RS62857B1

RS62857B1 - Unapređeni varijabilni domeni imunoglobulina koji vezuju serumski albumin

Info

Publication number: RS62857B1
Application number: RS20220086A
Authority: RS
Inventors: Marie-Ange Buyse
Original assignee: Ablynx Nv
Priority date: 2015-11-13
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2022-02-28
Also published as: HRP20220080T1; LT3374392T; AU2016351710B2; JP7195142B2; JP2023027258A; AU2016351710A1; EP3974449A1; EP3374392B1; EP3374392A1; DK3374392T3; HUE057241T2; ES2905912T3; US20220112275A1; US20180312578A1; CA3005061A1; US11142569B2; SI3374392T1; WO2017080850A1; PL3374392T3; PT3374392T

Description

Opis

[0001] Predmetni pronalazak odnosi se na poboljšane pojedinačne varijabilne domene imunoglobulina (koji se ovde takođe pominju kao „ISV“ ili „ISVD“), a posebno na poboljšane pojedinačne varijabilne domene teškog lanca imunoglobulina, koji vezuju serumski albumin, kao i za proteine, polipeptide i druge konstrukte, jedinjenja, molekule ili hemijske entitete koji sadrže takve poboljšane veznike serumskog albumina kao što je definisano patentnim zahtevima.

[0002] Poboljšani ISVD koji vezuju serumski albumin, kako je definisano patentnim zahtevima, takođe se ovde nazivaju „veznici serumskog albumina prema pronalasku“, „veznici albumina prema pronalasku“ ili „veznici serumskog albumina“ ili „veznici albumina“. Takođe, proteini, polipeptidi i drugi konstrukti, jedinjenja, molekuli ili hemijski entiteti kako su definisani patentnim zahtevima koji sadrže najmanje jednog veznika serumskog albumina prema pronalasku takođe se ovde nazivaju „jedinjenja pronalaska“ ili „polipeptidi pronalaska“.

[0003] Poželjno, polipeptidi pronalaska su fuzioni proteini.

[0004] U predmetnoj prijavi, aminokiselinski ostaci/položaji u varijabilnom domenu teškog lanca imunoglobulina biće naznačeni numerisanjem prema Kabatu. Radi pogodnosti, Slika 1 pruža tabelu koja navodi neke od položaja aminokiselina koji će se ovde posebno pominjati i njihovo numerisanje prema nekim alternativnim sistemima numerisanja (kao što su Aho i IMGT. Napomena: osim ako nije eksplicitno drugačije naznačeno, za potrebe predmetnog opisa i patentnih zahteva, Kabat numerisanje je preovlađujuće; ostali su sistemi numerisanja dati samo kao referenca).

[0005] Što se tiče CDR, kao što je dobro poznato u struci, postoji više konvencija za definisanje i opisivanje CDR od VH ili VHH fragmenta, kao što je Kabat definicija (koja se zasniva na varijabilnosti sekvence i najčešće se koristi) i Chothia definicija (koja se zasniva na lokaciji regiona strukturne petlje). Na primer, upućuje se na veb stranicu http://www.bioinf.org.uk/abs/. Za potrebe ove specifikacije i patentnih zahteva, iako se CDR prema Kabatu takođe mogu navedeni, CDR su najpoželjnije definisani na osnovu Abm definicije (koja je zasnovana na softveru za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular), jer se to se optimalnim kompromisom između Kabat i Chothia definicija. Ponovo se upućuje na veb stranicu http://www.bioinf.org.uk/abs/).

[0006] ISVD koji se mogu vezati za serumski albumin i njihova upotreba je dobro poznata u struci, na primer iz WO 2004/041865, WO 2006/122787, EP 2139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400 i WO 2014/111550, koji opisuju ISVD koji vezuju serumski albumin i njihovu upotrebu za produženje poluživota u serumu (kao što je definisano u ovim aplikacijama) terapeutskih jedinjenja, grupa i entiteta.

[0007] Predmetni pronalazak ima za cilj da pruži poboljšane veznike serumskog albumina, posebno u poređenju sa veznicima serumskog albumina obelodanjenim u WO 2011/006915 i WO 2014/111550. Reprezentativni primeri veznika serumskog albumina poznatih iz ove dve PCT prijave dati su u Tabeli A u nastavku kao „Referenca A“ do „Reference D“, respektivno. Poravnanje ovih referentnih sekvenci dato je na Slici 2. (Kombinacije) CDR ovih referentnih jedinjenja (prema Kabat i Abm konvencijama, respektivno) navedene su u Tabeli B.

[0008] Konkretnije, predmetni pronalazak ima za cilj da pruži poboljšane ISVD koji vezuju serumski albumin koji su varijante ISVD koji vezuju serumski albumin navedenih u Tabeli A i koji imaju smanjeno vezivanje interferišućim faktorima (uopšteno poznatim kao „prethodno postojeća antitela“) koji mogu biti prisutni u serumima nekih zdravih ljudi kao i pacijenata. Poziva se na WO 12/175741, WO 2013/024059, a takođe i na primer od Holland i dr. (J. Clin. Immunol. 2013, 33(7): 1192-203) kao i na PCT prijavu koja nije unapred objavljena PCT/EP2015/060643, koja je podnesena od strane sticaoca 13. maja 2015 pod nazivom „Poboljšani varijabilni domeni imunoglobulina“ (objavljeno 19. novembra 2015 kao WO 2015/173325).

Tabela A: referentne sekvence.

Tabela B: CDR referentnih jedinjenja A do D (prema Kabatu i Abm)

[0009] Kao što je definisano patentnim zahtevima, veznici serumskog albumina prema pronalasku poželjno imaju iste kombinacije CDR (tj. CDR1, CDR2 i CDR3) koje su prisutne u jednoj od Referenci A, B, C ili D, i najpoželjnije imaju istu kombinaciju CDR kao što je prisutno u Referenci C ili Referenci D (koje imaju iste CDR).

[0010] Od veznika serumskog albumina navedenih u Tabeli A, veznik SEQ ID NO: 4 ima proširenje alanina na C-terminalnom kraju, tj. alaninski ostatak na C-terminalnom kraju ISVD-sekvence (takođe se ponekad naziva „položaj 114“) u poređenju sa uobičajenom C-terminalnom sekvencom VTVSS (SEQ ID NO: 113, koja je prisutna u veznicima SEQ ID NO: 1 do 3). Kako je opisano u WO 12/175741 (ali na primer i u WO 2013/024059), ovo proširenje alanina na C-terminalnom kraju može sprečiti vezivanje takozvanih „prethodno postojećih antitela“ (pretpostavlja se da su IgG) za putativni epitop koji se nalazi na C-terminalnom regionu ISV. Pretpostavlja se da ovaj epitop uključuje, između ostalih ostataka, površinski izložene aminokiselinske ostatke C-terminalne sekvence VTVSS, kao i aminokiselinski ostatak na položaju 14 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su položaji 11, 13 i 15) i mogu takođe sadržati aminokiselinski ostatak na položaju 83 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u aminokiselinskoj sekvenci, kao što su položaji 82, 82a, 82b i 84) i/ili aminokiselinski ostatak na položaju 108 (i aminokiselinske ostatke pored/blizu njega u aminokiselinskoj sekvenci, kao što je položaj 107).

[0011] Međutim, iako prisustvo takvog C-terminalnog alanina (ili C-terminalnog produžetka uopšte) može u velikoj meri da smanji (a u mnogim slučajevima čak i suštinski u potpunosti spreči) vezivanje „prethodno postojećih antitela“ koja se mogu naći u serumima od niza pacijenata (i zdravih ispitanika i bolesnih pacijenata), obelodanjeno je da serumi nekih pacijenata (kao što su serumi pacijenata sa nekim imunološkim bolestima kao što je SLE) mogu sadržati prethodno postojeća antitela koja se mogu vezati na C-terminalni region ISV (kada je takav region izložen) čak i kada ISV sadrži takav C-terminalni alanin (ili uopštenije, takav C-terminalni produžetak). Ponovo se upućuje na PCT prijavu koja nije unapred objavljena PCT/EP2015/060643, koja je podnesena od strane zastupnika 13. maja 2015 pod nazivom „Poboljšani varijabilni domeni imunoglobulina“.

[0012] Shodno tome, jedan specifičan cilj pronalaska je da pruži veznike za serumski albumin koji su poboljšane varijante ISVD koji vezuju serumski albumin navedenih u Tabeli A i koji imaju smanjeno vezivanje od strane takozvanih „prethodno postojećih antitela“, a posebno vrste opisane u PCT/EP2015/060643 (tj. ona prethodno postojeća antitela koja se mogu vezati za izloženi C-terminalni region ISV čak i u prisustvu C-terminalnog produžetka).

[0013] Generalno, pronalazak postiže ovaj cilj pružanjem ISV koji vezuju serumski albumin koji su varijante sekvence SEQ ID NO: 1 kako je definisano patentnim zahtevima koji sadrže naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencama SEQ ID NO: 1):

• 89T; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q.

[0014] U specifičnom aspektu, u veznicima serumskog albumina prema pronalasku:

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 89 je poželjno odgovarajuće odabran od T, V ili L; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 110 je poželjno odgovarajuće odabran od T, K ili Q; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 112 je poželjno odgovarajuće odabran od S, K ili Q; tako da (i) položaj 89 predstavlja T; ili (ii) položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (iii) položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (iv) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V; ili (v) položaj 89 predstavlja L i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vi) položaj 89 predstavlja L i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (vi) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vii) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (viii) položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (ix) položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q.

[0015] Od aminokiselinskih sekvenci pruženih pronalaskom, aminokiselinske sekvence u kojima položaj 89 predstavlja T ili u kojima položaj 11 predstavlja V i položaj 89 predstavlja L (opciono u odgovarajućoj kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom i/ili 112K ili 112Q mutacijom, a posebno u kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom) su posebno poželjne. Još poželjnije su aminokiselinske sekvence u kojima položaj 11 predstavlja V i položaj 89 predstavlja L, opciono sa 110K ili 110Q mutacijom.

[0016] Aminokiselinske sekvence pronalaska se poželjno vezuju za (ljudski) serumski albumin sa afinitetom boljim od 100 nM, poželjno boljim od 50 nM. Na primer, veznici albumina prema pronalasku koja su varijante Reference A ili Reference B, respektivno, mogu imati afinitet prema (ljudskom) serumskom albuminu koji je otprilike isti kao što je opisano za Referencu A ili Referencu B, respektivno, u WO 2011/006915; i slično, veznici albumina prema pronalasku koja su varijante Reference C i/ili Reference D, respektivno, mogu imati afinitet prema (ljudskom) serumskom albuminu koji je otprilike isti kao što je opisano za Referencu C i/ili Referencu D, respektivno, in WO 2014/111550 (sa afinitetom koji se meri kao što je opisano u WO 2011/006915 ili WO 2014/111550, redom).

[0017] Takođe, veznici albumina pruženi pronalaskom i jedinjenja i polipeptidi koji se sastoje od njih (kao što je dalje opisano ovde) poželjno imaju poluživot (definisan kao t1/2 beta) kod čoveka koji je duži od 1 sata, poželjno duži od 2 sata, poželjnije duži od 6 sati, kao što je duži od 12 sati, i na primer oko jednog dana, dva dana, jedne nedelje, dve nedelje i do poluživota serumskog albumina kod čoveka (procenjuje se da je oko 19 dana), iako ovo drugo može biti manje kritično.

[0018] Na primer, veznici albumina prema pronalasku koja su varijante Reference A ili Reference B, respektivno, mogu imati poluživot kod čoveka koji je uporediv sa (i poželjno približno isti kao) poluživot Reference A ili Reference B, respektivno (pogledati ponovo WO 2011/006915); i slično, veznici albumina prema pronalasku koja su varijante Reference C i/ili Reference D, respektivno, mogu imati poluživot kod čoveka koji je uporediv (i poželjno približno isti kao) poluživot Reference C i /ili Referenca D, respektivno (pogledati ponovo WO 2014/111550).

[0019] Takođe, jedinjenje ili polipeptid pronalaska koji sadrže veznik albumina koji je varijanta Reference A ili Reference B, respektivno, može imati poluživot kod čoveka koji je uporediv (i poželjno približno isti kao) poluživot istog jedinjenja ili polipeptida ali sa Referencom A ili Referencom B, respektivno, umesto veznika albumina prema pronalasku; i slično, jedinjenje ili polipeptid pronalaska koji sadrži veznik albumina koje je varijanta Reference C ili Reference D, respektivno, može imati poluživot kod čoveka koji je uporediv (i poželjno približno isti kao) poluživot život istog jedinjenja ili polipeptida ali sa Referencom C ili Referencom D, respektivno.

[0020] Tabela C navodi neke neograničavajuće moguće kombinacije aminokiselinskih ostataka koji mogu biti prisutni na položajima 11, 89, 110 i 112 u veznicima serumskog albumina prema pronalasku. Kombinacije koje su posebno poželjne su naznačene podebljano, a najpoželjnije kombinacije su naznačene podebljano/podvučeno.

Tabela C: Moguće kombinacije aminokiselina na položajima 11, 89, 110 i 112.

[0021] Veznici serumskog albumina prema pronalasku su kao što je definisano patentnim zahtevima, tj. imaju CDR koji su definisani patentnim zahtevima i imaju ograničen broj „razlika aminokiselina“ (kao što je ovde opisano) sa sekvencom SEQ ID NO: 1 kako je definisano patentnim zahtevima.

[0022] Veznici serumskog albumina prema pronalasku poželjno sadrže naredne CDR (prema Kabat konvenciji):

• CDR1 (prema Kabatu) koji je izabran od narednih sekvenci: TGEMA (SEQ ID NO:

5) i TSSML (SEQ ID NO:10) i koji je poželjno TSSML (SEQ ID NO:10); i

• CDR2 (prema Kabatu) koji je izabran od narednih sekvenci:

SISSSGATTYYADSVKG (SEQ ID NO:6) i VIHQSGTPTYYADSVKG (SEQ ID NO:11) i koji je poželjno VIHQSGTPTYYADSVKG (SEQ ID NO:11); i

• CDR3 (prema Kabatu) koji je izabran od narednih sekvenci: PRHPQGGVTFDY (SEQ ID NO:7), FPSTHGKFDY (SEQ ID NO:12) i FPSSRMKFDY (SEQ ID NO:15) i koji je poželjno FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i najpoželjnije FPSSRMKFDY (SEQ ID NO:15).

[0023] Poželjnije, CDR su kako sledi (opet dati prema Kabat konvenciji): CDR1 je TSSML (SEQ ID NO: 10); CDR2 je VIHQSGTPTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) i CDR3 je FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO:15). najpoželjnije, CDR1 je TSSML (SEQ ID NO: 10); CDR2 je VIHQSGTPTYYADSVKG (SEQ ID NO: 11) i CDR3 je FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15)

[0024] U patentnim zahtevima, CDR su dati u skladu sa Abm konvencijom, tako da veznici serumskog albumina prema pronalasku sadrže naredne CDR:

• CDR1 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: GFTFSTGEMA (SEQ ID NO: 8) i GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13) i koji je poželjno GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13); i

• CDR2 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: SISSSGATTY (SEQ ID NO:9) i VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14) i koji je poželjno VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

• CDR3 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: PRHPQGGVTFDY (SEQ ID NO:7), FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) i FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je poželjno FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je najpoželjnije FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

[0025] Poželjno, CDR su kako sledi prema Abm konvenciji: CDR1 je GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13), CDR2 je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14) i CDR3 je FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15). najpoželjnije, CDR1 je GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13), CDR2 je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14) i CDR3 je FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

[0026] Poželjno je da veznik serumskog albumina prema pronalasku takođe ima:

• ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“ (kako je ovde definisano, ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutni i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan) sa sekvencom SEQ ID NO: 1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ ili CDR, ali je poželjno da su prisutne samo u okvirima, a ne u CDR).

[0027] Kada je reč o stepenu identičnosti sekvence u odnosu na SEQ ID NO:1, i/ili na broj i vrstu „razlike aminokiselina“ koje mogu biti prisutne u vezniku (tj. u poređenju sa SEQ ID NO:1), treba napomenuti da, kada se kaže da (i) aminokiselinska sekvenca pronalaska ima stepen identičnosti sekvence sa sekvencom SEQ ID NO: 1, od najmanje 85%, poželjno najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% (u kojima CDR, bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, kao i mutacije na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje zahtevaju specifični aspekti, nisu uzeti u obzir za određivanje stepena identičnosti sekvence); i/ili kada se kaže da (ii) sekvenca aminokiselina prema pronalasku nema više od 7, poželjno ne više od 5, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“ sa sekvencom SEQ ID NO :1 (opet, ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, a ne uzimajući u obzir mutacije na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje zahtevaju specifični aspekti), onda ovo takođe uključuje sekvence koje nemaju aminokiselinske razlike sa sekvencom SEQ ID NO:1, osim mutacija na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje zahtevaju specifični aspekti) i bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan.

[0028] Prema tome, u jednom specifičnom aspektu pronalaska, veznici albumina prema pronalasku mogu imati 100% identičnost sekvence sa SEQ ID NO: 1, respektivno i kako je primenljivo (uključujući CDR, ali ne uzimajući u obzir mutacije ili kombinaciju mutacija na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje su ovde obelodanjene i/ili bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan), i/ili možda nemaju razlike aminokiselina sa SEQ ID NO: 1, respektivno i kako je primenljivo (tj. osim mutacija ili kombinacije mutacija na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje su ovde obelodanjene i bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan).

[0029] Kada su prisutne bilo kakve razlike aminokiselina (tj. pored bilo kog C-terminalnog produžetka i mutacija na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koje su potrebne za specifični aspekt predmetnog pronalaska), ove razlike aminokiselina su prisutne samo u okvirnim regionima (kao što je definisano Abm konvencijom, tj. ne u CDR kako je definisano Abm konvencijom), tj. tako da veznici albumina prema pronalasku imaju istu kombinaciju CDR (definisano Abm konvencijom) kao što je prisutno u SEQ ID NO:1.

[0030] Veznici serumskog albumina prema pronalasku, kada su prisutni na i/ili formiraju C-terminalni kraj jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku (ili kada na drugi način imaju „izloženi” C-terminalni kraj u proteinu, polipeptidu ili drugom jedinjenju ili konstruktu u kom su prisutni, pod kojim se generalno podrazumeva da C-terminalni kraj ISV nije u vezi sa ili povezan sa konstantnim domenom (kao što je CHI domen); ponovo se upućuje na WO 12/175741 i PCT/EP2015/06043) poželjno takođe imaju C-terminalni produžetak formule (X)n, gde n iznosi 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran od prirodnih aminokiselinskih ostataka (iako prema poželjnom aspektu, ne obuhvata ostatke cisteina), i poželjno je nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I).

[0031] Prema nekim poželjnim, ali neograničavajućim primerima takvi C-terminalni produžeci X(n), X i n mogu biti kako sledi:

(a) n = 1 i X = Ala;

(b) n = 2 i svaki X = Ala;

(c) n = 3 i svaki X = Ala;

(d) n = 2 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(e) n = 3 i barem jedan X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(f) n = 3 i barem dva X = Ala (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(g) n = 1 i X = Gly;

(h) n = 2 i svaki X = Gly;

(i) n = 3 i svaki X = Gly;

(j) n = 2 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(k) n = 3 i barem jedan X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(l) n = 3 i barem dva X = Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

(m) n = 2 i svaki X = Ala ili Gly;

(n) n = 3 i svaki X = Ala ili Gly;

(o) n = 3 i barem jedan X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile); ili

(p) n = 3 i barem dva X = Ala ili Gly (gde su preostali aminokiselinski ostaci X nezavisno izabrani od bilo koje prirodne aminokiseline, ali su poželjno nezavisno izabrani od Val, Leu i/ili Ile);

gde su aspekti (a), (b), (c), (g), (h), (i), (m) i (n) posebno poželjni, gde su aspekti u kojima n =1 ili 2 poželjni, a aspekti u kojima n = 1 su posebno poželjni.

[0032] Takođe treba napomenuti da, poželjno, bilo koji C-terminalni produžetak prisutan u vezniku serumskog albumina prema pronalasku ne sadrži (slobodan) cisteinski ostatak (osim ako se navedeni cisteinski ostatak ne koristi ili je namenjen za dalju funkcionalizaciju, na primer za pegilaciju).

[0033] Neki specifični, ali neograničavajući primeri korisnih C-terminalnih produžetaka su naredne aminokiselinske sekvence: A, AA, AAA, G, GG, GGG, AG, GA, AAG, AGG, AGA, GGA, GAA ili GAG.

[0034] Kada veznici serumskog albumina prema pronalasku sadrže mutacije na položajima 110 ili 112 (opciono u kombinaciji sa mutacijama na položaju 11 i/ili 89 kako je ovde opisano), C-terminalni aminokiselinski ostaci okvira 4 (počev od položaja 109) mogu biti kako sledi: (i) ako nije prisutan C-terminalni produžetak: VTVKS (SEQ ID NO:101), VTVQS (SEQ ID NO:102), VKVSS (SEQ ID NO:103) ili VQVSS (SEQ ID NO:104); ili (ii) ako postoji C-terminalni produžetak: VTVKSX(n)(SEQ ID NO:105), VTVQSX(n) (SEQ ID NO:106), VKVSSX(n) (SEQ ID NO:107) ili VQVSSX(n)(SEQ ID NO:108), kao što je VTVKSA (SEQ ID NO:109), VTVQSA (SEQ ID NO:110), VKVSSA (SEQ ID NO:111) ili VQVSSA (SEQ ID NO:112). Kada veznici serumskog albumina prema pronalasku ne sadrže mutacije na položajima 110 ili 112 (već samo mutacije na položaju 11 i/ili 89 kako je ovde opisano), C-terminalni aminokiselinski ostaci okvira 4 (počev od položaja 109) će obično biti: (i) kada nije prisutan C-terminalni produžetak: VTVSS (SEQ ID NO:113) (kao u sekvenci SEQ ID NO:3); ili (ii) kada je prisutan C-terminalni produžetak: VTVSSX(n)(SEQ ID NO:114) kao što je VTVSSA (SEQ ID NO:115) (kao u sekvenci SEQ ID NO:4). U ovim C-terminalnim sekvencama, X i n su kao što je ovde definisano za C-terminalne produžetke.

[0035] Takođe, kada je veznik serumskog albumina prema pronalasku prisutan na/i ili formira N-terminalni kraj jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, onda veznik serumskog albumina poželjno ima D na položaju 1 (tj. E1D mutaciju u poređenju sa sekvencama datim kao SEQ ID NO: 1 do 4 i 16 do 99).

[0036] Takođe, generalno, kada jedinjenje ili polipeptid pronalaska ima ISVD teškog lanca na svom C-terminalnom kraju (koji može biti veznik serumskog albumina prema pronalasku, ali na primer takođe i ISVD vezivanje za terapeutski cilj), tada navedeni C-terminalni ISVD (i posledično, jedinjenje ili polipeptid pronalaska) poželjno ima C-terminalni produžetak X(n) kao što je ovde opisano. Slično, kada jedinjenje ili polipeptid pronalaska ima ISVD teškog lanca na svom N-terminalnom kraju (koji može biti veznik serumskog albumina prema pronalasku, ali na primer takođe i ISVD vezivanje za terapeutski cilj), tada navedeni N-terminalni ISVD (i posledično, jedinjenje ili polipeptid pronalaska) poželjno ima D na položaju 1.

[0037] Takođe, poželjno, kada jedinjenje ili polipeptid pronalaska sadrži jedan ili više drugih ISVD pored veznika albumina prema pronalasku (gde drugi ISVD mogu na primer biti jedan ili više ISVD protiv terapeutskog cilja), onda poželjno je da svi ISVD prisutni u navedenom jedinjenju ili polipeptidu unutar svoje sekvence sadrže jednu ili više mutacija okvira koje smanjuju vezivanje od strane već postojećih antitela. Konkretno, kada su ovi drugi ISVD nanotela ili antitela (jednog) domena koja se u suštini sastoje od i/ili su izvedena iz VH domena, oni mogu sadržati (odgovarajuću kombinaciju) aminokiselinskih ostataka/mutacija na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 koji su kao što je opisano u PCT/EP2015/060643 i/ili koji su u suštini kao što je opisano u PCT/EP2015/060643 i/ili kao što je ovde opisano za veznike albumina prema pronalasku.

[0038] Kao što je navedeno, aminokiselinske sekvence pružene pronalaskom su proteini koji se mogu vezati za, i koji se mogu posebno (kao što je ovde opisano) vezati za ljudski serumski albumin. Prema tome, oni se mogu koristiti kao vezujuće jedinice ili vezujući domeni za vezivanje za (ljudski) serumski albumin, na primer kako bi se povećao poluživot (kako je ovde definisano) terapeutskim jedinjenjima, delovima ili entitetima. Za upotrebu domena koji vezuju serumski albumin za produženje poluživota terapeutskih jedinjenja, grupa ili entiteta, generalno se upućuje na WO 2004/041865, WO 2006/122787, EP 2139 918, WO 2011/006915, WO 2012/175400 i/ili WO 2014/111550. Veznici albumina prema pronalasku se generalno mogu koristiti na isti način i za iste svrhe kao i veznici serumskog albumina opisani u ovim referencama.

[0039] Neki poželjni, ali neograničavajući primeri ISV pronalaska dati su u SEQ ID NO: 16 do 99, i svaka od ovih sekvenci čini dalji aspekt pronalaska (kao što to čine proteini, polipeptidi ili druga jedinjenja ili konstrukti koji sadrže jednu od ovih sekvenci). One su:

• SEQ ID NO: 16 do 29 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:1. Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 5; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 6; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 7;

• SEQ ID NO: 30 do 43 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:1 sa C-terminalnim alaninom (poželjni ali neograničavajući primer C-terminalnog produžetka kako je ovde opisano). Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 5; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 6; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 7;

• SEQ ID NO: 44 do 57 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:2. Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 10; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 11; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 12;

• SEQ ID NO: 58 do 71 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:2 sa C-terminalnim alaninom (poželjni ali neograničavajući primer C-terminalnog produžetka kako je ovde opisano). Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 10; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 11; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 12;

• SEQ ID NO: 72 do 85 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:3. Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 10; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 11; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 15;

• SEQ ID NO: 86 do 99 do 54 su primeri varijanti sekvence SEQ ID NO:4 (koji je SEQ ID NO:3 sa produžetkom C-terminalnog alanina). Ove sekvence imaju CDR1 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 10; CDR2 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 11; i CDR3 (definisano prema Kabatu) koji je sekvenca SEQ ID NO: 15.

[0040] Od ovih varijanti, najpoželjnije su sekvence SEQ ID NO: 72 do 85 (kada C-terminalni produžetak nije potreban) i sekvence SEQ ID NO: 86 do 99 (kada je potreban C-terminalni produžetak).

[0041] Stoga, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: GFTFSTGEMA (SEQ ID NO: 8) i GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13) i koji je poželjno GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13); i

• CDR3 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: PRHPQGGVTFDY (SEQ ID NO:7), FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) i FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je poželjno FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je najpoželjnije FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15);

• i ima:

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“, ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 prema Kabatu koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1, u kojoj su navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, prisutne samo u okvirima, a ne u CDR;

i opciono ima (posebno, kada je ISVD prisutan na i/ili formira C-terminalni kraj jedinjenja ili peptida prema pronalasku):

• C-terminalni produžetak (X)n, u kom n iznosi 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, a poželjno je nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I);

i opciono ima (posebno, kada je ISVD prisutan na i/ili formira N-terminalni kraj jedinjenja ili peptida prema pronalasku) D i/ili E1D mutaciju na položaju 1; gde:

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i • aminokiselinski ostatak na položaju 89 je poželjno odgovarajuće odabran od T, V ili L; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 112 je poželjno odgovarajuće odabran od S, K ili Q;

tako da (i) položaj 89 predstavlja T; ili (ii) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V; ili (iii) položaj 89 predstavlja L i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (iv) položaj 89 predstavlja L i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (v) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vi) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (vii) položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vii) položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q, gde navedeni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ima smanjeno vezivanje od strane već postojećih antitela prisutnih u serumu pacijenata sa SLE u poređenju sa SEQ ID NO: 1.

[0042] U specifičnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima:

i ima:

• ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“, ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, sa sekvencom SEQ ID NO: 1, u kojoj su navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, prisutne samo u okvirima, a ne u CDR;

i opciono ima (posebno, kada je ISVD prisutan na i/ili formira N-terminalni kraj jedinjenja ili peptida prema pronalasku) D i/ili E1D mutaciju na položaju 1; gde pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina sadrži naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu):

• 89T; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q,

gde navedeni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ima smanjeno vezivanje od strane već postojećih antitela prisutnih u serumu pacijenata sa SLE u poređenju sa SEQ ID NO: 1.

[0043] Konkretno, veznici serumskog albumina prema pronalasku poželjno nemaju više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“, ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, sa sekvencom SEQ ID NO: 1, u kojoj su navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, prisutne samo u okvirima, a ne u CDR.

[0044] Kao što je navedeno, u pronalasku, posebno su poželjne aminokiselinske sekvence u kojima položaj 89 predstavlja T ili u kojima položaj 11 predstavlja V i položaj 89 predstavlja L (opciono u odgovarajućoj kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom i/ili 112K ili 112Q mutacijom, a posebno u kombinaciji sa 110K ili 110Q mutacijom). Još poželjnije su aminokiselinske sekvence u kojima položaj 11 predstavlja V i položaj 89 predstavlja L, opciono sa 110K ili 110Q mutacijom.

[0045] Stoga, u jednom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina za koji se tvrdi da ima:

• CDR1 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: GFTFSTGEMA (SEQ ID NO: 8) i GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13) i koji je poželjno GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13); i

i ima:

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“, ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan, sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1, u kojoj su navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, prisutne samo u okvirima, a ne u CDR;

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 89 je T; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 110 je poželjno odgovarajuće odabran od T, K ili Q (i poželjno je T); i

• aminokiselinski ostatak na položaju 112 je poželjno odgovarajuće odabran od S, K ili Q (i poželjno je S).

[0046] U drugom poželjnom aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina za koji se tvrdi da ima:

• ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 „razlika aminokiselina“ (as definisano herein, i ne uzimajući u obzir nijednu od gore navedenih mutacija na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan) sa aminokiselinska sekvenca SEQ ID NO:1 (u kojoj navedene razlike aminokiselina, ako su prisutne, mogu biti prisutne u okvirima i/ili CDR ali su poželjno prisutne samo u okvirima, a ne u CDR);

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je V; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 89 je L; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 112 je poželjno odgovarajuće odabran od S, K ili Q.

[0047] U specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku imaju:

• CDR1 (prema Abm) koji je GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13); i

• CDR2 (prema Abm) koji je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

• CDR3 (prema Abm) koji je izabran od narednih sekvenci: FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je poželjno FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

a posebno:

• CDR1 (prema Abm) koji je GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13); i

• CDR2 (prema Abm) koji je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

• CDR3 (prema Abm) koji je FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

[0048] U jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku obuhvataju naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu):

• 11V u kombinaciji sa 89L; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q;

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q;

• 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 89L i 112K ili 112Q;

i imaju CDR i imaju ukupan stepen identičnosti sekvence sa referentnim sekvencama koje su definisane u patentnim zahtevima.

[0049] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku obuhvataju naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu): • 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q;

[0050] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku obuhvataju naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu):

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

[0051] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku obuhvataju naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu):

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V i 89L;

[0052] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, veznici serumskog albumina prema pronalasku obuhvataju naredne aminokiselinske ostatke (tj. mutacije u poređenju sa sekvencom SEQ ID NO: 1) na navedenim položajima (numerisanje prema Kabatu):

• 89T;

[0053] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 16 do 99.

[0054] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 44 do 99.

[0055] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je jedna od narednih sekvenci: SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID N0:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 ili SEQ ID NO:99.

[0056] U drugom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, pronalazak se odnosi na pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je jedna od narednih sekvenci: SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 78 ili SEQ ID NO: 92, i poželjno SEQ ID NO: 78 ili SEQ ID NO: 92.

[0057] Pronalazak se takođe odnosi na proteine, polipeptide i druge konstrukte, molekule ili hemijske entitete koji sadrže ili se suštinski sastoje od (jednog ili više) veznika serumskog albumina prema pronalasku kako je definisano patentnim zahtevima; na postupke za eksprimiranje/proizvodnju poboljšanih varijabilnih domena imunoglobulina teškog lanca prema pronalasku i/ili na eksprimiranje/proizvodnju proteina, polipeptida i drugih konstrukata, molekula ili hemijskih entiteta koji ih sadrže; na sastave i proizvode (kao što su farmaceutski sastavi i proizvodi) koji sadrže poboljšane varijabilne domene imunoglobulina teškog lanca prema pronalasku i/ili proteine, polipeptide i druge konstrukte, molekule ili hemijske entitete koji ih sadrže; na nukleotidnu sekvencu i nukleinske kiseline koje kodiraju poboljšane varijabilne domene imunoglobulina teškog lanca pronalaska i/ili koje kodiraju proteine ili polipeptide koji ih sadrže; i na upotrebu (a posebno za terapeutsku, profilaktičku i dijagnostičku upotrebu) poboljšanih varijabilnih domena imunoglobulina teškog lanca prema pronalasku i proteina, polipeptida i drugih konstrukata, molekula ili hemijskih entiteta koji ih sadrže.

[0058] U ovoj specifikaciji:

• izraz „pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina“ (koji se takođe naziva „ISV“ ili ISVD“) se generalno koristi za označavanje varijabilnih domena imunoglobulina (koji mogu biti domeni teškog ili lakog lanca, uključujući VH, VHH ili VL domene) koji mogu formiraju funkcionalno mesto vezivanja antigena bez interakcije sa drugim varijabilnim domenom (npr. bez VH/VL interakcije kao što je potrebno između VH i VL domena konvencionalnih 4-lančanih monoklonskih antitela). Primeri ISVD biće jasni stručnjacima i na primer uključuju nanotela (uključujući VHH, humanizovani VHH i/ili kamelizovane VH, kao što su kamelizovani ljudski VH), IgNAR, domene, (jednodomenska) antitela (kao što su dAb™) koja su VH domeni ili koja su izvedena iz VH domena i (jednodomenska) antitela (kao što je dAb™) koja su VL domeni ili koja su izvedena iz VL domena. Osim ako ovde nije izričito drugačije navedeno, generalno su poželjni ISVD koji su zasnovani i/ili izvedeni iz varijabilnih domena teškog lanca (kao što su VH ili VHH domeni). Najpoželjnije, osim ako je ovde eksplicitno drugačije naznačeno, ISVD će biti nanotelo.

• izraz „nanotelo“ je generalno kako je definisan u WO 2008/020079 ili WO 2009/138519, i stoga u specifičnom aspektu generalno označava VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH (kao što je kamelizovani ljudski VH) ili generalno sekvencno optimizovan VHH (kao što je npr. optimizovan za hemijsku stabilnost i/ili rastvorljivost, maksimalno preklapanje sa poznatim ljudskim okvirnim regionima i maksimalno eksprimiranje). Napominje se da su izrazi nanotelo ili nanotela registrovani zaštitni znaci kompanije Ablynx N.V. i stoga se mogu nazivati i Nanobody® i/ili nanoteloes®);

• Generalno, osim ako nije drugačije naznačeno ovde, ISVD, nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i konstrukti koji se ovde pominju biće namenjeni za upotrebu u profilaksi ili tretmanu bolesti ili poremećaja kod ljudi (i/ili opciono takođe kod toplokrvnih životinja, a posebno sisara). Stoga, generalno, ovde opisani ISVD, nanotela, polipeptidi, proteini i druga jedinjenja i konstrukti poželjno su takvi da se mogu koristiti kao, i/ili mogu na odgovarajući način biti deo, (biološkog) leka ili drugog farmaceutski ili terapeutski aktivnog jedinjenja i/ili farmaceutskog proizvoda ili sastava. Takav lek, jedinjenje ili proizvod su poželjno takvi da su pogodni za primenu na ljudskom biću, npr. za profilaksu ili tretman pacijenta koji ima potrebu za takvom profilaksom ili tretmanom ili, na primer, kao deo kliničkog ispitivanja. Kao što je dalje opisano ovde, za ovu svrhu, takav lek ili jedinjenje može sadržati druge delove, entitete ili vezujuće jedinice osim ISVD koje pruža pronalazak (koji, kao što je takođe ovde opisano, mogu na primer biti jedan ili više drugih terapeutskih delova i /ili jedan ili više drugih delova koji utiču na farmakokinetička ili farmakodinamička svojstva bioloških bioloških preparata zasnovanih na ISVD ili nanotelima, kao što je njegov poluživot). Pogodni primeri takvih daljih terapeutskih ili drugih delova biće jasni stručnjaku i, na primer, generalno mogu uključiti bilo koji terapeutski aktivan protein, polipeptid ili drugi vezujući domen ili vezujuću jedinicu, kao i na primer modifikacije kao što su one opisane na stranama 149. do 152 od WO 2009/138159. Biološki preparat zasnovan na ISVD ili biološki preparat zasnovan na nanotelu je poželjan terapeutski agens ili je namenjen za upotrebu kao terapeutski agens (što uključuje profilaksu i dijagnozu) i za tu svrhu poželjno je da sadrži najmanje jedan ISVD protiv terapeutski relevantnih ciljeva (kao što je na primer RANK- L, vWF, IgE, RSV, CXCR4, IL-23 ili drugi interleukini, itd.). Za neke specifične, ali neograničavajuće primere takvih bioloških preparata zasnovanih na ISVD ili nanotelu, upućuje se na Primere 8 do 18 i, takođe, na primer, na različite primene od strane Ablynx N.V. (kao što su na primer i bez ograničavanja WO 2004/062551, WO 2006/122825, WO 2008/020079 i WO 2009/068627), kao i na primer (i bez ograničavanja) na prijave kao što su npr. WO 2006/038027, WO 2006/059108, WO 2007/063308, WO 2007/063311, WO 2007/066016 i WO 2007/085814. Takođe, kao što je dalje opisano ovde, dalji deo može biti ISVD ili nanotelo kao što je ovde opisano usmereno protiv (ljudskog) serumskog proteina kao što je (ljudski) serumski albumin, i takav ISVD ili nanotelo takođe mogu naći terapeutsku upotrebu, posebno u i/ili za produženje poluživota ovde opisanih TNF veznika. Upućuje se, na primer, na WO 2004/041865, WO 2006/122787 i WO 2012/175400, koji generalno opisuju upotrebu nanotela koji vezuju serumski albumin za produženje poluživota. Takođe, u ovoj specifikaciji, osim ako ovde nije eksplicitno drugačije navedeno, svi izrazi navedeni ovde imaju značenje dato u WO 2009/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike citiranom u WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike citiranom u WO 2008/020079). Takođe, tamo gde postupak ili tehnika nisu posebno opisani ovde, mogu se izvesti kao što je opisano u WO 2009/138519 (ili u prethodnom stanju tehnike citiranom u WO 2009/138519) ili WO 2008/020079 (ili u prethodnom stanju tehnike citiranom u WO 2008/020079). Takođe, kao što je ovde opisano, bilo koji farmaceutski proizvod ili sastav koji sadrže bilo koji ISVD ili jedinjenje pronalaska mogu takođe da sadrže jednu ili više dodatnih komponenti poznatih za upotrebu u farmaceutskim proizvodima ili sastavima (tj. u zavisnosti od željenog farmaceutskog oblika) i/ili za na primer jedno ili više drugih jedinjenja ili aktivnih principa namenjenih za terapeutsku upotrebu (tj. za pružanje kombinovanog proizvoda).

[0059] Takođe, kada se koriste u ovoj specifikaciji ili patentnim zahtevima, naredni izrazi imaju isto značenje kao što je dato na, i/ili gde je primenljivo, kao što se može se odrediti na način opisan na stranama 62-75 od WO 2009/138519: „agonist“, „antagonist“, „inverzni agonist“, „nepolarni, nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni nenaelektrisani aminokiselinski ostatak“, „polarni, naelektrisani aminokiselinski ostatak“, „identičnost sekvence“, „potpuno isto“ i „razlika aminokiselina“ (kada se misli na poređenje sekvenci dve aminokiselinske sekvence), „suštinski izolovan (oblik)“, „domen“, „vezujući domen“, „antigenska determinanta“, „epitop“, „protiv“ ili „usmeren protiv“ (antigen), „specifičnost“ i „poluživot“. Pored toga, izrazi „modulirajući“ i „modulirati“, „mesto za interakciju“, „specifičan za“, „unakrsni blok“, „unakrsno blokiran“ i „unakrsno blokiranje“ i „suštinski nezavisno od pH vrednosti“ su definisani na (i/ili se mogu odrediti kako je opisano na) stranicama 74-79 od WO 2010/130832 od Ablynx N.V. Takođe, kada se odnosi na konstrukt, jedinjenje, protein ili polipeptid pronalaska, izrazi poput „jednovalentan“, „dvovalentan“ (ili „multivalentan“), „bispecifičan“ (ili „multispecifičan“), i „biparatopijski“ (ili „multiparatopijski“) može imati značenje dato u WO 2009/138519, WO 2010/130832 ili WO 2008/020079.

[0060] Izraz „poluživot“ kako se ovde koristi u vezi sa ISVD, nanotelom, biološkim preparatima zasnovanim na ISVD, biološkim preparatima zasnovanim na nanotelu ili bilo kojom drugom sekvencom aminokiselina, jedinjenjem ili polipeptidom koji se ovde pominju može se generalno definisati kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 od WO 2008/020079 i, kao što je tamo navedeno, odnosi se na vreme potrebno da se serumska koncentracija aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida smanji za 50%, in vivo, na primer zbog degradacije sekvence ili jedinjenja i/ili klirensa ili sekvestracije sekvence ili spoja prirodnim mehanizmima. Poluživot in vivo aminokiselinske sekvence, jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku može se odrediti na bilo koji način poznat sam po sebi, kao što je farmakokinetička analiza. Odgovarajuće tehnike će biti jasne stručnjaku i mogu, na primer, generalno biti kao što je opisano u paragrafu o) na strani 57 od WO 2008/020079. Kao što je takođe navedeno u paragrafu o) na strani 57 od WO 2008/020079, vreme poluraspada se može izraziti korišćenjem parametara kao što su t1/2-alfa, t1/2-beta i površina ispod krive (AUC). U tom pogledu treba napomenuti da se izraz „poluživot“ kako se ovde koristi posebno odnosi na t1/2-beta ili terminalni poluživot (u kom se t1/2-alfa i/ili AUC ili oba mogu držati po strani). Na primer, upućuje se na eksperimentalni odeljak u nastavku, kao i na standardne priručnike, kao npr Kenneth, A i dr: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and Peters i dr, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se upućuje na „Pharmacokinetics“, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, drugo rev. Izdanje (1982). Slično tome, izrazi „produženje poluživota“ ili „produženo vreme poluraspada“ su takođe definisani u paragrafu o) na strani 57 od WO 2008/020079 i posebno se odnose na povećanje t1/2-beta, bilo sa ili bez povećanja t1/2-alfa i/ili AUC ili oboje.

[0061] Kada izraz nije posebno definisan ovde, on ima svoje uobičajeno značenje u struci, koje će biti jasno stručnjaku. Na primer, upućuje se na standardne priručnike, kao npr Sambrook i dr, „Molecular Cloning: A Laboratory Manual“ (drugo izdanje), Vols.1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989); F. Ausubel i dr, eds., „Current protocols in molecular biology“, Green Publishing i Wiley Interscience, Njujork (1987); Lewin, „Genes II“, John Wiley & Sons, Njujork, N.Y., (1985); Old i dr., „Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering“, drugo izdanje, University of California Press, Berkli, CA (1981); Roitt i dr., „Immunology" (šesto izdanje), Mosby/Elsevier, Edinburg (2001); Roitt i dr., Roitt's Essential Immunology, deseto izdanje Blackwell Publishing, UK (2001); i Janeway i dr., „Immunobiology“ (šesto izdanje), Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, Njujork (2005), kao i na opšte stanje tehnike na koje se ovde poziva.

[0062] Takođe, kao što je već naznačeno ovde, aminokiselinski ostaci nanotela su numerisani prema opštem numerisanju za VH kako je dato kod Kabat i dr. („Sequence of proteins of immunological interes“, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No.91), primenjeno na VHH domene od kamelida u članku od Riechmann i Muyldermans, J.

Immunol. Methods 2000 Jun 23; 240 (1-2): 185-195; ili na koje se ovde poziva. Prema ovoj numerisanju, FR1 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 1-30, CDR1 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 31-35, FR2 od nanotela sadrži aminokiseline na položajima 36-49, CDR2 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 50-65, FR3 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 66-94, CDR3 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 95-102, i FR4 od nanotela sadrži aminokiselinske ostatke na položajima 103-113. [U tom pogledu, treba napomenuti da - kao što je dobro poznato u struci za VH domene i za VHH domene - ukupan broj aminokiselinskih ostataka u svakom od CDR može varirati i možda ne odgovara ukupnom broju aminokiselinskih ostataka naznačenih Kabat numerisanjem (to jest, jedna ili više položaja prema Kabat numerisanju možda neće biti zauzeta u stvarnom nizu, ili stvarna sekvenca može da sadrži više aminokiselinskih ostataka od broja dozvoljenog Kabat numerisanjem). To znači da, generalno, numerisanje prema Kabatu može ali ne mora odgovarati stvarnom numerisanju aminokiselinskih ostataka u stvarnom nizu. Generalno, međutim, može se reći da, prema Kabat numerisanju i bez obzira na broj aminokiselinskih ostataka u CDR, položaj 1 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR1 i obrnuto, položaj 36 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR2 i obrnuto, položaj 66 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR3 i obrnuto, i položaj 103 prema Kabat numerisanju odgovara početku FR4 i obrnuto.].

[0063] Alternativni postupci za numerisanje aminokiselinskih ostataka VH domena, koji se takođe mogu primeniti na analogan način na VHH domene iz kamelida i na nanotela, su postupci opisani kod Chothia i dr. (Nature 342, 877-883 (1989)), takozvana „AbM definicija“ i takozvana „kontaktna definicija“. Međutim, u predmetnom opisu, aspektima i slikama, pratiće se numerisanje prema Kabatu kako je primenjeno na VHH domene od strane Riechmanna i Muyldermansa, osim ako nije drugačije naznačeno.

[0064] Takođe treba napomenuti da su Slike, Spisak sekvenci i Eksperimentalni odeljak/Primeri dati samo da dodatno ilustruju pronalazak, i ne treba ih tumačiti ili tumačiti kao ograničavanje obima pronalaska i/ili priloženih patentnih zahteva na bilo koji način, osim ako je ovde izričito drugačije naznačeno.

[0065] Kao što je dalje opisano ovde, veznici serumskog albumina pronalaska mogu se povoljno koristiti kao deo, vezivna jedinica ili fuzioni partner u cilju povećanja poluživota terapeutskih delova kao što su polipeptidi, proteini, jedinjenja (uključujući, bez ograničenja, mali molekuli) ili drugi terapeutski entiteti.

[0066] Stoga, u drugom aspektu, pronalazak pruža polipeptide, proteine, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske entitete koji sadrže ili se suštinski sastoje od veznika serumskog albumina prema pronalasku i jedne ili više drugih aminokiselinskoj sekvenci, (vezujućih) domena, vezivnih jedinica ili drugih delova ili hemijskih entiteta.

[0067] Konkretno, pronalazak pruža polipeptide, proteine, konstrukte, jedinjenja ili druge hemijske entitete koji sadrže veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više (kao što je jedan ili dva) terapeutskih delova (koji mogu biti isti ili različiti, i mogu na primer, biti usmereni na isti cilj ili na različite ciljeve, a kada su usmereni na isti cilj mogu biti usmereni ka istim ili različitim epitopima, delovima, domenima ili podjedinicama navedeni ciljevi), koji su na odgovarajući način povezani jedni sa drugima, direktno ili preko jednog ili više odgovarajućih veznika ili odstojnika. Takvi polipeptidi, proteini ili konstrukti mogu na primer i bez ograničenja biti fuzioni protein, kao što je dalje opisano ovde.

[0068] Obelodanjenje se dalje odnosi na terapeutske upotrebe takvih polipeptida, proteina, konstrukata ili jedinjenja i na farmaceutske sastave koje sadrže takve polipeptide, proteine, konstrukte ili jedinjenja.

[0069] U jednom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se suštinski sastoji od terapeutskog proteina, polipeptida, jedinjenja, faktora ili drugog entiteta. U poželjnom otelotvorenju, terapeutski deo je usmeren protiv željenog antigena ili cilja, sposoban je da se veže za željeni antigen (a posebno sposoban da se specifično veže za željeni antigen) i/ili je sposoban da stupi u interakciju sa željenim ciljem. U drugom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se suštinski sastoji od terapeutskog proteina ili polipeptida. U daljem otelotvorenju, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se suštinski sastoji od vezujućeg domena ili vezujuće jedinice, kao što su imunoglobulin ili imunoglobulinska sekvenca (uključujući, ali ne ograničavajući se na fragment imunoglobulina), kao što su antitelo ili fragment antitela (uključujući, ali ne ograničavajući se na ScFv fragment), ili drugi pogodni proteinski okviri, kao što su domeni proteina A (kao što je Affibodies™), tendamistat, fibronektin, lipokalin, CTLA-4, T-ćelijski receptori, sintetička ponavljanja ankirina, avimeri i PDZ domeni (Binz i dr., Nat. Biotech 2005, Vol 23:1257), i vezujući delovi zasnovani na DNK ili RNK uključujući, ali ne ograničavajući se na DNK ili RNK aptamere (Ulrich i dr., Comb Chem High Throughput Screen 20069(8):619-32).

[0070] U još jednom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se suštinski sastoji od varijabilnog domena antitela, kao što je varijabilni domen teškog lanca ili varijabilni domen lakog lanca.

[0071] U poželjnom aspektu, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se u suštini sastoji od najmanje jednog pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina, kao što je domensko antitelo, jednodomensko antitelo, „dAb“ ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH) ili IgNAR domen.

[0072] U specifičnom otelotvorenju, najmanje jedan terapeutski deo sadrži ili se suštinski sastoji od najmanje jednog monovalentnog nanotela ili dvovalentnog, multivalentnog, bispecifičnog ili multispecifičnog konstrukta nanotela.

[0073] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koja sadrže veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više terapeutskih delova mogu generalno biti (pripremljeni i korišćeni) kao što je opisano u prethodnom stanju tehnike navedenom iznad (kao npr. WO 04/041865 i WO 06/122787), ali sa veznikom serumskog albumina prema pronalasku umesto delova koji povećavaju poluživot opisan u navedenom stanju tehnike.

[0074] Polipeptidi, (fuzioni) proteini, konstrukti ili jedinjenja koja sadrže veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više terapeutskih delova će generalno i poželjno imati produženi poluživot, u poređenju sa terapeutskim delom ili delovima samim po sebi.

[0075] Generalno, ovde opisani konstrukti ili fuzioni proteini poželjno imaju poluživot koji je najmanje 1,5 puta, poželjno najmanje 2 puta, kao što je najmanje 5 puta, na primer najmanje 10 puta ili više od 20 puta, duži od poluživota odgovarajućeg terapeutskog dela samog po sebi (mereno ili kod čoveka ili kod odgovarajuće životinje, kao što su miš ili cinomolgus majmun).

[0076] Takođe, poželjno, bilo koji takav fuzioni protein ili konstrukt ima poluživot kod čoveka koji se povećava za više od 1 sata, poželjno više od 2 sata, poželjnije više od 6 sati, kao što je više od 12 sati, u poređenju sa poluživotom odgovarajućeg terapeutskog dela samog po sebi.

[0077] Takođe, poželjno, bilo koji fuzioni protein ili konstrukt ima poluživot (definisan kao t1/2 beta) kod čoveka koji je duži od 1 sata, poželjno duži od 2 sata, poželjnije duži od 6 sati, kao što je duži od 12 sati, i na primer oko jednog dana, dva dana, jedne nedelje, dve nedelje i do poluživota serumskog albumina kod čoveka (procenjuje se da je oko 19 dana), iako ovo poslednje može biti manje kritično.

[0078] Poluživot se generalno može definisati kao vreme potrebno da se koncentracija polipeptida u serumu smanji za 50% in vivo, na primer zbog degradacije liganda i/ili klirensa ili sekvestracije liganda prirodnim mehanizmima. Konkretno, poluživot može biti kao što je definisano u WO 2009/068627.

[0079] Postupci za farmakokinetičku analizu i određivanje poluživota su poznati stručnjacima. Detalji se mogu naći kod Kenneth, A i dr: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists and in Peters i dr, Pharmacokinetic analysis: A Practical Approach (1996). Takođe se upućuje na „Pharmacokinetics“, M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2. revidirano izdanje (1982).

[0080] Kao što je navedeno, u jednom aspektu, veznik serumskog albumina prema pronalasku može se koristiti za produženje poluživota (jednog ili više) pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina, kao što su domenska antitela, jednodomenska antitela, „dAb“, VHH ili nanotela (kao što su VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH kao što su kamelizovani ljudski VH).

[0081] Stoga, jedno otelotvorenje pronalaska se odnosi na polipeptid, konstrukt ili fuzioni protein koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jednu ili više (kao što je jedna ili dve) sekvence pojedinačnog varijabilnog domena imunoglobulina, koje su na odgovarajući način povezane jedna sa drugom, bilo direktno ili opciono preko jednog ili više odgovarajućih veznika ili odstojnika. Kao što je ovde navedeno, svaki takav pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prisutan u takvom polipeptidu, konstruktu ili fuzionom proteinu može nezavisno biti domensko antitelo, jednodomensko antitelo, „dAb"' ili nanotelo (kao što je VHH, humanizovani VHH ili kamelizovani VH, kao što je kao kamelizovani ljudski VH); i prema jednom specifičnom, ali neograničavajućem aspektu, najmanje jedan (a najviše svi) od ovih pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina sadrži dva ili tri disulfidna mosta.

[0082] Kao što je navedeno, kada polipeptid, konstrukt fuzionog proteina ima ISVD teškog lanca na svom C-terminalnom kraju (gde IVSD može biti veznik serumskog albumina prema pronalasku ili ISVD protiv terapeutskog cilja, kao što je nanotelo protiv terapeutskog cilja), zatim (ISVD prisutan na C-terminalnom kraju) polipeptid, konstrukt fuzionog proteina poželjno ima C-terminalni produžetak na svom C-terminalnom kraju. Opet, navedeni C-terminalni produžetak imaće formulu (X)n, gde n iznosi 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran od prirodnih aminokiselinskih ostataka (iako prema poželjnom aspektu, ne obuhvata ostatke cisteina), i poželjno je nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I).

[0083] Kao što je navedeno, kada polipeptid, konstrukt fuzionog proteina ima ISVD teškog lanca na svom N-terminalnom kraju (gde IVSD može biti veznik serumskog albumina prema pronalasku ili ISVD protiv terapeutskog cilja, kao što je nanotelo protiv terapeutskog cilja), tada (ISVD prisutan na C-terminalnom kraju) polipeptid, konstrukt fuzionog proteina poželjno ima D ili E1D mutaciju na položaju 1.

[0084] Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje koje:

• sadrži ili se u suštini sastoji od najmanje jednog (i poželjno samo jednog) veznika serumskog albumina prema pronalasku i najmanje jednog (kao što je jedan, dva ili tri) terapeutskog dela ili entiteta (u kom su navedeni veznik serumskog albumina i jedan ili više terapeutskih delovi ili entiteta prikladno povezani, opciono preko jednog ili više odgovarajućih veznika);

• ima ISVD teškog lanca na svom C-terminalnom kraju, gde ISVD na C-terminalnom kraju ima C-terminalni produžetak (X)n(kao što je dalje opisano ovde);

• gde protein, polipeptid ili drugo jedinjenje takođe može imati ISVD teškog lanca na svom N-terminalnom kraju, u kom slučaju navedeni N-terminalni ISVD kraj poželjno ima D ili E1D na položaju 1.

[0085] Takođe, u poželjnom aspektu, kada je pored veznika serumskog albumina prema pronalasku, prisutan jedan ili više drugih ISVD (tj. kada su jedan ili više prisutnih terapeutskih grupa ISVD), onda (jedan ili više ili svi) navedeni „ terapeutski“ ISVD poželjno takođe imaju (kombinaciju) aminokiselinskih ostataka/mutacija koje smanjuju vezivanje od strane već postojećih antitela. Kada ISVD jesu ISVD teškog lanca, onda ove mutacije mogu, kao što je opisano u PCT/EP2015/060643, posebno biti (pogodna kombinacija) jedne ili više mutacija na položajima 11, 89, 110 i 112 koje u suštini mogu biti iste vrste mutacija (ili kombinacija mutacija) kao što je ovde opisano za veznike serumskog albumina prema pronalasku. Poželjno, ako je takav drugi ISVD prisutan na C-terminalnom kraju, onda barem navedeni terapeutski ISVD sadrži takve mutacije na položajima 11, 89, 110 i/ili 112 (tj. pored C-terminalnog produžetka kako je ovde opisano).

[0086] Prema jednom specifičnom aspektu, svi terapeutski delovi prisutni u konstruktu, fuzionom proteinu ili polipeptidu su ISVD (tj. ISVD protiv terapeutskog cilja), i posebno ISVD teškog lanca, i posebno nanotela (tj. nanotela protiv terapeutskog cilja).

[0087] Na primer i bez ograničavanja, konstrukt, fuzioni protein ili polipeptid koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku može sadržati:

• jednu kopiju veznika serumskog albumina prema pronalasku i jedan ISVD (i poželjno nanotelo) protiv terapeutskog cilja; ili

• jednu kopiju veznika serumskog albumina prema pronalasku i dva ISVD (i poželjno dva nanotela) protiv terapeutskog cilja (gde ISVD mogu biti isti ili različiti i kada su različiti mogu biti usmereni na isti cilj, protiv različitih epitopa na istom cilju ili protiv različitih terapeutskih ciljeva); ili

• jednu kopiju veznika serumskog albumina prema pronalasku i tri ISVD (i poželjno tri nanotela) protiv terapeutskog cilja (gde ISVD mogu biti isti ili različiti i kada su različiti mogu biti usmereni na isti cilj, protiv različitih epitopa na istom cilju ili protiv različitih terapeutskih ciljeva).

[0088] Neki neograničavajući primeri konstrukata, fuzionih proteina ili polipeptida prema pronalasku mogu biti šematski predstavljeni na naredni način, gde „[Alb]“ predstavlja veznik serumskog albumina prema pronalasku, „[terapeutski deo 1]“ i „[terapeutski deo

2]“ predstavljaju terapeutske delove (od kojih, kao što je navedeno, svaki može nezavisno da bude jedan pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina), „-“ predstavlja odgovarajući veznik (koji je opcioni; pogodni primeri su 9GS i 35GS veznici), a N-terminus je na levoj strana i C-terminus je na desnoj strani:

[Alb] - [terapeutski deo 1]

[terapeutski deo 1] - [Alb]-X(n)

[Alb] - [terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 1]

[terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 1] - [Alb]-X(n)

[terapeutski deo 1] - [Alb] - [terapeutski deo 1]

[Alb] - [terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 2]

[terapeutski deo 1] - [terapeutski deo 2] - [Alb]-X(n)

[terapeutski deo 1] - [Alb] - [terapeutski deo 2]

[0089] Kada su terapeutski delovi ISVD (i poželjno nanotela) protiv terapeutskog cilja, poželjni, ali neograničavajući konstrukti, fuzioni proteini ili polipeptidi pronalaska mogu biti šematski predstavljeni na naredni način, gde „[Alb]“ predstavlja veznik serumskog albumina od pronalazak, „[terapeutski ISVD 1]“ i „[terapeutski ISVD 2]“ predstavljaju ISVD protiv terapeutskog cilja (gde ISVD mogu biti isti ili različiti, a kada su različiti mogu biti usmereni protiv istog cilja, protiv različitih epitopa na istom cilj ili protiv različitih terapeutskih ciljeva), „ -“ predstavlja odgovarajući veznik (koji je opcioni), X(n) predstavlja C-terminalni produžetak kako je ovde opisano, a N-terminus je na levoj strani i C-terminus je na desnoj strani:

[Alb] - [terapeutski ISVD 1]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb]-X(n)

[Alb] - [terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 1]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 1] - [Alb]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb] - [terapeutski ISVD 1]-X(n)

[Alb] - [terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 2]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [terapeutski ISVD 2] - [Alb]-X(n)

[terapeutski ISVD 1] - [Alb] - [terapeutski ISVD 2]-X(n)

[0090] Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na multispecifičan (a posebno bispecifičan) nanotelo konstrukt koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i najmanje jedno drugo nanotelo (kao što je jedno ili dva druga nanotela, koja mogu biti ista ili različita), gde je navedeno najmanje jedno drugo nanotelo poželjno usmereno protiv željenog cilja (koji je poželjno terapeutski cilj) i/ili je drugo nanotelo korisno ili pogodno za terapeutske, profilaktičke i/ili dijagnostičke svrhe. Ponovo, veznik serumskog albumina prema pronalasku i druga nanotela mogu biti na odgovarajući način povezani jedni sa drugim bilo direktno ili opciono preko jednog ili više odgovarajućih veznika ili odstojnika.

[0091] Za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih polipeptida koji sadrže jedno ili više nanotela i njihove pripreme, takođe se upućuje na Conrath i dr., J. Biol. Chem., Vol.276, 10.

7346-7350, 2001; Muyldermans, Reviews in Molecular Biotechnology 74 (2001), 277-302; kao i, na primer, WO 96/34103, WO 99/23221, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0092] Neki drugi primeri nekog specifičnog multispecifičnog i/ili multivalentnog polipeptida prema pronalasku mogu se naći u ovde navedenim prijavama od strane Ablynx N.V. Konkretno, za opšti opis multivalentnih i multispecifičnih konstrukata koji sadrže najmanje jedno nanotelo protiv serumskog proteina za produženje poluživota, nukleinskih kiselina koje ih kodiraju, sastava koji se sastoje od njih, pripreme gore navedenog i upotrebe gore navedenog, upućuje se na međunarodne prijave WO 04/041865 i WO 06/122787 navedene iznad (ovde opisani veznici serumskog albumina prema pronalasku se generalno mogu koristiti analogno nanotelima koja produžavaju poluživot, kao što je Alb-8), kao i opštem opisu i specifičnim primerima takvih konstrukata datim u npr. WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0093] U jednom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca (npr. nanotela ili (jedan) domen antitela koja se sastoje ili su izvedena iz VH domena), u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i

tako da (i) položaj 89 predstavlja T; ili (ii) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V; ili (iii) položaj 89 predstavlja L i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (iv) položaj 89 predstavlja L i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (v) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vi) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili (vii) položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili (vii) položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q.

[0094] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• 89T; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q.

[0095] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 89 je T; i

[0096] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• aminokiselinski ostatak na položaju 11 je V; i

• aminokiselinski ostatak na položaju 89 je L; i

[0097] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• 11V u kombinaciji sa 89L; ili

• 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q;

• 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q;

• 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q; ili

• 11V u kombinaciji sa 89L i 112K ili 112Q.

[0098] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• 89L u kombinaciji sa 11V; ili

• 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

• 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q.

[0099] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V i 89L.

[0100] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže naredne aminokiselinske ostatke:

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 89L; ili

• 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V i 89L.

[0101] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i rekao je da jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže T na položaju 89.

[0102] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na protein, polipeptid ili drugo jedinjenje ili konstrukt (i poželjno fuzioni protein) koji sadrži veznik serumskog albumina prema pronalasku i jedan ili više daljih ISVD teškog lanca, u kojima navedeni veznik serumskog albumina i navedeni jedan ili više daljih ISVD teškog lanca sadrže V na položaju 11 i L na položaju 89.

[0103] Opet, svi ovi polipeptidi poželjno sadrže C-terminalni produžetak X(n) (kao što je ovde opisano) i D na položaju 1 i, kao što je dalje opisano ovde, mogu da sadrže ISVD koji se vezuje za serumski albumin. Oni takođe imaju poluživot koji je dalje opisan ovde.

[0104] Pronalazak se takođe odnosi na nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline koje kodiraju veznike albumina, jedinjenja ili polipeptide pronalaska. Pronalazak dalje uključuje genetske konstrukte koji uključuju prethodne nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline i jedan ili više elemenata za genetskih konstrukata poznatih samih po sebi. Genetski konstrukt može biti u obliku plazmida ili vektora. Opet, takvi konstrukti mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama od Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0105] Pronalazak se takođe odnosi na domaćine ili ćelije domaćine koje sadrže takve nukleotidne sekvence ili nukleinske kiseline, i/ili koje eksprimiraju (ili su sposobne da eksprimiraju), veznike albumina, jedinjenja ili polipeptide pronalaska. Opet, takve ćelije domaćini mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama od Ablynx N.V., kao što su na primer, WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0106] Pronalazak se takođe odnosi na postupak za pripremu veznika albumina, jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, gde postupak obuhvata kultivaciju ili održavanje ćelije domaćina kako je ovde opisano pod uslovima u kojima navedena ćelija domaćin proizvodi ili eksprimira veznik albumina, jedinjenje ili polipeptid prema pronalasku, i opciono dalje obuhvata izolovanje tako proizvedenog veznika albumina, jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku. Opet, takvi postupci se mogu izvesti kao što je uopšteno opisano u objavljenim patentnim prijavama od Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0107] Pronalazak se takođe odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid pronalaska i opciono najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv nosač, razblaživač ili ekscipijens. Takvi preparati, nosači, ekscipijensi i razblaživači mogu generalno biti kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama od Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0108] Međutim, pošto jedinjenja ili polipeptidi pronalaska imaju produženo vreme poluraspada, poželjno je da se primene u cirkulaciju. Kao takvi, oni se mogu primenjivati na bilo koji pogodan način koji omogućava jedinjenju ili polipeptidu pronalaska da uđe u cirkulaciju, kao što je intravenozno, putem injekcije ili infuzije, ili na bilo koji drugi pogodan način (uključujući oralnu primenu, potkožnu primenu, intramuskularnu primenu, primenu kroz kožu, intranazalnu primena, primenu preko pluća, itd.). Odgovarajuće postupci i putevi primene biće jasni stručnjacima, ponovo na primer kao što je opisano u objavljenim patentnim prijavama od Ablynx N.V., kao što su na primer WO 04/041862, WO 2006/122786, WO 2008/020079, WO 2008/142164 ili WO 2009/068627.

[0109] Stoga, u drugom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenje ili polipeptid kako je definisano patentnim zahtevima za upotrebu u postupku za prevenciju i/ili tretman najmanje jedne bolesti ili poremećaja koji se može sprečiti ili tretirati upotrebom takvog jedinjenja ili polipeptida pronalaska, gde postupak obuhvata primenu pacijentu koji ima potrebu za tim, farmaceutski aktivne količine takvog jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, i/ili farmaceutskog sastava koji ih sadrži. Bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili tretirati upotrebom jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku kako je definisano patentnim zahtevima će generalno biti isti kao i bolesti i poremećaji koji se mogu sprečiti ili tretirati upotrebom terapeutskog dela ili delova koji su/su prisutni u jedinjenju ili polipeptidu pronalaska.

[0110] U kontekstu predmetnog pronalaska, izraz „prevencija i/ili tretman“ ne obuhvata samo prevenciju i/ili tretman bolesti, već takođe generalno obuhvata sprečavanje početka bolesti, usporavanje ili preokretanje napredovanja bolesti, sprečavanje ili usporavanje početka jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenje i/ili ublažavanje jednog ili više simptoma povezanih sa bolešću, smanjenje težine i/ili trajanja bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa bolešću i/ili sprečavanje daljeg povećanja ozbiljnosti bolesti i/ili bilo kojih simptoma povezanih sa njom, sprečavanje, smanjenje ili poništavanje bilo kakvog fiziološkog oštećenja izazvanog bolešću i uopšte bilo kakvog farmakološkog delovanja koje je korisno za pacijenta koji se tretira.

[0111] Pacijent koji se tretira može biti bilo koja toplokrvna životinja, ali je to posebno sisar, konkretno ljudsko biće. Kao što će biti jasno stručnjaku, pacijent koji će se tretirati će posebno biti osoba koja pati od, ili je izložena riziku od ovde navedenih bolesti i poremećaja.

[0112] U drugom aspektu, pronalazak se odnosi na jedinjenje ili polipeptid kako je definisano patentnim zahtevima za upotrebu u postupku za imunoterapiju, a posebno za pasivnu imunoterapiju, gde postupak obuhvata primenu pacijentu koji pati ili je u opasnosti od ovde opisane bolesti i poremećaja, farmaceutski aktivne količina takvog jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, i/ili farmaceutskog sastava koji ih sadrži.

[0113] Jedinjenje ili polipeptid pronalaska i/ili sastavi koji ih sadrže mogu se primenjivati u skladu sa režimom tretmana koji je pogodan za prevenciju i/ili tretman bolesti ili poremećaja koji treba sprečiti ili tretirati. Kliničar će generalno moći da odredi odgovarajući režim tretmana, u zavisnosti od faktora kao što su bolest ili poremećaj koji treba sprečiti ili tretirati, ozbiljnost bolesti koja se tretira i/ili ozbiljnost njenih simptoma, specifični polipeptid pronalaska koji se koristi, specifičan način primene i farmaceutske formulacije ili sastava koji će se koristiti, uzrasta, pola, težine, ishrane, opšteg stanja pacijenta i sličnih faktore dobro poznatih kliničaru.

[0114] Generalno, režim tretmana će uključivati primenu jednog ili više jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku, ili jednog ili više sastava koji ih sadrže, u jednoj ili više farmaceutski efikasnih količina ili doza. Specifične količine ili doze koje će se primeniti može odrediti kliničar, ponovo na osnovu gore navedenih faktora.

[0115] Generalno, za prevenciju i/ili tretman bolesti i poremećaja navedenih ovde i u zavisnosti od specifične bolesti ili poremećaja koji se tretira, jačine i/ili poluživota jedinjenja ili polipeptida prema pronalasku koji će se koristiti, specifičan način primene i specifična farmaceutska formulacija ili sastav koji se koriste, jedinjenja ili polipeptidi pronalaska će se generalno primenjivati u količini između 1 grama i 0,01 mikrograma po kg telesne težine dnevno, poželjno između 0,1 grama i 0,1 mikrograma po kg tela težine dnevno, kao što je oko 1, 10, 100 ili 1000 mikrograma po kg telesne težine dnevno, bilo kontinuirano (npr. infuzijom), kao pojedinačna dnevna doza ili kao višestruke podeljene doze tokom dana. Lekar će generalno moći da odredi odgovarajuću dnevnu dozu, u zavisnosti od faktora navedenih ovde. Takođe će biti jasno da u određenim slučajevima, kliničar može odlučiti da odstupi od ovih iznosa, na primer na osnovu gore navedenih faktora i njegove stručne procene. Generalno, neka uputstva o količinama koje se primenjuju mogu se dobiti iz količina koje se obično primenjuju za uporediva konvencionalna antitela ili fragmente antitela protiv istog cilja koji se primenjuju suštinski istim putem, uzimajući u obzir međutim razlike u afinitetu/aviditetu, efikasnosti, biodistribuciji, poluživot i slični faktori dobro poznati stručnjaku.

[0116] Takođe, pošto jedinjenja pronalaska sadrže veznik serumskog albumina prema pronalasku koji produžava poluživot, ne treba ih primenjivati u suštini kontinuirano (npr. infuzijom), ali se mogu primenjivati u odgovarajućim intervalima (koji se određuju od strane stručnjaka). Na primer, mogu se primenjivati (u odgovarajućoj dozi) jednom u dva dana, jednom u četiri dana, jednom nedeljno, jednom u dve nedelje a u nekim slučajevima jednom u četiri nedelje ili čak ređe, na primer injekcijom ili infuzijom.

[0117] Jedan aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutski sastav koji sadrži najmanje jedno jedinjenje ili polipeptid pronalaska gde je navedeni sastav namenjen za primenu u intervalu između jednom nedeljno i jednom u 4 nedelje, a posebno između jednom u 7 dana i jednom na 21 dan, na primer jednom u 7 ili 14 dana.

[0118] Obično, u gornjem postupku, koristiće se jedan polipeptid pronalaska. Međutim, dva ili više polipeptida prema pronalasku se takođe mogu koristiti u kombinaciji.

[0119] Polipeptidi pronalaska se takođe mogu koristiti u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski aktivnih jedinjenja ili principa, tj. kao kombinovani režim tretmana, koji može, ali ne mora da dovede do sinergetskog efekta. Opet, kliničar će moći da izabere takva dalja jedinjenja ili principe, kao i odgovarajući kombinovani režim tretmana, na osnovu gore navedenih faktora i svog stručnog mišljenja.

[0120] Posebno, polipeptidi pronalaska mogu da se koriste u kombinaciji sa drugim farmaceutski aktivnim jedinjenjima ili principima koji se koriste ili se mogu koristiti za prevenciju i/ili tretman bolesti i poremećaja koji se mogu sprečiti ili tretirati fuzionim proteinima ili konstruktima. pronalaska, i kao rezultat toga sinergetski efekat može, ali i ne mora biti postignut.

[0121] Efikasnost režima tretmana koji se koristi prema pronalasku može se odrediti i/ili pratiti na bilo koji način poznat sam po sebi za uključenu bolest ili poremećaj, kao što će biti jasno kliničaru. Kliničar će takođe moći, gde je to prikladno i/ili od slučaja do slučaja, da promeni ili modifikuje određeni režim tretmana, kako bi postigao željeni terapeutski efekat, kako bi izbegao, ograničio ili smanjio neželjene nuspojave i/ili kako bi se postigla odgovarajuća ravnoteža između postizanja željenog terapeutskog efekta sa jedne strane i izbegavanja, ograničavanja ili smanjenja nuspojava sa druge strane.

[0122] Generalno, režim tretmana će se poštovati sve dok se ne postigne željeni terapeutski efekat i/ili dokle god treba da se održi željeni terapeutski efekat. Opet, to može odrediti kliničar.

[0123] Pacijent koji se tretira može biti bilo koja toplokrvna životinja, posebno sisar, konkretno ljudsko biće. Kao što će biti jasno stručnjaku, pacijent koji će se tretirati će posebno biti osoba koja pati od, ili je izložena riziku od ovde navedenih bolesti i poremećaja.

[0124] Pronalazak će sada biti dalje opisan pomoću narednih neograničavajućih poželjnih aspekata, primera i slika, gde:

• Slika 1 je tabela koja navodi neke od položaja aminokiselina koje će se ovde posebno pominjati i njihovo numerisanje prema nekim alternativnim sistemima numerisanja (kao što su Aho i IMGT);

• Slika 2 prikazuje poravnanje referentnih sekvenci koje se ovde pominju.

• Slika 3 navodi aminokiselinske sekvence koje se ovde pominju;

• Slika 4 prikazuje dva odgovarajuća grafikona sa tačkama podataka dobijenim u Primeru 1 kada je 96 uzoraka seruma od zdravih ljudi testirano na vezivanje za Referencu A i dve reprezentativne varijante Reference A prema pronalasku (tj.

[referenca A L11V V89L C-terminalni alanin] i [Referenca A L11V V89L T110K C-terminalni alanin], respektivno). Svaka tačka predstavlja nivo vezivanja za jedan od 96 testiranih uzoraka. Tačke podataka prikazane na desnom i levom panelu su iste; na desnom panelu tačke podataka merene sa svakim pojedinačnim uzorkom za svako od tri testirana jedinjenja (tj. Ref. A; Ref. A L11V V89L 114A; i Ref. A L11V V89L T110K 114A) su povezane linijom (kao rezultat, deklinacija linije pruža indikaciju do koje mere se smanjuje vezivanje već postojećih antitela kada se uvedu mutacije pronalaska i C-terminalni alanin);

• Slika 5 je tabela koja navodi podatke o vezivanju (3 kolone koje daju normalizovane nivoe PreAb vezivanja (RU na 700) i 3 kolone koje daju procenat smanjenja PreAb vezivanja u poređenju sa referentnim jedinjenjem koje se koristi, respektivno) tačaka podataka sakupljenih na Slici 4;

• Slika 6 prikazuje dva odgovarajuća grafikona sa tačkama podataka dobijenim u Primeru 2 kada je 96 uzoraka seruma od zdravih ljudi testirano na vezivanje za Referencu B i dve reprezentativne varijante Reference B prema pronalasku (tj.

[referenca B L11V V89L C-terminalni alanin] i [Referenca B L11V V89L T110K C-terminalni alanin], respektivno). Svaka tačka predstavlja nivo vezivanja za jedan od 96 testiranih uzoraka. Tačke podataka prikazane na desnom i levom panelu su iste; na desnom panelu tačke podataka merene sa svakim pojedinačnim uzorkom za svako od tri testirana jedinjenja (tj. Ref. B; Ref. B L11V V89L 114A; i Ref. B L11V V89L T110K 114A) su povezane linijom (kao rezultat, deklinacija linije pruža indikaciju do koje mere se smanjuje vezivanje već postojećih antitela kada se uvedu mutacije pronalaska i C-terminalni alanin);

• Slika 7 je tabela koja navodi podatke o vezivanju (3 kolone koje daju normalizovane nivoe PreAb vezivanja (RU na 700) i 2 kolone koje daju procenat smanjenja PreAb vezivanja u poređenju sa referentnim jedinjenjem koje se koristi, respektivno) tačaka podataka sakupljenih na Slici 6;

• Slika 8 prikazuje dva odgovarajuća grafikona podataka dobijenih u Primeru 3 kada je 96 uzoraka seruma (66 od zdravih ljudi i 30 od pacijenata za koje se pretpostavlja da sadrže prethodno postojeća antitela koja se mogu vezati u prisustvu C-terminalnog alanina, uključujući 13 uzoraka od pacijenata sa SLE) testirano na vezivanje za Referencu C, Referencu D i dve reprezentativne varijante Reference D prema pronalasku (tj. [referenca D L11V V89L] i [referenca D L11V V89L T110K], respektivno). Svaka tačka predstavlja nivo vezivanja za jedan od 96 testiranih uzoraka. Tačke podataka prikazane na desnom i levom panelu su iste; na desnom panelu tačke podataka merene sa svakim pojedinačnim uzorkom za svako od četiri testirana jedinjenja (tj. Ref. C; Ref. D; Ref. D L11V V89L; i Ref. D L11V V89L T110K) su povezane linijom (kao rezultat, deklinacija linije pruža indikaciju do koje mere se smanjuje vezivanje već postojećih antitela kada se uvedu mutacije pronalaska i C-terminalni alanin);

• Slika 9 prikazuje dijagram sa tačkama podataka dobijenim za četiri uzorka SLE koji su testirani u Primeru 3. Tačke podataka merene sa za pojedinačni uzorak (tj. „SLE 25“, „SLE 37“, „SLE39“ i „SLE41“, respektivno) su povezane linijom (kao rezultat toga, deklinacija svake linije pruža indikaciju do koje mere je vezivanje već postojećih antitela smanjeno u svakom uzorku kada se uvedu mutacije pronalaska); • Slika 10 je tabela koja navodi podatke o vezivanju (4 kolone koje daju normalizovane nivoe PreAb vezivanja (RU na 700) i 3 kolone koje daju procenat smanjenja PreAb vezivanja u poređenju sa referentnim jedinjenjima koja su korišćena, respektivno) tačaka podataka sakupljenih na Slici 8.

Eksperimentalni odeljak

[0125] Uzorci ljudi koji su korišćeni u eksperimentalnom odeljku u nastavku su ili dobijeni iz komercijalnih izvora ili od ljudskih dobrovoljaca (nakon što su dobijeni svi potrebni pristanci i odobrenja) i korišćeni su u skladu sa važećim zakonskim i regulatornim patentnim zahtevima (uključujući, ali ne ograničavajući se na one koji se odnose na medicinske tajne i privatnost pacijenata)

[0126] U dole navedenim Primerima, osim ako nije eksplicitno drugačije naznačeno, vezivanje već postojećih antitela koja su prisutna u korišćenim uzorcima (tj. od zdravih dobrovoljaca, pacijenata sa reumatoidnim artritisom (RA) i pacijenata sa SLE) za testirana nanotela je određeno koristeći ProteOn na naredni način :

Nanotela su uhvaćena ili na serumskom albuminu ili preko FLAG3 oznake koristeći monoklonski anti-FLAG M2.

[0127] U slučaju vezivanja već postojećih antitela na nanotela uhvaćena na ljudskom serumskom albuminu (HSA) su procenjena korišćenjem ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (fosfatom puferisan fiziološki rastvor, pH7,4, 0,005% Tween20) je korišćen kao tekući pufer i eksperimenti su izvedeni na 25°C. Ligandne trake ProteOn GLC senzorskog čipa su aktivirane sa EDC/NHS (brzina protoka 30 µl/min) i HSA je injektiran pri 10 µg/ml u ProteOn acetatnom puferu pH 4,5 (brzina protoka 100 µl/min) kako bi se postigao nivo imobilizacije od približno 3200 RU. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane etanolaminom HCl (brzina protoka 30 µl/min). Nanotela su injektirana 2 minuta pri 45 µl/min preko površine HSA kako bi se postigao nivo hvatanja nanotela od približno 200 RU. Uzorci koji sadrže prethodno postojeća antitela su centrifugirani 2 minuta na 14.000 obrtaja u minuti i supernatant je razblažen 1:10 u PBS-Tween20 (0,005%) pre nego što je injektiran tokom 2 minuta pri 45 µl/min nakon čega je usledio naredni korak disocijacije od 400 sekundi. Posle svakog ciklusa (tj. pre novog koraka hvatanja nanotela i koraka injektiranja uzorka krvi) površine HSA su regenerisane 2-minutnom injekcijom HCl (100 mM) pri 45 µl/min. Obrada senzorograma i analiza podataka obavljeni su sa ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzorgrami koji pokazuju prethodno postojeće vezivanje antitela dobijeni su nakon dvostrukog referenciranja oduzimanjem 1) Nanotelo-HSA disocijacije i 2) nespecifičnog vezivanja za referentnu ligandnu traku. Nivoi vezivanja već postojećih antitela su određeni postavljanjem tačaka izveštaja na 125 sekundi (5 sekundi nakon završetka povezivanja). Procenat smanjenja već postojećeg vezivanja antitela je izračunat u odnosu na nivoe vezivanja na 125 sekundi referentnog nanotela.

[0128] U slučaju vezivanja već postojećih antitela za FLAG označena nanotela, nanotela uhvaćena na monoklonskom anti-FLAG M2 (Sigma) su procenjena korišćenjem ProteOn XPR36 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). PBS/Tween (fosfatom puferisan fiziološki rastvor, pH7,4, 0,005% Tween20) je korišćen kao tekući pufer i eksperimenti su izvedeni na 25°C. Ligandne trake ProteOn GLC senzorskog čipa su aktivirane sa EDC/NHS (brzina protoka 30 µl/min) i anti-FLAG M2 mAb je injektirano pri 10 µg/ml u ProteOn acetatnom puferu pH 4,5 (brzina protoka 100 µl/min) kako bi se dobili nivoi imobilizacije od približno 4000 RU. Nakon imobilizacije, površine su deaktivirane etanolaminom HCl (brzina protoka 30 µl/min). Nanotela su injektirana 2 minuta pri 45 µl/min preko anti-FLAG M2 površine kako bi se postigao nivo hvatanja Nanotela od približno 100 RU. Kako bi se smanjilo nespecifično vezivanje uzoraka krvi za anti-FLAG M2 površinu, uzorcima krvi je dodato 100 nM 3xFLAG peptida (Sigma). Uzorci koji sadrže prethodno postojeća antitela su centrifugirani 2 minuta na 14,000 rpm, i supernatant je razblažen 1:10 u PBS-Tween20 (0,005%) pre nego što je injektiran 2 minuta pri 45 µl/min nakon čega je usledio naredni korak disocijacije od 600 sekundi. Posle svakog ciklusa (tj. pre novog koraka hvatanja nanotela i koraka injektiranja uzorka krvi) anti-FLAG M2 površine su regenerisane 10-sekundnom injekcijom glicina pH 1,5 (10 mM) pri 150 µl/min. Obrada senzorograma i analiza podataka obavljeni su koristeći ProteOn Manager 3.1.0 (Bio-Rad Laboratories, Inc.). Senzorgrami koji pokazuju prethodno postojeće vezivanje antitela dobijeni su nakon dvostrukog referenciranja oduzimanjem 1) disocijacije nanotelo-anti-FLAG M2 i 2) nespecifičnog vezivanja za referentnu ligandnu traku. Nivoi vezivanja već postojećih antitela su određeni postavljanjem tačaka izveštaja na 125 sekundi (5 sekundi nakon završetka povezivanja). Procenat smanjenja već postojećeg vezivanja antitela je izračunat u odnosu na nivoe vezivanja na 125 sekundi referentnog nanotela

Primer 1: Uvođenje mutacija pronalaska u Referencu A (SEQ ID NO: 1) dovodi do smanjenja vezivanja od strane već postojećih antitela.

[0129] Referenca A (SEQ ID NO: 1) i dva reprezentativna primera poboljšanih varijanti Reference A koje nose mutacije prema pronalasku (SEQ ID NOs: 37 i 38, obe sa produžetkom alanina i testirane sa N-terminalnom HIS6-FLAG3 oznakom, pogledati SEQ ID NO:100) su testirani za vezivanje od strane već postojećih antitela koja su prisutna u uzorcima iz 96 uzoraka seruma zdravih dobrovoljaca. Jedinjenja su uhvaćena korišćenjem FLAG-oznake i vezivanje je mereno korišćenjem ProteOn u skladu sa protokolom datim u preambuli ovog Eksperimentalnog odeljka.

[0130] Rezultati su prikazani na Slici 4. Na Slici 5 su navedeni rezultati za svaki od uzoraka koji čine jednu od tačaka podataka na Slici 4.

[0131] Može se videti da za većinu od 96 testiranih uzoraka, uvođenje mutacija prema pronalasku dovodi do smanjenja već postojećeg vezivanja antitela, gde stepen smanjenja generalno zavisi od nivoa do kog su prethodno postojeća antitela u svakom uzorku bila sposobna za vezivanje za Referencu A.

Primer 2: Uvođenje mutacija pronalaska u Referencu B (SEQ ID NO: 2) dovodi do smanjenja vezivanja od strane već postojećih antitela.

[0132] Referenca B (SEQ ID NO:2) i dva reprezentativna primera poboljšanih varijanti Reference B koja nose mutacije prema pronalasku (SEQ ID NOs: 65 i 66, obe sa produžetkom alanina i testirane sa N-terminalnom HIS6-FLAG3 oznakom, pogledati SEQ ID NO:100) testirani su za vezivanje od strane već postojećih antitela koja su prisutna u uzorcima iz 96 uzoraka seruma zdravih dobrovoljaca. Jedinjenja su uhvaćena korišćenjem FLAG-oznake i vezivanje je mereno korišćenjem ProteOn u skladu sa protokolom datim u preambuli ovog Eksperimentalnog odeljka.

[0133] Rezultati su prikazani na Slici 6. Na Slici 7 su navedeni rezultati za svaki od uzoraka koji čine jednu od tačaka podataka na Slici 6.

[0134] Slično Primeru 1, može se videti da za većinu od 96 testiranih uzoraka, uvođenje mutacija prema pronalasku dovodi do smanjenja već postojećeg vezivanja antitela, gde stepen smanjenja generalno zavisi od nivoa do kog su prethodno postojeća antitela u svakom uzorku bila sposobna za vezivanje za Referencu B.

Primer 3: Uvođenje mutacija pronalaska u Referencu C (SEQ ID NO: 3) i Referenca D (SEQ ID NO: 4) dovodi do smanjenja vezivanja od strane već postojećih antitela.

[0135] Referenca C (SEQ ID NO: 3), referenca D (SEQ ID NO: 4) i dva reprezentativna primera poboljšanih varijanti Reference C i Reference D koje nose mutacije prema pronalasku (SEQ ID NO: 93 i 94, oba sa produžetkom alanina koji je prisutan u Referenci D i testiran sa N-terminalnom HIS6-FLAG3 oznakom, pogledati SEQ ID NO: 100) testirana su za vezivanje od strane već postojećih antitela koja su prisutna u uzorcima iz 66 uzoraka seruma zdravih ljudskih dobrovoljca i 30 uzoraka za koje se pretpostavlja da sadrže prethodno postojeća antitela sposobna za vezivanje čak i kada je prisutan C-terminalni alanin (od čega je 13 pacijenata sa SLE). Jedinjenja su uhvaćena na ljudskom serumskom albuminu i vezivanje je mereno korišćenjem ProteOn u skladu sa protokolom datim u preambuli ovog Eksperimentalnog odeljka.

[0136] Rezultati su prikazani na Slici 8. Na Slici 9 su dati detalji za 4 reprezentativna uzorka SLE. Na Slici 10 su dati rezultati za svaki od uzoraka koji čine jednu od tačaka podataka na Slici 8.

[0137] Slično Primerima 1 i 2, može se videti da za većinu od 96 testiranih uzoraka, uvođenje mutacija prema pronalasku za veliku većinu uzoraka dovodi do smanjenja prethodno postojećeg vezivanja antitela, gde stepen smanjenja generalno zavisi od nivoa do kog su prethodno postojeća antitela u svakom uzorku bila sposobna za vezivanje za Referencu C ili Referencu D.

Claims

Patentni zahtevi

1. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina koji se vezuje za serumski albumin, koji ima:

(a) CDR1 prema Abm koji je izabran od narednih sekvenci: GFTFSTGEMA (SEQ ID NO: 8) i GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13) i koji je poželjno GFTFDTSSML (SEQ ID NO:13); i

(b) CDR2 prema Abm koji je izabran od narednih sekvenci: SISSSGATTY (SEQ ID NO:9) i VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14) i koji je poželjno VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

(c) CDR3 prema Abm koji je izabran od narednih sekvenci: PRHPQGGVTFDY (SEQ ID NO:7), FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) i FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je poželjno FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je najpoželjnije FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15);

gde navedeni pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina ima

ne više od 7, kao što je ne više od 5, poželjno ne više od 3, kao što su samo 3, 2 ili 1 razlika aminokiselina u okvirima u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1, ne uzimajući u obzir bilo koje mutacije na položajima 11, 89, 110 ili 112 prema Kabatu koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan;

gde:

- aminokiselinski ostatak na položaju 11 je poželjno odabran od L ili V; i

- aminokiselinski ostatak na položaju 89 je poželjno odgovarajuće odabran od T, V ili L; i

- aminokiselinski ostatak na položaju 110 je poželjno odgovarajuće odabran od T, K ili Q; i

- aminokiselinski ostatak na položaju 112 je poželjno odgovarajuće odabran od S, K ili Q;

tako da

(i) položaj 89 predstavlja T; ili

(ii) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V; ili

(iii) položaj 89 predstavlja L i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili

(iv) položaj 89 predstavlja L i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili

(v) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili

(vi) položaj 89 predstavlja L i položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q; ili

(vii) položaj 11 predstavlja V i položaj 110 predstavlja K ili Q; ili

(viii) položaj 11 predstavlja V i položaj 112 predstavlja K ili Q; i

2. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 1, koji ima C-terminalni produžetak (X)n, gde n iznosi 1 do 10, poželjno 1 do 5, kao što je 1, 2, 3, 4 ili 5 (i poželjno 1 ili 2, kao što je 1); i svaki X je (poželjno prirodni) aminokiselinski ostatak koji je nezavisno izabran, a poželjno je nezavisno izabran iz grupe koju čine alanin (A), glicin (G), valin (V), leucin (L) ili izoleucin (I).

3. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1 ili 2, koji ima D i/ili E1D mutaciju na položaju 1.

4. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 3, koji ima:

- CDR1 prema Abm koji je GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13); i

- CDR2 prema Abm koji je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

- CDR3 prema Abm koji je izabran od narednih sekvenci: FPSTHGKFDY (SEQ ID NO: 12) ili FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15) i koji je poželjno FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

5. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 4, koji ima:

- CDR1 prema Abm koji je GFTFDTSSML (SEQ ID NO: 13); i

- CDR2 prema Abm koji je VIHQSGTPTY (SEQ ID NO:14); i

- CDR3 prema Abm koji je FPSSRMKFDY (SEQ ID NO: 15).

6. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 5, koji ima:

- ne više od 5 razlika aminokiselina u okvirima u poređenju sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 1, ne uzimajući u obzir bilo koje mutacije na položajima 11, 89, 110 ili 112 koje mogu biti prisutne i ne uzimajući u obzir bilo koji C-terminalni produžetak koji može biti prisutan.

7. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 6, koji sadrži naredne aminokiselinske ostatke:

- 11V u kombinaciji sa 89L; ili

- 11V u kombinaciji sa 110K ili 110Q;

- 11V u kombinaciji sa 112K ili 112Q;

- 11V u kombinaciji sa 89L i 110K ili 110Q; ili

- 11V u kombinaciji sa 89L i 112K ili 112Q.

8. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 7, koji sadrži naredne aminokiselinske ostatke:

- 89L u kombinaciji sa 11V; ili

- 89L u kombinaciji sa 110K ili 110Q; ili

- 89L u kombinaciji sa 112K ili 112Q; ili

- 89L u kombinaciji sa 11V i 110K ili 110Q; ili

- 89L u kombinaciji sa 11V i 112K ili 112Q.

9. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 7, koji sadrži naredne aminokiselinske ostatke:

- 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V; ili

- 110K ili 110Q u kombinaciji sa 89L; ili

- 110K ili 110Q u kombinaciji sa 11V i 89L.

10. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 7, koji sadrži naredne aminokiselinske ostatke:

- 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V; ili

- 112K ili 112Q u kombinaciji sa 89L; ili

- 112K ili 112Q u kombinaciji sa 11V i 89L.

11. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 7, koji sadrži naredne aminokiselinske ostatke:

- 89T.

12. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 1, koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 16 do 99.

13. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 12, koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je izabrana od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 44 do 99.

14. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 13, koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je jedna od narednih sekvenci: SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:75, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:77, SEQ ID NO:79, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:81, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:83, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:85, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:87, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:89, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:91, SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:95, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:97, SEQ ID NO:98 ili SEQ ID NO:99.

15. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema patentnom zahtevu 13, koji ima aminokiselinsku sekvencu koja je jedna od narednih sekvenci: SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 78 ili SEQ ID NO: 92, i poželjno SEQ ID NO: 78 ili SEQ ID NO: 92.

16. Protein, polipeptid, konstrukt, molekul ili hemijski entitet koji sadrži jedan ili više pojedinačnih varijabilnih domena imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu od 1 do 15.

17. Nukleinska kiselina koja kodira pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15 i/ili protein ili polipeptid prema patentnom zahtevu 16.

18. Ne-humani domaćin ili ćelija domaćin koji sadrže nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 17, i/ili koji eksprimiraju pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15, ili polipeptid prema patentnom zahtevu 16.

19. Postupci za pripremu varijabilnog domena imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15 i/ili polipeptida prema patentnom zahtevu 16, koji obuhvataju kultivaciju ili održavanje ćelije domaćina prema patentnom zahtevu 18 pod uslovima u kojima navedena ćelija domaćin proizvodi ili eksprimira varijabilni domen imunoglobulina ili polipeptid i opciono izolovanje tako proizvedenog varijabilnog domena imunoglobulina ili polipeptida.

20. Sastav ili proizvod koji sadrže pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15 i/ili protein, polipeptid, konstrukt, molekul ili hemijski entitet prema patentnom zahtevu 16.

21. Pojedinačni varijabilni domen imunoglobulina prema bilo kom patentnom zahtevu 1-15 ili protein, polipeptid, konstrukt, molekul ili hemijski entitet prema patentnom zahtevu 16 za upotrebu u terapiji.