RS63646B1 - Isporuka lekova posredovana ultrazvukom - Google Patents

Isporuka lekova posredovana ultrazvukom

Info

Publication number
RS63646B1
RS63646B1 RS20220889A RSP20220889A RS63646B1 RS 63646 B1 RS63646 B1 RS 63646B1 RS 20220889 A RS20220889 A RS 20220889A RS P20220889 A RSP20220889 A RS P20220889A RS 63646 B1 RS63646 B1 RS 63646B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
cluster
microbubbles
ultrasound
clusters
activation
Prior art date
Application number
RS20220889A
Other languages
English (en)
Inventor
Andrew John Healey
Per Christian Sontum
Svein Kvåle
Original Assignee
Exact Therapeutics As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Exact Therapeutics As filed Critical Exact Therapeutics As
Publication of RS63646B1 publication Critical patent/RS63646B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0002—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy
    • A61K9/0009—Galenical forms characterised by the drug release technique; Application systems commanded by energy involving or responsive to electricity, magnetism or acoustic waves; Galenical aspects of sonophoresis, iontophoresis, electroporation or electroosmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0047—Sonopheresis, i.e. ultrasonically-enhanced transdermal delivery, electroporation of a pharmacologically active agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/454—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a five-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pimozide, domperidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/475—Quinolines; Isoquinolines having an indole ring, e.g. yohimbine, reserpine, strychnine, vinblastine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A61K31/52—Purines, e.g. adenine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/535—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with at least one nitrogen and one oxygen as the ring hetero atoms, e.g. 1,2-oxazines
    • A61K31/5375—1,4-Oxazines, e.g. morpholine
    • A61K31/5377—1,4-Oxazines, e.g. morpholine not condensed and containing further heterocyclic rings, e.g. timolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0028—Disruption, e.g. by heat or ultrasounds, sonophysical or sonochemical activation, e.g. thermosensitive or heat-sensitive liposomes, disruption of calculi with a medicinal preparation and ultrasounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0076—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion
    • A61K49/0078—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form dispersion, suspension, e.g. particles in a liquid, colloid, emulsion microemulsion, nanoemulsion
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations
    • A61K49/222—Echographic preparations; Ultrasonic imaging preparations characterised by a special physical form, e.g. emulsions, liposomes
    • A61K49/223—Microbubbles, hollow microspheres, free gas bubbles, gas microspheres
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A61K9/1075—Microemulsions or submicron emulsions; Preconcentrates or solids thereof; Micelles, e.g. made of phospholipids or block copolymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L24/00—Surgical adhesives or cements; Adhesives for colostomy devices
    • A61L24/001—Use of materials characterised by their function or physical properties
    • A61L24/0015—Medicaments; Biocides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/418—Agents promoting blood coagulation, blood-clotting agents, embolising agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/45—Mixtures of two or more drugs, e.g. synergistic mixtures
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/60—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a special physical form
    • A61L2300/62—Encapsulated active agents, e.g. emulsified droplets
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/36—Materials or treatment for tissue regeneration for embolization or occlusion, e.g. vaso-occlusive compositions or devices

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Radiology & Medical Imaging (AREA)
  • Acoustics & Sound (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Description

Opis
Oblast pronalaska
[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na isporuku terapijskih agenasa posredovanu ultrazvukom (UZ), kao što je isporuka leka, gena, nanočestice ili radioizotopa, korišćenjem dvofaznog sistema mikročestica koji sadrži mikromehuriće gasa, mikrokapljice emulzije i njihovih klastera. Stoga, predmetni pronalazak se odnosi na klaster kompoziciju i farmaceutsku kompoziciju, i njihovu primenu za isporuku terapijskih agenasa i kao kontrasnog agensa za snimanje ultrazvukom. Dalje se odnosi na postupke za isporuku takvih terapijskih agenasa i na primenu navedenih kompozicija.
Stanje tehnike pronalaska
[0002] Preduslov za uspešnu medicinsku terapiju je da lek dostigne ciljnu patologiju i da je toksičnost prema zdravom tkivu ograničena. Međutim, određeni broj lekova pokazuje nizak terapijski indeks koji ozbiljno ograničava njihovu kliničku korisnost. Tokom poslednjih nekoliko decenija, farmaceutska industrija je potrošila značajna sredstva pokušavajući da reši ovu dilemu različitim pristupima za ciljanu/lokalizovanu isporuku lekova primenom npr. platformi sa nanočesticama, mikromehurićima ili lipozomima. Lokalizovanom isporukom leka do patologije ili organa koji su u pitanju, sistemska izloženost se minimizuje (smanjuje toksičnost), a lokalna koncentracija, a time i efikasnost, se povećava.
[0003] Uprkos značajnim naporima, kontrolisana isporuka lekova ostaje suštinski nerešena u kliničkoj medicini. U novije vreme, istraživanje i razvoj su posebnu pažnju posvetili sistemima za isporuku lekova koji se aktiviraju spolja. Toplota, svetlost, ultrazvuk, električna i magnetna polja su korišćeni kao spoljni izvori energije za aktiviranje sistema formulacije leka in-vivo za oslobađanje i isporuku lekova na ciljane lokacije u telu. Za nedavni prikaz, videti Timko i saradnici [B.P. Timko i saradnici, Remotely triggerable drug delivery systems, Adv. Mater.22 (2010) 4925-4943].
[0004] Tokom poslednje dve decenije, raste interesovanje za isporuku lekova korišćenjem ultrazvuka. Za nedavni prikaz, videti Castle i saradnici [Castle i saradnici, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 1. februar 2013.304:H350-H357]. Mnogi pristupi zasnivaju se na primeni mikromehurića sličnih onima koji se koriste kao ultrazvučni kontrastni agensi za primene medicinskog snimanja, za oslobađanje inkorporiranih ili vezanih lekova i/ili za pojačano preuzimanje sistemski (ko)administriranih lekova.
[0005] Mikromehurići imaju potencijal da promene strukturu tkiva i ćelijskih membrana putem mehanizama kao što su kao sonoporacija, čime se pojačava ekstravazacija oslobođenog ili koadministriranog leka u ciljano tkivo. Primena ultrazvuka osciluje mikromehuriće prisutne u mikrocirkulaciji i indukuje dobro uspostavljene mehanizme koji povećavaju lokalnu propustljivost vaskulature, omogućavajući lekovima da difunduju povećanom brzinom u prostor tkiva [O’Neill, BE i Li, KC, Int. J. Hyperthermia, septembar 2008; 24(6): 506-520]. Poznato je da nekoliko mehanizama izazivaju takve bio efekte, uključujući sonoporaciju i endocitozu za intracelularnu isporuku, poremećaj endotela i/ili povećano otvaranje/(reverzibilnu) modifikaciju fenestracionih pora ili promenu vaskularnog endotela, ili druge mehanizme poboljšanog transporta i difuzije kao što su sila zračenja i mikrotok. Relativni značaj i tačna priroda mehanizama i odnos prema ultrazvučnoj dozimetriji zahtevaju dalja istraživanja i razjašnjenja. Nedavni rad je takođe motivisan da se pozabavi pitanjima isporuke lekova preko krvno-moždane barijere, i isporuke do solidnih tumora. Krvno-moždanu barijeru karakterišu čvrsti vaskularni endotelni spojevi koji inhibiraju prolaz većih molekula u prostor tkiva. Vaskulatura tumora je generalno više 'propusna' ali trpi više intersticijalne tečnost i onkotskog pritiska koji može ometati prolaz leka kroz celu masu tumora. Unos utvrđenih hemoterapiskih sredstava može biti veoma promenljiv u zavisnosti od tipa tumora i takve razlike u unosu mogu doprineti promenljivoj prirodi terapijskog efekta. Iako su mehanizmi isporuke posredovani mikromehurićima jasno demonstrirani in vivo, postoje povezani bioefekti koji postavljaju bezbednosna pitanja za pristup. Po svoj prilici, mehanizmi kavitacija mikromehurića su uključeni a posebno je primećeno mikro krvarenje i ireverzibilno vaskularno oštećenje. Za tehnike koje se odnose na primenu na krvno-moždanu barijeru, takođe postoje problemi u vezi sa isporukom dovoljne količine ultrazvučnom energijom do patološkog područja od interesa, posebno ako kost lobanje koja se nalazi iznad ostaje netaknuta i nije uklonjena.
[0006] Najosnovniji oblik isporuke leka posredovane ultrazvukom/mikromehurićima je administriranje formulacije mikromehurića zajedno sa sistemski administriranim lekom kao što je pojačano preuzimanje ciljane patologije. Primer takvog pristupa nedavno je ušao u klinička ispitivanja [Kotopoulis i sarad, Med Phys., 40(7) (2013)], gde se komercijalni UZ kontrasni agens Sonovue (Bracco Spa.) istovremeno administrira sa gemcitabinom nakon čega sledi UZ zračenje kancera pankreasa.
[0007] Pored pristuupa istovremenog administriranja, postoje tri opšte klase tehnologije sa mikromehurićima istražene za isporuku leka [Geers i saradnici, Journal of Controlled Release 164 (2012) 248-255]: (1) mikromegurići ispunjeni lekom; (2) in situ formirani mikromehurići od nanokapljica; i (3) ciljani mikromehurići (npr. mikromehurići sa ligandima koji su vezani za ciljanje receptora površine ćelije). Tokom godina, međutim, prepoznato je da svi ovi pristupi imaju fundamentalna ograničenja, koja su efektivno ometala prelazak na kliničku praksu. Možda najviše ograničavajuća je količina leka koja se može ugraditi u sisteme mikromehurića. Tanki, stabilizujući omotač ili membrana nosi ograničenu zapreminu dostupnu za punjenje lekom, a procenjeno je da će biti potrebni litri redovnog UZ kontrastnog agensa da bi se dobila terapijska doza za uobičajene hemoterapijske lekove [Geers i saradnici, Journal of Controlled Release 164 (2012) 248-255]. Dodatno, za pričvršćivanje i/ili ugradnju opterećenja lekom u sisteme mikromehurića, može biti potrebna hemijska modifikacija leka, sa potencijalnim promenama biološke aktivnosti.
[0008] Mikromehurići su takođe markeri slobodnog protoka krvi, i čim se aktiviraju da oslobode svoj sadržaj, lek će odmah početi da se ispira krvotokom. Kao što je napomenuto, osnovniji pristup sa mikromehurićima uključuje istovremeno ubrizgavanje sa regularnom formulacijom leka. Iako takav koncept nema ograničenje malog opterećenja lekovima, mikromehurići su veličine mikrona i kao takvi ostaju u vaskularnom prostoru, pa će posledično bioefekti kao što je sonoporacija za olakšavanje poboljšanog unosa biti ograničeni na vaskularni endotel. Pored toga, mikromehurići su mali i obično nisu u kontaktu sa zidovima krvnih sudova, što ograničava veličinu i opseg bioefekta za pojačani unos leka.
[0009] Drugačiji pristup koristi tehnologije sa nano emulzijama. Tehnike akustičnog isparavanja mikrokapljica (ADV - acoustic microdroplet vaporisation) su opisane za brojne primene uključujući isporuku leka i emboloterapiju [Stanley, S. i sarad., Microcirculation 19: 501-509 (2012), Reznik, N., Phys. Med. Biol.57 (2012) 7205-7217]. Ove mikrokapljice su dovoljno male (obično manje od 200 nm) da ekstravaziraju (tumorske) krvne sudove preko efekta poboljšane permeabilnosti i retencije (EPR) i imaju prednost u prevazilaženju kratkog vremena cirkulacije mikromehurića napunjenih lekom. Oni se mogu podstaći da ispare (prelazak faze iz tečnosti u gas, tj. pomeranje faze) in vivo primenom ultrazvučnog zračenja. Međutim, ove nano mikrokapljice imaju nedostatak što zahtevaju veoma visoku akustičnu snagu da bi se olakšao fazni pomak ulja u nano mikrokapljicama u gasovitu fazu i obezbedio gasni mikromehur. U okviru medicinskog UZ, akustična snaga se obično opisuje "mehaničkim indeksom" (MI). Ovaj parametar je definisan kao maksimalni negativan pritisak u ultrazvučnom polju (PNP - peak negative pressure), umanjen za 0.3dB/cm/MHz podeljeno kvadratnim korenom centralne frekvencije ultrazvučnog polja u MHz ( Fc) [Američki institut za ultrazvuk u medicini. Acoustic Output Measurement Standard for Diagnostic Ultrasound Equipment. 1. izd. 2. izd. Laurel, MD: Američki institut za ultrazvuk u medicini; 1998, 2003].
[0010] Regulatorni zahtevi tokom medicinskog snimanja UZ su da se koristi MI manji od 1.9. Tokom UZ snimanja sa kontrastnim agensima u obliku mikromehurića, preporučuje se MI ispod 0.7 da bi se izbegli štetni bioefekti kao što su mikrokrvarenje i ireverzibilno vaskularno oštećenje a korišćenje MI ispod 0.4 se smatra "najboljom praksom" [Miller i saradnici , J Ultrasound Med 2008; 27:611-632, AIUM Consensus Report on Potential Bioeffects of Diagnostic Ultrasound].
[0011] Za ADV, obično, potrebno je primeniti MI > 4 pri 3.5 MHz kako bi se olakšalo efikasno fazno pomeranje ulja, snage koje su znatno iznad regulatornih zahteva za medicinsko ultrazvučno snimanje (MI < 1.9) i daleko iznad preporučenog MI od manje od 0.7, i imaju značajne povezane bioefekte koji postavljaju bezbednosna pitanja za pristup, posebno mikrokrvarenje i nepovratno vaskularno oštećenje. Pored toga, imaju tendenciju da se ponovo kondenzuju u mikrokapljice skoro odmah nakon događaja pomeranja faze; stoga su potencijalni mehanizmi sonoporacije za poboljšanje biodostupnosti leka ograničeni.
[0012] U određenoj meri, ciljani mikromehurići mogu da poboljšaju specifičnost isporuke leka prema ciljanoj patologiji i/ili stepenu bioefekta sonoporacije, ali tehnologija je kompleksna i opet, ograničen uspeh i prelazak na kliničku primenu proizašli su iz ovih napora.
[0013] Alternative pristupima razmatranim iznad, koji su priznati kao stanje tehnike u odnosu na sasdašnji pronalazak su takođe predložene. Imajte na umu da je u kratkom prikazu prethodnog stanja tehnike predstavljenom u nastavku, terminologija korišćena u okviru ovih patenata zadržana. Ovo može malo odstupiti od definicija koje se koriste u sadašnjem pronalasku i detaljnije na stranicama 6 do 7.
[0014] WO 98/17324, "Improvements in or relating to contrast agents", predlaže kombinovani preparat koji sadrži 1) kompoziciju mikromehurića i 2) "difuzibilnu kompoziciju", npr. u obliku emulzije ulje u vodi, sposobnu da difunduje in vivo u kompoziciju mikromehurića, prolazno povećavajući svoju veličinu. Ukratko, ovaj patent podučava da primena ultrazvuka, nakon istovremenog administriranja ove dve kompozicije, aktivira dvofazni (gas/tečnost) sistem sa pratećim faznim pomeranjem difuzibilne komponente iz tečnosti u gas i stvaranjem velikih mehurića sa pomeranjem faze koji se prolazno zarobljavaju u mikrovaskulaturi, i stoga se mogu koristiti kao marker depozita, UZ kontrastni agens. Za kompoziciju koje može da difunduje, patent podučava o primeni ulja koja su suštinski nerastvorljiva i nemešljiva u vodi i koja postoje kao gasovi ili pokazuju značajan pritisak pare na telesnoj temperaturi. WO 98/17324 navodi mogućnost korišćenja predloženog sistema za isporuku leka pričvršćivanjem terapijske komponente na kompoziciju mikromehurića. U prijavi patenta se takođe navodi mogućnost mešanja dve kompozicije pre istovremenog administriranja, ali se navodi da bi smešu tada obično trebalo čuvati na povišenim pritiscima ili sniženim temperaturama kako bi se izbegao spontani rast mikromehurića pre administriranja.
[0015] WO 98/51284, "Novel acoustically active drug delivery systems", predlaže terapijski sistem za isporuku koji sadrži mikromehurić pri čemu mehurić sadrži ulje, surfaktant i terapijski agens rastvoren u sloju ulja. Ukratko, ova prijava patenta uči da primena ultrazvuka, nakon administriranja, će poremetiti mikromehuriće i izazvati lokalizovano oslobađanje njihovog opterećenja lekom. Takođe poučava o poželjnoj primeni ulja sa tačkom topljenja između -20 do 42 °C. Uljna komponenta je predstavljena kao nosač (rastvarač) za terapijski agens i sa dotičnom tačkom topljenja, ova ulja neće služiti kao "difuzibilna komponenta" kao što se podučava u WO 98/17324.
[0016] WO 99/53963, "Improvements in or relating to contrast agents" dalje nadograđuje na pronalazak detaljno opisan u WO 98/17324. Ukratko, ova prijava patenta podučava da se efikasnost preparata tipa koji je stavljen na uvid javnosti u WO 98/17324 može značajno poboljšati ako su dve komponente formulisane tako da mikromehurići i difuzibilne komponente imaju afinitet jedna prema drugoj, npr. kao rezultat privlačnih elektrostatičkih sila. WO 99/53963 takođe navodi mogućnost korišćenja predloženog sistema za isporuku leka vezivanjem terapijske komponente na kompoziciju mikromehurića. Kao i u WO 98/17324 patent navodi mogućnost mešanja dve kompozicije pre istovremenog administriranja, ali navodi da bi smeša tada obično morala da se čuva na povišenim pritiscima ili sniženim temperaturama kako bi se izbegao spontani rast mikromehurića pre administriranja.
[0017] WO 98/17324 i WO 99/53963 dosledno opisuju administriranje (istovremeno, odvojeno ili sekvencijalno) dve različite kompozicije; kompozicije disperznog gasa (mikromehurića) i difuzibilne kompozicije (emulzija mikrokapljica).
[0018] Ni WO 98/17324 ni WO 99/53963 ne opisuju dodavanje terapijskog agensa u difuzibilnu kompoziciju (emulziju mikrokapljica).
[0019] Ni WO 98/17324 ni WO 99/53963 ne opisuju primenu UZ insonacije nakon aktivacije događaja pomeranja faze da bi se olakšala ekstravazacija leka iz vaskularnog odeljka do ciljnog tkiva.
[0020] Dok prethodno citirano stanje tehnike predstavlja potencijalna poboljšanja u odnosu na trenutno istražene tehnologije koje koriste mikromehuriće kao takve, nije došlo do prelaska na kliničku praksu i još uvek postoji jaka potreba za poboljšanim postupkom za isporuku leka posredovanu ultrazvukom.
Definicije
[0021] Pojam 'mikromehurić' ili 'regularni, kontrasni mikromehurić' koristi se u ovom tekstu da opiše mikromehuriće sa prečnikom u opsegu od 0.2 do 10 mikrona, obično sa srednjim prečnikom između 2 do 3 µm. 'Regularni, kontrasni mikromehurići' uključuju komercijalno dostupne agense kao što su Sonazoid<™>(GE Healthcare), Optison<™>(GE Healthcare), Sonovue<™>(Bracco Spa.), Definity<™>(Lantheus Medical Imagin), Micromarker<™>(VisualSonics Inc.) i PolySon L<™>(Miltenyi Biotec GmbH).
[0022] Pojam HEPS/PFB mikromehurić koristi se u ovom trekstu da opiše mikromehuriće formirane rekonstruisanjem 1. komponente (videti primer 1) sa 2 mL vode.
[0023] Pojmovi 'mehurići sa pomeranjem faze', 'veliki, 'mehurići sa pomeranjem faze, 'veliki, aktivirani mehurići i 'aktivirani mehurići' u ovom tekstu se koriste za opisivanje velikih (> 10 µm) mehurića koji se formiraju nakon aktivacije klaster kompozicije izazvane UZ.
[0024] Pojam 'mikrokapljica' se koristi u ovom tekstu da opiše mikrokapljice emulzije sa prečnikom u opsegu od 0.2 do 10 mikrona.
[0025] Pojam 'emulzija' se koristi u ovom tekstu da opiše vodenu suspenziju ili disperziju mikromehurića.
[0026] Pojam 'surfaktant' se u ovom tekstu koristi za hemijska jedinjenja koja smanjuju površinski napon između dve tečnosti, npr. koristi se stabilizator u disperziji mikrokapljica, ili gas i tečnost, npr. koristi se kao stabilizator u disperziji mikromehurića.
[0027] Pojam 'nanočestica' se koristi u ovom tekstu da opiše čestice sa linearnim dimenzijama manjim od 200 nm.
[0028] 'Insonacija' ili 'UZ zračenje' su pojmovi koji se koriste za opisivanje izlaganja ultrazvuku ili tretman sa njim.
[0029] Pojam 'marker deponovanja' se koristi u ovom tekstu u odnosu na aktivirane mehuriće sa pomeranjem faze, u smislu da privremeno mehaničko hvatanje velikih mehurića u mikrocirkulaciji implicira da će regionalno deponovanje mehurića sa pomeranjem faze u tkivu odražavati količinu krvi koja je tekla kroz mikrocirkulaciju tkiva u vreme aktiviranog deponovanja mehurića. Stoga, broj zarobljenih 'deponovanih' mehurića sa faznim pomakom će linearno zavisiti od perfuzije tkiva u vreme deponovanje.
[0030] Pojam 'pomeranje faze (proces)' se koristi u ovom tekstu da opiše fazni prelaz materije iz tečnosti u gasovita stanja. Konkretno prelaz (proces) promene stanja iz tečnog u gasovito uljane komponente mikrokapljica klaster kompozicije.
[0031] Pojam 'dvofazno' odnosi se na sistem koji sadrži dve faze stanja, konkretno tečno i gasoviti stanje, kao što su mikromehurić (gas) i mikrokapljična (tečna) komponenta klaster kompozicije.
[0032] U ovom tekstu za pojmove "terapijska isporuka / terapijski agens(i)" i " isporuka leka / lek(ovi)" podrazumeva se da oba obuhvataju isporuku molekula lekova, nanočestice i sisteme za isporuku nanočestica, gene, i radioizotope.
[0033] Pojam '1. komponenta' se koristi u ovom tekstu da opiše komponentu dispegrovanog gasa (mikromehurića).
[0034] Pojam '2. komponenta' se koristi u ovom tekstu da opiše komponentu dispergovane uljane faze (mikrokapljica) koja sadrži difuzibilnu komponentu.
[0035] Pojam 'kluster kompozicija' se koristi u ovom tekstu da opiše kompoziciju dobijenu iz kombinacije 1. komponente (mikromehurić) i 2. komponente (mikrokapljica).
[0036] Pojam "difuzibilna komponenta" se koristi u ovom tekstu da opiše hemijsku komponentu uljanje faze druge komponente koja je sposobna za difuziju in vivo u mikromehuriće u 1. komponenti, prolazno povećavajući svoju veličinu.
[0037] Pojam 'kapacitet punjenja' se koristi u ovom tekstu da opiše količinu (kapacitet) leka koji se može ugraditi u sredstvo za isporuku leka.
[0038] Pojam "farmaceutska kompozicija" korišćen u ovom tekstu ima svoje uobičajeno značenje, a posebno su u obliku pogodnom za administriranje kod sisara, posebno putem parenteralne injekcije. Pod izrazom "u obliku pogodnom za administriranje kod sisara" podrazumeva se kompozicija koja je sterilna, bez pirogena, nema jedinjenja koja proizvode prekomerne toksične ili štetne efekte, i formulisana je na biokompatibilnom pH (približno pH 4.0 do 10.5). Takva kompozicija je formulisana tako da ne dolazi do taloženja u kontaktu sa biološkim tečnostima (npr. krvlju), sadrži samo biološki kompatibilne ekscipijense i poželjno je izotonična.
[0039] Pojam 'sonometrija (sistem)' u ovom tekstu odnosi se na sistem za merenje kako bi se dimenzionisali i prebrojali aktivirani mehurići sa pomakom faze dinamički korišćenjem akustične tehnike.
[0040] Pojam 'reaktivnost' se koristi u ovom tekstu da opiše sposobnost mikromehurića u 1. komponenti i mikrokapljica u 2. komponenti da formiraju klastere mikromehurić/mikrokapljica nakon mešanja.
[0041] Pojmovi 'klaster mikromehurić/mikrokapljica " ili "klaster" u ovom tekstu odnosi se na grupe mikromehurića i mikrokapljica koje se trajno drže zajedno elektrostatičkim privlačnim silama, u jednoj čestici, aglomerisanom entitetu.
[0042] Pojam 'klastering' u ovom tekstu se odnosi na proces gde mikromehurići u 1. komponenti i mikrokapljice u 2. komponente formiraju klastere.
[0043] Pojam 'aktivacija' u ovom tekstu se odnosi na indukciju faznog pomeranja klastera mikromehurić/mikrokapljica UZ zračenjem.
Skraćenice
[0044]
Hd: Hansen-ovo rastojanje.
ADV: Akustično isparavanje mikrokapljica (Acoustic microdroplet vaporization) ANOVA: analiza varijanse
a.u.: proizvoljne jedinice (arbitrary units)
t.k:. tačka ključanja (boiling point).
b.w.: telesna masa (body weight)
C: kružnost
C1: 1. komponenta
C2: 2. komponenta
dCldFEt: dihlorodifluoroetan.
CltFPr: hlorotrifluropropan.
COO: kontinuirani minutni volumen srca (continuous cardiac output).
CV: unakresna validacija (cross validation).
dB: decibel.
dCIMe: dihlorometan.
DiR: bliska infracrvena fluorescentna boja.
DP: klaster kompozicija ili farmaceutska kompozicija
DSPC: 1,2-distearoil-sn-glicerol-3-fosfoholin.
npr.: na primer
FPIA: Analiza slike protoka čestica (Flow Particle Image Analysis).
HEPS: hidrogenizovano natrijum-fosfatidil serin iz jajeta.
HIFU: fokusirani ultrazvuk visokog intenziteta.
i.v: intravenski.
LogP: logaritam (na osnovu 10) koeficijenta podele (oktanol/voda), mera lipofilnosti. LogS: logaritam (na osnovu 10) rastvorljivosti u vodi u gr/100 mL
M: molarni
MI: MI.
NA: nije primenljivo.
NR: nile red fluorescentna boja.
PBS: rastvor soli u vodi puferovan fosfatom.
PCA: analiza glavnih komponenti (principal component analysis)
PFB: perflurobutan.
pFMCP: perfluorometil-ciklopentan
PLSR:delimična regresija najmanjih kvadrata (partial least squares regression).
QC: kontrola kvaliteta (quality control).
R: Reaktivnost klaster kompozicije.
SA: stearilamin
tCIMe: trihlorometan.
TIC: kriva intenziteta vremena (time intensity curve)
TRIS: 2-amino-2-hidroksimetil-propan-1,3-diol.
UZ: Ultrazvuk
v.p:. pritisak pare (vapour pressure).
v/v: zapremina po zapremini.
~: približno.
Suština pronalaska
[0045] Sadašnji pronalazači su iznenađujuće otkrili da se isporuka leka može postići korišćenjem dvokomponentnog, dvofaznog sistema formulacije mikromehurić/mikrokapljica gde su mikromehurići u prvoj komponenti, putem elektrostatičke privlačnosti, fizički vezani za mikrokapljice emulzije veličine mikrona u drugoj komponenta pre administriranja. Suprotno učenjima u WO 99/53963 otkrili smo da je mešanje prve komponente sa drugom komponentom pre administiranja preduslov za efikasno formiranje takvih klastera mikromehurića/mikrokapljica i da klaster kompozicija može biti stabilna u uslovima okoline. Klasteri se lako aktiviraju in-vivo ultrazvukom male snage (tj. sa MI manjim od 1.9, poželjno manjim od 0.7 i najpoželjnije manjim od 0.4), koji indukuju prelaz tečnost-u-gas (pomeranje faze) difuzibilne komponente. Terapijski agens se može dodati u uljnu fazu mikrokapljica i/ili istovremeno administirati kao obična formulacija leka. Veliki, aktivirani mehurići se privremeno zadržavaju u mikrovaskulaturi i mogu se koristiti za olakšavanje preuzimanje leka u ciljno tkivo daljom primenom ultrazvuka.
[0046] Tehnologija isporuke leka predmetnog pronalaska značajno se razlikuje od postojećih tehnologija za isporuku leka posredovanih ultrazvukom i stanja tehnike navedeno gore. Glavna poboljšanja/elementi noviteta u odnosu na standardne pristupe sa mikromehurićima su:
• Značajno povećanje kapaciteta punjenja lekom gde se cela zapremina velike (veličine mikrona) mikrokapljice emulzije može iskoristiti za sadržaj leka u odnosu na samo tanku stabilizujuću membranu komponente mikromehurića za pristupe iz stanja tehnike.
• Veličina aktiviranih mehurića sa faznim pomakom je približno 10 puta veća od tipičnih mikromehurića: zarobljavanje aktiviranih mehurića u mikrovaskulaturi: prolazno zaustavljanje krvotoka, izbegavanje brzog ispiranja leka: blizak kontakt između aktiviranih mehurića i endotela: redovi veličine većeg bio-efekta tokom postaktivacionog UZ tretmana, izbegavanje mehanizama kavitacije.
[0047] Glavna poboljšanja/novi elementi prema pristupu akustičnog isparavanja mikrokapljica (ADV) su:
• Potrebna je znatno niža akustična snaga da bi se proizveo događaj pomeranja faze; obično je potreban MI od 0.2 do 0.4 za sadašnji pronalazak u odnosu na tipično > 4 za ADV. • Značajno duži životni vek aktiviranih mehurića, bez brzog ponovnog kondenzovanja; • Aktivacija u vaskularnom delu naspram aktivacije u tkivu.
• Veličina aktiviranih mehurića sa faznim pomakom je približno 10 puta veća od tipičnih mikromehurića iz ADV-a: zarobljavanje aktiviranih mehurića, izbegavanje brzog ispiranja leka: blizak kontakt između aktiviranih mehurića i endotela: redovi veličine većeg bioefekta tokom postaktivacionog UZ tretmana, izbegavanje mehanizama kavitacije.
[0048] Glavna poboljšanja/elementi novine naspram pristupa faznog pomeranja opisanih u WO 98/1732 i WO 99/53963 su:
• Formiranje stabilnih klastera mikromehurića/mikrokapljica u jednoj, kombinovanoj klaster kompoziciji pre administriranja, sa sledećim ~ 10-strukim povećanjem kapaciteta depozita. • Značajno povećanje kapaciteta punjenja lekom gde se cela zapremina velike (veličine mikrona) mikrokapljice emulzije može iskoristiti za sadržaj leka u odnosu na samo tanku stabilizujuću membranu komponente mikromehurića.
• Kontinuirano administriranje akustične energije, posle aktivacije, da bi se olakšala isporuka leka.
[0049] Klaster kompozicija, farmaceutska kompozicija za isporuku lekova i postupak za isporuku je sada identifikovano da koristi tehnologiju pomeranja faze prema sadašnjem pronalasku za generisanje velikih mehurića sa faznim pomakom in vivo iz administrirane kompozicije koja sadrži klastere mikromehurića/mikrokapljica, i koja olakšava isporuku pre-, i/ili ko- i/ili post terapijskog(ih) agensa(asa) administriranih pre, i/ili istovremeno i/ili posle.
[0050] Pronalazak je iznet u priloženim patentnim zahtevima.
Detaljan opis pronalaska
[0051] U prvom aspektu, pronalazak obezbeđuje kompoziciju klastera koja sadrži suspenziju klastera u vodenom biokompatibilnom medijumu, pri čemu pomenuti klasteri imaju prečnik u opsegu od 1 do 10 µm, i kružnost < 0.9 i sadrže:
(i) prvu komponenta koja sadrži gasni mikromehurić i prvi stabilizator za stabilizaciju navedenog mikromehurića, pri čemu gas gasnog mikromehurića sadrži sumpor heksafluorid, C3-6perfluorougljenik, azot, vazduh ili njihove smeše; i
(ii) drugu komponentu koja sadrži mikrokapljicu koja sadrži uljnu fazu i drugi stabilizator za stabilizaciju navedene mikrokapljice, pri čemu ulje sadrži difuzibilnu komponentu koja je sposobna da difunduje u navedeni gasni mikromehurić tako da barem privremeno poveća njegovu veličinu, i pri čemu uljna faza sadrži delimično ili potpuno halogenizovani ugljovodonik ili njihovu smešu;
pri čemu mikromehurići i mikrokapljice navedene prve i druge komponente imaju suprotna površinska naelektrisanja i formiraju navedene klastere putem atraktivnih elektrostatičkih interakcija,
pri čemu svaki prvi stabilizator i drugi stabilizator imaju neto elektrostatičko naelektrisanje koji je suprotan onom drugog, i
pri čemu prvi stabilizator i drugi stabilizator svaki nezavisno sadrži fosfolipid, protein ili polimer.
[0052] Kompozicija klastera, odnosno kombinacija prve i druge komponente, sadrži klastere mikromehurića gasa i mikrokapljica ulja, tj. suspenzija je ili disperzija pojedinačnih mikromehurića i mikrokapljica zajedno sa stabilnim klasterima mikromehurića/mikrokapljica. Kompozicija klastera je namenjena za administriranje (npr. intravenozno) subjektu sisaru. Analitičke metodologije za kvantitativnu detekciju i karakterizaciju navedenih klastera su opisane u primeru 1.
[0053] U ovom tekstu, pojam "klasteri" se odnosi na grupe mikromehurića i mikrokapljica koje se trajno drže zajedno elektrostatičkim privlačnim silama, u jednoj čestici, aglomeriranoj celini. Sadržaj i veličina klastera u kompoziciji klastera su suštinski stabilni tokom nekog vremena (npr. > 1h) nakon kombinovanja prve i druge komponente in vitro, tj. ne dezintegrišu se spontano, ne formiraju veće agregate ili se aktiviraju (fazni pomaci) spontano, i suštinski su stabilni tokom nekog vremena nakon razblaživanja, čak i tokom kontinuirane agitacije. Stoga je moguće otkriti i okarakterisati klastere u kompoziciji klastera različitim analitičkim tehnikama koje zahtevaju razblaživanje i/ili agitaciju.
[0054] Klasteri obično sadrže najmanje jedan mikromehurić i jednu mikrokapljicu, tipično 2-50 pojedinačnih mikromehurića/mikrokapljica, tipično su prečnika 1 do 10 µm u prečniku i stoga mogu slobodno teći u vaskulaturi. Oni su dalje okarakterisani i odvojeni od pojedinačnih mikromehurića i mikrokapljica parametrom kružnosti. Kružnost dvodimenzionalnog oblika (npr. projekcije mikromehurića, mikrokapljice ili klastera mikromehurića/mikrokapljica) je odnos obima kruga iste površine kao i oblik, podeljen stvarnim obimom oblika. Koristi se nekoliko matematičkih algoritama za izračunavanje i izveštavanje o kružnosti. Normalno, da bi se obezbedio odgovor koji je osetljiv na mala odstupanja od savršenog kružnog oblika, izračunava se i izveštava o kružnosti na kvadrat (takođe pod nazivom 'kružnost visoke osetljivosti'). Ovaj pojam (C) ima svoje konvencionalno značenje u oblasti analize slike [Wojnar, L. i sarad., Practical Guide to Image Analysis, ASM International, 2000, str 157-160] i predstavlja matematičku definiciju zaobljenosti u dve dimenzije izražene kao:
[0055] Gde je A dvodimenzionalna, projekcijska površina oblika a P je dvodimenzionalni, projekcijski obim forme. Shodno tome, savršeni krug (tj. dvodimenzionalna projekcija sfernog mikromehurića ili mikrokapljice) ima teorijsku vrednost kružnosti 1, a bilo koji drugi geometrijski oblik (npr. projekcija klastera) ima kružnost manju od 1. U sadašnjem tekstu, koristi se kružnost (C) kako je gore definisano.
[0056] Kao što je navedeno, suprotno učenjima u WO 99/53963, aktuelni pronalazači su otkrili da je mešanje prve komponente sa drugom komponentom pre administriranja preduslov za efikasno formiranje takvih klastera mikromehurića/mikrokapljica i da kompozicija klastera može biti stabilna u uslovima okoline. Pored toga, pronalazači su otkrili da je klasterizovani oblik mikromehurića i mikrokapljica u kompoziciji klastera koji omogućava efikasnu aktivaciju (pomeranje faze) i depoziciju aktiviranih mehurića in vivo u vaskulaturi. Kao što je detaljno opisano u primerima 1 i 2, takođe smo otkrili da različitim aspekatima inženjeringa klastera pronalaska, njihove koncentracije i veličine posebno; može se postići ~10 puta povećanje depozita i kapaciteta isporuke leka, u poređenju sa simultanim istovremenim administrairanjem dve odvojene komponente mikromehurića i mikrokapljica.
[0057] U skladu sa pronalaskom, klasteri u opsegu veličine 1-10 µm definisani kružnošću od < 0.9 smatraju se posebno korisnim, kao što je pokazano u primerima 2 i 5-1. Klasteri u ovom opsegu veličina slobodno teku u vaskulaturi pre aktivacije, lako se aktiviraju UZ zračenjem i proizvode aktivirane mehuriće koji su dovoljno veliki da se deponuju i privremeno zadrže u mikrovaskulaturi.
[0058] Utvrđeno je da prisustvo mikromehurića u klasterima omogućava efikasan prenos energije ultrazvučne energije u opsegu dijagnostičkih frekvencija (1-10 MHz), tj. aktivaciju, i omogućava isparavanje (fazni pomak) mikrokapljica emulzije pri niskom MI (ispod 1.9 i poželjno ispod 0.7 i poželjnije ispod 0.4) i difuziju isparene tečnosti u mikromehuriće i/ili fuziju između mehurića pare i mikromehurića. Aktivirani mehurić se zatim širi dalje od unutrašnje difuzije matriksnih gasova (npr. gasova krvi) da bi dostigao prečnik veći od 10 µm, poželjno veći od 20 µm. Za tačni mehanizmi uključeni tokom aktivacije klastera i generisanja mehurića sa faznim pomakom potrebno je dalje istraživanje i razjašnjenje.
[0059] Dalje je pronađeno da je formiranje klastera teze preduslov za efikasan događaj pomeranja faze i da su njihov broj i karakteristike veličine snažno povezane sa efikasnošću kompozicije, tj. njegovom sposobnošću da formira velike, aktivirane (tj. fazno pomerene) mehurići in-vivo. Broj i karakteristike veličine mogu se kontrolisati kroz različite parametre formulacije kao što su, ali ne ograničavajući se na; jačina privlačnih sila između mikromehurića u prvoj komponenti i mikrokapljica u drugoj komponenti (npr. razlika u površinskom naelektrisanju između mikromehurići i mikrokapljice): raspodela veličine mikromehurića i mikrokapljica: odnos između mikromehurića i mikrokapljica: i sastav vodenog matriksa (npr. koncentracija pufera, jonska snaga) (videti primere 1 i 2).
[0060] Veličina aktiviranih mehurića se može proizvesti inženjeringom variranjem raspodele veličine mikrokapljica u emulziji i karakteristika veličine klastera (videti primer 1). Klasteri se aktiviraju da proizvode velike mehuriće primenom spoljašnje ultrazvučne energije, kao što je klinički ultrazvučni sistem za snimanje, pod kontrolom slike. Proizvedeni veliki mehurići sa faznim pomakom su tipično prečnika 10 µm ili više (videti primere 1, 2, 3 i 4). Niski nivoi MI energije, koji su dobro u granicama izloženosti dijagnostičkim slikama (MI < 1.9), dovoljni su da aktiviraju klastere koji čine tehnologiju značajno različitom od drugih dostupnih tehnologija faznog prelaza (npr. ADV).
[0061] Usled velike veličine aktiviranih mehurića, oni se privremeno zadržavaju u mikrovaskulaturi i mogu se prostorno lokalizovati u tkivu ili organu od interesa prostorno lokalizovanim deponovanjem ultrazvučne energije da bi se aktivirali klasteri (videti primere 4 i 7). Proizvedeni veliki, aktivirani mehurići (10 µm ili više u prečniku) imaju akustične rezonancije na niskoj frekvenciji ultrazvuka (1 MHz ili manje). Utvrđeno je se da primena ultrazvuka niske frekvencije, blizu rezonantne frekvencije velikih, aktiviranih mehurića (tj. komponente frekvencije u opsegu od 0.05 do 2 MHz, poželjno u opsegu 0.1 do 1.5 MHz, najpoželjnije u opsegu od 0.2 do 1 MHz), može koristiti za proizvodnju mehaničkih i/ili termičkih mehanizama bioefekta da bi se povećala lokalna permeabilnost vaskulature i/ili sonoporacije i /ili endocitoza i time povećava isporuku i zadržavanje lekova (videti primer 8).
[0062] Ceniće se da će se mehanizmi isporuke tokom ovog UZ zračenja značajno razlikovati od onih indukovanih kada se UZ primenjuje na redovne mikromehuriće sa slobodnim protokom, kao što su kontrastni agensi za UZ slikanje. Dok su veliki mikromehurići sa fazim pomakom zarobljeni u segmentu sudova a površina mikromehurića je u bliskom kontaktu sa endotelom, mikromehurići veličine mikrona slobodno teku i (u proseku) su relativno udaljeni od zida suda (videti primer 4). Pored toga, zapremina aktiviranog mehurića iz sadašnjeg pronalaska je tipično 1000 puta one običnog mikromehurića. Pri jednakom MI, insoniranom na frekvenciji bliskoj rezonanciji za oba tipa mehurića (0.5 MHz za mikromehuriće sa faznim pomakom i 5 MHz za mikromehuriće redovnog kontrastnog agensa) pokazalo se da je apsolutni pomeraj zapremine tokom oscilacija skoro tri reda veličine veći sa mehurićima sa faznim pomakom nego sa redovnim kontrastnim mikromehurićem. Dakle, insonacija mehurića sa faznim pomakom će proizvesti potpuno različite nivoe biomehaničkih efekata, sa znatno većom veličinom efekta i dubinom penetracije nego tokom insoniranja regularnih kontrastnih mikromehurića. Bioefekti koji se primećuju kod regularnih kontrastnih mikromehurića koji slobodno teku verovatno zavise od mehanizama kavitacije, što dovodi do bezbednosnih problema kao što su mikrokrvarenje i ireverzibilno vaskularno oštećenje. Veći mehurići sa faznim pomakom mogu da osciluju na mekši način (niži MI, npr. < 0.4), izbegavajući mehanizme kavitacije, ali i dalje izazivajući dovoljan mehanički rad da bi se pojačalo preuzimanje leka iz vaskulature u ciljno tkivo (videti primer 8).
[0063] Zarobljavanje velikih mehurića sa faznim pomakom takođe će delovati kao marker depozita. Ovo dalje omogućava kvantifikaciju broja aktiviranih klastera i perfuzije tkiva, i omogućava snimanje vaskulature tkiva kontrastnim agensom kako bi se identifikovao prostorni obim patologije koja se leči (videti primer 7).
[0064] Kompozicija klastera, tj. koja sadrži kombinaciju prve i druge komponente, sastoji se od dvofaznog sistema mikro čestica proizvedenih inženjeringom za klaster i fazni pomak na kontrolisan način. Lek se može ugraditi u mikrokapljice ulja veličine mikrona druge komponente niske tačke ključanja, koje se stabilizuju npr. sa pozitivno naelektrisanom fosfolipidnom membranom. Pre administriranja, mikrokapljice ulja druge komponente koje su napunjene lekom se mešaju sa mikromehurićima gasa veličine mikrona u prvoj komponenti. Takvi gasni mikromehurići mogu da se sastoje od, na primer ali ne ograničavajući se na, gasnog jezgra perfluorougljenika niske rastvorljivosti stabilizovanog negativno naelektrisanom fosfolipidnom membranom.
[0065] Kada je izložen ultrazvuku (standardna učestalost i intenzitet medicinskog snimanja) na ciljanoj patologiji, mikromehurić prenosi akustičnu energiju na vezane mikrokapljice ulja i deluje kao 'seme' za ulje koje prolazi kroz fazni pomak iz tečnosti u gas (isparavanje). Tokom ovog procesa bilo kakav sadržaj leka se oslobađa iz uljne faze ili se ispoljava na površini aktiviranog mehurića. Dobijeni mehur se podvrgava početnoj brzoj ekspanziji usled isparavanja ulja, nakon čega sledi sporije širenje usled unutrašnje difuzije gasova krvi, do prečnika najmanje 10 µm ili više, poželjno najmanje 20 µm u prečniku ili više, i privremeno blokira mikrocirkulaciju (mrežu arteriola i kapilara), prolazno zaustavljajući protok krvi na približno 1 minut ili više, poželjno 2-3 minuta ili više, najpoželjnije 3-6 minuta ili više, održavanjući oslobođeni ili ispoljeni lek u visokoj koncentraciji i neposredno u blizini ciljne patologije (videti primere 4 i 7).
[0066] Alternativno, ako terapijski agerns nije ugrađen u uljnu fazu mikrokapljice emulzije, terapijski agens se može administrirati odvojeno, kao što je istovremeno administrirati ili administrirati pre ili administrirati posle sa kompozicijom klastera. U ovom slučaju, terapijski agens se može administrirati u bilo kom pogodnom za uključujući, ali ne ograničavajući se na, injekcijske ili oralne oblike, npr. kao obična formulacija leka, npr. taksol, gemzar ili druga plasirana hemoterapijska sredstva. Alternativno, terapijski agens može biti uključen i u uljnu fazu i administriran kao posebna kompozicija. Aktivacija tehnologije pomeranja faze proizvodi velike mehuriće sa faznim pomakom koji su zarobljeni na mestu od interesa privremeno zaustavljajući protok krvi koji sadrži odvojeno administrirani terapijski agens. Dalja primena ultrazvuka nakon zarobljavanja olakšava ekstravazaciju leka u ciljano tkivo.
[0067] Prva komponenta predmetnog pronalaska sadrži mikromehuriće koji su slični konvencionalnim ultrazvučnim kontrastnim agensima koji su na tržištu i odobreni za primenu za nekoliko kliničkih primena kao što su Sonazoid<™>, Optison<™>, Definity<™>ili Sonovue<™>, ili slični agensi korišćeni za predkliničke primene kao što su Micromarker<™>i PolySon L<™>. Prva komponenta je vodeni medijum za injektiranje koji sadrži dispergovani gas i materijal za stabilizaciju navedenog gasa. Bilo koji biokompatibilan gas može u principu biti prisutan u gasnoj disperziji, pojam "gas" kako se ovde koristi uključujući sve supstance (uključujući smeše) barem delimično, npr. uglavnom ili potpuno u gasovitom (uključujući paru) obliku na normalnoj temperaturi ljudskog tela od 37 °C. U pronalasku za koji se traži zaštita gas gasnog mikromehurića sadrži sumpor heksafluorid, C3-6perfluorougljenik, azot, vazduh ili njihove smeše.
[0068] Sledeći odeljak stavlja na uvid javnosti gasove koji prema tome mogu biti testirani, na primer vazduh; azot; kiseonik; ugljen dioksid; vodonik; inertan gas kao što je helijum, argon, ksenon ili kripton; sumpor fluorid kao što je sumpor heksafluorid, disumpor dekafluorid ili trifluorometilsumpor pentafluorid; selenijum heksafluorie; po izboru halogenizovani silan kao što je metilsilan ili dimetilsilan; ugljovodonik male molekulske težine (npr. koji sadrži do 7 atoma ugljenika), na primer alkan kao što je metan, etan, propan, butan ili pentan, cikloalkan kao što je ciklopropan, ciklobutan ili ciklopentan, alken kao što je etilen, propen, propadien ili buten, ili alkin kao što je acetilen ili propin; etar kao što je dimetil etar; keton; estar; halogenizovani ugljovodonik male molekulske mase (npr. koji sadrži do 7 atoma ugljenika); ili mešavina bilo čega od prethodno navedenog. Povoljno je da su barem neki od atoma halogena u halogenizovanim gasovima atomi fluora; stoga biološki kompatibilni halogenizovani ugljovodonični gasovi mogu, na primer, biti odabrani od bromohlorodifluorometana, hlorodifluorometana, dihlorodifluorometana, bromotrifluorometana, hlorotrifluorometana, hloropentafluoroetana, dihlorotetrafluoroetana, hlorotrifluoroetilena, fluoroetilena, etilfluorida, 1,1-difluoroetana i perfluorougljenika. Perfluorougljenici uzeti kao primer uključuju perfluoroalkane kao što su perfluorometan, perfluoroetan, perfluorpropani, perfluorobutani (npr. perfluoro-n-butan, po izboru u smeši sa drugim izomerima kao što je perfluor-izo-butan), perfluorpentani, perfluoroheksani ili perfluoroheptani; perfluoroalkeni kao što su perfluoropropen, perfluorobuteni (npr. perfluorobut-2-en), perfluorobutadien, perfluoropenteni (npr. perfluoropen-1-en) ili perfluoro-4-metilpent-2-en; perfluoroalkini kao što je perfluorobut-2-in; i perfluorocikloalkani kao što su perfluorociklobutan, perfluorometilciklobutan, perfluorodimetilciklobutan, perfluorotrimetil-ciklobutan, perfluorociklopentan, perfluorometil-ciklopentan, perfluorodimetilciklopentan, perfluorocikloheksan, perfluorometilcikloheksan ili perfluorometilcikloheksan. Ostali halogenizovani gasovi uključuju metil hlorid, fluorovane (npr. perfluorisane) ketone kao što je perfluoraceton i fluorovane (npr. perfluorisane) etre kao što je perfluorodietil etar.
[0069] Primena perfluorovanih gasova, na primer sumpor heksafluorida i perfluorougljenika, kao što su perfluorpropan, perfluorobutani, perfluorpentani i perfluoroheksani, ima posebnu prednost s obzirom na priznatu visoku stabilnost u krvotoku mikromehurića koji sadrže takve gasove. Drugi gasovi sa fizičko-hemijskim karakteristikama zbog kojih formiraju visoko stabilne mikromehuriće u krvotoku mogu takođe biti korisni. Najpoželjnije, dispergovani gas sadrži sumpor heksafluorid, perfluoropropan, perfluorobutan, perfluoropentan, perfluroheksan, azot, vazduh, ili njihovu mešavinu.
[0070] Dispergovani gas može biti u bilo kom prikladnom obliku, na primer korišćenjem bilo koje odgovarajuće formulacije ultrazvučnog kontrastnog agensa koji sadrži gas kao komponentu koja sadrži gas kao što je Sonazoid, Optison, Sonovue ili Definiti ili pretkliničke agense kao što su Micromarker ili PolySon L. Prva komponenta će takođe sadržati materijal za stabilizaciju disperzije mikromehurića, u ovom tekstu nazvan 'prvi stabilizator'. Reprezentativni primeri takvih formulacija uključuju mikromehuriće gasa stabilizovanog (npr. bar delimično inkapsuliran) prvim stabilizatorom kao što je površinska membrana otporna na koalescenciju (na primer želatin), filmogenim proteinom (na primer albuminom kao što je humani serum albumin), polimernim materijalom (na primer sintetički biorazgradivi polimer, elastična međufazna sintetička polimerna membrana, biorazgradivi polialdehid u obliku mikročestica, derivat N-dikarboksilne kiseline u obliku mikročesticama poliamino kiseline - policikličnog imida), nepolimerni i nepolimerizujući materijal za formiranje zidova, ili surfaktant (na primer polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimer surfaktant kao što je Pluronic, polimerni surfaktant, ili surfaktant koji stvara film kao što je fosfolipid). Poželjno, dispergovani gas je u obliku gasnih mikromehurića stabilizovanih fosfolipidom, proteinom ili polimerom. U pronalasku za koji se traži zaštita, prvi stabilizator sadrži fosfolipid, protein, ili polimer. Posebno korisni surfaktanti uključuju fosfolipide koji sadrže molekule sa ukupnim neto negativnim naelektrisanjem, kao što su prirodni (npr. dobijeni iz soje ili žumanca), polusintetički (npr. delimično ili potpuno hidrogenizovani) i sintetički fosfatidilserini, fosfatidilgliceroli, fosfatidilinozitoli, fosfatidne kiseline i/ili kardiolipini. Alternativno fosfolipidi koji se primenjuju za stabilizaciju mogu da nose i ukupno neutralno naelektrisanje i da im se doda negativni surfaktant kao što je masna kiselina, npr. palmitinska kiselina kojoj je dodat fosfatidilholin, ili biti mešavina različito naelektrisanih fosfolipida, npr. fosfatidiletanolamini i/ili fosfatidilholin i/ili fosfatidna kiselina.
[0071] Veličina mikromehurića komponente dispergovanog gasa namenjene za intravensku injekciju treba poželjno biti manja od 7 µm, poželjnije manja od 5 µm i najpoželjnije manja od 3 µm kako bi se omogućio nesmetan prolaz kroz plućni sistem, čak i kada je u klasteru mikromehurić/mikrokapljica.
[0072] Za drugu komponentu, "difuzibilna komponenta" je pogodno gas/para, isparljiva tečnost, isparljiva čvrsta supstanca ili njihov prekursor sposoban za stvaranje gasa, npr. nakon administriranja, pri čemu je glavni zahtev da komponenta ili treba da ima ili da bude sposobna da generiše dovoljan pritisak gasa ili pare in vivo (npr. najmanje 50 tora i poželjno veći od 100 tora) kako bi bila sposobna da podstakne unutrašnju difuziju gasa ili molekule pare u dispergovan gas. 'Difuzibilna komponenta' je poželjno formulisana kao emulzija (tj. stabilizovana suspenzija) mikrokapljica u odgovarajućem vodenom medijumu, pošto će u takvim sistemima pritisak pare u vodenoj fazi difuzibilne komponente biti suštinski jednak onom od čistog materijala komponente, čak i u veoma razblaženim emulzijama.
[0073] Difuzibilna komponenta u takvim mikrokapljicama je poželjno tečnost na temperaturi obrade i skladištenja, koja na primer može biti niska kao -10°C ukoliko vodena faza sadrži odgovarajući materijal protiv smrzavanja, dok je gas ili pokazuje značajan pritisak pare na telesnoj temperaturi. U pronalasku za koji se traži zaštita, mikrokapljica sadrži uljnu fazu, pri čemu uljna faza sadrži delimično ili potpuno halogenizovan ugljovodonik ili njihovu smešu, kao što su halogenizovani ugljovodonici male molekulske mase (npr. koji sadrži do 7 atoma ugljenika). Reprezentativni halogenizovani ugljovodonici uključuju dihlorometan, metil bromid, 1,2-dihloroetilen, 1,1-dihloroetan, 1-bromoetilen, 1-hloroetilen, etil bromid, etil hlorid, 1-hloropropen, 3-hloropropen, 1-hloropropan, 2-hloropropan i t-butil hlorid. Povoljno je da su bar neki od atoma halogena atomi fluora, na primer kao u dihlorofluorometanu, trihlorofluorometanu, 1,2-dihloro-1,2-difluoroetanu, 1,2-dihloro-1,1,2,2-tetrafluoroetanu, 1,1,2-trihloro-1,2,2-trifluoroetanu, 2bromo-2-hloro-1,1,1-trifluoroetanu, 2-hloro-1,1,2-trifluoroetil difluorometil etru, 1-hloro-2,2,2-trifluoroetil difluorometil etru, delimično fluorovani alkani (npr. pentafluorpropani kao što su 1H,1H,3H-pentafluoropropan, heksafluorobutani, nenafluorobutani kao što je 2H-nonafluoro-tbutan, i dekafluoropentani kao što je 2H,3H-dekafluoropentan), delimično fluorovani alkeni (npr. heptafluoropenteni kao što je 1H,1H,2H-heptafluoropen-1-en, i nenafluorohekseni kao što je 1H,1H,2H-nonafluoroheks-1-en), fluorovani etri (npr. 2,3,3,3,3-pentafluoropropil metil etar ili 2,2,3,3,3-pentafluoropropil difluorometil etar) i, poželjnije, perfluorougljenici. Primeri perfluorougljenika uključuju perfluoroalkane kao što su perfluorobutani, perfluoropentani, perfluoroheksani (npr. perfluoro-2-metilpentan), perfluoroheptani, perfluorooktani, perfluorononani i perfluorodekani; perfluorocikloalkani kao što su perfluorociklobutan, perfluorodimetil-ciklobutani, perfluorociklopentan i perfluorometilciklopentan; perfluoroalkeni kao što su perfluorobuteni (npr. perfluorobut-2-en ili perfluorobuta-1,3-dien), perfluoropenteni (npr. perfluoropent-1-en) i perfluorohekseni (npr. perfluoro-2-metilpent-2-en ili perfluoro-4-metilpent 2-en); perfluorocikloalkeni kao što su perfluorociklopenten ili perfluorociklopentadien; i perfluorovani alkoholi kao je perfluoro-t-butanol.
[0074] Posebno korisne u sadašnjem pronalasku su difuzibilne komponente sa rastvorljivošću u vodi ispod 1·10<-4>M, poželjnije ispod 1·10<-5>M (videti primer 5-3). Međutim, treba napomenuti da ako se koristi mešavina difuzibilnih komponenti i/ili korastvarača, značajni udeo smeše može da sadrži jedinjenja sa većom rastvorljivošću u vodi (videti primer 5-4).
[0075] Biće cenjeno da se smeše dve ili više difuzibilnih komponenti, ako se želi, mogu koristiti u skladu sa pronalaskom; pozivanje ovde na "difuzibilnu komponentu" treba tumačiti kao da uključuju takve smeše. Takođe će biti cenjeno da lekovi mogu biti ugrađeni u difuzibilnu(e) komponentu(e) i da se korastvarači, opisani u tekstu ispod, takođe mogu koristiti da bi se povećao kapacitet sistema za punjenje lekom.
[0076] Druga komponenta će takođe sadržati materijal da bi se stabilizovala disperzija mikrokapljica, u ovom tekstu nazvana ’drugi stabilizator’. Drugi stabilizator može biti isti ili različit od bilo kojeg(ih) materijala koji se koristi(e) da se stabilizuje disperzija gasa, npr. surfaktant, polimer ili protein. U pronalasku za koji se zahteva zaštita, prvi stabilizator i drugi stabilizator svaki nezavisno sadrži fosfolipid, protein ili polimer. Priroda svakog takvog materijala može značajno uticati na faktore kao što je brzina rasta dispergovane gasne faze. Generalno, širok spektar surfaktanata može biti koristan, na primer masne kiseline (npr. zasićene ili nezasićene masne kiseline ravnog lanca, na primer koje sadrže 10-20 atoma ugljenika) i njihovi estri ugljenih hidrata i triglicerida, koji su tehnička rešenja koja nisu obuhvaćena pronalaskom za koji se zahteva zaštita, ili fosfolipidi (npr. lecitin), fosfolipidi koji sadrže fluor, proteini (npr. albumini kao što je humani serum albumin), polietilen glikoli, i polimeri kao što su blok kopolimer surfaktanti (npr. polioksietilen-polioksipropilen blok kopolimeri kao što je Pluronics, produženi polimeri kao što su aciloksiacil polietilen glikoli, na primer polietilenglikol metil etar 16-heksadekanoiloksiheksadekanoat, npr. gde polietilen glikol ima molekulsku masu od 2300, 5000 ili 10000), i surfaktanti koji sadrže fluor (npr. kao koji se prodaju pod trgovačkim nazivom Zonyl i Fluorad. Posebno korisni surfaktanti uključuju fosfolipide koji sadrže molekule sa ukupnim neutralnim naelektrisanjem, npr. distearoil-sn-glicerol-fosfoholin.
[0077] Biće cenjeno da, da bi se olakšale privlačne elektrostatičke interakcije kako bi se postiglo grupisanje između mikromehurića u prvoj komponenti i mikrokapljica emulzije u drugoj komponenti, one treba da budu suprotnog površinskog naelektrisanja. Dakle, ako su mikromehurići prve komponente negativno naelektrisani, mikrokapljice druge komponente treba da budu pozitivno naelektrisane, ili obrnuto. Da bi se omogućilo odgovarajuće površinsko naelektrisanje za mikrokapljice ulja katjonski surfaktant se može dodati stabilizirajućoj strukturi. Širok spektar katjonskih supstanci može se koristiti, na primer barem donekle hidrofobna i/ili suštinski nerastvorljiva u vodi jedinjenja koja imaju osnovni atom azota, npr. primarni, sekundarni ili tercijarni amini i alkaloidi. Posebno koristan katjonski surfaktant je stearilamin.
[0078] Takođe će biti cenjeno da se mešanje prve i druge komponente može postići na različite načine u zavisnosti od oblika komponenti; npr. mešanje dve tečne komponente, rekonstitucija jedne komponente u obliku suvog praha sa jednom komponentom u tečnom obliku, mešanje dve komponente u suvom obliku pre rekonstitucije sa tečnošću (npr. voda za injekcije ili puferski rastvor). Takođe, biće cenjeno da druge komponente mogu uticati na sposobnost mikromehurića i mikrokapljica da formiraju klastere nakon mešanja uključujući, ali ne ograničavajući se na; nivo površinskog naelektrisanja mikromehurića/mikrokapljica, koncentraciju mikromehurića/ mikrokapljica u dve komponente, veličinu mikromehurića/mikrokapljica, sastav i koncentraciju jona, sastav i koncentraciju ekscipijenasa (npr. pufer ili komponente toničnosti) itd. (videti primer 1). Takve karakteristike komponenti i sastava takođe mogu uticati na veličinu i stabilnost (i invitro i in-vivo) generisanih klastera i mogu biti važni faktori koji utiču na biološke atribute (npr. efikasnost i bezbednosni profil). Takođe je cenjeno da ne mogu svi mikromehurići/mikrokapljice u kompoziciji klastera biti prisutni u grupisanom obliku, ali da značajna frakcija mikromehurića i/ili mikrokapljica može biti prisutna zajedno u slobodnom (ne grupisanom) obliku zajedno sa populacijom klastera mikromehurića/mikrokapljica. Pored toga, način na koji se dve komponente mešaju može uticati na ove aspekte, uključujući, ali ne ograničeno na; napon smicanja primenjen tokom homogenizacije (npr. meka ručna homogenizacija ili jaka mehanička homogenizacija) i vremenski opseg za homogenizaciju.
[0079] Veličina mikrokapljice dispergovane difuzibilne komponente u emulzijama namenjenim za intravensko ubrizgavanje treba poželjno biti manja od 7 µm, poželjnije manja od 5 µm, najpoželjnije manja od 3 µm, i veća od 0.5 µm, poželjnije veća od 1 µm da se olakša nesmetan prolaz kroz plućni sistem, ali i dalje zadrži zapreminu koja je dovoljna za punjenje lekom i aktivirano zadržavanje mehurića u mikrovaskulaturi.
[0080] Rast dispergovane gasne faze in vivo može, na primer, da bude praćen ekspanzijom bilo kog materijala za kapsuliranje (gde ovo ima dovoljnu fleksibilnost) i/ili apstrahovanjem viška surfaktanta iz administriranog materijala na rastuće interfejse gas-tečnost. Takođe je moguće, međutim, da istezanje materijala za kapsuliranje i/ili interakcija materijala sa ultrazvukom može značajno povećati njegovu poroznost. Dok je do sada utvrđeno da takvo narušavanje materijala za kapsuliranje u mnogim slučajevima dovodi do brzog gubitka ehogenosti kroz difuziju prema spolja i rastvaranje gasa koji je na taj način izložen, otkrili smo da kada se koristi kompozicija u skladu sa predmetnim pronalaskom, izloženi gas pokazuje značajnu stabilnost. Iako ne želimo da se vezujemo za teorijske proračune, verujemo da izloženi gas, npr. u obliku oslobođenih mikromehurića, može se stabilizovati, npr. protiv kolapsa mikromehurića, preko prezasićenog okruženja stvorenog difuzibilnom komponentom, koja obezbeđuje unutrašnji gradijent pritiska da bi se suprotstavio spoljnoj difuznoj tendenciji mikromehurića gasa. Izložena površina gasa, zbog značajnog odsustva materijala za kapsuliranje, može prouzrokovati da aktivirani mehurići pokažu izuzetno povoljna akustička svojstva što se vidi po velikom povratnom rasejanju i niskoj apsorpciji energije (npr. kao što je izraženo odnosom visoko povratno rasejanje:prigušenje) na tipičnom dijagnostičkom snimanju frekvencije; ovaj ehogeni efekat se može nastaviti tokom značajnog perioda, čak i tokom kontinuiranog ultrazvučnog zračenja.
[0081] Akustična rezonanca mikromehurić komponente klastera je u dijagnostičkom frekventnom opsegu (1-10 MHz). Aktivacija klastera se lako postiže pomoću standardnih dijagnostičkih ultrazvučnih impulsa za snimanje koji se koriste na primer u konvencionalnim medicinskim ultrazvučnim primenama za abdomen i srce, pri srednjim do niskim mehaničkim indeksima (MI ispod 1.9 i poželjno ispod 0.7 i poželjnije ispod 0.4). Aktivacija klastera u fazni pomak da bi se proizvele veće (10 µm ili više u prečniku) mehurići sa faznim pomakom može se postići pomoću kliničkog sistema za snimanje do milimetarske prostorne rezolucije korišćenjem impulsa za snimanje. Nakon aktivacije, ulje u mikrokapljici isparava, oslobađajući terapijski agens (ako je uključen) u tečnost koja ga okružuje u obliku slobodnog leka, ili kao kristalizovani lek (u obliku čestica) ili ispoljen na/povezan sa aktiviranom površinom mehurića. Aktivirani mehurići zarobljavaju se u mikrovaskulaturi, privremeno zaustavljajući protok krvi i zadržavajući lek u mikrovaskulaturi u visokoj koncentraciji. Dalja primena ultrazvuka nakon hvatanja olakšava mehanizme isporuke da bi se povećala efikasnosti isporuke leka u tkivo. Klasteri se ne aktiviraju pri niskom MI (ispod praga aktivacije klastera od približno 0.1) što omogućava da se izvrši standardno medicinsko ultrazvučno snimanje sa kontrastnim agensom, na primer da se identifikuje tumorska mikrovaskularna patologija bez aktivacije klastera. Aktivacija pod kontrolom medicinskog ultrazvučnog snimanja korišćenjem impulsa snimanja omogućava prostorno ciljanu aktivaciju klastera u regionu tkiva koji se ispituje ultrazvučnim poljem. Nakon aktivacije, proizvedeni veliki mehurići sa faznim pomakom su privremeno zarobljeni u mikrovaskulaturi zbog svoje veličine (10 µm ili više u prečniku). Dobijeni veliki mehurići sa faznim pomakom su otprilike 1000 puta zapremine emulzije mikrokapljica koja je isparila (mehurića prečnika 30 µm iz mikrokapljice ulja prečnika 3 µm). Poprečni preseci rasejanja ovih velikih mehurića sa faznim pomakom su za redove veličine veći od poprečnih preseka rasejanja mikromehurića veličine mikrona koji su sadržani u klasterima pre aktivacije. Kao rezultat toga, veliki mehurići sa faznim pomakom proizvode obilan signal povratnog rasejanja i lako se snimaju u osnovnom režimu snimanja pomoću dijagnostičkih sistema za snimanje (videti primere 2 i 7). Mehaničke rezonantne frekvencije velikih mehurića sa faznim pomakom su takođe za red veličine niže (1 MHz ili manje) od rezonantnih frekvencija mikromehurića koji se nalaze u klasterima pre aktivacije. Primena akustičnih polja srazmernih rezonantnim frekvencijama većih mehurića sa faznim pomakom proizvodi relativno velike oscilacije radijusa na MI u okviru medicinskog dijagnostičkog opsega. Prema tome, ultrazvuk niske frekvencije (0.05 do 2MHz, poželjno 0.1 do 1.5 MHz i najpoželjnije 0.2 do 1 MHz) ultrazvuk može se primeniti da bi se proizveli mehanizmi bioefekta koji pojačavaju uzimanje oslobođenog ili istovremeno administriranog leka. Iskorišćavanje efekata rezonancije aktiviranih mehurića omogućava bolju kontrolu pokretanja ovih bioefekata pri nižim akustičnim intenzitetima i nižim frekvencijama nego što je to moguće kod drugih tehnologija. Zajedno sa činjenicom da se veliki mehurići sa fazim pomakom aktiviraju i deponuju u mikrovaskulaturi tkiva pod kontrolom snimanja (omogućavaju prostorno ciljanje velikih aktiviranih mehurića u tkivu), i njihovo produženo vreme zadržavanja, omogućava efikasniju i kontrolisanu implementaciju mehanizama isporuke leka. Niža frekvencija i smanjene akustične snage koje se zahtevaju korišćenjem rezonantnih svojstava deponovanih velikih mehurića sa fazim pomakom imaju veliku potencijalnu prednost za otvaranje krvno moždane barijere. Polja niže frekvencije u velikoj meri smanjuju probleme sa toplotnim efektima koje trenutno imaju drugi pristupi, kao i potrebu za uklanjanjem kosti lobanje da bi se izbegli takvi problemi.
[0082] Terapijski agens, takože nazvan "lek", koji se isporučuje može biti odabran od grupe molekula lekova, nanočestica i sistema za isporuku nanočestica, gena, i radioizotopa. Ovi se mogu rastvoriti ili na drugi način ugraditi (npr. dispergovati) u uljnu fazu druge komponente. U tehničkom rešenju za koje se zahteva zaštita, terapijski agens se adminsitrira kao posebna kompozicija na kompoziciju klastera. Primeri klasa lekova uključuju, ali nisu ograničeni na, gene (za gensku terapiju), hemoterapijska sredstva, imunoterapijska sredstvae (npr. za terapiju kancera ili terapiju transplantacije organa), lekove koji proizvode angiogenezu na primer da stimulišu rast novih krvnih sudova, lekove koji prolaze krvno moždanu barijeru na primer za lečenje kancera ili neuroloških bolesti kao što su Parkinsonova i Alchajmerova bolest.
[0083] Za hemoterapijska sredstva primeri lekovi uključuju, ali nisu ograničeni na, klase lekova: alkilacioni agensi što je ciklofosfamid, mehloretamin, hlorambucil, melfalan; anthraciklini kao što su daunorubicin, doksorubicin, epirubicin, idarubicin, mitoksantron, valrubicin; disruptore citoskeleta (taksani) kao što su paclitaksel i docetaksel; epotiloni; inhibitori histon deacetilaze kao što su vorinostat, romidepsin; inhibitori topoizomeraze I i II kao što su irinotekan, topotekan, etopozid, tenipozid, taflupozid,; inhibitori kinaze kao što je bortezomib, erlotinib, gefitinib, imatinib, vemurafenib, vizmodegib; monoklonska antitela kao što su bevacizumab, cetuksimab, ipilimumab, ofatumumab, okrelizumab, panitumab, rituksimab; analoge nukleotida i analoge prekursora kao što su azacitidin, azatioprin, kapecitabin, citarabin, doksifluridin, fluorouracil, gemcitabin, hidroksiureea, merkaptopurin, metotreksat, tioguanin; peptidne antibiotike kao što su bleomicin, actinomicin; agense na bazi platine kao što su karboplatin, cisplatin, oksaliplatin; retinoide kao što su tretinoin, alitretinoin, beksaroten; vinka alkaloide i derivate ako što su vinblastin, vinkristin, vindesin, vinorelbin.
[0084] Kao što je navedeno u primeru 5, u sadašnjem pronalasku, poželjni su hidrofobni lekovi sa LogS manje od - 2.
[0085] Lek se može rastvoriti u mikrokapljicama ulja koje sadrže difuzibilnu komponentu. Da bi se lek rastvorio u dovoljnoj količini, npr. veće od 0.5% po masi ili poželjno veće od 2% po masi, jedan ili više rastvarača (korastvarača) se može dodati glavnoj komponenti ulja. Poželjno hemijska reaktivnost rastvarača treba da bude inertna, kao što su, ali ne ograničavajući se na, nesupstituisani alkani i etri, hidrogenizovani fluorougljenici (hFC) i perfluorovani (pF) alkani (pFC), pF-cikloalkani, pF-etri, hidrogenovani fluoro etri (hFE), pF-oksolani, pF-furani, pF-pirani, dietilsilan. Poželjno je da korastvarači budu ograničeni na IHC klase 2, 3 i 4, rastvarače sa niskim toksičnim potencijalom i rastvarače za koje nema adekvatnih toksikoloških podataka, kao što su, ali ne ograničavajući se na, aceton, etanol, etil acetat, 2-propanol, 1,1-dimetoksimetan, izopropil etar, trihlorsirćetna kiselina, itd. Dalji primeri potencijalno poželjnih rastvarača uključuju, ali nisu ograničeni na, dimetilsulfoksid (DMSO), oksetan (trimetilenoksid), 1-hloro-2-fluoroetan, dietilenglikoldikolmoetilhlorid diklorometan), metilentrihlorid (trihlorometan), 3-fluoroksetan, glikofurol, dihloretilen, 1,3-difluoropropan, 2-hloro-1,1-difluoroetan, 1-hloro-2,2-difluoroetan, 1,2,2-tetrafluoroetilfluorometiletar, metilizopropiletar, 1-propanol, propilenglikol, 2-propanol, 1-pentanol, 1-butanol, 2-butanol, 1,3-butandiol i izobutilalkohol.
[0086] Da bi se optimizovao kapacitet punjenja lekom, može biti posebno korisno koristiti dva ili više korastvarača istovremeno. Posebno korisni korastvarači uključuju metilendihlorid, metilenerihlorid i 2-hloro-1,1-difluoroetan.
[0087] Akustični signal iz velikih mehurića sa faznim pomakom koji nastaju nakon aktiviranja kompozicije klastera na željenoj prostornoj lokaciji može se meriti, obično pomoću medicinskog ultrazvučnog sistema za snimanje, kako bi se kvantifikovala količina leka koji se isporučuje u region tkiva. Akustične informacije snimljene i interpretirane, na primer pomoću odgovarajućih softverskih algoritama i potpornih metoda podrške korišćenjem kompjuterske obrade. Stoga, ova objava obezbeđuje postupak kvantifikacije količine leka koji se isporučuje analizom akustičnog potpisa proizvedenog od strane velikih mehurića sa fazim pomakom oslobođenih aktivacijom tehnologije pomeranja faze. Dakle, količina isporučenog leka se kvantifikuje obradom akustičnih potpisa velikih, aktiviranih mehurića.
[0088] U drugom tehničkom rešenju, pronalazak obezbeđuje postupak za isporuka lekova kao deo režim lečenja višestrukim lekovima.
[0089] U još jednom tehničkom rešenju pronalazak obezbeđuje postupak koji uključuje korak korišćenja režima snimanja sa niskim MI kontrastnim agensom (MI < 0.15) za snimanje komponente mikromehurića, tj. dispergovanog gasa, bez aktivacije klastera da bi se identifikovao region patologije za lečenje. Stoga, pošto se klasteri ne aktiviraju pri niskom MI (ispod aktivacionog praga), može se izvesti standardno medicinsko ultrazvučno slikanje sa kontrastnim agensom, pre koraka aktivacije, na primer da bi se identifikovala tumorska mikrovaskularna patologija bez aktivacije klastera.
[0090] U još jednom tehničkom rešenju, pronalazak obezbeđuje primenu svojstava markera depozita aktiviranih mehurića i ultrazvučno snimanje da se identifikuje region patologije za lečenje i za kvantifikaciju perfuzije. Pored upotrebe režima snimanja sa niskim MI kontrastnim agensom za snimanje komponente mikromehurića bez aktivacije klastera da bi se identifikovao region patologije za lečenje, postupak može uključivati upotrebu svojstava markera depozita aktiviranih mehurića da se identifikuje region patologije za lečenje i kvantifikaciju perfuzije.
[0091] U još jednom tehničkom rešenju pronalaska, terapijski agens se administrira pre, i/ili zajedno i/ili posle. Administrira se kompozicija klastera i izvodi se korak aktivacije. Aktivacija kompozicije klastera proizvodi velike mehuriće sa fazim pomakom koji su zarobljeni na mestu interesovanja i privremeno zaustavljaju protok krvi. Dalja primena ultrazvuka nakon hvatanja olakšava biomehanizme, kao što je povećanje permeabilnosti vaskulature, samim tim povećanje preuzimanja i/ili raspodele a samim tim i efikasnost leka administriranog pre, i/ili zajedno i/ili posle.
[0092] Dalje, terapijski agens se može davati i kao ubačen u emulziju mikrokapljice u drugoj komponenti i kao posebna kompozicija.
[0093] Dalje, perfuzija regiona tkiva koji se tretira može se kvantifikovati obradom akustičnih potpisa velikih, aktiviranih mehurića.
[0094] Dalje, akustični potpis velikih mehurića sa faznim pomakom može se u potpunosti ili delimično odvojiti od akustičnog potpisa regiona tkiva pomoću obrade povratno rasejanih signala i koristiti za poboljšanje kvantifikacije isporučenog leka i/ili perfuzije tkiva koje se tretira.
[0095] U još jednom tehničkom rešenju pronalaska ultrazvuka velike snage (High Intensity Focused Ultrasound, HIFU) [Lukka, H. i sarad., Clinical Oncology 23 (2011) 117-127] se primenjuje na region tkiva koji sadrži velike, aktivirane mehuriće. Prisustvo velikih mehurića sa fazim pomakom povećava lokalnu brzinu termičke isporuke korišćenjem ultrazvučnog tretmana hipertermije i/ili ablacije tkiva.
[0096] Dalje, ultrazvuk velike snage može se primeniti na region tkiva koji sadrži velike mehuriće sa fazim pomakom da lizira ćelije, na primer ćelije kancera, da bi se izazvao sistemski imuni odgovor na tkivo kancera.
[0097] Kompozicija klastera pronalaska stoga može biti za primenu kao farmaceutska kompozicija.
[0098] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutsku kompoziciju koja sadrži
(i) kompoziciju klastera kako je definisano u prvom aspektu
(ii) drugi terapijski agens, obezbeđen kao posebnu kompoziciju za (i).
[0099] Dakle, u prvom tehničkom rešenju ovog aspekta, bilo koji terapijski agens u kompoziciji klastera farmaceutske kompozicije je odsutan, ali je obezbeđen kao posebna kompozicija.
[0100] Dalje, prvi terapijski agens može biti prisutan u kompoziciji klastera farmaceutske kompozicije, a drugi terapijski agens je takođe prisutan i obezbeđen kao posebna kompozicija.
[0101] U trećem aspektu, pronalazak obezbeđuje ultrazvučni kontrasni agens koji sadrži kompoziciju klastera kako je opisano u prvom aspktu ili farmaceutsku kompoziciju opisanu u drugim aspektima.
[0102] U četvrtom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak isporuke najmanje jednog terapijskog agensa subjektu sisaru, koji obuhvata sledeće korake:
(i) administriranje farmaceutske kompozicije kako je definisana u drugom aspektu subjektu sisaru;
(ii) po izboru snimanje mikromehurića navedene farmaceutske kompozicije korišćenjem ultrazvučnog snimanja da se identifikuje region od interesa za tretman u okviru navedenog subjekta;
(iii) aktiviranje pomeranja faze difuzibilne komponente druge komponente kompozicije klastera iz koraka (i) ultrazvučnim zračenjem regiona od interesa u okviru navedenog subjekta, tako da:
(a) mikromehurići navedenih klastera se uvećavaju sa navedenom difuzibilnom komponentom iz koraka (iii) da daju uvećane mehuriće koji su lokalizovani u navedenom regionu od interesa zbog privremenog blokiranja mikrocirkulacije u navedenom regionu od interesa od strane navedenih uvećanih mehurića; i
(b) navedena aktivacija iz koraka (iii) olakšava ekstravazaciju terapijskog(ih) agensa(asa) administriranog(ih) u koraku (i).
(iv) po izboru, olakšavanje dalje ekstravazacije terapijskog(ih) agensa(asa) administriranog(ih) u koraku (i) daljim ultrazvučnim zračenjem.
[0103] U ovom kontekstu, u koracima ii, iii i iv, može se koristiti ultrazvuk bilo kog mehaničkog indeksa.
[0104] Međutim, u koraku ii MI od < 0.15 je poželjan, a u koracima iii i iv MI od < 0.7 je poželjan. U ovom kontekstu, u koracima ii, iii i iv, može se koristiti ultrazvuk bilo koje frekvenca između 0.05 do 30 MHz. Međutim, u korqacima ii i iii frekvenca u opsegu 1-10 MHz je poželjna, a u koraku iv frekvenca u opsegu 0.05-2 MHz je poželjna.
[0105] Farmaceutska kompozicija se poželjno administrira navedenom subjektu sisaru parenteralno, poželjno intravenozno. Put administriranja se takođe može izabrati između intraarterijskog, intramuskularnog, intraperitonealnog ili subkutanog administriranja. U petom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja subjekta sisara koji obuhvata postupak isporuke kao što je definisano u četvrtom aspektu.
[0106] Pronalazak se takođe odnosi na primenu farmaceutske kompozicije pronalaska ili postupak isporuke pronalaska u lečenju subjekta sisara.
[0107] U šestom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak lečenja subjekta sisara, koji obuhvata administriranje klaster kompozicije pronalaska ili farmaceutske kompozicije pronalaska i primenu fokusiranog ultrazvuka visokog intenziteta (HIFU) na region od interesa.
[0108] U sedmom aspektu, pronalazak obezbeđuje primenu kompozicije klastera pronalaska ili farmaceutske kompozicije pronalaska kao ultrazvučnog kontrastnog agensa ili leka. U osmom aspektu, pronalazak obezbeđuje postupak ultrazvučnog snimanja, koji obuhvata snimanje subjekta sisara kojem je prethodno administriran ultrazvučni kontrastni agens pronalaska
[0109] U drugom do osmom aspektu, mogu se koristiti iste komponente i tehnička rešenja kao što je opisano u prvom aspektu.
Primeri
[0110] Sledeći neograničavajući primeri služe da ilustruju pronalazak. Radi jednostavnosti, u sledećim primerima 1. komponenta je označena sa C1, 2.<.>je označena sa C2 a kompozicija klastera, tj. kompozicija dobijena od kombinacije 1<.>i 2. komponente, je označena sa DP (drug product - proizvod lek).
[0111] Example 1 obezbeđuje opise analitičkih metodologija za karakterizaciju i kvantifikaciju klastera mikromehurić/mikrokapljica u DP, i objašnjava relevantne odgovore i atribute uključujući koncentraciju, veličinu i kružnost. Takođe obezbeđuje detalje o analitičkoj metodologiji za karakterizaciju i kvantifikaciju veličine i koncentracije aktiviranog mehurića. Pored toga, prikazani su podaci o stabilnosti klastera nakon pripreme, kao i poređenje karakteristika za prethodno mešani u odnosu na istovremeno ubrizgani DP. Takođe detaljno opisuje inženjerske korake za kontrolisane manipulacije sadržajem i veličinom klastera u DP.
[0112] Primer 2 obezbeđuje rezultate iz dve in-vivo studije koje razjašnjavaju efekte karakteristika klastera na efikasnost proizvoda kao sposobnost deponovanja velikih, aktiviranih mehurića u mikrocirkulaciji. Dalje analizira ove podatke i zaključuje da klasteri sa veličinom između 3 do 10 µm, definisani kružnošću manjom od 0.9, doprinose efikasnosti kompozicije klastera. Takođe upoređuje rezultate o efikasnosti proizvoda sa rezultatima prijavljenim u WO 99/53963 i pokazuje da sadašnji pronalazak nudi 10-struko povećanje u količini deponovanih mehurića sa fazim pomakom.
[0113] Primer 3 obezbeđuje rezultate iz studije koja pokazuje veličinu i dinamiku aktiviranih mehurića in-vivo. Potvrđuje rezultate iz in-vitro analize, pokazujući aktiviranu srednju veličinu mehurića od pribl.20 µm.
[0114] Primer 4 obezbeđuje rezultate in-vivo studije koja demonstrira prirodu depozita aktiviranih mehurića intravitalnom mikroskopijom tkiva mezenterija. Takođe obezbeđuje teorijske proračune oscilacija zapremine velikih, aktiviranih mehurića pri UZ zračenju i upoređuje ih sa zapreminskim oscilacijama regularnih kontrastnih mikromehurića. Zaključuje se da su apsolutne oscilacije zapremine koje pružaju veliki, aktivirani mehurići sadašnjeg pronalaska za tri reda veličine veće nego kod regularnih kontrastnih mikromehurića.
[0115] Primer 5 obezbeđuje obezbeđuje rezultate različitih studija formulacije C1 i C2. Pokazuje da je koncept koji podučava sadašnji pronalazak funkcionalan kada se koriste komercijalno dostupne formulacije mikromehurića; Sonazoid, Optison, Sonovue, Micromarker i Polyson kao C1, čime se dokazuje da se niz komponenti mikromehurića može istražiti za primenu u sadašnjem pronalasku. Rezultati za kompozicije klastera napravljene sa nekim od ovih agenasa pokazuju da se klasteri do pribl. 1 µm u prečniku mogu aktivirati i time doprineti ukupnoj efikasnosti kompozicije. Primer 5 takođe istražuje niz difuzionih komponenti za primenu u C2 i pokazuje da se spontana aktivacija nakon mešanja C1 i C2 može izbeći korišćenjem niske rastvorljivosti u vodi, perfluorovanih ugljovodonika i takođe da primena takvih jedinjenja povećava sposobnost formiranja velikih mehurića sa faznim pomakom nakon UZ aktivacije. Dalje, primer 5 obezbeđuje podatke iz istraživanja o opterećenju C2 lekom i korišćenju delimično halogenovanih ugljovodonika kao korastvarača da bi se olakšalo takvo opterećenje.
[0116] Primer 6 obezbeđuje rezultate fluorescentne mikroskopije na aktiviranim mehurićima napravljenim sa C2 napunjenim fluorescentnom bojom Nile Red. Pokazuje da je, nakon aktivacije, napunjena supstanca homogeno ispoljena na površini aktiviranih mehurića i stoga će biti u bliskom kontaktu sa endotelnim zidom i dostupna za ekstravazaciju.
[0117] Primer 7 obezbeđuje rezultate UZ kontrastne studije za snimanje koja demonstrira prirodu depozita aktiviranih mehurića u murinskom modelu kancera, i upoređuje njihove karakteristike sa redovnim HEPS/PFB mikromehurićima (C1). Pokazuje da se, nakon administriranja DP i naknadne aktivacije, veliki mehurići sa fazim pomakom nagomilavaju u mikrocirkulaciji tumora i ostaju nepokretni nekoliko minuta. Ne primećuje se promena u nivou kontrasta 1.5 minuta nakon aktivacije. Nasuprot tome, HEPS/PFB mikromehurići pokazuju kontrast koji slobodno teče, koji se brzo ispira i potpuno se vraća na osnovnu liniju nakon manje od 1 minuta.
[0118] Primer 8 obezbeđuje rezultate ispitivanja isporuka istovremeno administriranih i napunjenih jedinjenja. U prvoj studijskoj kohorti, pokazano je da administriranje DP sa naknadnom aktivacijom i daljim UZ zračenjem povećava preuzimanje u mišićnom tkivu za faktor 2. Koristeći identične procedure UZ zračenja, nije primećeno povećanje preuzimanje nakon administriranja samo HEPS/PFB mikromehurića (C1). Sa DP, preuzimanje u tumoru se povećalo za faktor 2 samo nakon aktivacije i za faktor od 3.4 nakon daljeg UZ zračenja. U drugoj studijskoj kohorti, pokazano je da administriranje DP sa naknadnom aktivacijom povećava preuzimanje u tumoru (kao povećanje intenziteta luminiscencije) CW800 IR boje sa približno 30% i da dalje UZ zračenje povećava preuzimanje u tumoru za približno 60%. U trećoj studijskoj kohorti, ispitivano je administriranje DP napunjenog sa DiR fluorescentnom bojom, naknadna aktivacija i dalje UZ zračenje. Rezultati su pokazali snažno, značajno povećanje intenziteta fluorescencije u tretiranom tumorskom tkivu, demonstrirajući oslobađanje i preuzimanje fluorescentne boje umetnute u C2 komponentu.
[0119] Primer 9 obezbeđuje opis proizvodnje C1 i C2. Tri uzastopne serije C1 i C2 su prošle testiranje sterilnosti prema farmakopeji (Ph.Eur./USP).
Kratak opis slika nacrta
[0120]
Slika 1 - Rezultati analize sa Coulter-ovim brojačem za 1. komponentu (mikromehurići, isprekidana linija), 2. komponentu (mikrokapljice, tačka-crta linija), zbir 1. i 2. komponente (tačka-tačka-crta linija) i kompoziciju klastera (puna linija) za tri nivoa elektrostatičke privlačnosti između mikromehurića u 1. komponenti i mikrokapljica u 2. komponenti. Y-osa je koncentracija brojeva (a.u.), x-osa je prečnik u µm. Niska privlačnost sa 1.5% SA (gornji dijagram), srednja privlačnost sa 3% SA (srednji dijagram) i visoka privlačnost sa 5% SA (donji dijagram). Kao što se može primetiti gubitak ukupnog broja čestica u sistemu (označen belim strelicama) raste sa zanemarljivog na 1.5% SA na više od 50% pri 5% SA. Pored toga, veliki krajnji deo raspodele veličine kompozicije klastera (označen crnim strelicama) se povećava sa povećanjem elektrostatičke privlačnosti, pokazujući povećan sadržaj klastera mikromehurić/mikrokapljica.
Slika 2 - Rezultati analize slike čestica protoka kompozicije klastera. Reprezentativni izbor mikrosnimaka čestica između 5 do 10 µm na kojima se vide klasteri mikromehurić/mikrokapljica.
Slika 3 - Rezultati mikroskopije i analize slike za 1. komponentu (mikromehurići, gornji dijagram) i 2. komponentu (mikrokapljice, donji dijagram). Oblast dijagrama označena brojem 1 prikazuje raspodelu veličine mikromehurića/mikrokapljica, gde je y-osa broj detekcija, a x-osa prečnik u µm. Oblast dijagrama označena brojem 2 prikazuje raspodelu kružnosti mikromehurića/mikrokapljica, gde je y-osa kružnost, a x-osa broj detekcija. Oblast dijagrama označena brojem 3 prikazuje dijagram rasipanja veličine (x-osa) u odnosu na kružnost (y-osa) gde je svaka detekcija ucrtana kao jedna tačka u matrici veličina/kružnost. Zasivljeno područje u oblasti dijagrama 3 označava detekcije > 3 µm sa kružnošću < 0.9. Desna (velika) oblast prikazuje reprezentativni izbor mikrografa pojedinačnih detekcija mikromehurića/mikrokapljica. Kao što se može primetiti sa gornjeg dijagrama, mikromehurići u 1. komponenti prikazuju prilično usku raspodelu veličine sa srednjim prečnikom od približno 2.8 µm kao i usku raspodelu kružnosti sa srednjom veličinom kružnosti od približno 0.98. Manje od 1% detekcija se nalaze u prečniku > 3 µm i delu kružnosti < 0.9 i svi od ovih su pojedinačni mikromehurići. Kao što se može primetiti sa donjeg dijagrama, mikrokapljice u 2. komponenti prikazuju prilično usku raspodelu čestica sa srednjim prečnikom od približno 3.0 µm kao i usku raspodelu kružnosti sa srednjom veličinom kružnosti od približno 0.96. Manje od 1% detekcija se nalazi u prečniku > 3 µm i delu kružnosti < 0.9 i svi od ovih su pojedinačne mikrokapljice.
Slika 4 - Rezultati mikroskopije i analize kompozicije klastera, pre (gornji dijagram) i nakon (donji dijagram) aktivacije faznog pomeranja izazvane UZ. Oblast dijagrama označena sa 1 prikazuje raspodelu veličina detektovanih čestica, gde je y-osa broj detekcija, a x-osa prečnik u µm. Oblast dijagrama označena brojem 2 prikazuje kružnu raspodelu mikromehurića/mikrokapljica, gde je y-osa kružnost, a x-osa broj detekcija. Oblast dijagrama označena brojem 3 prikazuje dijagram rasipanja veličine (x-osa) u odnosu na kružnost (y-osa) gde je svaka detekcija ucrtana kao jedna tačka u matrici veličina/kružnost. Donji dijagram, zasivljeno područje u oblasti dijagrama 3 označava detekcije > 3 µm sa kružnošću < 0.9. Gornji dijagram, desna (velika) oblast prikazuje reprezentativni izbor mikrografa pojedinačnih detekcija u prečniku > 3 µm i delu kružnosti < 0.9. U poređenju sa slikom 3, čestice u neaktiviranoj kompoziciji klastera prikazuju dugi krajnji deo po veličini i donji krajnji deo po kružnosti, posmatrano kao izraženi greben (ridge) u dijagramu rasejanja veličine u odnosu na kružnost, što pokazuje prisustvo klastera mikromehurića/mikrokapljica. Približno 6% detekcija se nalazi u prečniku > 3 µm i delu kružnosti < 0.9. Od ovih, više od 95% su klasteri mikromehurić/mikrokapljica (tj. manje od 5% pojedinačnih mikromehurića ili mikrokapljica). Donji dijagram, desna (velika) oblast prikazuje reprezentativni izbor mikrografa od pojedinačnih detekcija velikih, aktiviranih mikromehurića. Kao što se može primetiti, nakon UZ zračenja klasteri u kompoziciji klastera pomeraju fazu da bi proizveli populaciju velikih mehurića sa faznim pomakom koji se nalaze između približno 10 do 100 µm sa srednjim prečnikom od približno 20 µm.
Slika 5 - Relativna raspodela veličine broja (gornja) i kružnosti (donja) klastera mikromehurića/mikrokapljica izolovanih iz rezultata za kompoziciju klastera prikazani su na slici 4. Kao što se može primetiti, klasteri u kompoziciji klastera su ~3 do -10 µm u prečnika i karakteriše ih kružnost < 0.9.
Slika 6 - Odgovori iz sonometrijske analize. Levi grafik: zapreminski udeo (y-osa) u sonometarskoj mernoj ćeliji u odnosu na vreme (x-osa) nakon aktivacije. Desni grafik: zapreminski ponderisana vrednost (A) i brojčano ponderisana vrednost (B) srednje vrednosti prečnika (y-osa) aktiviranih mehurića u odnosu na vreme (x-osa) nakon aktivacije.
Slika 7 - Stabilnost kompozicije klastera. Koncentracija klastera između 5 do 10 µm iz FPIA analize (otvoreni krugovi, leva osa) i aktivirana zapremina mehurića po zapremini mikrokapljice iz sonometrijske analize (popunjeni krugovi, desna osa) u odnosu na vreme nakon pripreme.
Slika 8 - Zapreminski ponderisana vrednost srednje vrednosti prečnika (y-osa, µm) aktiviranih mikromehurića iz sonometrijske analize u odnosu na reaktivnost (x-osa, %) kompozicije klastera iz Coulter-ove analize.
Slika 9 - Efikasnost kompozicije klastera u odnosu na reaktivnost. Y-osa prikazuje linearno pojačanje UZ signala iz miokarda psa (jedinice sive skale) nakon i.v. administracije kompozicije klastera i aktivacije u levoj komori. X-osa prikazuje reaktivnost (%) kompozicije klastera iz Coulter-ove analize. Ovi rezultati pokazuju optimalnu reaktivnost između 30 i 60%.
Slika 10 - Veličina klastera u kompoziciji klastera u odnosu na reaktivnost. Y-osa prikazuje sadržaj klastera u % prosečne vrednosti posmatrane za klase veličine; < 5 µm (isprekidana linija), 5 do 10 µm (puna linija), 10 do 20 µm (crta-tačka linija) i 20 do 40 µm (crta-tačka-tačka linija). X-osa prikazuje reaktivnost (%) kompozicije klastera iz Coulterove analize. Ovi rezultati pokazuju pomak ka većim klasterima sa povećanom reaktivnošću i iscrpljivanje malih i srednjih klastera pri visokoj reaktivnosti.
Slika 11 - Efikasnost kompozicije klastera u odnosu na koncentraciju klastera i zapreminu aktiviranih mehurića. Slika sa leve strane; Y-osa prikazuje linearno pojačanje UZ signala iz miokarda psa (jedinice sive skale) nakon i.v. administracije kompozicije klastera i aktivacije u levoj komori. X-osa prikazuje koncentraciju (milioni/mL) klastera između 5 i 10 µm u administriranoj kompoziciji klastera iz FPIA analize. Slika sa desne strane; Y- osa prikazuje linearno projačanje UZ signala iz miokarda psa (jedinice sive skale) nakon i.v. administracije kompozicije kompozicije i aktivacije u levoj komori. X-osa prikazuje zapreminu aktiviranog mehurića (µL/mL) u administriranoj kompoziciji klastera iz sonometrijske analize. Siva oblast na obe slike ukazuje na opseg prebojavanja miokarda (myocardial enhancement) koji je objavljen u WO 99/53963. Ovi rezultati pokazuju da su ispitani in-vitro parametri dobri prediktori efikasnosti kompozicije, i da efikasnost kompozicije klastera kako to podučava predmetni pronalazak nudi 10 puta povećanje efikasnosti u odnosu na ono što se podučava u WO 99/53963.
Slika 12 - Rezultati multivarijantne analize glavnih komponenti (PCA) doprinosa klastera u različitim klasama veličine linearnog pojačanja UZ signala iz miokarda psa (jedinice sive skale) nakon i.v. administracije kompozicije klastera i aktivacije u levoj komori. PCA je obavljena na podacima za liner30 uzoraka koji su detaljno prikazani u tabelama 7 i 8. Dijagram sa leve strane; Y-osa prikazuje izračunati koeficijent korelacije, tj. doprinos prebojavanja miokarda za klase veličine klastera (X-varijable) < 5 µm, 5 do 10 µm, 10 do 20 µm i 20 do 40 µm. Dijagram sa desne strane; Y-osa prikazuje izračunato prebojavanje miokarda (GS jedinice) korišćenjem modela sa grafikona sa leve strane a X-osa prikazuje izmereno prebojavanje miokarda (GS jedinice) za svaki uzorak (R=0.85). Ovi rezultati pokazuju da mali i srednji klasteri (< 10 µm) značajno doprinose efikasnosti kompozicije klastera, dok veći klasteri (> 10 µm) ne.
Slika 13 - Relativna raspodela veličine broja (gornja) i kružnosti (donja) klastera mikromehurić/mikrokapljica izolovana iz rezultata za kompoziciju klastera sa reaktivnošću od 46% (uzorak broj 3 iz tabele broj 2). Kao što se može primetiti, klasteri u kompoziciji klastera imaju ~3 do ~10 µm prečnik i karakteriše ih kružnost <0.9.
Slika 14 - Zapreminski udeo (y-osa, ppm) aktiviranih mehurića u arterijskoj krvi u odnosu na vreme (x-osa, sekunde) posle i.v. administracije kompozicije klastera i aktivacije u srčanoj komori.
Slika 15 - Mikrograf u gornjem levom uglu prikazuje sliku mezenterija pacova 17 sekundi nakon injekcije i aktivacije kompozicije klastera u mezenterijumu sa mehurićem sa faznim pomakom koji je privremeno smešten u mikrovaskulaturi i blokira protok krvi. Oblast označena isprekidanom pravougaonom kutijom je shematski prikazana na ilustraciji (dole levo). Kontura mehurića sa faznim pomakom je uvećana za faktor 5. Kontura mehurića sa faznim pomakom je označena sa A sa skalom od 20 mikrona sa oznakom C. HEPS/PFB mikromehurić od 3 µm, označen sa B i prikazan u razmeri, je očigledno dovoljno mali da ne blokira sud na isti način kao aktivirani mehurić sa faznim pomakom. (Gore desno) i (dole desno) prikazuje isti region mezenterija 5 minuta i 19 sekundi i 5 minuta i 45 sekundi nakon injekcije. Mehurić sa faznim pomakom se skuplja i kreće naizmenično niz vaskularno stablo pre nego što se potpuno odvoji, ispirući ga ponovo uspostavljenim protokom krvi.
Slika 16 - Mehurić sa faznim pomakom prečnika 30 mikrona označen sa A, i HEPS/PFB mikromehurić prečnika 3 mikrona označen sa B, u razmeri sa skalom od 10 mikrona. Minimalni i maksimalni prečnici simuliranih odgovora na UZ insonaciju su prikazani isprekidanim linijama manjeg i većeg prečnika takođe nacrtanim u razmeri. Postoji približno povećanje apsolutne promene zapremine za 3 reda veličine usled insonacije mehurića sa faznim pomakom u poređenju sa HEPS/PFB mikromehurićem, što pokazuje fundamentalnu razliku u mehaničkim efektima na okolno tkivo između ova dva tipa mehurića.
Slika 17 - Uticaj rastvorljivosti u uljnoj fazi u vodi na spontani rast UZ aktiviranih mehurića. Dijagram sa leve strane; Y-osa prikazuje rezultat mikroskopskog ispitivanja za količinu velikih mehurića sa faznim pomakom koji se spontano formiraju mešanjem 1. komponente i 2. komponente (tj. u kompoziciji klastera) (0 = nema ili uočen veoma mali broj mehurića > 15 µm, 1 = uočen srednji broj mehurića > 15 µm i 2 = uočen visok broj mehurića > 15 µm). X-osa prikazuje molarnu rastvorljivost uljne faze u vodi u 2. komponenti. Dijagram sa desne strane; X-osa prikazuje rezultat mikroskopskog ispitivanja za količinu velikih mehurića formiranih nakon UZ aktivacije kompozicije klastera (0 = nema ili uočen veoma mali broj mehurića > 15 µm, 1 = uočen srednji broj mehurića > 15 µm i 2 = uočen veliki broj mehurića > 15 µm). X-osa prikazuje molarnu rastvorljivost uljne faze u vodi u 2. komponenti. Ovi rezultati pokazuju da se nivo spontane aktivacije povećava, a da nivo izazvane UZ aktivacije opada, sa povećanjem rastvorljivosti u vodi uljne faze u 2. komponenti.
Slika 18 - Mikrografi 2. komponenti napunjeni sa DiR bojom, Nile Red bojom i paklitakselom prikazuju stabilne emulzije bez znaka precipitacije sadržaja molekula i prečnika mikrokapljice u opsegu veličine od 1 do 5 µm.
Slika 19 - Mikrograf sa fluorescentne mikroskopije na preseku aktiviranih mehurića sa faznim pomeranjem iz kompozicije klastera gde su mikrokapljice u 2. komponenti napunjene sa 5 mg/mL Nile Red boje. Kao što se može primetiti, nakon aktivacije molekularna boja ubačena u mikrokapljice se ispoljava na površini aktiviranog mehurića i stoga će biti u bliskom kontaktu sa endotelnim zidom i dostupna za ekstravazaciju.
Slika 20 - Slika sa leve strane prikazuje tipičnu sliku ultrazvuka PC-3 potkožnog tumora u zadnjem ekstremitetu miša. Isprekidana bela linija označava lokaciju tumorskog tkiva. Unutrašnjost tumora je tipično hipoehogena u poređenju sa okolnim tkivom kao što su koža i mišići. Slika sa desne strane prikazuje tipičnu ultrazvučnu sliku istog PC-3 tumora kao što je prikazano na levoj slici, nakon i.v. injektiranja i aktiviranje kompozicije klastera. Dodatni kontrastni eho koji je jasno prikazan u unutrašnjosti tumora se deponuje u tkivu i ostaju stacionaran u tumorskom tkivu nekoliko minuta.
Slika 21 -Tipične krive vremenskog intenziteta (TIC) prebojavanje kontrasom kod PC-3 tumora nakon administriranja i aktivacije kompozicije klastera (A) i nakon ekvivalentne doze samo HEPS/PFB mikromehurića (B), merene u istom tumoru. Intenzitet linearizovanog povratnog rasejanja je prosečan u regionu od interesa koji pokriva centar tumora. Y-osa je vrednost prosečnog linearizovanog povratnog rasejanja, a x-osa je broj video kadra u video sekvenci. Video je snimljen pri brzini od 10 kadrova u sekundi. Kao što se može primetiti, kod kompozicije klastera intenzitet rasejanja dostiže vrhunac na visokom nivou nakon približno 20s i ostaje stabilan tokom istraženog vremenskog perioda. Suprotno tome, administriran samo sa HEPS/PFB mikromehurićima, intenzitet rasejanja dostiže vrhunac na nižem nivou nego kod mehurića sa faznim pomakom i smanjuje se nazad na osnovnu liniju nakon približno 1 minut.
Slika 22 - Tipične slike epifluorescencije za istovremeno administriranje LiCor CW800 EPR agensa sa kompozicijom klastera. Životinja iz grupe 1 (leva slika) nije dobila UZ zračenje dok je životinja iz grupe 3 (desna slika) primila UZ aktivaciju i naknadno niskofrekventno UZ zračenje. Strelice označavaju lokaciju tumora koji su približno oba iste veličine i lokacije na svakoj životinji. Slike su snimljene sa istim podešavanjima skenera i predstavljene su sa istom linearnom sivom skalom intenziteta fluorescencije za direktno poređenje. Postoji jasno povećanje intenziteta fluorescencije od tumora koji je primio ultrazvučnu aktivaciju i naknadnog UZ zračenje u poređenju sa tumorom koji nije primio zračenje ultrazvukom, što pokazuje značajno povećano preuzimanje CW800 boje kada se tretira sa klaster kompozicijom.
Slika 23 - Odnos intenziteta fluorescencije tumora prema intenzitetu netretirane kontrolne noge od 1 minuta do 9 sati nakon tretmana. Y-osa je odnos intenziteta tumora i intenziteta netretirane kontrolne noge. X-osa je vreme u minutima. Postoji statistički značajno povećano početno preuzimanje u grupi 2 (kvadrati; samo aktivacija) u poređenju sa grupom 1 (dijamanti; bez aktivacije, bez naknadnog UZ zračenja), i statistički značajno povećano početno preuzimanje i stopa apsorpcije u grupi 3 (krugovi; aktivacija i naknadno UZ zračenje), u poređenju sa grupama 1 i 2.
Slika 24 - Odnos prosečnog intenziteta u regionu tumora i prosečnog intenziteta u netretiranoj nozi je integrisan od 1 minuta do 1 sata nakon tretmana. Grupe A, B i C su "bez aktivacije, bez naknadnog UZ zračenja", "samo aktivacija" i "aktivacija i naknadno UZ zračenje, redom. Uočeno povećanje preuzimanja je statistički značajno između grupa A i B i između grupa B i C.
Slika 25 - Tipične epifluorescentne slike posle tretmana sa kompozicijom klastera gde su mikrokapljice u 2. komponenti napunjene sa 10 mg/mL DiR boje. Gornja slika (A) je od životinje iz grupe 1 koja nije primila aktivaciju ili naknadno UZ zračenje na levu nogu koja nosi tumor. Donja slika (B) je od životinje iz grupe 2 gde je aktivirana kompozicija klastera praćena naknadnim UZ zračenjem leve noge koja nosi tumor. Lokacija tumora je označena strelicom. Uočene razlike u intenzitetu fluorescencije jasno pokazuju oslobađanje i preuzimanje od strane tkiva napunjene molekularne boje nakon aktivacije i naknadnog UZ zračenja, kao što pokazuje statistička analiza data u tabeli 22.
Primer 1 (E1) – Analitički alati i osnovne karakteristike pronalaska
E1-1 Uvod
[0121] Klasteri mikromehurić/mikrokapljica nakon kombinovanja C1 i C2, tj. prisutni u DP, ključni su za kritične atribute kvaliteta kompozicije, odnosno njegovu funkcionalnost za isporuku lekova. Dakle, analitička metodologija za karakterizaciju i kontrolu klastera formiranih u odnosu na koncentraciju i veličinu, predstavlja imperativni alat za procenu sadašnjeg pronalaska, kao i za medicinsku kontrolu kvaliteta (QC). Identifikovali smo tri različita analitička alata koji se mogu primeniti u ovu svrhu; Coulter-ovo brojanje, analiza slike čestica protoka (FPIA) i mikroskopija/analiza slike. U daljem tekstu, ove tri analitičke metodologije i odgovarajući odgovori su ukratko objašnjeni, neke osnovne karakteristike C1, C2 i DP date su primerima, kao i neki aspekti za kontrolisani inženjering ovih karakteristika.
[0122] Pored ovih tehnika, primenjenih za karakterizaciju klastera u kompoziciji klastera, razvijena je analitička metodologija za proučavanje aktivacije klastera in vitro, tj. generisanja velikih, aktiviranih mehurića nakon UZ zračenja. Ova meteorologija; "Sonometrija" je detaljno opisana u E1-6. Odgovori primarnog izvještaja iz sonometrijske analize su broj i zapremina aktiviranih mehurića i njihova raspodela veličine, oba u odnosu na vreme nakon aktivacije. Odgovori na aktivaciju se takođe mogu istražiti mikroskopijom/analizom slike kao što je detaljno opisano u E1-5.
E1-2 Ispitane komponente i kompozicije
[0123] 1. komponenta (C1) u svim kompozicijama ispitivanim u svim primerima sa izuzetkom E5-2, sastojala se od per-fluorobutan (PFB) mikromehurića stabilizovanih hidrogenizovanom fosfatidil serin-natrijum (HEPS-Na) membranom iz jajeta i ugrađenih u liofilizovanu saharozu. HEPS-Na nosi negativno naelektrisanu glavnu grupu sa posledičnim negativnim površinskim naelektrisanjem mikromehurića. Svaka bočica od C1 sadrži približno 16 µL ili 2·10<9>mikromehurića, sa srednjom vrednošću prečnika od približno 2.0 µm.
[0124] 2. komponenta (C2) u svim kompozicijama istraživanim u ovom primeru sastojala se od mikrokapljica perfluorometil-ciklopentana (pFMCP) stabilizovanih 1,2-distearoil-sn-glicerol-3-fosfoholina (DSPC) membranom sa 3% mol/mol stearilamina ( SA) dodatim da obezbedi pozitivno površinski naelektrisanje. Mikrokapljice u C2 su dispergovane u 5 mM TRIS puferu. Standardna formulacija C2 ispitivana u ovim studijama sadrži približno 4 µL ili 0.8·10<9>µm. mikrokapljica po mL, sa srednjom vrednošću prečnika od približno 1.8 µm.
[0125] U nekim slučajevima, da bi se razjasnili efekti na karakteristike klastera, različite varijable formulacije kao što su sadržaj SA, veličina mikrokapljica, koncentracija mikrokapljica, koncentracija TRIS-a i pH varirale su na kontrolisan način. U slučaju da su takvi uzorci korišćeni, ovi aspekti su detaljno opisani u tekstu.
[0126] Kompozicija klastera (DP) je pripremljena aseptički rekonstituisanjem bočice C1 sa 2 mL C2 nakon čega sledi ručna homogenizacija od 30 sekundi. 2 mL je izvučeno iz bočice C2 pomoću sterilnog šprica za jednokratnu upotrebu i igle. Sadržaj šprica je dodat kroz čep bočice sa C1 i dobijeni DP je homogenizovan.
[0127] C1 i C2 su proizvedeni kako je detaljno opisano u primeru 9.
[0128] U nekim slučajevima, da bi se uporedili efekti kompozicije klastera sadašnjeg pronalaska sa redovnim kontrastnim mikromehuricima, C1 je pripremljen sa čistom vodom umesto C2 da bi se dobila vodena disperzija HEPS/PFB mikromehurića.
E1-3 Coulter-ovo brojanje
[0129] Coulter-ovo brojanje je jedna od najčešće korišćenih analitičkih tehnika za kvantifikaciju i karakterizaciju veličine čestica supstanci većih od 1 µm i pokazala se pogodnom za QC medicinskih proizvoda [Sontum, PC. i Christiansen, C., J. Pharm. Biomed. Anal. tom.12, br.10, 1233-1241 (1994)]. Ukratko, mali alikvot analita (npr. C1, C2 ili DP) je razblažen/dispergovan u vodenom elektrolitu bez čestica (obično fosfatnim puferovanim rastvorom soli u vodi, PBS) i homogenizovan kontinuiranim mešanjem. Deo razblaženog uzorka je zatim uvučen kroz otvor na instrumentu, preko kojeg se neprekidno meri otpor. Svaka čestica koja se provuče kroz otvor će prouzrokovati da se otpor promeni proporcionalno zapremini čestice. Tokom analize, instrument uvlači poznatu zapreminu elektrolita kroz otvor, meri i broji svaki impuls otpora, i prikazuje rezultate kao brojčanu koncentraciju čestica izmerene u odnosu na veličinu. Za navedene analize korišćen je Coulter-ov Multisizer III ili IV (Beckman Coulter Ltd.) sa otvorom od 50 µm (opseg merenja od 1 do 30 µm). Odgovarajuća zapremina uzorka je razblažena u Isotonu II (PBS elektrolit, Beckman Coulter Ltd.) i homogenizovana uz nastavljanje mešanja tokom cele analize.
[0130] Coulter-ovo brojanje je pogodno za kvantifikaciju koncentracije mikromehurića i mikrokapljica i raspodelu veličine u C1 i C2, kao i za karakterizaciju čestica u DP. Kako se dva ili više mikromehurića/mikrokapljica u klasteru računaju kao jedna čestica, formiranje klastera kombinovanjem dve komponente će dovesti do 1) smanjenja ukupnog broja čestica u sistemu i 2) pomeranja ka većim veličinama. Ovi efekti su ilustrovani na slici 1 koja prikazuje koncentraciju i raspodelu veličine C1 i C2 kao pojedinačnih komponenti, zbir C1 i C2 (tj. kombinovana kompozicija da nije bilo formiranja klastera pri mešanju) i DP. Dijagrami pokazuju rezultate korišćenjem formulacije C2 sa 1.5%, 3.5% i 5.5% SA, pozitivno naelektrisanog surfaktanta, u stabilizacijskoj membrani. Količina SA utiče na površinsko naelektrisanje (zeta potencijal) mikrokapljica i jačinu privlačne elektrostatičke sile između mikrokapljica u C2 i mikromehurića u C1, a samim tim i na sposobnost formiranja klastera pri mešanju. Zeta potencijal mikrokapljica u ova tri uzorka je meren na 22 mV, 35 mV and 43 mV za formulacije od 1.5%, 3.5% i5.5% SA, redom. Svi uzorci su napravljeni sa istom C1 formulacijom. Zeta potencijal mikromehurića u C1 je izmeren na -57 mV. Kao što je prikazano na slici 1, veća razlika u površinskom naelektrisanju između dve komponente (tj. veće privlačne elektrostatičke sile) dovodi do formiranja više i većih klastera. Sa formulacijom od 1.5% SA, došlo je do beznačajne promene u koncentraciji i veličini u DP u odnosu na teorijsku sumu C1 i C2, tako da nisu primećeni dokazi o formiranju klastera. S druge strane, formulacija od 3.5% SA pokazuje blagi, ali značajan pad koncentracije i povećanje u velikom krajnjem delu a formulacija od 5.5% SA pokazuje dokaze značajnog grupisanja, sa značajnim smanjenjem koncentracije broja i jasnim pomakom ka jačem velikom krajnjem delu. Privlačna sila između mikromehurića i mikrokapljica stoga treba da bude iznad određenog praga da bi se formirali stabilni klasteri na kombinaciji C1 i C2.
[0131] Posebno koristan odgovor iz ovih merenja je reaktivnost (R) kompozicije klastera definisana kao;
[0132] Gde CC1,CC2i CDPsu koncentracija primećena u C1, C2 i DP, redom (u C1, zatim nakon rekonstitucije u 2 mL čiste vode). Ova reaktivnost je stoga mera koliko pojedinačnih mikromehurića i mikrokapljica u C1 i C2 koje se nalaze u obliku klastera u DP. Reaktivnost je takođe u korelaciji sa tim koliko su veliki ovi klasteri (tj. koliko pojedinačnih mikromehurića i mikrokapljica čini jedan klaster), vidi E2-5 za više detalja. Npr. ako onda nema grupisanja tada CDP= CC1+ CC2i R = 0% a ako svi mikromehurići i mikrokapljice u kompoziciji klastera formiraju jedan veliki klaster tada CDP~ 0 i R ~ 100%. Iz Coulter-ove analize C1 (nakon rekonstrukcije u 2 mL vode), C2 i DP, R mogu se lako izračunati.
[0133] Iako je Coulter-ova analiza pogodna za karakterizaciju ukupne koncentracije čestica i raspodele veličine u DP, ona sama, po sebi, ne pravi razliku između mikromehurića, mikrokapljica ili klastera; svi entiteti se broje i dimenzioniraju kao "čestica". Da bi se klasteri posebno razlikovali i karakterisali, neophodne su tehnike mikroskopije.
E1-4 Analiza slike čestica protoka
[0134] Analiza slike čestica protoka (FPIA) je potpuno automatizovana tehnika mikroskopije i analize slike [Sontum, PC. i Martinsen, E., Abstracts of Eur. Conf. Drug Deliv. Pharm. Tech., Sevilla (Španija), str. 47, # 25 (2004)]. Ukratko, mali alikvot analita (npr. C1, C2 ili DP) je razblažen/dispergovan u vodenom razblaživaču bez čestica (voda ili PBS) i homogenizovan kontinuiranim mešanjem. Poznati deo razblaženog uzorka je zatim izvučen kroz mernu ćeliju u instrumentu gde je fiksiran set mikrografa snimljen CCD kamerom sa stroboskopskim izvorom svetlosti. Čestice u svakom kadru se automatski izoluju i analiziraju pomoću softvera za analizu slike, a za svaku česticu se izračunavaju različiti morfološki parametri. Pored toga, prijavljena je koncentracija čestica. Od posebnog interesa za sadašnji pronalazak su parametri koji razlikuju slobodne mikromehurice ili mikrokapljice i klastere istih. U tu svrhu veličina čestica, opisana kao kružni ekvivalentni prečnik, i njihova kružnost su korišćeni kao standardni odgovori. Kružni ekvivalentni prečnik se definiše kao prečnik kruga sa ekvivalentnom površinom kao detektovana čestica. Pojam "kružnost" (C) ima svoje konvencionalno značenje u oblasti analize slike i definisan je na strani 12.
[0135] Pored numeričkih odgovora, instrument obezbeđuje reprezentativan izbor mikrografa za različite klase veličine; < 5 µm, 5 do 10 µm, 10 do 20 µm i 20 do 40 µm. Za prijavljene analize Sysmex 2100 instrument (Malvern Instruments Ltd.) je postavljen sa poljem visoke snage (20X) i merni opseg 0.7 do 40 µm je korišćen. Odgovarajuća zapremina uzorka je razblažena u vodi i homogenizovana stalnim mešanjem tokom cele analize.
[0136] Reprezentativni izbor mikrografa pojedinačnih klastera u klasi veličine između 5 i 10 µm, iz analize uzorka DP napravljenog sa C2 koji sadrži 3.5% stearilamina je prikazan na slici 2. Kao što se može primetiti, u ovoj klasi veličine sve detekcije osim jedne od 117 (tj. < 1%) su klasteri mikromehurić/mikrokapljica. Tabela 1 navodi brojčanu koncentraciju klastera uočenih u različitim klasama veličine za uzorke sa promenljivom količinom stearilamina (1.5 do 5.5 %) prikazane na slici 1. Kao što se može primetiti, potvrđujući rezultate na slici 1, koncentracija klastera na 1.5% stearilamin je bila zanemarljiv, na 3.5% značajan broj malih (tj. < 5 µm) i srednje (tj.5 - 10 µm) dimenzionisanih klastera je primećen a na 5.5% primećeno je smanjenje malih, i povećanje koncentracije srednjih i velikih (tj. >10 µm) klastera.
Tabela 1 Reaktivnost (R) i koncentracija (milioni/mL) klastera mikromehurić/mikrokapljica u različitim klasama veličine u kompoziciji klastera na tri nivoa elektrostatičke privlačnosti od promenljivih količina stearilamina (SA%) u stabilizacionoj membrani mikrokapljica.
E1- 5 Microskopija / Analiza slike
[0137] Kao alternativa FPIA analizi, može se koristiti tehnika ručne mikroskopije u kombinaciji sa softverom za analizu slike. U tu svrhu, korišćen je Malvern Morphology G3 sistem (Malvern Instruments Ltd.) sa 20X objektivom i opsegom merenja od 1.8 do 100 µm. U nekim slučajevima je korišćen 50X objektiv sa mernim opsegom od 0.5 do 40 µm. Ukratko, mali alikvot analita (npr. C1, C2 ili DP) je razblažen/dispergovan u vodenom razblaživaču bez čestica (npr. voda ili PBS) i homogenizovan. Razblaženi uzorak je zatim uveden u mikroskopsko staklo sa kanalićem (IBIDI µ-staklo, IBIDI GmBh), sa poznatom visinom kanalića od 400 µm i stavljen pod mikroskop. Instrument automatski skenira unapred podešenu oblast slajda i fiksni set mikrosnimaka snima CCD kamera. Čestice u svakom kadru se automatski izoluju i analiziraju pomoću softvera za analizu slike, a za svaku česticu se izračunavaju različiti morfološki parametri. Prijavljuje se ukupan broj čestica i iz poznate površine skeniranja i poznate visine kanalića može se izračunati koncentracija čestica u analitu. Što se tiče FPIA analize, prijavljen je kružni ekvivalentni prečnik i kružnost čestica. Mikrografi svih detektovanih čestica mogu se prikazati i proceniti ručnim, vizuelnim pregledom. Otuda se svi klasteri mogu izolovati od npr. slobodnih mikromehurića i klastera pune veličine a raspodela kružnosti može se konstruisati za klastere u svakom uzorku.
[0138] Ova metodologija se takođe može koristiti za karakterizaciju aktivirane populacije mehurića, odnosno kompozicije klastera nakon ultrazvučne aktivacije. U tu svrhu mikroskopsko staklo je potopljeno u vodu na 37 °C i insonirano 10s sa ATL 3-2 pretvarača (centralna frekvencija od 2.25 MHz) pri nominalnom MI od 0.8. Neposredno nakon aktivacije, slajd je stavljen pod mikroskop i analiza je ponovljena.
[0139] Tipični prajmeri izlaza iz ove analize prikazani su na slici 3 za C1 i C2 i slici 4 za DP pre i posle aktivacije. Kao što se može primetiti iz dijagrama rasejanja kružnosti u odnosu na prečnik, C1 i C2 pokazuju usku raspodelu veličine sa suštinski sfernim česticama, dok neaktivirani DP sadrže greben materijala sa nižom kružnošću uzrokovanom prisustvom klastera mikromehurića/mikrokapljica. Vizuelni pregled svih mikrosnimaka pokazuje da u čistim uzorcima C1 i C2 nisu uočeni mikromehurić/mikromehurić ili mikrokapljični/mikrokapljični aglomerati; sve detektovane čestice se sastoje od pojedinačnih sfernih entiteta. Rezultati za DP uzorak nakon UZ zračenja jasno pokazuju da su klasteri aktivirani i da imaju fazni pomak u velike (> 10 µm) gasovite mehuriće. Nisu primećeni veliki gasovi mehurići nakon ekvivalentnog insoniranja samo čistih C1 ili C2 uzoraka. Slika 5 prikazuje rezultate za celu populaciju klastera, izolovanu iz uzorka DP na slici 4. Kao što se može primetiti, klasteri se nalaze između ~3 do -10 µm i karakteriše ih kružnost < 0.9.
E1-6 Sonometrija
[0140] U cilju proučavanja i demonstracije karakteristika mehurića sa velikim faznim pomakom koji nastaju nakon aktivacije klastera mikromehurić/mikrokapljica prisutnih u kompoziciji, analitička metodologija koja omogućava određivanje koncentracije aktiviranog mehurića, veličine i dinamike nakon aktivacije u relevantnom in-vitro sistemu je razvijena. U tekstu ispod je detaljno opisan postupak određivanje veličine aktiviranih mehurića in vitro, koji proizvodi merenje koncentracije aktiviranih mehurića i raspodele veličine od 4 do 80 mikrona u prečniku tokom vremena. Merenja se vrše svakih 15 sekundi u periodu koji pokriva vreme aktiviranog rasta i rastvaranja mehurića.
[0141] Za merenje dinamike raspodele veličine aktivirane populacije velikih mehurića in vitro korišćena je tehnika akustične transmisije. Akustična tehnika zahteva merenje slabljenja u opsegu frekvencija, koje su za red veličine niže (oko 0.2 MHz) od onih koje se koriste za konvencionalno snimanje (1-10 MHz). Naknadna konverzija u aktiviranu informaciju o veličini mehurića zasnovana je na teoriji rezonance mehurića i rešenju rezultujuće Fredholm-ove integralne jednačine prve vrste, korišćenjem standardnih tehnika. Povezani podaci o disperziji brzine se koriste za obezbeđivanje kvantitativne metrike kvaliteta pomoću koje se procenjuje učinak postupka inverzije. Tehnika je zasnovana na metodama opisanim u sonarnoj literaturi za dimenzionisanje populacije mehurića u gornjem okeanu, sa nebitnim modifikacijama da bi odgovarale problemu koji je pri ruci.
[0142] Da bi se dobile informacije o veličini aktiviranog mehurića, glavne akustičke osobine se mere kao funkcija frekvencije. Ovi podaci se zatim invertuju da bi se pružile informacije o veličini. Inverzija zahteva tačan model interakcije aktiviranih mehurića sa upadnim zvučnim poljem. Brojni modeli za širenje nelinearnih talasa pritiska u mehurastim tečnostima su dostupni u literaturi. Ovde ograničavamo merenja na širenje akustičnih talasa male amplitude, što efektivno postavlja merenja u linearnom regionu, pa se stoga koristi linearni model. Takođe ćemo ograničiti razmatranje i merenja na gustine mehurića za koje je Foldy-jeva aproksimacija [Phys. Rev. B, tom.67, str.107-119, 1945] primenljiva. Relevantna teorija je predstavljena u [J. Acoust. Soc. Am 85, str.732-746, 1989].
[0143] Širokopojasni impuls niske frekvencije (Panametrics Videoscan SN:267202 deo #V1012, 0.25 MHz centralna frekvencija) se usmerava kroz ćeliju uzorka, odbija se od čelične ploče (približno 25 cm od niskofrekventnog pretvarača), širi se nazad kroz uzorak i primljen od istog pretvarača. Tako puls prolazi kroz ćeliju uzorka dva puta. Unutrašnje dimenzije ćelije za uzorke su: širina 7.4 cm, debljina 3.1 cm, visina 10.3 cm, što daje ukupan zapreminski kapacitet od 236.28 cm<3>. Ćelija je zatvorena i ne sadrži prostor za gornji deo tako da se može održavati na kontrolisanoj zasićenosti gasom. Temperatura za obavljanje merenja je izabrana da bude 37 °C da bi se oponašala telesna temperatura. Zasićenost gasom u krvi in vivo je približno 98 kPa u arterijskoj krvi i 90 kPa u venskoj krvi. Zajedno sa sistemskim nadpritiskom (~ 100 mmHg) ovo obezbeđuje okruženje zasićenosti gasom od približno 85% in vivo. Zasićenost ćelije uzorka gasom je kontrolisana na 85% da bi se oponašalo okruženje in vivo. Uključeno je lagano mešanje da bi se obezbedilo adekvatno mešanje. Mylar membrane se koriste za obezbeđivanje akustički transparentnih prozora. Izvor niske frekvencije ne aktivira klastere. Aktivaciju obezbeđuje visokofrekventni pretvarač. Propusnosni opseg pulsa niske frekvencije može da pokrije opseg veličine aktiviranog mehurića od 4 do 80 µm u prečniku.
[0144] Procedura inverzije je loše postavljena u Hadamar-ovom smislu i stoga zahteva optimizaciju odnosa signal-šum podataka. Stoga je prikladno da se u proseku postigne onoliko koliko je to praktično moguće. 200 uzastopnih rf A-linijskih signala se snima na frekvenciji uzorkovanja od 10 MHz do nominalnih 8 bita i sadrže jedan skup mernih podataka. Frekvencija ponavljanja impulsa transduktora za prenos je podešena na 200 Hz, tako da je za snimanje podataka potrebna jedna sekunda. Skupovi podataka se snimaju svakih 15 sekundi i preuzimaju na računar radi naknadne numeričke inverzije. 45 takvih skupova mernih podataka obuhvata jedan niz, obuhvatajući ukupno 11 minuta.
[0145] Invertovanje izmerenih primarnih akustičkih svojstava da bi se dobila informacija o aktiviranoj koncentraciji mehurića i raspodeli veličine zasnovano je na jednostavnom rešenju konačnih elemenata koje su predložili Commander i McDonald [J Acoust. Soc. Am.89 str. 592-597, 1991]. Detalji korišćenog algoritma inverzije mogu se naći u ["Solving least squares problems", Prentice Hall, poglavlje 23, str.161, 1974].
[0146] Iz akustičkih merenja, slabljenje zvuka i brzina kao funkcija frekvencije mogu se izračunati. Podaci o brzini mogu se smatrati nezavisnim od podataka o slabljenju. Za izračunavanje distribucije veličine aktiviranog mehurića koriste se samo podaci o slabljenju, podaci o brzini se mogu koristiti kao osnova za nezavisnu proveru procenjene raspodele aktivirane veličine mehurića. Brzina mehuraste tečnosti je veoma disperzivna oko rezonantne frekvencije. Ovaj fenomen se može koristiti za izvođenje metrike 'kvaliteta' kako bi se kvantitativno zaključila tačnost ili pouzdanost procenjene aktivirane raspodele veličine mehurića, nakon [IEEE J. of Oceanic Engineering, tom.23, br.3, 1998].
[0147] Primarni izveštaji iz gore opisane meteorologije su broj aktiviranog mehurića i zapreminska koncentracija, i prečnik mehurića ponderisan brojem i zapreminom, oba u odnosu na vreme nakon aktivacije.
[0148] Primenom sonometrijske analize analiziran je uzorak kompozicije klastera prikazan u E1-2. Slika 6 (leva strana) prikazuje aktiviranu zapreminsku koncentraciju mehurića (% v/v) u mernoj ćeliji (y-osa), a slika 6 (desna strana) prikazuje srednji prečnik ponderisan brojem i zapreminom (y-osa), oba kao funkcija vremena nakon aktivacije (x-osa). Mera kvaliteta je potvrdila da su predstavljene raspodele veličine robusne. Kao što se može primetiti na slici 6 dobijeni rezultati potvrđuju da se klasteri u kompoziciji aktiviraju u okviru željenog MI opsega i stvaraju rast mehurića u okviru željenog opsega veličine i dinamike u relevantnom in-vitro mernom sistemu.
[0149] U sledećim primerima, primarni odgovori procenjeni iz ove analize su maksimalna zapremina aktiviranog mehurića po zapremini mikrokapljice ili po zapremini DP, i zapreminski ponderisana srednja vrednost prečnika pri maksimalnoj aktiviranoj zapremini.
E1- 7 Stabilnost klastera u kompoziciji klastera
[0150] Klasteri u DP se formiraju i zadržavaju elektrostatičkim privlačenjem između mikromehurića i mikrokapljica. Ove sile su konačne i klasteri se mogu raspasti nakon formiranja različitim putevima/uticajima kao što su mehanički stres ili toplotno (Brownian-ovo) kretanje.
[0151] Za preciznu i tačnu karakterizaciju, važno je da klasteri ostanu stabilni tokom vremena analize. Ova stabilnost je ispitana svim gore opisanim metodologijama. Da bi se procenila stabilnost, 3 do 5 analiza je ponovljeno na jednom uzorku DP u vremenskom periodu od > 5 minuta. Nije primećena značajna promena ni u koncentraciji ni u veličini u ovim replikama, što dokazuje da su mikromehurići, mikrokapljice i klasteri stabilni tokom > 5 minuta pod navedenim analitičkim uslovima, odnosno nakon razblaživanja u PBS ili vodi i uz kontinuiranu homogenizaciju (mešanje).
[0152] Za primenu kao medicinskog leka neophodno je da se vitalne karakteristike proizvoda čuvaju tokom vremena koje omogućava primenu. Stabilnost DP nakon pripreme je proučavana različitim tehnikama uključujući FPIA i sonometriju. Slika 7 prikazuje koncentraciju klastera između 5 do 10 µm iz FPIA analize i maksimalnu aktiviranu zapreminu po zapremini mikrokapljice iz sonometrijske analize u dva DP uzorka, čuvana na sobnoj temperaturi i pritisku, u zavisnosti od vremena nakon pripreme. Tokom FPIA analize nisu primećeni dokazi o spontanoj aktivaciji. Kao što se može primetiti na slici 7, zanemarljiva promena sadržaja klastera i zapremine aktiviranog mehurića primećena je tokom perioda od 1 h nakon pripreme DP.
E1-9 Aspekti formulacije
[0153] Brojni različiti aspekti formulacije mogu se istražiti za kontrolu sadržaja i veličine klastera u DP-u i za ciljanje optimalnih svojstava. Parametri koji se mogu koristiti za projektovanje sadržaja klastera i raspodele veličine uključuju, ali nisu ograničeni na; razlika u površinskom naelektrisanju između mikromehurića i mikrokapljica (npr. SA% kao što je prikazano u E1-3): veličina mikrokapljica C2: pH: koncentracija TRIS-a u C2: i koncentracija mikromehurića i mikrokapljica. Pored toga, hemijska degradacija komponenti, npr. tokom dužeg skladištenja na visokim temperaturama, može uticati na sposobnost C1 i C2 da formiraju klastere tokom pripreme DP. Kratak opis ovih aspekata dat je u nastavku.
[0154] Veličina mikrokapljice - Uzorci C2 sa promenljivom veličinom mikrokapljica su napravljeni od jedne serije sirove emulzije centrifugiranjem i kontrolnim uklanjanjem supernatanta i/ili sedimenta nakon različitih vremena centrifugiranja. Nakon podešavanja veličine, koncentracija svih uzoraka je podešena na istu zapreminsku koncentraciju mikrokapljica (približno 4 µl mikrokapljica/mL). Uzorci C2 sa veličinom mikrokapljica kao zapreminskim srednjim prečnikom od 1.8 µm, 2.4 µm i 3.1 µm su pripremljeni i korišćeni za pripremu DP sa bočicama iz jedne serije C1, a reaktivnost je izmerena Coulter-ovim brojanjem. Utvrđeno je da se reaktivnost povećava sa smanjenjem veličine mikrokapljice, sa 27% pri 3.1 µm, na 49% pri 2.4 µm i 78% pri 1.8 µm. Smanjenje veličine mikrokapljice stoga povećava formiranje klastera nakon mešanja C1 i C2.
[0155] pH - dve bočice DP su pripremljene do pH od 6.6 i dve bočice su pripremljene do pH od 6.1. Dobijena reaktivnost, merena Coulter-ovim brojanjem, bila je 30-32% i 51-52% za uzorke sa pH 6.6. i pH 6.1, redom. Smanjenje pH stoga povećava formiranje klastera.
[0156] Koncentracija TRIS - za tri uzorka C2 iz iste serije, koncentracija TRIS je varirala od 1 mM do 10 mM. Korišćenjem jedne serije C1, svaki uzorak je korišćen za pripremu DP i koncentracija klastera između 5 do 10 µm je merena FPIA analizom na svim uzorcima. Utvrđeno je da se formiranje klastera smanjuje sa povećanjem koncentracije TRIS-a, uz smanjenje koncentracije klastera sa 6.7 na 3.7 miliona/mL, idući od 1 do 10 mM TRIS u C2.
[0157] Koncentracija mikrokapljica - Formiranje klastera pri kombinovanju C1 i C2 je takođe funkcija koncentracije mikromehurića i mikrokapljica u dve komponente, tj. odnosa mikromehurića i mikrokapljica. Iz intuitivne perspektive, čini se verovatnim da bi u sistemu gde je ukupno površinsko naelektrisanje predstavljeno od strane dve komponente u potpunosti balansirane, rezultat bi bio da bi svi mikromehurići i sve mikrokapljice formirale nekoliko, veoma velikih klastera (tj. što bi dovelo do potpunog kolapsa sistema). Otkrili smo da u cilju generisanja kontrolisanog i ciljanog grupisanja gde se većina mikrokapljica nalazi u obliku klastera, i gde su formirani klasteri prihvatljive veličine, ukupno naelektrisanje koje predstavljaju mikromehurići treba da bude veće od ukupnog naelektrisanje koje predstavljaju mikrokapljice. Međutim, odnos mikrokapljica/mikromehurić takođe mora biti iznad određenog praga da bi se formirala značajna količina klastera. Rezultati u tabeli 2 pokazuju efekat koncentracije mikrokapljica u C2, kada se koristi za pripremu DP sa fiksnom koncentracijom mikromehurića u C1 (8 µl mikrokapljica/mL). Kao što se može primetiti, nalazimo snažno povećanje grupisanja u pojmovima reaktivnosti i snažno povećanje srednjeg prečnika klastera, sa povećanjem koncentracije mikrokapljica koje se dodaju fiksnoj količini mikromehurića.
Tabela 2 Reaktivnost (R) iz Coulter-ove analize i srednjeg prečnika klastera i iz mikroskopije/analize slike u kompozicijama klastera napravljenim sa C2 sa promenljivom koncentracijom mikrokapljica (C).
[0158] Termička degradacija - SA komponenta u fosfolipidnoj membrani koja stabilizuje mikrokapljice u C2 je sklona termičkoj degradaciji pri dužem skladištenju na povišenim temperaturama, gubeći svoje pozitivno naelektrisanje u procesu degradacije. Sposobnost formiranja klastera mikromehurića/mikrokapljica u kombinaciji sa C1 je stoga smanjena. Dva uzorka C1 su stavljena u kontrolisane uslove skladištenja na 4 i 30 °C tokom tri meseca i korišćena za pripremu DP na kome je FPIA analizom meren sadržaj klastera između 5 i 10 µm. Uočeni sadržaj klastera bio je 29.6 i 0.2 miliona/mL za uskladištene uzorke na 4 i 30 °C, redom.
E1-10 Veličina aktiviranih mehurića
[0159] Veličina aktiviranih mehurića može biti od značaja za biološke atribute administrirane kompozicije, npr. aspekte bezbednosti i efikasnosti. Dok je prirodno zavisila od veličine mikrokapljica u C2, aktivirana veličina mehurića je takođe snažno povezana sa veličinom klastera. Slika 8 prikazuje kovarijansu između reaktivnosti sa Coulter-ovom analizom i prečnika aktiviranog mehurića sonometrijom, merene na uzorcima koji su detaljno prikazani u Tabeli 4, E2-3. Kao što se može primetiti, prečnik aktiviranog mehurića se povećava sa približno 20 µm pri niskoj reaktivnosti (tj. od malih klastera) do priblžno 50 µm pri visokoj reaktivnosti (tj. iz velikih klastera).
Primer 2 (E2) - In-vivo studije na atribute klastera u odnosu na efikasnost proizvoda
E2-1 Uvod
[0160] Pošto je u E1 pokazao kako se mere važne karakteristike sadašnjeg pronalaska; tj. za klastere u kompoziciji klastera, kao i kako da se njima manipuliše i kontroliše, sadašnji primer istražuje koje karakteristike klastera treba da budu ciljane za optimalnu in vivo efikasnost. Da bi se postigao ovaj cilj, obavljene su dve opsežne in vivo studije (studija A i studija B) gde je mereno prebojavanje UZ kontrastom dobijeno nakon administriranja većeg broja DP uzoraka sa različitim karakteristikama u modelu miokarda psa otvorenog grudnog koša. Prebojavanje miokarda UZ signala primećeno je nakon i.v. injekcija i aktivacija kompozicije u levoj komori. Nakon aktivacije veliki mehurići sa faznim pomakom su zarobljeni u kapilarnoj mreži miokarda i UZ prebojavanje kontrastom je direktna mera količine deponovanih aktiviranih mehurića, a samim tim i mera efikasnosti administriranog uzorka.
E2-2 Ispitivane komponente i kompozicije
[0161] 1. komponenta (C1) u ispitivanim kompozicijama u ovom primeru je opisana u P1-2.
[0162] 2. komponenta (C2) u svim ispitivanim kompozicijama u ovom primeru sastojala se od mikrokapljica perfluorometil-ciklopentana (pFMCP) stabilisanih sa membranom 1,2-distearoilsn-glicerol-3-fosfoholina (DSPC) sa stearilaminom (SA) dodatim da obezbedi pozitivno površinsko naelektrisanje. Mikrokapljice u C2 su rastvorene u TRIS puferu.
[0163] Da bi se dobila značajna varijansa u karakteristikama klastera varijable formulacije klaster kompozicije (DP), kao što su sadržaj SA, veličina mikrokapljica, koncentracija mikrokapljica, koncentracija TRIS-a i pH su varirali na kontrolisan način, kao što je opisano u E1.
[0164] U Studiji A veličina mikrokapljice, sadržaj SA (% mol/mol) i pH varirali su u seriji od 15 uzoraka kao što je detaljno prikazano u tabeli 3. Za ove uzorke, koncentracije mikrokapljice i TRIS su održavane konstantnim na približno 4 µl/mL i 5 mM.
Tabela 3 Varijanca u karakteristikama komponente C2 istražene u studiji A
[0165] U studiji B koncentracija mikrokapljice i TRIS-a i prečnik mikrokapljice varirali su u seriji od 15 uzoraka. Pored toga, jedan uzorak je termički degradiran putem skladištenja od 3 meseca na 40°C. Ispitani uzorci C2 su detaljno prikazani u tabeli 4. Za ove uzorke pH je održavana konstantnom na 6.2, a sadržaj SA je održavan konstantnim na 3%.
Tabela 4 Varijanca u karakteristikama komponente C2 ispitanih u studiji B
E2-3 In-vitro karakterizacija
[0166] Svi uzorci detaljno prikazani u tabelama 3 i 4 su korišćeni za pripremu i karakterizaciju DP kao što je detaljno opisano u E1. Za sve uzorke sadržaj i veličina klastera je određena FPIA analizom a sadržaj i veličina aktiviranih mehurića je određena sonometrijom. Pored toga, za uzorke date u tabeli 3, reaktivnost je merena Coulter-ovim brojanjem.
E2-4 In-vivo procedure
[0167] Za obe studije, sledeće in-vivo procedure su primenjene.
Rukovanje životinjama:
[0168] Životinje (mešanac ili mešanac određenih sorti) stigao je ujutro na dan eksperimenta. Nije bilo aklimatizacije. Anestezija je izazvana pentobarbitalom (12 - 25 mg kg<-1>i.v.) i fentanilom (1.5 - 2.5 µg kg<-1>) i umetnuta je endotrahealna cev. Životinja je prebačena na operacioni sto i stavljena je na mehaničku ventilaciju vazduha u prostoriji sa kontrolisanom zapreminom (New England mod. 101 ventilator za velike životinje). Kada je potrebno, vazduh obogaćen sa O2može se davati tokom nekih vremenskih perioda, mežutim ne u bilo kom od vremenskih intervala od 10 minuta pre do 11 minuta nakon injekcija ispitivane supstance.
Anestezija:
[0169] Životinja je držana u opštoj anesteziji kontinuiranom i.v. infuzija fentanila (20 µg kg<-1>h<-1>) kontrolisana infuzionom pumpom šprica (IVAC model P2000), i pentobarbitala (10 mg kg<-1>h<-1>) putem kapanje. Stopa administriranih anestetika može se donekle prilagoditi od nominalne vrednosti da bi se obezbedila konstantna dubina anestezije. Dubina anestezije praćena je fiziološkim snimcima (otkucaji srca, krvni pritisak) i opštim posmatranjem životinja (znaci mišićne aktivnosti, napori disanja, refleksi).
Telesna temperatura:
[0170] Telesna temperatura je održavana konstantnom na 38° sa Harvard-ovom homeotermnom povratnom kontrolnom jedinicom.
Hirurgija i instrumentacija:
[0171] Swann-Ganz-ov kateter za merenje pritiska je ubačen u plućnu arteriju preko femoralne vene i reza u preponama. Kateter senzora sistemskog arterijskog pritiska je ubačen u femoralnu arteriju istim rezom. Urađena je sternotomija srednje linije, i uklonjen je prednji perikard. Srce je suspendovano u perikardijalnoj šupljini da bi se izbegla kompresija atrija i vena. Venflon™ kanila od 0.8 mm je umetnuta u desnu cefaličnu venu proksimalno od zgloba lakta za injekcije ispitivanih supstanci.
Fiziološki monitoring:
[0172] Pritisak u arterijskoj i plućnoj arteriji mereni su senzorima SensoNor 840 (Sensonor AS, Horten, Norveška) povezanim sa prilagođenim most pojačivačima sa kompenzacijom zanošenja (MAX 420, Maxim Integrated Products, Sunnyvale CA). Izlazi pojačivača su uzorkovani na 500 Hz i napajani na 8-kanalnu 12-bitnu ADC karticu (CIO-DAS 08, kompjuterske ploče) za dalju obradu pomoću PC softvera (Turbo Pascal 5.0, Borland International). Udahnuti i izdahnuti sadržaj O2i CO2će se kontinuirano pratiti (Capnomac Ultima respiratorni gasni analizator) ali se neće snimati.
[0173] Sledeće varijable se izračunavaju, prikazuju i snimaju za svaki otkucaj srca: a) sistolni, dijastolni i pravi srednji sistemski arterijski pritisak (SAP - systemic arterial pressure), b) pravi srednji plućni arterijski pritisak (PAP - pulmonary arterial pressure) i c) trenutni broj otkucaja srca izveden iz automatizovane (po softveru) detekcije EKG r-talasa.
Snimanje:
[0174] Srednje-papilarni prikaz srca u kratkoj osovini po srednjoj liniji je snimljen sa ATL HDI-5000 skenerom. Korišćen je P3-2 transduktor, skener je radio u konvencionalnom osnovnom B-režimu sa dve fokusne zone, pri najvećoj brzini kadrova i maksimalnoj izlaznoj snazi (MI ≈ 1.0). Mekana silikonska gumena podloga od 30 mm je korišćena između površine sonde i epikarda. Svi interfejsi materijala su prekriveni akustičnim kontaktnim gelom na bazi vode.
[0175] Dubina slike je podešena na najmanju vrednost koja će obuhvatiti celo srce. Korišćen je dinamički opseg od 50 dB. Par digitalnih slika iz krajnje dijastole i krajnje sistole je sačuvan u svakom određenom trenutku u vremenu. Skener je ostavljen da neprekidno radi, osim kratkih perioda opoziva kinematografske petlje radi čuvanja slika. Digitalne slike se prenose na magnetooptički disk nakon završetka eksperimentalne sesije. PAL VHS video snimak ekrana je izveden da dokumentuje procedure. Identitet životinje i sve injekcije (broj injekcije, supstanca i doza) treba da budu označeni na ekranu.
Tehnike ubrizgavanja i doziranje:
[0176] Pre svake injekcije, nova bočica C1 je rekonstituisana sa 2 mL C2. Željena doza DP (200µl) je povučena i razblažena do 2,5 mL sa 50mg/mL manitola puferisanof sa TRIS (10 mM, pH 7,4). Administrirana doza je bila ekvivalentna 10 µl DP/kg b.w.., ekvivalentno nominalno 0.04 µl pFMCP mikrokapljice i 0.08 µl HEPS/PFB mikromehurića po kg. b.w. Injekcije se izvode preko Venflon™ kanile opremljene gumenim membranskim priključkom. Mrtvi prostor kanila i otvora (oko 0.1 mL) je ispran sa 5 mL izotoničnog rastvoroa soli u vodi odmah nakon svake injekcije.
Eksperimentalne procedure:
[0177] Injekcije DP se vrše preko desne cefalične vene, a dobijeni efekat kontrasta miokarda se kvantifikuje na 90 sekundi, 3, 5, 7 i 11 minuta. Očitavanje osnovne linije je obavljeno pre svake injekcije. Najmanje 20 minuta je dozvoljeno između injekcija da bi se smanjili potencijalni efekti prenošenja.
Analiza podataka i izveštavanje:
[0178] Za svaku od navedenih vremenskih tačaka, efekat kontrasta miokarda je očitan iz velikog regiona od interesa u prednjem miokardu (MathLab softver), tabelarno prikazan u odnosu na vreme i grafički ilustrovan. Kontrastni efekat na 90 sekundi je korišćen kao primarna mera efikasnosti za svaku injekciju. Vrednosti intenziteta kontrasta su prijavljene u dB i iz ovih vrednosti je izračunato linearno pojačanje (jedinice sive skale, GS).
E2-5 Rezultati iz studije A
[0179] Rezultati in-vitro karakterizacije i prebojavanje miokarda uočeni za 15 ispitivanih kompozicija su detaljno prikazani u tabeli 5. Nekoliko važnih korelacija koje razjašnjavaju prirodu i karakteristike sistema mogu se izdvojiti iz ovih podataka.
[0180] Najvažnije, nalazimo optimum u korelaciji reaktivnost u odnosu na prebojavanje, kao što je prikazano na slici 9. Ova kovarijansa jasno pokazuje da postoji optimalna ravnoteža u formiranju klastera u DP.
[0181] Drugo, nalazimo da je veličina formiranih klastera takođe snažno povezana sa reaktivnošću sistema, kao što je prikazano na slici 10. Kao što se može primetiti sa ove slike, samo mali klasteri (tj. < 5 um) i srednje veličine (tj.5-10 µm) se formiraju pri relativno niskim nivoima reaktivnosti (npr. < 20%). Sa povećanjem reaktivnosti, počinju da se formiraju veći klasteri; na R > približno 20%, klasteri od 10-20 µm počinju da se formiraju i na R > približno 50%, klasteri od 20-40 µm počinju da se formiraju. Kada se formiraju veći klasteri, to je na štetu manjih i srednjih klastera; nalazimo jasan optimum u sadržaju u odnosu na reaktivnost za koncentraciju klastera < 5 µm i 5 -10 µm.
[0182] U kombinaciji, rezultati prikazani na slikama 9 i 10 pokazuju da je formiranje većih klastera štetno za efikasnost kompozicije i da se potencijal grupisanja mora u skladu s tim izbalansirati.
[0183] Iako ne želimo da se držimo teoretskih spekulacija, mogući razlozi za ove efekte mogu biti 1) da veće mase sadržane u većim klasterima sprečavaju ili smanjuju efikasnost aktivacije ili 2) da se veći klasteri zadržavaju u plućnoj cirkulaciji nakon i.v. injekcije i samim tim ne stižu do leve komore gde se izvodi aktivacija.
Tabela 5 Rezultati iz in-vitro karakterizacije i in-vivo izvođenja ispitivanih kompozicija - Studija A (videti tekst)
E2-6 Rezultati iz studije B
[0184] Rezultati in-vitro karakterizacije i prebojavanja miokarda uočeni za 15 ispitivanih kompozicija su detaljno prikazani u Tabeli 6. Nekoliko važnih korelacija koje razjašnjavaju prirodu i karakteristike sistema mogu se izdvojiti iz ovih podataka.
[0185] Korelacije između koncentracije klastera između 5 do 10 µm i maksimalne zapremine aktiviranog mehurića uočena in-vitro u odnosu na prebojavanje miokarda uočenog in-vivo su prikazane na slici 11.
[0186] Primeri 20 do 27 dati u WO99/53963 takože navode podatke za modelu identičnom onom opisanom u E2-4 i primenjene procedure su identične. Dodatno doze u vidu gasa i zapremine mikrokapljica administrirane po kg b.w.. su uporedive između ovih studija; WO99/53963 navodi 0.35 µl gasa i 0.04 µl mikrokapljice/kg. b.w.. dok su u trenutnom primeru efektivne doze bile 0.08 µl gasa i 0.026 do 0.059 µl mikrokapljica/kg t. Za poređenje, opseg prebojavanja koji je uočen i citiran u primerima 20 do 27 u WO99/53963 je uključen na slici 11. Prebojavanje u ovom primeru je dato kao dB, stoga, za ovo poređenje vrednosti linearnog pojačanja su ponovo izračunate iz podataka koji se nalaze u tabeli 4, primeri 20 do 27, strana 63 u WO99/53963 prema kao; Linearno pojačanje = 10(<dB/10>)
[0187] Kao što se može primetiti sa slike 11, in-vivo pojačanje je u dobroj korelaciji sa dva in vitro parametra, što dokazuje njihovu relevantnost kao prediktora za in vivo performanse; tj. klasteri sadrže aktivnu komponentu u DP. Dodatno, maksimalna vrednost za linearno prebojavanje miokarda prijavljena u WO/9953963 je bila 51 naspram 693 u sadašnjoj studiji. Primenjujući koncept predmetnog pronalaska zatim; pripremanjem kompozicije od C1 i C2 pre administriranja, stoga formirajući klastere mikromehurić/mikrokapljica, suprotno zajedničkom ubrizgavanju dve komponente kao je podučavano u WO/9953963, omogućava povećanje efikasnosti > 10-puta.
Tabela 6 Rezultati iz in-vitro karakterizacije i in-vivo izvođenja ispitivanih kompozicija – Studija B (videti tekst).
E2-7 Multivarijantna analiza, veličina ciljnog klastera i diferencijacija kružnosti
[0188] Rezultati za sadržaj klastera u različitim klasama veličine i in vivo prebojavanju, za sve podatke prijavljene u E2-5 i E2-6, omogućavaju statističku procenu doprinosa različitih klasa veličine klastera in-vivo efikasnosti. U tu svrhu je izvršena multivarijantna analiza principa komponenti. Korelacija između sadržaja u različitim klasama veličine klastera (X) i prebojavanju (Y) je određena parcijalnom regresijom najmanjih kvadrata (PLSR - partial least squares regression). PLSR algoritam diskriminiše šum da bi izdvojio i definisao prave korelacije. Validacija PLSR modela je izvršena primenom pune unakrsne validacije (CV - cross validation). Procedura CV zadržava jedan uzorak van nakon čega sledi testiranje preciznosti modela procenom (predviđanjem) Y za isključeni uzorak i poređenjem sa izmerenim Y. Procedura je ponovljen za svaki uzorak, a broj modela je bio jednak broju uzoraka. Upoređivanjem svih modela izvedenih unakrsnom validacijom, značajnost X varijabli je određena procenom varijacije koeficijenata regresije koji potiču iz svakog modela (p=0.05). Konačni model je razvijen od svih 30 uzoraka.
[0189] Tačnost i pouzdanost modela je urađena poređenjem predviđenog prebojavanja i izmerenog prebojavanja, a pouzdani modeli su verifikovani klasičnim statističkim procenama kvaliteta (r, RMSEC, RMSEP). Procena dodatnih statističkih parametara kao poluge modela i udaljenosti uzorka prema modelu zaključila je da nikakvi kritični odstupnici nisu uticali na rešenja modela. Unscrambler softver v.9.8, Camo ASA, je korišćen za statističku analizu.
[0190] Rezultati iz ove analize su prikazani na slici 12. Kao što može biti primećeno statistički značajan doprinos prebojavanju miokarda je pronađen za klastere < 5 µm i, još jači, za klastere između 5 do 10 µm, potvrđujući dvodimenzionalnu analizu prikazanu na slici 11. Kluster između 10 do 20 µm ne doprinosi značajno prebojavanju, niti klasteri između 20 do 40 µm, poslednjim je čak naznačeno da imaju negativan doprinos, što potvrđuje rezultate prikazane na slikama 9 i 10. Rezultati pokazuju da formiranje većih klastera smanjuje funkcionalnost koncepta jer ova formacija smanjuje koncentraciju funkcionalnih klastera ispod 10 µm.
[0191] Uzorak srednje reaktivnosti (R = 46%) prikazan u tabeli 2 predstavlja DP sa atributima klastera koji treba da budu ciljani. Slika 13 prikazuje veličinu klastera i raspodelu kružnosti ovog uzorka. Kao što se može primetiti, klasteri u ovom uzorku su između ~3 do -10 µm i pokazuju kružnost manju od 0.9.
E2-8 Zaključci
[0192] Prema podacima i diskusijama detaljno datim u E1 i E2 pokazali smo da
• Formiranje klastera mikromehurić/mikrokapljica nakon kombinacije 1. komponente i 2.
komponente, tj. u kompoziciji klastera ili farmaceutskoj kompoziciji, je za njegovu nameravanu funkcionalnost in-vivo.
• Ciljani atributi klastera u pogledu veličine su manje od 10 µm, a razlikovanje od slobodnih mikromehurića/mikrokapljica može se označiti kružnošću < 0.9.
Primer 3 (E3) – Veličina aktiviranih mehurića in-vivo
E3-1 Uvod
[0193] U cilju proučavanja i demonstracije karakteristika mehurića velikog faznog pomaka koji nastaju nakon aktivacije klastera mikromehurić/mikrokapljica prisutnih u kompoziciji, razvijena je metodologija koja omogućava in-vivo određivanje veličine i dinamike aktiviranog mehurića u relevantnom životinjskom modelu.
E3-2 Ispitivane komponente i kompozicije
[0194] Detalji za ispitivane kompozicije u ovoj studiji su dati u E1-2.
E3-3 Metodologija
[0195] Merenje raspodele veličine aktiviranog mehurića i prinosa aktivacije izvršeno je na modelu psa. Studiju je odobrio lokalni komitet za dobrobit životinja. Kanila je postavljena u aortu da bi se omogućio protok krvi kroz ekstrakorporalnu mernu komoru koja vrši određivanje veličine akustičnog mehurića. Jedinjenje je administrirano intravenskom injekcijom pri 10 µl DP/kg. b.w.. i aktivacija je predviđena kliničkim ultrazvučnim skenerom snimanjem srčanih komora.
[0196] Da bi se obezbedili podaci o konzistentnosti, jedinjenje je takođe administrirano preko kanile leve pretkomore sa akustičnom aktivacijom u kanili, čime su obezbeđeni podaci koji se mogu direktno uporediti sa istom administracijom (aktivacija u kanili) u in-vitro sistemu za određivanje veličine mehurića.
[0197] Razvijen je matematički model za izračunavanje zapremine aktiviranih mehurića oslobođenih iz merenja u ekstrakorporalnoj mernoj komori. Rezultati modela su validirani ubrizgavanjem aktiviranih mehurića u levu pretkomoru preko kanile i poređenjem rezultata sa istom primenom u in-vitro sistemu merenja.
[0198] Najmanje 15 minuta je dozvoljeno između svakog doziranja. Ubrizgavanja su izvedena sa iglom od 18 G preko gumenog membranskog priključka na forelimb Venflon<™>i.v. kanili. Usled niskih nivoa doze, sve i.v. injekcije su date nakon razblaženja DP od 1:10 sa vodenim manitol/ TRIS rastvorom. Injekcije su date u oko 5 sekundi, zatim isprane sa slanim rastvorom. U nekim slučajevima, injekcije su vršene u levu pretkomoru srca preko kratkog polietilenskog katetera, bilo sa ili bez prethodne aktivacije leka ultrazvukom ex vivo. Injekcije u levu pretkomoru su bile spore (20 sekundi) da bi simulisale vremensku disperziju bolusa tokom normalnog prolaza pluća. Zbog potrebe za razblaživanjem ubrizganog uzorka da bi ex vivo ultrazvučna ekspozicija prodrla u tečnost, atrijalne injekcije su dalje razblažene izotoničnim rastvorom soli u vodi do ukupne zapremine od 20 mL.
[0199] Telesna temperatura je održavana konstantnom na 38 stepeni C pomoću Harvard-ove homeotermne kontrolne jedinice (senzor rektalne temperature koji kontroliše električni pokrivač za grejanje). Swann-Ganz-ov kateter za merenje pritiska i praćenje minutnog volumena srca (Baxter Vigilance Continuous Cardiac Output (CCO) monitor) je ubačen u plućnu arteriju preko femoralne vene i reza u preponama. Kateter senzora sistemskog arterijskog pritiska je ubačen u femoralnu arteriju preko istog reza. Venflon<™>kanila od 1.4-mm je umetnuta u u desnu cefaličnu venu proksimalno od lakatnog zgloba, za ubrizgavanje ispitivanih supstanci. Urađena je sternotomija po sredini, a PEEP je primenjen na izlaz respiratora pri ulasku u pleuralne prostore. Prednji perikard je uklonjen, a srce je suspendovano šivanjem ruba preostalog perikarda za ivice rane. Aurikularni dodatak leve pretkomore je kanuliran za injekcije aktiviranog DP, zaobilazeći plućnu cirkulaciju.
[0200] Životinja je potpuno antikoagulirana jednom intravenskom injekcijom heparina (1000 i. u./kg telesne mase) nakon što je postignuta potpuna hirurška hemostaza, a pre pokretanja ekstrakorporalne cirkulacije. Ekstrakorporalni šant i povezana cevčica su napunjeni izotoničnim rastvorom soli i sav vazduh je evakuisan iz sistema pre nego što su uspostavljene veze sa karotidnim i jugularnim kateterima.
[0201] Pritisak unutar komore za akustičko merenje proveravan je u redovnim intervalima kratkim povezivanjem transduktora pritiska plućne arterije na bočni otvor na komori, održavajući transduktor na istom nivou kao i komora.
[0202] Nisu primećena značajna odstupanja u protoku ili pritisku u cirkulaciji šanta tokom eksperimenata, a nakon eksperimenata nisu primećeni depoziti fibrinskog ugruška unutar uređaja za šant. Stoga, antikoagulacija je bila adekvatna.
[0203] Razvijen je matematički model sistema protoka, kako bi se procenila maksimalna koncentracija u mernoj ćeliji, kao funkcija brzine protoka u ćeliju, i poluživota aktiviranog mehurića, i poluživota bolusa. Brzina protoka se zatim može podesiti, menjanjem otpora protoka, kako bi se obezbedila adekvatna doza za mernu ćeliju. Pored toga, matematički model za procenu koncentracije aktiviranih mehurića u arterijskoj krvi iz koncentracije uočene u mernoj ćeliji.
E3- 4 Rezultati
[0204] Slika 14 prikazuje tipičnu krivu koncentracije aktiviranog mehurića-vreme u odeljku arterijske krvi nakon korekcije za minutni volumen srca, protok kroz ćeliju, vreme tranzita do ćelije, i životni vek aktiviranog mehurića. Samo prva dva minuta su ucrtana radi jasnoće prikaza. X-osa je vreme u sekundama a y-osa je frakcija gasa aktivirane populacije mehurića u arterijskoj krvi u delovima na milion.
[0205] Tabela 7 ispod prikazuje zapreminsko ponderisane srednje prečnike aktiviranih mehurića posle i.v. injekcija merene u arterijskim uslovima (normalna zasićenost gasom arterijske krvi, hidrostatički pritisak od oko 60 mmHg). Srednja vrednost svih posmatranja u tabeli je 21.4 µm.
Tabela 7 Srednja vrednost prečnika aktiviranog mehurića ponderisana zapreminom u arterijskim uslovima
[0206] Tabela 8 ispod prikazuje stope skupljanja aktiviranog mehurića pri arterijskom i venskom pritisku, date kao poluživot raspada zapreminske frakcije gasa u komori za akustičnu merenje. Pritisci su izračunati na osnovu merenja arterijskog pritiska kateterom/transduktorom, uz pretpostavku da je venski (jugularna vena) pritisak nula. Obratite pažnju na brži pad na arterijskom pritisku, ovo je uzrokovano povišenim parcijalnim pritiskom svih gasova unutar aktiviranih mehurića, dajući veće gradijente za difuziju gasa napolje.
Tabela 8 Pritisci u arterijskoj i venskoj komori i poluživot aktiviranih mehurića
[0207] Aktivirani mehurići u arterijskoj krvi imaju prečnike od 20 - 22 mikrona, što je dobro u predviđenom opsegu. Nakon ubrizgavanja supstance u levu pretkomoru i aktiviranja u levoj komori aktivirani mehurići postaju nešto veći, prečnika 22 - 25 mikrona u prečniku. Provera tačnih merenja i proračuna kod svih životinja dobijena je paralelnom in-vitro analizom uz aktivaciju ubrizganih uzoraka UZ zračenjem.
E3-5 Zaključci
[0208] Primer 3 potvrđuje da je kompozicija aktivirana u okviru željenog MI opsega i proizvodi rast mehurića i dinamiku unutar željenog opsega veličine in vivo nakon intravenskog administriranja.
Primer 4 (E4) - Intravitalna mikroskopija o prirodi depozita aktiviranih mehurića i modelovanje odgovora na UZ zračenje, u poređenju sa redovnim mikromehurićima
E4-1 Uvod
[0209] U cilju daljeg proučavanja i demonstracije karakteristika velikih mehurića nastalih nakon aktivacije in-vivo, sprovedena je studija direktnog posmatranja pojedinačnih aktiviranih mehurića sa pomakom faze u mikrocirkulaciji putem mikroskopije mezenterija pacova. Pored toga, da opišemo značajne razlike između velikih aktiviranih mehurića iz sadašnjeg pronalaska i regularnih UZ kontrastnih mikromehurića npr. kao što je Sonazoid, izvršeno je teorijsko modelovanje odgovora zapremine na UZ insonaciju.
E4-2 Komponente i ispitivanje kompozicije
[0210] Detalji za ispitivane kompozicije u ovoj studiji su dati u E1-2.
E4-3 Metodologija
[0211] Mužjaci pacova Wistar su koriščeni u studiji. Kompozicija je administrirana intravenozno u dozi od 1 mL DP/kg b.w. (tj.4 µL-kg b.w.. mikrokapljice i 8 µL/kg b.w. mikromehurići). Opšta anestezija je administrirana i održavana sa i.v. i.m. pentbarbital natrijum. Pacovi su intubirani, a repna vena ili karotidna vena su kanulizovane za administriranje test formulacije. Ultrazvuk je primenjen da se aktiviraju klasteri u mezenterijumu. Abdomen je otvoren vertikalnim srednjim rezom, pacovi su zatim stavljeni u bočni položaj na plastičnu ploču koja je uključivala okrugli prozor od pokrovnog stakla, a eksteriorizovani mezenteriji su postavljeni na prozor od pokrovnog stakla. Rašireni mezenteri su perfuzirani Krebs-Ringer-ovim puferom na 37°C. Ultrazvuk je primenjen direktno na eksteriorizovani mezenterijum pod objektivom mikroskopa.
Ultrazvučni skener (Elegra; Siemens, Sijetl, WA) opremljen sa linearnom sondom (7.5L40) je korišćen za izlaganje ultrazvuku. Izlazna snaga je postavljena na maksimum koji odgovara MI vrednosti od 1.2. Sonar gel je primenjen između ultrazvučnog pretvarača i zida grudnog koša ili mezenterija. Slike su snimljene na S-VHS ili DV traku za naknadni pregled.
[0212] Simulacije promene zapremine aktiviranih mehurića iz sadašnjeg pronalaska i regularnih HEPS/PFB mikromehurića (C1 rekonstituisana vodom) nakon insonacije modelovane su korišćenjem nelinearnog modela mehurića koji je razvio Lars Hof i koji je opisan u Acoustic Characterisation of Contrast Agents for Medical Ultrasound Imaging, Kluwer Academic Publishers, 2001, poglavlje 8. Parametri simulacije za aktivirani mehur sa pomeranjem faze: 8 ciklusa pokretačkog pulsa sa MI od 0.2 i frekvencijom od 0.5 MHz, u krvi, i prečnikom mirovanja od 30 mikrona. Parametri simulacije za HEPS/PFB mikromehuriće: 8 ciklusa pokretačkog pulsa sa MI od 0.2 i frekvencijom od 5MHz, u krvi, i prečnika mirovanja 3 mikrona.
E4-5 Rezultati
Bez ultrazvučne aktivacije:
[0213] Dve životinje su korišćene. Nisu primećeni veliki mehurići sa faznim pomakom u mikrocirkulaciji mezenterija nakon 6 izvršenih injekcija.
Aktivacija ultrazvukom:
[0214] Tri životinje su korišćene. Posle svih injekcija primećeni su veliki, aktivirani mehurići. Aktivirani mehurići su primećeni tek nakon primene ultrazvuka. Faza rasta aktiviranih mehurića sa faznim pomakom mogla se posmatrati u realnom vremenu. Jezgro aktiviranog mehurića je poraslo u roku od nekoliko sekundi zajedno sa opstrukcijom protoka krvi u mikro sudovima. Nije primećeno širenje mikro sudova. Aktivirani mehurići su se postepeno smanjivali i nezavisno napredovali u mikro sudovima. Svi aktivirani mehurići sa faznim pomakom bili su veći od crvenih krvnih zrnaca i smešteni su u mikro sudovima i prolazno blokirali protok krvi. Svi aktivirani mehurići su bili nesferični i izgledali su da su elipsoidnog oblika, formirajući se na odeljku mikro suda.
[0215] Slika 15 prikazuje video kadrove aktiviranog mehura sa faznim pomakom u mezenterijumu na; (gore levo) 17 sekundi nakon injekcije u mikro sud, blokirajući protok krvi; (gore desno) na 5 minuta i 19 sekundi; (dole desno) na 5 minuta i 45 sekundi, redom. Aktivirani mehur sa faznim pomakom (označen strelicom) postepeno se skuplja i napreduje u mikro posudi povremenim smeštanjem i pomeranjem, pre nego što se potpuno očisti. Slika 15 (dole levo) prikazuje 5 puta shematski zum isprekidanog pravougaonog okvira naznačenog na slici (gore levo). Obris mehurića sa fazim pomakom je prikazan (A) sa skalom od 20 mikrona prikazanom u C. Pod pretpostavkom da je cilindrični mehurić, dužina je izmerena na 30 mikrona a širina 13 mikrona dajući zapreminu od 3982 kubna mikrona što je ekvivalentno sfernom mehuriću prečnika 20 mikrona, u odličnoj saglasnosti sa rezultatima detaljno opisanim u E3. HEPS/PFB mikromehurić (B) je prikazan u razmeri. Ovi uobičajeni UZ kontrasni mikromehurići jasno slobodno teku u mikrovaskulaturi i nisu u kontaktu sa endotelnim zidom.
Simulacija dinamike mehurića kada je izložena ultrazvučnom polju:
[0216] Rezultati su prikazani na slici 16. Mehurić sa fazim pomakom ima minimalni prečnik 22.8 i maksimalni prečnik 36.4 mikrona kada osciluje kao odgovor na vodeće ultrazvučno polje. HEPS/PFB mikromehurić ima minimalni prečnik 2.3 i maksimalni prečnik 4.1 mikrona kada osciluje kao odgovor na vodeće ultrazvučno polje. Apsolutne promene zapremine izazvane za fazni pomak mehurića su približno tri reda veličine veći neko od HEPS/PFB mikromehurića.
E4-5 Zaključci
[0217] Aktivirani mehurići sa faznim pomakom sa veličinom približno 20 µm uočeni su pri kada je primenjena ultrazvučna aktivacija. Nisu primećeni aktivirani mehurići sa fazim pomakom kada nije primenjena ultrazvučna aktivacija. Aktivirani mehurići sa faznim pomakom su prolazno (5-19 minuta) deponovani u mikrocirkulaciju ali su pomereni kako se njihova veličina smanjivala.
[0218] Simulacija promene zapremine mehurića sa pomeranjem faze tokom UZ insonacije pokazuje tri reda veličine veći odgovor od HEPS/PFB mikromehurića, demonstrirajući redove veličine veći mehanički rad na tkivu od strane mehurića sa faznim pomakom.
Primer 5 (E5) – Studije formulacije
E5-1 Uvod
[0219] Kao što se vidi iz E1, pronalazači su namerno odabrali da fokusiraju studije formulacije na varijansu u C2. Ovo radi proučavanja opštih efekata na sposobnost formiranja klastera pri pripremi DP, a samim tim i dobijanja kontrole sa karakteristikama klastera i rasvetljavanja njihovog značaja. Razumno je pretpostaviti da se opšti aspekti/efekti formulacije prikazani u E1 odnose na širok spektar sistema formulacije mikromehurić/mikrokapljica. Da bi se ovo pokazalo, testirano je šest komercijalno dostupnih formulacija mikromehurića za pripremu kompozicije klastera i naknadnu aktivaciju.
[0220] Pored toga, dva važna aspekta pronalaska; stabilnost farmaceutskog preparata u pogledu izbegavanja spontane aktivacije (kao što je navedeno u WO99/53963) i sposobnost opterećenja mikrokapljica terapijskim agensima su razjašnjeni u aktuelnom primeru.
E5-2 Kompozicije klastera iz komercijalno dostupnih formulacija mikromehurića
[0221] Da bi se pokazalo da je koncept sadašnjeg pronalaska primenljiv na širok spektar formulacija mikromehurića, DP napravljen od C2 kako je detaljno opisano u E1-2 i šest komercijalno dostupnih mikromehurića proizvoda kao C1, testirani su na sadržaj klastera mikroskopijom/analizom slike i zapreminu aktiviranog mehurića i prečnik mehurića pomoću sonometrije. Komponente mikromehurića istražene kao C1 su detaljno prikazane u tabeli 9 zajedno sa dobavljačima, kompozicijom jezgra gasa, stabilizacionom membranom i farmaceutskim oblikom.
Tabela 9 Komercijalno dostupne formulacije mikromehurića testirane kao C1
[0222] Za liofilizovane oblike, priprema kompozicija klastera je izvedena kao što je detaljno opisano u E1-2, rekonstituisanjem C1 sa zapreminom C2 kao što je detaljno navedeno u uputstvu za pakovanje svake formulacije (2 mL za Sonazoid, 5 mL za Sonovue i 0.7 mL za Micromarker) . Za Optison i Definity mikromehurići u bočici proizvoda su izolovani uklanjanjem infranatanta nakon segregacije mikromehurića a kompozicija klastera je pripremljena dodavanjem iste zapremine C2 u bočicu pre homogenizacije. Za Pol<Son L, 0.5 mL homogenizovanog C1 je pomešano sa 0.5 mL C2.
[0223] Rezultati za sadržaj klastera i volumen i prečnik aktiviranog mehurića u različitim kompozicijama klastera navedeni su u tabeli 10. Komponenta C1 koja je detaljno prikazana u E1-2 ima istu formulaciju i oblik kao komercijalni kontrastni agens Sonazoid, pa bi se stoga očekivalo da bi ova dva agensa, kada se koriste kao C1, generisala kompoziciju klastera sa sličnim karakteristikama; što potvrđuju rezultati navedeni u tabeli 11. Od ostalih 5 ispitivanih komercijalnih mikromehurić proizvoda, svi osim Definity daju kompoziciju klastera sa značajnim količinama klastera koji su se, nakon UZ zračenja, aktivirali i pokazivali značajnu zapreminu aktiviranog mehurića. Micromarker, Optison, Sonovue i PolySon, iako pokazuju jaku varijaciju u hemijskoj kompoziciji jezgra gasa i stabilizirajuće membrane, pokazuju karakteristike za svoje odgovarajuće kompozicije klastera koje su uporedive sa onima pripremljenim sa Sonazoidom i C1 kao što je detaljno opisano u E1-2. Iako ne želimo da se vezujemo za teorijska razmatranja, moguće je da je razlog zašto Definity mikromehurići ne formiraju klasteri sa mikrokapljicom u C2 upotreba PEG-DDPE komponente u stabilizajućoj membrani. Ova komponenta će verovatno stvoriti debeo, gust sloj vode koji okružuje mikromehurić, štiteći tako elektrostatičku privlačnost na mikrokapljice C2. Dodatni nalaz iz ove studije, pri korišćenju objektiva 50X sa mernim opsegom od 0.5 do 40 µm, bilo je uočavanje značajne količine klastera manjih od 3 µm u kompozicijama klastera napravljenim sa Sonovue i PolySon L. Ovi agensi mikromehurići sadrže značajnu količinu malih mikromehurića u poređenju sa C1 kao što je detaljno opisano u E1-2, Sonazoid ili Optison. U kompozicijskim klasterama napravljenim sa Sonovue i PolySon primećena je značajna frakcija klastera formiranih od ∼1 µm mikromehurića i ∼1 µm mikrokapljica, i one su očigledno doprinele zapremini aktiviranih mehurićića nakon UZ zračenja. Klastere u opsegu veličine 1-10 µm stoga treba smatrati funkcionalnim pod sadašnjim pronalazakom.
Tabela 10 Sadržaj klastera i zapremina aktiviranih mehurića za kompozicije klastera pripremljenih korišćenjem komercijalno dostupnih formulacija mikromehurića kao C1
[0224] Gore navedeni rezultati pokazuju da je koncept sadašnjeg pronalaska primenljiv na širok spektar C1 formulacija, kako u pogledu kompozicije jezgra gasa, tako i u pogledu kompozicije stabilizacione membrane.
E5-3 Spontana aktivacija i UZ aktivacija
[0225] Osnovna priroda formulacije usmerena je na destabilizaciju sistema, tj. generisanje velikih mehurića faznog pomaka iz kombinacije mikromehurića i mikrokapljica izazvano UZ. Ova destabilizacija se mora desiti na kontrolisan način, in-vivo i na ciljnom mestu (patologija), a spontani rast (aktivacija) nakon pripreme DP, ili neposredno nakon administriranja (tj. u odsustvu insonacije) je štetna za funkcionalnost pronalaska. WO99/53963 samo istražuje istovremenu administraciju dve komponente, ali primećuje da, ako se komponente pomešaju pre administriranja, izbegavanje takve spontane aktivacije sistema će verovatno zahtevati skladištenje na povišenom pritisku ili niskoj temperaturi nakon kombinacije C1 i C2. Pronalazači su pokušali da eliminišu ove očigledno glomazne i ograničavajuće potrebe da obezbede formulaciju koja je stabilna u ambijentalnim uslovima. Kao što je navedeno u WO99/53963, na osnovu teorijske procene, verovatno je da je spontana aktivacija funkcija tačke ključanja (b.p.) uljne faze i njenog pritiska pare (p.p.). Međutim, autori te patentne prijave nisu identifikovali mogućnost da rastvorljivost u vodi uljne faze može biti još važniji doprinos spontanoj destabilizaciji i rastu mehurića kombinovanjem C1 i C2. Da bi se razjasnili ovi odnosi i dalo rešenje za ovaj problem, određeni broj komponenti mikrokapljične faze (fluorougljenična ulja), sa širokim opsegom b.p., p.p. i rastvorljivosti u vodi, pregledani su i korišćeni za proizvodnju C2. Ovi uzorci su zatim kombinovani sa C1 i procenjeni na sadržaj spontano aktiviranih i UZ aktiviranih mehurića. Proizvodnja i analiza ovih uzoraka opisani su u nastavku.
[0226] 641 mg distearoilfosfatidilholin (DSPC) i 73 mg 1,2-distearoil-3-(trimetilamonio) propan hlorida (DSTAP) su izmereni u bočici sa ravnim dnom od 250 mL i 50 mL hloroforma je dodato. Uzorak je zagrevan pod toplom vodom iz slavine dok se ne dobije bistar rastvor. Hloroform je uklonjen isparavanjem do suva na rotacionom isparivaču na 350 mm Hg i 40°C, nakon čega je usledilo dalje sušenje na 50 mm Hg u eksikatoru preko noći. Nakon toga, dodato je 143 mL vode i balon je ponovo stavljen na rotacioni isparivač i lipidi su rehidrirani punom brzinom rotacije i temperaturom vodenog kupatila na 80°C tokom 25 minuta. Uzorci su stavljeni u frižider preko noći. Lipidna disperzija je prebačena u pogodnu bočicu i čuvana u frižideru do upotrebe.
[0227] Emulzije su pripremljene prenošenjem alikvota od 1 mL hladne lipidne disperzije u bočice za hromatografiju od 2 mL. U svaku od sedam bočica je dodato 100 uL ulja fluorougljenika kao što je detaljno opisano u tabeli 11. Bočice za hromatografiju su mućkane na CapMix (Espe, GmbH) tokom 75 sekundi. Bočice su odmah ohlađene u ledu, sakupljene i držane na hladnom do upotrebe. Urađena je analiza Coulter-ovim brojačem da bi se odredila zapreminska koncentracija mikrokapljica i emulzije su zatim razblažene vodom do 10 µl/mL disperzne faze.
[0228] C1 (kako je detaljno navedeno u E1-2) je rekonstituisana u 2 mL vode i pomešana sa C2 uzorcima prioremljenim u epruveti od 10 mL do odnosa 10:1 mućkani pažljivo ručno. Smeša je zatim razblažena sa 7 mL vode. Uzorci su mikroskopski procenjeni na spontano aktivirane i UZ aktivirane mehuriće u ručnoj verziji metodologije opisane u E1-4. Jedan mL ovog rastvora je prebačen u mikroskopsku ćeliju gde je temperatura stabilizovana na 37°C posle 2 minuta. Ćelija je postavljena tako da se UZ sonikacija, koristeći ATL 3-2 pretvarač sa centralnom frekvencijom od 2.25 MHz, može primeniti na uzorak. Pri uvećanju od 200X skenirana je celokupna ćelijska površina i sadržaj velikih (> ∼ 15 µm), spontano aktiviranih mehurića je polukvantitativno procenjen vizuelnom inspekcijom. Za svaki uzorak, rezultat u rasponu od 0 do 2 je dat, pri čemu 0 označava "nema ili vrlo malo uočenih velikih mehurića sa faznim pomakom”, 1 označava "sprimećen srednji broj mehurića sa velikim faznim pomakom" i 2 označava "primećen veliki broj mehurića sa velikim faznim pomakom". Uzorak je zatim insoniran 5s pri nominalnom MI od 0.8 i sadržaj velikih, UZ aktiviranih mehurića je prebrojan i ocenjen na isti način. Rezultati ove studije su detaljno prikazani u tabeli 11 zajedno sa fizičko-hemijskim karakteristikama ispitivanih jedinjenja.
Tabela 11 Ispitivana jedinjenja i njihove fizičko-hemijske karakteristike; tačka ključanja (b.p., °C), pritisak pare (p.p., tor) na 20°C i rastvorljivost u vodi (logaritam molarne rastvorljivosti). U poređenju sa rezultatima procene količine spontano i UZ aktiviranih mehurića. Ocena 0 = nema ili veoma ograničena, ocena 1 = srednja i ocena 2 = visoka.
[0229] Podaci koji se nalaze u tabeli 11 iznenađujuće pokazuju da nivo spontane aktivacije nije značajno povezan sa b.p. ili p.p., ali snažno u odnosu na rastvorljivost uljne komponente u vodi, kao što je bio nivo UZ aktivacije. Slika 17 pokazuje rastvorljivost u vodi u odnosu na rezultat spontane i UZ aktivacije. Kao što se može primetiti, primetno je smanjenje formiranja spontano aktiviranih mehurića sa smanjenjem rastvorljivosti u vodi, dok se značajno povećanje nivoa UZ aktiviranih mehurića primećuje sa smanjenjem rastvorljivosti u vodi. Ovi rezultati pokazuju da se DP može stabilizovati protiv spontane aktivacije korišćenjem uljnih komponenti za C2 sa rastvorljivošću u vodi ispod približno 1·10<-5>M i takođe da nivo UZ aktivacije ima koristi od rastvorljivosti u vodi ispod ovog nivoa. Imajte na umu, međutim, kao što je prikazano u E5-4, značajana frakcija komponente mikrokapljice emulzije može se sastojati od komponenti (npr. korastvarači dodati za povećano opterećenje lekom) sa većom rastvorljivošću u vodi bez dovođenja do povećane spontane aktivacije ili smanjenja UZ indukovane aktivacije.
E5-4 Opterećenje lekom i korastvarači
[0230] U ovom primeru, terapijsko jedinjenje se dodaje u uljnu fazu mikrokapljica za oslobađanje na ciljanom mestu in vivo nakon aktivacije. Da bi se razjasnili koncepti za postizanje takvog opterećenja sprovedena je serija studija formulacije. Oni su ukratko rezimirani u nastavku.
[0231] Na osnovu skrining studija različitih komponenti navedenih u E5-3, sa dodatnim odgovorima kao što su lakoća emulgovanja, stabilnost emulzija, dostupnost, kvalitet itd., perfluorometilciklopentan (pFMCP) je izabran kao primarna komponenta ulja za proizvodnju C2, sa distearoilfosfatidilholin (DSPC) stabilizirajućom membrana dodatoj stearilaminu (SA) za pozitivno površinsko naelektrisanje. Kao polazna tačka za studiju o opterećenju lekovima, izvršena je teorijska procena rastvorljivosti različitih rastvorenih materija (lekovi i hromofori za optičko snimanje) u pFMCP i nizu drugih komponenti ulja. Ova procena je obavljena korišćenjem softvera iz stanja tehnike za procenu kompatibilnosti rastvarač-rastvor; Hansen-ovi parametri rastvorljivosti, HSPiP v.4 (Steven Abbott TCNF Ltd.). HSPiP analiza izračunava tri osnovna svojstva koja se odnose na kompatibilnost između supstanci; polaritet, disperzija i vezivanje vodonika i rastojanje u ovom trodimenzionalnom prostoru između npr. rastvarača i rastvora; Hansen-ova udaljenost (Hd). Što su rastvarač i rastvor bliži u ovom prostoru, to je (relativno) bolja rastvorljivost rastvorene supstance u rastvaraču. Hansen-ova teorija predviđa da Hd< 8 predstavlja rastvorljiv "rastvoren u rastvaraču" par, 8 < Hd< 12 predstavlja delimično rastvorljiv a Hd> 12 predstavlja nerastvorljiv. Ova analiza je obavljena za 1) niz rastvarača, odabranih na osnovu b.p. < 65 °C, rastvorljivosti u vodi < 0.1 M i verovatne biokompatibilnosti (toksičnost), sa velikim rasponom Hansen-ovih parametara i 2) nizom ciljanih rastvorenih materija; hemoterapijskih lekova i molekula pogodnih za optičko snimanje. Na osnovu navedenih kriterijuma za izbor rastvarača, poželjni rastvarači su bili svi delimično halogenovani ugljovodonici. Mešljivost između rastvarača i rastvorljivosti rastvorenih materija u jednom od rastvarača eksperimentalno je određeno. Rezultati ove studije su navedeni u tabeli 12. Pored tamo navedenih podataka, utvrđeno je da se hlorotrifluoropropan (CltFPr) i dihlorodifluoroetan (dCldFEt) potpuno mešaju u pFMCP, dihlormetanu (dCIMe) i triholormetanu (tClMe).
Tabela 12 Fizičko-hemijska svojstva rastvarača; tačka ključanja (b.p.), pritisak pare i rastvorljivost u vodi (logaritam molarne rastvorljivosti i ciljnih molekula, Hansen-ova udaljenost (Hd) od pFMCP i tCIMe i mešljivost/rastvorljivost u tCIMe (videti tekst).
[0232] Kao što se može primetiti iz ovih rezultata, dok se izračunati Hdrazumno uklapa sa predviđenom mešljivošću između rastvarača, to nije dobar prediktor apsolutne rastvorljivosti različitih ciljnih molekula u tCIMe. Ovo pokazuje da je Hansen-ova analiza prvenstveno alat za relativnu rastvorljivost datog molekula u različitim sistemima rastvarača, i da se ne može koristiti za procenu apsolutne rastvorljivosti različitih jedinjenja u različitim sistemima rastvarača.
[0233] Za sedam supstanci koje se nalaze u tabeli 12, izmerena rastvorljivost u tCIMe je takođe bila u korelaciji sa literaturnim vrednostima za LogP i LogS. Dok je ova analiza pokazala, kao što se očekivalo, da rastvorljivost u tCIMe jeste funkcija lipofilnosti, ove karakteristike ne mogu predvideti apsolutnu rastvorljivost. Supstance sa LogP < 0.9 i logS > -2.7 nisu pokazale nikakvu ili veoma nisku rastvorljivost, ali za supstance sa opsegom LogP od 3.2 do 3.9 rastvorljivost je varirala od 50 do 350 mg/mL bez kovarijanse prema LogP, a za supstance sa LogS opsegom od -3.7 do -5.2 rastvorljivost je varirala od 20 do 350 mg/mL bez kovarijanse prema LogS.
[0234] Ove procene pokazuju da, dok su lipofilne supstance poželjne, kompatibilnost između bilo kojih specifičnih terapijskih agenasa i pronalaska treba eksperimentalno ispitati.
[0235] Nijedan od ciljnih molekula u tabeli 12 nije pokazao nikakvu merljivu rastvorljivost u pFMCP, stoga je neophodna upotreba korastvarača da bi se postigao funkcionalni kapacitet opterećenja. Kako je mešljivost d- i t-CIMe u pFMCP-u samo nekih 10%, konstrukcija "niza rastvarača" ("solvent ladder" construction), tj. upotreba trećeg rastvarača između tCIMe i pFMCP u Hansen-ovom prostoru, je naznačema. Na osnovu ovih razmatranja, mešavina pFMCP, ClrFPr i pFMCP u odnosu 1:1:1 (po zapremini) je odabrana za dalje studije na C2 napunjenom terapijskim ili optičkim jedinjenjima za snimanje.
[0236] Rastvorljivost Nile Red (NR), DiR i paklitaksela (Ptx) je procenjena u smeši of pFMCP, ClrFPr i pFMCP u odnosu 1:1:1 i pronađeno je > 5 mg/mL, > 10 mg/mL i > 25 mg/mL, redom. Dodatno, smeša navedena tri rastvarača u odnosu 1:1:2 napunjena sa Ptx je istražena. Rastvorljivost Ptx u ovoj smeši rastvarača je > 50 mg/mL, pokazujući da kapacitet opterećenja može se značajno povećati promenom kompozicije uljne faze. C2 sa smešom ovih komponenti u odnosu 1:1:1 je proizveden kao što je detaljno opisano u nastavku.
[0237] Lipidna disperzija koja sadrži je napravljena merenjem 250 mg DSPC sa 3% mol/mol SA u 50 mL vode u bočici sa okruglim dnom od 100 mL, hidratisana tokom 30 minuta na 80°C i ostavljena da se ohladi. X mg supstance (X je 5, 10 i 25 mg za NR, DiR i Ptx, redom) je izmereno i rastvoreno u 333 µL tCIMe (rastvor A).333 µl rastvora A je razblaženo sa 333 µl CltFPr 333 µL pFMCP (rastvor B).900 µl lipidne disperzije je dodato u epruvetu za centrifugu od 1.5 mL.
100 µl rastvora B je dodato u lipidnu disperziju u epruveti za centrifugiranje. Emulgovanje je postignuto korišćenjem ZoneRay<®>Dental HL-AH G7 Amalgamatora na 3200 ob/min takom 20s. Dobijena emulzija je centrifugirana tokom 5 min pri 25g. Nakon centrigugacije, mikrokapljice su formirale definisani sloj sedimenta. Supernatant, koji sadrži višak lipidnih vezikula, pažljivo je uklonjen, dodat je ekvivalentni volumen od 5 mM TRIS u vodi i mikrokapljice su ponovo dispergovane ručnim mućkanjem. Urađena je Coulter-ova analiza i na osnovu otkrivene zapreminske koncentracije mikrokapljica emulzija je razblažena u 5 mM do 3 µl mikrokapljica/mL [0238] Dobijeni uzorci C2 su procenjeni mikroskopijom i Coulter-ovom analizom. Slika 18 prikazuje mikrografe iz mikroskopske ocene. Za sve uzorke, stabilne emulzije sa veličinama mikrokapljica u ciljanom opsegu 1 do 5 µm je posmatrana. Pored navedenog, napunjene supstance su jasno sadržane u rastvorenom stanju unutar mikrokapljica; nije primećen ekstra-vezikularni materijal i mikrokapljice su bistre i homogeno obojene bez znakova precipitacije. Za sve uzorke, Coulter-ova analiza je pokazala približno 3 µl mikrokapljice/mL srednje veličine od približno 3 µm.
[0239] Zajedno sa C1 kako je detaljno opisano u E1-2, ovi C2 uzorci su zatim korišćeni za pripremanje DP koji je ispitan na reaktivnost Coulter-ovim bojenjem, grupisanje mikroskopijom a veličina i zapremina aktiviranog sonometrijom. Primećena reaktivnost za sve uzorke je bila u opsegu 40-70%, mikroskopija je potvrdila prisustvo klastera, ali nije pokazala dokaz spontane aktivacije, zapremina aktiviranog mehurića je bila u opsegu 100-200 µl/µl mikrokapljica a veličina aktiviranih mehurića je bila u opsegu 42-48 µm. Ovi rezultati pokazuju;
• Da mikrokapljična uljna faza može da sadrži niz rastvarača kako bi se dobio prihvatljiv kapacitet punjenja lekom. Za ovo, posebno su korisni delimično halogenovani ugljovodonici.
• Da značajna frakcija (npr. > 60% v/v) rastvarača može imati značajno višu rastvorljivost u vodi (npr. < 1·10<-1>M) nego što je naznačeno iz E5-2 (< 1·10<-5>M).
• Da ove formulacije zadrže kritične atribute koncepta u formiranju klastera u kompoziciji klastera, njihovu sposobnost da se aktiviraju pri insonaciji i nedostatak spontane aktivacije.
[0240] Uzorci C2 napunjeni са DiR kao što je gore opisano korišćeni su za procenu isporuke invivo (videti E8). Uzorci C2 napunjeni sа NR kao što je gore opisano korišćeni su za procenu ispoljavanja napunjene supstance nakon aktivacije (videti E6).
Primer 6 (E6) – Ispoljavanje napunjene supstance pri aktivaciji
E6-1 Uvod
[0241] Da bi se istražilo kako će se molekularna supstanca, napunjena u mikrokapljice C2, ispoljavati nakon aktivacije kompozicije klastera, urađena je studija fluorescentne mikroskopije. Kompozicija klastera u kojoj su mikrokapljice u C2 bile napunjene bojom Nilе Red (NR) je aktivirana i proučavana fluorescentnom mikroskopijom.
E6-2 Jedinjenja i procedure
[0242] C2 napunjen sa 5 mg/mL boje Nilе Red, kao što je detaljno opisano u E5-4, korišćen je za pripremu kompozicije klastera kao što je detaljno opisano u E1-2. Kompozicija klastera je razblažena u vodi, stavljena u mikroskopski bunar i aktivirana pomoću Vscan UZ skenera (GE Healthcare).
[0243] Slike aktivirane kompozicije klastera su dobijene pomoću Leica TCS SP8 konfokalnog mikroskopa. Korišćeni objektiv је bio HCX IRAPO L 25X za uranjanje u vodu sa numeričkim otvorom od 0.95. Fluorescentna boja je pobuđena na 539 nm podesivim laserom bele svetlosti. Emisija u opsegu 570 - 670 nm je detektovana hibridnim detektorom (HyD). Korišćena brzina lasera je 400 Hz a prečnik otvora je postavljen na 1 AU. Slike prenosa su istovremeno dobijene u drugom detektoru, koji se može prekriti fluorescentnim slikama. Preseci i 3D slike uzorka su dobijene pomeranjem nosnog dela objektiva postupno u z-smeru.
E6-3 Rezultati
[0244] Slika 19 prikazuje fluorescentni mikrograf preseka mehurića sa faznim pomakom nakon aktivacije DP gde je komponenta mikrokapljica C2 napunjena sa 5 mg NR/mL.
[0245] Kao što se može primetiti sa ove slike, nakon aktivacije napunjeni NR se prikazuje na interfejsu tečnost/gas. Nakon aktivacije in vivo, ako je napunjena terapijskom supstancom, takva supstanca bi bila u bliskom kontaktu sa endotelnim zidom i stoga dostupna za ekstravazaciju.
Primer 7 (E7) – Deponovanje aktiviranih mehurića u tumorima
E7-1 Uvod
[0246] U cilju daljeg proučavanja i demonstracije karakteristika velikih mehurića nastalih nakon aktivacije u modelu tumora, urađena je studija snimanja aktiviranih mehurića sa faznim pomakom kod potkožnog ksenografta tumora kancera PC-3 prostate na mišjem modelu, demonstrirajući prirodu depozita i izraženu razliku u kinetici kontrasnog pojačavanja iz HEPS/PFB mikromehurića koji slobodno teku.
E7-2 Ispitivane komponente i kompozicije
[0247] Detalji za ispitivane kompozicije u ovoj studiji su dati u E1-2.
E7-3 Metodologija
[0248] Korišćeno je 16 ženki nude miševa Balb/c. Pre implantacije tumora, miševi su izmereni, anestezirani izofluranom, i obeleženo im je uvo.100µL ćelijske suspenzije koja sadrži 3·10<6>PC-3 ćelija je polako ubrizgana subkutano na bočnu stranu leve zadnje noge između kuka i kolena.
[0249] Miševima je administrirana hirurška anestezija subkutanom injekcijom mešavine fentanila (0.05 mg/kg), midazolama (5 mg/kg), i medetomidina (0.5 mg/kg). Intravenska kanila (BD NeoflonTM 24 GA) je postavljena u repunu venu. Prohodnost je verifikovana injekcijom male količine (∼20µL) 0.9% natrijum hlorida za injekciju nakon čega je ubrizgana mala količina (∼10µL) heparina (10U/mL) da bi se sprečilo zgrušavanje. Glava kanile je napunjena sa 0.9% natrijum hlorida za injekciju da se eliminiše mrtvi prostor i zatvorena poklopcem. Kanila je pričvršćena za rep hirurškom trakom.
[0250] Korišćena su tri komercijalna ultrazvučna sistema za snimanje. Tumor je snimljen za sve eksperimente sa visokofrekventnim sistemom za snimanje malih životinja Vevo 2100 (VisualSonic Inc.) sa MS250 pretvaračem (16-18MHz). Kompozicija klastera je aktivirana in-vivo ili pomoću Vivid E-9 sistema za kliničko snimanje (GE Healthcare) korišćenjem sonde za snimanje od 2MHz sa MI postavkom od 0.28, ili Vscan 1.2 sistema za kliničko snimanje (GE Healthcare) sa sondom za snimanje od 2MHz sa nominalno podešavanje MI od 0.8.
[0251] 16 životinja je podeljeno u 4 grupe od po 4 životinje u svakoj grupi. Sistem aktivacije i doza za grupe su navedeni u tabeli 13.
Tabela 13 Grupe ispitivane sa procedurom aktivacije i dozom
[0252] Pripremljeni miševi su stavljeni na sto za rukovanje (sa kontrolom temperature postavljenom na 37°C), sa njegove desne strane. Leva noga je podignuta horizontalno, podržana parčetom tkanine i fiksirana hirurškom trakom. Ultrazvučni gel je bogato nanešen na tumor i vreća za vodeno kupatilo je stavljena na tumor. Snimanje je izvedeno sa Visualsonics Vevo 2100 sistemom za snimanje sa pretvaračem smeštenim u vodeno kupatilo sa pretvaračem slike koji se drži u fiksnoj ravni skeniranja. Aktivacija kompozicija klastera je izvedena sa dodatnim pretvaračem (Vivid E9 ili Vscan) tokom 75 sekundi počevši od vremena ubrizgavanja kompozicije klastera.
[0253] Aktivacija kompozicije klastera proizvodi kontasne ehoe koji ostaju stacionarni na ultrazvučnoj slici nekoliko minuta. Broj stacionarnih kontrastnih signala je prebrojan po jedinici površine tumora snimljenog u ravni skeniranja. Pod pretpostavkom da je ravan skeniranja debljine 0.2 mm, izvedeni su brojni ehoi pomeranja faze po jedinici zapremine tumora.
E7-4 Rezultati
[0254] Tumor je hipo ehogen u ultrazvučnoj slici. Tipične slike tumora su prikazane na slici 20 za oba, pre ubrizgavanja kompozicije klastera (leva slika) i nakon ubrizgavanja i aktivacije (desna slika), prikazujući prisustvo stacionarnih ehoa sa faznim pomakom nakon aktivacije (desna slika). Procenjen broj stacionarnih kontrasnih ehoa sa faznim pomeranjem po mL tumorskog tkiva je prikazan u tabeli 14. Svi tumori su pokazali deponovanje stacionarnih kontrasnih ehoa. Ovi ehoi su nazvani stacionarni jer ostaju statični na ultrazvučnim slikama nekoliko minuta. Primena „burst“ sekvence iz Vevo 2100 sistema za snimanje, koji je dizajniran da uništi regularne kontrastne mikromehuriće kao što je HEPS/PFB ne uništava stacionarne ehoe. Ovo je u skladu sa teorijom koja predviđa da mehurići sa faznim pomeranjem nisu uništeni „burst“ sekvencama zbog njihove veće veličine, i potvrđuje da stacionarni kontrastni ehoi nisu proizvredeni od strane HEPS/PFB mikromehurića u kompoziciji. Slika 21 prikazuje tipičnu kinetiku integrisanog kontrasnog pojačanja u regionu tumora iz mehurića faznog pomeranja (označenih sa A na slici) u poređenju sa ekvivalentnom dozom samo HEPS/PFB mikromehurića (obeleženo B na slici). Ovo pokazuje razliku u kinetici mehurića sa faznim pomeranjem u poređenju sa HEPS/PFB mikromehurićima, tj. deponovanja u odnosu na prirodu slobodnog protoka. Pojačanje HEPS/PFB mikromehurića koji slobodno teku je mnogo nestalnije. Kontrast iz mehurića sa faznim pomakom pokazuje stacionarne eho koji se deponuje u tumoru i ostaje nekoliko minuta.
Tabela 14 Procenjeni srednji broj stacionarih ehoa pomeranja faze po mL tumorskog tkiva i standardna devijacija (SD).
[0255] Dvosmerna analiza varijanse je primenjena za dozu i tip aktivacije (Vivid E9 ili Vscan). Postoji statistički značajna razlika za dozu sa p=0.024, a neznatna razlika za aktivacioni pretvarač, p=0.352.
E7-5 Zaključci
[0256] Kompozicija klastera je aktivirana sa dva različita sistema kliničkog snimanja, Vivid E9 sa 2MHz sondom i MI od 0.28, i Vscan sa 2MHz sondom i MI od 0.8, a tumori su snimani sa ultrazvučnim sistemom za snimanje malih životinja sa visokom frekvencijom (16-18MHz). Sve procedure su proizvele stacionarne kontrasne ehoe u tumorima. Ovi kontrasni ehoi ostaju stacionarni u ultrazvučnoj slici tokom nekoliko minuta za razliku od prolaznih kontrastnih ehoa iz HEPS/PFB mikromehurića. Oni se ne uništavaju „burst“ sekvencama snimanja dizajniranim da unište HEPS/PFB mikromehurići. Ova zapažanja su u skladu sa deponovanjem mehurića sa fazim pomakom u tumorskom tkivu. Statistički značajan dozni odgovor je uočen (p=0.24) i količina deponovanja nije bila statistički različita kada se aktivira različitim kliničkim sistemima za snimanje sa MI od 0.28 i 0.8 (p=0.352).
Primer 8 (E8) - Isporuka istovremeno ubrizgane ili napunjene supstance tumorima
E8-1 Uvod
[0257] Da bi se demonstrirala sposobnost sadašnjeg pronalaska da pojača isporuku molekula invivo, sprovedene su studije na mišjem PC-3 ksenografskom modelu tumora. Tri modela sistema su istražena; istovremena injekcija DP i Evans Blue boje: istovremena injekcija DP i Licor CW800 EPR agensa: i injekcija DP gde je DiR-boja bila ubačena u komponentu mikrokapljice (C2). Evans blue je fluorescentna boja koja se vezuje za albumin protein kada se ubrizgava i.v. U fiziološkim uslovima, endotel je nepropustan za albumin, a albumin vezani Evans blue bojom ostaje zatvoren u krvnim sudovima. Prema tome, Evans blue se često koristi kao jedinjenje u studijama isporuke lekova [Bohmer i sarad., J Controlled Release, 148, Izdanje 1, 2010, str. 18-24]. Povećana permeabilnost i retencija (EPR - enhanced permeability and retention) je uobičajena karakteristika vaskulature tumora. Vaskularni endotel u mikrookruženju tumora je često diskontinuiran, omogućavajući molekulima da difunduju u okolno tumorsko tkivo. Komercijalno dostupan (Li-Cor Biosciences Inc.) IR dye 800CW PEG kontrastni agens (25-60 kDa) je nespecifični agens za snimanje koje se akumulira u tumorima zbog EPR efekta. DiR boja je komercijalno dostupna (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific Inc.) u blizini IR fluorescentne, lipofilne karbocijaninske DiOC18(7) boje koja je slabo fluorescentna u vodenim uslovima ali visoko fluorescentna i fotostabilna kada je ugrađena u npr. ćelijske membrane. Prema tome standardne tehnike ekstrakcije i kvantifikacije Evans Blue u tkivu, i optičko snimanje sa 800CW PEG i DiR bojama, su korišćene kao model jedinjenja za in-vivo demonstraciju isporuka leka sa sadašnjim pronalaskom.
E8-2 Ispitivane komponente i kompozicije
[0258] Detalji za ispitivane kompozicije u ovoj studiji su dati u E1-2 (ko-ubrizgani modeli) i E5-4 (napunjeni sa DiR).
E8-3 Metodologija
[0259] Ženke nude miševa Balb/c su korišćene u studiji. Pre implantacije tumora, miševi su izmereni, anestezirani izofluranom, i obeleženo im je uvo.100-µl ćelijske suspenzije koja sadrži 3·10<6>PC-3 ćelija je polako ubrizgano subkutano na bočnu stranu leve zadnje noge između kuka i kolena.
[0260] Miševima je administrirana hirurška anestezija subkutanom injekcijom mešavine fentanila (0.05 mg/kg), midazolama (5 mg/kg), i medetomidina (0.5 mg/kg). Intravenska kanila (BD NeoflonTM 24 GA) je postavljena u repnu venu. Prohodnost je verifikovana injekcijom male količine (-20 µL) 0.9% natrijum hlorida za injekciju nakon čega je ubrizgana mala količina (-10 µL) heparina (10U/mL) da bi se sprečilo zgrušavanje. Glava kanile je napunjena sa 0.9% natrijum hloridom za injekciju da se eliminiše mrtvi prostor i zatvori poklopcem. Kanila je pričvršćena za rep hirurškom trakom.
[0261] Zadnji ekstremitet miša je stavljen u vodeno kupatilo sa dva UZ pretvarača pripremljena za insonaciju tumora. Ultrazvučnu aktivaciju kompozicije klastera obezbedio je Vscan sa sondom od 2MHz i nominalnim MI od 0.8. Naknadno izlaganje ultrazvuku je primenjeno korišćenjem pretvarača napravljenog po meri od 500 kHz (Imasonic SAS), 8 ciklusnih impulsa sa frekvencijom ponavljanja impulsa od 1 kHz pri MI u rasponu od 0.1 do 0.8.
Evans Blue
[0262] 50 µl Evans Blue (50 mg/kg) je ubrizgano odmah zatim sledi 50 µL kompozicije klastera koja sadrži nominalnih 1.5 µL pFMCP mikrokapljica 4.0 µL HEPS/PFB mikromehurića po mL, ili samo 4.0 µL HEPS/PFB mikromehurića po mL. Aktivaciju je obezbedio Vscan klinički ultrazvučni skener sa sondom od 2MHz tokom 45 sekundi počevši od vremena ubrizgavanja. Nakon toga je usledilo 5-minutno ultrazvučno zračenje od 500 kHz pri MI od 0.1 ili 0.2.30 minuta nakon tretmana životinje su žrtvovane, uzorci tkiva; tumor, butni mišić sa tretiranom nogom i butni mišić sa kontralateralne netretirane noge, su sakupljeni i sadržaj Evans Blue je ekstrahovan i kvantifikovan. Tri životinje su testirane u svakoj grupi, sve sa aktivacijom od 45 s pomoću VScan sonde. Grupe i varijable su date u tabeli 15.
Tabela 15 Grupe ispitivane sa zajedničkim ubrizgavanjem Evans Blue boje; UZ procedure i predmeti za ispitivanje. UZ aktivacija je izvedena na svim životinjama, tri životinje po grupi.
LiCor CW800 EPR agens
[0263] LiCor CW800 EPR agens je administriran pri dozi od 5 nmol/kg telesne mase nakon čega odmah sa 50 µL kompozicije klastere koja sadrži nominalih 1.5 µL pFMCP mikrokapljica 4.0 µL HEPS/PFB mikromehurića po mL. Aktivaciju je obezbedio Vscan klinički ultrazvučni skener sa sondom od 2MHz tokom 45 sekundi počevši od vremena ubrizgavanja. Nakon toga je usledilo 5-minutno ultrazvučno zračenje od 500 kHz pri MI od 0.2. Epifluorescentno snimanje celog tela je izvedeno pomoću Pearl Impulse sistema za snimanje do 12 sati nakon administriranja. Grupe i brojevi životinja su dati u tabeli 16.
Tabela 16 Grupe ispitivane sa zajedničkim ubrizgavanjem LiCor CW800; UZ procedure.
Sve životinje su dozirane sa kompozicijom klastera.
[0264] Region od interesa je nacrtan preko tumora na slici epifluorescencije i izračunat je srednji intenzitet. Srazmerni region od interesa je takođe nacrtan preko netretirane, kontralateralne butine na približno istoj lokaciji na nozi. Izračunat je bezdimenzionalni odnos prosečnog intenziteta slike u oblasti tumorskog regiona podeljen sa prosečnim intenzitetom slike u netretiranoj nozi. Površina ispod krive ovog odnosa je izračunata i integrisana od vremenskih tačaka od 1 minuta do 1 sata.
Kompozicija klastera napunjena sa DiR
[0265] 50µL kompozicije klastera koja sadrži nominalih 1.5 µL pFMCP mikrokapljica napunjenih sa 10 mg/mL DiR bojom 4.0 µL HEPS/PFB mikromehurića po mL je administrirana. Aktivaciju je obezbedio Vscan klinički ultrazvučni skener sa sondom od 2MHz tokom 45 sekundi počevši od vremena ubrizgavanja. Nakon toga je usledilo 5-minutno ultrazvučno zračenje od 500 kHz pri MI od 0.2. Ultrazvučna polja su primenjena na tumor koji nose leve noge životinja. Kontrolna grupa je primila istu kompoziciju klastera napunjenu DiR-om i procedure rukovanja ali nije bila izložena ultrazvuku. Podaci o grupi životinja su dati u tabeli 17.
Tabela 17 Grupe ispitivane sa kompozicijom klastera napunjenom sa DiR; brojevi životinja i UZ procedure. Sve životinje su dozirane sa kompozicijom klastera.
[0266] Epifluorescentne slike su dobijene pomoću Pearl Impulse fluorescentnog sistema za snimanje i pre ubrizgavanja i 1 minut posle tretmana (otprilike 7 minuta posle injekcije) uz standardizovanu akviziciju slika kako bi se omogućila kvantitativna poređenja. Regioni od interesa su nacrtani preko tumora na levoj butini, a srazmerni region od interesa je nacrtan na desnoj butini bez tumora približno iste veličine i anatomske lokacije. Zabeležen je srednji intenzitet fluorescencije u regionima. Kao primarni odgovor, procenjena je razlika u intenzitetu fluorescencije između slike pre injekcije i slike posle tretmana. Urađena je dvosmerna analiza varijanse sa faktorima noge sa tumorom naspram noge koja ne nosi tumor, i UZ zračenje naspram nema UZ zračenja.
E8-4 Rezultat
Evans Blue
[0267] Evans Blue je ekstrahovan i kvantifikovan iz uzoraka tkiva (mg/mL tkiva). Koncentracija u tretiranom butnom mišiću je podeljena sa koncentracijom u netretiranom butnom mišiću za svaku životinju (podudarni par) da bi se obezbedio bezdimenzionalni odnos povećanog preuzimanja u tretiranom mišiću. Jednosmerna ANOVA je primenjena na podatke i rezultati su dati u tabeli 18. Došlo je do statistički značajnog, približno udvostručavanja u Evans Blue preuzimanju u nogu tretiranu aktiviranom kompozicijom klastera sa naknadnom primenjenom niskom frekvencijom. Za drugu grupu, nije primećeno statistički značajno povećanje preuzimanjaa.
Tabela 18 Odnos preuzimanja (srednja i standardna devijacija) za tretirano u odnosu na netretirano mišićna tkiva u različitim grupama.
[0268] Uzorci tumora su uzeti iz grupe 1 i 2. Koncentracija Evans Blue je podeljena sa koncentracijom Evans Blue u netretiranom uzorku mišićnog tkiva butine da bi se obezbedio bezdimenzionalni odnos koji opisuje povećanje preuzimanja. Primenjen je t-test sa 2 uzorka sa pretpostavljenom jednakom varijansom uzorka. Rezultati su prikazani u tabeli 19. Došlo je do povećanog preuzimanja u tumorskom tkivu u poređenju sa netretiranim mišićem butine od približno 3.4 prema 1 za tumor sa ultrazvukom od 500 kHz primenjen nakon aktivacije i približno 2 prema 1 bez primene ultrazvuka od 500 kHz nakon aktiviranje.
Tabela 19 Odnos preuzimanja (srednja, standardna devijacija i standardne greška srednje vrednosti) za tretirano u odnosu na netretirano tkivo butine u različitim grupama
Optičko snimanje sa LiCor CW800 EPR kontrastnim agensom
[0269] Tipične slike epifluorescencije prikazane su na slici 22 za životinju iz grupe 1 (leva slika; aktivacija i naknadno UZ zračenje) i grupe 3 (desna slika; bez aktivacije, bez naknadnog UZ zračenja). Strelice označavaju lokaciju tumora. Slike su snimljene sa istim podešavanjem Pearl skenera sistema za snimanje i predstavljene su sa istom linearnom sivom skalom intenziteta fluorescencije za direktno poređenje. Tumori kod dve životinje su približno iste lokacije i veličine.
[0270] Slika 23 prikazuje odnos intenziteta fluorescencije tumora prema intenzitetu netretirane kontrolne noge od 1 minuta do 9 sati nakon tretmana. Postoji statistički povećano početno preuzimanje u grupi 2 (kvadrati; samo aktivacija) u poređenju sa grupom 1 (dijamanti; bez aktivacije, bez naknadnog UZ zračenja), i statistički povećano početno preuzimanje i stopa preuzimanja u grupi 3 (krugovi; aktivacija i naknadno UZ zračenje ), u poređenju sa grupama 1 i 2.
[0271] Odnos prosečnog intenziteta u regionu tumora i prosečnog intenziteta u netretiranoj nozi je izračunat da bi se stvorio bezdimenzionalni odnos cilja prema pozadini (TBR - Target to Background), a površina ispod TBR krive je integrisana od 1 minuta do 1 sata nakon tretmana.
Snimanje je izvedeno u vremenskim tačkama od 1 minuta, 30 minuta i 60 minuta za sve životinje. Rezultati su tabelarno prikazani u tabeli 20. Slika 24 prikazuje srednje i procenjene standardne greške grupe 1, 2 i 3, označene A, B i C redom na slici.
Tabela 20 Površina ispod krive (AUC) za odnose preuzimanja TBR (srednja i standardna devijacija) za tretirano tumorsko tkivo naspram netretiranog tkiva butine u različitim grupama
[0272] Analiza varijanse je primenjena na tri grupe tretmana sa rezultujućom p vrednošću <0.001. Kontrasti su primenjeni između grupe 1 i 2 sa p vrednošću od 0.037, i između grupe 2 i 3 sa p vrednošću od 0.005. Dakle postoji statistički značajno (na nivou od 0.05) povećanje površine ispod krive između grupe 1 i 2 i između grupe 2 i 3.
Mikrokapljična komponenta napunjena sa DiR kompozicije klastera
[0273] Tipične slike epifluorescencije nakon tretmana prikazane su na slici 25 za životinju iz grupe 1 koja nije bila izložena ultrazvuku (označena A), i životinju iz grupe 2 (označena B) sa aktivacijom i naknadnim UZ zračenjem u levu nogu koja nosi tumor. Srednja razlika u intenzitetu fluorescencije definisana kao srednji intenzitet posle tretmana minus srednji intenzitet pre injekcije za levu (koja nosi tumor) i desnu nogu prikazana je u tabeli 21.
Tabela 21 Srednja vrednost povećanja ± SD intenziteta fluorescencije od vrednosti pre ubrizgavanja u različitim grupama
[0274] Dvosmerna analiza varijanse daje p vrednost <0.001 za povećan intenzitet fluorescencije u nozi koja nosi tumor kada je primenjena ultrazvučna aktivacija i naknadno zračenje. Ovi rezultati pokazuju lokalizovanu isporuku i preuzimanje molekula fluorescentne boje napunjene u uljnu fazu komponente mikrokapljice (C2).
E8-5 Zaključci
[0275] Došlo je do statistički značajnog povećanja isporuke Evans Blue boje u mišićno i tumorsko tkivo na nivo od 0.05 nakon istovremene injekcije sa kompozicijom klastera nakon čega je usledila UZ aktivacija i dalje UZ zračenje. Približno udvostručenje Evans Blue je primećeno u tretiranom mišićnom tkivu u poređenju sa bez aktivacije i bez naknadnog UZ zračenja. Nije primećeno značajno povećanje isporuke Evans Blue samo administriranjem HEPS/PFB mikromehurića, i primenom aktivacije i naknadnog izlaganja ultrazvuku. Preuzimanje u tumorskom tkivu u poređenju sa netretiranim mišićnim tkivom povećao se za faktor 2 samo nakon aktivacije i faktor od 3.4 nakon aktivacije i naknadnog UZ zračenja.
[0276] Došlo je do statistički značajnog povećanja isporuka Licor CW800 EPR agensa tumorskom tkivu nakon istovremene injekcije kompozicije klastera i ultrazvučne aktivacije u poređenju sa bez ultrazvučne aktivacije. Došlo je do daljeg statistički značajnog povećanja isporuke nakon naknadnog UZ zračenja sa naknadnim ultrazvučnim zračenjem za pojačanu isporuku, u poređenju sa samo aktivacijom.
[0277] Statistički značajno povećanje intenziteta fluorescencije u nozi koja nosi tumor uočeno je kada je primenjena aktivacija i naknadno UZ zračenje nakon injekcije kompozicije klastera gde je DiR boja bila ubačena u uljnu fazu mikrokapljica u C2. Ovo pokazuje lokalizovanu isporuku molekularnog sadržaja iz mikrokapljica, potvrđujući ciljano prostorno oslobađanje i preuzimanje u oblasti izložene ultrazvučnom postupku.
Primer 9 (E9) – Proizvodnja komponenti i pripremanje kompozicije klastera
[0278] Obe komponente su proizvedene aseptično.
[0279] C1 - Sirova disperzija mikromehurića pripremljena je od sterilne lipidne disperzije i sterilne gasne komponente. Lipidna disperzija je termički sterilisana u posudi za rasuti materijal i gas je sterilno filtriran. Kompletna proizvodna linija je sterilisana parom. Mikrosfere su proizvedene insitu u koloidnom mlinu, istovremeno napajane disperzijom lipida i gasom. Intermedijarni proizvod (sirova disperzija) je zatim frakcionisan po veličini u posudi za flotaciju, razblažen do ciljane koncentracije mikromehurića sa vodenim rastvorom agensa za zaštitu od liofilizacije, napunjen aseptički i liofilizovan.
[0280] C2 - Emulzija mikrokapljica je pripremljena od sterilne lipidne disperzije i sterilne uljne komponente. Lipidna disperzija je termički sterilisana u posudi za rasuti materijal i uljna komponenta je sterilno filtrirana. Kompletna proizvodna linija je sterilisana parom. Mikrokapljice su proizvedene in-situ u koloidnom mlinu, istovremeno napunjene lipidnom disperzijom i uljnom komponentom. Sirova emulzija je zatim frakcionisana po veličini u linijskoj centrifugi, razblažena do ciljane koncentracije mikrokapljica sa vodenim rastvorom TRIS pufera, i napunjena aseptički [0281] Tri uzastopne serije svake komponente su proizvedene i podvrgnute testiranju sterilnosti prema Ph.Eur i USP. Svih šest serija je prošlo test sterilnosti.
[0282] DP - Kompozicija klastera je pripremljena aseptički rekonstituisanjem bočice sa C1 sa 2 mL C2 nakon čega je usledila ručna homogenizacija od 30s. 2 mL je izvučeno iz bočice sa C2 pomoću sterilnog šprica, za jednokratnu upotrebu i igle. Sadržaj šprica je dodat kroz čep bočice sa C1 i dobijeni DP je homogenizovan.

Claims (12)

Patentni zahtevi
1. Kompozicija klastera koja sadrži suspenziju klastera u vodenom biokompatibilnom medijumu, gde navedeni klasteri imaju prečnik u opsegu 1 do 10 µm, i kružnost < 0.9 i sadrži:
(i) prvu komponentu koja sadrži mikromehurić gasa i prvi stabilizator da stabilizuje navedeni mikromehurić, gde gas mikromehurića gasa sadrži sumpor heksafluorid, C3-6 perfluorougljenik, azot, vazduh ili smeše istih; i
(ii) drugu komponentu koja sadrži mikrokapljicu koja sadrži uljnu fazu i drugi stabilizator da stabilizuje navedenu mikrokapljicu, gde uljna faza sadrži difuzibilnu komponentu sposobnu da difunduje u navedeni mikromehurić gasa tako da barem prolazno poveća njegovu veličinu, i gde uljna faza sadrži delimično ili potpuno halogenovan ugljovodonik ili smešu istog;
gde mikromehurići i mikrokapljice navedene prve i druge komponente imaju suprotna površinska naelektrisanja i formiraju navedene klastere putem atraktivnih elektrostatičkih interakcija, pri čemu svaki prvi stabilizator i drugi stabilizator imaju neto elektrostatičko naelektrisanje koje je suprotno onom drugog, i
gde prvi stabilizator i drugi stabilizator svaki nezavisno sadrži fosfolipid, protein ili polimer.
2. Kompozicija klastera prema patentnom zahtevu 1, za primenu kao farmaceutska kompozicija.
3. Farmaceutska kompozicija koja sadrži:
(i) kompoziciju klastera prema patentnom zahtevu 1;
(ii) terapijski agens obezbeđen kao posebna kompozicija za kompoziciju klastera (i).
4. Farmaceutska kompozicija prema patentnom zahtevu 3, gde je terapijski agens odabran iz grupe: molekuli leka, nanočestice i sistemi za isporuku nanočestica, geni, i radioizotopi.
5. Ultrazvučni kontrasni agens koji sadrži kompoziciju klastera prema patentnom zahtevu 1, ili farmaceutsku kompoziciju prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 4.
6. Farmaceutska kompozicija za primenu u postupku isporuke najmanje jednog terapijskog agensa subjektu sisaru, pri čemu navedeni postupak sadrži korake:
(i) administriranje farmaceutske kompozicije kako je definisano u bilo kom od patentnih zahteva 3 do 4 subjektu sisaru;
(ii) po izboru snimanje mikromehurića navedene farmaceutske kompozicije korišćenjem ultrazvučnog snimanja da se identifikuje region od interesa za tretiranje u okviru navedenog subjekta;
(iii) aktiviranje pomeranja faze difuzibilne komponente druge komponente kompozicije klastera iz koraka (i) ultrazvučnim zračenjem regiona od interesa unutar navedenog subjekta, tako da:
(a) su mikromehurići navedenih klastera uvećani sa navedenom difuzibilnom komponentom iz koraka (iii) da bi se dobili uvećani mehurići koji su lokalizovani u navedenom regionu od interesa zbog privremenog blokiranja mikrocirkulacije u navedenom regionu od interesa od strane navedenih uvećanih mehurića; i (b) navedena aktivacija iz koraka (iii) olakšava ekstravazaciju terapijskog(ih) agensa(asa) administriranog(ih) u koraku (i);
(iv) po izboru, omogućavanje dalje ekstravazacije terapijskog(ih) agensa(asa) administriranog(ih) u koraku (i) daljim ultrazvučnim zračenjem.
7. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za primenu u skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 6, gde ultrazvuk primenjen u koraku (iv) ima frekvenciju u opsegu od 0.05 do 2 MHz.
8. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za primenu skladu sa postupkom prema patentnom zahtevu 6, gde ultrazvuk primenjen u koraku (iii) ima mehanički indeks ispod 0.7.
9. Farmaceutska kompozicija u skladu sa patentnim zahtevom 6 za primenu skladu sa postupkom prema bilo kom od patentnih zahteva 6 do 8 u postupku lečenja navedenog subjekta sisara.
10. Kompozicija klastera prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 4 za primenu u postupku lečenja subjekta sisara, koji obuhvata administriranje kompozicije klastera prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutske kompozicije prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 4 i primena fokusiranog ultrazvuka visokog intenziteta (HIFU) na region od interesa.
11. Kompozicija klastera prema patentnom zahtevu 1 ili farmaceutska kompozicija prema bilo kom od patentnih zahteva 3 do 4 za primenu kao ultrazvučni kontrasni agens ili medikament.
12. Postupak ultrazvučnog snimanja, koji obuhvata snimanje subjekta sisara prethodno administriranog sa ultrazvučnim kontrasnim agensom prema patentnom zahtevu 5.
RS20220889A 2013-09-27 2014-09-26 Isporuka lekova posredovana ultrazvukom RS63646B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
NO20131293 2013-09-27
PCT/NO2014/050177 WO2015047103A1 (en) 2013-09-27 2014-09-26 Ultrasound mediated delivery of drugs
EP14847119.6A EP3049117B1 (en) 2013-09-27 2014-09-26 Ultrasound mediated delivery of drugs

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63646B1 true RS63646B1 (sr) 2022-11-30

Family

ID=52744068

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220889A RS63646B1 (sr) 2013-09-27 2014-09-26 Isporuka lekova posredovana ultrazvukom

Country Status (15)

Country Link
US (7) US20160243234A1 (sr)
EP (2) EP3049117B1 (sr)
JP (2) JP6876436B2 (sr)
CN (1) CN105658243B (sr)
DK (1) DK3049117T3 (sr)
ES (2) ES2927884T3 (sr)
HR (1) HRP20221118T1 (sr)
HU (1) HUE060034T2 (sr)
LT (1) LT3049117T (sr)
PL (1) PL3049117T3 (sr)
PT (1) PT3049117T (sr)
RS (1) RS63646B1 (sr)
SI (1) SI3049117T1 (sr)
SM (1) SMT202200398T1 (sr)
WO (1) WO2015047103A1 (sr)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3049117B1 (en) 2013-09-27 2022-07-27 Exact Therapeutics As Ultrasound mediated delivery of drugs
WO2016097867A2 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Implantable ultrasound generating treating device for brain treatment, apparatus comprising such device and method implementing such device
WO2017080481A1 (en) * 2015-11-11 2017-05-18 Navifus Co., Ltd. Method and kit for treating brain tumor by using ultrasound system
US10981021B2 (en) * 2016-03-11 2021-04-20 Carthera Method for transiently disrupting a region of the blood-brain barrier of a human
CA3017916C (en) 2016-03-11 2023-11-07 Sorbonne Universite External ultrasound generating treating device for spinal cord and spinal nerves treatment, apparatus comprising such device and method implementing such device
WO2017153798A1 (en) 2016-03-11 2017-09-14 Université Pierre Et Marie Curie (Paris 6) Implantable ultrasound generating treating device for spinal cord and/or spinal nerve treatment, apparatus comprising such device and method
WO2018222340A1 (en) * 2017-05-29 2018-12-06 Bionaut Labs Ltd. Triggering of payload release from miniaturized devices
WO2019002940A1 (en) * 2017-06-29 2019-01-03 Insightec, Ltd. TARGETED ADMINISTRATION AND DETERMINATION ENHANCED BY CAVITATION OF A MEDICAMENT
SG11202004025WA (en) * 2018-01-02 2020-05-28 Flodesign Sonics Inc Particles for use in acoustic standing wave processes
US12274530B2 (en) 2018-09-18 2025-04-15 The Johns Hopkins University Neuromodulation based nerve identification
GB201821049D0 (en) * 2018-12-21 2019-02-06 Ge Healthcare As Ultrasound contrast agent and methods for use therof
CN114760989A (zh) * 2019-10-25 2022-07-15 精准医疗股份有限公司 胰腺癌的治疗
GB2595513B (en) * 2020-05-29 2023-03-29 Act Therapeutics Ltd Treatment of infections
GB2605422B (en) * 2021-03-31 2025-04-30 Act Therapeutics Ltd Treatment of the central nervous system
GB2629999B (en) 2021-04-21 2025-03-26 Act Therapeutics Ltd Enhancement of treatment with immunotherapeutic agents
WO2024050075A2 (en) * 2022-09-01 2024-03-07 Microvascular Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of vascular obstruction
NO20221061A1 (en) * 2022-10-05 2024-04-08 Exact Therapeutics As Act enhanced ablation therapy
NO20221187A1 (en) 2022-11-04 2024-05-06 Exact Therapeutics As Method and system for calculating a point estimate of an ultrasound dose

Family Cites Families (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5356490A (en) 1992-04-01 1994-10-18 Henkel Corporation Composition and process for treating metal
US5335168A (en) 1993-01-13 1994-08-02 Compaq Computer Corporation Computer system with power-down mode for monitor
EP0727225A3 (en) 1995-02-14 1997-01-15 Sonus Pharma Inc Compositions and methods for directed ultrasonic imaging
US5997898A (en) 1995-06-06 1999-12-07 Imarx Pharmaceutical Corp. Stabilized compositions of fluorinated amphiphiles for methods of therapeutic delivery
WO1998001297A1 (en) 1996-07-09 1998-01-15 Panex Corporation Quartz construction
DE69738406T2 (de) 1996-10-21 2008-12-04 Ge Healthcare As Verbesserungen in oder an Kontrastmitteln
US6416740B1 (en) 1997-05-13 2002-07-09 Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Inc. Acoustically active drug delivery systems
WO1999039738A1 (en) 1998-02-09 1999-08-12 Bracco Research S.A. Targeted delivery of biologically active media
JP3514776B2 (ja) * 1998-04-15 2004-03-31 三菱電機株式会社 マルチビジョンシステム
GB9808599D0 (en) 1998-04-22 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or realting to contrast agents
GB9808581D0 (en) * 1998-04-22 1998-06-24 Nycomed Imaging As Improvements in or relating to contrast agents
NO20010234D0 (no) * 2001-01-12 2001-01-12 Nycomed Imaging As Perfusjon avbildningsbilde
JP2005168312A (ja) * 2003-12-08 2005-06-30 Mebiopharm Co Ltd 遺伝子類導入方法
EP1696965B1 (en) * 2003-12-22 2014-12-10 Bracco Suisse SA Assembly of gas-filled microvesicle with active component for contrast imaging
CA2577938C (en) 2004-08-26 2013-04-16 Himanshu Brahmbhatt Delivering functional nucleic acids to mammalian cells via bacterially derived, intact minicells
CN100427142C (zh) * 2005-01-10 2008-10-22 重庆海扶(Hifu)技术有限公司 一种高强度聚焦超声治疗用助剂及其筛选方法
US10219815B2 (en) 2005-09-22 2019-03-05 The Regents Of The University Of Michigan Histotripsy for thrombolysis
JP2007197403A (ja) 2006-01-30 2007-08-09 Hitachi Ltd 薬物キャリアー及び超音波装置
JP5342102B2 (ja) 2006-07-04 2013-11-13 昭和電工株式会社 エマルション組成物
WO2010121265A1 (en) * 2009-04-17 2010-10-21 Visualsonics Inc. A method for nonlinear imaging of ultrasound contrast agents at high frequencies
EP2468191B1 (en) 2010-12-22 2019-01-30 Samsung Medison Co., Ltd. Ultrasound diagnosis apparatus for providing map of interest index
WO2012125172A1 (en) 2011-03-15 2012-09-20 Kona Medical, Inc. Energetic modulation of nerves
EP3049117B1 (en) 2013-09-27 2022-07-27 Exact Therapeutics As Ultrasound mediated delivery of drugs
WO2017080481A1 (en) 2015-11-11 2017-05-18 Navifus Co., Ltd. Method and kit for treating brain tumor by using ultrasound system
US20200405258A1 (en) 2016-07-15 2020-12-31 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and systems for using phase change nanodroplets to enhance sonothrombolysis
CA3049278A1 (en) 2017-01-05 2018-07-12 Warren Lee Apparatus, method, and use for ultrasound mediated microbubble delivery of pharmaceutical compositions
CN111836666A (zh) 2017-11-09 2020-10-27 蒙特非奥里医疗中心 用于治疗癌症和转移的低能量免疫致敏
CN108815725A (zh) 2018-04-04 2018-11-16 重庆融海超声医学工程研究中心有限公司 治疗剂量规划方法及系统
GB201819853D0 (en) 2018-12-05 2019-01-23 Innovation Ulster Ltd Therapy
WO2020167640A1 (en) 2019-02-12 2020-08-20 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Systems and methods for high intensity focused ultrasound
US11730452B2 (en) 2019-04-09 2023-08-22 Insightec Ltd. Systems and methods for regulating microbubbles in ultrasound procedures
KR102379296B1 (ko) 2019-09-02 2022-03-29 (주)아이엠지티 면역 마이크로버블 복합체 및 이의 이용
CN114760989A (zh) 2019-10-25 2022-07-15 精准医疗股份有限公司 胰腺癌的治疗
US11786760B2 (en) 2019-12-10 2023-10-17 GE Precision Healthcare LLC Multi-beam neuromodulation techniques
US11123046B1 (en) 2020-05-05 2021-09-21 Techsomed Medical Technologies Ltd. Monitoring thermal ablation using registration of B-mode ultrasound images
GB2595513B (en) 2020-05-29 2023-03-29 Act Therapeutics Ltd Treatment of infections
WO2022069377A1 (en) 2020-09-29 2022-04-07 Koninklijke Philips N.V. Rendering of b-mode images based on tissue differentiation
GB2605422B (en) 2021-03-31 2025-04-30 Act Therapeutics Ltd Treatment of the central nervous system
GB2629999B (en) 2021-04-21 2025-03-26 Act Therapeutics Ltd Enhancement of treatment with immunotherapeutic agents

Also Published As

Publication number Publication date
US20210299256A1 (en) 2021-09-30
PT3049117T (pt) 2022-10-19
JP7042862B2 (ja) 2022-03-28
EP4005604B1 (en) 2023-06-07
EP4005604C0 (en) 2023-06-07
US20230241216A1 (en) 2023-08-03
US12377146B2 (en) 2025-08-05
US20260027211A1 (en) 2026-01-29
DK3049117T3 (da) 2022-10-31
JP2016532718A (ja) 2016-10-20
HRP20221118T1 (hr) 2022-12-23
CN105658243B (zh) 2019-11-08
EP3049117A1 (en) 2016-08-03
EP3049117B1 (en) 2022-07-27
US20230218760A1 (en) 2023-07-13
HUE060034T2 (hu) 2023-01-28
ES2927884T3 (es) 2022-11-11
US20230233681A1 (en) 2023-07-27
US12478676B2 (en) 2025-11-25
SI3049117T1 (sl) 2022-11-30
JP2020114846A (ja) 2020-07-30
US12343396B2 (en) 2025-07-01
SMT202200398T1 (it) 2022-11-18
US20230218759A1 (en) 2023-07-13
CN105658243A (zh) 2016-06-08
ES2951663T3 (es) 2023-10-24
EP4005604A1 (en) 2022-06-01
WO2015047103A1 (en) 2015-04-02
EP4005604B8 (en) 2023-07-19
JP6876436B2 (ja) 2021-05-26
US20160243234A1 (en) 2016-08-25
EP3049117A4 (en) 2017-03-29
PL3049117T3 (pl) 2022-11-07
LT3049117T (lt) 2022-10-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12377146B2 (en) Method of using high-frequency sound waves
AU2022248566B2 (en) Treatment of the central nervous system
US12622867B2 (en) Treatment of pancreatic cancer
CA3216195C (en) Enhancement of treatment with immunotherapeutic agents
JP2025118721A (ja) 校正されたガス充填微小胞を調製するための凍結乾燥組成物
HK40098205A (zh) 中枢神经系统的治疗