RS63090B1 - Kompozicije entrecoccus flagelina za upotrebu u terapiji - Google Patents

Description

Opis

POLJE PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak je iz oblasti kompozicija koje sadrže polipeptide flagelina iz bakterijskih sojeva i upotrebe takvih kompozicija u lečenju bolesti.

POZADINA PRONALASKA

[0002] Smatra se da je ljudsko crevo sterilno in utero, ali je izloženo velikom broju mikroba majke i mikroba iz okoline neposredno nakon rođenja. Nakon toga, dolazi do dinamičkog perioda kolonizacije i sukcesije mikroba, na koji utiču faktori kao što su način primene, okruženje, ishrana i genotip domac ́ina, što sve utiče na sastav mikrobiote creva, posebno tokom ranog života. Nakon toga, mikrobiota se stabilizuje i postaje slična mikrobioti odrasle osobe [1]. Ljudska crevna mikrobiota sadrži više od 500-1000 različitih filotipova koji u suštini pripadaju dvema glavnim bakterijskim divizijama, Bacteroidetes i Firmicutes [2]. Uspešni simbiotski odnosi koji proističu iz bakterijske kolonizacije ljudskog creva doneli su širok spektar metaboličkih, strukturnih, zaštitnih i drugih korisnih funkcija. Poboljšane metaboličke aktivnosti kolonizovanog creva obezbeđuju da se inače neprobavljive komponente ishrane razgrađuju uz oslobađanje nusproizvoda koji predstavljaju važan izvor hranljivih materija za domac ́ina. Slično tome, imunološki značaj crevne mikrobiote je dobro prepoznat i prikazan je kod životinja koje nisu kliconoše koje imaju oslabljen imuni sistem koji se funkcionalno rekonstituiše nakon uvođenja komenzalnih bakterija [3-5].

[0003] Za razliku od proizvodnje sekretornog crevnog IgA, na koju utiče mikrobna kolonizacija per se [6-7], čini se da razvoj i diferencijacija T c ́elija zahtevaju kolonizaciju specifičnih komenzalnih mikroorganizama. Č ini se da su vrste klostridija, a posebno segmentirane filamentne bakterije koje formiraju spore (SFB), snažan stimulans za diferencijaciju i sazrevanje Th1, Th17 i Tregs [8-9] creva i debelog creva. Novije studije su pokazale da druge crevne bakterije, uključujuc ́i one iz klastera Clostridium IV i XIVa i izmenjenu Schaedler floru (ASF), mogu da izazovu de novo generaciju Treg-ova, dok monokolonizacija sa Bacteroides fragilis može ispraviti neravnotežu Th1/Th2 kod miševa koji nisu kliconoše promovišuc ́i širenje Tregs-a [5][10-11]. Ovi podaci ukazuju na važne imunoregulatorne efekte drugih rezidentnih crevnih bakterija. Jasno je da su efekti komenzalnih bakterija na puteve diferencijacije T ćelija promenljivi i, kao što je prethodno pretpostavljeno, na njih može uticati niz TLR liganada koji su povezani sa specifičnim bakterijama [12]. Na primer, mehanizam kojim SFB utiče na odgovore T c ́elija trenutno je nepoznat, ali nedavne studije genoma koje potvrđuju prisustvo gena flagelina sugerišu da urođeni odgovori posredovani interakcijama TLR5-flagelina mogu igrati ulogu [13-14].

[0004] Flagelin je jedna od glavnih komponenti bakterijskog flageluma. Flagelum je dodatak nalik biču koji obezbeđuje pokretljivost bakterije i može da deluje kao senzorna organela. Struktura i sastav bakterijskog flagelina je sveobuhvatno proučavan u modelnim organizmima, kao što su Salmonella typhimurium i E. coli. Flagelin Salmonella typhimurium i E. coli aktiviraju imuni sistem preko TLR5 receptora, koji vodi aktivaciju različitih proinflamatornih gena i gena imunološkog odgovora [15]. Pretpostavlja se da agonisti TLR5, kao što je flagelin Salmonella typhimurium, mogu delovati kao agensi protiv raka [16]. Takođe je pretpostavljeno da Salmonella typhimurium koja je konstruisana da eksprimira flagelin Vibrio vulnifificus deluje kao sredstvo protiv raka [17]. Pored toga, sugerisano je da se flagelin peptidi iz Salmonella typhimurium, Vibrio cholera i Shigella disenteriae mogu koristiti za proizvodnju vakcina protiv infektivnih bolesti kao što su tifus, kolera i dizenterija kada se eksprimiraju crevnim bakterijama koje su genetski modifikovane [18]. Međutim, flagelin iz drugih vrsta bakterija ostaje slabo okarakterisan i takav drugi flagelin može imati različite efekte ili upotrebe.

[0005] Dramatične promene u sastavu mikrobiote su dokumentovane kod gastrointestinalnih poremec ́aja kao što je inflamatorna bolest creva (IBD). Na primer, nivoi bakterija Clostridium cluster XIVa su smanjeni kod pacijenata sa IBD, dok je broj E. coli povec ́an, što ukazuje na promenu u ravnoteži simbionta i patobiota u crevima [19-22]. Zanimljivo je da je ova mikrobna disbioza takođe povezana sa neravnotežama u populaciji T efektorskih c ́elija.

[0006] Prepoznajuc ́i potencijalni pozitivan efekat koji određeni sojevi bakterija mogu imati na creva životinja, predloženi su različiti sojevi za upotrebu u lečenju različitih bolesti (videti, na primer, [23-26]). Takođe, određeni sojevi, uključujuc ́i uglavnom sojeve Lactobacillus i Bifidobacterium, predloženi su za upotrebu u lečenju različitih inflamatornih i autoimunih bolesti koje nisu direktno povezane sa crevima (videti recenzije [27] i [28]). Međutim, veza između različitih bolesti i različitih bakterijskih sojeva, kao i precizni efekti pojedinih bakterijskih sojeva na creva i na sistemskom nivou i na bilo koju određenu vrstu bolesti, slabo su okarakterisani. Na primer, određene vrste Enterococcus dovedene su u vezu sa izazivanjem raka [29].

[0007] Predloženo je da određeni sojevi Streptococcus i Veillonella, i u manjoj meri, sojevi Enterococcus i Lactobaccillus imaju imunomodulatorno dejstvo, sa različitim efektima na različite citokine in vitro. Međutim, veza između različitih bolesti i različitih bakterijskih sojeva, kao i precizni efekti pojedinih bakterijskih sojeva na creva i na sistemskom nivou i na bilo koju određenu vrstu bolesti, slabo su okarakterisani.

[0008] JP2017/506212 otkriva jestive vakcine na bazi algi. WO2009/130618 otkriva vakcine polipeptida flagelina. WO2017/085520 otkriva kompozicije koje sadrže sojeve bakterija. Lorena Roman i dr. diskutuju o uticaju probiotika Enterococcus gallinarum L-1 na urođene imunološke parametre izvanrednih vrsta u morskoj akvakulturi. U struci postoji potreba za novim metodama lečenja bolesti. Takođe postoji potreba da se potencijalni efekti crevnih bakterija bliže okarakterišu kako bi se mogle razviti nove terapije.

SAŽETAK PRONALASKA

[0009] Pronalazak je izložen u priloženom skupu patentnih zahteva. Pronalazači su razvili nove terapije za lečenje i prevenciju bolesti. Konkretno, pronalazači su identifikovali da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus korisni u terapiji. Kao što je prikazano u primerima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu snažno aktivirati TLR5 odgovore na nivoima znatno višim od dobro poznatog TLR5 agonista Salmonella. typhimurium flagellin.

[0010] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u terapiji. U daljim poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina je iz soja deponovanog u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 42488. U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina je SEK ID BR:1. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz soja MRx0518 (soj deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42488) mogu jače aktivirati TLR5 odgovor u poređenju sa polipeptidima flagelina iz drugih sojeva Enterococcus gallinarum. Tako su polipeptidi flagelina iz soja NCIMB 42488 posebno efikasni za upotrebu u terapiji.

[0011] U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina je u monomernom obliku, što omoguc ́ava polipeptidu da se efikasnije vezuje za TLR5 receptor.

[0012] Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina iz soja NCIMB 42488 posebno efikasni u aktiviranju TLR5 odgovora. Polipeptidi flagelina iz soja NCIMB 42488 možda ne sadrže D3 domen i pronalazači su primetili da se većina varijacija sekvence između različitih polipeptida flagelina primec ́uje u D2-D3 regionu. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus ili vrste Enterococcus gallinarum koji ne sadrže D3 domen.

[0013] U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je deo bakterijskog flagelarnog sklopa. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje bakterijski flagelarni sklop koji sadrži polipeptid flagelina kao što je ovde opisano. U poželjnim izvođenjima, bakterijski flagelarni sklop sadrži proteine FliL i FlaG. Proteini FliL i FlaG prisutni su u bakterijskom flagelarnom sklopu MRx0518. Primeri pokazuju da je polipeptid flagelina iz MRx0518 posebno efikasan u aktiviranju TLR5 odgovora.

[0014] Pronalazak obezbeđuje fragment polipeptida flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji, pri čemu fragment sadrži aminokiseline 87-96, 165-272 i 290-295 iz SEK ID BR: 1.

[0015] Pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid koji sadrži flagelin polipeptid, kao što je ovde opisano, za upotrebu u terapiji.

[0016] Pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži fragment polipeptida flagelina iz roda Enterococcus, pri č emu fragment a) sadrži aminokiseline 87-96, 165-272 i 290-295 iz SEK ID BR: 1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača; ili b) sadrži aminokiseline 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 iz SEK ID BR: 1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača.

[0017] Pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, polinukleotidna sekvenca kodira polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u terapiji. U poželjnim izvođenjima, polinukleotidna sekvenca kodira polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u terapiji.

[0018] U drugim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje c ́eliju domac ́ina koja eksprimira rekombinantni polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji. U drugim izvođenjima, pronalazak takođe obezbeđuje c ́eliju domac ́ina koja sadrži rekombinantnu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji. U drugim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje vektor ili plazmid koji sadrži polinukleotidnu sekvencu prema pronalasku.

[0019] Pronalazak obezbeđuje kompozicije za upotrebu u terapiji pri čemu kompozicija sadrži polipeptide flagelina kao što je ovde opisano. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano, za upotrebu u terapiji. Pronalazak takođe obezbeđuje c ́eliju domac ́ina koja eksprimira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji. Pored toga, pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije za upotrebu u terapiji gde kompozicija sadrži c ́eliju domac ́ina, pri čemu c ́elija domac ́ina sadrži polinukleotid prema pronalasku.

[0020] Poznato je da aktivacija TLR5 flagelinom S. typhimurium potiskuje proliferaciju c ́elija i rast tumora [48]. Kompozicije koje sadrže sojeve Enterococcus gallinarum su efikasne u lečenju i prevenciji raka [50]. Rezultati pronalazača su iznenađujuc ́e pokazali da su polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum u stanju da stimulišu jak TLR5 odgovor, što može doprineti antikancerogenoj aktivnosti sojeva Enterococcus. Tako su pronalazači pokazali da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum korisni u terapiji, a posebno efikasni u lečenju i prevenciji raka.

[0021] U poželjnim izvođenjima, kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus su za upotrebu u lečenju imunološkogenih tumora i/ili čvrstih tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus su za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka pluća, raka dojke, raka jetre ili raka debelog creva. Kompozicije koje sadrže polipeptide flagelina iz roda Enterococcus mogu biti posebno efikasne za smanjenje veličine tumora ili sprečavanje rasta tumora u lečenju raka.

[0022] U poželjnim izvođenjima, kompozicija za upotrebu prema pronalasku se primenjuje injekcijom, poželjno subkutano ili alternativno intravenozno, ili intraperitonealno.

[0023] U određenim izvođenjima, na primer kada kompozicija sadrži c ́eliju domac ́ina prema pronalasku, kompozicija za upotrebu prema pronalasku je za oralnu primenu. U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu prema pronalasku sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača.

[0024] Pronalazači su razvili nove kompozicije koje sadrže polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, poželjno iz vrste Enterococcus gallinarum, koji se može koristiti u stimulaciji imunološkog sistema i lečenju i prevenciji bolesti. Pronalazači su identifikovali da takve kompozicije mogu snažno da aktiviraju imuni sistem i mogu da leče rak, što ukazuje da mogu da leče i druge bolesti gde aktivacija imunološkog sistema može biti korisna.

[0025] Pronalazak stoga obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema kod subjekta.

[0026] U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u lečenju, prevenciji ili odlaganju imunosenescencije.

[0027] U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu kao adjuvans za vakcinu.

[0028] U daljim aspektima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u poboljšanju c ́elijske terapije, kao što je CAR-T.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0029]

Slika 1: Struktura flagelina i poprečni presek i pogled odozgo flagelarnog filamenta. Flagelarni filament se sastoji od jednog proteina, flagelina. Region prepoznavanja TLR5 je u D1 domenu i nije dostupan kada je flagelin polimerizovan u flagelarnom filamentu. Slika je iz reference [30].

Slika 2: Poravnanje proteinske sekvence 24 polipeptida flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum i modelnog organizma S. typhimurium. D0, D1 i D2 domeni i predviđena mesta vezivanja za TLR5 za polipeptid flagelina iz soja MRx0518 su istaknuti.

Slika 3: Poravnanje proteinske sekvence polipeptida flagelina iz soja MRx0518 sa 23 polipeptida flagelina iz vrste E. gallinarum. D0, D1 i D2 domeni i predviđena mesta vezivanja za TLR5 za polipeptid flagelina iz soja MRx0518 su istaknuti.

Slika 4: KEGG dijagram putanje flagelarnog sklopa. Geni označeni sivom bojom prisutni su u vrsti.

Slika 5: Poređenje predviđene strukture proteina MRx0518 flagelina (FliCMRx0518) sa poznatom strukturom proteina flagelina S. typhimurium. Struktura proteina flagelina S. typhimurium je iz reference [30].

Slika 6: MRx0518 aktivacija TLR5 reporterskih c ́elija.

Slika 7: Specifična aktivacija TLR5 reporterskih c ́elija.

Slika 8: TLR5 odgovor CFS od MRx0518 i DSM100110 nakon tretmana tripsinom.

Slika 9: a) Strategija kloniranja za proizvodnju rekombinantnih proteina flagelina u E.coli; b) Procena kvaliteta prečišc ́enih rekombinantnih proteina flagelina, FlaAMRx0518 i FlaADSM100110 na SDS-PAGE gelu.

Slika 10: Poređenje TLR5 aktivacije sa FlaAMRx0518, FlaADSM100110 i CFS sa MRx0518 i DSM100110.

Slika 11: Fenotipska karakterizacija MRx0518 flaA-mutanta.

Slika 12: Aktivacija TLR5 sa MRx0518 flaA-mutantom CFS

Slika 13: Strategija mutacije flaA.

Slika 14: Elektronska mikroskopija MRx0518.

Slika 15: Aktivacija mišjeg TLR5 rekombinantnim proteinima flagelina iz MRx0518 i DSM 100110. Podaci su reprezentativni za tri nezavisne replike.

Slika 16: Poravnavanje sekvenci proteina flagelina iz MRx0518 i DSM 100110 izvedeno korišc ́enjem CLUTAL OMEGA v2.1 softvera za višestruko poravnanje sekvenci.

Slika 17: Aktivacija humanog TLR5 pokretnim sojevima E. gallinarum i E. casseliflavus. Podaci predstavljaju prosek i standardnu devijaciju 3 biološke replike. Značajnost je procenjena jednosmernim ANOVA testom - "a" označava p < 0,0001.

Slika 18: Aktivacija NF-kB pomoc ́u MRx0518.

Slika 19: Indukcija diferencijacije T-c ́elija u populaciji (A) T-pomoc ́nih c ́elija i (B) citotoksičnih T limfocita (CTL) koristec ́i supernatant iz MRx518 i RPMI medijalno kao kontrolu, bez dodavanja citokina (bez cito).

Slika 20: Alternativna strategija flaA mutacije.

OTKRIVANJE PRONALASKA

Flagellin

[0030] Flagelin, glavna komponenta bakterijskih flagela, stimuliše odbranu domac ́ina u različitim organizmima, uključujuc ́i sisare, insekte i biljke. Struktura i sastav bakterijskog flagelina je sveobuhvatno proučavan u modelnim organizmima kao što su S. typhimurium i E. coli. Međutim, postoje veoma ograničeni dostupni podaci koji opisuju flagelin iz roda Enterococcus i posebno vrste Enterococcus gallinarum.

[0031] Flagelin može postojati ili kao monomerni protein ili može biti polimerizovan da bi se formirao flagelum filament. Bakterijski flagelum filamenti u Salmonelli se sastoje od približno 20.000 proteinskih jedinica flagelina. Flagelum filamenti čine deo potpuno sastavljenog bakterijskog flageluma.

[0032] Proteini flagelina generalno sadrže 3-4 domena (D0, D1, D2 i D3), pri čemu se D0 i D1 domeni sastoje od preklopa N- i C-terminusa [31]. Tokom sklapanja filamenta flageluma, domeni D0 i D1 su zaklonjeni unutar filamenta flageluma sa D2 i/ili D3 domenima okrenutim ka spolja (Slika 1).

[0033] Pokazalo se da su motivi aminokiselina unutar očuvanog domena D1 potrebni za prepoznavanje i interakciju TLR5 [32-33]. Takođe se pokazalo da domen D0 utiče na TLR5 signalizaciju [34]. Mesto za prepoznavanje TLR5 generalno nije dostupno u flagelarnom filamentu. Flagelin deluje efikasnije sa TLR5 u njegovom monomernom obliku, pošto mesta vezivanja TLR5 nisu dostupna kada su sastavljena u filament [30]. Centralni region proteina flagelina pokazuje varijabilnost sekvence i nije detaljno proučavan, ali se smatra antigenskim i imunološkogenim regionom proteina.

[0034] Domeni D0 i D1 su visoko konzervirani, dok su D2 i D3 domeni varijabilniji [35]. Slika 2 prikazuje poravnanje sekvence proteina flagelina iz roda Enterococcus sa opširno proučavanim proteinom flagela iz S. typhimurium. Vec ́ina varijacija u sekvenci između proteina flagelina iz S. typhimurium i proteina flagelina iz roda Enterococcus leži unutar centralnog regiona (D2-D3 domen). Vec ́ina varijacija sekvenci između različitih sojeva Enterococcus gallinarum je takođe primec ́ena u ovom regionu, na primer između proteina flagelina iz sojeva MRx0518 i DSM100110 (Slika 3).

[0035] Flagelum filament je komponenta bakterijskog flageluma. Geni za koje se zna da su uključeni u bakterijski flagelarni sklop sumirani su na slici 4. Oni osenčeni sivom bojom prisutni su u Enterococcus gallinarum. Proteini flagelina su kodirani pomoc ́u FliC, koji se ovde takođe naizmenično naziva FlaA.

[0036] Pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u terapiji. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u terapiji. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu aktivirati jak TLR5 odgovor, što pokazuje da polipeptidi flagelina mogu biti korisni u terapiji, a posebno korisni u lečenju raka.

[0037] Pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu da indukuju jake TLR5 odgovore, što je korisno u lečenju i prevenciji raka. Konkretno, primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum i posebno soja MRx0518 proizvode veoma visok TLR5 odgovor.

[0038] U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum ili vrste Enterococcus casseliflavus, za upotrebu u terapiji, posebno za lečenje ili prevenciju raka. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je iz vrste Enterococcus casseliflavus. U najpoželjnijim izvođenjima, polipeptid flagelina je iz vrste Enterococcus gallinarum.

[0039] U primerima su testirani polipeptidi flagelina iz soja MRx0518. MRx0518 je soj bakterije Enterococcus gallinarum deponovan pod pristupnim brojem NCIMB 42488. Soj MRx0518 je deponovan kod međunarodnog depozitarnog autoriteta NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9IA, Scotland PLibnovation Research Ltd.) , Aberdeen, AB252ZS, Škotska) 16. novembra 2015. kao „Enterococcus sp“ i dodeljen mu je pristupni broj NCIMB 42488.

[0040] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina sa najmanje 75% identičnosti sekvence sa polipeptidom flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u terapiji, a posebno u lečenju ili prevenciji raka. Primeri pokazuju da su takvi flagelin polipeptidi posebno efikasni. Konkretno, polipeptid flagelina koji ima sekvencu sa najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:1. Poželjno, polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku sadrži ili se sastoji od SEK ID BR:1. U drugim izvođenjima, polipeptid flagelina ima sekvencu sa najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnost sekvence sa SEK ID BR:2. Polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku može da sadrži ili se sastoji od SEK ID BR:2. Primeri takođe pokazuju da su takvi polipeptidi korisni.

[0041] U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR:3-42. U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina ima sekvencu sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR:3-16. U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina je iz vrste Enterococcus gallinarum.

[0042] U poželjnim izvođenjima, flagelin za upotrebu u pronalasku vezuje TLR5, na primer sa KD vrednošću od<najmanje 10-2>, najmanje 10<-3>, najmanje 10<-4>, najmanje 10<-5>, najmanje 10<-6>, najmanje 10<-7>, najmanje 10<-8>, najmanje 10<-9>, najmanje 10<-10>, ili najmanje 10<-11>. Vezivanje za TLR5 se može meriti bilo kojom odgovarajuc ́om metodom poznatom u tehnici, uključujuc ́i Spektroskopiju elektrohemijske impedanse (EIS), skenirajuc ́u elektrohemijsku mikroskopiju (SECM) [36] ili nativnu PAGE i gel-filtracionu hromatografsku analizu koristec ́i rekombinantni TLR5 protein [37] .

[0043] Polipeptidi flagelina za upotrebu u pronalasku mogu da sadrže četiri domena, D0, D1, D2 i D3. U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina ne sadrži D3 domen. U određenim izvođenjima polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku se sastoji od tri domena, D0, D1, D2. Lokacija D0, D1 i D2 domena u polipeptidu flagelina E. gallinarum prikazana je na slici 3. Predviđeni oblik polipeptida flagelina iz soja MRx0518 (FliCMRx0518) je prikazan na slici 5. Predviđena struktura FliCMRx0518je generisana korišc ́enjem alata Phire2 koji predviđa strukturu proteina na osnovu homologije sa javno dostupnim strukturama [38] i generisan je grafik sa UCSF Chimera paketom [39]. Predviđeni nedostatak D3 domena dovodi do promene konformacije u strukturi proteina u poređenju sa polipeptidom flagelina iz S. typhimurium SL1344 (GenBank pristupni broj CBV17983). Predviđeni nedostatak D3 domena može dovesti do toga da mesto za prepoznavanje TLR5 bude više izloženo, što dovodi do povec ́anja sposobnosti polipeptida flagelina da aktivira TLR5 odgovor. Predviđeni nedostatak D3 domena takođe može uticati na sposobnost polipeptida flagelina da se polimerizuje u filament flagela. Polipeptid flagelina efikasnije aktivira TLR5 odgovore u monomernom obliku, stoga je sprečavanje ili smanjenje polimerizacije polipeptida flagelina od koristi.

[0044] Polipeptidi flagelina za upotrebu u pronalasku mogu da sadrže D1 domen, koji može biti potreban za prepoznavanje i interakciju TLR5. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina sa D1 domenom ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa ostacima 43-164 i 273-317 u SEK ID BR: 1. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina ima TLR5 mesto za prepoznavanje u D1 domenu. Mesto za prepoznavanje TLR u polipeptidima flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum nalazi se na pozicijama 87-96 i 290-295 u SEK ID BR:1. U poželjnim izvođenjima, TLR5 mesto za prepoznavanje polipeptida flagelina ima najmanje 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sa ostacima 87-96 i 290-295 u SEK ID BR:1. U daljim poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina obuhvata TLR5 mesto za prepoznavanje ostataka 87-96 i 290-295 u SEK ID BR:1.

[0045] Polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku može takođe da sadrži D0 domen, koji može uticati na TLR5 signalizaciju. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina sa D0 domenom ima najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sa ostacima 2-32 i 234-358 u SEK ID BR:1.

[0046] Polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku može takođe da sadrži D2 domen. Većina varijacija sekvence između polipeptida flagele iz S. typhimurium i roda Enterococcus leži unutar centralnog regiona (D2-D3 domen). Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum u stanju da proizvedu jači TLR5 odgovor pri nižoj dozi u poređenju sa polipeptidom flagelina iz S. typhimurium. Varijacija sekvence u domenu D2 ili D3 može doprineti povec ́anju sposobnosti polipeptida flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum da aktiviraju TLR5 odgovor. Polipeptid flagelina takođe sadrži D0 domen, koji može uticati na TLR5 signalizaciju. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina sa na D2 domenu ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sa ostacima 165 -272 u SEK ID BR:1.

[0047] Polipeptid flagelina može postojati kao monomer ili u polimerizovanom obliku kao filament flageluma. Ovaj filament je deo bakterijskog flageluma. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je raspoređen u filamentu flagela. Pronalazak se takođe odnosi na polipeptide flagelina za upotrebu u terapiji koji nisu raspoređeni u filamentu flagela. U poželjnim izvođenjima, polipeptid flagelina je u svom monomernom obliku. Monomerni oblik polipeptida flagelina je povoljan jer može jače da interaguje sa TLR5. U izvođenjima, flagelin nije glikoziliran, da bi se pomoglo njegovom oslobađanju i dezagregaciji u monomerni oblik.

[0048] U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je deo bakterijskog flageluma. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je deo bakterijskog flageluma koji sadrži jedan ili više proteina odabranih od FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ and FliS. U poželjnim izvođenjima, bakterijski flagelarni sklop sadrži FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliQ, FliR, FliL, FliJ and FliS. U određenim izvođenjima, bakterijski flagelarni sklop sadrži proteine FliL i FlaG. FliL je protein povezan sa bazalnim telom flagela, koji kontroliše smer rotacije flagela tokom hemotaksije, a FlaG reguliše sklapanje flagelina zajedno sa FlaF. FliL i FlaG proteini su prisutni u MRX0518. Primeri pokazuju da polipeptid flagelina iz MRX0518 može aktivirati jači TLR5 odgovor u poređenju sa polipeptidom flagelina iz druge vrste Enterococcus gallinarum.

[0049] Polipeptidi flagelina mogu biti rekombinantno eksprimirani, ili mogu biti izolovani iz ćelija Enterococcus. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina nije vezan za c ́eliju enterokoka. U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina je u kompoziciji koja je u suštini bez bakterijskih c ́elija.

[0050] U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina su termički obrađeni i opciono denaturisani. Primeri pokazuju da su takvi polipeptidi flagelina i dalje snažno efikasni. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina su toplotno stabilni do 80°C, na primer mogu da održavaju aktivnost nakon zagrevanja na 80°C, na primer, 40 minuta. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina su podvrgnuti tripsinskoj digestiji. Drugim rečima, u određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina sadrže mesta cepanja tripsina. Predviđa se da flagelin MRxS518 sadrži 36 mesta cepanja tripsina.

[0051] Polipeptid flagelina za upotrebu prema pronalasku ne mora da funkcioniše kao normalni polipeptid flagelina da bi se smatrao polipeptidom flagelina. Polipeptid flagelina za upotrebu u skladu sa pronalaskom može da sadrži mutacije ili delecije koje uklanjaju određene aktivnosti. Generalno, polipeptid flagelina za upotrebu u pronalasku je TLR5 agonist. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina nisu u stanju da se polimerizuju u filament flageluma. U drugim izvođenjima, polipeptidi flagelina nisu u stanju da formiraju deo bakterijskog flagelarnog sklopa.

[0052] U poželjnim izvođenjima, polipeptidi imaju identičnu sekvencu kao SEK ID BR:1, kao što je gore navedeno, ili sadrže ili se sastoje od SEK ID BR:1.

[0053] Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u terapiji. U poželjnim izvođenjima, kompozicija sadrži polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u terapiji.

[0054] U alternativnim aspektima svakog aspekta pronalaska, polipeptid flagelina je vrste Enterococcus caselliflavus. Enterococcus caselliflavus je veoma sličan Enterococcus gallinarum i takođe je flageliran.

Fragmenti

[0055] Očekuje se da c ́e polipeptidi flagelina sa identičnom sekvencom sa onima testiranim u primerima takođe biti korisni u terapiji i obuhvac ́eni su pronalaskom, kao što je navedeno u prethodnom odeljku.

[0056] Pronalazak takođe obezbeđuje fragmente polipeptida flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji, pri čemu fragment sadrži aminokiseline 87-96, 165-272 i 290-295 iz SEK ID BR:1.

[0057] Poželjno, bilo koji fragment ima dužinu od najmanje 200, 250, 300 ili 350 amino kiselina.

[0058] Poželjni fragmenti obuhvataju jednu ili više od sledećih aminokiselina iz SEK ID BR:1: 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295.

[0059] Fragment za upotrebu prema pronalasku c ́e obično (i) imati najmanje w% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 1 i/ili (ii) c ́e se sastojati od fragmenta od najmanje x susednih amino kiselina iz SEK ID BR: 1. Vrednost w je najmanje 85 (na primer 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili više). Vrednost x je najamanje 7 (na primer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) a fragment c ́e obično uključivati epitop iz SEK ID BR: 1. Fragment c ́e obično moc ́i da se veže za TLR5.

[0060] Drugi fragmenti za upotrebu prema pronalasku c ́e obično (i) imati najmanje w% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 2 i/ili (ii) c ́e se sastojati od fragmenta od najmanje x susednih amino kiselina iz SEK ID BR: 2. Vrednost w je najmanje 85 (na primer 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili više). Vrednost x je najmanje 7 (na primer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) a fragment c ́e obično uključivati epitop iz SEK ID BR: 2. Fragment c ́e obično moc ́i da se veže za TLR5.

[0061] Drugi fragmenti za upotrebu prema pronalasku c ́e obično (i) imati najmanje w% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR: 3-42 i/ili (ii) c ́e se sastojati od fragmenta od najmanje x susednih amino kiselina iz jedne od SEK ID BR: 3-42. Vrednost w je najmanje 85 (na primer 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili više). Vrednost x je najmanje 7 (na primer 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 250, 300) a fragment c ́e obično uključivati epitop iz jednog od SEK ID BR: 3-42. Fragment c ́e obično moc ́i da se veže za TLR5.

Fuzije

[0062] Takođe se očekuje da c ́e fuzije koje sadrže polipeptide flagelina kako su ovde opisane biti korisne u terapiji. Stoga, pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid koji sadrži polipeptid flagelina kao što je gore opisano za upotrebu u terapiji, a posebno za upotrebu u lečenju raka. Poželjni fuzioni partneri uključuju ciljane delove i delove namenjene produženju poluživota. U određenim izvođenjima, fuzioni polipeptid sadrži polipeptid flagelina kao što je gore opisano i polipeptid izabran iz grupe koju čine Fc region, transferin, albumin, rekombinantni PEG, polimer homoamino kiseline, polimer prolin-alanin-serina, peptid sličan elastinu, ili karboksi-terminalni peptid [CTP; horionskog gonadotropina (CG) b-lanca].

[0063] Polipeptidi flagelina za upotrebu u pronalasku takođe mogu biti fuzionisani ili konjugovani sa ne-polipeptidnim delovima da bi se poboljšale njihove karakteristike i terapeutska upotreba. Na primer, u određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina kao što je gore opisano su kovalentno povezani sa PEG ili hijaluronskom kiselinom.

[0064] Polipeptidi flagelina za upotrebu u pronalasku mogu biti fuzionisani ili konjugovani sa antigenom, na primer, za upotrebu kao vakcina. Predstavljanje antigena u neposrednoj blizini flagelina može maksimizirati njihove imunostimulativne aktivnosti i dodatno poboljšati zaštitni imuni odgovor koji se stvara protiv antigena. Pored toga, proizvodnja i isporuka terapeutika koji sadrže antigen i flagelin kao što je ovde opisano može biti efikasnije i delotvornije kada su fuzionisani ili konjugovani. Prema tome, u određenim izvođenjima, fuzioni polipeptid koji sadrži polipeptid flagelina kao što je gore opisano i antigen. U daljim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina kao što je gore opisano konjugovan sa antigenom.

[0065] Poželjni antigeni za uključivanje u fuzije i konjugate za upotrebu u pronalasku su antigeni patogena i tumorski antigeni. Antigen c ́e izazvati imuni odgovor specifičan za antigen koji c ́e biti efikasan u zaštiti od infekcije patogenom ili napada na tumor. Antigeni mogu biti, na primer, peptidi ili polisaharidi. Primeri antigena za upotrebu sa fuzijama i konjugatima i za upotrebu u pronalasku uključuju: virusne antigene, kao što su virusni površinski proteini; bakterijski antigeni, kao što su proteinski i/ili saharidni antigeni; gljivični antigeni; antigeni parazita; i tumorskih antigena. Dalji antigeni za upotrebu sa fuzijama i konjugatima za upotrebu u pronalasku uključuju antigene glikoproteina i lipoglikana, antigene arheje, antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sijalil-Tn (STn), humanu reverznu transkriptazu telomeraze (hTERT), gen Vilms tumor (VT1), CA-125, antigen specifični za prostate (PSA), antigeni Epstein-Barr virusa, neoantigeni, onkoproteini, amiloid-beta, Tau, PCSK9 i supstance koje izazivaju zavisnost, na primer nikotin, alkohol ili opijati.

[0066] Fuzioni polipeptidi za upotrebu u pronalasku mogu uključiti linker sekvencu između flagelina i antigena. Poželjne linker sekvence uključuju peptide koji sadrže (Gli4)n motiv(e), (Gli4Ser)n motiv(e) i Ser(Gli4Ser)n motiv(e). Sekvence linkera mogu biti dugačke 1-50, 1-30, 1-20, 5-20, 5-10 ili 10-20 aminokiselina. Linker sekvence c ́e omoguc ́iti flagelinu i fuzionom partneru, na primer antigenu, da obavljaju svoje uloge i da im, na primer, pristupi imuni sistem. Prema tome, u određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid koji sadrži polipeptid flagelina kao što je gore opisano, sekvencu linkera i antigen, kao š to je antigen izveden iz patogena, ili tumorski antigen za upotrebu u terapiji.

[0067] Polipeptidi flagelina za upotrebu u pronalasku mogu biti posebno korisni kada su konjugovani sa nepolipeptidnim delovima kao što su polisaharidni antigeni. Pogodne metode konjugacije uključuju korišc ́enje karbodiimida, hidrazida, aktivnih estara, norborana, p-nitrobenzoeve kiseline, N-hidroksisukcinimida, S-NHS, EDC, CDAP ili TSTU.

Polinukleotidi

[0068] Pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u terapiji. U određenim izvođenjima, polinukleotidna sekvenca kodira polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u terapiji. U poželjnim izvođenjima, polinukleotidna sekvenca kodira polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u terapiji. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu aktivirati jak TLR5 odgovor, tako da polinukleotidi koji kodiraju takve polipeptide flagelina mogu biti korisni u terapiji, a posebno korisni u lečenju raka.

[0069] Pronalazak takođe obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. U poželjnim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz soja MRx0518 za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka. Primeri pokazuju da je polipeptid flagelina iz roda Enterococcus u stanju da izazove jake TLR5 odgovore, što je korisno u lečenju i prevenciji raka. Konkretno, primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum i posebno soja MRx0518 proizvode veoma visok TLR5 odgovor.

[0070] U poželjnim izvođenjima, polinukleotid pronalaska za upotrebu u terapiji kodira SEK ID BR:1, ili polipeptidnu sekvencu sa 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:1. U daljim poželjnim izvođenjima, polinukleotid može da kodira flagelin sa određenim D0, D1 i/ili D2 sekvencama navedenim gore, za koje je u primerima pokazano da su korisne.

[0071] U drugim izvođenjima, polinukleotid pronalaska za upotrebu u terapiji kodira SEK ID BR:2, ili polipeptidnu sekvencu sa 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 %, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:2. U daljim poželjnim izvođenjima, polinukleotid može da kodira flagelin sa određenim D0, D1 i/ili D2 sekvencama navedenim gore, za koje je u primerima pokazano da su korisne.

[0072] U drugim izvođenjima, polinukleotid pronalaska za upotrebu u terapiji kodira jedan od SEK ID BR: 3-42, ili polipeptidnu sekvencu sa 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR: 3-42. U daljim poželjnim izvođenjima, polinukleotid može da kodira flagelin sa određenim D0, D1 i/ili D2 sekvencama navedenim gore, za koje je u primerima pokazano da su korisne.

[0073] Nukleinske kiseline za upotrebu u pronalasku mogu imati različite oblike (npr. jednolančani, dvolančani, vektori itd.). Nukleinske kiseline za upotrebu u pronalasku mogu biti kružne ili razgranate, ali će generalno biti linearne.

[0074] Termin "polinukleotid" ili "nukleinska kiselina" uključuje i jednolančane i dvolančane nukleotidne polimere. Nukleotidi koji sadrže nukleinsku kiselinu mogu biti ribonukleotidi ili deoksiribonukleotidi ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Navedene modifikacije uključuju modifikacije baze kao što su derivati bromuridina i inozina, modifikacije riboze kao što je 2’,3’-dideoksiriboza i modifikacije internukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat i fosforoamidat.

[0075] Nukleinske kiseline se mogu pripremiti na mnogo načina, npr. hemijskom sintezom (npr. fosforamiditna sinteza DNK) u celini ili delimično, digestijom dužih nukleinskih kiselina korišc ́enjem nukleaza (npr. restrikcijskih enzima), spajanjem krac ́ih nukleinskih kiselina ili nukleotida (npr. korišc ́enjem ligaza ili polimeraza), iz genomskih ili cDNK biblioteka, itd.

[0076] Nukleinske kiseline za upotrebu u pronalasku sadrže sekvencu koja kodira najmanje jedan polipeptid flagelina kao što je ovde opisano. Tipično, nukleinske kiseline c ́e biti u rekombinantnom obliku, tj. u obliku koji se ne javlja u prirodi. Na primer, nukleinska kiselina može da sadrži jednu ili više heterolognih sekvenci nukleinske kiseline (npr. sekvencu koja kodira drugi antigen i/ili kontrolnu sekvencu kao što je promoter ili unutrašnje mesto ulaska u ribozom) pored sekvence koja kodira najmanje polipeptid flagelina. U takvim izvođenjima, nukleinska kiselina kodira polipetid flagelina kao što je gore diskutovano i antigen, kao što je antigen patogena ili antigen tumora. Opciono, nukleinska kiselina takođe kodira sekvencu linkera.

Ćelije domaćina

[0077] Pronalazak takođe obezbeđuje c ́elije domac ́ina koje eksprimiraju polipeptid flagelina kao što je ovde opisano, za upotrebu u terapiji. Primeri pokazuju da sojevi Enterococcus-a kao što je MRx0518, koji eksprimiraju Enterococcus flagelin, mogu da aktiviraju TLR5 i stoga mogu imati moc ́ne terapeutske efekte. C ́elije domac ́ini koje eksprimiraju polipeptide flagelina mogu biti korisne za proizvodnju polipeptida flagelina za uključivanje u terapeutsku kompoziciju, ili takve c ́elije domac ́ini mogu biti korisne za davanje pacijentu, pri čemu eksprimiraju polipeptid flagelina da bi ispoljile direktan terapeutski efekat.

[0078] U poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in za upotrebu u pronalasku eksprimira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano rekombinantno. Drugim rečima, c ́elija domac ́in sadrži heterolognu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano. U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in nije iz roda Enterococcus, nije iz vrste Enterococcus gallinarum, ili nije iz soja MRx0518. U poželjnim izvođenjima, ćelija domac ́in za ekspresiju rekombinantnih Enterococcus flagelin polipeptida je E. coli.

[0079] U alternativnim izvođenjima, gde je, na primer, c ́elija domac ́in za primenu pacijentu, c ́elija domac ́in je probiotički soj, kao što je soj Lactobacillus ili Bifidobacterium.

[0080] U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus. U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum. U poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz soja MRx0518. U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži vektor, pri čemu vektor sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus.

[0081] U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira jedan ili više, poželjno sve, gene za sklapanje bakterijskih flagelara FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliK, FliR, FliL, FliJ i FliS. U određenim izvođenjima, c ́elija domac ́in eksprimira jedan ili više, poželjno sve, polipeptide FliD, FlgL, FlgK, FlgE, FliK, FlgD, FlgG, MotB, MotA, FliF, FliG, FliM, FliN, FlhA FlhB, FliH, FliI, FliO, FliP, FliK, FliR, FliL, FliJ i FliS. U poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira bakterijski sklop flagelara koji se sastoji od FliL i FlaG. U poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in eksprimira polipeptide FliL i FlaG.

[0082] Poželjno, bilo koja c ́elija koja eksprimira polipeptid flagelina kao što je ovde opisan, a posebno bilo koja c ́elija za davanje pacijentu, je efikasna u oslobađanju polipeptida flagelina. Primeri pokazuju da takve c ́elije indukuju jači TLR5 odgovor. Flagelin se može "aktivno" izbaciti tokom sklapanja flageluma, kroz curenje njegovih monomernih jedinica. Međutim, u vec ́ini slučajeva monomerni flagelin nastaje pasivnom degradacijom odvojenih flagela. Odvajanje flagela može se desiti nakon mehaničkog naprezanja ili kao dobrovoljni proces. Kod nekih bakterijskih vrsta flagelin je glikoziliran da bi se poboljšala stabilnost filamenta i sprečilo nekontrolisano osipanje, na primer kod Shewanella oneidensis [40]. U poželjnim izvođenjima, flagelin eksprimiran u ćeliji domac ́inu nije glikoziliran, da bi se pomoglo njegovom oslobađanju i dezagregaciji u monomerni oblik.

[0083] U određenim izvođenjima, polipeptid flagelina i/ili bakterijski flagelarni sklop, kao što je ovde opisan, lako se odvaja od c ́elije domac ́ina.

[0084] Lakoc ́a izbacivanja flagelinskih polipeptida i/ili skupova flagelina može se odrediti odvojenim uzgojem i) c ́elija koje eksprimiraju flagelin kako je ovde opisano i ii) jedne ili više c ́elija (npr. 1, 2, 3, 4, 5, 10 ili više od 10) ekspresije referentnih flagelina dobijenih iz istih ili različitih sojeva koji pripadaju istoj bakterijskoj vrsti kao flagelin kao što je ovde opisano a) u stacionarnoj fazi tokom 18 sati korišc ́enjem 1% inokuluma odgovarajuc ́ih c ́elija, zatim b) a late-log faza u kojoj se 3 sata uzgaja 10% inokuluma c ́elija iz stacionarne faze. 10 ml kultura c ́elija koje eksprimiraju flagelin kako je ovde opisano i c ́elija koje eksprimiraju referentne flageline mogu se zatim centrifugirati na 5000xg tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi da bi se uklonila bakterijski talog. Dobijeni supernatanti se zatim mogu filtrirati (0,22 um) pod sterilnim uslovima. U izvođenjima u kojima je polipeptid flagelina i/ili bakterijski flagelarni sklop, kako je ovde opisan, dobar eliminator, koncentracija proteina flagelina u supernatantu izvedenom iz c ́elija koje eksprimiraju flagelin kako je ovde opisano bic ́e vec ́a (npr. 1,5x ili više, 2x ili više, 3x ili više, 4x ili više, 5x ili više, 7x ili više ili 10x ili više) od koncentracije proteina flagelina u supernatantu/ima izvedenim iz ćelija koje eksprimiraju referentne flageline.

[0085] U poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in za upotrebu u pronalasku oslobađa polipeptide flagelina/ili sklopove flagelara u svoju okolinu sa zahtevom hemijskog ili fizičkog prekida. U poželjnim izvođenjima, kultivisanje c ́elije domac ́ina za upotrebu u pronalasku pod uslovima pogodnim za ekspresiju polipeptida flagelina rezultira oslobađanjem polipeptida flagelina iz c ́elije u njeno okruženje. Primeri pokazuju da c ́elije koje eksprimiraju polipeptide flagelina, kako je ovde opisano, indukuju jači TLR5 odgovor. U drugim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku su dobri odvajači bakterijskog flagelarnog sklopa. U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini su dobri odvajači bakterijskih filamenata flageluma i posebno dobri odvajači polipeptida flagelina. U određenim izvođenjima, bakterijski flagelarni sklop kako je ovde opisan aktivno oslobađa monomerni flagelin. U određenim izvođenjima, filament flageluma kao što je ovde opisano aktivno oslobađa monomerni flagelin. Monomerni flagelin je efikasniji u izazivanju TLR5 odgovora.

[0086] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje metodu za dobijanje polipeptida flagelina ili flagelarnog sklopa kao što je ovde opisano, koji obuhvata kultivisanje ćelije koja eksprimira polipeptid flagelina ili sklop flagelara kao što je ovde opisano i kultivisanje pomenutog polipeptida flagelina ili sklopa flagelara, bez izvođenja bilo kog koraka da ukloni odvojeni polipeptid flagelina ili sklop flagelara sa površine ćelije.

[0087] Proces izlučivanja flagela (ili flagelina) trenutno nije povezan sa ekspresijom gena specifične podskupine i verovatno c ́e biti pod velikim uticajem uslova okoline. Međutim, pokazalo se da su brojni geni uključeni u rigidnost i stabilnost flageluma. Na primer, kod salmonele (Salmonella), pokazalo se da mutanti fliF i fliL lakše odvajaju flagele kada se uzgajaju u viskoznoj sredini [41,42]. U oba slučaja, flagele su pukle u blizini distalnog štapa [43]. Prema tome, u poželjnim izvođenjima, c ́elija domac ́in ne eksprimira fliF i/ili fliL. U drugim izvođenjima, c ́elija domac ́ina eksprimira fliL.

[0088] U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku su termički obrađene. Primeri pokazuju da su c ́elije koje eksprimiraju polipeptide flagelina, kako je ovde opisano, i dalje prilično efikasne nakon toplotne obrade. U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku su toplotno stabilne do 80°C, na primer mogu da održavaju aktivnost nakon zagrevanja na 80°C, na primer, 40 minuta.

[0089] Pronalazak dalje pruža postupke za proizvodnju polipeptida flagelina kao što je ovde opisano kultivisanjem c ́elija domac ́ina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju polipeptida flagelina i obnavljanjem tako proizvedenih polipeptida flagelina.

[0090] U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku dodatno eksprimiraju jedan ili više antigena. Generalno, antigen c ́e biti eksprimiran rekombinantno i bic ́e heterologan za c ́eliju domac ́ina. Antigen može biti deo fuzionog polipeptida koji je eksprimiran sa polipeptidom flagelina kao što je ovde opisano, ili c ́elija domac ́in može odvojeno da eksprimira flagelin i antigen iz različitih otvorenih okvira čitanja. Stoga, pronalazak obezbeđuje c ́eliju domac ́ina koja eksprimira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano i heterologni antigen za upotrebu u terapiji. Primeri antigena za upotrebu u pronalasku uključuju: virusne antigene, kao što su virusni površinski proteini; bakterijski antigeni, kao što su proteinski i/ili saharidni antigeni; gljivični antigeni; antigeni parazita; i tumorski antigeni. Dalji antigeni za ekspresiju u c ́eliji domac ́inu sa flagelinom za upotrebu u pronalasku uključuju antigene glikoproteina i lipoglikana, antigene arheje, antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sijalil-Tn (STn), reverznu transkriptazu humane telomeraze (hTERT), gen Vilms tumor (WT1), CA-125, antigen specifični za prostatu (PSA), antigene virusa EpsteinBarr, neoantigene, onkoproteine, amiloid-beta, Tau, PCSK9 i supstance koje izazivaju zavisnost, na primer nikotin, alkohol ili opijati.

Vektori, plazmidi i druge nukleinske kiseline

[0091] Nukleinska kiselina za upotrebu u pronalasku može biti deo vektora, tj. deo konstrukcije nukleinske kiseline dizajnirane za transdukciju/transfekciju jednog ili više tipova c ́elija. Vektori mogu biti, na primer, "ekspresioni vektori" koji su dizajnirani za ekspresiju nukleotidne sekvence u c ́eliji domac ́inu, ili "virusni vektori" koji su dizajnirani da dovedu do proizvodnje rekombinantnog virusa ili virusu slične čestice.

[0092] Alternativno, ili kao dodatak, sekvenca ili hemijska struktura nukleinske kiseline može biti modifikovana u poređenju sa sekvencom koja se javlja u prirodi koja kodira polipeptid flagelina. Sekvenca molekula nukleinske kiseline može biti modifikovana, npr. da se poveća efikasnost ekspresije ili replikacije nukleinske kiseline, ili da se obezbedi dodatna stabilnost ili otpornost na degradaciju. Na primer, sekvenca molekula nukleinske kiseline može biti optimizovana kodonom za ekspresiju u poželjnom domac ́inu, kao što je c ́elija sisara (npr. ljudska). Takva modifikacija u pogledu upotrebe kodona može povec ́ati efikasnost translacije i period poluraspada nukleinske kiseline. Poli A rep (npr. od oko 30 adenozinskih ostataka ili više) može biti pričvršc ́en za 3’ kraj RNK da bi se produžio njen period poluraspada. 5' kraj RNK može biti zatvoren modifikovanim ribonukleotidom sa strukturom m7G (5') ppp (5') N (cap 0 struktura) ili njegovim derivatom, koji se može ugraditi tokom sinteze RNK ili može biti enzimski konstruisan nakon transkripcije RNK (npr. korišc ́enjem enzima za zatvaranje virusa vakcinije (VCE) koji se sastoji od mRNA trifosfataze, gvanilil-transferaze i gvanin-7-metiltransferaze, koja katalizuje izgradnju N7-monometilovanih cap 0 struktura). Struktura Cap 0 igra važnu ulogu u održavanju stabilnosti i translacione efikasnosti molekula RNK. 5' kapa molekula RNK može se dalje modifikovati pomoc ́u 2 '-O-metiltransferaze što rezultira stvaranjem strukture kapa 1 (m7Gppp [m2 '-O] N), što može dodatno povec ́ati efikasnost translacije.

[0093] Nukleinske kiseline mogu da sadrže jedan ili više nukleotidnih analoga ili modifikovanih nukleotida. Kako se ovde koristi, "analog nukleotida" ili "modifikovani nukleotid" se odnosi na nukleotid koji sadrži jednu ili više hemijskih modifikacija (npr. supstitucije) u ili na azotnoj bazi nukleozida (npr. citozin (C), timin (T) ili uracil (U)), adenin (A) ili gvanin (G)). Analog nukleotida može sadržati dalje hemijske modifikacije u ili na šec ́ernom delu nukleozida (npr.

riboza, deoksiriboza, modifikovana riboza, modifikovana deoksiriboza, šestočlani analog šec ́era ili analog šec ́era otvorenog lanca) ili fosfat. Priprema nukleotida i modifikovanih nukleotida i nukleozida je dobro poznata u struci, npr. iz US Patent Numbers 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642, 5700642, 5700642 i mnogih modifikovanih nukleozida i modifikovanih nukleotida koji su komercijalno dostupni.

[0094] Pronalazak dalje obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore sposobne da eksprimiraju polipeptid flagelina. Na primer, pronalazak obezbeđuje rekombinantne ekspresione vektore koji sadrže bilo koji od molekula nukleinske kiseline pomenutih gore.

[0095] Pronalazak dalje obezbeđuje c ́elije domac ́ina u koje je uveden bilo koji od vektora pomenutih gore. Pronalazak dalje pruža metode za proizvodnju polipeptida flagelina kao što je ovde opisano kultivisanjem ćelija domac ́ina pod uslovima koji dozvoljavaju proizvodnju polipeptida flagelina i obnavljanjem tako proizvedenih polipeptida flagelina.

[0096] Kompozicija, kako je ovde predstavljena, koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira polipeptide flagelina može biti terapeutik na bazi nukleinske kiseline.

[0097] Nukleinska kiselina može, na primer, biti RNK (tj. terapeutik zasnovan na RNK) ili DNK (tj. terapeutik zasnovan na DNK, kao što je terapeutik za plazmidnu DNK). U određenim izvođenjima, terapeutik na bazi nukleinske kiseline je terapeutik zasnovan na RNK. U određenim izvođenjima, terapeutik zasnovan na RNK sadrži molekul RNK koji se samoreplicira. Molekul RNK koji se samoreplicira može biti replikon RNK koji potiče od alfavirusa.

[0098] Molekuli RNK koji se samorepliciraju su dobro poznati u tehnici i mogu se proizvesti korišćenjem replikacionih elemenata izvedenih iz, na primer, alfavirusa, i zamenom strukturnih virusnih proteina nukleotidnom sekvencom koja kodira protein od interesa. Molekul RNK koji se samoreplicira je tipično molekul lanca koji se može direktno prevesti nakon isporuke u c ́eliju, a ovaj prevod obezbeđuje RNK-zavisnu RNK polimerazu koja zatim proizvodi i antisens i sensne transkripte iz isporučene RNK. Tako isporučena RNK dovodi do proizvodnje više ćerki RNK. Ove c ́erke RNK, kao i kolinearni subgenomski transkripti, mogu sami da se prevedu da obezbede in situ ekspresiju kodiranog antigena (tj. flagelin polipeptida), ili mogu biti transkribovani da obezbede dalje transkripte sa istim smislom kao isporučena RNK koja se prevodi da obezbedi in situ ekspresiju antigena. Ukupni rezultat ove sekvence transkripcija je ogromno povec ́anje broja uvedenih replikonskih RNK i tako kodirani antigen postaje glavni polipeptidni proizvod c ́elija.

[0099] Jedan pogodan sistem za postizanje samoreplikacije na ovaj način je korišćenje replikona zasnovanog na alfavirusu. Ovi replikoni su lančane RNK koje dovode do translacije replikaze (ili replikaze-transkriptaze) nakon isporuke u c ́eliju. Replikaza je prevedena kao poliprotein koji se automatski cepa da bi obezbedio replikacioni kompleks koji stvara kopije genomskih lanaca isporučene RNK sa lancem. Ovi transkripti - lanca mogu se sami transkribovati da bi se dobile dalje kopije lančane roditeljske RNK i takođe da bi se dao subgenomski transkript koji kodira antigen. Translacija subgenomskog transkripta tako dovodi do in situ ekspresije antigena od strane inficirane c ́elije. Odgovarajuc ́i replikoni alfavirusa mogu da koriste repliku iz virusa Sindbis, šumskog virusa Semliki, virusa istočnog konjskog encefalitisa, virusa venecuelanskog encefalitisa konja, itd. Mogu se koristiti mutantne ili virusne sekvence divljeg tipa, npr. atenuirani TC83 mutant VEEV-a je korišc ́en u replikonima.

[0100] U određenim izvođenjima, ovde opisan molekul RNK koji se samoreplicira kodira (i) RNK zavisnu RNK polimerazu koja može da transkribuje RNK iz molekula RNK koja se samoreplicira i (ii) polipeptid flagelina. Polimeraza može biti replikaza alfavirusa, npr. koji sadrže jedan ili više alfavirusnih proteina nsP1, nsP2, nsP3 i nsP4.

[0101] Terapeutik na bazi nukleinske kiseline može sadržati virusni ili nevirusni sistem isporuke. Sistem za isporuku (koji se ovde takođe naziva sredstvo za isporuku) može imati adjuvantne efekte koji povećavaju imunološkogenost kodiranog flagelin polipeptida. Na primer, molekul nukleinske kiseline može biti inkapsuliran u lipozomima, netoksičnim biorazgradivim polimernim mikročesticama ili virusnim replikonskim česticama (VRPs), ili u kompleksu sa česticama katjonske emulzije ulja u vodi. U nekim izvođenjima, terapeutik na bazi nukleinske kiseline sadrži sistem za isporuku katjonske nano-emulzije (CNE) ili sistem za isporuku lipidnih nanočestica (LNP). Alternativno, terapeutik na bazi nukleinske kiseline može da sadrži čestice virusnog replikona. U drugim izvođenjima, terapeutik na bazi nukleinske kiseline može da sadrži golu nukleinsku kiselinu, kao što je gola RNK (npr. mRNA), ali je poželjna isporuka preko LNP-a.

[0102] U određenim izvođenjima, terapeutik na bazi nukleinske kiseline obuhvata sistem za isporuku katjonske nanoemulzije (CNE). Sistemi za isporuku CNE i metode za njihovu pripremu su opisani u ovoj oblasti. U sistemu za isporuku CNE, molekul nukleinske kiseline (npr. RNK) koji kodira antigen je kompleksiran sa česticom katjonske emulzije ulje u vodi. Katjonske emulzije ulje u vodi mogu se koristiti za isporuku negativno naelektrisanih molekula, kao što je molekul RNK u c ́elije. Č estice emulzije sadrže uljano jezgro i katjonski lipid. Katjonski lipid može da stupi u interakciju sa negativno naelektrisanim molekulom i tako pričvrsti molekul za čestice emulzije. Dalji detalji o korisnim CNE mogu se nac ́i u ovoj oblasti.

[0103] Prema tome, u terapijskom leku na bazi nukleinske kiseline za upotrebu u pronalasku, molekul RNK koji kodira polipeptid flagelina može biti u kompleksu sa česticom katjonske emulzije ulja u vodi. Čestice tipično sadrže uljano jezgro (npr. biljno ulje ili skvalen) koje je u tečnoj fazi na 25°C, katjonski lipid (npr. fosfolipid) i, opciono, surfaktant (npr. sorbitan trioleat, polisorbat 80); može se uključiti i polietilen glikol. U nekim izvođenjima, CNE sadrži skvalen i katjonski lipid, kao što je 1,2-dioleoiloksi-3-(trimetilamonio)propan (DOTAP). U nekim poželjnim izvođenjima, sistem za isporuku je nevirusni sistem za isporuku, kao što je CNE, a terapeutik na bazi nukleinske kiseline sadrži RNK koja se samoreplicira (mRNA). Ovo može biti posebno efikasno u izazivanju humoralnih i c ́elijskih imunih odgovora. Prednosti takođe uključuju odsustvo ograničavajuc ́eg antivektorskog imunološkog odgovora i nedostatak rizika od genomske integracije.

[0104] LNP sistemi za isporuku i netoksične biorazgradive polimerne mikročestice, i metode za njihovu pripremu su opisani u ovoj oblasti. LNP su nevirionske čestice lipozoma u koje se može inkapsulirati molekul nukleinske kiseline (npr. RNK). Čestice mogu uključivati neku spoljašnju RNK (npr. na površini č estica), ali najmanje polovina RNK (i idealno cela) je inkapsulirana. Lipozomske čestice mogu, na primer, biti formirane od mešavine cviterjonskih,

1

katjonskih i anjonskih lipida koji mogu biti zasic ́eni ili nezasic ́eni, na primer; DSPC (cviterjonski, zasic ́eni), DlinDMA (katjonski, nezasic ́eni) i/ili DMG (anjonski, zasic ́eni). Poželjni LNP za upotrebu u pronalasku uključuju amfifilni lipid koji može da formira lipozome, opciono u kombinaciji sa najmanje jednim katjonskim lipidom (kao što su DOTAP, DSDMA, DODMA, DLinDMA, DLenDMA, itd.). Mešavina DSPC, DlinDMA, PEG-DMG i holesterola je posebno efikasna. Drugi korisni LNP-ovi su otkriveni u ovoj oblasti. U nekim izvođenjima, LNP su RV01 lipozomi.

NF-κB

[0105] TLR signalni putevi kulminiraju u aktivaciji transkripcionog faktora nuklearnog faktora-kappaB (NF-kB). NF-kB kontroliše ekspresiju niza inflamatornih citokinskih gena, uključujući TNF-a. Flagelin indukuje dimerizaciju TLR5, koji zatim regrutuje MyD88 i aktivira protein kinaze, uključujuc ́i IRAK1, IRAK2, IRAK4 i IRAK-M. Aktivacija ovih kinaza dovodi do nuklearne lokalizacije NF-kB, koji je proinflamatorni citokin [44].

[0106] Kao što je pokazano u primerima (Slika 18), kompozicije za upotrebu u pronalasku dovode do povec ́anja ekspresije NF-kB. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku povećava ekspresiju proinflamatornog citokina NF-kB, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u stimulisanju imunološkog odgovora. Pored toga, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija i/ili bolesti koje se leče povećanim imunološkim odgovorom. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao imuni stimulans povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti NF-kB. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija povećanjem nivoa i/ili aktivnosti NF-kB. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti koje se leče povec ́anim imunološkim odgovorom povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti NF-kB.

[0107] Posebno, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivacije NF-kB. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivacije NF-kB

[0108] Aktivacija NF-kB je važna za izazivanje urođenih imunih odgovora i kasniji razvoj adaptivnih imunih odgovora. Prema tome, agonisti TLR-a, kao što je flagelin, verovatno c ́e biti korisni kao adjuvansi za lečenje infektivnih bolesti, alergija i tumora promovišuc ́i i urođeni i adaptivni imuni odgovor [44]. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju infektivnih bolesti, alergija i/ili tumora. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju infektivnih bolesti, alergija i/ili tumora povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti NF-kB.

Lečenje raka

[0109] Tolični receptori (TLR) su receptori vezani za membranu primarno eksprimirani na urođenim imunim c ́elijama koje igraju ključnu ulogu i u urođenom i u adaptivnom imunološkom sistemu. TLR reaguju na specifične molekularne obrasce povezane sa mikrobnim patogenom (PAMP). TLR-ovi osec ́aju komponente bakterijskog c ́elijskog zida, a poznato je da TLR5 prepoznaje bakterijski flagelin. Flagelin je jedini poznati ligand za TLR5, receptorski protein eksprimiran na površini niza ljudskih c ́elija, uključujuc ́i epitelne c ́elije, endotelne c ́elije, makrofage, dendritske c ́elije (DC) i T c ́elije [45-47]. Aktivacija TLR5 bakterijskim flagelinom dovodi do aktivacije raznih proinflamatornih gena i gena imunološkog odgovora [15].

[0110] Poznato je da aktivacija TLR5 flagelinom S. typhimurium potiskuje proliferaciju c ́elija i rast tumora [48]. Pokazalo se da soj S. typhimurium projektovan da luči Vibrio vulnificus flagelin B (FlaB) efikasno suzbija rast tumora i metastaze na modelima miša i produženo preživljavanje, kroz aktivaciju TLR4 i TLR5 signalnih puteva u dva koraka [49]. Efikasnost polipeptida flagelina iz drugih vrsta u lečenju raka nije poznata. Ispitivanje sposobnosti jedinjenja da aktivira TLR5 odgovor pokazuje da jedinjenje može biti efikasno u lečenju raka. [

[0111] Kompozicije koje sadrže sojeve Enterococcus gallinarum, a posebno soj MRx0518, efikasne su u lečenju i prevenciji raka [50]. Pronalazači su iznenađujuc ́e pokazali da su polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum u stanju da stimulišu jak TLR5 odgovor, što može doprineti antikancerogenoj aktivnosti sojeva Enterococcus. Polipeptidi flagelina iz Enterococcus gallinarum imaju veliku različitost sekvenci sa polipeptidima flagelina iz S. typhimurium. Primeri pokazuju da su flagelin polipeptidi iz vrste Enterococcus gallinarum u stanju da proizvedu jači TLR5 odgovor od polipeptida flagelina iz S. typhimurium. Tako su pronalazači pokazali da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, korisni u terapiji, a posebno efikasni u lečenju i prevenciji raka.

[0112] Pokazalo se da se TLR5 eksprimira u velikom broju različitih karcinoma, uključujući rak dojke, kolorektalni i želudačni rak. Primeri pokazuju da su flagelin polipeptidi iz roda Enterococcus u stanju da proizvedu jak TLR5 odgovor. Prema tome, u određenim izvođenjima pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka dojke, kolorektalnog raka ili raka želuca. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka dojke, kolorektalnog raka ili raka želuca. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze kod raka dojke, kolorektalnog raka ili raka želuca. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju raka dojke. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju kolorektalnog raka. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju raka želuca.

[0113] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka povezanih sa TLR5.

[0114] Pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.

Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide flagelina vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka. Još poželjnije, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518, posebno sa sekvencom SEK ID BR: 1, za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.

[0115] Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže polipeptide flagelina koji su ovde opisani za upotrebu u terapiji. Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji. Pronalazak takođe obezbeđuje c ́eliju domac ́ina koja eksprimira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji. Pored toga, pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije koje sadrže c ́eliju domac ́ina, pri čemu c ́elija domac ́ina sadrži polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina kao što je ovde opisano za upotrebu u terapiji.

[0116] U određenim izvođenjima, tretman sa kompozicijama za upotrebu u pronalasku dovodi do smanjenja veličine tumora ili smanjenja rasta tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora ili smanjenju rasta tumora. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti efikasne za smanjenje veličine ili rasta tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju pacijenata sa čvrstim tumorima. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju ili prevenciji angiogeneze u lečenju raka. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu imati efekat na imuni ili inflamatorni sistem, koji imaju centralnu ulogu u angiogenezi. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji metastaza.

[0117] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka dojke. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv raka dojke, tako da prema podacima u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka dojke. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka dojke. U poželjnim izvođenjima rak je karcinom dojke. U poželjnim izvođenjima, rak je stadijum IV raka dojke.

[0118] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka pluc ́a. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv raka pluc ́a, pa prema podacima u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka pluc ́a. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka pluća. U poželjnim izvođenjima rak je karcinom pluc ́a.

[0119] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka jetre. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv raka jetre, pa prema podacima u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka jetre. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka jetre. U poželjnim izvođenjima rak je hepatom (hepatocelularni karcinom).

[0120] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji kolorektalnog raka. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv kolorektalnog raka, tako da prateći podatke u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv kolorektalnog raka. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju kolorektalnog raka. U poželjnim izvođenjima rak je kolorektalni adenokarcinom.

[0121] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka debelog creva. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv raka debelog creva, tako da prateći podatke u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka debelog creva. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka debelog creva. U poželjnim izvođenjima rak je adenokarcinom debelog creva.

[0122] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka rektuma. Referenca [50] pokazuje da sojevi Enterococcus imaju snažan efekat protiv raka rektuma, pa prema podacima u ovoj prijavi, polipeptidi flagelina koji su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka rektuma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka rektuma. U poželjnim izvođenjima rak je rektalni adenokarcinom. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju raka rektuma.

[0123] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka želuca. Pokazalo se da rak želuca eksprimira visoke nivoe TLR5 i da tretman flagelinom izaziva snažno antitumorsko delovanje [51]. Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina koji su ovde opisani u stanju da proizvedu jak TLR5 odgovor, stoga polipeptidi flagelina kako su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv raka želuca. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju raka želuca. U poželjnim izvođenjima rak je adenokarcinom želuca. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju raka želuca.

[0124] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji melanoma. Pokazalo se da flagelin iz S. typhimurium, u kombinaciji sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti, ograničenim P10 peptidom klase II, smanjuje broj metastaza u pluc ́ima u modelu mišjeg melanoma [52]. Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina kako su ovde opisani u stanju da proizvedu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium, stoga polipeptidi flagelina kako su ovde opisani mogu biti posebno efikasni protiv melanoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju melanoma. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju melanoma.

[0125] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji neuroblastoma. Poznato je da aktivacija TLR5 flagelinom S. typhimurium potiskuje proliferaciju c ́elija i rast tumora [53]. Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina kako su ovde opisani u stanju da proizvedu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium, pa stoga polipeptidi flagelina mogu biti posebno efikasni protiv neuroblastoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju veličine tumora, smanjenju rasta tumora ili smanjenju angiogeneze u lečenju neuroblastoma. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju neuroblastoma.

[0126] U nekim izvođenjima, rak je rak creva. U nekim izvođenjima, rak je na delu tela koji nije crevo. U nekim izvođenjima, rak nije rak creva. U nekim izvođenjima, rak nije kolorektalni rak. U nekim izvođenjima, rak nije rak tankog creva. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija se dešava na mestu koje nije u crevima. U nekim izvođenjima, lečenje ili prevencija se dešava u crevima i takođe na mestu koje nije u crevima.

[0127] Ekspresija TLR5 je otkrivena u hematološkim c ́elijskim linijama raka, uključujuc ́i multipli mijelom [54] i akutnu mijeloidnu leukemiju [55]. Pronalazači su u primerima pokazali da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus posebno efikasni u aktiviranju snažnog TLR5 odgovora. Polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu stoga biti korisni u lečenju ili prevenciji hematoloških karcinoma, kao što su multipli mijelom i akutna mijeloična leukemija, koji eksprimiraju TLR5. Stoga, u određenim izvođenjima pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji hematoloških maligniteta, kao što su multipli mijelom, akutne i hronične leukemije kao što je akutna mijeloidna leukemija, akutna limfoblastična leukemija i hronična leukemija, leukemija, hronična mijelogena leukemija i akutna monocitna leukemija, limfomi, kao što su Hodgkinovi limfomi i Non-Hodgkinovi limfomi, i mijelodisplastični sindromi. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju akutne mijeloične leukemije.

[0128] U određenim izvođenjima pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji multiplog mijeloma. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji akutne mijeloične leukemije. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju multiplog mijeloma.

[0129] Različiti TLR agonisti su testirani u širokom spektru tumorskih modela i kliničkih ispitivanja [56]. Na primer, pokazalo se da agonist TLR5 CBLB502 promoviše klirens tumora kod miševa modela limfoma T i B c ́elija [57]. Sistemska primena agonista TLR5 entolimoda (farmakološki optimizovanog derivata flagelina) potisnula je metastaze kolorektalnih c ́elija u jetri na modelima miševa. Jetra pokazuje najjači odgovor aktivacije TLR5 nakon primene agonista TLR5 entolimoda [58]. Pronalazači su u primerima pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus deluju kao jaki agonisti TLR5. Stoga, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu biti posebno efikasni u lečenju ili prevenciji limfoma T i B c ́elija, kolorektalnog raka i raka jetre. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji limfoma T i B ćelija. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju limfoma T i B c ́elija.

[0130] U drugim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju ili prevenciji metastaza. U drugim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju metastatskog raka. U drugim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju uznapredovalog raka. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju, smanjenju ili prevenciji metastaza. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu smanjiti ili sprečiti rast metastaza. U poželjnoj izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastaza. U poželjnoj varijanti, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju ili prevenciji metastatskog raka. U poželjnom izvođenju, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, za upotrebu u lečenju ili prevenciji uznapredovalog raka.

[0131] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka.

[0132] Pokazalo se da Vibrio vulnificus flagelin B (FlaB) efikasno suzbija rast tumora kroz aktivaciju TLR4 i TLR5 signalnih puteva u dva koraka. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina mogu aktivirati TLR4 i TLR5 signalne puteve. U drugim izvođenjima, polipeptidi flagelina samo aktiviraju signalni put TLR5.

[0133] U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina mogu da aktiviraju NTkB signalne puteve. U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku mogu aktivirati TLR9 signalne puteve. Referenca [59] pokazuje da sinergija između flagelina i oligodeoksinukleotida koji sadrže TLR9 agonista CpG dovodi do supresije tumora. U određenim izvođenjima, c ́elije domac ́ini za upotrebu u pronalasku mogu aktivirati TLR5 i TLR9 signalne puteve. U određenim takvim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku sadrži oligodeoksinukleotide koji sadrže CpG ili se primenjuje u kombinaciji sa oligodeoksinukleotidima koji sadrže CpG.

[0134] Terapeutski efekti na rak kompozicija za upotrebu u pronalasku mogu biti posredovani proinflamatornim mehanizmom. Aktivacija TLR5 flagelinom pokrec ́e proinflamatornu signalnu kaskadu. Referenca [59] pokazuje da interakcija flagelina S. typhimurium sa visoko imunološkogenim tumorima indukuje Th1 odgovor i supresiju Tregs-a, što rezultira inhibicijom rasta tumora. Nasuprot tome, primena flagelina nije uticala na brzinu rasta slabo imunološkogenih tumora. Prema tome, u određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina i kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju imunološkogenih tumora, posebno visoko imunološkogenih tumora. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u podsticanju zapaljenja u lečenju kancera. U poželjnim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju Th1 inflamacije u lečenju raka. Th1 ćelije proizvode IFNg i imaju snažno dejstvo protiv raka [60]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju

1

raka u ranom stadijumu, kao što je rak koji nije metastazirao, ili stadijum 0 ili stadijum 1 raka. Podsticanje upale može biti efikasnije protiv raka u ranoj fazi [60].

[0135] Referenca [59] pokazuje da primena flagelina posle transplantacije tumora značajno inhibira rast antigenskih tumora. Različiti efekti flagelina na rast tumora su u korelaciji sa imunološkim odgovorom koji je izazvan. Primena flagelina posle transplantacije bila je povezana sa povec ́anim odnosom IFN-y:IL-4 i smanjenom učestalošc ́u CD4+CD25+ T regulatornih c ́elija. Stoga, u određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina i kompozicije za upotrebu u pronalasku povec ́avaju odnos IFN-y:IL-4. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina i kompozicije za upotrebu u pronalasku smanjuju učestalost CD4+CD25+ T regulatornih c ́elija. U drugim izvođenjima, polipeptidi flagelina i kompozicije za upotrebu u pronalasku ne smanjuju odnos IFN-y:IL-4 i povec ́avaju frekvenciju CD4+CD25+ T c ́elija. Upala može imati efekat supresije raka [60], a proinflamatorni citokini kao što je TNFa se istražuju kao terapije raka [61]. Povećana regulacija gena kao što je TNF može ukazivati na to da kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za lečenje raka putem sličnog mehanizma. Povec ́ana regulacija CXCR3 liganada (CXCL9, CXCL10) i gena inducibilnih IFNγ (IL-32) može ukazivati na to da kompozicije za upotrebu u pronalasku izazivaju odgovor tipa IFNγ. IFNγ je snažan faktor aktiviranja makrofaga koji može da stimuliše tumirocidnu aktivnost [62], a CXCL9 i CXCL10, na primer, takođe imaju antikancerogene efekte [63-65].

[0136] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u podsticanju zapaljenja da bi se pojačao efekat drugog agensa protiv raka. U određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povec ́anje nivoa ekspresije jednog ili više citokina. Na primer, u određenim izvođenjima, lečenje ili prevencija raka obuhvata povec ́anje nivoa ekspresije jednog ili više IL-1β, IL-6 i TNF-α, na primer, IL-1β i IL-6, IL-1β i TNF-α, IL-6 i TNF-α ili sva tri od IL-1β, IL-6 i TNF-α. Poznato je da povec ́anje nivoa ekspresije bilo kog od IL-1β, IL-6 i TNF-α ukazuje na efikasnost u lečenju raka.

[0137] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju pacijenata koji su prethodno primali hemoterapiju. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju pacijenata koji nisu tolerisali hemoterapijski tretman. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti posebno pogodne za takve pacijente.

[0138] U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku služe za sprečavanje relapsa. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti pogodne za dugotrajnu primenu. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji progresije raka.

[0139] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka pluća ne-malih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka pluc ́a malih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju raka skvamoznih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju adenokarcinoma. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju tumora žlezda, karcinoidnih tumora ili nediferenciranih karcinoma.

[0140] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju hepatoblastoma, holangiokarcinoma, holangiocelularnog cistadenokarcinoma ili raka jetre koji je rezultat virusne infekcije.

[0141] U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju invazivnog duktalnog raka, duktalnog raka in situ ili invazivnog lobularnog raka.

[0142] U daljim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji akutne limfoblastne leukemije (ALL), akutne mijeloične leukemije, adrenokortikalnog raka, raka bazalnih ćelija, raka žučnih kanala, raka bešike, tumora kostiju, osteosarkoma/ maligni fibrozni histiocitoma, glioma moždanog stabla, tumora mozga, cerebelarnog astrocitoma, cerebralnog astrocitoma/malignog glioma, ependimoma, meduloblastoma, supratentorijalnog primitivnog neuroektodermalnog tumora, raka dojke, bronhijalnog adenoma/karcinoidnog raka, Burkit limfoma, kanceroidnog raka, raka grlića materice, hronične limfocitne leukemije, hronične mijelogene leukemije, hroničnog mijeloproliferativnog poremećaja, raka debelog creva, kožnog T-ćejiskog limfoma, raka endometrijuma, ependimoma, raka jednjaka, Juingovog sarkoma, intraokularnog melanoma, retinoblastoma, raka žučne kese, raka žučne kese, gastrointestinalnog karcinoidnog tumora, gastrointestinalnog stromalnog tumora (GIST), tumora germinativnih ćelija, glioma, glioma vidnog puta i hipotalamusa, Hodžkinovog limfoma, melanoma, raka ćelija ostrvaca, Kaposi sarkoma, raka bubrežnih ć elija, raka larinksa, leukemije, limfoma, mezotelioma, neuroblastoma, Non-Hodžkinovog limfoma, orofaringealnog raka, osteosarkoma, raka jajnika, raka pankreasa, raka paratiroidne žlezde, raka faringealne ž lezde, adenoma hipofize, neoplazije plazma ćelija, raka prostate, raka bubrežnih c ́elija, retinoblastoma, sarkoma, raka testisa, raka štitne žlezde ili raka materice.

[0143] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti posebno efikasne kada se koriste u kombinaciji sa drugim terapeutskim agensima. Imunomodulatorni efekti kompozicija za upotrebu u pronalasku mogu biti efikasni kada se kombinuju sa direktnijim agensima protiv raka. Stoga, u određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus (ili koji kodira polinukleotid ili ekspresuje c ́eliju domac ́ina) i agens protiv raka. U poželjnim izvođenjima, agens protiv raka je inhibitor imunološke kontrolne tačke, ciljana imunoterapija antitelom, terapija CAR-T c ́elijama, onkolitički virus ili citostatski lek. Poželjno sredstvo protiv raka je Keytruda (pembrolizumab, Merck). U daljim poželjnim izvođenjima, kompozicija sadrži agens protiv raka izabran iz grupe koju č ine: Yervoy (ipilimumab, BMS); Opdivo (nivolumab, BMS); MEDI4736 (AZ/MedImmune); MPDL3280A (Roche/Genentech); Tremelimumab (AZ/MedImmune); CT-011 (pidilizumab, CureTech); BMS986015 (lirilumab, BMS); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MSB-0010718C (Merck); PF-05082566 (Pfizer); MEDI6469 (AZ/MedImmune); BMS-986016 (BMS); BMS-663513 (urelumab, BMS); IMP321 (Prima Biomed); LAG525 (Novartis); ARGX-110 (arGEN-X); PF-05082466 (Pfizer); CDX-1127 (varlilumab; CellDex Therapeutics); TRX-518 (GITR Inc.); MK4166 (Merck); JTX-2011 (Jounce Therapeutics); ARGX-115 (arGEN-X); NLG-9189 (indoximod, NewLink Genetics); INCB024360 (Incyte); IPH2201 (Innate Immotherapeutics/AZ); NLG-919 (NewLink Genetics); anti-VISTA (JnJ); Epacadostat (INCB24360, Incyte); F001287 (Flexus/BMS); CP 870893 (University of Pennsylvania); MGA271 (Macrogenix); Emactuzumab (Roche/Genentech); Galunisertib (Eli Lilly); Ulocuplumab (BMS); BKT140/BL8040 (Biokine Therapeutics); Bavituximab (Peregrine Pharmaceuticals); CC 90002 (Celgene); 852A (Pfizer); VTX-2337 (VentiRx Pharmaceuticals); IMO-2055 (Hybridon, Idera Pharmaceuticals); LY2157299 (Eli Lilly); EW-7197 (Ewha Women’s University, Korea); Vemurafenib (Plexxikon); Dabrafenib (Genentech/GSK); BMS-777607 (BMS); BLZ945 (Memorial Sloan-Kettering Cancer Centre); Unituxin (dinutuximab, United Therapeutics Corporation); Blincyto (blinatumomab, Amgen); Cyramza (ramucirumab, Eli Lilly); Gazyva (obinutuzumab, Roche/Biogen); Kadcyla (ado-trastuzumab emtansine, Roche/Genentech); Perjeta (pertuzumab, Roche/Genentech); Adcetris (brentuximab vedotin, Takeda/Millennium); Arzerra (ofatumumab, GSK); Vectibix (panitumumab, Amgen); Avastin (bevacizumab, Roche/Genentech); Erbitux (cetuximab, BMS/Merck); Bexxar (tositumomab-I131, GSK); Zevalin (ibritumomab tiuxetan, Biogen); Campath (alemtuzumab, Bayer); Mylotarg (gemtuzumab ozogamicin, Pfizer); Herceptin (trastuzumab, Roche/Genentech); Rituxan (rituximab, Genentech/Biogen); volociximab (Abbvie); Enavatuzumab (Abbvie); ABT-414 (Abbvie); Elotuzumab (Abbvie/BMS); ALX-0141 (Ablynx); Ozaralizumab (Ablynx); Actimab-C (Actinium); Actimab-P (Actinium); Milatuzumab-dox (Actinium); Emab-SN-38 (Actinium); Naptumonmab estafenatox (Active Biotech); AFM13 (Affimed); AFM11 (Affimed); AGS-16C3F (Agensys); AGS16M8F (Agensys); AGS-22ME (Agensys); AGS-15ME (Agensys); GS-67E (Agensys); ALXN6000 (samalizumab, Alexion); ALT-836 (Altor Bioscience); ALT-801 (Altor Bioscience); ALT-803 (Altor Bioscience); AMG780 (Amgen); AMG 228 (Amgen); AMG820 (Amgen); AMG172 (Amgen); AMG595 (Amgen); AMG110 (Amgen); AMG232 (adecatumumab, Amgen); AMG211 (Amgen/MedImmune); BAY20-10112 (Amgen/Bayer); Rilotumumab (Amgen); Denosumab (Amgen); AMP-514 (Amgen); MEDI575 (AZ/MedImmune); MEDI3617 (AZ/MedImmune); MEDI6383 (AZ/MedImmune); MEDI551 (AZ/MedImmune); Moxetumomab pasudotox (AZ/MedImmune); MEDI565 (AZ/MedImmune); MEDI0639 (AZ/MedImmune); MEDI0680 (AZ/MedImmune); MEDI562 (AZ/MedImmune); AV-380 (AVEO); AV203 (AVEO); AV299 (AVEO); BAY79-4620 (Bayer); Anetumab ravtansine (Bayer); vantictumab (Bayer); BAY94-9343 (Bayer); Sibrotuzumab (Boehringer Ingleheim); BI-836845 (Boehringer Ingleheim); B-701 (BioClin); BIIB015 (Biogen); Obinutuzumab (Biogen/Genentech); BI-505 (Bioinvent); BI-1206 (Bioinvent); TB-403 (Bioinvent); BT-062 (Biotest) BIL-010t (Biosceptre); MDX1203 (BMS); MDX-1204 (BMS); Necitumumab (BMS); CAN-4 (Cantargia AB); CDX-011 (Celldex); CDX1401 (Celldex); CDX301 (Celldex); U3-1565 (Daiichi Sankyo); patritumab (Daiichi Sankyo); tigatuzumab (Daiichi Sankyo); nimotuzumab (Daiichi Sankyo); DS-8895 (Daiichi Sankyo); DS-8873 (Daiichi Sankyo); DS-5573 (Daiichi Sankyo); MORab-004 (Eisai); MORab-009 (Eisai); MORab-003 (Eisai); MORab-066 (Eisai); LY3012207 (Eli Lilly); LY2875358 (Eli Lilly); LY2812176 (Eli Lilly); LY3012217(Eli Lilly); LY2495655 (Eli Lilly); LY3012212 (Eli Lilly); LY3012211 (Eli Lilly); LY3009806 (Eli Lilly); cixutumumab (Eli Lilly); Flanvotumab (Eli Lilly); IMC-TR1 (Eli Lilly); Ramucirumab (Eli Lilly); Tabalumab (Eli Lilly); Zanolimumab (Emergent Biosolution); FG-3019 (FibroGen); FPA008 (Five Prime Therapeutics); FP-1039 (Five Prime Therapeutics); FPA144 (Five Prime Therapeutics); catumaxomab (Fresenius Biotech); IMAB362 (Ganymed); IMAB027 (Ganymed); HuMax-CD74 (Genmab); HuMax-TFADC (Genmab); GS-5745 (Gilead); GS-6624 (Gilead); OMP-21M18 (demcizumab, GSK); mapatumumab (GSK); IMGN289 (ImmunoGen); IMGN901 (ImmunoGen); IMGN853 (ImmunoGen); IMGN529 (ImmunoGen); IMMU-130 (Immunomedics); milatuzumab-dox (Immunomedics); IMMU-115 (Immunomedics); IMMU-132 (Immunomedics); IMMU-106 (Immunomedics); IMMU-102 (Immunomedics); Epratuzumab (Immunomedics); Clivatuzumab (Immunomedics); IPH41 (Innate Immunotherapeutics); Daratumumab (Janssen/Genmab); CNTO-95 (Intetumumab, Janssen); CNTO-328 (siltuximab, Janssen); KB004 (KaloBios); mogamulizumab (Kyowa Hakko Kirrin); KW-2871 (ecromeximab, Life Science); Sonepcizumab (Lpath); Margetuximab (Macrogenics); Enoblituzumab (Macrogenics); MGD006 (Macrogenics); MGF007 (Macrogenics); MK-0646 (dalotuzumab, Merck); MK-3475 (Merck); Sym004 (Symphogen/Merck Serono); DI17E6 (Merck Serono); MOR208 (Morphosys); MOR202 (Morphosys); Xmab5574 (Morphosys); BPC-1C (ensituximab, Precision Biologics); TAS266 (Novartis); LFA102 (Novartis); BHQ880 (Novartis/Morphosys); QGE031 (Novartis); HCD122 (lucatumumab, Novartis); LJM716 (Novartis); AT355 (Novartis); OMP-21M18 (Demcizumab, OncoMed); OMP52M51 (Oncomed/GSK); OMP-59R5 (Oncomed/GSK); vantictumab (Oncomed/Bayer); CMC-544 (inotuzumab ozogamicin, Pfizer); PF-03446962 (Pfizer); PF-04856884 (Pfizer); PSMA-ADC (Progenics); REGN1400 (Regeneron); REGN910 (nesvacumab, Regeneron/Sanofi); REGN421 (enoticumab, Regeneron/Sanofi); RG7221, RG7356, RG7155, RG7444, RG7116, RG7458, RG7598, RG7599, RG7600, RG7636, RG7450, RG7593, RG7596, DCDS3410A, RG7414 (parsatuzumab), RG7160 (imgatuzumab), RG7159 (obintuzumab), RG7686, RG3638 (onartuzumab), RG7597 (Roche/Genentech); SAR307746 (Sanofi); SAR566658 (Sanofi); SAR650984 (Sanofi); SAR153192 (Sanofi); SAR3419 (Sanofi); SAR256212 (Sanofi), SGN-LIV1A (lintuzumab, Seattle Genetics); SGN-CD33A (Seattle Genetics); SGN-75 (vorsetuzumab mafodotin, Seattle Genetics); SGN-19A (Seattle Genetics) SGN-CD70A (Seattle Genetics); SEA-CD40 (Seattle Genetics); ibritumomab tiuxetan (Spectrum); MLN0264 (Takeda); ganitumab (Takeda/Amgen); CEP-37250 (Teva); TB-403 (Thrombogenic); VB4-845 (Viventia); Xmab2512 (Xencor); Xmab5574 (Xencor); nimotuzumab (YM Biosciences); Carlumab (Janssen); NY-ESO TCR (Adaptimmune); MAGE-A-10 TCR (Adaptimmune); CTL019 (Novartis); JCAR015 (Juno Therapeutics); KTE-C19 CAR (Kite Pharma); UCART19 (Cellectis); BPX401 (Bellicum Pharmaceuticals); BPX-601 (Bellicum Pharmaceuticals); ATTCK20 (Unum Therapeutics); CAR-NKG2D (Celyad); Onyx-015 (Onyx Pharmaceuticals); H101 (Shanghai Sunwaybio); DNX-2401 (DNAtrix); VCN-01 (VCN Biosciences); Colo-Adl (PsiOxus Therapeutics); ProstAtak (Advantagene); Oncos-102 (Oncos Therapeutics); CG0070 (Cold Genesys); Pexa-vac (JX-594, Jennerex Biotherapeutics); GL-ONC1 (Genelux); T-VEC (Amgen); G207 (Medigene); HF10 (Takara Bio); SEPREHVIR (HSV1716, Virttu Biologics); OrienX010 (OnenGene Biotechnology); Reolysin (Oncolytics Biotech); SVV-001 (Neotropix); Cacatak (CVA21, Viralytics); Alimta (Eli Lilly), cisplatin, oksaliplatin, irinotekan, folinska kiselina, metotreksat, ciklofosfamid, 5-fluorouracil, Zykadia (Novartis), Tafinlar (GSK), Xalkori (Pfizer), Iressa (AZ), Gilotrif (Boehringer Ingelheim), Tarceva (Astellas Pharma), Halaven (Eisai Pharma), Veliparib (Abbvie), AZD9291 (AZ), Alectinib (Chugai), LDK378 (Novartis), Genetespib (Synta Pharma), Tergenpumatucel-L (NewLink Genetics), GV1001 (Kael-GemVax), Tivantinib (ArQule); Cytoxan (BMS); Oncovin (Eli Lilly); Adriamycin (Pfizer); Gemzar (Eli Lilly); Xeloda (Roche); Ixempra (BMS); Abraxane (Celgene); Trelstar (Debiopharm); Taxotere (Sanofi); Nexavar (Bayer); IMMU-132 (Immunomedics); E7449 (Eisai); Thermodox (Celsion); Cometriq (Exellxis); Lonsurf (Taiho Pharmaceuticals); Camptosar (Pfizer); UFT (Taiho Pharmaceuticals); and TS-1 (Taiho Pharmaceuticals).

[0144] U daljim poželjnim izvođenjima, polipeptidi flagelina se primenjuju u kombinaciji (istovremeno ili uzastopno)

1

sa oligodeoksinukleotidima koji sadrže CpG, koji su pokazali korisne efekte sa drugim flagelinima [59].

[0145] U nekim izvođenjima, polipeptid flagelina iz roda Enterococcus je jedini terapeutski aktivan agens(i) u kompoziciji za upotrebu u pronalasku.

Zaštita od izlaganja toksičnim hemikalijama, patogenima ili zračenju

[0146] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, poželjno polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum, poželjno polipeptid flagelina iz soja MRx0518, za upotrebu u prevenciji ili lečenju simptoma povezanih sa toksičnom hemikalijom, patogenom, ili izlaganje zračenju. Flagelin se može davati subjektima koji su izloženi riziku od toksične hemikalije, patogena ili izloženosti zračenju, ili subjektima koji su nedavno bili izloženi toksičnim hemikalijama, patogenima ili zračenju, na primer subjektima izloženim 1, 2, 3, 4 ili 5 sati ranije.

[0147] Iznenadna izloženost ljudske populacije hemikalijama, patogenima ili zračenju može dovesti do značajnog morbiditeta. Jedna strategija za zaštitu ljudske populacije je aktiviranje urođenih odbrambenih puteva domac ́ina, posebno onih koji brzo indukuju citoprotektivnu i/ili antimikrobnu ekspresiju gena. Dosta rada u ovoj oblasti se fokusiralo na agonist TLR4 LPS/endotoksin, međutim primena LPS-a može dovesti do teških inflamatornih patologija, uključujuc ́i sepsu ili tešku povredu pluc ́a. Pored toga, LPS je loš stimulator epitelnih c ́elija, koje su prve c ́elije koje stupaju u interakciju sa patogenom ili hemijskim izazovom.

[0148] Flagelin stimuliše odbranu domac ́ina u različitim organizmima, uključujuc ́i sisare, insekte i biljke. Za razliku od LPS-a, flagelin je moc ́an aktivator urođenih imunoloških signalnih puteva u epitelnim c ́elijama, ali je generalno primec ́eno da je loš aktivator hemopoetskih c ́elija, kao što su makrofagi i dendritične c ́elije. Primec ́eno je da flagellin S. typhimurium ne stimuliše značajne nivoe "glavnih" proinflamatornih citokina, kao što je TNF-a, koji posreduju u neželjenim efektima povezanim sa LPS. Primec ́eno je da flagellin S. typhimurium aktivira urođeni imunitet posredovan TLR5 kod miševa, štitec ́i miševe od izlaganja hemikalijama, patogenima ili zračenju [66].

[0149] Pokazalo se da primena flagelina S. typhimurium štiti od izlaganja zračenju preko mehanizma koji zahteva TLR5 [66]. Optimalna zaštita je primec ́ena kada je flagelin primenjen profilaktički 2 sata pre zračenja, ali značajan stepen zaštite je i dalje primec ́en ako je flagelin primenjen do 4 sata nakon zračenja. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu da stimulišu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium. Tako su pronalazači pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, mogu biti korisni kao radioprotektivni agensi.

[0150] Pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu kao radioprotektivna sredstva. Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide flagelina vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu kao radioprotektivna sredstva. Još poželjnije, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518, posebno sa sekvencom SEK ID BR:1, za upotrebu kao radioprotektivna sredstva.

[0151] Takođe se pokazalo da tretman sa agonistom TLR5 Entolimod smanjuje oštec ́enje izazvano zračenjem u sva tri glavna tipa radiosenzitivnih tkiva: hematopoetskog, gastrointestinalnog i kože. Takođe se pokazalo da ublažava oštec ́enje epitela izazvano zračenjem u mišjem modelu zračenja glave i vrata [67]. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus deluju kao moc ́ni agonist TLR5. Tako su pronalazači pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, mogu biti korisni u smanjenju oštećenja izazvanog zračenjem. U određenim izvođenjima, kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus su za upotrebu u smanjenju oštec ́enja izazvanih zračenjem u hematopoetskom, gastrointestinalnom ili kožnom tkivu. U određenim izvođenjima, kompozicije koje sadrže flagelin polipeptide iz roda Enterococcus su za upotrebu u smanjenju oštec ́enja epitela izazvanog zračenjem. U poželjnoj varijanti, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u smanjenju oštec ́enja izazvanog zračenjem.

[0152] U određenim izvođenjima, kompozicija se može primeniti, poželjno oralno, pre radioterapije. U određenim izvođenjima, kompozicija se može primeniti, poželjno oralno, ubrzo nakon radioterapije. U određenim izvođenjima, kompozicije treba da se daju pacijentu koji je nedavno bio podvrgnut radioterapiji, ili koji je planiran da bude podvrgnut radioterapiji.

[0153] U poželjnim izvođenjima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus se primenjuju pre izlaganja zračenju. U drugim izvođenjima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus se primenjuju nakon izlaganja zračenju, poželjno u roku od 4 sata nakon izlaganja.

Lečenje bakterijskih infekcija

[0154] Pokazalo se da primena flagelina S. typhimurium stimuliše imuni odgovor na bakterijsku infekciju. Referenca [68] pokazuje da profilaktička intranazalna primena flagelina S. typhimurium sa antibiotikom š titi miševe od respiratornih bakterija Streptococcus pneumoniae, dok referenca [66] pokazuje da oralna primena flagelina S. typhimurium 2 sata pre infekcije S. typhimurium smanjuje mortalitet. Flagelin je izazvao ove odgovore aktiviranjem TLR5 urođenog imunološkog odgovora. Primeri pokazuju da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu da stimulišu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium. Tako su pronalazači pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, mogu biti korisni u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija.

[0155] Pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija. Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide flagelina vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija. Još poželjnije, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518, posebno sa sekvencom SEK ID BR: 1, za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija.

[0156] U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus se koriste u kombinaciji sa antibiotikom za upotrebu u lečenju bakterijskih infekcija. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus se koriste kao jedini terapeutski agens u kompoziciji za upotrebu u lečenju bakterijskih infekcija.

Adjuvansi za vakcinu

[0157] Mikrobne komponente se mogu koristiti kao adjuvansi za poboljšanje imunološkog odgovora slabo

1

imunološkogenih vakcina. Pokazalo se da flagelin deluje kao adjuvansi u vakcinama za bakterijske, virusne i parazitske infekcije, međutim, vec ́ina ovih studija je koristila flagelin iz S. typhimurium i Vibrio vulnificus [15]. Efikasnost polipeptida flagelina iz drugih vrsta da deluju kao adjuvansi za vakcinu, a posebno Enterococcus spp., nije poznata.

[0158] Flagelin deluje kao pomoc ́no sredstvo tako što stimuliše urođeni imuni odgovor preko TLR5 receptora. Pronalazači su iznenađujuc ́e pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu da stimulišu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium. Tako su pronalazači pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, mogu biti korisni kao adjuvansi za vakcinu. Upotreba polipeptida flagelina kao adjuvansa za vakcinu znači da se polipeptid flagelina koristi, na primer, da obezbedi zaštitu od infektivnog agensa ili spreči infekciju infektivnim agensom, generalno povećanjem imunološkog odgovora na poseban antigen.

[0159] Pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu kao adjuvansa za vakcinu. Pronalazak takođe obezbeđuje polipeptide flagelina vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu kao adjuvansa za vakcinu. Još poželjnije, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518, posebno sa sekvencom SEK ID BR:1, za upotrebu kao adjuvansa za vakcinu.

[0160] Pronalazak takođe obezbeđuje kompozicije vakcine koje sadrže polipeptide flagelina kao što je ovde opisano kao adjuvanse. U određenim izvođenjima, kompozicije vakcine su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija. U određenim izvođenjima, bakterijski patogen koji treba lečiti ili sprečiti je Y. pestis, tetanus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli ili M. tuberculosis. U određenim izvođenjima, kompozicije vakcine su za upotrebu u lečenju ili prevenciji virusnih infekcija. U određenim izvođenjima, virusni patogen koji treba lečiti ili sprečiti je virus gripa, HIV, besnila ili bolest ruku i nogu. U određenim izvođenjima, kompozicije vakcine su za upotrebu u lečenju ili prevenciji parazitskih infekcija. U određenim izvođenjima, parazit je Plasmodium vivax, Plasmodium yoelii ili Eimeria tenella. U bilo kom takvom izvođenju, kompozicija sadrži najmanje jedan antigen relevantnog patogena. U poželjnim takvim izvođenjima, kompozicija sadrži flagelin kako je ovde opisan fuzionisan ili konjugovan sa najmanje jednim antigenom relevantnog patogena. U takvim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje fuzioni polipeptid koji sadrži flagelin kako je ovde opisano, opcioni linker i antigen iz patogena ili parazita.

[0161] Primena mukoznim putem je atraktivan put primene vakcine. Flagelin je snažan aktivator urođenih imunoloških signalnih puteva u epitelnim c ́elijama, koje su prvi veliki tip c ́elija koji se susrec ́e sa agensima koji se primenjuju mukoznim putem. Pokazalo se da proteini flagelina S. typhimurium i Vibrio vulnificus imaju moc ́nu pomoc ́nu aktivnost u mukoznim vakcinama protiv gripa, virusa Zapadnog Nila, Escherichia coli, Iersinia pestis, Clostridium tetani, C. jejuni, Streptococcus spp. i Plasmodium falciparum [15]. Efikasnost polipeptida flagelina iz drugih vrsta da deluju kao adjuvansi za mukozne vakcine nije poznata.

[0162] Flagelin deluje kao pomoc ́no sredstvo tako što stimuliše urođeni imuni odgovor preko TLR5 receptora. Pronalazači su iznenađujuc ́e pokazali da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu da stimulišu jači TLR5 odgovor od S. typhimurium. Dakle, pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu kao pomoc ́no sredstvo za mukoznu vakcinu. U poželjnim izvođenjima pronalazak obezbeđuje polipeptide flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum za upotrebu kao pomoc ́na sredstva za mukozne vakcine. Još poželjnije, pronalazak obezbeđuje polipeptid flagelina iz soja MRx0518, posebno sa sekvencom SEK ID BR:1, za upotrebu na sluzokoži kao adjuvansi za vakcinu.

[0163] U određenim izvođenjima, flagelin polipeptidi iz roda Enterococcus su za upotrebu u mukoznoj vakcini za upotrebu u lečenju ili prevenciji bakterijskih infekcija. U poželjnim izvođenjima, bakterijska infekcija je Escherichia coli, Iersinia pestis, Clostridium tetani, C. jejuni, Streptococcus spp. ili Plasmodium falciparum. U određenim izvođenjima, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus su za upotrebu u mukoznim vakcinama za upotrebu u lečenju ili prevenciji virusnih infekcija. U poželjnim izvođenjima, virusna infekcija je grip ili virus Zapadnog Nila.

[0164] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije Faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). Poznato je da je TNF-α važan za odgovor na vakcinu. Na primer, pokazalo se da je TNF-α neophodan za efikasan odgovor na vakcinu u vakcinaciji starije populacije protiv gripa [69]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može da povec ́a ekspresiju TNF-α, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao aduvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu povećanjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu u terapiji gripa. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u poboljšanju imunološkog odgovora protiv antigena. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja se primenjuje u kombinaciji sa antigenom. U takvim izvođenjima pronalaska, flagelin za upotrebu u pronalasku može biti fuzionisan ili konjugovan sa antigenom. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku su za davanje pacijentu neposredno pre ili posle vakcinacije.

[0165] Enterococcus gallinarum i posebno soj MRx518 je flageliran i flagelini mogu biti agonisti TLR5. TLR agonisti su u razvoju kao adjuvansi za vakcinu za niz tipova antigena, posebno u starijoj populaciji [70]. Takođe, MRX518 je agonist TLR5. Prema tome, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne ka adjuvansi za vakcinu, posebno za vakcinu koja se primenjuje kod starijih pacijenata (npr. starijih od 40, 50, 60, 70 ili 80 godina), koji mogu imati smanjenu aktivnost imunološkog sistema. TLR5 signalizacija takođe igra ključnu ulogu u urođenim imunim odgovorima povezanim sa uzrastom [71]. U određenim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u poboljšanju urođenog imunološkog odgovora. Iako se agonisti TLR5 razvijaju kao adjuvansi za vakcinu, svi oni potiču od poznatih patogena i/ili sintetike. Nasuprot tome, kompozicije za upotrebu u pronalasku sadrže komenzalne bakterije.

[0166] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-6. Povec ́ana ekspresija 11-6 je povezana sa odgovorima na vakcinu za mnoge bolesti. Na primer, IL-6 su proizveli CD14+CD16- inflamatorni monociti nakon što su odrasli primili vakcinu protiv gripa [72], a viši nivoi IL-6 su bili povezani sa postizanjem odgovora vakcine na vakcinu protiv gripa [73]. Štaviše, 11-6 je proizveden nakon injekcije AS03 adjuvantnog sistema [74] i pokazalo se da smanjenje IL-6 kod miševa smanjuje odgovor T c ́elija pomagača nakon primene vakcine protiv

1

tuberkuloze [75]. Od primene kompozicija za upotreba u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-6, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu u terapiji tuberkuloze.

[0167] Štaviše, pokazalo se da je ekspresija IL-6 i TNF-α u korelaciji sa efikasnošc ́u terapijske HIV vakcine [Huang et al], vakcine protiv tuberkuloze i vakcine protiv hlamidije [76]. Su et al. [77] su pokazali da je ko-inokulacija IL-6 ili TNF-α sa FMDV DNK vakcinom rezultirala povec ́anom ekspresijom IFN-i u CD4+ i CD8+ T c ́elijama, vec ́om ekspresijom IL-4 u CD4+ T c ́elijama i vec ́im antigen-specifičnim citotoksičnim odgovorom. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-6 i TNF-α, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti IL-6. U posebnom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao pomoc ́no sredstvo za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti TNF-α i IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao pomoćno sredstvo za vakcinu u terapiji HIV-a. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao pomoc ́no sredstvo za vakcinu u terapiji hlamidije.

[0168] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povec ́anja ekspresije IL-1β. Li et al. [78] su pokazali da adjuvans aluminijum hidroksid aktivira sekreciju IL-1β i sugerisao da sam IL-b može delovati kao adjuvans. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povećati ekspresiju IL-1β, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. Primeri pokazuju da primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati odnos CD8+ T c ́elija prema Tregs. Pokazalo se da adjuvansi stimulišu CD8+ T c ́elije [79] i pošto se pokazalo da primena kompozicija za upotrebu u pronalasku povec ́ava odnos CD8+ T c ́elija prema Tregs, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu povec ́anjem odnosa CD8+ T c ́elija prema Tregs.

[0169] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije ili nivoa CXCR3 liganada CXCL9 i CXCL10. Svi poznati adjuvansi kao što su ASO3, CpG, GLA-SE, aGalCer povec ́avaju CXCL9 i 10 [80,81], što sugeriše da c ́e kompozicije za upotrebu u pronalasku biti efikasne kao adjuvansi. Takođe, CXCL9 i 10 su povezani sa IFNg/Th1 odgovorima i promovišu odgovore antitela [82]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju odgovora antitela na antigen, posebno na patogeni ili antigen raka. Takođe, CXCL9 je osetljivija mera od IFN-i odgovora T-c ́elija izazvanih vakcinom kod dobrovoljaca koji primaju ispitivane vakcine protiv malarije [83]. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju odgovora T-c ́elija na antigen, posebno na patogen ili antigen raka. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansa za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti CXCL9 i CXCL10. U određenim izvođenjima, kompozicije su za upotrebu u zaštiti od malarije.

[0170] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije ili nivoa IL-12p70. Ovaj efekat je povezan sa efikasnošc ́u adjuvansa za vakcinu, a IL-12 je predložen kao sam adjuvans [84], što sugeriše da c ́e kompozicije za upotrebu u pronalasku biti efikasne kao adjuvansi. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvansa za vakcinu povec ́anjem nivoa i/ili aktivnosti IL-12p70.

[0171] Generalno, kada se koriste kao adjuvansi za vakcinu, kompozicije za upotrebu u pronalasku c ́e se primenjivati same da bi se obezbedio efekat adjuvansa za antigen koji je posebno primenjen pacijentu. U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku se primenjuje oralno, dok se antigen ubrizgava parenteralno. U alternativnim izvođenjima, flagelin za upotrebu u pronalasku može biti fuzionisan ili konjugovan sa antigenom.

[0172] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se koristiti za pojačavanje imunološkog odgovora na bilo koji koristan antigen. Primeri antigena za upotrebu sa pronalaskom uključuju: virusne antigene, kao što su virusni površinski proteini; bakterijski antigeni, kao što su proteinski i/ili saharidni antigeni; gljivični antigeni; antigeni parazita; i tumorskih antigena. Pronalazak je posebno koristan za vakcine protiv virusa gripa, HIV-a, ankilostome, virusa hepatitisa B, virusa herpes simpleksa, besnila, respiratornog sincicijalnog virusa, citomegalovirusa, Staphylococcus aureus, hlamidije, SARS korona virusa, virusa varičela zoster, Streptococcus pneumoniae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis, Epstein Barr virus, humani papiloma virus, itd. U određenim izvođenjima, flagelin za upotrebu u pronalasku je fuzionisan ili konjugovan sa jednim ili više ovih antigena.

[0173] Dalji antigeni za upotrebu sa flagelinima za upotrebu u pronalasku uključuju glikoproteinske i lipoglikanske antigene. U određenim izvođenjima, antigen je antigen arheje. Primeri antigena povezanih sa tumorom uključuju antigen melanoma E (MAGE), karcinoembrionalni antigen (CEA), MUC-1, HER2, sijalil-Tn (STn), reverznu transkriptazu humane telomeraze (hTERT), Vilms tumor gen (WT1), CA-125, specifični antigen za prostatu (PSA), antigen Epstein-Barr virusa, neoantigene i onkoproteine. Flagelini za upotrebu u pronalasku takođe mogu biti korisni za poboljšanje odgovora na vakcine protiv nezaraznih bolesti kao što su Alchajmerova bolest i drugi neurodegenerativni poremec ́aji, u kom slučaju antigen za upotrebu u pronalasku može biti amiloid-beta ili Tau. Drugi takvi antigeni za nezarazne bolesti uključuju PCSK9 (za lečenje povišenog holesterola). Flagelini za upotrebu u pronalasku takođe mogu biti korisni za poboljšanje odgovora na vakcine protiv supstanci koje izazivaju zavisnost, na primer nikotin, alkohol ili opijati.

[0174] Imuni odgovor izazvan ovim metodama i primenama c ́e generalno uključivati odgovor antitela, poželjno zaštitni odgovor antitela.

Stimulisanje imunološkog sistema

[0175] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu dovesti do imunološke stimulacije. Pošto primena kompozicija za

1

upotrebu u pronalasku može imati imunostimulatorno dejstvo, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno bolesti koje karakteriše smanjena imunološka aktivacija i bolesti koje se leče povec ́anim imunološkim odgovorom. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulaciji imunološkog sistema. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti stimulisanjem imunološkog sistema. U određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora.

[0176] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše povec ́anje procenta Treg-ova u c ́elijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju bolesti koje karakteriše povec ́anje procenta Treg-ova u c ́elijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju bolesti koje karakteriše povec ́anje procenta CD4+CD25+CD127- c ́elija u c ́elijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti smanjenjem procenta Treg-ova u c ́elijskoj populaciji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u smanjenju supresije imunološkog odgovora pomoc ́u Tregs-a. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora selektivnom redukcijom Tregs. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji, pri čemu kompozicije smanjuju broj ili procenat Treg-ova.

[0177] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje odnosa CD8/Treg i/ili aktiviranih CD8/Treg c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje odnosa CD8/Treg c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje odnosa aktiviranih CD8/Treg ćelija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povec ́anjem odnosa CD8/Treg c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povec ́anjem odnosa aktiviranih CD8/Treg c ́elija.

[0178] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta B c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta B c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD19+CD3- c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem broja ili procenta B c ́elija u c ́elijskoj populaciji, pri čemu povec ́anje broja ili procenta B c ́elija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povec ́anjem broja ili procenta B c ́elija.

[0179] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povećanjem broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih c ́elija u c ́elijskoj populaciji, pri čemu povec ́anje broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih c ́elija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povec ́anjem broja ili procenta CD8 T-citotoksičnih c ́elija.

[0180] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8+ aktiviranih c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje broja ili procenta CD8+ aktiviranih c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem broja ili procenta CD8+ aktiviranih c ́elija u c ́elijskoj populaciji, pri čemu povec ́anje broja ili procenta CD8+ aktiviranih c ́elija dovodi do imunološke stimulacije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju imunološkog odgovora povec ́anjem broja ili procenta CD8+ aktiviranih c ́elija.

[0181] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije proinflamatornih molekula, kao što su proinflamatorni citokini. Primeri proinflamatornih molekula koji mogu pokazati povec ́anje nivoa ekspresije nakon primene kompozicija za upotrebu u pronalasku uključuju IL-8, IL-12p70, IL23, TNF-α, IL-1β i IL-6. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povećati ekspresiju proinflamatornih molekula, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije proinflamatornih molekula, kao što su pro-inflamatorni citokini. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti proinflamatornih molekula, posebno bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti proinflamatornih citokina. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-8, IL12p70, IL-23, TNF-α, IL-1β,- i /ili IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23, TNF-α, IL-1β i/ili IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-8, IL-12p70, IL-23, TNF-α, IL- 1β i/ili IL- 6.

[0182] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-1β. IL- β je proinflamatorni citokin [85]. Proizvodnju i sekreciju IL-1β reguliše inflamazom, proteinski kompleks koji je povezan sa aktivacijom inflamatornog odgovora [86]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-1β, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-1β. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-1β.

[0183] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-23. IL23 je povezan sa upalom [87,88]. Predložene funkcije IL-23 u imunološkom odgovoru uključuju promovisanje proliferacije CD4+

1

memorijskih T c ́elija i promovisanje lučenja IFN-i dendritskih c ́elija (DC) [89]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-23, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-23. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-23.

[0184] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije Faktora nekroze tumora alfa (TNF-α). TNF-α je proinflamatorni citokin za koji je poznato da je uključen u različite signalne puteve za promociju c ́elijske smrti. TNF-α inicira apoptozu vezivanjem za svoj srodni receptor, TNFR-1, što dovodi do kaskade događaja cepanja u apoptotičkom putu [90]. TNF-α takođe može izazvati nekrozu putem mehanizma koji zavisi od RIP kinaze [91]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povećati ekspresiju TNF-α, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti, posebno za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti koje karakteriše smanjena ekspresija TNF-α. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za lečenje ili prevenciju bolesti povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti TNF-α. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti TNF-a.

[0185] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-6. IL-6 je proinflamatorni citokin koji se proizvodi tokom inflamacije i promoviše diferencijaciju naivnih CD4+ T c ́elija i diferencijaciju CD8+ T c ́elija u citotoksične T c ́elije [92]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-6, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u lečenju bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije IL-6. U posebnom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti koje karakteriše smanjenje ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju ili prevenciji bolesti povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u promovisanju imunološkog odgovora povec ́anjem ekspresije i/ili aktivnosti IL-6.

[0186] Bettelli et al. [93] je objavio da IL-6 inhibira proizvodnju Treg-ova. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu povec ́ati ekspresiju IL-6, tako da kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu selektivno smanjiti broj ili procenat Treg-ova povec ́anjem ekspresije IL-6. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji povec ́anjem ekspresije IL-6. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u imunostimulaciji smanjenjem broja ili procenta Treg-ova.

[0187] Primeri takođe pokazuju da kompozicije za upotrebu u pronalasku promovišu diferencijaciju Thelper ćelija i citotoksičnih T limfocita. Prema tome, u određenim izvođenjima, kompozicije pronalaska su za upotrebu u stimulisanju diferencijacije T-pomoc ́nih c ́elija i/ili citotoksičnih T limfocita.

C ́elijske terapije

Terapija himernim antigenskim receptorima T c ́elija (CAR-T).

[0188] Primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može dovesti do povećanja ekspresije IL-6. Povec ́ana ekspresija 11-6 je u korelaciji sa odgovorom na CD19 CAR-T terapiju hronične limfocitne leukemije. Povec ́anje serumskog IL-6 bilo je povezano sa ekspanzijom CAR-T c ́elija, dok je inhibicija IL-6 bila povezana sa inhibicijom proliferacije CAR-T c ́elija [94]. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može povec ́ati ekspresiju IL-6, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u c ́elijskoj terapiji, posebno u c ́elijskoj terapiji CAR-T. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u ćelijskoj terapiji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u CAR-T c ́elijskoj terapiji. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju hronične limfocitne leukemije.

[0189] Pokazalo se da selektivno iscrpljivanje Tregs povec ́ava efikasnost citotoksičnih limfocita [95]. CAR-T c ́elije su podskup citotoksičnih limfocita, i stoga se smatra da je selektivno smanjenje Treg-ova efikasno u terapiji CAR-T c ́elijama. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može iscrpiti Tregs, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u c ́elijskoj terapiji, posebno u c ́elijskoj terapiji CAR-T.

[0190] Stoga, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u c ́elijskoj terapiji, posebno u poboljšanju odgovora na c ́elijsku terapiju.

Terapija mezenhimalnim matičnim c ́elijama (MSC)

[0191] Zabeleženo je da terapija mezenhimalnim matičnim c ́elijama (MSC) ima imunostimulatorna svojstva. Kada se MSC leče LPS-om, oni pojačavaju regulaciju proinflamatornih citokina IL-6 i IL-8 što uzrokuje povec ́anu proliferaciju B c ́elija [96]. Stoga, pošto kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu povec ́ati ekspresiju IL-6, one mogu biti korisne u kombinaciji sa MSC c ́elijskom terapijom.

Terapija transplantacije matičnih c ́elija

[0192] Zabeleženo je da, umesto korišc ́enja nediferenciranih matičnih c ́elija u terapiji transplantacije matičnih c ́elija, može biti korisno da se matične c ́elije u određenoj meri razlikuju pre transplantacije. Na primer, Heng et al.

[97] su objavili da kardiomiogena diferencijacija matičnih c ́elija može biti korisna jer ima vec ́u efikasnost

2

presađivanja, poboljšanu regeneraciju miocita i povec ́anu restauraciju srčane funkcije. Pošto primena kompozicija za upotrebu u pronalasku može pokrenuti diferencijaciju neurona u nediferenciranim c ́elijama neuroblastoma, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za diferencijaciju matičnih c ́elija u terapiji transplantacije matičnih c ́elija.

Transplantacija hematopoetskih matičnih c ́elija

[0193] Transplantacija hematopoetskih matičnih c ́elija je transplantacija multipotentnih hematopoetskih matičnih c ́elija, obično dobijenih iz koštane srži, periferne krvi ili krvi iz pupčane vrpce. Pokazalo se da kolonizacija creva Enterococci (Enterococcus gallinarum i Enterococcus casseliflavus) pre alogene transplantacije hematopoetskih matičnih c ́elija dovodi do značajnog poboljšanja dvogodišnjeg preživljavanja pacijenata posle smanjenog mortaliteta bez recidiva [98]. Stoga, imunomodulatorni efekat prikazan u primerima može biti koristan u terapiji transplantacije hematopoetskih matičnih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u poboljšanju preživljavanja nakon transplantacije hematopoetskih matičnih c ́elija, a posebno posle alogene transplantacije hematopoetskih matičnih c ́elija.

[0194] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne u kombinaciji sa alogenom transplantacijom hematopoetskih matičnih c ́elija. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu da utiču na podsticanje uspešnog odgovora pacijenata na alogenu transplantaciju hematopoetskih matičnih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku se primenjuju pre transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku su za davanje pacijentu koji treba da primi transplantaciju hematopoetskih matičnih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku se primenjuju nakon transplantacije hematopoetskih matičnih c ́elija. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku su za davanje pacijentu koji je primio transplantaciju hematopoetskih matičnih c ́elija.

Imunosenescencija

[0195] Fulop et al. [99] su identifikovali da su povec ́anje broja Treg c ́elija i smanjenje broja B c ́elija povezani sa starenjem u adaptivnom imunološkom sistemu. Prema tome, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu da se koriste za sprečavanje ili odlaganje imunonescencije. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u prevenciji imunosenscencije. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše povec ́anje broja Treg c ́elija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše smanjenje broja B c ́elija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije koju karakteriše povec ́anje broja Treg c ́elija i smanjenje broja B c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije smanjenjem broja Treg c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije povec ́anjem broja B c ́elija. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju imunosenescencije smanjenjem broja Treg c ́elija i povec ́anjem broja B c ́elija. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti izazvanih imunosenscencijom. U jednom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u lečenju bolesti povezanih sa starenjem odlaganjem i/ili sprečavanjem imunosenscencije.

[0196] Dalje, predloženo je da adjuvansi vakcine mogu da prevaziđu imunosenescenciju [100]. Pošto su kompozicije za upotrebu u pronalasku pogodne za upotrebu kao adjuvansi za vakcinu, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za prevenciju ili odlaganje imunosenescencije. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu u odlaganju i/ili prevenciji imunosenescencije kao adjuvans za vakcinu. U drugom izvođenju, kompozicije pronalaska su za upotrebu kao adjuvans za vakcinu, pri čemu kompozicije odlažu i/ili sprečavaju imunosenescenciju.

[0197] Bolesti koje su povezane sa imunosenscencijom uključuju kardiovaskularne bolesti, neurodegenerativne bolesti, kao što su Alchajmerova bolest i Parkinsonova bolest, rak, dijabetes melitus tip 2 [101] i autoimune poremec ́aje [102].

Načini administracije (primene)

[0198] Poželjno, kompozicije za upotrebu u pronalasku se daju injekcijom, subkutano ili alternativno intravenozno, ili intraperitonealno. Dalji detalji u vezi sa kompozicijama pogodnim za primenu injekcijom date su u sledec ́em odeljku. U alternativnim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku treba da se daju u gastrointestinalni trakt. Poznato je da je imunološki sistem moduliran prisustvom bakterija i bakterijskih proteina u gastrointestinalnom traktu. Kompozicije za upotrebu u pronalasku se primenjuju oralno, ali se mogu primeniti rektalno, intranazalno, ili bukalnim ili sublingvalnim putevima.

[0199] U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se davati kao pena, kao sprej ili gel.

[0200] U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se davati kao supozitorije, kao što su rektalne supozitorije, na primer u obliku ulja teobroma (kakao puter), sintetičke tvrde masti (npr. suppocire, vitepsol) , glicero-želatin, polietilen glikol ili sastav glicerina sapuna.

[0201] U određenim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku se primenjuje u gastrointestinalni trakt preko cevi, kao što je nazogastrična sonda, orogastrična sonda, gastrična sonda, jejunostomska sonda (J cev), perkutana endoskopska gastrostomija (PEG), ili otvor, kao što je otvor na zidu grudnog koša koji omoguc ́ava pristup stomaku, jejunumu i drugim odgovarajuc ́im pristupnim otvorima.

[0202] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se davati jednokratno, ili se mogu davati uzastopno kao deo režima lečenja. U određenim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku treba da se daju svakodnevno.

[0203] U određenim izvođenjima za upotrebu u pronalasku, tretman prema pronalasku je prac ́en procenom mikrobiote creva pacijenta.

[0204] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu da se daju pacijentu kome je dijagnostikovan rak, ili za koji je utvrđeno da ima rizik od raka. Kompozicije se takođe mogu davati kao profilaktička mera za sprečavanje razvoja raka kod zdravog pacijenta.

[0205] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se davati pacijentu za kojeg je utvrđeno da ima abnormalnu mikrobiotu creva. Na primer, pacijent može imati smanjenu ili odsutan kolonizaciju Enterococcus spp, posebno Enterococcus gallinarum.

[0206] Uopšteno, kompozicije za upotrebu u pronalasku su za lečenje ljudi, iako se mogu koristiti za lečenje životinja uključujuc ́i monogastrične sisare kao što su živina, svinje, mačke, psi, konji ili zečevi. Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu biti korisne za poboljšanje rasta i performansi životinja. Ako se daju životinjama, može se koristiti oralna sonda.

Kompozicije

[0207] Generalno, kompozicija za upotrebu u pronalasku sadrži polipeptid flagelina iz roda Enterococcus i posebno iz vrste Enterococcus gallinarum.

[0208] U poželjnim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku je inkapsulirana da bi se omoguc ́ila isporuka flagelina u crevo. Inkapsulacija štiti kompoziciju od degradacije do isporuke na ciljnu lokaciju kroz, na primer, pucanje hemijskim ili fizičkim stimulansima kao što su pritisak, enzimska aktivnost ili fizička dezintegracija, što može biti izazvano promenama pH. Može se koristiti bilo koji odgovarajuc ́i metod inkapsulacije. Primeri tehnika inkapsulacije obuhvataju zarobljavanje unutar porozne matrice, vezivanje ili adsorpciju na čvrstim površinama nosača, samoagregaciju flokulacijom ili sa agensima za unakrsno povezivanje i mehaničko zadržavanje iza mikroporozne membrane ili mikrokapsule.

[0209] Kompozicije stoga mogu biti farmaceutski prihvatljive. Obično c ́e uključivati komponente pored polipeptida flagelina (ili nukleinske kiseline), npr. oni obično uključuju jedan ili više farmaceutskih nosača i/ili ekscipijenata.

[0210] Kompozicije se mogu davati ljudima u tečnom obliku. U takvim izvođenjima, pre primene, međutim, kompozicija može biti u netečnom obliku. Na primer, iako se neki terapeutici proizvode u tečnom obliku, zatim se pune i distribuiraju i daju takođe u tečnom obliku, drugi terapeutici se liofilizuju tokom proizvodnje i rekonstituišu u tečni oblik u vreme upotrebe. Tako se kompozicija za upotrebu u pronalasku može osušiti, kao što je liofilizovana formulacija.

[0211] Kompozicija može uključivati konzervanse kao što su tiomersal ili 2-fenoksietanol. Poželjno je, međutim, da terapeutici budu suštinski oslobođeni (tj. manje od 5µg/ml) materijala žive, npr. bez tiomersala. Terapeutici koji ne sadrže živu su tipičniji. Terapeutika bez konzervansa je posebno favorizovana.

[0212] Da bi se poboljšala termička stabilnost, kompozicija može da sadrži agens za zaštitu od temperature. Više detalja o takvim agentima dato je u nastavku.

[0213] Za kontrolu toničnosti, tipično je uključiti fiziološku so, kao što je natrijumova so. Obično se koristi natrijum hlorid (NaCl), koji može biti prisutan između 1 i 20 mg/ml, npr. oko 10+2mg/ml NaCl. Druge soli koje mogu biti prisutne uključuju kalijum hlorid, kalijum dihidrogen fosfat, dinatrijum fosfat dehidrat, magnezijum hlorid, kalcijum hlorid itd.

[0214] Kompozicije c ́e generalno imati osmolalnost između 200 mOsm/kg i 400 mOsm/kg, češc ́e između 240-360 mOsm/kg, i tipičnije c ́e pasti u opsegu od 290-310 mOsm/kg.

[0215] Kompozicije mogu uključivati jedan ili više pufera. Tipični puferi uključuju: fosfatni pufer; Tris pufer; boratni pufer; sukcinatni pufer; histidinski pufer (posebno sa adjuvansom aluminijum hidroksida); ili citratni pufer. Puferi c ́e obično biti uključeni u opsegu 5-20 mM.

[0216] pH kompozicije c ́e generalno biti između 5,0 i 8,1, a tipičnije između 6,0 i 8,0, npr. 6.5 i 7.5, ili između 7.0 i 7.8.

[0217] Kompozicija je tipično sterilna. Kompozicija je takođe tipično nepirogena, npr. sadrži <1 EU (jedinica endotoksina, standardna mera) po dozi, na primer <0,1 EU po dozi. Sastav je često bez glutena.

[0218] Kompozicija može uključivati materijal za jednokratnu primenu, ili može uključivati materijal za višestruku primenu (tj. 'multidozni' komplet). Uključivanje konzervansa je tipično za aranžmane sa više doza. Kao alternativa (ili kao dodatak) uključivanju konzervansa u višedozne kompozicije, kompozicije mogu biti sadržane u kontejneru koji ima aseptični adapter za uklanjanje materijala.

[0219] Ljudski proteinski terapeutici se tipično daju u zapremini doze od oko 0,5 ml, iako se deci može davati polovina doze (tj. oko 0,25 ml).

[0220] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu takođe da sadrže jedan ili više imunoregulatornih agenasa. Često, jedan ili više imunoregulatornih agenasa uključuje jedan ili više adjuvansa. Adjuvansi mogu uključivati TH1 adjuvans i/ili TH2 adjuvans, o čemu se dalje govori u nastavku.

[0221] Kompozicije se mogu pripremiti kao injekcije, bilo kao tečni rastvori ili suspenzije. Čvrsti oblici pogodni za rastvaranje, ili suspenziju u tečnim nosačima pre ubrizgavanja, takođe se mogu pripremiti (npr. liofilizovana kompozicija ili kompozicija osušena smrzavanjem sprejom). Kompozicija se može pripremiti za lokalnu primenu, npr. kao mast, krema ili prah. Kompozicija se može pripremiti za oralnu primenu, npr. kao tableta ili kapsula, kao sprej ili kao sirup (opciono sa ukusom). Kompozicija se može pripremiti za plućnu primenu, npr. kao inhalator, koristec ́i fini prah ili sprej. Kompozicija se može pripremiti kao supozitorije ili pesar. Kompozicija se može pripremiti za nazalnu, ušnu ili okularnu primenu, npr. kao kapi. Kompozicija može biti u obliku kompleta, dizajniranog tako da se kombinovana kompozicija rekonstituiše neposredno pre davanja sisaru. Takvi kompleti mogu da sadrže jedan ili više antigena u tečnom obliku i jedan ili više liofilizovanih antigena. U određenim izvođenjima, flagelin za upotrebu u pronalasku prisutan u kompoziciji može biti fuzionisan ili konjugovan sa jednim ili više antigena.

[0222] Kada se kompozicija priprema neposredno pre upotrebe (npr. kada je komponenta predstavljena u liofilizovanom obliku) i predstavljena je kao komplet, komplet može da sadrži dve bočice, ili može da sadrži jedan vec ́ napunjen špric i jednu bočicu, sa sadržajem šprica koji se koristi za reaktivaciju sadržaja bočice pre injekcije.

[0223] Kompozicije koje se koriste kao terapeutici sadrže imunološki efikasnu količinu polipeptida ili nukleinske kiseline koja kodira, kao i bilo koje druge komponente, po potrebi. Pod „imunološki efikasnom količinom“ podrazumeva se da je primena te količine pojedincu, bilo u jednoj dozi ili kao deo serije, efikasna za lečenje ili prevenciju. Ova količina varira u zavisnosti od zdravstvenog i fizičkog stanja pojedinca koji se leči, starosti, taksonomske grupe pojedinca koji se leči (npr. neljudski primat, primat, itd.), kapaciteta imunološkog sistema pojedinca da sintetiše antitela, željenog stepena zaštite, formulacije vakcine, procene lekara o zdravstvenoj situaciji i drugih relevantnih faktora. Očekuje se da će količina pasti u relativno širokom rasponu koji se može utvrditi kroz rutinska ispitivanja. Kada je više od jednog antigena uključeno u kompoziciju, dva antigena mogu biti prisutna u istoj dozi ili u različitim dozama.

[0224] Kao što je gore pomenuto, kompozicija može da sadrži agens za zaštitu od temperature, a ova komponenta može biti posebno korisna u kompozicijama sa adjuvansom (posebno onima koje sadrže mineralni adjuvans, kao što je so aluminijuma). Kao što je opisano u referenci 103, tečno sredstvo za zaštitu temperature može se dodati u tečnu kompoziciju vakcine da bi se snizila njena tačka smrzavanja, npr. da smanji tačku smrzavanja na ispod 0°C. Stoga se kompozicija može čuvati ispod 0°C, ali iznad tačke smrzavanja, da bi se sprečilo termičko raspadanje. Sredstvo za zaštitu od temperature takođe dozvoljava zamrzavanje kompozicije dok štiti adjuvanse mineralne soli od aglomeracije ili sedimentacije nakon zamrzavanja i odmrzavanja, a takođe može zaštititi kompoziciju na povišenim temperaturama, npr. iznad 40°C. Početna tečna vakcina i tečno temperaturno zaštitno sredstvo mogu se mešati tako da tečno temperaturno zaštitno sredstvo formira od 1-80% zapremine finalne smeše. Odgovarajuc ́i agensi za zaštitu od temperature treba da budu bezbedni za ljudsku primenu, da se lako mešaju/rastvore u vodi i da ne oštec ́uju druge komponente (npr. antigen i adjuvans) u kompoziciji. Primeri uključuju glicerin, propilen glikol i/ili polietilen glikol (PEG). Pogodni PEG-ovi mogu imati prosečnu molekulsku težinu u rasponu od 200-20.000 Da. U jednom izvođenju, polietilen glikol može imati prosečnu molekulsku težinu od oko 300 Da ('PEG-300').

[0225] Pronalazak obezbeđuje kompoziciju koja sadrži: (i) jedan ili više polipeptida flagelina; i (ii) agens za zaštitu od temperature. Ova kompozicija se može formirati mešanjem (i) tečne kompozicije koja sadrži jedan ili više antigena(a), sa (ii) agensom za zaštitu od temperature. Smeša se tada može čuvati npr. ispod 0°C, od 0-20°C, od 20-35°C, od 35-55°C ili više. Može se čuvati u tečnom ili zamrznutom obliku. Smeša može biti liofilizovana. Kompozicija se alternativno može formirati mešanjem (i) osušene kompozicije koja sadrži jedan ili više antigena(a), sa (ii) tečnom kompozicijom koja sadrži agens za zaštitu od temperature. Tako se komponenta (ii) može koristiti za rekonstituisanje komponente (i).

[0226] Kompozicija se može primeniti oralno i može biti u obliku tablete, kapsule ili praha. Ostali sastojci (kao što je vitamin C, na primer) mogu biti uključeni kao sredstva za uklanjanje kiseonika i prebiotički supstrati da bi se poboljšala isporuka i/ili delimična ili potpuna kolonizacija i preživljavanje in vivo.

[0227] Kompozicija za upotrebu u pronalasku uključuje terapeutski efikasnu količinu polipeptida flagelina kao što je ovde opisano. Terapijski efikasna količina polipeptida flagelina je dovoljna da izvrši blagotvorno dejstvo na pacijenta.

[0228] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijente ili nosače. Primeri takvih pogodnih ekscipijenata mogu se naći u referenci [104]. Prihvatljivi nosači ili razblaživači za terapeutsku upotrebu su dobro poznati u farmaceutskoj struci i opisani su, na primer, u referenci [105]. Primeri pogodnih nosača uključuju laktozu, skrob, glukozu, metil celulozu, magnezijum stearat, manitol, sorbitol i slično. Primeri pogodnih razblaživača uključuju etanol, glicerol i vodu. Izbor farmaceutskog nosača, ekscipijensa ili razblaživača može biti izabran s obzirom na nameravani način primene i standardnu farmaceutsku praksu. Farmaceutske kompozicije mogu sadržati kao nosač, ekscipijens ili razblaživač, ili kao dodatak, bilo koje pogodno vezivo(a), lubrikant(e), agens(e) za suspendovanje, agens(e) za oblaganje, agens(e) za rastvaranje. Primeri pogodnih veziva uključuju skrob, želatin, prirodne šec ́ere kao što su glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza slobodnog protoka, beta-laktoza, kukuruzni zaslađivači, prirodne i sintetičke gume, kao što su bagrem, tragakant ili natrijum alginat, karboksimetil celuloza i polietilen gliko. Primeri pogodnih maziva uključuju natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat, natrijum hlorid i slično. U farmaceutskoj kompoziciji mogu biti i konzervansi, stabilizatori, boje, pa čak i arome. Primeri konzervansa uključuju natrijum benzoat, sorbinsku kiselinu i estre p-hidroksibenzojeve kiseline. Antioksidansi i suspendujući agensi se takođe mogu koristiti.

[0229] U nekim izvođenjima, kompozicija sadrži više od jednog polipeptida flagelina iz roda Enterococcus za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka. U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži polipeptid flagelina sa SEK ID BR: 1 i najmanje još jedan polipeptid flagelina iz roda Enterococcus. U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži polipeptid flagelina sa SEK ID BR:1 i najmanje jedan polipeptid flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum.

[0230] U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži polipeptid flagelina sa SEK ID BR:1 i najmanje jedan polipeptid flagelina izabran iz grupe koju čine SEK ID BR 2-42. U nekim izvođenjima, kompozicija može da sadrži najmanje 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40 ili 45 flagelin polipeptida iz rod Enterococcus i posebno iz vrste Enterococcus gallinarum. U nekim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku sadrže manje od 50 flagelin polipeptida iz iste vrste (npr. manje od 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 ili 3 soja) i, opciono, ne sadrže polipeptide flagelina bilo koje druge vrste. U nekim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku sadrže 1-40, 1-30, 1-20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1- 7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25 ili 31-50 polipeptida flagelina iz iste vrste i, opciono, ne sadrže polipeptide flagelina iz bilo koje druge vrste.

[0231] U nekim izvođenjima u kojima kompozicija za upotrebu u pronalasku sadrži više od jednog polipeptida flagelina, pojedinačni polipeptidi flagelina mogu biti za odvojenu, simultanu ili sekvencijalnu primenu. Na primer,

2

kompozicija može da sadrži sve polipeptide flagelina, ili se polipeptidi flagelina mogu čuvati odvojeno i davati odvojeno, istovremeno ili uzastopno. U nekim izvođenjima, više od jednog polipeptida flagelina se čuvaju odvojeno, ali se mešaju zajedno pre upotrebe.

[0232] Kompozicije za upotrebu u skladu sa pronalaskom mogu ili ne moraju zahtevati marketinško odobrenje.

[0233] Kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu da sadrže farmaceutski prihvatljive ekscipijente, razblaživače ili nosače.

[0234] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako se koristi u pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri č emu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno.

[0235] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako se koristi u pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri č emu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj rak dojke. U poželjnim izvođenjima rak je rak dojke. U poželjnim izvođenjima, rak je stadijum IV raka dojke.

[0236] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako se koristi u pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri č emu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj rak pluc ́a. U poželjnim izvođenjima rak je rak pluc ́a.

[0237] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako se koristi u pronalasku; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj rak jetre. U poželjnim izvođenjima rak je hepatom (hepatocelularni rak).

[0238] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kao što je ovde opisano; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i gde je poremec ́aj rak debelog creva. U poželjnim izvođenjima rak je kolorektalni adenokarcinom.

[0239] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako je ovde opisan; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i gde je poremec ́aj rak.

[0240] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kao što je ovde opisano; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj neimunološkogeni rak.

[0241] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kao što je ovde opisano; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremec ́aja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj imunološkogeni rak.

[0242] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako je ovde opisan; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj izabran iz grupe koju čine rak pluc ́a ne-malih c ́elija, rak pluc ́a malih c ́elija, rak skvamoznih c ́elija, adenokarcinom, tumori žlezde, karcinoidni tumori, nediferencirani karcinomi.

[0243] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako je ovde opisan; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj izabran iz grupe koju čine hepatoblastom, holangiokarcinom, holangiocelularni cistadenorak ili rak jetre koji je rezultat virusne infekcije.

[0244] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kako je ovde opisan; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj izabran iz grupe koju čine invazivni duktalni rak, duktalni rak in situ ili invazivni lobularni rak.

[0245] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži: polipeptid flagelina kao što je ovde opisano; i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent, nosač ili razblaživač; pri čemu je polipeptid flagelina u količini dovoljnoj za lečenje poremećaja kada se daje subjektu kome je to potrebno; i pri čemu je poremec ́aj izabran iz grupe koju čine akutna limfoblastna leukemija (ALL), akutna mijeloična leukemija, adrenokortikalni rak, rak bazalnih c ́elija, rak žučnih kanala, rak bešike, tumor kostiju, osteosarkom/maligni fibrozni histiocitom, gliom moždanog stabla, moždani tumor, cerebelarni astrocitom, cerebralni astrocitom/maligni gliom, ependimom, meduloblastom, supratentorijalni primitivni neuroektodermalni tumor, rak dojke, bronhijalni adenomi/karcinoidi, Burkitov limfom, karcinoidni tumor, rak grlic ́a materice, hronična limfocitna leukemija, hronična mijelogena leukemija, hronični mijeloproliferativni poremec ́aji, rak creva, kožni T-c ́elijski limfom, rak endometrijuma, ependimoma, rak jednjaka, Juingov sarkom, intraokularni melanom, retinoblastom, rak žučne kese, rak želuca, gastrointestinalni karcinoidni tumor, gastrointestinalni stromalni tumor (GIST), gliom dečjeg vidnog puta i hipotalamusa, Hodgkin limfom, melanom, rak c ́elija ostrvaca, Kaposi sarkom, rak bubrežnih c ́elija, rak larinksa, leukemije, limfomi, mezoteliom, neuroblastom, Non-Hodgkinov limfom, orofaringealni rak, osteosarkom, rak jajnika, rak pankreasa, paratiroidni rak, rak ždrela, adenom hipofize, plazma c ́elija neoplazija, rak prostate, rak bubrežnih c ́elija, retinoblastom, sarkom, rak testisa, rak štitne žlezde ili rak materice.

[0246] Doza nukleinske kiseline (npr. terapeutik na bazi nukleinske kiseline) može imati ≤ 100 µg nukleinske kiseline; na primer. od 10-100µg, kao što su oko 10µg, 25µg, 50µg, 75µg ili 100µg, ali ekspresija se može videti na mnogo nižim nivoima; na primer korišc ́enjem ≤1µg/dozi, <100ng/dozi, ≤10g/dozi, ≤1ng/dozi, itd. Slično, doza proteinskog antigena može imati ≤100µg proteina; na primer od 10-100µg, kao što su oko 10µg, 25µg, 50µg, 75µg ili 100µg. Polipeptid se može primeniti u dozi od oko 0,1-10 mg/kg telesne težine.

[0247] U određenim izvođenjima, farmaceutske kompozicije pronalaska ili kompozicije za upotrebu u pronalasku mogu se davati u jednoj dozi ili poželjnije u ponovljenim dozama. Poželjno je da se ponovljene doze daju otprilike svakih 2, 5, 10, 7, 10 ili 15 dana. U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu se kompozicija primenjuje u dozi od 100 µg/kg, 200 µg/kg, 300 µg/kg, 400 µg/kg, 500 µg/kg, 1 mg/kg , 2 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg, 30 mg/kg, 50 mg/kg, 100 mg/kg, 200 mg/kg ili 500 mg/kg telesne težine subjekta.

[0248] Pogodne jedinice doze uključuju 1 mg, 2 mg, 5 mg, 10 mg, 20 mg, 30 mg, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 500 mg, 1000 mg, 100-500 mg, 500-1000 mg-4, 20mg 5-00-750 mg, 750-1000 mg.

[0249] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju koja sadrži c ́elije domac ́ina za upotrebu u pronalasku. Pogodna dnevna doza ćelija domac ́ina, na primer za odraslog čoveka, može biti od oko 1 x 10<3>do oko 13x10<11>jedinica koje formiraju koloniju (CFU); na primer, od oko 1 x 10<7>do oko 1 x 1010 CFU; u drugom primeru od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<10>CFU.

[0250] U određenim izvođenjima, kompozicija sadrži c ́eliju domac ́ina u količini od oko 1 x 10<6>do oko 1 x 10<11>CFU/g, u odnosu na težinu kompozicije; na primer, od oko 1 x 10<8>do oko 1 x 10<10>CFU/g. Doza može biti, na primer, 1 g, 3 g, 5 g i 10 g. U nekim izvođenjima, kompozicija sadrži mešavinu živih c ́elija domac ́ina i c ́elija domac ́ina koje su ubijene.

[0251] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu se kompozicija primenjuje metodom izabranom iz grupe koju č ine oralni, rektalni, subkutani, nazalni, bukalni, sublingvalni, subkutani, intravenski i intramuskularni načini.

[0252] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži nosač izabran iz grupe koju čine laktoza, skrob, glukoza, metil celuloza, magnezijum stearat, manitol i sorbitol.

[0253] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži razblaživač izabran iz grupe koju čine etanol, glicerol i voda.

[0254] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži ekscipijent izabran iz grupe koju čine skrob, želatin, glukoza, anhidrovana laktoza, laktoza slobodnog protoka, betalaktoza, zaslađivač kukuruza, bagrem, tragakant, natrijum alginat, karboksimetil celuloza, polietilen glikol, natrijum oleat, natrijum stearat, magnezijum stearat, natrijum benzoat, natrijum acetat i natrijum hlorid.

[0255] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, koja dalje sadrži najmanje jedan od konzervansa, antioksidansa i stabilizatora.

[0256] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, koja sadrži konzervans izabran iz grupe koju čine natrijum benzoat, sorbinska kiselina i estri p-hidroksibenzojeve kiseline.

[0257] U određenim izvođenjima, pronalazak obezbeđuje gore pomenutu farmaceutsku kompoziciju, pri čemu kada se kompozicija č uva u zatvorenoj posudi na oko 4°C ili oko 25°C i kontejner se stavlja u atmosferu koja ima 50% relativne vlažnosti, na najmanje 80% bakterijskog soja, mereno u jedinicama koje formiraju kolonije, gde ostaje tokom perioda od najmanje: 1 mesec, 3 meseca, 6 meseci, 1 godina, 1,5 godina, 2 godine, 2,5 godine ili 3 godine.

[0258] U nekim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku je obezbeđena u zatvorenoj posudi koji sadrži kompoziciju kako je ovde opisano. U nekim izvođenjima, zatvorena posuda je kesica ili boca. U nekim izvođenjima, kompozicija za upotrebu u pronalasku je obezbeđena u špricu koji sadrži kompoziciju kako je ovde opisano.

[0259] Kompozicija ovog pronalaska može, u nekim izvođenjima, biti obezbeđena kao farmaceutska formulacija. Na primer, kompozicija može biti obezbeđena kao tableta ili kapsula. U nekim izvođenjima, kapsula je želatinska kapsula ("gel-cap").

[0260] U nekim izvođenjima, kompozicije za upotrebu u pronalasku se daju oralno. Oralna primena može uključivati gutanje, tako da jedinjenje ulazi u gastrointestinalni trakt, i/ili može uključivati bukalnu, lingvalnu ili sublingvalnu primenu kojom jedinjenje ulazi u krvotok direktno iz usta.

[0261] Farmaceutske formulacije pogodne za oralnu primenu uključuju čvrste čepove, čvrste mikročestice, polučvrste i tečne (uključujuc ́i višefazne ili dispergovane sisteme) kao što su tablete; meke ili tvrde kapsule koje sadrže višestruke ili nano-čestice, tečnosti (npr. vodeni rastvori), emulzije ili prahove; pastile (uključujuc ́i one punjene tečnošc ́u); žvake; gelove; brzo dispergujuc ́i dozne oblike; filmove; ovule; sprejeve; i bukalne/mukoadhezivne flastere.

[0262] U nekim izvođenjima farmaceutska formulacija je enterična formulacija, tj. gastrorezistentna formulacija (na primer, otporna na pH želuca) koja je pogodna za isporuku kompozicije za upotrebu u pronalasku u creva oralnom primenom. Enteričke formulacije mogu biti posebno korisne kada je bakterija ili druga komponenta kompozicije osetljiva na kiselinu, npr. sklona degradaciji u uslovima želuca.

[0263] U nekim izvođenjima, enterička formulacija sadrži enteričku oblogu. U nekim izvođenjima, formulacija je enterički obložen oblik doziranja. Na primer, formulacija može biti enterično obložena tableta ili enterično obložena kapsula, ili slično. Enterička obloga može biti uobičajena enterička obloga, na primer, konvencionalna obloga za tabletu, kapsulu ili slično za oralnu primenu. Formulacija može da sadrži filmsku oblogu, na primer, tanki filmski sloj enteričkog polimera, npr. polimer nerastvorljiv u kiselini.

[0264] U nekim izvođenjima, enterička formulacija je suštinski enterična, na primer, gastrorezistentna bez potrebe za enteričkom oblogom. Prema tome, u nekim izvođenjima, formulacija je enterička formulacija koja ne sadrži enteričku prevlaku. U nekim izvođenjima, formulacija je kapsula napravljena od termogelirajuc ́eg materijala. U nekim izvođenjima, termogelirajuc ́i materijal je celulozni materijal, kao što je metilceluloza, hidroksimetilceluloza ili hidroksipropilmetilceluloza (HPMC). U nekim izvođenjima, kapsula sadrži omotač koji ne sadrži nikakav polimer koji formira film. U nekim izvođenjima, kapsula sadrži omotač, a omotač sadrži hidroksipropilmetilcelulozu i ne sadrži nikakav polimer koji formira film (npr. videti [106]). U nekim izvođenjima, formulacija je intrinzična enterička

2

kapsula (na primer, Vcaps® iz Capsugela).

[0265] U nekim izvođenjima, formulacija je meka kapsula. Meke kapsule su kapsule koje mogu, zahvaljujuc ́i dodacima omekšivača, kao što su, na primer, glicerol, sorbitol, maltitol i polietilen glikoli, prisutni u omotaču kapsule, da imaju određenu elastičnost i mekoc ́u. Meke kapsule se mogu proizvesti, na primer, na bazi želatina ili skroba. Meke kapsule na bazi želatina su komercijalno dostupne od različitih dobavljača. U zavisnosti od načina davanja, kao što je, na primer, oralno ili rektalno, meke kapsule mogu imati različite oblike, na primer, mogu biti okrugle, ovalne, duguljaste ili torpedne. Meke kapsule se mogu proizvesti konvencionalnim procesima, kao što su, na primer, Scherer proces, Accogel proces ili proces kapljicama ili duvanjem.

Opšte

[0266] Primena ovog pronalaska c ́e koristiti, osim ako nije drugačije naznačeno, konvencionalne metode hemije, biohemije, molekularne biologije, imunologije i farmakologije, u okviru veština iz ove oblasti. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi. Videti, na primer, reference [107] i [108-114], itd.

[0267] Termin "sadrži" obuhvata "uključujuc ́i" kao i "sastoji se", npr. kompozicija "koja sadrži" X može se sastojati isključivo od X ili može uključivati nešto dodatno, npr. X Y.

[0268] Termin "oko" u odnosu na numeričku vrednost x je opcioni i znači, na primer, x+10%.

[0269] Izraz " u suštini" ne isključuje "potpuno", npr. kompozicija koja je "suštinski oslobođena" od Y može biti potpuno slobodna od Y. Gde je potrebno, Izraz "u suštini" može biti izostavljena iz definicije pronalaska.

[0270] Termin "polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus" obuhvata polipeptide flagelina divljeg tipa i mutirane polipeptide flagelina koji pokazuju imunostimulirajuc ́a svojstva, na primer koji mogu efikasno da aktiviraju TLR5 odgovore. Izraz "polipeptidi flagelina" takođe obuhvata fragmente polipeptide flagelina divljeg tipa i mutiranih polipeptida flagelina koji pokazuju imunostimulirajuc ́a svojstva, na primer koji mogu efikasno aktivirati TLR5 odgovore.

[0271] Referenca na procentualni identitet sekvence između dve sekvence proteina znači da, kada su poređani, taj procenat aminokiselinskih ostataka je isti u poređenju dve sekvence. Ovo poravnanje i procenat homologije ili identiteta sekvence mogu se odrediti korišc ́enjem softverskih programa poznatih u tehnici ove oblasti, na primer onih opisanih u ref. [115]. Poželjna metoda koristi MUSCLE poravnanje proteinskih sekvenci i može se izvesti sa Geneious (78,02% identitet u paru), Blossom62 matricom rezultata, prag=1.

[0272] Reference na procentualni identitet sekvence između dve nukleotidne sekvence znače da je, kada su poređani, taj procenat nukleotida isti u poređenju dve sekvence. Ovo poravnanje i procenat homologije ili identiteta sekvence mogu se odrediti korišćenjem softverskih programa poznatih u tehnici ove oblasti, na primer onih opisanih u odeljku 7.7.18 ref. [116]. Poželjno poravnanje je određeno Smith-Waterman algoritmom za pretragu homologije korišc ́enjem affine pretrage praznina sa vrednošću gap open penalty od 12 i vrednošću gap extension penalty od 2, BLOSUM matrica od 62. SmithWaterman algoritam za pretragu homologije predstavljen je u ref. [117].

[0273] Generalno, osim ako nije drugačije navedeno (na primer u vezi sa fragmentima), identitet sekvence se izračunava preko dužine referentne sekvence (na primer SEK ID BR:1), a ne preko dužine sekvence upita. Stoga se ne smatra da kratke i irelevantne sekvence imaju visoku identičnost sekvenci sa sekvencama pronalaska.

[0274] Osim ako nije posebno navedeno, proces ili metod koji se sastoji od brojnih koraka može sadržati dodatne korake na početku ili na kraju postupka, ili može sadržati dodatne korake koji se mogu umetnuti.

[0275] Ovde su opisana različita izvođenja pronalaska. Značajno je da se karakteristike navedene u svakom izvođenju mogu kombinovati sa drugim specificiranim karakteristikama, da bi se obezbedila dalja izvođenja. Posebno, izvođenja koje su ovde istaknuta kao pogodna, tipična ili poželjna mogu se kombinovati jedno sa drugim (osim kada se međusobno isključuju).

NAČINI ZA SPROVOĐENJE PRONALASKA

Primer 1 - Aktivacija TLR5 reporterskih c ́elija pomoc ́u MRx0518

Rezime

[0276] Ova studija je testirala efikasnost bakterijskog soja MRx0518 da aktivira TLR5 reporterske c ́elije.

Test aktivacije TLR5

[0277] HEK-plave TLR5 c ́elije su c ́elije HEK293 ko-transfektovane sa humanim TLR5 genom i inducibilnim SEAP (sekretovana embrionalna alkalna fosfataza) reporter genom. SEAP gen je stavljen pod kontrolu minimalnog promotera IFN-β fuzionisanog na pet mesta za vezivanje NF-κB i AP-1. Stimulacija sa TLR5 ligandom aktivira NF- κB i AP1 koji indukuju proizvodnju SEAP. Nivo alkalne fosfataze se stoga odnosi na aktivnost TLR5.

• Materijali

Reporterska c ́elijska linija: HEK-Blue hTLR5 (Invivogen, hkb-htlr5)

[0278] Medijum za rast c ́elija: DMEM (Sigma, D6171) sa dodatkom 10% (v/v) FBS (Sigma, F9665), 4 mM L-glutamina (Sigma, G7513), 100 U/ml penicilina i 100 ug/ml streptomicina, (Sigma, P4333), 100 ug/ml normocina (Invivogen, antnr1) i selektivni antibiotici blasticidin (30 ug/ml, Invivogen, ant-bl-05) i zeocin (100 ug/ml, Invivogen, ant-zn-1) Medijumi bez antibiotika: DMEM sa dodatkom 10% (v/v) FBS i 4mM L-glutamina

2

• Uslovi rasta bakterija

[0279] Uslovi rasta bakterija: Sve kulture Enterococcus gallinarum MRx0518 su uzgajane u bujonu ekstrakta kvascakazein hidrolizat-masne kiseline (ICFA) (E&O Laboratories, UK) na 37°C, u anaerobnim uslovima.

[0280] C ́elije MRx0518 u stacionarnoj fazi: 16-18-časovne kulture soja MRx0518 su uzgajane pod gore opisanim uslovima korišc ́enjem 1% inokuluma MRx0518 c ́elija, čuvane zamrznute kao radne banke c ́elija na -80°C.

[0281] C ́elije MRx0518 u kasnoj log fazi: 3 sata (približno) kulture soja MRx0518 su uzgajane pod gore opisanim uslovima korišc ́enjem 10% inokuluma stacionarne faze MRx0518 c ́elija.

• Procedura

[0282] Test aktivacije TLR5 je izveden sa sledec ́im tretmanima u dve doze - 10:1 (3x10<5>bakterija) ili 100:1 (3x10<6>bakterija):

- Žive bakterije MRx0518

- Toplota je ubila MRx0518 bakterije

- CFS iz MRx0518

[0283] Pozitivna kontrola je izvedena sa ultračistim FLA-ST u koncentraciji od 20 ng/ml i 5 ng/ml. Negativna kontrola je izvedena sa medijumom bez antibiotika koji nije sadržao reporterske c ́elije za kontrolu proizvodnje alkalne fosfataze bilo čime osim reporterske c ́elije. Dve dodatne kontrole su izvedene sa ICFA i vodom. Za sve tretmane urađena su tri ponavljanja.

• Priprema živog supernatanta bez c ́elija (CFS) MRx0518

[0284] Živi i CFS tretmani su pripremljeni iz jedne kulture od 10 ml MRx0518 c ́elija kasne log faze nakon centrifugiranja c ́elija na 5000xg tokom 5 minuta na sobnoj temperaturi. Bakterijski talog je jednom ispran u PBS (Sigma, D8537) i resuspendovan u medijumu bez antibiotika do procenjene gustine od 1,4x10<8>CFU/ml (2-struko razblaživanje) i 1,4x10<7>CFU/ml (20-struko razblaživanje). Bakterijski supernatant je sakupljen, filtriran (0,22 um) pod sterilnim uslovima i razblažen 10 puta i 20 puta korišc ́enjem H2O (Sigma, W3500) da bi se obezbedili ekvivalenti za suspenzije bakterija koje su gore navedene. CFS sadrži MRx0518 flagele koje se bacaju u supernatant.

• Priprema c ́elija koje ubijaju toplotu (HK)

[0285] Odvojeno, HK celije su generisane inkubacijom 10 ml kulture MRx0518 c ́elija kasne log faze na 80°C tokom 40 minuta. Nakon centrifugiranja (uslovi opisani iznad) supernatant kulture je odbačen, a c ́elijski talog je jednom ispran u PBS (Sigma, D8537) i resuspendovan u medijumu bez antibiotika do procenjene gustine od 1,4x10<8>CFU/ml (2-struko razblaživanje) i 1,4x10<7>. CFU/ml (20-struko razblaživanje). Kada su pripremljeni, svi tretmani su čuvani na ledu pre upotrebe. Određen je broj živih c ́elija po ml za sve žive i toplotno ubijene MRx0518 c ́elijske preparate.

• Priprema pozitivne kontrole

[0286] Poznati agonist TLR5, flagelin S. typhimurium (ultrapure, FLA-ST ultrapure od Invitrogena, tlrl-epsitfla) je pripremljen pri 200 ng/ml ili 50 ng/ml u H2O.

• Uslovi TLR5 testa

[0287] 20 µl odgovarajuc ́eg tretmana (bakterijske c ́elije, supernatant bez c ́elija, pozitivni kontrolni ligandi, rekombinantni flagelin, negativne kontrole, npr. ICFA, medijum bez antibiotika, H2O, PBS) postavljeno je u duplikatu ili tri primerka u c ́eliju sa 96 bunarića ploče za kulturu (Sigma, CLS3596). 180 µ l suspenzije reporterskih c ́elija je dodato u svaki bunarić da bi se dobila konačna zapremina od 200 ul i konačna koncentracija HEK-plavih TLR5 c ́elija od 3x10<4>. Testovi su inkubirani na 37°C, 5% CO2tokom 22 h.

[0288] Posle inkubacije, 20 ml testa je dodato u 180 ml Quantiblue (Invivogen, rep-qb1) supstrata u novoj ploči sa 96 bunarića i inkubirano na 37°C, 5% CO2tokom 2 h. Ploče koje sadrže Quantiblue su snimljene na čitaču mikroploča (Bio-Rad, iMark) uz očitavanja optičke gustine od 655 nm. Rezultati su uprosečeni iz tehničkih replika, a zatim nezavisni eksperimenti usrednjeni nakon toga da bi se obezbedili podaci za konačne grafikone.

Zaključci

[0289] Tretman sa živim i toplotno inaktiviranim MRx0518 doveo je do srednjeg i visokog nivoa TLR5 odgovora. Ovi podaci pokazuju da soj MRx0518 može da izazove TLR5 odgovor i da se ovaj odgovor ne eliminiše toplotnom inaktivacijom. Ovi podaci sugerišu da flagelin iz roda Enterococcus i posebno MRx0518 flagelin mogu izazvati TLR5 odgovor i da je flagelin toplotno stabilan.

[0290] Najviši nivo aktivnosti TLR5 primec ́en je nakon tretmana sa MRx0518-CFS i bio je čak i viši od poznatog agonista TLR5 FLA-ST (Slika 6). CFS sadrži MRx0518 flagele koje se bacaju u supernatant. Ovi podaci pokazuju da flagelin iz roda Enterococcus, a posebno iz MRx0518, proizvodi veoma jak TLR5 odgovor, i tako može biti koristan u terapiji, posebno u lečenju raka. Ovi podaci takođe pokazuju da je MRx0518 efikasan u izbacivanju svog flagelina u supernatant.

Primer 2 – aktivacija TLR5 od strane CFS-a je posebno jaka za MRx0518

Rezime

[0291] Ova studija je testirala da li aktivacija TLR5 korišćenjem CFS varira između sojeva. I MRx0518 i DSM100110 su flagelirani sojevi Enterococcus gallinarum. Sprovedena je studija kako bi se posmatralo da li CFS iz oba ova soja dovodi do TLR5 odgovora.

Test aktivacije TLR5

[0292] Izveden je TLR5 test kao što je opisano u Primeru 1.

• Procedura

[0293] Test aktivacije TLR5 je izveden sa sledec ́im tretmanima u dve doze - 10:1 i 100:1:

- MRx0518-CFS

- DSM100110-CFS

2

[0294] Tri negativne kontrole su izvedene sa medijumom bez antibiotika, ICFA i vodom. Pozitivna kontrola je izvedena sa ultračistim FLA-ST u koncentraciji od 20 ng/ml. Za sve tretmane urađena su tri ponavljanja.

Zaključci

[0295] MRx0518-CFS je bio u stanju da stimuliše visok TLR5 odgovor. DSM100110-CFS je takođe proizveo TLR5 odgovor na MOI od 100:1, iako je smanjen u odnosu na MRx0518-CFS. Ovi podaci pokazuju da dok supernatant iz oba soja izaziva imunostimulativni odgovor, što varira između sojeva. Ovi podaci su iznenađujuc ́i kako su sojevi MRx0518 i DSM100110 obojeni sojevi Enterococcus gallinarum. MRx0518-CFS proizvodi više TLR5 odgovora u poređenju sa DSM100110-CFS, potencijalno zato što MRx0518 ima poboljšanu sposobnost da izbaci svoj flagelin u supernatant u poređenju sa drugim sojevima Enterococcus gallinarum, što može biti posebno korisno u terapiji.

[0296] Ovi podaci sugerišu da polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu biti efikasniji za upotrebu u lečenju ili prevenciji raka, posebno karcinoma koji su povezani sa TLR5, kao što je rak dojke, kolorektalni i rak želuca.

Primer 3 - Aktivacija TLR5 posle tretmana tripsinom

Rezime

[0297] Ova studija je testirala da li je MRx0518-CFS aktivacija TLR5 zavisna od tripsina.

Test aktivacije TLR5

[0298] Izveden je TLR5 test kao što je opisano u Primeru 1.

• Procedura

[0299] Test aktivacije TLR5 je izveden sa sledec ́im tretmanima u dve doze - samo 10:1 i 100:1 ili u kombinaciji sa tripsinom:

- MRx0518-CFS

- DSM100110-CFS

- YCFA

[0300] Za sve tretmane su izvedena tri ponavljanja.

[0301] Digestija sa 500 µg/ml tripsina je izvršena na CFS (filtriran od 0,22 um, Sigma, T3924), ili ekvivalentnom zapreminom nosača tripsina (Hankov balansirani rastvor soli, Fisher Scientific, 1175129) kao lažna kontrola digestije, tokom 1 sata na 37°C, 5% CO2. Nakon inkubacije, uzorci CFS na kojima je izvršena digestija i kontrolni uzorci su dopunjeni FBS do konačne koncentracije od 10% (v/v) da bi se inhibirala aktivnost tripsina.

[0302] Tri negativne kontrole su izvedene sa medijumom bez antibiotika, HBSS i vodom. Pozitivna kontrola je izvedena sa ultračistim FLA-ST u koncentraciji od 20 ng/ml.

Zaključci

[0303] Aktivacija TLR5 pomoc ́u MRx0518-CFS je ukinuta tretmanom tripsinom (Slika 8). Ovi podaci pokazuju da TLR5 odgovor aktiviraju proteini u MRx0518-CFS. Degradacija ovih proteina tripsinom ukida TLR5 odgovor. Protein flagelina MRx0518 (FlaAMRx0518) sadrži 36 mesta cepanja tripsina, od kojih se neka nalaze u domenima interakcije TLR5.

Primer 4 - Aktivacija TLR5 sa prečišc ́enim proteinima flagelina

Rezime

[0304] Ova studija je testirala stimulativne profile prečišc ́enog MRx0518 i DSM100110 flagelina.

Proizvodnja rekombinantnih flazelin proteina

[0305] Prikaz strategije kloniranja je prikazan na slici 9a. Geni pune dužine za MRx0518 i DSM100110 flagelin su klonirani u rekombinantni ekspresioni konstrukt pQE-30 (koji ima N-terminalnu oznaku 6xHis) korišc ́enjem digestije restrikcionog enzima da bi se proizvelI pQE-30-FlaAMRx0518i pQE-310-Fla10-FlaDSM100110konstrukt. Pozitivne kolonije su identifikovane korišc ́enjem PCR kolonija, digestije restrikcijskih enzima i tehnika sekvenciranja DNK koje su dobro poznate u tehnici ove oblasti.

[0306] Rekombinantni proteini flagelina, FlaAMRx0518i FlaADSM100110su eksprimirani u c ́elijama E.coli i prečišc ́eni korišc ́enjem imobilizovane hromatografije sa metalnim afinitetom i eluacije imidazolom, nakon čega je usledilo uklanjanje endotoksina (videti tabelu ispod). Ovo rezultira preparatima visoke č istoc ́e sa minimalnim nivoom endotoksina. Veličina i čistoc ́a proteina je potvrđena korišc ́enjem SDS-PAGE gela (Slika 9b).

Odgovor doze na prečišc ́ene rekombinantne FlaAMRx0518i FlaADSM100110proteine

[0307] Izveden je TLR5 test kao što je opisano u Primeru 1.

• Procedura

[0308] Test aktivacije TLR5 je izveden sledec ́im tretmanima:

• Rekombinantnim prečišc ́enim FlaAMRx0518 u koncentracijama od 5, 1, 0,2, 0,04 i 0,008 ng/ml

2

• Rekombinantnim prečišc ́enim FlaADSM100110u koncentracijama od 5, 1, 0,2, 0,04 i 0,008 ng/ml

[0309] Negativna kontrola je izvedena sa FLA nosačem u koncentraciji od 5 ng/ml, a pozitivna kontrola je izvedena sa ultračistim FLA-ST u koncentraciji od 20 ng/ml. Za svaki tretman izvedena su tri ponavljanja.

Zaključci

[0310] I rekombinantni FlaAMRx0518i FlaADSM100110mogu aktivirati TLR5 odgovore. Slika 10 upoređuje aktivaciju TLR5 sa različitim dozama rekombinantnih FlaAMRx0518i FlaADSM100110sa tretmanima opisanim u primerima 3 i 4. U koncentraciji od 5 ng/ml, oba rekombinantna proteina flagelina mogu proizvesti TLR5 odgovor koji je vec ́i nego što ga proizvodi dobro- poznati agonist TLR5 FLA-ST koji se koristi u višoj koncentraciji (20 ng/ml). Ovi podaci pokazuju da su polipeptidi flagelina iz vrste Enterococcus gallinarum efikasniji u aktiviranju TLR5 odgovora od S. typhimurium. Poznato je da polipeptidi flagelina iz S. typhimurium potiskuju rast tumora kroz aktivaciju TLR5. Ovi podaci stoga sugerišu da su polipeptidi flagelina iz Enterococcus gallinarum efikasniji od polipeptida flagelina iz S. typhimurium u lečenju ili prevenciji raka.

[0311] FlaAMRx0518i FlaADSM100110imaju različite imunostimulatorne profile. U koncentracijama od 1 ng/ml i 0,2 ng/ml FlaAMRx0518 proizvodi približno pet puta snažniji TLR5 odgovor od FlaADSM100110. I MRx0518 i DSM100110 su veoma srodni sojevi. Oba su sojevi Enterococcus gallinarum sa flagelama, ali eksprimiraju fundamentalno različite flageline koji imaju različite imunostimulatorne profile. Iznenađujuće otkric ́e je da je FlaAMRx0518jak TLR5 aktivator, što pokazuje da je ovaj polipeptid flagelina posebno efikasan u lečenju ili prevenciji raka.

[0312] Ovi primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus agonisti za TLR5. Agonisti TLR5 su uključeni u lečenje limfoma T i B c ́elija. Stoga, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus mogu biti posebno efikasni u lečenju ili prevenciji limfoma T i B c ́elija.

[0313] Pokazalo se da aktivacija TLR5 poboljšava oštec ́enje tkiva izazvano zračenjem. Primeri pokazuju da su polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus jaki aktivatori TLR5 odgovora. Stoga, polipeptidi flagelina iz roda Enterococcus, a posebno vrste Enterococcus gallinarum, mogu biti posebno efikasni u ublažavanju oštec ́enja tkiva izazvanog zračenjem.

Primer 5 - Proizvodnja MRx0518 flaA- mutanta

Rezime

[0314] Stvoren je insercijski mutant NlRx0518 koji je poremetio gen flagelina.

Eksperimentalni uslovi

[0315] Unutrašnji fragment flaA je kloniran u vektor pORI19 (repA-). Dobijeni vektori ƒlaA<int>MRx0518-pORI19 su transformisani u MRx0518 i umetak je integrisan u bakterijski genom korišc ́enjem homologne rekombinacije (videti sliku 13).

[0316] Pozitivne kolonije su pregledane na prisustvo em gena i korišćenjem PCR-a i dalje potvrđene korišc ́enjem sekvenciranja. Fenotipska analiza mutanata korišc ́enjem testova pokretljivosti takođe je potvrdila insercioni mutant MRx0518 flaA-. Umetak sadrži rezistenciju na eritromicin iz pORI19 vektora. Slika 11 pokazuje da MRx0518 flaA-mutant nije pokretljiv na BBL pokretnom agaru sa dodatkom 20 µg/ml eritromicina u poređenju sa divljim tipom. Primer 6 - Aktivacija TLR5 je eliminisana u rezimeu mutanta MRx0518

Rezime

[0317] Ispitana je sposobnost CFS-a iz MRx0518 flaA<->mutanta da aktivira TLR5 odgovor.

Test aktivacije TLR5

[0318] Izveden je TLR5 test kao što je opisano u Primeru 1.

• Procedura

[0319] Test aktivacije TLR5 je izveden sa sledec ́im tretmanima u dve doze - 10:1 i 100:1:

- MRx0518-CFS - MRx0518ƒlaA--CFS

[0320] Pozitivne kontrole su izvedene sa ultračistim FLA-ST u koncentracijama od 5 ng/ml i 20 ng/ml. Urađena je negativna kontrola sa YFCA u dve doze - 10:1 i 100:1. Za sve tretmane urađena su tri ponavljanja.

Zaključci

[0321] Sposobnost MRx0518-CFS da stimuliše TLR5 odgovor je eliminisana u MRx0518 ƒlaA<->mutantu (Slika 12). Ovi podaci pokazuju da je polipeptid flagelina neophodan za aktivaciju TLR5 odgovora pomoc ́u MRx0518-CFS.

Primer 7 – Karakterizacija MRx0518

Rezime

[0322] Morfologija bakterija kao što je veličina, prisustvo ili odsustvo fimbrae/flagella/pilli, ili prisustvo ekstracelularnog matriksa utiče i na pokretljivost i na prijanjanje i stoga su važne u karakterizaciji bakterija.

[0323] MRx0518 kulture su ispitane na nivou elektronskog mikroskopa (skeniranje i transmisija) da bi se omogućila vizualizacija strukture bakterija u vec ́oj rezoluciji i uvec ́anju, od onih koje dozvoljavaju konvencionalne metode svetlosne mikroskopije.

Metodologija

• Prenos elektronska mikroskopija

[0324] Alikvot MRx0518 bakterijske kulture u eksponencijalnoj fazi je primljen direktno iz anaerobne haube u

2

zapečac ́enom Eppendorfu. Kulture su fiksirane u sveže napravljenom ledenom 2,5% glutaraldehid 0,1M Na kakodilatu pH 7,2. Ependorf je nežno preokrenut nekoliko puta pre nego što je stavljen na led i ostavljen da se fiksira 3-5 minuta. Nakon fiksacije, bakterije su kratko centrifugirane do taloga i resuspendovane u vodi čistoće mili-q. Koristec ́i staklenu pipetu, jedna kap fiksirane kulture je naneta na Formvar obložene Cu rešetke od 300 mesh. Bakterije su ostavljene da se talože i adsorbuju oko 1-2 minuta i višak rastvora je uklonjen sa rešetke korišc ́enjem filter papira Whatman No3. 10 µl 2% uranil acetata je naneto na rešetku na nekoliko sekundi i uklonjeno kapilarnim delovanjem korišc ́enjem filter papira kao što je gore opisano. Rešetke su ostavljene da se potpuno osuše pre nego što su ispitane u Philips CM100 TEM pri promenljivom kV.

• Skeniranje elektronska mikroskopija

[0325] Alikvot iz iste kulture kao gore je uzet za SEM analizu. Bakterije su fiksirane kao što je gore opisano, ali nisu istaložene. SPI PORE FILTERI (prečnik 25 mm, veličina pora 0,2 um) su prethodno tretirani sa 0,01% poli-lizina neposredno pre nego što su fiksirane bakterije utisnute kroz Luer-Lok špric na filter. Nakon toga je usledilo lagano utiskivanje 1 ml čiste vode kroz filter. Filteri su isečeni na veličinu i dehidrirani kroz seriju rastvora etanola (50%, 70% 90% i 3 x 100%). Filteri su zatim uronjeni uzastopno kroz sve vec ́e koncentracije heksametildisilazana (HMDS 25%, 50%, 75% u etanolu) sa završnim korakom dehidracije koji je izveden korišc ́enjem 100% HMDS. Ovo je ostavljeno da ispari preko noc ́i. Filteri su osušeni na kritičnoj tački i obloženi paladijumom i zlatom od 10 nm pre nego što su pregledani u Zeiss EVO MA10 skenirajuc ́em elektronskom mikroskopu.

Zaključci

[0326] Obe metode vizualizacije na nivou elektronskog mikroskopa pokazale su da MRx0518 ima flagele (Slika 14). I TEM i SEM analiza su pokazale da MRx0518 ima flagele (čvrste bele strelice). Veličina c ́elije se kretala između 1-2µm. Prisustvo vezikula spoljne membrane bilo je očigledno samo na SEM slikama MRx0518. SEM slika pokazuje ono što izgleda kao vezikule spoljne membrane (bela isprekidana strelica).

Primer 8 - Aktivacija mišjeg TLR5 rekombinantnim flagelin proteinima iz Enterococcus gallinarum sojeva MRx0518 i DSM 100110

Rezime

[0327] MRx0518 je bakterijski soj izolovan iz ljudskog uzorka, dok je DSM 100110 mišjeg porekla. Ispitana je sposobnost rekombinantnih proteina flagelina iz sojeva Enterococcus gallinarum MRx0518 i DSM 100110 da aktiviraju mišji TLR5.

Metodologija

[0328] Rekombinantno prečišc ́eni MRx0518 (FliCMRx0518) i DSM 100110 (FliCDSM100110) su proizvedeni kao što je opisano u Primeru 4.

[0329] Izveden je TLR5 test kao što je opisano u Primeru 1. Test aktivacije TLR5 je izveden sa sledec ́im tretmanima: - Rekombinantno prečišc ́eni FliCMRx0518u koncentracijama od 5, 1, 0,2, 0,04 i 0,008 ng/ml - Rekombinantno prečišc ́eni FliCDSM100110u koncentracijama od 5, 1, 0,2, 0,04 i 0,008 ng/ml Izvršena su tri nezavisna ponavljanja.

Zaključci

[0330] I FliCMRx0518i FliCDSM100110su aktivirali mišji TLR5 i nije bilo razlike u nivoima aktivacije između FliCMRx0518i FliCDSM100110pri bilo kojoj dozi (Slika 15). Ovaj efekat se razlikuje od rezultata uočenih za aktivaciju humanog TLR5 od strane FliCMRx0518i FliCDSM100110. Kao što je prikazano u Primeru 4, Slika 10, FliCMRx0518može stimulisati ljudski TLR5 na vec ́e nivoe od FliCDSM100110pri koncentracijama od 1 ng/ml i nižim. Bez vezivanja za bilo kakvu posebnu teoriju, različiti profili aktivacije humanog i mišjeg TLR5 pomoc ́u rekombinantnih proteina flagelina iz različitih sojeva Enterococcus gallinarum mogu biti posledica razlika u sekvenci između FliCMRx0518i FliCDSM100110, kao i varijabilnosti mesta vezivanja između humanog i mišjeg TLR5.

[0331] Kao što je prikazano na Slici 3, pronalazači su primetili da se većina varijacija sekvence između različitih polipeptida flagelina primec ́uje u D2-D3 regionu. Poravnanje sekvenci FliCMRx0518i FliCDSM100110pokazuje veliku varijaciju u domenu D2-D3 (Slika 16). Poravnanje je obavljeno korišc ́enjem softvera za višestruko poravnanje CLUTAL OMEGA v1.2.4.

Primer 9 - Imunostimulaciona sposobnost pokretnih sojeva E. gallinarum i E. casseliflavus dobijenih od ljudi Rezime

[0332] Procenjena je sposobnost pokretnih sojeva E. gallinarum i E. casseliflavus dobijenih od ljudi da aktiviraju humani TLR5 in vitro.

Metodologija

• Testirani sojevi bakterija

[0333]

[0334] MRX i test sojevi su izolovani od jednog od četiri donora iz 4D Pharma kolekcije kultura (brojevi donora F00, F14, F19 i F22).

• Uslovi TLR5 testa

[0335] Sojevi bakterija su kultivisani u YCFA bujonu (E&O Laboratories, Bonnybridge, Scotland, UK) sve dok nisu dostigli stacionarnu fazu rasta. C ́elije i supernatanti su razdvojeni centrifugiranjem na 5,000 x g tokom 5 minuta. Supernatanti su propušteni kroz filter od 0,22 µm i razblaženi u vodi.

[0336] HEK-Blue™-hTLR5 c ́elije (InvivoGen, San Diego, Kalifornija, SAD) su rutinski uzgajane u DMEM sa dodatkom 10% FBS, 4 mM L-glutamina, 4,5 mg/ml glukoze, 100 U/ml penicilina, 100 µg/ml streptomicina, 100 µg/ml Normocina™ (InvivoGen), 30 µg/ml blastocidina (InvivoGen) i 100 µg/ml zeocina (InvivoGen) do gustine 90%. C ́elijske linije su kultivisane na 37 °C i 5% CO2. Sve reagense je omogućila Sigma-Aldrich, Gillingham, Engleska, UK, osim ako nije drugačije navedeno.

[0337] Za ko-kulture, c ́elije koje su porasle do gustine od 90% su jednom isprane fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS) (SigmaAldrich) i resuspendovane u medijumu za rast bez antibiotika u gustini od 140,000 c ́elija/ml. Supernatanti su dodati c ́elijama u multiplicitetu infekcije (MOI) ekvivalentnom 100:1. Pozitivna kontrola testa, Salmonella Typhimurium flagellin (FLA-ST) (InvivoGen), je korišc ́ena pri 20 ng/ml. C ́elije su inkubirane sa supernatantima na 37°C u atmosferi sa 5% CO2tokom 22 h. Dodat je QUANTI-Blue™ (InvivoGen), bunarići su inkubirani još 2 h i zabeležena je optička gustina na 655 nm. Izvedene su tri nezavisne biološke replike za sve sojeve.

[0338] Podaci na Slici 18 predstavljaju tri nezavisne replike.

Zaključci

[0339] Svi ispitani supernatanti sojeva E. gallinarum i E. casseliflavus su bili u stanju da snažno aktiviraju TLR5 odgovor u poređenju sa netretiranom kontrolom. Od tri testirana soja E. casseliflavus, utvrđeno je da Test 6 snažno aktivira TLR5 odgovor, dok Test 5 i DSM25781 izazivaju manje potentne TLR5 odgovore.

Primer 10 -Aktivacija NF-κB pomoc ́u MRx0518

[0340] Ispitivana je sposobnost bakterijskog soja MRx0518 da aktivira NF-κB. Rezultati su predstavljeni na slici 18. MRx0518 supernatant je bio najsnažniji aktivator NF-κB. Aktivacija NF-κB je eliminisana nakon tretmana tripsinom.

[0341] Ovi podaci pokazuju da flagelin iz roda Enterococcus i posebno iz MRx0518 proizvodi veoma jak NF-κB odgovor, i tako može biti koristan u terapiji.

Primer 11 – Diferencijacija T c ́elija

[0342] Sposobnost MRx0518 da indukuje diferencijaciju T-c ́elija je istražena in vitro na mononuklearnim c ́elijama periferne krvi (PBMCs, Stemcell, Cat:70025).

Metodologija

[0343] PBMC su postavljeni u ploče sa 96 bunaric ́a na koje je postavljen anti-CD3 (Ebioscience, CD3 monoklonsko antitelo (OKT3 klon), funkcionalni stepen, kat. br. 16-0037-81) pri 400.000/bunaric ́u u 50µl cRPMI medijuma po bunaric ́u (cRPMI sadrži RPMI 1640 (+L-Glut, 21875-034) 2mM finalna konc. zaliha 200mM.; 10% HIFBS (Gibco life technologies, 10082-147); 50 µm merkaptoetanol (Gibco life technologes i Gibco life technologies), 5-122 % pen/strep (P4333, 10 mg/ml). MRx518 supernatant je zatim dodat u svaki bunarić, 4 000000 u 100 µl/bunaric ́u. Supernatanti su propušteni kroz filter od 0,22 µm i razblaženi na odgovarajuc ́i način u ko-kulturi.

[0344] Nakon 3 dana u inkubatoru na 37°C, c ́elije su uklonjene i ponovo suspendovane u medijumu koji sadrži PMA-(Sigma, kat. br. P8139), jonomicin (Sigma, kat. br. 13909) i GolgiSTOP (BD, Kat. br. 554724) 5 sati. PMA zaliha 1

1

mg/ml u DMSO koji je dalje razblažen u 100 ug/ml (svaki uzorak zahtevao je 50 ng/ml u cRPMI), zaliha jonomicina je bila 1 mM u DMSO (korišc ́en je 1 µM u cRPMI) i koncentracija GolgiStopa je korišc ́ena na 4 µ1/6 ml.

[0345] C ́elije su zatim podvrgnute bojenju protočnom citometrijom: Posle ispiranja, c ́elije su inkubirane sa Viobility 405/520 Fixable Dye iz Miltenyi biotec (1µl/uzorak) ljudski Fc blok, kat. 564219 (1 µl/uzorak) u PBS-u 10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi. Površinska antitela (svako po 2 µ l) su zatim dodata direktno u bunariće 10 minuta u mraku na sobnoj temperaturi - CD3-APC-Vio 770 (Miltenyi, kat. br. 130-113-136), CD4-VioBlue (Miltenyi, kat. br. 130-114-534) i CD25-VioBright FITC (Miltenyi, kat. br. 130-113-283). C ́elije su zatim isprane dva puta u PBS-u i centrifugirane na 300 g/5 min/RT.

[0346] Pufer za bojenje faktora transkripcije eBioscience FoxP3 je zatim korišćen za fiksiranje i permeabilizaciju c ́elija (kat. br. 00-5523). Pratec ́i eBioscience protokol, pripremljen je pufer za perm/fiks korišćenjem 1x koncentrata i 3 razblaživača. C ́elije su fiksirane 1 h na ST, a zatim isprane 2x u 1x Perm ispiranju i centrifugirane na 300 g/5 min/RT. Sledec ́a intracelularna antitela za bojenje ili transkripcioni faktor su dodata uzorcima u perm pranju (1x) tokom 45 mis/mrak/RT ili u frižideru preko noc ́i (do 18 h), nakon čega je sledilo pranje antitela 2x korišćenjem Perm wash (300 µl) i ponovo - suspenzija u PBS (250 µl) za dobijanje na citometru:

• Anti IFNy-PE Vio770 ljudska antitela (Miltenyi, kat. br. 130-114-025)

• Anti IL10-PE ljudska antitela (Miltenyi, kat. br. 130-112-728)

• Anti IL17a-APC ljudska antitela (Miltenyi, kat. br. 130-099-202)

• Anti RoRyt-PE ljudska antitela (Miltenyi, kat. br. 130-103-837)

• Anti Tbet-APC ljudska antitela (Miltenyi, kat. br. 130-098-655

• Foxp3 monoklonsko antitelo (236A/E7), Pe cy7 (ebioscience) kat. broj 25-4777-41

Zaključci

[0347] Kao što se može videti na slici 19, MRx518 supernatant (SP 518) može indukovati diferencijaciju T pomoc ́nih c ́elija i citotoksičnih T c ́elija.

Primer 12 - Generisanje mutanta gena za umetanje flagelina E. gallinarum MRx0518

[0348] Ovaj primer pruža alternativnu strategiju za inaktivaciju gena flagelina u poređenju sa Primerom 5. Gen ƒliC je poremec ́en homologijom vođenom insercijom samoubilačkog plazmida pORI19 (videti sliku 20). Umetanje pORI19 u gen ƒliC potvrđeno je sekvenciranjem DNK i nepokretan fenotip rezultujuc ́eg mutantnog soja je potvrđen in vitro. Metodologija

[0349] Mutant za umetanje flagelina je kreiran korišćenjem nereplikativnog plazmida pORI19 (Emr repA-Ori+; vektor za kloniranje [118]). Unutrašnji fragment gena E. gallinarum MRx0518 fliC je amplifikovan korišc ́enjem prajmera DC020 (SEK ID BR: 43: CCCGGGGGATCCGCGGTAAATGTTGCTAAAGCATCATCG) i DC021 (SEK ID BR: 44: ACGACGGTCGATGACCTGACG9 u pORI19.. Restrikcioni enzimi i Quick Ligase (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) su korišc ́eni prema uputstvima proizvođača. Ovaj konstrukt je razmnožen u E. coli EC101 hemijskom transformacijom [118] i izolovan korišc ́enjem Genopure Plasmid Maxi kompleta (Roche Diagnostics, Bazel, Švajcarska) iz kulture od 500 ml. Izolovana plazmidna DNK je koncentrovana korišc ́enjem 0,3 M natrijum acetata pH 5,2 i etanola do 20 µl.

[0350] Elektrokompetentne c ́elije su uspešno generisane uzgajanjem bakterijskih kultura u sub-inhibitornim koncentracijama glicina, prac ́ene tretmanima mutanolizinom i lizozimom da bi se dodatno oslabio sloj peptidoglikana c ́elijskog zida. Razvijen je protokol za pripremu elektrokompetentnih c ́elija E. gallinarum MRx0518, koji je adaptiran iz prethodno objavljene metode [119]. Ukratko, E. gallinarum MRx0518 je uzgajan 18 h u GM17 bujonu, sa dodatkom 0,5 M saharoze i 3 % (w/v) glicina (Sigma-Aldrich). C ́elije su zatim isprane dva puta sa 0,5 M saharoze i 10% (v/v) glicerola i tretirane sa 10 µg/ml lizozima i 10 U/ml mutanolizina (Sigma-Aldrich) tokom 30 minuta na 37°C. C ́elije E. gallinarum MRx0518 su zatim transformisane elektroporacijom sa 10 mg plazmidne DNK i regenerisane u BHI bujonu pre postavljanja na selektivni BHI agar. Pozitivne kolonije su skrinovane na prisustvo em gena korišc ́enjem prajmera DC047 (SEK ID BR:45: CCAAATTAAAGAGGGTTATAATGAACGAG) i DC048 (SEK ID BR:46: GATGCAGTTTATGCATCCCTTAAC). Umetanje plazmida je potvrđeno za uspešne transformante pomoc ́u PCR amplifikacije i sekvenciranja (GATC Biotech, Konstanz, Nemačka) korišc ́enjem prajmera DC013 (SEK ID BR:47: CCGATAAATAGTAGCAGAGGGAAACC) i DC014 (SEK ID BR:48: GGCTGAATATCCATCAGCTTCCTC).

[0351] In vitro pokretljivost mutanta za umetanje flagelina je procenjena korišc ́enjem BBL™ medijuma za testiranje pokretljivosti sa dodatkom 0,005% (w/v) 2,3,5-trifeniltetrazolijum hlorida (BD, Sparks, MD, USA). Ukratko, sveža kolonija je inokulisana ubodom u 20 ml ravnotežnog medijuma i inkubirana 48 h na 37 ° C u anaerobnim uslovima. Svi testovi su izvedeni u tri primerka.

Sekvence

[0352]

SEK ID BR: 1 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx0518

SEK ID BR:2 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM100110

SEK ID BR:3 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx0554

SEK ID BR:4 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx0556

2

SEK ID BR:5 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1548

SEK ID BR:6 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1650

SEK ID BR:7 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1763

SEK ID BR:8 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1766

SEK ID BR:9 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1775

SEK ID BR:10 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1886 SEK ID BR:11 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum 2A8

SEK ID BR:12 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum 9402

SEK ID BR:13 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum A6981

SEK ID BR:14 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum MRx1649 SEK ID BR:15 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum EG2

SEK ID BR:16 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum SKF1

SEK ID BR:17 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus DSM 7370 SEK ID BR:18 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus 1a6A

SEK ID BR:19 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus 3hl0B

SEK ID BR:20 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus 14-MB-W-14 SEK ID BR:21 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus ATCC12755 SEK ID BR:22 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus DSM4841 SEK ID BR:23 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus DSM20680 SEK ID BR:24 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus EC10

SEK ID BR:25 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus EC20

SEK ID BR:26 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus EC30

SEK ID BR:27 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus F1129

SEK ID BR:28 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus F1129F 46 SEK ID BR:29 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus NBRC 100478 SEK ID BR:30 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus PAVET15 SEK ID BR:31 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus NLAE-zl-G268 SEK ID BR:32 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus NLAE-zl-C414 SEK ID BR:33 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum FDAARGOS-163 SEK ID BR:34 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus MRx0858 SEK ID BR:35 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus casseliflavus DSM25781 SEK ID BR:36 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM28564 SEK ID BR:37 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM28565 SEK ID BR:38 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum F1213F 228 SEK ID BR:39 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM20718 SEK ID BR:40 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM20628 SEK ID BR:41 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum NBRC100675 SEK ID BR:42 - Polipeptid flagelina iz Enterococcus gallinarum DSM24841

REFERENCE

[0353]

[1] Spor et αl. (2011) NatRevMicrobiol. 9(4):279-90.

[2] Eckburg et al. (2005) Science. 10;308(5728):1635-8.

[3] Macpherson et al. (2001) Microbes Infect. 3(12):1021-35

[4] Macpherson et al. (2002) Cell Mol Life Sci. 59(12):2088-96.

[5] Mazmanian et al. (2005) Cell 15;122(1): 107-18.

[6] Chung & Kasper (2010) Curr. Opin. Immunol. 22: 455-460

[7] Macpherson (2006) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 308: 117-136.

[8] Gaboriau-Routhiau et al. (2009) Immunity. 31 : 677-689.

[9] Ivanov et al. (2009) Cell 139: 485-498

[10] Geuking et al. (2011) Immunity 34(5):794-806

[11] Atarashi et al. (2011) Science, 331, 6015, 337-341.

[12] Nutsch & Hsieh, (2012) Current opinion in immunology, 24, 4, 385-391.

[13] Prakash et al.(2011) Cell host & microbe, 10, 3, 273-284.

[14] Sczesnak et al. (2011) Cell host & microbe, 10, 3, 260-272.

[15] Hajam et al. (2017) Experimental & Molecular Medicine 49, e373;

[16] WO2012/097012

[17] Zheng et al. (2017) Science Translational Medicine 9

[18] WO2008/144889

[19] Frank et al. (2007) PNAS 104(34):13780-5.

[20] Scanlan et al. (2006) J Clin Microbiol. 44(11):3980-8.

[21] Kang et al. (2010) Inflamm Bowel Dis. 16(12):2034-42.

[22] Machiels et al. (2013) Gut. 63(8):1275-83.

[23] WO 2013/050792

[24] WO 03/046580

[25] WO 2013/008039

[26] WO 2014/167338

[27] Goldin and Gorbach (2008) Clin Infect Dis. 46 Suppl 2:S96-100.

[28] Azad et al. (2013) BMJ. 347:f6471.

[29] Strickertsson et al. (2014) Genes 5(3): 726-738.

[30] Lu et al. (2015). Functional properties of flagellin as a stimulator of innate immunity. Nat Publ Gr.

[31] Yonekura et al. (2003) Nature 424, 643-650.

[32] Jacchieri et al. (2003) J Bacteriol 185, 4243-7.

[33] Smith et al. (2003) Nat Immunol 4, 1247-1253.

[34] Yoon et al. (2013). NIH Public Access 335, 859-864.

[35] Beatson et al. (2006). Trends Microbiol 14, 151-155.

[36] She et al. (2015) Anal. Chem., 87 (8), pp 4218-4224

[37] Song et al. (2017) Sci Rep. 7: 40878

[38] Kelly et al. (2015) Nature Protocols 10, 845-858

[39] Pettersen EF et al. (2004), J Comput Chem 25(13):1605-12.

[40] Sun et al. (2013) J Bacteriol. 195(11):2550-61.

[41] Attmannspacher et al. (2008) MolMicrobiol 68, 328-341.

[42] Okino et al. (1989) J Bacteriol 171, 2075-82.

[43] Darnton and Berg (2008) J Bacteriol 190, 8223-4.

[44] Kawai and Akira (2007) Trends in Molecular Medicine 13, 11, 460-469

[45] Gewirtz et al. (2011) Journal of Immunology 167, 1882-1885

[46] Uematsu, S. et al. (2006 Nature Immunology 7, 868-874

[47] Steiner (2007). Infection and Immunity 75, 545-552

[48] Cai et al. (2011) Cancer Res. 71(7): 2466-2475

[49] Zheng et al. (2017) Sci Transl Med. 8;9(376).

[50] WO2017/085520

[51] Rhee et al (2008) Gastroenterology, 135, 2, 518-528.e3

[52] Melo et al. (2015) Immunology and Cell Biology 93, 86-98

[53] Cai et al. (2011) Cancer Res. 71(7): 2466-2475

[54] Bohnhorst et al. (2006) Leukemia, 20, 1138-1144

[55] Okamoto et al. (2009) British Journal of Haematology, 147, 582-590

[56] Rakoff-Nahoum et al (2009) Nat Rev Cancer 9: 57-63.

[57] Leigh et al. (2013) PLOSone 9, 1, e85587

[58] Brackett et al. (2016) PNAS E874-E883

[59] Sfondrini et al. (2006) J Immunol 176 (11) 6624-6630

[60] Haabeth et al. (2012) OncoImmunology 1(1):1146-1152.

[61] Lejeune et al. (2006) Cancer Immun. 6:6

[62] Pace et al. (1983) PNAS. 80:8782-6.

[63] Sgadari et al. (1996) PNAS. 93:13791-6.

[64] Arenberg et al. (1996) J. Exp. Med. 184:981-92.

[65] Sgadari et al. (1997) Blood. 89:2635-43.

[66] Vijay-Kumar et al. (2008) J Immunol; 180:8280-8285

[67] Toshkov et al. (2017) Radiat Res.187(5): 570-580

[68] Porte et al. (2015) Antimicrob. Agents Chemother. 59,106064-6072

[69] Bloch et al. (2016) Eur Cytokine Netw.;27(3):63-67

[70] Weinberger (2018) Curr Opin Pharmacol, 41, 34-41.

[71] Lim (2015)Aging Cell 14, 907-915

[72] Mohanty et al. (2015) J Infect Dis, 211(7) 1174-1184.

[73] Fernandez-Ruiz et al.,(2015) Vaccine 201533(51)

[74] Morel et a/.,(2011) Vaccine, 29(13) 2461-2473.

[75] Leal et al., (2001) Immunol 103(3) 375-381

[76] Knudsen et al. (2016), Sci Reps, 6 (19570).

[77] Su et al.,(2008) Vaccine 26(40), 5111-22

[78] Li et al, (2007) J Immunol, 178(8), 5271-5276

[79] Coffman et al.,(2012) Immunity 33(4) 492-503

[80] Olafsdottir et al., Vaccine 33(40) 5302-5307

[81] Didierlaurent et al., J Immunol 2014, 193(4) 1920-1930

[82] Park et al., (2002) J Immunol, 169(3), 1433-1443

[83] Berthoud et al. (2009) JImmunol Methods 340(1) 33-41

[84] Mori et al. (2012), Eur J Immunol 42, 2709-2719

[85] Ren and Torres (2009) Brain Res Rev.;60(1):57-64

[86] Martinon et al. (2002) Mol Cell.; 10(2):417-26.

[87] Murphy et al. (2003) J Exp Med. 2003; 198(12): 1951-1957.

[88] Chan et al. (2006) J Exp Med.; 203(12): 2577-2587.

[89] The Immune Response Basic and Clinical Principles, 1st Edition (2006)

[90] Gaur and Aggarwal (2003).Biochem Pharmacol.;66(8):1403-8.

[91] Wang and Lin (2008) Acta Pharmacol Sin.; 29(11): 1275-1288.

4

[92] Tanaka et al. (2014) Cold Spring Harb Perspect Biol.; 6(10): a016295.

[93] Bettelli et al. (2006) Nature 441:235-238

[94] Fraietta, et al. (2018) Nαt Med. 24(5):563-571

[95] Zhou, et al. (2010) Blood 116(14):2484-93.

[96] Glenn and Whartenby (2014) World J Stem Cells.; 6(5): 526-539.

[97] Heng et al. (2004) Cardiovasc Res. 2004 Apr 1;62(1):34-42.

[98] Rashidi et al. (2018) Biol Blood Marrow Transplant 24, 1260-1263

[99] Fulop et al (2013) Crit Rev Oncog. 2013;18(6):489-513.

[100] Bektas et al. (2017) J Leukoc Biol.; 102(4):977-988.

[101] Fulop et al (2016) Rev Invest Clin.;68(2):84-91.

[102] Fulop et al. (2018) Front Immunol.;8:1960.

[103] WO2006/110603.

[104] Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), Edited by A Wade and PJ Weller

[105] Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)

[106] US 2016/0067188

[107] Gennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472.

[108] Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press).

[109] Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.)

[110] Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds, 1986, Blackwell Scientific Publications)

[111] Sambrook et al. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition (Cold Spring Harbor Laboratory Press).

[112] Handbook of Surface and Colloidal Chemistry (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997)

[113] Ausubel et al. (eds) (2002) Short protocols in molecular biology, 5th edition (Current Protocols).

[114] PCR (Introduction to Biotechniques Series), 2nd ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag)

[115] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30

[116] Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987) Supplement 30 [117] Smith & Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482-489.

[118] Law J et al. (1995) J Bαcteriol 177:7011-7018.

[119] Shepard et αl., B. D. & Gilmore, M. S. In Electroporation and efficient transformation of Enterococcus faecalis grown in high concentrations of glycine in Methods in molecular biology: Vol 47: Electroporation protocols for microorganisms Vol 47 (ed J. A. Nickoloff) 217-226 (Humana Press Inc., 1995)

4

�

�

�

4

�

�

�

�

�

�

2

4

�

�

�

�

2

4

�

2

�

1

11

12

�

14

�

1

�

�

1

11

11

11

11

11

11

11

��

��

��

12

��

12

��

1

11

��

1

14

Claims (15)

Patentni zahtevi

1. Polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji.

2. Polipeptid flagelina za upotrebu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je:

a) polipeptid flagelina je iz vrste Enterococcus gallinarum; i/ili

b) polipeptid flagelina je iz soja deponovanog u NCIMB pod pristupnim brojem NCIMB 42488; i/ili

c) polipeptid flagelina ne sadrži D3 domen; i/ili

d) polipeptid flagelina je u monomernom obliku; i/ili

e) polipeptid flagelina sadrži TLR5 mesto za prepoznavanje koje je najmanje 99%, 99,5% ili 99,9% identično aminokiselinskim ostacima 87-96 i 290-295 u SEK ID BR:1; i/ili

f) polipeptid flagelina je deo bakterijskog flagelarnog sklopa.

3. Polipeptid flagelina za upotrebu prema bilo kojem od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu polipeptid flagelina:

(a) ima najmanje 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:1, ili

(b) ima najmanje 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:2, ili

(c) ima najmanje 75% 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR:3-42, opciono pri čemu polipeptid flagelina ima sekvencu sa najmanje 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa jednom od SEK ID BR:3-16; ili

(d) pri čemu polipeptid flagelina sadrži SEK ID BR:1 ili SEK ID BR:2.

4. Fragment polipeptida flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji, pri čemu fragment sadrži aminokiseline 87-96, 165-272 i 290-295 iz SEK ID BR:1; opciono pri čemu:

a) fragment sadrži aminokiseline 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 iz SEK ID BR: 1; i/ili

b) fragment ima dužinu od najmanje 200, 250, 300 ili 350 amino kiselina.; i/ili

c) fragment ima najmanje 85% identičnosti sekvence sa SEK ID BR: 1; i/ili

d) polipeptid flagelina je definisan prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3.

5. Polipeptid flagelina za upotrebu prema patentnim zahtevima od 1 do 3, konjugovan sa antigenom, kao što je antigen patogena ili antigen tumora.

6. Fuzioni polipeptid koji sadrži polipeptid flagelina za upotrebu u terapiji, pri čemu je polipeptid flagelina definisan prema bilo kojem patentnih od zahteva od 1 do 5; pri čemu fuzioni polipeptid opciono sadrži antigen, kao što je antigen patogena ili tumorski antigen.

7. Farmaceutska kompozicija koja sadrži fragment polipeptida flagelina iz roda Enterococcus, pri čemu fragment:

a) sadrži aminokiseline 87-96, 165-272 i 290-295 iz SEK ID NO:1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača; ili

b) sadrži aminokiseline 2-32, 87-96, 165-272, 234-358, 290-295 iz SEK ID NO: 1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača.

8. Fragment polipeptida flagelina ili farmaceutske kompozicije za upotrebu prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, pri čemu:

a) polipeptid je deo bakterijskog flagelarnog sklopa; i/ili

b) polipeptid dodatno sadrži jedan ili više antigena.

9. Polinukleotidna sekvenca koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji; opciono pri čemu je polipeptid flagelina definisan prema bilo kom od patentnih zahteva od 2 do 5; dalje opciono gde kodirana polipeptidna sekvenca ima najmanje 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% ili 99,9% identičnosti sekvence sa SEK ID BR:1 ili je SEK ID BR:1.

10. C ́elija domac ́ina

a) koja eksprimira rekombinantni polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji; ili b) koji sadrži rekombinantnu polinukleotidnu sekvencu koja kodira polipeptid flagelina iz roda Enterococcus, za upotrebu u terapiji; opciono pri čemu je polipeptid flagelina definisan prema bilo kom od patentnih zahteva od 2 do 9.

11. Vektor ili plazmid koji sadrži polinukleotidnu sekvencu prema patentnom zahtevu 9.

12. C ́elija domac ́ina koja sadrži vektor ili plazmid prema patentnom zahtevu 11; opciono pri čemu c ́elija domac ́in dodatno eksprimira heterologni antigen, kao što je antigen patogena ili tumorski antigen.

13. Kompozicija za upotrebu u terapiji, pri čemu kompozicija sadrži polipeptid flagelina prema bilo kom od patentnih zahteva od 1 do 4, fragment flagelin polipeptida prema patentom zahtevu 5, fuzioni polipeptid prema patentom zahtevu 7, polinukleotid prema patentom zahtevu 10, c ́eliju domac ́ina prema bilo kom od patentih zahteva 11 i 13, ili vektor prema patentom zahtevu 12.

14. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 13, za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka; opciono pri čemu je

a) kompozicija za upotrebu u lečenju imunološkogenih tumora; i/ili

b) kompozicija je za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije raka pluc ́a, raka dojke, raka jetre ili raka debelog creva; i/ili

c) kompozicija je za upotrebu u metodi za smanjenje veličine tumora, smanjenje rasta tumora, sprečavanje metastaza ili sprečavanje angiogeneze.

15. Kompozicija za upotrebu prema patentnom zahtevu 14,

1

a) za upotrebu u lečenju, prevenciji ili odlaganju imunosenscencije; ili b) za upotrebu kao pomoc ́no sredstvo za vakcinu; ili

c) za upotrebu u poboljšanju c ́elijske terapije, kao što je CAR-T

opciono pri čemu

i) kompozicija povec ́ava nivo i/ili aktivnost NF-kB; i/ili

ii) kompozicija je za oralnu primenu; i/ili

iii) kompozicija sadrži jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata ili nosača.

1