RS63380B1 - Klaudin-18.2-specifični imunoreceptori i t ćelijski epitopi - Google Patents

Klaudin-18.2-specifični imunoreceptori i t ćelijski epitopi

Info

Publication number
RS63380B1
RS63380B1 RS20220633A RSP20220633A RS63380B1 RS 63380 B1 RS63380 B1 RS 63380B1 RS 20220633 A RS20220633 A RS 20220633A RS P20220633 A RSP20220633 A RS P20220633A RS 63380 B1 RS63380 B1 RS 63380B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cells
cell
antigen
amino acid
cancer
Prior art date
Application number
RS20220633A
Other languages
English (en)
Inventor
Ugur Sahin
Özlem Türeci
Petra Simon
Tana Omokoko
Andrea Breitkreuz
Karolina Anna Mroz
Lisa Hebich
Original Assignee
Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh
Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=53181285&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RS63380(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh, Tron Translationale Onkologie An Der Univ Der Johannes Gutenberg Univ Mainz Gemeinnuetzige Gmbh filed Critical Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh
Publication of RS63380B1 publication Critical patent/RS63380B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70539—MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
    • A61K40/32—T-cell receptors [TCR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K40/00—Cellular immunotherapy
    • A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
    • A61K40/41—Vertebrate antigens
    • A61K40/42—Cancer antigens
    • A61K40/4202—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/575—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 humoral response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/035—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal for targeting to the external surface of a cell, e.g. to the outer membrane of Gram negative bacteria, GPI- anchored eukaryote proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis
TEHNIČKA OBLAST
[0001] Predmetno učenje se odnosi na obezbeđivanje klaudin-18.2-specifičnih imunoreceptora (T ćelijski receptori i veštački T ćelijski receptori (himerni antigenski receptori; CAR)) i T ćelijskih epitopa koji su korisni za imunoterapiju.
POZADINA
[0002] Evolucija imunskog sistema rezultovala je kod kičmenjaka veoma efikasnom mrežom zasnovanom na dva tipa odbrane: urođenom i stečenom imunitetu.
[0003] Nasuprot evolucionom drevnom urođenom imunskom sistemu koji se oslanja na invarijantne receptore koji prepoznaju zajedničke molekulske obrasce asocirane sa patogenima, stečeni imunitet se zasniva na visoko specifičnim antigenskim receptorima na B ćelijama (B limfociti) i T ćelijama (T limfociti) i klonskoj selekciji.
[0004] Dok B ćelije podižu humoralne imunske odgovore sekrecijom antitela, T ćelije posreduju u ćelijskim imunskim odgovorima dovodeći do uništavanja prepoznatih ćelija.
[0005] T ćelije igraju centralnu ulogu u ćelijski posredovanom imunitetu kod ljudi i životinja. Prepoznavanje i vezivanje određenog antigena posredovano je T ćelijskim receptorima (TCR) eksprimiranim na površini T ćelija.
[0006] T ćelijski receptor (TCR) T ćelije može da interaguje sa imunogenim peptidima (epitopima) vezanim za molekule glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) i prezentovanim na površini ciljnih ćelija. Specifično vezivanje TCR pokreće signalnu kaskadu unutar T ćelije što dovodi do proliferacije i diferencijacije u zrelu efektorsku T ćeliju. Kako bi mogli da ciljaju veliki broj različitih antigena, T ćelijski receptori treba da imaju veliku raznolikost.
[0007] Ova raznolikost se dobija genetičkim rearanžiranjem različitih diskontinuiranih segmenata gena koji kodiraju različite strukturne regione TCR. TCR se sastoje od jednog αlanca i jednog β-lanca ili od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. TCR α/β lanci se sastoje od N-terminusnog visoko polimorfnog varijabilnog regiona uključenog u prepoznavanje antigena i invarijantnog konstantnog regiona. Na genetičkom nivou, ovi lanci su razdvojeni u nekoliko regiona, varijabilni (V) region, region raznolikosti (D) (samo β- i δ-lanac), spojni (J) region i konstantni (C) region. Geni humanog β-lanca sadrže preko 60 varijabilnih (V) segmenata, 2 segmenta raznolikosti (D), preko 10 spojnih (J) segmenata, i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni humanog α-lanca sadrže preko 50 V segmenata, i preko 60 J segmenata, ali nemaju D segmente, kao i jedan C segment. Geni murinskog β-lanca sadrže preko 30 varijabilnih (V) segmenata, 2 segmenta raznolikosti (D), preko 10 spojnih (J) segmenata, i 2 segmenta konstantnog regiona (C). Geni murinskog α-lanca sadrže skoro 100 V segmenata, 60 J segmenata, nemaju D segmente, ali jedan C segment. Tokom diferencijacije T ćelija, geni specifičnog T ćelijskog receptora se stvaraju rearanžiranjem jednog V, jednog D (samo β- i δlanac), jednog J i jednog C regiona gena. Raznolikost TCR je dodatno amplifikovana nepreciznim V-(D)-J rearanžmanom pri čemu se nasumični nukleotidi introdukuju i/ili se vrši njihova delecija na mestima rekombinacije. Pošto se rearanžiranje lokusa TCR gena dešava u genomu tokom sazrevanja T ćelija, svaka zrela T ćelija eksprimira samo jedan specifični α/β TCR ili γ/δ TCR.
[0008] Vezivanje MHC i antigena je posredovano regionima koji određuju komplementarnost 1, 2 i 3 (CDR1, CDR2, CDR3) TCR. CDR3 β-lanca koji je najkritičniji za prepoznavanje i vezivanje antigena je kodiran V-D-J spojem rearanžiranog gena TCR β-lanca.
[0009] TCR je deo kompleksa signalne mašinerije, koja uključuje heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanaca, koreceptor CD4 ili CD8 i modul za transdukciju signala CD3 (Slika 1). Dok CD3 lanci vrše transfer aktivacionog signala unutar ćelije, TCR α/β heterodimer je jedini odgovoran za prepoznavanje antigena. Stoga, transfer TCR α/β lanaca nudi mogućnost preusmeravanja T ćelija ka bilo kom antigenu od interesa.
Imunoterapija
[0010] Antigen-specifična imunoterapija ima za cilj da poboljša ili indukuje specifične imunske odgovore kod pacijenata za kontrolu infektivnih ili malignih bolesti. Identifikacija sve većeg broja antigena asociranih sa patogenom i tumorom (TAA) dovela je do široke kolekcije pogodnih ciljeva za imunoterapiju. Ćelije koje prezentuju imunogene peptide (epitope) izvedene iz ovih antigena mogu biti specifično ciljane bilo aktivnim ili pasivnim strategijama imunizacije.
[0011] Aktivna imunizacija ima tendenciju da indukuje i umnoži antigen-specifične T ćelije kod pacijenta, koje mogu da specifično prepoznaju i ubiju bolesne ćelije. Nasuprot tome, pasivna imunizacija se oslanja na adoptivni transfer T ćelija, koje su umnožene i opciono genetički projektovane in vitro (adoptivna T ćelijska terapija).
Vakcinacija
[0012] Vakcine protiv tumora imaju za cilj da indukuju endogene imunske odgovore specifične za tumor pomoću aktivne imunizacije. Za vakcinaciju protiv tumora mogu se upotrebljavati različiti formati antigena, uključujući cele ćelije kancera, proteine, peptide ili vektore za imunizaciju kao što su RNK, DNK ili virusni vektori koji se mogu primeniti bilo direktno in vivo ili in vitro pulsiranjem DC nakon čega sledi transfer u pacijenta.
[0013] Broj kliničkih studija u kojima se mogu identifikovati imunski odgovori indukovani terapijom stalno raste zbog poboljšanja strategija imunizacije i postupaka za detekciju antigen-specifičnih imunskih odgovora (Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Schmitt, M. et al. (2008) Blood 111, 1357-1365; Speiser, D.E. et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 105, 3849-3854; Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784).
[0014] Međutim, u većini slučajeva detektovani imunski odgovori ne mogu sistemski biti korelisani sa kliničkim ishodima (Curigliano, G. et al. (2006) Ann. Oncol. 17, 750-762; Rosenberg, S.A. et al. (2004) Nat. Med.10, 909-915).
[0015] Tačna definicija peptidnih epitopa izvedenih iz tumorskih antigena prema tome može doprineti poboljšanju specifičnosti i efikasnosti strategija vakcinacije, kao i postupaka za imunomonitoring.
Adoptivni transfer ćelija (ACT)
[0016] Imunoterapija zasnovana na ACT može se široko definisati kao oblik pasivne imunizacije sa prethodno senzibilisanim T ćelijama koje se prenose u neimunske primaoce ili u autolognog domaćina posle ex vivo umnožavanja sa niskih učestalosti prekursora na klinički relevantne brojeve ćelija. Tipovi ćelija koje su upotrebljavane za ACT eksperimente su ćelije ubice aktivirane limfokinom (LAK) (Mule, J.J. et al. (1984) Science 225, 1487-1489; Rosenberg, S.A. et al. (1985) N. Engl. J. Med. 313, 1485-1492), tumor-infiltrirajući limfociti (TIL) (Rosenberg, S.A. et al. (1994) J. Natl. Cancer Inst. 86, 1159-1166), donorski limfociti posle transplantacije hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT) kao i tumor-specifične T ćelijske linije ili klonovi (Dudley, M.E. et al. (2001) J. Immunother. 24, 363-373; Yee, C. et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99, 16168-16173). Pokazano je da adoptivni transfer T ćelija ima terapijsku aktivnost protiv humanih virusnih infekcija kao što je CMV. Dok CMV infekciju i reaktivaciju endogenih latentnih virusa kontroliše imunski sistem kod zdravih pojedinaca, ona rezultuje značajnim morbiditetom i mortalitetom kod imunokompromitovanih pojedinaca kao što su primaoci transplantacije ili pacijenti sa AIDS.
[0017] Riddell i saradnici su demonstrirali rekonstituciju virusnog imuniteta pomoću adoptivne T ćelijske terapije kod pacijenata sa supresijom imuniteta posle transfera CD8+ CMV-specifičnih T ćelijskih klonova izvedenih od HLA-podudarnih CMV-seropozitivnih donora transplanta (Riddell, S.R. (1992) Science 257, 238-241).
[0018] Kao alternativni pristup, poliklonalne CMV- ili EBV-specifične populacije T ćelija izvedene od donora prenete su u primaoce transplantacije što je rezultovalo povećanom postojanošću prenetih T ćelija (Rooney, C.M. et al. (1998) Blood 92, 1549-1555; Peggs, K.S. et al. (2003) Lancet 362, 1375-1377).
[0019] Za adoptivnu imunoterapiju melanoma Rosenberg i saradnici su uspostavili ACT pristup koji se oslanja na infuziju in vitro umnoženih autolognih tumor-infiltrirajućih limfocita (TIL) izolovanih iz resektovanih tumora u kombinaciji sa nemijeloablativnom hemioterapijom sa limfodepletiranjem i visokom dozom IL2. Nedavno objavljena klinička studija rezultovala je objektivnom stopom odgovora od -50% lečenih pacijenata koji pate od metastatskog melanoma (Dudley, M.E. et al. (2005) J. Clin. Oncol.23: 2346-2357).
[0020] Međutim, pacijenti moraju ispuniti nekoliko premisa kako bi bili podobni za ACT imunoterapiju. Moraju imati resektabilne tumore. Tumori moraju generisati vijabilne TIL u uslovima ćelijske kulture. TIL moraju biti reaktivni protiv tumorskih antigena, i moraju se umnožavati in vitro do dovoljnog broja. Naročito kod drugih kancera koji nisu melanom, teško je dobiti takve tumor-reaktivne TIL. Štaviše, ponovljena in vitro stimulacija i klonska ekspanzija normalnih humanih T limfocita rezultuje progresivnim smanjenjem aktivnosti telomeraze i skraćivanjem telomera što rezultuje replikativnim starenjem i smanjenim potencijalom za postojanost prenetih T ćelija (Shen, X. et al. (2007) J Immunother. 30: 123-129).
ACT koji upotrebljava gen-projektovane T ćelije
[0021] Pristup koji prevazilazi ograničenja ACT je adoptivni transfer autolognih T ćelija reprogramiranih da eksprimiraju tumor-reaktivni imunoreceptor definisane specifičnosti tokom kratkotrajne ex vivo kulture koja je praćena reinfuzijom u pacijenta (Kershaw M.H. et al. (2013) Nature Reviews Cancer 13 (8): 525-41). Ova strategija čini ACT primenljivim na niz uobičajenih maligniteta čak i ukoliko su tumor-reaktivne T ćelije odsutne kod pacijenta. Pošto se antigena specifičnost T ćelija u potpunosti oslanja na heterodimerni kompleks TCR α- i β-lanca, transfer kloniranih TCR gena u T ćelije nudi potencijal da se one preusmere ka bilo kom antigenu od interesa. Prema tome, TCR genska terapija obezbeđuje atraktivnu strategiju za razvoj antigen-specifične imunoterapije sa autolognim limfocitima kao opcijom lečenja. Glavne prednosti transfera TCR gena su stvaranje terapijskih količina antigenspecifičnih T ćelija unutar nekoliko dana i mogućnost introdukovanja specifičnosti koje nisu prisutne u endogenom TCR repertoaru pacijenta.
[0022] Nekoliko grupa je demonstriralo, da je transfer TCR gena atraktivna strategija za preusmeravanje antigen-specifičnosti primarnih T ćelija (Morgan, R.A. et al. (2003) J. Immunol. 171, 3287-3295; Cooper, L.J. et al. (2000) J. Virol. 74, 8207-8212; Fujio, K. et al. (2000) J. Immunol. 165, 528-532; Kessels, H.W. et al. (2001) Nat. Immunol. 2, 957-961; Dembic, Z. et al. (1986) Nature 320, 232-238).
[0023] Rozenberg i njegova grupa su nedavno demonstrirali izvodljivost TCR genske terapije kod ljudi u kliničkim ispitivanjima za lečenje malignog melanoma. Adoptivni transfer autolognih limfocita retrovirusno transdukovanih sa melanom/melanocit antigen-specifičnim TCR rezultovao je regresijom kancera kod do 30% lečenih pacijenata sa melanomom (Morgan, R.A. et al. (2006) Science 314, 126-129; Johnson, L.A. et al. (2009) Blood 114, 535-546).
Himerni antigenski receptori
[0024] Himerni antigenski receptori (CAR) su projektovani receptori koji kombinuju jednolančani varijabilni fragment (scFv) monoklonalnog antitela sa unutarćelijskim delom koji se sastoji od jednog ili više signalnih domena za aktivaciju T ćelija. CAR prepoznaju nativne antigene na način koji nije ograničen sa MHC i prema tome se mogu upotrebljavati kod svih pojedinaca bez obzira koji je njihov HLA tip i funkcionalni su u CD4+ kao i CD8+ T ćelijama.
[0025] Mnoštvo CAR je bilo saopšteno tokom protekle decenije, koji ciljno deluju na panel različitih tumorskih antigena na ćelijskoj površini. Njihove biološke funkcije su dramatično poboljšane inkorporisanjem kostimulatornog domena koji je rezultovao tripartitnim receptorima (scFv, CD28, CD3ζ), nazvanim CAR 2. generacije. CAR 3. generacije obuhvataju dopunske domene kostimulatornih molekula kao što su OX40 i 4-1BB kako bi se poboljšao proliferativni kapacitet i postojanost modifikovanih T-ćelija (Slika 2).
Ciljne strukture za antigen-specifičnu imunoterapiju
[0026] Otkriće višestrukih antigena asociranih sa tumorom (TAA) obezbedilo je osnovu za antigen-specifične koncepte imunoterapije (Novellino, L. et al. (2005) Cancer Immunol. Immunother. 54, 187-207). TAA su neobični proteini eksprimirani na tumorskim ćelijama usled njihove genetičke nestabilnosti, koji nemaju ili imaju ograničenu ekspresiju u normalnim ćelijama. Ovi TAA mogu dovesti do specifičnog prepoznavanja malignih ćelija od strane imunskog sistema.
[0027] Molekulsko kloniranje TAA pregledom ekspresionih biblioteka cDNA izvedenih iz tumora upotrebom autolognih tumor-specifičnih T ćelija (van der Bruggen, P. et al. (1991) Science 254, 1643-1647) ili cirkulišućih antitela (Sahin, U. et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 11810-11813), pristupa reverzne imunologije, biohemijskih postupaka (Hunt, D.F. et al. (1992) Science 256, 1817-1820), analize ekspresije gena ili strategija in silico kloniranja (Helftenbein, G. et al. (2008) Gene 414, 76-84) dovele su do značajnog broja ciljnih kandidata za imunoterapijske strategije. TAA spadaju u nekoliko kategorija, uključujući antigene diferencijacije, prekomerno eksprimirane antigene, tumor-specifične splajs varijante, mutirane genske proizvode, virusne antigene i antigene kancera testisa (CTA). Porodica kancera testisa je veoma obećavajuća kategorija TAA, pošto je njihova ekspresija ograničena na testise i mnoštvo različitih tumorskih entiteta (Scanlan, M.J. et al. (2002) Immunol. Rev.188, 22-32). Do sada je opisano više od 50 CT gena (Scanlan, M.J. et al. (2004) Cancer Immun. 4, 1) i nekim od njih je posvećena pažnja u kliničkim studijama (Adams, S. et al. (2008) J. Immunol. 181, 776-784; Atanackovic, D. et al. (2004) J. Immunol.
172, 3289-3296; Chen, Q. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 9363-9368; Connerotte, T. et al. (2008). Cancer Res. 68, 3931-3940; Davis, I.D. et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 10697-10702; Jager, E. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 12198-12203; Marchand, M. et al. (1999) Int. J. Cancer 80, 219-230; Schuler-Thurner, B. et al. (2000) J. Immunol.165, 3492-3496).
[0028] Uprkos rastućem broju atraktivnih ciljnih struktura za imunoterapijske pristupe, specifični klonovi T ćelija ili linije definisane HLA restrikcije postoje samo za nekoliko njih Chaux, P. et al. (1999) J. Immunol. 163, 2928-2936; Zhang, Y. et al. (2002) Tissue Antigens 60, 365-371; Zhao, Y. et al. (2005) J. Immunol. 174, 4415-4423).
[0029] Klaudini su integralni membranski proteini koji su locirani unutar čvrstih spojeva epitela i endotela. Predviđeno je da klaudini imaju četiri transmembranska segmenta sa dve vanćelijske petlje, i N- i C-terminuse locirane u citoplazmi. Klaudin (CLDN) porodica transmembranskih proteina igra ključnu ulogu u održavanju čvrstih spojeva epitela i endotela i takođe može igrati ulogu u održavanju citoskeleta i ćelijskoj signalizaciji. CLDN18 pripada porodici klaudina, koji su molekuli ćelijske površine sa četiri domena koji se protežu kroz membranu uključeni u formiranje čvrstih spojeva (Tsukita S, Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2:285-93). Humani CLDN18 gen ima dva alternativna prva egzona, što dovodi do dve izoforme proteina (CLDN18.1 i CLDN18.2) koje se razlikuju u 69 N-terminusnih aminokiselina (Niimi T, MolCellBiol 2001; 21:7380-90), uključujući prvu vanćelijsku petlju (Slika 4A). Transkripciono profilisanje ograničenog skupa tkiva pokazalo je da se ove izoforme opredeljuju ka različitim lozama, pri čemu se CLDN18.1 pretežno eksprimira u tkivu pluća dok CLDN18.2 pokazuje specifičnost za želudac. Ekspresija CLDN18.2 je ograničena na kratkoživeći diferencirani epitel mukoze želuca i odsutan je u zoni matičnih ćelija želuca i bilo kom drugom zdravom tkivu. Ekspresija CLDN18.2 je asocirana sa gastroezofagealnim kancerom, kancerom pankreasa, i drugim kancerima (Slika 4B, C; Sahin U et al., Clin Cancer Res 2008; 14:7624-34; Karanjawala ZE et al., Am J Surg Pathol 2008; 32:188-96). Rekombinantno mAb prema ovom cilju je trenutno u kliničkim ispitivanjima faze II, ali evaluaciji CLDN18.2 kao cilja za pristupe terapija zasnovanih na T ćelijama još uvek nije posvećena pažnja.
[0030] Česta prekomerna ekspresija CLDN18.2 na tumorima kvalifikuje ovaj molekul kao veoma atraktivan cilj za razvoj terapeutika usmerenih prema CLDN18.2, kao što su terapeutici vakcine i terapijska antitela. Međutim, do sada nisu opisani HLA-A<∗>2-restriktivni CLDN18.2 T ćelijski epitopi i T ćelijski receptori ili CAR koji ciljaju CLDN18.2 i nije poznato da li ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 mogu biti ciljane in vivo imunoterapijama koje uključuju T ćelije upotrebom pristupa aktivne ili pasivne imunizacije.
OPIS
Sažetak pronalaska
[0031] Predmetni pronalazak je definisan priloženim patentnim zahtevima.
Sažetak učenja
[0032] Predmetna objava obezbeđuje učenja koja u nekim pogledima prevazilaze objavu pronalaska kao takvu, koja je definisana isključivo priloženim patentnim zahtevima. Učenja su obezbeđena kako bi se stvarni pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i kako bi se ilustrovali mogući povezani tehnički razvoji. Takve dodatne tehničke informacije koje ne spadaju unutar obima priloženih patentnih zahteva nisu deo pronalaska. Posebno, termine "primer izvođenja" i "aspekt" ne treba tumačiti kao da nužno označavaju pronalazak za koji se zahteva zaštita patenta, osim ukoliko predmetna tema ne spada unutar obima patentnih zahteva.
[0033] Ovo učenje se odnosi na T ćelijske receptore i veštačke T ćelijske receptore specifične za CLDN18.2 antigen asociran sa tumorom, posebno kada je prisutan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija ili je prezentovan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija ili antigenprezentujuća ćelija, kao i peptide koji sadrže epitope koje prepoznaju ovi T ćelijski receptori, tj. CLDN18.2-T ćelijski epitopi.
[0034] Adoptivnim transferom T ćelija projektovanih da eksprimiraju takav T ćelijski receptor ili veštački T ćelijski receptor ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 mogu biti specifično ciljane, što dovodi do selektivnog uništavanja ćelija kancera. Štaviše, T ćelijski epitopi obezbeđeni u skladu sa učenjem korisni su za dizajniranje vakcina protiv kancera koji eksprimiraju CLDN18.2.
[0035] U jednom aspektu, učenje se odnosi na peptid koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, peptid je dugačak 100 ili manje, 50 ili manje, 20 ili manje, ili 10 ili manje amino-kiselina. U jednom primeru izvođenja, peptid se može obraditi kako bi se proizveo peptid koji se sastoji od amino-kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, peptid se sastoji od amino-kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence.
[0036] U jednom primeru izvođenja, peptid je peptid koga prezentuje MHC klase I ili klase II, poželjno peptid koga prezentuje MHC klase I, ili, ukoliko je prisutan u ćelijama, može biti obrađen kako bi se proizveo proizvod njegove obrade koji je peptid koga prezentuje MHC klase I ili klase II, poželjno peptid koga prezentuje MHC klase I. Poželjno, navedeni peptid koga prezentuje MHC klase I ili klase II ima sekvencu koja suštinski odgovara datoj aminokiselinskoj sekvenci, tj. amino-kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence. Poželjno, peptid u skladu sa učenjem sposoban je da stimuliše ćelijski odgovor protiv bolesti koji uključuje ćelije koje su okarakterisane prezentovanjem CLDN18.2 sa MHC klase I.
[0037] U dodatnim aspektima, učenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz učenja i ćeliju koja sadrži nukleinsku kiselinu. Nukleinska kiselina može biti rekombinantna nukleinska kiselina. Nukleinska kiselina može biti prisutna u plazmidu ili ekspresionom vektoru i može biti funkcionalno vezana za promotor. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je RNK. Poželjno, ćelija eksprimira peptid. Ćelija može biti rekombinantna ćelija i može sekretovati kodirani peptid ili proizvod njegove obrade, može ga eksprimirati na površini i poželjno može dopunski eksprimirati MHC molekul koji se vezuje za navedeni peptid ili proizvod njegove obrade i poželjno prezentuje navedeni peptid ili proizvod njegove obrade na ćelijskoj površini. U jednom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul endogeno. U dodatnom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul i/ili peptid na rekombinantni način. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0038] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na ćeliju koja prezentuje peptid iz učenja ili proizvod njegove obrade, pri čemu je proizvod obrade poželjno peptid koji ima datu aminokiselinsku sekvencu, tj. amino-kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je ćelija koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz učenja. Poželjno navedena ćelija eksprimira navedenu nukleinsku kiselinu tako da proizvodi navedeni peptid. Opciono navedena ćelija obrađuje navedeni peptid tako da proizvede peptid koji se sastoji od amino-kiselinske sekvence odabrane iz grupe koja se sastoji SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene aminokiselinske sekvence. Ćelija može da prezentuje peptid ili proizvod njegove obrade pomoću MHC molekula na svojoj površini. U jednom primeru izvođenja, ćelija endogeno eksprimira MHC molekul. U dodatnom primeru izvođenja, ćelija rekombinantno eksprimira MHC molekul. U jednom primeru izvođenja, MHC molekuli ćelije su snabdeveni (pulsirani) sa peptidom dodavanjem peptida ćeliji. Ćelija može rekombinantno da eksprimira peptid i da prezentuje navedeni peptid ili proizvod njegove obrade na ćelijskoj površini. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigen-prezentujuća ćelija, kao što je dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0039] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na imunoreaktivnu ćeliju koja je reaktivna sa peptidom iz učenja, posebno kada je prezentovan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija.
1
Imunoreaktivna ćelija može biti ćelija koja je in vitro senzibilisana da prepozna peptid. Imunoreaktivna ćelija može biti T ćelija, poželjno citotoksična T ćelija. Poželjno, imunoreaktivna ćelija se vezuje za sekvencu koja suštinski odgovara datoj amino-kiselinskoj sekvenci, tj. amino-kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence, posebno kada je vezana za MHC kao što je MHC na površini ćelije kao što je bolesna ćelija.
[0040] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na vezujući agens koji se vezuje za peptid iz učenja, opciono u kompleksu sa MHC molekulom.
[0041] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na T ćelijski receptor koji se vezuje za peptid iz učenja, opciono u kompleksu sa MHC molekulom, i poželjno je reaktivan sa navedenim peptidom, ili polipeptidnim lancem navedenog T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, polipeptidni lanac navedenog T ćelijskog receptora je α-lanac T ćelijskog receptora ili β-lanac T ćelijskog receptora.
[0042] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na α-lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor koji sadrži navedeni α-lanac T ćelijskog receptora,
pri čemu je navedeni α-lanac T ćelijskog receptora odabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) α-lanca T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence α-lanca T ćelijskog receptora odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 i 18 ili njihove varijante i
(ii) α-lanca T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu α-lanca T ćelijskog receptora odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 10, 12, 14, 16 i 18 ili njihovog fragmenta, ili varijante navedene sekvence ili fragmenta.
[0043] U jednom primeru izvođenja, navedene SEQ ID NO: su odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 8, 10, 14 i 18 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0044] U jednom primeru izvođenja, navedene SEQ ID NO: su odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 10, 12 i 14 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0045] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na β-lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor koji sadrži navedeni β-lanac T ćelijskog receptora,
pri čemu je navedeni β-lanac T ćelijskog receptora odabran iz grupe koja se sastoji od:
(i) β-lanca T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence β-lanca T ćelijskog receptora odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 i 19 ili njihove varijante
i
(ii) β-lanca T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu β-lanca T ćelijskog receptora odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 11, 13, 15, 17 i 19 ili njihovog fragmenta, ili varijante navedene sekvence ili fragmenta.
[0046] U jednom primeru izvođenja, navedene SEQ ID NO: su odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 9, 11, 15 i 19 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0047] U jednom primeru izvođenja, navedene SEQ ID NO: su odabrane iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 11, 13 i 15 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0048] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na T ćelijski receptor odabran iz grupe koja se sastoji od:
(I) T ćelijskog receptora koji sadrži:
(i) α-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jednu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence α-lanca T ćelijskog receptora SEQ ID NO: x ili njene varijante, i
(ii) β-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži najmanje jedannu, poželjno dve, poželjnije sve tri CDR sekvence β-lanca T ćelijskog receptora SEQ ID NO: x+1 ili njene varijante; pri čemu je x odabran iz grupe koja se sastoji od 8, 10, 12, 14, 16 i 18
i
(II) T ćelijskog receptora koji sadrži:
(i) α-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu α-lanca T ćelijskog receptora SEQ ID NO: x ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta, i
(ii) β-lanac T ćelijskog receptora koji sadrži sekvencu β-lanca T ćelijskog receptora SEQ ID NO: x+1 ili njen fragment, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta;
pri čemu je x odabran iz grupe koja se sastoji od 8, 10, 12, 14, 16 i 18.
[0049] U jednom primeru izvođenja, navedeni x je odabran iz grupe koja se sastoji od 8, 10, 14 i 18 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 6 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0050] U jednom primeru izvođenja, navedeni x je odabran iz grupe koja se sastoji od 10, 12 i 14 i navedeni T ćelijski receptor je reaktivan sa peptidom koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 7 ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence.
[0051] U jednom primeru izvođenja, vezivanje navedenog T ćelijskog receptora kada se eksprimira od strane T ćelija i/ili kada je prisutan na T ćelijama za epitope CLDN18.2-peptida kao što je prethodno opisano prezentovanim na ćelijama kao što su ćelije kancera, rezultuje proliferacijom i/ili aktivacijom navedenih T ćelija, pri čemu navedene aktivirane T ćelije poželjno oslobađaju citotoksične faktore, npr. perforine i granzime, i iniciraju citolizu i/ili apoptozu ćelija kancera.
[0052] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na veštački T ćelijski receptor koji se vezuje za klaudin-18.2 (CLDN18.2). U jednom primeru izvođenja, vezivanje je specifično vezivanje.
[0053] U jednom primeru izvođenja, navedeni CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji kancera. U jednom primeru izvođenja navedeni CLDN18.2 se eksprimira na površini ćelije kancera. U jednom primeru izvođenja navedeni veštački T ćelijski receptor se vezuje za vanćelijski domen ili za epitop u vanćelijskom domenu CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja navedeni veštački T ćelijski receptor se vezuje za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija. U jednom primeru izvođenja navedeni veštački T ćelijski receptor se vezuje za prvu vanćelijsku petlju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, vezivanje navedenog veštačkog T ćelijskog receptora kada se eksprimira od strane T ćelija i/ili kada je prisutan na T ćelijama za CLDN18.2 prisutan na ćelijama kao što su ćelije kancera rezultuje proliferacijom i/ili aktivacijom navedenih T ćelija, pri čemu navedene aktivirane T ćelije poželjno oslobađaju citotoksične faktore, npr. perforine i granzime, i iniciraju citolizu i/ili apoptozu ćelija kancera.
1
[0054] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži vezujući domen za CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 se sastoji od egzodomena navedenog veštačkog T ćelijskog receptora. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži jednolančani varijabilni fragment (scFv) CLDN18.2 antitela. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca imunoglobulina (VH) sa specifičnošću za CLDN18.2 (VH(CLDN18.2)) i varijabilni region lakog lanca imunoglobulina (VL) sa specifičnošću za CLDN18.2 (VL(CLDN18.2)). U jednom primeru izvođenja, navedeni varijabilni region teškog lanca (VH) i odgovarajući varijabilni region lakog lanca (VL) spojeni su putem peptidnog linkera, poželjno peptidnog linkera koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu (GGGGS)3. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži VH(CLDN18.2) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži VL(CLDN18.2) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži VH(CLDN18.2) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta i VL(CLDN18.2) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 35 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta.
[0055] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao vezujući domen za CLDN18.2 ili antitelo za CLDN18.2 koje sadrži VH(CLDN18.2) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta i VL(CLDN18.2) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta i/ili je u kompeticiji sa navedenim CLDN18.2-vezujućim domenom ili CLDN18.2-antitelom za vezivanje za CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 prepoznaje isti ili suštinski isti epitop kao vezujući domen za CLDN18.2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 35 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta i/ili u je kompeticiji sa navedenim CLDN18.2-vezujućim domenom za vezivanje za CLDN18.2. Vezujući domen koji je u kompeticiji sa drugim vezujućim domenom ili antitelom za vezivanje za cilj poželjno je antagonističan prema navedenom drugom vezujućem domenu ili antitelu.
[0056] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži transmembranski domen. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen je hidrofobni alfa heliks koji se proteže kroz membranu. U jednom primeru izvođenja, transmembranski domen sadrži CD28 transmembranski domen ili njegov fragment.
[0057] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži T ćelijski signalni domen. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen lociran je unutarćelijski. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen sadrži CD3-zeta, poželjno endodomen CD3-zeta, opciono u kombinaciji sa CD28. U jednom primeru izvođenja, T ćelijski signalni domen sadrži sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 40 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0058] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži signalni peptid koji usmerava nascentni protein u endoplazmin retikulum. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid prethodi vezujućem domenu za CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, signalni peptid sadrži sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 37 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0059] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži spejser region koji povezuje vezujući domen za CLDN18.2 sa transmembranskim domenom. U jednom primeru izvođenja, spejser region dozvoljava vezujućem domenu za CLDN18.2 da se orijentiše u različitim pravcima kako bi se olakšalo prepoznavanje CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, spejser region sadrži zglobni region od IgG1. U jednom primeru izvođenja, spejser region sadrži sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 38 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene sekvence ili fragmenta.
[0060] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži strukturu: NH2 - signalni peptid - vezujući domen za CLDN18.2 - spejser region - transmembranski domen - T ćelijski signalni domen - COOH.
[0061] U jednom primeru izvođenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja sadrži aminokiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 41 ili njenim fragmentom, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta.
[0062] Prethodno navedeni T ćelijski receptori i veštački T ćelijski receptori su poželjno specifični za CLDN18.2 antigen asociran sa tumorom, posebno kada su prisutni na površini
1
ćelije kao što je bolesna ćelija ili kada su prisutni na površini ćelije kao što je bolesna ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija.
[0063] T ćelijski receptori i veštački T ćelijski receptori iz učenja mogu biti eksprimirani od strane i/ili biti prisutni na površini ćelija kao što su T ćelije.
[0064] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili koja kodira veštački T ćelijski receptor iz učenja. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je rekombinantna nukleinska kiselina. U jednom primeru izvođenja, nukleinska kiselina je u obliku vektora ili u obliku RNK.
[0065] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na ćeliju koja sadrži lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili veštački T ćelijski receptor iz učenja i/ili koja sadrži nukleinsku kiselinu koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili koji kodira veštački T ćelijski receptor iz učenja. U jednom primeru izvođenja, navedena nukleinska kiselina je RNK, poželjno in vitro transkribovana RNK. Ćelija može biti ćelija koja eksprimira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili veštački T ćelijski receptor iz učenja i/ili koja može imati lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili veštački T ćelijski receptor iz učenja na svojoj ćelijskoj površini. U jednom primeru izvođenja, navedena ćelija je ćelija koja je korisna za adoptivni transfer ćelija. Ćelija može biti efektorska ili matična ćelija, poželjno imunoreaktivna ćelija. Imunoreaktivna ćelija može biti T ćelija, poželjno citotoksična T ćelija. U jednom primeru izvođenja, imunoreaktivna ćelija je reaktivna sa CLDN18.2 antigenom asociranim sa tumorom. U jednom primeru izvođenja, navedeni CLDN18.2 je prisutan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija. U jednom primeru izvođenja, navedeni CLDN18.2 je prezentovan na površini ćelije kao što je bolesna ćelija ili antigen-prezentujuća ćelija, i imunoreaktivna ćelija je reaktivna sa peptidom iz učenja, posebno kada je prezentovan u kontekstu MHC, i poželjno se vezuje za sekvencu koja suštinski odgovara datoj aminokiselinskoj sekvenci, tj. amino-kiselinskoj sekvenci odabranoj iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 6 i 7 ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence. U jednom primeru izvođenja, navedenoj ćeliji nedostaje površinska ekspresija endogenog TCR ili je specifična za antigen koji nije srodan sa CLDN18.2.
[0066] U jednom primeru izvođenja, ćelije iz učenja pre upotrebe u adoptivnom transferu ćelija podvrgnute su antigen-specifičnom umnožavanju i ponovnom izazivanju, pri čemu se antigen-specifično umnožavanje i ponovno izazivanje mogu izvršiti izlaganjem ćelija
1
poželjno autolognim antigen-prezentujućim ćelijama koje prezentuju CLDN18.2 ili njegov peptidni fragment.
[0067] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na postupak proizvodnje imunoreaktivne ćelije koji sadrži korak transdukcije T ćelije sa nukleinskom kiselinom koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira lanac T ćelijskog receptora ili T ćelijski receptor iz učenja ili koja kodira veštački T ćelijski receptor iz učenja.
[0068] Štaviše, predmetno učenje generalno obuhvata lečenje bolesti ciljnim delovanjem na bolesne ćelije kao što su ćelije kancera, posebno ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2. Postupci obezbeđuju selektivnu eradikaciju ćelija koje eksprimiraju na svojoj površini i/ili prezentuju CLDN18.2 antigen asociran sa tumorom, čime se minimalizuju neželjeni efekti na normalne ćelije koje ne eksprimiraju i/ili ne prezentuju CLDN18.2. Stoga, poželjne bolesti za terapiju su one u kojima se CLDN18.2 eksprimira i opciono prezentuje, kao što su bolesti kancera, posebno one koje su ovde opisane.
[0069] Kada se primenjuje peptid iz učenja, nukleinska kiselina koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz učenja ili ćelija iz učenja koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu, lečenje poželjno uključuje aktivnu imunizaciju. Poželjno, CLDN18.2-specifične T ćelije se umnožavaju u pacijentu, koje su sposobne da prepoznaju i ubiju bolesne ćelije. Kada se primenjuje imunoreaktivna ćelija iz učenja, T ćelijski receptor iz učenja, veštački T ćelijski receptor iz učenja, nukleinska kiselina iz učenja koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira T ćelijski receptor iz učenja ili koja kodira veštački T ćelijski receptor iz učenja ili ćelija iz učenja koja sadrži T ćelijski receptor ili veštački T ćelijski receptor iz učenja i/ili sadrži nukleinsku kiselinu iz učenja koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira T ćelijski receptor iz učenja ili koja kodira veštački T ćelijski receptor iz učenja, lečenje poželjno uključuje pasivnu imunizaciju. Poželjno, CLDN18.2-specifične T ćelije koje su sposobne da prepoznaju i ubiju bolesne ćelije i koje su opciono genetički projektovane i/ili umnožene in vitro se adoptivno prenose pacijentu.
[0070] U jednom aspektu, učenje se odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži jedno ili više od:
(i) peptid iz učenja;
(ii) nukleinska kiselina iz učenja;
(iii) ćelija iz učenja;
(iv) imunoreaktivna ćelija iz učenja;
(v) vezujući agens iz učenja;
1
(vi) T ćelijski receptor iz učenja; i
(vi) veštački T ćelijski receptor iz učenja.
[0071] Farmaceutska kompozicija iz učenja može da sadrži farmaceutski prihvatljiv nosač i može opciono da sadrži jedan ili više adjuvanasa, stabilizatora itd. Farmaceutska kompozicija može biti u obliku terapijske ili profilaktičke vakcine. U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija je za upotrebu u lečenju ili preveniranju bolesti kancera kao što su one koje su ovde opisane.
[0072] Primena farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano može da obezbedi epitope koje prezentuje MHC klase II koji su sposobni da izazovu odgovor CD4+ pomoćničkih T ćelija i/ili odgovor CD8+ T ćelija prema CLDN18.2 (uključujući ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 na svojoj površini i/ili prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula). Alternativno ili dopunski, primena farmaceutske kompozicije kao što je prethodno opisano može da obezbedi epitope koje prezentuje MHC klase I koji su sposobni da izazovu odgovor CD8+ T ćelija prema CLDN18.2.
[0073] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na postupak lečenja ili preveniranja bolesti kancera koji se sastoji od primene pacijentu farmaceutske kompozicije iz učenja.
[0074] U dodatnom aspektu, učenje se odnosi na peptid iz učenja, nukleinsku kiselinu iz učenja, ćeliju iz učenja, imunoreaktivnu ćeliju iz učenja, vezujući agens iz učenja, T ćelijski receptor iz učenja, ili veštački T ćelijski receptor iz učenja za upotrebu u terapiji, posebno za upotrebu u lečenju ili preveniranju kancera.
[0075] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za indukovanje imunskog odgovora kod subjekta, koji sadrži primenu subjektu farmaceutske kompozicije iz učenja.
[0076] Sledeći aspekt se odnosi na postupak za stimulisanje, prajmovanje i/ili umnožavanje T ćelija, koji sadrži dovođenje u kontakt T ćelija sa jednim ili više od: peptida iz učenja, nukleinske kiseline iz učenja koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz učenja, ćelije iz učenja koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu i/ili ćelije iz učenja koja prezentuje peptid iz učenja ili proizvod njegove obrade. U jednom primeru izvođenja, peptid iz učenja se prezentuje u kontekstu MHC molekula kao što su MHC molekuli na površini ćelija, npr. antigen-prezentujućih ćelija.
[0077] U ovom aspektu, učenje se može odnositi na postupak za pripremanje CLDN18.2-specifičnih T ćelija. T ćelije mogu biti stimulisane, prajmovane i/ili umnožene in vitro ili in vivo. Poželjno, T ćelije su prisutne u uzorku dobijenom od subjekta. Stimulisane, prajmovane
1
i/ili umnožene T ćelije mogu da se primene subjektu i mogu biti autologne, alogene, singene za subjekta.
[0078] Učenje u prethodnim aspektima postupka za indukovanje imunskog odgovora kod subjekta ili postupka za stimulisanje, prajmovanje i/ili umnožavanje T ćelija može se odnositi na postupak za lečenje bolesti kancera kod subjekta.
[0079] Sledeći aspekt se odnosi na postupak ubijanja ćelija kancera kod subjekta, koji sadrži korak obezbeđivanja subjektu terapijski efikasne količine peptida iz učenja, nukleinske kiseline iz učenja, ćelije iz učenja, imunoreaktivne ćelije iz učenja, vezujućeg agensa iz učenja, T ćelijskog receptora iz učenja, ili veštačkog T ćelijskog receptora iz učenja.
[0080] Kompozicije i agensi koji su ovde opisani poželjno su sposobni da indukuju ili promovišu ćelijski odgovor, poželjno aktivnost citotoksičnih T ćelija, prema bolesti koja je okarakterisana ekspresijom CLDN18.2 i/ili prezentovanjem CLDN18.2 sa MHC klase I, npr. bolest kancera.
[0081] U jednom aspektu, učenje obezbeđuje agense i kompozicije koji su ovde opisani za upotrebu u postupcima lečenja koji su ovde opisani.
[0082] Ovde opisana lečenja bolesti kancera mogu se kombinovati sa hirurškom resekcijom i/ili zračenjem i/ili tradicionalnom hemioterapijom.
[0083] U sledećem aspektu, učenje se odnosi na postupak za određivanje imunskog odgovora kod subjekta, koji sadrži određivanje T ćelija reaktivnih sa peptidom iz učenja ili ćelijom iz učenja koja prezentuje peptid iz učenja ili proizvod njegove obrade u biološkom uzorku koji je izolovan iz subjekta. Postupak može da sadrži sledeće korake:
(a) inkubiranje uzorka koji sadrži T ćelije izolovane iz subjekta sa jednim ili više od:
(i) peptid iz učenja;
(ii) nukleinska kiselina iz učenja koja sadrži nukleotidnu sekvencu koja kodira peptid iz učenja; i
(iii) ćelija iz učenja koja sadrži navedenu nukleinsku kiselinu ili ćelija iz učenja koja prezentuje peptid iz učenja ili proizvod njegove obrade; i
(b) detektovanje specifične aktivacije T ćelija, na osnovu čega se utvrđuje prisustvo ili odsustvo imunskog odgovora kod navedenog subjekta.
1
[0084] Učenje u prethodnim aspektima postupka za određivanje imunskog odgovora kod subjekta može se odnositi na postupak za dijagnostikovanje bolesti kancera kod subjekta.
[0085] U jednom primeru izvođenja postupaka za dijagnozu, biološki uzorak je iz tkiva ili organa pri čemu ćelije kada su tkivo ili organ bez bolesti suštinski ne eksprimiraju CLDN18.2.
[0086] Tipično, nivo T ćelija u biološkom uzorku se upoređuje sa referentnim nivoom, pri čemu odstupanje od navedenog referentnog nivoa ukazuje na prisustvo i/ili stadijum bolesti kod subjekta. Referentni nivo može biti nivo kao što je određen u kontrolnom uzorku (npr. iz zdravog tkiva ili subjekta) ili srednji nivo od zdravih subjekata. "Odstupanje" od navedenog referentnog nivoa označava svaku značajnu promenu, kao što je povećanje za najmanje 10%, 20%, ili 30%, poželjno za najmanje 40% ili 50%, ili čak više. Poželjno, prisustvo T ćelija u navedenom biološkom uzorku ili količina T ćelija u biološkom uzorku koja je povećana u poređenju sa referentnim nivoom ukazuje na prisustvo bolesti.
[0087] T ćelije mogu biti izolovane iz pacijentove periferne krvi, limfnih čvorova, uzoraka tkiva kao što su oni koji su dobijeni biopsijom i resekcijom, ili iz drugog izvora. Testovi reaktivnosti se mogu izvesti na primarnim T ćelijama ili drugim prikladnim derivatima. Na primer, T ćelije mogu biti fuzionisane kako bi se generisali hibridomi. Testovi za merenje odziva T ćelija su poznati u struci, i uključuju testove proliferacije i testove oslobađanja citokina.
[0088] Testovi i indikacije za detektovanje reaktivnih T ćelija uključuju, ali nisu ograničeni na, upotrebu IFNγ ELISPOT i IFNγ unutarćelijskog bojenja citokina. Drugi različiti postupci su poznati u struci za određivanje da li će klon T ćelija reagovati na određeni peptid. Tipično se peptid dodaje u suspenziju T ćelija u periodu od jednog do tri dana. Odgovor T ćelija se može meriti proliferacijom, npr. preuzimanjem obeleženog timidina, ili oslobađanjem citokina, npr. IL-2. Dostupni su različiti testovi za detektovanje prisustva oslobođenih citokina. Testovi citotoksičnosti T ćelija mogu se upotrebljavati za detektovanje citotoksičnih T ćelija koje imaju specifičnost za antigene. U jednom primeru izvođenja, testira se sposobnost citotoksičnih T ćelija da ubijaju ciljne ćelije koje prezentuju antigen sa MHC molekulima klase I. Ciljne ćelije koje prezentuju antigen mogu biti obeležene i dodate u suspenziju T ćelija iz uzorka pacijenta. Citotoksičnost se može izmeriti kvantifikacijom oslobađanja obeleživača iz liziranih ćelija. Kontrole za spontano i potpuno oslobađanje mogu biti uključene u test.
[0089] U jednom primeru izvođenja učenja, kancer koji je ovde opisan uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 i/ili prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula.
2
U jednom primeru izvođenja učenja, bolesne ćelije su ćelije kancera. U jednom primeru izvođenja, bolesne ćelije kao što su ćelije kancera su ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 i/ili prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 je na površini bolesne ćelije.
[0090] U jednom primeru izvođenja učenja, kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom. U jednom primeru izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera dojke, kancera jajnika, kancera kolona, kancera jetre, kancera glave i vrata, kancera žučne kese i njegove metastaze, Krukenbergovog tumora, peritonealne metastaze i/ili metastaze u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera. U jednom primeru izvođenja, pacijent je HER2/neu negativan pacijent ili pacijent sa HER2/neu pozitivnim statusom, ali ne ispunjava uslove za terapiju trastuzumabom.
[0091] U jednom primeru izvođenja učenja, ćelije kancera su ćelije kancera iz kancera koji je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera dojke, kancera jajnika, kancera kolona, kancera jetre, kancera glave i vrata, kancera žučne kese i njegove metastaze, Krukenbergovog tumora, peritonealne metastaze i/ili metastaze u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, ćelije kancera su ćelije kancera iz kancera koji je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera.
[0092] U skladu sa pronalaskom, CLDN18.2 poželjno ima amino-kiselinsku sekvencu u skladu sa SEQ ID NO: 1.
[0093] Druga svojstva i prednosti trenutnog pronalaska biće očigledne iz sledećeg detaljnog opisa i patentnih zahteva.
Detaljan opis
[0094] Iako je predmetno učenje detaljno opisano u nastavku, treba razumeti da ovo učenje nije ograničeno na određene metodologije, protokole i reagense koji su ovde opisani pošto oni mogu da variraju. Takođe treba razumeti da je terminologija koja je ovde upotrebljena samo u svrhu opisivanja određenih primera izvođenja, i nije namenjena da ograniči obim predmetnog učenja koje će biti ograničeno samo priloženim patentnim zahtevima. Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni termini koji su ovde upotrebljeni imaju ista značenja kao što ih uobičajeno razumeju oni sa prosečnim iskustvom u struci.
[0095] U nastavku će biti opisani elementi predmetnog učenja. Ovi elementi su navedeni sa specifičnim primerima izvođenja, međutim, treba razumeti da se mogu kombinovati na bilo koji način i u bilo kom broju kako bi se stvorili dodatni primeri izvođenja. Različito opisane primere i poželjne primere izvođenja ne bi trebalo tumačiti tako da ograničavaju predmetno učenje samo na eksplicitno opisane primere izvođenja. Ovaj opis treba razumeti tako da podržava i obuhvata primere izvođenja koji kombinuju eksplicitno opisane primere izvođenja sa bilo kojim brojem objavljenih i/ili poželjnih elemenata. Štaviše, bilo koje permutacije i kombinacije svih elemenata koji su opisani u ovoj prijavi treba smatrati objavljenim putem opisa predmetne prijave osim ukoliko kontekst ne ukazuje drugačije.
[0096] Poželjno, termini koji se ovde upotrebljavaju definisani su kao što je opisano u "A multilingual glossary of biotechnological terms: (IUPAC Recommendations)", H.G.W. Leuenberger, B. Nagel, and H. Kölbl, Eds., (1995) Helvetica Chimica Acta, CH-4010 Basel, Švajcarska.
[0097] Praksa predmetnog učenja će koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke biohemije, ćelijske biologije, imunologije, i tehnike rekombinantne DNK koje su objašnjene u literaturi u ovoj oblasti (uporediti, npr. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, J. Sambrook et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor 1989).
[0098] U celoj ovoj specifikaciji i patentnim zahtevima koji slede, osim ukoliko kontekst ne zahteva drugačije, reč "sadrže" i varijacije kao što su "sadrži" i "koji sadrži", razumeće se da podrazumeva uključivanje navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka, ali ne isključivanje bilo kog drugog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka iako u nekim primerima izvođenja takav drugi član, ceo broj ili korak ili grupa članova, celih brojeva ili koraka može biti isključen, tj. tema se sastoji u uključivanju navedenog člana, celog broja ili koraka ili grupe članova, celih brojeva ili koraka. Termini neodređenih i određenih članova i slične reference koje se upotrebljavaju u kontekstu opisivanja učenja (naročito u kontekstu patentnih zahteva) treba da se tumače tako da pokrivaju i jedninu i množinu, osim ukoliko je drugačije naznačeno ovde ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom. Navođenje opsega vrednosti ovde je samo namenjeno da posluži kao stenografski postupak za pojedinačno upućivanje na svaku zasebnu vrednost koja spada u opseg. Osim ukoliko nije drugačije naznačeno ovde, svaka pojedinačna vrednost je inkorporisana u specifikaciju kao da je ovde pojedinačno navedena.
[0099] Svi postupci koji su ovde opisani mogu se izvesti u bilo kom pogodnom redosledu osim ukoliko je drugačije naznačeno ovde ili je na drugi način jasno u suprotnosti sa kontekstom. Upotreba bilo kog i svih primera, ili primernog jezika (npr. "kao što je"), koji je ovde obezbeđen je namenjen samo da bolje ilustruje učenje i ne predstavlja ograničenje obima učenja za koje se inače zahteva zaštita patenta. Nijedan jezik u specifikaciji ne treba da se tumači kao da ukazuje na bilo koji element za koji se ne zahteva zaštita patenta koji je bitan za praksu učenja.
[0100] Termin "rekombinantno" u kontekstu predmetnog učenja znači "napravljen genetičkim projektovanjem". Poželjno je da se "rekombinantni objekat" kao što je rekombinantna ćelija u kontekstu predmetnog učenja ne javlja u prirodi.
[0101] Termin "koji se javlja u prirodi" kao što se ovde upotrebljava označava činjenicu da se objekat može naći u prirodi. Na primer, peptid ili nukleinska kiselina koja je prisutna u organizmu (uključujući viruse) i može biti izolovana iz izvora u prirodi i koju čovek nije namerno modifikovao u laboratoriji, je ona koja se javlja u prirodi.
[0102] Termin "imunski odgovor" označava integrisani telesni odgovor na antigen i poželjno označava ćelijski imunski odgovor ili ćelijski kao i humoralni imunski odgovor. Imunski odgovor može biti zaštitni/preventivni/profilaktički i/ili terapijski.
[0103] "Indukovanje imunskog odgovora" može značiti da nije bilo imunskog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije, ali takođe može značiti da je postojao određeni nivo imunskog odgovora protiv određenog antigena pre indukcije i posle indukcije je navedeni imunski odgovor pojačan. Stoga, "indukovanje imunskog odgovora" takođe uključuje "pojačavanje imunskog odgovora". Poželjno, posle indukovanja imunskog odgovora kod subjekta, navedeni subjekt je zaštićen od razvoja bolesti kao što je bolest kancera ili se stanje bolesti poboljšava indukovanjem imunskog odgovora. Na primer, imunski odgovor protiv antigena asociranog sa tumorom, kao što je CLDN18.2, može biti indukovan kod pacijenta koji ima bolest kancera ili kod subjekta koji je u riziku od razvoja bolesti kancera. Indukovanje imunskog odgovora u ovom slučaju može značiti da se stanje bolesti subjekta poboljšava, da subjekt ne razvija metastaze, ili da subjekt koji je u riziku od razvoja bolesti kancera ne razvija bolest kancera.
[0104] "Ćelijski imunski odgovor", "ćelijski odgovor", "ćelijski odgovor protiv antigena" ili sličan termin podrazumeva da uključuje ćelijski odgovor koji je usmeren na ćelije su okarakterisane prezentovanjem antigena sa MHC klase I ili klase II. Ćelijski odgovor se odnosi na ćelije zvane T ćelije ili T-limfociti koji deluju ili kao "pomoćnici" ili "ubice". Pomoćničke T ćelije (takođe nazvane CD4<+>T ćelije) igraju centralnu ulogu regulisanjem
2
imunskog odgovora, i ćelije ubice (takođe nazvane citotoksične T ćelije, citolitičke T ćelije, CD8<+>T ćelije ili CTL) ubijaju bolesne ćelije kao što su ćelije kancera, prevenirajući stvaranje više bolesnih ćelija.
[0105] Termin "antigen" se odnosi na agens koji sadrži epitop protiv koga treba da se generiše i/ili usmeri imunski odgovor. Poželjno, antigen u kontekstu predmetnog učenja je molekul koji, opciono posle obrade, indukuje imunsku reakciju, koja je poželjno specifična za antigen ili ćelije koje eksprimiraju i/ili prezentuju antigen. Termin "antigen" uključuje posebno proteine i peptide. Antigen je poželjno proizvod koji odgovara ili je izveden iz antigena koji se javlja u prirodi. Takvi antigeni koji se javljaju u prirodi mogu uključivati ili mogu biti izvedeni iz antigena asociranih sa tumorom.
[0106] Konkretno, T ćelijski receptor treba da prepozna antigen ili njegove peptidne fragmente. Poželjno, antigen ili peptid, ukoliko ih prepozna T ćelijski receptor, može da izazove u prisustvu prikladnih kostimulatornih signala, klonsku ekspanziju T ćelije koja nosi T ćelijski receptor koji prepoznaje antigen ili peptid. U kontekstu primera izvođenja predmetnog učenja, antigen je poželjno prezentovan od strane ćelije, poželjno antigenprezentujuće ćelije i/ili bolesne ćelije, u kontekstu MHC molekula, što može rezultovati imunskom reakcijom protiv antigena (ili ćelije koja prezentuje antigen).
[0107] U poželjnom primeru izvođenja, antigen je antigen asociran sa tumorom, tj. konstituent ćelija kancera koji može biti izveden iz citoplazme, ćelijske površine i nukleusa ćelije, posebno onih antigena koji se proizvode, poželjno u velikim količinama, unutarćelijski ili kao površinski antigeni na ćelijama kancera.
[0108] U kontekstu predmetnog učenja, termin "antigen asociran sa tumorom" ili "tumorski antigen" se odnosi na proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u ograničenom broju tkiva i/ili organa ili u specifičnim stadijumima razvića, na primer, antigen asociran sa tumorom može biti pod normalnim uslovima specifično eksprimiran u tkivu želuca, poželjno u mukozi želuca, u reproduktivnim organima, npr. u testisima, u trofoblastnom tkivu, npr. u placenti, ili u ćelijama germinativne linije, i eksprimira se ili se aberantno eksprimira u jednom ili više tkiva tumora ili kancera. U ovom kontekstu, "ograničeni broj" poželjno znači ne više od 3, poželjnije ne više od 2. Antigeni asocirani sa tumorom u kontekstu predmetnog učenja uključuju, na primer, antigene diferencijacije, poželjno antigene diferencijacije specifične za ćelijski tip, tj. proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u određenom tipu ćelije u određenom stadijumu diferencijacije, antigene kancera/testisa, tj. proteine koji su pod normalnim uslovima specifično eksprimirani u testisima i ponekad u placenti, i antigene specifične za germinativnu liniju. U kontekstu predmetnog učenja, antigen asociran sa tumorom je poželjno asociran sa ćelijskom površinom ćelije kancera i poželjno nije ili se samo retko eksprimira u normalnim tkivima. Poželjno, antigen asociran sa tumorom ili aberantna ekspresija antigena asociranog sa tumorom identifikuje ćelije kancera. U kontekstu predmetnog učenja, antigen asociran sa tumorom koji eksprimira ćelija kancera kod subjekta, npr. pacijenta koji pati od bolesti kancera, poželjno je sopstveni protein kod navedenog subjekta. U poželjnim primerima izvođenja, antigen asociran sa tumorom u kontekstu predmetnog učenja se eksprimira pod normalnim uslovima, specifično u tkivu ili organu koji nije esencijalan, tj. tkivima ili organima koji kada su oštećeni imunskim sistemom ne dovode do smrti subjekta, ili u organima ili strukturama tela koje nisu ili su teško dostupne imunskom sistemu. Poželjno, amino-kiselinska sekvenca antigena asociranog sa tumorom je identična između antigena asociranog sa tumorom koji se eksprimira u normalnim tkivima i antigena asociranog sa tumorom koji se eksprimira u tkivima kancera. Poželjno, antigen asociran sa tumorom prezentuje ćelija kancera u kojoj se on i eksprimira.
[0109] Različiti aspekti učenja uključuju CLDN18.2 antigen asociran sa tumorom i predmetno učenje može uključivati stimulaciju ili obezbeđivanje antitumorske CTL reakcije protiv ćelija kancera koje eksprimiraju navedeni antigen asociran sa tumorom i poželjno prezentuju navedeni antigen asociran sa tumorom sa MHC klase I.
[0110] Klaudini su porodica proteina koji su najvažnije komponente čvrstih spojeva, gde uspostavljaju paraćelijsku barijeru koja kontroliše protok molekula u međućelijskom prostoru između ćelija epitela. Klaudini su transmembranski proteini koji se protežu kroz membranu 4 puta sa N-terminusnim i C-terminusnim krajevima koji su locirani u citoplazmi. Prva vanćelijska petlja ili domen, nazvana EC1 ili ECL1, sastoji se u proseku od 53 aminokiseline, a druga vanćelijska petlja ili domen, nazvana EC2 ili ECL2, sastoji se od oko 24 amino-kiseline. Proteini ćelijske površine porodice klaudina, kao što je CLDN18.2, eksprimiraju se u tumorima različitog porekla, i posebno su pogodni kao ciljne strukture u vezi sa imunoterapijom kancera posredovanom antitelima zbog svoje selektivne ekspresije (bez ekspresije u normalnim tkivima relevantnim za toksičnost) i lokalizacije na ćelijskoj membrani.
[0111] CLDN18.2 se selektivno eksprimira u normalnim tkivima u diferenciranim epitelskim ćelijama mukoze želuca. CLDN18.2 se eksprimira u kancerima različitog porekla kao što su karcinom pankreasa, karcinom jednjaka, karcinom želuca, bronhijalni karcinom, karcinom dojke, i ORL tumori. CLDN18.2 je vredan cilj za prevenciju i/ili lečenje primarnih tumora, kao što su kancer želuca, kancer jednjaka, kancer pankreasa, kancer pluća kao što je
2
nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancer jajnika, kancer kolona, kancer jetre, kancer glave i vrata, i kanceri žučne kese, i njihove metastaze, posebno metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealne metastaze, i metastaze u limfnim čvorovima.
[0112] Termin "CLDN" kao što se ovde upotrebljava znači klaudin i uključuje CLDN18.2. Poželjno, klaudin je humani klaudin.
[0113] Termin "CLDN18" se odnosi na klaudin 18 i uključuje bilo koje varijante, uključujući klaudin 18 splajs varijantu 1 (klaudin 18.1 (CLDN18.1)) i klaudin 18 splajs varijantu 2 (klaudin 18.2 (CLDN18.2)).
[0114] Termin "CLDN18.2" se poželjno odnosi na humani CLDN18.2, i, posebno na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence u skladu sa SEQ ID NO: 1 na listi sekvenci ili varijantom navedene amino-kiselinske sekvence. Prva vanćelijska petlja ili domen CLDN18.2 poželjno sadrži amino-kiseline 27 do 81, poželjnije amino-kiseline 29 do 78 amino-kiselinske sekvence pokazane u SEQ ID NO: 1. Druga vanćelijska petlja ili domen CLDN18.2 poželjno sadrži amino-kiseline 140 do 180 amino-kiselinske sekvence pokazane u SEQ ID NO: 1. Navedene prve i druge vanćelijske petlje ili domeni poželjno formiraju vanćelijski deo ili domen CLDN18.2.
[0115] Termin "varijanta" u skladu sa učenjem označava, posebno, mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologe vrsta, posebno one koji su prisutni u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na alteraciju u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiselinska sekvenca izolovan od različite vrste od one od date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence. Termin "varijanta" će obuhvatati sve posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0116] U skladu sa različitim aspektima učenja, cilj je poželjno da se indukuje ili odredi imunski odgovor protiv ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 i poželjno je da budu okarakterisane prezentovanjem CLDN18.2, i da se dijagnostikuje, leči ili prevenira bolest kancera koja uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2. Poželjno, imunski odgovor uključuje stimulaciju anti-CLDN18.2 CTL odgovora protiv ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 i poželjno prezentuju CLDN18.2 sa MHC klase I.
[0117] U skladu sa učenjem, termin "kancer koji eksprimira CLDN18.2" ili "kancer pozitivan na CLDN18.2" označava kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2, poželjno na površini navedenih ćelija kancera. Alternativno ili dopunski, navedene ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula.
2
Ćelije kancera koje prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula mogu biti ciljane imunoreaktivnim ćelijama koje nose T ćelijske receptore, dok ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 na površini mogu biti ciljane imunoreaktivnim ćelijama koje nose veštačke T ćelijske receptore.
[0118] "Ćelijska površina" se upotrebljava u skladu sa svojim normalnim značenjem u struci, i stoga uključuje spoljašnjost ćelije koja je dostupna za vezivanje proteinima i drugim molekulima.
[0119] CLDN18.2 se eksprimira na površini ćelija ukoliko je lociran na površini navedenih ćelija i dostupan je za vezivanje CLDN18.2-specifičnim antitelima koja se dodaju ćelijama.
[0120] Termin "vanćelijski deo" ili "egzodomen" u kontekstu predmetnog učenja označava deo molekula kao što je protein koji je okrenut prema vanćelijskom prostoru ćelije i poželjno je dostupan sa spoljašnje strane navedene ćelije, npr. antigen-vezujućim molekulima kao što su antitela koja su locirana van ćelije. Poželjno, termin označava jednu ili više vanćelijskih petlji ili domena ili njihov fragment.
[0121] Termin "deo" označava frakciju. U odnosu na određenu strukturu kao što je aminokiselinska sekvenca ili protein, termin njegov "deo" može označavati kontinuiranu ili diskontinuiranu frakciju navedene strukture. Poželjno, deo amino-kiselinske sekvence sadrži najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, poželjno najmanje 40%, poželjno najmanje 50%, poželjnije najmanje 60%, poželjnije najmanje 70%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 90% amino-kiselina navedene aminokiselinske sekvence. Poželjno, ukoliko je deo diskontinuirana frakcija, navedena diskontinuirana frakcija sačinjena je od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više delova strukture, pri čemu je svaki deo kontinuirani element strukture. Na primer, diskontinuirana frakcija aminokiselinske sekvence može biti sačinjena od 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ili više, poželjno ne više od 4 dela navedene amino-kiselinske sekvence, pri čemu svaki deo poželjno sadrži najmanje 5 kontinuiranih amino-kiselina, najmanje 10 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 20 kontinuiranih amino-kiselina, poželjno najmanje 30 kontinuiranih amino-kiselina aminokiselinske sekvence.
[0122] Termini "deo" i "fragment" se ovde upotrebljavaju naizmenično i označavaju kontinuirani element. Na primer, deo strukture kao što je amino-kiselinska sekvenca ili protein označava kontinuirani element navedene strukture. Porcija, deo ili fragment strukture poželjno sadrži jedno ili više funkcionalnih svojstava navedene strukture. Na primer, porcija, deo ili fragment epitopa, peptida ili proteina je poželjno imunski ekvivalentan epitopu, peptidu ili proteinu iz kojeg je izveden. U kontekstu predmetnog učenja, "deo" strukture kao
2
što je amino-kiselinska sekvenca poželjno sadrži, poželjno se sastoji od najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 92%, najmanje 94%, najmanje 96%, najmanje 98%, najmanje 99% celokupne strukture ili amino-kiselinske sekvence. Deo ili fragment proteinske sekvence poželjno sadrži sekvencu od najmanje 6, posebno najmanje 8, najmanje 12, najmanje 15, najmanje 20, najmanje 30, najmanje 50, ili najmanje 100 uzastopnih amino-kiselina proteinske sekvence. Porcije, delovi ili fragmenti kao što je prethodno diskutovano su obuhvaćeni terminom "varijanta" koji se ovde upotrebljava.
[0123] U skladu sa učenjem, CLDN18.2 se suštinski ne eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije niži u poređenju sa ekspresijom u ćelijama želuca ili tkivu želuca. Poželjno, nivo ekspresije je manji od 10%, poželjno manji od 5%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,1% ili 0,05% ekspresije u ćelijama želuca ili tkivu želuca ili čak niži. Poželjno, CLDN18.2 se suštinski ne eksprimira u ćeliji ukoliko nivo ekspresije premašuje nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu osim želuca za ne više od 2 puta, poželjno 1,5 puta, i poželjno ne premašuje nivo ekspresije u navedenom nekanceroznom tkivu. Poželjno, CLDN18.2 se suštinski ne eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije ispod granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije suviše nizak da omogući vezivanje CLDN18.2-specifičnih antitela dodatih ćelijama.
[0124] U skladu sa učenjem, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko nivo ekspresije premašuje nivo ekspresije u nekanceroznom tkivu osim želuca, poželjno za više od 2 puta, poželjno 10 puta, 100 puta, 1000 puta, ili 10000 puta. Poželjno, CLDN18.2 se eksprimira u ćeliji ukoliko je nivo ekspresije iznad granice detekcije i/ili ukoliko je nivo ekspresije dovoljno visok da omogući vezivanje CLDN18.2-specifičnih antitela dodatih ćelijama. Poželjno, CLDN18.2 eksprimiran u ćeliji je eksprimiran ili izložen na površini navedene ćelije.
[0125] "Ciljna ćelija" će značiti ćeliju koja je cilj za imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor. Ciljne ćelije uključuju ćelije koje prezentuju antigen ili epitop antigena, tj. fragment peptida izveden iz antigena, i uključuju bilo koju neželjenu ćeliju kao što je ćelija kancera. U poželjnim primerima izvođenja, ciljna ćelija je ćelija koja eksprimira CLDN18.2 koji je poželjno prisutan na ćelijskoj površini i/ili je prezantovan sa MHC klase I.
[0126] Termin "epitop" označava antigenu determinantu u molekulu kao što je antigen, tj. deo ili fragment molekula koji prepoznaje imunski sistem, na primer, koji prepoznaje T ćelija, posebno kada se prezentuje u kontekstu MHC molekula. Epitop proteina kao što je antigen asociran sa tumorom poželjno sadrži kontinuirani ili diskontinuirani deo navedenog proteina i poželjno je dugačak između 5 i 100, poželjno između 5 i 50, poželjnije između 8 i 30,
2
najpoželjnije između 10 i 25 amino-kiselina, na primer, epitop može biti poželjno dugačak 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, ili 25 amino-kiselina. Posebno je poželjno da je epitop u kontekstu predmetnog učenja T ćelijski epitop.
[0127] Termini kao što su "epitop", "fragment antigena", "antigenski peptid" ili "imunogeni peptid" se ovde upotrebljavaju naizmenično i poželjno se odnose na nepotpuno reprezentovanje antigena koji je poželjno sposoban da izazove imunski odgovor protiv antigena ili ćelije koja eksprimira ili sadrži i poželjno prezentuje antigen. Poželjno, termini se odnose na imunogeni deo antigena. Poželjno, to je deo antigena koji je prepoznat (tj. specifično vezan) T ćelijskim receptorom, posebno ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula. Određeni poželjni imunogeni delovi se vezuju za MHC molekule klase I ili klase II, kao što je na površini ćelije i stoga su MHC vezujući peptidi. Kao što se ovde upotrebljava, za peptid se kaže da se "vezuje za" MHC molekul klase I ili klase II ukoliko se takvo vezivanje može detektovati upotrebom bilo kog testa poznatog u struci.
[0128] Poželjno, peptidi koji su ovde objavljeni koji sadrže amino-kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence sposobni su da stimulišu imunski odgovor, poželjno ćelijski odgovor protiv CLDN18.2 ili ćelija koje su okarakterisane ekspresijom CLDN18.2 i poželjno okarakterisane prezentovanje CLDN18.2. Poželjno, takav peptid je sposoban da stimuliše ćelijski odgovor protiv ćelije koja je okarakterisana prezentovanjem CLDN18.2 sa MHC klase I i poželjno je sposoban da stimuliše CTL koji reaguje na CLDN18.2. Poželjno, peptidi u skladu sa učenjem su peptidi koje prezentuje MHC klase I i/ili klase II ili mogu biti obrađeni kako bi se proizveli peptidi koje prezentuje MHC klase I i/ili klase II. Poželjno, sekvenca vezana za MHC molekul je odabrana od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7.
[0129] Ukoliko antigenski peptid treba da bude prezentovan direktno, tj. bez obrade, posebno bez isecanja, on ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno za MHC molekul klase I, i poželjno je dugačak 7-20 amino-kiselina, poželjnije je dugačak 7-12 aminokiselina, poželjnije je dugačak 8-11 amino-kiselina, posebno je dugačak 9 ili 10 aminokiselina. Poželjno je da sekvenca antigenskog peptida koja treba da se prezentuje direktno suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sekvenci odabranoj od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7.
[0130] Ukoliko antigenski peptid treba da bude prezentovan nakon obrade, posebno nakon isecanja, peptid proizveden obradom ima dužinu koja je pogodna za vezivanje za MHC molekul, posebno za MHC molekul klase I, i poželjno je dugačak 7-20 amino-kiselina, poželjnije je dugačak 7-12 amino-kiselina, poželjnije je dugačak 8-11 amino-kiselina,
2
posebno je dugačak 9 ili 10 amino-kiselina. Poželjno, sekvenca peptida koja treba da se prezentuje nakon obrade suštinski odgovara i poželjno je potpuno identična sekvenci odabranoj od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7. Stoga, antigenski peptid u skladu sa učenjem u jednom primeru izvođenja sadrži sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7 i nakon obrade antigenski peptid čini sekvencu odabranu od SEQ ID NO: 2, 3, 4, 5, 6 i 7.
[0131] Peptidi koji imaju amino-kiselinske sekvence koje suštinski odgovaraju sekvenci peptida koju prezentuju MHC molekuli mogu se razlikovati u jednom ili više ostataka koji nisu esencijalni za TCR prepoznavanje peptida kao što ga prezentuje MHC, ili za vezivanje peptida za MHC. Takvi suštinski odgovarajući peptidi poželjno su takođe sposobni da stimulišu antigen-specifičan ćelijski odgovor kao što je antigen-specifičan CTL. Peptidi koji imaju amino-kiselinske sekvence koje se razlikuju od prezentovanog peptida u ostacima koji ne utiču na TCR prepoznavanje, ali poboljšavaju stabilnost vezivanja za MHC, mogu poboljšati imunogenost antigenskog peptida, i mogu ovde biti označeni kao "optimizovani peptidi". Upotrebljavajući postojeće znanje o tome koji od ovih ostataka će verovatnije uticati na vezivanje bilo za MHC ili za TCR, može se koristiti racionalan pristup dizajnu suštinski odgovarajućih peptida. Rezultujući peptidi koji su funkcionalni smatraju se antigenskim peptidima. Sekvence kao što je prethodno diskutovano su obuhvaćene terminom "varijanta" koji se ovde upotrebljava.
[0132] "Obrada antigena" označava degradaciju antigena u proizvode obrade, koji su fragmenti navedenog antigena (npr. degradacija proteina u peptide) i asocijaciju jednog ili više ovih fragmenata (npr. putem vezivanja) sa MHC molekulima za prezentovanje od strane ćelija, poželjno antigen-prezentujućih ćelija specifičnim T ćelijama.
[0133] Antigen-prezentujuća ćelija (APC) je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti (MHC) na svojoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks upotrebljavajući svoj T ćelijski receptor (TCR). Antigen-prezentujuće ćelije obrađuju antigene i prezentuju ih T ćelijama.
[0134] Profesionalne antigen-prezentujuće ćelije su veoma efikasne u internalizaciji antigena, bilo fagocitozom ili endocitozom posredovanom receptorima, i zatim prikazuju fragment antigena, vezan za MHC molekul klase II, na svojoj membrani. T ćelija prepoznaje i interaguje sa kompleksom antigen-MHC molekul klase II na membrani antigen-prezentujuće ćelije. Antigen-prezentujuća ćelija tada proizvodi dodatni kostimulatorni signal, što dovodi do aktivacije T ćelije. Ekspresija kostimulatornih molekula je definišuća odlika profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija. Antigen-prezentujuće ćelije uključuju profesionalne antigenprezentujuće ćelije i neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije.
[0135] Glavni tipovi profesionalnih antigen-prezentujućih ćelija su dendritske ćelije, koje imaju najširi opseg prezentovanja antigena, i verovatno su najvažnije antigen-prezentujuće ćelije, makrofagi, B-ćelije, monociti i određene aktivirane epitelske ćelije.
[0136] Neprofesionalne antigen-prezentujuće ćelije ne eksprimiraju konstitutivno proteine MHC klase II potrebne za interakciju sa naivnim T ćelijama; oni se eksprimiraju samo nakon stimulacije neprofesionalnih antigen-prezentujućih ćelija pomoću određenih citokina kao što je IFNγ.
[0137] Dendritske ćelije (DC) su populacija leukocita koje T ćelijama prezentuju antigene zarobljene u perifernim tkivima putem MHC klase II i I puteva prezentovanja antigena. Dobro je poznato da su dendritske ćelije moćni induceri imunskih odgovora i da je aktivacija ovih ćelija kritičan korak za indukciju antitumorskog imuniteta.
[0138] Dendritske ćelije i progenitori se mogu dobiti iz periferne krvi, kostne srži, ćelija koje infiltriraju tumor, ćelija koje infiltriraju peritumoralno tkivo, limfnih čvorova, slezine, kože, krvi pupčane vrpce ili bilo kog drugog pogodnog tkiva ili tečnosti. Na primer, dendritske ćelije se mogu diferencirati ex vivo dodavanjem kombinacije citokina kao što su GM-CSF, IL-4, IL-13 i/ili TNFα kulturama monocita sakupljenih iz periferne krvi. Alternativno, CD34 pozitivne ćelije sakupljene iz periferne krvi, krvi pupčane vrpce ili kostne srži mogu se diferencirati u dendritske ćelije dodavanjem medijumu za kulturu kombinacija GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 liganda, LPS, flt3 liganda i/ili drugih jedinjenja koja indukuju diferencijaciju, sazrevanje i proliferaciju dendritskih ćelija.
[0139] Dendritske ćelije su pogodno kategorisane kao "nezrele" i "zrele" ćelije, koje se mogu upotrebljavati kao jednostavan način za razlikovanje između dva dobro okarakterisana fenotipa. Međutim, ovu nomenklaturu ne treba tumačiti tako da isključuje sve moguće intermedijarne stadijume diferencijacije.
[0140] Nezrele dendritske ćelije su okarakterisane kao antigen-prezentujuće ćelije sa visokim kapacitetom za preuzimanje i obradu antigena, što je u korelaciji sa visokom ekspresijom Fcγ receptora i receptora manoze. Zreli fenotip je tipično okarakterisan nižom ekspresijom ovih markera, ali visokom ekspresijom molekula ćelijske površine odgovornih za aktivaciju T ćelija, kao što su MHC klase I i klase II, molekula adhezije (npr. CD54 i CD11) i kostimulatornih molekula (npr. CD40, CD80, CD86 i 4-1 BB).
[0141] Sazrevanje dendritskih ćelija se označava kao status aktivacije dendritskih ćelija u kome takve antigen-prezentujuće dendritske ćelije dovode do prajmovanja T ćelija, dok prezentovanje od strane nezrelih dendritskih ćelija rezultuje tolerancijom. Sazrevanje dendritskih ćelija je uglavnom uzrokovano biomolekulima sa mikrobnim karakteristikama
1
koje detektuju urođeni receptori (bakterijska DNK, virusna RNK, endotoksin, itd.), proinflamatorni citokini (TNF, IL-1, IFN), ligacija CD40 na površini dendritske ćelije od strane CD40L, i supstance koje se oslobađaju iz ćelija koje prolaze kroz stresnu ćelijsku smrt. Dendritske ćelije se mogu dobiti kultivisanjem ćelija kostne srži in vitro sa citokinima, kao što su faktor stimulacije kolonije granulocita-makrofaga (GM-CSF) i faktor nekroze tumora alfa.
[0142] Ćelije kao što su antigen-prezentujuće ćelije ili ciljne ćelije mogu biti snabdevene peptidima koje prezentuje MHC klase I izlaganjem, tj. pulsiranjem, ćelije sa peptidom ili transdukcijom ćelija nukleinskom kiselinom, poželjno RNK, koja kodira peptid ili protein koji sadrži peptid koji treba da bude prezentovan, npr. nukleinskom kiselinom koja kodira antigen.
[0143] U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija iz učenja sadrži antigenprezentujuću ćeliju snabdevenu antigenskim peptidom. U tom pogledu, protokoli se mogu oslanjati na in vitro kulturu/diferencijaciju dendritskih ćelija kojima se manipuliše na takav način da veštački prezentuju antigenski peptid. Proizvodnja genetički projektovanih dendritskih ćelija može uključivati introdukovanje nukleinskih kiselina koje kodiraju antigene ili antigene peptide u dendritske ćelije. Transfekcija dendritskih ćelija sa iRNK je obećavajuća tehnika snabdevanja antigena za stimulisanje snažnog antitumorskog imuniteta. Takva transfekcija se može odvijati ex vivo, i farmaceutska kompozicija koja sadrži takve transfektovane ćelije može se zatim upotrebljavati u terapijske svrhe. Alternativno, vehikulum za isporuku gena koji cilja dendritsku ili drugu antigen-prezentujuću ćeliju može biti primenjen pacijentu, što rezultuje transfekcijom koja se dešava in vivo. In vivo i ex vivo transfekcija dendritskih ćelija, na primer, može se generalno izvesti upotrebom bilo kog postupka poznatog u struci, kao što su oni koji su opisani u WO 97/24447, ili pristup genskim pištoljem koji su opisali Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460,1997. Snabdevanje dendritskih ćelija antigenom može se postići inkubacijom dendritskih ćelija ili progenitorskih ćelija sa antigenom, DNK (golom ili unutar plazmidnog vektora) ili RNK; ili sa rekombinantnim bakterijama ili virusima koji eksprimiraju antigen (npr. vakcinija, fovipoks (fowipox), adenovirusni ili lentivirusni vektori).
[0144] Termin "imunogenost" se odnosi na relativnu efikasnost antigena da indukuje imunsku reakciju.
[0145] Termin "imunske efektorske funkcije" u kontekstu predmetnog učenja uključuje sve funkcije posredovane komponentama imunskog sistema koje rezultuju, na primer, ubijanjem tumorskih ćelija, ili inhibicijom rasta tumora i/ili inhibicijom razvića tumora, uključujući
2
inhibiciju širenja tumora i metastaza. Poželjno, imunske efektorske funkcije u kontekstu predmetnog učenja su efektorske funkcije posredovane T ćelijama. Takve funkcije sadrže u slučaju pomoćničke T ćelije (CD4<+>T ćelije) prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II od strane T ćelijskih receptora, oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija, i u slučaju CTL prepoznavanje antigena ili antigenskog peptida izvedenog iz antigena u kontekstu MHC molekula klase I od strane T ćelijskih receptora, eliminaciju ćelija koje su prezentovane u kontekstu MHC molekula klase I, tj. ćelija koje su okarakterisane prezentovanjem antigena sa MHC klase I, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom, proizvodnje citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, i specifičnog citolitičkog ubijanja ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0146] Termin "imunoreaktivna ćelija" ili "imunska efektorska ćelija" u kontekstu predmetnog učenja odnosi se na ćeliju koja ispoljava efektorske funkcije tokom imunske reakcije. "Imunoreaktivna ćelija" poželjno je sposobna da veže antigen kao što je antigen eksprimiran na površini ćelije ili ćelije koja je okarakterisana prezentovanjem antigena ili antigenskog peptida koji je izveden iz antigena i posreduje u imunskom odgovoru. Na primer, takve ćelije sekretuju citokine i/ili hemokine, ubijaju mikrobe, sekretuju antitela, prepoznaju inficirane ili kancerske ćelije, i opciono eliminišu takve ćelije. Na primer, imunoreaktivne ćelije sadrže T ćelije (citotoksične T ćelije, pomoćničke T ćelije, T ćelije koje infiltriraju tumor), B ćelije, ćelije prirodne ubice, neutrofile, makrofage, i dendritske ćelije. Poželjno, u kontekstu predmetnog učenja, "imunoreaktivne ćelije" su T ćelije, poželjno CD4<+>i/ili CD8<+>T ćelije.
[0147] Poželjno, "imunoreaktivna ćelija" prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena sa određenim stepenom specifičnosti, posebno ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije kancera. Poželjno, navedeno prepoznavanje omogućava ćeliji koja prepoznaje antigen ili antigenski peptid izveden iz navedenog antigena da odgovori ili bude reaktivna. Ukoliko je ćelija pomoćnička T ćelija (CD4<+>T ćelija) koja nosi receptore koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena u kontekstu MHC molekula klase II, takav odziv ili reaktivnost može uključivati oslobađanje citokina i/ili aktivaciju CD8<+>limfocita (CTL) i/ili B-ćelija. Ukoliko je ćelija CTL, takav odziv ili reaktivnost može uključivati eliminaciju ćelija koje su prezentovane u kontekstu MHC molekula klase I, tj. ćelija koje su okarakterisane prezentovanjem antigena sa MHC klase I, na primer, putem apoptoze ili ćelijske lize posredovane perforinom. U skladu sa učenjem, CTL odziv može uključivati neprekidni fluks kalcijuma, ćelijsku deobu, proizvodnju citokina kao što su IFN-γ i TNF-α, povećanu ekspresiju aktivacionih markera kao što su CD44 i CD69, i specifično citolitičko ubijanje ciljnih ćelija koje eksprimiraju antigen. CTL odziv se takođe može odrediti upotrebom veštačkog reportera koji tačno ukazuje na CTL odziv. Takvi CTL koji prepoznaju antigen ili antigenski peptid izveden iz antigena i koji odgovaraju ili su reaktivni takođe se ovde nazivaju "CTL koji odgovaraju na antigen". Ukoliko je ćelija B ćelija, takav odziv može uključivati oslobađanje imunoglobulina.
[0148] U skladu sa učenjem, termin "imunoreaktivna ćelija" takođe uključuje ćeliju koja može sazreti u imunsku ćeliju (kao što je T ćelija, posebno T pomoćnička ćelija, ili citolitička T ćelija) uz pogodnu stimulaciju. Imunoreaktivne ćelije sadrže CD34<+>hematopoetske matične ćelije, nezrele i zrele T ćelije i nezrele i zrele B ćelije. Ukoliko je poželjna proizvodnja citolitičkih ili T pomoćničkih ćelija koje prepoznaju antigen, imunoreaktivna ćelija se dovodi u kontakt sa ćelijom koja prezentuje antigen ili antigenski peptid pod uslovima koji favorizuju proizvodnju, diferencijaciju i/ili selekciju citolitičkih T ćelija i T pomoćničkih ćelija. Diferencijacija prekursora T ćelija u citolitičku T ćeliju, kada su izloženi antigenu, slična je klonskoj selekciji imunskog sistema.
[0149] "Limfoidna ćelija" je ćelija koja je, opciono, posle pogodne modifikacije, npr. posle transfera T ćelijskog receptora, sposobna da proizvede imunski odgovor kao što je ćelijski imunski odgovor, ili ćelija prekursora takve ćelije, i uključuje limfocite, poželjno T limfocite, limfoblaste, i plazma ćelije. Limfoidna ćelija može biti imunoreaktivna ćelija kao što je ovde opisano. Poželjna limfoidna ćelija je T ćelija kojoj nedostaje endogena ekspresija T ćelijskog receptora i koja se može modifikovati da eksprimira takav T ćelijski receptor na ćelijskoj površini.
[0150] Termini "T ćelija" i "T limfocit" se ovde uzpotrebljavaju naizmenično i uključuju T pomoćničke ćelije (CD4+ T ćelije) i citotoksične T ćelije (CTL, CD8+ T ćelije) koje sadrže citolitičke T ćelije.
[0151] T ćelije pripadaju grupi belih krvnih zrnaca poznatih kao limfociti, i igraju centralnu ulogu u imunitetu posredovanom ćelijama. Mogu se razlikovati od drugih tipova limfocita, kao što su B ćelije i ćelije prirodne ubice po prisustvu specijalnih receptora na svojoj ćelijskoj površini koji se zovu T ćelijski receptori (TCR). Timus je glavni organ odgovoran za T ćelijsko sazrevanje T ćelija. Otkriveno je nekoliko različitih podskupova T ćelija, svaki sa različitom funkcijom.
[0152] T pomoćničke ćelije pomažu drugim belim krvnim zrncima u imunskim procesima, uključujući sazrevanje B ćelija u plazma ćelije i aktivaciju citotoksičnih T ćelija i makrofaga,
4
između ostalih funkcija. Ove ćelije su takođe poznate kao CD4+ T ćelije zato što eksprimiraju CD4 protein na svojoj površini. Pomoćničke T ćelije postaju aktivirane kada im se prezentuju peptidni antigeni od strane MHC molekula klase II koji se eksprimiraju na površini antigenprezentujućih ćelija (APC). Kada se aktiviraju, one se brzo dele i sekretuju male proteine zvane citokini koji regulišu ili pomažu u aktivnom imunskom odgovoru.
[0153] Citotoksične T ćelije uništavaju ćelije inficirane virusima i tumorske ćelije, i takođe su implicirane u odbacivanje transplanta. Ove ćelije su takođe poznate kao CD8+ T ćelije pošto eksprimiraju CD8 glikoprotein na svojoj površini. Ove ćelije prepoznaju svoje ciljeve vezivanjem za antigen asociran sa MHC klase I, koji je prisutan na površini skoro svake ćelije u telu.
[0154] Većina T ćelija ima T ćelijski receptor (TCR) koji postoji kao kompleks nekoliko proteina. Stvarni T ćelijski receptor se sastoji od dva odvojena peptidna lanca, koji se proizvode sa nezavisnih gena alfa i beta T ćelijskog receptora (TCRα i TCRβ) i nazivaju se αi β-TCR lanci. γδ T ćelije (gama delta T ćelije) predstavljaju mali podskup T ćelija koje poseduju poseban T ćelijski receptor (TCR) na svojoj površini. Međutim, u γδ T ćelijama, TCR je sačinjen od jednog γ-lanca i jednog δ-lanca. Ova grupa T ćelija je mnogo ređa (2% ukupnih T ćelija) od αβ T ćelija.
[0155] Struktura T ćelijskog receptora je veoma slična Fab fragmentima imunoglobulina, koji su regioni definisani kao kombinovani laki i teški lanac kraka antitela. Svaki lanac TCR je član superporodice imunoglobulina i poseduje jedan N-terminusni varijabilni (V) domen, jedan konstantni (C) domen, transmembranski/region koji se proteže kroz ćelijsku membranu, i kratak citoplazmatski rep na C-terminusnom kraju.
[0156] U skladu sa učenjem, termin "varijabilni region T ćelijskog receptora" se odnosi na varijabilne domene TCR lanaca.
[0157] Varijabilni region i TCR α-lanca i β-lanca ima tri hipervarijabilna regiona ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR), dok varijabilni region β-lanca ima dodatnu oblast hipervarijabilnosti (HV4) koja normalno ne dolazi u kontakt sa antigenom i prema tome se ne smatra da je CDR. CDR3 je glavni CDR odgovoran za prepoznavanje obrađenog antigena, iako je takođe pokazano da CDR1 α-lanca interaguje sa N-terminusnim delom antigenskog peptida, dok CDR1 β-lanca interaguje sa C-terminusnim delom peptida. Misli se da CDR2 prepoznaje MHC. Misli se da CDR4 β-lanca ne učestvuje u prepoznavanju antigena, ali je pokazano da interaguje sa superantigenima.
[0158] U skladu sa učenjem, termin "najmanje jedna od CDR sekvenci" poželjno znači najmanje CDR3 sekvencu. Termin "CDR sekvence lanca T ćelijskog receptora" poželjno se odnosi na CDR1, CDR2 i CDR3 α-lanca ili β-lanca T ćelijskog receptora.
[0159] Konstantni domen TCR domena sastoji se od kratkih povezujućih sekvenci u kojima cisteinski ostatak formira disulfidne veze, što formira vezu između dva lanca.
[0160] Sve T ćelije potiču od hematopoetskih matičnih ćelija u kostnoj srži. Hematopoetski progenitori izvedeni iz hematopoetskih matičnih ćelija naseljavaju timus i umnožavaju se ćelijskom deobom kako bi stvorili veliku populaciju nezrelih timocita. Najraniji timociti ne eksprimiraju ni CD4 ni CD8, pa su stoga klasifikovani kao dvostruko negativne (CD4-CD8-) ćelije. Kako napreduju kroz svoje razviće, oni postaju dvostruko pozitivni timociti (CD4+CD8+), i konačno sazrevaju do jednostruko pozitivnih (CD4+CD8- ili CD4-CD8+) timocita koji se zatim oslobađaju iz timusa u periferna tkiva.
[0161] Prvi signal u aktivaciji T ćelija obezbeđuje se vezivanjem T ćelijskog receptora za kratki peptid koga prezentuje glavni kompleks histokompatibilnosti (MHC) na drugoj ćeliji. Ovo osigurava da se aktivira samo T ćelija sa TCR specifičnim za taj peptid. Partnerska ćelija je uobičajeno profesionalna antigen-prezentujuća ćelija (APC), uobičajeno dendritska ćelija u slučaju naivnih odgovora, iako B ćelije i makrofagi mogu biti važne APC. Peptidi prezentovani CD8+ T ćelijama od strane MHC molekula klase I su dugački 8-10 aminokiselina; peptidi prezentovani CD4+ T ćelijama od strane MHC molekula klase II su duži, pošto su krajevi vezujućeg useka MHC molekula klase II otvoreni.
[0162] T ćelije se generalno mogu pripremiti in vitro ili ex vivo, upotrebom standardnih procedura. Na primer, T ćelije mogu biti prisutne unutar (ili izolovane iz) kostne srži, periferne krvi ili frakcije kostne srži ili periferne krvi sisara, kao što je pacijent, upotrebom komercijalno dostupnog sistema za odvajanje ćelija. Alternativno, T ćelije mogu biti izvedene od srodnih ili nesrodnih ljudi, ne-humanih životinja, ćelijskih linija ili kultura. "Uzorak koji sadrži T ćelije" mogu, na primer, biti mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC).
[0163] T ćelije mogu biti stimulisane antigenom, peptidom, nukleinskom kiselinom i/ili antigen-prezentujućim ćelijama (APC) koje eksprimiraju antigen. Takva stimulacija se izvodi pod uslovima i tokom vremena dovoljnog da dozvoli generisanje T ćelija koje su specifične za antigen, peptid i/ili ćelije koje prezentuju antigen ili peptid.
[0164] Specifična aktivacija CD4+ ili CD8+ T ćelija može se detektovati na različite načine. Postupci za detektovanje specifične aktivacije T ćelija uključuju detektovanje proliferacije T ćelija, proizvodnju citokina (npr. limfokina), ili generisanje citolitičke aktivnosti. Za CD4+ T ćelije, poželjan postupak za detektovanje specifične aktivacije T ćelija je detekcija proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, poželjan postupak za detektovanje specifične aktivacije T ćelija je detekcija generisanja citolitičke aktivnosti.
[0165] Kako bi se generisale CD8+ T ćelijske linije, antigen-prezentujuće ćelije, poželjno autologne antigen-prezentujuće ćelije, transfektovane sa nukleinskom kiselinom koja proizvodi antigen, mogu se upotrebljavati kao stimulatorne ćelije.
[0166] Nukleinske kiseline kao što je RNK koja kodira lance T ćelijskog receptora (TCR) mogu se introdukovati u limfoidne ćelije kao što su T ćelije ili druge ćelije sa litičkim potencijalom. U pogodnom primeru izvođenja, TCR α- i β-lanci kloniraju se iz antigenspecifične T ćelijske linije i upotrebljavaju se za adoptivnu T ćelijsku terapiju. U tom pogledu, predmetno učenje obezbeđuje T ćelijske receptore specifične za CLDN18.2 ili CLDN18.2 peptide koji su ovde objavljeni. Generalno, ovaj aspekt učenja se odnosi na T ćelijske receptore koji prepoznaju ili vezuju CLDN18.2 peptide prezentovane u kontekstu MHC. Nukleinske kiseline koje kodiraju α- i β-lance T ćelijskog receptora, npr. T ćelijskog receptora koji je obezbeđen u skladu sa predmetnim učenjem, mogu biti sadržane na odvojenim molekulima nukleinske kiseline kao što su ekspresioni vektori ili alternativno, na jednom molekulu nukleinske kiseline. U skladu sa tim, termin "nukleinska kiselina koja kodira T ćelijski receptor" ili slični termini odnose se na molekule nukleinske kiseline koji kodiraju lance T ćelijskog receptora na istim ili poželjno na različitim molekulima nukleinske kiseline.
[0167] Termin "imunoreaktivna ćelija reaktivna sa peptidom" odnosi se na imunoreaktivnu ćeliju koja kada prepozna peptid, posebno ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije kancera, ispoljava efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija kao što je prethodno opisano.
[0168] Termin "T ćelijski receptor reaktivan sa peptidom" odnosi se na T ćelijski receptor koji kada je prisutan na imunoreaktivnoj ćeliji prepoznaje peptid, posebno ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije kancera, tako da imunoreaktivna ćelija ispoljava efektorske funkcije imunoreaktivnih ćelija kao što je prethodno opisano.
[0169] Termin "antigen-reaktivna T ćelija" ili slični termini se odnose na T ćeliju koja prepoznaje antigen ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije kancera i ispoljava efektorske funkcije T ćelije kao što je prethodno opisano.
[0170] Termin "antigen-specifična limfoidna ćelija" odnosi se na limfoidnu ćeliju koja, posebno kada je obezbeđena sa antigen-specifičnim T ćelijskim receptorom, prepoznaje antigen ukoliko je prezentovan u kontekstu MHC molekula kao što je na površini antigenprezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija kao što su ćelije kancera i poželjno ispoljava efektorske funkcije T ćelija kao što je prethodno opisano. Smatra se da su T ćelije i druge limfoidne ćelije specifične za antigen ukoliko ćelije ubijaju ciljne ćelije koje eksprimiraju antigen i/ili prezentuju antigenski peptid. Specifičnost T ćelija može da se proceni upotrebom bilo koje od niza standardnih tehnika, na primer, u okviru testa oslobađanja hroma ili testa proliferacije. Alternativno, može se izmeriti sinteza limfokina (kao što je interferon-γ).
[0171] Termin "glavni kompleks histokompatibilnosti" i skraćenica "MHC" uključuju MHC molekule klase I i MHC molekule klase II i odnose se na kompleks gena koji se javlja kod svih kičmenjaka. MHC proteini ili molekuli su važni za signalizaciju između limfocita i antigen-prezentujućih ćelija ili bolesnih ćelija u imunskim reakcijama, pri čemu MHC proteini ili molekuli vezuju peptide i prezentuju ih za prepoznavanje T ćelijskim receptorima. Proteini koje kodira MHC eksprimiraju se na površini ćelija, i prikazuju i sopstvene antigene (fragmente peptida iz same ćelije) i nesopstvene antigene (npr. fragmente invazivnih mikroorganizama) T ćeliji.
[0172] MHC region je podeljen u tri podgrupe, klasu I, klasu II, i klasu III. Proteini MHC klase I sadrže α-lanac i β2-mikroglobulin (nije deo MHC koji je kodiran hromozomom 15). Oni prezentuju fragmente antigena citotoksičnim T ćelijama. Na većini ćelija imunskog sistema, specifično na antigen-prezentujućim ćelijama, proteini MHC klase II sadrže α- i βlance i prezentuju fragmente antigena T-pomoćničkim ćelijama. Region MHC klase III kodira druge imunske komponente, kao što su komponente komplementa i neke koje kodiraju citokine.
[0173] Kod ljudi, geni u MHC regionu koji kodiraju antigen-prezentujuće proteine na ćelijskoj površini označavaju se kao geni humanog leukocitnog antigena (HLA). Međutim, skraćenica MHC se često upotrebljava za označavanje proizvoda HLA gena. HLA geni uključuju devet takozvanih klasičnih MHC gena: HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1, HLA-DRA, i HLA-DRB1.
[0174] U jednom poželjnom primeru izvođenja svih aspekata učenja MHC molekul je HLA molekul.
[0175] Pod "ćelija koja je okarakterisana prezentovanjem antigena", "ćelija koja prezentuje antigen", "antigen prezentovan od strane ćelije", "prezentovani antigen" ili sličnim izrazima podrazumeva se ćelija kao što je bolesna ćelija kao što je ćelija kancera, ili antigenprezentujuća ćelija koja prezentuje antigen koji eksprimira ili fragment izveden iz navedenog antigena, npr. obradom antigena, u kontekstu MHC molekula, posebno MHC molekula klase I. Slično, termini "bolest koja je okarakterisana prezentovanjem antigena" označava bolest koja uključuje ćelije koje su okarakterisane prezentovanjem antigena, posebno sa MHC klase I. Prezentovanje antigena od strane ćelije može da se izvrši transfekcijom ćelije sa nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira antigen.
[0176] Pod "fragmentom antigena koji se prezentuje" ili sličnim izrazima podrazumeva se da fragment može biti prezentovan od strane MHC klase I ili klase II, poželjno MHC klase I, npr. kada se doda direktno antigen-prezentujućim ćelijama. U jednom primeru izvođenja, fragment je fragment koji je prirodno prezentovan od strane ćelija koje eksprimiraju antigen.
[0177] Neki terapijski postupci se zasnivaju na reakciji imunskog sistema pacijenta, koja rezultuje lizom bolesnih ćelija koje prezentuju antigen sa MHC klase I. S tim u vezi, na primer, autologni citotoksični T limfociti specifični za kompleks antigenskog peptida i MHC molekula mogu da se primenjuju pacijentu koji ima bolest. Proizvodnja takvih citotoksičnih T limfocita in vitro je poznata. Primer postupka diferencijacije T ćelija može se naći u WO-A-9633265. Generalno, uzorak koji sadrži ćelije kao što su ćelije krvi uzima se od pacijenta i ćelije se dovode u kontakt sa ćelijom koja prezentuje kompleks i koja može da izazove propagaciju citotoksičnih T limfocita (npr. dendritske ćelije). Ciljna ćelija može biti transfektovana ćelija kao što je COS ćelija. Ove transfektovane ćelije prezentuju željeni kompleks na svojoj površini i, kada su u kontaktu sa citotoksičnim T limfocitima, stimulišu propagaciju ovih potonjih. Klonalno umnoženi autologni citotoksični T limfociti se zatim primenjuju pacijentu.
[0178] U sledećem postupku selekcije citotoksičnih T limfocita, fluorogeni tetrameri MHC molekul klase I/peptid kompleksa upotrebljavaju se za dobijanje specifičnih klonova citotoksičnih T limfocita (Altman et al. (1996), Science 274:94-96; Dunbar et al. (1998), Curr. Biol. 8:413-416, 1998).
[0179] Štaviše, ćelije koje prezentuju željeni kompleks (npr. dendritske ćelije) mogu se kombinovati sa citotoksičnim T limfocitima zdravih pojedinaca ili druge vrste (npr. miša) što može rezultovati propagacijom specifičnih citotoksičnih T limfocita sa visokim afinitetom. T ćelijski receptor visokog afiniteta ovih propagiranih specifičnih T limfocita može biti kloniran i opciono humanizovan u različitoj meri, i tako dobijeni T ćelijski receptori se zatim transduciraju putem transfera gena, na primer upotrebom retrovirusnih vektora, u T ćelije pacijenata. Adoptivni transfer se zatim može izvršiti upotrebom ovih genetički izmenjenih T limfocita (Stanislawski et al. (2001), Nat Immunol. 2:962-70; Kessels et al. (2001), Nat Immunol. 2:957-61).
[0180] Citotoksični T limfociti se takođe mogu generisati in vivo na način poznat per se. Jedan postupak upotrebljava neproliferativne ćelije koje eksprimiraju MHC klase I/peptid kompleks. Ćelije koje se ovde upotrebljavaju biće one koje uobičajeno eksprimiraju kompleks, kao što su ozračene tumorske ćelije ili ćelije transfektovane sa jednim ili oba gena neophodna za prezentovanje kompleksa (tj. antigenski peptid i prezentujući MHC molekul). Sledeći poželjni oblik je introdukovanje antigena u obliku rekombinantne RNK koja se može introdukovati u ćelije lipozomskim transferom ili elektroporacijom, na primer. Rezultujuće ćelije prezentuju kompleks od interesa i prepoznaju ih autologni citotoksični T limfociti koji se zatim propagiraju.
[0181] Sličan efekat se može postići kombinovanjem antigena ili antigenskog peptida sa adjuvansom kako bi se omogućilo in vivo inkorporisanje u antigen-prezentujuće ćelije. Antigen ili antigenski peptid može biti predstavljen kao protein, kao DNK (npr. unutar vektora) ili kao RNK. Antigen se može obraditi kako bi se proizveo peptidni partner za MHC molekul, dok se njegov fragment može prezentovati bez potrebe za daljom obradom. Ovo potonje je slučaj posebno, ukoliko se oni mogu vezati za MHC molekule. Prednost se daje oblicima primene u kojima se kompletan antigen obrađuje in vivo od strane dendritske ćelije, pošto ovo takođe može proizvesti odgovore T pomoćničkih ćelija koji su potrebni za efikasan imunski odgovor (Ossendorp et al., Immunol Lett. (2000), 74:75-9; Ossendorp et al., (1998), J Exp. Med. 187:693-702. Generalno, moguće je da se pacijentu primeni efikasna količina antigena asociranog sa tumorom pomoću intradermalne injekcije, na primer. Međutim, injekcija se takođe može izvršiti intranodalno u limfni čvor (Maloy et al. (2001), Proc Natl Acad Sci USA 98:3299-303).
[0182] U skladu sa učenjem, termin "veštački T ćelijski receptor" je sinonim za termine "himerni T ćelijski receptor" i "himerni antigenski receptor (CAR)".
[0183] Ovi termini se odnose na projektovane receptore, koji daju proizvoljnu specifičnost kao što je specifičnost monoklonalnog antitela, na imunskoj efektorskoj ćeliji kao što je T ćelija. Na ovaj način, može se generisati veliki broj T ćelija specifičnih za kancer za adoptivni transfer ćelija. Stoga, veštački T ćelijski receptor može biti prisutan na T ćelijama, npr. umesto ili pored sopstvenog T ćelijskog receptora T ćelije. Takve T ćelije ne zahtevaju nužno obradu i prezentovanje antigena za prepoznavanje ciljne ćelije, već mogu da prepoznaju poželjno sa specifičnošću bilo koji antigen koji je prisutan na ciljnoj ćeliji. Poželjno, navedeni veštački T ćelijski receptor se eksprimira na površini ćelija. U svrhu predmetnog učenja T ćelije koje sadrže veštački T ćelijski receptor su sadržane pod terminom "T ćelija" kao što se ovde upotrebljava.
4
[0184] U jednom primeru izvođenja, jednolančani varijabilni fragment (scFv) izveden iz monoklonalnog antitela je fuzionisan za CD3-zeta transmembranski i endodomen. Takvi molekuli rezultuju prenošenjem zeta signala kao odgovora na prepoznavanje od strane scFv njegovog antigenskog cilja na ciljnoj ćeliji i ubijanje ciljne ćelije koja eksprimira ciljni antigen. Domeni za prepoznavanje antigena koji se takođe mogu upotrebljavati uključuju, između ostalog, alfa i beta pojedinačne lance T-ćelijskog receptora (TCR). U stvari, skoro sve što vezuje dati cilj sa visokim afinitetom može se upotrebljavati kao domen za prepoznavanje antigena.
[0185] Nakon prepoznavanja antigena, receptori se grupišu i signal se prenosi u ćeliju. U tom pogledu, "T ćelijski signalni domen" je domen, poželjno endodomen, koji prenosi aktivacioni signal na T ćeliju pošto se antigen veže. Najčešće upotrebljavana komponenta endodomena je CD3-zeta.
[0186] Terapija adoptivnog transfera ćelija sa CAR-projektovanim T ćelijama koje eksprimiraju himerne antigenske receptore je obećavajući antikancerski terapeutik, pošto T CAR-modifikovane ćelije mogu biti projektovane da ciljaju praktično bilo koji tumorski antigen. Na primer, T ćelije pacijenta mogu biti genetički projektovane tako da eksprimiraju CAR koji su specifično usmereni na antigene na tumorskim ćelijama pacijenta, i zatim infuzijom vraćene u pacijenta.
[0187] U skladu sa učenjem veštački T ćelijski receptor može da zameni funkciju T ćelijskog receptora kao što je prethodno opisano i, posebno, može dati reaktivnost kao što je citolitička aktivnost ćeliji kao što je T ćelija kao što je prethodno opisano. Međutim, za razliku od vezivanja T ćelijskog receptora za antigenski peptid-MHC kompleks kao što je prethodno opisano, veštački T ćelijski receptor se može vezati za antigen, posebno eksprimiran na ćelijskoj površini.
[0188] CD3-zeta lanac površinskog glikoproteina T ćelije je protein koji je kod ljudi kodiran CD247 genom. CD3-zeta zajedno sa T-ćelijskim receptornim alfa/beta i gama/delta heterodimerima i CD3-gama, -delta, i -ipsilon, formira T-ćelijski receptor-CD3 kompleks. Zeta lanac igra važnu ulogu u sprezi prepoznavanja antigena sa nekoliko unutarćelijskih puteva transdukcije signala. Termin "CD3-zeta" se poželjno odnosi na humani CD3-zeta, i, posebno, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 40 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence.
[0189] CD28 (klaster diferencijacije 28) je jedan od molekula koji se eksprimiraju na T ćelijama koje obezbeđuju kostimulatorne signale, koji su potrebni za aktivaciju T ćelija. CD28 je receptor za CD80 (B7.1) i CD86 (B7.2). Stimulacija preko CD28 pored T ćelijskog receptora (TCR) može da obezbedi potentan kostimulatorni signal T ćelijama za proizvodnju različitih interleukina (posebno IL-6). Termin "CD28" se poželjno odnosi na humani CD28, i posebno, na protein koji sadrži, poželjno se sastoji od amino-kiselinske sekvence SEQ ID NO: 39 na listi sekvenci ili varijante navedene amino-kiselinske sekvence.
[0190] U skladu sa učenjem, CAR generalno mogu sadržati tri domena.
[0191] Prvi domen je vezujući domen koji prepoznaje i vezuje CLDN18.2.
[0192] Drugi domen je kostimulacioni domen. Kostimulacioni domen služi za poboljšanje proliferacije i preživljavanja citotoksičnih limfocita nakon vezivanja CAR za ciljanu funkcionalnu grupu. Identičnost kostimulacionog domena je ograničena samo po tome što ima sposobnost da poboljša ćelijsku proliferaciju i preživljavanje nakon vezivanja ciljane funkcionalne grupe od strane CAR. Pogodni kostimulacioni domeni uključuju CD28, CD137 (4-1BB), člana porodice receptora faktora nekroze tumora (TNF), CD134 (OX40), člana TNFR-superporodice receptora, i CD278 (ICOS), kostimulatorni molekul CD28-superporodice koji se eksprimira na aktiviranim T ćelijama. Osoba sa iskustvom će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih kostimulacionih domena mogu upotrebljavati bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelirane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa aminokiselinskom sekvencom domena iz kog su izvedene. U nekim primerima izvođenja učenja, CAR konstrukti sadrže dva kostimulaciona domena. Dok posebne kombinacije uključuju sve moguće varijacije četiri navedena domena, specifični primeri uključuju CD28+CD137 (4-1BB) i CD28+CD134 (OX40).
[0193] Treći domen je aktivacioni signalni domen (ili T ćelijski signalni domen). Aktivacioni signalni domen služi da aktivira citotoksične limfocite nakon vezivanja CAR za CLDN18.2. Identičnost aktivacionog signalnog domena je ograničena samo po tome što ima sposobnost da indukuje aktivaciju odabranog citotoksičnog limfocita nakon vezivanja CLDN18.2 od strane CAR. Pogodni aktivacioni signalni domeni uključuju T ćelijski CD3[zeta] lanac i Fc receptor [gama]. Osoba sa iskustvom će razumeti da se varijante sekvenci ovih napomenutih aktivacionih signalnih domena mogu upotrebljavati bez negativnog uticaja na učenje, gde varijante imaju istu ili sličnu aktivnost kao domen na kome su modelirane. Takve varijante će imati najmanje oko 80% identičnosti sekvence sa amino-kiselinskom sekvencom domena iz kog su izvedene.
[0194] CAR iz predmetnog učenja mogu da sadrže tri domena, zajedno u obliku fuzionog proteina. Takvi fuzioni proteini će generalno sadržati vezujući domen, jedan ili više kostimulacionih domena, i aktivacioni signalni domen, koji su povezani u smeru od Nterminusa prema C-terminusu. Međutim, CAR iz predmetnog učenja nisu ograničeni na ovaj aranžman i drugi aranžmani su prihvatljivi i uključuju vezujući domen, aktivacioni signalni domen, i jedan ili više kostimulacionih domena. Razumeće se da zato što vezujući domen mora biti slobodan da veže CLDN18.2, postavljanje vezujućeg domena u fuzioni protein će generalno biti takvo da se postiže prikaz regiona na spoljašnjosti ćelije. Na isti način, zato što kostimulacioni i aktivacioni signalni domeni služe da indukuju aktivnost i proliferaciju citotoksičnih limfocita, fuzioni protein će generalno prikazati ova dva domena u unutrašnjosti ćelije. CAR mogu uključivati dodatne elemente, kao što je signalni peptid kako bi se osigurao pravilan eksport fuzionog proteina na površinu ćelije, transmembranski domen kako bi se osiguralo da se fuzioni protein održava kao integralni membranski protein, i zglobni domen (ili spejser region) koji daje fleksibilnost vezujućem domenu i omogućava snažno vezivanje za CLDN18.2.
[0195] Ćelije koje se upotrebljavaju u vezi sa CAR sistemom iz predmetnog učenja su poželjno T ćelije, posebno citotoksični limfociti, poželjno odabrani od citotoksičnih T ćelija, ćelija prirodnih ubica (NK), i ćelija ubica aktiviranih limfokinom (LAK). Nakon aktivacije, svaki od ovih citotoksičnih limfocita pokreće uništavanje ciljnih ćelija. Na primer, citotoksične T ćelije pokreću uništavanje ciljnih ćelija na jedan ili oba od sledećih načina. Prvo, nakon aktivacije T ćelije oslobađaju citotoksine kao što su perforin, granzimi, i granulizin. Perforin i granulizin stvaraju pore u ciljnoj ćeliji, i granzimi ulaze u ćeliju i pokreću kaspaznu kaskadu u citoplazmi koja indukuje apoptozu (programirana ćelijska smrt) ćelije. Drugo, apoptoza se može indukovati putem interakcije Fas-Fas liganda između T ćelija i ciljnih tumorskih ćelija. Citotoksični limfociti će poželjno biti autologne ćelije, iako se mogu upotrebljavati heterologne ćelije ili alogene ćelije.
[0196] U skladu sa učenjem, "referenca" kao što je referentni uzorak ili referentni organizam može se upotrebljavati za korelaciju i upoređivanje rezultata dobijenih postupcima iz učenja iz test uzorka ili test organizma. Tipično, referentni organizam je zdrav organizam, posebno organizam koji ne pati od bolesti kao što je bolest kancera. "Referentna vrednost" ili "referentni nivo" se može odrediti iz reference empirijski merenjem dovoljno velikog broja referenci. Poželjno, referentna vrednost se određuje merenjem najmanje 2, poželjno najmanje 3, poželjno najmanje 5, poželjno najmanje 8, poželjno najmanje 12, poželjno najmanje 20, poželjno najmanje 30, poželjno najmanje 50, ili poželjno najmanje 100 referenci.
[0197] U skladu sa učenjem, termin "vezujući agens" uključuje svako jedinjenje koje ima kapacitet vezivanja za cilj. Poželjno, takav vezujući agens sadrži najmanje jedan vezujući domen za cilj. Termin uključuje molekule kao što su antitela i fragmenti antitela, bispecifične
4
ili multispecifične molekule, himerne antigenske receptore (CAR) i sve veštačke vezujuće molekule (skele) koji imaju kapacitet vezivanja za cilj uključujući, ali ne ograničavajući se na nanotela, afitela, antikaline, DARPine, monotela, avimere, i mikrotela. U jednom primeru izvođenja navedeno vezivanje je specifično vezivanje.
[0198] Termin "imunoglobulin" se odnosi na proteine superporodice imunoglobulina, poželjno na antigenske receptore kao što su antitela ili B ćelijski receptor (BCR). Imunoglobulini su okarakterisani strukturnim domenom, tj. domenom imunoglobulina, koji ima karakterističan imunoglobulinski (Ig) nabor. Termin obuhvata imunoglobuline vezane za membranu, kao i solubilne imunoglobuline. Imunoglobulini vezani za membranu se takođe nazivaju površinski imunoglobulini ili membranski imunoglobulini, koji su generalno deo BCR. Solubilni imunoglobulini se generalno nazivaju antitelima. Imunoglobulini generalno sadrže nekoliko lanaca, tipično dva identična teška lanca i dva identična laka lanca koji su povezani putem disulfidnih veza. Ovi lanci su primarno sačinjeni od domena imunoglobulina, kao što su VL(varijabilni laki lanac) domen, CL(konstantni laki lanac) domen, i CH(konstantni teški lanac) domeni CH1, CH2, CH3, i CH4. Postoji pet tipova teških lanaca imunoglobulina sisara, tj. α, δ, ε, γ, i μ koji doprinose različitim klasama antitela, tj. IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM. Za razliku od teških lanaca solubilnih imunoglobulina, teški lanci membranskih ili površinskih imunoglobulina sadrže transmembranski domen i kratki citoplazmatski domen na svom karboksi-terminusu. Kod sisara postoje dva tipa lakih lanaca, tj. lambda i kapa. Lanci imunoglobulina sadrže varijabilni region i konstantni region. Konstantni region je suštinski konzerviran unutar različitih izotipova imunoglobulina, pri čemu je varijabilni deo veoma raznolik i doprinosi prepoznavanju antigena.
[0199] Termin "antitelo" označava glikoprotein koji sadrži najmanje dva teška (H) lanca i dva laka (L) lanca međusobno povezana pomoću disulfidnih veza. Termin "antitelo" uključuje monoklonalna antitela, rekombinantna antitela, humana antitela, humanizovana antitela i himerna antitela. Svaki teški lanac se sastoji od varijabilnog regiona teškog lanca (ovde skraćeno kao VH) i konstantnog regiona teškog lanca. Svaki laki lanac se sastoji od varijabilnog regiona lakog lanca (ovde skraćeno kao VL) i konstantnog regiona lakog lanca. VH i VL regioni se mogu dodatno podeliti na regione hipervarijabilnosti, nazvane regioni koji određuju komplementarnost (CDR), ispresecane regionima koji su konzerviraniji, nazvanim regioni okvira (FR). Svaki VH i VL je sačinjen od tri CDR i četiri FR, raspoređenih od amino-terminusa prema karboksi-terminusu u sledećem redosledu: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Varijabilni regioni teških i lakih lanaca sadrže vezujući domen koji interaguje sa antigenom. Konstantni regioni antitela mogu posredovati u vezivanju imunoglobulina za tkiva ili faktore domaćina, uključujući različite ćelije imunskog sistema (npr. efektorske ćelije) i prvu komponentu (Clq) klasičnog sistema komplementa.
[0200] Termin "monoklonalno antitelo" kao što se ovde upotrebljava označava pripremu molekula antitela jednomolekulske kompozicije. Monoklonalno antitelo pokazuje jednu specifičnost i afinitet vezivanja. U jednom primeru izvođenja, monoklonalna antitela su proizvedena od strane hibridoma koji uključuje B ćeliju dobijenu od ne-humane životinje, npr. miša, fuzionisanu sa imortalizovanom ćelijom.
[0201] Termin "rekombinantno antitelo", kao što se ovde upotrebljava, uključuje sva antitela koja su pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana rekombinantnim načinima, kao što su (a) antitela izolovana iz životinje (npr. miša) koja je transgena ili transhromozomska u odnosu na gene imunoglobulina ili hibridoma pripremljenog od njih, (b) antitela izolovana iz ćelije domaćina transformisane da eksprimira antitelo, npr. iz transfektoma, (c) antitela izolovana iz rekombinantne, kombinatorne biblioteke antitela, i (d) antitela pripremljena, eksprimirana, stvorena ili izolovana na bilo koji drugi način koji uključuje splajsovanje sekvenci gena imunoglobulina sa drugim DNK sekvencama.
[0202] Termin "humano antitelo", kao što se ovde upotrebljava, je namenjeno da uključi antitela koja imaju varijabilne i konstantne regione izvedene iz sekvenci imunoglobulina humane germinativne linije. Humana antitela mogu uključivati amino-kiselinske ostatke koji nisu kodirani sekvencama imunoglobulina humane germinativne linije (npr. mutacije introdukovane nasumičnom mutagenezom ili mutagenezom specifičnom za mesto in vitro ili somatskom mutacijom in vivo).
[0203] Termin "humanizovano antitelo" označava molekul koji ima vezujuće mesto za antigen koje je suštinski izvedeno iz imunoglobulina ne-humane vrste, pri čemu je preostala struktura molekula imunoglobulina zasnovana na strukturi i/ili sekvenci humanog imunoglobulina. Vezujuće mesto za antigen može da sadrži ili kompletne varijabilne domene fuzionisane na konstantne domene ili samo regione koji određuju komplementarnost (CDR) graftovane na prikladne regione okvira u varijabilnim domenima. Vezujuća mesta za antigen mogu biti divljeg tipa ili modifikovana sa jednom ili više amino-kiselinskih supstitucija, npr. modifikovane tako da više liče na humane imunoglobuline. Neki oblici humanizovanih antitela čuvaju sve CDR sekvence (na primer humanizovano mišje antitelo koje sadrži svih šest CDR iz antitela miša). Drugi oblici imaju jedan ili više CDR koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo.
[0204] Termin "himerno antitelo" označava ona antitela kod kojih je jedan deo svake od amino-kiselinskih sekvenci teških i lakih lanaca homologan odgovarajućim sekvencama u
4
antitelima izvedenim iz određene vrste ili koje pripadaju određenoj klasi, dok je preostali segment lanca homologan odgovarajućim sekvencama u drugoj. Tipično varijabilni region i lakih i teških lanaca oponaša varijabilne regione antitela izvedenih iz jedne vrste sisara, dok su konstantni delovi homologni sekvencama antitela izvedenih iz druge. Jedna jasna prednost ovakvih himernih oblika je da se varijabilni region može pogodno izvesti iz trenutno poznatih izvora upotrebom lako dostupnih B-ćelija ili hibridoma iz organizama domaćina koji nisu humani u kombinaciji sa konstantnim regionima koji su izvedeni iz, na primer, preparata humanih ćelija. Dok varijabilni region ima prednost u jednostavnosti pripreme i na specifičnost ne utiče izvor, pošto je konstantni region humani, manje je verovatno da će izazvati imunski odgovor kod humanog subjekta kada se antitela injektiraju nego što bi to bio slučaj sa konstantnim regionom iz ne-humanog izvora. Međutim, definicija nije ograničena na ovaj konkretan primer.
[0205] Antitela mogu biti izvedena iz različitih vrsta, uključujući, ali ne ograničavajući se na, miša, pacova, zeca, zamorca i čoveka.
[0206] Antitela koja su ovde opisana uključuju IgA kao što su IgA1 ili IgA2, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM, i IgD antitela. U različitim primerima izvođenja, antitelo je IgG1 antitelo, konkretnije IgG1, kapa ili IgG1, lambda izotip (tj. IgG1, κ, λ), IgG2a antitelo (npr. IgG2a, κ, λ), IgG2b antitelo (npr. IgG2b, κ, λ), IgG3 antitelo (npr. IgG3, κ, λ) ili IgG4 antitelo (npr. IgG4, κ, λ).
[0207] Antitela koja su ovde opisana su poželjno izolovana. "Izolovano antitelo" kao što se ovde upotrebljava, namenjeno je da označi antitelo koje je suštinski bez drugih antitela koja imaju različite antigene specifičnosti (npr. izolovano antitelo koje se specifično vezuje za CLDN18.2 je suštinski bez antitela koja specifično vezuju antigene druge nego CLDN18.2). Izolovano antitelo koje se specifično vezuje za epitop, izoformu ili varijantu humanog CLDN18.2 može, međutim, da ima unakrsnu reaktivnost sa drugim srodnim antigenima, npr. iz drugih vrsta (npr. homologe CLDN18.2 vrsta). Štaviše, izolovano antitelo može biti suštinski bez drugog ćelijskog materijala i/ili hemikalija. U jednom primeru izvođenja učenja, kombinacija "izolovanih" monoklonalnih antitela se odnosi na antitela koja imaju različite specifičnosti i koja su kombinovana u dobro definisanu kompoziciju ili smešu.
[0208] Termini "antigen-vezujući deo" antitela (ili jednostavno "vezujući deo") ili "antigenvezujući fragment" antitela (ili jednostavno "vezujući fragment") ili slični termini označavaju jedan ili više fragmenata antitela koji zadržavaju sposobnost specifičnog vezivanja za antigen. Pokazano je da antigen-vezujuću funkciju antitela mogu izvršiti fragmenti antitela pune dužine. Primeri vezujućih fragmenata obuhvaćenih terminom "antigen-vezujući deo" antitela
4
uključuju (i) Fab fragmente, monovalentne fragmente koji se sastoje od VL, VH, CL i CH domena; (ii) F(ab’)2fragmente, bivalentne fragmente koji sadrže dva Fab fragmenta povezana pomoću disulfidnog mosta u zglobnom regionu; (iii) Fd fragmente koji se sastoje od VH i CH domena; (iv) Fv fragmente koji se sastoje od VL i VH domena jednog kraka antitela, (v) dAb fragmente (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546), koji se sastoje od VH domena; (vi) izolovane regione koji određuju komplementarnost (CDR), i (vii) kombinacije dva ili više izolovana CDR koji opciono mogu biti spojeni sintetičkim linkerom. Štaviše, iako su dva domena Fv fragmenta, VL i VH, kodirani odvojenim genima, oni se mogu spojiti, upotrebom rekombinantnih postupaka, sintetičkim linkerom koji im omogućava da budu napravljeni kao jedan proteinski lanac u kome se VL i VH regioni sparuju da formiraju monovalentne molekule (poznate kao jednolančani Fv (scFv); videti npr. Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; i Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883). Takođe je namenjeno da ovakva jednolančana antitela budu obuhvaćena terminom "antigen-vezujući fragment" antitela. Dodatni primer su fuzioni proteini imunoglobulina sa vezujućim domenom koji sadrže (i) polipeptid vezujućeg domena koji je fuzionisan sa polipeptidom zglobnog regiona imunoglobulina, (ii) CH2 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa zglobnim regionom, i (iii) CH3 konstantni region teškog lanca imunoglobulina fuzionisan sa CH2 konstantnim regionom. Polipeptid vezujućeg domena može biti varijabilni region teškog lanca ili varijabilni region lakog lanca. Fuzioni proteini imunoglobulina sa vezujućim domenom su dodatno objavljeni u US 2003/0118592 i US 2003/0133939. Ovi fragmenti antitela se dobijaju upotrebom konvencionalnih tehnika koje su poznate onima sa iskustvom u struci, i fragmenti se pregledaju za primenljivost na isti način kao i intaktna antitela.
[0209] U skladu sa učenjem, termin "vezujući domen za CLDN18.2" uključuje i poželjno se odnosi na antigen-vezujući deo CLDN18.2 antitela, tj. antitela koje je usmereno prema CLDN18.2 i poželjno je specifično za CLDN18.2.
[0210] Termin "vezujući domen" je okarakterisan u vezi sa predmetnim učenjem strukturom, npr. antitela, koja se vezuje za/interaguje sa datom ciljnom strukturom/antigenom/epitopom. Stoga, vezujući domen u skladu sa učenjem označava "mesto interakcije sa antigenom".
[0211] Sva antitela i derivati antitela, kao što su fragmenti antitela, kao što su ovde opisani u svrhe učenja obuhvaćeni su terminom "antitelo".
[0212] Antitela se mogu proizvesti različitim tehnikama, uključujući konvencionalnu metodologiju monoklonalnih antitela, npr. standardnu tehniku hibridizacije somatskih ćelija Kolera (Kohler) i Milštajna (Milstein), Nature 256: 495 (1975). Iako su procedure hibridizacije somatskih ćelija poželjnije, u principu, mogu se koristiti druge tehnike za
4
proizvodnju monoklonalnih antitela, npr. virusna ili onkogena transformacija B-limfocita ili tehnike displeja faga upotrebom biblioteka gena antitela.
[0213] Poželjni životinjski sistem za pripremanje hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela je murinski sistem. Proizvodnja hibridoma kod miša je veoma dobro uspostavljena procedura. Protokoli i tehnike imunizacije za izolaciju imunizovanih splenocita za fuziju poznate su u struci. Takođe su poznati fuzioni partneri (npr. murinske ćelije mijeloma) i procedure fuzije.
[0214] Drugi poželjni životinjski sistemi za pripremanje hibridoma koji sekretuju monoklonalna antitela su pacovski i zečji sistem (npr. opisano u Spieker-Polet et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:9348 (1995), videti takođe Rossi et al., Am J. Clin. Pathol. 124: 295 (2005)).
[0215] Kako bi se generisala antitela, miševi mogu biti imunizovani peptidima koji su izvedeni iz sekvence antigena, tj. sekvence prema kojoj antitela treba da budu usmerena konjugovanim sa nosačem, obogaćenim preparatom rekombinantno eksprimiranog antigena ili njegovih fragmenata i/ili ćelijama koje eksprimiraju antigen, kao što je opisano. Alternativno, miševi mogu biti imunizovani sa DNK koja kodira antigen ili njegove fragmente. U slučaju da imunizacije koje upotrebljevaju prečišćeni ili obogaćeni preparat antigena ne rezultuju antitelima, miševi se takođe mogu imunizovati ćelijama koje eksprimiraju antigen, npr. ćelijskom linijom, kako bi se promovisali imunski odgovori.
[0216] Imunski odgovor se može pratiti tokom protokola imunizacije sa uzorcima plazme i seruma koji se dobijaju pomoću uzimanja krvi iz repne vene ili retroorbitalnog uzimanja krvi. Za fuzije se mogu upotrebljavati miševi sa dovoljnim titrima imunoglobulina. Miševi se mogu podstaći intraperitonealno ili intravenski sa ćelijama koje eksprimiraju antigen 3 dana pre žrtvovanja i uklanjanja slezine kako bi se povećala stopa hibridoma koji sekretuju specifična antitela.
[0217] Kako bi se generisali hibridomi koji proizvode monoklonalna antitela, splenociti i ćelije iz limfnih čvorova imunizovanih miševa mogu se izolovati i fuzionosati za prikladnu imortalizovanu ćelijsku liniju, kao što je ćelijska linija mijeloma miša. Rezultujući hibridomi se zatim mogu pregledati za proizvodnju antigen-specifičnih antitela. Pojedinačni bunarići se zatim mogu pregledati pomoću ELISA testa na hibridome koji sekretuju antitela. Pomoću imunofluorescence i FACS analize upotrebom ćelija koje eksprimiraju antigen, mogu se identifikovati antitela sa specifičnošću za antigen. Hibridomi koji sekretuju antitela se mogu ponovo zasejati, ponovo pregledati, i ukoliko su još pozitivni na monoklonalna antitela, mogu
4
se subklonirati ograničenim razblaženjem. Stabilni subklonovi se zatim mogu kultivisati in vitro kako bi se generisalo antitelo u medijumu za kulturu tkiva za karakterizaciju.
[0218] Sposobnost antitela i drugih vezujućih agenasa da vezuju antigen može se odrediti upotrebom standardnih testova vezivanja (npr. ELISA, Western blot, imunofluorescenca i analiza protočnom citometrijom).
[0219] Antitela i derivati antitela su korisni za obezbeđivanje vezujućih domena kao što su fragmenti antitela, posebno za obezbeđivanje VL i VH regiona.
[0220] Vezujući domen za CLDN18.2 koji može biti prisutan unutar veštačkog T ćelijskog receptora ima sposobnost vezivanja za CLDN18.2, tj. sposobnost vezivanja za epitop prisutan u CLDN18.2, poželjno epitop koji je lociran unutar vanćelijskih domena CLDN18.2, posebno prve vanćelijske petlje, poželjno amino-kiselinske pozicije 29 do 78 CLDN18.2. U posebnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 se vezuje za epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN18.1. Najpoželjnije, vezujući domen za CLDN18.2 se vezuje za epitop na CLDN18.2 koji nije prisutan na CLDN proteinu koji je drugi nego CLDN18.2.
[0221] Vezujući domen za CLDN18.2 poželjno se vezuje za CLDN18.2, ali ne i za CLDN18.1. Poželjno, vezujući domen za CLDN18.2 je specifičan za CLDN18.2. Poželjno, vezujući domen za CLDN18.2 se vezuje za CLDN18.2 koji se eksprimira na ćelijskoj površini. U posebno poželjnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 se vezuje za nativne epitope CLDN18.2 prisutne na površini živih ćelija.
[0222] U poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži varijabilni region teškog lanca (VH) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23, 24 i 25, ili njen fragment, ili varijantu navedene aminokiselinske sekvence ili fragmenta.
[0223] U poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži varijabilni region lakog lanca (VL) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu odabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 i 34, ili njen fragment, ili varijantu navedene amino-kiselinske sekvence ili fragmenta.
[0224] U određenim poželjnim primerima izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) odabranu od sledećih mogućnosti (i) do (ix):
(i) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 20 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 27 ili njenim fragmentom,
4
(ii) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 21 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 26 ili njenim fragmentom,
(iii) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 22 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 28 ili njenim fragmentom,
(iv) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 24 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 31 ili njenim fragmentom,
(v) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili njenim fragmentom,
(vi) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 25 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 29 ili njenim fragmentom,
(vii) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 25 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 32 ili njenim fragmentom,
(viii) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 25 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 33 ili njenim fragmentom,
(ix) VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 25 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 34 ili njenim fragmentom.
[0225] U posebno poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži sledeću kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL): VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili njenim fragmentom.
[0226] U dodatnom posebno poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži sledeću kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL): VH sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 21 ili njenim fragmentom i VL sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 26 ili njenim fragmentom.
[0227] U poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži (i) VH koji sadrži CDR3 koji sadrži sledeću sekvencu: TRSWRGNSFDY i/ili (ii) VL koji sadrži CDR3 koji sadrži sledeću sekvencu: QNDYSYPFT.
[0228] U poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži
(i) VH koji sadrži sledeći skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3:
CDR1: GYTFTSYW, CDR2: IYPSDSYT, CDR3: TRSWRGNSFDY
i/ili
(ii) VL koji sadrži sledeći skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3:
CDR1: QSLLNSGNQKNY, CDR2: WAS, CDR3: QNDYSYPFT.
[0229] U poželjnom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 sadrži kombinaciju VH i VL od kojih svaki sadrži sledeći skup regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3:
VH: CDR1: GYTFTSYW, CDR2: IYPSDSYT, CDR3: TRSWRGNSFDY, VL: CDR1: QSLLNSGNQKNY, CDR2: WAS, CDR3: QNDYSYPFT.
[0230] Poželjno, kombinacija varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koja je ovde opisana je raspoređena u jednolančanom Fv (scFv).
[0231] Termin "fragment" označava, posebno, jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR), poželjno najmanje CDR3 varijabilni region, varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL). U jednom primeru izvođenja navedeni jedan ili više regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su odabrani iz skupa regiona koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3. U posebno poželjnom primeru izvođenja, termin "fragment" označava regione koji određuju komplementarnost CDR1, CDR2 i CDR3 varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i/ili varijabilnog regiona lakog lanca (VL).
[0232] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 koji sadrži jedan ili više CDR, skup CDR ili kombinaciju skupova CDR kao što je ovde opisano sadrži navedene CDR zajedno sa regionima okvira koji su postavljeni između njih. Poželjno, deo će takođe uključivati najmanje oko 50% od bilo kog jednog ili oba od prvog i četvrtog regiona okvira,
1
pri čemu je 50% C-terminusnih 50% prvog regiona okvira i N-terminusnih 50% četvrtog regiona okvira. Konstrukcija vezujućih agenasa napravljenih tehnikama rekombinantne DNK može rezultovati introdukovanjem ostataka N- ili C-terminusno prema varijabilnim regionima koji su kodirani linkerima introdukovanim kako bi se olakšalo kloniranje ili drugi koraci manipulacije, uključujući introdukovanje linkera za spajanje varijabilnih regiona iz učenja na dodatne proteinske sekvence uključujući teške lance imunoglobulina, druge varijabilne domene (na primer u proizvodnji dijatela) ili proteinske obeleživače.
[0233] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 koji sadrži jedan ili više CDR, skup CDR ili kombinaciju skupova CDR kao što je ovde opisano sadrži navedene CDR u regionu okvira humanog antitela.
[0234] U jednom primeru izvođenja, vezujući domen za CLDN18.2 u skladu sa učenjem odnosi se na vezujući domen za CLDN18.2 koji prepoznaje, tj. vezuje se za isti ili suštinski isti epitop kao vezujući domen za CLDN18.2 koji je ovde opisan (kao što je antitelo koje sadrži kombinaciju varijabilnog regiona teškog lanca (VH) i varijabilnog regiona lakog lanca (VL) koja je ovde opisana), i/ili je u kompeticiji sa navedenim vezujućim domenom za CLDN18.2 za vezivanje za CLDN18.2.
[0235] Termin "vezivanje" u skladu sa učenjem poželjno se odnosi na specifično vezivanje.
[0236] U skladu sa predmetnim učenjem, agens kao što je T ćelijski receptor ili antitelo je sposoban da se vezuje za unapred određeni cilj ukoliko ima značajan afinitet za navedeni unapred određeni cilj i vezuje se za navedeni unapred određeni cilj u standardnim testovima. "Afinitet" ili "afinitet vezivanja" se često meri ravnotežnom konstantom disocijacije (KD). Poželjno, termin "značajan afinitet" označava vezivanje za unapred određeni cilj sa konstantom disocijacije (KD) od 10<-5>M ili nižom, 10<-6>M ili nižom, 10<-7>M ili nižom, 10<-8>M ili nižom, 10<-9>M ili nižom, 10<-10>M ili nižom, 10<-11>M ili nižom, ili 10<-12>M ili nižom.
[0237] Agens nije (suštinski) sposoban da se vezuje za cilj ukoliko nema značajan afinitet za navedeni cilj i ne vezuje se značajno, i posebno se ne vezuje detektabilno, za navedeni cilj u standardnim testovima. Poželjno, agens se ne vezuje detektabilno za navedeni cilj ukoliko je prisutan u koncentraciji do 2, poželjno 10, poželjnije 20, posebno 50 ili 100 μg/ml ili višoj. Poželjno, agens nema značajan afinitet za cilj ukoliko se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta viša od KDza vezivanje za unapred određeni cilj za koji je agens sposoban da se vezuje. Na primer, ukoliko je KDza vezivanje agensa za cilj za koji je agens sposoban da se vezuje 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji agens nema značajan afinitet bio bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.
2
[0238] Agens je specifičan za unapred određeni cilj ukoliko je sposoban da se vezuje za navedeni unapred određeni cilj dok nije (suštinski) sposoban da se vezuje za druge ciljeve, tj. nema značajan afinitet za druge ciljeve i ne vezuje se značajno za druge ciljeve u standardnim testovima. U skladu sa učenjem, agens je specifičan za CLDN18.2 ukoliko je sposoban da se vezuje za CLDN18.2 ali nije (suštinski) sposoban da se vezuje za druge ciljeve. Poželjno, agens je specifičan za CLDN18.2 ukoliko afinitet za i vezivanje za takve druge ciljeve ne premašuje značajno afinitet za ili vezivanje za proteine koji nisu srodni sa CLDN18.2 kao što su goveđi serumski albumin (BSA), kazein, humani serumski albumin (HSA) ili ne-klaudin transmembranski proteini kao što su MHC molekuli ili receptor transferina ili bilo koji drugi specificirani polipeptid. Poželjno, agens je specifičan za unapred određeni cilj ukoliko se vezuje za navedeni cilj sa KDkoja je najmanje 10 puta, 100 puta, 10<3>puta, 10<4>puta, 10<5>puta, ili 10<6>puta niža od KDza vezivanje za cilj za koji nije specifičan. Na primer, ukoliko je KDza vezivanje agensa za cilj za koji je specifičan 10<-7>M, KDza vezivanje za cilj za koji nije specifičan bio bi najmanje 10<-6>M, 10<-5>M, 10<-4>M, 10<-3>M, 10<-2>M, ili 10<-1>M.
[0239] Vezivanje agensa za cilj može se odrediti eksperimentalno upotrebom bilo kog pogodnog postupka; videti, na primer, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" u Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, N Y (1984), Kuby, Janis Immunology, W. H. Freeman and Company New York, N Y (1992), i postupcima koji su ovde opisani. Afiniteti se mogu lako odrediti upotrebom konvencionalnih tehnika, kao što je ravnotežna dijaliza; upotrebom BIAcore 2000 instrumenta, upotrebom opštih procedura koje je naveo proizvođač; radioimunološkim testom upotrebom radioaktivno obeleženog ciljnog antigena; ili drugim postupkom koji je poznat iskusnom stručnjaku. Podaci o afinitetu mogu se analizirati, na primer, postupkom iz Scatchard et al., Ann N.Y. Acad. ScL, 51:660 (1949). Izmereni afinitet određene interakcije antitela sa antigenom može da varira ukoliko se meri pod različitim uslovima, npr. koncentracija soli, pH. Stoga, merenja afiniteta i drugih antigena-vezujućih parametara, npr. KD, IC50, poželjno se vrše sa standardizovanim rastvorima antitela i antigena, i standardizovanim puferom.
[0240] Podrazumeva se da se peptidni i proteinski agensi koji su ovde opisani mogu obezbediti in vitro ili in vivo u obliku nukleinske kiseline kao što je RNK koja kodira agens i/ili u obliku ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kao što je RNK koja kodira agens. Posebno, različiti postupci se mogu upotrebljavati za introdukovanje CAR konstrukata u T ćelije uključujući transfekciju DNK koja nije zasnovana na virusu, sisteme zasnovane na transpozonu i sisteme zasnovane na virusima. Transfekcija DNK koja nije zasnovana na virusu ima nizak rizik od insercione mutageneze. Sistemi zasnovani na transpozonu mogu efikasnije da integrišu transgene od plazmida koji ne sadrže integracioni element. Sistemi zasnovani na virusima uključuju upotrebu γ-retrovirusnih i lentivirusnih vektora. γ-retroviruse je relativno lako proizvesti, efikasno i trajno vrše transdukciju T ćelija, i preliminarno su se pokazali bezbednim sa stanovišta integracije u primarne humane T ćelije. Lentivirusni vektori takođe efikasno i trajno vrše transdukciju T ćelija, ali su skuplji za proizvodnju. Takođe su potencijalno bezbedniji od sistema zasnovanih na retrovirusima.
[0241] Peptidni i proteinski agensi koji su ovde opisani mogu biti isporučeni pacijentu primenom nukleinske kiseline kao što je RNK koja kodira agens i/ili primenom ćelije domaćina koja sadrži nukleinsku kiselinu kao što je RNK koja kodira agens. Nukleinska kiselina kada se primenjuje pacijentu može biti prisutna u golom obliku ili u pogodnom vehikulumu za isporuku, kao što je u obliku lipozoma ili virusnih čestica, ili unutar ćelije domaćina. Obezbeđena nukleinska kiselina može da proizvede agens tokom produženih vremenskih perioda na održiv način ublažavajući barem delimično nestabilnost uočenu za terapijske proteine. Ukoliko se nukleinska kiselina primenjuje pacijentu a da nije prisutna u ćeliji domaćinu, poželjno je da je preuzmu ćelije pacijenta za ekspresiju agensa koji je kodiran nukleinskom kiselinom. Ukoliko se nukleinska kiselina primenjuje pacijentu dok je prisutna u ćeliji domaćinu, poželjno je da se ona eksprimira u ćeliji domaćinu unutar pacijenta tako da proizvodi agens koji je kodiran nukleinskom kiselinom.
[0242] Termin "nukleinska kiselina", kao što se ovde upotrebljava, namenjen je da uključi DNK i RNK kao što su genomska DNK, cDNA, iRNK, rekombinantno proizvedene i hemijski sintetisane molekule. Nukleinska kiselina može biti jednolančana ili dvolančana. RNK uključuje in vitro transkribovanu RNK (IVT RNK) ili sintetičku RNK. U skladu sa učenjem, nukleinska kiselina je poželjno izolovana nukleinska kiselina.
[0243] Nukleinske kiseline mogu biti sadržane u vektoru. Termin "vektor" kao što se ovde upotrebljava uključuje sve vektore poznate osobi sa iskustvom uključujući plazmidne vektore, kozmidne vektore, fag vektore kao što je lambda fag, virusne vektore kao što su adenovirusni ili bakulovirusni vektori, ili vektore veštačkog hromozoma kao što su bakterijski veštački hromozomi (BAC), veštački hromozomi kvasca (YAC), ili P1 veštački hromozomi (PAC). Navedeni vektori uključuju ekspresione kao i klonirajuće vektore. Ekspresioni vektori sadrže plazmide kao i virusni vektori i generalno sadrže željenu kodirajuću sekvencu i prikladne DNK sekvence neophodne za ekspresiju operativno povezane kodirajuće sekvence u određenom organizmu domaćina (npr. bakterija, kvasac, biljka, insekt, ili sisar) ili u in vitro ekspresionim sistemima. Klonirajući vektori se generalno upotrebljavaju za projektovanje i
4
amplifikaciju određenog željenog DNK fragmenta i mogu im nedostajati funkcionalne sekvence potrebne za ekspresiju željenih DNK fragmenata.
[0244] U kontekstu predmetnog učenja, termin "RNK" se odnosi na molekul koji sadrži ribonukleotidne ostatke i poželjno je u potpunosti ili suštinski sačinjen od ribonukleotidnih ostataka. "Ribonukleotid" se odnosi na nukleotid sa hidroksilnom grupom na 2’-poziciji β-D-ribofuranozil grupe. Termin uključuje dvolančanu RNK, jednolančanu RNK, izolovanu RNK kao što je delimično prečišćena RNK, suštinski čista RNK, sintetička RNK, rekombinantno proizvedena RNK, kao i modifikovanu RNK koja se razlikuje od RNK koja se javlja u prirodi po adiciji, deleciji, supstituciji i/ili izmeni jednog ili više nukleotida. Takve izmene mogu uključivati adiciju ne-nukleotidnog materijala, kao što je na kraj(eve) RNK ili interno, na primer na jednom ili više nukleotida RNK. Nukleotidi u molekulima RNK takođe mogu da sadrže nestandardne nukleotide, kao što su nukleotidi koji se ne javljaju u prirodi ili hemijski sintetisani nukleotidi ili dezoksinukleotidi. Ove izmenjene RNK mogu biti označene kao analozi ili analozi RNK koja se javlja u prirodi.
[0245] U skladu sa predmetnim učenjem, termin "RNK" uključuje i poželjno se odnosi na "iRNK" što znači "informaciona RNK" i odnosi se na "transkript" koji se može proizvesti upotrebom DNK kao templata i kodira peptid ili protein. iRNK tipično sadrži 5’ netranslatirani region (5’-UTR), region koji kodira protein ili peptid i 3’ netranslatirani region (3’-UTR). iRNK ima ograničeni poluživot u ćelijama i in vitro. Poželjno, iRNK se proizvodi in vitro transkripcijom upotrebom DNK templata. U jednom primeru izvođenja učenja, RNK se dobija in vitro transkripcijom ili hemijskom sintezom. Metodologija in vitro transkripcije je poznata osobi sa iskustvom. Na primer, postoji niz in vitro kompleta za transkripciju koji su komercijalno dostupni.
[0246] U jednom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK je samoreplicirajuća RNK, kao što je jednolančana samoreplicirajuća RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je jednolančana RNK pozitivnog sensa. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je virusna RNK ili RNK izvedena iz virusne RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je alfavirusna genomska RNK ili je izvedena iz alfavirusne genomske RNK. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je ekspresioni vektor virusnog gena. U jednom primeru izvođenja, virus je virus Semliki šume. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK sadrži jedan ili više transgena, najmanje jedan od navedenih transgena kodira agense koji su ovde opisani. U jednom primeru izvođenja, ukoliko je RNK virusna RNK ili je izvedena iz virusne RNK, transgeni mogu delimično ili potpuno da zamene virusne sekvence kao što su virusne sekvence koje kodiraju strukturne proteine. U jednom primeru izvođenja, samoreplicirajuća RNK je in vitro transkribovana RNK.
[0247] Kako bi se povećala ekspresija i/ili stabilnost RNK koja se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem, ona se može modifikovati, poželjno bez izmene sekvence eksprimiranog peptida ili proteina.
[0248] Termin "modifikacija" u kontekstu RNK kao što se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem uključuje bilo koju modifikaciju RNK koja nije prisutna u prirodi u navedenoj RNK.
[0249] U jednom primeru izvođenja učenja, RNK upotrebljena u skladu sa učenjem nema 5'-trifosfate bez kape. Uklanjanje takvih 5'-trifosfata bez kape može se postići tretiranjem RNK sa fosfatazom.
[0250] RNK u skladu sa učenjem može imati modifikovane ribonukleotide koji se javljaju u prirodi ili sintetičke ribonukleotide kako bi se povećala njena stabilnost i/ili smanjila citotoksičnost. Na primer, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava u skladu sa učenjem 5-metilcitidin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan za citidin. Alternativno ili dopunski, u jednom primeru izvođenja, u RNK koja se upotrebljava u skladu sa učenjem pseudouridin je delimično ili potpuno, poželjno potpuno, supstituisan za uridin.
[0251] U jednom primeru izvođenja, termin "modifikacija" se odnosi na obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili analogom 5'-kape. Termin "5'-kapa" označava strukturu kape koja se nalazi na 5'-kraju iRNK molekula i generalno se sastoji od nukleotida guanozina povezanog sa iRNK putem neobične 5' do 5' trifosfatne veze. U jednom primeru izvođenja, ovaj guanozin je metilovan na poziciji 7. Termin "konvencionalna 5'-kapa" označava RNK 5'-kapu koja se javlja u prirodi, poželjno 7-metilguanozin kapu (m7G). U kontekstu predmetnog učenja, termin "5'-kapa" uključuje analog 5'-kape koji podseća na strukturu RNK kape i modifikovan je da poseduje sposobnost stabilizacije RNK ukoliko je za nju prikačen, poželjno in vivo i/ili u ćeliji.
[0252] Obezbeđivanje RNK sa 5'-kapom ili analogom 5'-kape može se postići in vitro transkripcijom DNK templata u prisustvu navedene 5'-kape ili analoga 5'-kape, pri čemu je navedena 5'-kapa kotranskripciono inkorporisana u generisani RNK lanac, ili RNK može da se generiše, na primer, in vitro transkripcijom, a 5'-kapa može biti prikačena za RNK posttranskripciono upotrebom enzima za dodavanje kape, na primer, enzima za dodavanje kape vakcinija virusa.
[0253] RNK može da sadrži dodatne modifikacije. Na primer, dodatna modifikacija RNK koja se upotrebljava u predmetnom učenju može biti izduživanje ili skraćivanje poli(A) repa koji se javlja u prirodi ili izmena 5'- ili 3'-netranslatiranih regiona (UTR) kao što je introdukovanje UTR koji nije srodan sa kodirajućim regionom navedene RNK, na primer, insercija jedne ili više, poželjno dve kopije 3'-UTR izvedene iz gena globina, kao što su alfa2-globin, alfa1-globin, beta-globin, poželjno beta-globin, poželjnije humani beta-globin.
[0254] Prema tome, kako bi se povećala stabilnost i/ili ekspresija RNK koja se upotrebljava u skladu sa predmetnim učenjem, ona može biti modifikovana tako da bude prisutna u vezi sa poli-A sekvencom, poželjno koja ima dužinu od 10 do 500, poželjnije 30 do 300, još poželjnije 65 do 200 i naročito 100 do 150 ostataka adenozina. U naročito poželjnom primeru izvođenju poli-A sekvenca ima dužinu od približno 120 ostataka adenozina. Pored toga, inkorporisanje dva ili više 3’-netranslatiranih regiona (UTR) u 3’-netranslatirani region RNK molekula može rezultovati poboljšanjem efikasnosti translacije. U jednom posebnom primeru izvođenja, 3'-UTR je izveden iz gena humanog β-globina.
[0255] Termin "stabilnost" RNK se odnosi na "poluživot" RNK. "Poluživot" se odnosi na vremenski period koji je potreban da se eliminiše polovina aktivnosti, količine, ili broja molekula. U kontekstu predmetnog učenja, poluživot RNK je indikativnan za stabilnost navedene RNK. Poluživot RNK može uticati na "trajanje ekspresije" RNK. Može se očekivati da će RNK koja ima dug poluživot biti eksprimirana tokom produženog vremenskog perioda.
[0256] U kontekstu predmetnog učenja, termin "transkripcija" se odnosi na proces, pri čemu se genetički kod u DNK sekvenci transkribuje u RNK. Nakon toga, RNK se može translatirati u protein. U skladu sa predmetnim učenjem, termin "transkripcija" sadrži "in vitro transkripciju", pri čemu se termin "in vitro transkripcija" odnosi na proces pri čemu se RNK, posebno iRNK, in vitro sintetiše u sistemu bez ćelija, poželjno upotrebom prikladnih ćelijskih ekstrakata. Poželjno, klonirajući vektori se primenjuju za generisanje transkripata. Ovi klonirajući vektori su generalno označeni kao transkripcioni vektori i u skladu sa predmetnim učenjem obuhvaćeni su terminom "vektor".
[0257] Termin "translacija" u skladu sa učenjem odnosi se na proces u ribozomima ćelije pomoću kog lanac informacione RNK usmerava asembliranje amino-kiselinske sekvence kako bi se napravio peptid ili protein.
[0258] Nukleinske kiseline mogu, u skladu sa učenjem, biti prisutne same ili u kombinaciji sa drugim nukleinskim kiselinama, koje mogu biti homologne ili heterologne. U poželjnim primerima izvođenja, nukleinska kiselina je funkcionalno povezana sa sekvencama kontrole ekspresije koje mogu biti homologne ili heterologne u odnosu na navedenu nukleinsku kiselinu. Termin "homologne" znači da su nukleinske kiseline takođe funkcionalno povezane prirodno i termin "heterologne" znači da nukleinske kiseline nisu funkcionalno povezane prirodno.
[0259] Nukleinska kiselina i sekvenca kontrole ekspresije su "funkcionalno" povezane jedna sa drugom, ukoliko su kovalentno povezane jedna sa drugom na takav način da je ekspresija ili transkripcija navedene nukleinske kiseline pod kontrolom ili pod uticajem navedene sekvence kontrole ekspresije. Ukoliko nukleinska kiselina treba da bude translatirana u funkcionalni protein, onda, sa sekvencom kontrole ekspresije koja je funkcionalno povezana sa kodirajućom sekvencom, indukcija navedene sekvence kontrole ekspresije rezultuje transkripcijom navedene nukleinske kiseline, bez uzrokovanja pomeranja okvira u kodirajućoj sekvenci ili navedena kodirajuća sekvenca nije sposobna da se translatira u željeni protein ili peptid.
[0260] Termin "sekvenca kontrole ekspresije" ili "element kontrole ekspresije" sadrži u skladu sa promotorima iz učenja, vezujuća mesta ribozoma, pojačivače i druge elemente kontrole koji regulišu transkripciju gena ili translaciju iRNK. U posebnim primerima izvođenja učenja, sekvence kontrole ekspresije mogu da se regulišu. Tačna struktura sekvenci kontrole ekspresije može da varira u zavisnosti od vrste ili tipa ćelije, ali generalno sadrži 5'-netranskribovane i 5'- i 3'-netranslatirane sekvence koje su uključene u inicijaciju transkripcije i translacije, respektivno, kao što su TATA boks, sekvenca kape, CAAT sekvenca, i slično. Tačnije, 5'-netranskribovane sekvence kontrole ekspresije sadrže promotorski region koji uključuje promotorsku sekvencu za kontrolu transkripcije funkcionalno povezane nukleinske kiseline. Sekvence kontrole ekspresije mogu takođe sadržati pojačivačke sekvence ili uzvodne aktivatorske sekvence.
[0261] Termin "ekspresija" se upotrebljava u skladu sa učenjem u svom najopštijem značenju i sadrži proizvodnju RNK i/ili peptida ili proteina, npr. pomoću transkripcije i/ili translacije. U vezi sa RNK, termin "ekspresija" ili "translacija" se posebno odnosi na proizvodnju peptida ili proteina. Takođe sadrži delimičnu ekspresiju nukleinskih kiselina. Štaviše, ekspresija može biti prolazna ili stabilna. U skladu sa učenjem, termin ekspresija takođe uključuje "aberantnu ekspresiju" ili "abnormalnu ekspresiju".
[0262] "Aberantna ekspresija" ili "abnormalna ekspresija" znači u skladu sa učenjem da je ekspresija izmenjena, poželjno povećana, u poređenju sa referencom, npr. stanjem kod subjekta koji nema bolest asociranu sa aberantnom ili abnormalnom ekspresijom određenog proteina, npr. tumorskog antigena. Povećanje ekspresije označava povećanje za najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50% ili najmanje 100%, ili više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se pronalazi samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta.
[0263] Termin "specifično eksprimiran" znači da se protein suštinski eksprimira samo u specifičnom tkivu ili organu. Na primer, tumorski antigen specifično eksprimiran u mukozi želuca znači da se navedeni protein primarno eksprimira u mukozi želuca i da se ne eksprimira u drugim tkivima ili se ne eksprimira u značajnoj meri u drugom tipu tkiva ili organa. Stoga, protein koji se eksprimira isključivo u ćelijama mukoze želuca i u značajno manjoj meri u bilo kom drugom tkivu, kao što je testis, specifično se eksprimira u ćelijama mukoze želuca. U nekim primerima izvođenja, tumorski antigen može takođe biti specifično eksprimiran pod normalnim uslovima u više od jednog tipa tkiva ili organa, kao što su 2 ili 3 tipa tkiva ili organa, ali poželjno u ne više od 3 različita tipa tkiva ili organa. U ovom slučaju, tumorski antigen se tada specifično eksprimira u ovim organima. Na primer, ukoliko se tumorski antigen eksprimira pod normalnim uslovima, poželjno u približno jednakoj meri u plućima i želucu, navedeni tumorski antigen se specifično eksprimira u plućima i želucu.
[0264] U skladu sa učenjem, termin "kodiranje nukleinskom kiselinom" znači da nukleinska kiselina, ukoliko je prisutna u prikladnom okruženju, poželjno unutar ćelije, može biti eksprimirana da proizvede protein ili peptid koji kodira.
[0265] Neki aspekti učenja oslanjaju se na adoptivni transfer ćelija domaćina koje su in vitro transfektovane sa nukleinskom kiselinom kao što je RNK koja kodira agens koji je ovde opisan i koje se prenose u primaoce kao što su pacijenti, poželjno posle ex vivo umnožavanja sa niskih učestalosti prekursora na klinički relevantne brojeve ćelija. Ćelije domaćini koje se upotrebljavaju za lečenje u skladu sa učenjem mogu biti autologne, alogene, ili singene za lečenog primaoca.
[0266] Termin "autologno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je izvedeno iz istog subjekta. Na primer, "autologni transplant" označava transplant tkiva ili organa izveden iz istog subjekta. Takve procedure imaju prednost zato što prevazilaze imunsku barijeru koja inače rezultuje odbacivanjem.
[0267] Termin "alogeno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je izvedeno iz različitih pojedinaca iste vrste. Za dva ili više pojedinaca se kaže da su međusobno alogeni kada geni na jednom ili više lokusa nisu identični.
[0268] Termin "singeno" se upotrebljava da opiše bilo šta što je izvedeno iz pojedinaca ili tkiva koja imaju identične genotipove, tj. identični blizanci ili životinje istog inbriding soja, ili njihova tkiva.
[0269] Termin "heterologno" se upotrebljava da opiše nešto što se sastoji od više različitih elemenata. Na primer, transfer kostne srži jednog pojedinca u drugog pojedinca predstavlja heterologni transplant. Heterologni gen je gen izveden iz izvora koji nije subjekt.
[0270] Termin "transfekcija" se odnosi na introdukovanje nukleinskih kiselina, posebno RNK, u ćeliju. U svrhe predmetnog učenja, termin "transfekcija" takođe uključuje introdukovanje nukleinske kiseline u ćeliju ili preuzimanje nukleinske kiseline od strane takve ćelije, pri čemu ćelija može biti prisutna u subjektu, npr. pacijentu. Stoga, u skladu sa predmetnim učenjem, ćelija za transfekciju nukleinske kiseline koja je ovde opisana može biti prisutna in vitro ili in vivo, npr. ćelija može činiti deo organa, tkiva i/ili organizma pacijenta. U skladu sa učenjem, transfekcija može biti prolazna ili stabilna. Za neke primene transfekcije, dovoljno je da se transfektovani genetički materijal samo prolazno eksprimira. Pošto nukleinska kiselina introdukovana u procesu transfekcije uobičajeno nije integrisana u nukleusni genom, strana nukleinska kiselina biće razblažena mitozom ili degradirana. Ćelije koje omogućavaju epizomsku amplifikaciju nukleinskih kiselina u velikoj meri redukuju stopu razblaživanja. Ukoliko se želi da transfektovana nukleinska kiselina zaista ostane u genomu ćelije i njenih ćerki ćelija, mora doći do stabilne transfekcije. RNK se može transfektovati u ćelije kako bi prolazno eksprimirala svoj kodirani protein.
[0271] U skladu sa predmetnim učenjem, može se upotrebljavati bilo koja tehnika korisna za introdukovanje, tj. transfer ili transfekciju, nukleinskih kiselina u ćelije. Poželjno, RNK se transfektuje u ćelije standardnim tehnikama. Takve tehnike uključuju elektroporaciju, lipofekciju i mikroinjekciju. U jednom posebno poželjnom primeru izvođenja predmetnog učenja, RNK se introdukuje u ćelije elektroporacijom.
[0272] Elektroporacija ili elektropermeabilizacija se odnosi na značajno povećanje električne provodljivosti i permeabilnosti ćelijske membrane izazvano spoljašnjim električnim poljem. Uobičajeno se upotrebljava u molekularnoj biologiji kao način introdukovanja neke supstance u ćeliju.
[0273] U skladu sa učenjem, poželjno je da introdukovanje nukleinske kiseline koja kodira protein ili peptid u ćelije rezultuje ekspresijom navedenog proteina ili peptida.
[0274] Termin "peptid" u skladu sa učenjem sadrži oligo- i polipeptide i označava supstance koje sadrže dve ili više, poželjno 3 ili više, poželjno 4 ili više, poželjno 6 ili više, poželjno 8 ili više, poželjno 9 ili više, poželjno 10 ili više, poželjno 13 ili više, poželjno 16 više, poželjno 21 ili više i do poželjno 8, 10, 20, 30, 40 ili 50, posebno 100 amino-kiselina kovalentno povezanih peptidnim vezama. Termin "protein" označava velike peptide, poželjno peptide sa više od 100 amino-kiselinskih ostataka, ali generalno termini "peptidi" i "proteini" su sinonimi i ovde se upotrebljavaju naizmenično.
[0275] U skladu sa učenjem, peptid može uključivati prirodne amino-kiseline i neprirodne amino-kiseline. U jednom primeru izvođenja, peptid samo uključuje prirodne amino-kiseline.
[0276] U skladu sa učenjem, termin "neprirodna amino-kiselina" označava amino-kiselinu koja ima strukturu drugačiju od strukture 20 prirodnih amino-kiselinskih vrsta. Pošto neprirodne amino-kiseline imaju strukture slične onima prirodnih amino-kiselina, neprirodne amino-kiseline se mogu klasifikovati kao derivati ili analozi datih prirodnih amino-kiselina.
[0277] Poželjno, proteini i peptidi koji su opisani u skladu sa učenjem su izolovani. Termini "izolovani protein" ili "izolovani peptid" znače da je protein ili peptid odvojen od svog prirodnog okruženja. Izolovani protein ili peptid može biti u suštinski prečišćenom stanju. Termin "suštinski prečišćen" znači da je protein ili peptid suštinski bez drugih supstanci sa kojima je asociran u prirodi ili in vivo.
[0278] Učenje koji je ovde dato u vezi sa specifičnim amino-kiselinskim sekvencama, npr. onim pokazanim u listi sekvenci, treba tumačiti tako da se takođe odnose na varijante navedenih specifičnih sekvenci koje rezultuju sekvencama koje su funkcionalno ekvivalentne navedenim specifičnim sekvencama, npr. amino-kiselinske sekvence koje pokazuju svojstva identična ili slična onima specifičnih amino-kiselinskih sekvenci. Jedno važno svojstvo je zadržavanje vezivanja peptida za MHC molekul i/ili za T ćelijski receptor ili T ćelijskog receptora za njegov cilj ili za održavanje efektorskih funkcija T ćelije. Poželjno, sekvenca modifikovana u odnosu na specifičnu sekvencu, kada zameni specifičnu sekvencu u T ćelijskom receptoru zadržava vezivanje navedenog T ćelijskog receptora za cilj i poželjno funkcije navedenog T ćelijskog receptora ili T ćelije koja nosi T ćelijski receptor kao što je ovde opisano.
[0279] Na primer, sekvence pokazane u listi sekvenci mogu se modifikovati tako da se uklone jedan ili više, poželjno svi slobodni ostaci cisteina, posebno zamenom ostataka cisteina amino-kiselinama koje nisu cistein, poželjno serinom, alaninom, treoninom, glicinom, tirozinom, leucinom ili metioninom, najpoželjnije alaninom ili serinom.
[0280] Oni sa iskustvom u struci će ceniti da se posebno sekvence CDR sekvenci, hipervarijabilnih i varijabilnih regiona mogu modifikovati bez gubitka sposobnosti vezivanja za cilj. Na primer, CDR regioni će biti ili identični ili visoko homologni regionima antitela koji su ovde specificirani. Pod "visoko homolognim" se smatra da od 1 do 5, poželjno od 1 do 4, kao što je 1 do 3 ili 1 ili 2 supstitucije mogu biti napravljene u CDR. Pored toga,
1
hipervarijabilni i varijabilni regioni mogu biti modifikovani tako da pokazuju značajnu homologiju sa regionima koji su ovde specifično objavljeni.
[0281] Peptidna "varijanta" može zadržati imunogenost datog peptida (npr. sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno smanjena u odnosu na dati peptid). Drugim rečima, sposobnost varijante da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima može biti poboljšana ili nepromenjena, u odnosu na dati peptid, ili može biti smanjena za manje od 50%, i poželjno manje od 20%, u odnosu na dati peptid.
[0282] Varijanta se može identifikovati procenom njene sposobnosti da se vezuje za MHC molekul. U jednom poželjnom primeru izvođenja, varijantni peptid ima modifikaciju tako da je sposobnost varijantnog peptida da se vezuje za MHC molekul povećana u odnosu na dati peptid. Sposobnost varijantnog peptida da se vezuje za MHC molekul može se povećati za najmanje 2 puta, poželjno najmanje 3 puta, 4 puta, ili 5 puta u odnosu na onu od datog peptida. U skladu sa tim, unutar određenih poželjnih primera izvođenja, peptid sadrži varijantu u kojoj su 1 do 3 amino-kiselinska ostatka koji se nalaze unutar imunogenog dela supstituisana tako da je sposobnost da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima statistički veća od one za nemodifikovani peptid. Takve supstitucije su poželjno locirane unutar MHC vezujućeg mesta peptida. Poželjne supstitucije omogućavaju povećano vezivanje za MHC molekule klase I ili klase II. Određene varijante sadrže konzervativne supstitucije.
[0283] Termin "varijanta" u skladu sa učenjem takođe uključuje mutante, splajs varijante, konformacije, izoforme, alelne varijante, varijante vrste i homologe vrste, posebno one koje su prisutne u prirodi. Alelna varijanta se odnosi na izmenu u normalnoj sekvenci gena, čiji je značaj često nejasan. Kompletno sekvenciranje gena često identifikuje brojne alelne varijante za dati gen. Homolog vrste je sekvenca nukleinske kiseline ili amino-kiselinska sekvenca poreklom od različite vrste od one od date sekvence nukleinske kiseline ili amino-kiselinske sekvence. Termin "varijanta" će obuhvatati bilo koje posttranslaciono modifikovane varijante i konformacione varijante.
[0284] U svrhe predmetnog učenja, "varijante" amino-kiselinske sekvence sadrže varijante insercije amino-kiseline, varijante adicije amino-kiseline, varijante delecije amino-kiseline i/ili varijante supstitucije amino-kiseline. Varijante delecije amino-kiseline koje sadrže deleciju na N-terminusnom i/ili C-terminusnom kraju proteina se takođe nazivaju N-terminusne i/ili C-terminusne varijante skraćenja.
[0285] Varijante insercije amino-kiseline sadrže inserciju jedne ili dve ili više amino-kiselina u određenoj amino-kiselinskoj sekvenci. U slučaju varijanti amino-kiselinske sekvence koje imaju inserciju, jedan ili više amino-kiselinskih ostataka se inserira na određeno mesto u
2
amino-kiselinskoj sekvenci, iako je takođe moguće i nasumično inseriranje sa prikladnim pregledom rezultujućeg proizvoda.
[0286] Varijante adicije amino-kiseline sadrže amino- i/ili karboksi-terminusne fuzije jedne ili više amino-kiselina, kao što su 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino-kiselina.
[0287] Varijante delecije amino-kiseline okarakterisane su uklanjanjem jedne ili više aminokiselina iz sekvence, kao što je uklanjanjem 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30, 50, ili više amino-kiselina. Delecije mogu biti na bilo kojoj poziciji proteina.
[0288] Varijante supstitucije amino-kiseline okarakterisane su uklanjanjem najmanje jednog ostatka u sekvenci i insercijom drugog ostatka na njegovo mesto. Prednost se daje modifikacijama na pozicijama u amino-kiselinskoj sekvenci koje nisu konzervirane između homolognih proteina ili peptida i/ili zamenama amino-kiselina drugim amino-kiselinama koje imaju slična svojstva. Poželjno, promene amino-kiselina u varijantama proteina su konzervativne promene amino-kiselina, tj. supstitucije slično naelektrisanih ili nenaelektrisanih amino-kiselina. Konzervativna promena amino-kiselina uključuje supstituciju jedne iz porodice amino-kiselina koje su srodne po svojim bočnim lancima. Amino-kiseline koje se javljaju u prirodi se generalno dele u četiri porodice: kisele (aspartat, glutamat), bazne (lizin, arginin, histidin), nepolarne (alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), i nenaelektrisane polarne (glicin, asparagin, glutamin, cistein, serin, treonin, tirozin) amino-kiseline. Fenilalanin, triptofan, i tirozin se ponekad zajedno klasifikuju kao aromatične amino-kiseline.
[0289] Poželjno je da će stepen sličnosti, poželjno identičnosti između date amino-kiselinske sekvence i amino-kiselinske sekvence koja je varijanta navedene date amino-kiselinske sekvence biti najmanje oko 60%, 65%, 70%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99%. Stepen sličnosti ili identičnosti se poželjno daje za region amino-kiselina koji je najmanje oko 10%, najmanje oko 20%, najmanje oko 30%, najmanje oko 40%, najmanje oko 50%, najmanje oko 60%, najmanje oko 70%, najmanje oko 80%, najmanje oko 90% ili oko 100% cele dužine referentne amino-kiselinske sekvence. Na primer, ukoliko se referentna amino-kiselinska sekvenca sastoji od 200 amino-kiselina, stepen sličnosti ili identičnosti se poželjno daje za najmanje oko 20, najmanje oko 40, najmanje oko 60, najmanje oko 80, najmanje oko 100, najmanje oko 120, najmanje oko 140, najmanje oko 160, najmanje oko 180, ili oko 200 amino-kiselina, poželjno kontinuiranih amino-kiselina. U poželjnim primerima izvođenja, stepen sličnosti ili identičnosti se daje za celu dužinu referentne amino-kiselinske sekvence. Poravnanje za određivanje sličnosti sekvence, poželjno identičnosti sekvence može se obaviti pomoću alata poznatih u struci, poželjno upotrebom najboljeg poravnanja sekvence, na primer, upotrebom Align, upotrebljavajući standardna podešavanja, poželjno EMBOSS::igla, Matriks: Blosum62, Otvoreni razmak 10,0, Produžetak razmaka 0,5.
[0290] "Sličnost sekvence" ukazuje na procenat amino-kiselina koje su ili identične ili koje predstavljaju konzervativne amino-kiselinske supstitucije. "Identičnost sekvence" između dve amino-kiselinske sekvence ukazuje na procenat amino-kiselina koje su identične između sekvenci.
[0291] Termin "procenat identičnosti" je namenjen da označi procenat amino-kiselinskih ostataka koji su identični između dve sekvence koje treba da se porede, dobijen posle najboljeg poravnanja, pri čemu je ovaj procenat čisto statistički i razlike između dve sekvence su raspoređene nasumično i duž cele njihove dužine. Poređenja sekvenci između dve aminokiselinske sekvence se konvencionalno izvode upoređivanjem ovih sekvenci pošto su one optimalno poravnate, pri čemu se navedeno poređenje vrši po segmentima ili "prozoru poređenja" kako bi se identifikovali i uporedili lokalni regioni sličnosti sekvence. Optimalno poravnanje sekvenci za poređenje može se proizvesti, osim ručno, pomoću algoritma lokalne homologije Smita i Vatermana (Smith and Waterman), 1981, Ads App. Math.2, 482, pomoću algoritma lokalne homologije Nidelmana i Vunša (Neddleman and Wunsch), 1970, J. Mol. Biol. 48, 443, pomoću postupka pretraživanja sličnosti Pirsona i Lipmana (Pearson and Lipman), 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444, ili pomoću kompjuterskih programa koji upotrebljavaju ove algoritme (GAP, BESTFIT, FASTA, BLAST P, BLAST N i TFASTA u Wisconsin Genetics softverskom paketu, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wis.).
[0292] Procenat identičnosti se izračunava određivanjem broja identičnih pozicija između dve sekvence koje se porede, deljenjem ovog broja brojem upoređenih pozicija i množenjem dobijenog rezultata sa 100 kako bi se dobio procenat identičnosti između ove dve sekvence.
[0293] Homologne amino-kiselinske sekvence prikazuju u skladu sa učenjem najmanje 40%, posebno najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, najmanje 90% i poželjno najmanje 95%, najmanje 98% ili najmanje 99% identičnosti amino-kiselinskih ostataka.
[0294] Ovde opisane varijante amino-kiselinske sekvence može lako da pripremi osoba sa iskustvom, na primer, manipulacijom rekombinantnom DNK. Manipulacija DNK sekvencama za pripremanje proteina i peptida koji imaju supstitucije, adicije, insercije ili delecije, detaljno je opisana u Sambrook et al. (1989), na primer. Štaviše, ovde opisani peptidi
4
i varijante amino-kiselina mogu se lako pripremiti uz pomoć poznatih tehnika sinteze peptida kao što je, na primer, sinteza u čvrstoj fazi i sličnim postupcima.
[0295] Učenje uključuje derivate peptida ili proteina koji su ovde opisani koji su sadržani pod terminima "peptid" i "protein". U skladu sa učenjem, "derivati" proteina i peptida su modifikovani oblici proteina i peptida. Takve modifikacije uključuju bilo koju hemijsku modifikaciju i sadrže jednu ili više supstitucija, delecija i/ili adicija bilo kojih molekula asociranih sa proteinom ili peptidom, kao što su ugljeni hidrati, lipidi i/ili proteini ili peptidi. U jednom primeru izvođenja, "derivati" proteina ili peptida uključuju one modifikovane analoge koji su rezultat glikozilacije, acetilacije, fosforilacije, amidacije, palmitoilacije, miristoilacije, izoprenilacije, lipidacije, alkilacije, derivatizacije, introdukovanja zaštitnih/blokirajućih grupa, proteolitičkog isecanja ili vezivanja za antitelo ili za drugi ćelijski ligand. Termin "derivat" se takođe proteže na sve funkcionalne hemijske ekvivalente navedenih proteina i peptida. Poželjno, modifikovani peptid ima povećanu stabilnost i/ili povećanu imunogenost.
[0296] Takođe su uključeni i mimetici peptida. Takvi mimetici mogu sadržati amino-kiseline povezane sa jednim ili više mimetika amino-kiselina (tj. jedna ili više amino-kiselina unutar peptida mogu biti zamenjene mimetikom amino-kiselina) ili mogu biti u potpunosti nepeptidni mimetici. Mimetik amino-kiselina je jedinjenje koje je konformaciono slično amino-kiselini, npr. tako da može biti supstituisan za amino-kiselinu bez značajnog smanjenja sposobnosti da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima. Nepeptidni mimetik je jedinjenje koje ne sadrži amino-kiseline, i koje ima sveukupnu konformaciju koja je slična peptidu, npr. tako da sposobnost mimetika da reaguje sa T ćelijskim linijama ili klonovima nije značajno smanjena u odnosu na sposobnost datog peptida.
[0297] U skladu sa učenjem, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina poželjno ima funkcionalno svojstvo aminokiselinske sekvence, peptida ili proteina, respektivno, od kojih je izveden, tj. funkcionalno je ekvivalentan. U jednom primeru izvođenja, varijanta, derivat, modifikovani oblik, fragment, deo ili porcija amino-kiselinske sekvence, peptida ili proteina je imunski ekvivalentan aminokiselinskoj sekvenci, peptidu ili proteinu, respektivno, iz kojeg je izveden. U jednom primeru izvođenja, funkcionalno svojstvo je imunsko svojstvo.
[0298] Posebno svojstvo je sposobnost formiranja kompleksa sa MHC molekulima i, gde je prikladno, generisanja imunskog odgovora, poželjno stimulisanjem citotoksičnih ili T pomoćničkih ćelija. Termin "imunski ekvivalentan" znači da imunski ekvivalentan molekul kao što je imunski ekvivalentna amino-kiselinska sekvenca pokazuje ista ili suštinski ista imunska svojstva i/ili ispoljava iste ili suštinski iste imunske efekte, npr. u odnosu na tip imunskog efekta kao što je indukcija humoralnog i/ili ćelijskog imunskog odgovora, jačina i/ili trajanje indukovane imunske reakcije, ili specifičnost indukovane imunske reakcije. U kontekstu predmetnog učenja, termin "imunski ekvivalentno" se poželjno upotrebljava u pogledu imunskih efekata ili svojstava peptida ili varijante peptida koji se upotrebljavaju za imunizaciju. Na primer, amino-kiselinska sekvenca je imunski ekvivalentna referentnoj amino-kiselinskoj sekvenci ukoliko navedena amino-kiselinska sekvenca kada je izložena imunskom sistemu subjekta indukuje imunsku reakciju koja ima specifičnost reagovanja sa referentnom amino-kiselinskom sekvencom.
[0299] Termin "izveden" znači u skladu sa učenjem da je određeni entitet, posebno određena sekvenca, prisutna u objektu iz kog je izvedena, posebno u organizmu ili molekulu. U slučaju amino-kiselinskih sekvenci, naročito određenih regiona sekvence, "izvedeno" posebno znači da je relevantna amino-kiselinska sekvenca izvedena iz amino-kiselinske sekvence u kojoj je prisutna.
[0300] Termin "ćelija" ili "ćelija domaćin" se poželjno odnosi na intaktnu ćeliju, tj. ćeliju sa intaktnom membranom koja nije oslobodila svoje normalne unutarćelijske komponente kao što su enzimi, organele, ili genetički materijal. Poželjno je da je intaktna ćelija vijabilna ćelija, tj. živa ćelija sposobna da obavlja svoje normalne metaboličke funkcije. Poželjno je da se navedeni termin odnosi u skladu sa učenjem na bilo koju ćeliju koja može biti transfektovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom. Poželjno, ćelija kada je transfektovana sa egzogenom nukleinskom kiselinom i preneta u primaoca može da eksprimira nukleinsku kiselinu u primaocu. Termin "ćelija" uključuje bakterijske ćelije; druge korisne ćelije su ćelije kvasca, ćelije gljivica ili ćelije sisara. Pogodne bakterijske ćelije uključuju ćelije iz gram-negativnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Escherichia coli, Proteus, i Pseudomonas, i grampozitivnih bakterijskih sojeva kao što su sojevi Bacillus, Streptomyces, Staphylococcus, i Lactococcus. Pogodne ćelije gljivica uključuju ćelije iz vrsta Trichoderma, Neurospora, i Aspergillus. Pogodne ćelije kvasca uključuju ćelije iz vrsta Saccharomyces (na primer Saccharomyces cerevisiae), Schizosaccharomyces (na primer Schizo saccharomyces pombe), Pichia (na primer Pichia pastoris i Pichia metanolicd), i Hansenula. Pogodne ćelije sisara uključuju na primer CHO ćelije, BHK ćelije, HeLa ćelije, COS ćelije, 293 HEK i slične. Međutim, ćelije vodozemaca, ćelije insekata, ćelije biljaka, i bilo koje druge ćelije koje se upotrebljavaju u struci za ekspresiju heterolognih proteina takođe se mogu upotrebljavati. Ćelije sisara su posebno poželjne za adoptivni transfer, kao što su ćelije iz ljudi, miševa, hrčaka, svinja, koza, i primata. Ćelije mogu biti izvedene iz velikog broja tipova tkiva i uključuju primarne ćelije i ćelijske linije kao što su ćelije imunskog sistema, posebno antigenprezentujuće ćelije kao što su dendritske ćelije i T ćelije, matične ćelije kao što su hematopoetske matične ćelije i mezenhimske matične ćelije i druge tipove ćelija. Antigenprezentujuća ćelija je ćelija koja prikazuje antigen u kontekstu glavnog kompleksa histokompatibilnosti na svojoj površini. T ćelije mogu prepoznati ovaj kompleks upotrebom svog T ćelijskog receptora (TCR).
[0301] Ćelija koja sadrži molekul nukleinske kiseline poželjno eksprimira peptid ili protein koji je kodiran nukleinskom kiselinom.
[0302] Ćelija može biti rekombinantna ćelija i može da sekretuje kodirani peptid ili protein, može da ga eksprimira na površini i poželjno može dodatno da eksprimira MHC molekul koji se vezuje za navedeni peptid ili protein ili proizvod njihove obrade. U jednom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul endogeno. U dodatnom primeru izvođenja, ćelija eksprimira MHC molekul i/ili peptid ili protein ili proizvod njihove obrade na rekombinantni način. Ćelija je poželjno neproliferativna. U poželjnom primeru izvođenja, ćelija je antigenprezentujuća ćelija, posebno dendritska ćelija, monocit ili makrofag.
[0303] Termin "klonska ekspanzija" odnosi se na proces pri kom se multiplikuje specifični entitet. U kontekstu predmetnog učenja, termin se poželjno upotrebljava u kontekstu imunskog odgovora u kome se limfociti stimulišu antigenom, proliferišu, i specifični limfocit koji prepoznaje navedeni antigen se amplifikuje. Poželjno, klonska ekspanzija dovodi do diferencijacije limfocita.
[0304] Bolest asocirana sa ekspresijom antigena može se detektovati na osnovu prisustva T ćelija koje specifično reaguju sa peptidom u biološkom uzorku. U okviru određenih postupaka, biološki uzorak koji sadrži CD4+ i/ili CD8+ T ćelije izolovane iz pacijenta inkubira se sa peptidom iz učenja, nukleinskom kiselinom koja kodira takav peptid i/ili antigen-prezentujućom ćelijom koja eksprimira i/ili prezentuje barem imunogeni deo takvog peptida, i detektuje se prisustvo ili odsustvo specifične aktivacije T ćelija. Pogodni biološki uzorci uključuju, ali nisu ograničeni na, izolovane T ćelije. Na primer, T ćelije mogu biti izolovane iz pacijenta rutinskim tehnikama (kao što je centrifugiranje limfocita periferne krvi u Ficoll/Hypaque gradijentu gustine). Za CD4+ T ćelije, aktivacija se poželjno detektuje procenom proliferacije T ćelija. Za CD8+ T ćelije, aktivacija se poželjno detektuje procenom citolitičke aktivnosti. Nivo proliferacije koji je najmanje dva puta veći i/ili nivo citolitičke aktivnosti koji je najmanje 20% veći nego kod subjekata bez bolesti ukazuje na prisustvo bolesti asocirane sa ekspresijom antigena kod subjekta.
[0305] "Redukovati" ili "inhibirati" kao što se ovde upotrebljava znači sposobnost da uzrokuje sveukupno smanjenje nivoa, poželjno od 5% ili više, 10% ili više, 20% ili više, poželjnije od 50% ili više, i najpoželjnije od 75% ili više. Termin "inhibirati" ili slične fraze uključuje potpunu ili suštinski potpunu inhibiciju, tj. redukovanje na nulu ili suštinski na nulu.
[0306] Termini kao što su "povećanje" ili "poboljšanje" poželjno se odnose na povećanje ili poboljšanje za oko najmanje 10%, poželjno najmanje 20%, poželjno najmanje 30%, poželjnije najmanje 40%, poželjnije najmanje 50%, još poželjnije najmanje 80%, i najpoželjnije najmanje 100%.
[0307] Agensi, kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu se upotrebljavati za lečenje subjekta sa bolešću, npr. bolešću koja je okarakterisana prisustvom bolesnih ćelija koje eksprimiraju CLDN18.2 i poželjno prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula. Primeri bolesti koje se mogu lečiti i/ili prevenirati obuhvataju sve bolesti koje eksprimiraju CLDN18.2. Posebno poželjne bolesti su bolesti kancera.
[0308] Agensi, kompozicije i postupci koji su ovde opisani mogu se takođe upotrebljavati za imunizaciju ili vakcinaciju kako bi se prevenirala bolest koja je ovde opisana.
[0309] Termini "normalno tkivo" ili "normalna stanja" označavaju zdravo tkivo ili stanja kod zdravog subjekta, tj. nepatološka stanja, pri čemu "zdravo" poželjno znači ne-kancersko.
[0310] Termin "bolest" označava abnormalno stanje koje utiče na telo pojedinca. Bolest se često tumači kao medicinsko stanje asocirano sa specifičnim simptomima i znacima. Bolest može biti uzrokovana faktorima iz nekog spoljašnjeg izvora, kao što je zarazna bolest, ili može biti uzrokovana unutrašnjim disfunkcijama, kao što su autoimunske bolesti. Kod ljudi, "bolest" se često upotrebljava u širem smislu da označi bilo koje stanje koje uzrokuje bol, disfunkciju, uznemirenost, socijalne probleme, ili smrt pojedinca koji je pogođen, ili slične probleme za one u kontaktu sa pojedincem. U ovom širem smislu, ponekad uključuje povrede, invaliditete, poremećaje, sindrome, infekcije, izolovane simptome, devijantna ponašanja, i atipične varijacije strukture i funkcije, dok se u drugim kontekstima i u druge svrhe mogu smatrati prepoznatljivim kategorijama. Bolesti uobičajeno pogađaju pojedince ne samo fizički, već i emocionalno, pošto dobijanje i život sa mnogim bolestima može izmeniti nečiju perspektivu na život, i nečiju ličnost. U skladu sa učenjem, termin "bolest" uključuje kancer, posebno one oblike kancera koji su ovde opisani. Svaka referenca ovde na kancer ili određene oblike kancera takođe uključuje njegove metastaze kancera. U poželjnom primeru izvođenja, bolest koja treba da se leči u skladu sa predmetnom prijavom uključuje ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 i opciono prezentuju CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula.
[0311] "Bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2" ili slični izrazi znači u skladu sa učenjem da se CLDN18.2 eksprimira u ćelijama bolesnog tkiva ili organa. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 u ćelijama bolesnog tkiva ili organa je povećana u poređenju sa stanjem u zdravom tkivu ili organu. Povećanje označava povećanje za najmanje 10%, posebno najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 100%, najmanje 200%, najmanje 500%, najmanje 1000%, najmanje 10000% ili čak više. U jednom primeru izvođenja, ekspresija se nalazi samo u bolesnom tkivu, dok je ekspresija u zdravom tkivu potisnuta. U skladu sa učenjem, bolesti koje uključuju ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 uključuju bolesti kancera. Štaviše, u skladu sa učenjem, bolesti kancera su poželjno one kod kojih ćelije kancera eksprimiraju CLDN18.2.
[0312] Termini "bolest kancera" ili "kancer" označavaju ili opisuju fiziološko stanje kod pojedinca koje je tipično okarakterisano neregulisanim ćelijskim rastom. Primeri kancera uključuju, ali nisu ograničeni na, karcinom, limfom, blastom, sarkom, i leukemiju. Preciznije, primeri takvih kancera uključuju kancer kostiju, kancer krvi, kancer pluća, kancer jetre, kancer pankreasa, kancer kože, kancer glave ili vrata, melanom kože ili intraokularni melanom, kancer materice, kancer jajnika, kancer rektuma, kancer analnog regiona, kancer želuca, kancer kolona, kancer dojke, kancer prostate, kancer materice, karcinom polnih i reproduktivnih organa, Hočkinovu (Hodgkin’s) bolest, kancer jednjaka, kancer tankog creva, kancer endokrinog sistema, kancer štitne žlezde, kancer paraštitne žlezde, kancer nadbubrežne žlezde, sarkom mekog tkiva, kancer mokraćne bešike, kancer bubrega, karcinom bubrežnih ćelija, karcinom bubrežne karlice, neoplazme centralnog nervnog sistema
[0313] (CNS), neuroektodermalni kancer, tumore kičmene ose, gliom, meningiom, i adenom hipofize. Termin "kancer" u skladu sa učenjem takođe sadrži i metastaze kancera. Poželjno, "bolest kancera" je okarakterisana ćelijama koje eksprimiraju CLDN18.2, i ćelija kancera eksprimira CLDN18.2.
[0314] Bolesna ćelija je poželjno ćelija koja eksprimira CLDN18.2 navedeni CLDN18.2 je poželjno prisutan na površini navedene ćelije kao transmembranski protein i/ili je prezentovan od strane navedene ćelije u kontekstu MHC kao što je MHC I. Ćelija koja eksprimira CLDN18. 2 je poželjno ćelija kancera, poželjno od kancera koji su ovde opisani.
[0315] U jednom primeru izvođenja, bolest kancera je maligna bolest koja je okarakterisana svojstvima anaplazije, invazivnosti, i metastaza. Maligni tumor može biti u suprotnosti sa nekancerskim benignim tumorom po tome što malignitet nije samoograničen u svom rastu, sposoban je da vrši invaziju u susedna tkiva, i može biti sposoban da se širi na udaljena tkiva (metastazira), dok benigni tumor nema nijedno od ovih svojstava.
[0316] U jednom primeru izvođenja, kancer u skladu sa učenjem uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, kancer je CLDN18.2 pozitivan. U jednom primeru izvođenja, ekspresija CLDN18.2 je na površini ćelija. U jednom primeru izvođenja, najmanje 50%, poželjno 60%, 70%, 80% ili 90% ćelija kancera je CLDN18.2 pozitivno i/ili najmanje 40%, poželjno najmanje 50% ćelija kancera je pozitivno na površinsku ekspresiju CLDN18.2. U jednom primeru izvođenja, najmanje 95% ili najmanje 98% ćelija kancera je CLDN18.2 pozitivno. U jednom primeru izvođenja, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90% ćelija kancera je pozitivno na površinsku ekspresiju CLDN18.2.
[0317] U jednom primeru izvođenja, kancer koji eksprimira CLDN18.2, kancer koji uključuje ćelije kancera koje eksprimiraju CLDN18.2 ili CLDN18.2 pozitivan kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, kancera pankreasa, kancera pluća kao što je nesitnoćelijski kancer pluća (NSCLC), kancera jajnika, kancera kolona, kancera jetre, kancera glave i vrata, i kancera žučne kese i njegove metastaze, posebno metastaze kancera želuca kao što su Krukenbergovi tumori, peritonealne metastaze i metastaze u limfnim čvorovima. U jednom primeru izvođenja, kancer je adenokarcinom, posebno uznapredovali adenokarcinom. Posebno poželjne bolesti kancera su adenokarcinomi želuca, jednjaka, kanala pankreasa, žučnih kanala, pluća i jajnika. U jednom primeru izvođenja, kancer je odabran iz grupe koja se sastoji od kancera želuca, kancera jednjaka, posebno donjeg jednjaka, kancera ezo-gastričnog spoja i gastroezofagealnog kancera. U posebno poželjnom primeru izvođenja, kancer je gastroezofagealni kancer kao što je metastatski, refraktorni ili rekurentni uznapredovali gastroezofagealni kancer.
[0318] U skladu sa učenjem, termin "tumor" ili "bolest tumora" označava otok ili leziju koja je formirana abnormalnim rastom ćelija (zvanim neoplastične ćelije ili tumorske ćelije). Pod "tumorskom ćelijom" podrazumeva se abnormalna ćelija koja raste brzom, nekontrolisanom ćelijskom proliferacijom i nastavlja da raste pošto prestanu stimulusi koji su inicirali novi rast. Tumori pokazuju delimični ili potpuni nedostatak strukturne organizacije i funkcionalne koordinacije sa normalnim tkivom, i uobičajeno formiraju posebnu masu tkiva, koja može biti benigna, premaligna ili maligna.
[0319] U skladu sa učenjem, "karcinom" je maligni tumor izveden iz epitelskih ćelija. Ova grupa predstavlja najčešće kancere, uključujući uobičajene oblike kancera dojke, prostate, pluća i kolona.
[0320] "Adenokarcinom" je kancer koji nastaje u žlezdanom tkivu. Ovo tkivo je takođe deo veće kategorije tkiva poznate kao epitelsko tkivo. Epitelsko tkivo uključuje kožu, žlezde i razna druga tkiva koja oblažu šupljine i organe u telu. Epitel je embriološki izveden iz ektoderma, endoderma i mezoderma. Kako bi bile klasifikovane kao adenokarcinom, ćelije ne moraju nužno da budu deo žlezde, sve dok imaju sekretorna svojstva. Ovaj oblik karcinoma može se javiti kod nekih viših sisara, uključujući ljude. Dobro diferencirani adenokarcinomi imaju tendenciju da liče na žlezdano tkivo iz kojeg su izvedeni, dok slabo diferencirani možda i ne. Bojenjem ćelija iz biopsije, patolog će odrediti da li je tumor adenokarcinom ili neki drugi tip kancera. Adenokarcinomi mogu nastati u mnogim tkivima tela zbog sveprisutne prirode žlezda u telu. Iako svaka žlezda možda ne sekretuje istu supstancu, sve dok postoji egzokrina funkcija ćelije, ona se smatra žlezdanom i njen maligni oblik se prema tome naziva adenokarcinom. Maligni adenokarcinomi vrše invaziju u druga tkiva i često metastaziraju ukoliko im se da dovoljno vremena za to. Adenokarcinom jajnika je najčešći tip karcinoma jajnika. On uključuje serozni i mukozni adenokarcinom, adenokarcinom svetlih ćelija i endometrioidni adenokarcinom.
[0321] Limfom i leukemija su maligniteti koji su izvedeni iz hematopoetskih (krvotvornih) ćelija.
[0322] Blastni tumor ili blastom je tumor (uobičajeno maligni) koji podseća na nezrelo ili embrionalno tkivo. Mnogi od ovih tumora su najčešći kod dece.
[0323] Pod "metastazom" se misli na širenje ćelija kancera sa prvobitnog mesta na drugi deo tela. Formiranje metastaza je veoma složen proces i zavisi od odvajanja malignih ćelija od primarnog tumora, invazije vanćelijskog matriksa, prodora endotelskih bazalnih membrana kako bi ušle u telesnu šupljinu i krvne sudove, i zatim, pošto su transportovane krvlju, infiltracije ciljnih organa. Na kraju, rast novog tumora na ciljnom mestu zavisi od angiogeneze. Metastaze tumora se često javljaju čak i posle uklanjanja primarnog tumora zato što tumorske ćelije ili komponente mogu ostati i razviti metastatski potencijal. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" u skladu sa učenjem odnosi se na "udaljenu metastazu" koja se odnosi na metastazu koja je udaljena od primarnog tumora i sistema regionalnih limfnih čvorova. U jednom primeru izvođenja, termin "metastaza" u skladu sa učenjem odnosi se na metastaze u limfnim čvorovima.
[0324] Ćelije sekundarnog ili metastatskog tumora su kao one u prvobitnom tumoru. To znači, na primer, da, ukoliko kancer jajnika metastazira u jetru, sekundarni tumor je sačinjen od abnormalnih ćelija jajnika, a ne od abnormalnih ćelija jetre. Tumor u jetri se tada naziva metastatski kancer jajnika, a ne kancer jetre.
[0325] Relaps ili recidiv se dešava kada je osoba ponovo pogođena stanjem koje ju je pogađalo u prošlosti. Na primer, ukoliko je pacijent patio od bolesti tumora, dobio je uspešno
1
lečenje navedene bolesti i ponovo razvije navedenu bolest, navedena novorazvijena bolest može se smatrati relapsom ili recidivom. Međutim, u skladu sa učenjem, relaps ili recidiv bolesti tumora može, ali ne mora nužno da se desi na mestu prvobitne bolesti tumora. Stoga, na primer, ukoliko je pacijent patio od tumora jajnika i dobio je uspešno lečenje, relaps ili recidiv može biti pojava tumora jajnika ili pojava tumora na mestu koje se razlikuje od jajnika. Relaps ili recidiv tumora takođe uključuje situacije u kojima se tumor javlja na mestu različitom od mesta prvobitnog tumora, kao i na mestu prvobitnog tumora. Poželjno, prvobitni tumor za koji je pacijent dobio lečenje je primarni tumor, a tumor na mestu različitom od mesta prvobitnog tumora je sekundarni ili metastatski tumor.
[0326] Termin "lečenje" ili "terapijsko lečenje" odnosi se na bilo koje lečenje koje poboljšava zdravstveni status i/ili produžava (povećava) životni vek pojedinca. Navedeno lečenje može eliminisati bolest kod pojedinca, zaustaviti ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, inhibirati ili usporiti razvoj bolesti kod pojedinca, smanjiti učestalost ili ozbiljnost simptoma kod pojedinca, i/ili smanjiti recidiv kod pojedinca koji trenutno ima ili je ranije imao bolest.
[0327] Termini "profilaktičko lečenje" ili "preventivno lečenje" odnose se na bilo koje lečenje koje je namenjeno da prevenira pojavu bolesti kod pojedinca. Termini "profilaktičko lečenje" ili "preventivno lečenje" se ovde upotrebljavaju naizmenično.
[0328] Termini "pojedinac" i "subjekt" se ovde upotrebljavaju naizmenično. Oni se odnose na ljudska bića, ne-humane primate ili druge sisare (npr. miš, pacov, zec, pas, mačka, govedo, svinja, ovca, konj ili primat) koji mogu biti pogođeni ili su podložni bolestima ili poremećajima (npr. kancer), ali mogu ili ne moraju imati bolest ili poremećaj. U mnogim primerima izvođenja, pojedinac je ljudsko biće. Osim ukoliko nije drugačije navedeno, termini "pojedinac" i "subjekt" ne označavaju određeni uzrast, pa stoga obuhvataju odrasle, starije, decu, i novorođenčad. U poželjnim primerima izvođenja predmetnog učenja, "pojedinac" ili "subjekt" je "pacijent". Termin "pacijent" podrazumeva u skladu sa učenjem subjekta za lečenje, posebno bolesnog subjekta.
[0329] Pod "biti u riziku" se podrazumeva subjekt, tj. pacijent, za kog je identifikovano da ima veće šanse od normalnih za razvoj bolesti, posebno kancera, u poređenju sa opštom populacijom. Pored toga, subjekt koji je imao, ili trenutno ima bolest, posebno kancer, je subjekt koji ima povećan rizik za razvoj bolesti, pošto takav subjekt može nastaviti da razvija bolest. Subjekti koji trenutno imaju ili su imali kancer takođe imaju povećan rizik od metastaza kancera.
[0330] Termin "imunoterapija" se odnosi na lečenje koje uključuje specifičnu imunsku reakciju.
2
[0331] U kontekstu predmetnog učenja, termini kao što su "zaštititi", "prevenirati", "profilaktički", "preventivni", ili "zaštitni" odnose se na prevenciju ili lečenje, ili oba, pojave i/ili širenja bolesti kod subjekta i, posebno, za minimalizovanje šanse da će subjekt razviti bolest ili za odlaganje razvoja bolesti. Na primer, osoba sa rizikom od tumora, kao što je prethodno opisano, bila bi kandidat za terapiju za preveniranje tumora.
[0332] Profilaktička primena imunoterapije, na primer, profilaktička primena agensa ili kompozicije iz učenja, poželjno štiti primaoca od razvoja bolesti. Terapijska primena imunoterapije, na primer, terapijska primena agensa ili kompozicije iz učenja, može dovesti do inhibicije napredovanja/rasta bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja/rasta bolesti, posebno ometanje progresije bolesti, što poželjno dovodi do eliminacije bolesti.
[0333] Imunoterapija se može izvesti upotrebom bilo koje od različitih tehnika, u kojima agensi koji su ovde obezbeđeni poželjno funkcionišu da uklone ćelije koje eksprimiraju CLDN18.2 iz pacijenta. Takvo uklanjanje se može desiti kao rezultat poboljšavanja ili indukovanja imunskog odgovora kod pacijenta koji je specifičan za CLDN18.2 ili ćeliju koja eksprimira CLDN18.2 i/ili prezentuje CLDN18.2 u kontekstu MHC molekula.
[0334] Unutar određenih primera izvođenja, imunoterapija može biti aktivna imunoterapija, u kojoj se lečenje oslanja na in vivo stimulaciju endogenog imunskog sistema domaćina da reaguje prema bolesnim ćelijama primenom agenasa za modifikaciju imunskog odgovora (kao što su peptidi i nukleinske kiseline kao što je ovde obezbeđeno).
[0335] Unutar drugih primera izvođenja, imunoterapija može biti pasivna imunoterapija, u kojoj lečenje uključuje isporuku agenasa sa utvrđenom tumor-imunskom reaktivnošću (kao što su efektorske ćelije) koji mogu direktno ili indirektno posredovati u antitumorskim efektima i ne zavisi nužno od intaktnog imunskog sistema domaćina. Primeri efektorskih ćelija uključuju T limfocite (kao što su CD8+ citotoksični T limfociti i CD4+ T-pomoćnički limfociti), i antigen-prezentujuće ćelije (kao što su dendritske ćelije i makrofagi). T ćelijski receptori specifični za CLDN18.2 peptide koji su ovde navedeni i veštački T ćelijski receptori specifični za CLDN18.2 mogu se preneti u efektorske ćelije za adoptivnu imunoterapiju.
[0336] Kao što je prethodno napomenuto, imunoreaktivni peptidi kao što su ovde obezbeđeni mogu da se upotrebljavaju za brzo umnožavanje antigen-specifičnih kultura T ćelija kako bi se generisao dovoljan broj ćelija za imunoterapiju. Posebno, antigen-prezentujuće ćelije, kao što su dendriske ćelije, makrofagi, monociti, fibroblasti i/ili B ćelije, mogu biti pulsirane sa imunoreaktivnim peptidima ili transfektovane sa jednom ili više nukleinskih kiselina upotrebom standardnih tehnika koje su dobro poznate u struci. Kultivisane efektorske ćelije za upotrebu u terapiji moraju biti sposobne da rastu i široko se distribuiraju, i da prežive dugoročno in vivo. Studije su pokazale da se kultivisane efektorske ćelije mogu indukovati da rastu in vivo i da prežive dugoročno u značajnom broju ponovljenom stimulacijom antigenom sa dodatkom IL-2 (videti, na primer, Cheever et al. (1997), Immunological Reviews 157, 177).
[0337] Alternativno, nukleinska kiselina koja eksprimira peptid koji je ovde naveden može se introdukovati u antigen-prezentujuće ćelije uzete od pacijenta i klonski propagirane ex vivo za transplantaciju nazad u istog pacijenta.
[0338] Transfektovane ćelije se mogu reintrodukovati u pacijenta upotrebom bilo kog načina poznatog u struci, poželjno u sterilnom obliku intravenskom, intrakavitarnom, intraperitonealnom ili intratumorskom primenom.
[0339] Postupci koji su ovde objavljeni mogu uključivati primenu autolognih T ćelija koje su aktivirane kao odgovor na peptid ili antigen-prezentujuću ćeliju koja eksprimira peptid. Takve T ćelije mogu biti CD4+ i/ili CD8+, i mogu proliferisati kao što je prethodno opisano. T ćelije se mogu primeniti subjektu u količini efikasnoj da inhibira razvoj bolesti.
[0340] Termin "imunizacija" ili "vakcinacija" opisuje proces lečenja subjekta sa svrhom indukovanja imunskog odgovora iz terapijskih ili profilaktičkih razloga.
[0341] Termin "in vivo" se odnosi na situaciju u subjektu.
[0342] U skladu sa učenjem, "uzorak" može biti bilo koji uzorak koristan u skladu sa predmetnim učenjem, posebno biološki uzorak kao što je uzorak tkiva, uključujući telesne tečnosti, i/ili ćelijski uzorak i može se dobiti na konvencionalni način kao što je biopsijom tkiva, uključujući biopsiju udarcem (punch biopsy), i uzimanjem krvi, bronhijalnog aspirata, sputuma, urina, fecesa ili drugih telesnih tečnosti. U skladu sa učenjem, termin "uzorak" takođe uključuje obrađene uzorke kao što su frakcije ili izolati bioloških uzoraka, npr. izolati nukleinske kiseline i peptida/proteina.
[0343] Ovde opisana jedinjenja i agensi mogu se primenjivati u obliku bilo koje pogodne farmaceutske kompozicije.
[0344] Farmaceutske kompozicije iz učenja su poželjno sterilne i sadrže efikasnu količinu agenasa koji su ovde opisani i opciono dodatnih agenasa kao što je ovde razmatrano kako bi se generisala željena reakcija ili željeni efekat.
[0345] Farmaceutske kompozicije se uobičajeno obezbeđuju u uniformnom doznom obliku i mogu se pripremiti na način poznat per se. Farmaceutska kompozicija može npr. biti u obliku rastvora ili suspenzije.
[0346] Farmaceutska kompozicija može da sadrži soli, puferske supstance, konzervanse, nosače, razblaživače i/ili ekscipijense od kojih su svi poželjno farmaceutski prihvatljivi.
4
Termin "farmaceutski prihvatljiv" označava netoksičnost materijala koji ne interaguje sa dejstvom aktivne komponente farmaceutske kompozicije.
[0347] Soli koje nisu farmaceutski prihvatljive mogu se upotrebljavati za pripremanje farmaceutski prihvatljivih soli i uključene su u učenje. Farmaceutski prihvatljive soli ove vrste sadrže na neograničavajući način one koje su pripremljene od sledećih kiselina: hlorovodonične, bromovodonične, sumporne, azotne, fosforne, maleinske, sirćetne, salicilne, limunske, mravlje, malonske, jantarne kiseline, i slično. Farmaceutski prihvatljive soli se takođe mogu pripremiti kao soli alkalnih metala ili soli zemnoalkalnih metala, kao što su natrijumove soli, kalijumove soli ili kalcijumove soli.
[0348] Pogodne puferske supstance za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju sirćetnu kiselinu u soli, limunsku kiselinu u soli, bornu kiselinu u soli i fosfornu kiselinu u soli.
[0349] Pogodni konzervansi za upotrebu u farmaceutskoj kompoziciji uključuju benzalkonijum hlorid, hlorobutanol, paraben i timerosal.
[0350] Injektabilna formulacija može da sadrži farmaceutski prihvatljiv ekscipijens kao što je Ringerov laktat.
[0351] Termin "nosač" označava organsku ili neorgansku komponentu, prirodne ili sintetičke prirode, u kojoj je aktivna komponenta kombinovana kako bi se olakšala, poboljšala ili omogućila primena. U skladu sa učenjem, termin "nosač" takođe uključuje jedan ili više kompatibilnih čvrstih ili tečnih filera, razblaživača ili supstanci za inkapsuliranje, koji su pogodni za primenu pacijentu. Moguće supstance nosača za parenteralnu primenu su npr. sterilna voda, Ringer, Ringerov laktat, sterilni rastvor natrijum hlorida, polialkilen glikoli, hidrogenizovani naftaleni i, posebno, biokompatibilni laktidni polimeri, laktid/glikolid kopolimeri ili polioksietilen/polioksipropilen kopolimeri.
[0352] Termin "ekscipijens" kada se ovde upotrebljava je namenjen da ukaže na sve supstance koje mogu biti prisutne u farmaceutskoj kompoziciji i koje nisu aktivni sastojci kao što su, npr. nosači, bajnderi, lubrikanti, zgušnjivači, površinski aktivni agensi, konzervansi, emulgatori, puferi, agensi za aromu, ili boje.
[0353] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu se primenjivati putem bilo kog konvencionalnog puta, kao što je parenteralna primena uključujući injekciju ili infuziju. Primena je poželjno parenteralno, npr. intravenski, intraarterijski, subkutano, intradermalno ili intramuskularno.
[0354] Kompozicije pogodne za parenteralnu primenu uobičajeno sadrže sterilni vodeni ili nevodeni preparat aktivnog jedinjenja, koji je poželjno izotoničan sa krvlju primaoca. Primeri kompatibilnih nosača i rastvarača su Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, uobičajeno se upotrebljavaju sterilna, fiksna ulja kao medijum za rastvor ili suspenziju.
[0355] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani se primenjuju u efikasnim količinama. "Efikasna količina" označava količinu kojom se postiže željena reakcija ili željeni efekat sam ili zajedno sa dodatnim dozama. U slučaju lečenja određene bolesti ili određenog stanja, željena reakcija se poželjno odnosi na inhibiciju toka bolesti. Ovo sadrži usporavanje napredovanja bolesti i, posebno, prekidanje ili preokretanje napredovanja bolesti. Željena reakcija u lečenju bolesti ili stanja može takođe biti odlaganje početka ili prevencija početka navedene bolesti ili navedenog stanja.
[0356] Efikasna količina agensa ili kompozicije koja je ovde opisana zavisiće od stanja koje se leči, ozbiljnosti bolesti, individualnih parametara pacijenta, uključujući starost, fiziološko stanje, veličinu i težinu, trajanje lečenja, vrstu prateće terapije (ukoliko postoji), specifičan put primene i slične faktore. U skladu sa tim, doze koje se primenjuju agenasa koji su ovde opisani mogu zavisiti od različitih takvih parametara. U slučaju da je reakcija kod pacijenta nedovoljna sa inicijalnom dozom, mogu se upotrebiti veće doze (ili efikasno veće doze koje se postižu drugačijim, lokalizovanijim putem primene).
[0357] Agensi i kompozicije koji su ovde opisani mogu da se primenjuju pacijentima, npr. in vivo, za lečenje ili preveniranje niza poremećaja kao što su oni koji su ovde opisani. Poželjni pacijenti uključuju humane pacijente koji imaju poremećaje koji se mogu ispraviti ili poboljšati primenom agenasa i kompozicija koje su ovde opisane. Ovo uključuje poremećaje koji uključuju ćelije koje su okarakterisane ekspresijom CLDN18.2.
[0358] Na primer, u jednom primeru izvođenja, agensi koji su ovde opisani mogu da se upotrebljavaju za lečenje pacijenta sa bolešću kancera, npr. bolešću kancera kao što je ovde opisano, koja je okarakterisana prisustvom ćelija kancera koje eksprimiraju CLDN18.2.
[0359] Farmaceutske kompozicije i postupci lečenja koji su opisani u skladu sa učenjem takođe se mogu upotrebljavati za imunizaciju ili vakcinaciju kako bi se prevenirala bolest koja je ovde opisana.
[0360] Farmaceutska kompozicija iz učenja može da se primenjuje zajedno sa suplementnim supstancama za poboljšanje imuniteta kao što je jedan ili više adjuvanasa i može da sadrži jednu ili više supstanci za poboljšanje imuniteta kako bi se dodatno povećala njena efikasnost, poželjno kako bi se postigao sinergistički efekat imunostimulacije. Termin "adjuvans" se odnosi na jedinjenja koja produžavaju ili poboljšavaju ili ubrzavaju imunski odgovor. U ovom pogledu su mogući različiti mehanizmi, u zavisnosti od različitih tipova adjuvanasa. Na primer, jedinjenja koja omogućavaju sazrevanje DC, npr. lipopolisaharidi ili CD40 ligand, čine prvu klasu pogodnih adjuvanasa. Generalno, bilo koji agens koji utiče na imunski sistem tipa "signala opasnosti" (LPS, GP96, dsRNA itd.) ili citokini, kao što je GM-CSF, mogu se upotrebljavati kao adjuvans koji omogućava da imunski odgovor bude intenziviran i/ili da se na njega utiče na kontrolisan način. CpG oligodezoksinukleotidi se takođe mogu opciono upotrebljavati u ovom kontekstu, iako se moraju uzeti u obzir njihovi neželjeni efekti koji se javljaju pod određenim okolnostima, kao što je prethodno objašnjeno. Posebno poželjni adjuvansi su citokini, kao što su monokini, limfokini, interleukini ili hemokini, npr. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IFNα, IFNγ, GM-CSF, LT-α, ili faktori rasta, npr. hGH. Dodatni poznati adjuvansi su aluminijum hidroksid, Frojndov (Freund’s) adjuvans ili ulje kao što je Montanide™, najpoželjnije Montanide® ISA51. Lipopeptidi, kao što je Pam3Cys, su takođe pogodni za upotrebu kao adjuvansi u farmaceutskoj kompoziciji iz predmetnog učenja.
[0361] Farmaceutska kompozicija se može primeniti lokalno ili sistemski, poželjno sistemski.
[0362] Termin "sistemska primena" označava primenu agensa tako da agens postane široko distribuiran u telu pojedinca u značajnim količinama i da razvije željeni efekat. Na primer, agens može da razvije svoj željeni efekat u krvi i/ili dostigne željeno mesto delovanja putem vaskularnog sistema. Tipični sistemski putevi primene uključuju primenu introdukovanjem agensa direktno u vaskularni sistem ili oralnu, plućnu, ili intramuskularnu primenu pri čemu se agens adsorbuje, ulazi u vaskularni sistem, i prenosi na jedno ili više željenih mesta delovanja putem krvi.
[0363] U skladu sa predmetnim učenjem, poželjno je da se sistemska primena vrši parenteralnom primenom. Termin "parenteralna primena" označava primenu agensa tako da agens ne prođe kroz creva. Termin "parenteralna primena" uključuje intravensku primenu, subkutanu primenu, intradermalnu primenu ili intraarterijsku primenu, ali nije ograničen na njih.
[0364] Primena se takođe može izvršiti, na primer, oralno, intraperitonealno ili intramuskularno.
[0365] Agensi i kompozicije koji su ovde obezbeđeni mogu da se upotrebljavaju sami ili u kombinaciji sa konvencionalnim terapijskim režimima kao što su operacija, zračenje, hemioterapija i/ili transplantacija kostne srži (autologna, singena, alogena ili nesrodna).
[0366] Predmetno učenje je detaljno opisano slikama i primerima u nastavku, koji se upotrebljavaju samo u svrhu ilustracije i nemaju za cilj da budu ograničavajući. Zahvaljujući opisu i primerima, radniku sa iskustvom dostupni su dodatni primeri izvođenja koji su takođe uključeni u učenje.
SLIKE
[0367]
Slika 1: Prikaz TCR-CD3 kompleksa. Unutarcitoplazmatski CD3 imunoreceptorski tirozinski aktivacioni motivi (ITAM) označeni su kao cilindri (prilagođeno iz "The T cell receptor facts book", MP Lefranc, G Lefranc, 2001).
Slika 2: Dizajn uzastopnih generacija CAR. Šematski prikaz različitih generacija CAR (1G, prva generacija, 2G, druga generacija, 3G, treća generacija). Prva generacija sadrži vanćelijske scFv i citoplazmatski CD3ζ lanac/ZAP70 koji posreduje u citotoksičnosti, druga generacija dopunski CD28/PI3K koji promoviše proliferaciju i treća generacija još i 4-1BB ili OX40/TRAF koji održava opstanak ćelija (Casucci, M. et al. (2011) 2: 378-382).
Slika 3: Šematski prikaz različitih formata receptora za preusmeravanje T ćelija prema CLDN18.2. Levo: druga generacija CAR koja se sastoji od CLDN18.2-specifičnog scFv fragmenta, IgG1-izvedenog spejser domena, CD28 kostimulatornog i CD3ζ signalnog domena (CAR-28ζ); sredina: novi CAR format zasnovan na povezivanju scFv sa konstantnim domenom murinskog TCRβ lanca i koekspresiji konstantnog domena murinskog TCRα lanca (CAR/Cα); desno: murinski TCR sačinjen od TCR α/β lanaca (mu, murinski TCR);
Slika 4: Profilisanje CLDN18.1 i CLDN18.2 transkripata u panelu humanih tkiva.
A, genomska struktura CLDN18 lokusa (gore). Šrafirani regioni, egzoni jedinstveni za CLDN18.1 (E 1.1) ili CLDN18.2 (E 1.2), respektivno; dole, kompozicija egzona CLDN18 varijanti; lukovi, dva vanćelijska domena; strelice, prajmeri koji se upotrebljavaju za RT-PCR. B, komparativna analiza CLDN18 izoformi u normalnim humanim tkivima (N), uzorku primarnog tumora, i ćelijskim linijama tumora pomoću RT-PCR krajnje tačke. C, kvantifikacija u normalnim humanim tkivima (N), uzorku primarnog tumora, i ćelijskim linijama tumora pomoću PCR u realnom vremenu (Sahin U et al., Clin Cancer Res 2008;14:7624-34).
Slika 5: Ex vivo reaktivnost ćelija slezine iz imunizovanih HLA-A∗02-transgenih miševa prema peptidima izvedenim iz CLDN18.2 analizirano IFNγ-ELISPOT testom. HLA-A∗02 CLDN18.2-specifični vezujući peptidi su predviđeni za prvih 80 amino-kiselina CLDN18.2 primenom specifičnog algoritma (Rammensee H. et al. (1999) Immunogenetics 50, 213-9). Ćelije slezine CLDN18.2-imunizovanih HLA-A∗02-transgenih miševa analizirane su na reaktivnost prema CLDN18.2 peptidnom pulu ili predviđenim HLA-A∗02-vezujućim CLDN18.2-izvedenim peptidima CLDN18.2-A2-1-6. Pozitivna kontrola: ćelije slezine tretirane sa PMA; negativna kontrola: irelevantan peptidni pul (HIV-gag), irelevantan nonamer peptid (PLAC1-31-39).
Slika 6: Sortiranje protočnom citometrijom CLDN18.2-specifičnih murinskih CD8+ T ćelija iz HLA-A∗02-transgenih miševa posle in vitro restimulacije.
Pojedinačne CD8+/ CD137+ T ćelije su izolovane posle restimulacije ćelija slezine sa CLDN18.2 preklapajućim peptidnim pulom. Kontrola: ćelije slezine su restimulisane irelevantnim peptidnim pulom (HIV-gag).
Slika 7: Testiranje specifičnosti TCR izolovanih iz CD8+ T ćelija CLDN18.2-imunizovanih miševa. CD8+ T ćelije HLA-A∗02-pozitivnog zdravog donora su transfektovane sa RNK za TCR-α/β lanac i testirane na prepoznavanje K562-A2 ćelija pulsiranih sa CLDN18.2 preklapajućim 15mer peptidima (= CLDN18.2 pul) ili CLDN18.2-izvedenim HLA-A∗02 vezujućim peptidima (CLDN18.2-A2-4, CLDN218.2-A2-5, CLDN18.2-A2-6) pomoću IFNγ-ELISPOT. Negativne kontrole: irelevantan peptidni pul (HIV-gag), irelevantan 9mer peptid (PLAC1-31-39); Pozitivna kontrola: SEB;
Slika 8: Površinska ekspresija CLDN18.2- i CLDN6-specifičnih CAR na humanim preaktiviranim CD8+ T ćelijama. CD8+ T ćelije su preaktivirane sa OKT3 i transfektovane sa 20 μg CAR-RNK.20 h posle elektroporacije ćelije su obojene sa PE-konjugovanim anti-CD8 antitelom i idiotip-specifičnim fluorohrom-konjugovanim antitelima specifičnim za CLDN18.2-CAR i CLDN6-CAR, respektivno. Ćelije su gejtovane na pojedinačne CD8+ T limfocite.
Slika 9: Specifična liza CLDN18.2-eksprimirajućih ciljnih ćelija posredovana od strane CLDN18.2-CAR. Preaktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20 μg CAR RNK i kokultivisane 20 h kasnije zajedno sa autolognim iDC transfektovanim sa RNK koja kodira bilo CLDN18.2-CAR upotrebom titriranih E:T odnosa (30:1, 10:1, 3:1). Negativne kontrole: T ćelije transfektovane sa CLND6-specifičnim CAR ili bez CAR RNK (= lažno), iDC transfektovane sa CLDN6-RNK. Specifična liza je analizirana testom citotoksičnosti na bazi luciferaze posle 4 h kokulture.
Slika 10: Specifična inhibicija CLDN18.2-CAR posredovane lize CLDN18.2-eksprimirajućih ciljnih ćelija dodavanjem idiotip-specifičnog antitela. Preaktivirane CD8+ T ćelije su transfektovane sa 20 μg CAR RNK i kokultivisane 20 h kasnije zajedno sa autolognim iDC transfektovanim bilo sa CLDN18.2- ili sa CLDN6-RNK upotrebom E:T odnosa od 30:1. Efektorske T ćelije su preinkubirane sa ili bez 2 μg/ml idiotip-specifičnog antitela tokom 1 h pre nego što su dodate ciljne ćelije. Specifična liza je analizirana testom citotoksičnosti na bazi luciferaze posle 4 h kokulture.
Slika 11: In vitro antigen-specifična proliferacija CLDN18.2-CAR T ćelija. CD8+ T ćelije su elektroporisane sa RNK koja kodira bilo CLDN18.2-CAR ili bez RNK (lažno) i obeležene karboksifluorescein sukcinimidil estrom (CFSE). CAR T ćelije su kokultivisane sa iDC transfektovanim sa 5 μg IVT-RNK koja kodira bilo CLDN18.2 ili kontrolne antigene CLDN9 ili CLDN6. Posle 96 h kokulture ćelije su sakupljene, a CFSE fluorescenca je analizirana pomoću protočne citometrije. Ćelije su gejtovane na žive pojedinačne CD8+ limfocite.
Slika 12: In vivo antigen-specifična aktivacija CLDN18.2-CAR T ćelije kod miševa posle vakcinacije. BALB/c-miševi su bili i.v. graftovani sa 5 x 10<6>CLDN18-2-CAR-effLuc-GFP transdukovanim T ćelijama. 24 h posle ACT, miševi su vakcinisani i.v. sa RNK(F12-Lip)koja sadrži 25 μg CLDN18.2 RNK ili kont RNK. (A) Efikasnost transdukcije T ćelija je izmerena putem protočne citometrije upotrebom antitela kuplovanih za fluorohrom (B) Intenziteti in vivo luminescence kod miševa su izmereni 48 h posle vakcinacije. Snimci karikiranih boja (off-color) predstavljaju intenzitet svetlosti (crna, najmanje intenzivna; bela do tamnosive, najintenzivnija) koja je postavljena preko referentne fotografije u sivim tonovima.
PRIMERI
[0368] Tehnike i postupci koji se ovde upotrebljavaju opisani su ovde ili izvedeni na način poznat per se i kao što je opisano, na primer, u Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. Svi postupci, uključujući upotrebu kompleta i reagensa, izvedeni su u skladu sa informacijama proizvođača osim ukoliko nije specifično naznačeno.
Primer 1: Materijali i postupci
Ćelijske linije i reagensi
[0369] Ćelijska linija humane hronične mijeloidne leukemije K562 (Lozzio, C.B. & Lozzio, B.B (1975), Blood 45, 321-334) stabilno transfektovana sa HLA-A∗0201 (Britten, C.M. et al. (2002), J. Immunol. Methods 259, 95-110) (označene npr. kao K562-A2) i upotrebljena za testove validacije TCR kultivisana je pod standardnim uslovima. Primarna ćelijska linija fibroblasta prepucijuma humanog novorođenčeta CCD-1079Sk (ATCC br. CRL-2097) kultivisana je u skladu sa uputstvima proizvođača.
Mononukleusne ćelije periferne krvi (PBMC), monociti i dendritske ćelije (DC)
[0370] PBMC su izolovane pomoću Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences, Uppsala, Švedska) centrifugiranja u gradijentu gustine iz slojeva istaloženih leukocita i krvnih pločica (buffy coats). HLA alelotipovi su određeni pomoću PCR standardnim postupcima. Monociti su obogaćeni sa anti-CD14 mikroperlama (Miltenyi Biotech, Bergisch-Gladbach, Nemačka). Nezrele DC (iDC) su dobijene diferenciranjem monocita tokom 5 dana u medijumu za kulturu supelmentovanim citokinom kao što je opisano u Kreiter et al. (2007), Cancer Immunol. Immunother., CII, 56, 1577-87.
Peptidi i peptidno pulsiranje stimulatorskih ćelija
1
[0371] Pulovi N- i C-terminusno slobodnih 15-mer peptida sa 11 amino-kiselinskih preklapanja koja odgovaraju sekvencama klaudina-18.2 ili HIV-gag (koji se označavaju kao pul antigenskih peptida) sintetisani su pomoću standardne hemije čvrste faze (JPT GmbH, Berlin, Nemačka) i rastvoreni u DMSO do krajnje koncentracije od 0,5 mg/ml. Nonamerni peptidi su rekonstituisani u PBS 10% DMSO. Za pulsiranje stimulatorske ćelije su inkubirane tokom 1 h na 37 °C u medijumu za kulturu upotrebljavajući različite koncentracije peptida.
Vektori za in vitro transkripciju (IVT) RNK
[0372] Svi konstrukti su varijante prethodno opisanog pST1-sec-insert-2βgUTR-A(120)-Sap1 plazmida (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017). Za generisanje plazmida koji kodiraju murinske TCR lance, cDNA koje kodiraju za murinske TCR-α, -β1i -β2konstantne regione naručene su od komercijalnog provajdera i klonirane analogno (GenBank pristupni brojevi M14506, M64239 i X67127, respektivno). Specifični V(D)J PCR proizvodi su introdukovani u takve kasete kako bi se dobili TCR lanci pune dužine (koji su označeni kao pST1-murineTCRαβ-2βgUTR-A(120)).
[0373] Antigeni CLDN18.2, CLDN18.2 aa 1-80 i CLDN6 pune dužine klonirani su povezani sa signalom za transport MHC klase I (MITD) u pST1 plazmidima koji su prethodno opisani (Kreiter, S. et al. (2008), J. Immunol. 180, 309-318).
Generisanje in vitro transkribovane (IVT) RNK i prenos u ćelije
[0374] Generisanje IVT RNK je izvedeno kao što je prethodno opisano (Holtkamp, S. et al. (2006), Blood 108, 4009-4017) i dodata je ćelijama koje su suspendovane u X-VIVO 15 medijumu (Lonza, Basel, Švajcarska) u prethodno ohlađenoj sterilnoj kiveti za elektroporaciju sa otvorom od 4 mm (Bio-Rad Laboratories GmbH, Minhen, Nemačka). Elektroporacija je izvedena sa Gene-Pulser-II aparatom (Bio-Rad Laboratories GmbH, Minhen, Nemačka) (T ćelije: 450 V/250 μF; K562-A2: 200 V/300 μF).
In vivo prajmovanje T ćelija intranodalnom imunizacijom HLA A2.1/DR1 miševa sa IVT RNK
[0375] T ćelije A2/DR1 miševa (Pajot A. et al. (2004), Eur. J. Immunol. 34, 3060-69) prajmovane su in vivo prema antigenu od interesa ponavljanom intranodalnom imunizacijom
2
upotrebom IVT RNK koja kodira antigen (Kreiter S. et al., (2010), Cancer Research 70, 9031-40). Za intranodalne imunizacije, miševi su anestezirani ksilazinom/ketaminom. Ingvinalni limfni čvor je hirurški izložen, 10 μl RNK (20 μg) razblažene u Ringerovom rastvoru i vodi bez Rnaze polako je injektirano špricem od 0,3 ml za jednokratnu upotrebu sa ultrafinom iglom (31G, BD Biosciences), i rana je zatvorena. Posle šest ciklusa imunizacije, miševi su žrtvovani i ćelije slezine su izolovane.
Sakupljanje ćelija slezine
[0376] Posle disekcije u sterilnim uslovima, slezine su prebačene u falkon tube koje sadrže PBS. Slezine su mehanički razbijene pincetom i ćelijske suspenzije su dobijene ćelijskom cediljkom (40 μm). Splenociti su isprani sa PBS, centrifugirani i resuspendovani u hipotoničnom puferu za lizu eritrocita. Posle 5 min inkubacije na RT, reakcija je zaustavljena dodavanjem 20-30 ml medijuma ili PBS. Ćelije slezine su centrifugirane i isprane dva puta sa PBS.
Sortiranje pojedinačnih ćelija antigen-specifičnih CD8+ T ćelija posle CD137 bojenja
[0377] Za antigen-specifičnu restimulaciju, 2,5 x 10^6/bunariću ćelija slezine iz imunizovanih A2/DR1 miševa je zasejano u ploču sa 24 bunarića i pulsirano sa pulom preklapajućih peptida koji kodiraju antigen od interesa ili kontrolni antigen. Posle 24 h inkubacije ćelije su sakupljene, obojene sa FITC-konjugovanim anti-CD3 antitelom, PE-konjugovanim anti-CD4 antitelom, PerCP-Cy5.5-konjugovanim anti-CD8 antitelom i Dylight-649-konjugovanim anti-CD137 antitelom. Sortiranje je obavljeno na BD FACS Aria protočnom citometru (BD Biosciences). Ćelije pozitivne na CD137, CD3 i CD8 su sortirane, jedna ćelija po bunariću je sakupljena u ploču sa 96 bunarića sa V-dnom (Greiner Bio-One) koja je sadržala humane CCD-1079Sk ćelije kao hraniteljske ćelije, centrifugirane na 4 °C i uskladištene odmah na -80 °C.
Ekstrakcija RNK, sinteza cDNA zasnovana na SMART i nespecifična amplifikacija iz sortiranih ćelija
[0378] RNK iz sortiranih T ćelija je ekstrahovana sa RNeasy Micro kompletom (Qiagen, Hilden, Nemačka) u skladu sa uputstvima dobavljača. Za sintezu cDNA upotrebljen je protokol za menjanje templata: Mint reverzna transkriptaza (Evrogen JSC) je kombinovana sa oligo(dT)-T-primer long za prajmovanje reakcije sinteze prvog lanca i TS-short (Eurofins Genomic) introdukovanjem oligo(riboG) sekvence kako bi se omogućilo stvaranje izduženog templata pomoću aktivnosti terminusne transferaze reverzne transkriptaze i za menjanje templata (Matz, M. et al. (1999) Nucleic Acids Res. 27, 1558-1560). Prvi lanac cDNA sintetisan u skladu sa uputstvima proizvođača podvrgnut je 21 ciklusu amplifikacije sa 5 U PfuUltra Hotstart High-Fidelity DNK polimeraze (Agilent Technologies) i 0,48 μM prajmera TS-PCR prajmera u prisustvu 200 μM dNTP (uslovi ciklusa: 2 min na 95 °C za, 30 s na 94 °C, 30 s na 65 °C, 1 min na 72 °C za, krajnje izduživanje od 6 minuta na 72 °C). Uspešna amplifikacija TCR gena je kontrolisana pomoću prajmera specifičnih za konstantni region murinskog TCR-β i zatim su murinski Vα-/Vβ-PCR specifične za klonotip izvedene samo ukoliko su detektovane jake trake.
Dizajn PCR prajmera za TCR amplifikaciju
[0379] Za dizajn murinskih TCR konsenzus prajmera, svi funkcionalni murinski TCR-Vβ i -Vα geni koji su navedeni u ImMunoGeneTics (IMGT) bazi podataka (http://www.imgt.org) zajedno sa njihovim odgovarajućim lider sekvencama poravnati su sa BioEdit Sequence Alignment Editor (npr. http://www.bio-soft.net). Forvard prajmeri dužine od 24 do 27 bp sa maksimalno 3 degenerisane baze, GC-sadržajem između 40-60% i G ili C na 3' kraju dizajnirani su da se vežu sa što je moguće više lider sekvenci i opremljeni su sa 5' ekstenzijom od 15 bp koja ima retko mesto restrikcionog enzima i Kozak sekvencu. Reverzni prajmeri su dizajnirani da se vežu sa prvim egzonima gena konstantnog regiona, pri čemu se prajmer mTRACex1_as vezuje za sekvence koje odgovaraju amino-kiselinama 24 do 31 Ca i mTRBCex1_as za amino-kiseline (aa) 8 do 15 u Cβ1 i Cβ2. Oba oligonukleotida su sintetisana sa 5' fosfatom. Prajmeri su spojeni u pulove od 2-6 forvard oliga sa identičnom temperaturom vezivanja.
PCR amplifikacija i kloniranje V(D)J sekvenci
[0380] 6 μl preamplifikovane cDNA iz izolovanih T ćelija podvrgnuto je ciklusima PCR (40 ciklusa) u prisustvu 0,6 μM mVα-/mVβ-specifičnog oligo pula, 0,6 μM mCα- ili mCβ-oligo, 200 μM dNTP i 5 U PfuULTRA II Fusion HS DNK polimeraze (Agilent; uslovi ciklusa: 1 min na 95 °C, 30 s na 94 °C, 30 s temperatura vezivanja, 30 s na 72 °C, krajnje vreme
4
izduživanja od 3 min na 72 °C). PCR proizvodi su analizirani upotrebom Qiagen sistema kapilarne elektroforeze. Uzorci sa trakama na 470-550 bp su frakcionisani po veličini na agaroznim gelovima, trake su izrezane i prečišćene upotrebom kompleta za ekstrakciju gela (Qiagen, Hilden, Nemačka). Analiza sekvence je izvršena kako bi se otkrila sekvenca i V(D)J domena i β konstantnog regiona, pošto se mTRBCex1_as i mTRBCex1_as prajmer, respektivno, poklapaju sa oba gena TCR konstantnog regiona Cβ1 i Cβ2 kod miša. DNK je digestirana i klonirana u IVT vektore koji sadrže odgovarajuću okosnicu za kompletan murinski TCR-α/β lanac.
Analize protočnom citometrijom
[0381] Ekspresija na ćelijskoj površini transfektovanih TCR gena analizirana je pomoću protočne citometrije upotrebom fluorohrom-konjugovanih anti-TCR antitela prema odgovarajućoj porodici varijabilnih regiona ili konstantnom regionu TCR β lanca (Beckman Coulter Inc., Fullerton, SAD) u kombinaciji sa antitelima usmerenim prema CD3, CD8 ili CD4 (BD Biosciences). Ekspresija na ćelijskoj površini transfektovanih CAR analizirana je upotrebom fluorohrom-konjugovanih idiotip-specifičnih antitela (Ganymed Pharmaceuticals) koja prepoznaju scFv fragmente sadržane u respektivnom CAR konstruktu. Analiza protočnom citometrijom je izvedena na FACS CANTO II protočnom citometru upotrebom FACS Diva softvera (BD Biosciences).
Test citotoksičnosti sa luciferazom
[0382] Za procenu citotoksičnosti posredovane ćelijama upotrebljen je test zasnovan na bioluminescenci kao alternativa i optimizacija oslobađanja<51>Cr. Za razliku od standardnog testa oslobađanja hroma, ovaj test meri litičku aktivnost efektorskih ćelija tako što se izračunava broj vijabilnih ciljnih ćelija koje eksprimiraju luciferazu nakon koinkubacije. Ciljne ćelije su stabilno ili prolazno transfektovane sa genom za luciferazu koji kodira za luciferazu svica iz svica Photinus pyralis (EC 1.13.12.7). Luciferaza je enzim koji katalizuje oksidaciju luciferina. Reakcija je ATP-zavisna i odvija se u dva koraka:
luciferin ATP → luciferil adenilat PPi
luciferil adenilat O2→ oksiluciferin AMP svetlost
[0383] Ciljne ćelije su zasejane pri koncentraciji od 10<4>ćelija po bunariću u bele ploče sa 96 bunarića (Nunc, Wiesbaden, Nemačka) i kokultivisane su sa različitim brojem T ćelija transfektovanih sa TCR u krajnjoj zapremini od 100 μl. 3 h kasnije ćelijama je dodato 50 μl D-luciferina (BD Biosciences) koji sadrži reakcionu smešu (luciferin (1 μg/μl), HEPES-pufer (50 mM, pH), adenozin 5'-trifosfataza (ATPaza, 0,4 mU/μl, Sigma-Aldrich, St. Louis, SAD). Dodavanjem ATPaze u reakcionu smešu smanjena je luminescenca koja je rezultat luciferaze oslobođene iz mrtvih ćelija.
[0384] Posle ukupnog vremena inkubacije od 4 h, bioluminescenca koju emituju vijabilne ćelije izmerena je upotrebom čitača Tecan Infinite 200 (Tecan, Crailsheim, Nemačka). Aktivnost ubijanja ćelija izračunata je u odnosu na vrednosti luminescence dobijene posle potpune ćelijske lize indukovane dodavanjem 2% Triton-X 100 i u odnosu na luminescencu koju emituju same ciljne ćelije. Izlazni podaci su u brojevima po sekundi (CPS) i procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:
[0385] Maksimalna luminescenca (maksimalni broj po sekundi, CPSmax) je procenjena posle inkubiranja ciljnih ćelija bez efektora i minimalna luminescenca (CPSmin) je procenjena posle tretmana ciljeva deterdžentom Triton-X-100 za potpunu lizu.
ELISPOT (enzimski immunoSPOT test)
[0386] Mikrotitarske ploče (Millipore, Bedford, MA, SAD) su obložene preko noći na sobnoj temperaturi bilo sa anti-humanim IFNγ antitelom 1-Dlk (Mabtech, Stockholm, Švedska) ili preko noći na 4 °C sa anti-murinskim IFNγ antitelom AN18 (Mabtech) i blokirane sa 2% humanim albuminom (CSL Behring, Marburg, Nemačka) ili sa murinskim medijumom za kulturu. U murinskoj postavci, 5 x 10<5>ćelija slezine je raspoređeno po bunariću, dok je u humanoj postavci 2-5 x 10<4>/bunariću antigen-prezentujućih stimulatorskih ćelija zasejano u triplikatima zajedno sa 0,3-3 x 10<5>/bunariću TCR-transfektovanih CD4+ ili CD8+ efektorskih ćelija 24 h posle elektroporacije. Ploče su inkubirane preko noći (37 °C, 5% CO2), isprane sa PBS 0,05% Tween 20, i inkubirane tokom 2 sata sa anti-humanim IFNγ biotinilisanim mAb 7-B6-1 (Mabtech) ili anti-murinskim IFNγ biotinilisanim mAb R4-6A2 (Mabtech) pri krajnjoj koncentraciji od 1 μg/ml na 37 °C. Avidin-vezana peroksidaza rena H (Vectastain Elite Kit; Vector Laboratories, Burlingame, SAD) je dodata u bunariće, inkubirana tokom 1 sata na sobnoj temperaturi i razvijena sa 3-amino-9-etil karbazolom (Sigma, Deisenhofen, Nemačka).
Test proliferacije sa CFSE (karboksifluorescein sukcinimidil estar)
[0387] CD8<+>T ćelije su transfektovane sa CAR RNK i oko 20 h kasnije obeležene sa 0,8 μM CFSE. Obeležene T ćelije su isprane i kokultivisane sa RNK-transfektovanim autolognim iDC (odnos E:T = 10:1). Posle 4 dana kokulture ćelije su sakupljene i proliferacija je analizirana pomoću protočne citometrije na osnovu progresivnog prepolovljavanja fluorescence CFSE unutar ćerki ćelija nakon ćelijskih deoba.
Životinje
[0388] BALB/c miševi su kupljeni od Javier Labs. U eksperimentima su upotrebljavane životinje ujednačene starosti (8 nedelja) i pola (ženke). Kongenični BALB/c-Thy1.1 miševi su uzgajani u objektu za životinje BioNTech AG, Nemačka.
Retrovirusna genska manipulacija i priprema CAR T ćelija za adoptivni transfer T ćelija
[0389] Splenociti BALB/c-Thy1.1 miševa su izolovani i preaktivirani sa 2 μg/ml solubilnog anti-CD3 (eBioscience) i 1 μg/ml solubilnog anti-CD28 (Novus Biologicals) u prisustvu 5 ng/ml rh IL-7 i 10 ng/ml rh IL-15 (oba Miltenyi). 24 h i 48 h posle preaktivacije, T ćelije su retrovirusno (MLV-E) transdukovane sa tricistronskim vektorom koji kodira CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP upotrebom RetroNectin-tehnike (Takara). Transdukovane T ćelije su zatim umnožavane 3 dana u prisustvu 5 ng/ml rh IL-7 i 10 ng/ml rh IL-15 i zatim su očišćene fikolom sa Ficoll-Paque PREMIUM (1,084) pre adoptivnog transfera u miševe.
Eksperimenti sa miševima
[0390] 5 x 10<6>CLDN18.2 CAR transdukovanih BALB/c-Thy1.1<+>T ćelija su intravenski (i.v.) prenete u BALB/c miševe. Nakon toga, miševi su i.v. vakcinisani sa F12:RNK odnosom od 1,3:2 RNK(Lip)24 sata posle adoptivnog transfera T ćelija (ACT). Urađeno je bioluminescentno snimanje celog tela.
In vivo bioluminescentno snimanje (BLI)
[0391] Umnožavanje CLDN18.2-CAR-effLuc-GFP transdukovanih T ćelija procenjeno je pomoću in vivo bioluminescentnog snimanja upotrebom IVIS Lumina sistema za snimanje (Caliper Life Sciences). Ukratko, 5 min posle injekcije vodenog rastvora D-luciferina (80 mg/kg telesne težine; Perkin Elmer), emitovani fotoni su kvantifikovani (vreme integracije od 1 min). Intenzitet prenesene svetlosti koja potiče od ćelija koje eksprimiraju luciferazu unutar životinje prikazan je kao slika u nijansama sive, gde je crna boja najmanje intenzivan i bela do tamnosiva najintenzivniji signal bioluminescence. Referentne slike miševa u nijansama sive dobijene su pod slabim LED osvetljenjem. Slike su preklopljene upotrebom Living Image 4.0 softvera.
Primer 2: Izolovanje HLA-A∗02-ograničenih murinskih TCR sa visokim afinitetom specifičnih za klaudin-18.2
[0392] Potvrdili smo imunogeni potencijal CLDN18.2 kod A2/DR1 miševa ponavljanom intranodalnom imunizacijom sa IVT-RNK koja kodira aa 1-80 CLDN18.2. Humani CLDN18 gen ima dva alternativna prva egzona, što dovodi do dve izoforme proteina (CLDN18.1 i CLDN18.2) koje se razlikuju u N-terminusnih 69 amino-kiselina (Slika 4A). Pošto se CLDN18.1 takođe eksprimira u normalnim tkivima, naročito u plućima, upotrebili smo samo N-terminusni deo CLDN18.2 kako bi isključivo indukovali CLDN18.2-specifične T ćelijske reaktivnosti. Upotrebili smo ćelije slezine ovih miševa za izolovanje CLDN18.2-specifičnih T ćelija i naknadno kloniranje odgovarajućih TCR gena. Ćelije slezine imunizovanih miševa su analizirane na uspešnu indukciju CLDN18.2-specifičnih T ćelija i njihovu reaktivnost prema predviđenim HLA-A∗02 vezujućim CLDN18.2 peptidima ex vivo pomoću IFNγ-ELISPOT testa (Slika 5).
[0393] Značajne učestalosti CLDN18.2-specifičnih T ćelija mogle su biti indukovane kod sva tri miša pomoću RNK imunizacije, dok je T ćelijska reaktivnost bila fokusirana na dva CLDN18.2 peptida za koja je predviđeno da se vežu za HLA-A∗0201 (CLDN18.2-A2-5 i CLDN18.2-A2-6).
[0394] Za izolovanje CLDN18.2-specifičnih T ćelija, ćelije slezine imunizovanih miševa su restimulisane in vitro i pojedinačne ćelije su izolovane pomoću protočne citometrije na osnovu aktivacijom-indukovane povećane ekspresije CD137 (Slika 6).
[0395] CLDN18.2-specifične CD8+ T ćelije su mogle biti izdvojene iz sva tri imunizovana A2/DR1 miša i ukupno 6 CLDN18.2-specifičnih TCR je klonirano iz pojedinačno sortiranih murinskih T ćelija.
[0396] TCR su podvrgnuti testovima imunske validacije, koji su otkrili da svih šest CLDN18.2-TCR prepoznaje jedan ili oba od dva HLA-A∗0201-ograničena epitopa CLDN18.2 aa 7-15 (CLDN18.2-A2-5) i CLDN18.2 aa 8-16 (CLDN18.2-A2-6), koji su prethodno identifikovani pomoću ex vivo ELISPOT analize (Slika 7).
Primer 3: Generisanje i in vitro validacija klaudin-18.2-specifičnog CAR
[0397] Generisali smo drugu generaciju CAR koji ciljno deluje na CLDN18.2 koji sadrži signalne i kostimulatorne funkcionalne grupe CD3ζ i CD28, respektivno. Delecija lck vezujuće funkcionalne grupe u CD28 endodomenu poništava IL2 sekreciju nakon angažovanja CAR kako bi se sprečila indukcija regulatornih T ćelija (Kofler D.M. et al., (2011) Molecular Therapy 19 (4), 760-767). Modifikacija IgG1 Fc 'spejser' domena u vanćelijskoj funkcionalnoj grupi CAR izbegava aktivaciju 'van cilja' i nenamernu inicijaciju urođenog imunskog odgovora (Hombach A. et al., (2010) Gene Therapy 17, 1206-1213).
[0398] Kako bi se analizirala specifična liza CLDN18.2-eksprimirajućih ciljnih ćelija pomoću CLDN18.2-CAR T ćelija, izveden je test citotoksičnosti zasnovan na luciferazi. CD8+ T ćelije su preaktivirane i transfektovane sa IVT-RNK koja kodira bilo CLDN18.2-CAR ili CLDN6-specifični CAR kao kontrolu. Površinska ekspresija CAR je potvrđena posle bojenja antitelima konjugovanim sa fluorohromom pomoću protočne citometrije (Slika 8). Oba CAR su bila dobro eksprimirana na površini CD8+ T ćelija. CAR-transfektovane T ćelije su kultivisane sa autolognim iDC transfektovanim bilo sa CLDN18.2- ili CLDN6-RNK upotrebom različitih odnosa efektora i cilja i specifična liza je izračunata posle 4 h kokulture (Slika 9). I CLDN18.2-CAR i CLDN6-CAR su posredovali u specifičnoj lizi iDC koje eksprimiraju CLDN18.2 i CLDN6, respektivno. Liza se nije mogla uočiti kada su iDC eksprimirale odgovarajući kontrolni antigen.
[0399] Kako bi se analiziralo da li CLDN18.2-CAR-posredovana liza CLDN18.2-eksprimirajućih ciljnih ćelija može biti inhibirana dodavanjem antitela specifičnog za idiotip, CAR T ćelije su preinkubirane sa ili bez antitela koje se specifično vezuje za scFv fragment sadržan u CLDN18.2-CAR pre nego što je započeta kokultura sa ciljnim ćelijama i liza je analizirana upotrebom testa citotoksičnosti zasnovanog na luciferazi (Slika 10).
[0400] CLDN18.2-CAR-posredovana liza CLDN18.2-eksprimirajućih ciljnih ćelija mogla bi se efikasno inhibirati čak i sa visokim E:T odnosom od 30:1 blokiranjem vezivanja CLDN18.2-CAR za njegov ciljni antigen. Nije se mogla uočiti inhibicija CLDN6-CAR posredovane lize, što potvrđuje selektivno vezivanje antitela za CLDN18.2-CAR. Ovaj eksperiment je s jedne strane potvrdio da CLDN18.2-CAR-posredovana liza isključivo zavisi od CLDN18.2 specifičnosti CAR i sa druge strane da se antitelo specifično za idiotip koje se upotrebljava za detekciju CLDN18.2-CAR može u principu takođe primeniti za inhibiciju CLDN18.2-CAR T ćelija in vivo u slučaju ozbiljnog neželjenog događaja.
[0401] Suštinski preduslov za antitumorsku efikasnost CAR-projektovanih T ćelija je njihova sposobnost da proliferišu i opstaju u pacijentu. Kako bi se analiziralo da li CLDN18.2-CAR T ćelije efikasno proliferišu kao odgovor na CLDN18.2 ektopično eksprimiran u iDC, izveden je test in vitro kokulture zasnovan na karboksifluorescein sukcinimidil estru (CFSE). CD8<+>T ćelije transfektovane sa IVT-RNK koja kodira CLDN18.2-CAR obeležene su sa CFSE i kokultivisane sa autolognim iDC transfektovanim sa IVT-RNK koja kodira bilo CLDN18.2 ili kontrolne antigene CLDN9 ili CLDN6. Površinska ekspresija CAR je analizirana pomoću protočne citometrije upotrebom fluorohrom-kuplovanog anti-idiotip-specifičnog antitela (Slika 11A). Posle četiri dana kokulture, antigen-specifična proliferacija CFSE-obeleženih CAR-transfektovanih CD8<+>T ćelija je analizirana pomoću protočne citometrije. Mogla se uočiti CLDN18.2-CAR posredovana proliferacija od oko 86% CD8<+>T ćelija kao odgovor na CLDN18.2, a samo pozadinska proliferacija CAR T ćelija kao odgovor na iDC transfektovane sa kontrolnim antigenom (CLDN9, CLDN6) (Slika 11B). Ovi podaci potvrđuju da se efikasna antigen-specifična aktivacija i umnožavanje CLDN18.2-CAR T ćelija može postići ektopičnom CLDN18.2 ekspresijom u humanim iDC.
[0402] Potentnost CLDN18.2-CAR da posreduju u antigen-specifičnoj aktivaciji i umnožavanju T ćelija koje nose CAR in vivo ispitana je u singenom mišjem modelu. Kako bi se pratila sudbina adoptivno transferisanih CAR-T ćelija in vivo, upotrebljen je tricistronski retrovirusni vektor koji kodira luciferazu (effLuc) i eGFP reporterske gene nizvodno od CLDN18.2-CAR odvojene virusnim T2A sekvencama.
[0403] Naivni BALB/c miševi su graftovani sa CLDN18.2-CAR transdukovanim murinskim T ćelijama. Na dan transfera, ekspresija CLDN18.2-CAR na transdukovanim T ćelijama je procenjena pomoću protočne citometrije upotrebom fluorohrom-kuplovanog anti-idiotipspecifičnog antitela u kombinaciji sa ekspresijom eGFP reportera. CLDN18.2-CAR je bio visoko eksprimiran u oko 36% CD8<+>i u oko 45% CD4<+>T ćelija (Slika 12A). Graftovani miševi su zatim tretirani sa IVT-RNK koja kodira bilo CLDN18.2 ili kontrolni (Kont) antigen. Snažno povećanje emisije svetlosti moglo se uočiti u CLDN18.2 RNK u poređenju sa miševima tretiranim sa kontrolnom RNK dva dana posle vakcinacije sa iRNK što ukazuje na značajnu aktivaciju i proliferaciju CLDN18.2-CAR T ćelija kao odgovor na srodni antigen (Slika 12B). Ovi podaci su jasno pokazali funkcionalnost i antigen specifičnost CLDN18.2 CAR u T ćelijama in vivo.
1
>Alfa V12D.1 J33 C (MN nedostaje N-terminal; V→G i S→C)
mTCRCD8-CL18#4
[0406]
>Alfa V6D.7 ∗04 J26 C (S→F)
mTCRCD8-CL18#5
2
>Alfa V6D.7∗04 J47 C (N→D i S→F)
mTCRCD8-CL18#8
[0408]
>Alfa V8D.2∗02 ili V8N.2 J31 C
mTCRCD8-CL18#9
[0409]
>Alfa V9N.3 J21 C (P→S)
mTCRCD8-CL18#12
[0410]
>Alfa V6.3∗02 ili V6D.3 J26 C (N→T)
>Beta V2 D2 J2.7 C2 (CASSPDWGAEYEQYF)
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
11
11
11
11
11
11
11
12
12
12
12
12
12
12
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
14

Claims (15)

Patentni zahtevi
1. Himerni antigenski receptor (CAR) koji sadrži vezujući domen za klaudin-18.2 (CLDN18.2), transmembranski domen, kostimulacioni domen i signalni domen, naznačeno time što vezujući domen za CLDN18.2 sadrži
(a) varijabilni region teškog lanca antitela (VH) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 23 ili VH koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog VH, pri čemu se navedeni CDR1, CDR2 i CDR3 sastoje od amino-kiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID NO: 42, 43 i 44;
i
(b) varijabilni region lakog lanca antitela (VL) koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 30 ili VL koji sadrži CDR1, CDR2 i CDR3 navedenog VL, pri čemu se navedeni CDR1, CDR2 i CDR3 sastoje od amino-kiselinske sekvence predstavljene pomoću SEQ ID NO: 45, 46 i 47.
2. Himerni antigenski receptor prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što je kostimulacioni domen kostimulacioni domen odabran iz grupe koja se sastoji od CD28, CD134 (OX40), CD137 (4-1BB), CD278 (ICOS).
3. Himerni antigenski receptor prema patentnom zahtevu 2, naznačeno time što je kostimulacioni domen onaj od (i) CD28 i CD137 (4-1BB) ili (ii) CD28 i CD134 (OX40).
4. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 3, naznačeno time što je signalni domen onaj od CD3-zeta ili Fc receptora gama, poželjno signalni domen koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 40.
5. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 4, naznačeno time što sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 39 ili njenim fragmentom.
6. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5, naznačeno time što su navedeni VH i VL aranžirani u jednolančani FV i pri čemu himerni antigenski receptor sadrži CD3-zeta transmembranski i endodomen.
7. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 6, naznačeno time što sadrži signalni peptid, poželjno koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 37.
8. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 5 i 7, naznačeno time što je transmembranski domen onaj od CD28.
9. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 8, naznačeno time što su VH i VL spojeni putem peptidnog linkera, poželjno peptidnog linkera koji sadrži amino-kiselinsku sekvencu (GGGGS)3.
10. Himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 9, naznačeno time što sadrži spejser region koji povezuje vezujući domen za CLDN18.2 za transmembranski domen.
11. Himerni antigenski receptor prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što sadrži amino-kiselinsku sekvencu predstavljenu pomoću SEQ ID NO: 41.
12. Nukleinska kiselina koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja kodira himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11, naznačeno time što je nukleinska kiselina RNK ili DNK, poželjno iRNK ili samoreplicirajuća RNK.
13. Vektor naznačen time što sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12.
14. Vektor prema patentnom zahtevu 13, koji je virusni vektor ili vektor zasnovan na virusu, poželjno γ-retrovirusni vektor, lentivirusni vektor ili adenovirusni vektor.
15. Ćelija naznačena time što sadrži nukleinsku kiselinu prema patentnom zahtevu 12 ili eksprimira himerni antigenski receptor prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 11.
14
RS20220633A 2015-05-11 2016-05-09 Klaudin-18.2-specifični imunoreceptori i t ćelijski epitopi RS63380B1 (sr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/EP2015/060357 WO2016180468A1 (en) 2015-05-11 2015-05-11 Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
EP20193185.4A EP3795177B1 (en) 2015-05-11 2016-05-09 Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63380B1 true RS63380B1 (sr) 2022-08-31

Family

ID=53181285

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220633A RS63380B1 (sr) 2015-05-11 2016-05-09 Klaudin-18.2-specifični imunoreceptori i t ćelijski epitopi

Country Status (21)

Country Link
US (2) US11713346B2 (sr)
EP (3) EP3294333B9 (sr)
JP (3) JP6942059B2 (sr)
KR (2) KR102409948B1 (sr)
CN (2) CN107960056B (sr)
AU (2) AU2016259730B2 (sr)
CA (1) CA2982422C (sr)
CY (1) CY1125347T1 (sr)
DK (2) DK3294333T5 (sr)
ES (2) ES2921801T3 (sr)
FI (1) FI3294333T4 (sr)
HR (1) HRP20220799T1 (sr)
HU (2) HUE052961T2 (sr)
LT (1) LT3795177T (sr)
MX (2) MX389021B (sr)
PL (2) PL3294333T5 (sr)
PT (2) PT3294333T (sr)
RS (1) RS63380B1 (sr)
SI (2) SI3795177T1 (sr)
SM (1) SMT202200282T1 (sr)
WO (2) WO2016180468A1 (sr)

Families Citing this family (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3099706B1 (en) * 2014-01-29 2018-10-31 BioNTech AG Peptide mimotopes of claudin 18.2 and uses thereof
CN120137055A (zh) 2014-07-17 2025-06-13 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016180468A1 (en) * 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
US20210122831A1 (en) * 2017-03-27 2021-04-29 Noile-Immune Biotech, Inc. Chimeric antigen receptor
CA3090791A1 (en) 2018-02-11 2019-08-15 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Non-hla restricted t cell receptors and uses thereof
JP7398380B2 (ja) 2018-03-08 2023-12-14 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗クローディン１８．２抗体及びその使用
CN111989344A (zh) * 2018-03-09 2020-11-24 科济生物医药（上海）有限公司 用于治疗肿瘤的方法和组合物
KR102340989B1 (ko) 2018-03-28 2021-12-20 에이비온 주식회사 클라우딘 3의 ecl-2에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 단편 및 이들의 용도
CN111867630B (zh) * 2018-06-17 2023-10-13 上海健信生物医药科技有限公司 靶向cldn18.2的抗体、双特异性抗体、adc和car及其应用
CN112770723B (zh) * 2018-07-25 2024-08-02 阿克罗斯生物科学公司 Cldn 18.2特异性单克隆抗体及其使用方法
WO2020038404A1 (zh) * 2018-08-22 2020-02-27 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
CN110857322A (zh) 2018-08-22 2020-03-03 瑞阳(苏州)生物科技有限公司 抗人claudin 18.2单克隆抗体及其应用
EP3878863A4 (en) * 2018-08-27 2022-06-22 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. ANTI-CLAUDIN18.2 ANTIBODIES AND ITS USE
MX2021002317A (es) * 2018-08-31 2021-07-15 Invectys SA Metodo para evaluar la funcionalidad del car.
BR112021007690A2 (pt) * 2018-10-22 2021-08-10 Shanghai GenBase Biotechnology Co., Ltd. anticorpo anti-cldn18.2 e uso do mesmo
TW202029971A (zh) * 2018-10-24 2020-08-16 美國衛生與公眾服務部 針對突變ras之hla-a3–限制性t細胞受體
CN113227146B (zh) * 2018-12-28 2024-03-01 南京金斯瑞生物科技有限公司 密蛋白18.2结合部分和其用途
KR20210126008A (ko) * 2019-01-07 2021-10-19 카르스젠 테라퓨틱스 컴퍼니, 리미티드 세포 면역 치료의 조합
CN114106183B (zh) 2019-01-15 2023-06-23 浙江道尔生物科技有限公司 抗cld18a2纳米抗体及其应用
CN109762067B (zh) * 2019-01-17 2020-02-28 北京天广实生物技术股份有限公司 结合人Claudin 18.2的抗体及其用途
US20220184126A1 (en) * 2019-03-29 2022-06-16 Phanes Therapeutis, Inc. Humanized anti-claudin 18.2 chimeric antigen receptors and uses thereof
EP3929214A4 (en) * 2019-05-30 2022-06-22 Shandong Boan Biotechnology Co., Ltd. ANTIBODY OR CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR DIRECTED AGAINST CLAUDIN 18.2
CN114026125B (zh) * 2019-07-12 2022-09-20 明济生物制药（北京）有限公司 Cldn18.2抗体及其用途
PE20211147A1 (es) 2019-08-12 2021-06-28 I Mab Biopharma Us Ltd Anticuerpos anti-claudina 18.2 y anti-4-1bb biespecificos y su uso
WO2021032157A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Mabspace Biosciences (Suzhou) Co., Limited Novel anti-cldn18.2 antibodies
CN114981303B (zh) * 2019-09-13 2024-01-23 安徽俊义医疗管理咨询有限公司 人源化抗Claudin18.2（CLDN18.2）抗体
JP2023527937A (ja) * 2020-05-25 2023-06-30 スーチョウ・トランスセンタ・セラピューティクス・カンパニー・リミテッド 抗ｃｌｄｎ１８．２抗体及びその診断用途
CN113754778A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 上海交通大学 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体及其用途
CN114222761B (zh) * 2020-07-14 2024-02-20 浙江道尔生物科技有限公司 一种抗cld18a2的单域抗体
CA3173810A1 (en) * 2021-06-01 2022-12-01 Andreas Bader Claudin 18.2 t cell-antigen couplers and uses thereof
CR20240124A (es) 2021-08-09 2024-08-06 Harbour Biomed Shanghai Co Ltd Anticuerpo dirigido contra cldn18.2, anticuerpo biespecífico y el uso de estos
KR102809807B1 (ko) * 2021-12-21 2025-05-16 한림대학교 산학협력단 항-cldn18.2를 포함하는 키메릭 항원 수용체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 이의 제조 방법
CN117229398A (zh) * 2022-06-15 2023-12-15 中山康方生物医药有限公司 抗cldn18.2抗体、其药物组合物及用途
US20240228610A9 (en) * 2022-10-10 2024-07-11 Medimmune, Llc Compositions and methods of treating cancer with chimeric antigen receptors targeting claudin 18.2
TW202421667A (zh) 2022-11-29 2024-06-01 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 Ｃｌｄｎ１８．２／４－１ｂｂ結合蛋白及其醫藥用途
CN116751302B (zh) * 2023-08-03 2023-11-10 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 靶向Claudin18.2的抗体、衍生产品及其在肿瘤治疗中的应用
WO2025059162A1 (en) 2023-09-11 2025-03-20 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Car-engager containing il-2 variants to enhance the functionality of car t cells

Family Cites Families (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5677139A (en) 1995-04-21 1997-10-14 President And Fellows Of Harvard College In vitro differentiation of CD34+ progenitor cells into T lymphocytes
JP2002515734A (ja) 1996-01-02 2002-05-28 カイロン コーポレイション 遺伝子改変された樹状細胞により媒介される免疫刺激
US20030133939A1 (en) 2001-01-17 2003-07-17 Genecraft, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
US7754208B2 (en) 2001-01-17 2010-07-13 Trubion Pharmaceuticals, Inc. Binding domain-immunoglobulin fusion proteins
DE102004024617A1 (de) * 2004-05-18 2005-12-29 Ganymed Pharmaceuticals Ag Differentiell in Tumoren exprimierte Genprodukte und deren Verwendung
JP5139800B2 (ja) * 2004-06-03 2013-02-06 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３抗体およびその使用方法
EP1790664A1 (en) * 2005-11-24 2007-05-30 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against claudin-18 for treatment of cancer
WO2008146672A1 (ja) 2007-05-23 2008-12-04 Mitsubishi Electric Corporation 遮光検知システム
EP1997832A1 (en) * 2007-05-29 2008-12-03 Ganymed Pharmaceuticals AG Monoclonal antibodies against Claudin-18 for treatment of cancer
EP2547695B1 (en) * 2010-03-16 2018-05-09 Biontech Protein Therapeutics GmbH Tumor vaccination involving a humoral immune response against self-protein cldn18.2
ES2635335T3 (es) * 2010-09-20 2017-10-03 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Receptores de células T específicos de antígeno y epítopos de células T
WO2013051718A1 (ja) 2011-10-07 2013-04-11 国立大学法人三重大学 キメラ抗原受容体
WO2013167153A1 (en) * 2012-05-09 2013-11-14 Ganymed Pharmaceuticals Ag Antibodies useful in cancer diagnosis
WO2013174403A1 (en) * 2012-05-23 2013-11-28 Ganymed Pharmaceuticals Ag Combination therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
WO2014075788A1 (en) 2012-11-13 2014-05-22 Biontech Ag Agents for treatment of claudin expressing cancer diseases
WO2014146672A1 (en) * 2013-03-18 2014-09-25 Ganymed Pharmaceuticals Ag Therapy involving antibodies against claudin 18.2 for treatment of cancer
CN105940102B (zh) * 2013-08-26 2020-02-18 海瑞克·亚柏坎 抗cd30嵌合抗原受体及其用途
EP3099706B1 (en) * 2014-01-29 2018-10-31 BioNTech AG Peptide mimotopes of claudin 18.2 and uses thereof
SI3126381T2 (sl) * 2014-04-01 2022-05-31 Biontech Cell&Gene Therapies Gmbh Claudin-6-specifični imunoreceptorji in t-celični epitopi
CN120137055A (zh) * 2014-07-17 2025-06-13 恺兴生命科技(上海)有限公司 靶向cld18a2的t淋巴细胞及其制备方法和应用
WO2016123143A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 The University Of Chicago CAR T-CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Rα2
WO2016180468A1 (en) 2015-05-11 2016-11-17 Biontech Cell & Gene Therapies Gmbh Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes

Also Published As

Publication number Publication date
ES2921801T3 (es) 2022-08-31
JP7194230B2 (ja) 2022-12-21
EP3795177A1 (en) 2021-03-24
HRP20220799T1 (hr) 2022-10-14
JP2018524273A (ja) 2018-08-30
PT3294333T (pt) 2020-11-25
NZ735850A (en) 2022-03-25
EP3294333B1 (en) 2020-09-02
PL3294333T3 (pl) 2021-03-08
CN115109141B (zh) 2026-01-02
HK1247815A1 (zh) 2018-10-05
EP3294333B9 (en) 2025-07-09
CY1125347T1 (el) 2025-05-09
JP7562623B2 (ja) 2024-10-07
BR112017020894A2 (pt) 2018-07-10
EP3795177B1 (en) 2022-04-13
US20230303656A1 (en) 2023-09-28
AU2016259730A1 (en) 2017-10-19
DK3294333T5 (da) 2025-09-08
EP3294333B2 (en) 2025-03-19
JP2023039980A (ja) 2023-03-22
DK3294333T4 (da) 2025-06-16
DK3795177T3 (da) 2022-07-04
JP2021153589A (ja) 2021-10-07
CA2982422A1 (en) 2016-11-17
ES2835269T9 (en) 2025-09-03
SI3795177T1 (sl) 2022-08-31
KR20170140266A (ko) 2017-12-20
AU2020257113A1 (en) 2020-11-19
CN107960056A (zh) 2018-04-24
EP4082565A1 (en) 2022-11-02
KR102703764B1 (ko) 2024-09-06
EP3294333A1 (en) 2018-03-21
FI3294333T4 (fi) 2025-07-02
US20180282389A1 (en) 2018-10-04
WO2016180782A1 (en) 2016-11-17
CN115109141A (zh) 2022-09-27
PL3294333T5 (pl) 2025-07-28
AU2020257113B2 (en) 2022-12-01
AU2016259730A8 (en) 2017-11-02
SI3294333T2 (sl) 2025-08-29
PL3795177T3 (pl) 2022-08-08
MX389021B (es) 2025-03-20
US11713346B2 (en) 2023-08-01
LT3795177T (lt) 2022-08-10
CN107960056B (zh) 2022-07-12
HUE059282T2 (hu) 2022-11-28
JP6942059B2 (ja) 2021-09-29
HK1250331A1 (zh) 2018-12-14
SMT202200282T1 (it) 2022-09-14
PT3795177T (pt) 2022-07-12
DK3294333T3 (da) 2020-11-23
CA2982422C (en) 2023-11-28
KR20220084208A (ko) 2022-06-21
ES2835269T3 (es) 2021-06-22
MX2017014193A (es) 2018-03-28
HUE052961T2 (hu) 2021-06-28
AU2016259730B2 (en) 2020-11-05
KR102409948B1 (ko) 2022-06-21
MX2022000132A (es) 2022-02-16
ES2835269T5 (en) 2025-07-31
WO2016180468A1 (en) 2016-11-17
SI3294333T1 (sl) 2021-03-31
WO2016180782A8 (en) 2017-11-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7562623B2 (ja) クローディン－１８．２－特異的免疫受容体およびｔ細胞エピトープ
EP3514172B1 (en) Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40049189B (en) Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40049189A (en) Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40026429A (en) Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40026429B (en) Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40011474B (en) Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK40011474A (en) Claudin-6-specific immunoreceptors and t cell epitopes
HK1250331B (en) Claudin-18.2-specific immunoreceptors and t cell epitopes