RS63482B1

RS63482B1 - Nova anti-humana gpvi antitela i njihove upotrebe

Info

Publication number: RS63482B1
Application number: RS20220683A
Authority: RS
Inventors: Philippe Billiald; Martine Jandrot-Perrus
Original assignee: Acticor Biotech; Univ Paris Cite; Univ Paris Xiii; Inst Nat Sante Rech Med; Univ Paris Saclay
Priority date: 2015-08-05
Filing date: 2016-08-05
Publication date: 2022-09-30
Also published as: IL257323A; BR112018002382A8; EP4091628A1; RU2018107409A; JP2022025033A; EP3331553B1; US20200384106A1; RU2018107409A3; AU2016301969A1; CY1125400T1; JP2018526990A; BR112018002382A2; CN108289939B; PT3331553T; WO2017021539A2; US20180236071A1; EP3331553A2; HK1256816A1; SI3331553T1; CN108289939A

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na nova antitela protiv humanog glikoproteina VI, i na njihove upotrebe u lečenju kardiovaskularnih bolesti.

OSNOVA PRONALASKA

[0002] Akutni koronarni i cerebrovaskularni akcidenti su trenutno glavni uzrok smrti u svetu. Pored toga, globalna incidenca recidiva i smrti u periodu od 6 meseci nakon tretmana nakon akutnog koronarnog sindroma je i dalje 8-15%.

[0003] U slučaju akutnog koronarnog sindroma sa elevacijom ST segmenta, mehaničko lečenje koronarnom angioplastikom i uvođenjem stenta je veoma efikasno za hitno obnavljanje koronarnog arterijskog protoka, ali ne sprečava morbiditet/mortalitet kod oko 15% pacijenata u narednih 6 meseci. Trombolitički tretmani, koji se zasnivaju na dugotrajnim udruživanjima fibrinolitičkih, antikoagulantnih i anti-agregacionih lekova, daju još manje ohrabrujuće rezultate. Zaista, uprkos poboljšanjima u medicinskom lečenju tromboze, morbiditet/mortalitet nakon 6 meseci je sličan onom uočenom za akutni koronarni sindrom bez elevacije ST segmenta.

[0004] Što se tiče cerebrovaskularnih ishemijskih akcidenata, tretmani su i dalje veoma ograničeni zbog generalno kasnog zbrinjavanja većine pacijenata i zbog rizika od hemoragije trenutno dostupnih antitrombotičkih tretmana.

[0005] Stoga još uvek postoji klinička potreba za poboljšanjem lečenja kardiovaskularnih bolesti, a posebno za novim molekulima sa poboljšanim karakteristikama u poređenju sa dostupnim molekulima. Izazov sa kojim se treba suočiti je da se dobiju molekuli sa odličnom efikasnošću kod patološke tromboze, ali bez rizika od krvarenja.

[0006] Da bi se odgovorilo na ovaj zahtev, ciljno mesto mora imati veću ulogu u formiranju tromba koji se javlja u bolesnom sudu nego u fiziološkoj hemostazi koja je potrebna da se ograniči krvarenje u zdravom sudu. Ovo je slučaj trombocitnog glikoproteina VI za koji je pokazano kod životinja da igra ulogu u eksperimentalnoj trombozi uključujući moždani udar, vaskularno remodeliranje i da je kritičan kod aterotromboze.

[0007] Za razliku od antagonista αIIbβ3 integrina, koji se trenutno koriste u lečenju tromboze i inhibiraju završnu fazu aktivacije trombocita, odnosno agregaciju trombocita, i antagonista regrutacije trombocita (inhibitori P2Y12 ADP receptora i aspirina), GPVI je uključen u nekoliko koraka formiranja čepa od trombocita: inicijacija preko interakcije sa povređenim vaskularnim zidom, amplifikacija preko inicijalne aktivacije trombocita koja dovodi do sekrecije sekundarnih agonista, aktivacija integrina i prokoagulantne aktivnosti trombocita, rast i stabilizacija preko interakcije sa fibrinom (Mammadova et al., Blood 2015). Dakle, antagonisti GPVI mogu sprečiti ne samo agregaciju trombocita, već i oslobađanje sekundarnih agonista, kao i lučenje faktora rasta i citokina koji rezultiraju razvojem vaskularnih lezija. Konačno, ekspresija GPVI je ograničena na trombocite i megakariocite, i stoga predstavlja savršeno specifično ciljno mesto za lečenje tromboze.

[0008] Tako su razvijeni antagonisti GPVI za lečenje kardiovaskularnih bolesti.

[0009] WO 2001/000810 i WO 2003/008454 oba opisuju rastvorljivi GPVI rekombinantni protein koji je fuzioni protein između GPVI ekstracelularnog domena i humanog Ig Fc domena. Ovaj rastvorljivi rekombinantni GPVI protein je u kompeticiji sa trombocitnim GPVI za vezivanje kolagena. Ohrabrujući rezultati su prvi put dobijeni sa ovim rastvorljivim GPVI proteinom u mišjem modelu tromboze, ali ovi rezultati nisu potvrđeni. Pored toga, ovaj pristup uključuje strukturne, funkcionalne i farmakološke nedostatke. Prvo, ovo jedinjenje je himerni protein visoke molekularne težine (~ 160 kDa). GPVI-Fc ciljno deluje na kolagen izložen na mestu vaskularne povrede, čija količina i dostupnost su slabo predvidljivi i, stoga, količina proizvoda koji se ubrizgava predstavlja potencijalno ograničenje za upotrebu GPVI-Fc. Drugo ograničenje može biti rizik od imunizacije protiv neoepitopa koji su potencijalno izloženi na fuzionom proteinu.

[0010] Neutrališuća monoklonska antitela usmerena protiv humanog GPVI takođe su opisana u stanju tehnike.

[0011] Na primer, EP 1224942 i EP 1228768 otkrivaju monoklonsko anti-GPVI antitelo JAQ1 pacova, koje se specifično vezuje za mišji GPVI, za lečenje trombotičke bolesti. JAQ1 antitelo indukuje ireverzibilnu internalizaciju GPVI receptora na trombocitima miša.

[0012] EP 1538165 opisuje još jedno monoklonsko anti-GPVI antitelo pacova (hGP 5C4), za čiji je Fab fragment ustanovljeno da ima izražene inhibitorne efekte na glavne fiziološke funkcije trombocita izazvane stimulacijom kolagena: stimulacija kolagenom posredovanih markera fiziološke aktivacije PAC-I i CD62P-selektina je potpuno sprečena pomoću hGP 5C4 Fab, i hGP 5C4 Fab je snažno inhibirao agregaciju humanih trombocita ex vivo bez ikakve intrinzičke aktivnosti. Međutim, 5C4 je antitelo pacova, i stoga predstavlja veoma ograničen terapeutski potencijal.

[0013] WO 2005/111083 opisuje 4 mišja monoklonska anti-GPVI antitela OM1, OM2, OM3 i OM4, za koja je utvrđeno da inhibiraju vezivanje GPVI za kolagen, sekreciju izazvanu kolagenom i formiranje tromboksana A2 (TXA2) in vitro, kao i ex vivo agregaciju trombocita izazvanu kolagenom nakon intravenske injekcije makaki majmunima. Čini se da OM4 takođe inhibira formiranje tromba u modelu tromboze pacova.

[0014] WO 2001/000810 takođe opisuje različita mišja monoklonska anti-GPVI antitela pod nazivom 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, 9O12.2, 7H14.1 i 9E18.2, kao i nekoliko fragmenata scFv antitela humanih faga pod nazivom A9, A10, C9, A4, C10, B4, C3 i D11. Utvrđeno je da neka od ovih antitela i scFv fragmenata inhibiraju vezivanje GPVI za kolagen, uključujući antitela 8M14.3, 3F8.1, 9E18.3, 3J24.2, 6E12.3, 1P10.2, 4L7.3, 7H4.6, i 9O12.2, i scFv fragmente A10, A4, C10, B4, C3 i D11. Pored toga, otkriveno je da 9O12.2 Fab fragmenti potpuno blokiraju agregaciju i sekreciju trombocita izazvanu kolagenom, da blokiraju agregaciju trombocita izazvanu fibrinom, da inhibiraju prokoagulantnu aktivnost kolagenom stimulisanih ili fibrinom stimulisanih trombocita i adheziju trombocita na kolagen ili fibrin u statičkim uslovima, da narušavaju adheziju trombocita i da sprečavaju stvaranje tromba u uslovima arterijskog protoka.

[0015] WO 2008/049928 opisuje scFv fragment izveden iz 9O12.2, koga čine VH i VL domeni monoklonskog antitela 9O12.2 povezani preko (Gly4Ser)3peptida. Međutim, nijedno od trenutno poznatih anti-GPVI antitela se nije pokazalo efikasnim in vivo za prevenciju i/ili lečenje kardiovaskularnih bolesti. Konkretno, većina antitela na GPVI koja su prijavljena izgledala su kao neprikladna za razvoj antitrombotika za medicinsku upotrebu kod ljudi, posebno zbog njihovog životinjskog porekla.

[0016] Naročito, prijavljeno je da su neka humana antitela na fag scFv usmerena na humani GPVI inhibitorna, ali izgleda da je njihov afinitet nizak. Štaviše, unakrno vezivanje GPVI na površini trombocita dvovalentnim ili multivalentnim ligandom kao što je celi IgG 9O12.2 dovodi do aktivacije trombocita preko GPVI dimerizacije i preko unakrsnog vezivanja GPVI sa Fc receptorom niskog afiniteta (FcyRIIA). Nasuprot tome, monovalentni 9O12.2 Fab i scFv fragmenti su inhibitorni.

[0017] Međutim, ovi fragmenti nisu mogli da se koriste u terapiji zbog svoje veličine i životinjskog porekla što ih čini imunogenim kod pacijenata. Štaviše, scFv fragmenti imaju kratak poluživot, što ograničava njihove terapeutske potencijale.

[0018] Stoga i dalje postoji potreba za neutralizacijom antagonista GPVI bez imunogenosti kod ljudi.

[0019] US 2006/0088531 opisuje humani scFv fragment 10B12, predstavljajući KDza vezivanje za humani GPVI od oko 7,9.10<-7>M. Smethurst et al., 2004, dalje opisuju epitop vezan za 10B12 na Ig-sličnom domenu C2 tipa 1 (D1) humanog GPVI. Ovaj epitop sadrži ostatke R58, K61, R66, K79 i R80 humanog GPVI (numeracija zasnovana na UniProtKB pristupnom broju Q9HCN6).

[0020] O'Connor et al., 2006, takođe opisuju humani scFv fragment 1C3, niskog afiniteta za GPVI (5.4 10<-7>M), koji nije blokirao agregaciju trombocita izazvanu kolagenom niti vezivanje GPVI za kolagen, ali je potencirao inhibitorni efekat 10B12 antitela. 1C3 epitop u GPVI sadrži aminokiselinu 1168, a dalje se pretpostavlja da bi ovaj epitop mogao da obuhvati region između ostataka S164 i S182, region koji je visoko konzervativan od miša do čoveka.

[0021] Stoga postoji potreba za humanizovanim antitelom (tj. antitelom bez imunogenosti kod ljudi) sa poboljšanim afinitetom, efikasnošću i poluživotom u poređenju sa antagonistima iz prethodnog stanja tehnike, kao sredstvom za efikasnu i zadovoljavajuću prevenciju i/ili lečenje kardiovaskularnih bolesti kod ljudi. Štaviše, poželjno je da se ovi antagonisti lako prečiste.

[0022] U struci su opisana anti-GPVI antitela koja izazivaju fenotip deplecije GPVI (WO 2006/118350, WO 2011/073954, EP 2363416). Naročito, WO 2006/118350 otkriva anti-GPVI antitelo usmereno protiv svih sisara. Epitop GPVI vezan ovim antitelom je opisan i odgovara petljama 9 i 11 Ig-sličnog C2-tipa domena 2 GPVI, što odgovara aminokiselinskim ostacima 136-142 i 158-162, respektivno.

[0023] Međutim, smanjenje GPVI je nepoželjno jer se ne može kontrolisati i ireverzibilno je (tj. traje tokom životnog veka trombocita, ili čak duže zbog smanjenja GPVI na megakariocitima).

[0024] U terapiji je potreban brz i siguran antiagregacioni efekat. Stoga, trebalo bi razviti antitela koja ne izazivaju fenotip deplecije GPVI, a poželjno ne izazivaju smanjenje broja trombocita in vivo (tj. sa reverzibilnim efektom).

[0025] Prijavilac je razvio antitelo anti-GPVI koje se vezuje za novi, neopisani, konformacioni epitop. Navedeno antitelo anti-GPVI ima jak afinitet za humani GPVI i blokira interakciju GPVI sa njegovim ligandima (uključujući kolagen i fibrin), bez smanjenja broja trombocita niti iscrpljivanja GPVI in vivo. Ovaj pronalazak se stoga odnosi na poboljšano humanizovano neutralizujuće antitelo specifično za humani GPVI.

KRATAK OPIS

[0026] Ovaj pronalazak se odnosi na izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela, pri čemu aminokiselinska sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca navedenog antitela ili njegovog fragmenta sadrži SEQ ID NO: 7 i aminokiselinska sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca pomenutog antitela ili njegovog fragmenta sadrži SEQ ID NO: 8.

[0027] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku je molekul antitela izabran iz grupe koja se sastoji od celog antitela, jednolančanog antitela, Fv, fragmenta antitela kome nedostaje zglobni region IgG4 antitela i koji ima jednovalentni region vezivanja i Fab.

[0028] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku je monovalentan.

[0029] U jednom primeru izvođenja, antitelo ili fragment antitela prema pronalasku je za upotrebu kao lek.

[0030] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na kompoziciju koja sadrži antitelo koje se vezuje za humani GPVI ili njegov fragment antitela kako je gore definisano.

[0031] Ovaj pronalazak se dalje odnosi na farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo koje se vezuje za humani GPVI ili njegov fragment antitela kao što je gore definisano i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0032] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, pri čemu, pomenuto stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od arterijske i venske tromboze, restenoze, akutnog koronarnog sindroma, ishemijskih cerebrovaskularnih akcidenata, cerebralnih vaskularnih bolesti, bolesti venske tromboembolije, trombotičkih mikroangiopatija i vaskularne purpure.

[0033] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, pri čemu, pomenuto stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od koronarnih arterijskih bolesti i cerebralnih arterijskih bolesti.

[0034] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska je za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, pri čemu, navedeno stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od aterotromboze, ishemijskih događaja, akutnog koronarnog arterijskog sindroma, infarkta miokarda, moždanog udara, perkutane koronarne intervencije, tromboze stenta, ishemijske restenoze, akutne ishemije, hronične ishemije, bolesti aorte i njenih grana, periferne arterijske bolesti, venske tromboze, akutnog flebitisa, plućne embolije, tromboze povezane sa kancerom, inflamatorne tromboze i tromboze povezane sa infekcijom.

[0035] Sledeći predmet pronalaska je ekspresioni vektor koji sadrži nukleinske sekvence koje kodiraju antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela kako je gore definisano, pri čemu pomenuti vektor sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 10 ili bilo koju sekvencu koja ima sekvencu nukleinske kiseline koja deli najmanje 75% identičnosti sa navedenom SEQ ID NO: 10, i nukleinsku sekvencu koja kodira varijabilni region lakog lanca SEQ ID NO: 11 ili bilo koju sekvencu koja ima sekvencu nukleinske kiseline koja deli najmanje 75% identičnosti sa navedenom SEQ ID NO: 11.

DETALJAN OPIS

[0036] Svako upućivanje na postupke lečenja smatra se pozivanjem na jedinjenja i kompozicije ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja koji se primenjuje na humanom/životinjskom telu.

[0037] "Glikoprotein VI (GPVI)" je glikoprotein trombocitne membrane koji je uključen u interakcije trombocita i kolagena. GPVI je transmembranski receptor kolagena eksprimiran na površini trombocita. U jednom primeru izvođenja, aminokiselinska sekvenca humanog GPVI je SEQ ID NO: 13 (pristupni broj: BAA89353.1) ili bilo koja sekvenca aminokiselina koja predstavlja najmanje oko 90% identičnosti sa SEQ ID NO: 13, poželjno najmanje oko 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% identičnosti ili više sa SEQ ID NO: 13.

[0038] (SEQ ID NO: 13)

[0039] MSPSPTALFCLGLCLGRVPA (signalni peptid)

[0040] Ekstracelularni domen GPVI je sastavljen od dva domena tipa C2 slična Ig, naime D1 i D2, povezanih zglobnim interdomenom. U jednom primeru izvođenja, D1 sadrži aminokiselinske ostatke 21 do 109 SEQ ID NO: 13. U jednom primeru izvođenja, zglobni interdomen između D1 i D2 sadrži aminokiselinske ostatke 110 do 113 SEQ ID NO: 13. U jednom primeru izvođenja, D2 sadrži aminokiselinske ostatke 114 do 207 SEQ ID NO: 13.

[0041] „Oko“ ispred broja znači plus ili manje od 10% vrednosti navedenog broja.

[0042] "Antitelo" ili "imunoglobulin" - Kako se ovde koristi, termin "imunoglobulin" uključuje protein koji ima kombinaciju dva teška i dva laka lanca, bez obzira da li poseduje bilo kakvu relevantnu specifičnu imunoreaktivnost. "Antitela" se odnose na takve sklopove koji imaju značajnu poznatu specifičnu imunoreaktivnu aktivnost na antigen od interesa (npr. humani GPVI). Termin "anti-GPVI antitela" se ovde koristi za označavanje antitela koja pokazuju imunološku specifičnost za humani GPVI protein. Kao što je objašnjeno na drugom mestu ovde, "specifičnost" za humani GPVI ne isključuje unakrsnu reakciju sa homolozima vrsta GPVI. Antitela i imunoglobulini obuhvataju lake i teške lance, sa ili bez međulančane kovalentne veze između njih. Osnovne strukture imunoglobulina u sistemima kičmenjaka su relativno dobro shvaćene. Generički termin "imunoglobulin" obuhvata pet različitih klasa antitela koja se mogu biohemijski razlikovati. Svih pet klasa antitela su u okviru ovog pronalaska; sledeća diskusija će generalno biti usmerena na IgG klasu molekula imunoglobulina. Što se tiče IgG, imunoglobulini sadrže dva identična laka polipeptidna lanca molekulske težine od oko 23.000 Daltona i dva identična teška lanca molekulske težine od oko 53.000-70.000 Daltona. Četiri lanca su spojena disulfidnim vezama u "Y" konfiguraciji pri čemu laki lanci uokviruju teške lance počevši od ušća "Y" i nastavljajući se kroz varijabilni region. Laki lanci antitela su klasifikovani kao kapa ili lambda ([κ], [λ]). Svaka klasa teškog lanca može biti vezana ili sa kapa ili lambda lakim lancem. Uopšteno govoreći, laki i teški lanci su kovalentno vezani jedan za drugi, a "repni" regioni dva teška lanca su međusobno povezani kovalentnim disulfidnim vezama ili nekovalentnim vezama kada se imunoglobulini generišu bilo hibridomima, B ćelijama ili genetskim inženjeringom dobijenim ćelijama domaćinima. U teškom lancu, aminokiselinske sekvence idu od N-kraja na račvastim krajevima Y konfiguracije do C-kraja na dnu svakog lanca. Stručnjaci će razumeti da su teški lanci klasifikovani kao gama, mu, alfa, delta ili epsilon (γ, µ, α, δ, ε) sa nekim podklasama među njima (npr. γ1 - γ4). Priroda ovog lanca određuje "klasu" antitela kao IgG, IgM, IgA IgD ili IgE, respektivno. Podklase (izotipovi) imunoglobulina, npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, itd. su dobro okarakterisane i poznato je da daju funkcionalnu specijalizaciju. Modifikovane verzije svake od ovih klasa i izotipova su lako uočljive kvalifikovanom stručnjaku u pogledu trenutnog otkrića i, shodno tome, nalaze se u okviru ovog pronalaska. Kao što je gore navedeno, varijabilni region antitela omogućava antitelu da selektivno prepozna i specifično vezuje epitope na antigenima. To jest, varijabilni domen lakog lanca (VL domen) i varijabilni domen teškog lanca (VH domen) antitela se kombinuju da bi formirali varijabilni region koji definiše trodimenzionalno mesto vezivanja antigena. Ova kvaternarna struktura antitela formira mesto vezivanja antigena prisutno na kraju svakog kraka "Y". Tačnije, mesto vezivanja antigena je definisano sa tri regiona koji određuju komplementarnost (CDR) na svakom od VH i VL lanaca.

[0043] "Izolovano antitelo" - Kako se ovde koristi, "izolovano antitelo" je ono koje je izdvojeno i/ili izvučeno iz komponente svog prirodnog okruženja. Zagađujuće komponente njegovog prirodnog okruženja su materijali koji bi ometali dijagnostičku ili terapijsku upotrebu antitela, a mogu uključivati enzime, hormone i druge proteinske ili neproteinske komponente. U poželjnim primerima izvođenja, antitelo se prečišćava: (1) na više od 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95% ili više po težini antitela kako je određeno Lowry metodom, a najpoželjnije više od 99% prema težini; (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili unutrašnje aminokiselinske sekvence korišćenjem „spinning cup“ sekvenatora; ili (3) do homogenosti kao što je prikazano pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima i korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno, srebrnog bojenja. Izolovano antitelo uključuje antitelo in situ unutar rekombinantnih ćelija pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja antitela neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovano antitelo će biti pripremljeno najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0044] „Varijante afiniteta“ - Kako se ovde koristi, izraz "varijanta afiniteta" se odnosi na varijantu antitela koje pokazuje jednu ili više promena u aminokiselinskoj sekvenci u poređenju sa referentnim anti-GPVI antitelom, pri čemu varijanta afiniteta pokazuje izmenjeni afinitet za humani GPVI protein u poređenju sa referentnim antitelom. Tipično, varijante afiniteta će pokazati poboljšani afinitet za humani GPVI, u poređenju sa referentnim anti-GPVI antitelom. Poboljšanje može biti ili niži KDza humani GPVI, viši KAza humani GPVI, brža stopa asocijacije za humani GPVI ili sporija stopa disocijacije za humani GPVI ili promena u obrascu unakrsne reaktivnosti sa nehumanim GPVI homolozima. Afinitetne varijante tipično pokazuju jednu ili više promena u aminokiselinskoj sekvenci u CDR regionima, u poređenju sa referentnim anti-GPVI antitelom. Takve supstitucije mogu dovesti do zamene originalne aminokiseline prisutne na datoj poziciji u CDR regionima sa drugim aminokiselinskim ostatkom, koji može biti aminokiselinski ostatak koji se pojavljuje u prirodi ili aminokiselinski ostatak koji se ne pojavljuje u prirodi. Supstitucije aminokiselina mogu biti konzervativne ili nekonzervativne.

[0045] "Vezujuće mesto" - Kako se ovde koristi, termin "vezujuće mesto" sadrži region proteina koji je odgovoran za selektivno vezivanje za ciljni antigen od interesa (npr. humani GPVI). Vezujući domeni ili vezujući regioni sadrže najmanje jedno mesto vezivanja. Primeri vezujućih domena uključuju varijabilni domen antitela. Protein pronalaska može da sadrži jedno mesto vezivanja antigena ili više (npr. dva, tri ili četiri) mesta vezivanja antigena. Međutim, poželjno je da protein pronalaska sadrži jedno mesto vezivanja antigena.

[0046] "Konzervativna aminokiselinska supstitucija" - Kako se ovde koristi, "konzervativna aminokiselinska supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima sličan bočni lanac. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici, uključujući osnovne bočne lance (npr. lizin, arginin, histidin), kisele bočne lance (npr. asparaginsku kiselinu, glutaminsku kiselinu), nenaelektrisane polarne bočne lance (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein), nepolarne bočne lance (npr., alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin, triptofan), beta-razgranate bočne lance, treonin (npr. izoleucin) i aromatične bočne lance (npr. tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Dakle, neesencijalni aminokiselinski ostatak u polipeptidu imunoglobulina može biti zamenjen drugim aminokiselinskim ostatkom iz iste porodice bočnih lanaca. U sledećem primeru izvođenja, niz aminokiselina može biti zamenjen strukturno sličnim nizom koji se razlikuje po redosledu i/ili sastavu članova porodice bočnih lanaca.

[0047] "Himerni" - Kako se ovde koristi, "himerni" protein sadrži prvu aminokiselinsku sekvencu povezanu sa drugom aminokiselinskom sekvencom sa kojom nije prirodno vezan u prirodi. Aminokiselinske sekvence mogu normalno postojati u odvojenim proteinima koji su spojeni u fuzioni protein ili mogu normalno postojati u istom proteinu, ali su smešteni u novom rasporedu u fuzionom proteinu. Himerni protein se može stvoriti, na primer, hemijskom sintezom, ili stvaranjem i translacijom polinukleotida u kome su peptidni regioni kodirani u željenoj vezi.

[0048] "CDR" - Kako se ovde koristi, izraz "CDR" ili "region koji određuje komplementarnost" označava nekontinuirana mesta za kombinovanje antigena koja se nalaze unutar varijabilnog regiona i teškog i lakog lanca polipeptida. CDR regioni su identifikovani prema sledećim pravilima kao što su izvedena iz Kabat et al. (1991) i Chotia and Lesk (1987):

- CDR-L1:

Početak - Približno ostatak 24

Ostatak pre je uvek Cys

Ostatak posle je uvek Trp. Obično TRP-TYR-GLN, ali takođe, TRP-LEU-GLN, TRP-PHE-GLN, TRP-TYR-LEU

Dužina 10 do 17 ostataka

- CDR-L2:

Početak - uvek 16 ostataka nakon završetka L1

Ostaci pre generalno ILE-TYR, ali takođe, VAL-TYR, ILE-LYS, ILE-PHE

Dužina uvek 7 ostataka.

- CDR-L3:

Početak - uvek 33 ostatka nakon završetka L2

Ostatak pre je uvek Cys

Ostaci posle uvek PHE-GLY-XXX-GLY (SEQ ID NO: 21)

Dužina 7 do 11 ostataka

- CDR-H1:

1

Početak – Približno ostatak 26 (uvek 4 nakon CYS) [Chothia / AbM definicija] Kabat definicija počinje 5 ostataka kasnije

Ostaci pre uvek CYS-XXX-XXX-XXX (SEQ ID NO: 22)

Ostaci posle uvek TRP. Tipično TRP-VAL, ali takođe, TRP-ILE, TRP-ALA

Dužina 10 do 12 ostataka (AbM definicija) Chothia definicija isključuje poslednja 4 ostatka

- CDR-H2:

Početak - uvek 15 ostataka nakon završetka Kabat / AbM definicije) CDR-H1 ostataka pre tipično LEU-GLU-TRP-ILE-GLY (SEQ ID NO: 23), ali brojne varijacije

Ostaci posle LYS/ARG-LEU/ILE/VAL/PHE/THR/ALA-THR/SER/ILE/ALA Dužina Kabat definicija 16 do 19 ostataka (AbM definicija završava 7 ostataka ranije)

- CDR-H3:

Početak - uvek 33 ostatka nakon završetka CDR-H2 (uvek 2 posle CYS)

Ostaci pre uvek CYS-XXX-XXX (obično CYS-ALA-ARG)

Ostaci posle uvek TRP-GLY-XXX-GLY (SEQ ID NO: 24)

Dužina od 3 do 25 ostataka

[0049] „CH2 domen“ - Kako se ovde koristi, termin "CH2 domen" uključuje region molekula teškog lanca koji se obično proteže od oko 231 aminokiseline do oko aminokiseline 340. CH2 domen je jedinstven po tome što nije blisko uparen sa drugim domenom. Umesto toga, dva N-vezana razgranata lanca ugljenih hidrata su smeštena između dva CH2 domena intaktnog prirodnog IgG molekula. Spekulisalo se da ugljeni hidrati mogu da budu zamena za uparivanje domen-domen i da pomognu u stabilizaciji CH2 domena (Burton, Molec. Immunol. 22 (1985) 161-206).

[0050] "Izveden iz" - Kako se ovde koristi, termin "izveden iz" označenog proteina (npr. anti-GPVI antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen) odnosi se na poreklo proteina. U jednom primeru izvođenja, sekvenca proteina ili aminokiselina koja je izvedena iz određenog početnog proteina je CDR sekvenca ili sekvenca srodna sa njom. U jednom primeru izvođenja, sekvenca aminokiselina koja je izvedena iz određenog početnog proteina nije susedna. Na primer, u jednom primeru izvođenja, jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR regiona su izvedeni iz početnog antitela. U jednom primeru izvođenja, sekvenca proteina ili aminokiselina koja je izvedena iz određenog početnog proteina ili aminokiselinske sekvence ima aminokiselinsku sekvencu koja je suštinski identična onoj od početne sekvence, ili njenom regionu pri čemu se region sastoji od najmanje 3 -5 aminokiselina, najmanje 5-10 aminokiselina, najmanje 10-20 aminokiselina, najmanje 20-30 aminokiselina, ili najmanje 30-50 aminokiselina, ili koja se na drugi način može identifikovati prosečnom stručnjaku u stanju tehnike koja svoje poreklo ima u početnoj sekvenci. U jednom primeru izvođenja, jedna ili više CDR sekvenci izvedenih iz početnog antitela se menjaju da bi proizvele varijante CDR sekvence, npr. afinitetne varijante, pri čemu varijantne CDR sekvence održavaju aktivnost vezivanja GPVI.

[0051] "Diatela" - Kako se ovde koristi, termin "diatela" se odnosi na male fragmente antitela pripremljene konstruisanjem sFv fragmenata (videti sFv paragraf) sa kratkim linkerima (oko 5-10 ostataka) između VH i VL domena tako da se postiže inter-lančano, ali ne intra-lančano uparivanje V domena, što rezultira dvovalentnim fragmentom, tj. fragmentom koji ima dva mesta za vezivanje antigena. Bispecifična diatela su heterodimeri dva "unakrsno vezujuća" sFv fragmenta u kojima su VH i VL domeni dva antitela prisutni na različitim polipeptidnim lancima. Diatela su potpunije opisana u npr. EP 0404097; WO 1993/011161; i Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 90:6444-6448 (1993).

[0052] "Konstruisano inženjeringom" – Kako se ovde koristi, termin „konstruisano inženjeringom“ uključuje manipulaciju molekulima nukleinske kiseline ili polipeptida sintetičkim sredstvima (npr. rekombinantnim tehnikama, in vitro sintezom peptida, enzimskim ili hemijskim spajanjem peptida ili nekom kombinacijom ovih tehnika). Poželjno, antitela pronalaska su konstruisana inženjeringom, uključujući, na primer, humanizovana i/ili himerna antitela, i antitela koja su konstruisana da poboljšaju jedno ili više svojstava, kao što je vezivanje antigena, stabilnost/poluživot ili efektorska funkcija.

[0053] "Epitop" - Kako se ovde koristi, termin "epitop" se odnosi na specifičan raspored aminokiselina koje se nalaze na proteinu ili proteinima za koje se antitelo vezuje. Epitopi se često sastoje od hemijski aktivnih površinskih grupa molekula kao što su aminokiseline ili bočni lanci šećera, i imaju specifične trodimenzionalne strukturne karakteristike kao i specifične karakteristike naelektrisanja. Epitopi mogu biti linearni ili konformacioni, tj. da uključuju dve ili više sekvenci aminokiselina u različitim regionima antigena koji ne moraju nužno biti uzastopni.

[0054] "Okvirni region" - Kako se ovde koristi, termin "okvirni region" ili "FR region" uključuje aminokiselinske ostatke koji su deo varijabilnog regiona, ali nisu deo CDR regiona (npr., korišćenjem Kabat/Chothia definicije CDR regiona). Prema tome, okvir varijabilnog regiona je dužine između oko 100-120 aminokiselina, ali uključuje samo one aminokiseline izvan CDR regiona. Za specifičan primer varijabilnog regiona teškog lanca i za CDR regione kako je definisao Kabat/Chothia, okvirni region 1 može odgovarati domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 1-25; okvirni region 2 može odgovarati domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 36-49; okvirni region 3 može odgovarati domenu varijabilnog regiona koji obuhvata aminokiseline 67-98, a okvirni region 4 može odgovarati domenu varijabilnog regiona od aminokiselina 110 do kraja varijabilnog regiona. Okvirni regioni za laki lanac su na sličan način odvojeni svakim od CDR regiona varijabilnog regiona lakog lanca. U prirodnim antitelima, šest CDR regiona prisutnih na svakom monomernom antitelu su kratke, neprekidne sekvence aminokiselina koje su specifično pozicionirane da formiraju mesto vezivanja antigena dok antitelo poprima svoju trodimenzionalnu konfiguraciju u vodenom okruženju. Ostaci teških i lakih varijabilnih domena pokazuju manju inter-molekularnu varijabilnost u aminokiselinskoj sekvenci i nazivaju se okvirni regioni. Okvirni regioni uglavnom usvajaju konformaciju [beta] lista, a CDR regioni formiraju petlje koje povezuju, a u nekim slučajevima čine deo strukture [beta] lista. Dakle, ovi okvirni regioni deluju tako da formiraju skelu koja obezbeđuje pozicioniranje šest CDR regiona u ispravnoj orijentaciji putem inter-lančanih, nekovalentnih interakcija. Mesto vezivanja antigena formirano od pozicioniranih CDR regiona definiše površinu komplementarnu epitopu na imunoreaktivnom antigenu. Ova komplementarna površina stimuliše nekovalentno vezivanje antitela za epitop imunoreaktivnog antigena. Stručnjak iz date oblasti tehnike može lako da identifikuje položaj CDR regiona.

[0055] "Fragment" - Kako se ovde koristi, termin "fragment" se odnosi na deo ili region antitela ili lanca antitela koji sadrži manje aminokiselinskih ostataka od intaktnog ili kompletnog antitela ili lanca antitela. Termin "fragment koji se vezuje za antigen" odnosi se na proteinski fragment imunoglobulina ili antitela koji vezuje antigen ili je u kompeticiji sa intaktnim antitelom (tj., sa netaknutim antitelom iz kojeg su izvedeni) za vezivanje antigena (tj. specifično vezivanje za humani GPVI). Kako se ovde koristi, termin "fragment" molekula antitela uključuje fragmente antitela koji se vezuju za antigen, na primer, varijabilni domen lakog lanca antitela (VL), varijabilni domen teškog lanca antitela (VH), jednolančano antitelo (scFv), F(ab')2 fragment, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, fragment antitela sa jednim domenom (DAb), jednokrako (monovalentno) antitelo, diatela ili bilo koji molekul koji se vezuje za antigen formiran kombinacijom, sklapanjem ili konjugacijom takvih fragmenata koji se vezuju za antigen. Fragmenti se mogu dobiti, na primer, hemijskim ili enzimskim tretmanom intaktnog ili kompletnog antitela ili lanca antitela ili rekombinantnim putem.

[0056] "Fv" - Kako se ovde koristi, termin "Fv" je minimalni fragment antitela koji sadrži kompletno mesto za prepoznavanje i vezivanje antigena. Ovaj fragment se sastoji od dimera jednog domena varijabilnog regiona teškog i jednog lakog lanca u čvrstoj, nekovalentnoj vezi. Iz savijanja ova dva domena proizilazi šest hipervarijabilnih petlji (po tri petlje iz H i L lanca) koje doprinose vezivanju antigena i daju antitelu specifičnost vezivanja antigena. Međutim, čak i jedan varijabilni domen (ili polovina Fv koji sadrži samo tri CDR regiona specifična za antigen) ima sposobnost da prepozna i veže antigen, iako sa nižim afinitetom od celog mesta vezivanja.

1

[0057] „Region teškog lanca“ - Kako se ovde koristi, termin "region teškog lanca" uključuje aminokiselinske sekvence izvedene iz konstantnih domena teškog lanca imunoglobulina. Protein koji sadrži region teškog lanca sadrži najmanje jedan od: CH1 domena, zglobnog (npr. gornjeg, srednjeg i/ili donjeg zglobnog regiona) domena, CH2 domena, CH3 domena, ili njihove varijante ili fragmenta. U jednom primeru izvođenja, vezujući molekul pronalaska može da sadrži Fc region teškog lanca imunoglobulina (npr. zglobni deo, CH2 domen i CH3 domen). U sledećem primeru izvođenja, vezujućem molekulu pronalaska nedostaje najmanje region konstantnog domena (npr. ceo ili deo CH2 domena). U određenim primerima izvođenja, najmanje jedan, a poželjno svi, konstantni domeni su izvedeni iz teškog lanca humanog imunoglobulina. Na primer, u jednom poželjnom primeru izvođenja, region teškog lanca obuhvata potpuno humani zglobni domen. U drugim poželjnim primerima izvođenja, region teškog lanca koji sadrži potpuno humani Fc region (npr. sekvence zglobnog, CH2 i CH3 domena iz humanog imunoglobulina). U određenim primerima izvođenja, gradivni konstantni domeni regiona teškog lanca su iz različitih molekula imunoglobulina. Na primer, region teškog lanca proteina može da sadrži CH2 domen izveden iz IgG1 molekula i zglobni region izveden iz IgG3 ili IgG4 molekula. U ostalim primerima izvođenja, konstantni domeni su himerni domeni koji sadrže regione različitih molekula imunoglobulina. Na primer, zglobni može da sadrži prvi region od IgG1 molekula i drugi region od IgG3 ili IgG4 molekula. Kao što je gore navedeno, stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u tehnici će biti jasno da konstantni domeni regiona teškog lanca mogu biti modifikovani tako da variraju u aminokiselinskoj sekvenci od prirodnog (divljeg tipa) imunoglobulinskog molekula. To jest, proteini pronalaska koji su ovde otkriveni mogu da sadrže izmene ili modifikacije jednog ili više konstantnih domena teškog lanca (CH1, zglobni, CH2 ili CH3) i/ili konstantnog domena lakog lanca (CL). Primeri modifikacija uključuju adicije, delecije ili supstitucije jedne ili više aminokiselina u jednom ili više domena.

[0058] „Zglobni region“ - Kako se ovde koristi, termin "zglobni region" uključuje region molekula teškog lanca koji spaja CH1 domen sa CH2 domenom. Ovaj zglobni region obuhvata približno 25 ostataka i fleksibilan je, omogućavajući na taj način da se dva N-terminalna regiona za vezivanje antigena kreću nezavisno. Zglobni regioni se mogu podeliti u tri različita domena: gornji, srednji i donji zglobni domeni (Roux et al., J. Immunol. 1998 161 :4083).

[0059] Termini "hipervarijabilna petlja" i "region koji određuje komplementarnost" nisu striktno sinonimi, pošto su hipervarijabilne petlje (HV) definisane na osnovu strukture, dok su regioni koji određuju komplementarnost (CDR) definisani na osnovu varijabilnosti sekvence (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD., 1983) i granice HV i CDR regiona mogu biti različite u nekim VH i VL domenima. CDR regioni VL i VH domena se tipično mogu definisati Kabat/Chothia definicijom (vidi gore). U jednom primeru izvođenja, CDR regioni VL i VH domena mogu da sadrže sledeće aminokiseline: ostatke 24-39 (CDRL1), 55-61 (CDRL2) i 94-102 (CDRL3) u varijabilnom domenu lakog lanca, i ostatke 26-35 (CDRH1), 50-66 (CDRH2) i 99-109 (CDRH3) u varijabilnom domenu teškog lanca. Dakle, HV mogu biti sadržani u okviru odgovarajućih CDR regiona i reference ovde na "hipervarijabilne petlje" VH i VL domena treba da se tumače kao da takođe obuhvataju odgovarajuće CDR regione, i obrnuto, osim ako nije drugačije naznačeno. Više konzervativnih regiona varijabilnih domena nazivaju se okvirni region (FR), kao što je definisano u nastavku. Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR (FR1, FR2, FR3 i FR4, respektivno), u velikoj meri usvajajući konfiguraciju [beta]-lista, povezan sa tri hipervarijabilne petlje. Hipervarijabilne petlje u svakom lancu drže se zajedno u neposrednoj blizini pomoću FR i, sa hipervarijabilnim petljama iz drugog lanca, doprinose formiranju mesta antitela za vezivanje antigena. Strukturna analiza antitela je otkrila vezu između sekvence i oblika vezujućeg mesta formiranog od regiona koji određuju komplementarnost (Chothia et al., J. Mol. Biol.227: 799-817 (1992)); Tramontano et al., J. Mol. Biol, 215: 175-182 (1990)). Uprkos njihovoj visokoj varijabilnosti sekvenci, pet od šest petlji usvajaju samo mali repertoar konformacija glavnog lanca, nazvanih "kanonske strukture". Ove konformacije su pre svega određene dužinom petlji, a drugo, prisustvom ključnih ostataka na određenim pozicijama u petlji i u okvirnim regionima koji određuju konformaciju kroz njihovo pakovanje, vodoničnu vezu ili sposobnost da se usvoje neuobičajene konformacije glavnoglanca.

[0060] "Humanizovani" - Kako se ovde koristi, termin "humanizovani" se odnosi na himerne imunoglobuline, lance imunoglobulina ili njihove fragmente (kao što su Fv, Fab, Fab', ili druge podsekvence antitela koji se vezuju za antigen) koji sadrže minimalnu sekvencu izvedenu iz mišjeg imunoglobulina. Na primer, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) primaoca zamenjeni ostacima iz CDR originalnog antitela (donorsko antitelo) uz održavanje željene specifičnosti, afiniteta, i kapaciteta originalnog antitela.

[0061] "Humanizujuće supstitucije" - Kako se ovde koristi, termin "humanizujuće supstitucije" se odnosi na supstitucije aminokiselina u kojima je aminokiselinski ostatak prisutan na određenoj poziciji u VH ili VL domenu ne-humanog anti-GPVI antitela (na primer mišjeg anti-GPVI antitela) zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji se javlja na ekvivalentnoj poziciji u referentnom humanom VH ili VL domenu. Referentni humani VH ili VL domen može biti VH ili VL domen kodiran humanom klicinom linijom, u kom slučaju se supstituisani ostaci mogu nazvati "supstitucijama klicine linije". Humanizujuće/za klicinu liniju supstitucije mogu se napraviti u okvirnim regionima i/ili CDR regionima anti-GPVI antitela, ovde definisanim.

1

[0062] "Visoka humana homologija" - Antitelo koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) smatraće se da ima visoku humanu homologiju ako VH domeni i VL domeni, uzeti zajedno, pokazuju najmanje 70, 75, 80, 85, 90, 95% ili više identičnosti aminokiselinske sekvence sa VH i VL sekvencama koje se najbliže podudaraju sa humanim klicinim linijama. Antitela koja imaju visoku humanu homologiju mogu uključivati antitela koja sadrže VH i VL domene nativnih ne-humanih antitela koja pokazuju dovoljno visok % identičnosti sekvenci sa sekvencom humane klicine linije, kao i konstruisanih inženjeringom, posebno humanizovanih, varijanti takvih antitela i takođe "potpuno humanih" antitela. U jednom primeru izvođenja, VH domen antitela sa visokom humanom homologijom može da pokaže identičnost aminokiselinske sekvence ili homologiju sekvence od 75%, 80% ili više sa jednim ili više humanih VH domena u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4. U ostalim primerima izvođenja, identičnost aminokiselinske sekvence ili homologija sekvence između VH domena proteina pronalaska i sekvence VH domena humane klicine linije koja se najbliže podudara može biti 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100%. U jednom primeru izvođenja, VH domen antitela sa visokom humanom homologijom može da sadrži jednu ili više (npr. 1 do 20) nepodudaranja sekvenci aminokiselina u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4, u poređenju sa najbližom humanom VH sekvencom. U sledećem primeru izvođenja, VL domen antitela sa visokom humanom homologijom može da pokaže identičnost sekvence ili homologiju sekvence od 80% ili više sa jednim ili više humanih VL domena u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4. U ostalim primerima izvođenja, identičnost aminokiselinske sekvence ili homologija sekvence između VL domena proteina pronalaska i sekvence VL domena humane klicine linije koja se najbliže podudara može biti 85% ili više 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100%.

[0063] U jednom primeru izvođenja, VL domen antitela sa visokom humanom homologijom može da sadrži jedno ili više (npr.1 do 20, poželjno 1 do 10 i poželjnije 1 do 5) nepodudaranja aminokiselinskih sekvenci u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4, u poređenju sa najbližom sekvencom humanog VL. Pre analize procenta identičnosti sekvenci između antitela sa visokom humanom homologijom i VH i VL humane klicine linije, mogu se odrediti kanonski nabori, koji omogućavaju identifikaciju porodice segmenata humane klicine linije sa identičnom kombinacijom kanonskih nabora za H1 i H2 ili L1 i L2 (i L3). Nakon toga, član porodice humane klicine linije koji ima najviši stepen homologije sekvence sa varijabilnim regionom antitela od interesa je izabran za bodovanje homologije sekvence. Određivanje Chothia kanonskih klasa hipervarijabilnih petlji L1, L2, L3, H1 i H2 može se izvršiti pomoću bioinformatičkih alata koji su javno dostupni na veb stranici www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html.page. Izlaz programa pokazuje ključne zahteve za ostatke u

1

datoteci sa podacima. U ovim datotekama sa podacima, ključne pozicije ostataka su prikazane sa dozvoljenim aminokiselinama na svakoj poziciji. Sekvenca varijabilnog regiona antitela od interesa je data kao ulaz i prvo je usklađena sa konsenzus sekvencom antitela da bi se dodelila Kabat/Chothia šema numerisanja. Analiza kanonskih nabora koristi skup ključnih šablona ostataka izvedenih automatizovanom metodom koju su razvili Martin i Tornton (Martin et al., J. Mol. Biol. 263:800-815 (1996)). Sa određenim poznatim V segmentom humane klicine linije, koji koristi istu kombinaciju kanonskih nabora za H1 i H2 ili L1 i L2 (i L3), može se odrediti najbolji odgovarajući član porodice u smislu homologije sekvence. Pomoću bioinformatičkih alata može se odrediti procenat identičnosti sekvenci između aminokiselinskih sekvenci okvira VH i VL domena antitela od interesa i odgovarajućih sekvenci kodiranih humanom klicinom linijom, ali se može primeniti i ručno poravnavanje sekvenci. Sekvence humanog imunoglobulina mogu se identifikovati iz nekoliko baza podataka o proteinima, kao što je VBase (http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/) ili baze podataka Pluckthun/Honegger (http://www.bioc.unizh. ch/antibody/Sequences/Germline s). Da bi se uporedile humane sekvence sa V regionima VH ili VL domena u antitelu od interesa, može se koristiti algoritam poravnanja sekvence kao što je dostupan preko veb stranica kao što je www.expasy.ch/tools/#align, ali se može izvesti i ručno poravnanje sa ograničenim skupom sekvenci. Selekcije lakog i teškog lanca humane klicine linije iz porodica sa istim kombinacijama kanonskih nabora i sa najvišim stepenom homologije sa okvirnim regionima 1, 2 i 3 svakog lanca su odabrane i upoređene sa varijabilnim regionom od interesa; takođe se FR4 proverava u odnosu na JH i JK ili JL regione humane klicine linije. Imajte na umu da se u izračunavanju ukupnog procenta homologije sekvence, ostaci FR1, FR2 i FR3 procenjuju korišćenjem sekvence koja se najbliže podudara iz porodice humane klicine linije sa identičnom kombinacijom kanonskih nabora. Boduju se samo ostaci različiti od najbližeg podudaranja ili drugi članovi iste porodice sa istom kombinacijom kanonskih nabora (napomena - isključujući razlike kodirane prajmerom). Međutim, za potrebe humanizacije, ostaci u okvirnim regionima identičnim članovima drugih familija humanr klicine linije, koji nemaju istu kombinaciju kanonskih nabora, mogu se smatrati „humanim“, uprkos činjenici da su oni ocenjeni kao „negativni“ prema prema gore opisanim strogim uslovima. Ova pretpostavka je zasnovana na pristupu humanizacije „pomešaj i spoji“, u kojem se svaki od FR1, FR2, FR3 i FR4 posebno upoređuje sa svojom najbližom sekvencom humane klicine linije i humanizovani molekul stoga sadrži kombinaciju različitih FR kao što je to učinjeno od strane Kua i kolega (Ku et al., Clin. Cancer Res.5:3095-3100 (1999)) i Ono i kolega (Ono et al., Mol. Immunol. 36:387-395 (1999)). Granice pojedinačnih okvirnih regiona mogu biti dodeljene korišćenjem IMGT šeme numeracije, koja je adaptacija šeme numeracije Chothia (Lefranc et al., Nucleic acid res 27: 209-212 (1999); http://im.gt.cines.fr). Antitela sa visokom humanom homologijom mogu

1

sadržati hipervarijabilne petlje ili CDR regione koji imaju humane ili slične humanim kanonske nabore, kao što je detaljno razmotreno u nastavku. U jednom primeru izvođenja, najmanje jedna hipervarijabilna petlja ili CDR u VH domenu ili VL domenu antitela sa visokom humanom homologijom može biti dobijena ili izvedena iz VH ili VL domena ne-humanog antitela, a ipak pokazuje predviđenu ili stvarnu strukturu kanonskog nabora koja je suštinski identična strukturi kanonskog nabora koja se javlja u humanim antitelima. U struci je dobro poznato da iako su primarne aminokiselinske sekvence hipervarijabilnih petlji prisutne u VH domenima i VL domenima kodiranih humanom klicinom linijom, po definiciji, veoma varijabilne, sve hipervarijabilne petlje, osim CDR H3 VH domena, usvajaju samo nekoliko različitih strukturnih konformacija, nazvanih kanonski nabori (Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Tramontano et al., Proteins 6:382-94 (1989)), koji zavise i od dužine hipervarijabilne petlje i od prisustva takozvanih kanonskih aminokiselinskih ostataka (Chothia et al., J. Mol. Biol.196:901-917 (1987)). Stvarne kanonske strukture hipervarijabilnih petlji u intaktnim VH ili VL domenima mogu se odrediti strukturnom analizom (npr. rendgenska kristalografija), ali je takođe moguće predvideti kanonsku strukturu na osnovu ključnih aminokiselinskih ostataka koji su karakteristični za određeni strukturu (o kojoj se dalje govori u nastavku). U suštini, specifičan obrazac ostataka koji određuje svaku kanonsku strukturu formira "potpis" koji omogućava da se kanonska struktura prepozna u hipervarijabilnim petljama VH ili VL domena nepoznate strukture; kanonske strukture se stoga mogu predvideti samo na osnovu primarne aminokiselinske sekvence. Predviđene kanonske strukture nabora za hipervarijabilne petlje bilo koje VH ili VL sekvence u antitelu sa visokom humanom homologijom mogu se analizirati korišćenjem algoritama koji su javno dostupni na www.bioinf.org.uk/abs/chothia.html, www.biochem.ucl.ac.uk/~martin/antibodies.html i www.bioc.unizh.ch/antibody/Sequences/Germlines/Vbase_hVk.html. Ovi alati dozvoljavaju da se VH ili VL sekvence upita poravnaju sa sekvencama humanog VH ili VL domena poznate kanonske strukture, i da se napravi predviđanje kanonske strukture za hipervarijabilne petlje sekvence upita. U slučaju VH domena, petlje H1 i H2 mogu se oceniti kao da imaju kanonsku strukturu nabora "suštinski identičnu" strukturi kanonskog nabora za koju je poznato da se javlja u humanim antitelima ako je bar prvi, a poželjno oba, od sledećih kriterijuma ispunjen:

1. Identična dužina, određena brojem ostataka, najbližoj humanoj kanonskoj strukturnoj klasi.

2. Najmanje 33% identičnosti, poželjno najmanje 50% identičnosti sa ključnim aminokiselinskim ostacima opisanim za odgovarajuće humane H1 i H2 kanonske strukturne klase (napomena za potrebe prethodne analize H1 i H2 petlje se tretiraju

1

odvojeno i svaka se upoređuje sa njenom najbližom humanom kanonskom strukturnom klasom). Prethodna analiza se oslanja na predviđanje kanonske strukture H1 i H2 petlji antitela od interesa. Ako su stvarne strukture H1 i H2 petlji u antitelu od interesa poznate, na primer na osnovu rendgenske kristalografije, onda se H1 i H2 petlje u antitelu od interesa takođe mogu oceniti kao da imaju kanonsku strukturu nabora "u suštini identičnu" kanonskoj strukturi nabora za koju se zna da se javlja u humanim antitelima ako se dužina petlje razlikuje od dužine najbliže humane kanonske strukturne klase (obično za 1 ili 2 aminokiseline), ali stvarna struktura H1 i H2 petlje u antitelu od interesa odgovara strukturi humanog kanonskog nabora. Ključne aminokiselinske ostatke pronađene u humanim kanonskim strukturnim klasama za prvu i drugu hipervarijabilnu petlju humanih VH domena (H1 i H2) opisuju Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799-817 (1992), čiji je sadržaj ovde u celini obuhvaćen kao referenca. Konkretno, tabela 3 na strani 802 Chothia et al., koji je ovde posebno uključen kao referenca, navodi poželjne aminokiselinske ostatke na ključnim mestima za H1 kanonske strukture koje se nalaze u humanoj klicinoj liniji, dok Tabela 4 na strani 803, takođe posebno uključena referencom, navodi poželjne aminokiselinske ostatke na ključnim mestima za CDR H2 kanonske strukture pronađene u humanoj klicinoj liniji. U primeru izvođenja, i H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom humanom homologijom pokazuju predviđenu ili stvarnu strukturu kanonskog nabora koja je suštinski identična strukturi kanonskog nabora koja se javlja u humanim antitelima. Antitela sa visokom humanom homologijom mogu da sadrže VH domen u kome hipervarijabilne petlje H1 i H2 formiraju kombinaciju kanonskih struktura nabora koja je identična kombinaciji kanonskih struktura za koje je poznato da se javljaju u najmanje jednom VH domenu humane klicine linije. Primećeno je da se samo određene kombinacije kanonskih struktura nabora na H1 i H2 zapravo javljaju u VH domenima koje kodira humana klicina linija. U jednom primeru izvođenja H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom humanom homologijom mogu se dobiti iz VH domena nehumane vrste, a ipak formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura nabora koja je identična kombinaciji kanonskih struktura nabora za koje je poznato da se javljaju u humanoj klicinoj liniji ili somatski mutiranom VH domenu. U neograničavajućim primerima izvođenja H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom humanom homologijom mogu se dobiti iz VH domena ne-humane vrste i formirati jednu od sledećih kanonskih kombinacija: 1-1, 1-2 , 1-3, 1-6, 1-4, 2- 1, 3-1 i 3-5. Antitelo sa visokom humanom homologijom može da sadrži VH domen koji pokazuje i visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VH, i koje sadrži hipervarijabilne petlje koje pokazuju strukturnu homologiju sa humanim VH. Može biti korisno da

1

kanonski nabori prisutni na H1 i H2 u VH domenu antitela sa visokom humanom homologijom, i njihova kombinacija, budu "tačni" za sekvencu humane VH klicine linije koja predstavlja najbliže podudaranje sa VH domenom antitela sa visokom humanom homologijom u smislu ukupne identičnosti primarne aminokiselinske sekvence. Na primer, ako je najbliže podudaranje sekvence sa VH3 domenom humane klicine linije, onda može biti korisno za H1 i H2 da formiraju kombinaciju kanonskih nabora koja se takođe prirodno javlja u domenu VH3 čoveka. Ovo može biti posebno važno u slučaju antitela sa visokom humanom homologijom koja su izvedena iz nehumanih vrsta, npr. antitela koja sadrže VH i VL domene koja su izvedena iz konvencionalnih antitela kamile, posebno antitela koja sadrže VH i VL domene humanizovanih kamilida. Tako, u jednom aspektu, VH domen antitela na GPVI sa visokom humanom homologijom može da pokaže identičnost sekvence ili homologiju sekvence od 70% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili veći, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100% sa humanim VH domenom u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4, i pored toga H1 i H2 u istom antitelu se dobijaju od nehumanog VH domena, ali formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura nabora koja je ista kao kombinacija kanonskog nabora za koju se zna da se prirodno javlja u istom humanom VH domenu. U ostalim primerima izvođenja, L1 i L2 u VL domenu antitela sa visokom humanom homologijom su svaki dobijeni iz VL domena nehumane vrste, i svaki pokazuje predviđenu ili stvarnu strukturu kanonskog nabora koja je suštinski identična kanonskom naboru struktura koja se javlja u humanim antitelima. Kao i kod VH domena, hipervarijabilne petlje VL domena i tipa VLambda i VKapa mogu usvojiti ograničen broj konformacija ili kanonskih struktura, delimično određene dužinom, a takođe i prisustvom ključnih aminokiselinskih ostataka na određenim kanonskim pozicijama. Unutar antitela od interesa koje ima visoku humanu homologiju, L1, L2 i L3 petlje dobijene iz VL domena ne-humane vrste, npr. vrsta Camelidae, može se oceniti kao da ima kanonsku strukturu nabora "u suštini identičnu" strukturi kanonskog nabora za koju se zna da se javlja u humanim antitelima ako su ispunjeni barem prvi, a poželjno oba, od sledećih kriterijuma:

1. Identična dužina, određena brojem ostataka, do najbliže poklapajuće humane strukturne klase.

2. Najmanje 33% identičnosti, poželjno najmanje 50% identičnosti sa ključnim aminokiselinskim ostacima opisanim za odgovarajuće humane L1 ili L2 kanonske strukturne klase, bilo iz VLambda ili VKapa repertoara (za potrebe prethodne analize imajte na umu L1 i L2 petlje se tretiraju odvojeno i svaka upoređuje sa

2

svojom najbližom odgovarajućom humanom kanonskom strukturnom klasom). Prethodna analiza se oslanja na predviđanje kanonske strukture L1, L2 i L3 petlji u VL domenu antitela od interesa. Ako je stvarna struktura L1, L2 i L3 petlji poznata, na primer na osnovu rendgenske kristalografije, onda L1, L2 ili L3 petlje izvedene iz antitela od interesa mogu se takođe oceniti kao da imaju kanonsku strukturu nabora „suštinski identičnu " kanonskoj strukturi nabora za koju se zna da se javlja u humanim antitelima ako se dužina petlje razlikuje od one najbliže humane kanonske strukturne klase (obično za 1 ili 2 aminokiseline), ali stvarna struktura petlji u antitelu od interesa odgovara humanom kanonskom naboru. Ključne aminokiselinske ostatke pronađene u humanim kanonskim strukturnim klasama za CDR regione humanih VLambda i VKapa domena opisuju Morea et al., Methods, 20: 267-279 (2000) i Martin et al., J. Mol. Biol., 263:800-815 (1996). Strukturni repertoar humanog VKapa domena je takođe opisan od strane Tomlinson et al., EMBO J. 14:4628-4638 (1995), i onaj od VLambda od strane Williams et al., J. Mol. Biol., 264:220-232 (1996). Sadržaj svih ovih dokumenata treba da bude uključen ovde kao referenca. L1 i L2 u VL domenu antitela sa visokom humanom homologijom mogu da formiraju kombinaciju predviđenih ili stvarnih struktura kanonskog nabora koja je identična kombinaciji kanonskih struktura nabora za koje je poznato da se javljaju u VL domenu humane klicine linije. U neograničavajućim primerima izvođenja LI i L2 u VLambda domenu antitela sa visokom humanom homologijom mogu da formiraju jednu od sledećih kanonskih kombinacija nabora: 11-7, 13-7(A,B,C), 14-7(A, B), 12-11, 14-11 i 12-12 (kako je definisano u Williams et al., J. Mol. Biol.264:220 -32 (1996) i kao što je prikazano na http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVL.html). U neograničavajućim primerima izvođenja L1 i L2 u domenu VKapa mogu formirati jednu od sledećih kanonskih kombinacija: 2-1, 3-1, 4-1 i 6-1 (kao što je definisano u Tomlinson et al., EMBO J.14:4628-38 (1995) i kao što je prikazano na http://www.bioc.uzh.ch/antibody/Sequences/Germlines/VBase_hVK.html).

[0064] U dodatnom primeru izvođenja, sva tri L1, L2 i L3 u VL domenu antitela sa visokom humanom homologijom mogu da ispolje suštinski humanu strukturu. Poželjno je da VL domen antitela sa visokom humanom homologijom pokazuje oba, visoku identičnost/homologiju sekvencije sa humanim VL, kao i da hipervarijabilne petlje u VL domenu pokazuju strukturnu homologiju sa humanim VL.

[0065] U jednom primeru izvođenja, VL domen antitela na GPVI sa visokom humanom homologijom može da pokaže identičnost sekvence od 70% ili više, 80% ili više, 85% ili više, 90% ili više, 95% ili više, 97% ili više, ili do 99% ili čak 100% sa humanim VL domenom u okvirnim regionima FR1, FR2, FR3 i FR4, i pored toga hipervarijabilna petlja L1 i hipervarijabilna petlja L2 mogu formirati kombinaciju predviđenih ili stvarnih kanonskih struktura nabora što je isto što i kanonska kombinacija za koju se zna da se prirodno javlja u istom humanom VL domenu. Predviđeno je, naravno, da se VH domeni koji pokazuju visoku identičnost/homologiju sekvence sa humanim VH, kao i strukturnu homologiju sa hipervarijabilnim petljama humanog VH kombinuju sa VL domenima koji pokazuju visoku identičnost sekvence/homologiju sekvence sa humanim VL, a takođe strukturnu homologiju sa hipervarijabilnim petljama humanog VL da bi se obezbedila antitela sa visokom humanom homologijom koja sadrže VH/VL parove sa maksimalnom homologijom sekvence i strukturnom homologijom sa VH/VL parovima kodiranim od čoveka.

[0066] "Imunospecifičan", "specifičan za" ili "specifično vezuje" – Kako se ovde koristi, za antitelo se kaže da je „imunospecifično”, „specifično za” ili da „specifično vezuje” antigen ako reaguje na detektabilnom nivou sa antigenom, poželjno sa konstantom afiniteta, KA, većom od ili jednakom oko 10<6>M<-1>, većom ili jednakom oko 10<7>M<-1>, ili većom ili jednakom 10<8>M<-1>, ili većom ili jednakom 1.510<8>M<-1,>, ili većom ili jednakom 10<9>M<-1>ili većom ili jednakom 510<9>M<-1>. Afinitet antitela za njegov srodni antigen se takođe obično izražava kao konstanta disocijacije KDi u određenim primerima izvođenja, antitelo se specifično vezuje za antigen ako se vezuje sa KDmanjim ili jednkim 10<-6>M, manjim ili jednakim 10<-7>M, ili manjim ili jednakim 1.5 10<-8>M, ili manjim ili jednakim 10<-8>M, ili manjim ili jednakim 510<-9>M ili manjim ili jednakim 10<-9>M. Afiniteti antitela mogu se lako odrediti korišćenjem konvencionalnih tehnika, na primer, onih koje opisuje Scatchard G et al. (The attractions of proteins for small molecules and ions. Ann NY Acad Sci 1949; 51: 660-672). Svojstva vezivanja antitela za antigene, ćelije ili njihova tkiva mogu se generalno odrediti i proceniti korišćenjem metoda imunodetekcije uključujući, na primer, ELISA, testove zasnovane na imunofluorescenciji, kao što je imunohistohemija (IHC) i/ili sortiranje ćelija aktivirano fluorescencijom (FACS) ili površinskom plazmon rezonancom (SPR, BIAcore).

[0067] "Izolovana nukleinska kiselina" - Kako se ovde koristi, "izolovana nukleinska kiselina" je nukleinska kiselina koja je suštinski odvojena od drugih sekvenci DNK genoma, kao i od proteina ili kompleksa kao što su ribozomi i polimeraze, koji prirodno prate nativnu sekvencu. Termin obuhvata sekvencu nukleinske kiseline koja je uklonjena iz svog prirodnog okruženja i uključuje rekombinantne ili klonirane DNK izolate i hemijski sintetisane analoge ili analoge biološki sintetisane heterolognim sistemima. U suštini čista nukleinska kiselina uključuje izolovane oblike nukleinske kiseline. Naravno, ovo se odnosi na nukleinsku kiselinu koja je prvobitno izolovana i ne isključuje gene ili sekvence koje su izolovanoj nukleinskoj kiselini kasnije dodane rukom čoveka.

[0068] Termin "polipeptid" se koristi u svom konvencionalnom značenju, tj. kao sekvenca od manje od 100 aminokiselina. Polipeptid se obično odnosi na monomerni entitet. Termin "protein" se odnosi na sekvencu od više od 100 aminokiselina i/ili na multimerni entitet. Proteini pronalaska nisu ograničeni na specifičnu dužinu proizvoda. Ovaj termin se ne odnosi na ili isključuje post-ekspresione modifikacije proteina, na primer, glikozilaciju, acetilaciju, fosforilaciju i slično, kao i druge modifikacije poznate u tehnici, kako prirodne tako i neprirodne. Protein može biti ceo protein ili njegova pod-sekvenca. Posebni proteini od interesa u kontekstu ovog pronalaska su aminokiselinske podsekvence koje sadrže CDR regione i koje su sposobne da vežu antigen. "Izolovani protein" je onaj koji je identifikovan i izdvojen i/ili izvučen iz komponente svog prirodnog okruženja. U poželjnim primerima izvođenja, izolovani protein će biti prečišćen (1) na više od 80, 85, 90, 95% po težini proteina kao što je određeno Lowry metodom, a najpoželjnije više od 96, 97, 98 ili 99% prema težini, (2) do stepena koji je dovoljan da se dobije najmanje 15 ostataka N-terminalne ili interne aminokiselinske sekvence korišćenjem „spinning cup“ sekvenatora, ili (3) do homogenosti pomoću SDS-PAGE pod redukcionim ili neredukcionim uslovima korišćenjem Coomassie plavog ili, poželjno, bojenja srebrom. Izolovani protein uključuje protein in situ unutar rekombinantnih ćelija pošto najmanje jedna komponenta prirodnog okruženja proteina neće biti prisutna. Obično, međutim, izolovani protein će biti pripremljen najmanje jednim korakom prečišćavanja.

[0069] „Identičnost“ ili „identičan“ - Kako se ovde koristi, termin "identičnost" ili "identičan", kada se koristi u vezi između sekvenci dve ili više aminokiselinskih sekvenci, odnosi se na stepen povezanosti sekvenci između sekvenci aminokiselina, kao što je određeno brojem podudaranja između nizova od dva ili više aminokiselinskih ostataka. „Identičnost“ meri procenat identičnih podudaranja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ako ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili računarski program (tj. „algoritmi“). Identičnost srodnih sekvenci aminokiselina može se lako izračunati poznatim metodama. Takve metode uključuju, ali nisu ograničene na, one opisane u Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988). Poželjne metode za određivanje identičnosti su

2

dizajnirane da daju najveće podudaranje između testiranih sekvenci. Metode utvrđivanja identičnosti opisane su u javno dostupnim kompjuterskim programima. Poželjne metode računarskog programa za određivanje identičnosti između dve sekvence uključuju GCG programski paket, uključujući GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. \2, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN i FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). Program BLASTX je javno dostupan od Nacionalnog centra za biotehnološke informacije (NCBI) i drugih izvora (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). Dobro poznati algoritam Smith Waterman se takođe može koristiti za određivanje identičnosti.

[0070] "Modifikovano antitelo" - Kako se ovde koristi, termin "modifikovano antitelo" uključuje sintetičke forme antitela koje su izmenjene tako da se ne javljaju u prirodi, npr. antitela ili minitela); multispecifični oblici antitela (npr., bispecifična, trispecifična, itd.) izmenjeni da se vezuju za dva ili više različitih antigena ili za različite epitope na jednom antigenu; molekuli teškog lanca spojeni sa scFv molekulima i slično. ScFv molekuli su poznati u tehnici i opisani su, npr SAD patentu 5,892,019. Pored toga, termin "modifikovano antitelo" uključuje multivalentne oblike antitela (npr. trovalentna, tetravalentna, itd., antitela koja se vezuju za tri ili više kopija istog antigena). U sledećem primeru izvođenja, modifikovano antitelo pronalaska je fuzioni protein koji sadrži najmanje jedan region teškog lanca kome nedostaje CH2 domen i koji sadrži vezujući domen proteina koji sadrži vezujući region jednog člana para receptorskog liganda.

[0071] "Sisar" - Kako se ovde koristi, termin "sisar" se odnosi na bilo kog sisara, uključujući ljude, domaće i životinje sa farme i zoološkog vrta, sportske ili kućne ljubimce, kao što su psi, mačke, goveda, konji, ovce, svinje, koze, zečevi, itd. Poželjno, sisar je primat, poželjnije čovek.

[0072] "Monoklonsko antitelo" - Kako se ovde koristi, termin "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, tj. pojedinačna antitela koja se nalaze u populaciji su identična osim mogućih mutacija koje se javljaju u prirodi koje mogu biti prisutne u manjim količinama. Monoklonska antitela su visoko specifična, usmerena su protiv jednog antigenskog mesta. Štaviše, za razliku od preparata poliklonskih antitela koji uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopa), svako monoklonsko antitelo je usmereno protiv jedne determinante na antigenu. Pored svoje specifičnosti, monoklonska antitela imaju prednost u tome što se mogu sintetisati nekontaminirana drugim antitelima. Modifikator "monoklonski" ne treba tumačiti tako da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim metodom. Na primer, monoklonska antitela korisna u ovom pronalasku mogu biti pripremljena metodologijom hibridoma koja je prvi put opisana od Kohler et al., Nature, 256:495 (1975) ili mogu biti napravljena korišćenjem metoda rekombinantne DNK u bakterijskim, eukariotskim životinjskim ili biljnim ćelijama (videti, npr. SAD Pat. br.4,816,567). „Monoklonska antitela“ takođe mogu da se izoluju iz biblioteka antitela faga korišćenjem tehnika opisanih u Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) i Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), na primer.

[0073] "Nativna sekvenca" - Kako se ovde koristi, termin nukleotid "nativne sekvence" odnosi se na polinukleotid koji ima istu nukleotidnu sekvencu kao polinukleotid izveden iz prirode. Shodno tome, protein "nativne sekvence" je onaj koji ima istu aminokiselinsku sekvencu kao protein (npr. antitelo) izveden iz prirode (npr. iz bilo koje vrste). Takvi polinukleotidi i proteini prirodne sekvence mogu biti izolovani iz prirode ili se mogu proizvesti rekombinantnim ili sintetičkim sredstvima. Polinukleotidna "varijanta", kako se ovde koristi termin, je polinukleotid koji se tipično razlikuje od polinukleotida koji je ovde specifično otkriven u jednoj ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija. Takve varijante se mogu pojaviti u prirodi ili mogu biti sintetički generisane, na primer, modifikovanjem jedne ili više polinukleotidnih sekvenci pronalaska i procenom jedne ili više bioloških aktivnosti kodiranih proteina kao što je ovde opisano i/ili korišćenjem bilo koje od brojnih tehnika dobro poznatih u stanju tehnike. "Varijanta" proteina, kako se ovde koristi termin, je protein koji se tipično razlikuje od proteina koji je ovde specifično otkriven u jednoj ili više supstitucija, delecija, adicija i/ili insercija. Takve varijante se mogu pojaviti u prirodi ili mogu biti sintetički generisane, na primer, modifikacijom jedne ili više gornjih proteinskih sekvenci pronalaska i procenom jedne ili više bioloških aktivnosti proteina kako je ovde opisano i/ili korišćenjem bilo koje od brojnih tehnika dobro poznatih u stanju tehnike. Mogu se napraviti modifikacije u strukturi polinukleotida i proteina iz ovog pronalaska i dalje dobiti funkcionalni molekul koji kodira varijantu ili derivat proteina sa poželjnim karakteristikama. Kada se želi promeniti aminokiselinska sekvenca proteina da bi se stvorila ekvivalentna, ili čak poboljšana varijanta ili region proteina pronalaska, stručnjak će tipično promeniti jedan ili više kodona kodirajuće DNK sekvence. Na primer, određene aminokiseline mogu biti zamenjene drugim aminokiselinama u strukturi proteina bez značajnog gubitka njegove sposobnosti da vezuju druge proteine (npr. antigene) ili ćelije. Pošto je kapacitet vezivanja i priroda proteina ono što definiše biološku funkcionalnu aktivnost tog proteina, određene supstitucije aminokiselinske sekvence se mogu izvršiti u sekvenci proteina, i naravno, u njegovoj osnovnoj DNK kodirajućoj sekvenci, i pored toga dobiti protein sa sličnim svojstvima. Stoga se smatra da se mogu napraviti različite promene u aminokiselinskim sekvencama otkrivenih kompozicija, ili odgovarajućim DNK sekvencama koje kodiraju pomenute proteine bez značajnog gubitka njihove biološke koristi ili aktivnosti. U mnogim slučajevima, varijanta proteina će sadržati jednu ili više konzervativnih supstitucija. "Konzervativna supstitucija" je ona u kojoj je aminokiselina zamenjena drugom aminokiselinom

2

koja ima slična svojstva, tako da bi stručnjak u oblasti hemije peptida očekivao da će sekundarna struktura i hidropatska priroda proteina biti suštinski nepromenjena. Kao što je gore navedeno, supstitucije aminokiselina su generalno zasnovane na relativnoj sličnosti supstituenata bočnog lanca aminokiselina, na primer, njihovoj hidrofobnosti, hidrofilnosti, naelektrisanju, veličini i slično. Primeri supstitucija koje uzimaju u obzir nekoliko prethodnih karakteristika su dobro poznate stručnjacima u ovoj oblasti i uključuju: arginin i lizin; glutamat i aspartat; serin i treonin; glutamin i asparagin; i valin, leucin i izoleucin. Supstitucije aminokiselina se dalje mogu izvršiti na osnovu sličnosti u polarnosti, naelektrisanju, rastvorljivosti, hidrofobnosti, hidrofilnosti i/ili amfipatskoj prirodi ostataka. Na primer, negativno naelektrisane aminokiseline uključuju asparaginsku kiselinu i glutaminsku kiselinu; pozitivno naelektrisane aminokiseline uključuju lizin i arginin; i aminokiseline sa nenaelektrisanim polarnim grupama koje imaju slične vrednosti hidrofilnosti uključuju leucin, izoleucin i valin; glicin i alanin; asparagin i glutamin; i serin, treonin, fenilalanin i tirozin. Druge grupe aminokiselina koje mogu predstavljati konzervativne promene uključuju: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; i (5) phe, tyr, trp, his. Varijanta takođe, ili alternativno, može da sadrži nekonzervativne promene. U poželjnom primeru izvođenja, varijantni proteini se razlikuju od nativne sekvence u supstituciji, deleciji ili adiciji pet aminokiselina ili manje. Varijante se takođe (ili alternativno) mogu modifikovati, na primer, delecijom ili adicijom aminokiselina koje imaju minimalan uticaj na imunogenost, sekundarnu strukturu i hidropatsku prirodu proteina.

[0074] "Farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" - Kako se ovde koristi, izraz "farmaceutski prihvatljiv ekscipijens" uključuje sve rastvarače, disperzione medijume, omotače, antibakterijske i antifungalne agense, izotonične agense i agense za odlaganje apsorpcije i slično. Navedeni ekscipijens ne izaziva neželjenu, alergijsku ili drugu nepovoljnu reakciju kada se daje životinji, poželjno čoveku. Za primenu kod ljudi, preparati treba da ispunjavaju standarde sterilnosti, pirogenosti i opšte bezbednosti i čistoće koje zahtevaju regulatorne kancelarije, kao što je, na primer, kancelarija FDA ili EMA.

[0075] "Specifičnost" - Kako se ovde koristi, termin "specifičnost" se odnosi na sposobnost specifičnog vezivanja (npr. imunoreagovanja sa) datog ciljnog mesta, npr., GPVI. Protein može biti monospecifičan i sadržati jedno ili više mesta vezivanja koja specifično vezuju ciljno mesto, ili protein može biti multispecifičan i sadržati dva ili više mesta vezivanja koja specifično vezuju ista ili različita ciljna mesta. U jednom primeru izvođenja, antitelo pronalaska je specifično za više od jednog ciljnog mesta. Na primer, u jednom primeru izvođenja, multispecifični vezujući molekul pronalaska se vezuje za GPVI i drugi molekul.

[0076] „Jednolančani Fv“ takođe skraćeno kao "sFv" ili "scFv" - Kako se ovde koristi,

2

termini "jednolančani Fv", "sFv" ili "scFv" su fragmenti antitela koji sadrže VH i VL domene antitela povezane u jedan lanac aminokiselina. Poželjno, sFv aminokiselinska sekvenca dalje sadrži peptidni linker između VH i VL domena koji omogućava sFv da formira željenu strukturu za vezivanje antigena. Za pregled sFv, pogledati Pluckthun u The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

[0077] "Subjekat" - Kako se ovde koristi, termin "subjekat" se odnosi na sisara, poželjno čoveka. U jednom primeru izvođenja, subjekat može biti "pacijent", tj. toplokrvna životinja, poželjnije čovek, koji/koja čeka na prijem, ili prima medicinsku negu ili je bio/je/će biti podvrgnut medicinskoj proceduri, ili se prati radi razvoja bolesti.

[0078] "Sintetički" - Kako se ovde koristi, termin "sintetički" u odnosu na proteine uključuje proteine koji sadrže aminokiselinsku sekvencu koja se ne pojavljuje u prirodi. Na primer, proteini koji se ne pojavljuju u prirodi su modifikovani oblici proteina koji se javljaju u prirodi (npr. koji sadrže mutaciju kao što je adicija, supstitucija ili delecija) ili proteini koji sadrže prvu aminokiselinsku sekvencu (koja se može, ali ne mora pojaviti u prirodi) koja je vezana u linearnoj aminokiselinskoj sekvenci sa drugom aminokiselinskom sekvencom (koja se može, ali i ne mora se pojaviti u prirodi) za koju nije prirodno povezana u prirodi.

[0079] "Terapeutski efikasna količina" označava nivo ili količinu agensa koji je usmeren na, bez izazivanja značajnih negativnih ili štetnih neželjenih efekata na ciljno mesto, (1) odlaganje ili sprečavanje početka bolesti povezane sa GPVI; (2) usporavanje ili zaustavljanje napredovanja, otežavanja ili pogoršanja jednog ili više simptoma bolesti povezane sa GPVI; (3) dovođenje do poboljšanja simptoma bolesti povezane sa GPVI; (4) smanjenje težine ili incidence bolesti povezane sa GPVI; ili (5) izlečenje bolesti povezane sa GPVI. Terapeutski efikasna količina se može primeniti pre početka bolesti povezane sa GPVI, za profilaktičku ili preventivnu aktivnost. Alternativno ili dodatno, terapeutski efikasna količina se može primeniti nakon iniciranja bolesti povezane sa GPVI, radi terapijskog delovanja.

[0080] "Varijabilni region" ili "varijabilni domen" - Kako se ovde koristi, termin "varijabilni" se odnosi na činjenicu da se određeni regioni varijabilnih domena VH i VL u velikoj meri razlikuju u sekvenci među antitelima i da se koriste u vezivanju i specifičnosti svakog posebnog antitela za njegov ciljni antigen. Međutim, varijabilnost nije ravnomerno raspoređena kroz varijabilne domene antitela. Koncentrisana je u tri segmenta nazvana "hipervarijabilne petlje" u svakom od VL domena i VH domena koji čine deo mesta vezivanja antigena. Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja domena VLambda lakog lanca se ovde pominju kao L1 (λ), L2 (λ) i L3 (λ) i mogu se definisati kao da sadrže ostatke 24-33 (L1(λ), koji se sastoje od od 9, 10 ili 11 aminokiselinskih ostataka), 49-53 L2 (λ), koji se sastoji od 3 ostatka)

2

i 90-96 (L3(λ), koji se sastoji od 6 ostataka) u VL domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja domena lakog lanca VKapa se ovde pominju kao L1(κ), L2(κ) i L3(κ) i mogu se definisati tako da sadrže ostatke 25-33 (L1(κ), koji se sastoje od od 6, 7, 8, 11, 12 ili 13 ostataka), 49-53 (L2(K), koji se sastoji od 3 ostatka) i 90-97 (L3(K), koji se sastoji od 6 ostataka) u VL domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Prva, druga i treća hipervarijabilna petlja VH domena se ovde pominju kao H1, H2 i H3 i mogu se definisati kao da sadrže ostatke 25-33 (H1, koji se sastoji od 7, 8 ili 9 ostataka), 52-56 (H2, koji se sastoji od 3 ili 4 ostatka) i 91-105 (H3, veoma varijabilne dužine) u VH domenu (Morea et al., Methods 20:267-279 (2000)). Osim ako nije drugačije naznačeno, termini L1, L2 i L3 respektivno se odnose na prvu, drugu i treću hipervarijabilnu petlju VL domena, i obuhvataju hipervarijabilne petlje dobijene i od VKapa i od VLambda izotipova. Termini H1, H2 i H3 respektivno se odnose na prvu, drugu i treću hipervarijabilnu petlju VH domena i obuhvataju hipervarijabilne petlje dobijene iz bilo kog od poznatih izotipova teškog lanca, uključujući [gama], [epsilon], [delta], [alfa] ili [mu]. Hipervarijabilne petlje L1, L2, L3, H1, H2 i H3 mogu svaka sadržati deo "regiona koji određuje komplementarnost" ili "CDR", kao što je definisano gore.

[0081] "Valenca" - Kako se ovde koristi, termin "valenca" se odnosi na broj potencijalnih ciljnih mesta vezivanja u proteinu. Svako ciljno mesto vezivanja specifično vezuje jedan ciljni molekul ili specifično mesto na ciljnom molekulu. Kada protein sadrži više od jednog ciljnog vezujućeg mesta, svako ciljno mesto vezivanja može specifično da veže iste ili različite molekule (npr. može da se vezuje za različite ligande ili različite antigene, ili različite epitope na istom antigenu). Predmetni vezujući molekuli poželjno imaju najmanje jedno vezujuće mesto specifično za humani GPVI molekul. Poželjno, proteini koji su ovde dati su monovalentni.

[0082] "Lečenje" ili "tretman" ili "ublažavanje" - Kako se ovde koristi, termini "lečenje" ili "tretman" ili "ublažavanje" odnose se i na terapeutski tretman i na profilaktičke ili preventivne mere; pri čemu je cilj sprečiti ili usporiti (umanjiti) ciljano patološko stanje ili poremećaj. Oni kojima je potreban tretman uključuju one koji već imaju poremećaj, kao i one koji su skloni da imaju poremećaj ili one kod kojih se poremećaj treba sprečiti. Subjekat ili sisar je uspešno "lečen" od ciljanog patološkog stanja ili poremećaja ako, nakon što je primio terapeutsku količinu proteina prema ovom pronalasku, pacijent pokaže vidljivo i/ili merljivo smanjenje ili odsustvo jednog ili više od sledećih: smanjenje broja patogenih ćelija; smanjenje procenta ukupnih ćelija koje su patogene; i/ili olakšanje u određenoj meri, jednog ili više simptoma povezanih sa specifičnom bolešću ili stanjem; smanjenje morbiditeta i mortaliteta i poboljšanje kvaliteta života. Gore navedeni parametri za procenu uspešnog lečenja i poboljšanja bolesti se lako mogu izmeriti rutinskim procedurama koje su poznate lekaru.

2

[0083] Ovaj pronalazak se odnosi na izolovane humanizovane proteine koji se vezuju za humani GPVI, poželjno na izolovana humanizovana antitela protiv humanog GPVI. U jednom primeru izvođenja, izolovani protein pronalaska je prečišćen.

[0084] Protein pronalaska se vezuje za ekstracelularni domen GPVI.

[0085] Protein pronalaska se vezuje za Ig-sličan C2-tip domena 2 (D2) humanog GPVI.

[0086] Protein pronalaska može da se veže za epitop koji sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 207 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili za sekvencu koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 207 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0087] Navedeni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 1811, poželjnije od 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 186, poželjnije od 119 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0088] Navedeni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 ili više aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 1811 do poželjnije od 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 186, poželjnije od 119 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0089] Navedeni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 1311, poželjnije od 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

2

[0090] Navedeni epitop može sadržati najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 aminokiselinskih ostataka od 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 118 do 138119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0091] Navedeni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 1311, poželjnije od 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0092] Navedeni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 aminokiselina ostaci od 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, još poželjnije od 120 do 135 od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili iz sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 1312, poželjnije od 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0093] Navedeni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili iz sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0094] Navedeni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 od aminokiselinski ostaci od 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili iz sekvence dele najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0095] Izolovani protein pronalaska može da se veže za konformacioni epitop.

[0096] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak humanog GPVI.

[0097] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak Ig-sličnog C2-tipa domena 2 (D2) humanog GPVI.

[0098] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od 114 do 207 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0099] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 1811, poželjnije od 118 do 1811 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 186, poželjnije od 119 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0100] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 , 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50 ili više aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 18119 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 187, poželjno od 115 do 187, poželjnije od 116 do 187, poželjnije od 117 do 187, poželjnije od 118 do 186, poželjnije od 119 do 185, poželjnije od 120 do 184, još poželjnije od 121 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0101] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 1311, poželjnije od 118 do 1311 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od

1

116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0102] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 131, poželjnije od 131 poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0103] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0104] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 135, poželjnije od 117 do 135 još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13), ili iz sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0105] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

2

[0106] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili sekvencu koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0107] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži:

- najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137 od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i

- najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 1) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0108] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži:

- najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, poželjnije od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 142, poželjno od 115 do 141, poželjnije od 116 do 140, poželjnije od 117 do 139, poželjnije od 118 do 138, više poželjno od 119 do 137, poželjnije od 120 do 136, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i

- najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka od 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 165 do 187, poželjno od 166 do 186, poželjnije od 167 do 185, poželjnije od 168 do 184, još poželjnije od 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0109] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži:

- najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135 od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i

[0110] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži:

- najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 aminokiselinskih ostataka od aminokiselinskih ostataka 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135, poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 120 do 135, još poželjnije od 118 do 135 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka od 114 do 135, poželjno od 115 do 135, poželjnije od 116 do 135, poželjnije od 117 do 135, poželjnije od 118 do 135, poželjnije od 119 do 135,

4

poželjnije od 116 do 120 do čak poželjnije od 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i

[0111] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0112] Dakle, protein pronalaska može da se veže za konformacioni epitop koji sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili za sekvencu koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0113] Navedeni konformacioni epitop može da sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0114] Dakle, protein pronalaska može da se veže za konformacioni epitop koji sadrži najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili za sekvencu koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i najmanje jedan aminokiselinski ostatak od aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili od sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0115] Navedeni konformacioni epitop može da se sastoji od:

- aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 121 do 135 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13); i

- aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 183 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0116] Dakle, protein pronalaska može da se veže za konformacioni epitop koji se sastoji od:

[0117] Navedeni konformacioni epitop može da se sastoji od:

- aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13) ili sekvence koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti preko aminokiselinskih ostataka 169 do 180 humanog GPVI (SEQ ID NO: 13).

[0118] Dakle, protein pronalaska može da se veže za konformacioni epitop koji se sastoji od:

[0119] Izolovani protein koji se vezuje za humani GPVI može imati KDza vezivanje za humani GPVI, poželjno rastvorljivi humani GPVI, manji ili jednak 15 nM, poželjno manji ili jednak 10 nM i poželjnije manji ili jednak 5 nM.

[0120] Izolovani protein pronalaska može imati koffza vezivanje za humani GPVI manji ili jednak oko 8.10<-4>sec<-1>, poželjno manji od ili jednak oko 6.10<-4>sec<-1>, a poželjnije manji od ili jednak oko 4.10<-4>sec<-1>.

[0121] Izolovani protein pronalaska može imati konza vezivanje za humani GPVI od najmanje oko 5.10<4>M<-1>sec<-1>, poželjno najmanje oko 5,5.10<4>M<-1>sec<-1>i poželjnije najmanje oko 5,9.10<4>M<-1>sec<-1>i poželjnije najmanje oko 6.10<-4>sec<-1>.

[0122] KDmože se odrediti površinskom plazmon rezonancom (SPR, BIAcore), korišćenjem imobilizovanog rastvorljivog GPVI u dozi koja se kreće od oko 700 do oko 1600 rezonantnih jedinica (RU) (što odgovara oko 8,5 do oko 11,3 fmol/mm<2>), poželjno od oko 850 do oko 1200 RU, poželjnije od oko 950 do oko 1075 RU i/ili korišćenjem PBS pH 7,4 kao pufera za rad, i/ili korišćenjem softvera BIAevaluation verzije 3.0 za analizu podataka. U jednom primeru izvođenja, rastvorljivi GPVI odgovara ekstracelularnom domenu GPVI fuzionisanom na svom C-terminusu preko linkera (kao što je, na primer, preko Gly-Gly-Arg linkera) sa hFc sekvencom. Ovaj rastvorljivi GPVI se može nazvati rastvorljivim GPVI-Fc.

[0123] Metoda za određivanje afiniteta proteina pronalaska za rastvorljivi GPVI je prikazana u nastavku:

Vezivanje proteina pronalaska za rastvorljivi humani GPVI se analizira sa površinskom plazmon rezonancom korišćenjem BIAcore 2000 sistema (Upsala, Švedska).

[0124] Rastvorljivi GPVI-Fc se imobiliše u dozi koja se kreće od oko 700 do oko 1600 RU (što odgovara oko 8,5 do oko 11,3 fmol/mm<2>), poželjno od oko 850 do oko 1200 RU, poželjnije od oko 950 do oko 1075 RU, a još poželjnije od oko 960 do oko 1071 RU na karboksi-metil dekstran CM5 senzorski čip korišćenjem metode spajanja amina (Wizard postupak). Protein je zatim propušten preko imobilizovanog GPVI-Fc u PBS pH 7,4 (10 mM fosfat, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,42 na 25,4°C) pri brzini protoka od 20 µL/min na 25°C. Kinetičke konstante (kon, koff) i afinitet se određuju korišćenjem softvera BIAevaluation verzije 3.0, prilagođavanjem podataka modelu vezivanja. PBS pH 7,4 je pufer za analizu.

[0125] Navedeni protein može biti molekul antitela izabran iz grupe koja se sastoji od celog antitela, humanizovanog antitela, jednolančanog antitela, dimernog jednolančanog antitela, Fv, Fab, F(ab)'2, defukozilovanog antitela, bispecifičnog antitela, diatela, triatela i tetratela.

[0126] Navedeni protein može biti fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od unitela, domen antitela i nanotela.

[0127] Drugi aspekt otkrića je mimetik antitela izabran iz grupe koju čine afitelo, afilin, afinin, adnektin, atrimer, evasin, DARPin, antitikalin, avimer, finomer, versabodi i duokalin.

[0128] Domen antitelo je dobro poznato u tehnici i odnosi se na najmanje funkcionalne vezujuće jedinice antitela, koje odgovaraju varijabilnim regionima bilo teških ili lakih lanaca antitela.

[0129] Nanotelo je dobro poznato u tehnici i odnosi se na terapeutski protein dobijen iz antitela koji sadrži jedinstvena strukturna i funkcionalna svojstva antitela teškog lanca koja se javljaju u prirodi. Ova antitela teškog lanca mogu da sadrže jedan varijabilni domen (VHH) i dva konstantna domena (CH2 i CH3).

[0130] Unitelo je dobro poznato u tehnici i odnosi se na fragment antitela kome nedostaje zglobni region IgG4 antitela. Delecija zglobnog regiona dovodi do molekula koji je u suštini upola manji od tradicionalnih IgG4 antitela i ima univalentni vezujući region pre nego bivalentni vezujući region IgG4 antitela.

[0131] Afitelo je dobro poznato u tehnici i odnosi se na afinitetne proteine zasnovane na proteinskom domenu sa 58 aminokiselinskih ostataka, izvedenom iz jednog od IgG vezujućih domena stafilokoknog proteina A.

[0132] DARPins („Designed Ankyrin Repeat Proteins“) su dobro poznati u tehnici i odnose se na tehnologiju DRP (dizajnirani ponavljajući protein) koja oponaša antitela koja je razvijena da iskoristi sposobnosti vezivanja proteina koji nisu antitela.

[0133] Antikalini su dobro poznati u tehnici i odnose se na drugu tehnologiju mimetike antitela, gde specifičnost vezivanja potiče od lipokalina. Antikalini se takođe mogu formatirati kao dvostruki ciljani protein, koji se nazivaju duokalini.

[0134] Avimeri su dobro poznati u tehnici i odnose se na drugu tehnologiju mimetike antitela.

[0135] Versabodi su dobro poznati u tehnici i odnose se na drugu tehnologiju mimetike antitela. Oni su mali proteini od 3-5 kDa sa >15% cisteina, koji formiraju skelu visoke gustine disulfida, zamenjujući hidrofobno jezgro koje imaju tipični proteini.

[0136] U jednom primeru izvođenja, protein je monovalentan i poželjno je izabran od celog monovalentnog antitela, humanizovanog monovalentnog antitela, jednolančanog antitela, Fv, Fab ili fragmenta antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od unitela, domen antitela i nanotela; ili mimetik monomernog antitela izabran iz grupe koja se sastoji od afitela, afilina, afinina, adnektina, atrimera, evazina, DARPin, antikalina, avimera, finomera i versabodi.

[0137] Navedeni protein može biti imunokonjugat koji sadrži antitelo ili njegov fragment konjugovan sa terapeutskim agensom.

[0138] Navedeni protein može biti konjugat koji sadrži protein pronalaska konjugovan sa sredstvom za imadžing. Navedeni protein bi se mogao koristiti na primer za primene za imadžing.

[0139] Navedeni protein može biti monoklonsko antitelo.

[0140] Navedeni protein može biti poliklonsko antitelo.

[0141] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku ima varijabilni region teškog lanca koji sadrži najmanje jedan od sledećih CDR regiona:

VH-CDR1: GYTFSYNMH (SEQ ID NO: 1);

VH-CDR2: GIYPGNGDTSYNQKFQG (SEQ ID NO: 2); i

VH-CDR3: GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3).

[0142] CDR numerisanje i definicija su u skladu sa Kabat/Chothia definicijom.

[0143] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku ima varijabilni region lakog lanca koji sadrži najmanje jedan od sledećih CDR regiona:

VL-CDR1: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 4);

VL-CDR2: RVSNRFS (SEQ ID NO: 5); i

VL-CDR3: LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

[0144] CDR numerisanje i definicija su u skladu sa Kabat/Chothia definicijom.

[0145] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku sadrži:

- u teškom lancu, najmanje jedan od sledećih CDR: GYTFSYNMH (SEQ ID NO: 1), GIYPGNGDTSYNKQFQG (SEQ ID NO: 2) i GTVVGDWYFDV (SEQ ID NO: 3), i/ili - u lakom lancu, najmanje jedan od sledećih CDR: RSSQSLENSNGNTYLN (SEQ ID NO: 4), RVSNRFS (SEQ ID NO: 5) i LQLTHVPWT (SEQ ID NO: 6).

[0146] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži u svom teškom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3.

[0147] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži u svom lakom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6.

[0148] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži u svom teškom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3, i u svom lakom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6.

[0149] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži u svom teškom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 i SEQ ID NO: 3, i u svom lakom lancu 3 CDR regiona SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 i SEQ ID NO: 6, izborno pri čemu jedna, dve, tri ili više aminokiselina u bilo kojoj od navedenih sekvenci mogu biti supstituisane drugom aminokiselinom.

[0150] Bilo koji od CDR regiona 1, 2 i 3 teških i lakih lanaca može se okarakterisati kao da ima aminokiselinsku sekvencu koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa određenim CDR regionom ili skupovima CDR regiona navedenih u odgovarajućem SEQ ID NO.

[0151] Anti-hGPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen je izabran iz grupe koja se sastoji od antitela koje ima:

(i) aminokiselinske sekvence CDR 1, 2 i 3 teškog lanca (VH-CDR1, VH-CDR2, VH-CDR3) kao što su prikazane u SEQ ID NO: 1, 2 i 3 respektivno; i

(ii) aminokiselinske sekvence CDR 1, 2 i 3 lakog lanca (VL-CDR1, VL-CDR2, VL-CDR3) kao što su prikazane u SEQ ID NO: 4, 5 i 6 respektivno;

izborno pri čemu jedna, dve, tri ili više aminokiselina u bilo kojoj od navedenih sekvenci mogu biti supstituisane drugom aminokiselinom.

[0152] Prema pronalasku, antitelo na GPVI ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 7.

(SEQ ID NO: 7)

[0153]

4

[0154] Prema pronalasku, anti-GPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen prema pronalasku sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 8.

(SEQ ID NO: 8)

[0155]

[0156] U jednom primeru izvođenja koji nije obuhvaćen zahtevima, anti-GPVI antitelo ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 9.

(SEQ ID NO: 9)

[0157]

[0158] U jednom primeru izvođenja pronalaska, anti-GPVI antitelo (ACT017 antitelo) ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 8.

[0159] U jednom primeru izvođenja koji nije obuhvaćen zahtevima, anti-GPVI antitelo (ACT006 antitelo) ili njegov fragment koji se vezuje za antigen sadrži varijabilni region teškog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 7 i varijabilni region lakog lanca koji sadrži ili se sastoji od sekvence SEQ ID NO: 9.

[0160] Jedna, dve, tri ili više aminokiselina varijabilnih regiona teškog ili lakog lanca, kao što je gore opisano, mogu biti supstituisane drugom aminokiselinom.

[0161] Antitelo pronalaska može da sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologne sekvencama aminokiselina ACT017 antitela opisanog ovde, i pri čemu antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva proteina pronalaska.

[0162] U jednom primeru izvođenja koji nije obuhvaćen zahtevima, antitelo sadrži varijabilne regione teškog i lakog lanca koji sadrže aminokiselinske sekvence koje su homologne aminokiselinskim sekvencama ovde opisanog antitela ACT006 i pri čemu antitela zadržavaju željena funkcionalna svojstva proteina.

[0163] Varijabilni region teškog lanca može da obuhvata sekvence koje imaju 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sa SEQ ID NO: 7.

[0164] Varijabilni region lakog lanca može da obuhvata sekvence koje imaju 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili više identičnosti sa SEQ ID NO: 8 ili SEQ ID NO: 9.

[0165] U bilo kom od ovde opisanih antitela, npr. ACT017 ili ACT006, navedeni varijabilni region i CDR sekvence mogu sadržati konzervativne modifikacije sekvence. Konzervativne modifikacije sekvence odnose se na modifikacije aminokiselina koje ne utiču značajno ili ne menjaju karakteristike vezivanja antitela koje sadrži aminokiselinsku sekvencu. Takve konzervativne modifikacije uključuju aminokiselinske supstitucije, adicije i delecije. Modifikacije se mogu uneti u antitelo pronalaska standardnim tehnikama poznatim u tehnici, kao što su mutageneza usmerena na mesto i mutageneza posredovana PCR-om. Konzervativne aminokiselinske supstitucije su tipično one u kojima je aminokiselinski ostatak zamenjen aminokiselinskim ostatkom koji ima bočni lanac sa sličnim fizičko-hemijskim svojstvima. Specifikovani varijabilni region i CDR sekvence mogu da sadrže jednu, dve, tri, četiri ili više aminokiselinskih insercija, delecija ili supstitucija. Tamo gde se vrše zamene, poželjne zamene će biti konzervativne modifikacije. Porodice aminokiselinskih ostataka koji imaju slične bočne lance su definisane u tehnici. Ove porodice uključuju aminokiseline sa osnovnim bočnim lancima (npr. lizin, arginin, histidin), kiselim bočnim lancima (npr. asparaginska kiselina, glutaminska kiselina), nenaelektrisanim polarnim bočnim lancima (npr. glicin, asparagin, glutamin, serin, treonin, tirozin, cistein, triptofan), nepolarnim bočnim lancima (npr. alanin, valin, leucin, izoleucin, prolin, fenilalanin, metionin), beta-razgranatim bočnim lancima (npr. treonin, valin, izoleucin) i aromatičnim bočnim lancima (npr., tirozin, fenilalanin, triptofan, histidin). Prema tome, jedan ili više aminokiselinskih ostataka unutar CDR regiona antitela iz pronalaska mogu biti zamenjeni drugim aminokiselinskim ostacima iz iste porodice bočnih lanaca i izmenjeno antitelo se može testirati na zadržanu funkciju (tj. svojstva koja su ovde navedena) koristeći ovde opisane testove.

[0166] Otkriće takođe obezbeđuje antitelo koje vezuje suštinski isti epitop kao ACT017 ili ACT006 antitela. Antitelo koje vezuje suštinski isti epitop kao antitela ACT017 ili ACT006 biće označena kao antitela slična ACT017 ili ACT006, respektivno.

[0167] Anti-hGPVI antitela koja sadrže VH i VL domene, ili njihove CDR regione, mogu da sadrže CH1 domene i/ili CL domene, čija je aminokiselinska sekvenca u potpunosti ili suštinski humana. Tamo gde antigen-vezujući protein pronalaska je antitelo namenjeno za humanu terapeutsku upotrebu, tipično je da ceo konstantni region antitela, ili bar njegov deo, ima u potpunosti ili suštinski sekvencu humanih aminokiselina. Prema tome, jedna ili više ili bilo koja kombinacija CH1 domena, zglobnog regiona, CH2 domena, CH3 domena i CL domena (i CH4 domena ako je prisutna) može biti u potpunosti ili suštinski humana u pogledu svoje aminokiselinske sekvence. Povoljno je da CH1 domen, zglobni region, CH2 domen, CH3 domen i CL domen (i CH4 domen ako je prisutan) mogu imati u potpunosti ili suštinski humanu aminokiselinsku sekvencu. U kontekstu konstantnog regiona humanizovanog ili himernog antitela, ili fragmenta antitela, termin "suštinski humani" se odnosi na identičnost sekvence aminokiselina od najmanje 70%, ili najmanje 80%, ili najmanje 90%, ili najmanje 95%, ili najmanje 97%, ili najmanje 99% sa humanim konstantnim regionom. Termin "humana aminokiselinska sekvenca" u ovom kontekstu se odnosi na aminokiselinsku sekvencu koja je kodirana humanim imunoglobulinskim genom, koji uključuje klicinu liniju, preuređene i somatski mutirane gene. Pronalazak takođe razmatra proteine koji sadrže konstantne domene "humane" sekvence koji su izmenjeni, jednom ili više aminokiselinskih adicija, delecija ili supstitucija u odnosu na humanu sekvencu, izuzev onih primera izvođenja gde je prisustvo "potpuno humanog" zglobnog regiona izričito traženo. Prisustvo "potpuno humanog" zglobnog regiona u anti-hGPVI antitelima pronalaska može biti korisno i za minimiziranje imunogenosti i za optimizaciju stabilnosti antitela. Smatra se da jedna ili više aminokiselinskih supstitucija, insercija ili delecija mogu biti napravljene unutar konstantnog regiona teškog i/ili lakog lanca, posebno unutar Fc regiona. Supstitucije aminokiselina mogu dovesti do zamene supstituisane aminokiseline sa drugom prirodnom aminokiselinom, ili sa neprirodnom ili modifikovanom aminokiselinom. Druge strukturne modifikacije su takođe dozvoljene, kao što su na primer promene u obrascu glikozilacije (npr. dodavanjem ili brisanjem N- ili O-vezanih mesta glikozilacije). U zavisnosti od nameravane upotrebe antitela, može biti poželjno modifikovati antitelo pronalaska u pogledu njegovih osobina vezivanja za Fc receptore, na primer za moduliranje efektorske funkcije. Na primer, cisteinski ostatak (ostaci) se može uvesti u Fc region, čime se omogućava formiranje interlančane disulfidne veze u ovom regionu. Tako generisano homodimerno antitelo može imati poboljšanu efektorsku funkciju. Videti Caron et al., J. Exp. Med.176: 1191-1195 (1992) i Shopes, BJ Immunol. 148:2918-2922 (1992).

[0168] Sledeći predmet otkrića je izolovana nukleinska sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca sekvence SEQ ID NO: 7. Poželjno, navedena nukleinska sekvenca je SEQ ID NO: 10:

(SEQ ID NO: 10)

[0169]

4

[0170] Sledeći predmet otkrića je izolovana nukleinska sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 8. Poželjno, navedena nukleinska sekvenca je SEQ ID NO: 11:

(SEQ ID NO: 11)

[0171]

[0172] Sledeći predmet otkrića je izolovana nukleinska sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca sekvence SEQ ID NO: 9. Poželjno, pomenuta nukleinska sekvenca je SEQ ID NO: 12

(SEQ ID NO: 12)

[0173]

[0174] Sledeći predmet pronalaska je ekspresioni vektor koji sadrži nukleinske sekvence koje kodiraju anti-GPVI antitelo pronalaska. U jednom primeru izvođenja, ekspresioni vektor pronalaska sadrži najmanje jednu od SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 i SEQ ID NO: 12 ili bilo koju sekvencu koja ima sekvencu nukleinske kiseline koja deli najmanje 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% identičnosti sa navedenom SEQ ID NO: 10-12.

[0175] Vektor može da sadrži sekvencu SEQ ID NO: 10 i sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca. Neograničavajući primer sekvence koja kodira konstantni region teškog lanca je SEQ ID NO: 14.

(SEQ ID NO: 14)

[0176]

[0177] Vektor može da sadrži sekvencu SEQ ID NO: 11 ili SEQ ID NO: 12 i sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca. Neograničavajući primer sekvence koja kodira konstantni region lakog lanca je SEQ ID NO: 15.

(SEQ ID NO: 15)

[0178]

[0179] Vektor može da sadrži sekvencu koja kodira signalni peptid. Neograničavajući primeri sekvenci signalnih peptida uključuju, ali nisu ograničeni na, SEQ ID NO: 16 i SEQ ID NO: 17.

(SEQ ID NO: 16)

[0180]

(SEQ ID NO: 17)

[0181]

4

[0182] Vektor može da sadrži SEQ ID NO: 10, i sekvencu koja kodira konstantni region teškog lanca (kao što je, na primer, SEQ ID NO: 14), i sekvencu signalnog peptida. Primer takvog vektora je vektor koji sadrži SEQ ID NO: 18. SEQ ID NO: 18 dalje sadrži mesta za kloniranje.

(SEQ ID NO: 18)

[0183]

[0184] Vektor može da sadrži SEQ ID NO: 8 i sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca (kao što je, na primer, SEQ ID NO: 15), i sekvencu signalnog peptida. Primer takvog vektora je vektor koji sadrži SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 19 dalje sadrži mesta za kloniranje.

(SEQ ID NO: 19)

[0185]

4

[0186] Vektor može da sadrži SEQ ID NO: 9 i sekvencu koja kodira konstantni region lakog lanca (kao što je, na primer, SEQ ID NO: 15), i sekvencu signalnog peptida. Primer takvog vektora je vektor koji sadrži SEQ ID NO: 20. SEQ ID NO: 20 dalje sadrži mesta za kloniranje.

(SEQ ID NO: 20)

[0187]

[0188] Ćelija domaćin se može koristiti za rekombinantnu proizvodnju antitela prema pronalasku. Ćelije domaćini mogu biti ćelije prokariota, kvasca ili eukariota, poželjno ćelije sisara, kao što su, na primer: CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7,

4

ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); Ćelije jajnika kineskog hrčka/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); mišje Sertolijeve ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23: 243-251 (1980)); ćelije mijeloma miša SP2/0-AG14 (ATCC CRL 1581; ATCC CRL 8287) ili NSO (kolekcije HPA kultura br. 85110503); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (V138, ATCC CCL 75); ćelije humane jetre (Hep G2, HB 8065); tumor dojke kod miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci.383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2), kao i DSM-ova PERC-6 ćelijska linija. Ekspresioni vektori pogodni za upotrebu u svakoj od ovih ćelija domaćina su takođe opšte poznati u tehnici. Treba napomenuti da se termin "ćelija domaćin" generalno odnosi na kultivisanu ćelijsku liniju. Cela humana bića u koja je uveden ekspresioni vektor koji kodira protein koji vezuje antigen prema pronalasku su eksplicitno isključena iz definicije "ćelije domaćina".

[0189] Postupak koji se može koristiti za proizvodnju anti-hGPVI antitela ili njegovog fragmenta koji se vezuje za antigen obuhvata kultivisanje ćelija domaćina koje sadrže izolovanu polinukleotidnu sekvencu koja kodira anti-hGPVI antitelo pod uslovima pogodnim za ekspresiju anti-hGPVI antitela i obnavljanje eksprimiranih anti-hGPVI antitela. Ovaj rekombinantni postupak se može koristiti za proizvodnju anti-hGPVI antitela u velikoj meri prema pronalasku, uključujući monoklonska antitela namenjena za in vitro, ex vivo, in vivo terapeutske, dijagnostičke upotrebe. Ovi postupci su dostupni u tehnici i biće poznati stručnjacima.

[0190] Protein pronalaska može biti prečišćen hromatografijom, poželjno afinitetnom hromatografijom, poželjnije afinitetnom hromatografijom na protein L agarozi.

[0191] Protein pronalaska može da sadrži domen za vezivanje proteina L (PpL). Postupci za prenošenje aktivnosti vezivanja PpL na proteine pronalaska su opisani u Muzard et al., Analitical Biochemistry 388, 331-338, 2009 i u Lakhrif et al., MAbs. 2016;8(2):379-88, koji su ovde uključeni kao referenca.

[0192] Fragmenti i derivati antitela iz ovog otkrića (koji su obuhvaćeni terminom "antitela" ili "antitela" kako se koristi u ovoj prijavi, osim ako nije drugačije navedeno ili je jasno u suprotnosti sa kontekstom), posebno antitela slična ACT017 ili ACT006, mogu biti proizvedeni tehnikama koje su poznate u tehnici. "Fragmenti" obuhvataju deo intaktnog antitela, generalno mesto vezivanja antigena ili varijabilni region. Primeri fragmenata antitela uključuju Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab')2 i Fv fragmente; diatela; bilo koji fragment antitela koji je protein koji ima

4

primarnu strukturu koja se sastoji od jedne neprekidne sekvence kontinuiranih aminokiselinskih ostataka (ovde se pominje kao „fragment jednolančanog antitela“ ili „jednolančani protein“), uključujući bez ograničenja (1) jednolančane Fv molekule (2) jednolančane proteine koji sadrže samo jedan varijabilni domen lakog lanca, ili njegov fragment koji sadrži tri CDR regiona varijabilnog domena lakog lanca, bez pridruženog ostatka teškog lanca i (3) jednolančane proteine koji sadrže samo jedan varijabilni region teškog lanca, ili njegov fragment koji sadrži tri CDR regiona varijabilnog regiona teškog lanca, bez pridruženog dela lakog lanca; i multispecifična antitela formirana od fragmenata antitela. Fragmenti prisutnih antitela mogu se dobiti korišćenjem standardnih metoda. Na primer, Fab ili F(ab')2 fragmenti mogu biti proizvedeni digestijom proteazom izolovanih antitela, u skladu sa konvencionalnim tehnikama. Biće jasno da se imunoreaktivni fragmenti mogu modifikovati korišćenjem poznatih postupaka, na primer za usporavanje klirensa in vivo i dobijanje poželjnijeg farmakokinetičkog profila, fragment može biti modifikovan polietilen glikolom (PEG). Postupci za kuplovanje i konjugaciju specifičnu za mesto PEG na Fab' fragment su opisani u, na primer, Leong et al., Cytokines 16 (3): 106-119 (2001) i Delgado et al., Br. J. Cancer 73 (2): 175-182 (1996), čija su otkrića ovde obuhvaćena kao referenca.

[0193] Alternativno, DNK koja kodira antitelo prema pronalasku, posebno antitelo slično ACT017 ili ACT006, može biti modifikovano tako da kodira fragment. Modifikovana DNK se zatim ubacuje u ekspresioni vektor i koristi za transformaciju ili transfekciju odgovarajuće ćelije, koja zatim eksprimira željeni fragment.

[0194] Predmet pronalaska je kompozicija koja sadrži najmanje jedan od proteina pronalaska kao što je gore opisano.

[0195] Drugi predmet pronalaska je farmaceutska kompozicija koja sadrži najmanje jedan od proteina pronalaska kako je gore opisano i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

[0196] Farmaceutski prihvatljivi ekscipijensi koji se mogu koristiti u ovim kompozicijama uključuju, ali nisu ograničeni na, jonoizmenjivače, glinicu, aluminijum stearat, lecitin, proteine seruma, kao što je humani serum albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, delimične smeše glicerida i zasićenih biljnih masnih kiselina, vode, soli ili elektroliti, kao što su protamin sulfat, dinatrijum hidrogen fosfat, kalijum hidrogen fosfat, natrijum hlorid, soli cinka, koloidni silicijum dioksid, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance na bazi celuloze (na primer natrijum karboksimetilceluloza), polietilen glikol, poliakrilati, voskovi, polietilen-polioksipropilen-blok polimeri, polietilen glikol i vunena mast.

[0197] Sledeći predmet pronalaska je lek koji sadrži najmanje jedan od proteina pronalaska kao što su gore opisani.

[0198] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein je antitelo na hGPVI ili njegov fragment

4

koji se vezuje za antigen koji inhibira signalizaciju GPVI i/ili signalizaciju liganda GPVI. Kako se ovde koristi, termin "inhibicija" znači da je protein sposoban da blokira, smanji, spreči ili neutrališe interakciju GPVI sa svojim ligandima, signalizaciju GPVI i/ili aktivaciju molekula iz GPVI signalnog puta.

[0199] Primeri liganada GPVI uključuju, ali nisu ograničeni na, kolagen, fibrin, fibronektin, vitronektin i laminine.

[0200] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein je neutralizirajuće anti-hGPVI antitelo.

[0201] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira vezivanje GPVI za njegov ligand (kao što je, na primer, kolagen, fibrin ili bilo koji drugi GPVI ligand sposoban da indukuje nishodnu signalizaciju i aktivaciju trombocita).

[0202] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira i/ili sprečava agregaciju trombocita kao odgovor na ligand GPVI, kao što je, na primer, kolagen. U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira i/ili sprečava adheziju trombocita na ligand GPVI, kao što je, na primer, kolagen.

[0203] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira i/ili sprečava GPVI zavisnu proizvodnju trombina kao odgovor na ligand GPVI, kao što je, na primer, fibrin. U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira i/ili sprečava proizvodnju trombina katalizovanu trombocitima kao odgovor na kolagen i/ili tkivni faktor.

[0204] U jednom primeru izvođenja, navedeni protein inhibira i/ili sprečava regrutovanje trombocita pomoću liganda GPVI (kao što je, na primer, fibrin) preko GPVI.

[0205] U jednom primeru izvođenja, protein pronalaska indukuje zasićenje trombocita u punoj krvi ili plazmi bogatoj trombocitima kada je prisutan u koncentraciji u rasponu od oko 0,1 do oko 10 µg/mL, poželjno od oko 0,5 do oko 5 µg/mL, i poželjnije od oko 1 do oko 2 µg/mL (što odgovara oko 2 do oko 200 nM, poželjno od oko 10 do oko 100 nM, a poželjnije od oko 20 do oko 40 nM).

[0206] U jednom primeru izvođenja, protein pronalaska inhibira agregaciju trombocita izazvanu kolagenom kada se koristi u koncentraciji od najmanje oko 15 µg/mL, poželjno od najmanje oko 10 µg/mL, a poželjnije od najmanje oko 5 µg/mL. Poželjno, protein pronalaska u potpunosti inhibira kolagenom indukovanu agregaciju trombocita kada se koristi u takvim koncentracijama.

[0207] U jednom primeru izvođenja, IC50 proteina pronalaska za inhibiciju agregacije trombocita izazvane kolagenom kreće se od oko 0,5 do oko 10 µg/mL, poželjno od oko 1 do oko 6 µg/mL, poželjnije od oko 2 do oko 3,2 µg /mL.

[0208] U jednom primeru izvođenja, koncentracija proteina pronalaska koja smanjuje za 50% brzinu agregacije trombocita izazvane kolagenom kreće se od oko 0,5 do oko 5 µg/mL, poželjno od oko 1 do oko 3 µg/mL, poželjnije od oko 2 µg/mL.

[0209] U jednom primeru izvođenja, koncentracija proteina pronalaska koja smanjuje intenzitet agregacije trombocita izazvane kolagenom kreće se od oko 0,5 do oko 10 µg/mL, poželjno od oko 1 do oko 6 µg/mL, poželjnije od oko 3,2 µg/ mL. U jednom primeru izvođenja, protein pronalaska ne izaziva iscrpljivanje GPVI kada se primenjuje in vivo, kao što je, na primer, kada se daje u dozi u rasponu od 0,01 do 500 mg.

[0210] U jednom primeru izvođenja, protein pronalaska ne izaziva smanjenje broja trombocita, tj. trombocitopeniju, kada se primenjuje in vivo, kao što je, na primer, kada se daje u dozi u rasponu od 0,01 do 500 mg.

[0211] Ovaj pronalazak se takođe odnosi na protein, kompoziciju, farmaceutsku kompoziciju ili lek kao što je gore opisano za upotrebu u lečenju bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa GPVI.

[0212] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koristi za modulaciju interakcija leukocita-trombocita i trombocitaendotela u inflamaciji i/ili trombozi. Prema tome, prema jednom primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koristi za lečenje upale i/ili tromboze.

[0213] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za modulaciju, poželjno za sprečavanje agregacije i degranulacije trombocita.

[0214] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja povezanih sa abnormalnom ili aberantnom proliferacijom megakariocita i/ili trombocita, diferencijacijom, morfologijom, migracijom, agregacijom, degranulacijom i/ili funkcijom. Primeri ovih poremećaja uključuju, ali nisu ograničeni na, poremećaje krvarenja (kao što je, na primer, sklonost krvarenju i/ili produženo vreme krvarenja) kao što je trombocitopenija kao što je, na primer, idiopatska trombocitopenična purpura (ITP) ili imunološka trombocitopenija.

[0215] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje trombotičkih poremećaja (kao što je, na primer, trombotička okluzija koronarnih arterija), hemoragijskih poremećaja, bolesti koje pokazuju kvantitativnu ili kvalitativnu disfunkciju trombocita i bolesti koje pokazuju endotelnu disfunkciju. Ove bolesti uključuju, ali nisu ograničene na, bolesti koronarnih arterija i cerebralnih arterija.

[0216] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje cerebralnih vaskularnih bolesti, uključujući moždani udar i ishemiju, bolesti venske tromboembolije (kao što su, na primer, bolesti koje uključuju

1

oticanje nogu, bol i ulceraciju, plućnu emboliju, abdominalnu vensku trombozu), trombotičke mikroangiopatije, vaskularnu purpuru.

[0217] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje simptoma povezanih sa poremećajima i/ili bolestima trombocita (kao što su, na primer, poremećaji krvarenja). Konkretno, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što je gore opisano mogu se koristiti za modulaciju simptoma povezanih sa ITP kao što su purpura i teški problemi sa krvarenjem.

[0218] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje koronarnih bolesti (kao što su, na primer, kardiovaskularne bolesti uključujući nestabilnu anginu pektoris, infarkt miokarda, akutni infarkt miokarda, bolest koronarne arterije, koronarna revaskularizacija, koronarna restenoza, ventrikularna tromboembolija, ateroskleroza, bolest koronarne arterije (npr. arterijski okluzivni poremećaji), formiranje plaka, ishemija srca, uključujući komplikacije povezane sa koronarnim procedurama, kao što su procedure perkutane angioplastike koronarne arterije (balon angioplastika). Što se tiče koronarnih procedura, takav tretman se može postići primenom proteina pronalaska pre, tokom ili posle procedure. U poželjnom primeru izvođenja, takva primena se može koristiti za sprečavanje akutne srčane ishemije posle angioplastike.

[0219] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja koji su rezultat bilo kakvog oštećenja krvnih sudova koji može dovesti do agregacije trombocita. Takve povrede krvnih sudova uključuju, ali nisu ograničene na, povrede zida krvnih sudova, kao što su povrede sudova koje rezultiraju visoko trombogenom površinom izloženom unutar inače netaknutog krvnog suda, npr., povrede zida krvnih sudova koje rezultiraju oslobađanjem ADP, trombina i/ili epinefrina, stres smicanja tečnosti koji se javlja na mestu suženja krvnih sudova, rupture i/ili kidanje na mestima aterosklerotskih plakova i povrede koje su rezultat balon angioplastike ili aterektomija.

[0220] Dalje, u određenim primerima izvođenja, poželjno je da protein pronalaska ne utiče na druge atribute ili funkcije trombocita, kao što je promena oblika trombocita izazvana agonistom (npr. aktivacija trombocita posredovana preko GPIb-vWF), oslobađanje unutrašnjih komponenti granula trombocita, aktivacija puteva prenosa signala ili indukcija mobilizacije kalcijuma nakon aktivacije trombocita od strane agonista koji nisu u interakciji sa GPVI.

[0221] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja povezanih sa aberantnim prenosom signala kao odgovorom na ligande GPVI (uključujući, bez ograničenja, kolagen, fibrin, fibronektin, vitronektin i laminine) ili za druge proteine ekstracelularnog matriksa.

[0222] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek

2

kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja povezanih sa aberantnim nivoima ekspresije i/ili aktivnosti GPVI bilo u ćelijama koje normalno eksprimiraju GPVI ili u ćelijama koje ne eksprimiraju GPVI. Na primer, protein pronalaska se može koristiti za modulaciju poremećaja povezanih sa aberantnom ekspresijom GPVI u kanceroznim (npr. tumorskim) ćelijama koje normalno ne eksprimiraju GPVI. Takvi poremećaji mogu uključivati, na primer, one koji su povezani sa migracijom tumorskih ćelija i progresijom do metastaza.

[0223] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za modulaciju imunoregulatornih funkcija trombocita.

[0224] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja jetre, koštane srži i periferne krvi.

[0225] U sledećem primeru izvođenja, protein, kompozicija, farmaceutska kompozicija ili lek kao što su gore opisani se koriste za lečenje poremećaja u kojima trombociti doprinose modulacijom inflamatornih odgovora uključujući, bez ograničenja, trajnu ili produženu upalu povezanu sa infekcijom, artritisom, fibrozom ili poremećajima u kojima trombociti moduliraju ćelijske funkcije uključujući, bez ograničenja, proliferaciju i/ili diseminaciju ćelija kancera.

[0226] Dodatni primeri bolesti, poremećaja ili stanja povezanih sa GPVI uključuju, ali nisu ograničeni na, kardiovaskularne bolesti i/ili kardiovaskularne događaje, kao što su, na primer, arterijska tromboza uključujući aterotrombozu, ishemijske događaje, sindrom akutne koronarne arterije, infarkt miokarda (srčani napad), akutna cerebrovaskularna ishemija (moždani udar), perkutana koronarna intervencija, tromboza stenta, ishemija, restenoza, ishemija (akutna i hronična), bolesti aorte i njenih grana (kao što su aneurizma aorte, tromboza), bolest perifernih arterija, venska tromboza, akutni flebitis i plućna embolija, tromboza povezana sa kancerom (Trusoov sindrom), inflamatorna tromboza i tromboza povezana sa infekcijom.

[0227] U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija ili lek prema pronalasku je za upotrebu u lečenju arterijske ili venske tromboze, restenoze, akutnog koronarnog sindroma ili cerebrovaskularnih akcidenata usled ateroskleroze, poželjno tromboze.

[0228] Poželjno, terapeutski efikasna količina proteina pronalaska se primenjuje na subjekta kome je to potrebno.

[0229] Podrazumeva se da će o ukupnoj dnevnoj upotrebi proteina pronalaska, kompozicije, farmaceutske kompozicije ili leka ovog pronalaska odlučivati lekar koji prisustvuje u okviru racionalne medicinske procene. Specifični terapeutski efikasni nivo doze za svakog određenog pacijenta zavisiće od niza faktora uključujući bolest koja se leči i težinu bolesti; aktivnost specifičnog korišćenog proteina; specifičnu kompoziciju koja se koristi, starost, telesnu težinu, opšte zdravlje, pol i ishranu ispitanika; vreme primene, put primene i brzinu izlučivanja specifičnog proteina koji se koristi; trajanje lečenja; lekove koji se koriste u kombinaciji ili istovremeno sa određenim proteinom koji se koristi; i slični faktori dobro poznati u medicinskoj tehnici. Na primer, dobro je u okviru veštine da se započne sa dozama jedinjenja na nivoima nižim od onih koji su potrebni za postizanje željenog terapeutskog efekta i da se postepeno povećava doza dok se ne postigne željeni efekat. Međutim, dnevna doza proteina može varirati u širokom opsegu od oko 0,01 do 500 mg po odrasloj osobi dnevno. Poželjno, kompozicije sadrže oko 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 ili 500 mg aktivnog sastojka za simptomatsko podešavanje doze prema pacijentu koji se leči. Lek tipično sadrži od oko 0,01 mg do oko 1000 mg aktivnog sastojka, poželjno od 1 mg do oko 500 mg aktivnog sastojka.

[0230] U jednom primeru izvođenja, subjekat je pogođen bolešću, poremećajem ili stanjem povezanim sa GPVI, poželjno mu se postavlja dijagnoza bolesti, poremećaja ili stanja povezanog sa GPVI, poželjno kardiovaskularna bolest i/ili događaj.

[0231] U sledećem primeru izvođenja, subjekat je izložen riziku od razvoja bolesti, poremećaja ili stanja povezanog sa GPVI, poželjno kardiovaskularne bolesti i/ili događaja. Primeri rizika uključuju, ali nisu ograničeni na, porodičnu istoriju (kao što je, na primer, genetska predispozicija), etničku pripadnost, godine, izloženost duvanu, visok krvni pritisak (hipertenziju), visok holesterol, gojaznost, fizičku neaktivnost, dijabetes (posebno dijabetes tipa 2), nezdravu ishranu i štetnu upotrebu alkohola.

[0232] Za upotrebu u primeni na subjekta, kompozicija će biti formulisana za primenu na subjekta. Kompozicije ovog pronalaska se mogu davati parenteralno, sprejom za inhalaciju, rektalno, nazalno ili preko implantiranog rezervoara. Termin primena koji se ovde koristi tako da obuhvata subkutanu, intravensku, intramuskularnu, intraartikularnu, intrasinovijalnu, intrasternalnu, intratekalnu, intrahepatičnu, intralezijsku i intrakranijalnu tehniku injekcije ili infuzije.

[0233] Primeri oblika prilagođenih za injekcije uključuju, ali nisu ograničeni na, rastvore, kao što su, na primer, sterilni vodeni rastvori, gelovi, disperzije, emulzije, suspenzije, čvrsti oblici pogodni za upotrebu za pripremu rastvora ili suspenzija nakon dodavanja tečnosti pre upotrebe, kao što su, na primer, prah, lipozomalni oblici i slično.

[0234] Sterilni injekcioni oblici kompozicija ovog pronalaska mogu biti vodene ili uljane suspenzije. Ove suspenzije se mogu formulisati u skladu sa tehnikama poznatim u stanju tehnike korišćenjem pogodnih sredstava za dispergovanje ili vlaženje i sredstava za suspendovanje. Sterilni preparat za injekcije može takođe biti sterilni rastvor ili suspenzija za injekcije u netoksičnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu koristiti su voda, Ringerov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Pored toga, sterilna, fiksna ulja se uobičajeno koriste kao rastvarač ili medijum

4

za suspendovanje. U tu svrhu, može se koristiti bilo koje blago fiksno ulje uključujući sintetičke mono- ili digliceride. Masne kiseline, kao što je oleinska kiselina i njeni derivati glicerida su korisni u pripremi injekcija, kao i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što su maslinovo ulje ili ricinusovo ulje, posebno u njihovim polioksietilisanim verzijama. Ovi uljani rastvori ili suspenzije mogu takođe da sadrže dugolančani alkoholni razblaživač ili disperzante, kao što je karboksimetil celuloza ili slična sredstva za dispergovanje koja se obično koriste u formulaciji farmaceutski prihvatljivih doznih oblika uključujući emulzije i suspenzije. Drugi uobičajeno korišćeni surfaktanti, kao što su Tweens, Spans i drugi emulgatori ili pojačivači biodostupnosti koji se obično koriste u proizvodnji farmaceutski prihvatljivih čvrstih, tečnih ili drugih doznih oblika, takođe mogu da se koriste za svrhe formulacije.

[0235] Rasporedi i doze za primenu proteina u farmaceutskim kompozicijama ovog pronalaska mogu se odrediti u skladu sa poznatim postupcima za ove proizvode, na primer korišćenjem uputstava proizvođača. Na primer, protein prisutan u farmaceutskoj kompoziciji ovog pronalaska može da se isporučuje u koncentraciji u rasponu od oko 1 do oko 100 mg/mL, kao što je, na primer, u koncentraciji od 1 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 50 mg/mL ili 100 mg/mL. U jednom primeru izvođenja, protein se isporučuje u koncentraciji od oko 10 mg/mL u bočicama za jednokratnu upotrebu od 100 mg (10 mL) ili 500 mg (50 mL). U jednom primeru izvođenja, farmaceutska kompozicija pronalaska može da sadrži protein pronalaska u PBS pH 7,2-7,7. Biće jasno da su ovi rasporedi primeri i da se optimalni raspored i režim mogu prilagoditi uzimajući u obzir afinitet i podnošljivost određenog antitela u farmaceutskoj kompoziciji koja se mora odrediti u kliničkim ispitivanjima.

[0236] Protein pronalaska se može koristiti in vitro ili in vivo za identifikaciju uzoraka, tkiva, organa ili ćelija koje eksprimiraju GPVI.

[0237] Primeri testova u kojima se može koristiti protein pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, ELISA, sendvič ELISA, RIA, FACS, imunohistohemiju tkiva, Western-blot i imunoprecipitaciju.

[0238] Uzorak je biološki uzorak. Primeri bioloških uzoraka uključuju, ali nisu ograničeni na, telesne tečnosti, poželjno krv, poželjnije krvni serum, plazmu, sinovijalnu tečnost, bronhoalveolarnu tečnost za ispiranje, sputum, limfu, ascitnu tečnost, urin, amnionsku tečnost, peritonealnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pleuralnu tečnost, perikardijalnu tečnost i alveolarne makrofage, lizate tkiva, biopsije i ekstrakte pripremljene iz obolelih tkiva.

[0239] Termin "uzorak" označava uzorak uzet od pojedinca pre bilo kakve analize.

[0240] Protein pronalaska može biti obeležen u dijagnostičke ili detekcione svrhe. Pod označenim ovde se podrazumeva da jedinjenje ima najmanje jedan element, izotop ili hemijsko jedinjenje vezan da omogući detekciju jedinjenja. Primeri oznaka uključuju, ali nisu ograničeni na, izotopske oznake kao što su radioaktivni ili teški izotopi; magnetne, električne ili termalne etikete i obojene ili luminiscentne boje. Primeri luminiscentnih boja uključuju, ali nisu ograničeni na, komplekse lantanida, kvantne tačke, fluorescein, rodamin, tetrametilrodamin, eozin, eritrozin, kumarin, metil-kumarine, piren, malahit zelenu, stilben, lucifer žutu, kaskadnu plavu, teksas crvenu, aleksa boje i cy boje.

[0241] Sledeći predmet otkrića je komplet koji sadrži najmanje jedan protein pronalaska.

[0242] Pod "kompletom" se podrazumeva svaka proizvodnja (npr. pakovanje ili kontejner) koji sadrži najmanje jedan reagens, tj. na primer antitelo, za specifičnu detekciju ekspresije GPVI. Komplet se može promovisati, distribuirati ili prodavati kao jedinica za izvođenje postupaka ovog pronalaska. Štaviše, bilo koji ili svi reagensi iz kompleta mogu biti obezbeđeni u kontejnerima koji ih štite od spoljašnje sredine, kao što su zatvoreni kontejneri. Kompleti mogu takođe sadržati uputstvo za pakovanje koji opisuje komplet i postupke za njegovu upotrebu.

[0243] U jednom primeru izvođenja, primena proteina pronalaska na subjekta ne izaziva iscrpljivanje GPVI in vivo.

[0244] U jednom primeru izvođenja, primena proteina pronalaska na subjekta ne indukuje smanjenje broja trombocita. Prema tome, u jednom primeru izvođenja, primena proteina pronalaska na subjekta ne indukuje trombocitopeniju.

[0245] U jednom primeru izvođenja, primena proteina pronalaska na subjekta ne indukuje povećanje vremena krvarenja.

KRATAK OPIS CRTEŽA

[0246]

Slika 1 je fotografija gela obojenog Coomassie Blue, koja prikazuje protein pronalaska. MM: marker molekulske težine, FT: protok kroz frakciju, PX: prečišćen protein (eluiran iz kolone Protein-L agaroze). CM kultura ćelija sa kondicioniranim medijumom

Slika 2 je grafik koji prikazuje krive vezivanja izoterme dva humanizovana Fab prema pronalasku. Prečišćeni GPVI-Fc je obložen na mikrotitracione ploče i prečišćeni proteini su dodavani u rastućim koncentracijama. Nakon ispiranja, otkriveni su vezani proteini korišćenjem antitela vezanog za alkalnu fosfatazu na humani Fab fragment i merena je hidroliza supstrata alkalne fosfataze na 485 nm.

Slika 3 je kriva dobijena protočnom citometrijom sa Alexa488-spojenom ACT017. ACT017 je spojen na A488 prema uputstvima proizvođača. A488-ACT017 je dodat u rastućim koncentracijama celoj humanoj antikoagulisanoj krvi ili plazmi bogatoj trombocitima zdravog dobrovoljca. Posle 20 minuta na sobnoj temperaturi, uzorci su razblaženi i odmah analizirani protočnom citometrijom. Srednja fluorescencija trombocita je predstavljena kao funkcija A488sparene koncentracije ACT017. Podaci iz jednog reprezentativnog eksperimenta od ukupno 3. Slika 4 je kriva koja pokazuje agregaciju trombocita merenu u humanoj plazmi bogatoj trombocitima (PRP). PRP je prethodno inkubirana sa rastućim koncentracijama prečišćenog ACT017 tokom 10 minuta na 37°C bez mešanja pre nego što je kolagen pokrenuo agregaciju trombocita (1 µg.mL<-1>). Inkubacija je produžena na 37°C uz mešanje i kontinuirano registrovanje promena u propuštanju svetlosti. Podaci iz jednog reprezentativnog eksperimenta od ukupno 3.

Slika 5 je grafikon koji pokazuje kapacitet ACT017 da inhibira kolagenom indukovanu agregaciju trombocita kvantitativno određenu na osnovu brzine i intenziteta odgovora. Intenzitet i brzina agregacije trombocita mereni su pri svakoj koncentraciji ACT017. Preostali odgovori su izračunati kao odnos odgovora u prisustvu ACT017 i odgovora u odsustvu ACT017 x100 i prikazani su kao funkcija koncentracije ACT017 korišćenjem nelinearne regresione krive konkurencije (log (inhibitor) naspram odgovora) (tri parametra) iz softvera Graph Pad Prism (5.0). Krive su iz jednog reprezentativnog eksperimenta od ukupno 3.

Slika 6 je kombinacija grafikona koji prikazuje agregaciju trombocita izazvanu kolagenom. Prijavljen je maksimalni stepen agregacije trombocita izazvan dodatkom kolagena (1 µg/mL) u plazmu bogatu trombocitima (PRP) miševa koji su primili vehikulum ili rastuće doze ACT017.

Slika 7 je kombinacija grafikona koji prikazuje ekspresiju GPVI na trombocitima. Krv dobijena pre injekcije i 30 minuta nakon injekcije vehikuluma ili rastućih doza ACT017 inkubirana je sa FITC-sparenim anti-GPVI monoklonskim antitelom 3J24. Levi panel: srednja fluorescencija trombocita miševa tretiranih vehikulumom (ACT17 0 mg/kg) ili ACT017 u različitim dozama. Srednji i desni panel: Evolucija ekspresije GPVI između vremena pre injekcije i 30 minuta nakon injekcije je prijavljena za pojedinačne životinje tretirane vehikulumom ili sa ACT017 (4 mg/kg).

Figura 8 je grafik koji prikazuje broj trombocita u krvi miševa nakon primene ACT017 (4 mg/kg) ili vehikuluma (ACT170 mg/kg).

Slika 9 je kombinacija grafikona koji prikazuje vreme krvarenja (A) i gubitak krvi (B) miševa 30 minuta nakon primene vehikuluma (Ctrl), ACT017 (4 mg/kg) ili klopidogrela, antagonista P2Y12 ADP receptora na trombocitima (10 mg/kg).

Slika 10 je kombinacija grafikona koji prikazuje srednju vrednost ± SEM intenziteta (A) i brzine (B) agregacije trombocita izazvane kolagenom izmerena 30 minuta i 2 sata nakon završetka 15-minutne infuzije rastućih doza ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) makaki majmunima (n=4).

Slika 11 prikazuje broj trombocita u krvi makakija izmeren pre bilo kakvog tretmana (T0) ili 24 sata nakon infuzije vehikuluma ili ACT017 u rastućim dozama (1, 2, 4, 8 mg/kg).

Slika 12 je kombinacija grafikona koji prikazuje vreme krvarenja izmereno kod 4 subjekta, pre tretmana (vreme = 0) i 30 minuta i 2 sata nakon infuzije ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) ili vehikuluma makaki majmunima.

Slika 13 je kombinacija grafikona koji prikazuje srednju vrednost ± SD intenziteta (A) i brzine (B) kolagenom indukovane agregacije trombocita merene u različito vreme nakon početka jednočasovne infuzije dve doze ACT017 (2 i 8 mg/kg) makaki majmunima (n=8).

Slika 14 je grafikon koji pokazuje nivo ekspresije GPVI izmeren protočnom citometrijom na trombocitima makaki majmuna (n = 8) u različito vreme nakon početka jednočasovne infuzije ACT017 pri 2 mg/kg (MFI: srednji intenzitet fluorescencije).

PRIMERI

[0247] Ovaj pronalazak je dalje ilustrovan sledećim primerima.

Primer 1: Proizvodnja ACT017 i ACT006

[0248] Antitela ACT017 i ACT006 (Fab fragmenti) su proizvedena u CHO-S ćelijama (Invitrogen) prolaznom transfekcijom, korišćenjem standardnih uslova prema uputstvima proizvođača.

[0249] Ukratko, neposredno pre transfekcije, CHO-S ćelije su podeljene i zasejane u 10 mL medijuma za rast bez seruma u gustini od 0,5-1,0 × 10<6>ćelija/mL. Ćelije su zatim transfektovane vektorom koji sadrži sekvencu koja kodira laki i teški lanac antitela prema pronalasku. Supernatanti kulture su dobijeni 4 do 5 dana nakon transfekcije, kada je vitalnost ćelija bila niža od 80%.

[0250] Za ACT017, ćelije su transfektovane korišćenjem vektora koji sadrži SEQ ID NO: 19 i SEQ ID NO: 18, pri čemu SEQ ID NO: 19 sadrži sekvence koje kodiraju konstantne i varijabilne regione lakog lanca ACT017 fuzionisane sa sekvencom signalnog peptida, i mesta kloniranja, i gde SEQ ID NO: 18 sadrži sekvence koje kodiraju konstantne i varijabilne regione teškog lanca ACT017 fuzionisane sa sekvencom signalnog peptida i mesta za kloniranje.

[0251] Za ACT006, ćelije su transfektovane korišćenjem vektora koji sadrži SEQ ID NO: 20 i SEQ ID NO: 18, pri čemu SEQ ID NO: 20 sadrži sekvence koje kodiraju konstantne i varijabilne regione lakog lanca ACT006 fuzionisane sa sekvencom signalnog peptida, i mesta kloniranja, i gde SEQ ID NO: 18 sadrži sekvence koje kodiraju konstantne i varijabilne regione teškog lanca ACT006 fuzionisane sa sekvencom signalnog peptida i mesta za kloniranje.

[0252] Za prečišćavanje, kondicionirani medijum ćelija koje su prolazno transfektovane sa cDNK humanizovanog Fab je nanet na kolonu Protein L agaroze (PIERCE protein L Agarose kat br. 20510017) prema uputstvima proizvođača. Fab je eluiran korišćenjem glicina 0,1 M pH 2,5 i frakcije su sakupljene na Tris 1 M pH 11 da bi se neutralisao pH. Nakon dijalize protiv PBS-a, koncentracija Fab je određena merenjem apsorbance na 280 nm i 320 nm za korekciju rasejanja svetlosti i korišćenjem vrednosti apsorbance za 0,1% rastvora (A280nm<0.1%>) od 1,5 kako je određeno iz niza. Koncentracija proteina je potvrđena BCA testom. Čistoća Fab je procenjena pomoću SDS-PAGE i Coomassie Blue bojenjem.

[0253] Kao što je prikazano na slici 1, u neredukcionim uslovima, prečišćeni humanizovani Fab je migrirao kao glavnu traku od 42 kDa u skladu sa njegovom aminokiselinskom sekvencom. Nakon redukcije disulfidnog mosta, primećen je dublet na 23-24 kDa koji odgovara teškim i lakim lancima.

Primer 2: Vezivanje za GPVI-Fc

[0254] Rastvorljivi GPVI-Fc je proizveden na sledeći način: otvoreni okvir čitanja predviđenog ekstracelularnog domena GPVI je PCR-amplifikovan iz Kozak sekvence pre prvog metionina do asparagina 269, neposredno pre predviđene transmembranske sekvence. PCR fragment je vezan u pCDM8 vektor domaćina koji sadrži genomsku sekvencu humanog IgG1 Fc domena, tako da je ekstracelularni deo cDNK hGPVI fuzionisan na svom C-terminusu preko 3 alaninskog linkera sa hFc sekvencom. Sekvencirani DNK konstrukt je transfektovan u HEK 293T ćelije. GPVI-Fc je prečišćen iz kondicioniranog medijuma ćelija afinitetnom hromatografijom na Protein A agarozi prema preporukama proizvođača.

[0255] Ploče za mikrotitraciju su obložene GPVI-Fc u PBS (2 µg/mL, 100 µL po bunarčiću) preko noći na 4°C. Mesta nespecifičnog vezivanja su zasićena sa 100 µL 1% BSA u PBS tokom 120 min. Ploče su zatim inkubirane sa povećanjem koncentracija preparata antitela (100 µL u PBS koji sadrži 0,1% BSA i 0,1% Tween 20) tokom 120 min. Posle 4 kruga ispiranja ploče su inkubirane sa mišjim antitelom vezanim za alkalnu fosfatazu protiv humanog Fab (100 µL, u PBS-u koji sadrži 0,1% BSA i 0,1% Tween 20) tokom 120 minuta. Konačno, 100 µL rastvora supstrata (paranitrofenilfosfat) je dodato u svaki bunarčić tokom 5 minuta, a kolorimetrijska reakcija je zaustavljena sa 25 µL NaOH 3 M pre očitavanja apsorbance na 405 nm. Alternativno, antitela vezana za GPVI su detektovana korišćenjem proteina L vezanog za peroksidazu i O-fenilendiamin dihidrohlorida (OPD) kao supstrata, očitavanje je zatim obavljeno na 485 nm.

[0256] Slika 2 prikazuje izotermne krive vezivanja dva humanizovana Fab pronalaska na imobilizovanom GPVI-Fc. Analiza krivih je omogućila izračunavanje konstante poluzasićenja od 1 nM za ACT006 i 0,5 nM za ACT017.

Primer 3: Površinska plazmon rezonanca (BIAcore)

[0257] Vezivanje ACT017, ACT006 i Fab 9012 za rastvorljivi humani GPVI analizirano je površinskom plazmon rezonancom korišćenjem BIAcore 2000 sistema (Upsala, Švedska).

[0258] Rastvorljivi GPVI-Fc (proizveden kao što je opisano u Primeru 2) je imobilizovan u acetatnom puferu 10 mM pH 6 u dozi u rasponu od 960 do 1071 RU (što odgovara oko 6,4 do 7,15 fmol/mm<2>) na karboksi-metil dekstran CM5 senzorski čip korišćenjem postupka spajanja amina (Wizard postupak). Protein je zatim propušten preko imobilizovanog GPVI-Fc u PBS pH 7,4 (10 mM fosfat, 138 mM NaCl, 2,7 mM KCl, pH 7,42 na 25,4°C) pri brzini protoka od 20 µL/ηmin na 25°C. Kinetičke konstante (KA, KD, kon, koff) i afinitet se određuju korišćenjem softvera BIAevaluation verzije 3.0, prilagođavanjem podataka modelu vezivanja. PBS pH 7,4 je pufer za analizu.

[0259] Rezultati su prikazani u tabeli 1 ispod:

Tabela 1

[0260] Antitela pronalaska (ACT017 i ACT006) stoga prikazuju pojačan afinitet za rastvorljivi GPVI u poređenju sa monoklonalnim Fab 9012 opisanim u prethodnom stanju tehnike i proučavanim u istim eksperimentalnim uslovima.

Primer 4: Biološki podaci

Materijali i metode

[0261] Humani trombociti: Krv je sakupljena od zdravih dobrovoljaca koji nisu uzimali lekove od 10 dana punkcijom vene na natrijum citrat 3,2% (Vacutainer Beckton Dickinson, Le Pont-de-Clais, Francuska). Svi davaoci krvi su bili volonteri koji su dali svoj besplatni pismeni pristanak na ovu istraživačku studiju, koja je u skladu sa etičkim standardima Helsinške deklaracije.

[0262] Protočna citometrija: Humanizovani Fab ACT017 je spojen na Alexa488 (Molecular Probes) prema preporuci proizvođača. Razdvajanje je izvedeno korišćenjem kompleta za prečišćavanje konjugata antitela (Molecular Probes) i koncentracija je određena na 280 i 494 nm. Humanizovani Fab spojen sa A488 u različitim koncentracijama je inkubiran sa humanim trombocitima u punoj krvi ili plazmi bogatoj trombocitima 20 minuta na sobnoj temperaturi u mraku. Nakon razblaženja u PBS, ćelije su analizirane pomoću protočnog citometra aktiviranog fluorescencijom ćelija (FACS LSR II BD).

[0263] Agregacija trombocita: Humana plazma bogata trombocitima (PRP) je dobijena nakon centrifugiranja (120 x g; 15 min; 20°C) i odmah korišćena. Agregacija trombocita je merena korišćenjem APACT<®>agregometra i inicirana dodavanjem 1 µg.mL<-1>kolagena tipa I (Horm kolagen, Nicomed, DE) na PRP koji sadrži različite koncentracije humanizovanog Fab i kontinuirano se beleži. Izmereni su brzina i intenzitet agregacije.

[0264] GPVI-humanizovani miševi: gp6 „knock-in“ mutantna linija miša je uspostavljena kao što je prethodno objavljeno uvođenjem sekvence humanog gp6 gena u egzon 1 na ATG mišjeg gp6 gena (Mangin P et al., A Humanized Glycoprotein VI (GPVI) Mouse Model to Assess the Antithrombotic Efficacies of Anti-GPVI Agents. J Pharmacol Exp Ther. 2012;341(1):156-63. doi: 10.1124/jpet.111.189050. Epub 2012 Jan 11). Miševi su bili vijabilni i plodni i nisu imali nikakve hematološke defekte. Otprilike 3700 kopija humanog GPVI otkriveno je na površini trombocita.

[0265] Broj trombocita: Cela krv je sakupljena u EDTA (6 mM) nakon presecanja repa miša. Broj trombocita je određen u scil Vet abc automatskom brojaču ćelija (Scil Animal Care Company, Holtzheim, Francuska) podešenom na parametre miša.

[0266] Ex vivo agregacija trombocita: Krv prikupljena na trinatrijum citratu pre injekcije i 30 minuta nakon injekcije rastućih doza ACT017 ili ekvivalentne zapremine vehikuluma i PRP dobijenog centrifugiranjem. Broj trombocita je podešen na 30010<9>.L<-1>i agregacija trombocita pokrenuta sa 1 µg.mL<-1>Kolagen tipa I je kontinuirano beležen u četvorokanalnom CARAT TX4 agregometru.

[0267] Ekspresija GPVI: Uzorci krvi su sakupljeni na EDTA pre injekcije i 30 minuta nakon injekcije rastućih doza ACT017 ili ekvivalentne zapremine vehikuluma i inkubirani su sa FITC-spojenim anti-GPVI monoklonskim antitelom 3J24 (10 µg.mL<-1>) koji prepoznaje humani GPVI na epitopu različitom od epitopa ACT017, a fluorescencija je merena na Beckman Coulter Gallios Flow citometru.

[0268] Vreme krvarenja iz repa i izgubljena krv: Ekstremitet repa anesteziranih miševa je presečen poprečno skalpelom (3 mm) i odmah uronjen u epruvetu koja sadrži 13 mL 0,9% izotoničnog fiziološkog rastvora na 37°C. Krvarenje je posmatrano i mereno tokom 30 minuta, a kada je bilo potrebno, krvarenje je zaustavljeno ručno u vremenskoj tački od 10 minuta da bi se sprečila smrt. Obim izgubljene krvi je meren na osnovu sadržaja hemoglobina.

1

[0269] Makaki majmuni: U studiji je korišćeno 8 makaki majmuna bez bilo kakvog prethodnog tretmana. Merenja agregacije trombocita vršena su uglavnom kao što je opisano za humane trombocite i korišćenjem koncentracije kolagena od 2,5 mg.mL<-1>. Broj trombocita je meren u EDTA antikoaguliranoj krvi. Vreme krvarenja je mereno na budnim majmunima na površini podlaktice, prema standardnoj kliničkoj proceduri i korišćenjem 0,5 cm Surgicutt<™>uređaja za vreme krvarenja. Ekspresija GPVI je merena uglavnom kao što je gore opisano korišćenjem komercijalnog FITC spojenog anti-humanog GPVI monoklonskog antitela (klon 1G5, Biocytex) koje unakrsno reaguje sa GPVI makakija.

Rezultati

[0270] In vitro vezivanje ACT017 za humane trombocite - Tipična kriva vezivanja Alexa488-spojenog ACT017 za humane trombocite kao što je utvrđeno protočnom citometrijom prikazana je na slici 3. Zasićenje trombocita se dobija u punoj krvi i PRP za koncentraciju antitela od 1 do 2 µg/ mL (20 do 40 nM).

[0271] Inhibicija, in vitro, kolagenom indukovane agregacije humanih trombocita - Tipične krive agregacije dobijene nakon preinkubacije humanog PRP sa povećanjem koncentracije ACT017 su prikazane na slici 4. U ovim uslovima ACT017 je u potpunosti inhibirao kolagenom indukovanu agregaciju trombocita za koncentraciju ≥ 5 µg/mL.

[0272] Kapacitet ACT017 da inhibira agregaciju trombocita izazvanu kolagenom kvantifikovan je na osnovu brzine i intenziteta odgovora kao što je prikazano na slici 5. Na tri različita donatora, srednja vrednost IC50 bila je 3,2±2,5 i 2±0,7 µg.mL<-1>za intenzitet i brzinu respektivno, dok je potpuna inhibicija uočena za koncentraciju od 6,7±2,9 µg.mL<-1>u oba slučaja to se dobro slaže sa rezultatima vezivanja za trombocite.

[0273] Ovi rezultati stoga pokazuju da su proteini pronalaska potentni inhibitori agregacije trombocita izazvane kolagenom.

[0274] Spremni za analizu ex vivo efekat ACT017 na kolagenom indukovanu agregaciju trombocita, broj trombocita i ekspresiju GPVI, GPVI-humanizovani miševi su primili intravensku injekciju ACT017 (1, 2 ili 4 mg/kg) ili vehikulum. 30 minuta nakon injekcije, krv je sakupljena za analizu kolagenom indukovane agregacije trombocita, broja trombocita i ekspresije GPVI.

[0275] Kao što je prikazano na slici 6, primećena je potpuna inhibicija kolagenom indukovane agregacije trombocita kada su miševi primili ACT017 u dozi ≥ 0,5 mg/kg.

[0276] Što se tiče ekspresije GPVI, nije bilo statističke razlike u srednjoj fluorescenciji trombocita u uzorcima dobijenim pre i posle tretmana, kao ni između uzoraka miševa tretiranih

2

nosačem (ACT017 0 mg/kg) ili ACT017 u različitim dozama (Slika 7, levi panel). Srednji i desni paneli na slici 7 pokazuju evoluciju ekspresije GPVI između vremena pre injekcije i 30 minuta nakon injekcije kod pojedinačnih životinja tretiranih vehikulumom ili sa ACT017 4 mg/kg.

[0277] Ovi rezultati pokazuju da ACT017 ne izaziva iscrpljivanje GPVI in vivo.

[0278] Štaviše, meren je broj trombocita kod miševa koji su primili vehikulum (ACT017 0 mg/kg) ili ACT017 (4 mg/kg). Kao što je prikazano na slici 8, nije dokazana statistička razlika između dve grupe (srednja vrednost ± SD: 847,7±110,5 naspram 842±115,5).

[0279] Vreme krvarenja i gubitak krvi izmereni transekcijom repa miševa 30 minuta nakon primene ACT017 (4 mg/kg) bili su nepromenjeni u poređenju sa vrednostima dobijenim kod kontrolnih miševa (injekcija nosačem) (Slika 9). Poređenja radi, vreme krvarenja kod miševa tretiranih klopidogrelom (10 mg/kg dan pre i dva sata pre eksperimenta) je značajno povećano, kao i gubitak krvi.

[0280] Ovaj rezultat pokazuje da ACT017 ne izaziva smanjenje broja trombocita, tj. trombocitopeniju in vivo.

[0281] Efekat primene ACT017 je dalje karakterisan kod primata koji nisu ljudi. U studiju je uključeno osam makaki majmuna. Prvo, rastuće doze ACT017 (1, 2, 4, 8 mg/kg) su intravenski primenjivane tokom 15 minuta. U vreme 30 minuta i 2 sata nakon primene, sakupljena je krv. Agregacija trombocita je reverzibilno inhibirana na način koji zavisi od doze (Slika 10). Povećanje doze sa 1 na 2 i sa 2 na 4 mg/kg povećava efekat, dok 8 mg/kg nema dodatnog efekta u poređenju sa 4 mg/kg. Broj trombocita izmeren 24 sata nakon injekcije nije modifikovan u poređenju sa vrednostima dobijenim pre injekcije (Slika 11). Nije primećeno značajno povećanje vremena krvarenja nakon tretmana sa vehikulumom ili sa 2, 4 ili 8 mg/kg ACT017 (Slika 12). Zatim, nakon perioda ispiranja, makaki je primio ACT017 (2 ili 8 mg/kg) primenjen kao jednosatnu perfuziju. Agregacija trombocita i ekspresija GPVI mereni su u različito vreme nakon početka tretmana: (1, 1,5, 2, 4 i 7 sati) (Slike 13 i 14). Agregacija trombocita izazvana kolagenom je reverzibilno inhibirana i trajanje efekta je produženo kod makakija tretiranog sa 8 mg/kg u poređenju sa 2 mg/kg (Slika 13). Ekspresija GPVI na trombocitima ostala je stabilna u različito vreme nakon početka tretmana u poređenju sa vrednostima pre tretmana (Slika 14).

[0282] Zajedno, ovi rezultati potvrđuju kod primata koji nisu ljudi da primena ACT017 efikasno i reverzibilno inhibira funkciju GPVI bez uticaja na broj trombocita, na ekspresiju GPVI na površini trombocita ili na vreme krvarenja.

Primer 5: Mapiranje epitopa

Materijali i metode

[0283] Za rekonstrukciju epitopa ciljnog molekula, tj. humanog GPVI, sintetisana je biblioteka peptida. Amino funkcionalizovana polipropilenska podloga dobijena je graftovanjem sa vlasničkom formulacijom hidrofilnog polimera, nakon čega je usledila reakcija sa tbutiloksikarbonil-heksametilendiaminom (BocHMDA) upotrebom dicikloheksilkarbodiimida (DCC) sa N-hidroksibenzotriazolom (HOBt) i naknadnim cepanjem Boc-grupa upotrebom trifluorosirćetne kiseline (TFA). Standardna Fmoc-peptidna sinteza je korišćena za sintezu peptida na amino-funkcionalizovanoj čvrstoj podlozi pomoću prilagođenih modifikovanih JANUS stanica za rukovanje tečnostima (Perkin Elmer).

[0284] Sinteza strukturnih mimika je urađena korišćenjem Pepscan-ove vlasničke Chemically Linked Peptides on Scaffolds (CLIPS) tehnologije. CLIPS tehnologija omogućava strukturiranje peptida u pojedinačne petlje, dvostruke petlje, trostruke petlje, nabore nalik na listove, nabore nalik spirali i njihove kombinacije. CLIPS šabloni su spojeni sa ostacima cisteina. Bočni lanci više cisteina u peptidima su povezani sa jednim ili dva CLIPS šablona. Na primer, 0,5 mM rastvor P2 CLIPS (2,6-bis(bromometil)piridin) rastvoren je u amonijum bikarbonatu (20 mM, pH 7,8)/acetonitrilu (1:3 (zapr./zapr.)). Ovaj rastvor se dodaje na peptidne nizove. CLIPS šablon se vezuje za bočne lance dva cisteina koji su prisutni u peptidima vezanim za čvrstu fazu peptidnih nizova (ploča sa 455 otvora sa 3 µL bunarčića). Nizovi peptida se lagano mućkaju u rastvoru 30 do 60 minuta dok su potpuno prekriveni rastvorom. Konačno, nizovi peptida se intenzivno isperu sa viškom H2O i obrađuju ultrazvukom u puferu za prekidanje koji sadrži 1% SDS/0,1% betamerkaptoetanola u PBS (pH 7,2) na 70°C tokom 30 minuta, nakon čega je usledilo obrađivanje ultrazvukom u H2O još 45 minuta. Peptidi koji nose T3 CLIPS napravljeni su na sličan način, ali sa tri cisteina.

[0285] Vezivanje ACT017 za svaki od sintetisanih peptida je testirano u ELISA baziranoj na PEPSCAN. Peptidni nizovi su inkubirani sa primarnim rastvorom antitela (preko noći na 4°C). Nakon ispiranja, peptidni nizovi su inkubirani sa 1/1000 razblaženjem odgovarajućeg konjugata peroksidaze antitela (SBA; kozji anti-humani HRP konjugat, Southern Biotech, 2010-05) tokom jednog sata na 25°C. Nakon ispiranja, dodati su supstrat peroksidaze 2,2'-azino-di-3-etilbenztiazolin sulfonat (ABTS) i 20 µl/mL 3 procenta H2O2. Posle jednog sata, izmeren je razvoj boje. Razvoj boje je kvantitativno određen pomoću kamere sa uređajem sa spojenim punjenjem (CCD) i sistema za obradu slike.

[0286] Vrednosti dobijene sa CCD-kamere se kreću od 0 do 3000 mAU, slično kao kod standardnog ELISA čitača ploča sa 96 bunarčića. Rezultati se kvantitativno određuju i čuvaju u Peplab bazi podataka.

[0287] Da bi se proverio kvalitet sintetisanih peptida, paralelno je sintetisan odvojen skup

4

peptida pozitivne i negativne kontrole. Oni su testirani antitelom 57.9 (Posthumus et al., J. Virology, 1990, 64:3304-3309).

[0288] Analizirani su profili intenziteta za svaki set peptida (linearni, spiralni, petljasti, diskontinualni) i procenjeno je sistematsko vezivanje.

Rezultati

[0289] Nakon nekoliko rundi optimizacije stanja, pokazalo se da ACT017 sistematski prepoznaje diskontinuirani epitop sastavljen od peptidnih delova GPAVSSGGDVTLQCQ i TVTAAHSGTYRCYSF, gde je GPAVSSGGDVTLQCQ dominantni deo mesta prepoznavanja, pošto CLIPS-ograničeni peptidi koji sadrže ovu sekvencu takođe mogu biti vezani sa ACT017, međutim, nema detektabilnog vezivanja sa linearnim peptidima koji sadrže ovu sekvencu.

[0290] Bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, pretpostavlja se da peptidni niz TVTAAHSGTYRCYSF verovatno pruža dodatni strukturni kontekst za vezivanje.

[0291] Peptidni niz GPAVSSGGDVTLQCQ je značajno modifikovan u mišjem GPVI, sa nekoliko nesinonimnih mutacija; nasuprot tome, visoko je očuvan kod primata koji nisu ljudi. Bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, sugeriše se da ovo objašnjava zašto se ACT017 vezuje za humani GPVI i GPVI ne-humanih primata, ali ne i za mišji GPVI.

[0292] Bez želje da budemo vezani bilo kakvom teorijom, sugeriše se da bi vezivanje ACT17 za identifikovani epitop trebalo da naruši vezivanje kolagena za GPVI Ig sličan C2-tip domena 1 (D1) i/ili dimerizaciju GPVI i posledično visok afinitet vezivanje za kolagen.

1

2

4

Claims

Patentni zahtevi

1. Izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela, naznačeno time što aminokiselinska sekvenca koja kodira varijabilni region teškog lanca navedenog antitela ili njegovog fragmenta sadrži SEQ ID NO: 7 i aminokiselinska sekvenca koja kodira varijabilni region lakog lanca pomenutog antitela ili njegovog fragmenta sadrži SEQ ID NO: 8.

2. Izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema zahtevu 1, koje je molekul antitela izabran iz grupe koja se sastoji od celog antitela, jednolančanog antitela, Fv, fragmenta antitela kome nedostaje zglobni region IgG4 antitela i koji ima univalentni vezujući region i Fab.

3. Izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 ili 2, koje je monovalentno.

4. Izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, za upotrebu kao lek.

5. Kompozicija koja sadrži izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3.

6. Farmaceutska kompozicija koja sadrži izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3 i najmanje jedan farmaceutski prihvatljiv ekscipijens.

7. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 6 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, naznačena time što, navedeno stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od arterijske i venske tromboze, restenoze, akutnog koronarnog sindroma, ishemičnih cerebrovaskularnih akcidenata, cerebralnih vaskularnih bolesti, venskih tromboembolijskih bolesti, trombotičkih mikroangiopatija i vaskularne purpure.

8. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 6 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, naznačena time što, navedeno stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od koronarnih arterijskih bolesti i cerebralnih arterijskih bolesti.

9. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 6 za upotrebu u lečenju stanja povezanog sa GPVI, naznačena time što, navedeno stanje povezano sa GPVI je kardiovaskularna bolest izabrana od aterotromboze, ishemijskih događaja, sindroma akutne koronarne arterije, infarkta miokarda, moždanog udara, perkutane koronarne intervencije, tromboze stenta, ishemijske restenoze, akutne ishemije, hronične ishemije, bolesti aorte i njenih grana, periferne arterijske bolesti, venske tromboze, akutnog flebitisa, plućne embolije, tromboze povezane sa kancerom, inflamatorne tromboze i tromboze povezane sa infekcijom.

10. Ekspresioni vektor koji sadrži nukleinske sekvence koje kodiraju izolovano humanizovano antitelo koje se vezuje za humani glikoprotein VI (hGPVI) ili njegov fragment antitela prema bilo kom od zahteva 1 do 3, naznačen time što navedeni vektor sadrži nukleinsku sekvencu koja kodira varijabilni region teškog lanca SEQ ID NO: 10 ili bilo koju sekvencu koja ima sekvencu nukleinske kiseline koja deli najmanje 75% identičnosti sa navedenom SEQ ID NO: 10, i nukleinsku sekvencu koja kodira laki lanac varijabilnog regiona SEQ ID NO: 11 ili bilo koju sekvencu koja ima sekvencu nukleinske kiseline koja deli najmanje 75% identičnosti sa navedenom SEQ ID NO: 11.