RS62604B1

RS62604B1 - N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2h-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat kao mek1/2 inhibitor

Info

Publication number: RS62604B1
Application number: RS20211338A
Authority: RS
Inventors: Alexey Evgenievich Repik; Alexandre Vasilievich Ivachtchenko; Vasily Gennadievich Ignatiev; Mikhail Airatovich Chafeev
Original assignee: R Pharm Joint Stock Company R Pharm Jsc; Alexey Evgenievich Repik
Priority date: 2016-10-10
Filing date: 2016-12-12
Publication date: 2021-12-31
Also published as: US20190233415A1; RU2627692C1; PL3524601T3; AU2016426350B2; CO2019004688A2; SMT202100633T1; ZA201902861B; US10738049B2; WO2018070900A1; KR20190062512A; CN110012668B; EP3524601A1; JP6909299B2; EP3524601A4; AU2016426350A1; ES2898026T3; HRP20211693T1; PH12019500721A1; LT3524601T; PT3524601T

Description

Opis

Oblast tehnike

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nove derivate pirido[4,3-d]pirimidin-2,4,7-triona, naime N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvata, koji je interesantan kao lek za lečenje poremećaja izazvanih štetnom ćelijskom proliferacijom, naročito kao agens protiv tumora. Konkretno, ovaj pronalazak se odnosi na MEK1, MEK2 i MEK1/2 inhibitor interesantan kao lek protiv tumora, koji se može koristiti za lečenje malignih melanoma.

Stanje tehnike

[0002] Poznati su MEK1, MEK2 i MEK1/2 inhibitori, čija struktura uključuje 1H,6H-pirido[4,3-d]-2,4,7-trion [WO 2005/121142, WO 2012/088033, USA 7378423], pri čemu je najnapredniji lek Mekinist (Trametinib dimetil sulfoksid, GSK1120212) [H. Abe, S. Kikuchi, K. Hayakawa i sarad. ACS Med. Chem. Lett. 2011, 2, 320-324]. GSK1120212 je efikasan MEK1/2 inhibitor, koji ispoljava veću efikasnost protiv u-MEK1/2 pre C-Raf aktivacije (u-MEKl: IC50 = 0.7 nM) u poređenju sa prethodno aktiviranim (pp-MEK1: IC50 = 14.9 nM)

[http ://clincancerres.aacrjournals.org/content/17/5/989.full].

[0003] Međutim, Trametinib i Mekinist su praktično nerastvorni u vodenom medijumu između pH = 2 i pH = 8. Trametinib i Mekinist su takođe veoma slabo rastvorni u organskim rastvaračima uključujući visoko polarne (oskudno rastvorljivi u vrućim aprotičnim rastvaračima).

[0004] Zbog toga se jedinjenja, koja mogu ispoljiti pogodne profile efikasnosti u pogledu MEK1, MEK2 i MEK1/2, i visoku rastvorljivost u vodenim ili organskim rastvaračima, i dalje traže. Usled poboljšane biološke raspoloživosti za ova jedinjenja se očekuje da budu pogodnija kao terapijski agensi za kancer.

[0005] Pored toga, iako Mekinist ima nisku oralnu toksičnost pojedinačne doze (LD50> 2000 mg/kg kod miševa), primećeni su tokom dugotrajnog administriranja visokog doznog nivoa kritični gubitak težine ili ponekad čak smrt životinja. Stoga, ostaje veoma važna potraga za proizvodima iz ove grupe sa nižom toksičnošću pri dugotrajnom doziranju.

[0006] Cilj predmetnog pronalaska je da se stvore novi MEK1, MEK2 i MEK1/2 inhibitori koji imaju nisku toksičnost pri dugotrajnom doziranju.

[0007] Cilj je postignut novim jedinjenjem N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat formule 1.

Izlaganje suštine pronalaska

[0008] Predmet ovog pronalaska je N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat formule 1.

[0009] Podnosioci prijave su neočekivano pronašli da je novo jedinjenje N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat formule 1 uporedivo sa Trametinibom po efikasnosti prema MEK1, MEK2 i MEK1/2 bivajući netoksično pri dugotrajnoj dozi.

[0010] Stoga, novo jedinjenje N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso- 3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat formule 1 može biti naročito korisno u profilaksi i/ili lečenju poremećaja koji uključuju MEK1, MEK2 i MEK1/2, npr. u lečenju kancera koji uključuje maligne melanome, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, pri čemu je pomenuti pedijatrijski tumor odabran od Ewing-ovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma.

[0011] Prednost novog jedinjenja formule 1 je veća rastvoljivost u organskim medijumima, što može da obezbedi širi izbor pogodnih formulacija i omogući veću biološku raspoloživost i druge farmakokinetičke parametre. Tako, na primer, rastvorljivost jedinjenja formule 1 u dimetil sulfoksidu je više od 2 puta veća nego ona od Trametiniba. Rastvorljivost u smeši od 4 % dimetil sulfoksida i 96 % biljnog ulja je veća takođe. Rastvorljivost jedinjenja formule 1 u raznim medijumima u poređenju sa onom od Trametiniba je data u Tabeli 1.

Tabela 1. Rastvorljivost jedinjenja formule 1 i Trametiniba u raznim medijumima

[0012] Inhibirajuća aktivnosti novog jedinjenja formule 1 je uporediva sa inhibirajućom aktivnošću Trametiniba u pogledu MEK1, pri čemu je eksperimentalna vrednost IC50= 8.02 nM (IC50= 8.14 nM za Trametinib).

[0013] Značajno niža toksičnost doze u odnosu na prototip (Mekinist, dimetil sulfoksid kompleks Trametiniba) je apsolutna prednost novog jedinjenja formule 1. Studije efikasnosti na A375 humanom melanomskom ksenograft modelu su pokazale da jedinjenje formule 1 inhibira rast tumora i izaziva regresiju tumora na dozno-zavisan način. Efikasnost jedinjenja formule 1 je uporediva sa onom od Mekinista, pri čemu je jedinjenje formule 1 manje toksično: eksperimentalno lečenje pomoću Mekinista dovelo je do kritičnog gubitka na težini i do smrti dve životinje, dok jedinjenje formule 1 nije izazvalo smrt životinja čak ni u višim dozama.

[0014] Studija antitumorske aktivnosti jedinjenja formule 1 naspram Mekinista je izvedena na NMRI ženkama golih (eng. nude) miševa. Nakon formiranja tumora životinje su podeljene u grupe tako da je prosečna veličina tumora bila ~150 mM<3>. Životinje su lečene ispitivanim proizvodima tokom 21 dan. Težine životinja u eksperimentalnim grupama koje su primile jedinjenje formule 1 u dozama do i uključujući 3 mg/kg nisu bile znatno drugačije od onih od životinja u kontrolnoj grupi (Slika 1). Lečenje pomoću doze 10 mg/kg jedinjenja formule 1 dovelo je do gubitka telesne težine životinje, što je primećeno tokom studije od prve administracije, ali nije bilo više od 20 % u poređenju sa datumom početka lečenja. Međutim, intragastrična administracija 3 mg/kg Mekinista tokom 9 dana je dovela do kritičnog gubitka telesne težine i smrti dve životinje što je izazvalo potrebu za zaustavljanjem lečenja u ovoj grupi tokom 3 dana da bi se povratila težina.

[0015] Dinamika rasta tumora je prikazana na slici 2. Intragastrična administracija 0.3 mg/kg jedinjenja formule 1 nije imala efekta na rast tumora, dok je znatna inhibicija rasta tumora primećena u svim drugim grupama. Takođe, regresija tumora je primećena kod tri od osam životinja koje su primile 1 mg/kg jedinjenja formule 1, i kod 7/8 i 8/8 životinja koje su primile 3 i 10 mg/kg jedinjenja formule 1, redom. Intragastrična administracija 3 mg/kg Mekinista izazvala je regresiju kod 100 % životinja u grupi takođe.

[0016] Stoga, jedinjenje formule 1 je ispoljilo dozno-zavisnu inhibiciju rasta tumora i regresiju, nije izazvalo smrt životinja i umereno je smanjilo težinu životinja pri maksimalnoj ispitanoj dozi samo.

[0017] Jedinjenje formule 1 koje je MEK1, MEK2 i MEK1/2 inhibitor je poželjno korišćeno za lečenje kancera koji uključuje maligne melanome kod pacijenta.

[0018] Predmet ovog pronalaska je takođe postupak proizvodnje jedinjenja formule 1, kojeg čine interakcija 1-(3-aminofenil)-3-ciklopropil-5-{(2-fluoro-4-jodofenil)amino}-6,8-dimetilpirido[4,3-d]pirimidin-2,4,7(1H,3H,6H)-triona formule 2 ili njegove soli sa ciklopropilkarboksilnom kiselinom ili njenim aktiviranim derivatom (npr., hloroanhidridom ili odgovarajućim aktiviranim estrom ili anhidridom ove kiseline) u rastvaraču, npr., CH2Cl2, tetrahidrofuranu, N,N-dimetilformamidu, N,N-dimetilacetamidu ili N-metilpirolidonu sa daljim dobijanjem kristalnog solvata gotovog proizvoda sporim hlađenjem vrućeg zasićenog rastvora u dimetil sulfoksidu.

[0019] Predmet ovog pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efikasnu količinu jedinjenja formule 1 kao aktivnog sastojka, i farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za primenu u profilaksi i/ili lečenju kancera koji je u vezi sa MEK1, MEK2 i MEK1/2, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, pri čemu je navedeni dečiji tumor odabran od Ewingovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma.

[0020] Farmaceutska kompozicija može se primeniti u profilaksi i/ili lečenju malignih melanoma.

[0021] Farmaceutska kompozicija može biti u obliku pogodnom za oralnu primenu (npr., tablete, pastile, tvrde ili meke kapsule, vodene ili uljane suspenzije, emulzije, disperzibilni praškovi ili granule, sirupi ili eliksiri), za topikalnu primenu (npr., kreme, masti, gelovi, vodeni ili uljani rastvori ili suspenzije), za inhalacije (npr., sitni prašak ili tečni aerosol), za insuflaciju (npr., sitan prašak) ili za parenteralnu administraciju (npr., sterilni vodeni ili uljani rastvor za intravensku, subkutanu ili intramuskularnu doznu injekciju, ili supozitorije za rektalnu administraciju).

[0022] Farmaceutska kompozicija može se dobiti uobičajenim postupcima mešanjem terapijski efikasne količine jedinjenja formule 1 sa dobropoznatim konvencionalnim farmaceutskim ekscipijensima. Tako. farmaceutska kompozicija namenjena za oralnu administraciju može sadržati, npr., jedan ili nekoliko boja, zaslađivača, aroma i/ili konzervanasa.

[0023] Uobičajeno su jedinjenja formule 1 administrirana pacijentu kao pojedinačna doza od 5 - 5000 mg/m<2>površine tela, tj. oko 0.1 - 100 mg/kg što generalno obezbeđuje terapijski efikasnu dozu. Uobičajeno oblik pojedinačne doze, kao što je tableta ili kapsula, sadrži, npr., 1 - 250 mg aktivnog sastojka. Dnevna doza uvek varira zavisno od pacijenta, specifičnog puta administracije i ozbiljnosti poremećaja nakon lečenja. Stoga, doktor, koji sprovodi lečenje posebnog pacijenta, može da odredi optimalnu dozu. U ovom opisu pojam "terapija" uključuje "profilaksu".

[0024] Tipovi kancera, koji mogu osetljivi na lečenje primenom jedinjenja formule 1 ili njegovih farmaceutski prihvatljivih soli i/ili solvata uključuju (bez ograničenja) maligne melanome.

[0025] Predmet ovog pronalaska je takođe lek koji uključuje terapijski efikasnu količinu jedinjenja formule 1 za primenu u profilaksi i/ili lečenju kancera koji je u vezi sa MEK1, MEK2 i MEK1/2, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, navedeni pedijatrijski tumor je odabran od Ewing-ovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma.

[0026] U skladu sa drugim aspektom ovog pronalaska jedinjenje formule 1 je predloženo da se koristi, kao što je iznad definisano, za pripremu farmaceutske kompozicije za lečenje kancera mešanjem terapijski efikasne količine jedinjenja formule 1 sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima.

[0027] Antikancerski efekat kod pacijenta kojima je potrebno ovakvo lečenje je takođe predložen administracijom efikasne količine jedinjenja formule 1 pacijentu.

[0028] Takođe je predložen postupak lečenja, koji nije deo ovog pronalaska, osobe koja pati od bolesti u kojem je korisna inhibicija MEK1/2; postupak uključuje korake administracije efikasne količine jedinjenja formule 1 pacijentu kome je potrebno ovakvo lečenje. Posebno, bolest kod koje je korisna MEK1, MEK2 i MEK1/2 inhibicija je kancer.

[0029] U bilo kom od aspekata ili verzija koje su ovde pomenute, gde je kancer naznačen u generalnom smislu, pomenuti kancer može biti odabran od tumora mozga (neurogliom sa komponentom malignog astroglioma i oligodendrogliomi, itd.), kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera (kancer debelog creva, rektalni kancer, itd.), kancera pluća (nesitnoćelijski kancer pluća, sitnoćelijski kancer pluća, primarni i metastatski kancer skvamoznih ćelija, itd.), kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice (kancer grlića materice, kancer endometrijuma, itd.), kancera glave i tumora vrata (maksilarnog sinusa, kancer larinksa, kancer farinksa, kancer jezika, intraoralni kancer, itd.), multiplog mijeloma, malignog limfoma (retikulosarkom, limfosarkom, Hodgkin-ova bolest, itd.), prave policitemije, leukemije (akutna mijeloidna leukemija, hronična mijeloidna leukemija, akutna limfocitna leukemija, hronična limfocitna leukemija, itd.), strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, pedijatrijskog tumora (Ewing-ov sarkom, Wilms-ov tumor, rabdomiosarkom, vaskularni sarkom, embrionalni testikularni kancer, neuroblastom, retinoblastom, hepatoblastom, nefroblastom, itd.) i sličnog.

[0030] Lečenje kancerskih bolesti opisanih iznad može se primeniti kao monoterapija ili može uključiti opštu hiruršku ili terapiju zračenjem, ili hemoterapiju, ili imunoterapiju pored jedinjenja prema ovom pronalasku. Ova hemoterapija može biti uvedena istovremeno, uzastopno ili odvojeno, i može dodatno uključiti jedan ili više agenasa protiv tumora iz sledećih kategorija: antiproliferativne/antikancerske lekove i njihove kombinacije korišćene u medicinskoj onkologiji; citostatske agense; anti-invazivne agense; inhibitore faktora rasta; antiangiogenetske agense; vaskularne agense; oštećujuće antagoniste endotelinskog receptora; antisens terapije; gensko terapijske pristupe; i imunoterapijske pristupe (J).

[0031] Stoga, ovaj pronalazak predlaže farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje formule 1 i dodatnu supstancu protiv tumora, kako je iznad definisano, za primenu u istovremenom lečenju kancera.

[0032] Ovaj pronalazak predlaže farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje formule 1 i dodatnu supstancu protiv tumora, kako je iznad definisano, za primenu u kombinovanom lečenju kancera.

[0033] Pojam "istovremeno lečenje" korišćen u vezi sa kombinovanom terapijom treba čitati kao simultana, odvojena ili uzastopnu administracija.

[0034] Pronalazak predlaže primenu jedinjenja formule 1 i dodatne supstance protiv tumora za primenu u istovremenom lečenju kancera.

[0035] Ovaj pronalazak je podržan crtežima.

Slika 1. Dinamika promene telesne težine životinja tokom lečenja lekovima tokom studije.

Slika 2. Dinamika rasta A375 humanog melanomskog tumora u ksenograft modelu tokom lečenja Mekinistom i jedinjenjem formule 1.

Najbolji način primene pronalaska

[0036] Ovaj pronalazak će biti detaljnije opisan primenom specifičnih primera. Sledeći primeri su obezbeđeni kao ilustracije i nisu namenjeni za bilo kakvo ograničavanje pronalaska. Stručnjaci u ovoj oblasti mogu lako da razumeju razne nekritičke parametre, koji se mogu menjati ili modifikovati kako bi dali suštinski iste rezultate.

[0037] Primer 1. Postupak pripreme N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7- triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropa-nekarboksamid dimetil sulfoksid solvata.

[0038] Dodati ciklopropilkarbonil hlorid (182 mg, 1.74 mmol) rastvoru 1-(3-aminofenil)-3-ciklopropil-5-{(2- fluoro-4-jodofenil)amino}-6,8-dimetilpirido[4,3-d]pirimidin-2,4,7(1H,3H,6H)-triona formule 2 (500 mg, 0.87 mmol) i diizopropiletilamina (225 mg, 1.74 mmol) u 5 mL dimetilformamida na ambijentalnoj temperaturi i mešati reakcionu masu preko noći. Nakon završetka reakcije upariti rastvarač pod vakuumom, rastvoriti ostatak u 5 mL dihloromeana i oprati uzastupno sa zasićenim vodenim rastvorom natrijum hidrogen karbonata i zasićenim vodenim rastvorom natrijum hlorida. Odvojiti organski sloj i sušiti preko anhidrovanog natrijum sulfata preko noći, filtrirati i upariti filtrat pod vakuumom. Izolovati proizvod pomoću silika gel fleš hromatografije primenom dihlorometana i smeše dihlorometana i etil acetata (1:1) kao efluenta. Rastvoriti sirovi proizvod (250 mg) u 1.3 mL dimetil sulfoksida na 70 °C i mešati rastvor tokom 1 sata, zatim ohladiti do ambijentalne temperature i mešati preko noći. Filtrirati talog, oprati dihlorometanom na filteru i sušiti pod visokim vakuumom na 40 - 50 °C tokom 2 sata. Dobiti N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3-d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat (130 mg, 48 %) kao beli kristalni prah.

[0039]<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz): 0.79 (m, 2H), 0.86 (m, 2H), 1.05 - 1.15 (m, 4H), 1.44 (s, 3H), 1.5 (m, 1H), 2.62 (s, 6H), 2.74 (m, 1H), 3.21 (s, 3H), 6.7 (t, 1H), 7.03 (m, 1H), 7.31 - 7.4 (m, 2H), 7.45 (d, 1H), 7.53 (d, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 11.3 (s, 1H).

[0040] Primer 2. Određivanje termodinamske rastvorljivosti jedinjenja formule 1 i Trametinib prototipa. Pomešati 5 mg jedinjenja iz studije sa 1 mL univerzalnog pufera (Pion Ltd), pH = 2.0; 4.0 ili 7.0 tokom 15 min na 25 °C. Primeniti dodatne količine supstanci dok rastvor ne postane zamućen. Inkubirati bočice sa rastvorom tokom 24 h na 25 °C uz mešanje da bi se postigla ravnoteža između zasićenog rastvora i taloga. Nakon uravnoteženja filtrirati 200 mL rastvora (u duplikatu) kroz filter ploču sa 96-bunarića (Millipore) da se odvoji talog. Odrediti koncentracije jedinjenja u filtratu pomoću spektrofotometrije primenom standardne kalibracione krive. Izvršiti merenje optičkog spektra apsorpcije supstance i ucrtati kalibracionu krivu pri odabranoj talasnoj dužini (koja uobičajeno odgovara maksimumu apsorpcije supstance λmax). Izračunati koncentraciju supstance u filtratu (tj., rastvorljivost) pomoću sledeće jednačine:

gde:

ODxmaxfiltrat = apsorpcija filtrata:

1

ODλmaxslepa proba = apsorpcija rastvora slepe probe bez supstance;

Nagib = nagib kalibracione krive;

1.67 = faktor razblaženja za filtrat u acetonitrilu;

Razblaženje filtrata = faktor razblaženja za filtrat u puferu.

[0041] Rezultati su prikazani u Tabeli 1.

[0042] Primer 3. Test. Supstance su ispitane za efekat na MEK1 kinaznu aktivnost primenom Z’-LYTE platforme za skrining (Life Technologies). Koncentracija DMSO u reakcionoj smeši je bila 1 %. Razblažiti 100 nL 100-strukih zaliha (eng. sinks) supstanci iz studije u 100 % DMSO-u u 2.4 mL kinaznog pufera (50 mM HEPES pH 7.5, 0.01 % BRIJ-35, 10 mM mgCl2, 1 mM EGTA) i dodati u 5 mL 2-struke smeše supstrat/kinaza (MEK1 /inaktiviran MARK1(ERK2)/Ser/Thr03, finalni sadržaj 0.08 - 0.31 ng od MEK1, 105 ng od inaktiviranog MARK1 (ERK2), i 2 mM od Ser/Thr03) u ploči sa 384-bunarića (crna, male zapremine koju izrađuje Corning, κaT. #3676). Prethodno inkubirati supstance sa kinazama tokom 10 min na ambijentalnoj temperaturi. Nakon toga dodati 2.5 mL 4-strukog ATP rastvora da se započne reakcija (finalna koncentracija ATP-a u reakcionoj smeši je 100 mM). Nakon 30 sekundi inkubacije na šejkeru inkubirati reakciju tokom 60 min na ambijentalnoj temperaturi. Zatim dodati 5 mL Reagensa B (Life Technologies) razblaženog kao 1:1024 i inkubirati tokom još 60 min na ambijentalnoj temperaturi. Izmeriti fluorescenciju sa ekscitacijom pri 400 nM i emisijom pri 445 nM i 520 nM. Izračunati stepen fosforilacije peptidnog supstrata pomoću jednačine ispod (nizak odnos emisije znači da je peptid fosforilisan, tj. kinazna aktivnost nije inhibirana a visok odnos emisije znači da peptid nije fosforilisan, tj. kinazna aktivnost je inhibirana).

[0043] Izračunati % fosforilacije kako sledi:

[0044] Izračunati % inhibicije kako sledi:

gde:

C100%= prosečan emisioni signal kumarina, 100 % fosforilaciona kontrola;

C0%= prosečan emisioni signal kumarina, 0 % fosforilaciona kontrola;

F100%= prosečan emisioni signal fluoresceina, 100 % fosforilaciona kontrola;

F0%= prosečan emisioni signal fluoresceina, 0 % fosforilaciona kontrola.

[0045] Primer 4. Studija efikasnosti u modelu ksenografta humanog melanoma. Studija je izvedena u ProQinase GmbH Freiburg, Ulica Breisacher 117, D-79106 Freiburg, Nemačka.

[0046] Ćelije A375 humanog melanoma su kultivisane u bočicama sa DMEM medijumom uz dodatak 10 % FBS u vlažnoj atmosferi koja sadrži 95 % vazduha i 5 % CO2 na 37 °C. Ćelije kancera su pasažirane životinjama nakon perioda adaptacije. U tu svrhu ćelije su prikupljenenprimenom TrypLE Express (Invitrogen), oprane i suspendovane u sterilnom PBS do konačne koncentracije 3 x 10<7>ćelija/mL. Ova suspenzija ćelija je injektirana supkutano (SC) u leve bokove miševa (3 x 10<6>ćelija ili 100 mL po mišu).

[0047] Kada prosečna veličina tumora dostigne 100 - 200 mM<3>životinje su podeljene u eksperimentalne grupe i lečenje lekovima započinje. Proizvodi su administrirani intragastrično dnevno, dok je kontrolna grupa primila rastvarač. Doze eksperimentalnog proizvoda su predstavljene u Tabeli 2.

Tabela 2. Doze proizvoda u studiji efikasnosti u modelu ksenografta humanog melanoma

[0048] Ključni izmereni parametri:

Merenje supkutano implantiranih tumora je izvedeno 2 puta nedeljno počevši od dana uvođenja ćelija. Zapremina tumora (mm<3>) je određena pomoću jednačine:

gde L odgovara maksimalnom, a W minimalnom prečniku (mm) prečnika. Merenja su izvedena korišćenjem kliznog kalipera.

[0049] Studija je uključila izrčunavanje vrednosti inhibicije rasta tumora:

gde:

Vctrl= prosečna zapremina tumora u kontrolnoj grupi;

Vexp= prosečna zapremina tumora u eksperimentalnoj grupi.

[0050] Takođe, zdravlje i ponašanje životinja su posmatrani, broj smrtnih ishoda i regresija tumora su zabeleženi:

gde:

Vini= početna zapremina tumora na početku lečenja;

Vfin= zapremina tumora na kraju lečenja.

[0051] Merenje težina životinja je izvođeno 3 puta nedeljno.

Tabela 3. Parametri inhibicije tumora nakon 21 dana lečenja (T/C)

[0052] Slika 2 prikazuje dinamiku rasta tumora A375 melanoma u modelu ksenografta tokom lečenja Mekinistom i jedinjenjem formule 1.

[0053] Jedinjenje formule 1 je ispoljilo dozno-zavisnu inhibiciju rasta tumora i regresiju koja je uporediva sa intenzitetom efekta Mekinista. Međutim, različito od Mekinista, jedinjenje formule 1 nije uzrokovalo smrt životinja pri nijednoj dozi iz studije (lečenje

1

Mekinistom je dovelo do kritičnog gubitka težine i smrti dve životinje) i samo je umereno redukovalo težinu životinja pri maksimalnoj ispitivanoj dozi. Ovo podrazumeva manje toksičnosti jedinjenja formule 1 u poređenju sa Mekinistom bez gubitka efikasnosti lečenja melanoma.

[0054] Primer 5. Priprema leka u tabletama. Pomešati 1600 mg skroba, 1600 mg samlevene laktoze, 400 mg talka i 1000 mg inhibitora formule 1, i komprimovati u pločicu. Samleti ovu pločicu u granule i prosejati prikupljajući granule veličine od 14 -16 mesh-a. Komprimovati ove granule u tablete odgovarajućih oblika (500 mg svaka).

[0055] Primer 6. Priprema leka u kapsulama. Pomešati inhibitor formule 1 sa laktozom (2:1). Napuniti ovu smešu praškova u želatinske kapsule odgovarajuće veličine (600 mg svaka).

[0056] Primer 7. Priprema leka kao kompozicije za intramuskularne, intraperitonealne ili subkutane injekcije. Pomešati 500 mg inhibitora formule 1 sa 300 mg hlorobutanola, 2 mL propilen glikola i 100 mL vode za injekcije. Filtrirati rastvor i napuniti u ampule od 1 mL, koje se zatim zatvaraju.

Industrijska primenjivost

[0057] Stručnjaci iz ove oblasti mogu lako razumeti razne nekritične parametre, koji se mogu menjati ili modifikovati da se dobiju isti rezultati. Razne modifikacije pronalaska, dodatno onim koje su ovde opisane, bi bile očigledne stručnjacima u ovoj oblasti iz opisa koji je dat iznad.

Claims

Patentni zahtevi 1. N-{3-[3-ciklopropil-5-(2-fluoro-4-jodofenilamino)-6,8-dimetil-2,4,7-triokso-3,4,6,7-tetrahidro-2H-pirido[4,3- d]pirimidin-1-il]-fenil}-ciklopropankarboksamid dimetil sulfoksid solvat formule 1:
2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za primenu u profilaksi i/ili lečenju kancera koji je u vezi sa MEK1, MEK2 i MEK1/2, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, pomenuti pedijatrijski tumor je odabran od Ewing-ovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma.
3. Jedinjenje za primenu prema patentnom zahtevu 2 pri čemu je kancer maligni melanom.
4. Farmaceutska kompozicija koja sadrži terapijski efikasnu količinu jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 kao aktivni sastojak, i farmaceutski prihvatljive ekscipijense za primenu u profilaksi i/ili lečenju kancera koji je u vezi sa MEK1, MEK2 i MEK1/2, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, navedeni pedijatrijski tumor je odabran od Ewingovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma.
5. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 4 pri čemu je kancer maligni melanom.
6. Farmaceutska kompozicija za primenu prema patentnom zahtevu 4 pri čemu je kompozicija u obliku tableta, kapsula ili injekcija.
7. Lek koji sadrži jedinjenje prema patentnom zahtevu 1 za primenu u profilaksi i/ili lečenju kancera koji je u vezi sa MEK1, MEK2 i MEK1/2, pomenuti kancer je odabran od tumora mozga, kancera jednjaka, kancera želuca, kancera jetre, kancera pankreasa, kolorektalnog kancera, kancera pluća, kancera bubrega, kancera dojke, kancera jajnika, kancera prostate, kancera kože, neuroblastoma, sarkoma, osteohondroma, osteoma, osteosarkoma, seminoma, ekstragonadalnih tumora, testikularnog tumora, kancera materice, kancera glave i tumora vrata, multiplog mijeloma, malignog limfoma, prave policitemije, leukemije, strume, kancera pelvisa, tumora uretre, tumora bešike, kancera žučne kese, kancera žučnog kanala, malignog melanoma, i pedijatrijskog tumora, navedeni pedijatrijski tumor je odabran od Ewing-ovog sarkoma, Wilms-ovog tumora, rabdomiosarkoma, vaskularnog sarkoma, embrionalnog testikularnog kancera, neuroblastoma, retinoblastoma, hepatoblastoma, i nefroblastoma. 1
8. Lek za primenu prema patentnom zahtevu 7 pri čemu je kancer maligni melanom.
9. Postupak za primenu farmaceutske kompozicije prema patentnom zahtevu 4 mešanjem terapijski efikasne količine jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 sa farmaceutski prihvatljivim ekscipijensima.
10. Postupak za pripremu jedinjenja prema patentnom zahtevu 1 koji uključuje interakciju jedinjenja prema formuli 2 ili njegove soli sa ciklopropankarboksilnom kiselinom ili njenim aktiviranim derivatom:

1