RS63078B1 - Poboljšano jedinjenje za lečenje srčane insuficijencije - Google Patents

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak odnosi se na oligonukleotid koji predstavlja efikasan inhibitor mikroRNK miR-132 i njegovu upotrebu u medicini, određenije u prevenciji ili lečenju srčanih poremećaja i/ili fibroznih poremećaja.

[0002] Srčana insuficijencija predstavlja jedan od vodećih patoloških uzroka smrtnosti u svetu. Infarkt miokarda (MI) je najvažniji uzročnik srčane insuficijencije jer MI dovodi do posledičnog progresivnog remodelovanja srca koje prouzrokuje srčanu insuficijenciju sa lošom prognozom. Trenutno korišćene terapijske farmakološke opcije za srčanu insuficijenciju uključuju agense za modulisanje angiotenzina, βblokatore, diuretike, antagoniste aldosterona, inhibitor neprilizina u kombinaciji sa blokatorom angiotenzin-II-receptora, vazodilatatore ili inotropne agense. Iako je nekoliko kliničkih ispitivanja pokazalo značajna opadanja u stopama smrtnosti indukovanim srčanom insuficijencijom za sve te agense, 5-godišnja stopa smrtnosti neprihvatljivo ostaje na približno 50%. Prema tome, postoji velika potreba za razvojem novih i efikasnijih terapijskih pristupa za srčanu insuficijenciju.

[0003] Patološki hipertrofični rast kardiomiocita može dovesti do razvoja srčanog remodelovanja, srčane insuficijencije i iznenadne smrti usled prestanka rada srca. Hipertrofični rast kardiomiocita predstavlja odgovor na povećan napon u srčanim zidovima koji je prouzrokovan prekomernim opterećenjem srčane zapremine i/ili srčanog pritiska. U početku, hipertrofija srca predstavlja kompenzacioni mehanizam čiji je cilj da smanji napon u zidovima i da poveća minutni volumen srca. Međutim, produžena hipertrofija srca napreduje u kontraktilnu disfunkciju, srčanu dekompenzaciju i najzad srčanu insuficijenciju (Hill i Olson, 2008; Barry i Townsend, 2010). Tranzicija sa fiziološke na patološku hipertrofiju može se desiti u zavisnosti od velikog broja faktora koji uključuju gubitak miocita kroz apoptozu ili nekrozu, promene u autofagiji, defekte u kontraktilnom odgovoru, disregulisanu homeostazu kalcijuma, desenzibilizaciju adrenergičnih receptora ili fibrozu srca (Hill i Olson, 2008; Barry i Townsend, 2010). Hipertrofična signalizacija je u velikoj meri posredovana signalnim putem insulina (DeBosch i Muslin, 2008; Barry i Townsend, 2010). I insulin i insulinu sličan faktor rasta-1 (IGF-1) aktiviraju prohipertrofične puteve u kardiomiocitima preko IGF-1 receptora, koji aktivira fosfoinozitin-3-kinazu (PI3K) (McMullen et al., 2004). Dejstvo PI3K-a dovodi do aktiviranja serin/treonin kinaze Akt preko njene fosforilacije te aktivni Akt fosforiliše antihipertrofične FoxO transkripcione faktore što dovodi do njihove destabilizacije i sprečavanja jedarne lokalizacije (Datta et al., 1999; Skurk et al., 2005; Ronnebaum i Patterson, 2010). Nasuprot tome, acetilacija FoxO faktora sirtuinom-1 (Sirt-1) dovodi do njihove stabilizacije i jedarne translokacije (Frescas et al., 2005). Stabilizovani FoxO transkripcioni faktori lokalizovani su u jedru kako bi regulisali ekspresiju antihipertofičnih gena. Antihipertrofične funkcije FoxO proteina su u velikoj meri posredovane kroz supresiju prohipertrofičnog signalnog puta kalcineurina preko ekspresije antihipertrofičnih genskih ciljeva FoxO faktora, kao što su atrogin-1 (Ni et al., 2006; Ronnebaum i Patterson, 2010; Glas, 2010). Štaviše, FoxO transkripcioni faktori takođe indukuju apoptozu i regulišu autofagiju u kardiomiocitima (Ronnebaum i Patterson, 2010).

[0004] Pokazalo se da mikroRNK-ovi imaju ključnu ulogu u štetnom srčanom remodelovanju. WO 2013/034653 opisuje da miR-132 i/ili miR-212 mogu indukovati hipertrofiju srca pa samim tim čine potencijalne terapijske mete za lečenje srčane insuficijencije.

[0005] WO 2016/042561 opisuje postupak za lečenje poremećaja povezanog sa lipidima davanjem subjektu terapijski efektivne količine polinukleotidnog agensa koji je suštinski komplementaran nukleotidnoj sekvenci humanog miR-132.

[0006] Pronalazači su identifikovali novi analog oligonukleotida koji je efikasan inhibitor ekspresije miR-132 u kardiomiocitima. Taj analog oligonukleotida, u nastavku naznačen kao CDR132L, predstavlja miksmer koji se sastoji od DNK i LNA jedinica građe, sa internukleozidnim fosforotioatnim vezama. Nedostaje mu značajna toksičnost u humanoj ćelijskoj liniji jetre i izolovanim neonatalnim kardiomiocitima pacova. Osim toga, pokazalo se da CDR132L ispoljava superiorne efekte u poređenju sa drugim analozima oligonukleotida koji imaju istu nukleotidnu sekvencu, ali različitu distribuciju LNA jedinica građe.

[0007] Efikasnost CDR132L-a ispitana je na nekoliko životinjskih modela. U transgenom mišjem modelu hipertrofije srca, CDR132L je doveo do reverznog srčanog remodelovanja povezanog sa smanjenom ekspresijom miR-132. U mišjem modelu post-MI srčane insuficijencije, pokazalo se da lečenje CDR132L-om smanjuje post-MI disfunkciju leve srčane komore i parametre sistolne kontraktilne funkcije koji su nezavisni od opterećenja. Pored toga, davanje CDR132L-a dovelo je do poboljšanja srčane funkcije i smanjilo ekspresiju miR-132, signalizaciju srčanog napora i post-MI hipertrofiju. U svinjskom modelu post-MI srčane insuficijencije, pokazalo se da lečenje CDR132L-om sprečava maladaptivno remodelovanje i da poboljšava funkciju leve srčane komore. Osim toga, CDR132L normalizuje ekspresiju tkiva markera patološke srčane insuficijencije kao što su BNP, ANP i obezbeđuje promenu u izoformama teške promene miozina (MYH7/6 odnos).

[0008] U dodatnom ispitivanju, pronalazači su identifikovali antifibrozne terapijske efekte za oligonukleotidni analog CDR132L u in vivo mišjem modelu infarkta miokarda i in vitro modelima fibroze jetre i fibroze pluća.

[0009] Dakle, oligonukleotid CDR132L je koristan kao aktivni agens u medicini, određenije u prevenciji ili lečenju srčanih poremećaja i/ili fibroznih poremećaja.

[0010] Prema tome, prvi aspekt ovog pronalaska obezbeđuje oligonukleotid, koji obuhvata ili ima sekvencu formule II:

5'-A+TG+GC+TG+TA+GACTG+T+T-3'

pri čemu A, T, G i C predstavljaju dezoksiribonukleotidne jedinice građe i

gde G i T predstavljaju premošćene nukleotidne jedinice građe.

[0011] Analog oligonukleotida formule II može obuhvatati najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, npr. internukleozidnu vezu koja je stabilizovana protiv nukleazne digestije, npr. fosforotioatnu ili fosforodiamidatnu vezu. U specifičnim načinima ostvarivanja, sve internukleozidne veze predstavljaju modifikovane veze, određenije fosforotioatne veze.

[0012] U specifičnijem načinu ostvarivanja, ovaj pronalazak odnosi se na oligonukleotid CDR132L kao što je ovde opisan.

[0013] Taj oligonukleotid CDR132L ima sekvencu formule III:

5'-dA*+T*dG*+G*dC*+T*dG*+T*dA*+G*dA*dC*dT*dG*+T*+T-3'

pri čemu dA predstavlja 2'dezoksiadenozin, dG predstavlja 2'dezoksigvanozin, dC predstavlja 2'dezoksicitidin, a T predstavlja timidin,

gde T predstavlja LNA-T jedinicu građe, a G predstavlja LNA-G jedinicu građe i pri čemu * predstavlja fosforotioatnu vezu.

[0014] Dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na farmaceutsku kompoziciju koja kao aktivni agens obuhvata analog oligonukleotida koji obuhvata sekvencu formule II ili III i farmaceutski prihvatljiv nosač.

[0015] Još dalji aspekt ovog pronalaska odnosi se na medicinsku upotrebu analoga oligonukleotida koji obuhvata sekvencu formule II ili III. U određenim načinima ostvarivanja, medicinska upotreba odnosi se na upotrebu za lečenje ili prevenciju poremećaja povezanog sa, praćenog i/ili prouzrokovanog patološkom ekspresijom miR-132. U određenim načinima ostvarivanja, medicinska upotreba odnosi se na lečenje ili prevenciju srčanih poremećaja, određenije poremećaja povezanih sa hipertrofijom srca. U određenim načinima ostvarivanja, medicinska upotreba odnosi se na lečenje fibroznih poremećaja, npr. poremećaja povezanih sa, praćenih i/ili prouzrokovanih patološkom fibrozom, određenije poremećajima fibroze srca, poremećajima fibroze pluća ili poremećajima fibroze jetre.

[0016] Oligonukleotid formule II ili III može se sastojati od dezoksiribonukleotidnih DNK jedinica građe i premošćenih nukleotidnih jedinice građe. „Premošćeni nukleotidˮ odnosi se na modifikovani ribonukleotid u kom ribozna grupa obuhvata dvoatomski ili troatomski most koji povezuje 2'- i 4'-atom ugljenika. Na primer, taj most može obuhvatati 2'-O-CH2-4', 2'-O-CH2-CH2-4', 2'-O-CH(CH3)-4' strukturu ili odgovarajuću strukturu u kojoj je O zamenjen sa S ili NH. U naročitom načinu ostvarivanja, najmanje jedna premošćena nukleotidna jedinica građe predstavlja jedinicu građe zaključane nukleinske kiseline (LNA) sa 2'-O-CH2-4'-mostom.

[0017] Oligonukleotid formule II ili III ima dužinu od najmanje 16 jedinica građe, npr. dužinu od 16 do 20 jedinica građe. U naročitom načinu ostvarivanja, oligonukleotid formule II ili III ima dužinu od 16 jedinica građe.

[0018] U nekim načinima ostvarivanja, oligonukleotid formule II ili III obuhvata 5 do 10, npr.6 do 8, određenije, 7 premošćenih nukleotidnih jedinica građe, npr. LNA jedinica građe.

[0019] U nekim načinima ostvarivanja, oligonukleotid formule II ili III predstavlja goli oligonukleotid. U nekim načinima ostvarivanja, oligonukleotid se može konjugovati sa najmanje jednom heterolognom grupom, npr. grupom koja ne doprinosi vezivanju oligonukleotida za miR-132. Heterologna grupa može biti grupa koja unapređuje ciljanje i/ili apsorpciju ćelije, npr. lipidna grupa kao što je holesterol ili masna kiselina, saharidna ili aminosaharidna grupa kao što je grupa koja sadrži N-galaktozamin, peptidna ili polipeptidna grupa ili nukleozidna ili nukleotidna grupa kao što je aptamer. Heterologna grupa može se konjugovati sa 5'- i/ili 3'-terminusom analoga oligonukleotida kovalentnom vezom ili spejserom.

[0020] Oligonukleotid ovog pronalaska prikladan je za upotrebu u medicini uključujući humanu ili veterinarsku medicinu. U određenim načinima ostvarivanja, jedinjenje je korisno u prevenciji ili lečenju poremećaja povezanog sa, praćenog i/ili prouzrokovanog patološkom ekspresijom, npr. prekomernom ekspresijom miR-132. Pokazalo se da davanje tog jedinjenja značajno smanjuje ekspresiju miR-132 in vitro i in vivo.

[0021] U nekim se načinima ostvarivanja jedinjenje može davati pacijentima koji pokazuju prekomernu ekspresiju miR-132 u poređenju sa zdravim subjektima. U nekim se načinima ostvarivanja jedinjenje može davati pacijentima koji ne pokazuju prekomernu ekspresiju miR-132 u poređenju sa zdravim subjektima, ali im je i dalje potrebno smanjivanje nivoa miR-132.

[0022] Pojam „prevencijaˮ u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na davanje jedinjenja pacijentu za kog se zna da ima povećani rizik od razvoja određenog poremećaja. Pojam „lečenjeˮ u kontekstu ovog pronalaska odnosi se na davanje jedinjenja pacijentu koji je već razvio znakove i/ili simptome određenog poremećaja. Pojam „pacijentˮ odnosi se na subjekta kom je potrebno davanje jedinjenja ovog pronalaska u oblasti humane ili veterinarske medicine. U specifičnim načinima ostvarivanja, pacijent je humani pacijent.

[0023] U određenim načinima ostvarivanja, jedinjenje ovog pronalaska je korisno u prevenciji ili lečenju srčanih poremećaja, određenije poremećaja povezanih sa hipertrofijom srca. Na primer, jedinjenje je korisno u prevenciji ili lečenju kontraktilne disfunkcije, srčane dekompenzacije, srčane insuficijencije ili za prevenciju ili lečenje srčanog remodelovanja nakon infarkta miokarda, zapaljenja miokarda, bolesti srčanih zalistaka kao što su suženje aortnog zaliska ili insuficijencija mitralnog zaliska, genetskih srčanih poremećaja sa hipertrofijom srca, npr. hipertrofične neopstruktivne i opstruktivne kardiomiopatije ili Fabrijeve bolesti.

[0024] Jedinjenje je korisno za davanje pacijentima odabranim iz grupe koju čine

(i) pacijenti sa povećanim rizikom od razvoja srčane insuficijencije,

(ii) pacijenti koji pate od (kongestivne) srčane insuficijencije, npr. pacijenti sa povećanim rizikom od progresije srčane insuficijencije,

(iii) pacijenti posle infarkta miokarda i/ili

(iv) pacijenti sa urođenim srčanim bolestima povezanim sa hipertrofijom srca, kao što su suženje plućnih vena, atrijalni ili ventrikularni septalni defekti.

[0025] U određenim načinima ostvarivanja, jedinjenje ovog pronalaska je korisno u prevenciji ili lečenju fibroznih poremećaja, određenije poremećaja povezanih sa, praćenih i/ili prouzrokovanih patološkom fibrozom.

[0026] Patološka fibroza predstavlja obrazovanje viška vlaknastog vezivnog tkiva u organu ili tkivu, naročito povezano sa, praćeno i/ili prouzrokovano patološkim stanjem. Patološka fibroza može se javiti u velikom broju različitih organa i tkiva u telu, obično kao posledica zapaljenja ili oštećenja.

[0027] U određenom načinu ostvarivanja, fibroza predstavlja fibrozu srca, npr. stanje koje uključuje patološku fibrozu u srcu. Primerni tipovi fibroze srca uključuju atrijalnu fibrozu, endomiokardnu fibrozu ili fibrozu koja je posledica prethodnog infarkta miokarda.

[0028] U daljem načinu ostvarivanja, fibroza predstavlja fibrozu pluća, npr. stanje koje uključuje patološku fibrozu u plućima. Primerni tipovi fibroze pluća uključuju fibrozne poremećaje prouzrokovane okupacionim ili sredinskim faktorima, na primer izlaganjem toksinima i zagađivačima kao što su silikatna prašina, azbestna vlakna, metalna prašina, ugljena prašina, prašina koja nastaje proizvodnjom žitarica, ptičji i životinjski izmeti. Druge tipove poremećaja fibroze pluća prouzrokuju radioterapija i/ili lečenje medikamentima kao što su hemoterapijski lekovi, lekovi za srce, antibiotici ili lekovi protiv zapaljenja. Dalje druge tipove poremećaja fibroze pluća prouzrokuju poremećaji koji uključuju idiopatsku fibrozu pluća, zapaljenje kože, zapaljenje više mišića, mešovitu bolest vezivnog tkiva, autoimunu bolest kao što je reumatoidni artritis, otvrdnuće kože, Šergenov sindrom ili sistemski eritemski lupus, sarkoidozu, zapaljenje pluća, virusnu infekciju ili gastro-ezofagealnu refluksnu bolest (GERB).

[0029] U daljem načinu ostvarivanja, fibroza može biti fibroza jetre, npr. stanja koja uključuju patološku fibrozu u jetri. Primerne tipove fibroze jetre prouzrokuju virusna infekcija, npr. virusom hepatitisa B i/ili C, nasledni poremećaji metabolizma, autoimunski hepatitis, opstrukcija žučnih puteva, prezasićenost gvožđem, bolest masne degeneracije jetre koja nije uzrokovana alkoholom, uključujući masnu degeneraciju jetre koja nije uzrokovana alkoholom (NAFL) i nealkoholni steatohepatitis (NASH) i bolest jetre uzrokovanu alkoholom.

[0030] U još daljim načinima ostvarivanja, fibroza može biti i fibroza krvnih sudova, npr. arterijska krutost, fibroza kože, npr. obrazovanje keloida ili nefrogena sistemska fibroza, artrofibroza, neki oblici adhezivnog kapsulitisa, fibroza mekog tkiva kao što je medijastinalna fibroza ili retroperitonealna fibroza ili fibroza koštane srži kao što je mijelofibroza.

[0031] U određenim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obuhvata određivanje količine i/ili dejstva određenih fizioloških parametara kod subjekta kog treba lečiti pre, tokom i/ili posle davanja jedinjenja ovog pronalaska. Ta konkomitantna dijagnostička procedura može biti od pomoći za medicinsku upotrebu kao što je gore opisano. Na primer, dijagnostička procedura može biti od pomoći u proceni rizika, stratifikaciji pacijenata, praćenju toka lečenja i/ili kontroli nakon lečenja.

[0032] U određenim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obuhvata određivanje količine i/ili dejstva miR-132 kod subjekta kog treba lečiti pre, tokom i/ili posle davanja jedinjenja ovog pronalaska. U daljim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obuhvata određivanje količine i/ili dejstva srčanih markera kao što su BNP, ANP ili izoforme teške promene miozina, npr. MYH7/6 odnosa, i/ili nivoa FoxO3 i/ili SERCA2. U još daljim načinima ostvarivanja, ovaj pronalazak obuhvata određivanje količine i/ili dejstva markera fibroze kao što je kolagen, npr. depozicija kolagena i/ili ekspresija gena markera fibroze kao što je kolagen 1A1, kolagen 1A2, kolagen 3A1 i/ili matrična metalopeptidaza kao što je matrična metalopeptidaza 2.

[0033] Određivanje gorepomenutih parametara može se izvoditi u uzorcima telesnih tečnosti kao što su krv, plazma ili serum ili u uzorcima tkiva u skladu sa poznatim postupcima na nivou nukleinske kiseline i/ili proteina i može obezbediti korisne dijagnostičke informacije, npr. o toku i/ili uspešnosti lečenja.

[0034] Jedinjenje ovog pronalaska može se davati kao farmaceutska kompozicija koja obuhvata farmakološki prihvatljiv nosač. Davanje se može izvoditi poznatim postupcima, pri čemu se jedinjenje uvodi u željenu ciljnu ćeliju ili organ subjekta kog treba lečiti.

[0035] Jedinjenje se može davati kao takvo ili kao konjugat sa heterolognom grupom kao što je gore opisano.

[0036] Za farmaceutske primene, kompozicija može biti u obliku rastvora, npr. rastvora koji se može ubrizgati, emulzije, inhalacije, suspenzije ili slično.

[0037] Kompozicija se može davati na bilo koji prikladan način, npr. parenteralno, određenije injekcijom kao što je subkutana, intramuskularna, intravenska ili intraarterijalna injekcija, ili infuzijom, oralnim ili inhalacionim unosom i/ili dermalnom primenom. Nosač može biti bilo koji prikladan farmaceutski nosač. Poželjno se koristi nosač koji može da poveća efikasnost ulaska oligonukleotidnih molekula u ciljne ćelije. Prikladni primeri takvih nosača su lipozomi, npr. katjonski lipozomi, ili prethodno dizajnirani eksozomi.

[0038] Jedinjenje se daje u farmaceutski efektivnim dozama u zavisnosti od načina davanja i tipa ili težine bolesti.

[0039] Jedinjenje se može davati kao monoterapija ili u kombinaciji sa daljim različitim medikamentom, određenije medikamentom prikladnim za prevenciju ili lečenje srčanih poremećaja ili fibroznih poremećaja kao što je gore opisano.

[0040] Primeri daljih medikamenata prikladnih za prevenciju ili lečenje srčanih poremećaja jesu agensi za modulisanje angiotenzina, β-blokatori, diuretici, antagonisti aldosterona, vazodilatatori, jonotrofni agensi, statini ili inhibitori neprilizina ili njihove kombinacije, npr. kombinacija inhibitora neprilizina, npr. sakubitril, sa blokatorom angiotenzin-II-receptora, npr. valsartan.

[0041] Primeri daljih medikamenata prikladnih za prevenciju lečenja fibroznih poremećaja jesu medikamenti za prevenciju ili lečenje fibroze srca kao što su ACE inhibitori, npr. lizinopril, blokatori angiotenzin II receptora, npr. kandesartan, losartan ili olmesartan, antagonisti aldosterona, npr. spironolakton i/ili TGF β inhibitori, npr. pirfenidon ili tranilast, medikamenti za prevenciju ili lečenje fibroze pluća kao što su agensi protiv fibroze, npr. nintedanib ili pirfenidon, agensi protiv zapaljenja, npr. kortikosteroidi, azatioprin, ciklofosfamid i mikofenolat-mofetil, agensi protiv refluksa, npr. inhibitori proteinske pumpe ili H2blokatori i/ili agensi protiv kašlja i medikamenti za prevenciju i/ili lečenje fibroze jetre kao što su ACE inhibitori, npr. benazepril, lizinopril ili ramipril, agensi protiv virusa ili PPAR αagonisti.

[0042] Još dalje, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja ovog pronalaska kao što je gore opisano za proizvodnju medikamenta za prevenciju ili lečenje srčanog poremećaja.

[0043] Još dalje, ovaj pronalazak se odnosi na upotrebu jedinjenja ovog pronalaska kao što je gore opisano za proizvodnju medikamenta za prevenciju ili lečenje fibroznog poremećaja.

[0044] Nadalje će ovaj pronalazak biti detaljnije opisan sledećim crtežima i primerima.

Primer 1 - Utišavanje ekspresije miR-132 u kardiomiocitima

[0045] Izvedena je kvantitativna in vitro analiza miRNK inhibitornog dejstva brojnih strukturno analognih jedinjenja izvedenih iz anti-miR-132 biblioteke. Utišavanje ekspresije miRNK kvantifikovano je TaqMan<®>analizama i kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu.

[0046] Ispitivanje je sprovedeno u izolovanim kardiomiocitima pacova nakon hipertrofične stimulacije tretiranjem fenilefrinom/izoproterenolom u koncetracijama od 10 µM. Ćelije su inkubirane tokom 48 sati u standardnoj podlozi za uzgajanje ćelija. Ispitna jedinjenja data su pojedinačno u koncentraciji od 100 nM. Ispitivanja su izvedena u triplikatima.

[0047] Jedinjenje CDR132L, LNA-DNK miksmer sa fosforotioatnom okosnicom, identifikovano je kao najsnažnije jedinjenje iz biblioteke anti-miR-132 strukturnih analoga.

[0048] Struktura CDR132L je sledeća:

5'-dA*+T*dG*+G*dC*+T*dG*+T*dA*+G*dA*dC*dT*dG*+T*+T-3'

pri čemu dA predstavlja 2'dezoksiadenozin, dG predstavlja 2'dezoksigvanozin, dC predstavlja 2'dezoksicitidin, a T predstavlja timidin,

gde T predstavlja LNA-T jedinicu građe, a G predstavlja LNA-G jedinicu građe i pri čemu * predstavlja fosforotioatnu vezu.

Primer 2 - Toksikološko profilisanje

2.1 Cilj ispitivanja: Toksikološko profilisanje CDR132L-a

2.2 Nacrt ispitivanja:

[0049] In vitro analiza citotoksičnosti izvedena je u humanim ćelijama ćelija jetre (HepG2) i izolovanim neonatalnim kardiomiocitima (NRCM). Za procenu citotoksičnosti korišćena je kolorimetrijska komercijalna MTT analiza. Nakon dodavanja pojedinačnih jedinjenja, ćelije su inkubirane u DMEM podlozi tokom 48h. Efekat CDR132L-a (crvena) upoređen je sa kodiranim LNA oligonukleotidom, koji je korišćen kao kontrola (plava) u doznom opsegu 0,01-100 µM. Terapijski dozni opseg označen je sivom bojom.

[0050] 2.3 Rezultati: Nije ustanovljena značajna toksičnost CDR132L-a u HepG2 ćelijama i NRCM-u u terapijskom doznom opsegu (v. Fig.1A i 1B).

Primer 3 - Reverzno remodelovanje leve komore srca sa srčanom insuficijencijom davanjem CDR132L-a u transgenom mišjem modelu

3.1 Cilj ispitivanja: Ispitati efikasnost CDR132L-a u preokretanju srčane insuficijencije u mišjem modelu srčane insuficijencije.

3.2 Nacrt ispitivanja:

[0051] Model hipertrofije srca: Transgeni (TG) miševi sa prekomernom ekspresijom miR-132 u srcu (Ucar et al.2012).

[0052] Tretiranje: sedmično 20 mg/kg ip. CDR132L ili placebo (v. Fig.2A) Grupe: divlji tip (WT) iz istog legla placebo, WT+CDR132L, TG+placebo, TG+CDR132L. n=6/grupa.

[0053] Nivoi ekspresije miR-132 detektovani su putem qPCR-a. Statistički test: t-test neuparenih uzoraka. (Fig.2B).

[0054] **p<0,01, n=6/grupa.

3.3 Rezultati:

[0055] Reprezentativni snimci ehokardiografije srca (Fig.3A).

[0056] CDR132L preokreće hipertrofiju na osnovu merenja srčane mase i krajnjeg dijastolnog volumena (LVEDV) (Fig.3B).

[0057] CDR132L poboljšava regionalnu kontraktilnu funkciju u većini segmenata leve srčane komore (AB, anteriorni bazalni; AM, srednji anteriorni; AA, anteriorni apikalni; PA posteriorni apikalni; PM, srednji posteriorni i PB, posteriorni bazalni) (Fig.3C).

Primer 4 - Davanje CDR132L-a u mišjem modelu post-MI srčane insuficijencije

4.1 Cilj ispitivanja: Ispitati efikasnost CDR132L-a u mišjem modelu post-MI srčane insuficijencije

4.2 Nacrt ispitivanja

[0058] Mišji model infarkta miokarda (MI): permanentno podvezivanje koronarne arterije (LAD) kod C57BL/6N miševa (Kolk et al., 2009).

Grupe: MI ili lažno operisani, tretirani CDR132L-om ili placebom

Tretiranje: 20 mg/kg ip, 7. i 14. dana post-MI

Krajnja tačka: Funkcija LV-a 28. dana post-MI. n=6-7/grupa. (Fig.4).

4.3 Rezultati:

[0059] Tretiranje CDR132L-om poboljšava post-MI disfunkciju leve srčane komore (Fig.5A). Poboljšani su i parametri sistolne kontraktilne funkcije koji su nezavisni od opterećenja (Fig.5B) (*p<0,05).

[0060] Tretiranje CDR132L-om takođe poboljšava longitudinalni stepen deformacije u sekundi (LSR) pa samim tim preokreće post-MI kontraktilnu disfunkciju u pojedinačnim srčanim segmentima u udaljenom području srca (*p<0,05) (Fig.6).

[0061] Tretiranje CDR123L-om efikasno utišava ekspresiju miR-132 u srčanim tkivima, u npr. udaljenom

1

(neinfarktnom) području i periinfarktnoj zoni (Fig.7A).

[0062] Na histološkom nivou, CDR132L smanjuje veličinu kardiomiocita u udaljenom području post-MI srca (Fig.7B).

[0063] Na nivou tkiva, CDR132L smanjuje ekspresiju signala srčanog napora ANP u post-MI srcu (Fig.7C).

Primer 5 - Ispitivanje CDR132L-a u svinjskom modelu post-MI srčane insuficijencije

5.1 Cilj ispitivanja: Dokaz in vivo efikasnosti CDR132L-a u klinički relevantnom modelu nakon infarkta miokarda.

5.2 Postavka ispitivanja:

[0064]

• Svinjski model infarkta miokarda izazvan 90 min ishemijom (okluzijom LAD-a) i naknadnom reperfuzijom.

• Grupe: Placebo ili CDR132L, n=6 po grupi.

• Tretiranje: dvaput, 3. dana i 28. dana post-MI, 0,3 mg/kg intrakoronarno i 0,5 mg/kg intravenski, tim redom (Fig.8).

• Krajnja tačka: 8 nedelja post-MI. Merenja primarnih rezultata: Remodelovanje EF-a i LV-a.

5.3 Rezultati:

[0065]

• Tretiranje CDR132L-om sprečava maladaptivno remodelovanje i poboljšava funkciju, na osnovu merenja krajnjeg dijastolnog volumena, krajnjeg sistolnog volumena, ejekcione frakcije i funkcije leve srčane komore (Fig.9A-D).

• Tretiranje CDR132L-om poboljšava segmentalnu kontraktilnost u segmentima koji odgovaraju preživljavanju/udaljenom miokardijumu; MRI srca u krajnjoj tački: n=6/grupa, crveno područje: p<0,05 (Fig.9E).

• Tretiranje CDR132L-om sprečava maladaptivno remodelovanje i poboljšava vijabilnost LV-a u apikalnom području na osnovu merenja pomoću NOGA, elektroanatomskog mapiranja u krajnjoj tački: n=6/grupa, placebo vs CDR132L: p<0,05 (Fig.10).

• CDR132L normalizuje ekspresiju tkiva markera patološke srčane insuficijencije u ANP-u i BNP-u te obezbeđuje promenu u izoformama teške promene miozina, tj. MYH7/6 odnosu (Fig.11). • Na histološkom nivou, tretiranje CDR132L-om efikasno smanjuje hipertrofiju kardiomiocita u udaljenim područjima LV-a prikazanim na snimcima fotomikrografije područja LV-a (WGA/DAPI Bojenje 20x) (Fig.12A) i grafičkom prikazu (Fig.12B), n=6/grupa, placebo vs CDR132L: p<0,05.

Primer 6 - PD profil/ciljno vezivanje CDR132L-a kod svinja

6.1 Postavka ispitivanja:

[0066] Tretiranje: 1x, 0. dan, 0,5 mg/kg ili 5 mg/kg intrakoronarna perfuzija, n=3 svinje/grupa, placebo vs CDR132L: p<0,05.

• qPCR tkivna miRNK analiza u krajnjoj tački (24h nakon tretiranja).

6.2 Rezultati:

[0067]

• Jedna doza tretiranja CDR132L-om utišava nivoe miR-132 u srcu na dozno zavisan način (Fig.13).

Primer 7 - Toksikološko profilisanje organa

7.1 Postavka ispitivanja:

[0068]

• Tretiranje: dvaput, 3. dana i 28. dana post-MI, 0,3 mg/kg intrakoronarno i 0,5 mg/kg intravenski, tim redom.

• Serijsko uzorkovanje krvi, krajnja tačka: 72h nakon tretiranja, n=6 svinja/grupa, placebo vs CDR132L: p<0,05.

7.2 Rezultati:

[0069]

• Tretiranje CDR132L-om in vivo ne izaziva bilo kakvu toksičnost organa kod svinja (Fig.14).

Primer 8 - Nivoi FoxO3 i SERCA2 mRNK u srcu u mišjem modelu srčane insuficijencije

[0070] Nivoi FoxO3 i Serca2 mRNK u srcu izmereni su u kontrolnim i miR-132 TG miševima tretiranim intraperitonealnom injekcijom bilo kontrolnog kodiranog oligonukleotida ili CDR132L-a, sedmično, 4 puta. Sve vrednosti predstavljaju srednju vrednost ± SEM. *P < 0,05 (Fig.15A i 15B).

Primer 9 - Poređenje različitih oligonukleotida

[0071] Svrha ovog ispitivanja je da se proceni terapijski efekat novog inhibitora miR-132-3p, CDR132L, prema sprečavanju pronalaska sa dvama komparativnim oligonukleotidima. Ta dva komparativna oligonukleotida ispoljavaju istu oligonukleotidnu sekvencu i fosforotioatnu okosnicu kao CDR132L, ali se razlikuju u distribuciji LNA jedinica građe unutar molekula. CDR2u1 ima dve LNA jedinice građe na 5' i 3' kraju, dok kod CDR301 svaki nukleotid nosi LNA jedinicu građe.

[0072] Kako bi se ispitala efikasnost, različiti oligonukleotidi su primenjeni na neonatalne kardiomiocite pacova (NRCM). Efekti tog tretiranja praćeni su kvantitativnim PCR-om u realnom vremenu (qRT-PCR) nakon alteracija u ekspresiji miR-132-3p i njegovog poznatog ciljnog gena FoxO3 (Forkhead box O3).

[0073] Dizajn eksperimenta i rezultati prikazani su na Fig.16: (A) Pregled postavke eksperimenta.

Neonatalni kardiomiociti pacova zasejani su 0. dana, a 1. dana su tretirani oligonukleotidima CDR132L, CDR2u1 ili CDR301 (100 nM svaki). U krajnjoj tački, ćelije su sakupljene radi analize ekspresije gena. (B) Nivoi ekspresije miR-132-3p nakon tretiranja CDR132L-om, CDR2u1 ili CDR301. (C) Nivoi ekspresije miR-132-3p ciljnog gena Forkhead box O3 (FoxO3) nakon tretiranja CDR132L-om, CDR2u1 ili CDR301. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD. P vrednosti oligonukleotida naspram placeba određene su dvosmernim Studentovim t-testom.

[0074] Tretiranje NRCM-ova CDR132L-om i CDR301 dovelo je do značajnog smanjenja nivoa miR-132-3p za 96%, dok je CDR2u1 smanjio ekspresiju miRNK za 30% (Fig.16A-B). Nadalje, tretiranje CDR132L-om dovelo je do značajne depresije miR-132-3p ciljnog gena Foxo3, što nije postignuto pomoću CDR2u1 i CDR301 (Fig.16C).

[0075] Ukratko, podaci pokazuju superiorni inhibitorni efekat CDR132L-a u poređenju sa CDR2u1 i CDR301 na koji ukazuju značajno sniženi nivoi ekspresije ili miR-132-3p i značajna represija njegovog ciljnog gena FoxO3.

1

Primer 10 - Efekti CDR132L-a u fibrozi srca

[0076] Svrha ovog ispitivanja je da se procene antifibrozni terapijski efekti CDR132L-a u in vivo modelu fibroze.

[0077] Za in vivo dokaz antifibroznog dejstva, korišćen je mišji model infarkta miokarda (MI) permanentnim podvezivanjem leve anteriorne silazne koronarne arterije (LAD) kod C57BL/6N miševa. Tretiranje CDR132L-om primenjeno je 7. i 14. dana, placebo (kodirani oligo analog CDR132L-a, 20 mg/kg) i CDR132L (20 mg/kg). Grupe su uključivale kontrolnu grupu (lažno operisane miševe) i miševe sa podvezanim LAD-om (MI, infarkt miokarda), koji su primali bilo placebo ili CDR132L: Lažno operisani+placebo, Lažno operisani+CDR132L, MI+placebo, MI+CDR132L. n=6-7/grupa. Dizajn eksperimenta prikazan je na Fig.17.

[0078] Procena antifibroznog efekta CDR132L-a in vivo u post MI srčanoj insuficijenciji prikazana je na Fig.18. Fibroza (prikazana kao % depozicije kolagena detektovan Pikro-sirijus crvenim (PSR) bojenjem i ekspresijom gena kolagena tipa III alfa 1 lanac (Col3a1) u odnosu na β-Aktin) ublažena je nakon MI tretiranjem CDR132L-om. Grupe su uključivale kontrolnu grupu (lažno operisane miševe) i miševe sa podvezanim LAD-om (MI), koji su primali bilo placebo (crna kolona) ili CDR132L (bela kolona): Lažno operisani+placebo, Lažno operisani+CDR132L, MI+placebo, MI+CDR132L. Statistički test (t-test neuparenih uzoraka) izveden je između MI miševa tretiranih placebom ili CDR132L-om. **p<0,01, n=6-7/grupa.

[0079] Prema histološkim rezultatima, fibroza je ublažena nakon tretiranja CDR132L-om (Fig.18A). To je na molekulskom nivou potvrđeno smanjenom ekspresijom gena za markere fibroze poput kolagena tipa III alfa 1 lanac (Col3a1) (Fig.18B).

Primer 11 - Efekti CDR132L-a u fibrozi pluća i jetre

[0080] Antifibrozni efekat CDR132L-a ispitan je u in vitro modelima fibroze pluća i jetre. Za to, humani primarni fibroblasti izvedeni iz jetre (humani primarni fibroblasti jetre, HPLF, PeloBiotech) i pluća (normalni humani primarni fibroblasti pluća, NHLF, Lonza) stimulisani su profibroznim agensima i tretirani CDR132L-om. Terapijski efekti CDRL132L-a praćeni su sledećim ključnim procesima u fibroznom putu uključujući stopu rasta i alteracije u ekspresiji gena markera fibroze u krajnjoj tački. Uz to, procenjeno je da ekspresija miR-132-3p dokazuje efikasno tretiranje CDR132L-om.

[0081] Kako bi se utvrdio rast ćelija, korišćen je ELISA (imunoenzimska proba) komplet za rast ćelija (koji je obezbedio Roche). Ta kolorimetrijska analiza omogućava kvantifikovanje rasta ćelija na osnovu merenja BrdU-a (Bromdezoksiuridina) koji je inkorporisan u novosintetizovanu DNK rastućih ćelija. Detektovana je i kvantifikovana količina inkorporisanog BrdU-a. Vrednosti apsorbancije su u direktnoj korelaciji sa količinom DNK sinteze pa samim tim i sa brojem rastućih ćelija u odgovarajućim mikrokulturama. Ekspresija gena procenjena je pomoću kvantitativnog PCR-a u realnom vremenu (qRT-PCR) koji meri nivoe ekspresije miR-132-3p i markere fibroze uključujući kolagen 1A1 (COL1A1), kolagen 1A2 (COL1A2) i matričnu metalopeptidazu 2 (MMP2).

[0082] Fig.19 odnosi se na in vitro model fibroze jetre: (A) Pregled postavke eksperimenta. Humani primarni fibroblasti jetre (koje je obezbedio PeloBiotech) zasejani su 0. dana, a 1. dana su tretirani fibroznim stimulansom (10 ng/ml TGF-β u normalnoj podlozi za rast (kompletna podloga za fibroblaste dopunjena sa 10% FBS-om)) i CDR132L-om (100 nM). U krajnjoj tački, procenjeni su rast ćelija i ekspresija gena markera fibroze. (B) Nivoi ekspresije miR-132-3p nakon tretiranja CDR132L-om. (C) Rast je procenjen praćenjem inkorporacije BrdU-a (Bromdezoksiuridina) tokom DNK sinteze. BrdU reagens je dodat podlozi 20 h pre krajnje tačke. (D) Nivoi ekspresije gena markera fibroze (kolagen 1A1 (COL1A1), kolagen 1A2 (COL1A2) i matrična metalopeptidaza 2 (MMP2)). U (B) i (D) isprekidana linija označava nivo ekspresije nestimulisanih kontrolnih ćelija. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD. P vrednosti CDR132L-a naspram kontrole određene su dvosmernim Studentovim t-testom.

[0083] Stimulacija HPLF-ova transformacionim faktorom rasta beta (TGF-β) (Fig.19A) dovela je do blage indukcije miR-132-3p koja je značajno smanjena tretiranjem CDR132L-om (Fig.19B). Nadalje, to jedinjenje smanjilo je rast fibroblasta (Fig.19C) i ekspresiju fibroznih gena uključujući COL1A1, COL1A2 i MMP2 (Fig.19D).

[0084] Fig.20 odnosi se na in vitro model fibroze pluća: (A) Pregled postavke eksperimenta. Normalni humani fibroblasti pluća (koje je obezbedila Lonza) zasejani su 0. dana, a 1. dana su tretirani fibroznim stimulansom (Visoki FBS (5%) u podlozi za rast fibroblasta i CDR132L-om (100 nM). U krajnjoj tački, procenjeni su rast ćelija i ekspresija gena. (B) Nivoi ekspresije miR-132-3p nakon terapije CDR132L-om. (C) Rast procenjen praćenjem inkorporacije BrdU-a (Bromdezoksiuridina) tokom DNK sinteze.

[0085] BrdU reagens dodat je podlozi 20 h pre krajnje tačke. Na (B) isprekidana linija označava nivo ekspresije nestimulisanih kontrolnih ćelija. Podaci predstavljaju srednju vrednost ± SD. P vrednosti CDR132L-a naspram kontrole određene su dvosmernim Studentovim t-testom.

[0086] U NHLF ćelijama, nakon fibrozne stimulacije visokim FBS-om (5% u poređenju sa normalnim uslovima rasta od 2% FBS-a) (Fig.20A) nije primećen porast miR-132-3p (Fig.20B). Međutim, tretiranje CDR132L-om dovelo je značajnog smanjenja ciljne mikroRNK (Fig.20B) i rasta fibroblasta (Fig.20C).

[0087] Ukratko, podaci pokazuju značajan antifibrozni efekat oligonukleotidnog analoga CDR132L u fibroblastima izvedenim iz jetre ili pluća kao i u srčanom tkivu. Pretpostavlja se da se taj efekat može biti zasnovan na antiproliferativnom kapacitetu leka i/ili na njegovom efektu na ekspresiju proteina ekstracelularnog matriksa.

1

Lista referenci

[0088]

1. Barry, S.P.; Townsend, P.A. (2010). What causes a broken heart-Molecular insights into heart failure. Int Rev Cell Mol Biol 284, 113-179

2. Datta, S.R.; Brunet, A.; Greenberg, M.E. (1999). Cellular survival: a play in three Akts. Genes Dev.13, 2905-2927.

3. DeBosch, B.J.; Muslin, A.J. (2008). Insulin signaling pathways and cardiac growth. J Mol Cell Cardiol.44, 855-864.

4. Frescas, D.; Valenti, L.; Accili, D. (2005). Nuclear trapping of the forkhead transcription factor FoxO1 via Sirt1-dependent deacetylation promotes expression of glucogenetic genes. J Biol Chem.280, 20589-20595.

5. Glas, D.J. (2010). PI3 kinase regulation of skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Curr Top Microbiol Immunol.346, 267-278.

6. Gottlieb, R.A.; Gustafsson, A.B. (2011). Mitochondrial turnover in the heart. Biochim Biophys Acta.1813, 1295-1301.

7. Kolk, M.V.; Meyberg, D.; DenseT.; Tang-Quam, K. R.; Robbins R.C.; Reichenspurner, H.;

Schrepfer. S (2009), J. Vis Exp.32, pii: 1438. doi: 103791/1438.

8. McMullen, J.R.; Shioi, T.; Huang, W.Y.; Zhang, L.; Tarnavski, O.; Bisping, E.; Schinke, M.; Kong, S.; Sherwood, M.C.; Brown, J. et al. (2004). The insulin-like growth factor 1 receptor induces physiological heart growth via the phosphoinositide 3-kinase (p110alpha) pathway. J Biol Chem.

279, 4782-4793.

9. Ni, Y.G.; Berenji, K.; Wang, N.; Oh, M.; Sachan, N.; Dey, A.; Cheng, J.; Lu, G.; Morris, D.J.; Castrillon, D.H. et al. (2006). Foxo transcription factors blunt cardiac hypertrophy by inhibiting calcineurin signaling. Circulation.114, 1159-1168.

10. Ronnebaum, S.M.; Patterson, C. (2010). The foxO family in cardiac function and dysfunction. Annu Rev Physiol.72, 81-94.

11. Skurk, C.; Izumiya, Y.; Maatz, H.; Razeghi, P.; Shiojima, I.; Sandri, M.; Sato, K.; Zeng, L.;

Schiekofer, S.; Pimentel, D. et al. (2005). The FOXO3a transcription factor regulates cardiac myocyte size downstream of AKT signaling. J Biol Chem.280, 20814-23.

12. Ucar, A. et al. (2012), Nat. Commun.3: 1078. doi: 10.1038/ncomms2009.

1

1

1

1

Claims (1)

1. Patentni zahtevi 1. Oligonukleotid koji obuhvata sekvencu formule II: 5'-A+TG+GC+TG+TA+GACTG+T+T-3' pri čemu A, T, G i C predstavljaju dezoksiribonukleotidne jedinice građe i gde G i T predstavljaju premošćene nukleotidne jedinice građe. 2 2. Oligonukleotid prema zahtevu 1, pri čemu G i T predstavljaju zaključane nukleotidne (LNA) jedinice građe sa 2'-O-CH2-4' mostom. 3. Oligonukleotid prema zahtevu 1 ili 2 sa dužinom od 16 jedinica građe. 4. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-3 koji obuhvata najmanje jednu modifikovanu internukleozidnu vezu, određenije najmanje jednu fosforotioatnu ili fosforodiamidatnu internukleozidnu vezu, pri čemu sve internukleozidne veze određenije predstavljaju fosforotioatne veze. 5. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-4 koji obuhvata sekvencu formule III: 5'-dA*+T*dG*+G*dC*+T*dG*+T*dA*+G*dA*dC*dT*dG*+T*+T-3' pri čemu dA predstavlja 2'dezoksiadenozin, dG predstavlja 2'dezoksigvanozin, dC predstavlja 2'dezoksicitidin, a T predstavlja timidin, gde T predstavlja zaključanu nukleotidnu (LNA)-T jedinicu građe, a G predstavlja zaključanu nukleotidnu (LNA)-G jedinicu građe i pri čemu * predstavlja fosforotioatnu vezu. 6. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-5 konjugovan sa heterolognom grupom. 7. Farmaceutska kompozicija koja obuhvata oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 i farmaceutski prihvatljiv nosač. 8. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u medicini, određenije za upotrebu u humanoj medicini. 9. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u prevenciji ili lečenju poremećaja povezanog sa, praćenog i/ili prouzrokovanog patološkom ekspresijom miR-132. 10. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u prevenciji ili lečenju srčanih poremećaja, određenije poremećaja povezanih sa hipertrofijom srca, određenije za upotrebu u prevenciji ili lečenju kontraktilne disfunkcije, srčane dekompenzacije ili srčane insuficijencije. 11. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u prevenciji lečenja srčanih poremećaja, pri čemu se jedinjenje daje pacijentima odabranim iz grupe koju čine: (i) pacijenti sa povećanim rizikom od razvoja srčane insuficijencije, (ii) pacijenti koji pate od (kongestivne) srčane insuficijencije, npr. pacijenti sa povećanim rizikom od progresije srčane insuficijencije; (iii) pacijenti posle infarkta miokarda, i/ili (iv) pacijenti sa urođenim srčanim bolestima povezanim sa hipertrofijom srca, kao što su suženje plućnih vena, atrijalni ili ventrikularni septalni defekti. 12. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u lečenju ili prevenciji srčanih poremećaja kao monoterapija ili u kombinaciji sa daljim medikamentom, određenije odabranim iz grupe koju čine agensi za modulisanje angiotenzina, βblokatori, diuretici, antagonisti aldosterona, vazodilatatori, jonotrofni agensi ili njihove kombinacije. 13. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u lečenju ili prevenciji fibroznih poremećaja, određenije za upotrebu u prevenciji ili lečenju poremećaja fibroze srca, određenije atrijalne fibroze, endomiokardne fibroze ili fibroze koja je posledica prethodnog infarkta miokarda, poremećaja fibroze pluća, određenije fibroze pluća prouzrokovane okupacionim ili sredinskim faktorima, fibroze pluća prouzrokovane radioterapijom i/ili lečenjem medikamentima ili idiopatske fibroze pluća, ili poremećaja fibroze jetre, određenije bolesti jetre uzrokovane alkoholom ili bolesti masne degeneracije jetre koja nije uzrokovana alkoholom (NAFLD). 14. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 farmaceutske kompozicije prema zahtevu 7 za upotrebu u prevenciji ili lečenju fibroznih poremećaja kao monoterapija ili u kombinaciji sa daljim medikamentom. 15. Oligonukleotid prema bilo kom od zahteva 1-6 ili farmaceutska kompozicija prema zahtevu 7 za upotrebu u lečenju ili prevenciji poremećaja prema bilo kom od zahteva 8-14 uključujući fazu određivanja količine i/ili dejstva (i) miR-132 (ii) najmanje jednog srčanog markera i/ili (iii) najmanje jednog markera fibroze kod pacijenta kog treba lečiti pre, tokom i/ili posle davanja oligonukleotida ili farmaceutske kompozicije.