RS62623B1 - Receptori t-ćelija - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na receptore T-ćelija (TCR) koji vezuju HLA-A*0201 ograničeni dekapeptid GVYDGREHTV izveden iz antigena povezanog sa melanomom (MAGE) A4 proteina (aminokiseline 230 - 239). TCR-ovi ovog pronalaska pokazuju odlične profile specifičnosti za ovaj MAGE epitop.

Pozadina pronalaska

[0002] Kancer-testis antigeni (CTA) su potklasa antigena povezanih sa tumorom (TAA) koje kodiraju približno 140 gena. Ekspresija ovih antigena ograničena je u imunski privilegovanim mestima kao što su testisi, placenta i fetalni jajnik; obično se ne eksprimiraju u drugim tkivima. Ekspresija ovih gena primećena je kod malignih tumora. Imunogenost CTA dovela je do široko rasprostranjenog razvoja vakcina za kancer koje ciljaju ove antigene kod mnogih čvrstih tumora. Unutar ove velike klase TAA, antigeni povezani sa melanomom (MAGE) pojavili su se kao kandidati za imunoterapiju kancera koji obećavaju.

[0003] Prijavljeno je da više od 30 kancer-testis (CT) gena predstavlja članove višegenskih familija koje su organizovane u klastere gena na X hromozomu (CT-X antigeni). Klasteri CT gena smešteni su između Xq24 i Xq28 i uključuju genske familije kao što su MAGE i NY-ESO-1. Najopsežnije su okarakterisani klasteri gena I MAGE tipa i uključuju MAGE-A, MAGE-B i MAGE-C familije. MAGE-A proteine kodiraju 12 različitih članova genske familije MAGE-A (MAGE-A1 do MAGE-A12), a definiše ih očuvana 165-171 aminokiselinska baza, zvana MAGE homologni domen (MHD). MHD odgovara jedinom regionu čije aminokiseline dele svi članovi familije MAGE-A.

[0004] T-ćelije prepoznaju i stupaju u interakciju sa kompleksima molekula na površini ćelije, koji se nazivaju humanim leukocitnim antigenima („HLAˮ) ili glavnim kompleksima histokompatibilnosti („MHCˮ) i peptidima. Peptidi su izvedeni iz većih molekula, koje obrađuju ćelije koje takođe predstavljaju HLA/MHC molekul. Interakcija T-ćelija i HLA/peptid kompleksa je ograničena, pri čemu zahteva T-ćeliju specifičnu za određenu kombinaciju HLA molekula i peptida. Ako specifična T-ćelija nije prisutna, odgovora T-ćelija nema čak i ako je njegov partnerski kompleks prisutan. Slično tome, nema odgovora ukoliko je specifični kompleks odsutan, a T-ćelija prisutna. Taj mehanizam je uključen u odgovor imunog sistema na infekciju, kod autoimune bolesti, i kod odgovora na abnormalnosti kao što su tumori.

[0005] Neki proteini iz genske familije MAGE eksprimiraju se isključivo kod germinativnih ćelija i kancera (MAGE-A do MAGE-C familije). Drugi se naširoko eksprimiraju u normalnim tkivima (MAGE-D do MAGE-H). Sve ove familije MAGE proteina imaju homologni region koji je blisko usklađen sa sekvencom drugih MAGE proteina i obuhvata peptide prikazane kao HLA/peptid komplekse u imunskom prepoznavanju. EP1930433 opisuje HLA-A24-ograničen, MAGE-A4143-151-specifičan receptor T-ćelija. Stoga, važno je izabrati TCR kliničke kandidate koji su visokospecifični za željeni MAGE peptid/HLA-A2 antigen.

[0006] MAGE A4 je CTA član MAGE A genske familije. Iako se smatra da bi mogao imati ulogu u embrionalnom razvoju, njegova funkcija je nepoznata. U patogenezi tumora, čini se da je uključen u transformaciju tumora ili aspekte progresije tumora. MAGE A4 je umešan u veliki broj tumora, uključujući seminom, kongenitalnu diskeratozu, melanom, hepatocelularni karcinom, karcinom renalnih ćelija, kancer pankreasa, kancer pluća, kancer debelog creva i kancer dojke. Peptid GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) odgovara brojevima aminokiselinskih ostataka 230-239 poznatog MAGE-A4 proteina.

[0007] MAGE B2 je CTA MAGE B genske familije. MAGE B2 se eksprimira u testisima i placenti, kao i u značajnom delu tumora različitih histoloških tipova. Peptid GVYDGEEHSV (SEQ ID No.2) prikazuje unakrsnu reaktivnost sa MAGE A4, tako da se određeni TCR-ovi mogu vezati za HLA molekule koji prikazuju oba peptida.

Kratak sadržaj pronalaska

[0008] Razvijen je TCR koji se vezuje za HLA molekule koji prikazuju MAGE A4 peptid GVYDGREHTV pre nego MAGE B2. U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje receptor T-ćelija (TCR) sa svojstvom vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*0201 sa konstantom disocijacije od oko 0,05 µM do oko 20,0 µM na osnovu merenja sa rezonancijom površinskog plazmona na 25°C i sa pH između 7,1 i 7,5 uz upotrebu rastvorljivog oblika TCR-a, pri čemu taj TCR obuhvata varijabilni domen alfa lanca TCR-a i varijabilni domen beta lanca TCR-a, i pri čemu TCR varijabilni domeni obrazuju kontakte najmanje sa ostacima V2, Y3 i D4 iz GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1).

[0009] U načinima ostvarivanja, TCR prema ovom otkrivanju ima svojstvo vezivanja za GVYDGEEHSV (SEQ ID No: 2) u kompleksu sa HLA-A*0201 sa konstantom disocijacije od oko 20 µM do oko 50 µM na osnovu merenja sa rezonancijom površinskog plazmona na 25°C i sa pH između 7,1 i 7,5 uz upotrebu rastvorljivog oblika TCR-a, pri čemu taj TCR obuhvata varijabilni domen alfa lanca TCR-a i varijabilni domen beta lanca TCR-a. U nekim načinima ostvarivanja, konstanta disocijacije je iznad 50mikroM, kao što je 100µM, 200µM, 500µM ili više.

[0010] Stoga se TCR prema ovom otkrivanju može efikasno vezivati za HLA koji prikazuje GVYDGREHTV, ali ne i za HLA koji prikazuje GVYDGEEHSV.

[0011] U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, varijabilni domen alfa lanca TCR-a obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-111 iz SEQ ID No: 3 (alfa lanac) i/ili varijabilni domen beta lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-111 iz SEQ ID No: 4 (beta lanac).

[0012] U daljem aspektu, ovo otkrivanje obezbeđuje receptor T-ćelija (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*0201 i koji obuhvata varijabilni domen alfa lanca TCR-a i varijabilni domen beta lanca TCR-a,

varijabilni domen alfa lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-111 iz SEQ ID No: 3, i/ili

varijabilni domen beta lanca koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-111 iz SEQ ID No: 4.

[0013] GVYDGREHTV HLA-A2 kompleks obezbeđuje tumor marker koji TCR-ovi ovog pronalaska mogu ciljati. Ovaj pronalazak obezbeđuje takve TCR-ove korisne za potrebe dostavljanja citotoksičnih ili agenasa imunoefektora ćelijama kancera i/ili korisne za upotrebu u adoptivnoj terapiji.

[0014] TCR-ovi su opisani pomoću Međunarodne imunogenetske (IMGT) TCR nomenklature i veza do IMGT javne baze podataka TCR sekvenci. Nativni alfa-beta heterodimerni TCR-ovi imaju alfa lanac i beta lanac. Uopšteno govoreći, svaki lanac obuhvata varijabilne, spojne i konstantne regione, a beta lanac obično sadrži i kratki region raznolikosti između varijabilnih i spojnih regiona, ali se ovaj region raznolikosti često smatra delom spojnog regiona. Svaki varijabilni region obuhvata tri CDR-a (regiona koji određuju komplementarnost) fiksirana u sekvencu okvira, pri čemu jedan predstavlja hipervarijabilni region zvani CDR3. Postoje nekoliko tipova varijabilnih (Vα) regiona alfa lanca i nekoliko tipova varijabilnih (Vβ) regiona beta lanca koji se razlikuju po njihovom okviru, CDR1 i CDR2 sekvencama, kao i delimično definisanoj CDR3 sekvenci. Vα tipovi se u IMGT nomenklaturi označavaju jedinstvenim TRAV brojem. Prema tome, „TRAV21ˮ definiše TCR Vα region sa jedinstvenim okvirom i CDR1 i CDR2 sekvencama, kao i CDR3 sekvencom koja je delimično definisana aminokiselinskom sekvencom koja je očuvana iz TCR-a u TCR, ali koja uključuje i aminokiselinsku sekvencu koja varira iz TCR-a u TCR. Na isti način, „TRBV5-1ˮ definiše TCR Vβ region sa jedinstvenim okvirom i CDR1 i CDR2 sekvencama, ali samo sa delimično definisanom CDR3 sekvencom.

[0015] Spojni regioni TCR-a se slično definišu jedinstvenom IMGT TRAJ i TRBJ nomenklaturom, a konstantni regioni IMGT TRAC i TRBC nomenklaturom.

[0016] Region raznolikosti beta lanca se u IMGT nomenklaturi označava skraćenicom TRBD, a, kao što je pomenuto, međusobno spojeni TRBD/TRBJ regioni često se zajedno smatraju spojnim regionom.

[0017] Za α i β lance αβ TCR-a generalno se smatra da svaki ima dva „domenaˮ, to jest varijabilni i konstantni domen. Varijabilni domen se sastoji od konkatenacije varijabilnog regiona i spojnog regiona.

Stoga se, u ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima, pojam „TCR alfa varijabilni domenˮ odnosi na konkatenaciju TRAV i TRAJ regiona, dok se pojam TCR alfa konstantni domen odnosi na ekstracelularni TRAC region ili na C-terminalno skraćenu TRAC sekvencu. Slično tome, pojam „TCR beta varijabilni domenˮ odnosi se na konkatenaciju TRBV i TRBD/TRBJ regiona, dok se pojam TCR beta konstantni domen odnosi na ekstracelularni TRBC region ili na C-terminalno skraćenu TRBC sekvencu.

[0018] Jedinstvene sekvence definisane IMGT nomenklaturom naširoko su poznate i dostupne stručnjacima iz TCR oblasti. Na primer, mogu se naći u IMGT javnoj bazi podataka. "T cell Receptor Factsbook", (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8 takođe opisuje sekvence definisane IMGT nomenklaturom, ali se zbog njenog datuma izdavanja, a samim tim i vremenskog kašnjenja, informacije u njoj moraju ponekad potvrditi referencom na IMGT bazu podataka.

[0019] Jedan TCR prema ovom pronalasku obuhvata ekstracelularni domen alfa lanca kao što je prikazano u SEQ ID No: 3 (TRAV10 TRAC) i ekstracelularni domen beta lanca kao što je prikazano u SEQ ID No: 4 (TRBV24-1 TRBC-2). Pojmovi „roditeljski TCRˮ, „roditeljski MAGE-A4 TCRˮ, ovde se koriste kao sinonimi za označavanje ovog TCR-a koji redom obuhvata ekstracelularni alfa i beta lanac iz SEQ ID No: 3 i 4. Poželjno je obezbediti TCR-ove koji su mutirani ili modifikovani u odnosu na roditeljski TCR, koji imaju viši afinitet za peptid-HLA kompleks i/ili sporiju brzinu razdvajanja od njega u odnosu roditeljski TCR.

[0020] Za potrebe obezbeđivanja referentnog TCR-a spram kog se može uporediti profil vezivanja takvih mutiranih ili modifikovanih TCR-ova, pogodno je koristiti rastvorljivi TCR prema ovom pronalasku, koji ima ekstracelularnu sekvencu roditeljskog MAGE-A4 TCR alfa lanca datu u SEQ ID No.3 i ekstracelularnu sekvencu roditeljskog MAGE-A4 TCR beta lanca datu u SEQ ID No: 4. Taj se TCR ovde označava kao „referentni TCRˮ ili „referentni MAGE-A4 TCRˮ. Treba zapaziti da SEQ ID No: 5 obuhvata ekstracelularnu sekvencu roditeljskog alfa lanca iz SEQ ID No: 3 i da je C162 supstituisan za T162 (tj. T48 iz TRAC-a). Slično tome, SEQ ID No: 6 je ekstracelularna sekvenca roditeljskog beta lanca iz SEQ ID No: 4 i taj je C169 supstituisan za S169 (tj. S57 iz TRBC2), A187 je supstituisan za C187, a D201 je supstituisan za N201. Ove cisteinske supstitucije u odnosu na ekstracelularne sekvence roditeljskih alfa i beta lanaca omogućavaju obrazovanje međulančane disulfidne veze koja stabilizuje ponovo savijeni rastvorljivi TCR, tj. TCR obrazovan ponovnim savijanjem ekstracelularnih alfa i beta lanaca. Upotreba stabilnog rastvorljivog TCR-a sa disulfidnom vezom kao referentnog TCR-a omogućava zgodniju procenu vezujućeg afiniteta i poluživota vezivanja. TCR-ovi ovog pronalaska mogu obuhvatati gore opisane mutacije.

[0021] TCR-ovi ovog pronalaska mogu biti oni koji se ne javljaju prirodno i/ili prečišćeni i/ili inženjerisani. TCR-ovi ovog pronalaska mogu imati više od jedne mutacije prisutne u varijabilnom domenu alfa lanca i/ili varijabilnom domenu beta lanca u odnosu na roditeljski TCR. „Inženjerisani TCRˮ i „mutant TCRˮ ovde se koriste kao sinonimi i generalno označavaju TCR koji ima uvedenu jednu mutaciju ili više njih u odnosu na roditeljski TCR, naročito u njegov varijabilni domen alfa lanca i/ili varijabilni domen beta lanca. Ova(e) mutacija(e) može(gu) poboljšati vezujući afinitet za GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*020101. U određenim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, postoji 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ili 8 mutacija u varijabilnom domenu alfa lanca, na primer 4 ili 8 mutacija, i/ili 1, 2, 3, 4 ili 5 mutacija u varijabilnom domenu beta lanca, na primer 5 mutacija. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, varijabilni domen α lanca TCR-a ovog pronalaska može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 % ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1- 111 iz SEQ ID No: 3. U nekim načinima ostvarivanja ovog otkrivanja, varijabilni domen β lanca TCR-a ovog pronalaska može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98 % ili najmanje 99% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-111 iz SEQ ID No: 4.

[0022] Varijabilni domen alfa lanca TCR-a ovog pronalaska može imati sledeću mutaciju:

uz pozivanje na numerisanje prikazano u SEQ ID No: 3, i/ili

varijabilni domen beta lanca može imati najmanje jednu od sledećih mutacija:

uz pozivanje na numerisanje prikazano u SEQ ID No: 4.

[0023] Varijabilni domen alfa lanca TCR-a ovog pronalaska može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu aminokiselinskih ostataka 1-105 iz SEQ ID No:3, 5 ili 7 do 8

ili aminokiselinsku sekvencu u kojoj su njeni aminokiselinski ostaci 1-27, 34-47 i 54-90 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-27, 34-47 i 54-90 tim redom iz SEQ ID No: 3, 5 ili 7 do 8 i u kojoj su aminokiselinski ostaci 28-33, 48-53 i 91-105 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 28-33, 48-53 i 91-105 tim redom iz SEQ ID No: 3, 5 ili 7 do 8.

[0024] Prema ovom pronalasku, u varijabilnom domenu alfa lanca, sekvenca

(i) njenih aminokiselinskih ostataka 1-26 može biti (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-26 iz SEQ ID No: 3 ili (b) može imati jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a);

(ii) aminokiselinskih ostataka 28-33 je VSPFSN

(iii) njenih aminokiselinskih ostataka 33-49 može biti (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 34-47 iz SEQ ID NO: 3 ili (b) može imati jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a);

(iv) aminokiselinskih ostataka 48-53 može biti LTIMTF ili LTRMTF ili LTIVTF ili LTILTF

(v) njenih aminokiselinskih ostataka 55-89 može biti najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 54-90 iz SEQ ID No: 3 ili može imati jedno, dva ili tri umetanja, brisanja ili supstitucije u odnosu na nju;

(vi) aminokiselina 90-93 može biti CWSGGTDSWGKLQF

[0025] Varijabilni domen beta lanca TCR-a ovog pronalaska može obuhvatati aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID No: 4 ili 6 ili 9

ili aminokiselinsku sekvencu u kojoj su njeni aminokiselinski ostaci 1-45, 51-67, 74-109 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-45, 51-67, 74-109 tim redom iz SEQ ID No: 4 ili 9 i u kojoj su aminokiselinski ostaci 46-50, 68-73 i 109-123 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 46-50, 68-73 i 109-123 tim redom iz SEQ ID No: 4 ili 9.

[0026] U varijabilnom domenu beta lanca, sekvenca

(i) njenih aminokiselinskih ostataka 1-45 može biti (a) najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci ostataka 1-45 iz SEQ ID No: 4 ili (b) može imati jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a);

(ii) aminokiselinskih ostataka 46-50 može biti KGHDR;

(iii) njenih aminokiselinskih ostataka 51-67 može biti (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 51-67 iz SEQ ID NO: 4 ili (b) može imati jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a);

(iv) aminokiselinskih ostataka 68-73 može biti SVFDK;

(v) njenih aminokiselinskih ostataka 54-90 može biti (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 54-90 iz SEQ ID NO: 4 ili (b) može imati jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a);

(vi) aminokiselina 109-123 je CATSGQGAYNEQFF ILI CATSGQGAYREQFF;

[0027] TCR ovog pronalaska može imati jednu od sledećih kombinacija varijabilnih domena alfa i beta lanaca:

[0028] Unutar obima ovog otkrivanja su fenotipski tihe varijante bilo kog ovde otkrivenog TCR-a ovog pronalaska. Podrazumeva se da se pojam „fenotipski tihe varijante”, kao što se ovde koristi, odnosi na TCR koji inkorporiše jednu dalju aminokiselinsku promenu ili više njih pored gore izloženih promena, pri čemu taj TCR ima fenotip sličan odgovarajućem TCR-u bez pomenute(ih) promene(a). Za potrebe ove prijave, TCR fenotip obuhvata specifičnost vezivanja antigena (KDi/ili poluživot vezivanja) i antigensku specifičnost. Fenotipski tiha varijanta može imati KDi/ili poluživot vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A*0201 kompleks unutar 10% od izmerenog KDi/ili poluživota vezivanja odgovarajućeg TCR-a bez pomenute(ih) promene(a), na osnovu merenja u identičnim uslovima (na primer na 25°C i na istom SPR čipu). Pogodni uslovi su dalje definisani u Primeru 3. Antigenska specifičnost je dalje opisana u nastavku. Kao što je poznato stručnjacima iz ove oblasti, možda je moguće proizvesti TCR-ove koji inkorporišu promene u njihovim konstantnim i/ili varijabilnim domenima u poređenju sa onima koji su gore detaljno opisani bez menjanja afiniteta za interakciju sa GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A*0201 kompleksom. Određenije, takve se tihe mutacije mogu inkorporisati unutar delova sekvence za koje se zna da nisu direktno uključeni u vezivanje antigena (npr. izvan CDR-ova). Takve trivijalne varijante uključene su u obim ovog otkrivanja. Ti TCR-ovi u kojima je izvedena jedna konzervativna supstitucija ili više njih takođe čine deo ovog pronalaska.

[0029] Mutacije se mogu izvoditi pomoću bilo kog prikladnog postupka uključujući, ali ne ograničavajući se na, postupke zasnovane na reakciji lančane polimeraze (PCR), kloniranju zasnovanom na restrikcionim enzimima ili procedurama za kloniranje nezavisno od ligacije (LIC). Ti postupci su detaljno opisani u mnogim standardnim udžbenicima molekularne biologije. Za više detalja koji se tiču reakcije lančane polimeraze (PCR) i kloniranja zasnovanog na restrikcionim enzimima, vidi Sambrook & Russell, (2001) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (3rd Ed.) CSHL Press. Više informacija o procedurama za kloniranje nezavisno od ligacije (LIC) može se pronaći u Rashtchian, (1995) Curr Opin Biotechnol 6(1): 30-6.

[0030] TCR-ovi ovog pronalaska imaju svojstvo vezivanja MAGE-A4 peptida, GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) HLA-A2 kompleksa. Utvrđeno je da su TCR-ovi ovog pronalaska visoko specifični za te MAGE epitope u odnosu na druge, irelevantne epitope i stoga su naročito pogodni kao ciljajući vektori za dostavljanje terapijskih agenasa ili oznaka koje se mogu detektovati, ćelijama i tkivima koja prikazuju te epitope. Specifičnost u kontekstu TCR-ova ovog pronalaska odnosi se na njihovu sposobnost da prepoznaju HLA-A*0201 ciljne ćelije koje su pozitivne na peptid GVYDGREHTV, pri čemu imaju minimalnu sposobnost da prepoznaju HLA-A*0201 ciljne ćelije koje su negativne na peptid, ili HLA ćelije koje prikazuju MAGE B2 peptid GVYDGEEHSV. Kako bi se testirala specifičnost, TCR-ovi mogu biti u rastvorljivom obliku i/ili se mogu eksprimirati na površini T-ćelija. Prepoznavanje se može utvrditi merenjem nivoa aktiviranja T-ćelija u prisustvu TCR-a i ciljne ćelije. U tom slučaju, minimalno prepoznavanje peptid negativnih ili MAGE B2 ciljnih ćelija definisano je kao nivo aktiviranja T-ćelija koji je manji od 10%, poželjno manji od 5% i poželjnije manji od 1% nivoa proizvedenog u prisustvu peptid pozitivnih ciljnih ćelija, na osnovu merenja u istim uslovima. Za rastvorljive TCR-ove ovog pronalaska, specifičnost se može utvrditi na terapijski relevantnoj TCR koncentraciji. Terapijski relevantna koncentracija može se definisati kao TCR koncentracija od 10<-9>M ili manje, i/ili koncentracija do 100, poželjno do 1000, pri čemu je umnožak veći od odgovarajuće EC50 vrednosti. Peptid pozitivne ćelije mogu se dobiti pulsiranjem peptida ili, poželjnije, mogu prirodno predstavljati pomenuti peptid. I peptid pozitivne i peptid negativne ćelije poželjno su humane ćelije.

[0031] Utvrđeno je da su određeni TCR-ovi ovog otkrivanja veoma pogodni za upotrebu u adoptivnoj terapiji. Takvi TCR-ovi mogu imati KDza kompleks manji od 200 µM, na primer od oko 0,05 µM do oko 20 µM ili oko 100 µM i/ili imati poluživot vezivanja (T1⁄2) za kompleks u opsegu oko 0,5 sekundi do oko 12 minuta. U nekim načinima ostvarivanja, TCR-ovi ovog otkrivanja mogu imati KDza kompleks od oko 0,05 µM do oko 20 µM, oko 0,1 µM do oko 5 µM ili oko 0,1 µM do oko 2 µM. Iako nema želje za ograničavanjem postojećom teorijom, čini se da postoji optimalan okvir afiniteta za TCR-ove sa terapijskom upotrebom u adoptivnoj ćelijskoj terapiji. TCR-ovi koji se prirodno javljaju, koji prepoznaju epitope iz antigena tumora generalno imaju prenizak afinitet (20 mikroM do 50 mikroM), a TCR-ovi veoma visokog afiniteta (u nanomolekulskom ili višem opsegu) pate od problema unakrsne reaktivnosti (Robbins et al (2008) J. Immunol.1806116-6131; Zhao et al (2007) J. Immunol.1795845-5854; Scmid et al (2010) J. Immunol 1844936-4946).

[0032] TCR-ovi ovog pronalaska mogu biti αβ heterodimeri ili mogu biti u jednolančanom formatu.

Jednolančani formati uključuju αβ TCR polipeptide Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ ili Vα-L-Vβ-Cβ tipova, pri čemu Vα i Vβ redom predstavljaju TCR α i β varijabilne regione, Cα i Cβ redom predstavljaju TCR α i β konstantne regione, a L predstavlja linker sekvencu. Za upotrebu kao ciljajući agens za dostavljanje terapijskih agenasa ćeliji koja predstavlja antigen, TCR može biti u rastvorljivom obliku (tj. bez transmembranskih ili citoplazmatskih domena). Radi stabilnosti, rastvorljivi αβ heterodimerni TCR-ovi poželjno imaju uvedenu disulfidnu vezu između ostataka odgovarajućih konstantnih domena, kao što je opisano, na primer, u WO 03/020763. Jedan konstantan domen ili oba prisutna u αβ heterodimeru ovog pronalaska mogu biti skraćena na C-terminusu ili C-terminusima, na primer za do 15 ili do 10 ili do 8 ili manje aminokiselina. Za upotrebu u adoptivnoj terapiji, αβ heterodimerni TCR može se, na primer, transfektovati kao lanci punih dužina koji imaju i citoplazmatske i transmembranske domene. TCR-ovi za upotrebu u adoptivnoj terapiji mogu sadržati disulfidnu vezu koja odgovara vezi pronađenoj u prirodi između odgovarajućih alfa i beta konstantnih domena, dodatno ili alternativno može biti prisutna nenativna disulfidna veza.

[0033] Stručnjacima iz ove oblasti biće očigledno da se obezbeđene sekvence mogu skratiti na njihovom C-terminusu i/ili N-terminusu, za 1, 2, 3, 4, 5 ili više ostataka, bez suštinskog uticaja na vezujuće karakteristike TCR-a. Ovim otkrivanjem obuhvaćene su sve takve trivijalne varijante.

[0034] Alfa-beta heterodimerni TCR-ovi ovog pronalaska obično obuhvataju sekvencu konstantnog domena TRAC alfa lanca i sekvencu konstantnog domena TRBC1 ili TRBC2 beta lanca. Sekvence konstantnih domena alfa i beta lanaca mogu se modifikovati skraćivanjem ili supstitucijom kako bi se izbrisala nativna disulfidna veza između Cys4 eksona 2 TRAC-a i Cys2 eksona 2 TRBC1 ili TRBC2. Sekvence konstantnih domena alfa i beta lanaca mogu se takođe modifikovati supstitucijom cisteinskih ostataka za Thr 48 TRAC-a i Ser 57 TRBC1 ili TRBC2, pri čemu pomenuti cisteini obrazuju disulfidnu vezu između alfa i beta konstantnih domena TCR-a.

[0035] Neki TCR-ovi ovog otkrivanja imaju vezujući afinitet za, i/ili poluživot vezivanja za, GVYDGREHTV -HLA-A2 kompleks suštinski viši od referentnog MAGE-A4 TCR-a. Povećavanje vezujućeg afiniteta nativnog TCR-a često smanjuje specifičnost tog TCR-a za njegov peptid-MHC ligand, a to je demonstrirano u Zhao Yangbing et al., The Journal of Immunology, The American Association of Immunologists, US, vol.179, No.9, 1 November 2007, 5845-5854. Međutim, TCR-ovi ovog pronalaska koji su izvedeni iz roditeljskog TCR-a ostaju specifični za GVYDGREHTV-HLA-A2 kompleks, uprkos tome što imaju suštinski viši vezujući afinitet od roditeljskog TCR-a. Štaviše, oni su značajno više (npr. najmanje deset puta) selektivni za MAGE-A4 u odnosu na MAGE-B2, od roditeljskog TCR-a.

[0036] Vezujući afinitet (obrnuto proporcionalan ravnotežnoj konstanti KD) i poluživot vezivanja (izražen kao T1⁄2) mogu se utvrditi pomoću postupka rezonancije površinskog plazmona (BIAcore) iz Primera 3 u nastavku. Merenja se mogu izvoditi na 25°C i sa pH između 7,1 i 7,5 uz upotrebu rastvorljive verzije TCR-a. Podrazumeva se da udvostručavanje afiniteta TCR-a dovodi do toga da se KDprepolovi. T1⁄2 se računa

1

kao In2 podeljen sa brzinom razdvajanja (koff). Dakle, udvostručavanje T1⁄2 dovodi do toga da se koffprepolovi. Vrednosti KDi koffza TCR-ove obično se mere za rastvorljive oblike TCR-a, tj. one oblike koji se skraćuju kako bi se uklonili ostaci hidrofobnog transmembranskog domena. Prema tome, podrazumeva se da dati TCR ispunjava zahtev da ima vezujući afinitet za, i/ili poluživot vezivanja za, GVYDGREHTV-HLA-A2 kompleks ukoliko rastvorljivi oblik tog TCR-a ispunjava taj zahtev. Poželjno se vezujući afinitet ili poluživot vezivanja datog TCR-a meri nekoliko puta, na primer 3 ili više puta, pomoću istog protokola ispitivanja, i uzima se prosek rezultata. Referentni MAGE-A4 TCR ima KDpribližno 65 µM na osnovu merenja tim postupkom, a njegov koffje približno 0,73 s<-1>(tj. T1⁄2 je približno 0,95 s).

[0037] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira TCR ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, nukleinska kiselina je cDNK. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni domen α lanca TCR-a ovog pronalaska. U nekim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja obuhvata sekvencu koja kodira varijabilni domen β lanca TCR-a ovog pronalaska.

Nukleinska kiselina može biti ona koja se ne javlja prirodno i/ili prečišćena i/ili inženjerisana.

[0038] U drugom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu ovog pronalaska. Taj vektor je poželjno TCR ekspresioni vektor.

[0039] Ovaj pronalazak obezbeđuje i ćeliju koja sadrži vektor ovog pronalaska, poželjno TCR ekspresioni vektor. Taj vektor može obuhvatati nukleinsku kiselinu ovog pronalaska koja redom kodira alfa lanac i beta lanac u jednom otvorenom okviru čitanja ili dva različita otvorena okvira čitanja. Drugi aspekt obezbeđuje ćeliju koja sadrži prvi ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR-a ovog pronalaska i drugi ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR-a ovog pronalaska. Takve ćelije su naročito korisne u adoptivnoj terapiji. Ćelije ovog pronalaska mogu biti izolovane i/ili rekombinantne i/ili one koje se ne javljaju prirodno i/ili inženjerisane.

[0040] Pošto su TCR-ovi ovog pronalaska korisni u adoptivnoj terapiji, ovaj pronalazak uključuje ćeliju koja se ne javlja prirodno i/ili prečišćenu i/ili inženjerisanu ćeliju, naročito T-ćeliju, koja predstavlja TCR ovog pronalaska. Ovo otkrivanje takođe obezbeđuje proširenu populaciju T-ćelija koja predstavlja TCR ovog pronalaska. Postoji nekoliko postupaka prikladnih za transfekciju T-ćelija nukleinskom kiselinom (kao što je DNK, cDNK ili RNK) koja kodira TCR-ove ovog pronalaska (vidi na primer Robbins et al., (2008) J Immunol.180: 6116-6131). T-ćelije koje eksprimiraju TCR-ove ovog pronalaska biće prikladne za upotrebu u lečenju kancera koje je zasnovano na adoptivnoj terapiji. Stručnjacima iz ove oblasti biće poznato da postoji nekoliko prikladnih postupaka kojima se može izvesti adoptivna terapija (vidi na primer Rosenberg et al., (2008) Nat Rev Cancer 8(4): 299-308).

[0041] Rastvorljivi TCR-ovi ovog pronalaska korisni su za dostavljanje oznaka koje se mogu detektovati ili terapijskih agenasa ćelijama koje predstavljaju antigen i tkivima koja sadrže ćelije koje predstavljaju antigen. One se stoga mogu povezati (kovalentno ili na drugi način) sa oznakom koja se može detektovati (za potrebe dijagnostikovanja u kojima se TCR koristi za detektovanje prisustva ćelija koje predstavljaju GVYDGREHTV-HLA-A2 kompleks); terapijskim agensom; ili PK modifikujućom grupom (na primer PEGilacijom).

[0042] Oznake koje se mogu detektovati, za potrebe dijagnostikovanja uključuju na primer, fluorescentne oznake, radiooznake, enzime, probe na nukleinske kiseline i kontrastne reagense.

[0043] Kao što je ovde otkriveno, terapijski agensi koji se mogu povezati sa TCR-ovima ovog pronalaska uključuju imunomodulatore, radioaktivna jedinjenja, enzime (perforin na primer) ili hemoterapijske agense (cisplatin na primer). Kako bi se osiguralo da se toksični efekti primenjuju na željenu lokaciju, toksin može biti unutar lipozoma vezanog za TCR tako da se jedinjenje oslobađa polako. Time će se sprečiti štetni efekti tokom transporta u telu i osigurati da toksin ima maksimalni efekat nakon vezivanja TCR-a za relevantne ćelije koje predstavljaju antigen.

[0044] Drugi prikladni terapijski agensi uključuju:

• citotoksične agense malih molekula, tj. jedinjenja sa sposobnošću da ubiju ćelije sisara sa molekulskom masom manjom od 700 daltona. Takva jedinjenja mogu takođe sadržati toksične metale koji mogu imati citotoksični efekat. Pored toga, podrazumeva se da ovi citotoksični agensi malih molekula uključuju i prolekove, tj. jedinjenja koja se razgrađuju ili konvertuju u fiziološkim uslovima kako bi oslobodili citotoksične agense. Primeri takvih agenasa uključuju cisplatin, derivate maitansina, rahelmicin, kaliheamicin, docetaksel, etopozid, gemcitabin, ifosfamid, irinotekan, melfalan, mitoksantron, sorfimer natrijumfotofrin II, temozolomid, topotekan, trimetreat glukuronat, auristatin E vinkristin i doksorubicin;

• peptidne citotoksine, tj. proteine ili njegove fragmente sa sposobnošću da ubiju ćelije sisara. Na primer, ricin, difterični toksin, pseudomonas bakterijski egzotoksin A, DNaza i RNaza;

• radionuklide, tj. nestabilne izotope elemenata koji se razgrađuju uz istovremenu emisiju jedne α ili β čestice ili više njih, ili γ zraka. Na primer, jod 131, renijum 186, indijum 111, itrijum 90, bizmut 210 i 213, aktinijum 225 i astat 213; helacioni agensi mogu se koristiti kako bi se olakšalo vezivanje ovih radionuklida za TCR-ove visokog afiniteta ili njihove multimere;

• imunostimulanse, tj. molekule imunoefektora koji stimulišu imunski odgovor. Na primer, citokini kao što su IL-2 i IFN-γ,

• Superantigene i njihove mutante;

• TCR-HLA fuzije;

• hemokine kao što su IL-8, trombocit faktor 4, protein koji stimuliše rast melanoma, itd.;

• antitela ili njihove fragmente, uključujući anti-T-ćelijska ili NK ćelijska determinantna antitela (npr. anti-CD3, anti-CD28 ili anti-CD16);

• alternativne proteinske osnove sa vezujućim karakteristikama poput antitela

• aktivatore komplemenata;

• ksenogene proteinske domene, alogenske proteinske domene, virusne/bakterijske proteinske domene, virusne/bakterijske peptide.

[0045] Jedno poželjno otkrivanje obezbeđeno je TCR-om ovog pronalaska koji je vezan (obično fuzijom za N- ili C-terminus alfa ili beta lanca) za anti-CD3 antitelo ili funkcionalni fragment ili varijantu pomenutog anti-CD3 antitela. Fragmenti antitela i varijante/analozi koji su pogodni za upotrebu u ovde opisanim kompozicijama i postupcima uključuju minitela, Fab fragmente, F(ab')2fragmente, dsFv i scFv fragmente, Nanobodies™ (ovi konstrukti, koje prodaje Ablynx (Belgija), obuhvataju sintetički varijabilni teški domen sa jednim imunoglobulinom izveden iz camelidae (npr. kamile ili lame) antitela) i domenska antitela (Domantis (Belgija), koja obuhvataju varijabilni teški domen zrelog afiniteta sa jednim imunoglobulinom ili imunoglobulinski varijabilni laki domen) ili alternativne proteinske osnove koje ispoljavaju vezujuće karakteristike poput antitela kao što su Afitela (Affibody (Švedska), koja obuhvataju inženjerisanu proteinsku A osnovu) ili Antikalini (Pieris (Nemačka), koji obuhvataju inženjerisane antikaline), da navedemo samo nekoliko primera.

[0046] Za neke potrebe, od TCR-ova ovog otkrivanja mogu se praviti agregacije u kompleks koji obuhvata nekoliko TCR-ova radi obrazovanja multivalentnog TCR kompleksa. Postoji nekoliko humanih proteina koji sadrže multimerizacioni domen koji se može koristiti u proizvodnji multivalentnih TCR kompleksa. Na primer, tetramerizacioni domen od p53 koji se koristio za proizvodnju tetramera scFv fragmenata antitela koji su prikazali postojanost u serumu i značajno smanjenu brzinu razdvajanja u poređenju sa monomernim scFv fragmentom. (Willuda et al. (2001) J. Biol. Chem.276 (17) 14385-14392). Hemoglobin takođe ima tetramerizacioni domen koji bi se potencijalno mogao koristiti za ovu vrstu primene. Multivalentni TCR kompleks ovog otkrivanja može imati poboljšanu sposobnost vezivanja za GVYDGREHTV HLA-A2 kompleks u poređenju sa nemultimernim heterodimerom divljeg tipa ili heterodimerom receptora T-ćelija ovog otkrivanja. Prema tome, multivalentni TCR kompleksi ovog otkrivanja takođe su uključeni u ovaj pronalazak. Takvi multivalentni TCR kompleksi prema ovom otkrivanju naročito su korisni za praćenje ili ciljanje ćelija koje predstavljaju određene antigene in vitro ili in vivo, a korisni su i kao posrednici za proizvodnju daljih multivalentnih TCR kompleksa sa takvim primenama.

[0047] U tehnici je dobro poznato da se TCR-ovi mogu podvrgnuti posttranslacionim modifikacijama. Glikozilacija predstavlja jednu takvu modifikaciju, koja obuhvata kovalentno vezivanje oligosaharidnih grupa za definisane aminokiseline u TCR lancu. Na primer, asparaginski ostaci ili serinski/treoninski ostaci predstavljaju dobro poznata mesta za oligosaharidno vezivanje. Status glikozilacije određenog proteina zavisi od nekoliko faktora, uključujući sekvencu proteina, konformaciju proteina i dostupnost

1

određenih enzima. Osim toga, status glikozilacije (tj. tip oligosaharida, kovalentna veza i ukupan broj vezivanja) može uticati na funkciju proteina. Prema tome, često je poželjno kontrolisanje glikozilacije pri proizvodnji rekombinantnih proteina. Kontrolisana glikozilacija se koristila kako bi se unapredili terapeutici zasnovani na antitelima. (Jefferis R., Nat Rev Drug Discov.2009 Mar;8(3):226-34.). Za rastvorljive TCR-ove ovog pronalaska, glikozilacija se može kontrolisati in vivo, primenom određenih ćelijskih linija na primer, ili in vitro, hemijskom modifikacijom. Takve modifikacije su poželjne, pošto glikozilacija može unaprediti farmakokinetike, smanjiti imunogenost i bliže imitirati nativni humani protein (Sinclair AM and Elliott S., Pharm Sci.2005 Aug; 94(8):1626-35).

[0048] Za davanje pacijentima, TCR-ovi, nukleinske kiseline i/ili ćelije ovog pronalaska (obično povezane sa oznakom koja se može detektovati ili terapijskim agensom), mogu se obezbediti u farmaceutskoj kompoziciji zajedno sa farmaceutski prihvatljivim nosačem ili ekscipijensom. Terapijski ili imidžing TCR-ovi prema ovom otkrivanju obično će biti obezbeđeni kao deo sterilne, farmaceutske kompozicije koja će obično uključivati farmaceutski prihvatljiv nosač. Ova farmaceutska kompozicija može biti u bilo kom prikladnom obliku, (u zavisnosti od željenog postupka za njeno davanje pacijentu). Može biti obezbeđena u jediničnom doznom obliku, obično će biti obezbeđena u zaptivenom kontejneru, a može biti obezbeđena i kao deo kompleta. Takav komplet bi obično (mada ne nužno) uključivao uputstva za upotrebu. Može uključivati veći broj pomenutih jediničnih doznih oblika.

[0049] Farmaceutska kompozicija može se adaptirati za davanje na bilo koji prikladan način, poželjno parenteralni (uključujući supkutani, intramuskularni ili poželjno intravenski) način davanja. Takve kompozicije mogu se pripremati bilo kojim postupkom poznatim u tehnici farmacije, na primer mešanjem aktivne supstance sa nosačem(ima) ili ekscipijensom(ima) u sterilnim uslovima.

[0050] Doze supstanci ovog pronalaska mogu varirati u širokim opsezima, u zavisnosti od bolesti ili poremećaja kog treba lečiti, starosti i stanja pojedinca koje treba lečiti, itd., a lekar će naposletku utvrditi prikladne doze koje treba koristiti.

[0051] TCR-ovi, farmaceutske kompozicije, vektori, nukleinske kiseline i ćelije ovog pronalaska mogu se obezbediti u suštinski čistom obliku, na primer najmanje 80%, najmanje 85 %, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% čistom.

[0052] Ovim pronalaskom su takođe obezbeđeni:

• TCR, nukleinska kiselina ili ćelija ovog pronalaska za upotrebu u medicini, poželjno za upotrebu u postupku za lečenje kancera, kao što su opisani čvrsti tumori (npr., plućne, jetrene i gastritične metastaze) i/ili karcinomi skvamoznih ćelija.

• kao što je opisana, upotreba TCR-a, nukleinske kiseline ili ćelije ovog pronalaska u proizvodnji medikamenta za lečenje kancera.

• kao što je opisan, postupak za lečenje kancera kod pacijenta, koji obuhvata davanje pacijentu TCR-a, nukleinske kiseline ili ćelije ovog pronalaska.

[0053] Poželjna svojstva svakog aspekta ovog pronalaska su kao i za svaki drugi aspekt mutatis mutandis.

[0054] Ovaj pronalazak je dalje opisan u sledećim neograničavajućim primerima.

[0055] Upućuje se na pridružene sekvence, u kojima:

SEQ ID No.1 predstavlja MAGE A4 peptid

SEQ ID No.2 predstavlja MAGE B2 peptid

SEQ ID No: 3 predstavlja aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog dela alfa lanca roditeljskog MAGE-A4-specifičnog TCR-a, a SEQ ID No: 4 prikazuje aminokiselinsku sekvencu ekstracelularnog dela beta lanca roditeljske MAGE-A4-specifične aminokiselinske sekvence beta lanca TCR-a.

SEQ ID No: 5 prikazuje aminokiselinsku sekvencu alfa lanca nativnog Lenti TCR-a (koji se ovde označava kao „referentni TCRˮ). Ta sekvenca je ista kao sekvenca roditeljskog TCR-a osim toga što je cistein supstituisan za T162 (tj. T48 iz TRAC konstantnog regiona). SEQ ID No: 6 predstavlja beta lanac nativnog Lenti TCR-a (koji se ovde označava kao „referentni TCRˮ). Ta sekvenca je ista kao sekvenca roditeljskog TCR-a osim toga što je a_cistein supstituisan za S169 (tj. S57 iz TRBC2 konstantnog regiona) i A187 je supstituisan za C187 i D201 je supstituisan za N201.

SEQ ID No: 7 i 8 prikazuju sekvence alfa lanaca koji mogu biti prisutni u TCR-ovima ovog pronalaska. Podvučene su supsekvence koje obrazuju CDR regione ili suštinske delove CDR regiona.

SEQ ID No 9 prikazuje sekvencu beta lanca koja može biti prisutna u TCR-ovima ovog pronalaska. Podvučene su supsekvence koje obrazuju CDR regione ili suštinske delove CDR regiona.

SED ID No 10 do 15 prikazuju sekvence rastvorljivih alfa i beta lanaca TCR-ova A, B i C. Nijedan od ovih TCR-ova ne može se razviti u funkcionalan TCR prema ovom pronalasku.

1

Primeri

Primer 1 – Kloniranje sekvenci varijabilnih regiona alfa i beta lanaca referentnih MAGE-A4 TCR-ova u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7

[0056] Roditeljski MAGE-A4 TCR varijabilni alfa i TCR varijabilni beta domeni iz SEQ ID NO: 3 i 4 su tim redom klonirani u ekspresione plazmide zasnovane na pGMT7 koji sadrže bilo Cα ili Cβ standardnim postupcima opisanim u (Molecular Cloning a Laboratory Manual Third edition by Sambrook and Russell). Plazmidi su sekvencirani pomoću Applied Biosystems 3730xl DNK analizatora. Referentni MAGE-A4 TCR varijabilni alfa i TCR varijabilni beta domeni iz SEQ ID NO: 5 i 6 su tim redom klonirani na isti način.

[0057] DNK sekvenca koja kodira varijabilni region alfa lanca TCR-a podvrgnuta je ligaciji do pEX956, koji je isečen restrikcionim enzimima. DNK sekvenca koja kodira varijabilni region beta lanca TCR-a podvrgnut je ligaciji do pEXb21, koji je takođe isečen restrikcionim enzimima.

[0058] Plazmidi podvrgnuti ligaciji transformisani su u kompetentne XL1-plave ćelije E.coli soja i zasejani na LB/agar pločama koje sadrže 100 µg/mL ampicilina. Nakon inkubacije preko noći na 37°C, izabrane su pojedinačne kolonije i gajene u 5 mL LB koji sadrži 100 µg/mL ampicilina preko noći na 37°C uz mućkanje. Klonirani plazmidi su prečišćeni pomoću Miniprep kompleta (Qiagen) i plazmidi su sekvencirani pomoću Applied Biosystems 3730xl DNK analizatora.

Primer 2 – Ekspresija, ponovno savijanje i prečišćavanje rastvorljivog referentnog MAGE-A4 TCR-a

[0059] Ekspresioni plazmidi koji redom sadrže referentni TCR α-lanac i β-lanac, kao što su pripremljeni u Primeru 1, transformisani su odvojeno u BL21pLysS E.coli soja, a pojedinačne kolonije rezistentne na ampicilin gajene su na 37°C u TYP (ampicilin 100 µg/ml) podlozi do OD600od ∼0,6-0,8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0,5 mM IPTG-a. Ćelije su sakupljene tri sata posle indukcije centrifugiranjem tokom 30 minuta na 4000o/min u Beckman J-6B. Ćelijski peleti su podvrgnuti lizi sa 25 ml Bug Buster-a (NovaGen) u prisustvu MgCl2i DNasel-a. Peleti inkluzionih telašaca rekuperovani su centrifugiranjem tokom 30 minuta na 13000o/min u Beckman J2-21 centrifugi. Zatim su izvedena tri ispiranja deterdžentom kako bi se uklonio ćelijski talog i komponente membrana. Pelet inkluzionih telašaca je svaki put homogenizovan u Triton puferu (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA,) pre nego što je peletiran centrifugiranjem tokom 15 minuta na 13000o/min u Beckman J2-21. Deterdžent i so su potom uklonjeni sličnim ispiranjem u sledećem puferu: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM NaEDTA. Najzad, inkluziona telašca su podeljena u alikvote od 30 mg i zamrznuta na -70°C. Prinos proteina inkluzionih telašaca kvantifikovan je rastvaranjem sa 6 M gvanidin-HCI-a, a OD merenje je izvedeno na Hitachi U-2001 spektrofotometru. Potom je pomoću ekstinkcionog koeficijenta izračunata koncentracija proteina.

1

[0060] Približno 15mg TCR α lančanih i 15mg TCR β lančanih rastvorenih inkluzionih telašaca odmrznuto je iz zamrznutih štokova i razblaženo u 10ml rastvora gvanidina (6 M Gvanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT), kako bi se osigurala potpuna denaturacija lanca. Zatim je rastvor gvanidina koji sadrži potpuno redukovane i denaturisane TCR lance injektovan u 0,5 litara sledećeg pufera za ponovno savijanje: 100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-Arginina, 2 mM EDTA, 5 M Uree. Redoks par (cisteaminhidrohlorid i cistamindihidrohlorid) dodavan je do krajnjih koncentracija od 6,6 mM i 3,7 mM tim redom, približno 5 minuta pre dodavanja denaturisanih TCR lanaca. Rastvor je ostavljen tokom ∼30 minuta. Ponovo savijeni TCR podvrgnut je dijalizi u Spectrapor 1 membrani (Spectrum; Proizvod br.132670) naspram 10 L H2O tokom 18-20 sati. Nakon tog vremena, pufer za dijalizu je dvaput zamenjen svežim 10 mM Tris pH 8,1 (10 L) i dijaliza je nastavljena na 5 °C ± 3 °C tokom još ∼8 sati.

[0061] Rastvorljivi TCR je odvojen od proizvoda degradacije i nečistoća uvođenjem dijalizovanog refolda na POROS 50HQ kolonu anjonske izmene i eluiranjem vezanog proteina sa gradijentom od 0-500mM NaCl u 10 mM Tris pH 8,1 preko 50 zapremina kolona pomoću Akta prečišćivača (GE Healthcare).

Frakcije pikova su pulovane i dodat je koktel inhibitora proteaze (Calbiochem). Pulovane frakcije su zatim skladištene na 4 °C i analizirane kumasi obojenim SDS-PAGE-om pre nego što su pulovane i koncentrovane. Najzad, rastvorljivi TCR je prečišćen i okarakterisan pomoću GE Healthcare Superdex 75HR gel-filtracione kolone prethodno uravnotežene u PBS puferu (Sigma). Pik eluiranja na relativnoj molekulskoj masi od približno 50 kDa pulovan je i koncentrovan pre karakterizacije BIAcore analizom rezonancije površinskog plazmona.

Primer 3 – Karakterizacija vezivanja

BIAcore analiza

[0062] Biosenzor rezonancije površinskog plazmona (BIAcore 3000™) može se koristiti za analizu vezivanja rastvorljivog TCR-a za njegov peptid-MHC ligand. To je olakšano proizvodnjom rastvorljivih biotiniziranih peptid-HLA („pHLAˮ) kompleksa koji se mogu imobilizovati za vezujuću površinu obloženu streptavidinom (senzorski čip). Senzorski čipovi obuhvataju četiri individualne protočne ćelije koje omogućavaju istovremeno merenje vezivanja receptora T-ćelija za četiri različita pHLA kompleksa. Ručna injekcija pHLA kompleksa omogućava lako rukovanje tačnim nivoom imobilizovanih molekula klase I.

[0063] Biotinizirani HLA-A*0201 molekuli klase I ponovo su savijeni in vitro iz bakterijski eksprimiranih inkluzionih telašaca koja sadrže konstituentne podjedinične proteine i sintetički peptid, zatim sledi prečišćavanje i in vitro enzimska biotinizacija (O’Callaghan et al. (1999) Anal. Biochem.266: 9-15). HLA-A*0201-teški lanac eksprimiran je sa C-terminalnom biotinizacionom oznakom koja zamenjuje

1

transmembranske i citoplazmatske domene proteina u odgovarajućem konstruktu. Dobijeni su nivoi ekspresije inkluzionih telašaca od ∼75 mg/litar bakterijske kulture. MHC laki-lanac ili β2-mikroglobulin takođe je eksprimiran kao inkluziona telašca u E.coli iz odgovarajućeg konstrukta, na nivou od ∼500 mg/litar bakterijske kulture.

[0064] Ćelije E. coli su podvrgnute lizi, a inkluziona telašca su prečišćena do približno 80% čistoće.

Protein iz inkluzionih telašaca denaturisan je u 6 M gvanidin-HCl-a, 50 mM Tris pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM DTT, 10 mM EDTA i ponovo je savijen na koncentraciji od 30 mg/litar teškog lanca, 30 mg/litar β2m u 0,4 M L-Arginina, 100 mM Tris pH 8,1, 3,7 mM cistamindihidrohlorida, 6,6 mM cisteaminhidrohlorida, 4 mg/L MAGE-A4 GVYDGREHTV ili MAGE-B2 GVYDGEEHSV peptida koji mora biti uveden HLA-A*02 molekulom, dodavanjem jednog pulsa denaturisanog proteina u pufer za ponovno savijanje na < 5°C. Dozvoljeno je da ponovo savijanje dostigne završetak na 4°C za najmanje 1 sat.

[0065] Pufer je zamenjen dijalizom u 10 zapremina 10 mM Tris pH 8,1. Neophodne su dve zamene pufera kako bi se dovoljno smanjila jonska sila rastvora. Rastvor proteina je zatim filtriran kroz 1,5µm acetilcelulozni filter i uveden na POROS 50HQ kolonu anjonske promene (8 ml ukupne zapremine kolone). Protein je eluiran sa linearnim 0-500 mM NaCl gradijentom u 10 mM Tris pH 8,1 pomoću Akta prečišćivača (GE Healthcare). HLA-A*0201-peptid kompleks eluiran je na približno 250 mM NaCl, i sakupljene su frakcije pikova, dodat je koktel inhibitora proteaze (Calbiochem), a frakcije su ohlađene na ledu.

[0066] Biotinom obeleženi pHLA molekuli puferski su zamenjeni u 10 mM Tris pH 8,1, 5 mM NaCl pomoću GE Healthcare brze kolone za uklanjanje soli, uravnotežene na istom puferu. Odmah nakon elucije, frakcije koje sadrže protein ohlađene su na ledu i dodat je koktel inhibitora proteaze (Calbiochem). Zatim su dodati biotinizacioni reagensi: 1 mM biotina, 5 mM ATP-a (puferovanog do pH 8), 7,5 mM MgCl2i 5 µg/ml BirA enzima (prečišćenog u skladu sa O'Callaghan et al. (1999) Anal.

Biochem.266: 9-15). Mešavina je zatim ostavljena da se inkubira na sobnoj temperaturi preko noći.

[0067] Biotinizirani pHLA-A*0201 molekuli prečišćeni su pomoću gel-filtracione hromatografije. GE Healthcare Superdex 75 HR 10/30 kolona je prethodno uravnotežena filtriranim PBS-om i uveden je 1 ml biotinizacione reakcione mešavine, a kolona je razvijena PBS-om na 0,5 ml/min pomoću Akta prečišćivača (GE Healthcare). Biotinizirani pHLA-A*0201 molekuli eluirani su kao pojedinačni pik na približno 15 ml. Frakcije koje sadrže protein su pulovane, ohlađene na ledu i dodat je koktel inhibitora proteaze. Koncentracija proteina utvrđena je pomoću testa vezivanja kumasija (PerBio), a alikvoti biotiniziranih pHLA-A*01 molekula skladišteni su zaleđeni na -20°C.

[0068] Takvi imobilizovani kompleksi mogu vezivati i receptore T-ćelija i koreceptore CD8αα, pri čemu se oba mogu injektovati u rastvorljivu fazu. Primećeno je da su pHLA vezujuća svojstva rastvorljivih TCR-ova kvalitativno i kvantitativno slična ukoliko se TCR koristi bilo u rastvorljivoj ili imobilizovanoj fazi. To predstavlja važnu kontrolu za delimičnu aktivnost rastvorljivih vrsta i takođe ukazuje da su biotinizirani

1

pHLA kompleksi podjednako biološki aktivni kao nebiotinizirani kompleksi.

[0069] BIAcore 3000™ biosenzor rezonancije površinskog plazmona (SPR) meri promene u indeksu refrakcije izraženom u jedinicama odgovora (RU) blizu površine senzora unutar male protočne ćelije, pri čemu se taj princip može koristiti za detektovanje interakcije receptora i liganda kao i za analiziranje njihovog afiniteta i kinetičkih parametara. BIAcore eksperimenti su izvedeni na temperaturi od 25°C, pomoću PBS pufera (Sigma, pH 7,1-7,5) kao pufera za elektroforezu i u pripremi razblaživanja uzoraka proteina. Streptavidin je imobilisan u protočne ćelije standardnim postupcima za uparivanje amina. pHLA kompleksi imobilisani su preko biotinske oznake. Test je zatim izveden propuštanjem rastvorljivog TCR-a preko površina različitih protočnih ćelija pri konstantnom protoku, uz merenje SPR odgovora tokom toga.

Ravnotežna konstanta vezivanja

[0070] Gorepomenuti BIAcore postupci za analizu korišćeni su za utvrđivanje ravnotežnih konstanti vezivanja. Serijska razblaživanja rastvorljivog heterodimernog oblika sa disulfidnom vezom, referentnog MAGE-A4 TCR-a pripremljena su i injektovana pri konstantnom protoku od 5 µl min<-1>preko dve različite protočne ćelije; jedne obložene sa ∼1000 RU specifičnog GVYDGREHTV HLA-A*0201 kompleksa, druge obložene sa ∼1000 RU nespecifičnog kompleksa. Odgovor je normalizovan za svaku koncentraciju pomoću merenja iz kontrolne ćelije. Normalizovani podaci odgovora prikazani su na grafiku spram koncentracije TCR uzorka i uklopljeni u model uklapanja nelinearnih krivih kako bi se izračunala ravnotežna konstanta vezivanja, KD. (Price & Dwek, Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemists (2nd Edition) 1979, Clarendon Press, Oxford). Rastvorljivi oblik sa disulfidnom vezom, referentnog MAGE-A4 TCR-a (Primer 2) prikazao je KDod približno 2,00 µM. Iz istih BIAcore podataka, T1⁄2 je približno bio 0,95 s.

Kinetički parametri

[0071] Gorepomenuti BIAcore postupci za analizu korišćeni su i za utvrđivanje ravnotežnih konstanti vezivanja i brzina razdvajanja.

[0072] Za TCR-ove visokog afiniteta (vidi Primer 4 u nastavku), KDje utvrđen eksperimentalnim merenjem konstante brzine razdvajanja, koff, i konstante brzine vezivanja, kon. Ravnotežna konstanta KDizračunata je kao koff/kon.

[0073] TCR je injektovan preko dve različite ćelije, jedne obložene sa ∼1000 RU specifičnog GVYDGREHTV HLA-A*0201 kompleksa, druge obložene sa ∼1000 RU nespecifičnog kompleksa. Protok je podešen na 50 µl/min. Tipično je injektovano 250 µl TCR-a na koncentraciji od ∼ 1 µM. Pufer je zatim

1

bio izložen protoku dok se odgovor nije vratio na osnovnu liniju ili dok nije prošlo >2 sata. Kinetički parametri su izračunati pomoću BIAevaluation softvera. Faza disocijacije je uklopljena u jednačinu jedne eksponencijalne razgradnje čime se omogućava izračunavanje poluživota.

Primer 4 – Priprema TCR-ova visokog afiniteta ovog pronalaska

[0074] Ekspresioni plazmidi koji obuhvataju TCR α-lanac i β-lanac redom su pripremani kao u Primeru 1:

[0075] Plazmidi su zasebno transformisani u BL21pLysS E.coli soja, a pojedinačne kolonije rezistentne na ampicilin gajene su na 37°C u TYP (ampicilin 100 µg/ml) podlozi do OD600od ∼0,6-0,8 pre indukovanja ekspresije proteina sa 0,5 mM IPTG-a. Ćelije su sakupljene tri sata posle indukcije centrifugiranjem tokom 30 minuta na 4000o/min u Beckman J-6B. Ćelijski peleti su podvrgnuti lizi sa 25 ml Bug Buster-a (Novagen) u prisustvu MgCl2i DNasel-a. Peleti inkluzionih telašaca rekuperovani su centrifugiranjem tokom 30 minuta na 13000o/min u Beckman J2-21 centrifugi. Zatim su izvedena tri ispiranja deterdžentom kako bi se uklonio ćelijski talog i komponente membrana. Pelet inkluzionih telašaca je svaki put homogenizovan u Triton puferu (50 mM Tris-HCI pH 8,0, 0,5% Triton-X100, 200 mM NaCl, 10 mM NaEDTA,) pre nego što je peletiran centrifugiranjem tokom 15 minuta na 13000o/min u Beckman J2-21. Deterdžent i so su potom uklonjeni sličnim ispiranjem u sledećem puferu: 50 mM Tris-HCI pH 8,0, 1 mM NaEDTA. Najzad, inkluziona telašca su podeljena u alikvote od 30 mg i zamrznuta na -70°C. Prinos proteina inkluzionih telašaca kvantifikovan je rastvaranjem sa 6 M gvanidin-HCI-a, a OD merenje je izvedeno na Hitachi U-2001 spektrofotometru. Potom je pomoću ekstinkcionog koeficijenta izračunata koncentracija proteina.

[0076] Približno 10mg TCR α lančanih i 10mg TCR β lančanih rastvorenih inkluzionih telašaca za svaki TCR ovog pronalaska razblaženo je u 10ml rastvora gvanidina (6 M Gvanidin-hidrohlorid, 50 mM Tris HCI pH 8,1, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT), kako bi se osigurala potpuna denaturacija lanca. Zatim je rastvor gvanidina koji sadrži potpuno redukovane i denaturisane TCR lance injektovan u 0,5 litara sledećeg pufera za ponovno savijanje: 100 mM Tris pH 8,1, 400 mM L-Arginina, 2 mM EDTA, 5 M Uree.

2

Redoks par (cisteaminhidrohlorid i cistamindihidrohlorid) dodavan je do krajnjih koncentracija od 6,6 mM i 3,7 mM tim redom, približno 5 minuta pre dodavanja denaturisanih TCR lanaca. Rastvor je ostavljen tokom ∼30 minuta. Ponovo savijeni TCR podvrgnut je dijalizi u Spectrapor 1 membrani (Spectrum; Proizvod br.132670) naspram 10 L H2O tokom 18-20 sati. Nakon tog vremena, pufer za dijalizu je dvaput zamenjen svežim 10 mM Tris pH 8,1 (10 L) i dijaliza je nastavljena na 5 °C ± 3 °C tokom još ∼8 sati.

[0077] Rastvorljivi TCR je odvojen od proizvoda degradacije i nečistoća uvođenjem dijalizovanog refolda na POROS 50HQ kolonu anjonske izmene i eluiranjem vezanog proteina sa gradijentom od 0-500mM NaCl u 10 mM Tris pH 8,1 preko 15 zapremina kolona pomoću Akta prečišćivača (GE Healthcare).

Pulovane frakcije su potom skladištene na 4 °C i analizirane kumasi obojenim SDS-PAGE-om pre nego što su pulovane i koncentrovane. Najzad, rastvorljivi TCR-ovi su prečišćeni i okarakterisani pomoću GE Healthcare Superdex 75HR gel-filtracione kolone prethodno uravnotežene u PBS puferu (Sigma). Pik eluiranja na relativnoj molekulskoj masi od približno 50 kDa pulovan je i koncentrovan pre karakterizacije BIAcore analizom rezonancije površinskog plazmona.

[0078] Profili afiniteta tako pripremljenih TCR-ova za MAGE-A4 epitop ili MAGE-B2 epitop procenjeni su pomoću postupka iz Primera 3 i upoređeni sa referentnim TCR-om. Rezultati su izloženi u sledećoj tabeli:

[0079] Bilo je pokušaja i da se pripreme TCR-ovi visokog afiniteta na osnovu kombinacija iz SEQ ID No 10/11, 12/13, 14/15.

[0080] U slučaju TCR A, koji kombinuje alfa lanac iz SEQ ID No 10 i beta lanac iz SEQ ID No.11, uočena je unakrsna reaktivnost između MAGE-A1, MAGE-A10 i PRAME. Ovu unakrsnu reaktivnost nije bilo moguće ukloniti mutacijom i selekcijom.

[0081] TCR B kombinuje alfa lanac iz SEQ ID No 12 i beta lanac iz SEQ ID No.13. TCR B se nije mogao saviti kako bi se obrazovao rastvorljivi TCR, tako da nije bila moguća nikakva karakterizacija vezivanja.

[0082] TCR C kombinuje alfa lanac iz SEQ ID NO 14 i beta lanac iz SEQ ID No 15. Taj TCR je bio rastvorljiv kada se eksprimirao i mogao se vezati za antigen. Međutim, kada se eksprimirao u T-ćelijama, TCR C nije prikazao nikakvu aktivnost.

Primer 5 – Transfekcija T-ćelija sa roditeljskim MAGE-A4 TCR-ovima i njihovim varijantama

(a) Priprema lentivirusnog vektora Express-In posredovanom tranzijentnom transfekcijom 293T ćelija

[0083] Za pakovanje lentivirusnih vektora koji sadrže gen koji kodira željeni TCR korišćena je 3. generacija lentivirusnog sistema za pakovanje.293T ćelije su transfektovane sa 4 plazmida (jednim lentivirusnim vektorom koji sadrži TCR alfa lančani-P2A-TCR beta lančani pojedinačni ORF gen opisan u Primeru 5c (u nastavku) i 3 plazmida koja sadrže druge komponente neophodne za stvaranje infektivnih, ali nereplikativnih lentivirusnih čestica) pomoću Express-In posredovane transfekcije (Open Biosystems).

[0084] Za transfekciju je uzet jedan T150 flask 293T ćelija u fazi eksponencijalnog rasta, sa ćelijama ravnomerno raspoređenim na ploči, i malo više od 50% konfluenta. Express-In alikvoti su dovedeni na sobnu temperaturu.3 ml podloge bez seruma (RPMI 1640 10mM HEPES) postavljeno je u sterilnu 15 ml centrifušku epruvetu. Direktno u podlogu bez seruma dodato je 174 µl Express-In reagensa (time se obezbeđuje 3,6:1 maseni odnos reagensa prema DNK). To se temeljno mešalo okretanjem epruveta 3-4 puta i inkubiralo na sobnoj temperaturi tokom 5-20 minuta.

[0085] U zasebnu 1,5 ml mikrotubu dodato je 15 µg plazmidne DNK u prethodno izmešanu mešavinu alikvota za pakovanje (koja sadrži 18 µg pRSV.REV (Rev ekspresioni plazmid), 18 µg pMDLg/p.RRE (Gag/Pol ekspresioni plazmid), 7 µg pVSV-G (VSV glikoproteinski ekspresioni plazmid), obično ∼22 µl, i pipetirano gore-dole kako bi se obezbedila homogenost DNK mešavine. Približno 1 mL Express-In/podloge bez seruma dodato je DNK mešavini kap po kap, a potom lagano pipetirano gore-dole pre prebacivanja nazad u ostatak Express-In/podloge bez seruma. Tuba je okrenuta 3-4 puta i inkubirana na sobnoj temperaturi tokom 15-30 minuta. Stara podloga za uzgajanje uklonjena je iz flaska ćelija. Express-In/podloga/DNK (3mL) kompleks dodat je direktno na dno uspravnog flaska 293T ćelija. Flask je polako položen tako da prekrije ćelije i veoma nežno ljuljan kako bi se osigurala podjednaka distribucija. Nakon 1 minuta dodato je 22 ml sveže podloge za kultivisanje (R10+HEPES: RPMI 1640, 10% toplotom inaktivisani FBS, 1% Pen/Strep/L-glutamin, 10 mM HEPES), a flask je pažljivo vraćen u inkubator. To je inkubirano preko noći na 37°C/5% CO2. Nakon 24 sata, sakupljena je podloga koja sadrži upakovane lentivirusne vektore.

[0086] Kako bi se sakupili upakovani lentivirusni vektori, supernatant ćelijske kulture filtriran je kroz 0,45mikronski najlonski filter za špric, podloga za kultivisanje centrifugirana je na 10,000 g tokom 18 sati (ili 112,000 g tokom 2 sata), većina supernatanta je uklonjena (uz pažnju da se ne poremeti pelet), a pelet je ponovo suspendovan u nekoliko preostalih mL supernatanta (obično oko 2 ml od 31 ml početne zapremine po tubi). To je brzo smrznuto na suvom ledu u alikvotima od 1 ml i skladišteno na -80°C.

(b) Transdukcija T-ćelija upakovanim lentivirusnim vektorima koji sadrže gen od interesa

[0087] Pre transdukcije upakovanim lentivirusnim vektorima, iz krvi zdravih dobrovoljaca izolovane su humane T-ćelije (CD8 ili CD4 ili obe u zavisnosti od zahteva). Ove ćelije su izbrojane i inkubirane preko noći u R10 koji sadrži 50 U/mL IL-2 at 1x10<6>ćelija po ml (0,5 mL/bazenčić) u ploči sa 48 bazenčića sa prethodno ispranim anti-CD3/CD28 mikroperlama obloženim antitelima (Dynabeads® ekspander T-ćelija, Invitrogen) u odnosu 3 perle po ćeliji.

[0088] Nakon stimulacije preko noći, željenim ćelijama dodato je 0,5 ml uredno upakovanog lentivirusnog vektora. To je inkubirano na 37°C/5% CO2 tokom 3 dana. Ćelije su 3 dana nakon transdukcije izbrojane i razblažene do 0,5x10<6>ćelija/ml. Po potrebi je dodavana sveža podloga koja sadrži IL-2. Perle su uklonjene 5-7 dana posle transdukcije. Ćelije su izbrojane, a sveža podloga koja sadrži IL-2 menjana je ili dodavana u intervalima od 2 dana. Ćelije su održavane između 0,5x10<6>i 1x10<6>ćelije/mL. Ćelije su analizirane protočnom citometrijom iz dana 3 i korišćene za funkcionalne testove (npr. ELISpot za otpuštanje IFNγ, vidi Primer 6) iz dana 5. Iz dana 10 ili kada su ćelije usporavale deobu i kada im se smanjivala veličina, ćelije su zamrzavane u alikvotima od najmanje

4x10<6>ćelije/bočica (na 1x10<7>ćelije/ml u 90% FBS/10% DMSO) radi skladištenja.

Primer 6 – Aktiviranje MAGE A4 TCR inženjerisanih T-ćelija

[0089] Sledeći test je izveden kako bi se pokazalo aktiviranje TCR-transdukovanih citotoksičnih T-limfocita (CTL) kao odgovor na ćelijske linije tumora. Proizvodnja IFN-γ, na osnovu merenja pomoću ELISPOT testa, korišćena je kao iščitavanje za aktiviranje citotoksičnih T-limfocita (CTL).

ELISPOT-ovi

Reagensi

[0090]

Podloga za test: 10% FCS (Gibco, Cat# 2011-09), 88% RPMI 1640 (Gibco, Cat# 42401), 1% glutamin (Gibco Cat# 25030) i 1% penicilin/streptomicin (Gibco Cat# 15070-063).

Pufer za ispiranje: 0,01M PBS/0,05% Tween 20

PBS (Gibco Cat# 10010)

2

Humani IFNγ ELISPOT komplet (BD Bioscience; Cat# 551849) koji zadrži antitela za hvatanje i detekciju kao i humane IFN-γ PVDF ELISPOT ploče sa 96 bazenčića, sa pridruženim AEC setom supstrata (BD Bioscience, Cat# 551951)

Postupci

Priprema ciljne ćelije

[0091] Ciljne ćelije korišćene u ovom postupku su prirodne ćelije koje predstavljaju epitop: A375 humane ćelije melanoma koje su obe HLA-A2<+>MAGE A10<+>. Kao negativna kontrola korišćene su HCT116 humanog kancera debelog creva, koje su HLA-A2<+>MAGE A10-. Dovoljan broj ciljnih ćelija (50,000 ćelije/bazenčić) triput je ispran centrifugiranjem na 1200 o/min, 10 min u Megafuge® 1.0 (Heraeus). Ćelije su potom ponovo suspendovane u podlogama za test na 10<6>ćelije/ml.

Priprema efektorskih ćelija

[0092] Efektorske ćelije (T-ćelije) korišćene u ovom postupku bile su limfociti periferne krvi (PBL), dobijeni negativnom selekcijom pomoću CD14 i CD25 kompleta mikroperli (Miltenyi Biotech Cat# 130-050-201 i 130-092-983, tim redom) iz sveže izolovanih mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) iz venske krvi zdravih dobrovoljaca. Ćelije su stimulisane antiCD3/CD28 obloženim perlama (Dynabeads® ekspander T-ćelija, Invitrogen), transdukovane lentivirusom koji nosi gen koji kodira ceo αβ TCR od interesa (na osnovu konstrukta opisanog u Primeru 5) i ekspandirane u podloge za test koje sadrže 50U/mL IL-2 do između 10 i 13 dana posle transdukcije. Ove ćelije su potom postavljene u podloge za test pre ispiranja centrifugiranjem na 1200 o/min, 10 min u Megafuge® 1.0 (Heraeus). Ćelije su potom ponovo suspendovane u podloge za test na 4X krajnje zahtevane koncentracija.

[0093] Ploče su pripremljene na sledeći način: 100 µL antitela za hvatanje anti-IFN-γ razblaženo je u 10 ml sterilnog PBS-a po ploči. Potom je 100 µL razblaženog antitela za hvatanje dispenzirano u svaki bazenčić. Ploče su zatim inkubirane tokom noći na 4°C. Posle inkubacije, ploče su isprane (program 1, tip ploče 2, Ultrawash Plus perač ploča sa 96 bazenčića; Dynex) kako bi se uklonilo antitelo za hvatanje. Ploče su zatim blokirane dodavanjem 200 µL podloga za test svakom bazenčiću i inkubirane na sobnoj temperaturi tokom dva sata. Zatim su podloge za test isprane sa ploča (program 1, tip ploče 2, Ultrawash Plus perač ploča sa 96 bazenčića, Dynex), a bilo koja preostala podloga uklonjena je laganim udaranjem i tapkanjem ELISPOT ploča po ubrusu.

[0094] Konstituenti testa su zatim dodati ELISPOT ploči u sledećem redosledu:

50 µL ciljnih ćelija 10<6>ćelije/ml (što ukupno daje 50,000 ciljnih ćelija/bazenčić) 50 µL podloga (podloga za test)

50 µL efektorskih ćelija (20,000 TCR-transdukovanih PBL ćelija/bazenčić)

[0095] Ploče su potom inkubirane preko noći (37°C / 5%CO2). Sledećeg dana, ploče su triput isprane (program 1, tip ploče 2, Ultrawash Plus perač ploča sa 96 bazenčića, Dynex) puferom za ispiranje i osušene tapkanjem po ubrusu kako bi se uklonio višak pufera za pranje. Potom je svakom bazenčiću dodato 100 µl primarnog detekcionog antitela. Primarno detekciono antitelo razblaženo je u 10mL pufera za razblaživanje (zapremina neophodna za jednu ploču) pomoću razblaživanja naznačenog u uputstvima proizvođača. Ploče su zatim inkubirane na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata pre nego što su triput isprane (program 1, tip ploča 2, Ultrawash Plus perač ploča sa 96 bazenčića, Dynex) puferom za ispiranje; višak pufera za ispiranje uklanja se tapkanjem ploče po ubrusu.

[0096] Sekundarna detekcija izvodi se dodavanjem 100 µL razblaženog streptavidin-HRP-a svakom bazenčiću i inkubiranjem ploče na sobnoj temperaturi tokom 1 sata. Streptavidin-HRP razblažen je u 10mL pufera za razblaživanje (zapremina neophodna za jednu ploču), pomoću razblaživanja naznačenog u uputstvima proizvođača. Ploče su potom triput isprane (program 1, tip ploče 2, Ultrawash Plus perač ploča 96 bazenčića, Dynex) puferom za ispiranje i tapkane po ubrusu kako bi se uklonio višak pufera za ispiranje. Ploče su zatim dvaput isprane PBS-om dodavanjem 200 µL svakom bazenčiću, pri čemu se pufer uklanja laganim udaranjem i tapkanjem po ubrusu kako bi se uklonio višak pufera. Ne više od 15 min pre upotrebe, jedna kap (20 uL) AEC hromogena dodata je svakom 1 ml AEC supstrata i promešana. Za svaku ploču pripremljeno je 10ml ovog rastvora; 100 µL je dodato po bazenčiću. Ploča je zatim zaštićena od svetlosti pomoću folije, a razvoj spotova je redovno praćen, pri čemu se obično javlja unutar 5 - 20 min. Ploče su isprane vodom iz vodovoda kako bi se završila reakcija razvoja i osušene protresanjem pre njihovog rastavljanja na tri sastavna dela. Ploče su onda ostavljene da se osuše na sobnoj temperaturi tokom najmanje 2 sata pre brojanja spotova pomoću Immunospot® čitača ploča (CTL; Cellular Technology Limited).

Primer 7 – Identifikacija vezujućeg motiva supstitucijom svim alternativnim aminokiselinama

[0097] Dobijene su varijante nativnog MAGE-A4peptida u kojima je aminokiselinski ostatak na svakoj poziciji sekvencijalno zamenjen svim 19 alternativnih aminokiselina koje se prirodno javljaju, tako da je ukupno pripremljen 171 peptid. Nativini i peptidi sa supstituisanim aminokiselinama pulsirani su na ćelije koje predstavljaju antigen, a proizvodnja interferona γ (IFNγ), na osnovu merenja pomoću ELISpot testa, korišćena je kao iščitavanje za aktiviranje T-ćelija transdukovanih TCR4. Suštinske pozicije

2

definisane su redukcijom većom od 50% aktivnosti T-ćelija u odnosu na nativni peptid.

[0098] ELISpot testovi izvedeni su kao što je opisano u Primeru 6.

[0099] Tolerisani ostaci na svakoj poziciji peptida prikazani su u nastavku. Podvučene aminokiseline predstavljaju nativni ostatak na odgovarajućoj poziciji u peptidu.

[0100] Prema tome, očigledno je da MAGE A4 TCR4 stupa u kontakt najmanje sa V2 Y3 i D4 peptida (SEQ ID no: 1) kada je u kompleksu sa HLA-A*0201 na površini ćelija koje predstavljaju antigen.

SEQ ID No.1 MAGE A4 Epitop

GVVDGREHTV

SEQ ID No.2 MAGE B2 Epitop

GVYDGEEHSV

SEQ ID No.3 alfa varijabilni lanac

SEQ ID No.4 beta varijabilni lanac

2

SEQ ID No.5 rastvorljivi oblik alfa lanca

SEQ ID No 6 rastvorljivi oblik beta lanca

SEQ ID No.7 mutant alfa varijabilnog lanca

SEQ ID No.8 mutant alfa varijabilnog lanca

SEQ ID No.9 mutant beta varijabilnog lanca

SEQ ID No.10 rastvorljivi oblik alfa lanca

2

SEQ ID No 11 rastvorljivi oblik beta lanca

SEQ ID No.12 rastvorljivi oblik alfa lanca

SEQ ID No 13 rastvorljivi oblik beta lanca

SEQ ID No.14 rastvorljivi oblik alfa lanca

2

Claims (17)

1. SEQ ID No 15 rastvorljivi oblik beta lanca

   Patentni zahtevi 1. Receptor T-ćelija (TCR) koji ima svojstvo vezivanja za GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1) u kompleksu sa HLA-A*0201 sa konstantom disocijacije od oko 0,05 µM do oko 20,0 µM na osnovu merenja sa rezonancijom površinskog plazmona na 25°C i sa pH između 7,1 i 7,5 uz upotrebu rastvorljivog oblika TCR-a, i ima najmanje desetostruku selektivnost vezivanja za SEQ ID No:1 u kompleksu sa HLA-A*0201 u odnosu na vezivanje za GVYDGEEHSV (SEQ ID No 2) u kompleksu sa HLA-A*0201, pri čemu taj TCR obuhvata varijabilni domen alfa lanca TCR-a i varijabilni domen beta lanca TCR-a, i pri čemu TCR varijabilni domeni obrazuju kontakte najmanje sa ostacima V2, Y3 i D4 iz GVYDGREHTV (SEQ ID No: 1).
2. 2. TCR prema zahtevu 1, koji je alfa-beta heterodimer, sa sekvencom konstantnog domena TRAV10 TRAC alfa lanca i sekvencom konstantnog domena TRBV24-1 TRBC-2 beta lanca.
3. 3. TCR prema zahtevu 1, koji je u jednolančanom formatu tipa Vα-L-Vβ, Vβ-L-Vα, Vα-Cα-L-Vβ ili Vα-L-Vβ-Cβ, pri čemu Vα i Vβ redom predstavljaju TCR α i β varijabilne regione, Cα i Cβ redom predstavljaju TCR α i β konstantne regione, a L predstavlja linker sekvencu.
4. 4. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, koji je povezan sa oznakom koja se može detektovati, terapijskim agensom ili PK modifikujućom grupom.
5. 5. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom varijabilni domen alfa lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-105 iz SEQ ID No: 3 i ima sledeću CDR mutaciju:

   2 uz pozivanje na numerisanje CDR-ova prikazanih na SEQ ID No: 3, i/ili varijabilni domen beta lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 80% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-105 iz SEQ ID No: 4 i ima najmanje jednu od sledećih CDR mutacija:

   uz pozivanje na numerisanje CDR-ova prikazanih u SEQ ID No: 4.
6. 6. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom varijabilni domen alfa lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena alfa lanca izložena u SEQ ID No.3, a varijabilni domen beta lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena beta lanca izložena u SEQ ID No.9; ili varijabilni domen alfa lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena alfa lanca izložena u SEQ ID No.7, a varijabilni domen beta lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena beta lanca izložena u SEQ ID No.9; ili varijabilni domen alfa lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena alfa lanca izložena u SEQ ID No.8, a varijabilni domen beta lanca predstavlja sekvenca varijabilnog domena beta lanca izložena u SEQ ID No.9.
7. 7. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom varijabilni domen alfa lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu aminokiselinskih ostataka 1-105 iz SEQ ID No: 3 ili 5 ili 7 do 8 ili aminokiselinsku sekvencu u kojoj su njeni aminokiselinski ostaci 1-27, 34-47 i 54-90 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-27, 34-47 i 54-90 tim redom iz SEQ ID No: 3 ili 5 ili 7 do 8 i u kom su aminokiselinski ostaci 28-34, 48-53 i 91- 105 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 28-33, 48-53 i 91-105 tim redom iz SEQ ID No 3 ili 5 ili 7 do 8.
8. 8. TCR prema bilo kom od zahteva 1-7, u kom varijabilni domen alfa lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu aminokiselinskih ostataka 1-105 iz SEQ ID No: 7 ili 8 ili aminokiselinsku sekvencu u kojoj su njeni aminokiselinski ostaci 1-27, 34-47 i 55-89 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-27, 34-47 i 55-89 tim redom iz SEQ ID No: 7 ili 8 i u kojoj su aminokiselinski ostaci 28-33, 48-53 i 91-105 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 28-33, 48-53 i 91-105 tim redom iz SEQ ID No: 7 ili 8.
9. 9. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom, u varijabilnom domenu alfa lanca, sekvenca (i) njenih aminokiselinskih ostataka 1-27 je (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-26 iz SEQ ID No: 3 ili (b) ima jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a); (ii) aminokiselinskih ostataka 28-33 je VSPFSN; (iii) njenih aminokiselinskih ostataka 34-47 je (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 34-47 iz SEQ ID NO: 3 ili (b) ima jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a); (iv) aminokiselinskih ostataka 48-53 je LTIMTF ili LTRMTF ili LTIVTF ili LTILTF (v) njenih aminokiselinskih ostataka 54-90 je najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 55-89 iz SEQ ID No: 3 ili ima jedno, dva ili tri umetanja, brisanja ili supstitucije u odnosu na nju; i (vi) aminokiselina 91-105 je CWSGGTDSWGKLQF
10. 10. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom varijabilni domen beta lanca obuhvata aminokiselinsku sekvencu iz SEQ ID No: 4 ili 6 ili 9 ili aminokiselinsku sekvencu u kojoj su njeni aminokiselinski ostaci 1-45, 51-67 i 74-109 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 1-45, 51-67 i 74-109 tim redom iz SEQ ID No: 4 ili 6 ili 9 i u kojoj su aminokiselinski ostaci 46-50, 68-73 i 109-123 najmanje 90% ili 95% identični sekvenci aminokiselinskih ostataka 46-50, 68-73 i 109-123 tim redom iz SEQ ID No: 4 ili 6 ili 9.
11. 11. TCR prema bilo kom prethodnom zahtevu, u kom, u varijabilnom domenu beta lanca, sekvenca (i) njenih aminokiselinskih ostataka 1-45 je (a) najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci ostataka 1-26 iz SEQ ID No: 4 ili (b) ima jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a); (ii) aminokiselinskih ostataka 46-50 je KGHDR; (iii) njenih aminokiselinskih ostataka 51-67 je (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 51-67 iz SEQ ID NO: 4 ili (b) ima jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a); (iv) aminokiselinskih ostataka 68-73 je SFDVK; (v) njenih aminokiselinskih ostataka 54-90 je (a) najmanje 90% identična sekvenci aminokiselinskih ostataka 54-90 iz SEQ ID NO: 4 ili (b) ima jedan, dva ili tri aminokiselinska ostatka umetnuta ili izbrisana u odnosu na sekvencu iz (a); i (vi) aminokiselina 109-123 je CATSGQGAYNEQFF ili CATSGQGAYREQFF 1
12. 12. Nukleinska kiselina koja kodira TCR prema bilo kom od prethodnih zahteva.
13. 13. Izolovana ili ćelija koja se ne javlja prirodno, naročito T-ćelija, koja predstavlja TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 12.
14. 14. Ćelija koja sadrži (a) TCR ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu prema zahtevu 13 u jednom otvorenom okviru čitanja ili dva različita otvorena okvira čitanja koja redom kodiraju alfa lanac i beta lanac; ili (b) prvi ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira alfa lanac TCR-a prema bilo kom od zahteva 1 do 12 i drugi ekspresioni vektor koji obuhvata nukleinsku kiselinu koja kodira beta lanac TCR-a prema bilo kom od zahteva 1 do 12.
15. 15. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 11, nukleinsku kiselinu prema zahtevu 12 ili ćeliju prema zahtevu 13 ili zahtevu 14, zajedno sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili ekscipijenasa.
16. 16. TCR prema bilo kom od zahteva 1 do 13, nukleinska kiselina prema zahtevu 14 ili ćelija prema zahtevu 15 ili zahtevu 16 za upotrebu u medicini.
17. 17. TCR, nukleinska kiselina ili ćelija za upotrebu prema zahtevu 16, za upotrebu u postupku za lečenje kancera. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5 2