RS63330B1 - Kontrolisana transkripcija - Google Patents

Kontrolisana transkripcija

Info

Publication number
RS63330B1
RS63330B1 RS20220597A RSP20220597A RS63330B1 RS 63330 B1 RS63330 B1 RS 63330B1 RS 20220597 A RS20220597 A RS 20220597A RS P20220597 A RSP20220597 A RS P20220597A RS 63330 B1 RS63330 B1 RS 63330B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
gene
inducible
cell
cells
transcriptional regulatory
Prior art date
Application number
RS20220597A
Other languages
English (en)
Inventor
Ludovic Vallier
Mark Kotter
Matthias Pawlowski
Alessandro Bertero
Daniel Ortmann
Original Assignee
Cambridge Entpr Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=58073446&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63330(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Cambridge Entpr Ltd filed Critical Cambridge Entpr Ltd
Publication of RS63330B1 publication Critical patent/RS63330B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/721—Steroid/thyroid hormone superfamily, e.g. GR, EcR, androgen receptor, oestrogen receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0607—Non-embryonic pluripotent stem cells, e.g. MASC
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases [RNase]; Deoxyribonucleases [DNase]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/03—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from non-embryonic pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)

Description

Opis pronalaska
[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na stabilan ex vivo postupak za uvođenje najmanje jedne inducibilne kasete u ćeliju i omogućavanje kontrolisane transkripcije unutar te inducibilne kasete. Postupak se može koristiti za bilo koji tip ćelije, iz bilo kog eukariotskog organizma, ali ima posebnu primenu u uvođenju inducibilnih kaseta u pluripotentne matične ćelije, kao što su životinjske ili humane pluripotentne matične ćelije (hPSCs). Inducibilna kaseta se kontrolno ubacuje na takav način da se obezbedi da genetički materijal koji sadrži nije utišan ili podložan negativnim uticajima sa mesta insercije, a transkripcija genetskog materijala je kontrolisana.
Osnova pronalaska
[0002] Istraživanje matičnih ćelija dosta obećava u pogledu istraživanja razvića kod ljudi, regenerativne medicine, modeliranja bolesti, otkrivanja lekova i transplantacije ćelija. Štaviše, ćelije izvedene iz matičnih ćelija omogućavaju proučavanje fizioloških i patoloških odgovora populacija humanih ćelija koje nisu lako dostupne. Ovo često podrazumeva proučavanje gena (i drugih oblika regulatornih mehanizama kodiranih u RNK koje ne kodiraju proteine - ncRNK). Nažalost, pokazalo se da je kontrolisana transkripcija ili ekspresija genetičkih informacija u humanim ćelijama posebno teška.
[0003] Štaviše, za nekoliko ključnih aspekata regenerativne medicine, modeliranje bolesti, otkrivanje lekova i transplantaciju ćelija, potrebna je manipulacija i proizvodnja zrelih tipova humanih ćelija iz lako dostupnih izvora. Kontrola ekspresije transgena u humanim ćelijama je osnova bioloških istraživanja. Međutim, pokazalo se da je to teško u humanim ćelijama. Štaviše, postoji stvarna potreba za in vitro dobijanjem mnogih veoma poželjnih tipova humanih ćelija u količini i kvalitetu pogodnom za otkrivanje lekova i svrhe regenerativne medicine. Pošto je usmerena diferencijacija matičnih ćelija u željene tipove ćelija često izazovna, pojavili su se drugi pristupi, uključujući direktno reprogramiranje ćelija u željene tipove ćelija. Posebno, programiranje unapred, kao postupak direktnog pretvaranja pluripotentnih matičnih ćelija, uključujući hPSCs, u zrele tipove ćelija, prepoznato je kao moćna strategija za dobijanje humanih ćelija. Ovo reprogramiranje uključuje prinuđenu ekspresiju ključne linije transkripcionih faktora (ili nekodirajuće RNK, uključujući IncRNK i mikroRNK) da bi se matična ćelija pretvorila u određeni tip zrele ćelije. Takođe u ovom kontekstu, kontrolisana ekspresija genetičkih informacija u humanim ćelijama predstavlja izazov. Trenutno dostupni protokoli za programiranje unapred uglavnom su zasnovani na lentivirusnoj transdukciji ćelija, što rezultuje raznolikom ekspresijom ili potpunim utišavanjem nasumično insertovanih inducibilnih kaseta. Ovo rezultuje dodatnim koracima prečišćavanja da bi se izolovala podpopulacija koja eksprimira potrebne transkripcione faktore. Stoga, jasno je da su potrebna dalja usavršavanja ovih postupaka.
[0004] Pored inducibilne ekspresije transgena, veoma je poželjno da se mogu kontrolisati smanjivanje ili inaktivacija gena ili drugih kodirajućih sekvenci u ćelijama, da bi se omogućilo sprovođenje studija o gubitku funkcije. Studije gubitka funkcija u matičnim ćelijama i tipovima zrelih ćelija pružaju jedinstvenu priliku za proučavanje mehanizama koji regulišu razviće ljudi, bolest i fiziologiju. Međutim, sadašnje tehnike ne dozvoljavaju laku i efikasnu manipulaciju ekspresijom gena. Trenutne tehnike za uvođenje materijala kao što su inducibilne kratke ukosne RNK (shRNK) u matične ćelije da bi izazvale smanjenje gena podnose mnoge nedostatke uočene sa naprednim reprogramiranjem o kojem je prethodno diskutovano, kao što su utišavanje transgena i pozicioni efekti koji ograničavaju aktivnost. Dakle, postoji potreba za inducibilnom inaktivacijom i smanjivanjem gena i u matičnim ćelijama što omogućava studiju gubitka funkcija u matičnim ćelijama.
[0005] Bilo kakva poboljšanja prethodno pomenutih postupaka moraju osigurati da se postigne stabilna transkripcija genetičkog materijala sadržanog u inducibilnoj kaseti, kao što je transgen, koji je otporan na utišavanje i druge negativne uticaje vezane za mesto integracije. Utišavanje može biti uzrokovano višestrukim epigenetskim mehanizmima, uključujući metilaciju DNK ili modifikacije histona. Sa prethodnim tehnikama postupaka zasnovanim na lentivirusnoj transdukciji, dobijene ćelije su heterogena populacija sa transgenom koji je eksprimiran u potpunosti, delimično ili je utišan. Jasno je da ovo nije poželjno za mnoge primene. Virusni vektori pokazuju tendenciju da integrišu svoj genetički materijal u transkripciono aktivna područja genoma, čime se povećava potencijal za onkogene događaje usled insercione mutageneze.
[0006] Za mnoge primene, poželjno je kontrolisati transkripciju insertovanog genetičkog materijala u ćeliji, tako da se inducibilna kaseta može uključiti po potrebi i transkribovati na određenim nivoima, uključujući visoke nivoe. Ovo se ne može postići ako je insercija inducibilne kasete u genom nasumična.
[0007] Istraživači su tako razvili ex vivo postupak za omogućavanje stabilnog uvođenja inducibilne kasete u genom ćelije, dok su u stanju da kontrolišu transkripciju te inducibilne kasete. Ovo ima prednosti u bilo kom tipu ćelije u koji se želi uvesti inducibilna kaseta i kontrolisati transkripcija insertovanog genetičkog materijala, posebno u pluripotentnim matičnim ćelijama. Inducibilna kaseta može uključivati bilo koji genetički materijal sposoban za transkripciju, na primer transgen ili nekodirajuću RNK (ncRNK). Materijal uključen u inducibilnu kasetu će biti određen efektima koji se zahtevaju od matične ćelije, uključujući ekspresiju transgena ili smanjivanje ili inaktivaciju gena.
Sažetak pronalaska
[0008] Istraživači su otkrili da je moguće ubaciti inducibilnu kasetu i kontrolisati transkripciju genetičkog materijala unutar te inducibilne kasete korišćenjem ciljanog sistema dvostruke genomske sigurne luke koji je ovde opisan. Ovakav postupak je veoma poželjan, jer postoji smanjen rizik od epigenetskog utišavanja umetnutog genetičkog materijala i moguće je dobiti homogenu populaciju ćelija koje transkribuju inducibilnu kasetu.
[0009] Ovaj pronalazak se stoga odnosi na ex vivo postupak za kontrolu transkripcije genske sekvence u ćeliji, koji sadrži sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu pomenuta inducibilna kaseta sadrži pomenutu gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i pomenuti promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne sadrži postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0010] Integracija inducibilne kasete posebno u genomske sigurne luke (GSHs) je poželjnija u odnosu na nasumičnu inserciju u genom. GSHs su ranije definisani kao „intrageni ili ekstrageni regioni humanog genoma koji su u stanju da prilagode predvidljivu ekspresiju novointegrisane DNK bez štetnih efekata na ćeliju ili organizam domaćina. Korisna sigurna luka mora da omogući dovoljnu transkripciju insertovane genske sekvence da se dobiju željeni nivoi proteina (putem dalje translacije) ili nekodirajuće RNK. GSH takođe ne sme da predisponira ćelije na malignu transformaciju niti da menja ćelijske funkcije"( Sadelain et al., 2012, Nature Reviews Cancer, 12(1), 51-8. doi:10.1038/nrc3179).
[0011] Prva genska sigurna luka se koristi za uvođenje gena koji kodira najmanje transkripcioni regulatorni protein. Transkripcioni regulatorni protein (ili faktor transkripcije) povećava gensku transkripciju gena. Većina transkripcionih regulatora su DNK-vezujući proteini koji se vezuju za pojačivače ili promotor-proksimalne elemente koji su operativno povezani sa genom.
[0012] U nekim aspektima, transkripcioni regulatorni protein je konstitutivno eksprimiran i trajno je eksprimiran u ćeliji. Transkripcioni regulatorni protein tako može biti operativno vezan za konstitutivni promotor. Konstitutivni promotori ravnomerno usmeravaju ekspresiju gena u većini tkiva i ćelija u svim fazama rasta i razvića. Konstitutivni promotori obezbeđuju visoke nivoe ekspresije gena kada se koriste u postupcima prema ovom pronalasku.
[0013] Dalje genetički materijal uključuje gene koji mogu biti insertovani u prvi GSH sa transkripcionim regulatornim proteinom. Takvi geni mogu uključivati jedan ili više markera kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP) koji se može koristiti da pokaže, na primer, da je
transkripcioni regulatorni protein uspešno insertovan. Druge opcije uključuju gene koji omogućavaju uređivanje gena, na primer Cas9 i derivati ili CasL i derivati, i reporterske sekvence koje se mogu koristiti za analiziranje endogene ili egzogene ekspresije specifičnih gena u ćeliji.
[0014] Drugi GSH se koristi za uvođenje inducibilne kasete u kojoj je željena genska sekvenca operativno povezana sa inducibilnim promotorom. Takav promotor omogućava transkripciju samo kada je pravilno indukovan transkripcionim regulatornim proteinom. Transkripcioni regulatorni protein može biti kontrolisan supstancom koja se egzogeno unosi u ćeliju. Prema tome, prisustvo egzogene supstance može dozvoliti ili blokirati ekspresiju inducibilnog promotora. Primer takve kontrolisane ekspresije je Tet-ON sistem koji je u nastavku opisan ovde.
[0015] Dalje inducibilne kasete se mogu insertovati u dalje GSHs, pomenute GSHs se razlikuju od prvog i drugog GSH prethodno pomenutog.
[0016] Jedna ili više genskih sekvenci mogu biti kontrolisano transkribovane unutar drugog i/ili daljeg GSH. Zaista, inducibilna kaseta može sadržati 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 genskih sekvenci koje se žele insertovati u GSH i čija se transkripcija može kontrolno indukovati.
[0017] Genska sekvenca ili sekvence koje se želi ubaciti u GSH ili GSHs su prisutne unutar inducibilne kasete, operativno su povezane sa inducibilnim promotorom. Ove genske sekvence mogu biti bilo koje pogodne sekvence, koja su sposobne da se transkribuje u RNK kada je aktivnost promotora indukovana. Pogodne genske sekvence uključuju, ali se ne ograničavaju na transgene (geni koji kodiraju proteine, u kojima se proizvedena RNK, informaciona RNK (mRNK), prevodi u polipeptid), nekodirajuće RNK (ncRNK-uključujući, ali ne ograničavajući se na shRNK, antisens RNK (asRNK), vodeću RNK (gRNK), mikroRNK (miRNK), malu interferirajuću RNK (siRNK), trans-aktivnu RNK (tasiRNK), antagomire, aptamere, sunđere za miRNK i bilo koju drugu funkcionalnu RNK).
[0018] Inducibilne kasete mogu uključivati dodatni genetički materijal koji se insertuje u drugi ili dalji GSH. Takav dodatni genetički materijal može uključivati jedan ili markere kao što je zeleni fluorescentni protein (GFP) da označe da se transkripcija dešava. Alternativno, ili dodatno, geni kao što su geni otpornosti na antibiotike ili lekove mogu omogućiti selekciju uspešno insertovanih inducibilnih kaseta. Štaviše, inducibilna ekspresija određenog gena za proučavanje njegove funkcije ili sekvenci koje će ometati njegovu funkciju može biti poželjna. Jednako tako, može biti poželjna ekspresija gena za poboljšanje ili opstrukciju bioloških funkcija ćelije ili uticaj na ćelije u drugom delu organizma, uključujući ekspresiju faktora rasta, peptidnih hormona, uključujući insulin itd.
[0019] Tehnički, insercije u prvi i/ili drugi GSH mogu se desiti na jednom hromozomu ili na oba hromozoma. GSH postoji na istim genskim lokusima na oba hromozoma diploidnih organizama. Insercija unutar oba hromozoma je prednost jer može omogućiti povećanje nivoa transkripcije iz insertovanog genetičkog materijala unutar inducibilne kasete, čime se postižu posebno visoki nivoi transkripcije.
[0020] Insercije u GSHs se mogu kontrolisati specifičnom insercijom genetičkog materijala u određeni GSH na osnovu prilagođenog, specifičnog za lokaciju generisanja dvolančanih prekida DNK (DSB) na GSH. Genetički materijal se zatim može uvesti korišćenjem bilo kog pogodnog mehanizma, kao što je homologna rekombinacija. Može se koristiti bilo koji postupak za pravljenje specifičnog DSB u genomu, ali poželjni sistemi uključuju CRISPR/Cas9 i njegove modifikovane verzije, ZFNs i TALEN sistem.
[0021] Štaviše, insercija transkripcionog regulatora i/ili inducibilne kasete može biti dizajnirano da bude reverzibilno, a insertovani genetički materijal može biti uklonjen i/ili zamenjen alternativnim transkripcionim regulatorom/inducibilnom kasetom prema potrebi. Postupci zamene transkripcionih regulatora i/ili inducibilne kasete čine deo pronalaska. Takva zamena može biti korisna kada je kultura ćelija uspešno modifikovana sa jednim transkripcionim regulatorom i/ili jednom inducibilnom kasetom, i poželjno je zameniti transkripcioni regulator i/ili inducibilnu kasetu. Ovo koristi prednost već uspešne insercije i može omogućiti veće insercije. Da bi se izvršio ovaj aspekt prema pronalasku, insercije mogu uključiti sekvence koje se mogu prekidati da bi se omogućilo uklanjanje celog ili dela insercija iz GSH, kao što je deo insercije. Poželjni postupci uklanjanja ili zamene uključuju rekombinacione pristupe.
[0022] Dalje, pronalazak se odnosi na vektore pogodne za inserciju transkripcionih regulatora i/ili inducibilne kasete u GSH.
[0023] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za kontrolu ekspresije transgena u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju transgena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugoj genskoj sigurnoj luci, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenute prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne sadrži postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0024] U ovom aspektu pronalaska, inducibilna kaseta koja je prethodno opisana sadrži transgen koji je operativno vezan za inducibilni promotor. U ovom aspektu pronalaska, željena genska sekvenca uključena u inducibilnu kasetu je transgen, poželjno gen koji kodira protein. Tako se transkripcija i translacija (ekspresija) transgena mogu kontrolisati unutar ćelije. Prednost ovog postupka je u tome što dozvoljava prekomernu ekspresiju transgena, ako je potrebno.
[0025] Dalje, u ovom aspektu pronalaska, dalji identičan ili drugačiji transgen može biti insertovan u dalji GSH, koji se razlikuje od prvog i drugog GSH. Takav transgen je operativno povezan sa inducibilnim promotorom kao što je prethodno opisano.
[0026] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za kontrolu transkripcije nekodirajuće RNK u ćeliji, koji sadrži sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu navedena inducibilna kaseta sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0027] Dalje, u ovom aspektu pronalaska, dalja identična ili drugačija inducibilna kaseta može biti insertovana u dalji GSH, koji se razlikuje od prvog i drugog GSH. Takva inducibilna kaseta može da sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu ili bilo koju drugu gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom.
[0028] Tačnije, ovaj postupak omogućava smanjivanje endogenog gena u ćeliji. Dakle, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za smanjenje transkripcije i/ili translacije endogenog gena u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu navedena inducibilna kaseta sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu pomenuta nekodirajuća RNK sekvenca potiskuje transkripciju ili translaciju endogenog gena;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0029] Dalje, u ovom aspektu pronalaska, dalja identična ili različita inducibilna kaseta može biti insertovana u dalji GSH, koji se razlikuje od prvog i drugog GSH. Takva inducibilna kaseta može da sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu ili bilo koju drugu gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom.
[0030] U bilo kom aspektu ili primeru izvođenja, endogeni gen može da kodira protein ili nekodirajuću RNK.
[0031] U gornja dva aspekta pronalaska, inducibilna kaseta(e) sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK, tj. RNK koja je funkcionalna, ali nije translatirana u protein. Ova nekodirajuća RNK može biti bilo koja pogodna RNK, kao što su one o kojima je prethodno bilo reči, ali je poželjno da je kratka ukosna RNK (shRNK). U poslednjem aspektu pronalaska, nekodirajuća RNK može uticati na smanjivanje gena na bilo koji pogodan način, blokiranjem transkripcije ili translacije gena ili sprečavanjem ekspresije uopšte. Na kraju, ekspresija pomenutog gena je smanjena ili blokirana, ali sam gen ostaje netaknut.
[0032] Alternativno, nekodirajuća RNK sadržana u sekvenci inducibilne kasete može uključivati RNK koje se mogu koristiti za inaktivaciju endogenog gena u ćeliji, posebno da zameni ili poremeti sam gen. Pogodne nekodirajuće RNK koje bi mogle da se koriste za ovaj aspekt pronalaska uključuju elemente CRISPR/Cas9 platforme, tačnije vodeće RNK (gRNK) koje su usmerene da ciljaju endogeni gen.
[0033] Dakle, u jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za inaktiviranje endogenog gena u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein i gena koji kodira Cas9 ili njegovog derivata u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu pomenuta inducibilna kaseta sadrži vodeću RNK operativno povezanu sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu pomenuta gRNK sekvenca ciljano deluje na endogeni gen;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0034] Dalje, u ovom aspektu pronalaska, dalja identična ili različita inducibilna kaseta može biti insertovana u dalji GSH, koji se razlikuje od prvog i drugog GSH. Takva inducibilna kaseta može da sadrži bilo koju gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom.
[0035] Prema tome, u prethodnom aspektu pronalaska, transkripcija gRNK je kontrolisano indukovana.
[0036] Ovde je otkriven postupak za smanjenje transkripcije i/ili translacije endogenog gena u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvi alel genske sigurne luke; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugi alel iste genske sigurne luke, pri čemu navedena inducibilna kaseta sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu navedena nekodirajuća RNK sekvenca potiskuje transkripciju ili translaciju endogenog gena.
[0037] Ovde je takođe otkriven postupak za inaktiviranje endogenog gena u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein i gena koji kodira Cas9 ili njegovog derivata u prvi alel genske sigurne luke; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugi alel iste genske sigurne luke, pri čemu pomenuta inducibilna kaseta sadrži vodeću RNK operativno povezanu sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu navedena gRNK sekvenca ciljano deluje na endogeni gen.
[0038] Takve inaktivacije ili smanjenja u jednom koraku su novi.
[0039] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za unapred programiranje pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu pomenuta inducibilna kaseta sadrži gensku sekvencu koja kodira ključnu liniju transkripcionog faktora operativno vezanog za inducibilni promotor, pri čemu je navedeni inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0040] Dalje ili dodatne inducibilne kasete mogu biti insertovane u dalje GSH različite od prvog i drugog GSH.
[0041] Programiranje pluripotentnih matičnih ćelija unapred u određene zrele tipove ćelija je veoma poželjno i može se postići korišćenjem platforme za dvostruko ciljano delovanje prema ovom pronalasku. Posebni postupci za određene tipove ćelija su opisani u nastavku.
[0042] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za proizvodnju miocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju MYOD1 gena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenute prve i druge genske sigurne luke različite,
i kultivisanje navedenih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0043] Gen MYOD1 je gen koji kodira protein miogene diferencijacije 1. Poželjno, retinoična kiselina (RA) je u potpunosti trans RA.
[0044] Poželjno, RA je potpuno trans RA. Poželjno je da ćelije prekomerno eksprimiraju MYOD1.
[0045] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za proizvodnju oligodendrocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
1
b) ciljanu inserciju bilo koje kombinacije SOX 10, OLIG2, NKX2.2, AND NKX6.2 gena koji su operativno povezani sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenute prve i druge genske sigurne luke različite,
i kultivisanje navedenih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0046] SOX-10, OLIG2, NKX2.2, NKX6.2 geni kodiraju transkripcione faktore SOX-10, OLIG2, NKX2.2, AND NKX6.2, respektivno.
Opis slika
[0047] Slika 1 (a-d): Validacija optimizovanog sistema prekomerne ekspresije sa dvostrukom genomskom sigurnom lukom. Slika 1(a) Dizajn vektora za ciljano delovanje gena za lokuse hROSA26 i AAVS1. HAR: homologa grana; SA: akceptor za spajanje; T2A: T2A ribozomski signal preskakanja; Neo: gen otpornosti na neomicin; Puro: gen otpornosti na puromicin; pA: signal poliadenilacije; CAG: konstitutivno aktivan CAG promotor; rtTA: treća generacija rtTA; TRE: inducibilni Tet-reaktivni element; EGFP: poboljšani zeleni fluorescentni protein. Slika 1(b) prikazuje EGFP indukciju i kinetiku spasavanja (1(c)) u EGFP koji eksprimira hESC otkrivene protočnom citometrijom (srednji intenzitet fluorescencije, MFI). Rezultati su iz dve biološke replike po vremenskoj tački i izraženi su kao srednja vrednost ± SEM. Sve vrednosti su normalizovane na maksimalni intenzitet fluorescencije nakon 5 dana doksiciklina (na slici je označen kao dan 0). Slika 1(d) prikazuje odgovor doksiciklina na dozu za prekomernu ekspresiju EGFP u EGFP koji eksprimira hESC nakon indukcije sa doksiciklinom tokom 5 dana. Rezultati su iz dve biološke replike po stanju i izraženi su kao srednja vrednost ± SEM. Sve vrednosti su normalizovane na maksimalni intenzitet fluorescencije izmeren u eksperimentu. Nivoi ekspresije EGFP u konstitutivnim CAG-EGFP hPSC sa ciljanim delovanjem na GSH i u inducibilnim TRE-EGFP hPSC sa ciljanim delovanjem u dvostrukim GSH nakon indukcije sa doksiciklinom. hPSC divljeg tipa i neindukovane TRE-EGFP ćelije su uključene kao negativne kontrole.
[0048] Slika 2 (a - d): Pregled eksperimentalnog pristupa i rezultata za brzu konverziju hPSC u jednom koraku u neuronskim ćelijama (i-neuroni) nakon tretmana doksiciklinom (dox). Slika 2(a) je šematski prikaz ove konverzije, u kojoj se ćelije transformisane prema pronalasku sa NGN2 indukuju da bi se diferencirale u neuronske ćelije nakon Dox tretmana. Slika 2(b) pokazuje vremenski tok programiranja generisanja i-neurona iz hESC dokumentovanog kvantitativnom RT-PCR analizom, koja pokazuje vremenski obrazac ekspresije pan-neurona (MAP2, SYP), prednjeg mozga (BRN2, FOXG1) i glutamatergični neuronski marker geni (VGLUT2, GRIA4). Ćelije su analizirane u naznačenim danima tretmana sa doksiciklinom. Vrednosti su prikazane u odnosu na endogeni „housekeeping” gen PBGD i normalizovane na uslove pluripotencije. Rezultati su dobijeni od tri biološke replike po vremenskoj tački i izraženi su kao srednja vrednost ± SEM.
[0049] Slika 2(c) prikazuje kvantifikaciju βIII-tubulin (TUBB3) pozitivnih neuronskih ćelija imunološkim bojenjem u i-neuronima dobijenim iz hESC nakon jedne nedelje indukcije. Nediferencirane ćelije su korišćene kao negativna kontrola (Kontrola), a prikazani su brojevi za generisanje i-Neurona u novoizolovanim NGN2 koji eksprimiraju hESC i nakon 25 prolaza (+P25). Slika 2 (d) su fotografije ćelija koje prikazuju vremenski tok programiranja unapred generisanja i-neurona iz hESC preko serijskih slika faznog kontrasta koje ilustruju morfološke promene.
[0050] Slika 3 (a-d): Programiranje unapred hPSC u skeletne miocite. Slika 3a prikazuje šemu brze konverzije hPSC u jednom koraku u skeletne miocite inducibilnom prekomernom ekspresijom MYOD1 i tretmanom retinoičnom kiselinom. Slika 3b prikazuje kvantitativnu RT-PCR analizu vremenskog obrasca ekspresije gena markera miocita tokom generisanja i-miocita iz hESC. Sve vrednosti su prikazane u odnosu na hPSC. Rezultati su dobijeni od tri biološke replike po vremenskoj tački i izraženi su kao srednja vrednost ± SEM. Slike 3 (c) i (d) prikazuju kvantifikaciju MHC pozitivnih ćelija pomoću protočne citometrije deset dana nakon indukcije, pokazujući da OPTi-MYOD1 hPSC zadržavaju svoju miogenu potenciju čak i nakon produženih perioda kulture i prolaza (p) nakon ciljane integracije MYOD1 sistema . Nediferencirane ćelije su korišćene kao negativna kontrola (kontrola), a prikazane su brojke za generisanje i-miocita u novoizolovanim OPTi-MYOD1 hESC, ili u istim ćelijama nakon 50 prolaza (+P50).
[0051] Slika 4 (a-f): Strategija ciljanog delovanja za sistem Tet-ON prekomerne ekspresije sa ciljanim dvostrukim delovanjem na GSH. Slika 4 (a) prikazuje eksperimentalni tok rada za sekvencijalno ciljano delovanje hROSA26 i AAVS1 lokusa u hPSC. Ključ: Cas9n: D10A nikaza mutant Cas9 endonukleaza iz S. piogenes; ZFN: nukleaza sa cinkanim prstima; Neo: neomicin; Puro: puromicin; rtTA: treća generacija reverznog tetraciklinskog trans-aktivatora. Ovo prikazuje inducibilni sistem ekspresije EGFP (i-EGFP). Slika 4(b) prikazuje šemu strategije ciljanog delovanja hROSA26. Slika 4(c) prikazuje strategiju ciljanog delovanja AAVS1. Ključ za slike 4(b) i (c): R26-prom: ROSA26 lokus promotor (THUMPD3-AS1 gen); AAV-prom: AAVS1 lokus promotora (gen PPP1R12C); ZFN: nukleaze sa cinkanim prstima; 5'-HAR/3'-HAR: uzvodna/nizvodna homologa grana; SA: akceptor za spajanje; T2A: T2A peptid; pA: signal poliadenilacije; CAG: rani pojačivač CMV, hibridni promotor pilećeg β -aktina i zečjeg β -globina; TRE: Tet-reaktivni element; EGFP: poboljšani zeleni fluorescentni protein. Slika 4 (d) prikazuje šemu strategije genotipizacije koja se koristi za identifikaciju hROSA26 sa tačnim ciljanim delovanjem i AAVS1 sa ciljanim delovanjem hPSC linija.; GSH-prom: GSH promotor (hROSA26 i AAVS1, respektivno); WT: divlji tip; Inducibilna kaseta: cela egzogena sekvenca integrisana nakon ciljanog delovanja. Lokus PCR: PCR obuhvata lokus sa ciljanim delovanjem sa oba prajmera koja se vezuju isključivo za genomsku DNK izvan genomske sekvence koja odgovara homologim granama. Treba imati na umu da zbog visokog sadržaja GC, CAG promotor ne može biti amplifikovan rutinskim PCR-om. Stoga, ispravna insercija ekspresione kasete koja sadrži CAG dovodi do gubitka PCR amplikona. Prisustvo trake divljeg tipa ukazuje na prisustvo alela sa neciljanim delovanjem; gubitak trake divljeg tipa ukazuje na homozigotno ciljano delovanje.5'-INT/3'-INT: PCR-ovi: PCR-ovi koji obuhvataju 5'- i 3'-mesto insercije, respektivno. PCR amplikoni odgovarajuće veličine ukazuju na ispravnu integraciju.3'BB PCR: PCR koji obuhvata homologu granu/vektorski spoj okosnice sa ciljanim delovanjem. Prisustvo PCR proizvoda ukazuje na nespecifičnu integraciju donorskog plazmida van ciljanog delovanja.
[0052] Slika 4(e) je gel fotografija koja prikazuje rezultate genotipizacije za odabrane hROSA26-CAG-rtTA sa ciljanim delovanjem na heterozigotne (HET) i homozigotne (HOM) H9 hESC. Slika 4 (f) je gel fotografija koja prikazuje rezultate genotipizacije za odabrane AAVS1-TRE-EGFP sa ciljanim delovanjem na heterozigotne (HET) i homozigotne (HOM) H9 hESC. 1kb+: 1kb plus DNK lestvica; WT: divlji tip hESC; PL: plazmid sa ciljanim delovanjem; H2O: kontrola vode.
[0053] Slika 5 (a-e): Razvoj optimizovane inducibilne platforme prekomerne ekspresije (OPTi-OX) zasnovane na hPSC dvostrukom GSH ciljanom delovanju. Slika 5 (a) prikazuje dvostruko ciljano delovanje inducibilnog EGFP H9 hESC na GSH koje su objedinjene u četiri eksperimentalne grupe u zavisnosti od toga da li su jedan ili oba alela hROSA26 i AAVS1 lokusa, respektivno, bili uspešno ciljano delovali. Slika 5(b) prikazuje detekciju rtTA proteina pomoću Western blot-a hetero- i homozigotnih H9 hROSA26-CAG-rtTA hESC sa uspešno ciljanim delovanjem. Humani ESC koji nose drugu generaciju rtTA u nasumičnoj genomskoj poziciji uključeni su kao kontrolni uzorak. α -tubulin: kontrola opterećenja. Slika 5(c) prikazuje analizu protočne citometrije za reprezentativne primere različitih inducibilnih EGFP hESC sa dvostrukim ciljanim delovanjem na GSH opisanim na Slici 5(a). Slika 5(d) prikazuje srednji fluorescentni intenzitet (MFI) ekspresije EGFP u različitim inducibilnim EGFP hESC sa dvostrukim ciljanim delovanjem na GSH, opisanim na slici 5(a). Ćelije su analizirane protočnom citometrijom u kontrolnim uslovima (bez doksiciklina, CTR) ili nakon 5 dana tretmana doksiciklinom (DOX). Svaka tačka podataka predstavlja pojedinačnu klonsku liniju. CAG-EGFP hESC i divlji tip (WT) hESC su uključeni za poređenje. Statistička analiza grupa tretiranih doksiciklinom (n=4-5, kako je naznačeno) pokazala je da su nivoi ekspresije EGFP bili najviši kod dvostruko homozigotnih klonova (jednofaktorska ANOVA sa post-hoc Dunnet-ovim testom; F (2, 10) = 25.34, p=0.0001; ∗∗∗∗ p<0.0001; ∗∗ p=0.0026). Ovaj uslov je odabran za dalje eksperimente.
1
[0054] Slika 5(e) prikazuje procenat EGFP<+>ćelija u različitim i-EGFP hESC sa dvostrukim ciljanim delovanjem na GSH opisanim na Slici 5(a).
[0055] Slika 6(a-d): Karakterizacija OPTi-OX platforme u hPSC i tokom diferencijacije germinativnog sloja. Slika 6(a) prikazuje analizu nivoa EGFP protočnom citometrijom u živim hPSC sa uspešnim ciljanim delovanjem i nakon njihove diferencijacije u tretmanu sa tri germinativna sloja nakon petodnevnog tretmana doksiciklinom. Podešavanja akvizicije su podešena tako da uključuju visoke nivoe indukovane ekspresije EGFP (DOX,). Neindukovane kontrolne populacije (CTR) se nalaze direktno pored leve y-ose. Slike 6(b) i 6(c) prikazuju sažetak dijagrama protočne citometrije u 6(a), uključujući srednji intenzitet fluorescenta (MFI) i procenat EGFP<+>ćelija. Slika 6(d) prikazuje grafikon sa stubićima kvantitativnih RT-PCR rezultata nivoa ekspresije EGFP mRNK homozigotnih pluripotentnih matičnih ćelija i nakon diferencijacije u tri germinativna sloja. WT: divlji tip;
[0056] Slika 7: Karakterizacija humanih i-neurona. Kvantitativni RT-PCR rezultati pokazuju brzo smanjenje faktora pluripotencije NANOG i OCT4 nakon tretmana doksiciklinom.
[0057] Slika 8: RA signalizacija tokom indukcije miocita. Ova slika prikazuje qPCR analizu šest retinoida i retinoidnih receptora tokom indukcije miocita i pokazuje ekspresiju RARα, RARβ i sve tri RXR izoforme, ali ne i RARγ tokom indukcije i-miocita. A je α, B je β i G je y.
[0058] Slika 9(a) do 9(c): Karakterizacija razvoja OPTi-MYOD1 hESC u humane i-miocite. Slika 9(a) prikazuje unapred vremenski tok programiranja OPTi-MYOD1 hPSC u indukovane miocite. Morfološke promene su dokumentovane pomoću automatizovanih slika faznog kontrasta koje su dobijane svakih 30 minuta pomoću Nikon Biostation IM time lapse sistema. Skala bar: 200µm. Slika 9(b) prikazuje qPCR rezultate koji demonstriraju brzo smanjenje faktora pluripotencije NANOG i OCT4 nakon tretmana doksiciklinom OPTi-NGN2 hESC (levi grafikon). Svih pet glavnih izoforma teškog lanca miocita specifičnih za humane skeletne miocite (kodirane familijom gena MYH) su snažno pojačane tokom programiranja miocita unapred (desni grafikon). Ovo uključuje dve izoforme koje se eksprimiraju tokom embrionalnog i postnatalnog razvića mišića (embrionalna izoforma MYH3; neonatalna izoforma MYH8) i tri izoforme koje se obično eksprimiraju u skeletnim mišićima odraslih ljudi [MYH7 u vlaknima koja se sporo trzaju (tip I); MYH2 u brzo zamornim vlaknima otpornim na zamor (tip IIa), i MYH1 u brzo zamornim vlaknima (tip IIx)]. Nasuprot tome, MYH4 koji predstavlja MHC-izoformu koja se sastoji od brzo trzajućih, brzo zamornih miocitnih vlakana kod mačaka nije eksprimirana u značajnim količinama kod ljudi (<1%) i takođe nije indukovana tokom vremenskog toka programiranja. Slika 9(c) prikazuje indukovane skeletne miocite koje eksprimiraju širok spektar tipičnih marker proteina, uključujući F-aktin (vizualizovan preko AlexaFluor488-konjugovanog faloidin toksina), molekul neuralne ćelijske adhezije (NCAM), desmin (DES), teški lanac miozina (MYH ), titin (TTN), α aktinin (ACTN2) i troponin T (TNNT), ali ne i markere mioblastnih progenitora PAX3 i PAX7. Svi uzorci su obojeni miogeninom (MYOG). Skala bar: 50µm. DAPI: nuklearno bojenje.
[0059] Slika 10: Ova tri grafikona prikazuju rezultate qPCR za ukupni MYOD1, endogeni MYOD1 i MYOG 2 dana nakon indukcije OPTi-MYOD1 hPSC sa različitim koncentracijama doksiciklina. Rezultati qPCR su prikazani 48h nakon indukcije sa različitim koncentracijama doksiciklina. Ekspresija je prikazana u odnosu na endogeni "housekeeping" gen PBGD.
[0060] Slika 11: Prikaz Tet-ON sistema. Tet-ON se sastoji od dve komponente: Na vrhu je prikazana kaseta aktivatora, u kojoj konstitutivni promotor (cP) pokreće ekspresiju rtTA (reverzni tetraciklinski trans-aktivator). RtTA je fuzioni protein koji se sastoji od mutantnog oblika prokariotskog Tet represora (TetR) i transkripcionog trans-aktivatorskog domena VP16 (izveden iz virusa herpes simpleksa). Na dnu je prikazan domen odgovora. Sastoji se od inducibilnog promotora (TRE, Tet Responsive Element) i gena od interesa. TRE je veštački promotor koji reaguje na rtTA. Sastoji se od 7 serijskih tet operona (tetO7) i jakog minimalnog CMV promotora (mCMV), koji sam po sebi nije aktivan i samo regrutuje transkripcionu mašineriju nakon vezivanja rtTA za sedam tet operona. Doksiciklin, derivat tetraciklina, je neophodan za vezivanje mutantnog TetR za TRE, što dovodi do ekspresije inducibilne kasete, u ovom slučaju EGFP. (pA: signal poliadenilacije).
[0061] Slika 12 (a-d) Programiranje unapred hPSC u oligodendrocitama. Slika 12(a) prikazuje šemu eksperimentalnog pristupa za brzu konverziju OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC u liniji ćelija oligodendrocita (i-OPC i i-OL). Slika 12(b) prikazuje kvantifikaciju BrdU-pozitivnih ćelija nakon 3 serijska prolaza svaka 4 dana i pratećih BrdU-pulseva svaki u trajanju od 4 dana (P = broj prolaza). Slika 12(c) prikazuje kvantitativnu RT-PCR analizu obrasca temporalne ekspresije gena koji kodiraju za proteine povezane sa mijelinom (CNP, MAG, MBP, MOG i PLP) tokom generisanja i-oligodendrocita iz hPSC. OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC su indukovani u medijumu oligodendrocita sa dodatkom PDGFaa i FGF2. Posle jedne nedelje indukcije, mitogeni su povučeni da bi se omogućila terminalna diferencijacija. Sve vrednosti su prikazane u odnosu na endogeni "housekeeping" gen PBGD i normalizovane na uslove pluripotencije. Rezultati su od 2-3 biološke replike po vremenskoj tački i izraženi su kao srednja vrednost ± SEM. Slika 12(d) prikazuje kvantifikaciju CNP i PLP pozitivnih ćelija imunološkim bojenjem u i-oligodendrocitima izvedenim iz OPTi-OLIG2-SOX10 hPSC nakon 20 dana indukcije. Nediferencirane ćelije su korišćene kao negativna kontrola, a prikazane su brojke za i-oligodendrocite u novoizolovanim OPTi-NGN2 hPSC i nakon 50 prolaza (+P50).
[0062] Slika 13 je šematski prikaz principa ovog pronalaska. U suštini, ovo opisuje inserciju u dve različite genske sigurne luke u srži ovog pronalaska. Jedna insercija kontroliše ekspresiju genske sekvence unutar inducibilne kasete u drugoj inserciji. Dodatni genetički materijal može biti
1
uključen u policistronske vektorske konstrukte kao što je prikazano. Dalje, više od dve genske sigurne luke mogu biti sa ciljanim delovanjem, tako da se višestruke inducibilne kasete ili drugi genetički materijal može staviti pod kontrolu modulatora postavljenog na prvom GSH.
[0063] Slika 14 (a do f) su prikazi rezultata koji pokazuju razvoj inducibilnog sistema smanjivanja zasnovanog na dvostrukom ciljanom delovanju GSH na hSPC. Na slici 14a prikazan je eksperimentalni pristup - H1- H1 promotor, TO - tet operon, tetR- tetraciklin represor. Slika 14b je šema transgenih alela generisanih za dobijanje hESC koji eksprimiraju EFGP reporterski transgen koji bi mogao biti utišan korišćenjem inducibilne EGFP shRNK. Slika 14c prikazuje ekspresiju EGFP u odsustvu ili prisustvu tetraciklina tokom 5 dana u hESC sa ciljanim delovanjem sa naznačenim kombinacijama inducibilne EGFP shRNK i tetR (STD = standard divljeg tipa, OPT = optimizovan kodon). Dvostruko ciljano delovanje hESC koji nisu nosili EGFP shRNK korišćeni su kao negativne kontrole. n.s.=p>0.05 (neznačajno), ∗∗=p>0.01, ∗∗∗=p>0.001 VS ista tetR linija bez tet i bez shRNK. Slika 14d je reprezentativni vestern blot za tetR u ROSA26 sa ciljanim delovanjem hESC koji eksprimiraju STD ili OPT tetR. HET= heterozigotno ciljano delovanje, HOM= homozigotno ciljano delovanje. hESC sa STD tetR nasumičnom integracijom prikazani su kao pozitivna referenca, dok su WT h9 hESC negativne kontrole. TUB4A4A je kontrola operećenja. Opterećene su različite količine proteina da bi se olakšalo kvantitativno poređenje. Slika 14 (E): kinetika obaranja i spasavanja EGFP u EGFP OPTiKD hESC merena protočnom citometrijom (MFI) i qPCR (mRNK). Rezultati su iz 2 nezavisne kulture po vremenskoj tački. Slika 14(F): kriva doza-odgovor tetraciklina za smanjivanje EGFP u EGFP OPTiKD hESC. Prijavljena je polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50). Rezultati su iz 2 nezavisne kulture po dozi, a prikazana je srednja vrednost.
[0064] Slika 15 (a, b i c) Validacija ROSA26 i AAVS1 lokusa kao verodostojnog GSH Slika 15a prikazuje eksperimentalni pristup koji stoji iza generisanja GSH EGFP reporterskih hPSC za testiranje ekspresije GSH tokom diferencijacije. Neuroni, oligodendrociti i astrociti su dobijeni u masovnim kulturama koje sadrže mešavinu ovih ćelijskih linija, dok su svi ostali tipovi ćelija generisani pojedinačno. Slika 15b je šema ROSA26 i AAVS1 EGFP reporter transgenih alela. R26-prom: ROSA26 lokus promotor; AAV-prom: AAVS1 lokus promotor; 5'- HAR/3'-HAR: uzvodna/nizvodna homologa grana; SA: akceptor za spajanje; T2A: samocepajući T2A peptid; Neo: otpornost na neomicin; Puro: otpornost na puromicin; pA: signal poliadenilacije; CAG: CAG promotor; EGFP: poboljšani zeleni fluorescentni protein. Slika 15 (C): Ekspresija EGFP u odsustvu ili prisustvu tetraciklina tokom 5 dana u hESC sa ciljanim delovanjem sa naznačenim kombinacijama inducibilne EGFP shRNK i tetR (standardni tetR divljeg tipa, STDtetR ili tetR optimizovanim kodonom, OPTtetR). hESC sa dvostrukim ciljanim delovanjem koji nisu nosili EGFP shRNK korišćeni su kao negativne kontrole. Rezultati su od 2-3 pojedinačne linije po uslovu
1
(tabela 1). n.s.=p>0.05 (neznačajno), ∗∗=p<0.01,∗∗∗=p<0.001 VS ista tetR linija bez tet i bez shRNK (ANOVA sa post-hoc Holm-Sidak-ovim poređenjima).
[0065] Slika 16 (a-d) Generisanje ROSA26 i AAVS1 EGFP reporterskih hESC. Slika 16(A): Šema pristupa ciljanom delovanju ROSA26 i strategija genotipizacije koje se koriste za identifikaciju linija sa ispravnim ciljanim delovanjem. Cas9n: D10A nikaza mutant Cas9 endonukleaza iz S. piogenes. R26-prom: ROSA26 lokus promotora (THUMPD3-AS1 gen); 5'-HAR/3'-HAR: uzvodna/nizvodna homologa grana; Transgen: region integrisan nakon ciljanog delovanja gena; Lokus PCR: PCR proizvod divljeg tipa ROSA26 lokusa (što ukazuje na alel sa neciljanim delovanjem); Lokus PCR/gubitak alela: PCR proizvod alela sa ciljanim delovanjem/PCR koji ne uspe ako transgen sadrži CAG promotor bogat GC (indikativno za očekivano ciljano delovanje transgena); 5' INT/3' INT PCR: PCR proizvod regiona integracije 5'-kraja/3'-kraja transgena (indikativno za očekivano ciljano delovanje transgena); 5' BB/3' BB PCR: PCR proizvod 5'-kraja/3'-kraja okosnice vektora (ukazuje na nespecifičnu integraciju plazmida van ciljanog delovanja). Treba imati na umu da su slične strategije ciljanog delovanja i genotipizacije primenjene za ciljano delovanje lokusa AAVS1. Slika 16(B): Šema ROSA26 transgenih alela generisanih za testiranje najbolje strategije za konstitutivnu ekspresiju EGFP (pojačanog zelenog fluorescentnog proteina). ENDO-EGFP: EGFP pokretan endogenim ROSA26 promotorom (R26-prom; vektor pR26-Puro_ENDO-EGFP sa ciljanim delovanjem); EF1 α -EGFP: EGFP pokretan promotorom faktora elongacije 1 α (vektor pR26-Neo_EF1 α -EGFP sa ciljanim delovanjem); CAG-EGFP: EGFP pokretnut CAG promotorom (vektor pR26-Neo_CAG-EGFP sa ciljanim delovanjem); SA: akceptor za spajanje; Puro: rezistencija na puromicin (puromicin N-acetiltransferaza); Neo: otpornost na neomicin (neomicin fosfotransferaza II); pA: signal poliadenilacije. Slika 16(C): Kvantifikacija protočne citometrije procenta EGFP pozitivnih ćelija (EGFP<+>; kapija je prikazana) i EGFP srednjeg intenziteta fluorescencije (MFI) u reprezentativnim ROSA26-EGFP reporterskim hESC klonskim linijama, ili divljeg tipa H9 hESCs.
[0066] Slika 16 (D): Procenat EGFP pozitivnih ćelija u ROSA26-EGFP reporterskim hESCs. Rezultati su za 3 klona sa heterozigotnim ROSA26 sa ciljanim delovanjem po stanju.
[0067] Slika 17. Validacija optimizovanih inducibilnih platformi smanjivanja nakon hPSC diferencijacije. Grafikon prikazuje ekspresiju EGFP merenu qPCR u odsustvu (CTR) ili prisustvu tetraciklina tokom 5 dana (TET) u naznačenim tipovima ćelija izvedenih iz EGFP OPTiKD (iKD) i sOPTiKD (siKD) hESCs. Nivoi EGFP su prijavljeni u odnosu na kontrolne uslove u istoj liniji za svaku pojedinačnu liniju. Skraćenice označavaju linije opisane na slici 15 (množina: nediferencirano). Rezultati su iz dve nezavisne kulture po stanju.
[0068] Slika 18 (a - d). Razvoj optimizovane inducibilne CRISPR/Cas9 platforme inaktivacije u hPSCs. Slika 18a prikazuje eksperimentalni pristup za generisanje inducibilnih inaktivatora (iKO)
1
hPSC. Slika 18b prikazuje šemu postupka kloniranja za generisanje AAVS1 vektora sa ciljanim delovanjem sa inducibilnom gRNK kasetom. Slika 18c prikazuje transgene alele generisane za dobijanje hESCs koji eksprimiraju EGFPd2 reporter transgen koji bi mogao biti inaktivator pomoću CRISPR/Cas9 korišćenjem inducibilne EGFP gRNK (EGFP sOPTiKO hESCs). Bsd: otpornost na blasticidin; EGFPd2: destabilizovani EGFP. Slika 18 (d): Kvantifikacija protočne citometrije EGFPd2 inducibilne kinetike inaktivatora u sOPTiKO ćelijama sa slike 19c (gRNK 2 -TO) i b (gRNK 3 - 2TO). Procenat EGFP pozitivnih ćelija je praćen svakodnevno nakon dodavanja tetraciklina. Rezultati su iz 2 nezavisne kulture.
[0069] Slika 19 (a do e): Razvoj optimizovane inducibilne CRISPR/Cas9 platforme inaktivacije u hESCs. (A-D) prikazuju reprezentativnu protočnu citometriju za ekspresiju EGFPd2 u EGFPd2 homozigotnim sOPTiKO hESCs koji nose naznačene kombinacije gRNK (2 ili 3) i inducibilnog promotora (TO ili 2TO, videti sliku 19 e). Vektori sa ciljanim delovanjem: pAAV-Puro_siKOEGFP-2 (19a), pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-2 (19b), pAAV-Puro_siKO-EGFP-3 (19c), pAAV-Puro_siKO-2TO-EGFP-3 (19d). Ćelije su kultivisane u prisustvu tetraciklina (TET) tokom 5 dana, ili su održavane u kontrolnim uslovima (CTR) u odsustvu tetraciklina. Treba imati na umu da su histogrami normalizovani tako da je površina ispod krive jednaka 1 (100%) za sve predstavljene uzorke, da bi se olakšalo direktno vizuelno poređenje. Slika 19(e): Nukleotidne sekvence inducibilnih H1 Pol III promotora za sOPTiKO sistem koji sadrži jedan ili dva tet operona (H1-TO i H1-2TO, respektivno). Ključne karakteristike sekvence su istaknute. Prikazana su mesta iskrajanja restrikcionog enzima koja se koriste za kloniranje gRNK (slika 18B). DSE: distalni element sekvence; PSE: proksimalni element sekvence; TETO2: tet operon; 1: početna pozicija transkripcije RNK.
[0070] Slike 20 do 33 su prikazi mapa različitih plazmida korišćenih u Primerima ove prijave. Oni su:
20) pSpCas9n(BB)_R26-R
21) pSpCas9n(BB)_R26-L
22) pR26_CAG_EGFP
23) pR26_CAG_rtTA
24) pZFN-AAVS1-L-ELD (nukleaza sa cinkanim prstima levo)
25) pZFN-AAVS1-R-KKR (nukleaza sa cinkanim prstima desno)
26) pAAV_CAG_EGFP (donor)
27) pR26-Neo_CAG-OPTtetR (hROSA26 ciljano delovanje kodonom optimizovanim sa tetR) 28) pAAV-Puro_iKD (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne shRNK)
29) pAAV-Neo_CAG-Cas9 (AAVS1 ciljano delovanje Cas9)
1
30) pAAV-Puro_siKO (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne gRNK,)
31) pAAV-Puro_siKO-2TO (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne gRNK, verzija sa 2 tet operona u promotoru)
32) pAAVTRE-EGFP (EGFP inducibilna prekomerna ekspresija, priloženo)
33) pAAV_TRE-MYOD1 (MYOD1 inducibilna prekomerna ekspresija za mišiće)
Detaljan opis pronalaska
[0071] Istraživači su razvili ex vivo postupak koji je koristan za inducibilnu transkripciju genskih sekvenci sadržanih u inducibilnim kasetama u eukariotskim ćelijama, a posebno pluripotentnim matičnim ćelijama i ćelijama koje nastaju od njih.
[0072] Posebno je primenljiv na unapred programirane pluripotentne matične ćelije, preko prekomerne ekspresije inducibilnih kaseta unutar navedenih matičnih ćelija koje promovišu razvoj određenog tipa zrelih ćelija. Dalje, on je takođe primenljiv na smanjenje ili inaktivaciju endogene funkcije unutar ćelije da bi se proučavao gubitak funkcije ili promenile ćelijske funkcije ili ponašanje u ovim ćelijama. Smanjenje ili inaktivacija se može primeniti na gene koji kodiraju proteine ili na DNK sekvence koje kodiraju nekodirajuću RNK. I jedno i drugo može ciljano delovati postupcima prema ovom pronalasku pomoću smanjenja ili inaktivacije.
[0073] Ovaj postupak se zasniva na najmanje dvostrukom ciljanom delovanju sigurnih luka u genomu matične ćelije, sa sistemom za indukovanu transkripciju podeljenom na dva ili više GSH. Međutim, ovaj postupak nije ograničen na matične ćelije i može se koristiti za modifikovanje genoma bilo kog tipa ćelije, na primer u istraživanju ili u genskoj terapiji. U postupcima prema pronalasku jedan GSH je modifikovan da sadrži regulator transkripcije koji je neophodan da indukuje transkripciju genske sekvence sadržane u inducibilnoj kaseti ubačenoj u drugi GSH negde drugde u genomu. Poželjno je da je regulator transkripcije konstitutivno eksprimiran. Poželjno je da se obezbedi egzogena supstanca/sredstvo da bi se kontrolisala aktivnost transkripcionog regulatornog proteina i na taj način kontrolisala ekspresija inducibilne kasete. Pošto su najmanje dva odvojena GSH korišćena u postupku prema pronalasku, postoje ukupno četiri moguća lokusa insercije, pošto svaki GSH postoji na oba hromozoma diploidnog organizma. Ovo povećava količinu moguće transkripcije iz ćelije ako su sva četiri lokusa modifikovana korišćenjem postupka prema pronalasku. Primer različitih ishoda ciljane insercije prikazan je na slici 5a. Dalje, postupak prema pronalasku koristi najmanje dva različita GSH mesta. Razumeće se da bi se dalja GSH mesta mogla koristiti za uvođenje daljih regulatora transkripcije, inducibilnih kaseta ili bilo kog drugog genetičkog materijala uključujući, ali ne ograničavajući se na selektivne
1
markere, gene otpornosti na antibiotike ili lekove, gene koji se odnose na CRISPR/Cas9 sistem ili gene nepoznate funkcije.
[0074] Dakle, ovaj pronalazak se odnosi na ex vivo postupak za kontrolu ekspresije insertovane genske sekvence u ćeliji, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju genske sekvence koja kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu pomenuta inducibilna kaseta sadrži pomenutu gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom, a navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0075] Dalje, u ovom aspektu pronalaska, dalja identična ili drugačija inducibilna kaseta može biti insertovana u dalji GSH, koji se razlikuje od prvog i drugog GSH. Takva inducibilna kaseta je kako je ovde opisano.
[0076] Insercije specifično unutar genskih sigurnih luka su poželjnije u odnosu na nasumične integracije genoma, jer se očekuje da će to biti bezbednija modifikacija genoma i manje je verovatno da će dovesti do neželjenih nuspojava kao što je utišavanje ekspresije prirodnih gena ili izazivanje mutacija koje dovode do kancerogenih tipova ćelija.
[0077] Mesto genske sigurne luke (GSH) je lokus unutar genoma pri čemu se gen ili drugi genetički materijal može insertovati bez ikakvih štetnih efekata na ćeliju ili na insertovani genetički materijal. Najkorisnije GSH mesto je ono u kome ekspresija insertovane genske sekvence nije ometana bilo kakvom ekspresijom učitavanja iz susednih gena i ono u kome ekspresija inducibilne kasete minimizira interferenciju sa programom endogene transkripcije. Predloženi su formalniji kriterijumi koji pomažu u određivanju da li je određeni lokus GSH mesto u budućnosti (Papapetrou et al, 2011, Nature Biotechnology, 29(1), 73-8. doi:10.1038/nbt.1717.) Ovi kriterijumi uključuju mesto koje je (i) 50 kb ili više od 5' kraja bilo kog gena, (ii) 300 kb ili više od bilo kog gena povezanog sa kancerom, (iii) 300 kb ili više od bilo koje mikroRNK (miRNK) , (iv) lociran izvan transkripcione jedinice i (v) lociran izvan ultrakonzerviranih regiona (UCR). Možda neće biti neophodno da se zadovolje svi ovi predloženi kriterijumi, pošto već identifikovani GSH ne ispunjavaju sve kriterijume. Smatra se da će odgovarajući GSH zadovoljiti najmanje 2, 3, 4 ili sve ove kriterijume.
2
[0078] Dalja mesta se mogu identifikovati traženjem mesta na kojima se virusi prirodno integrišu bez ometanja prirodne ekspresije gena.
[0079] Bilo koje pogodno GSH mesto se može koristiti u postupku prema pronalasku, na osnovu toga što mesto dozvoljava inserciju genetičkog materijala bez štetnih efekata na ćeliju i dozvoljava transkripciju insertovanog genetičkog materijala. Stručnjaci u ovoj tehnici mogu koristiti ove pojednostavljene kriterijume da identifikuju odgovarajući GSH, i/ili formalnije kriterijume prethodno navedene.
[0080] Za humani genom identifikovano je nekoliko GSH mesta, a to uključuje AAVS1 lokus, hROSA26 lokus i CLYBL gen. CCR5 gen i HPRT gen su takođe razmatrani kao moguća GSHs, a dalje istraživanje može identifikovati jedan ili više njih kao GSHs u humanom genomu.
[0081] Lokus 1 mesta integracije adeno-asociranog virusa (AAVS1) nalazi se u okviru gena protein fosfataze 1, regulatorne podjedinice 12C (PPP1R12C) na humanom hromozomu 19, koji je uniformno i sveprisutno eksprimiran u humanim tkivima. Ovo mesto služi kao specifično mesto integracije za AAV serotip 2, i stoga je identifikovana kao mogući GSH. Pokazalo se da je AAVS1 povoljno okruženje za transkripciju, jer sadrži otvorenu strukturu hromatina i nativne hromozomske izolatore koji omogućavaju otpornost inducibilnih kaseta na utišavanje. Nema poznatih štetnih efekata na ćeliju koji su rezultat poremećaja gena PPP1R12C. Štaviše, inducibilna kaseta insertovana u ovo mesto ostaje transkripciono aktivna u mnogim različitim tipovima ćelija. AAVS1 se stoga smatra GSH i naširoko se koristi za trangenezu sa ciljanim delovanjem u humanom genomu.
[0082] Mesto hROSA26 je identifikovano na osnovu analogije sekvence sa GSH od miševa (ROSA26-reverzno orijentisano mesto akceptora spajanja #26). Iako je ortološko mesto identifikovano kod ljudi, ovo mesto se obično ne koristi za inserciju inducibilne kasete. Sadašnji istraživači su razvili sistem ciljanog delovanja posebno za hROSA26 mesto i tako su mogli da insertuju genetički materijal u ovaj lokus. Lokus hROSA26 je na hromozomu 3 (3p25.3) i može se naći u Ensembl bazi podataka (GenBank:CR624523). Tačne genomske koordinate mesta integracije su 3:9396280-9396303: Ensembl. Mesto integracije se nalazi unutar otvorenog okvira čitanja (ORF) THUMPD3 duge nekodirajuće RNK (obrnuti lanac). Pošto hROSA26 mesto ima endogeni promotor, insertovani genetički materijal može iskoristiti prednost tog endogenog promotora, ili alternativno može biti insertovan operativno povezan za promotor.
[0083] Intron 2 gena citrat liaza beta (CLYBL), na dugom kraku hromozoma 13, identifikovan je kao pogodan GSH pošto je jedno od identifikovanih veoma učestalih mesta integracije phiC31 integraze izvedeno iz faga. Studije su pokazale da su nasumično insertovane inducibilne kasete u ovaj lokus stabilne i eksprimirane. Pokazalo se da insercija inducibilnih kaseta na ovaj GSH ne remeti ekspresiju lokalnih gena (Cerbibi et al, 2015, PLOS One, DOI:1O.1371). CLYBL tako obezbeđuje GSH koji može biti pogodan za upotrebu u ovom pronalasku.
[0084] CCR5, koji se nalazi na hromozomu 3 (pozicija 3p21.31) je gen koji kodira glavni koreceptor HIV-1. Interesovanje za korišćenje ovog mesta kao GSH proizilazi iz nulte mutacije u ovom genu za koju se čini da nema štetnih efekata, ali predisponira otpornosti na HIV-1 infekciju. Razvijene su nukleaze sa cinkanim prstima koje ciljano deluju na treći egzon, što omogućava inserciju genetičkog materijala na ovaj lokus. S obzirom na to da prirodna funkcija CCR5 tek treba da bude razjašnjena, ovo mesto ostaje navodni GSH koji može imati koristi za ovaj pronalazak.
[0085] Gen hipoksantin-guanin fosforiboziltransferaze (HPRT) kodira enzim transferazu koji ima centralnu ulogu u stvaranju purinskih nukleotida kroz put spasavanja purina. Stoga je potreban dalji rad da bi se osiguralo da insercija na ovom mestu ne ometa normalnu ćelijsku funkciju. Međutim, razmatrano je kao GSH mesto. Insercije na ovom mestu mogu biti primenljivije za zrele tipove ćelija, kao što je modifikacija za gensku terapiju.
[0086] GSH je identifikovan u drugim organizmima i uključuje ROSA26, HPRT i Hipp11 (H11) lokuse kod miševa. Genomi sisara mogu uključivati GSH mesta zasnovana na pseudo attP mestima. Za takva mesta, hiC31 integraza, rekombinaza izvedena iz faga Streptomyces, razvijena je kao nevirusni alat za inserciju, jer ima sposobnost da integriše inducibilni plazmid koji sadrži kasetu koja nosi attB mesto u pseudo attP mestima.
[0087] GSH su takođe prisutne u genomima biljaka, a modifikacija biljnih ćelija može činiti deo ovog pronalaska. GSH je identifikovan u genomima pirinča (Cantos et al, Front. Plant Sci., 26 June 2014, Volume 5, Article 302, http://dx.doi.org/10.3389/fpls.2014.00302).
[0088] U postupcima prema pronalasku, insercije se javljaju na različitim GSH, tako da su najmanje dva GSH potrebna za postupak prema pronalasku. Prvi GSH je modifikovan insercijom transkripcionog regulatornog proteina. Drugi GSH je modifikovan insercijom inducibilne kasete koja sadrži gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom. Drugi genetički materijal takođe može biti insertovan sa jednim ili oba ova elementa. Genska sekvenca koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom unutar inducibilne kasete je poželjno DNK sekvenca. Poželjno je da genska sekvenca(e) inducibilne kasete kodira RNK molekul, pa je stoga sposobna da bude transkribovana. Transkripcija se kontroliše korišćenjem inducibilnog promotora. RNK molekul može biti bilo koje sekvence, ali poželjno je mRNK koja kodira protein, shRNK ili gRNK.
[0089] Prvi GSH može biti bilo koje odgovarajuće GSH mesto. Izborno, to je GSH sa endogenim promotorom koji je konstitutivno eksprimiran; što će rezultovati konstitutivnom ekspresijom insertovanog transkripcionog regulatornog proteina. Pogodan GSH je hROSA26 mesto za humane ćelije. Alternativno, insertovani transkripcioni regulatorni protein je operativno vezan za promotor, poželjno konstitutivni promotor. Konstitutivni promotor se može koristiti zajedno sa insercijom na mestu hROSA26.
[0090] Transkripcioni regulatorni protein je protein koji se vezuje za DNK, poželjno specifično za sekvencu za mesto DNK koje se nalazi u ili blizu promotora, i ili olakšava vezivanje transkripcione mašinerije za promotor, a samim tim i transkripciju DNK sekvence (transkripcioni aktivator) ili blokira ovaj postupak (represor transkripcije). Takvi entiteti su takođe poznati kao transkripcioni faktori.
[0091] DNK sekvenca za koju se vezuje transkripcioni regulatorni protein naziva se mesto vezivanja faktora transkripcije ili element odgovora, a oni se nalaze u ili blizu promotora regulisane sekvence DNK.
[0092] Proteini aktivatori transkripcije vezuju se za element odgovora i pospešuju ekspresiju gena. Takvi proteini su poželjni u postupcima prema ovom pronalasku za kontrolu ekspresije inducibilne kasete.
[0093] Proteini represori transkripcije vezuju se za element odgovora i sprečavaju ekspresiju gena [0094] Proteini regulatori transkripcije mogu se aktivirati ili deaktivirati brojnim mehanizmima uključujući vezivanje supstance, interakciju sa drugim transkripcionim faktorima (npr. homo- ili hetero-dimerizacija) ili koregulatornim proteinima, fosforilacijom i/ili metilacijom. Regulator transkripcije se može kontrolisati aktivacijom ili deaktivacijom.
[0095] Ako je transkripcioni regulatorni protein, protein aktivator transkripcije, poželjno je da protein aktivator transkripcije zahteva aktivaciju. Ova aktivacija može biti na bilo koji pogodan način, ali je poželjno da se transkripcioni regulatorni protein aktivira dodavanjem egzogene supstance u ćeliju. Može se kontrolisati snabdevanje ćelije egzogenom supstancom, a samim tim se i aktivacija transkripcionog regulatornog proteina može kontrolisati. Alternativno, egzogena supstanca se može obezbediti da bi se deaktivirao transkripcioni regulatorni protein, a zatim se snabdevanje povuklo da bi se aktivirao transkripcioni regulatorni protein.
[0096] Ako je transkripcioni regulatorni protein, protein represor transkripcije, poželjno je da protein represor transkripcije zahteva deaktivaciju. Dakle, isporučuje se supstanca da spreči protein represor transkripcije koji potiskuje transkripciju, i stoga je transkripcija dozvoljena.
[0097] Može se koristiti bilo koji odgovarajući transkripcioni regulatorni protein, poželjno onaj koji se može aktivirati ili deaktivirati. Poželjno je da se egzogena supstanca može obezbediti za kontrolu transkripcionog regulatornog proteina. Takvi transkripcioni regulatorni proteini se takođe nazivaju inducibilni transkripcioni regulatorni proteini.
[0098] Transkripciona aktivacija kontrolisana tetraciklinom je postupak inducibilne ekspresije gena gde se transkripcija reverzibilno uključuje ili isključuje u prisustvu antibiotika tetraciklina ili jednog od njegovih derivata (npr. doksiciklin koji je stabilniji). U ovom sistemu, protein aktivator
2
transkripcije je protein aktivator transkripcije koji odgovara na tetraciklin (rtTa) ili njegov derivat. Protein rtTA je u stanju da se veže za DNK na specifičnim TetO sekvencama operatora. Nekoliko ponavljanja takvih TetO sekvenci postavljeno je uzvodno od minimalnog promotora (kao što je CMV promotor), koji zajedno formiraju tetraciklinski odzivni element (TRE). Postoje dva oblika ovog sistema, u zavisnosti od toga da li dodavanje tetraciklina ili derivata aktivira (Tet-On) ili deaktivira (Tet-Off) protein rtTA.
[0099] U Tet-Off sistemu, tetraciklin ili njegov derivat vezuje rtTA i deaktivira rtTA, čineći ga nesposobnim da se veže za TRE sekvence, čime se sprečava transkripcija TRE kontrolisanih gena. Ovaj sistem je prvi put opisan u Bujard, et al (1992). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.89 (12): 5547-51.
[0100] Tet-On sistem se sastoji od dve komponente; (1) konstitutivno eksprimirani protein aktivatora transkripcije koji odgovara na tetraciklin (rtTa) i rtTa senzitivni inducibilni promotor (Tet Responsive Element, TRE). Ovo može biti povezano sa tetraciklinom ili njegovim stabilnijim derivatima, uključujući doksiciklin (dox), što dovodi do aktivacije rtTa, omogućavajući mu da se veže za TRE sekvence i izaziva ekspresiju TRE-kontrolisanih gena. Upotreba ovoga može biti poželjna u postupku prema pronalasku. Ovaj sistem je prikazan na slici 11.
[0101] Prema tome, transkripcioni regulatorni protein može biti protein aktivator transkripcije koji odgovara na tetraciklin (rtTa), koji može biti aktiviran ili deaktiviran antibiotikom tetraciklinom ili jednim od njegovih derivata, koji se snabdevaju egzogeno. Ako je transkripcioni regulatorni protein rtTA, onda inducibilni promotor insertovan u drugo GSH mesto uključuje tetraciklinski odzivni element (TRE). Egzogena supstanca je antibiotik tetraciklin ili jedan od njegovih derivata.
[0102] Varijante i modifikovani rtTa proteini se mogu koristiti u postupcima prema pronalasku, oni uključuju Tet-On napredni transaktivator (takođe poznat kao rtTA2S-M2) i Tet-On 3G (takođe poznat kao rtTA-V16, izveden iz rtTA2S-S2.
[0103] Tetraciklinski odzivni element (TRE) se generalno sastoji od 7 ponavljanja 19bp bakterijske TetO sekvence razdvojene razmaknim sekvencama, zajedno sa minimalnim promotorom. Moguće su varijante i modifikacije TRE sekvence, pošto minimalni promotor može biti bilo koji pogodan promotor. Poželjno, minimalni promotor ne pokazuje nikakve ili minimalne nivoe ekspresije u odsustvu vezivanja rtTa. Inducibilni promotor umetnut u drugi GSH može tako da sadrži TRE.
[0104] Modifikovani sistem zasnovan na kontroli tetraciklina je T-REx™ sistem (Thermofisher Scientific), u kome je transkripcioni regulatorni protein, protein represor transkripcije, TetR. Komponente ovog sistema uključuju (i) inducibilni promotor koji se sastoji od snažnog humanog promotora neposrednog ranog (CMV) humanog citomegalovirusa i dva mesta tetraciklinskog operatora 2 (TetO2), i Tet represora (TetR). TetO2 sekvence se sastoje od 2 kopije sekvence od 19 nukleotida, 5'-TCCCTATCAGTGATAGAGA-3’ razdvojene razmakom od 2 para baza. U odsustvu tetraciklina, Tet represor formira homodimer koji se vezuje sa izuzetno visokim afinitetom za svaku TetO2 sekvencu u inducibilnom promotoru i sprečava transkripciju sa promotora. Kada se jednom doda, tetraciklin se vezuje sa visokim afinitetom za svaki homodimer Tet represora, što ga čini nesposobnim da se veže za Tet operatora. Tet represor: kompleks tetraciklina se zatim odvaja od Tet operatora i omogućava indukciju ekspresije. U ovom slučaju, transkripcioni regulatorni protein je TetR, a inducibilni promotor sadrži dva TetO2 mesta. Egzogena supstanca je tetraciklin ili njegov derivat.
[0105] Takođe je opisan tetR optimizovan kodonom (OPTtetR). Ovo se može koristiti u bilo kom postupku koji je ovde opisan, ili za bilo koju dodatnu upotrebu gde je poželjna inducibilna promocija. Ovaj entitet je generisan korišćenjem multiparametarske optimizacije bakterijske tetR cDNK sekvence. OPTtetR omogućava desetostruko povećanje ekspresije tetR u poređenju sa standardnom sekvencom (STDtetR). Homozigotna OPTtetR ekspresija tetR bila je dovoljna da spreči propuštanje shRNK uz očuvanje indukcije smanjenja u Primerima. Ovde je uključena sekvenca za OPTtetR, sa standardnom sekvencom prikazanom kao poređenje. Ovim se zahtevaju sekvence sa najmanje 75%, 80%, 85% ili 90% homologije za ovu sekvencu, tačnije 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 ili 99% homologije. Ostaci za koje je pokazano da se menjaju između STDtetR i OPTtetR su naznačeni u sekvencama, i poželjno je da se ovi ostaci ne menjaju ni u jednom derivatu OPTtetR pošto se smatra da su važni za poboljšana svojstva. Bilo koji derivat bi izborno zadržao ove modifikacije na naznačenim pozicijama.
[0106] Drugi inducibilni ekspresioni sistemi su poznati i mogu se koristiti u postupku prema pronalasku. Ovo uključuje Complete Control Inducible sistem kompanije Agilent Technologies. Ovo se zasniva na hormonu insekata ekdizonu ili njegovom analogu ponasteronu A (ponA) koji može aktivirati transkripciju u ćelijama sisara koje su transfektovane i genom za receptor ekdizona Drosophila melongaster (EcR) i inducibilnim promotorom koji sadrži mesto vezivanja za receptor ekdizona. EcR je član familije nuklearnih receptora retinoid-X-receptora (RXR). Kod ljudi, EcR formira heterodimer sa RXR koji se vezuje za element koji odgovara na ekdizon (EcRE). U odsustvu PonA, transkripcija je potisnuta heterodimerom.
[0107] Prema tome, transkripcioni regulatorni protein može biti represorski protein, kao što je receptor ekdizona ili njegov derivat. Primeri poslednjeg uključuju VgEcR sintetički receptor iz Agilent technologies koji je fuzija EcR, domen koji se vezuje za DNK glukokortikoidnog receptora i domen aktivacije transkripcije Herpes Simplex Virus VP16. Inducibilni promotor sadrži EcRE sekvencu ili njene modifikovane verzije zajedno sa minimalnim promotorom. Modifikovane verzije uključuju sekvencu prepoznavanja E/GRE kompanije Agilent Technologies, u kojoj su napravljene mutacije sekvence. E/GRE sekvenca prepoznavanja sadrži invertovane elemente za
2
prepoznavanje na pola mesta za retinoid-X-receptor (RXR) i GR vezujuće domene. U svim permutacijama, egzogeno obezbeđena supstanca je ponasteron A, koji uklanja represivni efekat EcR ili njegovih derivata na inducibilni promotor i omogućava da se izvrši transkripcija.
[0108] Alternativno, inducibilni sistemi mogu da se zasnivaju na sintetičkom steroidu mifepristonu kao egzogenoj supstanci. U ovom scenariju se insertuje hibridni transkripcioni regulatorni protein, koji se zasniva na domenu za vezivanje DNK iz GAL4 proteina kvasca, domenu za vezivanje skraćenog liganda (LBD) iz humanog progesteronskog receptora i domenu aktivacije (AD) iz humanog NF-κB. Ovaj hibridni transkripcioni regulatorni protein dostupan je od Thermofisher Scientific (Gene Switch™). Mifepriston aktivira hibridni protein i dozvoljava transkripciju sa inducibilnog promotora koji sadrži sekvence za aktiviranje uzvodnih GAL4 (UAS) i adenovirusa E1b TATA kutiju. Ovaj sistem je opisan u Wang, Y. et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8184.
[0109] Transkripcioni regulatorni protein stoga može biti bilo koji odgovarajući protein regulatora, bilo aktivator ili represorski protein. Pogodni proteini aktivatori transkripcije su proteini aktivatori transkripcije koji odgovara na tetraciklin(rtTa) ili hibridni transkripcioni regulatorni protein Gene Switch. Odgovarajući proteini represora uključuju Tet-Off verziju rtTA, TetR ili EcR. Transkripcioni regulatorni proteini mogu biti modifikovani ili derivatizovani prema potrebi.
[0110] Inducibilni promotor može da sadrži elemente koji su pogodni za vezivanje ili interakciju sa transkripcionim regulatornim proteinom. Interakcija transkripcionog regulatornog proteina sa inducibilnim promotorom je poželjno kontrolisana egzogeno dostavljenom supstancom.
[0111] Supstanca koja se isporučuje egzogeno može biti bilo koja pogodna supstanca koja se vezuje za transkripciono regulatorni protein ili je u interakciji sa njim. Pogodne supstance uključuju tetraciklin, ponasteron A i mifepriston. Dakle, insercija gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvi GSH obezbeđuje kontrolni mehanizam za ekspresiju inducibilne kasete koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i insertovana u drugo, drugačije, GSH mesto.
[0112] Gen za transkripciono regulatorni protein može biti obezbeđen za insercijom sa drugim genetičkim materijalom. Takav materijal uključuje gene za markere ili reporterske molekule, kao što su geni koji indukuju vizuelno prepoznatljive karakteristike uključujući fluorescentne i luminiscentne proteine. Primeri uključuju gen koji kodira zeleni fluorescentni protein meduze (GFP), koji uzrokuje da ćelije koje ga eksprimiraju svetle zeleno pod plavim/UV svetlom, luciferazu, koja katalizuje reakciju sa luciferinom da proizvodi svetlost, i crveni fluorescentni protein iz gena dsRed. Takvi markeri ili reporterski geni su korisni, pošto prisustvo reporterskog proteina potvrđuje ekspresiju proteina iz prvog GSH, što ukazuje na uspešnu inserciju. Markeri koji se mogu birati mogu dalje uključivati gene otpornosti na antibiotike ili druge lekove. Mogu
2
se uvesti i markeri ili sekvence reporter gena koje omogućavaju proučavanje ekspresije endogenih (ili egzogenih gena). Ovo uključuje Cas proteine, uključujući CasL, Cas9 proteine koji omogućavaju eksciziju gena od interesa, kao i Cas-Fusion proteine koji posreduju u promenama u ekspresiji drugih gena, npr. delujući kao pojačivači ili represori transkripcije. Štaviše, neinducibilna ekspresija molekularnih sredstava može biti poželjna, uključujući optogenetičke alate, fuzione proteine nuklearnih receptora, kao što su ERT sistemi koji se indukuju sa tamoksifenom, i dizajnerske receptore koji se isključivo aktiviraju dizajnerskim lekovima. Štaviše, sekvence koje kodiraju signalne faktore koji menjaju funkciju iste ćelije ili susednih ili čak udaljenih ćelija u organizmu, uključujući hormone autokrine ili parakrine faktore, mogu se koeksprimirati iz istog GSH kao transkripcioni regulatorni protein.
[0113] Dodatno, dalji genetički materijal može uključivati sekvence koje kodiraju nekodirajuću RNK, kako je ovde diskutovano. Primeri takvog genetičkog materijala uključuju gene za miRNK, koja može da funkcioniše kao genetički prekidač.
[0114] Poželjno je da gen koji kodira transkripcioni regulatorni protein bude operativno vezan za konstitutivni promotor. Alternativno, prvi GSH može biti odabran tako da već ima konstitutivni promotor koji takođe može da pokrene ekspresiju gena transkripcionog regulatornog proteina i bilo kog povezanog genetičkog materijala. Konstitutivni promotori obezbeđuju održivu ekspresiju gena na visokom nivou. Obično korišćeni konstitutivni promotori, uključujući humani β -aktin promotor (ACTB), citomegalovirus (CMV), faktor elongacije-la, (EF1 α), fosfoglicerat kinazu (PGK) i ubikvitinC (UbC). CAG promotor je snažan sintetički promotor koji se često koristi za pokretanje visokog nivoa ekspresije gena i konstruisan je od sledećih sekvenci: (C) rani pojačivač citomegalovirusa (CMV), (A) promotor, prvi egzon i prvi intron pilećeg beta-aktin gena, i (G) akceptora spajanja zečjeg beta-globin gena.
[0115] Dalje, regulator transkripcije, plus bilo koji dalji genetički materijal može biti obezbeđen zajedno sa sekvencama za prekidanje. Takve sekvence su sekvence koje prepoznaju entitet sposoban da specifično preseče DNK, i uključuju restrikciona mesta, koja su sekvence sa ciljanim delovanjem za restrikcione enzime ili sekvence za prepoznavanje od strane drugih entiteta koji cepaju DNK, kao što su nukleaze, rekombinaze, ribozimi ili veštački konstrukti. Može biti uključena najmanje jedna sekvenca za prekidanje, ali poželjno je da su prisutne dve ili više. Ove sekvence za prekidanje mogu biti na bilo kojoj pogodnoj tački insercije, tako da se odabrani deo insercije, ili cela insercija, može selektivno ukloniti iz GSH. Postupak se stoga može proširiti na uklanjanje i/ili zamenu insercije ili njegovog dela iz GSH. Mesta za prekidanje tako mogu da okružuju deo/celu inserciju koju bi možda bilo poželjno ukloniti. Regulator transkripcije i/ili dalji genetički materijal mogu biti uklonjeni korišćenjem ovog postupka.
2
[0116] Deo insercije može biti bilo koji deo do 99% insercije - tj.1-99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ili manje od 10%.
[0117] Može biti poželjno da deo insercije koji je okružen mestima za prekidanje uključuje konstitutivni promotor. Alternativno, konstitutivni promotor nije uključen u deo koji je okružen sekvencama za prekidanje.
[0118] Poželjna sekvenca za prekidanje je IoxP mesto za Cre rekombinazu jer omogućava direktnu zamenu uklonjene insercije. Alternativno ili dodatno, sekvenca za prekidanje je rox mesto za Dre rekombinazu.
[0119] Poželjno je da insercija na prvom GSH bude na oba lokusa u genomu, tako da se svaki alel modifikuje insercijom. Ovo omogućava veću ekspresiju iz gena koji kodira transkripcioni regulator i bilo kog povezanog genetičkog materijala.
[0120] Drugi GSH može biti bilo koje pogodno GSH mesto. Može biti poželjno da drugo GSH mesto nije povezano sa endogenim promotorom, tako da je ekspresija insertovane inducibilne kasete isključivo pod kontrolom transkripcionog regulatornog proteina.
[0121] Inducibilna kaseta uključuje željenu gensku sekvencu, poželjno DNK sekvencu, koja treba da se prenese u ćeliju. Uvođenje inducibilne kasete u genom ima potencijal da promeni fenotip te ćelije, bilo dodavanjem genske sekvence koja dozvoljava ekspresiju gena ili endogenu ekspresiju smanjenja/inaktivacije. Postupci prema pronalasku obezbeđuju transkripciju genske sekvence (sekvenci) koja se može kontrolisati unutar inducibilne kasete u ćeliji.
[0122] Željena genska sekvenca za inserciju je poželjno DNK sekvenca koja kodira molekul RNK. Molekul RNK može biti bilo koje sekvence, ali poželjno je kodirajuća ili nekodirajuća RNK. Kodirajuća ili informaciona RNK kodira polipeptidne sekvence, a transkripcija takve RNK dovodi do ekspresije proteina unutar ćelije. Nekodirajuća RNK može biti funkcionalna i može uključivati bez ograničenja: mikroRNK, malu interferirajuću RNK, RNK koja interaguje sa Piwi, antisense RNK, malu nuklearnu RNK, malu nukleolarnu RNK, malu RNK Cajal tela, Y RNK, RNK za pojačanje, vodeća RNK, ribozime , RNK male ukosnice, malu temporalnu RNK, RNK sa transaktivnim dejstvom, malu interferirajuću RNK i subgenomsku informacionu RNK. RNK koja ne kodira može biti poznata i kao funkcionalna RNK. Nekoliko tipova RNK su regulatorne prirode i, na primer, mogu da smanje ekspresiju gena tako što su komplementarne delu mRNK ili DNK gena. MikroRNK (miRNK; 21-22 nukleotida) se nalaze u eukariotima i deluju putem interferencije RNK (RNKi), gde efektorski kompleks miRNK i enzima može da cepa komplementarnu mRNK, blokira translaciju mRNK ili ubrza njenu degradaciju. Druga vrsta RNK, male interferirajuće RNK (siRNK; 20-25 nukleotida) deluju kroz interferenciju RNK na način sličan miRNK. Neke miRNK i siRNK mogu uzrokovati metilaciju gena na koje ciljano deluju, čime se smanjuje ili povećava transkripcija tih gena. Životinje imaju RNK u interakciji sa Piwi (piRNK; 29-30 nukleotida) koje
2
su aktivne u ćelijama reproduktivne linije i za koje se smatra da predstavljaju odbranu od transpozona. Mnogi prokarioti imaju CRISPR RNK, regulatorni sistem sličan interferenciji RNK, a takav sistem uključuje vodeću RNK (gRNK). Antisense RNK su široko rasprostranjene; većina smanjuje regulaciju gena, ali neki su aktivatori transkripcije. Antisense RNK može delovati vezivanjem za mRNK, formirajući dvolančanu RNK koja se enzimski razgrađuje. Postoji mnogo dugih nekodirajućih RNK koje regulišu gene kod eukariota, jedna takva RNK je Xist, koja oblaže jedan X hromozom kod ženki sisara i inaktivira ga. Prema tome, postoji mnoštvo funkcionalnih RNK koje se mogu koristiti u postupcima prema ovom pronalasku.
[0123] Dakle, inducibilna kaseta može uključivati gensku sekvencu koja je gen koji kodira protein. Ovaj gen možda nije prirodno prisutan u ćeliji, ili se može prirodno pojaviti u ćeliji, ali je neophodna kontrolna ekspresija tog gena. Alternativno, inducibilna kaseta može biti mutirana, modifikovana ili ispravna verzija gena prisutnog u ćeliji, posebno za potrebe genske terapije ili izvođenje modela bolesti. Inducibilna kaseta stoga može uključivati transgen iz drugog organizma iste vrste (tj. bolesnu/mutiranu verziju gena od čoveka, ili gen divljeg tipa od čoveka) ili biti iz druge vrste.
[0124] U bilo kom aspektu ili primeru izvođenja, genska sekvenca koja se nalazi unutar inducibilne kasete može biti sintetička sekvenca.
[0125] Inducibilna kaseta može uključiti bilo koju pogodnu gensku sekvencu koju se želi insertovati u genom ćelije. Stoga, genska sekvenca može biti gen koji kodira proteinski proizvod ili sekvencu koja se transkribuje u ribonukleinsku kiselinu (RNK) koja ima funkciju (kao što je mala nuklearna RNK (snRNK), antisens RNK, mikro RNK (miRNK), mala interferirajuća RNK (siRNK), transfer RNK (tRNK) i druge nekodirajuće RNK (ncRNK), uključujući CRISPR-RNK (crRNK) i vodeća RNK (gRNK).
[0126] Inducibilna kaseta stoga može uključivati bilo koju gensku sekvencu, čija transkripciju se želi kontrolisati unutar ćelije. Odabrana genska sekvenca zavisiće od tipa ćelije i upotrebe na koju će ćelija biti stavljena nakon modifikacije, kao što je objašnjeno dalje u nastavku.
[0127] Na primer, za postupke genske terapije, može biti poželjno obezbediti sekvencu gena divljeg tipa kao komponentu inducibilne kasete. U ovom scenariju, genska sekvenca može biti bilo koji gen koji kodira humani ili životinjski protein. Primeri gena koji kodiraju protein uključuju gen za humani ß-globin, gen za humanu lipoprotein lipazu (LPL), Rab escort protein 1 kod ljudi kodiranog CHM genom i još mnogo toga. Alternativno, inducibilna kaseta može da eksprimira faktore rasta, uključujući BDNF, GDF, NGF, IGF, FGF i/ili enzime koji mogu da cepaju propeptide da bi formirali aktivne forme. Genska terapija se takođe može postići ekspresijom inducibilne kasete uključujući gensku sekvencu koja kodira antisense RNK, miRNK, siRNK ili bilo koju vrstu RNK koja ometa ekspresiju drugog gena unutar ćelije.
2
[0128] Alternativno, ako je ćelija matična ćelija, inducibilna kaseta može da sadrži gensku sekvencu koja kodira ključnu liniju specifičnog glavnog regulatora, skraćeno ovde je glavni regulator. Glavni regulatori mogu biti jedan ili više od: transkripcionih faktora, regulatora transkripcije, receptora citokina ili signalnih molekula i slično. Glavni regulator je eksprimirani gen koji utiče na liniju ćelije koja ga eksprimira. Možda je potrebna mreža glavnih regulatora da bi se odredila linija ćelije. Kako je upotrebljen ovde, gen glavnog regulatora koji je eksprimiran na početku razvojne linije ili tipa ćelije, učestvuje u specifikaciji te linije regulacijom više nizvodnih gena direktno ili kroz kaskadu promena ekspresije gena. Ako je glavni regulator eksprimiran, on ima sposobnost da ponovo odredi sudbinu ćelija koje su predodređene da formiraju druge linije. Primeri glavnih regulatora uključuju miogeni transkripcioni faktor MyoD i hematopoetski transkripcioni faktor SCL. Konkretno, glavni regulatori uključuju, ali se ne ograničavaju na:
Neuralne linije: Oligodendrociti: SOX10, OLIG2, NKX2.2., NKX6.2; Astrociti: NFIA, NFIB i SOX9;
Neuroni: Ascl1, neurogenin i NeuroD, Pax6, Neurog2, Ascl1, Dlx2 i NeuroD1; Hematopoetske ćelije,
uključujući eritrocite i megakariocite: GATA1, FLI1 i TAL1
Mezenhimske linije: Skeletni mišići: MYOD; Kardiomiociti: Gata4, Mef2c, Baf60c i Tbx5; Kost: L-Myc (RXOL) Runx2, Osterix, Oct4; Hrskavica: c-Myc Klf4, SOX9; i smeđi adipociti: C/EBP- β i c-Myc.
Endoderm
[0129] Tipovi ćelija pankreasa:PDX1 i GATA6.
Matične ćelije: Epiblast SC: Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc
[0130] Alternativno, ili dodatno, genska sekvenca ili dalji genetički materijal mogu biti geni čija funkcija zahteva istraživanje, tako da kontrolisana ekspresija može sagledati efekat ekspresije na ćeliju; gen može uključivati faktore rasta i/ili citokine da bi se ćelije koristile u transplantaciji ćelija; i/ili gen može biti komponenta reporterske analize.
[0131] Dalje, genska sekvenca može da kodira nekodirajuću RNK čija je funkcija da smanji ekspresiju endogenog gena ili DNK sekvencu koja kodira nekodirajuću RNK u ćeliji. Alternativno, genska sekvenca može da kodira vodeću RNK za CRISPR-Cas9 sistem da bi izvršila inaktivaciju endogenog gena.
[0132] Postupci prema pronalasku se stoga proširuju na ex vivo postupke smanjenja ekspresije endogenog gena unutar ćelije. Postupci su kako je prethodno opisano, a inducibilna kaseta sadrži gensku sekvencu koja kodira nekodirajuću RNK operativno povezanu sa inducibilnim promotorom, pri čemu nekodirajuća RNK potiskuje ekspresiju navedenog endogenog gena. Nekodirajuća RNK može potisnuti ekspresiju gena na bilo koji pogodan način uključujući interferenciju RNK i antisense RNK. Prema tome, genska sekvenca može kodirati shRNK koja može interferirati sa informacionom RNK za endogeni gen.
[0133] Smanjenje ekspresije endogenog gena može biti delimično ili potpuno – tj. ekspresija može biti 50, 55, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ili 100% smanjena u poređenju sa ćelijom pre indukcije transkripcije nekodirajuće RNK.
[0134] Postupci prema pronalasku se takođe proširuju na ex vivo postupke inaktivacije endogenih gena unutar ćelije, na osnovu CRIPSR-Cas9 sistema, iako se mogu koristiti bilo koji drugi pogodni sistemi za inaktivaciju gena. U ovom scenariju, poželjno je da Cas9 geni budu konstitutivno eksprimirani, i da su stoga uključeni u prvi GSH sa genom za regulator transkripcije. Genske sekvence koje kodiraju gRNK mogu biti uključene u inducibilnu kasetu, koja je umetnuta u drugi GSH. gRNK je kratka sintetička RNK sastavljena od skeletne sekvence neophodne za vezivanje Cas9 i sekvence sa ciljanim delovanjem od približno 20 nukleotida koja definiše ciljani deo genoma koji treba modifikovati. Stoga se ciljani deo genoma Cas9 može promeniti jednostavnom promenom sekvence sa ciljanim delovanjem prisutnom u gRNK. Iako je primarna upotreba takvog sistema dizajniranje gRNK za ciljano delovanje na endogeni gen da bi se inaktivirao gen, on se takođe može modifikovati da bi se izborno aktivirali ili potisnuli geni sa ciljanim delovanjem, prečistili specifični regioni DNK, pa čak i slikali DNK. Predviđene su sve moguće upotrebe.
[0135] Inducibilna kaseta uključuje gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom. "Promotor" je nukleotidna sekvenca koja inicira i reguliše transkripciju polinukleotida. "Inducibilni promotor" je nukleotidna sekvenca u kojoj se ekspresija genske sekvence koja je operativno povezana sa promotorom kontroliše analitom, ko-faktorom, regulatornim proteinom, itd. U slučaju ovog pronalaska, kontrola se vrši transkripcionim regulatornim proteinom. Predviđeno je da termin "promotor" ili "kontrolni element" uključuje regione promotora pune dužine i funkcionalne (npr., kontroliše transkripciju ili translaciju) segmente ovih regiona. "Operabilno povezan" se odnosi na raspored elemenata pri čemu su tako opisane komponente konfigurisane tako da obavljaju svoju uobičajenu funkciju. Dakle, dati promotor operativno vezan za gensku sekvencu je sposoban da utiče na ekspresiju te sekvence kada su prisutni odgovarajući enzimi. Promotor ne mora biti u blizini sekvence, sve dok
1
funkcioniše da usmerava njegovu ekspresiju. Tako, na primer, intervenišuće netranslatirane, ali transkribovane sekvence mogu biti prisutne između promotorske sekvence i genske sekvence, a sekvenca promotora se i dalje može smatrati "operativno povezanom" sa genskom sekvencom. Prema tome, termin "operabilno vezan" ima za cilj da obuhvati bilo koji razmak ili orijentaciju promotorskog elementa i genske sekvence u inducibilnoj kaseti koja omogućava iniciranje transkripcije inducibilne kasete nakon prepoznavanja promotorskog elementa transkripcionim kompleksom.
[0136] Dalje, drugi genetički materijal takođe može biti operativno vezan za inducibilni promotor. Dalji genetički materijal može uključivati gene, sekvence koje kodiraju za RNK, genetički materijal, kao što su markeri ili reporterski geni. Takav dodatni genetički materijal je prethodno razmatran. U nekim okolnostima, može biti poželjno uključiti suicidni gen u inducibilnu kasetu, ako sama genska sekvenca nije suicidni gen za gensku terapiju karcinoma. Suicidni gen može da koristi isti inducibilni promotor unutar inducibilne kasete, ili može biti poseban inducibilni promotor da bi se omogućila odvojena kontrola. Takav gen može biti koristan u scenarijima genske terapije gde je poželjno biti u stanju da se unište donorske/transfektovane ćelije ako su ispunjeni određeni uslovi. Suicidni geni su geni koji eksprimiraju protein koji uzrokuje da se ćelija podvrgne apoptozi, ili alternativno mogu zahtevati spoljni kofaktor ili ko-lek da bi funkcionisali. Kofaktor ili ko-lek se može konvertovati proizvodom suicidnog gena u visoko citotoksični entitet.
[0137] Dalje, inducibilna kaseta može uključivati sekvence za prekidanje. Takve sekvence su sekvence koje prepoznaje entitet sposoban da specifično preseče DNK, i uključuju restrikciona mesta, koja su ciljane sekvence za restrikcione enzime ili sekvence za prepoznavanje drugim entitetima koji cepaju DNK, kao što su nukleaze, rekombinaze, ribozimi ili veštački konstrukti. Može biti uključena najmanje jedna sekvenca za prekidanje, ali poželjno je da su prisutne dve ili više. Ove sekvence za prekidanje mogu biti na bilo kojoj pogodnoj tački u kaseti, tako da se odabrani deo kasete, ili cela kaseta, može selektivno ukloniti iz GSH. Postupak se stoga može proširiti na uklanjanje i/ili zamenu kasete ili njenog dela iz GSH. Mesta za prekidanje tako mogu da okružuju deo/celu gensku sekvencu koju bi bilo poželjno ukloniti. Postupak može dovesti do uklanjanja inducibilne kasete i/ili daljeg genetičkog materijala.
[0138] Deo kasete može biti bilo koji deo do 99% kasete - tj.1-99%, 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ili manje od 10%.
[0139] Može biti poželjno da deo insercije okružen mestima za prekidanje uključuje promotor koji je operativno vezan za gensku sekvencu. Alternativno, promotor operativno vezan za gensku sekvencu nije uključen u deo koji je okružen sekvencama za prekidanje.
2
[0140] Poželjna sekvenca za prekidanje je IoxP mesto za Cre rekombinazu jer omogućava direktnu zamenu uklonjene insercije. Alternativno ili dodatno mesto prekidanja može biti rox mesto za Dre rekombinazu.
[0141] Transkripcioni regulatorni protein i inducibilna kaseta, zajedno sa bilo kojim povezanim genetičkim materijalom, se ubacuju u različite GSH unutar genoma ćelije.
[0142] Insercije u GSH su poželjno specifično unutar sekvence GSH kao što je prethodno opisano. Može se koristiti bilo koja pogodna tehnika za inserciju polinukleotida u specifičnu sekvencu, a nekoliko je opisano u tehnici. Pogodne tehnike uključuju bilo koji postupak koji uvodi prekid na željenoj lokaciji i dozvoljava rekombinaciju vektora u prazninu. Dakle, ključni prvi korak za ciljanu genomsku modifikaciju specifičnu za mesto je stvaranje dvolančanog prekida DNK (DSB) na genomskom lokusu koji treba modifikovati. Različiti mehanizmi popravke ćelija mogu se iskoristiti za popravku DSB i uvođenje željene sekvence, a to su popravka nehomolognog sparivanja krajeva (NHEJ), koja je sklonija grešci; i popravka homologne rekombinacije (HR) posredovana donorskim DNK šablonom, koji se može koristiti za umetanje inducibilnih kaseta.
[0143] Postoji nekoliko tehnika koje omogućavaju prilagođeno generisanje DSB specifično za mesto u genomu. Mnogi od njih uključuju upotrebu prilagođenih endonukleaza, kao što su nukleaze sa cinkanim prstima (ZFN), efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALENs) ili klasterizovani, redovno raspoređeni kratki palindromski ponovci/CRISPR povezani proteinski sistem (CRISPR/Cas9) (Gaj, T, et al, al "ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering," Trends Biotechnol, 31:397-405, July 2013).
[0144] Nukleaze sa cinkanim prstima su veštački enzimi koji se stvaraju fuzijom domena koji vezuje DNK cinkanog prsta sa domenom nukleaze restrikcionog enzima Fokl. Ovaj drugi ima nespecifičan domen cepanja koji mora da se dimerizuje da bi cepao DNK. To znači da su potrebna dva ZFN monomera da bi se omogućila dimerizacija Fokl domena i da bi se cepala DNK. DNK domen za vezivanje može biti dizajniran da ciljano deluje na bilo koju genomsku sekvencu od interesa, predstavlja tandemski niz Cys2His2cinkanovih prstiju, od kojih svaki prepoznaje tri susedna nukleotida u ciljanoj sekvenci. Dva mesta vezivanja su razdvojena za 5-7 bp da bi se omogućila optimalna dimerizacija Fokl domena. Enzim je stoga u stanju da cepa DNK na određenom mestu, a ciljana specifičnost se povećava osiguravanjem da se moraju desiti dva proksimalna događaja vezivanja DNK da bi se postigao dvolančani prekid.
[0145] Efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije, ili TALENs, su dimerni faktor/nukleaze transkripcije. Napravljeni su spajanjem TAL efektorskog domena za vezivanje DNK sa domenom cepanja DNK (nukleaza). Efektori slični aktivatoru transkripcije (TALEs) mogu se konstruisati da vežu praktično bilo koju željenu sekvencu DNK, tako da kada se kombinuje sa nukleazom, DNK se može preseći na određenim lokacijama. TAL efektori su proteini koje luče bakterije Xanthomonas, čiji domen za vezivanje DNK sadrži ponovljenu visoko konzerviranu sekvencu 33-34 aminokiselina sa divergentnim 12-tim i 13-tim aminokiselinama. Ove dve pozicije su veoma varijabilne i pokazuju jaku korelaciju sa specifičnim prepoznavanjem nukleotida. Ova jasna veza između sekvence aminokiselina i prepoznavanja DNK omogućila je projektovanje specifičnih domena za vezivanje DNK odabirom kombinacije ponovljenih segmenata koji sadrže odgovarajuće ostatke na dve varijabilne pozicije. TALENs su tako izgrađeni od nizova od 33 do 35 modula aminokiselina, od kojih svaki ciljano deluje na jedan nukleotid. Odabirom niza modula, skoro svaka sekvenca može biti ciljana. Opet, korišćena nukleaza može biti Fokl ili njegov derivat.
[0146] Identifikovana su tri tipa CRISPR mehanizama, od kojih je tip II najviše proučavan. CRISPR/Cas9 sistem (tip II) koristi Cas9 nukleazu da napravi dvolančani prekid DNK na mestu određenom kratkom vodećom RNK. CRISPR/Cas sistem je prokariotski imuni sistem koji pruža otpornost na strane genske elemente. CRISPR su segmenti prokariotske DNK koji sadrže kratka ponavljanja baznih sekvenci. Svako ponavljanje je praćeno kratkim segmentima "protorazmaknuta DNK" iz prethodnih izlaganja stranim genskim elementima. CRISPR razmaknice prepoznaju i seku egzogene genske elemente koristeći RNK interferenciju. CRISPR imuni odgovor se odvija kroz dva koraka: biogeneza CRISPR-RNK (crRNK) i interferencija vođena crRNK. CrRNK molekuli se sastoje od varijabilne sekvence transkribovane iz protorazmaknute DNK i CRISP ponavljanja. Svaki molekul crRNK se zatim hibridizuje sa drugom RNK, poznatom kao transaktivirajuća CRISPR RNK (tracrRNK) i zajedno ova dva na kraju formiraju kompleks sa nukleazom Cas9. Kodirani deo protorazmaknute DNK crRNK usmerava Cas9 da cepa komplementarne ciljane DNK sekvence, ako su one susedne kratke sekvence poznate kao protorazmaknuti susedni motivi (PAMs). Ovaj prirodni sistem je projektovan i iskorišćen da uvede DSB prekide na određenim mestima u genomskoj DNK, između mnogih drugih aplikacija. Konkretno, može se koristiti sistem CRIPSR tipa II iz Streptococcus pyogenes. Najjednostavnije rečeno, CRISPR/Cas9 sistem se sastoji od dve komponente koje se isporučuju u ćeliju da bi obezbedile uređivanje genoma: samu Cas9 nukleazu i malu vodeću RNK (gRNK). gRNK je fuzija prilagođene crRNK specifične za mesto (usmerene na ciljanu sekvencu) i standardizovane tracrRNK.
[0147] Kada je DSB napravljen, dostavlja se šablon donora sa homologijom na ciljani lokus; DSB može da se popravi popravkom usmerenom na homologiju (HDR), omogućavajući precizne insercije.
[0148] Mogući su i derivati ovog sistema. Dostupni su mutantni oblici Cas9, kao što je Cas9D10A, samo sa aktivnošću nikaze. To znači da cepa samo jedan lanac DNK i ne aktivira NHEJ. Umesto toga, kada se obezbedi homologni šablon za popravku, popravke DNK se sprovode samo putem
4
HDR visoke tačnosti. Cas9D10A (Cong L., et al, al. (2013) Science, 339, 819-823) se može koristiti u uparenim Cas9 kompleksima dizajniranim da generišu susedne nick DNK u kombinaciji sa dve sgRNK komplementarne susednoj oblasti na suprotnim lancima ciljanog mesta, što može biti posebno korisno.
[0149] Elementi za pravljenje prekida dvolančane DNK mogu se uvesti u jedan ili više vektora kao što su plazmidi za ekspresiju u ćeliji.
[0150] Prema tome, bilo koji postupak pravljenja specifičnih, ciljanih prekida dvostrukih lanaca u genomu da bi se izvršila insercija gena/inducibilne kasete može se koristiti u postupku prema pronalasku. Može biti poželjno da postupak za inserciju gena/inducibilne kasete koristi bilo koji od ZFN, TALEN i/ili CRISPR/Cas9 sistema ili bilo koji njihov derivat.
[0151] Kada je DSB napravljen na bilo koji odgovarajući način, gen/inducibilna kaseta za inserciju može biti isporučena na bilo koji pogodan način kao što je opisano u nastavku. Gen/inducibilna kaseta i povezani genetički materijal formiraju donorsku DNK za popravku DNK u DSB i insertuju se korišćenjem standardne mašinerije/puteva za popravku ćelija. Kako je prekid pokrenut promeniće se koji put se koristi za popravku štete, kao što je prethodno navedeno.
[0152] Transkripcioni regulatorni protein i inducibilna kaseta mogu da se isporuče za postupak pronalaska na odvojenim vektorima. „Vektor“ je molekul nukleinske kiseline, kao što je molekul DNK, koji se koristi kao sredstvo za veštačko prenošenje genetičkog materijala u ćeliju. Vektor je generalno sekvenca nukleinske kiseline koja se sastoji od insertovanog dela (kao što je inducibilna kaseta ili gen za transkripcioni regulatorni protein) i veće sekvence koja služi kao "okosnica" vektora. Vektor može biti u bilo kom pogodnom formatu, uključujući plazmide, minikrug ili linearnu DNK. Vektor sadrži najmanje gen za regulator transkripcije ili inducibilnu kasetu operativno povezanu sa inducibilnim promotorom, zajedno sa minimalnim sekvencama koje omogućavaju inserciju gena u relevantni GSH. Izborno, vektori takođe poseduju poreklo replikacije (ori) koje dozvoljava amplifikaciju vektora, na primer u bakterijama. Dodatno, ili alternativno, vektor uključuje selektivne markere kao što su geni otpornosti na antibiotike, geni za obojene markere i suicidni geni.
[0153] Primeri vektora korišćenih u Primerima su prikazani na slikama 20 do 33.
[0154] Ćelija koja se koristi u postupku prema pronalasku može biti bilo koja humana ili životinjska ćelija. Poželjno je da je to ćelija sisara, kao što je ćelija glodara, kao što su miševi i pacovi; torbari kao što su kenguri i koale; ne-humani primati kao što su bonobo, šimpanza, lemuri, giboni i majmuni bez repa; kamile kao što su kamile i lame; stočne životinje kao što su konji, svinje, goveda, bivoli, bizoni, koze, ovce, jeleni, irvasi, magarci, bantengi, jaki, kokoške, patke i ćurke; domaće životinje kao što su mačke, psi, zečevi i zamorci. Ćelija je poželjno humana ćelija. U određenim aspektima, ćelija je poželjno ćelija od stočne životinje.
[0155] Tip ćelije koji se koristi u postupku prema pronalasku zavisiće od primene ćelije kada se završi insercija genetičkog materijala u GSH mesta.
[0156] Tamo gde je cilj da se proizvedu zreli tipovi ćelija iz progenitornih ćelija, ćelija koja je modifikovana je matična ćelija, poželjno pluripotentna matična ćelija. Pluripotentne matične ćelije imaju potencijal da se diferenciraju u skoro svaku ćeliju u telu. Postoji nekoliko izvora pluripotentnih matičnih ćelija. Embrionalne matične ćelije (ES ćelije) su pluripotentne matične ćelije izvedene iz unutrašnje ćelijske mase blastociste, preimplantacionog embriona u ranoj fazi. Indukovane pluripotentne matične ćelije (iPSC) su adultne ćelije koje su genetički reprogramirane u stanje slično embrionalnim matičnim ćelijama tako što su bile prinuđene da eksprimiraju gene i faktore važne za održavanje definišnih svojstava embrionalnih matičnih ćelija. Godine 2006. pokazano je da bi uvođenje četiri specifična gena koji kodiraju faktore transkripcije moglo da konvertuje adultne ćelije u pluripotentne matične ćelije (Takahashi, K; Yamanaka, S (2006), Cell 126 (4): 663-76), ali kasniji rad ima smanjen/promenjen broj gena koji su potrebni. Oct-3/4 i određeni članovi Sox familije gena identifikovani su kao potencijalno ključni transkripcioni regulatori uključeni u proces indukcije. Dodatni geni, uključujući određene članove Klf familije, Myc familije, Nanog i LIN28, mogu povećati efikasnost indukcije. Primeri gena koji mogu biti sadržani u faktorima reprogramiranja uključuju Oct3/4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15-2, Tcl1, beta-katenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 and Glis1, a ovi faktori reprogramiranja mogu se koristiti pojedinačno ili u kombinaciji dve ili više vrsta.
[0157] Tamo gde je cilj da se proizvedu matične ćelije sa genom za smanjenje ili inaktivaciju za dalja istraživanja, kao što su studije razvoja ili funkcije gena, ćelija koja je modifikovana može biti matična ćelija, poželjno pluripotentna matična ćelija, ili zrela ćelija. Izvori pluripotentnih matičnih ćelija su prethodno razmatrani.
[0158] Ako ćelije modifikovane insercijom inducibilne kasete treba da se koriste kod humanog pacijenta, može biti poželjno da ćelija bude iPSC izvedena od te osobe. Takva upotreba autolognih ćelija bi uklonila potrebu za podudaranjem ćelija sa primaocem. Alternativno, može se koristiti komercijalno dostupan iPSC, kao što su oni dostupni od WiCell<®>(WiCell Research Institute, Inc, Wisconsin, US). Alternativno, ćelije mogu biti tkivno specifične matične ćelije koje takođe mogu biti autologne ili donirane. Pogodne ćelije uključuju matične ćelije epiblasta, indukovane neuralne matične ćelije i druge matične ćelije specifične za tkivo.
[0159] U određenim primerima izvođenja, može biti poželjno da korišćena ćelija bude embrionalna matična ćelija ili linija matičnih ćelija. Brojne linije embrionalnih matičnih ćelija su sada dostupne, na primer, WA01 (H1) i WA09 (H9) se mogu dobiti od WiCell, a KhES-1, KhES-2 i KhES-3 se mogu dobiti od Instituta za medicinske nauke, Univerzitet Kjoto (Kjoto, Japan).
[0160] Može biti poželjno da se embrionalna matična ćelija dobije bez uništavanja embriona, posebno tamo gde su humane ćelije, pošto su takve tehnike lako dostupne (Chung, Young et al., Cell Stem Cell , Volume 2, Issue 2,113 - 117). Dostupne su i linije matičnih ćelija koje su dobijene bez uništavanja embriona. U jednom aspektu, pronalazak se ne odnosi ni na jedan postupak koji uključuje uništavanje humanih embriona.
[0161] Poželjni aspekt ovog pronalaska je unapred programiranje pluripotentnih matičnih ćelija u zrele tipove ćelija. Prema tome, postupak prema pronalasku može da se koristi za proizvodnju zrelih tipova ćelija od pluripotentnih matičnih ćelija. U ovom aspektu pronalaska, inducibilna kaseta za inserciju u drugi GSH je poželjno jedan ili više glavnih regulatora kako je prethodno diskutovano. Ove inducibilne kasete mogu omogućiti da se ćelija programira u određenu liniju, a različite inducibilne kasete će se koristiti da bi se usmerila diferencijacija u zrele tipove ćelija. Razmatra se bilo koja vrsta zrelih ćelija, uključujući, ali ne ograničavajući se na nervne ćelije, miocite, osteocite, hondrocite, epitelne ćelije, sekretorne ćelije i/ili krvne ćelije.
[0162] Istraživači ove aplikacije razvili su brz, efikasan i skalabilan postupak za generisanje praktično bilo kog tipa zrelih ćelija. Ovakav jednostavan i jeftin postupak imaće posebnu vrednost za regenerativnu medicinu. Prethodne tehnike programiranja unapred su koristile Tet-On sistem, ali su pokušale da uključe sav materijal u jedan vektor/mesto (sve-u-jednom Tet-On) ili su pokušale da ubace inducibilnu kasetu u jedan AAVS1 alel i kontrolni sistem u drugi AAVS1 alel (DeKelver et al, 2010, Genome Res., 20, 1133-43 and Qian et al, 2014, Stem Cells, 32, 1230-8). Iznenađujuće, postupak dvostrukog GSH ciljanog delovanja razvijen i opisan ovde ima mnoge nepredviđene prednosti. Ne postoji potencijalna interferencija promotora između gena insertovanog u prvi GSH i genske sekvence inducibilne kasete ubačene u drugi GSH. Drugo, omogućava inserciju veće količine iz vektora, pošto manje materijala treba da se insertuje na svako mesto. Treće, postupak maksimizira broj bezbedno insertovanih kopija. Četvrto, omogućava veću fleksibilnost dizajna. Konačno, omogućava inserciju dodatnog genetičkog materijala, uključujući reporterske gene i miRNK prekidače. Pokazalo se da je postupak prema pronalasku robustan i efikasan način proizvodnje zrelih ćelija iz pluripotentnih ćelija.
[0163] Kada je gen insertovan u prvi GSH i inducibilna kaseta koja sadrži transgen je insertovana u drugi GSH, pluripotentne matične ćelije mogu da se kultivišu da bi se omogućilo dalje programiranje. Ovi uslovi kultivisanja mogu biti specifični za tip pluripotentne matične ćelije koja se koristi, ili mogu zavisiti od konačnog tipa zrele ćelije. Koji god se uslovi kultivisanja koriste, egzogena supstanca će kontrolisati ekspresiju genske sekvence unutar inducibilne kasete; i može se ili neprekidno isporučivati, a zatim povući da bi se indukovala transkripcija, ili se može isporučiti pošto je transkripcija potrebna, u zavisnosti od njegovog načina delovanja, kao što je prethodno diskutovano.
[0164] Ako je cilj programiranje matične ćelije, može biti korisno da se toj ćeliji obezbede ekstracelularna uputstva za pomoć pri diferencijaciji u vezi sa snabdevanjem inducibilnih kaseta koje kodiraju glavne regulatore. Strategije ćelijskog reprogramiranja mogu se poboljšati kombinovanjem prekomerne ekspresije glavnog regulatora ili transkripcionog faktora sa ekstracelularnim signalnim signalima. Prema tome, može biti moguće izvršiti sistematski pregled faktora pro-diferencijacije modulacijom glavnih signalnih kaskada koje su uključene u razviće tog određenog tipa zrele ćelije. Primer ovoga se vidi u Primeru 3.
[0165] U jednom aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za proizvodnju miocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju MYOD1 gena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenute prve i druge genske sigurne luke različite,
i kultivisanje pomenutih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0166] Gen MYOD1 je gen koji kodira protein miogene diferencijacije 1. Poželjno, retinoična kiselina (RA) je potpuno trans RA.
[0167] Poželjno, RA je potpuno trans RA. Poželjno je da ćelija prekomerno eksprimira MYOD1.
[0168] U daljem aspektu, ovaj pronalazak obezbeđuje ex vivo postupak za proizvodnju oligodendrocita miocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji obuhvata sledeće korake:
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju SOX 10 gena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenute prve i druge genske sigurne luke različite,
i kultivisanje pomenutih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
[0169] Ćelije koje se koriste za ovo mogu biti životinjske ili humane ćelije. Ako su ćelije životinjske, poželjno je da životinja bude stočna životinja kao što je prethodno definisano.
[0170] SOX-10 gen kodira faktor transkripcije SOX-10. Poželjno, retinoična kiselina (RA) je potpuno trans RA.
[0171] Tamo gde je ćelija korišćena u postupcima prema pronalasku pluripotentna, nastala ćelija može biti matična ćelija ograničeno specifične za liniju, progenitorna ćelija ili tip zrele ćelije sa željenim svojstvima, ekspresijom glavnog regulatora. Ove matične ćelije specifične za liniju, progenitorne ili zrele ćelije mogu se koristiti na bilo koji pogodan način. Na primer, zrele ćelije se mogu koristiti direktno za transplantaciju u humano ili životinjsko telo, u zavisnosti od tipa ćelije. Alternativno, ćelije mogu da formiraju materijal za testiranje u istraživanjima, uključujući efekte lekova na ekspresiju gena i interakciju lekova sa određenim genom. Ćelije za istraživanje mogu uključiti upotrebu inducibilne kasete sa genskom sekvencom nepoznate funkcije, da bi se proučavala kontrolisana ekspresija te genske sekvence. Pored toga, može omogućiti da se ćelije koriste za proizvodnju velikih količina poželjnih materijala, kao što su faktori rasta ili citokini.
[0172] U drugom aspektu, ćelije se mogu koristiti u tkivnom inženjerstvu. Tkivno inženjerstvo zahteva stvaranje tkiva koje bi se moglo koristiti za zamenu tkiva ili čak celih organa čoveka ili životinje. Postupci tkivnog inženjeringa su poznati stručnjacima u ovoj oblasti, ali uključuju upotrebu skeletnog (ekstracelularnog matriksa) na koji se nanose ćelije da bi se stvorila tkiva/organi. Ovi postupci se mogu koristiti za stvaranje "veštačkog" dušnika, bešike, jetre, pankreasa, želuca, creva, krvnih sudova, srčanog tkiva, kostiju, koštane srži, mukoznog tkiva, nerava, mišića, kože, bubrega ili bilo kog drugog tkiva ili organa . Postupci generisanja tkiva mogu uključivati aditivnu proizvodnju, inače poznatu kao trodimenzionalno (3D) štampanje, koje može uključivati direktno štampanje ćelija za pravljenje tkiva. Ovaj pronalazak stoga obezbeđuje postupak za stvaranje tkiva korišćenjem ćelija proizvedenih kako je opisano u bilo kom aspektu prema pronalasku.
[0173] Tkiva dobijena korišćenjem ćelija napravljenih prema postupcima ovog pronalaska mogu se koristiti za transplantaciju u humano ili životinjsko telo. Alternativno, ako su ćelije od životinje, tkiva se mogu koristiti za in vitro/kultivisano meso. Primarni tip ćelije za kultivisano meso su miociti. Takvo tkivo može, međutim, da uključuje upotrebu kombinacije tipova ćelija napravljenih prema postupcima pronalaska. To mogu biti miociti (mišićne ćelije), ćelije krvnih sudova, krvne ćelije i adipociti (masne ćelije). Ako je cilj projektovanog tkiva za kultivisano meso, onda se ćelija može uzeti od stočne životinje.
[0174] Postupci prema pronalasku se takođe mogu izvesti na ćelijama koje nisu pluripotentne matične ćelije, iz različitih razloga, uključujući istraživanje, gensku terapiju uključujući genske vakcine, proizvodnju in vitro modela bolesti i proizvodnju ne-humanih in vivo modela.
[0175] Ćelije koje se koriste u postupku prema pronalasku mogu stoga biti bilo koji tip adultnih matičnih ćelija; ovo su nespecijalizovane ćelije koje se mogu razviti u mnoge, ali ne sve, tipove ćelija. Adultne matične ćelije su nediferencirane ćelije koje se nalaze u celom telu koje se dele da bi nadoknadile umiruće ćelije i regenerisale oštećena tkiva. Poznate i kao somatske matične ćelije, one nisu pluripotentne. Adultne matične ćelije su identifikovane u mnogim organima i tkivima, uključujući mozak, koštanu srž, perifernu krv, krvne sudove, skeletne mišiće, kožu, zube, srce, creva, jetru, epitel jajnika i testise. Da bi se ćelija označila somatskom matičnom ćelijom, stručnjak mora da pokaže da jedna adultna matična ćelija može da generiše liniju genetički identičnih ćelija koje potom stvaraju sve odgovarajuće diferencirane tipove ćelija tkiva. Da bi se eksperimentalno potvrdilo da je pretpostavljena adultna matična ćelija zaista matična ćelija, ćelija mora ili da proizvede ove genetički identične ćelije u kulturi, ili prečišćena populacija ovih ćelija mora ponovo da naseli tkivo nakon transplantacije u životinju. Pogodni tipovi ćelija uključuju, ali se ne ograničavaju na neuralne, mezenhimalne i endodermalne matične ćelije i prekursorske ćelije.
[0176] Alternativno, korišćene ćelije mogu biti zrele ćelije. Takve ćelije su diferencirane i specijalizovane i nisu u stanju da se razviju u drugi tip ćelije. Tipovi zrelih ćelija uključuju, ali se ne ograničavaju na nervne ćelije, miocite, osteocite, hondrocite, epitelne ćelije, sekretorne ćelije i/ili krvne ćelije. Zreli tipovi ćelija mogu biti bilo koja ćelija iz humanog ili životinjskog tela.
[0177] Somatske matične ćelije i tipovi zrelih ćelija mogu se modifikovati u skladu sa ovim pronalaskom i zatim koristiti za primene kao što je genska terapija ili genska vakcinacija. Genska terapija se može definisati kao namerna insercija strane DNK u nukleus ćelije sa terapijskom namerom. Takva definicija uključuje obezbeđivanje gena ili gena ćeliji da bi se obezbedila verzija neispravnog gena divljeg tipa, dodavanje gena za molekule RNK koji ometaju ekspresiju ciljanog gena (koji može biti defektan), obezbeđivanje suicidnih gena (kao što su enzimi timidin kinaze herpes simpleks virusa (HSV-tk) i citozin deaminaze (CD) koji pretvaraju bezopasni prolek ganciklovir (GCV) u citotoksični lek), DNK vakcine za imunizaciju ili terapiju kancera (uključujući ćelijsku usvojenu imunoterapiju) i bilo koje drugo obezbeđivanje gena ćeliji u terapeutske svrhe.
[0178] Tipično, postupak pronalaska se može koristiti za inserciju željene genske sekvence za transkripciju u ćeliju, poželjno ekspresiju, posebno u DNK vakcinama. DNK vakcine obično kodiraju modifikovani oblik DNK infektivnog organizma. DNK vakcine se daju subjektu gde zatim eksprimiraju odabrani protein infektivnog organizma, pokrećući imuni odgovor protiv tog proteina koji je tipično zaštitni. DNK vakcine takođe mogu kodirati tumorski antigen u pristupu imunoterapije kancera.
[0179] DNK vakcina može da sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen za lečenje ili prevenciju brojnih stanja uključujući, ali ne ograničavajući se na kancer, alergije, toksičnost i
4
infekciju patogenom kao što su, ali ne ograničavajući se na, gljive, virusi uključujući humane papiloma viruse (HPV), HIV, HSV2/HSV1, virus gripa (tipovi A, B i C), virus poliomijelitisa, RSV virus, rinovirusi, rotavirusi, virus hepatitisa A, virus malih boginja, virus parainfluence, virus zauški, Varicella-Zoster virus, citomegalovirus, Epstein-Barr virus, adenovirusi, virus rubeole, virus humanog limfoma T-ćelija tipa I (HTLV-I), virusni hepatitisa B (HBV), virusni hepatitisa C (HCV), virusni hepatitisa D, Pox virus, Zika virus, Marburg i ebola; bakterije uključujući Meningococcus, Haemophilus influenza (tip b); i parazitski patogeni. DNK vakcine mogu da sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira antigen bilo kog pogodnog patogena. Antigen može biti od patogena odgovornog za ljudsku ili veterinarsku bolest, a posebno može biti od virusnog patogena.
[0180] DNK vakcine insertovne u GSH mogu takođe da sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja kodira tumorske antigene. Primeri antigena povezanih sa tumorom uključuju, ali se ne ograničavaju na, antigene kancera kao što su članovi familije MAGE (MAGE 1, 2, 3 itd.), NY-ESO-I i SSX-2, antigeni za diferencijaciju kao što je tirozinaza, gplOO, PSA, Her-2 i CEA, mutirani samoantigeni i virusni tumorski antigeni kao što su E6 i/ili E7 iz onkogenih HPV tipova. Dalji primeri određenih tumorskih antigena uključuju MART-I, Melan-A, p97, beta-HCG, GaINAc, MAGE-I, MAGE-2, MAGE-4, MAGE-12, MUCI, MUC2, MUC3, MUC4, MUC18, CEA , DDC, PIA, EpCam, antigen melanoma gp75, Hker 8, antigen melanoma visoke molekulske težine, KI 9, Tyrl, Tyr2, članovi familije pMel 17 gena, c-Met, PSM (antigen mucina prostate), PSMA (membranski antigen specifičan za prostatu), protein sekrecije prostate, alfa-fetoprotein, CA 125, CA 19.9, TAG-72, BRCA-I i BRCA-2 antigen.
[0181] Insertovana genska sekvenca može proizvesti druge tipove terapeutskih DNK molekula. Na primer, takvi molekuli DNK se mogu koristiti za ekspresiju funkcionalnog gena gde subjekt ima genetički poremećaj uzrokovan disfunkcionalnom verzijom tog gena. Primeri takvih bolesti uključuju Duchenne–ovu mišićnu distrofiju, cističnu fibrozu, Gaucher-ovu bolest i nedostatak adenozin deaminaze (ADA). Druge bolesti kod kojih genska terapija može biti korisna uključuju inflamatorne bolesti, autoimune, hronične i zarazne bolesti, uključujući poremećaje kao što su sida, kancer, neurološke bolesti, kardiovaskularne bolesti, hiperholestemija, različiti poremećaji krvi uključujući različite anemije, talasemiju i hemofiliju i emfizem. Za lečenje solidnih tumora, mogu biti eksprimirani geni koji kodiraju toksične peptide (tj. hemoterapeutska sredstva kao što su ricin, toksin difterije i faktor otrova kobre), geni supresora tumora kao što je p53, geni koji kodiraju sekvence mRNK koje su antisense za transformaciju onkogena, antineoplastični peptidi kao faktor tumorske nekroze (TNF) i drugi citokini, ili transdominantni negativni mutanti transformišućih onkogena.
[0182] Razmatraju se i druge vrste terapeutskih molekula DNK. Na primer, molekuli DNK koji su transkribovani u aktivni, nekodirajući RNK oblik, na primer mala interferirajuća RNK (siRNK) mogu biti insertovana. Postupci pronalaska se stoga proširuju na ex vivo postupke smanjenja ekspresije endogenih gena ili inaktivacije endogenih gena korišćenjem nekodirajućih RNK unutar inducibilne kasete.
[0183] Prema tome, postupak pronalaska se može koristiti za specifičnu i stabilnu inserciju genske sekvence unutar inducibilne kasete koja se može kontrolno transkribovati. Ovo ima brojne prednosti u somatskim matičnim ćelijama i tipovima zrelih ćelija. Omogućava bliže regulisane pristupe genskoj terapiji, obezbeđujući da kritični geni nisu poremećeni i omogućavajući da se ekspresija inducibilne kasete isključi ako dođe do bilo kakvih neželjenih efekata. Takođe omogućava blisko regulisano smanjivanje ili inaktivaciju endogenog gena, da bi se ispitala funkcija i razvoj gena.
[0184] Pronalazak se odnosi na ćelije proizvedene postupkom pronalaska. Ćelije se mogu definisati kao modifikovane na prvom mestu genomske sigurne luke da bi uključile transkripcioni regulatorni protein i na drugom mestu genske sigurne luke da bi uključile gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom koji je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom. Dva GSH su različita i posebna. Poželjno je da su ćelije homozigotne na oba mesta insercije. Svi elementi su kao što je prethodno opisano.
[0185] Ćelije proizvedene u skladu sa bilo kojim od postupaka pronalaska imaju primenu u dijagnostičkim i terapeutskim postupcima. Ćelije se mogu koristiti in vitro za proučavanje razvića ćelije, obezbeđivanje sistema testiranja za nove lekove, omogućavanje razvoja postupaka skrininga, ispitivanje terapijskih režima, obezbeđivanje dijagnostičkih testova i slično. Ove upotrebe čine deo ovog pronalaska. Alternativno, ćelije se mogu transplantirati u humanog ili životinjskog pacijenta u dijagnostičke ili terapeutske svrhe. Upotreba ćelija u terapiji je takođe uključena u ovaj pronalazak. Ćelije mogu biti alogene (tj. zrele ćelije uklonjene, modifikovane i vraćene istoj osobi) ili od donatora (uključujući liniju matičnih ćelija).
Sekvence
[0186]
AAVS1- NCBI GenBank S51329.1
SEQ ID Br.1 : Tet0219n sekvenca
SEQ ID Br.2 : hROSA mesto insercije genomske sekvence
SEQ ID Br.3 : STDtetR-nls (nukleotid) i SEQ ID Br.4 - STDtetR-nls (aminokiselina)
SEQ ID Br.5 : OPTtetR-nls (nukleotid) i SEQ ID Br.6 - OPTtetR-nls (aminokiselina)
SEQ ID Br.7 do 80: Prajmeri iz tabele 3.
SEQ ID Br.81: Slika 18B AAVS1 FWD; SEQ ID Br.82: Slika 18B AAVS1 REV
SEQ ID Br.83: Slika 18B FWD trag; SEQ ID Br.84: Slika 18B REV trag
SEQ ID Br.85: Slika 19E HI POL3 FWD; SEQ ID Br.82: Slika 19E HI POL3 REV
[0187] Ovo je genomska sekvenca mesta insercije hROSA26; uključuje 5' homologu granu, mesto preseka (podebljano) i 3' homologu granu: (SEQ ID Br.2)
STDtetR-nls: (SEQ ID Br. 3 i 4)
[0188] Nukleotidne i aminokiselinske sekvence proteina represora osetljivog na tetraciklin (tetR) koje sadrže signal za nuklearnu lokalizaciju SV40 N kraja (nls, označen sivom bojom). Saopštene su sekvence pre ili posle optimizacije kodona (STDtetR i OPTtetR, respektivno). Tačke označavaju sinonimne mutacije uvedene u OPTtetR.
4
[0189] Sekvenca za optimizovani tetR: OPTtetR-nls (SEQ ID Br.5 i 6):
[0190] Pronalazak će sada biti opisan u vezi sa sledećim neograničavajućim primerima:
Primeri
Materijali i postupci korišćeni u Primerima:
hPSC kultura održavanja i diferencijacija reproduktivnog sloja
[0191] Urađena je kultura hESC bez hranilice i seruma (linija H9; WiCell) i hiPSC (Cheung et al, Nat. Biotechnol.30, 165-173 (2012)). Ukratko, ćelije su postavljene na posude za kulturu obložene želatinom/MEF medijumom [MEF-medijumi su se sastojali od Advanced DMEM/F12 (90%, Gibco), fetalnog goveđeg seruma (10%, Gibco), L-glutamina (1 mM, Gibco) , 2-merkaptoetanola (0.1 mM, Sigma-Aldrich) i penicilina/streptomicina (1%, Gibco)], i kultivisane su u hemijski definisanom medijumu [CDM, koji se sastoji od IMDM (50%, Gibco), F12 (50%, Gibco) , koncentrovanih lipida (100x, Gibco), monotioglicerola (450 µM, Sigma-Aldrich), insulina (7 µg/ml, Roche), transferina (15 µg/ml, Roche), goveđeg seruma albuminske frakcije V (5 mg/ml) i penicilina/streptomicina (1%)] sa dodatkom 10 ng/ml aktivina-A i 12 ng/ml FGF2. Ćelije su prolazile u malim nakupinama koristeći kolagenazu svakih 5-6 dana.
[0192] Diferencijacija hPSCs u reproduktivne slojeve indukovana je u adherentnim hESC kulturama u skladu sa prethodno objavljenim protokolima usmerene diferencijacije za endoderm, mezoderm lateralne ploče i neuroektoderm (Touboul, T. et al, al. Hepatology 51, 1754-1765 (2010), Cheung et al, al, (2012) i Douvaras, P. et al, al. Stem Cell Reports 3, 250-259 (2014).) Ukratko, definitivni endoderm je dobijen kultivisanjem hPSCs tokom 3 dana u CDM-PVA (bez insulina). ) dopunjen sa FGF2 (20 ng/ml), aktivin-A (100 ng/ml), BMP4 (10 ng/ml, Marko Hyvonen, Dept. of Biochemistry, University of Cambridge) i LY-294002 (10 µM, Promega) 3. Za dobijanje neuroektoderma, hPSCs su kultivisani 6 dana u CDM-BSA sa dodatkom SB-431542 (10 µM, Tocris), LDN-193189 (0.1 µM, Tocris) i RA (0.1 µM, Sigma) 4. mezoderm lateralne ploče je dobijen kultivisanjem hPSCs tokom 36 sati u CDMPVA sa dodatkom FGF2 (20 ng/ml), 10 ng/ml BMP4 (R&D) i LY294002 (10 µM), i tokom 3.5 narednih dana u CDM-PVA sa dodatkom FGF2 (20 ng/ml) i BMP4 (50 ng/ml).
[0193] Diferencijacija hESCs. Diferencijacija je započeta u adherentnim kulturama hESCs 48 sati nakon prolaženja. Promene medijuma su generalno vršene svakodnevno, a zapremine su prilagođene gustini ćelija. Zreli tipovi ćelija su dobijeni korišćenjem postupaka koji su prethodno opisani u tehnici. Dobijeni tipovi zrelih ćelija uključuju neuronske ćelije, osteocite, hondrocite, glatke mišiće, srčane fibroblaste, kardiomiocite, creva, pankreas, hepatocite, holangiocite ili pluća.
Konstrukti gena sa ciljanim delovanjem i molekularno kloniranje
[0194] Dizajn i konstrukcija ekspresionog plazmida hROSA26 gRNK i Cas9n je opisana ovde: Strategija zasnovana na CRISPR/Cas9n za specifično ciljano delovanje na hROSA26 lokusa i inserciju inducibilnih kaseta korišćenjem homologne rekombinacije. Da bi se indukovao genomski DSB na tačnom mestu integracije, dizajniran je CRISPR/Cas9 nikazni sistem. Za razliku od obično korišćene Cas9 nukleaze divljeg tipa koju jedna gRNK pušta do svog genomskog ciljanog mesta, D10A mutant Cas9 nikaze (Cas9n) je usmeren parom odgovarajuće dizajniranih gRNK da istovremeno uvede jednolančane prekide na oba lanca ciljane DNK. Ova strategija efektivno udvostručuje broj baza potrebnih za uređivanje genoma i na taj način povećava specifičnost.
4
Softver zasnovan na internet stranici „CRISPR Design Tool“ je korišćen da bi se definisala potencijalna ciljana mesta za crRNK vođene nukleaze koje su blizu mesta integracije. U okviru niza od 250 bp oko mesta sa ciljanim delovanjem (125 bp na svakom mestu stvarnog mesta integracije), najveći pogodak je dao par gRNK koje su zajedno dostigle ocenu „visokog kvaliteta“ od 97, bez predviđenih efekata van ciljanog delovanja. gRNK [gRNK-A 5'-GTCGAGTCGCTTCTCGATTA-(TGG)-3' i gRNK-B 5'-GGCGATGACGAGATCACGCG-(AGG)-3' (PAM mesta u zagradi) su sintetizovane de novo i vezane u ekspresione vektore. Konačni plazmidi kodiraju bilo koju od dve gRNK, respektivno, i Cas9n D10A-mutant (Slike 20 i 21).
[0195] Konstruisan je donorski plazmid koji služi kao šablon DNK da bi se olakšala homologa usmerena popravka Cas9n-indukovanog DSB. Dve homologe grane hROSA26 su generisane PCR amplifikacijom visoke vernosti. Genomska DNK koja je izolovana iz H9 hESCs služila je kao šablon. Dužine 5' i 3' homolgih grana bile su 904bp i 869bp, respektivno. Obe su naknadno insertovane u mesto višestrukog kloniranja pUC19 vektora. Da bi se ciljano delovalo na hROSA26 lokus, ćelije su transfektovane plazmidom, sa dve gRNK/Cas9n konstrukcije i plazmidom donora EGFP (Slika 22).
[0196] Vektor sa ciljanim delovanjem pR26_CAG-rtTA (slika 23) je konstruisan kloniranjem kodirajuće sekvence treće generacije rtTA (PCR-amplifikovane sa pLVX-Tet3G) u BamHI/Mlul mestima pR26_CAG-EGFP čime je zamenjena EGFP sekvenca. Ekspresioni plazmidi AAVS1 ZFN bili su velikodušan poklon dr Kosuke Yusa (Wellcome-Trust Sanger Institute). Inducibilni EGFP AAVS1 vektor za ciljano delovanje je konstruisao Gibson Assembly (New England Biolabs) u kojem su tri inserta vezana u EcoRl/Hindlll mestima na mestu višestrukog kloniranja pUC19 vektora (Thermo Fisher Scientific): Prvi insert je sadržao uzvodnu AAVS1 homologu granu, akceptor spajanja, T2A-mesto i kasetu otpornosti na puromicin (PCR-amplifikovan sa pTRE-EGFP; addgene 22074, deponovano Rudolf Jaenisch). Drugi insert je sadržao inducibilni TRE3G promotor (PCR-amplifikovan iz pLVX-TRE3G). Treći insert je sadržao EGFP ekspresionu kasetu i AAVS1 nizvodnu homologu granu (PCR-amplifikovanu iz pTRE-EGFP; addgene 22074, deponovao Rudolf Jaenisch). Dobijeni plazmid je nazvan pAAV TRE-EGFP (Slika 32). Vektori za ciljano delovanje pAAV_TRE-NGN2 i pAAV_TRE-MYOD1 (Slika 33) su konstruisani kloniranjem kodirajuće sekvence NGN2 i MYOD1, respektivno (NGN2: PCR-amplifikovan od pLVX-TRE-NGN2, poklon od Oliver Brüstle; MYOD1: PCR-amplifikovan od komercijalno dostupanog cDNK plazmida, Open Biosystems MHS6278-202832821, Pristup: BC064493, ID klona: 5022419) u Spel/EcoRI mestima pAAV_TRE-EGFP, zamenjujući tako sekvencu EGFP.
4
[0197] Dalji plazmidi su takođe kreirani korišćenjem sličnih postupaka, a svi korišćeni plazmidi su prikazani na slikama 20 do 33. Ovi plazmidi su ili stvoreni ili velikodušno donirani. Plazmidi koji se koriste u Primerima uključuju (redosledom slika 20 - 33): pSpCas9n(BB),_R26-R, pSpCas9n(BB) (predviđeno je da kombinacija ova dva plazmida izazove specifičan prekid dvostrukog lanca introna između egzona 1 i 2 THUMPDS3-AS1 na hromozomu 3 (ROSA26 lokus)),_R26-L pR26_CAG_EGFP, pR26_CAG_rtTA, pZFN-AAVS1-L-ELD (nukleaza sa cinkanim prstima levo), pZFN-AAVS1-R-KKR (nukleaza sa cinkanim prstima desno), pAAV CAG_EGFP (donor), pR26-Neo_CAG-OPTtetR (hROSA26 ciljano delovanje kodonom optimizovanog tetR), pAAV-Puro-iKD (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne shRNK), pAAV-Neo_CAG-Cas9 (AAVS1 ciljano delovanje Cas-9), pAAV- Puro_siKO (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne gRNK,), pAAV-Puro_siKO-2TO (AAVS1 ciljano delovanje inducibilne gRNK, verzija sa 2 tet operona u promotoru), pAAV_TRE-EGFP (EGFP inducibilna prekomerna ekspresija, priložen) i pAAV_TRE-MYOD1 (MYOD1 inducibilna prekomerna ekspresija za mišić).
Geni sa ciljanim delovanjem
[0198] Ciljano delovanje na lokus hROSA26 i AAVS1 za smanjivanje i inaktivaciju gena izvedeno je nukleofekcijom. Humane pluripotentne matične ćelije (PSCs) su razdvojene na pojedinačne ćelije pomoću TrypLE Select (Gibco), a 2×10<6>ćelija su nukleofektovane (100 µl reakcione zapremine; ukupno 12 µg DNK, koja je podjednako podeljena između dva gRNK/Cas9n plazmida i vektora sa ciljanim delovanjem) koristeći Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X komplet i ciklus CA-137 Lonza 4D-Nucleofector sistema. Nukleofektirani hPSCs su postavljeni na ozračene embrionalne fibroblaste miša otporne na više lekova (DR4) i kultivisani u KSR medijumu [koji se sastoji od Advanced DMEM/F12 (80%), zamene seruma za inaktivaciju (20%, Gibco), L-glutamina (1 mM), 2-merkaptoetanol (0.1 mM) i penicilin/streptomicin (1%)] sa dodatkom FGF2 (4 ng/ml, Department of Biochemistry, University of Cambridge). Y-27632 (5 µM, Tocris) je dodat 24 sata pre i posle nukleofekcije da bi se podstaklo preživljavanje ćelija. Posle 3-6 dana, hPSC otporni na neomicin su odabrani dodavanjem G418 (50 µg/ml, Sigma-Aldrich) tokom 7-10 dana. Nakon toga, pojedinačni klonovi su odabrani, prošireni u uslovima bez hranilice i konačno analizirani genotipizacijom.
[0199] Ciljano delovanje na lokus AAVS1 je takođe izvedeno lipofekcijom. Humani PSCs su zasejani u uslovima bez hranilice u ploče sa 6 udubljenja i transfektovani 48 sati nakon prolaženja. Transfekcija je izvedena u Opti-MEM (Gibco) sa dodatkom Lipofectamine2000 (10 µl/udubljenju,
4
Thermo Fisher Scientific) i ukupno 4 µg DNK (jednako podeljenih između dva AAVS1 ZFN plazmida i vektora sa ciljanim delovanjem) tokom 24 sata. Posle 3-5 dana, rezistentni hPSCs su odabrani dodavanjem puromicina (1 µg/ml, Sigma-Aldrich) tokom 5-8 dana. Nakon toga, pojedinačni klonovi su odabrani, prošireni i analizirani genotipizacijom. Otpornost na antibiotike može se koristiti za odabir linija klonova.
[0200] hPSC klonovi otporni na lekove iz eksperimenata sa ciljanim delovanjem su pregledani genomskim PCR da bi se verifikovala integracija inducibilne kasete specifične za mesto, da bi se odredio broj alela sa ciljanim delovanjem i da bi se isključile integracije van ciljanog delovanja. PCRs su izvedeni sa LongAmp Taq DNK polimerazom (New England Biolabs). Tabela 2 prikazuje kombinacije prajmera koje se koriste za različite vektore sa ciljanim delovanjem. Rezultati svih eksperimenata sa ciljanim delovanjem su sumirani u tabeli 1. Analiza kariotipa je obavljena standardnim tehnikama G traka (Medical Genetics Service, Cambridge University Hospitals). Da bi se humani PSCs sa ciljanim delovanjem pripremili za analizu hromozoma, ćelije su inkubirane u svežem medijumu kulture sa dodatkom Y-27632 (5 µM, Tocris) i KaryoMAX Colcemida (100 ng/ml, Gibco) tokom 4 sata na 37°C. Nakon toga, ćelije su sakupljene kao pojedinačne ćelije, isprane i peletirane. Oticanje nukleusa i širenje hromozoma postignuto je tretiranjem hipotoničnim 0.055 M KCI-rastvorom u trajanju od 5-10 minuta. Na kraju, ćelije su fiksirane metanolom i glacijalnom sirćetnom kiselinom (odnos 3:1).
[0201] Za OPTiKD, AAVS1 sa ciljanim delovanjem je izveden lipofekcijom kao što je prethodno opisano. Ukratko, hPSCs su zasejani bez hranilice u ploče sa 6 udubljenja i transfektovani 48 h nakon prolaska ćelije sa 4 µg DNK (jednako podeljene između dva AAVS1 ZFN plazmida i vektora sa ciljanim delovanjem) korišćenjem 10 µl po udubljenju lipofectamin 2000 u Opti-MEM medijumu (Gibco) 24 h, sve prema uputstvima proizvođača. Posle 4 dana, 1 µg ml-1 puromicina je dodato u medijum za kulturu, a pojedinačni klonovi su odabrani i prošireni nakon 7-10 dana selekcije.
[0202] Za jedno mesto OPTiKO, AAVS1 sa ciljanim delovanjem je izvedeno nukleofekcijom. hESCs prethodno tretirani tokom 16 h sa 10 µM Y-27632 (Tocris) su razdvojeni na nakupine od 2-8 ćelija korišćenjem Accutase (Gibco), a 2 x 106 ćelija su nukleofektovane u 100 µ1 sa ukupno 12 µg DNK (4 µg svaki za dva ZFN plazmida, i 2 µg svaki za dva vektora sa ciljanim delovanjem) koristeći Lonza P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X komplet i ciklus CA-137 na Lonza 4D-Nucleofector sistemu, sve u skladu sa uputstvima proizvođača. Nukleofektirani hESCs su postavljeni na sloj za hranilicu ozračenih DR4 (otpornih na puromicin i neomicin) mišjih embrionalnih fibroblasta i kultivisani u KSR medijumu sa dodatkom 4 ng ml-1 FGF2 i 10 µM Y-27632 (ovo poslednje samo tokom prvih 24h). Posle 4 dana, hPSC kolonije koje nose i gen otpornosti na puromicin i neomicin su odabrane tokom 7-10 dana sa 25 µg ml-1 geneticina (G418
4
sulfat, Gibco) i 0.5 µg ml-1 puromicina. Pojedinačni klonovi su zatim odabrani i prošireni u uslovima bez hranilice.
[0203] AAVS1-EGFP, ROSA26-EGFP, ROSA26-STDtetR, ROSA26-OPTtetR i ROSA26-EGFPd2 hESC su generisani lipofekcijom (AAVS1 lokus) ili nukleofekcijom (ROSA26 lokus) vektora sa ciljanim delovanjem sa AAVS1 ZFN ili ROSA26 CRISPR/Cas9n parovima (kako je prethodno opisano).2 µg ml-1 blasticidin S-HCl (Gibco) je korišćen za pR26-Bsd_CAG-EGFPd2 plazmid. Generisanje inducibilnih EGFP prekomerno eksprimiranih hESCs koji nose ROSA26-rtTA i AAVS1-TRE-EGFP transgene opisano je na drugom mestu. Ukratko, ćelije su sekvencijalno ciljano delovale na gen prvo nukleofekcijom pR26-Neo_CAG-rtTA sa ROSA26 CRISPR/Cas9n plazmidima, zatim lipofekcijom pAAVPuro_ TRE-EGFP sa AAVS1 ZFN plazmidima.
[0204] hPSC klonske linije sa ciljanim delovanjem na gen pregledane su genomskim PCR da bi se potvrdilo ciljano delovanje specifično za mesto, odredio broj ciljanih alela i isključile integracije plazmida sa ciljanim delovanjem van ciljanog delovanja (videti sliku 16A).
Prekomerna ekspresija inducibilne kasete
[0205] Prekomerna ekspresija inducibilnih kaseta (EGFP, NGN2, MYOD1 i OLIG2-SOX10, respektivno) je izazvana dodavanjem doksiciklin hiklata (Sigma-Aldrich) u medijum za kulturu. Osim ako nije drugačije navedeno, doksiciklin je korišćen u konačnoj koncentraciji od 1 µg/ml. Podloga koja sadrži doksiciklin je držana zaštićena od svetlosti i menjana je svaka 24 sata. Ćelije koje eksprimiraju EGFP se ovde nazivaju OPTi-EGFP, one koje eksprimiraju NGN2 se nazivaju OPTi-NGN2, ćelije koje eksprimiraju MYOD1 se zovu OPTi-MYOD1, a ćelije koje eksprimiraju OLIG2-SOX10 se zovu OPTi-OLIG2-SOX10.
Inaktivacija i smanjenje inducibilnog gena
[0206] Osim ako nije drugačije opisano u opisima slika ili primerima, tetraciklin hidrohlorid (sigma-Aldrich) je korišćen u količini od 1 µg ml<-1>da bi se indukovalo smanjenje ili inaktivacija gena.
Indukcija neurona
4
[0207] Pluripotentne OPTi-NGN2 ćelije su disocirane u pojedinačne ćelije sa TrypLE i postavljene na Matrigel (35 µg/cm<2>, Scientific Laboratory Supplies) obložene posude u gustini od 75.000 ćelija po udubljenju ploče sa 12 udubljenja. Programiranje unapred je započeto 24-48 sati nakon razdvajanja. Osim ako nije drugačije navedeno, indukcija je izvedena u DMEM/F12 (Gibco) sa dodatkom Glutamax (100x, Gibco), neesencijalnih aminokiselina (100x, Gibco), 2-merkaptoetanola (50 µM), penicilina/streptomicina (1%) i doksiciklin (1 µg/ml). Nakon 2 dana indukcije, medijum je prebačen na Neurobasal-medium sa dodatkom glutamax (100x), B27 (50x, Gibco), BDNF (10 ng/ml, Peprotech), NT3 (10 ng/ml, R&D Systems), penicilina/streptomicina (1%) i doksiciklin (1 µg/ml).
Indukcija skeletnih miocita
[0208] Pluripotentne OPTi-MYOD1 ćelije su razdvojene u pojedinačne ćelije sa TrypLE i postavljene na posude obložene želatinom/MEF medijumom pri gustini od 100.000 ćelija po udubljenju ploče sa 12 udubljenja. Programiranje unapred je započeto 24-48 sati nakon razdvajanja. Osim ako nije drugačije navedeno, indukcija je izvedena u DMEM (Sigma-Aldrich) sa dodatkom L-glutamina (2 mM), 2-merkaptoetanola (50 µM), penicilina/streptomicina (1%), insulina (7 µg/ml), sve-trans retinoične kiseline (1 µM, Sigma-Aldrich) i doksiciklina (1 µg/ml). Posle 5 dana indukcije, medijum je dopunjen sa CHIR99021 (3 µM, Tocris) i konjskim serumom inaktiviranim toplotom (2%, Gibco) da bi se poboljšalo sazrevanje.
Indukcija oligodendrocita
[0209] Pluripotentni OLIG2-2A-SOX10 OPTi-OX hPSC su uzgajani u kolonijama na posudama za kulturu obloženim želatinom/MEF. Pre početka indukcije tretirani su sa SB i LDN preko noći. Sledećeg dana indukcija je započeta u CDM sa dodatkom doksiciklina (1 µg/ml) i RA (0.1 µM). Jedan dan nakon indukcije, ćelije su podeljene u CDM sa dodatkom RA (0.1 µM), PM (1 µM) i Y-27632 (5 µM), PDGFaa (20 ng/ml, Peprotech), FGF2 (5 ng/ml) na posude za kulturu obložene PDL/lamininom (100.000 ćelija po udubljenu na ploči sa 12 udubljenja). Sledećeg dana ćelije su prebačene na medijum oligodendrocita koji se sastoji od DMEM/F12, dopunjenog glutamax-om (100x), neesencijalnim aminokiselinama (100x), 2-merkaptoetanolom (1000x), penicilinstreptomicinom (100x), N2 suplementom (100x) , B27 suplementom (50x), insulin 7 µg/ml (Marko Hyvonnen), T360 ng/ml (Sigma), Biotin 100 ng/ml (Sigma), db-cAMP 1 µM (Sigma).
Medijum oligodendrocita je dopunjen sa dox (1 µg/ml), PDGFaa (20 ng/ml), FGF2 (5 ng/ml), RA (0.1 µM) i PM (1 µM). Sedam dana nakon indukcije RA i PM su povučeni. Da bi se indukovane ćelije održale u proliferativnom stanju, ćelije su prolazile svaka 4 dana (75.000 ćelija po udubljenju ploče sa 24 udubljenja) u stalnom prisustvu mitogena PDGFaa i FGF2. Za diferencijaciju proliferativnih prekursora oligodendrocita, PDGFaa i FGF2 su povučeni. Humani rekombinantni NT3 (5 ng/µl, R&D Systems) je dodat da bi se poboljšalo preživljavanje ćelija.
Kvantitativni PCR u realnom vremenu (qPCR)
[0210] RNK je ekstrahovana korišćenjem GenElute Mammalian Total RNA Miniprep kompleta i seta za varenje DNKaze I na koloni (Sigma-Aldrich). Sinteza cDNK je izvedena sa Maxima First Strand cDNA Synthesis kompletom (Thermo Fisher Scientific). Korišćen je Applied Biosystems SYBR Green PCR Master Mix za qPCR. Uzorci su rađeni na Applied Biosystems 7500 brzoj PCR mašini. Svi uzorci su analizirani u tehničkim duplikatima i normalizovani na house-keeping gen porfobilinogen Deaminaza 1 (PBGD). Rezultati su analizirani ΔΔCt postupkom. Videti tabelu 3 za sekvence prajmera.
Protočna citometrija
[0211] Za analizu ekspresije EGFP ćelije su sakupljene sa TrypLE Select (Gibco) tokom 5-10 minuta na 37°C da bi se dobila suspenzija jedne ćelije. Posle ispiranja sa PBS, ćelije su resuspendovane u ledeno hladnom PBS sa dodatkom DAPI (10 µg/ml) i inkubirane 5 minuta na ledu. Ćelije su analizirane korišćenjem Cyan ADP protočnog citometra da bi se odredili nivoi ekspresije EGFP vitalnih ćelija (DAPI negativan). Za bojenje i analizu teškog lanca miozina eksprimirane ćelije su sakupljene pomoću TrypLE Select (kao za analizu ekspresije EGFP), isprane jednom sa PBS, i fiksirane i permeabilizovane rastvorom Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences). Nakon toga, ćelije su isprane i blokirane u puferu Perm/Wash (BD Biosciences) sa dodatkom 3% albumina goveđeg seruma (BSA) na 4°C preko noći. Bojenje sa PE-konjugovanim anti-MYH antitelom (tabela 4) izvedeno je u puferu Perm/Wash tokom 1 h na 4°C u mraku. Posle tri ispiranja sa Perm/Wash puferom, ćelije su analizirane sa Cyan ADP protočnim citometrom da bi se odredili nivoi ekspresije MHC. Analiza podataka je izvršena sa FlowJo (v10) i Graphpad Prism (v6).
Western blot
1
[0212] Protein celokupne ćelije je ekstrahovan sa CelLytic M (Sigma-Aldrich) sa dodatkom kompletnog inhibitora proteaze (Roche), a zatim je kvantifikovan korišćenjem Protein Quantification Kit-Rapid (Sigma-Aldrich). Elektroforeza proteina je izvedena sa NuPAGE LDS puferom za uzorke i 4-12% NuPAGE Bis-Tris Precast Gels (Invitrogen). Nakon transfera proteina na PVDF, membrane su blokirane sa PBS sa dodatkom 0.05% Tween-20 (PBST) 4% mleka tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i inkubirane sa primarnim antitelima preko noći u PBST 4% mleka. Membrane su isprane sa PBST, inkubirane sa sekundarnim antitelima konjugovanim sa HRP (Sigma-Aldrich) u PBST 4% mleku, inkubirane sa Pierce ECL2 Western Blotting supstratom (Thermo Fisher Scientific) i izložene X-Ray Super RX Films (Fujifilm).
Imunocitohemija
[0213] Ćelije su fiksirane u 4% paraformaldehidu (razblaženom u PBS) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi i zatim tri puta isprane sa PBS. Ćelije su zatim blokirane sa 10% magarećeg seruma (Sigma-Aldrich) i permeabilizovane sa 0.3% Triton X-100 (razblaženim u PBS) tokom 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon toga, ćelije su inkubirane sa odgovarajuće razblaženim primarnim antitelima (dodatni eksperimentalni postupci) u 2% magarećeg seruma i 0.1% Triton X-100 (razblaženim u PBS) na 4°C preko noći. Triton-X je izostavljen tokom svih koraka prilikom bojenja površinskog antigena PDGFRA, A2B5 i O4. Posle tri ispiranja sa PBS, ćelije su inkubirane 1 sat na sobnoj temperaturi sa odgovarajućim sekundarnim antitelima konjugovanim sa fluoroforom magarca (Alexa Fluor 488, 555, 568, i/ili 647) u PBS sa dodatkom 1% magarećeg seruma. Nukleusi su vizuelizovani sa 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI, Thermo Fisher Scientific). Ekspresija EGFP i imunobojenje su snimljeni korišćenjem Zeiss LSM 700 konfokalnog mikroskopa (Leica). Procenat βIII-tubulin pozitivnih ćelija je izračunat određivanjem ekspresije βIII-tubulina u najmanje 50 nasumično odabranih DAPI-pozitivnih ćelija u 3 vidna polja od 3 biološke replike korišćenjem invertovanog Olympus IX71 fluorescentnog mikroskopa.
[0214] Statistička analiza je izvršena sa GraphPad Prism (v6). Broj ponavljanja, korišćeni statistički test i rezultati testa su opisani u opisima slika. Osim ako nije drugačije navedeno, podaci su predstavljeni kao srednja vrednost ± SEM.
Primer 1: Dvostruko ciljano delovanje EGFP
2
[0215] Da bismo razvili platformu za inducibilnu prekomernu ekspresiju u hPSCs, uzastopno smo usmerili dve komponente Tet-ON sistema u dva različita GSHs. Konstitutivno eksprimirana treća generacija rtTA je ciljano delovala na humani ROSA26 (hROSA26) lokus korišćenjem strategije ciljanog delovanja zasnovanog na CRISPR/Cas9n, a inducibilna EGFP inducibilna kaseta je ubačena u AAVS1 (Slika 1a; Slike 4a - c). Ciljano delovanje i hROSA26 i AAVS1 bilo je veoma efikasno (Slike 4d-f, Tabela 1) i nije uticalo na hPSC genomsku stabilnost, samoobnavljanje i diferencijaciju (podaci nisu prikazani), stoga se osporava ćelijska toksičnost zavisna od rtTA.
[0216] Zatim smo odabrali dvostruke sa ciljanim delovanjem GSH klonove koji su nosili jednu ili dve kopije svake od dve inducibilne kasete (Slika 5a). Homozigotno ciljano delovanje rtTA rezultovalo je približno dvostruko višim nivoima rtTA proteina (Slika 5b), a takođe i značajno povećanim nivoima EGFP nakon indukcije, u poređenju sa heterozigotnom ekspresijom rtTA (Slike 5c-5e). Pored toga, klonovi sa homozigotnim ciljanim delovanjem inducibilne EGFP kasete su pokazali više i homogenije nivoe EGFP u poređenju sa linijama sa heterozigotnim ciljanim delovanjem (Slike 5c-5e). Važno je da su sve linije sa ispravnim ciljanim delovanjem pokazale robusnu inducibilnu ekspresiju EGFP, koja je bila najmanje dvadeset puta veća u poređenju sa jakim konstitutivnim CAG promotorom (Slika 1b, Slike 5c-e). Zajedno, ovi rezultati podržavaju našu početnu hipotezu da bi ciljano delovanje dve kopije oba elementa Tet-ON sistema rezultovalo maksimalnom ekspresijom nakon indukcije. Vrhunac nivoa EGFP je dostignut otprilike četiri dana nakon indukcije, a ekspresija je brzo preokrenuta nakon povlačenja doksiciklina (Slika 1c). Štaviše, ekspresija EGFP se može titrirati podešavanjem doze doksiciklina (Slika 1d). Važno je da inducibilna ekspresija EGFP nije bila samo visoko efikasna u hPSCs, već i tokom diferencijacije u reproduktivnim slojevima (fotografski podaci u boji nisu prikazani, podaci na Slikama 6a-6d). Konačno, i u skladu sa poznatom strogom kontrolom transkripcije treće generacije Tet-ON sistema, nije bilo uočene pozadinske ekspresije EGFP mRNK ili proteina u odsustvu doksiciklina kako je utvrđeno protočnom citometrijom i qPCR, respektivno (Slika 1b, Slika 6d). Sve u svemu, ovi rezultati su utvrdili da je dvostruko GSH ciljano delovanje Tet-ON sistema moćna strategija za optimalnu ekspresiju inducibilnih kaseta u hPSCs i njihovim derivatima.
Primer 2: Izvođenje ekscitatornih kortikalnih neurona iz hESC i hiPSC
[0217] Prethodne studije su pokazale da se ove ćelije mogu lako dobiti lentivirusnom prekomernom ekspresijom bilo kog od proneuronskih bHLH-faktora (ASCL1, NGN2 ili NEUROD1) u hPSCs. Stoga smo generisali OPTi-NGN2 hPSCs (Slika 2a, Tabela 1). Indukcija NGN2 je dovela do brze smanjene regulacije faktora pluripotencije (Slika 7) i pokretanja programa neuronske transkripcije (Slika 2b). Indukovane ćelije su pokazale neuronske postupke već tri dana nakon indukcije (podaci nisu prikazani). Posle nedelju dana, sve ćelije su pokazale neuronsku morfologiju i eksprimirale pan-neuronske marker proteine, kao što su βIII-tubulin i MAP2 (Slika 2c). Kvantitativni RT-PCR je otkrio snažnu indukciju tipičnih markera prednjeg mozga kao što su BRN2 i FOXG1, i glutamatergičnih neurona uključujući GRIA4 i VGLUT2 (Slika 2b), što ukazuje na ekscitatorni kortikalni neuronski identitet. Zajedno, ovi rezultati su pokazali dramatično poboljšanje i brzine i efikasnosti u generisanju neurona u poređenju sa tradicionalnim hPSC protokolima diferencijacije, i značajno povećanje efikasnosti i čistoće u odnosu na transdiferencijaciju i protokole za napredno programiranje zasnovane na lentivirusima. Slični rezultati su dobijeni sa OPTi-NGN2 hiPSCs, potvrđujući robusnost ovog postupka. Konačno, nismo primetili pad efikasnosti neuronske indukcije tokom produženih perioda kulture Opti-NGN2 hPSCs (>25 prolaza, Slika 2c). Sve u svemu, naši rezultati su pokazali da se OPTi-NGN2 hPSCs mogu koristiti kao neiscrpni izvor za neograničeno, visoko skalabilno, brzo, jednostepeno, bez virusa i skoro determinističko generisanje neurona.
Primer 3: Generisanje skeletnih miocita
[0218] Poznato je da faktor transkripcije MYOD1 indukuje miogenu transdiferencijaciju kada je prekomerno eksprimiran u različitim tipovima somatskih ćelija, međutim, trenutno se raspravlja o sposobnosti hPSCs da se podvrgnu unapred programiranom miogenu indukovanom sa MYOD1. Generisali smo OPTi -MYOD1 hPSCs (Tabela 1), ali smo primetili da je indukcija ekspresije MYOD1 nakon tretmana doksiciklinom rezultovala skoro potpunom ćelijskom smrti u roku od 3-5 dana u širokom spektru uslova kulture koji su prethodno predloženi da bi se olakšala konverzija hPSCs u skeletne miocite. Pošto je široko utvrđeno da se strategije ćelijskog reprogramiranja mogu poboljšati kombinovanjem prekomerne ekspresije faktora transkripcije sa vanćelijskim signalnim znacima, izvršili smo sistematski pregled pro-miogenih faktora modulacijom glavnih signalnih kaskada koje su uključene u formiranje primitivnih pruga, somitogenezu i miogenezu. Otkrili smo da je dodavanje sve-trans retinoične kiseline (RA) u vezi sa prekomernom ekspresijom MYOD1 rezultovalo brzom i skoro potpunom konverzijom u miocite dvostruko pozitivne miogeninom i miozinom teškog lanca (MHC) do 5 dana nakon indukcije. Efekat RA je zavisio od koncentracije i posredovan je preko izoformi RA-receptora RAR α i RARβ, u skladu sa obrascem ekspresije RA receptora tokom razvojne miogeneze (Slika 8). Smatra se da je ovaj efekat nezavisan od mehanizma prekomerne ekspresije MYOD1. Indukovani skeletni miociti su imali tipičnu vretenastu, izduženu morfologiju, bili su podvrgnuti ekstenzivnoj ćelijskoj fuziji i pokazali snažnu ekspresiju miogenih markera i na mRNK i na proteinskim nivoima (Slika 3b, Slika 9a - 9c). Dodavanje nanomolarnih koncentracija acetilholina (ACh) ili selektivnog agonista ACh receptora
4
karbahola rezultovalo je potpunom kontrakcijom mišićnih vlakana, demonstrirajući funkcionalnost indukovanih miocita. Slični rezultati su dobijeni sa Opti-MYOD1 hiPSCs (podaci nisu prikazani). Važno je da se efikasnost miogene indukcije nije smanjila tokom dužih perioda kulture (>50 prolaza, slika 3d), što pokazuje robusnost i ponovljivost ovog postupka. Konačno, primetili smo da su nivoi MYOD1-inducibilne kasete u pozitivnoj korelaciji sa efikasnošću konverzije, što naglašava važnost snažne isporuke gena i superiornost ovog postupka nad pristupima reprogramiranja posredovanim lentivirusom (Slika 10). Sve u svemu, strategija programiranja unapred OPTi-MYOD1 je približno sedam puta brža i pet puta efikasnija od najnovijih protokola diferencijacije hPSCs u skeletne miocite. U poređenju sa prethodnim protokolima za programiranje unapred (Tanaka, A. et al, al. PLoS One 8, e61540 (2013) i Abujarour, R. et al. Stem Cells Transl. Med. 3, 149-60 (2014)) više je efikasan (>95% naspram 30-80%), bez nasumično insertovanih inducibilnih kaseta, hemijski definisan, potpuno reproducibilan i skalabilniji.
[0219] Ovi nalazi pokazuju da se ovaj postupak kontrole ekspresije inducibilne kasete u hPSCs može koristiti kao neiscrpni izvor za visoku propusnost i proizvodnju velikih razmera homogenih ćelijskih populacija. Brzina indukcije i čistoća željenih ćelija sa ciljanim delovanjem trenutno ne može da se poredi drugim postupcima.
Primer 4: Generisanje prekursora oligodendrocita i oligodendrocita:
[0220] OPTi-OX hPSCs koji nose inducibilni SOX10 bilo sam ili u kombinaciji sa OLIG2 u obliku bicistronske ekspresione kasete. Iako su ćelije indukovane samo sa SOX10 snažno eksprimirale marker O4 prekursora oligodendrocita (OPC) nakon 10 dana indukcije, ove ćelije nisu uspele da se dalje diferenciraju u ćelije koje eksprimiraju mijelin i progresivno su umrle. Nasuprot tome, ćelije sa dvostrukom prekomernom ekspresijom OLIG2-SOX10 lako su napredovale od O4-pozitivnog progenitorskog stadijuma u zreli CNP/MBP-pozitivni fenotip 20 dana nakon indukcije. Štaviše, dodatna analiza ekspresije proteina markera potvrdila je da su OPTi-OLIG2-SOX10 hPSCs indukovani u medijumu oligodendrocita (Douvaras et al. 2014) sa dodatkom mitogena PDGFaa i FGF2 prvo prošli kroz fazu sličnu OPC u kojoj su bili visoko proliferativni i u kojoj su ko-eksprimirani su PDGFRA, A2B5 i O4. Ove ćelije su bile visoko proliferativne i mogle su se održavati najmanje tri prolaza (slika 12b) kultivisanjem u prisustvu mitogena. Stoga smo ove ćelije nazvali i-OPCs, za indukovane OPCs. Zanimljivo, nakon povlačenja mitogena i u stalnom prisustvu doksiciklina, i-OPCs su se lako diferencirali za otprilike nedelju dana u zrele oligodendrocite koji eksprimiraju glavne mijelinske proteine CNP, PLP, MAG, MOG i MBP (Slika 12c-12d) koji su bili sposobni za formiranje mijelinske ovojnice (podaci nisu prikazani).
Zajedno, ovi rezultati su pokazali da je pronalazak omogućio razvoj novog, robusnog i brzog hPSC protokola za programiranje unapred za generisanje prekursora oligodendrocita i oligodendrocita.
Tabela 2:
Lista prajmera korišćenih za genotipizaciju PCR
Lokus PCR tip Mesto vezivanja prajmera Sekvenca prajmera
Tabela 3: Lista prajmera za kvantitativni PCR
Gen Orijentacija Sekvenca prajmera
Gen Orijentacija Sekvenca prajmera
Gen Orijentacija Sekvenca prajmera
Tabela 4: Lista antibiotika
Antigen Vrsta Izotip Klonalnost Kompanija Kat. Br. Razblaživanje A2B5 miš IgM monoklonski Millipore MAB312 1:300
1
Primer 5: TET-ON inducibilni sistem smanjivanja
Razvoj optimizovane inducibilne platforme smanjenja u hPSCs.
[0221] Generisali smo hESC linije u kojima je EGFP transgen mogao biti utišan na inducibilan način (slika 14B). Za to smo ciljano delovali na: (1) CAG-tetR ekspresionu kasetu u ROSA26 lokus; i (2) CAG-EGFP transgen plus inducibilnu EGFP shRNK kasetu u AAVS1 lokus (Slika 14A,B). Za ekspresiju viših nivoa tetR proteina za jače potiskivanje ekspresije shRNK u odsustvu tetraciklina. Za ovo smo izvršili multiparametarsku optimizaciju RNK i kodona bakterijske tetR cDNK i koristili nastali kodonom optimizovani tetR (OPTtetR) da generišemo nove inducibilne EGFP smanjenih hESC linija (slika 14B). Ova modifikacija je omogućila desetostruko povećanje ekspresije tetR u poređenju sa standardnom sekvencom (STDtetR; slika 14D). Dalje, homozigotna ekspresija OPTtetR bila je dovoljna da u potpunosti spreči propuštanje shRNK uz potpuno očuvanje efikasne indukcije smanjenja (slika 14C). Treba napomenuti da je inducibilno smanjenje bilo brzo, reverzibilno i reagovalo je na dozu (Slika 14E, F). Konačno, inducibilni hESCs su pokazali normalan kariotip (podaci nisu prikazani), pokazujući da genomski inženjering neophodan za stvaranje ovih linija nije promenio njihovu genetičku stabilnost.
2
[0222] Na osnovu ovih ohrabrujućih rezultata, dodatno smo potvrdili ovaj postupak u kontekstu endogenih gena generisanjem hESCs koji nose inducibilne shRNK protiv POU5F1/OCT4 ili B2M (podaci nisu prikazani). Zanimljivo je da su sve analizirane podlinije (6 za svaki gen) pokazale robusno inducibilno smanjenje bez značajnog propuštanja shRNK. Titracijom tetraciklina identifikovane su optimalne koncentracije za delimično ili potpuno smanjenje OCT4. Kao što se očekivalo, snažno smanjenje OCT4 specifično je dovelo do gubitka pluripotencije i indukcije neuroektoderma i definitivnih markera endoderma. Slični rezultati su dobijeni sa 20 dodatnih OCT4 inducibilnih smanjenja hESC podlinija, potvrđujući robusnost i ponovljivost ovog postupka. Važno je da je generisanje hESCs sa jakim i strogo regulisanim smanjenjem bilo toliko efikasno da su se fenotipske analize mogle izvršiti odmah nakon selekcije antibiotika na mešovitoj populaciji ćelija, čime se u potpunosti zaobilazi potreba za odabirom pojedinačnih kolonija za klonsku izolaciju. Sve u svemu, ovi rezultati pokazuju da je dvostruko ciljano delovanje GSHs sa optimizovanim inducibilnim sistemom smanjivanja moćan postupak za kontrolu ekspresije gena u hPSCs. Ovaj pristup je u daljem tekstu nazvan OPTiKD, za OPTimizovano inducibilno smanjenje (slika 14A).
Primer 6
[0223] Kapacitet da se smanjuju geni u različitim diferenciranim ćelijama bi predstavljao značajan napredak u odnosu na prethodne sisteme za inducibilno smanjivanje gena. Da bismo temeljno testirali ovu mogućnost, analizirali smo efikasnost OPTiKD platforme da smanji EGFP transgen u hPSCs diferenciranim u tri reproduktivna sloja, kao i na panelu od trinaest potpuno diferenciranih tipova ćelija (slika 15A). Za oba postupka, qPCR analize su pokazale snažno i inducibilno smanjenje EGFP transkripata u svim testiranim linijama (Slika 17). Zapažanja mikroskopijom su potvrdila snažno smanjenje ekspresije EGFP proteina, a protočna citometrija je pokazala smanjenje fluorescencije EGFP za više od 70% za većinu linija (podaci nisu prikazani).
Primer 7
[0224] Razvoj optimizovane inducibilne CRISPR/Cas9 platforme smanjivanja u hPSCs.
[0225] Skrenuli smo pažnju na razvoj inducibilnog pristupa smanjenja. Trenutni inducibilni CRISPR/Cas9 postupci se oslanjaju na uslovnu prekomernu ekspresiju Cas9 u prisustvu konstitutivno eksprimirane gRNK. U ovom slučaju, kontrola prekomerne ekspresije Cas9 se postiže TET-ON postupkom u kome nakon tretmana doksiciklinom reverzni transaktivator kontrolisan tetraciklinom (rtTA) aktivira promotor element koji reaguje na tetraciklin (TRE) zavisan od Pol II (fuzija između više TET operona i minimalni CMV promotor). Iako je ova TET-ON platforma uspešno primenjena na određene tipove humanih ćelija, primetili smo da je ovaj inducibilni sistem utišan tokom hPSC diferencijacije u više linija (uključujući kardiomiocite, hepatocite i ćelije glatkih mišića), čak i nakon ciljanog delovanja na AAVS1 GSH (podaci nisu prikazani). Istražili smo mogućnost da razvijemo alternativni i poboljšani postupak kombinovanjem konstitutivno eksprimiranog Cas9 pokrenutog CAG promotorom sa inducibilnom gRNK kasetom zasnovanom na onoj razvijenoj za inducibilnu ekspresiju shRNK (Slika 18A, B). Stoga smo generisali hESCs linije u kojima bi fluorescentni reporterski gen mogao biti inaktiviran na inducibilan način (slika 18C). Za ovo smo ciljano delovali na ROSA26-EGFPd2 reporterske hESCs sa inducibilnom EGFP gRNK i konstitutivnim Cas9 u lokusu AAVS1, pri čemu je svaki transgen integrisan u jedan od dva alela. Ovaj pristup dvostrukog ciljanog delovanja bio je brz (<2 nedelje) i efikasan (>90% linija koje sadrže oba transgena. Izvanredno, kada su pojedinačne klonske podlinije uzgajane u prisustvu tetraciklina primetili smo smanjenu ekspresiju EGFPd2 u svim linijama sa ciljanim delovanjem i EGFPd2 homozigotne ćelije su pokazale skoro homogeni gubitak najmanje jedne kopije reporterskog gena već pet dana nakon indukcije tetraciklina (što je pokazano smanjenjem fluorescencije EGFPd2 od 50%). Produženi tretman tetraciklinom doveo je do progresivnog potpunog gubitka fluorescencije EGFPd2 u porastu do 75% homozigotnih ćelija EGFPd2 (podaci nisu prikazani). Interesantno je da je koekspresija bilo dve ili tri kopije iste EGFP gRNK kasete sa istog AAVS1 lokusa bila dovoljna da značajno poveća brzinu i efikasnost inducibilne inaktivacije EGFPd2 u svim analiziranim klonskim podlinijama. Na primer, istovremena indukcija tri kopije iste gRNK rezultovala je izuzetnom 95% efikasnošću inaktivacije nakon tretmana tetraciklinom. Važno je da inducibilne EGFPd2 inaktivacije hESCs nisu pokazale nikakvo značajno smanjenje ni u proporciji EGFPd2 pozitivnih ćelija niti u njihovoj fluorescenciji nakon produžene kulture u odsustvu tetraciklina, čak i kada je korišćeno nekoliko kopija gRNK. Ovo je pokazalo da je inducibilna ekspresija gRNK strogo kontrolisana. Konačno, testiranje dodatnih gRNK protiv EGFPd2 otkrilo je da se brzina i efikasnost inducibilne inaktivacije snažno oslanjaju na gRNK. Zaista, optimalna sekvenca je dozvoljavala do 90% inaktivacija nakon samo 2 dana indukcije. Treba napomenuti da je najefikasnija gRNK takođe rezultovala nekontrolisanom inaktivacijom EGFPd2, ali ovo ograničenje je izbegnuto jednostavnim dodavanjem drugog TET operona inducibilnom H1 promotoru da bi se osigurala još strožija kontrola transkripcije. Zajedno,
4
ovi rezultati pokazuju da bi se sistem smanjenja mogao lako preurediti da podrži inducibilnu ekspresiju gRNK i omogući strogo kontrolisanu aktivnost CRISPR/Cas9 u širokom opsegu potencije gRNK. Koliko nam je poznato, ovo je prvi uslovni CRISPR/Cas9 pristup zasnovan na inducibilnoj ekspresiji gRNK.
LISTING SEKVENCI
1
2
4
1
2
4
1
2

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Ex vivo postupak za kontrolu transkripcije genske sekvence u ćeliji koji sadrži
a) ciljanu inserciju gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljanu inserciju inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, naznačeno time da pomenuta inducibilna kaseta sadrži pomenutu gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom, a navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
2. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da je genska sekvenca transgen ili kodira nekodirajuću RNK.
3. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time da se aktivnost pomenutog transkripcionog regulatornog proteina kontroliše pomoću egzogeno snabdevene supstance.
4. Ex vivo postupak prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačen time da je navedeni transkripcioni regulatorni protein konstitutivno eksprimiran.
5. Ex vivo postupak prema bilo kom od prethodnih patentnih zahteva, naznačen time da je pomenuti transkripcioni regulatorni protein odabran između bilo kog od: protein aktivatora transkripcije koji odgovara na tetraciklin (rtTa), represor tetraciklina (TetR), VgEcR sintetički receptor ili hibridni transkripcioni regulatorni protein koji sadrži DNK vezujući domen iz GAL4 proteina kvasca, domen za vezivanje skraćenog liganda iz humanog progesteronskog receptora i aktivacioni domen iz humanog NF -κB.
6. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 5, naznačen time da se aktivnost rtTA kontroliše pomoću tetraciklina ili njegovog derivata, izborno doksiciklina, i pri čemu inducibilni promotor uključuje element koji reaguje na tetraciklin (TRE).
4
7. Ex vivo postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da su pomenuta prva i druga genomska sigurna luka odabrana između bilo koja dva od hROSA26 lokusa, AAVS1 lokusa, CLYBL gena ili CCR5 gena.
8. Ex vivo postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da se dodatni genetički materijal ubacuje na prvu/i ili drugu genomsku sigurnu luku, izborno jedno ili više od sledećeg:
a) suicidni gen;
b) selektabilni marker;
c) reporter gen; i/ili
d) gen za nekodirajuću RNK.
9. Ex vivo postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da je navedena ćelija odabrana između pluripotentne matične ćelije, somatske matične ćelije ili zrele ćelije.
10. Ex vivo postupak prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu, naznačen time da je pomenuta ćelija humana ćelija, ćelija torbara, ne-humanih primata, kamile ili stočne životinje.
11. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time da je pomenut postupak za programiranje pluripotentnih matičnih ćelija u definisane zrele ćelije.
12. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 1 ili patentnom zahtevu 2, naznačen time da je navedena ćelija pluripotentna matična ćelija i pomenuta genska sekvenca je transgen za jedan ili više glavnih regulatora, izborno transkripcioni faktor, i izborno pri čemu transkripcija pomenute genske sekvence rezultuje u unapred programiranju ćelije u definisani tip zrele ćelije.
13. Ex vivo postupak prema patentnom zahtevu 1, naznačen time da je pomenuti postupak za inserciju genske sekvence za potrebe genske terapije, izborno pri čemu genska sekvenca kodira protein uključujući protein divljeg tipa, modifikovani protein, antigen, enzim, selektabilni marker ili nekodirajući RNK molekul.
14. Ćelija je napravljena postupkom prema patentnom zahtevu 1.
15. Ćelija sa modifikovanim genomom koja sadrži insertovani gen koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i insertovanu inducibilnu kasetu koja sadrži gensku sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, pri čemu je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pomenuta prva i druga mesta su različita.
16. Ćelija prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15, za upotrebu u terapiji, ili upotrebu ćelije prema patentnom zahtevu 14 ili patentnom zahtevu 15 za in vitro dijagnostiku ili za tkivno inženjerstvo.
17. Ex vivo postupak za proizvodnju miocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji sadrži korake:
a) ciljane insercije gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljane insercije MYOD1 gena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, naznačeno time da je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite,
i kultivisanje navedenih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
18. Ex vivo postupak za proizvodnju oligodendrocita iz pluripotentnih matičnih ćelija, koji sadrži korake:
a) ciljane insercije gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljane insercije SOX-10 gena koji je operativno povezan sa inducibilnim promotorom u drugu gensku sigurnu luku, naznačeno time da je pomenuti inducibilni promotor regulisan transkripcionim regulatornim proteinom; pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite,
i kultivisanje navedenih ćelija u prisustvu retinoične kiseline,
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
19. Ex vivo postupak za smanjivanje trakskripcije i/ili translacije endogenih gena u ćeliji, koji sadrži korake:
a) ciljane insercije gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljane insercije inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, naznačeno time da navedena inducibilna kaseta sadrži DNK koja kodira nekodirajuću RNK sekvencu koja je operativno povezana sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu navedena nekodirajuća RNK sekvenca potiskuje transkripciju ili translaciju endogenog gena;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
20. Ex vivo postupak za inaktivaciju endogenog gena u ćeliji, koji sadrži sledeće korake:
a) ciljane insercije gena koji kodira transkripcioni regulatorni protein i gena koji kodira Cas9 u prvu gensku sigurnu luku; i
b) ciljane insercije inducibilne kasete u drugu gensku sigurnu luku, naznačeno time da pomenuta inducibilna kaseta sadrži vodeću RNK operativno povezanu sa inducibilnim promotorom i navedeni promotor je regulisan transkripcionim regulatornim proteinom i pri čemu pomenuta gRNK sekvenca ciljano deluje na endogeni gen;
pri čemu su pomenuta prva i druga genska sigurna luka različite, i
pri čemu postupak ne obuhvata postupak za modifikaciju genetičkog identiteta reproduktivne linije humanog bića.
RS20220597A 2016-11-24 2017-11-24 Kontrolisana transkripcija RS63330B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1619876.4A GB201619876D0 (en) 2016-11-24 2016-11-24 Controllable transcription
PCT/GB2017/053531 WO2018096343A1 (en) 2016-11-24 2017-11-24 Controllable transcription
EP17807909.1A EP3545079B2 (en) 2016-11-24 2017-11-24 Controllable transcription

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63330B1 true RS63330B1 (sr) 2022-07-29

Family

ID=58073446

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220597A RS63330B1 (sr) 2016-11-24 2017-11-24 Kontrolisana transkripcija

Country Status (26)

Country Link
US (5) US11697823B2 (sr)
EP (5) EP4092110A1 (sr)
JP (2) JP7748174B2 (sr)
KR (3) KR102622856B1 (sr)
CN (3) CN117512009A (sr)
AU (2) AU2017363950A1 (sr)
BR (1) BR112019010692A2 (sr)
CA (1) CA3044628A1 (sr)
CY (1) CY1125251T1 (sr)
DK (1) DK3545079T4 (sr)
EA (1) EA201991255A1 (sr)
ES (1) ES2918013T5 (sr)
FI (1) FI3545079T4 (sr)
GB (1) GB201619876D0 (sr)
HR (1) HRP20220836T1 (sr)
HU (1) HUE059163T2 (sr)
IL (2) IL266832B1 (sr)
LT (1) LT3545079T (sr)
MX (3) MX2019006025A (sr)
MY (1) MY204429A (sr)
PL (1) PL3545079T5 (sr)
PT (1) PT3545079T (sr)
RS (1) RS63330B1 (sr)
SI (1) SI3545079T1 (sr)
SM (1) SMT202200256T1 (sr)
WO (1) WO2018096343A1 (sr)

Families Citing this family (84)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201210857D0 (en) * 2012-06-19 2012-08-01 Cambridge Entpr Ltd Transcription factor mediated programming towards megakaryocytes
GB201619876D0 (en) 2016-11-24 2017-01-11 Cambridge Entpr Ltd Controllable transcription
CN110891420B (zh) 2017-07-31 2022-06-03 瑞泽恩制药公司 Cas转基因小鼠胚胎干细胞和小鼠及其应用
EP3759226A4 (en) * 2018-03-02 2022-06-15 Generation Bio Co. IDENTIFICATION AND CHARACTERIZATION OF GENOMIC SAFE HARBOR (GSH) IN HUMAN AND MURINE GENOMES AND VIRAL AND NON-VIRAL VECTOR COMPOSITIONS FOR TARGETED INTEGRATION AT IDENTIFIED GSH LOCI
EP3592140A1 (en) 2018-03-19 2020-01-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Transcription modulation in animals using crispr/cas systems
KR102871263B1 (ko) * 2018-11-08 2025-10-16 이슘 리서치 디벨롭먼트 컴퍼니 오브 더 히브루 유니버시티 오브 예루살렘 엘티디. 부착 비의존성 세포 및 그 용도
MA56393A (fr) * 2019-06-28 2022-05-04 Bayer Healthcare Llc Matériels et méthodes de régulation de l'édition de gènes
CN110592014A (zh) * 2019-08-14 2019-12-20 广东美赛尔细胞生物科技有限公司 一种在nk细胞治疗中免辐照体外体内持续去除饲养细胞的方法
KR20220142433A (ko) * 2020-01-17 2022-10-21 사나 바이오테크놀로지, 인크. 유전자 발현 조절용 안전 스위치
WO2021181110A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Bit Bio Limited Method of generating hepatic cells
CA3175071A1 (en) 2020-03-11 2021-09-16 Bit Bio Limited Method of generating hepatic cells
CN112342196A (zh) * 2020-08-18 2021-02-09 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种免疫兼容可逆的通用型多能干细胞及其应用
JP7849796B2 (ja) * 2020-09-10 2026-04-22 Jsr株式会社 オリゴデンドロサイト様細胞の製造方法
CN114276995A (zh) * 2020-09-28 2022-04-05 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达ctla-4阻遏分子的多能干细胞及其衍生物
CN114350611A (zh) * 2020-09-28 2022-04-15 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 表达靶向pd-1/pd-l1的效应rna分子的多能干细胞及其衍生物
CN114276996A (zh) * 2020-09-28 2022-04-05 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达pd-1/pd-l1阻断物的多能干细胞衍生物及应用
CN114350612A (zh) * 2020-09-28 2022-04-15 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 表达靶向CTLA-4的shRNA/shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
WO2022072822A1 (en) * 2020-10-01 2022-04-07 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method of generating multipotent stem cells
CN114507643A (zh) * 2020-10-29 2022-05-17 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-2的多能干细胞衍生物及应用
CN114426953A (zh) * 2020-10-29 2022-05-03 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-12的多能干细胞衍生物及应用
CN114525255A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-11的多能干细胞衍生物及其应用
CN114517184A (zh) * 2020-10-30 2022-05-20 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达adipsin的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114525257A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Tim-3阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457034A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-1阻断物的多能干细胞衍生物及其应用
CN114457035A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达lag-3阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457031A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达b7-h5阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457033A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达il-6阻断物的多能干细胞衍生物及其应用
CN114457025A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达btla阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114525254A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达fgf-21的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457021A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达cd47抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114457029A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达vegf-a阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457024A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达IL-4Rα阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457023A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达cd28激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114457032A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达b7-h4阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457026A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达4-1bb激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114525258A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达pcsk9阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457028A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达cd38抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114457027A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Amyloidβ抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114525256A (zh) * 2020-10-30 2022-05-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Siglec-15阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457030A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达IgE阻断物的多能干细胞或其衍生物及应用
CN114457022A (zh) * 2020-10-30 2022-05-10 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达ox40激活型抗体的多能干细胞及其衍生物与应用
CN112430624B (zh) * 2020-11-25 2023-08-18 汕头大学 一种斑马鱼肌肉特异诱导型表达载体及应用
KR20230118887A (ko) 2020-12-03 2023-08-14 센츄리 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 유전자 조작 세포 및 이의 용도
US11661459B2 (en) 2020-12-03 2023-05-30 Century Therapeutics, Inc. Artificial cell death polypeptide for chimeric antigen receptor and uses thereof
CN114107211B (zh) * 2020-12-04 2025-09-30 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种多能干细胞及其衍生物
WO2022118972A1 (ja) * 2020-12-04 2022-06-09 国立大学法人神戸大学 高発現高制御性遺伝子スイッチ
AR124414A1 (es) 2020-12-18 2023-03-22 Century Therapeutics Inc Sistema de receptor de antígeno quimérico con especificidad de receptor adaptable
CN114645020A (zh) * 2020-12-21 2022-06-21 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向nr4a1抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114645021A (zh) * 2020-12-21 2022-06-21 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向cd47抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114657136A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向PCSK9的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
CN114657133A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向IL-4 Rα的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞
CN114657132A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Siglec-15靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114657139A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达lag-3靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114657134A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向IgE的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
CN114657137A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向BTLA的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
CN114657131A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达尿酸氧化酶的多能干细胞或其衍生物
CN114717232A (zh) * 2020-12-22 2022-07-08 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 表达irf-1靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114717192A (zh) * 2020-12-22 2022-07-08 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Amyloidβ靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114717193A (zh) * 2020-12-22 2022-07-08 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向B7-H5的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
CN114657130A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达vegf-a靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114657135A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达Tim-3靶向抑制因子的多能干细胞及其衍生物与应用
CN114657138A (zh) * 2020-12-22 2022-06-24 未来智人再生医学研究院(广州)有限公司 一种表达靶向B7-H4的shRNA和/或shRNA-miR的多能干细胞或其衍生物
US20240093146A1 (en) * 2021-01-26 2024-03-21 Koji Tanabe Method for producing oligodendrocytes
GB202112937D0 (en) 2021-09-10 2021-10-27 Cambridge Entpr Ltd Production of hepatocytes
AU2022369299A1 (en) 2021-10-19 2024-03-14 Eat Scifi Inc. Plant base/animal cell hybrid meat substitute
WO2023067090A1 (en) 2021-10-20 2023-04-27 Roslin Technologies Limited Ipsc induction and progeny derivation
KR20240117571A (ko) 2021-12-08 2024-08-01 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 돌연변이 마이오실린 질환 모델 및 이의 용도
WO2023135318A1 (en) * 2022-01-17 2023-07-20 Westfälische Wilhelms-Universität Münster Method for expression of a transgene of interest from neural precursor cells
GB202206113D0 (en) 2022-04-27 2022-06-08 Cambridge Entpr Ltd Novel method
EP4342979A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Bit Bio Discovery GmbH Novel method
EP4665841A1 (en) 2023-02-15 2025-12-24 Meatable B.V. Maturation of skeletal muscle cells
AU2024222968A1 (en) * 2023-02-15 2025-08-28 Meatable B.V. Maturation of skeletal muscle cells
WO2024252001A1 (en) 2023-06-08 2024-12-12 Meatable B.V. Methods for culturing cells
WO2025022129A1 (en) 2023-07-27 2025-01-30 Bit Bio Limited Method of generating adipocytes
WO2025078824A1 (en) 2023-10-10 2025-04-17 Bit Bio Limited Novel method to modulate expression of an endogenous gene in a somatic cell
GB202316503D0 (en) 2023-10-27 2023-12-13 Clock Bio Ltd Novel cells and methods
WO2025099413A1 (en) 2023-11-06 2025-05-15 Bit Bio Limited Method of generating pancreatic beta cells
WO2025141193A1 (en) 2023-12-29 2025-07-03 Meatable B.V. Adipocyte maturation
WO2025141211A1 (en) * 2023-12-29 2025-07-03 Meatable B.V. Cells for forward programming
WO2025224346A1 (en) 2024-04-25 2025-10-30 Meatable B.V. Adipocyte maturation
WO2025257694A1 (en) * 2024-06-10 2025-12-18 Università Degli Studi Di Torino Cell differentiation through multimodal tuning of gene expression
WO2025265021A1 (en) * 2024-06-21 2025-12-26 University Of Massachusetts Packaging and producer cell lines for recombinant adeno-associated virus, plasmids, and methods of making and using
WO2026068559A1 (en) 2024-09-24 2026-04-02 Bit Bio Limited Forward programming in a cell aggregate culture
GB202414658D0 (en) 2024-10-04 2024-11-20 Daresbury Proteins Ltd Genetic elements

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU734051B2 (en) * 1996-04-05 2001-05-31 Salk Institute For Biological Studies, The Hormone-mediated methods for modulating expression of exogenous genes in mammalian systems, and products related thereto
JPH1080274A (ja) * 1996-09-06 1998-03-31 Hirofumi Hamada 核移行シグナルを結合したテトラサイクリン・トランスアクチベーター
US20070134796A1 (en) 2005-07-26 2007-06-14 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted integration and expression of exogenous nucleic acid sequences
US20090210955A1 (en) 2005-06-09 2009-08-20 Artemis Pharmaceuticals Gmbh Shrna and sirna expression in a living organism under control of a codon-optimized repressor gene
JP2010516250A (ja) 2007-01-19 2010-05-20 マウント シナイ スクール オブ メディスン オブ ニューヨーク ユニバーシティー 幹細胞遺伝子標的化法
US8227247B2 (en) 2007-12-20 2012-07-24 Wisconsin Alumni Research Foundation Method of generating myelinating oligodendrocytes
GB0905331D0 (en) * 2009-03-27 2009-05-13 Avecia Biolog Ltd Expression process
EP2419511B1 (en) * 2009-04-09 2018-01-17 Sangamo Therapeutics, Inc. Targeted integration into stem cells
WO2012071549A2 (en) * 2010-11-24 2012-05-31 Clontech Laboratories, Inc. Inducible expression system transcription modulators comprising a distributed protein transduction domain and methods for using the same
WO2013123365A1 (en) 2012-02-15 2013-08-22 Mice With Horns, Llc Transgenic animals with customizable traits
KR101535070B1 (ko) 2014-07-16 2015-07-10 서울대학교산학협력단 혈관성장인자 유전자의 형질전환을 위한 재조합 발현 벡터 및 이를 이용한 혈관성장인자 발현 줄기세포주
WO2016143826A1 (ja) 2015-03-09 2016-09-15 学校法人慶應義塾 多能性幹細胞を所望の細胞型へ分化する方法
US20180072988A1 (en) 2015-04-10 2018-03-15 Agency For Science, Technology And Research Generation of functional cells from stem cells
CN107921148A (zh) * 2015-05-08 2018-04-17 哈佛学院校长同事会 通用供体干细胞和相关方法
WO2016210313A1 (en) 2015-06-24 2016-12-29 Whitehead Institute For Biomedical Research Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods
JP6713691B2 (ja) 2015-08-20 2020-07-01 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 動物細胞ゲノム部位特異的外来ｄｎａ挿入方法及び前記挿入方法を用いて得られる細胞
CN109715801B (zh) 2015-12-01 2022-11-01 克里斯普治疗股份公司 用于治疗α1抗胰蛋白酶缺乏的材料和方法
KR20180118111A (ko) 2015-12-23 2018-10-30 크리스퍼 테라퓨틱스 아게 근위축성 측색 경화증 및/또는 전두측두엽 퇴행의 치료 물질 및 방법
CN105505880B (zh) 2015-12-29 2016-11-09 苏州系统医学研究所 一种用于筛选流感病毒聚合酶组装抑制剂的细胞系及其构建方法
EP3416689B1 (en) 2016-02-18 2023-01-18 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of severe combined immunodeficiency (scid) or omenn syndrome
EP3429632B1 (en) 2016-03-16 2023-01-04 CRISPR Therapeutics AG Materials and methods for treatment of hereditary haemochromatosis
GB201619876D0 (en) 2016-11-24 2017-01-11 Cambridge Entpr Ltd Controllable transcription
EP4272551A3 (en) 2017-02-28 2024-03-06 The Regents of the University of California Differentiation and use of human microglia-like cells from pluripotent stem cells and hematopoietic progenitors
WO2018185709A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Centro De Neurociencias E Biologia Celular Compositions for reprogramming cells into dendritic cells or antigen presenting cells, methods and uses thereof
WO2018204262A1 (en) 2017-05-01 2018-11-08 President And Fellows Of Harvard College Transcription factors controlling differentiation of stem cells
EP3957721A1 (en) 2020-08-20 2022-02-23 Life & Brain GmbH Rapid production of human neuronal cultures with single cell resolution
CN112852877A (zh) 2021-04-07 2021-05-28 成都中科奥格生物科技有限公司 质粒载体及其在靶向猪col1a1位点定点整合外源基因中的应用
WO2023205743A2 (en) 2022-04-22 2023-10-26 President And Fellows Of Harvard College Methods and compositions for producing microglia
EP4342979A1 (en) 2022-09-20 2024-03-27 Bit Bio Discovery GmbH Novel method

Also Published As

Publication number Publication date
EP4516914A2 (en) 2025-03-05
WO2018096343A1 (en) 2018-05-31
EP4529958A3 (en) 2025-06-11
CY1125251T1 (el) 2025-03-28
GB201619876D0 (en) 2017-01-11
ES2918013T5 (en) 2025-09-01
US20190338309A1 (en) 2019-11-07
CN117587067A (zh) 2024-02-23
KR102500322B1 (ko) 2023-02-16
CN117512009A (zh) 2024-02-06
IL325891A (en) 2026-03-01
JP2020501533A (ja) 2020-01-23
AU2024203288A1 (en) 2024-06-06
US20240002880A1 (en) 2024-01-04
KR20230025947A (ko) 2023-02-23
EP4516914A3 (en) 2025-06-04
US11697823B2 (en) 2023-07-11
US20240200098A1 (en) 2024-06-20
MY204429A (en) 2024-08-28
KR102622856B1 (ko) 2024-01-08
BR112019010692A2 (pt) 2019-10-22
US12454703B2 (en) 2025-10-28
CA3044628A1 (en) 2018-05-31
HUE059163T2 (hu) 2022-10-28
DK3545079T4 (da) 2025-08-18
JP2023134465A (ja) 2023-09-27
ES2918013T3 (es) 2022-07-13
FI3545079T4 (fi) 2025-07-29
IL266832B1 (en) 2026-02-01
HRP20220836T1 (hr) 2022-10-14
EA201991255A1 (ru) 2019-11-29
IL266832A (en) 2019-07-31
SMT202200256T1 (it) 2022-07-21
MX2019006025A (es) 2019-11-25
PT3545079T (pt) 2022-07-07
CN110249045B (zh) 2023-11-24
CN110249045A (zh) 2019-09-17
EP3545079B1 (en) 2022-04-06
EP4092110A1 (en) 2022-11-23
DK3545079T3 (da) 2022-06-13
EP3545079B2 (en) 2025-06-11
EP4529958A2 (en) 2025-04-02
PL3545079T3 (pl) 2022-07-25
KR20240007714A (ko) 2024-01-16
EP3545079A1 (en) 2019-10-02
EP4186972A1 (en) 2023-05-31
SI3545079T1 (sl) 2022-09-30
MX2026000626A (es) 2026-03-02
US20250101460A1 (en) 2025-03-27
PL3545079T5 (pl) 2025-08-11
KR20190084309A (ko) 2019-07-16
LT3545079T (lt) 2022-06-10
MX2026000627A (es) 2026-03-02
AU2017363950A1 (en) 2019-06-06
JP7748174B2 (ja) 2025-10-02
US20230392165A1 (en) 2023-12-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12454703B2 (en) Controllable transcription
WO2025099413A1 (en) Method of generating pancreatic beta cells
AU2024301825A1 (en) Method of generating adipocytes
EP4342979A1 (en) Novel method
HK40091850A (en) Controllable transcription
HK40084242A (en) Controllable transcription
HK40122857A (en) Controllable transcription
HK40122856A (en) Controllable transcription
HK40014277A (en) Controllable transcription
HK40014277B (en) Controllable transcription
EA053028B1 (ru) Регулируемая транскрипция
NZ794568A (en) Controllable transcription
WO2025257695A1 (en) Growth factor-free stem cell expansion and differentiation
KR20260058911A (ko) 지방세포 생성 방법
WO2025257694A1 (en) Cell differentiation through multimodal tuning of gene expression
Zou et al. INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS AND GENE TARGETING FOR REGENERATIVE MEDICINE