RS63347B1 - Formulacija na bazi vitamina e ili njegovog estra za lečenje bakterijskih i gljivičnih biofilmova - Google Patents

Description

Opis

Oblast primene

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na tehničku oblast farmaceutske industrije.

[0002] Konkretno, pronalazak se odnosi na formulaciju za topikalnu primenu za lečenje biofilma patogenih bakterija ili gljivica.

Stanje tehnike

[0003] Poznato je da je biofilm složena agregacija mikroorganizama koju karakteriše lučenje adhezivnog i zaštitnog ekstracelularnog matriksa, definisanog kao EPS (ekstracelularne polimerne supstance).

[0004] Navedena matrica nije statična struktura, jer je podvrgnuta znatnim varijacijama u zavisnosti od vrste mikroorganizma koji ga proizvodi i uslova rasta, iako je moguće identifikovati ponavljajuće prisustvo nekih polisaharida, proteina i nukleinskih kiselina, i predstavlja visok procenat, koji varira od 50% do 90%, organske komponente biofilma, toliko da se smatra primarnim elementom ove strukture.

[0005] Biofilm može biti prisutan u bilo kom prirodnom i veštačkom okruženju i karakteriše ga izuzetna sposobnost da prijanja na površine, da garantuje složene interakcije između mikrobnih zajednica koje se u njemu nalaze i, dalje, da ih zaštiti od delovanja spoljašnjih agenasa, uključujući antibiotike.

[0006] Zaista, sinteza biofilma predstavlja do danas jednu od najčešćih komplikacija ljudskih infekcija, do te mere da je predmet brojnih studija na međunarodnom nivou.

[0007] Ozbiljnost ovakvih infekcija leži u teškoći dijagnoze, u teškoći lečenja i iskorenjivanja mikrobne zajednice, kao i u teškoći prevencije.

[0008] Zaista, otpornost ove specifične mikrobne zajednice, često bakterijskog tipa, je značajna i infekcije koje su rezultat toga ponekad mogu izazvati smrt. Procenjuje se da je oko 65% ljudskih infekcija trenutno povezano sa proizvodnjom ovog ekstracelularnog matriksa, u kome mikroorganizmi borave i komuniciraju jedni sa drugima, mogu da prežive čak i u ekstremnim uslovima životne sredine.

[0009] Lečenje infekcija povezanih sa biofilmom je posebno teško jer su bakterije u ovom načinu rasta suštinski otporne na antimikrobne lekove i odbranu domaćina.

[0010] Smanjena difuzija lekova kroz ekstracelularni matriks, niska stopa rasta ćelija, povećana sposobnost razmene genetskih elemenata zbog blizine ćelija, prisustvo subpopulacija uspavanih ćelija su faktori za koje se veruje da doprinose otpornost biofilma na lečenje antibioticima.

[0011] Kao rezultat, svaka strategija prevencije ili dezintegracije biofilma je korisna za sprečavanje infekcija, smanjenje hospitalizacija i bolničkih troškova.

[0012] Dhall S et al., (J Diabetes Res, 2014:562625) opisuju tretman povreda kod db/db mišjeg modela sa poremećenim zarastanjem primenom alfa-tokoferola i N-acetil cisteina. Nakon pomenutog tretmana, konstatovano je da biofilm ima povećanu osetljivost na antibiotike i da je formirano granulaciono tkivo uz pravilno taloženje i remodelovanje kolagena. Međutim, alfa-tokoferol je davan intraperitonealno i samo je N-acetilcistein primenjen topikalno.

[0013] Lee AL et al., (Biomaterials, 2013, decembar; 34(38): 10278-86) opisuju biorazgradive hidrogelove na bazi polikarbonata funkcionalizovanih vitaminom E za antimikrobnu primenu. Ovi hidrogelovi su pokazali antimikrobne/antigljivične efekte i sposobnost da smanje vitalnost mikroba biofilma.

[0014] Campoccia D et al., (J Biomed Res A, 2015. april; 103(4):1447-58) opisuju mogućnost upotrebe polimera polimlečne kiseline (PLA) pomešanih sa vitaminom E ili acetatom vitamina E kao blagih antiinfektivnih biomaterijala. In vitro eksperiment sa stafilokokom koji proizvodi biofilm pokazao je značajno smanjenje bakterijskog prijanjanja i akumulacije biofilma na površini ovih polimera obogaćenih vitaminom E (acetatom).

[0015] Jagani S et al. (Biofouling, 2009; 25(4):321-4) procenili su, testom na mikrotitarskoj ploči, aktivnost 14 fenola i prirodnih fenolnih jedinjenja protiv bioobrastanja protiv Pseudomonas aeruginosa i pokazalo se da takva jedinjenja, osim etil linoleata i tokoferola, uzrokuju značajno smanjenje formiranja biofilma od strane Pseudomonas aeruginosa.

[0016] Tehnički problem koji leži u osnovi ovog pronalaska je bio da se obezbedi formulacija za topikalnu primenu koja je u stanju da smanji ili ukloni patogene bakterijske i/ili gljivične biofilmove ili da inhibira njihovo stvaranje, i koja je pogodna za primenu takođe na osetljivoj, netolerantnoj koži ili koži sklonoj alergijama.

Suština pronalaska

[0017] Ovaj pronalazak rešava gore pomenuti problem obezbeđivanjem formulacije za topikalnu upotrebu koja se sastoji od vitamina E ili njegovog estra za terapeutsku upotrebu u uklanjanju, redukciji ili inhibiciji bakterijskog i/ili gljivičnog biofilma, pri čemu je estar vitamina E estar sa karboksilnom kiselinom formule R-COOH, u kojoj je R alkil radikal koji ima od 1 do 19 atoma ugljenika, ili alkenil ili alkinil koji ima od 2 do 19 atoma ugljenika.

[0018] Poželjno, estar je alfa-tokoferil acetat, n-propionat ili linoleat.

[0019] Poželjno, estar je alfa-tokoferil acetat.

[0020] Poželjno, formulacija se sastoji od acetata vitamina E.

[0021] U sledećem aspektu, formulacija se sastoji od alfa-tokoferil acetata.

[0022] Prema sledećem aspektu, problem je rešen obezbeđivanjem formulacije za topikalnu upotrebu koja sadrži, u težinskom procentu od ukupne težine formulacije, 20 do 70% acetata vitamina E i 20 do 70% isparljivog silikona za terapeutsku upotrebu u uklanjanju, smanjenju ili inhibiciji bakterijskog i/ili gljivičnog biofilma.

[0023] Isparljivi silikon se može izabrati iz grupe koja sadrži pentamer ciklometikon, tetramer ciklometikon, heksamer ciklometikon, heksametildisiloksan, dimetikon niskog viskoziteta i njihove smeše.

[0024] Poželjno, isparljivi silikon je dimetikon niskog viskoziteta, kao što je na primer jedan ili više dimetikona Belsil DM2 i Belsil DM5 firme Wacker ili dimetikona KF-96A-5cs i KF-96A-2cs firme Shin Etsu.

[0025] Poželjno, formulacija dalje sadrži 7 do 13% hidrogenizovanog ricinusovog ulja po težini ukupne težine formulacije.

[0026] Poželjno, formulacija dalje sadrži 7 do 15% težine ukupne težine formulacije uljne komponente izabrane iz grupe koja sadrži biljna ulja i estre masnih kiselina kao što su oktil palmitat, izopropil miristat, etil oleat i njihove smeše.

[0027] Poželjno, formulacija dalje sadrži 2 do 3% dimetikonola po težini ukupne težine formulacije.

[0028] Pod izrazom "za topikalnu upotrebu" se ovde podrazumeva upotreba formulacije topikalnim nanošenjem na deo tela, posebno kožu, sluzokožu, kosu, nokte.

[0029] Podnosilac prijave je iznenađujuće otkrio da formulacija za topikalnu primenu prema ovom pronalasku, zasnovana na vitaminu E ili njegovom estru, može efikasno da smanji formiranje patogenih bakterijskih i/ili gljivičnih biofilmova, kao što je prikazano u Primerima.

[0030] U aspektu ovog pronalaska, formulacija prema pronalasku ne sadrži ekscipijense niti aditive i stoga je pogodna za topikalnu primenu takođe na osetljivoj, netolerantnoj ili koži sklonoj alergijama.

[0031] Izraz "biofilm" identifikuje zajednicu mikrobne, bakterijske ili gljivične prirode, koju karakterišu ćelije koje prijanjaju na biotički supstrat uronjen u ekstraćelijski polimerni matriks koji se samostalno proizvodi koji ih štiti od spoljašnje sredine.

Slike

[0032]

Slika 1 prikazuje histogram proizvodnje biofilma soja Staphilococcus epidermidis R na TSB medijumu sa promenljivom koncentracijom glukoze, sa i bez formulacije Primera 1 prema pronalasku.

Slika 2 prikazuje histogram proizvodnje biofilma soja Staphilococcus aureus na TSB medijumu sa promenljivom koncentracijom glukoze, sa i bez formulacije Primera 1 prema pronalasku.

Detaljan opis

[0033] Ovaj pronalazak će biti dalje opisan u vezi sa nekim neograničavajućim primerima i pozivajući se takođe na priložene crteže.

PRIMER 1

[0034] Primer formulacije koja se može koristiti za uklanjanje, smanjenje ili inhibiciju bakterijskog i/ili gljivičnog biofilma je proizvod VEA<®>Olio, koje prodaje firma Hulka S.r.l. iz Roviga i koji se sastoji od alfa-tokoferil acetata.

PRIMER 2

[0035] Formulacija prema pronalasku u obliku hidrofobnog gela je pripremljena prema sledećoj kompoziciji, pri čemu su procenti težinski u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

Pentamer ciklometikon 245 39.5%

Vitamin E acetat 30.0%

Hidrogenizovano ricinusovo ulje 10.5%

Oktil palmitat 10.0%

8:2 Ciklometikon / dimetikonol 10.0%

[0036] Takva formulacija je napravljena prema sledećem postupku.

[0037] 525 g hidrogenizovanog ricinusovog ulja (Cutina HR) i 500 g oktil palmitata uneti su u mešalicu čelične turbine (proizvođača Dumec) i sadržaj je mešan uz zagrevanje na temperaturi od oko 80-90° dok se hidrogenizovano ricinusovo ulje ne rastvori.

[0038] Zatim je dodato 1500 g acetata vitamina E uz mešanje na gornjoj temperaturi i stvoren je vakuum unutar mešalice (vakuum jednak 600 cmHg).

[0039] Kada je postignut željeni stepen vakuuma, uz mešanje je dodato 500 g prethodno pripremljene smeše 8:2 pentamera ciklometikon/dimetikonol i 1975 g pentamera ciklometikon 245.

[0040] Tako dobijena homogena smeša je dovedena do sobne temperature uz neprekidno mešanje da bi se na kraju dobio providni hidrofobni gel polučvrste konzistencije.

[0041] Ovako pripremljenim gelom napunjeno je 100 malih plastičnih tegli koje sadrže po 50 g i navedene tegle su propisno zatvorene i podvrgnute testu konzervacije na različitim temperaturama: - 20°C, 3°C i 30°C tokom 90 dana i 60°C tokom 21 dana.

[0042] Izgled kreme je ostao nepromenjen tokom čitavog perioda konzervacije na navedene četiri temperature, kao i njen viskozitet i ostale reološke karakteristike.

PRIMER 3 (NE PREMA PRONALASKU)

[0043] Sledeća formulacija prema pronalasku u obliku hidrofobnog gela je pripremljena prema sledećoj kompoziciji, pri čemu su procenti težinski u odnosu na ukupnu težinu kompozicije.

- tokoferil acetat: 30%

- ši puter: 24%

- trigliceridi kaprilne i kaprinske kiseline: 21,7%

- sorbitan olivat: 14 %

- fitosteroli: 10%

- ceramid-NP: 0,3%

[0044] Postupak pripreme je sledeći: prva faza koja sadrži vitamin E, fitosterole i ceramide priprema se zagrevanjem cele smeše do 120°C da bi se dobio homogeni rastvor. Ostali sastojci se zagrevaju do 60°C u posebnoj posudi. Dve faze se zatim kombinuju zajedno i mešaju oko 30 minuta na sobnoj temperaturi.

PRIMER 4

[0045] Izbor sojeva koji proizvode biofilm za izvođenje in vitro testova opisani u sledećem Primeru 5 su izvedeni na sledeći način.

[0046] U početku je selekcija predviđala korak skrininga na 30 sojeva mikroorganizama, korišćenjem postupka za uspostavljanje proizvodnje biofilma od analiziranih sojeva, koja je opisana u nastavku.

[0047] Sojevi su kultivisani na TSB medijumu (triptičan sojin bujon, tj. hranljiva podloga koja podržava rast širokog spektra mikroorganizama) koja je korišćena za pre-inokulaciju.

[0048] Nakon toga, sojevi su podvrgnuti postupku za kvantitativno određivanje proizvedenog biofilma prema Srđanu Stepanoviću et al. (Stepanovic S., Vukovic D., Dakic I., Savic B., Svabic-Vlahovic M., "A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation", Journal of Microbiological Methods 2000; 40:175-179) i navedeni postupak je opisan u nastavku.

[0049] Epruvete koje sadrže TSB prethodno inkubirane na 37°C tokom 24 sata su centrifugirane na 3000 rpm tokom 10 minuta, supernatant je zatim uklonjen i talog je resuspendovan u sledećem medijumu: TSB sa 0,25%, 1% i 2,5% D- glukoza.

[0050] Zatim je pripremljena ploča sa 96 bunarčića koja sadrži 200 µl bakterijske suspenzije i inkubirana na 37°C tokom 24 sata. Kada je period inkubacije završen, sadržaj pojedinačnih bunarčića je aspiriran, a bunarčići ploče su isprani 3 puta sa 250 µl sterilnog fiziološkog rastvora (NaCl 9 g/L) i, pri svakom pranju, ploča je okrenuta naopako da bi se uklonio višak fiziološkog rastvora.

[0051] Ćelije su zatim fiksirane, dodajući u svaki bunarčić 200 µl 99% metanola tokom 15 minuta; zatim su bunarčići ispražnjeni i osušeni.

[0052] Ploča sa 96 bunarčića je zatim obojena 5 minuta dodavanjem u svaki bunarčić 200 µl 2% kristalno ljubičastog rastvora, nakon čega je ploča isprana vodom iz slavine i ostavljena da se osuši.

[0053] Boja vezana za prilepljene ćelije je ponovo rastvorena sa 160 µl 33% glacijalne sirćetne kiseline (zapr./zapr.) po bunarčiću; ploča je očitana na čitaču mikroploče (Victor) na talasnoj dužini od 570 nm pre i posle dodavanja 33% glacijalne sirćetne kiseline.

[0054] Za potrebe uporedne analize rezultata uvedena je klasifikacija u četiri kategorije na osnovu sposobnosti prijanjanja ispitivanih sojeva.

[0055] Svi sojevi su klasifikovani u sledeće kategorije: neprijanjajući (0), slabo (+), umereno (++) ili jako (+++) prijanjajući, u zavisnosti od vrednosti optičke gustine bakterijskih biofilmova.

[0056] Granica ("prag") optičke gustine (ODc) za mikrotitarsku ploču definisana je kao tri standardne devijacije iznad srednje OD negativne kontrole.

[0057] Sojevi su klasifikovani na sledeći način:

● OD ≤ ODc- ne prijanjaju

● ODc< OD ≤ 2× ODc- slabo prijanjaju

● 2 × ODc< OD ≤ 4 × ODc- umereno prijanjaju

● 4 × ODc< OD - snažno prijanjaju

[0058] Svi testovi su izvedeni u tri ponavljanja i izračunat je prosek rezultata.

[0059] Nakon što je takav korak skrininga završen, mikrobni sojevi korišćeni za in vitro testove su bili Staphilococcus epidermidis R (izolovan iz kliničkih uzoraka) i Staphilococcus aureus (izolovan iz kliničkih uzoraka).

PRIMER 5

[0060] Prijavilac je testirao sposobnost smanjenja, uklanjanja i inhibicije biofilma Staphilococcus epidermidis R i Staphilococcus aureus proizvoda VEA<®>Olio, koji prodaje firma Hulka S.r.l., koji se sastoji od 100% alfa-tokoferil acetata.

[0061] Ploča sa 96 bunarčića je pripremljena u četiri primerka za svaki uslov predviđen eksperimentom, svi testovi su izvedeni na TSB sa 0,25%, 1% i 2,5% D-glukoze.

[0062] Postavljeni uslovi su bili sledeći:

1. Staphilococcus epidermidis R i Staphilococcus aureus (sa brojem 1×10<8>cfu/mL) bez dodavanja VEA Olio (pozitivna kontrola);

2. Staphilococcus epidermidis R i Staphilococcus aureus (sa brojem 1×10<8>cfu/mL) sipan u bunarčić tek nakon ravnomernog oblaganja ploče sa VEA Olio.

[0063] Slika 1 pokazuje da, na TSB medijumu sa 0,25% glukoze, proizvodnja biofilma sojem Staphilococcus epidermidis R bila je 30% uz smanjenje proizvodnje od 70% u prisustvu VEA Olio.

[0064] U TSB medijumu sa 1% glukoze, gornji soj je pokazao proizvodnju biofilma od 14% uz smanjenje od 86% u prisustvu VEA Olio, dok je na TSB medijumu sa 2,5% glukoze pokazao proizvodnju od 30% sa posledično smanjenje od 70% u prisustvu VEA Olio.

[0065] Slika 2 pokazuje da, na TSB medijumu sa 0,25% glukoze, proizvodnja biofilma sojem Staphilococcus aureus bila je 50%, uz smanjenje proizvodnje od 50% u prisustvu VEA Olio.

[0066] U TSB medijumu sa 1% glukoze, sporni soj je pokazao proizvodnju biofilma od 32% uz smanjenje od 68% u prisustvu VEA Olio, dok je na TSB medijumu sa 2,5% glukoze pokazao proizvodnju od 50% sa posledičnim smanjenjem od 50% u prisustvu VEA Olio.

[0067] Ovi rezultati pokazuju da alfa-tokoferil acetat korišćen za eksperimente ima iznenađujuću inhibitornu aktivnost u pogledu formiranja biofilma.

PRIMER 6

[0068] VEA<®>Olio je takođe testiran na sposobnost da smanji, ukloni i inhibira biofilm sledećih mikroorganizama: Staphilococcus aureus Staphilococcus epidermidis, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas putida (Tabela 1).

[0069] Ploča sa 96 bunarčića je pripremljena u četiri primerka za svaki uslov predviđen eksperimentom, svi testovi su izvedeni na TSB sa ili bez VEA<®>Olio.

Tabela 1: Proizvodnja biofilma na TSB medijumu sa ili bez VEA Olio.

1

[0070] Tabela 1 pokazuje da je proizvodnja biofilma od strane nekoliko tipova mikroorganizama bila snažno inhibirana na medijumu TSB+VEA Olio.

[0071] Na primer, proizvodnja biofilma od strane P. aeruginosa bila je 49%, S.epidermidis bila je 39% i S.aureus bila je 44%, s obzirom da je proizvodnja biofilma na TSB medijumu 100%.

[0072] Ovi rezultati pokazuju da alfa-tokoferil acetat korišćen za ove eksperimente pokazuje iznenađujuću inhibitornu aktivnost u pogledu formiranja biofilma od strane različitih mikroorganizama.

PRIMER 7

[0073] Gel dobijen prema Primeru 2 je testiran na sposobnost da redukuje, uklanja i inhibira biofilm istih mikroorganizama navedenih u Primeru 6 (Tabela 2).

[0074] Eksperimentalni uslovi su bili isti kao u Primeru 6.

Tabela 2: Proizvodnja biofilma na TSB medijumu sa ili bez gela prema Primeru 2.

[0075] Tabela 2 pokazuje da je proizvodnja biofilma od strane nekoliko tipova mikroorganizama bila snažno inhibirana na medijumu TSB+GEL (prema Primeru 2).

[0076] Na primer, proizvodnja biofilma od strane P. aeruginosa bila je 54%, P.mirabilis bila je 41% i S.epidermidis bila je 33%, s obzirom da je proizvodnja biofilma na TSB medijumu 100%.

1

Claims (10)

Patentni zahtevi

1. Formulacija za topikalnu upotrebu koja se sastoji od vitamina E ili njegovog estra za terapeutsku upotrebu u uklanjanju, redukciji ili inhibiciji bakterijskog i/ili gljivičnog biofilma, pri čemu navedeni estar vitamina E je estar sa karboksilnom kiselinom formule R-COOH, u kome R je alkil radikal koji ima od 1 do 19 atoma ugljenika, ili alkenil ili alkinil koji ima od 2 do 19 atoma ugljenika.

2. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, naznačena time što navedeni estar je alfatokoferil acetat, n-propionat ili linoleat.

3. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 2, naznačena time što pomenuti estar je alfatokoferil acetat.

4. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, koja se sastoji od acetata vitamina E.

5. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 1, koja se sastoji od alfa-tokoferil acetata.

6. Formulacija za topikalnu upotrebu koja se sastoji u težinskim procentima od ukupne težine formulacije, 20 do 70% acetata vitamina E i 20 do 70% isparljivog silikona za terapeutsku upotrebu u uklanjanju, smanjenju ili inhibiciji bakterijskog i/ili gljivičnog biofilma.

7. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 6, naznačena time što je navedeni isparljivi silikon izabran iz grupe koja sadrži pentamer ciklometikon, tetramer ciklometikon, heksamer ciklometikon, heksametildisiloksan, dimetikon niskog viskoziteta i njihove smeše.

8. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 7, koja dalje sadrži 7 do 13% hidrogenizovanog ricinusovog ulja po težini ukupne težine formulacije.

9. Formulacija za upotrebu prema patentnom zahtevu 8, koja dalje sadrži 7 do 15 težinskih % ukupne težine formulacije uljane komponente izabrane iz grupe koja sadrži biljna ulja i estre masnih kiselina kao što su oktil palmitat, izopropil miristat i etil oleat i njihove smeše.

10. Formulacija za upotrebu prema zahtevu 9, koja dalje sadrži 2 do 3% dimetikonola po težini ukupne težine formulacije.