RS63448B1 - Bakar-cink-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini, kompozicije, preparati, postupci i upotrebe - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE

Ovaj pronalazak se uopšteno odnosi na kompozicije sa antimikrobnom aktivnošću i, preciznije, na kompozicije koje kao aktivne sastojke sadrže bakar-cink-amonijum komplekse solubilizovane u kiselini.

OSNOV PRONALASKA

Još od antičkih vremena poznati su antimikrobni efekti bakra i soli bakra. Uloga bakra kao antimikrobnog sredstva prvi put je opisana u Smith-ovom papirusu, medicinskom tekstu iz starog Egipta, napisanom 2600 godina p.n.e. u kojem se opisuje primena bakra za sterilisanje rana na grudima i sterilisanje pijaće vode.

Grci, Rimljani i Asteci koristili su bakar ili njegova jedinjenja za lečenje hroničnih infekcija i za higijenu uopšte. Na primer, u Hipokratovoj zbirci, bakar se preporučuje za lečenje rana na nogama koje se javljaju kod varikoznih vena. Za sprečavanje infekcije svežih rana, Grci su rane posipali suvim praškom sačinjenim od bakar oksida i bakar sulfata. Još jedan način antiseptičkog tretiranja rana u to vreme bilo je kuvanje smeše meda i crvenog bakar oksida. Grci su lako dolazili do bakra s obzirom na to da je metal bio lako dostupan na ostrvu Kipar, po kojem je izvedeno latinsko ime bakra, cuprum.

U drevnoindijskom ajurvedskom tekstu Charaka Samhita (300 p.n.e) takođe se pominje da bakar ubija fatalne mikrobe, uključujući tu i njegovu ulogu u prečišćavanju vode za piće. Plinije (23. do 79. god. n.e.) opisuje brojne lekove koji sadrže bakar, na primer, crni bakar oksid davan je sa medom za uklanjanje crevnih glista.

U savremenije doba, prvo zapažanje o ulozi bakra u imunskom sistemu bilo je objavljeno 1867. kada je saopšteno da su tokom epidemija kolere u Parizu 1832, 1849. i 1852. radnici koji su radili sa bakrom bili imuni na bolest. Pored toga, pokazano je da su životinje sa deficijencijom bakra bile podložnije bakterijskim patogenima kao što su salmonela i listerija.

Bakar sulfat je ključna aktivna komponenta fungicidne "smeše iz Bordoa" koja je pronađena u 19. veku i koja se i danas koristi u poljoprivredi, kao i brojnih drugih agrohemijskih sredstava na bazi bakra.

Patogeni mikrobi kao što su bakterije, gljive i virusi odgovorni su za mnoge bolesti višećelijskih organizama, kao što je ilustrovano neograničavajućim primerima koji slede.

U oblasti farmacije, bakterijske infekcije uključene su u oboljenja kože kao što su akne (Propionibacterium acnes) i ekcemi (Staphylococcus aureus). Infekcije koje se dobijaju tokom primanja zdravstvene nege (healthcare-acquired infections, HAI) izazvane su meticilin-rezistentnim Staphylococcus aureus (meticillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA), Acinetobacter sp., Klebsiella pneumonia (kod koje je originalno identifikovan gen za NDM-1 enzim) i Legionella pneumophila koja je izazivač legionarske bolesti. Escherichia coli (E. coli), je čest izazivač infekcija urinarnog trakta. Procenjuje se da u SAD ove i druge HAI dovode do smrti gotovo 100 000 ljudi godišnje. Kada se patogena E. coli O157:H7 ingestira zajedno sa kontaminiranom hranom, izaziva gastroenteritis. Bolesti izazvane gljivama mogu biti relativno blage, na primer atletsko stopalo (Trichophyton sp.), perut (Malassezia globosa), i sor (Candida albicans), ali gljive kao što su Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) i Candida albicans (C. albicans) i kvasac kao što je Cryptococcus neoformans mogu kod imunokompromitovanih pacijenata izazvati infekcije opasne po život. Virusi su takođe odgovorni za uobičajene bolesti kao što su prehlada (rinovirusi) i grip (virus influence A, B i C) i herpes (Herpes simplex virus), ali i ozbiljna virusna oboljenja kao što su besnilo i ebola.

Bakterijske infekcije rana na koži, na primer dekubitusa i rana na nogama kod dijabetesa, mogu dovesti do pogoršanja stanja, a pokazano je da su soli bakra i kompozicije na bazi bakra efikasne protiv ovih oboljenja, i to zahvaljujući svojim antibakterijskim efektima i sposobnosti da podstiču zarastanje rana pojačavanjem proizvodnje faktora rasta.

U oblasti kozmetike, pokazano je da su kompozicije bakra ili bakra-cinka efikasne, na primer, u poboljšanju efekata blagih do umerenih opekotina od sunca i blagih opekotina, kao i u smanjenju svraba i zapaljenja izazvanih ujedima insekata, i smanjenju pojave bora.

U oblasti poljoprivrede, gljivična oboljenja su trenutno iznenadno sušenje hrasta tanoaka na zapadu Sjedinjenih Američkih Država (Phytophthora ramorum) i jasenovog drveta u Evropi (Chalara fraxinea). Gljivična i bakterijska oboljenja vinove loze, biljaka koje nose voće i povrće i žitarica, predstavljaju pretnju za proizvodnju hrane u svetu.

Postojanje sve većeg broja sojeva patogenih mikroba otpornih na lekove u bolnicama i u okruženju uopšte, postaje veliki problem što ilustruju i sledeći primeri. Patogeni bakterijski sojevi rezistentni na antibiotike i rezistentni na veći broj lekova, npr., MRSA, Staphylococcus aureus rezistentan na vankomicin (vancomycin-resistant Staphylococcus aureus, VRSA), Acinetobacter baumannii, E. coli i Mycobacterium tuberculosis, danas su opšte poznati.

Rezistentni sojevi patogenih gljiva, na primer C. albicans i A. fumigatus, rezistentni na ketokonazol, predstavljaju rastući problem naročito kod imunokompromitovanih pacijenata. Gljive patogene za biljke, rezistentne na fungicide, stalno se razvijaju i potrebna su nova antigljivična sredstva za njihovo suzbijanje. Na primer, Phytophthora infestans, izazivač plamenjače krompira, postala je krajem 20. veka visokorezistentna na metalaksil. Slično tome, patogeni virusi razvijaju rezistenciju na antivirusne lekove, noviji primer je razvoj rezistencije soja H1N1virusa influence A, koji izaziva "svinjski grip", na oseltamivir fosfat (TAMIFLU®, registrovani zaštitni znak Genentech, San Francisco, California, USA) u poslednjih pet godina.

Antimikrobne kompozicije i postupci za lečenje bolesti, na bazi aktivirane kompozicije koja sadrži bakar sulfat, cink sulfat, natrijum hlorid, i amonijum sulfat objavljeni su u WO2019/055799 i u US2008/0166424 A1.

OBJAVA PRONALASKA

U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđena je antimikrobna kompozicija prema patentnom zahtevu 1. Pogodni primeri izvođenja pronalaska opisani su u zavisnim patentnim zahtevima.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Pronalazak će biti opisan uz upućivanje na sledeće crteže, u kojima se slični brojevi odnose na slične elemente, i u kojima:

Slika 1 je grafikon koji prikazuje efekte bakar sulfata i kompozicije Cu#1 na rast bakterijskog soja S1 (S. aureus).

Slika 2 je grafikon koji prikazuje efekte cink sulfata samog i kombinovanog sa kompozicijom Cu#1 na rast bakterijskog soja S1 (S. aureus).

Slika 3 je grafikon sa stubićima koji prikazuje efekte gela, cink sulfata (100 µg/ml) samog i kompozicija Cu#9 ili Cu#10 (200 µg/ml) samih ili u kombinaciji sa cink sulfatom, na rast S1 (S. aureus).

Slika 4 je grafikon preživljavanja ćelija kože čoveka posle 24 h kultivisanja sa bakar sulfatom i kompozicijama Cu#9, Cu#10 i Cu-Zn#1: Gel Cu#9, Gel Cu-Zn#1, i

Slika 5 je grafikon preživljavanja ćelija kože čoveka posle 24 h kultivisanja sa Gel Cu#9, Gel Cu-Zn#1 i dva CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England), krem-proizvoda protiv akni, koja kao aktivna jedinjenja sadrže salicilnu kiselinu i benzoil peroksid.

Predmetni pronalazak biće opisan u vezi sa poželjnim primerom izvođenja, međutim, treba razumeti da ne postoji namera da se pronalazak ograniči na opisani primer izvođenja.

NAJBOLJI NAČIN IZVOĐENJA PRONALASKA

Predmetni pronalazak izložen je u priloženom setu patentnih zahteva. Predmetni pronalazak biće opisan putem primera, a ne ograničenja.

Posle čitanja ove publikacije i pregledanja priloženih crteža, ovde opisanom pronalasku mogu se odrediti modifikacije, poboljšanja i dodaci.

Izumitelj je iznenađujuće pronašao da su bakar-amonijum i bakar-cink-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini, opisani u ovom tekstu, korisni u borbi protiv specifičnih patogenih mikroba koji su, u slučaju određenih bakterija, rezistentni na antibiotike ili koji se, u slučaju određenih sojeva bakterija i gljiva, na drugi način teško tretiraju ili suzbijaju. Pored toga, izumitelj je iznenađujuće pronašao da ovi bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini mogu biti visokoefikasni protiv bakterija koje se teško leče, na primer MRSA i Acinetobacter baumannii, a da istovremeno u sličnim koncentracijama nisu toksični za ćelije kože čoveka u kulturi.

Zbog relativno malih količina bakra koje se mogu bezbedno ingestirati (ne više od 6 miligrama na dan za odrasle ljude) ili koje biljke i životinje mogu tolerisati u okruženju, i posebno u vodenoj sredini, bakar-amonijum ili bakar-cink-amonijum kompozicije solubilizovane u kiselini, opisane u ovom tekstu, namenjene su prvenstveno površinskoj upotrebi, na primer, nanošenju na kožu ili mukozne membrane životinja i ljudi, na listove biljaka, ili, na primer, na površine u okruženju kao što su domovi ili bolnice.

Izuzeci od površinske upotrebe su, na primer, (i) tretiranje vode kontaminirane jednom ili više vrsta mikroba, da bi mogla da postane pijaća voda, upotrebom u kiselini solubilizovanih bakar-amonijum ili u kiselini solubilizovanih bakar-cink-amonijum kompozicija, za uklanjanje ili ubijanje mikroba, ili (ii) dovođenje vode u stanje upotrebljivosti uklanjanjem ili ubijanjem mikroalgi ili bakterija koje kontaminiraju vodu u objektu kao što je bazen za plivanje ili kada za kupanje, dodavanjem jedne ili više ovde opisanih kompozicija bakra ili bakra-cinka solubilizovanih u kiselini.

Kompozicije bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini, opisane u ovom tekstu, mogu se naneti na površinu kože pacijenta da bi se prevenirala ili lečila, na primer, MRSA infekcija ili gljivična infekcija, kao što je infekcija C. albicans. Nanošenje se može izvršiti i prskanjem, na primer, na listove biljaka sa gljivičnom infekcijom kao što je pepelnica. Posle površinskog nanošenja, dezinfikujuća svojstva kompleksa jona bakra mogu ostati ispoljena tokom značajnog vremenskog perioda.

Bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini mogu se nanositi i na provršine, na primer, prskanjem ili pomoću tkanine i neočekivano mogu pokazati efikasnost protiv većeg broja različitih patogenih mikroba istovremeno, i mogu pružiti zaštitu od infekcije i reinfekcije takvim mikrobima. Posle površinskog nanošenja, dezinfikujuća svojstva kompleksa jona bakra mogu ostati ispoljena tokom značajnog vremenskog perioda.

Predmetni bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini i njima impregnirani supstrati mogu veoma efikasno inhibirati rast patogenih mikroba koji su do sada bili teški za suzbijanje konvencionalnim lekovima i/ili konvencionalnim dezinfekcionim režimima. Ova inhibicija rasta patogenih mikroba može se, iznenađujuće, postići koncentracijama koje nisu toksične za ćelije kože čoveka.

Bakar-amonijum kompozicije solubilizovane u kiselini mogu se spraviti u vidu površinskih formulacija, na primer kremova, gelova, rastvora za prskanje, rastvora za irigaciju i impregniranih gaza, namenjenih nanošenju na površinu kože i sluzokože, listove biljaka, i radne površine u domovima, bolnicama, fabrikama, vozilima, itd.

Bakar-amonijum i bakar-cink-amonijum kompozicije solubilizovane u kiselini konvencionalno se pripremaju u skladu sa opštom procedurom navedenom u nastavku ovog teksta. Ovde objavljeni primeri izvođenja predmetnog pronalaska dati su kao primer određenih poželjnih kompozicija, međutim, ovi primeri ne treba da ograničavaju obim pronalaska.

Referentni primer koji sledi opisuje opšti protokol za spravljanje formulacije Cu#3 bakar-amonijum kompleksa solubilizovanog u kiselini. Sve hemikalije nabavljene su od Sigma-Aldrich Company Ltd., The old Brickyard, New Road, Gillingham, Dorset SP84 XT, UK, ili Oxoid Ltd., Wade Road, Basingstoke, Hampshire RG248PW, UK.

U 80 mililitara destilovane vode u staklenoj čaši, doda se 16.0 grama bakar sulfat pentahidrata, uz snažno mešanje magnetom na magnetnoj mešalici, da se formira bistri plavi rastvor. U rastvor bakar sulfata doda se 4.0 grama amonijum karbonata u porcijama od po 0.5 do 1 grama, pri čemu dolazi do snažnog oslobađanja ugljen-dioksida, koje treba sačekati da se stiša pre dodavanja sledećeg alikvota amonijum karbonata. Tokom dodavanja amonijum karbonata u rastvor bakar sulfata formira se bledoplavi nesolubilni bakar-amonijum kompleks koji se održava u suspenziji snažnim mešanjem. Postepeno se dodaje 10.0 mililitara fosforne kiseline (85% rastvor) uz razvijanje ugljen-dioksida i solubilizaciju bakar-amonijum kompleksa. Mora se dodati dovoljno kiseline da se bakar-amonijum kompleks potpuno solubilizuje i da se kontroliše pH rastvora. Dobijeni bistri svetloplavi rastvor snažno se meša još 5 minuta i zatim se destilovanom vodom dopuni do konačne zapremine od 100 mililitara.

Poželjno je da koncentracija elementarnog bakra u kompozicijama bude reda 1 do 10 grama/decilitru, poželjno 3 do 7 grama/decilitru, poželjnije 3.5 do 5 grama/decilitru, pri čemu je rastvaračka faza predstavljena destilovanom ili dejonizovanom vodom.

Za primere drugih formulacija bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini na osnovu ovog protokola, vidi Tabelu 1 u nastavku, gram ili grami su označeni skraćenicom g, a mililitar ili mililitri skraćenicom ml.

Tabela 1. Referentni primeri kompozicija bakar-amonijum kompleksa solubilizovanog u kiselini (Cu#)

*Navedene količine daju stok-rastvor od približno 4.0 grama/decilitru ili

**3.75 grama/decilitru elementarnog bakra

Primer koji sledi opisuje opšti protokol za spravljanje bakar-cink-amonijum formulacije solubilizovane u kiselini, CuZn#10.

U 80 mililitara destilovane vode u staklenoj čaši, doda se 6.0 grama bakar sulfat pentahidrata, uz snažno mešanje magnetom na magnetnoj mešalici, da se formira bistri plavi rastvor. U rastvor bakar sulfata doda se 6.6 grama cink sulfata i meša se dok se ne rastvori. U rastvor bakar sulfata/cink sulfata u kapima se doda 2.0 mililitra amonijum hidroksida (10% rastvor). Tokom dodavanja rastvora amonijum hidroksida u rastvor bakar sulfata/cink sulfata formira se bledoplavi nerastvorljivi bakar-cink-amonijum kompleks koji se snažnim mešanjem održava u suspenziji. U alikvotima od približno 0.5 g postepeno se doda 4.0 grama fosforaste kiseline da bi se bakar-cink-amonijum kompleks solubilizovao. Potrebno je dodati dovoljno kiseline da se bakar-cink-amonijum kompleks potpuno rastvori i da se kontroliše pH rastvora. Dobijeni bistri, bledoplavi rastvor snažno se meša još 5 minuta i zatim se destilovanom vodom dopuni do finalne zapremine od 100 mililitara.

Poželjno je da koncentracija elementarnog bakra i cinka u kompozicijama bude reda 1:1 sa fazom rastvarača koji je predstavljen destilovanom ili dejonizovanom vodom.

Za druge bakar-cink-amonijum formulacije solubilizovane u kiselini na bazi ovog protokola, vidi Tabelu 2. U tabeli, gram ili grami označeni su skraćenicom g, a mililitri skraćenicom ml.

Tabela 2. Primeri bakar-cink kompozicija solubilizovanih u kiselini (CuZn#). Kompozicije Cu-Zn#2-5 su referentni primeri.

*Navedene količine proizvode stok-rastvor od približno 1.5 grama/decilitru i elementarnog bakra i elementarnog cinka.

Postupci za spravljanje gela na bazi aloje (Aloe vera, prava aloja) predmetnog pronalaska opisani su u ovom tekstu, zajedno sa primerima.

PRIMER 1. Sipati 1.0 gram ksantanove gume u 150 ml destilovane vode, na oko 60 °C u 300 ml-skoj laboratorijskoj čaši od borosilikatnog stakla i snažno mešati mutilicom 30 sekundi da se formira glatki penušavi rastvor. Sipati 1.0 gram praška aloje u rastvor ksantanove gume i ponovo snažno mutiti 30 sekundi ili dok se prašak aloje potpuno ne rastvori. Dodati destilovanu vodu sobne temperature do finalne zapremine od 200 mililitara. Uskladištiti gel na 4 °C i upotrebiti ga u roku od mesec dana. Ovaj gel se koristi za razblaživanje bakar i bakar/cink kompozicija u antibakterijskim testovima na agarnoj ploči. Ako gel treba koristiti u kozmetičke svrhe i/ili držati na sobnoj temperaturi, moraju se dodati antimikrobni prezervansi. Oni mogu uključivati, na primer, bademovu kiselinu, glicerol, kalijum sorbat, fenoksietanol, natrijum benzoat. Efikasna kombinacija je kalijum sorbat (potassium sorbate, KS) i natrijum benzoat (sodium benzoate, NaB). Pripremaju se zasebni stok-rastvori od 10% tež/zapr KS i NaB, i po 2.0 mililitra svakog proizvoda doda se u gore opisani rastvor ksantanove gume-aloje, uz snažno mešanje, a zatim se doda destilovana voda sobne temperature do finalne zapremine od 200 mililitara. Kompozicije bakar-amonijum ili bakarcink-amonijum kompleksa solubilizovanog u kiselini razblaže se u gelu, na primer, u razmeri 1:100 zapr/zapr.

PRIMER 2. U izmerenoj graduisanoj laboratorijskoj čaši umešati 3 grama ksantanove gume u alikvotima od ~1 grama, u 3.0 grama glicerola na sobnoj temperaturi (oko 20 °C) dok se ne formira glatka homogena pasta. Ponovo izmeriti laboratorijsku čašu i njen sadržaj. Postepeno dodati 5 grama smeše glicerol-ksantanova guma (u laboratorijskoj čaši treba da ostane 1 gram smeše) u 400 ml destilovane vode, na oko 60 °C, u 800-mililitarskoj laboratorijskoj čaši od borosilikatnog stakla, uz snažno mućenje dok se ne formira bistri, penušavi rastvor. Sipati 2.5 grama praška aloje u rastvor i nastaviti sa mućenjem dok se prašak aloje potpuno ne rastvori. Na ovom stupnju mogu se dodati antimikrobni prezervansi (npr. 5.0 mililitara 10% stokrastvora KS i NaB, kako je opisano gore), uz mućenje, pre dodavanja destilovane vode sobne temperature do finalne zapremine od 500 mililitara.

Da bi predmetni pronalazak mogao da se ilustruje i da bi stručnjaci u oblasti mogli lakše da ga procene i izvedu, njegovi primeri izvođenja će sada biti predstavljeni samo putem neograničavajućih primera i opisani uz upućivanje na priložene crteže.

PRIMER 1. Test antibakterijskog efekta odabranih kompozicija na bakterije na agarnoj ploči. Soj Staphylococcus aureus (S1) izolovan sa kože pacijenta sa ekcemom kultiviše se na tripton-soja agaru (tryptone-soya agar, TSA) i jedna kolonija se kultiviše u RPMI-1640 medijumu na 37 °C, preko noći. Kultura S1 (S. aureus) se razblaži u odnosu 1:10 svežim RPMI-1640 medijumom i 0.2 mililitra se razlije po Petrijevoj šolji prečnika 9 centimetara, koja sadrži TSA i ostavi se da se osuši. Propionibacterium acnes soj ATCC 11828 (P. acnes) kultiviše se u moždano-srčanom infuzionom bujonu sa 1% glukoze (brain-heart infusion broth, BHI) na 37 °C, tokom 72 h u anaerobnim uslovima uz korišćenje AnaeroGen kesice. Uzorak kulture P. acnes od 0.2 mililitra razlije se po Petrijevoj šolji prečnika 9 centimetara, koja sadrži BHI agar i ostavi se da se osuši.

Kompozicija koja će se testirati razblaži se destilovanom vodom i 5 mikrolitara se stavi na petomilimetarski filterpapirni disk ili se doda u gel na bazi aloje (bez prezervanasa) opisan ranije u ovom tekstu, u različitim koncentracijama, i kap od 5 mikrolitara stavi se na površinu agara. Ploče se zatim inkubiraju na 37 °C, 24 h (u anaerobnim uslovima za P. acnes), kada se zone inhibicije (zones of inhibition, ZoI) (u milimetrima) mere dva puta pod uglom od 90° uz korišćenje lenjira i izračunava se prosečni dijametar (D). Oblast inhibicije u mm<2>(area of inhibition, AoI) izračunava se korišćenjem formule AoI = π × (D/2)<2>.

Rezultati:

1. Rezultati na Slici 1 upoređuju efekte bakar sulfata i kompozicije Cu#1 rastvorene u gelu, na rast bakterijskog soja S1 (S. aureus), na TSA. Vidi se da je kompozicija Cu#1 približno 4 puta potentnija od bakar sulfata u inhibiranju rasta S1 (S. aureus) jer bakar sulfat u koncentraciji od 800 mikrograma/mililitru i kompozicija Cu#1 od 200 mikrograma/mililitru imaju istu AoI (28 mm<2>). Rezultati pokazuju da kompozicije bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini imaju iznenađujuće bolju antimikrobnu aktivnost nego sam bakar sulfat.

2. Rezultati na Slici 2 upoređuju efekte cink sulfata samog i u kombinaciji sa kompozicijom Cu#1 rastvorenom u gelu na rast bakterijskog soja S1 (S. aureus), na TSA. Cink sulfat sam nije uticao na rast S1 (S. aureus) ni u jednoj testiranoj koncentraciji (50-200 mikrograma/mililitru). Nasuprot tome, kada se kompozicija Cu#1 (100 mikrograma/mililitru)

1

kombinuje sa rastućim koncentracijama cink sulfata, postoji jasan sinergistički inhibirotorni efekat na rast S1 (S. aureus). Prema tome, kompozicija Cu#1 sama ima AoI od 3 mm<2>, ali se ona povećava na 13, 20 i 28 mm<2>posle kombinovanja sa cink sulfatom u koncentracijama od 50, 100, odnosno 200 mikrograma/mililitru. Ovi rezultati iznenađujuće pokazuju da antimikrobni bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini mogu delovati sinergistički sa cink sulfatom koji sam ne poseduje antimikrobnu aktivnost prema soju S1 (S. aureus). Ovi rezultati sugerišu da bakar-cink-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini mogu imati pogodnu antimikrobnu aktivnost protiv određenih organizama.

3. Slika 3 prikazuje efekat dveju kompozicija Cu#9 i Cu#10 (200 mikrograma/mililitru) u gelu, samih ili u kombinaciji sa cink sulfatom (100 mikrograma/mililitru) u gelu na rast S1 (S. aureus). Rezultati pokazuju da gel sam i cink sulfat u gelu ne utiču na rast S1 (S. aureus). Kompozicije Cu#9 i Cu#10 u gelu, same, inhibiraju rast S1 (S. aureus), uz AoI od 20, odnosno 33 mm<2>. Nasuprot tome, kada se kombinuju sa cink sulfatom u gelu, kompozicije Cu#9 i Cu#10 pokazuju porast inhibicije rasta S1 (S. aureus), uz AoI od 38, odnosno 57 mm<2>. Ovi rezultati potvrđuju i proširuju one koji su prikazani na Slici 2, ukazujući na postojanje jasnog sinergističkog inhibitornog efekta bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini i cink sulfata na rast soja S1 (S. aureus).

4. Tabela 3 prikazuje efekat bakar sulfata, pet različitih bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini i jednog bakar-cink-amonijum kompleksa solubilizovanog u kiselini, na rast P. acnes na BHI agaru, kako je opisano u odeljku postupaka, gore. Svi stokrastvori bakar-amonijum kompleksa solubilizovanih u kiselini bili su razblaženi 1:200 (zapr/zapr), a pripremljen je i rastvor bakar sulfata iste koncentracije elementarnog bakra (200 mikrograma/mililitru). Stok-rastvor kompozicije Cu-Zn#1 (vidi Tabelu 2) takođe se za testiranje razblaži 1:200. Sva razblaženja su u destilovanoj vodi.

Tabela 3. Efekat bakar sulfata i različitih kompozicija (opisanih u Tabelama 1 i 2) na rast P. acnes na BHI agaru. Nije bilo korelacije između antibakterijske aktivnosti i pH kompozicija.

Rezultati u Tabeli 3 pokazuju da su svi bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini imali veći inhibitorni efekat na rast P. acnes nego ekvivalentna koncentracija elementarnog bakra u vidu bakar sulfata. Iako su ZoI za pet testiranih Cu# kompozicija bile slične, formulacije kompozicija su se prilično razlikovale – kao što je prikazano u Tabeli 1. Cu#9 i Cu#13 imale su istu ZoI, ali su se razlikovale po kiselini upotrebljenoj za solubilizovanje bakar-amonijum kompleksa (fosforna, hlorovodonična, odnosno sumporna kiselina), a Cu#13 sadržala je bakar hlorid umesto bakar sulfata. Cu#12 (bakar sulfat i sumporna kiselina) imala je najveću ZoI prema P. acnes, ali se od Cu#13 razlikovala samo po soli bakra upotrebljenoj u kompoziciji (vidi Tabelu 1).

Pošto su bakar-amonijum i bakar-cink-amonijum kompozicije solubilizovane u kiselinama to bi moglo da sugeriše da je kiselost kompozicija odgovorna za njihovu veću antimikrobnu aktivnost u poređenju sa bakar sulfatom. Međutim, kako je pokazano u Tabeli 3, stok-rastvor Cu#10 ima viši pH nego ekvivalentni rastvor bakar sulfata, a i dalje ima veći inhibitorni efekat na rast P. acnes. Pored toga, neparametarski Spearman-ov test korelacije između ZoI i pH jedinjenja/kompozicija pokazanih u Tabeli 3 dao je koeficijent korelacije = -0.056 sa p = 0.81 (uz korišćenje Prism 6 statističkog paketa, Graph Pad softver, La Jolla, California) što pokazuje da za kompozicije upotrebljene u ovom eksperimentu nije bilo značajne korelacije između pH i antimikrobne aktivnosti.

Zanimljivo, kompozicija Cu-Zn#1 bila je jedna od kompozicija sa većom inhibitornom aktivnošću uprkos tome što je imala samo 37.5% elementarnog bakra Cu# kompozicija, ali zajedno sa ekvimolarnom koncentracijom elementarnog cinka (1.5 grama/decilitru u stok-rastvoru). Impresivna aktivnost Cu-Zn#1 podržava zaključke iz rezultata prikazanih na Slikama 2 i 3, da postoji sinergija između jona bakra i cinka i pokazuje da ovaj bakar-cink-amonijum kompleks solubilizovan u kiselini ispoljava inhibitorni efekat viši od očekivanog prema P. acnes. Ovi rezultati takođe sugerišu da kompozicija Cu-Zn#1 može biti terapijski vredna za lečenje akni, bolesti blisko povezane sa P. acnes. Pored toga, s obzirom na to da je poznato da P. acnes ne raste dobro na pH 4.5-5, što je raspon pH "normalne" kože, bakar-cink-amonijum kompleks Cu-Zn#1 solubilizovan u kiselini može biti terapijsku vredan u lečenju akni jer snažno inhibira rast P. acnes, a pH vrednosti 1% (zapr/zapr) Cu-Zn#1 u gelu sa prezervansima iznosi oko pH 4.6.

PRIMER 2. Bakterijske kulture na mikropločama.

Aerobni bakterijski sojevi Acinetobacter baumannii (A. baumannii), mezotelin-rezistentni Staphylococcus aureus (MRSA) i Klebsiella pneumonia (K. pneumoniae) izolovani su iz briseva uzetih na bolničkim odeljenjima. Escherichia coli (NCT 9001; E. coli) je klinički izolat iz mokraćne bešike pacijenta; svi sojevi kultivišu se u RPMI-1640. Stok-rastvori jedinjenja/kompozicija koje će se testirati razblaže se tako da dvostruka razblaženja u testu na mikropločama započinju koncentracijom od 1% zapr/zapr. Dvostruka razblaženja kompozicija koje će se testirati pripremaju se u RPMI-1640, u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Bakterijske kulture se razblažuju 1:40 svežim RPMI i dodaju se kompozicijama. P. acnes se kultiviše kako je opisano u PRIMERU 1 (postupci testa na agarnim pločama) i uzorak se razblaži 1:100 korišćenjem svežeg BHI. Dvostruka razblaženja kompozicija koje će se testirati pripremaju se kako je opisano ranije u ovom tekstu, u destilovanoj vodi, u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarčića (100 mikrolitara) i doda se 100 mikrolitara razblažene kulture P. acnes. Ploče se zatim inkubiraju na 37 °C, 24 sata (pod anaerobnim uslovima za P. acnes). Minimalna inhibitorna koncentracija (muinimal inhibitory concentration, MIC) kompozicija definiše se kao najniža koncentracija pri kojoj nije zapažen vidljiv rast bakterija.

Rezultati:

1. Tabela 4 pokazuje rezultate MIC za bakar sulfat, cink sulfat i različite kompozicije opisane u Tabelama 1 i 2. U Eksperimentu #1, dve testirane kompozicije na bazi bakra (Cu#3 i Cu#9) bile su dvostruko aktivnije od bakar sulfata. Iznenađujuće, cink sulfat je imao nižu MIC za P. acnes nego bilo koji od proizvoda na bazi Cu, a u kiselini solubilizovana bakar-cinkamonijum formulacija Cu-Zn#1 bila je najaktivnija testirana kompozicija. Cu-Zn#3 koja je sadržala istu količinu elementarnog bakra kao CuZn#1, ali 6 puta manje elementarnog cinka (videti Tabelu 2) bila je 4 puta manje aktivna od Cu-Zn#1).

Tabela 4. Efekat bakar sulfata i cink sulfata i različitih kompozicija (opisanih u Tabelama 1 i 2) na rast P. acnes u kulturama bakterija na mikroploči.

1

U Eksperimentu #2, MIC za bakar sulfat i Cu#3 prema P. acnes bile su dvostruko više od uočenih u prvom eksperimentu, ali je Cu#3 i dalje duplo aktivnija. Cu#12 i Cu#13 imale su istu MIC kao Cu#3 uprkos tome što su sadržale sumpornu kiselinu umesto fosforne kiseline u Cu#3; Cu#13 sadržala je bakar hlorid umesto bakar sulfata u Cu#3 i Cu#12. Ovi rezultati ukazuju na to da su bakar-amonijum kompleksi solubilizovani u kiselini, uopšteno, aktivniji nego sam bakar sulfat. Kao u Eksperimentu #1, Cu-Zn#1 bila je kompozicija sa najvećom aktivnošću protiv rasta P. acnes i ponovo je bila 4 puta aktivnija od Cu-Zn#3.

U celini uzevši, ovi eksperimenti potvrđuju i proširuju rezultate testa na agarnoj ploči opisane ranije u ovom tekstu i prikazane u Tabeli 3. Rezultati potvrđuju da su bakaramonijum kompozicije solubilizovane u kiselini aktivnije od samog bakar sulfata. Ovi rezultati su iznenađujuće pokazali da cink sulfat inhibira rast P. acnes i da je Cu-Zn#1 bila značajno aktivnija od bilo koje Cu# kompozicije, uprkos tome što je sadržala samo 37.5% elementarnog bakra. Rezulatati pokazuju da je kombinacija ekvimolarnog elementarnog cinka i bakra u kompoziciji Cu-Zn#1 aktivnija od cink sulfata samog i da je aktivnija čak i od Cu-Zn#3 koja sadrži 6 puta manje elementarnog cinka u odnosu na bakar. Ukupni rezultati ovih eksperimenata potvrđuju da Cu-Zn#1 može biti od terapijske koristi kod akni.

2. Tabela 5 prikazuje rezultate MIC za Cu-Zn kompozicije #1 do #5, koje imaju različite odnose elementarnog bakra i cinka, dok su količine amonijum karbonata upotrebljene za pravljenje Cu-Zn kompleksa i količina hlorovodonične kiseline upotrebljene za solubilizovanje Cu-Zn kompleksa ostale konstantne (vidi Tabelu 2). U ovom eksperimentu, kompozicija Cu#3 (upotrebljena u eksperimentima kao referentna) imala je MIC = 50 mikrograma/mililitru kao i cink sulfat. Kao u prethodnim eksperimentima, kompozicija Cu-Zn#1 imala je 4 puta veću aktivnost na rast P. acnes nego Cu-Zn#3 i, u ovom eksperimentu, Cu-Zn#2. Cu-Zn#4 i #5 bile su obe upola manje aktivne od Cu-Zn#2 i #3 i 8 puta manje aktivne od Cu-Zn#1. Ovi rezultati pokazuju da među svim testiranim kompozicijama, kompozicija Cu-Zn#1 koja sadrži ekvimolarne količine elementarnog bakra i cinka ima najveću aktivnost protiv rasta P. acnes. Rezultati sa Cu-Zn#2 i #3 sugerišu da je uloga bakra protiv rasta P. acnes nešto veća od uloge cinka, ali iznenađujuća sinergija ova dva metala kada se nađu u ekvimolarnoj ekvivalenciji (Cu-Zn#1) daje kompoziciju koja je daleko najefikasnija protiv rasta P. acnes.

Tabela 5. Efekat različitih Cu-Zn# kompozicija, Cu#3 i cink sulfata na rast P. acnes u kulturama bakterija na mikroploči.

3. Tabela 6 prikazuje rezultate MIC za bakar sulfat i različite Cu# i Cu-Zn# kompozicije protiv rasta MRSA, E. coli, A. baumannii i K. pneumoniae u kulturama na mikroploči. MRSA i A. baumannii su jasno osetljiviji na efekte bakar sulfata, Cu# i Cu-Zn# kompozicija nego E. coli i K. pneumoniae, pri čemu je A. baumannii iznenađujuće osetljiv na inhibitorni efekat Cu-Zn# kompozicija. Pošto je A. baumannii posebno perzistentna bakterija koja izaziva bolničke infekcije (HAI), čišćenje ili prskanje kompozicijom Cu-Zn#1 može biti od posebne koristi za oslobađanje bolnica i drugih zdravstvenih ustanova od rastuće prevalencije i teškoća u suzbijanju mikroba.

Tabela 6. Efekat bakar sulfata i različitih Cu# i Cu-Zn# kompozicija (opisanih u Tabelama 1 i 2) na rast MRSA, E. coli, A. baumannii i K. pneumoniae u kulturama bakterija na mikroploči. NT = nije testirano.

1

MRSA i E. coli su bile osetljivije na efekte inhibicije rasta Cu# kompozicija nego CuZn# kompozicija i bakar sulfata, dok je suprotno važilo za A. baumannii i K. pneumoniae. Međutim, E. coli je generalno bila oko 8 puta manje osetljiva na sve testirane kompozicije nego MRSA.

Primećeno je da određene kompozicije napravljene sa amonijum karbonatom ili amonijum hidrogen karbonatom i uz korišćenje sirćetne kiseline (Cu#10) i limunske kiseline (Cu#1; nije prikazano u Tabeli 1 ili testirano jer je primećena precipitacija posle 24 h), počinju da precipitiraju u roku od nekoliko dana posle pripreme. Vrlo slične kompozicije napravljene su korišćenjem amonijum hidroksida i pokazalo se da su ove kompozicije (Cu#10a i Cu#11a) iznenađujuće stabilnije i da ne pokazuju znake precipitacije mesecima posle pripreme (skladištenje na sobnoj temperaturi). Tri kompozicije su napravljene korišćenjem amonijum hidroksida (videti Tabelu 1 za detalje) i testirane protiv MRSA, A. baumannii i E. coli kako je pokazano u donjem delu Tabele 6. Cu#3 je stabilna kompozicija i Cu#3a je jednako stabilna i aktivna protiv tri testirana soja bakterija. Cu10a pokazala je aktivnost sličnu Cu#10, a Cu#11a sa limunskom kiselinom bila je aktivna kao druge Cu# kompozicije. Ne samo što su ove kompozicije (i druge kompozicije pripremljene sa amonijum hidroksidom - vidi u nastavku) bile stabilnije, one su se brže i lakše pravile jer nije bilo oslobađanja ugljen-dioksida, i Cu-/Cu-Zn-amonijum kompleksi formirani sa amonijum hidroksidom zahtevaju manje kiseline za solubilizovanje, tako da pH kompozicija može biti viši, što predstavlja prednost u njihovim formulacijama.

MRSA je verovatno najpoznatija i najproblematičnija patogena bakterija koja izaziva HAI, ali MRSA soj USA300 postao je posebno zabrinjavajući i kao vanbolnička infekcija, posebno kože. K. pneumoniae rezistentna na karbapenem (carbapenem-resistant K. pneumoniae, CRKP) pojavila se tokom poslednjih 10 godina da bi širom sveta postala bolnički patogen koji je gotovo potpuno rezistentan na lekove. Međutim, senzitivnost testiranih bakterijskih sojeva na Cu# i Cu-Zn# kompozicije (Tabela 6), sugeriše da ove kompozicije mogu biti od koristi za čišćenje, prskanje, i slično bolnica, domova i drugih građevina kako bi se ovi organizmi uklonili. Ukupno uzevši, pošto je A. baumannii takođe prilično osetljiv na Cu# kompozicije, Cu#3 može predstavljati posebno efikasnu kompoziciju za čišćenje i dezinfekciju kako bi se ovi patogeni uklonili iz zgrada.

PRIMER 3. Test citotoksičnosti sa ćelijskom linijom (A-431) pločastih epitelnih ćelija kože čoveka.

1

A-431 (ATCC) kultiviše se u RPMI-1640 medijumu dopunjenom 10% fetalnim goveđim serumom i 2 mM L-glutaminom (kompletni medijum) u humidifikovanom inkubatoru na 37 °C uz 5% CO2, na vazduhu. Za eksperimente citotoksičnosti, ćelije se tripsinizuju, isperu, broje i 2 × 10<4>ćelija se zaseje u bunarčiće ploča sa 96 bunarčića sa ravnim dnom, u kompletnom medijumu i kultiviše 3 dana dok se ne formira konfluentni monosloj. Testirani proizvodi bili su: (i) bakar-sulfat, Cu#9, Cu#10 i Cu-Zn#1 kako je prikazano na Slici 4, i (ii) kompozicije Cu#9 i Cu-Zn#1 razblažene u gelu aloje sa prezervansima, zajedno sa dva komercijalna krema za akne: CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) gel za tretman sa ultrabrzim dejstvom, sa 2% salicilnom kiselinom i CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) krem za dnevni tretman akni, sa 10% benzoil peroksidom, kako je prikazano na Slici 5. Svi testirani proizvodi razblaženi su u kompletnom medijumu i zatim u triplikatu dodati konfluentnim A-431 ćelijama koje se zatim gaje još 24 sata, posle čega se kvantitativno procenjuje citotoksičnost/preživljavanje ćelija, uz korišćenje testa sa sulforodaminom B (sulforhodamine B, SRB), kako je opisano u nastavku.

Ćelije se isperu dva puta korišćenjem RPMI-1640 medijuma i zatim fiksiraju 10% trihlorsirćetnom kiselinom, 1 sat na 4 °C. Posle ispiranja u dve promene česmenske vode, ćelije se boje korišćenjem SRB (0.4% tež/zapr SRB u 1% sirćetnoj kiselini) 30 min na sobnoj temperaturi. Posle ispiranja u dve promene česmenske vode preostala boja se rastvori u 10 mM Tris bazi i apsorbanca bunarčića se meri na Dynatech Multiple ELISA čitaču na 540 nm. Procenat preživljavanja ćelija izračunava se deljenjem apsorbance testnog proizvoda kontrolnom apsorbancom i množenjem sa 100.

Rezultati

Slika 4 prikazuje da bakar sulfat i kompozicije Cu#9 i #10 imaju gotovo identične profile citotoksičnosti za ćelije kože čoveka, sa 50% citotoksičnim koncentracijama (50% cytotoxic concentration, CC50) od 50 mikrograma/mililitru, što sugeriše da su joni bakra odgovorni za citotoksične efekte ova tri proizvoda. Kompozicija Cu-Zn#1 imala je blago povišenu citotoksičnost u odnosu na ostala tri proizvoda (CC50= 30 mikrograma/mililitru) verovatno zbog prisustva i jona bakra i jona cinka, iako je koncentracija elementarnog bakra iznosila samo 37.5% od one kod ostala tri proizvoda, što sugeriše da za ćelije kože čoveka joni cinka imaju još višu citotoksičnost od jona bakra, i/ili pojačavaju citotoksičnost jona bakra.

1

Što je važno, ovi rezultati pokazuju da ovde opisane kompozicije kao što su Cu#3, #3a, #9, #10, #10a, #11a, #12, #13 i Cu-Zn#1 i #3 mogu inhibirati rast bakterija, na primer MRSA i A. baumannii, u koncentracijama (MIC 1.6-6.3 mikrograma/mililitru - videti Tabelu 6) znatno nižim od onih koje izazivaju citotoksičnost kod ćelija kože čoveka u kulturi (oko 30 mikrograma/mililitru). Cu-Zn#1 inhibira i rast P. acnes, sa MIC = 12.5 mikrograma/mililitru (Tabela 4) što je koncentracija pri kojoj ne ispoljava citotoksičnost za ćelije kože čoveka.

Slika 5 prikazuje efekte gela koji sadrži 1% zapr/zapr kompozicije Cu#9 (400 mikrograma/mililitru elementarnog bakra) i Cu-Zn#1 (150 mikrograma/mililitru elementarnog bakra i cinka) i dva komercijalno dostupna CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) krema za akne, na preživljavanje ćelija kože čoveka u kulturi tkiva. Oba CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) proizvoda, jedan koji kao aktivni sastojak sadrži 10% benzoil peroksid i drugi koji sadrži 2% salicilnu kiselinu, dala su slične profile citotoksičnosti, uz CC50vrednosti od 0.02%, odnosno 0.05% i 100% citotoksičnosti (preživelo 0%) u koncentracijama od oko 0.5% i višim. Gel koji sadrži 1% kompozicije Cu-Zn#1, što bi bila poželjna kompozicija za lečenje akni, imao je CC50od 4%, dok gel koji sadrži 1% kompoziciju Cu#9 u testu nije postigao CC50čak ni pri 10% zapr/zapr. CC50vrednosti za tri gel formulacije bile su kompatibilne sa CC50vrednostima dobijenim sa kompozicijama samim (vidi Sliku 4). Prema tome, jasno je da su za ćelije kože čoveka CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) proizvodi oko 200 puta toksičniji od bilo koje gel formulacije.

Važno je pomenuti da zbog relativne jednostavnosti kultura ćelija kože u poređenju sa kompleksnom strukturom kože, zdravstvene implikacije treba oprezno interpretirati i ove in vitro rezultate ne treba prevoditi u kliničke razlike. Bez obzira na to, izgleda da su aktivni sastojci u CLEARASIL® (registrovani zaštitni znak Reckitt Benckiser LLC, Berkshire, England) proizvodima, salicilna kiselina i benzoil peroksid, koji se široko koriste u proizvodima za lečenje akni, posebno toksični za ćelije kože, koje mogu biti izloženije na koži osoba koje pate od akni. Prema tome, gel sa Cu-Zn#1 formulacijom može biti manje oštećujući za kožu osoba koje imaju akne, uz istovremeno visoku aktivnost protiv P. acnes, bakterije povezane sa aknama (vidi PRIMERE 1 i 2).

PRIMER 4. Antigljivični testovi sa gljivama koje su patogene za biljke

Izolati Chalara fraxinea 196/28 (C. fraxinea), Aspergillus niger (A. niger) i soj izolovan iz pepelnice (powdery mildew, Pm; izolovan iz lista jabuke) kultivišu se na krompir-

1

dekstroza agarnoj podlozi (potato dextrose agar, PDA) na sobnoj temperaturi (oko 22 °C). Da bi se procenili efekti kompozicija na rast gljiva, po 10 mikrolitara testnih kompozicija razblaženih u sterilnoj destilovanoj vodi stavi se u bunarčiće ploče za kulturu tkiva sa 12 bunarčića i pipetom se u svaki bunarčić doda 1 mililitar PDA. Ploča se agitira da bi se testna kompozicija ujednačeno distribuirala u agaru (kao kontrola koristi se destilovana voda) i zatim se agar ostavi da se slegne. Agarni jastučići koji sadrže hife gljiva (3 mm<2>) iz uspostavljenih kultura gljiva pažljivo se iseku skalpelom i stave u otvore u centru agara u svakom bunarčiću ploče sa 12 bunarčića, i to se zatim kultiviše na sobnoj temperaturi (oko 22 °C). Pošto stopa rasta gljiva varira u zavisnosti od soja, eksperimenti se procenjuju posle 3 dana za Pm, i u odgovarajućim intervalima od 3-4 dana za A. niger i oko 7 dana za C. fraxinea. Da bi se procenili efekti kompozicija na rast gljiva, prečnik hifa gljiva meri se lenjirom, dva puta pod uglom od 90°, i izračunava se prosečan dijametar u milimetrima. Ako rast gljiva ne može da se detektuje od oka, kultura se posmatra pomoću faznog mikroskopa (40 ×) da bi se na osnovu vizuelne procene potvrdilo odsustvo rasta (no growth, NG).

Rezultati

1. Tabela 7 prikazuje efekte bakar sulfata i kompozicije Cu#16 na rast C. fraxinea. Kompozicija Cu#16 u koncentraciji od 125 mikrograma/mililitru snažno inhibira rast gljive, u obe vremenske tačke i ispoljava oko 30 puta veću inhibitornu aktivnost na rast gljive nego bakar sulfat (rezultati sa 3.75 mikrograma/mililitru Cu#16 bili su vrlo slični onima sa 125 mikrograma/mililitru bakar sulfata), verovatno zbog solubilizacije bakar-amonijum kompleksa u Cu#16 fosforastom kiselinom (vidi Tabelu 1) čija je antigljivična aktivnost poznata.

Tabela 7. Efekti bakar sulfata i kompozicije Cu#16 na rast C. fraxinea na PDA. *Blagi rast zapažen je faznom mikroskopijom na uveličanju 40 ×. **Širina bunarčića iznosi 20 milimetara i predstavlja konfluentni rast gljive.

1

2. Tabela 8 pokazuje efekte kompozicija Cu-Zn#1 i Cu-Zn#7 na rast C. fraxinea. Kompozicija Cu-Zn#1 manje je efikasna od kompozicije Cu-Zn#7 u inhibiranju rasta C. fraxinea, i iako su formulacije dvaju kompozicija veoma slične (Tabela 2), kompozicija Cu-Zn#7 sadrži fosforastu kiselinu kao kiselinu koja solubilizuje bakar-cink dok Cu-Zn#1 sadrži hlorovodoničnu kiselinu. Poznato je da fosforasta kiselina ima antigljivičnu aktivnost i njena upotreba u kompoziciji Cu-Zn#7 rezultuje antigljivičnom kompozicijom koja je 3 do 10 puta aktivnija od Cu-Zn#1 na dane 7, odnosno 14 testa.

1% koncentracija Cu-Zn#7 sadrži 150 mikrograma/mililitru elementarnog bakra, tako da poređenje efekata Cu-Zn#7 sa efektima bakar sulfata i Cu#16 u Tabeli 7 ukazuje na to da Cu-Zn#7 ima blago sniženu inhibitornu aktivnost na rast C fraxinea u odnosu na Cu#16, ali je značajno efikasnija od bakar sulfata.

Tabela 8. Efekat kompozicija Cu-Zn#1 i Cu-Zn#7 na rast C. fraxinea na PDA. Kompozicije Cu-Zn# korišćene su kao procentna razblaženja stok-rastvora (Tabela 2) tako da 1% rastvor sadrži 150 µg/ml elementarnog bakra (i cinka). **Širina bunarčića iznosi 20 milimetara i predstavlja konfluentni rast gljive.

2

3. Tabela 9 prikazuje efekte bakar sulfata i kompozicije Cu#16 na rast A. niger. Kompozicija Cu#16 u koncentraciji od 125 mikrograma/mililitru potpuno je inhibirala rast gljive i u sve tri vremenske tačke imala je 3 do 10 puta veću inhibitornu aktivnost na rast gljive nego bakar sulfat, kao što je zapaženo i za C. fraxinea (Tabela 7).

Tabela 9. Efekti bakar sulfata i kompozicije Cu#16 na rast A. niger na PDA. NG označava odsustvo rasta, procenjeno faznom mikroskopijom na uveličanju 40 ×.

4. Tabela 10 pokazuje da su obe Cu# kompozicije koje sadrže fosforastu kiselinu bile efikasnije od bakar sulfata u inhibiranju rasta Pm. Kompozicija Cu#16 napravljena je sa amonijum hidrogen karbonatom, dok Cu#27 sadrži amonijum hidroksid i kako je prikazano ranije (Tabela 6), ovo nije dovelo do značajne razlike u antigljivičnoj aktivnosti kompozicije. Međutim, posle nekoliko dana na sobnoj temperaturi, u kompoziciji Cu#16 zapažena je precipitacija, dok ovo nije uočeno za Cu#27, što sugeriše da amonijum hidroksid može biti iznenađujuće pogodan za pripremanje bakar-amonijum kompleksa kada se za solubilizovanje kompleksa koristi fosforasta kiselina. Kompozicije Cu-Zn#7 i Zn-Cu#10, koje su bile jednako efikasne kao inhibitori Pm rasta, razlikovale su se po korišćenju amonijum karbonata, odnosno amonijum hidroksida, za stvaranje Cu-Zn-amonijum kompleksa koji su u oba slučaja solubilizovani u fosforastoj kiselini (Tabela 2). Međutim, precipitacija nije zapažena kada je amonijum karbonat upotrebljen za pripremanje Cu-Zn-amonijum kompleksa koji su solubilizovani u fosforastoj kiselini. Iznenađujuće, Cu-Zn# kompozicije bile su u odnosu na sadržaj elementarnog bakra efikasniji inhibitori Pm rasta nego Cu# kompozicije. Prema tome, pri jednopostotnom razblaženju (150 mikrograma/mililitru bakra) Cu-Zn# kompozicije potpuno su inhibirale rast kao i Cu# kompozicije - ali pri 375 mikrograma/mililitru elementarnog bakra. Pri razblaženju od 0.3 procenta (45 mikrograma/mililitru bakra) Cu-Zn# kompozicije i dalje snažno inhibiraju Pm rast, dok su pri 37.5 mikrograma/mililitru Cu# kompozicije imale samo blagu inhibitornu aktivnost na Pm rast.

Izračunavanja pokazuju da koncentracija potrebna za 50% inhibiciju rasta Pm iznosi oko 40 mikrograma/mililitru za Cu-Zn# kompozicije i oko 170 mikrograma/mililitru za Cu# kompozicije. Prema tome, ovi rezultati pokazuju da su Cu-Zn# kompozicije solubilizovane fosforastom kiselinom iznenađujuće efikasnije u inhibiranju rasta Pm od Cu# kompozicija rastvorenih u fosforastoj kiselini, bez obzira na amonijumovu so upotrebljenu za formiranje kompleksa.

Tabela 10. Efekti bakar sulfata, dve Cu# kompozicije i dve Cu-Zn# kompozicije na rast Pm na PDA, posle 3 dana kulture. Cu-Zn# kompozicije upotrebljene su kao procentno razblaženje stok-rastvora (Tabela 2) tako da 1% rastvor sadrži 150 µg/ml elementarnog bakra (i cinka). NG označava odsustvo rasta, procenjeno faznom mikroskopijom na uveličanju od 40 ×. *Blagi rast zapažen faznom mikroskopijom na uveličanju od 40 ×.

C. fraxinea je uzrok sušenja jasena, koje predstavlja ozbiljan problem u šumarstvu u Evropi. A. niger izaziva crnu buđ na određenom voću i povrću, na primer grožđu, luku, i kikirikiju, i čest je zagađivač hrane. Gljive roda Blumeria su široko rasprostranjeni biljni patogeni koji izazivaju pepelnicu na listovima mnogih biljaka uključujući vinovu lozu, tikvu, luk, drvo jabuke i drvo kruške. Rezultati opisani gore pokazuju da bakar-amonijum i bakar-cinkamonijum kompleksi solubilizovani u fosforastoj kiselini imaju visoku efikasnost u inhibiranju rasta različitih testiranih biljnih patogenih gljiva i stoga se mogu praktično primenjivati u oblasti poljoprivrede, za zaštitu useva, biljaka, drveća, cveća i ukrasnog grmlja. Iznenađujuće, Cu-Zn#7 i #10 bile su značajno efikasnije od Cu#16 i #27 u inhibiranju rasta pepelnice, što sugeriše da ove kompozicije mogu imati pogodnu antigljivičnu aktivnost protiv određenih biljnih patogena.

PRIMER 5. Antigljivični/antikvasni testovi sa Candida albicans i Cryprococcus neoformans, patogenim za čoveka.

Upotrebljena su tri soja Candida albicans (C. albicans): 1-1, 3-1 i 4-1, izolovani su iz krvi, vagine, i orofarinksa čoveka, respektivno. Upotrebljen je soj Cryprococcus neoformans (C. neoformans) CCTP13. Svi sojevi su kultivisani u RPMI-1640 medijumu na 37 °C. Bakar sulfat i Cu# kompozicije počinjale su od visokih koncentracija od 200 mikrograma/mililitru, dok su Cu-Zn# kompozicije počinjale od visokih koncentracija 1% stok-rastvora (Tabela 2), a cink sulfat i fosforasta kiselina počinjali su od visokih koncentracija ekvivalentnih onima u Cu-Zn#7 i #10 (videti legendu Tabele 11 za detalje) i dvostruka razblaženja (100 mikrolitara) koncentracija pripremljena su u RPMI-1640, u ploči za kulturu tkiva sa 96 bunarčića. Prekonoćne kulture C. albicans i C. neoformans razblaže se u odnosu 1:40, odnosno 1:10, svežim RPMI koji sadrži 40 mM MOPS pufer i 90 mikrolitara se doda kompozicijama u ploči. Rezazurin A (10 mikrolitara 0.0675% zapr/zapr rastvora u destilovanoj vodi) doda se kao indikator rasta i kulture se inkubiraju na 37 °C, 24 h. Minimalna inhibitorna koncentracija (MIC) jedinjenja/kompozicija definiše se kao najniža koncentracija pri kojoj rezazurin A indikator ostaje plav (žive ćelije konvertuju plavu boju u ružičastu boju).

Rezultati

Tabela 11 pokazuje da su svi testirani sojevi bili iznenađujuće osetljivi na bakar, sa MIC koje su slične viđenim sa MRSA i A baumannii (oko 6 mikrograma/mililitru, Tabela 6), bilo u formi bakar sulfata ili bakar-amonijum kompozicija (Cu#) solubilizovanih u kiselini.

Kompozicije Cu-Zn-amonijum kompleksa #1 i #7 solubilizovane u kiselini, koje sadrže ekvimolarna količine elementarnog bakra i cinka sa hlorovodoničnom, odnosno fosforastom kiselinom, imale su malo višu efikasnost u inhibiciji rasta C. albicans nego bakar sulfat i Cu# kompozicije u pogledu koncentracije jona bakra (MIC = 4.7 mikrograma/muililitru elementarnog Cu<2+>). Kvasac C. neoformans bio je takođe visoko osetljiv na bakar, bez obzira

2

na formu, ali je bio manje osetljiv na Cu-Zn#1 nego sojevi C. albicans. Na rast sojeva C. albicans nisu uticali cink sulfat ili fosforasta kiselina (MIC>150, odnosno >500 mikrograma/mililitru). Na rast C. neoformans nije uticao ni cink sulfat.

Tabela 11. Efekat različitih kompozicija na rast tri soja C. albicans i soja C. neoformans. *Cu-Zn# kompozicije sadrže 4.7 µg/ml i Cu<2+>i Zn<2+>. **1% zapr/zapr rastvor Cu-Zn#7 i #10 stok-kompozicija (vidi Tabelu 2) sadrže 150 µg/ml cink sulfata i 500 µg/ml fosforaste kiseline. NT = nije testirano.

Ovi rezultati pokazuju da su svi sojevi C. albicans izolovani sa različitih anatomskih pozicija visoko osetljivi na prisustvo bakra kada rastu na RPMI medijumu. Može se, dakle, zaključiti da Cu# ili Cu-Zn# kompozicije mogu biti korisne za površinsko lečenje bolesti povezanih sa C. albicans, kao što su vaginalni ili oralni sor.

C. neoformans je takođe veoma osetljiv na bakar sulfat i Cu# kompozicije, ali je mnogo manje osetljiv na Cu-Zn#1 i cink sulfat. C. neoformans izaziva teški meningitis kod ljudi sa HIV/AIDS i selektivna dostava bakar-sadržavajućih kompleksa u mozak može predstavljati potencijalni način lečenja ove smrtonosne bolesti.

PRIMER 6. Testovi stabilnosti.

Uzorci (3 mililitra) kompozicije Cu#1 i gela aloje sa prezervansima, koji sadrži 1% zapr/zapr kompozicije Cu#1 stave se u sterilne plastične tube od 7 mililitara i uzorci se u replikatima drže u četiri uslova: na 37 °C u humidifikovanom inkubatoru, na sobnoj temperaturi (oko 22 °C) u ormanu, na 4 °C u hladnoj sobi i na -20 °C u zamrzivaču. Posle 5 meseci skladištenja, set uzoraka Cu#1 i gela koji sadrži 1% Cu#1 iznesu se na sobnu temperaturu. Uzorci gela (5 mikrolitara) i uzorci Cu#1 (razblaženi 1:1 ili 1:10 zapr/zapr u destilovanoj vodi i 5 mikrolitara stavljeni na papirni disk) testiraju se na bakterijskom soju S1 (S.aureus) u testu na agarnoj ploči i posle 24 h kultivisanja na 37 °C, mere se dijametri zona inhibicije, kao što je opisano u PRIMERU 1.

Rezultati

Uzorci gela koji sadrži 1% kompozicije Cu#1 su svi dali zone inhibicije od 6 milimetara u testu protiv S1 (S.aureus) što ukazuje da skladištenje na širokom rasponu temperatura nije uticalo na antibakterijsku aktivnost gelova.

Tabela 12 prikazuje zone inhibicije za uzorke kompozicije Cu#1 skladištene na različitim temperaturama u trajanju od 5 meseci. Uzorak držan na 37 °C imao je malo nižu inhibitornu aktivnost na rast S1 (S.aureus) nego drugi uzorci koji su imali veoma slične zone inhibicije pri obe testirane koncentracije. Ovi rezultati pokazuju da kompozicija Cu#1 zadržava svoju antibakterijsku aktivnost posle 5 meseci skladištenja na širokom rasponu temperatura.

Tabela 12. Efekat uzoraka kompozicije Cu#1 držanih na različitim temperaturama, u trajanju od 5 meseci, na rast bakterijskog soja S1 (S.aureus) u testu na agarnoj ploči.

2

Claims (10)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Antimikrobna kompozicija, naznačena time, što uključuje:

rastvor koji sadrži hidratisani bakar sulfat u vodi; i

ekvimolarnu količinu cinkove soli u rastvoru;

baznu amonijumovu so dodatu u rastvor da bi nastao nesolubilni bakar-cink-amonijum kompleks; i

najmanje jednu kiselinu solubilnu u vodi, odabranu iz grupe koja se sastoji od sumporne, hlorovodonične, fosforne i fosforaste kiseline, dodatu u rastvor da bi se solubilizovao bakar-cink-amonijum kompleks i da bi se kontrolisao pH tako formiranog bistrog plavog u kiselini solubilizovanog bakar-cink-amonijum rastvora.

2. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što je voda odabrana iz grupe koja se sastoji od destilovane vode, dejonizovane vode, prečišćene vode, filtrirane vode, vode farmaceutske čistoće, vode medicinske čistoće, i vode prečišćene reverznom osmozom.

3. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što je cinkova so odabrana iz grupe koja se sastoji od anhidrovanog cink sulfata, anhidrovanog cink hlorida, hidratisanog cink sulfata i hidratisanog cink hlorida.

4. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 1, naznačena time, što sadrži još i nosač koji je odabran iz grupe koja se sastoji od gela, masti, ulja, paste, leka, rastvora koji se može se raspršivati, rastvora koji se može naneti na gazu, rastvora za irigaciju, krema, sapuna, deterdženta, rastvora za ispiranje i pene.

5. Antimikrobna kompozicija proizvedena procesom:

kombinovanja hidratisanog bakar sulfata i ekvimolarne količine cinkove soli sa vodom,

da se snažno mešaju kombinovani bakar sulfat i cinkova so i vodena smeša; dodavanja bazne amonijumove soli u dobijenu smešu da se dobije nesolubilni bakarcink-amonijum kompleks; i

dodavanja kiseline solubilne u vodi odabrane iz grupe koja se sastoji od sumporne, hlorovodonične, fosforne i fosforaste kiseline u bakar-cink-amonijum kompleks da bi

2

se bakar-cink-amonijum kompleks solubilizovao i da bi se kontrolisao pH tako formiranog bistrog plavog rastvora.

6. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 5, naznačena time, što je voda odabrana iz grupe koja se sastoji od destilovane vode, dejonizovane vode, prečišćene vode, filtrirane vode, vode farmaceutske čistoće, vode medicinske čistoće, i vode prečišćene reverznom osmozom.

7. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 5, naznačena time, što je cinkova so odabrana iz grupe koja se sastoji od anhidrovanog cink sulfata, anhidrovanog cink hlorida, hidratisanog cink sulfata i hidratisanog cink hlorida.

8. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 5, naznačena time, što je bazna amonijumova so rastvorena u vodi pre nego što je kombinovana sa solju bakra i vodenom smešom.

9. Antimikrobna kompozicija iz patentnog zahteva 5, naznačena time, što sadrži još i nosač odabran iz grupe koja se sastoji od gela, masti, ulja, paste, leka, rastvora koji se može raspršivati, rastvora koji se može naneti na gazu, rastvora za irigaciju, krema, sapuna, deterdženta, rastvora za ispiranje i pene.

10. Postupak proizvodnje antimikrobne kompozicije, naznačen time, što uključuje korake:

kombinovanja hidratisanog bakar sulfata i ekvimolarne količine cinkove soli u vodi, snažnog mešanja kombinovanog bakar sulfata i cinkove soli i vodene smeše; dodavanja bazne amonijumove soli u dobijenu smešu da nastane nesolubilni bakarcink-amonijum kompleks; i

dodavanja kiseline solubilne u vodi odabrane iz grupe koja se sastoji od sumporne, hlorovodonične, fosforne i fosforaste kiseline u bakar-cink-amonijum kompleks da bi se bakar-cink-amonijum kompleks solubilizovao i da bi se kontrolisao pH tako formirane bistre plave antimikrobne kompozicije.