RS63276B1 - Supstrati koji mogu da se seku matriksnom metaloproteazom i serin proteazom i postupci njihove upotrebe - Google Patents

Supstrati koji mogu da se seku matriksnom metaloproteazom i serin proteazom i postupci njihove upotrebe

Info

Publication number
RS63276B1
RS63276B1 RS20220534A RSP20220534A RS63276B1 RS 63276 B1 RS63276 B1 RS 63276B1 RS 20220534 A RS20220534 A RS 20220534A RS P20220534 A RSP20220534 A RS P20220534A RS 63276 B1 RS63276 B1 RS 63276B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
antibody
seq
activatable
agent
amino acid
Prior art date
Application number
RS20220534A
Other languages
English (en)
Inventor
Stephen James Moore
Margaret Thy Luu Nguyen
Daniel R Hostetter
Olga Vasiljeva
Jason Gary Sagert
Jonathan Alexander Terrett
James William West
Original Assignee
Cytomx Therapeutics Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cytomx Therapeutics Inc filed Critical Cytomx Therapeutics Inc
Publication of RS63276B1 publication Critical patent/RS63276B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
    • A61K47/6817—Toxins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0058—Antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/51—Complete heavy chain or Fd fragment, i.e. VH + CH1
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/515—Complete light chain, i.e. VL + CL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Pronalazak se uopšteno odnosi na polipeptide koji sadrže najmanje prvu komponentu koja može da se seče (cleavable moiety 1, CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (matrix metalloprotease, MMP) i najmanje drugu komponentu koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (serine protease, SP), na antitela i druge veće molekule koji mogu da se aktiviraju, koji uključuju ove polipeptide koji sadrže najmanje CM1 koja je supstrat za najmanje jednu MMP proteazu i CM2 koja je supstrat za najmanje jednu SP proteazu, i na postupke spravljanja i upotrebe ovih polipeptida koji sadrže najmanje CM1 koja je supstrat za najmanje jednu MMP proteazu i CM2 koja je supstrat za najmanje jednu SP proteazu u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama.
Osnov pronalaska
[0002] Proteaze su enzimi koji razgrađuju proteine sečenjem peptidnih veza između aminokiselinskih rezidua. Proteaze se sreću prirodno u svim organizmima i uključene su u različite fiziološke reakcije od jednostavne razgradnje do visokoregulisanih puteva. Za neke proteaze se zna da prekidaju specifične peptidne veze zasnovane na prisustvu određene aminokiselinske sekvence u proteinu.
[0003] Gerspach et al. (2006), Cancer Immunology Immunotherapy, 55:12, str. 1590-1600, opisuju TNF prolek koji sadrži ili linker selektivan za uPA ili linker sa dvojnom specifičnošću i za uPA i MMP-2. WO2014/052462 opisuje antitela koja mogu da se aktiviraju, koja sadrže maskirajuću komponentu (masking moiety, MM), komponentu koja može da se seče (CM), i antitelo (antibody, AB) koje se specifično vezuje za receptor za interleukin-6 (interleukin-6 receptor, (IL-6R). WO2014/107599 opisuje postupke i kompozicije za detektovanje specifične proteazne aktivnosti u biološkim uzorcima. uz korišćenje antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0004] Prema tome, postoji potreba za identifikovanjem novih supstrata za proteaze i za upotrebom tih supstrata u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama.
Kratak opis pronalaska
[0005] Pronalazak je definisan setom priloženih patentnih zahteva.
[0006] Objava obezbeđuje aminokiselinske sekvence koje sadrže najmanje prvu komponentu koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje drugu komponentu koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP). Ove aminokiselinske sekvence se zajedno u ovom tekstu označavaju kao "CM1-CM2 supstrati". Namena ovog izraza nije postavljanje bilo kakvog uslova u vezi sa orijentacijom ili drugim strukturnim rasporedom prve komponente koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje druge komponente koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP). Prema tome, izraz "CM1-CM2 supstrati" obuhvata CM1-CM2 supstrate koji od N-terminusa do C-terminusa imaju sledeći strukturni aranžman: CM1-CM2 ili CM2-CM1. Izraz "CM1-CM2 supstrati" obuhvata i supstrate u kojima se najmanje deo CM1 sekvence preklapa sa najmanje delom CM2 sekvence.
[0007] CM1-CM2 supstrati opisani u ovom tekstu korisni su u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama. Na primer, ovi CM1-CM2 supstrati korisni su u antitelima koja mogu da se aktiviraju, koja uključuju antitela ili njihove antigen-vezujuće fragmente (AB) koji uključuju najmanje jednu maskirajuću komponentu (MM) vezanu za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen AB tako da povezivanje MM smanjuje sposobnost AB da se veže sa svojim ciljem.
[0008] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvu CM (CM1) i drugu CM (CM2). U nekim primerima izvođenja, najmanje deo CM1 sekvence supstrata preklapa se sa najmanje delom CM2 sekvence. U nekim primerima izvođenja, CM1 sekvenca supstrata i CM2 sekvenca supstrata imaju zajedničku najmanje jednu aminokiselinsku reziduu. U nekim primerima izvođenja, CM1 sekvenca supstrata i CM2 sekvenca supstrata imaju zajedničke najmanje dve aminokiselinske rezidue. U nekim primerima izvođenja, CM1 sekvenca supstrata i CM2 sekvenca supstrata imaju zajedničke najmanje tri aminokiselinske rezidue. U nekim primerima izvođenja, CM1 sekvenca supstrata i CM2 sekvenca supstrata imaju zajedničke tri ili više aminokiselinskih sekvenci.
[0009] U nekim primerima izvođenja, CM1 i CM2 su zasebni polipeptidi koji su međusobno operabilno povezani.
[0010] U nekim primerima izvođenja, CM1 i CM2 su zasebni polipeptidi koji su direktno međusobno povezani, tj., N-terminus jednog supstrata direktno je povezan sa C-terminusom drugog polipeptidnog supstrata. U nekim primerima izvođenja, N-terminus CM1 direktno je povezan sa C-terminusom CM2. U nekim primerima izvođenja, N-terminus CM2 direktno je povezan sa C-terminusom CM1.
[0011] U nekim primerima izvođenja, CM1 i CM2 su zasebni polipeptidi koji su međusobno operabilno povezani preko najmanje jedne povezujuće komponente.
[0012] U nekim primerima izvođenja, prva komponenta koja može da se seče CM1 i druga komponenta koja može da se seče CM2 u antitelu koje može da se aktivira, u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa imaju sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB, ili AB-CM1-CM2-MM.
[0013] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (linking peptide, LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između maskirajuće komponente (MM) i CM1. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između MM i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između MM i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između MM i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB.
[0014] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1. U nekim primerima izvođenja antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i maskirajuće komponente (MM). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između AB i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM.
[0015] U nekim primerima izvođenja, LP' je GG. U nekim primerima izvođenja, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
[0016] U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP). Primeri MMP uključuju MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; i MMP27.
[0017] U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za MMP2, MMP9, MMP14, MMP1, MMP3, MMP13, MMP17, MMP11, i/ili MMP19. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za MMP2. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za MMP9. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za dve ili više MMP. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za najmanje MMP9 i MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za najmanje MMP2 i MMP9. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za najmanje MMP2 i MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za tri ili više MMP. U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za najmanje MMP2, MMP9, i MMP14. U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje dva ili više supstrata za istu MMP. U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje najmanje dva ili više MMP2 supstrata. U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje najmanje dva ili više MMP9 supstrata. U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje najmanje dva ili više MMP14 supstrata.
[0018] U nekim primerima izvođenja, CM1 je supstrat za MMP i uključuje najmanje sekvencu ISSGLLSS (SEQ ID NO: 20); QNQALRMA (SEQ ID NO: 21); AQNLLGMV (SEQ ID NO: 351); STFPFGMF (SEQ ID NO: 352); PVGYTSSL (SEQ ID NO: 353); DWLYWPGI (SEQ ID NO: 354); MIAPVAYR (SEQ ID NO: 355); RPSPMWAY (SEQ ID NO: 356); WATPRPMR (SEQ ID NO: 357); FRLLDWQW (SEQ ID NO: 358); LKAAPRWA (SEQ ID NO: 359); GPSHLVLT (SEQ ID NO: 360); LPGGLSPW (SEQ ID NO: 361); MGLFSEAG (SEQ ID NO: 362); SPLPLRVP (SEQ ID NO: 363); RMHLRSLG (SEQ ID NO: 364); LAAPLGLL (SEQ ID NO: 365); AVGLLAPP (SEQ ID NO: 366); LLAPSHRA (SEQ ID NO: 367); PAGLWLDP (SEQ ID NO: 368); ISSGLSS (SEQ ID NO: 369); ISSGL (SEQ ID NO: 480); ISSGLLS (SEQ ID NO: 481); ISSGLL (SEQ ID NO: 482); i/ili VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411).
[0019] U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu ISSGLLSS (SEQ ID NO: 20). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu QNQALRMA (SEQ ID NO: 21). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu AQNLLGMV (SEQ ID NO: 351). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu STFPFGMF (SEQ ID NO: 352). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu PVGYTSSL (SEQ ID NO: 353). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu DWLYWPGI (SEQ ID NO: 354). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu MIAPVAYR (SEQ ID NO: 355). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu RPSPMWAY (SEQ ID NO: 356). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu WATPRPMR (SEQ ID NO: 357). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu FRLLDWQW (SEQ ID NO: 358). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu LKAAPRWA (SEQ ID NO: 359). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu GPSHLVLT (SEQ ID NO: 360). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu LPGGLSPW (SEQ ID NO: 361). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu MGLFSEAG (SEQ ID NO: 362). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu SPLPLRVP (SEQ ID NO: 363). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu RMHLRSLG (SEQ ID NO: 364). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu LAAPLGLL (SEQ ID NO: 365). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu AVGLLAPP (SEQ ID NO: 366). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu LLAPSHRA (SEQ ID NO: 367). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu PAGLWLDP (SEQ ID NO: 368). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu ISSGLSS (SEQ ID NO: 369). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu VHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 411). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu ISSGL (SEQ ID NO: 480). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu ISSGLLS (SEQ ID NO: 481). U nekim primerima izvođenja, CM1 uključuje aminokiselinsku sekvencu ISSGLL (SEQ ID NO: 482).
[0020] U nekim primerima izvođenja, CM2 je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP). U nekim primerima izvođenja, SP se bira između plazminogen-aktivatora u-tipa (u-type plasminogen activator, uPA, označen i kao urokinaza), matriptaze (ovde označena i kao MT-SP1 ili MTSP1), i njihovih kombinacija. Primeri drugih SP koje seku CM2 opisanu u ovom tekstu uključuju, na primer, bez ograničavanja, aktivirani protein C; katepsin A; katepsin G; himazu; proteazne koagulacione faktore kao što su, npr., FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa; elastazu; granzim B; guanidinobenzoatazu; HtrA1; elastazu humanih neutrofila; laktoferin; marapsin; NS3/4A; PACE4; plazmin; PSA; tPA; trombin; triptazu; transmembranske serin proteaze tipa II (type II transmembrane serine protease, TTSP) kao npr., DESC1, DPP-4, FAP, hepsin, matriptaza-2, TMPRSS2, TMPRSS3, i/ili TMPRSS4.
[0021] Na primer, pogodne CM2 seku se najmanje jednom serin proteazom i uključuju sekvencu TGRGPSWV (SEQ ID NO: 370); SARGPSRW (SEQ ID NO: 371); TARGPSFK (SEQ ID NO: 372); LSGRSDNH (SEQ ID NO: 18); GGWHTGRN (SEQ ID NO: 373); HTGRSGAL (SEQ ID NO: 374); PLTGRSGG (SEQ ID NO: 375); AARGPAIH (SEQ ID NO: 376); RGPAFNPM (SEQ ID NO: 377); SSRGPAYL (SEQ ID NO: 378); RGPATPIM (SEQ ID NO: 379); RGPA (SEQ ID NO: 380); LSGRSGNH (SEQ ID NO: 412); TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 413); TSGRSANP (SEQ ID NO: 414); SGRSANPRG (SEQ ID NO: 468); VAGRSMRP (SEQ ID NO: 415); LSGRSDDH (SEQ ID NO: 547); LSGRSDIH (SEQ ID NO: 548); LSGRSDQH (SEQ ID NO: 549); LSGRSDTH (SEQ ID NO: 550); LSGRSDYH (SEQ ID NO: 551); LSGRSDNP (SEQ ID NO: 552); LSGRSANP (SEQ ID NO: 553); LSGRSANI (SEQ ID NO: 554); i/ili LSGRSDNI (SEQ ID NO: 71).
[0022] U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu TGRGPSWV (SEQ ID NO: 370). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu SARGPSRW (SEQ ID NO: 371). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu TARGPSFK (SEQ ID NO: 372). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNH (SEQ ID NO: 18). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu GGWHTGRN (SEQ ID NO: 373). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu HTGRSGAL (SEQ ID NO: 374). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu PLTGRSGG (SEQ ID NO: 375). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu AARGPAIH (SEQ ID NO: 376). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu RGPAFNPM (SEQ ID NO: 377). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu SSRGPAYL (SEQ ID NO: 378). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu RGPATPIM (SEQ ID NO: 379). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu RGPA (SEQ ID NO: 380). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSGNH (SEQ ID NO: 412). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu e TSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 413). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu SGRSANPRG (SEQ ID NO: 468). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu TSGRSANP (SEQ ID NO: 414). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu VAGRSMRP (SEQ ID NO: 415). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDDH (SEQ ID NO: 547). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDIH (SEQ ID NO: 548). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDQH (SEQ ID NO: 549). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDTH (SEQ ID NO: 550). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDYH (SEQ ID NO: 551). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNP (SEQ ID NO: 552). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSANP (SEQ ID NO: 553). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSANI (SEQ ID NO: 554). U nekim primerima izvođenja, CM2 uključuje aminokiselinsku sekvencu LSGRSDNI (SEQ ID NO: 71).
[0023] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 1); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 2); AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 3); TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 4); VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 5); TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 6); AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 7); LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 8); VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 9); LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 10); LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 11); LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 12); ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 13); LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 14); QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 15); LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 16); QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 17); ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 22); ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 469); AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 470); AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 471); ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 483); ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 484); ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 485); ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 486); ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 487); ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 488); ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 489); ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 490); AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 515); AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 516); AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 517); AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 518); AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 519); AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 520); AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 521); AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 522); ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 555); i/ili AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 557).
[0024] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNH (SEQ ID NO: 1). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSSGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 2). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 3). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu TSTSGRSANPRGGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 4). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu VHMPLGFLGPGGTSTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 5). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu TSTSGRSANPRGGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 6). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 7). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGAVGLLAPP (SEQ ID NO: 8). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu VHMPLGFLGPGGLSGRSDNH (SEQ ID NO: 9). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGVHMPLGFLGP (SEQ ID NO: 10). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 11). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSGNHGGSGGSISSGLLSS (SEQ ID NO: 12). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSSGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 13). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSDNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 14). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu QNQALRMAGGSGGSLSGRSDNH (SEQ ID NO: 15). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu LSGRSGNHGGSGGSQNQALRMA (SEQ ID NO: 16). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu QNQALRMAGGSGGSLSGRSGNH (SEQ ID NO: 17). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSGNH (SEQ ID NO: 22). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSANPRG (SEQ ID NO: 469). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPTSGRSANPRG (SEQ ID NO: 470). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPSGRSANPRG (SEQ ID NO: 471). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDDH (SEQ ID NO: 483). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDIH (SEQ ID NO: 484). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDQH (SEQ ID NO: 485). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu. U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDTH (SEQ ID NO: 486). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDYH (SEQ ID NO: 487). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNP (SEQ ID NO: 488). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSANP (SEQ ID NO: 489). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSANI (SEQ ID NO: 490). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDDH (SEQ ID NO: 515). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDIH (SEQ ID NO: 516). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDQH (SEQ ID NO: 517). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDTH (SEQ ID NO: 518). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDYH (SEQ ID NO: 519). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNP (SEQ ID NO: 520). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSANP (SEQ ID NO: 521). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSANI (SEQ ID NO: 522). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu ISSGLLSGRSDNI (SEQ ID NO: 555). U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat uključuje sekvencu AVGLLAPPGGLSGRSDNI (SEQ ID NO: 557).
[0025] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB, ili AB-CM1-CM2-MM.
[0026] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i antitelo u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB, ili AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM. U nekim primerima izvođenja, svaki od LP1 i LP2 je peptid dug od oko 1 do 20 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična.
[0027] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između maskirajuće komponente (MM) i CM1. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje
1
povezujući peptid (LP") između MM i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između MM i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između MM i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB.
[0028] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i maskirajuće komponente (MM). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između AB i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM.
[0029] U nekim primerima izvođenja, LP' je GG. U nekim primerima izvođenja, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
[0030] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 381) i (GGGS)n(SEQ ID NO: 382), pri čemu je n ceo broj koji iznosi najmanje jedan.
[0031] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 383), GGSGG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), i GSSSG (SEQ ID NO: 388).
[0032] U nekim primerima izvođenja, LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 389), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 390), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 391), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 392), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 393), ili GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 394).
[0033] U nekim primerima izvođenja, LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 395), GSSGT (SEQ ID NO: 396) ili GSSG (SEQ ID NO: 397).
[0034] U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije za vezivanje sa ciljem koja iznosi oko 100 nM ili manje.
[0035] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj. U nekim primerima izvođenja, AB je antitelo pune dužine. U nekim primerima izvođenja, AB je imunološki aktivan fragment. U nekim primerima izvođenja, AB je antigen-vezujući fragment. U nekim primerima izvođenja, AB je monoklonsko antitelo, domensko antitelo, jedan lanac, Fab fragment, F(ab')2fragment, scFv, scab, dAb, jednodomensko teškolančano antitelo, ili jednodomensko lakolančano antitelo. U nekim primerima izvođenja, takvo AB je mišje, drugog glodara, himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0036] U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza je u tkivu kolokalizovana sa ciljem, i MMP proteaza seče CM1 u antitelu kada je antitelo izloženo proteazi. U nekim primerima izvođenja, SP proteaza je u tkivu kolokalizovana sa ciljem, i SP proteaza seče CM2 supstrat u antitelu kada je antitelo izloženo proteazi. U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza i/ili SP proteaza kolokalizovane su u tkivu sa ciljem, i MMP proteaza i/ili SP proteaza seče CM1-CM2 supstrat u antitelu kada je antitelo izloženo proteazi. U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza i SP proteaza su kolokalizovane u tkivu sa ciljem, i najmanje jedna od MMP proteaze i SP proteaze seče CM1-CM2 supstrat u antitelu kada je antitelo izloženo proteazi.
[0037] U nekim primerima izvođenja, svaka od CM1 sekvence supstrata i CM2 sekvence supstrata CM1-CM2 supstrata nezavisno je polipeptid dug do oko 15 amino-kiselina.
[0038] U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja nije suštinski identična ni sa jednom polipeptidnom sekvencom, npr., ni sa jednom životinjskom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom MMP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja nije suštinski identična ni sa jednom sisarskom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom MMP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja nije suštinski identična ni sa jednom humanom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom MMP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 90% ili više identična bilo kojom polipeptidnom skvencom, npr., bilo kojom životinjskom polipeptidnom sekvencom, koja se prirodno seče istom MMP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 90% ili više identična sa bilo kojom sisarskom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom MMP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM1 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu MMP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 90% ili više identična sa bilo kojom humanom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom MMP proteazom.
[0039] U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja suštinski nije identična ni sa jednom polipeptidnom sekvencom, npr., ni sa jednom životinjskom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom SP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja suštinski nije identična ni sa jednom sisarskom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom SP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja suštinski nije identična ni sa jednom humanom polipeptidnom sekvencom koja se prirodno seče istom SP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja nije više od 90% ili više identična ni sa jednom polipeptidnom skvencom, npr., ni sa jednom životinjskom polipeptidnom sekvencom, koja se prirodno seče istom SP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 90% ili više identična sa bilo kojom sisarskom polipeptidnom sekvencom, koja se prirodno seče istom SP proteazom. U nekim primerima izvođenja, CM2 supstratna sekvenca CM1-CM2 supstrata je supstrat za najmanje jednu SP i sadrži polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 90% ili više identična sa bilo kojom humanom polipeptidnom sekvencom, koja se prirodno seče istom SP proteazom.
[0040] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, kao i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se vezuje za cilj i maskirajuću komponentu (MM) koja smanjuje sposobnost antigenili epitop-vezujućeg domena AB da se veže sa svojim ciljem.
[0041] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO:
1
1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i anti-Jagged antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu anti-Jagged antitela objavljenu u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i antitelo koje ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162 ili SEQ ID NO: 164 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 ili SEQ ID NO: 163.
[0042] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 je uključen u antitelo koje može da se aktivira, koje ima aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561, i 562, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 67.
[0043] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 je uključen u antitelo koje može da se aktivira, koje ima aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561, i 562, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 163.
[0044] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i anti-EGFR antitelo koje sadrži aminokiselinsku sekvencu anti-EGFR antitela objavljenu u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i antitelo koje ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 111 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, ili SEQ ID NO: 110.
[0045] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 je uključen u antitelo koje može da se aktivira koje ima aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, i 560, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 108.
[0046] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 je uključen u antitelo koje može da se aktivira koje ima aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, i 560, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 109.
[0047] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 je uključen u antitelo koje može da se aktivira koje ima aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, i 560, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 110.
[0048] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat je supstrat i za najmanje jednu dodatnu proteazu.
[0049] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna proteaza je različita MMP proteza od MMP proteaze koja seče CM1. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna proteaza je MMP proteaza odabrana iz grupe koja se sastoji od MMP1; MMP2; MMP3; MMP7; MMP8; MMP9; MMP10; MMP11; MMP12; MMP13; MMP14; MMP15; MMP16; MMP17; MMP19; MMP20; MMP23; MMP24; MMP26; i MMP27.
[0050] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna proteaza je SP proteaza različita od SP proteaze koja seče CM2. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna proteaza je SP proteaza odabrana je iz grupe koja se sastoji od uPA; matriptaze; aktiviranog proteina C; katepsina A; katepsina G; himaze; proteaznog koagulacionog faktora kao npr., FVIIa, FIXa, FXa, FXIa, FXIIa; elastaze; granzima B; guanidinobenzoataze; HtrA1; elastaze humanih neutrofila; laktoferina; marapsina; NS3/4A; PACE4; plazmina; PSA; tPA; trombina; triptaze; transmembranske serin proteaze tipa II (TTSP) kao, npr., DESC1, DPP-4, FAP, hepsin, matriptaza-2, TMPRSS2, TMPRSS3, i TMPRSS4.
[0051] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedna dodatna proteaza odabrana je iz grupe koja se sastoji od prikazanih u Tabeli 6.
Tabela 6: Primeri proteaza i/ili enzima
1
[0052] Objava obezbeđuje i antitelo koje uključuje najmanje prvu CM1 i drugu CM2 i konjugovano je sa sredstvom. U nekim primerima izvođenja, prva CM1 i druga CM2 su, svaka, polipeptidi dugi ne više od 15 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje, u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2-AB-sredstvo, sredstvo-AB-CM2-CM1-MM, MM-CM2-CM1-AB-sredstvo, ili sredstvo-AB-CM1-CM2-MM. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje, u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: sredstvo-MM-CM1-CM2-AB, AB-CM2-CM1-MM-sredstvo, sredstvo-MM-CM2-CM1-AB, ili AB-CM1-CM2-MM-sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje, u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: sredstvo-MM-CM1-CM2-AB-sredstvo, sredstvo-AB-CM2-CM1-MM-sredstvo, sredstvo-MM-CM2-CM1-AB-sredstvo, ili sredstvo-AB-CM1-CM2-MM-sredstvo.
[0053] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koje sadrži maskirajuću komponentu (MM), prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i antitelo u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-sredstvo, sredstvo-AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-sredstvo, ili sredstvo-AB-
1
LP2-CM1-CM2-LP1-MM. U nekim primerima izvođenja, svaki od LP1 i LP2 je peptid dug od oko 1 do 20 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična.
[0054] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koje sadrži maskirajuću komponentu (MM), prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i antitelo u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: sredstvo-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-sredstvo, sredstvo-MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB, ili AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-sredstvo. U nekim primerima izvođenja, svaki od LP1 i LP2 je peptid dug od oko 1 do 20 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična.
[0055] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koje sadrži maskirajuću komponentu (MM), prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i antitelo u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: sredstvo-MM1-LP1-CM1-CM2-LP2-AB-sredstvo, sredstvo-AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM-sredstvo, sredstvo-MM1-LP1-CM2-CM1-LP2-AB-sredstvo, ili sredstvo-AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM-sredstvo. U nekim primerima izvođenja, svaki od LP1 i LP2 je peptid dug od oko 1 do 20 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, dva povezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična.
[0056] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između maskirajuće komponente (MM) i CM1. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između MM i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između MM i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između MM i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i AB.
[0057] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje
1
povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP‴) između CM2 i maskirajuće komponente (MM). U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1 i povezujući peptid (LP‴) između
[0058] CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid između AB i CM1 (LP") i povezujući peptid između CM1 i CM2 (LP'). U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2 i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP") između AB i CM1, povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i povezujući peptid (LP‴) između CM2 i MM.
[0059] U nekim primerima izvođenja, LP' je GG. U nekim primerima izvođenja, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
[0060] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 381) and (GGGS)n(SEQ ID NO: 382), pri čemu je n ceo broj koji iznosi najmanje jedan.
[0061] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 383), GGSGG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), i GSSSG (SEQ ID NO: 388).
[0062] U nekim primerima izvođenja, LP1 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSSGGSGGSGGSG (SEQ ID NO: 389), GSSGGSGGSGG (SEQ ID NO: 390), GSSGGSGGSGGS (SEQ ID NO: 391), GSSGGSGGSGGSGGGS (SEQ ID NO: 392), GSSGGSGGSG (SEQ ID NO: 393), ili GSSGGSGGSGS (SEQ ID NO: 394).
[0063] U nekim primerima izvođenja, LP2 sadrži aminokiselinsku sekvencu GSS, GGS, GGGS (SEQ ID NO: 395), GSSGT (SEQ ID NO: 396) ili GSSG (SEQ ID NO: 397).
[0064] U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat je povezan ili na drugi način prikačen za antitelo. Na primer, CM1-CM2 se koristi za povezivanje jednog ili više sredstava sa antitelom ili njegovim antigen-vezujućim fragmentom (AB) koji se vezuje za dati cilj, tako da se CM1-CM2 seče kada se izloži MMP i/ili SP, i sredstvo se oslobađa od AB. Primeri ciljeva uključuju, ali se ne ograničavaju na ciljeve prikazane u Tabeli 1. Primeri AB uključuju, ali se ne ograničavaju na antitela prikazana u Tabeli 2.
1
[0065] U nekim primerima izvođenja, AB ima konstantu disocijacije za vezivanje sa svojim ciljem koja iznosi oko 100 nM ili manje.
[0066] U nekim primerima izvođenja, antitelo uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo ili njegov imunološki aktivan fragment koji se vezuje za cilj je monoklonsko antitelo, domensko antitelo, jedan lanac, Fab fragment, F(ab′)2fragment, scFv, scab, dAb, jednodomensko teškolančano antitelo, ili jednodomensko lakolančano antitelo. U nekim primerima izvođenja, takvo antitelo ili njegov imunološki aktivan fragment koji se vezuje za cilj je mišje, drugog glodara, himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0067] U nekim primerima izvođenja, MM ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja nije viša od konstante disocijacije AB za cilj.
[0068] U nekim primerima izvođenja, MM ne interferira ili kompetira sa AB u vezivanju za cilj u isečenom stanju.
[0069] U nekim primerima izvođenja, MM je polipeptid dug oko 2 do 40 amino-kiselina. Na primer, MM je polipeptid dug do oko 40 amino-kiselina.
[0070] U nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca MM različita je od one bilo kojeg prirodnog vezujućeg partnera AB. U nekim primerima izvođenja, polipeptidna sekvenca MM je ne više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM polipeptidna sekvenca je ne više od 40%, 30%, 25%, 20%, 15%, ili 10% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0071] U nekim primerima izvođenja, sredstvo konjugovano sa AB ili AB antitela koje može da se aktivira je terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antineoplastično sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je toksin ili njegov fragment. Kako se koristi u ovom tekstu, fragment toksina je fragment koji zadržava toksičnu aktivnost. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji uključuje najmanje jednu CM1-CM2 supstratnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji ne može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu, kao što je alkilator DNK ili interkalator DNK, ili drugo sredstvo koje oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin
1
E (monomethyl auristatin MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0072] U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antizapaljensko sredstvo.
[0073] U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira uključuje i detektabilnu komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilna komponenta je dijagnostičko sredstvo.
[0074] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač uključuje sredstvo za dobijanje slike, kontrastno sredstvo, enzim, fluorescentni obeleživač, hromoforu, boju, jedan ili više jona metala, ili obeleživač na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja, sredstvo za dobijanje slike uključuje radioizotop. U nekim primerima izvođenja, radioizotop je indijum ili tehnicijum. U nekim primerima izvođenja, kontrastno sredstvo uključuje jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja, enzim uključuje peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, ili β-galaktozidazu. U nekim primerima izvođenja, fluorescentni obeleživač uključuje žuti fluorescentni protein (yellow fluorescent protein, YFP), plavi fluorescentni protein (cyan fluorescent protein, CFP), zeleni fluorescentni protein (green fluorescent protein, GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (modified red fluorescent protein, mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (red fluorescent protein tdimer2, RFP tdimer2), HCRED, ili derivat europijuma. U nekim primerima izvođenja, luminiscentni obeleživač uključuje N-metilakridinijumski derivat. U nekim primerima izvođenja, obeleživač uključuje Alexa Fluor<®>obeleživač, kao na primer Alex Fluor<®>680 ili Alexa Fluor<®>750. U nekim primerima izvođenja, obeleživač na bazi liganda uključuje biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
[0075] U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili AB antitela koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, AB može da se inženjeriše tako da uključi jednu ili više disulfidnih veza.
[0076] U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili konjugovano antitelo je monospecifično. U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili konjugovano antitelo je multispecifično, označeno u ovom tekstu kao multispecifična antitela i/ili konjugovana multispecifična antitela. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo i/ili konjugovano multispecifično antitelo je
2
bispecifično ili trifunkcionalno. U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili konjugovano antitelo je formulisano kao deo molekula pro-bispecifičnog antitela koje regrutuje T ćelije (pro-Bispecific T Cell Engager, pro-BITE). U nekim primerima izvođenja, antitelo i/ili konjugovano antitelo je formulisano kao deo T ćelije modifikovane prohimernim antigenskim receptorom (pro-Chimeric Antigen Receptor, pro-CAR) ili drugi inženjerisani receptor ili druga imunska efektorska ćelija, kao što je CAR modifikovana NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira formulisano je kao deo T ćelije modifikovane prohimernim antigenskim receptorom (CAR). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira formulisano je kao deo NK ćelije modifikovane prohimernim antigenskim receptorom (CAR).
[0077] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira je monospecifično. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira je multispecifično, označena u ovom tekstu kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi kao "antitelo koje može da se aktivira" i sve njihove gramatičke varijacije, ukoliko nije drugačije navedeno, treba da obuhvate, ali se ne ograničavaju na primere izvođenja u kojima je antitelo koje može da se aktivira multispecifično antitelo koje može da se aktivira, objave. Kako se koristi u ovom tekstu, "konjugovano antitelo koje može da se aktivira" i sve njegove gramatičke varijacije, ukoliko nije drugačije navedeno, treba da obuhvati, bez ograničavanja, primere izvođenja u kojima je konjugovano antitelo koje može da se aktivira konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira, objave. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira je bispecifično ili trifunkcionalno. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira formulisano je kao deo molekula probispecifičnog antitela koje regrutuje T ćelije (pro-BITE). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira formulisano je kao deo T ćelije modifikovane prohimernim antigenskim receptorom (pro-CAR) ili kao deo drugog inženjerisanog receptora.
[0078] U nekim primerima izvođenja, antitela, konjugati antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom tekstu koriste se zajedno sa jednim ili više sredstava ili kombinacijom dodatnih sredstava.
Pogodna dodatna sredstva uključuju trenutne farmaceutske i/ili hirurške terapije za predviđenu primenu, kao što je, na primer, kancer. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju, konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste zajedno sa dodatnim hemioterapijskim ili antineoplastičnim sredstvom.
[0079] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je multispecifično antitelo koje može da se aktivira. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu su multispecifična antitela koja prepoznaju dva ili više različitih antigena ili epitopa i koja uključuju najmanje jednu maskirajuću komponentu (MM) vezanu za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen multispecifičnog antitela tako da kuplovanje MM smanjuje sposobnost antigen- ili epitop-vezujućeg domena da se veže sa svojim ciljem. U nekim primerima izvođenja, MM kuplovana je sa antigen- ili epitop-vezujućim domenom na multispecifičnom antitelu preko CM1-CM2 supstrata koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu MMP proteazu i najmanje jednu SP proteazu. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu stabilna su u cirkulaciji, aktiviraju se na mestima predviđenim za terapiju i/ili dijagnozu, ali ne i u normalnom, tj., zdravom tkivu, i kada se aktiviraju, ispoljavaju vezivanje za svoj cilj koje je bar uporedivo sa vezivanjem odgovarajućeg nemodifikovanog multispecifičnog antitela.
[0080] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragament (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence odabrana između VH CDR1 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO: 398); VH CD2 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); VH CDR3 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400), i kombinacije istog.
[0081] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragament (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence odabrana između VL CDR1 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); VL CDR2 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu AASSLQS (SEQ ID NO: 402); VL CDR3 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403), i kombinacije istog.
[0082] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence odabrana između VH CDR1 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SYAMS (SEQ ID NO: 398); VH CD2 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); VH CDR3 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400), i kombinacije istog.
[0083] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragament (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence odabrana između VL CDR1 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); VL CDR2 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom AASSLQS (SEQ ID NO: 402); i VL CDR3 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%
2
ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403), i kombinacije istog.
[0084] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence, VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR1 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO: 398); VH CD2 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); VH CDR3 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400); VL CDR1 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); VL CDR2 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu AASSLQS (SEQ ID NO: 402); i VL CDR3 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403).
[0085] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, VH CDR3 sekvence, VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR1 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SYAMS (SEQ ID NO: 398); VH CD2 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SIDPEGRQTYYADSVKG (SEQ ID NO: 399); VH CDR3 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom DIGGRSAFDY (SEQ ID NO: 400); VL CDR1 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom RASQSISSY (SEQ ID NO: 401); VL CDR2 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom AASSLQS (SEQ ID NO: 402); i VL CDR3 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom QQTVVAPPL (SEQ ID NO: 403).
[0086] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za receptor za faktor rasta epiderma (epidermal growth factor receptor, EGFR) i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence odabrana između VH CDR1 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu NYGVH (SEQ ID NO: 404); VH CD2 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); VH CDR3 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); i kombinacije istog.
[0087] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za EGFR i koji sadrži kombinaciju VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence odabrana između VL CDR1 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); VL CDR2 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu KYASESIS (SEQ ID NO: 408); i VL CDR3 sekvence koja uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409), i kombinacije istog.
[0088] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje sa EGFR i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, i VH CDR3 sekvence odabrana između VH CDR1 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom NYGVH (SEQ ID NO:
2
404); VH CD2 sekvence koja uključujue sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); VH CDR3 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); i kombinacije istog.
[0089] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje sa EGFR i koji sadrži kombinaciju VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu je najmanje jedna od VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence odabrana između VL CDR1 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); VL CDR2 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom KYASESIS (SEQ ID NO: 408); i VL CDR3 sekvence koja uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409), i kombinacije istog.
[0090] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za EGFR i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, VH CDR3 sekvence, VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR1 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu NYGVH (SEQ ID NO: 404); VH CD2 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); VH CDR3 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); VL CDR1 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); VL CDR2 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu KYASESIS (SEQ ID NO: 408); i VL CDR3 sekvenca uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409).
[0091] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano
2
antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za EGFR i koji sadrži kombinaciju VH CDR1 sekvence, VH CDR2 sekvence, VH CDR3 sekvence, VL CDR1 sekvence, VL CDR2 sekvence, i VL CDR3 sekvence, pri čemu VH CDR1 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom NYGVH (SEQ ID NO: 404); VH CD2 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom VIWSGGNTDYNTPFTS (SEQ ID NO: 405); VH CDR3 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom ALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 406); VL CDR1 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom RASQSIGTNIH (SEQ ID NO: 407); VL CDR2 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom KYASESIS (SEQ ID NO: 408); i VL CDR3 sekvenca uključuje sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 409).
[0092] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i anti-Jagged antitelo koje uključuje aminokiselinsku sekvencu anti-Jagged antitela objavljenu u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje CM1-CM2 supstrat koji sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i antitelo koje ima laki lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162 ili SEQ ID NO: 164 i teški lanac koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 67 ili SEQ ID NO: 163.
[0093] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano
2
antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 67 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561, i 562.
[0094] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, sadrži CM1-CM2 supstrat koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i anti-EGFR antitelo koje uključuje aminokiselinsku sekvencu anti-EGFR antitela objavljenu u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, sadrži CM1-CM2 supstrat koji uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 1-17, 22, 469-471, 483-490, 515-522, 555, i 557, i antitelo koje ima laki lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 111 i teški lanac koji uključuje aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 108, SEQ ID NO: 109, ili SEQ ID NO: 110.
[0095] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca SEQ ID NO: 108 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja se bira iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, i 560.
[0096] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 67 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više
2
identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 422, 424, 426, 428, 430, 432, 434, 436, 439, 477, 479, 507-514, 539-546, 561, i 562.
[0097] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira obezbeđeno u ovom tekstu, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifično antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano multispecifično antitelo koje može da se aktivira objave, uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 108 i aminokiselinsku sekvencu lakog lanca koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom odabranom iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 451, 453, 455, 457, 459, 461, 463, 465, 467, 472, 474, 499-506, 531-538, 559, i 560.
[0098] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje i sredstvo konjugovano sa AB. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antineoplastično sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu, na primer DNK alkilator ili DNK interkalator, ili drugo sredstvo koje oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji uključuje najmanje jednu CM1-CM2 supstratnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0099] U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antizapaljensko sredstvo.
[0100] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje i detektabilnu komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilna komponenta je dijagnostičko
2
sredstvo.
[0101] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač uključuje sredstvo za dobijanje slike, kontrastno sredstvo, enzim, fluorescentni obeleživač, hromoforu, boju, jedan ili više jona metala, ili obeleživač na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja, sredstvo za dobijanje slike uključuje radioizotop. U nekim primerima izvođenja, radioizotop je indijum ili tehnicijum. U nekim primerima izvođenja, kontrastno sredstvo uključuje jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja, enzim uključuje peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, ili βgalaktozidazu. U nekim primerima izvođenja, fluorescentni obeleživač uključuje žuti fluorescentni protein (YFP), plavi fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, ili derivat europijuma. U nekim primerima izvođenja, luminiscentni obeleživač uključuje N- metilakridinijumski derivat. U nekim primerima izvođenja, obeleživač uključuje Alexa Fluor<®>obeleživač, na primer Alex Fluor<®>680 ili Alexa Fluor<®>750. U nekim primerima izvođenja, obeleživač na bazi liganda uključuje biotin, avidin, streptavidin ili jedna ili više haptena.
[0102] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje i signalni peptid. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je konjugovan za antitelo koje može da se aktivira, preko spejsera. U nekim primerima izvođenja, spejser je konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira, u odsustvu signalnog peptida. U nekim primerima izvođenja, spejser je spojen direktno sa MM antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, spejser je spojen direktno sa MM antitela koje može da se aktivira u strukturnom aranžmanu od N-terminusa do C-terminusa spejser-MM-CM1-CM2 supstrat-AB. Primer spejsera spojenog direktno sa N-terminusom MM antitela koje može da se aktivira je aminokiselinska sekvenca odabrana iz grupe koja se sastoji od QGQSGQ (SEQ ID NO: 410), GQSGQ (SEQ ID NO: 416), QSGQ (SEQ ID NO: 417), SGQ (SEQ ID NO: 418), GQ, i Q. U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QGQSGQ (SEQ ID NO: 410). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQSGQ (SEQ ID NO: 416). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu QSGQ (SEQ ID NO: 417). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu SGQ (SEQ ID NO: 418). U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu GQ. U nekim primerima izvođenja, spejser uključuje najmanje aminokiselinsku sekvencu Q.
[0103] U nekim primerima izvođenja, AB antitela koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, AB može da se inženjeriše tako da sadrži jednu ili više disulfidnih veza.
[0104] U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira duži je poluživota odgovarajućeg antitela; npr., pK vrednost antitela koje može da se aktivira duža je od one odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira slično je poluživotu odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 15 dana, kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 12 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 11 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 10 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 9 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 8 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 7 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 6 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 5 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 4 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 3 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 2 dana kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 24 sata kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 20 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 18 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 16 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 14 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 12 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 10 sati kada se primeni u organizmu.
1
U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 8 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 6 sati kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 4 sata kada se primeni u organizmu. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 3 sata kada se primeni u organizmu.
[0105] Objava obezbeđuje i kompozicije i postupke koji uključuju antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje antitelo ili fragment antitela (AB) koji se specifično vezuje za dati cilj, gde je AB kuplovano sa maskirajućom komponentom (MM) koja smanjuje sposobnost AB da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje još i CM1-CM2 supstrat koji je supstrat za najmanje jednu MMP i najmanje jednu SP. Kompozicije i postupci obezbeđeni u ovom tekstu omogućavaju prikačinjanje jednog ili više sredstava za jednu ili više cisteinskih rezidua u AB, bez kompromitovanja aktivnosti (npr., maskirajuće, aktivirajuće ili vezujuće aktivnosti) antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, kompozicije i postupci obezbeđeni u ovom tekstu omogućavaju prikačinjanje jednog ili više sredstava za jednu ili više cisteinskih rezidua u AB, bez smanjivanja ili na drugi način ometanja jedne ili više disulfidnih veza unutar MM. Kompozicije i postupci obezbeđeni u ovom tekstu proizvode antitelo koje može da se aktivira koje je konjugovano sa jednim ili više sredstava, npr., sa bilo kojim od različitih terapijskih, dijagnostičkih i/ili profilaktičkih sredstava, na primer, u nekim primerima izvođenja, bez bilo kojeg sredstva(-ava) konjugovanog za MM antitela koje može da se aktivira. Kompozicije i postupci obezbeđeni u ovom tekstu proizvode konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima MM zadržava sposobnost da efektno i efikasno maskira AB antitela koje može da se aktivira, u neisečenom stanju. Kompozicije i postupci obezbeđeni u ovom tekstu proizvode konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je antitelo koje može da se aktivira još uvek aktivno, tj., isečeno, u prisustvu MMP koja može da iseče CM1-CM2 supstrat.
[0106] Antitela koja mogu da se aktiviraju imaju najmanje jednu tačku konjugacije sa sredstvom, ali u postupcima i kompozicijama obezbeđenim u ovom tekstu za konjugaciju sa sredstvom na raspolaganju je manje od svih mogućih tačaka konjugacije. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije su atomi sumpora uključeni u međulančane sulfidne veze, ali ne i atomi sumpora uključeni u međulančane disulfidne veze. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više tačaka konjugacije
2
su atomi sumpora cisteina ili drugih aminokiselinskih rezidua koje sadrže atom sumpora. Takve rezidue mogu se sresti prirodno u strukturi antitela ili mogu biti inkorporisane u antitelo usmerenom mutagenezom, hemijskom konverzijom, ili pogrešnom inkorporacijom neprirodnih amino-kiselina.
[0107] Obezbeđeni su i postupci pripremanja konjugata antitela koje može da se aktivira koje ima jednu ili više međulančanih disulfidnih veza u AB i jednu ili više međulančanih disulfidnih veza u MM, i obezbeđen je lek reaktivan sa slobodnim tiolima. Postupci uopšteno uključuju delimično redukovanje međulančane disulfidne veze u antitelu koje može da se aktivira sa redukujućim sredstvom, kao, na primer, TCEP; i konjugovanje leka reaktivnog sa slobodnim tiolima sa delimično redukovanim antitelom koje može da se aktivira. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz delimična redukcija označava situacije u kojima antitelo koje može da se aktivira kontaktira sa redukujućim sredstvom i dolazi do redukovanja manje nego svih disulfidnih veza, npr., redukuje se manje od svih mogućih mesta konjugacije. U nekim primerima izvođenja, redukuje se manje od 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% ili manje od 5% svih mogućih mesta konjugacije.
[0108] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak redukovanja i konjugovanja sredstva, npr., leka, za antitelo koje može da se aktivira, koji rezultuje selektivnošću u smeštanju sredstva. Postupak uopšteno uključuje delimično redukovanje antitela koje može da se aktivira redukujućim sredstvom tako da nije redukovano svako mesto konjugacije u maskirajućoj komponenti ili drugom ne-AB delu antitela koje može da se aktivira, i konjugovanje sredstva za međulančane tiole u AB. Mesto(-a) konjugacije bira se tako da se omogući željeno postavljanje sredstva da bi se omogućilo odigravanje konjugacije na željenom mestu. Redukujuće sredstvo je, na primer, TCEP. Uslovi redukcione reakcije kao, na primer, odnos redukujućeg sredstva prema antitelu koje može da se aktivira, dužina inkubacije, temperatura tokom inkubacije, pH redukujućeg reakcionog rastvora, itd., određuju se identifikovanjem uslova koji proizvode konjugovano antitelo koje može da se aktivira u kojem MM zadržava sposobnost da efektno i efikasno maskira AB antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju. Odnos redukujućeg sredstva prema antitelu koje može da se aktivira variraće u zavisnosti od antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukujućeg sredstva prema antitelu koje može da se aktivira biće u opsegu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od od oko 2.5:1 do 1:1.
[0109] U nekim primerima izvođenja, obezbeđen je postupak redukovanja međulančanih disulfidnih veza u AB antitela koje može da se aktivira i konjugovanja sredstva, npr., tiolsadržavajućeg sredstva kao što je lek, za rezultujuće međulančane tiole za selektivno lociranje sredstva(-ava) na AB. Postupak uopšteno uključuje delimično redukovanje AB redukujućim sredstvom da se formiraju najmanje dva međulančana tiola, bez formiranja svih mogućih međulančanih tiola u antitelu koje može da se aktivira; i konjugovanje sredstva sa međulančanim tiolima delimično redukovanog antitela. Na primer, AB antitela koje može da se aktivira delimično se redukuje za oko 1 sat na oko 37°C pri željenom odnosu redukujuće sredstvo:antitelo koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, odnos redukujućeg sredstva prema antitelu koje može da se aktivira biće u rasponu od oko 20:1 do 1:1, od oko 10:1 do 1:1, od oko 9:1 do 1:1, od oko 8:1 do 1:1, od oko 7:1 do 1:1, od oko 6:1 do 1:1, od oko 5:1 do 1:1, od oko 4:1 do 1:1, od oko 3:1 do 1:1, od oko 2:1 do 1:1, od oko 20:1 do 1:1.5, od oko 10:1 do 1:1.5, od oko 9:1 do 1:1.5, od oko 8:1 do 1:1.5, od oko 7:1 do 1:1.5, od oko 6:1 do 1:1.5, od oko 5:1 do 1:1.5, od oko 4:1 do 1:1.5, od oko 3:1 do 1:1.5, od oko 2:1 do 1:1.5, od oko 1.5:1 do 1:1.5, ili od oko 1:1 do 1:1.5. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 5:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 5:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 4:1 do 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 4:1 do 1.5:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 8:1 do oko 1:1. U nekim primerima izvođenja, odnos je u rasponu od oko 2.5:1 do 1:1.
[0110] Tiol-sadržavajuće sredstvo može biti, na primer, cistein ili N-acetil cistein. Redukujuće sredstvo može biti, na primer, TCEP. U nekim primerima izvođenja, redukovano antitelo koje može da se aktivira može se prečistiti pre konjugacije korišćenjem na primer, hromatografije na koloni, dijalize, ili dijafiltracije. U nekim primerima izvođenja, redukovano antitelo nije prečišćeno posle parcijalne redukcije i pre konjugacije.
[0111] Objava obezbeđuje i parcijalno redukovana antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je najmanje jedna međulančana disulfidna veza u antitelu koje može da se aktivira bila
4
redukovana redukujućim sredstvom, bez narušavanja bilo kojih međulančanih disulfidnih veza u antitelu koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, maskirajuću komponentu (MM) koja inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju za cilj, i CM1-CM2 supstrat kuplovan sa AB, pri čemu je CM1-CM2 supstrat polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu MMP i jednu SP. U nekim primerima izvođenja, MM je kuplovana za AB preko CM1-CM2 supstrata. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više međulančanih disulfidnih veza antitela koje može da se aktivira nije narušena redukujućim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više međulančanih disulfidnih veza MM unutar antitela koje može da se aktivira nije narušena redukujućim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM. U nekim primerima izvođenja, redukujuće sredstvo je TCEP.
[0112] Objava obezbeđuje i parcijalno redukovana antitela koja mogu da se aktiviraju, uključujući ali ne ograničavajući se na multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju objave, u kojima je najmanje jedna međulančana disulfidna veza u antitelu koje može da se aktivira bila redukovana redukujućim sredstvom, bez narušavanja ili na drugi način kompromitovanja aktivnosti i/ili efikasnosti antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, maskirajuću komponentu (MM) koja inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju za cilj, i CM1-CM2 supstrat kuplovan sa AB, a CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu. Aktivnost i/ili efikasnost antitela koje može da se aktivira je, kao neograničavajući primer, maskirajuća aktivnost, aktivacija antitela koje može da se aktivira, i/ili vezujuća aktivnost aktiviranog antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više međulančanih disulfidnih veza antitela koje može da se aktivira nije narušeno redukujućim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, jedna ili više međulančanih disulfidnih veza MM unutar antitela koje može da se aktivira nije narušeno redukujućim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM. U nekim primerima izvođenja, redukujuće sredstvo je TCEP.
[0113] Objava obezbeđuje i konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju antitelo koje može da se aktivira opterećeno monometil auristatinom D (MMAD), pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, maskirajuću komponentu (MM) koja inhibira vezivanje AB antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju za cilj, i CM1-CM2 supstrat kuplovan sa AB, a CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu MMP proteazu i najmanje jednu SP proteazu.
[0114] U nekim primerima izvođenja, MMAD-konjugovano antitelo koje može da se aktivira može biti konjugovano korišćenjem bilo kojeg od nekoliko postupaka prikačinjanja sredstava za AB: (a) prikačinjanje za ugljenohidratne komponente AB, ili (b) prikačinjanje za sulfhidrilne grupe AB, ili (c) prikačinjanje za amino grupe AB, ili (d) prikačinjanje za karboksilatne grupe AB.
[0115] U nekim primerima izvođenja, MMAD teret konjugovan je sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, MMAD teret konjugovan je sa cisteinom u AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, MMAD teret konjugovan je sa lizinom u AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, MMAD teret konjugovan je sa drugom reziduom AB preko linkera, kao što su rezidue objavljene u ovom tekstu. U nekim primerima izvođenja, linker je tiol-sadržavajući linker. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji ne može da se seče. U nekim primerima izvođenja, linker je odabran iz grupe koja se sastoji od linkera prikazanih u Tabelama 5 i 6. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i MMAD teret povezani su preko linkera maleimid kaproil-valin-citrulin. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i MMAD teret povezani su preko linkera maleimid PEG-valin-citrulin. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i MMAD teret povezani su preko linkera maleimid kaproil-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i MMAD teret povezani su preko linkera maleimid PEG-valincitrulin-para-aminobenziloksikarbonil. U nekim primerima izvođenja, MMAD teret je konjugovan sa AB korišćenjem tehnologije delimične redukcije i konjugacije, objavljene u ovom tekstu.
[0116] Objava obezbeđuje i polipeptide i druge veće molekule koji sadžr jednu ili više CM1-CM2 supstratnih sekvenci prikazanih u ovom tekstu. Kao neograničavajući primer, CM1-CM2 supstratne sekvence prikazane u ovom tekstu korisne su u kompozicijama proleka i postupcima njihove primene. Ove CM1-CM2 supstratne sekvence prikazane u ovom tekstu korisne su i u probama i drugim detekcionim sredstvima i postupcima njihove upotrebe. Na primer, CM1-CM2 supstratne sekvence prikazane u ovom tekstu mogu da se upotrebe zajedno sa fluoro i drugim gasiocima da bi se proizvela detekciona sredstva, kao što su sredstva za dobijanje slike i/ili druga dijagnostička sredstva. Prosečno obučen stručnjak u oblasti razumeće da su CM1CM2 supstratne sekvence prikazane u ovom tekstu korisne u bilo kojoj kompoziciji i/ili postupku u struci u kojima se koristi supstrat koji može da se seče najmanje jednom MMP i najmanje jednom SP.
[0117] Objava obezbeđuje i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira antitelo i/ili antitelo koje može da se aktivira opisano u ovom tekstu, kao i vektore koji uključuju ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Objava obezbeđuje postupke proizvodnje antitela i/ili antitela koje može da se aktivira, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela i/ili antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takav vektor.
[0118] Objava obezbeđuje postupak izrade konjugovanog antitela objave, koje se vezuje sa datim ciljem (a) kultivisanjem ćelije koja uključuje konstrukt nukleinske kiseline, koji kodira antitelo pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela, (i) pri čemu antitelo uključuje CM1-CM2 supstrat, i (ii) pri čemu je CM1-CM2 polipeptidni supstrat koji funkcioniše kao supstrat za matriksnu metaloproteazu i serin proteazu; (b) oporavljanjem antitela; i (c) konjugovanjem oporavljenog antitela sa jednim ili više dodatnih sredstava.
[0119] Objava obezbeđuje i postupak izrade antitela koja mogu da se aktiviraju objave, koja se vezuju u aktiviranom stanju za dati cilj (a) kultivisanjem ćelije koja uključuje konstrukt nukleinske kiseline, koji kodira antitelo koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat, i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, (i) pri čemu je CM1-CM2 polipeptidni supstrat koji funkcioniše kao supstrat za MMP i SP; i (ii) pri čemu je CM1-CM2 supstrat pozicioniran u antitelu koje može da se aktivira tako da, u neisečenom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; i (b) oporavljanjem antitela koje može da se aktivira.
[0120] Objava obezbeđuje i postupak izrade konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju objave, koja se vezuju u aktiviranom stanju za dati cilj (a) kultivisanjem ćelije koja uključuje konstrukt nukleinske kiseline, koji kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat, i antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, (i) pri čemu je CM1-CM2 polipeptidni supstrat koji funkcioniše kao supstrat za MMP i SP; i (ii) pri čemu je CM1-CM2 supstrat pozicioniran u antitelu koje može da se aktivira tako da, u neisečenom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; (b) oporavljanjem antitela koje može da se aktivira; i (c) konjugovanjem oporavljenog antitela sa jednim ili više dodatnih sredstava.
[0121] Objava obezbeđuje postupke prevencije, odlaganja progresije, lečenja, ublažavanja simptoma, ili na drugi način poboljšanja oboljenja povezanog sa ciljem, kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira opisanog u ovom tekstu, kod subjekta kojem je to potrebno.
[0122] Objava obezbeđuje postupke prevencije, odlaganja progresije, lečenja, ublažavanja simptoma, ili na drugi način poboljšanja zapaljenja i/ili zapaljenskog poremećaja kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira opisanog u ovom tekstu, kod subjekta kojem je to potrebno. Objava takođe obezbeđuje postupke prevencije, odlaganja progresije, lečenja, ublažavanja simptoma, ili na drugi način poboljšanja kancera kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira opisanog u ovom tekstu, kod subjekta kojem je to potrebno. Objava takođe obezbeđuje postupke prevencije, odlaganja progresije, lečenja, ublažavanja simptoma, ili na drugi način poboljšanja autoimunskog oboljenja kod subjekta, primenom terapijski efikasne količine konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira opisanog u ovom tekstu, kod subjekta kojem je to potrebno.
[0123] Konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira upotrebljeno u bilo kojem od primera izvođenja ovih postupaka i upotreba može se primeniti na bilo kojem stadijumu bolesti. Na primer, takvo konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira može se primeniti kod pacijenta koji pati od kancera bilo kojeg stadijuma, od ranog do metastatskog. Izrazi subjekt i pacijent koriste se naizmenično u ovom tekstu.
[0124] U nekim primerima izvođenja, subjekt je sisar, na primer čovek, nehumani primat, životinja za društvo (npr., mačka, pas, konj), životinja sa farme, radna životinja, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekt je glodar. U nekim primerima izvođenja, subjekt je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekt je životinja za društvo. U nekim primerima izvođenja, subjekt je životinja o kojoj se stara veterinar.
[0125] Konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i njihove terapijske formulacije primenjuju se kod pacijenta koji je oboleo ili je podložan bolesti ili poremećaju udruženom sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja. Subjekt koji je oboleo ili je podložan oboljenju ili poremećaju udruženom sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja identifikuje se korišćenjem nekog od različitih postupaka poznatih u struci. Na primer, subjekti koji su oboleli od kancera ili drugog neoplastičnog stanja identifikuje se korišćenjem nekog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što su fizički pregled i analiza krvi, urina i/ili stolice, za evaluaciju zdravstvenog stanja. Na primer, subjekti koji su oboleli od zapaljenja i/ili zapaljenskog poremećaja identifikuju se korišćenjem nekog od različitih kliničkih i/ili laboratorijskih testova kao što su fizički pregled i analiza telesnih tečnosti npr., krvi, urina i/ili stolice za evaluaciju zdravstvenog stanja.
[0126] Primena konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod pacijenta obolelog od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja smatra se uspešnom ako se postigne neki od različitih laboratorijskih ili kliničkih ciljeva. Na primer, primena konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod pacijenta obolelog od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja smatra se uspešnom ako se jedan ili više simptoma udruženih sa oboljenjem ili poremećajem ublaži, redukuje, inhibira ili ne progredira u dalje, tj., gore, stanje. Primena konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod pacijenta obolelog od bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja smatra se uspešnom ako bolest ili poremećaj uđe u remisiju ili ne progredira u dalje, tj., gore, stanje.
[0127] U nekim primerima izvođenja, antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom tekstu koriste se zajedno sa jednim ili više dodatnih sredstava. Pogodna dodatna sredstva uključuju trenutne farmaceutske i/ili hirurške terapije za predviđenu primenu, kao što je, na primer, kancer. Na primer, antitela, konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste zajedno sa dodatnim hemioterapijskim ili antineoplastičnim sredstvom.
[0128] U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo(-a) je hemioterapijsko sredstvo, na primer hemioterapijsko sredstvo odabrano iz grupe koja se sastoji od docetaksela, paklitaksela, abraksana (tj., albumin-konjugovanog paklitaksela), doksorubicina, oksaliplatina, karboplatina, cisplatina, irinotekana, i gemcitabina.
[0129] U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo(-a) je inhibitor kontrolne tačke, inhibitor kinaze, sredstvo koje cilja inhibitore u tumorskom mikrookruženju, i/ili T ćelijski ili NK agonist. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo(-a) je radijaciona terapija, sama ili u kombinaciji sa drugim dodatnim sredstvom(-ima) na primer hemioterapijskim ili antineoplastičnim sredstvom. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo(-a) je vakcina, onkovirus, i/ili DC-aktivirajuće sredstvo kao što je, kao neograničavajući primer, agonist tolllike receptora (toll-like receptor, TLR) i/ili α-CD40. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo(-a) je tumor-ciljajuće antitelo dizajnirano da ubije tumor putem ADCC ili putem direktne konjugacije sa toksinom (npr., konjugat antitela i leka, antibody drug conjugate, ADC).
[0130] U nekim primerima izvođenja, inhibitor kontrolne tačke je inhibitor cilja odabranog iz grupe koja se sastoji od CTLA-4, LAG-3, PD-1, PD-1, TIGIT, TIM-3, B7H4, BTLA, i Vista. U nekim primerima izvođenja, inhibitor kinaze je odabran iz grupe koja se sastoji od B-RAFi, MEKi, i Btk inhibitora, kao što je ibrutinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor kinaze je krizotinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor tumorskog mikrookruženja je odabran iz grupe koja se sastoji od IDO inhibitora, α-CSF1R inhibitora, α-CCR4 inhibitora, TGF-beta, supresorske ćelije mijeloidnog porekla, ili T-regulatorne ćelije. U nekim primerima izvođenja, agonist je odabran iz grupe koja se sastoji od Ox40, GITR, CD137, ICOS, CD27, i HVEM.
[0131] U nekim primerima izvođenja, inhibitor je CTLA-4 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je LAG-3 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je PD-1 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je PD-1 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je TIGIT inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je TIM-3 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je B7H4 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je Vista inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je B-RAFi inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je MEKi inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je Btk inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je ibrutinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je krizotinib. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je IDO inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je α-CSF1R inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je α-CCR4 inhibitor. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je TGF-beta. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je supresorska ćelija mijeloidnog porekla. U nekim primerima izvođenja, inhibitor je T-regulatorna ćelija.
[0132] U nekim primerima izvođenja, agonist je Ox40. U nekim primerima izvođenja, agonist je GITR. U nekim primerima izvođenja, agonist je CD137. U nekim primerima izvođenja, agonist je ICOS. U nekim primerima izvođenja, agonist je CD27. U nekim primerima izvođenja, agonist je HVEM.
[0133] U nekim primerima izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se tokom i/ili posle tretmana u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih sredstava kao što su, na primer, hemioterapijsko sredstvo, antizapaljensko sredstvo, i/ili imunosupresivno sredstvo. U nekim
4
primerima izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo formulisani su kao jedna terapijska kompozicija. i antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo primenjuju se istovremeno. Alternativno, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo razdvojeni su jedno od drugoga, npr., svako je formulisano u zasebnoj terapijskoj kompoziciji, i antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo primenjuju se istovremeno, ili antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo primenjuju se u različito vreme tokom režima lečenja. Na primer, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se pre primene dodatnog sredstva, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se posle primene dodatnog sredstva, ili antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo primenjuju se naizmenično. Kako je opisano u ovom tekstu, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo primenjuju se u pojedinačnim dozama ili u višestrukim dozama.
[0134] U nekim primerima izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) primenjuju se istovremeno. Na primer, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) mogu se formulisati u jednoj kompoziciji ili primeniti u vidu dve ili više zasebnih kompozicija. U nekim primerima izvođenja, antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) primenjuju se jedno za drugim, ili se antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) primenjuju u različito vreme tokom režima lečenja.
[0135] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira, i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se tokom i/ili posle tretmana u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih sredstava kao što su, na primer bez ograničavanja, antizapaljensko sredstvo, imunosupresorsko sredstvo, hemioterapijsko sredstvo, na primer alkilirajuće sredstvo, antimetabolit, antimikrotubularno sredstvo, inhibitor topoizomeraze, citotoksični antibiotik, i/ili neko drugo sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je taksan, kao što je paklitaksel (npr., Abraxane<®>). U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je antimetabolit, kao što je gemcitabin. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je alkilirajuće sredstvo, kao što je hemioterapija na bazi platine, na primer karboplatin ili cisplatin. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je ciljajuće sredstvo, kao što je inhibitor kinaze, npr., sorafenib ili erlotinib. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je ciljajuće sredstvo, kao što je drugo antitelo, npr., monoklonsko antitelo (npr., bevacizumab), bispecifično antitelo, ili multispecifično antitelo. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je inhibitor proteazoma, kao što je bortezomib ili karfilzomib. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je imunomodulišuće sredstvo, kao što je lenalidomid ili IL-2. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je radijacija. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je sredstvo koje stručnjak u oblasti smatra standardnom negom. U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je hemioterapijsko sredstvo dobro poznato stručnjacima u oblasti.
[0136] U nekim primerima izvođenja, dodatno sredstvo je antitelo, drugo konjugovano antitelo, drugo antitelo koje može da se aktivira i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja dodatno sredstvo je antitelo, drugo konjugovano antitelo, drugo antitelo koje može da se aktivira i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira protiv istog cilja kao prvo konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja dodatno sredstvo je antitelo, drugo konjugovano antitelo, drugo antitelo koje može da se aktivira i/ili drugo konjugovano antitelo koje može da se aktivira protiv cilja različitog od cilja prvog konjugovanog antitela, antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira.
[0137] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) primenjuju se istovremeno. Na primer, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) mogu da se formulišu u jednoj kompoziciji ili primene u vidu dve ili više zasebnih kompozicija. U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i dodatno sredstvo(-a) primenjuju se jedno za drugim, ili antitelo i/ili konjugovana antitela i dodatno sredstvo primenjuju se u različito vreme tokom režima lečenja. Na primer, antitelo i/ili konjugovana antitela primenjuju se pre primene dodatnog sredstva, antitelo i/ili konjugovana antitela primenjuju se posle primene dodatnog sredstva ili antitelo i/ili konjugovana antitela i dodatno sredstvo primenjuju se naizmenično. Kako je opisano u ovom tekstu, antitelo i/ili konjugovana antitela i dodatno sredstvo su u pojedinačnim dozama ili u višestrukim dozama.
[0138] Objava takođe obezbeđuje postupke i kitove za upotrebu konjugovanih antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju, u različitim dijagnostičkim i/ili profilaktičkim indikacijama.
[0139] Farmaceutske kompozicije u skladu sa objavom mogu uključiti antitelo, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira, objave i nosač. Ove farmaceutske kompozicije mogu biti uključene u kitove, kao što su, na primer, dijagnostički kitovi.
Kratak opis crteža
[0140] Slike 1A i 1B predstavljaju niz grafikona koji prikazuju rezultate ELISA testova vezivanja humanog Jagged 1, koji demonstriraju vezivanje anti-Jagged antitela i maskiranih i aktiviranih antitela koja mogu da se aktiviraju. I (A) 2001 i (B) 1001/LP'/0001 supstratsadržavajuća antitela koja mogu da se aktiviraju bila su aktivirana putem uPA (serin proteaza), MMP14 (MMP), i uPA u kombianciji sa MMP14. Aktivirana antitela koja mogu da se aktiviraju pokazala su vezivanje ekvivalentno anti-Jagged antitelu.
[0141] Slika 2 predstavlja grafikon koji prikazuje koncentracije u serumu humanog IgG za anti-Jagged antitelo i 1001/LP'/0001 i 2001 antitela koja mogu da se aktiviraju posle jedne intravenske doze od 5 mg/kg. Anti-Jagged antitelo se brzo uklanja zbog ciljem posredovanog klirensa. Nasuprot tome, anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju ostaju maskirana u cirkulaciji.
[0142] Slika 3 predstavlja grafikon koji prikazuje zapreminu HCC1806 tumora (srednja vrednost za grupu ± SEM, n=8) u zavisnosti od veremena posle inicijalne doze. Grupe su bile dozirane na dan 1 i dan 8 studije. Grupe dozirane anti-Jagged-SPDB-DM4 antitelom i anti-Jagged 2001 antitelom koje može da se aktivira-SPDB-DM4 su obe pokazale regresiju tumora dok izotip-SPDB-DM4 grupa nije pokazala inhibiciju rasta tumora.
[0143] Slika 4 predstavlja grafikon koji prikazuje procenat inicijalne telesne težine (srednja vrednost za grupu n=8) u zavisnosti od vremena posle inicijalne doze. Grupe su bile dozirane na dan 1 i dan 8 studije. Životinje u anti-Jagged-SPDB-DM4 ADC-tretiranoj grupi pokazale su značajan gubitak telesne težine, dok životinje tretirane sa PBS, izotip-SPDB-DM4 ADC, i anti-Jagged 2001 antitelom koje može da se aktivira-SPDB-DM4 nisu pokazale značajan gubitak telesne težine.
[0144] Slika 5 predstavlja grafikon koji prikazuje in vivo aktivaciju EGFR antitela koja mogu
4
da se aktiviraju, merenu u plazmi 8 dana posle doziranja sa 12.5 mg/kg takvih EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju u miševima koji nose ksenograft H292 tumora.
[0145] Slika 6 predstavlja grafikon koji prikazuje in vivo efikasnost EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju u miševima koji nose ksenograft H292 tumora.
[0146] Slika 7 predstavlja grafikon koji prikazuje in situ evaluaciju aktivacije EGFR antitela koje može da se aktivira u mikrookruženju ksenografta H292 tumora.
[0147] Slike 8A, 8B, 8C, 8D, 8E, 8F predstavljaju niz grafikona koji prikazuju zapreminu tumora ksenografta H292 tumora u nu/nu miševima, u različitim vremenskim tačkama posle primene kontrolnog intravenskog imunoglobulina (IVIG, Slika 8A), anti-EGFR antitela cetuksimaba (Slika 8B), anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-EGFR 2001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 449 (Slika 8C); anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-EGFR 2003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 472 (Slika 8D); ili anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-EGFR 2005 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 474 (Slika 8E). Za podatke prikazane na Slikama 8C i 8D, u svakoj grupi izgubljena je po jedna životinja zbog gubitka telesne težine. Slika 8F predstavlja grafikon u kojem se na jednom grafikonu upoređuju podaci prikazani na Slikama 8A-8E.
[0148] Slika 9 predstavlja grafikon koji prikazuje toksičnost merenu gubitkom telesne težine (body weight, BW) posle primene izotipskog kontrolnog intravenskog imunoglobulina (IVIG), doze od 20 mg/kg anti-Jagged antitela označenog ovde kao 4D11, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67 i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 162, doze od 10 mg/kg 4D11 antitela, doze od 5 mg/kg 4D11 antitela, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 2001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 420, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 1004/LP'/0001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 432, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 2003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 477, i anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 2005 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 479. Rezultati su prikazani kao procenat (%)promene relativne telesne težine (BW) u različitim vremenskim tačkama tokom studije.
[0149] Slika 10 predstavlja grafikon koji prikazuje toksičnost merenu gubitkom telesne težine posle primene izotipskog kontrolnog intravenskog imunoglobulina (IVIG), doze od 20 mg/kg anti-Jagged antitela označenog ovde kao 4D11, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67 i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 162, doze od 10 mg/kg 4D11 antitela, doze od 5 mg/kg 4D11 antitela, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 2001 antitelo koje može da se aktivira ("2001"), koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 420, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 1004/LP'/0001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 432, i anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog ovde kao anti-Jagged 1004/LP'/0003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 424. Rezultati su prikazani kao procenat (%)promene relativne telesne težine (BW) u različitim vremenskim tačkama tokom studije.
[0150] Slike 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F, 11G, i 11H i Slika 12 predstavljaju niz grafikona koji prikazuju efikasnost različitih supstrata objave kada se inkorporišu u anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju, objave. Efikasnost supstrata evaluira se merenjem zapremine tumora (tumor volume, TV mm<3>) u različitim vremenskim tačkama posle primene.
[0151] Slika 13 predstavlja grafikon koji prikazuje toksičnost merenu u funkciji gubitka telesne težine (BW) u DBA/1 miševima posle primene kontrolnog intravenskog imunoglobulina (IVIG), anti-Jagged antitela objave, i anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju objave koja sadrže različite supstrate objave.
[0152] Slika 14 predstavlja grafikon koji prikazuje 3D rekonstrukciju FLIT-µCT slikanih podataka za cetuksimab i dva EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju, koja sadrže tandem supstrate u H292 (otvorene strelice) i FaDu (popunjene strelice) u tumorskom modelu koimplantiranog ksenografta.
Detaljan opis pronalaska
[0153] Objava obezbeđuje aminokiselinske sekvence koje uključuju najmanje prvu komponentu koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje drugu komponentu koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP). Ovi CM1-CM2 supstrati korisni su u različitim terapijskim, dijagnostičkim i profilaktičkim indikacijama. Na primer, ovi CM1-CM2 supstrati
4
korisni su u antitelima koja mogu da se aktiviraju, koja uključuju antitela ili njihove antigenvezujuće fragmente (AB) koji sadrže najmanje jednu maskirajuću komponentu (MM) vezanu za najmanje jedan antigen- ili epitop-vezujući domen AB tako da kuplovanje MM smanjuje sposobnost AB da se veže sa svojim ciljem.
[0154] Radni primeri obezbeđeni u ovom tekstu demonstriraju da ovi CM1-CM2 supstrati ispoljavaju veliki broj željenih karakteristika sečenja kada se izlože najmanje jednoj MMP proteazi i/ili najmanje jednoj SP proteazi pod specifikovanim uslovima.
[0155] Objava obezbeđuje i antitela koja sadrže jedan ili više ovih CM1-CM2 supstrata. Na primer, ovi CM1-CM2 supstrati su korisni kada se antitela konjuguju sa jednim ili više dodatnih sredstava da bi se proizvela konjugovana antitela. Ovi CM1-CM2 supstrati su takođe korisni u antitelima koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugatima antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0156] Konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju, i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj. Primeri klasa ciljeva AB uključuju, ali se ne ograničavaju obavezno na ćelijske površinske receptore i sekretovane vezujuće proteine (npr., faktore rasta), solubilne enzime, strukturne proteine (npr. kolagen, fibronektin) i slično. U nekim primerima izvođenja, konjugovana antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju imaju AB koji se vezuje za vanćelijski cilj, obično vanćelijski ciljni protein. U nekim primerima izvođenja, konjugovana antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju dizajnirana su za ćelijsko preuzimanje i aktiviraju se unutar ćelije.
[0157] Kao neograničavajući primer, AB je vezujući partner za bilo koji od ciljeva navedenih u Tabeli 1.
Tabela 1: Primeri ciljeva
4
4
[0158] Kao neograničavajući primer, AB je ili je izvedeno iz antitela navedenih u Tabeli 2.
Tabela 2: Primeri izvora Ab
4
4
[0159] Primeri konjugovanih antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju, na primer, antitela koja se vezuju za receptor za interleukin 6 (IL-6R) i koja uključuju teški lanac i laki lanac koja su, ili su izvedeni iz, antitela označenog ovde kao "Av1" antitelo, koje se vezuje za interleukin-6 receptor (IL-6R). Aminokiselinske sekvence za Av1 teški lanac i Av1 laki lanac prikazane su u nastavku u SEQ ID NO: 100, odnosno SEQ ID NO: 101.
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca Av1 antitela:
Aminokiselinska sekvenca lakog lanca Av1 antitela:
[0160] Primeri antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju, na primer, antitela koja se vezuju za receptor za interleukin 6 (IL-6R) i koja uključuju teški lanac i laki lanac koji su, ili su izvedeni iz Av1 antitela i maskirajuće komponente. Primeri antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju aminokiselinsku sekvencu prikačenu za N-terminus lakog
1
lanca AV1. Ove N-terminalne aminokiselinske sekvence uključuju, na primer, YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 102); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 103); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 104); QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 105); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 106); ili QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 107). Treba takođe razumeti da takve aminokiselinske sekvence mogu biti prikačene za N-terminus teškog lanca AV1 ili za C-terminus teškog ili lakog lanca AV1.
[0161] Primeri antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju, na primer, antitela koja se vezuju za receptor faktora rasta epiderma (EGFR) i koja uključuju teški lanac i laki lanac koji su, ili su izvedeni iz antitela odabranih iz grupe koja se sastoji od antitela označenog ovde kao "c225v5" antitelo (označeno u ovom tekstu i kao C225v5 antitelo), antitela označenog ovde kao "c225v4" antitelo (označeno u ovom tekstu i kao C225v4 antitelo), i antitela označenog ovde kao "c225v6" antitelo (označeno u ovom tekstu i kao C225v6 antitelo), od kojih se svako vezuje za EGFR. c225v5 antitelo, c225v4 antitelo, i c225v6 antitelo imaju istu sekvencu lakog lanca, ovde označenu kao "c225 laki lanac". Aminokiselinske sekvence za teški lanac c225v5, c225v4 antitela, c225v6 antitela, i c225 laki lanac prikazane su u nastavku.
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca C225v5 antitela:
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca C225v4 antitela:
Aminokiselinska sekvenca teškog lanca C225v6 antitela:
2
Aminokiselinska sekvenca lakog lanca C225 antitela:
[0162] Primeri konjugovanih antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju, na primer, antitela koja se vezuju za Jagged cilj, npr., Jagged-1, Jagged-2 i/ili i Jagged-1 i Jagged-2, i koja uključuju kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca i varijabilnog regiona lakog lanca koji su, ili su izvedeni iz varijabilnih sekvenci teškog lanca i varijabilnih sekvenci lakog lanca prikazanih u nastavku.
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc4
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc4
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc5
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc5
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc7
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc7
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc8
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc8
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc13
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc13
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc16
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc16
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc19
4
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc19
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc21
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc21
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc24
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc24
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc26
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc26
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc27
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc27 Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc28
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc28
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc30
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc30
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc31
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc31
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc32
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc32
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc37
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc37
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc39
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc39
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc40
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc40
Varijabilna lakolančana aminokiselinska sekvenca Lc47
Varijabilna teškolančana aminokiselinska sekvenca Hc47
Varijabilni 4B2 laki lanac
Varijabilni 4D11 laki lanac
VArijabilni 4E7 laki lanac
Varijabilni 4E11 laki lanac
Varijabilni 6B7 laki lanac
Varijabilni 6F8 laki lanac
[0163] Primeri konjugovanih antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju, na primer, antitela koja se vezuju za Jagged cilj, npr., Jagged-1, Jagged-2 i/ili i Jagged-1 i Jagged-2, i koja uključuju kombinaciju teškolančanog regiona i lakolančanog regiona koji su, ili su izvedeni iz, teškolančanih i lakolančanih sekvenci prikazanih u nastavku.
Sekvenca lakog lanca 4D11:
Sekvenca teškog lanca 4D11v2
[0164] Antitela koja mogu da se aktiviraju i kompozicije antitela koje može da se aktivira, obezbeđeni u ovom tekstu sadrže najmanje antitelo ili fragment antitela (zajedno u objavi označeni kao AB) koji se specifično vezuju za cilj, npr., humani cilj, pri čemu je AB modifikovano maskirajućom komponentom (MM).
[0165] U nekim primerima izvođenja, maskirajuća komponenta je odabrana za upotrebu sa specifičnim antitelom ili fragmentom antitela. Na primer, pogodne maskirajuće komponente za upotrebu sa antitelima koja se vezuju za EGFR uključuju MM koje sadrže sekvencu CISPRG (SEQ ID NO: 165). Kao neograničavajući primeri, MM može uključiti sekvencu kao što je CISPRGC (SEQ ID NO: 166); CISPRGCG (SEQ ID NO: 167); CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168); CISPRGCPDGPYVM (SEQ ID NO: 169), CISPRGCEPGTYVPT (SEQ ID NO: 170) i CISPRGCPGQIWHPP (SEQ ID NO: 171). Druge pogodne maskirajuće komponente uključuju neku od EGFR-specifičnih maski objavljenih u PCT publikaciji br. WO 2010/081173, na primer, bez ograničavanja, GSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 172); CISPRGCGGSSASQSGQGSHCLIPINMGAPSC (SEQ ID NO: 173); CNHHYFYTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 174); ADHVFWGSYGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 175); CHHVYWGHCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 176); CPHFTTTSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 177); CNHHYHYYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 178); CPHVSFGSCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 179); CPYYTLSYCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 180); CNHVYFGTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 181); CNHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 182); CHHFTLTTCGCISPRGCPG (SEQ ID NO: 183); YNPCATPMCCISPRGCPG (SEQ ID NO: 184); CNHHYFYTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 185); CNHHYHYYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 186); CNHVYFGTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 187); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 188); CPHFTTTSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 189); CNHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 190); CHHFTLTTCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 191); CPYYTLSYCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 192); CPHVSFGSCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 193); ADHVFWGSYGCISPRGCG (SEQ ID NO: 194); YNPCATPMCCISPRGCG (SEQ ID NO: 195); CHHVYWGHCGCISPRGCG (SEQ ID NO: 196); C(N/P)H(H/V/F)(Y/T)(F/W/T/L)(Y/G/T/S)(T/S/Y/H)CGCISPRGCG (SEQ ID NO: 197); CISPRGCGQPIPSVK (SEQ ID NO: 198); CISPRGCTQPYHVSR (SEQ ID NO: 199); i/ili CISPRGCNAVSGLGS (SEQ ID NO: 200).
[0166] Pogodne maskirajuće komponente za upotrebu sa antitelima koja se vezuju za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, uključuju, kao neograničavajući primer, maskirajuće komponente koje sadrže sekvencu kao što je QGQSGQCNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 201); QGQSGQGQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 202); PWCMQRQDFLRCPQP (SEQ ID NO: 203); QLGLPAYMCTFECLR (SEQ ID NO: 204); CNLWVSGGDCGGLQG (SEQ ID NO: 205); SCSLWTSGSCLPHSP (SEQ ID NO: 206); YCLQLPHYMQAMCGR (SEQ ID NO: 207); CFLYSCTDVSYWNNT (SEQ ID NO: 208); PWCMQRQDYLRCPQP (SEQ ID NO: 209); CNLWISGGDCRGLAG (SEQ ID NO: 210); CNLWVSGGDCRGVQG (SEQ ID NO: 211); CNLWVSGGDCRGLRG (SEQ ID NO: 212); CNLWISGGDCRGLPG (SEQ ID NO: 213); CNLWVSGGDCRDAPW (SEQ ID NO: 214); CNLWVSGGDCRDLLG (SEQ ID NO: 215); CNLWVSGGDCRGLQG (SEQ ID NO: 216); CNLWLHGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 217); CNIWLVGGDCRGWQG (SEQ ID NO: 218); CTTWFCGGDCGVMRG (SEQ ID NO: 219); CNIWGPSVDCGALLG (SEQ ID NO: 220); CNIWVNGGDCRSFEG (SEQ ID NO: 221); YCLNLPRYMQDMCWA (SEQ ID NO: 222); YCLALPHYMQADCAR (SEQ ID NO: 223); CFLYSCGDVSYWGSA (SEQ ID NO: 224); CYLYSCTDSAFWNNR (SEQ ID NO: 225); CYLYSCNDVSYWSNT (SEQ ID NO: 226); CFLYSCTDVSYW (SEQ ID NO: 227); CFLYSCTDVAYWNSA (SEQ ID NO: 228); CFLYSCTDVSYWGDT (SEQ ID NO: 229); CFLYSCTDVSYWGNS (SEQ ID NO: 230); CFLYSCTDVAYWNNT (SEQ ID NO: 231); CFLYSCGDVSYWGNPGLS (SEQ ID NO: 232); CFLYSCTDVAYWSGL (SEQ ID NO: 233); CYLYSCTDGSYWNST (SEQ ID NO: 234); CFLYSCSDVSYWGNI (SEQ ID NO: 235); CFLYSCTDVAYW (SEQ ID NO: 236); CFLYSCTDVSYWGST (SEQ ID NO: 237); CFLYSCTDVAYWGDT (SEQ ID NO: 238); GCNIWLNGGDCRGWVDPLQG (SEQ ID NO: 239); GCNIWLVGGDCRGWIGDTNG (SEQ ID NO: 240); GCNIWLVGGDCRGWIEDSNG (SEQ ID NO: 241);
1
GCNIWANGGDCRGWIDNIDG (SEQ ID NO: 242); GCNIWLVGGDCRGWLGEAVG (SEQ ID NO: 243); GCNIWLVGGDCRGWLEEAVG (SEQ ID NO: 244); GGPALCNIWLNGGDCRGWSG (SEQ ID NO: 245); GAPVFCNIWLNGGDCRGWMG (SEQ ID NO: 246); GQQQWCNIWINGGDCRGWNG (SEQ ID NO: 247); GKSEFCNIWLNGGDCRGWIG (SEQ ID NO: 248); GTPGGCNIWANGGDCRGWEG (SEQ ID NO: 249); GASQYCNLWINGGDCRGWRG (SEQ ID NO: 250); GCNIWLVGGDCRPWVEGG (SEQ ID NO: 251); GCNIWAVGGDCRPFVDGG (SEQ ID NO: 252); GCNIWLNGGDCRAWVDTG (SEQ ID NO: 253); GCNIWIVGGDCRPFINDG (SEQ ID NO: 254); GCNIWLNGGDCRPVVFGG (SEQ ID NO: 255); GCNIWLSGGDCRMFMNEG (SEQ ID NO: 256); GCNIWVNGGDCRSFVYSG (SEQ ID NO: 257); GCNIWLNGGDCRGWEASG (SEQ ID NO: 258); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 259); GCNIWLNGGDCRTFVASG (SEQ ID NO: 260); GCNIWAHGGDCRGFIEPG (SEQ ID NO: 261); GFLENCNIWLNGGDCRTG (SEQ ID NO: 262); GIYENCNIWLNGGDCRMG (SEQ ID NO: 263); i/ili GIPDNCNIWINGGDCRYG (SEQ ID NO: 264).
[0167] Pogodne maskirajuće komponente za upotrebu sa antitelima koja se vezuju za interleukin 6-cilj, npr., receptor za interleukin 6 (IL-6R), uključuju, kao neograničavajući primer, maskirajuće komponente koje sadrže sekvencu kao što je QGQSGQYGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 265); QGQSGQGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 266); QGQSGQMGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO: 267); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 268); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 269); ESSCVWNYVHIYMDC (SEQ ID NO: 270); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 271); YRTCSWNYVGIFLDC (SEQ ID NO: 272); YGSCSWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 273); YGSCSWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 274); YGSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 275); YTSCNWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 276); YPGCKWNYDRIFLDC (SEQ ID NO: 277); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 278); WSNCHWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 279); DRSCTWNYVRISYDC (SEQ ID NO: 280); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 281); SRSCIWNYAHIHLDC (SEQ ID NO: 282); SMSCYWQYERIFLDC (SEQ ID NO: 283); YRSCNWNYVSIFLDC (SEQ ID NO: 284); SGSCKWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 285); YKSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 286); YGSCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 287); FSSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 288); WRSCNWNYAHIFLDC (SEQ ID NO: 289); YGSCQWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 290); YRSCNWNYVHIFLDC (SEQ ID NO: 291); NMSCHWDYVHIFLDC (SEQ ID NO: 292); FGPCTWNYARISWDC (SEQ ID NO: 293); XXsCXWXYvhIfXdC (SEQ ID NO: 294); MGVPAGCVWNYAHIFMDC (SEQ ID NO:
2
295); RDTGGQCRWDYVHIFMDC (SEQ ID NO: 296); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 297); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 298); DGGPAGCSWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 299); AVGPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 300); CTWNYVHIFMDCGEGEGP (SEQ ID NO: 301); GGVPEGCTWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 302); AEVPAGCWWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 303); AGVPAGCTWNYVHIFMEC (SEQ ID NO: 304); SGASGGCKWNYVHIFMDC (SEQ ID NO: 305); TPGCRWNYVHIFMECEAL (SEQ ID NO: 306); VGVPNGCVWNYAHIFMEC (SEQ ID NO: 307); PGAFDIPFPAHWVPNT (SEQ ID NO: 308); RGACDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 309); QGDFDIPFPAHWVPIT (SEQ ID NO: 310); XGafDIPFPAHWvPnT (SEQ ID NO: 311); RGDGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 312); SGVGRDRDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 313); WAGGNDCDIPFPAHWIPNT (SEQ ID NO: 314); WGDGMDVDIPFPAHWVPVT (SEQ ID NO: 315); AGSGNDSDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 316); ESRSGYADIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 317); i/ili RECGRCGDIPFPAHWVPRT (SEQ ID NO: 318).
[0168] Kada ja AB modifikovano pomoću MM i kada je u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili zaustavljeno, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM ili u poređenju sa specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj.
[0169] KdAB modifikovanog pomoću MM, prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,000-10,000,000 puta veća od KdAB koje nije modifikovano pomoću MM ili roditeljskog AB prema cilju. Nasuprot tome, vezujući afinitet AB modifikovanog pomoću MM prema cilju je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,000-10,000,000 manji od vezujućeg afiniteta AB koje nije modifikovano pomoću MM ili roditeljskog AB prema cilju.
[0170] Disocijaciona konstanta (Kd) MM prema AB je uopšteno veća od KdAB prema cilju. KdMM prema AB može biti najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 ili čak 10,000,000 puta veća od KdAB prema cilju. Nasuprot tome, vezujući afinitet MM prema AB je uopšteno niži nego vezujući afinitet AB prema cilju. Vezujući afinitet MM prema AB može biti najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 100,000, 1,000,000 ili čak 10,000,000 puta niži od vezujućeg afiniteta AB prema cilju.
[0171] Kada je AB modifikovano pomoću MM i kada je u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili zaustavljeno, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM ili specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj. Kada se upoređuje sa vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM ili vezivanjem roditeljskog AB za cilj, sposobnost AB da se veže za cilj kada je modifikovano pomoću MM može biti smanjena za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili više kada se meri in vivo ili u testu in vitro.
[0172] MM inhibira vezivanje AB za cilj. MM se vezuje za antigen-vezujući domen AB i inhibira vezivanje AB za cilj. MM može sterički da inhibira vezivanje AB za cilj. MM može da alosterički inhibira vezivanje AB za cilj. U ovim primerima izvođenja kada je AB modifikovano ili kuplovano sa MM i u prisustvu cilja, nema vezivanja ili suštinski nema vezivanja AB za cilj, ili nema više od 0.001%, 0.01%, 0.1%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, ili 50% vezivanja AB za cilj, u poređenju sa vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM, roditeljskog AB, ili AB koje nije kuplovano sa MM za cilj, tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže kada se meri in vivo ili u testu in vitro.
[0173] Kada je AB kuplovano, ili modifikovano pomoću MM, MM 'maskira' ili smanjuje ili na drugi način inhibira specifično vezivanje AB za cilj. Kada je AB kuplovano ili modifikovano pomoću MM, takvo kuplovanje ili modifikacija mogu dovesti do strukturne promene koja smanjuje ili inhibira sposobnost AB da se specifično vezuje sa svojim ciljem.
[0174] AB kuplovano, ili modifikovano pomoću MM može biti predstavljeno sledećim formulama (redom od amino (N) terminalnog regiona do karboksil (C) terminalnog regiona:
(MM)-(AB)
(AB)-(MM)
(MM)-L-(AB)
(AB)-L-(MM)
4
pri čemu je MM maskirajuća komponeta, AB je antitelo ili fragment antitela, i L je linker. U mnogim primerima izvođenja, može biti poželjno insertovanje jednog ili više linkera, npr., fleksibilnog linkera, u kompoziciju da bi se tako obezbedila fleksibilnost.
[0175] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodno vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM ne sadrži ili suštinski ne sadrži homologiju ni sa jednim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% sličan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 25% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 50% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 20% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 10% identičan sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0176] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju uključuju AB koje je modifikovano pomoću MM i takođe uključuju najmanje jednu odsecajuću komponentu (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje drugu odsecajuću komponentu (CM2) koja je subjekt za najmanje jednu serin proteazu (SP). Takva antitela koja mogu da se aktiviraju pokazuju vezivanje koje može da se aktivira/menja, za cilj AB. Antitela koja mogu da se aktiviraju uopšteno uključuju antitelo ili fragment antitela (AB), modifikovan ili kuplovan sa maskirajućom komponentom (MM) i CM1-CM2 supstratom.
[0177] Elementi antitela koja mogu da se aktiviraju aranžirani su tako da su MM i CM1-CM2 supstrat pozicionirani tako da se u odsečenom (ili relativno aktivnom) stanju i u prisustvu cilja, AB vezuje za cilj dok je u neisečenom (ili realtivno neaktivnom) stanju u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za cilj smanjeno ili inhibirano. Specifično vezivanje AB za njegov cilj može biti smanjeno zbog inhibiranja ili maskiranja sposobnosti AB da se specifično veže za svoj cilj, pomoću MM.
[0178] KdAB modifikovanog pomoću MM i CM1-CM2 supstrata prema cilju je najmanje 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili veća, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,00010,000,000 puta veća od KdAB koje nije modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata ili roditeljskog AB prema cilju. Nasuprot tome, vezujući afinitet AB modifikovanog pomoću MM i CM1-CM2 supstrata prema cilju je najmanje 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 40, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili veći, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,000-10,000,000 puta manji od vezujućeg afiniteta AB koje nije modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata ili roditeljskog AB prema cilju.
[0179] Kada je AB modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata i kada je u prisustvu cilja, ali ne i u prisustvu modifikujućeg sredstva (na primer MMP i SP), specifično vezivanje AB za njegov cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata ili roditeljskog AB za cilj. U poređenju sa vezivanjem roditeljskog AB ili vezivanjem AB koje nije modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata za cilj, sposobnost AB da se veže za cilj kada je modifikovano pomoću MM i CM1-CM2 supstrata može biti smanjena za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% i čak 100% za najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 sati ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže kada se meri in vivo ili u testu in vitro.
[0180] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz isečeno stanje označava uslove antitela koja mogu da se aktiviraju posle modifikacije, tj., sečenja, CM1-CM2 supstrata najmanje jednom matriksnom metaloproteazom i/ili najmanje jednom serin proteazom. Izraz neisečeno stanje ili potpuno neisečeno, kako se koristi u ovom tekstu, označava stanje antitela koja mogu da se aktiviraju u odsustvo sečenja CM1-CM2 supstrata putem MMP i/ili SP. Kako je gore rečeno, izraz "antitela koja mogu da se aktiviraju" koristi se u ovom tekstu da označi antitelo koje može da se aktivira i u njegovom neisečenom (nativnom) stanju, kao i u njegovom isečenom stanju. Antitelo koje može da se aktivira u isečenom stanju, u ovom tekstu se označava i kao aktivirano antitelo i/ili aktivirano antitelo koje može da se aktivira. Prosečno obučen stručnjak u oblasti prepoznaće da u nekim primerima izvođenja, isečenom antitelu koje može da se aktivira može nedostajati MM zbog sečenja CM1-CM2 supstrata proteazom, što rezultuje oslobađanjem najmanje MM.
[0181] Koje može da se aktivira ili promenljivo označava da antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za cilj kada je u inhibiranom, maskiranom ili neisečenom stanju (tj., prvoj konformaciji), i drugi nivo vezivanja za cilj kada je u neinhibiranom, demaskiranom i/ili isečenom stanju (tj., drugoj konformaciji), gde je drugi nivo vezivanja za cilj veći od prvog nivoa vezivanja. Uopšteno, pristupanje cilja AB antitela koje može da se aktivira veći je u prisustvu isecajućeg sredstva koje može da iseče CM1-CM2 supstrat nego u odsustvu takvog isecajućeg sredstva. Prema tome, kada je antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju, AB je inhibirano za vezivanje sa ciljem i može biti maskirano za vezivanje sa ciljem (tj., prva konformacija je takva da AB ne može da se veže sa ciljem), i u isečenom stanju AB nije inhibirano ili je demaskirano za vezivanje sa ciljem.
[0182] CM1-CM2 supstrat i AB antitela koja mogu da se aktiviraju odabrani su tako da AB predstavlja vezujuću komponentu za dati cilj, i CM1-CM2 supstrat predstavlja supstrat za MMP i SP, pri čemu su MMP i/ili SP kolokalizovane sa ciljem na mestu tretmana ili dijagnostičkom mestu, kod subjekta. Antitela koja mogu da se aktiviraju objavljena u ovom tekstu imaju posebnu primenu kada je, na primer, svaka od MMP i SP, sposobna da seče mesto u CM1-CM2 supstratu, prisutna u relativno višem nivou u tkivu koje sadrži cilj na mestu tretmana ili dijagnostičkom mestu nego u tkivu mesta koja se ne tretiraju (na primer u zdravom tkivu).
[0183] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju smanjenje toksičnosti i/ili neželjenih sporednih efekata koji bi inače bili rezultat vezivanja AB na netretiranim mestima ako AB nije maskirano ili na drugi način inhibirano za vezivanjr sa ciljem.
[0184] Uopšteno, antitelo koje može da se aktivira može da se dizajnira biranjem AB od interesa i konstruisanjem preostalog dela antitela koje može da se aktivira tako da, kada je konformaciono ograničeno, MM obezbeđuje maskiranje AB ili smanjenje vezivanja AB za njegov cilj. Kriterijumi strukturnog dizajna mogu se uzeti u obzir da bi se obezbedila ova strukturna osobina.
[0185] Obezbeđena su antitela koja mogu da se aktiviraju, koja pokazuju promenljivi fenotip sa željenim dinamičkim opsegom, za vezivanje sa ciljem u inhibiranoj u odnosu na neinhibiranu konformaciju. Dinamički opseg se uopšteno odnosi na odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa parametra pod prvim setom stanja prema (b) minimalnoj detektovanoj vrednosti tog parametra pod drugim setom stanja. Na primer, u kontekstu antitela koje može da se aktivira, dinamički opseg označava odnos (a) maksimalnog detektovanog nivoa vezivanja ciljnog proteina za antitelo koje može da se aktivira u prisustvu MMP i SP koje su sposobne da seku CM1-CM2 supstrat antitela koja mogu da se aktiviraju prema (b) minimalnom detektovanom nivou vezivanja ciljnog proteina za antitelo koje može da se aktivira u odsustvu proteaze. Dinamički opseg antitela koje može da se aktivira može se izračunati kao odnos konstante disocijacije tretmana sredstvom (npr., enzim) koje seče antitelo koje može da se aktivira prema konstanti disocijacije tretmana sredstvom koje seče antitela koja mogu da se aktiviraju. Što je veći dinamički opseg antitela koje može da se aktivira, bolji je fenotip promenljivosti antitela koje može da se aktivira. Antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju relativno više vrednosti dinamičnog opsega (npr., više od 1) ispoljavaju poželjnije promenljive fenotipove tako da do vezivanja ciljnog proteina antitelima koja mogu da se aktiviraju dolazi u većoj meri (npr., dešava se preovlađujuće) u prisustvu isecajućeg sredstva (npr., enzima) koje može da seče CM1-CM2 supstrat antitela koja mogu da se aktiviraju nego u odsustvu isecajućeg sredstva.
[0186] Antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se obezbediti u različitim strukturnim konfiguracijama. Primeri formula za antitela koja mogu da se aktiviraju dati su u nastavku ovog teksta. Specifično se razmatra da redosled od N- do C-terminusa AB, MM i CM1-CM2 supstrata može biti obrnut u antitelu koje može da se aktivira. Isto tako, specifično se razmatra da se CM i MM mogu preklapati u aminokiselinskoj sekvenci, npr., tako da CM1-CM2 supstrat bude bar delimično sadržan u MM.
[0187] Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu biti predstavljena sledećom formulom (redom od amino (N) terminalnog regiona do karboksil (C) terminalnog regiona:
(MM)-(CM1-CM2 supstrat)-(AB)
(AB)-(CM1-CM2 supstrat)-(MM)
gde je MM maskirajuća komponenta, CM1-CM2 supstrat je komponenta koja se seče, i AB je antitelo ili njegov fragment. Kako je ranije napomenuto, namena izraza "CM1-CM2 supstrat" nije postavljanje bilo kakvog uslova u vezi sa orijentacijom ili drugim strukturnim aranžmanom prve komponente koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje druge komponente koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP). Prema tome, izraz "CM1-CM2 supstrati" obuhvata CM1-CM2 supstrate koji od N-terminusa do C-terminusa imaju sledeći strukturni aranžman: CM1-CM2 ili CM2-CM1. Izraz "CM1-CM2 supstrati" obuhvata i supstrate u kojima se najmanje deo CM1 sekvence preklapa sa najmanje delom CM2 sekvence. Treba napomenuti i to da iako su u gornjim formulama MM i CM1-CM2 supstrat naznačeni kao različite komponente, u svim primerima izvođenja datim kao primer (uključujući formule) objavljenim u ovom tekstu smatra se da aminokiselinske sekvence MM i CM1-CM2 supstrata mogu da se preklapaju, npr., tako da je CM1-CM2 supstrat potpuno ili delimično sadržan u MM. Pored toga, gornje formule obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu biti pozicionirane N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0188] U određenim primerima izvođenja, MM nije prirodni vezujući partner AB. U nekim primerima izvođenja, MM ne sadrži ili suštinski ne sadrži homologiju ni sa jednim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% slična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, ili 80% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 25% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 20% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB. U nekim primerima izvođenja, MM je ne više od 10% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom AB.
[0189] U mnogim primerima izvođenja, može biti poželjno insertovati jedan ili više linkera, npr., fleksibilnih linkera, u konstrukt antitela koje može da se aktivira tako da se obezbedi fleksiblnost na jednom ili više od spojeva MM-CM1-CM2 supstrat, CM1-CM2 supstrat-AB ili oba. Na primer, AB, MM, i/ili CM1-CM2 supstrat ne moraju sadržati dovoljan broj rezidua (npr., Gly, Ser, Asp, Asn, posebno Gly i Ser, posebno Gly) da bi se obezbedila željena fleksibilnost. Kao takav, promenljivi fenotip takvih konstrukata antitela koje može da se aktivira može imati koristi od uvođenja jedne ili više amino-kiselina da bi se obezbedio fleksibilan linker. Pored toga, kako je opisano u nastavku ovog teksta, kada je antitelo koje može da se aktivira dato u vidu konformaciono ograničenog konstrukta, fleksibilni linker može biti operabilno insertovan da se olakšalo formiranje i održavanje ciklične strukture u neisečenom antitelu koje može da se aktivira.
[0190] Na primer, u određenim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži jednu od sledećih formula (gde donja formula predstavlja aminokiselinsku sekvencu u smeru od N- do C-terminusa ili u smeru od C- do N-terminusa):
(MM)-L1-(CM1-CM2 supstrat)-(AB)
(MM)-(CM1-CM2 supstrat)-L2-(AB)
(MM)-L1-(CM1-CM2 supstrat)-L2-(AB)
pri čemu su MM, CM1-CM2 supstrat, i AB kako je definisano gore; pri čemu su svaki od nezavisnih i opciono prisutnih L1 i L2, isti ili različiti fleksibilni linkeri koji uključuju najmanje 1 fleksibilnu amino-kiselinu (npr., Gly). Pored toga, gornje formule obezbeđuju dodatne aminokiselinske sekvence koje mogu biti pozicionirane N-terminalno ili C-terminalno u odnosu na elemente antitela koja mogu da se aktiviraju. Primeri uključuju, ali se ne ograničavaju na ciljajuće komponente (npr., ligand za receptor ćelije prisutne u ciljnom tkivu) i komponente koje produžavaju poluživot u serumu (npr., polipeptidi koji se vezuju za proteine seruma, na primer imunoglobulin (npr., IgG) ili serumski albumin (npr., humani serumski albumin (human serum albumin, HAS)).
[0191] CM1-CM2 supstrat se specifično seče najmanje jednom MMP stopom od oko 0.001-1500 × 10<4>M<-1>S<-1>ili najmanje 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, ili 1500 × 10<4>M<-1>S<-1>i specifično se seče najmanje jednom SP stopom od oko 0.001-1500 × 10<4>M<-1>S<-1>ili najmanje 0.001, 0.005, 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 2.5, 5, 7.5, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 500, 750, 1000, 1250, ili 1500 × 10<4>M<-1>S<-1>.
[0192] Za specifično sečenje enzimom, uspostavlja se kontakt između enzima i CM1-CM2 supstrata. Kada je antitelo koje može da se aktivira koje sadrži AB kuplovano sa MM i CM1-CM2 supstratom u prisustvu cilja i enzimska aktivnost je dovoljna, CM1-CM2 supstrat može da se seče. Dovoljna enzimska aktivnost može označavati sposobnost enzima da načini kontakt sa CM1-CM2 supstratom i izvrši sečenje. Lako se može zamisliti da enzim može biti u blizini CM1-CM2 supstrata, ali da ne može da izvrši sečenje zbog drugih ćelijskih faktora ili proteinske modifikacije enzima.
[0193] Linkeri pogodni za upotrebu u kompozicijama opisanim u ovom tekstu obično su oni koji obezbeđuju fleksibilnost modifikovanog AB ili antitela koja mogu da se aktiviraju da bi se olakšala inhibicija vezivanja AB za cilj. Takvi linkeri se obično označavaju kao fleksibilni linkeri. Pogodni linkeri mogu se lako odabrati i mogu biti bilo koje pogodne, različite veličine, na primer od 1 amino-kiseline (npr., Gly) do 20 amino-kiselina, od 2 amino-kiseline do 15 amino-kiselina, od 3 amino-kiselina do 12 amino-kiselina, uključujući 4 amino-kiseline do 10 amino-kiselina, 5 amino-kiselina do 9 amino-kiselina, 6 amino-kiselina do 8 amino-kiselina, ili 7 amino-kiselina do 8 amino-kiselina, i može biti dug 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20 amino-kiselina.
[0194] Primeri fleksibilnih linkera uključuju glicinske polimere (G)n, glicin-serinske polimere (uključujući, na primer, (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) i (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), pri čemu je n ceo broj koji iznosi najmanje jedan), glicin-alaninske polimere, alanin-serinske polimere, i druge fleksibilne linkere poznate u struci. Glicinski i glicin-serinski polimeri su relativno nestrukturirani i zbog toga mogu da služe kao neutralne spone između komponenti.
Glicin dopušta značajno više fi-psi prostora nego čak alanin, i mnogo je manje ograničen nego rezidue sa dužim bočnim lancima (vidi Scheraga, Rev. Computational Chem. 11173-142 (1992)). Primeri fleksibilnih linkera uključuju, ali se ne ograničavaju na Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 383), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 384, Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 385), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 386), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 387), Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 388), i slično. Prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da dizajn antitela koja mogu da se aktiviraju može uključiti linkere koji su potpuno ili delimično fleksibilni, tako da linker može uključiti fleksibilni linker kao i jedan ili više delova koji daju manje fleksibilnu strukturu, da bi se obezbedila željena struktura antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0195] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom tekstu uključuju sredstvo konjugovano sa antitelom koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, konjugovano sredstvo je terapijsko sredstvo, na primer antizapaljensko i/ili antineoplastičnno sredstvo. U takvim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa ugljenohidratnom komponentom antitela koje može da se aktivira, na primer, u nekim primerima izvođenja, kada se ugljenohidratna komponeta nalazi izvan antigen-vezujućeg regiona antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u antitelu koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa sulfhidrilnom grupom antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta u antitelu koje može da se aktivira.
[0196] U nekim primerima izvođenja, sredstvo je citotoksično sredstvo kao što je toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili fragment istog), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat).
[0197] U nekim primerima izvođenja, sredstvo je detektabilna komponenta kao, na primer, obeleživač ili drugi marker. Na primer, sredstvo je, ili uključuje, radioobeleženu aminokiselinu, jednu ili više biotinisanih komponenti koje mogu da se detektuju obeleženim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja može da se detektuje optičkim ili kalorimetrijskim postupcima), jedan ili više radioizotopa ili radionuklida, jedan ili više fluorescentnih obeleživača, jedan ili više enzimskih obeleživača, i/ili jedno ili više hemiluminiscentnih sredstava. U nekim primerima izvođenja, detektabilne komponente su prikačene preko spejserskog molekula.
[0198] Objava se takođe odnosi na imunokonjugate koji sadrže antitelo konjugovano sa citotoksičnim sredstvom kao što je toksin (npr., enzimski aktivan toksin bakterijskog, gljivičnog, biljnog ili životinjskog porekla, ili fragment istog), ili radioaktivni izotop (tj., radiokonjugat). Pogodna citotoksična sredstva uključuju, na primer, dolastatine i njihove
1
derivate (npr. auristatin E, AFP, MMAF, MMAE, MMAD, DMAF, DMAE). Na primer, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE) ili monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0199] U nekim primerima izvođenja, sredstvo je povezano sa AB korišćenjem linkera maleimid kaproil-valin-citrulin ili linkera maleimid PEG-valin-citrulin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je povezano sa AB korišćenjem linkera maleimid kaproil-valin-citrulin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je povezano sa AB korišćenjem linkera maleimid PEG-valin-citrulin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD) povezan sa AB korišćenjem linkera maleimid PEG-valin-citrulin-paraaminobenziloksikarbonil, i ovaj konstrukt linker-opterećenje označen je u ovom tekstu kao "vc-MMAD." U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE) povezan sa AB korišćenjem linkera maleimid PEG-valin-citrulin-para-aminobenziloksikarbonil, i ovaj konstrukt linker-opterećenje označen je u ovom tekstu kao "vc-MMAE". Strukture vc-MMAD i vc-MMAE prikazane su u nastavku ovog teksta:
vc-MMAD
vc-MMAE:
2
[0200] Enzimski aktivni toksini i njihovi fragmenti koji mogu da se koriste uključuju A lanac difterija toksina, nevezujuće aktivne fragmente toksina difterije, egzotoksin A lanac (iz Pseudomonas aeruginosa), ricin A lanac, abrin A lanac, modecin A lanac, alfa-sarcin, proteine Aleurites fordii, proteine diantina, proteine Phytolacca americana (PAPI, PAPII, i PAP-S), inhibitor iz Momordica charantia, kurcin, krotin, inhibitor iz Saponaria officinalis, gelonin, mitogelin, restriktocin, fenomicin, enomicin, i triotecene. Različiti radionuklidi na raspolaganju su za proizvodnju radiokonjugovanih antitela. Primeri uključuju<212>Bi,<131>I,<131>In<90>Y, i<186>Re.
[0201] Konjugati antitela i citotoksičnog sredstva prave se korišćenjem različitih bifunkcionalnih protein-kuplujućih sredstava kao što su N-sukcinimidil-3-(2-piridilditiol) propionat (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithiol) propionate, SPDP), iminotiolan (iminothiolane, IT), bifunkcionalni derivati imidoestara (kao što je dimetil adipimidat HCL), aktivnih estara (kao što je disukcinimidil suberat), aldehida (kao što je glutaraldehid), bis-azido jedinjenja (kao što je bis (p-azidobenzoil) heksandiamin), bis-diazonijum derivata (kao što je bis-(pdiazonijumbenzoil)-etilendiamin), diizocijanata (kao što je toluen 2,6-diizocijanat), i bisaktivnih jedinjenja fluora (kao što je 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzen). Na primer, ricinski imunotoksin može da se pripremi kako je opisano u Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). Uglenikom-14-obeležena 1-izotiocijanatobenzil-3-metildietilen triaminpentasirćetna kiselina (MX-DTPA) primer je helirajućeg sredstva za konjugaciju radionukleotida sa antitelom. (Vidi WO94/11026).
[0202] U Tabeli 3 navedeni su neki primeri farmaceutskih sredstava koja mogu da se upotrebe u objavi opisanoj u ovom tekstu, ali ona ovom listom nisu ni na koji način iscrpljena.
Tabela 3: Primeri farmaceutskih sredstava za konjugaciju CITOTOKSIČNA SREDSTVA
Auristatini Turbostatin
Auristatin E Fenstatini
Monometil auristatin D (MMAD) Hidroksifenstatin
Monometil auristatin E (MMAE) Spongistatin 5
Desmetil auristatin E (DMAE) Spongistatin 7
Auristatin F Halistatin 1
Monometil auristatin F (MMAF) Halistatin 2
Dezmetil auristatin F (DMAF) Halistatin 3
Derivati auristatina, npr., njegovi amidi Modifikovani briostatini
Auristatin tiramin Halokomstatini
Auristatin hinolin Pirolobenzimidazoli (pyrrolobenzimidazoles,
PBI)
Dolastatini Cibrostatin6
Derivati dolastatina Doksaliform
Dolastatin 16 DmJ Antraciklinski analozi
Dolastatin 16 Dpv
Majtanzinoidi, npr. DM-1; DM-4
Derivati majtanzinoida Analog cemadotina (CemCH2-SH) Duokarmicin Pseudomonas toksin A (PE38) varijanta Derivati duokarmicina Pseudomonas toksin A (ZZ-PE38) varijanta Alfa-amanitin ZJ-101
Antraciklini OSW-1
Doksorubicin 4-nitrobenziloksikarbonilni derivati
O6-benzilguanina
Daunorubicin Inhibitori topoizomeraze
Briostatini Hemiasterlin
Kamptotecin Cefalotaksin
Derivati kamptotecina Homoharingtonin
7-supstituisani kamptotecin Pirolobenzodiazepin (pyrrolobenzodiazepine,
PBD)
10, 11- Pirolobenzodiazepinski (PBD) dimeri difluorometilendioksi kamptotecin
4
Kombretastatini Funkcionalizovani pirolobenzodiazepini Debromoaplizijatoksin Funkcionalizovani pirolobenzodiazepinski dimeri
Kahalalid-F Kaliheamicini
Diskodermolid Podofilotoksini
Ekteinascidini Taksani
Alkaloidi vinke
ANTIVIRUSNA SREDSTVA KONJUGACIONI DETEKCIONI
Aciklovir<REAGENSI>
Vira A Fluorescein i njegovi derivati
Simetrel Fluorescein izotiocijanat (fluorescein isothiocyanate, FITC)
ANTIGLJIVIČNA SREDSTVA RADIOFARMACEUTICI
Nistatin<125>I
<131>I
DODATNA ANTINEOPLASTIČNA<89>Zr
SREDSTVA
Adriamicin<111>In
Cerubidin<123>I
Bleomicin<131>In
Alkeran<99>mTc
Velban<201>Tl
Onkovin<133>Xe
Fluorouracil<11>C
Metotreksat<62>Cu
Tiotepa<18>F
Bisantren<68>Ga
Novantron<13>N
Tioguanin<15>O
Prokarbazin<38>K
Citarabin<82>Rb
<99>mTc (Technetium) ANTIBAKTERIJSKA SREDSTVA
Aminoglikozidi TEŠKI METALI
Streptomicin Barijum
Neomicin Zlato
Kanamicin Platina
Amikacin
Gentamicin SREDSTVA PROTIV MIKOPLAZMI Tobramicin Tilozin
Streptomicin B Spektinomicin
Spektinomicin
Ampicilin
Sulfanilamid
Polimicin
Hloramfenikol
[0203] Prosečno obučeni stručnjak će prepoznati da veliki broj raznovrsnih mogućih komponenti može da se kupluje sa rezultantnim antitelima objave. (Vidi, na primer, "Conjugate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr (eds), Carger Press, New York, (1989)).
[0204] Kuplovanje može da se izvrši bilo kojom hemijskom reakcijom koja će povezati dva molekula, uz uslov da antitelo i druga komponenta zadrže svoje aktivnosti. Ova veza može uključiti mnoge hemijske mehanizme, na primer, kovalentno vezivanje, afinitetno vezivanje, interkalaciju, koordinatno vezivanje i kompleksovanje. U nekim primerima izvođenja, vezivanje je, međutim, kovalentno vezivanje. Kovalentno vezivanje može da se obavi ili direktnom kondenzacijom postojećih bočnih lanaca ili inkorporisanjem spoljašnjih premošćujućih molekula. Mnoga bivalentna ili polivalentna povezujuća sredstva korisna su za kuplovanje proteinskih molekula, kao što su antitela predmetne objave, za druge molekule. Na primer, reprezentativna kuplujuća sredstva mogu uključivati organska jedinjenja kao što su tioestri, karbodiimidi, sukcinimidni estri, diizocijanati, glutaraldehid, diazobenzeni i heksametilen diamini. Ovom listom nisu iscrpljene različite klase kuplujućih sredstava poznatih u struci, već ona pre predstavlja primere najčešćih kuplujućih sredstava. (Vidi Killen and Lindstrom, Jour. Immun. 133:1335-2549 (1984); Jansen et al., Immunological Reviews 62:185-216 (1982); i Vitetta et al., Science 238:1098 (1987).
[0205] U nekim primerima izvođenja, pored kompozicija i postupaka obezbeđenih u ovom tekstu, konjugovano antitelo koje može da se aktivira može takođe da se modifikuje za specifično usmerenu konjugaciju preko modifikovanih aminokiselinskih sekvenci insertovanih ili na drugi način uključenih u sekvencu antitela koje može da se aktivira. Ove modifikovane aminokiselinske sekvence dizajnirane su tako da omoguće kontrolisano postavljanje i/ili doziranje konjugovanog sredstva u konjugovanom antitelu koje može da se aktivira. Na primer, antitelo koje može da se aktivira može biti inženjerisano tako da uključi cisteinsku supstituciju na pozicijama na lakim i teškim lanicma, koja obezbeđuje reaktivne tiolne grupe i ne utiče negativno na savijanje i asambliranje proteina, i ne menja vezivanje antigena. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može biti inženjerisano tako da uključi ili na drugi način uvede jednu ili više neprirodnih aminokiselinskih rezidua u antitelo koje može da se aktivira, da bi se obezbedila mesta pogodna za konjugaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može biti inženjerisano tako da uključi ili na drugi način uvede peptidnu sekvencu koja može da se aktivira enzimski, u sekvencu antitela koje može da se aktivira.
[0206] Pogodni linkeri opisani su u litertauri. (Vidi, na primer, Ramakrishnan, S. et al., Cancer Res. 44:201-208 (1984) koji opisuju upotrebu MBS (M-maleimidobenzoil-N-hidroksisukcinimid estra). Vidi i U.S. patent br.5,030,719, koji opisuje upotrebu halogenisanog acetil hidrazidnog derivata kuplovanog sa antitelom preko oligopeptidnog linkera. U nekim primerima izvođenja, pogodni linkeri uključuju: (i) EDC (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) karbodiimid hidrohlorid; (ii) SMPT (4-sukcinimidiloksikarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridilditio)-toluen (Pierce Chem. Co., kat. (21558G); (iii) SPDP (sukcinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido]heksanoat (Pierce Chem. Co., kat #21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (sulfosukcinimidil 6 [3-(2-piridilditio)-propianamid] heksanoat (Pierce Chem. Co. kat. #2165-G); i (v) sulfo-NHS (N-hidroksisulfo-sukcinimid: Pierce Chem. Co., kat. #24510) konjugovan sa EDC. Dodatni linkeri uključuju, ali se ne ograničavaju na SMCC, sulfo-SMCC, SPDB, ili sulfo-SPDB.
[0207] Linkeri opisani gore sadrže komponente koje imaju različite odlike, dovodeći tako do konjugata sa različitim fizičko-hemijskim osobinama. Na primer, sulfo-NHS estri alkil karboksilata stabilniji su od sulfo-NHS estara aromatičnih karboksilata. NHS-estarsadržavajući linkeri manje su solubilni nego sulfo-NHS estri. Dalje, linker SMPT sadrži sterično ometenu disulfidnu vezu, i može formirati konjugate sa povećanom stabilnosšću. Disulfidne veze su, uopšteno, manje stabilne nego druge veze zbog toga što se disulfidna veza seče in vitro, što rezultuje manjom raspoloživošću konjugata. Sulfo-NHS, posebno, može povećati stabilnost karbodiimidnih spojeva. Karbodiimidno kuplovanje (na primer EDC), kada se koristi zajedno sa sulfo-NHS, formira estre koji su rezistentniji na hidrolizu nego u reakciji karbodiimidnog kuplujućeg sredstva samog.
[0208] U nekim primerima izvođenja, linkeri mogu da se seku. U nekim primerima izvođenja, linkeri ne mogu da se seku. U nekim primerima izvođenja, prisutna su dva ili više linkera. Dva ili više linkera su svi isti, tj., mogu da se seku ili ne mogu da se seku, ili su dva ili više linkera različiti, tj., najmanje jedan može da se seče i najmanje jedan ne može da se seče.
[0209] U predmetnoj objavi koristi se nekoliko postupaka za prikačinjanje sredstava za AB: (a) prikačinjanje za ugljenohidratnu komponentu AB, ili (b) prikačinjanje za sulfhidrilne grupe AB, ili (c) prikačinjanje za amino grupe AB, ili (d) prikačinjanje za karboksilatne grupe AB. U skladu sa objavom, AB mogu biti kovalentno prikačena za sredstvo preko intermedijarnog linkera koji ima najmanje dve reaktivne grupe, jednu za reakciju sa AB i jednu za reakciju sa sredstvom. Linker koji može uključivati bilo koje kompatibilno organsko jedinjenje, može se odabrati tako da reakcija sa AB (ili sredstvom) ne utiče negativno na reaktivnost i selektivnost AB. Pored toga, prikačinjanje linkera za sredstvo ne mora narušiti aktivnost sredstva. Pogodni linkeri za reakciju sa oksidisanim antitelima ili fragmentima oksidisanih antitela uključuju one koji sadrže amin odabran iz grupe koja se sastoji od primarne aminske, sekundarne aminske, hidrazinske, hidrazidne, hidroksilaminske, fenilhidrazinske, semikarbazidne i tiosemikarbazidne grupe. Takve reaktivne funkcionalne grupe mogu postojati kao deo strukture linkera, ili mogu biti uvedene pogodnom hemijskom modifikacijom linkera koji ne sadrži takve grupe.
[0210] U skladu sa predmetnom objavom, pogodni linkeri za prikačinjanje za redukovana AB uključuju one koji imaju određene reaktivne grupe koje mogu da reaguju sa sulfhidrilnom grupom redukovanog antitela ili fragmenta. Takve reaktivne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na: reaktivne haloalkil grupe (uključujući, na primer, haloacetil grupe), pmerkuribenzoatne grupe i grupe koje su sposobne za adicione reakcije Michael-tipa (uključujući, na primer, maleimide i grupe tipa koje su opisali Mitra and Lawton, 1979, J. Amer. Chem. Soc.101: 3097-3110).
[0211] U skladu sa predmetnom objavom, pogodni linkeri za prikačinjanje za Ab koja nisu ni oksidisana ni redukovana uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa primarnim amino grupama prisutnim u nemodifikovanim lizinskim reziduama u Ab. Takve reaktivne grupe uključuju, ali se ne ograničavaju na NHS karboksilne ili karbonske estre, sulfo-NHS karboksilne ili karbonske estre, 4-nitrofenil karboksilne ili karbonske estre, pentafluorofenil karboksilne ili karbonske estre, acil imidazole, izocijanate, i izotiocijanate.
[0212] U skladu sa predmetnom objavom, pogodni linkeri za prikačinjanje za Ab koja nisu ni oksidisana ni redukovana uključuju one koji imaju određene funkcionalne grupe sposobne za reakciju sa karboksilnokiselinskim grupama prisutnim u reziduama aspartata ili glutamata u Ab, koje su aktivirane pogodnim reagensima. Pogodni aktivirajući reagensi uključuju EDC, sa ili bez dodatog NHS ili sulfo-NHS, i druga dehidrirajuća sredstva koja se koriste za formiranje karboksamida. U ovim slučajevima, funkcionalne grupe prisutne u pogodnim linkerima uključivale bi primarne i sekundarne amine, hidrazine, hidroksilamine, i hidrazide.
[0213] Sredstvo može biti prikačeno za linker pre ili posle prikačinjanja linkera za AB. U određenim primenama može biti poželjno da se prvo proizvede intermedijar AB-linker, u kojem linker ne nosi pridruženo sredstvo. U zavisnosti od date primene, specifično sredstvo može zatim kovalentno da se prikači za linker. U nekim primerima izvođenja, AB je prvo prikačeno za MM, CM1-CM2 supstrat i pridružene linkere, a zatim je prikačeno za linker koji je namenjen konjugovanju.
[0214] Granati linkeri: U specifičnim primerima izvođenja, koriste se granati linkeri koji imaju više mesta za prikačinjanje sredstava. Za linkere sa većim brojem mesta, jedno kovalentno povezivanje sa AB rezultovaće intermedijarom AB-linker za koji može da se prikači sredstvo preko većeg broja mesta. Mesta mogu biti aldehidne ili sulfhidrilne grupe ili bilo koje hemijsko mesto za koje sredstvo može da se prikači.
[0215] U nekim primerima izvođenja, viša specifična aktivnost (ili viši odnos sredstava prema AB) može se postići prikačinjanjem linkera jednog mesta na veliki broj mesta na AB. Ovaj veliki broj mesta može se uvesti u AB jednim od dva postupka. Prvo, u istom AB može se generisati veliki broj aldehidnih grupa i/ili sulfhidrilnih grupa. Drugo, za aldehid ili sulfhidril AB može se prikačiti "granati linker" koji ima veliki broj funkcionalnih mesta za kasnije prikačinjanje za linkere. Funkcionalna mesta granatog linkera ili linkera sa velikim brojem mesta mogu biti aldehidne ili sulfhidrilne grupe, ili može biti bilo koje hemijsko mesto za koje se linkeri mogu prikačiti. Još više specifične aktivnosti mogu se dobiti kombinovanjem ova dva pristupa, to jest, prikačinjanjem linkera sa više mesta na nekoliko mesta na AB.
[0216] Linkeri koji mogu da se seku: Peptidni linkeri koji su podložni sečenju enzimima sistema komplementa, kao što su bez ograničavanja urokinaza, tkivni plazminogen aktivator, tripsin, plazmin, ili drugi enzim koji ima proteolitičku aktivnost, mogu se koristiti u jednom primeru izvođenja predmetne objave. Prema jednom postupku predmetne objave, sredstvo je prikačeno preko linkera podložnog odsecanju komplementom. Antitelo se bira iz klase koja može da aktivira komplement. Konjugat antitelo-sredstvo, dakle, aktivira kaskadu komplementa i oslobađa sredstvo na ciljnom mestu. Prema jednom postupku predmetne objave, sredstvo je prikačeno preko linkera podložnog odsecanju enzimima koji imaju proteolitičku aktivnost kao što su urokinaza, tkivni plazminogen aktivator, plazmin ili tripsin. Ovi linkeri koji mogu da se odsecaju korisni su za konjugovanje antitela koja mogu da se aktiviraju, koja uključuju vanćelijski toksin, npr., kao neograničavajući primer, bilo koji od vanćelijskih toksina prikazanih u Tabeli 3.
[0217] Neograničavajući primeri odsecajućih linkerskih sekvenci dati su u Tabeli 4.
[0218] Pored toga, sredstva mogu biti prikačena preko disulfidnih veza (na primer, disulfidne veze na molekulu cisteina) za AB. Pošto mnogi tumori prirodno oslobađaju visoke nivoe glutationa (redukujuće sredstvo) ovo može redukovati disulfidne veze uz posledično oslobađanje sredstva na mestu dostave. U određenim specifičnim primerima izvođenja, redukujuće sredstvo koje bi modifikovalo CM1-CM2 supstrat modifikovalo bi i linker konjugovanog antitela koje može da se aktivira.
[0219] Spejseri i isecajući elementi: U nekim primerima izvođenja, može biti neophodno konstruisati linker tako da se optimizuje razmak između sredstva i AB antitela koje može da se aktivira. Ovo se može postići upotrebom linkera opšte strukture:
1
W - (CH2)n - Q
gde
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je amino-kiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0220] U nekim primerima izvođenja, linker može sadržati spejserski element i element koji može da se seče. Spejserski element služi za pozicioniranje elementa koji može da se seče dalje od središta AB tako da element koji može da se seče bude pristupačniji za enzime odgvorne za sečenje. Neki od granatih linkera opisanih ranije u ovom tekstu mogu služiti kao spejserski elementi.
[0221] U ovoj diskusiji, treba razumeti da prikačinjanje linkera za sredstvo (ili spejserskog elementa za element koji može da se seče, ili elementa koji može da se seče za sredstvo) ne mora biti predstavljeno određenim načinom prikačinjanja ili reakcije. Prihvatljiva je bilo koja reakcija koja obezbeđuje proizvod odgovarajuće stabilnosti i biološke kompatibilnosti.
[0222] Komplement seruma i selekcija linkera: U skladu sa jednim postupkom predmetne objave, kada je poželjno oslobađanje sredstva, koristi se AB koje je antitelo klase koja može aktivirati komplement. Rezultujući konjugat zadržava i sposobnost vezivanja antigena i sposobnost aktivacije kaskade komplementa. Prema tome, u skladu sa ovim primerom izvođenja predmetne objave, sredstvo je spojeno sa jednim krajem linkera koji može da se iseče ili elementa koji može da se iseče, a drugi kraj linkerske grupe je prikačen za specifično mesto na AB. Na primer, ako sredstvo ima hidroksi grupu ili amino grupu, ono može biti prikačeno za karboksi terminus peptida, amino-kiselinu ili drugi pogodno odabrani linker preko estarske odnosno amidne veze. Na primer, takva sredstva mogu biti prikačena za linkerski peptid karbodiimidnom reakcijom. Ako sredstvo sadrži funkcionalnu grupu koja bi interferirala sa prikačinjanjem linkera, ove interferirajuće funkcionalne grupe mogu se blokirati pre prikačinjanja i deblokirati kada se napravi konjugatski proizvod ili intermedijar. Suprotni ili amino terminus linkera se zatim koristi, direktno ili posle dodatne modifikacije, za vezivanje sa AB koje može da aktivira komplement.
[0223] Linkeri (ili spejserski elementi linkera) mogu biti bilo koje željene dužine, jedan njihov kraj može biti kovalentno prikačen za određena mesta na AB antitela koje može da se aktivira. Drugi kraj linkera ili spejserskog elementa može biti vezan za aminokiselinski ili peptidni linker.
2
[0224] Prema tome, kada se ovi konjugati vežu za antigen u prisustvu komplementa, amidna ili estarska veza koja prikačinje sredstvo za linker će se iseći, što će rezultovati oslobađanjem sredstva u njegovoj aktivnoj formi. Kada se ovi konjugati primene kod subjekta, izvršiće isporuku i oslobađanje sredstva na ciljnom mestu, a posebno su efikasni za in vivo isporuku farmaceutskih sredstava, antibiotika, antimetabolita, antiproliferativnih sredstava i slično, kako je predstavljeno, ali nije ograničeno. onima u Tabeli 3.
[0225] Linkeri za oslobađanje bez aktivacije komplementa: U još jednoj primeni ciljane isporuke, poželjno je oslobađanje sredstva bez aktivacije komplementa, pošto će aktivacija kaskade komplementa na kraju lizirati ciljnu ćeliju. Stoga je ovaj pristup koristan kada isporuka i oslobađanje agensa treba da se postignu bez ubijanja ciljne ćelije. Takav je slučaj kada se želi da se ciljnim ćelijama isporuče ćelijski medijatori kao što su hormoni, enzimi, kortikosteroidi, neurotransmiteri, geni ili enzimi. Ovi konjugati se mogu pripremiti prikačinjanjem sredstava za AB koje nije sposobno da aktivira komplement preko linkera koji je blago osetljiv na sečenje serumskim proteazama. Kada se ovaj konjugat primeni kod individue, kompleksi antigenantitelo će se brzo formirati, dok će se sečenje agensa odvijati sporo, što dovodi do oslobađanja jedinjenja na ciljnom mestu.
[0226] Biohemijski unakrsni linkeri: U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira može se konjugovati sa jednim ili više terapijskih sredstava korišćenjem određenih biohemijskih unakrsnih linkera. Reagensi za unakrsno povezivanje formiraju molekularne mostove koji povezuju funkcionalne grupe dva različita molekula. Da bi se postupno povezala dva različita proteina, mogu se koristiti hetero-bifunkcionalni unakrsni linkeri koji eliminišu neželjeno formiranje homopolimera
[0227] Peptidilni linkeri koji se mogu seći lizozomskim proteazama takođe su korisni, Na primer, Val-Cit, Val-Ala ili drugi dipeptidi. Pored toga, mogu se koristiti linkeri labilni u kiseloj sredini, koji se mogu seći u lizozomskom okruženju sa niskim pH, Na primer: bis-sijalil etar. Drugi pogodni linkeri uključuju supstrate osetljive na katepsin, posebno one koji pokazuju optimalnu funkciju pri kiselom pH
[0228] Primeri hetero-bifunkcionalnih unakrsnih linkera navedeni su u Tabeli 5.
4 Sulfhidrili Rastvorljiv u vodi
EDE/Sulfo- Primarni amini Konjugacija hapten-nosač 0
NHS Karboksilne grupe
ABH Ugljeni hidrati Reaguje sa šečernim 11.9 Å
Neselektivni grupama
[0229] Linkeri koji ne mogu da se seku ili direktno prikačinjanje: U nekim primerima izvođenja objave, konjugat može biti dizajniran tako da se sredstvo isporučuje do cilja, ali ne i oslobađa. Ovo se može postići vezivanjem sredstva za AB direktno ili preko linkera koji ne može da se seče.
[0230] Ovi linkeri koji ne mogu da se seku mogu uključivati amino-kiseline, peptide, D-aminokiseline ili druga organska jedinjenja koja se mogu modifikovati da bi uključila funkcionalne grupe koje se kasnije mogu koristiti u prikačinjanju za AB pomoću postupaka opisanih u ovom tekstu. A-opšta formula za takav organski linker može biti
W - (CH2)n - Q
pri čemu
W je ili --NH--CH2-- ili --CH2--;
Q je amino-kiselina, peptid; i
n je ceo broj od 0 do 20.
[0231] Konjugati koji ne mogu da se seku: U nekim primerima izvođenja, jedinjenje može biti prikačeno za AB koje ne aktivira komplement. Kada se koristi AB koje nije sposobno da aktivira komplement, ovo prikačinjanje se može ostvariti korišćenjem linkera koji su podložni sečenju aktiviranim komplementom ili korišćenjem linkera koji nisu podložni sečenju aktiviranim komplementom.
[0232] Ovde objavljena antitela mogu biti formulisana i kao imunolipozomi. Lipozomi koji sadrže antitelo pripremaju se postupcima poznatim u struci, kao što je opisano u Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); i U.S. pat. br. 4,485,045 i 4,544,545. Lipozomi sa produženim vremenom cirkulacije objavljeni su u U.S. patentu br.5,013,556.
[0233] Posebno korisni lipozomi se mogu napraviti postupkom reverzno-fazne evaporacije sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEG-PE). Lipozomi se ekstrudiraju kroz filtere definisane veličine pora da bi se dobili lipozomi željenog prečnika. Fab' fragmenti antitela predmetne objave mogu biti konjugovani sa lipozomima kao što je opisano u Martin et al., J. Biol. Chem., 257: 286-288 (1982) preko reakcije razmene disulfida.
Definicije:
[0234] Ukoliko nije drugačije definisano, naučni i tehnički termini koji se koriste u vezi sa predmetnom objavom imaće značenja koja su uobičajeno razumljiva stručnjacima u ovoj oblasti. Izraz u jednini odnosi se na jedan ili više tih entiteta. Na primer, jedinjenje se odnosi na jedno ili više jedinjenja. Kao takvi, izrazi u jednini, "jedan ili više" i "najmanje jedan" mogu se koristiti naizmenično. Dalje, ukoliko kontekst ne nalaže drugačije, izrazi u jednini uključivaće množinu, a izrazi u množini uključivaće jedninu. Generalno, nomenklatura koja se koristi u vezi sa, i tehnike kulture ćelija i tkiva, molekularne biologije, i hemije proteina i oligoili polinukleotida i hibridizacije, koje su ovde opisane, dobro su poznate i uobičajeno se koriste u struci. Standardne tehnike se koriste za rekombinantnu DNK, sintezu oligonukleotida i kulturu i transformaciju tkiva (npr. elektroporacija, lipofekcija). Enzimske reakcije i tehnike prečišćavanja izvode se u skladu sa specifikacijama proizvođača ili kao što je uobičajeno u struci ili kako je ovde opisano. Gore pomenute tehnike i procedure se generalno izvode u skladu sa konvencionalnim postupcima dobro poznatim u tehnici i kako je opisano u različitim opštim i specifičnijim referencama koje su citirane i diskutovane u ovoj specifikaciji. Vidi npr., Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2. izdanje, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)). Nomenklatura koja se koriste u vezi sa, i laboratorijske procedure i tehnike, analitičke hemije, sintetske organske hemije i medicinske i farmaceutske hemije koje su ovde opisane dobro su poznate i uobičajeno se koriste u struci. Standardne tehnike se koriste za hemijske sinteze, hemijske analize, farmaceutsku pripremu, formulaciju i isporuku i lečenje pacijenata.
[0235] Kako se koriste u skladu sa predmetnom objavom, podrazumeva se da sledeći izrazi, ako nije drugačije naznačeno, imaju sledeća značenja:
[0236] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "antitelo" odnosi se na molekule imunoglobulina i imunološki aktivne delove molekula imunoglobulina (Ig), tj., molekule koji sadrže antigenvezujuće mesto koje se specifično vezuje (imunski reaguje sa) antigenom. Pod "specifično se vezuje" ili "imunski reaguje sa" ili "imunospecifično se vezuje" podrazumeva se da antitelo reaguje sa jednom ili više antigenskih determinanti željenog antigena i ne reaguje sa drugim polipeptidima ili se vezuje sa mnogo nižim afinitetom (Kd> 10<-6>). Antitela uključuju, ali se ne ograničavaju na, poliklonsko, monoklonsko, himerno, domensko antitelo, jednolančano, Fab i F(ab')2 fragmente, scFvs i Fab ekspresionu biblioteku.
[0237] Poznato je da osnovna strukturna jedinica antitela sadrži tetramer. Svaki tetramer se sastoji od dva identična para polipeptidnih lanaca, pri čemu svaki par ima jedan "laki" (oko 25 kDa) i jedan "teški" lanac (oko 50-70 kDa). Amino-terminalni deo svakog lanca uključuje varijabilni region od oko 100 do 110 ili više amino-kiselina prvenstveno odgovornih za prepoznavanje antigena. Karboksi-terminalni deo svakog lanca definiše konstantni region prvenstveno odgovoran za efektorsku funkciju. Uopšteno, molekuli antitela dobijeni od ljudi odnose se na bilo koju od klasa IgG, IgM, IgA, IgE i IgD, koje se međusobno razlikuju po prirodi teškog lanca prisutnog u molekulu. Određene klase takođe imaju potklase, kao što su IgG1, IgG2i druge. Pored toga, kod ljudi, laki lanac može biti kapa lanac ili lambda lanac.
[0238] Izraz „monoklonsko antitelo“ (mAb) ili „kompozicija monoklonskog antitela“, kako se koristi u ovom tekstu, odnosi se na populaciju molekula antitela koja sadrži samo jednu molekularnu vrstu molekula antitela koja se sastoji od jedinstvenog lakolančanog genskog proizvoda i jedinstvenog teškolančanog genskog proizvoda. Konkretno, regioni koji određuju komplementarnost (complementarity determining regions, CDR) monoklonskog antitela su identični u svim molekulima populacije. MAb sadrže antigen-vezujuće mesto koje je sposobno da reaguje sa određenim epitopom antigena koji se karakteriše jedinstvenim afinitetom vezivanja za njega.
[0239] Termin "antigen-vezujuće mesto" ili "vezujući deo" odnosi se na deo molekula imunoglobulina koji učestvuje u vezivanju antigena. Antigen-vezujuće mesto formiraju aminokiselinske rezidue N-terminalnih varijabilnih ("V") regiona teških ("H") i lakih ("L") lanaca. Tri veoma divergentna niza unutar V regiona teških i lakih lanaca, koja se nazivaju "hipervarijabilni regioni", smeštena su između više konzerviranih bočnih delova poznatih kao "okvirni regioni" ("frame work") ili "FR". Prema tome, izraz "FR" se odnosi na sekvence amino-kiselina koje se prirodno nalaze između i pored hipervarijabilnih regiona u imunoglobulinima. U molekulu antitela, tri hipervarijabilna regiona lakog lanca i tri hipervarijabilna regiona teškog lanca raspoređena su jedan u odnosu na drugi u trodimenzionalnom prostoru tako da formiraju antigen-vezujuću površinu. Antigen-vezujuća površina je komplementarna trodimenzionalnoj površini vezanog antigena, a tri hipervarijabilna regiona svakog od teškog i lakog lanca nazivaju se „regioni koji određuju komplementarnost“ ili „CDR“. Označavanje amino-kiselina u svakom domenu u skladu je sa definicijama Kabat-ovih sekvenci proteina od imunološkog interesa (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 i 1991)), ili Chothia & Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), Chothia et al. Nature 342:878-883 (1989).
[0240] Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin, scFv ili T-ćelijski receptor. Izraz "epitop" uključuje bilo koju proteinsku determinantu sposobnu da se specifično veže za imunoglobulin ili T-ćelijski receptor. Epitopske determinante se obično sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su amino-kiseline ili bočni lanci šećera i obično imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike, kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Na primer, antitela mogu da se naprave protiv N-terminalnih ili C-terminalnih peptida polipeptida.. Kaže se da se antitelo specifično vezuje za antigen kada je konstanta disocijacije ≤ 1 µM; U nekim primerima izvođenja, ≤ 100 nM i u nekim primerima izvođenja, ≤ 10 nM.
[0241] Kako se koristi u ovom tekstu, izrazi"specifično vezivanje", "imunološko vezivanje" i "imunološka vezujuća svojstva" odnose se na nekovalentne interakcije tipa koji se sreće između molekula imunoglobulina i antigena za koji je imunoglobulin specifičan. Snaga, ili afinitet imunoloških vezujućih interakcija, može se izraziti u okvirima konstante disocijacije (Kd) interakcije, pri čemu manja Kdpredstavlja veći afinitet. Imunološka vezujuća svojstva odabranih polipeptida mogu se kvantifikovati korišćenjem postupaka dobro poznatih u struci. Jedan takav postupak podrazumeva merenje stope formiranja i disocijacije kompleksa antigenvezujuće mesto/antigen, pri čemu te stope zavise od koncentracija partnera u kompleksu, afiniteta interakcije i geometrijskih parametara koji podjednako utiču na brzinu u oba smera. Dakle, i "konstanta brzine vezivanja" (on rate constant, Kon) i "konstanta brzine otpuštanja" (off rate constant, Koff) mogu se odrediti izračunavanjem koncentracija i stvarnih stopa asocijacije i disocijacije. (Vidi Nature 361:186-87 (1993)). Odnos Koff/Konomogućava poništavanje svih parametara koji nisu vezani za afinitet, i jednak je konstanti disocijacije Kd. (Vidi, generalno, Davies et al. (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Za antitelo predmetne objave se kaže da se specifično vezuje za cilj, kada je konstanta vezivanja (Kd) ≤1 µM, u nekim primerima izvođenja ≤ 100 nM, u nekim primerima izvođenja ≤ 10 nM, i u nekim primerima izvođenja ≤ 100 pM do oko 1 pM, kako je izmereno testovima kao što su testovi vezivanja radioliganda ili slični testovi poznati stručnjacima u oblasti.
[0242] Izraz "izolovani polinukleotid" kako se koristi u ovom tekstu će označavati polinukleotid genomskog, cDNK ili sintetskog porekla ili neku kombinaciju istog, koji zbog svog porekla "izolovani polinukleotid" (1) nije udružen sa celim ili delom polinukleotida u kojem se "izolovani polinukleotid" nalazi u prirodi, (2) operabilno je povezan sa polinukleotidom sa kojim nije povezan u prirodi, ili (3) ne pojavljuje se u prirodi kao deo veće sekvence. Polinukleotidi u skladu sa objavom obuhvataju molekule nukleinske kiseline koji kodiraju teškolančane imunoglobulinske molekule prikazane u ovom tekstu, i molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lakolančane imunoglobulinske molekule prikazane u ovom tekstu.
[0243] Izraz "izolovani protein" pomenut u ovo tekstu označava protein cDNK, rekombinantne RNK ili sintetskog porekla ili neku njihovu kombinaciju, koji na osnovu svog porekla, ili izvora derivacije, "izolovani protein" (1) nije povezan sa proteinima koji se nalaze u prirodi, (2) ne sadrži druge proteine iz istog izvora, npr., ne sadrži mišje proteine, (3) eksprimira se u ćeliji druge vrste, ili (4) se ne sreće u prirodi.
[0244] Izraz "polipeptid" koristi se u ovom tekstu kao generički izraz koji se odnosi na prirodni protein, fragmente ili analoge polipeptidne sekvence. Prema tome, nativni proteinski fragmenti i analozi su vrste roda polipeptida. Polipeptidi u skladu sa objavom obuhvataju teškolančane imunoglobulinske molekule prikazane u ovom tekstu, i lakolančane imunoglobulinske molekule prikazane u ovom tekstu, kao i molekule antitela formirane kombinacijama koje sadrže teškolančane imunoglobulinske molekule i lakolančane imunoglobulinske molekule, na primer kapa lakolančane imunoglobulinske molekule, i obrnuto, kao i njihove fragmente i analoge.
[0245] Izraz „koji se javlja prirodno“ kako se koristi u ovom tekstu kada se primenjuje na objekat odnosi se na činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, polipeptidna ili polinukleotidna sekvenca koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) koja se može izolovati iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji ili na neki drugi način, ona je koja se javlja u prirodi.
[0246] Izraz "operabilno povezan" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na tako opisane pozicije komponenti koje su u međusobnom odnosu koji im omogućava da funkcionišu na predviđeni način. Kontrolna sekvenca "operabilno povezana" sa kodirajućom sekvencom povezana je tako da se ekspresija kodirajuće sekvence postiže pod uslovima kompatibilnim sa kontrolnim sekvencama.
[0247] Izraz "kontrolna sekvenca" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na polinukleotidne sekvence neophodne za vršenje ekspresije i obrade kodirajućih sekvenci sa kojima su povezane. Priroda takvih kontrolnih sekvenci se razlikuje u zavisnosti od organizma domaćina u prokariotima, takve kontrolne sekvence generalno uključuju promotor, mesto vezivanja ribozoma i sekvencu za završetak transkripcije kod eukariota, generalno, takve kontrolne sekvence uključuju promotore i sekvencu za završetak transkripcije. Izraz "kontrolne sekvence" treba da obuhvati, kao minimum, sve komponente čije je prisustvo bitno za ekspresiju i obradu, a takođe može uključiti dodatne komponente čije je prisustvo korisno, Na primer, liderske sekvence i sekvence fuzionog partnera. Izraz "polinukleotid" kako se ovde navodi označava nukleotide duge najmanje 10 baza, bilo ribonukleotide ili deoksinukleotide ili modifikovani oblik bilo kog tipa nukleotida. Izraz uključuje jednolančane i dvolančane forme DNK.
[0248] Izraz oligonukleotid koji se navodi u ovom tekstu uključuje prirodne i modifikovane nukleotide međusobno povezane oligonukleotidnim vezama koje se javljaju u prirodi i koje se ne pojavljuju u prirodi. Oligonukleotidi predstavljaju podgrupu polinukleotida koji su generalno dugi 200 baza ili manje. U nekim primerima izvođenja, oligonukleotidi imaju dužinu od 10 do 60 baza i u nekim primerima izvođenja, dužinu od 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ili 20 do 40 baza. Oligonukleotidi su obično jednolančani, npr., za probe, iako oligonukleotidi mogu biti dvolančani, npr., za upotrebu u konstrukciji genskog mutanta. Oligonukleotidi objave su ili sense ili antisense oligonukleotidi.
[0249] Izraz "nukleotidi koji se sreću u prirodi" koji se pominje u ovom tekstu uključuje dezoksiribonukleotide i ribonukleotide. Izraz "modifikovani nukleotidi" koji se pominje u ovom tekstu uključuje nukleotide sa modifikovanim ili supstituisanim šećernim grupama i slično. Izraz "oligonukleotidne veze" koji se pominje u ovom tekstu uključuje oligonukleotidne veze kao što su fosforotioat, fosforoditioat, fosforoselenoat, fosforodiselenoat, fosforoanilotioat, fosforaniladat, fosforonmidat i slično. Vidi npr., LaPlanche et al. Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al. J. Am. Chem. Soc.106:6077 (1984), Stein et al. Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon et al. Anti Cancer Drug Design 6:539 (1991); Zon et al. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp.87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec et al. U.S. patent br.5,151,510; Uhlmann and Peyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Oligonukleotid može uključiti obeleživač za detekciju, po želji.
[0250] Kako se koristi u ovom tekstu, dvadeset konvencionalnih amino-kiselina i njihove skraćenice upotrebljavaju se na uobičajen način. Vidi Immunology - A Synthesis (2. izdanje, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Stereoizomeri (npr., D-amino-kiseline) dvadeset konvencionalnih amino-kiselina, neprirodnih aminokiselinakao što su α-, α-disupstituisane amino-kiseline, N-alkil amino-kiseline, mlečna kiselina i druge nekonvencionalne amino-kiseline mogu takođe biti pogodne komponente polipeptida predmetne objave. Primeri nekonvencionalnih amino-kiselina uključuju: 4-hidroksiprolin, γkarboksiglutamat, ε-N,N,N-trimetillizin, ε -N-acetillizin, O-fosfoserin, N-acetilserin, N-formilmetionin, 3-metilhistidin, 5-hidroksilizin, σ-N-metilarginin, i druge slične amino-kiseline i imino-kiseline (npr., 4- hidroksiprolin). U zapisima polipeptida upotrebljenim u ovom tekstu, u smeru levo je amino terminus a u smeru desno je karboksi-terminus, u skladu sa standardnom upotrebom i konvencijom.
[0251] Slično tome, ukoliko nije drugačije naznačeno, levi kraj jednolančanih polinukleotidnih sekvenci je 5' kraj, a smer nalevo dvolančanih polinukleotidnih sekvenci označen je kao 5' smer. Smer 5' ka 3' dodavanja nascentnih RNK transkripata označava se kao smer transkripcije regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 5' ka 5' kraju RNK transkripta označavaju se kao "uzvodne sekvence", regioni sekvence na DNK lancu koji imaju istu sekvencu kao RNK i koji su 3' ka 3' kraju RNK transkripta označavaju se kao "nizvodne sekvence".
[0252] Kada se primenjuje na polipeptide, izraz „suštinska identičnost “ znači da dve peptidne sekvence, kada su optimalno poravnate, na primer programima GAP ili BESTFIT uz korišćenje zadate težine procepa, imaju najmanje 80 procenata sekvencione identičnosti, U nekim primerima izvođenja, najmanje 90 procenata sekvencione identičnosti, u nekim primerima izvođenja, najmanje 95 procenata sekvencione identičnosti, i u nekim primerima izvođenja, najmanje 99 procenata sekvencione identičnosti.
[0253] U nekim primerima izvođenja, pozicije rezidua koje nisu identične razlikuju se po konzervativnim aminokiselinskim supstitucijama.
[0254] Kako se diskutuje u ovom tekstu, smatra se da su male varijacije u aminokiselinskim sekvencamaa molekula antitela ili imunoglobulina obuhvaćene predmetnom objavom, uz uslov da varijacije u sekvenci amino-kiselina zadržavaju najmanje 75%, u nekim primerima izvođenja, najmanje 80%, 90%, 95%, i u nekim primerima izvođenja, 99%. Konkretno, razmatraju se konzervativne zamene amino-kiselina. Konzervativne zamene su one koje se odvijaju unutar familije amino-kiselina srodnih prema svojim bočnim lancima. Genetički kodirane amino-kiseline se generalno dele na familije: (1) kisele amino-kiseline su aspartat, glutamat; (2) bazne amino-kiseline su lizin, arginin, histidin; (3) nepolarne amino-kiseline su alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan i (4) nenaelektrisane polarne amino-kiseline su glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin. Hidrofilne amino-kiseline uključuju arginin, asparagin, aspartat, glutamin, glutamat, histidin, lizin, serin i treonin. Hidrofobne amino-kiseline uključuju alanin, cistein, izoleucin, leucin, metionin, fenilalanin, prolin, triptofan, tirozin i valin. Druge familije amino-kiselina uključuju (i) serin i treonin, koji pripadaju alifatično-hidroksi familiji; (ii) asparagin i glutamin, koji pripadaju familiji amino-kiselina koje sadrže amid; (iii) alanin, valin, leucin i izoleucin, koji pripadaju familiji alifatičnih amino-kiselina; i (iv) fenilalanin, triptofan i tirozin, koji pripadaju familiji
1
aromatičnih amino-kiselina. Na primer, razumno je očekivati da izolovana zamena leucina izoleucinom ili valinom, aspartata glutamatom, treonina serinom, ili slična zamena aminokiseline strukturno srodnom amino-kiselinom neće imati veliki efekat na vezivanje ili svojstva rezultujućeg molekula, posebno ako zamena ne uključuje amino-kiselinu unutar regiona okvira. Da li promena amino-kiseline rezultuje funkcionalnim peptidom može se lako utvrditi ispitivanjem specifične aktivnosti polipeptidnog derivata. Testovi su detaljno opisani u ovom tekstu. Fragmente ili analoge antitela ili molekula imunoglobulina mogu lako pripremiti prosečno obučeni stručnjaci u oblasti. Pogodni amino- i karboksi-terminusi fragmenata ili analoga sreću se u blizini granica funkcionalnih domena. Strukturni i funkcionalni domeni se mogu identifikovati upoređivanjem podataka o sekvenci nukleotida i/ili amino-kiselina sa javnim ili vlasničkim bazama podataka sekvenci. U nekim primerima izvođenja, kompjuterizovani postupci upoređivanja koriste se za identifikaciju sekvencionih motiva ili predviđenih proteinskih konformacionih domena koji se javljaju u drugim proteinima poznate strukture i/ili funkcije. Poznati su postupci za identifikaciju proteinskih sekvenci koje se savijaju u poznatu trodimenzionalnu strukturu. Bovie et al. Science 253:164 (1991). Prema tome, prethodni primeri pokazuju da stručnjaci u ovoj oblasti mogu prepoznati sekvencione motive i strukturne konformacije, koji se mogu koristiti za definisanje strukturnih i funkcionalnih domena u skladu sa objavom.
[0255] Pogodne supstitucije amino-kiselina su one koje: (1) smanjuju podložnost proteolizi, (2) smanjuju podložnost oksidaciji, (3) menjaju vezujući afinitet za formiranje proteinskih kompleksa, (4) menjaju vezujuće afinitete i (5) daju ili modifikuju druge fizičko-hemijske ili funkcionalne osobine takvih analoga. Analozi mogu uključiti različite muteine sekvence koja nije prirodna peptidna sekvenca. Na primer, pojedinačne ili višestruke aminokiselinske supstitucije (na primer, konzervativne aminokiselinske supstitucije) mogu se napraviti u prirodnoj sekvenci (na primer, u delu polipeptida van domena koji formira(-ju) intermolekularne kontakte. Konzervativna aminokiselinska supstitucija ne bi trebalo suštinski da promeni strukturne karakteristike roditeljske sekvence (npr. zamenska amino-kiselina ne bi trebalo da ima tendenciju da prekine zavojnicu koja se javlja u roditeljskoj sekvenci, ili da poremeti druge tipove sekundarne strukture karakteristične za roditeljsku sekvencu). Primeri sekundarnih i tercijarnih struktura polipeptida priznatih u struci opisani su u Proteins, Structures and Molecular Principles (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); i Thornton et at. Nature 354:105 (1991).
[0256] Izraz "polipeptidni fragment" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na polipeptid koji
2
ima amino-terminalnu i/ili karboksi-terminalnu deleciju i/ili jednu ili više unutrašnjih delecija, ali gde je preostala aminokiselinska sekvenca identična sa odgovarajućim pozicijama u prirodnoj sekvenci koja je izvedena, na primer, iz cDNK sekvence pune dužine. Fragmenti su tipično dugi najmanje 5, 6, 8 ili 10 amino-kiselina, u nekim primerima izvođenja, najmanje 14 amino-kiselina, u nekim primerima izvođenja, najmanje 20 amino-kiselina, obično najmanje 50 amino-kiselina, i u nekim primerima izvođenja, dugi su najmanje 70 amino-kiselina. Izraz "analogni" kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na polipeptide koji se sastoje od segmenta od najmanje 25 amino-kiselina koji je suštinski identičan sa delom dedukovane aminokiselinske sekvence i koji se specifično vezuje za cilj, pod pogodnim uslovima vezivanja. Tipično, polipeptidni analozi sadrže konzervativnu aminokiselinsku supstituciju (ili adiciju ili deleciju) u odnosu na sekvencu koja se javlja u prirodi. Analozi su tipično dugi najmanje 20 aminokiselina, U nekim primerima izvođenja, najmanje 50 amino-kiselina ili duži, i često mogu biti dugi kao prirodni polipeptid pune dužine.
[0257] Izraz "sredstvo" koristi se u ovom tekstu da označi hemijsko jedinjenje, smešu hemijskih jedinjenja, biološki makromolekul ili ekstrakt napravljen od bioloških materijala.
[0258] Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "obeleživač" ili "obeležen" odnose se na inkorporisanje detektabilnog markera, npr., inkorporisanje radio-obeležene amino-kiseline ili prikačinjanje za polipeptid biotinisanih komponenti koje se mogu detektovati markiranim avidinom (npr., streptavidin koji sadrži fluorescentni marker ili enzimsku aktivnost koja se može detektovati optičkim ili kalorimetrijskim postupcima). U određenim situacijama, obeleživač ili marker može biti i terapijsko sredstvo. Različiti postupci obeležavanja polipeptida i glikoproteina su poznati u struci i mogu se koristiti. Primeri obeleživača za polipeptide uključuju, ali se ne ograničavaju, na sledeće: radioizotope ili radionuklide (npr.,<3>H,<14>C,<15>N,<35>S,<90>Y,<99>Tc,<111>In,<125>I,<131>I), fluorescentne obeleživače (npr., FITC, rodamin, lantanid fosfore), enzimske obeleživače (npr., peroksidaza rena, β-galaktozidaza, luciferaza, alkalna fosfataza), hemiluminiscentne, biotinizovane grupe, predeterminisane polipeptidne epitope koje prepoznaje sekundarni reporter (npr., par sekvenci leucinskog zatvarača, vezujuća mesta za sekundarna antitela, metal-vezujući domeni, epitopske oznake). U nekim primerima izvođenja, oznake se prikačinju spejserskim ručicama različite dužine da bi se smanjilo potencijalno sterično ometanje. Izraz "farmaceutsko sredstvo ili lek" kako se koristi u ovom tekstu označava hemijsko jedinjenje ili kompoziciju koja može da indukuje željeni terapijski efekat kada se ispravno primeni kod pacijenta.
[0259] Drugi hemijski izrazi u ovom tekstu koriste se u skladu sa konvencionalnom upotrebom u struci, kako je na primer dato u The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).
[0260] Kako se koristi u ovom tekstu, "suštinski čist" znači da je predmetna vrsta preovlađujuće prisutna vrsta (tj., na molarnoj osnovi je zastupljenija od bilo koje druge pojedinačne vrste u kompoziciji), i u nekim primerima izvođenja, suštinski prečišćena frakcija je kompozicija u kojoj predmetna vrsta čini najmanje oko 50 procenata (na molarnoj osnovi) od svih prisutnih makromolekularnih vrsta.
[0261] Generalno, suštinski čista kompozicija će sadržati više od oko 80 procenata od svih makromolekularnih vrsta prisutnih u kompoziciji, U nekim primerima izvođenja, više od oko 85%, 90%, 95% i 99%. U nekim primerima izvođenja, predmetna vrsta se prečišćava do suštinske homogenosti (kontaminirajuće vrste se ne mogu otkriti u kompoziciji konvencionalnim postupcima detekcije) pri čemu se kompozicija u suštini sastoji od jedne makromolekularne vrste.
[0262] Izraz pacijent podrazumeva čoveka i veterinarske subjekte.
[0263] Antitela koja mogu da se aktiviraju objave specifično se vezuje za dati cilj, npr., humani ciljni protein. U objavu su uključena i antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za isti epitop kao i antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom tekstu.
[0264] Stručnjaci u oblasti će prepoznati da je moguće utvrditi, bez nepotrebnog eksperimentisanja, da li monoklonsko antitelo (npr. mišje monoklonsko ili humanizovano antitelo) ima istu specifičnost kao monoklonsko antitelo koje se koristi u postupcima opisanim u ovom tekstu, utvrđivanjem da li ovo prvo sprečava da se drugo veže za cilj. Ako monoklonsko antitelo koje se testira kompetira sa monoklonskim antitelom objave, što se pokazuje smanjenjem vezivanja korišćenjem monoklonskog antitela objave, onda se dva monoklonska antitela vezuju za isti, ili blisko povezan, epitop. Postupak za određivanje da li monoklonsko antitelo ima specifičnost monoklonskog antitela objave je da se monoklonsko antitelo objave preinkubira sa ciljem, a zatim da se doda monoklonsko antitelo koje se testira da bi se utvrdilo da li je monoklonsko antitelo koje se testira inhibirano u svojoj sposobnosti da se veže sa ciljem. Ako je monoklonsko antitelo koje se testira inhibirano, onda, po svoj prilici, ono ima istu, ili funkcionalno ekvivalentnu, epitopsku specifičnost kao monoklonsko antitelo objave.
Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju
[0265] Objava obezbeđuje i multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu su multispecifična antitela koja prepoznaju dva ili više različitih antigena ili epitopa i koja uključuju najmanje jednu
4
maskirajuću komponentu (MM) povezanu sa najmanje jednim antigen- ili epitop-vezujućim domenom multispecifičnog antitela tako da kuplovanje MM smanjuje sposobnost antigen- ili epitop-vezjućeg domena da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, MM je povezana sa antigen- ili epitop-vezujućim domenom multispecifičnog antitela preko CM1-CM2 supstrata koji funkcioniše kao supstrat za najmanje jednu MMP proteazu i najmanje jednu SP. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu su stabilna u cirkulaciji, aktiviraju se na mestima predviđenim za lečenje i/ili dijagnozu, ali ne u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada se aktiviraju, pokazuju vezivanje za cilj koje je bar uporedivo sa odgovarajućim, nemodifikovanim multispecifičnim antitelom.
[0266] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju dizajnirana su tako da angažuju imunske efektorske ćelije, i ovde su označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja angažuju imunske efektorske ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju dizajnirana su tako da angažuju leukocite, i u ovom tekstu su označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja angažuju leukocite. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju dizajnirana su tako da angažuju T ćelije, i u ovom tekstu su označena i kao multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, koja angažuju T ćelije. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju angažuju površinski antigen na leukocitu, na primer na T ćeliji, na ćeliji prirodnom ubici (NK), na mijeloidnoj mononuklearnoj ćeliji, na makrofagu, i/ili. na drugoj imunskoj efektorskoj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je T ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je mononuklearna ćelija, kao što je mijeloidna mononuklearna ćelija. U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju dizajnirana su tako da se vezuju ili na drugi način interaguju sa više nego jednim ciljem i/ili više nego jednim epitopom, i u ovom tekstu su označena i kao multi-antigen ciljajuća antitela koja mogu da se aktiviraju. Kako se koriste u ovom tekstu, izrazi "cilja" i "antigen" koriste se naizmenično.
[0267] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju, objave, koja angažuju imunsku efektorsku ćeliju uključuju ciljajuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment i antitelo koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu je najmanje jedan od ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi cilj imunske efektorske ćelije koja se angažuje, pri čemu se AB1 prikačinje za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže sa drugim ciljem. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi cilj koji angažuje imunsku efektorsku ćeliju, pri čemu se AB1 prikačinje za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj, i ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje ne angažuje imunsku efektorsku ćeliju je antitelo koje cilja kancer. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje ne afektuje imunsku ćeliju je IgG. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju je scFv. U nekim primerima izvođenja ciljajuće antitelo (npr., antitelo koje n eafektuje imunsku ćeliju) je IgG, a antitelo koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju je scFv. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je leukocit. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je T ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je NK ćelija. U nekim primerima izvođenja, imunska efektorska ćelija je mijeloidna mononuklearna ćelija.
[0268] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju objave uključuju ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu je najmanje jedan od ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje angažuje T-ćeliju ili njegovog antigenvezujućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi, T-ćelijski angažujući cilj, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T ćeliju, ili njegov antigen-vezujući fragment, uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi, T-ćelijski angažujući cilj, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj, a ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj.
[0269] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja angažuju T-ćelije uključuju kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i antitelo koje angažuje T-ćeliju, ili njegov antigen-vezujući deo, pri čemu je najmanje jedan od kancer-ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje angažuje T-ćeliju ili njegovog antigen-vezujućeg dela, maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi T-ćelijski angažujući cilj, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB 1 da se veže za prvi cilj. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj u vezi sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za prvi cilj koji angažuje T-ćeliju, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 redukuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj, a kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj povezan sa kancerom.
[0270] U nekim primerima izvođenja, multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju koja angažuju T-ćeliju uključuju kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment i scFv koji angažuje T-ćeliju, pri čemu je najmanje jedan od kancer-ciljajućeg IgG antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili antitela koje angažuje T-ćeliju ili njegovog antigenvezujućeg dela, maskiran. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje sa prvim, T-ćelijskim angažujućim ciljem, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigenvezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj povezan sa kancerom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje angažuje T-ćeliju ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje sa prvim, T-ćelijskim angažujućim ciljem, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za prvi cilj, i kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj povezan sa kancerom.
[0271] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, koje angažuje imunsku efektorsku ćeliju, jedan antigen je tipično antigen prisutan na površini tumorske ćelije ili drugog tipa ćelije udružene sa oboljenjem, na primer, bez ograničavanja, bilo koji cilj naveden u Tabeli 1, na primer, bez ograničavanja, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3,ili CD71 (transferinski receptor), a drugi antigen je tipično stimulatorni ili inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelije, ćelije-prirodnog ubice (NK), mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili druge imunske efektorske ćelije, na primer, bez ograničavanja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. U nekim primerima izvođenja, antigen je stimulatorni receptor prisutan na površini T ćelije ili NK ćelije; primeri takvih stimulatornih receptora uključuju, ali se ne ograničavaju na, CD3, CD27, CD28, CD137 (označen i kao 4-1BB), GITR, HVEM, ICOS, NKG2D, i OX40. U nekim primerima izvođenja, antigen je inhibitorni receptor prisutan na površini T ćelije; primeri takvih inhibitornih receptora uključuju, ali se ne ograničavaju na, BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, i KIR eksprimirane na NK. Domen antitela koji daje specifičnost za T-ćelijski površinski antigen može takođe biti supstituisan ligandom ili ligandskim domenom koji se vezuje za T-ćelijski receptor, NK-ćelijski receptor, receptor makrofaga, i/ili receptor druge imunske efektorske ćelije, kao što je, bez ograničavanja, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ili TNFSF9.
[0272] Jedan primer izvođenja objave je multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje može da se aktivira u kancerskom mikrookruženju i koje uključuje antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno ka tumorskom cilju i agonističko antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno prema kostimulatornom receptoru eksprimiranom na površini aktivirane T ćelije ili NK ćelije, pri čemu je najmanje jedno od kancer-ciljajućeg antitela i/ili agonističkog antitela maskirano. Primeri kostimulatornih receptora uključuju, ali se ne ograničavaju na, CD27, CD137, GITR, HVEM, NKG2D, i OX40. U ovom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, kada se aktivira tumor-asociranim proteazama, efikasno će se unakrsno povezati i aktivirati kostimulatorne receptore eksprimirane na T ćeliji ili NK ćeliji na tumor-zavisan način da bi se pojačala aktivnost T ćelija koje odgovaraju na bilo koji tumorski antigen preko svog endogenog T ćelijskog antigena ili NK-aktivirajućih receptora. Aktivaciono zavisna priroda ovih T ćelijskih ili NK ćelijskih kostimulatornih receptora usmeriće aktivnost aktiviranog multispecifičnog antitela koje može da se aktivira na tumor-specifične T ćelije, bez aktiviranja svih T ćelija nezavisno od njihove antigenske specifičnosti. U jednom primeru izvođenja, najmanje kostimulatorno receptorsko antitelo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira maskirano je da bi sprečilo aktivaciju autoreaktivnih T ćelija koje mogu biti prisutne u tkivima koja takođe eksprimiraju antigen koji prepoznaje antitelo usmereno na tumorski cilj u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, ali čija je aktivnost ograničena nedostatkom angažovanja koreceptora.
[0273] Jedan primer izvođenja objave je multispecifični antitelo koje može da se aktivira koje se može aktivirati u bolesti koja se karakteriše preteranom stimulacijom T ćelija, kao što je, bez ograničavanja, autoimunska bolest ili mikrookruženje zapaljenske bolesti. Takvo multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno ka cilju koji sadrži površinski antigen eksprimiran u tkivu koje cilja T ćelija u autoimunskoj ili zapaljenskoj bolesti i antitelo, na primer IgG ili scFv, usmereno ka inhibitornom receptoru eksprimiranom na površini T ćelije ili NK ćelije, pri čemu je bar jedno od antitela za cilj u obolelom tkivu i/ili antitela za T ćelijski inhibitorni receptor, maskirano. Primeri inhibitornih receptora uključuju, ali se ne ograničavaju na BTLA, CTLA-4, LAG3, PD-1, TIGIT, TIM3, i KIR eksprimirane na NK ćelijama. Primeri tkivnih antigena ciljanih T ćelijama u autoimunskom oboljenju uključuju, ali se ne ograničavaju na površinski antigen eksprimiran na mijelinu ili nervnim ćelijama u multiploj sklerozi ili površinski antigen eksprimiran na ćelijama pankreasnog ostrvca u dijabetesu tipa 1. U ovom primeru izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira, kada se lokalizuje u tkivu koje je pod autoimunskim napadom ili zapaljenjem, aktivira se i koangažuje T ćelijski ili NK ćelijski inhibitorni receptor da bi se suprimirala aktivnost autoreaktivnih T ćelija koje odgovaraju na sve antigene ciljanog obolelog tkiva preko svojih endogenih TCR ili aktivirajućih receptora. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedno ili veliki broj antitela je maskirano da bi se sprečila supresija odgovora T ćelija u neobolelim tkivima u kojima ciljni antigen takođe može da se eksprimira.
[0274] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje angažuje T-ćeliju koje može da se aktivira uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε, označen u ovom tekstu i kao CD3ε i CD3) scFv i ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, gde je najmanje jedan od anti-CD3ε scFv i/ili ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, gde je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se vezuje za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, gde je AB2 vezano za maskirajuću komponentu. (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, gde je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se vezuje za CD3ε, i ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, gde je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu ( MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se vezuje za drugi cilj.
[0275] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje anti-CD3ε scFv i kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, pri čemu je najmanje jedno od anti-CD3ε scFv i/ili kancer-ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskirano. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan
1
sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε, i kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj.
[0276] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje anti-CD3ε scFv i kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, pri čemu je najmanje jedan od anti-CD3ε scFv i/ili kancer-ciljajućeg IgG antitela ili njegovog antigen-ciljajućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov antigenvezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj povezan sa kancerom, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj. U nekim primerima izvođenja, CD3ε scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε, i kancer-ciljajuće antitelo IgG ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi, sa kancerom povezani cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj.
[0277] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje anti-CD3 epsilon (CD3ε) scFv koji je izveden iz OKT3, pri čemu je najmanje jedan od ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili OKT3 scFv ili OKT3-izvedenog scFv maskiran. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje
1 1
MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε, i ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj.
[0278] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv i kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je najmanje jedan od OKT3 scFv ili OKT3-izvedenog scFv i/ili kancer-ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigenvezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi, sa kancerom povezan cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε, i kancer-ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi, sa kancerom povezani cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj.
[0279] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv i kancer-ciljajuće IgG antitelo
1 2
ili njegov antigen-vezujući fragment, pri čemu je najmanje jedan od OKT3 scFv ili OKT3-izvedenog scFv i/ili kancer-ciljajućeg IgG antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε. U nekim primerima izvođenja, kancer-ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi sa kancerom povezani cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj. U nekim primerima izvođenja, OKT3 scFv ili OKT3-izvedeni scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CD3ε, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CD3ε, i kancer-ciljajuće antitelo IgG ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi, sa kancerom povezani cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi, sa kancerom povezani cilj.
[0280] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje anti-CTLA-4 scFv, pri čemu je najmanje jedan od ciljajućeg antitela ili njegovog antigen-vezujućeg fragmenta i/ili anti-CTLA-4 scFv maskiran. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CTLA-4, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CTLA-4. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CTLA-4, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CTLA-4, i ciljajuće antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da
1
kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj.
[0281] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje angažuje T ćeliju uključuje anti-CTLA-4 scFv i ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigenvezujući fragment, pri čemu je najmanje jedan od anti-CTLA-4 scFv i/ili ciljajućeg IgG antitela ili njegovog antigen-vezujućeg dela maskiran. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se vezuje za CTLA-4, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CTLA-4. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće IgG antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj. U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koje se vezuje za CTLA-4, pri čemu je AB1 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM1) tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za CTLA-4, i ciljajuće antitelo IgG ili njegov antigen-vezujući fragment uključuje drugo antitelo ili njegov fragment koji uključuje drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje za drugi cilj, pri čemu je AB2 prikačeno za maskirajuću komponentu (MM2) tako da kuplovanje MM2 smanjuje sposobnost AB2 da se veže za drugi cilj.
[0282] U nekim primerima izvođenja, antitela koja ciljaju veliki broj antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja ciljaju veliki broj antigena uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za prvi cilj i/ili prvi epitop i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se vezuje za drugi cilj i/ili drugi epitop. U nekim primerima izvođenja, antitela koja ciljaju veliki broj antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja ciljaju veliki broj antigena vezuju se za dva ili više različitih ciljeva. U nekim primerima izvođenja, antitela koja ciljaju veliki broj antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja ciljaju veliki broj antitela vezuju se za dva ili više različitih epitopa na istom cilju. U nekim primerima izvođenja, antitela koja ciljaju veliki broj antigena i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja ciljaju veliki broj antitela vezuju se za kombinaciju dva ili više različitih ciljeva i dva ili više različitih epitopa na istom cilju.
[0283] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje IgG ima maskirane varijabilne domene IgG. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje scFv ima maskirane scFv domene. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i
1 4
IgG varijabilne domene i scFv domene, pri čemu je najmanje jedan od IgG varijabilnih domena kuplovan sa maskirajućom komponentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, pri čemu je najmanje jedan od scFv domena kuplovan sa maskirajućom komponentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, pri čemu je najmanje jedan od IgG varijabilnih domena kuplovan sa maskirajućom komponentom i najmanje jedan od scFv domena je kuplovan sa maskirajućom komponentom. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira ima i IgG varijabilne domene i scFv domene, pri čemu je svaki od IgG varijabilnih domena i scFv domena kuplovan sa svojom maskirajućom komponentom. U nekim primerima izvođenja, jedan domen multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za ciljni antigen i drugi domen antitela ima specifičnost za T-ćelijski površinski antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za ciljni antigen i drugi domen antitela ima specifičnost za drugi ciljni antigen. U nekim primerima izvođenja, jedan domen multispecifičnog antitela koje može da se aktivira ima specifičnost za epitop ciljnog antigena i drugi domen antitela ima specifičnost za drugi epitop ciljnog antigena.
[0284] U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može biti fuzionisan sa karboksil terminusom teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa karboksil terminusom lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa karboksil terminusima i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može biti fuzionisan sa amino terminusom teškog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, sa amino terminusom lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira, ili sa amino terminusima i teškog i lakog lanca IgG antitela koje može da se aktivira. U multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, scFv može biti fuzionisan sa bilo kojom kombinacijom jednog ili više karboksil terminusa i jednog ili više amino terminusa IgG antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, maskirajuća komponenta (MM) povezana sa CM1-CM2 supstratom prikačena je i maskira antigen-vezujući domen IgG. U nekim primerima izvođenja, maskirajuća komponenta (MM) povezana sa CM1-CM2 supstratom prikačena je i maskira antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv. U nekim primerima izvođenja, maskirajuća komponenta (MM) povezana sa CM1-CM2 supstratom prikačena je i maskira antigen-vezujući domen IgG i maskirajuća komponenta (MM) povezana sa CM1-CM2 supstratom prikačena je i maskira antigen-vezujući domen najmanje jednog scFv.
[0285] Objava obezbeđuje primere struktura multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koji ujučuju, ali se ne ograničavaju na sledeće: (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH<*->L3- ;;;1 ;VL<*->L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2; (VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL)2:(MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL-CL)2:(VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL-CL)2:(VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3 -VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VL-CL)2:(VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>)2: (MM-L1-CM1-CM2 supstrat-L2-VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VH<∗>-L3-VL<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1MM)2: (VL<∗>-L3-VH<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2; ili (VL-CL-L4-VL<∗>-L3-VH<∗>-L2-CM1-CM2 supstrat-L1-MM)2: (VH<∗>-L3-VL<∗>-L4-VH-CH1-CH2-CH3)2, pri čemu: VL i VH predstavljaju laki i teški varijabilni domen prve specifičnosti, sadržane u IgG; VL<∗>i VH<∗>predstavljaju varijabilne domene druge specifičnosti, sadržane u scFv; L1 je linkerski peptid koji povezuje maskirajuću komponentu (MM) i CM1-CM2 supstrat; L2 je linkerski peptid koji povezuje CM1-CM2 supstrat, i antitelo; L3 je linkerski peptid koji povezuje varijabilne domene scFv; L4 je linkerski peptid koji povezuje antitelo prve specifičnosti sa antitelom druge specifičnosti; CL je konstantni domen lakog lanca; i CH1, CH2, CH3 su konstantni domeni teškog lanca. Prva i druga specifičnost mogu biti usmerene prema bilo kojem antigenu ili epitopu.
1
[0286] U nekim primerima izvođenja multispecifičnog antitela koje može da se aktivira koje angažuje T-ćeliju, jedan antigen je tipično antigen prisutan na površini tumorske ćelije ili drugog tipa ćelije udružene sa bolešću, na primer, ali bez ograničavanja, bilo koji cilj naveden u Tabeli 1, na primer, ali bez ograničavanja, EGFR, erbB2, EpCAM, Jagged, PD-L1, B7H3, ili CD71 (transferinski receptor), i drugi antigen je tipično stimulatorni (označen u ovom tekstu i kao aktivirajući) ili inhibitorni receptor prisutan na površini T-ćelije, ćelije prirodnog ubice (NK), mijeloidne mononuklearne ćelije, makrofaga, i/ili druge imunske efektorske ćelije, na primer, ali bez ograničavanja, B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137 (označen i kao TNFRSF9), CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA. Domen antitela koji daje specifičnost za T-ćelijski površinski antigen može takođe biti supstituisan ligandom ili ligandskim domenom koji se vezuje za T-ćelijski receptor, NK-ćelijski receptor, receptor makrofaga, i/ili receptor druge imunske efektorske ćelije, na primer, ali bez ograničavanja, B7-1, B7-2, B7H3, PD-L1, PD-L2, ili TNFSF9. U nekim primerima izvođenja antitela koje može da se aktivira, koje cilja veliki broj antigena, jedan antigen je odabran iz grupe ciljeva navedenih u Tabeli 1, i drugi antigen je odabran iz grupe ciljeva navedenih u Tabeli 1.
[0287] U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je anti-EGFR antitelo. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je C225v5, koje je specifično za vezivanje sa EGFR. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je C225, koje je specifično za vezivanje sa EGFR. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je C225v4, koje je specifično za vezivanje sa EGFR. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je C225v6, koje je specifično za vezivanje sa EGFR. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je anti-Jagged antitelo. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je 4D11, koje je specifično za vezivanje sa humanim i mišjim Jagged 1 i Jagged 2. U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo je 4D11v2, koje je specifično za vezivanje sa humanim i mišjim Jagged 1 i Jagged 2.
[0288] U nekim primerima izvođenja, ciljajuće antitelo može biti u formi antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, scFv može biti u formi Pro-scFv (vidi, npr., WO 2009/025846, WO 2010/081173).
[0289] U nekim primerima izvođenja, scFv je specifično za vezivanje sa CD3ε, i jeste ili je izvedeno iz antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za CD3ε, npr., CH2527, FN18, H2C, OKT3, 2C11, UCHT1, ili V9. U nekim primerima izvođenja, scFv je specifično za vezivanje sa CTLA-4 (u ovom tekstu označen i kao CTLA i CTLA4).
[0290] U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu:
1
[0291] U nekim primerima izvođenja, anti-CTLA-4 scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 347.
[0292] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu:
[0293] U nekim primerima izvođenja, anti-CD3ε scFv uključuje aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 349.
[0294] U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje sa jednom ili više T-ćelija, jednom ili više NK-ćelija i/ili jednim ili više makrofaga. U nekim primerima izvođenja, scFv je specifičan za vezivanje sa odabranim iz grupe koja se sastoji od B7-H4, BTLA, CD3, CD4, CD8, CD16a, CD25, CD27, CD28, CD32, CD56, CD137, CTLA-4, GITR, HVEM, ICOS, LAG3, NKG2D, OX40, PD-1, TIGIT, TIM3, ili VISTA.
[0295] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje sredstvo konjugovano sa AB. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antineoplastično sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je tokisn ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa multispecifičnim antitelom koje može da se aktivira preko linkera. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji uključuje najmanje jednu CM1-CM2 supstratnu sekvencu. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji ne može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo koje oštećuje nukleinske kiseline, na primer DNK alkilator ili DNK interkalator, ili drugo sredstvo koje oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je
1
sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0296] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje i detektabilnu komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilna komponenta je dijagnostičko sredstvo.
[0297] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira prirodno sadrži jednu ili više disulfidnih veza. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira može biti inženjerisano tako da uključuje jednu ili više disulfidnih veza.
[0298] Objava obezbeđuje i izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira multispecifično antitelo koje može da se aktivira opisano u ovom tekstu, kao i vektore koji sadrže ove sekvence izolovane nukleinske kiseline. Objava obezbeđuje postupke proizvodnje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takav molekul nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0299] Objava obezbeđuje i postupak izrade multispecifičnih antitela koja mogu da se aktiviraju objave (a) kultivisanjem ćelije koja uključuje nukleinskokiselinski konstrukt koji kodira multispecifično antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji dovode do ekspresije multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, i (b) oporavljanjem multispecifičnog antitela koje može da se aktivira.
[0300] Objava obezbeđuje multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili kompozicije multispecifičnog antitela koje može da se aktivira, koje uključuju najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za prvi cilj ili prvi epitop i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se vezuje sa drugim ciljem ili drugim epitopom, pri čemu je najmanje AB1 kuplovan ili na drugi način prikačen za maskirajuću komponentu (MM1), tako da kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost AB1 da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, MM1 je kuplovan sa AB1 preko CM1-CM2
1
supstrata za MMP i SP, pri čemu je najmanje jedna od MMP i SP kolokalizovana sa ciljem AB1 na mestu tretmana ili mestu dijagnostikovanja, kod subjekta. Multispecifična antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu stabilna su u cirkulaciji, aktiviraju se na mestima predviđenim za lečenje i/ili dijagnostikovanje, ali ne u normalnom, tj., zdravom tkivu, i, kada se aktiviraju, ispoljavaju vezivanje za cilj AB1 koje je bar uporedivo sa vezivanjem odgovarajućeg, nemodifikovanog multispecifičnog antitela.
[0301] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži povezujući peptid između MM1 i CM1-CM2 supstrata.
[0302] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira sadrži povezujući peptid između CM1-CM2 supstrata i AB1.
[0303] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i bar deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM1-LP1-CM1-CM2 supstrat-LP2-AB1 ili AB1-LP2-CM1-CM2 supstrat-LP1-MM1. U nekim primerima izvođenja, dva vezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična.
[0304] U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GGS)n, (GSGGS)n(SEQ ID NO: 381) i (GGGS)n(SEQ ID NO: 382), pri čemu je n ceo broj i iznosi najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja, najmanje jedan od LP1 ili LP2 uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od GGSG (SEQ ID NO: 383), GGSGG (SEQ ID NO: 384), GSGSG (SEQ ID NO: 385), GSGGG (SEQ ID NO: 386), GGGSG (SEQ ID NO: 387), i GSSSG (SEQ ID NO: 388).
[0305] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2.
[0306] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje prvi povezujući peptid (LP1), i drugi povezujući peptid (LP2), i povezujući peptid (LP') između CM1 i CM2, i bar deo multispecifičnog antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM1-LP1-CM1-CM2 supstrat-LP2-AB1 ili AB1-LP2-CM1-CM2 supstrat-LP1-MM1. U nekim primerima izvođenja, povezujući peptidi ne moraju biti međusobno identični.
[0307] U nekim primerima izvođenja, LP' je GG. U nekim primerima izvođenja, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350).
[0308] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira
11
uključuje najmanje prvo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB1) koji se specifično vezuje za prvi cilj ili prvi epitop i drugo antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB2) koji se specifično vezuje za drugi cilj ili drugi epitop. U nekim primerima izvođenja, svako od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je nezavisno odabrano iz grupe koja se sastoji od monoklonskog antitela, domenskog antitela, jednog lanca, Fab fragmenta, F(ab')2 fragmenta, scFv, scAb, dAb, jednodomenskog teškolančanog antitela i jednodomenskog lakolančanog antitela. U nekim primerima izvođenja, svako od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je glodarsko (npr., mišje ili pacovsko), himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0309] U nekim primerima izvođenja, svako od AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajući cilj ili epitop od oko 100 nM ili manje.
[0310] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajuće AB koja je viša od konstante disocijacije AB za odgovarajući cilj ili epitop.
[0311] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima konstantu disocijacije za vezivanje za odgovarajuće AB koja nije viša od konstante disocijacije AB za odgovarajući cilj ili epitop.
[0312] U nekim primerima izvođenja, MM1 ne interferira ili kompetira sa svojim odgovarajućim AB za vezivanje sa odgovarajućim ciljem ili epitopom kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u isečenom stanju.
[0313] U nekim primerima izvođenja, MM1 je polipeptid dug oko 2 do 40 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, svaki od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dug ne više od 40 amino-kiselina.
[0314] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja je različita od one cilja odgovarajućeg AB.
[0315] U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 50% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 25% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, MM1 ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 10% identična sa bilo kojim prirodnim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB.
[0316] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 20 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0317] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 40 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0318] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 100 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0319] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 1000 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0320] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje MM1 smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 10000 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM1 prema odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0321] U nekim primerima izvođenja, MM1 je aminokiselinska sekvenca odabrana između MM objavljenih u ovom tekstu.
[0322] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje drugu maskirajuću komponentu (MM2) koja inhibira vezivanje AB2 za njegov cilj kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju, i dodatnu komponentu koja može da se seče (CM') kuplovanu sa AB2, pri čemu je CM' ili CM1-CM2 supstrat ili polipeptid koji funkcioniše kao supstrat za drugu proteazu. U nekim primerima izvođenja, CM' je polipeptid dug ne više od 15 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, CM' je CM1-CM2 supstrat, pri čemu je svaki od CM1 i CM2 u CM1-CM2 supstratu nezavisno dug ne više od 15 amino-kiselina.
[0323] U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza, SP proteaza, i/ili druga proteaza je kolokalizovana sa drugim ciljem ili epitopom u tkivu, i pri čemu MMP proteaza, SP proteaza, i/ili druga proteaza seče CM' u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo MMP proteazi, SP proteazi, i/ili drugoj proteazi. U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza, SP proteaza i/ili druga proteaza su kolokalizovane sa prvim ciljem ili epitopom i drugim ciljem ili epitopom u tkivu. U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza, SP proteaza i/ili druga proteaza su ista MMP proteaza i ista SP proteaza. U nekim primerima izvođenja, MMP proteaza, SP proteaza i/ili druga proteaza nisu ista MMP proteaza i nisu ista SP proteaza. U nekim primerima izvođenja, CM1-CM2 supstrat i CM' su različiti supstrati za istu MMP proteazu i istu SP proteazu. U nekim primerima izvođenja, proteaza koja seče CM' je odabrana iz grupe koja se sastoji od onih prikazanih u Tabeli 6.
[0324] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, npr., MM1 i najmanje MM2, ima konstantu disocijacije za vezivanje za svoje odgovarajuće AB koja je viša od konstante disocijacije AB za njegov odgovarajući cilj ili epitop.
[0325] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, ima konstantu disocijacije za vezivanje za svoje odgovarajuće AB koja nije viša od konstante disocijacije AB za njegov odgovarajući cilj ili epitop.
[0326] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira, ne interferira ili kompetira sa svojim odgovarajućim AB za vezivanje sa odgovarajućim ciljem ili epitopom kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira u isečenom stanju.
[0327] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dug oko 2 do 40 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira je polipeptid dug ne više od 40 amino-kiselina.
[0328] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja se razlikuje od one cilja odgovarajućeg AB.
[0329] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 50% identčna sa bilo kojim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 25% identčna sa bilo kojim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB. U nekim primerima izvođenja, svaka od MM u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira ima polipeptidnu sekvencu koja je ne više od 10% identčna sa bilo kojim vezujućim partnerom odgovarajućeg AB.
[0330] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje svake od MM smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 20 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0331] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje svake od MM smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB
11
kada je kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 40 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0332] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje svake od MM smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 100 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0333] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje svake od MM smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 1000 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0334] U nekim primerima izvođenja, kuplovanje svake od MM smanjuje sposobnost odgovarajućeg AB da se veže za svoj cilj ili epitop tako da je konstanta disocijacije (Kd) AB kada je kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu najmanje 10000 puta viša od KdAB kada nije kuplovano sa MM prema njegovom odgovarajućem cilju ili epitopu.
[0335] U nekim primerima izvođenja, svaka od MM je aminokiselinska sekvenca odabrana između MM objavljenih u ovom tekstu.
[0336] U nekim primerima izvođenja, proteaza koja seče sekvencu CM1-CM2 supstrata kolokalizovana je sa ciljem AB1 u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira u tkivu, i MMP proteaza i/ili SP proteaza, tj., najmanje jedna od MMP proteaze i SP proteaze, seče CM1-CM2 supstrat u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazama.
[0337] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje više od jedne sekvence CM1-CM2 supstrata, i MMP proteaza i/ili SP proteaza koja seče najmanje jednu sekvencu CM1-CM2 supstrata kolokalizovana je sa ciljem najmanje jednog od AB regiona u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira u tkivu, i MMP proteaza i/ili SP proteaza seče CM1-CM2 supstrat u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kada je multispecifično antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazama.
[0338] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje dvostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0339] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje trostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0340] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje četvorostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0341] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje petorostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0342] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje desetostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0343] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje dvadesetostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0344] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje četrdesetostruko viša od konstante disocijacije
11
vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0345] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje pedesetostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0346] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje stostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0347] U nekim primerima izvođenja, svaki CM1-CM2 supstrat, pozicioniran je u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira tako da se u neisečenom stanju, vezivanje multispecifičnog antitela koje može da se aktivira za cilj jednog od AB regiona dešava u manjoj meri sa konstantom disocijacije koja je najmanje dvestostruko viša od konstante disocijacije vezivanja nemodifikovanog AB za njegov cilj, i pri čemu se u isečenom stanju, AB vezuje za svoj cilj.
[0348] Objava obezbeđuje i kompozicije i postupke koji uključuju multispecifično antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za cilj i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), pri čemu je najmanje prvo AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovano sa maskirajućom komponentom (MM1) koja smanjuje sposobnost AB1 da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, svako AB je kuplovano sa MM koja smanjuje sposobnost svog odgovarajućeg AB za svaki cilj. Na primer, u primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovano sa prvom maskirajućom komponentom (MM1) koja smanjuje sposobnost AB1 da se veže za svoj cilj, i AB2 je kuplovano sa drugom maskirajućom komponentom (MM2) koja smanjuje sposobnost AB2 da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira koje uključuje više od dva AB regiona; u takvim primerima izvođenja, AB1 je kuplovano sa prvom maskirajućom komponentom (MM1) koja smanjuje sposobnost AB1 da se veže za svoj cilj, i AB2 je kuplovano sa drugom maskirajućom komponentom (MM2) koja smanjuje sposobnost AB2 da
11
se veže za svoj cilj, AB3 je kuplovano sa trećom maskirajućom komponentom (MM3) koja smanjuje sposobnost AB3 da se veže za svoj cilj i tako dalje za svako AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
[0349] U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje još i najmanje jedan CM1-CM2 supstrat koji je supstrat za MMP proteazu i SP proteazu, pri čemu CM1-CM2 supstrat povezuje MM za AB. Na primer, u nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje najmanje prvo antitelo ili fragment antitela (AB1) koji se specifično vezuje za cilj i drugo antitelo ili fragment antitela (AB2), pri čemu je najmanje prvo AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira kuplovano preko CM1-CM2 supstrata za maskirajuću komponentu (MM1) koja smanjuje sposobnost AB1 da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja bispecifičnog antitela koje može da se aktivira, AB1 je kuplovano preko prvog CM1-CM2 supstrata za MM1, i AB2 je kuplovano preko drugog CM1-CM2 supstrata za drugu maskirajuću komponentu (MM2) koja smanjuje sposobnost AB2 da se veže za svoj cilj. U nekim primerima izvođenja, multispecifično antitelo koje može da se aktivira uključuje više od dva AB regiona; u nekim od ovih primera izvođenja, AB1 je kuplovano preko prvog CM1-CM2 supstrata za MM1, AB2 je kuplovano preko drugog CM1-CM2 supstrata za MM2, i AB3 je kuplovano preko trećeg CM1-CM2 supstrata za treću maskirajuću komponentu (MM3) koja smanjuje sposobnost AB3 da se veže za svoj cilj, i tako dalje za svako AB u multispecifičnom antitelu koje može da se aktivira.
Antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju nevezujuće steričke komponente ili vezujuće partnere za nevezujuće steričke komponente
[0350] Objava obezbeđuje i antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže nevezujuće steričke komponente (non-binding, NB) ili vezujuće partnere (binding partner, BP) za nevezujuće steričke komponente, pri čemu BP regrutuje ili na drugi način privlači NB na antitelo koje može da se aktivira. Antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđena u ovom tekstu uključuju, na primer, antitelo koje može da se aktivira koje sadrži nevezujuću steričku komponentu (NB), CM1-CM2 supstrat i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje za cilj; antitelo koje može da se aktivira koje sadrži vezujućeg partnera za nevezujuću steričku komponentu (BP), CM1-CM2 supstrat i AB; i antitelo koje može da se aktivira koje sadrži BP za kojeg je regrutovan NB, CM1-CM2 supstrat i AB koje se vezuje za cilj. Antitela koja mogu da se aktiviraju u kojima je NB kovalentno povezan sa CM1-CM2 supstratom i AB antitela koje može da se aktivira ili je interakcijama udružen sa BP koji je kovalentno povezan sa CM1-CM2 supstratom i AB
11
antitela koje može da se aktivira označavaju se u ovom tekstu kao "NB-sadržavajuća antitela koja mogu da se aktiviraju". Koji može da se aktivira ili promenljiv znači da antitelo koje može da se aktivira ispoljava prvi nivo vezivanja za cilj kada je antitelo koje može da se aktivira u inhibiranom, maskiranom ili neisečenom stanju (tj., prva konformacija), i drugi nivo vezivanja za cilj kada je antitelo koje može da se aktivira u deinhibiranom, demaskiranom i/ili isečenom stanju (tj., druga konformacija, tj., aktivirano antitelo), pri čemu je drugi nivo vezivanja za cilj veći od prvog nivoa vezivanja za cilj. Kompozicije antitela koje može da se aktivira mogu ispoljiti povišenu bioraspoloživost i pogodniju biodistribuciju u poređenju sa konvencionalnim terapijskim antitelima.
[0351] U nekim primerima izvođenja, antitela koja mogu da se aktiviraju obezbeđuju smanjenje toksičnosti i/ili neželjenih sporednih efekata koji bi inače bili rezultat vezivanja za mesta koja se ne tretiraju ili mesta koja nisu dijagnostička, da AB nije maskirano ili da na drugi način nije inhibirano njegovo vezivanje za takva mesta.
[0352] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujuću steričku komponentu (NB); CM1-CM2 supstrat; i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje specifično za cilj, pri čemu je NB polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB; CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanje AB za cilj; i NB ne inhibira enzimsko sečenje CM1-CM2 supstrata. Kako se koristi u ovom tekstu i inače, izraz polipeptid označava bilo koji polipeptid koji uključuje najmanje dve aminokiselinske rezidue, uključujući veće polipeptide, proteine pune dužine i njihove fragmente, i izraz polipeptid nije ograničen na jednolančane polipeptide i može uključiti multijedinične, npr., multilančane polipeptide. U slučajevima kada je polipeptid kraći, na primer, kraći od ukupno 50 amino-kiselina, izrazi peptid i polipeptid koriste se u ovom tekstu naizmenično, a u slučajevima kada je polipeptid duži, npr. 50 amino-kiselina ili duži, termini polipeptid i protein koriste se u ovom tekstu naizmenično
[0353] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujuću steričku komponentu (NB); CM1-CM2 supstrat; i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje specifično za cilj, pri čemu (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB; (ii) CM1-CM2 supstrat je polipeptid dužine do 50 amino-kiselina, koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj; i (iv) NB ne inhibira sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom. Na primer, svaka od sekvence CM1 supstrata i CM2 supstrata u CM1-CM2 supstratu nezavisno je duga do 15
11
amino-kiselina.
[0354] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujuću steričku komponentu (NB); CM1-CM2 supstrat; i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje specifično za cilj, pri čemu (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB; (ii) CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj; (iv) NB ne inhibira sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom; i (v) antitelo koje može da se aktivira ima strukturni aranžman od N-terminusa do C-terminusa sledeći u neisečenom stanju: NB-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-NB.
[0355] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje nevezujuću steričku komponentu (NB); CM1-CM2 supstrat; i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje specifično za cilj, pri čemu (i) NB uključuje polipeptid koji se ne vezuje specifično za AB; (ii) CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (iii) CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj, i pri čemu NB u neisečenom antitelu koje može da se aktivira smanjuje sposobnost AB da se veže za cilj za najmanje 50%, na primer, za najmanje 60%, za najmanje 70%, za najmanje 75%, za najmanje 80%, za najmanje 85%, za najmanje 90%, za najmanje 95%, za najmanje 96%, za najmanje 97%, za najmanje 98%, za najmanje 99%, za najmanje 100% u poređenju sa sposobnošću isečenog AB da se veže za cilj; i (iv) NB ne inhibira sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom. Smanjenje sposobnosti AB da se veže za cilj određuje se, npr., korišćenjem testa opisanog u ovom tekstu ili in vitro testom istiskivanja cilja kao što je, na primer, test opisan u PCT publikacijama br. WO 2009/025846 i WO 2010/081173.
[0356] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje vezujućeg partnera (BP) za nevezujuću steričku komponentu (NB); CM1-CM2 supstrat; i antitelo ili fragment antitela (AB) koji se vezuje specifično za cilje, pri čemu je BP polipeptid koji se vezuje za NB kada mu se izloži; NB se ne vezuje specifično za AB; CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju u prisustvu NB, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj i BP ne interferira sa vezivanjem AB za cilj; i NB i BP ne inhibiraju sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP antitela koje može da se aktivira opciono je vezan za NB. U jednom primeru izvođenja, NB je regrutovan pomoću BP antitela koje može da se aktivira in vivo.
11
[0357] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira formuliše se kao kompozicija. U nekim od ovih primera izvođenja, kompozicija uključuje i NB, pri čemu je NB koformulisan sa antitelom koje može da se aktivira koje uključuje BP, CM1-CM2 supstrat, i AB. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP je odabran iz grupe koja se sastoji od albumin-vezujućeg peptida, fibrinogen-vezujućeg peptida, fibronektin-vezujućeg peptida, hemoglobin-vezujućeg peptida, transferin-vezujućeg peptida, peptida koji se vezuje za domen imunoglobulina, i peptida koji se vezuju za druge serumske proteine.
[0358] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, NB je solubilan, globularan protein. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, NB je protein koji cirkuliše u krvotoku. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, NB je odabran iz grupe koja se sastoji od albumina, fibrinogena, fibronektina, hemoglobina, transferina, imunoglobulinskog domena, i drugih serumskih proteina.
[0359] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za proteazu. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, proteaza je kolokalizovana u tkivu, i proteaza seče CM1-CM2 supstrat u antitelu koje može da se aktivira kada je antitelo koje može da se aktivira izloženo proteazi. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, CM1-CM2 supstrat je polipeptid dužine do 50 amino-kiselina. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) koji je dug do 15 amino-kiselina, npr., dug 3 amino-kiseline, dug 4 amino-kiseline, dug 5 aminokiselina, dug 6 amino-kiselina, dug 7 amino-kiselina, dug 8 amino-kiselina, dug 9 aminokiselina, dug 10 amino-kiselina, dug 11 amino-kiselina, dug 12 amino-kiselina, dug 13 aminokiselina, dug 14 amino-kiselina, ili dug 15 amino-kiselina,
[0360] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: NB-CM1-CM2 supstrat-AB, AB-CM1-CM2 supstrat-NB, BP-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-BP. U primerima izvođenja u kojima antitelo koje može da se aktivira uključuje BP i antitelo koje može da se aktivira je u prisustvu odgovarajućeg NB, antitelo koje može da se aktivira u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: NB:BP-CM1-CM2-AB, NB:BP-CM2-CM1-AB, AB-CM1-CM2-BP:NB ili AB-CM2-CM1-BP:NB, pri čemu ":" predstavlja interakciju, npr.,
12
vezivanje, između NB i BP.
[0361] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment koji se specifično vezuje za dati cilj i monoklonsko je antitelo, domensko anttielo, jedan lanac, Fab fragment, F(ab')2fragment, scFv, scab, dAb, jednodomensko teškolančano antitelo, ili jednodomensko lakolančano antitelo. U nekim primerima izvođenja, takvo antitelo ili njegov imunološki aktivan fragment koji se vezuje za cilj je mišje, drugog glodara, himerno, humanizovano ili potpuno humano monoklonsko antitelo.
[0362] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u ovom tekstu i varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu prikazanu u ovom tekstu.. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u ovom tekstu, i varijabilnog regiona lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identična sa aminokiselinskom sekvencom prikazanom u ovom tekstu.
[0363] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje i sredstvo konjugovano sa AB. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je antineoplastično sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji ne može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu, na primer DNK alkilator ili DNK interkalator, ili drugo sredstvo koje oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0364] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje i detektabilnu komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilna komponenta je dijagnostičko sredstvo.
[0365] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje i spejser. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje i signalni peptid. U nekim primerima izvođenja, signalni peptid je konjugovan sa antitelom koje može da se aktivira preko spejsera. U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, spejser je spojen direktno sa MM antitela koje može da se aktivira.
[0366] U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira je duži nego kod odgovarajućeg antitela; npr., pK antitela koje može da se aktivira je duža od pK odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, poluživot antitela koje može da se aktivira u serumu sličan je onom kod odgovarajućeg antitela. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 15 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 12 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 11 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 10 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 9 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 8 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 7 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 6 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 5 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 4 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 3 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 2 dana kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 24 sata kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 20 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 18 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 16 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 14 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 12 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje10 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 8 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 6 sati kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 4 sata kada se primeni kod organizma. U nekim primerima izvođenja, poluživot u serumu antitela koje može da se aktivira iznosi najmanje 3 sata kada se primeni kod organizma.
[0367] Objava takođe obezbeđuje izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira bilo koje od ovih antitela koja mogu da se aktiviraju, kao i vektore koji uključuju ove izolovane sekvence nukleinske kiseline. Objava obezbeđuje postupke za proizvodnju antitela koje može da se aktivira, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži takvu sekvencu nukleinske kiseline. U nekim primerima izvođenja, ćelija sadrži takav vektor.
[0368] Konstanta disocijacije (Kd) NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira prema cilju viša je od KdAB prema cilju kada ono nije udruženo sa NB ili NB:BP. Konstanta disocijacije (Kd) NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira prema cilju višaa je od Kdroditeljskog AB prema cilju. Na primer, KdNB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,000-10,000,000 puta veća od KdAB kada ono nije udruženo sa NB ili NB:BP i Kd
12
roditeljskog AB prema cilju. Nasuprot tome, vezujući afinitet NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira prema cilju niži je od vezujućeg afiniteta AB kada ono nije udruženo sa NB ili NB:BP ili je niži od vezujućeg afiniteta roditeljskog AB prema cilju. Na primer, vezujući afinitet NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira prema cilju je najmanje 5, 10, 25, 50, 100, 250, 500, 1,000, 2,500, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, 500,000, 1,000,000, 5,000,000, 10,000,000, 50,000,000 ili više, ili između 5-10, 10-100, 10-1,000, 10-10,000, 10-100,000, 10-1,000,000, 10-10,000,000, 100-1,000, 100-10,000, 100-100,000, 100-1,000,000, 100-10,000,000, 1,000-10,000, 1,000-100,000, 1,000-1,000,000, 1000-10,000,000, 10,000-100,000, 10,000-1,000,000, 10,000-10,000,000, 100,000-1,000,000, ili 100,000-10,000,000 puta niži od vezujućeg afiniteta AB kada ono nije udruženo sa NB ili NB:BP ili niži od vezujućeg afiniteta roditeljskog AB prema cilju
[0369] Kada je NB-sadržavajuće antitelo koje može da se aktivira u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB kada nije udruženo sa NB ili NB:BP. Kada je NB-sadržavajuće antitelo koje može da se aktivira u prisustvu cilja, specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj. U poređenju sa vezivanjem AB koje nije udruženo sa NB ili NB:BP ili vezivanjem roditeljskog AB za cilj, sposobnost NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira da se veže sa ciljem je smanjena, na primer, za 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže kada se meri in vitro i/ili in vivo.
[0370] Kada je NB-sadržavajuće antitelo koje može da se aktivira u prisustvu cilja, ali ne u prisustvu modifikujućeg sredstva (na primer proteaza ili drugi enzim), specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem AB kada ono nije udruženo sa NB ili NB:BP. Kada je NB-sadržavajuće antitelo koje može da se aktivira u prisustvu cilja, ali ne u prisustvu modifikujućeg sredstva (na primer proteaza, drugi enzim, redukciono sredstvo, ili svetlo), specifično vezivanje AB za cilj je smanjeno ili inhibirano, u poređenju sa specifičnim vezivanjem roditeljskog AB za cilj. U poređenju sa vezivanjem AB koje nije udruženo sa NB ili NB:BP ili vezivanjem roditeljskog AB za cilj, sposobnost NB-sadržavajućeg antitela koje može da se aktivira da se veže za cilj je smanjenja, na primer, za najmanje 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili čak 100% tokom najmanje 2, 4, 6, 8, 12, 28, 24, 30, 36, 48, 60, 72, 84, ili 96 sati, ili 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 150, ili 180 dana, ili 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ili 12 meseci ili duže kada se meri in vitro i/ili in vivo.
[0371] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitelo koje može da se aktivira uključuje sredstvo konjugovano za AB da bi se prizveo konjugat antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja konjugata antitela koje može da se aktivira, sredstvo je terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dijagnostičko sredstvo U nekim primerima izvođenja, sredstvo je detektabilni marker. U nekim primerima izvođenja konjugata antitela koje može da se aktivira, sredstvo je antineoplastično sredstvo. U nekim primerima izvođenja konjugata antitela koje može da se aktivira, sredstvo je toksin ili njegov fragment. U nekim primerima izvođenja konjugata antitela koje može da se aktivira, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera. U nekim primerima izvođenja konjugata antitela koje može da se aktivira, linker je linker koji može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je konjugovano sa AB preko linkera koji ne može da se seče. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu, na primer DNK alkilator ili DNK interkalator, ili drugo sredstvo koje oštećuje DNK. U nekim primerima izvođenja sredstvo je sredstvo odabrano iz grupe navedene u Tabeli 3. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je dolastatin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je auristatin E ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin E (MMAE). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je monometil auristatin D (MMAD). U nekim primerima izvođenja, sredstvo je majtanzinoid ili majtanzinoidni derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je DM1 ili DM4. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je duokarmicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je kaliheamicin ili njegov derivat. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepin. U nekim primerima izvođenja, sredstvo je pirolobenzodiazepinski dimer.
[0372] U nekim primerima bilo kojeg od ovih primera izvođenja antitela koje može da se aktivira, antitela koja mogu da se aktiviraju su antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za dva cilja. Takva za dva cilja vezujuća antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže dva Ab koja mogu da se vežu za iste il različite ciljeve. U specifičnim primerima izvođenja, dvojno ciljajuća antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže bispecifična antitela ili fragmente antitela.
[0373] Antitela koja mogu da se aktiviraju, koja se vezuju za dva cilja dizajnirana su tako da imaju CM1-CM2 supstrat koji se seče sredstvom za sečenje koje je kolokalizovano u ciljnom tkivu sa jednim ili oba cilja sposobna za vezivanje sa AB antitela koja mogu da se aktiviraju. Antitela koja mogu da se aktiviraju, koja se vezuju za dva cilja, sa više od jednog AB za isti ili
12
različite ciljeve mogu da se dizajniraju tako da imaju više od jednog CM1-CM2 supstrata, pri čemu prvi CM1-CM2 supstrat može da se seče sredstvom za sečenje u prvom ciljnom tkivu i pri čemu drugi CM1-CM2 supstrat može da se seče sredstvom za sečenje u drugom ciljnom tkivu, uz vezivanje jednog ili više ciljeva za AB antitela koja mogu da se aktiviraju. U jednom primeru izvođenja, prvo i drugo ciljno tkivo su prostorno razdvojeni, na primer, na različitim su mestima u organizmu. U jednom primeru izvođenja, prvo i drugo ciljno tkivo su isto tkivo privremeno razdvojeno, na primer isto tkivo u dve različite vremenske tačke, na primer prva vremenska tačka je kada tkivo predstavlja rani stadijum tumora, a druga vremenska tačka je kada tkivo predstavlja kasni stadijum tumora.
[0374] Objava takođe obezbeđuje molekule nukleinske kiseline koji kodiraju antitela koja mogu da se aktiviraju, opisana u ovom tekstu. Objava takođe obezbeđuje vektore koji uključuju ove nukleinske kiseline. Antitela koja mogu da se aktiviraju opisana u ovom tekstu proizvode se kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu ćelija sadrži ove molekule nukleinske kiseline ili vektore.
[0375] Objava obezbeđuje i postupke izrade antitela koja mogu da se aktiviraju. U jednom primeru izvođenja, postupak uključuje korake (a) kultivisanja ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje (i) nevezujuću steričku komponentu (NB); (ii) CM1-CM2 supstrat; i (iii) antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, pri čemu (1) NB se ne vezuje spcifično za AB; (2) CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (3) CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj; i (4) NB ne inhibira sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom; i (b) oporavljanja antitela koje može da se aktivira.
[0376] U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje korake (a) kultivisanja ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koja kodira antitelo koje može da se aktivira pod uslovima koji dovode do ekspresije antitela koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje (i) vezujućeg partnera (BP) za nevezujuću steričku komponentu (NB); (ii) CM1-CM2 supstrat; i (iii) antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilje, pri čemu (1) NB se ne vezuje specifično za AB; (2) CM1-CM2 supstrat je polipeptid koji uključuje supstrat (S) za enzim; (3) CM1-CM2 supstrat je pozicioniran tako da u neisečenom stanju u prisustvi NB, NB interferira sa vezivanjem AB za cilj i u isečenom stanju, NB ne interferira sa vezivanjem AB za cilj i BP ne interferira sa vezivanjem AB za cilj; i (4) NB i BP ne inhibiraju sečenje CM1-CM2 supstrata enzimom; i (b) oporavljanja antitela koje
12
može da se aktivira. U nekim primerima ovog primera izvođenja, BP antitela koje može da se aktivira vezano je za NB.
Upotreba antitela koja mogu da se aktiviraju i konjugovanih antitela koja mogu da se aktiviraju
[0377] Procenjuje se da će se terapijski entiteti prema objavi primenjivati sa pogodim nosačima, ekscipijentima i drugim sredstvima inkorporisanim u formulacije radi obezbeđivanja poboljšanog transfera, isporuke, tolerancije i slično. Veliki broj odgovarajućih formulacija može se naći u zbirci formula poznatoj svim farmaceutskim hemičarima: Remington's Pharmaceutical Sciences (15. izdanje, Mack Publishing Compani, Easton, PA (1975)), posebno Poglavlje 87, Blauga, Seimour. Ove formulacije uključuju na primer, praškove, paste, masti, želee, voskove, ulja, vezikule koje sadrže lipide (katjonske ili anjonske) (kao što je Lipofectin™), DNK konjugate, anhidrovane apsorpcione paste, emulzije tipa ulje u vodi i voda u ulju, emulzije karbovoskova (polietilen glikoli različite molekulske težine), polučvrste gelove i polučvrste smeše koje sadrže ugljene hidrate. Bilo koja od gore navedenih smeša može biti pogodna u tretmanima i terapijama u skladu sa predmetnom objavom, pod uslovom da aktivni sastojak u formulaciji nije inaktiviran formulacijom i da je formulacija fiziološki kompatibilna i tolerabilna pri datom putu primene. Za dodatne informacije u vezi sa formulacijama, ekscipijentima i nosačima dobro poznatim farmaceutskim hemičarima vidi i Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8 (2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm.203(1-2):1-60 (2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery -some emerging concepts". J Pharm Sci.89(8):967-78 (2000), Powell et al. "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol.52:238-311 (1998) i citate u njima.
[0378] Terapijske formulacije objave koje sadrže konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koriste se za prevenciju, lečenje ili na drugi način poboljšanje bolesti ili poremećaja udruženog sa aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja. Na primer, terapijske formulacije objave, koje uključuju konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira, koriste se za lečenje ili na drugi način poboljšanje zapaljenja, zapaljenskog poremećaja, autoimunske bolesti i/ili kancera ili drugog neoplastičnog stanja. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni tumor ili hematološki malignitet u kojem se eksprimira cilj. U nekim primerima izvođenja, kancer je solidni tumor u kojem se eksprimira cilj. U nekim primerima izvođenja,
12
kancer je hematološki malignitet u kojem se eksprimira cilj. U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na parenhimu (npr., u kanceru, delu organa ili tkiva koji često obavlja funkciju(-e) organa ili tkiva). U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na ćeliji, tkivu ili organu. U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na stromi (tj., vezivnoj potpornoj mreži ćelija, tkiva, ili organa). U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na osteoblastu. U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na endotelu (vaskulatura). U nekim primerima izvođenja, cilj se eksprimira na kancerskoj matičnoj ćeliji. U nekim primerima izvođenja, sredstvo sa kojim je konjugovano antitelo koje može da se aktivira je inhibitor mikrotubula. U nekim primerima izvođenja, sredstvo sa kojim je konjugovano antitelo koje može da se aktivira je sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu.
[0379] Efikasnost prevencije, poboljšanja ili lečenja određuje uz korišćenje bilo kojeg poznatog postupka za dijagnostikovanje ili lečenje bolesti ili poremećaja povezanih sa ekspresijom i/ili aktivnošću cilja, kao što je na primer, aberantna ekspresija i/ili aktivnost cilja. Produžavanje preživljavanja subjekta ili na drugi način odlaganje progresije bolesti ili poremećaja povezanog sa ekspresijom i/ili aktivnošću cilja, npr., aberantnom ekspresijom i/ili aktivnošću cilja, kod subjekta ukazuje na to da konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira pruža kliničku korist.
[0380] Konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira može se primeniti u formi farmaceutskih kompozicija. Principi i razmatranja u vezi sa pripremanjem takvih kompozicija, obezbeđeni su, na primer, u Remington: The Science And Practice Of Pharmacy 19. izd. (Alfonso R. Gennaro, et al., izdavači) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Limitations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa., 1994; i Peptide And Protein Drug Delivery (Advances in Parenteral Sciences, Vol. 4), 1991, M. Dekker, New York.
[0381] U nekim primerima izvođenja gde se koriste fragmenti antitela, bira se najmanji fragment koji se specifično vezuje za vezujući domen ciljnog proteina. Na primer, na osnovu sekvenci varijabilnog regiona antitela, mogu se dizajnirati peptidni molekuli koji zadržavaju sposobnost da se vežu za sekvencu ciljnog proteina. Takvi peptidi mogu se sintetisati hemijski i/ili proizvesti tehnologijom rekombinantne DNK. (Vidi, npr., Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7889-7893 (1993)). Formulacija takođe može da sadrži više od jednog aktivnog jedinjenja po potrebi za određenu indikaciju koja se leči, na primer, u nekim primerima izvođenja, ona sa komplementarnim aktivnostima, koja ne utiču štetno jedno na drugo. U nekim primerima izvođenja, ili dodatno, kompozicija može da sadrži sredstvo koje pojačava njenu
12
funkciju, kao što je na primer, citotoksično sredstvo, citokin, hemioterapijsko sredstvo ili sredstvo za inhibiciju rasta. Takvi molekuli se pogodno nalaze u kombinaciji u količinama koje su efikasne za predviđenu svrhu.
[0382] Aktivni sastojci mogu biti i zatvoreni u mikrokapsule pripremljene, na primer, tehnikama koacervacije ili interfacijalnom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilcelulozne ili želatinske mikrokapsule i poli-(metilmetakrilat) mikrokapsule, respektivno, u koloidnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomi, albuminske mikrosfere, mikroemulzije, nanočestice, i nanokapsule) ili u makroemulzijama.
[0383] Formulacije koje će se koristiti za primenu in vivo moraju biti sterilne. Ovo se lako postiže filtracijom kroz sterilne filtracione membrane.
[0384] Mogu se pripremiti preparati sa produženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa produženim oslobađanjem uključuju semipermeabilne matrikse čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, matriksi su u formi uobličenih artikala, npr., filmova, ili mikrokapsula. Primeri matriksa sa produženim oslobađanjem uključuju poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietil-metakrilat), ili poli(vinilalkohol)), polilaktide (U.S. pat. br. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i γ etil-L-glutamata, nedegradabilne etilen-vinil acetate, degradabilne kopolimere mlečne kiseline-glikolne kiseline kao LUPRON DEPOT<™>(injektabilne mikrosfere sačinjene od kopolimera mlečna kiselina-glikolna kiselina i leuprolid acetata), i poli-D-(-)-3-hidroksibuterne kiseline. Dok polimeri kao što su etilen-vinil acetat i mlečna kiselina-glikolna kiselina omogućavaju oslobađanje molekula tokom 100 dana, određeni hidrogelovi oslobađaju proteine tokom kraćih vremenskih perioda.
[0385] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni obeleživač. Koristi se intaktno antitelo, ili njegov fragment (npr., Fab, scFv, ili F(ab)2). Izraz "obeležen", u vezi sa probom ili antitelom, treba da obuhvati direktno obeležavanje probe ili antitela kuplovanjem (tj., fizičkim povezivanjem) detektabilne supstance sa probom ili antitelom, kao i indirektno obeležavanje probe ili antitela reaktivacijom sa drugim reagensom koji je direktno obeležen. Primeri indirektnog obeležavanja uključuju detekciju primarnog antitela korišćenjem fluorescentno obeleženog sekundarnog antitela i obeležavanje krajeva DNK probe biotinom tako da on može da se detektuje fluorescentno obeleženim streptavidinom. Izraz "biološki uzorak" treba da obuhvati tkiva, ćelije i biološke tečnosti izolovane iz subjekta, kao i tkiva, ćelije i tečnosti prisutne u subjektu. Izraz "biološki uzorak", prema tome, obuhvata krv i frakciju ili komponentu krvi uključujući krvni serum, krvnu plazmu ili limfu. To jest, postupak detekcije objave može se koristiti za detekciju analita iRNK, proteina ili genomske DNK u biološkom
12
uzorku in vitro kao i in vivo. Na primer, in vitro tehnike za detekciju analitske iRNK uključuju Northern hibridizacije i in situ hibridizacije. In vitro tehnike za detekciju analitskog proteina uključuju enzimske imunosorbentne testove (ELISA), Western blotove, imunoprecipitacije, imunohemijsko bojenje, i imunofluorescenciju. In vitro tehnike za detekciju analitske genomske DNK uključuju Southern hibridizacije. Procedure za sprovođenje imunotestova opisane su, na primer u "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol.
42, J. R. Crowther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1996; i "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Pored toga, in vivo tehnike za detektovanje analitskog proteina uključuju uvođenje obeleženog antianalitskog proteinskog antitela u subjekta. Na primer, antitelo može biti obeleženo radioaktivnim markerom čije prisustvo i lokacija u subjektu mogu da se detektuju standardnim tehnikama dobijanja slike.
[0386] Konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju objave korisna su i u različitim dijagnostičkim i profilaktičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod pacijenata koji su pod rizikom da razviju jedan ili više gore pomenutih poremećaja. Predispozicija pacijenta ili organa za jedan ili više gore pomenutih poremećaja može se odrediti korišćenjem genotipskih, seroloških ili biohemijskih markera.
[0387] U nekim primerima izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod ljudi kojima su dijagnostikovane kliničke indikacije udružene sa jednim ili više gore pomenutih poremećaja. Posle dijagnoze, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira primenjuje se za ublažavanje ili reverziju efekata kliničke indikacije.
[0388] Konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira objave korisno je i za detekciju cilja u pacijentovim uzorcima i prema tome korisna su kao dijagnostička sredstva. Na primer, antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju, i njihove konjugovane verzije objave koriste se u testovima in vitro, npr., ELISA, za detektovanje ciljnih nivoa u pacijentovom uzorku.
[0389] U jednom primeru izvođenja, konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira objave imobilisano je na čvrstoj podlozi (npr., bunarčić(-i) mikrotitarske ploče). Imobilisano konjugovano antitelo, antitelo koje može
1
da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira služi kao "zarobljavajuće" antitelo za bilo koji cilj koji može biti prisutan u testnom uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog antitela sa pacijentovim uzorkom, čvrsta podloga se ispere i tretira blokirajućim sredstvom kao što su proteini mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0390] Posle toga, bunarčići se tretiraju testnim uzorkom za koji se misli da sadrži antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., uzorak seruma od subjekta za kojeg se misli da ima nivoe antigena u cirkulaciji za koje se smatra da dijagnostikuju bolest. Posle ispiranja testnog uzorka ili standarda, čvrsta podloga se tretira drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao detekciono antitelo. Meri se nivo detektabilnog obeleživača, a koncentracija ciljnog antigena u testnom uzorku se određuje poređenjem sa standardnom krivom konstruisanom na osnovu standardnih uzoraka.
[0391] Procenjuje se da je na osnovu rezultata dobijenih korišćenjem antitela objave i njihovih konjugovanih verzija, u in vitro dijagnostičkom testu, moguće odrediti stadijum bolesti kod subjekta na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest, uzorci krvi se uzimaju od subjekata za koje je dijagnostikovano da su u različitim fazama progresije bolesti, i/ili u različitim tačkama terapijskog tretmana bolesti. Korišćenjem populacije uzoraka koji obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaki stupanj progresije ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stupanj.
[0392] Konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira može da se koristi i u dijagnostičkim postupcima i/ili postupcima dobijanja slike. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vitro postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in vivo postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su in situ postupci. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su ex vivo postupci. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju, koja imaju CM1-CM2 supstrat koji može da se seče enzimima, mogu se koristiti za detektovanje prisustva ili odsustva enzima koji je sposoban da seče CM1-CM2 supstrat. Takva antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste u dijagnostici, koja može uključivati in vivo detekciju (npr., kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim primerima izvođenja, okruženje povišenog redukcionog potencijala na primer ono koje može obezbediti redukciju disulfidne veze) merenjem akumulacije aktiviranih antitela (tj., antitela koja su rezultat sečenja antitela koje može da se aktivira) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma-domaćina. Takva akumulacija aktiviranih antitela ukazuje ne samo na to da tkivo ispoljava enzimsku aktivnost (ili povišeni redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM1-CM2 supstrata) nego i na to da tkivo eksprimira cilj za koji se aktivirano antitelo vezuje.
1 1
[0393] Na primer, CM1-CM2 supstrat može da se odabere tako da bude supstrat za matriksnu metaloproteazu (MMP) i serin proteazu (SP) koje se nalaze na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr., u apscesu, organu, i slično), i slično. AB može biti ono koje se vezuje za ciljni antigen. Korišćenjem postupaka objavljenih u ovom tekstu, ili kada je pogodno, postupaka poznatih stručnjaku u oblasti, detektabilni obeleživač (npr., fluorescentni obeleživač ili radioaktivni obeleživač ili radiotrejser) može se konjugovati sa AB ili drugim regionom antitela i/ili antitela koje može da se aktivira. Pogodni detektabilni obeleživači razmatraju se u kontekstu gornjih postupaka pretraživanja i dodatni specifični primeri dati su u nastavku ovog teksta. Korišćenjem AB specifičnog za protein ili peptid bolesnog stanja, zajedno sa MMP čija je aktivnost povišena u obolelom tkivu od interesa, antitela koja mogu da se aktiviraju pokazaće povećanu stopu vezivanja za bolesno tkivo u odnosu na tkiva u kojima enzim specifičan za CM1-CM2 supstrat nije prisutan na detektabilnom nivou ili je prisutan na nižem nivou nego u bolesnom tkivu ili je neaktivan (npr. u obliku zimogena ili u kompleksu sa inhibitorom). Pošto se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi pomoću sistema bubrežne filtracije, i zato što enzim specifičan za CM1-CM2 supstrat nije prisutan na detektabilnom nivou (ili je prisutan na nižim nivoima u neobolelim tkivima ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), akumulacija aktiviranih antitela u bolesnom tkivu je pojačana u odnosu na tkiva koja nisu obolela.
[0394] U drugom primeru, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za otkrivanje prisustva ili odsustva sredstva za sečenje u uzorku. Na primer, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM1-CM2 supstrat podložan sečenju enzimom, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za detektovanje (kvalitativno ili kvantitativno) prisustva enzima u uzorku. U drugom primeru, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM1-CM2 supstrat podložan sečenju redukcionim sredstvom, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za detektovanje (kvalitativno ili kvantitativno) prisustva redukcionih uslova u uzorku. Da bi se olakšala analiza u ovim postupcima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se detektabilno obeležiti i mogu se vezati za podlogu (npr. čvrsta podloga, na primer pločica ili perlica). Detektabilni obeleživač može biti postavljen na deo antitela koje može da se aktivira koji se ne oslobađa posle sečenja, na primer, detektabilni obeleživač može biti ugašeni fluorescentni obeleživač ili drugi obeleživač koji se ne može detektovati dok ne dođe do sečenja. Test se može izvesti tako što se, na primer, dovede u kontakt imobilisano, detektabilno obeleženo antitelo koje može da se aktivira sa uzorkom za koji se veruje da sadrži enzim i/ili redukciono sredstvo, tokom vremena dovoljnog da dođe do sečenja, zatim se vrši ispiranje da se uklone višak uzorka. i kontaminanti. Prisustvo ili odsustvo sredstva za sečenje (npr. enzima ili
1 2
redukcionog sredstva) u uzorku se zatim procenjuje promenom detektabilnog signala antitela koja mogu da se aktiviraju pre dovođenja u kontakt sa uzorkom npr. prisustvo i/ili povećanje detektabilnog signala usled sečenja antitela koje može da se aktivira sredstvom za sečenje u uzorku.
[0395] Ovi postupci detekcije mogu se prilagoditi tako da obezbede i detekciju prisustva ili odsustva cilja koji je sposoban da se veže za AB antitela koja mogu da se aktiviraju kada se seku. Prema tome, testovi se mogu prilagoditi da bi se procenilo prisustvo ili odsustvo sredstva za sečenje seče i prisustvo ili odsustvo cilja od interesa. Prisustvo ili odsustvo sredstva za sečenje može se detektovati prisustvom i/ili povećanjem detektabilnog obeleživača antitela koja mogu da se aktiviraju, kao što je gore opisano, a prisustvo ili odsustvo cilja može se odrediti detekcijom kompleksa cilj-AB npr., upotrebom detektabilno obeleženog anticiljnog antitela [0396] Antitela koja mogu da se aktiviraju korisna su i za dobijanje slike in situ za validaciju aktivacije antitela koje može da se aktivira, npr., sečenjem proteazom, i vezivanja za određeni cilj. In situ dobijanje slike je tehnika koja omogućava lokalizovanje proteolitičke aktivnosti i cilja u biološkim uzorcima kao što su ćelijske kulture ili preseci tkiva. Korišćenjem ove tehnike, moguće je potvrditi i vezivanje za dati cilj i proteolitičku aktivnost, na osnovu prisustva detektabilnog obeleživača (npr., fluorescentnog obeleživača).
[0397] Ove tehnike su korisne za bilo koje zamrznute ćelije ili tkivo poreklom sa mesta bolesti (npr. tumorsko tkivo) ili zdrava tkiva. Ove tehnike su korisne i za sveže uzorke ćelija ili tkiva.
[0398] U ovim tehmikama, antitelo koje može da se aktivira obeleženo je detektabilnim obeleživačem. Detektabilni obeleživač može biti fluorescentna boja, (npr. fluorofora, fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), Alexa Fluor<®>obeleživač), boja bliska infracrvenoj (near infrared ,NIR) (npr., Qdot<®>nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens na primer streptavidin, ili enzim (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0399] Detekcija obeleživača u uzorku koji je inkubiran sa obeleženim antitelom koje može da se aktivira ukazuje na to da uzorak sadrži cilj i da sadrži matriksnu metaloproteazu (MMP) i jednu serin proteazu (SP) koje su specifične za CM-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo MMP se može potvrditi korišćenjem širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili korišćenjem sredstva koje je specifično za proteazu, na primer, antitela kao što je A11, koje je specifično. za proteazu matriptazu (MT-SP1) i inhibira proteolitičku aktivnost matriptaze; vidi npr., Međunarodnu publikaciju broj WO 2010/129609, objavljenu 11. novembra 2010. Isti pristup korišćenjem širokog spektra inhibitora proteze kao što su oni opisani u ovom tekstu, i/ili korišćenjem
1
selektivnijeg inhibitornog sredstva može se upotrebiti za identifikovanje MMP i SP specifičnih za CM1-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo cilja može da se potvrdi korišćenjem sredstva koje je specifično za cilj, npr., drugog antitela, ili detektabilni obeleživač može da se kupluje sa neobeleženim ciljem. U nekim primerima izvođenja, može se koristiti neobeleženo antitelo koje može da se aktivira, uz detekciju obeleženim sekundarnim antitelom ili kompleksnijim detekcionim sistemom.
[0400] Slične tehnike su takođe korisne za in vivo dobijanje slike gde detekcija fluorescentnog signala kod subjekta, npr., sisara, uključujući čoveka, ukazuje da bolesno mesto sadrži cilj i sadrži MMP i SP koje su specifične za CM1-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira.
[0401] Ove tehnike su takođe korisne u kitovima i/ili kao reagensi za detekciju, identifikaciju ili karakterizaciju aktivnosti proteaze u različitim ćelijama, tkivima i organizmima na osnovu proteaza-specifičnog CM1-CM2 supstrata u antitelu koje može da se aktivira .
[0402] Objava obezbeđuje postupke upotrebe antitela i/ili antitela koja mogu da se aktiviraju u različitim dijagnostičkim i/ili profilaktičkim indikacijama. Na primer, objava obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili odsustva sredstva za sečenje i cilja od interesa u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče sredstvom za sečenje, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje sa ciljem od interesa, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom, neaktiviranom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovana forma prirodno vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu u neisečenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i u isečenom, aktiviranom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; i (ii) merenjem nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da su sredstvo za sečenje i cilj prisutnui u subjektu ili uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da su sredstvo za sečenje, cilj ili i sredstvo za sečenje i cilj odsutni i/ili nisu prisutni u dovoljnoj meri u subjektu ili uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira za koje je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni
1 4
obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje uključuje detektabilni obeleživač.
[0403] Objava takođe obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili odsustva sredstva za sečenje u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, u prisustvu cilja od interesa npr., cilja, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče sredstvom za sečenje, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje sa ciljem od interesa, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom, neaktiviranom stanju od N-terminusa do C-terminusa sadrži sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovana forma prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu u neisečenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i u isečenom, aktiviranom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da je sredstvo za sečenje prisutno u subjektu ili uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da je sredstvo za sečenje, odsutno i/ili nije prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira za koje je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje uključuje detektabilni obeleživač.
[0404] Objava takođe obezbeđuje kitove za upotrebu u postupcima detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva i cilja u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju bar antitelo koje može da se aktivira koje sadrži maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče isecajućim sredstvom koje može da se seče, i antigen-vezujući domen ili njegov
1
fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj od interesa, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom, neaktiviranom stanju od N-terminusa do C-terminusa sadrži sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovana forma prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu u neisečenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i u isečenom, aktiviranom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; i (ii) merenjem nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da je sredstvo koje može da se seče prisutno u subjektu ili uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo odsutno i/ili nije prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira za koje je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje uključuje detektabilni obeleživač.
[0405] Objava takođe obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira sadrži maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče sredstvom za sečenje, antigen-vezujući domen (AB) koji se specifično vezuje sa ciljem, i detektabilni obeleživač, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom, neaktiviranom stanju sadrži sledeći strukturni aranžman od N-terminusa do C-terminusa: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB i nije modifikovana forma prirodnog vezujućeg partnera AB; pri čemu u neisečenom, neaktiviranom stanju, MM interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i u isečenom, aktiviranom stanju MM ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj; i pri čemu je detektabilni obeleživač pozicioniran na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa posle sečenja CM1-CM2 supstrata; i (ii)
1
merenjem nivoa detktabilnog obeleživača u subjektu ili uzorku, pri čemu detektabilni nivo detektabilnog obeleživača u subjektu ili uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo odsutno i/ili nije prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa detektabilnog obeleživača u subjektu ili uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili uzorku. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira za koje je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje uključuje detektabilni obeleživač.
[0406] Objava obezbeđuje i kitove za upotrebu u postupcim detektovanja prisustva ili odsustva sredstva koje vrši sečenje i cilja u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira (npr., antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo) opisane u ovom tekstu za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstva za detektovanje nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje na to da su isecajuće sredstvo i cilj prisutni u subjektu ili biološkom uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje na to da su isecajuće sredstvo, cilj ili i isecajuće sredstvo i cilj odsutni ili da nisu prisutni u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom uzorku, tako da vezivanje sa ciljem i/ili sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne mogu da se detektuju u subjektu ili biološkom uzorku.
[0407] Objava takođe obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira u prisustvu cilja, i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje na to da je isecajuće sredstvo prisutno u subjektu ili biološkom uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje na to da je isecajuće sredstvo odsutno ili da nije prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom
1
uzorku na detektabilnom nivou, tako da sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče isecajućim sredstvom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom (tj., neaktiviranom) stanju od N-terminusa do C-terminusa sadrži sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj, i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u isečenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je prikačen za maskirajuću komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je prikačen za maskirajuću komponentu N-terminalno od mesta sečenja proteazom. U nekim primerima izvođenja, jedno antigen-vezujuće mesto AB je maskirano. U nekim primerima izvođenja gde antitelo objave ima najmanje dva antigen-vezujuća mesta, najmanje jedno antigen-vezujuće mesto je maskirano i najmanje jedno antigen-vezujuće mesto nije maskirano. U nekim primerima izvođenja, sva antigen-vezujuća mesta su maskirana. U nekim primerima izvođenja, korak merenja uključuje upotrebu sekundarnog reagensa koji sadrži detektabilni obeleživač.
[0408] Objava obezbeđuje i kitove za upotrebu u postupcima detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva i cilja u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju bar antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira opisane u ovom tekstu za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira u prisustvu cilja i merenju nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo prisutno u subjektu ili biološkom uzorku i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo odsutno i/ili nije prisutno u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom uzorku na nivou detekcije, tako da proteazno sečenje antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče isecajućim sredstvom, i antigen-vezujući domen ili njegov
1
fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom (tj., neaktiviranom) stanju od N-terminusa do C-terminusa uključuje sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u isečenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je prikačen za maskirajuću komponentu. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je prikačen za maskirajuću komponentu N-terminalno od mesta sečenja proteazom. U nekim primerima izvođenja, jedno antigenvezujuće mesto AB je maskirano. U nekim primerima izvođenja gde antitelo objave ima najmanje dva antigen-vezujuća mesta, najmanje jedno antigen-vezujuće mesto je maskirano i najmanje jedno antigen-vezujuće mesto nije maskirano.U nekim primerima izvođenja, sva antigen-vezujuća mesta su maskirana. U nekim primerima izvođenja, korak merenja uključuje upotrebu sekundarnog reagensa koji sadrži detektabilni obeleživač.
[0409] Objava obezbeđuje i kitove za upotrebu u postupcima detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira opisano u ovom tekstu za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstava za detektovanje nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač koji je pozicioniran na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa posle sečenja CM1-CM2 supstrata, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo odsutno i/ili nije u dovoljnoj meri prisutno u subjektu ili biološkom uzorku tako da vezivanje za cilj i/ili proteazno sečenje antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku, i pri čemu odsustvo detektabilnog nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo prisutno u subjektu ili biološkom uzorku na detektabilnom nivou.
[0410] Objava obezbeđuje postupke detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom
1
koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač koji je pozicioniran na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa posle sečenja CM1-CM2 supstrata i (ii) merenja nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo, cilj ili i isecajuće sredstvo i cilj odsutni i/ili nisu prisutni u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom uzorku, tako da vezivanje sa ciljem i/ili sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku, i pri čemu smanjeni detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo i cilj prisutni u subjektu ili biološkom uzorku. Smanjeni nivo detektabilnog obeleživača je, na primer, smanjenje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče isecajućim sredstvom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom (tj., neaktiviranom) stanju od N-terminusa do C-terminusa uključuje sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u isečenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano za sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa sredstvom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilni obeleživač.
[0411] Objava obezbeđuje i kitove za upotrebu u postupcima detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva i cilja u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju najmanje
14
antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira opisano u ovom tekstu za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstava za detektovanje nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo, cilj ili i isecajuće sredstvo i cilj odsutni i/ili nisu prisutni u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom uzorku, tako da vezivanje sa ciljem i/ili sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku, i pri čemu smanjeni detektabilni nivo aktiviranog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo i cilj prisutni u subjektu ili biološkom uzorku. Smanjeni nivo detektabilnog obeleživača je, na primer, smanjenje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%.
[0412] Objava obezbeđuje i postupke detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u subjektu ili uzorku putem (i) dovođenja u kontakt subjekta ili biološkog uzorka sa antitelom koje može da se aktivira, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač koji je pozicioniran na delu antitela koje može da se aktivira, koji se oslobađa posle sečenja CM1-CM2 supstrata; i (ii) merenja nivoa detektabilnog obeleživača u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu detektabilni nivo detektabilnog obeleživača u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo odsutno i/ili nije dovoljno prisutno u subjektu ili biološkom uzorku, na detektabilnom nivou, tako da sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku, i pri čemu smanjeni detektabilni nivo detektabilnog obeleživača u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da je isecajuće sredstvo prisutno u subjektu ili biološkom uzorku. Smanjeni nivo detektabilnog obeleživača je, na primer, smanjenje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%. Takvo antitelo koje može da se aktivira uključuje maskirajuću komponentu (MM), CM1-CM2 supstrat koji se seče isecajućim sredstvom, i antigen-vezujući domen ili njegov fragment (AB) koji se specifično vezuje za cilj, pri čemu antitelo koje može da se aktivira u neisečenom (tj., neaktiviranom) stanju od N-terminusa do C-terminusa uključuje sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2 supstrat-AB ili AB-CM1-CM2 supstrat-MM; (a) pri čemu je MM peptid koji inhibira vezivanje AB za cilj i pri čemu MM nema aminokiselinsku sekvencu prirodnog vezujućeg partnera AB; i (b) pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u neisečenom stanju interferira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj, i pri čemu MM antitela koje može da se aktivira u isečenom (tj., aktiviranom) stanju ne interferira ili kompetira sa specifičnim vezivanjem AB za cilj. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa sredstvom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilni obeleživač.
[0413] ] Objava obezbeđuje i kitove za upotrebu u postupcima detektovanja prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva od interesa u subjektu ili uzorku, pri čemu kitovi uključuju najmanje antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira opisano u ovom tekstu za upotrebu u dovođenju u kontakt subjekta ili biološkog uzorka i sredstava za detektovanje nivoa aktiviranog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira u subjektu ili biološkom uzorku, pri čemu antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač koji je pozicioniran na delu antitela koje može da se aktivira koji se oslobađa posle sečenje CM1-CM2 supstrata, pri čemu detektabilni nivo detektabilnog obeleživača u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo, cilj, ili i isecajuće sredstvo i cilj odsutni i/ili nisu prisutni u dovoljnoj meri u subjektu ili biološkom uzorku, tako da vezivanje za cilj i/ili sečenje proteazom antitela koje može da se aktivira ne može da se detektuje u subjektu ili biološkom uzorku, i pri čemu smanjeni detektabilni nivo detektabilnog obeleživača u subjektu ili biološkom uzorku ukazuje da su isecajuće sredstvo i cilj prisutni u subjektu ili biološkom uzorku. Smanjeni nivo detektabilnog obeleživača je, na primer, smanjenje od oko 5%, oko 10%, oko 15%, oko 20%, oko 25%, oko 30%, oko 35%, oko 40%, oko 45%, oko 50%, oko 55%, oko 60%, oko 65%, oko 70%, oko 75%, oko 80%, oko 85%, oko 90%, oko 95% i/ili oko 100%.
[0414] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, antitelo koje može da se aktivira uključuje detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, detektabilni obeleživač uključuje sredstvo za dobijanje slike, kontrastno sredstvo, enzim, fluorescentni obeleživač, hromoforu, boju, jedan ili više jona metala, ili obeleživač na bazi liganda. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, sredstvo za dobijanje slike uključuje radioizotop. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, radioizotop je indijum ili tehnicijum. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, kontrastno sredstvo uključuje jod, gadolinijum ili gvožđe oksid. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, enzim uključuje peroksidazu rena, alkalnu fosfatazu, ili β-galaktozidazu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, fluorescentni obeleživač uključuje žuti fluorescentni protein (YFP), plavi fluorescentni protein (CFP), zeleni fluorescentni protein (GFP), modifikovani crveni fluorescentni protein (mRFP), crveni fluorescentni protein tdimer2 (RFP tdimer2), HCRED, ili derivat europijuma. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, luminiscentni obeleživač uključuje N- metilakridinijumski derivat. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, obeleživač uključuje Alexa Fluor<®>obeleživač, kao što je Alex Fluor<®>680 ili Alexa Fluor<®>750. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, obeleživač na bazi liganda uključuje biotin, avidin, streptavidin ili jedan ili više haptena.
[0415] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, subjekt je sisar. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, subjekt je čovek. U nekim primerima izvođenja, subjekt je nehumani sisar, na primer nehumani primat, životinja za društvo (npr., mačka, pas, konj), životinja sa farme, životinja za rad, ili životinja iz zoološkog vrta. U nekim primerima izvođenja, subjekt je glodar.
[0416] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in situ postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je ex vivo postupak. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka, postupak je in vitro postupak.
[0417] U nekim primerima izvođenja, in situ dobijanje slike i/ili in vivo dobijanje slike korisni su u postupcima identifikovanja pacijenata koje treba lečiti. Na primer, u in situ dobijanju slike, antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se za skrining uzoraka pacijenata da bi se identifikovali oni pacijenti koji imaju odgovarajuću proteazu(-e) i cilj(-eve) na pogodnoj lokaciji, npr., na mestu tumora.
[0418] U nekim primerima izvođenja, in situ dobijanje slike koristi se za identifikovanje ili na drugi način sužavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira objave. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni za cilj (npr., cilj) i proteazu koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu antitela koje može da se aktivira koje je testirano (npr., akumuliraju aktivirana antitela na obolelom mestu) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni za jedan ili oba od cilja (npr., cilj) i proteaze koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu u antitelu koje može da se aktivira koje je testirano korišćenjem ovih postupaka mogli bi biti identifikovani kao pogodni kandidati za drugu formu lečenja. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji su testirani kao
14
negativni u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu se testirati za druga antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju različite CM1-CM2 supstrate dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., an antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se tada primenjuje terapijski efikasna količina konjugovanog antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent testiran kao pozitivan.
[0419] U nekim primerima izvođenja, in vivo dobijanje slike koristi se za identifikovanje ili na drugi način sužavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira objave. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni i za cilj (npr., cilj) i za proteazu koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu antitela koje može da se aktivira koje je testirano (npr., akumuliraju aktivirana antitela na obolelom mestu) identifikuju se kao pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni mogu se identifikovati kao pogodni kandidati za drugu formu lečenja. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji su testirani kao negativni u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu se testirati drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja sadrže različite CM1-CM2 supstrate dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje uključuje CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se zatim primenjuje terapijski efikasna količina konjugovanog antitela koje može da se aktivira za koje je pacijent testiran kao pozitivan.
[0420] U nekim primerima izvođenja postupaka i kitova, postupak ili kit se koristi za identifikovanje ili na drugi način sužavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira objave. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni i za cilj (npr., cilj) i za proteazu koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu antitela koje može da se aktivira koji su testirani u ovim postupcima identifikovani su kao kandidati pogodni za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni i za ciljeve (npr., cilj) i za proteazu koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu u antitela koje može da se aktivira testirani korišćenjem ovih postupaka mogu se identifikovati kao pogodni kandidati za drugu formu lečenja. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu se testirati drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje uključuje CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti). U nekim primerima izvođenja, pacijenti koji su testirani kao negativni za neki od ciljeva (npr., cilj) identifikuju se kao kandidati pogodni za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat. U nekim primerima izvođenja, pacijenti koji su testirani kao negativni za neki od ciljeva (npr., cilj) identifikuju se kao da nisu pogodni kandidati za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu se testirati drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje uključuje CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira je antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira nije konjugovano sa sredstvom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, detektabilni obeleživač je pozicioniran na AB. U nekim primerima izvođenja, merenje nivoa antitela koje može da se aktivira u subjektu ili uzorku vrši se korišćenjem sekundarnog reagensa koji se specifično vezuje za aktivirano antitelo, pri čemu reagens sadrži detektabilni obeleživač. U nekim primerima izvođenja, sekundarni reagens je antitelo koje sadrži detektabilni obeleživač.
[0421] U nekim primerima izvođenja, postupak ili kit se koristi za identifikovanje ili na drugi način prečišćavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom za cilj, koje može da se aktivira i/ili konjugovanim antitelom koje može da se aktivira (npr., antitelo koje može da se aktivira sa kojim je konjugovano terapijsko sredstvo) objave, praćeno lečenjem primenom tog antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira kod subjekta kojem je to potrebno. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni i za ciljeve (npr., cilj) i za proteazu koja seče CM1-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira, koji su testirani u ovim postupcima identifikovani su kao kandidati pogodni za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira i/ili takvim konjugovanim antitelom koje može da se aktivira, koje uključuje takav CM1-CM2 supstrat i kod pacijenta se zatim primenjuje terapijski efikasna količina antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela koje može da se aktivira koje je testirano. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni i za cilj (npr., cilj) i za proteazu koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu u antitelu koje može da se aktivira koji su bili testirani korišćenjem ovih postupaka mogu da se identifikuju kao kandidati pogodni za drugu formu lečenja. U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti mogu da se testiraju drugim antitelom i/ili konjugovanim antitelom koje može da se aktivira dok se ne identifikuje antitelo i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira pogodno za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira koje sadrži CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu
14
namestu oboljenja). U nekim primerima izvođenja, kod pacijenta se tada primenjuje terapijski efikasna količina antitela koje može da se aktivira i/ili konjugovanog antitela za koje je pacijent testiran kao pozitivan.
[0422] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, MM je peptid koji ima dužinu od oko 4 do 40 amino-kiselina. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, antitelo koje može da se aktivira sadrži linkerski peptid, pri čemu je linkerski peptid pozicioniran između MM i CM1-CM2 supstrata. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, antitelo koje može da se aktivira sadrži linkerski peptid, pri čemu je linkerski peptid pozicioniran između AB i CM1-CM2 supstrata. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, antitelo koje može da se aktivira sadrži prvi linkerski peptid (LI) i drugi linkerski peptid (L2), pri čemu je prvi linkerski peptid pozicioniran između MM i CM1-CM2 supstrata i drugi linkerski peptid je pozicioniran između AB i CM1-CM2 supstrata. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, svaki od L1 i L2 je peptid dug od oko 1 do 20 amino-kiselina, i pri čemu svaki od L1 i L2 ne mora biti isti linker. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, jedan ili oba od L1 i L2 sadrže polimer glicin-serin. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od (GS)n, (GSGGS)n (SEQ ID NO: 381) i (GGGS)n (SEQ ID NO: 382), pri čemu je n ceo broj i iznosi najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu koja ima formulu (GGS)n, pri čemu je n ceo broj i iznosi najmanje jedan. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, najmanje jedan od L1 i L2 sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 383), Gly-Gly-Ser-Gly-Gly (SEQ ID NO: 384), Gly-Ser-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 385), Gly-Ser-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO: 386), Gly-Gly-Gly-Ser-Gly (SEQ ID NO: 387), i Gly-Ser-Ser-Ser-Gly (SEQ ID NO: 388).
[0423] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, AB sadrži sekvencu antitela ili fragmenta antitela odabranu između sekvenci unakrsno reaktivnog antitela prikazanog u ovom tesktu. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, AB sadrži Fab fragment, scFv ili jednolančano antitelo (scAb).
[0424] U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, sredstvo za sečenje je proteaza koja je kolokalizovana sa ciljem u subjektu ili uzorku i CM1-CM2 supstrat je polpeptid koji funkcioniše kao supstrat za proteazu, pri čemu proteaza seče CM1-CM2 supstrat u antitelu koje može da se aktivira kada se antitelo koje može da se aktivira izloži proteazi. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, svaka od sekvence CM1 supstrata i sekvence CM2 supstrata u CM1-CM2 supstratu je nezavisno polipeptid dužine do 15 amino-kiselina. U nekim
14
primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, CM1-CM2 supstrat je kuplovan sa N-terminusom AB. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, CM1-CM2 supstrat je kuplovan sa C-terminusom AB. U nekim primerima izvođenja ovih postupaka i kitova, CM1-CM2 supstrat je kuplovan sa N-terminusom VL lanca AB.
[0425] Antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju objave koriste se u dijagnostičkim i prognostičkim formulacijama. U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira primenjuje se kod pacijenata koji su pod rizikom da razviju jedno ili više od gore pomenutih zapaljenja, zapaljenskih poremećaja, kancera ili drugih poremećaja.
[0426] Predispozicija pacijenta ili organa za jedan ili više od gore pomenutih poremećaja može se odrediti genotipskim, serološkim ili biohemijskim markerima.
[0427] U nekim primerima izvođenja, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju primenjuju se kod čoveka kod kojeg je postavljena dijagnoza kliničke indikacije udružene sa jednim ili više gore pomenutih poremećaja. Posle dijagnoze, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se za olakšavanje ili reverziju efekata kliničke indikacije.
[0428] Antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju objave korisna su u detekciji cilja u pacijentovim uzorcima i prema tome korisna su kao dijagnostička sredstva. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju objave koriste se u in vitro testovima, npr., ELISA, za detektovanje nivoa cilja u pacijentovom uzorku.
[0429] U jednom primeru izvođenja, antitelo koje može da se aktivira objave je imobilisano na čvrstoj podlozi (npr., bunarčić(-i) mikrotitarske ploče). Imobilisano antitelo koje može da se aktivira služi kao "zarobljavajuće" antitelo za bilo koji cilj koji može biti prisutan u testnom uzorku. Pre dovođenja u kontakt imobilisanog antitela sa pacijentovim uzorkom, čvrsta podloga se ispere i tretira blokirajućim sredstvom kao što su proteini mleka ili albumin da bi se sprečila nespecifična adsorpcija analita.
[0430] Posle toga, bunarčići se tretiraju testnim uzorkom za koji se misli da sadrži antigen, ili rastvorom koji sadrži standardnu količinu antigena. Takav uzorak je, npr., uzorak seruma od subjekta za kojeg se misli da ima nivoe antigena u cirkulaciji za koje se smatra da dijagnostikuju bolest. Posle ispiranja testnog uzorka ili standarda, čvrsta podloga se tretira drugim antitelom koje je detektabilno obeleženo. Obeleženo drugo antitelo služi kao detekciono antitelo. Meri se nivo detektabilnog obeleživača, a koncentracija ciljnog antigena u testnom uzorku se određuje poređenjem sa standardnom krivom konstruisanom na osnovu standardnih uzoraka.
14
[0431] Procenjuje se da je na osnovu rezultata dobijenih korišćenjem antitela objave u in vitro dijagnostičkom testu, moguće kod subjekta odrediti stadijum bolesti na osnovu nivoa ekspresije ciljnog antigena. Za datu bolest, uzorci krvi se uzimaju od subjekata za koje je dijagnostikovano da su u različitim stadijumima progresije bolesti, i/ili u različitim tačkama terapijskog tretmana bolesti. Korišćenjem populacije uzoraka koji obezbeđuju statistički značajne rezultate za svaki stupanj progresije ili terapije, određuje se opseg koncentracija antigena koji se može smatrati karakterističnim za svaki stupanj.
[0432] Antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se koriste i u dijagnostičkim i/ili postupcima dobijanja slike. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su postupci in vitro. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su postupci in vivo. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su postupci in situ. U nekim primerima izvođenja, takvi postupci su postupci ex vivo. Na primer, antitela koja mogu da se aktiviraju koja imaju enzimom isecajući CM1-CM2 supstrat mogu se upotrebiti za detektovanje prisustva ili odsustva enzima koji je sposoban da seče CM1-CM2 supstrat. Takva antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti u dijagnostici, koja može uključiti in vivo detekciju (npr., kvalitativnu ili kvantitativnu) enzimske aktivnosti (ili, u nekim primerima izvođenja, sredine povišenog redukcionog potencijala koja je takva da obezbeđuje redukciju disulfidne veze) merenjem akumulacije aktiviranih antitela (tj., antitela nastalih sečenjem antitela koje može da se aktivira) u datoj ćeliji ili tkivu datog organizma-domaćina. Takva akumulacija aktiviranih antitela ukazuje ne samo na to da tkivo ispoljava enzimsku aktivnost (ili povišeni redukcioni potencijal u zavisnosti od prirode CM1-CM2 supstrata) nego i na to da tkivo eksprimira cilj za koji se vezuje aktivirano antitelo.
[0433] Na primer, CM1-CM2 supstrat može se odabrati tako da bude supstrat za proteazu nađenu na mestu tumora, na mestu virusne ili bakterijske infekcije na biološki ograničenom mestu (npr., u apscesu, u organu, i slično), i slično. AB može biti ono koje se vezuje sa ciljnim antigenom. Korišćenjem postupaka poznatih stručnjaku u oblasti, detektabilni obeleživač (npr., fluorescentni obeleživač ili radioaktivni obeleživač ili radiotrejser) može se konjugovati sa AB ili drugim regionom antitela i/ili antitela koje može da se aktivira. Pogodni detektabilni obeleživači razmatraju se u kontekstu gornjih postupaka skrininga i dodatni specifični primeri dati su u nastavku ovog teksta. Korišćenjem AB specifičnog za protein ili peptid bolesnog stanja, zajedno sa proteazom čija je aktivnost povišena u obolelom tkivu od interesa, antitela koja mogu da se aktiviraju pokazaće povećanu stopu vezivanja za bolesno tkivo u odnosu na tkiva u kojima enzim specifičan za CM1-CM2 supstrat nije prisutan na detektabilnom nivou ili je prisutan na nižem nivou nego u bolesnom tkivu ili je neaktivan (npr. u obliku zimogena ili u
14
kompleksu sa inhibitorom). Pošto se mali proteini i peptidi brzo uklanjaju iz krvi sistemom bubrežne filtracije, i zato što enzim specifičan za CM1-CM2 supstrat nije prisutan na detektabilnom nivou (ili je prisutan na nižim nivoima u neobolelim tkivima ili je prisutan u neaktivnoj konformaciji), akumulacija aktiviranih antitela u bolesnom tkivu je pojačana u odnosu na tkiva koja nisu obolela.
[0434] U sledećem primeru, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za detektovanje prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva u uzorku. Na primer, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM1-CM2 supstrat podložan sečenju enzimom, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za detektovanje (kvalitativno ili kvantitativno) prisustva enzima u uzorku. U sledećem primeru, kada antitela koja mogu da se aktiviraju sadrže CM1-CM2 supstrat podložan sečenju redukcionim sredstvom, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu se koristiti za detektovanje (kvalitativno ili kvantitativno) prisustva redukujućih uslova u uzorku. Za olakšavanje analize u ovim postupcima, antitela koja mogu da se aktiviraju mogu biti detektabilno obeležena, i mogu biti vezana za podlogu (npr. čvrsta podloga, na primer pločica ili perlica). Detektabilni obeleživač može biti postavljen na deo antitela koje može da se aktivira koji se ne oslobađa posle sečenja, na primer, detektabilni obeleživač može biti ugašeni fluorescentni obeleživač ili drugi obeleživač koji se ne može detektovati dok ne dođe do sečenja. Test se može izvesti na primer dovođenjem u kontakt imobilisanog, detektabilno obeleženog antitela koje može da se aktivira sa uzorkom za koji se misli da sadrži enzim i/ili redukciono sredstvo, tokom vremena dovoljnog da dođe do sečenja, zatim se vrši ispiranje da se uklone višak uzorka. i kontaminanti. Prisustvo ili odsustvo sredstva za sečenje (npr. enzima ili redukcionog sredstva) u uzorku se zatim procenjuje promenom detektabilnog signala antitela koja mogu da se aktiviraju pre dovođenja u kontakt sa uzorkom npr. prisustvo i /ili povećanje detektabilnog signala usled sečenja antitela koje može da se aktivira sredstvom za sečenje u uzorku.
[0435] Takvi postupci detekcije mogu se prilagoditi da obezbede i detekciju prisustva ili odsustva cilja koji može da se veže za AB antitela koja mogu da se aktiviraju kada se iseku. Prema tome, testovi se mogu prilagoditi za procenu prisustva ili odsustva isecajućeg sredstva i prisustva ili odsustva cilja od interesa. Prisustvo ili odsustvo isecajućeg sredstva može se detektovati po prisustvu i/ili porastu detektabilnog obeleživača antitela koja mogu da se aktiviraju, kako je opisano ranije u ovom tesktu, i prisustvo ili odsustvo cilja može se pokazati detekcijom kompleksa cilj-AB npr., upotrebom detektabilno obeleženog antitela na cilj.
[0436] Antitela koja mogu da se aktiviraju korisna su i za dobijanje slike in situ, za validaciju aktivacije antitela koje može da se aktivira, npr., sečenjem proteazom, i vezivanjem za određeni
14
cilj. In situ dobijanje slike je tehnika koja omogućava lokalizovanje proteolitičke aktivnosti i cilja u biološkim uzorcima kao što su ćelijske kulture ili preseci tkiva. Korišćenjem ove tehnike, moguće je potvrditi i vezivanje za dati cilj i proteolitičku aktivnost, na osnovu prisustva detektabilnog obeleživača (npr., fluorescentnog obeleživača).
[0437] Ove tehnike su korisne za sve zamrznute ćelije ili tkivo poreklom sa mesta bolesti (npr. tumorsko tkivo) ili zdrava tkiva. Ove tehnike su takođe korisne za sveže uzorke ćelija ili tkiva.
[0438] U ovim tehmikama, antitelo koje može da se aktivira obeleženo je detektabilnim obeleživačem. Detektabilni obeleživač može biti fluorescentna boja, (npr. fluorofora, fluorescein izotiocijanat (FITC), rodamin izotiocijanat (TRITC), boja bliska infracrvenoj (near infrared, NIR) (npr., Qdot<®>nanokristali), koloidni metal, hapten, radioaktivni marker, biotin i amplifikacioni reagens na primer streptavidin, ili enzim (npr. peroksidaza rena ili alkalna fosfataza).
[0439] Detekcija obeleživača u uzorku koji je inkubiran sa obeleženim antitelom koje može da se aktivira ukazuje na to da uzorak sadrži cilj i da sadrži proteazu (MMP) koja je specifična za CM-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo proteaze se može potvrditi korišćenjem širokog spektra inhibitora proteaze kao što su oni koji su ovde opisani, i/ili korišćenjem sredstva koje je specifično za proteazu, na primer, antitela kao što je A11 koje je specifično za proteazu matriptazu (MT-SP1) i inhibira proteolitičku aktivnost matriptaze; vidi npr., Međunarodnu publikaciju broj WO 2010/129609, objavljenu 11. novembra 2010. Isti pristup korišćenjem širokog spektra inhibitora proteze kao što su oni opisani u ovom tekstu, i/ili korišćenjem selektivnijeg inhibitornog sredstva, može se upotrebiti za identifikovanje proteaze ili klase proteaza specifičnih za CM1-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira. U nekim primerima izvođenja, prisustvo cilja može se potvrditi korišćenjem sredstva koje je specifično za cilj, npr., drugog antitela, ili detektabilni obeleživač može kompetirati sa neobeleženim ciljem. U nekim primerima izvođenja, može da se koristi neobeleženo antitelo koje može da se aktivira, uz detekciju obeleženim sekundarnim antitelom ili kompleksnijim detekcionim sistemom.
[0440] Slične tehnike su takođe korisne za in vivo dobijanje slike gde detekcija fluorescentnog signala kod subjekta, npr., sisara, uključujući čoveka, ukazuje da bolesno mesto sadrži cilj i da sadrži proteazu koja je specifična za CM1-CM2 supstrat antitela koje može da se aktivira.
[0441] Ove tehnike su korisne i u kitovima i/ili kao reagensi za detekciju, identifikaciju ili karakterizaciju proteazne aktivnosti u različitim ćelijama, tkivima i organizmima na osnovu proteaza-specifičnog CM1-CM2 supstrata u antitelu koje može da se aktivira.
[0442] U nekim primerima izvođenja, in situ dobijanje slike i/ili in vivo dobijanje slike korisni
1
su u postupcima za identifikovanje pacijenata koje treba lečiti. Na primer, u dobijanju slike in situ, antitela koja mogu da se aktiviraju koriste se za skrining uzoraka dobijenih od pacijenata, za identifikovanje pacijenata koji imaju pogodnu proteazu(-e) i cilj(-eve) na pogodnoj lokaciji, npr., na mestu tumora.
[0443] U nekim primerima izvođenja, in situ dobijanje slike koristi se za identifikovanje ili na drugi način sužavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira objave. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni i za cilj i za proteazu koja seče supstrat u isecajućoj komponenti (CM1-CM2 supstrat) antitela koje može da se aktivira koja su testirana (npr., akumuliraju aktivirana antitela na mestu oboljenja) identifikuju se kao pogodni kandidati za za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM1-CM2 supstrat. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni za jedan ili oba od cilja i proteaze koja seče supstrat u CM1-CM2 supstratu u antitelu koje može da se aktivira koja su testirana korišćenjem ovih postupaka, identifikuju se kao kandidati pogodni za lečenje drugom formom terapije (tj., nisu pogodni za lečenje antitelom koje može da se aktivira koje je testirano). U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji su testirani kao negativni u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu se testirati drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja sadrže različite CM dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje uključuje CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti).
[0444] U nekim primerima izvođenja, in vivo dobijanje slike koristi se za identifikovanje ili na drugi način sužavanje populacije pacijenata pogodnih za lečenje antitelom koje može da se aktivira objave. Na primer, pacijenti koji su testirani kao pozitivni i za cilj i za proteazu koja seče supstrat u isecajućoj komponenti (CM1-CM2 supstrat) antitela koje može da se aktivira koje je testirano (npr., akumuliraju aktivirana antitela na mestu oboljenja) identifikuju se kao kandidati pogodni za lečenje takvim antitelom koje može da se aktivira koje sadrži takav CM1-CM2 supstrat. Slično tome, pacijenti koji su testirani kao negativni identifikuju se kao kandidati pogodni za lečenje drugom formom terapije (tj., nisu pogodni za lečenje antitelom koje može da se aktivira koje je testirano). U nekim primerima izvođenja, takvi pacijenti koji su testirani kao negativni u pogledu prvog antitela koje može da se aktivira mogu se testirati drugim antitelima koja mogu da se aktiviraju koja sadrže različite CM dok se ne identifikuje pogodno antitelo koje može da se aktivira za lečenje (npr., antitelo koje može da se aktivira koje uključuje CM1-CM2 supstrat koji se seče u pacijentu na mestu bolesti).
Farmaceutske kompozicije
1 1
[0445] Konjugovana antitela, antitela koja mogu da se aktiviraju i/ili konjugovana antitela koja mogu da se aktiviraju objave (označena u ovom tekstu i kao "aktivna jedinjenja"), i njihovi derivati, fragmenti, analozi i homolozi, mogu se inkorporisati u farmaceutske kompozicije pogodne za primenu. Takve kompozicije tipično uključuju konjugovano antitelo, antitelo koje može da se aktivira i/ili konjugovano antitelo koje može da se aktivira i farmaceutski prihvatljivi nosač. Kako se koristi u ovom tekstu, izraz "farmaceutski prihvatljivi nosač" treba da uključi svaki i sve rastvarače, disperzione medijume, sredstva za oblaganje, antibakterijska i antigljivična sredstva, izotonična i sredstva za odlaganje apsorpcije, i slično, kompatibilna sa farmaceutskom primenom. Pogodni nosači su opisani u najnovijem izdanju Remington's Pharmaceutical Sciences, standardnom referentnom tekstu u oblasti. Pogodni primeri takvih nosača ili razblaživača uključuju, ali se ne ograničavaju na vodu, fiziološki rastvor, Ringer-ove rastvore, rastvor dekstroze, i 5% humani serumski albumin. Lipozomi i nevodeni prenosnici kao što su fiksirana ulja takođe mogu da se koriste. Upotreba takvih medijuma i sredstava za farmaceutski aktivne supstance dobro je poznata u struci. Osim u meri u kojoj neki konvencionalni medijum ili sredstvo nisu kompatibilni sa aktivnim jedinjenjem, razmatra se njihova upotreba u kompozicijama. Dodatna aktivna jedinjenja se takođe mogu inkorporisati u kompozicije.
[0446] Farmaceutska kompozicija objave formulisana je tako da bude kompatibilna sa predviđenim načinom primene. Primeri puteva primene uključuju parenteralnu, npr., intravensku, intradermalnu, supkutanu, oralnu (npr. inhalacija), transdermalnu (tj., lokalnu), transmukoznu i rektalnu primenu. Rastvori ili suspenzije koji se koriste za parenteralnu, intradermalnu ili supkutanu primenu mogu uključivati sledeće komponente: sterilni razblaživač kao što je voda za injekcije, fiziološki rastvor, fiksirana ulja, polietilen glikole, glicerin, propilen glikol ili druge sintetske rastvarače; antibakterijska sredstva kao što su benzil alkohol ili metil parabene; antioksidante kao što su askorbinska kiselina ili natrijum bisulfit; helirajuća sredstva kao što je etilendiamintetrasirćetna kiselina (ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA); pufere kao što su acetati, citrati ili fosfati, i sredstva za podešavanje toničnosti kao što su natrijum hlorid ili dekstroza. pH se može podesiti kiselinama ili bazama, kao što su hlorovodonična kiselina ili natrijum hidroksid. Parenteralni preparat se može staviti u ampule, špriceve za jednokratnu upotrebu ili staklene ili plastične bočice za više doza.
[0447] Farmaceutske kompozicije pogodne za injektabilnu upotrebu uključuju sterilne vodene rastvore (kada su rastvorljive u vodi) ili disperzije i sterilne praškove za pripremu sterilnih rastvora za injekcije ili disperzije, na licu mesta. Za intravensku primenu, pogodni nosači uključuju fiziološki rastvor, bakteriostatičku vodu, Cremophor EL™ (BASF, Parsippany, N.J.)
1 2
ili fiziološki rastvor puferisan fosfatom (phosphate buffered saline, PBS). U svim slučajevima, kompozicija mora biti sterilna i treba da bude tečna u meri koja omogućava lako ubrizgavanje. Mora biti stabilna u uslovima proizvodnje i skladištenja i mora biti zaštićena od kontaminacije mikroorganizmima kao što su bakterije i gljivice. Nosač može biti rastvarač ili disperzioni medijum koji sadrži na primer, vodu, etanol, poliol (na primer, glicerol, propilen glikol i tečni polietilen glikol, i slično), i njihove pogodne smeše. Odgovarajuća fluidnost se može održavati, na primer, upotrebom sredstava za oblaganje kao što je lecitin, održavanjem potrebne veličine čestica u slučaju disperzije i upotrebom surfaktanata. Prevencija delovanja mikroorganizama može se postići raznim antibakterijskim i antifungalnim sredstvima, na primer, parabenima, hlorobutanolom, fenolom, askorbinskom kiselinom, timerosalom i sl. U nekim primerima izvođenja, biće poželjno da se u kompoziciju uključe izotonična sredstva, na primer, šećeri, polialkoholi kao što su manitol, sorbitol, natrijum hlorid. Produžena apsorpcija injektabilnih kompozicija može se postići uključivanjem u kompoziciju sredstva koje odlaže apsorpciju, na primer, aluminijum monostearata i želatina.
[0448] Sterilni injektabilni rastvori se mogu pripremiti inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u potrebnoj količini u odgovarajući rastvarač sa jednim ili kombinacijom sastojaka nabrojanih ranije u ovom tekstu, po potrebi, posle čega sledi sterilizacija filtriranjem. Generalno, disperzije se pripremaju inkorporisanjem aktivnog jedinjenja u sterilni prenosnik koji sadrži osnovni disperzioni medijum i potrebne druge sastojke od onih koji su navedeni ranije u ovom tekstu. U slučaju sterilnih praškova za pripremu sterilnih injektabilnih rastvora, postupci pripreme su sušenje u vakuumu i sušenje zamrzavanjem koje daje prašak aktivnog sastojka plus bilo koji dodatni željeni sastojak iz prethodno sterilno filtriranog rastvora istog.
[0449] Oralne kompozicije generalno uključuju inertni razblaživač ili jestivi nosač. Mogu se staviti u želatinske kapsule ili komprimovati u tablete. U svrhu oralne terapijske primene, aktivno jedinjenje se može inkorporisati sa ekscipijentima i koristiti u formi tableta, pastila ili kapsula. Oralne kompozicije se mogu pripremiti i korišćenjem tečnog nosača za upotrebu u vidu tečnosti za ispiranje usta, pri čemu se jedinjenje u tečnom nosaču primenjuje oralno i iskašljava ili guta. Farmaceutski kompatibilna vezujuća sredstva, i/ili adjuvansni materijali mogu biti uključeni kao deo kompozicije. Tablete, pilule, kapsule, pastile i slično mogu da sadrže bilo koji od sledećih sastojaka ili jedinjenja slične prirode: povezivač kao što je mikrokristalna celuloza, tragakantova guma ili želatin; ekscipijent kao što je skrob ili laktoza, dezintegrišuće sredstvo kao što je alginska kiselina, Primogel ili kukuruzni skrob; lubrikans kao što je magnezijum stearat ili Sterotes; glidans kao što je koloidni silicijum dioksid; zaslađivač kao što je saharoza ili saharin; ili aroma kao što je pepermint, metil salicilat ili aroma
1
pomorandže.
[0450] Za primenu inhalacijom, jedinjenja se isporučuju u obliku aerosol spreja iz posude pod pritiskom ili dispenzera koji sadrži odgovarajući propelant, npr., gas kao što je ugljen-dioksid, ili nebulizer.
[0451] Sistemska primena može se vršiti i transmukoznim ili transdermalnim putem. Za transmukoznu ili transdermalnu primenu, u formulaciji se koriste penetranti u skladu sa barijerom koju treba savladati. Takvi penetranti su opštepoznati u struci i uključuju, na primer, za transmukoznu primenu, deterdžente, žučne soli i derivate fuzidne kiseline. Transmukozna primena se može postići upotrebom nazalnih sprejova ili supozitorija. Za transdermalnu primenu, aktivna jedinjenja se formulišu u masti, meleme, gelove ili kremove, kako je opšte poznato u struci.
[0452] Jedinjenja se takođe mogu pripremiti u formi supozitorija (npr. sa konvencionalnim osnovama za supozitorije kao što su kakao buter i drugi gliceridi) ili retencionih enema za rektalnu isporuku.
[0453] U jednom primeru izvođenja, aktivna jedinjenja se pripremaju sa nosačima koji će zaštititi jedinjenje od brze eliminacije iz tela, kao što je formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem, uključujući implante i mikroinkapsulirane sisteme za isporuku. Mogu se koristiti biorazgradivi, biokompatibilni polimeri, kao što su etilen vinil acetat, polianhidridi, poliglikolna kiselina, kolagen, poliortoestri i polilaktična kiselina. Postupci za pripremu takvih formulacija biće očigledni stručnjacima u oblasti. Materijali se takođe mogu komercijalno nabaviti od Alza Corporation i Nova Pharmaceuticals, Inc. Lipozomske suspenzije (uključujući lipozome koji ciljaju inficirane ćelije pomoću monoklonskih antitela na virusne antigene) takođe se mogu koristiti kao farmaceutski prihvatljivi nosači. Ovi se mogu pripremiti u skladu sa postupcima koji su poznati stručnjacima u oblasti, na primer, kako je opisano u U.S. patentu br. 4,522,811.
[0454] Posebno je pogodno formulisati oralne ili parenteralne kompozicije u jediničnoj doznoj formi radi lakše primene i uniformnosti doziranja. Jedinična dozna forma kako se koristi u ovom tekstu odnosi se na fizički odvojene jedinice koje su podešene kao dozne jedinice za subjekta koji se leči; svaka jedinica sadrži unapred određenu količinu aktivnog jedinjenja izračunatu da proizvede željeni terapijski efekat, u kombinaciji sa potrebnim farmaceutskim nosačem. Specifikacije za jedinične dozne forme iz objave diktirane su i direktno zavise od jedinstvenih karakteristika aktivnog jedinjenja i posebnog terapijskog efekta koji treba da se postigne, kao i od ograničenja inherentnih struci pravljenja aktivnog jedinjenja za lečenje individua.
1 4
[0455] Farmaceutske kompozicije mogu biti sadržane u kontejneru, pakovanju ili dispenzeru, zajedno sa uputstvima za primenu.
[0456] Pronalazak će dalje biti opisan u primerima koji slede, koji ne ograničavaju obim pronalaska opisanog u patentnim zahtevima.
Primeri
Primer 1. Anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju koja se seku matriksnom metaloproteazom (MMP) i serin proteazom (SP)
[0457] Ovaj Primer pokazuje generisanje i evaluaciju antitela koja mogu da se aktiviraju koja se vezuju za Jagged cilj, npr., Jagged 1 i/ili Jagged 2, gde se antitela koja mogu da se aktiviraju aktiviraju u prisustvu najmanje jedne matriksne metaloproteaze (MMP) i najmanje jedne serin proteaze.
[0458] Studije opisane u ovom tekstu koriste sledeće sekvence supstrata, gde je LP' povezujući peptid između CM1 i CM2. Za CM1-CM2 supstrat 1001/LP'/0001, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350), i za sve druge CM1-CM2 u Tabeli u nastavku, LP' je GG:
[0459] Konstrukcija lakih lanaca anti-Jagged antitela koje može da se aktivira izvodi se na sledeći način.
[0460] CM1-CM2 supstrati se inkorporišu u vektor Jagged antitela koje može da se aktivira
1
(opisan u PCT publikaciji br. WO2013/192550) na sledeći način. Koristeći standardne tehnike molekularne biologije, upotrebljavaju se forward (F) prajmeri koji kodiraju CM1-CM2 supstrate (videti tabelu A) i reverse (R) prajmer CX1198 za amplifikovanje supstrata i VL domena Jagged antitela koje može da se aktivira, i zatim se vrši kloniranje u vektor antitela koje može da se aktivira, uz korišćenje XhoI i BsiVI restrikcionih mesta. Dobijeni vektori su kodirali sledeće lake lance anti-Jagged antitela koje može da se aktivira.
Tabela A: Prajmeri upotrebljeni za konstruisanje CM1-CM2 ekspresionih vektora
1
Lc anti-Jagged 2001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2001 antitela koje može da se aktivira Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1
Lc anti-Jagged antitela koje može da se aktivira 1001/LP'/0001 sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged antitela koje može da se aktivira 1001/LP'/0001
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1004/LP'/0003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1004/LP'/0003 antitela koje može da se aktivira
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0003/LP'/1004 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
1 1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0003/LP'/1004 antitela koje može da se aktivira Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1 2
Lc anti-Jagged 1003/LP'/0003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1003/LP'/0003 antitela koje može da se aktivira
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0003/LP'/1003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1 4
Lc anti-Jagged 0003/LP'/1003 antitela koje može da se aktivira
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1004/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1004/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0001/LP'/1004 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
1
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0001/LP'/1004 antitela koje može da se aktivira Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1
Lc anti-Jagged 1003/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 1003/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 0001/LP'/1003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1
Lc anti-Jagged 0001/LP'/1003 antitela koje može da se aktivira Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
Hc anti-Jagged antitela koje može da se aktivira
1
[0461] In vitro vezivanje i aktivacija anti-Jagged CM1-CM2 antitela koje može da se aktivira evaluirani su na sledeći način.
[0462] Anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju eksprimiraju se iz prolazno transfektovanih HEK-293 ćelija i prečiste iz supernatanta kulture, hromatografijom sa proteinom A. Da bi se verifikovalo da anti-Jagged CM1-CM2 antitela koja mogu da se aktiviraju mogu da se aktiviraju i pomoću MMP i pomoću serin proteaza, prečišćena antitela koja mogu da se aktiviraju digestiraju se pomoću uPA i/ili MMP14 i zatim se pomoću ELISA evaluiraju u pogledu sposobnosti da se vežu za humani Jagged 1-Fc. ELISA ploče (Greiner Bio-One #655061) oblože se humanim Jag1-Fc (R&D #1277-JG-050) u Hank-ovom balansiranom fiziološkm rastvoru pH 7.4 (Hank’s balanced salt solution, HBSS) (Teknova #H8057) pri 1 mikrogramu/ml, preko noći, na 4°C; kako se koristi u ovom tekstu, mikrogram(i) se prikazuju i kao ug i µg. Ploče se blokiraju 2% mlekom u prahu koje ne sadrži masti (nonfat dry milk, NFDM) u HBSS 1 sat na sobnoj temperaturi (room temperature, RT). Blok se ukloni i anti-Jagged antitelo 4D11, anti-Jagged CM1-CM2 antitelo koje može da se aktivira, ili digestirano antitelo koje može da se aktivira, dodaju se u navedenoj koncentraciji u 2% NFDM/HBSS i inkubiraju na RT 1 sat. ELISA ploče se isperu u 3 promene HBSS u višku, sa 0.05% TWEEN (HBSS-T) pre dodavanja mišjeg antithumanog IgG, F'Ab(2)specifičnog, konjugovanog sa HRP (Jackson ImmunoResearch #209-035-097) u razblaženju 1:30,000 u 2% NFDM/HBSS. ELISA ploča se zatim ispere 3x sa HBSS-T i razvije korišćenjem 1-Step TMB supstrata (Pierce/Thermo Fisher #NC0140927). Ploče se očitavaju na OD450i podaci grafički prikazuju korišćenjem Prism softvera.
[0463] Slika 1 pokazuje da su anti-Jagged CM1-CM2 antitela koja mogu da se aktiviraju (a) bila efikasno maskirana pre sečenja pomoću uPA ili MMP14 i (b) pokazala su vezivanje ekvivalentno antitelu kada se seče pomoću uPA ili MMP14 ili kombinacijom uPA i MMP14.
[0464] Farmakokinetika anti-Jagged antitela koje može da se aktivira koje sadrži CM1-CM2 supstrat evaluira se u nude miševima koji ne nose tumor, na sledeći način.
[0465] Kao surogat za stabilnost maske i supstrata, farmakokinetika anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže CM1-CM2 supstrate 2001 i 1001/LP'/0001 upoređivana je sa onom anti-Jagged antitela kod miševa koji ne nose tumor. Miš/čovek unakrsno reaktivno anti-Jagged antitelo pokazuje brzi klirens u miševima zbog vezivanja Jagged 1/2 u normalnim tkivima. Ako anti-Jagged CM1-CM2 antitelo koje može da se aktivira ostane maskirano (stabilno) u cirkulaciji, onda antitelo koje može da se aktivira izbegava ciljem posredovani klirens i pokazuje produženi poluživot u serumu.
[0466] Farmakokinetika anti-Jagged antitela i antitela koja mogu da se aktiviraju, u plazmi,
1 1
evaluira se na sledeći način. Kao što je prikazano u Tabeli B, svaka grupa sastojala se od 2 kohorta od po 5 miševa. Miševima je data jedna intravenska doza od 5 mg/kg navedenog jedinjenja. Litijum-heparinizovana plazma sakuplja se od kohorta 1 na 24 sata, 96 sati, i 10 dana posle doziranja, dok se plazma kohorta 2 sakuplja na 48 sati, 7 dana, i 14 dana, retroorbitalnim putem, uz anesteziju izofluranom. Nivoi ukupnog humanog IgG u plazmi detektuju se korišćenjem humanog IgG-sendvič ELISA. Ukratko, ELISA ploče (Costar 3590 Fisher Scientific kat. # 07-200-35) oblože se AffiniPure kozjim antitelom specifičnim za F(ab')2 fragment humanog IgG (Jackson ImmunoResearch kat. # 109-006-097) u fiziološkom rastvoru puferisanom fosfatom (PBS) pri 1 ug/ml, preko noći, na 4°C. Ploče se blokiraju korišćenjem Superblock (ScyTek Laboratories kat. # AAA500) 1 sat na sobnoj temperaturi (RT). Blok se ukloni i odgovarajuće razblaženje standarda (testni artikl) i testnih uzoraka (uzorci plazme) dodaju se pločama i inkubiraju na RT 1 sat. ELISA ploče se isperu u 3 promene PBS u višku, sa 0.05% TWEEN (PBS-T) pre dodavanja AffiniPure kozjeg antitela specifičnog za F(ab')2fragment humanog IgG konjugovanog sa peroksidazom rena (HRP) (Jackson ImmunoResearch kat. # 109-035-097) u razblaženju 1:25,000. ELISA ploča se zatim ispere 3x korišćenjem PBS-T i razvije korišćenjem 1-Step TMB supstrata (Pierce/Thermo Fisher #NC0140927) prema protokolu proizvođača. Nivoi humanog IgG u serumu izračunavaju se upoređivanjem vrednosti testnih uzoraka sa standardnom krivom. Farmakokinetički parametri se izračunavaju korišćenjem nekompartmentalne analize sa malim brojem uzoraka (Phoenix WinNonlin v6.3).
[0467] Kako je prikazano na Slici 2, anti-Jagged antitelo se brzo eliminiše i ispod je detekcionog limita testa do dana 10. Nasuprot tome, anti-Jagged CM1-CM2 antitela koja mogu da se aktiviraju 1001/LP'/0001 i 2001 pokazuju značajno produžen poluživot što ukazuje da antitela koja mogu da se aktiviraju ostaju stabilna i dobro maskirana u cirkulaciji.
Tabela B. Grupe i doziranje za farmakokinetičku analizu anti-Jagged CM1-CM2 antitela koja mogu da se aktiviraju 2001 i 1001/LP'/0001.
1 2
[0468] In vivo evaluacija bezbednosti i efikasnosti anti-Jagged CM1-CM2 supstratsadržavajućeg antitela koje može da se aktivira, konjugovanog sa lekom izvodi se na sledeći način.
[0469] Efikasnost konjugata anti-Jagged CM1-CM2 supstrat-sadržavajućeg 2001 antitela koje može da se aktivira, sa lekom, koji podrazumeva anti-Jagged 2001 antitelo koje može da se aktivira konjugovano sa majtanzinoidom DM4 (vidi, npr., US 7,276,497) preko SPDB linkera, evaluirana je u modelu tumorskog ksenografta ćelijske linije humanog kancera dojke HCC1806. HCC1806 ćelije se sakupe tokom log faze rasta i resuspenduju u 50% Matrigel (BD Biosciences) u PBS u koncentraciji od 5 × 10<7>ćelija/ml. Miševima se supkutano injektira u desni bok 5 × 10<6>ćelija i ostave se da rastu do srednje zapremine od 100-150 mm<3>. Miševi se randomizuju i doziraju kako je navedeno u Tabeli C. Zapremina tumora i telesna težina mere se dva puta nedeljno tokom trajanja studije, i dobijaju se mere efikasnosti, odnosno bezbednosti.
[0470] Slika 3 prikazuje srednju zapreminu tumora za grupu ± standardna greška srednje vrednosti (SEM) za životinje tretirane PBS, izotipom-SPDB-DM4, konjugatom anti-Jagged-SPDB-DM4 i leka (ADC), i konjugatom anti-Jagged 2001 antitela koje može da se aktivira i leka. Nijedna kontrolna grupa (PBS ni izotip-SPDB-DM4) nije pokazala inhibiciju rasta tumora dok su i grupa anti-Jagged ADC i grupa konjugat anti-Jagged 2001 antitela koje može da se aktivira i leka pokazale regresiju tumora. Životinje tretirane anti-Jagged ADC pokazale su značajne sporedne efekte merene gubitkom težine, kako je pokazano na Slici 4. Međutim, životinje tretirane konjugatom anti-Jagged 2001 antitela koje može da se aktivira i leka nisu pokazale gubitak težine (takođe je prikazano na Slici 4) što pokazuje da je aktivnost konjugata anti-Jagged CM1-CM2 antitela koje može da se aktivira i leka bila lokalizovana u tumoru.
Tabela C. Grupe i raspored doziranja za studiju HCC1806
Primer 2. Anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju, koja se seku matriksnom metaloproteazom (MMP) i serin proteazom (SP)
[0471] Ovaj Primer pokazuje generisanje i evaluaciju antitela koja mogu da se aktiviraju koja
1
se vezuju za receptor za faktor rasta epiderma (EGFR), pri čemu se aktiviranje antitela koja mogu da se aktiviraju vrši u prisustvu najmanje jedne matriksne metaloproteaze (MMP) i najmanje jedne serin proteaze.
[0472] Anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju upotrebljena u ovom Primeru generišu se korišćenjem postupaka sličnih onima koji su korišćeni u Primeru 1 za generisanje anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0473] U studijama opisanim u ovom tekstu koriste se sledeće supstratne sekvence, pri čemu je LP' povezujući peptid između CM1 i CM2. Za sve CM1-CM2 supstrate u Tabeli u nastavku, LP' je GGSGGS (SEQ ID NO: 350):
1 4
1
Teški lanac (Hc) anti-EGFR:
[0474]
Nukleotidna sekvenca
Aminokiselinska sekvenca
1
Laki lanac anti-EGFR:
[0475]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0476]
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0001 antitela koje može da se aktivira:
[0477]
Nukleotidna sekvenca
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0478]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0002 antitela koje može da se aktivira:
[0479]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001 antitela koje može da se sa spejserskom sekvencom:
[0480]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001 antitela koje može da se aktivira:
[0481]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
1 1
Laki lanac anti-EGFR 1002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0482]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1002 antitela koje može da se aktivira:
[0483]
Nukleotidna sekvenca:
1 2
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0484]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2001 antitela koje može da se aktivira:
[0485]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0486]
Nukleotidna sekvenca:
1 4
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2002 antitela koje može da se aktivira:
[0487]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0001/LP'/1001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0488]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
1
Laki lanac anti-EGFR 0001/LP'/1001 antitela koje može da se aktivira:
[0489]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0490]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira:
[0491]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0002/LP'/1001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0492]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
1
Laki lanac anti-EGFR 0002/LP'/1001 antitela koje može da se aktivira:
[0493]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001/LP'/0002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0494]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1001/LP'/0002 antitela koje može da se aktivira:
[0495]
Nukleotidna sekvenca:
1 1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0001/LP'/1002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0496]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0001/LP'/1002 antitela koje može da se aktivira:
[0497]
Nukleotidna sekvenca:
1 2
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1002/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0498]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1002/LP'/0001 antitela koje može da se aktivira:
[0499]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0002/LP'/1002 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
[0500]
Nukleotidna sekvenca:
1 4
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 0002/LP'/1002 antitela koje može da se aktivira:
[0501]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1002/LP'/0002 antitela koje može da se aktivirasa spejserskom sekvencom:
[0502]
Nukleotidna sekvenca:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 1002/LP'/0002 antitela koje može da se aktivira:
[0503]
Nukleotidna sekvenca:
1
Aminokiselinska sekvenca:
[0504] Sledeći materijali upotrebljeni su u studijama opisanim u ovom tekstu.
[0505] Reagensi i sojevi: Humana u-PA (Research & Diagnostics Systems, Inc.) upotrebljena je bez modifikacija. Humana matriptaza (Research & Diagnostics Systems, Inc.) upotrebljena je bez modifikacija. Humana MMP14 (Research & Diagnostics Systems, Inc.) aktivirana je prema protokolu dobavljača i upotrebljena bez modifikacija. Za MMP14 korišćen je pufer HCM (50 mM HEPES (pH 6.8), 10 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2). Za u-PA i matriptazu korišćen je pufer TBST (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.4).
[0506] Sledeći postupci upotrebljeni su za evaluaciju in vitro supstratne aktivnosti u antitelima koja mogu da se aktiviraju.
[0507] Supstratna proteoliza: Sposobnost supstrata u antitelima koja mogu da se aktiviraju da se seče pomoću u-PA, matriptaze i/ili MMP14 određuje se na sledeći način. Uzorci se inkubiraju preko noći, 16 do 24 sata na 37°C, u prisustvu ili odsustvu proteaze u PBS, pH 7.2. Digestija proteazom priprema se tako da se održi odnos antitela koje može da se aktivira prema proteazi od 9 prema 1. Proteoliza se potvrđuje korišćenjem kapilarne elektroforeze, ELISA, ili SDS-PAGE.
1
[0508] Kinetika sečenja supstrata (kcat/Km): Sposobnost EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 ili 1001/LP'/0001, da budu isečena matriptazom i/ili MMP14 određuje se na sledeći način. Digestije proteazom matriptazom izvode se u TBST, 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.05% Tween20, pH 7.4. Digestije proteazom MMP14 izvode se u HCM, 50 mM HEPES (pH 6.8), 10 mM CaCl2, 0.5 mM MgCl2. Različite koncentracije na aktivnom mestu titrovane matriptaze ili MMP14 kombinuju se sa fiksiranim koncentracijama antitela koje može da se aktivira da se održi odnos supstrata prema proteazi od najmanje 50. Uzorci koji sadrže ove supstrate inkubiraju se na 37°C do 24 h. Da se reakcija zaustavi, 5 µl sredstva za digestiju doda se u 7 µl HT Protein Express uzoračkog pufera (Caliper LifeSciences) koji sadrži 20 mM 2-merkaptoetanola, 10 minuta na 95°C. Posle denaturacije toplotom, doda se 32 µl ddH2O i uzorci se analiziraju na LabChip GXII prema uputstvima proizvođača. LabChip GXII softver koristi se za kvantifikovanje oblasti pika lakog lanca. Konverzija proizvoda izračunava se uključivanjem područja pikova lakog lanca u sledeću jednačinu: isečeni LC/(isečeni LC neisečeni LC), LC = područje pika lakog lanca. kcat/Kmvrednosti određuju se sledećom jednačinom
gde je C proizvod konverzije, t je vreme (s), i p je koncentracija proteaze (M), koja pretpostavlja da je koncentracija supstrata niža od Kmi u višku u odnosu na koncentraciju proteaze.
[0509] Sledeći postupci mogu da se koriste za evaluaciju in vivo stabilnosti supstrata antitela koja mogu da se aktiviraju opisanih u ovom tekstu.
[0510] Ovaj odeljak opisuje eksperimentalni postupak za procenu in vivo stabilnosti supstrata primera izvođenja kada se ugrade u EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju i ubrizgaju miševima.
[0511] Tri nude miša (Crl:NU-Foxnlnu) primila su jednu IP dozu svakog od EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže 2001, 2002, 0001/LP'/1001, 1001/LP'/0001, 1001/LP'/0002, 0001/LP'/1002, ili 0002/LP'/1002 supstrate u dozi od 12.5 mg/kg na Dan 0. Miševi se eutanaziraju na dan 4 (~96 sati posle doziranja) korišćenjem CO2, a krv se odmah sakuplja u vidu plazma-EDTA i skladišti na -80°C.
[0512] EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju prečiste se iz plazme korišćenjem anti-humani IgG-imunoprecipitacije korišćenjem magnetnih perlica. Eluirana EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju pripreme se za analizu kapilarnom elektroforezom kako je opisano u odeljku kcat/Km. Ukratko, 5 µl eluiranog IgG doda se u 7 µl Protein Express uzoračkog pufera sa 2-
1
merkaptoetanolom. Postupak kvantifikacije stabilnosti u cirkulaciji isti je kao postupak kvantifikacije konverzije proizvoda.
[0513] Sledeći postupci upotrebljeni za evaluaciju in vivo efikasnosti antitela koja mogu da se aktiviraju.
[0514] Ovaj odeljak opisuje eksperimentalni postupak procene da li su EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate koji mogu da se seku matriptazom, supstrate koji mogu da se seku pomoću MMP14, ili supstrate primera izvođenja, tj., supstrate koji mogu da se seku pomoću matriptaze i MMP14, efikasna in vivo. Sedam EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstratne sekvence 0001, 0002, 1001, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 ili 1001/LP'/0001, koje se seku jednom ili obema, matriptazom i/ili MMP14, primenjena su u dozi od 12.5 mg/kg intraperitonealno (i.p.) kod miševa koji nose H292 tumorski ksenograft (kancer pluća) na Dan 0. Miševima je uzeta krv retroorbitalno na dan 8 (~192 sati posle doziranja). Krv je uzeta odmah kao plazma-EDTA i uskladištena na -80°C. EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju prečiste se iz plazme putem anti-humani IgG-imunoprecipitacije korišćenjem magnetnih perlica. Eluirana EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju pripreme se za analizu kapilarnom elektroforezom. Ukratko, 5 µl eluiranog IgG doda se u 7 µl Protein Express uzoračkog pufera sa 2-merkaptoetanolom. Kvantifikacija stabilnosti u cirkulaciji ista je kao kvantifikacija konverzije proizvoda.
[0515] Na dan 8, tri EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate koji se seku matriptazom ili supstrate koji se seku pomoću MMP14, 0001, 0002 ili 1001, pokazala su vrednosti prosečnog procenta (%) aktivacije u rasponu od 14% do 15% i četiri EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 ili 1001/LP'/0001, primera izvođenja, tj., supstrate koji mogu da se aktiviraju pomoću matriptaze i MMP14, pokazala su vrednosti prosečnog procenta (%) aktivacije od 28% do 33%. Prosečan % aktivacije izračunava se kao ((zbir konverzije proizvoda testne grupe)<∗>100%)/(broj životinja u testnoj grupi).
[0516] Svih sedam EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstratne sekvence 0001, 0002, 1001, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 ili 1001/LP'/0001, uključuju i maskirajuću komponentu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168) i anti-EGFR antitelo C225v5 antitelo koje sadrži laki lanac (SEQ ID NO: 111) i teški lanac (SEQ ID NO: 108). Konfiguracija lakog lanca antitela koje može da se aktivira je maskirajuća komponenta - supstrat - laki lanac C225v5.
[0517] Na dan 21, tri EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate koji mogu da se seku matriptazom ili sadrže supstrate koji mogu da se seku pomoću MMP14, 0001, 0002
1
ili 1001, pokazala su inhibiciju rasta tumora u rasponu od 41% do 57% mereno kao prosečan procenat (%) inhibicije, a četiri EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstrate, 2001, 2002, 0001/LP'/1001 ili 1001/LP'/0001, primera izvođenja, tj., supstrate koji mogu da se seku pomoću matriptaze i MMP14, pokazala su inhibiciju rasta tumora u rasponu od 77% do 80% mereno prosečnim % inhibicije. Srednji % inhibicije izračunava se kao (srednji (C)-srednji (C0))-(srednji(T)-srednji (T0)) / (srednji(C)-srednji(C0))<∗>100%, gde jeT trenutna vrednost za testnu grupu, TO je inicijalna vrednost sadašnje testne grupe, C je vrednost kontrolne grupe, i C0 je početna vrednost kontrolne grupe. EGFR antitelo cetuksimab na dan 21 pokazalo je u ovoj studiji 86% inhibicije.
Primer 3. In situ dobijanje slike anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju
[0518] Ovaj Primer opisuje upotrebu in situ snimanja neobeleženih anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju. Sečenje i vezivanje detektuju se korišćenjem sekundarnog antitela koje se specifično vezuje za AB deo antitela koje može da se aktivira.
[0519] In situ dobijenje slike aktivacije i vezivanja neobeleženog anti-EGFR antitela koje može da se aktivira 3954-2001-C225v5 na tumorskom tkivu H292 kancera pluća izvedeno je na sledeći način: Zamrznuti preseci tkiva postavljaju se na staklene pločice. Rastvor koji sadrži neobeležena anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju nanese se na tkivo i inkubira, npr., 1 sat na sobnoj temperaturi (oko 22-24°C) u puferu za inkubaciju - 10 mM Hepes pufer pH 7.4, koji sadrži 150 mM NaCl, 10 µM ZnCl2, 2 mM CaCl2i 0.005% Tween 20; antitelo koje može da se aktivira u koncentraciji od oko 1 µg/ml. Uslovi takve inkubacije mogu da se podese tako da budu pogodni za sečenje sredstva u preseku tkiva, na primer, variranjem pH rastvora (npr., u rasponu od oko pH 7 do oko pH 8.5), temperature inkubacije (npr., u rasponu od oko 20°C do oko 40°C, npr., sobna temperatura ili 37°C), vremena inkubacije (npr., u rasponu od oko 15 minuta do oko 150 minuta), i/ili koncentracije antitela koje može da se aktivira (npr., u rasponu od oko 0.05 µg/ml do oko 10 µg/ml). Tkivo se zatim dobro ispere da bi se uklonio nevezani materijal. Prisustvo aktiviranog antitela na tkivu detektuje se korišćenjem sekundarnog antihumanog IgG antitela obeleženog sa AlexaFluor-647. Uslovi te detekcije mogu da se podese prema detektujućem reagensu i modalitetu detekcije (npr., fluorescentno obeleženo). Na primer, kada se koristi fluorescentna oznaka, tkivo se izlaže fluorescentnoj mikroskopiji. Kako je prikazano na Slici 6, anti-EGFR antitelo koje može da se aktivira 3954-2001-C225v5 pokazuje bojenje čiji su intenzitet i obrazac uporedivi sa roditeljskim anti-EGFR antitelom. Fluorescentni signal anti-EGFR antitela koje može da se aktivira 3954-2001-C225v5 bio je
2
značajno inhibiran pretretmanom tkiva sa 1:100 razblaženjem seta III inhibitornog koktela širokog spektra (539134, EMD Millipore, Billerica, MA) i 50 mM EDTA.
Primer 4. Dodatna antitela koja mogu da se aktiviraju matriksnom metaloproteazom (MMP) i serin proteazom (SP)
[0520] Ovaj Primer prikazuje generisanje i evaluaciju dodatnih supstratnih sekvenci koje se aktiviraju u prisustvu najmanje jedne matriksne metaloproteaze (MMP) i najmanje jedne serin proteaze.
[0521] U studijama opisanim u ovom tekstu upotrebljavaju se sledeće supstratne sekvence:
[0522] Sposobnost supstrata, 2001, 1004/LP'/0001, 1004/LP'/0003, 2003, 2004, ili 2005 da se seku humanom matriptazom i/ili humanom uPA određuje se kako je opisano gore u Primeru 2.
[0523] Supstrat 2003 pokazuje približno 50-struko povećanje kinetike sečenja za matriptazu u poređenju sa supstratom 2001, a supstrat 2005 pokazuje približno 50-struko povećanje kinetike sečenja za matriptazu u poređenju sa supstratom 1004/LP70001.
[0524] Supstrati 2003 i 2005 pokazuju i umerena povećanja u rasponu od oko 3 do 4 puta u uPA kinetici u poređenju sa 2001 i 1004/LP'/0001, respektivno. Nađeno je da se supstrati 2003 i 2005 seku i u prisustvu mišje uPA.
[0525] Supstrati 2003, 2004, i 2005 inkorporisani su u sledeća antitela koja mogu da se aktiviraju:
Teški lanac anti-EGFR:
Aminokiselinska sekvenca:
2 1
Laki lanac anti-EGFR:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2003 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2005 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
2 2
Laki lanac anti-EGFR 2005 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom:
Aminokiselinska sekvenca:
[0526] Supstrati upotrebljeni u svim anti-EGFR antitelima koja mogu da se aktiviraju pokazanim gore seku se humanom matriptazom, humanom uPA, humanom matriksnom metaloproteazom 14 (MMP14), i humanom matriksnom metaloproteazom 9 (MMP9).
[0527] U ovom poglavlju opisuje se evaluacija različitih anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju pokazanih gore, u studiji efikasnosti kod H292 tumora uz korišćenje H292 tumorskih ksenografta u nu/nu miševima. Studija efikasnosti u H292 tumoru opisana je u Primeru 2, a opisana je i u PCT publikaciji br. WO 2013/163631.
[0528] U ovoj studiji, miševi se grupišu i doziraju kao što je prikazano u Tabeli u nastavku, uz korišćenje kontrolnog intravenskog imunoglobulina (intravenous immunoglobulin, IVIG), anti-EGFR antitela cetuksimaba, anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-EGFR 2001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 449; anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-EGFR 2003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 472; ili anti-EGFR antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-EGFR 2005 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 474:
2
[0529] Efikasnost supstrata upotrebljenih u anti-EGFR antitelima pokazanim gore evaluirana je merenjem zapremine tumora (TV mm<3>) u različitim vremenskim tačkama posle primene. Rezultati ove studije prikazani su na Slikama 8A-8F.
[0530] Ovaj odeljak prikazuje evaluaciju različitih anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju u toksikološkoj studiji uz korišćenje postupaka sličnih onima koji su opisani u Primeru 2 imajući u vidu podatke prikazane na Slici 4.
[0531] U ovoj studiji, toksičnost je merena u funkciji gubitka telesne težine (BW), u DBA/1 miševima posle primene kontrolnog intravenskog imunoglobulina (IVIG), doze od 20 mg/kg anti-Jagged antitela označenog u ovom tekstu kao 4D11, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67 i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 162, doze od 10 mg/kg 4D11 antitela, doze od 5 mg/kg 4D11 antitela, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-Jagged 2001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 420, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-Jagged 1004/LP'/0001 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 432, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-Jagged 1004/LP'/0003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 424, anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-Jagged 2003 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 477 prikazane u nastavku, i anti-Jagged antitela koje može da se aktivira označenog u ovom tekstu kao anti-Jagged 2005 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 479 prikazanu u nastavku.
2 4
Lc anti-Jagged 2003 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2003 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2005 antitela koje može da se aktivira sa spejserskom sekvencom Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2005 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
[0532] U studiji prikazanoj na Slici 9, miševi su grupisani i dozirani kako je prikazano u Tabeli u nastavku:
2
[0533] Rezultati su prikazani na Slici 9 kao procenat (%) relativne promene telesne težine (BW) u različitim vremenskim tačkama tokom studije.
[0534] Rezultati su prikazani na Slici 10 kao procenat (%) relativne promene telesne težine (BW) u različitim vremenskim tačkama tokom studije.
[0535] Kako je prikazano na Slikama 8A-8F, Slici 9, i Slici 10, antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju supstrate koji mogu da se seku objave bezbedna su i efikasna. Posebno, supstrat 2003 pokazao je efikasnost uporedivu sa supstratom 2001 i bezbednost uporedivu sa IVIG, i supstrat 2005 pokazao je efikasnost uporedivu sa roditeljskim i bezbednost uporedivu sa roditeljskim u 4-struko nižoj dozi.
Primer 5. Dodatna antitela koja mogu da se aktiviraju matriksnom metaloproteazom (MMP) i serin proteazom (SP)
[0536] Ovaj Primer prikazuje generisanje i evaluaciju dodatnih supstratnih sekvenci koje se aktiviraju u prisustvu najmanje jedne matriksne metaloproteaze (MMP) i najmanje jedne serin proteaze.
[0537] U studijama opisanim u ovom tekstu koriste se sledeće supstratne sekvence:
2
2
[0538] Prosečno obučeni stručnjak u oblasti prepoznaće da su nukleotidne sekvence predstavljene u ovom tekstu primer, a iskusan stručnjak može koristiti i druge kombinacije kodona i/ili degenerisanu nukleotidnu sekvencu(-e) za ekspresiju iste peptidne sekvence.
[0539] Supstrati 2006-2014 i supstrati 3006-3014 inkorporisani su u sledeća antitela koja mogu da se aktiviraju:
Teški lanac anti-EGFR:
Aminokiselinska sekvenca:
2
Laki lanac anti-EGFR:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2006 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2007 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2008 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
2
Laki lanac anti-EGFR 2009 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2010 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2011 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2012 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
21
Laki lanac anti-EGFR 2013 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 2014 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3006 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3007 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3008 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3009 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3010 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3011 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3012 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3013 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
Laki lanac anti-EGFR 3014 antitela koje može da se aktivira:
Aminokiselinska sekvenca:
[0540] Svih osamnaest EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstratne sekvence supstrata 2006 (SEQ ID NO: 483), supstrata 2007 (SEQ ID NO: 484), supstrata 2008 (SEQ ID NO: 485), supstrata 2009 (SEQ ID NO: 486), supstrata 2010 (SEQ ID NO: 487), supstrata 2011 (SEQ ID NO: 488), supstrata 2012 (SEQ ID NO: 489), supstrata 2013 (SEQ ID NO: 490), 2014 (SEQ ID NO: 555), supstrata 3006 (SEQ ID NO: 515), supstrata 3007 (SEQ ID NO: 516), supstrata 3008 (SEQ ID NO: 517), supstrata 3009 (SEQ ID NO: 518), supstrata 3010 (SEQ ID NO: 519), supstrata 3011 (SEQ ID NO: 520), supstrata 3012 (SEQ ID NO: 521), supstrata 3013 (SEQ ID NO: 522), ili supstrata 3014 (SEQ ID NO: 557) uključuju i maskirajuću komponentu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu CISPRGCPDGPYVMY (SEQ ID NO: 168) i anti-EGFR antitelo C225v5 antitelo koje sadrži laki lanac (SEQ ID NO: 111) i teški lanac (SEQ ID NO: 108). Konfiguracija lakog lanca antitela koje može da se aktivira je maskirajuća
21
komponenta - supstrat - laki lanac C225v5.
[0541] Sečenje anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju supstrate 2001, 2006-2010 i 2012, humanom matriptazom korišćenjem tehnika sličnih onima koje su opisane u ovom tekstu, pokazuje raspon vrednosti kcat/Kmu opsegu od 6E+02 do 2E+04. Sečenje anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju supstrate 2001, 2006-2010, 2012 i 2013, humanom matriksnom metaloproteazom 14 (MMP14) korišćenjem tehnika sličnih onima koje su opisane u ovom tekstu pokazuje raspon vrednosti kcat/Kmu rasponu od 1E+04 do 5E+04. In vivo, ova antitela takođe pokazuju uporedivu 4-dnevnu stabilnost u normalnim miševima i miševima koji nose tumor, korišćenjem tehnika sličnih onima koje su opisane u ovom tekstu.
[0542] Ovaj odeljak opisuje evaluaciju različitih anti-EGFR antitela koja mogu da se aktiviraju pokazanih ranije u ovom tekstu, u studiji efikasnosti kod H292 tumora uz korišćenje H292 tumorskog ksenografta u nu/nu miševima. Studija efikasnosti u H292 tumoru opisana je u Primeru 2 i takođe je opisana u PCT publikaciji br. WO 2013/163631.
[0543] U ovoj studiji, miševi su grupisani i dozirani kako je prikazano u Tabeli u nastavku korišćenjem kontrolnog PBS, antitela koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 108, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 111; anti-EGFR C225v5-3954-2001 antitela koje može da se aktivira, anti-EGFR C225v5-3954-2006 antitela koje može da se aktivira, anti-EGFR C225v5-3954-2007 antitela koje može da se aktivira, itd., kako je prikazano u Tabeli u nastavku:
[0544] Efikasnost supstrata korišćenih u gore prikazanim anti-EGFR antitelima evaluirana je merenjem zapremine tumora (TV mm3) u različitim vremenskim tačkama posle primene. Rezultati ove studije prikazani su na Slikama 11A-11H i 12.
[0545] Ovaj odeljak opisuje evaluaciju različitih anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju, u toksikološkoj studiji, korišćenjem postupaka sličnih onima opisanim u Primeru 2 imajući u vidu podatke prikazane na Slici 4
[0546] U ovoj studiji, koriste se doza od 20 mg/kg anti-Jagged antitela označenog u ovom tekstu kao 4D11, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67 i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 162, doza od 10 mg/kg 4D11 antitela, doza od 5 mg/kg 4D11 antitela, anti-Jagged antitelo koje može da se aktivira označeno u ovom tekstu kao anti-Jagged 2006 antitelo koje može da se aktivira, koje uključuje teškolančanu sekvencu SEQ ID NO: 67, i lakolančanu sekvencu SEQ ID NO: 507-514 prikazano u nastavku.
Lc anti-Jagged 2006 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2007 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2008 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
21
Lc anti-Jagged 2009 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2010 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2011 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2012 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 2013 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
21
Lc anti-Jagged 2014 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3006 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3007 antitelo koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3008 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
21
Lc anti-Jagged 3009 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3010 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3011 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3012 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
Lc anti-Jagged 3013 antitela koje može da se aktivira Aminokiselinska sekvenca
21
Lc anti-Jagged 3014 antitela koje može da se aktivira
Aminokiselinska sekvenca
[0547] Svih osamnaest anti-Jagged antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže supstratne sekvence supstrata 2006 (SEQ ID NO: 483), supstrata 2007 (SEQ ID NO: 484), supstrata 2008 (SEQ ID NO: 485), supstrata 2009 (SEQ ID NO: 486), supstrata 2010 (SEQ ID NO: 487), supstrata 2011 (SEQ ID NO: 488), supstrata 2012 (SEQ ID NO: 489), supstrata 2013 (SEQ ID NO: 490), 2014 (SEQ ID NO: 555); supstrata 3006 (SEQ ID NO: 515); supstrata 3007 (SEQ ID NO: 516); supstrata 3008 (SEQ ID NO: 517); supstrata 3009 (SEQ ID NO: 518); supstrata 3010 (SEQ ID NO: 519); supstrata 3011 (SEQ ID NO: 520); supstrata 3012 (SEQ ID NO: 521); supstrata 3013 (SEQ ID NO: 522); ili supstrata 3014 (SEQ ID NO: 557) sadrže takođe maskirajuću komponentu koja uključuje aminokiselinsku sekvencu i anti-Jagged antitelo 4D11 antitelo koje uključuje laki lanac (SEQ ID NO: 162) i teški lanac (SEQ ID NO: 67). Konfiguracija lakog lanca antitela koje može da se aktivira je maskirajuća komponenta -supstrat - laki lanac 4D11.
[0548] U ovoj studiji, miševi su grupisani i doziranje je kako je prikazano u Tabeli u nastavku:
21
[0549] Rezultati su prikazani na Slici 13 kao procenat (%) relativne promene telesne težine (BW) u različitim vremenskim tačkama tokom ove studije.
[0550] Kao što je prikazano na Slikama 11A-11H, Slici 12, i Slici 13, antitela koja mogu da se aktiviraju koja uključuju supstrate koji mogu da se seku objave bezbedna su i efikasna.
Primer 6. In Vivo dobijanje slike
[0551] Sedam do devet nedelja stare ženke nu/nu miševa, bez timusa (Charles River Laboratories) inokulišu se supkutano sa 5 × 10<6>NCI-H292 (levi zadnji bok) i FaDu ćelija (desni zadnji bok). NCI-H292 ćelije (ATCC) i FaDu ćelije (ATCC) suspenduju se 1:1 sa Matrigelom u medijumu koji ne sadrži serum, odnosno bez Matrigela u medijumu koji ne sadrži serum. Kliničke opservacije, telesne težine, merenja zapremine tumora digitalnim pomičnim kljunastim merilom, vršena su dva puta nedeljno kada tumor postane merljiv. Zapremine tumora se izračunavaju prema formuli (ab^2)/2, gde je a duži i b je kraći od dva dijametra normalno postavljena jedan u odnosu na drugi. Miševi koji nose H292 i FaDu tumorski ksenograft sa zapreminom tumora od 250-500 mm3 distribuirani su po veličini tumora u 3 grupe sa n=3 po grupi. Životinjama je injektirano intraperitonealno 15 mg/kg AlexaFluor 750 (AF750)-konjugovanog cetuksimaba (Cetuximab-AF750) ili antitela koja mogu da se aktiviraju koja sadrže 2001 i 1004/LP'/0001 supstrate (Pb2001-AF750 i Pb1004/LP'/0001-SF750). Skenovi sa kompjuterizovane tomografije (computed tomography, CT) sa potom napravljenim snimcima dobijeni su IVIS Spectrum/CT sistemom za snimanje (Caliper Life Sciences, PE). Niz slika površinskog fluorescentnog zračenja dobija se na više lokacija transiluminacije koje obuhvataju region od interesa na talasnim dužinama ekscitacije i emisije od 745 nm i 800 nm (Slika 14). Trodimenzionalna rekonstrukcija optičkih i µCT slika i njihova koregistracija
22
izvršene su pomoću softvera Living Image 4.2 (Caliper Life Sciences). Dobijeni snimljeni podaci pokazuju akumulaciju antitela koja mogu da se aktiviraju u oba tumorska ksenografta sa fluorescentnim signalom sličnim signalu roditeljskog cetuksimab-antitela.
LISTING SEKVENCI
22
22
22
22
22
22
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
24
24
24
24
24
24
24
2
21
22
2
24
2
�
2
2
�
�
21
22
2
��
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
�
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
�
2
2
2
2
�
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
44
44
44
44
44
44
44
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
�
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4

Claims (27)

PATENTNI ZAHTEVI
1. Izolovani polipeptid, naznačen time, što sadrži CM1-CM2 supstrat koji uključuje najmanje prvu komponentu koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje drugu komponentu koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP), pri čemu CM1-CM2 supstrat sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 1, 7, 555, i 557.
2. Izolovani polipeptid iz patentnog zahteva 1, naznačen time, što je MMP MMP2, MMP9, ili MMP14.
3. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1 ili 2, naznačen time, što je SP uPA ili matriptaza.
4. Izolovani polipeptid, naznačen time, što sadrži antitelo ili njegov antigen-vezujući fragment (AB) koji se vezuje za cilj, i najmanje prvu komponentu koja može da se seče (CM1) koja je supstrat za najmanje jednu matriksnu metaloproteazu (MMP) i najmanje drugu komponentu koja može da se seče (CM2) koja je supstrat za najmanje jednu serin proteazu (SP) pri čemu CM1-CM2 supstrat uključuje aminokiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od: SEQ ID NO: 1, 7, 555, i 557.
5. Izolovani polipeptid iz patentnog zahteva 4, naznačen time, što su MMP, SP, ili i MMP i SP u tkivu kolokalizovane sa ciljem.
6. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-5, naznačen time, što je njegov antigen-vezujući fragment odabran iz grupe koja se sastoji od Fab fragmenta, F(ab')2fragmenta, scFv, scAb, dAb, jednodomenskog teškolančanog antitela, i jednodomenskog lakolančanog antitela.
7. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-6, naznačen time, što je AB povezano sa CM1, i/ili opciono
gde je AB povezano direktno sa CM1 i/ili opciono;
gde je AB povezano sa CM1 preko povezujućeg peptida.
8. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-7, naznačen time, što je AB povezano sa CM2; i/ili opciono
gde je AB povezano direktno sa CM2; i/ili opciono
gde je AB povezano sa CM2 preko povezujućeg peptida.
9. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-8, naznačen time, što je MMP MMP2, MMP9, ili MMP14; i/ili opciono gde je SP uPA ili matriptaza.
10. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-9, naznačen time, što izolovani polipeptid uključuje maskirajuću komponentu (MM); i/ili opciono
gde MM ima konstantu disocijacije za vezivanje sa AB koja je viša od konstante disocijacije AB za vezivanje za cilj; i/ili opciono
gde je MM polipeptid dug ne više od 40 amino-kiselina.
11. Izolovani polipeptid iz patentnog zahteva 10, naznačen time, što je MM povezana sa CM1 tako da izolovani polipeptid u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa sadrži sledeći strukturni aranžman: MM-CM1-CM2-AB ili AB-CM2-CM1-MM; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje povezujući peptid između MM i CM1; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje povezujući peptid između CM2 i AB.
12. Izolovani polipeptid iz patentnog zahteva 10, naznačen time, što je MM povezana sa CM2 tako da izolovani polipeptid u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa sadrži sledeći strukturni aranžman: MM-CM2-CM1-AB ili AB-CM1-CM2-MM; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje povezujući peptid između MM i CM2; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje povezujući peptid između CM1 i AB.
13. Izolovani polipeptid iz patentnog zahteva 10, naznačen time, što izolovani polipeptid uključuje prvi povezujući peptid (LP1) i drugi povezujući peptid (LP2), i gde izolovani polipeptid u neisečenom stanju od N-terminusa do C-terminusa ima sledeći strukturni aranžman: MM-LP1-CM1-CM2-LP2-AB, AB-LP2-CM2-CM1-LP1-MM, MM-LP1CM2-CM1-LP2-AB, ili AB-LP2-CM1-CM2-LP1-MM; i/ili opciono
gde dva povezujuća peptida ne moraju biti međusobno identična; i/ili opciono gde je svaki od LP1 i LP2 peptid dug oko 1 do 20 amino-kiselina.
14. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 10-13, naznačen time, što je aminokiselinska sekvenca MM različita od one cilja i identična je ne više od 10% sa aminokiselinskom sekvencom prirodnog vezujućeg partnera AB.
15. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 10-14, naznačen time, što MM ne interferira ili kompetira sa AB za vezivanje sa ciljem u isečenom stanju.
16. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 4-15, naznačen time, što izolovani polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 432, 561, i 562, aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja uključuje SEQ ID NO: 67; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu lakog lanca odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449,559, i 560, i aminokiselinsku sekvencu teškog lanca koja uključuje SEQ ID NO: 108.
17. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 1-15, naznačen time, što izolovani polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 420, 432, 561, i 562; i/ili opciono
gde izolovani polipeptid uključuje aminokiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 449, 559, i 560.
18. Izolovani polipeptid iz bilo kojeg od patentnih zahteva 10-17, naznačen time, što je MMP MMP2, MMP9, ili MMP14; i/ili opciono gde je SP uPA ili matriptaza.
19. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira, naznačeno time, što sadrži izolovani polipeptid kao u bilo kojem od patentnih zahteva 4-18 konjugovan sa sredstvom; i/ili opciono
gde je sredstvo konjugovano sa AB preko linkera; i/ili opciono
gde je linker onaj linker koji može da se seče ili linker koji ne može da se seče.
20. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira iz patentnog zahteva 19, naznačeno time, što je sredstvo toksin; i/ili opciono
gde je sredstvo inhibitor mikrotubula; i/ili opciono
gde je sredstvo ono sredstvo koje oštećuje nukleinsku kiselinu; i/ili opciono gde je sredstvo odabrano iz grupe koja se sastoji od dolastatina, auristatina, majtanzinoida, duokarmicina, i kaliheamicina; i/ili opciono
gde je sredstvo auristatin E; i/ili opciono
gde je sredstvo monometil auristatin E (MMAE); i/ili opciono
gde je sredstvo monometil auristatin D (MMAD); i/ili opciono
gde je sredstvo majtanzinoid odabranu iz grupe koja se sastoji od DM1 i DM4.
21. Konjugovano antitelo koje može da se aktivira iz bilo kojeg od patentnog zahteva 19 ili patentnog zahteva 20, naznačeno time, što je sredstvo detektabilna komponenta; i/ili opciono
gde je detektabilna komponeta dijagnostičko sredstvo.
22. Farmaceutska kompozicija, naznačena time, što sadrži izolovani polipeptid kao u bilo kojem od patentnih zahteva 4-18 i nosač; i/ili opciono
sadrži dodatno sredstvo; i/ili opciono
gde je dodatno sredstvo terapijsko sredstvo.
23. Izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira izolovani polipeptid kao u bilo kojem od patentnih zahteva 1-18.
24. Vektor, naznačen time, što uključuje izolovani molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 23.
25. Postupak proizvodnje antitela ili antitela koje može da se aktivira, kultivisanjem ćelije pod uslovima koji dovode do ekspresije izolovanog polipeptida kao u bilo kojem od patentnih zahteva 4-18, pri čemu ćelija sadrži molekul nukleinske kiseline iz patentnog zahteva 23.
26. Postupak izrade antitela ili antitela koje može da se aktivira koje se, u aktiviranom stanju, vezuje za cilj, postupak uključuje:
(a) kultivisanje ćelije koja sadrži konstrukt nukleinske kiseline koji kodira izolovani polipeptid kao u bilo kojem od patentnih zahteva 4-18; i
(b) oporavljanje antitela koje može da se aktivira.
27. Izolovani polipeptid kao u bilo kojem od patentnih zahteva 4-18, konjugovano antitelo koje može da se aktivira kao u bilo kojem od patentnih zahteva 19-21, ili farmaceutska kompozicija kao u patentnom zahtevu 22 za upotrebu u lečenju kancera, opciono uz dodatno sredstvo koje je opciono terapijsko sredstvo.
1
RS20220534A 2015-01-20 2016-01-20 Supstrati koji mogu da se seku matriksnom metaloproteazom i serin proteazom i postupci njihove upotrebe RS63276B1 (sr)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201562105490P 2015-01-20 2015-01-20
US201562258015P 2015-11-20 2015-11-20
US201662278713P 2016-01-14 2016-01-14
PCT/US2016/014132 WO2016118629A1 (en) 2015-01-20 2016-01-20 Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof
EP16704511.1A EP3247393B1 (en) 2015-01-20 2016-01-20 Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63276B1 true RS63276B1 (sr) 2022-06-30

Family

ID=55358121

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220534A RS63276B1 (sr) 2015-01-20 2016-01-20 Supstrati koji mogu da se seku matriksnom metaloproteazom i serin proteazom i postupci njihove upotrebe

Country Status (20)

Country Link
US (5) US11046759B2 (sr)
EP (2) EP4079323A1 (sr)
JP (3) JP6996981B2 (sr)
KR (1) KR102784383B1 (sr)
CN (7) CN114478704B (sr)
AU (2) AU2016209403A1 (sr)
CA (1) CA2974087A1 (sr)
DK (1) DK3247393T3 (sr)
EA (1) EA201791647A1 (sr)
ES (1) ES2919879T3 (sr)
HR (1) HRP20220631T8 (sr)
HU (1) HUE058974T2 (sr)
IL (2) IL300408B2 (sr)
MA (1) MA41374A (sr)
PL (1) PL3247393T3 (sr)
PT (1) PT3247393T (sr)
RS (1) RS63276B1 (sr)
SG (2) SG10201913901QA (sr)
WO (1) WO2016118629A1 (sr)
ZA (1) ZA202208160B (sr)

Families Citing this family (99)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2403964B1 (en) 2009-03-02 2021-09-08 Massachusetts Institute of Technology Methods and products for in vivo enzyme profiling
CA2915412A1 (en) * 2012-06-14 2013-12-19 Therapix Biosciences Ltd. Humanized antibodies to cluster of differentiation 3 (cd3)
WO2014197840A1 (en) 2013-06-07 2014-12-11 Massachusetts Institute Of Technology Affinity-based detection of ligand-encoded synthetic biomarkers
JP6693872B2 (ja) 2013-07-25 2020-05-13 シトムクス セラピューティクス，インコーポレイティド 多重特異性抗体、多重特異性活性化可能抗体、及びそれらの使用方法
KR102488220B1 (ko) 2013-09-25 2023-01-12 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 매트릭스 메탈로프로테이나제 기질 및 다른 절단성 모이어티 및 이의 사용 방법
KR102466591B1 (ko) * 2014-01-31 2022-11-14 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 마트립타제 및 ｕ-플라스미노겐 활성화인자 기질 및 다른 절단성 모이어티 및 이의 사용 방법
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
MA41374A (fr) 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
WO2016182064A1 (ja) 2015-05-13 2016-11-17 中外製薬株式会社 多重抗原結合分子融合体、医薬組成物、線状エピトープの同定方法、および多重抗原結合分子融合体の製造方法
IL319047A (en) 2015-08-28 2025-04-01 Amunix Operating Inc Chimeric polypeptide composition and methods for its preparation and use
EP3440013A4 (en) 2016-04-08 2021-03-17 Massachusetts Institute of Technology METHOD FOR SPECIFIC PROFILING OF PROTEASE ACTIVITY ON LYMPH NODES
CA3022928A1 (en) 2016-05-05 2017-11-09 Massachusetts Institute Of Technology Methods and uses for remotely triggered protease activity measurements
BR112019008223A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti-ctla-4 ativáveis e usos dos mesmos
TW202235438A (zh) 2016-11-28 2022-09-16 日商中外製藥股份有限公司 能夠調節配體結合活性的配體結合分子
MX2019005756A (es) 2016-11-28 2019-08-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Dominio de union al antigeno y polipeptido que incluye seccion de transporte.
KR20190089034A (ko) 2016-12-09 2019-07-29 시애틀 지네틱스, 인크. 코일드 코일에 의해 차폐된 이가 항체
TW201834685A (zh) * 2016-12-29 2018-10-01 財團法人生物技術開發中心 Klk6-介導cns-特異性抗體前藥活化
AU2018248327B2 (en) 2017-04-07 2024-10-10 Massachusetts Institute Of Technology Methods to spatially profile protease activity in tissue and sections
WO2018191438A1 (en) 2017-04-11 2018-10-18 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs having constrained cd3 binding and methods of using the same
WO2019018828A1 (en) * 2017-07-20 2019-01-24 Cytomx Therapeutics, Inc. METHODS OF QUALITATIVE AND / OR QUANTITATIVE ANALYSIS OF ACTIVATABLE ANTIBODY PROPERTIES AND USES THEREOF
CN111278461A (zh) 2017-08-16 2020-06-12 百时美施贵宝公司 可前药化抗体、其前药以及使用和制备方法
US11472889B2 (en) 2017-10-14 2022-10-18 Cytomx Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
EP3719035A4 (en) 2017-11-28 2021-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha POLYPEPTIDE WITH ANTIGEN-BINDING AREA AND CARRYING SECTION
TWI880235B (zh) 2017-11-28 2025-04-11 日商中外製藥股份有限公司 可調整配體結合活性的配體結合分子
WO2019148444A1 (en) * 2018-02-02 2019-08-08 Adagene Inc. Anti-ctla4 antibodies and methods of making and using the same
US11054428B2 (en) 2018-03-05 2021-07-06 Massachusetts Institute Of Technology Inhalable nanosensors with volatile reporters and uses thereof
WO2019173771A1 (en) * 2018-03-09 2019-09-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cd147 antibodies and methods of making and use thereof
JP2021518603A (ja) * 2018-03-20 2021-08-02 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 哺乳動物対象における活性化可能抗体種の定量薬理学モデリングのためのシステムおよび方法
IL277863B2 (en) 2018-04-11 2026-02-01 Inhibrx Inc Multispecific polypeptide constructs with forced CD3 binding and related methods and uses
EP3788077A1 (en) 2018-05-02 2021-03-10 CytomX Therapeutics, Inc. Antibodies, activatable antibodies, bispecific antibodies, and bispecific activatable antibodies and methods of use thereof
WO2019222294A1 (en) 2018-05-14 2019-11-21 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
US20210130430A1 (en) 2018-05-14 2021-05-06 Werewolf Therapeutics, Inc. Activatable cytokine polypeptides and methods of use thereof
CN113840832A (zh) 2018-05-14 2021-12-24 狼人治疗公司 可活化白介素-2多肽及其使用方法
JP7414736B2 (ja) 2018-05-30 2024-01-16 中外製薬株式会社 アグリカン結合ドメインおよび運搬部分を含むポリペプチド
JPWO2019230868A1 (ja) 2018-05-30 2021-06-24 中外製薬株式会社 単ドメイン抗体含有リガンド結合分子
CA3105891A1 (en) 2018-07-24 2020-01-30 Inhibrx, Inc. Multispecific polypeptide constructs containing a constrained cd3 binding domain and a receptor binding region and methods of using the same
WO2020068920A2 (en) 2018-09-25 2020-04-02 Massachusetts Institute Of Technology Lung protease nanosensors and uses thereof
MX2021003543A (es) 2018-09-27 2021-06-23 Xilio Dev Inc Polipeptidos de citocinas enmascaradas.
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
CA3115082A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. B7h3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
CN113518647A (zh) 2018-10-11 2021-10-19 印希比股份有限公司 5t4单域抗体及其治疗性组合物
EP3864045A2 (en) 2018-10-11 2021-08-18 Inhibrx, Inc. Dll3 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
WO2020077257A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Inhibrx, Inc. Pd-1 single domain antibodies and therapeutic compositions thereof
SG11202105476XA (en) 2018-12-06 2021-06-29 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof
WO2020150560A1 (en) 2019-01-17 2020-07-23 Massachusetts Institute Of Technology Sensors for detecting and imaging of cancer metastasis
AU2020240310A1 (en) 2019-03-21 2021-10-07 Immunogen, Inc. Methods of preparing cell-binding agent-drug conjugates
HUE065484T2 (hu) 2019-04-26 2024-05-28 Immunogen Inc Camptothecin-származékok
KR20220023988A (ko) 2019-05-14 2022-03-03 웨어울프 세라퓨틱스, 인크. 분리 모이어티 및 이의 사용 방법
JPWO2020246563A1 (sr) 2019-06-05 2020-12-10
US20230220105A1 (en) * 2019-06-06 2023-07-13 Janux Therapeutics, Inc. Tumor activated t cell engagers and methods of use thereof
US20220251206A1 (en) 2019-06-11 2022-08-11 Bristol-Myers Squibb Company Anti-ctla4 antibody prodruggable (probody) at a cdr position
JP7682150B2 (ja) * 2019-07-25 2025-05-23 ザ・ユニバーシティ・オブ・シカゴ プロテアーゼ活性化治療剤を含む組成物および方法
KR102386849B1 (ko) 2019-10-14 2022-04-13 포항공과대학교 산학협력단 면역치료를 위한 환경 반응형 접착성 항체전달체 및 이의 제조방법
BR112022009110A2 (pt) 2019-11-14 2022-07-26 Werewolf Therapeutics Inc Polipeptídeos de citocina ativáveis e métodos de uso destes
IL294879A (en) 2020-01-29 2022-09-01 Inhibrx Inc Monodomain antibodies of cd28 and their multivalent and multispecific constructs
MX2022011676A (es) * 2020-03-23 2023-03-08 Zymeworks Bc Inc Proteinas de fusion de il12 con enmascaramiento y metodos para su uso.
CN115734806A (zh) * 2020-04-01 2023-03-03 西里欧发展公司 掩蔽的il-12细胞因子和其切割产物
CA3174665A1 (en) 2020-04-09 2021-10-14 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions containing activatable antibodies
JP2023520922A (ja) 2020-04-10 2023-05-22 シートムエックス セラピューティクス，インコーポレイテッド 活性化可能サイトカイン構築物および関連組成物ならびに方法
KR20260042619A (ko) 2020-08-11 2026-03-31 재눅스 테라퓨틱스 인크. 절단 가능한 링커 조성물 및 방법
CN116438456A (zh) 2020-09-11 2023-07-14 格里姆普斯生物股份有限公司 用于疾病检测/诊断、分期、监测和治疗的离体蛋白酶活性检测
JP2023553323A (ja) * 2020-11-25 2023-12-21 エクシリオ デベロップメント， インコーポレイテッド 腫瘍特異的に切断可能なリンカー
EP4259193A4 (en) 2020-12-09 2025-01-15 Janux Therapeutics, Inc. Compositions and methods related to tumor activated antibodies targeting psma and effector cell antigens
US12404315B2 (en) 2020-12-21 2025-09-02 Allogene Therapeutics, Inc. Protease-activating CD45-gate CAR
CA3211924A1 (en) 2021-03-16 2022-09-22 Sayantan Mitra Masked activatable cytokine constructs and related compositions and methods
US20240384323A1 (en) 2021-08-30 2024-11-21 Cytomx Therapeutics, Inc. Method for determining protease activity in a biological sample
AU2022361492A1 (en) 2021-10-08 2024-05-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
AU2022360371A1 (en) 2021-10-08 2024-05-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and combination methods
KR20240115809A (ko) 2021-10-15 2024-07-26 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 활성화 가능한 폴리펩타이드 복합체
TW202323282A (zh) 2021-10-15 2023-06-16 美商賽特艾克斯生物製藥公司 可活化之多肽複合物
WO2023064955A1 (en) 2021-10-15 2023-04-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable anti-cd3, anti-egfr, heteromultimeric bispecific polypeptide complex
AU2023226005A1 (en) 2022-02-23 2024-08-29 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 polypeptides
US20250197917A1 (en) * 2022-03-09 2025-06-19 Glympse Bio, Inc. Method of protease detection
US20250333539A1 (en) 2022-03-23 2025-10-30 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antigen-binding protein constructs and uses of the same
WO2023182037A1 (ja) 2022-03-23 2023-09-28 ソニーグループ株式会社 構造体
JP2025512798A (ja) 2022-03-25 2025-04-22 サイトムエックス セラピューティクス，インク． 活性化可能な二重アンカー型マスク化分子及びその使用方法
EP4504782A2 (en) 2022-04-01 2025-02-12 CytomX Therapeutics, Inc. Cd3-binding proteins and methods of use thereof
WO2023192973A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable multispecific molecules and methods of use thereof
US20250136717A1 (en) 2022-05-16 2025-05-01 Byondis B.V. Novel masked antibodies
AR130080A1 (es) 2022-08-01 2024-10-30 Cytomx Therapeutics Inc Restos escindibles por proteasas, y métodos de uso de los mismos
EP4565260A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 CytomX Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
US20260015425A1 (en) 2022-08-01 2026-01-15 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
US20260049148A1 (en) 2022-08-01 2026-02-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-cleavable moieties and methods of use thereof
EP4565250A1 (en) 2022-08-01 2025-06-11 CytomX Therapeutics, Inc. Protease-cleavable substrates and methods of use thereof
US20240376170A1 (en) 2023-01-11 2024-11-14 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated proteins and methods of use
WO2024150174A1 (en) 2023-01-11 2024-07-18 Bright Peak Therapeutics Ag Conditionally activated immunocytokines and methods of use
WO2024216170A2 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable cytokine constructs and related compositions and methods
JP2026513839A (ja) 2023-04-12 2026-05-01 サイトムエックス セラピューティクス，インク． マスキングポリペプチド、活性化可能サイトカイン構成体、ならびに関連する組成物及び方法
WO2024216194A1 (en) 2023-04-12 2024-10-17 Cytomx Therapeutics, Inc. Masking polypeptides, activatable cytokine constructs, and related compositions and methods
WO2025038668A1 (en) 2023-08-14 2025-02-20 Voro Therapeutics, Inc. Therapeutic binding agents that conditionally promote myeloid cell activity against target cells and uses thereof
US20250197467A1 (en) 2023-08-23 2025-06-19 Bright Peak Therapeutics Ag Activatable il-18 immunocytokines and uses thereof
AR134512A1 (es) 2023-12-01 2026-01-21 Ablynx Nv Polipéptidos activados con precisión
WO2025235515A1 (en) 2024-05-07 2025-11-13 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable polypeptide complex formulations
WO2025240659A2 (en) 2024-05-14 2025-11-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable constructs, compositions and methods
WO2026020161A1 (en) 2024-07-19 2026-01-22 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable il-12 constructs and related compositions and methods
WO2026035650A2 (en) 2024-08-05 2026-02-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Cleavable polypeptides and methods of use thereof
WO2026067689A1 (zh) * 2024-09-28 2026-04-02 浙江道尔生物科技有限公司 肿瘤特异性激活的蛋白药物及其应用
WO2026083295A1 (en) 2024-10-16 2026-04-23 Bright Peak Therapeutics Ag Trispecific compositions comprising il-2, vegf binding domains, and pd-1 binding domains
WO2026083296A1 (en) 2024-10-16 2026-04-23 Bright Peak Therapeutics Ag Trispecific compositions comprising il-18, vegf binding domains, and pd-1 binding domains

Family Cites Families (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4522811A (en) 1982-07-08 1985-06-11 Syntex (U.S.A.) Inc. Serial injection of muramyldipeptides and liposomes enhances the anti-infective activity of muramyldipeptides
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
DE3788058T2 (de) 1986-08-28 1994-04-21 Teijin Ltd Zelltoxischer antikörperkomplex und verfahren zu seiner herstellung.
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5151510A (en) 1990-04-20 1992-09-29 Applied Biosystems, Inc. Method of synethesizing sulfurized oligonucleotide analogs
DE69303494T2 (de) 1992-11-13 1997-01-16 Idec Pharma Corp Therapeutische verwendung von chimerischen und markierten antikörper gegen menschlichen b lymphozyt beschränkter differenzierung antigen für die behandlung von b-zell-lymphoma
ZA974084B (en) 1996-05-10 1998-02-23 Danisco Novel α-glucuronidases, production hereof and their uses.
AUPO930697A0 (en) 1997-09-19 1997-10-09 Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The Catalytic antibodies and a method of producing same
US6551795B1 (en) 1998-02-18 2003-04-22 Genome Therapeutics Corporation Nucleic acid and amino acid sequences relating to pseudomonas aeruginosa for diagnostics and therapeutics
DK1078051T3 (da) 1998-05-13 2008-04-07 Domantis Ltd Fagvisningsselektionssystem til selektion af korrekt foldede proteiner
WO2001055321A2 (en) 2000-01-31 2001-08-02 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
US20110131679A2 (en) 2000-04-19 2011-06-02 Thomas La Rosa Rice Nucleic Acid Molecules and Other Molecules Associated with Plants and Uses Thereof for Plant Improvement
EP1286700A2 (en) 2000-06-01 2003-03-05 Universite Catholique De Louvain Tumor activated prodrug compounds
EP1328632A2 (en) 2000-08-04 2003-07-23 Eli Lilly And Company C1q-related factor, homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
JP4334866B2 (ja) 2000-10-09 2009-09-30 アイシス イノヴェイション リミテッド 治療用抗体
US7465790B2 (en) 2000-10-09 2008-12-16 Isis Innovation, Inc. Therapeutic antibodies
WO2002038796A2 (en) 2000-11-08 2002-05-16 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods for determining protease cleavage site motifs
NZ527971A (en) * 2001-03-27 2006-03-31 Dendreon Corp Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 9, the encoded polypeptides and methods based thereon
WO2003004681A2 (en) * 2001-07-03 2003-01-16 Dendreon San Diego Llc Nucleic acid molecules encoding a transmembrane serine protease 20, the encoded polypeptides and methods based thereon
US20050208602A1 (en) 2001-08-10 2005-09-22 Rosen Craig A 89 human secreted proteins
US7439319B2 (en) 2001-09-14 2008-10-21 Burnham Institute For Medical Research Selective substrates for matrix metalloproteinases
WO2003038083A1 (en) 2001-10-29 2003-05-08 Bayer Healthcare Ag Regulation of human type i adenylate cyclase
WO2003068934A2 (en) 2002-02-14 2003-08-21 Rutter William J Chimeric molecules for cleavage in a treated host
US20040109855A1 (en) 2002-07-23 2004-06-10 Herman Waldmann Therapeutic antibodies with reduced side effect
US8809504B2 (en) 2002-09-03 2014-08-19 Vit Lauermann Inhibitor which is deactivatable by a reagent produced by a target cell
US20080166375A1 (en) * 2003-05-06 2008-07-10 The Government Of The United States Of America, As Rep. By The Secretary Of Health And Human Service Activation of Recombinant Diphtheria Toxin Fusion Proteins by Specific Proteases Highly Expressed on the Surface of Tumor Cells
US7276497B2 (en) 2003-05-20 2007-10-02 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising new maytansinoids
US9079936B2 (en) 2003-07-01 2015-07-14 University Of Maryland, Baltimore Derivatives of APF and methods of use
US7947289B2 (en) * 2004-02-09 2011-05-24 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Multimeric protein toxins to target cells having multiple identifying characteristics
GB0417430D0 (en) 2004-08-05 2004-09-08 Uc3 A novel HPV vaccine comprising peptides from host cell proteins
ATE504602T1 (de) 2004-12-20 2011-04-15 Amgen Fremont Inc Für humane matriptase spezifische bindungsproteine
CA2604885A1 (en) 2005-04-07 2006-10-19 Guoying Yu Cacna1e in cancer diagnosis, detection and treatment
EP2535346B1 (en) 2005-08-31 2017-08-02 The Regents of The University of California Cellular libraries of peptide sequences (CLiPS) and methods of using the same
MX2008004693A (es) 2005-10-21 2008-09-03 Catalyst Biosciences Inc Proteasas modificadas que inhiben la activacion del complemento.
CA2645347A1 (en) 2006-03-10 2007-09-20 Diatos Anticancer drugs conjugated to antibody via an enzyme cleavable linker
AU2007308792B2 (en) 2006-10-27 2013-01-24 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates and uses therefor
TWI412367B (zh) * 2006-12-28 2013-10-21 梅達雷克斯有限責任公司 化學鏈接劑與可裂解基質以及其之綴合物
NZ580530A (en) * 2007-06-06 2012-04-27 Domantis Ltd Anti vegf polypeptides, antibody variable domains and antagonists
AU2008259590A1 (en) 2007-06-06 2008-12-11 Domantis Limited Methods for selecting protease resistant polypeptides
GB0724331D0 (en) 2007-12-13 2008-01-23 Domantis Ltd Compositions for pulmonary delivery
US20090304719A1 (en) 2007-08-22 2009-12-10 Patrick Daugherty Activatable binding polypeptides and methods of identification and use thereof
GB0819287D0 (en) 2008-10-22 2008-11-26 Univ Bradford Compounds
US8895702B2 (en) 2008-12-08 2014-11-25 City Of Hope Development of masked therapeutic antibodies to limit off-target effects; application to anti-EGFR antibodies
WO2010081173A2 (en) 2009-01-12 2010-07-15 Cytomx Therapeutics, Llc Modified antibody compositions, methods of making and using thereof
US9102925B2 (en) 2009-02-02 2015-08-11 Washington State University Compositions and methods for treating or preventing conditions and diseases associated with Mannheimia haemolytica
CN108530543B (zh) * 2009-02-03 2023-06-23 阿穆尼克斯制药公司 延伸重组多肽和包含该延伸重组多肽的组合物
US8399219B2 (en) 2009-02-23 2013-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease activatable interferon alpha proprotein
EP2427479B1 (en) 2009-05-07 2018-11-21 The Regents of The University of California Antibodies and methods of use thereof
US20120157824A1 (en) 2009-09-02 2012-06-21 Nanoscale Corporation Mri and optical assays for proteases
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
US20110214205A1 (en) 2010-02-26 2011-09-01 Monsanto Technology Llc. Isolated Novel Nucleic Acid and Protein Molecules from Foxtail Millet and Methods of Using Those Molecules to Generate Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits
MX369263B (es) 2010-05-20 2019-11-04 Allergan Inc Toxinas de clostridium degradables.
GB201009271D0 (en) 2010-06-02 2010-07-21 Promar As Compositions
PL391627A1 (pl) 2010-06-25 2012-01-02 Adamed Spółka Z Ograniczoną Odpowiedzialnością Przeciwnowotworowe białko fuzyjne
RU2013110876A (ru) * 2010-08-24 2014-09-27 Рош Гликарт Аг Активируемые биспецифические антитела
WO2012158818A2 (en) * 2011-05-16 2012-11-22 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific fab fusion proteins and methods of use
EP2709666B1 (en) 2011-05-16 2021-07-14 Koninklijke Philips N.V. Bio-orthogonal drug activation
CN103946388A (zh) 2011-06-28 2014-07-23 英伊布里克斯有限责任公司 Wap结构域融合多肽及其使用方法
US20130078201A1 (en) 2011-09-28 2013-03-28 Susan Daly Topical sunscreen compositions
CN110078827A (zh) 2012-04-27 2019-08-02 西托姆克斯治疗公司 结合表皮生长因子受体的可活化的抗体其使用方法
US9856314B2 (en) 2012-06-22 2018-01-02 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies having non-binding steric moieties and methods of using the same
SG11201408554QA (en) 2012-06-22 2015-02-27 Cytomx Therapeutics Inc Anti-jagged 1/jagged 2 cross-reactive antibodies, activatable anti-jagged antibodies and methods of use thereof
US9309510B2 (en) 2012-08-10 2016-04-12 Cytomx Therapeutics, Inc. Protease-resistant systems for polypeptide display and methods of making and using thereof
US9487590B2 (en) 2012-09-25 2016-11-08 Cytomx Therapeutics, Inc. Activatable antibodies that bind interleukin-6 receptor and methods of use thereof
CA2896282C (en) * 2013-01-04 2021-07-20 Cytomx Therapeutics, Inc. Compositions and methods for detecting protease activity in biological systems
HK1222122A1 (zh) * 2013-04-22 2017-06-23 Avelas Biosciences, Inc. 选择性药物递送组合物及使用方法
MX2015016329A (es) * 2013-05-28 2016-07-20 Dcb Usa Llc Bloqueador de anticuerpo para la inactivacion de farmaco de proteina.
BR112015030514A2 (pt) * 2013-06-04 2017-08-29 Cytomx Therapeutics Inc Composições e métodos para conjugação de anticorpos ativáveis
KR102488220B1 (ko) 2013-09-25 2023-01-12 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 매트릭스 메탈로프로테이나제 기질 및 다른 절단성 모이어티 및 이의 사용 방법
KR102466591B1 (ko) 2014-01-31 2022-11-14 싸이톰스 테라퓨틱스, 인크. 마트립타제 및 ｕ-플라스미노겐 활성화인자 기질 및 다른 절단성 모이어티 및 이의 사용 방법
WO2016014974A2 (en) 2014-07-25 2016-01-28 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-cd3 antibodies, activatable anti-cd3 antibodies, multispecific anti-cd3 antibodies, multispecific activatable anti-cd3 antibodies, and methods of using the same
MA41374A (fr) * 2015-01-20 2017-11-28 Cytomx Therapeutics Inc Substrats clivables par métalloprotéase matricielle et clivables par sérine protéase et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN108112254B (zh) * 2015-03-13 2022-01-28 西托姆克斯治疗公司 抗-pdl1抗体、可活化的抗-pdl1抗体、及其使用方法
IL310251A (en) * 2015-05-04 2024-03-01 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd71 antibodies, activatable anti-cd71 antibodies, compositions comprising same and uses thereof
SG10202110908WA (en) * 2015-05-04 2021-11-29 Cytomx Therapeutics Inc Anti-cd166 antibodies, activatable anti-cd166 antibodies, and methods of use thereof
US10233244B2 (en) 2015-05-04 2019-03-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-ITGA3 antibodies, activatable anti-ITGA3 antibodies, and methods of use thereof
CN107709356A (zh) 2015-06-26 2018-02-16 南加利福尼亚大学 用于肿瘤特异性活化的掩蔽嵌合抗原受体t细胞
CA2991976A1 (en) 2015-07-13 2017-01-19 Cytomx Therapeutics, Inc. Anti-pd-1 antibodies, activatable anti-pd-1 antibodies, and methods of use thereof
BR112019008223A2 (pt) 2016-11-03 2019-07-16 Bristol-Myers Squibb Company anticorpos anti-ctla-4 ativáveis e usos dos mesmos
AU2018231127A1 (en) 2017-03-09 2019-09-19 Cytomx Therapeutics, Inc. CD147 antibodies, activatable CD147 antibodies, and methods of making and use thereof
BR112019025188A2 (pt) 2017-06-01 2020-06-23 Cytomx Therapeutics, Inc. Anticorpos anti-pdl1 ativáveis e métodos de uso dos mesmos
WO2020077267A1 (en) 2018-10-11 2020-04-16 Northwestern University Biomarker of chronic kidney disease in liver transplant recipients
SG11202105476XA (en) 2018-12-06 2021-06-29 Cytomx Therapeutics Inc Matrix metalloprotease-cleavable and serine or cysteine protease-cleavable substrates and methods of use thereof

Also Published As

Publication number Publication date
HUE058974T2 (hu) 2022-10-28
US20160289324A1 (en) 2016-10-06
JP2024170436A (ja) 2024-12-10
EA201791647A1 (ru) 2018-04-30
JP6996981B2 (ja) 2022-03-03
SG11201705901PA (en) 2017-08-30
NZ772087A (en) 2024-07-05
US11548944B2 (en) 2023-01-10
WO2016118629A1 (en) 2016-07-28
IL253599B1 (en) 2023-03-01
AU2021257963A1 (en) 2021-11-25
AU2021257963B2 (en) 2025-02-27
CA2974087A1 (en) 2016-07-28
JP7540990B2 (ja) 2024-08-27
CN114478704B (zh) 2024-07-26
NZ772090A (en) 2024-07-05
JP2018504925A (ja) 2018-02-22
CN114685611B (zh) 2025-01-07
US20190241652A9 (en) 2019-08-08
KR102784383B1 (ko) 2025-03-24
JP2022046569A (ja) 2022-03-23
US11548943B2 (en) 2023-01-10
NZ772089A (en) 2024-07-05
CN114716513A (zh) 2022-07-08
CN114685611A (zh) 2022-07-01
DK3247393T3 (da) 2022-05-23
EP3247393A1 (en) 2017-11-29
IL300408B1 (en) 2025-07-01
HRP20220631T8 (hr) 2022-07-08
PL3247393T3 (pl) 2022-06-27
ZA202208160B (en) 2024-11-27
CN114907446B (zh) 2024-08-02
US20220380453A9 (en) 2022-12-01
US20210347886A1 (en) 2021-11-11
US12459999B2 (en) 2025-11-04
CN119119209A (zh) 2024-12-13
US11472875B1 (en) 2022-10-18
IL300408A (en) 2023-04-01
SG10201913901QA (en) 2020-03-30
MA41374A (fr) 2017-11-28
BR112017015468A2 (pt) 2018-06-05
IL253599B2 (en) 2023-07-01
AU2016209403A1 (en) 2017-08-03
US11046759B2 (en) 2021-06-29
CN107531758A (zh) 2018-01-02
CN114478704A (zh) 2022-05-13
US20210355208A1 (en) 2021-11-18
EP3247393B1 (en) 2022-03-09
HK1247131A1 (en) 2018-09-21
IL253599A0 (en) 2017-09-28
IL300408B2 (en) 2025-11-01
US20230212283A1 (en) 2023-07-06
EP4079323A1 (en) 2022-10-26
KR20170108052A (ko) 2017-09-26
CN114685661B (zh) 2025-01-07
HRP20220631T1 (hr) 2022-06-24
NZ733811A (en) 2024-07-05
ES2919879T3 (es) 2022-07-28
CN114685661A (zh) 2022-07-01
CN107531758B (zh) 2022-02-11
US20230021301A9 (en) 2023-01-19
PT3247393T (pt) 2022-07-01
CN114907446A (zh) 2022-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7540990B2 (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能及びセリンプロテアーゼ切断可能な基質並びにそれらの使用方法
JP7781254B2 (ja) マトリックスメタロプロテアーゼ切断可能なおよびセリンまたはシステインプロテアーゼ切断可能な基質ならびにそれらの使用方法
JP7028648B2 (ja) 抗ｃｄ１６６抗体、活性化可能抗ｃｄ１６６抗体、およびその使用方法
KR20190134654A (ko) Cd147 항체, 활성화가능한 cd147 항체, 그리고 이를 만들고, 이용하는 방법
RS62956B1 (sr) Anti-cd71 antitela koja se mogu aktivirati, i postupci njihove upotrebe
JP2018520092A (ja) 抗ＩＴＧａ３抗体、活性化可能抗ＩＴＧａ３抗体、およびその使用方法
EA042544B1 (ru) Расщепляемые матриксными металлопротеиназами и расщепляемые сериновыми протеиназами вещества и способы их использования
BR112017015468B1 (pt) Polipeptídeos isolados, composição farmacêutica compreendendo-os, uso terapêutico destes, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, método para produzir um polipeptídeo isolado e método para fabricar um anticorpo ativável que, em um estado ativado, se liga a um alvo
BR122022003994B1 (pt) Polipeptídeos isolados, composição farmacêutica compreendendo os mesmos, uso terapêutico dos mesmos, molécula de ácido nucleico isolada, vetor, bem como métodos de produzir um polipeptídeo isolado e de fabricar um anticorpo ativável que, em um estado ativado, se liga a um alvo
HK1247131B (en) Matrix metalloprotease-cleavable and serine protease cleavable substrates and methods of use thereof