RS62975B1 - In vitro postupak za povećanje nivoa izlučivanja interleukina 2 i iz njega izvedenih proteina - Google Patents

In vitro postupak za povećanje nivoa izlučivanja interleukina 2 i iz njega izvedenih proteina

Info

Publication number
RS62975B1
RS62975B1 RS20220217A RSP20220217A RS62975B1 RS 62975 B1 RS62975 B1 RS 62975B1 RS 20220217 A RS20220217 A RS 20220217A RS P20220217 A RSP20220217 A RS P20220217A RS 62975 B1 RS62975 B1 RS 62975B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
sec
cells
human
muteins
vitro
Prior art date
Application number
RS20220217A
Other languages
English (en)
Inventor
Dorantes Gertrudis Rojas
Monzón Kalet León
Portilla Tania Carmenate
Original Assignee
Ct Inmunologia Molecular
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ct Inmunologia Molecular filed Critical Ct Inmunologia Molecular
Publication of RS62975B1 publication Critical patent/RS62975B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2013—IL-2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Description

Opis
OBLAST TEHNIKE
[0001] Ovaj se pronalazak odnosi na oblast biotehnologije. Specifično na in vitro postupak za uvođenje mutacija u gen interleukin 2 (IL-2) što dovodi do povećanja nivoa izlučivanja pomenutog molekula u familiji imunomodulatornih muteina izvedenih iz njega bez uticaja na njihove biološke funkcije.
OBLAST TEHNIKE
[0002] IL-2, je originalno opisan kao faktor rasta za T ćelije (Smith, K.A. Immunol. Rev.51: 337-357, 1980), se naknadno pojavio kao regulator sa dvostrukim funkcijama unutar odgovora imunog sistema (Malek, T.R. Annu. Rev. Immunol.26: 453-479, 2008; Hoyer K.K. et al, Immunol. Rev. 226: 19-28, 2008), što ispoljava sposobnost da se promovišu ili negativno modulišu efektorske funkcijeimunog sistema. Njegova glavna uloga se trenutno razmatra da je povezana sa održavanjem imunološke tolerancije (Malek, T.R. & Bayer, A.L. Nat. Rev. Immunol.4: 665-674, 2004) iako stimulacija regulatornih T ćelija, koja konstitutivno eksprimuje visoke nivoe alfa lanca IL-2 receptora. Iako beta i gama podjedinice formiraju posredni afinitet dimerni receptor konstitutivno predstavlja u ćelijama efektora imunog sistema, konstitutivno prisustvo visokih nivoa alfa lanca daje regulatorne T ćelije visokoafinitetan trimerni receptor koji omogućava preferencijalnu upotrebu citokina pomoću ove populacije ćelije. (Malek, T.R. & Castro, I. Immunity.33:
153-165, 2010).
[0003] Funkcionalna dihotomija IL-2 je istraživana da bi se proizvela suprotna teapijska dejstva na imuni sistem i modulisao odgovor imunog sistema u željenom smislu u različitim scenarijima. Njegov imunojačajući kapacitet se koristi da bi se stimulisali antitumorski odgovori (Klapper, J.A. et al, Cancer.113: 293-301, 2008). Sa druge strane, sposobnost IL-2 da stimuliše preferencijalno T regulatorne ćelije sekoriste kroz primenu niskih doza, nedovoljno da se stimulišu efektorske T ćelije ili proizvedu toksična dejstva, za kontrolu autoimunih poremećaja (Hartemann, A. et al, Lancet Diabetes Endocrinol.1: 295-305, 2013) i upala (Saadoun, D. et al, N. Engl. J. Med.365: 2067-2077, 2011), i bolesti transplantiranog organa naspram organizma domaćina (Koreth, A. et al, N. Engl. J. Med. 365: 2055-2066, 2011).
[0004] Odvajanje interakcija IL-2 kroz uvođenje mutacija u različite vezujuće interfejse pri čemu su podjedinice tog receptora predložene kao način da se dobiju mtanti sa različitim imunomodulatornim svojstvima. Selektivna perturbacija interfejsa sa alfa lancem pomoću usmerene mutageneze je omogućila da se dobije molekul koji se zove nema-alfa smanjenog kapaicteta da stimuliše regulatorne T ćelije, ali koji zadržava svoju aktivnost agonista na efektorske ćelije koje nose beta/gama dimerni receptor (Carmenate, T. et al, J. Immunol.190: 6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2). Ovaj molekul ima jako anti tumorsko dejstvo kod miševa. Sa druge strane, ometanje pomoću mutageneze IL-2 interfejsa sa beta i/ili gama podjedinicama može da generiše antagoniste IL-2 receptora koji selektivno modulišu stimulaciju različitih populacija ćelija (Shanafelt, A.B. et al, Nat. Biotechnol.18: 1197-1202, 2000; WO 2011/063770). Primeri ovog tipa molekula su muteini M1 i M2 su opisani u US 8,759,486 B2.
[0005] Pored muteina sa gubitkom njihovog kapaciteta interakcije, mutirane varijante IL-2 sa svojstvima superagonista usled povećanja njihovog kapaciteta vezivanja jednu ili drugu podjedinicu receptora su takođe opisane. Povećanje afiniteta za beta podjedinicu dovodi do proizvodnje molekula koji potencijalno stimuliše ćelije efektora i ima jako antitumorsko dejstvo (Levin, A.M. et al, Nature. 484: 529-533, 2012). Sa druge strane, povećani afinitet IL-2 za alfa podjedinicu receptora daje zamah drugim varijantama superagonista sa superiornom sposobnošću da se stimuliše proliferativni odgovor T ćelija in vitro (WO 2005/007121).
[0006] Iz IL-2 izvedeni muteini opisani gore u tekstu su dobijeni kroz racionalno projektovanje, in siliko pregledanje i usmerena evolucija IL-2 je prikazana na površini ćelija kvasca. Iako je prikaz biološki aktivnih IL-2 na filamentoznim fagima postignut (Buchli, P.J. et al, Arch. Biochem. Biophys.339: 79-84, 1997; Vispo, N.S. et al, Immunotechnology 3: 185-193, 1997), ova tehnološka platforma još nije iskorišćena za odabir novih varijanti citokina sa modifikovanim svojstvima. Preko imunomodulatornih svojstava IL-2 i njegovih izvedenih muteina, ključan element za njihovu terapijsku eksploataciju je razvoj sistema koji mu omogućavaju da se dobije u dovoljnim količinama. Specifično, na laboratorijskom nivou, na industrijskom nivou, ili transfekcijom ili transdukcijom normalnih i/ili tumoroznih ćelija ili tkiva.
[0007] Preovaldavajuća putanja za rekombinantnu proizvodnju IL-2 i drugih srodnih molekula je eksprimovanje citoplazme E. coli koja formira inkluziona tela, posle čega slede in vitro postupci ponovne naturalizacije (Devos, R. et al, Nucl. Acids Res.11: 4307-4323, 1983; Weir, M.P. & Sparks, J., Biochem. J. 245: 85-91, 1987). Uprkos upotrebi već pokazanoj za ovu strategiju, nastavlja se istraživanje drugih sistema eksprimovanja koje dovodi od početka do dobijanja pravilno presavijenih molekula je veoma slično prirodnim IL-2. Izlučivanje IL-2 u nekim od ovih sistema eksprimovanja je ograničeno tendenciom IL-2 da nagomila (Halfmann, G. et al, J. Gen. Microbiol.139: 2465-2473, 1993; Cha, H.J. et al, Biochem. Eng. J.24: 225-233, 2005).
[0008] Neočekivano, pronalazači ovog pronalaska su pronašli nekoliko mutacija koje nisu prethodno opisane ili predvidive iz analize kristalne strukture humanog IL-2, čije uvođenje povećava sposobnost različitih tipova ćelije da izluče rekombinantni humani IL-2 i višestruke muteine izvedene iz njega koji imaju specifična imunomodulatorna svojstva. Ovo otkriće obezbeđuje osnovu za upotrebu ovih mutacija na proizvodnom nivou.
[0009] Sauve K. et al, in "Localization in human interleukin 2 of the binding site to the alpha chain. Proceedings national academy of sciences PNAS, National Academy of Sciences, US, (19910101), vol.88, no.11, doi:10.1073/pnas.88.11.4636, ISSN 0027-8424 ((Lokalizacija u humanom interleukinu 2 za vezujuće mesto na alfa lanac (p55) od receptora interleukina (p55)receptora interleukina 2)", Zbornik radova nacionalne akademije nauka, SAD), opisuje upotrebu analoga humanog interleukina 2 (IL-2) sa definisanim supstitucijama aminokiseline da bi se identifikovali specifični ostaci koji su u interakciji sa 55-kDa podjedinicom (p55) ili alfa lancem receptora humanog IL-2.
[0010] WO 2005086798 opisuje nove muteine humanog interleukina 2 (IL-2) ili njihove varijante, i molekule nukleinske kiseline i njihove varijante, sa IL-2 muteinima sa nižom toksičnošću od nativnog IL-2 ili Proleukina(R) IL-2, pri čemu se zadržavaju ili pospešuju dejstva posredovana NK ćelijom.
[0011] Ulrih Vigel i saradnici., u Proteini mutanti humanog interleukina 2. Prinos iz renaturacije, proliferativna aktivnost i vezivanje receptora) (Ulrich Weigel et al., in "Mutant proteins of human interleukin 2. Renaturation yield, proliferative activity and receptor binding", European Journal of Biochemistry, GB, (19890315), vol. 180, no. 2, doi:10.1111/j.1432-1033.1989.tb14647.x, ISSN 0014-2956, stranice 295 - 300), opisuje muteine interleukina 2 (I12) generisane oligonukleotidom usmerenom mutagenezom in vitro.
[0012] Vispo N.S. I saradnici, u Prikazivanje humanog interleukina 2 na površinu bakteriofaga (Vispo N. S. et al., in "Displaying human interleukin-2 on the surface of bacteriophage", Immunotechnology, Elsevier Science Publishers BV, NL, (19971001), vol. 3, no. 3, doi:10.1016/S1380-2933(97)00012-2, ISSN 1380-2933), stranice 185 - 193, se odnosi na upotrebu tehnologije prikaza faga za izbor tehnologije visokog afiniteta za odabir visokoafinitetnih varijanti iz biblioteka hIL-2 mutanata.
[0013] Robens J. i saradnici, u radu Poboljšana periplazmična proizvodnji bioloških aktivnog mišjeg interleukna -2 za Ešerihiju koli kroz pojedinačnu promenu aminokiseline na mestu cepanja, (Robbens J. et at., in "Improved periplasmic production of biologically active murine interleukin-2 in Escherichia coli through a single amino acid change at the cleavage site", Process Biochemistry, Elsevier LTD, GB, vol. 41, no. 6, ISSN 1359-5113, (20060228)), stranice 1343 - 1346, se odnosi na postupak za povećanje izlučivanja interleukina 2 pomoću ubacivanja ostatka serina između OMpA signalnog peptida i mIL-2 zrele sekvence.
[0014] WO 2005007121 opisuje IL-2 mutante sa povećanim afinitetom za IL-2 podjedinicu alfa receptora (IL-2Ralfa).
[0015] Bilo koji od ovih dokumenata iz prethodnog stanja tehnike opisuje ove mutacije koje dovode do nekonzervativne promene aminokiseline koja zauzima poziciju 35 primarne sekvence proteina (Lys u originalnoj sekvenci), poželjno posebno supstitucije K35E, K35D i K35Q.
KRATAK OPIS PRONALASKA.
[0016] Ovaj se pronalazak odnosi na in vitro postupak koji dovodi do povećanih nivoa izlučivanja rekombinantnog humanog IL-2 u različitim domaćinima a da ne utiče na njihove biološke funkcije. Pomenuti in vitro postupak se zasniva na uvođenju jedinstvenih mutacija u gene koji kodiraju humani IL-2 i druge polipeptide izvedene iz njega, specifično muteine izvedene iz humanog IL-2 projektovanog da deluje kao antagonisti, superagonisti ili selektivni agonisti. Da bi se povećali nivoi izlučivanja pomenutih proteina kada se koristi postupak iz ovog pronalaska najmanje tri puta više u vezi sa nemutiranim parnjacima. Muteini izvedeni u ovom pronalasku se odnose na one koji imaju više od 90% identičnost sa humanim IL-2.
[0017] In vitro postupak iz ovog pronalaska se odnosi na mutacije koje dovode do nekonzervativne promene aminokiseline koja zauzima poziciju 35 primarne sekvence proteina (Lys u originalnoj sekvenci), poželjno posebno supstitucije K35E, K35D i K35Q.
[0018] Specifično, ovaj se pronalazak odnosi na proteine dobijene prema ovde opisanom postupku koji se biraju iz grupe koj obuhvata SEK ID BR.1 i SEK ID BR.4 do 6 i 8 do 18.
[0019] Takođe ovaj pronalazak opisuje genetičke konstrukte koji uključuju gore opisane gene spojene fuzijom na druge sekvence nukleotida koji kodiraju sintezu proteina fuzije na druge sekvence nukleotida pomoću IL-2 ili drugih imunomodulatornih polipeptida izvedenih odatle i dodatnim sekvencama proteina. Dodatne sekvence proteina uključuju ali se ne ograničavaju na kapsidne proteine filamentozne fage, albumin, Fc region antitela, cela antitela ili fragmente antitela koji uključuju neke promenljive domene.
[0020] Domaćini koji se koriste da bi se dobili molekuli gore opisani uključuju ćelije E. Coli, kvasca i ćelije sisara kao što je HEK-293, CHO, NSO, između ostalog. Taj in vitro postupak iz ovog pronalaska je koristan za poboljšanje efikasnosti proizvodnje IL-2 i drugih polipeptida izvedenih iz njega, i u laboratorijskoj i u industrijskoj primeni. Proteini dobijeni pomoću in vitro postupka iz ovog pronalaska mogu da se koriste u svrhe terapije.
[0021] Ovaj pronalazak takođe opisuje modifikaciju fiziologije normalnih i tumoroznih ćelija i/ili tkiva kroz ekspresiju humanog IL-2 i / ili familiju imunomodulatornih muteina izvedenih iz njih (samih ili fuzionisanih na druge proteine), i in vitro i in vivo. Primeri transdukcije T limfocita, B limfocita ili NK ćelija za adoptivne terapije transfera; ili direktnu transdukciju / transfekciju tkiva tumora. Postupak iz ovog pronalaska je koristan za povećanje izlučivanja molekula od interesa u ovim kontekstima.
DETALJAN OPIS OVOG PRONALASKA:
[0022] Ovaj se pronalazak odnosi na in vitro postupak koji dovodi do povećanih nivoa izlučivanja rekombinantnog humanog IL-2 za različite domaćine koji se biraju iz grupe koja obuhvata E. coli, ćelije sisara i kvasce a bez uticaja na njihove biološke funkcije. Pomenuti in vitro postupak se zasniva na uvođenju jedinstvenih mutacija u gene koji kodiraju humani IL-2 i druge polipeptide izvedene iz njega, koji uključuju muteine izvedene iz humanog IL-2 projektovanih da deluju kao antagonisti, superagonisti ili selektivni agonisti.
Identifikacija mutacija povećanja kapaciteta proteina izvedenih iz humanog IL-2 koji treba da se prikažu na filamentoznim fagima.
[0023] Odabir polipeptida izvedenih iz humanog IL-2, sa jedinstvenim mutacijama koje dovode do povećanja njihovih nivoa prikaza na filamentozne fage može da se napravi iz biblioteka od više od 10<8>molekula prikazanih na filamentoznim fagima. Geni koji odgovaraju pomenutim polipeptidima mogu da budu umetnuti u vektore eksprimovanja tipa fagemida (fuzionisane na jedan od gena koji kodiraju proteine kapsida filamentoznog faga) i koriste se za proizvodnju virusnih čestica koje prikazuju varijante proteina na njihovoj površini. Početne biblioteke mogu da uključe različite stepene diverzifikacije u celoj sekvenci ili u skupu unapred definisanih pozicija. Svaki od originalnih ostataka na ovm pozicijama može biti zamenjen mešavinom 20 aminokiselina ili podskupom izabranih ostataka. Diverzifikaciju je moguće postići kroz nasumičnu ili na mesto usmerenu mutagenezu.
[0024] Izbor faga sa povećanim nivoima prikaza humanog IL-2 može da se zasniva na inkubaciji mešavina faga iz biblioteka u kontaktu sa molekulom selektora imobilisanim na čvrstoj površini, eliminaciji nevezanih faga pranjem, i eluaciji vezanih faga pod uslovima koji ometaju interakcije proteina. Kao molekul selektor, jedna od rekombinantnih IL-2 podjedinica receptora ili monoklonalno antitelo usmereno protiv IL-2 ili protiv peptida genetički fuzionisanih na njih može da se koristi. Nekoliko sukcesivnih ciklusa selekcije može da se napravi pod sličnim uslovima. Analiza DNK sekvenci umetnutih u izabrane fagemide može da otkrije pravilnosti koje dovode do identifikacije supstitucija sa više obilja i potencijalno se odnose na povećanje kapaciteta prikaza na fagima.
[0025] Nivoe prikaza mutiranih varijanti IL-2 moguće je proceniti kroz oglede vezivanja kao što je ELISA, na imobilisanom uhvaćenom molekulu koji prepoznaje indistinktivno različite IL-2 mutirane varijante i nativnu referencu. Kao molekul hvatač za ovaj tip ogleda, poželjnije je antitelo protiv sekvence marker peptida je genetski fuzionisano na IL-2 varijante, kao što je c-myc peptid, koji je fuzionisan na sve strane proteine u sistemu eksprimovanja na osnovu pCSM vektora fagemida. Opštost dejstava mutacija je identifikovana u analizi opisanoj gore na IL-2 izvedenoj familiji muteina može da bude pokazana kroz uvođenje pomenutih promena u sekvenci različitih mutiranih varijanti opisanih za humani IL-2, koji uključuje promenljivi broj supstitucija različite prirode u celoj svojoj sekvenci koja je usmerena na selektivno uticanje interakcija sa različitim podjedinicama IL-2 receptora, sa naknadnom modifikacijom njihovih imunomodulatornih funkcija. Svi ovi modifikovani muteini se prikazuju na filamentoznim fagima, umetanjem njihovih kodirajućih gena u vekore fagemida. Procena svakog nivoa prikaza muteina na filamentoznim fagima može da se izvede pomoću ELISA tehnike kao što je opisano za IL-2. Kao referenca za izračunavanje magnitude povećanja prikaza faga povezana sa uvođenjem promena identifikovanih kao deo ovog pronalaska, originalni muteini se koriste bez bilo kakve dodatne promene i prikaza na fagima. Alternativno, postupak iz ovog pronalaska je moguće izvesti iskorišćavanjem drugih platformi kombinatorne biologije, kao što je prikaz na ćelijama kvasca ili sisara, da bi se izabrale varijante IL-2 i / ili njegovi izvedeni muteini sa povećanim nivoima prisutnosti na membrani ćelije.
[0026] Iz postupka odabira opisanog gore u tekstu, ponovljene nekonzervativne mutacije mogu da nastanu na poziciji 35 (specifično K35E, K35D i K35Q).
Upotreba identifikovanih mutacija da bi se povećali nivoi izlučivanja humanog IL-2 i iz njega izvedenih muteina, kao rastvorljivih proteina i njihove ponovne naturalizacije iz inkluzionih tela
[0027] Jednom kada se grupa mtacija koja da kao rezultat povećani prikaz na filamentoznim fagima humanog IL-2 i njegovih izvedenih muteina identifikuje, dejstva ovih istih promena na izlučivanje rastvorljivh proteina može da se pokaže, uvođenjem njih u odgovarajuće kodirajuće gene klonirane u rastvorljivim vektorima eksprimovanja za ćelije kvasca ili ćelije sisara. Procena koncentracija proteina izlučenih u supernatant pomoću ćelija domaćina koje sadrže pomenute vektore ekspresije omogućava da se pokaže povećanje izlučivanja IL-2 i njegovih izvedenih muteina povezanih sa uvođenjem mutacija koje postupak iz ovog pronalaska koristi, u poređenju sa njegovim originalnim parnjacima koje ne uključuju pomenute promene. Alternativno, povećana proizvodnja humanog IL-2 i njegovih izvedenih muteina treba da bude verifikovana iz transfekcije i/ili transdukcije normalnih i/ili tumorskih ćelija i/ili tkiva in vivo ili in vitro.
[0028] Studije su opisale gore da upotreba postupka iz ovog pronalaska može da se izvede sa IL-2 i njegovim izvedenim muteinima samim ili spojenih fuziono na dodatne sekvence polipeptida, kao što je albumin, Fc region humanih imunoglobulina, celih antitela ili fragmenata antitela na osnovu njegovih promenljivih regiona.
[0029] Mutacije opisane u ovom pronalasku mogu takođe da se koriste da poboljšaju postupke in vitro ponovne naturalizacije humanog IL-2 i njegovih izvedenih muteina, dobijenih kao inkluziona tela u citoplazmi E. coli. Povećanje efikasnosti ponovne naturalizacije može da se proceni merenjem specifične biološke aktivnosti pro masi proteina upoređivanjem sa nemutiranom varijantom.
[0030] Demonstracija kompatibilnosti upotrebljenih mutacija sa biološkim funkcijama IL-2 i selektivne modulacije njegovih interakcija sa podjedinicama receptora. Procena biološke aktivnosti IL-2 varijanata modifikovanih ovim pronalaskom može da pokrije in vitro i in vivo tehnike usmerene na dokaz očuvanja njihove sposobnosti da indukuju proliferaciju, diferencijaciju i aktivaciju različitih tipova ćelije, kao što su podpopulacije T limfocita, NK ćelije i linije ćelija limfoidnog porekla zavisnog od IL-2 za njihov rast. Dejstvo prirodnog IL-2 na proliferaciju T limfocita koji eksprimuju trimerni receptor moguće je odrediti putem in vitro ogleda CTLL- 2 proliferacije linije ćelije korišćenjem kolometrijske tehnike Alamar blue redukcije ili protočne citometrije. To in vitro dejstvo prirodnog IL-2 na diferencijaciju T CD4+ limfocita na T regulatorne limfocite i kapacitet ovih molekula da se prošire i aktiviraju NK ćelije in vitro, su određeni protočnom citometrijom.
[0031] Kompatibilnost mutacija korišćenih u postupku iz ovog pronalaska sa selektivnom modulacijom interakcije IL-2 sa njegovim receptorom može da bude potvrđena uvođenjem pomenutih promena na okvir muteina prethodno projektovanih i/ ili izabrnaih da se poveća ili smanji njihov kapacitet vezivanja na bilo koje podjedinice IL-2 receptora. Pojava željenih promena u svojstvima vezivanja može da se pokaže kroz direktno određivanje njih u ELISA eksperimentima na mikrotitarskim pločama obloženim sa svakim od podjedinica receptora. Prethodno opisani ogledi korišćeni da se karakteriše imunomodulatorna i /ili antitumorska aktivnost različitih muteina in vitro i in vivo mogu da se koriste kao dodatni alati verifikacije. U slučaju da nema alfa muteina (Carmenate, T. y otros, J. Immunol.190: 6230-6238, 2013), moguće je verifikovati da zadržava isti kapacitet kao nativni IL-2 da stimulate in vitro proliferaciju T CD8 limfocita. U slučaju muteina sa povećanim kapacitetom vezivanja na beta podjedinicu receptora i koji ima aktivnost superagonista (super-beta mutein), moguće je verifikovati da zadržava viši kapacitet od nativnog IL-2 da bi stimulisao in vitro proliferaciju NK ćelije. U oba slučaja proliferaciju je moguće odrediti protočnom citometrijom. Diferencijalno dejstvo na proliferaciju populacija in vivo moguće je odrediti eksperimentima iz inkorporacije bromodeoksiuridina. Moguće je pokazati da i muteini indukuju veće antitumorsko dejstvo in vivo nego nativni IL-2, na eksperimentalnom modelu metastaza koje koriste MB16F0 liniju melanoma.
KRATAK OPIS SLIKA
[0032]
Slika 1. ELISA evaluacija nivoa prikaza faga mutiranih IL-2. Sve pripreme faga su podešene na ekvivalentnu koncentraciju 10<13>virusnih čestica/ml.
Slika 2. ELISA evaluacija nivoa izlučivanja proteina fuzije je formirana bilo pomoću IL-2 ili njegovih izvedenih muteina i humanog IgG1 Fc domena. Ćelije su transfektovane sa polietileniminom i genetskim konstruktima koji kodiraju proteine fuzije koji obuhvataju:
a. IL-2 sa i bez mutacije K35E
b. Nema-alfa IL-2 (NA) sa i bez dodatne mutacije K35E
c. Super-beta IL-2 (SB) sa i bez K35E
d. Nema-gama M1 IL-2 (NG M1) sa i bez K35E
e. Nema-gama M2 IL-2 (NG M2) sa i bez K35E
Slika 3. Konzervacija molekularnih interakcija nativnog IL-2 u K35E varijanti (ELISA).
Slika 4. Konzervacija IL-2 biološke aktivnosti sa zamenom K35E korišćenjem CTLL-2 ogleda proliferacije.
Slika 5. Sposobnost IL-2 K35E da proširi in vivo populacije ćelije zavisne od IL-2.
5a. Fotografija slezina miševa kojima su ubrizgani IL-2 K35E varijanta i PBS.
5b. Histogrami protočne citometrije CD3+CD8+ fenotipa memorije (CD44hi) populacije ćelije u slezinama.
Slika 6. Kompatibilnost zamene K35E uz gubitak sposobnosti vezivanja na IL-2 alfa podjedinicu receptora već opisanu za IL-2 izveden mutein (ELISA). Mikrotitracione ploče su obložene sa humanom (a) i mišjom (b) alfa podjedinicom.
Slika 7. Kompatibilnost zamene K35E sa povećanjem sposobnosti vezivanja na IL-2 beta podjedinicu receptora je već opisana za IL-2 izveden mutein (ELISA).
PRIMERI
Primer 1. Odabir i karakterizacija filamentoznih faga koji prikazuju funkcionalni mutirani humani IL-2.
[0033] Napravljena je biblioteka meke randomizacije ciljanjem nekoliko pozicija humanog IL-2. Selektovane pozicije su uključile one koje imaju ostatke sa bočnim lancima koji doprinose interfejsu receptora alfa podjedinice (K35, R38, T41, F42, K43, F44, Y45, E61, E62, K64, P65, E68, V69, N71, L72, Q74 i Y107). Humani IL-2 je diverzifikovan pomoću Kunkel mutageneze sa šiljatim mutagenim oligonukleotidima koji drže 85% originalnog oligonukleotida na svakoj ciljanoj poziciji, plus 15% jednakomolarne mešavine preostala tri nukleotida, da bi se uveo umeren stepen različitosti u celom izabranom regionu. Kao rezultat, biblioteka 10<9>klonova je sadržala kao celinu 20 aminokiselina na svakoj poziciji interfejsa, dok je svaki molekul unutar biblioteke imao samo nekoliko zamena, ograničavajući pretragu za novim polipeptidima pri funkcionalnom prostoru sekvence bliže početnom molekulu. Fagi iz biblioteke su prečišćeni istaloživanjem sa polietilen glikolom korišćenjem utvrđenih procedura (Marks, J. et al, J. Mol. Biol.222: 581-597, 1991). Prečišćene virusne čestice su inkubirane na imunocevčicama (Nunc, Denmark) obložene sa rekombinantnom alfa IL-2 podjedinicom receptora (R&D), da bi se izolovale funkcionalne mutirane IL-2 varijante usled njihove stabilnosti da budu prikazane na fagima. Dva nezavisna postupka istaloživanja na pločama za ispiranje su izvedena na humanim i mišjim IL-2 podjedinicama receptora. Posle pranja nevezanih faga, vezani fagi su eluirani dodavanjem osnovnog rastvora trietilamina. TG1 bakterije su inficirane sa izabranim fagima, koji su pojačani korišćenjem M13KO7 faga pomoćnika i korišćeni kao početni materijal za nov krug odabira. Izvedena su četiri kruga odabira faga. Sekvenciranje umetaka u izabranim fagemidima (iz trećeg i četvrtog kruga odabira) su otkrili sličnosti u mutiranim varijantama dobijenim kao rezultat. Uprkos preovladavajućem originalnom nemutiranom IL- 2 genu (visoko zastupljenom u originalnoj biblioteci), postojala je manja proporcija varijanti koje imaju zamene K35E, K35D i K35Q, što pokazuje uticaj nekonzervativnih promena na poziciji 35 u prikazu funkcionalnog IL-2 na filamentoznim fagima. K35E je bio najčešća zamena. Ovo otkriće je bilo neočekivano, jer je analiza kristalne strukture IL-2/receptorskog kompleksa (PDB kodovi3B5I i 2ERJ) ukazuje na učešće originalnog K35 ostatka u jonskim interakcijama u polarnom perifernom regonu interfejsa sa alfa podjedinicom. Sposobnost nekonzervativnih zamena (inverzija naelektrisanja u dva slučaja) da bi se očuvala interakcija sa molekulima selektora je bila dakle neočekivana.
Primer 2. Povećanje izlučivanja i prikaza faga humanog IL-2 sa nekonzervativnim promenama na poziciji 35.
[0034] Upoređena je sposobnost različitih IL-2 varijanti izabranih iz biblioteke koju treba izlučiti na E.coli periplazmu i prikazana je na fagima. Nativni IL-2 je korišćen kao referentni molekul. Varijanta koja sadrži K35R (konzervativna promena na poziciji 35) je takođe konstruisana pomoću Kunkel mutageneze da se koristi kao dodatna kontrola. Svi proteini su dobijeni kroz ubacivanje njihovih kodirajućih gena u vektoru fagemida pCSM (spojenog fuziono na M13 gen 3) i naknadnu proizvodnju faga iz TG1 bakterija transformisanih sa genetičkim konstruktima dobijenim kao rezultat (Rojas, G. et al, Immunobiology. 218: 105-113, 2013). Nivoi prikaza faga svake varijante su procenjeni kroz ELISA na mikrotitracionim pločama obloženim 9E10 monoklonalnim antitelom. Vezani fagi su detektovani sa anti-M13 antitelom spojenim na peroksidazu rena. Pokazalo se da su zamene K35E, K35D i K35Q
1
dale kao rezultat povećanje prikaza humanog IL-2 u poređenju sa originalnim molekulom (Slika 1). Magnituda ovog povećanja je bila 10-struka za promene inverzionog naelektrisanja K35E i K35D, i 7-struka za K35Q. Sa druge strane, konzervativno naelektrisanje K35R nije modifikovalo sposobnost IL-2 da bude prikazano (Slika 1). K35E je izabrano za dalja proučavanja.
Primer 3. Dejstvo K35E zamene na izlučivanje i prikaz faga se produžava na panel IL-2 mutiranih varijanti.
[0035] K35E je uveden pomoću Kunkel mutageneze u genima nekoliko mutiranih varijanti humanog IL-2 (u formatu sa prikazanim fagom). Panel je uključio četiri muteina koji su već opisani da izvode različite imunomodulatorne funkcije: jedan nema-alfa mutein sa selektivnom funkcijom agonista na efektorske T ćelije (Carmenate, T. et al, J. Immunol.190: 6230-6238, 2013; US 9,206,243 B2), jedan mutein antagonista koji gubi svoju sposobnost vezivanja na gama IL-2 podjedinicu receptora (nema-gama) (US 8,759,486 B2), i dva muteina superagonista sa pospešenom sposobnošću vezivanja na bilo beta (super-beta) ili alfa (super-alpha) IL-2 podjedinice receptora (Levin, A.M. et al, Nature.484: 529-533, 2012; WO 2005/007121). Fagovi koji prikazuju svaki od ovih proteina su proizvedeni i prečišćeni (zajedno sa originalnim molekulima bez K35E), sa nivoima prikaza stranih proteina su procenjeni korišćenem ELISA tehnike na mikrotitracionim pločama obloženim sa 9E10 monoklonalnim antitelom. Dobijanje faga prikazom nativnog IL-2 je korišćeno kao referenca (što podrazumeva prisustvo 100 arbitrarnih jedinica/ml u njemu) da bi se konstruisala standardna krivulja da bi se izračunali relativni nivoi prikaza za svaku varijantu. Tabela 1 pokazuje povećanje nivoaprikaza za svaki mutein povezan na uvođenje K35E.
Tabela 1. Povećanje nivoa prikaza testiranih muteina povezanih na uvođenje zamene K35E.
Primer 4. Zamenski K35 pospešuje izlučivanje proteina fuzije na osnovu IL-2 i njegovih izvedenih muteina pomoću humanih ćelija domaćina.
[0036] Genetički konstrukti su projektovani da spoje fuziono gene humanog IL-2 i njegove izvedene muteine na humani IgG1 Fc region gena, u kontekstu pCMX vektora ekspresije. Dodatni panel ekvivalentnih konstrukata sa mutacijom K35E je takođe pripremljen. HEK 293 T ćelije (prilagođene da rastu u suspenziji su transfektovane sa svakim od gore opisanih genetičkih konstrukata propisno pomešanih sa polietileniminom. Zapremina transfekcije je bila 50 ml. Supernatanti iz transfektovnaih ćelija su prikupljeni posle šest dana od kulture. Prisustvo rekombinantnih iz IL-2 izvedenih proteina je procenjeno pomoću ELISA na mikrotitracionim pločama obloženim sa IL-2.2 monoklonal antibody (usmereno direktno protiv linearnog epitopa prisutnog na svim muteinima). Uhvaćeni fuzioni proteini su detektovani sa anti-humanim Fc antitelom spojeni na peroksidazu rena. Nivoi proteina fuzije u supernatantima su bili viši za one molekule koji su obuhvatali zamenu K35E u poređenju sa njihovim originalnim duplikatima (Slika 2a-e). Takvi rekombinantni proteini su prečišćeni Protein A afinitetnom hromatografijom. Tabela 2 pokazuje prinose posle prečišćavanja.
Tabela 2. Prinosi prečišćavanja od IL-2 i njegovi izvedeni muteini su spojeni fuziono na Fc domen humanih imunoglobulina iz HEK 293 T ćelija transfektovanih u suspenziji.
Primer 5. K35E zamena je kompatibilna sa molekularnim interakcijama nativnog IL-2.
[0037] Sposobnost vezivanja rekombinovanog mutiranog IL-2 (K35E) u humanom formatu homodimera Fc fuzionog spoja je procenjena pomoću ELISA na mikrotitracionim pločama obloženim sa različitim molekulima poznatim da dolaze u interakciju sa nativnim IL-2. Panel molekula obloga je uključio četiri monoklonalna antitela koja prepoznaju različite epitope na IL-2, kao i IL-2 alfa podjedinicu receptora (humanog ili mišjeg porekla). Uhvaćeni fuzioni proteini su detektovani sa antihumanim Fc antitelom spojeni na peroksidazu rena. Sličan homodimer fuzije uključujući ne-mutirani IL-2, proizveden je u istom sistemu eksprimovanja, korišćen je kao kontrolno sredstvo. Vezivanje mutiranog homodimera na oba antitela i receptore nije bilo pod dejstvom prisustva K35E, nasuprot, proizvelo je suprotno dejstvo. Reaktivnost mutiranih varijanti prema svim molekulima obloge je bila viša nego u slučaju njihovog nemutiranog rekombinantnog duplikata (Slika 3), što ukazuje da antigenost i funkcionalnost K35E varijante reprodukuju one iz nativnog IL- 2 u većoj meri nego one iz nemutiranog rekombinantnog proteina dobijenog pod sličnim uslovima.
Primer 6. Fc fuzijom spojen IL-2 K35E zadržava svoju sposobnost da stimuliše proliferaciju CTLL-2 ćelija.
[0038] Procenjena je sposobnost mutiranog IL-2 (K35E) u format Fc fuzijom spojenog homodimera (prečišćen iz HEK 293 T ćelija transfektovanih u suspenziji) da bi se indukovala CTLL-2 proliferacija. Rekombinantni humani IL-2 je korišćen kao kontrola. Ćelije su uzgajane u prisustvu različitih koncentracija oba proteina, i proliferacija je izmerena kolorimetrijskim ogledom redukcije Alamar blue (Slika 4). Specifična aktivnost je izračunata u svakom slučaju iz doze molekula koji je proizveo polumaksimalnu proliferaciju korišćenjem GraphPad softvera. Specifična aktivnost Fc fuziono spojenog mutiranog IL-2 (uključujući K35E) je bila 4 X 10<6>IU/mg, u istom opsegu nego što je za referentni rekombinantni IL-2 (2,3 X 10<6>IU/mg). Ovaj rezultat je pokazao konzervaciju IL-2 biološke aktivnosti u prisustvu K35E.
Primer 7. Fc fuzijom spojen IL-2 K35E ima sposobnost da stimuliše proširenje memorijskog fenotipa CD8 T ćelija in vivo.
[0039] C57BL/6 miševi su primili pet dnevnih doza 4 X 10<4>IU Fc fuziono spojenog mutiranog IL-2 (K35E) tokom 5 uzastopnih dana da bi se proučila sposobnost ovog proteina da stimuliše in vivo proliferaciju od IL-2 zavisnih populacija ćelije. Životinje su žrtvovane posle lečenja i njihove slezine su posmatrane. Pored toga, veličina populacije CD3+CD8+ ćelija koje imaju memorijski fenotip (CD44hi) je određena protočnom citometrijom. Kontrola za ovaj eksperiment je bila grupa miševa kojima je ubrizgan fosfat puferisani slani rastvor (PBS). Rekombinantni Fc fuziono spojen IL-2
1
(K35E) je imao očekivano dejstvo na populaciju memorijske CD8 T ćelije, sudeći prema uvećanju slezina (Slika 5a) i duplikaciju proporcije memorijskog fenotipa CD8 T ćelija unutar njih (Slika 5b).
Primer 8. Zamena K35E je kompatibilna sa gubitkom sposobnosti vezivanja na IL-2 alfa podjedinicu receptora koja odgređuje svojstva selektivnog agonista.
[0040] Svojstva vezivanja i humanog IL-2 i nema-alfa muteina su pretnodno opisana (Carmenate, T. et al, J. Immunol.190: 6230-6238, 2013; US 9,206,243), koji zahteva zamene R38A, F42A, Y45A i E62A daje kao rezultat gubitak sposobnosti da veže IL-2 alfa podjedinicu receptora usmerenu na smanjenje njegovog stimulatornog potencijala na T regulatornim ćelijama bez uticaja na aktIvnost ćelija efektora koje imaju heterodimerni beta/gama receptor, su upoređene. Oba rekombinantna proteina su imala dodatnu K35E mutaciju i proizvedeni su kao fuzioni proteini koji obuhvataju Fc domen od humanih imunoglobulina. Mikrotitracione ploče su obložene sa rekombinantnom IL-2 alfa podjedinicom receptora humanog (a) i mišjeg (b) porekla. Uhvaćeni proteini fuzije su detektovani sa anti-humanim Fc antitelom spojeni na peroksidazu rena. Uvođenje K35E je dalo podstrek novom nema-alfa molekulu sa nivoima eksprimovanja višim od onih kod njegovog originalnog duplikata (slika 2b) i ozbiljno smanjenje vezivanja za humani i mišji alfa lanac u poređenju sa nemutiranim IL-2 koji je takođe sa zamenom K35E (Slika 6). Ovi rezultati su dali prve dokaze o kompatibilnosti K35E sa selektivnom modulacijom interakcija i imunomodulatornim funkcijama IL-2.
Primer 9. Zamena K35E je kompatibilna sa povećanjem u pogledu sposobnosti vezivanja IL-2 beta podjedinici receptora što je već opisano za varijantu superagonista.
[0041] Sposobnost vezivanja IL-2 i super-beta mutein koji obuhvata mutacije L80F, R81D, L85V, I86V i I92F (i sa dodatnom mutacijom K35E i fuzionisan na Fc domen humanog IgG1) je procenjena pomoću ELISA tehnike na pločama obloženim sa IL-2 beta podjedinicom receptora. Uhvaćeni proteini fuzije su detektovani sa antihumanim Fc antitelom spojeni na peroksidazu rena. Uvođenje K35E je dalo podsticaj za novi molekul sa višim nivoima eksprimovanja u poređenju sa originalnim superbeta muteinom (Slika 2c) i sa pospešenom sposobnošću vezivanja beta podjedinice, što je osnova za njenu funkciju superagonista (Slika 7). Ovaj rezultat je proširio dokaze o kompatibilnosti K35E zamene sa konstrukcijom novih IL-2 izvedenih molekula sa modifikacijama u njihovim interakcijama sa podjedinicama receptora i imunomodulatornim funkcijama.
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
1
2

Claims (5)

Patentni zahtevi
1. In vitro postupak za povećanje nivoa izlučivanja rekombinantnog humanog IL-2 i iz njega izvedenih muteina je domaćin, bez uticaja na njegove biološke funkcije i selektivnu modulaciju njegovih interakcija sa podjedinicama receptora, naznačen time što je uvođenje pojedinačne nekonzervativne mutacije na poziciji 35 njegove primarne sekvence izabrano iz grupe koja obuhvata:
- K35E,
- K35D i
- K35Q
pri čemu se pomenuti muteini biraju iz grupe koja obuhvata:
SEK ID BR: 1,
SEK ID BR: 4,
SEK ID BR: 5,
SEK ID BR: 6,
SEK ID BR: 8,
SEK ID BR: 9,
SEK ID BR: 10,
SEK ID BR: 11,
SEK ID BR: 12,
SEK ID BR: 13,
SEK ID BR: 14,
SEK ID BR: 15,
SEK ID BR: 16,
SEK ID BR: 17 i
SEK ID BR: 18
i pri čemu se domaćin bira iz grupe koja obuhvata:
<->E. coli,
<->ćelije siara i
<->kvasce.
2. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 1 pri čemu su rekombinantni humani IL-2 i iz njega izvedeni muteini fuzionisani na bilo koji od proteina izabranih iz grupe koja obuhvata:
4
<->proteine kapside filamentoznih faga,
<->albumin
<->Fc region antitela,
<->kompletna antitela i
- fragmente antitela uključujući njihove promenljive domene.
3. Upotrebu in vitro postupka prema patentnom zahtevu 2 u laboratorijskoj ili industrijskoj razmeri.
4. In vitro postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1-2 za in vitro modifikovanje fiziologije normalnih ili tumorom zahvaćenih ćelija i/ili tkiva.
5. In vitro postupak prema patentnom zahtevu 4 pri čemu su modifikovane NK ćelije, T ili B limfociti.
RS20220217A 2016-11-15 2017-11-10 In vitro postupak za povećanje nivoa izlučivanja interleukina 2 i iz njega izvedenih proteina RS62975B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CU2016000171A CU24483B1 (es) 2016-11-15 2016-11-15 Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
EP17817648.3A EP3543252B1 (en) 2016-11-15 2017-11-10 In vitro method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it
PCT/CU2017/050007 WO2018091003A1 (es) 2016-11-15 2017-11-10 Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina 2 y sus proteínas derivadas

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS62975B1 true RS62975B1 (sr) 2022-03-31

Family

ID=60765569

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220217A RS62975B1 (sr) 2016-11-15 2017-11-10 In vitro postupak za povećanje nivoa izlučivanja interleukina 2 i iz njega izvedenih proteina

Country Status (23)

Country Link
US (1) US12312388B2 (sr)
EP (1) EP3543252B1 (sr)
JP (1) JP6918405B2 (sr)
KR (1) KR102525674B1 (sr)
CN (1) CN109952311B (sr)
AR (1) AR110076A1 (sr)
AU (1) AU2017359841B2 (sr)
BR (1) BR112019009106A2 (sr)
CA (1) CA3040313A1 (sr)
CO (1) CO2019004006A2 (sr)
CU (1) CU24483B1 (sr)
EA (1) EA201991093A1 (sr)
ES (1) ES2906832T3 (sr)
IL (1) IL266517A (sr)
JO (1) JOP20190087A1 (sr)
MX (1) MX2019005599A (sr)
MY (1) MY197059A (sr)
RS (1) RS62975B1 (sr)
TN (1) TN2019000122A1 (sr)
TW (1) TWI713798B (sr)
UA (1) UA125440C2 (sr)
WO (1) WO2018091003A1 (sr)
ZA (1) ZA201902968B (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU24483B1 (es) * 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
JP7464530B2 (ja) 2018-03-28 2024-04-09 ブリストル－マイヤーズ スクイブ カンパニー インターロイキン－２／インターロイキン－２受容体アルファ融合タンパク質および使用方法
WO2019185705A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Ascendis Pharma A/S Il-2 conjugates
MX2021000801A (es) * 2018-07-24 2021-04-12 BioNTech SE Agonistas de il2.
WO2020057646A1 (zh) 2018-09-21 2020-03-26 信达生物制药(苏州)有限公司 新型白介素2及其用途
EP3854805A4 (en) * 2018-09-21 2022-08-24 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. NOVEL INTERLEUKIN 2 AND ITS USE
US11633488B2 (en) 2020-01-10 2023-04-25 Bright Peak Therapeutics Ag Modified IL-2 polypeptides and uses thereof
MX2022014082A (es) * 2020-06-03 2022-12-07 Ascendis Pharma Oncology Div A/S Secuencias de interleucina (il-2) y usos de las mismas.
EP4232071A4 (en) 2020-10-23 2024-08-28 Asher Biotherapeutics, Inc. FUSIONS WITH CD8 ANTIGEN-BINDING MOLECULES TO MODULATE IMMUNE CELL FUNCTION
MX2023005030A (es) 2020-10-29 2023-05-16 Bristol Myers Squibb Co Proteinas de fusion para el tratamiento de enfermedades.
CN112724259B (zh) * 2020-11-16 2022-12-20 天津林达生物科技有限公司 人血清白蛋白与白介素2的融合蛋白及其用途
CN116854802A (zh) * 2021-04-13 2023-10-10 苏州复融生物技术有限公司 白介素2突变体及其应用
WO2022260909A1 (en) * 2021-06-09 2022-12-15 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute Inc. Methods of using anti-cd83 chimeric antigen receptor expressing t cells
CU24763B1 (es) * 2021-12-21 2025-07-09 Ct Inmunologia Molecular Proteínas de fusión compuestas por un anticuerpo y una muteína agonista de interleucina 2
CU24775B1 (es) 2022-03-18 2026-01-12 Ct Inmunologia Molecular Muteínas derivadas de la interleucina-2 humana con actividad superagonista
TW202409069A (zh) * 2022-07-01 2024-03-01 大陸商北京星奇原生物科技有限公司 Ｉｌ－２多肽和使用方法
JP2025527694A (ja) * 2022-08-23 2025-08-22 マストバイオ株式会社 Ｉｌ２変異体及びそれを含むタンパク質複合体

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3377363D1 (en) * 1982-03-31 1988-08-18 Ajinomoto Kk Gene coding for interleukin-2 polypeptide, recombinant dna carrying said gene, cell lines possessing the recombinant dna,and method for producing interleukin-2 using said cells
WO2005007121A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 Massachusetts Institute Of Technology Mutant interleukin-2(il-2) polypeptides
BRPI0508470A (pt) * 2004-03-05 2007-07-31 Chiron Corp sistema de teste in vitro para prever toleráncia do paciente aos agentes terapêuticos
AU2006207987B2 (en) * 2005-01-27 2011-09-15 Novartis Vaccines And Diagnostics Inc. Methods for treating renal cell carcinoma
CU23734A1 (es) * 2009-11-27 2011-11-15 Centro Inmunologia Molecular Polipéptidos inmunomoduladores derivados de la il-2 con actividad antagonista de esta citocina útiles en la terapia del cáncer y enfermedades infecciosas crónicas
CU23923B1 (es) 2010-11-12 2013-07-31 Ct De Inmunología Molecular Polipéptidos derivados de la il-2 con actividad agonista
HUE029139T2 (hu) * 2011-02-10 2017-02-28 Roche Glycart Ag Mutáns interleukin-2 polipeptidek
CU24483B1 (es) 2016-11-15 2020-04-02 Ct Inmunologia Molecular Método para incrementar los niveles de secreción de la interleucina-2

Also Published As

Publication number Publication date
MY197059A (en) 2023-05-23
CA3040313A1 (en) 2018-05-24
CU20160171A7 (es) 2018-06-05
US20190315826A1 (en) 2019-10-17
EA201991093A1 (ru) 2019-09-30
JOP20190087A1 (ar) 2019-04-18
TW201831688A (zh) 2018-09-01
TN2019000122A1 (en) 2020-10-05
WO2018091003A1 (es) 2018-05-24
JP2019535269A (ja) 2019-12-12
AU2017359841B2 (en) 2020-08-27
ES2906832T3 (es) 2022-04-20
US12312388B2 (en) 2025-05-27
KR20190079636A (ko) 2019-07-05
KR102525674B1 (ko) 2023-04-25
CN109952311A (zh) 2019-06-28
CO2019004006A2 (es) 2019-04-30
UA125440C2 (uk) 2022-03-09
JP6918405B2 (ja) 2021-08-11
BR112019009106A2 (pt) 2019-07-16
TWI713798B (zh) 2020-12-21
CU24483B1 (es) 2020-04-02
MX2019005599A (es) 2019-07-04
IL266517A (en) 2019-07-31
CN109952311B (zh) 2022-07-01
EP3543252A1 (en) 2019-09-25
ZA201902968B (en) 2020-07-29
AU2017359841A1 (en) 2019-06-13
AR110076A1 (es) 2019-02-20
EP3543252B1 (en) 2021-12-29
NZ753820A (en) 2021-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3543252B1 (en) In vitro method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it
KR102777151B1 (ko) 인터루킨-2의 부분 효능제
CN114853874B (zh) 靶向调节t细胞的长效白介素-2及其在治疗自身免疫病中的应用
Yoon et al. Conformational changes mediate interleukin-10 receptor 2 (IL-10R2) binding to IL-10 and assembly of the signaling complex
Cosman et al. A new cytokine receptor superfamily
Zdanov et al. Crystal structure of Epstein-Barr virus protein BCRF1, a homolog of cellular interleukin-10
JP3286310B2 (ja) 受容体複合体三次元モデル化に基づくヒトインターロイキン−６のアンタゴニストおよびスーパーアンタゴニストを選択する方法
CN107001438A (zh) 白细胞介素‑15组合物及其用途
Kuziel et al. Interleukin-2 and the IL-2 Receptor: New Insight Into Structure and Function.
CN113943374B (zh) 一种白介素15及其受体的多肽复合物
Showers et al. Activation of the erythropoietin receptor by the Friend spleen focus-forming virus gp55 glycoprotein induces constitutive protein tyrosine phosphorylation
JP2009501517A (ja) Ｉｌ−６結合タンパク質
Schreiber et al. The biology and biochemistry of interferon-gamma and its receptor
NZ753820B2 (en) Method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it
EA043757B1 (ru) Способ повышения уровней секреции интерлейкина-2 и полученных из него белков
HK40003610B (en) Method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it
Morsey et al. Interleukin-2
US20250179139A1 (en) Human interleukin-2-derived muteins with superagonist activity
HK40003610A (en) Method for increasing the secretion levels of interleukin 2 and proteins derived from it
EP4538285A1 (en) Pd-1 variant and use thereof
VAN KESSEL et al. MOHAMAD A. MORSEY*, GRAHAM JM COX*, ANDREW G.
Benton et al. Signal transduction from cytokine receptors
Buchli Biological and receptor binding properties of interleukin-2 analogs employing site-directed mutagenesis and filamentous phage display
HK1182403A1 (en) Polypeptides derived from il-2 having agonist activity, for the therapy of cancer and chronic infections
HK1182403B (en) Polypeptides derived from il-2 having agonist activity, for the therapy of cancer and chronic infections