neimunogene iRNK za MOG35-55 ili 20 µg neimunogene irelevantne kontrolne iRNK. iRNK je bila injecirana 2x nedeljno počevši od 7. i 10. dana nakon indukovanja EAE.
[0229] U svrhu ispitivanja efekata kombinovanih tretmana sa iRNK koja kodira citokine i iRNK koja je specifična za antigen, po 5 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 je injecirano zajedno sa 15 µg neimunogene iRNK koja je kodirala mIL-10 ili mIL-27, 7. i 10. dana nakon indukovanja EAE. Kontrolni miševi su primali 5 µg neimunogene iRNK za MOG35-55 zajedno sa 15 µg neimunogene irelevantne iRNK, ili 15 µg neimunogene iRNK koja kodira citokine ili 20 µg neimunogene irelevantne iRNK.
U svim eksperimentima, iRNK je injecirana i.v. u retro-orbitalni pleksus pod anestezijom, upotrebom vaporizatora za smešu kiseonika i izoflurana (2,5% izofluran/kiseonik).
Lečenje antitelima
[0230] C57BL/6 miševi su tretirani sa PD-1 (500 µg prvi tretman, 250 µg sledeći tretmani, klon RMP1-14, BioXcell) ili sa CTLA-4 blokirajućim antitelom (500 µg prvi tretman, 250 µg sledeći tretmani, klon 9H10, BioXcell) ili sa kontrolnim antitelima podudarnog izotipa (IgG2a pacova i IgG sirijskog hrčka, BioXCell) 7., 10., 14. i 17. dana nakon indukcije EAE. Antitela su razblaživana u PBS-u i primenjivana su i.p.
Izolacija infiltrata u slezini, LN i CNS-u
[0231] Sve ćelijske analize su izvedene na jednoćelijskim suspenzijama slezine, limfnih čvorova i organa CNS-a. Ukratko, slezine i LN su inkubirani sa 1 mg/ml kolagenaze D i 0,1 mg/ml DNazeI tokom 15 minuta, nakon čega su propuštene kroz sito od 70 µm uz ispiranja sa PBS-om. Liza eritrocita (pufer za hipotoničnu lizu: 1 g KHCO3 i 8,25 g NH4Cl rastvoreni u 11H2O i 200 μl 0,5 M EDTA) izvedena je sa jednoćelijskom suspenzijom splenocita. Nakon dodatnog koraka ispiranja sa PBS-om, ćelije su prebrojane upotrebom Vi-Cell brojača ćelija (Beckman Coulter). Za izolaciju CNS infiltrata u mozgu i kičmenoj moždini, miševi su anestezirani sa Ketamin-Rompunom i perfundovani su kroz levu komoru srca upotrebom 0,9% NaCl. Mozak i kičmena moždina su zatim disekovani, isečeni na male komade i podvrgnuti digestiji u PBS + (PBS sa kalcijumom i magnezijumom, Gibco) koji je sadržavao kolagenazu D (1 mg/ml) i DNazu I (0,1 mg/ml) tokom 20 minuta na 37°C. Digerirano tkivo je zatim ručno homogenizovano, uvlačenjem komadića tkiva u špric i njegovim istiskivanjm na zid falkonske epruvete od 15 ml. Navedeno je izvođeno do 10 puta, sve dok komadići nisu prestali da budu vidljivi. Jedoćelijska suspenzija je zatim resuspendovana u 70% Percoll-u i raslojena je u gradijentu Percoll-a od 30:37. Finalni gradijent Percoll-a je iznosio 30:37:70% i centrifugiran je konačno na 300 g tokom 40 minuta na sobnoj temperaturi. Mononuklearni ćelijski sloj međufaze između 70% i 37% Percoll-a je ispran sa 2% FCS/PBS-om pre daljih analiza.
Statistička analiza
[0232] Statistička značajnost pri poređenju dve grupe je procenjivana upotrebom GraphPad Prism 7 kompjuterskog programa (Graphpad Software, Inc.) koji koristi jednofaktorsku ANOVA korigovanu Tukijevim faktorom za poređenje. Krive razvoja EAE su poređene izračunavanjem površine ispod krive razvoja bolesti (AUC) za pojedinačne miševe. Vrednosti p ≤ 0,05 su smatrane statistički značajnim; *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001. Korišćeni testovi su navedeni u legendama odgovarajućih slika.
Primer 2: Ispitivanje neimunogene iRNK u pogledu aktivacije splenocita
[0233] Da bi se analizirale aktivacija splenocita i translaciona efikasnost upotrebljavanih neimunogenih iRNK, BALB/c miševima je u retro-orbitalni pleksus intravenski injecirana iRNK za luciferazu (10 µg) u kompleksu sa F12lipozomima. Aktivnosti luciferaze je procenjivana putem in vivo snimanja, 6, 24, 48 i 72 sata nakon injeciranja RNK-LPX, a reprezentativni miševi su prikazani na slici 1C. Imunizacija miševa sa neimunogenom iRNK je dovela do dugotrajne visoke translacije LUC-iRNK. Shodno tome, ekspresija LUC proteina se mogla detektovati do 72 sata nakon imunizacije sa iRNK.
Štaviše, kao što se vidi na Slici 1A, imunizacija miševa sa neimunogenom iRNK nije dovela do pozitivne regulacije aktivacionih markera CD86 na DC i CD69 na limfocitima kao što je to bio slučaj kod netretiranih kontrolnih miševa. Kod miševa imunizovanih neimunogenom LUC-iRNK takođe nije bilo moguće detektovati IFNα u krvi, 6 sati nakon imunizacije sa iRNK (Slika 1B).
Primer 3: Karakterizacija neimunogene iRNK
[0234] Neimunogena iRNK se upotrebljava za isporuku antigena relevantnih za specifična oboljenja dendritičnim ćelijama, da bi se osigurala prezentacija antigena bez imunske aktivacije, u terapijskim aplikacijama. Pokazano je da ugrađivanje 1-metilpseudouridina u iRNK pojačava proteinsku ekspresiju u ćelijama i da smanjuje imunogenost iRNK u ćelijskim linijama sisara, kao i in vivo, kod miševa (Andries i saradnici, 2015, J Control Release. 217, 337-344). Ovaj efekat se najverovatnije oslanja na povećanu sposobnost iRNK da izbegne aktivaciju endozomalnih receptora sličnih Toll receptorima i time nizvodnu signalizaciju urođenog imunskog sistema (Andries i saradnici, 2015). Pored upotrebe 1-metilpseudouridina umesto uridinskog nukleozida za ugradnju u iRNK tokom in vitro transkripcije, HPLC prečišćavanje sintetičke iRNK dodatno eliminiše komponenete koji dovode do imunske aktivacije i poboljšava translaciju iRNK sa modifikovanim nukleozidima koja kodira proteine (Kariko i saradnici, 2011, Nucleic Acids Res.
39, e142). Prečišćavanjem sa HPLC postupkom uklanjaju se dvolančane kontaminirajuće iRNK koje su preostale nakon in vitro transkripcije iRNK, rezultat čega je da ne dolazi do indukcije interferonskih signala i inflamatornih citokina (Kariko i saradnici, 2011). Alternativni postupak za dodatno prečišćavanje iRNK koja je prethodno prečišćena od nukleozida je celulozno prečišćavanje (PCT/EP2016/059056).
Da bi se istražilo da li je iRNK koja se upotrebljava za terapijsku primenu zaista neimunogena, izvršena je Bioanalyzer i Dotblot analiza da bi se osigurali integritet i čistoća iRNK. Slika 2 prikazuje Dotblot analizu neimunogene iRNK za MOG35-55 koja je prečišćene bilo celuloznim tretmanom ili HPLC prečišćavanjem. J2 antitelo, specifično za dsRNK, nije pokazalo signal nakon celuloznog ili HPLC prečišćavanja analizirane iRNK za MOG35-55, u opsegu od 40 ng do 1 µg upotrebljene iRNK. Ovakva kontrola kvaliteta osigurava neimunogene karakteristike iRNK, pošto se za obe serije iRNK mogu postići pozitivni terapijski efekti u tretmanu EAE. EAE je aktivno indukovan kod C57BL/6miševa, a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije bolesti sa neimunogenom iRNK koji kodira MOG35-55 i specifična je za antigen, a koja je prečišćavana bilo celuloznim ili HPLC postupkom. Obe grupe su bile u potpunosti rezistentne na indukciju EAE (Slika 3). Detaljniji opis terapijske vakcinacije sa neimunogenom antigen-specifičnom iRNK biće objašnjen u primerima koji slede.
Primer 4: Efekti imunizacije neimunogenom iRNK za MOG35-55 na proliferaciju T-ćelija specifičnih za antigen
[0235] Da bi se proučilo da li je rezultat imunizacije neimunogenom MOG35-55 iRNK-LPX prezentacija MOG35-55 antigena T-ćelijama od strane DC, isptivana je proliferacija CD4<+>T-ćelije specifičnih za antigen (CD4<+>2D2 T-ćelije) koje sadrže T-ćelijske receptore specifične za mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (MOG). Thy1,1<+>CD4+ 2D2 T ćelije specifične za MOG35-55<+>, obeležene sa Cell-Trace-Violet (CTV), prebačene su u Thy1,2<+>C57BL/6 miševe. Nakon 24 sata, miševi primaoci su imunizovani različitim koncentracijama (10, 20 ili 40 µg iRNK) neimunogene iRNK koja kodira epitop MOG35-55 i nakon 4 dana je analizirana proliferacija CD4+ 2D2 T-ćelija specifičnih za MOG35-55. Kontrolni miševi su primali bilo 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili fiziološki rastvor.2D2 T-ćelije su proliferisale kada su miševi tretirani neimunogenim iRNK MOG35-55 u poređenju sa kontrolnim miševima (Slika 4), što ukazuje da antigen-prezentujuće ćelije (APC) prevode i obrađuju neimunogenu iRNK koja kodira antigen na ispravan način i prezentuju MOG35-55 peptid. Dodatno, imunizacija miševa sa neimunogenom iRNK za MOG35-55 je, sa povećanjem doza od 10 do 40 µg, pokazala i povećanje populacije T-ćelija specifičnih za antigen.
Primer 5: Imunizacija sa antigen-specifičnom neimunogenom iRNK indukuje razvoj regulatornih T-ćelija kod naivnih miševa
[0236] Treg su fundamentalne u kontroli raznih imunskih odgovora i važne su za indukciju i održavanje tolerancije. Prekliničke studije na životinjskim modelima pokazuju da adoptivni transfer Treg ćelija može sprečiti ili izlečiti nekoliko bolesti posredovanih T-ćelijama, uključujući autoimune bolesti, obnovom imunske tolerancije na sopstvene antigene. Opisano je nekoliko vrsta CD4<+>regulatornih T-ćelija (Shevach E.M., 2006, Immunity 25, 195-201) i one su kategorisane u dve velike podgrupe: prirodne i inducibilne Treg ćelije, koje nastaju na periferiji pod različitim tolerogenim uslovima. Treg ćelije regulišu senzibilizaciju autoreaktivnih T-ćelija, ograničavajući njihovu ekspanziju i diferencijaciju (Sakaguchi S. i saradnici, 2008, Cell 133, 775-87).
Da bi se dodatno istražili efekti imunizacije sa neimunogenom iRNK specifičnom za antigen na odgovarajući fenotip T-ćelija, 2D2-Foxp3-eGFP fuzioni protein je transfektovan u T-ćelije Th1,1 pozitivnih miševa. Ovi miševi su ponavljano imunizovani (d0, d3, d6 i d9) sa neimunogenom i imunogenom iRNK za MOG35-55, kao i sa neimunogenom irelevantnom iRNK ili sa fiziološkim rastvorom. Imunizacija miševa sa neimunogenom MOG35-55 iRNK je dovela do razvoja Foxp3<+>ćelija kod miševa, što je dobijeno analizom 4 dana nakon poslednjeg tretmana sa iRNK (d13). Miševi tretirani imunogenom antigen-specifičnom iRNK ili irelevantnom neimunogenom iRNK nisu pokazali povećanje populacije Foxp3ćelija i imali su učestalost Foxp3 pozitivnih ćelija koja je bila ista kao ona koja je bila prisutna kod kontrolnih miševa tretiranih fiziološkim rastvorom (Slika 5A i B).
Da li su indukovane Foxp3<+>ćelije delovale supresivno je procenjeno upotrebom in vitro testa supresije (Slika 5C). Prema tome, ukupne CD4<+>ćelije imunizovanih miševa su najpre obeležene sa CFSE i zajedno su kultivisane tokom 72 sata sa naivnim CD4<+>2D2 T-ćelijama specifičnim za MOG35-55, koje su bile dodatno obeležene sa CTV, u različitim odnosima potrebnim za supresiju-odgovor. Važno je napomenuti da su indukovane regulatorne ćelije miševa imunizovanih sa neimunogenom iRNK za MOG35-55 posredovale u supresiji proliferacije 2D2 efektorskih T-ćelija u prisustvu BMDC ispunjenih sa MOG35-55 peptidom na dozno-zavisan način. Nasuprot navedenom, sve ostale grupe nisu ispoljile supresivnu aktivnost.
Uzeti zajedno, ovi rezultati ukazuju da je prezentacija antigena specifična za APC, pod uslovima koji nisu inflamatorni, posredovala u razvoju funkcionalnih regulatornih T-ćelija.
Primer 6: Uticaj terapijske vakcinacije sa neimunogenom iRNK za MOG35-55 u EAE modelu oboljenja
[0237] Da bi se razjasnio tolerogeni efekat iRNK imunizacije sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen u modelu bolesti, EAE je aktivno indukovan kod C57BL/6 miševa, a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukovanja bolesti sa neimunogenom iRNK koja kodira specifičan antigen MOG35-55, kao i sa neimunogenom irelevantnom iRNK. Tretman je započet u vremenskom periodu u kome je već došlo do jakih signala aktivacije i sazrevanja DC, kao i kada se već odigrala prva senzibilizacija T-ćelija. RNK-imunizacija sa neimunogenom antigenspecifičnom iRNK u potpunosti je blokirala sve znake EAE (Slika 6), a nijedan miš od 6 miševa imunizovanih sa iRNK nije razvio bolest.
U isto vreme, lečenje miševa neimunogenom iRNK koja kodira irelevantni epitop, nije zaštitilo miševe od bolesti i 5/6 miševa je razvilo EAE (Slika 6). Ovi nalazi pokazuju da prezentovanje MOG nezrelim DC može smanjiti modulaciju EAE i da su samo životinje tretirane neimunogenom antigen-specifičnom iRNK potpuno otporne na indukciju EAE. Štaviše, istraživano je i da li se EAE može lečiti tokom kasnijih vremenskih tačaka u progresiji bolesti, kada su simptomi bolesti vidljivi i miševi su sa skorom od 1-2. Dobijen je izuzetan rezultat, pošto je pokazano da nakon RNK imunizacije sa neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55, EAE miševima nisu razvili ozbiljan EAE i simptomi su mogli biti smanjeni kada su tretirani u stadijumu oboljenja označenom sa 1 (Slika 7). Čak i kada su miševi tretirani u stadijumu 2, moglo se zaustaviti brzo napredovanje bolesti. Miševi su pokazali kao maksimalna, skor bolesti od samo 2-3, dok su skoro svi netretirani kontrolni miševi razvili potpuni EAE sa maksimalnim skorom od 4. U poređenju sa EAE miševima koji su bili tretirani neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55, terapijski tretman sa neimunogenom irelevantnom iRNK nije imao pozitivan efekat na progresiju bolesti i životinje su razvile EAE slično kao netretirani kontrolni miševi.
Da bi se proučio molekulski mehanizam tolerancije izazvane tretmanom sa iRNK i utvrdilo da li iRNK imunizacija sa neimunogenom antigen-specifičnom iRNK, i time prezentacijom MOG35-55 putem DC, direktno utiče na efektorske T-ćelije (Teff), EAE je ponovo indukovan kod C57BL/6 miševa, nakon čega su životinje tretirane neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55, 7. i 10. dana nakon indukovanja bolesti, a 6 dana nakon poslednjeg tretmana su izolovani slezina, LN, mozak i kičmena moždina. Ćelije iz različitih organa su ponovno aktivirane in vitro sa MOG35-55 peptidom tokom 6 sati, nakon čega su izlagane CD40 ligandu (CD40L) Teff ćelija. CD40L se brzo eksprimira na T-ćelijama nakon aktivacije i stoga je upotrebljavan kao marker za MOG-specifične Teff ćelije. Kao što se vidi na Slici 8, primena neimunogene MOG35-55 iRNK dovodi do značajnog smanjenja učestalosti antigen-specifičnih CD4<+>T-ćelija u grupama tretiranim neimunogenom iRNK specifičnom za antigen u mozgu i kičmenoj moždini. Na funkcionalnom nivou se može pokazati da CD4<+>T-ćelije luče značajno manje Interferona-γ (IFNγ) u mozgu i Interleukina-17A (IL-17A) u kičmenoj moždini kod miševa tretiranih neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55, u odnosu na netretirane kontrolne miševe (Slika 9). Ovi podaci ukazuju da tretman iRNK sa neimunogenom MOG35-55 iRNK može inaktivirati memorijske T i Teff ćelije, što dovodi do smanjenja broja ovih ćelija.
Primer 7: Uticaj čistoće iRNK na efikasnost tretmana EAE
[0238] Eksperimenti sa kombinacijama imunogene iRNK koja sadrži uridin (U) i neimunogene iRNK koja sadrži 1-metilpseudouridin i koja je prečišćene celuloznim prečišćavanjem (m1Y) ukazale su da su aktivacija splenocita (ispitivana pozitivnom regulacijom aktivacionog markera CD86 na DC i CD69 na limfocitima), kao i sekrecija IFNα, u korelaciji sa količinom upotrebljene imunogene iRNK. Skoro da nije postignuta aktivacija sa neimunogenom iRNK (20 µg m1Y MOG35-55 iRNK), a aktivacija se stabilno povećavala dodavanjem imunogene iRNK (U MOG35-55 iRNK) (Slika 10).5 µg U iRNK 15 µg m1Y iRNK pokazalo je samo nešto manju aktivaciju u odnosu na 20 µg U iRNK, dok 20 µg m1Y iRNK ponovo uopšte nije aktivirala imunski sistem. Odgovarajuća Dotblot analiza različitih smeša iRNK takođe je ukazala da samo 100% neimunogene (m1Y) iRNK ne pokazuje signal za dsRNK (Slika 11).
Da bi se dalje ispitao uticaj čistoće korišćene iRNK na efektivnost tretmana EAE, upotrebljavane su smeše iRNK za lečenje EAE koja se razvija. EAE je bio ponovo aktivno indukovan u C57BL/6 miševima, a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukovanja bolesti sa antigen-specifičnom iRNK. U ovom eksperimentu su korišćene iste iRNK smeše neimunogene i imunogene MOG35-55 iRNK kao u prethodnom eksperimentu „aktivacije". Za razliku od 100% neimunogene (m1Y) iRNK, smeša neimunogene i imunogene iRNK (2,5 µg U 17,5 µg m1Y MOG35-55 iRNK, kao i 5 µg U 15 µg m1Y MOG35-55 iRNK) ne može sprečiti razvoj bolesti u potpunosti, a pojedini miševi počinju da razvijaju bolest sličnu miševima tretiranim 100% imunogenom iRNK (Slika 12). Ovi rezultati pokazuju da je za efikektivan tretman EAE neophodna čista neimunogena (m1Y) iRNK.
Izvršeno je i dodatno poređenje u kontekstu aktivacije slezine sa nemodifikovanom i modifikovanom iRNK, koja je bila ili nije bila prečišćena upotrebom HPLC postupka. Kao što je prikazano na Slici 13, nukleozidne modifikacije, poput samog pseudouridina (pU), ne izazivaju gubitak prepoznavanja iRNK od strane imunskog sistema, ali proces prečišćavanja doprinosi razlici. Neprečišćena pU-iRNK je još uvek imunogena i deluje kao regularna iRNK (U-iRNK) u kontekstu aktivacije slezine (snažna pozitivna regulacija CD86 na DC, pozitivna regulacija CD69 na B-ćelijama, T-ćelijama i NK ćelijama) i dalje sekrecije IFNα. Nasuprot tome, pU-iRNK koja je dodatno pročišćena HPLC postupkom, da bi se oslobodila od dsRNK (pU-HPLC iRNK), sprečava aktivaciju DC, B-ćelija, T-ćelija i NK ćelija i posledično sekreciju IFNa kao kod netretiranih kontrolnih miševa. Ovi rezultati ističu da isključivo kombinacija modifikacije Uridina i dodatnog prečišćavanja IVT iRNK smanjuje imunogenost iRNK do minimuma i na nulu, što je primećeno kod naivnih miševa, a što je nivo na kome ne može doći do indukcije tolerancije.
Neimunogena iRNK (uridin-modifikovana u kombinaciji sa prečišćavanjem iRNK) je stoga optimalna iRNK u svrhu indukcije tolerancije.
Primer 8: Tretman neimunogenom iRNK specifičnom za MOG35-55 ne indukuje de novo senzibilizaciju CD4<+>T-ćelija specifičnih za antigen, ali dovodi do ekspanzije anergičnih T-ćelija kod naivnih miševa
[0239] Održavanje i indukcija periferne tolerancije zavisi od prezentacije spostvenih antigena od strane APC, a koje na svojoj provršini eksprimiraju nizak nivo kostimulatornih molekula, poput CD86 ili CD40. Odsustvo ekspresije kostimulatornih molekula i proizvodnje citokina od strane APC nakon tretmana neimunogenom iRNK prikazano je u Primeru 2, Slika 1. Posledično, nakon tretmana sa iRNK, APC obrađuju i prezentuju epitop kodiran neimunogenom iRNK u odsustvo aktivirajućih stimulusa. Angažovanje TCR u odsustvu kostimulatornih signala ne dovodi do ekspanzije efektorskih T-ćelija, već do apoptoze ili anergije T-ćelija (Mueller D. L., 2010, Nat. Immunol. 11, 21-7). Nasuprot tome, tokom prajmovanja efektorskih T-ćelija, DC oslobađaju specifične citokine, koji zajedno sa prezentacijom antigena i ekspresijom kostimulatornih molekula polarizuju efektorske imunske odgovore podstičući diferencijaciju CD4<+>T-ćelije u Th1, Th2 ili Th17 ćelije. Zaista, stvaranje efektorskih T-ćelija nakon tretmana sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen nije predviđena za autoimunu bolest, pošto više efektorskih T-ćelija može čak dovesti do težeg toka bolesti umesto tretmana koji bi bio kurativan.
Da bi se istražio nastanak odgovora T-ćelija koji je usmeren na antigen, naivni C57BL/6 miševi su ponavljano tretirani (0., 3., 7. i 10. dana) sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa fiziološkim rastvorom. Nakon četiri imunizacije sa iRNK, CD4<+>T-ćelije su 13. dana izolovane iz slezine i urađen je ELISpot analiza za IFNγ. Slika 14A pokazuje da miševi tretirani neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 nisu razvili IFNγ<+>CD4<+>efekat kod T-ćelija koje reaguju na prepoznavanje antigena nakon tretmana iRNK specifičnim za antigen.
U skladu sa ovim rezultatima, takođe je pokazano da ponovna stimulacija CD4<+>T-ćelija slezine sa različitim koncentracijama MOG35-55 peptida (0, 5, 10, 20 i 100 µg) tokom 48 h nije dovela do sekrecije drugih inflamatornih citokina kao što su TNFα i GM-CSF, što je izmereno u supernatantima ELISA postupkom (Slika 14B). Kod miševa tretiranih neimunogenom antigenspecifičnom iRNK je detektovano samo lučenje anti-inflamatornog citokina IL-10, ali ne i sa neimunogenom irelevantnom iRNK (Slika 14C). Štaviše, samo se u ovoj grupi mogla detektovati sekrecija Th2 citokina poput IL-4 i IL-5 (podaci nisu prikazani). Proizvodnja IL-10 kao odgovora na neimunogenu iRNK specifičnu za antigen obzebedila je dokaz o ativaciji antigen-specifičnih regulatornih T-ćelija (Tregs) u odgovoru na tretman. Treg ćelije su od fundamentalnog značaja u kontroli raznih imunskih odgovora. Prijavljeno je mnogo razl. Ovakve regulatorne T-ćelije regulišu prajmovanje autoreaktivnih T-ćelija ograničavajući njihovu ekspanziju i diferencijaciju.
[0240] Da bi se ispitao CD4 fenotip nakon tretmana sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen, C57BL/6 miševi su ponavljano imunizovani sa 20 µg neimunogene antigen-specifične iRNK za MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa fiziološkim rastvorom, 0., 3., 7. i 10. dana. Ekspresija TIGIT, Tim-3, PD-1 i Lag-3 na CD4<+>MOG35-55 ćelijama koje su bile i tetramer<+>, kod miševa tretiranih neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 upoređene su sa ukupnim CD4<+>ćelijama kod miševa tretiranih neimunogenim irelevantnim iRNK i kod netretiranih kontrolnih miševa. Ponavljajuća imunizacija sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen dovela je do pozitivne regulacijom TIGIT, Tim-3, PD-1 i Lag-3 u poređenju sa miševima tretiranim neimunogenom irelevantnom iRNK (Slika 15).
Pozitivna regulacija ovih markera je u korelaciji sa anergičnim fenotipom T-ćelija. Anergija je stečeno stanje funkcionalne nereaktivnosti i posledica je angažovanja T-ćelijskog receptora (TCR) bez kostimulacije putem CD28 (Jenkins M.K. i saradnici, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.
84, 5409-13; Quill H. & Schwartz R.H., 1987, J. Immunol. 138, 3704-3712; Jenkins M.K. i saradnici, 1990, J. Immunol. 144, 16-22). Dodatno, ona predstavlja jedan od načina nametanja periferne tolerancije. Anergične T-ćelije su funkcionalno neaktivne i nisu u stanju da pokrenu produktivai imunski odgovor čak i kada naiđu na antigen u prisustvu pune kostimulacije. Anergic CD4<+>T-ćelije sa jasno različitim fenotipskim i programima ekspresije gena mogu se čak pretvoriti u regulatorne T-ćelije koje, zauzvrat, mogu pospešiti anergiju patogenih CD4<+>T-ćelija i inhibirati autoimunost (Kalekar L. A. i saradnici, 2016, Nat. Immunol. 17, 304-14). Lag-3, Tim-3, ICOS, kao i TIGIT posreduju u ko-inhibitornim funckijama na efektorske T-ćelije, a prekomerna ekspresija ovih molekula je povezana sa značajnim smanjenjem broja T-ćelija (Anderson A.C i saradnici, 2016, Immunity 44, 989-1004). Nakupljanje višestrukih ko-inhibitornih receptora na površini T-ćelija je čak povezano sa povećanom disfunkcijom (Blackburn S.D. i saradnici, 2009, Nat. Immunol.10, 29-37). Sam TIGIT deluje kao ko-inhibitorni molekul tako što direktno reguliše proliferaciju T-ćelija, ali i tako što sprečava sazrevanje DC, smanjuje sekreciju IL-12 i indukuje proizvodnju imunosupresivnog citokina IL-10 (Yu X. i saradnici, 2009, Nat. Immunol.10, 48-57; Joller N. i saradnici, 2011, J. Immunol. 186, 1338-1342). Lag-3 ima ulogu u modulaciji homeostaze T-ćelija i efektorskim odgovorima T-ćelija (Workman C J. i saradnici, 2002, J. Immunol. 169, 5392-5395; Workman C J. i Vignali D.A.A., 2003, Eur. J. Immunol.33, 970-979; Workman C J. i Vignali D.A.A., 2005, J. Immunol. 174, 688-695). Štaviše, molekuli imunskih kontrolnih tačaka poput receptora programirane smrti 1 (PD-1) i proteina 4 povezanog sa citotoksičnim T limfocitima (CTLA-4) su ko-inhibitorni molekuli uključeni u negativnu regulaciju imunskih odgovora i posledično u održavanje periferne auto-tolerancije. Ko-inhibitorni molekuli se generalno povećavaju nakon aktivacije T-ćelija i ograničavaju efektorski odgovor putem inhibicije tipa povratne sprege. PD-1 i njegovi ligandi, PD-L1 i PD-L2, na primer, isporučuju inhibitorne signale koji regulišu ravnotežu između aktivacije T-ćelija i tolerancije (Keir M.E. i saradnici, 2008, Annu. Rev. Immunol. 26, 677-704). Imunski odgovori na sopstvene antigene zahtevaju specifične i uravnotežene reakcije za održavanje tolerancije, što je posredovano koinhibitornim receptorima i njihovim ligandima. Pozitivnom regulacijom PD-1efektora, T-ćelijski odgovori će se isključiti, a tkiva će se zauzvrat zaštititi od oštećenja posredovanih imunskim ćelijama.
Svi ovi ko-inhibitorni receptori su sa centralnom ulogom u regulisanju autoimunih bolesti, a nedostatak pojedinih od ovih molekula čak dovodi do autoimunosti.
Primer 9: Detaljnija karakterizacija CD4<+>T-ćelija specifičnih za MOG35-55 nakon tretmana sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen u EAE modelu bolesti
[0241] U skladu sa rezultatima prikazanim u Primeru 6, Slike 8 i 9 takođe prikazuju da su u eksperimentima adoptivnog prenosa CD4<+>T-ćelija specifičnih za MOG35-55 dobijeni isti rezultati. Thy1,1<+>CD4<+>T-ćelije specifične za MOG35-55 iz 2D2 TCR transgenih miševa prebačene su u Thy1,2<+>C57BL/6 miševe i 24 sata kasnije EAE je indukovan kod miševa primilaca. Nakon indukcije bolesti, 7. i 10. dana, miševi su tretirani sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa fiziološkim rastvorom. Šest dana nakon poslednjeg tretmana sa iRNK, izolovani su mozak i kičmena moždina. Ćelije iz ovih tkiva su bile ponovo aktivirane in vitro sa MOG35-55 peptidom tokom 6 h, nakon čega su izložene Thy1,1<+>CD4<+>T-ćelijama. Kao što je prikazano na Slici 16, primena neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55 je dovela do značajnog smanjenja učestalosti CD4 T-ćelija specifičnih za MOG35-55 u mozgu i kičmenoj moždini. Na funkcionalnom nivou, CD4<+>T-ćelije izlučuju značajno manje IPNγ i interleukina-17A (IL-17A) u mozgu i kičmenoj moždini miševa tretiranih neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55u odnosu na kontrolne miševe (Slika 17). Ovi podaci ponovo ukazuju da iRNK tretman sa neimunogenom iRNK MOG35-55 može inaktivirati Teff ćelije, što dovodi do smanjene infiltracije ovih ćelija u mozak i kičmenu moždinu.
[0242] Da bi se ispitao antigen-specifični fenotip CD4 T-ćelije nakon uspešnog tretmana, EAE je aktivno indukovan i 7. i 10. dana nakon indukcije bolesti životinje su tretirane sa 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55, 20 µg neimunogene irelevantne iRNK ili sa fiziološkim rastvorom. U piku bolesti (16. dan nakon indukcije bolesti), fenotip CD4 T-ćelija u slezini je ispitivan bojenjem tetramera MOG35-55. U skladu sa eksperimentima prikazanim u Primerima 5 i 8, takođe u uslovima EAE bolesti, tolerancija specifična za antigen indukovana neimunogenom antigen-specifičnom iRNK posredovana je pozitivnom regulacijom koinhibitornih molekula Lag-3, ICOS, TIGIT i Tim-3 na CD4<+>T-ćelijama specifičnim za MOG35-55 u slezini (Slika 18A). Pored intrizičnih ćelijskih mehanizama koji posreduju u imunskoj toleranciji poput anergije i negativne kostimulacije, i ćelijski ekstrinzični (tolerancija posredovana Treg ćelijama) mogu posredovati u efektu lečenja sa neimunogenom iRNK koja he specifična za antigen. Kao što je prethodno razmotreno, Treg su sa ključnom ulogom u toleranciji specifičnoj za antigen (Sakaguchi S. i saradnici, 1985, J. Exp. Med.161, 72-87). FACS analiza CD4<+>T-ćelija specifičnih za MOG35-55 je dalje pokazala značajnu ekspanziju populacija Treg (Slika 18B). Pored toga, Treg u slezini miševa tretiranih sa neimunogenom RNK koja je specifična za antigen, eksprimiraju visoke nivoe CD69, što ukazuje na njihovu visoku aktivaciju.
[0243] Da bi se utvrdilo da li je za indukciju i održavanje tolerancije potrebna ekspresija negativnih kostimulatornih molekula, PD-1 ili CTLA-4 su blokirani tokom tretmana EAE sa iRNK. Tretman EAE 7. i 10. dana nakon indukcije bolesti sa neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 u kombinaciji sa anti-PD-1 ili anti-CTLA-4 antitelom doveo je do poništavanja protektivnih efekata u EAE u poređenju sa miševima koji su lečeni neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 u kombinaciji sa IgG kontrolama (Slika 19). Navedeno pokazuje da su PD-1 i CTLA-4 ključni za dugoročno održavanje tolerancije specifične za antigen indukovane neimunogenom antigen-specifičnom iRNK, pošto je blokada PD-1 i CTLA-4 sa antitelima paralelno sa tretmanom iRNK dovela do značajno smanjenje efisanosti indukcije tolerancije posredovane tretmanom sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen.
[0244] Uzeti zajedno, prikazani eksperimenti su istraživali način delovanja ovog novog terapijskog pristupa indukcije tolerancije specifične na antigen putem tretmana sa antigenspecifičnom neimunogenom iRNK. Rezultati pokazuju da je lečenje neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen efektivan postupak za izmenu štetnih imunskih odgovora u autoimunosti radi pružanja zaštite. Eksperimenti prikazani na naivnim miševima, kao i na miševima pogođenim bolestima, pokazuju da lečenje neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen dovodi do indukcije anergičnih i regulatornih T-ćelija koje posreduju u toleranciju na periferiji, što dovodi do uspešnog lečenja autoimune bolesti koja je u toku. Pokazano je i da se terapijski efekat oslanja na već dobro opisane mehanizme za indukciju tolerancije koji su opisani u literaturi koja je razmotrena u svakom primeru. Ovi mehanizmi su važni i od fundamentalnog značaja za indukciju tolerancije nezavisno od vrste autoimune bolesti. Mehanizam tolerancije posredovan tretmanom sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen može stoga biti prenet na bilo koju drugu vrstu autoimune bolesti.
Primer 10: Indukcija tolerancije specifične za antigen tretmanom sa neimunogenom antigen-specifičnom iRNK je nezavisna od EAE modela bolesti
[0245] Svi prethodno opisani EAE eksperimenti su rađeni na C57BL/6 miševima indukovanim sa MOG35-55 peptidom što je dovelo do monofazne progresije bolesti. Drugi model EAE karakteriše rekurentna bolest usled različitog relevantnog epitopa (PLP139-151) koji dovodi do recidivnoremitentnog toka bolesti kod SJL miševa. Ovaj model je korišćen za demonstraciju indukcije tolerancije u klinički značajnijim uslovima bolesti. Slika 20A pokazuje da tretman sa iRNK 2x nedeljno, počevši od 7. i 10, dana nakon indukcije EAE sa neimunogenom iRNK koja kodira PLP139-151, u modelu relaps-remitentne bolesti imao pozitivan efekat na razvoj EAE pošto su ovi miševi pokazali mnogo slabiju progresiju bolesti u odnosu na miševe tretirane neimunogenom irelevantnom kontrolnom iRNK. Da bi se još bolje simulirala situacija u MS, korišćen je kompleksni EAE povezan sa višestrukim patogenim autoreaktivnim klonovima T-ćelija. Pošto je nakon definitivne dijagnoze MS, bolest verovatno već povezana sa složenom autoreaktivnošću protiv mijelina, usled „širenja epitopa”, ispitivana je efikasnost pristupa tretmanu sa više epitopa. Kao što je prikazano na Slici 20B, kompleksni EAE je uspešno tretiran mešavinom četiri različite neimunogene iRNK koje su kodirale epitope od važnosti za oboljenje, MOG35-55, PLP139-151, PLP178-191 i MBP84-104. Od svake neimunogene iRNK koja je kodriala epitop od značaja za oboljenje, upotrebljavano je po 10 µg, što je ukupno predstavljalo 40 µg potrebnih za efikasan tretman. Nijedan od pojedinačnih tretmana epitopom nije mogao da obezbedi slične rezultate lečenja, kao što je prikazano za 20 µg neimunogene iRNK koja kodira MOG35-55.
Ovi rezultati pokazuju da je indukcija tolerancije specifične za antigen uočena u različitim eksperimentima nezavisna od specifičnog epitopa i da može biti posredovana sa različitim epitopima relevantnim za bolest. Štaviše, podaci naglašavaju da se čak i složena bolest koja je u toku, sa složenim patogenim autoimunim procesom, može uspešno lečiti primenom više neimunogenih mijelin-specifičnih konstrukata iRNK.
Primer 11: Istovremena isporuka imunomodulatornih citokina poboljšava tolerogeni efekat tretmana LPX-a sa neimunogenom iRNK specifičnom za antigen
[0246] Nekoliko imunoregulatornih molekula, poput IL-10, može podržati funkciju Treg. Štaviše, poznato je da anti-inflamatorni citokin IL-10 indukuje tolerogene DC (Torres-Aguilar H i saradnici, 2010, Autoimmun. Rev.10, 8-17; Torres-Aguilar H i saradnici, 2010, J. Immunol.184, 1765-1775; Steinbrink K. i saradnici, 1997, J. Immunol. 159, 4772-4780) i da suprimira proliferaciju T-ćelija i citokinske odgovore (Gu Y i saradnici, 2008, Eur. J. Immunol. 38, 1807-1813; Guo B., 2016., J. Clin. Cell Immunol.7, 1-16). Takođe, IL-27 je citokin za koji je poznato da je sa anti-inflamatornim osobinama, a u EAE studijama je pokazano da ovaj citokin umanjuje ozbiljnost bolesti (Mascanfroni I.D. i saradnici, 2013, Nat. Immunol. 14, 1054-63; Thom R. i saradnici, 2017, Front. Immunol.8, 1-14). U postavljenim EAE eksperimentima je bilo potrebno ispitati istovremenu isporuku neimunogene antigen-specifične iRNK sa imunomodulatornim citokinima poput IL-10 i IL-27 koji su kodirani neimunogenom iRNK, a u pogledu modulisanja imunskog odgovora i poboljšanja efiskasnosti indukcija tolerancije.
Sposobnost istovremene isporuke imunomodulatornih citokina da bi se poboljšala tolerogenost tretmana sa iRNK-LPX specifičnom za jedan antigen, ispitivana je upotrebom 'subterapijskog' tretmana EAE miševa. Tretman LPX kompeksa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen, pokazao je snažnu indukciju tolerancije u prethodnim eksperimentima, zbog čega je kombinovani pristup dodatnog tretmana neimunogenom iRNK koja je kodira citokine ispitivan u modelu EAE u subterapijskim dozama da bi se identifikovali terapijski doprinosi.
Da bi se istražilo povoljno dejstvo tretmana neimunogenom iRNK koja kodira citokine, na neimunogene antigen-specifične iRNK u modelu bolesti, EAE je aktivno indukovan kod C57BL/6 miševa, a miševi su tretirani 7. i 10. dana nakon indukcije bolesti sa neimunogenom iRNK koja je specifična za antigen i kodira MOG35-55, neimunogenom iRNK koja kodira MOG35-55 u kombinaciji sa neimunogenom iRNK koja kodirga mIL-10 (Slika 21A) ili mIL-27 (Slika 21B), neimunogenom iRNK koja je kodira samo citokin, kao i neimunogenom irelevantnom iRNK. Rezultati prikazani na slici 21 ukazuju da istovremena isporuka imunomodulatornih citokina kodiranih neimunogenom iRNK povećava toleranciju u kontekstu specifičnom za antigen. Štaviše, ista ne suprimiraju imunski odgovor u velikoj meri, pošto tretman samo sa iRNK koja kodira samo citokin nije pokazao promene u progresiji EAE u poređenju sa kontrolnim miševima.

Claims (14)

Patentni zahtevi
1. Farmaceutska kompozicija za upotrebu u terapiji, gde navedena kompozicija sadrži neimunogenu RNK koja kodira peptid ili polipeptid koji sadrži autoantigen, pri čemu neimunogena RNK postaje neimunogena ugradnjom 1-metilpseuduridina i uklanjanjem dsRNK.
2. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu neimunogena RNK prilikom primene ne dovodi do aktivacije dendritičnih ćelija, aktivacije T-ćelija i/ili sekrecije IFN-alfa.
3. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 1 ili 2, gde je neimunogena RNK in vitro transkribovana RNK.
4. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu je autoantigen povezan sa autoimunom bolešću i pri čemu je autoantigen poželjno T-ćelijski antigen.
5. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu je autoantigen mijelinski antigen i pri čemu je autoantigen poželjno mijelinski oligodendrocitni glikoprotein (MOG) ili njegov fragment koji sadrži aminokiseline 35 do 55 iz mijelinskog oligodendrocitnog glikoproteina (MOG).
6. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, koja dalje sadrži jedinjenje koje inhibira imunski sistem ili neimunogenu RNK koja kodira navedeno jedinjenje koje inhibira imunski sistem, pri čemu je navedeno jedinjenje koje inhibira imunski sistem izabrano iz grupe koja se sastoji od transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β), interleukina 10 (IL-10), antagoniste receptora interleukina 1 (IL-1RA), interleukina 4 (IL-4), interleukina 27 (IL-27), interleukina 35 (IL-35), liganda programirane smrti 1 (PD-L1), inducibilnog T-ćelijskog kostimulatornog liganda (ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamin 2,3-dioksigenaze 1 (IDO1), indolamin 2,3-dioksigenaze 2 (IDO2), acetaldehid dehidrogenaze 1 (ALDHl)/retinaldehid dehidrogenaze (RALDH), arginaze 1 (ARG1), arginaze 2 (ARG2), sintaza azot oksida (NOS2), galektina-1, galektina-9, semaforina 4A.
7. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu terapija uključuje lečenje ili prevenciju autoimune bolesti.
8. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu terapija obuhvata indukovanje tolerancije na autoreaktivne T-ćelije.
9. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je autoimuna bolest autoimuna bolest posredovana T-ćelijama.
10. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je autoimuna bolest autoimuna bolest CNS-a.
11. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 7, pri čemu je autoimuna bolest multipla skleroza.
12. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 11, pri čemu neimunogena RNK, kada se primenjuje, ne dovodi do aktivacije dendritičnih ćelija, aktivacije T-ćelija i/ili sekrecije IFN-alfa.
13. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 12, pri čemu modifikovani nukleotidi suprimiraju aktivaciju receptora urođenog imuniteta posredovanu sa RNK.
14. Farmaceutska kompozicija za upotrebu prema bilo kom od patentnih zahteva od 7 do 13, pri čemu terapija obuhvata obezbeđivanje jedinjenja koje inhibira imunski sistem, ili neimunogene RNK koja kodira jedinjenje koje inhibira imunski sistem, subjektu koji se leči, pri čemu je jedinjenje koje inhibira imunski sistem izabrano od grupa koja se sastoji od transformišućeg faktora rasta beta (TGF-β), interleukina 10 (IL-10), antagoniste receptora interleukina 1 (IL-1RA), interleukina 4 (IL-4), interleukina 27 (IL-27), interleukina 35 (IL-35), liganda programirane smrti 1 (PD-L1), inducibilnog T-ćelijskog kostimulatornog liganda (ICOSL), B7-H4, CD39, CD73, FAS, FAS-IL, indolamin 2,3-dioksigenaze 1 (IDO1), indolamin 2,3-dioksigenaze 2 (IDO2), acetaldehid dehidrogenaze 1 (ALDHl)/retinaldehid dehidrogenaze (RALDH), arginaze 1 (ARG1), arginaze 2 (ARG2), sintaza azot oksida (NOS2), galektina-1, galektina-9, semaforina 4A.
RS20211224A 2017-04-11 2018-04-10 Rnk za lečenje autoimunih bolesti RS62582B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2017/058651 WO2018188730A1 (en) 2017-04-11 2017-04-11 Rna for treatment of autoimmune diseases
PCT/EP2018/059188 WO2018189193A1 (en) 2017-04-11 2018-04-10 Rna for treatment of autoimmune diseases
EP18717580.7A EP3609529B1 (en) 2017-04-11 2018-04-10 Rna for treatment of autoimmune diseases

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62582B1 true RS62582B1 (sr) 2021-12-31

Family

ID=58632945

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20211224A RS62582B1 (sr) 2017-04-11 2018-04-10 Rnk za lečenje autoimunih bolesti

Country Status (23)

Country Link
US (2) US11701413B2 (sr)
EP (2) EP3609529B1 (sr)
JP (3) JP7078641B2 (sr)
KR (2) KR20240042138A (sr)
CN (2) CN110719787B (sr)
AU (1) AU2018253352B2 (sr)
BR (1) BR112019020667A8 (sr)
CA (1) CA3059505A1 (sr)
CY (1) CY1124767T1 (sr)
DK (1) DK3609529T3 (sr)
ES (1) ES2893451T3 (sr)
HR (1) HRP20211559T1 (sr)
HU (1) HUE056871T2 (sr)
IL (2) IL269793B (sr)
LT (1) LT3609529T (sr)
MX (1) MX2019012144A (sr)
PL (1) PL3609529T3 (sr)
PT (1) PT3609529T (sr)
RS (1) RS62582B1 (sr)
SG (2) SG11201909520VA (sr)
SI (1) SI3609529T1 (sr)
SM (1) SMT202100572T1 (sr)
WO (2) WO2018188730A1 (sr)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018188730A1 (en) * 2017-04-11 2018-10-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna for treatment of autoimmune diseases
CA3119449A1 (en) * 2018-11-12 2020-05-22 Translate Bio, Inc. Methods for inducing immune tolerance
IL297419B2 (en) * 2020-04-22 2025-02-01 BioNTech SE Coronavirus vaccine
CN116710115A (zh) 2020-11-20 2023-09-05 思维疗法股份有限公司 用于优化的肽疫苗的组合物和方法
US11058751B1 (en) 2020-11-20 2021-07-13 Think Therapeutics, Inc. Compositions for optimized RAS peptide vaccines
US11161892B1 (en) 2020-12-07 2021-11-02 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
US11421015B2 (en) 2020-12-07 2022-08-23 Think Therapeutics, Inc. Method of compact peptide vaccines using residue optimization
CN115232825B (zh) * 2021-04-22 2023-09-26 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 一种基于1083骨架的新冠病毒疫苗
US11464842B1 (en) 2021-04-28 2022-10-11 Think Therapeutics, Inc. Compositions and method for optimized peptide vaccines using residue optimization
CN117750971A (zh) 2021-05-26 2024-03-22 易姆赛斯股份公司 治疗或预防自身免疫病的方法
AR126654A1 (es) 2021-06-29 2023-11-01 Imcyse Sa Péptidos y métodos para el tratamiento de neuromielitis óptica
CN113336862B (zh) * 2021-07-05 2022-03-01 广东省科学院动物研究所 一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途
WO2023030635A1 (en) * 2021-09-02 2023-03-09 BioNTech SE Potency assay for therapeutic potential of coding nucleic acid
CN118369335A (zh) * 2022-01-06 2024-07-19 上海吉量医药工程有限公司 N1位修饰假尿嘧啶核苷及其在mRNA合成中的应用

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7030098B2 (en) * 1999-03-12 2006-04-18 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University DNA vaccination for treatment of autoimmune disease
AU2002952834A0 (en) 2002-09-16 2002-12-05 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research A method of treating an autoimmune disease
US9012219B2 (en) * 2005-08-23 2015-04-21 The Trustees Of The University Of Pennsylvania RNA preparations comprising purified modified RNA for reprogramming cells
PL2578685T3 (pl) 2005-08-23 2020-01-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna zawierający zmodyfikowane nukleozydy i sposoby jego zastosowania
WO2009030254A1 (en) * 2007-09-04 2009-03-12 Curevac Gmbh Complexes of rna and cationic peptides for transfection and for immunostimulation
EP2050814A1 (en) 2007-10-17 2009-04-22 Txcell Compositions for treating multiple sclerosis
US8808982B2 (en) 2009-12-07 2014-08-19 Cellscript, Llc Compositions and methods for reprogramming eukaryotic cells
WO2012154933A1 (en) * 2011-05-10 2012-11-15 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Detecting inclusion body myositis
CN103998055B (zh) * 2011-09-30 2017-10-24 北京艾棣维欣生物技术有限公司 预防和治疗自身免疫性疾病的联合促进剂、抗原和dna疫苗
EP3144389B1 (en) 2011-12-30 2018-05-09 Cellscript, Llc Making and using in vitro-synthesized ssrna for introducing into mammalian cells to induce a biological or biochemical effect
WO2013120498A1 (en) * 2012-02-15 2013-08-22 Curevac Gmbh Nucleic acid comprising or coding for a histone stem-loop and a poly(a) sequence or a polyadenylation signal for increasing the expression of an encoded allergenic antigen or an autoimmune self-antigen
US20160032316A1 (en) 2013-03-14 2016-02-04 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and Purity Assessment of RNA Molecules Synthesized with Modified Nucleosides
AU2016253972B2 (en) * 2015-04-27 2020-01-02 Acuitas Therapeutics Inc. Nucleoside-modified RNA for inducing an adaptive immune response
CN106395552B (zh) 2015-08-03 2020-03-17 奥的斯电梯公司 无绳电梯系统导轨组件
US10808242B2 (en) * 2015-08-28 2020-10-20 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Method for reducing immunogenicity of RNA
SI3445850T1 (sl) * 2016-04-22 2021-12-31 BioNTech SE Postopki za zagotavljanje enoverižne RNA
WO2018188730A1 (en) * 2017-04-11 2018-10-18 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna for treatment of autoimmune diseases

Also Published As

Publication number Publication date
US20200061166A1 (en) 2020-02-27
DK3609529T3 (da) 2021-10-11
CY1124767T1 (el) 2022-11-25
WO2018188730A1 (en) 2018-10-18
US20230330198A1 (en) 2023-10-19
LT3609529T (lt) 2021-10-25
KR102824942B1 (ko) 2025-06-25
CN110719787B (zh) 2024-03-15
IL269793A (en) 2019-11-28
SI3609529T1 (sl) 2021-11-30
MX2019012144A (es) 2019-11-21
IL290980A (en) 2022-05-01
EP3981424A1 (en) 2022-04-13
CN118161602A (zh) 2024-06-11
RU2019135808A3 (sr) 2021-08-10
SMT202100572T1 (it) 2021-11-12
HRP20211559T1 (hr) 2022-01-21
SG11201909520VA (en) 2019-11-28
KR20240042138A (ko) 2024-04-01
EP3609529B1 (en) 2021-09-08
CN110719787A (zh) 2020-01-21
JP2020516658A (ja) 2020-06-11
AU2018253352B2 (en) 2025-04-10
IL269793B (en) 2022-04-01
PL3609529T3 (pl) 2021-12-13
KR20190134765A (ko) 2019-12-04
US11701413B2 (en) 2023-07-18
JP7444924B2 (ja) 2024-03-06
PT3609529T (pt) 2021-10-14
RU2019135808A (ru) 2021-05-11
CA3059505A1 (en) 2018-10-18
HUE056871T2 (hu) 2022-04-28
EP3609529A1 (en) 2020-02-19
ES2893451T3 (es) 2022-02-09
JP2022110127A (ja) 2022-07-28
BR112019020667A8 (pt) 2022-08-16
WO2018189193A1 (en) 2018-10-18
JP2024059794A (ja) 2024-05-01
BR112019020667A2 (pt) 2020-05-05
SG10202111163VA (en) 2021-11-29
JP7078641B2 (ja) 2022-05-31
AU2018253352A1 (en) 2019-10-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7444924B2 (ja) 自己免疫疾患の治療のためのｒｎａ
KR102771195B1 (ko) 핵산 백신접종을 이용한 car-조작된 t 세포의 효과 증진
Sharma et al. Regulatory T cells in acute and chronic kidney diseases
BR112018001858A2 (en) modified monocytes / macrophages expressing chimeric antigen receptors and their uses
US12168051B2 (en) Methods and compositions for stimulating immune response
TW202245808A (zh) 用於治療癌症之治療性ｒｎａ
JP2024522179A (ja) 免疫エフェクタ細胞の活性化および標的化のための薬剤および方法
CA3145609A1 (en) Cell therapy methods
RU2790447C2 (ru) Рнк для лечения аутоиммунных заболеваний
HK40070905A (en) Rna for treatment of autoimmune diseases
HK40017292B (en) Rna for treatment of autoimmune diseases
HK40017292A (en) Rna for treatment of autoimmune diseases
JP7308750B2 (ja) 耐性を誘導するための操作された細胞
Llanos et al. Genetic and pharmacological modulation of dendritic cell-T cell interactions as a therapeutic strategy for systemic lupus erythematosus
HK40099663A (zh) 用於治疗癌症的治疗性rna
JP2023518935A (ja) 抗原特異的ｔ細胞受容体およびｔ細胞エピトープ