RS62847B1 - Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka - Google Patents

Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka

Info

Publication number
RS62847B1
RS62847B1 RS20220051A RSP20220051A RS62847B1 RS 62847 B1 RS62847 B1 RS 62847B1 RS 20220051 A RS20220051 A RS 20220051A RS P20220051 A RSP20220051 A RS P20220051A RS 62847 B1 RS62847 B1 RS 62847B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nucleic acid
microparticle
linker
exemplary embodiments
domain
Prior art date
Application number
RS20220051A
Other languages
English (en)
Inventor
Jacob Berlin
Gregory COPELAND
Kathleen Elison
Hurik Muradyan
Original Assignee
Hope City
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=56789474&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS62847(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Hope City filed Critical Hope City
Publication of RS62847B1 publication Critical patent/RS62847B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/14—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support
    • C40B50/16—Solid phase synthesis, i.e. wherein one or more library building blocks are bound to a solid support during library creation; Particular methods of cleavage from the solid support involving encoding steps
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B70/00—Tags or labels specially adapted for combinatorial chemistry or libraries, e.g. fluorescent tags or bar codes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1065—Preparation or screening of tagged libraries, e.g. tagged microorganisms by STM-mutagenesis, tagged polynucleotides, gene tags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
    • C40B40/04—Libraries containing only organic compounds
    • C40B40/10—Libraries containing peptides or polypeptides, or derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Structural Engineering (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Signal Processing For Digital Recording And Reproducing (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Opis
OSNOV PRONALASKA
[0001] Broj molekula prikazanih čipovima koji se koriste za postupke skrininga i detekcije ograničen je sintetskim metodom čipa. Teorijski, split pool (razdvajanje i spajanje) sintezom moguće je stvoriti izuzetno velike biblioteke - ograničene samo brojem hemijskih koraka i brojem jedinstvenih gradivnih blokova upotrebljenih po koraku (tj. biblioteka za 5 koraka, koja koristi 100 jedinstvenih gradivnih blokova po koraku, teorijski bi dala hemijsku biblioteku od 100<5>ili 10 milijardi članova). Međutim, u praksi, strategije kodirane split pool sinteze suočavaju se sa brojnim praktičnim ograničenjima. Biblioteke koje se mogu dekodirati, ali se ne može vršiti njihov skrining, ili obrnuto, nisu od koristi. Strategija kodiranja može biti praktično ograničena u broju i tipu korišćenih hemijskih koraka ili gradivnih blokova. Platforma kodirane split pool biblioteke, koja zahteva velike čestice za dekodiranje (npr., preko radio-frekventnih oznaka ili masenom spektrometrijom) obično će morati da sadrži manje članova biblioteke nego slična biblioteka koja se može kreirati na manjim česticama. Ako testovi treba da se izvode na čestici, gustina liganda na svakoj čestici i površinsko hemijsko okruženje oko svakog liganda ne bi trebalo da interferiraju sa testom. Serijska priroda saopštenih strategija dekodiranja ograničava i broj "pogodaka" koji se mogu identifikovati isplativo u datom skriningu, i dakle može ograničiti veličinu biblioteke čiji se skrining vrši. Predmetni pronalazak bavi se ovim i drugim problemima u struci.
[0002] US 2006/0040286 odnosi se na postupke skrininga, na kompozicije i kitove za detektovanje prisustva ili odsustva jednog ili više ciljnih analita, npr. biomolekula, u uzorku.
[0003] WO 2011/143583 odnosi se na kompozicije i postupke za testiranje prisustva ciljnog analita u uzorku, uz korišćenje čvrste podloge.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] U jednom aspektu, obezbeđena je mikročestica imobilisana na čvrstoj podlozi, pri čemu je pomenuta mikročestica dodatno kovalentno prikačena za: (i) ligandski domen preko prvog linkera; i (ii) nukleinskokiselinski domen preko drugog linkera; pri čemu je pomenuti nukleinskokiselinski domen kodirajuća oznaka koja identifikuje pomenuti ligandski domen; pri čemu je pomenuti drugi linker odseciv i pomenuti prvi linker nije odseciv pod uslovom da je pomenuti drugi linker odseciv; i pomenuti prvi linker uključuje -C(O)NH- ili -NHC(O)-, i pomenuti drugi linker uključuje -C(O)O- ili - OC(O)-.
[0005] U drugom aspektu, obezbeđena je čvrsta podloga koja uključuje veliki broj bunarčića, pri čemu svaki od velikog broja bunarčića uključuje imobilisanu mikročesticu, pri čemu je pomenuta mikročestica kovalentno prikačena za: (i) ligandski domen preko prvog linkera; i (ii) nukleinskokiselinski domen preko drugog linkera; pri čemu je pomenuti nukleinskokiselinski domen kodirajuća oznaka koja identifikuje pomenuti ligandski domen; pri čemu je pomenuti drugi linker odseciv i pomenuti prvi linker nije odseciv pod uslovom da je pomenuti drugi linker odseciv; i pomenuti prvi linker uključuje -C(O)NH- ili -NHC(O)-, i pomenuti drugi linker uključuje -C(O)O- ili - OC(O)-; i pri čemu pomenuti ligandski domen može da se veže za ligandski vezivač koji se bira između proteina, smeše proteina, malog molekula, smeše malih molekula, elementa, smeše elemenata, sintetskog polimera, smeše sintetskih polimera, ili ćelijskog lizata.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0006]
SL. 1: Šematska ilustracija opšte strukture mikročestica upotrebljenih za kreiranje biblioteke. Varijacije u odnosima A, B, i C postižu se preko jedne ili više sintetskih transformacija primenjenih na polaznom materijalu ProMag 1 COOH serije čestica. Inicijalni ciljni odnosi postavljeni su relativnim odnosima smeša gradivnih blokova upotrebljenih za sklapanje površine čestice. Finalni dostignuti odnosi mere se kombinacijom TGA, LC/MS ili analizom odsečenih proizvoda na gelu, i testovima na čvrstoj fazi na bazi kolorimetrije ili fluorescencije. Poželjni opsezi: X ima koncentraciju od 0.1 do 100 nanomola/mg; 1%X≤ A ≤20%X; 40%X≤ B ≤99%X; 0%X≤ C ≤50%X; pri čemu je X A (tačka vezivanja molekula biblioteke), B (tačka vezivanja kodirajuće oznake) ili C (tačka imobilizacije srži).
SL. 2: Opšta šema za izvođenje kodirane, split pool sinteze; naglašava eksponencijalni porast hemijske raznovrsnosti koji se zapaža sa linearnim porastom broja hemijskih koraka i gradivnih blokova. Za opšti pregled, vidi: Czarnik, A. W. "Encoding methods for combinatorial chemistry," Curr. Opin. Chem. Biol. 1997, 1, 60-66. Primer: 100 gradivnih blokova, 6 split-pool ciklusa, 1×10<12>jedinstvenih članova, 600 hemijskih reakcija. n je broj split pool ciklusa, x je broj gradivnih blokova, jedinstveni članovi biblioteke = X<n>, hemijske reakcije = n<X>
SL. 3: Ilustracija hemijskih veza koje se formiraju i raskidaju tokom jednog ciklusa koraka kodirane sinteze uz korišćenje sinteze peptida kao kodiranih hemijskih reakcija. U koraku 1, Fmoc-protektovana amino-kiselina kupluje se sa slobodnim aminom na mikročestici, kuplovanjem amida. U koraku 2, nukleinskokiselinska oznaka koja nosi alkin i slobodni primarni amin kupluje se sa azidnom grupom na mikročestici, Huisgenovom adicijom katalisanom bakrom. U koraku 3, azidna grupa se kupluje sa primarnim aminom na nukleinskoj kiselini, kuplovanjem amida. U koraku 4 uklanja se Fmoc grupa koja protektuje amino grupu inkorporisane amino-kiseline. Proizvod posle koraka 4 pokazuje iste reaktivne komponente kao polazni materijal (pre koraka 1), ali sadrži dodatnu nukleinskokiselinsku oznaku i dodatnu amino-kiselinu. Za detalje reakcije, vidi materijale i postupke. Za detaljni primer pripremanja inicijalnih mikročestica za ortogonalnu sintezu, vidi materijale i postupke.
SL. 4: Šematska ilustracija povezivanja nukleinskokiselinskih oznaka u jednom od potencijalnih pristupa označavanja. U ovoj varijanti, tokom svakog koraka označavanja, koriste se sve tačke prikačinjanja oznake na mikročestici, a zatim se kreira ekvivalentna količina novih tačaka prikačinjanja oznake na krajevima novoprikačenih nukleinskokiselinskih oznaka. Dva koraka označavanja u ovom primeru dovela bi do stvaranja predominantno jedne populacije oligomera koji sadrži nukleinsku kiselinu na svakoj perlici, koja se sastoji od oznake 1 povezane sa oznakom 2. Zapaziti da se po dizajnu, svaka populacija oznaka može nezavisno dekodirati, tako da mogućnost dekodiranja zavisi samo od prisustva svake pojedinačne oznake - tj. mogućnost dekodiranja oznake 2 ne zavisi od toga da li je direktno prikačena za oznaku 1 i obrnuto - tako da se podgrupe perlica koje možda nisu prošle kompletnu konverziju u nekom koraku označavanja i dalje mogu dekodirati, dokle god su dovoljne količine svake oznake prisutne za dekodiranje.
SL. 5: Šematska ilustracija povezivanja nukleinskokiselinskih oznaka u jednom od potencijalnih pristupa označavanja. U ovoj varijanti, tokom svakog koraka označavanja, koristi se samo deo tačaka prikačinjanja oznake na mikročestici, za oznake. Kao što je pokazano, dva koraka označavanja u ovom primeru dovela bi na svakoj perlici do stvaranja dve populacije oligomera koji sadrže nukleinsku kiselinu - jedna populacija koja se sastoji od oznake 1 i jedna populacija koja se sastoji od oznake 2. Za četiri koraka označavanja, napravile bi se četiri jedinstvene populacije po perlici.
SL. 6: Šematska ilustracija povezivanja nukleinskokiselinskih oznaka u jednom od potencijalnih pristupa označavanja. U ovoj varijanti, tokom svakog koraka označavanja, koristi se samo deo tačaka prikačinjanja oznake na mikročesticama, a zatim se kreira ekvivalentna količina novih tačaka prikačinjanja oznake na krajevima novoprikačenih nukleinskokiselinskih oznaka. Dva koraka označavanja u ovom primeru dovela bi do stvaranja tri populacije oligomera koji sadrže nukleinsku kiselinu na svakoj perlici, oznaku 1, oznaku 2, i oligomer koji se sastoji od oznake 1 povezane sa oznakom 2. Zapaziti da se po dizajnu, svaka populacija oznaka može nezavisno dekodirati, tako da mogućnost dekodiranja svake oznake zavisi samo od prisustva svake pojedinačne oznake - tj. mogućnost dekodiranja oznake 2 ne zavisi od toga da li je direktno prikačena za oznaku 1 i obrnuto.
SL. 7: LC tragovi različitih intermedijera oznaka tokom jednog ciklusa označavanja i dodavanja novog elementa koji vezuje oznaku. Kako je pokazano promenama vremena retencije i masenih spektara, cikloadicione hemijske reakcije na čvrstoj fazi pretežno daju željeni proizvod. Posle amidnog kuplovanja na čvrstoj fazi, novog elementa koji vezuje oznaku, LC/MS analiza ukazuje na konverziju u željeni proizvod. Za uslove cikloadicije, uslove kuplovanja amida i uslove odsecanja, videti materijale i postupke.
SL. 8: Deo PEG-modifikovanih mikročestica funkcionalizuje se linkerom labilnim u kiselim uslovima i izlaže sintezi peptida na čvrstoj fazi u sedam koraka. Proizvod se odseca sa mikročestica korišćenjem TFA. TFA se uklanja i rezidua se analizira masenom spektrometrijom, pokazujući uspešnu sintezu željenog peptida.
SL. 9A-9B: Prikaz dva različita modaliteta imobilizacije biblioteke. Na SL.9A, slika na svetlom polju predstavlja deo mikročestica Podnosilaca, koje su kovalentno imobilisane na pločici obloženoj aktiviranim karboksimetildekstranom, preko formiranja amidne veze. Na SL. 9B desno je slika sa SEM dela mikročestica Podnosilaca, koje su nekovalentno imobilisane unutar posebno prilagođene mikrofabrikovane silicijumske pločice.
SL. 10: Mikročestice koje prolaze četiri ciklusa koraka kodiranja/označavanja (kako je prikazano na Šemi kodiranja na SL.6 mogu se uspešno dekodirati. Dve različite porcije mikročestica prolaze paralelno četiri ciklusa označavanja, kako je ilustrovano na SL.6. Svaka porcija mikročestica označava se jedinstvenim 18-merom u svakom koraku označavanja. Posle četiri ciklusa kodiranja, svaka porcija se izlaže nizu hibridizacionih rastvora koji sadrže 1:1 smešu dve različite fluorescentno obeležene oligonukleotidne probe. Prikazano je osam različitih dvokanalnih fluorescentnih slika alikvota označenih mikročestica, posle hibridizacije. U koloni 1, dva uzorka mikročestica hibridizovana su sa 1:1 smešom Cy3-obeleženog oligonukleotida komplementarnog sa A0, i FITC-obeleženog oligonukleotida komplementarnog sa A1. Očekivano, čestice kodirane oznakom A0 fluoresciraju u crvenom (Cy3) kanalu (gornja slika, kolona 1), a čestice kodirane oznakom A1 fluoresciraju u zelenom (FITC) kanalu (donja slika, kolona 2). Trend se održava za sve druge uslove hibridizacije u kojima čestice selektivno fluoresciraju na talasnoj dužini koja odgovara fluorescentnom obeleživaču prikačenom za komplementarnu DNK sekvencu-oznaku, a ne za neodgovarajuću oznaku.
SL. 11: Mikročestice koje prolaze četiri ciklusa koraka kodiranja/označavanja (kako je prikazano na Šemi kodiranja na SL.5 mogu se uspešno dekodiratu. Dve različite porcije mikročestica prolaze paralelno četiri ciklusa označavanja kako je ilustrovano na SL.5. U svakom koraku označavanja, svaka porcija mikročestica označava se jedinstvenim 18-merom. Posle četiri ciklusa kodiranja, svaka porcija se izlaže nizu hibridizacionih rastvora koji sadrže 1:1 smešu dve različite fluorescentno obeležene oligonukleotidne probe. Prikazano je osam različitih dvokanalnih fluorescentnih slika alikvota označenih mikročestica, posle hibridizacije. U koloni 1, dva uzorka mikročestica hibridizovana su sa 1:1 smešom Cy3-obeleženog oligonukleotida komplementarnog sa A0, i FITC-obeleženog oligonukleotida komplementarnog sa A1. Očekivano, čestice kodirane sa oznakom A0 fluoresciraju u crvenom (Cy3) kanalu (gornja slika, kolona 1) a čestice kodirane sa oznakom A1 fluoresciraju u zelenom (FITC) kanalu (donja slika, kolona 2). Trend se održava za sve druge uslove hibridizacije, u kojima čestice selektivno fluoresciraju na talasnoj dužini koja odgovara fluorescentnom obeleživaču prikačenom za komplementarnu DNK sekvencu-oznaku, a ne za neodgovarajuću oznaku.
SL. 12: Da bi se prikazalo da je sinteza peptida kompatibilna sa hemijskim reakcijama kodiranja Podnosilaca, dva peptida (HA i Myc--dva česta epitopa antitela) sintetišu se paralelno na mikročesticama gde su četiri sintetska koraka kodirana DNK oznakama. Čestice se inkubiraju sa Cy5-obeleženim antitelom specifičnim za HA epitop, u različitim koracima sinteze. Mikročestice koje prikazuju DNK oznake i potpuno protektovani HA peptid (u kojem nisu uklonjene protektivne komponente bočnog lanca) ne vezuju se za obeleženo antitelo (gornji red slika). Posle odsecanja DNK oznaka, mikročestice koje prikazuju HA peptid sa zaštićenim bočnim lancima ne vezuju se za obeleženo antitelo (drugi red slika). Posle deprotektovanja protektivnih komponenti bočnog lanca (TFA tretman), mikročestice koje prikazuju HA sada se vezuju za obeleženo antitelo (treći red slika). Mikročestice koje prikazuju potpuno deprotektovani Myc peptid ne vezuju se za obeleženo antitelo (četvrti red slika).
SL. 13: Da bi se prikazalo da je sinteza peptida kompatibilna sa hemijskim reakcijama kodiranja Podnosilaca, dva peptida (HA i Myc--dva česta epitopa antitela) sintetišu se paralelno na mikročesticama gde su četiri sintetska koraka kodirana DNK oznakama. Čestice se inkubiraju sa Alexafluor 488-obeleženim antitelom specifičnim za Myc epitop, u različitim koracima sinteze. Mikročestice koje prikazuju DNK oznake i potpuno protektovani Myc peptid (u kojem nisu uklonjene komponente koje protektuju bočni lanac) ne vezuju se za obeleženo antitelo (gornji red slika). Posle odsecanja DNK oznaka, mikročestice koje prikazuju Myc peptid sa protektovanim bočnim lancima ne vezuju se za obeleženo antitelo (drugi red slika). Posle deprotektovanja protektivnih komponenti bočnog lanca (TFA tretman), mikročestice koje prikazuju Myc sada se vezuju za obeleženo antitelo (treći red slika). Mikročestice koje prikazuju potpuno deprotektovani Myc peptid ne vezuju se za obeleženo antitelo (četvrti red slika).
SL. 14: Mešanjem perlica i boje pokazuje se sposobnost diferenciranja bojenja. Neoznačene perlice koje nose potpuno deprotektovani HA peptid ili Myc peptid pomešaju se i boje smešom Anti-HA-Cy5 i Anti-Myc-Alexa 488. Dobijene fluorescentne slike ukazuju na dve zasebne populacije perlica.
SL. 15A-SL. 15H: SL.15A prikazuje SEM 0.88 µm Promag čestica. SL.15B prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu. SL. 15C prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u kvadratnom rasporedu. SL.15D prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u kvadratnom rasporedu - delimično ispunjen mikrosferama. SL. 15E prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu, ispunjen mikrosferama. SL.15F prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu, ispunjen mikrosferama - nagnut. SL. 15G prikazuje fluorescentnu sliku mikrosfera obeleženih sa Alexafluor 488, imobilisanih u delimično punom silicijumskom čipu sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu. SL. 15H prikazuje sliku u svetlom polju, mikrosfera imobilisanih na delimično punom kvarcnom čipu sa1.3 µm razmakom između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu.
SL. 16A-SL. 16D: SL. 16A prikazuje autofluorescenciju mikrosfera imobilisanih u delimično punom kvarcnom čipu sa razmakom od 1.3 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu. SL. 16B prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 2.4 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu. SL.16C prikazuje silicijumski čip sa razmakom od 2.4 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu, delimično ispunjen mikrosferama. SL. 16D prikazuje fluorescentnu sliku DNK-označenih mikrosfera hibridizovanih sa fluorescentno obeleženim DNK komplementima imobilisanim u silicijumskom čipu. Čip je delimično pun i ima razmak od 2.4 µm između centara bunarčića u šestougaonom rasporedu.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
DEFINICIJE
[0007] Naslovi poglavlja upotrebljeni u ovom tekstu namenjeni su organizovanju i ne treba ih shvatiti kao da ograničavaju opisanu materiju.
[0008] Skraćenice upotrebljene u ovom tekstu imaju značenja uobičajena u oblasti hemije i biologije. Hemijske strukture i formule navedene u nastavku ovog teksta konstruisane su u skladu sa standardnim pravilima hemijske valence poznatim u hemijskoj struci.
[0009] Kada su supstituentne grupe specifikovane svojim uobičajenim hemijskim formulama, napisanim sleva nadesno, one jednako obuhvataju hemijski identične supstituente koji bi bili rezultat pisanja strukture sdesna nalevo, npr., -CH2O- ekvivalentno je sa -OCH2-.
[0010] Izraz "alkil", sam ili kao deo drugog supstituenta, označava, ako nije drugačije naznačeno, pravi (tj., negranati) ili granati neciklični ugljenični lanac (ili ugljenik), ili njihovu kombinaciju, koji može biti potpuno zasićen, mono- ili polinezasićen i može uključiti di- i multivalentne radikale koji imaju naznačeni broj ugljenikovih atoma (tj., C1-C10označava jedan do deset ugljenika). Primeri zasićenih ugljovodoničnih radikala uključuju, ali se ne ograničavaju na grupe kao što su metil, etil, n-propil, izopropil, n-butil, t-butil, izobutil, secbutil, (cikloheksil)metil, homologe i izomere, na primer, n-pentil, n-heksil, n-heptil, n-oktil, i slično. Nezasićena alkil grupa je ona koja ima jednu ili više dvostrukih veza ili trostrukih veza. Primeri nezasićenih alkil grupa uključuju, ali se ne ograničavaju na vinil, 2-propenil, krotil, 2-izopentenil, 2-(butadienil), 2,4-pentadienil, 3-(1,4-pentadienil), etinil, 1- i 3-propinil, 3-butinil, i više homologe i izomere. Alkoksi je alkil prikačen za preostali deo molekula preko kiseoničnog linkera (-O-). Alkil komponenta može biti alkenil komponenta. Alkil komponenta može biti alkinil komponenta. Alkil komponenta može biti potpuno zasićena.
[0011] Izraz "alkilen", sam ili kao deo drugog supstituenta, označava, ako nije drugačije naznačeno, dvovalentni radikal izveden iz alkila, na primer, ali bez ograničavanja, -CH2CH2CH2CH2-. Tipično, alkil (ili alkilen) grupa imaće od 1 do 24 ugljenikova atoma, pri čemu su u predmetnom pronalasku poželjne grupe sa 10 ili manje ugljenikovih atoma. "Niži alkil" ili "niži alkilen" je alkil ili alkilen grupa kraćeg lanca, obično sa osam ili manje ugljenikovih atoma. Izraz "alkenilen" sam ili kao deo drugog supstituenta, označava, ako nije drugačije naznačeno, dvovalentni radikal izveden iz alkena.
[0012] Izraz "heteroalkil", sam ili u kombinaciji sa drugim izrazom, označava, ako nije drugačije naznačeno, stabilni neciklični pravi ili granati lanac, ili njihove kombinacije, koji uključuje najmanje jedan ugljenikov atom i najmanje jedan heteroatom odabran iz grupe koja se sastoji od O, N, P, Si, i S, i pri čemu atomi azota i sumpora mogu opciono biti oksidisani, i heteroatom azota opciono može biti kvaternizovan. Heteroatom(i) O, N, P, S, i Si mogu se postaviti na bilo koju unutrašnju poziciju heteroalkil grupe ili na poziciju na kojoj je alkil grupa prikačena za preostali deo molekula. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na: -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-CH2-NH-CH3, -CH2-CH2-N(CH3)-CH3, -CH2-S-CH2-CH3, -CH2-CH2, -S(O)-CH3, -CH2-CH2-S(O)2-CH3, -CH=CH-O-CH3, -Si(CH3)3, -CH2-CH=N-OCH3, -CH=CH-N(CH3)-CH3, -O-CH3, -O-CH2-CH3, i -CN. Do dva ili tri heteroatoma mogu biti uzastopna, kao na primer, -CH2-NH-OCH3i -CH2-O-Si(CH3)3. Heteroalkil komponenta može uključivati jedan heteroatom (npr., O, N, S, Si, ili P). Heteroalkil komponenta može uključivati dva opciono različita heteroatoma (npr., O, N, S, Si, ili P). Heteroalkil komponenta može ukljućivati tri opciono različita heteroatoma (npr., O, N, S, Si, ili P). Heteroalkil komponenta može uključivati četiri opciono različita heteroatoma (npr., O, N, S, Si, ili P). Heteroalkil komponenta može uključivati pet opciono različita heteroatoma (npr., O, N, S, Si, ili P). Heteroalkil komponenta može uključivati do 8 opciono različitih heteroatoma (npr., O, N, S, Si, ili P).
[0013] Slično tome, izraz "heteroalkilen", sam ili kao deo drugog supstituenta, označava, ako nije drugačije naznačeno, dvovalentni radikal izveden iz heteroalkila, na primer, ali bez ograničavanja na -CH2-CH2-S-CH2-CH2- i -CH2-SCH2-CH2-NH-CH2-. Za heteroalkilen grupe, heteroatomi mogu zauzimati i jedan ili oba kraja lanca (npr., alkilenoksi, alkilendioksi, alkilenamino, alkilendiamino, i slično). Pored toga, za alkilen- i heteroalkilen-povezujuće grupe, smer kojim je formula povezujuće grupe napisana ne implicira orijentaciju povezujuće grupe. Na primer, formula -C(O)2R’- predstavlja i -C(O)2R’- i -R’C(O)2-. Kako je opisano gore, heteroalkil grupe, kako se ovde koristi, uključuju one grupe koje su prikačene za preostali deo molekula preko heteroatoma, na primer -C(O)R’, -C(O)NR’, -NR’R", -OR’, -SR’, i/ili -SO2R’. Kada se navodi "heteroalkil", posle čega sledi navođenje specifičnih heteroalkil grupa, kao -NR’R" ili slično, treba razumeti da izrazi heteroalkil i -NR’R" nisu redundantni ili uzajamno isključivi. Umesto toga, specifične heteroalkil grupe se navode radi veće jasnoće. Prema tome, izraz "heteroalkil" ne treba tumačiti u ovom tekstu kao da isključuje specifične heteroalkil grupe, kao što su -NR’R" ili slično.
[0014] Izrazi "cikloalkil" i "heterocikloalkil", sami ili u kombinaciji sa drugim izrazima, označavaju, ako nije drugačije naznačeno, nearomatične ciklične verzije "alkila", odnosno "heteroalkila", pri čemu ugljenici koji čine prsten ili prstenove ne moraju obavezno biti vezani za vodonik, zbog svih valenci ugljenika koje učestvuju u vezama sa nevodoničnim atomima. Pored toga, za heterocikloalkil, heteroatom može zauzeti poziciju na kojoj je heterocikl prikačen za preostali deo molekula. Primeri cikloalkila uključuju, ali se ne ograničavaju na ciklopropil, ciklobutil, ciklopentil, cikloheksil, 1-cikloheksenil, 3-cikloheksenil, cikloheptil, 3-hidroksi-ciklobut-3-enil-1,2, dion, 1H-1,2,4-triazolil-5(4H)-on, 4H-1,2,4-triazolil, i slično. Primeri heterocikloalkila uključuju, ali se ne ograničavaju na 1-(1,2,5,6-tetrahidropiridil), 1-piperidinil, 2-piperidinil, 3-piperidinil, 4-morfolinil, 3-morfolinil, tetrahidrofuran-2-il, tetrahidrofuran-3-il, tetrahidrotien-2-il, tetrahidrotien-3-il, 1-piperazinil, 2-piperazinil, i slično. "Cikloalkilen" i "heterocikloalkilen", sami ili kao deo drugog supstituenta, označavaju dvovalentni radikal izveden iz cikloalkila, odnosno heterocikloalkila. Heterocikloalkil komponenta može uključivati jedan heteroatom u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P). Heterocikloalkil komponenta može uključivati dva opciono različita heteroatoma u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P). Heterocikloalkil komponenta može uključivati tri opciono različita heteroatoma u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P). Heterocikloalkil komponenta može uključivati četiri opciono različita heteroatoma u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P). Heterocikloalkil komponenta može uključivati pet opciono različita heteroatoma u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P). Heterocikloalkil komponenta može uključivati do 8 opciono različita heteroatoma u prstenu (npr., O, N, S, Si, ili P).
[0015] Izrazi "halo" ili "halogen", sami ili kao deo drugog supstituenta, označavaju, ako nije drugačije naznačeno, atom fluora, hlora, broma, ili joda. Pored toga, izrazi kao "haloalkil" treba da obuhvate monohaloalkil i polihaloalkil. Na primer, izraz "halo(C1-C4)alkil" uključuje, ali se ne ograničava na fluorometil, difluorometil, trifluorometil, 2,2,2-trifluoroetil, 4-hlorobutil, 3-bromopropil, i slično.
[0016] Izraz "acil" označava, ako nije drugačije naznačeno, -C(O)R gde je R supstituisani ili nesupstituisani alkil, supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil, supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkil, supstituisani ili nesupstituisani aril, ili supstituisani ili nesupstituisani heteroaril.
[0017] Izraz "aril" označava, ako nije drugačije naznačeno, polinezasićeni, aromatični, ugljovodonični supstituent, koji može biti predstavljen jednim prstenom ili većim brojem prstenova (poželjno 1 do 3 prstena) koji su fuzionisani međusobno (tj., fuzionisani prstenasti aril) ili povezani kovalentno. Fuzionisani prstenasti aril odnosi se na više međusobno fuzionisanih prstenova, pri čemu je najmanje jedan od fuzionisani prstenova aril prsten. Izraz "heteroaril" odnosi se na aril grupe (ili prstenove) koji sadrže najmanje jedan heteroatom kao što je N, O, ili S, pri čemu su atomi azota i sumpora opciono oksidisani, a atom(i) azota opciono kvaternizovan(i). Prema tome, izraz "heteroaril" uključuje fuzionisane prstenaste heteroaril grupe (tj., veći broj fuzionisanih prstenova pri čemu je najmanje jedan od fuzionisanih prstenova heteroaromatični prsten). 5,6-fuzionisani prstenasti heteroarilen označava dva međusobno fuzionisana prstena, pri čemu jedan prsten ima 5 članova i drugi prsten ima 6 članova, i pri čemu je najmanje jedan prsten heteroaril prsten. Slično tome, 6,6-fuzionisani prstenasti heteroarilen označava dva međusobno fuzionisana prstena, pri čemu jedan prsten ima 6 članova i drugi prsten ima 6 članova, i pri čemu je najmanje jedan prsten heteroaril prsten. I 6,5-fuzionisani prstenasti heteroarilen odnosi se na dva međusobno fuzionisana prstena, pri čemu jedan prsten ima 6 članova i drugi prsten ima 5 članova, i pri čemu je najmanje jedan prsten heteroaril prsten. Heteroaril grupa može biti prikačena za preostali deo molekula preko ugljenika ili heteroatoma. Neograničavajući primeri aril i heteroaril grupa uključuju fenil, 1-naftil, 2-naftil, 4-bifenil, 1-pirolil, 2-pirolil, 3-pirolil, 3-pirazolil, 2-imidazolil, 4-imidazolil, pirazinil, 2-oksazolil, 4-oksazolil, 2-fenil-4-oksazolil, 5-oksazolil, 3-izoksazolil, 4-izoksazolil, 5-izoksazolil, 2-tiazolil, 4-tiazolil, 5-tiazolil, 2-furil, 3-furil, 2-tienil, 3-tienil, 2-piridil, 3-piridil, 4-piridil, 2-pirimidil, 4-pirimidil, 5-benzotiazolil, purinil, 2-benzimidazolil, 5-indolil, 1-izohinolil, 5-izohinolil, 2-hinoksalinil, 5-hinoksalinil, 3-hinolil, i 6-hinolil. Supstituenti za svaki od gore pomenutih aril i heteroaril prstenastih sistema biraju se iz grupe prihvatljivih supstituenata opisanih u nastavku. "Arilen" i "heteroarilen", sami ili kao deo drugog supstituenta, označavaju dvovalentni radikal izveden iz arila, odnosno heteroarila. Neograničavajući primeri aril i heteroaril grupa uključuju piridinil, pirimidinil, tiofenil, tienil, furanil, indolil, benzoksadiazolil, benzodioksolil, benzodioksanil, tianaftanil, pirolopiridinil, indazolil, hinolinil, hinoksalinil, piridopirazinil, hinazolinonil, benzoizoksazolil, imidazopiridinil, benzofuranil, benzotienil, benzotiofenil, fenil, naftil, bifenil, pirolil, pirazolil, imidazolil, pirazinil, oksazolil, izoksazolil, tiazolil, furiltienil, piridil, pirimidil, benzotiazolil, purinil, benzimidazolil, izohinolil, tiadiazolil, oksadiazolil, pirolil, diazolil, triazolil, tetrazolil, benzotiadiazolil, izotiazolil, pirazolopirimidinil, pirolopirimidinil, benzotriazolil, benzoksazolil, ili hinolil. Gornji primeri mogu biti supstituisani ili nesupstituisani i dvovalentni radikali svakog primera heteroarila gore, neograničavajući su primeri heteroarilena. Heteroaril komponenta može uključivati jedan heteroatom prstena (npr., O, N, ili S). Heteroaril komponenta može uključivati dva opciono različita heteroatoma prstena (npr., O, N, ili S). Heteroaril komponenta može uključivati tri opciono različita heteroatoma prstena (npr., O, N, ili S). Heteroaril komponenta može uključivati četiri opciono različita heteroatoma prstena (npr., O, N, ili S). Heteroaril komponenta može uključivati pet opciono različitih heteroatoma prstena (npr., O, N, ili S). Aril komponenta može imati jedan prsten. Aril komponenta može imati dva opciono različita prstena. Aril komponenta može imati tri opciono različita prstena. Aril komponenta može imati četiri opciono različita prstena. Heteroaril komponenta može imati jedan prsten. Heteroaril komponenta može imati dva opciono različita prstena. Heteroaril komponenta može imati tri opciono različita prstena. Heteroaril komponenta može imati četiri opciono različita prstena. Heteroaril komponenta može imati pet opciono različitih prstenova.
[0018] Fuzionisani prstenati heterocikloalkil-aril je aril fuzionisan sa heterocikloalkil. Fuzionisani prstenati heterocikloalkil-heteroaril je heteroaril fuzionisan sa heterocikloalkilom. Fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-cikloalkil je heterocikloalkil fuzionisan sa cikloalkilom. Fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-heterocikloalkil je heterocikloalkil fuzionisan sa drugim heterocikloalkilom. Fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-aril, fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-heteroaril, fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-cikloalkil, ili fuzionisani prstenasti heterocikloalkil-heterocikloalkil može, svaki nezavisno, biti nesupstituisan ili supstituisan jednim ili više supstituenata opisanih u ovom tekstu.
[0019] Izraz "okso", kako se koristi u ovom tekstu, označava kiseonik koji je dvostrukom vezom povezan sa atomom ugljenika.
[0020] Izraz "alkilsulfonil", kako se koristi u ovom tekstu, označava komponentu koja ima formulu -S(O2)-R’, pri čemu je R’ supstituisana ili nesupstituisana alkil grupa, kako je definisano ranije u ovom tekstu. R’ može imati specifikovani broj ugljenikovih atoma (npr., "C1-C4alkilsulfonil").
[0021] Svaki od gornjih izraza (npr., "alkil", "heteroalkil", "cikloalkil", "heterocikloalkil", "aril" i "heteroaril") uključuje i supstituisane i nesuspstituisane forme navedenih radikala. Poželjni supstituenti za svaki tip radikala dati su u nastavku ovog teksta.
[0022] Supstituenti za alkil i heteroalkil radikale (uključujući grupe koje se često značavaju kao alkilen, alkenil, heteroalkilen, heteroalkenil, alkinil, cikloalkil, heterocikloalkil, cikloalkenil, i heterocikloalkenil) mogu biti jedna ili više od različitih grupa koje se biraju, bez ograničavanja između -OR’, =O, =NR’, =N-OR’, -NR’R", -SR’, -halogen, - SiR’R"R"’, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R", -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, -NR’-C(O)NR"R"’, -NR"C(O)2R’, -NRC(NR’R")=NR-, -S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2N(R)(’R"-NRSO2R’), -CN, i -NO2u broju u rasponu od nula do (2m’+1), pri čemu je m’ ukupan broj ugljenikovih atoma u takvom radikalu. R’, R", R-, i R"" svaki, poželjno nezavisno, odnose se na vodonik, supstituisanu ili nesupstituisanu heteroalkil, supstituisanu ili nesupstituisanu cikloalkil, supstituisanu ili nesupstituisanu heterocikloalkil, supstituisanu ili nesupstituisanu aril (npr., aril supstituisanu sa 1-3 halogena), supstituisanu ili nesupstituisanu alkil, alkoksi, ili tioalkoksi groupu, ili arilakil grupu. Kada jedinjenje pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa se nezavisno bira kao svaka od R’, R", R-, i R"" grupa, kada je prisutno više od jedne od ovih grupa. Kada su R’ i R" prikačene za isti atom azota, one se mogu kombinovati sa atomom azota da formiraju 4-, 5-, 6-, ili 7-člani prsten. Na primer, -NR’R" uključuje, ali se ne ograničava na 1-pirolidinil i 4-morfolinil. Iz gornje diskusije o supstituentima, stručnjak u oblasti će razumeti da izraz "alkil" uključuje grupe koje sadrže ugljenikove atome vezane za grupe različite od vodoničnih grupa, na primer haloalkil (npr., -CF3i -CH2CF3) i acil (pr., -C(O)CH3, -C(O)CF3, -C(O)CH2OCH3, i slično).
[0023] Slično supstituentima opisanim za alkil radikal, supstituenti za aril i heteroaril grupe su različiti i biraju se između, na primer: -OR’, -NR’R", -SR’, -halogen, - SiR’R"R-, -OC(O)R’, -C(O)R’, -CO2R’, -CONR’R", -OC(O)NR’R", -NR"C(O)R’, -NR’-C(O)NR"R-, NR"C(O)2R’, NRC(NR’R")=NR-, S(O)R’, -S(O)2R’, -S(O)2N(R’)(R", -NRSO2R’), - CN, -NO2, -R’, -N3, -CH(Ph)2, fluoro(C1-C4)alkoksi, i fluoro(C1-C4)alkil, u broju u rasponu od nula do ukupnog broja otvorenih valenci na aromatičnom prstenastom sistemu; i pri čemu se R’, R", R-, i R"" poželjno nezavisno biraju između vodonika, supstituisanog ili nesupstituisanog alkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog arila, i supstituisanog ili nesupstituisanog heteroarila. Kada jedinjenje pronalaska uključuje više od jedne R grupe, na primer, svaka od R grupa se nezavisno bira kao svaka od R’, R", R-, i R"" grupa kada je prisutno više od jedne od ovih grupa.
[0024] Kada je komponenta supstituisana R supstituentom, grupa može da se označi kao "R-supstituisana". Kada je komponenta R-supstituisana, komponenta je supstituisana najmanje jednim R supstituentom i svaki R supstituent je opciono različit. Na primer, kada je komponenta ovde R<1A>-supstituisani ili nesupstituisani alkil, veći broj R<1A>supstituenata može da se prikači za alkil komponentu pri čemu je svaki R<1A>supstituent opciono različit. Kada je R-supstituisana komponenta supstituisana većim brojem R supstituenata, svaki od R-supstituenata može se razlikovati u ovom tekstu korišćenjem simbola "prim" (’) na primer R’, R", itd. Na primer, kada je komponenta R<1A>-supstituisani ili nesupstituisani alkil, i komponenta je supstituisana velikim brojem R<1A>supstituenata, veći broj R<1A>supstituenata može se razlikovati kao R<1A’>, R<1A">, R<1A->, itd. U nekim primerima izvođenja, veći broj R supstituenata je 3. U nekim primerima izvođenja, veći broj R supstituenata je 2.
[0025] U primerima izvođenja, jedinjenje opisano u ovom tekstu može uključivati veliki broj primera R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<6A>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, R<12>, R<13>, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, R<23>, i/ili drugih supstituenata i varijabli. U takvim primerima izvođenja, svaka varijabla može opciono biti različita i odgovarajuće obeležena da bi se razlikovala svaka grupa, radi veće jasnoće. Na primer, kada su svi R<6A>različiti, oni se mogu označiti kao, na primer, R<6A.1>, R<6A.2>, R<6A.3>, odnosno R<6A.4>, pri čemu se definicija R<6A>pretpostavlja po R<6A.1>, R<6A.2>, R<6A.3>, i/ili R<6A.4>. Varijable upotrebljene u definiciji R<1>, R<2>, R<3>, R<4>, R<5>, R<6>, R<6A>, R<7>, R<8>, R<9>, R<10>, R<11>, R<12>, R<13>, R<14>, R<15>, R<16>, R<17>, R<18>, R<19>, R<20>, R<21>, R<22>, R<23>, i/ili druge varijable koje se pojavljuju u više primera i različite su, mogu slično biti na odgovarajući način obeležene da bi se razlikovala svaka grupa, radi veće jasnoće.
[0026] Dva ili više supstituenata mogu opciona biti spojeni da bi formirali aril, heteroaril, cikloalkil, ili heterocikloalkil grupe. Ti takozvani prsten-formirajući supstituenti se tipično, mada ne i obavezno, nalaze prikačeni za cikličnu osnovnu strukturu. U jednom primeru izvođenja, prsten-formirajući supstituenti prikačeni su za susedne članove osnovne strukture. Na primer, dva prsten-formirajuća supstituenta, prikačena za susedne članove ciklične osnovne strukture formiraju fuzionisanu prstenastu strukturu. U sledećem primeru izvođenja, prstenformirajući supstituenti prikačeni su za jednog člana osnovne strukture. Na primer, dva prstenformirajuća supstituenta prikačena za jednog člana ciklične osnovne strukture formiraju spirocikličnu strukturu. U još jednom primeru izvođenja, prsten-formirajući supstituenti prikačeni su za nesusedne članove osnovne strukture.
[0027] Dva supstituenta na susednim atomima aril ili heteroaril prstena mogu opciono formirati prsten formule -T-C(O)-(CRR’)q-U-, gde su T i U nezavisno -NR-, -O-, -CRR’-, ili jednostruka veza, i q je ceo broj od 0 do 3. Alternativno, dva supstituenta na susednim atomima aril ili heteroaril prstena mogu se opciono zameniti supstituentom formule -A-(CH2)r-B-, pri čemu su A i B nezavisno -CRR’-, -O-, -NR-, -S-, -S(O) -, -S(O)2-, -S(O)2NR’-, ili jednostruka veza, i r je ceo broj od 1 do 4. Jedna od jednostrukih veza novog tako formiranog prstena može opciono biti zamenjena dvostrukom vezom. Alternativno, dva od supstituenata na susednim atomima aril ili heteroaril prstena mogu se opciono zameniti supstituentom formule -(CRR’)s-X’-(C"R"R-)d-, pri čemu su varijable s i d nezavisno celi brojevi od 0 do 3, i X’ je -O-, -NR’-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, ili -S(O)2NR’-. Supstituenti R, R’, R", i R’" se poželjno nezavisno biraju između vodonika, supstituisanog ili nesupstituisanog alkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heteroalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog cikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog heterocikloalkila, supstituisanog ili nesupstituisanog arila, i supstituisanog ili nesupstituisanog heteroarila.
[0028] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "heteroatom" ili "heteroatom prstena" treba da uključe, kiseonik (O), azot (N), sumpor (S), fosfor (P), i silicijum (Si).
[0029] "Supstituentna grupa", kako se koristi u ovom tekstu, označava grupu odabranu između sledećih komponenti:
(A) okso, halogen, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, nesupstituisani alkil, nesupstituisani heteroalkil, nesupstituisani cikloalkil, nesupstituisani heterocikloalkil, nesupstituisani aril, nesupstituisani heteroaril, i
(B) alkil, heteroalkil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, supstituisan najmanje jednim supstituentom odabranim između:
(i) okso, halogen, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, - SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, - NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, nesupstituisani alkil, nesupstituisani heteroalkil, nesupstituisani cikloalkil, nesupstituisani heterocikloalkil, nesupstituisani aril, nesupstituisani heteroaril, i (ii) alkil, heteroalkil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, supstituisan najmanje jednim supstituentom odabranim između:
(a) okso, halogen, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, - NHSO2H, -NHC= (O)H, NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, nesupstituisani alkil, nesupstituisani heteroalkil, nesupstituisani cikloalkil, nesupstituisani heterocikloalkil, nesupstituisani aril, nesupstituisani heteroaril, i (b) alkil, heteroalkil, cikloalkil, heterocikloalkil, aril, heteroaril, supstituisan najmanje jednim supstituentom odabranim između: okso, halogen, -CF3, -CN, -OH, -NH2, -COOH, -CONH2, -NO2, -SH, -SO2Cl, -SO3H, -SO4H, -SO2NH2, -NHNH2, -ONH2, -NHC=(O)NHNH2, -NHC=(O) NH2, -NHSO2H, -NHC= (O)H, -NHC(O)-OH, -NHOH, -OCF3, -OCHF2, nesupstituisani alkil, nesupstituisani heteroalkil, nesupstituisani cikloalkil, nesupstituisani heterocikloalkil, nesupstituisani aril, nesupstituisani heteroaril.
[0030] "Veličinom ograničeni supstituent" ili "veličinom ograničena supstituentska grupa", kako se koristi u ovom tekstu, označava grupu odabranu između svih supstituenata opisanih gore za "supstituentsku grupu", pri čemu je svaki supstituisani ili nesupstituisani alkil supstituisani ili nesupstituisani C1-C20alkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil je supstituisani ili nesupstituisani 2- do 20-člani heteroalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani C3-C8cikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani 3 do 8 člani heterocikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani aril je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10aril, i svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroaril je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 10-člani heteroaril.
[0031] "Niži supstituent" ili "niža supstituentna grupa", kako se koristi u ovom tekstu, označava grupu odabranu između svih supstituenata opisanih gore za "supstituentsku grupu", pri čemu je svaki supstituisani ili nesupstituisani alkil supstituisani ili nesupstituisani C1-C8alkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil je supstituisani ili nesupstituisani 2- do 8-člani heteroalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani C3-C7cikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani 3- do 7-člani heterocikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani aril je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10aril, i svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroaril je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 9-člani heteroaril.
[0032] U nekim primerima izvođenja, svaka supstituisana grupa opisana u jedinjenjima u ovom tekstu supstituisana je sa najmanje jednom supstituentskom grupom. Tačnije, u nekim primerima izvođenja, svaki supstituisani alkil, supstituisani heteroalkil, supstituisani cikloalkil, supstituisani heterocikloalkil, supstituisani aril, supstituisani heteroaril, supstituisani alkilen, supstituisani heteroalkilen, supstituisani cikloalkilen, supstituisani heterocikloalkilen, supstituisani arilen, i/ili supstituisani heteroarilen opisan u jedinjenjima u ovom tekstu, supstituisan je najmanje jednom supstituentskom grupom. U drugim primerima izvođenja, najmanje jedna ili sve ove grupe supstituisane su najmanje jednom, veličinom ograničenom supstituentskom grupom. U drugim primerima izvođenja, najmanje jedna ili sve ove grupe supstituisane su najmanje jednom nižom supstituentskom grupom.
[0033] U drugim primerima izvođenja jedinjenja ovog teksta, svaki supstituisani ili nesupstituisani alkil može biti supstituisani ili nesupstituisani C1-C20alkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil je supstituisani ili nesupstituisani 2- do 20-člani heteroalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani C3-C8cikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani 3- do 8-člani heterocikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani aril je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10aril, i/ili svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroaril je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 10-člani heteroaril. U nekim primerima izvođenja jedinjenja ovog teksta, svaki supstituisani ili nesupstituisani alkilen je supstituisani ili nesupstituisani C1-C20alkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkilen je supstituisani ili nesupstituisani 2-do 20-člani heteroalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkilen je supstituisani ili nesupstituisani C3-C8cikloalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkilen je supstituisani ili nesupstituisani 3- do 8-člani heterocikloalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani arilen je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10arilen, i/ili svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroarilen je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 10-člani heteroarilen.
[0034] U nekim primerima izvođenja, svaki supstituisani ili nesupstituisani alkil je supstituisani ili nesupstituisani C1-C8alkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkil je supstituisani ili nesupstituisani 2- do 8-člani heteroalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani C3-C7cikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkil je supstituisani ili nesupstituisani 3- do 7-člani heterocikloalkil, svaki supstituisani ili nesupstituisani aril je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10aril, i/ili svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroaril je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 9-člani heteroaril. U nekim primerima izvođenja, svaki supstituisani ili nesupstituisani alkilen je supstituisani ili nesupstituisani C1-C8alkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroalkilen je supstituisani ili nesupstituisani 2- do 8-člani heteroalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani cikloalkilen je supstituisani ili nesupstituisani C3-C7cikloalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkilen je supstituisani ili nesupstituisani 3- do 7člani heterocikloalkilen, svaki supstituisani ili nesupstituisani arilen je supstituisani ili nesupstituisani C6-C10arilen, i/ili svaki supstituisani ili nesupstituisani heteroarilen je supstituisani ili nesupstituisani 5- do 9-člani heteroarilen. U nekim primerima izvođenja, jedinjenje je hemijska vrsta navedena u odeljku Primeri, na slikama ili u tabelama u nastavku ovog teksta.
[0035] Izrazi upotrebljeni u jednini označavaju jedan ili više. Pored toga, izraz "supstituisan sa [n]", kako se koristi u ovom tekstu, označava da specifikovana grupa može biti supstituisana jednim ili većim brojem jednog ili svih navedenih supstituenata. Na primer, kada je grupa, na primer alkil ili heteroaril grupa, "supstituisana nesupstituisanim C1-C20alkilom, ili nesupstituisanim 2- do 20-članim heteroalkilom", grupa može sadržati jedan ili više nesupstituisanih C1-C20alkila, i/ili jedan ili više nesupstituisanih 2- do 20-članih heteroalkila. Pored toga, kada je komponenta supstituisana R supstituentom, grupa može biti označena kao "R-supstituisana". Kada je komponenta R-supstituisana, komponenta je supstituisana najmanje jednim R supstituentom i svaki R supstituent je opciono različit.
[0036] Simbol označava tačku prikačinjanja hemijske komponente za preostali deo molekula ili hemijske formule.
[0037] Opisi jedinjenja predmetnog pronalaska ograničeni su prinipima uspostavljanja hemijskih veza, koji su poznati stručnjacima u oblasti. Prema tome, kada grupa može biti supstituisana jednim ili većim brojem supstituenata, takve supstitucije se biraju tako da budu u saglasnosti sa principima uspostavljanja hemijskih veza i da daju jedinjenja koja nisu inherentno nestabilna i/ili koja bi prosečno obučenom stručnjaku u oblasti bila poznata kao verovatno nestabilna pod ambijentalnim uslovima, na primer u vodenim, neutralnim i u nekoliko drugih fizioloških uslova. Na primer, heterocikloalkil ili heteroaril je prikačen za preostali deo molekula preko heteroatoma prstena u skladu sa principima uspostavljanja hemijskih veza poznatim stručnjacima u oblasti, čime se izbegavaju inherentno nestabilna jedinjenja.
[0038] Ukoliko nije drugačije definisano, tehnički i naučni izrazi upotrebljeni u ovom tekstu imaju značenja koja uobičajeno razume osoba prosečno obučena u struci. Vidi, npr., Singleton et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY 2. izd., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994); Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Springs Harbor Press (Cold Springs Harbor, NY 1989). Svi postupci, uređaji i materijali slični ili ekvivalentni onima koji su ovde opisani mogu se upotrebiti u praktičnom izvođenju ove objave.
[0039] Sledeće definicije date su da bi se olakšalo razumevanje određenih izraza koji se često koriste u ovom tekstu i nije im cilj da ograniče obim ove objave.
[0040] "Nukleinska kiselina" odnosi se na deoksiribonukleotide ili ribonukleotide i njihove polimere u jednolančanoj, dvolančanoj ili višelančanoj formi, ili na njihove komplemente. Izraz "polinukleotid" označava linearnu sekvencu nukleotida. Izraz "nukleotid" tipično se odnosi na jednu jedinicu polinukleotida, tj., monomer. Nukleotidi mogu biti ribonukleotidi, deoksiribonukleotidi, ili njihove modifikovane verzije. Primeri polinukleotida koji se razmatraju u ovom tekstu uključuju jednolančanu i dvolančanu DNK, jednolančanu i dvolančanu RNK (uključujući siRNK), i hibridne molekule koji imaju smeše jednolančane i dvolančane DNK i RNK. Nukleinske kiseline mogu biti linearne ili granate. Na primer, nukleinske kiseline mogu biti linearni lanac nukleotida ili nukleinske kiseline mogu biti granate, npr., tako da nukleinske kiseline sadrže jednu ili više nukleotidnih ručica ili ogranaka. Opciono, granate nukleinske kiseline se repetitivno granaju da formiraju strukture višeg reda kao što su dendrimeri i slično.
[0041] Nukleinske kiseline, uključujući nukleinske kiseline sa fosfotioatnom osovinom, mogu sadržati jednu ili više reaktivnih komponenti. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz reaktivna komponenta uključuje svaku grupu koja može da reaguje sa drugim molekulom, npr., nukleinskom kiselinom ili polipeptidom preko kovalentnih, nekovalentnih ili drugih interakcija. Kao primer, nukleinska kiselina može uključiti aminokiselinsku reaktivnu komponentu koja reaguje sa amino-kiselinom na proteinu ili polipeptidu preko kovalentne, nekovalentne ili druge interakcije.
[0042] Izrazi takođe obuhvataju nukleinske kiseline koje sadrže poznate nukleotidne analoge ili modifikovane osovinske rezidue ili veze, koje su sintetske, prirodne ili nisu prirodne, koje imaju slična vezujuća svojstva kao referentna nukleinska kiselina, i koje se metabolišu na način sličan referentnim nukleotidima. Primeri takvih analoga uključuju, bez ograničavanja, fosfodiestarske derivate uključujući, npr., veze fosforamidata, fosforodiamidata, fosforotioata (poznat i kao fosfotioat), fosforoditioata, fosfonokarboksilne kiseline, fosfonokarboksilata, fosfonosirćetne kiseline, fosfonoforminske kiseline, metil fosfonata, boron fosfonata, ili O-metilfosforoamidita (vidi Eckstein, Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Oxford University Press); i osovine i veze peptidnih nukleinskih kiselina. Druge analogne nukleinske kiseline uključuju one sa pozitivnim osovinama; nejonskim osovinama, modifikovanim šećernim i neriboznim osovinama (npr. fosforodiamidat morfolino oligo ili zaključane nukleinske kiseline (locked nucleic acids, LNA)), uključujući one koje su opisane u U.S. patentima br. 5,235,033 i 5,034,506, i Poglavljima 6 i 7, ASC Symposium Series 580, Carbohydrate Modifications in Antisense Research, Sanghui & Cook, eds. Nukleinske kiseline koje sadrže jedan ili više karbocikličnih šećera takođe su uključene u jednu definiciju nukleinskih kiselina. Modifikacije riboza-fosfatne osovine može se izvršiti iz različitih razloga, npr., da bi se povećali stabilnost i poluživot takvih molekula u fiziološkom okruženju ili kao proba na biočipu. Mogu se napraviti smeše prirodnih nukleinskih kiselina i analoga; alternativno, mogu se napraviti smeše različitih nukleinskokiselinskih analoga, i smeše prirodnih nukleinskih kiselina i analoga. U primerima izvođenja, međunukleotidne veze u DNK su fosfodiestarske, fosfodiestarski derivati ili kombinacija ta dva.
[0043] Nukleinske kiseline mogu uključivati nespecifične sekvence. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "nespecifična sekvenca" odnosi se na sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži niz rezidua koje nisu dizajnirane da budu komplementarne ili su samo parcijalno komplementarne sa bilo kojom drugom sekvencom nukleinske kiseline. Kao primer, nespecifična sekvenca nukleinske kiseline je sekvenca nukleinskokiselinskih rezidua koja ne funkcioniše kao inhibitorna nukleinska kiselina kada se dovede u kontakt sa ćelijom ili organizmom. "Inhibitorna nukleinska kiselina" je nukleinska kiselina (npr. DNK, RNK, polimer analoga nukleotidah) koja je sposobna da se veže za ciljnu nukleinsku kiselinu (npr. iRNK koja može da se translatuje u protein) i smanji transkripciju ciljne nukleinske kiseline (npr. iRNK na osnovu DNK) ili smanji translaciju ciljne nukleinske kiseline (npr. iRNK) ili izmeni splajsovanje transkripta (npr. jednolančani morfolino oligo).
[0044] "Obeležena nukleinska kiselina ili oligonukleotid" je ona koja se vezuje, kovalentno, preko linkera ili hemijskom vezom, ili nekovalentno, preko jonskih, van der Waals-ovih, elektrostatičkih ili vodoničnih veza radi obeležavanja, tako da prisustvo nukleinske kiseline može da se detektuje detektovanjem prisustva detektabilnog obeleživača vezanog za nukleinsku kiselinu. Alternativno, postupkom u kojem se koriste visokoafinitetne interakcije mogu se postići isti rezultati kada se jedan od para vezujućih partnera veže za drugi, npr., biotin, streptavidin. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje detektabilni obeleživač, kako je objavljeno u ovom tekstu i kako je opštepoznato u struci.
[0045] Izraz "proba" ili "prajmer", kako se koristi u ovom tekstu, definiše se kao jedan ili više fragmenata nukleinske kiseline čija specifična hibridizacija sa uzorkom može da se detektuje. Proba ili prajmer može biti bilo koje dužine, zavisno od posebne tehnike koja će se upotrebiti. Na primer, PCR prajmeri su obično dugi između 10 i 40 nukleotida, dok nukleinskokiselinske probe za, npr., Southern blot, mogu biti duge više od sto nukleotida. Proba može biti neobeležena ili obeležena kako je opisano u nastavku ovog teksta, tako da njeno vezivanje za cilj ili uzorak može da se detektuje. Proba može da se proizvede iz izvora nukleinske kiseline iz jednog ili više određenih (prethodno odabranih) delova hromozoma, npr., jednog ili više klonova, celog izolovanog hromozoma ili hromozomskog fragmenta, ili kolekcije amplifikacionih proizvoda lančane reakcije polimeraze (polymerase chain reaction, PCR). Dužina i kompleksnost nukleinske kiseline fiksirane na ciljnom elementu nisu kritične za pronalazak. Stručnjak će podesiti ove faktore da bi obezbedio optimalnu hibridizaciju i proizvodnju signala za datu proceduru hibridizacije, i za obezbeđivanje potrebne rezolucije između različitih gena ili genomskih lokacija.
[0046] Proba može takođe biti predstavljena izolovanim nukleinskim kiselinama imobilisanim na čvrstoj podlozi (npr., nitroceluloza, staklo, kvarc, fuzionisane pločice silicijum-dioksida), kao u čipu. U nekim primerima izvođenja, proba može biti član nukleinskokiselinskog čipa kako je opisano na primer, u WO 96/17958. Tehnike kojima mogu da se proizvedu čipovi visoke gustine mogu se koristiti i za ovu namenu (vidi, npr., Fodor (1991) Science 767-773; Johnston (1998) Curr. Biol. 8: R171-R174; Schummer (1997) Biotechniques 23: 1087-1092; Kern (1997) Biotechniques 23: 120-124; U.S. patent br.5,143,854).
[0047] Reči "komplementarno" ili "komplementarnost" odnose se na sposobnost nukleinske kiseline u polinukleotidu da formira bazni par sa drugom nukleinskom kiselinom u drugom polinukleotidu. Na primer, sekvenca A-G-T komplementarna je sa sekvencom T-C-A. Komplementarnost može biti delimična, kada se samo neke nukleinske kiseline poklapaju u skladu sa sparivanjem baza, ili kompletna, kada se sve nukleinske kiseline poklapaju u skladu sa sparivanjem baza.
[0048] Nukleinska kiselina je "operabilno povezana" kada se nalazi u funkcionalnom odnosu sa drugom sekvencom nukleinske kiseline. Na primer, DNK za presekvencu ili sekretorni lider operabilno je povezana sa DNK za polipeptid ako se eksprimira kao pre-protein koji učestvuje u sekreciji polipeptida; promotor ili enhenser je operabilno povezan sa kodirajućom sekvencom ako utiče na transkripciju sekvence; ili mesto vezivanja ribozoma je operabilno povezano aa kodirajućom sekvencom ako je pozicionirano tako da olakša translaciju. Obično, "operabilno povezan" znači da su povezane DNK sekvence blizu jedna drugoj, i, u slučaju sekretornog lidera, kontinuirane i u fazi čitanja. Međutim, enhenseri ne moraju biti kontinuirani. Povezivanje se obavlja ligacijom na uobičajenim restrikcionim mestima. Ako takva mesta ne postoje, koriste se sintetski oligonukleotidni adapteri u skladu sa uobičajenom praksom.
[0049] Izraz "gen" označava segment DNK uključen u proizvodnju proteina; uključuje regione koji prethode i prate kodirajući region (lider i pratilac) kao i umetnute sekvence (introni) između pojedinačnih kodirajućih segmenata (egzoni). Lider, pratilac, kao i introni, uključuju regulatorne elemente koji su neophodni tokom transkripcije i translacije gena. Pored toga, "proteinski genski proizvod" je protein koji se eksprimira na osnovu odgovarajućeg gena.
[0050] Reč "ekspresija" ili "eksprimiran", kako se koristi u ovom tekstu u vezi sa genom, označava proizvod transkripcije i/ili translacije tog gena. Nivo ekspresije DNK molekula u ćeliji može se odrediti na osnovu količine odgovarajuće iRNK prisutne u ćeliji, ili količine proteina kodiranog tom DNK, proizvedenog u ćeliji. Nivo ekspresije nekodirajućih molekula nukleinske kiseline (npr., siRNK) može se detektovati standardnim postupcima PCR ili Northern blot, dobro poznatim u struci. Vidi, Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 18.1-18.88.
[0051] Izraz "rekombinantno", kada sekoristi u vezi sa, npr., ćelijom, ili nukleinskom kiselinom, proteinom, ili vektorom, ukazuje na to da su ćelija, nukleinska kiselina, protein ili vektor, bili modifikovani uvođenjem heterologe nukleinske kiseline ili proteina, ili promenom nativne nukleinske kiseline ili proteina, ili da je ćelija poreklom od tako modifikovane ćelije. Dakle, na primer, rekombinantne ćelije eksprimiraju gene koji se ne nalaze u nativnom (nerekombinantnom) obliku ćelije, ili eksprimiraju nativne gene koji se inače normalno eksprimiraju, u manjoj meri ili se ne eksprimiraju uopšte. Transgene ćelije i biljke su one koje eksprimiraju heterologni gen ili kodirajuću sekvencu, tipično kao rezultat postupaka rekombinacije.
[0052] Izraz "heterolog" kada se koristi u vezi sa delom nukleinske kiseline, ukazuje da nukleinska kiselina sadrži dve ili više podsekvenci koje se u prirodi ne nalaze u istom odnosu jedna prema drugoj. Na primer, tipično rekombinantno proizvodena nukleinska kiselina ima dve ili više sekvenci iz nesrodnih gena aranžirane tako da čine novu funkcionalnu nukleinsku kiselinu, npr., promotor iz jednog izvora i kodirajući region iz drugog izvora. Slično tome, "heterologni protein" ukazuje na to da protein sadrži dve ili više podsekvenci koje se u prirodi ne nalaze u istom odnosu jedna prema drugoj (npr., fuzija
[0053] Izraz "egzogeni" odnosi se na molekul ili supstancu (npr., jedinjenje, nukleinsku kiselinu ili protein) poreklom izvan date ćelije ili organizma. Na primer, "egzogeni promotor", kada se pominje u ovom tekstu, predstavlja promotor koji nije poreklom iz biljke koja ga eksprimira. Nasuprot tome, izraz "endogen" ili "endogeni promotor" odnosi se na nativni, ili molekul ili supstancu poreklom iz date ćelije ili organizma.
[0054] Izraz "izolovan", kada se odnosi na nukleinsku kiselinu ili protein, označava da nukleinska kiselina ili protein suštinski ne sadrže druge ćelijske komponente sa kojima su udruženi u prirodnom stanju. To može biti, na primer, u homogenom stanju i može biti u suvom stanju ili u vodenom rastvoru. Čistoća i homogenost se tipično određuju korišćenjem tehnika analitičke hemije kao što su elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ili tečna hromatografija visokih performansi. Protein koji je dominantnaa vrsta prisutna u preparatu suštinski je prečišćen.
[0055] Izraz "prečišćen" označava da nukleinska kiselina ili protein daju suštinski jednu traku na gelu za elektroforezu. U nekim primerima izvođenja, nukleinska kiselina ili protein imaju čistoću najmanje 50%, opciono najmanje 65%, opciono najmanje 75%, opciono najmanje 85%, opciono najmanje 95%, i opciono najmanje 99%.
[0056] Izraz "izolovan" može se odnositi i na ćeliju ili uzorak ćelija. Izolovana ćelija ili uzorak ćelija predstavljaju jedan tip ćelija koje suštinski ne sadrže brojne komponente koje su normalno udružene sa ćelijama kada su one u svom nativnom stanju ili neposredno posle uklanjanja iz nativnog stanja. U određenim objavljenim primerima, izolovani uzorak ćelija zadržava one komponente iz svog prirodnog stanja koje su potrebne za održavanje ćelije u željenom stanju. U nekim primerima izvođenja, izolovana (npr. prečišćena, izdvojena) ćelija ili izolovane ćelije, su ćelije koje suštinski predstavljaju jedini tip ćelija u uzorku. Prečišćeni ćelijski uzorak može sadržati najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% jednog tipa ćelija. Izolovani ćelijski uzorak može se dobiti upotrebom ćelijskog markera ili kombinacije ćelijskih markera, od kojih je svaki jedinstven za jedan tip ćelija u neprečišćenom uzorku ćelija. U određenim objavljenim primerima, ćelije su izolovane upotrebom ćelijskog sortera. U određenim objavljenim primerima, antitela na ćelijske proteine koriste se za izolovanje ćelija.
[0057] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "konjugat" označava asocijaciju između atoma ili molekula. Asocijacija može biti direktna ili indirektna. Na primer, konjugat nukleinske kiseline i proteina može biti direktan, npr., kovalentnom vezom, ili indirektan, npr., nekovalentnom vezom (npr. elektrostatičke interakcije (npr. jonska veza, vodonična veza, halogenska veza), van der Waals-ove interakcije (npr. dipol-dipol, dipol-indukovani dipol, London-ova disperzija), slaganje prstenova (pi efekat), hidrofobne interakcije i slično). U primerima izvođenja, konjugati se formiraju korišćenjem hemije konjugata uključujući, ali ne ograničavajući se na nukleofilne supstitucije (npr., reakcije amina i alkohola sa acil halidima, aktivnim estrima), elektrofilne supstitucije (npr., reakcije enamina) i adicije na višestruke veze ugljenik-ugljenik i ugljenik-heteroatom (npr., Michael-ova reakcija, Diels-Alder-ova adicija). Ove i druge korisne reakcije razmatraju se, na primer, u March, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY, 3. izd., John Wiley & Sons, New York, 1985; Hermanson, BIOCONJUGATE TECHNIQUES, Academic Press, San Diego, 1996; i Feeney et al., MODIFICATION OF PROTEINS; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982. U primerima izvođenja, mikročestica je nekovalentno prikačena za čvrstu podlogu preko nekovalentne hemijske reakcije između komponente mikročestice i komponente čvrste podloge. U drugim primerima izvođenja, mikročestica uključuje jednu ili više reaktivnih komponenti, npr., kovalentnu reaktivnu komponentu, kako je opisano u ovom tekstu (npr., aminska reaktivna komponenta). U drugim primerima izvođenja, mikročestica uključuje linker sa jednom ili više aktivnih komponenti, npr., kovalentnu reaktivnu komponentu, kako je opisano u ovom tekstu (npr., aminska reaktivna komponenta).
[0058] Korisne reaktivne komponente ili reaktivne funkcionalne grupe upotrebljene za hemijske reakcije konjugacije u ovom tekstu uključuju, na primer:
(a) karboksilne grupe i njihove različite derivate uključujući, ali ne ograničavajući se na N-hidroksisukcinimidne estre, N-hidroksibenztriazolne estre, kisele halide, acil imidazole, tioestre, p-nitrofenil estre, alkil, alkenil, alkinil i aromatične estre;
(b) hidroksilne grupe koje mogu da se konvertuj u estre, etre, aldehide, itd.
(c) haloalkil grupe u kojima halid može kasnije da se istisne nukleofilnom grupom kao što je, na primer, amin, karboksilatni anjon, tiolni anjon, karbanjon, ili alkoksidni jon, što rezultuje kovalentnim prikačinjanjem nove grupe na mestu atoma halogena;
(d) dienofilne grupe koje mogu da učestvuju u Diels-Alder-ovim reakcijama kao što su, na primer, maleimido grupe;
(e) aldehidne ili ketonske grupe tako da je kasnija derivatizacija omogućena formiranjem karbonil derivata kao što su, na primer, imini, hidrazoni, semikarbazoni ili oksimi, ili mehanizmima kao što su Grignard-ova adicija ili alkillitijumska adicija;
(f) sulfonil halidne grupe za kasniju reakciju sa aminima, na primer, za formiranje sulfonamida;
(g) tiolne grupe koje se mogu konvertovati u disulfide, reagovati sa acil halidima ili se povezati sa metalima kao što je zlato;
(h) aminske ili sulfhidrilne grupe koje mogu biti, na primer, acilovane, alkilisane ili oksidisane;
(i) alkene, koji mogu biti podvrgnuti, na primer, cikloadicijama, acilaciji, Michael-ovoj adiciji, itd;
(j) epokside koji mogu reagovati sa, na primer, aminima i hidroksilnim jedinjenjima;
(k) fosforoamidate i druge standardne reaktivne komponente korisne u sintezi nukleinskih kiselina;
(l) veze metala i silicijum oksida;
(m) veze metala i reaktivnih fosfornih grupa (npr. fosfini) da se formiraju, na primer, fosfatne diestarske veze; i
(n) sulfone, na primer, vinil sulfon.
[0059] Reaktivne komponente mogu se odabrati tako da ne utiču ili ne interferiraju sa henijskom stabilnošću proteina ili nukleinskih kiselina opisanih u ovom tekstu. Kao primer, nukleinske kiseline mogu uključivati vinil sulfon ili drugu reaktivnu komponentu (npr., maleimid). Opciono, nukleinske kiseline mogu uključivati reaktivnu komponentu koja ima formulu S-S-R. R može biti, na primer, protektujuća komponenta. Opciono, R je heksanol. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz heksanol uključuje jedinjenja sa formulom C6H13OH i uključuje 1-heksanol, 2-heksanol, 3-heksanol, 2-metil-1-pentanol, 3-metil-1-pentanol, 4-metil-1-pentanol, 2-metil-2-pentanol, 3-metil-2-pentanol, 4-metil-2-pentanol, 2-metil-3-pentanol, 3-metil-3-pentanol, 2,2-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-1-butanol, 3,3-dimetil-1-butanol, 2,3-dimetil-2-butanol, 3,3-dimetil-2-butanol, i 2-etil-1-butanol. Opciono, R je 1-heksanol.
[0060] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "oko" označava raspon vrednosti koji uključuje specifikovanu vrednost, koju osoba prosečno obučena u struci smatra razumno sličnom specifikovanoj vrednosti. U primerima izvođenja, izraz "oko" znači u okviru standardne devijacije uz korišćenje merenja opšte prihvaćenih u struci. U primerima izvođenja, "oko" znači raspon koji se pruža do /- 10% od specifikovane vrednosti. U primerima izvođenja, "oko" označava specifikovanu vrednost.
[0061] Izrazi "polipeptid," "peptid" i "protein" koriste se u ovom tekstu naizmenično u vezi sa polimerom aminokiselinskih rezidua, pri čemu polimer može biti konjugovan sa komponentom koja ne sadrži amino-kiseline. Izrazi važe za aminokiselinske polimere u kojima su jedna ili više aminokiselinskih rezidua veštački hemijski mimetici odgovarajućih prirodnih aminokiselina, kao i za prirodne amino-kiselinske polimere i aminokiselinske polimere koji se ne sreću u prirodi. Izrazi važe za makrociklične peptide, peptide koji su modifikovani nepeptidnom funkcionalnom grupom, peptidomimetike, poliamide, i makrolaktame. "Fuzioni protein" odnosi se na himerni protein koji kodira dve ili više odvojenih proteinskih sekvenci koje se rekombinantno eksprimiraju kao jedna komponenta.
[0062] Izraz "peptidil" i "peptidil komponenta" označava monovalentni peptid.
[0063] Izraz "amino-kiselina" odnosi se na prirodne i sintetske amino-kiseline, kao i na aminokiselinske analoge i aminokiselinske mimetike koji funkcionišu na način sličan prirodnim amino-kiselinama. Prirodne amino-kiseline su one koje su kodirane genetičkim kodom, kao i one amino-kiseline koje su kasnije modifikovane, npr., hidroksiprolin, γ-karboksiglutamat, i O-fosfoserin. "Aminokiselinski analozi" odnosi se na jedinjenja koja imaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna amino-kiselina, tj., α ugljenik koji je vezan za vodonik, karboksilnu grupu, amino grupu, i R grupu, npr., homoserin, norleucin, metionin sulfoksid, metionin metil sulfonijum. Takvi analozi imaju modifikovane R grupe (npr., norleucin) ili modofikovane peptidne osovine, ali zadržavaju istu osnovnu hemijsku strukturu kao prirodna amino-kiselina. "Aminokiselinski mimetici" odnosi se na hemijska jedinjenja koja imaju strukturu različitu od uobičajene hemijske strukture amino-kiselina, ali koja funkcionišu na način sličan prirodnoj amino-kiselini. Izrazi "amino-kiselina koja se ne sreće u prirodi" i "amino-kiselina koja nije prirodna" označavaju aminokiselinske analoge, sintetske amino-kiseline i aminokiselinske mimetike koji se ne nalaze prirodi.
[0064] Amino-kiseline mogu ovde biti označene ili svojim uobičajenim, poznatim troslovnim simbolima ili jednoslovnim simbolima koje preporučuje IUPAC-IUB Komisija za nomenklaturu u biohemiji. Nukleotidi, slično tome, mogu se označavati svojim opšteprihvaćenim jednoslovnim šiframa.
[0065] "Konzervativno modifikovane varijante" primenjuje se za aminokiselinske i nukleinskokiselinske sekvence. U vezi sa određenim sekvencama nukleinskih kiselina, "konzervativno modifikovane varijante" odnosi se na one nukleinske kiseline koje kodiraju identične ili suštinski identične aminokiselinske sekvence, ili kada nukleinska kiselina ne kodira aminokiselinsku sekvencu, na suštinski identične sekvence. Zbog degeneracije genetičkog koda, veliki broj funkcionalno identičnih nukleinskih kiselina kodira svaki dati protein. Na primer, kodoni GCA, GCC, GCG i GCU svi kodiraju amino-kiselinu alanin. Prema tome, na svakoj poziciji gde je alanin specifikovan kodonom, kodon može biti izmenjen u bilo koji od opisanih odgovarajućih kodona bez izmene kodiranog polipeptida. Takve varijacije nukleinskih kiselina su "tihe varijacije" koje su jedna od vrsta konzervativno modifikovanih varijacija. Svaka sekvenca nukleinske kiseline u ovom tekstu, koja kodira polipeptid opisuje i svaku moguću tihu varijaciju nukleinske kiseline. Stručnjak će prepoznati da svaki kodon u nukleinskoj kiselini (osim AUG koji je obično jedini kodon za metionin, i TGG koji je obično jedini kodon za triptofan) mogu da se modifikuju da daju funkcionalno identičan molekul. Prema tome, svaka tiha varijacija nukleinke kiseline koja kodira polipeptid implicitna je u svakoj opisanoj sekvenci u pogledu proizvoda ekspresije, ali ne i u pogledu aktuelnih sekvenci probe.
[0066] Što se tiče aminokiselinskih sekvenci, stručnjak će prepoznati da pojedinačne supstitucije, delecije ili adicije u sekvenci nukleinske kiseline, peptida, polipeptida ili proteina, koje menjaju, dodaju ili brišu jednu amino-kiselinu ili mali procenat amino-kiselina u kodiranoj sekvenci predstavljaju "konzervativno modifikovanu varijantu" u kojoj izmena za rezultat ima supstituciju amino-kiseline hemijski sličnom amino-kiselinom. Tabele konzervativnih supstitucija koje obezbeđuju funkcionalno sličnu amino-kiselinu dobro su poznate u struci. Takve konzervativno modifikovane varijante su dodatne i ne isključuju polimorfne varijante, interspecijske homologe, i alele upotrebljene u pronalasku.
[0067] Sledećih osam grupa sadrži amino-kiseline koje su jedna drugoj konzervativne supstitucije: 1) alanin (A), glicin (G); 2) asparaginska kiselina (D), glutaminska kiselina (E); 3) asparagin (N), glutamin (Q); 4) arginin (R), lizin (K); 5) izoleucin (I), leucin (L), metionin (M), valin (V); 6) fenilalanin (F), tirozin (Y), triptofan (W); 7) serin (S), treonin (T); i 8) cistein (C), metionin (M) (vidi, npr., Creighton, Proteins (1984)).
[0068] "Procenat sekvencione identičnosti" određuje se kada se uporede dve optimalno poravnate sekvence duž prozora poređenja, pri čemu deo polinukleotidne ili polipeptidne sekvence u prozoru poređenja može uključivati adicije ili delecije (tj., procepe) u poređenju sa referentnom sekvencom (koja ne sadrži adicije ili delecije) za optimalno poravnanje dveju sekvenci. Procenat se izračunava određivanjem broja pozicija na kojima se u obe sekvence sreće identična baza nukleinske kiseline ili aminokiselinska rezidua da bi se dobio broj poklopljenih pozicija, deljenjem broja poklopljenjih pozicija sa ukupnim brojem pozicija u prozoru poređenja i množenjem rezultata sa 100 da bi se dobio procenat identičnosti sekvenci.
[0069] Izrazi "identičan" ili procenat "identičnosti", u kontekstu dve ili više nukleinskokiselinskih ili polipeptidnih sekvenci, odnosi se na dve ili više sekvenci ili podsekvenci koje su iste ili imaju specifikovani procenat aminokiselinskih rezidua ili nukleotida koji su isti (tj., 60% identičnosti, opciono 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, ili 99% identičnosti duž specifikovanog regiona, npr., čitavih polipeptidnih sekvenci upotrebljenih u pronalasku ili pojedinačnih domena polipeptida upotrebljenih u pronalasku), kada se porede i poravnavaju za maksimalno poklapanje duž prozora poređenja, ili naznačenog regiona, kako je mereno korišćenjem jednog od sledećih algoritama za poređenje sekvenci ili ručnim poravnavanjem i vizuelnim ispitivanjem. Za takve sekvence se kaže da su "susuštinski identične". Ova definicija se odnosi i na komplement testne sekvence. Opciono, identičnost postoji duž regiona koji je dug najmanje oko 50 nukleotida, ili poželjnije, duž regiona koji je dug 100 do 500 ili 1000 ili više nukleotida.
[0070] Za poređenje sekvenci, tipično jedna sekvenca deluje kao referentna sekvenca, sa kojom se upoređuju testne sekvence. Kada se koristi algoritam poređenja sekvenci, testna i referentna sekvenca se unose u kompjuter, naznačavaju se koordinate podsekvenci, po potrebi, i naznačavaju se programski parametri sekvencionog algoritma. Mogu se koristiti zadati programski parametri ili se mogu dizajnirati alternativni parametri. Algoritam poređenja sekvenci tada izračunava procenat sekvencionih identičnosti za testne sekvence u odnosu na referentnu sekvencu, na osnovu programskih parametara.
[0071] "Prozor poređenja ", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na bilo koju od brojnih kontinuiranih pozicija odabranih iz grupe koju čine, npr., sekvenca pune dužine ili od 20 do 600, oko 50 do oko 200, ili oko 100 do oko 150 amino-kiselina ili nukleotida gde sekvenca može da se upoređuje sa referentnom sekvencom istog broja kontinuiranih pozicija posle optimalnog poravnavanja dveju sekvenci. Postupci poravnavanja sekvenci radi poređenja dobro su poznati u struci. Optimalno poravnavanje sekvenci radi poređenja može se izvesti, npr., algoritmom lokalne homologije Smith-a i Waterman-a (1970) Adv. Appl. Math. 2:482c, algoritmom homologog poravnavanja Needleman-a i Wunsch-a (1970) J. Mol. Biol. 48:443, istraživanjem postupka sličnosti Pearson-a i Lipman-a (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444, kompjuterizovanim implementacijama ovih algoritama (GAP, BESTFIT, FASTA, i TFASTA u Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), ili ručnim poravnavanjem i vizuelnim ispitivanjem (vidi, npr., Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 dodatak)).
[0072] Primeri algoritama pogodnih za određivanje procenta sekvencione identičnosti i sekvencione sličnosti su BLAST i BLAST 2.0 algoritmi, opisani u Altschul et al. (1977) Nuc. Acids Res.25:3389-3402, odnosno Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol.215:403-410. Softver za izvođenje BLAST analiza javno je dostupan preko National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Ovaj algoritam uključuje prvo identifikovanje sekvencionih parova sa visokim skorom (high scoring sequence pairs, HSP) identifikovanjem kratkih reči dužine W u sekvenci upita, koje se ili poklapaju ili zadovoljavaju neki pozitivno vrednovani pražni skor T kada se poravnaju sa rečju iste dužine u sekvenci iz baze podataka. T se odnosi na pražni skor susedne reči (Altschul et al., supra). Ovi početni pogoci susednih reči deluju kao zametak za iniciranje pretrage za pronalaženje dužih HSP koji ih sadrže. Pogoci reči se produžavaju u oba smera duž svake sekvence sve dok kumulativni skor poravnavanja može da se poveća. Kumulativni skorovi se izračunavaju korišćenjem, za nukleotidne sekvence, parametara M (nagradni skor za par poklapajućih rezidua; uvek > 0) i N (kazneni skor za nepoklapajuće rezidue; uvek < 0). Za aminokiselinske sekvence, matrica za skorovanje koristi se za izračunavanje kumulativnog skora. Produžavanje pogodaka za reč u svakom smeru zaustavlja se kada: kumulativni skor poravnanja opadne za količinu X u odnosu na svoju maksimalnu dostignutu vrednost; kumulativni skor dođe na nulu ili niže, zbog akumulacije poravnavanja rezidua sa negativnim skorom; ili kada se dođe do kraja jedne od sekvenci. BLAST algoritamski parametri W, T, i X određuju osetljivost i brzinu poravnavanja. BLASTN program (za sekvence nukleotida) koristi kao zadatu dužinu reči (W) 11, očekivanje (E) 10, M=5, N=-4 i poređenje oba lanca. Za aminokiselinske sekvence, BLASTP program koristi kao zadatu dužinu reči 3, i očekivanje (E) 10, i BLOSUM62 skorujuću matricu (vidi Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915) poravnavanje (B) 50, očekivanje (E) 10, M=5, N=-4, i poređenje oba lanca.
[0073] BLAST algoritam vrši i statističku analizu sličnosti između dve sekvence (vidi, npr., Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787). Jedna mera sličnosti obezbeđena BLAST algoritmom je najmanji zbir verovatnoće (P(N)), koja ukazuje na verovatnoću sa kojom bi slučajno došlo do poklapanje između dve nukleotidne ili aminokiselinske sekvence. Na primer, smatra se da je nukleinska kiselina slična sa referentnom sekvencom ako je najmanji zbir verovatnoće u upoređivanju testne nukleinske kiseline sa referentnom nukleinskom kiselinom manji od oko 0.2, poželjnije manji od oko 0.01, i najpoželjnije manji od oko 0.001.
[0074] Indikacija da su dve sekvence nukleinske kiseline ili dva polipeptida suštinski identični je da je polipeptid kodiran prvom nukleinskom kiselinom imunološki unakrsno reaktivan sa antitelima proizvedenim na polipeptid kodiran drugom nukleinskom kiselinom, kako je opisano u nastavku. Prema tome, polipeptid je tipično suštinski identičan sa drugim polipeptidom, na primer, kada se dva peptida razlikuju samo po konzervativnim supstitucijama. Još jedan pokazatelj da su dve nukleinskokiselinske sekvence suštinski identične je da se dva molekula ili njihovi komplementi hibridizuju jedan sa drugim pod stringentnim uslovima, kako je opisano u nastavku. Još jedan pokazatelj da su dve nukleinskokiselinske sekvence suštinski identične je da se isti prajmeri mogu koristiti za amplifikovanje sekvenci.
[0075] "Dovođenje u kontakt" koristi se u skladu sa svojim jednostavnim uobičajenim značenjem i odnosi se na proces dopuštanja da se najmanje dve zasebne vrste (npr. hemijska jedinjenja, uključujući biomolekule ili ćelije) dovoljno približe da bi reagovali, interagovali ili se fizički dodirnuli. Treba imati u vidu, međutim, da rezultujući reakcioni proizvod može da se proizvede direktno iz reakcije između dodatih reagenasa ili od intermedijera poreklom od jednog ili više dodatih reagenasa koji se mogu proizvesti u reakcionoj smeši.
[0076] Izraz "dovođenje u kontakt" može uključivati dopuštanje da dve vrste reaguju, interaguju, ili se fizički dodirnu, pri čemu dve vrste mogu biti, na primer, ligandski domen kako je opisano u ovom tekstu i ligandski vezivač. U objavljenim primerima, kontakt uključuje, na primer, dopuštanje da ligandski domen opisan u ovom tesktu interaguje sa vezivačem liganda.
[0077] "Kontrolni" uzorak ili vrednost odnosi se na uzorak koji služi kao referenca, obično poznata referenca, za upoređivanje sa testnim uzorkom. Na primer, testni uzorak može da se uzme iz testnog uslova, npr., u prisustvu testnog jedinjenja, i uporedi sa uzorcima iz poznatih uslova, npr., u odsustvu testnog jedinjenja (negativna kontrola), ili u prisustvu poznatog jedinjenja (pozitivna kontrola). Kontrola takođe može predstavljati prosečnu vrednost većeg broja testova ili rezultata. Stručnjak u oblasti će prepoznati da kontrole mogu da se dizajniraju za procenu bilo kojeg broja parametara. Na primer, može se osmisliti kontrola za upoređivanje terapijske koristi na osnovu farmakoloških podataka (npr., poluživot) ili terapijskih mera (npr., poređenje sporednih efekata). Stručnjak u oblasti će razumeti koje su standardne kontrole najpogodnije u datoj situaciji i biće u stanju da analizira podatke na osnovu poređenja sa standardnim kontrolnim vrednostima. Standardne kontrole su korisne i za određivanje značajnosti (npr. statistička značajnost) podataka. Na primer, ako vrednosti za dati parametar široko variraju u standardnim kontrolama, varijacija u testnom uzorku se neće smatrati značajnom.
[0078] "Obeleživač" ili "detektabilna komponenta" je kompozicija koja se može detektovati spektroskopski, fotohemijski, biohemijski, imunohemijski, hemijski, ili fizički. Na primer, korisni obeleživači uključuju<32>P, fluorescentne boje, elektron-guste reagense, enzime (npr., koji se često koriste u ELISA), biotin, digoksigenin, ili haptene i proteine ili druge entitete koji se mogu učiniti detektabilnim, npr., inkorporisanjem radioobeleživača u peptid ili antitelo specifično reaktivno sa ciljnim peptidom. Može se upotrebiti svaki pogodan postupak poznat u struci za konjugovanje antitela za obeleživač, npr., korišćenjem postupaka opisanih u Hermanson, Bioconjugate Techniques 1996, Academic Press, Inc., San Diego.
[0079] "Obeleženi protein ili polipeptid" je onaj koji je za obeleživač vezan kovalentno, preko linkera ili hemijske veze, ili nekovalentno, preko jonskih, van der Waals-ovih, elektrostatičkih ili vodoničnih veza tako da prisustvo obeleženog proteina ili polipeptida može da se detektuje detektovanjem prisustva obeleživača vezanog za obeleženi protein ili polipeptid. Alternativno, postupcima u kojima se koriste visokoafinitetne interakcije mogu se postići isti rezultati kada se jedan iz para vezujućih partnera vezuje za drugi, npr., biotin, streptavidin.
[0080] "Biološki uzorak" ili "uzorak" odnosi se na materijale dobijene ili izvedene iz subjekta ili pacijenta. Biološki uzorak uključuje preseke tkiva kao što su uzorci biopsije i autopsije, i zamrznute preseke uzete u histološke svrhe. Takvi uzorci uključuju telesne tečnosti kao što su krv i krvne frakcije ili proizvodi (npr., serum, plazma, pločice, crvene krvne ćelije i slično), sputum, tkivo, ćelije u kulturi (npr., primarne kulture, eksplanti, i transformisane ćelije), stolicu, urin, sinovijalnu tečnost, tkivo zgloba, sinovijalno tkivo, sinoviocite, fibroblastima slične sinoviocite, makrofagima slične sinoviocite, imunske ćelije, hematopoetske ćelije, fibroblaste, makrofage, T ćelije, itd. Biološki uzorak se tipično dobija iz eukariotskog organizma kao što je sisar na primer primat, npr., šimpanza ili čovek; krava; pas; mačka; glodar, npr., zamorac, pacov, miš; zec; ili ptica; reptil; ili riba.
[0081] "Ćelija", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na ćeliju koja vrši metaboličku ili drugu funkciju dovoljnu da očuva ili replicira svoju genomsku DNK. Ćelija može biti identifikovana postupcima koji su dobro poznati u struci uključujući, na primer, prisustvo intaktne membrane, bojenje određenom bojom, sposbnost da proizvede potomstvo ili, u slučaju gameta, sposobnost da se kombinuje sa drugim gametom da bi proizvela vijabilno potomstvo. Ćelije mogu uključiti prokariotske i eukariotske ćelije. Prokariotske ćelije uključuju, ali se ne ograničavaju na bakterije. Eukariotske ćelije uključuju, ali se ne ograničavaju na ćelije kvasca i ćelije izvedene iz biljaka i životinja, na primer sisarske, insekatske (npr., spodoptera) i ćelije čoveka.
[0082] Izraz "antitelo" koristi se u skladu sa svojim značenjem opšte poznatim u struci. Antitela postoje, npr., kao intaktni imunoglobulini ili kao brojni, dobro okarakterisani fragmenti proizvedeni digestijom različitim peptidazama. Tako, na primer, pepsin digestira antitelo ispod disulfidnih veza u regionu šarke da se proizvede F(ab)’2, dimer Fab koji je po sebi laki lanac spojen sa VH-CH1disulfidnom vezom. F(ab)’2može da se redukuje pod blagim uslovima da se raskine disulfidna veza u regionu šarke, čime se F(ab)’2dimer konvertuje u Fab’ monomer. Fab’ monomer je suštinski Fab sa delom regiona šarke (vidi Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed. 1993). Iako se različiti fragmenti antitela definišu u odnosu na digestiju intaktnog antitela, stručnjak će razumeti da takvi fragmenti mogu da se sintetišu de novo hemijski ili korišćenjem metodologije rekombinantne DNK. Prema tome, izraz antitelo, kako se koristi u ovom tekstu, uključuje fragmente antitela proizvedene modifikacijom celih antitela, ili one koji se sintetišu de novo korišćenjem metodologija rekombinantne DNK (npr., jednolančani Fv) ili one koji se identifikuju korišćenjem biblioteka prikazanih na fagima (vidi, npr., McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990)).
[0083] Za pripremanje monoklonskih ili poliklonskih antitela, može se koristiti bilo koja tehnologija poznata u struci (vidi, npr., Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); Cole et al., str. 77-96 u Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). "Monoklonska" antitela (mAb) odnosi se na antitela poreklom iz jednog klona. Tehnike za proizvodnju jednolančanih antitela (U.S. pat. br.4,946,778) mogu se prilagoditi za proizvodnju antitela na polipeptide upotrebljene u ovom pronalasku. Isto tako, transgeni miševi, ili drugi organizmi kao što su sisari, mogu se upotrebiti za eksprimiranje humanizovanih antitela. Alternativno, tehnologija prikazivanja na fagima može se koristiti za identifikovanje antitela i heteromernih Fab fragmenata koji se specifično vezuju za odabrane antigene (vidi, npr., McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).
[0084] "Čvrsta podloga", kako je dato u ovom tekstu, odnosi se na svaki materijal koji može da se modifikuje tako da sadrži posebna pojedinačna mesta pogodna za prikačinjanje ili pridruživanje mikročestica obezbeđenih u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja i koji je podložan ovde datim postupcima, uključujući njihove primere izvođenja. Primeri čvrstih podloga uključuju, bez ograničavanja, staklo i modifikovano ili funkcionalizovano staklo (npr., karboksimetildekstranom funkcionalizovano staklo), plastiku (uključujući akrile, polistiren i kopolimere stirena i drugih materijala, polipropilen, polietilen, polibutilen, poliuretane, Teflon.TM., itd.), polisaharide, najlon ili nitrocelulozu, kompozitne materijale, keramiku, i plastične smole, silicijum-dioksid ili na njemu bazirane materijale uključujući silicijum i modifikovani silicijum (npr., silicijum sa mustrom), ugljenik, metale, kvarc (npr., kvarc sa mustrom), neorgansko staklo, plastiku, snopove optičkih vlakana, i razne druge polimere. Uopšteno, supstrati dopuštaju optičku detekciju i ne fluoresciraju u značajnoj meri.
[0085] Čvrsta podloga obezbeđena u ovom tekstu, uključujući njene primere izvođenja, može formirati deo ISFET mikročipa (ion-sensitive field-effect transistor, tranzistor sa efektom polja osetljiv na jone, ISFET). Čvrsta podloga može biti planarna (npr., pljosnati planarni supstrati kao što su staklo, polistiren i druge vrste plastičnih materijala i akrilni materijali). Ipak, stručnjak u oblasti će razumeti da se mogu koristiti i druge konfiguracije čvrstih podloga, na primer, mogu se koristiti trodimezionalne konfiguracije. Čvrsta podloga može se modifikovati tako da sadrži zasebna, pojedinačna mesta (ovde označena i kao "bunarčići") za vezivanje mikročestica. Ova mesta obično uključuju fizički promenjena mesta, tj. fizičke konfiguracije kao što su bunarčići ili male depresije u supstratu, koje mogu da zadržavaju mikročestice.
Bunarčići mogu da se formiraju korišćenjem različitih tehnika dobro poznatih u struci, uključujući, ali ne ograničavajući se na fotolitografiju, tehnike urezivanja, tehnike izlivanja i tehnike mikrourezivanja. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti će razumeti da će tehnika koja će se koristiti zavisiti od sastava i oblika čvrste podloge. U primerima izvođenja, na površini čvrste podloge vrše se fizičke promene da bi se formirali bunarčići. Potrebna dubina bunarčića zavisiće od veličine mirkočestice koja će se dodati u bunarčić.
[0086] "Mikročestica", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na neplanarnu (npr. sferičnu) česticu koja ima veličinu dovoljnu za prikačinjanje molekula (npr., obezbeđeni prvi, drugi ili treći linker, ligandski domen i nukleinskokiselinski domen), direktno ili indirektno, preko kovalentnih ili nekovalentnih veza. Mikročestica može uključivati svaki materijal koji može da obezbedi fizičku potporu molekulima (npr., obezbeđeni prvi, drugi ili treći linker, ligandski domen i nukleinskokiselinski domen) prikačenim za površinu. Materijal je obično sposoban da izdrži uslove u vezi sa prikačinjanjem molekula (npr., obezbeđeni prvi, drugi ili treći linker, ligandski domen i nukleinskokiselinski domen) za površinu i svaki kasniji tretman, rukovanje ili procesovanje tokom izvođenja testa. Materijali mogu biti oni koji se sreću u prirodi, sintetski ili modifikovani materijali koji se sreću u prirodi. Pogodni materijali za mikročestice mogu uključivati silicijum, keramiku, plastiku (uključujući polimere kao što je, npr., poli(vinil hlorid), cikloolefinske kopolimere, agarozu, poliakrilamid, poliakrilat, polietilen, polipropilen, poli(4-metilbuten), polistiren, polimetakrilat, poli(etilen tereftalat), politetrafluoroetilen (PTFE ili Teflon.RTM.), najlon, poli(vinil butirat)), germanijum, galijum arsenid, zlato ili srebro, bakarne ili aluminijumske poovršine , magnetne površine, npr. Fe, Mn, Ni, Co, i njihovi oksidi, kvantne tačke, npr., III-V (GaN, GaP, GaAs, InP, ili InAs) ili II-VI (ZnO, ZnS, CdS, CdSe, ili CdTe) poluprovodnike, ili nanokristale fluorida sa dodatim Ln, nanomaterijale sa dodatim oksidima retkih zemnih elemenata, upotrebljene same ili zajedno sa drugim materijalima. Mogu se razmatrati i drugi dodatni rigidni materijali, kao što je staklo koje uključuje silicijum-dioksid i uključuje još, na primer, staklo koje je na raspolaganju kao Bioglass. Drugi materijali koji se mogu upotrebiti uključuju porozne materijale kao što su, na primer, staklene perlice sa kontrolisanom veličinom pora, unakrsno povezane Sepharose.RTM. ili agarozne smole u vidu perlica, ili kopolimere unakrsno povezanog bis-akrilamida i azalaktona. Druge perlice uključuju polimerne perlice, perlice sa čvrstom srži, paramagnetne perlice, ili mikroperlice. Svi drugi materijali poznati u struci koji mogu da imaju jednu ili više kompnenti, na primer bilo koju od amino, karboksil, tiol, ili hidroksil reaktivnih komponenti, na primer, inkorporisanu na svojoj površini, takođe se razmatraju. U primerima izvođenja, mikročestica je magnetna sfera na bazi polimera. U primerima izvođenja, mikročestica je ProMag™ mikrosfera. U primerima izvođenja, najduža dimenzija mikročestice je manja od 1000 µm.
KOMPOZICIJE
[0087] Kompozicije obezbeđene u ovom tekstu su, između ostalog, korisne za sklapanje čipova visoke gustine pogodnih za različite postupke visokopropusnog skrininga. Mikročestice obezbeđene u ovom tekstu uključuju ligandski domen prikačen preko prvog linkera i nukleinskokiselinski domen prikačen preko drugog linkera. Vezivanjem za čvrstu podlogu, mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja, mogu formirati deo čipa. Ligandski domen i nukleinskokiselinski domen sintetisani su na mikročestici korišćenjem postupaka kodirane split-pool hemije. Kodirana split-pool hemija je postupak dobro poznat u struci i opisan, pored ostalog, u sledećim referencama: Furka, A.; et al. Int. J. Pept. Protein Res. 1991, 37, 487-493; Kit Lam et al., Nature, 1991; 354: 82-84; US patenti 6,060,596; 5,770,358; 6,368,874; 5,565,324; 6,936,477 i 5,573,905. Svaki korak sinteze ligandskog domena (npr., sinteza peptida ili hemijskog jedinjenja) kodiran je u nukleinskokiselinskom domenu kratkom sekvencom nukleinske kiseline koja služi kao identifikacioni bar-kod. Prema tome, svaka mikročestica sadrži jedinstveni ligandski domen i odgovarajući nukleinskokiselinski domen koji kodira specifične sekvence nukleinske kiseline. Specifične sekvence nukleinske kiseline odgovaraju gradivnim blokovima ligandskog domena i redu kojiim se oni inkorporišu u ligandski domen. Posle hibridizacije komplementarne nukleinske kiseline sa pomenutim nukleinskokiselinskim domenom, kompozicija ligandskog domena i njegova lokacija na čipu mogu se odrediti (dekodirati). Pošto se odrede identitet ligandskog domena i njegova lokacija na čipu, nukleinskokiselinski domen se uklanja, ligandski domen može dalje da se modifikuje i dovede u kontakt sa ligandskim vezivačem (npr., biomolekulom).
[0088] U jednom aspektu, obezbeđene su mikročestice imobilisane na čvrstoj podlozi. Mikročestica je kovalentno prikačena za ligandski domen preko prvog linkera; i nukleinskokiselinski domen preko drugog linkera, pri čemu je drugi linker odseciv i prvi linker nije odseciv pod uslovom da je drugi linker odseciv. Pomenuti nukleinskokiselinski domen je kodirajuća oznaka koja identifikuje pomenuti ligandski domen. Pomenuti drugi linker je odseciv i pomenuti prvi linker nije odseciv pod uslovom da je drugi linker odseciv. Pomenuti prvi linker sadrži -C(O)NH- ili -NHC(O)-, i pomenuti drugi linker sadrži -C(O)O- ili -OC(O)-.
[0089] U primerima izvođenja, mikročestica je mikroperlica. "Mikroperlica" u ovom tekstu označava mikročesticu na bazi polimera, grubo sferičnog oblika, sa dijametrom od oko 0.5 µm do oko 500 µm. Izraz "na bazi polimera" ili "polimeran", u ovom tekstu, odnosi se na mikročesticu ili mikroperlicu koja uključuje najmanje jedno polimerno jedinjenje (npr., polietilen glikoli, polietilen imidi, polisaharidi, polipeptidi, ili polinukleotidi). U primerima izvođenja, mikroperlica je ProMag™ mikrosfera. U primerima izvođenja, mikroperlica je magnetna mikroperlica na bazi polimera.
[0090] Mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja, mogu biti manje od 200 µm. Kada je mikročestica manja od 200 µm, osoba prosečno obučena u struci odmah će prepoznati da je najduža dimenzija (npr. dijametar ili dužina) mikročestice manja od 200 µm. U drugim primerima izvođenja, mikročestica je oko 20 nm. U nekim primerima izvođenja, mikročestica je od oko 0.01 µm do oko 200 µm, od oko 0.02 µm do oko 200 µm, od oko 0.05 µm do oko 200 µm, od oko 0.1 µm do oko 200 µm, od oko 0.5 µm do oko 200 µm, od oko 1 µm do oko 200 µm, od oko 2 µm do oko 200 µm, od oko 5 µm do oko 200 µm, od oko 10 µm do oko 200 µm, od oko 15 µm do oko 200 µm, od oko 20 µm do oko 200 µm, od oko 25 µm do oko 200 µm, od oko 30 µm do oko 200 µm, od oko 35 µm do oko 200 mm, od oko 40 µm do oko 200 µm, od oko 45 µm do oko 200 µm, od oko 50 µm do oko 200 µm, od oko 55 µm do oko 200 µm, od oko 60 µm do oko 200 µm, od oko 65 µm do oko 200 µm, od oko 70 µm do oko 200 µm, od oko 75 µm do oko 200 µm, od oko 80 µm do oko 200 µm, od oko 85 µm do oko 200 µm, od oko 90 µm do oko 200 µm, od oko 95 µm do oko 200 µm, od oko 100 µm do oko 200 µm, od oko 101 µm do oko 200 µm, od oko 102 µm do oko 200 µm, od oko 105 µm do oko 200 µm, od oko 10 µm do oko 200 µm, od oko 115 µm do oko 200 µm, od oko 120 µm do oko 200 µm, od oko 125 µm do oko 200 µm, od oko 130 µm do oko 200 µm, od oko 135 µm do oko 200 µm, od oko 140 µm do oko 200 µm, od oko 145 µm do oko 200 µm, od oko 150 µm do oko 200 µm, od oko 155 µm do oko 200 µm, od oko 160 µm do oko 200 µm, od oko 165 µm do oko 200 µm, od oko 170 µm do oko 200 µm, od oko 175 µm do oko 200 µm, od oko 180 µm do oko 200 µm, od oko 185 µm do oko 200 µm, od oko 190 µm do oko 200 µm, ili od oko 195 µm do oko 200 µm.
[0091] U nekim primerima izvođenja, mikročestica je od oko 0.01 µm do oko 100 µm, od oko 0.02 µm do oko 100 µm, od oko 0.05 µm do oko 100 µm, od oko 0.1 µm do oko 100 µm, od oko 0.5 µm do oko 100 µm, od oko 1 µm do oko 100 µm, od oko 2 µm do oko 100 µm, od oko 5 µm do oko 100 µm, od oko 10 µm do oko 100 µm, od oko 15 µm do oko 100 µm, od oko 20 µm do oko 100 µm, od oko 25 µm do oko 100 µm, od oko 30 µm do oko 100 µm, od oko 35 µm do oko 100 µm, od oko 40 µm do oko 100 µm, od oko 45 µm do oko 100 µm, od oko 50 µm do oko 100 µm, od oko 55 µm do oko 100 µm, od oko 60 µm do oko 100 µm, od oko 65 µm do oko 100 µm, od oko 70 µm do oko 100 µm, od oko 75 µm do oko 100 µm, od oko 80 µm do oko 100 µm, od oko 85 µm do oko 100 µm, od oko 90 µm do oko 100 µm, ili od oko 95 µm do oko 100 µm.
[0092] U nekim primerima izvođenja, mikročestica je od oko 0.01 µm do oko 50 µm, od oko 0.02 µm do oko 50 µm, od oko 0.05 µm do oko 50 µm, od oko 0.1 µm do oko 50 µm, od oko 0.5 µm do oko 50 µm, od oko 1 µm do oko 50 µm, od oko 2 µm do oko 50 µm, od oko 5 µm do oko 50 µm, od oko 10 µm do oko 50 µm, od oko 15 µm do oko 50 µm, od oko 20 µm do oko 50 µm, od oko 25 µm do oko 50 µm, od oko 30 µm do oko 50 µm, od oko 35 µm do oko 50 µm, od oko 40 µm do oko 50 µm, ili od oko 45 µm do oko 50 µm.
[0093] U nekim primerima izvođenja, mikročestica je od oko 0.01 µm do oko 20 µm, od oko 0.02 µm do oko 20 µm, od oko 0.05 µm do oko 20 µm, od oko 0.1 µm do oko 20 µm, od oko 0.5 µm do oko 20 µm, od oko 1 µm do oko 20 µm, od oko 2 µm do oko 20 µm, od oko 5 µm do oko 20 µm, od oko 10 µm do oko 20 µm, ili od oko 15 µm do oko 20 µm.
[0094] U nekim primerima izvođenja, mikročestica je od oko 0.01 µm do oko 10 µm, od oko 0.02 µm do oko 10 µm, od oko 0.05 µm do oko 10 µm, od oko 0.1 µm do oko 10 µm, od oko 0.2 µm do oko 10 µm, od oko 0.3 µm do oko 10 µm, od oko 0.4 µm do oko 10 µm, od oko 0.5 µm do oko 10 µm, od oko 0.6 µm do oko 10 µm, od oko 0.7 µm do oko 10 µm, od oko 0.8 µm do oko 10 µm, od oko 0.9 µm do oko 10 µm, od oko 1 µm do oko 10 µm, od oko 2 µm do oko 10 µm ili od oko 5 µm do oko 10 µm.
[0095] U primerima izvođenja, mikročestica je oko 0.9 µm. U primerima izvođenja, mikročestica ima dijametar od oko 0.9 µm. U primerima izvođenja, mikročestica je oko 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5,10, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, ili 200 µm. U drugim primerima izvođenja, mikročestica ima dijametar od oko 0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5,10, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, ili 200 µm. Gornje numeričke vrednosti predstavljaju veličinu mikročestice u µm.
[0096] U primerima izvođenja, mikročestica je funkcionalizovana mikroperlica. Kada je mikročestica funkcionalizovana mikroperlica, mikročestica može uključivati svaku reaktivnu komponentu pogodnu za reakcije hemijskog konjugovanja opisane u ovom tekstu. Izraz "funkcionalizovan", u ovom tekstu odnosi se na jedinjenje ili domen (npr., mikročestica, linker, ligandski domen, nukleinskokiselinski domen, sekvenca nukleinske kiseline) koji uključuju reaktivnu komponentu ili reaktivne funkcionalne grupe upotrebljene za hemijske reakcije konjugacije opisane u ovom tekstu. Na primer, funkcionalizovana mikroperlica može uključivati jednu ili više reaktivnih komponenti, na primer bilo koju od amino, karboksil, tiol, ili hidroksil reaktivnih komponenti, inkorporisanih na svojoj površini. U primerima izvođenja, prva funkcionalizovana grupa omogućava prikačinjanje ligandskog domena preko prvog linkera. U primerima izvođenja, druga funkcionalizovana grupa omogućava prikačinjanje nukleinskokiselinskog domena preko drugog linkera. U primerima izvođenja, prva i druga funkcionalizovana grupa su nezavisno različite. Prema tome, ligandski domen može da se prikači za mikročesticu preko prvog linkera konjugacijom sa funkcionalizovanom grupom različitom od one za prikačinjanje nukleinskokiselinskog domena. U primerima izvođenja, treća funkcionalizovana grupa spaja mikročesticu sa čvrstom podlogom. Prema tome, u primerima izvođenja, mikročestica je kovalentno prikačena za čvrstu podlogu.
[0097] Mikročestica obezbeđena u ovom tekstu može uključivati polimer. U tom slučaju polimeri će nositi reaktivne komponente koje će biti aktivirane. Polimer rmože da se bira iz bilo koje pogodne klase jedinjenja, na primer, polietilen glikoli, polietilen imidi, polisaharidi, polipeptidi, ili polinukleotidi. U primerima izvođenja, mikročestica uključuje bis-amino polietileneglikol 3000 i hidroksil-polietilen glikol 3000. U primerima izvođenja, mikročestica uključuje polimerni sloj. Na prikačinjanje polimera za mikročesticu može se uticati različitim postupcima koji su lako prepoznatljivi stručnjaku u oblasti. Na primer, polimeri koji nose trihlorosilil ili trisalkoksi grupe mogu reagovati sa hidroksilnim grupama na mikročestici da formiraju siloksanske veze. Prikačinjanje za zlatnu ili srebrnu mikročesticu može se izvesti preko tiolnih grupa na polimeru. Alternativno, polimer može da se prikači preko intermedijernih vrsta, na primer samoasamblirajućeg monosloja alkantiola. Tip odabranog polimera, i postupak odabran za prikačinjanje polimera za mikročesticu, zavisiće od toga da li polimer ima odgovarajuću reaktivnu grupu za prikačinjanje za površinu mikročestice, i od osobina polimera u vezi sa nespecifičnom adsorpcijom za, posebno, DNK ili peptide. Reaktivne komponente mogu biti prisutne na polimeru ili se mogu dodati polimeru adicijom jedne ili više reaktivnih komponenti. Opciono, spejserska ručica (npr., linker) može se upotrebiti za obezbeđivanje fleksiilnosti vezujućem nukleinskokiselinskom domenu ili ligandskom domenu dopuštajući im da interaguju sa svojim okruženjem na način koji na najmanju meru svodi sterno ometanje sa mikročesticom.
[0098] U primerima izvođenja, funkcionalizovana mikroperlica je magnetna na polimeru bazirana (polimerna) mikroperlica. U primerima izvođenja, mikroperlica je ProMag™ mikrosfera. U primerima izvođenja, mikroperlica sadrži više od jednog polimera. U primerima izvođenja, , mikroperlica sadrži prvi polimer i drugi polimer, pri čemu su prvi polimer i drugi polimer hemijski različiti. U primerima izvođenja, prvi polimer je bis-amino polietilenglikol 3000 i drugi polimer je hidroksil-polietilen glikol 3000. U primerima izvođenja, prvi polimer uključuje prvu reaktivnu komponentu i drugi polimer uključuje drugu reaktivnu komponentu-Reaktivna komponenta u ovom tekstu uključuje bilo koju od funkcionalnih komponenti konrisnih za reakcije hemijske konjugacije, opisamne ovde. U primerima izvođenja, prva reaktivna komponenta je amino funkcionalna grupa i druga reaktivna komponenta je hidroksil funkcionalna grupa. U primerima izvođenja, hidroksil funkcionalna grupa reaguje da formira azidoacetatnu komponentu. U primerima izvođenja, prva reaktivna komponenta (npr., amino funkcionalna grupa) reaguje sa reaktivnom komponentom (npr., karboksil funkcionalna grupa) prvog linkera. U primerima izvođenja, azidoacetatna komponenta reaguje sa reaktivnom komponentom (npr., alkinil funkcionalnom grupom) drugog linkera.
[0099] U primerima izvođenja, mikročestica je polimerna mikroperlica. U primerima izvođenja, mikročestica je dendrimer. "Dendrimer" u ovom tekstu odnosi se na sferični polimerni molekul sačinjen od dva monomera (npr., akrilna kiselina i diamin). Dendrimeri su precizno definisane hemijske strukture koje se sastoje od serije hemijskih ljuštura naslaganih na malom molekulu srži. Svaki sloj sastoji se od dve hemikalije, uvek istim redom. U primerima izvođenja, mikročestica je granati polimer. U primerima izvođenja, mikročestica je magnetna polimerna mikroperlica. U primerima izvođenja, mikročestica je karboksimetildekstranom funkcionalizovana mikroperlica. U primerima izvođenja, mikročestica je polietilen glikolom funkcionalizovana mikroperlica. U dodatnim primerima izvođenja, polietilen glikolom funkcionalizovana mikroperlica uključuje ortogonalno protektovane amine. U primerima izvođenja, mikročestica je magnetna mikroperlica. U primerima izvođenja, mikročestica je metalna mikroperlica. U primerima izvođenja, mikročestica je mikroperlica od silicijumdioksida.
[0100] Kako je prikazano na SL.1 mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja, mogu uključivati veliki broj tačaka prikačinjanja za prikačinjanje velikog broja prvog, drugog i trećeg linkera. Mikročestica može uključivati veliki broj prvih mesta prikačinjanja za prvi linker koji prikačinje ligandski domen, veliki broj drugih mesta prikačinjanja za drugi linker koji prikačinje nukleinskokiselinski domen i veliki broj trećih mesta prikačinjanja za treći linker koji prikačinje mikročesticu za čvrstu podlogu. Ukupan broj mesta prikačinjanja po mikročestici može iznositi oko 25-50 atomola. Kada je ukupan broj tačaka prikačinjanja 100%, broj prvih tačaka prikačinjanja može biti veći od oko 1% i manji od oko 20%. Kada je ukupan broj tačaka prikačinjanja 100%, broj drugih tačaka prikačinjanja može biti veći od oko 40% i manji od oko 90%. Kada je ukupan broj tačaka prikačinjanja 100%, broj trećih tačaka prikačinjanja može biti veći od oko 0% i manji od oko 50%.
[0101] "Ligandski domen" dat u ovom tekstu je domen sposoban za vezivanje ligandskog vezivača (npr., analit, biomolekul). U primerima izvođenja, ligandski domen je peptid. U primerima izvođenja, ligandski domen je polipeptid. U primerima izvođenja, ligandski domen uključuje površinski glikoprotein ili njegove fragmente. U primerima izvođenja, ligandski domen ima proteinsku sekvencu koja odgovara pozicijama amino-kiselina 98-106 proteina hemaglutinina (HA) čovečjeg gripa. U primerima izvođenja, ligandski domen uključuje sekvence SEQ ID NO: 17 ili SEQ ID NO: 18.
[0102] U primerima izvođenja, ligandski domen uključuje protektivnu komponentu prikačenu za reaktivnu komponentu (npr., karboksil funkcionalnu grupu) ligandskog domena. Kako se koristi u ovom tekstu, protektivna komponenta je hemijska komponenta kovalentno prikačena za ligandski domen, koja sprečava da ligandski domen veže ligandski vezivač, pri čemu protektivna komponenta može da se ukloni, na primer, hemijskim putem, po potrebi. U primerima izvođenja, protektivna komponenta je fluorenilmetiloksikarbonil. U primerima izvođenja, protektivna komponenta je tert-butil ili karboksibenzil. Kada ligandski domen uključuje protektivnu komponentu, ligandski domen može biti poliamid sa protektovanim bočnim lancem. Kada ligandski domen uključuje protektivnu komponentu, on može u ovom tekstu da se označi i kao "sintetski intermedijer" ili "sintetski prekursor". U primerima izvođenja, protektivna komponenta uključuje aminokiselinski bočni lanac. U primerima izvođenja, protektivna komponenta uključuje amino terminus (npr. terminalnu -NH2grupu) ili karboksi terminus (npr. terminalnu -COOH grupu). U primerima izvođenja, protektivna komponenta je prikačena za aminokiselinski bočni lanac. U primerima izvođenja, protektivna komponenta je prikačena za amino terminus (npr. terminalnu -NH2grupu) ili karboksi terminus (npr. terminalnu -COOH grupu). U prisustvu protektivne komponente, ligandski domen nije sposoban da veže ligandski vezivač. Prema tome, u primerima izvođenja ligandski domen uključuje protektivnu komponentu i nije vezan za ligandski vezivač. Posle uklanjanja protektivne komponente formira se reaktivna komponenta sa ligandskim domenom sposobnim za vezivanje ligandskog vezivača.
[0103] Ligandski domen obezbeđen u ovom tekstu može se formirati korišćenjem bilo koje sinteze u više koraka vezane za podlogu, kompatibilne sa sa kompozicijom mikročestica i sa hemijom sinteze nukleinskokiselinskog domena datog u ovom tekstu. Ligandski domen i nukleinskokiselinski domen mogu se simultano sintetisati na mikročestici. Alternativno, nukleinskokiselinski domen se sintetiše na mikročestici posle sinteze ligandskog domena. U objavljenim primerima, prikačinjanje ligandskog domena preko prvog linkera izvodi se pre prikačinjanja nukleinskog domena preko drugog linkera. U objavljenim primerima, prikačinjanje ligandskog domena preko prvog linkera obavlja se simultano sa prikačinjanjem nukleinskog domena preko drugog linkera. U primerima izvođenja, ligandski domen je peptid. U primerima izvođenja, ligandski domen je mali molekul. U primerima izvođenja, ligandski domen je protein. U primerima izvođenja, ligandski domen vezuje se za ligandski vezivač. Ligandski domen može biti prikačen za detektabilnu komponentu (npr., fluorescentnu komponentu, luminiscentnu komponentu, kolorimetrijsku komponentu, fosforescentnu komponentu, radioaktivnu komponentu ili elektroaktivnu komponentu).
[0104] "Ligandski vezivač", kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na agens (npr., atom, molekul, jon, molekulski jon, jedinjenje ili česticu) sposoban da veže ligandski domen obezbeđen u ovom tekstu, uključujući njegove primere izvođenja. Ligandski vezivači uključuju, bez ograničavanja, biomolekule (npr., hormone, citokine, proteine, nukleinske kiseline, lipide, ugljene hidrate, antigene i receptore ćelijske membrane (neuralne, hormonske, nutrijentne i ćelijske površinske receptore ili njihove ligande); cele ćelije ili njihove lizate (npr., prokariotske (npr., patogene bakterije), eukariotske ćelije (npr., tumorske ćelije sisara); viruse (npr., retrovirusi, herpesvirusi, adenovirusi, lentivirusi); i spore); hemikalije (npr., rastvarači, polimeri, organski materijali); terapijske molekule (npr., terapijski lekovi, lekovi koji se zloupotrebljavaju, antibiotici); ili sredinske zagađivače (npr., pesticidi, insekticidi, toksini). Ligandski vezivač može biti protein, smeša proteina, nukleinska kiselina, smeša nukleinskih kiselina, mali molekul, smeša malih molekula, element, smeša elemenata, sintetski polimer, smeša sintetskih polimera, ćelijski lizat. U primerima izvođenja, ligandski vezivač je biomolekul. U primerima izvođenja, biomolekul je nukleinska kiselina. U primerima izvođenja, biomolekul je protein (npr. antitelo). U primerima izvođenja, ligandski vezivač je antitelo. U primerima izvođenja, ligandski vezivač je anti-HA antitelo. U primerima izvođenja, ligandski vezivač je anti-Myc antitelo. U primerima izvođenja, ligandski domen vezuje peptid SEQ ID NO: 17. U primerima izvođenja, ligandski domen vezuje peptid SEQ ID NO: 18. U primerima izvođenja, ligandski vezivač je prikačen za detektabilnu komponentu. U primerima izvođenja, detektabilna komponenta je fluorescentna komponenta. U primerima izvođenja, ligandski vezivač je mali molekul. U primerima izvođenja, ligandski domen nije vezan za ligandski vezivač. Kada ligandski domen nije vezan za ligandski vezivač, ligandski domen može uključivati protektivnu komponentu ili neku drugu primenljivu modifikaciju, čineći ligandski domen inertnim. Ligandski vezivač može biti prikačen za detektabilnu komponentu (npr., fluorescentnu komponentu, luminiscentnu komponentu, kolorimetrijsku komponentu, fosforescentnu komponentu, radioaktivnu komponentu ili elektroaktivnu komponentu).
[0105] Kako je opisano ranije u ovom tekstu "nukleinskokiselinski domen" dat u ovom tekstu uključuje sekvencu nukleinske kiseline koja odgovara pojedinačnim gradivnim blokovima ligandskog domena i redu kojim se ovi gradivni blokovi inkorporišu u pomenuti ligandski domen. Prema tome, svaka mikročestica uključuje jedinstveni ligandski domen i odgovarajući nukleinskokiselinski domen koji kodira specifične sekvence nukleinskih kiselina koje odgovaraju gradivnim blokovima ligandskog domena i redu kojim se oni inkorporišu u ligandski domen. Nukleinskokiselinski domeni obezbeđeni u ovom tekstu označavaju se i kao "oznaka" ili "kodirajuća oznaka". U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen sadrži sekvencu nukleinske kiseline. U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline duga je oko 18 baznih parova. U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline duga je oko 20 baznih parova. U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline duga je oko 10, 11, 12, 13,14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 79, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ili 80 baznih parova. U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline ne uključuje citozin.
[0106] U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline uključuje kovalentni linker. U primerima izvođenja, kovalentni linker spaja dve nukleinskokiselinske sekvence unutar nukleinskokiselinskog domena. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje najmanje dve nukleinskokiselinske sekvence spojene kovalentnim linkerom. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje najmanje četiri nukleinskokiselinske sekvence spojene kovalentnim linkerima. Prema tome, u primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje prvu sekvencu nukleinske kiseline, drugu sekvencu nukleinske kiseline, treću sekvencu nukleinske kiseline i četvrtu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu je prva sekvenca nukleinske kiseline spojena sa drugom sekvencom nukleinske kiseline preko prvog kovalentnog linkera, druga sekvenca nukleinske kiseline spojena je sa trećom sekvencom nukleinske kiseline preko drugog kovalentnog linkera i treća sekvenca nukleinske kiseline spojena je sa četvrom sekvencom nukleinske kiseline preko trećeg kovalentnog linkera. U primerima izvođenja, kovalentni linker (npr., prvi, drugi, treći kovalentni linker) je veza, -S(O)-, -S(O)2NH-, -NHS(O)2-, -C(O)O-, -OC(O) -, -C(O)-, -C(O)NH-, -NH-, -NHC(O)-, -O-, -S-, supstituisani ili nesupstituisani alkilen, supstituisani ili nesupstituisani heteroalkilen, supstituisani ili nesupstituisani cikloalkilen, supstituisani ili nesupstituisani heterocikloalkilen, supstituisani ili nesupstituisani arilen, ili supstituisani ili nesupstituisani heteroarilen. U primerima izvođenja, kovalentni linker je 1,3 triazolenski linker. U primerima izvođenja, kovalentni linker ima strukturu
[0107] (I). U primerima izvođenja, kovalentni linker uključuje strukturu:
[0108] (I). U formuli (I), tačka prikačinjanja obeležena sa ∗ naznačava prikačinjanje kovalentnog linkera za prvu sekvencu nukleinske kiseline i tačka prikačinjanje označena sa ∗∗ naznačava tačku prikačinjanja kovalentnog linkera za drugu sekvencu nukleinske kiseline.
[0109] U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje funkcionalizovanu sekvencu nukleinske kiseline. Funkcionalizovana nukleinska kiselina obezbeđena u ovom tekstu uključuje reaktivne funkcionalne grupe upotrebljene za hemijske reakcije konjugacije, kako je opisano u ovom tekstu. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje veliki broj funkcionalizovanih nukleinskokiselinskih sekvenci. Kada nukleinskokiselinski domen uključuje veliki broj funkcionalizovanih nukleinskokiselinskih sekvenci, funkcionalizovane nukleinskokiselinske sekvence su spojene preko velikog broja kovalentnih linkera. U primerima izvođenja, svaki od velikog broja kovalentnih linkera je hemijski različit. Šematske ilustracije sinteze nukleinskog domena i ligandskog domena na mikročestici date su na Slikama 4, 5, i 6. Kako je prikazano na Slikama 5 i 6, nukleinskokiselinski domeni prikačeni za mikročesticu mogu biti nezavisno različiti, u zavisnosti od upotrebljene sinteze i mogu uključivati dve ili više nukleinskikiselinskih sekvenci spojenih kovalentnim linkerom.
[0110] Nukleinskokiselinski domeni obezbeđeni u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja, kompatibilni su sa (i) postupcima sinteze u više koraka, vezane za podlogu, koji se primenjuju za formiranje ligandskog domena, kako je dato u ovom tekstu, (ii) kompozicijom mikročestice i (iii) procedurama dekodiranja obezbeđenim u ovom tekstu (tj., kojima se identifikuje kompozicija ligandskog domena i njegova lokacija na čipu). Korisne procedure dekodiranja uključuju, bez ograničavanja, procedure sekvencioniranja hibridizacijom ili sekvenciranja na bazi enzima (npr., sekvenciranje sintezom, sekvenciranje ligacijom). Prema tome, u primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline vezana je za komplementarnu sekvencu nukleinske kiseline. U primerima izvođenja, komplementarna sekvenca nukleinske kiseline uključuje detektabilnu komponentu. U primerima izvođenja, detektabilna komponenta je fluorescentna komponenta. Posle hibridizacije komplementarne nukleinske kiseline sa pomenutim nukleinskokiselinskim domenom, moguće je odrediti kompoziciju ligandskog domena i njegovu lokaciju na čipu. Posle određivanja identiteta ligandskog domena i njegove lokacije na čipu, nukleinskokiselinski domen može da se ukloni (npr., odsecanjem drugog linkera), ligandski domen može dodatno da se modifikuje (npr., reakcijom reaktivne komponente ligandskog domena) i dovede u kontakt sa ligandskim vezivačem (npr., biomolekulom).
[0111] Linkeri obezbeđeni u ovom tekstu hemijski povezuju mikročesticu i ligandski domen (prvi linker), mikročesticu i nukleinskokiselinski domen (drugi linker) ili mikročesticu i čvrstu podlogu (treći linker). Kako je gore opisano nukleinskokiselinski domen obezbeđen u ovom tekstu, uključujući njegove primere izvođenja, može uključiti dve ili više nukleinskokiselinskih sekvenci spojenih kovalentnim linkerima (npr., 1,3 triazolenski linker). Prema tome, u primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen uključuje dva ili više 1,3 triazolenska linkera. Linkeri obezbeđeni u ovom tekstu (npr., prvi linker, drugi linker, treći linker) mogu biti kovalentno prikačeni za mikročesticu primenom postupaka dobro poznatih u struci i kompatibilnih sa kompozicijom linkera i mikročestice. Linkeri obezbeđeni u ovom tekstu mogu uključiti konjugovani proizvod reaktivnih komponenti na tački prikačinjanja za mikročesticu, na tački prikačinjanja za ligandski domen, na tački prikačinjanja za nukleinskokiselinski domen, ili na tački prikačinjanja za čvrstu podlogu. Prema tome, linkeri obezbeđeni u ovom tekstu mogu biti polivalentni i mogu se formirati tehnikama hemijske konjugacije.
[0112] U predmetnom pronalasku, prvi linker uključuje -C(O)NH- ili -NHC(O)-. U predmetnom pronalasku, drugi linker uključuje -C(O)O- ili -OC(O) -. U primerima izvođenja, prvi linker uključuje strukturu -N(H)-C(O)-. Kada prvi linker ima strukturu -N(H)-C(O)-, azot je prikačen za funkcionalizovanu čvrstu podlogu (npr., funkcionalizovanu sa bis-amino PEG 3000) i uglenik je prikačen za ligandski domen. Kako je opisano gore, posle određivanja identiteta ligandskog domena i njegove lokacije na čipu, nukleinskokiselinski domen može da se ukloni odsecanjem drugog linkera. U primerima izvođenja, drugi linker je linker labilan u kiselim uslovima. U predmetnom pronalasku, drugi linker uključuje estar. U primerima izvođenja, drugi linker je labilan u baznoj sredini. U primerima izvođenja, drugi linker ima strukturu:
[0113] (II). U primerima izvođenja, drugi linker uključuje strukturu:
[0114] (II). U formuli (II), tačka prikačinjanja obeležena sa ∗ naznačava mesto prikačinjanja funkcionalizovane čvrste podloge (npr., funkcionalizovane sa hidroksil-amin PEG 3000) i tačka prikačinjanje označena sa ∗∗ naznačava tačku prikačinjanja za nukleinskokiselinski domen. U primerima izvođenja, drugi linker ima strukturu:
[0115] (IIA). U formuli (IIA), X je ceo broj od 20 do 300. U primerima izvođenja, x je 68. U formuli (IIA), tačka prikačinjanja označena sa ∗ naznačava tačku prikačinjanja za čvrstu podlogu i tačka prikačinjanja označena sa ∗∗ naznačava tačku prikačinjanja za nukleinskokiselinski domen. U primerima izvođenja, drugi linker ima strukturu
(IIB). U formuli (IIB), L<1>je -C(O)O-, ili -OC(O) -. U formuli (IIB), tačka prikačinjanja označena sa ∗ naznačava tačku prikačinjanja za čvrstu podlogu i tačka prikačinjanja označena sa ∗∗ naznačava tačku prikačinjanja za nukleinskokiselinski domen.
[0116] U skladu sa ovde datim primerima izvođenja, mikročestice obezbeđene u ovom tekstu mogu uključiti veliki broj ligandskih domena i veliki broj nukleinskokiselinskih domena prikačenih preko velikog broja prvih linkera, odnosno velikog broja drugih linkera (vidi SL.3, 4, ili 5). Prema tome, u primerima izvođenja, ligandski domen predstavlja veliki broj ligandskih domena prikačenih preko velikog broja prvih linkera. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen predstavlja veliki broj nukleinskokiselinskih domena prikačenih preko velikog broja drugih linkera. U primerima izvođenja, veliki broj nukleinskokiselinskih domena prikačenih za jednu mikročesticu mogu biti isti ili nezavisno različiti (vidi SL.5 ili 6).
[0117] Mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njihove primere izvođenja, prikačene su za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, čvrsta podloga je planarna podloga. U primerima izvođenja, mikročestica je spojena preko trećeg linkera za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, mikročestica je nekovalentno prikačena za čvrstu podlogu (npr. preko elektrostatičkih interakcija (npr. jonska veza, vodonična veza, halogenska veza), van der Waalsovih interakcija (npr. dipol-dipol, dipol-indukovani dipol, London-ova disperzija), slaganja prstenova (pi efekti), hidrofobnih interakcija i slično). U primerima izvođenja, mikročestica je mehanički prikačena za čvrstu podlogu. Kada je mikročestica mehanički prikačena za čvrstu podlogu, ona se fizički drži na mestu na podlozi na mehanički način (npr., bunarčić). U primerima izvođenja, veliki broj mikročestica kovalentno je povezan za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, mikročestica je prikačena za čvrstu podlogu preko amidnog linkera. Prema tome, u primerima izvođenja, treći linker ima strukturu -N(H)-C(O)-. U primerima izvođenja, čvrsta podloga uključuje karboksimetildekstran. U primerima izvođenja, čvrsta podloga uključuje karboksimetildekstranom funkcinalizovano staklo. U primerima izvođenja, čvrsta podloga je silicijumska pločica.
[0118] U primerima izvođenja, veliki broj mikročestica formira neuređeni čip. "Neuređeni čip" u ovom tekstu odnosi se na čip mikročestica, pri čemu su mikročestice nasumično asamblirane ili prikačene za čvrstu podlogu i ne formiraju uređenu dvo- ili trodimenzionalnu strukturu. U primerima izvođenja, veliki broj mikročestica formira uređeni čip. U uređenom čipu, mikročestice su asamblirane ili prikačene za čvrstu podlogu u skladu sa dvo- ili trodimenzionalnom uređenošću. Na primer, šestougaoni čip sastoji se od velikog broja mikročestica asambliranih ili prikačenih za čvrstu podlogu tako da svaka mikročestica formira deo šestougla, pri čemu svaka mikročestica zauzima jedan ugao šestougla, i pri čemu centar šestougla zauzima sedma mikročestica. U primerima izvođenja, veliki broj mikročestica formira šestougaoni čip. U primerima izvođenja, veliki broj mikročestica formira kvadratno pakovani čip. Kvadratno pakovani čip sastoji se od velikog boja mikročestica asambliranih ili prikačenih za čvrstu podlogu tako da svaka mikročestica formira deo kvadrata ili pravougaonika koji se sastoji od najmanje četiri mikročestice. Formiranje čipova je u struci dobro poznat i korišćen postupak i opisan je pored ostalog u US patentima 6,110,426; 7,615,368; 7,932,213; 6,824,987; 5,143,854; 8,795,967 i Hughes TR et al. (2001) Nat. Biotech. 4, 342-347. U primerima izvođenja, najmanje oko 10<6>mikročestica prikačeno je za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, svaka mikročestica je različita. U primerima izvođenja, oko 10<6>do 10<9>mikročestica prikačeno je za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, oko 10<9>mikročestica prikačeno je za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, oko 10<5>, 10<6>, 10<7>, 10<8>, 10<9>, 10<10>ili 10<11>mikročestica prikačeno je za čvrstu podlogu. U primerima izvođenja, čip uključuje 10<6>mikročestica po kvadratnom milimetru.
[0119] U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 10,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 20,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 30,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 40,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 50,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 60,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 70,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 80,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 90,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 100,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 200,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 300,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 400,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 500,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 600,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 700,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 800,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje najmanje oko 900,000 mikročestica po kvadratnom milimetru.
[0120] U primerima izvođenja, čip uključuje oko 200,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje oko 789,000 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, čip uključuje oko 591,715 mikročestica po kvadratnom milimetru. U primerima izvođenja, the čip uključuje od oko 200,000 do oko 800,000 mikročestica po kvadratnom milimetru.
[0121] U primerima izvođenja, čip uključuje oko jednu mikročesticu na 4.99 kvadratnih mikrona. U primerima izvođenja, čip uključuje oko jednu mikročesticu na 1.46 kvadratnih mikrona. U primerima izvođenja, čip uključuje oko jednu mikročesticu na 1.69 kvadratnih mikrona. U primerima izvođenja, čip uključuje oko jednu mikročesticu na kvadratni mikron.
[0122] U primerima izvođenja, čvrsta podloga uključuje veliki broj bunarčića od kojih svaki zadržava jednu od mikročestica, kako je definisano u patentnim zahtevima. U primerima izvođenja, nukleinskokiselinski domen je sekvenca nukleinske kiseline, kako je opisano u ovom tekstu. U primerima izvođenja, sekvenca nukleinske kiseline vezana je sa komplementarnom sekvencom nukleinske kiseline. U primerima izvođenja, komplementarna sekvenca nukleinske kiseline uključuje detektabilnu komponentu. U primerima izvođenja, detektabilna komponenta je fluorescentna komponenta.
POSTUPCI
[0123] U sledećem primeru koji nije deo predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak formiranja odsečenih mikročestica. Postupak uključuje (i) prikačinjanje mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njene primere izvođenja, za čvrstu podlogu, čime se formira imobilisana mikročestica. (ii) Drugi linker imobilisane mikročestice se odseca, čime se formira odsečena mikročestica. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), postupak uključuje, pre odsecanja koraka (ii) i posle prikačinjanja koraka (i), vezivanje komplementarne sekvence nukleinske kiseline za nukleinskokiselinski domen. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecanje uključuje dovođenje u kontakt imobilisane mikročestice sa odsecajućim sredstvom. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je kiselina. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je trifluorosirćetna kiselina. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je alkalno sredstvo. U primerima izvođenja, odsecajuće sredstvo je amonijum hidroksid. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je amonijak. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je metilamin. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je smeša amonijum hidroksida i metilamina. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecanje se vrši na sobnoj temperaturi. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je UV zračenje. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecajuće sredstvo je svetlosno zračenje. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecanje ne uključuje odsecanje prvog linkera.
[0124] U primeru koji nije deo predmetnog pronalaska, postupak uključuje, posle odsecanja koraka (ii), korak (iii) reakcije reaktivne komponente ligandskog domena, čime se formira reaktivni ligandski domen i (iv) vezivanje ligandskog vezivača za reaktivni ligandski domen. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), postupak uključuje, posle odsecanja iz koraka (ii), korak (iii) vezivanja ligandskog vezivača za ligandski domen. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), korak (ii) odsecanja uključuje vezivanje ligandskog vezivača za ligandski domen. Prema tome, odsecanje drugog linkera može da se desi istovremeno sa vezivanjem ligandskog vezivača za ligandski domen. Alternativno, vezivanje ligandskog vezivača za ligandski domen može da se desi posle odsecanja drugog linkera. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), vezivanje ligandskog vezivača za ligandski domen uključuje reakciju reaktivne komponente ligandskog domena.
[0125] U još jednom primeru koji nije deo predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak detektovanja ligandskog vezivača. Postupak uključuje (i) prikačinjanje mikročestice obezbeđene u ovom tekstu, uključujući njene primere izvođenja, za čvrstu podlogu, čime se formira imobilisana mikročestica. (ii) Komplementarna nukleinska kiselina se vezuje za nukleinskokiselinski domen imobilisane mikročestice i određuje se lokacija nukleinskokiselinskog domena na čvrstoj podlozi, čime se formira dekodirana i mapirana mikročestica. (iii) Drugi linker dekodirane i mapirane mikročestice se odseca, čime se formira mapirana i odsečena mikročestica. (iv) Ligandski vezivač se vezuje za ligandski domen mapirane i odsečene mikročestice; i (v) identifikuje se lokacija vezanog ligandskog vezivača na čvrstoj podlozi, čime se detektuje ligandski vezivač. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), odsecanje iz koraka (iii) i vezivanje iz koraka (iv) dešavaju se istovremeno. U primeru (nije deo predmetnog pronalaska), vezivanje ligandskog vezivača za ligandski domen uključuje reakciju reaktivne komponente ligandskog domena.
[0126] U još jednom primeru koji nije deo predmetnog pronalaska, obezbeđen je postupak detektovanja ligandskog vezivača. Postupak (nije deo predmetnog pronalaska) uključuje (i) dovođenje u kontakt ligandskog vezivača sa mikročesticom obezbeđenom u ovom tekstu, uključujući njene primere, čime se formira vezani ligandski vezivač. (ii) Lokacija vezanog ligandskog vezivača identifikuje se na čvrstoj podlozi čime se detektuje ligandski vezivač.
PRIMERI
[0127] Korišćenjem split-pool postupka sinteze bibliotek,e Podnosioci su mogli da povećaju broj prikazanih jedinjenja za najmanje 1,000x u odnosu na postojeće postupke. Kompozicije obezbeđene u ovom tekstu predstavljaju kolekciju molekula velike raznovrsnosti, imobilisanih na izuzetno gustom čipu na čvrstoj podlozi. Da bi se pripremio sistem Podnosilaca, asamblirana biblioteka prekursora imobiliše se na planarnom čipu. Čitav imobilisani čip se dekodira, tako da sada svaki član biblioteke zauzima stalno i određeno mesto na planarnom čipu, dekodiranje konvertuje ono što je bila hemijski kodirana biblioteka u prostorno adresiranu biblioteku. Hemijske kodirajuće jedinice se uklanjaju i zatim se izvode sintetske transformacije duž imobilisane biblioteke, kompletirajući sintezu biblioteke. Zatim može da se izvrši skrining biblioteke da bi se identifikovali molekuli koji pokazuju korisnu funkciju.
[0128] Kada se kodirana split pool sinteza kombinuje sa utvrđenim postupcima imobilizacije perlica pri visokoj gustini i sekvenciranja oligonukleotida, sistem dopušta skrining potpuno dekodiranih split pool biblioteka u razmeri koja ranije nije bila moguća. Po analogiji sa tehnologijom sekvenciranja sledeće generacije, trebalo bi da mogu da se dostignu potpuno dekodirani setovi za skrining od 10<8>do 10<10>, u formatu mikročipa. U ovom tekstu obezbeđene su biblioteke "bez oznake" za dalju hemiju. Dekodiranjem pre skrininga, mogu se ukloniti oligonukleotidne oznake, čime se postižu dve stvari: (i) dodatne hemijske reakcije koje bi bile inkompatibilne sa oligonukleotidnom oznakom mogu da se izvedu na imobilisanoj biblioteci (hemijska inkompatibilnost je jedan od navedenih izazova kodirane kombinatorne hemije); (ii) uklanjanje oznaka eliminiše potencijal oznaka koje interferiraju sa testovima od interesa. Kodirajuća hemija omogućava Podnosiocima da iskoriste snagu split-pool sinteze za stvaranje hemijske biblioteke, uz omogućavanje da se biblioteke evaluiraju u relativno informaciono bogatim skrinovima, a ne selekcijama. Evaluiraju se relativne performanse svih članova biblioteke u datom testu, a ne samo odabrani ’pogoci’. Jedinjenja koja se pokažu kao problematična u jednom ili više testova mogu se lako identifikovati i označiti, čime se smanjuje broj potencijalnih lažno pozitivnih rezultata u narednim pretragama. Ovo olakšava razvijanje odnosa aktivnosti i strukture.
[0129] Finalna bioaktivna jedinjenja čiji se skrining vrši prema aktivnosti, formiraju se posle dekodiranja i uklanjanja oznaka. Ono što je imobilisano i dekodirano su protektovani, sintetski intermedijeri. Za objavljene postupke obezbeđene u ovom tekstu, najmanje jedan dodatan hemijski korak izvodi se posle dekodiranja i uklanjanje nukleinskokiselinskog domena kako bi se završilo pripremanje "bioaktivnih sredstava" (ovo bi moglo uključiti: deprotektovanje, makrociklizaciju itd).
[0130] Potencijalne koristi od kodirajuće split-pool sinteze biblioteka korišećnjem nukleinskih kiselina dobro su poznate, kao i izazovi u sintezi. Specifična kodirajuća strategija Podnosilaca dopušta kreiranje pretraživih DNK kodiranih biblioteka u manje linearnih hemijskih transformacija po koraku nego što je ranije pokazano, pri čemu se svaki kodirajući korak može nezavisno dekodirati.
[0131] Mikročestica takođe ovde označena kao "srž" može biti dendrimer, hipergranati polimer, funkcionalizovana čestica silicijum-dioksida, funkcionalizovana polimerska čestica. Srž može biti magnetna. Opseg veličine srži može iznositi od 20 nm do 200 mikrona u dijametru. Srž je funkcionalizovana reaktivnom komponentom koja dopušta prikačinjanje gradivnih blokova da bi se napravili molekuli biblioteke, drugačijom reaktivnom komponentom koja dopušta prikačinjanje DNK oznaka za kodiranje, i, u nekim slučajevima, trećom drugačijom reaktivnom komponentom koja pomaže u kovalentnoj imobilizaciji srži za površinu.
[0132] Multidentatna srž može biti magnetna polimerna perlica od 0.9 mikrona, funkcionalizovana površinom od polietilen glikola sa ortogonalno protektovanim aminima na krajevima.
[0133] Sintetski prekursor (ligandski domen koji uključuje protektivnu komponentu) može biti svaki proizvod za podlogu vezane sinteze u više koraka, uz ograničenje da sve sintetske transformacije upotrebljene za kreairanje sintetskog prekursora, jednom prikačenog za srž čestice moraju biti kompatibilne sa hemijskom strukturom srži i ortogonalne/kompatibilne sa opisanom kodirajućom hemijom ili izvedene pre inkorporisanja prvih kodirajućih oznaka. Sintetski prekursori mogu biti poliamidi sa protektovanim bočnim lancem.
[0134] Kodirajuće oznake (nukleinskokiselinski domeni) sastoje se od jedinstvenih, prethodno sintetisanih, funkcionalizovanih derivata nukleinske kiseline kovalentno vezanih direktno za sržnu česticu preko odsecajućeg linkera ili indirektno preko drugih kodirajućih oznaka. Sekvence oznake su zadovoljavajuće dužine i sastava i kodiraju celu biblioteku. Da bi se omogućilo dekodiranje specifičnih kodiranih sintetskih koraka, nezavisno od drugih kodiranih sintetskih koraka. Na primer: dekodiranje oznaka upotrebljenih za kodiranje za drugi korak u sintezi trebalo bi da bude potpuno nezavisno od sposobnosti dekodiranja oznaka koje se koriste za kodiranje prvog ili trećeg koraka u sintezi. Neuspešno inkorporisanje oznaka u koraku jedan negativno utiče na inkorporisanje oznaka u koraku dva. Nemogućnost "dekodiranja" koraka jedan uticaće na mogućnost "dekodiranja" koraka dva za datog kodiranog člana biblioteke. Pristup Podnosilaca može zahtevati duže nukleinskokiselinske sekvence, ali obezbeđuje robusniji proces kodiranja/dekodiranja. Oznake su kompatibilne sa odabranim postupkom dekodiranja ili sekvenciranja. Na primer; ako sekvenciranje oznaka treba da se obavi procesom sekvencijalne hibridizacije, oznake bi trebalo da budu relativno izotermalne jedna u odnosu na drugu i da sadrže dovoljne razlike sekvenci tako da se neželjena unakrsna hibridizacija svede na minimum. Ako sekvenciranje oznaka treba da se obavi sekvenciranjem na bazi enzima putem sinteze ili sekvenciranjem ligacijom, oznake mogu zahtevati zajednička mesta vezivanja prajmera.
[0135] Hemijske strukture oznake:(i) stabilna i nereaktivna na sintetske transformacije koje se koriste za konstruisanje prekursorske biblioteke; (ii) može se ukloniti iz sržne čestice posle sekvenciranja; (iii) kompatibilna sa postupkom dekodiranja/sekvenciranja. Na primer, sekvenciranje hibridizacijom može se obaviti sa DNK, PNK, LNK, RNK, modifikovanim RNK, modifikovanim DNK analozima ili nekim drugim njihovima kombinacijama. Za sve pristupe sekvencioniranja koji se baziraju na enzimima, poželjna je DNK. Protektovane oligonukleotidne strukture mogle bi se upotrebiti za poboljšanje hemijske ortogonalnosti, pri čemu se protektivne komponente na oznaci uklanjaju pre dekodiranja. (Na primer, egzociklični amini nukleobaza mogu se protektovati pre ili neposredno posle inkorporisanje oznake)
[0136] Strukture mesta odsecanja oznake: (i) oznake mogu biti direktno prikačene za sržnu česticu ili indirektno za srž preko drugih oznaka, sve tačke prikačinjanja oznaka za sržne čestice moraju sadržati mesto odsecanja. (ii) poželjne strukture koje mogu da se odseku, posle odsecanja ostavljaju površinu sržne čestice bez reaktivnih komponenti koje bi mogle interferirati sa kasnijim hemijskim reakcijama ili testovima (npr., estarsko mesto odsecanja koje ostavlja slobodan alkohol; tritil-etarsko mesto odsecanja koje ostavlja slobodan alkohol).
[0137] Strukture koje povezuju oznake: kodirajuće oznake mogu biti 20-merni oligonukleotidi na bazi DNK sa nultim sadržajem C i 25% sadržajem G. Oznake se jedna od druge razlikuju po najmanje šest nepoklopljenih baznih parova. Oznake su vezane za podlogu i/ili jedna za drugu preko 1,3 triazol veza koje su sve na kraju spojene za sržnu česticu preko odsecajuće estarske veze. Svi postupci prikačinjanja i svaka upotrebljena površina moraju biti kompatibilni sa dekodirajućim uslovima i uslovima testa na mikročipu, kao i sa uslovima uklanjanja oznaka, i svim uslovima reakcija sinteze primenjenih na čipu. Podnosioci su prikazali imobilizaciju na kvarcu sa mustrom, silicijumu sa mustrom i staklu funkcionalizovanom karboksimetildekstranom.
[0138] Uklanjanje DNK oznake: Uslovi zavise od strukture na mestu odsecanja oznake. Sa estarskom vezom, Podnosioci su upotrebili amonijum hidroksid i metilamin. Deprotektovanje liganda i dodatne modifikacije sinteze. Podnosioci su sve protektivne komponente bočnog lanca uklonili sa poliamidnih struktura. Izvešće se selektivno deprotektovanje bočnog lanca praćeno makrolaktamizacijom. Izvršiće se inkorporisanje parova fluorofora-gasilac ili solvatohromnih komponenti. Kompozicije obezbeđene u ovom tekstu mogu biti korisne, između ostalog, za skrining mikročipova, testove vezivanja sa fluorescentnim, kolorimetrijskim ili elektrohemijskim očitavanjem u kojima se fluorescentno obeleženi proteini od interesa inkubiraju preko čipa da bi se identifikoval vezivači.
[0139] U primerima izvođenja, prototipski čipovi imaju C-C (od centra do centra) prostor od 2.4 mikrona, u šestougaonom čipu. To za rezultat ima 4.99 kvadratnih mikrona po perlici (očekivano manje od 5.76 kvadratnih mikrona po perlici zbog toga što su perlice pakovane šestougaono), ili 20 miliona perlica po kvadratnom centimetru, ili 200,000 perlica po kvadratnom milimetru, ili ~376 miliona čestica u području ekvivalentnom standardnoj mikroskopskoj pločici od 25 mm sa 75 mm.
[0140] U primerima izvođenja, čestice se imobilišu na šestougaonom čipu, sa C-C razmakom od 1.3 mikrona. To za rezultat ima 1.46 kvadratnih mikrona po perlici, ili 78.9 miliona perlica po kvadratnom centimetru, ili 789,000 perlica po kvadratnom milimetru, ili 1.28 milijardi perlica na području koje je ekvivalentno mikroskopskoj pločici od 25 mm sa 75 mm.
[0141] U primerima izvođenja, čestice se imobilišu na kvadratnom pakovanom čipu sa sa C-C razmakom od 1.3 mikrona. To za rezultat ima 1.69 kvadratnih mikrona po perlici, ili 59 miliona perlica po kvadratnom centimetru, ili 591,715 perlica po kvadratnom milimetru, ili 1.11 milijardu perlica u području ekvivalentnom standardnoj mikroskopskoj pločici od 25 mm sa 75 mm.
[0142] U primerima izvođenja, čip je šestougaono pakovan sa gustinom od 1 perlice po kvadratnom mikronu (C-C razmak od ~ 1.075 mikrona).
MATERIJALI I POSTUPCI
Reagensi
[0143] Trietilamin (trietilamine, TEA), diizopropiletilamin (diisopropyletilamine, DIPEA), diizopropilkarbodiimid (diisopropylcarbodiimide, DIC), dimetilaminopiridin (dimetilaminopyridine, DMAP), dimetilformamid (dimetilformamide, DMF), dimetilsulfoksid (dimetilsulfoxide, DMSO), Triton X-100 (TX100), azidosirćetna kiselina (Aza), 1-[bis(dimetilamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinijum 3-oksid heksafluorofosfat (HATU), (7-azabenzotriazol-1-iloksi)tripirolidinofosfonijum heksafluorofosfat (PYAOP), tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amin (THPTA), bakar(I) bromid dimetil sulfid kompleks (CuBrDMS), Boc-Glicin, i Fmoc-Glicin nabavljeni su od Sigma-Aldrich i upotrebljeni kako su dobijeni. Sve druge Fmoc-protektovane amino-kiseline nabavljene su od Novabiochem ili Advanced Chemtech. Voda upotrebljena za sva ispiranja i reakcioni puferi dobijeni su od Millipore MilliQ purification system. Peg reagensi upotrebljeni za inicijalnu funkcionalizaciju mikročestica nabavljeni su od Rapp Polymere ili Quanta Biodesign. Promag Beads obezbedili su Bangs Laboratories u vidu 2.6% w/v rastvora u vodi i sa sledećim karakteristikama: prosečan dijametar 880 nm. Sastavljene od gvožđe-oksida uklopljenog u visokoumreženi polimerni matriks. Površina čestica prikazuje slobodne karboksilnokiselinske reaktivne komponente u količini od 440 nmol eekvivalenata po miligramu. Približno 2 milijarde mikročestica nalazi se u jednom miligramu stok-čestica. Sve nukleinskokiselinske oznake i fluorescentno obeležene kompelmentarne sekvence nabavljene su od IDT.
Tabela 1.
[0144] Sekvence ligandskog domena
SEQ ID NO: 17: YPYDVPDYA. (HA-oznaka)
SEQ ID NO:18 EQKLISEEDL (Myc-oznaka)
[0145] Skraćenice drugih reagenasa
DITx MilliQ voda koja sadrži 1% Triton X-100
DMSOTx DMSO koji sadrži 1% Triton X-100
PBT 100 mM fosfatni pufer, pH 7.0 koji sadrži 1% Triton X-100
AMA 1:1 mešavina amonijum hidroksida i 30% metilamina u etanolu
Opšti postupci rukovanja mikročesticama
[0146] Slično većini procedura sinteze na čvrstoj fazi, tipična reakcija podrazumeva 1) dispergovanje mikročestica u reakcionom rastvoru 2) dodavanje dodatnih rastvarača ili reagenasa potrebnih za reakciju 3) obezbeđivanje povremene ili konstantne agitacije na određenoj specifikovanoj reakcionoj temperaturi tokom određenog vremenskog perioda i 4) posle reakcije, reagensi i rastvorljivi sporedni proizvodi reakcije se odvajaju od mikročestica nizom ispiranja. Koraci odvajanja i ispiranja mikročestica Podnosilaca sastoje se od više ciklusa 1) magnetno-potpomognutog peletiranja mikročestica i aspiracije supernatanta praćenog 2) resuspendovanjem peleta mikročestica u odgovarajućem rastvoru za ispiranje.
Funkcionalizacija ProMag mikročestica
[0147] Inicijalna PEGilacija:
[0148] Funkcionalizacija u velikom obimu za kreiranje pegilisanih perlica (sa odnosom hidroksilnih grupa prema amino grupama od 4.5:1) obavlja se u cilju eliminisanja varijacija između serija. 250 uL stoka ProMag perlica ispere se korišćenjem DMFTx (1 mL, x3) i suspenduje u 150 uL DMFTx. Amino hidroksi PEG 3000 (270 mg) i bis amin PEG 3000 (30 mg) odmeri se u 1.5 mL-sku konusnu epruvetu i otopi u uljanom kupatilu na 65 C. Perlice se dodaju u otopljeni PEG i dobro mešaju/greju. Pedeset pet mikrolitara DIPEA doda se u reakcionu smešu i vorteksuje, što je praćeno dodavanjem čvrstog PyAOP (160 mg). Reakcija se odvija na 65C 45 minuta uz grejanje u uljanom kupatilu. Finalne koncentracije na kraju reakcije bile su (200 mM PEG, 600 mM PyAOP, 600 mM DIPEA). Posle 45 minuta, preostale karboksilne kiseline na površini pokriju se 2-metoksietil aminom (250 uL), izvrši se inkubacija na istoj temperaturi 10 minuta zatim se perlice isperu sa DMFTx (1 mL, x3), zatim resuspenduju sa 250 uL DMFTx. Uzme se alikvot od 50 uL i ispere sa MilliQ vodom (400 uL, x3) i stavi na plamenom očišćenu/tariranu tacnu, stavi u pećnicu na 95 C i odvija se sledeći postupak. Skok na 95C, izotermija 10 min, podizanje 20 C/min do 500 C, izotermija 30 minuta. [Početna masa: 1.5940 mg. Na 100 C 98.86%. Na 500 C 31.30%] Ovo odgovara dodatoj funkcionalnosti od 25.4%, poređenje sa poslednjom velikom serijom koja je iznosila 24.3% dodatne funkcionalizacije (1.704 mg, 99.81% na 100 C i 32.08% na 500C) u poređenju sa prve dve velike serije pripremljene po istom protokolu sa dodatn. funk. od 25.6%.
[0149] BOC-protektovanje (x2)
[0150] Ostatak perlica se Boc-protektuje ispiranjem u DMSOTx (1 mL, x3), suspendovanjem u 170uL DMFTx, dodavanjem 14 mg Boc-Gly OH, što je praćeno sa 22.3 uL TEA, i 30.4 mg HATU, tim redom. Reakcija se odvija na 65C 30 min u uljanom kupatilu, posle čega se perlice isperu sa DMFTx (500 mL, x3) i izlože istim uslovima još jednom. Perlice se zatim izlože AMA (200 uL, 65C, 5 min) zatim isperu u DMFTx u stok-koncentraciji.
[0151] DIC/DMAP sa dugolančanim azidom (x3)
[0152] Perlice se resuspenduju u 400 uL DMFTx, ovome se doda 80 uL 500 mM dugolančane azido kiseline (11.66 mg/100 uL), posle čega sledi 6.7 uL DIC, zatim 10 uL DMAP (80 mg/ml stoka u DMF). Ovi uslovi kuplovanja ponavljaju se ukupno tri puta--ispiranje sa DMFTx (200 uL, x3) između. Boc grupa se zatim ukloni tretmanom sa TFA u trajanju od 15 minuta. Ova velika serija se zatim ispere u PBT (400 uL, x3) i suspenduje u 400 uL (x4 razblaženje stoka). Protokol za prikačinjanje azidosirćetne kiseline u alkalno-odsecajućoj formi (spojena za mikročesticu preko estarske veze) izvodi se na sličan način.
Standardni uslovi kuplovanja amino-kiselina u prisustvu HATU
[0153] 400 mM HATU, 400 mM FMOC’-amino-kiseline, 800 mM TEA u 10% DITx, 90% DMSOTx, 65 C, 30 minuta
[0154] Perlice se isperu u DITx (100 uL, x3), i suspenduju u 10 uL DITx. Ovome se doda FMOC’-amino-kiselina u 80 uL DMSOTx (400 mM za 200 uL rxn zapremine), što je praćeno sa TEA (10 uL, 101.19 g/mol, 0.726 g/mL), i najzad, na kraju se doda HATU (15 mg, 380.23 g/mol) u vidu čvrstog materijala i epruveta se postavi na crveni grejni blok podešen na 65 C, 30 minuta. Obavi se dvostruko kuplovanje (bez ispiranja između) sa svim amino-kiselinama da se osigura 100% konverzija.
[0155] Standardno HATU-kuplovanje azida sa amino-reaktivnom komponentom na nukleinskokiselinskim oznakama 400 mM HATU, 400 mM 2-azidosirćetna kiselina, 800 mM TEA u 10% DITx, 90% DMSOTx, 65C, 30 minuta
[0156] Perlice se isperu u PBT (100 uL, x3), i suspenduju u 10 uL DITx. Ovome se doda DMSOTx (80 uL), što je praćeno 2-azidosirćetnom kiselinom (3 uL, 101.06 g/mol, 1.35 g/mL), praćeno sa TEA (22.3 uL, 101.19 g/mol, 0.726 g/mL), i na kraju doda se HATU (15 mg, 380.23 g/mol) u vidu čvrste supstance i epruveta se postavi na crveni grejni blok podešen na 65C 30 minuta. Obavi se dvostruko kuplovanje (bez ispiranja između) sa svim kiselinama, da se osigura 100% konverzija.
Uslovi bakrom katalisane azid alkin (Huisgen) cikloadicije (korak kodiranja)
[0157] Pripremanje stok-rastvora katalizatora: Cu(I)Br DMS (205.58 g/mol) ranije se odmeri u zaštitnoj komori sa rukavicama, u 20 mL-ske scincilacione fiole. DMSO (koji se drži u zaštitnoj komori) doda se u fiolu tako da se postigne koncentracija od 4.5 mg/mL (22 mM). THPTA (tris(3-hidroksipropiltriazolilmetil)amin) (434.5 g/mol) odmeri se izvan komore i rastvori u koncentraciji od 2.8 mg/125uL (52 mM). Rastvori Cu (I) i liganda kombinuju se u odnosu 1:2 v:v, Cu(I) prema ligandu, dajući sledeće koncentracije: 35 mM THPTA i 7.3 mM Cu(I)Br DMS u 50% DMSO i 50% MilliQ vode.
[0158] Perlice se isperu u PBT (100 uL, x3) i suspenduju u 13 uL PBT. Ovome se doda 10 uL oligo oznake (iz 500 uM stok-rastvora). Ovo se prenese u zaštitnu komoru sa rukavicama uz najmanje 4 ciklusa pumpanja/pročišćavanja. Dodaju se dva mikrolitra stok rastvora katalizatora i PCR epruvete se postave na PCR blok podešen na 60C 30 minuta, posle čega se reakcija gasi sa 500 mM EDTA (izvan zaštitne komore sa rukavicama) dodavanjem 100 uL EDTA i inkubiranjem 3 minuta pre ispiranja sa PBT (200 uL, x5).
Standardni uslovi FMOC-deprotektovanja
[0159] 100 uL 20% piperadina u DMFTx 10 minuta na rt (x3).
[0160] Uslovi kompetitivne hibridizacije, primer koji se koristi za razlikovanje oznaka A0 i A1
[0161] Anti-A0-Cy3, i Anti-Al-FITC nabavljaju se od IDT i razblažuju u stok-rastvore od 500 µM u MilliQ vodi. Hibridizacioni rastvor koji treba da se nanese na uzorke perlica priprema se kako sledi.40 µL formamida, 20 µL 20X SSPE pufera (Sigma), 10 µL DITx, 20 µL DI, 5 µL Anti-A0-Cy3 stoka, i 5 µL anti-Al-FITC stoka pomešaju se u jednoj PCR epruveti i drže u mraku do upotrebe.
[0162] Uzorci perlica (1.6 µg) koje prikazuju A0 ili A1 na svojoj površini stave se u zasebne PCR epruvete, peletiraju, i supernatant se ukloni vakuumskom aspiracijom. Svaki pelet perlica odmah se suspenduje u 25 µL hibridizacionog rastvora. Smeše perlica u vidu gustih suspenzija ostave se da se hibridizuju sledećih 15 minuta na sobnoj temperaturi, dalje od izvora svetlosti. Posle navedenog vremena, uzorci perlica se peletiraju, hibridizacioni rastvor se ukloni vakuumskom aspiracijom. Perlice se tada isperu 3X sa 25 µL PBT, i na kraju suspenduju u 25 µL PBT. 5 µL ovog uzorka perlica se uzme, stavi u ploču sa 1356 bunarčića i slika mikroskopom Zeiss Observer, 63X vodeni objektiv, 1.6 optovar u svetlom polju, DsRed i EGFP kanali. Još 5 µL uzorka svakog tipa perlica stavi se u zasebne bunarčiće na ploči i koristi za podešavanje vremena ekspozicije za DsRed i EGFP pomoću 2014 Zeiss ZenBlue softvera.
Dodatni A0 uzorak koristi se za podešavanje DsRed i dodatni A1 uzorak se koristi za podešavanje EGFP. Posle podešavanja vremena ekspozicije neeksponirani uzorci A0 i A1 se slikaju korišćenjem istih, fiksiranih vremena ekspozicije.

Claims (14)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Mikročestica imobilisana na čvrstoj podlozi, naznačena time, što je pomenuta mikročestica kovalentno prikačena još i za:
(i) ligandski domen preko prvog linkera; i
(ii) nukleinskokiselinski domen preko drugog linkera;
pri čemu je pomenuti nukleinskokiselinski domen kodirajuća oznaka koja identifikuje pomenuti ligandski domen;
pri čemu je pomenuti drugi linker odseciv i pomenuti prvi linker nije odseciv pod uslovima pod kojima je pomenuti drugi linker odseciv; i pomenuti prvi linker uključuje -C(O)NH- ili -NHC(O)-, i pomenuti drugi linker uključuje -C(O)O- ili -OC(O)-.
2. Mikročestica iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što je pomenuta mikročestica mikroperlica, funkcionalizovana mikroperlica, magnetna mikroperlica, metalna mikroperlica, mikroperlica od silicijum-dioksida, polimerna mikroperlica, dendrimer ili granati polimer.
3. Mikročestica iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačena time, što je pomenuti ligandski domen mali molekul.
4. Mikročestica iz patentnog zahteva 1 ili patentnog zahteva 2, naznačena time, što je pomenuti ligandski domen peptid ili protein.
5. Mikročestica iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-4, naznačena time, što pomenuti ligandski domen uključuje reaktivnu komponentu kovalentno prikačenu za uklonjivu protektivnu komponentu.
6. Mikročestica iz patentnog zahteva 5, naznačena time, što se pomenuta reaktivna komponenta bira između aminokiselinskog bočnog lanca, amino-terminusa, ili karboksi-terminusa.
7. Mikročestica iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 6, naznačena time, što je pomenuti nukleinskokiselinski domen vezan za komplementarnu sekvencu nukleinske kiseline, pri čemu pomenuta sekvenca nukleinske kiseline uključuje detektabilnu komponentu.
8. Mikročestica iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 do 7, naznačena time, što se pomenuti ligandski domen vezuje sa ligandskim vezivačem.
9. Čvrsta podloga, naznačena time, što uključuje veliki broj bunarčića, pri čemu svaki od pomenutog velikog broja bunarčića uključuje imobilisanu mikročesticu, pri čemu je pomenuta mikročestica kovalentno prikačena za:
(i) ligandski domen preko prvog linkera; i
(ii) nukleinskokiselinski domena preko drugog linkera;
pri čemu je pomenuti nukleinskokiselinski domen kodirajuća oznaka koja identifikuje pomenuti ligandski domen;
pri čemu je pomenuti drugi linker odseciv i pomenuti prvi linker nije odseciv pod uslovima pod kojima je pomenuti drugi linker odseciv; i pomenuti prvi linker uključuje -C(O)NH- ili -NHC(O)-, i pomenuti drugi linker uključuje -C(O)O- ili -OC(O)-;
i
pri čemu pomenuti ligandski domen može da se veže za ligandski vezivač koji se bira između proteina, smeše proteina, malog molekula, smeše malih molekula, elementa, smeše elemenata, sintetskog polimera, smeše sintetskih polimera, ili ćelijskog lizata.
10. Čvrsta podloga iz patentnog zahteva 9, naznačena time, što je ligandski domen peptid, mali molekul ili protein.
11. Čvrsta podloga iz patentnog zahteva 9 ili patentnog zahteva 10, naznačena time, što pomenuti ligandski domen uključuje reaktivnu komponentu kovalentno prikačenu za uklonjivu protektivnu komponentu.
12. Čvrsta podloga iz bilo kojeg od patentnih zahteva 9 do 11, naznačena time, što je pomenuti nukleinskokiselinski domen vezan za komplementarnu nukleinsku kiselinu koja uključuje detektabilnu komponentu.
13. Čvrsta podloga iz bilo kojeg od patentnih zahteva 9 do 12, naznačena time, što se pomenuti ligandski domen vezuje sa pomenutim ligandskim vezivačem.
14. Čvrsta podloga iz bilo kojeg od patentnih zahteva 9 do 13, naznačena time, što se mikročestice, uključujući pomenutu mikročesticu, asambliraju na čvrstoj podlozi da bi formirale uređeni čip koji uključuje najmanje 10,000 mikročestica po kvadratnom milimetru.
RS20220051A 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka RS62847B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562120262P 2015-02-24 2015-02-24
EP16756316.2A EP3262059B1 (en) 2015-02-24 2016-02-24 Chemically encoded spatially addressed library screening platforms
PCT/US2016/019426 WO2016138184A1 (en) 2015-02-24 2016-02-24 Chemically encoded spatially addressed library screening platforms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62847B1 true RS62847B1 (sr) 2022-02-28

Family

ID=56789474

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230660A RS64567B1 (sr) 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka
RS20231135A RS64899B1 (sr) 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka
RS20220051A RS62847B1 (sr) 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20230660A RS64567B1 (sr) 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka
RS20231135A RS64899B1 (sr) 2015-02-24 2016-02-24 Platforme za skrining hemijski kodiranih prostorno adresiranih biblioteka

Country Status (19)

Country Link
US (6) US10760181B2 (sr)
EP (4) EP3650459B1 (sr)
JP (2) JP6872501B2 (sr)
AU (2) AU2016222755B2 (sr)
CA (1) CA2976946C (sr)
CY (1) CY1124954T1 (sr)
DK (3) DK3650459T5 (sr)
ES (3) ES2954467T3 (sr)
FI (2) FI3650458T3 (sr)
HR (3) HRP20231536T1 (sr)
HU (3) HUE063406T2 (sr)
LT (3) LT3650459T (sr)
NZ (1) NZ734644A (sr)
PL (3) PL3650458T3 (sr)
PT (3) PT3650459T (sr)
RS (3) RS64567B1 (sr)
SI (3) SI3650459T1 (sr)
SM (3) SMT202300430T1 (sr)
WO (1) WO2016138184A1 (sr)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2622112B2 (ja) 1986-09-26 1997-06-18 キヤノン株式会社 画像処理システム
WO2009069203A1 (ja) * 2007-11-28 2009-06-04 Glory Ltd. チケット処理装置、チケット処理システム及びチケット処理方法
ES2954467T3 (es) 2015-02-24 2023-11-22 Hope City Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente
JP6554180B6 (ja) * 2015-04-14 2019-09-11 成都先導薬物開発股▲フン▼有限公司 Ｄｎａコード化化合物ライブラリーの固相合成方法
AU2017357638B2 (en) * 2016-11-08 2023-11-16 Nanna Therapeutics Limited Tagless encoded chemical library
US11084037B2 (en) 2017-09-25 2021-08-10 Plexium, Inc. Oligonucleotide encoded chemical libraries
AU2018358247A1 (en) 2017-10-31 2020-05-21 Encodia, Inc. Methods and kits using nucleic acid encoding and/or label
AU2020361681A1 (en) 2019-10-10 2022-05-05 1859, Inc. Methods and systems for microfluidic screening
US12577702B2 (en) 2020-01-28 2026-03-17 Plexium, Inc. Oligonucleotide encoded chemical libraries, related systems, devices, and methods for detecting, analyzing, quantifying, and testing biologics/genetics
WO2022170034A1 (en) * 2021-02-05 2022-08-11 Affinergy, Llc Rapid assay for apol1 g0 protein
WO2023027184A1 (ja) * 2021-08-27 2023-03-02 国立大学法人神戸大学 基材上に収率よく空孔を形成する技術のためのコアシェル鋳型分子・粒子

Family Cites Families (42)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4672040A (en) * 1983-05-12 1987-06-09 Advanced Magnetics, Inc. Magnetic particles for use in separations
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
ATE148889T1 (de) 1991-09-18 1997-02-15 Affymax Tech Nv Verfahren zur synthese der verschiedenen sammlungen von oligomeren
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5565324A (en) 1992-10-01 1996-10-15 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
CA2151473A1 (en) 1992-12-11 1994-06-23 Ronald N . Zuckermann Synthesis of encoded polymers
PT705279E (pt) * 1993-05-27 2003-07-31 Selectide Corp Bibliotecas em fase solida codificadas, segregadas topologicamente
PT751779E (pt) * 1993-06-21 2002-05-31 Selectide Corp Ligantes selectivamente clivaveis baseados em ligacoes ester de acido iminodiacetico
US6087186A (en) * 1993-07-16 2000-07-11 Irori Methods and apparatus for synthesizing labeled combinatorial chemistry libraries
GB2298863B (en) 1993-11-02 1998-03-11 Affymax Tech Nv Apparatus and process for the synthesis of diverse compounds especially for generating and screening compound libraries
US6936477B2 (en) 1994-04-13 2005-08-30 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Complex combinatorial chemical libraries encoded with tags
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US7615368B1 (en) 1994-06-17 2009-11-10 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Microarrays of polypeptides
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5846839A (en) 1995-12-22 1998-12-08 Glaxo Group Limited Methods for hard-tagging an encoded synthetic library
CA2255599C (en) * 1996-04-25 2006-09-05 Bioarray Solutions, Llc Light-controlled electrokinetic assembly of particles near surfaces
EP0918845A4 (en) * 1996-07-08 2000-08-30 Burstein Lab Inc METHOD AND APPARATUS WITH CLIVABLE SIGNAL ELEMENT
DE69706187T2 (de) * 1996-11-06 2002-04-11 Sequenom, Inc. Zusammensetzungen und verfahren zur immobilisierung von nukleinsäure auf festträgern
CA2335951C (en) 1998-06-24 2013-07-30 Mark S. Chee Decoding of array sensors with microspheres
US6429027B1 (en) * 1998-12-28 2002-08-06 Illumina, Inc. Composite arrays utilizing microspheres
US20020150909A1 (en) * 1999-02-09 2002-10-17 Stuelpnagel John R. Automated information processing in randomly ordered arrays
US6824987B1 (en) 1999-05-11 2004-11-30 President And Fellows Of Harvard College Small molecule printing
US7932213B2 (en) 1999-05-11 2011-04-26 President And Fellows Of Harvard College Small molecule printing
US6544732B1 (en) 1999-05-20 2003-04-08 Illumina, Inc. Encoding and decoding of array sensors utilizing nanocrystals
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
JP3899831B2 (ja) * 2001-03-02 2007-03-28 株式会社日立製作所 生化学センサ及びこれを用いた生化学検査装置
US20060040286A1 (en) 2001-03-28 2006-02-23 Nanosphere, Inc. Bio-barcode based detection of target analytes
US20030027221A1 (en) * 2001-04-06 2003-02-06 Scott Melissa E. High-throughput screening assays by encapsulation
US20030228619A1 (en) 2002-06-10 2003-12-11 Xenoport, Inc. Peptide nucleic acids as tags in encoded libraries
EP1774033A4 (en) 2004-06-10 2008-04-23 Perkinelmer Las Inc MULTIPLEX ASSAYS FOR DETECTION OF ANALYTES
US20060134697A1 (en) * 2004-10-28 2006-06-22 The Regents Of The University Of California Method of preparing coded compound libraries
CN101523156A (zh) * 2005-09-16 2009-09-02 加利福尼亚大学董事会 用于分析物检测的比色生物条形码扩增测定
MX2011008383A (es) * 2009-02-10 2011-09-06 Idera Pharmaceuticals Inc Agonistas basados en acido ribonucleico sintetico de receptor 7 tipo toll.
US9172561B2 (en) 2009-07-29 2015-10-27 Qualcomm Incorporated Adaptive transmissions in coordinated multiple point communications
JP2013500725A (ja) 2009-07-31 2013-01-10 プログノシス バイオサイエンシズ インコーポレイテッド アッセイツールおよびその使用方法
US20130059741A1 (en) 2010-05-13 2013-03-07 Illumina, Inc. Binding assays for markers
AU2013302270A1 (en) * 2012-08-14 2015-03-26 Angiochem Inc. Peptide-dendrimer conjugates and uses thereof
CN104620093B (zh) * 2012-08-23 2018-04-20 干细胞技术公司 用于快速可逆生物分子标记的组合物和方法
ES2954467T3 (es) 2015-02-24 2023-11-22 Hope City Plataformas de cribado de bibliotecas abordadas espacialmente codificadas químicamente

Also Published As

Publication number Publication date
DK3650459T5 (da) 2024-08-26
LT3650459T (lt) 2023-12-27
DK3650458T5 (da) 2024-08-26
HUE058813T2 (hu) 2022-09-28
FI3650458T3 (fi) 2023-08-21
US10760181B2 (en) 2020-09-01
SI3650459T1 (sl) 2024-04-30
DK3650458T3 (da) 2023-09-04
EP3650459A1 (en) 2020-05-13
US20210324538A1 (en) 2021-10-21
AU2016222755A1 (en) 2017-08-31
SMT202300275T1 (it) 2023-11-13
US11015265B2 (en) 2021-05-25
EP4276059A2 (en) 2023-11-15
SMT202300430T1 (it) 2024-01-10
SI3262059T1 (sl) 2022-04-29
PL3262059T3 (pl) 2022-02-21
SMT202200039T1 (it) 2022-03-21
US20220341059A1 (en) 2022-10-27
RS64567B1 (sr) 2023-10-31
HRP20231536T1 (hr) 2024-03-15
EP3650458A1 (en) 2020-05-13
JP7109618B6 (ja) 2022-08-22
US20190390367A1 (en) 2019-12-26
PT3650459T (pt) 2023-12-06
HUE063406T2 (hu) 2024-01-28
NZ734644A (en) 2023-02-24
EP3262059B1 (en) 2022-01-05
CA2976946A1 (en) 2016-09-01
RS64899B1 (sr) 2023-12-29
US10767278B2 (en) 2020-09-08
HUE064689T2 (hu) 2024-04-28
EP3650458B1 (en) 2023-08-09
NZ772386A (en) 2024-10-25
US20180245241A1 (en) 2018-08-30
ES2954467T3 (es) 2023-11-22
CA2976946C (en) 2023-09-19
CY1124954T1 (el) 2023-01-05
AU2021200399A1 (en) 2021-03-18
EP4276059A3 (en) 2024-05-01
US20200378032A1 (en) 2020-12-03
EP3262059A4 (en) 2018-12-05
EP3262059A1 (en) 2018-01-03
US11015266B2 (en) 2021-05-25
JP2021106607A (ja) 2021-07-29
JP6872501B2 (ja) 2021-05-19
LT3262059T (lt) 2022-02-25
PT3262059T (pt) 2022-01-27
AU2016222755B2 (en) 2021-02-18
DK3262059T3 (da) 2022-01-31
JP2018505700A (ja) 2018-03-01
SI3650458T1 (sl) 2023-11-30
DK3650459T3 (da) 2023-12-11
EP3650459B1 (en) 2023-09-06
PL3650459T3 (pl) 2024-02-26
AU2021200399B2 (en) 2023-04-20
ES2904997T3 (es) 2022-04-06
WO2016138184A1 (en) 2016-09-01
LT3650458T (lt) 2023-10-10
FI3650459T3 (fi) 2023-11-28
JP7109618B2 (ja) 2022-07-29
US20200378031A1 (en) 2020-12-03
PT3650458T (pt) 2023-08-31
PL3650458T3 (pl) 2023-11-06
ES2965764T3 (es) 2024-04-16
HRP20220093T1 (hr) 2022-04-15
HRP20230928T1 (hr) 2023-11-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20220341059A1 (en) Chemically Encoded Spatially Addressed Library Screening Platforms
US10544449B2 (en) Bis-biotinylation tags
EP2128616A1 (en) Support having protein immobilized thereon and method of producing the same
CA3203535A1 (en) Systems and methods for biomolecule preparation
JP2022526939A (ja) 修飾された切断酵素、その使用、および関連キット
US20130078390A1 (en) Methods and processes for attaching compounds to matrices
KR101104417B1 (ko) 단백질 ｇ 변형체를 이용한 항체의 특이적 공유결합 커플링방법
CN113683659A (zh) 一类蛋白质赖氨酸探针及其制备方法和应用
US20210262014A1 (en) Nanostructure, a biosensor including the nanostructure, and a screening method
US12180249B1 (en) Compositions and methods for selective labeling of secondary amines
CN110615844A (zh) 一种具有绿色荧光活性的多物种通用检测蛋白及其应用
KR20080058964A (ko) 질병마커 인지 에피토프와 연결된 단백질 나노입자를포함하는 진단용 단백질 칩과 그의 초고감도 검출 방법
US20250188538A1 (en) Single-molecule peptide sequencing using xanthate amino acid reactive groups
Stindl Evaluation of ligation methods and the synthesis of a specific PNA-encoded peptide library