RS62758B1 - Regulacija genske ekspresije korišćenjem inženjeringom nukleaza - Google Patents

Description

Opis

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetno obelodanjivanje je u oblasti inženjeringa genoma, posebno ciljane modifikacije genoma hematopoetske ćelije.

POZADINA

[0002] Kada se uzme u obzir da su napori na sekvenciranju genoma otkrili da ljudski genom sadrži između 20.000 i 25.000 gena, ali manje od 2.000 transkripcionih regulatora, postaje jasno da brojni faktori moraju biti u interakciji kako bi se kontrolisala genska ekspresija u svim njenim različitim vremenskim, razvojnim i tkivnim specifičnim manifestacijama.

Gensku ekspresiju kontroliše veoma složena mešavina opštih i specifičnih transkripcionih regulatora koji su u interakciji sa elementima DNK. Ovi elementi DNK obuhvataju i lokalne elemente DNK kao što je promoter jezgra i njegova povezana mesta vezivanja faktora transkripcije, kao i distalne elemente kao što su pojačivači, prigušivači, izolatori i regioni za kontrolu lokusa (LCR) (videti Matson i dr. (2006) Ann Rev Genome Hum Genet 7: 29-50).

[0003] Elementi pojačivača su prvo identifikovani u SV40 virusnom genomu, a zatim pronađeni u lokusu teškog lanca humanog imunoglobulina. Sada je poznato da igraju regulatornu ulogu u ekspresiji mnogih gena, čini se da pojačivači uglavnom utiču na vremenske i prostorne obrasce genske ekspresije. Takođe je pronađeno da pojačivači mogu funkcionisati da regulišu ekspresiju na velikim udaljenostima od promotera jezgra ciljanog gena i da ne zavise od bilo koje specifične orijentacije sekvence u odnosu na promoter.

Pojačivači mogu biti locirani nekoliko stotina kilobaza uzvodno ili nizvodno od regiona promotera jezgra, gde mogu biti locirani u intronskoj sekvenci, ili čak iza 3' kraja gena.

[0004] Opisani su različiti postupci i sastavi za ciljano deljenje genomske DNK. Takvi ciljani događaji deljenja mogu se koristiti, na primer, da indukuju ciljanu mutagenezu, indukuju ciljane delecije ćelijskih DNK sekvenci i olakšaju ciljanu rekombinaciju na unapred određenom hromozomskom lokusu. Videti, npr., patent SAD br.

9,255,250; 9,200,266; 9,045,763; 9,005,973; 9,150,847; 8,956,828; 8,945,868; 8,703,489; 8,5 86,526; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,067,317; 7,262,054; 7,888,121; 7,972, 854; 7,914,796; 7,951,925; 8,110,379; 8,409,861; patentnu objavu SAD br.

2003/0232410; 2005/0208489; 2005/0026157; 2005/0064474; 2006/0063231; 2008/0159996; 2010/00218264; 2012/0017290; 2011/0265198; 2013/0137104; 2013/0122591; 2013/017798 3; 2013/0196373; 2015/0056705 i 2015/0335708.

[0005] Ovi postupci često uključuju upotrebu projektovanih sistema deljenja da bi se indukovao prekid dvostrukog lanca (DSB) ili rez u ciljnoj DNK sekvenci tako da se popravka prekida procesom koji je nastao greškom, kao što je nehomologno spajanje kraja (NHEJ), nehomološki usmereno krajnje hvatanje donora ili popravka korišćenjem šablona za popravku (popravka usmerena na homologiju ili HDR) može dovesti do izbacivanja gena ili umetanja sekvence od interesa (ciljana integracija). Videti, npr., patent SAD br.

9,045,763; 9,200,266; 9,005,973; i 8,703,489. Ove tehnike se takođe mogu koristiti za uvođenje promena specifičnih za mesto u sekvenci genoma korišćenjem oligonukleotida donora, uključujući uvođenje specifičnih delecija genomskih regiona, ili specifičnih tačkastih mutacija ili lokalizovanih promena (takođe poznate kao korekcija gena). Deljenje se može desiti upotrebom specifičnih nukleaza kao što su projektovane nukleaze cinkovog prsta (ZFN), aktivator transkripcije poput efektorskih nukleaza (TALEN) ili korišćenjem CRISPR/Cas sistema sa projektovanom crRNK/obeležena RNK („pojedinačno vođena RNK“) za vođenje specifičnog cepanja. Dalje, ciljane nukleaze se razvijaju na osnovu sistema Argonaute (npr., od T. thermophilus, poznatog kao 'TtAgo', videti Swarts i dr. (2014) Nature 507(7491): 258-261), koji takođe može imati potencijal za upotrebu u uređivanju genoma i genskoj terapiji.

[0006] Crvena krvna zrnca (RBC) ili eritrociti su glavna ćelijska komponenta krvi i čine jednu četvrtinu ćelija kod ljudi. Zreli eritrociti nemaju jezgro i mnoge druge organele i puni su hemoglobina, metaloproteina koji funkcioniše da prenosi kiseonik iz pluća do tkiva, kao i da prenosi ugljen-dioksid iz tkiva i nazad u pluća radi uklanjanja. Ovaj protein čini približno 97% suve mase eritrocita i povećava sposobnost krvi da prenese kiseonik za oko sedamdeset puta. Hemoglobin je heterotetramer koji sadrži dva globinska lanca alfa (a) i dva globinska lanca slična beta (β) i 4 hem grupe. Kod odraslih, α2β2 tetramer se naziva hemoglobin A (HbA) ili hemoglobin odraslih. Tipično, alfa i beta globinski lanci se sintetišu u približnom odnosu 1:1 i čini se da je ovaj odnos kritičan u smislu stabilizacije hemoglobina i eritrocita. U fetusu u razvoju, proizvodi se drugačiji oblik hemoglobina, fetalni hemoglobin (HbF), koji ima veći afinitet vezivanja za kiseonik od hemoglobina A, tako da kiseonik može biti isporučen bebinom sistemu preko krvotoka majke. Postoje dva gena koji kodiraju fetalni globin koji su veoma slični po sekvenci i nazivaju se HBG1 (takođe se nazivaju Ggamma) i HBG2 (Agamma), na osnovu njihovog reda rasporeda u lokusu gena beta globina. Kao i hemoglobin odraslih, protein fetalnog hemoglobina sadrži dva α globinska lanca, ali umesto lanaca β-globina odraslih, ima dva fetalna gama (y)-globinska lanca (tj., fetalni hemoglobin je α2γ2). Otprilike u 30. nedelji gestacije, sinteza gama globina u fetusu počinje da opada, dok se proizvodnja beta globina povećava. Do otprilike 10 meseci starosti, hemoglobin novorođenčeta je skoro sav α2β2, iako deo HbF ostaje i u odraslom dobu (približno 1-3% ukupnog hemoglobina). Regulacija prelaska sa proizvodnje gama-globina na beta-globin je prilično složena i prvenstveno uključuje smanjenje transkripcije gama-globina uz istovremenu regulaciju beta-globina transkripcije.

[0007] Genetski defekti u sekvencama koje kodiraju lance hemoglobina mogu biti odgovorne za grupu bolesti poznatih kao hemoglobinopatije koje uključuju anemiju srpastih ćelija i alfa i beta talasemije. Kod većine pacijenata sa hemoglobinopatijama, geni koji kodiraju gama globin ostaju prisutni, ali je ekspresija relativno niska zbog normalne represije gena koja se javlja oko porođaja kao što je iznad opisano.

[0008] Procenjuje se da 1 od 5000 ljudi u SAD ima bolest srpastih ćelija (SCD), uglavnom kod ljudi podsaharskog porekla (Roseff (2009) Immunohematology 25(2):67) Čini se da postoji korist za heterozigotne nosioce mutacije srpastih ćelija zbog zaštite od malarije, tako da je ova osobina možda bila pozitivno odabrana tokom vremena, tako da se procenjuje da u subsaharskoj Africi do 28% populacije ima osobinu srpastih ćelija (Elguero i dr. (2015) PNAS USA 112 (22): 7051). Bolest srpastih ćelija je uzrokovana mutacijom b globin gena kao posledica zamene valinom za glutaminsku kiselinu na aminokiselini #6 (mutacija GAG u GTG na nivou DNK), gde se rezultujući hemoglobin naziva „hemoglobin S" ili "HbS". U uslovima nižeg kiseonika, konformacioni pomak u deoksi obliku HbS izlaže hidrofobni deo na proteinu između E i F spirala. Hidrofobni ostaci valina na poziciji 6 beta lanca u hemoglobinu su u stanju da se povežu sa hidrofobnim flasterom, uzrokujući da se molekuli HbS agregiraju i formiraju vlaknaste precipitate. Ovi agregati zauzvrat izazivaju abnormalnost ili 'srpljenje' eritrocita, što dovodi do gubitka fleksibilnosti ćelije. Srpasti eritrociti više nisu u stanju da se stisnu u kapilare i mogu dovesti do vazo okluzivne krize kod pacijenata sa srpastim ćelijama. Pored toga, srpasti eritrociti su krhkiji od normalnih eritrocita i imaju tendenciju ka hemolizi, što na kraju dovodi do anemije kod pacijenta.

[0009] Lečenje i lečenje pacijenata sa srpastim ćelijama je doživotni predlog koji uključuje lečenje antibiotikom, upravljanje bolom i transfuzije tokom akutnih epizoda. Jedan pristup je upotreba hidroksiureje, koja svoje efekte delimično ostvaruje povećanjem proizvodnje gama globina. Međutim, dugoročni neželjeni efekti terapije hronične hidroksiureje su još uvek nepoznati, a lečenje daje neželjene nuspojave koje dovode do niske saglasnosti pacijenata i ima promenljivu efikasnost od pacijenta do pacijenta (Brandow and Panepinto (2011) Am J Hematol 86(9):804-806). Uprkos povećanju efikasnosti tretmana srpastim ćelijama, očekivani životni vek pacijenata je i dalje tek sredinom do kasnih 50-ih godina i povezani morbiditeti bolesti imaju dubok uticaj na kvalitet života pacijenata.

[0010] Talasemije su takođe bolesti koje se odnose na hemoglobin i obično uključuju smanjenu ekspresiju globinskih lanaca. Ovo se može desiti kroz mutacije u regulatornim regionima gena ili zbog mutacije u sekvenci kodiranja globina koja rezultira smanjenom ekspresijom ili smanjenim nivoima ili funkcionalnim globinskim proteinom. Alfa talasemije, uzrokovane mutacijama u alfa globinskom lokusu, uglavnom su povezane sa ljudima zapadne Afrike i južnoazijskog porekla, i mogu da pruže otpornost na malariju. Beta talasemija, uzrokovana mutacijama u lokusu beta globina, uglavnom je povezana sa ljudima mediteranskog porekla, obično iz Grčke i priobalnih oblasti Turske i Italije. Kod talasemije minor, samo jedan od alela β globina nosi mutaciju. Pojedinci će patiti od mikrocitne anemije, a otkrivanje obično uključuje manji od normalnog srednjeg korpuskularnog volumena (<80fL). Aleli subjekata sa talasemijom minor su β+/β ili β0/β (gde se 'β+' odnosi na alele koji omogućavaju stvaranje određene količine β lanca, 'β' se odnosi na alele divljeg tipa b globina, a 'β0 ' odnosi se na mutacije β globina povezane sa potpunim odsustvom ekspresije beta-globina). Ispitanici sa intermedijalnom talasemijom često mogu da vode normalan život, ali im mogu biti potrebne povremene transfuzije, posebno u vreme bolesti ili trudnoće, u zavisnosti od mase njihove anemije. Aleli ovih pacijenata mogu biti β+/β+ ili βο/β+. Talasemija major se javlja kada oba alela imaju mutacije talasemije. Ovo je teška mikrocitna i hipohromna anemija. Ako se ne leči, izaziva anemiju, splenomegaliju i teške deformitete kostiju i napreduje do smrti pre 20. godine. Lečenje se sastoji od periodične transfuzije krvi; splenektomija za splenomegaliju i helaciju preopterećenja gvožđem izazvanog transfuzijom. Transplantacije koštane srži se takođe koriste za lečenje osoba sa teškim talasemijama ako se može identifikovati odgovarajući donor, ali ova procedura može imati značajne rizike.

[0011] Jedan pristup koji je predložen za lečenje i SCD i beta talasemija je povećanje ekspresije gama globina sa ciljem da HbF funkcionalno zameni aberantni hemoglobin odraslih. Kao što je iznad pomenuto, smatra se da je lečenje pacijenata sa ISS hidroksiureom delimično uspešno zbog njegovog efekta na povećanje ekspresije gama globina. Prva grupa jedinjenja za koje je otkriveno da utiču na ekspresiju gama globina bili su citotoksični lekovi. Sposobnost izazivanja de novo sinteze gama-globina farmakološkom manipulacijom je prvi put prikazana korišćenjem 5-azacitidina kod eksperimentalnih životinja (DeSimone (1982) Proc Nat'l Acad Sci USA 79(14):4428-31). Naknadna ispitivanja potvrdila su sposobnost 5-azacitidina da poveća HbF kod pacijenata sa β-talasemijom i anemije srpastih ćelija (Ley, i dr., (1982) N. Engl. J. Medicine, 307: 1469-1475, i Ley, i dr., (1983) Blood 62: 370-380). Pored toga, pokazano je da kratkolančane masne kiseline (npr. butirat i derivati) u eksperimentalnim sistemima povećavaju HbF (Constantoulakis i dr., (1988) Blood 72(6):1961-1967). Takođe, postoji segment ljudske populacije sa stanjem poznatim kao „nasledna perzistencija fetalnog hemoglobina“ (HPFH) gde povišene količine HbF opstaju u odraslom dobu (10-40% kod HPFH heterozigota (videti Thein i dr. (2009) Hum. Mol. Genet 18 (R2): R216-R223). Ovo je retko stanje, ali u odsustvu bilo kakvih povezanih abnormalnosti beta globina, nije povezano sa bilo kakvim značajnim kliničkim manifestacijama, čak i kada je 100% hemoglobina pojedinca HbF. Kada pojedinci koji imaju beta talasemiju takođe imaju istovremeni HPFH, ekspresija HbF može smanjiti ozbiljnost bolesti (Potoka and Gladwin (2015) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol.308(4): L314-L324). Dalje, ozbiljnost prirodnog toka bolesti srpastih ćelija može značajno da varira od pacijenta do pacijenta, a ova varijabilnost se delimično može pratiti činjenicom da neke osobe sa blažom bolešću izražavaju više nivoe HbF.

[0012] Jedan pristup povećanju ekspresije HbF uključuje identifikaciju gena čiji proizvodi igraju ulogu u regulaciji ekspresije gama globina. Jedan takav gen je BCL11A, koji je prvi put identifikovan zbog njegove uloge u razvoju limfocita. BCL11A kodira protein cinkovog prsta za koji se smatra da je uključen u regulaciju ekspresije gama globina specifičnu za fazu razvoja. BCL11A se eksprimira u odraslim ćelijama prekursora eritroida i smanjenje njegove ekspresije dovodi do povećanja ekspresije gama globina. Pored toga, spajanje mRNK BCL11A je razvojno regulisano. U embrionalnim ćelijama, kraće varijante mRNK BCL11A, poznate kao BCL11A-S i BCL11A-XS su primarno eksprimirane, dok se u ćelijama odraslih pretežno eksprimiraju duže varijante mRNK BCL11A-L i BCL11A-XL. Videti, Sankaran i dr. (2008) Science 322 p.1839. Čini se da protein BCL11A stupa u interakciju sa lokusom beta globina da bi promenio njegovu konformaciju, a time i ekspresiju u različitim razvojnim fazama. Predložena je upotreba inhibitorne RNK usmerene na gen BCL11A (vidite, npr.., Patentnu objavu SAD br.2011/0182867) ali ova tehnologija ima nekoliko potencijalnih nedostataka, odnosno da se potpuno uništenje možda neće postići, isporuka takvih RNK može biti problematičan i RNK moraju biti prisutni kontinuirano, što zahteva višestruke tretmane doživotno.

[0013] Ciljanje sekvenci pojačivača BCL11A obezbeđuje mehanizam za povećanje HbF. Videti npr., Patentnu objavu SAD br.2015/0132269 i PCT Publication No. WO 2016/183298. Ispitivanja asocijacije na nivou genoma su identifikovale skup genetskih varijacija na lokusu gena BCL11A koje su povezane sa povećanim nivoima HbF. Ove varijacije su kolekcija malih nukleotidnih polimorfizama (SNP) pronađenih u nekodirajućim regionima BCL11A koji funkcionišu kao stadijum-specifičan region pojačivača ograničen na liniju. Dalje istraživanje je otkrilo da je ovaj BCL11A pojačivač potreban u eritroidnim ćelijama za ekspresiju BCL11A, ali nije potreban za njegovu ekspresiju u B ćelijama (videti Bauer i dr. (2013) Science 343:253-257). Region pojačivača je pronađen unutar introna 2 gena BCL11A, a identifikovane su tri oblasti preosetljivosti na DNKseI (često ukazuje na stanje hromatina koje je povezano sa regulatornim potencijalom) u intronu 2. Ove tri oblasti su identifikovane kao "+62", "+58" i "+55" u skladu sa rastojanjem u kilobazama od mesta početka transkripcije BCL11A. Ovih pojačivača regiona je otprilike 350 (+55); 550 (+58); i 350 (+62) nukleotida dužine (Bauer 2013, ibid).

[0014] Kada se razvija nukleaza za upotrebu u terapijskim tretmanima ljudi, bitno je da nukleaza ima najveće bezbednosne karakteristike. Konkretno, nukleaze moraju imati veoma niske nivoe cepanja van cilja. Značajan broj presecanja dvostrukih lanaca na lokacijama koje nisu cilj koji je odredio korisnik može dovesti do potiskivanja gena izvan cilja, au retkim slučajevima i do pojave hromozomskih translokacija (videti Hoban and Bauer (2016) Blood, 127(21):2525-2535 i Tsang i dr. (2017) Nature Methods, u štampi). Poboljšanja u specifičnosti se mogu postići eliminisanjem nespecifičnih interakcija između projektovane nukleaze i genomske DNK (vidite U.S. Provisional Patent Application Nos.

62/378,978 i 62/443,981).

[0015] Stoga, ostaje potreba za dodatnim visoko specifičnim metodama i kompozicijama za promenu ekspresije gena BCL11A, na primer za lečenje hemoglobinopatija kao što je bolest srpastih ćelija i beta talasemija.

REZIME

[0016] Ovde su opisani visoko specifični sastavi i postupci za upotrebu u genskoj terapiji i genomskom inženjeringu. Konkretno, opisani postupci i sastavi se odnose na inaktivaciju (npr., potpunim ili delimičnim ukidanjem njegove ekspresije) gena BCL11A, na primer, gena koji deluje kao regulator jednog ili više dodatnih gena. Posebno su opisani postupci i sastavi za ometanje funkcije pojačivača u genu BCL11A da bi se smanjila ili poništila njegova aktivnost u specifičnim ćelijskim linijama (npr., eritroid). Dodatno, opisani su postupci i sastavi za ometanje funkcija pojačivača BCL11A pri čemu sekvence pojačivača nisu locirane unutar kodirajućih sekvenci gena BCL11A, i gde obezbeđeni reagensi pokazuju visoko specifičnu aktivnost. Rezultirajuća regulacija BCL11A gena u ovim okolnostima rezultira povećanom ekspresijom gama globina i smanjen je broj događaja cepanja van cilja.

Pronalazak obezbeđuje nukleazu cinkovog prsta (ZFN) koja sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:29 i sekvencu amino kiselina kao što je prikazano u SEQ ID NO:31.

Pronalazak takođe obezbeđuje jedan ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više nukleaza cinkova prsta prema pronalasku, opciono pri čemu jedan ili više polinukleotida je (su) mRNK.

Pronalazak dalje obezbeđuje jedan ili više vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jednu ili više nukleaza cinkova prsta prema pronalasku.

Pronalazak obezbeđuje ćeliju koja sadrži nukleazu cink prsta iz pronalaska, jedan ili više polinukleotida pronalaska ili jedan ili više vektora pronalaska.

Pronalazak takođe obezbeđuje ćeliju ili ćelijsku liniju proizvedenu iz ćelije pronalaska, koja sadrži nukleazu cinkovog prsta iz pronalaska, jedan ili više polinukleotida pronalaska ili jedan ili više vektora pronalaska.

Pronalazak dalje obezbeđuje delimično ili potpuno diferenciranu ćeliju koja potiče od ćelije ili ćelijske linije pronalaska, koja sadrži nukleazu cinkovog prsta iz pronalaska, jedan ili više polinukleotida pronalaska ili jedan ili više vektora pronalaska.

Pronalazak obezbeđuje farmaceutski sastav koji sadrži nukleazu cinkovog prsta iz pronalaska, jedan ili više polinukleotida pronalaska, jedan ili više vektora pronalaska i/ili ćeliju ili ćelijsku liniju pronalaska.

Pronalazak takođe obezbeđuje in vitro postupak za modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A u ćeliji, postupak koji obuhvata davanje nukleaze cinkovog prsta iz pronalaska ili jednog ili više polinukleotida pronalaska u ćeliju tako da je sekvenca endogenog pojačivača BCL11A modifikovan, opciono pri čemu: (i) postupak dalje obuhvata uvođenje egzogene sekvence u ćeliju tako da se egzogena sekvenca ubaci u endogenu sekvencu pojačivača BCL11A; ili (ii) modifikacija uključuje brisanje.

Pronalazak dalje obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju pronalaska za upotrebu u postupku lečenja hemoglobinopatije, kao što je talasemija (npr. beta-talasemija) ili bolest srpastih ćelija, kod pacijenta, postupak koji obuhvata davanje farmaceutskog sastava pacijentu, opciono pri čemu je pacijent čovek.

Pronalazak obezbeđuje in vitro postupak za proizvodnju genetski modifikovane ćelije koji sadrži genomsku modifikaciju unutar endogene sekvence pojačivača BCL11A, postupak koji obuhvata sledeće korake: a) dovođenje u kontakt ćelije sa jednim ili više polinukleotida pronalaska; b) podvrgavanje ćelije uslovima koji pogoduju ekspresiji fuzionog proteina iz polinukleotida; i c) modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A eksprimiranim fuzionim proteinom dovoljnim da proizvede genetski modifikovanu ćeliju, opciono pri čemu postupak dalje obuhvata stimulaciju ćelije sa najmanje jednim citokinom.

Pronalazak takođe obezbeđuje komplet koji sadrži nukleazu cinkovog prsta prema pronalasku, jedan ili više polinukleotida pronalaska, jedan ili više vektora pronalaska i/ili ćeliju ili ćelijsku liniju pronalaska.

Pronalazak dalje obezbeđuje ćeliju ili ćelijsku liniju pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije hemoglobinopatije, kao što je talasemija (npr. beta-talasemija) ili bolest srpastih ćelija.

[0017] Ovde je obelodanjen protein cinkovog prsta koji se ne pojavljuje u prirodi koji sadrži protein cinkovog prsta (ZFP) koji se sastoji iz 4, 5 ili 6 prstiju, pri čemu svaki prst sadrži region spirale prepoznavanja koji prepoznaje ciljno podmesto DNK pri čemu regioni spirale prepoznavanja obuhvataju sekvence u redosled prikazan u jednom redu Tabele 1. Unutar svakog cinkovog prsta, region spirale za prepoznavanje 7 aminokiselina je numerisan od -1 do 6 unutar glavnog lanca cinkovog prsta (od približno 30 ostataka, uključujući ostatke za koordinaciju cinka).1, 2, 3 ili više komponenti cinkovih prstiju proteina cinkovog prsta opisanih ovde mogu dalje da sadrže mutacije na jednom ili više ostataka izvan regiona spirale prepoznavanja, uključujući, ali ne ograničavajući se na mutacije na aminokiseline na poziciji -5, položaju -14 ili na obe pozicije -5 i -14 (numeracija koja se nastavlja od -1 do 6 numeracija koja se koristi za region heliksa prepoznavanja) su mutirani. Vidite, npr., Qm4 i Qm14 mutacije opisane u U.S. Provisional Patent Applications 62/378,978 i 62/443,981. Komponente cinkovih prstiju proteina cinkovih prstiju mogu biti povezane bilo kojim veznicima, na primer kao što je opisano u U.S. Patent No.8,772,453. ZFP sadrži spirale za prepoznavanje kao što je prikazano u Tabeli 1 za proteine označene na sledeći način: 63014 (koje se vezuje za ciljno mesto prikazano u SEQ ID NO:1) i 65722 (koje se vezuje za ciljno mesto prikazano u SEQ ID NO:2).

[0018] U određenim aspektima obelodanjivanja, proteini cinkovog prsta kako su ovde opisani mogu biti spojeni sa funkcionalnim domenom (npr., domen aktivacije transkripcije, domen represije transkripcije, domen cepanja (da bi se formirala nukleaza cink prsta), itd.). Bilo koji veznik može da se koristi za operativno povezivanje domena cepanja i proteina cink prsta, uključujući ali ne ograničavajući se na veznike kao što je opisano u Patente SAD br.

9,394,531 i 9,567,609. Štaviše, kada se koristi FokI domen cepanja, dalje mutacije u katalitičkom domenu, domenu dimerizacije, do fosfatnih kontaktnih ostataka (ne u domenu dimerizacije ili katalitičkog domena), i kombinacije mutacija u bilo kom od katalitičkog domena, domena dimerizacije i do mogu biti prisutni kontaktni ostaci fosfata, uključujući, ali ne ograničavajući se na ELD ili KKR mutacije na domenu dimerizacije, mutacije na ostatke 525 (K do S) FokI domena, i kombinacije ELD ili KKR mutacija na domenu dimerizacije i mutacije na ostatke 525 (K do S) FokI domena, numerisan u odnosu na divlji

tip. Videti, Patente SAD br.7,888,121; 7,914,796; 8,034,598; 8,623,618 i Patentnu objavu SAD br.2011/0201055 i U.S. Provisional Patent Application Nos.62/378,978 i 62/443,981.

[0019] Nukleaze cinkovih prstiju (ZFN) mogu se koristiti u dimerizirajućim parovima za cepanje na ili blizu jednog ili oba ciljna mesta za ZFN para, na primer, „levi partner“ iz Tabele 1 (npr., 63014) može da formira dimera sa „pravim partnerom“ iz Tabele

1 (npr., 65722) da cepa sekvence pojačivača BCL11A. Na primer, par ZFN može da sadrži sledeće sekvence aminokiselina:

63014: MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRI CMQNFSDQSNLRAHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNFSLTMETKIHTGSQKPF QCRICMQNFSSTGNLTNHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGSLTRHTKIHTHPR APIPKPFQCRICMQNFSDQSNLRAHIRTHTGEKPFACDICGRKFAAQCCLFHHT KIH-Veznik-

1

ELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGK HLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKA YSGGYNLPIGQADEMERYVEENQ TRDKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGA VLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRS (SEQ ID NO:3); i MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRI CMQKFARNDHRTTHTKIHTGEKPFQCRICMQNFSQKAHLIRHIRTHTGEKPFA CDICGRKFAQKGTLGEHTKIHTGSQKPFQCRICMQNFSRGRDLSRHIRTHTGE KPFACDICGRKFARRDNLHSHTKIH-Linker-ELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGK HLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQ TRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFSGNYKAQLTRLNRKTNCNGA VLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF (SEQ ID NO:4), pri čemu sekvenca linkera može biti bilo koja sekvenca linkera poznata u tehnici, na primer kako je opisano u patentima SAD br.9,394,531 i 9,567,609. Veznik za 63014 može da se sastoji od L7c5 veznika (LRGSISRARPLNPHP (SEQ ID NO:5)), a veznik koji se koristi u 65722 sadrži ili se sastoji od L0 veznika (LRGSQLVKS (SEQ ID NO:6), pogledajte U.S. Patent No.

9,567,609). Sekvenca FokI domena cepanja C-terminala na veznik sekvenci prikazanih iznad može takođe da sadrži alternativne FokI domene operativno povezane sa proteinom cinkovog prsta. FokI domen cepanja može uključivati alternativne ili dodatne mutacije katalitičkog domena, domena dimerizacije, kontaktnih ostataka fosfata, i kombinacije mutacija na bilo kom od katalitičkog domena, domena dimerizacije i ostataka kontakta fosfata.

[0020] Ovde je opisana isporuka najmanje jedne nukleaze (npr., nukleaze koja se vezuje za sekvencu pojačivača BCL11A) u ljudsku matičnu ćeliju ili ćeliju prekursora (HSC/PC) u svrhu inženjeringa genoma. U određenim aspektima obelodanjivanja, nukleaza sadrži protein cinkovog prsta (ZFP) koji se sastoji od 4, 5 ili 6 prstiju, pri čemu svaki prst sadrži region heliksa prepoznavanja koji prepoznaje ciljno podmesto pri čemu regioni spirale prepoznavanja sadrže sekvence u redosledu prikazanom u jedan red Tabele 1. ZFN nukleaza pronalaska obuhvata par nukleaza označenih 63014/65722. Nukleaza(e) kao što je ovde opisano može dalje da sadrži veznik (npr., između domena za vezivanje DNK i domena cepanja), na primer veznik kao što je prikazano u 9,567,609, uključujući ali ne ograničavajući se na LRGSISRARPLNPHP (SEQ ID NO:5) ili (LRGSQLVKS (SEQ ID NO:6)).

[0021] U nekim otelotvorenjima, nukleaza se isporučuje kao peptid, dok se u drugim isporučuje kao nukleinska kiselina koja kodira najmanje jednu nukleazu. U nekim otelotvorenjima, koristi se više od jedne nukleaze. U nekim poželjnim otelotvorenjima, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu je mRNK, a u nekim slučajevima, mRNK je zaštićena. U nekim aspektima, mRNK može biti hemijski modifikovana (videti

npr., Kormann i dr. (2011) Nature Biotechnology 29(2): 154-157). U drugim aspektima, mRNK može da sadrži ARCA kapu (videti Patente SAD br.7,074,596 i 8,153,773). U daljim otelotvorenjima, mRNK može da sadrži mešavinu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida (videti Patentnu objavu SAD br.2012/0195936). U poželjnom otelotvorenju, nukleinska kiselina koja kodira nukleazu(e) se isporučuje u HSC/PC putem elektroporacije. U nekim otelotvorenjima, nukleaza se cepa na ili blizu mesta vezivanja transkripcionog faktora. U nekim aspektima, faktor transkripcije je GATA-1.

[0022] Ovde je obelodanjena ćelija ili ćelijska linija u kojoj je endogena sekvenca pojačivača BCL11A genetski modifikovana pomoću nukleaze kao što je ovde opisano (npr., prikazano u Tabeli 1), na primer, u poređenju sa sekvencom divljeg tipa ćelije. Genetska modifikacija pojačivača BCL11A dovodi do modifikacije ekspresije globin (beta i gama) gena. Nukleazom modifikovane ćelije ili ćelijske linije kao što su ovde opisane razlikuju se po strukturi, funkciji i kombinacijama strukture i funkcije od divljeg tipa. Genetski modifikovana ćelija ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije mogu sadržati delecije umetanja (npr., umetanje transgena) i kombinacije umetanja i delecija; takva umetanja, brisanja i kombinacije umetanja i brisanja se obično nazivaju "indeli". U nekim poželjnim otelotvorenjima, indeli dovode do uništenja mesta vezivanja faktora transkripcije. U određenim otelotvorenjima, modifikacija je na ili blizu mesta vezivanja nukleaze, mesta cepanja i kombinacije mesta vezivanja i cepanja, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koje vrednosti između njih) parova baza uzvodno ili nizvodno od mesta cepanja, poželjnije unutar 1-100 parova baza (ili bilo koje vrednosti između njih) bilo koje strane vezivnog mesta, mesta cepanja i kombinacije mesta vezivanja i cepanja prikazano u Tabeli 1, još poželjnije unutar 1 do 50 parova baza (ili bilo koje vrednosti između njih) sa obe strane vezivnog mesta, mesta cepanja i kombinacije mesta vezivanja i mesta cepanja. U određenim otelotvorenjima, genetska modifikacija sekvence pojačivača BCL11A je unutar i/ili između sekvenci prikazanih u Tabeli 1 (ciljna mesta). Modifikacija može takođe uključiti modifikacije jednog ili više nukleotida na mestima cepanja. Modifikacija može takođe uključiti modifikacije jednog ili više nukleotida na mestima vezivanja. Modifikacija može dalje uključiti modifikacije jednog ili više nukleotida na mestima cepanja, i na jednom ili više mesta vezivanja. U određenim otelotvorenjima, jedno ili više ciljnih mesta nukleaze nije(su) modifikovano. U drugim otelotvorenjima, bar jedno od ciljnih mesta za nukleazu(e) je(su) modifikovano. U određenim otelotvorenjima, modifikacija je na ili blizu „+58“ regiona BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta vezivanja nukleaze prikazanog u bilo kojoj od SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2. Bilo koja ćelija ili ćelijska linija može biti modifikovana nukleazama kao što je ovde opisano, na primer matična ćelija (hematopoetska matična ćelija kao što je CD34+ hematopoetska matična ćelija) ili prekursorska ćelija crvenih krvnih zrnaca (RBC).

[0023] Takođe su opisane ćelije ili ćelijske linije dobijene posle modifikacije nukleazom kao što je ovde opisano, na primer ćelije ili ćelijske linije koje potiču od ćelije ili ćelijske linije modifikovane nukleazom kao što je ovde opisano. Delimično ili potpuno diferencirane ćelije koje potiču od modifikovanih matičnih ćelija kako je ovde opisano su takođe obezbeđene (npr., eritrociti ili ćelije prekursori eritrocita). Ćelije koje potiču od ćelija modifikovanih nukleazom mogu da se razmnožavaju, diferenciraju i kombinuju i razmnožene i diferencirane in vitro (kultura) ili mogu da se diferenciraju unutar živog ispitanika, na primer nakon ex vivo davanja matične ćelije modifikovane nukleazom. Bilo koja od ovde obelodanjenih genetski modifikovanih ćelija ili ćelijskih linija može pokazati povećanu ekspresiju gama globina. Sastavi kao što su farmaceutski sastavi koje sadrže genetski modifikovane ćelije kao što su ovde opisane su takođe obezbeđene.

[0024] Isporuka donorske nukleinske kiseline ciljnoj ćeliji može da obezbedi genetski modifikovanu ćeliju u kojoj je donor integrisan u ćeliju. Donator može biti isporučen pre, posle ili zajedno sa nukleinskom kiselinom koja kodira nukleazu(e) iz Tabele 1. Donorska nukleinska kiselina može da sadrži egzogenu sekvencu (transgen) koja se integriše u genom ćelije, na primer, endogeni lokus. U nekim otelotvorenjima, donor može da sadrži gen pune dužine ili njegov fragment koji je okružen regionima homologije sa ciljanim mestom cepanja. U nekim otelotvorenjima, donor nema homologne regione i integrisan je u ciljni lokus kroz mehanizam nezavisnog od homologije (tj., NHEJ). Donator može sadržati bilo koju sekvencu nukleinske kiseline, na primer nukleinsku kiselinu koja, kada se koristi kao supstrat za homologijom usmerenu popravku dvostrukog lanca indukovanog nukleazom, dovodi do delecije specificiranog od donatora koja se generiše na endogenom hromozomu. lokus (npr., BCL11A region pojačivača) ili, alternativno (ili kao dodatak), novi alelni

oblici (npr., tačkaste mutacije koje uklanjaju mesto vezivanja faktora transkripcije)

1

endogenog lokusa koji se stvara. U nekim aspektima, donatorska nukleinska kiselina je oligonukleotid pri čemu integracija dovodi do događaja korekcije gena ili ciljanog brisanja.

[0025] U drugim aspektima, nukleaza, donor i kombinacije i nukleaze i donora se (su) isporučuju virusnim, ne virusnim i kombinacijama virusnih i ne virusnih postupaka prenosa gena. U poželjnim otelotvorenjima, donor se isporučuje u ćeliju preko adeno-asociranog virusa (AAV). U nekim slučajevima, AAV sadrži LTR koji su heterolognog serotipa u poređenju sa serotipom kapsida.

[0026] U nekim aspektima, delecije koje sadrže regione unutar DNKseI preosetljivih regiona pojačivača (npr., 58 region pojačivača BCL11A) se prave korišćenjem jedne ili više nukleaza kao što je prikazano u Tabeli 1. Ove delecije mogu sadržati od oko 1 nukleotida do oko 551 nukleotida. Dakle, brisanja mogu sadržati 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 nukleaza ili bilo koju vrednost. U nekim otelotvorenjima, delecije sadrže vezujuće regione za jedan ili više faktora transkripcije. U nekim poželjnim otelotvorenjima, delecije obuhvataju GATA-1 vezujuće mesto, ili mesto vezivanja za GATA-1 u kombinaciji sa drugim faktorima.

[0027] U nekim aspektima obelodanjivanja, DNK vezujući domeni iz Tabele 1 su fuzionisani sa funkcionalnim domenom. Neki aspekti uključuju fuziju domena koji se vezuju za DNK sa domenima sposobnim da regulišu gensku ekspresiju. U nekim aspektima obelodanjivanja, fuzioni proteini obuhvataju DNK vezujući domen iz Tabele 1 fuzionisan sa modulatornim domenom genske ekspresije gde modulator potiskuje gensku ekspresiju.

[0028] U nekim aspektima obelodanjivanja, HSC/PC ćelije su u kontaktu sa nukleazama, proteinima koji se vezuju za DNK i kombinacijama nukleaza i DNK vezujućih proteina iz otkrića (tj., ZFP kao što je prikazano u Tabeli 1). Nukleaze, DNK vezujući proteini i kombinacije nukleaza i DNK vezujućih proteina mogu se isporučiti kao nukleinske kiseline ili kao proteini. Nukleinske kiseline mogu biti mRNK koje kodiraju proteine koji se vezuju za DNK, i kombinacije nukleaza i DNK vezujućih proteina, au daljim slučajevima, mRNK mogu biti zaštićene. mRNK može biti hemijski modifikovana, može da sadrži ARCA kapu, mešavinu nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida i kombinacije ARCA kape i mešavine nemodifikovanih i modifikovanih nukleotida. Takođe su obezbeđene ćelije ili ćelijske linije koje potiču od ovih ćelija, uključujući delimično ili potpuno diferencirane ćelije.

[0029] U nekim aspektima, HSC/PC su u kontaktu sa nukleazama, proteinima koji se vezuju za DNK i kombinacijama nukleaza i DNK vezujućih proteina iz otkrića ex vivo, prateći aferezu HSC/PC od ispitanika, ili prečišćavanje iz sakupljene kosti srž. U nekim otelotvorenjima, nukleaze koje su ovde opisane izazivaju modifikacije unutar regiona pojačivača BCL11A, na primer dovodeći do genetski modifikovane ćelije koja je strukturno, funkcionalno i kombinacija strukturno i funkcionalno različitih od ćelija divljeg tipa, drugih modifikovanih (npr., modifikovanih nukleazom) ćelije i kombinacije divljeg tipa i drugih modifikovanih ćelija. U daljim otelotvorenjima, HSC/PC koji sadrži modifikacije regiona pojačivača BCL11A se uvodi nazad u ispitanik. U nekim otelotvorenjima, HSC/PC koji sadrži modifikacije regiona pojačivača BCL11A se proširuje pre uvođenja. U drugim aspektima, genetski modifikovani HSC/PC se daju subjektu u transplantaciji koštane srži pri čemu se HSC/PC ugrađuje, diferencira i sazre in vivo. U nekim otelotvorenjima, HSC/PC su izolovani od subjekta nakon mobilizacije izazvane G-CSF, mobilizacije izazvane pleriksaforom i kombinacija mobilizacije izazvane G-CSF-om i pleriksaforom, au drugim, ćelije su izolovane iz ljudske kosti srž ili ljudske pupčane vrpce. U nekim aspektima, subjekt se leči blagom mijeloablativnom procedurom pre uvođenja transplantata koji sadrži modifikovani HSC/PC, dok se u drugim aspektima, ispitanik leči snažnim mijeloablativnim režimom kondicioniranja. U nekim otelotvorenjima, sastavi pronalaska se koriste za lečenje ili prevenciju hemoglobinopatije. U nekim aspektima, hemoglobinopatija je talasemija. U nekim aspektima, hemoglobinopatija je beta talasemija, dok je u drugim aspektima hemoglobinopatija bolest srpastih ćelija.

[0030] U nekim otelotvorenjima, HSC/PC su dalje u kontaktu sa donorskim molekulom. U nekim otelotvorenjima, molekul donora se isporučuje pomoću virusnog vektora. Donorski molekul može da sadrži jednu ili više sekvenci koje kodiraju funkcionalni polipeptid (npr., cDNK ili njegov fragment), sa ili bez promotera. Dodatne sekvence (kodirajuće ili nekodirajuće sekvence) mogu da budu uključene kada se molekul donora koristi za inaktivaciju, uključujući, ali ne ograničavajući se na, sekvence koje kodiraju 2A peptid, SA mesto, IRES itd.

[0031] U jednom aspektu, HSC/PC su u kontaktu sa sastavima pronalaska in vivo. Nukleaze, DNK vezujući proteini ili kombinacija nukleaza i DNK vezujućih proteina mogu se isporučiti u HSC/PC in situ postupcima poznatim u tehnici. U nekim otelotvorenjima, nukleaze

1

pronalaska sadrže virusnu česticu koja se daje subjektu kome je to potrebno, dok u drugim, nukleaze, DNK vezujući proteini ili kombinacija nukleaza i DNK vezujućih proteina sadrže nanočesticu (npr. lipozom). U nekim otelotvorenjima, virusne čestice, nanočestice ili kombinacija virusnih čestica i nanočestica se isporučuju u organ (npr. koštanu srž) u kome se nalaze HSC/PC.

[0032] U drugom aspektu, ovde su opisani postupci integracije donora nukleinske kiseline u genom ćelije putem mehanizama nezavisnih od homologije. Postupci obuhvataju stvaranje dvolančanog prekida (DSB) u genomu ćelije i cepanje molekula donora korišćenjem nukleaze kao što je ovde opisano, tako da je donorska nukleinska kiselina integrisana na mestu DSB. U određenim otelotvorenjima, donorska nukleinska kiselina je integrisana pomoću postupka koje nisu zavisne od homologije (npr., NHEJ). Kao što je iznad navedeno, nakon in vivo cepanja, donorske sekvence mogu biti ciljano integrisane u genom ćelije na lokaciji DSB. Donatorska sekvenca može uključiti jedno ili više istih ciljnih mesta za jednu ili više nukleaza koje se koriste za stvaranje DSB. Prema tome, donorska sekvenca može biti cepana pomoću jedne ili više istih nukleaza koje se koriste za cepanje endogenog gena u koji se želi integracija. U određenim otelotvorenjima, donorska sekvenca uključuje različita ciljna mesta nukleaze od nukleaza koje se koriste za indukciju DSB. DSB u genomu ciljne ćelije mogu se stvoriti bilo kojim mehanizmom. U određenim otelotvorenjima, DSB se stvara pomoću jedne ili više nukleaza cinkovog prsta (ZFN), fuzionih proteina koji sadrže domen za vezivanje cinkovog prsta koji je projektovan da veže sekvencu unutar regiona od interesa, i domen cepanja ili cepanje polu-domena.

[0033] U jednom aspektu, donator može da kodira regulatorni protein od interesa (npr. ZFP TF, TALE TF ili CRISPR/Cas TF) koji se vezuje za, modulira ekspresiju ili oba vezuje i modulira gensku ekspresiju od interesa. U jednom otelotvorenju, regulatorni proteini se vezuju za DNK sekvencu i sprečavaju vezivanje drugih regulatornih faktora. U drugom otelotvorenju, vezivanje regulatornog proteina može modulirati (tj. indukovati ili potisnuti) ekspresiju ciljne DNK.

[0034] U nekim otelotvorenjima, transgenska HSC/PC ćelija, transgenska životinja ili kombinacija transgene HSC/PC ćelije i životinje uključuje transgen koji kodira humani gen. U nekim slučajevima, transgenska životinja obuhvata nokaut na endogenom lokusu i zamenu endogenog gena njegovim humanim parom, čime se omogućava razvoj in vivo sistema gde se

1

humani protein može proučavati izolovano. Takvi transgenski modeli se mogu koristiti u svrhe skrininga za identifikaciju malih molekula ili velikih biomolekula ili drugih entiteta koji mogu da stupe u interakciju sa ili modifikuju humani protein od interesa. U nekim aspektima, transgen je integrisan u odabrani lokus (npr., sigurna luka) u matičnu

ćeliju (npr., embrionalnu matičnu ćeliju, indukovanu pluripotentnu matičnu ćeliju, hematopoetsku matičnu ćeliju, itd.) ili embrion životinje koja nije čovek dobijen bilo kojim od ovde opisanih postupaka, a zatim se embrion implantira tako da se rodi živa životinja koja nije čovek. Životinja se zatim odgaja do seksualne zrelosti i dozvoljava da proizvede potomstvo pri čemu bar deo potomaka sadrži uređenu endogenu sekvencu gena ili integrisani transgen.

[0035] U drugom aspektu, ovde je dat postupak promene ekspresije gena (npr., BCL11A, globinski gen i kombinacije BCL11A i globin gena) u ćeliji, postupak koji obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jedne ili više nukleaza kao što je ovde opisano (prikazano u Tabeli 1), pod takvim uslovima da se ekspresuje jedan ili više proteina i da se ekspresija gena menja. U određenim otelotvorenjima, ekspresija globin gena (npr., gama globin ili beta globin) je izmenjena (npr., povećana). Bilo koji od postupaka opisanih ovde može dalje da obuhvata integraciju donorske sekvence (npr., transgenska ili njegovog fragmenta pod kontrolom egzogenog ili endogenog promotera) u genom ćelije, na primer integraciju donora na ili blizu mesta cepanja nukleaze u genu BCL11A. Donatorska sekvenca se uvodi u ćeliju korišćenjem virusnog vektora, kao oligonukleotida, na plazmidu, i kombinacije jednog ili više metoda odabranih od korišćenja virusnog vektora, kao oligonukleotida ili na plazmidu. Ćelija u kojoj se menja ekspresija gena može biti, na primer, ćelija prekursora crvenih krvnih zrnaca (RBC), hematopoetska matična ćelija (npr., CD34+ ćelija) i kombinacije ćelije prekursora eritrocita i hematopoetske matične ćelije.

[0036] Ovde je opisan postupak proizvodnje genetski modifikovane ćelije koja sadrži genomsku modifikaciju unutar endogene sekvence pojačivača BCL11A (modifikacija nukleotidne sekvence pojačivača BCL11A), postupak koji sadrži korake: a) dovođenje u kontakt ćelije sa polinukleotidom (npr. DNK ili mRNK) koji kodira nukleazu cinkovog prsta koja sadrži 4, 5 ili 6 domena cink prsta u kojima svaki od domena cinkovog prsta sadrži region spirale za prepoznavanje u redosledu prikazanom u jednom redu iz Tabele 1; b) podvrgavanje ćelije uslovima koji pogoduju ekspresiji proteina cinkovog prsta iz polinukleotida; i c) modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A sa eksprimiranim

1

proteinom cinkovog prsta dovoljnim da proizvede genetski modifikovanu ćeliju. Ćelije mogu biti stimulisane sa najmanje jednim citokinom (npr., pre koraka (a)). Polinukleotid može biti u kontaktu sa ćelijom korišćenjem bilo kog pogodnog postupka, uključujući, ali bez ograničenja, transfekciju, korišćenje ne virusnog vektora, korišćenje virusnog vektora, hemijskim sredstvima ili izlaganjem električnom polju (npr., elektroporacijom).

[0037] Takođe su obezbeđene ćelije koje sadrže jednu ili kombinaciju genomskih modifikacija opisanih ovde, uključujući ćelije koje potiču od ćelija proizvedenih ovde opisanim postupcima.

[0038] Takođe je obelodanjen postupak lečenja pacijenta kome je potrebno povećanje ekspresije globin gena, postupak koji obuhvata davanje pacijentu farmaceutskog sastava, pri čemu farmaceutski sastav sadrži genetski modifikovane ćelije, proteine, polinukleotide i kombinacije jednog ili više odabranih iz genetski modifikovanih ćelija, proteina i polinukleotida, kao što je ovde opisano u količini dovoljnoj da poveća ekspresiju globin gena kod pacijenta. Može se znati da pacijent ima, sumnja se da ima ili je u opasnosti od razvoja talasemije ili bolesti srpastih ćelija.

[0039] Takođe je obezbeđen komplet, koji sadrži nukleinske kiseline, proteine, genetski modifikovane ćelije i kombinacije jedne ili više odabranih od nukleinskih kiselina, proteina i genetski modifikovanih ćelija pronalaska. Komplet može da sadrži nukleinske kiseline koje kodiraju nukleaze, (npr. RNK molekule ili ZFN, TALEN ili CRISPR/Cas sistem koji kodiraju gene koji se nalaze u odgovarajućem ekspresionom vektoru), alikvote proteina nukleaze, molekule donora, pogodne modifikatore samoobnavljanja matičnih ćelija („matičnost“), ćelije, puferi, uputstva (npr. za izvođenje postupka pronalaska) i slično, uključujući različite kombinacije ovih komponenti kompleta. Obelodanjena je genetski modifikovana ćelija (npr., matična ćelija kao što je hematopoetska (CD34+) matična ćelija ili ćelija prekursor eritrocita) koja sadrži najmanje jednu genomsku modifikaciju napravljenu od nukleaze (npr., kao što je prikazano u jednom redu tabele 1), pri čemu genomska modifikacija je unutar endogene sekvence pojačivača BCL11A, i dalje pri čemu je genomska modifikacija izabrana iz grupe koja se sastoji od insercija, delecija i njihovih kombinacija i obuhvata modifikaciju na, blizu ili između bilo koje od SEQ ID NO: 1 i SEQ ID NO:2. U određenim otelotvorenjima, ćelija je genetski modifikovana diferencirana ćelija koja potiče od matične ćelije kao što je ovde opisano (npr., eritrocita koja potiče od hematopoetske

1

matične ćelije ili ćelije prekursora eritrocita).

[0040] Nukleaza može da sadrži najmanje jednu nukleazu cinkovog prsta (ZFN) (npr., kao što je prikazano u Tabeli 1), najmanje jedan TALEN i kombinacije najmanje jednog ZFN i najmanje jednog TALEN. Nukleaza(e) se mogu uvesti u ćeliju u obliku proteina, kao polinukleotid koji kodira nukleazu(e), ili kao kombinacija oblika proteina i polinukleotida koji kodira nukleazu(e). U određenim otelotvorenjima, genomska modifikacija obuhvata inserciju koja obuhvata integraciju donorskog polinukleotida koji kodira transgen. Takođe su opisani farmaceutski sastavi koje sadrže jednu ili više genetski modifikovanih ćelija kako je ovde opisano.

[0041] Takođe je opisan protein koji se vezuje za DNK koji sadrži protein cinkovog prsta koji sadrži 4, 5 ili 6 domena cinkovih prstiju koji sadrže region spirale za prepoznavanje, pri čemu proteini cinkovog prsta obuhvataju regione spirale za prepoznavanje u redosledu prikazanom u jednom redu Tabele 1. Takođe je opisan protein TALE koji sadrži više ponavljanja koji se vezuju za sekvencu koja sadrži deo (npr., najmanje 4, 5, 6 ili više) parova baza ciljnih mesta prikazanih u Tabeli 1. Fuzioni protein koji sadrži protein cink prsta ili TALE protein kao što je ovde opisan i divlji tip ili projektovani domen cepanja ili poludomen cepanja je takođe opisan kao i polinukleotidi koji kodiraju proteine (ZFP, TALE, ZFN, TALEN) kao što je ovde opisano. Takođe su opisane ćelije (npr., izolovane matične ćelije kao što su hematopoetske (CD34+) matične ćelije) koje sadrže jedan ili više polinukleotida, proteina i kombinacije polinukleotida i proteina kao što je ovde opisano. Takođe su opisani kompleti koji sadrže jedan ili više proteina, polinukleotida, ćelija ili njihove kombinacije kako je ovde opisano.

[0042] Takođe je opisan postupak menjanja ekspresije globin gena u ćeliji (npr., ćelija prekursora eritrocita, matična hematopoetska ćelija i kombinacije ćelije prekursora eritrocita i hematopoetske matične ćelije), a postupak obuhvata: uvođenje, u ćeliju, jednog ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više nukleaza kao što je ovde opisano, pod uslovima u kojima se ekspresuje jedan ili više proteina i ekspresija globin gena (npr., gama globin, beta globin i kombinacije gama i beta globin) je izmenjen (npr., povećan). Postupci mogu dalje da obuhvataju integraciju donorske sekvence u genom ćelije, na primer korišćenjem virusnog vektora, kao oligonukleotida ili na plazmidu. Donorska sekvenca može da sadrži transgen pod kontrolom endogenog ili egzogenog promotera.

1

[0043] Takođe je opisana metoda proizvodnje genetski modifikovane ćelije koja sadrži genomsku modifikaciju unutar endogene sekvence pojačivača BCL11A (npr., ciljno mesto kao što je prikazano u Tabeli 1), a postupak obuhvata sledeće korake: (a) dovođenje u kontakt ćelije sa polinukleotidom koji kodira fuzioni protein koji sadrži nukleazu cink prsta koja sadrži 4, 5 ili 6 domena cinkovog prsta u kojima svaki od domena cinkovog prsta sadrži region heliksa za prepoznavanje u redosledu prikazanom u jednom redu Tabela 1; (b) podvrgavanje ćelije uslovima koji pogoduju ekspresiji fuzionog proteina iz polinukleotida; i (c) modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A sa eksprimiranim fuzionim proteinom dovoljnim da proizvede genetski modifikovanu ćeliju. Postupak može dalje da obuhvata stimulisanje ćelija sa najmanje jednim citokinom. Polinukleotid(i) se može isporučiti unutar ćelije, na primer korišćenjem ne virusnog sistema za isporuku, virusnog sistema za isporuku, nosača za isporuku i kombinacija odabranih od ne virusnog sistema za isporuku, sistema za isporuku virusa i dostava vozilo i može da obuhvata izlaganje ćelija električnom polju ili korišćenje oštećenja ćelijske membrane kao mehanizma isporuke (tzv. „Tehnologija stiskanja“, videti npr., Sharei i dr. (2015) PLOS ONE doi:

10.1371/journal/pone.0118803).

[0044] Postupci lečenja pacijenata kojima je potrebno povećanje ekspresije globin gena (npr., poznato je da pacijent ima, sumnja se da ima ili je u riziku od razvoja hemoglobinopatije kao što je talasemija (npr., β-talasemija) ili srp ćelijske bolesti su takođe opisane, metoda koja se sastoji iz davanja pacijentu farmaceutskog sastava kako je ovde opisano (npr., proteini, polinukleotidi, ćelije ili kombinacija odabrana između proteina, polinukleotida i ćelija) u količini dovoljnoj da poveća ekspresiju globin gena u pacijent.

[0045] Ovi i drugi aspekti će biti lako očigledni kvalifikovanoj osobi u svetlu obelodanjivanja u celini.

KRATAK OPIS SLIKA

[0046]

Slike 1A i 1B su šeme koje prikazuju pregled testa mesta integracije dupleksa oligonukleotida. Slika 1 prikazuje prvi korak testa, u kome se ćelije tretiraju sa ZFN u prisustvu dodatne oligonukleotidne dupleks DNK, koja je uhvaćena u deo nastalih događaja cepanja. Slika 1B prikazuje korak podsekvence u kome su ćelije kultivisane sedam dana, genomska DNK je izolovana, a segmenti mesta integracije donora koji se

2

nalaze na bočnim stranama genoma su amplifikovani putem PCR-a posredovanog adapterom korišćenjem prajmera za integrisani oligonukleotidni dupleks. Zatim se sekvencioniraju amplikoni da bi se otkrila mesta kandidata za cepanje.

Slika 2 prikazuje lokaciju 455 potencijalnih lokusa van cilja koji su identifikovani testom mesta integracije oligonukleotidnog dupleksa korišćenjem originalnog ili roditeljskog para ZFN 51857/51949. Top 63 lokusa su označeni sivom bojom i analizirani su u naknadnim indel analizama. Svaki lokus je identifikovan hromozomom i baznim brojem koji ukazuje na najverovatnije lokaciju cepanja, kao i indikaciju broja integranata otkrivenih na tom lokusu.

Slike 3A do 3C prikazuju uzorne ostatke u kontaktu sa fosfatom unutar skele za cinkov prst. Slika 3A prikazuje interakciju cinkovog prsta sa molekulom DNK i prikazuje lokaciju bočnog lanca arginina divljeg tipa i kako on stupa u interakciju sa fosfatnim glavnim lancem molekula DNK. Slika 3B (SEQ ID NO: 7 do 17) prikazuje primere ZFN sekvence koje pokazuju gde se ovaj arginin nalazi u primarnoj sekvenci svakog cink prsta (vertikalni red 'R' ostataka označenih podebljanom strelicom) i takođe ističe one arginine koji su zamenjeni sa glutaminom u ZFP glavnom lancu kako bi se eliminisao odgovarajući fosfatni kontakt (pojedinačno upakovani 'R' ostaci). Sekvence takođe pokazuju regione spirale prepoznavanja (gde su ostaci od -1 do 3, 5 i 6 uokvireni i osenčeni) kao i deo veznika između C-terminalnog domena cink prsta i domena cepanja (domen cepanja nije prikazano). Slika 3C dalje prikazuje prostornu lokaciju drugog potencijalnog bočnog lanca lizina koji dolazi u kontakt sa glavnim lancem, prisutnog u domenu cepanja FokI, koji tokom optimizacije specifičnosti može biti zamenjen serinom.

Slika 4 je grafikon koji poredi nivoe modifikacije putem tretmana CD34 ćelija sa originalnim parom 51857/51949 ili sa optimizovanim parom 63014/65722 na različitim testiranim lokusima. Prikazani preko dna ili na x-osi, su lokusi identifikovani kao potencijalni ciljevi cepanja, sa procentima indela za svako mesto prikazano na vertikalnoj ili y-osi. Imajte na umu da je y-osa prikazana u log skali. Tamnosive trake pokazuju lokuse koje je cepao par 51857/51949 i količinu detektovanog cepanja, dok su svetlosive trake oni lokusi koje je cepao optimizovani par gde je skoro sve mereno cepanje na ciljanoj BCL11a ciljnoj sekvenci.

Slike 5A i 5B su grafikoni koji prikazuju relativne odnose globinskih mRNK napravljenih u hCD34+ ćelijama nakon tretmana BCL11A specifičnim ZFN-ovima i diferencijacije eritroida. CD34+ ćelije dobijene od dva zdrava ljudska donora (PBMR-003 ili PB-MR-004) su tretirane ili nisu tretirane parom ZFN, a zatim je analizirana ekspresija α, β, i γ globina. Najbolji postupak za određivanje količine γ globin mRNK pronađene nakon tretmana ZFN je da se izrazi promena u ekspresiji ili kao odnos γ globina prema β globinu (Slika 5A), ili γ globina prema α globin iRNK (Slika 5B).

Slika 6 je grafik koji prikazuje relativne količine proteina γ-globina proizvedenih u tretiranim CD34+ ćelijama. Kao što je iznad navedeno, korišćene su dve serije CD34+ ćelija koje potiču od zdravih ljudskih donora (PB-MR-003 i PB-MR-004). U ovom eksperimentu, uočeno je približno 3-4 puta povećanje procenta proteina fetalnog globina na nivoe od oko 15%-20% u eritroidnom potomstvu HSPC nakon 63014/65722 posredovanog poremećaja BCL11A pojačivača u obe grupe donora. Slika 7 je grafik koji pokazuje relativni humani himerizam kod miševa koji su usađeni sa 63014/65722 tretiranim partijama donora („+ZFN“) kao što je iznad opisano. Humani himerizam je meren detekcijom ćelija koje nose hCD45 marker na svojoj površini korišćenjem FACS. Navedeni su procenti humanih hCD45+ ćelija u perifernoj krvi prikupljenih 8 ili 12 nedelja nakon transplantacije. Podaci su pokazali dobre nivoe presađivanja u ovoj studiji sa uporedivim humanim himerizmom nakon usađivanja netransfektovane kontrole ("(-)") i ZFN transficiranog HSPC-a ("+ZFN"). Otvoreni krugovi i trouglovi predstavljaju pojedinačne životinje.

Slika 8 pokazuje procenat himerizma otkriven u koštanoj srži presađenih miševa gde su ljudske ćelije identifikovane prisustvom hCD45 na njihovim ćelijskim površinama. Uzorci su analizirani 12 nedelja nakon presađivanja.

Slike 9A do 9D su grafici koji prikazuju rekonstituciju različitih linija hematopoetskih ćelija testiranih FACS analizom ćelija koštane srži kod usađenih miševa dobijenih u 12. nedelji sa antitelima koja prepoznaju površinske markere ćelijske linije specifične za lozu. Podaci su pokazali uporedivu zastupljenost svih analiziranih humanih hematopoetskih linija u koštanoj srži 12. nedelje nakon injekcije između CD34+ ćelijskog potomstva tretiranog BCL11A-specifičnom ZFN mRNK ("' 14/'22") i potomstva ne transficiranih ćelija ("( -)"). Prikazani su podaci iz limfoidnih, mijeloidnih, eritroidnih i HSPC (Slike 9A do 9D, respektivno) za ćelije dobijene od oba donora („003“ i „004“). Podaci su pokazali uporedivu zastupljenost svih analiziranih humanih hematopoetskih linija u koštanoj srži 12. nedelje nakon injekcije između CD34+ ćelijskog potomstva tretiranog Bcl11A ZFN mRNK i potomstva ne transficiranih ćelija.

Slika 10 je grafik koji prikazuje nivo modifikacije gena na BCL11A meti u DNK izolovanoj iz periferne krvi presađenih miševa, analiziran dubokim sekvenciranjem. Prikazani su podaci za ulazne ćelije (2 dana nakon transfekcije ZFN, ("+")), a zatim za krvne ćelije 8 ili 12 nedelja nakon usađivanja, i pokazali su dobro zadržavanje modifikacije gena. Ne transficirane ćelije su predstavljene sa "(-)" u liniji Tretmana.

Slika 11 je grafik koji prikazuje količinu modifikacije gena na BCL11A meti za uzorke ćelija koštane srži nakon usađivanja ćelija tretiranih ZFN-om („+“).

Netretirane ćelije su predstavljene sa "(-)" u liniji Tretmana. Uporediva modifikacija je primećena u obe BCL11A zavisne loze (B ćelije, koje eksprimiraju CD19 marker; primitivni progenitori, koji izražavaju CD45 i visoke nivoe CD38) i BCL11A nezavisnih (mijeloidnih) linija. Iako su nivoi modifikacije ulaznog gena bili viši u uzorku donora PB-MR-003 nego u uzorku donora PB-MR-004, ćelije izvedene iz PB-MR-004 su dosledno pokazivale više nivoe modifikacije, tj. bolje zadržavanje modifikacije, kod miševa od onih izvedenih iz PB-MR-003.

Slika 12 je grafik koji prikazuje količinu modifikacije gena u eritroidnim ćelijama dobijenim iz ćelija koštane srži 12. nedelje nakon in vitro diferencijacije tokom 14 dana. Podaci su dobijeni od miševa koji su prvobitno usađeni sa dva različita donatora opisana iznad, i pokazali su da modifikacija BCL11A posredovana tretmanom ZFN ("+ ZFN") nije značajno izmenjena tokom diferencijacije eritroida. Ćelije koje nisu tretirane ZFN označene su sa "(-) ZFN".

Slike 13A i 13B su grafikoni koji prikazuju relativnu količinu iRNK koja kodira γglobin, pri čemu je koncentracija iRNK γ-globina prikazana ili kao odnos γ globin/β globin iRNK (slika 9A) ili kao odnos γ globin/α globin mRNK (Slika 9B). I u ne transfektovanim ("(-) ZFN") i u uzorcima tretiranim ZFN ("+ ZFN") γ-globin prema β globinu ili γ-globin prema α-globinu mRNK odnosi su se uveliko razlikovali između eritroidnih potomaka pojedinačnih miševa iz ista grupa. Međutim, uprkos ovoj varijabilnosti i varijabilnosti koja je uvedena upotrebom dva različita humana donora, proseci tretiranih uzoraka 63014/65722 pokazuju ∼1,5-2 puta povećanje nivoa γ globin mRNK u poređenju sa njihovim odgovarajućim ne transficiranim kolegama.

Slika 14 je grafik koji prikazuje razliku u količini proteina γ-globina (izraženog ili kao odnos γ-globin/α-globin ili γ-globin/ukupni β-sličan protein) u ćelijama dobijenim iz koštane srži od presađenih miševa gde ćelije koštane srži su podvrgnute in vitro protokolu diferencijacije. Nivoi proteina su mereni 16 dana nakon diferencijacije. Određeni su Gama (γ) globin (zbir Agamma i Ggamma pikova) prema alfa (α)

2

globinskim odnosima, kao i Gama globin (zbir Agamma i Ggamma pikova)/ preko odnosa globina sličnih beta (zbir Agamma, Ggamma, beta i delta globin vrhovi). U skladu sa slabom eritroidnom diferencijacijom uzoraka dobijenih iz PB-MR-003, nivoi gama-globina u ne transficiranim ćelijama dobijenim od ovog donora bili su veoma visoki (∼30%), pa je stoga tretman ZFN-om („+ ZFN“) rezultirao samo 1,2 puta povećanje nivoa gama-globina u poređenju sa netretiranim ćelijama ("(-) ZFN"). PB-MR-004 je pokazao tipičnije netransfektovane nivoe (∼9%) i pokazao ∼2 puta povećanje nivoa proteina gama-globina nakon 12 nedelja prolaska kroz miša.

DETALJNI OPIS

[0047] Ovde su obelodanjeni sastavi i postupci za inženjering genoma za modulaciju BCL11A, gama globina i kombinacije ekspresije BCL11A i gama globina i za lečenje, prevenciju ili lečenje i prevenciju hemoglobinopatija. Konkretno, putem ciljanja sa nukleazama koje sadrže ZFP-ove koji imaju regione zavojnice za prepoznavanje kao što je prikazano u jednom redu tabele 1, poremećaj pojačivača BCL11A se efikasno postiže u HSC/PC i rezultira promenom relativne ekspresije gama globina tokom naknadnog eritropoeza. Ova modulacija ekspresije BCL11A i gama globina je posebno korisna za lečenje hemoglobinopatija (npr., beta talasemija, bolest srpastih ćelija) gde nema dovoljno ekspresije beta globina ili ekspresije mutiranog oblika beta-globina. Korišćenjem kompozicija prema pronalasku, komplikacije i posledice povezane sa bolešću izazvane aberantnim beta globinom mogu se prevazići promenom ekspresije gama globina u ćelijama prekursora eritrocita.

Uopšteno

[0048] Praksa postupaka, kao i priprema i upotreba sastava obelodanjenih ovde, koriste, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne tehnike u molekularnoj biologiji, biohemiji, strukturi i analizi hromatina, računarskoj hemiji, ćelijskoj kulturi, rekombinantnoj DNK i srodnim oblastima koje su u okviru veština umetnosti. Ove tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, Sambrook i dr. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 i Third edition, 2001; Ausubel i dr., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 i periodična ažuriranja; serije METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol.304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; i METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol.119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999.

Definicije

[0049] Termini "nukleinska kiselina", "polinukleotid" i "oligonukleotid" se koriste naizmenično i odnose se na deoksiribonukleotid ili ribonukleotidni polimer, u linearnoj ili kružnoj konformaciji, i u jednolančanom ili dvolančanom obliku. Za potrebe predmetnog obelodanjivanja, ovi termini ne treba da se tumače kao ograničavajući u pogledu dužine polimera. Termini mogu da obuhvataju poznate analoge prirodnih nukleotida, kao i nukleotide koji su modifikovani u bazi, šećeru, fosfatnim delovima (npr., fosforotioatni okosnici) i kombinacijama izabranim između baza, šećera i fosfata. Generalno, analog određenog nukleotida ima istu specifičnost uparivanja baza; tj., analog A će se upariti sa T.

[0050] Termini "polipeptid", "peptid" i "protein" su korišćeni naizmenično za označavanje polimera aminokiselinskih ostataka. Termin se takođe odnosi na polimere aminokiselina u kojima su jedna ili više aminokiselina hemijski analozi ili modifikovani derivati odgovarajućih amino kiselina koje se javljaju u prirodi.

[0051] "Vezivanje" se odnosi na sekvencu specifičnu, nekovalentnu interakciju između makromolekula (npr., između proteina i nukleinske kiseline). Ne moraju sve komponente vezujuće interakcije da budu specifične za sekvencu (npr., kontakti sa ostacima fosfata u kičmi DNK), sve dok je interakcija kao celina specifična za sekvencu. Takve interakcije generalno karakteriše konstanta disocijacije (Kd) od 10<-6>M<-1>ili niža. „Afinitet“ se odnosi na snagu vezivanja: povećan afinitet vezivanja je u korelaciji sa nižim Kd.

[0052] "Vezivni protein" je protein koji je u stanju da se vezuje za drugi molekul. Vezujući protein se može vezati za, na primer, molekul DNK (protein koji vezuje DNK), molekul RNK (protein koji vezuje RNK), proteinski molekul (protein koji vezuje protein) ili se može vezati za kombinaciju molekule odabrane od molekula DNK, molekula RNK ili proteina. U slučaju proteina koji vezuje protein, on može da se veže za sebe (da formira homodimere, homotrimere, itd.), može da se vezuje za jedan ili više molekula drugog proteina ili proteina, ili se može vezati i za sebe i za jedan ili molekule drugog proteina ili proteina. Vezivni protein može imati više od jedne vrste vezujuće aktivnosti. Na primer, proteini cinkovog prsta imaju aktivnost vezivanja DNK, RNK i vezivanja proteina.

2

[0053] „Protein koji vezuje DNK cinkovog prsta“ (ili vezujući domen) je protein, ili domen unutar većeg proteina, koji vezuje DNK na način specifičan za sekvencu preko jednog ili više cinkovih prstiju, koji su regioni sekvence aminokiselina unutar vezujući domen čija je struktura stabilizovana koordinacijom jona cinka. Termin protein koji vezuje DNK cinkovog prsta se često skraćuje kao protein cinkovog prsta ili ZFP.

[0054] "TALE DNK vezujući domen" ili "TALE" je polipeptid koji sadrži jedan ili više TALE ponavljajućih domena/jedinica. Domeni ponavljanja su uključeni u vezivanje TALE za njegovu srodnu ciljnu DNK sekvencu. Jedna "jedinica ponavljanja" (takođe se naziva i "ponavljanje") je tipično dugačka 33-35 aminokiselina i pokazuje barem neku homologiju sekvence sa drugim sekvencama ponavljanja TALE unutar prirodnog proteina TALE.

[0055] Cink prst i TALE vezujući domeni mogu biti „projektovani“ da se vezuju za unapred određenu nukleotidnu sekvencu, na primer, putem inženjeringa (promena jedne ili više aminokiselina) regiona spirale prepoznavanja prirodnog cinkovog prsta ili TALE proteina. Prema tome, projektovani DNK vezujući proteini (cinkovi prsti ili TALE) su proteini koji se ne javljaju u prirodi. Neograničavajući primeri postupaka za projektovanje proteina koji vezuju DNK su dizajn i selekcija. Dizajnirani DNK vezujući protein je protein koji se ne pojavljuje u prirodi čiji dizajn/sastav proizilazi uglavnom iz racionalnih kriterijuma.

Racionalni kriterijumi za projektovanje uključuju primenu pravila zamene i kompjuterizovanih algoritama za obradu informacija u bazi podataka koja čuva informacije o postojećim ZFP i/ili TALE dizajnima i obavezujućim podacima. Videti na primer, patent SAD br.6,140,081; 6,453,242; 6,534,261 i 8,585,526; videti takođe PCT objave br. WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0056] „Odabrani“ protein cinkovog prsta ili TALE je protein koji se ne nalazi u prirodi čija proizvodnja je prvenstveno rezultat empirijskog procesa kao što je prikaz faga, zamka interakcije ili hibridna selekcija. Videti, npr., patent SAD br.

5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; 8,586,526; PCT Objave br. WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197, WO 02/099084.

[0057] "TtAgo" je prokariotski protein argonauta za koji se smatra da je uključen u utišavanje gena. TtAgo je izveden iz bakterije Thermus thermophilus. Videti npr., Swarts i dr. ibid, G.

2

Sheng i dr. (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652). „TtAgo sistem“ su sve potrebne komponente uključujući, na primer, DNK za vođenje za cepanje pomoću TtAgo enzima.

[0058] "Rekombinacija" se odnosi na proces razmene genetičkih informacija između dva polinukleotida, uključujući, ali ne ograničavajući se na, hvatanje donora nehomolognim spajanjem kraja (NHEJ) i homolognu rekombinaciju. Za potrebe predmetnog obelodanjivanja, "homologna rekombinacija (HR)" se odnosi na specijalizovani oblik takve razmene koja se odvija, na primer, tokom popravke dvolančanih prekida u ćelijama putem mehanizama popravke usmerenih na homologiju. Ovaj proces zahteva homologiju nukleotidne sekvence, koristi molekul „donatora“ za popravku „ciljnog“ molekula (tj., onog koji je doživeo prekid dvostrukog lanca) i različito je poznat kao „konverzija gena bez ukrštanja“ ili „ konverzija gena kratkog trakta“, jer to dovodi do prenosa genetskih informacija od donora do mete. Bez želje da budemo vezan bilo kojom posebnom teorijom, takav transfer može uključivati korekciju neusklađenosti heterodupleksne DNK koja se formira između slomljene mete i donora, „zavisno od sinteze žarenja lanca“, u kojem se donor koristi za ponovnu sintetazu genetskih informacija koje će postati deo cilja, srodni procesi ili njihove kombinacije. Takav specijalizovani HR često dovodi do promene sekvence ciljnog molekula tako da je deo ili cela sekvenca donorskog polinukleotida ugrađena u ciljni polinukleotid.

[0059] U postupcima iz predmetnog obelodanjivanja, jedna ili više ciljanih nukleaza kao što je ovde opisano stvaraju dvolančani prekid (DSB) u ciljnoj sekvenci (npr., ćelijski hromatin) na unapred određenom mestu. DSB može dovesti do indela popravkom usmerenom na homologiju ili mehanizmima popravke koji nisu usmereni na homologiju. Brisanja mogu uključivati bilo koji broj baznih parova. Slično, insercije mogu uključivati bilo koji broj parova baza uključujući, na primer, integraciju polinukleotida "donora", opciono koji ima homologiju sa nukleotidnom sekvencom u regionu prekida. Donorska sekvenca može biti fizički integrisana ili, alternativno, donorski polinukleotid se koristi kao šablon za popravku prekida putem homologne rekombinacije, što rezultira uvođenjem cele ili dela nukleotidne sekvence kao kod donora u ćelijski hromatin. Dakle, prva sekvenca u ćelijskom hromatinu može biti izmenjena i, u određenim otelotvorenjima, može biti konvertovana u sekvencu prisutnu u polinukleotidu donora. Dakle, upotreba termina „zameniti“ ili „zamena“ može se shvatiti kao zamena jedne nukleotidne sekvence drugom, (tj., zamena sekvence u informativnom smislu), i ne zahteva nužno fizičku ili hemijsku zamenu jedan polinukleotid drugim.

2

[0060] U bilo kom od ovde opisanih postupaka, dodatni parovi proteina cink-prsti ili TALEN se mogu koristiti za dodatno dvolančano cepanje dodatnih ciljnih mesta unutar ćelije.

[0061] Bilo koja od ovde opisanih postupaka može se koristiti za umetanje donora bilo koje veličine, ili delimičnu ili potpunu inaktivaciju jedne ili više ciljnih sekvenci u ćeliji ciljanom integracijom donorske sekvence koja remeti ekspresiju gena od interesa. Takođe su opisane ćelijske linije sa delimično ili potpuno inaktiviranim genima.

[0062] U bilo kojem od postupaka opisanih ovde, egzogena nukleotidna sekvenca („sekvenca donora“ ili „transgen“) može sadržati sekvence koje su homologne, ali nisu identične genomskim sekvencama u regionu od interesa, čime se stimuliše homologna rekombinacija za umetanje ne-identična sekvenca u oblasti od interesa. Tako, u određenim otelotvorenjima, delovi donorske sekvence koji su homologni sekvencama u regionu od interesa pokazuju između oko 80 do 99% (ili bilo koji ceo broj između njih) identičnost sekvence sa genomskom sekvencom koja je zamenjena. U drugim otelotvorenjima, homologija između donora i genomske sekvence je veća od 99%, na primer ako se samo 1 nukleotid razlikuje kao između donora i genomske sekvence od preko 100 susednih parova baza. U određenim slučajevima, nehomologni deo donorske sekvence može sadržati sekvence koje nisu prisutne u regionu od interesa, tako da se nove sekvence uvode u region od interesa. U ovim slučajevima, nehomologna sekvenca je generalno okružena sekvencama od 50-1.000 parova baza (ili bilo koje integralne vrednosti između njih) ili bilo kog broja parova baza veći od 1.000, koji su homologni ili identični sekvencama u regionu od interesa. U drugim otelotvorenjima, donorska sekvenca je nehomologna sa prvom sekvencom, i umetnuta je u genom pomoću nehomolognih mehanizama rekombinacije.

[0063] "Cepanje" se odnosi na lomljenje kovalentnog glavnog lanca molekula DNK. Cepanje može biti pokrenuto različitim metodama uključujući, ali bez ograničenja, enzimsku ili hemijsku hidrolizu fosfodiestarske veze. Moguće je i jednolančano cepanje i dvolančano cepanje, a dvolančano cepanje može nastati kao rezultat dva različita događaja jednolančanog cepanja. Cepanje DNK može da dovede do stvaranja ili tupih krajeva ili raspoređenih krajeva. U određenim otelotvorenjima, fuzioni polipeptidi se koriste za ciljano cepanje dvolančane DNK.

2

[0064] "Polu-domen cepanja" je polipeptidna sekvenca koja, u sprezi sa drugim polipeptidom (bilo identičnim ili različitim) formira kompleks koji ima aktivnost cepanja (poželjno aktivnost dvolančanog cepanja). Termini "prvi i drugi polu-domeni cepanja;" "+ i – poludomeni cepanja" i "desni i levi polu-domeni cepanja" se koriste naizmenično da upućuju na parove polu-domena cepanja koji se dimerišu.

[0065] „Inženjerski polu-domen cepanja“ je polu-domen cepanja koji je modifikovan tako da formira obavezne heterodimere sa drugim polu-domenom cepanja (npr., drugim projektovanim polu-domenom cepanja). Videti takođe, Patente SAD br.

7,888,121; 7,914,796; 8,034,598; 8,623,618 i Patentnu objavu SAD br.2011/0201055.

[0066] Termin "sekvenca" se odnosi na nukleotidnu sekvencu bilo koje dužine, koja može biti DNK ili RNK; mogu biti linearni, kružni ili razgranati i mogu biti jednolančani ili dvolančani. Termin "donorska sekvenca" se odnosi na nukleotidnu sekvencu koja je umetnuta u genom. Donatorska sekvenca može biti bilo koje dužine, na primer između 2 i 100.000.000 nukleotida dužine (ili bilo koje vrednosti celog broja između njih ili iznad), poželjno između oko 100 i 100.000 nukleotida dužine (ili bilo kog celog broja između njih), poželjnije između oko 2020.000 nukleotida dužine (ili bilo koje vrednosti između njih) i još poželjnije, između oko 5 i 15 kb (ili bilo koje vrednosti između njih).

[0067] "Hromatin" je nukleoproteinska struktura koja sadrži ćelijski genom. Ćelijski hromatin se sastoji od nukleinske kiseline, prvenstveno DNK, i proteina, uključujući histone i ne histonske hromozomske proteine. Većina eukariotskog ćelijskog hromatina postoji u obliku nukleozoma, pri čemu jezgro nukleozoma sadrži približno 150 baznih parova DNK povezanih sa oktamerom koji sadrži po dva histona H2A, H2B, H3 i H4; a veznik DNK (promenljive dužine u zavisnosti od organizma) proteže se između jezgara nukleozoma. Molekul histona HI je generalno povezan sa DNK veznika. Za potrebe predmetnog obelodanjivanja, termin "hromatin" je namenjen da obuhvati sve tipove ćelijskih nukleoproteina, i prokariotske i eukariotske. Ćelijski hromatin uključuje i hromozomski i epizomalni hromatin.

[0068] "Hromozom" je kompleks hromatina koji sadrži ceo ili deo genoma ćelije. Genom ćelije često karakteriše njen kariotip, koji je skup svih hromozoma koji čine genom ćelije.

2

Genom ćelije može da sadrži jedan ili više hromozoma.

[0069] "Epizom" je replicirajuća nukleinska kiselina, nukleoproteinski kompleks ili druga struktura koja sadrži nukleinsku kiselinu koja nije deo hromozomskog kariotipa ćelije.

Primeri epizoma uključuju plazmide i određene virusne genome.

[0070] „Pristupačan region“ je mesto u ćelijskom hromatinu na kome ciljno mesto prisutno u nukleinskoj kiselini može biti vezano egzogenim molekulom koji prepoznaje ciljno mesto. Bez želje da budemo vezan bilo kojom posebnom teorijom, veruje se da je pristupačna regija ona koja nije upakovana u nukleozomsku strukturu. Izrazita struktura pristupačnog regiona se često može otkriti po njegovoj osetljivosti na hemijske i enzimske sonde, na primer, nukleaze.

[0071] "Ciljno mesto" ili "ciljna sekvenca" je sekvenca nukleinske kiseline koja definiše deo nukleinske kiseline za koji će se vezujući molekul vezati, pod uslovom da postoje dovoljni uslovi za vezivanje.

[0072] „Egzogeni“ molekul je molekul koji inače nije prisutan u ćeliji, ali se može uvesti u ćeliju pomoću jedne ili više genetskih, biohemijskih ili drugih postupaka. „Normalno prisustvo u ćeliji“ se određuje s obzirom na određeni razvojni stadijum i uslove životne sredine ćelije. Tako, na primer, molekul koji je prisutan samo tokom embrionalnog razvoja mišića je egzogeni molekul u odnosu na odraslu mišićnu ćeliju. Slično, molekul izazvan toplotnim šokom je egzogeni molekul u odnosu na ćeliju koja nije izložena toplotnom šoku. Egzogeni molekul može da sadrži, na primer, funkcionalnu verziju endogenog molekula koji ne funkcioniše ili neispravno funkcionalnu verziju endogenog molekula koji normalno funkcioniše.

[0073] Egzogeni molekul može biti, između ostalog, mali molekul, kao što je generisan kombinatornim hemijskim procesom, ili makromolekul kao što je protein, nukleinska kiselina, ugljeni hidrat, lipid, glikoprotein, lipoprotein, polisaharid, bilo koji modifikovani derivat gornjih molekula, ili bilo kog kompleksa koji sadrži jedan ili više od iznad navedenih molekula. Nukleinske kiseline uključuju DNK i RNK, mogu biti jednolančane ili dvolančane; mogu biti linearni, razgranati ili kružni; i može biti bilo koje dužine. Nukleinske kiseline uključuju one sposobne da formiraju duplekse, kao i nukleinske kiseline koje formiraju tripleks. Videti na primer, Patente SAD br.5,176,996 i 5,422,251. Proteini uključuju, ali nisu ograničeni na DNK-vezujuće proteine, faktore transkripcije, faktore remodeliranja hromatina, metilirane DNK vezujuće proteine, polimeraze, metilaze, demetilaze, acetilaze, deacetilaze, kinaze, fosfataze, integraze, ligameraze, rekombinaze, helikaze.

[0074] Egzogeni molekul može biti isti tip molekula kao i endogeni molekul, npr., egzogeni protein ili nukleinska kiselina. Na primer, egzogena nukleinska kiselina može da sadrži inficirajući virusni genom, plazmid ili epizom uveden u ćeliju, ili hromozom koji normalno nije prisutan u ćeliji. Postupci za uvođenje egzogenih molekula u ćelije poznate su stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju, ali nisu ograničeni na, transfer posredovan lipidima (tj., lipozome, uključujući neutralne i katjonske lipide), elektroporaciju, direktno ubrizgavanje, fuziju ćelija , bombardovanje česticama, koprecipitacija kalcijum fosfata, transfer posredovan DEAE-dekstranom i prenos posredovan virusnim vektorima. Egzogeni molekul takođe može biti isti tip molekula kao i endogeni molekul, ali izveden iz različite vrste od one iz koje potiče ćelija. Na primer, sekvenca humane nukleinske kiseline može biti uvedena u ćelijsku liniju prvobitno izvedenu od miša ili hrčka.

[0075] Nasuprot tome, "endogeni" molekul je onaj koji je normalno prisutan u određenoj ćeliji u određenoj fazi razvoja pod određenim uslovima sredine. Na primer, endogena nukleinska kiselina može da sadrži hromozom, genom mitohondrija, hloroplasta ili druge organele, ili epizomalnu nukleinsku kiselinu koja se javlja u prirodi. Dodatni endogeni molekuli mogu uključivati proteine, na primer, faktore transkripcije i enzime.

[0076] Kako se ovde koristi, termin "proizvod egzogene nukleinske kiseline" uključuje i polinukleotidne i polipeptidne proizvode, na primer, proizvode transkripcije (polinukleotide kao što je RNK) i proizvode translacije (polipeptide).

[0077] "Fuzioni" molekul je molekul u kome su dve ili više molekula podjedinica povezane, poželjno kovalentno. Molekuli podjedinice mogu biti istog hemijskog tipa molekula, ili mogu biti različite hemijske vrste molekula. Primeri prvog tipa fuzionih molekula uključuju, ali nisu ograničeni na, fuzione proteine (na primer, fuziju između domena koji se vezuje za ZFP ili TALE DNK i jednog ili više aktivacionih domena) i fuzione nukleinske kiseline (na primer, nukleinske kiselina koja kodira fuzioni protein opisan supra). Primeri drugog tipa fuzionog molekula obuhvataju, ali nisu ograničeni na, fuziju između nukleinske kiseline koja

1

formira tripleks i polipeptida, i fuziju između veziva manjeg žleba i nukleinske kiseline.

[0078] Ekspresija fuzionog proteina u ćeliji može biti rezultat isporuke fuzionog proteina u ćeliju ili isporukom polinukleotida koji kodira fuzioni protein u ćeliju, pri čemu se polinukleotid transkribuje, a transkript prevodi, da bi se generisao fuzioni protein. Transsplajsing, polipeptidno cepanje i polipeptidna ligacija takođe mogu biti uključeni u ekspresiju proteina u ćeliji. Postupci za isporuku polinukleotida i polipeptida u ćelije su predstavljeni na drugom mestu u predmetnom obelodanjivanju.

[0079] „Gen“, za potrebe predmetnog obelodanjivanja, uključuje DNK region koji kodira genski proizvod (videti infra), kao i sve DNK regione koji regulišu proizvodnju genskog proizvoda, bez obzira da li su takve regulatorne sekvence susedne ili ne kodirajuće sekvence, transkribovane sekvence i kombinacije kodirajućih i transkribovanih sekvenci. Shodno tome, gen uključuje, ali nije nužno ograničen na, promoterske sekvence, terminatore, translacione regulatorne sekvence kao što su mesta vezivanja ribozoma i unutrašnja mesta ulaska ribozoma, pojačivače, prigušivače, izolatore, granične elemente, poreklo replikacije, mesta vezivanja matriksa i kontrolu lokusa regioni.

[0080] "Ekspresija gena" se odnosi na konverziju informacija sadržanih u genu u genski proizvod. Genski proizvod može biti proizvod direktnog transkripcije gena (npr. mRNK, tRNK, rRNK, antisens RNK, mikroRNK, ribozim, strukturna RNK ili bilo koja druga vrsta RNK) ili protein proizveden translacijom iRNK. Genski proizvodi takođe uključuju RNK koje su modifikovane procesima kao što su zatvaranje, poliadenilacija, metilacija i uređivanje, i proteini modifikovani, na primer, metilacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ubikvitinacijom, ADP-ribozilacijom, miristilacijom i glikozilacijom.

[0081] "Modulacija" ekspresije gena se odnosi na promenu aktivnosti gena. Modulacija ekspresije može uključiti, ali nije ograničena na, aktivaciju gena i gensku represiju.

Uređivanje genoma (npr,. cepanje, promena, inaktivacija, nasumična mutacija) se može koristiti za modulaciju ekspresije. Inaktivacija gena se odnosi na bilo kakvo smanjenje ekspresije gena u poređenju sa ćelijom koja ne uključuje ZFP, TALE ili CRISPR/Cas sistem kao što je ovde opisano. Dakle, inaktivacija gena može biti delimična ili potpuna.

[0082] „Zaštićena“ iRNK je ona u kojoj je mRNK na neki način izmenjena da bi se povećala

2

stabilnost ili translacija iRNK. Primeri zaštite uključuju upotrebu zamene do 25% ostataka citodina i uridina sa 2-tiouridinom (s2U) i 5-metilcitidinom (m5C). Dobijena mRNK pokazuje manju imunogenost i veću stabilnost u poređenju sa nemodifikovanim kolegom. (videti Karikó i dr. ((2012), Molecular Therapy, Vol.16, No. 11, str.1833 - 1844). Ostale promene uključuju dodavanje takozvanog ARCA poklopca, koji povećava translativnost mRNK proizvedene in vitro (pogledajte U.S. Patent No.7,074,596).

[0083] "Oblast od interesa" je bilo koji region ćelijskog hromatina, kao što je, na primer, gen ili nekodirajuća sekvenca unutar ili u blizini gena, za koji je poželjno da se vezuje egzogeni molekul. Vezivanje može biti u svrhu ciljanog cepanja DNK, ciljane rekombinacije i kombinacije ciljanog cepanja DNK i ciljane rekombinacije. Region od interesa može biti prisutan u hromozomu, epizomu, organelarnom genomu (npr., mitohondrijskom, hloroplastu) ili inficiranom virusnom genomu, na primer. Region od interesa može biti unutar kodirajućeg regiona gena, unutar transkribovanih nekodirajućih regiona kao što su, na primer, vodeće sekvence, trejler sekvence ili introni, ili unutar ne transkribovanih regiona, bilo uzvodno ili nizvodno od kodirajućeg regiona. Region od interesa može biti mali kao jedan par nukleotida ili dužine do 2.000 parova nukleotida, ili bilo koja integralna vrednost nukleotidnih parova.

[0084] „Eukariotske“ ćelije obuhvataju, ali nisu ograničene na, gljivične ćelije (kao što je kvasac), biljne ćelije, životinjske ćelije, ćelije sisara i ljudske ćelije (npr., T-ćelije).

[0085] Termini „operativna veza“ i „operativno vezana“ (ili „operativno povezana“) se koriste naizmenično u odnosu na suprotstavljanje dve ili više komponenti (kao što su elementi sekvence), u kojima su komponente raspoređene tako da obe komponente normalno funkcionišu i dozvoljavaju mogućnost da bar jedna od komponenti može da posreduje u funkciji koja se vrši na najmanje jednoj od ostalih komponenti. Ilustracije radi, transkripciona regulatorna sekvenca, kao što je promoter, je operativno povezana sa sekvencom kodiranja ako transkripciona regulatorna sekvenca kontroliše nivo transkripcije kodirajuće sekvence kao odgovor na prisustvo ili odsustvo jednog ili više regulatornih faktora transkripcije.

Regulatorna sekvenca transkripcije je generalno operativno povezana u cis sa sekvencom kodiranja, ali ne mora biti direktno pored nje. Na primer, pojačivač je transkripciona regulatorna sekvenca koja je operativno povezana sa kodirajućom sekvencom, iako nisu uzastopne.

[0086] Što se tiče fuzionih polipeptida, termin "operativno povezan" može se odnositi na činjenicu da svaka od komponenti obavlja istu funkciju u vezi sa drugom komponentom kao što bi to činila da nije tako povezana. Na primer, u pogledu fuzionog polipeptida u kome je domen koji vezuje ZFP, TALE ili Cas DNK fuzionisan sa aktivacionim domenom, ZFP, TALE ili Cas DNK-vezujući domen i aktivacioni domen su u operativnoj vezi ako, u fuzionog polipeptida, ZFP, deo domena koji se vezuje za Cas DNK je u stanju da veže svoje ciljno mesto, svoje mesto vezivanja i kombinacije svog ciljnog mesta i mesta vezivanja, dok je aktivacioni domen u stanju da pojača ekspresiju gena. Kada je fuzioni polipeptid u kome je domen koji vezuje ZFP, TALE ili Cas DNK fuzionisan sa domenom cepanja, domen koji vezuje ZFP, TALE ili Cas DNK i domen cepanja su u operativnoj vezi ako, u fuzionom polipeptidu, ZFP Deo domena koji se vezuje za, TALE ili Cas može da veže svoje ciljno mesto, mesto vezivanja i kombinacije svog ciljnog mesta i mesta vezivanja, dok je domen cepanja u stanju da cepi DNK u blizini ciljnog mesta.

[0087] „Funkcionalni fragment“ proteina, polipeptida ili nukleinske kiseline je protein, polipeptid ili nukleinska kiselina čija sekvenca nije identična proteinu, polipeptidu ili nukleinskoj kiselini pune dužine, ali zadržava istu funkciju kao i protein pune dužine, polipeptida ili nukleinske kiseline. Funkcionalni fragment može imati više, manje ili isti broj ostataka kao odgovarajući prirodni molekul, može sadržati jednu ili više aminokiselinskih ili nukleotidnih supstitucija i može biti kombinacije koje imaju više, manje ili isti broj ostataka kao odgovarajući nativni molekul i koji sadrži jednu ili više aminokiselinskih ili nukleotidnih supstitucija. Postupke za određivanje funkcije nukleinske kiseline (npr., funkcija kodiranja, sposobnost hibridizacije sa drugom nukleinskom kiselinom) su dobro poznate u tehnici. Slično, postupke za određivanje funkcije proteina su dobro poznate. Na primer, funkcija vezivanja za DNK polipeptida može se odrediti, na primer, pomoću vezivanja filtera, elektroforetskog pomeranja pokretljivosti ili testova imunoprecipitacije. Cepanje DNK se može ispitati gel elektroforezom. Videti Ausubel i dr., supra. Sposobnost proteina da interaguje sa drugim proteinom može se odrediti, na primer, ko-imunoprecipitacijom, dvohibridnim testovima ili komplementacijom, genetskim i biohemijskim.

[0088] "Vektor" je sposoban da prenese sekvence gena na ciljne ćelije. Tipično, "vektorski konstrukt", "ekspresioni vektor" i "vektor za prenos gena" označavaju bilo koji konstrukt nukleinske kiseline sposoban da usmerava ekspresiju gena od interesa i koji može da prenese sekvence gena na ciljne ćelije. Dakle, pojam uključuje kloniranje i ekspresione nosače, kao i

4

integracione vektore.

[0089] Termini „ispitanik“ i „pacijent“ se koriste naizmenično i odnose se na sisare kao što su ljudi i primati koji nisu ljudi, kao i na eksperimentalne životinje kao što su svinje, krave, zečevi, psi, mačke, pacovi, miševi i druge životinje . Shodno tome, termin "ispitanik" ili "pacijent" kako se ovde koristi označava bilo kog pacijenta ili subjekta sisara kome se ili matične ćelije pronalaska mogu primeniti. Ispitanici predmetnog pronalaska uključuju one koji su bili izloženi jednom ili više hemijskih toksina, uključujući, na primer, nervni toksin.

[0090] „Matičnost“ se odnosi na relativnu sposobnost bilo koje ćelije da deluje na način sličan matičnoj ćeliji, tj., stepen toti-, pluri-, multi- ili oligo-potencije i proširenog ili neograničenog samoobnavljanja bilo koje određene matične ćelije mogu imati.

Nukleaze

[0091] Ovde su opisani sastavi, posebno nukleaze, koje su korisne za in vivo cepanje molekula donora koji nosi transgen i nukleaze za cepanje genoma ćelije tako da se transgen integriše u genom na ciljani način. Jedna ili više nukleaza može biti prirodno. Jedna ili više nukleaza mogu biti neprirodne, tj., projektovane u domenu za vezivanje DNK, domenu cepanja i kombinaciji domena koji se vezuje za DNK i domena cepanja. Na primer, domen koji se vezuje za DNK nukleaze koja se javlja u prirodi može da se promeni tako da se vezuje za izabrano ciljno mesto (npr., meganukleaza koja je projektovana da se vezuje za mesto koje se razlikuje od srodnog mesta vezivanja). U drugim aspektima obelodanjivanja, nukleaza sadrži heterologne domene za vezivanje DNK i domene cepanja (npr., nukleaze cinkovog prsta; DNK vezujući proteini domena TAL-efektora; meganukleazni DNK-vezujući domeni sa heterolognim domenima cepanja).

A. DNK-vezujući domeni

[0092] Domen za vezivanje DNK jedne ili više nukleaza koje se koriste za in vivo cepanje, ciljano cepanje genoma ćelije i kombinacije in vivo cepanja i ciljanog cepanja genoma ćelije mogu da sadrže protein cinkovog prsta. Jedan protein cinkovog prsta se sastoji od više domena cinkovih prstiju (npr., 3, 4, 5, 6 ili više domena cinkovog prsta). Svaki domen cinkovog prsta ima oko 30 aminokiselina u dužini koje sadrži beta okret (sadrži dva koordinirajuća ostatka cinka i alfa heliks (koji sadrži dva nepromenljiva koordinirajuća ostatka cinka), koji se drže u određenoj konformaciji koja omogućava vezivanje za proteina u ciljnu sekvencu. Mogu se koristiti kanonski (C2H2) domeni cinkovog prsta koji imaju dva cisteinska (Cys) koordinirajuća ostatka u beta okretu i dva histidin (His) koordinirajuća ostatka cinka u alfa heliksu ili ne kanonski (CH3). Videti, npr., patent SAD br.9,234,187. Heliks za prepoznavanje 7 aminokiselina nalazi se između koordinirajućih ostataka cinka beta zavoja i ostataka koji koordiniraju cink alfa heliksa. Region spirale prepoznavanja je numerisan od -1 do 6 unutar domena cinkovog prsta, a aminokiseline izvan ovog regiona prepoznavanja (i isključujući ostatke za koordinaciju cinka nazivaju se ostacima glavnog lanca).

[0093] Poželjno, protein cinkovog prsta nije prirodno prisutan u tome što je spirala za prepoznavanje projektovana da se vezuje za ciljno mesto izbora. Videti, na primer, Beerli i dr. (2002) Nature Biotechnol.20 :135-141 ; Pabo i dr. (2001) Ann. Rev. Biochem.70 :313-340 ; Isalan i dr. (2001) Nature Biotechnol. 19 :656-660 ; Segal i dr. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12 :632-637 ; Choo i dr. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416; Patente SAD br.

6,453,242; 6,534,261; 6,599,692; 6,503,717; 6,689,558; 7,030,215; 6,794,136; 7,067,317; 7,2 62,054; 7,070,934; 7,361,635; 7,253,273; i Patentnu objavu SAD br.

2005/0064474; 2007/0218528; 2005/0267061.

[0094] Dizajnirani domen za vezivanje cinkovih prstiju može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa prirodnim proteinom cinkovih prstiju. Inženjerski postupci uključuju, ali nisu ograničene na, racionalno projektovanje i različite vrste selekcije.

Racionalni dizajn uključuje, na primer, korišćenje baza podataka koje se sastoje od tripleta (ili četvorostrukih) nukleotidnih sekvenci i pojedinačnih aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta, u kojima je svaki triplet ili četvorostruka nukleotidna sekvenca povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovih prstiju koje vezuju određeni triplet ili četvorostruki niz. Pogledajte, na primer, patente u suvlasništvu u Patente SAD br.6,453,242 i 6,534,261.

[0095] Domeni koji se vezuju za ZFP DNK mogu dalje da sadrže jednu ili više modifikacija na okosnici jednog ili više komponentnih domena cinkovog prsta. Specifičnost ZFP-a za ciljnu DNK sekvencu zavisi od kontakata specifičnih za sekvencu između domena cinkovog prsta i specifičnih baza DNK, posebno između regiona spirale prepoznavanja i ciljnog mesta (obično se svaki heliks prepoznavanja vezuje za ciljno pod mesto od 3 nukleotidi). Pored toga, domeni cinkovog prsta takođe sadrže aminokiselinske ostatke koji učestvuju u nespecifičnim interakcijama sa fosfatima DNK kičme. Elrod-Erickson i dr. ((1996) Structure 4:1171) pokazao je kroz kokristalizaciju proteina cinkovog prsta i njegove srodne DNK mete da postoje specifične aminokiseline sposobne da stupe u interakciju sa fosfatima na kičmi DNK kroz formiranje vodoničnih veza. Proteini cinkovog prsta koji koriste dobro poznatu kičmu Zif268 tipično imaju arginin kao amino terminalni ostatak njihovog drugog lanca blista, koji je takođe drugi položaj karboksil-terminala u odnosu na drugi invarijantni cistein. Ova pozicija se može nazvati (-5) unutar svakog domena cinkovog prsta, pošto je 5. ostatak koji prethodi početku a-heliksa (i pozicija -5 u odnosu na spiralu za prepoznavanje sa brojevima od -1 do 6). Arginin na ovoj poziciji može da stupi u interakciju sa fosfatom na kičmi DNK putem formiranja naelektrisane vodonične veze sa svojom gvanidinijum grupom bočnog lanca. Proteini cinkovih prstiju u kičmi Zif268 takođe često imaju lizin na poziciji koja je 4 amino-terminalna ostatka u odnosu na prvi nepromenljivi cistein. Ova pozicija se može nazvati (-14) unutar svakog prsta, pošto je to 14. ostatak koji prethodi početku a-heliksa za cink prste sa dva ostatka između cisteinskih ostataka koji koordiniraju cistein (i položaj -14 u odnosu na spiralu za prepoznavanje region sa brojevima od -1 do 6). Lizin može da stupi u interakciju sa fosfatom na kičmi DNK putem formiranja naelektrisane vodonične veze posredovane vodom sa svojom amino grupom bočnog lanca. Pošto se fosfatne grupe nalaze duž cele DNK kičme, ova vrsta interakcije između cinkovog prsta i molekula DNK se generalno smatra nespecifičnim za sekvence (J. Miller, Massachusetts Institute of Technology Ph.D. Thesis, 2002).

[0096] Nedavna ispitivanja su postavile hipotezu da nespecifični bočni lanci u kontaktu sa fosfatom u nekim nukleazama takođe mogu predstavljati određenu količinu nespecifičnosti tih nukleaza (Kleinstiver i dr. (2016) Nature 529(7587):490-5; Guilinger i dr. (2014) Nat Meth: 429-435). Istraživači su predložili da ove nukleaze mogu posedovati „višak energije vezivanja DNK“, što znači da nukleaze mogu imati veći afinitet za svoju DNK metu nego što je potrebno za suštinsko vezivanje i cepanje ciljnog mesta. Stoga su učinjeni pokušaji da se smanje katjonski naboji u domenu vezivanja DNK TALE (Guilinger, ibid) ili Cas9 DNK vezujućem domenu (Kleinstiver, ibid) da bi se smanjila energija vezivanja DNK ovih nukleaza, što je rezultiralo povećanom specifičnošću cepanja in vitro. Međutim, dodatna ispitivanja (Sternberg i dr. (2015) Nature 527(7576): 110-113) takođe sugerišu ulogu u pravilnom savijanju i aktivaciji Cas9 domena nukleaze za neke od katjonskih aminokiselina koje su mutirane u Kleinstiver studiji o domenu za vezivanje Cas9 DNK. Dakle, tačna uloga ovih aminokiselina u aktivnosti Cas9 nije poznata.

[0097] Obelodanjene su mutacije aminokiselina unutar ZFP DNK vezujućeg domena („ZFP kičma“) koje mogu da reaguju nespecifično sa fosfatima na kičmi DNK, ali ne sadrže promene u spiralama za prepoznavanje DNK. Obelodanjene su mutacije katjonskih aminokiselinskih ostataka u ZFP kičmi koje nisu potrebne za specifičnost cilja nukleotida. Ove mutacije u ZFP kičmi mogu uključivati: mutiranje ostatka katjonske aminokiseline u ostatak neutralne ili anjonske aminokiseline; ili mutiranje polarnog aminokiselinskog ostatka u neutralni ili nepolarni aminokiselinski ostatak. Mutacije napravljene na poziciji (-5), poziciji (-9), poziciji (-14) i kombinacije mutacija odabranih od mutacija napravljenih na poziciji (-5), poziciji (-9) i poziciji (-14) u odnosu na spirale za vezivanje DNK su poželjne. Cinkov prst može da sadrži jednu ili više mutacija na (-5), (-9), (-14) i kombinacije mutacija odabranih od mutacija na (-5), (-9) i (-14). Jedan ili više cinkovih prstiju u proteinu cinkovih prstiju sa više prstiju može sadržati mutacije u (-5), (-9), (-14) i kombinacije izabrane između (-5), (-9) i (-14). Aminokiseline na (-5), (-9), (-14) i kombinacije izabrane između (-5), (-9) i (-14) (npr. arginin (R) ili lizin (K)) mogu biti mutirane u alanin (A), leucin (L), Ser (S), Asp (D), Glu (E), Tyr (Y) i/ili glutamin (Q).

[0098] U bilo kom od ovih fuzionih polipeptida koji su ovde opisani, ZFP partneri mogu dalje sadržati mutacije u domenu vezivanja DNK cinkovog prsta na (-5), (-9), (-14) pozicijama i kombinacije mutacija izabranih od mutacija na ( -5), (-9) i (-14). Arg (R) na poziciji -5 može da se promeni u Tyr (Y), Asp (D), Glu (E), Leu (L), Gln (K) ili Ala (A). Arg (R) na poziciji (-9) može biti zamenjen sa Ser (S), Asp (D) ili Glu (E). Arg (R) na poziciji (-14) može biti zamenjen sa Ser (S) ili Gln (Q). Fuzioni polipeptidi mogu sadržati mutacije u domenu vezivanja DNK cinkovog prsta gde su aminokiseline na (-5), (-9), (-14) pozicijama i kombinacije mutacija odabranih od mutacija na (-5), (-9), i (-14) se menjaju u bilo koju od iznad navedenih aminokiselina u bilo kojoj kombinaciji.

[0099] Primeri postupaka selekcije, uključujući prikaz faga i dvohibridne sisteme, obelodanjeni su u patenti SAD

5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i GB 2,338,237. Pored toga, opisano je poboljšanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja cinkovog prsta, na primer, u suvlasničkom WO 02/077227.

[0100] Izbor ciljnih lokacija; ZFP-ovi i postupci za projektovanje i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotida koji ih kodiraju) su poznati stručnjacima i detaljno opisani u Patente SAD br.

6,140,081; 5,789,538; 6,453,242; 6,534,261; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,200,759; PC T Objave br. WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197; WO 02/099084; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 i WO 03/016496.

[0101] Skoro svaki veznik (razdelnik) se može koristiti između jedne ili više komponenti domena za vezivanje DNK (npr., cinkovi prsti), između jednog ili više domena koji se vezuju za DNK, između domena koji vezuje DNK i funkcionalnog domena (npr., nukleaza), i između jednog ili više DNK-vezujućih domena i između DNK-vezujućeg domena i funkcionalnog domena. Neograničavajući primeri pogodnih veznika sekvenci uključuju Patente SAD br.8,772,453; 7,888,121; 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949;

i Patentnu objavu SAD brs.2009/0305419; 2015/0064789 i 2015/0132269. Dakle, ovde opisani proteini mogu uključivati bilo koju kombinaciju pogodnih veznika između pojedinačnih komponenti koje vezuju DNK, između domena koji se vezuje za DNK i funkcionalnog domena, ili između jednog ili više domena koji se vezuju za DNK i između domena koji se vezuje za DNK i domena koji se vezuje za DNK i funkcionalni domen sastava opisanih ovde.

B. Domeni cepanja

[0102] Bilo koji pogodan domen cepanja može biti operativno povezan sa DNK-vezujućim domenima kako je ovde opisano da bi se formirala nukleaza. Domen cepanja može biti heterologan domenu koji se vezuje za DNK, na primer domen koji se vezuje za DNK cinkovog prsta i domen cepanja od nukleaze. Heterološki domeni cepanja mogu se dobiti iz bilo koje endonukleaze ili egzonukleaze. Primeri endonukleaza iz kojih može da se izvede domen cepanja uključuju, ali nisu ograničeni na, restrikcione endonukleaze i endonukleaze hominga. Videti, na primer, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; i Belfort i dr. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388. Poznati su dodatni enzimi koji cepaju DNK (npr.. S1 nukleaza; nukleaza mungo pasulja; Dnaza I pankreasa; nikrokokalna nukleaza; HO endonukleaza kvasca; videti takođe Linn i dr. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993). Jedan ili više ovih enzima (ili njihovih funkcionalnih fragmenata) mogu se koristiti kao izvor domena cepanja i polu-domena cepanja.

[0103] Slično, polu-domen cepanja može biti izveden iz bilo koje nukleaze ili njenog dela, kao što je iznad navedeno, koji zahteva dimerizaciju za aktivnost cepanja. Generalno, dva fuziona proteina su potrebna za cepanje ako fuzioni proteini sadrže polu-domena cepanja. Alternativno, može se koristiti jedan protein koji sadrži dva polu-domena cepanja. Dva poludomena cepanja mogu biti izvedena iz iste endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata), ili svaki polu-domen cepanja može biti izveden iz različite endonukleaze (ili njenih funkcionalnih fragmenata). Pored toga, ciljna mesta za dva fuziona proteina su poželjno raspoređena, jedno u odnosu na drugo, tako da vezivanje dva fuziona proteina za njihova odgovarajuća ciljna mesta postavlja polu-domene cepanja u prostornu orijentaciju jedan prema drugom koji omogućava cepanje polu-domena da bi se formirao funkcionalni domen cepanja, npr., dimerizacijom. Dakle, bliske ivice ciljnih mesta mogu biti razdvojene sa 5-8 nukleotida ili sa 15-18 nukleotida. Međutim, bilo koji integralni broj nukleotida ili nukleotidnih parova može intervenisati između dva ciljna mesta (npr., od 2 do 50 parova nukleotida ili više). Generalno, mesto cepanja leži između ciljnih mesta.

[0104] Restrikcione endonukleaze (restrikcioni enzimi) su prisutne u mnogim vrstama i sposobne su da se vezuju za DNK specifično za sekvencu (na mestu prepoznavanja) i da cepaju DNK na ili blizu mesta vezivanja. Određeni restrikcijski enzimi (npr., tip IIS) cepaju DNK na mestima koja su uklonjena sa mesta prepoznavanja i imaju odvojive domene vezivanja i cepanja. Na primer, enzim tipa IIS Fok I katalizuje dvolančano cepanje DNK, na 9 nukleotida sa mesta prepoznavanja na jednom lancu i 13 nukleotida sa mesta prepoznavanja na drugom. Videti, na primer, Patente SAD br.5,356,802; 5,436,150 i 5,487,994; kao i Li i dr. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li i dr. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim i dr. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim i dr. (1994b) J. Biol. Chem.269:31.978-31.982. Prema tome, fuzioni proteini mogu sadržati domen cepanja (ili polu-domen cepanja) od najmanje jednog restrikcionog enzima tipa IIS i jednog ili više domena za vezivanje cinkovog prsta, koji mogu, ali ne moraju biti projektovani.

[0105] Za optimalnu specifičnost cepanja pomoću selektivne (veštačke) nukleaze, poželjno je da se uslovi tako da vezivanje na meti i aktivnost ne budu zasićeni. U uslovima zasićenja - po definiciji - koristi se višak nukleaze u odnosu na ono što je neophodno za postizanje potpune aktivnosti na meti. Ovaj višak ne pruža nikakvu korist na ciljnom nivou, ali ipak može dovesti do povećanog cepanja na mestima van cilja. Za monomerne nukleaze, uslovi zasićenja se mogu lako izbeći izvođenjem jednostavnog ispitivanja odgovora na dozu da bi se identifikovao i izbegao plato zasićenja na krivoj titracije. Međutim, za dimernu nukleazu kao

4

što je ZFN, TALEN ili dCas-Fok, identifikovanje i izbegavanje uslova zasićenja može biti komplikovanije ako su afiniteti vezivanja pojedinačnih monomera različiti. U takvim slučajevima, studija odgovora na dozu koristeći jednostavan odnos nukleaze 1:1 će otkriti samo tačku zasićenja slabijeg vezujućeg monomera. Prema takvom scenariju, ako se, na primer, afiniteti monomera razlikuju za faktor 10, tada će na tački zasićenja identifikovanoj u studiji titracije 1:1, monomer višeg afiniteta biti prisutan u koncentraciji koja je 10 puta veća nego što treba da bude. Rezultujući višak monomera višeg afiniteta može zauzvrat da dovede do povećane aktivnosti van cilja, bez obezbeđivanja bilo kakvog blagotvornog povećanja cepanja na predviđenoj meti, što potencijalno dovodi do sveukupne smanjene specifičnosti za bilo koji dati par nukleaza.

[0106] Primer restrikcionog enzima tipa IIS, čiji je domen cepanja odvojiv od domena vezivanja, je FokI. Ovaj određeni enzim je aktivan kao dimer. Bitinaite i dr. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10570-10575. Shodno tome, za potrebe predmetnog obelodanjivanja, deo Fok I enzima koji se koristi u obelodanjenim fuzionim proteinima smatra se polu-domenom cepanja. Dakle, za ciljano dvolančano cepanje, ciljanu zamenu ćelijskih sekvenci korišćenjem fuzije cinkovog prst-Fok I, i kombinacije ciljanog dvolančanog cepanja i ciljane zamene ćelijskih sekvenci korišćenjem fuzije cink prst-Fok I, dva fuziona proteina, od kojih svaki sadrži FokI polu-domen cepanja, može se koristiti za rekonstituisanje katalitički aktivnog domena cepanja. Alternativno, može se koristiti i jedan polipeptidni molekul koji sadrži domen za vezivanje cinkovog prsta i dva Fok I polu-domena cepanja. Parametri za ciljano cepanje i ciljanu promenu sekvence korišćenjem fuzije cinkovog prst-Fok I navedeni su na drugom mestu u predmetnom obelodanjivanju.

[0107] Domen cepanja ili polu-domen cepanja može biti bilo koji deo proteina koji zadržava aktivnost cepanja, ili koji zadržava sposobnost multimerizacije (npr., dimerizacije) da bi se formirao funkcionalni domen cepanja.

[0108] Primeri restrikcionih enzima tipa IIS opisani su u U.S. Patent No.7,888,121. Dodatni restrikcijski enzimi takođe sadrže odvojive domene vezivanja i cepanja, i oni su obuhvaćeni predmetnim obelodanjivanjem. Videti, na primer, Roberts i dr. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420.

[0109] Domen cepanja može da sadrži jedan ili više projektovanih polu-domena cepanja (koji se takođe nazivaju mutanti domena dimerizacije) koji minimiziraju ili sprečavaju homodimerizaciju, kao što je opisano, na primer, u videti, npr., Patente SAD br.

7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. Ostaci aminokiselina na pozicijama 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 i 538 za sve fluktuacije FokI za sve polu-domene cepanja gde je numerisanje u odnosu na kristalne strukture 1FOK.pdb i 2FOK.pdb (videti Wah i dr. (1997) Nature 388:97-100) koji imaju sekvencu prikazanu ispod: Divlji tip FokI cepanja polu-domena (SEQ ID NO:18) QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVY GYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRY VEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITN CNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF

[0110] Primeri projektovanih polu-domena cepanja FokI koji formiraju obavezne heterodimere uključuju par u kojem prvi polu-domen cepanja uključuje mutacije na aminokiselinskim ostacima na pozicijama 490 i 538 FokI, a drugi polu-domen cepanja uključuje mutacije na aminokiselinskim ostacima 486 i 499.

[0111] Dakle, mutacija na 490 može zameniti Glu (E) sa Lys (K); mutacija na 538 može zameniti Ile (I) sa Lys (K); mutacija na 486 može zameniti Gln (Q) sa Glu (E); a mutacija na poziciji 499 može zameniti Ile (I) sa Lys (K). Konkretno, projektovani polu-domeni cepanja opisani ovde su pripremljeni mutiranjem pozicija 490 (E→K) i 538 (I→K) u jednom poludomenu cepanja da bi se proizveo projektovani polu-domen cepanja označen kao "E490K:I538K" i mutirajuće pozicije 486 (Q→E) i 499 (I→L) u drugom polu-domenu cepanja da bi se proizveo projektovani polu-domen cepanja označen kao "K486E:I499L". Ovde opisani projektovani polu-domeni cepanja su obavezni heterodimer mutanti u kojima je aberantno cepanje preko ZFN homodimera minimizirano ili ukinuto. Videti npr., Patentnu objavu SAD br.2008/0131962. Konstruisani polu-domen cepanja može da sadrži mutacije na pozicijama 486, 499 i 496 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Gln (Q) na poziciji 486 sa Glu (E) ostatkom, ostatak Ile (I) divljeg tipa na poziciji 499 sa Leu (L) ostatkom i ostatak divljeg tipa Asn (N) na poziciji 496 sa Asp (D) ili Glu (E) ostatkom (takođe se naziva " ELD“ i „ELE“ domene). Dizajnirani polu-domen cepanja može da sadrži mutacije na pozicijama 490, 538 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Glu (E) na poziciji 490 sa Lys (K) ostatkom, ostatak Ile (I) divljeg tipa na poziciji 538 sa Lys (K) ostatkom, i ostatak divljeg tipa His (H) na poziciji 537 sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (takođe se pominje kao domene „KKK“ i „KKR“, respektivno). Konstruisani poludomen cepanja može da sadrži mutacije na pozicijama 490 i 537 (numerisane u odnosu na divlji tip FokI), na primer mutacije koje zamenjuju ostatak divljeg tipa Glu (E) na poziciji 490 sa Lys (K) ostatkom i divljeg tipa His (H) ostatak na poziciji 537 sa Lys (K) ostatkom ili Arg (R) ostatkom (koji se takođe nazivaju "KIK" i "KIR" domeni, respektivno. Videti, npr., patent SAD br.7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. Konstruisani polu-domen cepanja može da sadrži mutacije „Sharkey“, „Sharkey“ i kombinacije mutacija „Sharkey“ i „Sharkey“ (videti Guo i dr. (2010) J. Mol. Biol.400(1):96-107).

[0112] Prema tome, polu-domeni cepanja izvedeni iz FokI mogu sadržati mutaciju u jednom ili više aminokiselinskih ostataka kao što je prikazano u SEQ ID NO:18, uključujući mutacije u domenu dimerizacije kao što je iznad opisano; mutacije u katalitičkom domenu, mutacije u drugim aminokiselinskim ostacima kao što su kontaktni ostaci fosfata, i bilo koja kombinacija mutacija odabranih između mutacija u domenu dimerizacije, mutacija u katalitičkom domenu i mutacija u drugim ostacima aminokiselina kao što su kontaktni ostaci fosfata. Mutacije uključuju supstitucije (divljeg tipa aminokiselinskog ostatka sa različitim ostatkom), insercije (jednog ili više aminokiselinskih ostataka), delecije (jednog ili više aminokiselinskih ostataka) i bilo koju kombinaciju mutacija odabranih između supstitucija, umetanja i brisanja. Jedan ili više ostataka 414-426, 443-450, 467-488, 501-502, 521-531 (numerisani u odnosu na SEQ ID NO:18), i bilo koja kombinacija takvih ostataka, mogu biti mutirani pošto su ovi ostaci locirani blizu DNK kičme u molekularnom modelu ZFN vezanog za ciljno mesto opisano u Miller i dr. ((2007) Nat Biotechnol 25:778-784). Jedan ili više ostataka na pozicijama 416, 422, 447, 448 i 525 mogu biti mutirani. Mutacija može da obuhvata supstituciju ostatka divljeg tipa sa drugim ostatkom, na primer serinskim (S) ostatkom. FokI domen cepanja nukleaza opisanih ovde može da sadrži mutaciju domena dimerizacije ELD, mutaciju domena dimerizacije KKR, mutaciju K525S i bilo koju kombinaciju izabranu između mutacije domena dimerizacije ELD ili mutacije domena dimerizacije KKR i mutacije K525S.

[0113] Ovde opisani projektovani domeni cepanja mogu se pripremiti korišćenjem bilo kog pogodnog metoda, na primer, mutagenezom usmerenom na mesto polu-domena divljeg tipa cepanja (Fok I) kao što je opisano u patentima SAD br.

7,888,121; 7,914,796; 8,034,598 i 8,623,618. Štaviše, ovde opisani domeni cepanja mogu biti

4

spojeni sa domenom koji se vezuje za DNK (npr., ZFP) korišćenjem bilo kog pogodnog veznika, uključujući, ali ne ograničavajući se na veznike opisane u Patente SAD br.

9,394,531 i 9,567,609.

[0114] Alternativno, nukleaze se mogu sastaviti in vivo na ciljnom mestu nukleinske kiseline koristeći takozvanu tehnologiju „split-enzime“ (videti, npr. Patentnu objavu SAD br.

2009/0068164). Komponente takvih podeljenih enzima mogu biti eksprimirane ili na odvojenim ekspresionim konstruktima, ili mogu biti povezane u jedan otvoreni okvir čitanja gde su pojedinačne komponente razdvojene, na primer, samo-cepajućim 2A peptidom ili IRES sekvencom. Komponente mogu biti pojedinačni domeni za vezivanje cinkovih prstiju ili domeni vezujućeg domena meganukleaze nukleinske kiseline.

[0115] Nukleaze se mogu testirati na aktivnost pre upotrebe, na primer u hromozomskom sistemu na bazi kvasca kao što je opisano u WO 2009/042163 i 20090068164. Ekspresija nukleaze može biti pod kontrolom konstitutivnog promotera ili inducibilnog promotera, na primer promotera galaktokinaze koji se aktivira (depresuje) u prisustvu rafinoze, galaktoze i kombinacije rafinoze i galaktoze i potiskuje u prisustvu glukoza.

[0116] Nukleaza(e) kao što je ovde opisano može da napravi jedan ili više dvolančanih, jedan ili više jednolančanih preseka i kombinacije jednog ili više dvolančanih i jednog ili više jednolančanih preseka na ciljnom mestu. U određenim aspektima obelodanjivanja, nukleaza sadrži katalitički neaktivan domen cepanja (npr., FokI, Cas protein i kombinacije FokI i Cas proteina). Videti, npr., patent SAD br.9,200,266; 8,703,489 i Guillinger i dr. (2014) Nature Biotech. 32(6):577-582. Katalitički neaktivni domen cepanja može, u kombinaciji sa katalitički aktivnim domenom, delovati kao nikaze da bi napravio jednolančani presek. Zbog toga se dve nikaze mogu koristiti u kombinaciji da bi se napravio dvolančani rez u određenom regionu. Dodatne nikaze su takođe poznate u tehnici, na primer, McCaffery i dr. (2016) Nucleic Acids Res. 44(2):e11. doi: 10.1093/nar/gkv878. Epub 2015 Oct 19.

Ciljana mesta

[0117] Kao što je iznad detaljno opisano, DNK domeni se mogu konstruisati da se vežu za bilo koju sekvencu po izboru. Dizajnirani domen za vezivanje DNK može imati novu specifičnost vezivanja, u poređenju sa domenom za vezivanje DNK koji se javlja u prirodi. Domeni koji se vezuju za DNK mogu da se vežu za sekvencu unutar BCL11A pojačivačke sekvence, na primer za ciljno mesto (obično 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ili čak više parova baza) je između eksona 2 i egzona 3 BCL11A, uključujući domene koji se vezuju za DNK koji se vezuju za sekvencu unutar DNKseI preosetljivog mesta u sekvenci pojačivača BCL11A (npr., 58) kao što je prikazano u Tabeli 1. Inženjerski postupci uključuju, ali nisu ograničene na, racionalno projektovanje i različite vrste selekcije.

Racionalni dizajn uključuje, na primer, korišćenje baza podataka koje se sastoje od tripleta (ili četvorostrukih) nukleotidnih sekvenci i pojedinačnih aminokiselinskih sekvenci cinkovog prsta, u kojima je svaki triplet ili četvorostruka nukleotidna sekvenca povezana sa jednom ili više aminokiselinskih sekvenci cinkovih prstiju koje vezuju određeni triplet ili četvorostruki niz. Vidite, na primer, patente u suvlasništvu u Patente SAD br.6,453,242 i 6,534,261. Može se izvršiti i racionalno projektovanje domena TAL-efektora. Videti npr., Patentnu objavu SAD br.2011/0301073.

[0118] Primeri postupaka selekcije primenljivih na domene koji se vezuju za DNK, uključujući prikaz faga i dvohibridne sisteme, obelodanjeni su u Patente SAD br.

5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; i 6,242,568; kao i PCT Objave br. WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 i U.K. Patent No. GB 2,338,237. Pored toga, opisano je poboljšanje specifičnosti vezivanja za domene vezivanja cinkovog prsta, na primer, u suvlasničkom WO 02/077227.

[0119] Izbor ciljnih lokacija; nukleaze i metode za projektovanje i konstrukciju fuzionih proteina (i polinukleotida koji ih kodiraju) su poznati stručnjacima u ovoj oblasti i detaljno opisani u Patentnu objavu SAD brs.2005/0064474 i 2006/0188987.

[0120] Pored toga, kao što je obelodanjeno u ovim i drugim referencama, domeni koji se vezuju za DNK (npr., proteini cinkovih prstiju sa više prstiju) i fuzije domena koji se vezuju za DNK i funkcionalnih domena mogu biti povezani zajedno korišćenjem bilo koje odgovarajuće sekvence veznika uključujući, na primer, veznike od 5 ili više aminokiselina. Patente SAD br.8,772,453; 7,888,121 (npr., "ZC"

linker); 6,479,626; 6,903,185; i 7,153,949; objava SAD br.2009/0305419) i 2015/0064789. Proteini opisani ovde mogu uključiti bilo koju kombinaciju pogodnih veznika između pojedinačnih domena proteina koji se vezuju za DNK. Videti takođe, patent SAD br.

8,586,526.

Donori

[0121] Predmetno obelodanjivanje se odnosi na ciljanu integraciju egzogene sekvence u

4

genom ćelije posredovanu nukleazama korišćenjem molekula koji se vezuju za region pojačivača BCL11A opisanih ovde. Kao što je iznad navedeno, umetanje egzogene sekvence (takođe nazvane „sekvenca donora“ ili „donor“ ili „transgen“), na primer za deleciju određenog regiona, za korekciju mutantnog gena, za kombinaciju brisanja specificirani region i korekciju mutantnog gena, ili za povećanu ekspresiju gena divljeg tipa. Biće očigledno da donorska sekvenca tipično nije identična genomskoj sekvenci gde je smeštena. Donatorska sekvenca može da sadrži nehomolognu sekvencu okruženu dva regiona homologije kako bi se omogućio efikasan HDR na lokaciji od interesa ili može biti integrisana preko mehanizama popravke koji nisu usmereni na homologiju kao što je NHEJ. Pored toga, donorske sekvence mogu da sadrže vektorski molekul koji sadrži sekvence koje nisu homologne regionu od interesa u ćelijskom hromatinu. Donorski molekul može sadržati nekoliko, diskontinuiranih regiona homologije sa ćelijskim hromatinom, i, na primer, dovesti do delecije regiona pojačivača BCL11A (ili njegovog fragmenta) kada se koristi kao supstrat za popravku DSB indukovanog jednim od nukleaze opisane ovde. Dalje, za ciljano umetanje sekvenci koje nisu normalno prisutne u regionu od interesa, pomenute sekvence mogu biti prisutne u molekulu donora nukleinske kiseline i okružene regionima homologije sa sekvencom u regionu od interesa.

[0122] Polinukleotidi za umetanje se takođe mogu nazvati "egzogeni" polinukleotidi, "donatorski" polinukleotidi ili molekuli ili "transgeni". Donorski polinukleotid može biti DNK ili RNK, jednolančani ili dvolančani, i može se uvesti u ćeliju u linearnom ili kružnom obliku. Videti npr., patentnu prijavu SAD br.2010/0047805 i 2011/0207221. Donorska sekvenca(e) je poželjno sadržana u DNK MC, koja se može uvesti u ćeliju u kružnom ili linearnom obliku. Ako se uvedu u linearnom obliku, krajevi donorske sekvence mogu biti zaštićeni (npr., od egzonukleolitičke degradacije) postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti. Na primer, jedan ili više dideoksinukleotidnih ostataka se dodaju na 3' kraj linearnog molekula i samo komplementarni oligonukleotidi su opciono vezani za jedan ili oba kraja. Videti, na primer, Chang i dr. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA84:4959-4963; Nehls i dr. (1996) Science 272:886-889. Dodatne metode za zaštitu egzogenih polinukleotida od razgradnje uključuju, ali nisu ograničene na, dodavanje terminalne amino grupe(e) i upotrebu modifikovanih internukleotidnih veza kao što su, na primer, fosforotioati, fosforamidati i ostaci O-metil riboze ili deoksiriboze. Ako se uvede u dvolančanom obliku, donor može uključiti jedno ili više ciljnih mesta nukleaze, na primer, ciljna mesta nukleaze koja prate transgen da bi se integrisala u genom ćelije. Videti npr., Patentnu objavu SAD br.

4

[0123] Polinukleotid se može uvesti u ćeliju kao deo vektorskog molekula koji ima dodatne sekvence kao što su, na primer, poreklo replikacije, promoteri i geni koji kodiraju otpornost na antibiotike. Štaviše, donorski polinukleotidi mogu biti uvedeni kao gola nukleinska kiselina, kao nukleinska kiselina u kompleksu sa sredstvom kao što je lipozom ili poloksamer, ili mogu biti isporučeni virusima (npr., adenovirus, AAV, herpesvirus, retrovirus, lentivirus i lentivirus defektni integraze)).

[0124] U određenim otelotvorenjima, dvostruki donor uključuje sekvence (npr., kodirajuće sekvence, koje se takođe nazivaju transgeni) dužine veće od 1 kb, na primer između 2 i 200 kb, između 2 i 10 kb (ili bilo koju vrednost između njih). Dvolančani donor takođe uključuje najmanje jedno ciljno mesto nukleaze, na primer. U određenim otelotvorenjima, donator uključuje najmanje 2 ciljna mesta, na primer za par ZFN ili TALEN. Tipično, ciljna mesta nukleaze su izvan transgenskih sekvenci, na primer, 5' i/ili 3' u odnosu na sekvence transgena, za cepanje transgena. Mesto(a) cepanja nukleaze mogu biti za bilo koju(e) nukleazu(e). U određenim otelotvorenjima, ciljno mesto(a) nukleaze sadržano u dvolančanom donoru su za istu(e) nukleazu(e) koja se koristi za cepanje endogene mete u koju je cepani donor integrisan putem homološki nezavisnih postupaka.

[0125] Donor se generalno ubacuje tako da njegovu ekspresiju pokreće endogeni promoter na mestu integracije, odnosno promoter koji pokreće ekspresiju endogenog gena u koji je donor umetnut (npr., globin, AAVS1, itd.). Međutim, biće očigledno da donor može da sadrži promoter, pojačivač i kombinacije i promotera i pojačivača, na primer konstitutivni promoter ili inducibilni ili tkivno specifičan promoter.

[0126] Donorski molekul može biti umetnut u endogeni gen tako da se ekspresuje sav, neki ili nijedan od endogenih gena. U drugim otelotvorenjima, transgen (npr., sa ili bez sekvenci za kodiranje globina) je integrisan u bilo koji endogeni lokus, na primer lokus bezbedne luke. Videti npr., Patentnu objavu SAD brs.2008/0299580; 2008/0159996 i 2010/00218264.

[0127] Dalje, iako nisu potrebne za ekspresiju, egzogene sekvence mogu takođe uključivati transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promotere, pojačivače, izolatore, unutrašnja mesta ulaska u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide, signale

4

poliadenilacije i njihove kombinacije.

[0128] Transgeni koji se nose na donorskim sekvencama opisanim ovde mogu biti izolovani iz plazmida, ćelija ili drugih izvora korišćenjem standardnih tehnika poznatih u tehnici kao što je PCR. Donatori za upotrebu mogu uključiti različite tipove topologije, uključujući kružnu supernamotanu, kružnu opuštenu, linearnu i slično. Alternativno, oni mogu biti hemijski sintetisani korišćenjem standardnih tehnika sinteze oligonukleotida. Pored toga, donatori mogu biti metilovani ili nemaju metilaciju. Donori mogu biti u obliku bakterijskih ili veštačkih hromozoma kvasca (BAC ili IACs).

[0129] Dvolančani donorski polinukleotidi koji su ovde opisani mogu uključivati jednu ili više ne-prirodnih baza, jednu ili više okosnica i kombinacije jedne ili više ne-prirodnih baza i jedne ili više okosnica. Konkretno, umetanje molekula donora sa metilovanim citozinima može da se izvede korišćenjem postupaka opisanih ovde da bi se postiglo stanje mirovanja transkripcije u regionu od interesa.

[0130] Egzogeni (donorski) polinukleotid može sadržati bilo koju sekvencu od interesa (egzogena sekvenca). Primeri egzogenih sekvenci uključuju, ali nisu ograničeni na bilo koju polipeptidnu kodirajuću sekvencu (npr., cDNK), sekvence promotera, sekvence pojačivača, oznake epitopa, markerske gene, mesta za prepoznavanje enzima cepanja i različite tipove ekspresionih konstrukata. Markerski geni uključuju, ali nisu ograničeni na, sekvence koje kodiraju proteine koji posreduju otpornost na antibiotike (npr., rezistenciju na ampicilin, rezistenciju na kanamicin, rezistenciju na neomicin, otpornost na G418, rezistenciju na puromicin, otpornost na higromicin, rezistenciju na blasticidin), sekvence koje kodiraju obojene ili fluorescentne ili luminescentne proteine (npr., zeleni fluorescentni protein, pojačani zeleni fluorescentni protein, crveni fluorescentni protein, luciferaza) i proteini koji posreduju u povećanom rastu ćelija, amplifikaciji gena (npr., dihidrofolat reduktaza) i kombinacijama poboljšanog rasta ćelija i amplifikacije gena. Epitopske oznake uključuju, na primer, jednu ili više kopija FLAG, His, Myc, tandemsko afinitetno prečišćavanje (TAP), HA, biotinilacioni peptid ili bilo koju detektivnu sekvencu aminokiselina.

[0131] U poželjnom otelotvorenju, egzogena sekvenca (transgen) sadrži polinukleotid koji kodira bilo koji polipeptid čija je ekspresija u ćeliji poželjna, uključujući, ali ne ograničavajući se na antitela, antigene, enzime, receptore (površinske ili nuklearne),

4

hormone, limfokine, citokini, reporterski polipeptidi, faktori rasta i funkcionalni fragmenti bilo kog od iznad navedenih. Kodirajuće sekvence mogu biti, na primer, cDNK.

[0132] Na primer, egzogena sekvenca može da sadrži sekvencu koja kodira polipeptid koji nedostaje ili je nefunkcionalan kod subjekta koji ima genetsku bolest, uključujući, ali ne ograničavajući se na bilo koju od sledećih genetskih bolesti: ahondroplazija, ahromatopsija, nedostatak kisele maltaze, nedostatak adenozin deaminaze (OMIM br.102700), adrenoleukodistrofija, aikardijev sindrom, nedostatak alfa-1 antitripsina, alfa-talasemija, androgena neosetljivost, sindrom neosetljivosti na androgenu, desna hipertenzija, sindrom apertazije, apsertacija, beta-talasemija, sindrom plavog gumenog nevusa, Kanavanova bolest, hronične granulomatozne bolesti (CGD), sindrom mačijeg kašlja, cistična fibroza, Derkumova bolest, ektodermalna displazija, Fankonijeva anemija, fibrodisplazija ossificans progressiva, fragilni X sindrom, galaktozema, Gaucherova bolest, generalizovana ganglija (npr., GM1), hemohromatoza, mutacija hemoglobina C u 6. kodonu beta-globina (HbC), hemofilija, Hantingtonova bolest, Hurlerov sindrom, hipofosfatazija, Klinefelterov sindrom, Krabesova bolest, Langer-Giedionov sindrom, deficijencija leukocita119A adhe2., leukodistrofija, sindrom dugog KT intervala, Marfanov sindrom, Moebiusov sindrom, mukopolisaharidoza (MPS), nokat-patela sindrom, nefrogeni dijabetes insipdius, neurofibromatoza, Neimann-Pickova bolest, osteogenesis imperfecta, porfirija, Prader-Villi sindrom, progerija, Proteusov sindrom, Retinostein-Tabijev sindrom, Retino-Tabijev sindrom, Sanfilipov sindrom, teška kombinovana imunodeficijencija (SCID), Shwachmanov sindrom, bolest srpastih ćelija (anemija srpastih ćelija), Smith-Magenisov sindrom, Sticklerov sindrom, Tai-Sachsova bolest, sindrom odsutnog radijusa trombocitopenije (TAR), Treacher Collinsin sindrom, trizomija, tuberozna skleroza, Tarnerov sindrom, poremećaj ciklusa uree, von Hipel-Landauova bolest, Vardenburgov sindrom, Vilijamsov sindrom, Vilsonova bolest, Wiskott-Aldrich sindrom, X-vezan limfoproliferativni sindrom (XLP, OMIM br.308240).

[0133] Dodatne primere bolesti koje se mogu lečiti ciljanom integracijom uključuju stečene imunodeficijencije, lizozomalne bolesti skladištenja (npr. Gošerova bolest, GM1, Fabrijeva bolest i Tej-Saksova bolest), mukopolisaharidozu (npr. Hanterova bolest, Hurlerova bolest), hemoglobinopatije (npr., bolest, HbC, α-talasemija, β-talasemija) i hemofilije.

[0134] U određenim otelotvorenjima, egzogene sekvence mogu da sadrže marker gen (opisan iznad), omogućavajući selekciju ćelija koje su prošle ciljanu integraciju, i povezanu sekvencu

4

koja kodira dodatnu funkcionalnost. Neograničavajući primeri markerskih gena uključuju GFP, markere za selekciju leka i slično.

[0135] Dodatne sekvence gena koje se mogu umetnuti mogu uključivati, na primer, gene divljeg tipa koji zamenjuju mutirane sekvence. Na primer, sekvenca gena faktora IX divljeg tipa može biti umetnuta u genom matične ćelije u kojoj je endogena kopija gena mutirana. Kopija divljeg tipa može biti umetnuta na endogeni lokus, ili alternativno može biti usmerena na bezbedni lokus.

[0136] Konstrukcija takvih ekspresionih kaseta, prateći učenja ove specifikacije, koristi metodologije dobro poznate u umetnosti molekularne biologije (videti, na primer, Ausubel ili Maniatis). Pre upotrebe ekspresione kasete za generisanje transgene životinje, odziv ekspresione kasete na induktor stresa povezan sa odabranim kontrolnim elementima može se testirati uvođenjem ekspresione kasete u odgovarajuću ćelijsku liniju (npr., primarne ćelije, transformisane ćelije, ili ovekovečene ćelijske linije).

[0137] Štaviše, iako nisu potrebne za ekspresiju, egzogene sekvence mogu takođe transkripcione ili translacione regulatorne sekvence, na primer, promoteri, pojačivači, izolatori, unutrašnja mesta ulaska u ribozom, sekvence koje kodiraju 2A peptide, signale poliadenilacije i kombinacije 2A polipeptida i signala poliadenilacije. Dalje, kontrolni elementi gena od interesa mogu biti operativno povezani sa reporterskim genima da bi se stvorili himerni geni (npr., reporterske ekspresione kasete).

[0138] Može se postići i ciljano umetanje nekodirajuće sekvence nukleinske kiseline.

Sekvence koje kodiraju antisens RNK, RNKi, shRNK i mikro RNK (miRNK) takođe se mogu koristiti za ciljane insercije.

[0139] U dodatnim otelotvorenjima, donorska nukleinska kiselina može da sadrži nekodirajuće sekvence koje su specifična ciljna mesta za dodatne dizajne nukleaze. Nakon toga, dodatne nukleaze mogu biti eksprimirane u ćelijama tako da se originalni molekul donora cepa i modifikuje umetanjem drugog donorskog molekula od interesa. Na ovaj način se mogu generisati reiterativne integracije donatorskih molekula koje omogućavaju slaganje osobina na određenom lokusu od interesa ili na mestu bezbedne luke.

Isporuka

[0140] Nukleaze kao što su ovde opisane (Tabela 1), polinukleotidi koji kodiraju ove nukleaze, donorski polinukleotidi i sastavi koji sadrže proteine, polinukleotide i kombinacije proteina i polinukleotida koje su ovde opisane mogu se isporučiti in vivo ili ex vivo na bilo koji pogodan način.

[0141] Pogodne ćelije uključuju eukariotske (npr., životinjske) i prokariotske ćelije i eukariotske i prokariotske ćelijske linije. Neograničavajući primeri takvih ćelija ili ćelijskih linija generisanih iz takvih ćelija uključuju COS, CHO (npr., CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, VI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr. HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) i perC6 ćelije, kao i ćelije insekata kao što je Spodopterafugiperda (Sf) ili gljivične ćelije kao što su Saccharomyces, Pichia i Schizosaccharomyces. U određenim otelotvorenjima, ćelijska linija je ćelijska linija CHO, MDCK ili HEK293. Pogodne ćelije takođe uključuju matične ćelije kao što su, na primer, embrionalne matične ćelije, indukovane pluripotentne matične ćelije, hematopoetske matične ćelije, neuronske matične ćelije i mezenhimalne matične ćelije.

[0142] Postupci davanja nukleaza kao što je ovde opisano su opisane, na primer, u Patente SAD br.

6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,9 79,539; 7,013,219; i 7,163,824.

[0143] Nukleaze, donorski konstrukti i kombinacije nukleaza i donorskih konstrukata kao što su ovde opisani mogu takođe biti isporučeni korišćenjem vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jedan ili više ZFN(ova), ovde opisanih. Mogu se koristiti bilo koji vektorski sistemi uključujući, ali ne ograničavajući se na, plazmidne vektore, retrovirusne vektore, lentivirusne vektore, vektore adenovirusa, vektore poksvirusa; vektori herpesvirusa i vektori virusa povezani sa adeno, itd. Videti, takođe, Patente SAD br.

6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; i 7,163,824. Štaviše, biće očigledno da bilo koji od ovih vektora može da sadrži jednu ili više sekvenci potrebnih za lečenje. Prema tome, kada se jedna ili više nukleaza i donorski konstrukt uvedu u ćeliju, nukleaze, donorski polinukleotid i kombinacije nukleaza i donorski polinukleotid mogu se nositi na istom vektoru ili na različitim vektorima (DNK MC(s)). Kada se koristi više vektora, svaki vektor može da sadrži sekvencu koja kodira jednu ili više nukleaza, jednu ili

1

više donorskih konstrukcija i kombinacije jedne ili više nukleaza i jedne ili više donorskih konstrukcija. Konvencionalni postupci prenosa gena zasnovane na virusima i ne-virusima mogu se koristiti za uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju nukleaze, donorske konstrukcije i kombinacije nukleaza i donorskih konstrukata u ćelije (npr., ćelije sisara) i ciljna tkiva. Sistemi za isporuku ne virusnih vektora uključuju DNK ili RNK plazmide, DNK MC, golu nukleinsku kiselinu i nukleinsku kiselinu u kompleksu sa nosačem za isporuku kao što je lipozom ili poloksamer. Pogodni ne virusni vektori uključuju vektore nanotakse, uključujući vektore komercijalno dostupne od InCellArt-a (Francuska). Sistemi za isporuku virusnih vektora uključuju DNK i RNK viruse, koji imaju epizomalne ili integrisane genome nakon isporuke u ćeliju. Za pregled in vivo isporuke projektovanih DNK-vezujućih proteina i fuzionih proteina koji sadrže ove vezujuće proteine, pogledajte, npr., Rebar (2004) Expert Opinion Invest. Drugs 13(7):829-839; Rossi i dr. (2007) Nature Biotech. 25(12): 1444-1454 kao i opšte reference za isporuku gena kao što su Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10): 1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada i dr., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Böhm (eds.) (1995); i Yu i dr., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

[0144] Postupci ne virusne isporuke nukleinskih kiselina uključuju elektroporaciju, lipofekciju, mikroinjekciju, biolistiku, virosome, lipozome, imunolipozome, polikation ili konjugate lipid:nukleinska kiselina, golu DNK, veštačke virione, deformaciju membrane i DNK poboljšanu agensom. Sonoporacija pomoću, na primer, sistema Sonitron 2000 (Rich-Mar) takođe može da se koristi za isporuku nukleinskih kiselina.

[0145] Dodatni primeri sistema za isporuku nukleinske kiseline uključuju one koje obezbeđuju Amaka Biosistems (Keln, Nemačka), Makcite, Inc. (Rockville, Merilend), BTX Molecular Deliveri Sistems (Holliston, MA) i Copernicus Therapeutics Inc., (videti na primer US6008336). Lipofekcija je opisana u npr., Patente SAD br.5,049,386; 4,946,787; i 4,897,355) a reagensi za lipofekciju se prodaju komercijalno (npr., Transfectam™ i Lipofectin™). Katjonski i neutralni lipidi koji su pogodni za efikasnu lipofekciju polinukleotida za prepoznavanje receptora uključuju Felgnerove, WO 91/17424, WO

91/16024.

2

[0146] Priprema kompleksa lipid:nukleinska kiselina, uključujući ciljane lipozome kao što su imunolipidni kompleksi, dobro je poznato stručnjaku (videti, npr., Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese i dr., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr i dr., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy i dr., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao i dr., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad i dr., Cancer Res.52:4817-4820 (1992); pat. SAD. Nos.

4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, i 4,946,787). Drugi kompleksi lipid:nukleinska kiselina uključuju one koji sadrže nove katjonske lipide, nove pegilirane lipide i kombinacije novih katjonskih lipida i novih pegiliranih lipida (vidite npr. privremenu patentnu prijavu SAD br.62/432,042 i 62/458,373).

[0147] Dodatni postupci isporuke uključuju upotrebu pakovanja nukleinskih kiselina koje će biti isporučene u EnGeneIC transportna sredstva (EDV). Ovi EDV se specifično isporučuju u ciljna tkiva koristeći bispecifična antitela gde jedan krak antitela ima specifičnost za ciljno tkivo, a drugi za EDV. Antitelo dovodi EDV na površinu ciljne ćelije, a zatim se EDV dovodi u ćeliju endocitozom. Kada uđe u ćeliju, sadržaj se oslobađa (vidite MacDiarmid i dr. (2009) Nature Biotechnology 27(7):643).

[0148] Upotreba sistema zasnovanih na RNK ili DNK virusima za isporuku nukleinskih kiselina koje kodiraju projektovane ZFP, TALE i CRISPR/Cas sisteme koriste prednosti visoko razvijenih procesa za ciljanje virusa na specifične ćelije u telu i prenos virusnog tereta u jezgro. Virusni vektori se mogu davati direktno pacijentima (in vivo) ili se mogu koristiti za lečenje ćelija in vitro i modifikovane ćelije se daju pacijentima (ex vivo). Konvencionalni sistemi zasnovani na virusima za isporuku ZFP uključuju, ali nisu ograničeni na, retrovirusne, lentivirusne, adenovirusne, adeno-povezane vektore virusa vakcinije i herpes simpleksa za transfer gena. Integracija u genom domaćina je moguća sa postupcima prenosa gena za retrovirus, lentivirus i adeno-povezani virus, što često rezultira dugotrajnom ekspresijom umetnutog transgena. Pored toga, primećena je visoka efikasnost transdukcije u mnogim različitim tipovima ćelija i ciljnim tkivima.

[0149] Tropizam retrovirusa može se promeniti ugradnjom stranih proteina omotača, proširujući potencijalnu ciljnu populaciju ciljnih ćelija. Lentivirusni vektori su retrovirusni vektori koji su u stanju da transduciraju ili inficiraju ćelije koje se ne dele i tipično proizvode visoke titre virusa. Izbor sistema za prenos retrovirusnog gena zavisi od ciljnog tkiva.

Retrovirusni vektori se sastoje od cis-delujućih dugih terminalnih ponavljanja sa kapacitetom pakovanja do 6-10 kb strane sekvence. Minimalni LTR sa cis dejstvom su dovoljni za replikaciju i pakovanje vektora, koji se zatim koriste za integraciju terapeutskog gena u ciljnu ćeliju da bi se obezbedila trajna ekspresija transgena. Široko korišćeni retrovirusni vektori uključuju one zasnovane na virusu leukemije miša (MuLV), virusu leukemije majmuna gibona (GaLV), virusu imunodeficijencije Simian (SIV), virusu humane imunodeficijencije (HIV) i njihovim kombinacijama (videti, npr., Buchscher i dr., J. Virol.66:2731-2739 (1992); Johann i dr., J. Virol.66:1635-1640 (1992); Sommerfelt i dr., Virol.176:58-59 (1990); Wilson i dr., J. Virol.63:2374-2378 (1989); Miller i dr., J. Virol.65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700).

[0150] U aplikacijama u kojima se preferira prolazna ekspresija, mogu se koristiti sistemi zasnovani na adenovirusima. Vektori zasnovani na adenovirusima su sposobni za veoma visoku efikasnost transdukcije u mnogim tipovima ćelija i ne zahtevaju ćelijsku deobu. Sa takvim vektorima dobijeni su visoki titar i visoki nivoi ekspresije. Ovaj vektor se može proizvesti u velikim količinama u relativno jednostavnom sistemu. Vektori povezani sa adeno-asociranim virusom („AAV“) se takođe koriste za transdukciju ćelija ciljnim nukleinskim kiselinama, npr., u in vitro proizvodnji nukleinskih kiselina i peptida, i za in vivo i ex vivo procedure genske terapije (videti, npr., West i dr., Virology 160:38-47 (1987); patent SAD br.4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994). Konstrukcija rekombinantnih AAV vektora je opisana u brojnim objavama, uključujući U.S. Pat. No.5,173,414; Tratschin etal., Mol. Cell. Biol.5:3251-3260 (1985); Tratschin, etal., Mol. Cell. Biol.4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); i Samulski etal., J. Virol. 63:03822-3828 (1989).

[0151] Najmanje šest pristupa virusnim vektorima trenutno je dostupno za prenos gena u kliničkim ispitivanjima, koji koriste pristupe koji uključuju komplementaciju defektnih vektora genima umetnutim u pomoćne ćelijske linije da bi se stvorio transdukciono sredstvo.

[0152] pLASN i MFG-S su primeri retrovirusnih vektora koji su korišćeni u kliničkim ispitivanjima (Dunbar i dr., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn i dr., Nat. Med.1:1017-102 (1995); Malech i dr., PNAS 94:2212133-12138 (1997)). PA317/pLASN je bio prvi terapeutski vektor korišćen u ispitivanju genske terapije. (Blaese i dr., Science 270:475-480

4

(1995)). Zapakovana je efikasnost transdukcije od 50% ili više za MFG-S upakovane vektore. (Ellem i dr., Immunol Immunother. 44(1): 10-20 (1997); Dranoff i dr., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997).

[0153] Rekombinantni adeno-asocirani virusni vektori (rAAV) su obećavajući alternativni sistemi za isporuku gena zasnovani na defektnom i ne patogenom virusu tipa 2 adenopovezanom sa parvovirusom. Svi vektori su izvedeni iz plazmida koji zadržava samo AAV 145 bp obrnutih terminalnih ponavljanja koji flankiraju transgensku ekspresionu kasetu. Efikasan transfer gena i stabilna isporuka transgena zbog integracije u genome transdukovane ćelije su ključne karakteristike za ovaj vektorski sistem. (Wagner i dr., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns i dr., Gene Ther.9:748-55 (1996)). Drugi AAV serotipovi, uključujući AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 i AAVrh.10 i bilo koji novi AAV serotip se takođe mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom.

[0154] Rekombinantni adenovirusni vektori sa nedostatkom replikacije (Ad) mogu se proizvesti u visokom titru i lako inficirati brojne različite tipove ćelija. Većina adenovirusnih vektora je projektovana tako da transgen zamenjuje Ad E1a, E1b ili E3 gene; zatim se vektor sa defektom replikacije razmnožava u ljudskim ćelijama 293 koje obezbeđuju funkciju izbrisanog gena u trans. Vektori oglasa mogu da transduciraju više tipova tkiva in

vivo, uključujući ćelije koje se ne dele, diferencirane kao što su one koje se nalaze u jetri, bubrezima i mišićima. Konvencionalni Ad vektori imaju veliki kapacitet nosivosti. Primer upotrebe Ad vektora u kliničkom ispitivanju uključivao je polinukleotidnu terapiju za antitumornu imunizaciju intramuskularnom injekcijom (Sterman i dr., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)). Dodatni primeri upotrebe adenovirusnih vektora za transfer gena u kliničkim ispitivanjima uključuju Rosenecker i dr., Infection 24:15-10 (1996); Sterman i dr., Hum. Gene Ther.9:7 1083-1089 (1998); Welsh i dr., Hum. Gene Ther.2:205-18

(1995); Alvarez i dr., Hum. Gene Ther.5:597-613 (1997); Topf i dr., Gene Ther.5:507-513 (1998); Sterman i dr., Hum. Gene Ther.7:1083-1089 (1998).

[0155] Ćelije za pakovanje se koriste za formiranje virusnih čestica koje su sposobne da inficiraju ćeliju domaćina. Takve ćelije uključuju ćelije HEK293 i Sf9, koje se mogu koristiti za pakovanje AAV-a i adenovirusa, i ps2 ćelije ili PA317 ćelije, koje pakuju retrovirus.

Virusne vektore koji se koriste u genskoj terapiji obično generiše ćelijska linija proizvođača koja pakuje vektor nukleinske kiseline u virusnu česticu. Vektori tipično sadrže minimalne virusne sekvence potrebne za pakovanje i naknadnu integraciju u domaćina (ako je primenjivo), pri čemu se druge virusne sekvence zamenjuju ekspresionom kasetom koja kodira protein koji se ekspresuje. Virusne funkcije koje nedostaju se isporučuju u trans od strane ćelije za pakovanje. Na primer, AAV vektori koji se koriste u genskoj terapiji obično poseduju samo sekvence invertovanog terminalnog ponavljanja (ITR) iz AAV genoma koje su potrebne za pakovanje i integraciju u genom domaćina. Virusna DNK je upakovana u ćelijsku liniju, koja sadrži pomoćni plazmid koji kodira druge AAV gene,

odnosno rep i cap, ali nemaju ITR sekvence. Ćelijska linija je takođe inficirana adenovirusom kao pomoćnikom. Pomoćni virus promoviše replikaciju AAV vektora i ekspresiju AAV gena iz pomoćnog plazmida. Pomoćni plazmid nije upakovan u značajnim količinama zbog nedostatka ITR sekvenci. Kontaminacija adenovirusom može da se smanji, na primer, toplotnom obradom na koju je adenovirus osetljiviji od AAV-a. U nekim otelotvorenjima, AAV se proizvodi korišćenjem sistema ekspresije bakulovirusa

(vidite npr., Patente SAD br.6,723,551 i 7,271,002).

[0156] Prečišćavanje AAV čestica iz sistema 293 ili bakulovirusa obično uključuje rast ćelija koje proizvode virus, nakon čega sledi sakupljanje virusnih čestica iz ćelijskog supernatanta ili liziranje ćelija i sakupljanje virusa iz sirovog lizata. AAV se zatim prečišćava metodama poznatim u tehnici, uključujući hromatografiju za izmenu jona (npr. vidite Patente SAD br.

7,419,817 i 6,989,264), hromatografiju sa izmenom jona i centrifugiranje gustine CsCl (npr. PCT objava WO2011094198A10), purifikacija sa hromatografijom

(npr. WO2016128408) ili prečišćavanje korišćenjem AVB Sepharose (npr. GE Healthcare Life Sciences).

[0157] U mnogim primenama genske terapije, poželjno je da se vektor genske terapije isporučuje sa visokim stepenom specifičnosti na određeni tip tkiva. Shodno tome, virusni vektor može biti modifikovan tako da ima specifičnost za dati tip ćelije ekspresijom liganda kao fuzionog proteina sa proteinom virusnog omotača na spoljnoj površini virusa. Ligand se bira da ima afinitet za receptor za koji je poznato da je prisutan na tipu ćelije od interesa. Na primer, Han i dr., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995), izvestio je da virus mišje leukemije Moloney može biti modifikovan da ekspresuje humani heregulin fuzionisan sa gp70, a rekombinantni virus inficira određene ćelije humanog raka dojke koje eksprimiraju receptor humanog epidermalnog faktora rasta. Ovaj princip se može proširiti na druge parove virus-cilja ćelije, u kojima ciljna ćelija eksprimira receptor, a virus eksprimira fuzioni protein koji sadrži ligand za receptor na površini ćelije. Na primer, filamentni fag se može konstruisati da prikaže fragmente antitela (npr., FAB ili Fv) koji imaju specifičan afinitet vezivanja za praktično bilo koji izabrani ćelijski receptor. Iako se gornji opis odnosi prvenstveno na virusne vektore, isti principi se mogu primeniti i na ne virusne vektore. Takvi vektori se mogu konstruisati da sadrže specifične sekvence preuzimanja koje favorizuju uzimanje od strane specifičnih ciljnih ćelija.

[0158] Vektori genske terapije mogu da se isporuče in vivo davanjem pojedinačnom pacijentu, obično sistemskom primenom (npr., intravenska, intraperitonealna, intramuskularna, subdermalna ili intrakranijalna infuzija) ili lokalnom primenom, kao što je opisano u nastavku. Alternativno, vektori mogu da se isporuče u ćelije ex vivo, kao što su ćelije eksplantirane od pojedinačnog pacijenta (npr., limfociti, aspirati koštane srži, biopsija tkiva) ili univerzalni donator hematopoetskih matičnih ćelija, nakon čega sledi reimplantacija ćelija u pacijenta, obično nakon selekcija za ćelije koje su ugradile vektor.

[0159] Vektori (npr., retrovirusi, adenovirusi, lipozomi, itd.) koji sadrže nukleaze, donorske konstrukcije i kombinacije nukleaza i donorskih konstrukata takođe mogu da se daju direktno organizmu za transdukciju ćelija in vivo. Alternativno, može se primeniti gola DNK. Primena se vrši na bilo koji od puteva koji se obično koriste za uvođenje molekula u krajnji kontakt sa krvlju ili ćelijama tkiva uključujući, ali ne ograničavajući se na, injekciju, infuziju, lokalnu primenu i elektroporaciju. Pogodni postupci za davanje takvih nukleinskih kiselina su dostupni i dobro poznati stručnjacima u ovoj oblasti, i, iako se više od jednog puta može koristiti za davanje određene sastave, određeni put često može obezbediti neposredniju i efikasniju reakciju od druga ruta.

[0160] Vektori pogodni za uvođenje polinukleotida (npr. koji kodiraju nukleazu, dvostruki donori i kombinacije donora koji kodiraju nukleazu i dvostrukih lanaca) opisani ovde uključuju ne integrišuće lentivirusne vektore (IDLV). Videti, na primer, Ory i dr. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull i dr. (1998) J. Virol.72:8463-8471; Zuffery i dr. (1998) J. Virol.72:9873-9880; Follenzi i dr. (2000) Nature Genetics 25:217-222; Patentnu objavu SAD br.2009/0117617.

[0161] Farmaceutski prihvatljivi nosači su delimično određeni posebnim preparatom koji se primenjuje, kao i posebnim postupkom koji se koristi za davanje sastava. Shodno tome, postoji veliki izbor odgovarajućih formulacija farmaceutskih kompozicija koje su dostupne, kao što je opisano u nastavku (videti, npr., Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).

[0162] Biće očigledno da sekvence koje kodiraju nukleazu i donorski konstrukti mogu biti isporučeni korišćenjem istih ili različitih sistema. Na primer, nukleaze i donori mogu da se nose sa istim DNK MC. Alternativno, donorski polinukleotid može biti nošen MC, dok jedna ili više nukleaza može biti nošen standardnim plazmidom ili AAV vektorom. Štaviše, različiti vektori se mogu davati istim ili različitim putevima (intramuskularna injekcija, injekcija u repnu venu, druga intravenska injekcija, intraperitonealno davanje ili intramuskularna injekcija). Vektori se mogu isporučiti istovremeno ili u bilo kom sekvencijalnom redosledu.

[0163] Dakle, trenutno obelodanjivanje uključuje in vivo ili ex vivo lečenje bolesti i stanja koja su podložna umetanju transgena koji kodiraju terapeutski protein. Sastavi se daju ljudskom pacijentu u količini efikasnoj da se dobije željena koncentracija terapeutskog polipeptida u serumu ili ciljnom organu ili ćelijama. Davanje može biti na bilo koji način na koji se polinukleotidi isporučuju u željene ciljne ćelije. Na primer, razmatraju se i postupci in vivo i ex vivo. Intravenska injekcija u portalnu venu je poželjan postupak davanja. Drugi in vivo načini davanja uključuju, na primer, direktnu injekciju u režnjeve jetre ili bilijarni kanal i intravensku injekciju distalno od jetre, uključujući kroz hepatičnu arteriju, direktnu injekciju u parenhim jetre, injekciju preko hepatične arterije, i retrogradna injekcija kroz bilijarno stablo. Ex vivo načini primene uključuju transdukciju in vitro reseciranih hepatocita ili drugih ćelija jetre, nakon čega sledi infuzija transdukovanih, reseciranih hepatocita nazad u vaskulaturu portala, parenhim jetre ili bilijarno stablo ljudskog pacijenta,

videti npr., Grossman i dr., (1994) Nature Genetics, 6:335-341.

[0164] Efikasna količina nukleaze(a) i donora koji će se primeniti će varirati od pacijenta do pacijenta iu skladu sa terapijskim polipeptidom od interesa. Shodno tome, efikasne količine najbolje određuje lekar koji primenjuje sastave, a odgovarajuće doze može lako da odredi neko od uobičajenih veština u ovoj oblasti. Nakon što se ostavi dovoljno vremena za integraciju i ekspresiju (obično 4-15 dana, na primer), analiza nivoa seruma ili drugih tkiva u terapijskom polipeptidu i poređenje sa početnim nivoom pre davanja će utvrditi da li je količina koja se primenjuje preniska, u pravom opsegu ili previsoko. Pogodni režimi za početnu i naknadnu administraciju su takođe promenljivi, ali su tipični za početno davanje praćenu naknadnim davanjem ako je potrebno. Naredna davanja se mogu davati u promenljivim intervalima, u rasponu od dnevnog do godišnje do svakih nekoliko godina. Stručnjak u ovoj oblasti će ceniti da se odgovarajuće imunosupresivne tehnike mogu preporučiti da bi se izbegla inhibicija ili blokada transdukcije imunosupresijom vektora isporuke, videti npr., Vilquin i dr., (1995) Human Gene Ther., 6:1391-1401.

[0165] Formulacije za ex vivo i in vivo davanje uključuju suspenzije u tečnim ili emulgovanim tečnostima. Aktivni sastojci se često mešaju sa ekscipijensima koji su farmaceutski prihvatljivi i kompatibilni sa aktivnim sastojkom. Pogodni ekscipijensi uključuju, na primer, vodu, fiziološki rastvor, dekstrozu, glicerol, etanol ili slično, i njihove kombinacije. Pored toga, sastav može da sadrži manje količine pomoćnih supstanci, kao što su agensi za vlaženje ili emulgovanje, pH puferski agensi, stabilizatori ili drugi reagensi koji poboljšavaju efikasnost farmaceutskog sastava.

Ćelije

[0166] Ovde su takođe opisane ćelije i ćelijske linije u kojima je endogena sekvenca pojačivača BCL11A modifikovana ovde opisanim nukleazama (Tabela 1). Modifikacija se može, na primer, uporediti sa sekvencom divljeg tipa ćelije. Ćelije ili ćelijske linije mogu biti heterozigotne ili homozigotne za modifikaciju. Modifikacije sekvence BCL11A mogu da sadrže indele.

[0167] Modifikacija je poželjno na ili blizu mesta vezivanja nukleaze, mesta cepanja i kombinacije mesta vezivanja i mesta cepanja, na primer, unutar 1-300 (ili bilo koje vrednosti između njih ) parovi baza uzvodno ili nizvodno od mesta cepanja, poželjnije unutar 1-100 parova baza (ili bilo koje vrednosti između njih) bilo koje strane vezivnog mesta, mesta cepanja ili mesta vezivanja i mesto cepanja, još poželjnije u okviru 1 do 50 parova baza (ili bilo koje vrednosti između njih) sa obe strane vezivnog mesta, mesta cepanja ili mesta vezivanja i mesta cepanja. U određenim otelotvorenjima, modifikacija je na ili blizu regiona "+58" BCL11A pojačivača, na primer, na ili blizu mesta vezivanja nukleaze prikazanog u bilo kojoj od prve kolone Tabele 1.

[0168] Bilo koja ćelija ili ćelijska linija može biti modifikovana, na primer matična ćelija, na primer embrionalna matična ćelija, indukovana pluripotentna matična ćelija, hematopoetska matična ćelija, neuronska matična ćelija i mezenhimska matična ćelija. Drugi neograničavajući primeri ćelija kao što su ovde opisani uključuju T-ćelije (npr., CD4+, CD3+, CD8+, itd.); dendritične ćelije; B-ćelije. Potomak matične ćelije, uključujući delimično ili potpuno diferenciranu ćeliju, takođe je obezbeđen (npr., prekursorska ćelija RBC ili RBC). Neograničavajući primeri uključuju druge ćelijske linije uključujući modifikovanu BCL11A sekvencu CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, VI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293 (npr., HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) i perC6 ćelije, kao i ćelije insekata kao što je Spodopterafugiperda (Sf) ili gljivične ćelije kao što su Saccharomyces, Pichia i Schizosaccharomyces.

[0169] Ćelije kao što su ovde opisane su korisne u lečenju ili prevenciji poremećaja, na primer, ex vivo terapijama. Ćelije modifikovane nukleazom mogu se proširiti i zatim ponovo uvesti u pacijenta primenom standardnih tehnika. Videti npr., Tebas i dr. (2014) New Eng J Med 370(10):901. U slučaju matičnih ćelija, nakon infuzije subjektu, in vivo diferencijacija ovih prekursora u ćelije koje eksprimiraju funkcionalni transgen takođe se javlja.

Farmaceutskih sastava koji sadrže ćelije kao što su ovde opisane su takođe opisane. Pored toga, ćelije se mogu kriokonzervirati pre davanja pacijentu.

[0170] Bilo koja od ovde obelodanjenih modifikovanih ćelija ili ćelijskih linija može pokazati povećanu ekspresiju gama globina. Sastavi kao što su farmaceutski sastavi koje sadrže genetski modifikovane ćelije kao što su ovde opisane su takođe opisani.

Primene

[0171] Postupci i sastavi koji su ovde obelodanjeni su za modifikovanje ekspresije proteina, ili korekciju aberantne sekvence gena koja kodira protein eksprimiran u genetskoj bolesti, kao što je bolest srpastih ćelija ili talasemija. Prema tome, postupci i sastavi obezbeđuju lečenje ili prevenciju takvih genetskih bolesti. Uređivanje genoma, na primer matičnih ćelija, može se koristiti za korekciju aberantnog gena, umetanje gena divljeg tipa ili promenu ekspresije endogenog gena. Kao neograničavajući primer, gen divljeg tipa, npr. koji kodira najmanje jedan globin (npr., α globin, γ globin, β globin i njihove kombinacije), može se umetnuti u ćeliju (npr., u endogenu sekvencu pojačivača BCL11A pomoću jedne ili više nukleaza kao što je ovde opisano) da bi se obezbedili globinski proteini nedostatak ili nedostatak u ćeliji i na taj način lečiti genetsku bolest, npr., hemoglobinopatiju, uzrokovanu pogrešnom ekspresijom globina. Alternativno ili kao dodatak, genomsko uređivanje sa ili bez davanja odgovarajućeg donora, može ispraviti neispravan endogeni gen, npr., ispravljanje tačkaste mutacije u α- ili β-hemoglobinu, da bi se obnovila ekspresija gena ili lečila genetska bolest, npr. bolest srpastih ćelija, nokautiranje ili izmena (preterana ekspresija ili represija) bilo kog direktnog ili indirektnog regulatornog gena globina (npr. inaktivacija gena koji reguliše γ globin BCL11A ili BCL11A-regulatora KLF1). Konkretno, sastavi pronalaska imaju primenu u lečenju ili prevenciji hemoglobinopatija.

[0172] Nukleaze pronalaska su usmerene na region pojačivača BCL11A, za koji se zna da je potreban za ekspresiju BCL11A tokom eritropoeze, a samim tim i za smanjenje ekspresije gama globina. Modifikacija ovog regiona pojačivača može dovesti do eritrocita sa povećanom ekspresijom gama globina, i stoga može biti od pomoći za lečenje ili prevenciju bolesti srpastih ćelija ili beta talasemije.

[0173] Sledeći Primeri se odnose na primere otelotvorenja predmetnog obelodanjivanja u kojima nukleaza sadrži nukleazu cinkovog prsta (ZFN). Razumljivo je da je ovo samo u svrhu ilustracije i da se mogu koristiti i druge nukleaze, na primer TtAgo i CRISPR/Cas sistemi, endonukleaze (meganukleaze) sa konstruisanim domenima koji vezuju DNK, fuzije prirodno nastalih inženjering endonukleaza ( meganukleaze) domeni koji se vezuju za DNK, uključujući kombinacije homing endonukleaza (meganukleaza) sa projektovanim domenima za vezivanje DNK i fuzije prirodno nastalih inženjerskih endonukleaza (meganukleaza) DNK-vezujućih domena, i heterolognih domena cepanja proteina meganukleaze i domena meganukleaza uključujući kombinacije heterolognih domena cepanja i fuzije meganukleaza i TALE proteina.

PRIMERI

Primer 1: Sastavljanje nukleaza cinkovih prstiju

[0174] ZFN su sastavljeni protiv humanog BCL11A gena i aktivnost je testirana analizom dubokog sekvenciranja DNK izolovane iz transficiranih ćelija kao što je opisano u nastavku. ZFN specifični za 58 region regiona pojačivača su napravljeni kako je opisano. ZFN par 51857/51949 je prethodno opisan (videti WO 2016/183298).

Primer 2: Analiza van cilja

[0175] Da bi se analiziralo odvajanje cilja od strane ZFN parova, izvršena je dvostepena nepristrasna analiza specifičnosti. U prvoj fazi, (Slika 1), kandidati van ciljanih mesta za svaki ZFN su identifikovani putem analize mesta integracije oligonukleotidnog dupleksa korišćenjem procedure slične onoj koju su opisali Tsai i dr. ((2015), Nat Biotechnol 33(2): 187-197. doi: 10.1038/nbt.3117).

1

[0176] Test mesta integracije dupleksa oligonukleotida zasniva se na zapažanju da zajedničko uvođenje nukleaze i kratkog segmenta dupleks DNK u ciljnu ćeliju dovodi do dpleks integracije tokom popravke dela događaja cepanja genoma putem NHEJ puta popravke DNK (Orlando i dr., (2010), Nucleic Acids Res, 38(15) e152. doi: 10.1093/nar/gkq512; Gabriel i dr., (2011), Nat Biotechnol.2011 Aug 7;29(9):816-23. doi: 10.1038/nbt.1948; Tsai i dr., ibid). Nakon integracije, dupleks obezbeđuje trajnu oznaku događaja cepanja. Mesta integracije se zatim identifikuju ligacijom oligonukleotidnog adaptera na isečenu genomsku DNK, nakon čega slede 2 kruga od 25 ciklusa ugnežđenog PCR-a i duboko sekvenciranje rezultujućih spojeva donor-genom. Ovaj test omogućava procenu svih potencijalnih mesta integracije unutar genoma.

[0177] Test na mestu integracije je izveden u ćelijama K562 da bi se maksimizirala isporuka donora, ekspresija ZFN i integracija donora. Štaviše, pošto se ćelije K562 brzo dele (vreme udvostručenja približno 24 sata), očekuje se da će nametnuti minimalna epigenetska ograničenja na sposobnost ZFN-a da cepa ćelijske mete. Ćelije (2 x 10<5>) su elektroporisane sa 0,47 µg oligonukleotidnog dupleks donora i 400 ng svake mRNK koja kodira ZFN korišćenjem Amaxa šatla i podešavanja optimizovanih za maksimalnu aktivnost ZFN na meti. Pripremljena su četiri replika uzorka za svaku kombinaciju oligo i mRNK. Dana 7 nakon transfekcije, genomska DNK je izolovana za svaki uzorak (Kiagen DNeasi komplet za krv i tkivo) i 400 ng (133000 haploidnih genoma) je korišćeno kao ulaz za protokol amplifikacije prikazan na Slici 1. Uzorci su zatim obrađeni u suštini kako je opisano (Tsai i dr. ibid). Finalni proizvodi su objedinjeni, kvantifikovani i sekvencionirani na MiSeq instrumentu (Illumina) korišćenjem kompleta za sekvencioniranje v2300 ciklusa sa uparenim krajevima čitanja od 150 bp i čitanjima dvostrukog indeksa od 8 bp/16 bp da bi se otkrili uzorci bar kodova na svakom kraju amplikona.

[0178] Da bi se generisala lista kandidata van ciljnih mesta, podaci o sekvenciranju su filtrirani za ispravnu sekvencu prajminga, nakon čega je usledilo sečenje sekvenci adaptera i mapiranje u genom. Zatim su mapirane koordinate spoja, a spoj dupleks-genoma, kao i položaj preloma izazvanog smicanjem DNK, korišćeni su za identifikaciju različitih događaja integracije. Događaji integracije su zatim obrađeni da bi se identifikovali klasteri integracija u neposrednoj blizini unutar genoma (najmanje 4 različita integraciona događaja unutar 100bp jedan od drugog, zbranih u svim replikama). Klasteri koji se nalaze na kontigovima koji nisu

2

mogli da se mapiraju u sklopu hg38 (tj. chrUn u hg38) su uklonjeni iz dalje analize. Klasteri koji se mapiraju u ponavljajuće lokuse (medijan od tri ili više pogodaka u genom u svim sekvencama u klasteru) su takođe uklonjeni pošto je prethodno iskustvo pokazalo da su to artefakti amplifikacije. Preostali klasteri su ocenjeni kao kandidati za ZFN mesta cepanja ako su izvedeni iz najmanje 2 replicirana uzorka tretirana ZFN (od ukupno 4) i pokazuju ≥ 5 puta višak integracijskih događaja u uzorcima tretiranim ZFN u odnosu na kontrole. Kandidatna mesta cepanja su rangirana prema ukupnom broju jedinstvenih integracija u uzorcima tretiranim ZFN. Lokusi kandidata identifikovani ovom analizom su dati na Slici 2 za ZFN par 51857/51949, rangirani prema broju integranata.

Primer 3: Optimizacija ZFN-a

[0179] Da bi se smanjilo cepanje van cilja, strategija za optimizaciju nukleaza u kojoj se nespecifični fosfatni kontakti selektivno uklanjaju kako bi se došlo do globalne supresije cepanja van cilja (Guilinger i dr. (2014) Nat Methods.11(4):429-35. doi:

10.1038/nmeth.2845; Kleinstiver i dr. (2016) Nature 529(7587):490-5. doi:

10.1038/nature16526; Slaymaker i dr. (2016) Science) 351(6268):84-8. doi:

10.1126/science.aad5227) je usvojeno (videti privremenu patentnu prijavu SAD br.

62/443,981 i 62/378,978). Zamene aminokiselina su napravljene na ključnoj poziciji unutar okvira cinkovog prsta koji je u interakciji sa fosfatnom kičmom DNK (Pavletich and Pabo, (1991) Science 252(5007):809-17; Elrod-Erickson i dr. (1996) Structure 4(10): 1171-80) (Slika 3A-3B), kao i na jednoj poziciji u desnom ZFN FokI domenu takođe je predviđeno da napravi fosfatni kontakt (Slika 3C).

[0180] Specifičnost je dodatno poboljšana omogućavanjem nezavisne ekspresije svakog ZFN-a iz dve odvojene mRNK, što omogućava optimizaciju odnosa isporuke. Ovi napori su dali optimizovane parove ZFN koji su veoma povezani sa originalnim, koji se razlikuju po supstitucijama koje smanjuju energiju interakcije sa DNK fosfatnom kičmom, ali koje minimalno ili ne utiču na prepoznavanje baze specifičnog za sekvencu. U skladu sa ovim, test na mestu integracije dao je 455 lokusa za potencijalne mete ZFN cepanja za originalni par 51857/51949. Za optimizovani par, ovom analizom je identifikovan mnogo manji broj lokusa za dalje ispitivanje kao potencijalne mete cepanja ZFN (ukupno 72). Za oba para, nameravana meta u okviru BCL11A pojačivača je bila najbolje rangirani lokus. Štaviše, mnogo veći deo integracionih događaja je zabeležen kod BCL11A pojačivača za optimizovani par, u skladu sa njegovom većom specifičnošću.

[0181] Važno je napomenuti da su u definisanju cevovoda za obradu podataka sekvence, ključni parametri izabrani konzervativno, da bi se pogrešilo uključivanjem što većeg broja kandidata van ciljnih lokusa umesto njihovog filtriranja. Ovo je urađeno kako bi se osiguralo da svaki lokus koji bi mogao predstavljati verodostojno mesto cepanja za optimizovane ZFN-e bude identifikovan i testiran u naknadnim indel ispitivanjima, čak i po cenu prihvatanja mnogo većeg broja koji bi postao lažno pozitivni. Očekivalo se da će prva faza analize dati veliki skup kandidata lokusa za svaki ZFN par, od kojih velika većina (posebno za optimizovane ZFN) neće predstavljati istinska mesta cepanja van cilja, već pozadinske događaje koji bi dokazali negativan na cepanje u naknadnim indel ispitivanjima.

[0182] U drugoj fazi analize, kandidati van ciljanih lokusa identifikovani putem testa na mestu integracije su pregledani za dokaze modifikacije (npr., prisustvo indela) u CD34+ HSPC tretiranom ZFN-om.

[0183] Konkretno, humani CD34+ HSPC izveden iz mobilisane periferne krvi tretiran je originalnim i optimizovanim parovima ZFN koristeći kliničku skalu i kliničke uslove za transfekciju RNK (120 µg/mL mRNK za originalni ZFN par i 100 µg/mL mRNK za optimizovani par). Genomska DNK je izolovana 2 dana nakon transfekcije, nakon čega je usledila PCR amplifikacija kandidata van ciljanih lokusa i duboko sekvenciranje da bi se kvantifikovali nivoi indela. I za originalne i za optimizovane ZFN parove, isti skup od 137 kandidata van ciljanih lokusa je pregledan u ovom koraku, zajedno sa manjim brojem kandidata van ciljanih mesta koja su identifikovana drugim postupcima u ranijim ispitivanjima sa originalnim ZFN-ovima.

[0184] Rezultati su pokazali da su optimizovani ZFN-ovi znatno specifičniji od originalnog para. Ovo je očigledno ne samo iz broja lokusa koji su pozitivno ocenjeni za dokaz cepanja ZFN (52 za originalni par naspram 3 za optimizovani par), već i iz uočenih nivoa indela, koji su za optimizovani par bili mnogo niži. Slika 4 prikazuje dijagrame vrednosti indela na svakom lokusu koji pokazuju dokaze cepanja ZFN u ovom ispitivanju (obratite pažnju na log skalu y ose). Agregiranje indela van cilja u svim takvim lokusima ukazuje na smanjenje aktivnosti van cilja od 300 puta (46,5% ukupnih indela van cilja za originalni par, naspram 0,15% indela van cilja za optimizovani par). Ovo smanjenje aktivnosti van cilja je postignuto bez ikakvog gubitka aktivnosti na predviđenom ciljnom mestu (72,5% indela za originalni par naspram 81,9% za optimizovane ZFN). U ovim ispitivanjima, originalni par (ili

4

roditeljski par) je bio 51857/51949, dok je optimizovani ZFN par bio 63014/65722 (vidi dole).

[0185] Dizajni nukleaze su prikazani ispod u Tabeli 1:

Tabela 1: ZFN parovi specifični za 58 BCL11A region pojačivača

[0186] Tabela 1 pokazuje karakteristike informacija koje se odnose na svaki ZFN. Počevši sa leve strane, SBS broj (npr. 51857) se prikazuje sa DNK metom za koju se ZFN vezuje prikazanom ispod SBS broja. Sledeće su prikazani dizajni spirale za prepoznavanje aminokiselina za prste 1-6 ili 1-5 (podeljena kolona 2 u Tabeli 1). U Tabeli 1 pod odgovarajućim dizajnom heliksa prikazane su i mutacije napravljene na sekvencama kičme ZFP navedenog prsta, kao što je opisano u privremenim patentnim prijavama SAD br.

62/378,978 i 62/443,981. U oznakama koje se koriste u tabeli 1, „Qm5“ znači da je na poziciji minus 5 (u odnosu na spiralu koja je numerisana od -1 do 6) naznačenog prsta, arginin na ovoj poziciji zamenjen glutaminom (Q) , dok „Qm14“ znači da je arginin (R) koji je normalno prisutan na poziciji minus 14 zamenjen glutaminom (Q). „Ništa“ označava da nema promena izvan regiona spirale prepoznavanja. Tako, na primer, SBS# 63014 uključuje mutaciju Qm5 u prstima 1, 3 i 5, dok prsti 2, 4 i 6 nemaju mutacije na kičmi cinkovog prsta (npr., sekvenca cinkovog prsta izvan regiona spirale prepoznavanja).

[0187] Konačno, krajnja desna kolona Tabele 1 prikazuje linker koji se koristi za povezivanje domena za vezivanje DNK sa domenom cepanja FokI (npr., „L7c5“ (LRGSISRARPLNPHP (SEQ ID NO:5), kao što je opisano na primer u patentu SAD br.9,567,609) je prikazan u gornjem redu kolone, sa mestima kontaktnih mutacija FokI fosfata i mutacija dimerizacije prikazanim u polju ispod oznake veznika. Konkretno, na gornjoj liniji okvira Fok mutanti označena je vrsta mutacije koja se nalazi u domenu dimerizacije (npr., ELD ili KKR kao što je opisano na primer u U.S. Patent No.8,962,281). Ispod oznaka dimerizacionih mutanata prikazane su sve mutacije prisutne u FokI domenu napravljene da bi se uklonio nespecifičan fosfatni kontakt prikazan na dnu (npr. K525S ili R416S gde su serinski ostaci na pozicijama amino kiselina 525 ili 416 zamenjeni lizinom ili arginin, kao što je opisano u privremenim patentnim prijavama SAD br.62/378,978 i 62/443,981). Tako, na primer, u SBS# 63014, veznik je L7c5 veznik i FokI domen cepanja uključuje mutante ELD dimerizacije i bez mutacija u kontaktu sa fosfatom. Dalje, za SBS# 65722, linker je L0 linker (LRGSQLVKS (SEQ ID NO:6), koji se takođe naziva 'standardni' veznik, pogledajte U.S. Patent No.

9,567,609) i FokI domen cepanja uključuje KKR dimerizacione mutacije i K525S FokI kontaktnu mutaciju fosfata.

[0188] Svi ZFN su testirani na funkcionalnost (aktivnost cepanja koja je određena ispitivanjem za indele kao što je opisano u Primeru 4 ispod) i utvrđeno je da su aktivni.

[0189] Štaviše, da bi se utvrdilo koji su ZFN dizajni bili najspecifičniji, izvršene su indel analize poznatih mesta cepanja van cilja originalnog para ZFN u CD34+ HSPC tretiranom ZFN-om. Da bi se ovo postiglo, humani CD34+ HSPC dobijeni iz mobilisane periferne krvi tretirani su originalnim i optimizovanim parovima ZFN koristeći kliničke uslove i koncentracije mRNK (120 µg/mL za originalni ZFN par i 100 µg/mL za optimizovani par). Genomska DNK je izolovana 2 dana nakon transfekcije iz ovih ćelija i netretiranih kontrola, nakon čega je usledila PCR amplifikacija svakog kandidata lokusa i duboko sekvenciranje da bi se kvantifikovali nivoi indela.

[0190] Nivoi modifikacije na svakom lokusu određeni su dubokim sekvenciranjem uparenih krajeva na Illumina MiSeq-u korišćenjem kertridža od 300 ciklusa. Uparene sekvence su spojene, adapter isečen preko SeqPrep-a filtriran za rezultat kvaliteta od ≥15 na svim bazama, a zatim mapiran u ljudski genom (hg38 sklop). Sekvence koje su mapirane na netačan lokus su odbačene. Sekvence kraće od amplikona divljeg tipa za >70 bp ili >70% su uklonjene da bi se minimizirali proizvodi prajmera-dimera. Needleman-Wunsch poravnanje (Needleman and Wunsch, (1970), J Mol Biol 48(3):443-53)) je izvedeno između ciljnog amplikona i svakog MiSeq očitanog za mapiranje indela. Indeli u poređanim sekvencama su definisani kao što je opisano u Gabriel i dr.2011. (ibid), osim što su indeli dužine 1bp takođe prihvaćeni kako bi se izbeglo potcenjivanje stvarnih događaja. Imajte na umu da se deo lokusa ili nije amplifikovao ili nije sekvencirao, ili je odbijen iz analize zbog velike pozadine (>1% modifikacije u kontrolnim uzorcima) ili nedovoljne dubine sekvenciranja (<10000 čitanja). Rezultati ove analize i poređenja sa 'matičnim' parom 51857/51949 ZFN dati su ispod u Tabeli 2.

Tabela 2: Analiza cepanja van cilja

Primer 4: Aktivnost ZFN-a u humanim CD34+ ćelijama

[0191] Za in vitro testiranje, nukleaze su testirane u CD34+ ćelijama. ZFN-i su isporučeni kao mRNK, gde su mRNK napravljene in vitro na sledeći način: plazmidi koji sadrže gene koji kodiraju ZFN su linearizovani i koriste se za in vitro transkripciju mRNK pomoću mMessage mMachine® T7 Ultra kompleta (Ambion/Applied Biosystems). mRNK je zatim prečišćena korišćenjem RNeasy® mini kita (Qiagen).

[0192] CD34+ ćelije su izolovane iz mobilisane periferne krvi i održavane u medijumu X-VIVO 10 sa dodatkom penicilina, streptomicina i glutamina kao i StemSpan CC110 i inkubirane na 37°C i 5% CO2. Ćelije su transfektovane 48 sati nakon izolacije ili posle odmrzavanja. Mali alikvot je pomešan 1:1 sa rastvorom tripan plavog 0,4% (w/v) u PBS (Corning) i brojevi ćelija su određeni na TC20 automatizovanom brojaču ćelija (Bio-Rad).

[0193] Za transfekcije velikih razmera, ćelije su isprane MaxCyte puferom za elektroporaciju (Maxcyte) i ponovo suspendovane u količini od 3 do 5e7 ćelija po mL u puferu za elektroporaciju u 100 µL. Obično su koncentracije mRNK između 60 µg/mL i 120 µg/mL korišćene za skrining kandidata ZFN skupova. Ćelije su zatim uzgajane u medijumu za rast pri 3e6 ćelija po mL tokom 18 sati na 30°C, a zatim razblažene do 1e6 ćelija po mL dodatnih 24 sata na 37°C. Za određivanje aktivnosti cepanja, genomska DNK je izolovana 2-3 dana nakon transfekcije, a nivo modifikacije gena na lokusu pojačivača BCL11A meren je dubokim sekvenciranjem na MiSeq sekvenceru (Illumina).

[0194] ZFN parovi iz tabele 1 su testirani u CD34+ ćelijama i rezultati aktivnosti su prikazani u Tabeli 3.

Tabela 3: Aktivnost ZFN parova prema BCL11A cilju

[0195] Pored analize aktivnosti nukleaze u CD34+ ćelijama pre diferencijacije eritroida, uređene ćelije su takođe diferencirane in vitro u eritroidne ćelije. Protokol koji je sledio bio je zasnovan n Giarratana i dr., ((2011) Blood 120 (15):2945-53). Ukratko, sledio se sledeći protokol:

[0196] Dan 0 do dan 7: 4x10<4>CD34+ ćelije su kultivisane pri gustini od 2x10<4>/mL u medijumu za diferencijaciju (EDM) (Iscove-ov modifikovani Dulbekov medijum [IMDM], 330 µg/mL transferin, 10 µg/mL humani insulin, 2 U/mL Hepar5% natrijum AB+ plazma) u prisustvu 10<-6>M hidrokortizona, 100 ng/mL faktora matičnih ćelija (SCF), 5 ng/mL IL 3 i 3 IU/mL eritropoetina (EPO).

[0197] Dan 4: Ćelije su resuspendovane u svežem EDM-u koji sadrži SCF, IL-3, EPO i hidrokortizon.

[0198] Dan 7 do dan 11: Ćelije su resuspendovane pri gustini od 1,5 × 10<5>ćelija po svežem ml EDM-a sa dodatkom SCF i EPO.

[0199] Dan 11 do dan 21: 11. dana, ćelije su zamenjene sa 1 × 10<6>/mL u svežem EDM dopunjenom EPO. Ćelije su naknadno zamenjene u ovom istom medijumu pri 5 × 10<6>/mL 14. dana. Platoi rasta tokom ovog vremenskog perioda između 14. i 18. dana, kada je vitalnost ćelija počela da opada do završetka kultura 21. dana.

[0200] Broj ćelija je uzet u vreme sejanja i tokom diferencijacije merenjem pozitivnosti akridin narandže i isključenja propidijum jodida (AOPI) korišćenjem Nexcelom Bioscience Cellometra K2 sa režimom AOPI Eritroidnog testa sa fluorescentnim kanalom 1 (AO) podešenim na 700 milisekundi kanal 2 (PI) podešen na 5000 milisekundi.

[0201] Procenat enukleiranih ćelija je određen 21. dana diferencijacije korišćenjem sledećeg protokola. Stopa enukleacije bila je uporediva među netransficiranim kontrolama i uzorcima transficiranim ZFN sa procentima od 59-63% iz ove dve grupe:

1. Broj ćelija

2. 100.000 ćelija, okretanje dole na 450 x g, 5 min, RT.

3. Ponovo suspendujte 50 µL PBS-BSA 1 µL GlyA-FITC (DAKO).

4. Izmrljati 15 minuta u frižideru.

5. Dodati 1 mL PBS-BSA, mešati na vorteksu, okretati nadole.

6. Resuspendujte u 250 µL PBS-BSA-NucRed (2 kapi NucRed po mL).

7. Nabavite na FACS Canto koristeći APC kanal za NucRed.

8. Nukleisane eritroidne ćelije će biti u GlyA pozitivnoj NucRed negativnoj/niskoj frakciji, a eritroblasti će biti u dvostrukoj GlyA-NucRed pozitivnoj frakciji.

[0202] Modifikacija gena BCL11A je merena MiSeq dubokim sekvenciranjem u uzorcima DNK sakupljenih a) 48 sati nakon elektroporacije b) na dan odmrzavanja ćelija, u vreme kada je in vitro diferencijacija započeta i c) 14. dana in vitro eritroida diferencijacija. Dok je diferencijacija vršena tokom 21 dana, odabrana je vremenska tačka 14. dana za analizu DNK pošto je ona pre enukleacije velike frakcije eritroidnih ćelija što dovodi do gubitka oporavka DNK. Uočeni procenti modifikacije na BCL11A pojačivaču su navedeni u tabeli 4 zajedno sa detaljima o uslovima transfekcije.

Tabela 4: Nivoi modifikacije gena BCL11A pomoću MiSeq analize

[0203] Ovi podaci pokazuju da transfekcija CD34+ ćelija sa optimizovanim parom 63014 i 65722 mRNK dovodi do veoma efikasne modifikacije gena na ciljnom mestu pojačivača BCL11A (>75% modifikovanih alela) i da se modifikacija održava veoma dobro (>90% zadržavanje modifikacije ) posle zamrzavanja i odmrzavanja ćelija i posle diferencijacije eritroida.

[0204] ZFN par 63014/65722 je odabran za dalju analizu. Aminokiselinske sekvence za ove ZFN su prikazane u nastavku, gde svaka sadrži signal nuklearne lokalizacije (NLS, Kalderon i dr. (1984) Cell 39 (3 Pt 2):499-509) i hidrofilni peptid (Hopp i dr. (1988) Nat Biotechnol 6:1204-10) koji povećava aktivnost ZFN na ciljnoj meti, oba spojena sa sekvencom kodiranja N-terminala. Dakle, sekvence mRNK i aminokiselina ZFN-a su sledeće:

63014 mRNK (1725 nt)

1

[0205] 63014 aminokiselinska sekvenca (regioni spirale prepoznavanja su podvučeni; veznik je prikazan velikim kurzivom; mutacije na ostacima glavnog lanca prstiju 1, 3 i 5 prikazane su dvostrukim podvlačenjem; mutacije domena dimerizacije (ELD) su prikazane podebljano i kurzivom; hidrofilni peptid je naznačen malim slovima; a signal nuklearne lokalizacije (NLS) je prikazan malim kurzivom):

2

[0207] 65722 aminokiselinska sekvenca (regioni spirale prepoznavanja su podvučeni; veznik je prikazan velikim kurzivom; hidrofilni peptid je naznačen malim slovima; signal lokalizacije nukleaze ispisan je malim slovima kurzivom; mutacije na ostacima glavnog lanca prstiju 1, 2 i 4 prikazane su dvostrukim podvlačenjem; mutacije domena dimerizacije (ELD) su prikazane podebljano i kurzivom; a mutacija(e) kontakta FokI fosfata prikazana je talasastim podvlačenjem:

Primer 5: Procena nivoa globina u eritroidnom potomstvu

[0208] Nivoi α-, β- i γ-globinske iRNK u ćelijskoj mRNK izolovanoj 14. dana diferencijacije (pre nego što ukupni nivoi mRNK dramatično opadnu tokom enukleacije i sazrevanja eritroida) određeni su RT-qPCR za dva prikazana preparata ćelija iznad u Tabeli 4. Vrednosti γ-globinske iRNK su prikazane normalizovane u odnosu na b-globinsku iRNK (Slika 5A) ili vrednosti α-globinske mRNK (Slika 5B) iz istih uzoraka (koristeći proizvoljne jedinice zasnovane na odnosu u netransficiranom RT-PCR-u standard definisan kao 1).

[0209] HPLC reverzne faze uzoraka proteina izolovanih 21. dana, krajnje tačke diferencijacije eritroida, korišćena je da se utvrdi da li ZFN posredovana modifikacija BCL11A eritroidnog pojačivača podiže fetalni hemoglobin na nivou proteina. Određeni su Gama globin (zbir pikova Agama i Ggamma) prema alfa globinu, kao i Gama globin (zbir Agamma i Ggamma pikova)/ preko odnosa globina sličnih beta (zbir Agamma, Ggamma, beta i deltaglobinski vrhovi) i prikazani su na Slici 6.

[0210] U ovom eksperimentu, uočeno je približno 3-4 puta povećanje procenta proteina fetalnog globina na nivoe od oko 15%-20% u eritroidnom potomstvu HSPC nakon 63014/65722 posredovanog poremećaja BCL11A pojačivača.

Primer 6: Ugrađivanje uređenih ćelija u NSG miševe

[0211] Uređene humane CD34+ ćelije su zatim ubrizgane u NSG miševe da bi se procenilo presađivanje. Stepen ljudskog himerizma (tj. procenat ljudskih CD45+ ćelija) je meren korišćenjem sortiranja ćelija aktiviranog fluorescencijom (FACS) u perifernoj krvi sakupljenoj 8, 12, 16 i 20 nedelja nakon transplantacije i u koštanoj srži sakupljenoj 12 nedelja i 20 nedelja. Pored toga, da bi se testirao nivo presađivanja ZFN modifikovanih ćelija, nivo poremećaja gena na lokusu pojačivača BCL11A je procenjen direktnim visokopropusnim sekvenciranjem ciljnog lokusa ZFN i upoređen sa nivoima modifikacije ciljnog gena izmerenim u ulaznom materijalu.

[0212] HSPC od dva zdrava donora (nazvana PB-MR-003 i PB-MR-004) je mobilisan sa G-SCF i Pleriksaforom i prečišćen kao što je opisano u Yannaki i dr. ((2012) Mol Ther 20(1):230-8. doi: 10.1038/mt.2011). Deplecija trombocita je izvedena na proizvodu leukafereze korišćenjem Fresenius-Kabi Lovo uređaja pre nego što je obogaćen za CD34+

4

ćelije korišćenjem Miltenyi Biotech CliniMACS Plus instrumenta. Prečišćene ćelije su zatim zasejane u kulturu radi transfekcije.

[0213] Dva dana nakon prečišćavanja CD34+ ćelija, ćelije su elektroporisane pomoću Maxcyte instrumenta u prisustvu ili 120 µg/mL jedne mRNK koja kodira roditeljski ZFN par, 63014/65722 ili optimizovane količine dve odvojene mRNK koje kodiraju optimizovani ZFN par 80 µg/mL 63014 i 20 µg/mL 65722. Pre transfekcije, alikvot ćelija je stavljen na stranu kao netransfektovana kontrola.95 miliona ćelija je transfektovano iz PB-MR-003 i 120 miliona ćelija je transfektovano iz PB-MR-004.

[0214] Nakon elektroporacije, izvedena je prolazna kultura preko noći na 30°C i ćelije su potom kultivisane dodatna 24 sata na 37°C. Dva dana nakon elektroporacije, uzeti su alikvoti ćelija za analizu DNK, a preostale ćelije su sakupljene, kriokonzervirane i uskladištene u tečnom azotu.

[0215] Uslovljavanje: Miševi su tretirani sa 10 mg/kg/dan Baytril vode 1-2 dana pre zračenja i subletalno ozračeni sa 300 RAD 16-24 sata pre transplantacije. Transplantacija je izvršena injekcijom u repnu venu (videti ispod). Zatim su miševi dobili svežu Baytril vodu. Baytril voda je zamenjena nedelju dana kasnije, a dodavanje Baytril vode je prekinuto 14 dana nakon transplantacije.

[0216] Transplantacija: Na dan transplantacije, prethodno zagrejte koktel X-Vivo 10/1%PSG 3 citokina (rekombinantni faktor ljudskih matičnih ćelija (SCF), rekombinantni humani trombopoietin (TPO) i rekombinantni ljudski Flt-3 ligand (Flt-3L)) na 37°C, pripremiti svež PBS/0,1% BSA na temperaturi okoline (sterilno/filtrirano). Kriokonzervirane ćelije su odmrznute na 37°C, peletirane, resuspendovane u prethodno zagrejanom medijumu X-Vivo, ponovo peletirane, resuspendovane u PBS/0,1% BSA i izbrojane. Posle drugog peletiranja, ćelijska peleta je resuspendovana u 550 µL po mišu PBS/0,1% BSA (2 x 10^6 ćelija/mL na osnovu broja ćelija). Ćelije su zatim ubrizgane na sobnoj temperaturi u venu repa miša sa iglom od 25. Grupe ispitivanja su prikazane ispod u Tabeli 5.

Tabela 5: Grupe za doziranje za presađivanje uređenih hCD34+ ćelija

[0217] Životinje su svakodnevno posmatrane zbog opšteg zdravlja i merene su svakodnevno prve 2 nedelje, a zatim su merene svake dve nedelje. Periferna krv je sakupljena iz submandibularne vene (100 µL) 8, 12, 16 i 20 nedelja nakon transplantacije ili putem srčane punkcije (1 mL) za žrtvovane životinje 12 i 20 nedelja nakon transplantacije. Polovina životinja u svakoj grupi (5 miševa po grupi) je eutanazirana 12 nedelja nakon transplantacije, a koštana srž i terminalna krv su sakupljene za analizu. Preostale životinje u svakoj grupi (5 miševa po grupi) su žrtvovane 20 nedelja nakon transplantacije.

[0218] Sakupljanje krvi, sakupljanje i obrada ćelija: Periferna krv je sakupljena preko submandibularne vene ili punkcije srca u EDTA epruvete i centrifugirana na 500 x g tokom 5 minuta da bi se uklonila plazma. Nakon ispiranja i centrifugiranja goveđeg serumskog albumina (BSA) sa fosfatnim puferom (PBS), peletu je dodata 10X zapremina hemolitičkog pufera i smeša je inkubirana na 37°C tokom 15 minuta, centrifugirana i ponovo isprana. Peletirana frakcija je rekonstituisana u 1 mL PBS BSA; alikvot je uklonjen i centrifugiran na 1.000 x g tokom 5 minuta, sa rezultujućim peletom sačuvanim za genotipizaciju.

Supernatantna frakcija je korišćena za FACS analize.

[0219] Koštana srž, femur, tibija i karlične kosti su sakupljene u Iscove-ovom modifikovanom Dulbekovom medijumu (IMDM) koji sadrži fetalni teleći serum (FCS); ukupna koštana srž je isprana u PBS BSA rastvor i filtrirana pomoću najlonske cediljke od 70 µm. Zapremina je podešena na 10 mL sa PBS BSA, a alikvot je korišćen za brojanje ćelija (Cellometer).

[0220] ZFN aktivnost je analizirana korišćenjem MiSeq dubokog sekvenciranja. Ukratko, genomska DNK miševa kojima je ubrizgan ili netransfektovani kontrolni CD34+ HSPC ili CD34+ HSPC transfektovan sa pojačivačem ciljanom ZFN mRNK je izolovana iz uzoraka krvi dobijenih 8 nedelja i 12 nedelja ili iz koštane srži 12 nedelja nakon injekcije. Region od interesa (koji sadrži ZFN vezujuće mesto unutar BCL11A lokusa) je amplifikovan PCR-om i nivo modifikacije je određen uparenim krajnjim dubokim sekvenciranjem na platformi Illumina (MiSeq).

[0221] Da bi se generisale biblioteke kompatibilne sa platformom za sekvenciranje Illumina MiSeq, adapteri, bar kodovi i vezivo za protočne ćelije (kratka DNK sekvenca) su pričvršćeni za ciljne specifične amplikone koristeći dva seta fuzionih prajmera u sekvencijalnim PCR-ovima. Za MiSeq evaluacije modifikacije humanog BCL11A pojačivača u uzorcima krvi miša i koštane srži, protokol je morao da se prilagodi zbog niskih količina ciljne DNK u ovim uzorcima.

[0222] Sledeći prajmeri su korišćeni za MiSeq Adapter PCR:

PRJIYLFN-f2: ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTN NNN AGT CCT CTT CTA CCC CAC CCA (SEQ ID NO:32) i

PRJIYLFN-r4: GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTC TAC TCT TAG ACA TAA CAC ACC AGG G (SEQ ID NO:33).

[0223] Za analizu, DNK iz uzoraka koštane srži miša je izolovan pomoću DNeasy i približno 100 ng DNK je korišćeno u svakoj PCR reakciji. DNK iz uzoraka krvi miša je izolovan pomoću Tissue XS i 10 µL izolovane DNK od 15 µL je korišćeno u svakoj reakciji. Pored DNK, u svaku MiSeq PCR reakciju je dodato sledeće: 25 µL HotStar Taq mešavine (Qiagen), 0,5 µL svakog od prethodno navedenih prajmera za poboljšanje BCL11A (u koncentraciji od 100 nM), i vode do ukupne reakcione zapremine od 50 µL. Tipični MiSeq PCR uslovi su bili: Denaturacija na 95°C tokom 15', i 30 ciklusa na 94°C za 30", 62°C za 30" i 72°C za 40", nakon čega sledi elongacija od 10' na 72°C. Posle MiSeq PCR, PCR proizvod je razblažen između 1:50 i 1:200 sa vodom, ili ostavljen nerazblažen za uzorke sa veoma malim početnim brojem ćelija. Barkod PCR je izveden sa 1 µL MiSeq PCR proizvoda razblaženog kao što je gore opisano, 25 µL HotStar Taq mešavine, 1 µL prajmera za bar-kod unapred, 1 µL reverznog bar-koda prajmera (oba u koncentraciji od 10 nM) i vodom do ukupne količine od 50 µL zapremina reakcije. Barkod PCR uslovi su bili: Denaturacija na 95°C tokom 15', i 18 ciklusa na 94°C za 30", 60°C za 30" i 72°C za 30", nakon čega sledi elongacija od 10' na 72°C. Barkod PCR proizvodi su objedinjeni i sekvencionirani na Illumina MiSeq sekvenceru. Rezultati su prikazani u Tabeli 5 iznad.

[0224] FACS analiza za himerizam i određivanje ćelijske loze. Da bi se procenio stepen humanog himerizma, frakcija ćelija u perifernoj krvi (8, 12, 16 i 20 nedelja nakon usađivanja) i koštanoj srži (12 i 20 nedelja nakon usađivanja) obojena je hCD45-APC Cy7 (Biolegend) i hCD45-BV510 (BD Biosciences) antitela i FACS analiza je urađena. Pored toga, analiza hematopoetskih linija je izvršena bojenjem ćelija koštane srži specifičnim antitelima opisanim u Tabeli 6 ispod:

Tabela 6: Izvori antitela za ćelijske markere

[0225] Pored toga, da bismo prečistili i sortirali HSPC populacije, koristili smo strategiju obogaćivanja/iscrpljivanja koristeći magnetnu separaciju ćelija (MACS). Ćelije koštane srži su prvo obojene CD19-biotinom, CD3-biotinom, B220-biotinom, TER119-biotinom i m-ckitbiotinom (BD Biosciences), a zatim inkubirane sa zrncima anti-biotina (Miltenyi Biotec). Pozitivna frakcija i osiromašena frakcija su razdvojene korišćenjem LS kolona (Miltenyi Biotec) postavljenih u magnetno polje MACS-a. Nakon odvajanja, pozitivna frakcija je obojena Streptavidin-APC, CD3-FITC, CD19-PE, CD45-BV510 (BD Biosciences), a osiromašena frakcija sa CD34-FITC (BD Biosciences), Gli-A-PE (DAKO), CD19-APC (BD), Lin-APC (Biolegend), Streptavidin-APC, CD45-BV510, CD33-PE-CF594 (BD) i CD38-PECi-7 (Biolegend).

[0226] Netransfektovani HSPC i 63014/65722 -transfektovani HSPC su usađeni u NSG miševe korišćenjem standardnih procedura kao što je iznad opisano. Stepen humanog himerizma kod ovih miševa nakon usađivanja je procenjen merenjem frakcije hCD45 pozitivnih ćelija korišćenjem FACS.

[0227] Slika 7 prikazuje procente humanih CD45+ ćelija u perifernoj krvi prikupljenih 8 i 12 nedelja nakon transplantacije, a Slika 8 prikazuje procente u koštanoj srži sakupljene u 12. nedelji. Kao što je pokazano, nivoi presađivanja u ovom ispitivanju bili su uporedivi humani himerizam nakon usađivanja netransfektovane kontrole i 63014/65722 transfektovanog HSPC. Samo 3 miša od 60 raspoređenih kroz grupe nisu imale CD45+ ćelije što ukazuje na neuspeh u presađivanju.

[0228] Rekonstitucija različitih linija hematopoetskih ćelija je testirana FACS analizom ćelija koštane srži dobijenih u 12. nedelji sa antitelima koja prepoznaju površinske markere loze pomoću standardnih procedura. Kao što je prikazano na Slici 9, primećena je uporediva zastupljenost svih analiziranih humanih hematopoetskih linija u koštanoj srži 12. nedelje nakon injekcije između CD34+ ćelijskog potomstva tretiranog za BCL11A specifičnog ZFN koji kodira mRNK i potomstva netransficiranih ćelija. Izolovana je koštana srž miševa žrtvovanih u 12. nedelji nakon presađivanja i distribucija različitih hematopoetskih linija je analizirana pomoću FACS-a korišćenjem antitela koja prepoznaju naznačene markere loze. Svi brojevi su dati kao odnos ćelija koje su obojene pozitivno za naznačeni marker loze u odnosu na procenat humanih CD45 pozitivnih ćelija, osim ćelija koje eksprimiraju eritroidni marker Cd71+ (Ter119) na slici 9C, koje su date kao procenat pozitivnog bojenje ćelija u celoj populaciji pošto eritroidne ćelije nisu CD45 pozitivne.

[0229] Nivoi modifikacije gena na BCL11A eritroidnom pojačivaču (% alela sa insercijama i delecijama [indeli]) procenjeni su dubokim sekvencioniranjem ciljnog regiona ZFN korišćenjem MiSeq platforme za sekvenciranje kao što je iznad opisano. Podaci su prikazani na Slici 10 za uzorke krvi iz 8. i 12. nedelje, i na Slici 11 za uzorke koštane srži iz 12. nedelje i sortirane loze izvedene iz uzoraka ćelija koštane srži 12. nedelje tretiranih ćelija 63014/65722. Za poređenje, procenti indela izmereni 2 dana nakon transfekcije (kao što je navedeno u Tabeli 5) su takođe prikazani na grafikonima na Slikama 10 i 11.

[0230] Pored toga, pronađeno je dobro zadržavanje modifikacije gena na BCL11A eritroidnom pojačivaču za oba skupa HSPC donora tretiranih sa 63014/65722 u različitim vremenskim tačkama i u različitim linijama. Uporediva modifikacija je primećena i kod BCL11A zavisnih (B ćelije, 'CD19'; primitivni progenitori, 'CD38H') i BCL11A nezavisne (mijeloidne 'CD33') linije. Iako su nivoi modifikacije ulaznog gena bili viši u uzorku donora PB-MR-003 nego u uzorku donora PB-MR-004, ćelije izvedene iz PB-MR-004 dosledno pokazuju više nivoe modifikacije, tj. bolje zadržavanje modifikacije, kod miševa od onih izvedenih iz PB-MR-003.

[0231] Sve u svemu, uočeno zadržavanje modifikacije gena na BCL11A eritroidnom pojačivaču kod miševa bilo je u skladu sa onim uočenim u prethodnim eksperimentima sa miševima korišćenjem brojnih ZFN-ova koji ciljaju različite genske ciljeve.

[0232] Štaviše, pošto ljudski eritroidni progenitori nisu u stanju da se diferenciraju kod miševa, da bi se odredila količina ciljane modifikacije gena BCL11A koja se dogodila u ovim ćelijama, ćelije koštane srži su uklonjene iz miševa i diferencirane in vitro. U ovim eksperimentima, ljudske ćelije izvedene iz koštane srži su uklonjene iz žrtvovanih miševa u 12. nedelji nakon presađivanja i diferencirane in vitro kao što je iznad opisano. Modifikacija ciljnog gena BCL11A merena je visoko propusnim Miseq sekvenciranjem DNK izolovane iz ćelija 14. dana diferencijacije.

[0233] Podaci o modifikaciji (indeli) su predstavljeni na Slici 12, koja prikazuje nivoe modifikacije 14. dana diferencijacije eritroida. Procenti indela 14. dana in vitro diferencijacije značajno variraju za svaku kulturu koja je generisana iz ćelija izolovanih od jednog miša, odražavajući oligocelularnu prirodu ekspanzije dobijene pod ovim uslovima. Podaci ukazuju da modifikacija pojačivača BCL11A posredovana 63014/65722 ZFN nije značajno izmenjena tokom diferencijacije eritroida. Kao što je primećeno u uzorcima krvi i koštane srži, uzorci eritroidnog potomstva ćelija dobijenih iz PB-MR-004 pokazali su više prosečne nivoe modifikacije od eritroidnog potomstva ćelija dobijenih iz PB-MR-003.

[0234] Relativni nivoi različitih globinskih mRNK su određeni RT-PCR analizom RNK izolovane iz ćelija 14. dana in vitro eritroidne diferencijacije, a podaci su predstavljeni na Slici 13A gde je relativni γ-globin prema β globin iRNK i odnosi γ-globina i α-globina mRNK (Slika 13B) osrednjeni su za 5 eritroidnih kultura iz svake grupe. I u netransfektovanim i u uzorcima tretiranim sa 63014/65722 odnosi mRNK γ-globin prema β globinu ili γ-globin prema α globinu se uveliko razlikuju između eritroidnih potomaka pojedinačnih miševa iz iste grupe. Kulture dobijene od donora PB-MR-004 pokazuju u proseku niže odnose g-globina od onih iz donora PB-MR-003, u skladu sa boljim sazrevanjem uočenim za uzorke dobijene od PB-MR-004. Međutim, uprkos ovoj varijabilnosti, proseci uzoraka tretiranih ZFN-om pokazuju ∼1,5-2 puta povećanje nivoa γ globin mRNK u poređenju sa njihovim odgovarajućim netransficiranim kolegama.

[0235] Nivoi proteina globina su procenjeni HPLC analizom. Slika 14 prikazuje analize globinskih proteina uzoraka sakupljenih 16. dana diferencijacije. Određeni su Gama globin (zbir pikova Agama i Ggamma) prema alfa globinu, kao i Gama globin (zbir Agamma i Ggamma pikova)/ preko odnosa globina sličnih beta (zbir Agamma, Ggamma, beta i vrhovi delta-globina) i proseci za svaku grupu su prikazani iznad svake trake. U skladu sa slabom diferencijacijom eritroida uzoraka dobijenih iz PB-MR-003, nivoi gama-globina u netransficiranim ćelijama dobijenim od ovog donora su bili veoma visoki (∼30%), i stoga je tretman ZFN rezultirao samo 1,2 puta povećanjem nivoi gama-globina. PB-MR-004 je pokazao tipičnije netransfektovane nivoe (∼9%) i pokazao ∼2 puta povećanje nivoa proteina gama-globina nakon 12 nedelja prolaska kroz miša.

1

[0236] Smatra se da su pacijenti koji prirodno imaju > 8,6% g globina u prednosti u poređenju sa pacijentima sa nivoima g globina < 8,6% (Platt i dr. (1994) N Engl J Med, 330:1639-44). U stvari, postizanje himernog 10-20% procenta eritrocita ne-srpskih ćelija putem ugrađivanja uređenih ćelija može dovesti do kliničkog poboljšanja (Chang i dr. (2017) Mol Ther Methods Clin Dev 4:137-148. doi 10.1016/j.omtm.2016.12.009). Stoga, uprkos tome što se mora proći kroz in vitro proces diferencijacije eritroida, procenat himernih ćelija i nivo detektovanog γ-globina proteina ukazuju na terapijsku efikasnost.

2

Claims (17)

Patentni zahtevi

1. Nukleaza cinkovog prsta (ZFN) koja sadrži aminokiselinsku sekvencu kao što je prikazano u SEQ ID NO:29 i sekvenca aminokiselina kao što je prikazano u SEQ ID NO:31.

2. Jedan ili više polinukleotida koji kodiraju jednu ili više nukleaza cink prsta prema patentnom zahtevu 1, opciono pri čemu jedan ili više polinukleotida je(su) mRNK.

3. Jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 koji sadrže SEQ ID NO:28 i SEQ ID NO:30.

4. Jedan ili više vektora koji sadrže sekvence koje kodiraju jednu ili više nukleaza cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1.

5. Ćelija koja sadrži nukleazu cink prsta prema patentnom zahtevu 1, jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3 ili jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 4.

6. Ćelija prema patentnom zahtevu 5, naznačena time što:

(i) ćelija je matična ćelija ili prekursorska ćelija, opciono pri čemu je ćelija ljudska ćelija; i/ili

(ii) genom ćelije je modifikovan pomoću nukleaze cinkovog prsta, opciono pri čemu je genomska modifikacija izabrana iz grupe koja se sastoji od insercija, delecija i njihovih kombinacija, kao što je genomska modifikacija unutar 58 regiona sekvence pojačivača BCL11A.

7. Ćelija ili ćelijska linija proizvedena iz ćelije prema patentnom zahtevu 5 ili patentnom zahtevu 6, koja sadrži nukleazu cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1, jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili zahtevu 3 ili jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 4.

8. Delimično ili potpuno diferencirana ćelija koja potiče od ćelije ili ćelijske linije prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 7, koja sadrži nukleazu cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1, jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3 ili jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 4.

9. Ćelija ili ćelijska linija prema bilo kom od patentnih zahteva 5 do 8, gde je genom ćelije modifikovan nukleazom cinkovog prsta i ćelija ili ćelijska linija pokazuje povećanu ekspresiju gama i/ili beta globina u poređenju sa ćelijom ili ćelijskom linijom bez genomske modifikacije.

10. Farmaceutski sastav koja sadrži nukleazu cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1, jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 4, i/ili ćeliju ili ćelijsku liniju prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9.

11. Farmaceutski sastav prema patentnom zahtevu 10, koja sadrži ćeliju ili ćelijsku liniju prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9 i koja dalje sadrži propagirane i diferencirane ćelije koje potiču od ćelije ili ćelijske linije.

12. Metoda in vitro za modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A u ćeliji, postupak koji obuhvata davanje nukleaze cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1 ili jednog ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili 3 u ćeliju tako da endogena sekvenca pojačivača BCL11A bude modifikovan,

opciono gde:

(i) postupak dalje obuhvata uvođenje egzogene sekvence u ćeliju tako da se egzogena sekvenca ubaci u endogenu sekvencu pojačivača BCL11A; ili

(ii) modifikacija uključuje brisanje.

13. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 10 ili patentnom zahtevu 11 za upotrebu u postupku lečenja hemoglobinopatije, kao što je talasemija (npr. beta-talasemija) ili bolest srpastih ćelija, kod pacijenta, postupak koji obuhvata davanje farmaceutskog sastava pacijentu, opciono pri čemu je pacijent čovek.

14. In vitro postupak za proizvodnju genetski modifikovane ćelije koji sadrži genomsku modifikaciju unutar endogene sekvence pojačivača BCL11A, postupak koji obuhvata sledeće korake:

a) dovođenje u kontakt ćelije sa jednim ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3;

4

b) podvrgavanje ćelije uslovima koji pogoduju ekspresiji fuzionog proteina iz polinukleotida; i

c) modifikovanje endogene sekvence pojačivača BCL11A sa eksprimiranim fuzionim proteinom dovoljnim da proizvede genetski modifikovanu ćeliju,

opciono pri čemu postupak dalje obuhvata stimulaciju ćelije sa najmanje jednim citokinom.

15. Komplet koji sadrži nukleazu cinkovog prsta prema patentnom zahtevu 1, jedan ili više polinukleotida prema patentnom zahtevu 2 ili patentnom zahtevu 3, jedan ili više vektora prema patentnom zahtevu 4 i/ili ćeliju ili ćelijsku liniju prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9.

16. Ćelija ili ćelijska linija prema bilo kom od patentnih zahteva 5-9 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije hemoglobinopatije, kao što je talasemija (npr. beta-talasemija) ili bolest srpastih ćelija.

17. Ćelija ili ćelijska linija za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, gde je ćelija ljudska matična ćelija ili progenitorska ćelija i genom ćelije je modifikovan unutar BCL11A pojačivačke sekvence pomoću nukleaze cinkovog prsta, opciono gde:

(i) ćelije su proširene pre davanja ispitaniku;

(ii) ćelije se daju ispitaniku u transplantaciji koštane srži, gde se ćelije ugrađuju, diferenciraju i sazrevaju in vivo; i/ili

(iii) pre uvođenja transplantata koji sadrži ćelije, subjekt se leči blagom mijeloablativnom procedurom ili snažnom mijeloablativnom kondicionom režimom.