RS62632B1 - Dalargin za upotrebu u lečenju akutnih respiratornih virusnih infekcija - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Pronalazak definisan patentim zahtevima 1-12 odnosi se na medicinu, posebno farmakologiju, i odnosi se na primenu nazalne medicinske kompozicije koja sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicilfenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za lečenje akutnih respiratornih virusnih infekcija (ARVIs - engl. akutne respiratorne virusne infekcije), posebno one izazvane virusom gripa.

[0002] Posebno, pronalazak se odnosi na nazalnu medicinsku kompoziciju za upotrebu u lečenju akutnih respiratornih virusnih bolesti (ARVI).

STANJE TEHNIKE PRONALASKA

[0003] Akutne respiratorne virusne infekcije (ARVI) su trenutno najuobičajeniji tip infekcija, koje čine preko 90% ukupno svih (videti dole Referencu [1] ). Prema Svetskoj zdravstvenoj organizaciji, preko 40 milliona novih slučajeva se prijavi godišnje. Opterećenje društva sa ARVIs je najviše karakterisano visokim indirektnim troškovima, kao što su troškovi odsustva sa radnog mesta, ekonomski gubici usled smanjenje produktivnosti na radu, i troškovi odsustva sa posla članova familije zbog negovanja pacijenata (ekonomski gubici u USA usled privremene nesposobnosti su procenjeni na 232 milliona dolara) [2].

[0004] Ovaj problem je takođe ekstremno relevantan za Rusiju, jer je prema zvaničnim brojevima, 27.3 do 41.2 milliona slučajeva infekcija respiratornog trakta zabaleženo godišnje u Ruskoj Federaciji. Ova bolest, sa velikom specifičnom težinom u celokupnoj strukturi morbiditeta, čini gotovo 40% dana onesposobljenosti [3].

[0005] Trenutno je poznato preko 200 virusa koji izazivaju bolesti slične gripu. Analize rezultata brojnih ispitivanja strukture uzročnika ARVIs, koje su izvedene u različitim zemljama od strane različitih istraživačkih timova, pokazuju da najuobičajeniji patogeni obuhvataju rinoviruse, viruse gripa, viruse parainfluence, respiratorni sincitijalni virus (RSV), koronaviruse, bokavirus i adenoviruse [4].

[0006] Virusi gripa spadaju u grupu ortomiksovirusa i imaju sferni oblik. Unutrašnji deo virusa se sastoji od izopolimeraznog kompleksa (PA, PB1, PB2), ribonukleoproteina i proteina matriksa. Sa druge strane, virus je pokriven sa omotačem (eng. envelope) sa dve vrste površinskih antigena: haemaglutininom (HA) i neuraminidazom (NA). Ove strukture omogućavaju da se virus poveže sa većinom ćelija domaćina i prodre u njih. Površinski antigeni pokazuju varjabilnost, što dovodi do novih sojeva virusa gripa. Najveću varjabilnost pokazuju virusi gripa tipa A , koji su u stanju da izazovu, u toku kratkog vremena, epidemije širom zemlje ili pandemije gripa širom kontinenta. Prema US Center for Disease Kontrola (CDC), epidemije sezonskog gipa izazovu 200 hiljada hospitalizacija godišnje, dok je smrtnost 1.4-1.67 na populaciji od 100 hiljada [5]. Pandemija gripa koja je počela u 2009, bila je izazvana virusom gripa tipa A (H1N1) sa pandemijskim potencijalom. Ovaj virus je kasnije stigao do Rusije i najveći broj pacijenata je zabeležen 2010-2011 i 2015 [6]. Farmakoepidemiološka ispitivanja uzorkovanja izvedna na 1462 pacijenata su pokazala, da su ljudi starosne grupe 18-49 godina činili 84.7 % pacijenata [7].

[0007] Prema tome, prevencija širenja ove grupe bolesti je važan cilj za bilo koju zemlju. Prema tome, dostupno je nekoliko postupaka za lečenje i prevenciju ove grupe bolesti.

[0008] Određenije, masovna vakcinacija populacije je glavna profilaktička mera namenjena za prevenciju epidemija. Vakcine se razvijaju godišnje na osnovu epidemioloških podataka o sojevima virusa koji cirkulišu u okviru određene teritorije. Međutim, skretanje antigena virusa gripa može se javiti posle razvijanja vakcine za tekuću godinu. Poslednjih godina, uobičajena pojava su postali ARVIs izazvani sa nekoliko različitih patogena. Prema nekim proračunima, takvi slučajevi utiču na 70 % pacijenata. Pacijent može simultano da ispušta nekoliko virusa, ili virus u kombinaciji sa bakterijom ili u drugim asocijacijama. Postoje izveštaji koji ukazuju da infekcija može biti izazavana sa jednim virusom, sa uključivanjem drugog virusa u toku napredovanja infekcije, što može otežati klinički tok bolesti. Takve mešovite infekcije često otežavaju stanje pacijenta, produžavaju bolest, mogu pogoršati prethodno postojeća hronična stanja ili doprineti sekundarnim komplikacijma [8].

[0009] Dodatno, lečenje respiratornih virusnih bolesti uključuje antivirusne lekove, uključujući peptide sa antivirusnim efektom. Na primer, antimikrobni peptidi (AMPs) su molekuli same odbrane imunog sistema domaćina, koje verovatno proizvode sve višećelijske biljke i životinje. Oni su prva linija urođenog imuniteta, koja brzo eliminiše invazivne patogene u toku ranih stupnjeva infekcije i može izazvati sistemski adaptivan imuni odgovor. Većina AMPs su amfipatični i katjonski molekuli koji su u stanju da se vežu za mikrobne membrane, koje uglavnom nose negativno naelektrisanje. Idenitfikovane su hiljade AMPs i klasifikovani su na osnovu njihovih strukturnih karakteristika i/ili aminokiselinskog sastava. Dve familije AMP kod kičmenjaka, katelicidini i defensini, su mali molekuli koji su većinom proizvedeni od strane leukocita i epitelnih ćelija.

[0010] Kompozicija koja sadrži ovu klasu peptida je poznata u stanju tehnike, pri čemu peptid može suzbiti različite respiratorne virusne infekcije. Zahvaljuči funkcionalnom domenu koji je u stanju da se veže za površinu glikoproteina respiratornog virusa, peptid može da se veže za površinu glikoproteina i dospe do unutrašnjosti endozoma endositozom. S obzirom da je peptid bogat baznim aminokiselinama, može da spreči pad pH u kasnijim endozomima, tako blokirajući fuziju virusnih i endozomalnih membrana i naknadnu degradaciju virusa sa osobađanjem virusne RNK. Prema tome, peptid pokazuje jaku sposobnost blokiranja infekcija izazvanih respiratornim virusima, kao što su različiti podtipovi virusa gripa i koronavirusa; može biti korišćen za blokiranje ciljanih ćelijskih infekcija sa respiratornim virusima i za prevenciju ili lečenje virusnih respiratornih infekcija (patent RU 2639559, 21/12/2017).

[0011] Međutim, kao što je ranije pomenuto, upotreba takvih proizvoda je ometana različitim genetskim materijalom virusa; posledično, njihov efekat je ograničen na specifične patogene koji odgovaraju na ovaj tip lečenja.

[0012] Lečenje sa kombinovanim proizvodima je takođe korišćeno. Na primer, upotreba kombinovanih proizvoda sa antipiretičkim, analgetskim, anti-edematoznim i angioprotektivnim efektom za simptomatska lečenja ARVIs u svakodnevnoj kliničkoj praksi mogu se smatrati preporučljivim. Upotreba kombinacije simptomskih lekova je u vezi sa smanjenim javljanjem neželjenih efekata u odnosu na set jednokomponentnih lekova, i ekonomski je razumniji [9].

[0013] Međutim, upotreba lekova ovoga tipa zanemaruje važnost zadržavanja nazalne respiratorne funkcije i faktora lokalnog specifičnog i nespecifičnog imuniteta kod pacijenta sa ARVIs.

[0014] U međuvremenu, uzroci ARVI uključuju promene u funkciji nazalne respiracije koji su povezani sa mehanizmom rada, kojim se patogeni uklanjaju iz udahnutog vazduha. Ova funkcija zavisi od proizvodnje nespecifičnih i specifičnih imunih zaštitinih faktora nazalne mukoze i od mukocilijarnog klirensa.

[0015] Preventivni i terapeutski efekti takvih proizvoda su u direktnoj vezi sa njihovom sposobnošću da se uklone agresivni organski i neorganski faktori udahnutog vazduha iz nosne šupljine i normalizuju nespecifični i specifični imunitet i mukocilijarni klirens.

[0016] Upotreba proizvoda koji aktiviraju nespecifičnu otpornost tela je obećavajuća oblast takve prevencije. Induktori endogenih interferona, kao što su Tiloron, Arbidol i Cikloferon, se široko koriste u ruskoj kliničkoj praksi za ove svrhe.

[0017] Dipeptid α-glutamil-triptofan u obliku natrijumove soli je poznati iz literature (patent Ruske Federacije 2107691, 1998). Ovaj peptid se koristi kao imunomodulator koji utiče na ćelijski posredovan i krvni imuni odgovor i nespecifičnu otpornost organizma. On stimulište procese regeneracije ukoliko su suzbijeni, i poboljšava ćelijski metabolizam. Takođe pospešuje diferencijaciju limfoidnih ćelija i može stimulisati aktivnost obrazovanja kolonija ćelija koštane srži, izaziva ekspresiju receptora diferencijacije na limfocitima, normalizuje broj T ćelija pomoćnica i T ćelija supresora i njihov odnos kod pacijenta sa različitim imunodeficijentnim stanjima.

[0018] Ovaj peptid je korišćen u kompoziciji za nazalno davanje, koja je namenjena za prevenciju i/ili lečenje bolesti gornjeg respiratornog trakta, posebno akutne respiratorne virusne infekcije (ARVI), uključujui grip. Kompozicija sadrži aktivne sastojke i ekscipijente; aktivne supstance uključuju morsku so i α-glutamil-triptofan u sledećem odnosu (masenih %):

- morska so: 95.00-98.00;

- α-glutamil-triptofan: 2.00-5.00 (Patent RU2540496, objavljen 10-Feb-2015).

[0019] Ovaj nazalni medicinski proizvod sadrži sastojke morske vode i omogućava aktivno ispiranje nosne šupljine, pomažući uklanjanje mukusa, smanjenje infektivnog pražnjenja i naticanje nosne mukoze, omekšavanje i uklanjanje krasta. Proizvod normalizuje zaštitnu funkciju cilijarnog epitelijuma nosne mukoze i poboljšava disanje kroz nos.

[0020] Međutim, upotreba morske soli i dodatnog sastojka ne pojačava ustvari aktivnost dipeptida; umesto toga, ona smanjuje njegovu stabilnost i aktivnost. Zahvaljujući tome, uprkos činjenici da patentna specifikacija spominje opštepoznato imunomodulatorno svojstvo peptida, ne obuhvata direktne rezultate isptraživanja ili poređenja efikasnosti sa antivirusnim proizvodima koji se trenutno koriste, što onemogućava procenu antivirusnog mehanizma delovenja proizvoda, njegovu antivirusnu efikasnost ili selektivnost.

[0021] Ovi nedostaci zahtevaju razvoj novih proizvoda na bazi peptida sa izražnim antivirusnim dejstvom, koji pokreću fiziološke mehanizme koji inhibiraju razvoj ARVIs.

[0022] Posebno, heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin (označen kao Dalargin) je poznat u stanju tehnike, koji je sintetički strukturni analog endogenog opijatnog regulatornog pentapeptida leucin-enkefalin (H2N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COOH, molekulske mase 555.6 a.m.u.).

[0023] Dalargin pokazuje nespecifičan afinitet za μ (mu), δ (delta) i κ (kapa) opijatne receptore, što objašnjava široki spektar njegove biološke aktivnosti: analgetske [9] i antioksidacione [10] osobine. Registrovan je u Rusiji kao proizvod za smanjenje kiselosti želudačnog soka i egzokrine sekretorne aktivnosti pankreasa (State Registry of Medicinal Products database, Russia). Dodatno, poznato je da supstance pokazuju hipotenzivni i pozitivni hronotropni efekat [11].

[0024] Desetine patenata koji pokazuju različite efekte dalargina su do sada registrovane. Patent RU 2196603 opisuje upotrebu dalargina u lečenju opekotina kao dela infuzione terapije. Patenti UA 6829U, UA 6823U i UA 6826U opisuju upotrebu dalargina za lečenje akutnog eksperimentalnog pankreatitisa. Upotreba dalargina kao sredstva protiv stesa je pokrivena patentima UA 67632, UA 67630 i UA 67629 na eksperimentalnim modelima hroničnog pankreatitisa, akutnog adneksitisa i peritonitisa, tim redom. Aktivnost protiv stresa dalargina je pokazana u patentu UA 67626 na modelu eksperimentalnog hroničnog stresa. Dontsov A.V., "Dalargin in the correction of anxiety and depressive disorders in patients with metabolic syndrome", BIOSIS, BIOSCIENCES INFORMATION SERVICE, PHILADELPHIA, PA, US, (2013) opisuje endonazalno davanje dalargina za upotrebu u lečenju anksioznosti i depresivnih poremećaja kod pacijenta sa metaboličkim sindromom. Patent RU2323019 opisuje dobijanje dalargina za upotrebu u lečenju posttraumatske senzoneuralne gluvoće u akutnom stanju izazvanom od strane povrede od eksplozije mine u kombinaciji sa paralelnom upotrebom elektropunkture. Buglak N.P. et al, "The use of dalargin for treating duodenal peptic ulcer recurrences on an outpatient basis.", MEDLINE, US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US, (199407) opisuje intranazalno davanje dalargina za upotebu u lečenju recidiva peptičkog ulukusa duodenuma, gde patent RU2436588 opisuje intranazalnu kompoziciju dalargina za upotrebu u lečenju bolesti čira na želudcu i dvanaestopalačnom crevu, pankreatitis i pankreatonekrozu. Buglak N.P. et al "Use of a dalargin aerosol in treating the exacerbations of uncomplicated duodenal peptic ulcer", MEDLINE, US NATIONAL LIBRARY OF MEDICINE (NLM), BETHESDA, MD, US, (198807) opis intranazalne kompozicije dalargina (aerosol) za upotrebu u lečenju pogoršanja nekomplikovanog peptičkog ulukusa duodenuma.

[0025] Patent RU 2180598 opisuje upotrebu dalargina za lečenje toksičnog hepatitisa kod pacijenta sa hroničnom zavisnošču od lekova. Objava MD1413F opisuje upotrebu dalargina za lečenje oralne mukoze i lichen planusa, i objava MD1296F prikazuje podatke terapije lichen planusa sa dalarginom. Prijava RU 2008131509 predstavlja farmaceutsku kompoziciju za lečenje bolesti demijelinacije, koja sadrži dalargin. Patent RU 2218896 opisuje upotrebu dalargina za lečenje bulozne keratopatije. Objave MD1963F i MD1610F obuhvataju upotrebu dalargina u slučajevima hronične rekurentne oralne ulceracije, i patent RU 2230549 pokriva njegovu upotrebu u lečenju alergijskih dermatoza.

[0026] Dodatno, efikasnost dalargina u lečenju nekoliko virusnih bolesti je pokazana u patentima RU 2261722 (lečenje latentnog oblika genitalnog herpesa kod žena sa sindromom gubitka fetusa) i RU 2167671 (lečenje krpeljskog meningoencefalitisa). Međutim, ovi radovi ne pokrivaju lečenje ARVIs ; oni su povezani sa lečenjem drugih bolesti. Dodatno, oni ne daju indikacije direktnog antivirusnog efekta razmatranih heksapeptida.

[0027] Pored toga, uprkos činjenici da patent RU 2241488 opisuje upotrebu dalargina kao rastvora za injekcije, i prijava RU 2010152024 opisuju imunomodulatorne osobine dalargina; posebno su ignorisani njegov efekat na proizvodnju citokina, aktivnost prirodnih ćelija ubica, aktivnost koja indukuje interferon ili utičaj na fagocitozu. U stvari, ovi radovi propuštaju da pokazuju poboljšanje lokalnog imuniteta pod dejstvom heksapeptida.

[0028] Sumarno, do sada objavljeni materijali ne uspevaju da razmotre antivirusnu aktivnost dalargina kao takvu, ne opisuju potpuno njegove imunomodulatorne osobine i ne pokrivaju izvodljivost upotrebe ovog proizvoda u ARVI terapiji.

CILJ I SUŠTINA PRONALASKA

[0029] U isto vreme, izvedena ispitivanja od strane trenutnih autora pokazuju da efekti dalargina, posebno direktni antivirusni efekat, sposobnost da se pospeše faktori lokalnog i sistemskog imuniteta posle lokalnog nazalnog davanja, dozoljavaju njegovo korišćenje u monoterapiji ili u kombinaciji sa drugim medicinskim proizvodima za lečenje ili prevenciju ARVIs, uključujući grip. Prikazani pronalazak je definisan patentnim zahtevima 1 do 12.

[0030] Rezultati su dozvolili da autori razviju i predlože za primenu nazalne lekovite kompozicije koja sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za lečenje akutne respiratorne virusne infekcije (ARVIs), posebno one koja je izazvana virusom gripa.

[0031] U posebnom izvođenju pronalaska, ova bolest je grip.

[0032] U posebnom izvođenju pronalaska, farmaceutski prihvatljiva so je tirozil-D-alanil-glicilfenilalanil-leucil-arginin diacetat.

[0033] U posebnom izvođenju, nazalna kompozicija je dobijena u obliku spreja koji sadrži, kao aktivnu supstancu, heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegov farmaceutski prihvatljiv oblik u masenom procentu od 0.01 % do 3 % i ekscipijente koji čine ostatak.

[0034] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu masenih % komponenti: heksapeptid: 0.01-3 %, natrijum hlorid 7-11 %, sa vodom koja čini ostatak.

[0035] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu masenih % sastojaka: heksapeptid: 0.01-3 %, sa vodom koja čini ostatak.

[0036] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu masenih % komponenti: heksapeptid: 0.01-3 %, natrijum hlorid 7-11 %, benzalkonijum hlorid 0.1-0.2 %, sa vodom koja čini ostalo.

[0037] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži, kao ekscipijenate, natrijum hlorid i vodu u sledećem odnosu masenih % komponenti: natrijum hlorid 9 %, voda 90 %.

[0038] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži kao vodu, vodu za injekcije.

[0039] U posebnom izvođenju pronalaska, kompozicija je karakterisana time što sadrži kao vodu, prečišćenu vodu.

[0040] Tehnički rezultati pronalaska za koji je zatražena zaštita su:

- proširenje tehničkog alata za razvoj nazalnih kompozicija za lečenje ARVI;

- razvoj proizvoda čijom se primenom mogu ukloniti organski i neorganski faktori udahnutog vazduha iz nosne duplje i normalizovati nespecifična i specifična imunološka zaštita;

- razvoj proizvoda na bazi peptida sposoban da pokaže direktan antivirusni efekat na patogene koji izazivaju ARVI prisutne u organizmu i na mestima ulaza.

[0041] Prema tome, novost i suština ovog pronalaska se nalazi u razvoju proizvoda u kome je dokazan stvarni antivirusni efekat dalargina za glavne patogene koji izazivaju ARVI: viruse gripa i adenoviruse, i potpuno otkriće imunomodulatorne aktivnosti komponente dalargina u lečenju ovih bolesti.

KRATAK OPIS SLIKA NACRTA

[0042]

Slika 1 prikazuje dijagram koncentracije IFN-α u krvnoj plazmi miša posle davanja dalargina, arbidola i placeba

Slika 2 prikazuje dijagram koji odražava efekat dalargina na citotoksičku aktivnost prirodnih ćelija ubica.

Slika 3 prikazuje dijagram koji odražava suzbijanje sinteze pro-inflamatornih citokina pod dejstvom dalargina.

[0043] Tabela 1 pokazuje minimalne inhibitorne koncentracije (MIC50) i aktivnost upoređivanih proizvoda relativno u odnosu na soj virusa A gripa/Nove Kaledonije/20/99 (H1N1) u kulturi MDCK tkiva.

Tabela 1

[0044] -Tabela 2 pokazuje antivirusnu efikasnost jedinjenja na modelu upale pluća izazvane gripom kod miša.

Tabela 2

(nastavak)

[0045] Tabela 3 pokazuje efikasnost dalargina naspram adenovirusa tipa 5 u monosloju kulture HeLa ćelija.

Tabela 3

[0046] Tabela 4 pokazuje efekat dalargina na fagocitnu aktivnost mišjih neutofila i makrofaga.

Tabela 4

OPIS PRIMERA PRONALASKA

[0047] Dole su prikazani primeri primene pronalaska.

Primer 1. Dobijanje dalargina.

[0048] Postupak dobijanja dalargina i njegove farmaceutski prihvatljive soli je ranije opisan i klasičan je postupak peptidne sinteze. Dole je opisan postupak sinteze dalargina.

Sinteza H-Phe-Leu-Arg

[0049] Rastvoriti 750 g Z-Leu-ONSu u 3 L DMF, dodati 368 g Arg u dobijeni rastvor, mešati u toku 24 sati. Upariti DMF na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Rastvoriti dobijeno ulje u 15 L butanola i preneti u stakleni eksikator snabdeven mešalicom . Dodati 10 L destilvane vode u eksikator. Mešati u toku 5 minuta dok se slojevi potpuno ne odvoje (10-24 sati). Odliti vodu u čistu konzervu. Ispati organski sloj još 3 puta sa porcijama od 3 L destilovane vode.

[0050] Sakupiti vodeni sloj i vodu od ispiranja i dodatno ekstrahovati sa 4 L butanola. Upariti butanol na rotacionom uparivaču na 43 °C pod vakuumom membranske pumpe .

[0051] Rastvoriti dobijeno ulje Z-Leu-Arg u 3 L etanola. Premestiti rastvor u reaktor za hidrogenizaciju. Dodati 50 g suspendovanog Pd/C u 1.5 L vode. Pre hidrogenizacije, prečitstiti reaktor sa azotom. Povećati pritisak u reaktoru sa vodonikom do 2 kgf/cm<2>i pokrenuti pumpu za recirkulaciju, održavajući temperaturu na ili ispod 43 °C. Procediti katalizator, isprati reaktor sa 2 L destilovane vode, zatim isprati katalizator na filteru sa istom vodom. Upariti filtrat na rotacionom uparivaču na 43 °C pod vakuumom membranske pumpe .

[0052] Rastvoriti dobijeno ulje H-Leu-Arg u 3 L DMF i upariti 1 L na rotacionom uparivaču pod vakuumom krilne pumpe. Dodati rastvor 785 g Z-Phe-ONsu u 2 L DMF u dobijeni rastvor i mešati u toku 24 sata. Upariti DMF na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Rastvoriti dobijeno ulje u 15 L butanola i premestiti u stakleni eksikator snadeven sa mešalicom. Dodati 10 L destilovane vode u eksikator. Mešati u toku 5 minuta. Isprati sa organskim slojem još 3 puta sa porcijama od 3 L destilovane vode . Sakupiti vodeni sloj i vodu za ispiranje i dodatno ekstrahovati sa 4 L butanola. Sakupiti delove butanola i upariti butanol na rotacionom uparivaču na 43 °C pod vakuumom membranske pumpe.

[0053] Rastvoriti dobijeno ulje Z-Phe-Leu-Arg u 3 L etanola, da bi se dobilo 6 L rastvora. Premestiti rastvor u reaktor za hidrogenizaciju. Dodati 50 g suspendovanog paladijuma na ugljeniku u 1.5 L vode. Pre hidrogenizacije, pročistiti reaktor sa azotom. Povećati pritisak u reaktoru sa vodonikom do 2 kgf/cm<2>i pokrenuti pumpu za recirkulaciju. Recirkulacija izaziva zagrevanje; održava temperaturu na ili ispod 43 °C. Posle ceđenja katalizatora, isprati reaktor sa 2 L destilvane vode, zatim isprati katalizator na filteru sa istom vodom. Upariti filtrat na rotacionom uparivaču na 43 °C pod vakuumom membranske pumpe. Rastvoriti dobijeni H-Phc-Leu-Arg u 3 L DMF (približno 0.6 mola po kg rastvora), zatim koristiti rastvor za proteinsko umrežavanje.

Sinteza Boc-Tyr(Boc)-Ala-Gly-ONP

[0054] Rastvoriti 907 g H-Gly(OBzl)*Tos u 3 L DMF, podesiti pH na 7.2-7.5 sa N-metilmorfolinom. Dodati rastvor 773 g Boc-Ala-ONSu u 2 L DMF u jednoj porciji uz hlađenje na vodenom kupatilu . T ≤25 °C. Ukloniti kupatilo i mešati na sobnoj temperaturi. TLC kontrola. Upariti DMF na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Rastvoriti dobijeno ulje u 15 L etil acetata i premestiti u stakleni eksikator snabdeven sa mešalicom. Isprati organski sloj 3 puta sa porcijama od 3 L vode. Dovesti 200 mL zasićenog rastvora Na2CO3 do 3 L sa vodom, isprati organski sloj sa ovim rastvorom, zatim isprati još 3 puta sa porcijama od 3 L vode. Pripremiti rastvor 6.5 mL 20 % sumporne kiseline u 3 L vode, isprati organski sloj sa ovim rastvorom, zatim isprati još 3 puta sa porcijama od 3 L vode. Pri svakom ispiranju dodati 0.5 L etil acetata. Upariti etil acetat na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom membranske pumpe. ;;[0055] Rastvoriti dobijeni Boc-Ala-Gly(OBzl) u 3.4 kg trifluorosirćetne kiseline ohlađene na 5 °C uz hlađenje na ledenom kupatilu i intenzivno mešanje. Pošto je rastvaranje završeno, ukloniti kupatilo i mešati u toku još 1.5 sati na temperaturi okoline. Upariti TFA na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom membranske pumpe. Zatim zajedno-upariti sa 0.5 L benzena tri puta . ;;[0056] Rastvoriti dobijeno ulje H-Ala-Gly(OBzl) u 2.5 L DMF uz hlađenje na vodenom kupatilu , podesiti pH do 7.2-7.4. Dodati rastvor 1183 g Boc2-Tyr-ONSu u 2 L DMF, T ≤ 25 °C. Ukloniti kupatilo i mešati na sobnoj temperaturi tokom 12 sati. ;;[0057] TLC kontrola. Upariti DMF na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Rastvoriti dobijeno ulje u 15 L etil acetata i premestiti u stakleni eksikator snabdeven sa mešalicom. Isprati organski sloj 3 puta sa porcijama 3 L vode. Dovesti 200 mL zasićenog rastvora Na2CO3 do 3 L sa vodom, isprati organski sloj sa ovim rastvorom, zatim isprati još 3 puta sa porcijama od 3 L vode. Pripremiti rastvor 7.5 mL 20 % sumporne kiseline u 3 L vode, isprati organski sloj sa ovim rastvorom, zatim isprati još 3 puta sa porcijama od 3 L vode. Upariti etil acetat na rotacionom uparivaču na 41 °C. Rastvoriti ulje u 2.6 L vrelog izopropil alkohola i u porcijama , u toku približno jednog sata, dodati 7.5 L heksana, mešati do obrazovanja taloga. Procediti talog Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl), isprati 2 puta sa porcijama od 5 L smešom heksana/IPA (4.2/0.8). Osušiti na okolnom vazduhu. Prinos 1300 g. ;;;1 ;[0058] Rastvoriti dobijeni Boc2-Tyr-Ala-Gly(OBzl) u 5 L etanola, da bi se napravilo 6 L rastvora. Premestiti rastvor u reaktor za hidrogenizaciju. Dodati 50 g suspendovanog paladijuma na ugljeniku u 1.5 L vode. Pre hidrogenizacije, pročistiti reaktor sa azotom. Povećati pritisak u reaktoru sa vodonikom do 2 kgf/cm<2>i pokrenuti pumpu za recirkulaciju. Recirkulacija izaziva zagrevanje; održavati temperaturu na ili ispod 43 °C. TLC kontrola za 3 sata. Procediti katalizator, upariti filtrat na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom membranske pumpe. Rastvoriti u 2 L DMF, upariti 1 L na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Dodati 1 L DMF i 3.5 L etil acetata, zatim dodati rastvor 310 g nitrofenola u 0.5 L etil acetata i 0.3 L DMF. Ohladiti na 18 °C. Pripremiti rastvor 470 g DCC u 0.8 L etil acetata i 0.4 L DMF. Ohladiti na -18 °C. Posle toplotnog uravnotežavanja, pomešati oba rastvora i ostaviti ih u toku 24 sata na temperaturi okoline. Procediti staloženu ureu, isprati dva puta sa porcijama od 2 L etil acetata. Upariti filtrat na rotacionom uparivaču pod vakuumom membranske pumpe a zatim krilne pumpe na 41 °C. Kristalizovati staloženo ulje iz vrelog izopropanola i heksana u sledećem odnosu : uzeti 0.8 L izopropanola i 0.4 L heksana po 0.6 mol Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP, mešati do obrazovanja taloga. Procediti staložen Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP, isprati 2 puta sa porcijama od 5 L smeše heksan/izopropanol (1/2). Prinos 1170 g. ;;[0059] Rastvoriti 530 g Boc2-Tyr-Ala-Gly-ONP u 1.2 L DMF i, uz hlađenje na vodenom kupatilu , dodati ga u izračunatu količinu rastvora H-Phc-Lcu-Arg (1/1). Mešati u toku 2 sata. Upariti DMF na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom krilne pumpe. Rastvoriti ulje u 3.2 L vrelog izopropanola i u porcijama dodati 4.5 L vrelog heksana uz mešanje. Jednom kada se rastvor ohladi do približno 40-45 °C, dodati 110 g glacijalne sirćetne kiseline . Mešati u toku 2 sata. Procediti staloženi Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg, isprati 2 puta sa porcijama od 1.5 L smeše heksan/izopropanol (2/1). Osušiti na temperaturi okoline . Prinos 700 g. ;;Sinteza dalargina ;;[0060] Rastvoriti 100 g Boc2-Tyr-Ala-Gly-Phe-Leu-Arg u TFA uz hlađenje na ledenom kupatilu . Mešati u toku jednog sata posle potpunog rastvaranja. Upariti TFA na rotacionom uparivaču na 41 °C pod vakuumom membranske pumpe. Pomešati ostatak sa 1.5 L dietil etra, procediti, i isprati 3 puta sa etrom . Dozvoliti da se osuši pod vakuumom membranske pumpe na 35 °C u toku 6 sati. Prinos 95 g. ;Primer 2. Dobijanje nazalne kompozicije heksapeptida. ;;[0061] Dobijanje kompozicije u obliku spreja koja sadrži dalargin obuhvata: dobijanje rastvora dalargina, punjenje fiola. ;;[0062] U cilju pripremanja nazalne kompozicije, dodati 0.01 do 3 g heksapeptida (u zavisnosti od sastava rastvora) u 50 mL vode za injekcije na 20-25 °C. Dovesti dobijeni rastvor do 100 mL sa vodom za injekcije. Sterilisati dobijeni rastvor membranskom filtracijom pod aseptičkim uslovima propuštanjem kroz filter 0.22 μm, puniti u polimerne ili staklene fiole pod inertnim gasom, zatvoriti fiole sa gotovim proizvodom. ;;[0063] Dodatno, natrijum hlorid može biti dodat kao deo postupaka dobijanja kompozicije . Da bi se ovo postiglo, rastvoriti 7 do 11 g natrijum hlorida (u zavisnosti od sastava rastvora) u 50 mL vode za injekcije na 20-25 °C uz mešanje. Zatim dodati 0.01 do 3 g heksapeptida (u zavisnosti od sastava rastvora) uz mešanje. Dovesti dobijeni rastvor do 100 mL sa vodom za injekcije. Sterilizovati dobijeni rastvor membranskom filtracijom pod aseptičkim uslovima njegovim propuštanjem kroz filter od 0.22 μm , puniti u polimerne ili staklene fiole pod inertnim gasom, zatvoriti fiole sa završenim proizvodom. ;;[0064] Dodatno, benzalkonijum hlorid može biti dodat kao deo postupka dobijanja kompozicije . Da bi se ovo postiglo, rastvoriti 7 do 11 g natrijum hlorida (u zavisnosti od sastava rastvora) i 0.1-0.2 g benzalkonijum hlorida u 50 mL prečišćene vode za injekcije na 20-25 °C uz mešanje. Zatim dodati 0.01 do 3 g heksapeptida (u zavisnosti od sastava rastvora) uz mešanje. Dovesti dobijeni rastvor do 100 mL sa prečišćenom vodom. Sterilizovati dobijeni rastvor membranskom filtracijom pod aseptičkim uslovima njegovim propuštanjem kroz filter od 0.22 μm, napuniti u polimerne ili staklene fiole pod inertnim gasom, zatvoriti fiole sa završenim proizvodom . ;;[0065] Ovaj postupak može biti korišćen za dobijenje formulacija sledećeg sastava : ;;; ;;;; ;;;; ;;; [0066] Rezultati eksperimenata koji potvrđuju efikasnost dalargina kao antivirusnog i imunomodulatornog proizvoda su prikazani dole. Obezbeđena ispitivanja u ovim primerima su napravljena i izvedena prema efikasnim smernicama za postupke koje se odnose za predklinički razvoj antiviruskih medicinskih proizvoda, imunomodulatornih proizvoda i induktora interferona [17]. ;;[0067] Primer 3. In vitro ispitivanje antivirusne aktivnosti heksapeptida naspram referentnog soja A/H1N1 virusa gripa . ;;[0068] Test je izveden u odnosi na arbidol pomoću sojeva virusa A gripa/Nove Kaledonije/20/99 (H1N1) na modelu kulture MDCK tkiva. ;[0069] S obzirom da arbidol pokazuje 100 % inhibitorni efekat (na reprodukciju epidemijskih sojeva virusa ) u koncentraciji od 10.0 μg/mL, ova koncentracija u vodi je izabrana za upoređivanje antivirusne efikasnosti proizvoda pod uslovima identičnog stepena infekcije sa virusom A gripa. ;;[0070] Dodatno, koncentracije koje inhibiraju reprodukciju virusa za 50 % (MIC50) su izračnate za svaki proizvod . ;;[0071] Može se videti iz podatka iz Tabele 1 (Dodatak 4) da obe supstance pokazuju visoku antivirusnu aktivnost u odnosu na sojeve virusa A gripa/Nove Kaledonija/20/99 (H1N1), sa heksapeptidom koji ima niže MIC vrednosti, u ekstremno niskim koncentracijama u rastvoru. ;;[0072] Primer 4. Ispitivanje antivirusne efikasnosti dalargina u odnosu na virus A gripa na modelu upale pluća kod miševa. ;;[0073] Miševi (n = 40, BALB ženski, srednje vrednosti mase 18-22 g) su izazivani intranazalno sa virusom A gripa/Aichi/2/69 (H3N2) pod blagom anestezijom sa etrom. Virusna doza koja sadrži 10 LD50 je određena unapred. U tom cilju, grupe 5-6 miševa razblaženja (od 10<-1>do 10<-6>). Podaci sugerišu da LD50 odgovara razblaženju 10<-3>virusa. Sve životinje su bile izazivane sa a 10-strukom srednjom vrednošću letalne doze virusa u 50 μL. ;;[0074] Arbidol je izabran kao aktivna kontrola. Četiri grupe životinja (svaka po 10 životinja) su bile nasumično sastavljene (randomizacijom): ;;- kontrola grupa (rastvor soli); ;;- grupa sa arbidolom ; ;;- grupa IM dalargina ; ;;- grupa intranazalnog dalargina . ;;[0075] Dozni režim dalargina, arbidola i placeba: 24 h i 1 h pre izazivanja, zatim svaka 24 sata posle izazivanja u toku 5 dana. Dalargin je davan pri dnevnoj dozi od 2 mg/kg IM ili intranazalno. Arbidol je davan pomoću stomačne sonde (oralno). ;;[0076] Dalargin je davan kao farmaceutska kompozicija razblažena do potrebne koncentracije kao u primeru 2, sa ili bez natrijum hlorida, u cilju postizanja preporučenih zapremina za intramuslularni (0.5 mL) ili intranazalni (0.01 mL) način davanja. ;;[0077] Tretirane i kontrolne životinje su svakodnevno praćene. Miševi su mereni dana 3, 5 i 15 posle izazivanja. ;;[0078] Hemoterapeutska aktivnost jedinjenja na modelu upale pluća kod miševa izazvane gripom je bila procenjivana pomoću dva kriterijuma : 1) prosečni životni vek i 2) gubitak mase u toku vremena (u odnosu na kontrolnu grupu). ;;[0079] Prosečni životni vek miševa je izračunat pomoću formule MSD = f*(d -1)/n, gde f je broj miševa koji je umro dana d; miševi koji su preživeli su takođe uključeni u f, i d u ovom slučaju je 15; n je broj miševa u grupi ). ∑

1

[0080] Miševi su mereni dana 3, 5 i 15 posle izazivanja. Gubitak ili dobitak u masi je izračunavan odvojeno za svako miša i izražen u procentima. Masa životinje pre izazivanja je uzeta kao 100 %. Srednja vrednost gubitka ili dobitka u masi je izračunavana za sve miševe u okviru grupe.

[0081] U kontrolnoj grupi, gubitak mase je bio najveći dana 5 posle izazivanja. U grupama koje su primile testirani lekove, smanjenje mase je statistički značajno manjenje od obe kontrolne grupe. Grupe koje su primile arbidol ili dalargin nisu pokazale zanačajne razlike u gubitku mase u toku vremena jedna u odnosu na drugu .

[0082] Prosečan životni vek miševa u kontrolnoj grupi je bio najniži, 8.5 dana. Tretman sa arbidolom ili dalarginom je povećalo prosečan životni vek kod životinja , koji je narastao do 11-14 dana. Međutim, terapija, dok je omogućila da se poveća odnos životinja koje su preživele posle izazivanja (u odnosu na placebo), nije uspela da u potpunosti spreči mortalitet kod životinja (Tabela 2 -Dodatak 4).

[0083] Podaci pokazuju da IM ili intranazalno davanje dalargina po 2 mg/kg/danu u toku 5 dana smanjuje mortalite miševa usled upale pluća izazvane gripom i smanjuje gubitak mase u odnosu na placebo. Dalargin pokazuje veću efikasnost u odnosu na arbidol u smislu prosečnog životnog veka i odnosa preživljavanja. Intramuskularno i intranazalno davanje dalargina dalo je slične rezultate u smislu antivirusne aktivnosti.

[0084] Primer 5. Eksperimentalno testiranje antivirusne efikasnosti Dalargina u odnosu na infekciju adenovirusa .

[0085] Rad je izveden korišćenjem adenovirusa tipa 5, koji je nabavljen u 1998 od D.I. Ivanovsky Research Institute of Virology i čuvan u the Specialised Collection of a branch of the 48th Central Research Institute of the Ministry of Defence of Russia ------Computing Centre.

[0086] Korišćena je kultura HeLa tipa (ćelije karcinoma grlića) sa gustinom 200-250 hiljada/mL . Korišćen je polusintetički medijum za rast zasnovan na Hankovom rastvoru koji sadrži 7.5 i 2 % goveđeg seruma tim redom. 48-časovna kultura monosloja HeLa ćelija je inficirana sa andenovirusom tipa 5 adenovirus pri dozi od 0.01 TCID50 po ćeliji. Monosloj kulture je zatim inkubiran na 37 ± 0.5 °C u toku 96 sata.

[0087] Antivirusna aktivnost proizvoda je procenjena supresijom citopatogenog efekta (CPE) virusa u kulturi HeLa pošto je virus primenjen na ustanovljeni monosloj kulture HeLa ćelija.

[0088] Kriterijumi efikasnosti testiranog leka su bili: CPE detekciona brzina i konstanta inhibicije (Ki, %). Konstanta inhibicije je izračunata prema sledećoj formuli: Ki = 100·(Cc-Ct)/Cc, gde Cc i Ct je infektivni titar virusa u kontrolnom uzorku i tesiranom uzorku tim redom .

[0089] Kada je dalargin davan 24 h pre izazivanja monosloja kulture sa adenovirusom u dozi od 0.01 TCID50 po ćeliji pri koncentraciji od 100, 20 i 10 μg/mL, proizvod je gotovo potpuno zaštitio ćelije od citopatogenog efekta virusa. Pri 10 μg/mL, zaštitna efikasnost proizvoda je bila 40.0%. Kada je dalargin dat u medijum za održavanje 24 h pre izazivanja, zaštitni efekat proizvoda je narastao za 10-20 % u odnosu na davani lek 2 sata posle izazivanja.

[0090] Pre davanja, primerna dalargina je suprimovala reprodukciju adenovirusa tipa 5 u monosloju kulture HeLa, i rezultati potkrepljuju antivirusnu efikasnost ispitivanja leka u odnosu na infekciju adenovirusa (Tabela 3).

Primer 6. Procena efekta indukovanja interferona daralginom kod miševa.

[0091] U svim virusnim infekcijama, interferoni (INF) se dobijaju kao deo ranog odgovora citokina. Oni izazivaju da ribozomi porizvode brojne enzime koji inhibiraju tanskripciju i translaciju virusnog genoma, koji suzbijaju reprodukciju virusa. Izmenjene ćelije inficirane sa virusom su eliminisane uz pomoć NK ćelija i citotoksičnih T ćelija, gde antivirusna odbrana neinficiranih ćelija je aktivirana usled efekata IFN-α i IFN-β. Iz ovog razloga, potraga za netoksičnim induktorima endogenih interferona, kao i putevima za stimulaciju njegovih proizvoda, su glavni interes i važnost za medicinsku virologiju [18, 19].

[0092] Arbidol, antivirusni proizvoda sa aktivnošću indukovanja interferona, je izabran kao komparativni lek.

[0093] Eksperimenti su izvedeni na 40 CBA x C57BI/6 /muškim miševima sa telesnom masom od 20-25 g. Životinje su nasumično raspoređene u 4 grupe (10 životinja svaka): dve aktivne grupe (primale su dalargin ili arbidol) i dve kontrole grupe. Jedna kontrola grupa je namenjena za određivanje osnovne linije nivoa INF (pre početka eksperimenta), druga grupa je namenjenja za određivanje nivoa INF 24 sata posle davanja placeba (rastvora soli), obezbeđujući ekvivalentne uslove.

[0094] Životinje su smešte u kaveze u zvučno izolovanu sobu sa prirodnim ciklusom svetlo-mrak na 20-22 °C; hrana i voda su bili dostupni ad libitum.

[0095] Dalargin je davan u dozi od 1 mg/kg, koja je ekvivalentna humanoj dozi od 5-6 mg. Arbidol je davan intragastrično kao suspenzija premiksa u 1 % gelu skroba. Izvedena je statistička analiza pomoću Bonferoni korekcija za višestruko testiranje.

[0096] Nivoi IFN-α u plazmi krvi miševa su mereni 24 sata posle davnja leka. Krv za određivanje interferona je uzorkovana iz srca uz Nembutalnu anesteziju (60 mg/kg). Uzorci krvi su ostavljeni na sobnoj temperaturi u toku 2 sata da bi se izazvala koagulacija, krvna plazma je odvojena centrifugiranjem, sakupljena (2 miša po sakupljanju), zamrznuta i čuvana na -20 °C do testiranja. IFN nivoi su određeni korišćenjem komercijalno dostupnih kompleta enzimskih imunosorbentih testova (ELISA) proizvedenih od VeriKine™ (USA). ELISA je izvedena posle dvostrukog razblaženja sakupljenog seruma sa razblaživačima preporučenim u uputstvu proizvođača kompleta.

[0097] Uzorci za testiranje i razblaženi standardi su primenjivani na ploče u duplikatu. U korišćenom imunosorbentnom testu sa čvrstom fazom, analit je antigen (Ag) sa dva mesta vezivanja (epitopa), i sredstvo za prepoznavanje je predstavljeno sa dva tipa monoklonalnih antitela (Ab) (sendvič ELISA). Jedan tip antitela Ab je imobilizovan na čvrstoj fazi i veže se za epitop molekula analita, koji je prisutan u tećnoj fazi; drugi tip Ab je prisutan u konjugatu biotina i vezuje se za drugi epitop molekula analita. Peroksidaza rena konjugovana sa streptavidinom je komponenta indikatora . Tetrametilbenzidin (TMB) je korišćen kao supstrat u detekcionim sistemu. Aktivnost vezane peroksidaze je merena na UNIPLAN™ (Picon) analizatoru za imunotestove na 450 nm.

1

[0098] Kontrolne grupe nisu pokazele razlike u IFN nivoima pre i posle doziranja sa placebom (rastvor soli). Numeričko (ali neznačajno) povećanje u nivoima IFN-α je detektovano u uzorcima krvnog seruma sakupljenog analizom 24 sata posle doziranja sa arbidolom.

[0099] U međuvremenu, grupa dalargina je pokazala značanu proizvodnju INF-α u odnosu na obe kontrolne grupe i u odnosu na arbidol (p < 0.001) (Sl.1). Neuspeh! Referentni izvor nije pronađen

Primer 7. Procena efekta dalargina na funkcionalnu aktivnost ćelija prirodnih ubica (NK).

[0100] Ćelije prirodne ubice su velike granularne limfocite sa CD3-CD16+CD56+ fenotipom, koji može prepoznati i ubiti ciljane ćelije bez prethodne senzitizacije, što je naročito važno u funkcionisanju antititumorskog imuniteta i u slučajevima infestacije sa intraćelijskim parazitima.

[0101] Kada je procenjivan efekat dalargina in vitro na funkcionalnu aktivnost NK ćelija, ove ćelije su dobijene iz suspenzije mononuklearnih ćelija periferne krvi zdravih donora (n = 20).

[0102] Funkcionalna aktivnost NK ćelije je određena na bazi citotoksične reakcije (NK može lizirati ćelije mijeloblastoidnih i limfoblastoidnih linija) pomoću radiometrijskih testova. Da bi se to obavilo, ćelije K-562 mijeloblastoidne linije u koncentraciji od 10<6>/mL su inkubirane u toku jedan sat na 37 °C sa<3>H-uridinom na 3 μCi/mL ćelije suspenzije dana 2 posle subkultivacije. Posle inkubacije, ćelije su isprane od radioobleživača u medijumu 199 tri puta.

[0103] Citotoksična reakcija je izvedena u uzorcima od 200 μL na pločama sa 96- bunarčića sa okruglim dnom. U tom cilju, 100 μL obeleženih ciljanih ćelija i 100 μL mononuklearnih (efektorskih) ćelija periferne krvi donora je pomešano u odnosu 1:50 u triplikatu za svako razblaženje.

[0104] U jednom slučaju, pošto su efektorske ćelije i ciljane ćelije nanete na ploče, dalargin je dodat u molarnoj koncentraciji od 5·10<-8>M (≈0.036 μg/mL). Lek nije dodat u kontrole uzorke. U cilju određivanja oslobođenog obeleživača, jednaka količina Triton X-100 je dodata u ciljane ćelije. Ploče su inkubirane u toku 24 sata u inkubatoru CO2 na 37 °C, nakon čega je sadržaj premešten na filtere od fiberglasa, ispran, osušen, smešten u fiole sa scintilacionom tečnošću, i radioaktivnost je određivana pomoču brojača β-čestica, indeks citotoksičnosti (CI) je određen korišćenjem formule CI = ((A-B)/(C-B))·100%, gde je A radioaktivnost ciljanih ćelija u prisustvu ćelija efektora, B je zaostala aktivnost posle tretiranja ciljanih ćelija sa Triton X-100, C je radioaktivnost u ciljanim ćelija bez prisustva ćelija efektora.

[0105] Kako je prikazano na sl.2, rezultati testa ukazuju na imunotropski potencijal dalargina u odnosu na ćelije prirodne ubice.

Primer 8. Ispitivanje efekta dalargina na fagocitozu

[0106] Dalargin je trenutno odobren za humanu upotrebu u jednoj dozi u opsegi od 1 do 5 mg [20], koja, ukoliko je preračunata na miševe, odgovara ≈0.2-1 mg/kg. Prema tome, doza korišćena za procenu efkasnosti lekova na mišjim ćelijama fagocitnog ekstrudata je bila 0.2 mg/kg. Od dodatnog interesa su bila ispitivanja mogućih efekata načina davanja leka na funkcionalnu aktivnost fagocita.

[0107] Imunomodulatorna aktivnost leka je procenjivana mikroskopski. Test je izveden na 60 muških BALB/c miševa sa telesnom masom od 18-22 g. Životinje su podeljene u 6 jednakih grupa od 10 miševa svaka. Dve grupe su korišne kao kontrola. Aktivne terapijske grupe su primile dalargin IM ili

1

intranazalno u pojedinačnoj dozi 0.2 mg/kg. Postupci ekstrakcije makrofaga i neutrofila su izvedene sledećeg dana posle davanja ispitivanih lekova.

[0108] Miševima je data intraperitonealna injekcija 3-4 mL 10 % rastvora peptona kao hematoatraktanta da bi se izazvala akumulacija neutrofila i 2 sata kasnije miševi su bili eutanizirani pomoću pomoću hloroforma 2 sata kasnije. Oni su naknadno obducirani aseptičkim uslovima. Tečnost iz abodemenalne šupljine je izvučena pomoću Pasteurove pipete, smeštena u epruvete za testiranje i centrifugirana u toku 10 min na 1000 oum. Talog je zatim resuspendovan da bi se postigle koncentracije neutrofila od 2.5 milion/mL.

[0109] U cilju izolovanja makrofaga, miševi su eutanizirani 3 dana posle injekcije peptona. Zatim 3-4 mL medijuma 199 sa 10 % fetalnog goveđe zgure je davano intraperitonealno, i tečnost je aspirirana.

[0110] Bakterija Staph. aureus (soja bez proteina A) pre-opsonizovana sa sakupljenom mišijom zgurom (10 min. na 37 °C) je dodata u jednakim zapremina u suspenziju fagocitinih ćelija u odnosu 10:1 (tj.25 million/mL). Bris je pripremljen posle inkubacije (bojenje Romanovsky-Giemsa).

[0111] Fagocitna aktivnost neutrofila je procenjivana sledećim parametrima: fagocitni indeks i fagocitni broj. Funkcionalna aktivnost magkrofaga je procenjivana mikroskopski, kao i njihova spsobnost da se apsorbuje nitroplavi tetrazolijum (NBT) u aktivnom stanju.

[0112] Rezultati pokazuju da je dalargin (0.2 mg/kg) bio u stanju da poveća fagocitnu aktivnost (fagocitozu) peptonom mobilisanih neutorfila kod miševa. Put davanja nije imao efekata na efikasnost. Dalargin je takođe pokazao stimulišući efekat na fagocitozu peritonealnog eksudata markofaga, pospešujući njihovu sposobnost da smanjuje NBT. Nisu detektovane razlike u odnosu na način davanja (Tabela 4).

[0113] Prema tome, dalargin je pokazao stimulirajuči efekat na fagocitoznu komponentu nespecifične imunosti.

Primer 9. Procena efekata dalargina na proizvodnju proinflamatornih citokina.

[0114] Efekat dalargina na sintezu citokina IL-1 (interleukin-1), IL-6 (interleukin-6) i TNF-α (faktor nekroze tumora α) je procenjen u in vitro eksperimentu korišćenjem mononuklearne ćelijske kulture periferne krvi zdravih donora (n = 20). Stimulacija sa enterobakterijskim polisaharidima je korišćena da izazove proizvodnju proinflamatornih citokina.

[0115] U cilju dobijanja suspenzije mononuklearnih ćelija, krv je razblažena u donosu 1:2 sa medijumom 199, naneta na gradijent gustine Ficoll-Paque, d = 1.077 g/cm<3>, i centrigurana na 400 g u toku 40 min. Beli prsten obrazovan na granici faza, koji je sadržao mononuklearne ćelije, je pažljvo povučen sa Pasteur-ovom pipetom i ispran dva puta sa medijumom 199 pomoću 10-minutnog centrifugiranja (200 g). Talog je resuspendovan u medijumu hranjivih supstanci, brojan u komori Goryayev-og brojača i podešen na željenu koncentraciju.

[0116] Dalargin je dodat pri molarnoj koncentraciji 5·10<-8>M (≈0.036 μmg/mL) u testirane uzorke sa polisaharidnom i mononukleanom ćelijskom suspenzijom. Lek nije dodat u kontrolne uzorke.

[0117] Kvantifikacija citokina u krvnom serumu je izvedena pomoću dvostrane ELISA.

1

[0118] Rezultati prikazani na Sl.3 pokazuju značajnu supersiju lipsaharidno izazvane proizvodnje IL-6, IL-1 i TNF-α dalarginom. Stepen proizvodnje proinflamatornih citokina je prikazan kao odnos prema njihovoj koncentraciji u kontrolnim uzorcima, koji je uzet kao 100 %.

[0119] Prema tome, treba primetiti da testirani heksapeptid pokazuje antivirusne i imunomodulatorne osobine. Reguliše aktivnost ćelija urođenog i adaptivnog imuniteta. Dalargin pospešuje aktivnost fagocitnih komponenti imuniteta (macrofaga i neutrofila) i aktivnost prirodnih ćelija ubica. Proizvod takođe stimuliše proizvodnju endogenih interferona.

[0120] Pored toga, dalargin, suzbijanjem hipersekrecije proinflamatornih citokina (IL-1, IL-6 i TNF-α), može smanjiti intoksikaciju i kontrolu drugih manifestacija inflamatornih kaskada.

[0121] Prema tome, farmaceutska kompozicija pokazuje antivirusnu aktivnost u eksperimentu sa miševima koji primaju dalargin intranazalno 2 mg/kg/danu, što odgovara humanoj dozi od 10 mg dnevno.

[0122] Zapremina rastvora za pojedinačno intranazalno davanje ljudima je 1-2 kapi po nozdrvi (za ukupno 2-4 kapi), odgovara zapremini od 0.1-0.2 mL.

[0123] Izvedeni testovi potvrđuju zaključak da koncentracija ekvivalentna za ljude, farmaceutske kompozicije za intranazalno davanje je 0.01-30 mg/mL (0.01-3% rastvor dalargina).

[0124] Kada je davana intranazalno, kompozicija pokazuje antivirusne i imuno modulatorne efekte koji su uporedivi sa intramuskularnim davanjem, koje je naročito relevantno za kliničku primenu.

REFERENCE

[0125]

[1] Influenza and flu-like infections (including especially dangerous forms of influenza infections). Fundamental and applied aspects of investigation. Bulletin of the Task Committee. Eds.: V.I. Pokrovsky, D.K. Lvov, O.I. Kiselyov, F.I. Yershov. St. Petersburg, Roza mira, 2008.

[2] Sullivan KM, Monto AS, Longini IM. Estimates of the US health impact of influenza. AmlPublicHealth, 1993, 83: 1712-1716.

[3] According to reports of the Federal State Healthcare Institution "Federal Centre for Hygiene and Epidemiology of Rospotrebnadzor of the Russian Federation". Available at: http://www.fcgsen.ru/.

[4] Turner R. Epidemiology, pathogenesis and treatment of the common cold. Annals of allergy,asthma and immunology, 1997, 78: 531-539.

[5] Hayden F, Couch R. Clinical and epidemiological importance of influenza A viruses resistantto amantadine and rimantadine. ReviewsinMedicalvirology, 1992, 2: 89-96.

[6] O.I. Kiselyov, E.G. Deyeva, T.V. Sologub, V.V. Tsvetkova. Recommendations for the Treatment and Prevention of Influenza in Adults. Influenza Research Institute of the Healthcare Ministry of Russia. St. Petersburg, 2014, 4.

1

[7] E.P. Selkova. CurrentProblems of Symptomatic and Pathogenetic Treatment of Acute Respiratory ViralInfections. Reference Book of the Polyclinic Phycician, 2013, 01: 9-13.

[8] E.P. Selkova. New Technologies in the Prevention and Treatment of Akutne respiratorne virusne infekcije. Consiliummcdicum. Pediatriya, 2007, 1: 66-68.

[9] N.B. Lazareva, M.V. Zhuravlyova, L.R. Panteleyeva. ARVI: Rational Pharmacotherapy from the Standpoint of Clinical Pharmacology // Meditsinsky Sovet. -2016. -Nº.4.

[10] B.V. Balachevsky, A.N. Kurzanov, A.A. Slavinsky. Dalargin-induced Modulation of Functional-Metabolic Activity of Neutrophilic Leukocytes // Uspekhi Sovremennogo Yestestvoznaniya. -2008. -Nº.

5.

[11] A.N. Zokhirov et al. Effect of Dalargin, a Synthetic Analogue of Opioid Peptides, on the Anti-oxidant Status of Dogs // Vestnik Kurskoy Gosudarstvennoy Selskokhozyaystvennoy Akademii. -2016. - Nº.9.

[12] L.N. Maslov et al. Cardiovascular Effects of D-Ala2, Leu5, Arg6-enkephalin (Dalargin) are Associated with the Activation of Peripheral Opioid m-Receptors // Eksperimentalnaya i Klinicheskaya Farmakologiya. --2008. -Vol.71.- Nº.2. -p.21-28.

[13] Gabrilovac, J., Ikic-Sutlic, M., Knezevic, N., &Poljak, L. (1996). Leu-enkephalin enhances interferon secretion in mice. Research in experimental medicine, 196(1), 137-144.

[14] V.Yu. Cherdakov et al. Application of Regulatory Peptides: Timogen, Dalargin, Glicil-histidyl-lysine and Combinations Thereof, for the Correction of the Neutrophilic Component of Anti-Infection Immunity in Femur Fractures // Kursky Nauchno-Praktichesky Vestnik Chelovek.

[15] M.A. Zemskov et al. Peculiarities of Immunological Disturbances and their Correction in Infections of Different Origin // Vestnik Novykh Meditsinskikh Tekhnologiy. -2011. -Vol.18. - Nº.3.

[16] O.I. Chernyshyova, I.I. Bobyntsev. Biological Effects of the GLY-HIS-LYS Peptide // Mezhdunarodny Zhurnal Prikladnykh i Fundamentalnykh Issledovaniy. -2014. Nº.11-4. -p.688-692.

[17] V.A. Zemskova, S.S. Zemskova, V.I. Domnich, V.I. Shabunina. Mechanisms of Action of Differentiated Immunotherapy of Suppurative-Inflammatory Diseases of Various Origin // Prikladniye Informatsionniye Aspckty Meditsiny. -2009. -Vol.12. - Nº.2. -p.71-77.

[18] Guidelines on the Clinical Studies of Medicinal Products; Part one. Moscow. Grif i K, 2012. -944 p.

[19] I.E. Makarenko et al. Possible Routes and Volumes of Administration of Medicinal Products to Laboratory Animals // Mezhdunarodny Vestnik Veterinarii. -2013. -Nº.3. -p.78-84.

[20] F.I. Yershov, O.I. Kiselyov. Interferons and their Inductors (from Molecules to Drugs). Moscow, GEOTAR-Meida. -2005. -368 p.

[21] V.P. Kuznetsov. Interferons in the Cytokine Cascade: Historical and Modern Aspects. // Antibiotiki i Khimioterapiya.1988. -Vol.43. -Nº 5. -C.28 -40.

1

[22] Instruction for use of the medicinal product for human use Dalargin-Deko (LP-004596, web portal of the State Registry of Medicinal Products https://grls.rosminzdrav.ru/, accessed 31/01/2018).

2

Claims (12)

Patentni zahtevi

1. Nazalna lekovita kompozicija koja sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin (dalargin) ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u lečenju akutnih respiratornih virusnih bolesti (ARVI).

2. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde je bolest grip.

3. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde je farmaceutski prihvatljiva so tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin diacetat.

4. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde je nazalna kompozicija dobijena u obliku spreja koji sadrži, kao aktivni sastojak, heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegov farmaceutski prihvatljiv oblik u masenom procentu od 0.01 % do 3 % i ekscipijente koji čine ostatak.

5. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, gde kompozicija sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu sastojaka u masenim %: heksapeptid: 0.01-3 %, sa vodom koja čini ostatak.

6. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 4, gde kompozicija sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu sastojaka u masenom %: heksapeptid: 0.01-3 %, natrijum hlorid 7-11 %, sa vodom koja čini ostatak.

7. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, gde kompozicija sadrži heksapeptid tirozil-D-alanil-glicil-fenilalanil-leucil-arginin ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i ekscipijente u sledećem odnosu sastojaka u masenom %: heksapeptid: 0.01-3 %, natrijum hlorid 7-11 %, benzalkonijum hlorid 0.1-0.2 %, sa vodom koja čini ostatak.

8. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 1, gde kompozcija sadrži, kao ekscipijente, natrijum hlorid i vodu u sledećem odnosi komponenti u masenom %: natrijum hlorid 9 %, voda 90 %.

9. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 5, gde kompozicija sadrži, kao vodu, vodu za injekcije ili prečišćenu vodu.

10. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 6, gde kompozicija sadrži, kao vodu, vodu za injekcije ili prečišćenu vodu.

11. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 7, gde kompozicija sadrži, kao vodu, vodu za injekcije ili prečišćenu vodu.

12. Nazalna lekovita kompozicija za upotrebu prema zahtevu 8, gde kompozicija sadrži kao vodu, vodu za injekcije ili prečišćenu vodu.