RS63149B1 - Insertabilni varijabilni fragmenti antitela i modifikovani a1-a2 domeni nkg2d liganada - Google Patents

Insertabilni varijabilni fragmenti antitela i modifikovani a1-a2 domeni nkg2d liganada

Info

Publication number
RS63149B1
RS63149B1 RS20220389A RSP20220389A RS63149B1 RS 63149 B1 RS63149 B1 RS 63149B1 RS 20220389 A RS20220389 A RS 20220389A RS P20220389 A RSP20220389 A RS P20220389A RS 63149 B1 RS63149 B1 RS 63149B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
nkg2d
binding
mica
ifv
domain
Prior art date
Application number
RS20220389A
Other languages
English (en)
Inventor
Kyle Landgraf
Daniel Steiger
Steven R Williams
David W Martin
Original Assignee
Xyphos Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Xyphos Biosciences Inc filed Critical Xyphos Biosciences Inc
Publication of RS63149B1 publication Critical patent/RS63149B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/20—Antigen-binding scaffold molecules wherein the scaffold is not an immunoglobulin variable region or antibody mimetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/32—Fusion polypeptide fusions with soluble part of a cell surface receptor, "decoy receptors"
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

Opis
STANJE TEHNIKE PRONALASKA
OBLAST PRONALASKA
[0001] Ova prijava se uopšteno odnosi na proizvodnju polipeptida koji imaju specifične osobine Fv domena za vezivanje antigena, na primer, insertabilni varijabilni fragmenti antitela i modifikovani α1-α2 domeni liganada NKG2D.
OSNOVNE INFORMACIJE
[0002] Antitelo (Ab), Slika 1, takođe poznato kao imunoglobulin (Ig), kod mnogih sisara, uklјučujući čoveka, je veliki protein u obliku slova „Y“ koji imunski sistem koristi da identifikuje i neutrališe strane tela kao što su bakterije i virusi (Charles Janeway (2001). Immunobiology. (5th ed.), Chapter 3. Garland Publishing. ISBN 0-8153-3642-X. (electronic full text via NCBI Bookshelf). Antitelo prepoznaje jedinstveni deo stranog molekula, koji se zove antigen. Svaki vrh dva kraka antitela koji su u obliku slova "Y", sadrži mesto vezivanja antigena, ili paratop (struktura analogna bravi), koja je specifična za jedan određeni epitop (slično analogno klјuču) antigena, dopuštajući da se ove dve strukture precizno povežu. Upotrebom ovog mehanizma vezivanja, antitelo može obeležiti mikroorganizam ili inficiranu ćeliju za delovanje drugih delova imunskog sistema ili može direktno neutralisati svoj cilj, na primer, blokiranjem dela mikroorgnizma koji je neophodan za njegov ulazak i opstanak. Proizvodnja antitela je glavna funkcija humoralnog, ili "adaptivnog", imunskog sistema. Antitela luče ćelije plazme. Antitela mogu biti u dva fizička oblika, u solubilnom obliku koji se luči iz ćelije, i obliku vezanom za membranu koji je vezan za površinu B ćelije preko „stabla“ „Y“.
[0003] Antitela su glikoproteini koji pripadaju superfamiliji imunoglobulina i obično su sastavljena od osnovnih strukturnih jedinica – svaka sa dva velika teška lanca i dva manja laka lanca. Postoji nekoliko različitih tipova teških lanaca antitela i nekoliko različitih vrsta antitela, koji su grupisani u različite izotipove na osnovu vrste teškog lanca kojeg sadrže. Poznato je pet različitih izotipova antitela kod sisara (Market E, Papavasiliou FN (October 2003). "V(D)J recombination and the evolution of the adaptive immune system". PLoS Biol. 1 (1): E16. doi:10.1371/journal.pbio.0000016. PMC 212695. PMID 14551913). Iako je opšta struktura svih antitela veoma slična, mali region na vrhu svakog kraka proteina u obliku slova „Y“ je izuzetno varijabilan, što obezbeđuje da postoje milioni antitela sa malo drugačijim strukturama vrha, odnosno mestima za vezivanje antigena. Ovaj region je poznat kao hipervarijabilni ili varijabilni region. Svaka od ovih prirodnih varijanti može se vezati za drugačiji antigen. Ova ogromna raznolikost antitela omogućava imunskom sistemu da se prilagodi i prepozna jednako širok spektar antigena (Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi:10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.).
[0004] Prirodni Ig molekul u obliku „Y“ sastoji se od četiri polipeptidna lanca; dva identična teška lanca i dva identična laka lanca povezana disulfidnim vezama, Slika 1. Svaki teški lanac ima dva glavna regiona, konstantni region (CH) i varijabilni region (VH). Konstantni region je u suštini identičan kod svih antitela istog izotipa, ali se razlikuje kod antitela različitih izotipova. Laki lanac takođe ima dva uzastopna domena: manji konstantni region (CL) i varijabilni region (VL) (Woof J, Burton D (2004). "Human antibody-Fc receptor interactions illuminated by crystal structures." Nat Rev Immunol 4 (2): 89-99. doi:10.1038/nri1266. PMID 15040582).
[0005] Neki delovi antitela imaju iste funkcije. Svaki od dva kraka „Y“, na primer, sadrži mesta koja se mogu vezati za antigene i, prema tome, prepoznati specifična strana tela. Ovaj region antitela se naziva Fv (fragment, promenlјiva) region. Sastoji se od jednog varijabilnog regiona iz teškog lanca (VH) i jednog varijabilnog region iz lakog lanca (VL) antitela (Hochman J, Inbar D, Givol D (1973). An active antibody fragment (Fv) composed of the variable portions of heavy and light chains. Biochemistry 12 (6): 1130-1135. doi:10.1021/bi00730a018. PMID 4569769). Paratop je specifično oblikovan na jednom kraju Fv regiona, gde je region za vezivanje antigena. Sastoji se od varijabilnih petlјi β-lanaca, od po tri na VLi na VH,i odgovoran je za vezivanje antigena, Slika 2. Ovih 6 petlјi se nazivaju regioni koji određuju komplementarnost (CDR) (North B, Lehmann A, Dunbrack RL (2010). "A new clustering of antibody CDR loop conformations". J Mol Biol 406 (2): 228-256. doi:10.1016/j.jmb.2010.10.030. PMC 3065967. PMID 21035459).
[0006] Korisni polipeptidi koji poseduju specifičnu funkciju vezivanja antigena mogu biti izvedeni iz CDR-ova varijabilnih regiona antitela. Ova dva varijabilna domena antitela, jedan iz lakog lanca (VL) i jedan iz teškog lanca (VH), svaki sa 3 CDR-a može biti fuzionisan u tandemu, u bilo kom redosledu, upotrebom jednog, kratkog povezujućeg peptida od 10 do oko 25 aminokiselina da bi se stvorio polipeptidni linearni jednolančani varijabilni fragment (scFv) koji sadrži po jedan varijabilni domen teškog i lakog lanca, Slika 3 (Bird, R. E., Hardman, K. D., Jacobson, J. W., Johnson, S., Kaufman, B. M., Lee, S. M., Lee, T., Pope, S. H., Riordan, G. S., and Whitlow, M. (1988) Single-chain antigen-binding proteins, Science 242, 423-426; Huston, J. S., Levinson, D, Mudgett-Hunter, M, Tai, M-S, Novotny, J, Margolies, M.N., Ridge, R., Bruccoleri, RE., Haber, E., Crea, R., and Opperman, H. (1988). Protein engineering of antibody binding sites: Recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. PNAS 85: 5879-5883).
[0007] Povezujući deo (linker) je obično bogat glicinom zbog fleksibilnosti, kao i serinom, treoninom ili naelektrisanim aminokiselinama zbog solubilnosti, i može ili da poveže N-kraj VHsa C-krajem VL, ili obrnuto. Ovaj protein zadržava specifičnost originalnog imunoglobulina, uprkos uklanjanju konstantnih regiona i uvođenju jednog linkera. Ova forma omogućava stručnjaku u oblasti tehnologije rekombinantne DNK da genetski spoji linearni scFv sa N- ili C-krajem osnovnog proteina kako bi se osnovnom proteinu prenela svojstva scFv vezivanja antigena. Postoje brojni drugi predloženi ili kreirani aranžmani polivalentnih i tandemskih scFv regiona, ali kao što su opisani u nastavku, ali najvažnije je da svi imaju najmanje dva prostorno udalјena kraja, Slika 4 (Le Gall, F.; Kipriyanov, SM; Moldenhauer, G; Little, M (1999). "Di-, tri- and tetrameric single chain Fv antibody fragments against human CD19: effect of valency on cell binding". FEBS Letters 453 (1): 164-168. doi:10.1016/S0014-5793(99)00713-9. PMID 10403395).
[0008] Uniprot baza podataka otkriva NKG2D ligand, antigen povezan sa MHC molekulom klase I MICH2 (fragment) OS = Pan troglodytes (šimpanza) (pristupni broj bazi podataka Q5JCT8).
[0009] B. McFarland et al. Structure. 2003 Apr; 11(4):411-22. doi: 10.1016/s0969-2126(03)00047-9 opisuje analizu interakcija između lektinu sličnog imunoreceptora NKG2D tipa C i liganda sličnih MHC klase I.
[0010] S Henager et al. Protein Sci. 2012 Sep;21(9):1396-402. doi: 10.1002/pro.2115 opisuje kombinaciju različito dizajniranih strategija za realno sazrevanje afiniteta odnosa MICA-NKG2D. S Radaev et al. Immunity.2001 Dec; 15(6):1039-49. doi: 10.1016/s1074-7613(01)00241-2 opisuje da se konformaciona plastičnost otkriva kokristalnom strukturom NKG2D i njegovog liganda ULBP3 koji je sličan MHC klase I.
[0011] US 2014/302072 opisuje modifikovane MIC proteine. Lengyel et al. J Biol Chem.2007 Oct 19; 282(42):30658-66, doi: 10.1074/jbc.M704513200 opisuje da mutacije dizajnirane da destabilizuju konformaciju koja se vezuje za receptor povećavaju stopu i afinitet povezivanja MICA-NKG2D. Li et al. Nat Immunol. 2001. May; 2(5):443-51, doi: 10.1038/87757 opisuje kompleksnu strukturu aktivirajućeg imunoreceptora NKG2D i njegovog liganda MICA koji je sličan MHC klase I.
[0012] US 2012/295288 opisuje serološki marker za otkrivanje raka pankreasa i postupak za korišćenje serološkog markera.
[0013] US 2003/147847 opisuje ULBP DNK i polipeptide. S. Radaev et al. J Immunol. 2002 Dec 1; 169(11):6279-85 doi: 10.4049/jimmunol.169.11.6279 opisuje da postoji različito prepoznavanje liganda od strane NKG2D.
IZLAGANJE SUŠTINE PRONALASKA
[0014] Pronalazak je definisan u patentnom zahtevu 1. Dodatni aspekt i poželјna realizacija su definisani u povezanom patentnom zahtevu. Bilo koji aspekti, primeri realizacije i primeri predmetnog pronalaska koji ne potpadaju pod obim priloženih patentnih zahteva ne čine deo pronalaska i samo su dati u ilustrativne svrhe.
[0015] Shodno tome, ovaj pronalazak pruža molekul α1-α2 domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% sličnosti sa SEQ ID NO: 17,
pri čemu pomenuti domen molekula sadrži sve od (a)-(c):
(a) S ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 SEQ ID NO: 17,
(b) A, P, S, T ili H ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 165 SEQ ID NO: 17; i
(c) G ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 162 SEQ ID NO: 17,
i pri čemu pomenuti domen molekula pokazuje veći afinitet vezivanja za humani NKG2D u poređenju sa SEQ ID NO: 17.
KRATAK OPIS SLIKA NACRTA
[0016]
Slika 1. Nacrt tipičnog antitela sisara koji pokazuje njegovu strukturu u obliku slova „Y“ i strukturne komponente.
Slika 2. Nacrt strukture Fv regiona prirodnog antitela sisara koji prikazuje 3 obeležena (regiona koji određuju komplementarnost) CDR-a VHi 3 neobeležene petlјe CDR-a VL, koji formiraju mesto vezivanja paratopa ili antigena.
Slika 3. Nacrt dve moguće strukture jednolančanog varijabilnog fragmenta (scFv), sa mestima vezivanja antigena uklјučujući N-kraj na levoj i C-kraj na desnoj strani. Pojedinačni povezujući (linker) region, ili linker peptid, u svakom scFv-u prikazan je kao strelica.
Slika 4. Polivalentni jednolančani varijabilni fragmenti (scFv). Struktura dvovalentnog (gore) i trovalentnog (dole) scFvs, tandem (levo) i format di-/trimerizacije (desno). Opaska, svaki ima 2 ili više prostorno udalјenih slobodnih terminala.
Slike 5A i 5B. Dijagram insertabilnog varijabilnog fragmenta, iFv. Dijagram insertabilnog varijabilnog fragmenta, iFv. (A) Struktura varijabilnih lakih (VL) i varijabilnih teških (VH) domena antitela koje vezuje FGFR3 koja pokazuje topologiju domena iFv formata. Sive strelice predstavlјaju 2 linker regiona (LR), od kojih se jedan i samo jedan tradicionalno koristi za povezivanje krajeva VL i VH kako bi se formirao scFv. LR predstavljen strelicom sa tačkastim rubom povezao je C-terminus VL-a sa N-terminusom VH-a (vidlјivo iza molekula). LR predstavljen strelicom sa punom linijom povezao je C-terminus VH-a sa N-terminusom VL-a. Segmenti podelјenog VL domena su označeni kao Nt i Ct kao što je opisano u tekstu. Kao rezultat stvaranja modifikovanog para N- i C-kraja između lanca 1 (S1) i lanca 2 (S2), VL je podelјen na N-terminalni segment (VLN) i C-terminalni segment (VLC). 6 CDR-ova VL i VH su predstavlјeni kao petlјe na vrhu slike. (B) Šema rasporeda domena za umetanje iFv u petlјu 1 (L1) MICA-α3 sa ili bez regiona za odvajanje (SR). IFv se takođe može na sličan način umetnuti u petlјu 2 (L2) i/ili petlјu 3 (L3).
Slika 6. Krive titracije za modifikovane sMICA molekule koji se vezuju za FGFR3 kojim su obloženi bunari. Vezani sMICA je detektovan ELISA postupkom pomoću NKG2D-Fc kako bi se potvrdila bispecifična aktivnost. Obe verzije umetnutih varijabilnih fragmenata (MICA-α3-iFv.1 i MICA-α3-iFv.2) vezuju FGFR3 uporedivo sa fuzijom C-kraja scFv (MICA-scFv).
Slike 7A i 7B. Termička stabilnost MICA-α3-iFv.2. ELISA krive titracije MICA-scFv (A) ili MICA-α3-iFv.2 (B) vezivanja za FGFR3 kojim su obloženi bunari nakon izlaganja naznačenim temperaturama (stepeni Celzijusa) tokom 1 sata. MICA-α3-iFv je pokazao snažno vezivanje za FGFR3 nakon izlaganja temperaturi od 80°C, dok je MICA-scFv izgubio značajnu aktivnost nakon izlaganja temperaturi od 70°C.
Figura 8. Testovi lize cilјnih ćelija pomoću NK ćelija. NKL efektorske ćelije su ko-inkubirane sa cilјnim ćelijama P815 koje eksprimiraju FGFR3 i sadrže kalcein, u odnosu efektorske:ciljne ćelije od 15:1. Povećanja koncentracija negativne kontrole MICA (sMICA) nisu imale uticaja na lizu cilјnih ćelija, dok su prikazane varijante MICA-α3-iFv koje se vezuju za FGFR3 stimulisale lizu cilјnih ćelija. U poređenju sa MICA-scFv, obe varijante MICA-α3-iFv su jače stimulisale lizu cilјnih ćelija.
Slike 9A i 9B. Vezivanje targeta i aktivnost lize ćelija CD20-specifične sMICA varijante. MICA-α3-iFv.3 je prikazao titrabilno vezivanje za CD20 kojim su obloženi bunari u ELISA testu (A), a takođe je pobolјšao NK ćelijama posredovanu ćelijsku lizu Ramos ćelija koje eksprimiraju CD20 (B). U (B), efektorske ćelije NKL su koinkubirane sa Ramos ćelijama koje eksprimiraju CD20 i sadrže kalcein, u odnosu efektorske:ciljne ćelije od 15:1, i povećanja koncentracija bilo negativne kontrole (sMICA) ili MICA-α3-iFv.3.
Slika 10. Krive titracije za NKG2DL-α3-iFv.2 proteine koji se vezuju za FGFR3 kojim su obloženi bunari. Vezani protein je detektovan ELISA metodom pomoću NKG2D-Fc da bi se potvrdila bispecifična aktivnost. Sve varijante testiranih proteina NKG2DL-α3-iFv.2 (OMCP, ULBP1, 2, 3, 4, 6) vezale su se za FGFR3 na sličan način.
Slika 11. Testovi lize cilјnih ćelija pomoću NK ćelija. NKL efektorske ćelije su koinkubirane sa cilјnim ćelijama P815 koje eksprimiraju FGFR3 i sadrže kalcein, u odnosu efektorske:ciljne ćelije od 15:1. Povećanja koncentracija negativne kontrole MICA (sMICA) nisu imale uticaja na lizu cilјne ćelije, dok je svaki označeni protein NKG2DL-α3-iFv.2 stimulisao lizu cilјne ćelije.
Slika 12. Strukturno usmerena mutageneza α1-α2 domena MICA za pojačan afinitet prema NKG2D. (A) Struktura α1-α2 domena MICA (PDB 1HYR) sa površinom vezivanja za NKG2D mapiranom sa 57 ostataka obojenih tamno sivom bojom. (B) Šest pozicija je identifikovano kao klјučna mesta mutacija afiniteta za NKG2D. Ostaci aminokiselina su osenčeni i njihovi bočni lanci prikazani su tamno sivim sferama.
Slike 13A i 13B. NKG2D-Fc kompetitivni ELISA testovi za rangiranje afiniteta varijanti α1-α2. (A) Podaci o titraciji za panel afiniteta varijanti α1-α2 (15-18), divlјeg tipa (WT) ili WED solubilnih MICA proteina koji inhibiraju vezivanje humanog NKG2D-Fc za MICA obloženu ploču. (B) Isti skup proteina u (A) titriran protiv mišjeg NKG2D-Fc. U obe varijante testa 15, 16, 17 i 18 prikazuju IC50vrednosti značajno manje od oba WT i WED proteina. Ravnotežna vrednosti IC50su prikazane u Tabeli 3.
Slika 14. Analiza kinetika asocijacije i disocijacije za α1-α2 varijante koje se vezuju za NKG2D, mereno interferometrijom biosloja na instrumentu Octet. Kinetički tragovi za panel α1-α2 varijanti. Faze asocijacije i disocijacije su prilagođene korišćenjem jedne eksponencijalne jednačine vezivanja u odnosu 1:1, a konstante asocijacije („on-rate“) i disocijacije („off-rate“) izvedene iz jednačina krivi prikazane su u Tabeli 3.
Slika 15. Testovi ubijanja cilјnih ćelija pomoću NK ćelija za α1-α2 varijante koje odabiraju cilјne ćelije koje eksprimiraju FGFR3. NKL efektorske ćelije su koinkubirane sa cilјnim ćelijama P815 koje eksprimiraju FGFR3 i sadrže kalcein, u odnosu efektorske:ciljne ćelije od 15:1. Povećanja koncentracija negativne kontrole MICA (sMICA) nisu imale uticaja na lizu cilјnih ćelija, dok su prikazane α1-α2 varijante stimulisale lizu cilјnih ćelija. U odnosu na WT i WED-MICA, varijante 16, 17 i 18 su pokazale značajno veću sposobnost ubijanja ciljnih ćelija pri niskim koncentracijama.
Slika 16. Analiza kinetika asocijacije i disocijacije za α1-α2 varijante 20, 25 i 48 koje se vezuju za NKG2D, mereno interferometrijom biosloja na instrumentu Octet. Faze asocijacije i disocijacije su usklađene korišćenjem jedne eksponencijalne jednačine vezivanja u odnosu 1:1, a konstante asocijacije („on-rate“) i disocijacije („off-rate“) izvedene iz jednačina prikazane su u Tabeli 5.
Slika 17. Ubijanje cilјnih ćelija pomoću NK ćelija, test zasnovan na kalceinu za α1-α2 varijante 16, 25 i WED P815 ciljnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3.
Slika 18. Poravnanje proteinske sekvence α1-α2 domena MICA i ULBPs (SEQ ID NOs.: 77-83). Aminokiseline osenčene sivom bojom odabrane su za NNK mutagenezu u ULBP2 (60 aminokiselina) i ULBP3 (36 aminokiselina). Ostaci osenčeni crnom bojom su identifikovani kao klјučne pozicije za odabrane i identifikovane mutacije koje menjaju afinitet vezivanja za NKG2D (Tabele 6 i 7).
Slike 19A i 19B. Fagne ELISA titracije ULBP varijanti koje se vezuju za NKG2D. (A) ULBP2 varijante prikazane na fagu su titrirane u odnosu na NKG2D i mereni su relativni afiniteti vezivanja u odnosu na nativni ULBP2 (WT, crni krugovi). (B) ULBP3 varijante prikazane na fagu su titrirane u odnosu na NKG2D i mereni su relativni afiniteti vezivanja u odnosu na nativni ULBP3 (WT, crni krugovi).
Slike 20A-D. Fuzije nativne (WT), modifikovane varijante WED, 25 ili 48 α1-α2 domena sa teškim lancem (A) ili lakim lancem (B) antitela specifičnog za FGFR3, su uticale na smrtnost cilјne ćelije pomoću NK. Fuzije varijanti 25 i 48 bilo sa teškim lancem (C) ili lakim lancem (D) značajno su pobolјšale stepen smrtnosti i potenciju smrtnosti u poređenju sa WED varijantom i sa nativnim (WT) fuzijama.
Slike 21A-C. Fuzije varijante 25 α1-α2 domena sa teškim lancima ili lakim lancima antitela na humani EGFR (A), HER2 (B) ili PDL1 (C) svaka pojačava stepen smrtnosti cilјne ćelije pomoću NKL ćelija. Prikazana su slabi efekti ili odsustvo efekta smrtnosti od strane prikazanih relevantnih osnovnih antitela, cetuksimaba (A), trastuzumaba (B) i anti-PDL1 (C).
Slike 22A i 22B. In vivo fuzije NK ćelija sa varijantom 25 α1-α2 domena zasnovane na trastuzumabu. Osnovni trastuzumab, fuzioni trastuzumab HC_25 i fuzioni trastuzumab LC_25 su konjugovani sa Aleksa fluorom. Grupama od po tri C57BL/6 miša je ubrizgana pojedinačna doza od 100 µg osnovnog molekula, fuzije HC ili fuzije LC; i uzeta je krv od svake životinje u naznačeno vreme za dobijanje plazme za PK ELISA (A) i protočnu citometrijsku analizu fluorescentno obeleženih molekula vezanih za periferne NK ćelije (B).
Slike 23A-C. Antitela na lekove dobijena kod istih životinja opisanih u Primeru 7 i na Slici 21 kojima su primenjeni osnovni trastuzumab (A), fuzije na bazi trastuzumaba sa HC (B) i na bazi trastuzumab sa LC (C) sa varijantom 25. Kontrolna (Ctrl) plazma je bila od miša na kome nije primenjen nijedan tretman koji sadrži antitela.
Slike 24A i 24B. Antitela stvorena u životinjama kojima je primenjena varijanta 25 α1-α2 domena fuzionisana sa trastuzumab-HC i -LC, kao što je opisano u Primeru 7 i Slikama 21-22, vezana su i za osnovno antitelo (A) i za α1-α2 domen (B) .
Slika 25. Antitumorska aktivnost fuzije anti-PDL1 sa varijantom 25. Singeni MC38 tumori su implantirani subkutano C57BL/6 miševima, a tumori su narasli u proseku na 100 mm<3>pre početka tretmana. Nakon početka tretmana, četiri kohorte od 10 miševa po grupi su tretirane parenteralno sa pomoćnim supstancama (nosačem), anti-CTLA4 (100 ug i.p.), osnovnim anti-PDL1 (300 ug i.v.) ili anti-PDL1 HC_25 fuzijom (300 ug i.v.) prvog dana , 4 i 7. Zapremine tumora (kubni mm) merene su kod svake životinje u naznačeno vreme.
DETALJAN OPIS PRONALASKA
[0017] Tehničke informacije navedene u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići otkriće pronalaska, koje je definisano isklјučivo priloženim patentnim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su obezbeđene da bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i da bi se ilustrovali moguća povezana tehnička dostignuća. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju u obim priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska.
[0018] Ovde su opisani insertabilni peptidi varijabilnog fragmenta (iFv). Pošto su C-terminus i N-terminus scFv molekula, obuhvatajući polivalentne scFv strukture, udalјeni prostorno, scFv strukture ne mogu biti umetnute u region petlјe ugrađen u nabor osnovnog proteina ili proteina primaoca bez narušavanja ili destabilizacije njegovog nabora i/ili bez narušavanja Fv okvira potrebnog za pravilno pozicioniranje CDR-ova ili hipervarijabilnih regiona da bi zadržali svoja svojstva vezivanja za antigen.
[0019] Da bi insertovali varijabilni fragment antitela koji sadrži do 6 CDR-ova u jedan ili više regiona petlјi osnovnog nascentnog proteinskog molekula bez narušavanja strukturnih nabora varijabilnog fragmenta ili osnovnog proteina, pronašli smo novu klasu peptida koji se vezuju za antigen nastalu od varijabilnih domena lakog i teškog lanca antitela. Nove strukture su sadržale dva linker regiona, a ne tradicionalno pojedinačni linker scFv strukture, plus podelјeni varijabilni domen. Konceptualno, kanonski krajevi varijabilnih lakih (VL) i teških (VH) domena su fuzionisani u kontinualni ili "kružni" peptid. Ta kružna peptidna struktura koja sadrži svih 6 CDR-ova Fv-a može se zatim konceptualno podeliti na jedno od nekoliko mogućih novih mesta da bi se stvorio insertabilni Fv (iFv). Veštački podelјeno mesto može se stvoriti unutar varijabilnog domena bilo lakog ili teškog lanca na ili blizu vrha ili okreta petlјe, da bi se stvorili novi, jedinstveni N- i C-krajevi prostorno pozicionirani proksimalno jedan do drugog, poželјno unutar 0,5 do 1,5 nm, tako da se mogu umetnuti u petlјe drugih (osnovnih ili recipijentnih) proteina ili polipeptida, bez narušavanja strukture, stabilnosti ili želјene funkcije. Ova nova klasa peptida naziva se insertabilni varijabilni fragment (iFv). Specifičnost vezivanja ili targetiranja koju iFv prenosi na molekul primaoca može se promeniti umetanjem u primaoca drugog ili različitog iFV-a zasnovanog na drugom antitelu, ili scFv ili zamenom 1 ili više CDR-ova postojećeg insertabilnog iFv.
[0020] Višestruku korist imaće umetanje jednog ili više iFv polipeptida, koji pokazuju specifična svojstva vezivanja antigena u Fv domenu, u druge proteine i koji na taj način pružaju nova svojstva vezivanja. Takve upotrebe uklјučuju, ali nisu ograničene na, mogućnost osnovnog proteina da veže specifični antigen, da cilјa antigen, da detektuje prisustvo antigena, da ukloni antigen, stupi u kontak ili privuče antigen, da isporuči teret antigenu ili ćeliji koja eksprimira antigen, da regrutuje antigen i da pruži sliku prisustva antigena. Korisna nosivost može biti konjugovana direktno sa jednim ili oba amino-kraja i karboksi-krajem iFv-a ili indirektno sa iFv-om preko osnovnog proteina ili peptida. Primeri korisne nosivosti uklјučuju, ali nisu ograničeni na, hromofor, fluorofor, farmakofor, atom, teški ili radioaktivni izotop, sredstvo za snimanje, hemoterapeutsko sredstvo, ili toksin. Korisna nosivost iFv-a koji su mali i stabilni se može koristiti za lociranje ili identifikaciju prisustva cilјnog molekula za koji se iFv specifično vezuje, i kao takav može poslužiti kao in vitro ili in vivo sredstvo za snimanje ili dijagnostičko sredstvo. Pored toga, na jedan ili oba amino-kraj i karboksi-kraj iFv peptida može se konjugovati hemoterapeutski agens ili toksični molekul da bi se stvorio konjugat iFv-lek, na primer, kao tretman za malignitet ili infekciju. Pojedinačna korisna nosivost proteina može biti u konjugaciji i sa amino-krajem i sa karboksi-krajem iFv peptida tako da obuhvata ili povezuje dva kraja; takav raspon može dalјe stabilizovati iFv blokiranjem završetaka od degradacije egzopeptidazom ili zaštitom iFv od denaturacije ili odvijanja.
[0021] Primeri proteina ili polipeptida osnovnog ili primaoca koji su kandidati za inserciju iFv peptida uklјučuju, ali nisu ograničeni na antitela, proteine koji se sastoje od Ig nabora ili Ig domena, globulina, albumine, fibronektine i fibronektinske domene, integrine, fluorescentne proteine, enzime, spolјašnje membranske proteine, receptorske proteine, T-ćelijske receptore, himerične antigenske receptore, virusne antigene, virusne kapside, virusne ligande za ćelijske receptore, bakteriocine visoke molekulske težine, histone, hormone, čvoriće, ciklične peptide ili polipeptide, familiju proteina glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC), MIC proteine, lektine i ligande za lektine. Takođe je moguće ubaciti iFv strukture u molekule primaoca koji nisu proteini, kao što su polisaharidi, dendrimeri, poliglikoli, peptidoglikani, antibiotici i poliketidi.
[0022] Urođenoubilačke ćelije (NK) i određene (CD8+ αβ i γδ) T-ćelije imunskog sistema imaju važnu ulogu kod lјudi i drugih sisara kao prva linija urođene odbrane od neoplastičnih i ćelija inficiranih virusom (Cerwenka, A., and L.L. Lanier. 2001. NK cells, viruses and cancer. Nat. Rev. Immunol. 1:41-49). NK ćelije i određene T-ćelije ispoljavaju na svojim površinama NKG2D, istaknuti, homodimerni, površinski imunoreceptor odgovoran za prepoznavanje cilјne ćelije i aktiviranje urođene odbrane od patološke ćelije (Lanier, LL, 1998. NK cell receptors. Ann. Rev. Immunol.16: 359-393; Houchins JP et al. 1991. DNA sequence analysis of NKG2, a family of related cDNA clones encoding type II integral membrane proteins on human NK cells. J. Exp. Med.173: 1017-1020; Bauer, S et al., 1999. Activation of NK cells and T cells by NKG2D, a receptor for stress-inducible MICA. Science 285: 727-730). Humani NKG2D molekul poseduje ekstracelularni domen C tipa sličan lektinu koji se vezuje za njegove srodne ligande, 84% sekvence identične ili homologne, monomerne MICA i MICB, polimorfne analoge glikoproteina povezane sa glavnim kompleksom histokompatibilnosti (MHC) klase I (MIC) (Weis et al. 1998. The C-type lectin superfamily of the immune system. Immunol. Rev. 163: 19-34; Bahram et al.1994. A second lineage of mammalian MHC class I genes. PNAS 91:6259-6263; Bahram et al.1996a. Nucleotide sequence of the human MHC class I MICA gene. Immunogenetics 44: 80-81; Bahram and Spies TA. 1996. Nucleotide sequence of human MHC class I MICB cDNA. Immunogenetics 43: 230-233). Nepatološka ekspresija MICA i MICB ograničena je na crevni epitel, keratinocite, endotelne ćelije i monocite, ali aberantna površinska ekspresija ovih MIC proteina se javlјa kao odgovor na mnoge vrste ćelijskog stresa kao što su proliferacija, oksidacija i toplotni šok i obeležava ćeliju kao patološku (Groh et al. 1996. Cell stress-regulated human MHC class I gene expressed in GI epithelium. PNAS 93: 12445-12450; Groh et al. 1998. Recognition of stress-induced MHC molecules by intestinal γδT cells. Science 279: 1737-1740; Zwirner et al. 1999. Differential expression of MICA by endothelial cells, fibroblasts, keratinocytes and monocytes. Human Immunol.
60: 323-330). Patološka ekspresija MIC proteina takođe izgleda da je uklјučena u neke autoimunske bolesti (Ravetch, JV and Lanier LL. 2000. Immune Inhibitory Receptors. Science 290: 84-89; Burgess, SJ. 2008. Immunol. Res. 40: 18-34). Diferencijalna regulacija NKG2D liganada, kao što su polimorfni MICA i MICB, važna je da bi se imunskom sistemu obezbedilo sredstvo za identifikaciju i reagovanje na širok spektar infekcija, a istovremeno štiteći zdrave ćelije od neželјenog napada (Stephens HA, (2001) MICA and MICB genes: can the enigma of their polymorphism be resolved? Trends Immunol.
22: 378-85; Spies, T. 2008. Regulation of NKG2D ligands: a purposeful but delicate affair. Nature Immunol.9: 1013-1015).
[0023] Virusna infekcija je uobičajen induktor ekspresije MIC proteina, koji identifikuje ćeliju inficiranu virusom za delovanje NK ili T-ćelija (Groh et al. 1998; Groh et al. 2001. Co-stimulation of CD8+ aPT-cells by NKG2D via engagement by MIC induced on virus-infected cells. Nat. Immunol. 2: 255-260; Cerwenka, A., and L.L. Lanier.2001). U stvari, da bi izbegli takav napad na ćeliju domaćina, citomegalovirus i drugi virusi su razvili mehanizme koji sprečavaju ekspresiju MIC proteina na površini ćelije koju inficiraju kako bi izbegli odgovor urođenog imunskog sistema (Lodoen, M., K. Ogasawara, J.A. Hamerman, H. Arase, J.P. Houchins, E.S. Mocarski, and L.L. Lanier.2003. NKG2D-mediated NK cell protection against cytomegalovirus is impaired by gp40 modulation of RAE-1 molecules. J. Exp. Med.
197: 1245-1253; Stern-Ginossar et al., (2007) Host immune system gene targeting by viral miRNA. Science 317: 376-381; Stern-Ginossar et al., (2008) Human microRNAs regulate stress-induced immune responses mediated by the receptor NKG2D. Nature Immunology 9: 1065-73; Slavuljica, I A Busche, M Babic , M Mitrovic, I Gašparovic, Ð Cekinovic, E Markova Car, EP Pugel, A Cikovic, VJ Lisnic, WJ Britt, U Koszinowski, M Messerle, A Krmpotic and S Jonjic. 2010. Recombinant mouse cytomegalovirus expressing a ligand for the NKG2D receptor is attenuated and has improved vaccine properties. J. Clin. Invest.120: 4532-4545).
[0024] Uprkos samom stresu, mnoge maligne ćelije, kao što su one kancera pluća i glioblastoma kancera mozga, takođe izbegavaju ekspresiju MIC proteina i kao rezultat toga mogu biti posebno agresivne jer i one takođe izbegavaju urođeni imunski odgovor (Busche, A et al. 2006, NK cell mediated rejection of experimental human lung cancer by genetic over expression of MHC class I chain-related gene A. Human Gene Therapy 17: 135-146; Doubrovina, ES, MM Doubrovin, E Vider, RB Sisson, RJ O'Reilly, B Dupont, and YM Vyas, 2003. Evasion from NK Cell Immunity by MHC Class I Chain-Related Molecules Expressing Colon Adenocarcinoma (2003) J. Immunology 6891-99; Friese, M. et al. 2003. MICA/NKG2D-mediated immunogene therapy of experimental gliomas. Cancer Research 63: 8996-9006; Fuertes, MB, MV Girart, LL Molinero, CI Domaica, LE Rossi, MM Barrio, J Mordoh, GA Rabinovich and NW Zwirner. (2008) Intracellular Retention of the NKG2D Ligand MHC Class I Chain-Related Gene A in Human Melanomas Confers Immune Privilege and Prevents NK Cell-Mediated Cytotoxicity. J. Immunology, 180: 4606 -4614).
[0025] Visoka rezolucija same struktura humanog MICA proteina vezanog za NKG2D je opisana i pokazuje da α3 domen MICA ne stupa u direktnu interakciju sa NKG2D (Li et al. 2001. Complex structure of the activating immunoreceptor NKG2D and its MHC class I-like ligand MICA. Nature Immunol.2: 443-451; Protein Data Bank accession code 1HYR). α3 domen MICA, kao i onaj kod MICB, je povezan sa domenom α1-α2 platforme kratkim, fleksibilnim veznim peptidom, i sam je prirodno pozicioniran kao "odstojnik" između platforme i površine ćelije koja eksprimira MIC.3-dimenzionalne strukture humanih MICA i MICB α3 domena su skoro identične (srednja kvadratna udalјenost < 1 Å na 94 C-αα) i funkcionalno zamenlјive (Holmes et al.2001. Structural Studies of Allelic Diversity of the MHC Class I Homolog MICB, a Stress-Inducible Ligand for the Activating Immunoreceptor NKG2D. J Immunol.169: 1395-1400).
[0026] Kako se ovde koristi, "solubilni MIC protein", " solubilna MICA" i "solubilni MICB" se odnose na MIC protein koji sadrži α1, α2 i α3 domene MIC proteina, ali bez transmembranskih ili intracelularnih domena.
[0027] Domen α1-α2 platforme solubilnog MIC proteina je vezan za α3 domen, i difunduje kroz intracelularni i intravaskularni prostor kod sisara. Poželјno je da su domeni α1-α2 površine
1
modifikovanih MIC proteina koji su ovde opisani najmanje 80% identični ili homologni sa nativnim ili prirodnim α1-α2 domenom humanog MICA ili MICB proteina i da se vezuju za NKG2D. Domen α1-α2 platforme može biti 85% identičan nativnom ili prirodnom domenu α1-α2 platforme humanog MICA ili MICB proteina i da se vezuje za NKG2D. Domen α1-α2 platforme je 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% ili može biti identičan nativnom ili prirodnom domenu α1-α2 platforme humanog MICA ili MICB proteina i da se vezuje za NKG2D.
[0028] Heterologna peptidna oznaka može biti fuzionisana sa N-terminusom ili C-terminusom α1-α2 domena ili solubilnog MIC proteina kako bi se olakšalo u prečišćavanju solubilnog MIC proteina. Sekvence oznaka uključuju peptide kao što su polihistidin, mic-peptid ili FLAG oznaka. Takve oznake mogu biti uklonjene nakon izolacije MIC molekula postupcima koji su poznatim stručnjacima.
[0029] Kako se ovde koristi, "peptid", "polipeptid" i "protein" se koriste naizmenično; i "heterologni molekul", "heterologni peptid", "heterologna sekvenca" ili "heterologni atom" je molekul, peptid, sekvenca nukleinske kiseline ili aminokiseline, odnosno atom, tim redom, koji se prirodno ili uobičajeno ne nalaze u fizičkoj vezi sa predmetnim molekulom.
[0030] Termin „obuhvata“, koji se koristi naizmenično sa „uklјučuje“, „sadrži“ ili „okarakterisan po“, je inkluzivan ili otvoren jezik, i ne isklјučuje dodatne, neizrečene elemente ili korake postupka. Fraza „sastoji se od“ isklјučuje bilo koji element, korak ili sastojak koji nisu navedeni u patentnom zahtevu. Fraza "sastoji se u suštini od" ograničava obim patentnog zahteva na određene materijale ili korake, i one koji materijalno ne utiču na osnovne i nove karakteristike pronalaska za koji se traži patentni zahtev. Predmetni pronalazak razmatra primere realizacija i postupaka pronalaska koje odgovaraju obimu svake od ovih fraza. Prema tome, kompozicija ili postupak koji se sastoji od navedenih elemenata ili koraka razmatra određene realizacije u kojima se kompozicija ili postupak u suštini sastoji od tih elemenata ili koraka.
[0031] Kako se ovde koristi, termini u jednini kao neodređeni članovi i "bilo koji" imaju za cilј da uklјučuju oblike i jednine i množine.
[0032] Ova aplikacija ima za cilј da pokrije sve varijacije, upotrebe ili adaptacije pronalaska koje slede, uopšteno, principe pronalaska, uklјučujući i takva odstupanja od predmetnog pronalaska koja su u okviru poznate ili uobičajene prakse u oblasti tehnike na koju se pronalazak odnosi, a mogu se primeniti na suštinske karakteristike koje su prethodno navedene.
PRIMERI iFv i modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada
[0033] Primer 1 (iFv). Kao specifične primere, sintetizovali smo fragmente DNK od 1126 bp i 1144 bp (SEQ ID NO: 1 i 2, redosledno) koji kodiraju sledećim redosledom: α3 domen humanog MICA (kao osnovni peptid) od aminokiseline 182 do aminokiseline 194 (početak petlјe 1 α3 domena), bez razmaka ili GGS aminokiselinskog spejser regiona (SR), iFv peptid zasnovan na strukturi antitela za vezivanje za receptor 3 faktora rasta fibroblasta (FGFR3) (MAbR3); Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C., and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4;14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.), bez spejsera ili drugog GGS spejser regiona, distalni deo petlјe 1 α3 domena koji počinje od aminokiseline 196 i uklјučuje preostali karboksi-terminalni deo α3 domena do aminokiseline 276 solubilnog MICA molekula. Svaki sintetički, dvolančani DNK polinukleotid je zatim kodirao polipeptid koji je sadržao 6 CDR u obliku iFv umetnutog u petlјu 1 α3 domena MICA.
[0034] Sam ovaj iFv peptid (SEQ ID NO.:3), kodiran sa SEQ ID NO.:4, sadržao je dva identična, tipična regiona spajanja (linker region, LR) koji odgovaraju ostacima GGSSRSSSSGGGGSGGG (SEQ ID NO.:5) (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Jedan LR spojio je C-terminus VL sa N-terminusom VH domena, a drugi LR je spojio C-terminus VH domena sa N-terminusom VL. Teorijski, ova nova struktura je kontinuirani ili "kružni" peptid koji je gore pomenut i sadrži 6 CDR-ova početnog Fv. Varijabilni VL lanac antitela je efikasno podelјen unutar regiona petlјe između beta-lanaca 1 i 2 (S1 i S2) i na taj način su stvoreni novi N-terminalni segment (VLN) i novi C-terminalni segment (VLC) sa pratećim parom novih, modifikovanih C- i N-krajeva, respektivno, slika 5A. Ovaj par završetaka stvorio je jedino mesto za vezivanje ili konjugaciju iFv za molekul primaoca, kao što je protein. Šematski prikaz umetnutog iFv u osnovni α3 domen je prikazan na slici 5B.
[0035] Da bismo proizveli solubilne MICA proteine sa heterolognim iFv peptidom umetnutim u α3 domen, generisali smo bakulovirusni ekspresioni vektor da bi umetnuli DNK sekvence (SEQ ID NO.s:1 i 2) koje kodiraju α3-iFv.1 (SEQ ID NO. :6) i α3-iFv.2 (SEQ ID NO.:7), tim redom. Fragmenti DNK su amplifikovani pomoću PCR-a, korišćenjem restrikcionih enzima Ncol i EcoRI urađena je digestija, i fragmenti su subklonirani u bakulovirusni ekspresioni vektor, SW403, divlјi tip α3 domena je zamenjen. SW403 je bakulovirusni ekspresioni vektor izveden iz pVL1393 (Invitrogen, Inc.) u koji je divlјi tip sMICA (rezidue 1-276) prethodno kloniran korišćenjem 5' BamHI i 3' EcoRI mesta. Novi ekspresioni vektor je kotransfektovan bakulovirusnom DNK u SF9 ćelije insekata, a bakulovirus je umnožen tokom dva ciklusa amplifikacije i korišćen za ekspresiju His-tagovanih MICA-α3-iFv proteina u T.ni ćelijama insekata prema uputstvu proizvođača (Invitrogen). Ekspresija je urađena u zapremini od 100 mL tokom tri dana, medijum za rast je prikupljen i iz njega je upotrebom Ni-afinitetne hromatografije prečišćen sekretovan solubilni protein. Monomerni MICA-α3-iFv je prečišćen do čistoće >90% sa očekivanom molekulskom težinom od 60,9 kDa, što je određeno pomoću SDS-PAGE metode. Funkcionalna karakterizacija je sprovedena upotrebom vezujućih ELISA testova i in vitro esejima ubijanja cilјnih ćelija.
[0036] Prečišćeni MICA-α3-iFv proteini su testirani u ELISA testu vezivanja za FGFR3 kako bi se potvrdilo istovremeno vezivanje za cilјani FGFR3 i NKG2D receptor. FGFR3 u fosfatom puferu (PBS) je obložen na Maxisorp ploče u koncentraciji od 2 ug/ml. Svaki MICA protein je titriran, ostavlјen da se veže za FGFR3 tokom 1 sata, i potom ispran kako bi se uklonio nevezani sMICA protein. Vezani MICA-α3-iFv protein je detektovan korišćenjem NKG2D-Fc i anti-Fc-HRP konjugata. Slika 6 pokazuje da je vezivanje oba, i MICA-α3-iFv.1 i MICA-α3-iFv.2 za FGFR3 bilo uporedivo sa vezivanjem MICA-scFv, napravlјenim spajanjem na C-kraj solubilnog proteina MICA scFv konstruisanog od MAbR3. Ovi ELISA rezultati takođe su pokazali da su specifičnosti vezivanja i za FGFR3 i za NKG2D od starne scFv i α1-α2 domena, tim redom, zadržane od strane modifikovanog MICA, i da je iFv peptid umetnut upotrebom različitih formata spejsera bio funkcionalan.
[0037] Testirali smo i uporedili termičku stabilnost sMICA-α3-iFv.2 sa onom sMICA-scFv. Oba proteina su podvrgnuta rastućim temperaturama od 60-90°C tokom 1 sata, a zatim ostavlјena da se ekvilibrišu na sobnoj temperaturi tokom 1 sata pre nego što su testirana na svojstva vezivanja pomoću ELISA metode. Rezultati na Slici 7 pokazuju da MICA-α3-iFv.2 može biti podvrgnut temperaturama do 80°C bez gubitka specifičnog vezivanja za FGFR3. Tradicionalni MICA-scFv je izgubio vezujuću aktivnost na 70°C. Ovaj rezultat je pokazao da je solubilni MICA koji sadrži izumlјeni iFv format značajno stabilniji od terminalnih fuzija tradicionalnog scFv (Miller, B. R., Demarest, S. J., Lugovskoy, A., Huang, F., Wu, X., Snyder, W. B., Croner, L. J., Wang, N., Amatucci, A., Michaelson, J. S., and Glaser, S. M. (2010) Stability engineering of scFvs for the development of bispecific and multivalent antibodies, Protein engineering, design & selection : PEDS 23, 549-557; Weatherill, E. E., Cain, K. L., Heywood, S. P., Compson, J. E., Heads, J. T., Adams, R., and Humphreys, D. P. (2012) Towards a universal disulphide stabilised single chain Fv format: importance of interchain disulphide bond location and vL-vH orientation, Protein engineering, design & selection : PEDS25, 321-329).
[0038] Pokazana je sposobnost MICA-α3-iFv da preusmeri NK ćelijom posredovanu lizu cilјnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3 in vitro u testu oslobađanja kalceina. Ćelijska linija urođenoubilačke ćelije (NK), NKL, je gajena zajedno sa cilјnim ćelijama P815 koje sadrže kalcein i koje ektopično eksprimiraju FGFR3. Rezultati na Slici 8 pokazuju da su dva MICA-α3-iFv molekula izazvala značajno veću lizu posredovanu NK u poređenju sa tradicionalnom fuzijom MICA-scFv, dok necilјana solubilna MICA kontrola nije pokazala sposobnost ubijanja. Ovi rezultati su potvrdili da je pronađeni iFv vezani za FGFR3 za cilјne ćelije, a u kontekstu kompletnog osnovnog proteinskog molekula, solubilnog MICA, indukovao jaku lizu posredovanu NK ćelijama.
[0039] Primenlјivost iFv formata na druge varijabilne domene antitela je pokazana na sličan način konstruisanjem α3-iFv.3 (SEQ ID NO.:8), koji je sadržao iFv izveden iz CD20-specifičnog antitela (Du, J., Wang, H., Zhong, C., Peng, B., Zhang, M., Li, B., Huo, S., Guo, Y., and Ding, J. (2007) Structural basis for recognition of CD20 by therapeutic antibody Rituximab, The Journal of biological chemistry 282, 15073-15080). Slika 9 prikazuje da se MICA-α3-iFv.3 specifično vezao za bunare obložene sa CD20 u ELISA testu, kao što je iznad opisano, i da indukuje lizu posredovanu NK Ramos ćelija koje eksprimiraju CD20 u testu oslobađanja kalceina.
[0040] Primer 2 (Modifikovani α1- α2 domeni NKG2D liganada). Humani proteini označeni od ULBP-1 do ULBP-6 su, poput MICA i MICB, prirodni, stresom indukovani ligandi koji se vezuju za NKG2D receptore na površini ćelija, i aktiviraju humane NK ćelije i određene T-ćelije (15; Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Pored toga, protein virusa kravlјih boginja OMCP je sekretovani domen koji poput α1-α2 domena MIC proteina se vezuje za NKG2D. OMCP pokazuje veoma visok afinitet prema NKG2D, očigledno kako bi blokirao da NKG2D prepozna prirodne stresne liganade nastale delovanjem virusa u inficiranoj ćeliji domaćinu (Eric Lazear, Lance W. Peterson, Chris A. Nelson, David H. Fremont. J Virol.2013 January; 87(2): 840-850. doi: 10.1128/JVI.01948-12). Dok se ULBP i OMCP smatraju ligandima NKG2D (NKG2DL) koji dele kanonsku strukturu α1-α2 domena, homologija sekvence sa MICA α1-α2 je manja od 27%, i svima njima prirodno nedostaje α3 domen koji povezuje cilјane domene. Konstruisali smo seriju modifikovanih ULB i OMCP proteina, vezivanjem heterolognih polipeptida koji specifično ciljaju i ubijaju ćelije koje eksprimiraju FGFR3 kao rezultat spajanja sa svakim od ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 i OMCP, i sa modifikovanim α3 domenom MICA u koji je umetnut cilјani iFv. Pored toga, modifikovali smo α1-α2 domen MICA kako bi pobolјšali afinitet α1-α2 domena za NKG2D, a zatim smo spojili na modifikovane α1-α2 domene heterologne molekule kao što su polipeptidi. Kako bismo proizveli proteine koji se sastoje od ULBP i OMCP α1-α2 domena vezanih za modifikovane α3-
1
iFv domene, generisali smo bakulovirusni ekspresioni vektor u koji su umetnuti fragmenti DNK (SEQ ID NOs:9-14) koji su kodirali različite α1-α2 domene ULBP-1, ULBP-2, ULBP-3, ULBP-4, ULBP-6 i OMCP (SEQ ID NOs: 15-20, tim redom). Fragmenti DNK su amplifikovani pomoću PCR-a, korišćenjem restrikcionih enzima BlpI i Ncol urađena je digestija, i pojedinačno su subklonirani u bakulovirusni ekspresioni vektor, KLM44, zamenjujući MICA α1-α2 domen. KLM44 je bio bakulovirusni ekspresioni vektor izveden iz SW403 u koji je MICA-α3-iFv.2 prethodno kloniran (primer 1). Novi NKG2DL-α3-iFv.2 konstrukti koji sadrže ULBP i OMCP α1-α2 fuzije domena sa α3-iFv.2 (ULBP1-α3-iFv.2, ULBP2-α3-iFv.2, ULBP3-α3-iFv. 2, ULBP4-α3-iFv.2, ULBP6-α3-iFv.2 i OMCP-α3-iFv.2; SEQ ID NO.: 21-26, tim redom), kotransfektovani su bakulovirusnom DNK u ćelije insekata SF9 . Bakulovirus je umnožen tokom dva ciklusa amplifikacije i korišćen za ekspresiju ovih His-tagovanih NKG2DL-α3-iFv.2 proteina u T.ni ćelijama insekata prema uputstvu proizvođača (Invitrogen). Ekspresija je urađena u zapremini od 100 mL tokom tri dana, medijum za rast je prikuplјen i iz njega je upotrebom Ni-afinitetne hromatografije prečišćen sekretovan solubilni protein. Monomerni proteini željene molekulske težine su prečišćeni do čistoće >90% što je potvrđeno pomoću SDS-PAGE metode. Funkcionalna karakterizacija je sprovedena upotrebom vezujućih ELISA testova i in vitro esejima ubijanja cilјnih ćelija.
[0041] 6 prečišćenih NKG2DL-α3-iFv.2 proteina je testirano u ELISA testom vezivanja za FGFR3 kako bi se potvrdilo istovremeno vezivanje za cilјni FGFR3 i NKG2D receptor. FGFR3 u fosfatnom puferu (PBS) je obložen na Maxisorp ploče u koncentraciji od 2 ug/ml. Svaki NKG2DL-α3-iFv.2 protein je titriran, ostavlјen da se veže za FGFR3 tokom 1 sata, i ispran da bi se uklonio nevezani protein. Vezani NKG2DL-α3-iFv.2 protein je detektovan korišćenjem NKG2D-Fc i anti-Fc-HRP konjugata. Slika 10 prikazuje da se svih 6 NKG2DL-α3-iFv.2 proteina snažno vezuje za FGFR3, kao što se očekivalo, kroz interakciju iFv.2 domena, a aktivnost vezivanja NKG2D je zadržana pomoću vezanih NKG2DL α1-α2 domena, što je pokazalo da je vezani α3-iFv domen preneo funkcionalnu aktivnost vezivanja FGFR3 na ULBP i OMPC proteine koji se, poput MIC proteina, vezuju za NKG2D.
[0042] U in vitro testu oslobađanja kalceina je pokazana sposobnost proteina NKG2DL-α3-iFv.2 da preusmere NK ćelijama posredovanu lizu cilјnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3. Ćelijska linija urođenoubilačke ćelije (NK), NKL, je gajena zajedno sa cilјnim ćelijama P815 koje sadrže kalcein i koje ektopično eksprimiraju FGFR3. Rezultati na Slici 11 pokazuju da je OMCP-α3-iFv.2 indukovao najveću lizu posredovanu NK, dok su svi ostali NKG2DL-α3-iFv.2 proteini pokazali specifičnu aktivnost ubijanja sa različitim stepenom potencije i stepenom lize ćelija. Ovi rezultati su potvrdili da je iFv ovog pronalaska pruža specifičnu aktivnost vezivanja drugim proteinima koji su zadržali sopstvena funkcionalna svojstva i indukuju različite nivoe liziranja ćelija posredovane iFv-targetovanim ćelijama.
[0043] Primer 3 (Modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada). Ovo su primeri vezivanja polipeptida za NKG2DL koji su modifikovani tako da značajno pobolјšavaju njihov afinitet vezivanja za humani NKG2D receptor. α1-α2 domen MIC proteina je NKG2DL za NKG2D receptor. Ovaj afinitet je dovolјan za fiziološko aktiviranje NK ćelija i stimulisanje lize ćelija koje eksprimiraju prirodne MIC proteine pune dužine ireverzibilno vezane za dvodimenzionalnu površinu plazma membrane "cilјne ćelije" (Bauer S, Groh V, Wu J, Steinle A, Phillips JH, Lanier LL, Spies T., Science. 1999 Jul 30; 285(5428):727-9.). Ipak, konstruisani solubilni MIC proteini ovde opisani reverzibilno vezuju specifične cilјne antigene na površini cilјne ćelije, zato afinitet vezivanja konstruisanog solubilnog MIC proteina za NKG2D direktno utiče na stabilnost solubilnog MIC-zavisnog kompleksa formiranog između NK ćelija i ćelija koje eksprimiraju cilјne antigene. Naročito ako se afinitet između sMICA i NKG2D poveća znatno sporijom stopom disocijacije, ili „off-rate“, modifikovanog sMICA od NKG2D, očekivalo bi se da će stepen smrtnosti ćelija posredovan NK ćelijama biti veći pri nižim gustinama solubilnih MIC molekula vezanih za ciljne ćelije. Pre ovog otkrića nisu bile identifikovane ikakve α1-α2 mutacije koje menjaju sposobnost ubijanja solubilnih MIC proteina ili značajno smanjuju disocijaciju vezivanja kako bi se povećao afinitet MIC proteina za NKG2D. Upotrebom programa za kompjuterski dizajn je pokazano da tri mutacije u kombinaciji u α1-α2 domenu wild type MICA: N69W, K152E i K154D (WED-MICA) mogu umereno uticati na afinitet vezivanja NKG2D tako što deluju na stabilnost nevezane MICA i samim tim na njegovu stopu asocijacije ili „on-rate“ vezivanja za NKG2D (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ.J Biol Chem.2007 Oct 19; 282(42): 30658-66. Epub 2007 Aug 8); Naknadni opsežni rad iste grupe obuhvatio je upotrebu programa za kompjuterski dizajn kojim, su prema objavlјenim strukturnim opisima, skenirali iterativnim proračunima 22 aminokiselinske pozicije MICA koje su teoretski u kontaktu sa NKG2D, (Li P, Morris DL, Willcox BE, Steinle A, Spies T, Strong RK., Nat Immunol. 2001 May; 2(5): 443-451), eksperimentalno je pokazao da je, u kombinaciji sa ranije dizajniranim trima promenama, dalјi racionalni, iterativni kompjuterski dizajn MICA kvalitativno promenio njegov afinitet za NKG2D od slabog (Kd ~2,5 µM) do umereno čvrstog (Kd = 51 nM) sa ukupno sedam kombinovanih mutacija (Henager, Samuel H., Melissa A. Hale, Nicholas J. Maurice, Erin C. Dunnington, Carter J. Swanson, Megan J. Peterson, Joseph J. Ban, David J. Culpepper, Luke D. Davies, Lisa K. Sanders, and Benjamin J. McFarland, 2102, Combining different design strategies for rational affinity maturation of the MICA-NKG2D interface. Protein Science 21: 1396-1402). Nasuprot tome, eksperimentalni pristup opisan ovde eksperimentalno je odabrao aminokiselinske modifikacije MICA koje su usporile stopu disocijacije („off-rate“) između α1-α2 domena MICA i NKG2D, počevši od MICA stabilizovanog sa 3 WED promene Lengiel et al. (Lengyel CS, Willis LJ, Mann P, Baker D, Kortemme T, Strong RK, McFarland BJ., J Biol Chem.2007 Oct 19; 282(42): 30658-66. Epub 2007 Aug 8).
[0044] Ovaj primer koji je ovde opisan se odnosi na modifikaciju afiniteta vezivanja NKG2D solubilnih MIC proteina za NKG2D kroz konstruisanje specifičnih mutacija na odabranim pozicijama aminokiselina unutar α1-α2 domena koje utiču na „off-rate“ kinetiku vezivanja i na taj način menja pronađene modifikovane ciljne MIC molekule i njihovu NK ćelijom posredovanu sposobnost ubijanja.
[0045] Da bi se konstruisali solubilni modifikovani α1-α2 domeni sa izmenjenim afinitetom prema NKG2D, 57 ostataka u α1-α2 domenu je izabrano za ekstenzivnu mutagenezu (Slika 12). Sintetičke biblioteke DNK koje kodiraju α1-α2 domen i koje sadrže NNK mutagene kodone na svakoj od 57 pozicija aminokiselina su sintetizovane, potom pojedinačno klonirane fuzijom sa pIII manjim proteinom omotača M13 faga, i potom su čestice faga koje prikazuju mutagene varijante α1-α2 sintetisane u SS320 E.coli ćelijama upotrebom standardnih postupaka (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011) Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011). Biblioteke α1-α2 faga su sortirane prema rastućem afinitetu vezivanja upotrebom rekombinantnog biotiniziranog NKG2D kao cilјnog antigena, i kroz ponovljene iterativne postupke namerno produženog vezivanja, produženog ispiranja i eluiranja klonova faga da bi se izabrale varijante sa visokim afinitetom i sporom disocijacijom ili „off-rate“-om. Skup specifičnih aminokiselinskih mutacija pojavio se sa visokom učestalošću na 6 pozicija u α1-α2, i one su izabrane kao poželјne supstitucije aminokiselina koje pokazju pojačani afinitet vezivanja za NKG2D (Slika 12, Tabela 1).
1
Tabela 1. Odabrane mutacije koje menjaju afinitet na označenih 6 aminokiselinskih pozicija α1-α2 domena MIC-a. Aminokiseline SEQ ID NO: 35 na svakoj od 6 pozicija su prikazane podeblјanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti od vrha ka dnu tabele. Sve aminokiseline su predstavlјene IUPAC skraćenicama od jednog slova.
[0046] Sintetizovali smo DNK polinukleotide (SEQ ID NOs. 27-30) koji kodiraju α1-α2 domene 4 reprezentativne varijante 15, 16, 17, 18 koje su sadržale različite kombinacije otkrivenih specifičnih mutacija (Tabela 2).
Tabela 2. Sekvence specifičnih varijanti α1-α2 domena. Specifične aminokiselinske supstitucije za varijante 15, 16, 17 i 18 (SEQ ID NOS.: 31-34, tim redom) su navedene u odnosu prema aminokiselinama SEQ ID NO.:35 podeblјana slova. Sve aminokiseline su predstavlјene IUPAC skraćenicama od jednog slova.
[0047] Za NKG2DL-ove u gornjem primeru, direktno smo vezali upotrebom linker peptida heterologne molekule kao što je polipeptid za svaki od ova 4 modifikovana α1-α2 NKG2DL-a. Četiri
1
His-obeležena proteina (SEQ ID NOs.: 31-34) koja se sastoje od modifikovanih NKG2DL sa vezanim heterolognim molekulima eksprimirana su u ćelijama insekata i prečišćena kako bi se okarakterisali njihovi afiniteti vezivanja za NKG2D, i kinetički parametri vezivanja. Upotrebom ELISA testa kompetitivnog vezivanja, odredili smo relativne afinitete vezivanja 4 modifikovane α1-α2 varijante za NKG2D. Solubilni „wild type” (WT) NKG2DL, sMICA protein, obložen je na sve bunare maxisorp ELISA ploče kako bi se obezbedila podloga za vezivanje humanog NKG2D-Fc reagensa. Rastvori četiri α1-α2 varijante, kao i WT i WED-α1-α2 domena (SEQ ID NO.: 35) su titrirani u ELISA bunare, gde su kompetitivno inhibirali vezivanje 2 nM humanog NKG2D-Fc za WT sMICA kojim su obloženi bunari ploče. Nivo humanog NKG2D-Fc koji se vezao za WT NKG2DL na ploči je detektovan upotrebom anti-Fc-HRP antitela. Slika 13A prikazuje varijante 16, 17 i 18 sa IC50vrednostima od 0,7, 0,6, 0,5 nM, dok je varijanta 15 pokazala IC50vrednost od 1,7 nM, sve varijante pokazuju značajno bolјe vezivanje za NKG2D, 27, 32-, 38- i 11 puta veće od WT NKG2DL, tim redom, kao i značajno bolјe od WED-MICA (Tabela 3).
Tabela 3. Parametri ravnoteže i kinetike vezivanja za α1-α2 varijante. IC50vrednosti su izvedene iz 4 parametra uklapanja titracije kompetitivnog vezivanja (Slika 12), a kinetički parametri vezivanja su izvedeni iz pojedinačnih eksponencijalnih uklapanja kinetike vezivanja (Slika 13). Konstante ravnoteže vezivanja (Kd) su izvedene iz kinetičkih parametara vezivanja korišćenjem jednačine Kd= kOFF/ kON.
[0048] Važno je da su se relativne IC50razlike takođe odnosile na bolјe vezivanje za mišji NKG2D-Fc (Slika 13B), i pokazale su sposobnost pobolјšanja vezivanje solubilnih, modifikovanih α1-α2 domena za humane i ne-humane NKG2D receptore, što je važno svojstvo za preklinički razvoj lekova.
[0049] Kako bi se razumela kinetička osnova izmenjenih afiniteta pomoću interferometrije biosloja (Octet) na 100 nM svakog od modifikovanih α1-α2 proteina, određivane su i stope asocijacije(„onrate“) i disocijacije („off-rate“) α1-α2 varijante NKG2DL, koje se vezuju za površinski vezan biotiniziran humani NKG2D. U skladu sa rezultatima IC50ELISA, svaka varijanta 16, 17 i 18 je pokazala značajno smanjenje dosocijacije (18 puta u odnosu na WT), što je u velikoj meri odgovorno za povećanje afiniteta (~30 puta u odnosu na WT a1-a2) (Slika 14; Tabela 3). Iako je varijanta 15 pokazala sličnu sporu dosocijaciju kao i 16, 17 i 18, njena konstanta asocijacije je takođe smanjena, što je rezultiralo jačim afinitetom od WT, ali slabijim od varijanti 16, 17 i 18. Jedina razlika između varijanti 15 (SEQ ID NO.:31) i 16 (SEQ ID NO.:32) je bila K125N nasuprot K125L, mutacija na poziciji 125 je jasno promenila stopu asocijacije, dok je smanjena disocijacija pripisana mutaciji H161R. Stoga, dok je odabrani set NKG2DL mutacija (Tabela 1) korišćen za povećanje afiniteta α1-α2 za
1
NKG2D kroz značajno smanjenje disocijacije, određene supstitucije su takođe promenile stopu asocijacije što je dovelo do niza postepenih povećanja afiniteta za koje smo pokazali u ovom pronalasku da imaju diferencijalnu aktivnost u testovima NK ćelijom posredovanih ubijanja kao što je opisano u nastavku.
[0050] U in vitro u testu oslobađanja kalceina pokazana je sposobnost varijanti α1-α2 različitih afiniteta da preusmere NK ćelijom posredovanu lizu cilјnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3. Humana urođenoubilačka (NK) ćelijska linija, NKL, je gajena u kulturi ćelija zajedno sa cilјnim ćelijama P815 koje su sadržale kalcein i ektopično eksprimirale FGFR3, i titrirane su solubilnim modifikovanim MIC proteinima. Rezultati na Slici 15 su pokazali da je aktivnost ubijanja FGFR3-specifičnih solubilnih MIC varijanti u korelaciji sa njihovim projektovanim α1-α2 afinitetima. Konkretno, varijante 16, 17 i 18 su pokazale ~15 puta veću sposobnost ubijanja od WT na 0,78 nM. WED-MICA (SEQ ID NO.:35) je bio samo nešto bolјi od WT. Prema tome, pronalazak opisuje supstitucije aminokiselina unutar α1-α2 domena koje su povećale afinitet vezivanja za NKG2D uz smanjenje stope disocijacije solubilnog MIC proteina za humani NKG2D, i kao posledicu dovele do predvidlјivog povećanja sposobnosti ubijanja. WED-MICA, koji je imao nešto veći afinitet od WT MICA prema NKG2D (Slika 13A), povećanjem stepena asocijacije umesto smanjenja disocijacije (Slika 14), nije postignuto značajnije pobolјšanje ubijanja cilјnih ćelija (Slika 15). Štaviše, kao što je prikazano na Slici 13B, WED-MICA je pokazala znatno slabije vezivanje za mišji NKG2D nego čak i WT MICA, dok su varijante 15, 16, 17 i 18 pokazivale veći afinitet i za humani i za mišji NKG2D, Slika 13A-B.
[0051] Ove varijante afiniteta α1-α2 NKG2DL 15, 16, 17 i 18 su pojačale afinitet vezivanja vezanog polipeptida za NKG2D receptor i time pobolјšale lizu cilјanih ćelija posredovanu NK ćelijama, Slika 15.
[0052] Primer 4 (Modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada). Ovaj Primer trenutnog otkrića se odnosi na dodatne varijante afiniteta α1-α2 NKG2DL izvedene putem konstruisanja specifičnih mutacija na odabranim pozicijama aminokiselina unutar α1-α2 domena solubilnih MIC molekula, kao što je opisano u Primeru 3 (Tabela 1), koje takođe utiču na stepen disocijacije kinetike vezivanja i na taj način menjaju aktivnost ubijanja posredovanu NK ćelijama modifikovanih α1-α2 domena. Dok su varijante 15-18 fokusirane na specifične mutacije na pozicijama S20, G68, K125 i H161, drugi set varijanti je izolovan sa dodatnim mutacijama na pozicijama E152, H158 i Q166 (Tabela 4).
Tabela 4. Sekvence specifičnih varijanti α1-α2 domena. Specifične aminokiselinske supstitucije za varijante 20, 25 i 48 su navedene u odnosu na aminokiseline SEQ ID NO.:35, prikazane podeblјanim slovima u prvom redu tabele. Sve aminokiseline su predstavlјene IUPAC skraćenicama od jednog slova.
[0053] Sintetizovani su DNK polinukleotidi (SEQ ID NOs. 36-38) koji kodiraju α1-α2 domene 3 reprezentativne varijante 20, 25, 48 (SEQ ID NOs.39-41, tim redom) koje sadrže različite kombinacije specifičnih otkrivenih mutacija (Tabela 4). Za NKG2DL-ove u gore navedenom primeru, heterologni
1
molekuli, kao što je polipeptid koji se vezuje za FGFR3, su direktno vezani za svaki od ova 3 modifikovana α1-α2 NKG2DL-a upotrebom linker peptida. Konstrukti su klonirani na Xbal i BamHI mesta pD2509, sisarskog ekspresionog vektora zasnovanog na CMV. Tri His-obeležena proteina (SEQ ID NOs.: 39-41), koja se sastoje od modifikovanih NKG2DL sa vezanim heterolognim molekulima koji se vezuju za FGFR3, tranzijentno su eksprimirani u HEK293 ćelijama upotrebom Expi293 sistema ekspresije prema uputstvu proizvođača (Life Technologies), i prečišćeni upotrebom Ni-afinitetne hromatografije kako bi se dobili izolovani proteini za biohemijsku analizu i analizu zasnovanu na aktivnosti.
[0054] Da bi se okarakterisali afiniteti vezivanja NKG2D, merene su pomoću interferometrije biosloja (Octet) i kinetike asocijacije i disocijacije za tri α1-α2 varijante NKG2DL koje se vezuju za površinski vezani biotinizirani humani NKG2D. Titracije vezivanja su izvedene za svaki protein korišćenjem opsega titracije od 1-100 nM, a kinetički podaci su podešeni da bi se dobile konstante kinetike asocijacije i disocijacije, kao i konstante ravnoteže vezivanja.
[0055] Varijanta 25 (SEQ ID NO.: 40) koja sadrži samo dodatnu mutaciju Q166S u odnosu na varijantu 16 (SEQ ID NO.: 32) (Tabela 2), pokazala je afinitet vezivanja NKG2D od 62 pM uglavnom zbog smanjene stope disocijacije (Slika 16 i Tabela 5). Što predstavlja osmostruko povećanje ravnotežnog afiniteta vezivanja zbog mutacije Q166S (uporedite Tabelu 3 i Tabelu 5), i pokazuje da specifične mutacije na Q166 utiču na afinitet vezivanja kroz smanjenu stopu disocijacije.
Tabela 5. Kinetički parametri vezivanja za α1-α2 varijante. Kinetički parametri vezivanja su izvedeni iz pojedinačnih eksponencijalnih uklapanja u kinetiku vezivanja (Slika 16). Konstante ravnoteže vezivanja (Kd) su izvedeni iz kinetičkih parametara vezivanja korišćenjem jednačine Kd= kOFF/ kON.
[0056] Varijanta 20 (SEQ ID NO.: 39) je imala specifične mutacije G68A, E152Q, H158R i Q166F, i održavala je parametre vezivanja slične varijanti 25 (Tabela 5), što sugeriše da ova jedinstvena kombinacija specifičnih mutacija takođe pokazuje pobolјšan afinitet vezivanja NKG2D zbog smanjenje stope disocijacije.
[0057] Varijanta 48 (SEQ ID NO.: 41) je imala mutacije K125L i H161R pronađene u varijanti 16 (Tabela 2); međutim, dodavanje mutacija E152A, H1581 i Q166A (Tabela 4) značajno je povećalo stopu disocijacije, što je rezultiralo u 250 puta manjem afinitetu vezivanja za NKG2D (Slika 16 i Tabela 5). Mutacija Q166A nije jedna od poželjnijih mutacija odabranih za poziciju Q166 za pobolјšanje afiniteta (Tabela 1) i možda je doprinela smanjenju uočene stope disocijacije. Ovi podaci su jasno pokazali da jedinstvene kombinacije konstruisanih odabranih mutacija i identifikovanih na definisanim pozicijama unutar α1-α2 domena podešavaju afinitet vezivanja za NKG2D kroz modulaciju stope disocijacije.
1
[0058] Modifikovane varijante afiniteta α1-α2 sa vezanim polipeptidima preusmerile su NK ćelijom posredovanu lizu cilјnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3, kao što je pokazano in vitro u testu oslobađanja kalceina. Humana urođenoubilačka (NK) ćelijska linija, NKL, je gajena u kulturi ćelija zajedno sa cilјnim ćelijama P815 koje su sadržale kalcein i ektopično eksprimirale FGFR3, i titrirane su solubilnim modifikovanim NKG2D ligandnim α1-α2 proteinima. Rezultati na Slici 17 prikazuju da su sposobnosti ubijanja FGFR3 cilјanih solubilnih MIC varijanti u korelaciji sa njihovim projektovanim α1-α2 afinitetima. Konkretno, varijanta 25 je pokazala ~3 puta veću sposobnost ubijanja od varijante 16 na 0,2 nM, što predstavlјa petostruko pobolјšanje u vrednosti EC50u sposobnosti ubijanja ćelija. Pored toga, podaci su jasno pokazali preferiranu aktivnost ubijanja reprezentativnih solubilnih varijanti MIC-a u redosledu od varijante 25>16>WED (Slika 17).
[0059] Primer 5 (Modifikovani α1-α2 domeni NKG2D liganada). Ova realizacija se odnosi na dodatne varijante afiniteta α1-α2 NKG2DL dobijene konstruisanjem α1-α2 domena ULBP proteina. ULBP proteini sadrže α1-α2 domene, koji su NKG2D ligandi sposobni da se vežu za NKG2D receptor (Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Ovaj afinitet vezivanja za NKG2D je dovolјan za fiziološku aktivaciju NK ćelija i stimulaciju lize ćelija koje eksprimiraju prirodne ULBP proteine pune dužine koji su prirodno i ireverzibilno vezani za dvodimenzionalnu površinu plazma membrane "cilјne ćelije" (Cerwenka A, Lanier LL (2004). NKG2D ligands: unconventional MHC class I-like molecules exploited by viruses and cancer. Tissue Antigens 61 (5): 335-43. doi:10.1034/j.1399-0039.2003.00070.x. PMID 12753652). Međutim, pošto konstruisani solubilni α1-α2 domeni fuzionisani sa heterolognim polipeptidima u određenim realizacijama ovog pronalaska, reverzibilno vezuju specifične cilјne antigene na površini cilјne ćelije, afinitet vezivanja konstruisanih ULBP α1-α2 domena za NKG2D će direktno uticati na stabilnost veštačke sinapse formirane između NK ćelija i ćelija koje eksprimiraju cilјne antigene, kao što je već pokazano konstruisanim rastvorlјivim MIC proteinima (Primeri 2-4). Da bi se diverzifikovao repertoar projektovanih modifikovanih α1-α2 domena kao NKG2D liganada, ULBP proteini su korišćeni kao supstrat ili polazna tačka za inženjering zasnovan na fagnom izlaganju njihovog afiniteta vezivanja za NKG2D. Uprkos strukturnoj homologiji uočenoj između ULBP-a i MICA (Radaev, S., Rostro, B., Brooks, AG., Colonna, M., Sun, PD. (2001) Conformational plasticity revealed by the cocrystal structure of NKG2D and its class I MHC-like Ligand ULBP3. Immunity 15, 1039-49.), homologija sekvence je <50% za ULBP α1-α2 domene u odnosu na MICA (Slika 18). Stoga smo tražili identične pozicije kodona u ULBP α1-α2 domenima koji pobolјšavaju afinitet vezivanja za NKG2D.
[0060] Da bi se konstruisali solubilni, modifikovani α1-α2 domeni iz ULBP proteina, izabrani su ULBP2 i ULBP3 za fagni prikaz i selekciju mutanata sa visokim afinitetom vezivanja za NKG2D. Za ekstenzivnu mutagenezu izabrano je šezdeset pozicija aminokiselina u α1-α2 domenu ULBP2 (SEQ ID NO.:16), i trideset šest pozicija aminokiselina u α1-α2 domenu ULBP3 (SEQ ID NO.: 17) (Slika 18). Pored toga, napravlјene su konzervativne mutacije cisteina u serin na pozicijama C103S u ULBP3 (SEQ ID NO.:17) i C8S u ULBP2 (SEQ ID NO.: 16) kako bi se uklonili neupareni slobodni cisteini koji bi mogli da ometaju izlaganje faga. Sintetičke DNK biblioteke koje kodiraju ove α1-α2 domene i koje sadrže NNK mutagene kodone na svakoj od odabranih pozicija aminokiselina, su sintetizovane pojedinačno; klonirane fuzijom sa pIII manjim proteinom omotača M13 faga, i potom su čestice faga koje prikazuju mutagene varijante α1-α2 ULBP2 ili ULBP3 sintetisane u SS320 E.coli ćelijama prema standardnim postupcima (Andris-Widhopf, J., Steinberger, P., Fuller, R., Rader, C., and Barbas, C. F., 3rd. (2011). Generation of human Fab antibody libraries: PCR amplification and assembly of light- and heavy-
2
chain coding sequences, Cold Spring Harbor protocols 2011.). Biblioteke za prikaz α1-α2 faga su sortirane prema rastućem afinitetu vezivanja za NKG2D upotrebom humanog NKG2D-Fc kao cilјnog proteina i kroz ponovljene iterativne postupke namerno produženog vezivanja, produženog ispiranja i eluiranja klonova faga kako bi bile izabrane varijante sa visokim afinitetom i sporom disocijacijom ili „off-rate“-om. Za ULBP2, specifične aminokiselinske mutacije su pronađene sa visokom učestalošću na pozicijama R80, V151, V152 i A153 u α1-α2, i one su identifikovane kao poželјne supstitucije aminokiselina koje pokazuju pojačani afinitet vezivanja za NKG2D (Slika 19 A i Tabela 6).
Tabela 6. Odabrane mutacije koje menjaju afinitet na 4 označene aminokiselinske pozicije α1-α2 domena ULBP2. Aminokiseline SEQ ID NOs.: 16 na svakoj od 4 pozicije su prikazane podeblјanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti od vrha ka dnu tabele. Sve aminokiseline su predstavlјene IUPAC skraćenicama od jednog slova.
[0061] U ULBP3 su otkrivene sa visokom učestalošću specifične mutacije aminokiselina na različitim pozicijama u odnosu na ULBP2 (Slika 18). Pozicije R162 i K165 u α1-α2 domenu ULBP3 sadržale su specifične mutacije koje su identifikovane kao poželјne supstitucije aminokiselina koje doprinose pojačanom afinitetu vezivanja za NKG2D (Slika 19B i Tabela 7). Ovi modifikovani α1-α2 domeni izvedeni iz ULBP2 i ULBP3 mogu se koristiti za pojačano vezivanje za NKG2D u različitim terapeutskim protokolima kao pojedinačni proteini ili fuzije sa heterolognim peptidima ili polipeptidima.
[0062] Tabela 7. Odabrane mutacije koje menjaju afinitet na naznačenim dvema aminokiselinskim pozicijama α1-α2 domena ULBP3. Aminokiseline SEQ ID NO: 17 na svakoj od 2 pozicije su prikazane podeblјanim slovima u prvom redu tabele. Identifikovane afinitetne mutacije su navedene po opadajućoj učestalosti od vrha ka dnu tabele. Sve aminokiseline su predstavlјene IUPAC skraćenicama od jednog slova.
[0063] Primer 6 (Modifikovani α1-α2 domeni fuzionisani sa peptidima antitela). Ovo su primeri vezivanja polipeptida antitela za NKG2DL koji su modifikovani tako da značajno pobolјšavaju njihov afinitet vezivanja za humani NKG2D receptor. α1-α2 domen MIC proteina je NKG2DL za NKG2D receptor. Antitela su visoko stabilni glikoproteini sastavlјeni od dva velika teška lanca i dva mala laka lanca (Slika 1). Velika količina raznovrsnosti koja se može stvoriti unutar CDR regiona varijabilnih domena omogućava stvaranje specifičnih antitela za specifične antigenske ciljeve (Hozumi N, Tonegawa S (1976). "Evidence for somatic rearrangement of immunoglobulin genes coding for variable and constant regions". Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 73 (10): 3628-3632. doi: 10.1073/pnas.73.10.3628. PMC 431171. PMID 824647.) Antitela su postala značajna terapeutska platforma za razvoj lekova i mogu da posreduju i u vezivanju i u neutralizaciji, kao i da modulišu imunski sistem putem vezivanja komplementa i Fc receptora (Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. (2014) IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology 5, 520.). Pre ovog otkrića, nije postojao format IgG antitela koji može direktno da aktivira imunske ćelije upotrebom modifikovanih α1-α2 domena koji se jače vezuju od nativnih NKG2DL za NKG2D receptor. Prethodni rad je pokazao da se mišji NKG2D ligand, Rae1 beta, može spojiti sa anti-Her2 antitelom za upotrebu kao antitumorski agens kod miševa (Cho, HM., Rosenblatt, JD., Tolba, K., Shin, SJ., Shin, D., Calfa, C., Zhang, Y., Shin, SU. (2010) Delivery of NKG2D ligand using and anti-Her2 antibody-NKG2D ligand fusion protein results in an enhanced innate and adaptive antitumor response. Cancer Research 70, 10121-30.). Međutim, mišji NKG2D ligandi se ne vezuju za humani NKG2D, a ne postoje prirodni humani NKG2D ligandi sa visokim afinitetom prema humanom i mišjem NKG2D. Fuzije između konstruisanih α1-α2 NKG2D liganada iz ovog otkrića i teškog lanca ili lakog lanca IgG antitela (Slika 20 A i B) su prevazišle ova ograničenja i istakle raznovrsnost fuzija modifikovanih α1-α2 domena sa heterolognim proteinima ili peptidima.
[0064] Da bi se stvorile varijante fuzija α1-α2 domena sa antitelima, DNK sekvence koje kodiraju α1-α2 domen za MIC WT, varijante WED, 25 i 48, su sintetisane i klonirane kao C-terminalne fuzije sa sekvencom bilo teškog lanca (HC _WT, HC _WED, HC_25, HC_48) ili lakog lanca (LC VT, LC VED, LC_25, LC_48) FGFR3-specifičnog antitela (Qing, J., Du, X., Chen, Y., Chan, P., Li, H., Wu, P., Marsters, S., Stawicki, S., Tien, J., Totpal, K., Ross, S., Stinson, S., Dornan, D., French, D., Wang, Q. R., Stephan, J. P., Wu, Y., Wiesmann, C., and Ashkenazi, A. (2009) Antibody-based targeting of FGFR3 in bladder carcinoma and t(4; 14)-positive multiple myeloma in mice, The Journal of clinical investigation 119, 1216-1229.) (SEQ ID NOs.: 42-49, tim redom). Dobijene fuzije su klonirane u sisarski vektor ekspresije pD2509 i eksprimirane kao uparena cela IgG antitela sa fuzijama bilo teškog ili lakog lanca modifikovanih α1-α2 domena (SEQ ID NOs.: 50-57, tim redom). Tranzijentne ekspresije su izvedene u HEK293 ćelijama upotrebom ekspresionog sistema Expi293 prema uputstvu proizvođača (Life Technologies), i prečišćene korišćenjem standardne protein A afinitetne hromatografije. Pokazana je sposobnost fuzija modifikovanih α 1-α2-antitela da preusmere NK ćelijom posredovanu lizu cilјnih ćelija koje eksprimiraju FGFR3 in vitro u testu oslobađanja kalceina. Humana urođenoubilačka (NK) ćelijska linija, NKL, je gajena u kulturi ćelija zajedno sa cilјnim ćelijama P815 koje su sadržale kalcein i ektopično eksprimirale FGFR3, i titrirana je sa projektovanim fuzionim proteinima antitela. Rezultati na Slikama 20C i 20D su pokazali da su aktivnosti ubijanja fuzija FGFR3-specifično modifikovanih α1-α2-antitela u korelaciji sa njihovim projektovanim NKG2D afinitetima. Konkretno, antitela koja su sadržala fuzije bilo teškog ili lakog lanca modifikovanih varijanti 25 i 48 (HC 25, HC_48 i LC_25, LC_48) ubijala su ćelije koje eksprimiraju FGFR3 efikasnije od fuzija antitela koja su sadržala bilo WT ili WED α1-α2 domene.
[0065] Dalјe se pokazalo da je ovo opšti i koristan pristup spajanja modifikovanih α1-α2 domena sa antitelima, spajanjem varijante 25 α1-α2 domena sa C-krajem bilo teškog ili lakog lanca EGFR-specifičnog antitela cetuximab-a (US patent 6217866), Her2-specifičnog antitela trastuzumab (Carter, P., Presta, L., Gorman, CM., Ridgway, JB., Henner, D., Wong, WL., Rowland, AM., Kotts, C., Carver, ME., Shepard, HM. (1992) Proc Natl Acad Sci 15, 4285-9), ili anti-PDL1 antitela (US Patent 20140341917) (SEQ ID NOs.: 58-63, tim redom). Dobijene fuzije su eksprimirane kao parovi IgG antitela lakog i teškog lanca cele dužine sa fuzijama teškog ili lakog lanca varijante 25 α1-α2 domena. Tranzijentne ekspresije su izvedene u HEK293 ćelijama upotrebom ekspresionog sistema Expi293 u skladu sa uputstvom proizvođača (Life Technologies), a prečišćene upotrebom standardne protein A afinitetne hromatografije. Pokazana in vitro u testu oslobađanja kalceina sposobnost varijante 25 fuzije antitela da preusmere NK ćelijom posredovanu lizu ciljnih ćelija. Humana urođenoubilačka (NK) ćelijska linija, NKL, je gajena u kulturi ćelija zajedno sa cilјnim ćelijama A431 koje su sadržale kalcein i koje eksprimiraju EGFR, sa cilјnim ćelijama SKBR3 koje eksprimiraju Her2 ili B16 ćelijama koje eksprimiraju PDL1, i titrirane su sa odgovarajućim konstruisanim fuzionim proteinima antitela. Rezultati na Slikama 21A, 21B i 21C prikazuju da su antitela fuzionih specifičnih varijanti antitela 25 u svim slučajevima imala znatno bolju aktivnost ubijanja već sa subnanomolarnim EC50vrednostima u odnosu na osnovno antitelo koje nije fuzionisano. Ovi podaci pokazuju da su fuziono modifikovane α1-α2 varijante antitela univerzalna platforma koja omogućavanje IgG antitelima da se čvrsto vežu za NKG2D i da usmere antigen-specifičnu ćelijsku lizu.
[0066] Primer 7 (fuzije trastuzumaba sa α1-α2 varijantom 25 vezuju NK ćelije in vivo i izazivaju jaku prezentaciju antigena). U in vivo uslovima fuzioni proteini koji sadrže varijante α1-α2 domena koje se vezuju za NKG2D sa visokim afinitetom vezuju se za NK ćelije. Dakle, antigen-specifična antitela koja sadrže modifikovane α1-α2 fuzije se čvrsto vezuju za NKG2D i na taj način in vivo efikasno snabdevaju površinu NK ćelija sa antitelima da traže cilјne ćelije koje eksprimiraju određeni antigen. Ova aktivnost je bila slična projektovanim CAR ćelijama (Gill, S., and June, CH. (2015) Going viral: chimeric antigen receptor T-cell therapy for hematological malignancies. Immunol Rev 263, 68-89.), ali nije zahtevala genetsku modifikaciju ćelije koja eksprimira NKG2D.
[0067] Kako bi pokazali da antitela koja sadrže modifikovane α1-α2 fuzije vezuju NK ćelije in vivo, analizirani su in vivo trastuzumab i odgovarajuće fuzije teškog i lakog lanca varijante 25 za serumske farmakokinetičke (PK) profile i farmakodinamiku (PD) obeležavanja NK ćelija. Sva tri antitela: osnovni trastuzumab; fuzija trastuzumab HC_25; i fuzija trastuzumab LC_25, konjugovani su sa Alexa Flour 647 prema uputstvu proizvođača (Life Technologies). Grupama od po tri C57BL/6 miša je injecirana jedna doza od 100 µg svakog antitela, a krv je uzeta u naznačenim vremenskim tačkama za analizu
2
plazma PK ELISA-om i protočnu citometriju perifernih NK ćelija. PK profil osnovnog trastuzumab antitela je pokazao tipičnu distribuciju alfa faze u toku 24 sata, i beta fazu eliminacije u skladu sa poluživotom antitela dužim od 1 nedelјe kod miševa (Slika 22A). I za fuzije teškog i lakog lanca sa varijantom 25, početna alfa-faza je pokazala mnogo veći volumen distribucije u odnosu na osnovno antitelo, u skladu sa NKG2D, dok je beta-faza eliminacije takođe bila u skladu sa tipičnim klirensom antitela kod miševa (Slika 22 A). Upotrebom protočne citometrije perifernih NK ćelija iz krvi miša, nivo NK ćelija obeleženih sa Alexa Fluor 647 je pokazao jasno vremenski zavisno povećanje procenta NK ćelija obeleženih sa fuzionim antitelima, ali ne i sa osnovnim antitelom (Slika 22 B ). Povećanje u obeležavanju fuzijama dostiglo je vrhunac u roku od 24 sata, što je u skladu sa padom primećenim u PK profilima za fuzije, i bilo je stabilno najmanje tri dana nakon primanja injekcije. Kombinovani PK i PD podaci pokazuju da su trastuzumab antitela koja sadrže fuzije α1-α2 varijante 25 formirala in vivo stabilne komplekse sa NKG2D na NK ćelijama.
[0068] Da bi se procenila pojava antitela na lekove (ADA, eng. anti-drug antibodies) na humano IgG antitelo na trastuzumab, uzorci plazme iz PK/PD studije su analizirani na ADA pomoću ELISA metode. Na slikama 23A-C, ELISA metodom za vezivanje mišjeg IgG za bunare obložene sa 3 odgovarajuća antitela u različitim koncentracijama, su otkrila da samo antitela fuzionisana sa varijantom 25 su pobudila ADA u roku od sedam dana nakon jedne doze antitela. Osnovno antitelo na trastuzumab nije dalo ADA signal. Da bi se utvrdilo da li su fuzije antitela pobudile imunskii odgovor (ADA) i na α1-α2 domen i na samu komponentu antitela (trastuzumab) kada samo antitelo na trastuzumab nije izazvalo imunski odgovor, pozitivna ADA plazma iz fuzija antitela je pojedinačno testirana na osnovno antitelo i na varijantu 25 α1-α2 domena; oba dela su reagovala sa ADA iz plazme (Slike 24A i 24B). Ovi podaci pokazuju da je fuzija varijante 25 visokog afiniteta sa osnovnim antitelom posredovala u NKG2D-zavisnom preuzimanju i prezentaciji antigena kako bi se pobudila moćna i brza imunska reakcija na osnovno antitelo, koje samo nije bilo toliko imunogeno kod miševa. Dakle, varijanta α1-α2 domena visokog afiniteta vezana za antigen ili imunogen obezbedila je moćnu prezentaciju antigena i epitopa, efikasno služeći kao moćan adjuvans za imunizaciju.
[0069] Demonstrirani kombinovani efekti sposobnosti NK ćelija u cirkulaciji za usmerenu lizu cilјnih ćelija i pobolјšanje prezentacije antigena, su važne aktivnosti fuzija antitela sa modifikovanim α1-α2 domenima koje mogu pružiti terapeutsku korist.
[0070] Primer 8 (fuzija teškog lanca antitela sa α1-α2 varijantom 25 je in vivo pokazala antitumorsku aktivnost). Da bi se ispitao potencijal da antigen-specifična antitela fuzionisana sa modifikovanim α1-α2, imaju aktivnost protiv cilјne ćelije, fuzija teškog lanca anti-PDL1 antitela sa varijantom 25 α1-α2 je evaluirana u modelu singenog tumora MC38. MC38 tumori su implantirani subkutano u C57BL/6 miša i tumori su narasli do prosečno 100 mm<3>pre početka tretmana. Po započinjanju tretmana, četiri kohorte od po 10 miševa po grupi su prvog, 4 i 7 dana tretirane nosačem, anti-CTLA4 (100 ug i.p.), osnovnim anti-PDL1 (300 ug i.v.) ili anti-PDL1 HC_25 fuzijom (300 ug i.v.). Na slici 25, krive rasta tumora su pokazale da je anti-PDL1 HC_25 pokazalo najefikasniju antitumorsku aktivnost u prve dve nedelјe tretmana. Inhibicija rasta tumora bila je značajno bolјa od utvrđenog anti-CTLA4 tretmana i osnovnog anti-PDL1 antitela, tokom prvih 12 dana nakon početka tretmana. Do 16. dana, tretman anti-PDL1 HC_25 je počeo da gubi efikasnost u skladu sa pojavom ADA odgovora kao što je primećeno za trastuzumab fuzije (Primer 7). Značajna antitumorska aktivnost primećena je za fuziju teškog lanca antitela sa varijantom 25, u odnosu na osnovno antitelo i standardne anti-CTLA4 tretmane, i ova fuzija antitela sa modifikovanim α1-α2 domenima koji su služili kao NKG2D ligandi visokog afiniteta je pokazala upečatljiv terapeutski efekat.
2
2
2
�
2
�
2
4
4
4
4
�
�
4
�
1
�
�
�
2
4
�
2
4
�
�
�
1
�
�
�
11
��
1
��
�
1
�
�
1
11
11
11
11
11
11
11
12
��
��
��
12
��
12
�
11
12
�
��
1
�
1
1
1
��
14
��
14
14
14
��
1
11
��
1
14
1
1
1
1
�

Claims (2)

Patentni zahtevi
1. α1-α2 domen molekula koji obuhvata aminokiselinsku sekvencu koja ima najmanje 80% sličnosti sa SEQ ID NO: 17,
pri čemu pomenuti domen molekula sadrži sve (a)-(c):
(a) S ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 103 SEQ ID NO: 17,
(b) A, P, S, T ili H ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 165 SEQ ID NO: 17; i
(c) G ostatak na poziciji koja odgovara poziciji 162 SEQ ID NO: 17,
i pri čemu pomenuti domen molekula pokazuje veći afinitet vezivanja za humani NKG2D u poređenju sa SEQ ID NO: 17.
2. α1-α2 domen molekula prema patentnom zahtevu 1, gde je aminokiselina na poziciji 165 P ili H ostatak.
RS20220389A 2014-12-05 2015-12-04 Insertabilni varijabilni fragmenti antitela i modifikovani a1-a2 domeni nkg2d liganada RS63149B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462088456P 2014-12-05 2014-12-05
EP15864650.5A EP3227311B1 (en) 2014-12-05 2015-12-04 Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands
PCT/US2015/064051 WO2016090278A2 (en) 2014-12-05 2015-12-04 Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63149B1 true RS63149B1 (sr) 2022-05-31

Family

ID=56092677

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220389A RS63149B1 (sr) 2014-12-05 2015-12-04 Insertabilni varijabilni fragmenti antitela i modifikovani a1-a2 domeni nkg2d liganada

Country Status (16)

Country Link
US (2) US11453713B2 (sr)
EP (3) EP4079747A1 (sr)
JP (5) JP2017537617A (sr)
AU (2) AU2015357578B2 (sr)
CA (2) CA2963274C (sr)
CY (1) CY1125141T1 (sr)
DK (1) DK3227311T3 (sr)
ES (1) ES2907467T3 (sr)
HR (1) HRP20220531T1 (sr)
HU (1) HUE058851T2 (sr)
LT (1) LT3227311T (sr)
PL (1) PL3227311T3 (sr)
PT (1) PT3227311T (sr)
RS (1) RS63149B1 (sr)
SI (1) SI3227311T1 (sr)
WO (1) WO2016090278A2 (sr)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20240997T1 (hr) * 2015-08-04 2024-10-25 Xyphos Biosciences Inc. Varijabilni fragmenti antitijela koji se mogu umetnuti i modificirane α1-α2 domene nkg2d liganada, kao i neprirodni nkg2d ligandi koji se vežu za neprirodne nkg2d receptore
JP2019523016A (ja) * 2016-06-24 2019-08-22 サイフォス、バイオサイエンシズ、インコーポレイテッドＸｙｐｈｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｉｎｃ． 抗体の挿入可能な可変フラグメントおよびｎｋｇ２ｄリガンドの改変型ａ１−ａ２ドメイン
CN107964041B (zh) * 2016-10-20 2023-08-01 中国科学院广州生物医药与健康研究院 高稳定性和高亲和力的dmic及其制法
AU2018219887B2 (en) * 2017-02-08 2024-08-15 Dragonfly Therapeutics, LLC Multi-specific binding proteins for activation of natural killer cells and therapeutic uses thereof to treat cancer
CN110944661A (zh) 2017-02-20 2020-03-31 蜻蜓疗法股份有限公司 结合her2、nkg2d和cd16的蛋白质
CL2017003503A1 (es) 2017-12-29 2018-06-01 Univ Chile Anticuerpo humano y fragmentos de este, para ser utilizados en el tratamiento del cáncer gástrico (cg) y eventualmente otro tipo de tumores que expresen la proteína mica (del inglés “mhc class i chain-related gene a).
CA3237846A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Antibody variable domains targeting the nkg2d receptor
BR112020015994A2 (pt) 2018-02-08 2020-12-15 Dragonfly Therapeutics, Inc. Terapia de combinação do câncer que envolve proteínas de ligação multiespecíficas que ativam células natural killer
WO2019164930A1 (en) 2018-02-20 2019-08-29 Dragonfly Therapeutics, Inc. Multi-specific binding proteins that bind cd33, nkg2d, and cd16, and methods of use
JOP20200234A1 (ar) 2018-03-27 2020-09-15 Xyphos Biosciences Inc نطاقات a1-a2 معدلة لمركبات ترابطية nkg2d غير طبيعية ترتبط بمستقبلات nkg2d غير طبيعية.
KR102835308B1 (ko) 2018-08-08 2025-07-21 드래곤플라이 쎄라퓨틱스, 인크. Nkg2d, cd16 및 종양 관련 항원에 결합하는 단백질
EP3833392A4 (en) 2018-08-08 2022-05-18 Dragonfly Therapeutics, Inc. MULTISPECIFIC BINDING PROTEINS FOR BINDING CD33, NKG2D AND CD16 AND METHODS OF USE
EA202091888A1 (ru) * 2018-08-08 2020-10-23 Драгонфлай Терапьютикс, Инк. Вариабельные домены антител, нацеленные на рецептор nkg2d
AU2019376632B2 (en) * 2018-11-05 2025-07-24 Xyphos Biosciences Inc. Non-natural NKG2D receptors that do not directly signal the cells to which they are attached
EP3927722A4 (en) * 2019-02-18 2022-11-23 Courier Therapeutics, Inc. BISPECIFIC FUSION PROTEIN USING ORTHOPOXVIRUS MAJOR HISTOCOMPATIBILITY COMPLEX (MHC) CLASS L-LIKE PROTEIN (OMCP) AND TUMOR-SPECIFIC BINDING PARTNER
JP2023516080A (ja) 2020-03-06 2023-04-17 ジーオー セラピューティクス，インコーポレイテッド 抗グリコｃｄ４４抗体およびその使用
JP7512394B2 (ja) 2020-05-06 2024-07-08 ドラゴンフライ セラピューティクス， インコーポレイテッド Ｎｋｇ２ｄ、ｃｄ１６及びｃｌｅｃ１２ａに結合するタンパク質
EP4301774A4 (en) 2021-03-03 2025-08-13 Dragonfly Therapeutics Inc METHODS OF TREATING CANCER USING MULTI-SPECIFIC BINDING PROTEINS THAT BIND TO NKG2D, CD16, AND A TUMOR-ASSOCIATED ANTIGEN
EP4301782A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-cd44 antibodies and their uses
US20250101126A1 (en) 2021-08-05 2025-03-27 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-muc4 antibodies and their uses
EP4396232A1 (en) 2021-09-03 2024-07-10 Go Therapeutics, Inc. Anti-glyco-lamp1 antibodies and their uses
CN118354789A (zh) 2021-09-03 2024-07-16 Go医疗股份有限公司 抗糖-cMET抗体及其用途
CN120529915A (zh) 2023-02-07 2025-08-22 修普霍斯生物科学有限公司 嵌合抗原受体和抗体-nkg2d配体结构域融合蛋白
TW202448960A (zh) 2023-02-07 2024-12-16 美商Ｇｏ治療公司 包括抗醣MUC4抗體及MIC蛋白α1-α2結構域之抗體融合蛋白及其用途

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4128089A (en) 1988-09-15 1990-03-22 Rorer International (Overseas) Inc. Monoclonal antibodies specific to human epidermal growth factor receptor and therapeutic methods employing same
CA2315251A1 (en) 1997-12-17 1999-06-24 Immunex Corporation Cell surface glycoproteins associated with human b cell lymphomas - ulbp, dna and polypeptides
CN1294148C (zh) * 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
JP2009514537A (ja) 2005-11-03 2009-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 治療的抗ｈｅｒ２抗体融合ポリペプチド
CN101646771A (zh) * 2007-01-10 2010-02-10 萨斯喀彻温大学 环肽结构的稳定
US8796420B2 (en) 2009-12-31 2014-08-05 Avidbiotics Corp. Non-natural MIC proteins
WO2012091756A1 (en) 2010-12-30 2012-07-05 Avidbiotics Corp. Non-natural mic proteins
RU2444570C1 (ru) 2010-06-23 2012-03-10 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации Способ получения рекомбинантной вакцины
CA2823297C (en) * 2010-12-30 2021-05-25 Avidbiotics Corp. Non-natural mic proteins
TWI408370B (zh) 2011-05-19 2013-09-11 長庚大學 胰臟癌之血清生物檢測標誌及其應用
KR101764096B1 (ko) 2011-11-28 2017-08-02 메르크 파텐트 게엠베하 항-ｐｄ-ｌ1 항체 및 그의 용도
AU2013218017B2 (en) * 2012-02-07 2017-12-07 Innate Pharma MICA binding agents
US11117969B2 (en) * 2014-12-05 2021-09-14 Xyphos Biosciences Inc. Insertable variable fragments of antibodies and modified α1-α2 domains of NKG2D ligands
HRP20240997T1 (hr) * 2015-08-04 2024-10-25 Xyphos Biosciences Inc. Varijabilni fragmenti antitijela koji se mogu umetnuti i modificirane α1-α2 domene nkg2d liganada, kao i neprirodni nkg2d ligandi koji se vežu za neprirodne nkg2d receptore
WO2017191101A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 F. Hoffmann-La Roche Ag The contorsbody - a single chain target binder

Also Published As

Publication number Publication date
EP3227311B1 (en) 2022-02-02
AU2018223040B2 (en) 2020-04-30
AU2015357578A1 (en) 2017-04-13
PL3227311T3 (pl) 2022-05-16
JP7457558B2 (ja) 2024-03-28
CA2963274C (en) 2024-01-30
EP4043474A1 (en) 2022-08-17
AU2015357578B2 (en) 2018-11-08
JP2020114239A (ja) 2020-07-30
US20160159882A1 (en) 2016-06-09
JP2017537617A (ja) 2017-12-21
AU2018223040A1 (en) 2018-09-20
WO2016090278A3 (en) 2016-07-28
CY1125141T1 (el) 2024-12-13
HRP20220531T1 (hr) 2022-06-10
DK3227311T3 (da) 2022-03-07
US11453713B2 (en) 2022-09-27
EP4079747A1 (en) 2022-10-26
US20230002475A1 (en) 2023-01-05
JP2022093353A (ja) 2022-06-23
WO2016090278A2 (en) 2016-06-09
EP3227311A4 (en) 2018-08-01
JP2020114238A (ja) 2020-07-30
JP7132967B2 (ja) 2022-09-07
HUE058851T2 (hu) 2022-09-28
ES2907467T3 (es) 2022-04-25
PT3227311T (pt) 2022-02-23
EP3227311A2 (en) 2017-10-11
JP2020114854A (ja) 2020-07-30
CA3204990A1 (en) 2016-06-09
SI3227311T1 (sl) 2022-04-29
CA2963274A1 (en) 2016-06-09
JP7083862B2 (ja) 2022-06-13
LT3227311T (lt) 2022-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230002475A1 (en) Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands
JP7446501B2 (ja) 抗体の挿入可能な可変フラグメント及びｎｋｇ２ｄリガンドの改変されたａ１－ａ２ドメイン、及び非天然のｎｋｇ２ｄ受容体に結合する非天然のｎｋｇ２ｄリガンド
JP7000660B2 (ja) Ｒｏｒ１抗体組成物及び関連の方法
US11117969B2 (en) Insertable variable fragments of antibodies and modified α1-α2 domains of NKG2D ligands
EP3475300A2 (en) Insertable variable fragments of antibodies and modified a1-a2 domains of nkg2d ligands
WO2023165516A1 (zh) 抗pd-l1和vegf双特异性抗体及其应用