RS62803B1 - Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i njihova upotreba - Google Patents

Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i njihova upotreba

Info

Publication number
RS62803B1
RS62803B1 RS20220024A RSP20220024A RS62803B1 RS 62803 B1 RS62803 B1 RS 62803B1 RS 20220024 A RS20220024 A RS 20220024A RS P20220024 A RSP20220024 A RS P20220024A RS 62803 B1 RS62803 B1 RS 62803B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
fraction
determined
chromosome
free
predetermined
Prior art date
Application number
RS20220024A
Other languages
English (en)
Inventor
Fuman Jiang
Yuying Yuan
Wei Wang
Ye Yin
Original Assignee
Bgi Genomics Co Limited
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bgi Genomics Co Limited filed Critical Bgi Genomics Co Limited
Publication of RS62803B1 publication Critical patent/RS62803B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional [2D] or three-dimensional [3D] molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional [2D] or three-dimensional [3D] molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G16B15/10—Nucleic acid folding
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • G16B30/10—Sequence alignment; Homology search

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Description

Opis
OBLAST PRONALASKA
[0001] Predmetna objava se odnosi na određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i na njihovu upotrebu.
POZADINA
[0002] Od 1977. istraživači su sukcesivno pronalazili DNK poreklom od kancera u perifernoj krvi pacijenata sa tumorima; takođe je potvrđeno prisustvo slobodne fetalne DNK (cell-free fetal-DNA, cff-DNA) u plazmi trudnica. Određivanje frakcije slobodne fetalne DNK u plazmi trudnice je od velikog značaja.
[0003] WO2013/132305 (Kineski univerzitet Hong Konga), WO2014/068075 (Genesupport SA) i Yu et al. (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. 111, 8583-8588) su primeri objava koje nastoje da iskoriste distribuciju veličine fragmenata slobodnih nukleinskih kiselina u uzorcima krvi trudnica u kontekstu neinvazivnog fetalnog testiranja na fetalne genetičke abnormalnosti. Međutim, postojeći postupci za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u takvim biološkim uzorcima tek treba da se poboljšaju. Cilj predmetne objave je da obezbedi postupak koji je sposoban da precizno i efikasno odredi frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku krvi majke.
[0004] Trenutno postoje dva glavna pravca za procenu frakcije slobodne fetalne DNK u perifernoj krvi: (1) korišćenje prednosti različitih odgovora fragmenata DNK majke i fragmenata slobodne fetalne DNK u mononukleusnim ćelijama iz periferne krvi majke na metilaciju specifičnih markera; (2) odabir mnoštva reprezentativnih SNP mesta na osnovu razlika između mesta polimorfizma jednog nukleotida (SNP). Oba postupka imaju određena ograničenja: postupak (1) zahteva veliku količinu plazme, i postupak (2) zahteva hvatanje probom i veliku dubinu sekvenciranja, ili zahteva dobijanje roditeljskih informacija. Međutim, do sada nije publikovan nijedan izveštaj o proceni frakcije slobodne fetalne DNK sa sekvenciranjem celog genoma na maloj dubini pokrivenosti. Studije su pokazale da su fragmenti slobodne fetalne DNK u cirkulaciji majke, od kojih je većina kraća od 313 bp, generalno kraći od fragmenata slobodne DNK majke. Vođeni ovom inspiracijom, pronalazači su osmislili proceduru za procenu frakcije slobodne fetalne DNK zasnovanu na sekvenciranju plazme trudnice, i taj postupak ima široku primenu.
SAŽETAK PRONALASKA
[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice, koji sadrži:
(i) izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja;
(ii) određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u uzorku na osnovu rezultata sekvenciranja; i
(iii) određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg, pri čemu se navedeni unapred određeni opseg određuje pre koraka (i) pomoću sledećih koraka:
(a) određivanje dužina slobodnih nukleinskih kiselina u mnoštvu kontrolnih uzoraka periferne krvi trudnica, u svakom od kojih se zna frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina;
(b) postavljanje mnoštva kandidata opsega dužine i određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine;
(c) određivanje koeficijenta korelacije za svakog kandidata opsega dužine na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine i poznate frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u svakom od kontrolnih uzoraka; i (d) određivanje najmanje jednog kandidata opsega dužine ili kombinacije kandidata opsega dužine kao unapred određenog opsega na osnovu maksimalnog koeficijenta korelacije.
[0006] U primerima izvođenja predmetne objave, slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvenciraju se sekvenciranjem sparenih krajeva, sekvenciranjem jednog kraja ili sekvenciranjem jednog molekula. Na taj način, lako se mogu dobiti dužine slobodnih nukleinskih kiselina, što je pogodno za naredne korake.
[0007] U primerima izvođenja predmetne objave, slobodne nukleinske kiseline su DNK.
[0008] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku na osnovu rezultata sekvenciranja dodatno uključuje: poravnanje rezultata sekvenciranja sa referentnim genomom, tako da se konstruiše skup podataka koji se sastoji od mnoštva jedinstveno mapiranih očitavanja, gde svako očitavanje u skupu podataka može biti mapirano na jednu poziciju referentnog genoma; određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka; i određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg. Na taj način, lako se može odrediti broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0009] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka dodatno uključuje: određivanje dužine svakog očitavanja jedinstveno mapiranog na referentnom genomu kao dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara očitavanju. Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno poravnatom očitavanju u skupu podataka.
[0010] U primerima izvođenja predmetne objave, u slučaju da su slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvencirane sekvenciranjem sparenih krajeva, određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka uključuje: određivanje pozicije koja odgovara referentnom genomu 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja za 5' kraj svakog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva; određivanje pozicije koja odgovara referentnom genomu 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja na drugom kraju istog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva; i određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline na osnovu pozicije 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline i pozicije 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline. Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka.
[0011] Unapred određeni opseg određuje se na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka, u svakom od kojih se zna frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina. Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti kao precizan i pouzdan rezultat.
[0012] U primerima izvođenja predmetne objave, unapred određeni opseg određuje se na osnovu najmanje 20 kontrolnih uzoraka.
[0013] U primerima izvođenja predmetne objave, kandidat opsega dužine je raspon od 5 bp do 20 bp.
[0014] U primerima izvođenja predmetne objave, kandidat opsega dužine je raspon od 1 bp do 20 bp.
[0015] U primerima izvođenja predmetne objave, mnoštvo kandidata opsega dužine je veličine koraka od 1 bp do 2 bp.
[0016] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg dodatno uključuje:
određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg; i
određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku, na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu, u skladu sa unapred određenom funkcijom, pri čemu se unapred određena funkcija određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka. Na taj način, efikasno se može odrediti frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0017] U primerima izvođenja predmetne objave, unapred određena funkcija dobija se pomoću sledećih koraka:
(i) određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu; i
(ii) fitovanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu sa poznatom frakcijom slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kako bi se odredila unapred određena funkcija. Na taj način, unapred određena funkcija može se odrediti precizno i efikasno, što je pogodno za naredne korake.
[0018] U primerima izvođenja predmetne objave, procenat slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu fituje se sa poznatom frakcijom slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina pomoću linearnog fitovanja.
[0019] Putem primera, unapred određeni opseg je od 185 bp do 204 bp. Putem primera, kao što je ilustrovano pomoću primera, unapred određena funkcija može biti d=0,0334*p+1,6657, gde d predstavlja frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina, i p predstavlja procenat slobodne nukleinske kiseline prisutne u unapred određenom opsegu.
[0020] U primerima izvođenja predmetne objave, kontrolni uzorak je uzorak periferne krvi dobijen od trudnice sa normalnim muškim fetusom, u kome frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina zna da se odredi pomoću hromozoma Y. Na taj način, precizno se određuje unapred određeni opseg.
[0021] U primerima izvođenja predmetne objave, frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u kontrolnom uzorku je frakcija slobodne fetalne DNK koja se procenjuje pomoću hromozoma Y. Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti efikasnim korišćenjem frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kontrolnog uzorka, i zatim se može dodatno odrediti broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg i frakcija slobodne fetalne DNK u uzorku dobijenom od trudnice koja je predmet detektovanja.
[0022] Treba napomenuti da postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku krvi majke u skladu sa predmetnom objavom ima najmanje sledeće prednosti:
1) Univerzalnost: mogu se proceniti frakcije slobodne fetalne (posebno ženskog fetusa) DNK u svim uzorcima koji ispunjavaju kontrolu kvaliteta.
2) Preciznost NIPT detekcije može se poboljšati.
3) Operativna jednostavnost: frakcije slobodne fetalne DNK mogu se direktno proceniti samo upotrebom oflajn podataka.
[0023] U dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje pola blizanaca. Takav postupak uključuje: izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja; određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan; određivanje druge frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja; i određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i druge frakcije slobodne fetalne DNK. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da se ovim postupkom precizno i efikasno može odrediti pol blizanaca kod trudnice.
[0024] U primerima izvođenja predmetne objave, druga frakcija slobodne fetalne DNK određuje se u skladu sa sledećom formulom:
gde fra.chry predstavlja drugu frakciju slobodne fetalne DNK, chry.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; Female.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina koje su poravnate sa hromozomom Y u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan ženski fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; i Man.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od hromozoma Y u uzorku periferne krvi dobijenom od zdravog čoveka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
[0025] Na taj način, precizno se može odrediti druga frakcija slobodne fetalne DNK.
[0026] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i druge frakcije slobodne fetalne DNK dodatno uključuje: (a) određivanje odnosa druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje pola blizanaca upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim prvim pragom i unapred određenim drugim pragom, pri čemu se prvi prag određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju ženske blizance i drugi prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju muške blizance.
[0027] Određuje se da su oba fetusa blizanaca ženska ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od prvog praga, određuje se da su oba fetusa blizanaca muška ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od drugog praga, i određuje se da blizanci uključuju muški fetus i ženski fetus ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak prvom pragu ili drugom pragu, ili je između prvog praga i drugog praga.
[0028] U primerima izvođenja predmetne objave, prvi prag je 0,35 i drugi prag je 0,7.
[0029] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje aneuploidije hromozoma blizanaca. Takav postupak uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja;
određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan;
određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i
određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK.
[0030] Na taj način, aneuploidija hromozoma blizanaca može se detektovati precizno i efikasno.
[0031] U primerima izvođenja predmetne objave, treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje se u skladu sa sledećom formulom:
fra.chri = 2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalne blizance u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
[0032] Na taj način, precizno se može odrediti treća frakcija slobodne fetalne DNK.
[0033] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK dodatno uključuje: (a) određivanje odnosa treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim trećim pragom i unapred određenim četvrtim pragom i pri čemu se treći prag određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, i četvrti prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom.
[0034] Određuje se da oba fetusa blizanaca nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od trećeg praga, određuje se da oba fetusa blizanaca imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od četvrtog praga, i određuje se da jedan fetus blizanaca ima aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, dok se određuje da drugi fetus blizanaca nema aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak trećem pragu ili četvrtom pragu, ili je između trećeg praga i četvrtog praga.
[0035] U primerima izvođenja predmetne objave, treći prag je 0,35 i četvrti prag je 0,7.
[0036] U primerima izvođenja predmetne objave, unapred određeni hromozom je najmanje jedan odabran od hromozoma 18, 21 i 23.
[0037] U još dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja i određivanje odatle frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kao prve frakcije slobodne fetalne DNK postupkom iz pronalaska kao što je ovde prethodno opisano;
određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22;
određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
određivanje L skora hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, gde a predstavlja stepen slobode i fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK;
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T = unapred određeni peti prag i drugom pravom linijom gde je L = unapred određeni šesti prag, pri čemu se određuje da oba fetusa blizanaca imaju trizom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant; određuje se da jedan fetus blizanaca ima trizom i određuje se da je drugi fetus blizanaca normalan ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant; određuje se da su oba fetusa blizanaca normalna ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant i određuje se da su blizanci doveli do niske fetalne frakcije ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da se ovim postupkom može precizno i efikasno odrediti da li blizanci imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom.
[0038] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje fetalne himere koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom, opciono muškim fetusom, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja; određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan,
određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i
1
određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK.
Na taj način, precizno se može analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom.
[0039] U primerima izvođenja predmetne objave, treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje se pomoću sledeće formule:
fra.chri = 2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja. Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0040] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK, dodatno uključuje: (a) određivanje odnosa treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima himeru u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa utvrđenog u (a) sa mnoštvom unapred određenih pragova. Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0041] U primerima izvođenja predmetne objave, mnoštvo unapred određenih pragova uključuje najmanje jedan odabran od:
sedmog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan monozom,
osmog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je monozomna himera,
devetog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je normalan,
desetog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan trizom.
[0042] Određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan monozom, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od sedmog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja monozomna himera, ukoliko odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od sedmog praga i nije veći od osmog praga; određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja normalan, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od osmog praga i manji od devetog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja trizomna himera, ukoliko odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od devetog praga i nije veći od desetog praga; i
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan trizom, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od desetog praga.
[0043] U primerima izvođenja predmetne objave, sedmi prag je veći od -1 i manji od 0, na primer -0,85;
osmi prag je veći od sedmog praga i manji od 0, na primer -0,3;
deveti prag je veći od 0 i manji od 1, na primer 0,3; i
deseti prag je veći od devetog praga i manji od 1, na primer 0,85.
[0044] Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0045] U dopunskom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje fetalne himere koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja i određivanje odatle frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kao prve frakcije slobodne fetalne DNK postupkom iz pronalaska kao što je ovde prethodno opisano;
određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22;
određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečnu vrednost procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
određivanje L skora hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, a predstavlja stepen slobode i fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK;
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa trećom pravom linijom gde je T = unapred određeni jedanaesti prag i četvrtom pravom linijom gde je L = unapred određeni dvanaesti prag, kada T skor nije veći od 0,
pri čemu se određuje da fetus ima kompletan monozom ili monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da fetus ima monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant i
1
određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja,
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa petom pravom linijom gde je T = unapred određeni trinaesti prag i šestom pravom linijom gde je L = unapred određeni četrnaesti prag, kada je T skor veći od 0,
pri čemu se određuje da fetus ima kompletan trizom ili trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da fetus ima trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant;
određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja,
opciono, jedanaesti prag i trinaesti prag su svaki nezavisno 3, i dvanaesti prag i četrnaesti prag su svaki nezavisno 1.
[0046] Na taj način, efikasno se mogu analizirati situacije fetalne himere.
[0047] Dopunski aspekti i prednosti primera izvođenja predmetne objave biće delimično dati u sledećim opisima, delimično će postati očigledni iz sledećih opisa, ili će biti naučeni iz prakse primera izvođenja predmetne objave.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0048] Ovi i drugi aspekti i prednosti primera izvođenja predmetne objave postaće očigledni i lakše cenjeni iz sledećih opisa napravljenih sa pozivanjem na crteže, u kojima:
Sl. 1 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 2 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 3 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 4 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje unapred određenog opsega u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 5 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina iz unapred određenog izvora u biološkom uzorku u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 6 je dijagram toka koji pokazuje postupak za određivanje unapred određene funkcije u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 7 je strukturni dijagram uređaja za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina iz unapred određenog izvora u biološkom uzorku postupkom u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 8 je strukturni dijagram aparata za brojanje za upotrebu u sprovođenju postupka u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 9 je strukturni dijagram prve jedinice određivanja dužine za upotrebu u sprovođenju postupka u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 10 je strukturni dijagram aparata za određivanje unapred određenog opsega za upotrebu u sprovođenju postupka u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 11 je strukturni dijagram aparata za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina za upotrebu u sprovođenju postupka u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 12 je strukturni dijagram aparata za određivanje unapred određene funkcije za upotrebu u sprovođenju postupka u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetne objave;
Sl. 13 je dijagram linearnog fitovanja koeficijenta korelacije između frakcije slobodne fetalne DNK procenjene pomoću hromozoma Y i procenta DNK molekula prisutnih u opsegu dužine 185bp~204bp za svaki uzorak dobijen od 37 trudnica za koje se zna da
1
imaju normalan muški fetus, u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetnog pronalaska; i
Slike 14 do kraja su dijagrami sa četiri kvadranta za T skorove i L skorove za 11 uzoraka koji su predmet detektovanja u skladu sa jednim primerom izvođenja predmetnog pronalaska.
DETALJAN OPIS
[0049] Primeri izvođenja predmetne objave biće detaljno opisani u nastavku, koji su objašnjavajući, ilustrativni, i upotrebljeni za opšte objašnjenje predmetne objave, stoga se neće tumačiti da ograničavaju predmetnu objavu.
Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice
[0050] Kao što je ovde ranije ukazano, pronalazači su iznenađujuće pronašli da se frakcija fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice može precizno i efikasno odrediti pomoću postupka iz predmetne objave.
[0051] Frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina, označava frakciju broja slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u odnosu na ukupan broj slobodnih nukleinskih kiselina u perifernoj krvi dobijenoj od trudnice, koja ponekad može takođe biti poznata kao "frakcija slobodne fetalne DNK u perifernoj krvi dobijenoj od trudnice" ili "frakcija slobodne fetalne DNK".
[0052] Sa pozivanjem na Sl.1, postupak uključuje sledeće korake.
S100: sekvenciranje nukleinske kiseline
[0053] Slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvenciraju se kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja. Biološki uzorak je uzorak periferne krvi dobijen od trudnice. Slobodna nukleinska kiselina iz unapred određenog izvora su slobodne fetalne nukleinske kiseline u uzorku periferne krvi. Treba napomenuti da termin "podaci sekvenciranja" koji se ovde upotrebljava označava "očitavanja sekvence", koji odgovara nukleinskim kiselinama podvrgnutim sekvenciranju. Rezultat sekvenciranja uključuje dužine slobodnih nukleinskih kiselina.
1
[0054] U primerima izvođenja predmetne objave, slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvenciraju se sekvenciranjem sparenih krajeva, sekvenciranjem jednog kraja ili sekvenciranjem jednog molekula. Na taj način, lako se mogu dobiti dužine slobodnih nukleinskih kiselina, što je pogodno za naredne korake.
S200: određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg
[0055] Broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku određuje se na osnovu rezultata sekvenciranja.
[0056] Treba napomenuti da termin "dužina" koji se ovde upotrebljava označava "dužinu nukleinske kiseline (očitavanje)" u baznim parovima (bp).
[0057] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 2, S200 dodatno uključuje sledeće korake:
S210: rezultat sekvenciranja poravnava se sa referentnim genomom. Specifično, rezultat sekvenciranja poravnava se sa referentnim genomom, tako da konstruiše skup podataka koji se sastoji od mnoštva jedinstveno mapiranih očitavanja, gde svako očitavanje u skupu podataka može biti mapirano na jednu poziciju referentnog genoma; poželjno, nema pogrešno mapiranog očitavanja ili postoji najviše jedno pogrešno mapirano očitavanje ili postoji najviše dva pogrešno poravnata očitavanja.
S220: određuje se dužina slobodne nukleinske kiseline. Specifično, određuje se dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka.
S230: određuje se broj slobodnih nukleinskih kiselina koje potpadaju u unapred određeni opseg. Specifično, određuje se broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg.
[0058] Na taj način, lako se može odrediti broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0059] U primerima izvođenja predmetne objave, u S220, dužina svakog očitavanja jedinstveno mapiranog na referentni genom određuje se kao dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara očitavanju. Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne
1
nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka.
[0060] U primerima izvođenja predmetne objave, u slučaju da se slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvenciraju sekvenciranjem sparenih krajeva, sa pozivanjem na Sl. 3, S220 uključuje sledeće korake.
[0061] S2210: određuje se pozicija, koja odgovara referentnom genomu, 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline. Specifično, određuje se pozicija, koja odgovara referentnom genomu, 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja za 5' kraj svakog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva.
[0062] S2220: određuje se pozicija, koja odgovara referentnom genomu, 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline. Specifično, određuje se pozicija, koja odgovara referentnom genomu, 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja na drugom kraju istog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva.
[0063] S2230: određuje se dužina slobodne nukleinske kiseline. Specifično, određuje se dužina slobodne nukleinske kiseline na osnovu pozicije 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline i pozicije 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline.
[0064] Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno poravnatom očitavanju u skupu podataka.
S300: određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina
[0065] Određuje se frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg.
[0066] Dodatno, postupak u skladu sa predmetnim pronalaskom dodatno uključuje određivanje unapred određenog opsega (S400, nije pokazano na Slikama). Unapred određeni opseg određuje se na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka, u svakom od kojih se zna frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina. Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti kao precizan i pouzdan rezultat. U primerima izvođenja predmetne objave, unapred određeni opseg određuje se na osnovu najmanje 20 kontrolnih uzoraka.
[0067] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 4, S400 uključuje sledeće korake.
[0068] S410: određivanje dužina slobodnih nukleinskih kiselina u mnoštvu kontrolnih uzoraka.
1
[0069] S420: određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine. Specifično, postavlja se mnoštvo kandidata opsega dužine, i određuje se procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka, prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine.
[0070] S430: određuje se koeficijent korelacije. Specifično, određuje se koeficijent korelacije za svaog kandidata opsega dužine, na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine, i poznate frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u svakom od kontrolnih uzoraka; i
[0071] S440: određuje se unapred određeni opseg. Specifično, kandidat opsega dužine sa najvećim koeficijentom korelacije određuje se kao unapred određeni opseg.
[0072] Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti precizno i efikasno.
[0073] U primerima izvođenja predmetne objave, kandidat opsega dužine je raspon od 1 bp do 20 bp.
[0074] U primerima izvođenja predmetne objave, mnoštvo kandidata opsega dužine je veličine koraka od 1 bp do 2 bp.
[0075] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 5, S300 dodatno uključuje sledeće korake.
[0076] S310: određuje se procenat slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu. Specifično, procenat slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu određuje se na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg.
[0077] S320: određuje se frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku. Specifično, frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku određuje se na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu, u skladu sa unapred određenom funkcijom, u kojoj se unapred određena funkcija određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka.
[0078] Na taj način, efikasno se može odrediti frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0079] U primerima izvođenja predmetne objave, postupak dodatno uključuje određivanje unapred određene funkcije (S500, nije pokazano na Slikama).
[0080] U nekim specifičnim primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 6, S500 uključuje sledeće korake.
1
[0081] S510: određuje se procenat slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu.
[0082] S520: procenat slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu fituje se sa poznatom frakcijom slobodne fetalne nukleinske kiseline kako bi se odredila unapred određena funkcija.
[0083] Na taj način, unapred određena funkcija može se precizno i efikasno odrediti, što je pogodno za naredne korake.
[0084] U primerima izvođenja predmetne objave, procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka, prisutnih u unapred određenom opsegu fituje se sa poznatom frakcijom slobodne fetalne nukleinske kiseline pomoću linearnog fitovanja.
[0085] Kao što je prethodno napomenuto, putem primera, unapred određeni opseg je od 185 bp do 204 bp. Kao što je ilustrovano primerom, unapred određena funkcija može biti d=0,0334*p+1,6657, gde d predstavlja frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina, i p predstavlja procenat slobodne nukleinske kiseline prisutne u unapred određenom opsegu. Frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku može se efikasno odrediti na osnovu unapred određene funkcije, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0086] Treba napomenuti da izraz "procenat slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu" označava procenat broja slobodnih nukleinskih kiselina raspoređenih u određenom unapred određenom opsegu dužine u odnosu na ukupan broj slobodnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku.
[0087] U primerima izvođenja predmetne objave, kontrolni uzorak je uzorak periferne krvi dobijen od trudnice sa normalnim muškim fetusom, u kome frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina zna da se odredi pomoću hromozoma Y. Na taj način, precizno se određuje unapred određeni opseg.
[0088] U primerima izvođenja predmetne objave, kontrolni uzorak je uzorak periferne krvi dobijen od trudnice sa normalnim fetusom. Na taj način, precizno se određuje unapred određeni opseg.
[0089] U primerima izvođenja predmetne objave, frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u kontrolnom uzorku je frakcija slobodne fetalne DNK koja se procenjuje pomoću hromozoma Y. Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti efikasnim korišćenjem frakcije slobodne fetalne nukleinske kiseline kontrolnog uzorka, i zatim se dodatno može odrediti broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg i frakcija slobodne fetalne DNK u uzorku dobijenom od trudnice koja je predmet detektovanja.
2
[0090] U drugim primerima izvođenja predmetne objave, postupak može dodatno uključivati sledeće korake.
1) Sekvenciranje celog genoma (WGS): uzorak koji je predmet detektovanja podvrgava se sekvenciranju celog genoma upotrebom platforme visoke propusnosti. Slobodne fetalne DNK u plazmi, koje su relativno kratke i u kojima samo mala količina prelazi dužinu od 300 bp, sekvenciraju se sekvenciranjem jednog kraja ili sekvenciranjem sparenih krajeva pošto je potrebno dobiti dužine svih slobodnih fetalnih DNK, i ceo slobodni molekul DNK potrebno je sekvencirati ukoliko se sekvencira sekvenciranjem jednog kraja.
2) Dobijanje jedinstveno mapiranih očitavanja: očitavanja test uzorka poravnavaju se sa referentnom sekvencom genoma.
3) Dobijanje dužine DNK koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju na osnovu informacija o poravnanju svakog jedinstveno mapiranog očitavanja.
4) Odabir jednog ili više opsega sa visokom korelacijom: jedan ili više opsega sa visokom korelacijom je/su odabrani u skladu sa distribucijom dužine molekula DNK. 5) Dobijanje formule funkcije: dobija se formula funkcije između procenta DNK prisutne u jednom ili više opsega sa visokom korelacijom dobijenom u 4) i poznate frakcije slobodne fetalne DNK.
6) Dobijanje procenta DNK prisutne u jednom ili više odabranih opsega, tj. procenta DNK prisutne u jednom ili više opsega dužine.
7) Dobijanje frakcije slobodne fetalne DNK u uzorku koji je predmet detektovanja na osnovu formule funkcije i procenta DNK u uzorku koji je predmet detektovanja prisutne u jednom ili više opsega dužine.
[0091] Specifično, Korak 4) uključuje sledeće korake:
I. Odabir kontrolnog uzorka, tj. uzorka u kome se zna frakcija slobodne fetalne DNK. II. Svi uzorci podvrgavaju se WGS sekvenciranju i dobijaju se informacije o dužini molekula DNK predstavljene svakim jedinstveno poravnatim očitavanjem pomoću jedinstvenih informacija o poravnanju dobijenih jedinstvenim poravnanjem očitavanja u odnosu na hromozomom.
III. Broj molekula DNK sa dužinom odabranom do Mbp (M predstavlja vrednost maksimalne dužine, slobodni molekul DNK može imati dužinu do 400 bp) dobija se za sve kontrolne uzorke.
IV. Mnoštvo opsega okvira (opsega dužine) dobija se pomeranjem okvira u određenoj dužini okvira u skladu sa određenom veličinom koraka, i izračunava se procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira, tj. procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu dužine. Treba napomenuti da je broj molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira, tj. distribuiranih u svakom opsegu dužine podeljen ukupnim brojem molekula DNK, definisan kao procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira. Na primer, 1bp, 5bp, 10bp ili 15bp može se uzeti kao okvir i bilo koja veličina odabrana od 1bp do dužine okvira može se uzeti kao veličina koraka. Specifično, kao primer, ukoliko je 5bp uzeto kao okvir i 2bp uzeto kao veličina koraka, onda se mogu dobiti distribucije molekula DNK u [1bp,5bp], [2bp,6bp], [4bp,8bp], [6bp,10bp] i tako dalje. Kao drugi primer, ukoliko je 5bp uzeto kao okvir i 5bp uzeto kao veličina koraka, onda se mogu dobiti distribucije molekula DNK u [1bp,5bp], [6bp,10bp], [11bp, 15bp] i tako dalje. "Ukupan broj molekula DNK" koji je ovde ranije opisan označava ukupan broj svih molekula DNK različite dužine.
V. Određuje se opseg okvira ili kombinacija opsega okvira (tj. opseg dužine ili mnoštvo opsega dužine) u kom je procenat prisutnih molekula DNK u velikoj korelaciji sa poznatom frakcijom slobodne fetalne DNK, i uspostavlja se formula funkcije.
Uređaj za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku
[0092] Takođe se sada objavljuje, ali ne formira deo pronalaska za koji se zahteva zaštita patenta, uređaj za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice pomoću postupka iz pronalaska. Sa pozivanjem na Sl. 7, uređaj uključuje: aparat za sekvenciranje 100, aparat za brojanje 200 i aparat 300 za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina.
[0093] Specifično, aparat za sekvenciranje 100 konfigurisan je da sekvencira slobodne nukleinske kiseline sadržane u biološkom uzorku, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja. Aparat za brojanje 200 povezan je sa aparatom za sekvenciranje 100 i konfigurisan je da odredi broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku na osnovu rezultata sekvenciranja. Aparat 300 za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina povezan je sa aparatom za brojanje 200 i konfigurisan je da odredi frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg.
[0094] Kao što je prethodno napomenuto, slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvenciraju se sekvenciranjem sparenih krajeva, sekvenciranjem jednog kraja ili sekvenciranjem jednog molekula. Na taj način, lako se mogu dobiti dužine slobodnih nukleinskih kiselina, što je pogodno za naredne korake.
[0095] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 8, aparat za brojanje 200 dodatno uključuje: jedinicu za poravnanje 210, prvu jedinicu za određivanje dužine 220 i jedinicu za određivanje broja 230. Specifično, jedinica za poravnanje 210 je konfigurisana da poravna rezultat sekvenciranja u odnosu na referentni genom tako da se konstruiše skup podataka koji se sastoji od mnoštva jedinstveno mapiranih očitavanja, gde svako očitavanje u skupu podataka može biti mapirano na jednu poziciju referentnog genoma. Prva jedinica za određivanje dužine 220 povezana je sa jedinicom za poravnanje 210 i konfigurisana je da odredi dužinu slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka. Jedinica za određivanje broja 230 povezana je sa prvom jedinicom za određivanje dužine 220 i konfigurisana je da odredi broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg. Na taj način, lako se može odrediti broj slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u biološkom uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0096] U primerima izvođenja predmetne objave, prvi aparat za određivanje dužine 220 konfigurisan je da odredi dužinu svakog očitavanja jedinstveno mapiranog na referentni genom kao dužinu slobodne nukleinske kiseline koja odgovara očitavanju. Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka.
[0097] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 9, u slučaju da su slobodne nukleinske kiseline u biološkom uzorku sekvencirane sekvenciranjem sparenih krajeva, prva jedinica za određivanje dužine 220 dodatno uključuje: modul za određivanje pozicije 5'-kraja 2210, modul za određivanje pozicije 3'-kraja 2220 i modul za izračunavanje dužine 2230. Specifično, modul za određivanje pozicije 5'-kraja 2210 konfigurisan je da odredi poziciju koja odgovara referentnom genomu 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline, na osnovu podataka sekvenciranja na jednom kraju svakog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva. Modul za određivanje pozicije 3'-kraja 2220
2
povezan je sa modulom za određivanje pozicije 5'-kraja 2210 i konfigurisan je da odredi poziciju koja odgovara referentnom genomu 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline, na osnovu podataka sekvenciranja na drugom kraju istog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva. Modul za izračunavanje dužine 2230 povezan je sa modulom za određivanje pozicije 3'-kraja 2220 i konfigurisan je da odredi dužinu slobodne nukleinske kiseline na osnovu pozicije 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline i pozicije 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline. Na taj način, precizno se može odrediti dužina slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka.
[0098] U primerima izvođenja predmetne objave, uređaj dodatno uključuje aparat za određivanje unapred određenog opsega 400 konfigurisan da odredi unapred određeni opseg na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka, u svakom od kojih se zna frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina, opciono, unapred određeni opseg određuje se na osnovu najmanje 20 kontrolnih uzoraka.
[0099] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 10, uređaj za određivanje unapred određenog opsega 400 dodatno uključuje: drugu jedinicu za određivanje dužine 410, prvu jedinicu za određivanje procenta 420, jedinicu za određivanje koeficijenta korelacije 430 i jedinicu za određivanje unapred određenog opsega 440. Specifično, druga jedinica za određivanje dužine 410 konfigurisana je da odredi dužine slobodnih nukleinskih kiselina u mnoštvu kontrolnih uzoraka. Prva jedinica za određivanje procenta 420 povezana je sa drugom jedinicom za određivanje dužine 410 i konfigurisana je da postavi mnoštvo kandidata opsega dužine i odredi procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka, prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine. Jedinica za određivanje koeficijenta korelacije 430 povezana je sa prvom jedinicom za određivanje procenta 420 i konfigurisana je da odredi koeficijent korelacije između svakog kandidata opsega dužine i frakcije slobodne fetalne nukleinske kiseline, na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka, prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine i frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u kontrolnim uzorcima. Jedinica za određivanje unapred određenog opsega 440 povezana je sa jedinicom za određivanje koeficijenta korelacije 430 i konfigurisana je da odabere kandidata opsega dužine sa najvećim koeficijentom korelacije kao unapred određenim opsegom. Na taj način, unapred određeni opseg može se odrediti precizno i efikasno.
[0100] U primerima izvođenja predmetne objave, kandidat opsega dužine je raspon od 1 bp do 20 bp.
[0101] U primerima izvođenja predmetne objave, mnoštvo kandidata opsega dužine je veličine koraka od 1 bp do 2 bp.
[0102] U primerima izvođenja predmetne objave, sa pozivanjem na Sl. 11, aparat za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina 300 dodatno uključuje: drugu jedinicu za određivanje procenta 310 i jedinicu 320 za izračunavanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina. Specifično, druga jedinica za određivanje procenta 310 konfigurisana je da odredi procenat slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg. Jedinica 320 za izračunavanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina povezana je sa drugom jedinicom za određivanje procenta 310 i konfigurisana je da odredi frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku, na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu, u skladu sa unapred određenom funkcijom, u kojoj se unapred određena funkcija određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka. Na taj način, efikasno se može odrediti frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku, što daje precizan i pouzdan rezultat i dobru reproducibilnost.
[0103] U primerima izvođenja predmetne objave, uređaj dodatno uključuje aparat za određivanje unapred određene funkcije 500. Sa pozivanjem na Sl. 12, aparat za određivanje unapred određene funkcije 500 uključuje: treću jedinicu za određivanje procenta 510 i jedinicu za fitovanje 520. Specifično, treća jedinica za određivanje procenta 510 konfigurisana je da odredi procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka, prisutnih u unapred određenom opsegu. Jedinica za fitovanje 520 povezana je sa trećom jedinicom za određivanje procenta 510 i konfigurisana je da fituje procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka, prisutnih u unapred određenom opsegu, sa poznatom frakcijom slobodne fetalne nukleinske kiseline kako bi se odredila unapred određena funkcija. Na taj način, unapred određena funkcija može se odrediti precizno i pouzdano, što je pogodno za naredne korake. U primerima izvođenja predmetne objave, procenat slobodnih nukleinskih kiselina, dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka, prisutnih u unapred određenom opsegu, fituje se sa poznatom frakcijom slobodne fetalne nukleinske kiseline iz unapred određenog izvora pomoću linearnog fitovanja.
2
Postupak za određivanje pola blizanaca
[0104] Kao što je ovde prethodno napomenuto, u sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje pola blizanaca. Takav postupak uključuje: izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja; određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja, pomoću postupka iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan; određivanje druge frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja; i određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i druge frakcije slobodne fetalne DNK. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da se ovim postupkom može precizno i efikasno odrediti pol blizanaca kod trudnice.
[0105] U primerima izvođenja predmetne objave, druga frakcija slobodne fetalne DNK određuje se u skladu sa sledećom formulom:
gde fra.chry predstavlja drugu frakciju slobodne fetalne DNK, chry.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; Female.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina koje su poravnate sa hromozomom Y u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan ženski fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; i Man.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od hromozoma Y u uzorku periferne krvi dobijenom od zdravog čoveka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
[0106] Na taj način, precizno se može odrediti druga frakcija slobodne fetalne DNK.
[0107] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i druge frakcije slobodne fetalne DNK dodatno uključuje: (a) određivanje odnosa druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje pola blizanaca upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim prvim pragom i unapred određenim drugim pragom.
[0108] Prvi prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju ženske blizance, i drugi prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju muške blizance.
2
[0109] Određuje se da su oba fetusa blizanaca ženska ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od prvog praga, određuje se da su oba fetusa blizanaca muška ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od drugog praga, i određuje se da blizanci uključuju muški fetus i ženski fetus ukoliko je odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak prvom pragu ili drugom pragu, ili je između prvog praga i drugog praga.
[0110] U primerima izvođenja predmetne objave, prvi prag je 0,35 i drugi prag je 0,7.
[0111] Takođe se sada objavljuje, ali ne formira deo pronalaska za koji se zahteva zaštita patenta, sistem za određivanje pola blizanaca u skladu sa postupkom iz pronalaska. U primerima izvođenja predmetne objave, sistem uključuje:
uređaj za određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK, koji je ovde prethodno navedeni uređaj za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku, i konfigurisan da sekvencira slobodne nukleinske kiseline sadržane u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja, i konfigurisan da odredi prvu frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja;
uređaj za određivanje druge frakcije slobodne fetalne DNK, konfigurisan da odredi drugu frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja; i
uređaj za određivanje pola, konfigurisan da odredi pol blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i druge frakcije slobodne fetalne DNK.
[0112] U primerima izvođenja predmetne objave, uređaj za određivanje pola dodatno uključuje: jedinicu za određivanje odnosa, konfigurisanu da odredi odnos druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i jedinicu za poređenje, konfigurisanu da uporedi odnos određen pomoću jedinice za određivanje odnosa sa prvim unapred određenim pragom i drugim unapred određenim pragom, kako bi se odredio pol blizanaca. Na taj način, efikasno se može odrediti pol blizanaca.
2
Postupak za detektovanje aneuploidije hromozoma blizanaca
[0113] Kao što je ovde prethodno navedeno, u dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje aneuploidije hromozoma blizanaca. Takav postupak uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja;
određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK, na osnovu podataka sekvenciranja, postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan;
određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK, na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK.
[0114] Na taj način, aneuploidija hromozoma blizanaca može se detektovati precizno i efikasno.
[0115] U primerima izvođenja predmetne objave, treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje se u skladu sa sledećom formulom:
gde fra.chri predstavlja treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalne blizance u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja. Na taj način, precizno se može odrediti treća frakcija slobodne fetalne DNK.
[0116] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK dodatno uključuje: (a)
2
određivanje odnosa treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim trećim pragom i unapred određenim četvrtim pragom. Na taj način, efikasno se može detektovati aneuploidija hromozoma.
[0117] Treći prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, i četvrti prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom.
[0118] Određuje se da oba fetusa blizanaca nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od trećeg praga, određuje se da oba fetusa blizanaca imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od četvrtog praga, i određuje se da jedan fetus blizanaca ima aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, dok se određuje da drugi fetus blizanaca nema aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak trećem pragu ili četvrtom pragu, ili je između trećeg praga i četvrtog praga.
[0119] U primerima izvođenja predmetne objave, treći prag je 0,35 i četvrti prag je 0,7.
[0120] U primerima izvođenja predmetne objave, unapred određeni hromozom je najmanje jedan odabran od hromozoma 18, 21 i 23.
[0121] Takođe se sada objavljuje, ali ne formira deo pronalaska za koji se zahteva zaštita patenta, sistem za određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca u skladu sa postupkom kao što je gore. Sistem uključuje:
uređaj za određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK, koji je ovde prethodno navedeni uređaj za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku, i konfigurisan da sekvencira slobodne nukleinske kiseline sadržane u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja, i konfigurisan da odredi prvu frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja; uređaj za određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK, konfigurisan da odredi treću frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred
2
određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i prvi uređaj za određivanje aneuploidije, konfigurisan da odredi da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da se aneuploidija hromozoma blizanaca može precizno i efikasno detektovati pomoću takvog sistema u skladu sa predmetnom objavom.
[0122] U primerima izvođenja predmetne objave, prvi uređaj za određivanje aneuploidije dodatno uključuje:
jedinicu za određivanje odnosa, konfigurisanu da odredi odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i
jedinicu za poređenje, konfigurisanu da uporedi odnos određen pomoću jedinice za određivanje odnosa sa unapred određenim trećim pragom i unapred određenim četvrtim pragom, kako bi se odredilo da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom. Na taj način, efikasno se može detektovati aneuploidija hromozoma blizanaca.
[0123] U još dodatnom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja i određivanje odatle frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kao prve frakcije slobodne fetalne DNK postupkom iz pronalaska kao što je ovde prethodno opisano;
određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22;
određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
određivanje L skora hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, gde a predstavlja stepen slobode i fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK;
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T = unapred određeni peti prag i drugom pravom linijom gde je L = unapred određeni šesti prag, pri čemu se određuje da oba fetusa blizanaca imaju trizom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant; određuje se da jedan fetus blizanaca ima trizom i određuje se da je drugi fetus blizanaca normalan ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant; određuje se da su oba fetusa blizanaca normalna ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; određuje se da su blizanci doveli do niske fetalne frakcije ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja. Pronalazači su iznenađujuće pronašli da se ovim postupkom može precizno i efikasno odrediti da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom.
[0124] Takođe se sada objavljuje, ali ne formira deo pronalaska za koji se zahteva zaštita patenta, sistem za određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca u skladu sa pronalaskom koji uključuje:
uređaj za određivanje vrednosti xi, konfigurisan da sekvencira slobodne nukleinske kiseline sadržane u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja, i konfigurisan da odredi frakciju xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; uređaj za određivanje T skora, konfigurisan da odredi T skor hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu
1
od 1 do 22, μipredstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
uređaj za određivanje L skora, konfigurisan da odredi L skor hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, gde a predstavlja stepen slobode, i fra predstavlja prvu frakciju slobodne fetalne DNK određenu postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan;
drugi uređaj za određivanje aneuploidije, konfigurisan da predstavi u grafičkom formatu dijagram sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T = unapred određeni peti prag i drugom pravom linijom gde je L = unapred određeni šesti prag, pri čemu se određuje da oba fetusa blizanaca imaju trizom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant; određuje se da jedan fetus blizanaca ima trizom, i određuje se da je drugi fetus blizanaca normalan ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant; određuje se da su oba fetusa blizanaca normalna ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; određuje se da blizanci imaju nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja.
[0125] Treba napomenuti da "referentna baza podataka" opisana u "μipredstavlja prosečnu vrednost procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja" označava slobodne nukleinske kiseline u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa normalnim fetusom (ženski fetus, muški fetus, pojedinačni fetus ili blizanci) ili podatke sekvenciranja (očitavanja).
[0126] "Podaci sekvenciranja" izraženi u "podaci sekvenciranja poreklom od hromozoma Y" označavaju očitavanja dobijena u sekvenciranju.
2
[0127] U nekim specifičnim primerima izvođenja predmetne objave, termini "xi", "ERi" i "Chri.ER%" su ovde promenljivi, to jest, ximože biti rezultat dobijen posle podvrgavanja GC korekciji. Specifično, ER i GC sadržaj svakog hromozoma može se fitovati upotrebom poznatih podataka dobijenih iz normalnih uzoraka kako bi se dobila formula odnosa, tj. ERi= fi(GCi)+εi. Izračunava se srednja vrednost od ER. Za uzorak koji se analizira, ER vrednost posle korekcije izračunava se u skladu sa sledećom formulom i na osnovu prethodne formule odnosa i ER i GC uzorka.
Postupak za detektovanje fetalne himere
[0128] U sledećem aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje fetalne himere koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom, opciono muškim fetusom, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja; određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK, na osnovu podataka sekvenciranja, postupkom iz pronalaska koji je ovde prethodno opisan,
određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK.
[0129] Na taj način, precizno se može analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom.
[0130] U primerima izvođenja predmetne objave, treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje se pomoću sledeće formule:
fra.chri = 2*(chri.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja. Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0131] U primerima izvođenja predmetne objave, određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK dodatno uključuje: (a) određivanje odnosa treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i (b) određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima himeru u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa utvrđenog u (a) sa mnoštvom unapred određenih pragova. Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0132] U primerima izvođenja predmetne objave, mnoštvo unapred određenih pragova uključuje najmanje jedan odabran od:
sedmog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan monozom,
osmog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je monozomna himera,
devetog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je normalan,
desetog praga, određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan trizom.
[0133] Određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan monozom, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od sedmog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja monozomna himera, ukoliko odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od sedmog praga i nije veći od osmog praga;
4
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja normalan, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od osmog praga i manji od devetog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja trizomna himera, ukoliko odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od devetog praga i nije veći od desetog praga; i
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan trizom, ukoliko je odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od desetog praga.
[0134] U primerima izvođenja predmetne objave, sedmi prag je veći od -1 i manji od 0, na primer -0,85;
osmi prag je veći od sedmog praga i manji od 0, na primer -0,3;
deveti prag je veći od 0 i manji od 1, na primer 0,3;
deseti prag je veći od devetog praga i manji od 1, na primer 0,85.
[0135] Na taj način, može se analizirati da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na specifičan hromozom sa dodatno poboljšanom efikasnošću.
[0136] Takođe se sada objavljuje, ali ne formira deo pronalaska za koji se zahteva zaštita patenta, sistem za detektovanje fetalne himere kao što je prethodno navedeno. Sistem uključuje:
uređaj za određivanje prve frakcije slobodne fetalne DNK, koji je ovde prethodno navedeni uređaj za određivanje frakcije slobodnih nukleinskih kiselina u biološkom uzorku, i konfigurisan da sekvencira slobodne nukleinske kiseline sadržane u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja, i konfigurisan da odredi prvu frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja;
uređaj za određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK, konfigurisan da odredi treću frakciju slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i
uređaj za određivanje himere, konfigurisan da odredi da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i treće frakcije slobodne fetalne DNK.
[0137] Takav sistem za detektovanje fetalne himere može dodatno da uključuje:
jedinicu za određivanje odnosa, konfigurisanu da odredi odnos treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i
jedinicu za poređenje, konfigurisanu da uporedi odnos određen pomoću jedinice za određivanje odnosa sa mnoštvom unapred određenih pragova, kako bi se odredilo da li fetus koji je predmet detektovanja ima himeru u odnosu na unapred određeni hromozom.
[0138] U dopunskom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje postupak za detektovanje fetalne himere koji uključuje:
izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom, kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja i određivanje odatle frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kao prve frakcije slobodne fetalne DNK postupkom iz pronalaska kao što je ovde prethodno opisano;
određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22;
određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečnu vrednost procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
određivanje L skora hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, a predstavlja stepen slobode i fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK;
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa trećom pravom linijom gde je T = unapred određeni jedanaesti prag i četvrtom pravom linijom gde je L = unapred određeni dvanaesti prag, kada T skor nije veći od 0,
pri čemu se određuje da fetus ima kompletan monozom ili monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da fetus ima monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; i
određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja,
prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa petom pravom linijom gde je T = unapred određeni trinaesti prag i šestom pravom linijom gde je L = unapred određeni četrnaesti prag, kada je T skor veći od 0,
pri čemu se određuje da fetus ima kompletan trizom ili trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da fetus ima trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom, se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; i određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant, tako da se rezultat ne usvaja.
[0139] Opciono, jedanaesti prag i trinaesti prag su svaki nezavisno 3, i dvanaesti prag i četrnaesti prag su svaki nezavisno 1.
[0140] Na taj način, efikasno se mogu analizirati situacije fetalne himere.
[0141] Treba napomenuti da izraz "normalan muški fetus/ženski fetus/fetus" znači da je hromozom fetusa normalan, na primer, "normalan muški fetus" označava muški fetus sa normalnim hromozomima. Štaviše, "normalan muški fetus/ženski fetus/fetus" može da označava jedan fetus ili blizance, na primer, "normalan muški fetus" može biti normalan pojedinačni fetus ili normalni blizanci; "normalan fetus" niti ograničava pol fetusa niti ograničava da fetus bude pojedinačan fetus ili blizanci.
[0142] Primeri izvođenja predmetne objave biće detaljno opisani u nastavku sa pozivanjem na primere, ali oni sa iskustvom u struci treba da podrazumevaju da se sledeći primeri upotrebljavaju samo da ilustruju predmetnu objavu, stoga se neće tumačiti da ograničavaju obim predmetne objave. Primer u kom specifično stanje nije specificirano biće sproveden pod normalnim uslovima ili uslovima koje preporučuje proizvođač. Reagensi ili instrumenti bez naznačenog proizvođača su konvencionalni proizvodi dostupni na tržištu.
Primer 1
[0143] Frakcije slobodne fetalne DNK u uzorcima plazme dobijenim od 11 trudnica koje su predmet detektovanja procenjene su u skladu sa pronalaskom na sledeći način.
1) Sakupljanje i tretman uzoraka
[0144] Uzorci periferne krvi od 2 ml, uzeti tokom trudnoće od svake od 11 trudnica koje su predmet detektovanja i 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse, podvrgnuti su separaciji plazme, kako bi se dobio uzorak plazme svake trudnice.
2) Konstruisanje biblioteke
[0145] Biblioteka je konstruisana u skladu sa zahtevima za konstrisanje biblioteke plazme kompanije Complete Genomics Inc.
3) Sekvenciranje
[0146] Proces sekvenciranja sproveden je strogo prateći standardnu operativnu proceduru kompanije Complete Genomics Inc.
4) Analiza podataka
[0147] Distribucija po dužini fragmenata DNK analizirana je očitavanjima dobijenim u sekvenciranju sparenih krajeva; proces je bio kao što je pokazano na Sl. 1. Specifični koraci su bili sledeći:
a) Izračunate su dužine fragmenata DNK u uzorku periferne krvi dobijenom od svake od 11 trudnica koje su predmet detektovanja i 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse. Specifično, 19 bp na jednom kraju svakog jedinstveno mapiranog očitavanja i 12 bp na drugom kraju svakog jedinstveno mapiranog očitavanja odabrano je da se odredi početna i krajnja pozicija koja odgovara referentnom genomu jedinstveno mapiranog očitavanja, i stoga je dužina fragmenta DNK dobijena na osnovu početne i krajnje pozicije koja odgovara referentnom genomu jedinstveno poravnatog očitavanja.
b) Za uzorak periferne krvi dobijen od svake od 37 trudnica za koje se zna da imaju muški fetus, dobijeno je mnoštvo opsega okvira (opsega dužine) pomeranjem okvira u određenoj dužini okvira u skladu sa određenom veličinom koraka; izračunat je procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira, tj. procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu dužine. Treba napomenuti da je broj molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira, tj. distribuiranih u svakom opsegu dužine, podeljen ukupnim brojem molekula DNK, definisan kao procenat molekula DNK prisutnih u svakom opsegu okvira. Na primer, 1bp, 5bp, 10bp ili 15bp može se uzeti kao okvir i bilo koja veličina odabrana od 1bp do dužine okvira može se uzeti kao veličina koraka. Specifično, kao primer, ukoliko je 5bp uzeto kao okvir i 2bp uzeto kao veličina koraka, onda se mogu dobiti distribucije molekula DNK u [1bp,5bp], [2bp,6bp], [4bp,8bp], [6bp,10bp] i tako dalje. Kao drugi primer, ukoliko je 5bp uzeto kao okvir i 5bp uzeto kao veličina koraka, onda se mogu dobiti distribucije molekula DNK u [1bp,5bp], [6bp,10bp], [11bp, 15bp] i tako dalje.
c) Jedan ili više opsega je/su odabrani, u kojima su procenti prisutnih molekula DNK za uzorke periferne krvi dobijene od 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse bili u snažnoj korelaciji sa poznatom fetalnom frakcijom. Za određeni opseg dužine, frakcije slobodne fetalne DNK u uzorcima periferne krvi dobijenim od 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse procenjene su pomoću hromozoma Y (za specifičnan postupak procene može se pozvati na Jiang et al. Noninvasive Fetal Trisomy (NIFTY) test: an advanced noninvasive prenatal diagnosis methodology for fetal autosomal and sex chromosomal aneuploidies. BMC Med Genomics. 2012 Dec 1;5:57 i izračunat je koeficijent korelacije između svake frakcije slobodne fetalne DNK i procenta molekula DNK dužine koje potpada u M. Dodatno, odabran je opseg dužine M sa maksimalnom apsolutnom vrednošću koeficijenta korelacije, na primer, M=185∼204bp, koeficijent korelacije R=-0,87, kao što je pokazano na Sl. 13; ili M=121∼150bp, koeficijent korelacije R=-0,6199.
d) Određen je funkcionalni odnos između procenta molekula DNK u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice, prisutnih u opsegu dužine M i frakcije slobodne fetalne DNK (zabeleženo kao d). Specifično, u odnosu na gornjih 37 uzoraka sa poznatim frakcijama slobodne fetalne DNK d (uzorci dobijeni od 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse), prikazan je u grafičkom formatu grafikon linearnog fitovanja upotrebom procenata pi(i=1, 2, ..., 37) molekula DNK prisutnih u opsegu dužine 185∼204bp i frakcija slobodne fetalne DNK di(i=1, 2, .., 37), tako da je dobijena formula odnosa između njih: d-a*p+b, gde je d=0,0334*p+1,6657.
e) Distribucija dužine fragmenata DNK i procenat molekula DNK prisutnih u M dobijeni su za svaki uzorak dobijen od 11 trudnica koje su predmet detektovanja. Procenat p fragmenata DNK prisutnih u opsegu dužine 185bp~204bp dobijen je za svaki uzorak dobijen od trudnica koje su predmet detektovanja, i rezultati su pokazani u Tabeli 1 u nastavku.
f) Procenjene su frakcije slobodne fetalne DNK u uzorcima koji su predmet detektovanja. Frakcija slobodne fetalne DNK djsvakog uzorka koji je predmet detektovanja izračunata je direktno u skladu sa procentom pj(j je oznaka uzorka koji je predmet detektovanja) od fragmenata DNK prisutnih u opsegu dužine 185bp∼204bp dobijenim kao prethodno za svaki uzorak koji je predmet detektovanja i formulom odnosa d=a*p+b.
g) Procenjeni rezultati frakcija slobodne fetalne DNK u uzorcima koji su predmet detektovanja pokazani su u Tabeli 1; za uzorke dobijene od 37 trudnica za koje se zna da imaju muške fetuse, frakcije slobodne fetalne DNK koje su procenjene pomoću chrY bile su u osnovi u skladu sa onim dobijenim pomoću postupka iz pronalaska.
4
Tabela 1
Primer 2:
[0148] Određivanje pola blizanaca i detekcija aneuploidije hromozoma blizanaca izvedeni su upotrebom uzoraka periferne krvi dobijenih od 11 trudnica sa blizancima kao što je opisano u Primeru 1, u skladu sa prethodno ovde objavljenim postupcima za određivanje pola blizanaca i određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca i na osnovu rezultata frakcija slobodne fetalne DNK dobijenih u Primeru 1.
1. Određivanje pola fetusa trudnice koja je predmet detektovanja
[0149] Pol svakog fetusa od 11 trudnica koje su predmet detektovanja određen je na osnovu rezultata frakcija slobodne fetalne DNK određenih u Primeru 1 i u skladu sa sledećim koracima:
a) fra.chry je izračunat pomoću hromozoma Y;
b) fra.size je procenjena pomoću razlika unutar unapred određenog regiona između majke i fetusa;
c) Standard određivanja:
I. Ukoliko je vrednost fra.chry/fra.size manja od 0,35, oba fetusa blizanaca su ženski;
II. Ukoliko je greška! Nije pronađen referentni izvor. Ukoliko vrednost fra.chry/fra.size nije manja od 0,35 i nije veća od 0,7, blizanci uključuju muški fetus i ženski fetus;
III. Ukoliko je greška! Nije pronađen referentni izvor. Ukoliko je vrednost fra.chry/fra.size veća od 0,7, oba fetusa blizanaca su muška.
[0150] Rezultati su pokazani u tabeli u nastavku:
Rezultati detekcije pola fetusa od 11 trudnica koje su predmet detektovanja
1. Određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca pomoću fetalnih frakcija
[0151] Aneuploidija hromozoma blizanaca od 11 trudnica koje su predmet detektovanja određena je pomoću fetalnih frakcija, na osnovu rezultata frakcija slobodne fetalne DNK određenih u Primeru 1 i u skladu sa sledećim koracima:
a) fra.chry je izračunat pomoću hromozoma i (i=13,18,21);
b) fra.size je procenjena pomoću razlika unutar unapred određenog regiona između majke i fetusa;
c) Standard određivanja:
I. Ukoliko je greška! Nije pronađen referentni izvor. Ukoliko je vrednost fra.chry/fra.size manja od 0,35, hromozom i kod oba fetusa blizanaca je normalan; II. Ukoliko je greška! Nije pronađen referentni izvor. Ukoliko vrednost fra.chry/fra.size nije manja od 0,35 i nije veća od 0,7, hromozom i kod jednog fetusa blizanaca je trizom i kod drugog fetusa blizanaca je normalan;
4
III. Ukoliko je greška! Nije pronađen referentni izvor. Ukoliko je vrednost fra.chry/fra.size veća od 0,7, hromozom i kod oba fetusa blizanaca je trizom.
[0152] Rezultati su pokazani u tabeli u nastavku:
Rezultati određivanja aneuploidije hromozoma blizanaca od 11 trudnica koje su predmet detektovanja pomoću fetalnih frakcija
�
� 2. Određivanje aneuploidije hromozoma blizanaca trudnice koja je predmet detektovanja pomoću T skora i L skora
[0153] Aneuploidija hromozoma blizanaca od 11 trudnica koje su predmet detektovanja određena je pomoću T skora i L skora, na osnovu rezultata frakcija slobodne fetalne DNK određenih u Primeru 1 i u skladu sa sledećim koracima:
a) Sekvenciranje celog genoma (WGS): uzorak koji je predmet detektovanja podvrgnut je sekvenciranju celog genoma upotrebom Illumina platforme visoke propusnosti. b) Dobijene su informacije o poziciji efektivnih očitavanja: očitavanja test uzorka jedinstveno su mapirana na sekvencu referentnog genoma hg19 kako bi se dobila informacija o poziciji, koja odgovara referentnom genomu, jedinstveno mapiranih očitavanja.
c) Dobijen je procenat efektivnih očitavanja: Dobijen je procenat efektivnih očitavanja u svakom hromozomu u odnosu na ukupna efektivna očitavanja dobijena u b).
d) GC korekcija:
Sadržaji ER i GC svakog hromozoma fitovani su upotrebom poznatih podataka dobijenih iz normalnih uzoraka kako bi se dobila formula odnosa: ERi= fi(GCi)+ εi, i izračunata je srednja vrednost od ER. Za uzorak koji treba analizirati, ER vrednost posle korekcije izračunata je u skladu sa prethodnom formulom odnosa i ER i GC uzorka.
e) T skor je izračunat: Ti= (xi-μi)/σi
gde je i : serijski broj hromozoma (i=13,18,21);
xi: procenat efektivnih očitavanja hromozoma i u analitičkom uzorku; μi: prosečan procenat efektivnih očitavanja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka;
σi: standardna devijacija procenata efektivnih očitavanja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka;
4
f) L skor je izračunat:
L skor hromozoma i određen je u skladu sa formulom:
Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, a predstavlja stepen slobode, fra predstavlja prvu frakciju slobodne fetalne DNK određenu pomoću postupka iz Primera 1.
g) Dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T=3 i drugom pravom linijom gde je L=0,8 (određeno je da uzorak sa fetalnom frekcijom <5% ne ispunjava kontrolu kvaliteta), detalji su opisani na sledeći način:
I. Određeno je da oba fetusa blizanaca imaju trizom ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L>0,8) koji padaju u prvi kvadrant;
II. Određeno je da jedan fetus blizanaca ima trizom i određeno je da je drugi fetus blizanaca normalan ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L≤0,8) koji padaju u drugi kvadrant;
III. Određeno je da su oba fetusa blizanaca normalna ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L≤0,8) koji padaju u treći kvadrant;
IV. Određeno je da su blizanci doveli do niske fetalne frakcije ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L>0,8) koji padaju u četvrti kvadrant; takav uzorak nije ispunio kontrolu kvaliteta.
[0154] Dijagrami sa četiri kvadranta prikazani u grafičkom formatu sa T skorovima i L skorovima za 11 testiranih uzoraka pokazani su na Slikama 14 do kraja. Sa ovih slika može se videti da je aneuploidija hromozoma blizanaca od 11 trudnica koje su predmet detektovanja, određena pomoću T skora i L skora u skladu sa onom određenom u koraku 2 pomoću fetalne frakcije.
4
Primer 3: Detekcija himere
[0155] U sledećim primerima, smeša fragmenata DNK dobijenih iz abortiranog tkiva i plazme dobijene od žene koja nije trudna u određenoj proporciji upotrebljena je za simulaciju uzorka dobijenog od trudnice. Abnormalnost broja hromozoma (trizom, kompletan monozom, trizomna himera, monozomna himera) fetusa (muškog pola) detektovana je u skladu sa sledećim postupkom, koji uključuje sledeće korake.
1) Sekvenciranje celog genoma (WGS): uzorak koji je predmet detektovanja podvrgnut je sekvenciranju celog genoma upotrebom platforme visoke propusnosti.
2) Dobijene su informacije o poziciji efektivnih očitavanja: očitavanja test uzorka jedinstveno su poravnata sa sekvencom referentnog genoma kako bi se dobila informacija o poziciji, koja odgovara referentnom genomu, jedinstveno mapiranih očitavanja.
3) Dobijeni su frakcija jedinstveno mapiranih očitavanja u svakom hromozomu i procenat broja guanina (G baze) i citozina (C baze) jedinstveno mapiranih očitavanja u odnosu na ukupan broj baza u svakom hromozomu: dobijeni su procenat broja efektivnih očitavanja u svakom hromozomu u uzorku koji je predmet detektovanja u odnosu na ukupan broj efektivnih očitavanja i procenat broja G i C baza u efektivnim očitavanjima u svakom hromozomu u odnosu na ukupan broj baza, upotrebom informacije o poziciji i informacije o bazi efektivnih očitavanja.
4) Izračunata je frakcija DNK pomoću hromozoma i, koji je izračunat kao fra.chri,
fra.chri = 2*(chrt.ER%/adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22;
chri.ER% : ER% (skraćeno za stopu efektivnog očitavanja, procenat jedinstveno mapiranih očitavanja) hromozoma i u uzorku;
adjust.chri.ER% : teoretska vrednost ER% hromozoma i u normalnom uzorku;
5) Fetalna frakcija je izračunata pomoću hromozoma Y, koji je izračunat kao fra.chry;
fra.chry = (chry.ER% - Female.chry.ER%)/(Man.chry.ER%-Female.chry.ER%)*100%, gde je chry.ER% : ER% (skraćeno za stopu efektivnog očitavanja, procenat jedinstveno mapiranih očitavanja) hromozoma Y u uzorku koji je predmet detektovanja;
4
Female.chry.ER% : prosek ER% hromozoma Y u uzorku koji je predmet detektovanja dobijenom od trudnice sa ženskim fetusom;
Man.chry.ER% : prosek ER% hromozoma Y u uzorku koji je predmet detektovanja dobijenom od muškarca.
6) Standard određivanja:
I. Ukoliko je fra.chri / fra.chry < A1 (A1 je određena konstanta, i A1>-1, kao što je -0,85), hromozom i fetusa je kompletan monozom;
II. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [A1,A2] (A1 i A2 su određene konstante, i -1<A1<A2<0, kao što je [-0,85,-0,3]), hromozom i fetusa je monozomna himera; III. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [A2, A3] (A2 i A3 su određene konstante, i A2<0<A3, kao što je [-0,3,0,3]), hromozom i fetusa je normalan;
IV. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [A3,A4] (A3 i A4 su određene konstante, i 0<A3<A4<1, kao što je [0,3,0,85]), hromozom i fetusa je trizomna himera;
V. Ukoliko je fra.chri / fra.chry > A4 (A4 je određena konstanta, kao što je 0,85), hromozom i fetusa je kompletan trizom.
[0156] Aneuploidija hromozoma ispitivana je u 19 uzoraka (M1"'M19) od kojih je svaki bio smeša fragmenata DNK dobijenih iz abortiranog tkiva i plazme dobijene od žene koja nije trudna (detalji pokazani u tabeli A) i 2 uzorka plazme (N1, N2) respektivno dobijena od 2 trudnice sa muškim fetusom (muški fetus jedne trudnice imao je T18 himeru, i muški fetus druge trudnice imao je T21 himeru).
1) Sakupljanje i tretman uzoraka
[0157] Za separaciju plazme ekstrahovano je 2 ml periferne krvi.
2) Konstruisanje biblioteke
[0158] Biblioteka je konstruisana u skladu sa zahtevima za konstruisanje biblioteke plazme kompanije Complete Genomics Inc.
3) Sekvenciranje
[0159] Proces sekvenciranja sproveden je strogo prateći standardnu operativnu proceduru kompanije Complete Genomics Inc.
4) Analiza podataka
[0160]
a) Sekvenciranje celog genoma (WGS): uzorak koji je predmet detektovanja podvrgnut je sekvenciranju celog genoma upotrebom platforme visoke propusnosti (dužine svih slobodnih molekula DNK dobijene su sekvenciranjem jednog kraja ili sekvenciranjem sparenih krajeva, što je bilo važno. Bilo je potrebno da se celokupni slobodni molekul DNK sekvencira sekvenciranjem jednog kraja)
b) Dobijene su informacije o poziciji efektivnih očitavanja: očitavanja test uzorka jedinstveno su poravnata sa sekvencom referentnog genoma kako bi se dobila informacija o poziciji, koja odgovara referentnom genomu, jedinstveno mapiranih očitavanja.
c) Dobijen je procenat efektivnih očitavanja: Dobijen je procenat efektivnih očitavanja u svakom hromozomu u odnosu na ukupna efektivna očitavanja dobijena u b).
d) GC korekcija:
Sadržaji ER i GC svakog hromozoma fitovani su upotrebom poznatih podataka dobijenih iz normalnih uzoraka kako bi se dobila formula odnosa: ERi= fi(GCi)+ εi, i izračunata je srednja vrednost od ER. Za uzorak koji treba analizirati, ER vrednost posle korekcije izračunata je u skladu sa prethodnom formulom odnosa i ER i GC uzorka.
e) fra.chri je izračunat pomoću hromozoma i (i=13,18,21);
f) fra.chry je izračunat pomoću hromozoma Y;
g) fra.size je izračunata pomoću postupka za određivanje frakcije slobodne fetalne DNK iz predmetne objave;
h) T skor je izračunat: Ti= (xi-μi)/σi
1
gde je i : serijski broj hromozoma (i=1,2...22);
xi: procenat efektivnih očitavanja hromozoma i u analitičkom uzorku;
μi: prosečan procenat efektivnih očitavanja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka;
σi: standardna devijacija procenata efektivnih očitavanja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka;
i) L skor je izračunat:
prvo je izračunata T2 vrednost: T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi,
zatim je izračunat L skor: Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)),
gde d(Ti,a) i d(T2i,a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, a predstavlja stepen slobode, fra predstavlja fra.chry ili fra.size.
♦ Aneuploidija hromozoma iz uzorka koji je predmet detektovanja određena je pomoću fra.chry koja je procenjena pomoću hromozoma Y (kao što je pokazano u tabeli A).
a) Standard određivanja:
I. Ukoliko je fra.chri / fra.chry <-0,85, hromozom i fetusa je kompletan monozom;
II. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [-0,85,-0,3], hromozom i fetusa je monozomna himera;
III. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [-0,3,0,3], hromozom i fetusa je normalan;
IV. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [0,3,0,85], hromozom i fetusa je trizomna himera;
V. Ukoliko je fra.chri / fra.chry >0,85, hromozom i fetusa je kompletan trizom.
♦ Aneuploidija hromozoma iz uzorka koji je predmet detektovanja određena je pomoću T skora i L skora (fra.chry je procenjena pomoću hromozoma Y) (kao što je pokazano u tabeli B)
2
a) Dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu na osnovu T skorova i L skorova;
b) Kada je T≤0, dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu sa T kao vertikalnom koordinatom i apsolutnom vrednošću L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa pravom linijom gde je T=3 i pravom linijom gde je L=1 (određeno je da uzorak sa fetalnom frakcijom <5% ne ispunjava kontrolu kvaliteta),
I. Određeno je da fetus ima monozom ili monozomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L>1) koji padaju u prvi kvadrant;
II. Određeno je da fetus ima monozomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L≤1) koji padaju u drugi kvadrant;
III. Određeno je da je fetus normalan ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L≤1) koji padaju u treći kvadrant;
IV. Određeno je da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L>1) koji padaju u četvrti kvadrant; takav uzorak nije ispunio kontrolu kvaliteta.
kada je T>0, dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa pravom linijom gde je T=3 i pravom linijom gde je L=0,8 (određeno je da uzorak sa fetalnom frakcijom <5% ne ispunjava kontrolu kvaliteta),
I. Određeno je da fetus ima trizom ili trizomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L>1) koji padaju u prvi kvadrant;
II. Određeno je da fetus ima trizomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L≤1) koji padaju u drugi kvadrant;
III. Određeno je da je fetus normalan ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L≤1) koji padaju u treći kvadrant;
IV. Određeno je da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L>1) koji padaju u četvrti kvadrant; takav uzorak nije ispunio kontrolu kvaliteta.
♦ Aneuploidija hromozoma iz uzorka koji je predmet detektovanja određena je pomoću fra.size koja je procenjena postupkom za određivanje frakcije slobodne fetalne DNK iz predmetne objave (kao što je pokazano u tabeli C)
b) Standard određivanja:
I. Ukoliko je fra.chri / fra.chry <-0,85, hromozom i fetusa je kompletan monozom;
II. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [-0,85,-0,3], hromozom i fetusa je monozomna himera;
III. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [-0,3,0,3], hromozom i fetusa je normalan; IV. Ukoliko je fra.chri / fra.chry ∈ [0,3,0,85], hromozom i fetusa je trizomna himera;
V. Ukoliko je fra.chri / fra.chry >0,85, hromozom i fetusa je kompletan trizom.
♦ Aneuploidija hromozoma iz uzorka koji je predmet detektovanja određena je pomoću T skora i L skora (fra.size je procenjena postupkom za određivanje frakcije slobodne fetalne DNK iz predmetne objave) (kao što je pokazano u tabeli D, i na Sl.2)
a) Dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu na osnovu T skorova i L skorova;
b) Kada je T≤0, dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu sa T kao vertikalnom koordinatom i apsolutnom vrednošću L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa pravom linijom gde je T=3 i pravom linijom gde je L=1 (određeno je da uzorak sa fetalnom frakcijom <5% ne ispunjava kontrolu kvaliteta),
4
I. Određeno je da fetus ima monozom ili monozomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L>1) koji padaju u prvi kvadrant;
II. Određeno je da fetus ima monozomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L≤1) koji padaju u drugi kvadrant;
III. Određeno je da je fetus normalan ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L≤1) koji padaju u treći kvadrant;
IV. Određeno je da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L>1) koji padaju u četvrti kvadrant; takav uzorak nije ispunio kontrolu kvaliteta;
Kada je T>0, dijagram sa četiri kvadranta prikazan je u grafičkom formatu sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa pravom linijom gde je T=3 i pravom linijom gde je L=1 (određeno je da uzorak sa fetalnom frakcijom <5% ne ispunjava kontrolu kvaliteta),
I. Određeno je da fetus ima trizom ili trizomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L>1) koji padaju u prvi kvadrant;
II. Određeno je da fetus ima trizomnu himeru ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T>3, L≤1) koji padaju u drugi kvadrant;
III. Određeno je da je fetus normalan ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L≤1) koji padaju u treći kvadrant;
IV. Određeno je da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko je određeno da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor (T≤3, L>1) koji padaju u četvrti kvadrant; takav uzorak nije ispunio kontrolu kvaliteta.
[0161] U ovom primeru izvođenja, negativan uzorak je bio uzorak plazme dobijen od normalne žene koja nije bila trudna; pozitivan uzorak je pripremljen mešanjem fragmenata DNK koji su dobijeni nasumičnim razbijanjem DNK iz abortiranog tkiva u skladu sa veličinom u opsegu od 150bp do 200bp i plazme dobijene od normalne žene koja nije bila trudna; (T21, T18 svaki predstavlja muški fetus; T13 predstavlja ženski fetus); pozitivan himerni uzorak je pripremljen mešanjem fragmenata DNK iz tkiva placente (koji su dobijeni nasumičnim razbijanjem DNK iz tkiva placente u skladu sa veličinom u opsegu od 150bp do 200bp), fragmenata DNK kineske ćelijske linije (koji su dobijeni nasumičnim razbijanjem DNK iz kineske ćelijske linije u skladu sa veličinom u opsegu od 150bp do 200bp) i plazme dobijene od normalne žene; (T21, T18 svaki predstavlja muški fetus; T13 predstavlja ženski fetus).
�
�
�
[0162] Pozivanje duž ove specifikacije na "primer izvođenja", "neke primere izvođenja", "jedan primer izvođenja", "sledeći primer", "primer", "specifičan primer", ili "neke primere", znači da su posebno svojstvo, struktura, materijal, ili karakteristika opisani u vezi sa primerom izvođenja ili primerom uključeni u najmanje jedan primer izvođenja ili primer iz predmetne objave. Stoga, pojavljivanje fraza kao što su "u nekim primerima izvođenja", "u jednom primeru izvođenja", "u primeru izvođenja", "u sledećem primeru", "u primeru", "u specifičnom primeru", ili "u nekim primerima", na različitim mestima duž ove specifikacije ne označava nužno isti primer izvođenja ili primer iz predmetne objave. Štaviše, posebna svojstva, strukture, materijali, ili karakteristike mogu se kombinovati na bilo koji pogodan način u jednom ili više primera izvođenja ili primera.

Claims (26)

Patentni zahtevi
1. Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice, naznačen time što sadrži:
(i) izvođenje sekvenciranja na slobodnim nukleinskim kiselinama sadržanim u uzorku kako bi se dobio rezultat sekvenciranja koji se sastoji od mnoštva podataka sekvenciranja;
(ii) određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u uzorku na osnovu rezultata sekvenciranja; i
(iii) određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg, pri čemu se navedeni unapred određeni opseg određuje pre koraka (i) pomoću sledećih koraka:
(a) određivanje dužina slobodnih nukleinskih kiselina u mnoštvu kontrolnih uzoraka periferne krvi trudnica u svakom od kojih se zna frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina;
(b) postavljanje mnoštva kandidata opsega dužine i određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine;
(c) određivanje koeficijenta korelacije za svakog kandidata opsega dužine na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog od mnoštva kontrolnih uzoraka prisutnih u svakom kandidatu opsega dužine i poznate frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u svakom od kontrolnih uzoraka; i
(d) određivanje najmanje jednog kandidata opsega dužine ili kombinacije kandidata opsega dužine kao unapred određenog opsega na osnovu maksimalnog koeficijenta korelacije.
2. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg u uzorku na osnovu rezultata sekvenciranja dodatno sadrži:
(a) poravnanje rezultata sekvenciranja sa referentnim genomom, tako da se konstruiše skup podataka koji se sastoji od mnoštva jedinstveno mapiranih očitavanja, gde svako očitavanje u skupu podataka može biti mapirano na jednu poziciju referentnog genoma;
(b) određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka; i
(c) određivanje broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg.
3. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka dadodatno sadrži:
određivanje dužine svakog očitavanja jedinstveno mapiranog u odnosu na referentni genom kao dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara očitavanju.
4. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačen time što su slobodne nukleinske kiseline u uzorku sekvencirane sekvenciranjem sparenih krajeva i određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline koja odgovara svakom jedinstveno mapiranom očitavanju u skupu podataka dodatno sadrži:
određivanje pozicije koja odgovara referentnom genomu 5'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja za 5' kraj svakog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva; određivanje pozicije koja odgovara referentnom genomu 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline na osnovu podataka sekvenciranja na drugom kraju istog jedinstveno mapiranog očitavanja dobijenog u sekvenciranju sparenih krajeva; i određivanje dužine slobodne nukleinske kiseline na osnovu pozicija 5'-kraja i 3'-kraja slobodne nukleinske kiseline.
5. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg dodatno sadrži:
određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu na osnovu broja slobodnih nukleinskih kiselina dužine koja potpada u unapred određeni opseg; i
određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku, na osnovu procenta slobodnih nukleinskih kiselina prisutnih u unapred određenom opsegu u skladu sa unapred određenom funkcijom,
pri čemu se unapred određena funkcija određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka.
6. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što se unapred određena funkcija dobija pomoću sledećih koraka:
(i) određivanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu; i
(ii) fitovanje procenta slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu sa poznatom frakcijom slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina kako bi se odredila navedena funkcija; opciono pri čemu se procenat slobodnih nukleinskih kiselina dobijenih iz svakog kontrolnog uzorka prisutnih u unapred određenom opsegu fituje sa poznatom frakcijom slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina pomoću linearnog fitovanja.
7. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što je unapred određeni opseg 185 bp do 204 bp.
8. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 5, naznačen time što je unapred određena funkcija d=0,0334*p+1,6657, gde d predstavlja frakciju slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina, i p predstavlja procenat slobodne nukleinske kiseline prisutne u unapred određenom opsegu.
9. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačen time što su kontrolni uzorci uzorci periferne krvi dobijeni od trudnica sa normalnim muškim fetusom, u kojima frakcija slobodnih nukleinskih kiselina koje su slobodne fetalne nukleinske kiseline zna da se odredi pomoću hromozoma Y.
10. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se navedena frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina određuje u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima kao prva frakcija slobodne fetalne DNK i koji dodatno sadrži:
(a) određivanje druge frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja; i (b) određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK.
11. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 10, naznačen time što se navedena druga frakcija slobodne fetalne DNK određuje u skladu sa sledećom formulom:
gde fra.chry predstavlja navedenu drugu frakciju slobodne fetalne DNK, chry.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma Y u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; Female.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina koje su poravnate sa hromozomom Y u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan ženski fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; i Man.chry.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od hromozoma Y u uzorku periferne krvi dobijenom od zdravog čoveka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
12. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 10 ili patentnim zahtevom 11, naznačen time što određivanje pola blizanaca na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK dodatno sadrži:
(a) određivanje odnosa navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i
(b) određivanje pola blizanaca upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim prvim pragom i unapred određenim drugim pragom,
pri čemu se prvi prag određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju ženske blizance i drugi prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica za koje se zna da imaju muške blizance,
i pri čemu
određuje se da su oba fetusa blizanaca ženska ukoliko je odnos navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od prvog praga,
određuje se da su oba fetusa blizanaca muška ukoliko je odnos navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od drugog praga, i
određuje se da blizanci uključuju muški fetus i ženski fetus ukoliko je odnos navedene druge frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak prvom pragu ili drugom pragu, ili je između prvog praga i drugog praga.
13. Postupak kao što je zahtevano u patentnom zahtevu 12 naznačen time što je prvi prag 0,35 i drugi prag je 0,7.
14. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se navedena frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina određuje u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima kao prva frakcija slobodne fetalne DNK i koji dodatno sadrži:
(a) određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK, na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i
(b) određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK.
15. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačen time što se navedena treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje u skladu sa sledećom formulom:
fra.chri = 2*(chri.ER% / adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja navedenu treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog
1
hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalne blizance u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
16. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 14 ili patentnim zahtevom 15, naznačen time što određivanje da li bizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK dodatno sadrži:
(a) određivanje odnosa navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i
(b) određivanje da li blizanci koji su predmet detektovanja imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa određenog u (a) sa unapred određenim trećim pragom i unapred određenim četvrtim pragom,
i pri čemu se treći prag određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom i četvrti prag se određuje na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka dobijenih od trudnica sa blizancima za koje se zna da imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, i pri čemu
određuje se da oba fetusa blizanaca nemaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od trećeg praga,
određuje se da oba fetusa blizanaca imaju aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od četvrtog praga, i
2
određuje se da jedan fetus blizanaca ima aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom, dok se određuje da drugi fetus blizanaca nema aneuploidiju u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK jednak trećem pragu ili četvrtom pragu, ili je između trećeg praga i četvrtog praga.
17. Postupak kao što je zahtevano u patentnom zahtevu 1, naznačen time što je treći prag 0,35 i četvrti prag je 0,7.
18. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačen time što je unapred određeni hromozom najmanje jedan odabran od hromozoma 18, 21 i 23.
19. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se navedena frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina određuje u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa blizancima kao prva frakcija slobodne fetalne DNK i koji dodatno sadrži:
(a) određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; (b) određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
(c) određivanje L skora hromozoma i u skladu sa Li= log(d(Ti,a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti, a) i d(T2i, a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, gde a predstavlja stepen slobode, i fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK,
(d) prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T = unapred određeni peti prag i drugom pravom linijom gde je L = unapred određeni šesti prag,
pri čemu
određuje se da oba fetusa blizanaca imaju trizom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da jedan fetus blizanaca ima trizom i određuje se da je drugi fetus blizanaca normalan ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant; određuje se da su oba fetusa blizanaca normalna ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant, i
određuje se da su blizanci doveli do niske fetalne frakcije ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant tako da se rezultat ne usvaja.
20. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se navedena frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina određuje u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom kao prva frakcija slobodne fetalne DNK i koji dodatno sadrži:
(a) određivanje treće frakcije slobodne fetalne DNK na osnovu podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja; i
(b) određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK.
21. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 20, naznačen time što se navedena treća frakcija slobodne fetalne DNK određuje pomoću sledeće formule:
fra.chri = 2*(chri.ER% / adjust.chri.ER%-1)*100%, gde fra.chri predstavlja navedenu treću frakciju slobodne fetalne DNK, i predstavlja serijski broj unapred određenog hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; chri.ER% predstavlja procenat
4
podataka sekvenciranja poreklom od unapred određenog hromozoma u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja; adjust.chri.ER% predstavlja prosečan procenat podataka sekvenciranja slobodnih nukleinskih kiselina poreklom od unapred određenog hromozoma u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice za koju je unapred određeno da ima normalan fetus u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja.
22. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 20 ili patentnim zahtevom 21, naznačen time što određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima fetalnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom na osnovu prve frakcije slobodne fetalne DNK i navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK dodatno sadrži:
(a) određivanje odnosa navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK; i
(b) određivanje da li fetus koji je predmet detektovanja ima himeru u odnosu na unapred određeni hromozom upoređivanjem odnosa utvrđenog u (a) sa mnoštvom unapred određenih pragova.
23. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 22, naznačen time što mnoštvo unapred određenih pragova sadrži najmanje jedan odabran od:
sedmog praga određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan monozom,
osmog praga određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je monozomna himera,
devetog praga određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je normalan,
desetog praga određenog na osnovu mnoštva kontrolnih uzoraka sa unapred određenim hromozomom za koji se zna da je kompletan trizom,
i pri čemu
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan monozom ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK manji od sedmog praga; određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja monozomna himera ukoliko odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od sedmog praga i nije veći od osmog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja normalan ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od osmog praga i manji od devetog praga;
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja trizomna himera, ukoliko odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK nije manji od devetog praga i nije veći od desetog praga; i
određuje se da je unapred određeni hromozom fetusa koji je predmet detektovanja kompletan trizom, ukoliko je odnos navedene treće frakcije slobodne fetalne DNK prema prvoj frakciji slobodne fetalne DNK veći od desetog praga.
24. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 23, naznačen time što
sedmi prag je veći od -1 i manji od 0, na primer -0,85;
osmi prag je veći od sedmog praga i manji od 0, na primer -0,3;
deveti prag je veći od 0 i manji od 1, na primer 0,3; i
deseti prag je veći od devetog praga i manji od 1, na primer 0,85.
25. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačen time što se navedena frakcija slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina određuje u uzorku periferne krvi dobijenom od trudnice sa fetusom kao prva frakcija slobodne fetalne DNK i koji dodatno sadrži:
(a) određivanje frakcije xibroja podataka sekvenciranja poreklom od hromozoma i u rezultatu sekvenciranja u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, gde i predstavlja serijski broj hromozoma, i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22; (b) određivanje T skora hromozoma i u skladu sa Ti= (xi-μi)/σi, gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22, μipredstavlja prosečnu vrednost procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja, σipredstavlja standardnu devijaciju procenata podataka sekvenciranja hromozoma i odabranog kao referentni sistem u referentnoj bazi podataka u odnosu na ukupne podatke sekvenciranja,
(c) određivanje L skora hromozoma i u skladu sa
Li= log(d(Ti, a))/log(d(T2i,a)), gde i predstavlja serijski broj hromozoma i i je bilo koji ceo broj u opsegu od 1 do 22,
T2i= (xi-μi*(1+fra/2))/σi; d(Ti, a) i d(T2i, a) predstavljaju t funkciju gustine verovatnoće distribucije, gde a predstavlja stepen slobode, fra predstavlja navedenu prvu frakciju slobodne fetalne DNK;
(d) prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa trećom pravom linijom gde je T = unapred određeni jedanaesti prag i četvrtom pravom linijom gde je L = unapred određeni dvanaesti prag, kada T skor nije veći od 0,
pri čemu
određuje se da fetus ima kompletan monozom ili monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant; određuje se da fetus ima monozomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom, ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; i
određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant tako da se rezultat ne usvaja,
(e) prikazivanje u grafičkom formatu dijagrama sa četiri kvadranta sa T kao vertikalnom koordinatom i L kao horizontalnom koordinatom zoniranjem sa prvom pravom linijom gde je T = unapred određeni trinaesti prag i drugom pravom linijom gde je L = unapred određeni četrnaesti prag, kada je T skor veći od 0, pri čemu
određuje se da fetus ima kompletan trizom ili trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u prvi kvadrant;
određuje se da fetus ima trizomnu himeru u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u drugi kvadrant;
određuje se da je fetus normalan u odnosu na unapred određeni hromozom ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u treći kvadrant; i
određuje se da je fetus izazvao nisku fetalnu frakciju ukoliko se odredi da uzorak koji je predmet detektovanja ima T skor i L skor koji padaju u četvrti kvadrant tako da se rezultat ne usvaja.
26. Postupak u skladu sa patentnim zahtevom 25, naznačen time što su jedanaesti prag i trinaesti prag svaki nezavisno 3 i dvanaesti prag i četrnaesti prag su svaki nezavisno 1.
RS20220024A 2014-07-25 2015-07-24 Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i njihova upotreba RS62803B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410359726 2014-07-25
EP15825462.3A EP3178941B1 (en) 2014-07-25 2015-07-24 Method for determining the fraction of cell-free fetal nucleic acids in a peripheral blood sample from a pregnant woman and use thereof
PCT/CN2015/085109 WO2016011982A1 (zh) 2014-07-25 2015-07-24 确定生物样本中游离核酸比例的方法、装置及其用途

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62803B1 true RS62803B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=55162536

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220024A RS62803B1 (sr) 2014-07-25 2015-07-24 Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i njihova upotreba

Country Status (16)

Country Link
US (1) US20180082012A1 (sr)
EP (1) EP3178941B1 (sr)
KR (1) KR102018444B1 (sr)
CN (1) CN105296606B (sr)
AU (1) AU2015292020B2 (sr)
CA (1) CA2956105C (sr)
DK (1) DK3178941T3 (sr)
ES (1) ES2903103T3 (sr)
HR (1) HRP20220045T1 (sr)
HU (1) HUE059031T2 (sr)
PL (1) PL3178941T3 (sr)
RS (1) RS62803B1 (sr)
RU (1) RU2699728C2 (sr)
SG (1) SG11201700602WA (sr)
SI (1) SI3178941T1 (sr)
WO (1) WO2016011982A1 (sr)

Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012129363A2 (en) 2011-03-24 2012-09-27 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
ES2660989T3 (es) 2013-12-28 2018-03-27 Guardant Health, Inc. Métodos y sistemas para detectar variantes genéticas
SG11201805119QA (en) 2015-12-17 2018-07-30 Guardant Health Inc Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
EP3461274B1 (en) 2016-09-30 2020-11-04 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
HRP20240709T1 (hr) * 2017-01-24 2024-08-16 Bgi Genomics Co., Ltd. Postupak za određivanje udjela nukleinskih kiselina bez stanica iz unaprijed određenog izvora u biološkom uzorku
SG11201906397UA (en) * 2017-01-25 2019-08-27 Univ Hong Kong Chinese Diagnostic applications using nucleic acid fragments
AU2018244815A1 (en) * 2017-03-31 2019-10-31 Premaitha Limited Method of detecting a fetal chromosomal abnormality
US11535896B2 (en) * 2017-05-15 2022-12-27 Katholieke Universiteit Leuven Method for analysing cell-free nucleic acids
CN107239676B (zh) * 2017-05-17 2018-04-17 东莞博奥木华基因科技有限公司 一种针对胚胎染色体的序列数据处理装置
CN111051536A (zh) 2017-07-26 2020-04-21 香港中文大学 利用不含细胞的病毒核酸改善癌症筛选
CN108733979A (zh) * 2017-10-30 2018-11-02 成都凡迪医疗器械有限公司 Nipt的gc含量校准方法、装置及计算机可读存储介质
CN108060218A (zh) * 2017-11-14 2018-05-22 广州精科医学检验所有限公司 核酸测序文库中预定范围的核酸片段的筛选方法
DE202019005627U1 (de) 2018-04-02 2021-05-31 Grail, Inc. Methylierungsmarker und gezielte Methylierungssondenpanels
WO2020069350A1 (en) 2018-09-27 2020-04-02 Grail, Inc. Methylation markers and targeted methylation probe panel
WO2020160414A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Guardant Health, Inc. Compositions and methods for isolating cell-free dna
CN114945685B (zh) * 2020-01-17 2025-07-04 深圳华大生命科学研究院 确定胎儿核酸浓度的方法以及胎儿基因分型方法
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
WO2023010242A1 (zh) * 2021-08-02 2023-02-09 深圳华大生命科学研究院 估计无创产前基因检测数据中胎儿核酸浓度的方法和系统

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7645576B2 (en) * 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
US20130022973A1 (en) * 2010-01-15 2013-01-24 Hansen Carl L G Multiplex Amplification for the Detection of Nucleic Acid Variations
US9267174B2 (en) * 2010-10-26 2016-02-23 Stanford University Method of simultaneously screening for multiple genotypes and/or mutations
US9892230B2 (en) * 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
EP2728014B1 (en) 2012-10-31 2015-10-07 Genesupport SA Non-invasive method for detecting a fetal chromosomal aneuploidy
CN104093858B (zh) * 2012-11-13 2016-08-24 深圳华大基因医学有限公司 确定生物样本中染色体数目异常的方法、系统和计算机可读介质
CN103525939B (zh) * 2013-10-28 2015-12-02 博奥生物集团有限公司 无创检测胎儿染色体非整倍体的方法和系统
CN103923987A (zh) * 2014-04-01 2014-07-16 中山大学达安基因股份有限公司 一种基于高通量测序检测13、18、21三体综合征的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CA2956105A1 (en) 2016-01-28
PL3178941T3 (pl) 2022-02-14
EP3178941B1 (en) 2021-10-13
AU2015292020B2 (en) 2018-07-05
CA2956105C (en) 2021-04-27
RU2017105504A (ru) 2018-08-27
ES2903103T3 (es) 2022-03-31
US20180082012A1 (en) 2018-03-22
SI3178941T1 (sl) 2022-04-29
RU2699728C2 (ru) 2019-09-09
WO2016011982A1 (zh) 2016-01-28
CN105296606A (zh) 2016-02-03
HK1213601A1 (zh) 2016-07-08
KR102018444B1 (ko) 2019-09-04
HRP20220045T1 (hr) 2022-04-15
EP3178941A1 (en) 2017-06-14
RU2017105504A3 (sr) 2018-08-27
HUE059031T2 (hu) 2022-10-28
SG11201700602WA (en) 2017-03-30
KR20170036734A (ko) 2017-04-03
BR112017001481A2 (pt) 2017-12-05
CN105296606B (zh) 2019-08-09
EP3178941A4 (en) 2017-12-06
AU2015292020A1 (en) 2017-02-16
DK3178941T3 (da) 2022-01-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RS62803B1 (sr) Postupak za određivanje frakcije slobodnih fetalnih nukleinskih kiselina u uzorku periferne krvi trudnice i njihova upotreba
US20220093212A1 (en) Size-based analysis of fetal dna fraction in plasma
US11142799B2 (en) Detecting chromosomal aberrations associated with cancer using genomic sequencing
CN106795558B (zh) 检测胎儿亚染色体非整倍性和拷贝数变异
JP5938484B2 (ja) ゲノムのコピー数変異の有無を判断する方法、システム及びコンピューター読み取り可能な記憶媒体
JP6159336B2 (ja) 胎児の染色体異数性の診断
CA2948939A1 (en) Noninvasive detection of fetal genetic abnormality
Hahn et al. Determination of fetal chromosome aberrations from fetal DNA in maternal blood: has the challenge finally been met?
WO2015035555A1 (zh) 用于确定胎儿是否存在性染色体数目异常的方法、系统和计算机可读介质
TW201639967A (zh) 檢測胎兒基因資訊的方法、試劑盒、裝置和系統
CA3058551A1 (en) Method of detecting a fetal chromosomal abnormality
US11710565B2 (en) Method of detecting fetal chromosomal aneuploidy
WO2020119626A1 (zh) 一种无创产前检测胎儿是否患有遗传疾病的方法
HK1213601B (zh) 确定生物样本中游离核酸比例的方法、装置及其用途
BR112017001481B1 (pt) Método e dispositivo para a determinação de uma fração de ácidos nucleicos fetal livres de células em uma amostra de sangue periférico de uma mulher grávida, sistema para determinar o sexo de gêmeos, e sistema para determinação de uma aneuploidia cromossômica de gêmeos, sistema para detectar quimera fetal