RS63530B1

RS63530B1 - Jedinjenja korisna za inhibiciju cdk7

Info

Publication number: RS63530B1
Application number: RS20220824A
Authority: RS
Inventors: David Andrew Coates; Carlos Montero; Bharvin Kumar Rameschandra Patel; David Michael Remick; Vipin Yadav
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 2017-11-16
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2022-09-30
Also published as: MX2020004932A; SI3710446T1; UA122893C2; SA520411990B1; WO2019099298A1; AU2018369508A1; US20190144456A1; IL274540A; LT3710446T; US10787460B2; IL274540B; CR20200184A; DK3710446T3; MY197700A; ECSP20025899A; AU2018369508B2; JP6633254B2; MD3710446T2; CL2020001218A1; KR102450727B1

Description

Opis

[0001] Ovaj pronalazak se odnosi na jedinjenja korisna za inhibiciju ciklin-zavisne kinaze 7 (CDK7), na farmaceutske kompozicije i njihovu upotrebu u postupcima lečenja bolesti povezanih sa aktivnostima CDK7.

[0002] Ciklin-zavisne kinaze (CDKe) su glavna klasa kinaza i važne su u proliferaciji ćelija kancera i deregulaciji onkogenih transkripcija. CDK7 se vezuje za ciklin H i MATI da formira trimernu ciklin-aktivirajuću kinazu (CAK) koja obavlja svoju funkciju fosforilacijom drugih CDKa uključenih u kontrolu ćelijskog ciklusa. Ovi kompleksi kontrolišu specifične prelaze između dve naredne faze u ćelijskom ciklusu. CDK7 je uključena i u temporalnu kontrolu ćelijskog ciklusa i u transkripcionu aktivnost. CDK7 je uključena u proces incijacije transkripcije fosforilacijom Rbp1 podjedinice RNK polimeraze II (RNAPII). Nekontrolisana proliferacija ćelija i deregulisana transkripcija je obeležje kancera. Selektivno ciljanje CDK7 može da ponudi prednost istovremenom inhibicijom aktivne transkripcije i progresije ćelijskog ciklusa. Prema tome, CDK7 je obećavajući cilj za tretman kancera, posebno agresivnih kancera i kancera koji se teško leče.

[0003] U literaturi su zabeleženi inhibitori male molekule protiv CDK7 (videti, na primer, WO 2015/154022, WO 2016/142855, WO 2016/160617, WO 2016/193939 i WO 2017/044858). I dalje postoji potreba da se obezbede CDK7 inhibitori koji mogu da budu korisni u tretmanu poremećaja proliferacije ćelija, kao što je kancer. Pored toga, postoji potreba da se obezbede CDK7 inhibitori koji su selektivni za CDK7 u poređenju sa drugim CDK1 kinazama.

[0004] Ovaj pronalazak obezbeđuje nova jedinjenja koja su selektivni CDK7 inhibitori. Ova nova jedinjenja mogu da odgovore na potrebu za potentnim efektivnim tretmanom kancera, posebno kancera sa deregulisanom transkripcijom. Ovaj pronalazak može takođe da odgovori na potrebu za potentnim, efektivnim tretmanom urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože i/ili glioma.

[0005] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje formule:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Posebnu prednost ima besilatna so. Takođe je poželjna hemi-edisilat hidratna so.

[0006] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku tretmana kancera, posebno za tretman kancera sa deregulisanom transkripcijom. Preferirano, kancer je urotelijalni kancer, kancer materice, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika, kancer želuca, hepatobilijarni kancer, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer prostate, hematološki kanceri, sarkomi, kanceri kože ili gliomi. Još poželjnije, kancer je kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca. Najpoželjnije, kancer je kance dojke.

[0007] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku za lečenje urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože i/ili glioma kod pacijenta, uključujući testiranje na prisustvo gubitka najmanje jedne funkcije mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i/ili RB1 genima u biološkom uzorku od pacijenta i primenjujući terapeutski efektivnu količinu jedinjenja ili soli iz ovog pronalaska, preciznije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pacijentu ukoliko su testovi uzorka pozitivni na gubitak najmanje jedne funkcije mutacije u bilo kom od ARID1A, KMT2C, KMT2D i/ili RB1 gena. Preferirano, so je besilatna so ili hemiedisilat hidratna so. Još poželjnije, kancer je kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca. Najpoželjnije, kancer je kancer dojke. Preferirano, biološki uzorak je uzorak tumora a uzorak se ispituje genomskim/RNK sekvenciranjem. Preferirano, uzorak je dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli, poželjno je [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5- metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pacijentu. Preferirano, so je besilatna so ili hemi-edisilat hidratna so. Preferirano, gen je ARID1A gen. Preferirano, gen je KMT2C gen. Preferirano, gen je KMT2D gen. Preferirano, gen je RB1 gen.

[0008] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože ili glioma kod pacijenta, uključujući primenu terapeutski efektivne količine jedinjenja ili soli iz ovog pronalaska, preciznije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pacijentu, pod uslovom da biološki uzorak od pacijenta sadrži gubitak najmanje jedne funkcije mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i/ili RB1 genima. Preferirano, so je besilatna so ili hemi-edisilat hidratna so. Još poželjnije, kancer je kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca.

Najpoželjnije, kancer je kancer dojke. Preferirano, biološki uzorak je uzorak tumora i uzorak je ispitan genomskim/DNK sekvenciranjem. Preferirano, uzorak je dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli, preferirano [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu. Preferirano, so je besilatna so ili hemi-edisilat hidratna so. Preferirano, gen je ARID1A gen. Preferirano, gen je KMT2C gen. Preferirano, gen je KMT2D gen. Preferirano, gen je RB1 gen.

[0009] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje jedinjenja iz pronalaska za upotrebu u postupku lečenja urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože ili glioma kod pacijenta, uključujući primenu terapeutski efektivne količine jedinjenja ili soli iz ovog pronalaska, preciznije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli na pacijentu, pod uslovom da je pacijent izabran za tretman ukoliko je biološki uzorak od pacijenta testiran pozitivno na gubitak najmanje jedne funkcije mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i/ili RB1 genima. Preferirano, so je besilatna so ili hemi-edisilat hidratna so. Još poželjnije, kancer je izabran iz grupe koja se sastoji od kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika ili kancera želuca. Najpoželjnije, kancer je kancer dojke. Preferirano, biološki uzorak je uzorak tumora i uzorak je ispitan genomskim/DNK sekvenciranjem. Preferirano, uzorak je dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli, preferirano [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, na pacijentu. Preferirano, so je besilatna so ili hemi-edisilat hidratna so. Preferirano, gen je ARID1A gen. Preferirano, gen je KMT2C gen. Preferirano, gen je KMT2D gen. Preferirano, gen je RB1 gen.

[0010] Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja uključuje jedinjenje iz pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga. U narednom ostvarenju, kompozicija dalje uključuje jedno ili više drugih terapeutskih sredstava. U narednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za tretman kancera koja uključuje jedinjenje iz pronalaska, ili njegovu frarmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga. U još jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju za tretman kancera sa deregulisanom transkripcijom koja uključuje jedinjenje iz pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga. U navedenim ostvarenjima, kancer je urotelijalni kancer, kancer materice, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika, kancer želuca, hepatobilijarni kancer, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer prostate, hematološki kanceri, sarkomi, kanceri kože i gliomi.

[0011] U preferiranom ostvarenju, kancer je kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca. U još poželjnijem ostvarenju, kancer je kancer dojke.

[0012] Pored toga, ovaj pronalazak obezbeđuje jednjenje iz pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so za upotrebu u postupku tretmana kancera koji takođe uključuje sprovođenje in vitro ispitivanja koristeći biološki uzorak od pacijenta, da se odredi prisustvo inaktivacije najmanje jedne mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i RBI genima, i primenu terapeutski efektivne količine jedinjenja ili njegove soli na pacijentu ukoliko je prisutna inaktivacija najmanje jedne mutacije u bilo kom od gena. U ovom ostvarenju, jedinjenje je za upotrebu u tretmanu urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože ili glioma. Preferirano, biološki uzorak je uzorak tumora i uzorak je ispitan genomskim/DNK sekvenciranjem. Preferirano, jedinjenje ili njegova so se primenjuje na pacijentu u dozi od približno 1 mg do 2 g. Preferirano, uzorak je dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli na pacijentu. Preferirano, izabrani pacijent ima inaktivaciju mutacije u ARID1A genu. Preferirano, izabrani pacijent ima inaktivaciju mutacije u KMT2C genu. Preferirano, izabrani pacijent ima inaktivaciju mutacije u KMT2D genu. Preferirano, izabrani pacijent ima inaktivaciju mutacije u RB1 genu.

[0013] Isto tako, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje iz pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji, posebno za tretman kancera sa deregulisanom transkripcijom. U narednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja iz pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera sa deregulisanom transkripcijom. U navedenim ostvarenjima, kancer je urotelijalni kancer, kancer materice, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika, kancer želuca, hepatobilijarni kancer, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer prostate, hematološki kanceri, sarkomi, kanceri kože ili gliomi. U preferiranim ostvarenjima, kancer je izabran od kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika ili kancera želuca. U još poželjnijem ostvarenju, kancer je kancer dojke.

[0014] U čak još jednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje iz pronalaska, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, za upotrebu u terapiji, preciznije, za tretman kancera. U narednom ostvarenju, ovaj pronalazak obezbeđuje upotrebu jedinjenja iz pronalaska, ili njegove farmaceutski prihvatljive soli, za proizvodnju medikamenta za tretman kancera. U navedenim ostvarenjima, kancer je urotelijalni kancer, kancer materice, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika, kancer želuca, hepatobilijarni kancer, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer prostate, hematološki kanceri, sarkomi, kanceri kože ili gliomi. U preferiranom ostvarenju, kancer je kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca. U još poželjnijem ostvarenju, kancer je kancer dojke. Isto tako, ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje iz pronalaska za proizvodnju medikamenta za tretman urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože ili glioma, uključujući takođe sprovođenje in vitro ispitivanja korišćenjem biološkog uzorka od pacijenta da se odredi prisustvo najmanje jedne inaktivacije mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i RB1 genima, i primenjujući terapeutski efektivne količine jedinjenja ili njegove soli na pacijentu ukoliko je u bilo kom od gena prisutna najmanje jedna inaktivacija mutacije. Preferirano, biološki uzorak je uzorak tumora i uzorak se ispituje genomskim/DNK sekvenciranjem. Preferirano, jedinjenje u obliku njegove soli se primenjuje na pacijentu u dozi od približno 1 mg do 2 g. Preferirano, uzorak je dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli na pacijentu. Preferirano, pacijent je izabran po tome što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u ARID1A genu. Preferirano, pacijent je izabran po tome što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u KMT2C genu. Preferirano, pacijent je izabran po tome što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u KMT2D genu. Preferirano, pacijent je izabran po tome što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u RB1 genu.

[0015] Ovaj pronalazak obezbeđuje jedinjenje iz pronalaska, [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat u obliku kristalne soli. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kristalni [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hemi-edisilat hidrat. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin- 7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hemi-edisilat hidrat u kristalnom obliku koji se karakteriše profilom difrakcije X-zraka praška koji ima karakteristične pikove koristeći CuKa zračenje, u 2θ ± 0.2°, dobijene na 18.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 21.5°, 16.7°, i 15.2°. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kristalni [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin- 7-il)amino]piperidin-1-karboksilat besilat. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2- enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat besilat u kristalnom obliku koji se karakteriše profilom difrakcije X-zraka praška koji ima karakteristične pikove koristeći CuKa zračenje, u 2θ ± 0.2°, dobijene na 21.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 12.4°, 17.3°, i 15.8°. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje kristalni [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hidrohlorid. Ovaj pronalazak takođe obezbeđuje [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hidrohlorid u kristalnom obliku koji se karakteriše profilom difrakcije X-zraka praška koji ima karakteristične pikove koristeći CuKa zračenje, u 2θ ± 0.2°, dobijene na 18.9° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 5.5°, 15.5°, i 9.7°.

[0016] Ovaj pronalazak takođe obuhvata međuproizvode i procese korisne za sintezu jedinjenja iz ovog pronalaska.

[0017] Naziv "tretiranje" (ili "lečenje" ili "tretman") kako se ovde koristi, odnosi se na ograničavanje, usporavanje, zaustavljanje ili preokret progresije ili težine postojećeg simptoma, stanja ili poremećaja.

[0018] Kako se ovde koristi, nazivi "kancer" i "kancerogeni" se odnose na ili opisuju fiziološko stanje kod pacijenata koje obično karakteriše neregulisana proliferacija ćelija.

Ovom definicijom su obuhvaćeni benigni i maligni kanceri. "Rano stanje kancera" ili "rano stanje tumora" označava kancer koji nije uznapredovao ili metastazirao ili je klasifikovan kao kancer 0, I ili II grupe. Primeri kancera uključuju, ali bez ograničenja na, urotelijalni kancer, kancer materice, kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika, kancer želuca, hepatobilijarni kancer, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer prostate, hematološke kancere, sarkome, kancere kože ili gliome..

[0019] Jedinjenje iz ovog pronalaska može da reaguje da formira farmaceutski prihvatljive soli. Farmaceutski prihvatljive soli i uobičajena metodologija za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, P. Stahl, i saradnici Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection and Use, 2nd Revised Edition (Wiley-VCH, 2011); S.M. Berge, i saradnici, "Pharmaceutical Salts," Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol.66, No.1, January 1977).

[0020] Stručnjak sa iskustvom će razumeti da se jedinjenje iz pronalaska, kako je pokazano u (I), ili njegova farmaceutski prihvatljiva so, sastoji od jezgra koje sadrži jedan asimetrični centar, kako je niže označeno<*>:

[0021] Mada se ovaj pronalazak odnosi na sve pojedinačne enantiomere, kao i na smeše enantiomera datih jedinjenja uključujući racemate, preferirano jedinjenje iz pronalaska je niže predstavljeno sa (II):

ili njegove farmaceutski prihvaljive soli.

[0022] Stručnjak sa iskustvom će takođe da razume da će Cahn-Ingold-Prelog (R) ili (S) označavanja za sve asimstrične centre da variraju u zavisnosti od modela supstitucije određenog jedinjenja. Pojedinačni enantiomeri mogu da se izrade počevši od asimetričnih reagenasa ili stereoselektivnim ili stereospecifičnim tehnikama sinteze. Alternativno, pojedinačni enantiomeri mogu da se izoluju iz smeše standardnom asimetričnom hromatografijom ili tehnikama kristalizacije u bilo kojoj pogodnoj tački u toku sinteze jedinjenja iz pronalaska. Pojedinačni enantiomeri jedinjenja iz pronalaska su preferirano ostvarenje pronalaska.

[0023] Jedinjenje iz pronalaska je preferirano formulisano u obliku farmaceutskih kompozicija za primenu na različite načine. Ovakve farmaceutske kompozicije i procesi za njihovu izradu su dobro poznati u tehnici (videti, na primer, Remington: The Science and Practice of Pharmacy (A. Gennaro, i saradnici, eds., 21st ed., Mack Publishing Co., 2005)). Posebno je preferirana farmaceutska kompozicija koja uključuje jedinjenje formule,

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih nosača ili razblaživača.

[0024] Preferirano ostvarenje ovog pronalaska je

1

ili njegova farmaceutski prihvatljiva so.

[0025] Posebno preferirano ostvarenje ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje, (3S)-1-[(2E)-4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-karboksilat:

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Posebno je preferirana hemi-edisilat hidratna so ili besilatna salt.

[0026] Naredno posebno preferirano ostvarenje ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje, (3S)1-[(2E)- 4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-karboksilat:

[0027] Dalje posebno preferirano ostvarenje ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje, (3R)-1-[(2E)- 4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-karboksilat (kako je niže pokazano za (III)):

ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so. Posebno je preferirana hemi-edisilat hidratna so ili besilatna so.

[0028] Naredno posebno preferirano ostvarenje iz ovog pronalaska se odnosi na jedinjenje, (3R)-1-[(2E)- 4-(Dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il 4-{[5-metil-3-(propan-2-il)pirazolo[1,5-A]pirimidin-7-il]amino}piperidin-1-karboksilat:

[0029] Jedinjenja iz ovog pronalaska su generalno efikasna u širokom opsegu doza. Na primer, dnevne doze su u rasponu od približno 1 mg do približno 2 g. U nekim slučajevima, vrednosti doze ispod donje granice prethodno pomenutog opsega mogu da budu više nego adekvatne, dok u drugim slučajevima mogu da se primene čak i veće doze sve dok se održava povoljan profil korist/rizik, pa stoga gore dati opseg doze ne treba da ograniči okvir pronalaska na bilo koji način. Razumljivo je da količinu jedinjenja koja se trenutno primenjuje određuje lekar u svetlu relevantnih okolnosti, uključujući stanje koje se tretira, izabrani način primene, određeno jedinjenje ili jedinjenja koja se primenjuju, godine starosti, težinu i odgovor pojedinačnog pacijenta i težine simptoma kod pacijenta.

[0030] Stručnjak sa uobičajenim iskustvom u praksi može da razdvoji ili odvoji pojedinačne izomere i enantiomere u bilo kojoj odgovarajućoj tački sinteze jedinjenja iz pronalaska, postupcima kao što su tehnike selektivne kristalizacije ili asimetrična hromatografija (videti, na primer, J. Jacques, i saradnici, "Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, and E.L. Eliel and S.H. Wilen," Stereochemistry of Organic

1

Compounds", Wiley-Interscience, 1994).

[0031] Pored toga, neki ovde opisani međuproizvodi mogu da sadrže jednu ili više zaštitnih grupa. Promenljive zaštitne grupe mogu da budu iste ili različite u svakoj situaciji u zavisnosti od određenih uslova reakcije i određenih transformacija koje se izvode. Uslovi zaštite i deprotekcije su dobro poznati stručnjaku sa iskustvom i opisani su u literaturi (videti na primer "Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis", Fourth Edition, by Peter G.M. Wuts and Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc.2007).

[0032] Neke skraćenice su definisane na sledeći način: "<1>H NMR" se odnosi na 1H-nuklearnu magnetnu rezonancu; "eq" se odnosi na ekvivalent; "THF" se odnosi na tetrahidrofuran;

"DCM" se odnosi na dihlorometan; "MeCN" ili "ACN" se odnosi na acetonitril; "DMSO" se odnosi na dimetil sulfoksid; "MTBE" se odnosi na metil terc-butil etar; "TEA" se odnosi na trimetilamin; "HATU" se odnosi na I-[Bis(dimetilamino)metilen]-I 8-1,2,3-triazolo[4, 5-b]piridinijum 3-oksid-heksafluorofosfat; "MeOH" se odnosi na metanol; "TLC" se odnosi na hromatografiju na tankom sloju; "UV" se odnosi na ultraljubičaste zrake; "LC Column" se odnosi na kolonu tečne hromatografije; "DMEA" se odnosi na dimetilmetilamin; "EtOAc" se odnosi na etil acetat; "DMF" se odnosi na dimetilformamid; "SCX" se odnosi na jaku izmenu katjona; "ca." se odnosi na približno ili aproksimativno; "RBF" se odnosi na bocu okruglog dna; "ATP" se odnosi na adenozin trifosfat; "DTT" se odnosi na ditiotreitol; "HEPES" se odnosi na (4-(2-hidroksietil)-1- piperazinetansulfonsku kiselinu); "EDTA" se odnosi na etilendiamintetrasirćetnu kiselinu; "ATCC" se odnosi na American Type Culture Collection; "RT" se odnosi na sobnu temperaturu; "PBS" se odnosi na puferovane fosfatne soli; "BSA" se odnosi na albumin seruma govečeta; "FBS se odnosi na serum fetusa govečeta; "RNAase" se odnosi na ribonukleazue; "cDNA" se odnosi na komplementarnu DNK; "GST" se odnosi na glutation S-transferazu; "His" se odnosi na histidin; "GSH" se odnosi na glutation; i "HBSS" Hankov balansirani rastvor soli.

[0033] Jedinjenja iz pronalaska ili njihove farmaceutski prihvatljive soli, mogu da se izrade različitim procedurama poznatim u tehnici, kao što su niže date Izrade i Primeri. Specifične faze sinteze za svaki od opisanih načina izrade mogu da se kombinuju na različite načine ili u konjukciji sa fazama iz različitih šema da se izrade jedinjenja iz pronalaska ili njihove farmaceutski prihvatljive soli. Produkti svake faze u niže datim šemama mogu da se obnove uobičajenim postupcima dobro poznatim u praksi, uključujući ekstrakciju, evaporaciju, precipitaciju, hromatografiju, filtraciju, trituraciju i kristalizaciju. Reagensi i početni materijali su lako raspoloživi stručnjaku sa uobičajenim iskustvom u praksi.

[0034] Niže date izrade i primeri dalje ilustruju pronalazak i predstavljaju tipične sinteze jedinjenja iz ovog pronalaska.

Izrade i Primeri

Izrada 1

Sinteza 3-izopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diola.

[0035]

[0036] Natrijum etoksid (979 g, 14.4 mola, 3.0 eq) i dietil malonat (998 g, 6.23 mola, 3.0 eq) se na 23 °C dodaju u rastvor 4-izopropil-1H-pirazol-3-amina (600 g, 4.79 mola) u etanolu (4.2 L) i smeša se zagreva 15 sati na 80 °C (unutrašnja temperatura). Smeša se ohladi na 25 °C, doda se 1 M aq. HCl (2.0 L) (finalni pH = 2.0), filtrira, čvrsta supstanca ispere sa vodom (2.0 L) i suši da se dobije 3-izopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol (600 g, 65%) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS m/z 194 (M+H).

Izrada 2

Sinteza 5,7-dihloro-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina.

[0037]

1

[0038] POCl3(2.00 L, 25.8 mola, 10 eq) i N,N-dimetilanilin (162 mL, 2.58 mola, 1.0 eq) se na 50 °C dodaju u suspenziju 3-izopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diola (500 g, 2.58 mola) u MeCN (1.25 L) i smeša zagreva 36 sati na 100 °C. Ohladi se na 23 °C, u kapima sipa u 1:1 smešu led / fosfatni pufer (1 M, pH = 8, 10 L) i meša 15 sati. Filtrira, čvrsta supstanca se ispere sa vodom (5.0 L) i suši da se dobije 5,7-dihlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin (375 g, 63%) kao braon čvrsta supstanca. ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 230/232 (M+H).<1>H NMR (d6- DMSO) δ 1.32 (d, 6H), 3.19 (dq, 1H), 7.58 (s, 1H), 8.31 (s, 1H).

[0039] Alternativna sinteza 5,7-dihlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina.

[0040] Natrijum etoksid -21% u etanolu- (17.9 mL, 47.9 mmol) se doda u rastvor 4-izopropil-1H-pirazol-5-amina (5 g, 39.9 mmol) i dietil malonata (6.74 mL, 43.9 mmol) u etanolu (150 mL) i meša na RT. Nakon 5 minuta, zagreje na 90 °C i meša. Nakon 18 sati, ohladi na RT i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori sa vodom i doda se 1 N rastvor hlorovodonične kiseline do pH=3. Beli precipitat se filtrira i suši 18 sati pod sniženim pritiskom na 50 °C. Dobijena čvrsta supstanca, 3-izopropilpirazolo[1,5-a]pirimidin-5,7-diol (4.92 g, 25.5 mmol, 0.638), se suspenduje u fosfor oksihloridu (48 mL) i doda N,N-dimetilanilin (2.3 mL). Smeša se refluksuje na 110 °C. Nakon 2 sata, ohladi se na RT i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se sipa preko rastvora led/voda i ekstrahuje sa DCM (dva puta). Organski slojevi se kombinuju i isperu sa slanim rastvorom, suše preko magnezijum sulfata. Filtrira se i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa smešom etil heksan: acetat da se dobije 5,7- dihlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin (4.45 g, 19.3 mmol) kao braon čvrsta supstanca. MS (m/z): 230,232(M+1).<1>H NMR (400.21 MHz, DMSO): 8.31 (s, 1 H), 7.58 (s, 1 H), 3.19 (m, 1 H), 1.32 (d, J= 7.0 Hz, 6H).

Izrada 3

Sinteza terc-butil 4-[(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0041]

1

[0042] N,N-diizopropiletilamin (189 mL, 140 g, 1080 mmol, 2 eq) i terc-butil 4-aminopiperidin-1-karboksilat (114 g, 570 mmol, 1.05 eq) se na 23 °C dodaju u suspenziju 5,7-dihlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina (130 g, 542 mmol) u 2-propanolu (1.0 L) i smeša meša 18 sati. Smeša se filtrira, čvrsta supstanca ispere sa MTBE (200 mL) i suši da se dobije terc-butil 4-[(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (182 g, 85% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 394/396 (M+H).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.42 (s, 9H), 1.61 (m, 2H), 1.83 (m, 2H), 2.87 (m, 1H), 3.10 (dq, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.85 (m, 1H), 3.98 (m, 2H), 6.34 (s, 1H), 8.01 (s, 1H), 8.07 (d, 1H).

Izrada 4

Sinteza terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0043]

1

[0044] N,N-diizopropiletilamin (69.1 mL, 51.2 g, 396 mmol, 1 eq), 4-dimetilaminopiridin (4.84 g, 39.6 mmol, 0.1 eq) i di-terc-butil dikarbonat (200 mL, 190 g, 871 mmol, 2.2 eq) se na 23 °C dodaju u rastvor terc-butil 4-[(5-hlor-3- izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (156 g, 396 mmol) u THF (936 mL) i smeša zagreva 21 sat na 50 °C (unutrašnja temperatura). Ohladi se na 23 °C i koncentruje pod vakuumom da se dobije terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (195 g, 99%) kao narandžasta čvrsta supstanca. ES/MS m/z (<35>Cl/<37>Cl) 438/440 (M+H-56).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.20 (s, 9H), 1.31 (d, 6H), 1.35 (s, 9H), 1.46 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 2.75 (m, 1H), 3.19 (dq, 1H), 3.32 (m, 1H), 3.95 (m, 1H), 4.18 (m, 2H), 7.20 (s, 1H), 8.19 (s, 1H).

[0045] Alternativna sinteza terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0046] terc-butil 4-aminopiperidin-1-karboksilat (2.8 g, 14 mmol) se doda u rastvor 5,7-dihlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidina (3.1 g, 13 mmol) u etanolu (32 mL). Zagreje se na 80 °C. Nakon 18 sati, ohladi se na RT i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa smešom etil acetat:DCM da se dobije terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat kao bela čvrsta supstanca. Maseni spektar (m/e):

394,396(M+1) terc-butoksikarbonil terc-butil karbonat (1.14 g, 5.22 mmol) se doda u rastvor terc-butil 4-[(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (940 mg, 2.386 mmol) i 4-dimetilaminopiridina (290 mg, 2.33 mmol) u THF (7 mL). Smeša se zagreje na 60 °C. Nakon 30 minuta, ohladi se na RT i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa DCM da se dobije tercbutil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (1.1 g) kao žućkasto ulje. Maseni spektar (m/z): 438(M-t-Bu).<1>H NMR (400.13 MHz, d6-DMSO): 8.19 (s, 1H), 7.20 (s, 1H), 5.76 (s, 1H), 4.17(m, 1H), 3.95 (m, 2 H), 3.19 (m, 1 H), 1.87 (m, 2 H), 1.47 (m, 2 H), 1.35 (s, 9 H), 1-31 (d, 6H), 1.19 (s, 9H).

Izrada 5

Sinteza terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-

1

il)amino]piperidin-1-karboksilat.

[0047]

[0048] [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum (II) DCM adukt (15.7 g, 19.3 mmol, 0.05 eq), tribazni kalijum fosfat (245 g, 1160 mmol, 3 eq) i 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioksatriborinan (50 maseni % u THF, 75.3 mL, 67.6 g, 270 mmol, 0.7 eq) se na 90 °C (unutrašnja temperatura) dodaju u rastvor terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (190 g, 385 mmol) u 1,4-dioksanu (1.5 L). Nakon 5 dana, ohladi se na 23 °C, filtrira kroz ploču diatomejske zemlje i čvrsta supstanca ispere sa THF (3 x 250 mL). Kombinovani filtrati se na 23 °C tretiraju sa SiliaMetS® tiol smolom (40-63 µm; punjenje = 1.46 mmol/g; 320 g, 467 mmol) i zagrevaju 18 sati na 65 °C. Ohladi se na 23 °C, filtrira i smola ispere sa DCM (2 x 250 mL).

Kombinovani filtrati se koncentruju pod vakuumom, ostatak se rastvori u MTBE (1 mL), ispere sa vodom (200 mL), suši (MgSO4) i koncentruje pod vakuumom da se dobije terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (182 g, 100%) kao braon čvrsta supstanca. ES/MS m/z 474 (M+H).

Izrada 6

Sinteza 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin dihidrohlorida.

[0049]

1

[0050] Hlorovodonična kiselina u 2-propanolu (5.50 mol/L, 349 mL, 1920 mmol, 5 eq) se na 23 °C doda u suspenziju terc-butil 4-[terc- butoksikarbonil-(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (182 g, 384 mmol) u 2-propanolu (1.4 L) i smeša zagreva 3 sata na 70 °C (unutrašnja temperatura). Ohladi se na 23 °C, filtrira, čvrsta supstanca ispere sa MTBE (2 x 200 mL) i suši da se dobije 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin dihidrohlorid (95 g, 71% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. Osnovni rastvori se kombinuju, razblaže sa MTBE (2 L), filtriraju, čvrsta supstanca ispere sa MTBE (2 x 50 mL) i suši da se dobije dodatni materijal (8.42 g, 15% prinos). ES/MS m/z 274 (M+H).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 2.04 (m, 4H), 2.61 (s, 3H), 3.00 (m, 2H), 3.40 (m, 3H), 4.16 (m, 2H), 6.68 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 8.80 (m, 1H), 9.21 (m, 1H), 9.86 (m, 1H).

[0051] Alternativna sinteza 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin dihidrohlorida.

[0052] 7-hlor-3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin (2.1 kg, 10.0 mol) i diizopropiletilamin (4.18 L, 2.4 eq) se rastvori u izopropanolu (16.8 L, 8 mL/g). U raktivnu smešu se doda terc-butil 4-aminopiperidin-1-karboksilat (2.6 kg, 1.3 eq.) i zagreva 16 sati na 75-80 °C. Reaktivna smeša se ohladi na 5-10 °C i doda 4 M rastvor hlorovodonične kiseline u izopropanolu (17.5 L, 7.0 eq). Zagreva se 4 sata na 40-45 °C. Ohladi na 25-30 °C i smeša filtrira da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.25 kg, 72.7% prinos). Materijal se koristi u sledećoj fazi bez dodatnog prečišćavanja.<1>H NMR (500 MHz, D2O) δ 8.16 (s, 1H), 6.45 (s, 1H), 4.29-4.26 (m,1 H), 3.63 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 3.26 - 3.12 (m, 3H), 2.64 (s, 3H), 2.40 (d, J = 15.0 Hz, 2H), 2.08 (dd, J =10.0, 25.0 Hz, 2H), 1.31 (d, J = 5.0 Hz, 6H).

[0053] Alternativna sinteza 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina kao slobodne baze.

[0054] 1,4-dioksan (15 mL) se doda u smešu terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(5-hlor-3-

2

izopropil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (689 mg, 1.39 mmol), 2,4,6-trimetil-1,3,5,2,4,6-trioksatriborinana ( 350 mg, 2.79 mmol) i tribaznog kalijum fosfata (1.2 g, 5.5 mmol,). N2se u mehurićima propušta kroz rastvor u toku 5 minuta. Doda se [1,1’-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum(II) DCM adukt (60 mg, 0.072 mmol). Zagreva se na 110 °C. Nakon 1.5 sat doda se još [1,1-bis(difenilfosfino)ferocen]dihlorpaladijum(II) (60 mg, 0.072 mmol) i zagreje na 100 °C. Nakon 18 sati, ohladi se na RT, smeša filtrira kroz membranski filter, ispere sa etil acetatom i koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa etil acetatom i DCM da se dobije terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (537 mg, 1.077 mmol) kao narandžasto ulje. Maseni spektar (m/z): 474(M+1).

[0055] Trifluorosirćetna kiselina (2.5 mL, 33 mmol) se u kapima doda u rastvor terc-butil 4-[terc-butoksikarbonil-(3-izopropil- 5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (537 mg, 1.077 mmol) u DCM (12 mL). Meša se na RT. Nakon 2 sata, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti preko SCX-2 kertridža uz eluiranje sa 10% smešom DCM: MeOH zatim sa MeOH (2 N rastvor NH3). Bazne frakcije se koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin (345 mg, 1.199 mmol) kao braonkasta čvrsta supstanca. Maseni spektar (m/z): 274(M+1).<1>H NMR (400.13 MHz, DMSO): 7.82 (s, 1 H), 7.23 (d, 1H), 6.08 (s, 1 H), 3.58 (m, 1 H), 3.12 (m, 1 H), 2.97 (m, 2 H), 2.58 (m, 2 H), 2.39 (s, 3 H), 2.10 (m, 2 H), 1.28 (d, 6 H).

Izrada 7

Sinteza [(3S)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata

[0056]

[0057] U rastvor terc-butil (3S)-3- hidroksipirolidin-1-karboksilata (76.5 g, 409 mmol) u THF (765 mL) se u RBF sa 3 grla spojenoj sa bocom za pranje koja sadrži 32% vodeni rastvor NH4OH na 23 °C u toku 1 sat dodaje fozgen (20 maseni % u toluenu, 348 mL, 485 g, 981 mmol, 2.4 eq). N2se u mehurićima propušta kroz smešu u toku 30 minuta i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se rastvori u DCM (757 mL), ohladi na 0 °C (unutrašnja temperatura) i dodaje (polako u toku 7 minuta) suspenzija 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin dihidrohlorida (94.6 g, 273.2 mmol) u DCM (756.8 mL), prethodno tretirana sa trietilaminom (228 mL, 166 g., 1639 mmol, 6 eq). Nakon dodavanja, kupatilo za hlađenje se ukloni i nakon 30 minuta reakcija neutrališe sa 35% vodenim rastvorom HCl (20 mL) i 1 M vodenim rastvorom HCl (300 mL) (finalni pH = 7). Organski sloj se izdvoji, ispere sa vodom (300 mL) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (300 mL), suši (MgSO4) i koncentrujed pod vakuumom. Ostatak se rastvori (ca.180 g) u DCM (1.5 L), doda se SiliaMetS® tiol smola (40-63 µm; punjenje = 1.46 mmol/g; 10 g, 14.6 mmol, 140 eq na bazi Pd sadržaja) na 23 °C, a nakon toga smeša zagreva 2 sata na 40 °C. Filtrira, smola ispere sa DCM (2 x 10 mL) i kombinovani filtrati koncentruju pod vakuumom da se dobije [(3S)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (129 g, 97%) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS m/z 487 (M+H).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.40 (s, 9H), 1.65 (m, 2H), 1.88 (m, 2H), 1.96 (m, 1H), 2.07 (m, 1H), 2.46 (s, 3H), 2.90 (m, 2H), 3.31 (m, 5H), 3.89 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 5.10 (m, 1H), 6.32 (s, 1H), 8.01 (s, 1H)

[0058] Alternativna sinteza [(3S)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata

[0059] terc-butil (3S)-3-hidroksipirolidin-1-karboksilat (438 g, 1.3 eq.) se na 15-30 °C rastvori u ACN (4.4 L, 10.0 mL/g). Doda se trietilamin (595 mL, 4.5 eq.) a nakon toga se na 15-30 °C doda 4-nitrofenil hloroformat (490 g, 1.4 eq.). Zagreje se na 35-40 °C i smeša meša 4 sata. Ohladi se na 15-25 °C i doda se 3-izopropil-5-metil-N-(piperidin-4-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin (500 g, 1.8 mol). Meša se 5 sati na 15-30 °C. Koncentruje se pod sniženim pritiskom. Doda se 2-metil-tetrahidrofuran (4.4 L, 10.0 mL/g), meša i filtrira. Filtrat se po redu ispere sa 2 M rastvorom NaOH (1.1 L, 2.5 mL/g, 4 puta) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (4.4 L, 10.0 mL/g). Suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Doda se izopropil alkohol (2.2 L, 5 mL/g) da se dobije rastvor naslovljenog jedinjenja (660 g, 75.4% prinos).

Izrada 8

Sinteza [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat.

[0060]

[0061] Hlorovodonična kiselina u 2-propanolu (5.50 mol/L, 217 mL, 1190 mmol, 5 eq) se na 23 °C doda u suspenziju [(3S)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (116 g, 239 mmol) u 2-propanolu (755 mL) i smeša se zagreva 90 minuta na 70 °C. Ohladi se na 23 °C i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se suspenduje u DCM (1.5 L), dodaju se 1 M aq. NaOH (400 mL) i

2

50% aq. NaOH (100 mL). Meša se 15 minuta. Organska faza se izdvoji, suši (MgSO4) i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se suspenduje (ca.131 g) u smeši MTBE / heksan (2:1, 900 mL) i smeša meša 18 sati. Filtrira, filtrirana čvrsta supstanca ispere sa heksanom (2 x 100 mL) i suši da se dobije [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (82.7 g, 90% prinos) kao žuta čvrsta supstanca. ES/MS m/z 387 (M+H).<1>H NMR (d6-DMSO) δ 1.28 (d, 6H), 1.60 (m, 3H), 1.88 (m, 3H), 2.40 (s, 3H), 2.75 (m, 2H), 2.91 (m, 4H), 3.13 (dq, 1H), 3.78 (m, 1H), 4.02 (m, 2H), 5.10 (m, 1H), 6.14 (s, 1H), 7.41 (d, 1H), 7.87 (s, 1H).

[0062] Alternativna sinteza [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0063] 5.5 M hlorovodonična kiselina u izopropil alkoholu (8.4 L, 5.0 mL/g) se na 20-30 °C doda u rastvor izopropil alkohola koji sadrži (S)- 1-(terc-butoksikarbonil)pirolidin-3-il 4-((3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino)piperidin-1-karboksilat (819 g).

Reaktivna smeša se zagreva 5 sati na 50-60 °C. Ohladi se na 30-35 °C, doda se MTBE (8.2 L, 10 mL/g) i meša 1 sat. Filtrira, u vodeni rastvor natrijum hidroksida (3.0 equiv) se na 0-5 °C doda vlažna pogača i meša 30 minuta. Doda se 2-metiltetrahidrofuran (8.2 L, 10.0 mL/g) i meša. Organska faza se ekstrahuje i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl. Suši preko natrijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom na 1-2 zapremine. Doda se MTBE (2.46 L, 3 mL/g) i meša 3 sata. Filtriranjem se dobija naslovljeno jedinjenje (550 g).

<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.82 (s, 1H), 6.12 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.78 (s, 1H), 5.27 - 5.13 (m, 1H), 4.26 - 4.01 (m, 2H), 3.74 - 3.59 (m, 1H), 3.36 - 3.23 (m, 1H), 3.14 - 2.98 (m, 5H), 2.90 (ddd, J = 11.1, 8.4, 5.4 Hz, 1H), 2.52 (s, 3H), 2.18 - 2.00 (m, 3H), 1.87 (dd, J = 12.6, 6.4 Hz, 1H), 1.76 (s, 1H), 1.66 - 1.52 (m, 2H), 1.34 (d, J = 6.9 Hz, 6H).

[0064] Alternativna sinteza [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0065] Fozgen (1.14 mL, 20 maseni % u toluenu, 3.20 mmol) se doda u hladan (0 °C) rastvor terc-butil (3S)-3-hidroksipirolidin-1-karboksilata (500 mg, 2.67 mmol) i TEA (0.37 mL, 2.6 mmol) u THF (13 mL). Kupatilo za hlađenje se ukloni i smeša meša na RT. Nakon 30 minuta, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom i ostatak rastvori u DCM (11 mL). Ovaj rastvor se doda u rastvor 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (C, 365 mg, 100 maseni %, 0.365 g) i TEA (0.3 mL) u DCM ( 11 mL). Smeša se meša na RT. Nakon 10 minuta, doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa novom količinom DCM. Organski slojevi se kombinuju i isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa smešom DCM:MeOH da se dobije [(3S)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin- 3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (671 mg) kao žućkasto ulje. Maseni spektar (m/z): 487(M+1).

[0066] Trifluorosirćetna kiselina (2 mL, 26.45 mmol) se u kapima doda u rastvor [(3S)-1-tercbutoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (671 mg, 1.269 mmol) u DCM (12 mL). Meša se na RT. Nakon 18 sati, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se rastvori u DCM i organska faza ispere sa 10% vodenim rastvorom K2CO3. Organska faza se suši preko magnezijum sulfata, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (274 mg, 0.6593 mmol) kao bela pena. Maseni spektar (m/z): 387(M+1).<1>H NMR (400.13 MHz, d6-DMSO): 7.87 (s, 1H), 7.42 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 6.13 (s, 1H), 5.00 (ddd, J= 9.0, 5.2, 2.5 Hz, 1H), 4.02 (m, 2H), 3.77 (m, 1 H), 3.13 (m, 1 H), 2.89 (m, 4 H), 2.72 (m, 2H), 2.40 (s, 3 H), 1.87 (dd, J= 6.8, 14.1 Hz, 2 H), 1.63 (m, 3 H), 1.28 (d, J= 6.8 Hz, 6 H).

Izrada 9

Sinteza [(3R)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata

[0067]

2

[0068] Fozgen (1.14 mL, 20 maseni % u toluenu, 3.20 mmol) se doda u hladan (0 °C) rastvor terc-butil (3R)-3-hidroksipirolidin-1-karboksilata ( 500 mg, 2.67 mmol) i TEA (0.37 mL, 2.6 mmol) u THF (13 mL). Kupatilo za hlađenje se ukloni i smeša meša na RT.

[0069] Nakon 30 minuta, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom i ostatak rastvori u DCM (11 mL). Ovaj rastvor se doda u rastvor 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amina (365 mg, 100 maseni %, 0.365 g) i TEA (0.3 mL) u DCM ( 11 mL). Smeša se meša na RT. Nakon 10 minuta, doda se zasićeni vodeni rastvor NaHCO3i ekstrahuje sa još DCM. Organski slojevi se kombinuju i isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl, suše preko magnezijum sulfata, filtriraju i koncentruju pod sniženim pritiskom da se dobije ostatak. Ostatak se prečisti flash hromatografijom (silika gel), uz eluiranje sa smešom heksan: etil acetat da se dobije [(3R)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3-il] 4-[(3- izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (350 mg) kao žućkasto ulje. Maseni spektar (m/z): 487(M+1).

[0070] Trifluorosirćetna kiselina (0.8 mL, 0.72 mmol) se u kapima doda u rastvor [(3R)-1-terc-butoksikarbonilpirolidin-3- il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (350 mg, 0.72 mmol) u DCM (7 mL). Meša se na RT.

Nakon 45 minuta, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti preko SCX-2 kertridža uz eluiranje sa smešom 10% DCM: MeOH a zatim sa MeOH (2 N NH3). Bazna frakcija se koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije [(3R)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (246 mg) kao braonkasta čvrsta supstanca. Maseni spektar (m/z): 387(M+1).

Izrada 10

Sinteza 3-izopropil-5-metil-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-ona

[0071]

2

[0072] 4-izopropil-1H-pirazol-5-amin (2.2 kg, 17.6 mol) i etil acetoacetat (2.86 kg, 1.25 eq.) se rastvore u sirćetnoj kiselini (17.6 L, 8.0 mL/g.). Smeša se zagreje na 110-115 °C a nakon toga ohladi na 35-40 °C. Dodaju se heptan i MTBE (44 L, 20 mL/g., 5/1 odnos). Čvrsta supstanca se filtrira i ispere sa heptanom (4.4 L, 2 mL/g.) da se dobije naslovljeno jedinjenje (2.28 kg, 85.5% prinos).<1>H NMR (500 MHz, DMSO) δ 11.81 (s, 1H), 7.77 (s, 1H), 5.50 (s, 1H), 3.08 - 3.05 (m, 1H), 2.31 (s, 3H), 1.22 (d, J = 5.0 Hz, 6H).

Izrada 11

Sinteza 7-hlor-3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidina

[0073]

[0074] 3-izopropil-5-metil-4H-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-on (2.1 kg, 11.0 mol) i N,N-dimetilanilin (0.86 kg, 0.65 eq.) se rastvore u ACN (8.4 L, 4 mL/g.). Reakcija se zagreje na 50-55 °C i u kapima se doda POCl3(4.2 kg, 2.5 eq.). Temperatura se podesi na 60-65 °C i smeša meša 9 sati. Smeša se ohladi na 25-30 °C i sipa u 2M kalijum fosfatni pufer (pH=8.0, 42 L, 20 mL/g). Doda se MTBE (23.9 L, 11.4 mL/g) i organska faza ekstrahuje. Organska faza se po redu dva puta ispere sa 20% rastvorom sirćetne kiseline (4.2 L, 2.0 mL/g), 10% vodenim rastvorom NaHCO3(10.5 L, 5.0 mL/g) i zasićenim vodenim rastvorom NaCl (10.5 L, 5.0 mL/g). Organska faza se suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom da se dobije naslovljeno jedinjenje (1.8 kg, 78% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.02 (s, 1H), 6.75 (s, 1H), 3.27 - 3.25 (m, 1H), 2.58 (s, 3H), 1.42 (d, J= 8.0 Hz, 6H).

Izrada 12

3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin

2

[0076] 3-izopropil-5-metil-N-(4-piperidil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-amin dihidrohlorid (2.2 kg, 6.4 mol) se na 10-15 °C doda u 1 M vodeni rastvor natrijum hidroksida (19.2 L, 3.0 eq.). Reaktivna smeša se meša 15-20 minuta a zatim se doda 2-metiltetrahidrofuran (4.70 L, 10.0 equiv) i meša 20-25 minuta. Organska faza se izdvoji i vodena faza ispere sa 2-metiltetrahidrofuranom (6.6 L, 3.0 mL/g, 3 puta). Organski rastvori se kombinuju i isperu sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (11 L, 5.0 mL/g). Organska faza se suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Doda se MTBE (6.6 L, 3.0 mL/g) i meša 40 minuta na 25-30 °C. Filtriranjem se dobija naslovljeno jedinjenje (1.5 kg, 85.7% prinos).<1>H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 7.81 (s, 1H), 6.10 (d, J= 8.0 Hz 1H), 5.75 (s, 1H), 3.59-3.54 (m, 1 H), 3.32-3.28 (m, 1 H), 3.22-3.19 (m, 2 H), 2.77-2.73 (m, 2 H), 2.51 (s, 3H), 2.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 1.56-1.50 (m, 3 H), 1.34 (d, J = 8.0 Hz, 6H).

Primer 1

Sinteza [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0077]

2

[0078] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 1 asimetrični centar je promenio orijentaciju a S oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (II).] (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoatna kiselina hidrohlorid (15.0 g, 90.3 mmol, 1.2 eq), N,N-diizopropiletilamin (31.3 mL, 23.4 g, 181 mmol, 2.4 eq) i HATU (42.9 g, 113 mmol, 1.5 eq) se na 23 °C dodaju u suspenziju [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (29.1 g, 75.3 mmol) u THF (146 mL) i smeša meša 90 minuta. Razblaži se sa fosfatnim puferom (0.5 M, pH = 9, 150 mL), ekstrahuje sa DCM (2 x 375 mL), suši (MgSO4) i koncentruje pod vakuumom. Dobijeni ostatak se prečisti (ca.95 g) hromatografijom (koristi se ostatak rastvoren u 65 mL DCM; 330 g SiO2; eluent: MTBE / 7N NH3u MeOH 0% do 10%; TLC: MTBE / 7N NH3u MeOH 5:1). Materijal (ca.40 g) se rastvori u DCM (400 mL), ispere sa 1 M aq. K2HPO4(1 M, 80 mL), suši (MgSO4) i koncentruje pod vakuumom. Ostatak se prečisti (ca. 38 g) hromatografijom (koristi se ostatak apsorbovan u SiO2(50 g); 330 g SiO2; eluent: MTBE / 7N NH3u MeOH 0% do 10%) da se dobije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (28.1 g, 75%) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS m/z 498 (M+H).<1>H NMR (CD3OD) δ 1.33 (d, 6H), 1.64 (m, 2H), 2.10 (m, 2H), 2.18 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 2.29 (s, 6H), 2.50 (s, 3H), 3.11 (m, 2H), 3.18 (dd, 2H), 3.29 (dq, 1H), 3.70 (m, 3H), 3.87 (m, 2H), 4.14 (m, 2H), 5.31 (m, 1H), 6.12 (s, 1H), 6.47 (m, 1H), 6.86 (m, 1H), 7.88 (s, 1H). [α]D<20>= 49.9 ° (C=2.0, MeOH). Enantiomerni višak (ee) = 97%. Rt (vreme zadržavanja) = 2.79 minuta (UV); LC kolona: CHIRALPAK® AS (4.6 x 150 mm, 5 µm); MeOH 0.2% DMEA; brzina protoka: 1.0 mL/min.

[0079] Alternativna sinteza [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

2

[0080] N,N-diizopropiletilamin (0.36 mL, 2.1 mmol) se doda u rastvor [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (170 mg, 0.4091 mmol), hidrohlorida (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoatne kiseline; (135 mg, 0.81512 mmol) i HATU (317 mg, 0.8181 mmol) u N,N-dimetilformamidu (4 mL). Meša se na RT. Nakon 5 minuta, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti preko SCX-2 kertridža uz eluiranje sa 10% DCM: MeOH zatim sa MeOH (2N NH3). Bazna frakcija se koncentruje pod sniženim pritiskom i ostatak prečisti preko ISCO™ reverzno fazne Claricep C-serije uz eluiranje sa NH4CO3pH 9/ACN da se dobije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1- karboksilat (129 mg, 0.255 mmol) kao bela čvrsta supstanca. Maseni spektar (m/z): 498 (M+1).<1>H NMR (400.13 MHz, MeOD): 7.88 (s, 1H), 6.85 (m, 1 H), 6.47 (m, 1 H), 6.12 (s, 1 H), 3.91-3.52 (m, 5 H), 3.13 (m, 1 H), 3.03 (m, 2 H), 2.94 (m, 1 H), 2.39 (s, 3 H), 2.15 (s, 6 H), 2.06 (m, 1 H), 1.88 (d, J= 11.5 Hz, 2 H), 1.66 (m, 2 H), 1.28 (d, J= 6.8 Hz, 6H).

[0081] Alternativna sinteza [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil- pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0082] [(3S)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (550 g, 1.4 mol) se rastvori u THF (5.5 L, 10.0 mL/g) na 15-30 °C. Dodaju se hidrohlorid (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoatna kiselina (278 g, 1.2 eq.) i TEA (1.17 L, 6.0 eq.) na 15-30 °C i meša 40 minuta. Doda se 50% propilfosfatni anhidrid u EtOAc (1.68 L, 1.2 equiv) na 15-30 °C i meša 12 sati. Filtrira i rastvarač filtrata zameni sa izopropil acetatom pod sniženim pritiskom. Doda se 2 M vodeni rastvor NaOH (2.75 L, 5 mL/g) i meša 20 minuta na 25-30 °C. Organska faza se ekstrahuje i ispere sa zasićenim vodenim rastvorom NaCl (2.75 L, 5 mL/g). Suši preko Na2SO4, filtrira i koncentruje pod sniženim pritiskom. Dodaju se heptan (3.85 L, 7 mL/g) i THF (16.5 L, 3 mL/g) na 15-30 °C. Mešaju 1 sat i filtriraju da se dobije naslovljeno jedinjenje (440 g, 63.2% prinos).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.86 (s, 1H), 6.83 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.43 (dd, J= 34.3, 14.9 Hz, 1H), 6.08 (s, 1H), 5.26 (d, J= 24.2 Hz, 1H), 4.85 (s, 2H), 4.22 - 4.01 (m, 2H), 3.90 - 3.76 (m, 2H), 3.61 - 3.47 (m, 1H), 3.36 - 3.21 (m, 2H), 3.17 - 3.11 (m, 2H), 3.12 - 2.98 (m, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.28 - 2.21 (m, 7H), 2.16 - 2.00 (m, 3H), 1.68 - 1.48 (m, 2H), 1.30 (d, J= 6.2 Hz, 6H).

Primer 2

Sinteza [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hidrohlorida.

[0083]

[0084] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 2, asimetrični centar je promenio orijentaciju a S oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (II).]

HCl (1 M rastvor u EtOAc (0.589 mL, 0.590 g, 0.589 mmol, 1.07 eq) se na 23 °C doda u rastvor [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (0.283 g, 0.549 mmol) u acetonu (5.5 mL) i smeša meša 5 sati. Koncentruje se pod vakuumom da se dobije [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3- il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hidrohlorid (0.244 g, 81%) kao bela čvrsta supstanca. ES/MS m/z 498 (M+H).

[0085]<1>H NMR(CD3OD) δ 1.34 (d, 6H), 1.66 (m, 2H), 2.11 (m, 2H), 2.20 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.54 (s, 3H), 2.90 (s, 6H), 3.12 (m, 2H), 3.28 (dq, 1H), 3.74 (m, 4H), 3.95 (dd, 2H), 4.16 (m, 2H), 4.63 (m, 1H), 5.32 (m, 1H), 6.22 (s, 1H), 6.78 (m, 2H), 7.94 (s, 1H).

Primer 3

Sinteza [(3R)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata.

[0086]

1

[0087] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 3, asimetrični centar je promenio orijentaciju a R oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (III).] N,N-diizopropiletilamin (0.4 mL, 2.0 mmol,) se doda u rastvor [(3R)-pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata (170 mg, 0.43 mmol), hidrohlorida (E)-4-(dimetilamino)but-2-enoatne kiseline; (150 mg, 0.90 mmol) i HATU (343 mg, 0.87 mmol) u DMF (4 mL). Meša se na RT. Nakon 5 minuta, smeša se koncentruje pod sniženim pritiskom. Ostatak se prečisti na SCX-2 kertridžu uz eluiranje sa 10% DCM: MeOH a zatim sa MeOH (2 N NH3). Bazna frakcija se koncentruje pod sniženim pritiskom a ostatak prečisti preko ISCO reversed-phase Claricep C-serije uz eluiranje sa NH4CO3pH 9/ACN da se dobije [(3R)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (188 mg) kao bela čvrsta supstanca. Maseni spektar (m/z): 498 (M+1).

[0088]<1>H NMR(400.21 MHz, DMSO): 7.86 (s, 1 H), 7.41 (m, 1 H), 6.63 (m, 1 H), 6.37 (m, 1 H), 6.13 (s, 1 H), 5.16 (m, 1H), 4.09-3.92 (m, 2H), 3.78 (m, 2 H), 3.56 (m, 2 H), 3.13(m, 1 H), 3.03 (m, 2 H), 2.93 (m, 1 H), 2.39 (s, 3 H), 2.14 (s, 6 H), 2.06 (m, 1 H) 1.88 (m, 2 H), 1.60 (m, 2 H), 1.28 (d, J= 6.8 Hz, 6 H).

Primer 4

Sinteza kristalnog [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hemi-edisilat hidrata

[0089]

2

[0090] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 4, asimetrični centar je promenio orijentaciju a S oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (II).]

2.0 g [(3S)-1-[(E)-4-(dimetil- amino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata se na sobnoj temperaturi sipa u 8 mL acetona uz mešanje magnetnom mešalicom. U posebnoj bočici se rastvori 505 mg hidrata 1,2-etan-disulfonske kiseine u 6 mL acetona. Doda se rastvor kiseline u rastvor slobodne baze i meša na RT. Uzorak se temeljno meša, uz dodavanje nove količine rastvarača u retkuk žitku masu, ukoliko je potrebno. Suspenzija se razmuti u toku noći na 50 °C. Nakon mešanja u toku noći, preostala gusta žitka masa se ohladi do 20 °C u belu čvrstu supstancu. Čvrsti ostaci se izdvoje filtracijom pod vakuumom na filter papir i dobijena pogača bele čvrste supstance se suši na mestu filtriranja (2.1 g, 88% prinos).

[0091] XRD profili kristalne čvrste supstance su dobijeni na Bruker D4 Endeavor difraktometru X-zraka praška, opremljenom sa izvorom CuKa λ = 1.54060 Å) i Vantec detektorom, koji radi na 35 kV i 50 mA. Uzorak se skenira između 4 i 40° u 2θ, sa veličinom koraka od 0.008° u 2θ i brzinom skeniranja od 0.5 sekundi/koraku i sa 0.6 mm divergencije, 5.28 fiksnog anti-skatera i 9.5 mm detektor proreza. Suvi prašak se stavi na kvarcni držač uzorka a pomoću staklene ljuspice se dobija ravna površina. Profili difrakcije kristalnog oblika se sakupe na sobnoj temperaturi i pri prelativnoj vlažnosti. U tehnici kristalografije je dobro poznato da, za bilo koji dati kristalni oblik, pikovi relativnih intenziteta difrakcije mogu da variraju zbog preferirane orijentacije koja je rezultat faktora kao što su morfologija i karakteristike kristala. Kada su prisutni efekti preferirane orijentacije, intenziteti pika su izmenjeni, ali su pozicije karakterističnih pikova polimorfa nepromenjene. Videti, na primer The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, pages 1843-1844, 1995. Osim toga, takođe je dobro poznato u tehnici kristalografije da za bilo koji dati oblik kristala pozicije uglova pika mogu blago da variraju. Na primer, pozicije pika mogu da se menjaju zbog promena u temperaturi ili vlažnosti na kojima se uzorak analizira, zbog pomeranja uzorka ili zbog prisustva ili odsustva unutrašnjeg standarda. U ovom slučaju, promena pozicija pika od ± 0.2 u 2θ će uzeti u obzir ove potencijalne varijacije bez ometanja nedvosmislene identifikacije naznačenog kristalnog oblika. Potvrda kristalnog oblika može da se utvrdi na bazi bilo koje jedinstvene kombinacije različitih pikova (u jedinicama od ° 2θ), obično istaknutijih pikova. Profili difrakcije kristalnog oblika su podešeni tako što su sakupljeni na sobnoj temperaturi i pri relativnoj vlažnosti na bazi NIST 675 standardnih pikova za 8.853 i 26.774 stepeni 2-teta.

[0092] Pripremljeni uzorak kristala hemi-edisilat hidrata se karakteriše XRD profilom koristeći CuKa zračenje po tome što ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj tabeli i posebno time što ima pik na 18.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 21.5°, 16.7° i 15.2°; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Pikovi difrakcije X-zraka praška kristalnog hemi-edisilat hidrata

[0093]

4

Primer 5

Sinteza kristalnog [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat besilata

[0094]

[0095] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 5, asimetrični centar je promenio orijentaciju a S oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (II).]

Sipa se 1998 mg [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata u 15 mL acetona uz mešanje na RT pri 1000 opm. Doda se 650 mg benzenesulfonske kiseine (rastvorene u 5 mL acetona). Uzorak se meša na RT pri 1000 opm jedan sat i nakon nekog vremena, rastvor se zamuti i dobija se gusta žitka masa belih ćestica. Bela čvrsta supstanca se izdvoji filtracijom pod vakuumom na filter papir. Uzorak se suši u vakuumskoj pećnici 1 sat na 70 °C (2.23 g, 85% prinos).

[0096] [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat (440 g, 1.1 mol) se na 15-30 °C rastvori u EtOAc (1.4 L) i acetonu (357 mL). Zagreje se na 50-55 °C. Monohidrat benzenesulfonske kiseine (156 g, 0.89 eq.) se rastvori u EtOAc (709 mL) i acetonu (166 mL) i dodaje u reaktivnu smešu brzinom od 5-10 mL/minut na 50-55 °C. Meša se 1 sat. Ohladi na 15-30 °C i meša 12 sati. Smeša se filtrira a vlažna pogača suši u atmosferi azota da se dobije naslovljeno jedinjenje (525 g 72.9% prinos).<1>H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.89 (s, 1H), 7.85 - 7.79 (m, 2H), 7.43 - 7.39 (m, 3H), 6.82 - 6.66 (m, 2H), 6.15 (s, 1H), 5.27 (d, J = 21.5 Hz, 1H), 4.11 (d, J = 32.9 Hz, 2H), 3.94 - 3.79 (m, 4H), 3.33 - 3.18 (m, 2H), 3.10-2.97 (m, 2H), 2.84 (s, 6H), 2.49 (s, 3H), 2.25 - 1.94 (m, 5H), 1.68 - 1.51 (m, 2H), 1.31 (d, J = 6.8 Hz, 6H).

[0097] XRD profili kristalne čvrste supstance su u osnovi dobijeni kako je opisano u Primeru 4. Izrađeni uzorak kristalnog besilata se karakteriše XRD profilom koristeći CuKa zračenje tako što ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj tabeli a posebno što ima pik na 21.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 12.4°, 17.3° i 15.8°; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Pikovi difrakcije X-zraka praška kristalnog besilata

[0098]

Primer 6

Sinteza kristalnog [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hidrohlorida

[0099]

[0100] [*Treba imati na umu da kao što je ovde pokazano u Primeru 6, asimetrični centar je promenio orijentaciju a S oblik enantiomera je predstavljen drugačije nego kako je prethodno prikazano primerima u strukturi (II).]

557 mg [(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilata se sipa u 4 mL acetona uz mešanje na RT pri 1000 opm. Doda se 1200 µL HCl (1M u etil acetatu, 1.07 eq.). Uzorak se meša pri 1000 opm u toku noći da se dobije gusta žitka masa bele čvrste supstance. Bela čvrsta supstanca se izdvoji filtracijom pod vakuumom na filter papir. Dobijena pogača bele čvrste supstance se suši na mestu filtriranja u struji vazduha u toku 10 minuta (385 mg, 64% prinos).

[0101] XRD profili kristalne čvrste supstance su u suštini dobijeni kako je opisano u Primeru 4. Izrađeni uzorak kristalnog hidrohlorid hidrat se karakteriše XRD profilom koristeći CuKa zračenje tako što ima pikove difrakcije (2-teta vrednosti) kako je opisano u niže datoj tabeli a posebno što ima pik na 18.9° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 5.5°, 15.5° i 9.7°; uz toleranciju za uglove difrakcije od 0.2 stepena.

Pikovi difrakcije X-zraka praška kristalnog hidrohlorida

Biološka ispitivanja

[0103] Niže data ispitivanja pokazuju da je jedinjenje iz pronalaska inhibitor aktivnosti CDK7. Rezultati ispitivanja takođe pokazuju da jedinjenje iz pronalaska inhibira signalizaciju CDK7 u ćelijama kancera. Pored toga, jedinjenje iz pronalaska inhibira proliferaciju u linijama kancerogenih ćelija i rast tumora u ksenograft modelu tumora kancera.

[0104] "IC50" se odnosi na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% mogućeg maksimalnog inhibitornog odgovora za to sredstvo, ili alternativno, na koncentraciju sredstva koja produkuje 50% premeštanja liganda koji se specifično vezuje za receptor; relativne IC50vrednosti su određene korišćenjem jedinice fluorescencije izračunavanjem procenta inhibiticije u odnosu na "MIN" i "MAX" kontrola na ploči a nakon toga unošenjem podataka o odgovoru na dozu u deset tačaka u logističku jednačinu sa četiri parametra.

Ispitivanje aktivnosti CDK7 i CDK9 kinaze

[0105] Svrha ovog ispitivanja je da se izmeri sposobnost jedinjenja iz pronalaska da inhibira aktivnost CDK7/ciklinH/Mat1 kompleksa kinaze. Za pokazivanje da li jedinjenja obuhvaćena ovim pronalaskom ispoljavaju bilo kakav afinitet za CDK7, CDK7 i CDK9, sprovedene su biološke analize bez preinkubacije enzima sa jedinjenjem ili sa 3 sata preinkubacije.

Ispitivanja funkcionalnosti su pružili podršku da jedinjenja iz ovog pronalaska ispoljavaju sposobnost da inhibiraju aktivnosti CDK7 i CDK9 kinaze. Svi ligandi, rastvarači i reagensi korišćeni u narednim ispitivanjima su lako raspoloživi od komercijalnih dobavljača ili stručnjak sa iskustvom u tehnici može lako da ih sintetiše. Utvrđivanje IC50za CDK7 i CDK9 je izvedeno kako sledi.

Biohemijsko ispitivanje za inhibiciju CDK7/ciklinH/MAT1

[0106] IC50aktivnosti inhibitora je određena ispitivanjima uz korišćenje radioobeleženog vezujućeg filtera (FB) upotrebom prečišćenog humanog rekombinantnog enzima u prisustvu ATP//[<33>P]ATP i peptidnog substrata. Izabrane koncentracije ATP su na ili blizu Km enzima za ATP.

[0107] Reakcije se izvode u polistirenskim pločama sa 96 udubljenja u finalnoj zapremini od 25 µL po udubljenju. Izmeša se 5 µL test jedinjenja u 20% DMSO, 10 µL rastvora substrata (ATP/33PATP i CDK7/9 tide) i 10 µL rastvora enzima. Rastvor substrata se izradi tako da se dobije finalna koncentracija od 100 µM ATP/[<33>P]ATP (NEN 10µCi/µL, 3000 Ci/mmol) i 250 µM CDK7/9 peptida ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)) razblaženog u kinaza puferu od 4 mM MgCl2, 0.01% TRITON™ X-100, 2 mM DTT i 20 mM HEPES. Rastvor enzima se izrađuje tako da se dobije finalna koncentracija od 1nM CDK7/ciklinH/Mat1 enzima [Proqinase 0366-0360-4 Lot 002)] razblaženog u kinaza puferu. Test jedinjenja se serijski razblaže 1:3 u 20% DMSO da se izradi kriva od 10 tačaka sa početnom koncentracijom od 20 µM.20% DMSO pufer sam, bez test jedinjenja, se koristi kao visoka kontrola (potpuna aktivnost bez prisustva bilo kog inhibitora), 500 mM EDTA se koristi za određivanje vrednosti na početku bez prisustva aktivnosti enzima (niska kontrola). Nakon mešanja 5 µL jedinjenja sa 10 µL rastvora enzima, ploča se inkubira na 22 °C u toku 0 ili 180 minuta. Nakon tog vremena, reakcija se započinje dodavanjem 10 µL rastvora substrata i inkubira 50 minuta na 22 °C. Reakcija se prekida dodavanjem 80 µL ohlađenog 10% ortofosfornog rastvora. Filter ploče (neprozirne, nesterilne filter ploče) se prethodno operu sa po 10 µL 10% ortofosfornog rastvora za svako udubljenje.100 µL smeše se prenese na fosfocelulozni filter i inkubira 45 minuta na sobnoj temperaturi. Filter ploče se 3 puta isperu sa 200 µL 0.5 % ortofosforne kiseline na procesoru filter ploča. Inkorporiranje 33Pi (brojanje "cpm") se određuje dodavanjem 80 µL MICROSCINT™ u svako udubljenje i očitavanjem na brojaču nakon jedan sat. Rezultati se unesu u GENEDATA SCREENER® program. Rezultati se analiziraju pomoću 4-parametarske nelinearne logističke jednačine (kriva četiriparametarska logistička koncentracija-odgovor): Y = dno [(vrh-dno)/1+(x/ IC50)pad] gde je Y = % inhibicije, X = koncentracija kojom se dobija y % inhibicije, dno = minimalna vrednost y postignuta krivom, top = maksimalna vrednost y postignuta krivom i pad = nagib krive za IC50. %Inh = [(srednji Max- x/ srednji Max - srednji Min)] • 100 IC50: koncentracija jedinjenja koja redukuje dati odgovor (vezivanje liganda, odgovor enzima) za 50%.

[0108] Jedinjenja opisana u Primerima 1 i 3 imaju IC50sa 0.0173 µM i 0.0487 µM u CDK7 bez preinkubacije, tim redom. Nakon 3 sata inkubacije CDK7 enzima sa Primerima 1 i 3, oni pokazuju IC50sa 0.00237 µM i 0.00506 µM, tim redom. Ovi rezultati pokazuju da i Primer 1 i 3 inhibiraju CDK7.

Ispitivanje inhibicije aktivnosti CDK9/ciklinTl kinaze:

[0109] IC50aktivnosti inhibitora je određena ispitivanjima uz korišćenje radioobeleženog vezujućeg filtera (FB) upotrebom prečišćenog humanog rekombinantnog enzima u prisustvu ATP i peptidnog substrata. Izabrane koncentracije ATP su na ili blizu Km enzima za ATP. Reakcije se izvode u polistirenskim pločama sa 96 udubljenja u finalnoj zapremini od 25 µL po udubljenju. Izmeša se 5 µL test jedinjenja u 20% DMSO, 10 µL rastvora substrata (ATP//[33P]ATP i CDK7/9 tide) i 10 µL rastvora enzima. Rastvor substrata je izrađen tako da se dobije finalna koncentracija od 100 µM ATP/[33P]ATP (NEN 10uCi/ µL, 3000 Ci/mmol) i 200 µM CDK7/9 peptida ((YSPTSPSYSPTSPSYSPTSPSKKKK) (SEQ ID NO: 1)) razblažena u kinaza puferu koji se sastoji od 4 mM MgCl2, 0.0025% TRITON™ X-100, 1.58 mM DTT i 15.80 mM HEPES. Rastvor enzima je izrađen tako da je finalna koncentracija od 7.5 nM CDK9/ciklinT1 enzima [Proqinase 0371-0345-1 (Lot 004)] razblaženog u kinaza puferu. Test jedinjenja se serijski razblaže 1:3 u 20% DMSO da se izradi kriva od 10 tačaka sa početnom koncentracijom od 20 µM.20% DMSO pufer, sam bez test jedinjenja, se koristi kao visoka kontrola (potpuna aktivnost bez prisustva bilo kog inhibitora), 500 mM EDTA se koristi za određivanje vrednosti na početku bez prisustva aktivnosti enzima (niska kontrola). Nakon mešanja 5 µL jedinjenja sa 10 µL rastvora enzima, ploča se inkubira 0 ili 180 minuta

4

na 22 °C. Nakon tog vremena, reakcija se započinje dodavanjem 10 µL rastvora substrata i inkubira 60 minuta na 22 °C. Reakcija se zaustavlja dodavanjem 80 µL hladnog rastvora 10% ortofosforne kiseline. Filter ploče (neprozirne, nesterilne filter ploče) se prethodno isperu sa po 10 µL 10% ortofosfornog rastvora po udubljenju.100 µL smeše se prenese na fosfocelulozni filter i inkubira 45 minuta na sobnoj temperaturi. Filter ploče se tri puta isperu sa 200 µL 0.5 % ortofosforne kiseline na procesoru filter ploče. U svako udubljenje se doda po 80 µL MICROSCINT™ i nakon jedan sat očitava na brojaču scintilacije. Rezultati se unesu u GENEDATA SCREENER® program. Rezultati se analiziraju pomoću 4-parametarske nelinearne logističke jednačine (kriva četiriparametarska logistička koncentracija-odgovor): Y = dno [(vrh-dno)/1+(x/ IC50)pad] gde je Y = % inhibicije, X = koncentracija kojom se dobija y % inhibicije, dno = minimalna vrednost y postignuta krivom, top = maksimalna vrednost y postignuta krivom i pad = nagib krive za IC50. %Inh = [(srednji Max- x/ srednji Max - srednji Min)] • 100

IC50: koncentracija jedinjenja koja redukuje dati odgovor (vezivanje liganda, odgovor enzima) za 50%.

Relativna IC50: koncentracija koja daje polovinu maksimalnog odgovora jedinjenja.

[0110] Jedinjenja opisana u Primerima 1 i 3 pokazuju IC50sa 5.93 µM i 2.45 µM za CDK9 (3 sata preinkubacije), tim redom. Ovi rezultati pokazuju da Primeri 1 i 3 ne inhibiraju potentno aktivnost CDK9.

[0111] Uzeti zajedno, rezultati iz prethodnih ispitivanja pokazuju da jedinjenja iz Primera 1 i 3 selektivno inhibiraju CDK7 u odnosu na CDK9.

Mehanističko ispitivanje CDK7 i CDK9 ćelija

[0112] Svrha ovih ispitivanja je da se izmeri sposobnost jedinjenja da inhibiraju CDK7 i CDK9 signalizaciju u kancerogenim ćelijama in vitro.

Akumen ispitivanje na bazi fosfo-karboksil terminalnog domena (Rbp2) (Ser2) p-CTD (S2) ćelija

[0113] HCT116 ćelije (ATCC CCL-247) su uzgajane u McCoy’s 5A Medium modifikovanom medijumu obogaćenom sa 10% FBS, 1% NaPyr i 1% Pen/Strep i stave (pre postizanja 70% ispunjenosti) u ploče sa 96 udubljenja ravnog dna u gustini od 5,000 ćelija po udubljenju u 100 µL zapremine. Ćelije se nakon toga inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijske kulture (5% CO2, 95% relativna vlažnost (RH) i 37 °C) i ostave da se vežu za ploču. Narednog jutra se u ćelije dodaju jedinjenja. Jedinjenja inhibitori se prvo solubilizuju u količini od 60 µM u medijumu za kulturu koji sadrži 0.6% DMSO. Nakon toga se izrade serijska razblaženja (1:3) jedinjenja u rasponu od 60 µM do 0.003 µM. U ćelije se doda po 50 µL iz ploče sa serijskim razblaženjem u ploču za ispitivanje koja sadrži ćelije vezane sa 100 µL medijuma da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnim rasponom koncentracija jedinjenja između 20 i 0.001 µM. Za maksimalnu tačku se uzima medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za minimalnu tačku se uzima referentno jedinjenje razblaženo do 0.83 µM finalne koncentracije u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2u toku 4 sata. Medijum za rast se pažljivo ukloni a ćelije se fiksiraju dodavanjem 100 µL 4% paraformaldehida u toku 30 minuta na RT. Ćelije se jedanput isperu sa PBS i inkubiraju 15 minuta na RT sa 100 µL hladnog MeOH zbog permeacije ćelija. Ćelije se dva puta isperu sa PBS (100 µL/svaki) i blokiraju sa 100 µL/udubljenje sa 1% BSA/PBS na RT u toku 30 minuta. U svako udubljenje se doda po 50 µL 1:1000 primarnog antitela (Anti-fosfo CTD Ser2 Abcam, cat# ab5095-100) razblaženog u 1% BSA/PBS, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C.

[0114] Narednog dana, ćelije se tri puta isperu sa PBS (100 µL/udubljenje) i inkubiraju sa 50 µL/udubljenje sekundarnog antitela (1:2000 razblaženje, Goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS u toku 1 sat na RT. Nakon ispiranja 3x sa PBS (100 µL/udubljenje), u svako udubljenje se doda po 100 µL 50 µg/mL RNAaze i 1:1000 propidijum jodida razblaženog u PBS. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na RT na polici (zaštićeno od svetlosti). Ploče se analizairaju na Akumen na FL2 (srednji intenzitet) i FL3 (ukupni intenzitet). Ploče za fluorescenciju se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] za merenje antifosfo-karboksil terminalnog domena na Serinu 2 (pCTD). Analiza snimka se zasniva na ćelijskim fluorescentnim signalima za identifikaciju pozitivnih ćelija. pCTD (S2) pozitivne ćelije se identifikuju srednjim intenzitetom iznad praga od 500-530. Ukupan intenzitet za 575-640 za propidijum jodid/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Rezultat analize je % pCTD pozitivnih ćelija.

[0115] IC50je određena pomoću krive dobijene unošenjem krive u četiriparametarsku logističku jednačinu za svaki rezultat koristeći GENE DATA™. Jedinjenja opisana u Primerima 1 i 3 pokazuju relativnu IC50>20 µM i 3.52 µM za fosfoCTD (S2), tim redom. Ovi rezultati pokazuju da ni Primer 1 ni Primer 3 potentno ne inhibiraju CDK9 u ćelijama.

Akumen ispitivanje na bazi fosfo-karboksil terminalnog domena (Rbp2) (Ser5) p-CTD (S5) ćelija

[0116] HCT116 ćelije (ATCC CCL-247) su uzgajane u McCoy’s 5A Medium modifikovanom medijumu obogaćenom sa 10% FBS, 1% NaPyr i 1% Pen/Strep i stave (pre postizanja 70% ispunjenosti) u ploče sa 96 udubljenja ravnog dna u gustini od 5,000 ćelija po udubljenju u 100 µL zapremine. Ćelije se nakon toga inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijske kulture (5% CO2, 95% relativna vlažnost (RH) i 37 °C) i ostave da se vežu za ploču. Narednog jutra se u ćelije dodaju jedinjenja. Jedinjenja inhibitori se prvo solubilizuju u količini od 60 µM u medijumu za kulturu koji sadrži 0.6% DMSO. Nakon toga se izrade serijska razblaženja (1:3) jedinjenja u rasponu od 60 µM do 0.003 µM. U ćelije se doda po 50 µL iz ploče sa serijskim razblaženjem u ploču za ispitivanje koja sadrži ćelije vezane sa 100 µL medijuma da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnim rasponom koncentracija jedinjenja između 20 i 0.001 µM. Za maksimalnu tačku se uzima medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za minimalnu tačku se uzima referentno jedinjenje razblaženo do 0.83 µM finalne koncentracije u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2u toku 4 sata. Medijum za rast se pažljivo ukloni a ćelije se fiksiraju dodavanjem 100 µL 4% paraformaldehida u toku 30 minuta na RT. Ćelije se jedanput isperu sa PBS i inkubiraju 15 minuta na RT sa 100 µL hladnog MeOH zbog permeacije ćelija. Ćelije se dva puta isperu sa PBS (100 µL/svaki) i blokiraju sa 100 µL/udubljenje sa 1% BSA/PBS na RT u toku 30 minuta. U svako udubljenje se doda po 50 µL 1:1000 primarnog antitela (Anti-fosfo CTD Ser2 Abcam, cat# ab300-655A) razblaženog u 1% BSA/PBS, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C.

[0117] Narednog dana, ćelije se tri puta isperu sa PBS (100 µL/udubljenje) i inkubiraju sa 50 µL/udubljenje sekundarnog antitela (1:2000 razblaženje, Goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS u toku 1 sat na RT. Nakon ispiranja 3x sa PBS (100 µL/udubljenje), u svako udubljenje se doda po 100 µL 50 µg/mL RNAaze i 1:1000 propidijum jodida razblaženog u PBS. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na RT na polici (zaštićeno od svetlosti). Ploče se analizairaju na Akumen na FL2 (srednji intenzitet) i FL3 (ukupni intenzitet). Ploče za fluorescenciju se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] za merenje anti-

4

fosfo-karboksil terminalnog domena na Serinu 5 (pCTD). Analiza snimka se zasniva na ćelijskim fluorescentnim signalima za identifikaciju pozitivnih ćelija. pCTD (S5) pozitivne ćelije se identifikuju srednjim intenzitetom iznad praga od 500-530. Ukupan intenzitet za 575-640 za propidijum jodid/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Rezultat analize je % pCTD pozitivnih ćelija. IC50je određena pomoću krive dobijene unošenjem krive u četiriparametarsku logističku jednačinu za svaki rezultat koristeći GENE DATA™.

[0118] Jedinjenja opisana u Primerima 1 i 3 pokazuju relativnu IC50od 0.148 µM i 0.198 µM za pCTD Ser5, tim redom. Ovi rezultati pokazuju da i Primer 1 i Primer 3 inhibiraju ćelijsku aktivnost CDK7.

Akumen ispitivanje na bazi cMyc ćelija

[0119] HCT116 ćelije (ATCC CCL-247) su uzgajane u McCoy’s 5A Medium modifikovanom medijumu obogaćenom sa 10% FBS, 1% NaPyr i 1% Pen/Strep i stave (pre postizanja 70% ispunjenosti) u ploče sa 96 udubljenja ravnog dna u gustini od 5,000 ćelija po udubljenju u 100 µL zapremine. Ćelije se nakon toga inkubiraju u toku noći u inkubatoru za ćelijske kulture (5% CO2, 95% relativna vlažnost (RH) i 37 °C) i ostave da se vežu za ploču. Narednog jutra se u ćelije dodaju jedinjenja. Jedinjenja inhibitori se prvo solubilizuju u količini od 60 µM u medijumu za kulturu koji sadrži 0.6% DMSO. Nakon toga se izrade serijska razblaženja (1:3) jedinjenja u rasponu od 60 µM do 0.003 µM. U ćelije se doda po 50 µL iz ploče sa serijskim razblaženjem u ploču za ispitivanje koja sadrži ćelije vezane sa 100 µL medijuma da se dobije finalna koncentracija DMSO od 0.2% sa finalnim rasponom koncentracija jedinjenja između 20 i 0.001 µM. Za maksimalnu tačku se uzima medijum koji sadrži 0.2% DMSO a za minimalnu tačku se uzima referentno jedinjenje razblaženo do 0.83 µM finalne koncentracije u medijumu za rast koji sadrži 0.2% DMSO. Nakon dodavanja jedinjenja, ploče sa ćelijama se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2u toku 4 sata. Medijum za rast se pažljivo ukloni a ćelije se fiksiraju dodavanjem 100 µL 4% paraformaldehida u toku 30 minuta na RT. Ćelije se jedanput isperu sa PBS i inkubiraju 15 minuta na RT sa 100 µL hladnog MeOH zbog permeacije ćelija. Ćelije se dva puta isperu sa PBS (100 µL/svaki) i blokiraju sa 100 µL/udubljenje sa 1% BSA/PBS na RT u toku 30 minuta. U svako udubljenje se doda po 50 µL 1:1000 primarnog antitela (Anti-c-Myc antibody [Y69]Abcam, cat# ab32072) razblaženog u 1% BSA/PBS, ploče se zatvore i inkubiraju u toku noći na 4 °C. Narednog dana, ćelije se tri puta isperu sa PBS (100 µL/udubljenje) i inkubiraju sa 50 µL/udubljenje sekundarnog antitela (1:2000 razblaženje, Goat anti-rabbit IgM ALEXA FLUOR™ 488) u PBS u toku 1 sat na RT. Nakon ispiranja 3x sa PBS (100 µL/udubljenje), u svako udubljenje se doda po 100 µL 50 µg/mL RNAaze i 1:1000 propidijum jodida razblaženog u PBS. Ploče se zatvore i inkubiraju 1 sat na RT na polici (zaštićeno od svetlosti). Ploče se analiaziraju na Akumen na FL2 (srednji intenzitet) i FL3 (ukupni intenzitet). Ploče za fluorescenciju se skeniraju sa ACUMEN EXPLORER™ [Citometar sa fluorescentnom mikropločom za lasersko skeniranje proizvođača TTP LABTECH LTD] za merenje antifosfo-karboksil terminalnog domena na Serinu 5 (pCTD). Analiza snimka se zasniva na ćelijskim fluorescentnim signalima za identifikaciju pozitivnih ćelija. pCTD (S5) pozitivne ćelije se identifikuju srednjim intenzitetom iznad praga od 500-530. Ukupan intenzitet za 575-640 za propidijum jodid/DNK se koristi za identifikaciju pojedinačnih ćelija. Rezultat analize je % pCTD pozitivnih ćelija. IC50je određena pomoću krive dobijene unošenjem krive u četiriparametarsku logističku jednačinu za svaki rezultat koristeći GENE DATA™.

[0120] Jedinjenja opisana u Primerima 1 i 3 pokazuju relativnu IC50od 0.0828 µM i 0.0573 µM za cMyc. Ovi rezultati pokazuju da i Primer 1 i Primer 3 inhibiraju transkripciju cMyc u HCT116 ćelijama.

Eksperiment profilisanja selektivnosti: prokinaza WT profiler

[0121] Profil inhibicije kinaze jedinjenjem je određen merenjem rezidualnih vrednosti aktivnosti pojedinačno za četiri koncentracije u ispitivanju 320 izvornog tipa protein kinaza. Jedinjenja su testirana pojedinačno za 20 µM, 2 µM, 0.2 µM i 0.02 µM. Finalna koncentracija DMSO u svim koktelima reakcije (uključujući visoku i nisku kontrolu) je 1%.

Ispitivanje protein kinaze

[0122] Radiometrijsko ispitivanje protein kinaze (33PANQINASE® Activity Assay, ProQinase) se koristi za merenje aktivnosti kinaze za 320 protein kinaza. Sva ispitivanja kinaza se izvode u FLASHPLATES™ sa 96 udubljenja u 50 µL reaktivne zapremine.

Reaktivni koktel se pipetira u 4 faze sledećim redosledom:

1. 10 µL ne-radioaktivnog ATP rastvora (u H2O)

2. 25 µL pufera za ispitivanje/[γ-33P]-ATP smeše

4

3. 5 µL test uzorka u 10% DMSO

4. 10 µL smeše enzim/substrat

[0123] Analiza za sve protein kinaze sadrži 70 mM HEPES-NaOH pH 7.5, 3 mM MgCl2, 3 mM MnCl2, 3 µM Na-ortovanadata, 1.2 mM DTT, ATP (promenljive količine, koje odgovaraju očiglednoj ATP-Km određene kinaze, videti Tabelu 1), [γ-33P]-ATP (približno.8 x 1005 cpm po udubljenju), protein kinazu (promenljive količine; videti Tabelu 1) i substrat (promenljive količine; videti Tabelu 1). Sve PKC analize (izuzev PKC-mu i PKC-nu analize) dodatno sadrže 1 mM CaCl2,4 mM EDTA, 5 µg/mL fosfatidilserina i 1 µg/mL 1,2-dioleil glicerola. CAMK1D, CAMK2A, CAMK2B, CAMK2D, CAMK2G, CAMK4, CAMKK1, CAMKK2, DAPK2,EEF2K, MYLK, MYLK2 i MYLK3 analize dodatno sadrže 1 µg/mL kalmodulina i 0.5 mM CaCl2. PRKG1 i PRKG2 analize dodatno sadrže 1 µM cGMP. DNK-PK analiza dodatno sadrži 2.5 µg/mL DNK.

[0124] Kokteli reakcija protein kinaze se inkubiraju 60 minuta na 30 °C. Reakcija se zaustavlja sa 50 µL 2% (v/v) H3PO4, ploče se aspiriraju i isperu dva puta sa po 200 µL 0.9% (m/v) NaCl. Inkorporiranje 33Pi (brojanje "cpm") se određuje sa brojačem scintilacije mikro ploča. Sve analize protein kinaze se izvode sa BeckmanCoulter BIOMEK® 2000/SL robotskim sistemom. Sve protein kinaze obezbeđene od ProQinase su ekspresovane u Sf9 ćelijama insekta ili u E.coli kao proteini rekombinantne GST-fuzije ili His-označeni proteini, ili u punoj dužini ili kao enzimatično aktivni fragmenti. Sve kinaze su produkovane od humanih cDNKa i prečišćene ili hromatografijom sa GSH-afinitetom ili mobilisanim metalom. Oznake afiniteta se uklone iz brojnih kinaza u toku prečišćavanja. Čistoća protein kinaze se ispituje SDS-PAGE/Coomassie bojenjem, identitet se proverava masenom spektroskopijom. Kinaze od spoljašnjih dobavljača (CAR = Carna Biosciences Inc.; INV = Life Technologies (Invitrogen Corporation™); MIL = Merck-Millipore (Millipore Corporation™), videti Tabelu 1) se ekspresuju, prečiste a kvalitet kontroliše na osnovu očitavanja dobavljača. Koncentracije enzima i substrata za analize su pokazani u Tabeli 1.

Procena neobrađenih podataka

[0125] Za svaku kinazu, srednja vrednost cpm iz tri udubljenja se definiše kao "niska kontrola" (n=3). Ova vrednost pokazuje nespecifično vezivanje radioaktivnosti za ploču u odsustvu protein kinaze ali u prisustvu substrata. Pored toga, za svaku kinazu srednja vrednost

4

cpm iz tri druga udubljenja se uzima kao "visoka kontrola", to jest, potpuna aktivnost u odsustvu bilo kog inhibitora (n=3). Razlika između visoke i niske kontrole za svaki enzim se uzima kao 100% aktivnosti. Kao deo evaluacije rezultata, niska kontrola svake kinaze se oduzima od vrednosti visoke kontrole kao od njihovih odgovarajućih "vrednosti jedinjenja". Rezidualna aktivnost (u %) za svako udubljenje sa jedinjenjem se izračunava po sledećoj formuli: Rezidualna aktivnost (%) = 100 X [(signal jedinjenja - niska kontrola) / (visoka kontrola - niska kontrola)]. Nestandardne IC50se izračunavaju koristeći prilagođenu eksel tabelu u konjukciji sa XLFit Add-in. Zbog malog broja podataka, (4) XL-Fit izračunava nestandardnu IC50koristeći četiri parametarsku jednačinu u kojoj tri parametra imaju fiksne vrednosti.

Jednačina je:

Y=B+((A-B))/[1+(x/C)]^D

A: minimalna vrednost aktivnosti, takođe poznata kao dno. Fiksirana na 0

B: maksimalna vrednost aktivnosti, takođe poznata kao vrh. Fiksirana na 100

C: prelomna tačka krive

D: vrh nagiba. Fiksiran na 1

Y: zavisna promenljiva (to jest, šta je izmereno kao signal)

X: nezavisna promenljiva (to jest, šta je kontrolisano, kao što su doza, koncentracija, itd.)

[0126] Način za izračunavanje nestandardne IC50je da se dodele vrednosti za C parametar po slučajnom izboru i da se to iterativno ponovi. Algoritam nakon toga meri razlike u zbiru kvadrata ostataka i tražiće uzastopne iteracije gde se konverguje promena reziduala. Kada se dostigne granica konvergencije, rastvor se smatra optimalnim i proces uklapanja se završava.

[0127] CDK12 i CDK13 (ProQinase) se u suštini testiraju kako je prethodno dato ali posebno za 10 koncentracija (2 x 10<5>M do 6 x 10<10>M) koristeći semi-logaritamska razblaženja. Za 10 tačaka, analize rezidualnih aktivnost za svaku koncentraciju i IC50vrednosti jedinjenja se izračunavaju pomoću QUATTRO® WORKFLOW™ V3.1.1. Model uklapanja za određivanje IC50je "Sigmoidalni odgovor (promenljivi pad)" sa parametrima "vrh" fiksiran za 100% i "dno" za 0%. Korišćeni postupak uklapanja je uklapanje najmanjih kvadrata. Rezultati su pokazani u niže datoj Tabeli 1.

4

Tabela 1

[0128] Ovi rezultati pokazuju da je jedinjenje iz Primera 1 veoma selektivno za CDK7 iz predstavljenog panela kinaze.

Ispitivanje proliferacije ćelija

[0129] Rezultati u Tabeli 2 pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira proliferaciju i viabilnost navedenih ćelijskih linija tumora. Ćelijske linije se nanesu u gustini od 5000 ćelija po udubljenju u 100 µL medijuma za rast po udubljenju u belim pločama za kulturu ćelija sa 96 udubljenja. Za podatke o ćelijskoj liniji i medijumu za kulturu videti Tabelu 2. Ploče se inkubiraju na 37 °C i 5% CO2. Narednog dana, pripreme se serijska razblaženja test jedinjenja razblaživanjem jedinjenja 1:3 u DMSO za 10 tačaka. DMSO ploča je 1000X finalna koncentracija. Pored CDK7 inhibitora, kolona samog DMSO je uključena kao maksimalna kontrola rasta a finalna kolona sa 10 µM staurosporina je uključena kao maksimalna kontrola inhibicije rasta. Nakon toga se izradi ploča sa 10X razblaženja dodavanjem 2 µL po udubljenju iz 1000X DMSO ploče u 198 µL po udubljenju OMEM (Life Technologies,

4

Carlsbad, CA, cat#31985-070). Ćelije se tretiraju sa navedenim jedinjenjem dodavanjem 11 µL po udubljenju iz 10X OMEM ploče u ploču sa ćelijama koja sadrži 100 µL po udubljenju medijum za rast za 1X finalnu koncentraciju. Ploče se vrate u inkubator na 37 °C i 5% CO2. Sedam dana nakon dodavanja jedinjenja, ploče se uklone iz inkubatora i ostave da se uravnoteže na RT. CELL TITER GLO® reagens se otopi na sobnoj temperaturi a nakon toga pripremi mešanjem jedne bočice pufera za analizu sa jednom bočicom substrata i blago mućka da se izmeša. Nakon toga se u ploču sa ćelijama doda CELL TITER GLO® reagens, 100 µL po udubljenju i ploča prenese na Titer Plate šejker pri brzini od 2 u toku 15 minuta, na sobnoj temperaturi. Nakon 15 minuta inkubacije na šejkeru, očitava se luminescencija, 1 sekunda po udubljenju, koristeći Wallac VICTOR2™. Krive nelinearne regresije i sigmoidalnog odgovora na dozu se koriste za izračunavanje polovine maksimalne inhibitorne koncentracije (IC50) sa Graphpad Prism 6 softverom.

Tabela 2

4

(nastavlja se)

[0130] Ovi rezultati pokazuju da jedinjenje iz Primera 1 inhibira in vitro rast ćelijskih linija kancera različitih histologija uključujući kolon, dojku, pluća, jajnike i želudac, na način koji zavisi od doze.

Ksenograft modeli tumora

[0131] Svrha ovog ispitivanja je da se izmeri smanjenje zapremine tumora kao odgovor na jedinjenje iz Primera 1. Za procenu in vivo efikasnosti test jedinjenja, koriste se višestruki ksenograft modeli tumora. Ukratko, za najveći broj ksenograft modela tumora, 5-10 x 10<6>ćelija tumora u 1:1 MATRIGEL® smeši (0.2 mL ukupna zapremina) se subkutano injektuju u ženke atimičnih obrijanih miševa (Envigo, Harlan laboratories). Alternativne vrste miševa se koriste da se utvrde MDAMB468 (NOD SCID Gamma, Jackson labs), CT26 i EMT6 (BALB/c, Envigo, Harlan Laboratories) ksenografti. Nakon što se tumori ostave da dostignu traženu veličinu od ~300-500 mm<3>, životinje se nasumice podele u grupe od 6-8 za studije efikasnosti. Test jedinjenje se primenjuje oralnom gavažom (PO) u određenim dozama i režimima. Rast tumora i telesna težina se prate u toku vremena zbog procene efikasnosti i znakova toksičnosti.

[0132] Test jedinjenje je formulisano u 5% N-metil-2-pirolidonu (NMP) u 1% hidroksietilceluloze, 0.25% polisorbata 80, 0.05% antipenećeg sredstva u prečišćenoj vodi (HEC) i primenjuje oralnom gavažom (finalna zapremina 0.2 mL) u dozama navedenim u Tabeli 4. Test jedinjenje je formulisano na nedeljnoj bazi i čuva se na 4 °C. Vehikulumi se primenjuju na kontrolnim grupama u skladu sa prethodno korišćenom rasporedu primenjujući zapreminu od 0.2 mL po dozi. Miševi se doziraju oralnom gavažom a uzorci tumora se uzimaju po završetku i čuvaju na -80 °C.

[0133] Veličina tumora i telesna težina se beleže i analiziraju dvonedeljno. Krv se uzima upotrebom DBS (osušena krvna mrlja) karte 2 sata nakon doze i po završetku tretmana.

Tumori se uzimaju po završetku studije, seku na 3 dela i ili zamrznuti fotografišu za pokazivanje i analizu proteina, ili se prenesu u RNAlater® za analizu RNK. Uzorci tkiva se zamrznu i čuvaju na -80 °C.

[0134] Jedinjenje iz Primera 1 pokazuje značajnu anti-tumornu aktivnost u ksenograft modelima humanih kancera (Tabela 3).

Tabela 3: Sažetak efikasnosti pojedinačnog sredstva iz Primera 1 in-vivo (ΔT/C) kroz različite modele ksenograf tumora testiranih pri različitim vrednostima doze kako je navedeno.

[0135] Delta T/C% se izračunava kada je najveća zapremina tumora u tretiranoj grupi na ili iznad početne zapremine tumora. Formula je 100x(T-T0)/(C-C0). Ovde, T i C su prosečne završne zapremine tumora u tretiranoj ili kontrolnoj grupi, tim redom T0 i C0 su prosečne početne zapremine tumora u ovim grupama. *: značajno (p<0.05)

Biomarker studija

[0136] Svrha ove studije je da proceni potencijalne prediktivne biomarkere za jedinjenja iz ovog pronalaska.

1

[0137] Ćelijske linije kancera su profilisane za procenu anti-proliferativne aktivnosti test jedinjenja in vitro. Mutacija, broj kopija i informacije o ekspresiji gena za ARID1A, KMT2C, KMT2D i/ili RB1 gena ćelijskih linija kancera je dobijena iz COSMIC baze podataka (kancer.sanger.ac.uk) i cBioportal (http://www.cbioportal.org/). Ćelije se uzgajaju u medijumu za rast i prenesu u ploče sa 96 udubljenja u 100 µL/udubljenje medijuma za rast u količini od 5000 ćelija/udubljenje i nakon toga inkubiraju na 37 °C, 5% CO2u toku noći. Ćelije se uzgajaju korišćenjem medijuma preporučenog od strane dobavljača i pod uslovima dobro poznatim u tehnici, na primer sa RPMI 1640 sa ili bez HEPES & L-Glutamina (Thermo SH30255.01) i ImM natrijum piruvijata i 10% FBS(Gibco cat#10082). Ploča sa srednjim 1000X razblaženjem se pripremi izradom 10 mM osnovnog rastvora test uzorka u DMSO i urade se 1:3 razblaženja u DMSO za 10 tačaka. Ploča 10X doziranja se pripremi dodavanjem 2 µL iz ploče sa srednjim 1000X razblaženjem u 198 µL OPTIMEM® 10% FBS i dobro izmeša. Ploča sa ćelijama se nakon toga tretira dodavanjem 11 µL iz ploče 10X doziranje u 100 µL /udubljenje ploče sa ćelijama za 1X finalnu koncentraciju. Staurosporin se koristi kao kontrola maksimuma inhibicije rasta u finalnoj koncentraciji od 5 µM. Ploča sa ćelijama se inkubira 7 dana na 37 °C, 5% CO2. Sedam dana nakon tretmana, pufer za ispitivanje ćelija Titer-Glo® (Promega cat# G7571) i substrat se uklone sa -20 °C i ostave da se uravnoteže na RT. Pufer za analizu se doda u substrat i pažljivo mućka da se izmeša. U ploču sa ćelijama se doda CELL TITER-GLO® reagens (100 µL/udubljenje) i inkubira 15 minuta na RT. Nakon 15 minuta, luminescencija se očitava na čitaču ploča. Rezultati se analiziraju u ekscelu i grafički prikažu u GraphPad Prism. Statističke analize i p vrednost se izračunavaju korišćenjem Mann-Whitney neparametarskih t testova pomoću GraphPad Prism.

[0138] Zbirni rezultati proliferacije su pokazani u Tabeli 4. Anti-proliferativni efekti test jedinjenja su kategorizovani kao insenzitivni (IC50≥ 1 µM), citostatični (IC50< 1 µM i % inhibicije <70%) ili citotoksični (IC50<1 µM i % inhibicije ≥70%). Ćelijske linije kod kojih dolazi do inaktivacije ili gubitka mutacija funkcije (LOF) ili u ARID1A, KMT2C, KMT2D ili RB1 genu pokazuju značajno veći citotoksični odgovor za Primer 1 u poređenju sa drugim ćelijskim linijama pokazanim u Tabeli 5. Nasuprot tome, non-LOF ćelijske linije pokazuju veći (%) citostatični odgovor kao odgovor na Primer 1.

[0139] Osim toga, broj ksenograft modela tumora kod kojih postoje ove mutacije se koristi za procenu efikasnosti Primera 1 kao monoterapije (Tabela 3).

[0140] Sažetak studija efikasnosti i anti-tumorne aktivnosti (ΔT/C) je pokazan u Tabeli 3. Primer 1 pokazuje snažnu efikasnost kod različitih modela tumora, uz uočene značajne

2

regresije kod modela tumora sa mutacijama u ARID1A, KMT2C ili RB1 genima. Kao zaključak, ovi nalazi pokazuju da inaktivacija mutacija u ARID1A, KMT2C, KMT2D ili RB1 genu predstavlja potencijalnu strategiju za izbor pacijenata za tretman sa Primerom 1 kod više tipova kancera.

deno

nave

je

ok

ka

ra

kance

je .lini

izu ke

js anal

ćeli

lo® et G čiliter-az lTizar el 1 ćiCera

ste ri ko )Prim

e(%iransta

aalizr

ije ian a bic

dan hi

7 e )iin

an M

(n

tretir Izo

su

g-G jelo nine eli kijs tiv

ra

Ćellife

ro

-p

anti

ak

et

4:Saž

la

Tabe

)se a vlj sta(na

)se alj v sta(na

se)ljatav nas(

)se a vlj sta(na

)seljatav

(nas

l t

[0141] Podatak o medijumu:

A. RPMI 1640 (Gibco 11835, Gibco 22400-089, ili Hyclone Cat # SH30027 ) 10% FBS (Gibco cat#10082)

B. DMEM with L-Glutamin (Thermo cat#SH30022) NaPyr NEAA HEPES 10% FBS (Gibco cat#10082)

C. RPMI 1640 with HEPES & L-Glutamin (Gibco 22400) 1mM Na Pyruvate 10% FBS(Gibco cat#10082)

D. F-12K Medium (Cat#30-2004)+ 10% FBS (Gibco cat#10082)

E. EMEM (CellGro cat#17-305-CV) L-Glutamin Na Pyruvate Na Bikarbonat 10% FBS (Gibco cat#10082)

F. EMEM (CellGro cat#17-305-CV) L-Glutamin Na Pyruvate Na Bikarbonat NEAA+ 10% FBS (Gibco cat#10082)

G. DMEM (Gibco 11995) 1mM Na Pyruvate 10% FBS(Gibco cat#10082)

H. DMEM High Glucose (Hyclone Cat # SH30022) 10 % HIFBS (Gibco Cat # 10082) IX NEAA (Hyclone SH30328)

I. ATCC modified RPMI 1640 (Gibco A1049101) 1mM Na Pyruvate 10% FBS(Gibco cat#10082)

J. McCoy’s 5A 10% FBS (Gibco cat#10082)

K. DMEM (Gibco 11965) 10% FBS

L. MEM Eagle with Earle’s Salts (Gibco 11095-080) 1% NEAA 1% NaPyr 10% FBS (Gibco cat#10082)

M. RPMI-1640 with L-glutamin and HEPES 10% heat inactivated FBS

N. DMEM with L-Glutamin (Thermo cat#SH30022) Na Pyruvate 10% FBS (Gibco cat#10082)

O. MEM (Gibco 11095) Na Pyruvate NEAA 10% FBS (Gibco cat#10082)

P. RPMI 1640 with HEPES & L-Glutamin (Thermo SH30255.01 ili Gibco 11835) 1mM Sodium Pyruvate 10%FBS(Gibco cat#10082)

Q. DMEM:F12 w/ 2.5 mM L-glutamin, 15 mM HEPES 0.5 mM NaPyruv 10% FBS R. 49% RPMI 1640 49% Ham’s F12 2% h.i. FBS

S. 45% RPMI 1640 45% Ham’s F12 10% h.i. FBS

T. DMEM (Gibco 11965) 1mM Na Pyruvate 5% FBS (Gibco cat#10082)

U. Leibovitz’s L15 (Gibco cat#11415-064) 10% FBS (Gibco cat#10082), No CO2V. DMEM with high Glu & L-gln 10% heat inactivated FBS NaPyr NEAA HEPES W. DMEM:F12 (1:1) ITS 10nM Hidrocortizone 10nM beta-Estradiol 4.5mM L-glut 5% FBS (Gibco cat#10082)

X. RPMI-1640 with L-glutamin and HEPES 10% FBS

Y. RPMI 1640 with HEPES & L-Glutamin (Gibco 22400) 1mM Na Pyruvate NEAA 20% FBS(Gibco cat#10082)

Z. DMEM 2mM Glutamin 1mM Sodium Pyruvate (NaP) 20 IU/l Bovine Insulin 10% FBS(Gibco cat#10082)

AA. Williams’ E media (Gibco Cat # 12551) 10%FBS

BB. MEM 10% FBS NaPyr NEAA HEPES 1.5g/L NaHCO3

CC. McCoy’s 5A (Gibco 16600) 15% FBS (Gibco cat#10082)

DD. 1:1 MEM (11095): F12 (CellGro 10-080-CV) 10% FBS (Gibco cat#10082) EE. RPMI-1640 with glutamin and HEPES (Hyclone Cat # SH30255) 10% FBS (Gibco Cat # 16000) IX NaPyr

FF. Iscove’s modified Dulbecco’s medium w/L-glutamin,25mMHEPES [GIBCO 12440-053]+20% FBS

GG. RPMI 1640 with HEPES & L-Glutamin (phenol-red-free) 1mM Na Pyruvate 10% FBS(Gibco cat#10082)

HH. 1:1 Hams F12: DMEM L-Glutamin 5% FBS (Gibco cat#10082)

II. RPMI-1640 (Hyclone Cat # SH30027) 10% Heat inactivted FBS (Gibco Cat # 10082) JJ. 1:1 smeša MCDB 105 medijuma koji sadrži finalnu koncentraciju od 1.5 g/L natrijum bikarbonata i medijuma 199 koji sadrži finalnu koncentraciju od 2.2 g/L natrijum bikarbonata 15% FBS.

Tabela 5: distribucija (%) efekata anti-proliferacije Primera 1 za ćelijske linije kancera kod kojih postoje LOF mutacije.

Claims

Patentni zahtevi 1. Jedinjenje Formule (I), naznačeno time što je to
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 2. Jedinjenje Formule (II) u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 3. Jedinjenje Formule (II) u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to
4. Jedinjenje Formule (III) u skladu sa patentnim zahtevom 1, naznačeno time što je to
ili njegova farmaceutski prihvatljiva so. 5. Jedinjenje Formule (III) u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je to
6. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je to hidrohloridna, besilatna ili hemi-edisilat hidratna so.
7. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 4, naznačeno time što je to besilatna ili hemi-edisilat hidratna so.
8. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 2, naznačeno time što je u obliku kristalne soli.
9. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što je to kristalni[(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metil-pirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat besilat koji se karakteriše profilom difrakcije X-zraka praška koji ima karakteristične pikove koristeći CuKa zračenje u 2θ ± 0.2°, dobijene na 21.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 12.4°, 17.3° i 15.8°.
10. Jedinjenje ili so u skladu sa patentnim zahtevom 8, naznačeno time što je to kristalni[(3S)-1-[(E)-4-(dimetilamino)but-2-enoil]pirolidin-3-il] 4-[(3-izopropil-5-metilpirazolo[1,5-a]pirimidin-7-il)amino]piperidin-1-karboksilat hemi-edisilat hidrat koji se karakteriše profilom difrakcije X-zraka praška koji ima karakteristične pikove koristeći CuKa zračenje u 2θ ± 0.2°, dobijene na 18.5° u kombinaciji sa jednim ili više pikova izabranih iz grupe koja se sastoji od 21.5°, 16.7° i 15.2°.
11. Farmaceutska kompozicija, naznačena time što uključuje jedinjenje u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 10, ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, u kombinaciji sa jednim ili više farmaceutski prihvatljivih nosača, razblaživača ili podloga.
12. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 11, naznačena time što uključuje jedno ili više drugih terapeutskih sredstava.
13. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 10, naznačeno time što je za upotrebu u terapiji.
14. Jedinjenje ili njegova so u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 1 do 10, naznačeno time što je za upotrebu u postupku tretmana urotelijalnog kancera, kancera materice, kolorektalnog kancera, kancera dojke, kancera pluća, kancera jajnika, kancera želuca, hepatobilijarnog kancera, kancera pankreasa, kancera grlića materice, kancera prostate, hematoloških kancera, sarkoma, kancera kože ili glioma.
15. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 14, naznačeno time što je kancer kolorektalni kancer, kancer dojke, kancer pluća, kancer jajnika ili kancer želuca.
16. Jedinjenje ili so za upotrebu u skladu ili sa patentnim zahtevom 14 ili 15, naznačeno time što je kancer kancer dojke.
17. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 16, naznačeno time što postupak takođe uključuje sprovođenje in vitro analiza koristeći biološki uzorak od pacijenta, za određivanje prisustva najmanje jedne inaktivacije mutacije u ARID1A, KMT2C, KMT2D i RB1 genima i primenu terapeutski efektivne količine jedinjenja ili njegove soli na pacijentu ukoliko je prisutna bar jedna inaktivacija mutacije u bilo kom od gena.
18. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa patentnim zahtevom 17, naznačeno time što je biološki uzorak uzorak tumora a uzorak se analizira genomskim/DNK sekvenciranjem.
19. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu ili sa patentnim zahtevom 17 ili 18, naznačeno time što je uzorak dobijen od pacijenta pre prve primene jedinjenja ili njegove soli na pacijentu.
20. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 19, naznačeno time što je pacijent izabran za tretman tako što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u ARID1A genu.
21. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 19, naznačeno time što je pacijent izabran za tretman tako što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u KMT2C genu.
22. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 19, naznačeno time što je pacijent izabran za tretman tako što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u KMT2D genu.
23. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 19, naznačeno time što je pacijent izabran za tretman tako što ima najmanje jednu inaktivaciju mutacije u RB1 genu.
24. Jedinjenje ili njegova so za upotrebu u skladu sa bilo kojim od patentnih zahteva 13 do 23, naznačeno time što se jedinjenje u obliku soli primenjuje na pacijentu u dozi od približno 1 mg do 2 g. Izdaje i štampa: Zavod za intelektualnu svojinu, Beograd, Kneginje Ljubice 5