RS63123B1

RS63123B1 - 1,2,3’,5’-tetrahidro-2’h-spiro[indole-3,1’-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3’-dion jedinjenja kao terapeutski agensi koji aktiviraju tp53

Info

Publication number: RS63123B1
Application number: RS20220326A
Authority: RS
Inventors: Marcin Feder; Maria Mazur; Iwona Kalinowska; Joanna Jaszczewska-Adamczak; Wojciech Lewandowski; Jakub Witkowski; Sabina Jelen; Katarzyna Wos-Latosi
Original assignee: Adamed Pharma S A
Priority date: 2018-01-16
Filing date: 2019-01-09
Publication date: 2022-05-31
Also published as: SG11202006048PA; BR112020014427A2; CY1125134T1; NZ765577A; CA3086440A1; AU2019209114B2; EP3740492B1; UA127457C2; MX2020007580A; SI3740492T1; KR102755407B1; EA202091718A1; WO2019141549A9; AU2019209114A1; SMT202200172T1; CN111566110B; JP7284190B2; WO2019141549A1; US20200354372A1; IL276006B2

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na nova 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion jedinjenja i ova jedinjenja za upotrebu kao lek, posebno za lečenje bolesti kod kojih su poremećene interakcije p53-Mdm2 protein-protein i/ili koje su osetljiva na inhibiciju interakcija p53-Mdm2, uključujući proliferativne bolesti kao što je rak. Štaviše, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutske sastave koje sadrže gore pomenuta jedinjenja.

Pozadina pronalaska

[0002] p53 je faktor transkripcije koji reaguje na ćelijski stres regulacijom transkripcije brojnih gena koji određuju sudbinu ćelija. U uslovima stresa p53 može pokrenuti zaustavljanje ćelijskog ciklusa i procese popravke DNK ili programe ćelijske smrti kao što su apoptoza ili starenje. Izbor između ovih odgovora zavisi od vrste i intenziteta signala stresa. U ljudskim ćelijama aktivnost p53 je strogo kontrolisana njegovim negativnim regulatorom, proteinom po imenu Mdm2. Mdm2 formira čvrst kompleks sa domenom transaktivacije p53, blokirajući njegovu sposobnost da reguliše ciljne gene i da ispoljava antiproliferativne efekte. Pored toga, Mdm2 promoviše nuklearni izvoz i brzu degradaciju p53 od strane ubikvitin-proteazomskog sistema.

[0003] Kao ključni igrač u ćelijskom odgovoru na stres, p53 služi kao glavna prepreka tumorigenezi. Pacijenti sa Li-Fraumeni sindromom koji nasleđuju mutirani p53 veoma su podložni raku. Miševi sa oštećenim genom p53 izgledaju normalno, ali su skloni spontanom razvoju različitih neoplazmi do 6 meseci starosti. Ova istaknuta tumorska supresivna uloga p53 uzrokuje da je njegova funkcija onemogućena u gotovo svim ljudskim vrstama raka, bilo kroz mutaciju gena p53 ili kroz aberantnu ekspresiju proteina koji deluju kao njegovi negativni regulatori kao što je Mdm2.

[0004] Amplifikacija gena Mdm2 je prijavljena u više od 10% od 8000 različitih karcinoma kod ljudi, uključujući sarkome, tumore pluća i želuca, pri čemu gen p53 nije oštećen. Više drugih tumora stiče polimorfizam jednog nukleotida u Mdm2 promotoru koji dovodi do 2-3 puta povećanja ekspresije Mdm2 u korelaciji sa ubrzanim formiranjem tumora. Ove promene se percipiraju kao glavni mehanizmi za inhibiciju funkcije p53 kod kancera koji zadržavaju divlji tip p53.

[0005] Funkcionalne genetske studije na miševima su pokazale da je restauracija inaktiviranog p53 dovoljna da izazove brzu regresiju nekoliko različitih tipova tumora. Sledeći ovu liniju, ciljanje interakcije p53-Mdm2 pomoću malih molekula za oslobađanje i reaktivaciju p53 se pojavilo kao obećavajuća terapijska strategija za lečenje karcinoma kod ljudi koji su divljeg tipa p53. Nekoliko grupa malih molekula nepeptidnih inhibitora p53-Mdm2 interakcije je prijavljeno poslednjih godina, uključujući nutline, piperazin-4-fenil derivate, halkone, sulfonamide, benzodiazepindione, spiro-oksindole. MDM2 inhibitori daju uobičajene i različite ć elijske odgovore u normalnim i tumorskim ćelijama koji su u saglasnosti sa prethodnim rezultatima genetskih studija. U normalnim ćelijama, aktivacija p53 inhibitorima MDM2 indukuje zaustavljanje ćelijskog ciklusa, ali ne i smrt ćelije. U tumorskim ćelijama, aktivacija p53 inhibitorima izaziva ne samo zaustavljanje ćelijskog ciklusa, već i smrt ćelije. Ovaj profil pruža izglede za visoku selektivnost i nisku toksičnost potencijalne terapije. Ipak, nijedan od ovih Mdm2 antagonista nije dokazao svoju efikasnost u kliničkim ispitivanjima na ljudima. Dakle, i dalje postoji potreba za novim jedinjenjima sa povećanom potencijom, povoljnom farmakokinetikom i profilom toksičnosti.

[0006] Naša prethodna prijava WO2015/189799 otkriva jedinjenja koja sadrže 1,1’,2,5’-tetrahidrospiro[indol-3,2’-pirol]-2,5’-dion sistem koja pokazuju moćnu i specifičnu antitumorsku aktivnost u in vitro studijama. Međutim, dalje studije su otkrile da je njihova in vivo efikasnost umerena i da najefikasnija jedinjenja pokazuju neprihvatljivo visok klirens u ljudskim mikrozomima što onemogućava njihovu kliničku efikasnost.

[0007] Zbog toga i dalje postoji potreba za jedinjenjima sa odličnom in vitro aktivnošću koja imaju poboljšanu farmakokinetiku i na taj način pokazuju izvanrednu efikasnost protiv karcinoma kako na modelima miševa in vivo, tako iu budućim kliničkim ispitivanjima.

[0008] Ovaj pronalazak rešava problem obezbeđivanjem novih jedinjenja koja sadrže 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2 ,3'- dionski sistem.

Rezime pronalaska

[0009] U prvom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje koje ima sledeću strukturu

pri čemu

R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, -OH, -NH2, -NO2, -CN, -C1-C6- alkil, -O-(C1-C6- alkil), -S-(C1-C6- alkil), -C(O)O-(C1-C6- alkil), -NH(C1-C6-alkil), i -N(C1-C6- alkil)2,

R<2>i R<3>su nezavisno H ili halogen;

R<7>je -OCH3;

R<5>, R<6>, R<8>, R<9>su nezavisno H, halogen, -OCH3, -NH(CH3), ili -N(CH3)2.

Z je C-R<8>ili N, Y je C-R<9>ili N, pod uslovom da Z nije C-R<8>i Y nije C-R<9>u isto vreme,

Poželjno, u formuli (I), R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, -C1-C6-alkil, -O-(C1-C6-alkil), -NH(C1-C6-alkil), i -N(C1-C6-alkil)2. Poželjnije, u definiciji R<1>supstituenta u formuli (I), C1-C6-alkil je C1-C3-alkil.

[0010] Još poželjnije, u formuli (I), R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, CH3, -OCH3, -NH(CH3), and -N(CH3)2. Još poželjnije, R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, -CH3, and -OCH3. Najpoželjnije, R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen.

[0011] Poželjno, u formuli (I), R<2>je H, i R<3>je Cl.

[0012] Poželjno, u formuli (I), R<4>je izo-propil or izo-butil.

[0013] Poželjno, u formuli (I), Z i Y su oba N. Još poželjnije, u takvom izvođenju, R<5>i R<6>su oba -OCH3.

[0014] Poželjno, u formuli (I), Z je C-R<8>i Y je N. Još poželjnije, u takvom izvođenju R<8>je H, i barem jedan od R<5>i R<6>je -OCH3, i drugi je izabran od H, -N(CH3)2, i -OCH3.

[0015] Kao specifično jedinjenje pronalaska, može se pomenuti jedna od sledećih grupa:

(1) (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

(2) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il) - 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(3) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-metilfenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-trimetoksipirimidin-5-il) )- 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1' - pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(4) (3S)- 6-hloro-2'-(3-hloro-4-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il) - 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(5) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-trimetoksipirimidin-5-il) )- 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- p irolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(6) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(7) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'- tetrahidro- 2'H- spiro[indol-3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(8) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(9) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2- il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

(10) (3S)-6'-(butan-2-il)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0016] Kao još specifičnije jedinjenje pronalaska, može se pomenuti jedna od sledećih grupa:

(7) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(10) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2- il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

(11) (3S)-6'-(butan-2-il)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0017] Alternativno, kao specifičnije jedinjenje pronalaska, može se pomenuti jedna od sledećih grupa:

(6) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-[6-(dimetilamino)-4-metoksipiridin-3-il]-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[in dole-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

(8) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'- tetrahidro- 2'H- spiro[indol-3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

(9) (3S)- 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'- tetrahidro- 2'H-spiro[indol- 3,1'- pirolo[3,4-c]pirol]- 2,3'-dion

[0018] Posebno poželjno jedinjenje pronalaska je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturom

<10>w

što zna (č3iS) 6 ch oro- 2 - 3,4- dif u opheny )- 5 (46 dimet o ypyrid n 3 yl) ’ (p an 2 yl) ,2 3 5 - tetrahy o 2 (3S)-6- shploirroo i-n2d'-o(3 e,4-d ,1ifl -u poyrorrfenil)-5'-(4,6-dimetoksip ridin 3-il)-6'-( r opan-2-il)-1,2, 3',5'- tetrahidro- 2'H- spiro[indol- 3,1'-pirolo[3,4-c]pirol] 2,3'-dion

s ructure

[0019] Drugo posebno poželjno jedinjenje pronalaska je jedinjenje predstavljeno sledećom strukturom

što znači (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2,3 ',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.

[0020] Drugi aspekt pronalaska se odnosi na jedinjenje formule (I) za upotrebu kao lek.

[0021] Poželjno, lek je koristan za prevenciju i/ili lečenje bolesti izabranih iz grupe koju čine kancer, imunološke bolesti, inflamatorna stanja, alergijske kožne bolesti povezane sa prekomernim razmnožavanjem, zaslepljujuće bolesti i virusne infekcije.

[0022] Sledeći aspekt pronalaska se odnosi na farmaceutski sastav koji kao aktivni sastojak sadrži jedinjenje formule (I) u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.

[0023] Poslednji aspekt pronalaska se odnosi na metod lečenja i/ili prevencije bolesti izabranih iz grupe koju čine kancer, imunološke bolesti, inflamatorna stanja, alergijske kožne bolesti povezane sa prekomernom proliferacijom, slepeće bolesti i virusne infekcije, koje obuhvataju davanje terapeutski efikasne količine jedinjenja formule (I) ili farmaceutskog sastava kao što je gore definisano.

Kratak opis slika

[0024]

Slika 1 prikazuje in vivo efikasnost za jedinjenje 107 iz međunarodne publikacije WO2015/189799 kao referentno jedinjenje u mišjem modelu humanog osteosarkoma (SJSA-1). SJSA-1 ćelije su inokulisane subkutano (s.c.) u količini od 33106 po mišu; testirano jedinjenje je davano oralno (p.o.) po rasporedu k1d314; 7 miševa po grupi.

Slika 2 prikazuje in vivo efikasnost za jedinjenje 7, 8 i 11 ovog pronalaska na mišjem modelu humanog osteosarkoma (SJSA-1). SJSA-1 ćelije su inokulisane subkutano (s.c.) u količini od 33106 po mišu; testirana jedinjenja su davana oralno (p.o.) po rasporedu k1d314; 8 miševa po grupi.

Detaljan opis pronalaska

[0025] Tamo gde jedinjenja pronalaska mogu postojati u jednom ili više tautomernih oblika, svi takvi oblici iako nisu eksplicitno naznačeni u gornjoj formuli su u okviru ovog pronalaska. Shodno tome, jedinjenja mogu biti prisutna kao smeša tautomera ili kao pojedinačni tautomer.

[0026] Termini korišćeni u ovom pronalasku imaju sledeća značenja. Drugi termini koji nisu definisani u nastavku imaju značenja koja razumeju stručnjaci u ovoj oblasti.

[0027] Termin " C1-C6-alkil" je zasićeni, ravni ili razgranati ugljovodonik sa 1 do 6 atoma ugljenika. Primeri C1-C6-alkila su metil, etil, n-propil, izo-propil, n-butil, terc-butil, sek-butil, n-pentil i n-heksil. Više poželjno, C1-C6-alkil je C1-C4-alkil, C1-C3-alkil ili C1-C2-alkil. Oznaka C1-C4-alkil, C1-C3-alkil, C1-C2-alkil označava zasićeni, ravni ili razgranati ugljovodonik koji ima 1 do 4, 3 ili 2 atoma ugljenika, respektivno. Najpoželjnije, C1-C6-alkil je C1-alkil koji je metil grupa (skraćeno kao Me).

e erm m ao-p eny a r en n e n o o grou mea s p e gr

[0 h0a2lo8g] n Te arsm din f " nhealdog aebno"ve se b mirae iz am peđ suiti F, C inl, r Ber a it I o. Po tožel hjneo p,o ha nltog fe ant j aec ihzamberannt o izm theeđu p F i n Cyl. gr p to the t ogen atom [00 f2 h9e] p T rerrom oin[3 " 4m c ha ylor-rfoelnil r"in kgak so s je em pr.isutan u definiciji grupe R<1>označava fenil grupu koja je supstituisana halogenom kao što je gore definisano u meta poziciji u od osu na tačku vezivanja fenil grupe za atom azota pirolo[ 3,4-c]pirol prstenasti sistem.

[0030] Izraz "Z je C- R<8>ili N, I je C- R<9>ili N, pod uslovom da Z nije C- R<8>i I nije C- R<9>u isto vreme" znači da u jedinjenju pronalaska Z je C- R<8>i I je N, ili Z je N i I je C- R<9>, ili Z je N i Y je N.

[0031] Pošto jedinjenja pronalaska mogu biti kisela ili bazna, ona mogu formirati pogodne kisele adicione soli sa bazom ili kiselinom, respektivno.

[0032] Farmaceutski prihvatljiva kisela adiciona so se odnosi na one soli koje zadržavaju biološku efikasnost slobodnih baza i koje nisu biološki nepoželjne. Kisele adicione soli se mogu formirati sa neorganskim (mineralnim) kiselinama ili organskim kiselinama. Kao primeri kiselina mogu se navesti hlorovodonična, bromovodonična, jodovodonična, fosforna, sumporna, azotna, ugljena, jantarna, maleinska, mravlja, sirćetna, propionska, fumarna, limunska, vinska, mlečna, benzojeva, salicilna, glutaminska, asparaginska, p-toluensulfonska, benzensulfonska, metansulfonska, etansulfonska, naftalensulfonska, kao što je 2-naftalensulfonska, pamoična, ksinafoična, heksanska kiselina.

[0033] Kisela adiciona so se može pripremiti na jednostavan način reakcijom jedinjenja formule (I) sa odgovarajućom neorganskom ili organskom kiselinom u količini koja je suštinski ekvimolarna jedinjenju formule (I), opciono u odgovarajućem rastvaraču kao što je organski rastvarač da bi se formirala so koja se obično izoluje na primer kristalizacijom i filtracijom. Na primer, slobodne baze jedinjenja mogu da se konvertuju u odgovarajuće hidrohloridne soli tretiranjem rastvora jedinjenja, na primer, u metanolu, sa stehiometrijskom količinom hlorovodonične kiseline ili hlorovodonika u metanolu, etanolu ili dietil etru, a zatim isparavanjem rastvarača.

[0034] Slično, farmaceutski prihvatljive bazne adicione soli obuhvataju soli izvedene iz neorganskih baza kao što su natrijum, kalijum, litijum, amonijum, kalcijum, magnezijum, gvožđe, cink, bakar, mangan, aluminijum i slično. Soli dobijene od farmaceutski prihvatljivih netoksičnih organskih baza obuhvataju soli primarnih, sekundarnih i tercijalnih amina, uključujući prirodno prisutne supstituisane amine, ciklične amine i bazične jonoizmenjivačke smole, kao što su izopropilamin, trimetilamin, dietilamin, trietilamin, tripropilanomin i i trietanolamin.

[0035] Jedinjenja formule (I) se mogu dobiti korišćenjem sledećih metoda.

[0036] Jedinjenja na bazi 1',2,5'-tetrahidrospiro[indolo-3,2'-pirolo]-2,5'-diona fuzionisana sa pirolnim prstenom (jedinjenja formule (I)) mogu se dobiti prema sledećoj reakcionoj šemi 1.

[0037] U početku, metil keton C-1 je tretiran sa izatinom C-2 u prisustvu baze, tipično dietilamina (DEA) ili litijum bis(trimetilsilil)amida (LiHMDS).

[0038] Dobijeni aldol C-3 je zatim dehidriran u kiselim uslovima korišćenjem tipično konc. hlorovodonične kiseline (12 M), čime se dobija nezasićeno jedinjenje C-4.

[0039] Paralelno, amid C-6 je pripremljen kuplovanjem amina C-5 sa prop-2-inoinskom kiselinom, poželjno upotrebom reagenasa za kuplovanje, tipično karbodiimidnih reagensa kao što su dicikloheksilkarbodiimid (DCC) ili (3-dimetilaminopropil) -N'etilkarbodiimid hidrohlorid (EDC·HCl).

[0040] Hidroaminacija alkina C-6 sa aminom C-7 i naknadna reakcija sa enonom C-4, dovodi do supstituisanog pirola C-8. Ova reakcija u jednom loncu se obično može izvesti u sirćetnoj kiselini pod mikrotalasnim zračenjem.

[0041] Intermedijer C-8 se može oksidovati u derivat 3-hidroksi-2-oksindola u prisustvu viška baze, tipično natrijum tercbutoksida, odgovarajućeg trialkil fosfita, tipično trimetil ili trietil fosfita, i atmosferskog kiseonika.

[0042] Ovako pripremljena jedinjenja C-9 su ciklizovana u kiseloj sredini, tipično trifluorosirćetnoj kiselini, dajući željene racemske fuzionisane spirociklične oksindole.

[0043] Konačno, poželjni S-enantiomer je odvojen korišćenjem hiralnih HPLC uslova.

[0044] Više detalja o pripremi 1,1’,2,5’-tetrahidrospiro[indolo-3,2’-pirolo]-2,5’-dion jezgra je opisano u našoj prethodnoj patentnoj prijavi WO 2015/189799 A1.

[0045] Odgovarajući ketoni C-1, izatini C-2 i amini su komercijalno dostupni ili se mogu dobiti korišćenjem sledećih metoda.

[0046] Šema 2 ilustruje jednu reprezentativnu metodu za dobijanje 5-amino-2,4-dimetoksipirimidina (C-7A) putem nukleofilne supstitucije hlora na 2 i 4 poziciji u 2,4-dihloro-5-nitropirimidinu (C-7A1) metoksi grupom, i naknadnom redukcijom nitro grupe u 2,4-dimetoksi-5-nitropirimidinu (C-7A2).

[0047] Šema 3 ilustruje reprezentativnu metodu za dobijanje 3-amino-4,6-dimetoksipiridina (C-7B) putem nukleofilne supstitucije hlora na 2 i 4 poziciji u 2,4-dihloro-5-nitropiridinu (C-7B1) metoksi grupom, nakon čega sledi redukcija nitro grupe u 2,4-dimetoksi-5-nitropiridinu (C-7B2).

[0048] Šema 4 ilustruje reprezentativnu metodu za dobijanje 5-amino-4-metoksi-2-(dimetilamino)piridina (C-7C) putem nukleofilne supstitucije hlora na poziciji 2 u 2-hloro-4-metoksi-5 -nitropiridin (C-7C1) metoksi grupom i naknadnom redukcijom nitro grupe u 4-metoksi-2-(dimetilamino)-5-nitropiridinu (C-7C2).

[0049] Šema 5 ilustruje reprezentativnu metodu za dobijanje 5-amino-2,4,6-trimetoksipirimidina (C-7D) nitracijom 2-hloro-4,6-dimetoksipirimidina (C-7D1) na poziciji 5, nakon nukleofilnog supstitucija hlora na poziciji 2 u 2-hloro-4,6-dimetoksi-5-nitropirimidinu (C-7D2) metoksi grupom. Poslednji korak je bila redukcija nitro grupe u 2,4,6-trimetoksi-5-nitropirimidinu (C-7D3).

[0050] Kao što je gore pomenuto, jedinjenja pronalaska su za upotrebu kao lek koji je koristan za prevenciju i/ili lečenje bolesti izabranih iz grupe koju čine kancer, imunološke bolesti, upalna stanja, alergijske kožne bolesti povezane sa prekomernom proliferacijom, slepljenje bolesti i virusne infekcije.

[0051] Posebno, jedinjenja prema pronalasku su korisna za prevenciju i/ili lečenje bolesti povezanih sa disregulacijom ćelijskog ciklusa i apoptozom, odnosno imunoloških bolesti kao š to su na primer autoimune bolesti i stanja povezana sa odbacivanjem transplantacije tkiva/organa. kao što su reumatoidni artritis, bolest transplantata protiv domaćina, sistemski eritematozni lupus, Sjorgenov sindrom, multipla skleroza, Hašimotov tireoiditis, polimiozitis; hronična inflamatorna stanja su astma, osteoartritis, ateroskleroza, Morbus Crohn; inflamatorna ili alergijska stanja kože su psorijaza, kontaktni dermatitis, atopijski dermatitis, alopecija areata, eritema multiforma, dermatitis herpetiformis, skleroderma, vitiligo, angiitis preosetljivosti, urtikarija, bulozni pemfigoid, pemfidermoza, pemfidermoza; hiperproliferativni poremećaj je Li-Fraumeni sindrom; kancer ili tumorske bolesti su benigni ili maligni tumori, sarkomi, kao što su rabdomiosarkom, rak kostiju, npr. osteosarkomi, karcinomi mozga, npr. tumori mekog tkiva mozga, bubrega, jetre, nadbubrežne žlezde, bešike, dojke, želuca, tumori želuca , jajnici, debelo crevo, rektum, prostata, pankreas, pluća, vagina ili štitna žlezda, glioblastomi, multipli mijelom, gastrointestinalni kancer, posebno karcinom debelog creva ili kolorektalni adenom, tumor vrata i glave, melanom, hiperplazija prostate, neoplazija, neoplazija epitelnog karaktera, karcinom dojke, leukemija, kao što su limfomi B ili T-ćelija, vera policitemija, trombocitemija, karcinom adrenokortikalne žlezde, uključujući metastaze u drugim organima, respektivno; proliferativna vitre-oretinopatija, virusne infekcije su herpes, papiloma, HIV, hepatitis.

[0052] U lečenju gore navedenih bolesti, jedinjenja pronalaska se mogu davati kao hemijsko jedinjenje, ali će se tipično koristiti u obliku farmaceutskih sastava, koji sadrže jedinjenje prema pronalasku ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so kako je definisano gore kao aktivni sastojak, u kombinaciji sa farmaceutski prihvatljivim nosačima i ekscipijentima.

[0053] U lečenju gore navedenih bolesti, farmaceutski sastavi pronalaska se mogu davati na bilo koji način, poželjno oralno ili parenteralno, i imaće oblik preparata namenjenog za upotrebu u medicini, u zavisnosti od nameravanog puta primene.

[0054] Čvrsti preparati mogu biti u obliku, na primer, tableta ili kapsula pripremljenih na konvencionalne načine sa farmaceutski prihvatljivim neaktivnim sastojcima kao što su vezivni agensi (npr. preželatinizovani kukuruzni skrob, polivinilpirolidon ili hidroksipropil metilceluloza); punila (npr. laktoza, saharoza, karboksimetilceluloza, mikrokristalna celuloza ili kalcijum hidrogen fosfat); maziva (npr. magnezijum stearat, talk ili silicijum dioksid); dezintegranti (npr. krospovidon, krompirov skrob ili natrijum skrob glikolat); sredstva za vlaženje (npr. natrijum lauril sulfat). Tablete mogu biti obložene prema metodama koje su dobro poznate u tehnici sa konvencionalnim oblogama, oblogama za odlaganje/kontrolisanje oslobađanja ili enteričkim oblogama. Tečni preparati za oralnu primenu mogu biti u obliku, na primer, rastvora, sirupa ili suspenzija, ili mogu biti predstavljeni kao suvi proizvod za rekonstituciju sa vodom ili drugim pogodnim nosačem pre upotrebe. Takvi tečni preparati se mogu pripremiti na konvencionalne načine sa farmaceutski prihvatljivim neaktivnim sastojcima kao što su agensi za suspendovanje (npr., sorbitol sirup, derivati celuloze ili hidrogenizovane jestive masti); emulgatori (npr. lecitin ili bagrem); nevodeni prenosioci (npr. bademovo ulje, uljni estri, etil alkohol ili frakcionisana biljna ulja); i konzervansi (npr. metil p- ili propil hidroksibenzoat ili sorbinska kiselina). Preparati mogu takođe da sadrže odgovarajuće pufere, arome, boje i zaslađivače.

[0055] Preparati za oralnu primenu mogu biti na odgovarajući način formulisani postupcima poznatim stručnjacima u ovoj oblasti da bi se dobilo kontrolisano oslobađanje aktivnog jedinjenja.

[0056] Parenteralna primena obuhvata primenu intramuskularnom i intravenskom injekcijom i infuziju (infuziju) intravenozno. Formulacije za parenteralnu primenu mogu biti u obliku jedinične doze, na primer, u ampulama ili u kontejnerima za više doza, sa dodatkom konzervansa. Sastavi mogu biti u obliku suspenzija, rastvora ili emulzija u uljnim ili vodenim nosačima, i mogu sadržati sredstva za formulisanje kao što su agensi za suspendovanje, stabilizaciju i/ili disperziju.

[0057] Alternativno, aktivni sastojak može biti u obliku praha za rekonstituciju sa odgovarajućim nosačem, na primer, sterilnom vodom bez pirogena.

[0058] Metoda lečenja korišćenjem jedinjenja ovog pronalaska će uključivati davanje terapeutski efikasne količine jedinjenja pronalaska, poželjno u obliku farmaceutskog sastava subjektu kome je takav tretman potreban.

[0059] Predložena doza jedinjenja iz ovog pronalaska je od oko 0,1 do oko 1000 mg dnevno, u pojedinačnim ili podeljenim dozama. Stručnjak će shvatiti da će izbor doze potrebne za postizanje željenog biološkog efekta zavisiti od brojnih faktora, na primer specifičnog jedinjenja, upotrebe, načina primene, starosti i stanja pacijenta i tačna doza će na kraju biti određena po nahođenju lekara koji je prisutan.

PRIMERI

[0060] Sledeći primeri nemaju nameru da ograniče pronalazak, već samo služe kao ilustracija predmetnog pronalaska.

Skraćenice

[0061]

AcOEt etil acetat

AcOH sirćetna kiselina

br s široki singlet

CaCl2 kalcijum hlorid

CHCl3 hloroform

d dublet

dd dublet dubleta

ddd dublet dubleta dubleta

dq dublet kvarteta

DEA N,N’-dietilamin

DCC N,N’-dicikloheksilkarbodiimid

DCM dihlorometan

EDC·HCl N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilkarbodiimid hidrohlorid

EtOH etanol

ekv. ekvivalenti

ESI elektrosprej jonizacija

h sat(i)

HCI hlorovodonik

HPLC Hromatografija visokih performansi

L litar

LiHMDS litijum bis(trimetilsilil)amid

m multiplet

MeOH metanol

MgSO4 magnezijum sulfat

mL mililitar(i)

MsOH metansulfonska kiselina

MW mikrotalas

NaHCO3 natrijum bikarbonata

NaOH natrijum hidroksid

Na2SO4 natrijum sulfat

NMR Nuklearna magnetna rezonanca

NP HPLC Tečna hromatografija visokih performansi normalne faze

-OMe metoksi grupa

-OEt etoksi grupa

p.a. Puriss pro anlisi

PTSA·H2O monohidrat p-toluensulfonske kiseline

q kvartet

RP-HPLC Tečna hromatografija visokih performansi reverzne faze

s singlet

sep septet

SFC Superkritična fluidna hromatografija

SQD MS Maseni spektrometar sa jednim kvadrupolnim detektorom

t triplet

TFA trifluorosirćetna kiselina

TFAA trifluorosirćetni anhidrid

THF tetrahidrofuran

TLC Hromatografija tankog sloja

UPLCMS Masena spektrometrija tečne hromatografije ultra performansi

µL mikrolitar

[0062] TLC je izvedena sa silika gelom 60 F254na aluminijumskim folijama (Sigma-Aldrich, Merck) korišćenjem odgovarajućih sistema rastvarača. Vizuelizacija je uglavnom vršena UV svetlošću (254 nm).

UPLC-MS metod:

[0063] UPLCMS analize su obavljene na UPLC tečnom hromatografu opremljenom PDA detektorom i SKD MS detektorom, koji radi pod ESI(+) ili ESI(-) koristeći C18 kolonu, 2,1 mm 3 100 mm, 1,7 mm (AKUITI UPLC BEH ili ekvivalent). HPLC ili LC/MS metanol, HPLC voda, HPLC ili LC/MS mravlja kiselina, p.a. Kao mobilna faza korišćen je 25% rastvor amonijaka i njihova smeša. Radni uslovi su bili sledeći: protok mobilne faze 0,45 mL/min, talasna dužina 210 - 400 nm, zapremina injekcije 1 mL, temperatura kolone 60 °C, temperatura autosamplera 5 °C. Analiza je sprovedena 5,5 min 1,5 min za "kašnjenje sledeće injekcije". Gradijentno eluiranje sa linearnim tokom:

Rešenja su pripremljena na sledeći način:

[0064] Priprema mobilne faze A1 - bazni gradijent: 25 mL mravlje kiseline i 250 mL 25 % rastvora amonijaka dodato je u 250 mL vode. Degas koristite ultrazvučnu kupku 10 min.

[0065] Priprema mobilne faze A2 - kiseli gradijent: 50 mL mravlje kiseline je dodato u 250 mL vode. Degas koristite ultrazvučnu kupku 10 min.

[0066] Mobilna faza B: Metanol Super Gradient.

Sintetički postupci:

Intermedijer C-4A: 6-hloro-3-(3-metil-2-oksobutiliden)-1H-indol-2-on

[0067]

[0068] Reakciona posuda od 5 L je napunjena sa aldolom C-3A (1015 g, 3.79 mol, 1 ekv.) i dodat je EtOH (2.85 L). Suspenzija je zagrejana na 55 °C i 12 M HCl (202 mL, 2,42 mol, 0,64 ekv.) je dodato u jednoj porciji. Zatim je zagrevanje nastavljeno do temperature ključanja etanola. Utvrđeno je da je potrebno više EtOH (500 mL) zbog brzog taloženja proizvoda C-4A. Posle 1 h UPLCMS analiza je pokazala 98% površine pika proizvoda. Zagrevanje je prekinuto i započeto je hlađenje reakcione smeše. Kada je temperatura reakcione smeše dostigla 50 °C, cela smeša je prebačena u čašu i ohlađena na 0 - 5 °C. Čvrsti ostatak je filtriran i ispran sa 1,3 L hladnog EtOH. Čvrsti proizvod je sušen u laboratorijskoj sušari (40 °C) tokom 3 h, a zatim osušen na vazduhu UPLCMS analizi).

Intermedijer C-3A: 6-hloro-3-hidroksi-3-(3-metil-2-oksobutil)- 2,3 dihidro 1H-indol 2 on

[0069]

[0070] Reakciona posuda od 15 L je napunjena 6-hloroisatinom ([1000 g, 5,5 mol, 1 ekv.) i EtOH (7 L), a zatim je dodat 3-metilbutanon (2,94 L, 27,5 mol, 5 ekv.) u jedno- porciji Reakciiona smeša je zagrejana do 40 °C i DEA (250 mL, 2,41 mol, 0,44 ekv.) je dodata u jednom obr ku Za im je zagrevanje nastavljeno do temperature ključanja etanola. Posle 1 h UPLCMS analiza je pokazala 71 % proizvoda u reakcionoj smeši. Z grevanje je nastavljeno još 1 sat i nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 93 % proizvoda. Reakciona smeša je ohlađena na 50 °C, a zatim je cela smeša prebačena u balon sa okruglim dnom i svi tečni sastojci su uklonjeni. Ostatak je suspendovan u DCM (3,4 L) i kuvan pod refluksom 1 h. Posle tog vremena zagrevanje je zaustavljeno i n-heksan (2 L) je dodat u jednoj porciji. Sadržaj balone je ohlađen na oko 5 °C i mešan 1,5 h na ovoj temperaturi. Dobijena smeša je filtrirana i tako dobijena čvrsta supstanca je isprana sa 500 mL smeše DCM/n-heksan (1:1), a zatim je osušena na vazduhu preko noći. Kao rezultat, dobijen je očekivani aldol proizvod C-3A kao siva čvrsta supstanca (965 g, 98,5 % čistoće prema UPLCMS analizi). Mešavina rastvarača je posle filtracije redukovana in vacuo do oko 1,5 L, dodat je n-heksan (700 mL) i dobijena suspenzija je mešana 0,5 h na sobnoj temperaturi. Druga filtracija praćena dvostrukim ispiranjem smešom DCM/n- heksan (150 mL, 1:1, za sva ko ispiranje) i sušenjem na vazduhu dala je drugi deo aldol proizvoda C-3A (50 g, 99,1 % čistoće). Ukupan prinos aldola C-3A bio je 69 % (1015 g, 922,5 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-4B: 6-hloro 3-(3-metil-2-oksopentiliden)-2,3-dihidro-1H-indol-2-on

[0071]

[0072] Reakciona posuda od 250 mL je napunjena sa aldolom C-3B (11 g , 39 mmol, 1 ekv.) i dodat je EtOH (32 mL) u jednoj porciji. Suspenzija je zagrejana na 55 °C i 12 M HCl (1,63 mL, 19,5 mmol, 0,5 ekv.) je dodato u jednoj porciji. Zatim je zagrevanje nastavljeno do temperature ključanja etanola. Posle 1 h UPLCMS analiza je pokazala 98 % proizvoda. Reakciona smeša je ohlađena na 0 - 5 °C i mešana 0,5 h. Čvrsti ostatak je filtriran i ispran malim delom hladnog EtOH. Čvrsti proizvod je osušen na vazduhu preko noći. Kao rezultat, jedinjenje C 4B je dobijeno kao narandžasta čvrsta supstanca (5 g, 49 % prinos, 99 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-3B: 6-hloro-3-hidroksi-3-(3-metil-2-oksopentil) -2,3-dihidro-1 H-indol-2-on e

[0073]

[0074] U posudi sa okruglim dnom (250 mL) -hloroisatin (15 g 83 mmol, 1 ekv.) je suspendovan u EtOH (70 mL) a zatim 3-metilpent-2-on (51,3 mL, 415 mmol, 5 ekv.) je dodat u jednom porciji. Reakciona smeša je zagrejana do 40 °C i DEA (4,34 mL, 42 mol, 0,5 ekv.) je dodata u jednom porciji. Zatim je zagrevanje nastavljeno do temperature ključanja etanola. Posle 1 h UPLCMS analiza je pokazala 60 % proizvoda. Zagrevanje je nastavljeno još 2 sata i nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 99% proizvoda. Nakon hlađenja do sobne temperature, svi tečni sastojci sa uklonjeni u vakumu. Ostatak je suspendovan u AcOEt (50 mL) i mešan na sobnoj temperaturi 1 h. Posle tog vremena sadržaj balona je ohlađen na oko 5 °C i mešan 1,5 h na ovoj temperaturi Dobijena smeša je filtrirana tako dobijena čvrsta supstanca je isprana sa malom količinom hladnog EtOH, a zatim je os šena na vazduhu preko oći. Kao rezul a , dobijen je očekivani aldol proizvod C-3B kao svetlo braon čvrsta supstanca (5,1g 985 % čistoće prema UPLCMS analizi). Ostatak nakon filtracije je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (30% do 60% AcOEt u n heksanu). Posle hromatografije drugi deo proizvoda C-3B je dobijen kao svetlo braon čvrsta supstanca (5,9 g) sa 97 % čistoće (prema UPLCMS analizi). Ukupan prinos aldola C 3B bio je 47 % (11 g, 98 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-6A: N-(3-hlorofenil)prop-2-inamid

[0075]

[0076] U posudi sa okruglim dnom od 2 L sa dva grla i opremljenom mehaničkim mešanjem, 3-hloroanilin (75 g, 590 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u 500 mL DCM (HPLC kvaliteta). Zatim je u kapima dodata prop-2-inoična kiselina (53,5 g, 760 mmol, 1,3 ekv.) rastvorena u 100 mL DCM (pojavila se so amina). U sledećem koraku EDC·HCl (145 g, 760 mmol, 1.3 ekv.) je dodat u nekoliko porcija (tokom dodavanja reakciona boca je hlađena u ledenom kupatilu da bi se izbeglo refluksovanje DCM). Posle potpunog dodavanja EDC HCl, reakciona smeša je mešana 2 h na sobnoj temperaturi ,a zatim je smeša polako prebačen u čašu koja sadrži 500 mL vode i 250 g leda. Mešanje je n stavljeno na 05 °C oko 15 min, a zatim je beli talog odfiltriran, ispran sa 100 mL hladne vode i osušen na vazduhu. Kao rezultat, dobijen je očekivani amid C-6A kao bela čvrsta supstanca (102 g, prinos 96,6 %, čistoća 96,3 % prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-6B: N-(5-hloro-2-fluorofenil)prop-2-inamid

[0077]

[0078] Prop-2-inoična kiselina (15,16 g, 216,4 mmol, 1,05 ekv.) je dodata u jednom delu u mešani rastvor 5-hloro-2- fluoroanilina (30 g, 206,1 mmol, 1 ekv.) u toluenu (400 mL) koji je hlađen u kupatilu led/voda. Smeša je mešana 15 min, a zatim je dodat DCC (44,65 g, 216,4 mmol, 1,05 ekv.) u porcijama uz održavanje temperature ispod 10 °C. Mešanje je nastavljeno na 5 °C tokom 2 h, zatim je čvrsti DCU sakupljen filtracijom, i ispran toluenom (150 mL) i na kraju smešom AcOEt/n-heksan (150 mL, 1:9). Filtrat je koncentrovan do zapremine od oko 100 mL i mešan 15 min na sobnoj temperaturi. Dobijeni talog je sakupljen filtracijom, ispran smešom toluen/nheksana (20 mL, 1:1), n-heksana (20 mL) i sušen na vazduhu 16 h da bi se dobilo 15,29 g željenog proizvoda kao bela čvrsta supstanca. Filtrat je stavljen u frižider na 3 h i dobijeni talog je sakupljen filtracijom, ispran smešom toluen/n-heksana (20 mL, 1:1), n-heksana (20 mL) i osušen na vazduhu. 16 h da bi se dobilo 13,29 g amida C-6B. Filtrat je koncentrovan do zapremine od približno 20 mL i zatim je polako dodat heksan (400 mL) uz mešanje. Smeša je refluksovana 30 min, a vrući rastvor je filtriran, koncentrovan do približno 100 mL i stavljen u frižider na 18 h. Dobijeni precipitat je sakupljen filtracijom, ispran sa n-heksanom (2 x 20 mL) i osušen na vazduhu 16 h da bi se dobilo dodatno 7,19 g amida C-6B. Ukupan prinos proizvoda C-B6 bio je 88 % (35,77 g).

Intermedijer C-6C: N-(5-hloro-2-metilfenil)prop-2-inamid

[0080] U posudi sa okruglim dnom od 2 L sa dva grla i opremljenom mehaničkim mešanjem, 5-hloro-2-metilanilin (75 g, 530 mmol, 1 ekv.) je rastvoren u 1000 mL DCM (HPLC kvaliteta). Zatim je u kapima dodata prop-2-inoična kiselina (49 g, (590 mmol, 1,3 ekv. ) rastvorena u 100 mL DCM (HPLC kvaliteta) (pojavila se so amina). U sledećem koraku je dodat EDC·IHCl u nekoliko porcija (tokom dodavanja reakciona boca je hlađena u ledenom kupatilu da bi se izbeglo refluksovanje DCM).Posle potpunog dodavanja EDC·HCl, reakciona smeša je mešana 1 h na sobnoj temperaturi. Cela smeša je prebačena u čašu koja sadrži 750 mL vode i 250 g leda. Mešanje je nastavljeno na 0 5°C oko 15 min, a zatim je beli talog odfiltriran, ispran sa 100 mL hladne vode i osušen na vazduhu. Kao rezultat, očekivani amid C-6C je dobijen kao bela čvrsta supstanca (81 g, 80 % prinos, 99,1 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-6D: N-(3-hloro-4-fluorofenil)prop-2-inamid

[0081]

[0082] U posudu sa okruglim dnom od 1 L sa dva grla i opremljenu šipkom za magnetno mešanje i termometrom, dodat je 3- hloro-4-fluoroanilin (14,8 g, 100 mmol, 1 ekv.), a zatim DCM (200 mL, HPLC kvaliteta) i prop. -2-inoična kiselina (9,1 g, 130 mmol, 1,3 ekv.). Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i dodat je EDC·HCl (25,2 g, 130 mmol, 1,3 ekv.) u nekoliko porcija. Reakcija je egzotermna i treba izbegavati prekoračenje 5 °C tokom dodavanja. Posle potpunog dodavanja EDC·HCl, smeša je mešana 1 h na 5 °C. Posle ovog vremena, ledeno kupatilo je uklonjeno i u reakcionu smešu je dodato 200 mL hladne vode. Reakcija je mešana oko 0, 5 h, a nastali talog je filtriran i ispran sa 100 mL hladne vode . Ovako dobijena čvrsta supstanca je ponovo rastvorena u hloroformu, a rastvor je ispran vodom, osušen preko Na2S04 i rastvarač je uparen do suvoće. Dobijeni proizvod je osušen u vakumu. Kao rezultat, dobijen je očekivani amid C-6D kao svetlo žuta čvrsta supstanca (19,2 g, prinos 98 %, čistoća 98 % prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-6E: W-(3,4-difluorofeni)prop-2-inamid

[0083]

[0084] U posudu sa okruglim dnom od 1 L sa dva grla i opremljenom magnetnom mešalicom i termometrom, dodat je 3,4-difluoroanilin (12,9 g, 9,9 mL, 100 m mol, 1 ekv.), a zatim DCM (300 mL, HPLC kvaliteta) i prop-2-inoična kiselina (9,1 g, 130 mmol, 1,3 ekv. ). Reakciona smeša je ohlađena na 0 °C i dodat je EDC·HCl (24,9 g, 130 mmol, 1,3 ekv.) u nekoliko porcija. Reakcija je egzotermna i treba izbegavati prekoračenje 5 °C tokom dodavanja. Posle potpunog dodavanja EDC·HCl, smeša je mešana 1 h na 5 °C. Posle ovog vremena, ledeno kupatilo je uklonjeno i u reakcionu smešu je dodato 300 mL hladne vode.

u AcOEt:,a rastvor je ispran vodom, osušen preko Na2S04 i rastvarač je uparen do suva. Zatim je proizvod ispran sa 10 mL hladnog DCM i osuš n u vakumu. Kao rezultat toga, dobijen je očekivani amid C-6E kao sivobela čvrsta supstanca (17,3 g, 96 % prinos, 100 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-6F: N-(5-hloro-2,4-difluorofenil)prop-2-inamid

[0085]

[0086] U posudi sa okruglim dnom od 500 mL sa dva grla i opremljenom magnetnom mešalicom, 5-hloro-2,4 difluoroanilin (10 g, 61 mmol,1 ekv.) je rastvoren u DCM (150 mL,HPLC kvaliteta). Zatim je u kapima dodata prop-2-inoična kiselina (5,5 g, 78mmol, 1,3 ekv.) (pojavila se so amina ). Sledeći EDC·HCl (14 g, 78 mmol, 1,3 ekv. ) je dodat u nekoliko porcija (tokom dodavanja reakciona boca je hlađena u ledenom kupatilu da bi se održala sobna temperatura. Posle potpunog dodavanja EDC·HCl, reakciona smeša je mešano još 1 h na sobnoj temperaturi. Posle tog vremena je dodato 150 ml vode i smeša je prebačena u levak za odvajanje. Faze su razdvojene. Vodena faza je ekstrahovana dva puta sa DCM (2 x 100 mL) . Organske frakcije su kombinovane, isprane slanim rastvorom, osušene preko MgSO4 i koncentrovane do približno 50 ml in vacuo, što je rezultiralo gustom suspenzijom. Čvrste supstance su filtritane i osušene da bi se dobilo 8 g kremastih kristala. Filtrat je koncentrovan i zatim prečišćen fleš hromatografijom (n-heksan/AcOEt, 8:1 → 5:1) dajući dodatnih 4,4 g amida C-6F. Kao rezultat, očekivani amid C-6F je dobijen kao krem čvrsta supstanca (1.2,4 g, prinos 94 %, 100 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7A: 5-amino-2,4-dimetoksipirimidin

[0087]

[0088] U QianCap stakleni reaktor (1850 mL) opremljen magnetnom mešalicom dodat je C-7A2 (100 g, 540 mmol), a zatim THF (800 mL). Zatim je u jednom delu dodato 10% paladijuma na ugljeniku (2 g) i reaktor je povezan sa izvorom vodonika. Pritisak vodonika je postavljen na 2 bara i reakcija je dobro mešana tokom 16 h pod kontinuiranim protokom vodonika. Nakon tog vremena, UPLCMS analiza je pokazala potpunu konverziju polaznog materijala. Reakciona smeša je filtrirana kroz Cellite podlogu i filtrat je koncentrovan in vacuo do oko 150 - 200 mL. Zatim je u kapima dodat n-heksan (500 mL) i suspenzija je mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Talog je filtriran, ispran dva puta sa n-heksanom (2 3 50 mL) i osušen u vakumu. Kao rezultat, amin C-7A je dobijen kao žuta/zelena čvrsta supstanca (77,94 g, 93 % prinos, 99 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7A2: 2,4-dimetoksi-5-nitropirimidin

[0089]

[0090] U posudu sa okruglim dnom od 2 L sa tri grla, koja sadrži termometar, kondenzator vode priključak za izvor inertnog gasa (argon) i mehaničku mešalicu, dodat je metanol (1 mL, HPLC kvaliteta) i u atmosferi argona mali komadići natrijuma (65g, 2,83 mol, 2,2 ekv) su polako dodavani tokom oko 1 h uz dobro mešanje (reakcija je egzotermna, ali reakciona smeša nije hlađena; obično se dodaje još jedan komad natrijuma kada se prvi put konzumira). Nakon rastvaranja celog dela natrijuma, reakciona smeša je ohlađena na -5ºC i pažljivo je dodata sveže pripremljena suspenzija C-7A1 (250 g, 1,29 mol, 1 ekv.) u metanolu (500 mL, HPLC kvaliteta) (oko 40 minuta) u malim porcijama uz dobro mešanje. (UPOZORENJE: reakcija je veoma egzotermna), treba izbegavati prekoračenje 10 ºC tokom dodavanja. Š taviše, u toku reakcije formirane su partije čvrstog proizvoda. Nakon što je dodata cela količina suspenzije supstrata, reakciona smeša je održavana na 0 – 5 C oko 0,5 h, a zatim je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu (obično je trebalo oko 2 h). Nakon tog vremena, UPLCMS analiza je pokazala potpunu potrošnju supstrata. Zatim je reakciona smeša ohlađena na oko 5 ºC i čvrsti proizvod je filtriran, i ispran sa malom količinom (100 mL) hladnog metanola. Sirovi proizvod je stavljen u čašu sa vodom (1 L) i dobro suspendovan mehaničkom mešalicom (oko 10 minuta d br g mešanja). Suspenzija je zatim f ltrirana i dobijena čvrsta supstanca je isprana vodom (500 mL), heksanom (200 mL) i osušena na vazduhu preko noći Kao rezult t, dobijeno je 211 5 g jedi jenja C-7A2 k o svetlo žuta čvrsta supstanca (88% prinos, 99% čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7B: 5-amino-2,4-dimetoksipiridin

[0091]

[0092] U QianCap stakleni reaktor (1850 mL) opremljen magnetnom mešalicom dodat je C-7B2 (40 g, 217 mmol), a zatim THF (500 mL). Zatim je u jednom delu dodato 10% paladijuma na ugljeniku (1,5 g) i reaktor je povezan sa izvorom vodonika. Pritisak vodonika je postavjen na 2 bara i reakcoja je dobro mešana tokom 7 h pod kontlnuiranim protokom vodonika. Nakon tog vremena, UPLCMS analiza je pokazala potpunu konverziju početnog materijala. Reakciona smeša je filtrirana kroz Cellit podlogu i filtrat je koncentrovan in vacuo. Kao rezultat, amin C-7B je dobijen kao braon čvrsta supstanca (33 g, 99 % prinos).

Intermedijer C-7B2: 2,4-dimetoksi-5-nitropiridin

[0093]

[0094] U posudu sa okruglim dnom od 2 L sa tri grla, koji sadrži termometar, kondenzator vode, priključak za izvor inertnog gasa (argon) i mehaničku mešalicu, dodat je metanol (900 mL, HPLC kvaliteta) i u atmosferi argona mali komadići natrijuma (26,7). g, 1,16 mol, 2,1 ekv.) su polako dodavani tokom oko 1 h uz dobro mešanje (UPOZORENJE: reakcija je egzotermna, ali reakciona smeša nije ohlađena; obično se dodaje još jedan komad natrijuma kada se prvi put konzumira). Posle rastvaranja celog dela natrijuma, reakciona smeša je ohlađena na -5 °C i pažljivo je dodata sveže pripremljena suspenzija jedinjenja C-7B1 (106,25 g, 0,55 mol, 1 ekv.) u metanolu (100 mL, HPLC kvaliteta) ( oko 30 minuta) u malim porcijama uz dobro mešanje (UPOZORENJE: reakcija je veoma egzotermna, treba izbegavati prekoračenje 10 °C tokom dodavanja). Nakon što je dodata cela količina suspenzije supstrata C-7B1, reakciona smeša je održavana na 0 - 5 °C oko 40 min, a zatim je zagrejana do sobne temperature i

ohlađena ispod 10 °C i čvrsti proizvod je filtriran i ispran sa malom količinom (50 mL) hladnog metanola, vode (100 mL), n-heksana (100 mL) i osušen na vazduhu preko noći. Kao rezultat, dobijeno je 99,3 g jedinjenja C-7B2 kao svetlo žuta čvrsta supstanca (98 % prinos, 97 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7C: 5-amino-4-metoksi-2-(dimetilamino)piridin

[0095]

[0096] U QianCap stakleni reaktor (500 mL) opremljen magnetnom mešalicom dodat je C-7C2 (4,5 g, 22,8 mol), a zatim THF (70 mL) i metanol (70 mL). Zatim je u jednom delu dodato 10% paladijuma na ugljeniku (0,48 g), reaktor je povezan sa izvorom vodonika. Pritisak vodonika je postavjen na 2 bara i reakcija je bila dobro tokom 17 h pod kontinuiranim protokom vodonika na sobnoj temperaturi. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala potpunu konverziju polaznog materijala. Reakciona smeša je filtrirana kroz Cellit podlogu i filtrat je koncentrovan in vacuo do suvoće. Kao rezultat, amin C-7C je dobijen kao tamna čvrsta supstanca (3,9 g; 96 % prinos; 95 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7C2: 4-metoksi-2-(dimetilamino)-5-nitropiridin

[0097]

[0098] Posuda sa okruglim dnom od 0,5 L sa tri grla, koji sadrži termometar, kondenzator vode i levak za kapanje, napunjen je sa C-7C1 (10 g, 50,4 mmol, 1 ekv.), THF (50 mL) i metanolom (200 m L). Cela smeša je mešana na 22 °C tokom 10 min, a zatim je u kapima dodat dimetilamin (13,7 mL, 60 % rastvor u vodi). Posle 1 h bledo žuta čvrsta supstanca je počela da se taloži. Dodata je sledeća porcija dimetilamina (2 mL, 60 % rastvor u vodi) i reakcija je nastavljena još 24 h. Posle tog vremena, reakciona smeša je koncentrovana in vacuo i sirovi materijal je suspendovan u metanolu (70 m L) i vodi (140 mL) . Posle snažnog mešanja tokom 1 h na 0 °C, bledo žuta čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa malom količinom rastvora metanol-voda i osušena pod vakumom. Kao rezultat, jedinjenje C-7C2 je dobijeno kao bledo žuta čvrsta supstanca (10 g; 100 % prinos; 99 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7D: 5-amino-2,4,6-trimetoksipirimidin

[0099]

[0100] U QianCap stakleni reaktor (1850 mL) opremljen magnetnom mešalicom dodat je C -7D3 (46 g, 231 mmol), a zatim MeOH (750 mL). Zatim je u jednom delu dodato 10% paladijuma na ugljeniku (2,5 g) i reaktor je povezan sa izvorom vodonika. Pritisak vodonika je postavljen na 2 bara i reakcija je dobro mešana tokom 24 h pod kontinuiranim protokom vodonika. Nakon tog vremena, TLC analiza je pokaza la potpunu konverz iju početnog materijala . Reakciona smeša je filtrirana kroz Cellit podlogu i

[0102] Metanol (1000 mL) je dodat u posudu sa okruglim dnom od 2 L koja sadrži termometar i magnetnu mešalicu i sve je ohlađeno na 0 °C u smeši voda/led. Zatim je dodat natrijum hidrid (13 g, 327 mmol 1,2 ek, 60 °% u mineralnom ulju) u malim porcijama tokom 30 minuta (UPOZORENJE: Reakcija je egzotermna). Posle 60 minuta mešanja supstrat C-7D2 (60 g, 272 mmol, 1 ekv.) je dodat u nekoliko porcija. Reakcija je veoma egzotermna i tokom dodavanja reakcioni balon je hlađen u kupatilu voda/led. Tokom reakcije primećeno je formiranje čvrstog žutog proizvoda. Reakciona smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu (1 h) i nakon tog vremena TLC analiza (DCM kao eluent) je pokazala potpunu konverziju početnog materijala. U reakcionu smešu je dodato 1 L vode i metanol je uparen Talog je filtriran, spran sa 200 mL n-heksana i osušen na vazduhu. Kao rezultat, jedinjenje C-7D3 je dobijeno kao žuta čvrsta supstanca (46,5 g, 79 % prinos, 100 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Intermedijer C-7D2: 2 hloro-4,6-dimetoksi-5-nitropirimidin

[0103]

[0104] U posudu sa okruglim dnom od 0,5 L sa dva grla, koji sadrži termometar i opremljen magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-7D1 (50 g, 286 mmol, 1 ekv.) nakon čega je dodato TFAA (80 mL, 572 mmol, 2 ekv. )/DCM mešavina (1:1). Smeša je zatim ohlađena u kupatilu sa slanom vodom i ledom do -5 °C. Koncentrovana dima azotna kiselina (14,3 mL, 343 mmol, 1,2 ek) dodata je u kapima u dobro promešanu smešu (UPOZORENJE: Reakcija je veoma egzotermna) na tako da ne prelazi 40 °C. U toku reakcije formirane su partije čvrstog proizvoda. Nakon što je dodata cela količina azotne kiseline, reakciona smeša je ostavljena da dostigne sobnu temperaturu. Nakon tog vremena, TLC analiza je pokazala potpunu potrošnju supstrata (alikvot koji je ugašen vodom i ekstrahovan sa DCM; ploča eluirana sa DCM). Dobijeni gusti beli talog je izliven na led i mešanje je nastavljeno 10 minuta. Vodeni rastvor je ekstrahovan sa DCM (3 x 100 mL). Kombinovani organski slojevi su zatim isprani zasićenim vodenim rastvorom NaHCO3 dok ispiranja nisu ostala na pH 7. Rastvor j e osušen preko MgSO4 i rastvarač je uklonjen u vakuumu da bi se dobilo žuto-belo kristalno jedinjenje C-7D2 (61 g, 97 % prinos, 99 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje (1), C1: (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(24-dimetoksipi imidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3'5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0106] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nak n preparativne; hiralne SFC ( metod A) ili hiralne RP-HPLC odvajanja (metod R) racemskog jedinjenja C-10.C1; > 99 % ee; tr: 7.77 min. (metod R’);<1>H NMR (500 MHz, DiMSO-d6) ä 11.18 (s, 1H) , 8.55 - 8.42 (m, 1H), 7.37 (s, 1H), 7.36 - 7.27 (m, 2H), 7.14 (s, 1H), 7.08 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 6.98 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 6.93 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 7.94 (br s, 3H), 2.43 (sep, J = 7.0 Hiz, 1H), 0.86 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.413 (d, J = 7.0 Hz, 3H);<13>C NMR (126 MHz, DMSO-d6) ä 175.42, 166.58, 164.87, 164.85, 157.89, 144.17, 138.80, 135.26, 134.00, 233.38, 130.76, 127.52, 127.42, 127.30, 126.26, 126.02, 123.70, 123.04, 120.65, 118.41, 116.45, 111.18, 70.20, 55.52, 54.85, 25.47, 21.41, 21.25.

Jedinjenje C-10.C1: 6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-d metoks pirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol- 3,1'-pir lo[З,4-С]pirol-2,3'-dion

[0107]

50 mL TFA je stavljeno u posudu od 100 mL opremljenu magnetnom šipkom za mešanje. Zatim je dodat intermedijer C-9.C1 (17,8 g, 30,6 mmol) u nekoliko porcija i reakciona smeša je snažno mešana tokom 3 h na 40 °C. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 89% pikova proizvoda sa nekim manjim pikovima od nečistoća. Većina kiseline je zatim uparena i ostatak je rastvoren u DCM (100 mL) . Dodato je 100 mL vode i smeša je treti rana sa 3 M NaOH do pH 8. Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahova na sa DCM (23100 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom (30 mL), osušene preko MgSO4 i uparene do suva da bi se dobilo 18 g bež čvrstog jedinjenja C-10.C1 sa 90% čistoće. Sirovi proizvod C-10.C1 je rastvoren u 50 mL metanola (HPLC kvaliteta). Zatim je 25% rastvor natrijum metoksida (10 mL) dodat u kapima u toku 10 minuta i smeša je mešana na sobnoj temperaturi. Posle 24 h UPLCMS analiza je pokazala 97 % očekivanog proizvoda C-10.C 1. Smeša je koncentrovana do polovine zapremine i polako prebačena u mešanu smešu leda (100 g), a zatim zakiseljena 3 M HCl do neutralnog pH. Talog je filtriran, ispran sa 50 mL vode i osušen u vakumu da bi se dobilo jedinjenje C-10.C1 kao bež-narandžasta čvrsta supstanca (14,5 g, 84 % prinos, 98 % čistoća prema UPLCMS analizi).

[0108] Alternativni postupak za pripremu C-10.C1: 12,0 g (19 mmol) intermedijera C-9.C1 rastvoreno je u 50 mL glacijalnog AcOH. Dodat je MsO H (1 ekv.) i smeša je mešana na 40 °C. Posle 16 sati, smeša je prebačena u čašu koja sadrži 100 g leda i 100 mL 25% amonijaka. Čvrsti proizvod je filtriran, ispran sa 50 mL vode i osušen na vazduhu. Prečišćavanjem fleš hromatografijom (DCM/MeOH, 100: 0 □ 98:2) dobijeno je 9,6 g bež-narandžaste čvrste supstance sa 94% čistoće (prema UPLCMS analizi). Prinos: 78 %.

Jedinjenje C-9.C1: 4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-lH-indol-3-il)-N-(3-hlorofenil)-1-(2, 4-dimetoksipirimidin-5-il)-5- (propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid [0109]

[0110] U posudu od 500 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-8.C1 (15 g, 26,6 mmol, 1 ekv.) i THF (200 mL), a zatim trietil fosfit (6,81 mL, 39,8 mmol, 1,5 ekv.). Zatim je u nekoliko porcija dodat natrijum terc-butoksid (5,11 g, 53,2 mmol, 2 ekv.). Reakciona smeša je mešana 3 h na sobnoj temperaturi u atmosferi vazduha (boca je opremljena CaCl2 cevčicom). Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 82 % željenog proizvoda i 10 % glavne nečistoće. Reakciona smeša je polako prebačena u ohlađenu (0 - 5 °C) mešavinu vode (150 mL) i 12 M HCl (5 mL). Posle dodavanja AcOEt (100 mL) cela smeša je prebačena u levak za odvajanje. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je još jednom ekstrahovana sa AcOEt (100 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom, osušene preko MgSO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Sirovi proizvodi su prečišćeni korišćenjem fleš hromatografije (CHCl3/MeOH 100:0 □ 98:2). Kao rezultat, dobijeno je 5,86 g C-9.C1 sa čistoćom od 93,7 %. Prinos: 38 %.

Jedinjenje C-8.C1: 4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-N-(3-hlorofenil)-1-(2,4-dimetoksipirimidin- 5-il)-5-(propan-2-il)- 1H-pirol-3-karboksamid

[0112] U posudi sa okruglim dnom od 500 m L opremljenoj magnetnom mešalicom, jedinjenja C-4A (21 g, 117 mmol, 1 ekv.), C- 6A (29,25 g, 117 mmol, 1 ekv.) i C-7A (20 g, 130 mmol, 1,1 ekv.) suspendovano je u 90% vodenom rastvoru AcOH, a boca je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 70 °C i mešana na ovoj temperaturi 24 h. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 60% očekivanog proizvoda. Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i isparena do suvoće. Reakcija je ponovljena i ostatak iz dve serije je kombinovan i prečišćen prema sledećoj proceduri:

Čvrsti ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (30% do 50% AcOEt u n-heksanu). Sve frakcije koje su sadržale proizvod su koncentrovane do 500 mL i ostavljene na sobnoj temperaturi. Posle 24 sata, ružičasta čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa 50 mL n-heksana i osušena na vazduhu (40,8 g, 9 6,5 % čistoće prema UPLCMS analizi). Filtrat je isparen do suvoće da bi se dobilo dodatnih 6,6 g proizvoda C-8.C1, čistoće od 50%. Prinos: 33 %.

Jedinjenje (2), C2: (3S) -6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro- 2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metoda B) ili hiralnog RP-HPLC (metoda N) odvajanja racemskog jedinjenja C-10.C2; > 99 % ee; tr : 9.31 min. (metod N');<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) ä 11.23 (br s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 7.45 (ddd , J = 8.9, 4.1, 2.7 Hz, 1H), 7.39 (s, 1H), 7.32 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.21 - 7.13 (m, 1H), 7.08 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 6.3, 2.7 Hz, 1H), 6.90 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.94 (br s, 3H), 2.48 - 2.39 (m, 1H), 0.85 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H);<13>C NMR (125 MHz, DMSO-d6) ä 175.51, 166.44, 164.70, 164.24, 158.75, 157.96, 156.74, 144.03, 135.39, 134.14, 130.82, 130.75, 129.58, 128.33, 127.30, 125.99, 125.66, 125.54, 123.64, 123.04, 119.63, 118.75, 118.68, 118.57, 116.25, 111.12, 70.04, 55.67, 55.01, 49.04, 25.34, 22.00, 21.50-20.80.

Jedinjenje C-10.C2: 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0115] U posudu od 100 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom dodato je jedinjenje C-9.C2 (286 g, 4,76 mmol) i balon je ohlađen na ledenom kupatilu. Zatim je dodat TFA (25 mL) (oko 2 mL/min) Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 2 h na sobnoj temperaturi. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 72<0>/o površine pika proizvoda. Smeša je zatim sipana u led (oko 100 g) i razblažena sa DCM (5a mL). Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa DCM tri puta. Kombinovane organske faze su isprane vodom i slanim rastvorom i rastvarač je uklonjen u vakumu. Sirova smeša je prethodno adsorbovana na silikagelu i prečišćena korišćenjem fleš hromatografije (AcOEt/heksan 40 % □ 60 %o). Braon čvrsta supstanca dobijena hromatografijom (1,51 g) je mešana u 60°% AcOEt u n-heksanu (10 mL) tokom 0,5 h, a zatim filtrirana, isprana sa 60% AcOEt u n-heksanu i osušena na vazduhu. Kao rezultat, jedinjenje C-10.C2 je dobijeno kao svetlo braon čvrsta supstanca (1,35 g, 46 % prinos) sa 96 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje C-9.C2: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0117] U posudu od 500 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-8.C2 ( 5 g, 8,6 mmol, 1 ekv.) i THF (80 mL), a zatim trimetil fosfit (2 mL, 17,2 mmol, 2 e kv.). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenom kupatilu i dodat je natrijum tercpentoksid (3,79 g, 34,4 mmol, 4 ekv.) u jednoj porciji. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 1 h na sobnoj temperaturi (posuda je opremljena sa CaCl2 cevi). Posle tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 91% površine pika proizvoda. Otprilike 90% rastvarača je uklonjeno i tako dobijena smeša je razblažena sa 100 mL vode. Dobijena suspenzija je zakiseljena sa 3 M HCl do pH - 5 i razblažena sa 100 mL DCM. Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa DCM tri puta. Kombinovane organske faze su isprane vodom, slanim rastvorom, osušene preko Na2SO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Sirovi proizvod C-9.C2 je dobijen kao crveno-braon čvrsta supstanca/pena (72% čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje C-8.C2: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1-(2, 4-dimetoksipirimi-din-5-il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0119] U posudu od 500 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, jedinjenja C-4A (12,48 g, 50 mmol, 1 ekv.), C-7A (7,76 g, 50 mmol, 1 ekv.) i C- 6B (9,88 g, 50 mmol, Dodat je 1 ekv. a zatim glacijalni AcOH (125 m L), a boca je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 9 0°C (temperatura kupatila za zagrevanje) i mešana na ovoj temperaturi 16 h. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 40% površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i AcOH je uparen do suva. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (30% do 60% AcOEt u n-heksanu). Posle uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C2 je dobijen kao tamnocrvena čvrsta supstanca/pena (8,7 g, 30 % prinos) sa 84 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje (3), C3: (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-metilfenir) 6-(propan-2 il)-5'-(trimetok:sipirimidin 5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1`-pirolo[3,4-c]pirol]-23'-dion

[0120]

[0121] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metod C) ili hiralnog RP- HPLC (metoda T) odvajanja racemskog jedinjenja C-10.C3; > 99 % ee; tr: 16.7 min (metod T`).<1>H NMR (600 MHz, DMSO-d6) mešavina rotamera: ä 11.31 (br s, 1H ), 10.90 (br s, 1H), 7.35 (d, J = 8. 1 Hz, 1H), 7.33 - 7.18 (m , 4H), 7.02 (dd , J = 8.1, 2.0 Hz, 1H), 6.91 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.86 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.44 (d, J = 2.2 Hz, 1H), 3.97 (d, J = 1.4 Hz, 3H), 3.93 (d, J = 4.3 Hz, 3H ), 3.90 (d, J = 2.4 Hz, 3H), 2.38 - 2.32 (m, 1H), 2.24 (s, 1H ), 2.07 (s, 2H), 0.80 (dd, J = 13.5, 7.0 Hz, 3H), 0.41 (dd, J = 10.0, 7.0 Hz, 3H);<13>CNMR (151 MHz, DMSO -d6) mešavina rotamera: ä 176.16, 174.19, 167.19, 167.05, 166.99, 166.89, 163.67, 163.37, 162.67, 143.81, 137.44, 136.75, 136.68, 136.17, 134.82, 134.74, 133.24, 133.19, 132.37, 132.31, 129.95, 129.22, 128.11, 127.96, 127.92, 127.45, 127.11, 127.05, 125.63, 122.64, 122.44, 122.19, 119.53, 119.28, 117.89, 110.67, 110.59, 99.16, 70.13, 69.70, 55.04, 54.78, 54.74, 54.71, -40.41, -10.03, 39.89, 24.99, 24.97, 21.84, 21.06, 21.02, 20.85, 20.78, 17.97, 17.82.

Jedinjenje C-10.C3: 6-hloro-2'-(5-hloro-2-metilfenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(trimetoksipirimidin-5-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[ndol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion [0122]

[0123] U posudu od 25 mL opremljen sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-9.C3 (6,7 g, 1,19 mmol) i AcOH (10 mL) na sobnoj temperaturi. Zatim je dodat MsOH (0,077 mL, 1,1. 9 mmol) i reakciona smeša je mešana 3 h na 80 °C. Posle 1 h UPLCMS analiza je pokazala 93<0>/o površine pika proizvoda. AcOH je uparen i ostatak je rastvoren u AcOEt, ispran zasićenim NaHCO3, slanim rastvorom i osušen preko MgSO4. Smeša je koncentrovana do oko 5 mL AcOEt, a suspenzija je filtrirana. Sakupljena čvrsta supstanca je isprana sa 5 mL AcOEt i osušena in vacuo. Željeni proizvod C-10.C3 je dobijen kao bela čvrsta supstanca (0,31 g, 43 % prinos, 98 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C3: N-(5-hloro-2-metilfenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-5 -(propan-2-il)-1-(trimetoksipirimidin-5-il)-1H-pirol-3-karboksamid

U posudu od 50 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-8.C3 (0,8 g, 1,3 mmol, 1 ekv.) i THF (15 mL). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenom kupatilu do 0 °C i dodat je trietil fosfit (0,45 mL, 2,6 mmol, 2 ekv.). Posle 10 minuta na 0 °C natrijum terc-pentoksid (0,6 g, 5,2 mmol, 4 ekv.) je dodat u nekoliko porcija. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi (boca je opremljena sa CaCl2 cevčicom) i praćena je TLC (5 % MeOH u CHCl3). Posle 24 h smeša je izlivena na led i reakcija je zakiseljena sa 1 M HCl do pH ~ 5. Posle dodavanja AcOEt (50 mL) smeša je prebačena u levak za odvajanje. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je još jednom ekstrahovana sa AcOEt (25 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom, osušene preko Na2SO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni korišćenjem 1% MeOH u CHCl3 kao eluenta. Željeni proizvod C-9.C3 je dobijen kao ružičasta čvrsta supstanca (0,8 g, 90 % prinos, 93 % čistoća prema UPLC MS analizi).

Jedinjenje C-8.C3: N-(5-hloro-2-metilfenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-5-(propan- 2-il)-1-(tri-metoksipirimidin- 5-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0126] U posudi sa okruglim dnom od 25 mL opremljenoj magnetnom mešalicom, jedinjenja C-4A (0,67 g, 2,7 mmol, 1 ekv.), C- 7D (0,5 g, 2,7 mmol, 1 ekv.) i C-6C (0,52 g, Dodato je 2,7 mmol, 1 ekv., a zatim glacijalni AcOH (10 mL), a boca je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 90 °C i mešana na ovoj temperaturi preko noći. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 45% površine pika proizvoda). AcOH je zatim uparen u vakumu. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (n-heksan/AcOEt, 4:1 ^ 1:1) dajući očekivani proizvod C-8.C3 kao crvenu čvrstu supstancu (0,8 g, 40 % prinos, 82 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje (4), C4: (3S)-6-hloro-2'-(3-hloro-4-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro

[0128] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metoda D) ili hiralnog RP-HPLC (metoda K) odvajanja racemskog jedinjenja C 10.C4; > 99 %> ee; tr: 3.79 min (metod K').<1>H NMR (500 MHz, CDCl3) ä 8.47 (br s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.2-4 -7.19 (m, 1H), 7.18 - 7.12 (m, 1H), 7.12 - 7.06 (m, 1H), 7.05 - 6.96 (m, 2H), 6.966.86 (m, 2H), 4.07 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 2.49 - 2.38 (m, 1H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.5 2 (d, J = 7.0 Hz, 3 H);<13>CNMR (125 MHz, CDCl3) ä 175.2, 166.5, 165.6, 164.9, 158.5, 157.0, 156.5, 142.0, 136.4, 134.3, 132.6, 132.5, 131.0, 128.6, 128.5, 126.5, 126.2, 123.8, 122.8, 121.4, 120.7, 117.8, 117.0, 116.8, 116.2, 111.6, 70.1, 55.6, 54.7, 25.6, 21.2, 1.9.

Jedinjenje C-10.C4: 6-hloro-2'-(3-hloro-4-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0129]

[0130] U posudu od 250 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-9.C4 (10,34 mmol) i TFA (70 mL) na sobnoj temperaturi (TFA je dodat oko 5 mL/min). Zatim je reakcija mešana 3 h na 40 °C i praćena TLC. Posle ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala 71% površine pika proizvoda. Smeša je ohlađena do sobne temperature i uparena do suvoće. Sirovi proizvod je prečišćen hromatografijom na koloni (10 % - 50 °% AcOEt/n-heksan). Nakon uklanjanja rastvarača proizvod C-10.C4 je dobijen kao svetlo braon čvrsta supstanca/pena (5,44 g, - 80 % prinosa nakon dva koraka, počevši od C-8.C4) sa 88 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje C 9.C4: 4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-N-(3-hloro-4-fluorofenil)-1 -(2,4-dimetoksipirimidin-5- il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

, - . , , , , . (140 mL). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenom kupatilu do 0 °C i u jednom delu su dodati trimetil fosfit (1,83 mL, 15,51 mmol, 1,5 ekv.), natrijum terc-pentoksid (2,28 g, 20,68 mmol, 2 elkv.). Reakciona smeša je mešana 4 h na ovoj temperaturi (boca je opremljena CaCl2 cevčic m) i praćena TLC. Posle tog vremena UPLCMS an liza je pokazala 87% željene površine pika proizvoda. Zatim je u smešu dodata hladna voda (50 mL) i reakcija je zakiseljena sa 5% HCl do pH ~ 5. Reakciona smeša je mešana oko 0,5 h na sobnoj temperaturi i nastali talog je filtriran, ispran sa 100 mL hladne vode Ovako dobijena čvrsta supstanca je ponovo rastvorena u AcOEt, isprana vodom, osušena preko Na2SO4 i rastvarač je uparen. Sirovi proizvod C-9.C4 je dobijen kao smeđa čvrsta supstanca (85%, čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje C-8.C4: 4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-lH-indol-3-il)-N-(3-hloro-4-fluorofenil)-1-(2. 4-dimetoksipirimi-din-5-il)-5- (propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0133]

[0134] U mikrotalasni reaktor od 250 m L opremljen sa magnetnom mešalicom, jedinjenja C-4A ( 12,48 g, 50 m mol, 1 ekv.) , C-7A (8,5 g, 55 mmol, 1,1 ekv.) i C-6D (9,9 g, 50 mmol , 1 ekv.), a zatim glacijalni AcOH , i MV reaktor je čvrsto zatvoren. Smeša je zagrejana do 90 °C (300 Watt) i mešana 5 h na ovoj temperaturi. Nakon ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 40% površine pika proizvoda). Reakciona Smeša je ohlađena do sobne temperature i AcOH je uparen do suvoće. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen hromatografijom na koloni (10 % aceton/DCM). Nakon uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C4 je dobijen kao tamno braon čvrsta supstanca/pena (6,96 g, 20,7 % prinos) sa 87 % čistoće pre ma UPLCMS analizi.

Jedinjenje (5), C5: (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(trimetoksipirimidin-5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2`H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0135]

[0136] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metoda E) ili hiralne RP-HPLC (metod L) odvajanja racemskog jedinjenja C-10.C5; > 99 % ee; tr: 7.18 min. (metod L') ;<1>H NMR (600 MH z, DMSO-d6) ä 11.20 (s, 1H), 7.44 (ddd, J = 8.9, 4.1, 2.7 Hz, 1H), 7.31 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.25 (s, 1H) , 7.15 (dd , J = 8.1, 1.7 Hz, 1H), 7.08 (dd, J = 8.1, 1.9 Hz, 1H), 7.05 (dd, J = 6.3, 2.7 Hz, 1H), 6.89 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.97 (s, 3H), 3.93 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 2.40-2.31 (m, 1H), 0.82 (d, J = 7.1 Hz, 3H), 0.41 (d, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (151 MHz, DMSO-d6) ä 175.64, 167.54, 167.40, 164.33, 163.18, 158.6, 156.93, 144.05, 135.29, 133.95, 130.69, 129.61, 128.30, 127.19, 126.20, 125.74, 125.65, 123.01, 119.35, 118.69, 118.55, 111.07, 99.55, 70.08, 55.50, 55.20, 49.02, 25.42, 21.46, 21.26.

Jedinjenje C-10.C5: 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(trimetoksipirimidin-5-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2`H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0138] U posudu od 100 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-9.C5 (63,7 g, 10,6 mmol) i TFA (15 mL) na sobnoj temperaturi. Reakciona smeša je mešana 3 h na sobnoj temperaturi. Posle ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala 85% površine pika proizvoda. Reakciona smeša je izlivena na led i ekotrahovana sa DCM dva puta (2 x 30 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodom (30 mL), osušene preko Na2S04 i uparene do suvoće. U ostatak je dodat AcOEt (50 mL) i uočeno je formiranje ružičastog taloga. Čvrsta supstanca j filtrirana, isprana sa nekoliko porcija hladnog AcOEt i osušeno na vazduhu. Željeni proizvod C-10.C5 je dobijen kao bledo roze čvrsta supstanca (5,17 g, prinos 80 %, čistoća 99 % prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C5: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-5 -(propan-2-il)-1-(trimetoksipirimidin-5-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0140] U posudu od 500 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-8.C5 (5 g, 8,14 mm ol, 1 ekv.) i THF (15 0 m L). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenoj smeši do 0 °C i dodat je trimetil fosfit (1,92 mL, 16,3 mmol, 2 ekv.). Posle 10 minuta na 0 °C natrijum terc-pentoksid (3,6 g, 32,6 mmol, 4 ekv.) je dodat u nekoliko porcija. Reakciona smeša je mešana na sobnoj temperaturi (boca je opremljena sa CaCl2 cevčicom) i praćena je TLC (40 % AcOEt u n-heksanu). Zatim je smeša iz livena na led i reakcija je zakiseljena sa 0,5 M vodenim rastvorom HCl do pH ~ 5. Posle dodavanja DCM (100 mL) smeša je prebačena u levak za odvajanje. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je još jednom ekstrahovana sa DCM (100 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom, osušene preko Na2SO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Ostatak je prečišćen hromatografijom na koloni (30% - 50% AcOEt/n-heksan). Željeni proizvod C-9.C5 je dobijen kao braonkasta čvrsta supstanca (2,41 g, 47 % prinos, 96 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-8.C5: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-5-(propan- 2-il)-1-(tri-metoksipirimidin- 5-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0142] U posudi sa okruglim dnom od 150 mL opremljenoj magnetnom mešalicom, jedinjenja C-'IA (6,:3 g, 25,3 mmol, 1 ekv.), C-6B (4,7 g, 130 mmol, 1 ekv.) i C- 7D (5 g, Dodato je 1 17 m mol, 1 ekv., a zatim AcOH (40 mL), a posuda je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 80 °C i mešana na ovoj temperaturi preko noći. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnja početnih materijala (što je jednako 66%o površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i crvena čvrsta supstanca pr izvoda C-8.C5 je filtrirana, isprana sa AcOH i osušena na vazduhu (10 g, 64 % prinos, 82 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje (6), C6: (3S)-6-hloro 2'-(5-hloro-2 fluorofenil) 5'-[6 (dimetilamino)-4-metoksipiridin 3-il[ 6' (pro-pan 2-il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3' -dione

[0143]

[0144] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativne hiralne NP-HPLC (metod F) ili hiralne RP-HPLC (metod J) odvajanja racemskog jedinjenja C -10.C6; > 99 % ee; tr: 14.66 min. (metod J`);<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) a 11.20 (br s, 1H), 7.91 (d, J = 22.0 Hz, 1H) 7.43 (ddd, J = 8.9, 4 .1 , 2.7 Hz, 1H), 7.30 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.23 (s, 1H ), 7 .16 (dd, J = 8.0, 2.1 Hz, 1H), 7.10 - 7.03 (m, 2H), 6.89 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6. 25 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 3.82 (d, J = 20.8 Hz, 3H), 3.09 (s, 6H), 2.47 - 2.37 (m, 1H), 0.83 (dd, J = 12.2, 7.0 Hz, 3 H), 0.41 (t, J = 7.0 Hz, 3H); 13C NMR (126 MHz, DMSO-d6) a 175.77, 175.72, 164.50, 162.08, 161.95, 161.08, 158.79, 156.79, 147.23, 144.06, 135.26, 134.43, 134.39, 130.67, 130.60, 129.61, 128.30, 127.36, 127.20, 126.29, 126.23, 125.85, 125.75 123.20, 122.99, 122.94, 118.84, 118.71, 118.64, 118.53, 115.45, 111.06, 88.48, 70.09, 56.06, 56.03, 38.38, 25.38, 22.01, 21.63, 21.27, 21.04.

Jedinjenje C-10.C6: 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenin-5'-[6-(dimetilamino)-4-metoksipiridin-3-il]-6'-(propan-2 –il]-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0145]

posu u o m oprem enu sa magne nom me a com, o a o e e n en e - , g, , mmo m . Reakciona smeša je mešana 1 h na 40 °C. Posle ovog vremenа UPLCMS analiza je pokazala 97% željenog proizvoda C- 10.C6. Reakciona smeša je uprena do suva. U ostatak je dodato 20 ml metanola i zasićeni NaHCO3 (200 mL). Suspenzija je refluksovana 2 h, a zatim ohlađena do sobne temperature. Talog se odfiltrira i macerira u metanolu (20 mL). Čvrsta supstanca je sakupljena filtracijom, isprana sa malom količinom metanola i osušena u vakumu, da bi se dobio željeni proizvod C-10.C6 kao prljavo bela čvrsta supstanca (23 g, 83 % prinos, >99 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C:6: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il) -1-[6-(dimetilamino)-4-metoksipiridin-3-il1-5-(propan-2-il)-1H pirol-3-karboksamid

[0148] U posudu od 100 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-8.C6 (4 g, 6, 7 mmol, 1 ekv.) i THF (30 mL), a zatim rietil fosfit (1,72 mL, 10,1 mmol, 1,5 ekv.). Zatim je smeša ohlađena na 3 °C i dodat je natrijum terc- pentoksid (1,48 g, t3,4 mmol, 2 ekv.) u nekoliko porcija. Posle zagrevanja do sobne temperature, reakciona smeša je mešana 22 h (boca je opremljena CaCl2 cevčicom). Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala h4 % željenog proizvoda C-9.C6. U smešu je dodata voda (200 mL) i 1 M HCl da se postigne pH ~n 8. Vodena faza je ekstrahovana sa AcOEt (33150 mL). Organske faze su kombinovane i osušene preko MgSO4. Posle koncentracije, sirovi materijal je dalje prečišćen hromatografijom (10 - 30 % i-PrOH/n-heksan) da bi se dobilo jedinjenje C-9.C6 (3 g, 72 % prinos, 94 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-8.C6: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1-[6- (dimetilamino)-4-metoksipiridin- 3-il]-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0150] U posudi sa okruglim dnom (250 mL) opremljenoj magnetnom mešalicom, jedinjenja C-4A (5,37 g, 21,5 mmol, 1 ekv.), C-7C (3,6 g, 21,5 mmol, 1 ekv.), C- 6B ( 4,25 g, 21,5 mmol, 1 ekv .) i PTSA-H2O (4,09 g, 21,5 mmol, 1 ekv.) suspendovani su u vodi (9 mL) i metanolu (36 mL). Balon je dobro zatvoren, a zatim je smeša zagrejana do 60 °C i mešana na ovoj temperaturi 23 h. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 17 % očekivanog proizvoda C-8.C6. Zatim je dodata dodatna porcija jedinjenja C-6B (1,06 g, 5,4 mmol) i smeša je zagrejana do 75 °C i mešana na ovoj temperaturi 42 h. Uzorak je uzet i UPLCMS analiza je pokazala 58 % očekivanog proizvoda C-8.C6. Reakciona smeša je uparena do suva. Ostatku je dodat DCM (200 mL), 5 % rastvor NaHCO3 (150 mL) i smeša je mešana 20 min. Vodena faza je ekstrahovana sa DCM (4 x 200 mL). Organske faze su kombinovane i sušene preko MgSO4. Posle koncentracije, sirovi materijal je prečišćen hromatografijom na koloni (20 - 50 % AcOEt/n-heksan) da bi se dobilo jedinjenje C-8.C6 (4,1 g, 32 % prinos, 90 % čistoća prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje (7), C7: (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il) )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0152] N slovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metoda Gi) ili hiralne RP-HPLC (metod O) odvajanja racemskog jedinjenj3 C-10.C7; > 99<0>%o ee; tr: 5.61 min (metod 0").<1>H NMR (500 MIHz, CDG3) ei 8.76 (br s, 1H), 8.23 (s, 1H), 7.23 -7.18 (m, 1H), 7. 11 - 7.0(3 (m, 1H), 7.06 - 6.98 (m, 2H), 6.98 - 6.90 (m, 1H), 61.90 - 6.85 (m, 1 d), 6.83 - 6.76 (m, 1H), 4.06 (s, 3H), 3.99 (s, 3H), 2.49 - 2.39 (m, 1H), 0.90 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 0.51 (d, J = 7.0 Hz, 3H);<13>C NMR (125 MHz, CDCl3) a 175.0, 166.5, 165.7, 164.9, 157.0, 150.9, 149.0, 148.9, 148.8, 142.2, 136.4, 134.3, 130.3, -26.5, 126.2, 124.9, 123.7, 122.9, 120.6, 118.1, 118.0, 117.8, 117.5, 117.4, 116.1, 111.7, 77.3, 77.0, 76.7, 70.2, 55.6, 54.7, 25.6, 21.3.

Jedinjenje C-10.C7: 6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H- spirofindol 3,rpirolor3,4-clpiroll-2,3' dion

[0153]

[0154] U posudu od 250 mL opremljen sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-9.C7 (7,34 g, 15,57 mmol) i TFA (80 mL) na sobnoj temperaturi (TFA je dodat oko 5 mL/min). Zatim je reakcija mešana 3 h na 40 °C. Posle ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala 84% površine pika proizvoda. Smeša je ohlađena do sobne temperature i isparena d o suvoće. Sirovi proizvod je prečišćen fleš hromatografijom na koloni (20 % - 50 % AcOEt/n-heksan). Posle uklanjanja rastvarača proizvod C-10.C7 je dobijen kao svetlosmeđa čvrsta supstanca/pena (4,45 g, ~ 63 % pr. nos posle dva koraka sinteze) sa 93 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje C-9.C7: 4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-N-(3,4-difluorofenil)-1-( 2,4-dimetoksi-pirimidin-5-il)- 5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0155]

, . , , , , . (140 mLd. Zatim je reakciona smeša ohlađena u ladenom kupatilu do 0 °C i dodat je trimeltil fosfit (2,S5 mL, 18,536 mmol, 1,5 ek), a zatim natrijum terc-pentoksid (2,77 g, 25,14 mmol, 2 ekv.) u jednoj porciji. Reakciona smeša je mešana 1,5 h na 0 °C (posuda je opremljena sa CaCl2 cevčicom. Nakon ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala 88% površine pika proizvoda dodata je hladna voda (50 mL) i reakoija je zakiseljena sa 55a HCl do pH ~5. Reakciona smeša je mešana oko 0,5 h na sobnoj temperaturi i nastali talog je filtriran i ispran sa 100 mL hladne vode. Ovako dobijena čvrsta supstanca je ponovo rastvorena u AcOEt, isprana vodom, osušena preko Na2SO4 i rastvarač je uparen. Sirovi proizvod C-9.C7 je dobijen kao smeđa čvrsta supstanca (83% čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje C-8.C7: 4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-lH-indol-3-il)-N-(3,4-difluorofenil)-1-(2,4- dimetoksipirimidin-5-il)-5-(propan-2- il)-1H-pirol-3-karboksamid

U zatvorenu epruvetu od 250 mL opremljenu magnetnom mešalicom, jedinjenja C-4tA (10,48 g 50 mmol, 1 ekv.), C-7A (7,76 g, 50 mmol, 1 ekv.) i C-6E (9,06 g, 50 mmol) Dodato je 1 ekv, a zatim AcOH (100 m5), a epruveta je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 80 °C (temperatura smeše za zagrevanje) i mešana na ovoj temperaturi preko noći. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro put u potrošnju početnih materijala (što je jednako 40% površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i AcOH je isparena do suvoće. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen hromatografijom (50% AcOEt/n-heksan). Posle uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C7 je dobijen kao tamno braon čvrsta supstanca/pena (7,63 g, prinos 24,9 %, čistoća 84 % prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje (8), C8: (3S)-(6-hloro-2 -(3,4-dfluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin 3-il)-6' (propan 2-il) ) 1,2,3',5'-tetrahidro 2'H- spirorindol-3,l'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0159] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativnog hiralnog SFC (metoda H) ili hiralnog RP-HPLC (metoda N) odvajanja racemskog jedinjenja C-10.C8; > 99 % ee; tr: 6.2 min. (metod N');<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) a 11.15 (br s, 1H), 8.07 (d, J = 34.9 Hz, 1H), 7.46 -7.37 (m,1H), 7.37 - 7.27(m, 2H), 7.15 (m, 1H), 7.08 (dd, J = 8.0, 1.9 Hz, 1H), 6.92 (m, J =2.2 Hz, 1H), 6.85 (m, 1H), 6.64 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.90 (s,3H), 3.83 (d, J = 23.6 Hz, 3H), 2.37 (m, 1H), 0.85 (dd, J = 13.0, 7.0 Hz, 3H), 0.41 (dd, J = 9.4, 6.9 Hz,3H);13C NMR (125 MHz, DMSO-tf6) a 175.18, 175.05, 165.31, 164.56, 162.80, 162.74, 149.75, 149.64, 147.79, 147.68,147.33,147.24, 145.92, 145.79, 143.48, 143.43, 134.62, 134.59, 133.42, 127.08, 126.18, 126.10, 122.71, 122.67, 122.58, 120.23, 119.41, 117.79, 117.70, 117.55, 117.23, 117.09, 110.62, 93.37, 93.29, 69.61, 56.21, 53.64, 24.90, 21.39, 21.08, 20.64, 20.50.

Jedinjenje C-10.C8: 6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H-spirorindol-3,1'-pirolo[3,4-c]piro]e1-2,3'-dion

[0161] U posudu od 100 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-9.CtJ (2 g, 3,5 mmol) i bićilon je ohlađen u ledenoj smeši. Zatim ee p lako d davan TFA 020 mL) (oko 2 mL/min). Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 1 h na sobnoj temperaturi Posle ovog vremena UPLCMO analiza j pokazala 75% maksimuma proizvoda. Raakcija je mešana još 1 h i smeša je sipana u led (oko 50 g) i razblažena sa DCM (50 mL). Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa DCM tri puta (3 x 50 mL).Kombinovane organske faze su isprane vodom, slanim rastvorom i rastvarač je uklonjen u vakumu. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (50 %o AcOEt u n- heksanu). Nakon uklanjanja rastvarača proizvod C -10.C8 je dobijen kao crveno-braon čvrsta supstanca/pena (815 mg, 41 % prinos) sa 98 % čistoće, prema U PLCMS analizi. Gore navedena reakcija je ponovljena još tri puta i svi dobijeni uzorci (5,76 g) jedinjenja C-10.C8 su kombinovani i mešani u 25 mL smeše AcOEt/n-heksan (1:5). Smeša je zagrevana do refluksa i dodat je AcOEt dok se sva preostala čvrstu supstanca ne rastvori. Zatim je u kapima dodato 75 mL n-heksana i smeša je mešana 16 h na sobnoj temperaturi. Čvrsta supstanca je filtrirana, isprana sa AcOEt/nheksanom (1:1 0, 25 mL) i osušena pod visokim vakumom. Kao rezultat, finalni proizvod C-10.C8 je dobijen kao svetlocrvena čvrsta supstanca (4,77 g, 98 % čistoće, prema U PLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C8: 4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso 2,3-dihidro-1H- ndol-3-il)-N-(3,4-difluorofenil)-1-( 4,6 dimetoksi-piridin-3-il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0163] U posudu od 100 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, dodato je jedinjenje C-8 .C8 (2 g, 3,5 mmol , 1 ekv.) i THF (35 mL), a zatim trimetil fosfit ( 0,83 mL, 7 mmol, 2 e kv.) . Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenoj smeši i dodat je natrijum fercpentoksid (1, 54 g, 14 mmol, 4 e kv.) u jednoj porciji. Kupatilo za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 1 h na sobnoj temperaturi (boca je opremljena sa CaCl 2 cevi). Posle tog vremena U PLCMS analiza je pokazala 80% površine pika proizvoda. Posle još jednog sata mešanja, oko 90% rastvarača je uklonjeno i tako dobijena smeša je razblažena sa 50 g leda. Dobijena suspenzija je zakiseljena sa 1 M HCl do pH ~ 5 i dodatno razblažena sa 50 mL DCM. Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa DCM (2 x 30 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodom, slanim rastvorom, osušene preko Na2SO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Sirovi proizvod C-9.C8 je dobijen kao crveno-crna čvrsta supstanca/pena (70% čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (prinos je premašen 100%).

Jedinjenje C-8.C8: 4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-lH-indol-3-il)-N-(3,4-difluorofenil)-1-(4,6- dimetoksipiridin-3-il)-5-(propan-2-il)- 1H-pirol-3-karboksamid

[0165] U posudu od 500 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, jedinjenja C-4A (£1,1 g, 32,4 mmol, 1 ekv.)t C 7B (5 g, 32,4 mmol, 1 ekv.) i C-6 E (5,9 g, 32,4 mmol, Dodat je 1 ekv., a zatim AcOH (80 m L), a boca je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrevana do 85 °C (temperatura kupatila za zagrevanje) i mešana na ovoj tempera turi 16 h. Nakon ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 55% površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i ACOH je uparen do suva. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (30% do 60% AcOEt u n-heksanu). Posle uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C8 je dobijen ka o svetlocrvena čvrsta supstanca (8 g, 44 % prinos) sa 817 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje (9), C9: (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spirorindol-3,1' pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0167] Naslovljeno jedinjenje je dobijeno nakon preparativne hiralne SFC (metod I) ili hiralne RP-HPLC (metoda S) razdvajanja racemskog jedinjenja C-10 .C9; > 99 % ee; tr: 8.85 mi n (metod S'). ^H NMR (500 MHz, DMSO-d6) a 11.23 (br s, 1 H ), 8.10 (d, J = 26.0 Hz, 1H), 7.44 (ddd, J = 8.9, 4. 1, 2.7 Hz, 1H), 7. 35 - 7.27 (m, 2H) , 7.17 (dd, J = 8.1, 1.8 Hz, 1 H), 7.10 - 7.02 ( m, 2H), 6.90 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 6.64 (d, J = 2.1 Hz, 1H ), 3.90 (s, 3 H), 3.83 (d, J = 20. 7 Hz, 3H), 2.45 - 2.32 (m, 1H), 0.84 (dd, J = 9.4, 7.0 Hz, 3 H), 0.4 2 (dd, J = 7.1 , 4.0 Hz, 3H); 13C NMR (126 M Hz, DMSO -d6) a 175.68, 165.85, 164.38, 163.36, 163.24, 158.77, 156.77, 146.44, 144.17, 135.31, 134.21, 130.70, 129.60, 128.33, 127.33, 126.18, 125.78, 125.66, 123.46, 122.92, 120.71, 119.27, 118.72, 118.54, 111.11, 93.90, 70.08, 56.78, 54.18, 25.42, 22.00, 21.64, 21.24, 21.04.

Jedinjenje C-10. C9: 6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,r-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

anhidrovanog DCM i dodato je 10 mL TFA u jednoj porciji. Reakcija je mešana 3 h na sobnoj temperaturi Posle ovog vremena UPLCMS analiza je pokazala 54% površine pika proizvoda. Reakciona smeša je isparena do suvoće Ostatak je mešan u 30 mL AcO Et tokom 1 h i bledo siva čvrsta supstanca je istaložena iz smeše. Čvrsta supstanca je odvojena filtracijom i osušena na vazduhu Kao rezultat, dobijen je proizvod C-10.C9 (2,2 g, 34,1 %o prinos nakon 2 koraka, počevši od C-8.C9, 94 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C9: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1 -(4,6-dimetoksipiridin-3-il)- 5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0171] U posudu od 100 mL opremljejnu sa magnetnem mešalicom, dedato je jedinje nje C-8iC9 (6,08 g , 10,5 mmol, 1 ekv.) i THF (62 mL), a zatim trimetil fosfit (2,47 ml, 21 mmol, 2 ekv.). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenom kupatilu i dodat je natrijum tercpentoksid (3,47 g, 31,5 mmol, 3 ekv.) u jednoj porciji. Kupiatilo za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 1 h na sobnoj temperaturi (boca je opremljena sa CrCl2 cevi). Posle ovog vremena UPLCMS analiza je po kazala 94% površine pika proizvoda Reakciona smeša je ohlađena na oko -10 °C, zatim je izlivena na led i reakcija je zakiseljena sa 0,5 M HCl do pH ~ 5. Vodena faza je ekstrahovana sa AcOEt (3 3 100 mL), osušena preko Na2SO4 i rastvarač je ispario u vakumu. Sirovi proizvod C- 9.C9 je dobijen kao crveno-crna čvrsta supstanca/pena (68% čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja (prinos je premašen 100%).

Jedinjenje C-8.C9: N-(5-hloro-2-fluorofenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1-(4, 6-dimetoksipiridin-3-il)-5-(propan- 2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0173] U po sudu od 100 m L opremljen u šipkom za magnetno mešanje, jedinjenja C-4A (7,79 g, 30 m mol, 1 ekv .), C-7B (4,68 g, 30 mmol, 1 ekv.) i C-6B (6 g, 30 mmol, Dodat je 1 ekv., a zatim AcOH (60 mL), a boca je č vrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 85 °C (temperatura kupatila za zagrevanje) i mešana na ovoj temperaturi 16 h. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 40% površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena na oko 15 °C i obilni crveni čvrsti talog je odvojen filtracijom iz reakcione smeše. Filtrat je isparen do suvoće. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (10% do 60% AcOEt u n-heksanu). Nakon uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C9 je dobijen kao svetlocrvena čvrsta supstanca (5,58 g, prinos 31,5%) sa 93% čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje (10), C10: (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan -2-il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]piro]1-2,3'-dion

[ 200175] [01 N7a5slovl Tjehneo j teledi cnojemnpjeo j ned d woabsije onbot i na ekdon a p ere ppraerpaatirvanto vge c hhiriaralnlo Rg - RHPP-HLPCLC s p oadrvaatjiaon ja o r tahceem rasckeomg je cdoimnjpeonujand C C-10.C10 korišće 1n0jem C m 0e utsoid ge P h;e > me 9t9ho %d P e;e >; t 9r9: % 9.9 e6e; m trin. 9 (m6e mtoind ( Pm’)e;<1>hHod N PM )R ( H50 N0M MRH (z5, D 0MS HOz-d D6M) äS 11 -d.262) δ (b 1r1 s, 1H b)r, 8 , 1.5H0 ( 8br s 0, 1H), 7.64 (t, ( J r = 91.H4 Hz, 14H ()t,, J 7. =409 ( 4s, 1 zH), H 7.204 (0t, ( Js = 1H 7.)57 H 2z, 2 (tH) J, = 7.1.05 ( Hdzd, J H =) 87..01, 2 (.d0d H Jz, 18H.)0, 62.901 H (zd, J H =) 16.9 H (zd, 1 JH =), 3..98 (s, 3H), 3. H95z ( 1s, , 3H 9), 2 (. ,47 - 2.491 (m (s, 1H), 02.845 (d, J 4 = 7.0 H H)z, 3H 85), d 0.4 J4 (d, J = 6.9 ) H, z 0, 434H ();<1>J<3>=C 6 N 9MR z (12 H6 MHz, N DMMRSO-d6) ä 175.3 (61, 617 M0.7 z6,, M 16S6.4 -3d, 1 δ64.71., 164.035, 11569.045, 115684.961, 16548..356, 19580.2 ,6, 18597.9 ,51, 81.576.0135, 1.2566.913, 1956 ,.356, 0135,6.26, 144.01, 1355.46, 1343.20, 16321.1 ,3, 14207.4 ,1, 51245. ,841, 412230.515, 11233.019, 1.4211.722, 18241.6132, 119 ,.1462, 1198,.1727, 121,6.223, 115.5199, 1615.4148, 171,1.19, 107.31, 11607.310, 1150.6.99,0, 1750.4045, 1610.1.19, 515.66., 155.0017, 205,.1304, 2920.,31 - 250.8630

Jedinje Cnojmep Co-u1n0d.C C1-01: .6-h 1l0oro 6-2 ch -( o5r-oh-l2or -o(-2 -c,4h-lodrifolu 2o,r4o-fdeinfliul)o-r5o'-p(h2,4 n-ydl)im-5e -t(o2k,4si-pdir mimeitdhionx 5y-piyl)- i6m'-id(pinr-o5p-aynl)-26- -il()p )r- 1,2 n,32', y5' )--tetrahidro-2'H-spir 1o 2[in 3d’o 5l-3 te,1tr'a-phiyrodlro[32,4 H- c]pi rrole nl-2 o,l3e'- 3di 1on

[0176] [0

[0177] AcOH (25 mL) je stavljen u posudu od 100 mL opremljenu magnetnom šipkom za mešanje. Zatim je u jednoj porciji dodat C-9.C10 (2,3 g, 4 mmol, 1 ekv.). MsOH (0.25 mL, 4.85 mmol, 1.2 ek) je dodat u kapima i smeša je mešana 2 h na 45 °C. Većina AcOH je uparena i ostatak je rastvoren u DCM (100 mL), zatim je dodato 100 mL vode, i smeša je tretirana sa 3 M NaOH da bi se postigla pH ~ 8. Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa DCM (2 x 100 mL). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom (50 mL), osušene preko MgSO4i koncentrovane. Ostatak je prečišćen fleš hromatografijom (CHCl3:MeOH; 100:0 98:2) pri čemu se dobija 1,7 g proizvoda C-10.C10 sa 91% čistoće prema UPLCMS analizi.

Jedinjenje C-9.C10: N-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-4-(6-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il) -1-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0178]

[0179] U posudu od 100 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-8.C10 (8,9 g, 14,8 mmol, 1 ekv.) i m , a za m re os , m , , mmo, , e v. - as vor e o a en na , a za m e o a na r um erc- u o s (2,85 g, 29,6 mmol, 2 ekv.) u nekoliko porcija. Reakciona smeša je mešana 3 h na sobnoj temperaturi (boca je opremljena CaCl2 cevčicom). Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 82 % željenog proizvoda Reakciona smeša je polako sipana u ohlađenu (05 °C) mešavinu vode (150 mL) i ;36 % HCl (5 mL). Posle dodavanja etil acetata (100 mL) smeša je prebačena u levak za odvajanje. Slojevi su razdvojeni i vodena faza je još jednom ekstrahovana sa AcOEt: (100 ml). Kombinovane organske faze su isprane slanim rastvorom, osušene preko Mg SO4 i koncentrovane in vacuo. Uljani ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (DCM/MeOH 100:0 → 98:2) Izolovane su dve frakcije proizvoda C-9.C10: 3 g sa 85 % čistoća i 3 g sa 4U % čistoće prema UPLCMS analizi Prinos: 50 % (uključujući obe frakcije).

Jedinjenje C-8.C10: N-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol-3-il)-1-(2,4-dimetoksi-pirimidin-5-il)-5-(propan-2-il)-1H-pirol-3-karboksamid

[0181] Suva disperzija raspršivanjem može uključivati surfaktant. Surfaktant ili smeša surfaktanta bi generalno smanjila međufaznu napetost između suve disperzije raspršivanjem i vodenog medijuma. Odgovarajući surfaktant ili smeša surfaktanta takođe može poboljšati rastvorljivost u vodi i biodostupnost jedinjenja 2 iz disperzije suve sprejom. Surfaktanti za upotrebu u vezi sa ovim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, sorbitan estre masnih kiselina (npr . Spans®), polioksietilen sorbitan estre masnih kiselina (npr. Tveens®), natrijum lauril sulfat (SLS), natrijum dodecilbenzen sulfonat (SDBS) dioktil natrijum sulfosukcinat (Docusate), natrijumova so dioksiholne kiseline (DOSS) , sorbitan monostearat, sorbitan tristearat, heksodeciltrim etil amonijum bromid (HTAB), natrijum N-lauroilsarkozin, natrijum N-lauroilsarkozin, Stearat, natrijum palmitat, Gelucire 44/14, etilendiamin tetrasirćotna kiselina (EDTA), vitamin E d-alfa tokoforil polietilen glikol 1000 sukcinat (TPGS), lecitin MV 677-692, glutanska kiselina mono- Labrasol monohidrat, PEG /kaprini gliceridi, Transcutol, dietilen glikol monoetil etar, Solutol HS-15, polietilen glikol/hidroksistearat, tauroholna kiselina, Pluronic F68, Pluronic F108 i Pluronic F127 (iii bilo koji drugi polloksipropilen-ko-polioksietilen-P ronics®) ili zasićeni pollgliklizovani gliceridi (Gelucirs®)). Specifični primeri takvih surfaktanata koji se mogu koristiti u vezi sa ovim pronalaskom uključuju, ali nisu ograničeni na, Span 65, Span 25, Tveen 20, Capriol 90, Pluronic F108, natrijum lauril sulfat SSLS), vitamin E TPGSr pluronike i kopolimeri. SLS je generalno poželjniji.

Jedinjenje (11), C11: (3S)-6'-(butan-2-il) 6-hloro-2'-(5 hloro-2-fluorofenil) 5'-(2,4-dimetoksipirimidin 5 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro- 2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion

[0183] Naslovljeno jedinjenje (dijastereomerna smeša) je dobijeno nakon preparativne hiralne HPLC-RP razdvajanja racemskog jedinjenja C-10.C11 korišćenjem metode M; > 99 % ee; tr: 9.96 min. (method M');<1>H NMR (500 MHz, DMSO-d6) ä 11.24 (s, 1H), 8.50 (br s, 1H), 7.44 (ddd, J = 8.9, 4.2, 2.7 Hz, 1H), 7.38 (s, 1H), 7.31 (t, J = 9.1 Hz, 1H), 7.23 - 7.14 (m, 1H), 7.03 (dd, J = 6.4, 2.7 Hz, 1H), 6.84 (ddd, J = 10.5, 8.4, 2.4 Hz, 1H), 6.72 (dd, J = 8.9, 2.4 Hz, 1H), 3.98 (s, 3H), 3.95 (br s, 3H), 3.09 (q, J = 7.3 Hz, 2H), 2.48 -2.39 (m, 1H), 1.18 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.85 (d, J = 7.0 Hz, 2H), 0.44 (d, J = 7.0 Hz, 3H);<13>C NMR (126 MHz, DMSO-GT6) a 175.83, 166.45, 164.83, 164.70, 164.26, 162.87, 158.76, 157.95, 156.76, 144.36, 144.26, 134.08, 130.72, 130.66, 129.55, 128.30, 128.28, 127.61, 127.53, 125.73, 125.61, 123.86, 122.88, 119.71, 118.70, 118.59, 118.52, 116.26, 109.68, 109.50, 99.43, 99.21, 70.02, 55.66, 55.01, 46.14, 25.33, 21.51, 11.45, 9.08.

[0185] U posudu od 250 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-9.C11 (2,8 g, 4,56 mmol) zajedno sa DCM (60 mL). Zatim je dodat TFA (30 mL) (oko 2 mL/mi ). Reakcija je m šan 2 h a sobnoj temperaturi. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 65% očekivane površine pika proizvoda. Smeša je zatim izlivena na led (oko 200 mL) i razblažena sa DCM (100 mL). Faze su razdvojene i vodena faza te ekstrahovana sa DCM tri puta (3 x 50 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodom, slanim rastvorom, osušene preko МgSO4 i koncentrovane pod vakumom. Sirovi proizvod C-10.C11 je prečišćen hromatografijom na koloni (10% do 40% acetona u n-heksanu). Kao rezultat, dobijeno je 1,5 g smeđe čvrste supstance C- 10.C11. Ova čvrsta supstanca je mešana u AcOEt (5 mL), odvojena filtracijom, isprana sa 20 mL AcOEt i osušena na vazduhu, Kao rezultat, dobijen je proizvod C-10.C11 kao beli particip (1,4 g, 98 % čistoće prema UPLCMS analizi).

Jedinjenje C-9.C11: 5-(butan-2-il)-N-(5-hloro-2-fluorofenin-4-(č)-hloro-3-hidroksi-2-okso-2,3-dihidro- 1H-indol-3-il)-1-(2,4-dimetoksipirimidin-5-in-1H-pirol-3-karboksamid

[0187] U posudu od 250 mL opremljenu sa magnetnom mešalicom, dodato je jedinjenje C-8.C11 (3 g, 5 mmol, 1 ekv.) i THF (80 mL), a zatim trimetil fosfit (1,21 mL, 10 mmol, 2 ekv.). Zatim je reakciona smeša ohlađena u ledenom kupatilu i dodat je natrijum tercpentoksid (2,2 g, 20 mmol, 4 ekv.) u malim porcijama. Smeša za hlađenje je uklonjeno i reakcija je mešana 5 h na sobnoj temperaturi (posuda je opremljena sa CaCl2 cevčicom). Posle tog vremena UPLCMS analiza je pokazala 71% dva (dijastereomerna) pika proizvoda C-9.C11. Reakciona smeša je razblažena sa 200 mL vode sa ledom. Dobijena suspenzija je zakiseljena sa 3 M HCl do pH ~ 5 i razblažena sa 100 mL AcOEt. Faze su razdvojene i vodena faza je ekstrahovana sa AcOEt tri puta (3 x 50 mL). Kombinovane organske faze su isprane vodom, slanim rastvorom, osušene preko Na2SO4 i rastvarač je uklonjen in vacuo. Sirovi proizvod C-9.C11 je dobijen kao tamno crveno ulje (72% čistoće prema UPLCMS analizi) i korišćen je u sledećem koraku bez daljeg prečišćavanja.

Jedinjenje C-8.C11: 5-(butan-2-il)-N-(5-hloro-2-fluorofeniD-4-(6-hloro-2-okso-2,3-dihidro-1H-indol- 3-il)-1-(2,4- dimetoksipirimidin-5-il]-1H-pirol-3-karboksamid

[0189] U posudu od 250 mL opremljenu šipkom za magnetno mešanje, jedinjenja C-4B (4,44 g, 16,8 mmol, 1 ekv.), C-7A (2,87 g, 18,5 mmol, 1,1 ekv.) i C-6F (3,32 g, 16,8 mmol, Dodat je 1 ekv., a zatim AcOH (30 mL), a boca je čvrsto zatvorena plastičnim čepom. Smeša je zagrejana do 90 °C (temperatura smeše za zagrevanje) i mešana na ovoj temperaturi 16 h. Nakon tog vremena UPLCMS analiza je pokazala skoro punu potrošnju početnih materijala (što je jednako 50% površine pika proizvoda). Reakciona smeša je ohlađena do sobne temperature i isparena do suvoće. Ostatak je prethodno adsorbovan na silikagel i prečišćen korišćenjem fleš hromatografije (30% do 60% AcOEt u n-heksanu). Posle uklanjanja rastvarača proizvod C-8.C11 je dobijen kao tamnocrvena čvrsta supstanca/pena (3,5 g, 35 % prinos) sa 83 % čistoće prema UPLCMS analizi.

Dobijanje i analiza enantiomera

[0190] Svi enantiomeri su razdvojeni na preparativnom SFC ili HPLC sa hiralnim kolonama.

Uslovi hiralnog prečišćavanja - SFC

[0191]

Metod A: kolona: Luks Amiloza-1 (21.2 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 25:75, detekcija: UV 210 nm

Metod B: kolona: Luks Celuloza-1 (21.2 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 25:75, detekcija: UV 210 nm

Metod C: kolona: Luks Celuloza-4 (21.2 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 45:55, detekcija: UV 215 nm

Metod D: kolona: Chiralpak IC (20 mm x 250 mm, 5 µm), tok 21 mL/min, izokratsko eluiranje EtOH:CO2, 45:55, detekcija: UV 210 nm

Metod E: kolona: Luks Celuloza-4 (21.2 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 40:60, detekcija: UV 210 nm

Metod F: kolona: Chiralpak AS-H (20 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 25:75, detekcija: UV 210 nm

Metod G: kolona: Chiralpak IC (20 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 45:55, detekcija: UV 210 nm

Metod H: kolona: Luks Celuloza -4 (30 mm x 250 mm, 5 µm), tok 50 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH:CO2, 40:60, detekcija: UV 210 nm

Uslovi hiralnog prečišćavanja – NP-HPLC

[0192] Metod I: kolona: Chiralpak IC (20 mm x 250 mm, 5 µm) protok 21 mL/min, izokratsko eluiranje MeOH detekcija: UV 220 nm

Uslovi hiralnog prečišćavanja – RP-HPLC

Metod J: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:MeOH:H2O, 50:20:30, detekcija: UV 254 nm

Metoda K: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3 150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 80:20, detekcija: UV 254 nm

Metod L: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 65:35, detekcija: UV 254 nm

Metod M: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3 150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O+HCO2NH4(mobilna faza A1), 90:10, detekcija: UV 254 nm

Metod N: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 70:30, detekcija: UV 254 nm

Metod O: kolona: Luks Cellulose-2 (21 mm 3150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, gradijent eluiranja, A=ACN, B= H2O, detekcija: UV 254 nm

Metod P: kolona: Luks Amilose-2 (21 mm 3 150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 50:50, detekcija: UV 254 nm

Metod R: kolona: Luks Amilose-2 (21 mm 3 250 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, gradijent eluiranja; A=ACN, B= H2O, detekcija: UV 254 nm

Metod S: kolona: Luks amiloza-2 (21 mm x 250 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 60:40, detekcija: UV 254 nm

Metoda T: kolona: Luks Celuloza-4 (21 mm x 150 mm, 5 µm), protok: 30 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 60:40, detekcija: UV 254 nm

[0194]

Metod A': kolona: Luks Amiloza-1 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 25:75, detekcija: UV 211 nm i 254 nm

Metod B’: kolona: Luks Celuloza-1 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 25:75, detekcija: UV 211 i 254 nm

Metod C': kolona: Luks Celuloza-4 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 50:50, detekcija: UV 210 - 400 nm

Metod D': kolona: Chiralpak IC (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, EtOH:CO2, 45:55, detekcija: UV 210 - 400 nm

Metod E': kolona: Luks Cellulose-4 (4,6 mm 3250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 40:60, detekcija: UV 210 - 400 nm

Metod F': kolona: AMS (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 30:70, detekcija: UV 211 i 254 nm Metod G': kolona: Chiralpak IC (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 40:60, detekcija: UV 210 - 400 nm

Metod H’: kolona: Luks Celuloza-4 (4,6 mm x 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: 40 °C, protok: 4 mL/min, izokratsko eluiranje, MeOH:CO2, 40:60, detekcija: UV 211 i 254 nm

Analiza hiralne čistoće – NP-HPLC

[0195] Metod I’: kolona: Luks Celuloza-5 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1 mL/min, izokratsko eluiranje, EtOH, detekcija: UV 254 nm

Uslovi za analizu hiralne čistoće – RP-HPLC

[0196]

Metod J': kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:MeOH:H2O, 50:20:30, detekcija: UV 254 nm

Metoda K’: kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 80:20, detekcija: UV 254 nm

Metod L’: kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 65:35, detekcija: UV 254 nm

Metod M': kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O+HCO2NH4(mobilna faza A1), 90:10 , detekcija: UV 254 nm

Metod N’: kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 70:30, detekcija: UV 254 nm

Metoda O’: kolona: Luks Celuloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, gradijent eluiranja, A=ACN, B= H2O, detekcija: UV 254 nm

Metoda P': kolona: Luks Amiloza-2 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 50:50, detekcija: UV 254 nm Metoda R': kolona: Luks Amiloza-2 (4,6 mm 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, gradijent eluiranja; A=ACN, B= H2O, detekcija: UV 254 nm

Metod S': kolona: Luks amiloza-2 (4,6 mm 250 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 60:40, detekcija: UV 254 nm Metoda T ': kolona: Luks Celuloza-4 (4,6 mm x 150 mm, 5 µm), temperatura kolone: ambijentalna, protok: 1,23 ml/min, izokratsko eluiranje, ACN:H2O, 60:40, detekcija: UV 254 nm. Sledeći primeri su sintetizovani prema ovde opisanim procedurama ili poznatim metodama iz literature korišćenjem odgovarajućih početnih materijala i metoda poznatih stručnjaku u ovoj oblasti:

Tabela 1

l

Biološki primeri:

Biološki primer 1. Fluorescentni polarizacioni test

[0197] Inhibicija interakcije p53-Mdm2 je merena korišćenjem testa vezivanja fluorescentne polarizacije (FP). FP meri rotaciono kretanje molekula u homogenoj suspenziji. Za ovaj test, N-terminalni domen Mdm2 proteina (aminokiseline 1-111) je kombinovan sa fluoresceinom obeleženim (FAM) peptidom izvedenim iz p53 transaktivacionog domena (sekvenca: 5-FAM-TSFAEIVNLLSP). Nakon ekscitacije fluorescentnog liganda linearno polarizovanom svetlošću, peptid emituje okomito polarizovanu svetlost. Ako je peptid vezan za Mdm2, rotacija će se usporiti i okomita komponenta će se proporcionalno smanjiti. Nasuprot tome, prekid kompleksa peptid-Mdm2 usled vezivanja inhibitora za mesto vezivanja p53 Mdm2 dovodi do oslobađanja peptida i smanjenja polarizacije emitovane svetlosti.

[0198] Eksperimenti fluorescentne polarizacije očitani su na čitaču Biotek Citation 5 sa ekscitacionim filterima od 470 nm i emisionim filterima od 520 nm za fluorescein. Polarizacija fluorescencije je merena u crnim pločama sa 96 bunarčića (Corning, CLS3991) na sobnoj temperaturi. Čistoća Mdm2 je kontrolisana na >95%. Reakcioni pufer je optimizovan dodavanjem 5 mM DTT i 0,1% cviterjonskog deterdženta CHAPS da bi se smanjio efekat nespecifičnih interakcija.

[0199] Test je izveden kombinovanjem sukcesivnog razblaženja jedinjenja razblaženih u dimetil sulfoksidu (DMSO, 5% konačna koncentracija) sa 75 nM Mdm2 u reakcionom puferu (PBS, 0,1% CHAPS, 5 mM DTT (ditiotreitol)). Posle 15 minuta inkubacije na sobnoj temperaturi dodat je 10 nM FAM obeleženog peptida. Konačno očitavanje je obavljeno nakon 90 minuta inkubacije. Krive vezivanja zavisne od doze i vrednosti IC50 su izračunate korišćenjem GraphPad Prism5 i zatim transformisane u Ki vrednosti korišćenjem Kenakin jednačine (Tabela 2).

Tabela 2

[0200] Inspekcija izmerenih vrednosti Ki pokazuje da su sva otkrivena jedinjenja snažni (Ki u opsegu 1,7-2,5 nM) inhibitori Mdm2-p53 interakcija.

Biološki primer 2. Test vitalnosti ćelije

[0201] Efekat izumljenih inhibitora p53-Mdm2 na vitalnost ćelija je procenjen korišćenjem MTT testa. To je kolorimetrijski test koji meri konverziju tetrazolijumovog prstena rastvorljive žute boje (MTT) u nerastvorljivi ljubičasti formazan. Ovaj proces je katalizovan isključivo u mitohondrijalnim dehidrogenazama živih ćelija. Mrtve ćelije ne izazivaju ovu promenu. Da bi se izmerila specifična citotoksičnost inhibitora Mdm2-p53, MTT test je izveden sa ćelijskom linijom SJSA-1 osteosarkoma koja pokazuje amplifikaciju gena MDM2 i divlji tip p53.

[0202] Ćelije su zasejane na ploče sa 96 bunarčića i zatim tretirane uzastopnim razblaženjima testiranih jedinjenja. Posle 72 h inkubacije, MTT je dodat do konačne koncentracije 0,5 mg/ml. Ćelije su dalje inkubirane naredna 4 sata. Zatim je rastvor oceđen i preostali kristali formazana su rastvoreni u 100 ml DMSO. Očitavanje apsorbancije je izvedeno na 570 nm otkrivajući relativnu vijabilnost ćelija između ćelija tretiranih procenjenim jedinjenjima i DMSO kontrole. Svi MTT eksperimenti su nezavisno ponovljeni 2-5 puta. Krive vezivanja zavisne od doze i vrednosti IC50 su izračunate korišćenjem GraphPad Prism 5. Prikazane vrednosti IC50 predstavljaju prosečnu vrednost iz svih sprovedenih eksperimenata (Tabela 3).

Tabela 3

Biološki primer 3. Merenje in vitro unutrašnjeg klirensa korišćenjem mikrozoma

[0203] Metabolička stabilnost jedinjenja pronalaska je procenjena merenjem in vitro unutrašnjeg klirensa u mišjim i humanim mikrozomima.

[0204] 10 mM osnovni rastvori markera i test jedinjenja su pripremljeni u DMSO. Oni su razblaženi 100 puta u 91:9 MeCN:DMSO da bi se dobila 100 mM zaliha za ispitivanje. 10 mM NADPH je napravljeno u 0,1 M fosfatnom puferu (pH7,4). Mikrosomi su odmrznuti u vodenoj smeši na 37°C i razblaženi da bi se dobila konačna koncentracija testa od 0,5 mg/ml.

[0205] 100 µM zaliha za ispitivanje je dodato da se dobije konačna koncentracija od 1 mM u inkubacione epruvete koje sadrže pufer i NADPH (konačna koncentracija testa je 1 mM). Epruvete za inkubaciju i mikrozomi su prethodno zagrejani na 37°C tokom 3 minuta. Mikrosomi su zatim dodati u inkubacione epruvete koje su držane na 37°C i mućkane pomoću orbitalnog šejkera tokom trajanja testa. Uzorci su uzeti u 6 unapred određenih vremenskih tačaka do 1 sata i preneti u pripremljene epruvete za gašenje koje sadrže odgovarajući rastvarač sa internim standardom.

[0206] Ugašeni uzorci se temeljno izmešaju i protein se istaloži na -20°C najmanje 12 sati. Uzorci su zatim centrifugirani na 4°C. Supernatanti su prebačeni u svežu ploču sa 96 bunarčića, kompatibilnu sa automatskim uzorkivačem. Ploča je zapečaćena silikonskom prostirkom koja je prethodno bila urezana i analizirana pomoću LC-MS/MS.

[0207] U poređenju sa jedinjenjima opisanim u WO2015/189799, sva trenutno otkrivena jedinjenja pokazuju nizak unutrašnji klirens i u ljudskim i u mišjim mikrozomima. Jedini izuzetak je jedinjenje 6. Međutim, nešto manja stabilnost ovog jedinjenja je nadoknađena izuzetnom in vitro efikasnošću (SJSA-1 IC50=0,03 µM).

Biološki primer 4. In vivo efikasnost u modelu ksenotransplantata SJSA-1 kod miševa

[0208] Eksperiment je sproveden na ženkama miševa iz soja Crl:CD-1-Fokn1nu. Miševi su inokulisani subkutano u desnom boku linijom ćelija raka SJSA-1 u količini od 3 x 106 ćelija suspendovanih u 100 ml HBSS : Matrigel matriksa u odnosu 3:1 po mišu. 17. dana nakon inokulacije miševi su podeljeni u grupe, tako da je u svakoj grupi srednja zapremina tumora bila slična i u proseku iznosila oko 200 mm3. Odabrane su eksperimentalne grupe, od kojih se svaka sastojala od 8 miševa: Kontrolni NaCl 0,9% i jedinjenja. Jedinjenja 1-11 su rastvorena u 56,60% PEG 400, 9,43% Cremophor RH40, 9,43% ETOH, 18,87% Labrafil M1944CS, 5,67% DMSO. Za jedinjenje 107 iz VO2015/189799 korišćena je grupa od 7 miševa, koja je rastvorena u 15% PEG400, 10% Cremophor EL, 75% H2O.

[0209] Miševi korišćeni u eksperimentu davani su per os (p.o.) sa jedinjenjima ili NaCl 0,9% po rasporedu q1d x 14 (14 doza, dnevno). Tokom eksperimenta, miševi su mereni pre svake primene, - dva puta/tri puta nedeljno. Dobrobit životinja je svakodnevno praćena. Nije primećena značajna razlika u telesnoj težini ili dobrobiti između eksperimentalnih grupa tokom i na kraju studije.

[0210] Promena zapremine tumora je praćena dva puta/tri puta nedeljno počevši od prvog dana primene. Volumen tumora je izračunat na osnovu njegove dužine i širine izmerene elektronskim meračem:

gde je d - širina, D - dužina.

[0211] Volumen tumora u grupama je meren do 101 dan nakon inokulacije (72 dana nakon poslednje primene). Rezultati eksperimenta su izraženi kao srednje vrednosti inhibicije rasta tumora (TGI) 6 SEM (Tabela 4). Inhibicija rasta tumora izračunata je korišćenjem sledeće formule:

gde je C - srednja veličina tumora u kontrolnoj grupi, T - srednja veličina tumora u tretiranoj grupi. Svi proračuni i grafikoni su izvedeni korišćenjem softvera GraphPad Prism 5.

Tabela 4

[0212] Rezultati ovog eksperimenta su sumirani u tabeli 4 i slikama 1 i 2. Kao što se može videti, poboljšana metabolička stabilnost trenutno otkrivenih jedinjenja se prevodi u izuzetnu in vivo efikasnost. Vrednosti inhibicije rasta tumora primećene za jedinjenja 1-11 su značajno veće nego za najbolje jedinjenje otkriveno u WO2015/189799 i posle 7 (razlika 36,0-46,6%) i 12 (razlika 35,9-39,9%) doze supstance . Štaviše, kao što se može primetiti na Slici 1 tretman ksenotransplantata SJSA-1 sa 14 doza od 12,5 mg/kg p.o. iz WO2015/189799 samo usporava rast tumora. Isti protokol lečenja ali sa jedinjenjima 7, 8 i 11 je rezultirao potpunom eradikacijom tumora. Štaviše, nijedna od lezija nije pokazala ponovni rast tokom naknadnog praćenja do 101. dana.

Claims

Patentni zahtevi: 1. Jedinjenje koje ima sledeću strukturu

pri čemu R<1>je meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, -OH, -NH2, -NO2, -CN, -C1-C6-alkyl, -O-(C1-C6-alkyl), -S-(C1-C6-alkyl), -C(O)O-(C1-C6-alkyl),-NH(C1-C6-alkyl) i -N(C1-C6-alkyl)2, R<2>i R<3>su nezavisno H ili halogen; R<4>je -C1-C6-alkil; <R7 je -OC> Z je C-R<8>i H, halogen
2. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je <R1>meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, C1-C6-alkyl, -O-(C1-C6-alkyl), -NH(C1-C6-alkyl), i -N(C1-C6-alkyl)2.
3. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, pri čemu je R<1>meta-halo-fenil koji je opciono dalje supstituisan sa jednim do dva supstituenta nezavisno izabrana iz grupe koju čine halogen, - CH3, -OCH3, -NH(CH3), and -N(CH3)2.
4. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 3, pri čemu R<2>je H, i R<3>je Cl.
5. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 4, pri čemu je R<4>izo-propil ili izo-butil.
6. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu su Z i Y oba N.
7. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 5, pri čemu Z je C- R<8>i Y je N.
8. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, pri čemu su R<5>i R<6>oba OMe.
9. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, pri čemu R<8>je H,i najmanje jedan od R<5>i R<6>je OMe, a drugi je izabran od H, -N(Me)2i OMe.
10. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2, izabrani oblik: (1) (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (2) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (3) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-metilfenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-trimetoksipirimidin-5-il )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (4) (3S)-6-hloro-2'-(3-hloro-4-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (5) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-trimetoksipirimidin-5-il )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (6) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-[6-(dimetilamino)-4-metoksipiridin-3-il]-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (7) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (8) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (9) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (10) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il) )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (11) (3S)-6'-(butan-2-il)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.
11. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 6, izabrani oblik: (1) (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2, 3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (2) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (3) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-metilfenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-metoksipihmidin-5-il )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (4) (3S)-6-hloro-2'-(3-hloro-4-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (5) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-6'-(propan-2-il)-5'-(2,4,6-trimetoksipihmidin-5-il )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (7) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (10) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2,4-difluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il) )-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (11) (3S)-6'-(butan-2-il)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipihmidin-5-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.
12. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 7, izabrani oblik: (6) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-[6-(dimetilamino)-4-metoksipiridin-3-il]-6'-(propan-2 -il)-1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (8) (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1, 2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion (9) (3S)-6-hloro-2'-(5-hloro-2-fluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)- 1,2,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.
13. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 formule

je (3S)-6-hloro-2'-(3,4-difluorofenil)-5'-(4,6-dimetoksipiridin-3-il)-6'-(propan-2-il)-1,2 ,3',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.
14. Jedinjenje prema patentnom zahtevu 2 formule

je (3S)-6-hloro-2'-(3-hlorofenil)-5'-(2,4-dimetoksipirimidin-5-il)-6'-(propan-2-il)-1,2,3 ',5'-tetrahidro-2'H-spiro[indol-3,1'-pirolo[3,4-c]pirol]-2,3'-dion.
15. Jedinjenje prema bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 14 za upotrebu kao lek.
16. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 15 za upotrebu u postupku prevencije i/ili lečenja bolesti izabranih iz grupe koju č ine kancer, imunske bolesti, inflamatorna stanja, alergijske kožne bolesti povezane sa prekomernom proliferacijom, zaslepljujuća bolest i virusne infekcije.
17. Jedinjenje za upotrebu prema patentnom zahtevu 16, pri čemu je bolest rak.
18. Farmaceutska kompozicija koja kao aktivni sastojak sadrži jedinjenje kako je definisano u bilo kojem od patentnih zahteva od 1 do 14, u kombinaciji sa najmanje jednim farmaceutski prihvatljivim ekscipijensom.