RS62881B1

RS62881B1 - Mycoplasma hyopneumoniae vakcina

Info

Publication number: RS62881B1
Application number: RS20220098A
Authority: RS
Inventors: Jeffrey E Galvin; Gregory P Nitzel; John Keith Garrett; James R Ii Kulawik; Tracy L Ricker; Megan Marie Smutzer
Original assignee: Zoetis Services Llc
Priority date: 2012-04-04
Filing date: 2013-04-03
Publication date: 2022-03-31
Also published as: CN104271154A; PH12014502250B1; CN104271154B; EP4039271A1; RU2014140107A; EP2833908A1; KR101747507B1; US9650600B2; MX336504B; UA114502C2; WO2013152081A1; KR20150003257A; US20200330577A1; DK2833908T3; AU2013243535A1; BR112014024533B1; PH12014502250A1; MX2014012014A; CO7160026A2; CR20140436A

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyopneumoniae ili M.hyo).

Određenije, ovaj pronalazak odnosi se na imunogenu kompoziciju koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin.

Pozadina pronalaska

[0002] M.hyo izaziva enzootsku upalu pluća kod svinja, koja se takođe naziva mikoplazmatska upala pluća. Bolest je hronična, nefatalna bolest koja pogađa svinje svih starosti. Zaražene svinje pokazuju samo blage simptome kašlja i groznice, ali bolest ima značajan uticaj na ekonomiju zbog smanjene efikasnosti hranjenja i smanjenog dobijanja na težini. Enzootska upala pluća prenosi se sa svinje na svinju putem nazalnih prolaza, organizmima koji se šire u vazduhu izbačenim iz pluća zaražene svinje. Primarna infekcija putem M.hyo može biti praćena sekundarnom infekcijom putem drugih mikoplazmatskih vrsta (Mycoplasma hyorhinis i Mycoplasma flocculare) kao i drugim bakterijskim patogenima.

[0003] M.hyo je mali, prokariotski mikrob koji može samostalno da egzistira, iako je često pronađen u zajedništvu sa eukariotskim ćelijama budući da ima apsolutne potrebe prema egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Ove potrebe generalno zahtevaju rast u podlozi koja sadrži serum. M.hyo je ograničena ćelijskom membranom, ali ne i ćelijskim zidom.

[0004] Fizičko združivanje mikoplazmi sa površinom ćelije domaćina je osnova za razvoj i upornost enzootske upale pluća. M.hyo zaražava respiratorni trakt svinje, kolonizirajući dušnik, bronhije, i bronhiole. Mikoplazma prodizvodi ciliostatični faktor koji izaziva oblaganje ciliom respiratornih prolaza kako bi se prekinula borba. Vremenom, cilia se degeneriše, ostavljajući svinju podložnu infekciji putem sekundarnih patogena. Karakteristične lezije purpurnih do sivih oblasti ujedinjenja zapaženi su kod zaraženih životinje. Obdukcijom preklanih životinja otkrivene su lezije kod 30 do 80% svinja. Rezultati iz 37 krda u 13 država pokazali su da 99% krda broji svinje sa pneumoničnim lezijama tipičnim za enzootsku upalu pluća. Prema tome, potreba za efektivnim preventivnim i tretmanskim merama je velika.

[0005] Antibiotici kao što je tiamulin, trimetoprim, tetraciklini i linkomicin imaju neke benefite, ali su skupi i zahtevaju produženu primenu. Dodatno, antibiotici se nisu pokazali da efektivno eliminišu širenje i ponovno zaražavanje sa M.hyo. Prevencija održavanjem krda bez patogena ponekad je moguća, ali često ponovo dolazi do ponovnog zaražavanja sa M.hyo. Zbog ozbiljnih ekonomskih posledica svinjske pneumonije, vakcine protiv M.hyo su veoma tražene. Vakcine koje sadrže pripravke mikoplazmatskih organizama uzgajanih u podlozi koja sadrži serum, već se prodaju na tržištu, ali podižu zabrinutost po pitanju sporednih rekacija izazvanih komponentama seruma (kao što su imunokompleksi ili neimunogeni specifični proteini) prisutnih u imunizacionom materijalu.

[0006] Vakcina na bazi supernatanta M.hyo kulture je opisana (Okada M. et al., 2000, Vaccine, 18: 2825-2831).

[0007] Drugi pokušaji da se obezbede M.hyo vakcine bili su uspešni, ali bolest ostaje i dalje široko raspostranjena.

[0008] M.hyo i tip 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2) su dva najraspostranjenija patogena koja su zabeležena u industriji uzgajanja svinja. Svinje zaražene PCV2 ispoljavaju sindrom koji se često naziva Multisistemski sindrom kržljanja prasadi posle zalučenja (PMWS). PMWS je klinički okarakterisan kržljanjem, bledilom kože, zakržljalošću, respiratornim problemima, dijarejom, ikterusom, i žuticom. Pored PMWS, PCV2 je povezan sa nekoliko drugih infekcija koje uključuju pseudorabije, svinjski reproduktivni i respiratorni sindrom (PRRS), Glasser-ovu bolest, streptokokni meningitis, salmonelozu, kolibacilozu posle zalučenja, dijetetsku hepatozu, i supurativnu bronhopneumoniju. M.hyo je povezana sa sa enzootskom upalom pluća, a takođe se smatra kao jedan od glavnih zajedničkih faktora razvoja bolesti povezanih sa svinjskim cirkovirusom (PCVAD).

[0009] Svinjski reproduktivni i respiratorni sindrom (PRRS) izaziva se arterivirusom, koji posebno ima afinitet prema makrofagama naročito onim pronađenim u plućima (alveolarne makrofage). Ove makrofage unose u sebe i izbacuju napadajuće bakterije i viruse, ali ne u slučaju PRRS virusa. U slučaju PRRS virusa, on se umnožava unutar makrofaga proizvodeći još virusa i ubijajući makrofage. Kada se PRRSV uvuče u krdo, on nastoji da ostane prisutan i aktivan u nedogled. Čak do 40% makrofaga se uništava što omogućava bakterijama i drugim virusima da se razmnožavaju i prave štetu. Čest primer ovoga je zapaženo povećanje u težini enzootske upale pluće u jedinicama koje se uzgajaju/spremne za klanje kada postanu zaražene PRRS virusom. Više od polovine PRRS virus-negativih svinja u dobi za odvajanje postaju zaražene pre izlaska na tržište.

[0010] Ono što je potrebno je poboljšana vakcina protiv mikoplazma infekcija kod svinja. Poželjno, M.hyo vakcina biće kompatibilna sa drugim svinjskim antigenima, kao što je PCV2 i PRRS virus, bilo da se daju jednovremeno kao pojedinačne vakcine ili kombinovano u jednoj vakcini spremnoj za upotrebu. Veoma je poželjno da se obezbedi kombinovana jednodozna M.hyo/PCV2 vakcina spremna za upotrebu.

Kratak pregled pronalaska

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin. U jednom aspektu, rastvorljivi deo pripravka M.hyo cele ćelije tretiran je proteinom-A ili proteinom-G pre dodavanja imunogenoj kompoziciji.

[0012] Rastvorljivi deo M.hyo pripravka uključuje M.hyo proteinske antigene.

[0013] U nekim načinima izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska dalje uključuje najmanje jedan dodatni antigen. U jednom načinu izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen ima zaštitnu funkciju protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0014] U jednom načinu izvođenja, mikroorganizam uključuje bakterije, viruse, ili protozoe. U još jednom načinu izvođenja, mikroorganizam se bira od, ali se ne ograničava na, sledećih: tip 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakterije leptospira, Lawsonia intracellularis, virus svinjskog gripa (SIV), Escherichia coli antigen, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, svinjski epidemijski virus dijareje (PED), rotavirus, Torque teno virus (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjski enterovirusi, virus encefalomiokarditisa, patogen uzročnik Aujeskijeve bolesti, klasična svinjska kuga (CSF) i patogen uzročnik gastroenteritisa koji se prenosi kod svinja, ili njihove kombinacije.

[0015] U određenim načinima izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen predstavlja antigen tipa 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), antigen PRRS virusa ili njihovu kombinaciju. U jednom načinu izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv oba i M.hyo i PCV2. U još jednom načinu izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv M.hyo, PCV2 i PRRS virusa.

[0016] U jednom načinu izvođenja, PCV2 antigen je u obliku tipa 1-tipa 2 himernog cirkovirusa, pri čemu taj himerni virus uključuje inaktivirani rekombinantni tip 1 svinjskog cirkovirusa koji eksprimira ORF2 protein tipa 2 svinjskog cirkovirusa. U još jednom načinu izvođenja, PCV2 antigen je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina. U još jednom načinu izvođenja, rekombinantni ORF2 protein eksprimiran je iz vektora bakulovirusa.

[0017] U nekim načinima izvođenja, kompozicija ovog pronalaska dalje uključuje adjuvans. U jednom načinu izvođenja, adjuvans se bira od, ali se ne ograničava na, sledećih: adjuvans ulje-u-vodi, polimerni i vodeni adjuvans, adjuvans voda-u-ulju, aluminijumhidroksidni adjuvans, adjuvans vitamina E i njihove kombinacije. U još jednom načinu izvođenja, kompozicija ovog pronalaska dalje uključuje farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0018] U određenim načinima izvođenja, kompozicija ovog pronalaska izaziva zaštitni imuni odgovor protiv M.hyo kada se daje kao jednodozno davanje. U daljim načinima izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor protiv M.hyo i najmanje jednog dodatnog mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja, kada se daje kao jednodozno davanje. U još daljim načinima izvođenja, kompozicija ovog pronalaska izaziva zaštitni odgovor protiv oba i M.hyo i najmanje jednog dodatnog mikroorganizma koji izaziva bolest kod svinja, kada se daje kao dvodozno davanje.

[0019] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje postupak imunizacije svinje protiv M.hyo. Ovaj postupak uključuje davanje svinji imunogene kompozicije koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin. Rastvorljivi deo M.hyo pripravka date kompozicije uključuje M.hyo proteinske antigene.

[0020] U jednom načinu izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija se daje intramuskularno, intradermalno, transdermalno, ili subkutano. U još jednom načinu izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija se daje u jednoj dozi. U još jednom načinu izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija se daje kao dve doze.

[0021] U daljem načinu izvođenja postupka ovog pronalaska, kompozicija se daje u konjukciji sa najmanje jednim dodatnim antigenom koji ima zaštitnu funkciju protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja, kao što je jedan ili više mikroorganizama opisanih ovde. Takvi drugi antigeni mogu se dati jednovremeno sa M.hyo kompozicijom (tj., kao zasebna pojedinačna vakcina) ili kombinovano u vakcini spremnoj za upotrebu.

[0022] U daljem načinu izvođenja, kompozicija se daje svinjama koje imaju antitela majčinog porekla protiv M.hyo. U još daljem načinu izvođenja, kompozicija se daje svinjama koje imaju antitela majčinog porekla protiv oba i M.hyo i najmanje jednog drugog mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0023] U jednom načinu izvođenja, kompozicija se daje svinjama na 3 nedelje starosti ili starijim.

[0024] Ovaj pronalazak dalje obezbeđuje komplet. Ovaj komplet uključuje bočicu koja obuhvata imunogenu kompoziciju. Ova imunogena kompozicija uključuje supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin.

[0025] U jednom načinu izvođenja, komplet dalje uključuje uputstvo za upotrebu koje sadrži informacije za davanje imunogene kompozicije.

[0026] Dodatno, ovaj pronalazak obezbeđuje postupak za pripremanje imunogene kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj postupak uključuje i) uzgajanje M.hyo u pogodnoj podlozi tokom perioda koji se kreću od 18-144 sata; ii) naknadno inaktiviranje M.hyo kulture; iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu ta tečnost inaktivirane kulture obuhvata i rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal; iv) razdvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem; i v) suštinsko uklanjanje i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa iz izdvojene rastvorljive tečne frakcije.

Kratak opis crteža

[0027]

Fig.1 je grafikon koji prikazuje efikasnost M.hyo monovalentnih vakcina pripremljenih sa M.hyo antigenima iz različitih tretmana (T02-T10 opisani u Primeru 3) vs. placebo (T01). Rezultati su prikazani kao vrednosti % srednje vrednosti najmanjih kvadrata plućnih lezija.

Fig.2 je grafikon koji prikazuje rezultate PCV2 antigen potencije (PCV2 antigen ELISA) M.hyo vakcina u kombinaciji sa ubijenim PCV tip1-tip2 himernim virusom. Himerni virus uključen je u kompozicijama pri inicijalnom nivou od oko 1.6≤ RP. Status svakog uzorka je izražen kao relativna potencija (RP).

Fig.3 je grafikon koji prikazuje rezultate PCV2 viremije (PCV2 Kvantitativna PCR) zapažene sa PCV/M.hyo formulacijama vakcine koje koriste različite platforme adjuvanasa.

Fig.4 je grafikon koji prikazuje PCV2 antitelo ELISA (S/P) serološke rezultate zapažene sa PCV/M.hyo formulacijama vakcine koje koriste različite platforme adjuvanasa na dane 1, 20, i 42 čelendža.

Fig.5 je grafikon koji prikazuje PCV2 fekalno širenje dobijeno sa T02-T04 tretmanima opisanim u Primeru 7 vs. placebo (T01). Rezultati su izraženi kao PCV2 DNK kopije/ml.

Fig.6 je grafikon koji prikazuje PCV2 nazalno širenje dobijeno sa T02-T04 tretmanima opisanim u Primeru 7 vs. placebo (T01). Rezultati su izraženi kao PCV2 DNK kopije/ml.

Fig.7 (A i B) su grafikoni koji prikazuju interferon-gama (IFN-γ) test koji meri PCV2-specifične ćelijski posredovane imune (CMI) odgovore. Rezultati post-vakcinacije/pred-čelendža prikazani su na Fig.7A, a rezultati post-vakcinacije/post-čelendža prikazani su na Fig.7B. Stimulacija 5x10<6>ćelijama smatra se značajnom.

Fig.8 prikazuje M.hyo efikasnost PCV2/M.hyo eksperimentalnih formulacija vakcine u SP-ulju. Skorovi pluća za formulacije koje koriste M.hyo tretmane T02-T08 vs. placebo (T01) grafički su prikazani na Fig.8A. Tabela na Fig.8B prikazuje kontrast tretmana T02-T08 sa placebom.

Fig.9 prikaz toka koji pokazuje jedan način izvođenja postupka proizvodnje upotrebljenog za pripremanje PCV2-kompatibilnog M.hyo antigena tretiranog proteinom-A.

Fig.10 je tabela koja prikazuje evaluaciju adjuvanasa na virucidalno dejstvo protiv PRRS virusa.

Kratak opis sekvenci

[0028]

SEQ ID NO: 1 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira p46 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 2 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara p46 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 3 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira p97 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 4 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara p97 iz P-5722 soja M.hyo;

SEQ ID NO: 5 je jedan način izvođenja genomske sekvence koja kodira himerni PCV1-2 virus; SEQ ID NO: 6 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 7 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 8 je jedan način izvođenja genomske sekvence koja kodira himerni PCV1-2 virus; SEQ ID NO: 9 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 10 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 11 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 12 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 11;

SEQ ID NO: 13 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 14 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja kodira aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO: 13;

SEQ ID NO: 15 je jedan način izvođenja aminokiselinske sekvence koja odgovara ORF2 polipeptidu svinjskog cirkovirusa;

SEQ ID NO: 16 je jedan način izvođenja genomske sekvence nevirulentnog oblika severno američkog PRRS virusnog izolata označenog kao P129; i

SEQ ID NO: 17 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF2 do ORF5 PRRS virusnog izolata označenog kao ISU-55.

SEQ ID NO: 18 je jedan način izvođenja nukleotidne sekvence koja odgovara ORF6 i ORF7 PRRS virusnog izolata označenog kao ISU-55.

Detaljan opis pronalaska

[0029] Ovaj pronalazak obezbeđuje imunogenu kompoziciju koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin.

[0030] Prijavioci su začuđujuće otkrili da je nerastvorljiva frakcija pripravka M.hyo cele ćelije neimunogena. Nasuprot tome, IgG-oslobođen M.hyo rastvorljivi pripravak je imunogen i može biti efektivno kombinovan sa antigenima iz drugih patogena, kao što je PCV2, bez analitičkog ili imunološkog uplitanja između tih antigena. To čini M.hyo rastvorljivi pripravak ovog pronalaska efektivnom platformom za viševalentne vakcine, koje uključuju formulacije u jednoj bočici spremne za upotrebu. Prijavioci su takođe začuđujuće otkrili da uklanjanje imunoglobulina i nerastvorljivog ćelijskog debrisa ojačava bezbednost imunogene kompozicije.

[0031] Kako je upotrebljeno u specifikaciji i patentnim zahtevima, oblici jednine “neki”, “jedan” i “taj” uključuju i oblike množine ukoliko kontekst jasno ne objašnjava drugačije. Na primer, pojam “proteinski antigen” uključuje množinu proteinskih antigena, koja uključuje njihove mešavine.

[0032] Kako se koristi ovde, pojam “koji obuhvata” namenjen je da označi da kompozicije i postupci uključuju navedene elemente, ali ne isključuje druge elemente.

[0033] Kako je ovde definisano, rastvorljivi deo M.hyo celoćelijski pripravak odnosi se na supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin Supernatantna frakcija uključuje M.hyo-izražene rastvorljive proteine (M.hyo proteinske antigene) koji su odvojeni ili izolovani od nerastvorljivih proteina, celih bakterija, i drugog nerastvorljivog M.hyo ćelijskog materijala na konvencionalan način centrifugiranjem, filtriranjem, ili taloženjem. Pored toga što uključuje M.hyospecifične rastvorljive proteine, rastvorljivi deo pripravka M.hyo cele ćelije takođe uključuje heterologne proteine, kao što su oni u podlozi za uzgajanje upotrebljene za M.hyo fermentaciju.

[0034] Pojam “antigen” odnosi se na jedinjenje, kompoziciju, ili imunogenu supstancu koja može da stimuliše proizvodnju antitela ili T-ćelijskog odgovora, ili oba, kod neke životinje, koja uključuje kompozicije koje se injektuju ili aposrbuju u životinju. Imuni odgovor može se generisati u ceo molekul, ili u deo molekula (npr., epitop ili hapten).

[0035] Kako je ovde definisano, “imunogena ili imunološka kompozicija”, odnosi se na kompoziciju materije koja obuhvata najmanje jedan antigen koji izaziva imunološki odgovor kod domaćina ćelijskog i ili antitelom-posredovanog imunog odgovora na kompoziciju ili vakcinu od interesta.

[0036] Pojam “imuni odgovor” kako se koristi ovde odnosi se na odgovor pobuđen kod neke životinje. Imuni odgovor može da se odnosi na ćelijski imunitet (CMI); humoralni imunitet ili može da uključi oba. Ovaj pronalazak takođe predviđa odgovor ograničen na deo imunog sistema. Obično, “imunološki odgovor” uključuje, ali se ne ograničava na, jedan ili više sledećih efekata: proizvodnja ili aktivacija antitela, B ćelija, pomoćnih T ćelija, supresora T ćelija, i/ili citotoksičnih T ćelija i/ili yd T ćelija, usmeren specifično na neki antigen ili antigene uključene u kompoziciji ili vakcini od interesa. Poželjno, domaćin će pokazati ili terapeutski ili zaštitni imunološki odgovor tako što će otpornost na novu infekciju biti pojačana i/ili će klinička težina bolesti biti smanjena. Takva zaštita pokazaće se ili redukcijom ili nemanjem simptoma koji se uobičajeno javljaju kod zaraženog domaćina, bržim vremenom oporavka i/ili sniženim virusnim titrom kod zaražene bolesti.

[0037] Kako se koristi ovde, pojam “imunogenost” označava sposobnost proizvodnje imunog odgovora kod životinje domaćina protiv nekog antigena ili nekih antigena. Ovaj imuni odgovor formira osnovu za zaštitni imunitet pobuđen vakcinom protiv specifičnog infektivnog organizma.

[0038] “Adjuvans” kako se koristi ovde označava kompoziciju sastavljenu od jedne ili više supstanci koje ojačavaju imuni odgovor na antigen(e). Mehanizam rada nije potpuno poznat. Smatra se da neki adjuvansi ojačavaju imuni odgovor sporim oslobađanjem antigena, dok su drugi adjuvansi snažno imunogeni sami po sebi i smatra se da funkcionišu sinregistički.

[0039] Kako se koristi ovde, pojam “viševalentna” označava vakcinu kija sadrži više od jednog antigena bilo iste vrste (tj., različiti izolati Mycoplasma hyopneumoniae), iz različitih vrsta (tj., izolati iz oba i Pasteurella hemolytica i Pasteurella multocida), ili vakcina koja sadrži kombinaciju antigena iz različitih rodova (na primer, vakcina koja obuhvata antigene iz Pasteurella multocida, Salmonella, Escherichia coli, Haemophilus somnus i Clostridium).

[0040] Pojam “Svinja” ili “prase” kako se koristi ovde označava životinju svinjskog porekla, dok se “krmača” odnosi se na ženku reproduktivne starosti i sposobnosti. “Nazimica” je ženka svinje koja nije bila skotna.

[0041] Kako se koristi ovde, pojam “virulentan” označava neki izolat koji zadržava svoju sposobnost da bude infektivan u nekom životinjskom domaćinu.

[0042] ”Inaktivirana vakcina” označava kompoziciju vakcine koja sadrži infektivni organizam ili patogen koji više nije sposoban da se replikuje ili raste. Taj patogen može biti bakterijski, virusni, protozoalni ili gljivični. Inaktivacija se može postići raznim postupcima koji uključuju zamrzavanje-odmrzavanje, hemijski tretman (na primer, tretman timerozalom ili formalinom), ultrazvučnu obradu, ozračivanje, zagrevanje ili bilo koje drugo konvencijalno sredstvo dovoljno da se spreči replikacija ili rast nekog organizma održavajući njegovu imunogenost.

[0043] Pojam “varijanta” kako se koristi ovde odnosi se na polipeptid ili sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptid, koja ima jednu ili više konzervativnih aminokiselinskih varijacija ili drugih minornih modifikacija tako da odgovarajući polipeptid ima suštinski ekvivalentnu funkciju u poređenju sa polipeptidom divljeg-tipa.

[0044] ”Konzervativna varijacija” označava zamenu aminokiselinskog ostatka drugim biološki sličnim ostatkom, ili zamenu nukleotida u sekvenci nukleinske kiseline tako da kodirani aminokiselinski ostatak ne menja ili je još jedan biološki sličan ostatak. Primeri konzervativnih varijacija uključuju supstituciju jednog hidrofobnog ostatka, kao što je izoleucin, valin, leucin ili metionin za drugi hidrofobni ostatak, ili supstituciju jednog polarnog ostatka, kao što je supstitucija arginina za lizin, glutaminske kiseline za asparaginsku kiselinu, ili glutamina za asparagin, i slično. Pojam “konzervativna varijacija” takođe uključuje upotrebu supstituisane aminokiseline umesto nesupstituisane roditeljske aminokiseline pod uslovom da antitela podignuta do supstituisanog polipeptida takođe ulaze u imunološku reakciju sa nesupstituisanim polipeptidom.

[0045] Kako se koristi ovde, pojmovi “farmaceutski prihvatljiv nosač” i “farmaceutski prihvatljivo vozilo” koriste se naizmenično i odnose na tečno vozilo koje će da sadrži antigene vakcine, koje se može injektovati u domaćina bez štetnih efekata. Pogodni farmaceutski prihvatljivi nosači poznati u struci uključuju, ali se ne ograničavaju na, sterilnu vodu, slani rastvor, glukozu, dekstrozu, ili puferovane rastvore. Nosači mogu da uključuju pomoćne agense koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, razblaživače, stabilizatore (tj., šećere i aminokiseline), konzervanse, ovlaživače, emulgatore, pH puferujuće agense, aditive za pojačavanje viskoziteta, boje i slično.

[0046] Kako se koristi ovde, pojam “kompozicija vakcine” uključuje najmanje jedan antigen ili imunogen u farmaceutski prihvatljivom vozilu, koristan za indukovanje imunog odgovora kod nekog domaćina. Kompozicije vakcine mogu da se daju u dozama i putem tehnika koje su dobro poznate stručnjacima u oblasti medicine ili veterine, uzimajući u obzir faktore kao što su starost, pol, masa, vrste i stanje životinje primaoca, i put davanja. Put davanja može biti perkutano, putem mukozalnog davanja (npr., oralno, nazalno, analno, vaginalno) ili parenteralnim putem (intradermalno, transdermalno, intramuskularno, subkutano, intravenozno, ili intraperitonealno). Kompozicije vakcine mogu se davati same, ili se mogu davati zajedno ili davati uzastopno sa drugim tretmanima ili terapijama. Oblici davanja mogu da uključuju suspenzije, sirupe ili eliksire, i pripravke za parenteralno, subkutano, intradermalno, intramuskularno ili intravenozno davanje (npr., injektabilno davanje) kao što su sterilne suspenzije ili emulzije. Kompozicije vakcine mogu da se daju kao sprej ili umešane u hranu i/ili vodu ili dostavljene u mešavini sa pogodnim nosačem, razblaživačem, ili ekscipijensom kao što je sterilna voda, fiziološki slani rastvor, glukoza, ili slično. Kompozicije mogu da sadrže pomoćne supstance kao što su ovlaživači ili emulgatori, pH puferujući agensi, adjuvansi, agensi geliranja ili aditivi za pojačavanje viskoziteta, konzervansi, arome, boje, i slično, zavisno od puta davanja i poželjnog pripravka. Standardni farmaceutski tekstovi, kao što je “Remington's Pharmaceutical Sciences,” 1990 mogu se konsultovati u

1

pripremi pogodnih pripravaka, bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0047] ”Severno američki PRRS virus” označava bilo koji PRRS virus sa genetskim karakteristikama povezanim sa severno američkim PRRS virusnim izolatom, kao što je, ali se ne ograničava na PRRS virus koji je prvo izolovan u Sjedinjenim Državama oko ranih 1990-tih (videti, npr., Collins, J. E., et al., 1992, J. Vet. Diagn. Invest.4:117-126); Severno američki PRRS virusni izolat MN-1b (Kwang, J. et al., 1994, J. Vet. Diagn. Invest.6:293-296); Kvebek LAF-exp91 soj PRRS virusa (Mardassi, H. et al., 1995, Arch. Virol. 140:1405-1418); i Severno američki PRRS virusni izolat VR 2385 (Meng, X.-J et al., 1994, J. Gen. Virol. 75:1795-1801). Dodatni primeri severno američkih PRRS virusnih sojeva opisani su ovde. Genetske karakteristike se odnose na sličnosti genomske nukleotidne sekvence i sličnosti aminokiselinske sekvence koje dele severno američki PRRS virusni sojevi. Kineski PRRS virusni sojevi generalno svedoče oko 80-93% sličnosti nukleotidne sekvence sa severno američkim sojevima.

[0048] ”Evropski PRRS virus” odnosi se na bilo koji od sojeva PRRS virusa koji imaju genetske karakteristike povezane sa PRRS virusom koji je prvo izolovan u Evropi oko 1991. godine (videti, npr., Wensvoort, G., et al., 1991, Vet. Q.13:121-130). “Evropski PRRS virus” takođe se ponekad u struci naziva “Lelystad virus”. Ovde su opisani dalji primeri evropskih PRRS virusnih sojeva.

[0049] Genetski modifikovan virus je “oslabljen” ako je manje virulentan od svog nemodifikovanog roditeljskog soja. Soj je “manje virulentan” ako pokazuje statistički značajno smanjenje u jednom ili više parametara koji određuju težinu bolesti. Takvi parametri mogu da uključuju nivo viremije, groznice, težine respiratornih tegoba, težine reproduktivnih simptoma, ili broja ili težine plućnih lezija, itd.

[0050] “Infektivni klon” je izolovan ili kloniran genom agensa bolesti (npr. virusi) koji može biti specifično i namenski modifikovan u laboratoriji, a zatim upotrebljen za ponovno kreiranje živog genetski modifikovanog organizma. Živi genetski modifikovan virus proizveden iz infektivnog klona može biti upotrebljen u živoj virusnoj vakcini. Alternativno, inaktivirani virus vakcine može biti pripremljen tretiranjem živog virusa izvedenog iz infektivnog klona inaktivirajućim agensima kao što je formalin ili hidrofobni rastvarači, kiseline, itd., ozračivanjem ultraljubičastim svetlom ili X-zracima, zagrevanjem, itd.

[0051] Sve trenutno dostupne M.hyo vakcine izrađene su od ubijenih celoćelijskih mikoplazma pripravaka (bakterina). Nasuprot tome, ovaj pronalazak upotrebljava rastvorljivi deo Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) celoćelijskog pripravka, pri čemu rastvorljivi deo M.hyo pripravka je suštinski oslobođen i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin.

[0052] M.hyo ima apsolutne potrebe prema egzogenim sterolima i masnim kiselinama. Ove potrebe generalno zahtevaju rast M.hyo u podlozi koja sadrži serum, kao što je svinjski serum. Izdvajanje nerastvorljivog materijala iz rastvorljivog dela pripravka M.hyo cele ćelije (npr., centrifugiranjem, filtriranjem, ili taloženjem) ne uklanja svinjski IgG ili imune komplekse. U jednom načinu izvođenja ovog pronalaska, M.hyo rastvorljivi deo tretira se proteinom-A ili proteinom-G kako bi se suštinski ukinuli IgG i imuni kompleksi sadržani u supernatantu kulture. U ovom načinu izvođenja, podrazumeva se da se tretman proteinom A odigrava posle M.hyo fermentacije. To se ovde alternativno naziva nishodni tretman proteinom A. U još jednom načinu izvođenja, može biti upotrebljen ushodni tretman proteinom A podloge za uzgajanje (tj., pre M.hyo fermentacije). Protein A se vezuje za Fc deo IgG. Protein G vezuje se poželjno za Fc deo IgG, ali se takođe može vezati za Fab region. Postupci za prečišćavanje/uklanjanje ukupnog IgG iz sirovih mešavina proteina, kao što je supernatant kulture tkiva, serum i ascitesna tečnost, poznati su u struci.

[0053] Rastvorljivi deo M.hyo pripravka uključuje M.hyo proteinske antigene.

[0054] M.hyo supernatantna frakcija najmanje uključuje M.hyo proteinske antigene od približno 46kD (p46), 64kD (p64) i 97kD (p97) molekulskih masa. M.hyo protein od približno 64kD (p64) može se alternativno označiti u ovom tekstu kao p65 površinski antigen iz M.hyo opisan od strane Kim et al. [Infect. Immun.58(8):2637-2643 (1990)], kao i u U.S. Patentu Br.5,788,962.

[0055] Futo et al. su opisali kloniranje i karakterizaciju 46kD površinskog proteina iz M.hyo, koji može biti upotrebljen u kompozicijama ovog pronalaska [J. Bact 177: 1915-1917 (1995)]. U jednom načinu izvođenja, supernatant M.hyo kulture uključuje p46 čiji su odgovarajući nukleotid i aminokiselinske sekvence iz P-5722 soja navedeni u SEQ ID NO: 1 i 2, respektivno. Dalje je predviđeno da varijante takvih p46 sekvenci mogu biti upotrebljeni u kompozicijama ovog pronalaska, kako je opisano u nastavku.

[0056] Zhang et al. su opisali i okarakterisali p97 adhezin protein M.hyo [Infect. Immun.63: 1013-1019, 1995]. Dodatno, King et al. su opisali 124kD protein nazvan Mhp1 iz P-5722 soja M.hyo i predstavili podatke koji sugerišu da su Mhp1 i p97 isti protein [Vaccine 15:25-35 (1997)]. Takvi p97 proteini mogu biti upotrebljeni u kompozicijama ovog pronalaska. U jednom načinu izvođenja, supernatant M.hyo kulture uključuje p97 čije su odgovarajuće nukleotidne i aminokiselinske sekvence iz P-5722 soja navedene u SEQ ID NO: 3 i 4, respektivno. Dalje je predviđeno da varijante takvih p97sekvenci mogu biti upotrebljene u kompozicijama ovog pronalaska, kako je opisano u nastavku.

[0057] Supernatant M.hyo kulture može da uključuje dalje M.hyo specifične proteinske antigene kao što su, ali se ne ograničava na, proteine od približno 41kD (p41), 42kD (p42), 89kD (p89), i 65kD

(p65). Videti, Okada et al., 2000, J. Vet. Med. B 47:527-533 i Kim et al., 1990, Infect. Immun.58(8):2637-2643. Pored toga, supernatant M.hyo kulture može da uključuje M.hyo specifične proteinske antigene od približno 102kD (p102) i 216kD (p216). Videti, U.S. Patente Br.6,162,435 i 7,419,806 od Minnion et al.

[0058] Bilo koji M.hyo soj može se primeniti kao početni materijal za proizvodnju rastvorljivog dela M.hyo pripravka ovog pronalaska. Pogodni sojevi M.hyo mogu se dobiti iz komercijalnih ili akademskih izvora, koji uključuju spremišta kao što su American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, Va.) i NRRL Culture Collection (Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Ill.). Sam ATCC ubraja sledećih šest sojeva M.hyo za prodaju: M.hyo ATCC 25095, M.hyo ATCC 25617, M.hyo ATCC 25934, M.hyo ATCC 27714, M.hyo ATCC 27715, i M.hyo ATCC 25934D. Poželjan soj M.hyo za upotrebu u načinima izvođenja ovog pronalaska identifikovan je kao soj P-5722-3, ATCC #55052, deponovan 30. maja, 1990 godine u skladu sa pravilima dostupnosti propisanim od strane U.S. Zavoda za patente i žigove. U pogledu raspostranjenosti širenja bolesti, sojevi se takođe mogu obezbediti izdvajanjem M.hyo iz plućnih sekreta i tkiva svinje zaražene poznatim sojevima koji izazivaju mikoplazmatsku upalu pluća kod svinja.

[0059] Stručnjaci iz ove oblasto podrazumevaju da varijante M.hyo sekvenci mogu biti upotrebljene u kompozicijama ovog pronalaska. Takve varijante mogu da variraju za 10-20% u sekvencionom identitetu i dalje zadržavajući antigenske karakteristike koje su se pokazale korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, M.hyo varijante imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% sekvencionog identiteta sa genomskom sekvencom pune dužine M.hyo soja divljeg-tipa. Antigenske karakteristike imunološke kompozicije mogu se, na primer, proceniti eksperimentom čelendža kakav je obezbeđen u Primerima. Štaviše, antigenska karakteristika modifikovanog M.hyo antigena i dalje je zadržana kada modifikovani antigen dodeljuje najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa M.hyo proteinom divljeg-tipa.

[0060] U jednom načinu izvođenja, M.hyo rastvorljivi p46 antigen uključen je u kompozicijama ovog pronalaska pri konačnoj koncentraciji od oko 1.5 µg/ml do oko 10 µg/ml, poželjno pri oko 2 µg/ml do oko 6 µg/ml. Zabeleženo je da je p46 protein upotrebljen za M.hyo test potencije (videti sekciju primera u nastavku). U još jednom načinu izvođenja, M.hyo antigen može biti uključen u kompozicijama u konačnoj količini od oko 5.5% do oko 35% supernatanta M.hyo cele kulture tretiranog proteinom A.

[0061] M.hyo rastvorljivi pripravak ovog pronalaska je i bezbedan i efikasan protiv M.hyo i pogodan je za jednodozno davanje. Pored toga, Prijavioci su začuđujuće otkrili da M.hyo rastvorljivi pripravak može biti efektivno kombinovan sa antigenima iz drugih patogena bez imunološki uplitanja između tih antigena. To čini M.hyo rastvorljivi pripravak ovog pronalaska efektivnom platformom za viševalentne vakcine. Dodatni antigeni mogu se dati jednovremeno sa M.hyo kompozicijom (tj., kao zasebna pojedinačna vakcina) ili kombinovano u jednoj vakcini spremnoj za upotrebu.

[0062] U jednom načinu izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska uključuje najmanje jedan dodatni antigen. U jednom načinu izvođenja, najmanje jedan dodatni antigen ima zaštitnu funkciju protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0063] U nekim načinima izvođenja, najmanje jedna dodatna antigenska komponenta ima zaštitnu funkciju protiv bakterija, virusa, ili protozoa za koje se zna da zaražavaju svinje. Primeri takvih mikroorganizama uključuju, ali se ne ograničavaju na, sledeće: tip 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplama hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakterije

1

leptospira, Lawsonia intracellularis, virus svinjskog gripa (SIV), Escherichia coli antigen, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, svinjski epidemijski virus dijareje (PED), rotavirus, Torque teno virus (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjski enterovirusi, virus encefalomiokarditisa, patogen uzročnik Aujeskijeve bolesti, klasična svinjska kuga (CSF) i patogen uzročnik gastroenteritisa koji se prenosi kod svinja, ili njihove kombinacije.

[0064] U jednom načinu izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska uključuje kombinaciju sa PCV2 antigenom. U još jednom načinu izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv oba i M.hyo i PCV2.

[0065] U jednom načinu izvođenja, M.hyo/PCV2 kombinovana vakcina u skladu sa ovim pronalaskom obezbeđena je kao jednodozna vakcina spremna za upotrebu u jednoj bočici. Takva kombinovana vakcina spremna za upotrebu ne zahteva mešanje odvojenih vakcina, tako da ne postoji rizik od kontaminacije ili dodatni rad povezan sa mešanjem i bez nužnosti da se ta mešavina mora upotrebiti unutar nekoliko sati. Takođe, M.hyo/PCV2 kombinovana vakcina u jednoj bočici smanjuje otpad i mesto skladištenja u frižideru na pola. Pored toga, jednodozno davanje eliminiše rad povezan sa davanjem druge doze životinji. Zabeleženo je da iako PCV2/M.hyo kombinovane vakcine trenutno postoje, obezbeđene su ili kao dvodozna vakcina spremna za upotrebu (Circumvent<®>PCVM) ili kao jednodozna vakcina u 2 bočice koja zahteva jednovremeno davanje odvojenih vakcina (npr., Ingelvac CircoFLEX<®>i Ingelvac MycoFLEX<®>). Poželjno, M.hyo/PCV2 kombinacija u skladu sa ovim pronalaskom mogla bi da bude kompatibilna sa drugim antigenima, kao što su PRRS virusni antigeni, tako da se svi antigeni mogu davati u jednoj dozi.

[0066] U nekim načinima izvođenja, PCV2 antigenska komponenta M.hyo/PCV2 kombinovane vakcine je u obliku tipa 1-tipa 2 himernog cirkovirusa. Himerni virus uključuje inaktivirani rekombinantni tip 1 svinjskog cirkovirusa koji eksprimira ORF2 protein tipa 2 svinjskog cirkovirusa. Himerni svinjski cirkovirusi i postupci za njihovo pripremanje opisani su u WO 03/049703 A2, a takođe i u US Patentima Br.7,279,166 i 7,575,752, koji su ovde inkorporirani kao referenca u svojoj celosti.

[0067] U jednom načinu izvođenja, DNK sekvenca pune dužine genoma himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 5. ili njenim varijantama, kako je opisano u nastavku. U još jednom načinu izvođenja, imunogen ORF2 kapsidni gen himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 6. U daljem načinu izvođenja, aminokiselinska sekvenca imunogenog ORF2 proteina izraženog himernim PCV1-2 virusom odgovara SEQ ID NO: 7.

[0068] U još jednom načinu izvođenja, DNK sekvenca pune dužine genoma himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 8. U jednom načinu izvođenja, imunogen ORF2 kapsidni gen himernog PCV1-2 virusa odgovara SEQ ID NO: 9. U daljem načinu izvođenja, aminokiselinska sekvenca imunogenog ORF2 proteina izraženog himernim PCV1-2 virusom odgovara SEQ ID NO: 10.

[0069] Međutim, PCV2 ORF2 DNK i protein himernog PCV1-2 virusa nisu ograničeni na sekvence opisane ovde budući da su PCV2 ORF2 DNK i protein veoma očuvan domen unutar PCV2 izolata.

[0070] U nekim načinima izvođenja, PCV2 antigenska komponenta M.hyo/PCV2 kombinovane vakcine je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina. U jednom načinu izvođenja, rekombinantni ORF2 protein eksprimiran je iz vektora bakulovirusa. Alternativno, drugi poznati ekspresioni vektori mogu da se upotrebe, kao što su oni koji uključuju, ali se ne ograničavaju na, parapoks vektore.

[0071] U jednom načinu izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein je onaj iz SEQ ID NO: 11, koji je kodiran pomoću SEQ ID NO: 12 (GenBank Pristupni Br. AF086834). U još jednom načinu izvođenja, rekombinantni ORF2 protein je onaj iz SEQ ID NO: 13, koji je kodiran pomoću SEQ ID NO: 14. U još jednom načinu izvođenja, rekombinantni ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 15. U još jednom načinu izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 7. U još daljem načinu izvođenja, rekombinantni PCV2 ORF2 protein odgovara SEQ ID NO: 10.

[0072] Međutim, ovaj pronalazak nije ograničen na određeni ORF2 DNK i proteinske sekvence opisane ovde. Kako je PCV2 ORF2 DNK i protein veoma očuvan domen unutar PCV2 izolata, bilo koji PCV2 ORF2 vrlo verovatno će biti efektivan kao izvor PCV2 ORF2 DNK i/ili polipeptida kakav je upotrebljen u himernom PCV1-2 virusu ili u rekombinantnom PCV2 proteinu.

[0073] Primer pogodnog PCV2 izolata iz kog se PCV2 ORF2 DNK i proteinske sekvence mogu izvesti je PCV2 izolat broj 40895 (deponovan u ATCC 7. decembra, 2001 i kome je dodeljena ATCC Oznaka podnošenja Patentna PTA-3914). Genomska (nukleotidna) sekvenca PCV2 izolata broj 40895 dostupna je pod GenBank pristupnim brojem AF264042. Drugi primeri pogodnih PCV2 izolata iz kojih se PCV2 ORF2 DNK i proteinske sekvence mogu izvesti uključuju, ali se ne ograničavaju na, sledeće: Imp.999, Imp.1010-Stoon, Imp.1011-48121, i Imp.1011-48285. GenBank pristupni brojevi genomskih sekvenci koji odgovaraju ovim PCV2 izolatima su AF055391, AF055392, AF055393 i AF055394, respektivno.

[0074] U nekim oblicima, imunogeni delovi PCV2 ORF2 proteina koriste se kao antigenska komponenta u kompoziciji. Na primer, skraćeni i/ili supstituisani oblici ili fragmenti PCV2 ORF2 proteina mogu se upotrebiti u kompozicijama ovog pronalaska.

[0075] Stručnjaci iz ove oblasti podrazumevaju da varijante PCV2 sekvenci mogu biti upotrebljene u kompozicijama ovog pronalaska. Takve varijante mogu da variraju i do 10-20% u sekvencionom identitetu i dalje zadržavajući antigenske karakteristike koje su se pokazale korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, PCV2 varijante imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% sekvencionog identiteta sa genomskom sekvencom pune dužine PCV2 izolata divljeg-tipa. Antigenske karakteristike imunološke kompozicije mogu se, na primer, proceniti eksperimentom čelendža kakav je obezbeđen u Primerima. Štaviše, antigenska karakteristika modifikovanog PCV2 antigena i dalje je zadržana kada modifikovani antigen dodeljuje najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa PCV2 ORF2 proteinom divljeg-tipa.

[0076] PCV2 antigenska komponenta obezbeđena je u imunogenoj kompoziciji na nivou antigenske

1

inkluzije efektivnim za indukovanje poželjnog imunog odgovora, određenije redukovanje incidence ili slabljenja težine kliničkih znakova koji su rezultat PCV2 infekcije.

[0077] U jednom načinu izvođenja, himerni PCV1-2 virus uključen je u kompozicijama ovog pronalaska na nivou od najmanje 1.0 ≤ RP≤ 5.0, pri čemu RP predstavlja jedinicu relativne potencije određena pomoću ELISA antigenske kvantifikacije (in vitro test potencije) u poređenju sa referentnom vakcinom. U još jednom načinu izvođenja, himerni PCV1-2 virus uključen je u kompoziciji ovog pronalaska pri konačnoj koncentraciji od oko 0.5% do oko 5% 20-struko (20X) koncentrovane mase PCV1-2 antigena.

[0078] U još jednom načinu izvođenja, PCV2 ORF2 rekombinantni protein uključen je u kompozicijama ovog pronalaska na nivou od najmanje 0.2 µg antigen/ml konačne imunogene kompozicije (µg/ml). U daljem načinu izvođenja, inkluzioni nivo PCV2 ORF2 rekombinantnog proteina iznosi oko 0.2 do oko 400 µg/ml. U još jednom načinu izvođenja, inkluzioni nivo PCV2 ORF2 rekombinantnog proteina iznosi oko 0.3 do oko 200 µg/ml. U još daljem načinu izvođenja, inkluzioni nivo PCV2 ORF2 rekombinantnog proteina iznosi oko 0.35 do oko 100 µg/ml. U još jednom načinu izvođenja, inkluzioni nivo PCV2 ORF2 rekombinantnog proteina iznosi oko 0.4 do oko 50 µg/ml.

[0079] U jednom načinu izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska uključuje kombinaciju sa antigenom tipa 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), i antigenom PRRS virusa. U još jednom načinu izvođenja, kompozicija izaziva zaštitni imuni odgovor kod svinje protiv M.hyo, PCV2 i PRRS virusa.

[0080] U jednom načinu izvođenja, M.hyo/PCV2/PRRS kombinovana vakcina u skladu sa ovim pronalaskom obezbeđena je kao jednodozna vakcina u 2 bočice. Na primer, u nekim načinima izvođenja, M.hyo/PCV2 kombinacija obezbeđena je kao stabilna tečna kompozicija u prvoj bočici, a PRRS virus obezbeđen je u liofilizovanom stanju u drugoj bočici. U nekim načinima izvođenja, dodatni svinjski antigeni mogu biti dodati ili u prvu ili u drugu bočicu.

[0081] U jednom načinu izvođenja, PRRS virusna komponenta obezbeđena je kao liofilizovani, genetski modifikovan živi virus. Pre davanja, M.hyo/PCV2, tečnost iz prve bočice može se upotrebiti za rehidrataciju PRRS virusa u drugoj bočici tako da se sva tri antigena mogu davati životinji u jednoj dozi. Zabeleženo je da iako PCV2/M.hyo/PRRS kombinovane vakcine trenutno postoje, obezbeđene su kao jednodozna vakcina u 3 bočice koja zahteva jednovremeno davanje tri odvojene vakcine (npr., Ingelvac CircoFLEX<®>, Ingelvac MycoFLEX<®>i Ingelvac<®>PRRS MLV).

[0082] PRRS etiološki agens izolovan je prvi put u Holandiji, i nazvan Lelystad virus. Ovaj virus je opisan u u WO 92/21375 (Stichting Centraal Diegeneeskundig Instituut). Izolat evropskog PRRS virusa deponovan je u Institut Pasteur u Parizu, pod brojem 1-1102. Severno američki tip izolovan je gotovo jednovremeno sa izolovanjem evropskog tipa virusa, i opisan je u WO-93/03760 (Collins et al.) Izolat severno američkog tipa virusa deponovan je u American Type Culture Collection (ATCC), pod brojem VR-2332.

[0083] Različit sojevi izolovani su iz oba i evropskog i severno američkog tipa virusa. WO 93/07898 (Akzo) opisuje evropski soj, i vakcine izveden iz njega, deponovan u CNCM (Institut Pasteur), broj 1-

1

1140. Takođe, WO 93/14196 (Rhone-Merieux) opisuje novi soj izolovan u Francuskoj, deponovan u CNCM (Institut Pasteur), broj 1-1153. Pored toga, EP0595436 Bl (Solvay) opisuje novi severno američki tip soja, virulentniji od inicijalno opisanog, i njihove vakcine. Ovaj soj je deponovan u ATCC, ali broj deponovanja nije naveden u patentnoj prijavi. Pored toga, ES2074950 BA (Cyanamid Iberica) i njegov kontra deo GB2282811 B2 opisuju takozvani “španski soj”, koji se razlikuje od drugih evropskih i severno američkih sojeva. Ovaj “španski soj” deponovan je u European Animal Cell Culture Collection (EACCC), broj V93070108.

[0084] Pogodni PRRS virusni antigeni za upotrebu u M.hyo/PCV2/PRRS kompozicijama ovog pronalaska uključuju severno američke PRRS virusne izolate, kineske PRRS virusne sojeve, i evropske PRRS virusne sojeve, kao i genetski modifikovane verzije takvih izolata/sojeva. U jednom načinu izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta upotrebljena u kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom je severno američki PRRS virus.

[0085] U nekim načinima izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta upotrebljena u kompozicijama ovog pronalaska je severno američki PRRS virusni izolat označen kao P129 ili njegova živa, genetski modifikovana verzija. Poželjno, genetski modifikovan PRRS virus ne može da proizvodi patogenu infekciju, ali je sposoban da ispolji efektivni imunozaštitni odgovor protiv infekcije PRRS virusa divljeg-tipa.

[0086] Genetski modifikovan PRRS virus za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska može biti proizveden iz infektivnog klona. Pripremanje infektivnog cDNK klona severno američkog PRRS virusnog izolata označenog kao P129 opisan je u U.S. Pat. Br.6,500,662 koji ovde uključen u svojoj celosti kao referenca. Sekvenca P129 cDNK opisana je u Genbank Pristupnom broju AF494042 i u U.S. Pat. Br. 6,500,662.

[0087] U jednom načinu izvođenja, nukleotidna sekvenca nevirulentnog oblika P129 za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska predstavljena je putem SEQ ID NO: 16. Međutim, ovaj pronalazak nije ograničen na ovu sekvencu. Ova sekvenca i sekvence drugih nevirulentnih oblika P129, opisane su u Međunarodnoj prijavi Br. PCT/IB2011/055003, podnetoj 9. novembra 2011 godine, čiji su sadržaji (koji uključuju bilo koji podnesak US nacionalne faze na bazi ove Međunarodne prijave) ovde uključeni u svojoj celosti kao referenca. Poželjno, PRRS virus je modifikovan da spreči nishodnu regulaciju interferonom-posedovane funkcije.

[0088] U drugim načinima izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta upotrebljena u kompozicijama ovog pronalaska je PRRS virusni izolat označen kao ISU-55. ISU-55 izolat je deponovan u American Type Culture Collection (ATCC), pod pristupnim brojem VR2430. Nukleotidna sekvenca od ORF2 do ORF5 gena ISU-55 izolata predstavljena je putem SEQ ID NO:17. Nukleotidna sekvenca ORF6 i ORF7 gena ISU-55 izolata predstavljena je putem SEQ ID NO: 18.

[0089] Još jedan pogodan severno američki PRRS virusni izolat koji se može upotrebiti u kompozicijama

1

je ISU-12, koji je deponovan u ATCC pod pristupnim brojevima VR2385 [3 x prečišćen od plaka] i VR2386 [neprečišćen od plaka]. Dodatni pogodni severno američki PRRS virusni izolati koji se mogu upotrebiti u kompozicijama ovog pronalaska su sledeći: ISU-51, ISU-3927, ISU-1894, ISU-22 i ISU-79, koji su deponovani u ATCC pod pristupnim brojevima VR2498, VR2431, VR2475, VR2429 i VR2474, respektivno. Genetski modifikovane verzije bilo kog od ovih ISU izolata mogu se upotrebiti u kompozicijama ovog pronalaska. Ovi ISU izolati i ISU-55 izolat, opisani su detaljnije u sledećim U.S. patentima od Paul, et al: US5,695,766, 6,110,467, 6,251,397, 6,251,404, 6,380,376, 6,592,873, 6,773,908, 6,977,078, 7,223,854, 7 ,264,802, 7,264,957, i 7,517,976, koji su svi ovde inkorporirani kao referenca u svojoj celosti.

[0090] U još nekim načinima izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta upotrebljena u kompozicijama u skladu sa ovim pronalaskom je severno američki tip deponovan u American Type Culture Collection (ATCC), broj VR-2332 ili njegova genetski modifikovana verzija. Na primer, PRRS virus može biti modifikovani živi virus na bazi izolata identifikovanog kao ATCC VR2332, koji je upotrebljen u INGELVAC<®>PRRS ATP i INGELVAC<®>PRRS MLV, od Boehringer Ingelheim Vetmedica, Inc.

[0091] U još nekim načinima izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta upotrebljena u kompozicijama ovog pronalaska je evropski PRRS virusni izolat ili Lelystad virus ili njegova genetski modifikovana verzija. Primer pogodnog PRRS virusnog soja identifikovan je kao depozit Br. I-1102, opisan ovde. Nukleotidne i aminokiselinske sekvence koje odgovaraju 1-1102 depozitu opisane su u U.S. Patentu Br.5,620,691 od Wensvoort et al, koji je ovde u potpunosti inkorporiran kao referenca.

Pripremanje infektivnog klona evropskog PRRS virusnog izolata ili Lelystad virusa opisan je u U.S. Pat. Br.

6,268,199 koji je ovde u potpunosti inkorporiran kao referenca.

[0092] Drugi primeri pogodnih PRRS virusni izolata uključuju, ali se ne ograničavaju na, one opisane ovde. Takođe, žive, genetski modifikovane verzije PRRS virusnih izolata mogu se upotrebiti u kompozicijama ovog pronalaska. Infektivni klon može se upotrebiti da ponovo kreira takve žive genetski modifikovane organizme.

[0093] Stručnjaci iz ove oblasti podrazumevaju da varijante PRRS virusnih sekvenci mogu biti upotrebljene u kompozicijama ovog pronalaska. Takve varijante mogu da variraju i do 10-20% u sekvencionom identitetu i dalje zadržavajući antigenske karakteristike koje su se pokazale korisnim u imunogenim kompozicijama. Poželjno, PRRS virusne varijante imaju najmanje 80%, poželjno najmanje 85%, poželjnije najmanje 90%, još poželjnije najmanje 95% sekvencionog identiteta sa genomskom sekvencom pune dužine PPRS virusnog izolata divljeg-tipa. Antigenske karakteristike imunološke kompozicije mogu se, na primer, proceniti čelendž eksperimentima. Štaviše, antigenska karakteristika modifikovanog PRRS virusnog antigena i dalje je zadržana kada modifikovani antigen dodeljuje najmanje 70%, poželjno 80%, poželjnije 90% zaštitnog imuniteta u poređenju sa PRRS virusnim antigenom divljegtipa.

[0094] U jednom načinu izvođenja, PRRS virusna antigenska komponenta je genetski modifikovan živi

1

virus koji je uključen u kompozicijama ovog pronalaska na nivou od najmanje 2.1 ≤ TCID50≤ 5.2, pri čemu TCID50predstavlja kulturu tkiva infektivne doze od 50% određeno pomoću antigen kvantifikacije (in vitro test potencije).

[0095] PCV2 antigenska komponenta M.hyo/PCV2/PRRS kompozicija ovog pronalaska može biti u obliku tipa 1-tipa 2 himernog cirkovirusa, pri čemu taj himerni virus uključuje inaktivirani rekombinantni tip 1 svinjskog cirkovirusa koji eksprimira ORF2 protein tipa 2 svinjskog cirkovirusa. U još jednom načinu izvođenja, PCV2 antigenska komponenta M.hyo/PCV2/PRRS kompozicija ovog pronalaska je u obliku rekombinantnog ORF2 proteina.

[0096] Pogodni PCV2 antigeni za upotrebu u M.hyo/PCV2/PRRS kompozicijama mogu se izvesti iz bilo kog od ovde opisanih PCV2 izolata, kao i drugih PCV2 izolata. Pogodni PCV2 antigeni za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska uključuju, ali se ne ograničavaju na, PCV2 sekvence opisane ovde i njene varijante.

[0097] Vakcine ovog pronalaska mogu biti formulisane prateći prihvaćeni dogovor da se uključuju prihvatljivi nosači za životinje, što uključuju ljude (ako je primenjivo), kao što su standardni puferi, stabilizatori, razblaživači, konzervansi, i/ili solubilizatori, i koji takođe mogu biti formulisani da omoguće produženo oslobađanje. Razblaživači uključuju vodu, slani rastvor, dekstrozu, etanol, glicerol, i slično. Aditivi za izotoničnost uključuju natrijum hlorid, dekstrozu, manitol, sorbitol, i laktozu, između ostalog. Stabilizatori uključuju albumin, između ostalog. Drugi pogodni nosači vakcine i aditivi, koji uključuju one koji su naročito korisni u formulisanju modifikovanih živih vakcina, poznati su ili očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Videti, npr., Remington's Pharmaceutical Science, 18th ed., 1990, Mack Publishing, koji je ovde inkorporiran kao referenca.

[0098] Vakcine ovog pronalaska mogu dalje da obuhvataju jedan ili više dodatnih imunomodulatornih komponenti kao što je, npr., adjuvans ili citokin, između ostalog. Vrste pogodnih adjuvanasa za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska uključuju sledeće: adjuvans ulje-u-vodi, polimerni i vodeni adjuvans, adjuvans voda-u-ulju, aluminijumhidroksidni adjuvans, adjuvans vitamina E i njihove kombinacije. Neki specifični primeri adjuvanasa uključuju, ali se ne ograničavaju na, kompletan Freundov adjuvans, nekompletan Freund-ov adjuvans, Corynebacterium parvum, Bacillus Calmette Guerin, aluminijumhidroksidni gel, glukan, dekstran sulfat, železooksid, natrijum alginat, Bacto-adjuvans, određene sintetičke polimere kao što su poliaminokiseline i kopolimeri aminokiselina, Blok kompolimer (CytRx, Atlanta, Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), AMPHIGEN<®>adjuvans, saponin, Quil A ili druga frakcija saponina, monofosforilni lipid A, i Avridine lipid-aminski adjuvans (N,N-dioktadecil-N',N'-bis(2-hidroksietil)-propandiamin), “REGRESSIN” (Vetrepharm, Athens, Ga.), parafinsko ulje, RIBI sistem adjuvanasa (Ribi Inc., Hamilton, Mont.), muramil dipeptid i slično.

[0099] Neograničavajući primeri emulzija ulje-u-vodi korisni u vakcini ovog pronalaska uključuju

1

modifikovane SEAM62 i SEAM 1/2 formulacije. Modifikovan SEAM62 je emulzija ulje-u-vodi koja sadrži 5% (vol.) skvalena (Sigma), 1% (vol.) SPAN<®>85 deterdženta (ICI Surfaktanti), 0.7% (vol.) TWEEN<®>80 deterdženta (ICI Surfaktanti), 2.5% (vol.) etanola, 200 µg/ml Quil A, 100 µg/ml holesterola, i 0.5% (vol.) lecitina. Modifikovan SEAM 1/2 je emulzija ulje-u-vodi koja obuhvata 5% (vol.) skvalena, 1% (vol.) SPAN<®>85 deterdženta, 0.7% (vol.) Tween 80 deterdženta, 2.5% (vol.) etanola, 100 µg/ml Quil A, i 50 µg/ml holesterola.

[0100] Još jedan primer adjuvanasa korisnih u kompozicijama ovog pronalaska je SP-ulje. Kako je upotrebljeno u specifikaciji i patentnim zahtevima, pojam “SP ulje” označava uljastu emulziju koja obuhvata polioksietilen-polioksipropilen blok kompolimer, skvalan, polioksietilen sorbitan monooleat i puferovani slani rastvor. Polioksietilen-polioksipropilen blok kompolimeri su surfaktanti koji pomažu suspendovanje čvrstih i tečnih komponenata. Ovi surfaktanti komercijalno su dostupni kao polimeri pod trgovinskim nazivom Pluronic<®>. Poželjan surfaktant je poloksamer 401 koji je komercijalno dostupan pod trgovinskim nazivom Pluronic<®>L-121. Generalno, SP uljasta emulzija je imunostimulirajuća mešavina adjuvanasa koja obuhvata oko 1 do 3vol.% blok kompolimera, oko 2 do 6vol.% skvalana, određenije oko 3 do 6% skvalana, i oko 0.1 do 0.5vol.% polioksietilen sorbitan monooleata, sa ostatkom koji je puferovani slani rastvor. U jednom načinu izvođenja, SP-uljasta emulzija prisutna je u konačnoj kompoziciji u vol. količinama od oko 1vol.% do 25vol.%, poželjno oko 2vol.% do 15vol.%, poželjnije oko 5vol.% do 12vol.%.

[0101] Još jedan primer pogodnog adjuvansa za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska je AMPHIGEN™adjuvans koji se sastoji od oduljenog lecitina rastvorenog u ulju, obično laganog tečnog parafina.

[0102] Drugi primeri adjuvanasa korisnih u kompozicijama ovog pronalaska su sledeći zaštićeni adjuvansi: Microsol Diluvac Forte<®>dvostruki emulzioni sistem adjuvanasa, Emunade adjuvans, i Xsolve adjuvans. I Emunade i Xsolve adjuvansi su emulzije lakog mineralnog ulja u vodi, ali Emunade takođe sadrži alhidrogel, a d,1-α-tokoferil acetat je deo XSolve adjuvansa. Još dalji primer pogodnog adjuvansa za upotrebu u kompozicijama ovog pronalaska je ImpranFLEX™ adjuvans (adjuvans voda-u-ulju). Još dalji primer pogodnog adjuvansa je adjuvans na bazi Carbomer-a (Carbopol<®>). Poželjni Carbopol<®>adjuvansi uključuju Carbopol<®>934 polimer i Carbopol<®>941 polimer.

[0103] U jednom načinu izvođenja, adjuvans ili mešavina adjuvanasa dodati su u količini od oko 100 µg do oko 10 mg po dozi. U još jednom načinu izvođenja, adjuvans/mešavina adjuvanasa dodati su u količini od oko 200 µg do oko 5 mg po dozi. U još jednom načinu izvođenja, adjuvans/mešavina adjuvanasa dodati su u količini od oko 300 µg do oko 1 mg/dose.

[0104] Adjuvans ili mešavina adjuvanasa tipično su prisutni u kompoziciji vakcine ovog pronalaska u vol. količinama od oko 1vol.% do 25vol.%, poželjno oko 2vol.% do 15vol.%, poželjnije oko 5vol.% do 12vol.%.

[0105] Drugi “imunomodulatori” koji mogu biti uključeni u vakcinu uključuju, npr., jedan ili više

2

interleukina, interferona, ili drugih poznatih citokina. U jednom načinu izvođenja, adjuvans može biti derivat ciklodekstrina ili polianjonski polimer, kao što su oni opisani u U.S. Pat. Br.6,165,995 i 6,610,310, respektivno.

[0106] Dalji aspekt odnosi se na postupak za pripremanje imunogene kompozicije u skladu sa ovim pronalaskom. Ovaj postupak obuhvata i) uzgajanje M.hyo u pogodnoj podlozi tokom perioda koji se kreću od 18-144 sata; ii) naknadno inaktiviranje M.hyo kulture; iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu tečnost inaktivirane kulture obuhvata i rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal; iv) razdvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem; i v) suštinsko uklanjanje i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa iz izdvojene rastvorljive tečne frakcije.

[0107] Primer pogodne podloge za uzgajanje M.hyo je PPLO Bujon (Bujon Baza Mikoplazme), koja kada se dopuni nurtitivnim elementima, upotrebljava se za izolovanje i uzgajanje Mikoplazme.

[0108] U nekim načinima izvođenja, kultura M.hyo uzgaja se do kasne log faze rasta, nakon čega je kultura inaktivirana. U nekim drugim načinima izvođenja, kultura je inaktivirana podizanjem pH (npr., do oko 7.8). Ovo se dešava izlaganjem proizvodne kulture inaktivacionom agensu, kao što je binarni etilenimin (BEI). BEI je generisan in situ tokom inkubacije L-bromoetilamin hidrobromida (BEA) u proizvodnoj kulturi. Naknadno, pH inaktivirana kultura je neutralizovana, kao što je dodavanjem ekvivalentne količine agensa koji neutralizuje inaktivacioni agens unutar rastvora. U nekim načinima izvođenja, inaktivacioni agens je BEI, a neutralizacioni agens je natrijum tiosulfat. U jednom načinu izvođenja, pH inaktivirana kultura je podešena do oko 7.4 dodavanjem natrijum tiosulfata.

[0109] Rastvorljiva tečna frakcija pripravka M.hyo cele ćelije izdvaja se iz nerastvorljivog ćelijskog materijala primenom konvencionalnih postupaka. U jednom načinu izvođenja, ovo izdvajanje izvodi se fazom filtriranja. U još jednom načinu izvođenja, ovo izdvajanje izvodi se fazom centrifugiranja. U još jednom načinu izvođenja, izdvajanje se izvodi fazom taloženja.

[0110] U jednom načinu izvođenja, rastvorljive tečne frakcije inaktiviranog, neutralizovanog M.hyo celoćelijskog pripravka tretira se smolom proteina A radi suštinskog uklanjanja i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa u njemu. U drugim načinima izvođenja, smola proteina G može se upotrebiti radi suštinskog uklanja i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa sadržanih u rastvorljivim tečnim frakcijama. Postupci za uklanjanje i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa bilo sa smolom Proteina A ili Proteina G dobro su poznate u struci.

[0111] U skladu sa daljim aspektom, postupak za pripremanje imunogene kompozicije, kao što je vakcina, u skladu sa ovim pronalaskom obuhvata pripremanje rastvorljivog M.hyo antigena kakav je opisan ovde i njegovo mešanje sa pogodnim adjuvansom i jednim ili više farmaceutski-prihvatljivih nosača. Ovaj postupak opciono uključuje dodavanje najmanje jednog dodatnog svinjskog antigena, kao što je PCV2 antigen i/ili PRRS virusni antigen kakvi su opisani ovde.

[0112] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na komplet. “Komplet” se odnosi na više komponenti koje su grupisane zajedno. U jednom načinu izvođenja, komplet u skladu sa ovim pronalaskom uključuje bočicu (ili drugu pogodnu posudu) koja obuhvata imunogenu kompoziciju koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin. Opciono, komplet može dalje da uključuje uputstvo za upotrebu. To uputstvo za upotrebu uključuje informacije za davanje imunogene kompozicije.

[0113] U nekim načinima izvođenja, bočica koja sadrži rastvorljivi deo M.hyo pripravka dalje uključuje PCV2 antigen. U nekim načinima izvođenja, M.hyo/PCV2 kombinacija u bočici obezbeđena je kao tečna kompozicija spremna za upotrebu.

[0114] U drugim načinima izvođenja, komplet uključuje drugu bočicu koja obuhvata antigen PRRS virusa. U nekim načinima izvođenja, PRRS virusni antigen je u obliku genetski modifikovanog, živog virusa koji je obezbeđen u liofilizovanom stanju. U tim slučajevima, uputstvo za upotrebu uključuje smernice za rehidratisanje PRRS virusne komponente sa tečnim sadržajima iz bočice koja sadrži M.hyo/PCV2 kombinaciju. Uputstvo za upotrebu takođe uključuje informacije za davanje dobijene M.hyo/PCV2/PRRS trovalentne formulacije(a).

[0115] U nekim načinima izvođenja, imunogena kompozicija u skladu sa ovim pronalaskom daje se svinjama koje imaju antitela majčinog porekla protiv M.hyo. U drugim načinima izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska daje se svinjama koje imaju antitela majčinog porekla protiv oba i M.hyo i najmanje jednog drugog mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja.

[0116] U nekim načinima izvođenja, imunogena kompozicija ovog pronalaska, kao što je monovalentna ili viševalentna vakcina, daje se prasetu starosti 3 nedelje ili starije. Međutim, predviđeno je da se monovalentna ili viševalentna kompozicija vakcine u skladu sa ovim pronalaskom takođe može primeniti za revakcinisanje nazimica pre parenja. Kako je poznato u struci, nazimica je ženka praseta koja nije bila skotna. Vakcinisane nazimice prenose majčinski razvijena antitela na svoj okot putem kolostruma.

[0117] Dalje je predviđeno da se monovalentna ili viševalentna vakcina u skladu sa ovim pronalaskom može upotrebiti za godišnje revakcinisanje krda koji se uzgaja. Poželjno, monovalentna ili viševalentna vakcina u skladu sa ovim pronalaskom daje se svinjama (npr., prasići ili nazimice) u jednoj dozi. U jednom načinu izvođenja, viševalentna vakcina u skladu sa ovim pronalaskom ne zahteva mešanje odvojene monovalentne vakcine pre davanja, tj., obezbeđena je kao formulacija spremna za upotrebu. U još jednom načinu izvođenja, viševalentna formulacija zahteva mešanje dvovalentne vakcine sadržane u prvoj bočici sa monovalentnom vakcinom sadržanom u drugoj bočici. Opciono, dodatni antigeni mogu biti dodati u bilo koju od ovih bočica.

[0118] U nekim načinima izvođenja, početak imuniteta je od 2-3 nedelje post-vakcinacije sa monovalentnom ili viševalentnom kompozicijom vakcine u skladu sa ovim pronalaskom. U drugim načinima izvođenja, trajanje imuniteta iznosi oko 17-23 nedelje post-vakcinacije sa monovalentnom ili viševalentnom kompozicijom vakcine u skladu sa ovim pronalaskom.

[0119] Sledeći primeri navode poželjne materijale i postupke u skladu sa ovim pronalaskom. Međutim, podrazumeva se da su ovi primeri obezbeđeni samo u vidu ilustracije, i ništa u njima ne bi trebalo da predstavlja ograničenje ukupnog obima ovog pronalaska.

Primeri

Primer 1: Postupci proizvodnje Mycoplasma hyopneumoniae za PCV2 kombinujući M.hvo antigen M.hyo fermentacija i inaktivacija

[0120] Podloga za skaliranje semena i proizvodnju antigena pripremljena je kako sledi. Bujon iz svinjskog srca izvedenog Pleuropenumonia-sličnog organizma (PPLO) (BD Biosciences Katalog Br.21498) pripremljen je po uputstvima proizvođača (tj., 21g/L), a rastvor ekstrakta kvasca pripremljen je pri 21g/L u USP. Rastvor ekstrakta kvasca zatim je dodat u PPLO pri 6.25% i mešavina je stelizovana zagrevanjem do 121°C tokom ≥ 30 m minuta. Cistein hidrohlorid pripremljen je pri 90g/L i sterilizovan filterom. Rastvor dekstroze pripremljen je dodavanjem 450 g dekstroze po litri USP vode praćeno sterilizacijom toplotom. Za pripremu konačne podloge, svinjski serum dodat je osnovnoj podlozi pri 10% praćeno cisteinom pri 0.01% i dekstrozom pri 1.0%. Podloga je inokulisana sa 10vol.% kulture log faze M.hyopeumoniae (soj P-5722-3). Kultura je održavana na 37°C, a pH i dO održavani su na 7.0 i 25%, respektivno. U kasnim log fazama rasta, kultura je inaktivirana je inaktivirana binarnim etileniminom (BEI), aziridin jedinjenjem, proizvedenim iz 2-bromoetilamin hidrobromida. Specifično, inaktivacija se javila povišavanjem pH do 7.8 dodavanjem 2-bromoetilaminhidrobromida (BEA) do konačne koncentracija od 4 mM i inkubiranjem tokom 24 sata. BEI je neutralizovan dodavanjem natrijum tiosulfata u molarnom odnosu od 1:1 praćeno dodatnom 24 časovnom inkubacijom. Tečnost inaktivirane kulture je održavana na 2-8°C do dalje obrade.

Primer 2: Postupci proizvodnje himernog svinjskog cirkovirusa (cPCV)1-2

[0121] cPCV1-2 konstruisan je kloniranjem imunogenog kapsidnog gena patogenog tipa 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2) u genomsku kičmu nepatogenog tipa 1 svinjskog cirkovirusa (PCV1). Postupak za konstruisanje himernog DNK klona opisan je, na primer, u US Patentu Br.7,279,166, koji je ovde inkorporiran kao referenca u svojoj celosti. Infektivna zaliha himernog virusa dobijena je od Dr. X. J. Meng, Virginia Politechnic Institute and State University, Blacksburg, VA, i upotrebljena da zarazi ćelije svinjskog bubrega (PK)-15 uzgajane u minimalnoj esencijalnoj podlozi (MEM) dopunjenoj sa 0.05% laktalbumin hidrolizata (LAH), 30 µg/mL gentamicin sulfata, i 5% fetalnog goveđeg seruma. Dobijene cPCV1-2 zaražene PK-15 ćelije dalje su proširene serijskom pasažom još četiri puta primenom iste

2

podloge za rast osim što je bila sa 2-3% fetalnog goveđeg seruma. Peta pasaža je zamrznuta, odmrznuta i filtrirana, a dobijeni lizati su upotrebljeni za pripremanje pred-konačnog semena i naknadnog konačnog semena.

[0122] Podloga koja je upotrebljena za proizvodnju virusnog semena bila je ista ona koja upotrebljena za proizvodnju zalihe virusa. Za podlogu za rast, MEM, OptiMEM, ili ekvivalent je osnovna podloga koja može biti upotrebljena za zasejavanje PK-15 ćelijske linije za prerastanje. Podloga za rast može biti dopunjena sa do 10% goveđeg seruma, do 0.5% laktalbumin hidrolizata, do 0.5% goveđeg seruma albumina, i do 30 µg/mL gentamicina. Za podlogu za razmnožavanje virusa, upotrebljena je MEM, OptiMEM, ili neki ekvivalent. Podloga za razmnožavanje virusa može biti dopunjena sa do 0.5% laktalbumin hidrolizata, do 2% goveđeg seruma, do 0.5% goveđeg seruma albumina, i do 30 µg/mL gentamicina. Do 5 g/L glukoze i do 5 mmol/L L-glutamina može biti dodato podlozi za rast i/ili podlozi za razmnožavanje virusa potrebnoj za uzdržavanje ćelija.

[0123] cPCV1-2 konačna virusna semena dodata su ćelijskoj suspenziji PK-15 ćelija i adsorbovana tokom 3 sata. Seme virusa je razblaženo u osnovnoj podlozi za rast da bi se obezbedila višestrukost infekcije (MOI) od 0.1 - 0.0001.

[0124] Kulture PK-15 ćelija inicijalno su inokulisane radnim virusnim semenom u vreme zasađivanja ćelija, ili kada su ćelije dostigle približno 20% do 50% konfluentnosti. Ova inicijalna pasaža može se nazvati “postupak jednofazne infekcije” za proizvodnju antigenskih zaliha, ili se može primeniti dalje za serijske pasaže. Za serijske pasaže, cPCV1-2 zaražene PK-15 ćelije dalje su proširene do pasaže 7 serijskim razdvajanjem pri odnosu od 1:5-20 radi razmnožavanja virusa. Podloga za uzgajanje koja sadrži suspenziju zaraženih ćelija iz prethodne pasaže služi kao materijal semena za sledeću pasažu. cPCV1-2 zaražene ćelije su inkubirane tokom tri (3) do 14 dana za svaku pasažu pri 36 ± 2°C kada su ćelije dostigle ≥ 90% konfluencije. cPCV1-2 virus izaziva primetne citopatične promene tokom virusne replikacije. Pri sakupljanju, zaokruživanje ćelija i značajan plutajući debris su zapaženi. Kulture su takođe posmatrane na vizuelni dokaz bakterijske ili gljivične kontaminacija. Vreme inkubacije između sakupljanja za cPCV antigen obezbeđeno je u Tabeli 1 ispod:

Tabela 1 Minimalna i maksimalna vremena za sakupljanje cPCV antigena

[0125] Tečnosti cPCV1-2 kulture sakupljene su u sterilne bočice i uzorkovane za ispitivanje mikoplazme primenom poznatih postupaka. Može biti sprovedeno više sakupljanja sa bočica sa valjkom, bioreaktora i perfuzionih bočica.

[0126] Pre inaktivacije sakupljenog cPCV1-2 virusa, jedan ili više antigenskih lotova mogu se koncentrovati (npr., do 60X) ultrafiltriranjem. Koncentrati mogu biti oprani balansiranim slanim rastvorom da bi se redukovali proteini u serumu.

[0127] Postupak inaktivacije, slabljenja, ili detoksikacije cPCV1-2 virusa biće opisano u nastavku. Nakon koncentrovanja cPCV antigena, Beta-propiolakton (BPL) dodat je u pulovani cPCV1-2 virusni materijal da bi se dobila približna koncentracija od 0.2vol.%. Pulovane virusne tečnosti su zatim protresane tokom minimalno 15 minuta, a zatim su inaktivirajuće mase antigenskih tečnosti prebačene u drugu sterilnu bočicu. Prebačene antigenske tečnosti održavane su na 2-7°C, uz konstantno protresanje, tokom minimalno 24 sata. Posle minimalno 24 sata, drugo dodavanje 0.2vol.% BPL dodato je u pulovanu suspenziju. Sadržaji su naknadno protresani, transferovani u treću bočicu, i održavani na 2-7°C, uz konstantno protresanje, tokom dodatnog vremenskog perioda od ne manje od 84 sata. Generalno, ukupno vreme inaktivacije nije kraće od 108 sati i nije duže od 120 sati. Postupak inaktivacije je sumiran u Tabeli 2 ispod.

Tabela 2 Postupak inaktivacije

[0128] Inaktivacija je prekinuta dodavanjem konačne koncentracije od ne više od 0.1 M rastvora natrijum tiosulfata. pH zalihe inaktiviranog antigena podešena je do oko 6.8 primenom NaOH ili HCl. Prateći inaktivaciju, reprezentativni uzorak izdvojen je iz pula i ispitan na izvođenje inaktivacije.

Inaktivirani cPCV1-2 antigenski proizvod standardizovan je radi ispunjavanja cilja od više od 1.0 RP kako je izmereno ELISA potencije.

Primer 3: Nishodno obrađivanje M.hyo antigena i analitičko ispitivanje ovih obrađenih antigena Nishodno obrađivanje M.hyo antigena:

[0129] Inaktivirana fermentaciona tečnost (pripremljena kako je opisano ovde u Primeru 1) tretirana je za svaku indikovanu grupu kako sledi. Ovi obrađen M.hyo antigeni upotrebljeni su u Primeru 4 ispod.

[0130] T02: (Cela masa) Nije obrađen.

[0131] T03: (10X UF koncentrovan) Koncentrovan putem filtriranja primenom tangencijalnog protoka preko membrane od 100 KDa granične molekulske mase (šuplja vlakna). Konačna redukcija zapremine bila je jednaka 10X.

[0132] T04 i T05: (10X UF koncentrovan i centrifugiran) Koncentrovane mikoplazma ćelije (iz T03)

2

sakupljene su i oprane jednom sa PBS putem centrifugiranja pri ∼20,000xg (Sorvall model RC5B).

[0133] T06 i T07: (10X centrifugiran) Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana pri ∼20,000xg (Sorvall RC5B) i oprana jednom resuspendovanjem ćelija u PBS praćeno dodatnim centrifugiranjem. Konačna redukcija zapremine bila je jednaka 10X.

[0134] T08: (10X centrifugiran i zagrevan) Mikoplazma ćelije koncentrovane su i oprane za T06 i zagrevane do 65°C tokom 10 minuta.

[0135] T09: (Od ćelija oslobođen supernatant) Supernatant sakupljen iz prvog centrifugiranja kakav je opisan za T06 je sterilizovan filterom kroz 0.2 mikronski filter (Nalgene).

[0136] T10: (Od ćelija oslobođen supernatant tretiran Proteinom-A) Sterilni supernatant (pripremljen za T09) umešan je sa smolom Proteina A (Protein A Sepharose, Pharmacia Inc) pri zapreminskom odnosu od 10:1 tokom 4 sata. Smola je uklonjena sterilnim filtriranjem, a filtrirana tečnost uskladištena na 2-8°C. Ovaj postupak koristi post-fermentacioni “nishodni” tretman proteinom A radi uklanjanja antitela i imunokompleksa.

[0137] Iako ovaj pronalazak ne isključuje ushodni tretman proteinom A, pronalazači su otkrili da u slučaju M.hyo, ushodni tretman proteinom A podloge za uzgajanje dovodi do p46 rezultata koji su niži i nekonzistentni u poređenju sa netretiratim podlogama (podaci nisu prikazani).

Analitičko ispitivanje M.hyo nishodno obrađenih antigena

[0138] Pripravci nishodno obrađenih M.hyo antigena (pripremljeni kako je opisano ovde) ispitani su na izdvajanje M.hyo specifičnog p46 antigena, i prisustvo PCV2 antitela. Pored toga, ovi M.hyo antigenski pripravci ispitani su na prisustvo Torque Teno Virusa (TTV), koji uključuje genotip 1 (g1TTV) i genotip 2 (g2TTV). Rezultati su prikazani ispod u Tabeli 3.

Tabela 3 Karakterizacija M.hyo nishodno obrađenih antigena

2

[0139] Pozivajući se na gornju Tabelu 3, izdvajanje M.hyo-specifičnog p46 antigena pokazano je za svaki od M.hyo nishodno obrađenih antigenskih pripravaka. Pored toga, sledeći tretmani uspešno su uklonili PCV2 antitelo: 10X UF koncentrovan i centrifugiran, 10x centrifugiran, 10X centrifugiran i zagrevan i od ćelija oslobođen supernatant (Proteinom-A tretiran). Što se tiče TTV, sledeći tretmani uspešno su uklonili g1TTV: 10X UF koncentrovan i centrifugiran, 10x centrifugiran i zagrevan, i od ćelija oslobođen supernatant (Proteinom-A tretiran). Samo je tretman označen kao 10X UF koncentrovan i centrifugiran uklonio g2TTV. Torque teno virusni izolati, koji uključuju genotipove 1 i 2, opisani su u US20110150913, koji je ovde inkorporiran kao referenca u svojoj celosti.

[0140] Kako je poznato u struci da se Protein A vezuje za IgG, stručnjaci iz ove oblasti podrazumevaju da ne samo PCV2 antitelo, već i druga svinjska antitela, koja uključuju PRRS antitelo, HPS antitelo, i SIV antitelo mogu efektivno biti uklonjena tretmanom Proteinom-A. To čini da je Proteinom-A tretiran M.hyo supernatant ovog pronalaska, koji je oslobođen od ćelija, kompatibilan ne samo sa PCV2 antigenom, već i sa drugim svinjskim antigenima zbog manjka imunološkog uplitanja između tih antigena. Dodatno, uklanjanjem nezaštitnog ćelijskog debrisa i uklanjanjem imunoglobulina i antigen/imunoglobulin kompleksa sa pravom se smatra da dovodi do pripreme bezbednije vakcine.

Primer 4: Priprema eksperimentalnih formulacija M.hyo vakcine

[0141] Sve eksperimentalna M.hyo vakcine formulisane su sa konačnom koncentracijom od 5% Amphigen adjuvansa. Pored toga, sve vakcine standardizovane su sa p46 ELISA i konzervisane timerosolom. Eksperimentalne formulacije vakcine pripremljene su sa M.hyo antigenima obrađenim u skladu sa gornjim tretmanima T02-T10. Pored toga, Tretman T01 odgovara placebu (bez M.hyo antigena, samo 5% Amphigen adjuvans) dok je Tretman T11 pozitivna kontrola koja odgovara istekloj M.hyo vakcini na bazi bakterina (RespiSure-ONE<®>, Pfizer Animal Health). Ove formulacije opisane su u Tabeli 4 ispod.

Tabela 4 Eksperimentalne formulacije M.hyo vakcine

2

Primer 5: Evaluacija in vivo efikasnosti M.hyo vakcina sa M.hyo antigenima iz različitih nishodnih postupaka

[0142] Ovo ispitivanje sprovedeno je radi evaluacije in vivo efikasnosti Mycoplasma hyopneumoniae (M.Hyo) vakcine sa M.hyo antigenima iz različitih nishodnih postupaka (DSP). Svinje na 3 nedelje starosti intramuskularno su inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u gornjoj Tabeli 4. Šesnaest životinja uključeno je u svakoj od tretmanskih grupa. Životinje su čelendždovane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo izolatom polja. Životinje su obducirane 28 dana nakon čelendža i pluća su uklonjena i ocenjena na konsolidacije konzistentne sa M.hyo infekcijom. Primarni kriterijum za zaštitu protiv M.hyo čelendža bili su skorovi plućnih konsolidacija. Generalno je prihvaćeno da postoji veza između veličine plućnih lezija izazvanih enzootskom upalom pluća i štetnog efekta na brzinu rasta. Tabela 5 ispod sadrži skorove plućnih lezija za respektivne tretmanske grupe. Statistički značaj određen je pomoću analize mešovitog modela skorova pluća za svaku grupu.

Tabela 5 Rezultati plućnih lezija

2

[0143] Pozivajući se na gornju Tabelu 5, rezultati sa M.hyo antigenima iz različitih nishodnih postupaka pokazuju da se sve eksperimentalne vakcine osim T04 značajno razlikuju od placeba. Ovi rezultati M.hyo lezija grafički su prikazani na Fig.1. Kako je prikazano na Fig.1, T04 daje neprihvatljive rezultate. Svi drugi tretmani razlikuju se značajno od placeba (T01). Skorovi plućnih konsolidacija pokazuju da su T02, T03 i T09-T11 dali najefikasniju zaštitu protiv M.hyo čelendža.

[0144] p46 relativna potencija eksperimentalnih vakcina procenjena je primenom dvostrukog antitelo sendvič enzim-povezanog imunosorbentnog ogleda (DAS ELISA). p46 DAS ELISA rezultati prikazani u gornjoj Tabeli 5 pokazuju da sve eksperimentalne vakcine prevazilaze ciljanu potenciju. Pored toga, p46 relativna potencija ili je održavana ili povišena tokom skladištenja vakcina tokom jednomesečnog perioda (podaci nisu prikazani). Primećeno povećanje u potenciji tokom vremena zapaženo je kod centrifugiranih antigena sa izuzetkom onih antigena koji su podvrgnuti toploti. Bez želje da se vezuje za neku teoriju, može se reći da se ćelijski “trupovi” lome tokom vremena i oslobađaju više p46 antigena vezanog za membranu u slučaju centrifugiranih antigena.

2

Primer 6: Evaluacija kompatibilnosti eksperimentalnih M.hyo vakcina sa PCV2 antigenom

[0145] Ovo ispitivanje sprovedeno je radi evaluacije kompatibilnosti M.hyo eksperimentalnih vakcina sa M.hyo antigenima iz različitih nishodnih postupaka sa PCV2 antigenom. M.hyo eksperimentalne formulacije vakcine opisane su u gornjim Tabelama 4 i 5. Zapažene p46 relativne potencije za ove vakcine opisane su u gornjoj Tabeli 5. Ove M.hyo eksperimentalne vakcine su svaka kombinovana sa PCV2 antigenom. U ovom primeru, PCV2 antigen bio je ubijeni PCV Tip 1-Tip 2 himerni virus (Fostera PCV) pripremljen kako je opisano ovde u Primeru 2. Himerni virus uključen je u kompozicijama pri inicijalnom nivou od oko 1.6 ≤ RP, pri čemu RP predstavlja jedinicu relativne potencije određena pomoću PCV2 ELISA antigenske kvantifikacije (in vitro test potencije) u poređenju sa jednom efikasnom referentnom vakcinom.

[0146] Eksperimentalne M.hyo/PCV2 kombinovane formulacije evaluirane su pomoću PCV2 ELISA. Rezultati su prikazani na Fig.2. Kako je prikazano na Fig.2, samo M.hyo antigenski pripravci iz sledećih nishodnih postupaka bili su kompatibilni sa PCV2 antigenom: Ultrafiltriranje i centrifugiranje (T04 i T05), Centrifugiranje (T06 i T07), Centrifugiranje plus toplota (T08) i Proteinom A-tretiran supernatant (T10). Od ovih, M.hyo proteinom A-tretiran supernatant je nakompatibilniji sa PCV2 antigenom u poređenju sa placebo kontrolom koja uključuje himerni virus i Amphigen adjuvans, ali bez M.hyo antigena. Nivo himernog PCV virusa u supernatantu tretiranom Proteinom-A bio je 1.5 RP u poređenju sa 1.69 RP za placebo. Stoga je zaključeno da ne postoji ili postoji minimalno imunološkog uplitanja između Proteinom-A tretiranog M.hyo rastvorljivog antigenskog pripravka i PCV2 antigenskog himernog virusa.

[0147] In vivo efikasnost Proteinom-A tretiranog M.hyo supernatanta pokazana u gornjem Primeru 5 zajedno sa rezultatima opisanim u ovom primeru pokazuju da je Proteinom-A tretiran supernatant potencijalno efektivna platforma za M.hyo-PCV2 kombinacije.

Primer 7: Evaluacija PCV2 efikasnosti PCV2/M.hyo kombinovane vakcina u 1-bočici u različitim formulacijama adjuvanasa

[0148] Ovo ispitivanje dizajnirano je da proceni PCV2 efikasnost PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u 1-bočici u različitim formulacijama adjuvanasa. U ovom primeru, PCV2 antigen bio je ubijen PCV Tip 1-Tip 2 himerni virus (Fostera PCV). Himerni virus kombinovan je sa M.hyo rastvorljivim antigenskim pripravkom koji je suštinski oslobođen od IgG (tj., Proteinom A-tretiran supernatant).

Obrađivanje tečnosti:

[0149] Inaktivirana M.hyo fermentaciona tečnost (opisana ovde u Primeru 1) tretirana je za svaku indikovanu grupu kako sledi.

[0150] T02-T04: Cela fermentaciona tečnost koja sadrži žive M.hyopneumoniae ćelije (opisane ovde) je centrifugirana pri ∼20,000xg (Sorvall RC5B), a supernatant je sakupljen i sterilizovan kroz 0.2 µM filter.

rProtein A Sepharose (broj dela 17-5199-03, GE Healthcare) spakovan je u 1L hromatografsku kolonu. Nakon uklanjanja skladišnog pufera i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.04. Približno 2 litre izbistrenih/filtriranih M.hyopneumoniae antigen sadržavajućih tečnosti provučeno je kroz smolu Proteina A pri brzini protoka od 100 cm/h. Proizvod protoka sakupljen je i sterilizovan kroz 0.2 µM filter.

[0151] T05: Ovo je pozitivna kontrola koja odgovara Fostera PCV-sličnoj formulaciji (bez M.hyo antigena). Nivo himernog virusa u ovoj Fostera PCV-sličnoj formulaciji bio je približno na na nivioma formulacije minimalne doze imunizacije (MID). Himerni virus uključen je u PCV2/M.hyo eksperimentalne vakcine na sličnim nivoima formulacije.

[0152] Sve eksperimentalna PCV2/M.hyo vakcine formulisane su sa različitim formulacijama adjuvanasa. Eksperimentalne formulacije vakcine pripremljene su sa M.hyo antigenima obrađenim u skladu sa gornjim tretmanima T02-T04. Pored toga, tretman T01 odgovara placebu (sterilni slani rastvor).

[0153] Sve vakcine standardizovane su sa p46 ELISA i konzervisane timerosolom.

[0154] Ove eksperimentalne formulacije opisane su u Tabeli 6 ispod, pri čemu simbol * označava M.Hyo antigen iz globalnog M.Hyo semena, Proteinom A tretiran supernatant, a simbol ** označava Serijski ispitni veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 6 PCV2/M.hyo eksperimentalne formulacije vakcine upotrebljene za PCV2 ispitivanje efikasnosti

[0155] Svinje na 3 nedelje starosti intramuskularno su inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcine opisanih u gornjoj Tabeli 6. Šesnaest životinja uključeno je u svakoj od tretmanskih grupa.

Životinje su čelendždovane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim PCV2 izolatom polja.

[0156] Fig.3 je grafikon koji prikazuje rezultate PCV2 viremije (PCV2 kvantitativna PCR) zapaženi sa

1

različitim platformama adjuvanasa. Zabeleženo je da PCV2 viremija upotrebljena kao primarna varijabla efikasnosti. Rezultati PCV2 viremije su prikazani kao DNK kopije/ml. Kako je prikazano na Fig.3, svi tretmani imali su značajno manje viremije u poređenju sa placebom na dane 28, 35 i 42 (čelendž je bio dan 21).10% SP-ulje adjuvans imao je značajno manje viremije u poređenju sa 5% Amphigen na Dane 28 i 35.5% Amphigen plus 5% SLCD adjuvans imao je značajno manje viremije u poređenju sa 5% Amphigen na Dane 28 i 35.20% SLCD platforma adjuvansa imala je značajno manje viremije u poređenju sa 5% Amphigen na Dane 28, 35 i 42.

[0157] PCV2 Serologija, PCV2 fekalno širenje, PCV2 nazalno širenje, ćelijama posredovani imuni (CMI) odgovori, limfoidno iscrpljivanje, i imunohistohemija (IHC) takođe su praćeni kao sekundarne varijable efikasnosti. Ovi rezultati sada će biti opisani u nastavku.

[0158] Fig.4 je grafikon koji prikazuje PCV2 ELISA rezultate na dane 1, 20 i 42 ispitivanja (čelendž je bio dan 21). Status svakog uzorka izražen je kao uzorak prema pozitivnom odnosu (S/P). Kako je prikazano na Fig.4, 20% SLCD bio je jedini tretman koji je značajno različit od placeba (T01) i na danu 20 i danu 42. Takođe, 5% Amphigen bio je jedini tretman koji nije značajno različit od placeba na dan 20.

[0159] Fig.5 je grafikon koji prikazuje PCV2 fekalno širenje dobijeno sa T02-T04 tretmanima vs. placebo (T01). Ovi rezultati su izraženi kao PCV2 DNK kopije/ml. Rezultati na Fig.5 ukazuju da svi tretmani imaju značajno manje fekalno širenje u poređenju sa placebom na dan 42. Pored toga, 5% Amphigen i 5% SLCD (T04) imaju značajno manje fekalno širenje u poređenju sa 5% Amphigen (T03) na dan 42. Nisu zapažene neke druge razlike u tretmanima.

[0160] Fig.6 je grafikon koji prikazuje PCV2 nazalno širenje dobijeno sa T02-T04 tretmanima vs. placebo (T01). Ovi rezultati su izraženi kao PCV2 DNK kopije/ml. Rezultati na Fig.6 ukazuju da svi tretmani imaju značajno manje nazalno širenje u poređenju sa placebom na dan 42. Pored toga, 20% SLCD (T05) imaju značajno manje nazalno širenje u poređenju sa 5% Amphigen (T03) na dan 42. Nisu zapažene neke druge razlike u tretmanima.

[0161] Fig.7 (A i B) su dva grafikona koja pokazuju rezultate interferon-gama (IFN-γ) testa koji meri PCV2-specifične ćelijski posredovane imune (CMI) odgovore. CMI rezultati su prikazani postvakcinacije/pre-čelendža (Fig.7A), i post-vakcinacije/post-čelendža (Fig.7B). Na ovim grafikonima, stimulacija 5 x 10<6>ćelijama smatra se značajnom (...). Sve PCV2/M.hyo eksperimentalne vakcine daju detektabilni IFN-γ odgovor post-vakcinacije.10% SP-ulje (T02) pokazalo je najjači IFN-γ odgovor postvakcinacije.20% SLCD (T05) indukovao je raniji odgovor, ali najniži odgovor na dan 20. Postojao je veliki post-čelendž odgovor, naročito zapažen u placebo grupi. Dodatno, post-čelendž odgovor bio je niži u tretmanskim grupama sa vakcinisanim prasićima u poređenju sa placebo grupom.

[0162] Tabela 7 ispod pokazuje limfoidno iscrpljivanje dobijeno sa eksperimentalnim tretmanima u suprotnosti sa placebom.

2

Tabela 7 PCV2 Histopatologija (Limfoidno iscrpljivanje)

[0163] Rezultati prikazani u gornjoj Tabeli 7 prikazuju da vakcine obezbeđuju snažnu zaštitu protiv limfoidnog iscrpljivanja. Takođe, nisu primećeni statistički značajni kontrasti u tretmanima vakcine. Tabela 8 ispod pokazuje da je imunohistohemija dobijena sa eksperimentalnim tretmanima u suprotnosti sa placebom.

Tabela 8 PCV2 Histopatologija (Imunohistohemija)

[0164] Rezultati prikazani u gornjoj Tabeli 8 pokazuju da sve vakcine obezbeđuju snažnu zaštitu protiv PCV2 kolonizacije što je potvrđeno imunohistohemijom. Takođe, nisu primećeni statistički značajni kontrasti u tretmanima vakcine.

[0165] Kao zaključak, rezultati prikazani u ovom primeru pokazuju da M.hyo rastvorljivi antigenski pripravak ne utiče na PCV2 efikasnost. Rezultati takođe pokazuju da sve PCV/M.hyo eksperimentalne formulacije vakcine obezbeđuju efikasnost protiv PCV2 čelendža. Dodatno, rezultati ukazuju da postoje neke statističke i numeričke razlike dobijene sa različitim formulacijama adjuvanasa, pri čemu 10% SP-ulje daje najsnažniju efikasnost.

Primer 8: Evaluacija M.hyo efikasnosti PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u 1-bočici sa različitim formulacijama adjuvanasa

[0166] Ovo ispitivanje dizajnirano je da proceni M.hyo efikasnost PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u 1-bočici sa različitim formulacijama adjuvanasa. M.hyo antigen kombinovan je sa svinjskim cirkovirusom (Tip 1-Tip 2 himera, ili PCV1-2, ubijeni virus) u jednoj bočici.

Obrađivanje tečnosti:

[0167] Inaktivirana M.hyo fermentaciona tečnost (opisana ovde u Primeru 1) tretirana je za svaku indikovanu grupu kako sledi.

[0168] T02-T04: Ovi tretmani bili su isti kao oni opisani za tretmanske grupe T02-T04 u gornjem Primeru 7.

[0169] T05: Formulisanje izvedeno sa inaktiviranim M.hyo ćelijama (M.hyo bakterin) kako je opisano u gornjem Primeru 1 pod naslovom “Fermentacija i inaktivacija”.

[0170] Sve eksperimentalne PCV2/M.hyo vakcine formulisane su sa različitim formulacijama adjuvanasa. Eksperimentalne formulacije vakcine pripremljene su sa M.hyo antigenima obrađenim u skladu sa gornjim tretmanima T02-T04. Pored toga, Tretman T01 odgovara placebu (sterilni slani rastvor).

Tretman T05 je pozitivna kontrola koja odgovara istekloj RespiSure<®>vakcini, koja je M.hyo vakcina na bazi bakterina (Pfizer Animal Health).

[0171] Ove eksperimentalne formulacije opisane su u Tabeli 9 ispod, pri čemu simbol * označava M.Hyo antigen iz globalnog M.Hyo semena, Proteinom A tretiran supernatant , a simbol ** označava Serijski ispitni veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 9 PCV2/M.hyo eksperimentalne formulacije vakcine upotrebljene za M.hyo ispitivanje efikasnosti u različitim formulacijama adjuvanasa

4

[0172] Svinje na 3 nedelje starosti intramuskularno su inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcina opisanih u gornjoj Tabeli 9. Četrnaest životinja uključeno je i u placebo i 10% SP-ulje grupe, trinaest životinja uključeno je u grupu pozitivne kontrole, a šesnaest životinja uključeno je i u 5% Amphigen i 5% Amphigen 5% SLCD grupe.

[0173] Životinje su čelendždovane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo izolatom polja.

Životinje su obducirane 28 dana nakon čelendža i pluća su uklonjena i ocenjena na konsolidacije konzistentne sa M.hyo infekcijom. Tabela 10 ispod sadrži skorove plućnih lezija za respektivne tretmanske grupe. Statistički značaj određen je pomoću analize mešovitog modela skorova pluća za svaku grupu.

Tabela 10 M.hvo plućne lezije

[0174] Kako je prikazano u gornjoj Tabeli 10, placebo grupa imala je srednju vrednost skora plućnih lezija od 13.1%, u poređenju sa 10% SP-ulje i 5% Amphigen tretmanskim grupama koje su imale srednje vrednosti skorova pluća od 4.3% i 4.7%, respektivno. Obe i 10% SP-ulje i 5% Amphigen formulacije smanjile su i/ili sprečile plućne lezije. Zbog toga, eksperimentalne PCV/M.hyo vakcine formulisane sa 10% SP-uljem ili 5% Amphigen smatraju se efikasnim. PCV2 antigen nije pokazao uticanje na M.hyo efikasnost ovih formulacija.

[0175] Nasuprot tome, 5% Amphigen 5% SLCD grupa imala je srednju vrednost skora plućnih lezija od 12.0%. što je neprihvatljiv rezultat zbog toga što nije različit u poređenju sa placebom. Zbog toga, eksperimentalna PCV/M.hyo vakcina formulisana sa 5% Amphigen 5% SLCD ne smatra se efikasnom.

[0176] Zabeleženo je da zbog smanjenog broja životinja i visokog varijabiliteta u skorovima plućnih lezija, ni jedan statistički efekat tretmana ne bi mogao da se pokaže u ovom ispitivanju. Iz tog razloga, odlučeno je da se dizajnira još jedno ispitivanje radi ispitivanja M.hyo efikasnosti PCV/M.hyo eksperimentalnih formulacija u 10% SP-ulju. Ovo ponovljeno ispitivanje prikazano je u Primeru 9 ispod.

Primer 9: Evaluacija M.hyo efikasnosti PCV2/M.hyo kombinovane vakcine u 1-bočici u 10% SP-ulju [0177] Ovo ispitivanje je dokaz koncepta dizajniranog da se oceni efikasnost M.hyo frakcije četiri eksperimentalne PCV2/M.hyo vakcine (Serijski brojevi L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tabeli 11 ispod) pripremljene različitim postupcima proizvodnje M.hyo koji koriste Protein A za IgG uklanjanje u poređenju sa kontrolnim vakcinama pripremljenim standardim postupkom proizvodnje M.hyo. Svaka od ove četiri eksperimentalne PCV2/M.hyo vakcine uključuje 10% SP-ulje kao adjuvans.

Obrađivanje tečnosti:

[0178] T02: Inaktivirani M.hyopneumoniae antigen kakav je opisan pod “Fermentacija i inaktivacija” u Primeru 1 gore.

[0179] T03 i T04: Formulisane sa inaktiviranim M.hyopneumoniae ćelijama kakve su opisane pod “Fermentacija i inaktivacija” u Primeru 1 gore.

[0180] T05: Tretman proteinom A podloge upotrebljene za uzgajanje M.hyopneumoniae. PPLO (izveden iz svinjskog srca) pripremljen je po uputstvima proizvođača (tj., 21g/L), a rastvor ekstrakta kvasca pripremljen je na 21g/L u USP. Rastvor ekstrakta kvasca dodat je u PPLO pri 6.25% i mešavina je stelizovana zagrevanjem do 121°C tokom ≥ 30 minuta. Cistein hidrohlorid pripremljen je pri 90g/L i sterilizovan filterom. Rastvor dekstroze pripremljen je dodavanjem 450 g dekstroze po litri USP vode praćeno sterilizacijom toplotom. Za pripremu konačne podloge, svinjski serum dodat je osnovnoj podlozi pri 10% praćeno cisteinom pri 0.01% i dekstrozom pri 1.0%. Antitela u kompletnim PPLO podlogama su uklonjena tretmanom sa proteinom A. Ukratko, jedan litar rProtein A Sepharose (broj dela 17-5199-03 GE Healthcare) spakovan je u staklenu kolonu (10 X 11.5 cm). Nakon uklanjanja skladišnog pufera, kolona je tretirana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline. Smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone od 50 mM NaPO4, 1M NaCl pufera (pH 7.0). Petnaest litara kompletne PPLO podloge uvedeno je na smolu pri linearnoj brzini protoka od 140 cm/sat. Protok kolone je sakupljen i sterilizovan filterom kroz 0.2 mikronski filter (Sartorius). Tretirana podloga koja je upotrebljena, propagirala je M.hyopneumoniae ćelije kakve su opisane pod “Fermentacija i inaktivacija” gore. Cela inaktivirana kultura (koja uključuje ćelije) formulisana je u konačnu vakcinu.

[0181] T06: Inaktivirane M.hyopneumoniae ćelije pripremljene su kako je opisano pod “Fermentacija i inaktivacija” u Primeru 1 gore. Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana pri ∼20,000xg (Sorvall RC5B) tokom 30 min. a supernatant je stelizovan 0.2 uM filtriranjem. Stopetnaest ml smole rProtein A (broj dela 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) spakovano je u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Nakon uklanjanja skladišnog pufera i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 1.2 litre izbistrenih/filtriranih M.hyopneumoniae antigen sadržavajućih tečnosti provučeno je kroz smolu pri brzini protoka od 120 cm/h. Proizvod protoka sakupljen je i sterilizovan kroz 0.2 µM filter.

[0182] T07: Inaktivirane M.hyopneumoniae ćelije pripremljene su kako je opisano pod “Fermentacija i inaktivacija” u Primeru 1 gore. Inaktivirana fermentaciona tečnost izbistrena je putem filtriranja primenom tangencijalnog protoka. Ukratko, polietar sulfonski filter (GE HealthCare, broj dela 56-4102-71) sa nominalnom veličinom pore od 0.2 µM sanitizovan je sa 0.5N natrijum hidroksidnim rastvorom praćeno intenzivnim ispiranjem sterilnom USP vodom. Inaktivirana tečnost mikoplazma kulture uvedena je u uređaj pri brzini recirkulacije koja je ciljana do 14.6L/minut i transmembranksim pritiskom od 2-3.4 PSI. Razbistravanje je izvedeno na sobnoj temperaturi. Filterski permeat je sakupljen i uskladišten na 2-8C do dalje obrade. Stopetnaest ml smole rProtein A (broj dela 12-1279-04, MAbSelect, GE Healthcare) spakovano je u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Nakon uklanjanja skladišnog pufera i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 2.3 litre izbistrenih/filtriranih M.hyopneumoniae antigen sadržavajućih tečnosti provučeno je kroz smolu pri brzini protoka od 120 cm/h. Proizvod protoka sakupljen je i sterilizovan kroz 0.2 µM filter.

[0183] T08: Inaktivirane M.hyopneumoniae ćelije pripremljene su kako je opisano pod “Fermentacija i inaktivacija” gore. Inaktivirana fermentaciona tečnost je centrifugirana pri ∼20,000xg (Sorvall RC5B) tokom 30 min. a supernatant je stelizovan 0.2 uM filtriranjem. Stopetnaest ml rProtein A Sepharose (broj dela 17-5199-03 GE Healthcare) spakovano je u hromatografsku kolonu (5x6 cm). Nakon uklanjanja skladišnog pufera i tretmana sa 2 zapremine kolone 1M sirćetne kiseline, smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM NaPO4/1M NaCl pufera, pH 7.01. Približno 1.2 litre

izbistrenih/filtriranih M.hyopneumoniae antigen sadržavajućih tečnosti provučeno je kroz smolu pri brzini protoka od 120 cm/h. Proizvod protoka sakupljen je i sterilizovan kroz 0.2 uM filter.

[0184] Eksperimentalne formulacije vakcine pripremljene su sa M.hyo antigenima obrađenim u skladu sa gornjim tretmanima T02-T08. T02, T03 i T04 odgovaraju pozitivnim kontrolama. Pored toga, Tretman T01 odgovara placebu (sterilni slani rastvor).

[0185] Ove eksperimentalne formulacije opisane su u Tabeli 11 ispod. M.hyo antigen odgovara M.hyo antigenu iz globalnog M.hyo semena, Proteinom A tretiran supernatant. Informacije iz kolone sa “tretmanom Proteinom A” označava da li je M.hyo supernatant tretiran Proteinom A bilo pre ili posle fermentacije.

Tabela 11 PCV2/M.hyo eksperimentalne formulacije vakcina upotrebljene za M.hyo ispitivanje efikasnosti u adjuvansu SP-ulje

Tretman Serijski Br. PCV1- M.hyo Aq Tretman Postupak Brend Adjuvans Ostalo

[0186] Svinje na 3 nedelje starosti intramuskularno su inokulisane jednom dozom različitih formulacija vakcina opisanih u gornjoj Tabeli 11.18 svinja uključeno je u svaku tretmansku grupu. Životinje su čelendždovane 21 dan posle vakcinacije sa virulentnim M.hyo izolatom polja. Životinje su obducirane 28 dana nakon čelendža i pluća su uklonjena i ocenjena na konsolidacije konzistentne sa M.hyo infekcijom. Fig.8 (A i B) pokazuje skorove plućnih lezija za respektivne tretmanske grupe. Statistički značaj određen je pomoću analize mešovitog modela skorova pluća za svaku grupu.

[0187] Rezultati plućnih lezija prikazani na Fig.8A i 8B ukazuju da od svih tretmana, samo dva (T07 i T08) imaju učinak od 100% kod svinja u kategoriji <5% plućnih lezija. Zabeleženo je da su zapažene snažne statističke razlike u ovom ispitivanju.

[0188] Rezultati u ovom primeru pokazuju značajnu M.hyo efikasnost u PCV2/M.hyo eksperimentalnoj formulaciji u 1-bočici, koja koristi Proteinom A-tretiran M.hyo supernatant i koristi SP-ulje kao adjuvans. Dodatno, Primer 7 gore pokazuje PCV2 efikasnost u PCV2/M.hyo formulaciji u 1-bočici, koja koristi Proteinom A-tretiran M.hyo supernatant i koristi SP-ulje kao adjuvans. Uzeto zajedno, i M.hyo i PCV2 efikasnost su pokazane u PCV2/M.hyo kombinacijama u 1-bočici, koje koriste Proteinom A-tretiran M.hyo supernatant.

Primer 10: In vivo bezbednost eksperimentalnih PCV2/M.hyo eksperimentalnih vakcina

[0189] Ovo ispitivanje sprovedeno je radi evaluacije in vivo bezbednosti eksperimentalnih PCV2-M.hyo vakcina formulisanih pri maksimalnoj dozi antigena u različitim formulacijama adjuvanasa kod životinje domaćina kada se daje u najranijem dobu (3 nedelje starosti). Različite platforme adjuvanasa evaluirane su kako bi se odredilo koja od ovih platformi obezbeđuje prihvatljiv bezbednosni profil na osnovu temperature, reakcija na mestu injektovanja i kliničkih zapažanja.20% SLCD/10% SP-ulje formulacija upotrebljena kao pozitivna (“nebezbedna”) kontrola zbog problema u prošlosti povezanih sa reakcijama na mestu injektovanja zapaženim pomoću ove ispitne grupe i ostalih.

Obrađivanje tečnosti:

[0190] Sve vakcine pripremljene su sa inaktiviranim M.hyopneumoniae antigenom kakav je opisan pod “Fermentacija i inaktivacija” u Primeru 1. M.hyo antigen cele mase upotrebljen je budući da je poznato da sadrži rastvorljive i nerastvorljive M.hyo antigene, pored imunoglobulina i imunokompleksa koji bi bili ukonjeni posle tretmana proteinom A. Logično je zaključeno da će uklanjanje nerastvorljivog ćelijskog debrisa i imunuoglobulina i imunokompleksa samo dalje pojačati bezbednost formulacija vakcine. Cilj ovog ispitivanja je bio da se strogo ispita bezbednost različitih formulacija adjuvanasa koje sadrže PCV2 antigen i M.hyo antigen. PCV2 i M.hyo antigeni formulisani su pri maksimalnim nivoima oslobađanja radi dodatne procene bezbednosti. Ove eksperimentalne formulacije opisane su u Tabeli 12 ispod. IVP označava ispitni veterinarski proizvod (IVP).

Tabela 12 PCV2/M.hyo eksperimentalne formulacije vakcine upotrebljene za ispitivanje bezbednosti

[0191] Bezbednosni parametri upotrebljeni u ovom ispitivanju bili su profil rektalne temperature i reakcija na mestu injektovanja. Rezultati ovog ispitivanja pokazuju da su svi kandidati platformi adjuvanasa obezbedili prihvatljiv bezbednosni profil u smislu profila rektalne temperature i kliničkih zapažanja (rezultati nisu prikazani). Samo 20% SLCD 10% SP-ulje (tj., pozitivna kontrola) značajno se razlikovala od placebo vakcine i imala je određeni broj teških reakcija na mestu injektovanja (rezultati nisu prikazani).

Primer 11: Pripremanje M.hyo antigena tretiranog proteinom A za ključna ispitivanja

[0192] Fig.9 je prikaz toka koji prikazuje jedan način izvođenja postupka proizvodnje upotrebljenog za pripremanje PCV2 kompatibilnog M.hyo antigena tretiranog proteinom A. Inaktivirane cele M.hyo kulture razbistrene su od ćelija putem filtriranja primenom tangencijalnog protoka. Ukratko, polietar sulfonski filter (GE Healthcare, broj dela 56-4102-49) sa normalnom veličinom čestica od 0.45 µM sanitizovan je 0.5N natrijum hidroksid rastvorom praćeno intenzivnim ispiranjem sterilnom USP vodom. Inaktivirana tečnost mikoplazma kulture uvedena je u uređaj pri brzini recirkulacije ciljanom do 11.0 L/minut i transmembranksim pritiskom od ∼5 PSI. Razbistravanje je izvedeno na sobnoj temperaturi. Filterski permeat je sakupljen i uskladišten na 2-8°C do dalje obrade.

[0193] Prateći razbistravanje, antigen sadržavajuće tečnosti tretirane su smolom proteina A radi redukovanja nivoa antitela. Ukratko, smola MAbSelect protein A (GE Healthcare) spakovana je u staklenu kolonu do visine od 12 cm. Smola je ekvilibrisana sa 5 zapremina kolone 50 mM natrijum fosfata, 250 mM NaCl pufera (pH 7.0). Antigen sadržavajuća tečnost, ekvivalent do 10 zapremina kolone, uvedena je na smolu pri linearnoj brzini protoka od 100 cm/sat. Protok kolone je sakupljen i sterilizovan filterom kroz 0.2 mikronski filter. Regeneracija kolone postignuta je protokom 3 zapremine kolone 25 mM acetatnog rastvora pri pH 3.7 praćeno sa 4 zapremine kolone rastvora 1M sirćetne kiseline. Nivoi anti-PCV2 antitela i M.hyopneumoniae antigena izmereni su u konačnoj antigenskoj tečnost putem ELISA PCV2 specifičnog antitela i p46 antigen kvantifikacione ELISA, respektivno.

Primer 12: Evaluacija virucidalnog dejstva protiv PRRS virusa

[0194] Ispitivanja prikazana u ovom primeru dizajnirana su da pocene različite platforme adjuvanasa na virucidalno dejstvo protiv PRRS virusa. Inicijalni eksperimenti imali su fokus na sam adjuvans (tj., formulacije nisu sadržavale PCV ili M.hyo antigene). Evaluacija adjuvanasa na PRRS virucidalno dejstvo prikazana je na Fig.10. Preliminarne virucidalne procene pokazuju da su 10% SP-ulje, 0.2% Carbopol i 2.5% Amphigen nevirucidalni na PRRS virus. Nasuprot tome, 20% SLCD adjuvans pokazao se kao virucidalan na PRRS virus.

[0195] Dalja ispitivanja izvedena su radi procene da li PCV/M.hyo formulacije kojima je dodat adjuvans

4

različitih platformi adjuvanasa nisu virucidalne na PRRS virus. Ovi rezultati prikazani su na Tabela 13, pri čemu simbol * označava one serijske vakcine koje su virucidalne na PRRSV.

Tabela 13 Rezultati PRRS virucidalnih ogleda sa različitim formulacijama

[0196] Rezultati prikazani u Tabeli 13 gore ukazuju da 10% SP-ulje nije virucidalno na PRRS virus.

[0197] Dalje PCV/M.hyo serijske vakcine pripremljene su primenom 10% SP-ulja kao adjuvansa (Tabela 14). Antigenska potencija ovih serijskih vakcina upoređena je sa referentnom PCV/M.hyo serijskom vakcinom (L1211RK15) koja sadrži 0.688% 20X koncentrata PCV2 antigena (pripremljen kako je opisano u Primeru 2); i 9.40% M.hyo antigena pripremljenog kako je opisano u Primeru 11. Rezultati prikazani u Tabeli 14 ispod dalje ukazuju da 10% SP-ulje nije virucidalno na PRRS virus. Svaka od vrednosti ispitnih uzoraka u Tabeli 14 bila je viša (+ znak) od kontrole virucidalnog ispitivanja, koja je imala gemoetrijski srednji titar (GMT) od oko 5.9±0.5 log/ml.

Tabela 14 Rezultati virucidalnog ogleda sa različitim PCV/M.hyo formulacijama dopunjene 10% SP-uljem kao adjuvansom

[0198] Rezultati prikazani u ovom primeru pokazuju da 10% SP-ulje nije virucidalno na PRRS virus. Rezultati prikazani u ovom primeru dalje pokazuju da je PCV/M.hyo formulacija dopunjena sa 10% SP-uljem kao adjuvansom, među onim serijskim vakcinama koje se smatraju nevirucidalnim na PRRS virus (Tabela 13 i Tabela 14). Kao zaključak, PCV/M.hyo formulacija dopunjena sa 10% SP-uljem kao adjuvansom smatra se efektivnom platformom na kojoj je bazirana trovalentna kombinacija koja uključuje PCV, M.hyo, i PRRS virus.

Primer 13: Pripremanje PCV/M.hyo/PRRS kombinovane vakcine

[0199] PCV/M.hyo formulacija dopunjena platformom adjuvanasa koja nije virucidalna na PRRS virus (videti Tabele 13 i 14 gore), obezbeđena je kao tečna kompozicija u jednoj bočici spremna za upotrebu. Ova PCV/M.hyo formulacija u 1-bočici upotrebljava M.hyo supernatant tretiran proteinom A. Obe i M.hyo i PCV2 efikasnost pokazane su u takvim PCV2/M.hyo formulacijama koje koriste M.hyo supernatant tretiran proteinom A (videti Primere 7-9). U ovom primeru, ova dvovalentna PCV2/M.hyo formulacija kombinovana je sa monovalentnim PRRS virusnim antigenom.

[0200] U jednom načinu izvođenja, PCV/M.hyo kombinovana u 10% SP-ulju i koja odgovara jednoj od serijskih vakcina L0711RK11, L0711RK12, L0711RK13 i L0711RK14 u Tabeli 11 gore, obezbeđena je kao tečna kompozicija u jednoj bočici spremna za upotrebu. Rezultati prikazani u Primeru 12 gore pokazuju da 10% SP-ulje nije virucidalno na PRRS virus. Primer 12 takođe pokazuje da su PCV2/M.hyo formulacije dopunjene sa 10% SP-uljem kao adjuvansom među onim serijskim vakcinama koje se smatraju nevirucidalnim na PRRS virus. U ovom primeru, takva PCV2/M.hyo tečna kompozicija u 1-bočici, koristi se za rehidrataciju kompozicije liofilizovanog genetski modifikovanog živog PRRS virusa sadržan u drugoj

4

bočici, tako da su svi antigeni sadržani u jednoj bočici pre davanja svinji pogodne starosti (npr., na 3 nedelje starosti ili starijim).

[0201] U jednom načinu izvođenja, PRRS virus ima genomsku sekvencu koja odgovara SEQ ID NO: 16 ili njenoj varijanti. U još jednom načinu izvođenja, PRRS virus upotrebljen u trovalentnoj kompoziciji je PRRS virusni izolat označen kao ISU-55, koji je deponovan u ATCC pod pristupnim brojem VR 2430. Ovde su opisane pogodne količine respektivnih antigena. Poželjno, svi antigeni se daju svinjama u jednoj dozi.

4

�

4

1

2

�

1

2

Claims

Patentni zahtevi

1. Imunogena kompozicija koja obuhvata supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je supernatant M.hyo kulture odvojen od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem i oslobođen je i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin.

2. Kompozicija prema zahtevu 1, pri čemu je supernatant tretiran proteinom-A ili proteinom-G pre dodavanja imunogenoj kompoziciji.

3. Kompozicija prema zahtevu 2, pri čemu kompozicija dalje obuhvata najmanje jedan dodatni antigen koji ima zaštitnu funkciju protiv mikroorganizma koji može da izazove bolest kod svinja, pri čemu je taj mikroorganizam odabran iz grupe koju čine tip 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), virus svinjskog reproduktivnog i respiratornog sindroma (PRRSV), svinjski parvovirus (PPV), Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Staphylococcus hyicus, Actinobacilllus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Salmonella enteritidis, Erysipelothrix rhusiopathiae, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyosynoviae, bakterije leptospira, Lawsonia intracellularis, virus svinjskog gripa (SIV), Escherichia coli antigen, Brachyspira hyodysenteriae, svinjski respiratorni koronavirus, svinjski epidemijski virus dijareje (PED), rotavirus, Torque teno virus (TTV), svinjski citomegalovirus, svinjski enterovirusi, virus encefalomiokarditisa, patogen uzročnik Aujeskijeve bolesti, klasična svinjska kuga (CSF) i patogen uzročnik gastroenteritisa koji se prenosi kod svinja, ili njihove kombinacije.

4. Kompozicija prema zahtevu 3, pri čemu najmanje jedan dodatni antigen predstavlja antigen tipa 2 svinjskog cirkovirusa (PCV2), antigen PRRS virusa ili njihovu kombinaciju.

5. Kompozicija prema zahtevu 4, pri čemu je PCV2 antigen u obliku tipa 1-tipa 2 himernog cirkovirusa, pri čemu pomenuti himerni virus obuhvata inaktivirani rekombinantni tip 1 svinjskog cirkovirusa koji eksprimira ORF2 protein tipa 2 svinjskog cirkovirusa.

6. Kompozicija prema zahtevu 4, pri čemu je PCV2 antigen u obliku rekombinantnog ORF2 proteina.

4

7. Kompozicija prema zahtevu 6, pri čemu je rekombinantni ORF2 protein eksprimiran iz vektora bakulovirusa.

8. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 7, pri čemu kompozicija dalje obuhvata adjuvans.

9. Kompozicija prema zahtevu 8, pri čemu je adjuvans odabran iz grupe koju čine adjuvans ulje-u-vodi, polimerni i vodeni adjuvans, adjuvans voda-u-ulju, aluminijumhidroksidni adjuvans, adjuvans vitamina E i njihove kombinacije.

10. Kompozicija prema bilo kom od zahteva 1 do 9 za upotrebu u imunizaciji svinje protiv Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo), koja obuhvata davanje svinji kompozicije prema bilo kom od zahteva 1 do 9.

11. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10, pri čemu se kompozicija daje u jednoj dozi.

12. Kompozicija za upotrebu prema zahtevu 10 ili 11, pri čemu se kompozicija daje svinjama koje imaju antitela majčinog porekla protiv M.hyo.

13. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od zahteva 10 do 12, pri čemu se kompozicija daje svinjama na 3 nedelje starosti ili starijim.

14. Kompozicija vakcine koja obuhvata imunogenu kompoziciju kakva je definisana u bilo kom od zahteva 1 do 9, pri čemu kompozicija dalje obuhvata farmaceutski prihvatljiv nosač.

15. Kompozicija vakcine kakva je definisana u zahtevu 14 za upotrebu u zaštiti svinja protiv enzootske pneumonije.

16. Komplet koji obuhvata:

bočicu koja obuhvata imunogenu ili kompoziciju vakcine koja uključuje supernatant Mycoplasma hyopneumoniae (M.hyo) kulture, pri čemu je taj supernatant oslobođen i od (i) IgG i od (ii) antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa kako je definisano u bilo kom od zahteva 1 do 15, i opciono koji dalje uključuje uputstvo za upotrebu koje sadrži informacije za davanje imunogene kompozicije.

17. Postupak za pripremanje imunogene ili kompozicije vakcine kakva je definisana u bilo kom od zahteva 1 do 15, pri čemu taj postupak obuhvata:

(i) uzgajanje M.hyo u pogodnoj podlozi tokom perioda koji se kreću od 18-144 sata;

(i) naknadno inaktiviranje M.hyo kulture;

(iii) sakupljanje tečnosti inaktivirane kulture, pri čemu tečnost inaktivirane kulture obuhvata i rastvorljivu tečnu frakciju i nerastvorljivi ćelijski materijal;

iv) razdvajanje rastvorljive tečne frakcije od nerastvorljivog ćelijskog materijala centrifugiranjem, filtriranjem ili taloženjem; i

v) uklanjanje i IgG i antigenskih/imunoglobulinskih imunokompleksa iz izdvojene rastvorljive tečne frakcije radi formiranja supernatanta M.hyo kulture oslobođenog i od (i) IgG i od (ii) imunokompleksa sastavljenih od antigena vezanog za imunoglobulin; i

vi) ukoliko se priprema kompozicija vakcine, opciono mešanje sa adjuvansom i farmaceutski prihvatljivim nosačem.