RS62939B1

RS62939B1 - Kompozicije i metode u vezi sa multimodalnim terapijskim ćelijskim sistemima u indikacijama kancera

Info

Publication number: RS62939B1
Application number: RS20220172A
Authority: RS
Inventors: Avak Kahvejian; Jordi Mata-Fink; Robert J Deans; Tiffany F Chen; John Round; Noubar B Afeyan; Nissen Torben Straight; Nathan Dowden; Tom Wickham; Sivan Elloul
Original assignee: Rubius Therapeutics Inc
Priority date: 2016-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2022-03-31
Also published as: JP2021112216A; CA3009063A1; AU2017207736A1; SG11201805253SA; SG10202007639SA; JP2022171843A; KR20180095098A; US10517897B1; JP2021078519A; MX2018008514A; EP3402491B1; PT3402491T; JP2019501655A; US20180085402A1; JP7093302B2; HUE057660T2; EP3402492B1; CN108778298A; CA3010510A1; KR20180095713A

Description

Opis

POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prioritet američke prijave sa serijskim brojem 62/277130 podnete 11. januara 2016, američke prijave sa serijskim brojem 62/359448 podnete 7. jula 2016, američke prijave sa serijskim brojem 62/370915 podnete 4. avgusta 2016, i američke prijave sa serijskim brojem 62/420973 podnete 11. novembra 2016.

LISTA SEKVENCI

[0002] Trenutna prijava sadrži listu sekvenci koja je podneta elektronskim putem u ASCII formatu. Navedena ASCII kopija, kreirana 5. januara 2017, nosi naziv R2081-7020WO_SL.txt i veličine je 24 800 bajtova.

POZADINA

[0003] Razmatrano je da se crvene krvne ćelije koriste kao sistemi za isporuku lekova, na primer, za razgradnju toksičnih metabolita ili inaktivaciju ksenobiotika, i u drugim biomedicinskim primenama.

SUŠTINA PRONALASKA

[0004] Obim pronalaska je definisan patentnim zahtevima.

[0005] Pronalazak obuhvata preparate i postupke koji se odnose na multimodalne terapije. Terapije su korisne, na primer, za lečenje raka. Ovde opisana multimodalna terapija obezbeđuje i/ili primenjuje mnoštvo agenasa koji funkcionišu na koordinisani način da obezbede terapijsku korist kod subjekta kome je to potrebno, na primer, kod subjekta koji ima rak. Generalno, multimodalna terapija koja je ovde opisana uključuje primenu preparata konstruisanih crvenih krvnih ćelija kod subjekta, npr. enukleisanih crvenih krvnih ćelija, koje sadrže (npr. eksprimiraju ili sadrže) veći broj agenasa (npr. polipeptida) koji funkcionišu na koordinisani način (npr. agens-aditivna, agenssinergistička, multiplikativna, nezavisna funkcija, zasnovana na lokalizaciji, zavisna od blizine, zasnovana na osnovi, zasnovana na multimerima ili kompenzatorna).

[0006] Sadašnji pronalazak obezbeđuje enukleisanu crvenu krvnu ćeliju, na primer, retikulocit, koji sadrži mnoštvo agenasa, npr., mnoštvo polipeptida (npr. egzogeni polipeptidi), npr. prvi egzogeni polipeptid, drugi egzogeni polipeptid, i treći egzogeni polipeptid.

[0007] Sadašnji pronalazak obezbeđuje enukleisanu crvenu krvnu ćeliju, na primer, retikulocit, koji sadrži mnoštvo egzogenih polipeptida, pri čemu prvi i drugi egzogeni polipeptid iz mnoštva imaju aditivnu, sinergističku, multiplikativnu, nezavisnu funkciju agensa, aktivnosti zasnovane na lokalizaciji, blizini, na bazi osnove, na bazi multimera ili kompenzatorne aktivnosti.

[0008] Sadašnji pronalazak obezbeđuje enukleisanu crvenu krvnu ćeliju, na primer, retikulocit, koji sadrži prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid, gde:

a) prvi i drugi egzogeni polipeptidi deluju na istu metu, pri čemu opciono, cilj je receptor ćelijske površine i/ili endogeni humani protein;

b) prvi egzogeni polipeptid se vezuje za prvi endogeni humani protein, a drugi egzogeni polipeptid se vezuje za drugi endogeni humani ciljni protein, npr. sa Kd manjom od 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2 ili 1 nM;

c) prvi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) prvi cilj, a drugi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) drugi cilj, pri čemu su prvi i drugi cilj članovi istog biološkog puta, pri čemu su opciono, ciljevi ili mete receptori ćelijske površine, endogeni humani proteini ili oboje;

d) prvi egzogeni polipeptid sadrži prvi pro-apoptotički polipeptid, a drugi egzogeni polipeptid sadrži drugi pro-apoptotički polipeptid, npr., ligand TRAIL receptora, npr. TRAIL polipeptid;

e) prvi i drugi egzogeni polipeptidi su u neposrednoj međusobnoj blizini, npr. odvojeni su manje od 10, 7, 5, 4, 3, 2, 1, 0,5, 0,2 ili 0,1 nm u trajanju od najmanje 1 , 2, 5, 10, 30 ili 60 sekundi; 1, 2, 5, 10, 30 ili 60 minuta, ili 1, 2, 3, 6, 12 ili 14 sati;

f) prvi i drugi egzogeni polipeptidi imaju Kd manji od 500, 200, 100, 50, 20, 10, 5, 2 ili 1 nM jedan za drugog;

g) prvi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid koji predstavlja antigen, npr. MHC molekul, npr. MHC molekul klase II, a drugi egzogeni polipeptid sadrži antigen, npr., kancerogeni antigen;

h) prvi i drugi egzogeni polipeptidi deluju na različite ciljeve, pri čemu opciono, najmanje jedna od meta je receptor ćelijske površine i/ili endogeni humani protein, npr., prvi egzogeni polipeptid vezuje prvi tip ćelije, npr., ćeliju raka, a drugi egzogeni polipeptid vezuje drugi tip ćelije, npr. , imunološku efektornu ćeliju, npr. T ćeliju;

i) prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid imaju odnos mnoštva od oko 1:1, od oko 2:1 do 1:2, od oko 5:1 do 1:5, od oko 10:1 do 1:10, od oko 20:1 do 1:20, od oko 50:1 do 1:50, od oko 100:1 do 1:100 po težini ili po broju kopije;

j) prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid imaju Kd za prvu metu i drugu metu, respektivno, sa odnosom od oko 1:1, od oko 2:1 do 1:2, od oko 5:1 do 1:5, od oko 10:1 do 1:10, od oko 20:1 do 1:20, od oko 50:1 do 1:50, od oko 100:1 do 1:100;

k) prvi egzogeni polipeptid ima prvu aktivnost (npr. vezivanje) sa prvom metom, a drugi egzogeni polipeptid ima drugu aktivnost (npr. vezivanje) sa prvom metom, npr., prvi i drugi egzogeni polipeptid vezuju pojedinačnu metu;

l) prvi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje se) za prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) drugu metu, a prva i druga meta su deo istog puta, pri čemu opciono, prvi egzogeni polipeptid deluje na prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid deluje na drugu metu istovremeno;

m) prvi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) drugu metu, a prva i druga meta su deo različitih puteva, pri čemu opciono, i prvi i drugi put deluju tako da promovišu dati ćelijski odgovor;

n) prvi egzogeni polipeptid lokalizuje enukleisanu crvenu krvnu ćeliju na željeno mesto, na primer, humanu ćeliju, a drugi egzogeni polipeptid ima terapeutsku aktivnost, npr. imunomodulacionu aktivnost kao što je aktivnost T ćelijske aktivacije ili aktivnost predstavljanja antigena (npr. za vakcinu protiv raka);

o) prvi egzogeni polipeptid vezuje prvu metu, npr. prvu ćeliju, npr., prvi tip ćelije, npr. ćeliju raka, a drugi egzogeni polipeptid vezuje drugu metu, npr. drugu ćeliju, npr. drugi tip ćelije, npr. imunsku efektorsku ćeliju, npr. T ćeliju;

p) prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid su nehumani proteini;

q) prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid su oba enzimi, npr. biosintetički enzimi;

r) prvi egzogeni polipeptid podstiče formiranje intermedijernog molekula, a drugi egzogeni polipeptid deluje na intermedijerni molekul; ili

s) prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid deluju na uzastopnim koracima puta.

[0009] Egzogeni polipeptidi mogu imati sinergističku aktivnost. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi imaju aditivnu aktivnost.

[0010] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi imaju aktivnost zavisnu od blizine. Blizina između većeg broja polipeptida, pre, tokom ili posle interakcije sa ciljnim delom ili delovima, može dati svojstvo ili rezultat koji se ne vidi u odsustvu takve blizine in vivo ili in vitro.

[0011] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa, npr., vezuje se za prvi ciljni deo, npr., polipeptid prve ciljne ćelije na ciljnoj ćeliji (npr., imunska efektorna ćelija, npr., T ćelija), a drugi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa, npr., vezuje se za drugi ciljni deo, na primer, polipeptid druge ciljne ćelije na ciljnoj ćeliji (npr. pri čemu vezivanje prvog i drugog polipeptida ciljne ćelije menja biološko svojstvo ciljne ćelije). U jednom aspektu, prva i druga meta su podjedinice multimernog kompleksa na ciljnoj ćeliji.

[0012] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid promoviše fuziju crvenog krvnog zrnca sa ciljnom ćelijom, a drugi egzogeni polipeptid je polipeptid iz bilo koje od Tabele 1, Tabele 2 ili Tabele 3 (npr. humani polipeptid bilo koje od Tabele 1, Tabele 2, Tabele 3 ili Tabele 4, npr. polipeptid koji ima aminokiselinsku sekvencu humanog polipeptida divljeg tipa).

[0013] U nekim realizacijama, prvi i drugi egzogeni polipeptidi stupaju u interakciju jedan sa drugim, npr., prvi modifikuje, npr. cepanjem ili fosforilacijom, drugi, ili prvi i drugi formiraju dimerni ili multimerni protein.

[0014] U nekim realizacijama, enukleisane crvene krvne ćelije sadrže 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 različitih egzogenih polipeptida. U jednoj realizaciji, mnoštvo (npr.2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10), ili svi različiti egzogeni polipeptidi, imaju unapred izabrani nivo homologije jedan sa drugim, npr. najmanje 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 ili 99,5% međusobne identičnosti sekvenci. U jednoj realizaciji, mnoštvo (npr. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10), ili svi različiti egzogeni polipeptidi, imaju unapred izabrani nivo homologije sa referentnom sekvencom, npr. najmanje 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 99,5% ili 100% identičnosti sekvence sa referentnom sekvencom (pri čemu referentna sekvenca uključuje celu polipeptidnu sekvencu ili njen deo, npr. unapred odabrani domen), na primer, veći broj ili svi različiti egzogeni polipeptidi su antitela ili molekule antitela. U nekim realizacijama, referentna sekvenca je sekvenca antitela ili njen fragment. U nekim realizacijama, referentna sekvenca sadrži konstantni region teškog lanca ili njegov deo, konstantni region lakog lanca ili njegov fragment, varijabilni region teškog lanca ili njegov deo, varijabilni region lakog lanca ili njegov fragment, ili bilo koju kombinaciju prethodnog.

[0015] U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna zrnca obuhvataju najmanje 2, ali ne više od 5, 6, 7, 8, 9, ili 10 različitih egzogenih polipeptida, na primer, egzogenih polipeptida koji su kodirani sa jednom ili više egzogenih nukleinskih kiselina koje nisu zadržane od strane enukleisanih crvenih krvnih zrnaca.

[0016] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi su kodirani sa jednom ili više egzogenih nukleinskih kiselina koje ne zadržavaju enukleisana crvena krvna zrnca.

[0017] U nekim realizacijama, jedan ili više (npr. dva ili tri) od prvog, drugog i opciono, trećeg egzogenog polipeptida su transmembranski polipeptidi ili polipeptidi učvršćeni na površini.

[0018] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa, npr., vezuje se za deo na ciljnoj ćeliji, a drugi egzogeni polipeptid menja svojstvo ciljne ćelije, npr., ubija ili aktivira ciljnu ćeliju.

[0019] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid imaju odnos zastupljenosti od oko 1:1, od oko 2:1 do 1:2, od oko 5:1 do 1:5, od oko 10:1 do 1:10, od oko 20:1 do 1:20, od oko 50:1 do 1:50, ili od oko 100:1 do 1:100 po težini ili po broju kopije. U nekim realizacijama, i prvi i drugi polipeptidi imaju stehiometrijski način delovanja, ili oba imaju katalitički način delovanja, i oba su prisutna u sličnoj zastupljenosti, na primer, oko 1:1 ili od oko 2:1 do 1:2. U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid je zastupljeniji od drugog egzogenog polipeptida za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 50% ili faktorom od 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, ili 100 (i opciono do 10 ili 100 puta) po težini ili broju kopija. U nekim realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je zastupljeniji od prvog egzogenog polipeptida za najmanje oko 10%, 20%, 30%, 50% ili faktor od 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, ili 100 (i opciono do 10 ili 100 puta) po težini ili broju kopija. U nekim realizacijama, prvi polipeptid ima stehiometrijski način delovanja, a drugi polipeptid ima katalitički način delovanja, a prvi polipeptid je zastupljeniji od drugog polipeptida. U nekim realizacijama, drugi polipeptid ima stehiometrijski način delovanja, a prvi polipeptid ima katalitički način delovanja, a drugi polipeptid je zastupljeniji od prvog polipeptida.

[0020] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži deo za ciljanje.

[0021] U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija ima jednu ili više od sledećih karakteristika:

a) osmotsku fragilnost manju od 50% lize ćelija pri 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% ili 0,5% NaCl;

b) zapreminu ćelije od oko 10-200 fL ili prečnik ćelije između oko 1 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 2 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 3 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 4 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 5 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 6 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 5 mikrona i oko 15 mikrona, ili između oko 10 mikrona i oko 30 mikrona;

c) više od 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ili 10% fetalnog hemoglobina; ili najmanje oko 20, 25 ili 30 pg/ćeliji hemoglobina; ili

d) sadržaj fosfatidilserina u spoljašnjem listiću je manji od 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili 5% mereno bojenjem sa Aneksinom V.

[0022] U nekim realizacijama, najmanje jedan, npr., svi, od mnoštva egzogenih polipeptida su glikozilovani. U nekim realizacijama, najmanje jedan, npr., svi, od mnoštva egzogenih polipeptida su fosforilisani.

[0023] U nekim realizacijama, enukleisano crveno krvno zrnce je retikulocit.

[0024] U nekim realizacijama, egzogenom polipeptidu ili polipeptidima nedostaje potpis za transfer sortaze (tj. sekvenca koja se može stvoriti reakcijom sortaze), kao što je LPXTG (SEK ID BR: 17).

[0025] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metod lečenja bolesti ili stanja, ovde opisanog, koji obuhvata primenu kod subjekta kome je to potrebno enukleisane crvene krvne ćelije, npr., retikulocita, koji je ovde opisan. U nekim realizacijama, bolest ili stanje je kancer, npr. rak ovde opisan.

[0026] Sadašnji pronalazak obezbeđuje metod dovođenja u neposrednu blizinu prvog i drugog dela ćelijske površine, npr., transmembranskih receptora, koji obuhvata primenu kod subjekta kome je to potrebno enukleisane crvene krvne ćelije, npr., retikulocita, koji je ovde opisan.

[0027] Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak isporuke, predstavljanja ili ekspresije većeg broja molekula zavisnih od blizine koji obuhvata obezbeđivanje enukleisanih crvenih krvnih zrnaca, npr., retikulocita, ovde opisanih.

[0028] Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak za proizvodnju enukleisanog crvenog krvnog zrnca, na primer, retikulocita, ovde opisanog, obezbeđujući dovođenje u kontakt prekursora crvenih krvnih zrnaca sa jednom ili više nukleinskih kiselina koje kodiraju egzogene polipeptide i postavljanje ćelije pod uslovima koji omogućavaju da dođe do enukleacije.

[0029] Sadašnji pronalazak obezbeđuje preparat, na primer, farmaceutski preparat, koji sadrži mnoštvo crvenih krvnih ćelija bez jedra, na primer, retikulocita, koji su ovde opisani, npr., najmanje 10<8>, 10<9>, 10<10>, 10<11>ili 10<12>ćelija.

[0030] Sadašnji pronalazak obezbeđuje ćelijski kompleks, npr. in vitro ili in vivo kompleks, projektovanih crvenih krvnih zrnaca (RBC), na primer, enukleisanih crvenih krvnih zrnaca, npr. retikulocita i ciljne ćelije, kompleks posredovan jednim od egzogenih polipeptida. U nekim realizacijama, ćelijski kompleks sadrži najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 ćelija. U nekim realizacijama, ćelijski kompleks sadrži najmanje dva tipa ćelija pored konstruisanog RBC-a, npr. ćelije raka i imunološke efektorne ćelije.

[0031] Sadašnji pronalazak dokazuje reakcionu smešu koja sadrži konstruisani RBC, npr., enukleisano crveno krvno zrnce, na primer, retikulocit, i nukleinsku kiselinu, npr., jedan ili više molekula nukleinske kiseline, koji kodiraju ovde opisani multimodalni par. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina sadrži najmanje jedan promoter koji je aktivan u crvenim krvnim zrncima. U nekim realizacijama, nukleinska kiselina kodira najmanje dva ovde opisana proteina (npr. u tabeli 1, tabeli 2 i tabeli 3). U nekim realizacijama, nukleinska kiselina kodira treći egzogeni polipeptid.

[0032] Sadašnji pronalazak obuhvata postupak izrade konstruisanog crvenog krvnog zrnca (npr. enukleisanog crvenog krvnog zrnca, npr. retikulocita) koji je ovde opisan, koji obuhvata: obezbeđivanje, npr., primanje informacija o ciljnoj ćeliji ili subjektu, reakcijom na tu informaciju odabirom mnoštva egzogenih polipeptida, i uvođenje nukleinskih kiselina koje kodiraju egzogene polipeptide u RBC ili RBC prekursor.

[0033] Sadašnji pronalazak obuhvata metodu procene konstruisane eritroidne ćelije, npr. RBC (npr. enukleisane RBC, npr. retikulocita), koji obuhvata obezbeđivanje eritroidne ćelije kandidata, npr. RBC, i određivanje da li nukleinska kiselina kodira mnoštvo egzogenih polipeptida, npr. prisutan je multimodalni par egzogenih polipeptida.

[0034] Sadašnji pronalazak obuhvata metodu procene konstruisane eritroidne ćelije, npr. RBC (npr. enukleisane RBC, npr. retikulocita), koji obuhvata obezbeđivanje eritroidne ćelije kandidata, npr. RBC, i određivanje da li je prisutno mnoštvo egzogenih polipeptida na primer, multimodalni par egzogenih polipeptida, na primer, detekcijom proteina.

[0035] Sadašnji pronalazak obezbeđuje, enukleisanu eritroidnu ćeliju koja sadrži:

prvi egzogeni polipeptid koji stupa u interakciju sa ciljem,

i drugi egzogeni polipeptid koji modifikuje cilj;

pri čemu jedan ili više od:

(a) drugi egzogeni polipeptid sadrži deo koji cepa antitelo, npr., koji cepa u zglobnom regionu, CH2 regionu, ili između zglobnog i CH2 regiona, npr. IdeS polipeptid;

(b) drugi egzogeni polipeptid sadrži enzim (npr. proteazu) koji modifikuje, npr. specifičan je, npr. vezuje se za ciljno mesto, vezuje se (npr. specifično) i modifikuje, npr. kovalentno modifikuje, npr. cepa , ili uklanja ili vezuje deo za cilj;

(c) drugi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid, npr. enzim, npr., proteazu, koji modifikuje sekundarnu, tercijarnu ili kvarternarnu strukturu mete, i, u realizacijama, menja, npr. smanjuje ili povećava, sposobnost cilja da intereaguje sa drugim molekulom, npr. prvim egzogenim polipeptidom ili molekulom koji nije prvi egzogeni polipeptid, pri čemu opciono, cilj sadrži antitelo ili faktor komplementa;

(d) drugi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid, npr. enzim (npr. proteazu) koji cepa metu, npr. polipeptid, između prvog ciljnog domena i drugog ciljnog domena, npr., prvog ciljnog domena koji vezuje prvi supstrat i drugog ciljnog domena koji vezuje drugi supstrat;

(e) cilj je jedan polipeptid, ugljeni hidrat (npr. glikan), lipid (npr., jedan fosfolipid) ili nukleinske kiseline (npr. DNK ili RNK);

(f) prvi egzogeni polipeptid vezuje cilj, npr., antitelo, ali ne raskida, a drugi egzogeni polipeptid raskida vezu, npr., kovalentnu vezu, npr., kovalentnu vezu u antitelu;

(g) meta sadrži antitelo (npr. antitelo protiv leka) i prvi egzogeni polipeptid vezuje varijabilni region mete antitela;

(h) meta sadrži antitelo (npr. antitelo protiv leka) i prvi egzogeni polipeptid vezuje konstantni region mete antitela;

(i) prvi egzogeni polipeptid ima afinitet za cilj koji je oko 1-2 pM, 2-5 pM, 5-10 pM, 10-20 pM, 20-50 pM, 50-100 pM, 100-200 pM, 200-500 pM, 500-1000 pM, 1-2 nM, 2-5 nM, 5-10 nM, 10-20 nM, 20-50 nM, 50-100 nM, 100-200 nM, 200-500 nM, 500-1000 nM, 1-2 μΜ, 2-5 μΜ, 5-10 μΜ, 10-20 μΜ, 20-50 μΜ ili 50-100 μΜ;

(j) drugi egzogeni polipeptid ima KMza cilj od oko 10<-1>- 10<-7>M, 10<-1>- 10<-2>M, 10<-2>- 10<-3>M, 10<-3>- 10<-4>M, 10<-4>- 10<-5>M, 10<-5>- 10<-6>M ili 10<-6>- 10<-7>M;

(k) odnos Kdprvog egzogenog polipeptida za cilj (meren u M) podeljen sa KMdrugog egzogenog polipeptida za cilj (meren u M) je oko 1x10<-9>- 2x10<-9>, 2x10<-9>- 5x10<-9>, 5x10<-9>-1x10<-8>, 1x10<-8>- 2x10<-8>, 2x10<-8>- 5x10<-8>, 5x10<-8>- 1x10<-7>, 1x10<-7>- 2x10<-7>, 2x10<-7>- 5x10<-7>, 5x10<-7>- 1x10<-6>, 1x10<-6>- 2x10<-6>, 2x10<-6>- 5x10<-6>, 5x10<-6>- 1x10<-5>, 1x10<-5>- 2x10<-5>, 2x10<-5>- 5x10<-5>, 5x10<-5>-1x10<-4>, 1x10<-4>- 2x10<-4>, 2x 10<-4>- 5x10<-4>, 5x10<-4>-1x10<-3>, 1x10<-3>- 2x10<-3>, 2x10<-3>- 5x10<-3>, 5x10<-3>- 1x10<-2>, 1x10<-2>- 2x10<-2>, 2x10<-2>- 5x10<-2>, 5x10<-2>- 1x10<-1>, 1x10<-1>- 2x10<-1>, 2x10<-1>-5x10<-1>ili 5x10<-1>- 1;

(1) uočena brzina reakcije drugog egzogenog polipeptida koji modifikuje cilj je veća od brzine reakcije enukleisane ćelije koja je slična, ali kojoj nedostaje prvi egzogeni polipeptid pod inače sličnim reakcionim uslovima;

(m) odnos prosečnog broja prvog egzogenog polipeptida na eritroidnoj ćeliji prema prosečnom broju drugog egzogenog polipeptida na eritroidnoj ćeliji je oko 50:1, 20:1, 10: 1, 8:1, 6:1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20 ili 1:50;

(n) afinitet prvog egzogenog polipeptida za metu je veći od afiniteta prvog egzogenog polipeptida za modifikovanu (npr. cepljenu) metu;

(o) terapijski efikasna doza enukleisane eritroidne ćelije je stehiometrijski manja (npr. manja za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99 %) u odnosu na količinu cilja u perifernoj krvi subjekta u vreme primene;

(p) broj enukleisanih eritroidnih ćelija u efikasnoj dozi je manji od (npr. manji za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 %, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) broja ciljeva, npr. ciljnih molekula, u perifernoj krvi subjekta u vreme primene;

(q) broj drugih egzogenih polipeptida sadržan od strane unapred odabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efikasne doze, ili in vitro efikasne količine enukleisanih eritroidnih ćelija, manji je (npr. manji za 10%, 20%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) od referentne vrednosti za ciljeve, npr. manji od broja ciljeva u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(r) broj prvih egzogenih polipeptida sadržan od strane unapred odabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efikasne doze, ili in vitro efikasne količine enukleisanih eritroidnih ćelija, manji je (npr. manji za 10%, 20%, 30 %, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) od referentne vrednosti za ciljeve, npr. manji od broja ciljeva u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(s) broj prvih egzogenih polipeptida i broj drugih egzogenih polipeptida sadržan od strane unapred izabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efektivne doze, enukleisanih eritroidnih ćelija, svaki je manji od referentne vrednosti za ciljeve, npr. manji od broja meta u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(t) drugi egzogeni polipeptid modifikuje (npr. cepa) metu sa KMod najmanje 10<-1>M, 10<-2>M, 10<-3>M, 10<-4>M, 10<-5>M, 10<-6>M ili 10<-7>M;

(u) drugi egzogeni polipeptid sadrži pratioca;

(v) prvi egzogeni polipeptid sadrži deo koji je izložen površini i drugi egzogeni polipeptid sadrži deo koji je izložen površini; ili

(w) efikasna količina enukleisanih eritroidnih ćelija je manja od (npr. manja za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98 %, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) efikasne količine inače sličnih enukleisanih eritroidnih ćelija kojima nedostaje drugi egzogeni polipeptid.

[0036] U realizacijama, (b) drugi egzogeni polipeptid sadrži enzim (npr. proteazu) koji modifikuje, npr. specifičan je, npr. vezuje se za mesto na cilju, vezuje se (npr. specifično) i modifikuje, npr. kovalentno modifikuje, na primer, cepa, ili uklanja ili vezuje deo za cilj, pri čemu je cilj opciono antitelo, npr. antitelo protiv leka. U realizacijama modifikacija menja, npr., povećava ili smanjuje, sposobnost cilja da intereaguje sa drugim molekulom, npr., prvim egzogenim polipeptidom ili molekulom koji nije prvi egzogeni polipeptid.

[0037] U realizacijama, (d) drugi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid, npr. enzim (npr. proteazu) koji cepa cilj, na primer, polipeptid, između prvog ciljnog domena i drugog ciljnog domena, npr. prvog ciljnog domena koji vezuje prvi supstrat i drugog ciljnog domena koji vezuje drugi supstrat. U realizacijama, prvi ciljni domen se oslobađa od drugog ciljnog domena. U realizacijama cepanje menja afinitet jednog ili oba od prvog ciljnog domena za prvi supstrat i afinitet drugog ciljnog domena za drugi supstrat. U jednoj realizaciji cilj sadrži antitelo i prvi ciljni domen sadrži jedan ili više CDR-ova, a drugi ciljni domen sadrži deo konstantnog regiona, npr., Fc region.

[0038] U realizacijama su prisutna najmanje dva (npr. najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10) od (a)-(w). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (e). U realizacijama, prisutni su najmanje (a) i (i). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (j). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (m). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (q). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (a) i (s). U realizacijama, najmanje (e) i (i) su prisutni. U realizacijama su prisutni najmanje (e) i (j). U realizacijama su prisutni najmanje (e) i (m). U realizacijama su prisutni najmanje (e) i (q). U realizacijama su prisutni najmanje (e) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (e) i (s). U realizacijama su prisutni najmanje (i) i (j). U realizacijama su prisutni najmanje (i) i (m). U realizacijama su prisutni najmanje (i) i (q). U realizacijama su prisutni najmanje (i) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (i) i (s). U realizacijama su prisutni najmanje (j) i (m). U realizacijama su prisutni najmanje (j) i (q). U realizacijama su prisutni najmanje (j) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (j) i (s). U realizacijama su prisutni najmanje (m) i (q). U realizacijama su prisutni najmanje (m) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (m) i (s). U realizacijama su prisutni najmanje (q) i (r). U realizacijama su prisutni najmanje (q) i (s). U realizacijama su prisutni najmanje (r) i (s).

[0039] U realizacijama, prisutni su najmanje:

(a) i (b), (a) i (c), (a) i (d), (a) i (e), (a) i (f), (a) i (g), (a) i (h), (a) i (i), (a) i (j), (a) i (k), (a) i (l), (a) i (m), (a) i (n), (a) i (o), (a) i (p), (a) i (q), (a) i (r), (a) i (s), (a) i (t ), (a) i (u), (a) i (v), (a) i (w),

(b) i (c), (b) i (d), (b) i (e), (b) i (f), (b) i (g), (b) i (h), (b) i (i), (b) i (j), (b) i (k), (b) i (l), (b) i (m), (b) i (n), (b) i (o), (b) i (p), (b) i (q), (b) i (r), (b) i (s), (b) i (t), (b) i (u), (b) i (v), (b) i (w),

(c) i (d), (c) i (e), (c) i (f), (c) i (g), (c) i (h), (c) i (i), (c) i (j), (c) i (k), (c) i (l), (c) i (m), (c) i (n), (c) i (o), (c) i (p), (c) i (q), (c) i (r), (c) i (s), (c) i (t), (c) i (u), (c) i (v), (c) i (w),

(d) i (e), (d) i (f), (d) i (g), (d) i (h), (d) i (i), (d) i (j), (d) i (k), (d) i (l), (d) i (m), (d) i (n), (d) i (o), (d) i (p), (d) i (q), (d) i (r), (d) i (s), (d) i (t), (d) i (u), (d) i (v), (d) i (w),

(e) i (f), (e) i (g), (e) i (h), (e) i (i), (e) i (j), (e) i (k), (e) i (l), (e) i (m), (e) i (n), (e) i (o), (e) i (p), (e) i (q), (e) i (r), (e) i (s), (e) i (t), (e) i (u), (e) i (v), (e) i (w),

(f) i (g), (f) i (h), (f) i (i), (f) i (j), (f) i (k), (f) i (l), (f ) i (m), (f) i (n), (f) i (o), (f) i (p), (f) i (q), (f) i (r), (f) i (s), (f) i (t), (f) i (u), (f) i (v), (f) i (w),

(g) i (h), (g) i (i), (g) i (j), (g) i (k), (g) i (l), (g) i (m), (g) i (n), (g) i (o), (g) i (p), (g) i (q), (g) i (r), (g) i (s), (g) i (t), (g) i (u), (g) i (v), (g) i (w),

(h) i (i), (h) i (j), (h) i (k), (h) i (l), (h) i (m), (h) i (n), (h) i (o), (h) i (p), (h) i (q), (h) i (r), (h) i (s), (h) i (t), (h) i (u), (h) i (v), (h) i (w),

(i) i (j), (i) i (k), (i) i (l), (i) i (m), (i) i (n), (i) i (o), (i) i (p), (i) i (q), (i) i (r), (i) i (s), (i) i (t), (i) i (u), (i) i (v), (i) i (w),

(j) i (k), (j) i (l), (j) i (m), (j) i (n), (j) i (o), (j) i (p), (j) i (q), (j) i (r), (j) i (s), (j) i (t), (j) i (u), (j) i (v), (j) i (w),

(k) i (l), (k) i (m), (k) i (n), (k) i (o), (k) i (p), (k) i (q), (k) i (r), (k) i (s), (k) i (t), (k) i (u), (k) i (v), (k) i (w),

(l) i (m), (l) i (n), (l) i (o), (1) i (p), (l) i (q), (l) i (r), (l) i (s), (l) i (t), (l) i (u), (l) i (v), (l) i (w),

(m) i (n), (m) i (o), (m) i (p), (m) i (q), (m) i (r), (m) i (s), (m) i (t), (m) i (u), (m) i (v), (m) i (w),

(n) i (o), (n) i (p), (n) i (q), (n) i (r), (n) i (s), (n) i (t), (n) i (u), (n) i (v), (n) i (w),

(o) i (p), (o) i (q), (o) i (r), (o) i (s), (o) i (t), (o) i (u), (o) i (v), (o) i (w),

(p) i (q), (p) i (r), (p) i (s), (p) i (t), (p) i (u), (p) i (v), (p) i (w),

(q) i (r), (q) i (s), (q) i (t), (q) i (u), (q) i (v), (q) i (w),

(r) i (s), (r) i (t), (r) i (u), (r) i (v), (r) i (w),

(s) i (t), (s) i (u), (s) i (v), (s) i (w),

(t) i (u), (t) i (v), (t) i (w),

(u) i (v), (u) i (w), ili

(v) i (w).

[0040] U realizacijama, cilj je drugačiji od infektivne komponente npr. izuzev bakterijske komponente, virusne komponente, gljivične komponente ili parazitske komponente. U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži domen koji se vezuje za cilj. U realizacijama, deo prvog egzogenog polipeptida koji je izložen površini vezuje cilj. U realizacijama, površinski izloženi deo drugog egzogenog polipeptida sadrži enzimsku aktivnost, npr. aktivnost proteaze. U realizacijama, površinski izložen deo drugog egzogenog polipeptida enzimski modifikuje, npr., cepa metu. U realizacijama, cilj sadrži antitelo protiv leka, prvi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid za koji se vezuje antitelo protiv leka, a drugi egzogeni polipeptid sadrži proteazu koja cepa antitelo protiv leka da bi proizvela Fab deo i Fc deo. U realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija je sposobna da očisti metu iz tela subjekta vrećom brzinom od inače sličnog enukleisanog crvenog krvnog zrnca kome nedostaje drugi egzogeni polipeptid. U realizacijama, enukleisano crveno krvno zrnce je u kompleksu sa metom ili proizvodom reakcije drugog egzogenog proteina koji deluje na metu, na primer, tokom cepanja.

[0041] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje, enukleisanu eritroidnu ćeliju koja sadrži:

prvi egzogeni polipeptid koji sadrži transmembranski domen i površinski izložen polipeptid sposoban da vezuje antitelo protiv leka, i

drugi egzogeni polipeptid koji sadrži transmembranski domen i površinski izložen IdeS polipeptid.

[0042] Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje jedan polipeptid koji sadrži proteazu koja može da cepa antitelo, na primer, IdeS polipeptid, i domen učvršćenja membrane, na primer, transmembranski domen, na primer, transmembranski domen crvenih krvnih ćelija tipa I ili tipa II. Pronalazak takođe obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja kodira pomenuti polipeptid.

[0043] Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje nukleinsku kiselinu koja sadrži:

prvu sekvencu koja kodira proteazu koja može da cepa antitelo, npr. IdeS polipeptid,

drugu sekvencu koja kodira domen učvršćenja membrane, npr., transmembranski domen, pri čemu su prva i druga sekvenca operativno povezane da formiraju fuzioni protein; i

opciono, sekvencu promotera koja je aktivna u eritroidnoj ćeliji.

[0044] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje, kompoziciju nukleinske kiseline koja sadrži:

sekvencu prve nukleinske kiseline koja kodira prvi egzogeni polipeptid koji je u interakciji sa metom, npr., ovde opisani prvi egzogeni polipeptid,

sekvencu druge nukleinske kiseline koja kodira drugi egzogeni polipeptid koji modifikuje cilj, na primer, sekvencu ovde opisane druge nukleinske kiseline

opciono, sekvencu promotera koja je aktivna u eritroidnoj ćeliji.

[0045] U realizacijama, sekvenca prve nukleinske kiseline i sekvenca druge nukleinske kiseline su susedne ili odvojene molekule (npr. pomešane molekule ili u odvojenim kontejnerima). U realizacijama, sekvenca prve nukleinske kiseline i sekvenca druge nukleinske kiseline su deo istog otvorenog okvira čitanja i imaju mesto cepanja proteaze koje se nalazi između njih. U realizacijama, prva nukleinska kiselina je operativno povezana sa prvim promoterom, a druga nukleinska kiselina je operativno povezana sa drugim promoterom.

[0046] Pronalazak obezbeđuje, komplet koji sadrži:

(A) nukleinske kiseline koje kodiraju: (A-i) mnoštvo vezujućih ostataka (npr., molekule antitela, npr., scFv domene) fuzionisanih sa (A-ii) domenom učvršćenja membrane, npr., transmembranskim domenom, pri čemu su (A-i) i (A-ii) operativno povezani sa nukleinskom kiselinom koja usmerava ekspresiju u eritroidnoj ćeliji; i

(B) nukleinske kiseline koje kodiraju (B-i) mnoštvo enzima (npr. proteaza), opciono fuzionisanih sa (B-ii) domenom sidrenja membrane, npr., transmembranskim domenom, pri čemu su (B-i) i (B-ii) operativno povezani sa nukleinskom kiselinom koja usmerava ekspresiju u eritroidnoj ćeliji.

[0047] Sadašnji pronalazak obezbeđuje postupak izrade ciljnog fragmenta, npr. ciljnog polipeptida, na primer, postupak izrade ciljnog fragmenta koji sadrži prvi ciljni domen, npr. postupak izrade fragmenta varijabilnog regiona, ili postupak izrade fragmenta koji sadrži konstantni region, koji obuhvata dovođenje u kontakt ciljnog polipeptida sa ovde opisanom eritroidnom ćelijom. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid cepa cilj da bi se obezbedio fragment. U realizacijama, ciljni polipeptid je antitelo, npr., antitelo protiv leka. U realizacijama, fragment ciljnog polipeptida ne aktivira imunski odgovor i/ili upalu. U realizacijama, kontaktiranje obuhvata primenu eritroidne ćelije kod subjekta koji sadrži ciljni polipeptid.

[0048] Sadašnji pronalazak takođe obezbeđuje, postupak izrade inhibitora, npr., kompetitivnog inhibitora, koji obuhvata, na primer, dovođenje u kontakt prekursora inhibitora (cilja) sa ovde opisanom eritroidnom ćelijom. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa metom, npr. cepa metu. U realizacijama, inhibitor je fragment antitela (npr. Fab fragment). U realizacijama, meta je antitelo koje se cepa da bi se proizveo inhibitor koji je fragment antitela, npr. Fab fragment. U realizacijama, inhibitor ne aktivira imunski odgovor i/ili upalu. U realizacijama, prekursor inhibitora je antitelo, npr., antitelo protiv leka. U realizacijama, kontaktiranje obuhvata primenu eritroidne ćelije kod subjekta koji sadrži prekursor inhibitora.

[0049] Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje postupak za pretvaranje ili aktiviranje mete, npr., polipeptida, na primer, pretvaranje proleka u lek, koji obuhvata dovođenje u kontakt polipeptida sa ovde opisanom eritroidnom ćelijom. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa metom (npr., prolekom), npr. cepa metu. U realizacijama, prolek je antitelo, npr., antitelo protiv leka. U realizacijama, lek je fragment antitela, npr. Fab fragment. U realizacijama, lek ne aktivira imunološki odgovor i/ili upalu. U realizacijama, kontaktiranje obuhvata primenu eritroidne ćelije kod subjekta koji sadrži polipeptid, npr., prolek.

[0050] Sadašnji pronalazak takođe, obezbeđuje metodu pretvaranja endogenog polipeptida iz stanja jedne aktivnosti u stanje druge aktivnosti (npr. iz neaktivnog stanja u aktivno stanje ili aktivnog stanja u neaktivno stanje), koji obuhvata dovođenje u kontakt endogenog polipeptida sa ovde opisanom eritroidnom ćelijom. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid stupa u interakciju sa metom, npr., kovalentno modifikuje, npr. cepa cilj, ili menja njegovu sposobnost da stupi u interakciju sa, npr., vezuje, drugi molekul. U realizacijama, endogeni polipeptid je antitelo, npr., antitelo protiv leka. U realizacijama, kontaktiranje obuhvata primenu eritroidne ćelije kod subjekta koji sadrži endogeni polipeptid.

[0051] Pronalazak obezbeđuje postupak za smanjenje nivoa mete (npr., antitela, npr., antitela protiv leka) kod subjekta, koji obuhvata primenu, ovde opisane, eritroidne ćelije kod subjekta. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je u interakciji sa ciljem, npr., kovalentno modifikuje, npr. cepa cilj, ili menja njegovu sposobnost da intereaguje sa, npr., vezuje, drugi molekul. Otkriće takođe, obezbeđuje metodu za generisanje inhibitornog fragmenta antitela (npr. Fab fragmenta) kod subjekta, koja obuhvata primenu, ovde opisane, ćelije eritrocita kod subjekta. Otkriće obezbeđuje, dodatno, postupak za lečenje bolesti kod subjekta, na primer, raka, koji obuhvata primenu, ovde opisane, eritroidne ćelije kod subjekta.

[0052] U realizacijama, npr., realizacijama bilo koje od gore opisanih metoda, eritroidna ćelija sadrži:

prvi egzogeni polipeptid koji stupa u interakciju sa ciljem, i

drugi egzogeni polipeptid koji modifikuje cilj;

pri čemu jedan ili više:

(b) drugi egzogeni polipeptid sadrži enzim (npr. proteazu) koji modifikuje, npr. specifičan je, npr. vezuje se za ciljno mesto, vezuje se (npr. specifično) i modifikuje, npr. kovalentno modifikuje, npr. cepa ili uklanja ili vezuje deo za cilj, pri čemu je cilj opciono antitelo;

(c) drugi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid, npr. enzim, npr., proteazu, koji modifikuje sekundarnu, tercijarnu ili kvarternarnu strukturu cilja, i, u realizacijama, menja, npr. smanjuje ili povećava, sposobnost cilja da stupi u interakciju sa drugom molekulom, npr. prvim egzogenim polipeptidom ili molekulom koji nije prvi egzogeni polipeptid, pri čemu opciono, cilj sadrži antitelo ili komplementarni faktor;

(d) drugi egzogeni polipeptid sadrži polipeptid, npr. enzim (npr. proteazu) koji cepa cilj, npr. polipeptid, između prvog ciljnog domena i drugog ciljnog domena, npr., prvog ciljnog domena koji vezuje prvi supstrat i drugog ciljnog domena koji vezuje drugi supstrat;

(e) cilj je polipeptid, ugljeni hidrat (npr. glikan), lipid (npr. fosfolipid) ili nukleinske kiseline (npr. DNK ili RNK);

(g) cilj sadrži antitelo i prvi egzogeni polipeptid vezuje varijabilni region mete antitela;

(h) cilj sadrži antitelo i prvi egzogeni polipeptid vezuje konstantni region mete antitela;

(l) uočena brzina reakcije drugog egzogenog polipeptida koji modifikuje cilj je veća od brzine reakcije enukleisane ćelije koja je slična, ali kojoj nedostaje prvi egzogeni polipeptid pod inače sličnim reakcionim uslovima;

(m) odnos prosečnog broja prvog egzogenog polipeptida na eritroidnoj ćeliji i prosečnog broja drugog egzogenog polipeptida na eritroidnoj ćeliji je oko 50:1, 20:1, 10:1, 8:1, 6 : 1, 4:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:4, 1:6, 1:8, 1:10, 1:20 ili 1:50;

(n) ciljni afinitet prvog egzogenog polipeptida je veći od afiniteta prvog egzogenog polipeptida za modifikovani (npr. cepani) cilj;

(o) terapeutski efikasna doza enukleisane eritroidne ćelije je manja od (npr. manja za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) stehiometrijski u odnosu na količinu cilja u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(p) broj enukleisanih eritroidnih ćelija u efektivnoj dozi je manji od (npr. manji za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) broja ciljeva, npr., ciljnih molekula, u perifernoj krvi subjekta u periodu primene; (q) broj drugih egzogenih polipeptida sadržanih od strane prethodno odabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efektivne doze enukleisanih eritroidnih ćelija, manji je (npr. manji za 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) od referentne vrednosti za ciljeve, npr. manji od broja ciljeva u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(r) broj prvih egzogenih polipeptida sadržan od strane prethodno odabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efektivne doze enukleisanih eritroidnih ćelija, manji je (npr. manji za 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) od referentne vrednosti za mete, npr. manji od broja meta u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(s) broj prvih egzogenih polipeptida i broj drugih egzogenih polipeptida sadržan od unapred odabrane količine enukleisanih eritroidnih ćelija, npr. efektivne doze, enukleisanih eritroidnih ćelija, svaki je manji od (npr. manji za 10%, 20% , 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) referentne vrednosti za ciljeve, npr. manji od broja meta u perifernoj krvi subjekta u periodu primene;

(u) drugi egzogeni polipeptid sadrži pratioca;

(v) prvi egzogeni polipeptid sadrži deo koji je površinski izložen, a drugi egzogeni polipeptid sadrži deo koji je površinski izložen; ili

(v) efektivna količina enukleisanih eritroidnih ćelija je manja od (npr. manja za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) efektivne količine inače sličnih enukleisanih eritroidnih ćelija kojima nedostaje drugi egzogeni polipeptid.

[0053] U nekim realizacijama bilo koje od kompozicija i metoda, ovde opisanih, koje uključuju egzogeni polipeptid, npr., fuzioni protein:

i) najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 95 ili 99% fuzionih proteina na površini eritroidne ćelije ima identičnu sekvencu,

ii) najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 95 ili 99% fuzionog proteina ima isti transmembranski region, iii) fuzioni protein ne uključuje endogeni membranski protein pune dužine, npr. sadrži segment endogenog membranskog proteina pune dužine, čijem segmentu nedostaje najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ili 500 aminokiselina endogenog membranskog proteina pune dužine;

iv) najmanje 50, 60, 70, 80, 90, 95 ili 99% fuzionih proteina se ne razlikuju međusobno za više od 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ili 50 aminokiselina,

v) egzogenom polipeptidu nedostaje potpis za transfer sortaze,

vi) egzogeni polipeptid sadrži deo koji je prisutan na manje od 1, 2, 3, 4 ili 5 sekvenci različitih fuzionih polipeptida;

vii) egzogeni polipeptid je prisutan kao pojedinačni fuzioni polipeptid;

viii) fuzioni protein ne sadrži Gli-Gli na spoju endogenog transmembranskog proteina i ostatka;

ix) fuzioni protein ne sadrži Gli-Gli, ili fuzioni protein ne sadrži Gli-Gli, ili ne sadrži Gli-Gli u vanćelijskom regionu, ne sadrži Gli-Gli u vanćelijskom regionu koji je unutar 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50 ili 100 aminokiselina transmembranskog segmenta; ili njihovu kombinaciju.

[0054] Ćelijski sistemi koji su ovde opisani, mogu biti korišćeni u kombinaciji sa drugim (jednim ili više) anti-proliferativnim, anti-neoplastičnim ili antitumorskim lekom ili tretmanom koji nije deo ćelijskog sistema. Takvi lekovi ili tretmani uključuju hemioterapijske lekove, npr., citotoksične lekove (npr. alkilirajuća sredstva, antimetabolite, antitumorske antibiotike, inhibitore topoizomeraze, mitotičke inhibitore, kortikosteroide); blokatore rasta raka, kao što su inhibitori tirozin kinaze i inhibitori proteazoma; T ćelijsku terapiju (npr. CAR-T ćelijsku terapiju) (videti, npr., PMID: 26611350), imunomodulaciju ćelija prirodnih ubica (NK) (videti, npr., PMID: 26697006); i vakcine protiv raka (PMID: 26579225); druge hemijske lekove kao što su Lasparaginaza i bortezomib (Velcade<®>). Mogu se koristiti hormonske terapije (ili anti-hormonske terapije) na primer, za kancere osetljive na hormone.

[0055] Ovde opisani, ćelijski sistemi takođe, mogu biti korišćeni u kombinaciji sa terapijama za tretman kancera bez lekova kao što su hirurgija, radioterapija ili krioterapija. U nekim slučajevima, metode lečenja prema pronalasku, mogu uključivati ovde opisani ćelijski sistem u kombinaciji sa 2 ili više drugih terapija ili lekova, npr. rak dojke se može lečiti kombinacijom ovde opisanog ćelijskog sistema u kombinaciji sa hirurškom ili radioterapijom i hemioterapijskim koktelom ili biološkim lekom (npr. anti-HER2 antitelo).

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0056]

Slika 1 je skup grafikona koji prikazuje rezultate Raji testa apoptoze izmerene protočnom citometrijom. Raji ćelije su obeležene CFSE i zajedno kultivisane sa eritroidnim diferenciranim ćelijama koje su netransdukovane (kontrolne) i transdukovane sa jednom ili višestrukim TRAIL varijantama ili zajedno kultivisane sa dve različite pojedinačno transdukovane ćelije. Procenat apoptoze određen procentom ćelija koje su Raji (CFSE+) i aneksin V+. (Vrh) Dijagrami protočne citometrije CFSE i aneksin V bojenja različitih stanja. (Dno) Grafikon procenta apoptoze različitih stanja.

Slika 2 je grafikon bara koji prikazuje srednji intenzitet fluorescencije iz kontrolnih eritroidnih ćelija (UNT) ili eritroidnih ćelija koje eksprimiraju IdeS (IDES) obeleženih sa antitelom obeleženim anti-zečjim Fc fluoroforom, pre ili nakon 5-časovne inkubacije.

Slika 3 je Western blot koji prikazuje intaktni teški lanac ciljnih antitela ili fragmenata teškog lanca u supernatantu iz kontrolnih ćelija (UNT) ili ćelija koje eksprimiraju Ide-S (IdeS-RCT). Strelice označavaju teški lanac (Hc), fragment teškog lanca (Hc-fragment) i laki lanac (Lc). Slika 4 je dijagram eritroidne ćelije koja se sastoji od prvog egzogenog polipeptida (belo), drugog egzogenog polipeptida (šrafiran paralelnim linijama) i trećeg egzogenog polipeptida (blizu šrafiranog), pri čemu svaki egzogeni polipeptid sadrži agens za hvatanje sposoban da uhvati cilj, npr., neželjeni cilj. Eritroidna ćelija može da se uključi u dvostruko hvatanje, gde koristi više od jednog egzogenog polipeptida da veže jedan ili više rastvorljivih faktora.

Slika 5 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid, pri čemu je svaki egzogeni polipeptid sposoban za hvatanje antitela, npr., neželjenog antitela, npr., antitela protiv leka.

Slika 6 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji vezuje cilj, npr., antitelo, npr., neželjeno antitelo, npr. antitelo protiv leka, i drugi egzogeni polipeptid koji modifikuje cilj, npr. cepa cilj. Drugi egzogeni polipeptid može da sadrži proteazu kao što je IdeS.

Slika 7 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji vezuje cilj, npr., neželjeno antitelo protiv leka proizvedeno od strane subjekta u reakciji na lečenje lekom, drugi egzogeni polipeptid koji cepa cilj, i opcioni, treći egzogeni polipeptid koji sadrži terapeutski protein, npr. alternativu leku protiv kojeg subjekt proizvodi antitela protiv leka. Slika 8 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid sa terapeutskom aktivnošću (npr. molekul anti-CD40 antitela), drugi egzogeni polipeptid (npr. CD40 ili njegov fragment ili varijantu) koji inhibira prvi egzogeni polipeptid, i opciono, treći egzogeni polipeptid koji sadrži agens za ciljanje, npr. molekul anti-CD20 antitela.

Slika 9 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid sa prvim agensom za ciljanje i drugi egzogeni polipeptid sa drugim agensom za ciljanje.

Slika 10 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži antagonistu i/ili agonistu.

Slika 11 je dijagram ili eritroidna ćelija koja sadrži agens za ciljanje (npr. molekul anti-CD4 antitela) i unutrašnje punjenje (npr. IDO).

Slika 12 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji sadrži agens za ciljanje i drugi egzogeni polipeptid koji sadrži ciljni agonist.

Slika 13 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji sadrži agens za ciljanje (npr. molekul anti-BCMA antitela) i drugi egzogeni polipeptid koji sadrži agens za hvatanje.

Slika 14 je dijagram eritroidne ćelije koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji sadrži agens za ciljanje i drugi egzogeni polipeptid (npr. TRAIL) koji promoviše datu aktivnost, npr., apoptozu.

DETALJAN OPIS PRONALASKA

Definicije

[0057] Kako se ovde koristi, izraz "molekul antitela" se odnosi na protein, npr., lanac imunoglobulina ili njegov fragment, koji sadrži najmanje jednu sekvencu varijabilnog domena imunoglobulina. Izraz "molekul antitela" obuhvata antitela i fragmente antitela. U jednoj realizaciji, molekul antitela je multispecifičan molekul antitela, npr., molekul bispecifičnog antitela. Primeri molekula antitela uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, Fv fragmente, scFv fragmente antitela, disulfidno povezane Fvs (sdFv), Fd fragment koji se sastoji od VH i CH1 domena, linearna antitela, jednodomenska antitela kao što su sdAt (bilo VL ili VH), VHH domene kamile, multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela, kao što je bivalentni fragment koji sadrži dva Fab fragmenta povezana disulfidnim mostom u zglobnom regionu, izolovani epitop vezujući fragment antitela, maksitela, minitela, nanotela, intratela, dijatela, trijatela, tetratela, v-NAR i bis-scFv.

[0058] Kako se ovde koristi, "kombinovana terapija" ili "kombinovana primena" označava da se dva (ili više) različitih agenasa ili tretmana primenjuju kod subjekta kao deo režima lečenja za određenu bolest ili stanje. Režim lečenja uključuje doze i periodičnost primene svakog agensa tako da se efekti odvojenih agenasa na subjekta preklapaju. U nekim realizacijama, isporuka dva ili više agenasa je simultana ili istovremena i agensi mogu biti zajedno formulisani. U drugim realizacijama, dva ili više agenasa nisu zajedno formulisana i primenjuju se na sekvencijalni način kao deo propisanog režima. U nekim realizacijama, kombinovana primena dva ili više agenasa ili tretmana je takva da je smanjenje simptoma, ili drugog parametra u vezi sa poremećajem veće od onog koje bi bilo primećeno sa jednim agensom ili tretmanom koji se isporučuje samostalno ili u odsustvu drugog. Efekat dva tretmana može biti delimično aditivni, potpuno aditivni ili veći od aditivnog (npr. sinergistički). Uzastopna ili suštinski istovremena primena svakog terapeutskog agensa, može biti izvedena na bilo koji odgovarajući način uključujući, ali nije ograničena na, oralne puteve, intravenske puteve, intramuskularne puteve i direktnu apsorpciju preko mukoznih membrana tkiva. Terapeutski agensi mogu biti primenjeni istim putem ili različitim putevima. Na primer, prvi terapeutski agens iz kombinacije se može primeniti intravenskom injekcijom, dok drugi terapeutski agens iz kombinacije može biti primenjen oralno.

[0059] Izraz "koordinisan" ili "koordinisani način" označava da veći broj agenasa deluje zajedno da bi se obezbedila terapeutska korist. Tipovi koordinisane aktivnosti uključuju, aditivnu aktivnost agenasa, sinergističku aktivnost agenasa, multiplikativnu, nezavisnu funkciju, aktivnost zasnovanu na lokalizaciji, aktivnost zavisnu od blizine, baziranu na osnovi, multimer-baziranu i kompenzatornu aktivnost. U jednoj realizaciji, nivo terapeutske koristi koju daje veći broj egzogenih polipeptida isporučenih u istom enukleisanom eritrocitu je veći nego što bi se videlo da je svaki od mnoštva polipeptida isporučen iz različitih enukleisanih eritrocita.

[0060] Kako se ovde koristi, "enukleisana" se odnosi na ćeliju kojoj nedostaje jezgro, na primer, ćeliju koja je izgubila svoje jezgro kroz diferencijaciju u zrelo crveno krvno zrnce.

[0061] Kako se ovde koristi, izraz "egzogeni polipeptid" se odnosi na polipeptid koji nije proizveden od strane ćelije divljeg tipa tog tipa ili je prisutan na nižem nivou u ćeliji divljeg tipa nego u ćeliji koja sadrži egzogeni polipeptid. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid je polipeptid kodiran nukleinskom kiselinom koja je uvedena u ćeliju, a tu nukleinsku kiselinu ćelija opciono ne zadržava.

[0062] Kako se ovde koristi, izraz "multimodalna terapija" se odnosi na terapiju, npr. terapiju crvenih krvnih ćelija sa enukleacijom, koja obezbeđuje mnoštvo (npr. 2, 3, 4 ili 5 ili više) egzogenih agenasa (npr. polipeptida) koji imaju koordinisanu funkciju (npr. agens-aditivnu, agenssinergističku, multiplikativnu, nezavisnu funkcija, zasnovanu na lokalizaciji, zavisnu od blizine, zasnovanu na osnovi, baziranu na multimerima ili kompenzatornu aktivnost).

[0063] Kako se ovde koristi, izraz "put" ili "biološki put" odnosi se na mnoštvo bioloških molekula, npr. polipeptida, koji deluju zajedno na sekvencijalni način. Primeri puteva uključuju kaskade signalne transdukcije. U nekim realizacijama, put počinje detekcijom ekstracelularnog signala i završava se promenom transkripcije ciljnog gena. U nekim realizacijama, put počinje detekcijom citoplazmatskog signala i završava se promenom u transkripciji ciljnog gena. Put može biti linearan ili razgranat. Ako je razgranat, može imati mnoštvo ulaza (približavajući, konvergirajući) ili mnoštvo izlaza (divergirajući).

[0064] Kako se ovde koristi, molekul "zavisan od blizine" odnosi se na prvi molekul koji ima drugačiju, na primer, veću aktivnost kada je u blizini drugog molekula nego kada je sam. U nekim realizacijama, par liganada zavisnih od blizine snažnije aktivira nishodni faktor kada su ligandi u blizini nego kada su međusobno udaljeni.

[0065] Kako se ovde koristi, "receptorska komponenta" se odnosi na polipeptid koji funkcioniše kao receptor, sam ili kao deo kompleksa. Tako komponenta receptora obuhvata polipeptidni receptor i polipeptid koji funkcioniše kao deo receptorskog kompleksa.

[0066] Izraz "sinergija" ili "sinergistički" označava više nego aditivni efekat kombinacije dva ili više agenasa (npr. polipeptida koji su deo enukleisanih crvenih krvnih zrnaca) u poređenju sa njihovim pojedinačnim efektima. U određenim realizacijama, sinergistička aktivnost je više nego aditivni efekat enukleisanog crvenog krvnog zrnca koje sadrži prvi polipeptid i drugi polipeptid, u poređenju sa efektom enukleisanog crvenog krvnog zrnca koje sadrži prvi polipeptid i enukleisanog crvenog krvnog zrnca koje sadrži drugi polipeptid. U nekim realizacijama, sinergistička aktivnost je prisutna kada prvi agens proizvodi nivo izlaza X koji se može detektovati, drugi agens proizvodi nivo izlaza X koji se može detektovati, a prvi i drugi agens zajedno proizvode više nego dodatni nivo izlaza X.

[0067] Kako se ovde koristi, izraz polipeptidna "varijanta" se odnosi na polipeptid koji ima najmanje jednu razliku u sekvenci u poređenju sa tim polipeptidom, npr. jednu ili više supstitucija, insercija ili delecija. U nekim realizacijama, varijanta ima najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identitičnosti sa tim polipeptidom. Varijanta uključuje fragment. U nekim realizacijama, fragmentu nedostaje do 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20 ili 100 aminokiselina na N-kraju, C-kraju ili oba (svaki nezavisno), u poređenju sa celom dužinom polipeptida.

Primeri egzogenih polipeptida i njihova upotreba

[0068] U realizacijama, ovde opisani terapeutici crvenih krvnih ćelija sadrže jedan ili više (npr.2, 3, 4, 5, 6, 10 ili više) različitih egzogenih agenasa, npr., egzogene polipeptide, lipide ili male molekule. U nekim realizacijama, terapijski agens crvenih krvnih ćelija sadrži egzogeni fuzioni polipeptid koji sadrži dva ili više različitih proteina, ovde opisanih. U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija, npr., retikulocit, sadrži dva ili više različitih egzogenih polipeptida, ovde opisanih. U nekim realizacijama, jedan ili više (npr., svi) od egzogenih polipeptida su humani polipeptidi ili njihovi fragmenti ili varijante.

[0069] U nekim realizacijama, dva ili više polipeptida deluju na isti cilj, a u drugim realizacijama deluju na dve ili više različitih ciljeva. U nekim realizacijama, pojedinačni cilj ili veći broj ciljeva je odabran od endogenog humanog proteina ili rastvorljivog faktora (npr. polipeptid, mali molekul ili nukleinska kiselina bez ćelija).

[0070] Jedan ili više egzogenih proteina može imati post-translacione modifikacije karakteristične za eukariotske ćelije, na primer, ćelije sisara, npr., ćelije čoveka. U nekim realizacijama, jedan ili više (npr. 2, 3, 4, 5 ili više) egzogenih proteina su glikozilovani, fosforilisani ili oboje. In vitro detekcija glikoproteina se rutinski postiže na SDS-PAGE gelovima i Western blot-ovima korišćenjem modifikacije metode Periodic acid-Schiff (PAS). Ćelijska lokalizacija glikoproteina može se postići korišćenjem lektinskih fluorescentnih konjugata poznatih u tehnici. Fosforilacija se može proceniti Western blot-om korišćenjem fosfospecifičnih antitela.

[0071] Post-translacione modifikacije takođe, uključuju konjugaciju sa hidrofobnom grupom (npr. miristoilaciju, palmitoilaciju, izoprenilaciju, prenilaciju ili glipijaciju), konjugaciju sa kofaktorom (npr. lipoilacija, flavin ostatak (npr. FMN ili FAD), heme C vezivanje, fosfopanteteinilacija, ili formiranje retiniliden Šifove baze), formiranje diftamida, vezivanje etanolamina sa fosfoglicerolom, formiranje hipuzina, acilacija (npr. O-acilacija, N-acilacija ili S-acilacija), formilacija, acetilacija, alkilacija (npr. metilacija ili etilacija), amidacija, butirilacija, gamakarboksilacija, malonilacija, hidroksilacija, jodovanje, dodavanje nukleotida kao što su ADP-ribozilacija, oksidacija , formiranje fosfatnog estra (O-vezanog) ili fosforamidata (N-povezanog), (npr. fosforilacija ili adenililacija), propionilacija, formiranje piroglutamata, S-glutationilacija, S-nitrozilacija, sukcinilacija, sulfatizacija, ISGilacija, SUMOilacija, ubikvitinacija, nedilacija ili hemijska modifikacija aminokiseline (npr. citrulinacija, deamidacija, eliminilacija ili karbamilacija), formiranje disulfidnog mosta, racemizacija (npr. prolina, serina, alanina ili metionina). U realizacijama, glikozilacija uključuje dodavanje glikozilne grupe argininu, asparaginu, cisteinu, hidroksilizinu, serinu, treoninu, tirozinu ili triptofanu, što rezultira glikoproteinom. U realizacijama, glikozilacija obuhvata, npr., O-vezanu glikozilaciju ili N-vezanu glikozilaciju.

[0072] U nekim realizacijama, jedan ili više egzogenih polipeptida je fuzioni protein, npr., fuzija je sa endogenim proteinom crvenih krvnih ćelija ili njegovim fragmentom, npr. transmembranskim proteinom, npr. GPA ili njegovim transmembranskim fragmentom. U nekim realizacijama, jedan ili više egzogenih polipeptida je fuzionisano sa domenom koji promoviše dimerizaciju ili multimerizaciju, npr., sa drugim fuzionim egzogenim polipeptidom, koji opciono sadrži domen dimerizacije. U nekim realizacijama, domen dimerizacije obuhvata deo molekula antitela, npr. Fc domen ili CH3 domen. U nekim realizacijama, prvi i drugi domen dimerizacije obuhvataju mutacije „knob-in-hole“ (npr., T366Y ručku i Y407T otvor) za promovisanje heterodimerizacije.

[0073] Primer humanog polipeptida, npr., humanog polipeptida izabranog iz bilo koje od tabela 1-4, uključuje:

a) prirodni oblik humanog polipeptida, npr., prirodni oblik humanog polipeptida koji nije povezan sa bolesnim stanjem;

b) humani polipeptid koji ima sekvencu koja se pojavljuje u bazi podataka, npr. u bazi podataka GenBank, 11. januara 2017. godine, na primer prirodni oblik humanog polipeptida koji nije povezan sa bolesnim stanjem čija se sekvenca pojavljuje u bazi podataka, npr. baza podataka GenBank, 11. januara 2017;

c) humani polipeptid koji ima sekvencu koja se ne razlikuje za više od 1, 2, 3, 4, 5 ili 10 aminokiselinskih ostataka od sekvence a) ili b);

d) humani polipeptid koji ima sekvencu koja se ne razlikuje za više od 1, 2, 3, 4, 5 ili 10% njegovih aminokiselinskih ostataka iz sekvence a) ili b);

e) humani polipeptid koji ima sekvencu koja se suštinski ne razlikuje od sekvence a) ili b); ili f) humani polipeptid koji ima sekvencu c), d) ili e) koji se ne razlikuje suštinski u biološkoj aktivnosti, npr. enzimskoj aktivnosti (npr. specifičnosti ili obrtu) ili aktivnosti vezivanja (npr. specifičnosti ili afinitetu vezivanja) od humanog polipeptida koji ima sekvencu a) ili b). Peptidi-kandidati pod f) mogu biti izrađeni i praćeni na sličnu aktivnost, kao što je ovde opisano i bili bi ekvivalentni u nastavku ako su eksprimirani u enukleisanim eritrocitima, kao što je ovde opisano).

[0074] U realizacijama, egzogeni polipeptid obuhvata humani polipeptid ili njegov fragment, npr. ceo ili fragment humanog polipeptida od a), b), c), d), e) ili f) iz prethodnog paragrafa. U jednoj realizaciji, egzogeni polipeptid sadrži fuzioni polipeptid koji sadrži ceo ili fragment humanog polipeptida od a), b), c), d), e) ili f) iz prethodnog pasusa i dodatne aminokiselinske sekvence. U jednoj realizaciji, dodatna aminokiselinska sekvenca obuhvata ceo ili fragment humanog polipeptida od a), b), c), d), e) ili f) iz prethodnog pasusa za različiti humani polipeptid.

[0075] Pronalazak predviđa da se funkcionalni fragmenti ili njihove varijante (npr. fragment koji se vezuje za ligand ili njegova varijanta receptora navedenih u tabelama 1-4) mogu napraviti i pregledati na sličnu aktivnost, kao što je ovde opisano i da bi bili ekvivalentni u nastavku ako su izraženi u eritrocitima sa enukleacijom, kao što je ovde opisano).

[0076] U realizacijama, dva ili više egzogenih agenasa (npr. polipeptidi) imaju srodne funkcije koje su agens-aditivne, agens-sinergističke, multiplikativne, nezavisne funkcije, zasnovane na lokalizaciji, zavisne od blizine, zasnovane na podlozi, zasnovane na multimerima ili kompenzatorne, kao što je ovde opisano. U nekim realizacijama, više od jednog od ovih opisa se primenjuje na dati RBC.

Agens-aditivne konfiguracije

[0077] Kada su dva ili više agenasa (npr. polipeptidi) aditivni agens, efekat agenasa koji deluju zajedno je veći od efekta bilo kog agensa koji deluje samostalno. U jednom izvođenju, dva agensa imaju različite (npr. komplementarne) funkcije u eritrocitu (npr. na površini eritrocita) i deluju zajedno da bi imali jači efekat (u poređenju sa bilo kojim od agenasa koji deluju samostalno), npr., veći afinitet vezivanja za cilj, ili veći stepen modulacije signalne transdukcije od strane cilja, npr. jednog cilja. U nekim realizacijama, dva ili više agenasa se vezuju za istu metu, npr., za različite epitope unutar istog ciljnog proteina.

[0078] U jednoj realizaciji, agensi su povezani jedan sa drugim, npr., članovi su heterodimernog kompleksa. U jednoj realizaciji, agensi imaju veći aviditet za metu kada deluju zajedno nego kada deluju samostalno.

[0079] U nekim realizacijama, dva ili više agenasa omogućavaju čvršće vezivanje za cilj nego bilo koji od agenasa samostalno. U nekim realizacijama, heterodimer receptorskih komponenata, npr., komponente citokinskih receptora, npr. komponente interleukinskih receptora, npr. komponente IL-1 receptora, vezuju se za cilj, npr., IL-1, sa većim afinitetom nego bilo koja receptorska komponenta samostalno. Mnoge signalne molekule formiraju heterodimere ili heteromultimere na površini ćelije da bi se vezali za svoj ligand. Citokinski receptori, na primer, mogu biti heterodimeri ili heteromultimeri. Na primer, IL-2 receptor sadrži tri različita molekula: IL2Ra, IL2Rb i IL2Rg. IL-13 receptor je heterodimer od IL13Ra i IL4R. IL-23 receptor je heterodimer IL23R i IL 12Rb1. TNFa receptor je, u realizacijama, heterodimer TNFR1 i TNFR2. U nekim realizacijama, jedan ili više egzogenih polipeptida sadrži citokin iz Tabele 1, ili fragment koji se vezuje za receptor citokina ili njegovu varijantu. Izraženi citokini tipično imaju sekvencu humanog receptora divljeg tipa ili njenu varijantu ili fragment koji je u stanju da se vezuje i signalizira preko svog ciljnog receptora. Tabela citokina i njihovih receptora je data u tabeli 1. Citokini mogu biti prisutni na površini eritrocita.

Tabela 1. Citokini i receptori

(nastavak)

[0080] U nekim realizacijama agensi su različiti molekuli koji vezuju antitela, npr., molekuli koji vezuju Fc, za hvatanje antitela u cirkulaciji, npr., antitela protiv lekova. U realizacijama, agensi nisu kompetitivni jedan sa drugim da bi omogućili vezivanje većeg afiniteta pojedinačnih antitela ili opsonizovanih čestica. Na primer, u realizacijama, jedan ili više agenasa je izabrano između proteina A, Fc receptora 1 (FcR1), FcR2a, FcR2b, FcR3, FcR4, FcRn (neonatalni Fc receptor) ili fragmenta koji se vezuje za antitelo ili njegove varijante.

[0081] U nekim realizacijama meta je cirkulišuća ćelija raka, npr. kancerogena B ćelija, T ćelija, limfoidna ćelija ili cirkulišuća tumorska ćelija (CTC). U realizacijama, projektovana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) se koristi da uhvati ćeliju raka i ukloni je iz cirkulacije. Na primer, jedan ili više agenasa se vezuju za različite proteine na površini ćelije da bi poboljšali specifičnost terapije. Na primer, agensi sadrže molekule anti-EPCAM i anti CD45 antitela za hvatanje CTC, ili molekule anti-CD19 i anti-CD20 antitela za hvatanje akutnih leukemijskih ćelija B ćelijske loze.

[0082] Enukleisana eritroidna ćelija može da sadrži prvi egzogeni polipeptid koji intereaguje sa metom (npr. antitelo protiv leka) i drugi egzogeni polipeptid (npr. proteazu, npr. IdeS) koji modifikuje metu. U realizacijama, eritroidna ćelija se daje subjektu, na primer, subjektu koji ima rak, npr., kancer koji je ovde opisan.

[0083] U realizacijama, efikasna količina enukleisanih eritroidnih ćelija koje sadrže prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid je manja (npr. manja za 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% ili 99,99%) od efikasne količine inače sličnih enukleisanih eritroidnih ćelija kojima nedostaje prvi egzogeni polipeptid ili nedostaje drugi egzogeni polipeptid. U realizacijama, unapred izabrana količina je efikasna doza ili in vitro efikasna količina enukleisanih eritroidnih ćelija. U realizacijama, prethodno izabrana količina (npr. in vitro efikasna količina) je količina koja je efikasna u ispitivanju, npr. da konvertuje najmanje 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ili 90% supstrata u proizvodnji u unapred odabranom vremenskom periodu, npr.1, 2, 3, 4, 5 ili 6 sati. U realizacijama, unapred odabrana količina (npr., in vitro efikasna količina) je efikasna za cepanje najmanje 50% ciljnog antitela za 5 sati. Test može da meri, npr., smanjenje nivoa rastvorljivog, nemodifikovanog (npr. necepljenog) cilja u rastvoru.

[0084] U realizacijama, referentna vrednost za ciljeve je broj ciljeva u perifernoj krvi subjekta u periodu primene. U realizacijama (npr., realizacijama koje uključuju in vitro efikasnu količinu ćelija) referentna vrednost za ciljeve je broj ciljeva u reakcionoj smeši za ispitivanje.

Prvi egzogeni polipeptid (npr. vezivni agens)

[0085] Prvi egzogeni polipeptid može da veže cilj. U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži vezujući domen koji prepoznaje antitelo, npr., antitelo protiv leka.

[0086] U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži vezujući domen i domen učvršćenja membrane (npr. transmembranski domen, npr., tip I ili tip II transmembranski domen crvenih krvnih ćelija). U realizacijama, domen učvršćenja membrane je C-terminalni ili N-terminalni domen modifikatora (npr. proteaze). U realizacijama, transmembranski domen sadrži GPA ili njegov transmembranski deo, na primer, kao što je navedeno u SEK ID BR: 9 ovde ili njegov transmembranski deo, ili polipeptid koji ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa bilo kojim od gore navedenog. U realizacijama, GPA polipeptid je C-terminal domena vezivanja.

[0087] U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži adresirani deo ili deo za ciljanje koji je opisan u WO2007030708, npr. na stranama 34-45 u njemu.

[0088] Drugi primeri proteina koji se mogu prikladno prilagoditi za upotrebu kao prvi egzogeni polipeptid, obuhvataju domene receptora koji se vezuju za ligand, kao što je kada je cilj receptorski ligand. Suprotno tome, prvi egzogeni polipeptid može da sadrži receptorski ligand, gde je meta receptor. Ciljni ligand može biti polipeptid ili mali molekulski ligand.

[0089] U daljem izvođenju, prvi egzogeni polipeptid može da sadrži domen izveden od polipeptida koji ima prevoj sličan imunoglobulinu, kao što je 10. tip III domena humanog fibronektina („Fn3“). Videti US Pat. br.6,673,901; 6,462,189. Fn3 je mali (oko 95 ostataka), monomerni, rastvorljiv i stabilan. Ne sadrži disulfidne veze koje omogućavaju poboljšanu stabilnost u smanjenom okruženju. Struktura se može opisati kao beta-sendvič slična onoj kod At VH domena, osim što Fn3 ima sedam beta-lanaca umesto devet. Postoje tri petlje na svakom kraju Fn3; a pozicije tri od ovih petlji odgovaraju onima od CDR1, 2 i 3 VH domena. Fn3 sekvenca od 94 aminokiseline je: VSDVPRDLEWAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPG SKST-ATISGLKPGVDYTITGYAVTGRGDSPASSKPISINYRT (SEK ID BR: 18)

[0090] Aminokiselinski položaji CDR-nalik petlji biće definisani kao ostaci 23-30 (BC petlja), 52-56 (DE petlja) i 77-87 (FG petlja). Shodno tome, jedna ili više petlji sličnih CDR-u, mogu biti modifikovane ili randomizovane, da bi se generisala biblioteka Fn3 vezujućih domena koji se zatim mogu pregledati za vezivanje za željeno adresirano mesto vezivanja. Videti takođe PCT publikaciju WO0232925. Fn3 je primer velike podfamilije superfamilije imunoglobulina (IgSF). Familija Fn3 uključuje molekule ćelijske adhezije, receptore hormona i citokina na površini ćelije, prateće i domene koji se vezuju za ugljene hidrate, a svi oni takođe, mogu biti prilagođeni za upotrebu kao vezivni agensi. Pored toga, struktura DNK vezujućih domena transkripcionog faktora NF-kB je takođe blisko povezana sa Fn3 prevojem i takođe, može biti prilagođena za upotrebu kao vezivno sredstvo. Slično, serumski albumin, kao što je albumin humanog seruma, sadrži pregib nalik imunoglobulinu koji se može prilagoditi za upotrebu kao ciljni deo.

[0091] U još drugim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid može da sadrži konstruisanu polipeptidnu sekvencu koja je odabrana, npr., sintetički razvijena, na osnovu njene kinetike i selektivnosti za vezivanje za upućeno mesto. U realizacijama, sekvenca prvog egzogenog polipeptida je dizajnirana korišćenjem metode skrininga ili selekcije, na primer, praćenjem fagnog prikaza ili dvohibridnog kvasca.

[0092] U nekim realizacijama, prvi egzogeni polipeptid sadrži peptidni ligand za rastvorljivi receptor (i opciono cilj sadrži rastvorljivi receptor), sintetički peptid koji vezuje cilj, regulatorni domen komplementa (i opciono cilj sadrži faktor komplementa), ili ligand za receptor ćelijske površine (i opciono cilj obuhvata receptor ćelijske površine).

Drugi egzogeni polipeptid (npr. proteaza)

[0093] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid (koji modifikuje cilj) je faktor naveden u Tabeli 4. U nekim realizacijama, proteaza je jedna proteaza navedena u Tabeli 4. U realizacijama, proteaza je jedna bakterijska proteaza, humana proteaza, ili biljna proteaza, ili njen fragment ili varijanta.

[0094] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid (koji modifikuje cilj) je jedna proteaza. Primeri proteaza uključuju one klasifikovane kao aminopeptidaze; dipeptidaze; dipeptidil-peptidaze i tripeptidil peptidaze; peptidil-dipeptidaze; serinski tip karboksipeptidaze; metalokarboksipeptidaze; karboksipeptidaze cisteinskog tipa; omegapeptidaze; serinske proteinaze; cisteinske proteinaze; asparaginske proteinaze; metaloproteinaze; ili proteinaze nepoznatog mehanizma.

[0095] Aminopeptidaze uključuju citozol aminopeptidazu (leucil aminopeptidazu), membransku alanil aminopeptidazu, cistinil aminopeptidazu, tripeptid aminopeptidazu, prolil aminopeptidazu, arginil aminopeptidazu, glutamil aminopeptidazu, x-pro aminopeptidazu, bakterijsku leucil aminopeptidazu, termofilnu aminopeptidazu, klostridijalnu aminopeptidazu, citozol alanilnu aminopeptidazu, lizil aminopeptidazu, x-trp aminopeptidazu, triptofanil aminopeptidazu, metionil aminopeptidazu, d-stereospecifičnu aminopeptidazu i aminopeptidazu. Dipeptidaze uključuju xhis dipeptidazu, x-arg dipeptidazu, x-metil-his dipeptidazu, cis-gli dipeptidazu, glu-glu dipeptidazu, pro-x dipeptidazu, x-pro dipeptidazu, met-x dipeptidazu, ne-stereo specifičnu dipeptidazu, citozolnu nespecifičnu dipeptidazu, membransku dipeptidazu i beta-ala-his dipeptidazu. Dipeptidil-peptidaze i tripeptidil peptidaze uključuju dipeptidil-peptidazu I, dipeptidil-peptidazu II, dipeptidil-peptidazu III, dipeptidil-peptidazu IV, dipeptidil-dipeptidazu, tripeptidil-peptidazu I i tripeptidil-peptidazu II. Peptidil-dipeptidaze uključuju peptidildipeptidazu A i peptidil-dipeptidazu B. Karboksipeptidaze serinskog tipa uključuju lizozomalnu pro-x karboksipeptidazu, serinski tip D-ala-D-ala karboksipeptidaze, karboksipeptidazu C i karboksipeptidazu D. Metalokarboksipeptidaze uključuju karboksipeptidazu A, karboksipeptidazu B, lizin(arginin) karboksipeptidazu, gli-X karboksipeptidazu, alanin karboksipeptidazu, muramoilpentapeptid karboksipeptidazu, karboksipeptidazu H, glutamat karboksipeptidazu, karboksipeptidazu M, muramoiltetrapeptid karboksipeptidazu, cink D-ala-D-ala karboksipeptidazu, karboksipeptidazu A2, membransku pro-x karboksipeptidazu, tubulinil-tir karboksipeptidazu i karboksipeptidazu T. Omegapeptidaze uključuju acilaminoacil-peptidazu, peptidil-glicinamidazu, piroglutamil-peptidazu I, beta-aspartil-peptidazu, piroglutamil-peptidazu II, n-formilmetionil-peptidazu, pteroilpoli-[gama]-glutamat karboksipeptidazu, gama-glu-X karboksipeptidazu i acilmuramoil-ala peptidazu. Serinske proteinaze uključuju himotripsin, himotripsin C, metridin, tripsin, trombin, faktor koagulacije Xa, plazmin, enteropeptidazu, akrozin, alfa-litičku proteazu, glutamil, endopeptidazu, katepsin G, faktor koagulacije VIla, faktor koagulacije IXa, kukumizi, prolil oligopeptidazu, faktor koagulacije XIa, brahiurin, kalikrein plazme, tkivni kalikrein, elastazu pankreasa, elastazu leukocita, faktor koagulacije XIIa, himazu, komponentu komplementa clr55, komponentu komplementa cls55, konvertazu klasičnokomplementarnog puta c3/c5, komplementarni faktor I, komplementarni faktor D, konvertazu alternativno-komplementarnog puta c3/c5, cerevizin, hipodermin C, lizil endopeptidazu, endopeptidazu 1a, gama-reni, venombin AB, leucil endopeptidazu, triptazu, skutelarin, keksin, subtilizin, orizin, endopeptidazu K, termomikolin, termitazu, endopeptidazu SO, aktivator T-plazminogena, protein C, pankreasnu endopeptidazu E, pankreasnu elastazu II, IGA-specifičnu serinsku endopeptidazu, U-plazminogen, aktivator, venombin A, furin, mijeloblastin, semenogelazu, granzim A ili citotoksičnu T-limfocitnu proteinazu 1, granzim B ili citotoksičnu T-limfocitnu proteinazu 2, streptogrizin A, treptogrizin B, glutamil endopeptidazu II, oligopeptidazu B, faktor C za zgrušavanje limulusa, faktor za zgrušavanje limulusa, enzim za zgrušavanje limulusa, omptin, represor lexa, lidersku bakterijsku peptidazu I i togavirin, flavirin. Cisteinske proteinaze uključuju katepsin B, papain, ficin, himopapain, asklepain, klostripain, streptopain, aktinid, katepsin 1, katepsin H, kalpain, katepsin T, glicil, endopeptidazu, prokoagulans kancera, katepsin S, pikornain 3C, pikornain 2A, karikain, anain, bromelain iz stabljike, bromelain iz voća, legumain, histolizain i enzim za pretvaranje interleukina 1-beta. Asparaginske proteinaze uključuju pepsin A, pepsin B, gastriksin, himozin, katepsin D, neopentezin, renin, retropepsin, proopiomelanokortin konvertujući enzim, aspergilopepsin I, aspergilopepsin II, penicilopepsin, rizopuspepsin, endotiapepsin, mukoropepsin, kandidapepsin, saharopepsin, rodotorulapepsin, fizaropepsin, akrocilindropepsin, poliporopepsin, piknoporopepsin, scitalidopepsin A, scitalidopepsin B, ksantomonapepsin, katepsin E, barijerpepsin, bakterijsku vodeću peptidazu I, pseudomonapepsin i plazmepsin. Metaloproteinaze uključuju atrolizin A, mikrobnu kolagenazu, leukolizin, intersticijalnu kolagenazu, neprilizin, envelizin, IgA-specifičnu metaloendopeptidazu, prokolagen N-endopeptidazu, timet oligopeptidazu, neurolizin, stromelizin 1, meprin A, prokolagen C-endopeptidazu, peptidil-liz metaloendopeptidazu, astacin, stromelizin 2, matrilizin gelatinazu, aeromonolizin, pseudolizin, termolizin, bacilolizin, aureolizin, kokolizin, mikolizin, beta-litičku metaloendopeptidazu, peptidil-asp metaloendopeptidazu, neutrofilnu kolagenazu, gelatinazu B, leishmanolizin, saharolizin, autolizin, deuterolizin, seralizin, atrolizin B, atrolizin C, atroksazu, atrolizin E, atrolizin F, adamalizin, horilizin, ruberlizin, botropazin, botrolizin, ofiolizin, trimerelizin I, trimerelizin II, mukrolizin, pitrilizin, insulizin, O-sijaloglikoproteinsku endopeptidazu, ruselizin, mitrohondrijsku, intermedijernu, peptidazu, daktilizin, nardilizin, magnolizin, meprin B, peptidazu za obradu mitohondrija, makrofagnu elastazu, horiolizin i toksilizin. Proteinaze nepoznatog mehanizma uključuju termopsin i multikatalitički endopeptidazni kompleks. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži fragment ili varijantu bilo kog od prethodno navedenih.

[0096] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži IdeS polipeptid. U nekim realizacijama, IdeS polipeptid sadrži sekvencu niže navedenu kao SEK ID BR: 8 ili proteolitički aktivan fragment sekvence od SEK ID BR: 8 (npr. fragment od najmanje 100, 150, 200, 250 ili 300 aminokiselina) ili sekvencu koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa bilo kojim od prethodno navedenih. U nekim realizacijama koje uključuju nukleinske kiseline, nukleinska kiselina kodira IdeS polipeptid koji ima sekvencu datu niže kao SEK ID BR: 8, ili njegov proteolitički aktivan fragment, ili sekvencu koja ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa bilo kojim od prethodno navedenih.

[0097] IdeS polipeptid:

(SEK ID BR: 8)

[0098] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži domen modifikatora (npr. domen proteaze, npr. IdeS polipeptid) i membranski učvršćeni domen (npr. transmembranski domen, npr., tip I ili tip II transmembranski domen crvenih krvnih ćelija). U realizacijama, domen usidrenja membrane je C-terminalni ili N-terminalni domen modifikatora (npr. proteaze). U realizacijama, transmembranski domen obuhvata GPA ili njegov transmembranski deo. U realizacijama, GPA polipeptid ima sekvencu od:

ili njegov transmembranski deo, ili polipeptid koji ima najmanje 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa bilo kojim od prethodno navedenih. U realizacijama, GPA polipeptid je C-terminal domena modifikatora (npr. proteaze).

[0099] U nekim realizacijama, linker je raspoređen između IdeS polipeptida i transmembranskog polipeptida, npr., linker glicin-serin, npr., linker koji sadrži sekvencu GGSGGSGG (SEK ID BR: 10) i/ili GGGSGGGS (SEK ID BR: 11).

[0100] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid, npr. drugi egzogeni polipeptid, npr. proteaza, npr. IdeS polipeptid, sadrži vodeću sekvencu, npr. GPA vodeću sekvencu, npr. MYGKIIFVLLLS EIVSISA (SEK ID BR: 12).

[0101] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid, npr., drugi egzogeni polipeptid dalje sadrži oznaku, npr. HA oznaku ili FLAG oznaku.

[0102] U nekim realizacijama, proteaza (npr. enzim za razgradnju imunoglobulina, npr. enzim za razgradnju imunoglobulina-G, npr. IdeS) cepa imunoglobulin u zglobnom regionu, CH2 regionu ili između šarke i CH2 regiona. U realizacijama, proteaza cepa imunoglobulin u jednoj od sekvenci ispod, npr., između dva glicina označena kurzivom ili alanina i glicina označena kurzivom u nižim sekvencama.

Humana IgG1 šarke/CH2 sekvenca CPPCPAPELLGGPSVF (SEK ID BR: 13)

Humana IgG2 šarke/CH2 sekvenca CPPCPAPPVAGPSVF (SEK ID BR: 14)

Humana IgG3 šarke/CH2 sekvenca CPRCPAPELLGGPSVF (SEK ID BR: 15)

Humana IgG4 šarke/CH2 sekvenca AHHAQAPEFLGGPSVF (SEK ID BR: 16)

[0103] U realizacijama, proteaza (npr., bakterijska proteaza) cepa IgG, npr., IdeS ili IgA proteaza.

[0104] U realizacijama, proteaza (npr. proteaza iz familije papaina, npr. papain) cepa imunoglobulin između Fc i Fab regiona, npr. vezu histidin-treonin između položaja 224 i 225 teškog lanca i/ili vezu glutaminske kiseline-leucina između položaja 233 i 234 teškog lanca.

[0105] U realizacijama, proteaza ili drugi modifikator deluje na cilj naveden u Tabeli 4.

[0106] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži katalitički deo opisan u WO2007030708, na primer, na str. 45-46.

[0107] Drugi egzogeni polipeptid može da sadrži deo sposoban da deluje na cilj da indukuje hemijsku promenu, čime moduliše njegovu aktivnost, na primer, deo sposoban da katalizuje reakciju unutar cilja. Drugi egzogeni polipeptid može sadržati enzim koji se javlja u prirodi, njegov aktivni (npr. katalitički aktivan) fragment ili konstruisani enzim, na primer, protein projektovan da ima enzimsku aktivnost, kao što je protein dizajniran da sadrži aktivni motiv serinske proteaze. Katalitički domen drugog egzogenog polipeptida može da sadrži raspored aminokiselina koje su efikasne da indukuju željenu hemijsku promenu u cilju. One mogu biti N-terminalne ili C-terminalne skraćene verzije prirodnih enzima, mutirane verzije, zimogeni ili kompletni globularni domeni.

[0108] Drugi egzogeni polipeptid može da sadrži enzimski aktivno mesto koje je samo slobodno, vezujući se za mesto cepanja koje prepoznaje na mnogim različitim biomolekulima, i može imati relativno lošu reakcionu kinetiku. U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid obezbeđuje ili poboljšava specifičnost povećanjem lokalne koncentracije cilja u blizini drugog egzogenog polipeptida.

[0109] Drugi egzogeni polipeptid može, u realizacijama, modifikovati cilj tako da bude prepoznat i na njega deluje drugi enzim (npr. enzim koji je već prisutan kod subjekta). U jednoj realizaciji, drugi egzogeni polipeptid sadrži deo koji menja strukturu cilja tako da je njegova aktivnost inhibirana ili povećana. Mnogi enzimi koji se pojavljuju u prirodi aktiviraju druge enzime, i oni se mogu koristiti u skladu sa ovde opisanim kompozicijama i metodama.

[0110] Drugi egzogeni polipeptid može da sadrži proteazu, glikozidazu, lipazu ili druge hidrolaze, amidazu (npr. N-acetilmuramoil-L-alanin amidazu, PGRP-L amidazu) ili drugu enzimsku aktivnost, uključujući izomeraze, transferaze (uključujući kinaze), liaze, oksidoreduktaze, oksidaze, aldolaze, ketolaze, glikozidaze, transferaze i slično. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži humani lizozim, funkcionalni deo humanog lizozima, humani PGRP-L, funkcionalni deo humanog PGRP-L, fosfolipazu A2, funkcionalni deo fosfolipaze A2 ili ekstracelularni enzim matriksne metaloproteinaze (MMP), kao što je MMP-2 (želatinaza A) ili MMP-9 (želatinaza B).

[0111] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je serinska proteinaza, na primer, iz familije himotripsina koja uključuje enzime sisara kao što su himotripsin, tripsin ili elastaza ili kalikrein, ili familije substilizina koja uključuje bakterijske enzime kao što je subtilizin. Opšta trodimenzionalna struktura je različita kod dve familije, ali imaju istu geometriju aktivnog mesta i kataliza se odvija putem istog mehanizma. Serinske proteinaze ispoljavaju različite specifičnosti supstrata koje su povezane sa aminokiselinskim supstitucijama u različitim enzimskim sublokacijama u interakciji sa supstratnim ostacima. Tri ostatka koja formiraju katalitičku trijadu su važna u katalitičkom procesu: His-57, Asp-102 i Ser-195 (numeracija himotripsinogena).

[0112] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je cisteinska proteinaza koja uključuje biljne proteaze, kao što su papain, aktinidin ili bromelain, nekoliko lizozomalnih katepsina sisara, citozolne kalpaine (aktivirane kalcijumom) i nekoliko parazitskih proteaza (npr. Trypanosoma, Schistosoma). Papain je arhetip i najbolje proučavan član familije. Kao i serinske proteinaze, kataliza se odvija kroz formiranje kovalentnog intermedijera i uključuje cisteinteinski i histidinski ostatak. Esencijalni Cis-25 i His-159 (numerisanje papaina) igraju istu ulogu kao Ser-195 i His-57, respektivno. Nukleofil je tiolatni jon, a ne hidroksilna grupa. Tiolatni jon je stabilizovan formiranjem jonskog para sa susednom imidazolijum grupom His-159. Nukleofil koji napada je jonski par tiolat-imidazolijum u oba koraka i tada molekul vode nije potreban.

[0113] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je asparaginska proteinaza, od kojih većina pripada familiji pepsina. Familija pepsina uključuje digestivne enzime kao što su pepsin i himozin, kao i lizozomalne katepsine D, enzime za obradu kao što su renin i određene gljivične proteaze (penicilopepsin, rizopuspepsin, endotiapepsin). Druga familija obuhvata virusne proteinaze, kao što je proteaza virusa SIDE (HIV-a) koja se takođe naziva retropepsin. Za razliku od serinskih i cisteinskih proteinaza, kataliza asparaginskim proteinazama ne uključuje kovalentni intermedijer, iako postoji tetraedarski intermedijer. Nukleofilni napad se postiže sa dva istovremena transfera protona: jednim sa molekula vode na dijadu od dve karboksilne grupe i drugim sa dijade na karbonilni kiseonik supstrata sa istovremenim cepanjem CO-NH veze. Ova opšta kiselo-bazna kataliza, koja se može nazvati "push-pull" mehanizam dovodi do formiranja nekovalentnog neutralnog tetraedarskog intermedijera.

[0114] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je jedna metaloproteinaza, koja se može naći u bakterijama, gljivama kao i u višim organizmima. Oni se veoma razlikuju po svojim sekvencama i strukturi, ali velika većina enzima sadrži atom cinka (Zn) koji je katalitički aktivan. U nekim slučajevima, cink se može zameniti drugim metalom kao što je kobalt ili nikl bez gubitka aktivnosti. Bakterijski termolizin je dobro okarakterisan i njegova kristalografska struktura ukazuje da je cink vezan pomoću dva histidina i jedne glutaminske kiseline. Mnogi enzimi sadrže sekvencu HEXXH, koja obezbeđuje dva histidinska liganda za cink, dok je treći ligand ili glutaminska kiselina (termolizin, neprilizin, alanil aminopeptidaza) ili histidin (astacin). Druge familije pokazuju različiti način vezivanja atoma Zn. Katalitički mehanizam dovodi do formiranja nekovalentnog tetraedarskog intermedijera nakon napada molekula vode vezanog za cink na karbonilnu grupu raskinute veze. Ovaj intermedijer se dalje razlaže prenosom protona glutaminske kiseline u odlazeću grupu.

[0115] U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži izomerazu (npr. izomerazu koja prekida i formira hemijske veze ili katalizuje konformacionu promenu). U realizacijama, izomeraza je racemaza (npr. aminokiselinska racemaza), epimeraza, cis-trans izomeraza, intramolekularna oksidoreduktaza, intramolekularna transferaza ili intramolekularna liaza.

[0116] U realizacijama, druga egzogena proteaza sadrži pratioca. Na primer, pratilac može biti opšti pratilac (npr. GRP78/BiP, GRP94, GRP170), lektinski pratilac (npr. kalneksin ili kalretikulin), neklasični molekularni pratilac (npr. HSP47 ili ERp29), preklapajući pratilac (npr. PDI, PPI ili ERp57), bakterijski ili arhealni pratilac (npr. Hsp60, GroEL/GroES kompleks, Hsp70, DnaK, Hsp90, HtpG, Hsp100, Clp familija (npr. ClpA i ClpX), Hsp104). U realizacijama, enukleisani eritrocit sadrži ko-pratioca, npr. imunofilin, Sti1, p50 (Cdc37) ili Aha1. U realizacijama, molekularni pratilac je šaperonin.

[0117] Kandidati za drugi egzogeni protein (koji modifikuje metu) mogu biti pregledani na osnovu njihove aktivnosti. U zavisnosti od specifične aktivnosti svakog molekula koji se ispituje, može se koristiti odgovarajući test za taj molekul. Na primer, ako je drugi egzogeni protein proteaza, test koji se koristi za skrining proteaze može biti test za otkrivanje proizvoda cepanja generisanog pomoću proteaze, na primer, test zasnovan na hromatografiji ili gel elektroforezi.

[0118] U jednom primeru, drugi egzogeni polipeptid može imati aktivnost kinaze. Test za aktivnost kinaze bi mogao da izmeri količinu fosfata koji je kovalentno ugrađen u cilj od interesa.

Na primer, fosfat ugrađen u metu od interesa može biti radioizotop fosfata koji se može kvantifikovati merenjem emisije zračenja korišćenjem scintilacionog brojača.

Ciljevi i indikacije

[0119] U realizacijama, cilj je meta navedena u Tabeli 4.

[0120] U realizacijama, meta je molekul imunološke kontrolne tačke izabran između PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (npr. CEACAM-1, CEACAM-3 i/ili CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1 , CD160, 2B4 ili TGF beta. U realizacijama, meta je inhibitorni ligand naveden u Tabeli 3, a prvi egzogeni polipeptid opciono, sadrži vezujući domen iz odgovarajućeg ciljnog receptora iz Tabele 3. U nekim realizacijama, meta je ciljni receptor iz Tabele 3, a prvi egzogeni polipeptid opciono sadrži vezujući domen iz odgovarajućeg inhibitornog liganda iz Tabele 3. U nekim realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži proteazu koja cepa molekul kontrolne tačke imunog sistema, npr. tripsin. U realizacijama, npr., za lečenje kancera, T ćelija se aktivira ili sprečava da bude inaktivirana, na primer, kontaktiranjem njenog receptora (npr. receptora iz Tabele 3) sa molekulom koji blokira inhibiciju T ćelija.

[0121] U realizacijama, meta je antitelo, npr. humano antitelo.

[0122] Ovde opisane projektovane eritroidne ćelije takođe se mogu koristiti za lečenje subjekta koji ima antitela protiv leka (npr., videti sliku 7). Eritroidna ćelija može da smanji nivoe antitela protiv leka kod subjekta i može opciono, dalje da sadrži terapeutski protein koji leči bolest. Na primer, eritroidna ćelija sadrži prvi egzogeni polipeptid koji vezuje metu, na primer, gde je meta antitelo protiv leka. Eritroidna ćelija može dalje da sadrži drugi egzogeni polipeptid (npr. IdeS) koji inaktivira, na primer, cepa metu. Eritroidna ćelija može opciono, dalje da sadrži treći egzogeni polipeptid, na primer, terapeutski protein koji leči istu bolest kao prethodni terapeutik na koji je subjekt razvio antitela protiv leka, npr. terapijski protein koji je isti ili različit od prethodnog terapeutika na koga je subjekt razvio antitela protiv leka. U realizacijama, subjekt sadrži antitela protiv leka, protiv molekula anti-CD20 antitela, molekula anti-VEGF-A antitela, molekula anti-HER2 antitela, G-CSF analoga kao što je filgrastim, molekula anti EGFR antitela (npr. cetuksimab), eritropoetin, npr. epoetin, ili interferon, npr. IFNβ1a ili IFNβ1b. U takvim metodama lečenja, pacijent može biti testiran na prisustvo antitela protiv leka, na primer, na prisustvo neutrališućih antitela protiv leka, pre, tokom i/ili posle primene, ovde opisanih, projektovanih eritroidnih ćelija.

Agens-sinergističke konfiguracije

[0123] Kada su dva ili više agenasa (npr. polipeptidi) agens-sinergistički, agensi deluju na dve ili više različitih meta unutar jednog puta. U jednoj realizaciji, dejstvo dva ili više agenasa zajedno je veće od dejstva bilo kog pojedinačnog agensa. Na primer, prvi i drugi polipeptidi su ligandi za ćelijske receptore koji signaliziraju ka istom nishodnom cilju. Na primer, prvi egzogeni polipeptid sadrži ligand za prvi ciljni ćelijski receptor, a drugi egzogeni polipeptid sadrži ligand za drugi ciljni ćelijski receptor, npr., čiji prvi i drugi ciljni ćelijski receptori signaliziraju ka istom nishodnom cilju. U realizacijama, istovremeno prvi egzogeni polipeptid deluje na prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid deluje na drugu metu, npr. postoji određeno vremensko preklapanje u vezivanju prvog egzogenog polipeptida za prvu metu i vezivanju drugog egzogenog polipeptida za drugu metu. U nekim realizacijama, simultano dejstvo generiše sinergistički odgovor veće veličine nego što bi se očekivalo kada se na bilo koju metu deluje samostalno ili izolovano.

[0124] U jednoj realizaciji, prvi i drugi polipeptidi su ligandi za prvi ćelijski receptor i drugi ćelijski receptor koji posreduje apoptozu. U jednoj realizaciji, agensi sadrže dva ili više liganda TRAIL receptora, npr., divljeg tipa ili mutantne TRAIL polipeptide, ili molekule antitela koji vezuju TRAIL receptore, i indukuju apoptozu u ciljnoj ćeliji, npr., ćeliji raka. U nekim realizacijama, enukleisani RBC koji sadrži TRAIL receptorne ligande se koristi za lečenje NSCLC. U nekim realizacijama, RBC koji sadrži ligande TRAIL receptora dalje sadrži ciljni deo, npr., ciljni deo koji je ovde opisan. U jednoj realizaciji, prva meta i druga meta stupaju u interakciju sa istim supstratom, npr., proteinom supstrata. U jednoj realizaciji, prva meta i druga meta stupaju u interakciju sa različitim supstratima.

[0125] TRAIL (TNF-povezani ligand koji indukuje apoptozu) je član familije TNF-a koji indukuje apoptozu. TRAIL ima najmanje dva receptora, TRAIL R1 i TRAIL R2. Agonisti TRAIL receptora, npr., mutanti TRAIL-a koji vezuju jedan ili više receptora, ili molekule antitela koje vezuju jedan ili oba TRAIL R1 ili TRAIL R2 (videti, npr. Gasparian i sar., Apoptosis 2009 Jun 14(6), Buchsbaum i sar. Future Oncol 2007, avgust 3(4)), razvijeni su kao klinička terapija za širok spektar karcinoma. Klinička ispitivanja agonista TRAIL receptora nisu uspela, između ostalih razloga, zbog činjenice da mnogi primarni karcinomi nisu osetljivi na signalizaciju preko jednog receptora, već zahtevaju angažovanje oba receptora da bi indukovali citotoksičnost (Marconi i sar., Cell Death and Disease (2013) 4, e863). U jednoj realizaciji, agensi eksprimirani na konstruisanoj krvnoj ćeliji su TRAIL agonisti specifični za pojedinačni receptor koji, u kombinaciji, omogućavaju ćeliji da angažuje i agonizira oba TRAIL receptora istovremeno, što dovodi do sinergističke indukcije apoptoze ciljne ćelije raka. Prema tome, u nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) sadrži na svojoj površini prvi polipeptid koji vezuje TRAIL R1 i drugi polipeptid koji vezuje TRAIL R2. U realizacijama, svaki polipeptid ima Kd za TRAIL R1 ili TRAIL R2 koji je 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200 ili 500 puta jači od Kd za drugi receptor. Bez namere da budemo ograničeni teorijom, u nekim realizacijama enukleisana crvena krvna ćelija koja sadrži TRAIL R1-specifičan ligand i TRAIL R2-specifičan ligand promoviše bolju heterodimerizaciju TRAIL R1 i TRAIL R2 nego enukleisana crvena krvna ćelija koja sadrži ligand koji se vezuje za TRAIL R1 i TRAIL R2 sa približno istim afinitetom.

[0126] U nekim realizacijama, jedan, dva ili više egzogenih polipeptida su članovi TNF superfamilije. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi se vezuju za jedan ili oba receptora smrti DR4 (TRAIL-R1) i DR5 (TRAIL-R2). U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi se vezuju za jedan ili više od TNFRSF10A/TRAILR1, TNFRSF10B/TRAILR2, TNFRSF10C/TRAILR3, TNFRSF10D/TRAILR4, ili TNFRSF11B/OPG. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptidi aktiviraju jedan ili više od MAPK8/JNK, kaspazu 8 i kaspazu 3.

[0127] U nekim realizacijama, TRAIL polipeptid je TRAIL agonist koji poseduje sekvencu bilo koje od SEK ID BR-a: 1-5 ovde, ili sekvencu sa najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identičnosti sa tom. Identičnost sekvence je izmerena, na primer, pomoću BLAST-a (Basic Local Alignment Search Tool). SEK ID br.1-5 su dalje opisane od strane Mohr i sar. BMC Cancer (2015) 15:494).

SEK ID BR: 1 Rastvorljivi TRAIL varijanta DR4-1

SEK ID BR: 2 Rastvorljivi TRAIL varijanta DR4-2

SEK ID BR: 4 Rastvorljivi TRAIL varijanta DR5-1

[0128] Predviđene su sve kombinacije TRAIL receptornih liganada. U nekim realizacijama, prvi i drugi agensi obuhvataju SEK ID BR: 1 i SEK ID BR: 2; SEK ID BR: 1 i SEK ID BR: 3; SEK ID BR: 1 i SEK ID BR: 4; SEK ID BR: 1 i SEK ID BR: 5; SEK ID BR: 2 i SEK ID BR: 3; SEK ID BR: 2 i SEK ID BR: 4; SEK ID BR: 2 i SEK ID BR: 5; SEK ID BR: 3 i SEK ID BR: 4; SEK ID BR: 3 i SEK ID BR: 5; ili SEK ID BR: 4 i SEK ID BR: 5, ili fragment ili varijantu bilo koje od prethodno navedenih.

[0129] U nekim realizacijama, ligand TRAIL receptora sadrži molekul antitela. U realizacijama, molekul antitela prepoznaje jedan ili oba TRAIL R1 i TRAIL R2. Molekul antitela može biti, na primer, Mapatumumab (humano anti-DR4 mAt), Tigatuzumab (humanizovano anti-DR5 mAt), Leksatumumab (humano anti-DR5 mAt), Conatumumab (humano anti-DR5 mAt) ili Apomab (humano anti-DR5 mAt). U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr. retikulocit) sadrži dva ili više (npr. tri, četiri, pet ili više) različitih molekula antitela koji vezuju TRAIL receptor. U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) sadrži najmanje jednu molekulu antitela koji vezuje TRAIL receptor i najmanje jedan TRAIL polipeptid.

[0130] U nekim realizacijama, agensi su modulatori višestepenog puta koji deluju agenssinergistički ciljajući ushodne i nishodne korake puta, npr., istovremeno.

Multiplikativne konfiguracije

[0131] Kada su dva ili više agenasa (npr. polipeptidi) multiplikativni, prvi agens deluje na prvi molekul koji je deo prvog puta, a drugi agens deluje na drugi molekul koji je deo drugog puta, čiji putevi deluju udruženo ka željenom odgovoru.

[0132] U nekim realizacijama, željeni odgovor je ćelijska smrt, npr. ćelije raka. Bez želje da budemo ograničeni teorijom, u lečenju raka može biti korisno aktivirati endogene ili egzogene antitumorske T ćelije koje su anergične ili na drugi način ne funkcionišu, na primer, zbog tumora ili tumorskog mikrookruženja. U nekim realizacijama, agensi pokreću višestruke puteve aktivacije T ćelija da bi izazvali imunski odgovor protiv raka. U nekim realizacijama, projektovana eritroidna ćelija promoviše proliferaciju T ćelija. U realizacijama, jedan ili više (npr. 2, 3, 4, ili 5 ili više) liganda za aktivaciju T ćelija sadrže ligand iz Tabele 2 ili njegovu varijantu za aktiviranje T-ćelija (npr. fragment).

[0133] U realizacijama, jedan ili više (npr., 2, 3, 4, ili 5 ili više) liganada za aktivaciju T ćelija sadrže molekul antitela koji vezuje ciljni receptor iz tabele 2 ili njegovu varijantu za T-ćelijsku aktivaciju (npr. fragment). U nekim realizacijama, prvi i drugi polipeptidi sadrže različite ligande za aktivaciju T ćelija, npr.CD80, 41BB-ligand, CD86, ili bilo koju njihovu kombinaciju, za stimulaciju T ćelija i prevazilaženje nedostatka imunosti u imuno-onkološkom okruženju. U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) sadrži 4-1BBL, OX40L i CD40L, ili njihove fragmente ili varijante. U realizacijama, ovi proteini signaliziraju putem komplementarnih aktivacionih puteva. U nekim realizacijama ligandi su aktivirajući citokini, interferoni ili članovi porodice TNF-a (npr. iz Tabele 1), npr. IFNa, IL2 ili IL6 ili bilo koja njihova kombinacija. U nekim realizacijama agensi su kombinacije gornjih klasa molekula. Agensi mogu biti izvedeni iz endogenih liganada ili molekula antitela za ciljne receptore.

Tabela 2. Aktivacija T ćelija

[0134] U nekim realizacijama, molekul antitela protiv IL6 ili TNFa sadrži sekvencu bilo koje od SEK ID BR: 6 ili 7 ovde, ili sekvencu sa najmanje 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96% , 97%, 98% ili 99% identičnosti sa tom.

SEK ID BR: 6 Anti-IL6 scFv

[0135] Kao drugi primer, prvi i drugi polipeptidi sadrže liganda koji aktivira T ćelije i agens koji inhibira imuno inhibitorni molekul (npr. imuno inhibitorni receptor), npr. CD80 i anti-PD1, u imuno-onkološkom okruženju. U drugoj realizaciji, jedan agens je aktivirajući 4-1BBL, ili njegov fragment ili varijanta, a drugi agens je molekul antitela koji blokira PD1 signalizaciju (npr. molekul antitela za PD1 ili PD-L1). Prema tome, u realizacijama, ciljna T ćelija je i aktivirana i sprečena da bude potisnuta. Primeri agenasa koji inhibiraju imuno inhibitorni molekul uključuju inhibitore (npr. molekule antitela koja vezuju) PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (npr. CEACAM-1, CEACAM-3 i/ili CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 i TGF beta, ili njihovu funkcionalnu varijantu (npr. fragment). U nekim realizacijama, agens koji inhibira imunološki inhibitorni molekul je inhibitor inhibitornog liganda iz Tabele 3, ili inhibitorni fragment ili njegova varijanta. U nekim realizacijama, agens koji inhibira imuno inhibitorni molekul je molekul antitela koji vezuje ciljni receptor iz Tabele 3, ili njegov fragment ili varijanta.

Tabela 3. Inhibicija T ćelija

(nastavak)

[0136] U nekim realizacijama, jedan od agenasa za lečenje kancera sadrži aktivirajući citokin, npr., IL-2, IL-12, ili drugi aktivirajući citokin iz Tabele 1, ili njihov fragment ili varijantu.

[0137] U nekim realizacijama cilj je aktiviranje ili inhibiranje T ćelija. Da bi se osiguralo da su T ćelije preferencijalno ciljane u odnosu na druge imunske ćelije koje takođe mogu da eksprimiraju ili aktivirajuće ili inhibitorne receptore, kao što je ovde opisano, jedan od agenasa na crvenim krvnim ćelijama (npr.retikulocit) može da sadrži ciljajući deo, npr., molekul antitela koji vezuje T ćelijski receptor (TCR) ili drugi marker T ćelija. Ciljajuće grupe su detaljnije opisane ovde u odeljku pod naslovom "Konfiguracije lokalizacije". U nekim realizacijama, specifični podtip ili klon T ćelija može biti poboljšan (T ćelija sa antitumorskom specifičnošću) ili inhibiran. U nekim realizacijama, jedan ili više agenasa na crvenim krvnim ćelijama (npr. retikulocitu) je peptid-MHC molekul koji će se selektivno vezati za receptor T ćelije na način specifičan za antigen.

[0138] U nekim realizacijama, mnoštvo agenasa sadrži više antigena izvedenih iz kompleksne mete, npr. tumorske ćelije, protiv koje je poželjno postaviti kompleksan imuni odgovor sa višestrukim specifičnostima.

[0139] U nekim realizacijama, prvi i drugi egzogeni polipeptidi sadrže, u nekim realizacijama, antigen i kostimulatorni molekul, na primer, pri čemu eritroidna ćelija može delovati kao APC, npr., za vakcinaciju protiv raka.

[0140] U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) koja sadrži prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid se primenjuje kod subjekta koji ima prvu metu i drugu metu. U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid deluje na drugu metu. Opciono, enukleisana crvena krvna ćelija sadrži treći egzogeni polipeptid, a pacijent sadrži treću metu. U realizacijama, treći egzogeni polipeptid deluje na treću metu.

[0141] U nekim realizacijama eritroidna ćelija sadrži prvi egzogeni polipeptid koji je agonist ili antagonist prve mete u prvom putu, i dalje sadrži drugi egzogeni polipeptid koji je agonist ili antagonist druge mete u drugom putu, pri čemu prvi i drugi put deluju zajedno ka željenom odgovoru. I prvi i drugi egzogeni polipeptidi mogu biti agonisti; mogu oboje biti antagonisti; ili jedan može biti agonist, a drugi može biti antagonist. U nekim realizacijama, jedan ili više egzogenih polipeptida su agonisti ili antagonisti imunološke kontrolne tačke. U nekim realizacijama, eritroidna ćelija dalje sadrži agens za ciljanje.

Nezavisne funkcijske konfiguracije

[0142] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju odnos nezavisne funkcije, agensi imaju dve različite (npr. komplementarne) funkcije. Na primer, prvi agens vezuje prvi cilj, a drugi agens vezuje drugi cilj. Pacijentu može nedostajati prvi ili drugi cilj. Opciono, prvi i drugi agens su na različitim putevima.

[0143] Kod sepse, sindroma tumorske lize i drugih stanja obeleženih citokinskom olujom, oštećenje je vođeno raznolikom mešavinom inflamatornih citokina. Postojeće monoterapije protiv jednog citokina su često nedovoljne za lečenje ovih akutnih stanja. Štaviše, ponekad može biti nemoguće izmeriti pokretača citokinske oluje na vreme kako bi se sprečila klinička oštećenja. U jednoj realizaciji, prvi i drugi peptidi su molekuli (npr. molekuli antitela) koji vezuju dva različita citokina. U nekim realizacijama, agensi vezuju i neutrališu različite citokine i na taj način proizvod konstruisane crvene krvne ćelije pruža višestruku zaštitu od citokinske oluje.

[0144] U realizacijama citokini sadrže interleukine, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-29, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, IL-35 ili IL-36. U nekim realizacijama, citokin je citokin iz Tabele 1 ili njegov fragment ili varijanta. U nekim realizacijama, prvi citokin je TNFa, a drugi je interleukin, npr., IL-6, ili fragment ili varijanta bilo kog od prethodno navedenih. U nekim realizacijama, agensi sadrže molekule antitela protiv TNFa, protiv IL-6 ili protiv IFNg, ili bilo koju njihovu kombinaciju, ili fragment ili varijantu bilo kog od prethodno navedenih.

[0145] U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija (npr. retikulocit) koja sadrži prvi egzogeni polipeptid i drugi egzogeni polipeptid se daje subjektu koji ima prvu metu, ali ne i drugu metu, ili gde nije poznato da pacijent ima prvu metu ili drugu metu. U realizacijama, prvi egzogeni polipeptid deluje na (npr. vezuje) prvu metu, a drugi egzogeni polipeptid ostaje suštinski nevezan. Opciono, enukleisana crvena krvna ćelija sadrži treći egzogeni polipeptid i pacijentu nedostaje treća meta, ili se ne zna da ima treću metu. U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna ćelija obuhvata mnoštvo egzogenih polipeptida, a pacijent nema, ili nije poznato da ima, ciljeve za jedan ili podskup mnoštva egzogenih polipeptida.

[0146] Primer konfiguracije nezavisne funkcije prikazan je na slici 4. Eritroidna ćelija na slici 4 sadrži prvi egzogeni polipeptid (beli), drugi egzogeni polipeptid (šrafiran paralelnim linijama) i opcioni treći egzogeni polipeptid (blizu šrafiran). Prvi egzogeni polipeptid može da veže prvi cilj, npr., citokin A, a drugi egzogeni polipeptid može nezavisno da veže drugi cilj, na primer, citokin B. Ova projektovana zamka eritroidnih ćelija čisti oba citokina ako su oba prisutna u subjektu. Ako je samo jedan od citokina prisutan kod subjekta, projektovana eritroidna ćelija može da očisti taj citokin. U realizacijama, jedan ili više (npr. dva ili svi) od egzogenih polipeptida sadrže molekule antitela, npr., scFvs, i opciono dalje sadrže transmembranski domen. U realizacijama, mete sadrže mnoštvo citokina, hemokina ili njihove kombinacije.

Lokalizacijske konfiguracije

[0147] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju lokalizacionu vezu, prvi agens lokalizuje crvenu krvnu ćeliju na mestu delovanja koje pojačava aktivnost drugog ili nekog drugog agensa ili agenasa u poređenju sa njihovom aktivnošću kada nije lokalizovana na mestu delovanja (npr. vezivanjem prvog agensa za njegovu metu, dolazi do povećanja lokalne koncentracije drugog agensa u oblasti njegove mete). U nekim realizacijama jedan agens služi za ciljanje crvenih krvnih ćelija (npr. retikulocita) na mestu delovanja i jedan ili više agenasa imaju terapeutski efekat. U jednoj realizaciji, vezivanje prvog agensa povećava aktivnost entiteta, npr., polipeptida, vezanog drugim agensom. U jednoj realizaciji, prvi agens se vezuje za supstrat ili proizvod entiteta, npr., polipeptid, vezan drugim agensom. Sredstvo koje lokalizuje RBC može biti, na primer, ligand za receptor na ciljnoj ćeliji, ili antitelo koje vezuje površinski ćelijski molekul na ciljnoj ćeliji.

[0148] Kao što je prikazano na slici 9, ćelija može da sadrži jedan ili više agenasa za ciljanje. Ciljni agens može biti egzogeni polipeptid. U realizacijama, eritroidna ćelija sadrži dva ciljajuća agensa, koja mogu povećati specifičnost i/ili afinitet i/ili avidnost vezivanja eritroidne ćelije za njenu metu, u poređenju sa inače sličnom eritroidnom ćelijom koja sadrži samo jedan od ciljnih agenasa. Eritroidna ćelija opciono dalje sadrži egzogeni polipeptid sa terapeutskom aktivnošću, npr. antikancerogenom aktivnošću. Egzogeni polipeptid sa terapeutskom aktivnošću može da sadrži enzim, reagens za hvatanje, agonist ili antagonist.

[0149] U realizacijama, ciljni deo sadrži receptor ili njegov fragment ili varijantu. U realizacijama, ciljni deo sadrži molekul antitela kao što je scFv.

[0150] Kao drugi primer, agens za ciljanje se vezuje za ili blizu ćelije raka, na primer, čvrste ćelije tumora, a drugi agens (npr. drugi polipeptid) ima funkciju protiv raka. U nekim realizacijama mesto delovanja je tumorska vaskulatura. U realizacijama, agens za ciljanje vezuje markera neovaskulature, npr. vezuje integrin kao što su avB1, avB3, ili avB5, ili a4b1 integrini, npr. sintetički peptidni čvor (Kim i sar, JACS 2016, 137(1)) ili endogeni ili prirodni ligand, npr. ehistatin, RGD, EETI2.5F ili VCAM-1, ili vezuje membranski antigen specifičan za prostatu, koji je takođe nađen u izobilju na neovaskulaturi. U nekim realizacijama, agens za ciljanje vezuje markere ćelije raka, kao što su CD269 (izražen, npr. u ćelijama multiplog mijeloma) ili CD123 (izražen, npr. u ALM ćelijama), CD28 (izražen, npr. u T ćelijama; CD28 može biti vezan pomoću CD80/CD86), NY-ESO-1 (izražen, npr. kod raka jajnika).

[0151] Terapeutski agens može imati, na primer, efekat protiv raka, za koji postoji nekoliko strategija. Na primer, terapeutsko sredstvo može biti enzim, npr. asparaginaza, metionin gama liaza (MGL), serin dehidrogenaza ili njihov fragment ili varijanta, koji razgrađuju metabolite koji su selektivno potrebni ćelijama tumora za rast. Terapeutski agens može biti inhibitor angiogeneze, npr. inhibitor angiopoitina ili inhibitor VEGF ili VEGFR da bi se sprečio dalji rast krvnih sudova. Terapeutski agens može biti imunostimulacioni molekul za aktiviranje T ćelija, bilo citokin ili ligand za aktivaciju T ćelija (videti, na primer, tabelu 1 i tabelu 2). Terapeutski agens može da veže imunološku efektornu ćeliju, npr. T ćeliju ili inflamatornog makrofaga i može uhvatiti i dovesti efektornu ćeliju u blizinu tumora. Terapeutski agens može biti direktan medijator ubijanja ćelija, npr. TRAIL ili FAS-L ili drugi ligandi smrti, ili toksin. U nekim realizacijama, terapeutski agens sadrži agonistu TRAIL receptora, npr., molekul agonističkog antitela. U realizacijama, terapeutski agens je pro-apoptotički agens. U realizacijama, terapeutsko sredstvo sadrži pomoćno sredstvo. Za bilo koji od ovih terapeutskih agenasa, konačni rezultat je terapeutik crvena krvna ćelija koja se lokalizuje na mestu tumora i tako koncentriše svoj antitumorski efekat na mestu koje povećava njenu efikasnost.

[0152] U nekim realizacijama, na primer, za lečenje karcinoma B ćelija, prvi egzogeni polipeptid sadrži površinski izložen molekul anti-CD20 antitela koji može da cilja ćeliju na ćeliju raka, a drugi egzogeni polipeptid sadrži površinski izložen anti-CD40 molekul antitela koji može inhibirati (npr. ubiti) ćeliju raka. Eritroidna ćelija može dalje da sadrži inhibitor molekula anti-CD40 antitela, na primer, kao što je ilustrovano na slici 8.

[0153] Prvi egzogeni polipeptid može da sadrži agens za ciljanje, a drugi egzogeni polipeptid može da sadrži enzim (npr., slika 11). Na primer, u nekim realizacijama, npr., za lečenje kancera, eritroidna ćelija sadrži prvi polipeptid koji sadrži agens za ciljanje koji vezuje ćeliju raka i drugi polipeptid koji inhibira (npr. ubija, indukuje anergiju, inhibira rast) ćelije raka. Na primer, agens za ciljanje može da sadrži anti-CD4 antitelo koje vezuje CD4 na površini T ćelije, na primer, T ćelije raka. Drugi polipeptid može da sadrži enzim koji može biti površinski izložen ili intracelularan, npr., intraćelijski i nije povezan sa membranom. Enzim može biti IDO ili njegov fragment ili varijanta, koji prazni triptofan i može indukovati anergiju u kancerogenoj T ćeliji, ili ADA ili njegov fragment ili varijanta. Enzim može biti proteaza.

[0154] U realizacijama, ciljna ćelija je imunska ćelija, npr. T ćelija, npr. pomoćna T ćelija, i/ili bolesna ćelija. Sredstvo za ciljanje može da sadrži molekul antitela, npr., scFv.

[0155] Prvi egzogeni polipeptid može da sadrži agens za ciljanje, a drugi egzogeni polipeptid može da sadrži ciljni agonist (videti, npr., sliku 12). U realizacijama, agens za ciljanje sadrži receptor ili fragment ili njegovu varijantu, molekul antitela, ligand ili fragment ili njegovu varijantu, citokin ili fragment ili njegovu varijantu. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid sadrži jedan prigušivač, aktivator, agens za ubijanje ćelija ili citotoksični molekul (npr. mali molekul, protein, RNK, npr., antismisaonu RNK ili TLR ligand). U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je intracelularni, npr., nije povezan sa membranom, a u nekim realizacijama, drugi egzogeni polipeptid je površinski izložen.

[0156] Eritroidna ćelija može da sadrži agens za ciljanje i agens za hvatanje (npr., slika 13). Na primer, prvi egzogeni polipeptid može da sadrži agens za ciljanje koji vezuje plazmatsku ćeliju, na primer, molekul anti-BCMA antitela. U realizacijama, drugi egzogeni polipeptid vezuje svoju metu na način koji sprečava da cilj stupi u interakciju sa endogenim receptorom, na primer, vezuje cilj za deo koji se preklapa sa mestom vezivanja receptora. U realizacijama, ciljajući ostatak vezuje receptor na mestu bolesti. U realizacijama, agens za ciljanje sadrži ligand ili citokin ili njihov fragment ili varijantu, ili molekul antitela, npr., scFv. U realizacijama, agens za hvatanje sadrži receptor ili fragment ili njegovu varijantu, ili molekul antitela, npr., scFv. U realizacijama, ligand je neželjeni citokin ili hemokin.

[0157] Sredstvo za ciljanje može usmeriti eritroidnu ćeliju na određeni podtip ćelije. Ćelija može dalje da sadrži drugi egzogeni polipeptid koji promoviše datu aktivnost ili put u ciljnoj ćeliji, na primer, može da oslabi, aktivira ili indukuje smrt ćelije. Na primer, slika 14 prikazuje eritroidnu ćeliju koja sadrži prvi egzogeni polipeptid koji može da veže ciljnu ćeliju. Eritroidna ćelija može dalje da sadrži drugi egzogeni polipeptid koji inhibira (npr., ubija ili inhibira rast) ćelije raka. Na primer, drugi egzogeni polipeptid može da sadrži agens za ubijanje ćelija, na primer, proapoptotički agens, na primer, TRAIL polipeptid koji indukuje apoptozu u ćeliji raka. Eritroidna ćelija takođe može da sadrži agens za ciljanje i oslabljivač ili aktivator koji je površinski izložen ili je intracelularan. Na primer, ćelija može da sadrži agens za ciljanje i enzim, kao što su IDO ili ADA ili njihov fragment ili varijantu.

Konfiguracije zasnovane na blizini

[0158] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju vezu zasnovanu na blizini, dva agensa funkcionišu jače, na primer, ispoljavaju izraženiji efekat, kada su u blizini jedan drugome nego kada su fizički odvojeni. U realizacijama, dva agensa su u blizini kada se direktno vezuju jedan za drugog, kada su deo kompleksa (npr. povezani trećim agensom), kada su prisutni na istoj ćelijskoj membrani, ili kada su prisutni na istom pod-odeljku ćelijske membrane (npr. unutar lipidnog mnoštva, izvan lipidnog mnoštva, ili vezani direktno ili indirektno za intracelularnu strukturu kao što je komponenta citoskeleta). U nekim realizacijama, prvi polipeptid vezuje prvi ciljni molekul, a drugi polipeptid vezuje drugi ciljni molekul, i ovo vezivanje uzrokuje da se prvi ciljni molekul i drugi ciljni molekul pomeraju bliže jedan drugome, npr. da se međusobno vezuju. U nekim realizacijama, prvi i drugi ciljni molekuli su površinski ćelijski receptori na ciljnim ćelijama.

[0159] Primer konfiguracije zasnovane na blizini prikazan je na slici 4. Eritroidna ćelija sa slike 4 sadrži opcioni prvi egzogeni polipeptid (beli), drugi egzogeni polipeptid (svetlo sivi) i treći egzogeni polipeptid (tamno sivi). Drugi i treći egzogeni polipeptidi se vezuju za različite epitope unutar istog polipeptidnog lanca mete, npr., citokin B. Drugi i treći egzogeni polipeptidi, koji su postavljeni na eritrocitu, vezuju se za cilj sa većom avidnošću nego ako bi drugi i treći egzogeni polipeptidi, bili slobodni polipeptidi. Kao primeri, dva ili više egzogenih polipeptida mogu da vežu različita mesta na istoj meti, pri čemu je meta citokin, enzim ili antitelo.

Konfiguracije skele

[0160] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju vezu osnove, agensi dovode dve ili više ciljeva zajedno, kako bi se povećala verovatnoća međusobne interakcije ciljeva. U jednoj realizaciji, prvi i drugi agens su povezani jedan sa drugim (formirajući skelu) na površini eritrocita, npr., dva kompleksirana polipeptida. U jednoj realizaciji, crvena krvna ćelija (npr. retikulocit) sadrži molekul bispecifičnog antitela, npr. molekul antitela koji prepoznaje jedan ili više (npr.2) proteina, ovde opisanih, npr. u bilo kojoj od Tabele 1, Tabele 2 i Tabele 3.

[0161] Ciljevi mogu sadržati, na primer, proteine, ćelije, male molekule ili bilo koju njihovu kombinaciju. U jednoj realizaciji, prva i druga meta su proteini. U jednoj realizaciji, prva i druga meta su ćelije.

[0162] Kao drugi primer, eritrocit dovodi imunsku efektornu ćeliju (npr. T ćeliju) i ćeliju raka u neposrednu blizinu jedne sa drugom da bi se olakšalo ubijanje ćelije raka od strane imunološke efektorske ćelije. Tako, u nekim realizacijama, prvi polipeptid vezuje površinski ćelijski marker ćelije raka, a drugi polipeptid vezuje marker ćelijske površine efektorske ćelije imunog sistema. Prvi i drugi polipeptidi mogu da sadrže, na primer, molekule antitela. U nekim realizacijama, marker ćelije raka je izabran između CD19 (izražen, npr. u akutnoj leukemiji B ćelija), EpCAM (izražen, npr. u CTC), CD20 (izražen, npr. u akutnoj leukemiji B ćelija), CD45 (izražen, npr., u CTCs), EGFR, HER2 (izražen, npr. u ćelijama raka dojke). U nekim realizacijama, marker imunih ćelija je CD3.

[0163] U nekim realizacijama, RBC dovodi imunološku efektornu ćeliju u blizinu sa drugom imunom ćelijom, na primer, da bi promovisao prezentaciju antigena (npr. kada je jedna ćelija ćelija koja prezentuje antigen, a druga ćelija je T ćelija), npr. za vakcinu protiv raka.

[0164] U nekim realizacijama, RBC eksprimira egzogeni fuzioni polipeptid koji sadrži domen prvog molekula antitela i domen drugog molekula antitela, pri čemu egzogeni polipeptid funkcioniše kao bispecifično antitelo, na primer, gde domen prvog molekula antitela vezuje prvu metu na prvoj ćeliji a domen drugog molekula antitela vezuje drugu metu na drugoj ćeliji, na primer, različiti tip ćelije.

Multimerne konfiguracije

[0165] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju multimernu konfiguraciju, agensi se kombinuju jedan sa drugim, npr. vezuju se međusobno, da bi formirali kompleks koji ima funkciju ili aktivnost na meti. U jednoj realizaciji, agensi su podjedinice kompleksa ćelijske površine, npr. MHCI, a funkcija je da vezuju peptid. U jednoj realizaciji, agensi su podjedinice MHCII, a funkcija je da vezuju peptid. U jednoj realizaciji, agensi su podjedinice površinskih ćelijskih molekula, npr., MHCI i peptida, npr. peptida sadržanog na molekuli MHCI, a funkcija je da predstavljaju peptid. U jednom aspektu, agensi su podjedinice MHCII i peptida, npr. peptida napunjenog molekulom MHCII, a funkcija je da predstavi peptid. U jednoj realizaciji, kompleks je funkcionalni MHC I, agensi su MHC I (alfa lanac 1-3) i beta-2 mikroglobulin, ili njihovi fragmenti ili varijante. U jednoj realizaciji kompleks je MHC II, a agensi su MHC II alfa lanac i MHC II beta lanac, ili njihovi fragmenti ili varijante. U nekim realizacijama, MHC molekul obuhvata humani MHC klase I ili II, npr., MHC II alfa podjedinicu i MHC II beta podjedinicu ili fuzioni molekul koji sadrži obe podjedinice ili njihove fragmente koji predstavljaju antigen. RBC sa ova dva polipeptida se koristi, u nekim realizacijama, za indukciju imuniteta ili prezentaciju antigena. U nekim realizacijama, RBC sadrži pojedinačni protein koji je fuzija između MHC molekula i antigena, na primer, jednolančani peptid-MHC konstrukt. U nekim realizacijama, komponenta kompleksa vezana bez membrane, npr. peptid, ili beta-2 mikroglobulin, je udružena sa drugim agensom unutar ćelije pre nego što se iznese na površinu, izlučen od strane ćelija, a zatim uhvaćen na površini komponentom multimera vezanom za membranu, ili se dodaje u prečišćenom obliku konstruisanoj crvenoj krvnoj ćeliji.

[0166] Antigen je, u nekim realizacijama, antigen raka, na primer, za vakcinu protiv raka. U nekim realizacijama, antigen je dužine oko 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30 ili 35 aminokiselina.

[0167] U nekim realizacijama kompleks sadrži višestruke poddomene izvedene iz različitih polipeptidnih lanaca, od kojih svi moraju biti eksprimirani da bi kompleks bio aktivan.

Kompenzatorne konfiguracije

[0168] Kada dva ili više agenasa (npr. polipeptida) imaju kompenzatorni odnos, prvi agens smanjuje neželjenu karakteristiku drugog agensa. Na primer, u nekim realizacijama, drugi agens ima dati nivo imunogenosti, a prvi agens smanjuje imunogenost, npr. negativno signalizirajući imunske ćelije (videti Tabelu 3), ili štiteći antigenski epitop drugog agensa. U nekim realizacijama, drugi agens ima dati poluživot, a prvi agens produžava poluživot drugog agensa. Na primer, prvi agens može da sadrži šaperon ili njegov fragment ili njegovu varijantu.

[0169] Enukleisana eritroidna ćelija može zajedno izražavati terapeutski protein i njegov inhibitor (npr., slika 8). Inhibitor može biti oslobođen (npr. prestaje da vezuje terapeutik, ali ostaje na površini ćelije) na željenoj lokaciji u telu, da bi aktivirao terapeutski protein.

[0170] Na primer, u nekim realizacijama, eritroidna ćelija sadrži prvi egzogeni polipeptid sa terapeutskom aktivnošću (npr. molekul anti-CD40 antitela), drugi egzogeni polipeptid (npr. CD40 ili njegov fragment ili varijantu) koji inhibira prvi egzogeni polipeptid. Drugi polipeptid (npr. CD40) može inhibirati aktivnost prvog egzogenog polipeptida (npr. anti-CD40) sve dok se eritroidna ćelija ne nađe na željenoj lokaciji, npr. ćeliji raka, na primer, ograničavajući efekte van cilja. Drugi egzogeni polipeptid (npr. CD40 ili njegova varijanta) može da sadrži varijantu mete (npr. endogeni CD40) za koju se vezuje prvi egzogeni polipeptid (npr. anti-CD40). Na primer, varijanta može biti slabo vezujuća varijanta koja se nadmeće u prisustvu mete. U realizacijama, Kd prvog egzogenog polipeptida za drugi egzogeni polipeptid je najmanje 2, 3, 5, 10, 20, 50 ili 100 puta veći od Kd prvog egzogenog polipeptida za njegovu metu. Eritroidna ćelija opciono sadrži treći egzogeni polipeptid koji sadrži agens za ciljanje, na primer, molekul anti-CD20 antitela.

[0171] U nekim realizacijama, enukleisana eritroidna ćelija sadrži prolek (npr., pro-insulin) koji postaje lek (npr. insulin) na željenom mestu kod subjekta.

Enukleisane crvene krvne ćelije koje sadrže tri ili više agenasa (npr. polipeptide)

[0172] U realizacijama, ovde opisana crvena krvna ćelija (npr., retikulocit) obuhvata tri ili više, npr., najmanje 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ili 1000 agenasa. U realizacijama, ovde opisana populacija crvenih krvnih zrnaca obuhvata tri ili više, npr. najmanje 4, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000 ili 5000 agenasa, npr. pri čemu različita crvena krvna zrnca u populaciji sadrže različite agense ili pri čemu različiti eritrociti u populaciji sadrže različita mnoštva agenasa. U realizacijama, dva ili više (npr. svi) agenasa u eritrocitu ili populaciji ili eritrocitima imaju aditivnu, sinergističku, multiplikativnu, nezavisnu funkciju, zasnovanu na lokalizaciji, zavisnu od blizine, zasnovanu na osnovi, zasnovanu na multimerima, ili kompenzatornu aktivnost.

[0173] U realizacijama, RBC se proizvodi kontaktiranjem RBC progenitorske ćelije sa mnoštvom mRNK koje kodiraju agense.

[0174] Skrining eukariotskog prikaza. U jednoj realizaciji, proizveden je kombinovani skup ćelija visoke raznolikosti, na primer, za upotrebu u in vitro ili in vivo testu vezivanja. Može se stvoriti kombinatorna biblioteka nukleinskih kiselina velike raznolikosti koja kodira proteine na površini ćelije. Takva biblioteka može, na primer, da se sastoji od potpuno varijabilnih sekvenci, ili da sadrži fiksnu sekvencu fuzionisanu sa veoma varijabilnom, kombinatornom sekvencom. One se mogu uvoditi u progenitore crvenih krvnih zrnaca kao mešavina ili pojedinačno, korišćenjem metoda kao što su elektroporacija, transfekcija ili virusna transdukcija. U jednoj realizaciji, ćelije se potom uzgajaju u medijumu za diferencijaciju do željenog nivoa zrelosti. U jednoj realizaciji, ćelije se koriste za visoko multipleksno in vitro ispitivanje. Ćelije se inkubiraju sa biološkim uzorkom u mikrotitarskoj ploči. Bazenčići se ispiraju sa ćelijski kompatibilnim puferom, sa željenim nivoom kontrolisanosti. Preostale ćelije se izoluju i analiziraju na obogaćivanje specifičnim sekvencima. U jednoj realizaciji, analiza se izvodi na nivou proteina, na primer, korišćenjem masene spektrometrije, da bi se identifikovali motivi aminokiselina koji su obogaćeni vezanom populacijom. U jednoj realizaciji, analiza se izvodi na nivou nukleinske kiseline (RNK ili DNK) da bi se identifikovale sekvence nukleinske kiseline koje identifikuju odgovarajući motiv aminokiseline obogaćen vezanom populacijom. U jednoj realizaciji, ćelijska populacija visoke raznolikosti se ubrizgava u životinjski model (bilo zdrav ili bolestan). U jednoj realizaciji, ćelije su fluorescentno obeležene da bi se vizuelizovala njihova in vivo distribucija ili lokalizacija. Različita tkiva životinje mogu se zatim prikupiti i analizirati za relativno obogaćivanje specifičnih aminokiselinskih motiva ili sekvenci nukleinskih kiselina koje identifikuju odgovarajući motiv aminokiselina.

[0175] Optimizacija ekspresije. Veliki broj varijanti može biti istovremeno transfektovan u pojedinačne ćelije da bi se procenila njihova relativna transkripciona ili translaciona sposobnost. U realizacijama, biblioteka sekvenci koje kodiraju protein je dizajnirana i sintetizovana sa raznovrsnošću 5' neprevedenih regiona, 3' neprevedenih regiona, reprezentacijama kodona, aminokiselinskih promena i drugih razlika sekvenci. Ova biblioteka bi bila uvedena u progenitore crvenih krvnih zrnaca kao mešavina ili pojedinačno, korišćenjem metoda, kao što su elektroporacija, transfekcija ili virusna transdukcija. U jednoj realizaciji, ćelije se potom uzgajaju u medijumu za diferencijaciju do željenog nivoa zrelosti.

Fizičke karakteristike enukleisanih crvenih krvnih ćelija

[0176] U nekim realizacijama, ovde opisani eritrociti (npr. retikulociti) imaju jednu ili više (npr.

2, 3, 4 ili više) ovde opisanih fizičkih karakteristika, npr., osmotsku krhkost, veličinu ćelije, koncentraciju hemoglobina ili sadržaj fosfatidilserina. Iako ne želimo da budemo ograničeni teorijom, u nekim realizacijama enukleisani eritrocit koji eksprimira egzogeni protein ima fizičke karakteristike koje podsećaju na divlji tip, netretirane eritrocite. Nasuprot tome, hipotonični eritrocit ponekad pokazuje abnormalne fizičke karakteristike kao što su povećana osmotska krhkost, izmenjena veličina ćelije, smanjena koncentracija hemoglobina ili povećani nivoi fosfatidilserina na spoljašnjem delu ćelijske membrane.

[0177] U nekim realizacijama, enukleisani RBC sadrži egzogeni protein koji je kodiran egzogenom nukleinskom kiselinom koja nije zadržana od strane ćelije, nije bila prečišćena ili nije u potpunosti postojala izvan RBC. U nekim realizacijama, RBC je u kompoziciji kojoj nedostaje stabilizator.

Osmotska fragilnost

[0178] U nekim realizacijama, enukleisana crvena krvna zrnca ispoljavaju suštinski istu fragilnost osmotske membrane kao izolovana, eritroidna ćelija koja nije kultivisana i koja ne sadrži egzogeni polipeptid. U nekim realizacijama, populacija crvenih krvnih zrnaca sa enukleacijom ima osmotsku krhkost manju od 50% ćelijske lize pri 0,3%, 0,35%, 0,4%, 0,45% ili 0,5% NaCl. Osmotska krhkost se može ispitati korišćenjem metode iz Primera 59 iz WO2015/073587.

Veličina ćelije

[0179] U nekim realizacijama, enukleisani RBC ima približno prečnik ili zapreminu kao divlji tip, netretirani RBC.

[0180] U nekim realizacijama, populacija RBC ima prosečan prečnik od oko 4, 5, 6, 7 ili 8 mikrona, a opciono standardna devijacija populacije je manja od 1, 2 ili 3 mikrona. U nekim realizacijama, jedan ili više eritrocita ima prečnik od oko 4-8, 5-7 ili oko 6 mikrona. U nekim realizacijama, prečnik eritrocita je manji od oko 1 mikrona, veći od oko 20 mikrona, između oko 1 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 2 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 3 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 4 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 5 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 6 mikrona i oko 20 mikrona, između oko 5 mikrona i oko 15 mikrona ili između oko 10 mikrona i oko 30 mikrona. Prečnik ćelije je izmeren, u nekim realizacijama, korišćenjem Advia 120 hematološkog sistema.

[0181] U nekom izvođenju zapremina srednjeg korpuskularnog volumena eritrocita je veća od 10 fL, 20 fL, 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL ili veća od 150 fL. U jednoj realizaciji srednji korpuskularni volumen eritrocita je manji od 30 fL, 40 fL, 50 fL, 60 fL, 70 fL, 80 fL, 90 fL, 100 fL, 110 fL, 120 fL, 130 fL, 140 fL, 150 fL, 160 fL, 170 fL, 180 fL, 190 fL, 200 fL ili manji od 200 fL. U jednoj realizaciji srednji korpuskularni volumen eritrocita je između 80-100, 100-200, 200-300, 300-400 ili 400-500 femtolitara (fL). U nekim realizacijama, populacija eritrocita ima srednji korpuskularni volumen naveden u ovom paragrafu i standardna devijacija populacije je manja od 50, 40, 30, 20, 10, 5 ili 2 fL. Prosečni korpuskularni volumen je izmeren, u nekim realizacijama, korišćenjem instrumenta za hematološke analize, na primer, Coulterovog brojača.

Koncentracija hemoglobina

[0182] U nekim realizacijama, enukleisani RBC ima sadržaj hemoglobina sličan divljem tipu, netretiranom RBC-u. U nekim realizacijama, eritrociti sadrže više od 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9% ili više od 10% fetalnog hemoglobina. U nekim realizacijama, eritrociti sadrže najmanje oko 20, 22, 24, 26, 28 ili 30 pg, i opciono do oko 30 pg, ukupnog hemoglobina. Nivoi hemoglobina su određeni, u nekim realizacijama, korišćenjem Drabkinovog reagensa iz Primera 33 iz WO2015/073587.

Sadržaj fosfatidilserina

[0183] U nekim realizacijama, enukleisani RBC ima približno isti sadržaj fosfatidilserina na spoljnom listiću njegove ćelijske membrane kao kod divljeg tipa, netretiranog eritrocita. Fosfatidilserin se pretežno nalazi na unutrašnjem listiću ćelijske membrane divljih, netretiranih eritrocita, a hipotonično opterećenje može prouzrokovati da se fosfatidilserin distribuira do spoljašnjeg listića gde može da izazove imuni odgovor. U nekim realizacijama, populacija RBC-a obuhvata manje od oko 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1% ćelija koje su pozitivne na bojenje Aneksinom V. Izloženost fosfatidilserinu se procenjuje, u nekim realizacijama, bojenjem na Aneksin-V-FITC, koji se prvenstveno vezuje za PS, i merenjem FITC fluorescencije protočnom citometrijom, na primer, korišćenjem metode iz Primera 54 iz WO2015/073587.

Ostale karakteristike

[0184] U nekim realizacijama, populacija RBC-a sadrži najmanje oko 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili 95% (i opciono do 90 ili 100%) ćelija koje su pozitivne na GPA. Prisustvo GPA se detektuje, u nekim realizacijama, korišćenjem FACS-a.

[0185] U nekim realizacijama, eritrociti imaju poluživot od najmanje 30, 45 ili 90 dana kod subjekta.

[0186] U nekim realizacijama, populacija ćelija koja sadrži eritrocite sadrži manje od oko 10, 5, 4, 3, 2, ili 1% ehinocita.

[0187] U nekim realizacijama, eritrocit je enukleisan, npr., populacija ćelija koja sadrži eritrocite koji se koriste kao terapeutski preparat, ovde opisan, je više od 50%, 60%, 70%, 80%, 90% enukleisana. U nekim realizacijama, ćelija, na primer, RBC, sadrži jezgro koje nije funkcionalno, na primer, inaktivirano je.

Metode proizvodnje enukleisanih crvenih krvnih zrnaca

[0188] Postupci proizvodnje crvenih krvnih zrnaca sa enukleacijom (npr. retikulocita) koji sadrže (npr. izražavaju) egzogeni agens (npr. polipeptide) opisani su, na primer, u WO2015/073587 i WO2015/153102.

[0189] U nekim realizacijama, hematopoetske progenitorske ćelije, npr., CD34+ hematopoetske progenitorske ćelije, dovode se u kontakt sa nukleinskom kiselinom ili nukleinskim kiselinama koje kodiraju jedan ili više egzogenih polipeptida, i ćelijama je omogućeno da se prošire i diferenciraju u kulturi.

[0190] U nekim realizacijama, dva ili više polipeptida su kodirani u jednoj nukleinskoj kiselini, npr. pojedinačni vektor. U realizacijama, pojedinačni vektor ima poseban promoter za svaki gen, ima dva proteina koji su inicijalno transkribovani u jedan polipeptid koji ima mesto cepanja proteaze u sredini, tako da naknadna proteolitička obrada daje dva proteina, ili bilo koju drugu pogodnu konfiguraciju. U nekim realizacijama, dva ili više polipeptida su kodirani u dve ili više nukleinskih kiselina, npr., svaki vektor kodira jedan od polipeptida.

[0191] Nukleinska kiselina može biti, na primer, DNK ili RNK. Brojni virusi se mogu koristiti kao prenosioci gena uključujući retroviruse, Moloney virus mišje leukemije (MMLV), adenovirus, adeno-povezani virus (AAV), herpes simpleks virus (HSV), lentiviruse, kao što je virus humane imunodeficijencije 1 (HIV 1) i spumavirusi kao što su penasti virusi, na primer.

[0192] U nekim realizacijama, ćelije se proizvode korišćenjem sortiranja, na primer, kao što je opisano u WO2014/183071 ili WO2014/183066.

[0193] U nekim realizacijama, eritrociti su prošireni najmanje 1000, 2000, 5000, 10.000, 20.000, 50.000, ili 100.000 puta (i opciono do 100.000, 200.000 ili 500.000 puta). Broj ćelija se meri, u nekim realizacijama, korišćenjem automatizovanog ćelijskog brojača.

[0194] U nekim realizacijama, populacija RBC-a sadrži najmanje 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ili 98% (i opciono do oko 80, 90, ili 100%) enukleisanih eritrocita. U nekim realizacijama, populacija RBC sadrži manje od 1% živih ćelija sa enukleacijom, npr., ne sadrži žive enukleisane ćelije koje se mogu detektovati. Enukleacija je merena, u nekim realizacijama, pomoću FACS-a korišćenjem jedarnog bojenja. U nekim realizacijama, najmanje 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ili 80% (i opciono do oko 70, 80, 90 ili 100%) eritrocita u populaciji sadrže jedan ili više (npr.2, 3, 4 ili više) egzogenih polipeptida. Ekspresija polipeptida se meri, u nekim realizacijama, pomoću FACS-a korišćenjem obeleženih antitela protiv polipeptida. U nekim realizacijama, najmanje 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75 ili 80% (i opciono do oko 70, 80, 90 ili 100%) eritrocita u populaciji su enukleisani i sadrže jedan ili više (npr.2, 3, 4 ili više) egzogenih polipeptida. U nekim realizacijama, populacija RBC-a sadrži oko 1x10<9>- 2x10<9>, 2x10<9>- 5x10<9>, 5x10<9>- 1x10<10>, 1x10<10>- 2x10<10>, 2x10<10>- 5x10<10>, 5x10<10>- 1x10<11>, 1x10<11>- 2x10<11>, 2x10<11>- 5x10<11>, 5x10<11>- 1x10<12>, 1x10<12>- 2x10<12>, 2x10<12>- 5x10<12>, ili 5x10<12>- 1x10<13>ćelija.

Fizički proksimalni, sinergistički agensi

[0195] Sadašnji pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži prvi agens i drugi agens u fizičkoj blizini jedan sa drugim. U nekim realizacijama, agensi deluju sinergistički kada su u fizičkoj blizini jedan drugom, ali ne i kada su odvojeni. U nekim realizacijama, prvi i drugi agens su kovalentno povezani, npr. deo su fuzionog proteina ili su zajedno hemijski konjugovani. U nekim realizacijama, prvi i drugi agens su nekovalentno povezani, npr. vezani su direktno jedan za drugog ili za osnovu. U nekim realizacijama, prvi i drugi agensi su deo (npr. vezani za) nanočestice (npr.

1 - 100, 100 - 2.500 ili 2.500 - 10.000 nm u prečniku) liposoma, vezikule, zrna, polimera, implantata ili polipeptidnog kompleksa.

[0196] U nekim realizacijama, kompozicija sadrži najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 različitih agenasa koji su u međusobnoj fizičkoj blizini (npr. kovalentno ili nekovalentno povezani).

[0197] U nekim realizacijama, kompozicija sadrži jedan ili više (npr. 2, 3, 4, 5 ili više) ovde opisanih agenasa, npr. ovde opisane egzogene polipeptide, npr. polipeptide iz bilo koje od tabele 1, tabele 2 ili tabele 3 ili njegov fragment ili varijantu, ili njegov molekul antitela. U nekim realizacijama, jedan ili više (npr.2, 3 ili više) egzogenih polipeptida sadrže citokine, interleukine, receptore citokina, Fc-vezujuće molekule, ligande koji aktiviraju T ćelije, T ćelijske receptore, imuno inhibitorne molekule, kostimulatorni molekul, MHC molekule, APC-vezujući molekul, toksin, agens za ciljanje, agens protiv raka, marker ćelije raka, agens koji vezuje marker ćelije raka, ili ligande TRAIL receptora.

[0198] U nekim realizacijama, jedan ili više (npr.2, 3 ili više) egzogenih polipeptida sadrže ligande TRAIL receptora, na primer, sekvencu bilo koje od SEK ID Br-a: 1-5 ovde, ili sekvencu sa najmanje 70% , 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identičnosti sa njima, ili molekul antitela koji vezuje TRAIL receptor. U nekim realizacijama, prvi agens se vezuje za prvi TRAIL receptor, npr., TRAIL-RI, a drugi agens se vezuje za drugi TRAIL receptor, npr., TRAIL-RII. U realizacijama, dva liganda TRAIL receptora u blizini obezbeđuju sinergistički stepen apoptoze u ciljnoj ćeliji, u poređenju sa bilo kojim ligandom TRAIL receptora samostalno. Primer 1 ovde pokazuje sinergističku aktivnost kada se ćelije raka tretiraju kompozicijom koja sadrži dva liganda TRAIL receptora u neposrednoj blizini (npr., na površini enukleisane crvene krvne ćelije).

Dizajnirane crvene krvne ćelije koje sadrže jedan ili više agenasa

[0199] Sadašnji pronalazak obezbeđuje projektovanu crvenu krvnu ćeliju (npr. retikulocit) koja sadrži egzogeni agens. Preciznije, sadašnji pronalazak obezbeđuje enukleisanu crvenu krvnu ćeliju (npr. retikulocit) koja sadrži egzogeni polipeptid. Crvena krvna ćelija opciono, dalje sadrži drugi, različiti, egzogeni polipeptid.

[0200] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid (npr. egzogeni polipeptid sadržan od crvenih krvnih ćelija koje opciono dalje sadrže drugi egzogeni polipeptid) je ovde opisan egzogeni polipeptid. U realizacijama, polipeptid je izabran iz bilo koje od tabele 1, tabele 2 ili tabele 3, ili njegovog fragmenta ili varijante, ili molekula antitela na njega.

[0201] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid (npr. egzogeni polipeptid sadržan od crvenih krvnih ćelija koje opciono dodatno sadrže drugi egzogeni polipeptid) sadrži stimulativni ligand, npr. CD80, CD86, 41BBL, ili bilo koju njihovu kombinaciju, npr. za lečenje kancera. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid sadrži antigen ćelije raka kao što je CD269, na primer, za lečenje kancera kao što je multipli mijelom.

[0202] U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid (npr. egzogeni polipeptid sadržan od crvenih krvnih ćelija koje opciono dalje sadrže drugi egzogeni polipeptid) inhibira molekul kontrolne tačke imunog sistema. U realizacijama, egzogeni polipeptid se nalazi na površini konstruisanih crvenih krvnih zrnaca (npr. obuhvata transmembranski deo i deo koji je izložen površini) i vezuje se za molekul kontrolne tačke imunog sistema. U realizacijama, molekul imunološke kontrolne tačke je PD-1 ili PD-L1. U realizacijama, molekul imunološke kontrolne tačke je PD1, PD-L1, CTLA4, TIM3, CEACAM (npr. CEACAM-1, CEACAM-3 i/ili CEACAM-5), LAG3, VISTA, BTLA, TIGIT, LAIR1, CD160, 2B4 ili TGF beta. U nekim realizacijama, egzogeni polipeptid (npr. egzogeni polipeptid sadržan od strane crvene krvne ćelije koja opciono dalje sadrži drugi egzogeni polipeptid) inhibira molekul kontrolne tačke imunog sistema. U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitorni molekul antitela (npr., antitelo kao što je monospecifično antitelo, monoklonsko antitelo ili jednolančano antitelo). Molekul antitela može biti, na primer, humanizovan ili potpuno humani. U drugim realizacijama, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je fuzioni protein, npr. fuzioni protein Fc-receptora. U nekim realizacijama, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je agens, kao što je molekul antitela, koji stupa u interakciju sa proteinom imunološke kontrolne tačke. U nekim realizacijama, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je agens, kao što je molekul antitela, koji je u interakciji sa ligandom receptora imunološke kontrolne tačke. U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitor (npr. inhibitorno antitelo ili inhibitor malih molekula) CTLA-4 (npr. anti-CTLA4 antitelo kao što je ipilimumab/Yervoy ili tremelimumab). U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitor (npr. inhibitorno antitelo ili inhibitor malih molekula) PD-1 (npr. nivolumab/Opdivo<®>; pembrolizumab/Keytruda<®>; pidilizumab/CT-011). U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitor (npr. inhibitorno antitelo ili inhibitor malih molekula) PD-Ll (npr. MPDL3280A/RG7446; MEDI4736; MSB0010718C; BMS 936559). U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitor (npr. inhibitorno antitelo ili Fc fuzija ili inhibitor malih molekula) PDL2 (npr. PDL2/Ig fuzioni protein kao što je AMP 224). U jednoj realizaciji, inhibitor molekula imunološke kontrolne tačke je inhibitor (npr. inhibitorno antitelo ili inhibitor malih molekula) B7-H3 (npr. MGA271), B7-H4, BTLA, HVEM, TIM3, GAL9, LAG3, VISTA, KIR, 2B4, CD160, CGEN-15049, CHK 1, CHK2, A2aR, B-7 familija liganada, ili njihova kombinacija. Inhibitori molekula imunih kontrolnih tačaka mogu se podeliti u najmanje 4 glavne kategorije: i) agensi kao što su molekuli antitela koji blokiraju inhibitorni put direktno na T ćelijama ili ćelije prirodnih ubica (NK) (npr. PD-1 ciljaju antitela kao što su nivolumab i pembrolizumab, antitela koja ciljaju TIM-3, i antitela koja ciljaju LAG-3, 2B4, CD160, A2aR, BTLA, CGEN-15049 ili KIR), ii) agensi kao što su antitela koja aktiviraju stimulativne puteve direktno na T ćelije ili NK ćelije (npr. antitela koja ciljaju OX40, GITR ili 4-1BB), iii) agensi kao što su molekuli antitela koji blokiraju supresivni put na imunim ćelijama ili se oslanjaju na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela kako bi se iscrpile supresivne populacije imunih ćelija (npr. CTLA-4 ciljajuća antitela kao što je ipilimumab, antitela koja ciljaju VISTA, i antitela koja ciljaju PD-L2, Gr1 ili Li6G), i iv) agensi kao što su molekuli antitela koji blokiraju supresivni put direktno na kancerogenim ćelijama ili koji se oslanjaju na ćelijsku citotoksičnost zavisnu od antitela da pojačaju citotoksičnost za ćelije raka (npr. rituksimab, antitela koja ciljaju PD-Ll i antitela koja ciljaju B7-H3, B7-H4, Gal-9 ili MUC1). Ovakvi agensi koji su ovde opisani mogu biti dizajnirani i proizvedeni, na primer, konvencionalnim metodama poznatim u tehnici (npr. Templeton, Gene and Cell Therapy, 2015; Green and Sambrook, Molecular Cloning, 2012).

Nosači ovde opisani za polipeptide

[0203] Dok se u mnogim realizacijama ovde, jedan ili više (npr. dva ili više) egzogenih polipeptida nalaze na ili u crvenim krvnim zrncima, podrazumeva se da bilo koji egzogeni polipeptid ili kombinacija egzogenih polipeptida ovde opisanih takođe, može da se nalazi na ili u drugom nosaču. Nosač može da sadrži, na primer, ćeliju, eritroidnu ćeliju, telo, nanočesticu, micelu, liposom ili egzozom. Na primer, sadašnji pronalazak obezbeđuje vehikulum (npr. ćeliju, eritroidnu ćeliju, telo, nanočesticu, micelu, liposom ili egzosom) koji sadrži, npr., na svojoj površini, jedan ili više agenasa koji su ovde opisani. U nekim realizacijama, jedan ili više agenasa sadrži polipeptid koji vezuje PD-1 (npr. molekul antitela koji vezuje PD-1 ili agonistu PD-1 kao što je PD-L1), polipeptid koji vezuje PD-L1 (npr. molekul antitela koji vezuje PD-L1), polipeptid koji vezuje CD20 (npr. molekul antitela koji vezuje CD20), ili polipeptid koji vezuje TRAIL receptor (npr. agonistu TRAIL receptora). U nekim realizacijama, jedan ili više agenasa sadrže agens izabranog polipeptida iz bilo koje od Tabele 1, Tabele 2 ili Tabele 3, ili njegov fragment ili varijantu, ili njegovog agonistu ili antagonistu, ili njegov molekul antitela. U nekim realizacijama, nosač sadrži dva ili više ovde opisanih agenasa, npr., bilo koji par ovde opisanih agenasa.

[0204] U nekim realizacijama, nosač sadrži eritroidnu ćeliju. U realizacijama, eritroidna ćelija je crvena krvna ćelija sa jezgrom, prekursor crvenih krvnih zrnaca ili enukleisana crvena krvna ćelija. U realizacijama, eritroidna ćelija je matična ćelija iz pupčane vrpce, CD34+ ćelija, hematopoetska matična ćelija (HSC), ćelija koja formira koloniju slezine (CFU-S), ćelija zajedničkog mijeloidnog progenitora (CMP), ćelija koja formira koloniju blastocita, jedinica za formiranje praska-eritroid (BFU-E), megakariocitno-eritroidna progenitorska ćelija (MEP), jedinica za formiranje eritroidne kolonije (CFU-E), retikulocit, eritrocit, indukovana pluripotentna matična ćelija (iPSC), mezenhimska matična ćelija (MSC), polihromatski normoblast, ortohromatski normoblast ili njihova kombinacija. U nekim realizacijama, eritroidne ćelije su besmrtne ili imortalizovane ćelije.

Ćelije inkapsulirane u membrani

[0205] U nekim realizacijama, enukleisane eritroidne ćelije ili drugi ovde opisani nosači su inkapsulirani u membrani, npr., polupropusnoj membrani. U realizacijama, membrana sadrži polisaharid, npr. anjonski polisaharid alginat. U realizacijama, polupropusna membrana ne dozvoljava ćelijama da prođu, ali dozvoljava prolaz malim molekulima ili makromolekulima, npr. metabolitima, proteinima ili DNK. U realizacijama, membrana je ona koja je opisana u Lienert et al., "Sintetička biologija u ćelijama sisara: alati za istraživanje nove generacije i terapeutici" Nature Reviews Molecular Cell Biology 15, 95-107 (2014). Ne želeći da budemo ograničeni teorijom, u nekim realizacijama, membrana štiti ćelije od imunog sistema i/ili drži veći broj ćelija u blizini, olakšavajući međusobnu interakciju ili interakciju međusobnih proizvoda.

Otkriveni preparati za upotrebu u metodama lečenja, npr. crvene krvne ćelije sa enukleacijom

[0206] Metode primene enukleisanih crvenih krvnih ćelija (npr. retikulocita) koje sadrže (npr. izražavaju) egzogeni agens (npr. polipeptide) su opisane, npr., u WO2015/073587 i WO2015/153102.

[0207] U realizacijama, ovde opisana enukleisana crvena krvna zrnca, mogu biti korišćena u postupku lečenja subjekta kome je to potrebno, pri čemu postupak obuhvata primenu ćelija kod subjekta npr., sisara, npr. čoveka. Primeri sisara koji se mogu lečiti uključuju, bez ograničenja, ljude, domaće životinje (npr. pse, mačke i slično), gajene životinje (npr. krave, ovce, svinje, konje i slično) i laboratorijske životinje (npr. majmune, pacove, miševe, zečeve, morsku prasad i slično). Metode opisane ovde su primenljive i za humanu terapiju i veterinarsku primenu.

[0208] U nekim realizacijama, eritrociti se daju pacijentu svakih 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 meseci.

[0209] U nekim realizacijama, doza RBC-a sadrži oko 1x10<9>- 2x10<9>, 2x10<9>- 5x10<9>, 5x10<9>- 1x10<10>, 1x10<10>- 2x10<10>, 2x10<10>- 5x10<10>, 5x10<10>- 1x10<11>, 1x10<11>- 2x10<11>, 2x10<11>- 5x10<11>, 5x10<11>- 1x10<12>, 1x10<12>- 2x10<12>, 2x10<12>- 5x10<12>, ili 5x10<12>- 1x10<13>ćelija.

[0210] U nekim realizacijama, eritrociti se daju pacijentu u režimu doziranja (doza i periodičnost primene) koji je dovoljan da održi funkciju primenjenih eritrocita u krvotoku pacijenta tokom perioda od 2 nedelje do godinu dana, npr. jednog meseca do godinu dana ili duže, npr. najmanje 2 nedelje, 4 nedelje, 6 nedelja, 8 nedelja, 3 meseca, 6 meseci, godinu, 2 godine.

[0211] Sadašnji pronalazak obezbeđuje preparat, ovde opisan, za upotrebu u postupku lečenja bolesti ili stanja opisanog ovde, koji obuhvata primenu kod subjekta kome je to potrebno ovde opisane kompozicije, npr., enukleisanog crvenog krvnog zrnca (npr. retikulocita) opisanog ovde. U nekim realizacijama, bolest ili stanje je rak. Pronalazak obezbeđuje eritroidnu ćeliju, npr. crvenu krvnu ćeliju, koja je ovde opisana za lečenje bolesti ili stanja opisanog ovde, npr. raka. Pronalazak obezbeđuje upotrebu eritroidne ćelije, npr. crvenih krvnih zrnaca opisanih ovde za proizvodnju leka za lečenje bolesti ili stanja opisanog ovde, npr. raka.

[0212] Tipovi karcinoma uključuju akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL), akutnu mijeloidnu leukemiju (AML), analni kancer, rak žučnih kanala, rak mokraćne bešike, kancer kostiju, rak creva, tumore mozga, rak dojke, kancer nepoznate osnove, rak koji se širi na kosti, rak koji se širi na mozak, rak koji se širi na jetru, rak koji se širi na pluća, karcinoid, rak grlića materice, horiokarcinom, hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL), hroničnu mijeloidnu leukemiju (CML), rak debelog creva, kolorektalni kancer, rak endometrijuma, rak oka, rak žučne kese, rak želuca, gestacijske trofoblastične tumore (GTT), leukemiju vlaknastih ćelija, rak glave i vrata, Hočkinov limfom, rak bubrega, rak larinksa, leukemiju, rak jetre, rak pluća, NSCLC, limfom, melanomski rak kože, mezoteliom, rak kod muškaraca, molarnu trudnoću, rak usta i orofarinksa, mijelom, rak nosa i sinusa, rak nazofarinksa, ne-Hočkinov limfom (NHL), rak jednjaka, rak jajnika, rak pankreasa, rak penisa, rak prostate, retke kancere, rak rektuma, rak pljuvačke žlezde, sekundarne karcinome, rak kože (nemelanomski), sarkom mekog tkiva, rak stomaka, rak testisa, rak štitne žlezde, nepoznati primarni kancer, rak materice, rak vagine i rak vulve.

DODATNE TABELE

[0213]

Tabela 4. Primeri modifikatora, npr., proteaze

(nastavak)

PRIMERI

Primer 1. Agens-sinergistička aktivnost eRBC-a koji izražava dva različita liganda TRAIL receptora na površini

[0214] Sintetizovani su geni za agoniste TRAIL receptora DR4.2 (SEK ID 2) i DR5.2 (SEK ID 5). Geni su klonirani u lentivirusni vektor (SBI) ushodno od gena za humani glikoforin A i razdvojeni sekvencom koja kodira Gli-Ser od 12 aminokiselina (GGGSGGGSGGGS (SEK ID BR: 19)) fleksibilni linker i oznaku HA epitopa (YPYDVPDY (SEK ID BR: 20)).

[0215] Humane CD34+ ćelije izvedene iz mobilisanih ćelija periferne krvi normalnih ljudskih donora kupljene su zamrznute od AUCells Inc. Ćelije su odmrznute u PBS-u sa 1% FBS. Ćelije su zatim kultivisane u StemSpan SFEM medijumu sa StemSpan CC100 mešavinom citokina pri gustini od 1E5 ćelija/mL. Medijum je zamenjen sa medijumom za diferencijaciju 5. dana.

[0216] Protokol proizvodnje virusa je sproveden na sledeći način. Ukratko, HEK293T ćelije su zasejane 24 sata pre transfekcije. Ćelije su transfektovane sa lentivektorom koji sadrži konstrukt zajedno sa plazmidima za pakovanje. Zamena medija je izvršena 24 sata nakon transfekcije, a virusi su sakupljeni 72 sata nakon transfekcije. Šestog dana nakon odmrzavanja, ćelije su transdukovane sa jednakim zapreminama svakog od virusa u odnosu zapremine ćelije prema zapremini virusa od 1:1 i spinokulisane na 845xg tokom 1,5 sata sa 5-10 μg/ml polibrena).

[0217] Transdukovane ćelije su diferencirane u definisanom medijumu na ćelije eritroidne loze i na zrele enukleisane retikulocite prema metodi od strane Hu i sar., Blood 18 April 2013 Vol 121, 16. Ukratko, postupak ćelijske kulture je obuhvatao 3 faze. Sastav baznog medijuma za kulturu bio je Iscove-ov modifikovani Dulbekov medijum, 2% humane periferne krvne plazme, 3% humanog AB seruma, 200 mg/mL holohumanog transferina, 3 IU/mL heparina i 10 mg/mL insulina. U prvoj fazi (od 0 do 6 dana), CD341 ćelije u koncentraciji od 10^5/mL su kultivisane u prisustvu 10 ng/mL faktora matičnih ćelija, 1 ng/mL IL-3 i 3 IU/mL eritropoetina. U drugoj fazi (od 7. do 11. dana), IL-3 je izostavljen iz medijuma za kulturu. U trećoj fazi koja je trajala do 21. dana, koncentracija ćelija je podešena na 10^6/mL 11. dana i na 5x10^6/mL 15. dana, respektivno. Medijum za ovu fazu je bio bazni medijum plus 3 IU/mL eritropoetina, a koncentracija transferina je podešena na 1 mg/mL.

[0218] Ekspresija transgena je praćena obeležavanjem sa rastvorljivim TRAIL R1 i TRAIL R2 (nabavljen od Sigma-Aldrich Inc.) hemijski konjugovanim sa komplementarnim fluorescentnim bojama Fluoresceinom i DyLight 650 i analizirani protočnom citometrijom. Nivoi ekspresije oba liganda DR4.2 i DR5.2 su verifikovani protočnom citometrijom.

[0219] Test apoptoze ćelijske linije tumora je sproveden prema modifikovanoj verziji Marconi i sar., Cell Death and Disease 2013. Ukratko, potpuno zreli enukleisani retikulociti koji eksprimiraju DR4.2 i DR5.2 su inkubirani sa CFSE-obeleženim Raji ćelijama tokom 24 sata u odnosu 1:1. Nakon toga ćelije su obojene sa aneksinom V i analizirane protočnom citometrijom. Procenti apoptoze su određeni iz CFSE pozitivnih Raji ćelija koje su takođe pozitivno obojene na aneksin V.

[0220] Kao što je prikazano na slici 1, kada su CFSE obeležene Raji ćelije inkubirane sa netransdukovanim, DR4.2 transdukovanim, DR5.2 transdukovanim, ili mešavinom DR4.2 transdukovanih i DR5.2 transdukovanih kultivisanih retikulocita, primećena je minimalna ćelijska smrt u pozadini. Međutim, kada su CFSE obeležene Raji ćelije inkubirane sa kultivisanim retikulocitima koji su istovremeno transdukovani sa DR4.2 i DR5.2 i na taj način eksprimiraju oba proteina istovremeno, primećena je značajna količina ćelijske smrti (ekvivalentna maksimalnoj količini TRAIL- indukovane apoptoze koja se može postići u ovom testu sa Raji ćelijama - videti, npr. Marconi i sar., Cell Death and Disease 2013). Ovi podaci ukazuju da je koordinisano delovanje agonista TRAIL receptora na površini jednog konstruisanog crvenog krvnog zrnca u stanju da indukuje ubijanje ćelija na sinergistički način, u odnosu na ćelije koje eksprimiraju pojedinačne agoniste TRAIL receptora, čak i u odnosu na mešavinu ćelija od kojih svaka eksprimira različiti agonist TRAIL receptora.

[0221] Ćelijska populacija se može formulisati u rastvoru aditiva AS-3 i primeniti intravenozno pacijentu koji boluje od Burkitovog limfoma. Očekuje se da pacijent tada pokaže poboljšanje simptoma mereno smanjenjem veličine limfnih čvorova, poboljšanjem hepatosplenomegalije i/ili smanjenjem mučnine i povraćanja.

Primer 2. Generisanje eRBC-a za hvatanje koji sadrži 5 citokine za upotrebu u lečenju sepse

[0222] Geni za anti-TNFa (SEK ID 7), anti-IL6 (SEK ID 6), CD14 (Uniprot # P08571), IFNGR1 (Uniprot # P15260) i IL12R1 (Uniprot # P42701) su sintetisani od strane komercijalnog prodavača. Geni su klonirani u lentivirusni vektor (SBI) ushodno od gena za humani glikoforin A i razdvojeni sekvencom koja kodira Gli-Ser od 12 aminokiselina (GGGSGGGSGGGS (SEK ID BR: 19)) fleksibilni linker i oznaku HA epitopa (YPYDVPDY (SEK ID BR: 20)).

[0223] Humane CD34+ ćelije se mogu kultivisati i virus se može proizvesti, kao što je opisano u Primeru 1. Transdukovane ćelije se diferenciraju kao što je ovde opisano.

[0224] Da bi se procenila ekspresija transgena, ćelije su istovremeno obeležene sa ligandima TNFa, IL-6, IFNg i IL-12 (nabavljenim od Life Technologies), kao i lipopolisaharidima (ThermoFisher), koji su hemijski konjugovani sa komplementarnim fluorescentnim bojama. Ćelije se analiziraju protočnom citometrijom da bi se potvrdilo da su (a) svi agensi eksprimirani na površini ćelije i (b) da su agensi sposobni da se vežu za svoje ciljne ligande.

[0225] Ćelijska populacija se formuliše u rastvoru aditiva AS-3 i primenjuje intravenozno pacijentu koji razvija sepsu. Očekuje se da pacijent tada pokaže poboljšanje simptoma mereno smanjenjem nivoa cirkulišućih citokina, smanjenjem ili prevencijom sindroma vaskularnog curenja i poboljšanim preživljavanjem.

Primer 3. eRBC koji sadrži kombinatornu biblioteku tumorskih antigena za upotrebu kao vakcina protiv raka

[0226] Humane CD34+ ćelije se mogu kultivisati kao što je opisano u Primeru 1. Ćelije se diferenciraju u ćelije eritroidne loze kao što je ovde opisano.

[0227] Biopsijom se izoluje uzorak ćelija raka melanoma od pacijenta. Ćelije se liziraju i ukupna RNK se ekstrahuje korišćenjem prečišćavanja na koloni silicijum dioksida (ThermoFisher), kvantifikuje na sadržaj RNK apsorpcionom spektroskopijom i čuva na -80 C.

[0228] Četiri dana pre terminalne diferencijacije kulture crvenih krvnih zrnaca, ćelije su sakupljene, isprane dva puta sa IMDM-om bez seruma i resuspendovane do konačne koncentracije od 10-40x10^6 ćelija/mL u Opti-MEM. Nakon toga, 0,5 mL ćelijske suspenzije se pomeša sa 20 ug mRNK i elektroporiše u kiveti od 0,4 cm koristeći Easyject Plus uređaj (EquiBio, Kent, Ujedinjeno Kraljevstvo) pri uslovima od 300V i 150 uF. Nakon elektroporacije, svež medijum za sazrevanje crvenih krvnih zrnaca se dodaje ćelijskoj suspenziji i ćelije se dalje inkubiraju na 37°C u vlažnoj atmosferi sa dodatkom 5% CO2.

[0229] Potpuno zreli retikulociti su okarakterisani na ekspresiju proteina masenom spektrometrijskom analizom ćelijskog lizata. Neelektroporisane ćelije i ćelije sa elektroporacijom koje se primenjuju u PBS-u umesto RNK se koriste kao kontrole za identifikaciju endogenih retikulocitnih proteina iz egzogenih proteina dobijenih od raka.

[0230] Ćelijska populacija se formuliše u rastvoru aditiva AS-3 i primenjuje intravenozno pacijentu koji boluje od melanoma. Očekuje se da pacijent tada ispolji imuni odgovor protiv antigena melanoma, mereno smanjenjem metastatskih masa CT skeniranjem i rezolucijom melanomskih lezija kože.

Primer 4: Genetski inženjering eritrocita kao antitumorska terapija za ne-Hočkinov limfom (NHL)

[0231] Generisana su crvena krvna zrnca koja na svojoj površini eksprimiraju antitela protiv PD-1 i PD-L1 (RCT-antiPD-1 i RCT-antiPD-L1) da se proceni da li ove ćelije mogu da vežu svoje mete i aktiviraju snažan imuni odgovor. Vezivanje RCT-antiPD-1 i RCT-antiPD-Ll za rekombinantne PD-1 i PD-L1, respektivno, određeno je korišćenjem protočne citometrije i pokazano je da je visoko specifično. Proizvedena su i crvena krvna zrnca koja na svojoj površini eksprimiraju fuzioni protein koji sadrži, od N-do-C kraja, domen anti-CTLA4 scFv antitela na bazi ipilimumaba, oznaku epitopa i GPA pune dužine (ekstracelularni, transmembranski i citoplazmatski domeni. Snažna ekspresija anti-CTLA4 polipeptida je primećena u testu protočne citometrije, pri čemu je preko 95,2% ćelija izrazilo anti-CTLA4 nakon transfekcije sa vektorom koji kodira anti-CTLA4.

[0232] Funkcionalna aktivnost je testirana korišćenjem in vitro ispitivanja sekrecije IL-2 Jurkatovih ćelija. U ovom testu, sekrecija IL-2 je inhibirana inkubacijom Jurkat ćelija sa NHL ćelijama (Z138) koje eksprimiraju PD-L1 indukovan stimulacijom sa CD3/CD28 tetramerima. Sekrecija IL-2 je spašena kultivisanjem ćelija Jurkat i Z138 sa RCT-antiPD-1 ili RCT-antiPD-L1, ali ne i kontrolnim RCT. RCT-antiCTLA4 je takođe pokazao spasavanje i obnavljanje sekrecije IL-2 T ćelija.

[0233] Ispitana je sposobnost ovih konstruisanih crvenih krvnih ćelija da pobude aktivaciju u standardnom testu poziva antigena. Pokazano je snažno povećanje od 4-6 puta u sekreciji gama interferona od mononuklearnih ćelija periferne krvi (PBMC) u testu poziva antigena. Donorski PBMC su stimulisani uobičajenim antigenom virusa gripa. Memorijske T ćelije osetljive na inhibiciju imunološke kontrolne tačke testirane su na aktivaciju i lučenje gama interferona kokulturom sa RCT-antiPD-1 ili RCT-antiPD-L1 u poređenju sa kontrolnim PBMC ili kontrolnim RCT.

[0234] Ovi eksperimenti pokazuju da su crvene krvne ćelije sposobne za angažovanje u specifičnim interakcijama ćelije sa ćelijom i angažovanjem kontrolne tačke imuniteta.

[0235] Pored toga, generisane su crvene krvne ćelije koja eksprimiraju jednolančani varijabilni fragment anti-CD20 na svojoj površini (RCT-antiCD20). Procenjena je njihova sposobnost da vezuju CD20+ ćelije limfoma in vitro. Ovaj eksperiment je pokazao efikasno i specifično vezivanje RCT-antiCD20 za ciljne ćelije korišćenjem protočne citometrije i imunofluorescentne mikroskopije. Takođe je procenjeno da li ova interakcija može da izazove apoptozu, zajedničkim kultivisanjem RCT-antiCD20 ćelija sa panelom CD20+ ćelijskih linija humanog limfoma, koje predstavljaju podtipove limfoma; DoHH2 (folikularni limfom), Ramos (Burkitov limfom), Granta-519 (primarni limfom gastrointestinalnog trakta) i SU-DHL-4 (difuzni limfom velikih B ćelija). U svim slučajevima, RCT-antiCD20 ko-kultura je rezultirala povećanom apoptozom u odnosu na RCT ili rastvorljivo monoklonsko antitelo rituksimab samostalno. Pretpostavlja se da je direktno ubijanje tumorskih ćelija in vitro efikasnije od samog monoklonskog antitela usled hiper-umrežavanja CD20 na ćeliji limfoma. Ovaj efekat je prikazan i in situ demonstracijom grupisanja receptora i stimulacijom apoptotičkih puteva. Ovi nalazi stoga pokazuju novu biologiju za proteine eksprimirane na RCT-u i opravdavaju ispitivanje uticaja na tumore limfoma in vivo.

Primer 5: Hvatanje i modifikacija ciljnog proteina

[0236] U ovom primeru, transgene enukleisane eritroidne ćelije su korišćene za hvatanje i modifikovanje ciljnog proteina. Kontrolne ćelije i eksperimentalne ćelije sadrže endogeni glikoforin A (GPA) u svojim membranama, koji je korišćen za vezivanje ciljnog proteina. Eksperimentalne ćelije su eksprimirale egzogeni protein koji sadrži površinski izložen IdeS spojen sa GPA kao membransko sidro. IdeS je sposoban za cepanje antitela da bi proizveo F(ab')2 fragment i Fc fragment. Ciljni protein je anti-GPA antitelo koje je fluorescentno obeleženo FITC-om. I konstantni i varijabilni regioni ciljnog antitela bili su obeleženi FITC, tako da ako je antitelo cepljeno, oba fragmenta mogu biti detektovana.

[0237] Prvo, pomoću FACS analize su testirane kontrolne ćelije i ćelije koje eksprimiraju IdeS na sposobnost vezivanja anti-GPA antitela. I kontrolne ćelije i ćelije koje eksprimiraju IdeS su vezivale antitelo što je mereno povezivanjem FITC sa ćelijama (podaci nisu prikazani). Pored toga, i kontrolne ćelije i ćelije koje eksprimiraju IdeS su vezivale antitelo kao što je mereno drugom metodom detekcije sa fluorescentno obeleženim anti-zečjim Fc antitelom (podaci nisu prikazani). Ova merenja su sprovedena u ranoj vremenskoj tački, pre nego što su ćelije inkubirane da bi se omogućilo cepanje ciljnog antitela posredovano IdeS.

[0238] Nasuprot tome, samo ćelije koje eksprimiraju IdeS su bile u stanju da cepaju ciljno antitelo. Ovo je pokazano inkubacijom kontrolnih ćelija ili ćelija koje eksprimiraju IdeS sa ciljnim antitelom da bi se omogućilo cepanje antitela. U reakciju je dodato fluorescentno obeleženo antizečje Fc antitelo da bi se otkrila intaktna antitela na površini eritroidnih ćelija. Ćelije koje eksprimiraju IdeS pokazale su smanjenje anti-zečje Fc veze sa ćelijama (slika 2), što ukazuje na niže nivoe Fc na površini ćelija koje eksprimiraju IdeS u poređenju sa kontrolnim ćelijama. Nije došlo do smanjenja količine direktno FITC-obeleženog ciljnog antitela povezanog sa kontrolnim ćelijama ili ćelijama koje eksprimiraju IdeS, što ukazuje da je barem FITC-obeleženi varijabilni region ciljnog antitela još uvek vezivao IdeS-eksprimirajuće i kontrolne ćelije. Ovaj rezultat je potvrđen Western blot-om, gde su korišćena antitela protiv zečjeg teškog lanca i protiv zečjeg lakog lanca za detekciju intaktnog i cepanog antitela u supernatantu kontrolnih ćelija ili ćelija koje eksprimiraju IdeS. Eksperiment je pokazao da eritroidne ćelije koje eksprimiraju IdeS, ali ne i kontrolne eritroidne ćelije, cepaju anti-GPA-antitelo, što je rezultiralo pojavom fragmenta teškog lanca (Sl.3).

[0239] Stoga, kontrolne ćelije su bile sposobne da vezuju ciljno antitelo, ali samo ćelije koje eksprimiraju IdeS su bile sposobne da vezuju i cepaju ciljno antitelo.

Primer 6: RCT-anti-PD-L1 promoviše proliferaciju T ćelija

[0240] Ovaj primer pokazuje da je ko-kultura RCT-antiPD-L1 sa PBMC dovela do poboljšane proliferacije T-ćelija, na osnovu povećanja ukupnog broja T ćelija od 4,4 puta nakon inkubacije sa RCT-antiPD-L1 u poređenju sa PBMC samostalno.

Primer 7: RCTs koji eksprimiraju kostimulatorni protein

[0241] Približavajući se aktivaciji T-ćelija iz drugog ugla, RCT-ovi su konstruisani da eksprimiraju 41-BB-L, kostimulativni protein koji se eksprimuje na ćelijama koje predstavljaju antigen i vezuje 41-BB receptor na T-ćelijama (RCT-41-BB-L). Vezivanje RCT-41-BB-L za rekombinantni 41-BB je određeno korišćenjem protočne citometrije. Ko-kultura PBMC sa RCT-41-BB-L pokazala je povećanje u proliferaciji T-ćelija od 1,7 puta u poređenju sa samim PBMC. Konačno, kada je RCT-41-BB-L inkubiran sa Jurkatovim ćelijama koje prekomerno eksprimiraju 41-BB i NFkB-Luc2P, aktivacija ekspresije luciferaze posredovane NFkB se povećala 30 puta u poređenju sa kontrolama.

Primer 8: Terapeutici crvenih ćelija koji zajedno izražavaju anti-CD20 i TRAIL ligand

[0242] Kada su eritroidne ćelije konstruisane da istovremeno eksprimiraju anti-CD20 kao i Trail ligand (sredstvo za indukciju apoptoze), ko-kultura Ramos ćelija sa RCT-antiCD20, RCT-Trail i RCT-antiCD20 Trail (zajedno eksprimiran) ispoljava 32%, 47% i 76% apoptoze respektivno nakon 48 sati, što ukazuje na sinergistički efekat ubijanja ćelija ko-eksprimirajućih RCT-ova.

[0243] Populacija ćelija koja sadrži TRAIL ligand i anti-CD20 deo može biti formulisana u rastvoru aditiva AS-3 i primenjena intravenski kod pacijenta, na primer, kod pacijenta koji boluje od raka.

[0244] Populacija ćelija koja sadrži TRAIL ligand i anti-CD20 deo može biti formulisana u rastvoru aditiva AS-3 i primenjena intravenski kod pacijenta, na primer, kod pacijenta koji boluje od raka.

Claims

PATENTNI ZAHTEVI 1. Enukleisana crvena krvna ćelija koja sadrži egzogeni polipeptid koji uključuje 4-1BBL ili njegov funkcionalni fragment, naznačena time, da je fragment sposoban da se vezuje za i signalizira preko receptora 4-1BB.
2. Enukleisana crvena krvna ćelija prema patentnom zahtevu 1, gde je egzogeni polipeptid prisutan na površini crvenog krvnog zrnca.
3. Enukleisana crvena krvna ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, da je egzogeni polipeptid fuzioni protein sa transmembranskim proteinom.
4. Enukleisana crvena krvna ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, da je crvena krvna ćelija pripremljena postupkom koji obuhvata dovođenje u kontakt hematopoetske progenitorske ćelije sa nukleinskom kiselinom koja kodira egzogeni polipeptid, i omogućavanje hematopoetskoj progenitorskoj ćeliji da se širi i diferencira u kulturi tako da formira enukleisanu crvenu krvnu ćeliju.
5. Enukleisana crvena krvna ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, da egzogenom polipeptidu nedostaje signatura prenosa sortaze.
6. Enukleisana crvena krvna ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačena time, da crvena krvna ćelija dalje sadrži drugi egzogeni polipeptid.
7. Farmaceutski preparat koji sadrži mnoštvo enukleisanih crvenih krvnih ćelija prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva.
8. Farmaceutski preparat prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u postupku za lečenje raka kod subjekta.
9. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 7, za upotrebu u promovisanju T-ćelijske proliferacije kod subjekta kome je to potrebno.
10. Postupak izrade enukleisane crvene krvne ćelije prema patentnom zahtevu 1, postupak koji obuhvata: kontaktiranje hematopoetske progenitorske ćelije sa nukleinskom kiselinom koja kodira egzogeni polipeptid, i omogućavanje hematopoetskoj progenitorskoj ćeliji da se širi i diferencira u kulturi tako da formira enukleisanu crvenu krvnu ćeliju.