RS63658B1 - Antitela protiv signalno-regulatornog proteina alfa i postupci za upotrebu - Google Patents

Antitela protiv signalno-regulatornog proteina alfa i postupci za upotrebu

Info

Publication number
RS63658B1
RS63658B1 RS20220955A RSP20220955A RS63658B1 RS 63658 B1 RS63658 B1 RS 63658B1 RS 20220955 A RS20220955 A RS 20220955A RS P20220955 A RSP20220955 A RS P20220955A RS 63658 B1 RS63658 B1 RS 63658B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
seq
amino acid
domain
acid sequence
antibody
Prior art date
Application number
RS20220955A
Other languages
English (en)
Inventor
Jaume Pons
Bang Janet Sim
Hong Wan
Tracy Chia-Chien Kuo
Steven Elliot Kauder
William Don Harriman
Shelley Izquierdo
Original Assignee
Alx Oncology Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alx Oncology Inc filed Critical Alx Oncology Inc
Publication of RS63658B1 publication Critical patent/RS63658B1/sr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P15/00—Drugs for genital or sexual disorders; Contraceptives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/289—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD45
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/23—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from birds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/02—Screening involving studying the effect of compounds C on the interaction between interacting molecules A and B (e.g. A = enzyme and B = substrate for A, or A = receptor and B = ligand for the receptor)

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)

Description

Opis
OBLAST
[0001] Ovo otkriće se odnosi na izolovana antitela koja vezuju ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oba, kao i polinukleotide, vektore, ćelije domaćine i postupke u vezi sa tim.
OSNOVA
[0002] Signalno-regulatorni protein alfa (SIRP-α) je deo porodice receptora na površini ćelije koji igra kritičnu ulogu u regulaciji imunog sistema (videti, npr., Barclay, A.N. and Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64). SIRP-α se eksprimira na površini različitih ćelija, uključujući leukocite kao što su dendritske ćelije, eozinofili, neutrofili i makrofagi. SIRP-α uključuje ekstracelularni domen koji je u interakciji sa spoljnim stimulansima kao što su ligandi i intracelularni domen koji posreduje u različitim intracelularnim signalima.
[0003] Jedna od glavnih uloga SIRP-α je njegova regulacija imunološkog odgovora kroz interakcije sa CD47. CD47 se eksprimira na površini različitih tipova ćelija. Kada IgSF domen CD47 veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α eksprimiranog na imunoj ćeliji (npr., makrofag), ovo prenosi signal posredovan preko SIRP-α u imunoj ćeliji koji sprečava fagocitozu ćelije koja eksprimira CD47. Dakle, CD47 služi da imunom sistemu prenese ono što se naziva "nemoj me jesti" signal koji sprečava fagocitozu zdravih ćelija (videti, npr., WO2015/138600 i Weiskopf, K. et al. (2013) Science 341:88-91). Međutim, pokazalo se da je CD47 visoko eksprimiran u različitim vrstama kancera, a smatra se da njegova interakcija sa SIRP-α u ovom kontekstu omogućava tumorima da imitiraju zdrav signal „nemoj me jesti“ kako bi izbegao imunološki nadzor i fagocitozu makrofaga (videti, npr., Majeti, R. et al. (2009) Cell 138:286-99; Zhao, X.W. et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci.
108:18342-7). Kao takva, antitela koja blokiraju ovu interakciju su veoma poželjna.
[0004] Poznato je da je SIRP-α visoko polimorfni protein kod ljudi, majmuna i miševa. Na primer, identifikovano je 20 aminokiselinskih razlika između SIRP-α proteina u sojevima miša NOD i C57BL/6, a ovi polimorfizmi dovode do funkcionalnih posledica vezanih za CD47 vezivanje i presađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija u ove sojeve miša. Kod ljudi, najmanje 10 različitih alela SIRPA gena je identifikovano (Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23, Zhao, X. et al. (2011), PNAS. 108:18342-47; van der Heijden, J. (2014). Genetic variation in human Fc gamma receptors: Functional consequences of polymorphisms and copy number variation (Doctoral dissertation).
[0005] Zbog značaja interakcije SIRP-α-CD47 u normalnoj imunološkoj funkciji i tumorigenezi, kao i polimorfne prirode SIRP-α i postojanja drugih receptora SIRP porodice, identifikacija antitela koja imaju različite specifičnosti vezivanja sa intra- i /ili unakrsnom reaktivnosti među vrstama je od velikog interesa za razvoj kliničkih kandidata koji su efikasni u humanim populacijama i karakterizaciju ovih kandidata u različitim životinjskim modelima. Dakle, postoji potreba za istraživačkim alatima i potencijalnim kliničkim kandidatima koji moduliraju funkciju SIRP-α, npr., njegova vezujuća interakcija sa CD47. Takođe postoji potreba za postupcima izolovanja antitela sa različitim specifičnostima vezivanja SIRP-α i efektima na vezivanje CD47-SIRP-α da bi se razumela i efikasno ciljala ova kritična interakcija. Opisana su mnoga monoklonska antitela koja se vezuju za ekstracelularni domen SIRPα (Seiffert et al (1999), Blood 94:3633-3643; US 2003/054415; WO 2016/063233; Lee et al (2007), The Journal of Immunology, 179: 7741-7750)
SUŠTINA PRONALASKA
[0006] Ovaj pronalazak se odnosi na izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida, pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida, ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida majmuna, i ekstracelularni domen mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži:
(i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2AX3S, gde X1je S ili T; X2je N, Y, H ili D; i X3je M, L ili V (SEQ ID NO:297);
(ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, gde X1je A ili S; X2je G, S, ili je odsutan; X3je S, D ili G; X4je G ili S; X5je D, S ili G; X6je T ili A; X7je P, G, V, I, A ili S; X8je A, D ili G; i X9je V ili M (SEQ ID NO:298); i
(iii) HVR-H3 sekvenca koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); i
(b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži:
(i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1X2X3SX4YYX5, gde X1je D, G, S, I, ili je odsutan; X2je S, W, G, Y, D, ili je odsutan; X3je S, Y, T, ili D; X4je H, T, S, ili Y; i X5je G ili A (SEQ ID NO:299);
(ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDX1X2RPX3, gde X1je D ili N; X2je E, K, ili Q; i X3je S ili P (SEQ ID NO:300); i
(iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2YDX3X4X5YX6NX7, gde X1je G ili A; X2je G ili A; X3je G, Y, Q, S, ili A; X4je S, R, ili T; X5je T ili S; X6je A, I, V, L, ili T; i X7je T, A, D, ili P (SEQ ID NO:301).
[0007] Ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo sadrži: varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2AX3S, gde X1je S ili T; X2je N, Y, H, ili D; i X3je M, L, ili V (SEQ ID NO:297); HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, gde X1je A ili S; X2je G, S, ili je odsutan; X3je S, D ili G; X4je G ili S; X5je D, S, ili G; X6je T ili A; X7je P, G, V, I, A, ili S; X8je A, D, ili G; i X9je V ili M (SEQ ID NO:298); i HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193); i/ili varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1X2X3SX4YYX5, gde X1je D, G, S, I, ili je odsutan; X2je S, W, G, Y, D, ili je odsutan; X3je S, Y, T, ili D; X4je H, T, S, ili Y; i X5je G ili A (SEQ ID NO:299); HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDX1X2RPX3, gde X1je D ili N; X2je E, K, ili Q; i X3je S ili P (SEQ ID NO:300); i HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2YDX3X4X5YX6NX7, gde X1je G ili A; X2je G ili A; X3je G, Y, Q, S, ili A; X4je S, R, ili T; X5je T ili S; X6je A, I, V, L, ili T; i X7je T, A, D, ili P (SEQ ID NO:301). U drugim aspektima, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo sadrži: varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SX1AX2S, gde X1je N ili Y; i gde X2je M, L, ili V (SEQ ID NO:302); HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, gde X1je A ili S; X2je G ili je odsutan; X3je S ili G; X4je P, G, ili V; i X5je A ili D (SEQ ID NO:303); i HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); i/ili varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1YSSYYYA, gde X1je S ili A (SEQ ID NO:304); HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336); i HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO:195), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 135, 263, 264 ili 330. U nekim primerima izvođenja, the VH domain comprises (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO: 197), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična sekvenci aminokiselina SEQ ID NO: 137, 265, 266 ili 331. U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272), ili SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO: 193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 139, 267, 268 ili 332.U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži sekvencu FW1-HVR-L1-FW2-HVR-L2-FW3-HVR-L3-FW4 (N-terminus do C-terminusa), gde FW1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO:314), FW2 sadrži aminokiselinsku sekvencu WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO:315), FW3 sadrži aminokiselinsku sekvencu NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO:316), i FW4 sadrži aminokiselinsku sekvencu FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:317). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO:170), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:252. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:262. U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262.
[0008] U drugim aspektima, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu se antitelo vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više odabranih aminokiselinskih pozicija iz grupe koja se sastoji od I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 i K96, prema SEQ ID NO:296. U nekim primerima izvođenja, antitelo se vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 i K96, prema SEQ ID NO:296. U nekim primerima izvođenja, antitelo se dalje vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 i R95, prema SEQ ID NO:296. U nekim primerima izvođenja, antitelo se dalje vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 i R95, prema SEQ ID NO:296.
[0009] U nekim primerima izvođenja, antitelo je monoklonsko antitelo ili scFv-Fc antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 263, i VL domen koji sadrži amino kiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 252; pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 325, 326 ili 426; i gde antitelo dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID Nos: 320-324.
[0010] Ovde su dalje obezbeđena antitela za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja napredovanja kancera kod individue, postupci koji sadrže primenu na individuu efikasne količine antitela u skladu sa bilo kojim od gornjih primerima izvođenja. U nekim primerima izvođenja, postupci dalje obuhvataju primenu na individuu efikasne količine drugog antitela. U nekim primerima izvođenja, drugo antitelo vezuje antigen eksprimiran od strane ćelije kancera. U nekim primerima izvođenja, antigen eksprimiran od strane ćelije raka je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucin 1, Mucin 16, PTK7, STEAP1, receptor za endotelin B, mezotelin, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektin 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaze C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrin αVβ3, integrin α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, Le<y>, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, mucin, CAIX, EPHA3, folat receptor α, GD2, GD3, i MHC/peptidni kompleks koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, protein MAGE porodice, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaze, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezrelog laminin receptora, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenina, TGF-βRII, HPV E6, ili HPV E7. U nekim primerima izvođenja, postupci dalje obuhvataju primenu na individuu efikasne količine imunoterapeutskog agensa. U nekim primerima izvođenja, imunoterapeutski agens sadrži drugo antitelo. U nekim primerima izvođenja, drugo antitelo se vezuje za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R , CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginaze, TDO i PVRIG.
[0011] Ovde su dalje obezbeđena antitela za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja progresije autoimune bolesti ili inflamatorne bolesti kod pojedinca, pri čemu postupci sadrže primenu na pojedinca efikasne količine antitela u skladu sa bilo kojom od gore navedenih primera izvođenja. Autoimuna bolest ili inflamatorna bolest može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih: multipla skleroza, reumatoidni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna ili autoimuna bolest posredovana antitelima, bolest transplantata protiv domaćina, sepsa, dijabetes, psorijaza, artritis, ateroskleroza, Sjogrenov sindrom, progresivna sistemska skleroza, skleroderma, akutni koronarni sindrom, ishemijska reperfuzija, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, endometrioza, glomerulonefritis, IgA nefropatija, respiratorna bolest, policistična fibroza i respiratorni distres sindrom (ARDS), vaskulitis i inflamatorni autoimuni miozitis. U nekim primerima izvođenja, individua je čovek.
[0012] Ovde su dalje obezbeđene farmaceutske kompozicije koje sadrže antitelo prema ovom pronalasku i farmaceutski prihvatljiv nosač.
REZIME DODATNOG OTKRIĆA
[0013] Ovde su takođe opisana izolovana antitela koja vezuju vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida. Antitelo vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida. Antitelo može da veže vanćelijski domen humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPR VTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK PS (SEQ ID NO:5). Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:6). Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPR VTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK PS (SEQ ID NO:5) i mogu da vežu ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:6). Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida. Svaki od tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida može sadržati ekstracelularni domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 5, 6 i 76-83. Antitelo vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna. SIRP-α polipeptid majmuna može biti SIRP-α polipeptid makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) najmanje dva različita polipeptida varijante SIRP-α majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen makaki SIRP-α polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11, ekstracelularni domen makaki SIRP-α polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:12, ili oboje. Antitelo vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih mišjih SIRP-α varijantnih polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen jednog ili više mišjih SIRP-α polipeptida, i pri čemu jedan ili više mišjih SIRP-α polipeptida svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 7-10. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo možda ne vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo možda ne vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-β polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13, ekstracelularni domen humanog SIRP-β polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:14, ili oba. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP- γ polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:15. Antitelo može da moduliše SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Ćelija može biti leukocit izabran iz grupe koja se sastoji od makrofaga, dendritske ćelije, neutrofila, eozinofila i supresorske ćelije izvedene iz mijeloida (MDSC). Antitelo može inhibirati SIRP-α signalizaciju u makrofagu koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo može da pojača fagocitozu pomoću makrofaga koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo može da blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Antitelo se možda ne vezuje za kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47. Antitelo možda neće blokirati vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo možda ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Antitelo može da veže
1
kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu povezanu za IgSF domen CD47, pri čemu, SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde se SIRP-α D1 varijanta vezuje se za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može smanjiti afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije može smanjiti afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i pri čemu antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i pri čemu vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr., D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr.
D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr., D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida; pri čemu se antitelo vezuje za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr., D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domen) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida i SIRP-α polipeptid majmuna; pri čemu se antitelo ne vezuje za najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela S130. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida, majmunskog SIRP-α polipeptida i najmanje jednog od ekstraćelijskih domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela izabranog iz grupe koju čine S8, S13, S14 i S121. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida i SIRP-α polipeptida majmuna; pri čemu se antitelo ne vezuje ili se vezuje sa smanjenim afinitetom za najmanje jedan od ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i pri čemu antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela S137. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida i majmunskog SIRP-α polipeptida; pri čemu se antitelo ne vezuje za mišji SIRP-α polipeptid; pri čemu se antitelo ne vezuje za najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od S128. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida, majmunski SIRP-α polipeptid i najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; pri čemu se antitelo ne vezuje za mišji SIRP-α polipeptid; i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR
1
sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od S9, S11, S119, S120, S122 i S135. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida i ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih polipeptida SIRP-α varijante majmuna, i gde vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest CDR sekvenci; sekvencu varijabilnog domena teškog lanca; i/ili sekvencu varijabilnog domena lakog lanca iz antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od S115, S116, S117 i S118. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 97. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. U nekim primerima izvođenja, antitelo sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:138. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142.
[0014] Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 115 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinu sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 115 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 116 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 116 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 117 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 117 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 118 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 118 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 119 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 119 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 120 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 120 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 121 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 121 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 122 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 122 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
1
98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 123 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 123 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 126 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 126 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 128 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 128 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 130 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 130 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 135 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 135 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 137 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 137 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 138 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku
1
sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 138 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 1 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 1 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 2 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 2 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 8 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 8 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 9 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 9 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 11 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 11 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 12 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom
1
antitela 12 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 13 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 13 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 14 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 14 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VH domenom antitela 21, 25, 27, ili 66 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2) i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa VL domenom antitela 21, 25, 27, ili 66 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:116 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:93. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:117 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:94. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 118 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:95. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:119 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%,
1
ili 100% identična sa SEQ ID NO:96. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:335 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:97. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:121 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:98. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:122 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:99. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 123 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:100. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:124 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:101. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:125 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:102. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:126 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 103. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:127 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%,
1
87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:104. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:128 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:105. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:129 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO: 106. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:130 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:107. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:108 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:85. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:109 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:86. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:110 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:87. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:111 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:88. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:112 i/ili VL domenom
2
koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:89. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:113 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:90. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:114 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:91. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:115 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:92. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:135, 137, 139, ili 141 i/ili VL domenom koji sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ili 100% identična sa SEQ ID NO:136, 138, 140, ili 142.
[0015] Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:227 ili 230, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:228 ili 231, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:229; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:232, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:233, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:234. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:219 ili 235, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:236 ili 238, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:237; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:239, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:240, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:241. Antitelo može da sadrži (a) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GFSFSX1X2AMX3, gde X1je N ili I; X2je F ili Y; i X3je T ili S (SEQ ID NO: 185); (b) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGX4X5DTYYADSVKG, gde X4je S ili A i X5je G ili D (SEQ ID NO:186); (c) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVX6WSGDFFDY, gde X6je S ili G (SEQ ID NO: 187); (d) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVX7X8DX9A, gde X7je K ili R; X8je N ili S; i X9je L ili I (SEQ ID NO:188); (e) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AAX10X11RX12T, gde X10je R ili S; X11je I ili S; i X12je E ili D (SEQ ID NO:189); i (f) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO:148). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 119 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs:335 i 97 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:335 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:97). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 135 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs:127 i 104 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:127 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:104). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs:97, 104, 120, 335, i 127 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NOs:335 i 127 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NOs:97 i 104). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 143-148 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 143-145 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 146-148). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs:148-153 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs:149-151 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs:152, 153, i 148). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 136 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs:155-160 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs:155-157 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs:158-160). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 21 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs:161-166 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs:161-163 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 164-166). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 25 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 161, 163, 168, i 170-172 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 161, 168, i 163 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs:170-172). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 27 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 163, 173, 174, i 176-178 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs:163, 173, i 174 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 176-178). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 66 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs:162, 163, 179, i 182-184 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 162, 163, i 179 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 182-184). Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:143, 202, 204, ili 205, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:144, 203, ili 206, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145 ili 207; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 ili 208, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147 ili 209, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148 ili 210. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:149, 211, 213, ili 214, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:150, 212, ili 215, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151 ili 216; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:152 ili 217, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:153 ili 218, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:155, 219, 221, ili 222, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:156, 220, ili 223, i HVR-H3 koji sadrži
2
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:157 ili 224; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:158 ili 225, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:159 ili 226, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:160. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:161, 191, ili 194, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:162, 192, ili 195, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163 ili 193; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:161, 191, ili 194, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168, 196, ili 197, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163 ili 193; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:170, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:171, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173, 198, ili 200, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174, 199, ili 201, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163 ili 193; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:176, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:177, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178. Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:179, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:184. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:170, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:171, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:172. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:176, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:177, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:184. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 3 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:242; i/ili (b) VL domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:243. Antitelo može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz antitela 45 (npr., kao što je navedeno u Tabeli 2). Antitelo može da sadrži (a) VH domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:244; i/ili (b) VL domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:245. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184. Antitelo može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184. Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci mogu biti definisane pomoću Kabat. Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci mogu biti definisane pomoću Chothia. Jedna, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci mogu biti definisane pomoću IMGT. Antitelo može da sadrži HVR sekvence kao što su definisane sa dva ili više Kabat, Chothia, i IMGT (npr., antitelo sadrži jednu ili više HVR sekvenci kao što su definisane jednim razgrančenjem i jednu ili više HVR sekvenci kao što su definidasane različitim razgraničenjem).
2
[0016] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu NFAMT (SEQ ID NO: 175), NFAVT (SEQ ID N0:204), ili NFALT (SEQ ID NO:305), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGSGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 144), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVSWSGDFFDY (SEQ ID NO: 145); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVKNDLA (SEQ ID NO: 146), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AARIRET (SEQ ID NO: 147), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:120, 335, 246, 258, ili 327; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:97 ili 312. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:246, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:258, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:246, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:258, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:335, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312.
[0017] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu IYAMS (SEQ ID NO:269), IYAVS (SEQ ID NO:213), ili IYALS (SEQ ID NO:306), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 150), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVGWSGDFFDY (SEQ ID NO:151); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVRSDIA (SEQ ID NO:152), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AASSRDT (SEQ ID NO:153), i (iii) HVR-L3
2
sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO: 148). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:341, 247, 259, ili 328; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:104 ili 248. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:247, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:259, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:247, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:259, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248.
[0018] Ovde je takođe opisano izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2DX3N, gde X1je S ili T; X2je Y ili S; i X3je M, L, ili V (SEQ ID NO:307); (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LISGSGEIX1YYADSVKG, gde X1je I ili T (SEQ ID NO:308); i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu EX1X2X3YRFFDX4, gde X1je N ili D; X2je N ili D; X3je R ili M; i X4je D ili Y (SEQ ID NO:309); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RAX1QSVYX2YLA, gde X1je S ili D; i X2je T ili S (SEQ ID NO:310); (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1AX2X3RAX4, gde X1je G, A, ili D; X2je S ili R; X3je S, N, ili T; i X4je T ili A (SEQ ID NO:311); i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDRPPLT (SEQ ID NO:160). Antitelo može da sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYDMN (SEQ ID NO:270), SYDVN (SEQ ID NO:221), ili SYDLN (SEQ ID NO:313), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LISGSGEIIYYADSVKG (SEQ ID NO:156), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ENNRYRFFDD (SEQ ID NO:157); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži
2
aminokiselinsku sekvencu RASQSVYTYLA (SEQ ID NO:158), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GASSRAT (SEQ ID NO: 159), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDRPPLT (SEQ ID NO:160). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO: 249, 133, 260, ili 329; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:134, 250, ili 251. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251.
[0019] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu se antitelo vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo se može vezati za humani SIRP-α v1 polipeptid na K11, A42, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo se može vezati za humani SIRP-α v1 polipeptid na I7, P9, D10, K11, S12, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više pozicija aminokiselina izabranih iz grupe koju čine L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 i A116, prema SEQ ID NO:296 . Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na L14, T88, Y90, S106, S113 i A116 humanog SIRP-α v1, prema SEQ ID
2
NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na L14, T26 i T28, prema SEQ ID NO:296.
[0020] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu se antitelo vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koju čine od E47, L48, P58, R59, T82 i A84, prema SEQ ID NO:296. Antitelo se može vezati za humani SIRP-α v1 polipeptid na E47, L48, P58, R59, T82 i A84, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više pozicija aminokiselina izabranih iz grupe koja se sastoji od A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 i P83, prema SEQ ID NO :296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 i P83 humanog SIRP-α v1, prema SEQ ID NO:296.
[0021] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu antitelo vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 100 nM, i pri čemu antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manje od 100 nM. Antitelo može da veže D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida i D1 domen humanog SIRP-α v2 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen mišjeg SIRP-α polipeptida.
[0022] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu se antitelo vezuje za D1 domen humanog SIRP-α polipeptida, i gde antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže D1 domen ljudskog SIRP-α sa konstantom disocijacije (KD) manje od 100 nM. Antitelo može da veže D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 100 nM i/ili vezuje D1 domen humanog SIRP-α v2 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 100 nM. Antitelo može da veže D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida i D1 domen humanog SIRP-α v2 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen mišjeg SIRP-α polipeptida.
[0023] Ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog
2
SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i domen varijabilnog lakog lanca (VL) antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od antitela 119, 120, 121, 122, 21, 25, 27, 66 i 135. U drugim aspekti, ovde je obezbeđeno izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; (b) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:121 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:98; (c) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:107; (d) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:122 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:99; (e) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:136; (f) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:138; (g) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:140; (h) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142; ili (i) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104.
[0024] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i domen varijabilnog lakog lanca (VL) antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od antitela 136 i 137. Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134; ili (b) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 i domen varijabilnog lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105.
[0025] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i domen varijabilnog lakog lanca (VL) antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od antitela 3, 213, 173 i 209. Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:242 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:243; (b) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276; (c) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279; ili (d) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281.
[0026] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i domen varijabilnog lakog lanca (VL) antitela izabranog iz grupe koja se sasatoji od antitela 115, 116, 117, 118 i 132. Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje vanćelijski domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:116 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93; (b) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:117 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94; (c) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:118 i varijabilni domen
1
lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95; (d) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:119 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96; ili (e) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:282 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:283.
[0027] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela izabranog iz grupe koja se sastoji od antitela 218, 123, 149, 161, 162 i 194. Ovde je opisano izolovano antitelo koje se vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži: (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:285; (b) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100; (c) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287; (d) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:288 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289; (e) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291; ili (f) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:293.
[0028] Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), pri čemu je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) i varijabilni domen lakog lanca (VL) antitela 45. Ovde je opisano izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen), gde je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom koje sadrži varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:244 i
2
varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:245.
[0029] Antitelo može da pojača fagocitozu pomoću makrofaga koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo može da pojača aktivaciju dendritske ćelije koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo može da inhibira in vivo rast tumora koji eksprimira CD47. Antitelo možda neće sprečiti interakcije između ćelije koja eksprimira CD47 i T ćelije.
[0030] Antitelo može da sadrži Fc region. U nekim primerima izvođenja, Fc region je humani Fc region izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1 Fc regiona, IgG2 Fc regiona i IgG4 Fc regiona. U nekim primerima izvođenja, Fc region sadrži humani IgG1 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od L234A, L235A, L235E, G237A i N297A, prema EU numeraciji. U nekim primerima izvođenja, Fc region sadrži humani IgG2 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od A330S, P331S i N297A, prema EU numeraciji. U nekim primerima izvođenja, Fc region sadrži humani IgG4 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od S228P, E233P, F234V, L235A, L235E, delG236 i N297A, prema EU numeraciji. Antitelo može biti fragment antitela izabran iz grupe koja se sastoji od Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv i scFv fragment. U nekim primerima izvođenja, antitelo je konjugovano sa citotoksičnim agensom ili obeleživačem.
[0031] U nekim primerima izvođenja, antitelo je bispecifično antitelo. Antitelo može da sadrži prvi domen za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i drugi domen za vezivanje antigena koji vezuje antigen eksprimiran u ćeliji kancera. Antigen eksprimiran od strane ćelije kancera može biti izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4 , EphA4, BCMA, Mucin 1, Mucin 16, PD-L1, PTK7, STEAP1, receptor endotelina B, mezotelin, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektin 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaza C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrin αVβ3, integrin α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, Le<y>, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, mucin, CAIX, EPHA3, folate receptor α, GD2, GD3, i MHC/peptid kompleks koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, protein MAGE poridice, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaza, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli laminin receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivin, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenin, TGF-βRII, HPV E6, ili HPV E7. Antitelo može biti pileće, humanizovano, himerno ili humano antitelo. Antitelo može biti generisano ili dobijeno od pileta.
[0032] Ovde su dalje obezbeđeni polinukleotidi koji sadrže antitelo u skladu sa bilo kojim od gornjih primera izvođenja. Ovde su dalje obezbeđeni vektori koji sadrže polinukleotid prema bilo kome od gornjih primera izvođenja. Ovde su dalje obezbeđene ćelije domaćini koje sadrže polinukleotid ili vektor prema bilo kom od gornjih primera izvođenja. Ovde su dalje obezbeđeni postupci za proizvodnju antitela, koje obuhvataju kultivisanje ćelije domaćina u skladu sa bilo kojim od gornjih primera izvođenja tako da se antitelo proizvodi. U nekim primerima izvođenja, postupci dalje uključuju izolaciju antitela iz ćelije domaćina.
[0033] Ovde su dalje obezbeđena antitela za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja napredovanja kancera kod individue, postupci koji obuhvataju primenu na individuu efikasne količine antitela u skladu sa bilo kojim od gore navedenih primera izvođenja. U nekim primerima izvođenja, postupci dalje obuhvataju primenu na pojedinca efikasne količine drugog antitela. U nekim primerima izvođenja, drugo antitelo vezuje antigen eksprimiran od strane ćelije kancera. U nekim primerima izvođenja, antigen eksprimiran od strane ćelije kancera je izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucin 1, Mucin 16, PTK7, STEAP1, Endotelin B Receptor, mezotelin, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektin 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaze C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrin αVβ3, integrin α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, Le<y>, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, mucin, CAIX, EPHA3, folate receptor α, GD2, GD3, i MHC/peptid kompleksa koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, protein MAGE poridice, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaze, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezrelog laminin receptora, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenina, TGF-βRII, HPV E6, ili HPV E7. U nekim primerima izvođenja, postupci dalje obuhvataju primenu na individuu efikasne količine imunoterapeutskog agensa. U nekim primerima izvođenja, imunoterapeutski agens sadrži drugo antitelo. U nekim primerima izvođenja, drugo antitelo se vezuje za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginaze, TDO, i PVRIG. U nekim primerima izvođenja, prvo antitelo vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili ekstracelularne domene i humanog SIRP-α v1 polipeptida i humanog SIRP- α v2 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 100 nM, pri čemu prvo antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α
4
polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida, i gde se drugo antitelo vezuje za PD-1. U nekim primerima izvođenja, prvo antitelo vezuje D1 domen humanog SIRP-α polipeptida, pri čemu prvo antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida, i gde drugo antitelo se vezuje za PD-1. U nekim primerima izvođenja, prvo antitelo vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manjom od 100 nM, pri čemu prvo antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida, i gde se drugo antitelo vezuje za PD-L1. U nekim primerima izvođenja, prvo antitelo vezuje D1 domen humanog SIRP-α polipeptida, pri čemu prvo antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida, i gde drugo antitelo se vezuje za PD-L1. U nekim primerima izvođenja, individua je čovek.
[0034] Ovde su dalje obezbeđena antitela za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja progresije autoimune bolesti ili inflamatorne bolesti kod pojedinca, postupci koji se sastoje od primene na individuu efikasne količine antitela u skladu sa bilo kojim od gore navedenih primera izvođenja. Autoimuna bolest ili inflamatorna bolest može biti izabrana iz grupe koja se sastoji od sledećih: multipla skleroza, reumatoidni artritis, spondiloartropatija, sistemski eritematozni lupus, inflamatorna ili autoimuna bolest posredovana antitelima, bolest transplantata protiv domaćina, sepsa, dijabetes, psorijaza, artritis, ateroskleroza, Sjogrenov sindrom, progresivna sistemska skleroza, skleroderma, akutni koronarni sindrom, ishemijska reperfuzija, Kronova bolest, ulcerozni kolitis, endometrioza, glomerulonefritis, IgA nefropatija, respiratorna bolest, policistična fibroza i respiratorni distres sindrom (ARDS), vaskulitis i inflamatorni autoimuni miozitis. U nekim primerima izvođenja, individua je čovek.
[0035] Ovde su dalje opisani postupci identifikacije domena za vezivanje antigena koji vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, postupci koji sadrže (a) obezbeđivanje domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida; (b) sklapanje kompleksa koji sadrži SIRP-α D1 varijante vezane za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47; (c) dovođenje u kontakt domena za vezivanje antigena sa sastavljenim kompleksom; i (d) detekciju vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu vezivanje domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje da domen koji vezuje antigen ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Ovde su dalje opisani postupci identifikacije antitela ili domena za vezivanje antigena koji vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, postupci koji sadrže dovođenje u kontakt antitela ili domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida sa kompleksom koji sadrži SIRP-α D1 varijantu povezanu za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta vezivanja SIRP-α D1 domena koji se javlja u prirodi za humani CD47; i detekciju vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu vezivanje domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Ovde su dalje opisani postupci identifikacije domena za vezivanje antigena koji vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, postupci koji sadrže (a) obezbeđivanje domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida; (b) sklapanje kompleksa koji sadrži SIRP-α D1 varijante vezane za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47; (c) dovođenje u kontakt domena za vezivanje antigena sa sastavljenim kompleksom; i (d) detekciju vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu nedostatak vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Ovde su dalje opisani postupci identifikacije antitela ili domena za vezivanje antigena koji vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, postupci koji sadrže dovođenje u kontakt antitela ili domena koji vezuje antigen koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida sa kompleksom koji sadrži SIRP-α D1 varijantu povezanu za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47; i (d) detekciju vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu nedostatak vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. SIRP-α D1 varijanta može da sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 17-52. IgSF domen CD47 može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 16. Polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47 može da sadrži humani CD47 vanćelijski domen. Polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47 može dalje da sadrži Fc region antitela.
[0036] Ovde su dalje opisani postupci za proizvodnju anti-SIRP-α antitela koje vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida, postupci koji sadrže: (a) imunizaciju pileta peptidom koji sadrži najmanje deo humanog SIRP-α ekstracelularnog domena (npr. D1 domen); (b) dobijanje antitela iz ćelije koja proizvodi antitela od imunizovanih pilića; i (c) detekciju vezivanja između antitela dobijenog iz ćelije i ekstracelularnih domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida, pri čemu vezivanje između antitela i ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humani SIRP-α polipeptid ukazuje na to da antitelo anti-SIRP-α je antitelo koje vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α varijantnog polipeptida. Antitelo može biti pileće, humanizovano, himerno ili humano antitelo. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oba. Antitelo može da veže vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EEELQVIQPDKSVLVAAGETATLRCTATSLIPVGPIQWFRGAGPGRELIYNQKEGHFPR VTTVSDLTKRNNMDFSIRIGNITPADAGTYYCVKFRKGSPDDVEFKSGAGTELSVRAK PS (SEQ ID NO:5). Antitelo može da veže vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:6). Antitelo može da veže vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
PS (SEQ ID NO:5) i vezuje ekstracelularni domen (npr., D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:6). Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida. Svaki od tri, četiri, pet, šest, sedam, osam, devet ili deset različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida može sadržati ekstracelularni domen (npr. D1 domen) koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOS: 5, 6 i 76-83. Postupci mogu dalje da obuhvataju detekciju vezivanja između antitela dobijenog iz ćelije i ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) jednog ili više SIRP-α polipeptida izabranih iz grupe koja se sastojo od majmunskog SIRP-α polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida, humanog SIRP-β polipeptida i humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna. SIRP-α polipeptid majmuna može biti SIRP-α polipeptid makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) najmanje dva različita polipeptida varijante SIRP-α majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida makaki majmuna koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) polipeptida SIRP-α makaki majmuna koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 12, ili obe. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih mišjih SIRP-α varijantnih polipeptida. Antitelo može da veže vanćelijski domen (npr. D1 domen) jednog ili više mišjih SIRP-α polipeptida, i pri čemu jedan ili više mišjih SIRP-α polipeptida svaki sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO.: 7-10. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo možda ne veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo možda ne veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:13, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 14, ili obe. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 15. Postupci mogu dalje da sadrže detekciju vezivanja ili nedostatka vezivanja između antitela dobijenog od ćelija i kompleksa koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47. Antitelo može da veže kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu povezanu za IgSF domen CD47, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde je SIRP-α D1 varijanta vezuje se za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47. Antitelo možda neće blokirati vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo možda ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Antitelo se možda ne vezuje za kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za IgSF domen CD47, pri čemu SIRP-α D1 varijanta je SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde SIRP-α D1 domen varijanta se vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47. Antitelo može da blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može smanjiti afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije može smanjiti afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije. Antitelo može da moduliše SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Ćelija može biti leukocit izabran iz grupe koja se sastoji od makrofaga, dendristke ćelije, neutrofila, eozinofila i supresorske ćelije izvedene iz mijeloida (MDSC). Antitelo može inhibirati SIRP-α signalizaciju u makrofagu koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo može da pojača fagocitozu makrofagom koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid.
[0037] Podrazumeva se da se jedna, neka ili sva svojstva različitih ovde opisanih primera izvođenja mogu kombinovati da bi se formirali drugi primeri izvođenja ovog pronalaska. Ovi i drugi aspekti pronalaska će postati očigledni stručnjacima u ovoj oblasti. Ovi i drugi primeri izvođenja pronalaska su dalje opisani detaljnim opisom koji sledi.
KRATAK OPIS CRTEŽA
[0038]
SL. 1A prikazuje poravnanje između D1 domena 10 različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida. Prikazane sekvence odgovaraju SEQ ID NO: 5, 6 i 76-83 (od vrha do dna). Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 1B prikazuje poravnanje između humanog v1, humanog v2, makaki majmuna i 129 mišjih SIRP-α D1 domena. Prikazane sekvence odgovaraju SEQ ID NO: 5, 6, 11 i 7 (od vrha do dna). Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 1C prikazuje poravnanja između različitih humanih i mišjih SIRP-α D1 domena, sa naznačenim R1, R2 i R3 petljama. Prikazano je poravnanje između humanog v1, humanog v2, 129 miša, NOD miša, C57BL/6 miša i SIRP-α D1 domena BALB/c miša. Prikazane sekvence odgovaraju SEQ ID NO: 5-10 (od vrha do dna). Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 2 pokazuje poravnanje između humanog v1, humanog v2, makaki majmuna, 129 mišjeg i piležeg domena SIRP-α D1. Prikazane sekvence odgovaraju SEQ ID NO: 5, 6, 11, 7 i 84 (od vrha do dna). Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 3A i 3B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S130 za različite SIRP peptide.
SL. 3A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmuna SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO:15) i prethodno formiranog kompleksa SIRP-α varijanti visokog afiniteta vezanih za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). Prethodno formirani kompleks je generisan mešanjem dva humana SIRP-α v1 i v2 polipeptida visokog afiniteta (SEQ ID NOs: 17 i 19) u odnosu 1:1 i kombinovanjem smeše sa
4
CD47 da bi se dobio SIRP-α:CD47 kompleks. Prethodno formirani kompleks SIRP-α:CD47 kompleks za SL. 4A-9B se takođe pripremaju na sličan način. SL. 3B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljnih mesta ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 4A i 4B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S121 za različite SIRP peptide.
SL. 4A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO:15) i prethodno formiranog kompleksa SIRP-α varijanti visokog afiniteta (SEQ ID NO:17 i 19) vezani za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). SL. 4B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljnih mesta ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 5A i 5B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S137 za različite SIRP peptide.
SL. 5A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki mjamunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO: 15) i prethodno formiranog kompleksa varijanti SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO: 17 i 19) vezanih za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO: 16). SL. 5B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljnog mesta ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 6A i 6B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S128 za različite SIRP peptide.
SL. 6A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO: 15) i prethodno formiranog kompleksa varijanti SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO:17 i 19) vezani za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). SL. 6B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljeva ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 7A i 7B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S135 za različite SIRP peptide.
SL. 7A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO: 15) i prethodno formiranog kompleksa varijanti SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO:17 i 19) vezanih za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). SL. 7B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljnih mesta ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 8A i 8B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S 126 za različite SIRP peptide.
SL. 8A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO: 15) i prethodno formiranog kompleksa varijanti SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO:17 i 19) vezani za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). SL. 8B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljeva ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 9A i 9B prikazuju specifičnost vezivanja klona antitela S138 za različite SIRP peptide.
SL. 9A prikazuje ELISA krive vezivanja za antitelo protiv humanih v1, humanih v2, mišjih i makaki majmunskih SIRPα D1 domena, kao i humanog SIRPγ (SEQ ID NO:15) i prethodno formiranog kompleksa SIRP-α varijanti visokog afiniteta (SEQ ID NO:17 i 19) vezani za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16). SL. 9B sumira specifičnost vezivanja klona prema svakom od ovih ciljeva ("+" označava vezivanje; "-" označava nevezivanje).
SL. 10A prikazuje poravnanje VH i VL domena scFv-Fc klonova dobijenih od divljeg tipa pilića. Prikazani su SEQ ID NO: 53-60 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). CDR i linker sekvence su označene linijama. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama. SL. 10B prikazuje poravnanje VH i VL domena scFv-Fc klonova dobijenih od pileta koje proizvodi humanih antitela. Prikazani su SEQ ID NO: 61-74 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). CDR i linker sekvence su označene linijama. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11A prikazuje poravnanje VH i VL domena klonova Familije 2. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NOs: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141 , 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372 i 378 (po redu od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NOs 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, i 373 (redom od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11B prikazuje i poravnavanje VH i VL domena klonova porodice 3. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 133, 128, 396, 386, 398,402, 392, 388, 390, 394, i 400 (redom od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NOs 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393 i 401 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11C prikazuje poravnanje VH i VL domena klonova porodice 4. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 116, 117, 118, 119, 282, 404 i 406 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NOs 93, 94, 95, 96, 283, 405 i 407 (po redu od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11D prikazuje poravnanje VH i VL domena poridice 5, bina 4 klonova. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 278 i 412 (po redu od vrha do dna u poravnanju).
Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NOs 279 i 413 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11E prikazuje poravnanje VH i VL domena dodatnih klonova poridice 5, bin 4. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 275 i 414 (po redu od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NO: 276 i 415 (po redu od vrha do dna u poravnanju). HVR i linker sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11F prikazuje sekvence VH i VL domena (SEQ ID NOs 280 i 281, redom poridice 5, bin 4 klon S209. HVR sekvence su podvučene.
SL. 11G prikazuje poravnanje VH i VL domena porodice 5, bin 5 klonova. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 123 i 292 (po redu od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NOs 100 i 293 (po redu od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11H prikazuje poravnanje VH i VL domena dodatnih klonova porodice 5, bin 5. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 288, 290, 408 i 410 (po redu od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NO: 289, 291, 409 i 411 (redosledom od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 11I prikazuje sekvence VH i VL domena klona 149 (SEQ ID NOs 286 i 287, respektivno) i klona 218 (SEQ ID NOs 284 i 285, respektivno. HVR sekvence su podvučene.
SL. 11J prikazuje poravnanje VH i VL domena klonova porodice 1. Aminokiselinske sekvence VH domena su SEQ ID NO: 120, 121, 130 i 122 (po redu od vrha do dna u poravnanju). Aminokiselinske sekvence VL domena su SEQ ID NO: 97, 98, 107 i 99 (po redu od vrha do dna u poravnanju). HVR sekvence su označene linijama. HVR su prema Kabatu. Razlike u aminokiselinama su označene zvezdicama.
SL. 12A-12C prikazuju profile vezivanja preko rezonance površinskog plazmona (SPR) reprezentativnih klonova antitela koji vezuju prethodno formirani kompleks varijante SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO:18) pomešanog sa rastućim koncentracijama IgSF domena CD47 (SEQ ID NO: 16 ). SL. 12A prikazuje krivu vezivanja klona antitela (S123) koji ne blokira vezivanje CD47 za SIRP-α (npr., antitelo koje ne blokira). SL. 12B prikazuje krivu vezivanja klona antitela (S119) koji blokira vezivanje CD47 za SIRP-α (npr., blokirajuće antitelo). SL. 12C prikazuje krivu vezivanja klona antitela (S118) koji se vezuje za SIRP-α i
4
smanjuje njegov afinitet za vezivanje CD47 (npr., “Kick off” antitelo).
SL. 13A-13G prikazuje rezultate in vitro testova fagocitoze tumorskih ćelija korišćenjem makrofaga tretiranih anti-SIRP-α antitelom (u naznačenim serijama koncentracija), cetuksimabom ili trastuzumabom, anti-SIRP-α antitelom plus cetuksimabom ili trastuzumabom, ili kontrolnim antitelom (IgG1, κ), kako je naznačeno. Makrofagi koji su fagocitovali tumorske ćelije identifikovani su kao ćelije pozitivne na CD33, CD206 i CFSE pomoću protočne citometrije. Testirane tumorske ćelije su DLD-1 (SL. 13A-13D & 13G) ili OE19 ćelije (SL. 13E & 13F). Testirana anti-SIRP-α antitela su bila AB3a (SL. 13A i 13B), AB45a (SL.13C & 13D), AB119a (SL.13E), AB135a (SL.13F), i AB136c (SL. 13G). SL. 14 pokazuje rezultate in vivo test aktivacije dendritskih ćelija na dendritskim ćelijama izolovanim iz slezine Balb/c miševa tretiranih anti-SIRP-α antitelom AB136b, kontrolnog pacova anti-mišjeg anti-SIRP-α antagonističkog antitela (klon p84), kontrole IgG pacova ili mišjih IgG kontrola, kako je naznačeno. Miševima je intravenozno ubrizgano naznačeno antitelo u dozi od 10 mg/kg, a slezine su sakupljene pet sati nakon injekcije. Aktivacioni marker CD86 na dendritskim ćelijama meren je protočnom citometrijom.
SL. 15 prikazuje rezultate in vivo modela singenog karcinoma debelog creva miša za procenu aktivnosti jednog agensa. MC38 ćelije su implantirane subkutano u C57BL/6 miševe i randomizirane u grupe (8 miševa/grupi). Miševi su tretirani nosačem (PBS), CD47 blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB25b, CD47 blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB25c, CD47 blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB27b, CD47 ne-blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB3b ili CD47 ne-blokirajućim anti-SIRP-α antitelom 136b. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 60 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševima je davana intraperitonealna (IP) doza od 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje sa anti-SIRPα antitelima. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
SL. 16 pokazuje rezultate in vivo modela singenog karcinoma debelog creva miša za procenu aktivnosti jednog agensa. CT26 ćelije su implantirane supkutano u BALB/c miševe (korišćeno je 8-9 miševa po grupi) koji su tretirani sa AB136b ili nosačem (PBS), kako je naznačeno. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 80 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševima je davana intraperitonealna (IP) doza od 3 mg/kg ili 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje sa anti-SIRPα antitelima. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
SL. 17A prikazuje poređenje CD47 i anti-SIRP-α antitela klon 119 Fab vezivanja za SIRP-α, kao što je određeno rendgenskom kristalografijom.
SL. 17B prikazuje mesto interakcije između anti-SIRP-α klona antitela 119 Fab i SIRP-α, kao što je određeno podpovršinskom analizom. Ostaci SIRP-α uključeni u epitop koji se vezuje za antitelo 119 Fab su zasenčeni u skladu sa podpovršinskim promenama. Ključni ostaci antitela u paratopu SIRP-α su naznačeni: (H) = ostatak teškog lanca; (L) = ostatak lakog lanca.
SL. 18A prikazuje poređenje CD47 i anti-SIRP-α antitela 136 Fab vezivanja za SIRP-α, kao što je određeno kristalografijom rendgenskih zraka.
SL. 18B prikazuje mesto interakcije između anti-SIRP-α klona antitela 136 Fab i SIRP-α, kao što je određeno podpovršinskom analizom. SIRP-α ostaci uključeni u epitop koji se vezuje za antitelo 136 Fab su osenčeni u skladu sa podpovršinskim promenama. Ključni ostaci antitela u paratopu SIRP-α su naznačeni: (H) = ostatak teškog lanca; (L) = ostatak lakog lanca.
SL. 19A prikazuje poređenje CD47 i anti-SIRP-α antitela klon 3 Fab vezivanja za SIRP-α, kao što je određeno rendgenskom kristalografijom.
SL. 19B prikazuje mesto interakcije između anti-SIRP-α klona antitela 3 Fab i SIRP-α, kao što je određeno podpovršinskom analizom zakopane površine. SIRP-α ostaci uključeni u epitop koji se vezuje za antitelo 3 Fab su zasenčeni u skladu sa podpovršinskim promenama. Ključni ostaci antitela u paratopu SIRP-α su naznačeni: (H) = ostatak teškog lanca; (L) = ostatak lakog lanca.
SL. 19C prikazuje poređenje CD47 i anti-SIRP-α antitela 115 Fab vezivanja za SIRP-α, kao što je utvrđeno rendgenskom kristalografijom.
SL. 19D prikazuje mesto interakcije između anti-SIRP-α klona antitela 115 Fab i SIRP-α, kao što je određeno podpovršinskom analizom zakopane površine. SIRP-α ostaci uključeni u epitop koji se vezuje za antitelo 115 Fab su osenčeni u skladu sa podpovršinskim promenama. Ključni ostaci antitela u SIRP-α paratopu su naznačeni: (H) = ostatak teškog lanca; (L) = ostatak lakog lanca.
SL. 20A pokazuje poređenje CD47, anti-SIRP-α klona antitela 119 Fab, anti-SIRP-α klona antitela 136 Fab, anti-SIRP-α klona antitela 3 Fab, anti-SIRP-α klona antitela 115 Fab koji se vezuje za SIRP-α , kako je utvrđeno rendgenskom kristalografijom.
SL. 20B prikazuje epitope za CD47, anti-SIRP-α klon antitela 119 Fab, anti-SIRP-α klon antitela 136 Fab, anti-SIRP-α klon antitela 3 Fab i anti-SIRP-α klon antitela 115 Fab koji se vezuje za SIRP-α, kako je utvrđeno rendgenskom kristalografijom. Vrednosti ukazuju na razliku između površine pristupačne površine svakog atoma ostatka u Fab/CD47 kada se analizira sama u odnosu na to kada se analizira u kompleksu sa SIRP-α, izraženu kao podpovršina (Å<2>). Numerisanje ostataka prema SEQ ID NO: 296.
SL. 21A prikazuje dijagram toka za spajanje epitopa anti-SIRP-α antitela.
SL. 21B pokazuje rezultate oglednog testa za vezivanje epitopa anti-SIRP-α antitela A, B, C,
4
D, E i F.
SL. 22A & 22B pokazuju rezultate vezivanja epitopa naznačenih anti-SIRP-α antitela. Broj klona za ligand (anti-SIRPα) vezan za čip je označen kao redovi, a broj klona za analite (anti-SIRPα) ubrizgane preko čipa je naznačen kao kolone. Beli boksovi označavaju antitela koja formiraju sendviče (i smatra se da vezuju različite epitope). Sive kutije označavaju antitela koja nisu formirala sendviče (i smatra se da vezuju isti epitop). „X“ označava scenarije u kojima se podaci iz jedne orijentacije ne slažu sa drugom.
SL. 23 obezbeđuje model za vezivanje anti-SIRP-α antitela i CD47 za SIRP-α D1 domen na osnovu vezivanja epitopa. Dati su reprezentativni klonovi antitela za svaki bin (i označeni brojem).
SL. 24A prikazuje poravnanja između roditeljskog teškog lanca 119 („119_VH_Wt“), teškog lanca varijante 119 sa 4 mutacije (3 povratne mutacije na sekvenci klicine linije u okviru i jedna mutacija u CDR-H1 koja uklanja potencijalno žarište oksidacije; „VH_MutALL“) , 119 varijantni teški lanac sa 3 mutacije (3 povratne mutacije na sekvenci klicine linije samo u okviru; "VH_MutAll_V34M"), i 119 varijantni teški lanac sa 3 mutacije i mutacijom M34L (3 povratne mutacije na sekvenci klicine linije u okviru; „VH_MutAll_V34L“). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO:335 za 119_VH_Wt, SEQ ID NO:246 za VH MutALL, SEQ ID NO:258 za VH_MutAllV34M i SEQ ID NO:327 za VH_MutAll_V34L. CDR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 24B prikazuje poravnanja između roditeljskog lakog lanca 119 ("119_VL _Wt"), i 119 varijantnog lakog lanca sa 4 mutacije (4 povratne mutacije na sekvenci klicine linije u okviru; "VL_mutAll"). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO:97 za 119_VL_Wt i SEQ ID NO:312 za VL_mutAll. CDR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 25A prikazuje poravnanja između roditeljskog lakog lanca 135 ("VL _wt") i 135 varijantnog lakog lanca sa 2 mutacije (2 povratne mutacije na sekvenci klicine linije u okviru; "VL_mutALL"). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO:104 za 135 VL_wt i SEQ ID NO:248 za 135 VL_MutALL. HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 25B prikazuje poravnanja između roditeljskog teškog lanca 135 ("VH_wt") 135 varijante teškog lanca sa 6 mutacija (5 povratnih mutacija na sekvenci klicine linije u okviru i jedna mutacija u CDR-H1 koja uklanja potencijalnu žarišnu tačku oksidacije; "VH_MutAll"), teški lanac 135 varijante sa 5 povratnih mutacija na sekvenci klicine linije u okviru („VH_MutAll_V34M“), i 135 varijantni teški lanac sa 5 povratnih mutacija na sekvenci
4
klicine linije u okviru i mutacijom M34L („VH_MutAll_V34L“). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO:341 za VH_wt, SEQ ID NO:247 za VH_MutAll i SEQ ID NO:259 za VH_MutAll_V34M i SEQ ID NO:328 za VH_MutAll_V34L. HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 26A prikazuje poravnanja između roditeljskog lakog lanca 136 („VL _wt“), 136 varijantnog lakog lanca sa 4 mutacije (4 povratne mutacije na sekvenci klicine linije u okviru; „VL_mutaLL“), 136 varijantnog lakog lanca sa jednim I2T back- mutacija je vraćena na sekvencu divljeg tipa u pozadini koja je inače "all mut" ("VL_Mutall_I2T"). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO: 134 za VL_wt, SEQ ID NO: 250 za VL_mutaLL i SEQ ID NO: 251 za VL_Mutall_I2T. HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 26B prikazuje poravnanja između roditeljskog teškog lanca 136 ("VH_wt"), 136 varijante teškog lanca sa 6 mutacija (5 povratnih mutacija na sekvenci klicine linije u okviru i jedna mutacija u CDR-H1 koja uklanja potencijalnu žarišnu tačku oksidacije; "VH_mutall") , 136 varijantni teški lanac sa 5 povratnih mutacija na sekvenci klicine linije u okviru („VH_Mutall_V34M“), i 136 varijantni teški lanac sa 5 povratnih mutacija na sekvenci klicine linije u okviru i mutacijom M34L („VH_Mutall_V34L“). Prikazane sekvence su: SEQ ID NO:133 za VH_wt, SEQ ID NO:249 za VH_mutall, SEQ ID NO:260 za VH_Mutall_V34M i SEQ ID NO:329 za VH_Mutall_V34L. HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 27A pokazuje afinitete vezivanja varijanti antitela 136 za šest SIRP-α proteina: humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), humani SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11), NOD mišji SIRP-α (SEQ ID NO:8), BL/6 mišji SIRP-α (SEQ ID NO:9) i BALB/c mišji SIRP-α (SEQ ID NO:10). Varijante antitela su imale mutantne ("mut") ili roditeljske ("wt") lake lance i mutantne ili roditeljske teške lance, kao što je naznačeno u redosledu laki lanac/teški lanac. Na grafiku, y-osa označava odnos KDmut/KDwt. Odnos 1 znači da je antitelo imalo ekvivalent KDna wt/wt antitelo (označeno isprekidanom linijom); odnos >1 ukazuje na niži afinitet od wt/wt; a odnos <1 ukazuje na veći afinitet od wt/wt.
SL. 27B pokazuje afinitete vezivanja varijanti antitela 136 za sedam SIRP-α proteina: BL/6 mišji SIRP-α (SEQ ID NO:9), NOD mišji SIRP-α (SEQ ID NO:8), BALB/c mišji SIRP-α ( SEQ ID NO:10), humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), ljudski SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11) i humani SIRP-γ v1 (SEQ ID NO:15). Pored testiranja wt 136 i svih mutanta 136, konstruisane su varijante koje eliminišu svaku pojedinačnu mutaciju u pozadini lakog lanca svih mutanta. Na grafiku, y-osa označava odnos KDmut/KDwt. Odnos 1
4
znači da je antitelo imalo ekvivalent KDna wt/wt antitelo (označeno isprekidanom linijom); odnos >1 ukazuje na niži afinitet od wt/wt; a odnos <1 ukazuje na veći afinitet od wt/wt.
SL. 28 upoređuje prinos ekspresije i afinitet vezivanja antitela koja imaju naznačene humane teške lance i humanizovane lake lance u FreeStyle<™>293-FS ćelijama (Thermo Fisher).
SL. 29 pokazuje poravnanje između Hum1, Hum 8 i Hum9 VL domena. Hum8 je generisan na osnovu Hum1, ali sa 5 supstitucija aminokiselina u blizini ili u HVR-L1 i -L2 koje povećavaju humanizaciju. Hum9 je generisan na osnovu Hum1 ali sa 4 zamene aminokiselina u blizini ili u HVR-L1 i -L2 koje povećavaju humanizaciju. Prikazani su SEQ ID NO: 252 (Hum1), 416 (Hum 8) i 262 (Hum9). HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 30 pokazuje usklađenost između varijante antitela 21 sa povratnim mutacijama klicine linije („HC_MutAll“), varijante antitela 21 sa povratnim mutacijama klicine linije i mutacije u CDR-H1 koja uklanja potencijalno žarište oksidacije M34V („HC_MutAll_M34V“), varijantnog antitela 21 sa povratnim mutacijama klicine linije i mutacijom M34L („HC_MutAll_M34L“), varijanta antitela 25 sa povratnim mutacijama klicine linije („HC MutAll“), varijanta antitela 25 sa povratnim mutacijama klicine linije i mutacijom u CDR-H1 koja uklanja potencijalnu tačkastu oksidacionu M34V („HC_MutAll_M34V“), varijanta antitela 25 sa povratnim mutacijama klicine linije i mutacijom M34L („HC_MutAll_M34L“), varijanta antitela 27 sa povratnim mutacijama klicine linije („HC MutAll“), varijanta antitela sa pozadinskom linijom 27 mutacije klicine linije i mutacije u CDR-H1 koje uklanjaju potencijalnu žarišnu tačku oksidacije M34V („HC_MutAll_M34V“), i varijantu antitela 27 sa povratnim mutacijama klicine linije i mutacijom M34L („HC_MutAll_M34L“). Prikazane sekvence su SEQ ID NO: 263, 264, 330, 267, 268, 332, 265, 266 i 331 (od vrha do dna). HVR sekvence su označene linijama; razlike aminokiselina su označene zvezdicama.
SL. 31 pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze koristeći HER2(+) OE19 ćelije kao metu i M2 makrofage kao ćeliju koja fagocitira. “Kick off” anti-SIRP-α antitela su testirana u naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa anti-HER2 antitelom trastuzumabom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 32 pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Neblokirajuća anti-SIRP-α antitela su testirana na naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 33A-33C prikazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Anti-SIRP-α antitela su testirana u
4
naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 34 pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Neblokirajuća anti-SIRP-αantitela 27 i 136 su testirana kao antitelo pune dužine (sa Fc regionom) ili F(ab)2fragment u naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa cetuksimabom anti-EGFR antitelom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 35 pokazuje rezultate in vitro testova i fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Blokirajuće varijante anti-SIRP-α antitela 119 su testirane na naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa cetuksimabom anti-EGFR antitelom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 36 pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Blokirajuće varijante anti-SIRP-α antitela 135 su testirane na naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa cetuksimabom anti-EGFR antitelom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 37 pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Neblokirajuća anti-SIRP-α antitela su testirana na naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 38A-38B pokazuje rezultate in vivo testova aktivacije dendritskih ćelija sa naznačenim anti-SIRP-α antitelima. Miševima je intravenozno ubrizgano naznačeno antitelo u dozi od 10 mg/kg, a slezine su sakupljene pet sati nakon injekcije. Markeri aktivacije CD86, MHCII i CCR7 na CD4+ dendritskim ćelijama mereni su protočnom citometrijom.
SL. 39A pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. 218a i 218 varijanta anti-SIRP-α antitela su testirana na naznačenim koncentracijama u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 39B pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Primeri blokirajućih anti-SIRP-α antitela 119a, 120a i 122a su testirani na naznačenim koncentracijama. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 39C pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Primeri neblokirajućih anti-SIRP-α antitela 136a i 137a su testirani na naznačenim koncentracijama. Fagocitoza je merena procentom
4
CFSE+ ćelija.
SL. 39D pokazuje rezultate in vitro testova fagocitoze korišćenjem ćelija EGFR(+) DLD-1 kao mete i M2 makrofaga kao ćelije za fagocitozu. Primeri anti-SIRP-α antitela 115a, 116a, 117a, 118a i 132a su testirana na naznačenim koncentracijama. Fagocitoza je merena procentom CFSE+ ćelija.
SL. 40 pokazuje rezultate in vivo modela singenog karcinoma debelog creva miša za procenu aktivnosti kombinovanja tretmana anti-SIRP-α sa inhibicijom puta PD-L1/PD-1. CT26 ćelije su implantirane supkutano u C57BL/6 miševe i randomizirane u grupe (8 miševa/grupi). Miševi su tretirani nosačem (PBS), anti-PD-L1 antitelom, CD47 blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB25b, ili AB25b i PD-L1. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 60 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševi su tretirani intraperitonealno (IP) u dozi od 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje i žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
SL. 41 pokazuje rezultate in vivo modela singenog karcinoma debelog creva miša za procenu aktivnosti kombinovanja tretmana anti-SIRP-α sa inhibicijom puta PD-L1/PD-1. MC38 ćelije su implantirane subkutano u C57BL/6 miševe i randomizirane u grupe (8 miševa/grupi). Miševi su tretirani nosačem (PBS), anti-PD-1 antitelom, CD47 blokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB25b, AB25b i anti-PD-1, CD47 neblokirajućim anti-SIRP-α antitelom AB136b, ili AB136b i anti -PD-1. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 60 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševi su tretirani intraperitonealno (IP) u dozi od 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje i žrtvovani kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
DETALJAN OPIS
[0039] Ovo otkriće opisuje antitela koja vezuju ekstracelularne domene (npr. D1 domene) jednog ili više humanih SIRP-α polipeptida i imaju različite profile vezivanja SIRP-α od potencijalnog interesa. Ovi jedinstveni SIRP-α profili vezivanja uključuju jednu ili više od sledećih sposobnosti vezivanja, koje su kombinovane na višefaktorski način da bi se dobilo mnoštvo jedinstvenih specifičnosti. Na primer, antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) humanog SIRP-α v1, humanog SIRP-α v2, ili oba; antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) jednog ili više majmunskih SIRP-α polipeptida, ili može da nedostaje vezivanje za njih; antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) jednog ili više mišjih SIRP-α polipeptida, ili može da nedostaje vezivanje za njih; antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRPβ polipeptida, ili može da se ne vezuje za njega; i/ili antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRPγ polipeptida, ili može da se ne vezuje za njega. Pored toga, ovo otkriće opisuje antitela koja blokiraju vezivanje CD47 za SIRP-α, antitela koja ne blokiraju vezivanje CD47 za SIRP-α i antitela koja ne blokiraju vezivanje CD47 za SIRP-α, ali smanjuju afinitet SIRP-α za CD47, što dovodi do brže disocijacije CD47/SIRP-α kompleksa. Pored toga, ovo otkriće opisuje anti-SIRP-α antitela sa jednim ili više in vitro i/ili in vivo biološka svojstva od interesa, kao što je sposobnost da pojačaju fagocitozu makrofaga, pojačaju aktivaciju dendritskih ćelija, inhibiraju in vivo rast tumora koji eksprimira CD47, i/ili sposobnost da se ostvari jedna ili više ovih aktivnosti bez sprečavanja interakcija između ćelije koja eksprimira CD47 i T ćelije.
[0040] Ovde opisani postupci mogu da se koriste za identifikaciju antitela sa jedinstvenim kombinacijama gore navedenih specifičnosti vezivanja. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da sposobnost da se identifikuju jedinstvena anti-SIRP-α antitela sa različitim profilima vezivanja kao što je gore opisano omogućava identifikaciju antitela (npr. ona koja su ovde opisana) sa poželjnim kliničkim svojstvima i prednostima za pretklinička istraživanja.
[0041] Ovde su opisana izolovana antitela koja vezuju ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje. Ovde su dalje obezbeđeni polinukleotidi i vektori koji kodiraju antitela prema ovom pronalasku, kao i metode proizvodnje antitela u vezi sa tim.
[0042] Ovde su opisana antitela za upotrebu u postupcima za lečenje ili odlaganje napredovanja kancera kod pojedinca, koji obuhvataju davanje pojedincu efikasne količine antitela prema ovom pronalasku.
[0043] Ovde su opisana antitela za upotrebu u postupcima za lečenje ili odlaganje progresije autoimune ili inflamatorne bolesti kod pojedinca, koji obuhvataju davanje pojedincu efikasne količine antitela prema ovom pronalasku.
[0044] Ovde su opisani postupci za identifikaciju domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. U nekim primerima izvođenja, metode uključuju (a) obezbeđivanje domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida; (b) sklapanje kompleksa koji se sastoji od SIRP-α D1 varijante vezane za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu SIRP- α D1 varijanta se vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47; (c) dovođenje u
1
kontakt domena za vezivanje antigena sa sastavljenim kompleksom; i (d) detekcija vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu vezivanje domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje da domen koji vezuje antigen ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Ovde su opisani postupci za identifikaciju domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. U nekim primerima izvođenja, metode uključuju kontaktiranje domena za vezivanje antigena ili antitela koje vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida sa kompleksom koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za polipeptid koji sadrži IgSF domena CD47, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta vezivanja prirodnog SIRP-α D1 domena za humani CD47; i otkrivanje vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu vezivanje domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida.
[0045] Ovde su opisani postupci za identifikaciju domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. U nekim primerima izvođenja, postupak obuhvata (a) obezbeđivanje domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida; (b) sklapanje kompleksa koji se sastoji od SIRP-α D1 varijante vezane za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47, pri čemu je SIRP-α D1 varijanta SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i pri čemu SIRP- α D1 varijanta se vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afiniteta prirodnog SIRP-α D1 domena koji se vezuje za humani CD47; (c) dovođenje u kontakt domena za vezivanje antigena sa sastavljenim kompleksom; i (d) detekcija vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu nedostatak vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje da domen koji vezuje antigen blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Ovde su opisani postupci za identifikaciju domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida i blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje kontaktiranje domena za vezivanje antigena ili antitela koje vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida sa kompleksom koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za polipeptid koji sadrži IgSF domena CD47, pri čemu je SIRP-α
2
D1 varijanta SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi, i gde se SIRP-α D1 varijanta vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta veći od afinitet vezivanja prirodnog SIRP-α D1 domena za humani CD47; i detekcija vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks, pri čemu nedostatak vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida.
[0046] Ovde su opisani postupci za proizvodnju anti-SIRP-α antitela koje vezuje ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida. U nekim primerima izvođenja, postupak uključuje (a) imunizaciju pileta peptidom koji sadrži najmanje deo humanog SIRP-α ekstracelularnog domena (npr. D1 domen); (b) dobijanje antitela iz ćelije koja proizvodi antitela od imunizovanog pileta; i (c) otkrivanje vezivanja između antitela dobijenog iz ćelije i ekstracelularnih domena (npr. D1 domena) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida, pri čemu vezivanje između antitela i ekstracelularnih domena (npr. D1 domena) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida ukazuje da je antitelo anti-SIRP-α antitelo koje vezuje ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida.
Definicije
[0047] Pre nego što se detaljno opišu otkrivena izvođenja, treba shvatiti da ovo otkriće nije ograničeno na određene kompozicije ili biološke sisteme, koji, naravno, mogu da variraju. Takođe treba shvatiti da je terminologija korišćena ovde samo u svrhu opisivanja određenih realizacija, i nije namera da bude ograničavajuća.
[0048] Kao što se koristi u ovoj specifikaciji i priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "an" i "the" (na engleskom jeziku) uključuju reference za množinu osim ako sadržaj jasno ne nalaže drugačije. Tako, na primer, referenca na "molekul" opciono uključuje kombinaciju dva ili više takvih molekula i slično.
[0049] Termin "oko" kako se ovde koristi odnosi se na uobičajeni opseg greške za odgovarajuću vrednost koja je jasno poznata stručnjaku iz ove oblasti tehnike. Pozivanje na "oko" vrednosti ili parametra ovde uključuje (i opisuje) realizacije koje su usmerene na tu vrednost ili parametar per se.
[0050] Podrazumeva se da aspekti i realizacije ovog otkrića uključuju "sastoje", "sastoje se" i "sastoje se u suštini od" aspekata i realizacije.
[0051] "SIRP-α polipeptid" kako se ovde koristi može se odnositi na bilo koji endogeni ili prirodni SIRP-α polipeptid koji je kodiran genomom bilo kog kičmenjaka, uključujući sisare kao što su ljudi, majmuni, glodari (npr. miš ili pacov) i ptice, kao što su pilići. Termin takođe uključuje varijante koje se javljaju u prirodi, npr., alternativno spojene varijante, alelne varijante ili polimorfizme (npr., one opisane ovde). Termin se dalje može odnositi na neprerađene SIRP-α polipeptide pune dužine kao i na SIRP-α polipeptide koji su rezultat ćelijske obrade, npr. uklanjanja signalne sekvence, itd. Primeri SIRP-α polipeptidnih sekvenci su opisani ovde. U nekim primerima izvođenja, humani SIRP-α polipeptid je onaj koji kodira humani SIRPA gen, npr., kao što je opisano u NCBI gen ID br. 140885. Kao što je ovde opisano, SIRP-α polipeptidi su visoko polimorfni unutar i među vrstama. Na primer, identifikovano je najmanje 10 humanih varijanti sa polimorfizmom aminokiselina u ekstracelularnom domenu.
[0052] SIRP-α polipeptidi uključuju ekstracelularni domen koji vezuje ligande/partnere, npr., CD47. SIRP-α polipeptidi obuhvataju 3 visoko homologna ekstracelularna domena slična imunoglobulinu (Ig)-D1, D2 i D3. SIRP-α D1 domen („D1 domen“) se odnosi na membranski distalni, ekstracelularni domen SIRP-α i posreduje u vezivanju SIRP-α za CD47 (vidi, npr., Hatherley, D. et al. (2008) Mol. Cell 31:266-77; Hatherley, D. et al. (2007) J. Biol. Chem.
282:14567-75; Hatherley, D. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9; i Lee, W. Y. et al. (2010) J. Biol. Chem. 285:37953-63). Ekstracelularni domen se generalno odnosi na ceo ekstracelularni deo SIRP-α, npr., kao što je eksprimiran na površini ćelije, i može uključivati različite SIRP-α domene, kao što je D1 domen. D1 domen sadrži ostatke za koje se pokazalo da su kritični za posredovanje vezivanja CD47 (vidi, npr., Lee, W.Y. et al. (2007) J. Immunol.
179:7741-50). U nekim primerima izvođenja, antitelo koje vezuje ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida vezuje jedan ili više ostataka D1 domena. Primeri sekvenci humanog SIRP-α D1 domena su opisane u ovom otkriću i uključuju bez ograničenja SEQ ID NO: 5, 6 i 76-83. Sekvence humanih SIRP-α D2 i D3 domena su takođe poznate i uključuju, bez ograničenja, APVVSGPAARATPQHTVSFTCESHGFSPRDITLKWFKNGNELSDFQTNVDPVGESVSY SIHSTAKVVLTREDVHSQVICEVAHVTLQGDPLRGTANLSETIR (SEQ ID NO:131) za D2 domen i VPPTLEVTQQPVRAENQVNVTCQVRKFYPQRLQLTWLENGNVSRTETASTVTENKD GT YNWMSWLLVNVSAHRDDVKLTCQVEHDGQPAVSKSHDLKVS (SEQ ID NO:132) za D3 domen.
[0053] Kako se ovde koristi, "CD47" (takođe poznat kao protein povezan sa integrinom
4
(IAP), MER6 i OA3) se odnosi na polipeptid koji, između ostalih uloga, služi kao vezujući partner za SIRP-α polipeptide. U nekim primerima izvođenja, CD47 se odnosi na humani CD47 polipeptid, npr., polipeptid koji kodira humani CD47 gen, kao što je onaj koji je opisan u NCBI Ref SEQ ID NO. 961. Poznati su primeri humanih CD47 aminokiselinskih sekvenci (vidi, npr., NCBI referentna sekvenca pristupni broj NP_001768). Konkretno, IgSF domen CD47 se odnosi na N-terminalni ekstracelularni domen CD47 za koji se zna da je kritičan za vezivanje SIRP-α (vidi, npr., Barclay, A.N. i Brown, M.H. (2006) Nat. Rev. Immunol. 6:457-64 i Hatherley, D. et al. (2009) J. Biol. Chem. 284:26613-9). U nekim primerima izvođenja, IgSF domen CD47 sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:16). Termin "CD47" takođe može uključivati modifikovane CD47 polipeptide koji su u stanju da vežu SIRP-α, npr., polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47 konjugovan sa drugim polipeptidom ili drugim ostatkom, npr., Ig Fc region.
[0054] Kako se ovde koristi, "SIRP-α epitop" se može odnositi na aminokiseline SIRP-α polipeptida koje formiraju mesto vezivanja za anti-SIRP-α antitelo prema ovom pronalasku i/ili SIRP-α vezujućeg partnera, uključujući bez ograničenja CD47. Vezivanje antitela ili drugog polipeptida za epitop može se okarakterisati i/ili mapirati korišćenjem različitih testova poznatih u tehnici, uključujući bez ograničenja test unakrsnog blokiranja (vidi Antibodies, A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)), mapiranje epitopa (vidi Champe et al., J. Biol. Chem. 270:1388-1394 (1995)), rendgenska kokristalografija, bining epitopa, mutageneza usmerena na mesto, skeniranje oligo-peptida, mapiranje mutageneze visoke propusnosti, razmena vodonika/deuterijuma, ograničena proteoliza i tako dalje.
[0055] Kako se ovde koristi, "modulisanje SIRP-α signalizacije" može se odnositi na antagoniziranje, agoniziranje ili na drugi način ometanje jednog ili više aspekata SIRP-α signalizacije u ćeliji koja eksprimira SIRP-α polipeptid. SIRP-α signalizacija se može odnositi na jedan ili više intracelularnih signalnih događaja posredovanih aktivacijom SIRP-α polipeptida, uključujući bez ograničenja fosforilaciju tirozina intracelularnog regiona SIRP-α, vezivanje fosfataze (npr. SHP1), vezivanje za protein adaptera (npr., SCAP2, FYB i/ili GRB2), proizvodnju citokina (npr. IL-10, IL-1β, IFN ili TNF) i proizvodnju azot oksida; i/ili jedan ili više međućelijskih fenotipova, uključujući bez ograničenja fagocitozu makrofaga i druge aktivirajuće ili supresivne fenotipove makrofaga, eozinofila, neutrofila, dendritskih ćelija i supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (MDSC).
[0056] Kako se ovde koristi, termin "antitelo" može se odnositi na intaktna antitela; fragmente antitela (uključujući bez ograničenja Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv, dijatela, scFv, scFv-Fc, jednodomenska antitela, jednostruka antitela teškog lanca i jednostruka antitela lakog lanca), pod uslovom da pokazuju željenu biološku aktivnost (npr. vezivanje epitopa); monoklonska antitela; poliklonska antitela; monospecifična antitela; multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela); i proteini slični antitelu.
[0057] Kako se ovde koristi, termin "bispecifičan" kada se koristi u odnosu na antitelo ili fragment antitela uključuje antitelo ili fragment antitela koji poseduju dve različite specifičnosti vezivanja. Na primer, svaka specifičnost vezivanja može prepoznati drugačiji antigen, ili svaka specifičnost vezivanja može prepoznati isti antigen sa različitim afinitetom i/ili preciznim epitopom. U nekim primerima izvođenja, svaka različita specifičnost vezivanja obuhvata jedan ili više različitih domena za vezivanje antigena antitela (npr. varijabilnih domena), tako da bispecifično antitelo ili fragment antitela sadrži najmanje prvi domen vezivanja za antigen sa prvom specifičnošću vezivanja i drugi antigen vezujući domen domen sa drugom specifičnošću vezivanja. Različiti primeri formata bispecifičnih antitela su ovde opisani i poznati u tehnici.
[0058] „Izolovano“ antitelo se može odnositi na antitelo koje je izdvojeno i/ili izvučeno iz komponente svog prirodnog okruženja, npr., ćelija domaćina ili organizam. U nekim primerima izvođenja, antitelo je prečišćeno do željene čistoće po težini (npr., najmanje 95%); i/ili homogenosti pomoću SDS-PAGE koristeći, na primer, bojenje srebrom, Coomassie, itd. U nekim primerima izvođenja, izolovano antitelo se dobija nakon jednog ili više koraka prečišćavanja.
[0059] Kao što je poznato u tehnici, "nativna" antitela se odnose na tipično heterotetramerne komplekse uključujući dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Promenljivi broj disulfidnih veza povezuje dva teška lanca, a jedan povezuje svaki laki lanac sa teškim lancem, pored intralančanih disulfidnih mostova. Teški lanci uključuju varijabilni domen (VH) praćen (N-terminus do C-terminusa) sa tri ili četiri konstantna domena. Laki lanci uključuju varijabilni domen (VL) praćen konstantnim domenom (CL). Tipično, laki lanci sisara spadaju u jednu od dve kategorije zasnovane na sekvenci aminokiselina: kapa i lambda.
[0060] "Konstantni domen" se može odnositi na očuvaniji deo antitela ili fragmenta, npr., izvan varijabilnih domena. Termin može uključivati CL domen kao i konstantne domene teškog lanca CH1, CH2, CH3 i opciono CH4.
[0061] Konstantni domeni teškog lanca mogu se dodeliti jednom od 5 glavnih tipova: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM. Postoji nekoliko podtipova za mnoge od ovih glavnih tipova. Strukture podjedinica i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina su dobro poznate i generalno opisane u, npr. Abbas et al. Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000).
[0062] Kako se ovde koristi, termin "promenljivi domen antitela" odnosi se na delove lakih i teških lanaca antitela koji uključuju regione koji određuju komplementarnost (CDR, npr., CDR L1, CDR L2, CDR L3, CDR H1, CDR H2, i CDR H3) i okvirni regioni (FR).
[0063] Termin "varijabilna" se odnosi na činjenicu da se podsekvence varijabilnih domena značajno razlikuju u sekvenci između antitela i da su kritične za specifičnost vezivanja određenog antitela za njegov antigen. Varijabilnost je koncentrisana u tri hipervarijabilna regiona (HVRs) u VH i VL domenima. Očuvaniji delovi varijabilnih domena nazivaju se okvirni regioni (FR) u kojima su HVR-ovi umešani. Svaki varijabilni domen nativnih teških i lakih lanaca sadrži četiri FR regiona povezana sa tri HVR-a koji formiraju petlje (vidi Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)).
[0064] Termin "hipervarijabilni region (HVR)" može se odnositi na podregione VH i VL domena koje karakteriše povećana varijabilnost sekvence i/ili formiranje definisanih petlji. Ovo uključuje tri HVR u VH domenu (H1, H2 i H3) i tri HVR u VL domenu (L1, L2 i L3). Veruje se da je H3 kritičan u prenošenju fine specifičnosti vezivanja, pri čemu L3 i H3 pokazuju najviši nivo raznolikosti. Vidi Johnson and Wu, in Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, N.J., 2003).
[0065] Poznato je nekoliko HVR razgraničenja. Kabat regioni za određivanje komplementarnosti (CDR) su zasnovani na varijabilnosti sekvence i najčešće se koriste (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Chothia se umesto toga odnosi na lokaciju strukturnih petlji (Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). AbM HVR predstavljaju kompromis između Kabat HVR i Chothia strukturnih petlji, a koristi ih softver za modeliranje AbM antitela kompanije Oxford Molecular. „Kontakt“ HVR se zasnivaju na analizi dostupnih složenih kristalnih struktura. Ostaci iz svakog od ovih HVR su navedeni u nastavku. „Okvirni“ ili „FR“ ostaci su oni ostaci varijabilnog domena koji nisu HVR ostaci.
Petlja Kabat AbM Chothia Kontakt
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (kabat numeracija)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia numeracija)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101
[0066] Poznati su i "prošireni" HVR: 24-36 ili 24-34 (L1), 46-56 ili 50-56 (L2) i 89-97 ili 89-96 (L3) u VL i 26-35 (H1) , 50-65 ili 49-65 (H2) i 93-102, 94-102 ili 95-102 (H3) u VH (Kabat numeracija).
[0067] „Numerisanje prema Kabat“ se može odnositi na sistem numerisanja koji se koristi za varijabilne domene teškog lanca ili varijabilne domene lakog lanca u kompilaciji antitela u Kabat et al., supra. Stvarna linearna aminokiselinska sekvenca može da sadrži manje ili dodatne aminokiseline koje odgovaraju skraćivanju ili umetanju u FR ili HVR varijabilnog domena. Kabat numerisanje ostataka može da se odredi za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom sa Kabat brojem. Tipično, Kabat numeracija se koristi kada se odnosi na ostatak u varijabilnim domenima (približno ostaci 1-107 lakog lanca i ostaci 1-113 teškog lanca), dok EU sistem numerisanja ili indeks (npr., EU indeks kao u Kabatu, numerisanje prema EU IgG1) se generalno koristi kada se govori o ostatku u konstantnom regionu teškog lanca.
[0068] Antitela „pune dužine“ ili „intaktna“ obično uključuju teške lance sa Fc regionom, npr., za razliku od fragmenta antitela. "Fab" fragmenti koji se vezuju za antigen sa jednim mestom za vezivanje antigena mogu se osloboditi iz zaostalog Fc fragmenta digestijom sa papainom. F(ab')2 fragmenti uključuju dva mesta za vezivanje antigena proizvedena pepsinskim tretmanom antitela. Međutim, fragmenti antitela će uključivati jedan ili više varijabilnih regiona antitela.
[0069] "Fv" fragment sadrži kompletno mesto za vezivanje antigena. Jednolančani Fv (scFv) može uključivati VH i VL domen povezan peptidnim linkerom tako da se VH i VL domeni povezuju, npr., kao u antitelu ili Fab fragmentu, tako da HVR formiraju mesto vezivanja antigena. Vidi Pluckthün, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York, 1994), pp. 269-315. U nekim primerima izvođenja, scFv je fuzionisan sa Fc domenom antitela (npr., scFv-Fc). Dok šest HVR tipično sadrži mesto vezivanja antigena, jedan varijabilni domen sa tri HVR je i dalje sposoban da veže antigen, iako sa nižim afinitetom. Vidi Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-448 (1993.); Sheriff et al., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996.).). Antitela sa jednim domenom (npr., kamelidna antitela) tipično uključuju jedan, monomerni varijabilni domen za vezivanje antigena. Takođe su poznata antitela sa jednim teškim lancem (VHH) i jednostrukim lakim lancem. Fab' fragment tipično uključuje nekoliko ostataka više na C-terminalnom kraju nego Fab fragment. Fab'-SH uključuje ostatke cisteina sa slobodnim tiolom. U struci su poznata različita hemijska kuplovanja fragmenata antitela.
[0070] "Dijatelo" uključuje fragmente antitela sa dva mesta za vezivanje antigena. Ovo uključuje VH i VL domen povezan linkerom, koji je obično prekratak da bi olakšao uparivanje domena u istom lancu. Dijatela mogu biti dvovalentna ili bispecifična. Poznata su tritela i tetratela, ili drugi brojevi VH/VL domena. Vidi Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003.).).
[0071] Kako se ovde koristi, "monoklonsko" antitelo se odnosi na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih antitela, npr., suštinski identične, ali dozvoljavaju manje nivoe pozadinskih mutacija i/ili modifikacija. "Monoklonsko" označava suštinski homogen karakter antitela i ne zahteva proizvodnju antitela bilo kojim posebnim metodom. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo se bira prema njegovim HVR, VH i/ili VL sekvencama i/ili svojstvima vezivanja, npr., izabran iz grupe klonova (npr., rekombinantni, hibridomski ili izvedeni iz faga). Monoklonsko antitelo može biti konstruisano tako da uključuje jednu ili više mutacija, npr., da utiče na afinitet vezivanja ili druga svojstva antitela, stvara humanizovano ili himerno antitelo, poboljšava proizvodnju i/ili homogenost antitela, konstruiše multispecifično antitelo, čija se rezultujuća antitela još uvek smatraju monoklonskim po prirodi. Populacija monoklonskih antitela se može razlikovati od poliklonskih antitela pošto pojedinačna monoklonska antitela populacije prepoznaju isto antigensko mesto. Poznate su razne tehnike za proizvodnju monoklonskih antitela; vidi, npr. metoda hibridoma (npr., Kohler and Milstein, Nature, 256:495-97 (1975); Hongo et al., Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), metode rekombinantne DNK (videti, npr. SAD Pat. br.4,816,567), tehnologije prikaza faga (vidi, npr. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991.); Marks et al., J. Mol. Biol.222: 581-597 (1992.).); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004).); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004.).); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); i Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004.).), i tehnologije za proizvodnju humanih ili antitela sličnih humanim kod životinja koje imaju delove ili sve lokuse humanog imunoglobulina ili gene koji kodiraju sekvence humanog imunoglobulina (videti, npr. WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362: 255-258 (1993.); Bruggemann et al., Year in Immunol.
7:33 (1993); U.S. Pat. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; i 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992.); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994); Morison, Nature 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnol.14: 845-851 (1996.).); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996.).); i Lonberg and Huszar, intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995.).).
[0072] "Himerna" antitela se mogu odnositi na antitelo sa jednim delom teškog i/ili lakog lanca iz određenog izotipa, klase ili organizma i drugim delom iz drugog izotipa, klase ili organizma. U nekim primerima izvođenja, varijabilni region će biti iz jednog izvora ili organizma, a konstantni region će biti iz drugog.
[0073] "Humanizovana antitela" se mogu odnositi na antitela sa pretežno humanom sekvencom i minimalnom količinom ne-humane (npr., miš ili pile) sekvence. U nekim primerima izvođenja, humanizovano antitelo ima jednu ili više sekvenci HVR (koje nose specifičnost vezivanja od interesa) iz antitela izvedenog iz ne-humanog (npr. miša ili pileta) organizma kalemljenog na okvir antitela humanog primaoca (FR). U nekim primerima izvođenja, ne-humani ostaci se dalje kaleme na humani okvir (nisu prisutni ni u izvornim ni u akceptorskim antitelima), npr., da poboljša svojstva antitela. Uopšteno govoreći, humanizovano antitelo će sadržati suštinski sve od najmanje jednog, a tipično dva, varijabilna domena, u kojima sve ili suštinski sve hipervarijabilne petlje odgovaraju onima ne-humanog imunoglobulina, i sve ili suštinski sve FR-ove. su one sekvence humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo izborno će takođe sadržati bar deo konstantnog regiona imunoglobulina (Fc), tipično onaj humanog imunoglobulina. Vidi Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); i Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992.).).
[0074] "Humano" antitelo se može odnositi na antitelo koje ima aminokiselinsku sekvencu koja odgovara onoj antitela proizvedenog od čoveka i/ili je napravljeno korišćenjem bilo koje od tehnika za pravljenje humanih antitela kao što je ovde otkriveno. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici, uključujući biblioteke za prikaz faga. Hoogenboom and Vinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991).); priprema humanih monoklonskih antitela kao što je opisano u Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, str. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991); i davanjem antigena transgenoj životinji koja je modifikovana da proizvodi takva antitela kao odgovor na antigenski izazov, ali čiji su endogeni lokusi onemogućeni, npr., imunizovani ksenomiševi (vidi, npr., SAD Pat. br.
6,075,181 i 6,150,584 u vezi XENOMOUSE<™>tehnologije) ili pilići sa sekvencom (sekvencama) humanog imunoglobulina (vidi, npr. WO2012162422, WO2011019844, i WO2013059159).
[0075] Kako se ovde koristi, termin "linker" se odnosi na vezu između dva elementa, npr. proteinskih domena. U nekim primerima izvođenja, linker može biti kovalentna veza ili razmak. Termin "spejser" se odnosi na deo (npr. polietilen glikol (PEG) polimer) ili aminokiselinsku sekvencu (npr. sekvencu od 1-200 aminokiselina) koja se javlja između dva polipeptida ili polipeptidnih domena da bi se obezbedio prostor ili fleksibilnost (ili i prostor i fleksibilnost) između dva polipeptida ili polipeptidnih domena. U nekim primerima izvođenja, razmak aminokiselina je deo primarne sekvence polipeptida (npr., povezan sa razmaknutim polipeptidima ili polipeptidnim domenima preko polipeptidne kičme).
[0076] Termin "citotoksični agens" kako se ovde koristi može se odnositi na bilo koji agens koji inhibira ćelijsku proliferaciju ili indukuje ćelijsku smrt. Citotoksični agensi uključuju, ali nisu ograničeni na, hemoterapeutske agense; radioaktivne izotope; sredstva za inhibiciju rasta; i toksini kao što su toksini malih molekula ili enzimski aktivni toksini, uključujući njihove fragmente i/ili varijante. Primeri citotoksičnih agenasa uključuju bez ograničenja metaboličke inhibitore, agense protiv mikrotubula, jedinjenja koja sadrže platinu, agense za alkilovanje, inhibitore proteazoma, inhibitore topoizomeraze II, antimetabolite, inhibitore topoizomeraze I, inhibitore puteva signalne transdukcije, inhibitore angiogeneze nereceptorske tirozin kinaze, hormone i hormonske analoge, proapoptotičke agense, inhibitore LDH-A, inhibitore ćelijskog ciklusa, inhibitore HDAC i antibiotska sredstva.
[0077] Kako se ovde koristi, "oznaka" može uključivati bilo koji deo koji služi kao detekcioni agens, npr., vezivanja između obeleženog antitela prema ovom pronalasku i makromolekula ili ćelije. Primeri oznaka uključuju bez ograničenja fluorescentne (npr. jedinjenja ili proteine), radioaktivne ili enzimske delove, kao i oznake za prečišćavanje afiniteta.
[0078] Kao što se ovde koristi, može se reći da antitelo "veže" antigen sa afinitetom dovoljnim da antitelo učini korisnim za in vitro i/ili in vivo manipulaciju antigenom. U nekim primerima izvođenja, antitelo koje "veže" antigen ima konstantu disocijacije (KD) za antigen koji je manji ili jednak 1 µM na 25°C.
1
[0079] Kako se ovde koristi, termin "afinitet" ili "afinitet vezivanja" odnosi se na jačinu interakcije vezivanja između dva molekula. Generalno, afinitet vezivanja se odnosi na snagu zbira nekovalentnih interakcija između molekula i njegovog partnera za vezivanje, kao što je SIRP-α D1 varijanta visokog afiniteta i CD47. Osim ako nije drugačije naznačeno, afinitet vezivanja se odnosi na unutrašnji afinitet vezivanja, koji odražava interakciju 1:1 između članova vezujućeg para. Afinitet vezivanja između dva molekula se obično opisuje konstantom disocijacije (KD) ili konstantom asocijacije (KA). Dva molekula koji imaju nizak afinitet vezivanja jedan za drugi uglavnom se sporo vezuju, imaju tendenciju da se lako razdvoje i pokazuju veliku KD. Dva molekula koji imaju visok afinitet jedan prema drugom uglavnom se lako vezuju, teže da ostanu vezani duže i pokazuju malu KD. U nekim primerima izvođenja, KDdva molekula u interakciji se određuje korišćenjem poznatih metoda i tehnika, npr. rezonancom površinskog plazmona (SPR). KDse može izračunati kao odnos koff/kon.
[0080] Kako se ovde koristi, izraz "KDmanje od" odnosi se na brojčano manji KDvrednost i sve veći afinitet vezivanja u odnosu na navedenu KDvrednost. Kako se ovde koristi, izraz "KDveći od" odnosi se na brojčano veće KDvrednost i opadajući afinitet vezivanja u odnosu na navedenu KDvrednost.
[0081] Kako se ovde koristi, "tretman" se može odnositi na terapeutsku primenu molekula, jedinjenja, formulacije, kompozicije, itd. tako da se promeni jedan ili više patoloških simptoma kod pojedinca ili ćelije koja se leči. Poželjni efekti lečenja mogu uključivati bez ograničenja usporavanje progresije bolesti, ublažavanje ili umanjivanje patološkog simptoma ili bolesnog stanja, poboljšanje prognoze i/ili postizanje remisije bolesti. Na primer, rak pojedinca se uspešno „leči“ ako se ublaži ili ukine jedan ili više simptoma povezanih sa rakom, kao što je, bez ograničenja, smanjenje proliferacije ćelija raka, eliminisanje ćelija raka ili opterećenja tumora, smanjenje simptoma koji su posledica raka, povećanje kvaliteta života pojedinca, smanjenje doze drugih lekova i/ili produženje preživljavanja pojedinca. Kao drugi primer, autoimuna ili inflamatorna bolest može se uspešno „lečiti“ ako se ublaži ili ukine jedan ili više simptoma povezanih sa autoimunom ili inflamatornom bolešću, kao što je, bez ograničenja, smanjenje autoreaktivnih imunih ćelija i/ili inflamatornih imunih ćelija ili citokina. , smanjenje imunološke aktivacije i/ili upale, usporavanje ili ublažavanje oštećenja organa koje je rezultat bolesti, smanjenje simptoma uzrokovanih bolešću, povećanje kvaliteta života pojedinca, smanjenje doze drugih lekova i/ili produženje preživljavanja pojedinca.
[0082] Kako se ovde koristi, "odlaganje napredovanja" bolesti može se odnositi na usporavanje, retardaciju, odlaganje, odlaganje razvoja, stabilizaciju ili na drugi način ometanje patološkog toka bolesti. U nekim primerima izvođenja, termin se može odnositi na
2
kašnjenje dovoljno da efektivno obuhvati prevenciju, npr., u sprečavanju da se kod pojedinca razvije bolest. U nekim primerima izvođenja, npr., uznapredovali rak, odlaganje progresije može uključivati odlaganje metastaza. Stručnjak u ovoj oblasti razume da precizna dužina kašnjenja može zavisiti, npr., od konkretne bolesti, stanja pojedinca i sl.
[0083] Termini "rak" i "kancerogen" mogu da opisuju neregulisan ili neregulisan ćelijski rast/proliferaciju od strane ćelije ili ćelija kod sisara. Može biti uključen bilo koji tip raka poznat u tehnici, kao što su, ali bez ograničenja, karcinom, sarkom, limfom, leukemija, limfom i blastom. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na, rak pluća, kancer skvamoznih ćelija, tumore mozga, glioblastom, kancer glave i vrata, hepatocelularni kancer, kolorektalni kancer (npr., karcinom debelog creva ili rektuma), kancer jetre, kancer mokraćne bešike, gastrični ili kancer želuca, kancer pankreasa, kancer grlića materice, kancer jajnika, kancer urinarnog trakta, kancer dojke, kancer peritoneuma, kancer materice, kancer pljuvačne žlezde, renalni ili kancer bubrega, kancer prostate, kancer vulve, kancer štitne žlezde, analni karcinom, karcinom penisa, melanom, multipli mijelom i B-ćelijski limfom (uključujući ne-Hodgkinove limfome (NHL)); akutnu limfoblastnu leukemiju (ALL); hroničnu limfocitnu leukemiju (CLL); akutnu mijeloidnu leukemiju (AML); karcinom Merkelovih ćelija; leukemiju vlasastih ćelija; hroničnu mijeloblastnu leukemiju (CML); i povezane metastaze.
[0084] Kako se ovde koristi, termin "efikasna količina" može se odnositi na količinu antitela prema ovom pronalasku ili farmaceutsku kompoziciju koja sadrži antitelo prema ovom pronalasku koja je dovoljna i efikasna u postizanju željenog terapeutskog efekta u lečenju ili odlaganju progresije bolesti kod pacijenta koji ima bolest, kao što je rak, npr. solidni tumor ili hematološki kancer. U nekim primerima izvođenja, terapeutski efikasna količina će izbeći neželjene sporedne efekte, i/ili će takvi neželjeni efekti biti prevagnuti korisnim efektima. Efikasna količina može zavisiti od pojedinca koji se leči, npr., starost, težina, pol, stanje bolesti, kao i sposobnosti agensa da proizvede željeni odgovor. Efikasna količina se može primeniti u jednoj ili više primena. Kao u kliničkom kontekstu, efikasna količina leka, jedinjenja ili farmaceutske kompozicije može, ali ne mora biti postignuta u kombinaciji sa drugim lekom, jedinjenjem ili farmaceutskom kompozicijom, kao što je drugi terapeutski agens. Prema tome, "efikasna količina" se takođe može uzeti u obzir u kontekstu davanja jednog ili više dodatnih terapeutskih agenasa, a može se smatrati da se jedan agens daje u efektivnoj količini ako, u kombinaciji sa jednim ili više drugih agenasa, poželjan rezultat može postojati ili je postignut.
[0085] Kako se ovde koristi, termin "farmaceutska kompozicija" može da se odnosi na medicinsku ili farmaceutsku formulaciju koja uključuje aktivni sastojak kao i ekscipijense ili razblaživače (ili i ekscipijense i razblaživače) i omogućava da se aktivni sastojak primenjuje odgovarajućim metodama primene. U nekim primerima izvođenja, farmaceutske kompozicije koje su ovde otkrivene uključuju farmaceutski prihvatljive komponente koje su kompatibilne sa jednim ili više antitela prema ovom pronalasku. U nekim primerima izvođenja, farmaceutska kompozicija je u obliku tableta ili kapsula za oralnu primenu ili u vodenom obliku za intravensku ili subkutanu primenu, na primer injekcijom.
[0086] Kako se ovde koristi, termini "subjekat", "pojedinac" i "pacijent" se koriste naizmenično za označavanje kičmenjaka, na primer, sisara. Sisari uključuju, ali nisu ograničeni na, miševe, majmune, ljude, poljoprivredne životinje, sportske životinje i kućne ljubimce.
[0087] Kako se ovde koristi, "u vezi sa" ili "u kombinaciji sa" može se odnositi na primenu jednog terapeutskog leka pored (npr., pre, tokom i/ili posle) druge terapije.
Antitela
[0088] Određeni aspekti ovog otkrića se odnose na antitela koja vezuju ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje. Kao što je ovde pokazano, okarakterisana su antitela koja se specifično vezuju za v1 ili v2, kao i antitela koja se vezuju za oba proteina. Kod ljudi, najmanje 10 različitih alela SIRPA su identifikovani (vidi SL. 1A; vidi takođe Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23). Antitela koja vezuju jedan ili više humanih SIRP-α polipeptida i poseduju jednu ili više drugih specifičnosti vezivanja opisanih ovde su korisno otkriće ovog otkrića. Dalje, ovo otkriće pokazuje metode za proizvodnju i identifikaciju antitela koja predstavljaju iznenađujuću raznolikost novih profila specifičnosti vezivanja za SIRP-α.
[0089] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:5). Antitelo prema ovom pronalasku može da veže vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu EEELQVIQPDKSVSVAAGESAILHCTVTSLIPVGPIQW-FRGAGP
4
ARELIYNQKEGHFPRVTTVSESTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCVKFRKGSPDTEF KSGAG-TELSVRAKPS (SEQ ID NO:6). Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:5) i vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
[0090] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) od 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida. Kako se ovde koristi, "humani polipeptid varijante SIRP-α" može se odnositi na prirodni polipeptid varijante SIRP-α kod čoveka ili polimorfizam koji je izražen kod ljudi, npr., za razliku od varijante koja nosi jednu ili više projektovanih mutacija. Na primer, antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) jednog ili više humanih SIRP-α varijantnih polipeptida koji sadrže sekvencu prikazanu u Tabeli 1. Antitelo ovog otkrića može da se veže za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida i/ili ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida i vezuje se za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) jednog ili više humanih SIRP-α polipeptida izabranih od v3, v4, v5, v6, v7, v8, v9 i v10.
Tabela 1. Humane SIRP-α varijante polipeptidnih sekvenci koje odgovaraju D1 domenu.
[0091] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna (npr. D1 domen SIRP-α polipeptida majmuna). Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) polipeptida makaki SIRP-α (npr., nalazi se u organizmu Macaca fascicularis). Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) najmanje dva različita polipeptida varijante SIRP-α majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) najmanje dva različita polipeptida varijante makaki SIRP-α. Na primer, antitelo može vezati ekstracelularni domen (npr., D1 domen) makaki SIRP-α polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
ADAGTYYCVKFRKGSPDVELKSGAGTELSVRAKPS (SEQ ID NO:11), ekstracelularni domen (npr., D1 domen) makaki SIRP-α polipeptida koji sadrži aminokiselinsku sekvencu
S (SEQ ID NO:12), ili oba.
[0092] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen mišjeg ili mišjeg SIRP-α polipeptida (npr., nalazi se u organizmu Mus musculus; npr., D1 domen mišjeg ili mišjeg SIRP-α polipeptida). Antitelo može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih mišjih SIRP-α varijantnih polipeptida. Poznato je mnoštvo mišjih SIRP-α varijanti polipeptida iz različitih sojeva miševa. U nekim primerima izvođenja, mišji SIRP-α varijantni polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu odabranu od
(SEQ ID NO:9; od C57BL/6 soja miša), i TEVKVTQPEKSVSVAAGDSTILNCTVTSLL-
PVGPIRWYRGVGQSRLLIYSFTGEHFPRIRNVSDTTKRNNMDFSIRISNVTPEDAGTYY
CVKFQRGSSEPDTEIQSGGGTEVYVLAK (SEQ ID NO:10; od BALB/c soja miša).
[0093] Antitelo prema ovom pronalasku može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog proteina porodice SIRP. Antitelo prema ovom pronalasku može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. U nekim primerima izvođenja, humani SIRP-β polipeptid se odnosi na polipeptid kodiran od strane humanog SIRPB1 gena, npr., kao što je opisano u NCBI Ref SEQ ID NO. 10326. U nekim primerima izvođenja, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:14).
[0094] Antitelo prema ovom pronalasku može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. U nekim primerima izvođenja, humani SIRP-γ polipeptid se odnosi na polipeptid kodiran od strane humanog SIRPG gena, npr., kao što je opisano u NCBI Ref SEQ ID NO. 55423. U nekim primerima izvođenja, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida sadrži aminokiselinsku sekvencu
(SEQ ID NO:15).
[0095] Pored antitela koja vezuju jedan ili više polipeptida opisanih gore, ovo otkriće razmatra antitela koja ne vezuju jedan ili više prethodno opisanih polipeptida. Na drugi način, profil vezivanja antitela prema ovom pronalasku može biti okarakterisan pozitivnim ili negativnim navođenjem bilo koje od specifičnosti vezivanja i/ili osobina opisanih ovde.
[0096] Antitelo ovog otkrića može da moduliše SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo prema ovom pronalasku može antagonizovati SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo prema ovom pronalasku može ometati SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Antitelo prema ovom pronalasku može da agonizuje SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid. SIRP-α signalizacija može uključiti jedan ili više intracelularnih signalnih događaja posredovanih aktivacijom SIRP-α polipeptida, uključujući bez ograničenja fosforilaciju tirozina intracelularnog regiona SIRP-α, vezivanje fosfataze (npr. SHP1), vezivanje za protein adaptera (npr. SCAP2, FYB i/ili GRB2) i proizvodnja azotnog oksida. Različiti testovi za merenje SIRP-α signalizacije u ćeliji uključuju bez ograničenja fosforilaciju SIRP-α, ko-imunoprecipitaciju SHP1 i SHP2, signalizaciju PI3-kinaze, proizvodnju citokina (i inflamatorni IL-12, IL-23, TNFα, IFN i supresivne citokine IL-10, IL-4, IL-13, nivoe markera ćelijske površine za markere M1 i M2 makrofaga) ili aktivaciju i funkciju dendritskih ćelija; Kharitonenkov, A. et al. (1997) Nature 386: 181-6; Ochi, F. et al. (1997) Biochem. Biophys. Res. Commun. 239:483-7; Kim, E.J. et al. (2013) Inflammation Research 62:377-86; Yi, T. et al. (2015) Immunity 43:764-75.
[0097] Ćelija koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid može biti leukocit. Ćelija može biti makrofag, dendritska ćelija, neutrofil, eozinofil ili supresorska ćelija izvedena iz mijeloida (MDSC). Antitelo ovog otkrića može da smanji ili antagonizuje SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90%, npr., korišćenjem jednog ili više SIRP-α signalnih testova opisanih ovde ili na drugi način poznatih u tehnici. Antitelo ovog otkrića može povećati ili agonizovati SIRP-α signalizaciju u ćeliji koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90%, npr., korišćenjem jednog ili više SIRP-α signalnih testova opisanih ovde ili na drugi način poznatih u tehnici.
[0098] Antitelo ovog otkrića može da moduliše međućelijski fenotip posredovan SIRP-α.
Antitelo prema ovom pronalasku može da pojača fagocitozu pomoću makrofaga koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid. Na primer, fagocitna aktivnost makrofaga tretiranog ili u kontaktu sa antitelom prema ovom pronalasku može se uporediti sa fagocitnom aktivnošću makrofaga koji nije tretiran ili je u kontaktu sa antitelom, ili fagocitnom aktivnošću makrofaga koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid i je tretiran ili je u kontaktu sa antitelom prema ovom pronalasku može se uporediti sa fagocitnom aktivnošću makrofaga koji ne eksprimira humani SIRP-α polipeptid i koji je tretiran ili je u kontaktu sa antitelom. Mogu se naći primeri testova fagocitoze, npr., in Wieskopf, K. et al (2013) Science 341: 88 i Willingham, S.B. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci.109:6662-7. Antitelo ovog otkrića može povećati fagocitozu makrofagom koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80%, ili najmanje 90%, npr., korišćenjem jednog ili više testova fagocitoze koji su ovde opisani ili na drugi način poznati u tehnici.
[0099] Antitelo prema ovom pronalasku može poboljšati aktivaciju dendritskih ćelija(e) koje eksprimiraju humani SIRP-α polipeptid (npr. povećan nivo aktivacije pojedinačnih dendritskih ćelija, ili povećani udeo dendritskih ćelija koje se aktiviraju u populaciji uzorka) . Na primer, aktivacija dendritskih ćelija tretiranih ili u kontaktu sa antitelom prema ovom pronalasku može se uporediti sa aktivacijom dendritskih ćelija koje nisu tretirane ili u kontaktu sa antitelom, ili aktivacijom dendritskih ćelija koje eksprimiraju humani SIRP-α polipeptid i koji su tretirani ili dovedeni u kontakt sa antitelom prema ovom pronalasku mogu se uporediti sa aktivacijom dendritskih ćelija(a) koje ne eksprimiraju humani SIRP-α polipeptid i koje su tretirane ili su u kontaktu sa antitelom. Ovde su opisani primeri testova aktivacije dendritskih ćelija. Antitelo prema ovom pronalasku može povećati dendritske ćelije (npr., eksprimirajući humani SIRP-α polipeptid) aktivaciju za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90%, npr., korišćenjem jednog ili više testova aktivacije dendritskih ćelija koji su ovde opisani ili na drugi način poznati u tehnici.
[0100] Antitelo prema ovom pronalasku može inhibirati in vivo rast tumora koji eksprimira CD47. Na primer, in vivo rast tumora koji eksprimira CD47 i koji se leči antitelom prema ovom pronalasku može se uporediti sa in vivo rastom tumora koji eksprimira CD47 i nije lečen antitelom prema ovom pronalasku. Primeri testova rasta tumora su opisani ovde. Antitelo prema ovom pronalasku može inhibirati in vivo rast tumora koji eksprimira CD47 za najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80% ili najmanje 90%, npr., koristeći jedan ili više od in vivo testovi rasta tumora opisani ovde ili na drugi način poznati u tehnici.
[0101] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (npr., "blokirajuće" antitelo). Na primer, antitelo i CD47 polipeptid mogu da se "takmiče" za isti SIRP-α epitop, i/ili vezivanje antitela za SIRP-α može biti međusobno isključeno sa vezivanjem CD47 za SIRP-α. Interfejs vezivanja između SIRP-α i CD47, kao i ostaci oba proteina koji učestvuju u vezivanju su poznati; vidi Hatherley, D. et al. (2007) J. Biol. Chem.282:14567-75 i Nakaishi, A. et al. (2008) J. Mol. Biol.375:650-60. Ovde su opisani primeri testova za određivanje da li antitelo blokira vezivanje CD47 za SIRP-α. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida u in vitro testu, npr., korišćenjem prečišćenih SIRP-α i/ili CD47 polipeptida. Na primer, ovde su opisani in vitro ELISA i SPR testovi, iako ovo ne bi trebalo da bude ograničavajuće, kao drugi in vitro testovi takođe se mogu koristiti testovi vezivanja. U nekim primerima izvođenja, vezivanje antitela za kompleks koji sadrži varijantu SIRP-α D1 (npr. SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi koji se vezuje za CD47 sa većim afinitetom od jednog ili više analoga koji se javljaju u prirodi kao što je ovde opisano) vezuje se za IgSF domen CD47 se koristi za skrining za blokiranje, neblokiranje i/ili pokretanje antitela. U nekim primerima izvođenja, "blokirajuća" i/ili "neblokirajuća" antitela se mogu testirati preko rezonance površinskog plazmona (SPR; npr., kao što je opisano u Primeru 1). Na primer, kompleks se može formirati između IgSF domena CD47 i SIRP-α D1 varijante (npr., SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi koji se vezuje za CD47 sa većim afinitetom od jednog ili više parnjaka koji se javljaju u prirodi kao što je ovde opisano), onda se može meriti vezivanje test antitela za kompleks. Za antitelo koje blokira vezivanje SIRP-α za CD47, pri rastućim koncentracijama CD47, očekivalo bi se da će manje molekula SIRP-α biti dostupno da se veže za antitelo pošto se antitelo takmiči za isto mesto vezivanja kao CD47 i većina/sav SIRP-α je kompleksiran sa CD47. Stoga bi se očekivalo da se rezonancija (RU) smanjuje sa povećanjem koncentracije CD47 u smeši. U nekim primerima izvođenja, "blokirajuće" anti-SIRP-α antitelo iz ovog otkrića vezuje se za ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen) na jednom ili više ostataka na interfejsu vezivanja između CD47 i SIRP- α, tj. blokirajuće antitelo i CD47 dele epitope koji se delimično ili potpuno preklapaju. U nekim primerima izvođenja, "blokirajuće" anti-SIRP-α antitelo ovog otkrića se vezuje za ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen) na jednoj ili više pozicija aminokiselina koje su takođe vezane za CD47 u CD47: SIRP-α
1
kompleksu. Interfejsi vezivanja između SIRP-α i primera anti-SIRP-α antitela ili CD47 su opisani u Primeru 4. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) ljudskog SIRP- -α polipeptid eksprimiran na površini prve ćelije i IgSF domen humanog CD47 polipeptida eksprimiran na površini druge ćelije, npr., in vivo test vezivanja između polipeptida eksprimiranih na površini ćelija. U nekim primerima izvođenja, in vivo test može proceniti vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije ispitivanjem jednog ili više aspekata SIRP-α signalizacije, npr., jedan ili više intracelularnih signalnih događaja posredovanih aktivacijom SIRP-α polipeptida, uključujući bez ograničenja fosforilaciju tirozina intracelularnog regiona SIRP-α, vezivanje fosfataze (npr. SHP1), vezivanje za protein adaptera (npr., SCAP2, FYB, i/ili GRB2), proizvodnju citokina (npr. IL-10, IL-1β, IFN ili TNF) i proizvodnju azot-oksida; i/ili jedan ili više međućelijskih fenotipova, uključujući bez ograničenja fagocitozu makrofaga i druge aktivirajuće ili supresivne fenotipove makrofaga, neutrofila, dendritskih ćelija, eozinofila i supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (MDSC).
[0102] Antitelo ovog otkrića možda neće blokirati vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (npr., "neblokirajuće" antitelo). Na primer, antitelo i polipeptid CD47 mogu da vežu različite i/ili ne-preklapajuće epitope SIRP-α. Antitelo ovog otkrića možda neće blokirati vezivanje između ekstraćelijskog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida u in vitro testu, npr., korišćenjem prečišćenih SIRP-α i/ili CD47 polipeptida. Na primer, ovde su opisani in vitro ELISA i SPR testovi, iako ovo ne bi trebalo da bude ograničavajuće, kao drugi in vitro testovi takođe se mogu koristiti testovi vezivanja. Vezivanje antitela za kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu (npr., SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi koji se vezuje za CD47 sa većim afinitetom od jednog ili više prirodnih parnjaka kao što je ovde opisano) vezan za IgSF domen CD47 može se koristiti za skrining za blokiranje, neblokiranje i/ ili pokrenuti antitela. „Blokirajuća“ i/ili „neblokirajuća“ antitela se mogu testirati preko rezonance površinskog plazmona (SPR; npr., kao što je opisano u Primeru 1). Na primer, kompleks se može formirati između IgSF domena CD47 i SIRP-α D1 varijante (npr., SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi koji se vezuje za CD47 sa većim afinitetom od jednog ili više parnjaka koji se javljaju u prirodi kao što je ovde opisano), onda se može meriti vezivanje test antitela za kompleks. Za antitelo koje ne blokira vezivanje SIRP-α za CD47, očekuje se da se
2
antitelo veže za SIRP-α/CD47 kompleks i formira sendvič. Stoga, pri rastućim koncentracijama CD47, rezonanca bi se povećala u skladu sa tim zbog povećanog formiranja sendviča. "Neblokirajuće" anti-SIRP-α antitelo ovog otkrića može da se veže za ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida (npr. D1 domen) na jednom ili više ostataka koji se razlikuju od interfejsa vezivanja između CD47 i SIRP-α, tj. neblokirajuće antitelo i CD47 dele epitope koji se potpuno ne preklapaju. Interfejsi vezivanja između SIRP-α i primera anti-SIRP-α antitela ili CD47 su opisani u Primeru 4. Antitelo ovog otkrića možda neće blokirati vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije, npr., in vivo test vezivanja između polipeptida eksprimiranih na površini ćelija. in vivo test može proceniti vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije ispitivanjem jednog ili više aspekata SIRP-α signalizacije, npr., jedan ili više intracelularnih signalnih događaja posredovanih aktivacijom SIRP-α polipeptida, uključujući bez ograničenja fosforilaciju tirozina intracelularnog regiona SIRP-α, fosfatazu (npr., SHP1) vezivanje, vezivanje za protein adaptera (npr., SCAP2, FYB i/ili GRB2), proizvodnju citokina (npr. IL-10, IL-1β, IFN ili TNF) i proizvodnju azot oksida; i/ili jedan ili više međućelijskih fenotipova, uključujući bez ograničenja fagocitozu makrofaga i druge aktivirajuće ili supresivne fenotipove makrofaga, neutrofila, dendritskih ćelija, eozinofila i supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (MDSC). Iznenađujuće je otkriće ovog otkrića da su antitela koja ne blokiraju interakciju SIRP-α sa CD47 u stanju da povećaju fagocitozu i blokiraju in vivo rast tumora. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da anti-SIRP-α antitela koja ne blokiraju mogu modulirati jednu ili više funkcija SIRP-α nezavisno od vezivanja CD47.
[0103] Vezivanje antitela iz ovog otkrića za vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može smanjiti afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida (npr., “Kick off” antitelo). Vezivanje antitela za vanćelijski domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida visokog afiniteta (npr., kako je ovde opisano) može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida visokog afiniteta (npr., kako je ovde opisano) za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida na više od oko 1x10<-3>1/s. Na primer, antitelo i CD47 polipeptid mogu imati susedne ili delimično preklapajuće SIRP-α epitope, tako da je antitelo u stanju da veže SIRP-α kada je vezano za CD47, ali antitelo: SIRP-α promoviše disocijaciju SIRP-α: CD47 kompleksa. Antitelo ovog otkrića može da smanji afinitet ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida u in vitro testu, npr., korišćenjem prečišćenih SIRP-α i/ili CD47 polipeptida. Vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida u in vitro testu, npr., korišćenjem prečišćenih SIRP-α i/ili CD47 polipeptida. Na primer, ovde su opisani in vitro ELISA i SPR testovi, iako ovo ne bi trebalo da bude ograničavajuće, kao drugi in vitro testovi takođe se mogu koristiti testovi vezivanja. Vezivanje antitela za kompleks koji sadrži SIRP-α D1 varijantu (npr., SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji se ne pojavljuje u prirodi koji se vezuje za CD47 sa većim afinitetom od jednog ili više prirodnih parnjaka kao što je ovde opisano) vezan za IgSF domen CD47 može se koristiti za skrining za blokiranje, neblokiranje i/ ili „kick-off“ antitela. Antitelo ovog otkrića može da smanji afinitet ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelija, npr., in vivo test vezivanja između polipeptida eksprimiranih na površini ćelija. "Kickoff" anti-SIRP-α antitelo ovog otkrića može da se veže za vanćelijski domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida na jednom ili više ostataka na interfejsu vezivanja između CD47 i SIRP-α, tj. „kick-off“ antitelo i CD47 dele epitope koji se delimično preklapaju. "Početno" anti-SIRP-α antitelo iz ovog otkrića može da se veže za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida na 1 ili više ostataka koji su takođe vezani za CD47 u CD47:SIRP-α kompleks. Na primer, “Kick off” anti-SIRP-α antitelo može da se veže za vanćelijski domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida na 2 ili više ostataka koji su takođe vezani za CD47 u CD47:SIRP-α kompleksa i nalaze se na periferiji epitopa koji se vezuje za CD47 SIRP-α interfejs vezivanja između SIRP-α i primera anti-SIRP-α antitela ili CD47 su opisani u Primeru 4. Vezivanje antitela iz ovog otkrića za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije može povećati koffhumanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije, npr., in vivo test vezivanja između polipeptida eksprimiranih na površini ćelija. in vivo test može da proceni vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida eksprimiranog na površini prve ćelije i IgSF domena humanog CD47 polipeptida eksprimiranog na površini druge ćelije ispitivanjem jednog ili više aspekata SIRP-α signalizacije, npr., jedan ili više intracelularnih signalnih događaja posredovanih aktivacijom SIRP-α polipeptida, uključujući
4
bez ograničenja fosforilaciju tirozina intracelularnog regiona SIRP-α, fosfatazu (npr., SHP1) vezivanje, vezivanje za protein adaptera (npr., SCAP2, FYB i/ili GRB2), proizvodnju citokina (npr. IL-10, IL-1β, IFN ili TNF) i proizvodnju azot-oksida; i/ili jedan ili više međućelijskih fenotipova, uključujući bez ograničenja fagocitozu makrofaga i druge aktivirajuće ili supresivne fenotipove makrofaga, neutrofila, dendritskih ćelija, eozinofila i supresorskih ćelija dobijenih iz mijeloida (MDSC).
[0104] Antitelo prema ovom pronalasku može da moduliše jednu ili više funkcija imunih ćelija vezivanjem za dva ili više (ili sva tri) SIRP-α, SIRPβ i SIRPγ.
[0105] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0106] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0107] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna; i vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0108] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0109] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0110] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0111] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna (npr. makaki); vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0112] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna (npr. makaki); vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0113] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v2 polipeptida, ili oboje; vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) SIRP-α polipeptida majmuna (npr. makaki); vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida; i vezivanje antitela za ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida smanjuje afinitet humanog SIRP-α polipeptida za vezivanje IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
[0114] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida i SIRP-α polipeptida majmuna; antitelo se ne vezuje za najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (videti, npr., SL. 3A i 3B).
[0115] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, mišji SIRP-α polipeptid, majmunski SIRP-α polipeptid i najmanje jedan od ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (videti, npr., SL.4A i 4B).
[0116] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, mišjeg SIRP-α polipeptida i SIRP-α polipeptida majmuna; antitelo se ne vezuje za najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i antitelo ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (videti, npr., SL. 5A i 5B).
[0117] Antitelo prema ovom pronalasku može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida i majmunskog SIRP-α polipeptida; antitelo ne vezuje mišji SIRP-α polipeptid; antitelo se ne vezuje za najmanje jedan ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (videti, npr., SL. 6A i 6B).
[0118] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijanti polipeptida, majmunski SIRP-α polipeptid i najmanje jedan od ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida i ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida; antitelo ne vezuje mišji SIRP-α polipeptid; i antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida (videti, npr., SL. 7A i 7B).
[0119] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži tri CDR-a iz VH domena koji sadrže sekvencu datu u Tabeli 2 i/ili tri CDR-a iz VL domena koja sadrži sekvencu datu u Tabeli 2 (VH i VL sekvence sa CDR-ovima istaknutim su obezbeđeni u SL.10A-10B & 11A-11J). Na primer, u nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži tri CDR-a iz VH domena koji sadrži sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398, 402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 280, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130, i 122 i/ili tri CDR-a iz VL domena koji sadrži sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381 , 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107, i 99 antitela. ovog otkrića obuhvata VH domen koji sadrži sekvencu datu u Tabeli 2 i/ili VL domen koji se sastoji od niza navedenih u tabeli 2 (vidi SL.10A-10B & 11A-11J). Na primer, u nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 294, 139, 358, 362, 354, 380, 384, 350, 137, 374, 356, 352, 135, 348, 376, 346, 342, 344, 141, 360, 370, 382, 364, 366, 368, 372, 378, 133, 128, 396, 386, 398, 402, 392, 388, 390, 394, 400, 116, 117, 118, 119, 282, 404, 406, 278, 412, 275, 414, 280, 123, 292, 288, 290, 408, 410, 286, 284, 120, 121, 130, i 122 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 295, 363, 140, 359, 355, 351, 136, 349, 377, 138, 375, 357, 353, 381, 385, 345, 365, 367, 369, 347, 142, 343, 371, 379, 383, 361, 373, 134, 105, 387, 389, 395, 397, 399, 403, 391, 393, 401, 93, 94, 95, 96, 283, 405, 407, 279, 413, 276, 415, 281, 100, 293, 289, 291, 409, 411, 287, 285, 97, 98, 107, i 99. U nekim primerima izvođenja, sadašnje otkriće obuhvata šest CDR sekvenci iz antitela opisanog u Tabeli 2 (videti SL. 10A-10B & 11A-11J). U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VL domen koji sadrži sekvencu VL domena VL domena Hum1-Hum9 kao što je ovde opisano. U nekim primerima izvođenja, antitelo je humanizovano antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo je humano antitelo. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VH domen i/ili VL domen iz antitela opisanog u Tabeli 2. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VH domen koji sadrži D ili E ostatak praćen (npr., u pravcu od N-kraja do C-kraja) sekvencom VH domena izabranog od SEQ ID NOs: 116-130.
Tabela 2. Ovde opisane aminokiselinske sekvence klonova antitela.
1
2
4
Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
1
2
Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
4 Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
1
11
12 Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
1 Klon/Anti Okvir Domen SEQ ID Sekvenca
[0120] Antitelo prema ovom pronalasku može da se veže za humani SIRP-α polipeptid na jednom ili više ostataka. Podrazumeva se da ostaci SIRP-α polipeptida koji su vezani antitelom iz ovog otkrića mogu biti opisani u odnosu na referentni SIRP-α polipeptid, ali ovaj opis nije ograničen na jedan SIRP-α polipeptid (tj. referentni SIRP-α polipeptid). Umesto toga, opisani su specifični aminokiselinski ostaci referentnog SIRP-α polipeptida da identifikuju odgovarajuće pozicije aminokiselina koje se mogu identifikovati na različitim SIRP-α polipeptidima. Na primer, specifični ostaci koji odgovaraju jednoj ili više aminokiselinskih pozicija SEQ ID NO: 296 mogu se identifikovati za različite humane SIRP-α polipeptide, kao što su v1 i/ili v2. Pošto se sekvence aminokiselina SEQ ID NO:296 i SEQ ID NO:5 razlikuju samo na poziciji N80 (osim malog broja C-terminalnih ostataka SEQ ID NO:296 korisnih za proizvodnju i prečišćavanje proteina), jedan od stručnjaka u stanju
1 4
tehnike će razumeti da će reference ovde na aminokiselinske pozicije u odnosu na aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:296 odgovarati istim pozicijama u aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:5. Tehnike za određivanje ostataka SIRP-α polipeptida vezanog antitelom su poznate u tehnici; primerni i neograničavajući opisi dati su u Primeru 4.
[0121] SEQ ID NO:296
[0122] Antitelo ovog otkrića može da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih od I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 i K96, prema SEQ ID NO:296. U nekim primerima izvođenja, antitelo se dalje vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih od L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 i R95, prema SEQ ID NO:296.
[0123] Antitelo ovog otkrića može da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih od I7, P9, D10, K11, S12, A42, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo se može vezati za humani SIRP-α v1 polipeptid na K11, A42, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo se može vezati za humani SIRP-α v1 polipeptid na I7, P9, D10, K11, S12, A108 i E111, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih između L14, T26, T28, T88, Y90, S106, S113 i A116, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na L14, T88, Y90, S106, S113 i A116 humanog SIRP-α v1, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na L14, T26 i T28, prema SEQ ID NO:296.
[0124] Antitelo prema ovom pronalasku može da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija odabranih od E47, L48, P58, R59, T82 i A84, prema SEQ ID NO:296. Antitelo može dalje da se veže za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih od A17, P44, G45, I49, E54, G55, H56, F57 i P83, prema SEQ ID NO:296.
[0125] Antitelo ovog otkrića može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manje od 100 nM, manje od 50 nM ili manje od 30 nM. U nekim primerima izvođenja, antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida, a antitelo vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen)
1
humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manje od 100 nM, manje od 50 nM ili manje od 30 nM. Antitelo može da veže D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida i D1 domen humanog SIRP-α v2 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) polipeptida SIRP-α makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-γ polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida.
[0126] Antitelo ovog otkrića može da veže D1 domen humanog SIRP-α polipeptida i ne blokira vezivanje između ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α v1 polipeptida sa konstantom disocijacije (KD) manje od 100 nM, manje od 50 nM ili manje od 30 nM. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje D1 domen humanog SIRP-α v1 polipeptida i D1 domen humanog SIRP-α v2 polipeptida. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) polipeptida SIRP-α makaki majmuna. Antitelo može da veže ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-β polipeptida. U nekim primerima izvođenja, antitelo vezuje vanćelijski domen (npr. D1 domen) mišjeg SIRP-α polipeptida.
[0127] Antitelo prema ovom pronalasku može da se takmiči za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom. Tehnike za određivanje da li je antitelo u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom su poznate u tehnici; primerni i neograničavajući opisi dati su u Primeru 5.
[0128] Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više referentnih anti-SIRP-α antitela izabranih od 119, 120, 121, 122, 21, 25, 27, 66 i 135 Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji takmiči za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više od sledećih referentnih anti-SIRP-α antitela: (a) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97, (b) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu od SEQ ID NO:121 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:98, (c) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:130 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 107, (d) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinu sekvencu SEQ ID NO:122 i
1
VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:99, (e) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136, (f) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138, (g) antitelo koji sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140, (h) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 142, i (i) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104.
[0129] Antitelo ovog otkrića može da se takmiči za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više referentnih anti-SIRP-α antitela izabranih između 136 i 137. Antitelo ovog otkrića može da se takmiči za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više od sledećih referentnih anti-SIRP-α antitela: (a) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134, i (b) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 128 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 105.
[0130] Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više referentnih anti-SIRP-α antitela izabranih od 3, 213, 173 i 209. Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više od sledećih referentnih anti-SIRP-α antitela: (a) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:242 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:243, (b) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276, (c) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279, i (d) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281.
[0131] Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više referentnih anti-SIRP-α antitela izabranih od 115, 116, 117, 118 i 132 Antitelo ovog otkrića može da se takmiči za
1
vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više od sledećih referentnih anti-SIRP-α antitela: (a) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:116 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:93, (b) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:117 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:94, (c) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:118 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:95, (d) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:119 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:96, i (e) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:282 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:283.
[0132] Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više referentnih anti-SIRP-α antitela izabranih od 218, 123, 149, 161, 162, i 194. Antitelo ovog otkrića može da se takmiči za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa jednim ili više od sledećih referentnih anti-SIRP-α antitela: (a) antitelo koje sadrže VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:285, (b) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100, (c) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287, (d) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži sekvencu aminokiselina od SEQ ID NO:288 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289, (e) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291, i (f) antitelo koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:293.
[0133] Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domena) humanog SIRP-α polipeptida sa referentnim anti-SIRP-α antitelom 45. Antitelo ovog otkrića može da je u kompeticiji za vezivanje ekstracelularnog domena (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida sa antitelom koje sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:244 i VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:245.
[0134] Ovo otkriće obezbeđuje više porodica anti-SIRP-α antitela, pri čemu svaka porodica
1
sadrži više antitela. Kao što je ovde pokazano, antitela unutar date porodice mogu da dele određena strukturna svojstva (npr. slične ili identične HVR ili CDR sekvence) kao i jedno ili više funkcionalnih svojstava, uključujući, ali ne ograničavajući se na, afinitet vezivanja za čoveka, majmuna i/ili miša SIRP-α polipeptid(e), afinitet vezivanja za SIRP-β polipeptide, afinitet vezivanja za SIRP-γ polipeptide, način vezivanja za SIRP-α (npr., blokiranje CD47, neblokiranje CD47 ili "kick-off" vezivanje), indukcija fagocitoze (npr., u in vitro testu), aktivacija dendritskih ćelija, antitumorska efikasnost, ostatak(e) epitopa koji se vezuje za SIRP-α ili "bin" (npr., kako je utvrđeno „bining“ testom) i slično (videti, npr. Tabele P-T). Zbog ovih zajedničkih svojstava, smatra se da HVR i/ili VH ili VL sekvence antitela koje pripadaju istoj porodici mogu biti zamenjene ili pomešane, tako da anti-SIRP-α antitelo može da sadrži HVR i/ili VH ili VL izvedeno od više od jednog specifičnog anti-SIRP-α antitela opisanog ovde. Kao što je ovde detaljnije diskutovano, različite metodologije za određivanje HVR ili CDR sekvenci varijabilnog domena antitela su poznate u tehnici i mogu se ovde koristiti naizmenično, uključujući bez ograničenja Kabat, Chothia i IMGT definicije, kao i njihove kombinacije.
[0135] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:97, 98, 107, 99, 104, i 312; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99,
1
104, i 312. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 120, 246, 258, 327, 121, 130, 122, 127, 247, 259, 335, i 328; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 97, 98, 107, 99, 104, i 312.
[0136] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; i HVR-H3 iz sekvence VH
11
domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 135, 137, 265, 266, 331, 139, 267, 332, 141, 263, 264, 268, 330, 294, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, i 384; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 136, 138, 140, 142, 252, 254, 262, 416, 295, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, i 385.
[0137] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 133, 249, 260, 329, 128, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, i 402; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 134, 251, 105, 250, 417, 418, 419, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401, i 403.
[0138] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs:93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 116, 117, 118, 119, 282, 404, i 406; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 93, 94, 95, 96, 283, 405, i 407.
[0139] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; i HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 242; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena
11
navedene u SEQ ID NO: 243; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 243.
[0140] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 278 i 412; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 279 i 413.
[0141] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 275 i 414; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 276 i 415.
[0142] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; i HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 280; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 281.
[0143] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i
11
293. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 123 i 292; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 100 i 293.
[0144] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; i HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-H2 iz sekvence VH domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-H3 iz sekvence VH domena izabrane od
11
aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 288, 290, 408, i 410; HVR-L1 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; HVR-L2 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane od aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NOs: 289, 291, 409, i 411.
[0145] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; i HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 286; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 287.
[0146] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; i HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 284; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO:
11
285; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 285.
[0147] Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO:244; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 244; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 244; iz HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 245; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 245; i/ili HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 245. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 244; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 244; i HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO: 244. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO:245; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO:245; i HVR-L3 iz sekvence VL domena izabrane kao što je navedeno u SEQ ID NO:245. Antitelo ovog otkrića može da sadrži HVR-H1 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO:244; HVR-H2 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO:244; HVR-H3 iz sekvence VH domena navedene u SEQ ID NO:244; HVR-L1 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO:245; HVR-L2 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 245; i HVR-L3 iz sekvence VL domena navedene u SEQ ID NO: 245.
[0148] Antitelo ovog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koje sadrže aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:242 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:243. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:242 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:243. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:244 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:245. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:244 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:245. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID
11
NO:279. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:282 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:283. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:282 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:283. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:285. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:285. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:288 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:288 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i/ili jednu, dve ili
11
tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:293. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:293.
[0149] Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:278 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:279. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:280 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:281. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:275 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:276. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:414 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:415. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:414 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:415. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 100. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 123 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:100. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:293. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:292 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID
12
NO:293. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:288 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:288 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:289. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:290 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:291. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:286 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:287. Antitelo predmetnog otkrića može da sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz VH domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz VL domena koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs:285, 333, ili 334. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:284 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NOs: 285, 333, ili 334.
[0150] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu NFAMT (SEQ ID NO:175), NFAVT (SEQ ID NO:204), ili NFALT (SEQ ID NO:305), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGSGDTYYADSVKG (SEQ ID NO:144), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVSWSGDFFDY (SEQ ID NO:145); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVKNDLA (SEQ ID NO:146), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AARIRET (SEQ ID NO:147), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO:148). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:120, 246, 258, ili 327; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:97 ili 312. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:246, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:258, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:246, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:258, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:120, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:327, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:312.
[0151] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu IYAMS (SEQ ID NO:269), IYAVS (SEQ ID NO:213), ili IYALS (SEQ ID NO:306), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGADDTYYADSVKG (SEQ ID NO:150), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVGWSGDFFDY (SEQ ID NO:151); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVRSDIA (SEQ ID NO:152), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AASSRDT (SEQ ID NO:153), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO:148). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:341, 127, 247, 259, ili 328; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%,or 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:104 ili 248. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:247, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:259, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:104; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:127, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:341, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:247, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:259, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:328, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:248.
[0152] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2DX3N, gde X1je S ili T; X2je Y ili S; i X3je M, L, ili V (SEQ ID NO:307); (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LISGSGEIX1YYADSVKG, gde X1je I ili T (SEQ ID NO:308); i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu EX1X2X3YRFFDX4, gde X1je N ili D; X2je N ili D; X3je R ili M; i X4je D ili Y (SEQ ID NO:309); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RAX1QSVYX2YLA, gde X1je S ili D; i X2je T ili S (SEQ ID NO:310); (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1AX2X3RAX4, gde X1je G, A, ili D; X2je S ili R; X3je S, N, ili T; i X4je T ili A (SEQ ID NO:311); i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDRPPLT (SEQ ID NO:160). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYDMN (SEQ ID NO:270), SYDVN (SEQ ID NO:221), ili SYDLN (SEQ ID NO:313), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu LISGSGEIIYYADSVKG (SEQ ID NO:156), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ENNRYRFFDD (SEQ ID NO:157); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQSVYTYLA (SEQ ID NO:158), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GASSRAT (SEQ ID NO:159), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDRPPLT (SEQ ID NO:160). VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%,or 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:133, 260, 329, ili 249 ; i/ili VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje
12
91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:134, 250, 251, 417, 418, ili 419. VH domen može da sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:417; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:417; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:417; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:417; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:418; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:418; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:418; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:418; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:419; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:419; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:419; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:419; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:133, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:260, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:329, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:134; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:250; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:249, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:251.
[0153] U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2AX3S, gde X1je S ili T; X2je N, Y, H, ili D; i X3je M, L, ili V (SEQ ID NO:297); (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, gde X1je A ili S; X2je G, S, ili je odsutan; X3je S, D ili G; X4je G ili S; X5je D, S, ili G; X6je T ili A; X7je P, G, V, I, A, ili S; X8je A, D, ili G; i X9je V ili M (SEQ ID NO:298); i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1X2X3SX4YYX5, gde X1je D, G, S, I, ili je odsutan; X2je S, W, G, Y, D, ili je odsutan; X3je S, Y, T, ili D; X4je H, T, S, ili Y; i X5je G ili A (SEQ ID NO:299); (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDX1X2RPX3, gde X1je D ili N; X2je E, K, ili Q; i X3je S ili P (SEQ ID NO:300); i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2YDX3X4X5YX6NX7, gde X1je G ili A; X2je G ili A; X3je G, Y, Q, S, ili A; X4je S, R, ili T; X5je T ili S; X6je A, I, V, L, ili T; i X7je T, A, D, ili P (SEQ ID NO:301). U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži (a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži: (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SX1AX2S, gde X1je N ili Y; i gde X2je M, L, ili V (SEQ ID NO:302); (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, gde X1je A ili S; X2je G ili je odsutan; X3je S ili G; X4je P, G, ili V; i X5je A ili D (SEQ ID NO:303); i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); i/ili (b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži: (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1YSSYYYA, gde X1je S ili A (SEQ ID NO:304); (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336); i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO:194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO:195), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY
12
(SEQ ID NO:193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 135, 263, 264, ili 330. U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO:197), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 137, 265, 266, ili 331. U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272), ili SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193). U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO: 139, 267, 268, ili 332. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži jednu ili više humanih IGLV3 okvirnih sekvenci. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži four human IGLV3 framework sequences. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži sekvencu FW1-HVR-L1-FW2-HVR-L2-FW3-HVR-L3-FW4 (N-terminus do C-terminusa), gde FW1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO:314), FW2 sadrži aminokiselinsku sekvencu WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO:315), FW3 sadrži aminokiselinsku sekvencu NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO:316), i FW4 sadrži aminokiselinsku sekvencu FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:317). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO:170), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%,
12
najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:252. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:254. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:416. U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172). U nekim primerima izvođenja, VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100% identična sa aminokiselinskom sekvencom SEQ ID NO:262. U nekim primerima izvođenja, VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen
12
sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu
12
SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:416; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:254; VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:416; ili VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262.
[0154] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 120 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:97. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 127 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 104. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 133 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 134. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 135 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 136. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 137 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 138. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 140. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 141 i/ili VL domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:142.
[0155] Antitelo može da sadrži (a) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GFSFSX1X2AMX3, gde X1je N ili I; X2je F ili Y; i X3je T ili S (SEQ ID NO:185); (b) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu TIGX4X5DTYYADSVKG, gde X4je S ili
12
A i X5je G ili D (SEQ ID NO: 186); (c) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu DSTVX6WSGDFFDY, gde X6je S ili G (SEQ ID NO:187); (d) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu RASQNVX7X8DX9A, gde X7je K ili R; X8je N ili S; i X9je L ili I (SEQ ID NO: 188); (e) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu AAX10X11RX12T, gde X10je R ili S; X11je I ili S; i X12je E ili D (SEQ ID NO: 189); i (f) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu QQYYDWPPFT (SEQ ID NO:148).
[0156] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 143-148 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 143-145 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 146-148). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 148-153 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 149-151 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 152, 153, i 148). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 155-160 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 155-157 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 158-160). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 161-166 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs:161-163 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs:164-166). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 161-166 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 161-163 i/ili jedna, dve, ili tri HVR sekvenci lakog lanca varijabilnog domena prikazane u Tabeli 2). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 161, 163, 168, i 170-172 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 161, 168, i 163 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 170-172). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 161, 163, 168, i 170-172 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 161, 168, i 163 i/ili ili jedna, dve, ili tri HVR sekvenci lakog lanca varijabilnog domena prikazane u Tabeli 2). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR
1
sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 163, 173, 174, i 176-178 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 163, 173, i 174 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 176-178). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 162, 163, 179, i 182-184 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 162, 163, i 179 i/ili jedna, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 182-184). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci koje imaju aminokiselinsku sekvencu izabranu od SEQ ID NOs: 162, 163, 179, i 182-184 (npr., jedna, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca izabrane od SEQ ID NOs: 162, 163, i 179 i/ili jedna, dve, ili tri HVR sekvenci lakog lanca varijabilnog domena prikazane u Tabeli 2). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs: 120 i 97 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO:120 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO:97). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs: 127 i 104 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NO: 127 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NO: 104). Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži jednu, dve, tri, četiri, pet ili šest HVR sekvenci iz sekvenci varijabilnog domena SEQ ID NOs:97, 104, 120, i 127 (npr., jednu, dve ili tri HVR sekvence teškog lanca iz sekvence varijabilnog domena teškog lanca SEQ ID NOs: 120 i 127 i/ili jednu, dve ili tri HVR sekvence lakog lanca iz sekvence varijabilnog domena lakog lanca SEQ ID NOs:97 i 104).
[0157] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 149, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku
1 1
sekvencu SEQ ID NO: 153, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 143 ili 149, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144 ili 150, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 145 ili 151; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146 ili 152, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147 ili 153, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 155, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:157; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 158, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:160. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 176, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 177, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:178. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID
1 2
NO: 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 184.
[0158] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 170, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 171, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 172. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 176, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 177, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 178. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:184.
[0159] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, 170, 176, ili 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 168, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, 170, 176, ili 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 173, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 174, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165,
1
171, 177, ili 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 179, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, 170, 176, ili 182, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135 i/ili a VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 139 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166, 172, 178, ili 184. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži VH domen koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:141 i/ili VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, 170, 176, ili 182; HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:165, 171, 177, ili 183; i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:166, 172, 178, ili 184.
[0160] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:242; i/ili (b) VL domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:243. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:244; i/ili (b) VL domen koji sadrži jednu, dve ili tri HVR sekvence iz SEQ ID NO:245.
[0161] Kako je opisano supra, različite tehnike za određivanje hipervarijabilnih regiona (HVR) ili regiona koji određuju komplementarnost (CDR) su poznate u tehnici i mogu se primeniti na sekvence varijabilnog domena opisane ovde. Antitelo ovog otkrića može sadržati HVR kao što je definisano od Chothia, Kabat, IMGT ili njihove kombinacije (npr., jedan ili
1 4
više HVR definisanih jednim ocrtavanjem i jedan ili više HVR definisanih različitim ocrtavanjem). HVR sekvence antitela iz ovog otkrića ocrtavanjem korišćenjem tri poznata ocrtavanja (Chothia, Kabat i IMGT) su date u Tabeli 5. Kako se ovde koristi, osim ako nije drugačije naznačeno, numerisanje HVR ostataka je definisano Kabat numeracijom.
Tabela 5. HVR ocrtavanja.
1
1
1
1
[0162] U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži 1, 2, 3, 4, 5 ili 6 HVR navedenih u Tabeli 5. (npr., VL domen koji sadrži 1, 2 ili 3 HVR lakog lanca navedenih u Tabeli 5 i/ili VH domen koji sadrži 1, 2 ili 3 HVR teška lanca navedena u Tabeli 5).
[0163] Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 191, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 192, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 191, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 196,
1
i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 198, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 199, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 191 ili 198, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 192, 196, ili 199, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:232, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:233, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:234 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:230, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:231, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:232. U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:239, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:240, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:241 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:219, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:238, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:237.
[0164] Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 194, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 194, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 197, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 200, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 201, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 164, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 165, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 166 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 194, 198, ili 200, HVR-H2 koji sadrži
14
aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 195, 197, ili 201, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 193. U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:232, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:233, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:234 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:227, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:228, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:230. U nekim primerima izvođenja, antitelo povog otkrića sadrži VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:239, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:240, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:241 i/ili VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:235, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:236, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:237.
[0165] Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:162, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:161, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:168, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163. Antitelo ovog otkrića može da sadrži VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:173, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:174, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:163.
[0166] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 202, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 203, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:146, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:147, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 211, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 212, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:151; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:152, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:153, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 219, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 220, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:158, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160.
[0167] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 204, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 144, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:145; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 146, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 147, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 213, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 150, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 151; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 152, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 153, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 221, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 156, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 157; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:158, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 159, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160.
[0168] Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 205, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 206, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 207; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 208, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 209, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 210. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 214, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 215, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 216; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 217, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 218, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 148. Antitelo prema ovom otkriću može da sadrži (a) VH domen koji sadrži HVR-H1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 222, HVR-H2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 223, i HVR-H3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 224; i/ili (b) VL domen koji sadrži HVR-L1 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 225, HVR-L2 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 226, i HVR-L3 koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 160.
[0169] Antitelo može da pojača fagocitozu pomoću makrofaga koji eksprimira humani SIRP-α polipeptid, pojačava aktivaciju dendritske ćelije koja eksprimira humani SIRP-α polipeptid, inhibira in vivo rast tumora ili tumorske ćelije(a) koje eksprimiraju CD47, i/ili ne sprečavaju interakcije između ćelije koja eksprimira CD47 i T ćelije. Primeri testova za merenje fagocitoze, aktivacije dendritskih ćelija, inhibicije rasta tumora i interakcija između ćelija koje eksprimiraju CD47 i T ćelija (npr. testovi adhezije) su ovde opisani i poznati u tehnici.
Proizvodnja antitela i druga svojstva antitela
[0170] Antitelo prema ovom pronalasku može se proizvesti na bilo koji način poznat u tehnici. Primeri tehnika za proizvodnju antitela su opisani u nastavku; međutim, ove ilustrativne tehnike su date samo u ilustrativne svrhe i nemaju nameru da budu ograničavajuće. Pored toga, dalje su opisana primerna svojstva antitela predviđena za upotrebu sa ovde opisanim antitelima.
[0171] Antitelo koje "veže" antigen može imati konstantu disocijacije (KD) za antigen koja je manja ili jednaka 1 µM na 25°C. Antitelo prema ovom pronalasku može imati konstantu disocijacije (KD) za humane v1 i/ili v2 SIRP-α polipeptide koja je manja ili jednaka 1 µM na 25°C, manja ili jednaka 500 nM na 25°C, manja ili jednaka 400 nM na 25°C, manja ili jednaka 300 nM na 25°C, manja ili jednaka 250 nM na 25°C, manja ili jednaka 200 nM na 25°C, manja ili jednaka 200 nM na 25°C, manja ili jednaka 100 nM na 25°C, ili manja ili jednaka 50 nM na 25°C. Antitelo koje vezuje humani SIRP-α polipeptid i jedan ili više nehumanih SIRP-α polipeptida može da veže humani SIRP-α polipeptid sa većim afinitetom (npr., 10-puta ili 100 puta veći) od nehumanog SIRP-α polipeptida, iako se i dalje smatra da "veže" oba polipeptida. Antitelo koje vezuje nehumani SIRP-α polipeptid i jedan ili više humanih SIRP-α polipeptida može da veže nehumani SIRP-α polipeptid sa većim afinitetom (npr., 10-puta ili 100 puta veći) od humanog SIRP-α polipeptida, iako se i dalje smatra da "veže" oba polipeptida. Testovi za određivanje afiniteta vezivanja su poznati u tehnici i uključuju bez ograničenja rezonancu površinskog plazmona (SPR), npr., kao što je ovde opisano; test vezivanja radioaktivno obeleženog antigena (RIA), npr., korišćenje Fab verzije
14
antitela i njegovog antigena; i slično. Ovde su opisani drugi primeri testova vezivanja.
[0172] Da bi se pripremio antigen, antigen može biti prečišćen ili na drugi način dobijen iz prirodnog izvora, ili može biti eksprimiran korišćenjem rekombinantnih tehnika. Antigen se može koristiti kao rastvorljivi protein. Antigen može biti konjugovan sa drugim polipeptidom ili drugim ostatkom, na primer, da bi se povećala njegova imunogenost. Na primer, ovde opisani antigen može biti spojen sa Fc regionom. Ćelija koja eksprimira antigen na svojoj ćelijskoj površini može se koristiti kao antigen.
[0173] Poliklonska antitela se mogu podići kod životinje višestrukim subkutanim (sc) ili intraperitonealnim (ip) injekcijama antigena i adjuvansa. Na primer, ovde su opisani opisi imunizacije pilića. Antigen može da se konjuguje sa imunogenim proteinom, npr., hemocijaninom životinja iz porodice Fissurellidae, serumskim albuminom, goveđim tiroglobulinom ili inhibitorom sojinog tripsina korišćenjem bifunkcionalnog ili derivatizujućeg agensa. Ovde su dati primeri metoda za imunizaciju pilića. Relevantne metode pogodne za razne druge organizme, kao što su sisari, dobro su poznate u tehnici.
[0174] Kako je prethodno opisano, monoklonska antitela se mogu proizvesti raznim metodama. U nekim primerima izvođenja, monoklonsko antitelo ovog otkrića je napravljeno korišćenjem hibridomskog postupka koji je prvi opisao Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), i dalje opisano u Hongo et al., Hibridoma, 14 (3): 253-260 (1995.)); Harlow et al., Antibodies: A LaboratoryManual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed.1988); i Hammerling et al., in: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981). Tehnologija humanog hibridoma (Trioma tehnologija) je opisana u Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) i Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3): 185-91 (2005). Mediji za kulturu u kome se uzgajaju ćelije hibridoma može biti pregledan na prisustvo antitela od interesa, npr. in vitro test vezivanja, imunoprecipitacija, ELISA, RIA, itd.; afinitet vezivanja se može odrediti, na primer, Scatchard analizom. Hibridom koji proizvodi antitelo sa željenim svojstvima vezivanja može se subklonirati i uzgajati korišćenjem poznatih tehnika kulture, uzgajati in vivo kao što su tumori ascitesa kod životinje i slično.
[0175] Monoklonsko antitelo se može napraviti korišćenjem metoda biblioteke, kao što je biblioteka za prikaz faga. Vidi, npr. Hoogenboom et al. u Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., Ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001). Repertoari VH i VL gena mogu biti klonirani lančanom reakcijom polimeraze (PCR) i nasumično rekombinovani u bibliotekama faga, koje se zatim testiraju na fag koji vezuje antigen, npr., kako je opisano u Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)). Fag obično prikazuje fragmente antitela, bilo kao jednolančane Fv (scFv) fragmente ili kao Fab fragmente. Alternativno, naivni repertoar se može klonirati (npr., od ljudi) da obezbedi jedan izvor antitela na širok spektar stranih, a takođe i sopstvenih antigena bez ikakve imunizacije kako je opisano u Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993.). Konačno, naivne biblioteke se takođe mogu napraviti sintetički kloniranjem nepreuređenih V-genskih segmenata iz matičnih ćelija i korišćenjem PCR prajmera koji sadrže nasumične sekvence za kodiranje visoko varijabilnih CDR3 regiona i za postizanje preuređenja in vitro, kako opisuje Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992.).).
[0176] Antitelo prema ovom pronalasku može biti pileće antitelo. Pileća antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici; vidi, npr. SAD Pat. br.6,143,559; 8,592,644; i 9,380,769.
[0177] Antitelo prema ovom pronalasku može biti himerno antitelo. Vidi, npr. SAD Patent br.
4,816,567 i Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 81:6851-6855 (1984). Himerno antitelo može da sadrži ne-humani varijabilni region (npr., varijabilni region dobijen od pileta, miša, pacova, hrčka, zeca ili primata koji nije čovek, kao što je majmun) i humani konstantni region. Himerno antitelo može biti antitelo sa "promenjenom klasom" u kome je klasa ili podklasa promenjena od one roditeljskog antitela. Himerna antitela uključuju njihove fragmente koji se vezuju za antigen.
[0178] Himerno antitelo može biti humanizovano antitelo. Ne-humano antitelo se može humanizovati da bi se smanjila imunogenost na ljude, uz zadržavanje specifičnosti i afiniteta roditeljskog ne-humanog antitela. Generalno, humanizovano antitelo sadrži jedan ili više varijabilnih domena u kojima su HVR, npr., CDR, (ili njihovi delovi) izvedeni iz ne-humanog antitela (npr., pileće antitelo), a FR (ili njihovi delovi) su izvedeni iz sekvence humanih antitela. Humanizovano antitelo opciono će takođe sadržati bar deo humanog konstantnog regiona. Neki FR ostaci u humanizovanom antitelu mogu biti zamenjeni odgovarajućim ostacima iz ne-humanog antitela (npr. antitela od kojih su HVR ostaci izvedeni), npr., za obnavljanje ili poboljšanje specifičnosti ili afiniteta antitela. Razmotrena su humanizovana antitela i metode njihovog pravljenja, npr., u Almagro i Franson, Front. Biosci.13:1619-1633 (2008). Metode humanizacije pilećeg antitela su takođe opisane, npr., u WO2005014653.
[0179] Humani okvirni regioni korisni za humanizaciju uključuju, ali nisu ograničeni na: okvirne regione odabrane korišćenjem metode "najbolje uklapanje"; okvirni regioni izvedeni iz konsenzus sekvence humanih antitela određene podgrupe varijabilnih regiona lakog ili teškog lanca; humani somatski mutirani okvirni regioni ili okvirni regioni humane klicine linije; i okvirni regioni izvedeni iz pregleda FR biblioteka. Vidi, npr. Sims et al. J. Immunol.
14
151:2296 (1993); Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993); Almagro and Franson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008); i Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997).
[0180] Antitelo prema ovom pronalasku može biti humano antitelo. Humana antitela se mogu proizvesti korišćenjem različitih tehnika poznatih u tehnici. Humano antitelo može da proizvede ne-humana životinja, kao što su genetski modifikovani pilići (vidi, npr. SAD Pat. br. 8,592,644; i 9,380,769) i/ili miševa opisanih ovde. Ljudska antitela su generalno opisana u Lonberg, Curr. Opin. Immunol.20:450-459 (2008)).
[0181] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku se generiše ili se dobija od pileta, na primer, korišćenjem metoda opisanih ovde.
[0182] Antitelo ovog otkrića može biti fragment antitela, uključujući bez ograničenja Fab, F(ab')2, Fab'-SH, Fv ili scFv fragment, ili jedan domen, jedan teški lanac ili jedan laki lanac antitela. Fragmenti antitela se mogu generisati, na primer, enzimskom digestijom ili rekombinantnim tehnikama. Proteolitička digestija intaktnog antitela može se koristiti za stvaranje fragmenta antitela, npr., kako je opisano u Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) i Brennan et al., Science, 229:81 (1985). Fragment antitela može da proizvede rekombinantna ćelija domaćin. Na primer, fragmenti antitela Fab, Fv i ScFv se eksprimiraju i izlučuju iz E. coli. Fragmenti antitela mogu alternativno biti izolovani iz biblioteke faga antitela.
[0183] Fab'-SH fragmenti se mogu direktno oporaviti E. coli i hemijski spojeni da formiraju F(ab')2fragmente. Vidi Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992). F(ab')2fragmenti se takođe mogu izolovati direktno iz kulture rekombinantne ćelije domaćina. Fab i F(ab')2fragment sa povećanim in vivo poluživot koji obuhvata ostatke epitopa koji se vezuju za receptor za spasavanje opisani su u U.S. Pat. No.5,869,046.
[0184] Antitelo može biti jednolančani Fv fragment (scFv). Vidi WO 93/16185 i SAD Pat. br.
5,571,894 i 5,587,458. scFv fuzioni proteini mogu biti konstruisani da proizvedu fuziju efektorskog proteina bilo na amino ili karboksi terminusu scFv. Fragment antitela takođe može biti "linearno antitelo", npr., kao što je opisano u SAD Pat. br. 5,641,870, npr. Takva linearna antitela mogu biti monospecifična ili bispecifična.
[0185] Antitelo prema ovom pronalasku može biti multispecifično antitelo. Multispecifična antitela poseduju specifičnosti vezivanja protiv više od jednog antigena (npr. imaju dve, tri ili više specifičnosti vezivanja). U nekim primerima izvođenja, antitelo je bispecifično antitelo. Bispecifično antitelo može da sadrži dve različite specifičnosti vezivanja za isti antigen (npr. ima različit afinitet vezivanja i/ili specifičan epitop istog antigena). Bispecifično antitelo može
14
da sadrži specifičnosti vezivanja za dva različita antigena. Bispecifično antitelo može biti antitelo pune dužine ili netaknuto. Bispecifično antitelo može biti fragment antitela ovog otkrića.
[0186] Ovde se razmatraju bispecifična ili multispecifična antitela sa različitim kombinacijama specifičnosti vezivanja. U nekim primerima izvođenja, bispecifično antitelo ima prvu specifičnost vezivanja za jedan ili više SIRP-α polipeptida kao što je ovde opisano. Bispecifično antitelo može imati drugu specifičnost vezivanja za antigen eksprimiran od strane ćelije raka, npr., na površini ćelije. Primeri takvih antigena uključuju bez ograničenja CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucin 1, Mucin 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, Endotelin B receptor, mezotelin, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektin 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaza C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrin αVβ3, integrin α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, Ley, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, amucin, CAIX, EPHA3, folat receptor α, GD2, GD3, i MHC/peptid kompleks koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, protein iz MAGE familije, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaza, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli laminin receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivin, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenin, TGF-βRII, HPV E6, ili HPV E7. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da je kombinovanje takve specifičnosti vezivanja sa specifičnošću vezivanja protiv SIRP-α posebno povoljno, na primer, da se leukociti koji eksprimiraju FcR usmere da ciljaju tumorsku ćeliju sa drugom specifičnošću vezivanja, a takođe inhibiranje reagovanja SIRP-α izraženog od strane leukocita na bilo koji CD47 eksprimiran od tumorske ćelije sa prvom specifičnošću vezivanja.
[0187] U struci su poznate različite metode za generisanje i prečišćavanje bispecifičnog antitela. Opisani su brojni pristupi. Jedan pristup je pristup „knobs-in-to-hole” ili „izbočina-ušupljinu” (vidi, npr., SAD Pat. br. 5,731,168). Heterodimerizacija monomera Fc domena može biti unapređena uvođenjem različitih, ali kompatibilnih, supstitucija u dva monomera Fc domena, kao što su parovi ostataka „knob-into-hole” i parovi ostataka naelektrisanja. Interakcija izbočine i rupe favorizuje formiranje heterodimera, dok interakcija izbočinaizbočina i interakcija rupa-rupa ometaju formiranje homodimera zbog steričkog sukoba i brisanja povoljnih interakcija. Rupa se odnosi na prazninu koja nastaje kada se originalna aminokiselina u proteinu zameni drugom aminokiselinom koja ima manju zapreminu bočnog lanca. Izbočina se odnosi na izbočinu koja nastaje kada se originalna aminokiselina u proteinu
14
zameni drugom amino kiselinom koja ima veću zapreminu bočnog lanca. Na primer, aminokiselina koja se zamenjuje je u konstantnom domenu CH3 antitela monomera Fc domena i uključena je u dimerizaciju dva monomera Fc domena. Rupa u jednom konstantnom domenu CH3 antitela može da se stvori da bi se prilagodila izbočini u drugom konstantnom domenu CH3 antitela, tako da aminokiseline izbočine i rupe deluju da promovišu ili favorizuju heterodimerizaciju dva monomera Fc domena. Rupa u jednom konstantnom domenu CH3 antitela može da se stvori da bi se bolje prilagodila originalna aminokiselina u drugom konstantnom domenu CH3 antitela. Izbočina u jednom konstantnom domenu CH3 antitela može da se napravi da formira dodatne interakcije sa originalnim aminokiselinama u drugom CH3 konstantnom domenu antitela.
[0188] Rupa se može konstruisati zamenom aminokiselina koje imaju veće bočne lance kao što su tirozin ili triptofan sa aminokiselinama koje imaju manje bočne lance kao što su alanin, valin ili treonin, na primer Y407V mutacija u konstantnom domenu CH3 antitela. Slično, izbočina se može konstruisati zamenom aminokiselina koje imaju manje bočne lance sa aminokiselinama koje imaju veće bočne lance, na primer T366W mutacija u konstantnom domenu CH3 antitela. Jedan monomer Fc domena može uključivati mutaciju izbočine T366W, a drugi monomer Fc domena uključuje mutacije T366S, L358A i Y407V. Polipeptid prema pronalasku koji uključuje varijantu SIRP-α D1 visokog afiniteta može biti fuzionisan sa monomerom Fc domena uključujući mutaciju T366W da bi se ograničilo neželjeno formiranje homodimera izbočine. Primeri parova aminokiselina „knob-in-hole“ uključeni su, bez ograničenja, u tabeli 3.
Tabela 3. Parovi aminokiselina izbočina-u-rupu.
[0189] Drugi pristup koristi varijabilne domene antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta za kombinovanje antitelo-antigen) fuzionisane sa sekvencama konstantnog domena imunoglobulina, npr., sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji obuhvata najmanje deo zglobnih, CH2 i CH3 regiona. Bispecifično antitelo može imati hibridni teški
14
lanac imunoglobulina sa prvom specifičnošću vezivanja u jednoj ruci i parom hibridnog imunoglobulina težak lanac-laki lanac (obezbeđujući drugu specifičnost vezivanja) u drugom kraku. Vidi WO 94/04690. Drugi pristup koristi unakrsno povezivanje (vidi, npr. US Pat No.
4,676,980) za proizvodnju heterokonjugovanog antitela. Bispecifična antitela se mogu pripremiti korišćenjem hemijskog povezivanja (vidi, npr. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)) da proteolitički cepa intaktno antitelo u F(ab')2fragmenti koji se redukuju u prisustvu agensa za stvaranje kompleksa ditiola i konvertuju u derivate tionitrobenzoata (TNB), od kojih se jedan redukcijom ponovo konvertuje u Fab'-tiol i meša sa drugim derivatom Fab'-TNB da bi se formiralo bispecifično antitelo. Fab'-SH fragmenti mogu biti hemijski spregnuti. Bispecifični fragmenti antitela mogu se proizvesti u ćelijskoj kulturi korišćenjem leucinskih zatvarača, kao u Kostelni et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)). Za druge formate bispecifičnih antitela, videti, npr., Spiess, C. et al. (2015) Mol. Immunol.67:95-106.
[0190] Antitelo prema ovom pronalasku može biti dijatelo. Vidi, npr. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD, 90:6444-6448 (1993). U dijatelu, VHi VLdomeni jednog fragmenata uparuju se sa komplementarnim VLi VHdomenima drugog fragmenta, formirajući tako dva mesta za vezivanje antigena. Takođe je objavljena još jedna strategija za pravljenje fragmenata bispecifičnih antitela upotrebom jednolančanih Fv (sFv) dimera. Vidi Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).
[0191] Antitelo prema ovom pronalasku može biti antitelo sa jednim domenom. Antitelo sa jednim domenom se odnosi na jedan polipeptidni lanac koji sadrži ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca ili ceo ili deo varijabilnog domena lakog lanca antitela. Antitelo sa jednim domenom može biti ljudsko antitelo sa jednim domenom (vidi, npr. SAD Pat. br.
6,248,516 B1). U jednom aspektu, jednodomensko antitelo uključuje ceo ili deo varijabilnog domena teškog lanca antitela. Poznata su i antitela kamelida.
[0192] Antitela se mogu proizvesti korišćenjem rekombinantnih metoda. Za rekombinantnu proizvodnju antitela protiv antigena, nukleinska kiselina koja kodira antitelo je izolovana i ubačena u vektor koji se može replicirati za dalje kloniranje (amplifikacija DNK) ili za ekspresiju. DNK koja kodira antitelo može se lako izolovati i sekvencirati korišćenjem konvencionalnih procedura (npr., korišćenjem oligonukleotidnih sondi koje su sposobne da se specifično vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance antitela). Dostupni su mnogi vektori. Komponente vektora generalno uključuju, ali nisu ograničene na, jedno ili više od sledećeg: signalnu sekvencu, oridžin replikacije, jedan ili više gena markera, pojačivač, promotor i sekvencu za završetak transkripcije.
[0193] Antitelo ovog otkrića može se proizvesti rekombinantno kao fuzioni polipeptid sa
14
heterolognim polipeptidom, npr., signalnu sekvencu ili drugi polipeptid koji ima specifično mesto cepanja na N-terminusu zrelog proteina ili polipeptida. Odabrana heterologna signalna sekvenca može biti ona koju prepoznaje i obrađuje (npr. cepa signalna peptidaza) od strane ćelije domaćina. Za prokariotske ćelije domaćine koje ne prepoznaju i ne obrađuju signalnu sekvencu nativnog antitela, signalna sekvenca je supstituisana prokariotskom signalnom sekvencom odabranom, na primer, od alkalne fosfataze, penicilinaze, lpp ili toplotno stabilnih enterotoksin II lidera. Za sekreciju kvasca, nativna signalna sekvenca može biti zamenjena, npr., lider invertaze kvasca, lider faktora (uključujući Saccharomices i Kluiveromices lideri αfaktora), ili lider kisele fosfataze, C. albicans glukoamilazni lider, itd.. U ekspresiji ćelija sisara, dostupne su signalne sekvence sisara kao i lideri virusne sekrecije, na primer, herpes simplex gD signal.
[0194] I ekspresioni i klonirajući vektori sadrže sekvencu nukleinske kiseline koja omogućava vektoru da se replicira u jednoj ili više odabranih ćelija domaćina, npr., da bi se omogućilo da se vektor replicira nezavisno od hromozomske DNK domaćina. Ova sekvenca može uključivati oridžin replikacije ili sekvence koje se autonomno repliciraju. Takve sekvence su dobro poznate po raznim bakterijama, kvascima i virusima. Generalno, poreklo komponente replikacije nije potrebno za vektore ekspresije sisara (može se koristiti oridžin SV40 jer sadrži rani promotor).
[0195] Vektori ekspresije i kloniranja mogu da sadrže selekcioni gen ili selektabilni marker. Tipični selekcioni geni kodiraju proteine koji (a) daju otpornost na antibiotike ili druge toksine, na primer, ampicilin, neomicin, metotreksat ili tetraciklin, (b) dopunjuju auksotrofne nedostatke, ili (c) snabdevaju kritične hranljive materije koje nisu dostupne iz složenih medija. Primeri dominantne selekcije koriste lekove neomicin, mikofenolnu kiselinu i higromicin. Drugi primer pogodnih selektivnih markera za ćelije sisara su oni koji omogućavaju identifikaciju ćelija kompetentnih da preuzmu nukleinsku kiselinu koja kodira antitela, kao što je DHFR, glutamin sintetaza (GS), timidin kinaza, metalotionein-I i -II, poželjno metalotionein geni primata, adenozin deaminaza, ornitin dekarboksilaza i slično. Na primer, ćelijska linija ovarijuma kineskog hrčka (CHO) sa nedostatkom endogene aktivnosti DHFR transformisana DHFR genom se identifikuje kultivisanjem transformanata u medijumu kulture koji sadrži metotreksat (Mtk), kompetitivni antagonist DHFR.
[0196] Alternativno, ćelije domaćini (posebno domaćini divljeg tipa koji sadrže endogeni DHFR) transformisane ili ko-transformisane sa DNK sekvencama koje kodiraju antitelo od interesa, divlji tip DHFR gena i drugi selektivni marker kao što je aminoglikozid 3'-fosfotransferaza (APH) mogu biti odabrani rastom ćelija u medijumu koji sadrži selekcioni
1
agens za selektabilni marker kao što je aminoglikozidni antibiotik, npr., kanamicin, neomicin ili G418.
[0197] Vektori ekspresije i kloniranja generalno sadrže promotor koji prepoznaje organizam domaćin i koji je operativno vezan za nukleinsku kiselinu koja kodira antitelo. Promotori pogodni za upotrebu sa prokariotskim domaćinima uključuju phoA promotor, sistemi promotora β-laktamaze i laktoze, promotor alkalne fosfataze, promotorski sistem triptofana (trp) i hibridni promotori kao što je tac promotor. Međutim, pogodni su i drugi poznati bakterijski promotori. Promotorske sekvence su poznate za eukariote. Promotori kvasca su dobro poznati u tehnici i mogu uključivati inducibilne promotore/pojačivače regulisane uslovima rasta. Praktično svi eukariotski geni imaju region bogat AT koji se nalazi otprilike 25 do 30 baza uzvodno od mesta gde je transkripcija pokrenuta. Primeri uključuju, bez ograničenja, promotore za 3-fosfoglicerat kinazu ili druge glikolitičke enzime, kao što su enolaza, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza, heksokinaza, piruvat dekarboksilaza, fosfofruktokinaza, glukoza-6-fosfat izomeraza, 3-fosfoglicerat mutaza, piruvat kinaza, triozafosfat izomeraza, fosfoglukoza izomeraza i glukokinaza. Transkripcija antitela iz vektora u ćelijama domaćina sisara može se kontrolisati, na primer, promotorima dobijenim iz genoma virusa. Rani i kasni promotori virusa SV40 se prikladno dobijaju kao SV40 restrikcioni fragment koji takođe sadrži SV40 virusni oridžin replikacije. Neposredni rani promotor humanog citomegalovirusa se pogodno dobija kao restrikcioni fragment HindIII E. Alternativno, dugo terminalno ponavljanje Rous sarkoma virusa može se koristiti kao promotor.
[0198] Transkripcija DNK koja kodira antitelo ovog pronalaska od strane viših eukariota se često povećava umetanjem sekvence pojačivača u vektor. Mnoge sekvence pojačivača su sada poznate iz gena sisara (globin, elastaza, albumin, α-fetoprotein i insulin). Međutim, obično se koristi pojačivač koji je virus eukariotske ćelije.
[0199] Ekspresioni vektori koji se koriste u eukariotskim ćelijama domaćinima (kvasac, gljive, insekti, biljke, životinje, ljudske ili ćelije sa jedrom iz drugih višećelijskih organizama) takođe će sadržati sekvence neophodne za završetak transkripcije i za stabilizaciju iRNK.
[0200] Pogodne ćelije domaćini za kloniranje ili ekspresiju DNK u vektorima ovde su ćelije prokariota, kvasca ili viših eukariota opisanih prethodno. Pogodni prokarioti za ovu svrhu uključuju eubakterije, kao što su Gram-negativni ili Gram-pozitivni organizmi, na primer, Enterobacteriaceae kao npr. Escherichia, npr., E. coli, Enterobacter, Ervinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, npr. Salmonella tiphimurium, Serratia, npr. Serratia marcescans, i Shigella, itd. Pored prokariota, eukariotski mikrobi kao što su filamentozne gljive ili kvasac su
1 1
pogodni domaćini za kloniranje ili ekspresiju za vektore koji kodiraju antitela. Saccharomices cerevisiae, ili obični pekarski kvasac, najčešće se koristi među nižim eukariotskim mikroorganizmima domaćinima. Određene gljive i sojevi kvasca mogu biti odabrani u kojima su putevi glikozilacije "humanizovani", što rezultira proizvodnjom antitela sa delimično ili potpuno ljudskom glikozilacijom. Vidi, npr. Li et al., Nat. Biotech.24: 210-215 (2006.).
[0201] Kulture biljnih ćelija pamuka, kukuruza, krompira, soje, petunije, paradajza, vodenog sočiva (Leninaceae), lucerke (M. truncatula), a duvan se takođe može koristiti kao domaćin.
[0202] Pogodne ćelije domaćini za ekspresiju glikozilovanog antitela su takođe izvedene iz višećelijskih organizama (beskičmenjaka i kičmenjaka). Primeri ćelija beskičmenjaka uključuju ćelije biljaka i insekata. Brojni bakulovirusni sojevi i varijante i odgovarajuće permisivne ćelije domaćina insekata iz domaćina kao npr. Spodoptera frugiperda (gusenica), Aedes aegipti (komarac), Aedes albopictus (komarac), Drosophila melanogaster (voćna mušica), i Bombix mori su identifikovani.
[0203] Ćelije kičmenjaka se mogu koristiti kao domaćini, a razmnožavanje ćelija kičmenjaka u kulturi (kultura tkiva) postalo je rutinska procedura. Primeri korisnih ćelijskih linija domaćina sisara su CV1 linija bubrega majmuna transformisana sa SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); humana embrionalna linija bubrega (293 ili 293 ćelije subklonirane za rast u kulturi suspenzije, Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); ćelije bubrega bebe hrčka (BHK, ATCC CCL 10); mišje Sertoli ćelije (TM4, Mather, Biol. Reprod.23:243-251 (1980)); ćelije bubrega majmuna (CV1 ATCC CCL 70); ćelije bubrega afričkog zelenog majmuna (VERO-76, ATCC CRL-1587); ćelije humanog karcinoma grlića materice (HELA, ATCC CCL 2); ćelije psećeg bubrega (MDCK, ATCC CCL 34); ćelije jetre bivoljeg pacova (BRL 3A, ATCC CRL 1442); ćelije pluća čoveka (W138, ATCC CCL 75); ćelije ljudske jetre (Hep G2, HB 8065); tumor mlečne žlezde miša (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI ćelije (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); MRC 5 ćelije; FS4 ćelije; i linija humanog hepatoma (Hep G2). Druge korisne ćelijske linije domaćina sisara uključuju ćelije jajnika kineskog hrčka (CHO), uključujući DHFR" CHO ćelije (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. SAD 77:4216 (1980)); i ćelijske linije mijeloma kao što su NS0 i Sp2/0. Za pregled određenih ćelijskih linija domaćina sisara pogodnih za proizvodnju antitela, videti, npr. Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B. K. C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, N.J., 2003), pp.255-268.
[0204] Ćelije domaćini prema ovom pronalasku mogu se kultivisati u različitim medijumima. Komercijalno dostupni medijumi kao što su Hamov F10 (Sigma), Minimalni esencijalni medijum ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma) i Dulbekov modifikovani Eagle medijum
1 2
((DMEM), Sigma) su pogodni za kultivisanje ćelija domaćina. Pored toga, bilo koji medijum opisan u Ham et al., Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes et al., Anal. Biochem. 102:255 (1980), U.S. Pat. Nos. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 4,560,655; ili 5,122,469; WO 90/03430; WO 87/00195; ili SAD Pat. Re.30,985 može se koristiti kao medijum za kulturu ćelija domaćina. Bilo koji od ovih medijuma može se po potrebi dopuniti hormonima i/ili drugim faktorima rasta (kao što su insulin, transferin ili epidermalni faktor rasta), solima (kao što su natrijum hlorid, kalcijum, magnezijum i fosfat), puferima (kao što je HEPES), nukleotidima (kao što su adenozin i timidin), antibioticima (kao što je GENTAMYCIN<™>lek), elementima u tragovima (definisani kao neorganska jedinjenja koja su obično prisutna u konačnim koncentracijama u mikromolarnom opsegu) i glukozom ili ekvivalentnim izvorom energije. Bilo koji drugi neophodni dodaci takođe mogu biti uključeni u odgovarajućim koncentracijama koje bi bile poznate stručnjacima u ovoj oblasti. Uslovi kulture, kao što su temperatura, pH i slično, su oni koji su prethodno korišćeni sa ćelijom domaćinom odabranom za ekspresiju, i biće očigledni stručnjaku u ovoj oblasti.
[0205] Kada se koriste rekombinantne tehnike, antitelo se može proizvesti intracelularno, u periplazmatskom prostoru ili direktno izlučeno u medijum. Ako se antitelo proizvodi intracelularno, kao prvi korak, debris čestica, bilo ćelije domaćina ili lizirani fragmenti, se uklanjaju, na primer, centrifugiranjem ili ultrafiltracijom. Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) opisuje postupak za izolovanje antitela koja se luče u periplazmatski prostor E. coli.
[0206] Kompozicija antitela pripremljena od ćelija može se prečistiti korišćenjem, na primer, hidroksilapatit hromatografije, hromatografije hidrofobne interakcije, gel elektroforeze, dijalize i afinitetne hromatografije, pri čemu je afinitetna hromatografija jedan od tipično poželjnih koraka prečišćavanja.
[0207] Antitelo prema ovom pronalasku može da sadrži konstantni region kapa ili lambda lakog lanca. Antitelo ovog otkrića može da sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 325, 326 ili 426. Primeri i neograničavajuće sekvence konstantnog regiona lakog lanca date su u Tabeli 6. Ovo otkriće može da sadrži konstantni region IGLC3 lambda lakog lanca ili konstantni region IGLC7.
[0208] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku uključuje Fc region. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Fc region je ljudski Fc region, npr., IgG1, IgG2 ili IgG4 i njihovi podtipovi. Primeri i neograničavajući Fc regioni su obezbeđeni unutar aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 320-324 prikazanih u Tabeli 6. U nekim primerima izvođenja, Fc region unutar jedne ili više aminokiselinskih sekvenci SEQ ID NO: 320- 324
1
sadrži jednu ili više mutacija opisanih ovde, npr. u nastavku.
Tabela 6. Primeri sekvenci konstantnog regiona
1 4
Ime SEQ Sekvenca
[0209] U nekim primerima izvođenja, Fc region uključuje jednu ili više mutacija koje utiču na jedno ili više svojstava antitela, kao što su stabilnost, obrazac glikozilacije ili druge
1
modifikacije, funkcija efektorske ćelije, farmakokinetika i tako dalje. U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog pronalaska ima smanjenu ili minimalnu glikozilaciju. U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku ima ablaciju ili smanjenu efektorsku funkciju. Primeri Fc mutacija uključuju bez ograničenja (i) mutacije ljudskog IgG1 Fc regiona L234A, L235A, G237A i N297A; (ii) mutacije ljudskog IgG2 Fc regiona A330S, P331S i N297A; i (iii) mutacije ljudskog IgG4 Fc regiona S228P, E233P, F234V, L235A, delG236 i N297A (EU numerisanje). U nekim primerima izvođenja, ljudski IgG2 Fc region sadrži A330S i P331S mutacije. U nekim primerima izvođenja, ljudski IgG4 Fc region sadrži mutaciju S288P. U nekim primerima izvođenja, humani IgG4 Fc region sadrži S288P i L235E mutacije.
[0210] Antitela koja ciljaju antigene ćelijske površine mogu pokrenuti imunostimulativne i efektorske funkcije koje su povezane sa angažovanjem Fc receptora (FcR) na imunim ćelijama. Postoji veliki broj Fc receptora koji su specifični za određene klase antitela, uključujući IgG (gama receptore), IgE (eta receptore), IgA (alfa receptore) i IgM (mu receptore). Vezivanje Fc regiona za Fc receptore na ćelijskim površinama može da izazove brojne biološke odgovore uključujući fagocitozu čestica obloženih antitelom (fagocitoza posredovana ćelijama zavisna od antitela, ili ADCP), uklanjanje imunskih kompleksa, lizu ćelija obloženih antitelima od strane ćelije ubice (citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela, ili ADCC) i oslobađanje inflamatornih medijatora, placentalni transfer i kontrola proizvodnje imunoglobulina. Dodatno, vezivanje C1 komponente komplementa za antitela može aktivirati sistem komplementa. Aktivacija komplementa može biti važna za lizu ćelijskih patogena. Međutim, aktivacija komplementa takođe može stimulisati inflamatorni odgovor i takođe može biti uključena u autoimunu preosetljivost ili druge imunološke poremećaje. Varijantni Fc regioni sa smanjenom ili ablatiranom sposobnošću da vezuju određene Fc receptore su korisni za razvoj terapeutskih antitela i Fc-fuzionih polipeptidnih konstrukata koji deluju ciljanjem, aktiviranjem ili neutralizacijom funkcija liganda, a da pritom ne oštećuju ili uništavaju lokalne ćelije ili tkiva.
[0211] Monomer Fc domena može se odnositi na polipeptidni lanac koji uključuje drugi i treći konstantni domen antitela (npr. CH2 i CH3). Monomer Fc domena može takođe uključiti zglobni domen. Monomer Fc domena može biti bilo kog izotipa antitela imunoglobulina, uključujući IgG, IgE, IgM, IgA i IgD. Dodatno, monomer Fc domena može biti bilo kog IgG podtipa (npr. IgG1, IgG2, IgG2a, IgG2b, IgG2c, IgG3 i IgG4). Monomeri Fc domena mogu uključivati čak deset promena iz monomerne sekvence divljeg tipa Fc domena (npr.1-10, 1-8, 1-6, 1-4 aminokiselinske supstitucije, dodavanja ili insercije, delecije ili njihove kombinacije )
1
koji menjaju interakciju između Fc domena i Fc receptora.
[0212] Monomer Fc domena imunoglobulina ili fragment monomera Fc domena može biti sposoban da formira Fc domen sa drugim monomerom Fc domena. Monomer Fc domena imunoglobulina ili fragment monomera Fc domena možda neće biti sposoban da formira Fc domen sa drugim monomerom Fc domena. Monomer Fc domena ili fragment Fc domena može biti fuzionisan sa polipeptidom prema pronalasku da bi se povećao poluživot polipeptida u serumu. Monomer Fc domena ili fragment monomera Fc domena može biti fuzionisan sa polipeptidom prema pronalasku koji se dimerizuje sa drugim monomerom Fc domena da bi se formirao Fc domen koji se vezuje za Fc receptor, ili alternativno, monomer Fc domena se vezuje za Fc receptor. Fc domen ili fragment Fc domena može biti fuzionisan sa polipeptidom da bi se povećao poluživot polipeptida u serumu ne indukuje nikakav odgovor vezan za imuni sistem. Fc domen uključuje dva monomera Fc domena koji su dimerizovani interakcijom između konstantnih domena CH3 antitela.
[0213] Fc domen divljeg tipa formira minimalnu strukturu koja se vezuje za Fc receptor, npr. FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa, FcγRIIIb i FcγRIV. Fc domen u antitelu ovog otkrića može da sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija, dodataka ili insercija, delecija ili bilo koje njihove kombinacije koje dovode do smanjene efektorske funkcije kao što je smanjena citotoksičnost posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCC), smanjena citoliza zavisna od komplementa (CDC), smanjena fagocitoza posredovana ćelijama zavisna od antitela (ADCP) ili bilo koja njihova kombinacija. Na primer, antitelo prema ovom pronalasku može da pokaže smanjeno vezivanje (npr. minimalno vezivanje ili odsustvo vezivanja) za ljudski Fc receptor i smanjeno vezivanje (npr. minimalno vezivanje ili odsustvo vezivanja) za komplementarni protein C1q; smanjeno vezivanje (npr. minimalno vezivanje ili odsustvo vezivanja) za humani FcγRI, FcγRIIA, FcγRIIB, FcγRIIIB, FcγRIIIB, ili bilo koju njihovu kombinaciju, i C1q; izmenjena ili smanjena efektorska funkcija zavisna od antitela, kao što su ADCC, CDC, ADCP, ili bilo koja njihova kombinacija; i tako dalje. Primeri mutacija uključuju bez ograničenja jednu ili više supstitucija aminokiselina na E233, L234, L235, G236, G237, D265, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 ili P329 (broj EU indeksa prema Kabat (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)).
[0214] Antitelo prema ovom pronalasku može imati smanjeno ili ablatno vezivanje za CD16a, CD32a, CD32b, CD32c i CD64 Fcγ receptore. Ovde opisano antitelo sa ne-nativnim Fc regionom može da pokazuje najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili više smanjenje C1q vezivanja u poređenju sa antitelom koje sadrži Fc region
1
divljeg tipa. Antitelo sa ne-nativnim Fc regionom kako je ovde opisano može da pokaže najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće smanjenje CDC-a u poređenju sa antitelom koje sadrži divlji tip Fc regiona.
[0215] U nekim primerima izvođenja, Fc varijante ovde su minimalno glikozilovane ili imaju smanjenu glikozilaciju u odnosu na sekvencu divljeg tipa. U nekim primerima izvođenja, deglikozilacija se postiže mutacijom N297A, ili mutacijom N297 na bilo koju aminokiselinu koja nije N.
[0216] Varijante konstantnih regiona IgG antitela (npr. Fc varijante) mogu posedovati smanjeni kapacitet da specifično vezuju Fcγ receptore ili imaju smanjen kapacitet da indukuju fagocitozu. Varijante konstantnih regiona IgG antitela (npr. Fc varijante) mogu posedovati smanjeni kapacitet da specifično vezuju Fcγ receptore i imaju smanjen kapacitet da indukuju fagocitozu. Na primer, Fc domen može biti mutiran tako da mu nedostaju efektorske funkcije, tipične za "mrtv" Fc domen. Na primer, u nekim primerima izvođenja, Fc domen uključuje specifične aminokiselinske supstitucije za koje je poznato da minimiziraju interakciju između Fc domena i Fcγ receptora. U nekim primerima izvođenja, monomer Fc domena je iz IgG1 antitela i uključuje jednu ili više aminokiselinskih supstitucija L234A, L235A, G237A i N297A (kako je označeno prema sistemu numeracije EU prema Kabat et al., 1991). Jedna ili više dodatnih mutacija može biti uključeno u takvu IgG1 Fc varijantu. Neograničavajući primeri takvih dodatnih mutacija za ljudske IgG1 Fc varijante uključuju E318A i K322A. U nekim slučajevima, varijanta humanog IgG1 Fc ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 ili manje mutacija ukupno u poređenju sa sekvencom humanog IgG1 divljeg tipa. Jedna ili više dodatnih delecija mogu biti uključene u takvu IgG1 Fc varijantu. Na primer, C-terminalni lizin konstantnog regiona teškog lanca Fc IgG1 može biti obrisan, na primer da bi se povećala homogenost polipeptida kada se polipeptid proizvodi u ćelijama bakterija ili sisara. U nekim slučajevima, ljudska IgG1 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5 ili 4 ili manje delecija ukupno u poređenju sa divljim tipom humane IgG1 sekvence.
[0217] U nekim primerima izvođenja, monomer Fc domena je iz IgG2 antitela i uključuje supstitucije aminokiselina A330S, P331S ili oba A330S i P331S. Gore pomenute aminokiselinske pozicije su definisane prema Kabat, et al. (1991). Kabat numerisanje aminokiselinskih ostataka može se odrediti za dato antitelo poravnavanjem u regionima homologije sekvence antitela sa "standardnom" sekvencom sa Kabat brojem. U nekim primerima izvođenja, Fc varijanta sadrži humanu IgG2 Fc sekvencu koja sadrži jednu ili više aminokiselinskih supstitucija A330S, P331S i N297A (kako je naznačeno prema sistemu numeracije EU prema Kabat, et al. (1991). Jedna ili više dodatnih mutacija mogu biti
1
uključeni u takve varijante IgG2 Fc. Neograničavajući primeri takvih dodatnih mutacija za varijantu humanog IgG2 Fc uključuju V234A, G237A, P238S, V309L i H268A (kako je označeno prema sistemu numeracije EU prema Kabat et al. (1991)) U nekim slučajevima, humana IgG2 Fc varijanta ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 ili manje mutacija ukupno u poređenju sa divljim tipom humane IgG2 sekvence. Jedna ili više dodatne delecije mogu biti uključene u takvu IgG2 Fc varijantu.
[0218] Kada je Fc varijanta IgG4 Fc varijanta, u nekim primerima izvođenja, takva Fc varijanta sadrži mutaciju S228P, E233P, F234V, L235A, L235E ili delG236 (kako je naznačeno prema Kabat, et al. (1991)). U nekim slučajevima, ljudska varijanta IgG4 Fc ima do 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ili 1 mutaciju(e) ukupno u poređenju sa divljim tipom humane IgG4 sekvence .
[0219] Fc varijanta može da pokaže smanjeno vezivanje za Fc receptor subjekta u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. Fc varijanta može da pokaže ablatirano vezivanje za Fc receptor subjekta u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. Fc varijanta može da pokaže smanjenje fagocitoze u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. Fc varijanta može da pokaže ablaciju fagocitoze u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona.
[0220] Ćelijski posredovana citotoksičnost zavisna od antitela, koja se ovde takođe naziva ADCC, odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojoj se izlučeni Ig vezuje za Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim citotoksičnim ćelijama (npr., ćelije prirodnog ubice (NK) i neutrofili ) omogućavajući ovim citotoksičnim efektorskim ćelijama da se specifično vežu za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i zatim ubije ciljnu ćeliju. Ćelijski posredovana fagocitoza zavisna od antitela, koja se ovde takođe naziva ADCP, odnosi se na oblik citotoksičnosti u kojoj se izlučeni Ig vezuje za Fc receptore (FcRs) prisutne na određenim fagocitnim ćelijama (npr., makrofagi) omogućavajući ovim fagocitnim efektorskim ćelijama da vezuju se specifično za ciljnu ćeliju koja nosi antigen i zatim proguta i vari ciljnu ćeliju. Ligand-specifična IgG antitela visokog afiniteta usmerena na površinu ciljnih ćelija mogu stimulisati citotoksične ili fagocitne ćelije i mogu se koristiti za takvo ubijanje. Polipeptidni konstrukti koji sadrže Fc varijantu kako je ovde opisano mogu da ispolje smanjeni ADCC ili ADCP u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa. Polipeptidni konstrukti koji sadrže Fc varijantu kako je ovde opisano mogu pokazati smanjenje od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće ADCC ili ADCP u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa. Antitela koja sadrže Fc varijantu kao što je ovde opisano mogu da ispolje ablaciju ADCC ili ADCP u poređenju sa
1
polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa.
[0221] Citotoksičnost usmerena na komplement, koja se ovde takođe naziva CDC, odnosi se na oblik citotoksičnosti u kome se kaskada komplementa aktivira komponentom komplementa C1q koja se vezuje za antitelo Fc. Polipeptidni konstrukti koji sadrže Fc varijantu kako je ovde opisano mogu pokazati smanjenje od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće C1q vezivanje u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži divlji tip Fc regiona. U nekim slučajevima, polipeptidni konstrukti koji sadrže Fc varijantu kako je ovde opisano pokazuju smanjeni CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa. Polipeptidni konstrukti koji sadrže Fc varijantu kako je ovde opisano mogu pokazati smanjenje od najmanje 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ili veće CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa. U nekim slučajevima, antitela koja sadrže Fc varijantu kako je ovde opisana pokazuju zanemarljiv CDC u poređenju sa polipeptidnim konstruktom koji sadrži Fc region divljeg tipa.
[0222] Fc varijante ovde uključuju one koje pokazuju smanjeno vezivanje za Fcγ receptor u poređenju sa divljim tipom humanog IgG Fc regiona. Na primer, Fc varijanta može da pokaže vezivanje za Fcγ receptor koje je manje od vezivanja koje pokazuje divlji tip humanog IgG Fc regiona za Fcγ receptor. U nekim slučajevima, Fc varijanta je smanjila vezivanje za Fcγ receptor za faktor od 10%, 20% 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% (potpuna ablacija efektorske funkcije). Smanjeno vezivanje može biti za bilo koji jedan ili više Fcγ receptora, npr., CD16a, CD32a, CD32b, CD32c ili CD64.
[0223] U nekim slučajevima, Fc varijante koje su ovde otkrivene pokazuju smanjenje fagocitoze u poređenju sa njenim divljim tipom humanog IgG Fc regiona. Takve Fc varijante pokazuju smanjenje fagocitoze u poređenju sa njegovim divljim tipom humanog IgG Fc regiona, pri čemu je smanjenje aktivnosti fagocitoze, npr., faktorom od 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100%. U nekim slučajevima, Fc varijanta pokazuje ablaciju fagocitoze u poređenju sa njenim divljim tipom humanog IgG Fc regiona.
[0224] Ovde otkrivene Fc varijante mogu biti spregnute sa jednim ili više fuzionih partnera. U nekim slučajevima, fuzioni partner je terapeutski deo, kao što je citotoksični agens prema ovom pronalasku. U nekim slučajevima, fuzioni partner se bira da omogući ciljanje eksprimiranog proteina, prečišćavanje, skrining, prikaz i slično. Fuzioni partner takođe može uticati na stepen vezivanja za Fc receptore ili na stepen redukcije fagocitoze.
[0225] Partneri fuzije mogu biti povezani sa sekvencom varijante Fc preko sekvence linkera.
1
Linker sekvenca generalno sadrži mali broj aminokiselina, kao što je manje od deset aminokiselina, mada se koriste i duži linkeri. U nekim slučajevima, veznik ima dužinu manju od 10, 9, 8, 7, 6 ili 5 aminokiselina ili kraću. U nekim slučajevima, linker ima dužinu od najmanje 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 ili 35 aminokiselina ili duže. Opciono, koristi se cepljivi linker.
[0226] Fuzioni partner može biti ciljana ili signalna sekvenca koja usmerava protein varijante Fc i sve povezane fuzione partnere na željenu ćelijsku lokaciju ili u vanćelijski medijum. Određene signalne sekvence mogu ciljati protein koji se ili sekretuje u medijum za rast, ili u periplazmatski prostor, koji se nalazi između unutrašnje i spoljašnje membrane ćelije. U nekim primerima izvođenja, fuzioni partner je sekvenca koja kodira peptid ili protein koji omogućava prečišćavanje ili skrining. Takvi partneri za fuziju uključuju, ali nisu ograničeni na, polihistidinske oznake (His-oznake) (na primer His6 i His10) ili druge oznake za upotrebu sa sistemima imobilizovane metalne afinitetne hromatografije (IMAC) (npr. Ni+2 afinitetne kolone), GST fuzije, MBP fuzije, Strep-oznaku, ciljnu sekvencu BSP biotinilacije bakterijskog enzima BirA i oznake epitopa koje su ciljane antitelima (na primer c-mic oznake, flagtagovi i slično).
[0227] Takve oznake mogu biti korisne za prečišćavanje, za skrining ili oboje. Na primer, Fc varijanta se može prečistiti korišćenjem His-oznake imobilizacijom na Ni+2 afinitetnu kolonu, a zatim se nakon prečišćavanja ista His-oznaka koristi za imobilizaciju antitela na pločicu obloženu Ni+2 da bi se izvršio ELISA ili drugi test vezivanja.
[0228] Dostupni su različiti fuzioni partneri koji omogućavaju različite metode selekcije. Na primer, spajanjem članova biblioteke varijanti Fc sa proteinom gena III, može se primeniti prikaz faga. Partneri za fuziju mogu omogućiti označavanje Fc varijanti. Alternativno, fuzioni partner može da se veže za specifičnu sekvencu na vektoru ekspresije, omogućavajući fuzionom partneru i pridruženoj Fc varijanti da budu povezani kovalentno ili nekovalentno sa nukleinskom kiselinom koja ih kodira.
[0229] Kada je fuzioni partner terapeutski deo, terapeutski deo može biti, na primer, citotoksični agens, peptid, protein, antitelo, siRNK ili mali molekul.
[0230] Antitelo prema ovom pronalasku može biti vezano za različite nosače ili oznake i korišćeno za otkrivanje prisustva ćelija koje eksprimiraju specifični antigen. Primeri nosača uključuju staklo, polistiren, polipropilen, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, prirodnu i modifikovanu celulozu, poliakrilamide, agaroze i magnetit. Priroda nosača može biti rastvorljiva ili nerastvorljiva. Poznate su razne različite oznake i metode obeležavanja. Primeri oznaka uključuju enzime, radioizotope, fluorescentna jedinjenja, koloidne metale,
1 1
hemiluminiscentna jedinjenja i bioluminiscentna jedinjenja. Dostupne su različite tehnike za vezivanje oznaka za antitela koja su ovde otkrivena. Antitela se mogu povezati sa haptenima male molekularne težine. Ovi hapteni se zatim specifično detektuju pomoću druge reakcije. Na primer, hapten biotin može da se koristi sa avidinom ili se hapten dinitrofenol, piridoksal ili fluorescein detektuju specifičnim anti-hapten antitelima (npr. antidinitrofenol antitela, antipiridoksalna antitela i anti-fluoresceinska antitela). Ovde opisana antitela mogu da se koriste in vitro za testove vezivanja, kao što su imuni testovi. Na primer, antitela se mogu koristiti u tečnoj fazi ili vezana za nosač čvrste faze. Antitela koja se koriste za imunološke testove mogu se detektovati na različite načine.
Metode identifikacije i/ili generisanje antitela
[0231] Određeni aspekti ovog otkrića se odnose na metode identifikacije domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida. Povoljno, metode opisane ovde mogu da se koriste za identifikaciju domena za vezivanje antigena koji blokiraju vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, ne blokiraju vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida, ili smanjuju afinitet humanog SIRP -α polipeptid za humani CD47.
[0232] Metode mogu uključiti obezbeđivanje domena za vezivanje antigena koji vezuje ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida. Primeri domena za vezivanje antigena i antitela koja vezuju ekstracelularni domen (npr. D1 domen) humanog SIRP-α polipeptida, i/ili drugih SIRP polipeptida, su opisani ovde, kao i primeri metoda za identifikaciju takvih domena/antitela za vezivanje antigena. Primeri metoda su detaljnije opisani u Primerima u nastavku.
[0233] Metode mogu uključiti sklapanje kompleksa koji sadrži SIRP-α D1 varijantu vezanu za polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47. „Sklapanje“ kompleksa može uključiti obezbeđivanje rastvora koji sadrži i SIRP-α D1 varijantu i polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47. SIRP-α D1 varijanta može biti varijanta koja se ne pojavljuje u prirodi, na primer, koja se vezuje za humani CD47 sa afinitetom koji je najmanje 10 puta, najmanje 100 puta ili najmanje 100 puta veći od afiniteta prirodni SIRP-α D1 domen koji se vezuje za humani CD47. Povoljno, ovo olakšava skrining antitela, pošto prirodna interakcija SIRP-α:CD47 može biti preslaba za upotrebu u testovima vezivanja i skrininga. Primerne varijante su detaljnije opisane infra.
[0234] Metode mogu uključivati dovođenje u kontakt domena za vezivanje antigena sa
1 2
sastavljenim kompleksom. Može se otkriti vezivanje, ili njegov nedostatak ili deficijencija, domena vezivanja antigena za kompleks. Ovde su opisane različite tehnike detekcije. Mogu se koristiti SPR ili ELISA. Detektabilno vezivanje domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen ne blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Nedostatak vezivanja domena za vezivanje antigena za kompleks ukazuje na to da domen koji vezuje antigen blokira vezivanje između humanog CD47 i humanog SIRP-α polipeptida. Pored toga, SPR se koristi za razlikovanje blokirajućih, neblokirajućih i početnih antitela. Na primer, neblokirajuće antitelo može povećati RU kada se ubrizga na vrh prethodno formiranog kompleksa SIRPα:CD47, a antitelo za početak može povećati Koffprethodno formiranog kompleksa SIRPα:CD47, a blokirajuće antitelo možda neće promeniti RU ili Koffprethodno formiranog kompleksa SIRPα:CD47.
[0235] IgSF domen CD47 može biti humani IgSF domen. Polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47 može da sadrži humani CD47 vanćelijski domen. IgSF domen CD47 može da sadrži sekvencu aminokiselina QLLFNKTKSVEFTFSNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKS TVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRV VS (SEQ ID NO:16). Polipeptid koji sadrži IgSF domen CD47 može biti konjugovan sa drugim polipeptidom ili drugim delom, npr., Ig Fc regionom.
Varijante SIRP-α D1 domena sa visokim afinitetom
[0236] Razne varijante SIRP-α D1 visokog afiniteta su predviđene za upotrebu ovde. Na primer, SIRP-α D1 varijanta može da sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koju čine SEQ ID NO: 17-52 (videti tabelu 4). Slede dalji opisi SIRP-α D1 varijanti.
Tabela 4. Primeri sekvenci aminokiselina varijante SIRP-α D1.
1
SEQ Sekvenca
14 SEQ Sekvenca
1 SEQ Sekvenca
1 SEQ Sekvenca
1
[0237] Polipeptid varijante SIRP-α D1 ili njegov fragment može se vezati za CD47 sa KDmanjom od 1 x 10<-8>M, manjom od 5 x 10<-9>M, manjom od 1 x 10<-9>M, manjom 5 x 10<-10>M, manjom od 1 x 10<-10>M ili manjom od 1 x 10<-11>M. Polipeptid varijante SIRP-α D1 ili njegov fragment može da se veže za CD47 sa KDizmeđu oko 500 nM i 100 nM, između oko 100 nM i 50 nM, između oko 50 nM i 10 nM, između oko 10 nM i 5 nM, između oko 5 nM i 1 nM,
1
između oko 1 nM i 500 pM, između oko 500 pM i 100 pM, između oko 100 pM i 50 pM, ili između oko 50 pM i 10 pM.
[0238] Fragmenti mogu uključivati polipeptide manje od 10 aminokiselina u dužinu, oko 10 aminokiselina u dužinu, oko 20 aminokiselina u dužinu, oko 30 aminokiselina u dužinu, oko 40 aminokiselina u dužinu, oko 50 aminokiselina u dužinu, oko 60 aminokiselina u dužinu, oko 70 aminokiselina u dužinu, oko 80 aminokiselina u dužinu, oko 90 aminokiselina u dužinu, oko 100 aminokiselina u dužinu ili više od oko 100 aminokiselina u dužinu. Fragmenti zadržavaju sposobnost vezivanja za CD47. Poželjno je da se polipeptidi varijante SIRP-α D1 i njihovi fragmenti vezuju za CD47 sa većim afinitetom nego što se SIRP-α polipeptid vezuje za CD47.
[0239] Gore pomenuti polipeptidi varijante SIRP-α D1 mogu biti vezani ili fuzionisani za drugi polipeptid. Drugi polipeptid može uključivati, bez ograničenja, Fc polipeptid, Fc varijantu, HSA polipeptid, albuminski peptid, PEG polimer ili fragment prethodnog.
[0240] Polipeptid može uključivati SIRP-α D1 domen visokog afiniteta koji ima najmanje 85% identiteta sekvence (npr., najmanje 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94 %, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ili 100% identitet sekvence) na bilo koju varijantu datu u tabeli 4.
Generisanje antitela kod pileta
[0241] Određeni aspekti ovog otkrića se odnose na postupke za proizvodnju anti-SIRP-α antitela koje vezuje ekstracelularne domene (npr. D1 domene) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da je upotreba pilića posebno korisna zbog veće raznolikosti između SIRP-α pileta i SIRP-α sisara (npr. ljudi, majmuna, miša, itd.). Dalje, filogenetska udaljenost između pilića i sisara omogućava identifikaciju antitela koja unakrsno reaguju protiv, na primer, humanih i mišjih SIRP-α polipeptida, što može biti teško postići stvaranjem antitela kod miša zbog samotolerancije.
[0242] U nekim primerima izvođenja, metode uključuju imunizaciju pilića peptidom koji sadrži najmanje deo humanog SIRP-α ekstracelularnog domena (npr. D1 domen). Opisan je primerni raspored imunizacije u nastavku. Metode imunizacije pilića su opisane, npr., u Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16. U nekim primerima izvođenja, metode uključuju dobijanje antitela iz ćelije koja proizvodi antitela od imunizovanog pileta.
[0243] Postupci mogu uključiti otkrivanje vezivanja između antitela dobijenog iz ćelije i ekstracelularnih domena (npr. D1 domena) dva ili više različitih humanih SIRP-α varijantnih polipeptida. Na primer, humani SIRP-α v1 i v2, npr., kao što je ovde opisano, se koriste.
1
Primeri tehnika detekcije su ovde opisani i uključuju bez ograničenja GEM test (vidi npr. WO2009111014 i Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Mikroskopija (Oxf) 1-16), SPR i ELISA.
Metode lečenja
[0244] Sve reference u opisu na metode lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom. Određeni aspekti ovog otkrića se odnose na lečenje bolesti ili poremećaj korišćenjem ovde opisanog antitela. U nekim primerima izvođenja, bolest je rak. U nekim primerima izvođenja, bolest je autoimuna ili inflamatorna bolest.
[0245] Na primer, ovde je opisano antitelo prema ovom pronalasku za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja progresije kancera kod pojedinca davanjem efikasne količine antitela. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da ovde opisana antitela mogu biti korisna u lečenju raka, npr., ukidanjem sposobnosti raka da inhibira fagocitozu i imunološki nadzor preko CD47: SIRP-α signalne ose, ili na drugi način pojačavajući aktivaciju imunog sistema (kao što je aktivacija dendritskih ćelija).
[0246] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa hemoterapeutskim agensom.
[0247] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa drugim antitelom, npr., antitelom koje vezuje antigen eksprimiran u kanceru. Primeri antigena eksprimiranih od raka poznati su u tehnici i uključuju bez ograničenja CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucin 1, Mucin 16, PTK7, PD-L1, STEAP1, receptor endotelina B, mezotelin, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektin 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaza C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrin αVβ3, integrin α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascin, Le<y>, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, mucin, CAIX, EPHA3, folatni receptor α, GD2, GD3 i MHC/peptidni kompleks koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, protein iz MAGE familije, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaza, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezreli lamininski receptor, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP -1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivin, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenin, TGF-βRII, HPV E6 ili HPV E7. Na primer, u nekim primerima izvođenja, antitelo ovog otkrića se primenjuje u kombinaciji sa monoklonskim antitelom koje vezuje CD123 (takođe poznat kao IL-3 receptor alfa), kao što je talakotuzumab (takođe poznat kao CSL362 i JNJ-
1
56022473). U nekim primerima izvođenja, antitelo ovog pronalaska se primenjuje u kombinaciji sa monoklonskim antitelom koje vezuje EGFR (kao što je cetuksimab). U nekim primerima izvođenja, drugo antitelo uključuje jednu ili više efektorskih funkcija, npr. efektorske funkcije koje su povezane sa angažovanjem Fc receptora (FcR) na imunim ćelijama uključujući bez ograničenja ADCC ili ADCP, i/ili citotoksičnost zavisnu od komplementa (CDC). Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da je kombinovanje takvog antitela sa antitelom iz ovog otkrića posebno povoljno, na primer, da se leukociti koji eksprimiraju FcR usmere da ciljaju tumorsku ćeliju za koju je vezano drugo antitelo, a istovremeno inhibira odziv SIRP-α koji leukociti eksprimiraju na bilo koji CD47 eksprimiran od strane tumorske ćelije sa SIRP-α antitelom.
[0248] U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa imunoterapeutskim agensom. Imunoterapeutski agens se može odnositi na bilo koji terapeutik koji cilja na imuni sistem i promoviše terapijsko preusmeravanje imunog sistema, kao što je modulator kostimulatornog puta, vakcina protiv raka, rekombinantno modifikovana imunska ćelija, itd. U nekim primerima izvođenja, imunoterapeutski agens sadrži antitelo. Primeri antigena imunoterapeutskih antitela su poznati u tehnici i uključuju bez ograničenja PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, B7-H3, FZD7, CD27, TNFR2, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginaza, TDO i PVRIG. Imunoterapeutski agensi koji su odobreni ili u kasnoj fazi kliničkog testiranja uključuju, bez ograničenja, ipilimumab, pembrolizumab, nivolumab, atezolizumab, avelumab, durvalumab i slično. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da su antitela iz ovog otkrića pogodna za upotrebu sa imunoterapijskim agensima zbog komplementarnih mehanizama delovanja, npr., u aktiviranju i makrofaga i Tefektorćelije da ciljaju tumorske ćelije. U određenim realizacijama, antitelo ovog otkrića se primenjuje u kombinaciji sa inhibitorom PD-L1/PD-1 puta, npr., anti-PD-L1 ili anti-PD-1 antitelom. Kao što je ovde pokazano, kombinovana primena anti-SIRP-α antitela prema ovom pronalasku i inhibitora PD-L1/PD-1 puta može dovesti do sinergističke antitumorske aktivnosti. Na primer, u nekim primerima izvođenja, blokirajuće anti-SIRP-α antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom. U nekim primerima izvođenja, neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom. U nekim primerima izvođenja, blokirajuće anti-SIRP-α antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-Ll antitelom. U nekim primerima izvođenja, neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom.
1 1
[0249] Može biti uključen bilo koji tip raka poznat u tehnici, kao što su, ali bez ograničenja, karcinom, sarkom, limfom, leukemija, limfom i blastom. Konkretniji primeri takvih karcinoma uključuju, ali nisu ograničeni na, rak pluća, kancer skvamoznih ćelija, tumore mozga, glioblastom, kancer glave i vrata, hepatocelularni kancer, kolorektalni kancer (npr., karcinom debelog creva ili rektuma), rak jetre, rak mokraćne bešike, rak želuca ili želuca, rak pankreasa, rak grlića materice, rak jajnika, rak urinarnog trakta, rak dojke, rak peritoneuma, rak materice, rak pljuvačne žlezde, rak bubrega ili bubrega, rak prostate, rak vulve, rak štitne žlezde, analni karcinom, karcinom penisa, melanom, multipli mijelom i B-ćelijski limfom (uključujući ne-Hodgkinove limfome (NHL)); akutna limfoblastna leukemija (ALL); hronična limfocitna leukemija (CLL); akutna mijeloidna leukemija (AML); karcinom Merkelovih ćelija; leukemija vlasastih ćelija; hronična mijeloblastna leukemija (CML); i povezane metastaze.
[0250] Pored terapija raka, ovde navedena antitela su korisna u terapijama u kojima se daju monoklonska antitela u svrhu iscrpljivanja ćelija, npr., u lečenju inflamatornih bolesti iscrpljivanjem imunih ćelija. U te svrhe, ovde dato antitelo se primenjuje u kombinaciji sa drugim terapeutskim antitelom, npr. sa rituksimabom za iscrpljivanje B ćelija kod inflamatornih bolesti i autoimunih stanja; alemtuzumab za multiplu sklerozu; OKT3 za imunosupresiju; drugi za kondicioniranje transplantacije koštane srži; i slično.
[0251] Ovde je dalje opisano antitelo prema ovom pronalasku za upotrebu u postupcima lečenja ili odlaganja progresije autoimune bolesti ili inflamatorne bolesti kod pojedinca davanjem efikasne količine antitela. Autoimune bolesti i inflamatorne bolesti koje se mogu tretirati prema pronalasku obuhvataju, ali nisu ograničene na, multiplu sklerozu, reumatoidni artritis, spondiloartropatiju, sistemski eritematozni lupus, inflamatornu ili autoimunu bolest posredovanu antitelima, bolest transplantata protiv domaćina, sepsu, psorijaza, aterosklerozu, Sjogrenov sindrom, progresivnu sistemsku sklerozu, sklerodermu, akutni koronarni sindrom, ishemijsku reperfuziju, Kronovu bolest, endometriozu, glomerulonefritis, mijasteniju gravis, idiopatsku fibrozu, astmu, sindrom akutnog respiratornog distresa (ARDS),vaskulitis i inflamatorni autoimuni miozitis. U nekim primerima izvođenja, antitelo prema ovom pronalasku se primenjuje u kombinaciji sa terapeutskim agensom, kao što je imunosupresivni, antiinflamatorni ili imunomodulatorni agens. U nekim primerima izvođenja, ovde dato antitelo se koristi u lečenju autoimune bolesti ili inflamatorne bolesti, na primer, multiple skleroze, reumatoidnog artritisa, spondiloartropatije, sistemskog eritematoznog lupusa, inflamatorne ili autoimune bolesti izazvane antitelom, bolesti transplantata, sepse, dijabetese, psorijaze, psorijatičnog artritisa, ateroskleroze, Sjogrenovog sindroma, progresivne sistemske
1 2
skleroze, skleroderme, akutnog koronarnog sindroma, ishemijske reperfuzije, Kronove bolesti, ulceroznog kolitisa, endometrioze, glomerulonefritisa, IgA nefropatije, bolesti policističnih bubrega, miastenije gravis, idiopatkse plućne fibroze, astme, atopijskog dermatitisa, sindroma akutnog respiratornog distresa (ARDS), vaskulitisa ili inflamatornog autoimunog miozitisa.
[0252] Farmaceutske kompozicije i formulacije kako su ovde opisane mogu se pripremiti mešanjem aktivnih sastojaka (kao što su antitelo ili polipeptid) koji imaju željeni stepen čistoće sa jednim ili više opcionih farmaceutski prihvatljivih nosača (Remington's Pharmaceutical Sciences 16. Edition, Osol, A. Ed. (1980)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Farmaceutski prihvatljivi nosači su generalno netoksični za primaoce u korišćenim dozama i koncentracijama, i uključuju, ali nisu ograničeni na: pufere kao što su fosfat, citrat i druge organske kiseline; antioksidansi uključujući askorbinsku kiselinu i metionin; konzervansi; polipeptide male molekulske težine (manje od oko 10 ostataka); proteini, kao što su serumski albumin, želatin ili imunoglobulini; hidrofilni polimeri kao što je polivinilpirolidon; amino kiseline; monosaharidi, disaharidi i drugi ugljeni hidrati uključujući glukozu, manozu ili dekstrine; helatni agensi kao što je EDTA; šećeri kao što su saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; protivjoni koji stvaraju soli kao što je natrijum; kompleksi metala (npr. kompleksi Zn-proteina); i/ili nejonske površinski aktivne materije kao što je polietilen glikol (PEG). Antitelo prema ovom pronalasku može biti liofilizovano.
PRIMERI
[0253] Ovo otkriće će biti potpunije shvaćeno pozivanjem na sledeće primere. Primere, međutim, ne treba tumačiti kao ograničavanje obima ovog otkrića.
Primer 1: Identifikacija antitela sa novim specifičnostima vezivanja za SIRP-α proteine
Metode
Proizvodnja antitela
[0254] Sledeći proteini su korišćeni za imunizaciju. Svaki uključuje humani ili mišji SIRP-α peptid fuzionisan sa modifikovanim Fc regionom (bilo S228P humani IgG4 Fc ili L234A/L235A/G237A/N297A humani IgG1 Fc označen kao IgG1_AAA_N297A) za povećanu imunogeničnost.
1
Tabela A. Imunogene sekvence.
14
[0255] Gore navedeni proteini su korišćeni za imunizaciju pilića divljeg tipa, SynVH pilića koje su transgenog pileta koje sadrže VH od ljudi i VL od pilića, ili pilića sa potpuno ljudskim "HuMAB" imunoglobulinskim lokusima (Crystal Bioscience; vidi, npr. WO2012162422, WO2011019844, i WO2013059159). Pilići su imunizovani različitim rasporedima sa naizmeničnim dozama antigena. Primer rasporeda imunizacije je sledeći: početna imunizacija sa dozom od 100 µg antigena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 1 u nedelji 1, pojačavanje od 100 µg antigena sa sekvencom SEQ ID NO: 2 u nedelji 3, izvlačenje u nedelji 4, pojačati sa 50 µg doze antigena koji ima sekvencu SEQ ID NO:1 u 5. nedelji, izvući u 6. nedelji, pojačati sa 50 µg antigena koji ima sekvencu SEQ ID NO: 2 u nedelji 7, i izvući u 8. nedelji. mogu se naći opisi imunizacije pilića, npr., u Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16.
Skrining i ekspresija klonova antitela
[0256] Klonovi su generisani i pregledani prema GEM testu (vidi Mettler Izquierdo, S. et al. (2016) Microscopy (Oxf) 1-16). Klonovi su testirani u scFv-Fc formatu u kome je laki lanac fuzionisan preko linkera sa teškim lancem. ScFv je fuzionisan sa N-terminusom humanog Fc-IgG1. Klonovi su izraženi u FreeStyle<™>293-FS ćelije (Thermo Fisher) i izlučeni medijum su korišćeni za ELISA i SPR karakterizaciju vezivanja.
SPR
[0257] Vezivanje klonova antitela za različite SIRP proteine je određeno korišćenjem
1
površinske plazmonske rezonance (SPR) detekcije na ProteOn XPR36 instrumentu (Bio-Rad, Hercules, CA) korišćenjem fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS, pH 7,4) sa dodatkom 0,01% Tween-20 (PBST) kao radni pufer. Prethodno filtrirani medijum koji sadrži izlučena antitela je korišćen direktno za test. Prvo, anti-humani IgG Fc (BR-1008-39, GE Healthcare) je spojen aminom na GLC senzorski čip da bi se stvorile površine za hvatanje antitela. Postiže se oko 4000 RU po protočnoj ćeliji imobilisanog anti-humanog IgG Fc. Svaki klon je pregledan koristeći isti metod kao što sledi. SIRP analiti koji se koriste za ekran su navedeni u tabeli C.
(1) ~5-10 uL prethodno filtriranog medijuma u 10 mM natrijum acetatnog pufera (pH4,5) je injektirano 2 minuta pri 30 ul/min;
(2) protok pufera 1 min pri 100 uL/min;
(3) SIRP analit (100 nM) ubrizgan tokom 1 min pri 100 uL/min, nakon čega sledi ciklus disocijacije od 10 minuta;
(4) regeneracija površine čipa strujanjem 3M magnezijum hlorida tokom 1 min pri 25 uL/min u obe orijentacije; i
(5) protok pufera 1 min pri 100 uL/min.
[0258] Podaci o biosenzoru su dvostruko referencirani oduzimanjem podataka između tačaka (koji ne sadrže imobilizovani anti-humani IgG Fc) od podataka o tačkama reakcije (imobilizovani anti-humani IgG Fc) i zatim oduzimanjem odgovora puferske "prazne" injekcije analita od onog injekcije analita. Vezivanje je postavljeno pomoću 1:1 Langmuir i Koff(1/S) izračunate vrednosti. Svi SPR testovi su izvedeni na 25 °C.
ELISA
[0259] ELISA testovi su sprovedeni za skrining vezivanja klonova antitela za SIRP analite i SIRP-α:CD47 kompleks. Ukratko, ploče sa ravnim dnom sa 96 bunarčića, sa visokim stepenom vezivanja (Greiner Bio-One #655061) su obložene sledećim proteinima u odvojenim ELISA eksperimentima: Avidin (Sigma A9275) (2 ug/ml), a zatim biotinilovani humani SIRPα V1 (0,5 ug /ml), avidin (2ug/ml), zatim humani SIRPα V2 biotin (0,5ug/ml), mišji NOD SIRPα (2ug/ml), ljudski SIRPγ (2ug/ml), CD47 (2ug/ml) praćen visokim afinitetom humani SIRPα V1 i V2 (po 2 ug/ml svaki) ili anti-hFc (2 ug/ml Rockland 609-4103). Ploče su blokirane sa PBSTM (fosfatnim puferom pH 7,4, 0,05% Tween20, 3%
1
mleka), dodato je 50 ul supernatanta koji sadrži izlučeni scFv-Fc tokom 1 sata na sobnoj temperaturi. Ploče su isprane sa PBST. Dodato je 50 ul anti-hFc-HRP (1:5000 Rockland 609-4303) 1 sat na sobnoj temp. Ploče su isprane sa PBST. TMB je razvijen 5 minuta i zaustavljen sa 1N HCl. Rezultati ELISA su očitani korišćenjem BioTek Sinergi H1 Hybrid Reader. Odgovarajući proteini korišćeni za test i ovde opisani su: humani SIRPα V1 (SEQ ID NO: 5); humani SIRPα V2 (SEQ ID NO:6); makaki SIRPa (SEQ ID NO:11); mišji NOD SIRPα (SEQ ID NO: 8); humani SIRPγ (SEQ ID NO: 15); CD47 (SEQ ID NO: 16); SIRPα V1 visokog afiniteta (SEQ ID NO: 42); SIRPα V2 visokog afiniteta (SEQ ID NO:17).
Rezultati
[0260] SIRP-α je visoko polimorfni protein kod ljudi, majmuna i miševa. Na primer, identifikovano je 20 aminokiselinskih razlika između SIRP-α proteina u sojevima miša NOD i C57BL/6, a ovi polimorfizmi dovode do funkcionalnih posledica vezanih za CD47 vezivanje i presađivanje humanih hematopoetskih matičnih ćelija u ove sojeve miša. Kod ljudi, najmanje 10 različitih alela SIRPA su identifikovane, a varijacije aminokiselina koje razlikuju alele su pronađene u predviđenim ostacima koji se vezuju za CD47 (Takenaka, K. et al. (2007) Nat. Immunol. 8:1313-23). Poravnanje 10 humanih varijanti SIRP-α proteinskih sekvenci je dato u SL. 1A. Identifikacija antitela koja imaju različite specifičnosti vezivanja sa unakrsnom reaktivnošću unutar i/ili među vrstama je od velikog interesa za razvoj kliničkih kandidata koji su efikasni u ljudskim populacijama i karakterizaciju ovih kandidata u različitim životinjskim modelima.
[0261] D1 domeni SIRP-α proteina iz čoveka (varijante v1 i v2), makaki majmuna i miša 129 su poređani da identifikuju konzervirane aminokiseline (SL. 1B). Dok se sekvence makaki majmuna i 129 miša mnogo više razlikuju od ljudskih v1 i v2 od ljudskih varijanti v3-v10 kao što je prikazano na SL. 1A, ova poravnanja pokazuju izvestan stepen očuvanosti između sva četiri proteina, što sugeriše da bi se unakrsna reaktivna antitela možda mogla identifikovati. Međutim, svaki protein takođe pokazuje jedinstvene polimorfizme, što sugeriše da su moguća i specifična antitela.
[0262] Kao što je prikazano u SL. 1C, SIRP-α proteinske sekvence koje predstavljaju višestruke ljudske varijante i sojeve miša (npr. 129, NOD, C57BL/6 i BALB/c) su takođe poređane. R1, R2, R3 ocrtavaju ostatke koji se nalaze oko mesta vezivanja SIRPα za CD47. Ova poravnanja su pokazala da su R2 i R3 znatno više divergentni između i između ljudskih i mišjih sekvenci od R1. Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da anti-SIRP-α antitela
1
koja se vezuju za specifične mišje SIRP-α proteine mogu biti korisna, npr., za farmakokinetičke studije (kao što su one koje koriste CD-1 miševe), razvoj transgenih miševa (kao što su oni u pozadini C57BL/6) i/ili karakterizaciju u SCID (npr., u pozadini NOD) ili singene (npr. u pozadini BALB/c ili C57BL/6) modele miša.
[0263] SIRP-α D1 domeni sisara koji su gore opisani takođe su usklađeni sa D1 domenom pilećeg SIRP-α koji sadrži sekvencu DFKLQQPQSSVVVIKGDTLTLNCTASGSGPIGAVKWVKGWGSDNQTVYEHKGSFPR VMRAVPDPTNDFTIRISNVSLEDAGTYYCVKLRKGIVDDVVFTRGGGTEVSVHA
(SEQ ID NO:84) (SL. 2). U poređenju sa sekvencama SIRP-α sisara, utvrđeno je da je sekvenca pilećeg SIPRα značajno divergentnija. Poređenje u paru procenta identičnosti sekvence između različitih SIRP-α proteina je prikazano u tabeli B.
Tabela B. Parovi identičnosti sekvenci (%) između SIRP-α proteina.
[0264] Bez želje da budemo vezani za teoriju, smatralo se da će ova divergencija pružiti jedinstvene mogućnosti za stvaranje antitela koja unakrsno reaguju na više SIRP-α proteina
1
sisara. Na primer, može biti teško generisati anti-SIRP-α antitela koja unakrsno reaguju sa mišjim sekvencom iz mišjeg domaćina zbog imunološke tolerancije. Štaviše, veća divergencija između imunološkog sistema pileta i sisara može dovesti do veće raznolikosti u proizvodnji antitela.
[0265] Da bi se identifikovala antitela sa novim specifičnostima vezivanja za SIRP-α proteine, klonovi antitela su okarakterisani u scFv-Fc formatu kao što je gore opisano. Svaki klon antitela je testiran u koncentracijama između 0,008 i 1,0µg/mL za vezivanje korišćenjem ELISA za sledeće ciljeve: D1 domen humanog SIRP-α v1 (sekvenca prema SEQ ID NO:5), D1 domen humanog SIRP- α v2 (sekvenca prema SEQ ID NO:6), D1 domen varijante makaki SIRP-α (sekvenca prema SEQ ID NO:11), D1 domen miša 129 SIRP-α (sekvenca prema SEQ ID NO: :7), i humana SIRPγ izoforma (sekvenca prema SEQ ID NO:15). Kako se u daljem tekstu koristi, klonovi antitela se nazivaju ID brojem klona. Pored toga, oznaka "S[broj klona]" se odnosi na format sc-Fv-Fc; oznaka "AB[broj klona]" se odnosi na puni format IgG antitela; oznaka "AB[broj klona]a" se odnosi na ljudski IgG1 sa mutacijama L234A, L235A, G237A i N297A; "AB[broj klona]b" se odnosi na format miša IgG1 N297A; "AB[broj klona]c" se odnosi na format mišjeg IgG2a; a „[broj klona] Fab“ se odnosi na format Fab fragmenta.
[0266] Pored toga, vezivanje svakog klona antitela za pre-kompleks pripremljen korišćenjem mešavine 1:1 dve varijante SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NO:42 i SEQ ID NO:18) vezanih za IgSF domen CD47 ( okarakterisana je sekvenca prema SEQ ID NO:16). Povoljno, pošto je afinitet između divljeg tipa SIRP-α D1 domena i IgSF domena CD47 relativno nizak, upotreba kompleksa koji sadrži varijantu SIRP-α visokog afiniteta omogućava identifikaciju antitela koja se vezuju za SIRP-α dok kompleksiran je sa CD47 (npr., antitelo koje ne blokira). Takođe omogućava identifikaciju antitela koja nisu u stanju da vežu SIRP-α dok je u kompleksu sa CD47, što sugeriše da se antitelo i CD47 takmiče za isti interfejs vezivanja na SIRP-α (npr., blokirajuće antitelo). Dve korišćene SIRPα varijante (SEQ ID NO:17 i SEQ ID NO:19) odgovaraju SIRPα D1 domenu visokog afiniteta projektovanom korišćenjem humanog SIRPα polipeptida varijante 1 i varijante 2, respektivno.
[0267] SL. 3A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S130 (SEQ ID NO:71). Ovaj klon je pokazao unakrsnu reaktivnost preko SIRP-α proteina sisara, sa vezivanjem za više ljudskih varijanti, kao i za makaki i mišje proteine (SL. 3B). Međutim, njegovo vezivanje je takođe bilo specifično za izoformu, pošto nije primećeno vezivanje sa humanim SIRPγ. Ovaj klon je takođe identifikovan kao blokator interakcije između SIRP-α i CD47, pošto nije otkriveno vezivanje za prethodno formirani kompleks koji sadrži CD47 vezan za varijantu SIRP-α
1
visokog afiniteta.
[0268] SL. 4A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S121 (SEQ ID NO:75). Ovaj klon je takođe pokazao unakrsnu reaktivnost preko SIRP-α proteina sisara, ali se takođe vezao za humani SIRPγ, što ukazuje na pan-izoformno vezivanje (SL. 4B). Ovaj klon je takođe identifikovan kao blokator interakcije između SIRP-α i CD47.
[0269] SL. 5A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S137 (SEQ ID NO:73). Kao klon prikazan na SL. 3A i 3B, ovaj klon je pokazao unakrsnu reaktivnost preko SIRP-α proteina sisara sa vezivanjem specifičnim za izoforme, pošto se nije vezivao za humani SIRPγ (SL.
5B). Međutim, ovaj klon je identifikovan kao neblokator interakcije između SIRP-α i CD47, pošto se vezuje za prethodno formirani kompleks.
[0270] SL. 6A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S128 (SEQ ID NO:70). Ovaj klon je pokazao unakrsnu reaktivnost specifičnu za izoforme preko proteina SIRP-α primata, ali se nije vezao za mišji protein (SL. 6B). Ovaj klon je takođe identifikovan kao blokator interakcije između SIRP-α i CD47.
[0271] SL. 7A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S135 (SEQ ID NO:72). Slično klonu prikazanom u SL.6A i 6B, ovaj blokirajući klon pokazao je unakrsnu reaktivnost preko SIRP-α proteina primata, ali se nije vezao za mišji protein (SL. 7B). Za razliku od klona S128, otkriveno je da ovaj klon unakrsno reaguje sa ljudskim SIRPγ.
[0272] SL. 8A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S126 (SEQ ID NO:69). Utvrđeno je da je ovaj klon specifičan za ljude, vezujući se za obe ljudske SIRP-α varijante, ali nijedan od drugih peptida (SL. 8B). Ovaj klon je identifikovan kao blokator interakcije između SIRP-α i CD47.
[0273] SL. 9A prikazuje ELISA krivu vezivanja za klon S138 (SEQ ID NO:74). Ovaj klon je vezao samo humanu SIRP-α varijantu 1, pokazujući visok stepen specifičnosti vezivanja unutar i među vrstama (SL. 9B). Ovaj klon je identifikovan kao blokator interakcije između SIRP-α i CD47.
[0274] U zaključku, okarakterisana su nova antitela sa brojnim jedinstvenim specifičnostima vezivanja za SIRP-α proteine. SL. 10A obezbeđuje poravnanje koje prikazuje sekvence varijabilnog domena scFv-Fc dobijene od pileta koja proizvodi pileća antitela (CDR-ovi su naznačeni). SL. 10B obezbeđuje poravnanje koje prikazuje sekvence varijabilnog domena scFv-Fc dobijene od pileta koje proizvodi ljudska antitela (CDR-ovi su naznačeni). Ove studije naglašavaju korist od pilića kao izvora raznolikosti antitela za identifikaciju anti-SIRP-α antitela.
[0275] Da bi se procenilo da li antitela mogu da blokiraju vezivanje SIRPα za CD47, takođe
1
je sproveden SPR skrin, pored skrininga pomoću ELISA. Hvatanje antitela je izvedeno korišćenjem anti-humane IgG-Fc imobilisane GLC površine pripremljene kao što je gore opisano. Varijanta SIRPα (SEQ ID NO: 17) projektovana da veže CD47 (SEQ ID NO: 16) sa visokim nM afinitetom je korišćena za ekran umesto divljeg tipa SIRP-α. To je zato što varijanta SIRP-α divljeg tipa ima nizak afinitet vezivanja uM za CD47, što ne dozvoljava stabilnu interakciju kompleksa za procenu formiranja sendviča. Slani rastvor sa fosfatnim puferom (PBS, pH 7,4) sa dodatkom 0,01% Tween-20 (PBST) kao tekući pufer.
[0276] Prvo, približno 5-10 uL prethodno filtriranog medijuma koji sadrži antitela u 10 mM natrijum acetatnom puferu (pH4,5) je ubrizgano 2 minuta pri 30 ul/min i uhvaćeno preko antihumanog IgG-Fc imobilizovane GLC površine, nakon čega je usledio kratki protok pufera od l min pri 100 uL/min. Zatim, 100 nM SIRP-α varijante visokog afiniteta (SEQ ID NO: 17) prethodno pomešane sa CD47 (SEQ ID NO: 16) u različitim koncentracijama od 0, 20, 55, 500 ili 1500 nM je ubrizgano odvojeno na minut pri 100 uL/min sa vremenom disocijacije od 10 minuta. Za opis u nastavku, SIRP-α se odnosi na SEQ ID NO: 17.
[0277] Za antitelo koje ne blokira vezivanje SIRP-α za CD47, očekivalo bi se da se veže za SIRP-α/CD47 kompleks i formira sendvič. Stoga, sa povećanjem koncentracije CD47, rezonanca se povećava u skladu sa tim zbog povećanog formiranja sendviča. Pronađeno je da klon antitela S123 odgovara ovom profilu. Primer profila za S123 je prikazan u SL.12A.
[0278] Za antitelo koje blokira vezivanje SIRP-α za CD47, profil će biti drugačiji od neblokirajućih antitela. Sa povećanjem koncentracije CD47, očekivalo bi se da će manje molekula SIRP-α biti dostupno da se veže za antitelo jer se antitelo takmiči za isto mesto vezivanja kao CD47 i većina/sve SIRP-α je u kompleksu sa CD47. Stoga bi se očekivalo da se rezonancija (RU) smanjuje sa povećanjem koncentracije CD47 u smeši. Pronađeno je da klon antitela S119 odgovara ovom profilu. Primer profila za S119 je prikazan u SL. 12B.
[0279] Pored blokatora i neblokatora, izolovana je i treća kategorija antitela koja imaju „Kick off“ profil. Pronađeno je da klon antitela S118 odgovara ovom profilu. Primer profila za S118 je prikazan u SL. 12C. Pri višoj koncentraciji CD47 (npr.500 nM i 1500 nM CD47), formiran je prolazni sendvič između antitela, SIRP-α i CD47, na šta ukazuje veća rezonancija od 300RU koja se zatim vremenom raspada. Ovo raspadanje rezonantnih jedinica ukazuje na to da je antitelo bilo u stanju da se veže za SIRP-α u kompleksu i da "izbaci SIRP-α" od vezivanja za CD47.
[0280] koffstope vezivanja svakog klona za svaki SIRP analit su određene korišćenjem SPR (Tabela C). Uslovi SPR skrininga su opisani ovde, a Koff vrednosti su određene korišćenjem Langmuir kinetičkih fitinga. Osobine blokiranja CD47 (blok, neblokiranje, početak) su
1 1
opisane u poslednjoj koloni tabele C. Svako antitelo je identifikovano prema njegovom odgovarajućem SEQ ID NO. Sekvence SIRP analita su sledeće: CV1-3, SEQ ID NO:18; v1, SEQ ID NO:5; v2, SEQ ID NO:6; cino1, SEQ ID NO:11; cino2, SEQ ID NO:12; m129, SEQ ID NO:7; NOD, SEQ ID NO:8; BL6, SEQ ID NO:9; sirpb1, SEQ ID NO:13; sirpg, SEQ ID NO:15.
1 2
�
��
�
[0281] Ovi podaci ukazuju da su identifikovani klonovi antitela sa različitim specifičnostima vezivanja za SIRP-α proteine u različitim vrstama i varijantama unutar vrste. Specifičnosti vezivanja za odabrana antitela su dalje okarakterisane korišćenjem ELISA kao što je gore opisano generisanjem krivih vezivanja u odnosu na humani v1 (SEQ ID NO:5), humani v2 (SEQ ID NO:6), NOD miša (SEQ ID NO:8), i makaki SIRP-α D1 domeni (SEQ ID NO:11), kao i ljudski SIRPγ (SEQ ID NO:15) i prethodno formirani kompleks mešavine 1:1 dve varijante SIRP-α visokog afiniteta (SEQ ID NOs:17 i 19) vezani za IgSF domen CD47 (SEQ ID NO:16).
[0282] Sekvence testiranih scFv-Fc klonova date su u tabeli D.
Tabela D. scFv-Fc sekvence.
1
1
1
1
1
11
12
1
[0283] Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da antitela sa unakrsnim reaktivnim vezivanjem između humanih, makaki i/ili mišjih proteina mogu omogućiti karakterizaciju antitela i na životinjskim modelima i u kliničkom testiranju. Antitela sa vezanjem specifičnim za izoformu i/ili varijantu mogu biti korisna za personalizovane medicinske pristupe specifičnim ljudskim populacijama i/ili studije o specifičnim varijantama od interesa. Pored profilisanja specifičnosti vezivanja unutar i među vrstama, metode opisane ovde takođe omogućavaju identifikaciju antitela koja blokiraju ili ne blokiraju vezivanje između SIRP-α i CD47, kao i antitela koja „pokreću SIRPα-off“ od vezivanja do CD47.
Primer 2: Identifikacija dodatnih antitela sa novim specifičnostima vezivanja za SIRP-α proteine
Metode
Utvrđivanje KD
[0284] Interakcije anti-SIRPα antitela sa SIPRα različitih vrsta (human v1, human v2, makaki, miš 129, BL6, BALBc, NOD), SIRPβ i SIRPγ analizirane su korišćenjem dve metode, direktnom imobilizacijom antitela (preko GLC čipa) ili hvatanjem putem biotinilovanog proteina A (preko NLC čipa), u skladu sa sledećim protokolima. Svi eksperimenti su izvedeni na 25°C korišćenjem biosenzora ProteOn XPR36 zasnovanog na SPR-u (BioRad, Inc, Hercules, CA) opremljenog GLC ili NLC senzorskim čipovima. Antitela su eksprimirana korišćenjem FreeStyle<™>293-FS ćelije (Thermo Fisher) kao što je opisano u Primeru 1. Prečišćavanje je izvedeno standardnom Protein A afinitetnom kolonskom hromatografijom i
1 4
eluirana antitela su čuvana u PBS puferu.
[0285] Pufer za rad je bio PBS pH 7,4 sa 0,01% Tween-20 (PBST+). Svi analiti su korišćeni u njihovim nominalnim koncentracijama koje su određene pomoću A280 apsorpcije i korišćenjem njihovog molarnog izračunatog koeficijenta ekstinkcije. Analiti su ubrizgani u kinetičkom režimu "one-shot" kao što je opisano na drugom mestu (vidi, npr. Brawman, T. et al. (2006) Anal. Biochem. 358:281-288).
[0286] Za metod koji koristi GLC čip, analiti su ubrizgani i proticali preko anti-SIRPα antitela imobilizovanih (~ 1000 RU) na GLC čipovima korišćenjem Proteon Amine Coupling Kit. Za korak imobilizacije, GLC čip je aktiviran sa EDAC/Sulpho-NHS 1:1 (Biorad) razblaženim 1/100 tokom 300 s pri 25 µL/min. Anti-SIRPα antitela su razblažena do koncentracije od 80 nM u 10 mM natrijum acetatnog pufera pH 4,5 i imobilizovana na čip pri 30 µL/min tokom 50 sekundi. Čip je inaktiviran etanolaminom tokom 300 sekundi pri 25 µL/min. Analiti (npr. SIRP-α iz različitih vrsta, SIRP-β, SIRP-γ) su ubrizgani u kinetičkom režimu "one-shot" pri nominalnim koncentracijama od 100, 33, 11, 3,7, 1,2 i 0 nM. Vremena asocijacije su praćena 90s pri 100µL/min, a vremena disocijacije su praćena 1200s. Površine su regenerisane sa 2:1 zapr/zapr mešavinom Pierce IgG pufera za eluiranje/4M NaCl.
[0287] Alternativno, KDodređivanje je izvedeno korišćenjem hvatanja antitela preko NLC čipa. U ovom slučaju, 15 ug/mL biotinilovanog proteina A (Thermofisher) je ubrizgan pri 30 uL/min tokom 120 s preko NLC čipa da bi se dobio odgovor na imobilizaciju od ~1000-1200RUs. Zatim su ubrizgana anti-SIRPα antitela (~ 160 nM) tokom 80 sekundi pri 30 uL/min. Analiti (SIRPα iz različitih vrsta, SIRP-β i SIPR-γ) su naknadno ubrizgani kinetičkim režimom “one-shot” pri nominalnim koncentracijama od 100, 33, 11, 3.7, 1.2 i 0 nM. Vremena asocijacije su praćena 60 s pri 25 µL/min, a vremena disocijacije su praćena 120 s. Površine su regenerisane sa 2:1 zapr/zapr mešavinom Pierce IgG elucionog pufera/4M NaCl.
[0288] Podaci o biosenzoru su dvostruko referencirani oduzimanjem tačaka između podataka (koji ne sadrže imobilizovani protein) od podataka tačke reakcije (imobilizovani protein) i zatim oduzimanjem odgovora injekcije analita „praznog“ pufera od injekcije analita. Podaci sa dvostrukom referencom su globalno prilagođeni jednostavnom Langmuirovom modelu i KDvrednost je izračunata iz odnosa konstanti prividne kinetičke brzine (KD= kd/ka).
Rezultati
[0289] Tri reprezentativna antitela (blokirajuće, ne-blokirajuće i "kick-off" antitelo) su dalje okarakterisana za vezivanje za različite SIRP-α, -β, -γ proteine kao što je gore opisano. Tri
1
antitela sadrže ljudske sekvence i izvedena su iz HuMab eksperimenata imunizacije pilića. Ova antitela su testirana kao ljudska IgG1 antitela pune dužine sa mutacijama L234A, L235A, G237A i N297A. SIRP-α proteini ispitani u ovim eksperimentima odgovaraju humanom SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), humanom SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11), humanom SIRPβ izoforma 1 (SEQ ID NO:13), humana SIRPβ izoforma 2 (SEQ ID NO:14) i humana SIRPγ izoforma 1 (SEQ ID NO:15). Humana SIRPβ izoforma 1 (SEQ ID NO:13) je takođe poznata u tehnici kao SIRPβ1 izoforma 1.
[0290] KDvrednosti dobijene za tri antitela su prikazane u tabeli E ispod.
Tabela E. Rezime KDvrednosti (M)
[0291] Zatim je određena kinetika vezivanja različitih klonova antitela za odabrane mišje SIRP-α proteine kao što je prethodno opisano. Mišji proteini koji su testirani uključuju BALBc (SEQ ID NO: 10), BL6 (SEQ ID NO: 9), NOD (SEQ ID NO: 8) i m129 (SEQ ID NO: 7) SIRP-α proteine. Rezultati su sažeti u tabelama F-I u nastavku. Klonovi antitela označeni kao "c" su testirani kao mišja IgG2a antitela pune dužine; klonovi antitela označeni kao "a" su testirani kao ljudska IgG1 antitela pune dužine sa mutacijama L234A, L235A, G237A i N297A.
Tabela F. Rezime kinetike vezivanja odabranih antitela za BALBc mišji SIRP-α protein (SEQ ID N
O:10)
1
Tabela G. Rezime kinetike za vezivanje odabranih antitela za BL6 mišji SIRP-α protein (SEQ ID NO:9)
Tabela H. Rezime kinetike za vezivanje odabranih antitela za NOD mišji SIRP-α protein (SEQ ID NO: 8)
Tabela I. Rezime kinetike vezivanja odabranih antitela za m129 mišji SIRP-α protein (SEQ
1
ID NO: 7)
[0292] Za gornja antitela, sekvence VH i VL domena (respektivno) bile su sledeće: AB136a: SEQ ID NO: 133 i 134; AB3c: SEQ ID NO: 242 i 243; AB21c: SEQ ID NO: 135 i 136; AB25c: SEQ ID NO: 137 i 138; AB27c: SEQ ID NO: 139 i 140; AB66c: SEQ ID NO: 141 i 142.
[0293] Ovi rezultati pokazuju da se višestruki klonovi antitela vezuju za sva četiri mišja SIRP-α proteina, čineći ova antitela pogodnim za karakterizaciju u in vivo modelima miševa.
Primer 3: Funkcionalna svojstva anti-SIRP-α antitela
[0294] Prethodni primeri opisuju identifikaciju i karakterizaciju anti-SIRP-α antitela sa raznovrsnim nizom svojstava, kao što je specifičnost vezivanja za različite humane, makaki i/ili mišje SIRP-α, SIRP-β i SIRP-γ proteine, i da li antitela blokiraju vezivanje između SIRP-α i CD47. Antitela koja predstavljaju posebne kategorije od interesa su zatim ispitivana u nizu in vitro i in vivo funkcionalnih testova koji imaju za cilj da karakterišu njihove efekte na biološke funkcije SIRP-α. Konkretno, "blokiranje" (tj. antitela koja blokiraju vezivanje između SIRP-α i CD47) i „neblokiranje“ (tj. antitela koja ne blokiraju vezivanje između SIRP-α i CD47) okarakterisana su za aktivnosti u različitim in vitro i in vivo testovima.
[0295] Kao što je gore navedeno, klonovi antitela označeni kao "a" su testirani kao ljudska IgG1 antitela pune dužine sa mutacijama L234A, L235A, G237A i N297A. Klonovi antitela označeni kao "b" su testirani kao mišja IgG1 antitela pune dužine sa mutacijom N297A. Klonovi antitela označeni kao "c" su testirani kao mišja IgG2a antitela pune dužine.
1
Metode
Kultivacija tumorskih ćelija
[0296] Ćelije DLD-1 (humani kolorektalni adenokarcinom) i OE19 (karcinom jednjaka) održavane su u medijumu za rast koji se sastoji od RPMI (Gibco) dopunjenog sa 10 procenata toplotno inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (Gibco), jedan procenat penicilina/streptomicina (Gibco), i jedan procenat Glutamax (Gibco).
Derivacija i kultura makrofaga dobijenih iz ljudskih monocita
[0297] Ostaci Trima su dobijeni iz krvnih centara Pacifika i razblaženi 1:4 sa fiziološkim rastvorom puferovanim fosfatom (PBS, Gibco). Razblažena krv je podeljena u četiri epruvete i podložena sa 20 ml Ficoll-Paque Plus (GE Healthcare). Epruvete su centrifugirane 30 minuta na 400 x g. PBMC su sakupljeni sa interfejsa i resuspendovani u FACS puferu (PBS sa 0,5 procenata goveđeg serumskog albumina (Gibco)). CD14<+>monociti su prečišćeni negativnom selekcijom koristeći Monocite Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) i LS kolone (Miltenyi Biotec) prema protokolu proizvođača.
[0298] Za nepolarizovane makrofage, CD14<+>monociti su zasejani u ploče za kulturu tkiva od 15 cm (Corning) sa 10 miliona ćelija po posudi u 25 ml IMDM (Gibco) sa dodatkom 10 procenata humanog AB seruma (Corning), jedan procenat penicilina/streptomicina i jedan procenat Glutamax. Ćelije su kultivisane sedam do deset dana.
[0299] Za M2 polarizovane makrofage, CD14<+>monociti su zasejani u ploče za kulturu tkiva od 15 cm (Corning) sa 6 miliona ćelija po posudi u 25 ml RPMI (Gibco) sa dodatkom 10 fetalnog goveđeg seruma (Thermo Fisher), jedan procenat penicilina/streptomicina i jedan procenat glutGlutamax i 50 ng/ ml M-CSF (Miltenyi). Ćelije su kultivisane sedam do deset dana.
In vitro testovi fagocitoze
[0300] DLD-1 i OE19 ćelije su odvojene od ploča za kulturu ispiranjem dva puta sa 20 ml PBS i inkubacijom u 10 ml TripLE Select (Gibco) tokom 10 minuta na 37°C. Ćelije su centrifugirane, isprane u PBS i resuspendovane u medijumu. Ćelije su obeležene Celltrace CFSE kompletom za proliferaciju ćelija (Thermo Fisher) prema uputstvima proizvođača i resuspendovane u IMDM. Makrofagi su odvojeni od ploča za kulturu ispiranjem dva puta sa
1
20 ml PBS i inkubacijom u 10 ml TripLE Select tokom 20 minuta na 37°C. Ćelije su uklonjene strugačem za ćelije (Corning), isprane u PBS i resuspendovane u IMDM.
[0301] Testovi fagocitoze su sastavljeni u pločama sa 96 bunarčića sa ultra niskim pričvršćivanjem U-dna (Corning) koje sadrže 100.000 DLD-1 ili OE19 ćelija, 50.000 makrofaga, petostruka serijska razblaženja anti-SIRP-α antitela od 100 nM do 6,4 pM. cetuksimab (apsolutno antitelo) na 1 ili 0,01 ug/ml, trastuzumab na 0,01 ug/ml, ili kontrolno antitelo istog izotipa (Southern Biotech). Sva testirana anti-SIRP-α antitela imala su ljudski IgG1 sa L234A, L235A, G237A i N297A mutacijama osim AB136c, koji je imao mišji IgG2a. Ploče su inkubirane dva sata na 37°C u vlažnom inkubatoru sa 5 procenata ugljendioksida. Ćelije su peletirane centrifugiranjem pet minuta na 400 x g i isprane u 250 ul FACS pufera. Makrofagi su obojeni na ledu 15 minuta u 50 µl FACS pufera koji sadrži 10 µl humanog reagensa za blokiranje FcR (Miltenii Biotec), 0,5 µl anti-CD33 BV421 (Biolegend) i 0,5 µl anti-CD206 APC-Cy7 (Biolegend). Ćelije su isprane u 200 µl FACS pufera, isprane u 250 µl PBS-a i obojene na ledu 30 minuta u 50 µl Fikable Viability Die eFluor 506 (ebioscience) razblaženog 1:1000 u PBS-u. Ćelije su dva puta isprane u 250 µl FACS pufera i fiksirane 30 minuta na ledu u 75 µl Cytofix (BD Biosciences). Ćelije su isprane u 175 µl FACS pufera i resuspendovane u 75 µl FACS pufera. Ćelije su analizirane na FACS Canto II (BD Biosciences), uz naknadnu analizu podataka pomoću Flowjo 10.7 (Treestar). Mrtve ćelije su isključene gejtovanjem na e506-negativnoj populaciji. Makrofagi koji su fagocitovali tumorske ćelije identifikovani su kao ćelije pozitivne na CD33, CD206 i CFSE.
Aktivacija dendritskih ćelija in vivo
[0302] Balb/c miševima (n=3/grupi) je intravenoski ubrizgano kontrolno anti-mišje anti-SIRP-α antagonističko antitelo pacova (klon p84), kontrola IgG pacova, AB136b (AB136 sa mišjim IgG1 Fc regionom koji nosi mutaciju N297A), kontrola miša IgG ili vehikulum (PBS) na 10 mg/kg. Pet sati nakon injekcije, slezine su sakupljene i obrađene u jednoćelijsku suspenziju mehaničkom disocijacijom kroz 70 µM ćelijsku cediljku. Ćelije su isprane dva puta sa PBS i izvršena je liza crvenih krvnih zrnaca. Nakon toga, ćelije su isprane još dva puta sa PBS/10% FBS i pripremljene za bojenje ćelija. Ćelije su obojene fluorohromom konjugovanim MHC-II, CD8, 33D1, CD4, CD11c, CD86, CCR7 i bojom za održivost na 4 stepena tokom jednog sata. Ćelije su isprane dva puta i analizirane korišćenjem BD Canto II protočnog citometra, a podaci su obrađeni korišćenjem Flowjo.
2
In vivo antitumorska aktivnost
[0303] Za model CT26 singenog mišjeg karcinoma debelog creva, CT26 ćelije su implantirane potkožno u BALB/c miševe i randomizirane u grupe (8-9 miševa/grupi). Grupe za tretman su uključivale vehikulum (PBS) i AB136b. AB136 anti-SIRP-α je imao mišji IgG1 Fc region koji nosi mutaciju N297A. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 75-80 mm<3>7 ili 8 dan nakon implantacije. Miševima je dozirano intraperitonealno (IP) 3 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje sa AB136b. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
[0304] Za model MC38 singenog mišjeg karcinoma debelog creva, MC38 ćelije su implantirane potkožno u C57BL/6 miševe i randomizirane u grupe (8-10 miševa/grupi). Grupe za tretman su uključivale vehikulum (PBS), AB25b, AB25c, AB27b, AB3b i AB136b. Sva anti-SIRPα antitela su imala mišji IgG1 Fc region koji nosi mutaciju N297A osim AB25c, koji je imao mišji IgG2a. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 60-65 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševima je davana intraperitonealna (IP) doza od 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje za anti-SIRPα. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
Rezultati
[0305] Ispitivana su različita anti-SIRP-α antitela na indukciju fagocitoze u in vitro testovima fagocitoze korišćenjem polarizovanih i nepolarizovanih makrofaga.
[0306] Dodatna anti-SIRP-α antitela AB3 i AB45 su testirana u eksperimentima opisanim u nastavku. Oba su antitela koja ne blokiraju. The koffstope vezivanja svakog klona (u scFv-Fc formatu) za svaki SIRP analit su određene korišćenjem SPR (Tabela J1). Uslovi SPR skrininga su opisani ovde, a Koff vrednosti su određene korišćenjem Langmuir kinetičkih fitinga. Sekvence SIRP analita su sledeće: CV1-3, SEQ ID NO:18; v1, SEQ ID NO:5; v2, SEQ ID NO:6; cino1, SEQ ID NO:11; cino2, SEQ ID NO:12; m129, SEQ ID NO:7; NOD, SEQ ID NO:8; BL6, SEQ ID NO:9; sirpb1, SEQ ID NO:13; sirpg, SEQ ID NO:15.
2 1
Tabela J1. Langmuir kinetički fiting KD(M) za AB3 i AB45
[0307] Kao što je prikazano u SL. 13A i 13B, utvrđeno je da neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo AB3a indukuje fagocitozu DLD-1 tumorskih ćelija u M2 polarizovanim makrofagima. Konkretno, tretman makrofaga cetuksimabom (anti-EGFR antitelom) i AB3a doveo je do snažne indukcije fagocitoze tumorskih ćelija. Slično, otkriveno je da neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo AB45a indukuje fagocitozu DLD-1 tumorskih ćelija M2 polarizovanih makrofaga, a tretman makrofaga cetuksimabom (anti-EGFR antitelo) i AB45a dovodi do snažne indukcije fagocitoze tumorskih ćelija SL. 13C & 13D). Otkriveno je da blokirajuća anti-SIRP-α antitela AB119a (SL. 13E) i AB135a (SL. 13F) takođe indukuju fagocitozu OE19 tumorskih ćelija kada se istovremeno primenjuju sa trastuzumabom (anti-HER2 antitelo). Takođe je otkriveno da neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo AB136c indukuje fagocitozu DLD-1 tumorskih ćelija (SL.13G).
[0308] Test aktivacije dendritskih ćelija je korišćen za karakterizaciju in vivo efekata neblokirajućih anti-SIRP-α antitela AB136b (SEQ ID NO: 133 i 134 za sekvence VH i VL domena, respektivno). Neuspeh da se angažuje mišji SIRP-α receptor na dendritskim ćelijama slezine preko CD47 vezivanja dovodi do aktivacije dendritskih ćelija slezine. Kontrolno anti-SIRP-α antagonističko antitelo p84 aktivira dendritske ćelije slezine kada se intravenozno ubrizgava miševima (SL. 14). Testirano je neblokirajuće anti-SIRP-α antitelo AB136b in vivo da se utvrdi da li to dovodi do aktivacije dendritskih ćelija. Zanimljivo je da je tretman AB136b doveo do aktivacije dendritskih ćelija slezine na sličnom nivou kao p84 (SL.14).
[0309] Sledeće, the in vivo antitumorski efekti različitih anti-SIRP-α antitela su analizirani na
2 2
dva modela karcinoma debelog creva kod miševa. Antitumorske aktivnosti blokirajućih anti-SIRP-α antitela AB25b, AB25c i AB27b i neblokirajućih anti-SIRP-α antitela AB3b i AB136b ispitane su u MC38 modelu singenog karcinoma debelog creva miša da bi se procenile njihove aktivnosti pojedinačnog agensa. I blokirajuća (AB25b, AB25c i AB27b) i neblokirajuća (AB3b i AB136b) anti-SIRP-α antitela su odložila formiranje tumora pri dozi od 10 mg/kg u poređenju sa samim nosačem (SL. 15) u MC38 modelu singenog miša. 25. dana, grupe tretirane anti-SIRPα antitelima imale su tri miša ispod 600 mm<3>za AB25b i AB27b, četiri miša ispod 600 mm<3>za AB25c i AB3b i pet miševa ispod 600 mm<3>za AB136b, dok je grupa tretirana vehikulumom imala samo dva miša ispod 600 mm<3>.
[0310] Antitumorska aktivnost neblokirajućeg AB136b je zatim procenjena na CT26 singenom modelu karcinoma debelog creva miša da bi se procenila aktivnost jednog agensa. Ovi rezultati su potvrdili da tretman AB136b odlaže formiranje tumora pri 3 mg/kg u poređenju sa samim nosačem u modelu CT26 singenog miša (SL. 16).
[0311] Uzeti zajedno, ovi rezultati pokazuju efikasnost tretmana anti-SIRP-α antitelom u izazivanju fagocitoze tumorskih ćelija makrofagama, aktiviranju dendritskih ćelija i inhibiranju rasta tumora. in vivo. Utvrđeno je da višestruka blokirajuća anti-SIRP-α antitela promovišu fagocitozu tumorskih ćelija, aktiviraju dendritske ćelije i blokiraju in vivo rast tumora. Iznenađujuće, međutim, otkriveno je da tretman neblokirajućim anti-SIRP-α antitelom aktivira dendritske ćelije slezine i inhibira rast tumora in vivo u dva različita modela singenog tumora miševa. Otkriće da su neblokirajuća anti-SIRP-α antitela bila u stanju da povećaju fagocitozu i blokiraju in vivo rast tumora bio je i iznenađujući i neočekivan. Prethodni rad je sugerisao da bi samo blokirajuća anti-SIRP-α antitela mogla da inhibiraju in vivo rast tumora (vidi Yanagita, T. et al. (2017) JCI Insight 2: e89140).
Primer 4: Strukturna analiza epitopa anti-SIRP-α antitela na SIRP-α
[0312] Kao što je opisano u Primerima 1-3 prethodno, anti-SIRP-α antitela su stvorena sa različitim specifičnostima i načinima vezivanja za SIRP-α, npr., antitela koja blokiraju vezivanje CD47 za SIRP-α, antitela koja ne blokiraju vezivanje CD47 za SIRP-α i antitela koja se vezuju za SIRP-α i smanjuju njegov afinitet za vezivanje CD47 („Kick off” antitela). Strukturne analize su preduzete da bi se razumelo kako se ovi tipovi antitela vezuju za D1 domen SIRP-α u poređenju sa CD47 i karakterišu epitope odabranih anti-SIRP-α antitela.
2
Metode
Kristalografija i strukturna analiza
[0313] Ekspresija Fabs i SIRPα bila je slična prethodno uspostavljenim protokolima i uključivala je tradicionalne metode afinitetne hromatografije i isključivanja veličine za prečišćavanje proteina. Humani SIRP-α v1 mutant koji nosi mutaciju N80A u poređenju sa SEQ ID NO:5 korišćen je za lakšu proizvodnju proteina u Expi293 (SEQ ID NO:296). Cilj korišćenja N80A SIRPα bio je da se proizvede homogeni, ne-glikozilovani oblik SIRPα koji bi bio najpogodniji za kristalizaciju. Konačni pufer za prečišćavanje je minimalan sa samo 10 mM Tris pH 7,5 i 50 mM NaCl. Prečišćeni kompleksni uzorak je stabilan na 4°C i koncentrovan je na 10-12 mg/mL u pripremi za eksperimente kristalizacije i konačno određivanje strukture.
[0314] Metode za kompleksni projekat Fab:SIRPα sledile su dobro utvrđene principe ili kristalografiju počevši od tehnike retke matrice, što je dovelo do prilagođenih optimizovanih uslova, uspostavljajući rutinski protokol. Kristalizacija je izvedena primenom tehnike difuzije pare u sedećem obliku. Za početni skrining retke matrice, kompleti za stanje komercijalno dostupni preko Qiagena® su korišćeni (Tabela J2). Ovi eksperimenti kristalizacije su postavljeni u kapima sa različitim odnosima proteina i kristalnog stanja. Postavljeni odnosi su bili u opsegu od 1:1, 2:1 i 3:1 proteina za kondicioniranje u ukupnoj zapremini od 1 µL u podbunarčićima posude sa 96 bunarčića (8 × 12).100 uL uslova za kristalizaciju je stavljeno u rezervoar bunarčića. Ove kapi su postavljene korišćenjem robota Mosquito za postavljanje kapi, a završene ploče su zapečaćene i uskladištene u inkubatoru na 12°C. Eksperiment je praćen posmatranjem ploča/kapi pod mikroskopom da bi se videla dešavanja koja su uključivala precipitaciju kapi, agregaciju, razdvajanje faza, amorfno formiranje, kao i početne kristale proteina.
Tabela J2. Kompleti koji se koriste za početni skrining retke matrice.
2 4
Rezime kristalizacije i sakupljanje kristala
[0315] Kristalizacija 4 kompleksa je postignuta sa derivatima dva glavna uslova kao što je prikazano u Tabeli J3). Sakupljanje kristala je obavljeno na optimalnim kristalnim oblicima kako manipulacija i krio-zamrzavanje u tečnom azotu ne bi ugrozilo integritet kristala pre rendgenske difrakcije i mogućeg prikupljanja podataka. Da bi se sprečilo zaleđivanje, tokom zamrzavanja je uveden krio-protektor. Tipični krio-protektor uključivao je dodavanje 20% glicerola u uslove kristalizacije koji su formirali kristal. Kada se kristali formiraju u uslovima sa 30% PEG 4000 ili više, dodavanje glicerola nije bilo potrebno. Visok procenat PEG 4000 ponašao se kao održiv krio-protektor. Kristali kompleksa su manipulisani krio petljama koje su ili najlonske ili Mitigen® stila. Pojedinačni kristali su izolovani i izrezani iz kapi u kojoj su se formirali i prebačeni u krio-protektor na kratak period pre nego što su potopljeni u tečni azot da bi se brzo zamrznuli.
Tabela J3. Uslovi kristalizacije za formiranje kompleksnih kristala Fab:SIRP-α.
2
Prikupljanje i obrada podataka
[0316] Podaci su prikupljeni na kristalima brzo zamrznutim u tečnom azotu kao što je gore opisano. Ovi uzorci su ostali u krio struji kada su pregledani na difrakciju proteinske rešetke pre naknadnog prikupljanja skupova podataka metodom oscilovanja. Prikupljanje je obavljeno na naprednom izvoru fotona ili dijamantskom izvoru svetlosti. Skupovi podataka su smanjeni korišćenjem xia2 paketa. xia2 je skripta koja omogućava automatizovano smanjenje makromolekularnih kristalografskih podataka. Program je u stanju da koristi više programa za smanjenje podataka kao što su XDS, DIALS, Mosflm i Aimless. Ovi programi omogućavaju da se podaci o difrakciji indeksiraju u odgovarajuću prostornu grupu i jediničnu ćeliju, integraciju intenziteta i skaliranje da bi se proizvela procena intenziteta svake jedinstvene refleksije. Za početni skup podataka Kompleksa 1, faze su izračunate putem molekularne zamene (MR) koristeći Phaser MR iz CCP4 Suite koristeći homolog modele SIRPα kao i Fab (vidi PDB KOD: 2UV3 i PDB KOD: 4NM4 respektivno). Za naredne skupove podataka Kompleksa 2, 3 i 4, koordinate modela završene strukture Kompleksa 1 korišćene su kao model pretraživanja za fazni proračun i početnu izgradnju modela.
Izgradnja i usavršavanje strukture
[0317] Izgradnja modela je koristila Coot program. Kao primer, izračunato je da kompleks 1 ima 4 molekula u ASU, stoga je potrebno izgraditi 4 para AB119f kompleksa sa SIRPα da bi se kompletirao model strukture. Strategija izgradnje strukture bila je da se aminokiselinski ostaci ugrade u elektronsku gustinu prateći poznatu sekvencu ciljnih proteina. Kvalitet podataka direktno korelira sa uklapanjem modela strukture u posmatrani skup podataka kristala. Stoga je izgradnja tercijarne strukture Kompleksa išla po utvrđenom protokolu. U početku je izgrađena peptidna kost ostatka. Nakon toga je usledilo postavljanje ispravnog bočnog lanca ostatka ako to dozvoljava mapa elektronske gustine. U slučaju da originalna aminokiselina u sekvenci proteina nije modelovana, to je bilo zbog nedostatka gustine za odgovarajući bočni lanac, tako da se može modelovati samo peptidna kičma aminokiseline i
2
bočni lanac alanina je izgrađen na mestu . Delovi sekvence mogu biti poremećeni regioni i ne mogu se izgraditi zbog nedostatka gustine čak ni za postavljanje aminokiselinske kičme. Izgradnje su pratile naredne runde usavršavanja kroz Refmac program, deo CCP4 Suite. Program za preciziranje se koristi za minimiziranje koordinatnih parametara kroz rezidual maksimalne verovatnoće. Prečišćavanje je završeno kada su parametri modela unutar povoljne statističke tolerancije za parametre uključujući: vrednost R, dužinu veze i uglove i Ramachandrana fitovanje. Pored toga, za proveru fizičkih tolerancija modela, Molprobity je takođe korišćen da bi se obezbedilo potpuno i pravilno određivanje strukture.
Mapiranje epitopa i analiza superimpozicije
[0318] Podpovršina antigena za epitop je izračunata kao razlika između površine pristupačne rastvaraču samog antigena i antigena u kompleksu sa Fab fragmentom antitela. Nasuprot tome, podpovršina teškog i lakog lanaca antitela za paratop je izračunata kao razlika između površine dostupne rastvaraču samog fab fragmenta i u kompleksu sa njegovim antigenom. Površina pristupačne površine izračunata je metodom kotrljajuće kugle sa radijusom sonde od 1,4Å. Podpovršina je prijavljena u Å<2>.Svi kompleksi antitela: SIRPα su superponirani odabirom SIRPα iz svake strukture i superponiranjem njegovih atoma ugljenika. CD47: struktura SIRPα kompleksa (V1 varijanta) korišćena za analizu je PDB:4CMM. Superponiranje i izračunavanje RMSD izvršeno je korišćenjem PYMOL.
Rezultati
[0319] Prvo je određena struktura blokirajućeg antitela 119 Fab vezanog za SIRP-α i upoređena sa vezivanjem CD47 za SIRP-α. Kao što je prikazano u SL. 17A, antitelo 119 i CD47 vezano za sličan epitop SIRP-α D1 domena. 56% SIRP-α ostataka u epitopu antitela 119 takođe je pronađeno u epitopu CD47, dok je 75% SIRP-α ostataka u epitopu CD47 takođe pronađeno u epitopu antitela 119. Ostaci SIRP-α koji učestvuju u interakciji sa antitelom 119 (kako je utvrđeno promenama podpovršine, opisano supra) su osenčeni i prikazani kao modeli ispunjeni prostorom u SL. 17B. Takođe su prikazani ključni ostaci paratopa antitela 119 Fab (crni štapići), uključujući ostatke teškog lanca N31, S53, D55, Y57, T99, S101 i W102 (N31 nije vidljiv u orijentaciji strukture prikazanoj na SLIKA 17B) i ostaci lakog lanca Y92 i W94 (na osnovu sekvenci varijabilnog domena teškog i lakog lanca prema SEQ ID NOs: 335 i 97, respektivno).
2
[0320] SL. 18A pokazuje poređenje između vezivanja CD47 za SIRP-α D1 domen i neblokirajućeg antitela 136 Fab vezivanja za SIRP-α D1 domen. Utvrđeno je da se epitopi antitela 136 i CD47 koji se vezuju za SIRP-α potpuno ne preklapaju. SIRP-α ostaci koji učestvuju u interakciji sa antitelom 136 su osenčeni i prikazani kao modeli ispunjeni prostorom u SL. 18B. Takođe su prikazani ključni ostaci paratopa antitela 136 Fab (crni štapići), uključujući ostatke teškog lanca E56, Y59 i R102 i ostatke lakog lanca Y92 i R94 (zasnovano na sekvencama varijabilnog domena teškog i lakog lanca prema SEQ ID NOs: 133 i 134, respektivno).
[0321] SL. 19A pokazuje poređenje između vezivanja CD47 za SIRP-α D1 domen i neblokirajućeg antitela 3 Fab vezivanja za SIRP-α D1 domen. Takođe je utvrđeno da se epitopi antitela 3 i CD47 koji se vezuju za SIRP-α potpuno ne preklapaju. SIRP-α ostaci koji učestvuju u interakciji sa antitelom 3 su osenčeni i prikazani kao modeli ispunjeni prostorom u SL. 19B. Takođe su prikazani ključni ostaci paratopa antitela 3 Fab (crni štapići), uključujući ostatke teškog lanca R56 i G100 i ostatke lakog lanca R24, R26, Y86 i G88 (zasnovano na sekvencama varijabilnog domena teškog i lakog lanca prema SEK ID NOs: 242 i 243, respektivno).
[0322] SL. 19C pokazuje poređenje između vezivanja CD47 za SIRP-α D1 domen i “Kick off” antitela 115 Fab vezivanja za SIRP-α D1 domen. Utvrđeno je da je epitop koji se vezuje za SIRP-α antitela 115 susedan epitopu CD47. Dok je otkriveno da mAb 115 vezuje epitop SIRP-α D1 domena u blizini onog kod CD47, delovi epitopa 115 se verovatno preklapaju sa samim CD47. Upoređujući oba epitopa, postoje 2 identična ostatka, što sugeriše da interakcije ne- -preklapajući delovi svakog epitopa omogućavaju 115 Fab i CD47 da vežu SIRP-α istovremeno Kinetičke analize opisane ovde pokazuju da antitelo 115 formira prolazni kompleks sa SIRP-α i CD47, ali smanjuje afinitet CD47 za SIRP-α D1 domen SIRP-α ostaci koji učestvuju u interakciji sa antitelom 115 su osenčeni u SL. 19D. Takođe su prikazani ključni ostaci paratopa antitela 115 Fab, uključujući ostatke teškog lanca S31, Y32, N52, Y100 i W102 i ostatke lakog lanca K32 i Y92 (na osnovu sekvenci varijabilnog domena teškog i lakog lanca prema SEQ ID NOs: 273 i 274).
[0323] SL. 20A ilustruje vezivanje antitela 119, 136, 3 i 115 za SIRP-α, u poređenju sa CD47 vezivanjem za SIRP-α. Utvrđeno je da blokirajuće antitelo 119 vezuje SIRP-α epitop koji se potpuno ne preklapa, u poređenju sa SIRP-α epitopima oba neblokirajuća antitela 136 i 3. SIRP-α i ostaci antitela koji učestvuju u ovim interakcijama sumirani su u tabeli. K1. SIRP-α ostaci za koje je utvrđeno da interaguju sa CD47 određeni su na sledeći način: 29, 30, 31, 33, 34, 35, 36, 37, 50, 51, 52, 53, 54, 66, 67, 68, 69, 74, 93, 96, 97, 98, 99 i 101 (prema SEQ ID
2
NO:5). SL. 20B sumira epitope za CD47 i anti-SIRP-α Fabs 119, 136, 3 i 115 koji se vezuju za SIRP-α (ostaci prema SEQ ID NO: 296) i navodi promene zakopane površine. Kao što je ovde opisano, numerisanje aminokiselinskih ostataka antitela koji se koristi za označavanje paratopa zasniva se na numerisanju prema sekvenci aminokiselina teškog ili lakog lanca, a ne, npr., Kabat ili Chothia numerisanje ostataka antitela.
2
21 Tabela K2. Paratopi anti-SIRP-α antitela i proračuni podpovršine.
21
[0324] Ovi rezultati razjašnjavaju interfejse vezivanja između SIRP-α D1 domena i različitih anti-SIRP-α antitela, kao i vezu vezivanja između CD47 i SIRP-α. Oni takođe pružaju strukturnu osnovu za zapažanja da antitelo 119 blokira vezivanje između CD47 i SIRP-α (pošto dele preklapajuće SIRP-α epitope), da antitela 136 i 3 ne blokiraju vezivanje (pošto se njihovi epitopi ne preklapaju sa epitopima CD47), i to antitelo 115 "isključuje CD47" od vezivanja SIRP-α (pošto dele samo malo preklapajuće SIRP-α epitope). Ove studije dalje naglašavaju specifična antitela i ostatke SIRP-α koji učestvuju u svakoj interakciji.
[0325] Sa epitopima koji se vezuju za SIRPα neblokatora (3, 136), blokatora (119) i „kickoff“ (115) antitela definisanih kristalografijom, lokacije vezivanja za dodatna anti-SIRPα antitela mogu se okarakterisati sprovođenjem vezivanja epitopa opisanog u Primer 5. Na primer, za bilo koja anti-SIRPα antitela koja se takmiče sa neblokatorom 136 za vezivanje za SIRPα, možemo predvideti da će ova antitela deliti slične vezujuće epitope kao 136 kako je definisano kristalografijom.
Primer 5: Bining epitopa anti-SIRP-α antitela
[0326] Anti-SIRP-α antitela opisana prethodno su zatim analizirana u eksperimentima vezivanja epitopa sa SIRP-α da bi se kategorisala antitela koja imaju zajedničke i različite epitope.
21
Metode
Bining epitopa
[0327] Ukratko, spajanje epitopa je sprovedeno kao što je prikazano u SL. 21A. Prvo anti-SIRP-α antitelo je imobilizovano na čipu, a zatim je ubrizgan humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5). Zatim je ubrizgano drugo anti-SIRP-α antitelo. Ako je drugo antitelo bilo u stanju da veže kompleks formiran između prvog anti-SIRP-α antitela i SIRP-α, utvrđeno je da prvo i drugo antitelo vezuju različite epitope. Ako drugo antitelo nije bilo u stanju da se veže, utvrđeno je da prvo i drugo antitelo dele epitop.
[0328] Primeri rezultata analize bininga korišćenjem anti-SIRP-α antitela (A) imobilizovanog na čip i ubrizgavanja anti-SIRP-α antitela (B-F) prikazani su u SL. 21B. Anti-SIRPα antitelo (B), (E) i (F) formiraju sendviče sa kompleksom, a na to ukazuje povećanje RU u vremenu od 60s (nakon injekcije odgovarajućih anti-SIRPα antitela). Kao takvi, oni su determinisani da vežu različite epitope od anti-SIRPα (A) i označeni su belim okvirima u dijagramu bininga (SL. 22A & 22B). Za anti-SIRPα antitela (C) i (D), oni nisu formirali sendvič, a to je naznačeno stabilnim RU nakon injekcije odgovarajućih anti-SIRPα antitela. Kao takvi, oni su determinisani da vežu isti epitop kao anti-SIRPα (A) i osenčeni su sivo na dijagramu bininga (SL. 22A & 22B). Broj klona za ligand (anti-SIRPα) vezan za čip je označen kao redovi, a broj klona za analite (anti-SIRPα) ubrizgane preko čipa je naznačen kao kolone u SL. 22A & 22B. „X“ označava scenarije u kojima se podaci iz jedne orijentacije ne slažu sa drugom.
[0329] Prvo, anti-SIRPα antitela su imobilizovana na GLC čipovima koristeći Proteon Amine Coupling Kit kao što je ranije opisano. Ukratko, za korak imobilizacije, GLC čip je aktiviran sa EDAC/Sulpho-NHS 1:1 (Biorad) razblaženim 1/80 tokom 300 s pri 25 µL/min. Anti-SIRPα antitela su razblažena do koncentracije od 80 nM u 10 mM natrijum acetatnog pufera pH 4,5 i imobilizovana na čip pri 30 µL/min tokom 50 sekundi. Čip je inaktiviran etanolaminom tokom 300 sekundi pri 25 µL/min. Nakon toga, SIRP-α v1 (SEQ ID NO: 5) (100 nM) je prvo ubrizgan pri 100 uL/min tokom 60 s, a zatim je ubrizgan anti-SIRPa antitela tokom testiranja (100-150 nM) pri 100 uL/min tokom 60 s. Površine su regenerisane sa 2:1 zapr/zapr mešavinom Pierce IgG pufera za eluiranje/4M NaCl. Dobijeni senzogrami su korišćeni da se ocenjuju i grupišu antitela u različite binove prema njihovim profilima vezivanja.
21
Rezultati
[0330] Sledeći klonovi anti-SIRP-α antitela su izdvojeni: 3, 21, 25, 27, 45, 66, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 132, 135, 136, 137, 149, 161, 162, 173, 194, 209, 213 i 218. Kao što je prikazano na SL. 22A & 22B, rezultati su pokazali da se svaki način (B:blokiranje, NB:neblokiranje i KO:“Kick off”) vezivanja anti-SIRP-α antitela za humani SIRP-α v1 odvojeno spaja. Za neblokatore, anti-SIRPα antitela se mogu dalje razdvojiti u 4 bina na osnovu njihovog profila vezivanja. Na primer, anti-SIRPα antitela 123, 149, 161, 162, 194 i 218 su grupisana kao Bin5. Anti-SIRPα antitela 3, 173, 209 i 213 su grupisana kao bin 4. Anti-SIRPα antitela 136 i 137 su grupisana kao Bin 2. Anti-SIRPα antitelo 45 ima jedinstven profil vezivanja i grupisano je kao bin 6.
[0331] U kombinaciji sa strukturnim analizama opisanim u Primeru 4, ovi rezultati su doveli do modela vezivanja antitela i CD47 za SIRP-α D1 domen prikazan u SL. 23. Na primer, pretpostavljeno je da različita anti-SIRPα antitela u binovima 1, 2, 3 i 4 dele slične vezujuće epitope sa anti-SIRPα 119, 136, 115 i 3 koji su kategorisani u odgovarajućim binama. Vezujući epitopi za anti-SIRPα 119, 136, 115 i 3 su dobijeni iz kristalnih rastvora kao što je opisano u Primeru 4.
[0332] Pored toga, pretpostavlja se da se anti-SIRPα antitela u binu 5 vezuju za anti-SIRPα 136 (Bin 2) i 115 (Bin 3) respektivno i dele epitope koji se preklapaju. Ovo je zasnovano na podacima o biningu koji pokazuju da su se anti-SIRPα antitela u binu 5 takmičila sa antitelima u binovima 2 i 3 za vezivanje za SIRPα V1, a nisu se takmičila sa antitelima u binovima 1, 4 i 6 (SL.22B).
[0333] Pretpostavlja se da se anti-SIRPα antitelo 45 (Bin 6) vezuje za anti-SIRPα 3 (Bin 4) i 136 (Bin 2) respektivno i deli epitope koji se preklapaju. Ovo je zasnovano na podacima o biningu koji pokazuju da se anti-SIRPα 45 takmičio sa antitelima u binovima 2 i 4 za vezivanje za SIRPα V1, a anti-SIRPα 45 se nije takmičio sa antitelima u binovima 1, 3 i 5 (SL. 22B).
[0334] Model u SL. 23 ilustruje epitop svakog bina za antitela na osnovu strukturnih analiza i analiza i demonstrira preklapanje između različitih binova antitela korišćenjem primera klonova antitela. Dodatna anti-SIRP-α antitela izolovana ovde su grupisana u porodice i binove na osnovu njihovih profila mapiranja epitopa, homologija u njihovim sekvencama VH/VL domena, specifičnosti vezivanja za SIRP proteine i izvora antitela. Na primer, anti-SIRP-α antitela u porodici 1 / binu 1 su CD47 blokatori koji dele homologije visoke sekvence u svojim VH i VL domenima (tabela P i SL. 11J). VH i VL su potpuno ljudske sekvence. Anti-SIRP-α antitela u familiji2/binu 1 su takođe CD47 blokatori. Njihovi VH i VL dele
21
visoke homologije i potiču iz ljudskih i pilećih izvora (tabela P, SL. 11A). Anti-SIRP-α antitela u porodici 3/binu 2 uključuju neblokatore CD47, a njihove visoko homologne VH/VL su potpuno ljudske sekvence (Tabela P, SL. 11B). Anti-SIRP-α antitela u porodici 4/Bin3 uključuju „kick-off“ antitela, a njihove visoko homologne VH/VL su potpuno ljudske sekvence (Tabela P, SL. 11C). Porodica 5 uključuje CD47 neblokatore koji su odvojeno mapirani u bin 4, 5 i 6. Poravnanje sekvenci ovih antitela i njihovi profili vezivanja su prikazani u SL. 11D-11I i tabela P, respektivno. Koffvrednosti vezivanja za različite SIRP-α, SIRP-β i SIRP-γ polipeptide odgovarajućih anti-SIRPa antitela u porodicama 1-5 su predstavljene u tabeli T.
Primer 6: Varijante mutacije klicine linije i nepoželjne mutacije anti-SIRP-α antitela
[0335] Neka anti-SIRP-α antitela opisana iznad su potpuno ljudska antitela stvorena u piletu (npr. antitela 119, 135 i 136). Kao takva, neka od ovih antitela mogu da sadrže mutacije u sekvencama okvira varijabilnog domena, u poređenju sa sekvencom humane klicine linije divljeg tipa, na osnovu generisanja ovih antitela u B ćelijama pileta. Zbog toga je poželjno da se ovi odgovarajući ostaci "povratno mutiraju" da bi se poklopili sa sekvencom ljudske klicine linije sa ciljem ograničavanja imunogenosti kada se ova anti-SIRPα antitela testiraju na ljudima kao potencijalni terapeutici. Pored povratnih mutacija klicine linije, CDR-ovi i okvirni region antitela 119, 135 i 136 su analizirani na žarišta nepoželjnih mutacija. Ove analize su identifikovale lokacije na kojima bi inženjering mogao biti poželjan da bi se ograničio rizik zbog modifikacija do kojih može doći tokom proizvodnje, skladištenja i/ili razvoja leka anti-SIRPα antitela.
Metode
Mutacije klicine linije/nepoželjne mutacije
[0336] KDza odgovarajuće mutante klicine linije i nepoželjne mutante koji se vezuju za SIRP su određeni korišćenjem direktne imobilizacije korišćenjem GLC čipa kako je opisano supra.
[0337] Antitela divljeg tipa i mutantna antitela su eksprimirana u Ekpi293 i prečišćena hromatografijom na afinitetnoj koloni za protein A kao što je ranije opisano. Sva antitela su eksprimirana kao ljudska L234A/L235A/G237A/N297A IgG1 Fc antitela. Mutageneza je sprovedena korišćenjem QuikChange Lightning Site Directed Mutagenesis kompleta prema
21
uputstvima proizvođača (Agilent Catalog # 210518).
Rezultati
[0338] Ispitana su antitela 119, 135 i 136. Odabrane sekvence antitela su usklađene sa dostupnim sekvencama humanih klicinih linija korišćenjem IgBlasta (NCBI). Na primer, identifikovano je ukupno 7 mesta na teškim i lakim lancima od 119. Kao što je prikazano u SL. 24A, ostaci koji se nisu obično javljali u sekvenci ljudske klicine linije od 119 VH (npr., D1, E43 i L112) su povratno mutirani da bi odgovarali sekvenci ljudske klicine linije (npr. D1E, E43K i L112Q) dok su CDR sekvence ostale intaktne. Što se tiče 119 VL (SL. 24B), ostaci koji se obično nisu javljali u sekvenci humane klicine linije od 119 VL (npr. F21, R39, E60 i T76) su povratno mutirani da bi se poklapali sa sekvencom ljudske klicine linije (npr. F21L, R39K, E60A i T76S) dok su CDR sekvence ostale intaktne. Kako se ovde koristi, termini "all mut" i "mut" odnose se na varijabilne domene koji sadrže sve mutacije klicine linije opisane ovde za određeni varijabilni domen antitela. Numeracije aminokiselina koje se koriste za opisivanje mutacija klicine linije i odgovornosti su zasnovane na sekvencijalnom numerisanju u skladu sa odgovarajućim SEQ ID.
[0339] Pored toga, sekvence antitela su takođe analizirane na „nepoželjna“ žarišta, uključujući ostatke koji mogu biti podložni oksidaciji, deamidaciji, izomerizaciji, hidrolizi i N-vezanoj glikozilaciji. Potencijalne vruće tačke su prikazane u Tabeli L. Konkretno, M34V i M34L varijante HVR-H1 su generisane za VH domen višestrukih antitela.
Tabela L. Potencijalna i poznata žarišta
21
[0340] Varijante antitela 119 su generisane korišćenjem varijabilnih domena teškog i/ili lakog lanca koji nose klicinu liniju i povratne mutacije. 119 mutantni („mut“) VH domen je generisan sa mutacijama povratne linije klicine linije D1E, E43K i L112Q, kao i mutacijama M34V u CDR-H1 koje uklanjaju ostatak metionina koji bi potencijalno mogao da bude oksidovan (vidi SEQ ID NOs:246 za VH sekvence). Druga varijanta je generisana sa povratnim mutacijama klicine linije D1E, E43K i L112Q (vidi SEQ ID NO: 258 za VH sekvencu). Poravnanja između roditeljske i varijantne sekvence su prikazana u SL. 24A. Laki lanac od 119 mutanta ("mut") je takođe generisan sa povratnim mutacijama klicine linije F21L, R39K, E60A i T76S; prikazano je poravnanje između roditeljskog i varijantnog niza SL. 24B.
[0341] Varijante antitela 119 sa mutantnim teškim i/ili lakim lancem su upoređene sa roditeljskim antitelom 119 sa IgG1 Fc regionom koji nosi mutacije L234A, L235A, G237A i N297A (EU numeracije), i roditeljskim antitelom 119 sa IgG4 Fc regionom koji nosi mutacija S228P (EU numeracija), za afinitet vezivanja za humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), ljudski SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6) i makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11) . Utvrđeno je da oba 119 mutantnih teških i lakih lanaca izazivaju blago smanjenje afiniteta vezivanja za sva tri SIRP-α proteina. Međutim, varijanta antitela 119 sa mutiranim teškim i lakim lancima i dalje pokazuje snažno vezivanje za oba humana SIRP-α proteina, sa KDod približno 30 nM (Tabela M). U poređenju sa roditeljskim antitelom, prinos varijante antitela 119 sa mutiranim teškim i lakim lancima takođe je smanjen za približno 4,5 puta (Tabela M).
[0342] Da bi se istražio efekat metionina u HVR-H1 na vezivanje 119 SIRPα, generisane su pojedinačne mutacije M34V i M34L u pozadini 119 VH divljeg tipa i kombinovane sa 119 divljeg tipa lakog lanca. I 119 wt/wt_M34V i 119 wt/wt_M34L su imali uporedive afinitete (KD, M) na humani SIRPα v1 i v2 u poređenju sa 119 wt/wt. Ovo ukazuje da ostatak M34 nije kritičan za vezivanje SIRP-α i da se može zameniti mutacijama M34L ili M34V. Odgovarajuće VH sekvence za pojedinačne mutacije M34V i M34L generisane u pozadini divljeg tipa 119 VH su SEQ ID NO: 421 i 420, respektivno.
22
Tabela M. Afiniteti vezivanja (KD, M) od 119 varijanti antitela na humane i makaki SIRP-α proteine
[0343] Zatim su stvorene slične varijante antitela 135. 135 mutantni (mut) teški lanac je generisan sa povratnim mutacijama klicine linije D1E, R13Q, E16G, E43K i L112Q, kao i mutacijom M34V u CDR-H1 koja uklanja ostatak metionina koji bi potencijalno mogao da bude oksidovan (vidi SEQ ID NO: 247 za VH sekvencu). Slična varijanta je konstruisana bez mutacije M34V u CDR-H1 (vidi SEQ ID NO: 259 za VH sekvencu). 135 mutantni (mut) laki lanac je generisan sa povratnim mutacijama F21L i D60A klicine linije (vidi SEQ ID NO:248 za VL sekvencu). Poravnanja između roditeljske i varijantne sekvence su prikazana u SL. 25A & 25B.
[0344] Varijante antitela 135 sa mutantnim teškim i/ili lakim lancem su upoređene sa roditeljskim antitelom 135 za afinitet vezivanja za humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), humani SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11), i humani SIRP-γ v1 (SEQ ID NO:15). 135 mutantnih teških i lakih lanaca imalo je uporediv afinitet vezivanja za sva četiri SIRP-α proteina, kao i uporedive prinose (Tabela N1).
[0345] Da bi se istražio efekat metionina u HVR-H1 od 135 na vezivanje SIRP-α, generisane su pojedinačne mutacije M34V i M34L u pozadini 135 VH divljeg tipa i kombinovane sa lakim lancem 135 divljeg tipa. I 135 wt/wt_M34V i 135 wt/wt_M34L su imali uporedive afinitete (KD, M) na humani SIRPα v1 i v2 u poređenju sa 135 wt/wt. Ovo ukazuje da ostatak M34 nije kritičan za vezivanje SIRP-α i može biti zamenjen mutacijom M34L ili M34V. Odgovarajuće VH sekvence za pojedinačne mutacije M34V i M34L generisane u pozadini divljeg tipa 135 VH su SEQ ID NO: 423 i 422, respektivno.
Tabela N1. Afiniteti vezivanja (KD, M) od 135 varijanti antitela na humane i makaki SIRP-α proteine i humani SIRP-γ protein
[0346] Generisane su slične varijante antitela 136. Teški lanac od 136 mutanta (mut) je generisan sa povratnim mutacijama klicine linije D1E, R13Q, E16R, E43K i L111Q, kao i mutacijom M34V u CDR-H1 koja uklanja ostatak metionina koji bi potencijalno mogao da bude oksidovan (vidi SEQ ID NO: 249 za VH sekvencu). Slična varijanta je konstruisana bez mutacije M34V u CDR-H1 (vidi SEQ ID NO: 260 za VH sekvencu). 136 mutantni (mut) laki lanac je generisan sa povratnim mutacijama klicine linije T2I, T12S, T22S i E38Q (vidi SEQ ID NO: 250 za VL). Poravnanja između roditeljske i varijantne sekvence su prikazana u SL.
26A & 26B.
[0347] Kao što je prikazano u SL. 27A, varijante antitela 136 sa mutantnim teškim i/ili lakim lancem su upoređene sa roditeljskim ("wt") antitelom 136 kao IgG1_AAA_N297A za afinitet vezivanja za humani SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), humani SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP-α (SEQ ID NO:11), NOD miš SIRP-α (SEQ ID NO:8), BL/6 miš SIRP-α (SEQ ID NO:9) i BALB/c mišji SIRP-α (SEQ ID NO:10). Na sl.27A, Y-osa pokazuje odnos KDmut / KDwt vezivanje za različite SIRP. Ako je odnos = 1 ukazuje da nema promene u KDu poređenju sa vezivanjem roditeljskih antitela. Odnos = >1 i <1 ukazuje na smanjenje i povećanje afiniteta vezivanja za SIRPα(e) u poređenju sa roditeljskim antitelom. Dok se antitelo od 136 wt (VL)/mut (VH) ponašalo slično kao wt (VL)/wt(VH), obe varijante sa mutiranim lakim lancem imale su slabije afinitete vezivanja, što ukazuje da se neke VL mutacije nisu tolerisale.
[0348] Da bi se analizirao efekat svake povratne mutacije lakog lanca na afinitet vezivanja, konstruisane su dodatne varijante antitela 136 i okarakterisane za afinitet vezivanja za BL/6 mišji SIRP-α (SEQ ID NO:9), NOD mišji SIRP-α (SEQ ID NO:8), BALB/c miš SIRP-α (SEQ ID NO:10), ljudski SIRP-α v1 (SEQ ID NO:5), ljudski SIRP-α v2 (SEQ ID NO:6), makaki SIRP- α (SEQ ID NO:11), i humani SIRP-γ v1 (SEQ ID NO:15). Počevši od pozadine „all mutant“, svaka pojedinačna mutacija je obrnuta. I2T, S12T, S22T i Q38E mutacije su pojedinačno testirane u inače "all mutant" lakim lancima, kao što je prikazano u SL. 27B. I2T mutacija u pozadini koja je inače all mut pokazala je dosledno sličan afinitet vezivanja, u poređenju sa roditeljskim wt/wt antitelom (vidi SEQ ID NO: 251 za I2T u all mut pozadini i SL. 27A za usklađivanje sa roditeljskim i mutantnim 136 antitelima). Međutim, ostale tri reverzne mutacije (S12T, S22T i Q38E) su dosledno pokazivale afinitete vezivanja sličnije 136 mut/mut, što ukazuje da je mutacija T2I odgovorna za smanjeni afinitet vezivanja za različite SIRP proteine. Dodatni podaci iz ovih eksperimenata dati su u tabeli Q infra.
Tabela N2. Afiniteti vezivanja (KD, M) od 136 varijanti antitela na humane, mišje i makaki SIRP-α proteine i humani SIRP-γ protein
22
Primer 7: Humanizacija anti-SIRP-α antitela
[0349] Gore navedeni primeri opisuju stvaranje anti-SIRP-α antitela koja imaju potpuno ljudski teški lanac i pileći laki lanac. Da bi se humanizovali laki lanci dobijeni od pileta, pileći HVR ovih antitela su kalemljeni na različite okvire humanih lambda lakih lanaca.
Metode
Humanizacija
[0350] Antitela su humanizovana korišćenjem standardnih tehnika. Za merenje prinosa proizvodnje, jednaka zapremina Expi293 kultura koje eksprimiraju anti-SIRPα antitela je prečišćena afinitetnom hromatografijom za protein A. Posle razmene pufera u PBS, koncentracija proteina je određena pomoću A280 i izražena u mg/mL.
Rezultati
[0351] Da bi se dizajnirali humanizovani laki lanci, svaka sekvenca lakog lanca pileta je bila poravnata sa najbližim okvirom ljudske klicine linije pomoću IgBLAST-a (NCBI). Koristeći ovu analizu, najbliži okvir pilećeg lambda lakog lanca je ljudski IGLV3 (vidi SEQ ID NO: 314-317).
[0352] U drugom pristupu, izvršena je pretraga literature da bi se odredile optimalne sekvence okvira lambda lakog lanca za uparivanje sa sekvencama humanog VH3 (humani teški lanac koji se koristi za ova antitela). Na osnovu ovih analiza, smatralo se da će se ljudski VH3 dobro upariti sa ljudskim IGLV1 i IGLV2. Vidi Glanville, J. et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. 106:20216-20221; Lloyd, C. et al. (2009) Protein Eng. Des. Sel. 22:159-168; i Jayaram, N. et al. (2012) Protein Eng. Des. Sel.25:523-529.
[0353] Stoga je stvoreno šest humanizovanih lakih lanaca: Hum1 (AB25 HVRs ljudski IGLV3 okvir), Hum2 (AB25 HVRs ljudski IGLV1 okvir), Hum3 (AB66 HVRs ljudski IGLV3 okvir), Hum4 (AB66 HVRs ljudski IGLV1 okvir), Hum5 (AB25 HVRs ljudski IGLV2 okvir), i Hum6 (AB21 HVRs ljudski IGLV1 okvir). Sekvence rezultujućih varijabilnih domena lakog lanca date su u Tabeli O1.
Tabela O1. Testirane sekvence humanizovanih varijabilnih domena lakog lanca. HVR sekvence su podebljane i podvučene.
22
[0354] Svaki od 6 humanizovanih lakih lanaca je uparen sa svakim od četiri teška lanca (izvedena od AB21, AB25, AB27 i AB66), generišući 24 jedinstvena antitela. Antitela su eksprimirana kao što je gore opisano. Iznenađujuće, humane IGLV1 okvirne sekvence su dovele do smanjene ekspresije antitela bez obzira na teški lanac. Ovo se odnosi na sva uparivanja teških lanaca sa Hum2, Hum4 i Hum6 (osim kada je uparivanje izvršeno sa teškim lancem iz AB66). Rezultati su sumirani u SL. 28 kao "prinos proteina" (red 1). Nasuprot tome, antitela sa lakim lancima uključujući humane IGLV2 i IGLV3 okvire (Hum 1, Hum3, Hum5) pokazala su više nivoe ekspresije bez obzira na teški lanac.
[0355] Odabrana antitela su zatim karakterisana za vezivanje za različite SIRP proteine (npr., za ljudski SIRP-α v1, ljudski SIRP-α v2, makaki SIRP-α, miš BALB/c SIRP-α i ljudski SIRP-γ). Ovi podaci su takođe sažeti u SL. 28. Odabrani humanizovani laki lanci izazvali su smanjenje vezivanja za jedan ili više antigena. Na primer, utvrđeno je da ljudski IGLV3 okvir (koji predstavljaju Hum1 i Hum3) omogućava superiorne nivoe proizvodnje antitela bez remećenja afiniteta vezivanja. Na primer, varijabilni domeni lakog lanca sa IGLV3 okvirima i HVR sekvencama antitela 25 ili antitela 66 (predstavljane Hum1 i Hum 3 respektivno) dobro su kombinovani sa različitim teškim lancima (npr. teški varijabilni domeni iz antitela 21, 25, 27 i 66) i pokazao slično vezivanje za različite SIRP-α i SIRP-γ proteine. Nasuprot tome, utvrđeno je da IGLV1 i IGLV2 okviri (predstavljani Hum2, Hum4, Hum5 i Hum6) ili smanjuju ekspresiju i/ili smanjuju vezivanje za SIRP kada su upareni sa teškim lancima iz antitela 21, 25, 27 i 66. Dodatni podaci o vezivanju iz ovih eksperimenata dati su u tabeli R
22
infra. Ljudski IGLV3 okvir je odabran za dalje testiranje.
[0356] Drugi cilj humanizacije ovih antitela bile su sekvence antitela koje imaju veći ili jednak 85% identiteta sa sekvencama lakog lanca/teškog lanca klicine linije. Dodatni VL domen Hum9 i Hum8 je generisan na osnovu Hum1 VL domena. U poređenju sa Hum1, Hum9 sadrži 4 aminokiselinske supstitucije u blizini ili u HVR-L1 i -L2 koje povećavaju humanost lakog lanca na više od ili jednako 85% identičnosti sa sekvencom ljudskog lakog lanca (SL. 29). U poređenju sa Hum1, Hum8 sadrži 5 supstitucija aminokiselina, respektivno blizu ili u HVR-L1 i -L2 koje povećavaju humani udeo lakog lanca na više ili jednako 85% identičnosti sa sekvencom lakog lanca čoveka (SL. 29). Hum1, Hum8 i Hum9 VL kada su upareni sa teškim lancem all_mut_AB21 (koji nose mutacije klicine linije) proizveli su anti-SIRPα antitela koja se vezuju za humani v1 sa afinitetom jednakim ili boljim od 10 pM (Tabela S). Slično, kada su Hum1, Hum8 i Hum9 VL upareni sa teškim lancem all_mut_AB25 (koji nose mutacije klicine linije), anti-SIRPα antitela se vezuju za humani v1 sa afinitetom jednakim ili boljim od 10 pM. Dodatni podaci o vezivanju iz ovih eksperimenata dati su u tabeli S infra. Ovi laki lanci se mogu naizmenično kombinovati sa VH domenima antitela 21, 25 i 27 (kao i njihovim varijantama, koje su modifikovane kako je opisano supra za antitela 119, 135 i 136; SL. 30). Bez želje da se vezujemo za teoriju, smatra se da se gore opisani proces humanizacije može primeniti na laki lanac bilo kog antitela iz porodice 2 (bin 1).
Primer 8: Indukcija fagocitoze i aktivacija dendritskih ćelija anti-SIRP-α antitelima
[0357] Različita anti-SIRP-α antitela koja predstavljaju različite načine vezivanja za SIRP-α (npr. blokirajuća, ne-blokirajuća i "kick-off" antitela) su zatim ispitana u testovima fagocitoze.
Testovi vezivanja CD47-Fc
[0358] CD47-Fc je konjugovan sa Alexa Fluor 647 (AF647) koristeći Alexa Fluor 647 Microscale Protein Labeling Kit (Thermo Fisher Scientific). U polipropilenskim pločama sa 96 bunarčića (Corning), 100.000 PBMC je suspendovano u 100 µl 0,25 µM AF647 obeleženog CD47-Fc i 1 µl anti-CD 14 PE antitela (Biolegend) u FACS puferu. Ćelije su inkubirane na ledu 30 minuta, isprane u FACS puferu i inkubirane u 10-strukim serijskim razblaženjima anti-SIRP-α antitela od 1,25 µM do 25 pM. Ćelije su inkubirane na ledu 30 minuta, isprane u FACS puferu i fiksirane u 75 µl 0,5% formaldehida. Ćelije su analizirane na
22
FACS Canto II (BD Biosciences), uz naknadnu analizu podataka pomoću Flowjo 10.7 (Treestar). Geometrijska srednja vrednost intenziteta fluorescencije CD47-Fc signala je određena u CD14-pozitivnoj populaciji monocita.
Test aktivacije dendritskih ćelija
[0359] Test aktivacije dendritskih ćelija je izveden kao što je opisano na drugom mestu. Ukratko, Balb/c miševima (n=3/grupi) je intravenski ubrizgano kontrolno anti-mišje anti-SIRP-α antagonističko antitelo pacova (klon p84), ljudska IgG1 kontrola, različita anti-SIRP-α antitela, mišja IgG kontrola ili nosač (PBS) na 10 mg/kg. Pet sati nakon injekcije, slezine su sakupljene i obrađene u jednoćelijsku suspenziju mehaničkom disocijacijom. Nivo aktivacionog markera CD86, MHCII i CCR7 na CD4+ dendritskim ćelijama slezine meren je protočnom citometrijom.
Testovi ćelijske adhezije
[0360] Test adhezije je izveden korišćenjem izogenih ćelija koje nemaju ili eksprimiraju humani CD47. CD47 hrčka nokautiraju CHO ćelije (CHO<CD47 KO>) generisani su korišćenjem CRISPR tehnologije. Izogene ćelije koje eksprimiraju humani CD47 su generisane prolaznom transfekcijom humanog CD47 u CHO<CD47 KO>.24 sata nakon transfekcije, CHO<CD47 KO>ćelije (4 × 10<5>) transficirane sa humanim CD47 su ponovo postavljene na ploče sa 24 bunarčića tretirane kulturom tkiva i ostavljene da se ponovo povežu i dostignu konfluentnost preko noći na 37°C.
[0361] Mononuklearne ćelije ljudske periferne krvi (PBMC) su odvojene od periferne krvi zdravih davalaca centrifugiranjem sa Ficoll gradijentom. CD3+ i CD14+ ćelije su izolovane iz PBMC negativnom selekcijom korišćenjem magnetnih perli. Izolovane CD3+ i CD14+ ćelije (5 × 10<6>) su prethodno inkubirane sa Hum1/AB21mutall, Hum9/AB21mutall ili 136 wt/mut antitelima koja sadrže mutirani humani IgG1 (L234A L235A G237A i N297A) (20 ug/mL) na 37°C, pre postavljanja na 20 minuta<CD47 KO>i CHO<hCD47+>ćelije i ostavljeno da se drži 1 sat na 37°C. Ne-adherentne ćelije su uklonjene sa pet blagih ispiranja sa PBS. Adherentne ćelije su odvojene tripsinom i neutralizovane sa 10% FBS. Ćelije su prebačene na ploču sa 96 bunarčića i isprane 2 puta sa PBS 0,5% BSA, nakon čega je usledilo obeležavanje ćelijske površine sa fluorohromom konjugovanim humanim CD3, CD4, CD8 i CD14 antitelima. Dodate su perle za brojanje i ćelijska adhezija je kvantifikovana korišćenjem BD Canto II
22
protočnog citometra. Analiza podataka protočne citometrije je urađena korišćenjem Flowjo.
Rezultati
[0362] Pet antitela koja „pokreću“ CD47 od vezivanja SIRP-α ispitana su zbog njihovih efekata na fagocitozu HER2(+) OE19 ćelija od strane M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-HER2 antitelom trastuzumabom (SL. 31). Utvrđeno je da svih 5 "kick-off" antitela pojačavaju fagocitozu izazvanu trastuzumabom.
[0363] Pet antitela koja ne blokiraju CD47 da se vezuje za SIRP-α su zatim ispitana zbog njihovih efekata na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija od strane M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 32). Utvrđeno je da sva antitela koja ne blokiraju pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuzimabom.
[0364] Zatim, gore opisana humanizovana antitela su testirana na njihov efekat na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom. (SL. 33A). Utvrđeno je da sva humanizovana antitela pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuzimabom. Dodatne varijante antitela 136 (opisano supra) testirani su na njihove efekte na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 33B). Sve varijante antitela 136 pojačale su fagocitozu izazvanu cetuksimabom, ali u različitom stepenu. Dodatna humanizovana antitela opisana iznad (varijante teškog lanca antitela 25 i 27 kombinovane sa Hum1 ili Hum9 lakim lancem) su testirana na njihov efekat na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (Slika 33C). Utvrđeno je da sva humanizovana antitela pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuksimabom.
[0365] Da bi se istražio efekat Fc regiona anti-SIRP-α antitela na fagocitozu, dva neblokirajuća antitela su testirana ili kao antitela pune dužine ili kao F(ab)2fragmenti za njihov efekat na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija od strane M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 34). Ovi rezultati su pokazali da antitela koja ne blokiraju gube sposobnost da indukuju fagocitozu kao F(ab)2fragmenti, što sugeriše da je Fc region ove klase antitela neophodan za indukciju fagocitoze.
[0366] Tri varijante blokirajućeg antitela 119 (opisano supra) testirane su u odnosu na njihove efekte na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 35). Rezultati su pokazali da sve tri varijante pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuksimabom.
[0367] Dve varijante blokirajućeg antitela 135 (opisano supra) testirani su na njihove efekte
22
na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 36). Rezultati su pokazali da obe varijante pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuksimabom.
[0368] Dodatna antitela koja ne blokiraju (opisano supra) testirani su na njihove efekte na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga u kombinaciji sa anti-EGFR antitelom cetuksimabom (SL. 37). Utvrđeno je da sva antitela koja ne blokiraju pojačavaju fagocitozu izazvanu cetuksimabom.
[0369] Zatim su ispitana različita anti-SIRP-α antitela na njihov efekat na in vivo aktivaciju dendritskih ćelija (SL. 38A-38B), uključujući poznato anti-SIRP-α antitelo p84 (vidi, npr. Tangsheng, Y. et al (2015) Immunity 433:1-12). Neuspeh uključivanja mišjeg SIRP-α receptora na dendritske ćelije slezine preko CD47 vezivanja dovodi do aktivacije dendritskih ćelija slezine. Kontrolno anti-SIRP-α antagonističko antitelo p84 aktiviralo je dendritske ćelije slezine kada se intravenozno ubrizgava u miševe. Testirana su neblokirajuća anti-SIRP-α antitela (AB136b, AB3b i AB136 wt/mut) i blokirajuća anti-SIRP-α antitela (Hum1/AB21mutall, Hum8/AB21mutall i Hum9/AB21mutall). in vivo da se utvrdi da li to dovodi do aktivacije dendritskih ćelija. Kako je utvrđeno ekspresijom CD86 i MHCII, i SIRP-α blokatori i neblokatori indukuju aktivaciju dendritskih ćelija. Ovi rezultati sugerišu da blokirajuća i neblokirajuća anti-SIRP-α antitela indukuju aktivaciju dendritskih ćelija.
[0370] Dve varijante antitela 218, 218-Hum13/VH_wt i 218-Hum14/VH_wt, generisane su ekspresijom humanizovanih lakih lanaca (Hum13 i Hum14 respektivno) sa divljim teškim lancem antitela 218. Hum13 je koristio ljudski okvir IGLV2, gde je korišćen okvir Hum14, ljudski okvir IGLV3 (vidi SEQ ID NOs: 333 i 334 za VL sekvence Hum 13 i Hum14, respektivno). Oba klona su pokazala niži afinitet vezivanja za v1 i v2 (KDje ~29,3 do 53,1 nM), kao što je prikazano u tabeli O2.
Tabela O2. Afinitet vezivanja (KD, M) varijanti antitela 218 i 218 za humani SIRP-α v1 i v2.
2
[0371] Oba antitela su testirana u testu fagocitoze u kombinaciji sa cetuksimabom u DLD-1 ćelijama. Zanimljivo je da nijedna humanizovana varijanta nije bila u stanju da pojača fagocitozu u odnosu na roditeljsko AB218a antitelo (SL. 39A). Bez želje da se vezujemo za teoriju, ovi rezultati sugerišu da antitela sa KDna ili ispod približnog opsega od 30-50 nM mogu biti efikasnija u izazivanju fagocitoze od antitela koja se vezuju sa slabijim afinitetom.
[0372] Primeri blokirajućih, neblokirajućih i „kick-off“ anti-SIRP-α antitela su zatim testirani na indukciju fagocitoze kao pojedinačni agensi. Prvo, tri antitela koja blokiraju CD47 od vezivanja SIRP-α, AB 119a, AB 120a i AB 122a, ispitana su na njihov efekat kao pojedinačni agensi na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga (kao što je gore opisano) . Utvrđeno je da sva blokirajuća antitela indukuju fagocitozu kao pojedinačni agensi (SL.
39B). Zatim, dva antitela koja ne blokiraju CD47 od vezivanja SIRP-α, AB136a i AB137a, ispitana su u odnosu na njihov efekat kao pojedinačnih agenasa na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija pomoću M2 makrofaga. Utvrđeno je da sva antitela koja ne blokiraju indukuju fagocitozu kao pojedinačni agensi (SL. 39C). Konačno, kod pet "početnih" anti-SIRP-α antitela, AB115a, AB116a, AB117a, AB118a i AB132a, ispitan je na njihov efekat kao pojedinačnih agenasa na fagocitozu EGFR(+) DLD-1 ćelija od strane M2 makrofaga. Utvrđeno je da sva "početna" antitela indukuju fagocitozu kao pojedinačni agensi (SL.39D).
Primer 9: Sinergistički antitumorski efekti kombinovanja blokirajućih ili neblokirajućih anti-SIRP-α antitela sa inhibicijom PD-L1/PD-1 puta
Metode
In vivo antitumorska aktivnost
[0373] Za model CT26 singenog mišjeg karcinoma debelog creva, CT26 ćelije su implantirane potkožno u BALB/c miševe i randomizirane u grupe (8-9 miševa/grupi). Grupe za tretman su uključivale vehikulum (PBS), AB25b, anti-PD-L1 i AB25b/anti-PD-L1. Anti-PD-L1 se generiše spajanjem VH i VL domena atezolizumaba sa Fc regionom miša IgG1 koji nosi mutaciju N297A. Sva anti-SIRP-α antitela takođe imaju mišji IgG1 Fc region koji nosi mutaciju N297A. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 75-80 mm<3>7 ili 8 dan nakon implantacije. Miševima je davana intraperitonealna (IP) doza od 3 mg/kg ili 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje za anti-SIRPα antitela i tri doze od 3 mg/kg, u razmaku od
2 1
pet dana za anti-PD-L1. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
[0374] Za model MC38 singenog mišjeg karcinoma debelog creva, MC38 ćelije su implantirane potkožno u C57BL/6 miševe i randomizirane u grupe (8-10 miševa/grupi). Grupe za tretman su uključivale vehikulum (PBS), AB25b, AB136b, anti-PDl (klon RMP1-14, BioXCell), AB136b/anti-PD1 i AB25b/anti-PD1. Sva anti-SIRPα antitela su imala mišji IgG1 Fc region koji nosi mutaciju N297A osim AB25c. Lečenje je započeto kada su tumori bili u proseku 60-65 mm<3>, 7. dan nakon implantacije. Miševima je davana intraperitonealna (IP) doza od 10 mg/kg dva puta nedeljno tokom tri nedelje za anti-SIRPα i tri doze od 2 mg/kg za anti-PD1. Životinje su žrtvovane kada su tumori dostigli zapreminu od ~2000 mm<3>.
Rezultati
[0375] Anti-tumorska aktivnost blokirajućeg AB25b anti-SIRP-α antitela je testirana samostalno i u kombinaciji sa anti-PD-L1 antitelom u modelu CT26 singenog mišjeg karcinoma debelog creva. Kao što je prikazano u SL. 40, primena AB25b u dozi od 10 mg/kg u kombinaciji sa anti-PD-L1 u dozi od 3 mg/kg odložila je formiranje tumora u poređenju sa tretmanom sa svakim pojedinačnim agensom ili kontrolom nosača. 27. dana studije, grupa kombinovanog tretmana imala je šest miševa sa tumorima ispod 600 mm<3>po veličini, u poređenju sa dva, dva i dva miša sa tumorima ispod 600 mm<3>po veličini u nosaču, anti-PD-L1 pojedinačnim agensima i anti-SIRP-α pojedinačnim grupama za tretman, respektivno.
[0376] Zatim, antitumorske aktivnosti blokirajućeg AB25b anti-SIRP-α antitela i neblokirajućeg AB136b anti-SIRP-α antitela su testirane same i u kombinaciji sa anti-PD-1 antitelom u modelu MC38 singenog mišjeg karcinoma debelog creva. Kao što je prikazano u SL. 41, kombinovanjem ili AB25b ili AB136b (pri 10 mg/kg) sa anti-PD-1 pri 5 mg/kg odloženo je formiranje tumora u poređenju sa tretmanom sa svakim pojedinačnim agensom ili kontrolom nosača. 27. dana studije, grupa kombinovanog tretmana AB25b/PD-1 imala je sedam miševa sa tumorima ispod 600 mm<3>po veličini, a grupa kombinovanog tretmana AB136b/PD-1 imala je šest miševa sa tumorima ispod 600 mm<3>po veličini, u poređenju sa jednim, pet, dva i jednim mišem sa tumorima ispod 600 mm<3>po veličini u vehikulumu, anti-PD-1 pojedinačni agens, AB25b pojedinačni agens i AB136b grupe za tretman sa jednim agensom, respektivno.
[0377] Rezime ovde opisanih antitela i njihovih svojstava dat je u tabeli P. Dodatni podaci o vezivanju su dati u tabeli T.
2 2
�
��
�
�
�
�
�
��
��
��
��
��
24
24
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
1
11
12
1
14
1
1
1
1
1
2
21
22
2
24
2
2
2
2
2
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
1
2
4
4
41
42
4
44
4
4
4
4
4
41
41
41
41
41
41
41
42
42
42
42
42
42
42
4
41
42
4
44
4
4
4
�

Claims (20)

Patentni zahtevi
1. Izolovano antitelo koje vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α polipeptida, pri čemu antitelo vezuje ekstracelularni domen humanog SIRP-α v1 polipeptida, ekstracelularni domen humanog SIRP-α v2 polipeptida, ekstracelularni domen SIRP-α polipeptida majmuna i ekstracelularni domen mišjeg SIRP-α polipeptida; i pri čemu antitelo sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži:
(i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2AX3S, gde X1je S ili T; X2je N, Y, H, ili D; i X3je M, L, ili V (SEQ ID NO:297);
(ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1X2X3X4X5X6YYX7X8SX9KG, gde X1je A ili S; X2je G, S, ili je odsutan; X3je S, D ili G; X4je G ili S; X5je D, S, ili G; X6je T ili A; X7je P, G, V, I, A, ili S; X8je A, D, ili G; i X9je V ili M (SEQ ID NO:298); i
(iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); i
(b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži:
(i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1X2X3SX4YYX5, gde X1je D, G, S, I, ili je odsutan; X2je S, W, G, Y, D, ili je odsutan; X3je S, Y, T, ili D; X4je H, T, S, ili Y; i X5je G ili A (SEQ ID NO:299);
(ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDX1X2RPX3, gde X1je D ili N; X2je E, K, ili Q; i X3je S ili P (SEQ ID NO:300); i
(iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu X1X2YDX3X4X5YX6NX7, gde X1je G ili A; X2je G ili A; X3je G, Y, Q, S, ili A; X4je S, R, ili T; X5je T ili S; X6je A, I, V, L, ili T; i X7je T, A, D, ili P (SEQ ID NO:301).
2. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time da antitelo je humanizovano antitelo koje se generiše ili je izvedeno od pileta.
4
3. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što antitelo blokira vezivanje između ekstracelularnog domena humanog SIRP-α polipeptida i IgSF domena humanog CD47 polipeptida.
4. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što antitelo sadrži:
(a) varijabilni domen teškog lanca (VH) koji sadrži:
(i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SX1AX2S, gde X1je N ili Y; i gde X2je M, L, ili V (SEQ ID NO:302);
(ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISX1GX2X3DTYYX4X5SVKG, gde X1je A ili S; X2je G ili je odsutan; X3je S ili G; X4je P, G, ili V; i X5je A ili D (SEQ ID NO:303); i
(iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); i
(b) varijabilni domen lakog lanca (VL) koji sadrži:
(i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGX1YSSYYYA, gde X1je S ili A (SEQ ID NO:304);
(ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336); i
(iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172).
5. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što VH domen sadrži:
(a) (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO: 195), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193);
(b) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:135, 263, 264, ili 330;
44
(c) (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO: 197), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193);
(d) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:137, 265, 266, ili 331;
(e) (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272), ili SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193); ili (f) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:139, 267, 268, ili 332.
6. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 4-5, naznačeno time što VL domen sadrži:
(a) (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172);
(b) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:252;
(c) (i) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (ii) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (iii) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172); ili
(d) aminokiselinsku sekvencu koja je najmanje 90% identična aminokiselinskoj sekvenci SEQ ID NO:262;
pri čemu opciono VL domen sadrži sekvencu FW1-HVR-L1-FW2-HVR-L2-FW3-HVR-L3-FW4 (N-terminus do C-terminusa), gde FW1 sadrži aminokiselinsku sekvencu SYELTQPPSVSVSPGQTARITC (SEQ ID NO:314), FW2 sadrži aminokiselinsku sekvencu WYQQKPGQAPVTLIY (SEQ ID NO:315), FW3 sadrži aminokiselinsku sekvencu NIPERFSGSSSGTTVTLTISGVQAEDEADYYC (SEQ ID NO:316), i FW4 sadrži aminokiselinsku sekvencu FGGGTKLTVL (SEQ ID NO:317); i
pri čemu izborno antitelo sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 325, 326 ili 426.
7. Antitelo prema patentnom zahtevu 4, naznačeno time što
(a) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO:195), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO:170), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172);
(b) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO: 197), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO: 170), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172);
(c) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272), ili SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGSYSSYYYA (SEQ ID NO:170), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172);
(d) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO:194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISAGGSDTYYPASVKG (SEQ ID NO: 195), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172);
(e) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SNAMS (SEQ ID NO: 194), SNAVS (SEQ ID NO:271), ili SNALS (SEQ ID NO:318), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGSDTYYGDSVKG (SEQ ID NO:197), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO: 172); ili
(f) VH domen sadrži (i) HVR-H1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SYAMS (SEQ ID NO:200), SYAVS (SEQ ID NO:272), ili SYALS (SEQ ID NO:319), (ii) HVR-H2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GISSGGDTYYVDSVKG (SEQ ID NO:201), i (iii) HVR-H3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu ETWNHLFDY (SEQ ID NO:193), i VL domen sadrži (iv) HVR-L1 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SGGAYSSYYYA (SEQ ID NO:261), (v) HVR-L2 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu SDDKRPS (SEQ ID NO:336), i (vi) HVR-L3 sekvencu koja sadrži aminokiselinsku sekvencu GGYDQSSYTNP (SEQ ID NO:172).
8. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što
(a) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(b) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(c) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(d) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(e) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(f) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
44
(g) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(h) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(i) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(j) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(k) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(l) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:252;
(j) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(m) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:264, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(n) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:330, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(o) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:265, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(p) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:266, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(q) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:331, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(r) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:267, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(s) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:268, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(t) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:332, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(u) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:135, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262;
(v) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:137, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262; ili
(w) VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:139, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:262.
9. Antitelo prema patentnom zahtevu 1 ili 2, naznačeno time što se antitelo vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od I31, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 i K96, prema SEQ ID NO:296;
pri čemu izborno:
(a) antitelo se vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na 131, V33, Q52, K53, T67, R69, N70 i K96, prema SEQ ID NO:296;
(b) antitelo se dalje vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na jednoj ili više aminokiselinskih pozicija izabranih iz grupe koja se sastoji od L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 i R95, prema SEQ ID NO :296;
(c) antitelo se dalje vezuje za humani SIRP-α v1 polipeptid na L30, P32, E54, T62, N71, M72, F74 i R95, prema SEQ ID NO:296; i/ili
(d) humani SIRP-α v1 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:5, humani SIRP-α v2 polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:6, majmunski SIRP-α polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:11, a mišji SIRP-α polipeptid sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO:7.
10. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time što, antitelo je:
(a) monoklonsko antitelo; ili
(b) scFv-Fc antitelo.
11. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-9, naznačeno time što antitelo sadrži Fc region; pri čemu izborno:
(a) antitelo sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NO: 320-324;
(b) Fc region je humani Fc region izabran iz grupe koja se sastoji od IgG1 Fc regiona, IgG2 Fc regiona i IgG4 Fc regiona;
(c) Fc region sadrži ljudski IgG1 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od L234A, L235A, G237A i N297A, prema EU numeraciji;
44
(d) Fc region sadrži humani IgG2 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od A330S, P331S i N297A, prema EU numeraciji;
(e) Fc region sadrži humani IgG2 Fc region koji sadrži mutaciju N297A, prema EU numeraciji;
(f) Fc region sadrži humani IgG2 Fc region koji sadrži A330S i/ili P331S mutacije, prema EU numeraciji; ili
(g) Fc region sadrži humani IgG4 Fc region koji sadrži jednu ili više mutacija izabranih iz grupe koja se sastoji od S228P, E233P, F234V, L235A, L235E, delG236 i N297A, prema EU numeraciji.
12. Antitelo prema patentnom zahtevu 1, naznačeno time što VH domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 263, i VL domen sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 252; pri čemu antitelo dalje sadrži konstantni region lakog lanca koji sadrži aminokiselinsku sekvencu SEQ ID NO: 325, 326 ili 426; i pri čemu antitelo dalje sadrži aminokiselinsku sekvencu izabranu iz grupe koja se sastoji od SEQ ID NOs: 320-324.
13. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-12, naznačeno time što;
(a) antitelo je konjugovano za citotoksični agens ili obeleživač; ili
(b) antitelo je bispecifično antitelo.
14. Jedan ili više polinukleotida koji kodiraju antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13.
15. Jedan ili više vektora koji sadrže polinukleotide prema patentnom zahtevu 14.
16. Jedna ili više ćelija domaćina koje sadrže polinukleotide prema patentnom zahtevu 14 ili vektore prema patentnom zahtevu 15.
17. Postupak za proizvodnju antitela, naznačen time što postupak sadrži kultivisanje ćelija domaćina prema patentnom zahtevu 16 tako da se antitelo proizvodi; pri čemu izborno postupak dalje sadrži izolaciju antitela iz ćelije domaćina.
18. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13 i
44
farmaceutski prihvatljiv nosač.
19. Antitelo prema bilo kom od patentnih zahteva 1-13 za upotrebu u (a) postupku lečenja ili odlaganja napredovanja kancera kod individue ili (b) postupku lečenja ili odlaganja napredovanja autoimune bolesti ili inflamatorne bolesti kod individue, pri čemu postupak sadrži primenu na pojedinca efikasne količine antitela.
20. Antitelo za upotrebu prema patentnom zahtevu 19(a), naznačeno time što postupak dalje sadrži primenu na individuu:
(a) efikasnu količinu drugog antitela koje vezuje antigen eksprimiran od strane kancera, pri čemu je izborno antigen eksprimiran od strane kancera izabran iz grupe koja se sastoji od CD19, CD20, CD22, CD30, CD33, CD38, CD52, CD56, CD70, CD74, CD79b, CD123, CD138, CS1/SLAMF7, Trop-2, 5T4, EphA4, BCMA, Mucina 1, Mucina 16, PTK7, STEAP1, Endotelin B Receptora, mezotelina, EGFRvIII, ENPP3, SLC44A4, GNMB, nektina 4, NaPi2b, LIV-1A, Guanilil ciklaze C, DLL3, EGFR, HER2, VEGF, VEGFR, integrina αVβ3, integrina α5β1, MET, IGF1R, TRAILR1, TRAILR2, RANKL, FAP, Tenascina, Le<y>, EpCAM, CEA, gpA33, PSMA, TAG72, mucina, CAIX, EPHA3, folate receptora α, GD2, GD3, i MHC/peptidnog kompleksa koji sadrži peptid iz NY-ESO-1/LAGE, SSX-2, proteina MAGE porodice, MAGE-A3, gp100/pmel17, Melan-A/MART-1, gp75/TRP1, tirozinaze, TRP2, CEA, PSA, TAG-72, nezrezlog laminin receptora, MOK/RAGE-1, WT-1, SAP-1, BING-4, EpCAM, MUC1, PRAME, survivina, BRCA1, BRCA2, CDK4, CML66, MART-2, p53, Ras, β-katenina, TGF-βRII, HPV E6, ili HPV E7; ili
(b) efikasnu količinu imunoterapeutskog sredstva, pri čemu izborno imunoterapeutsko sredstvo sadrži drugo antitelo, i gde se izborno drugo antitelo vezuje za antigen izabran iz grupe koja se sastoji od PD-1, PD-L1, OX40, CTLA-4, CD137/4-1BB, TNFR2, B7-H3, FZD7, CD27, CCR4, CSF1R, CSF, TIM-3, LAG-3, VISTA, ICOS, CCR2, IDO, A2R, CD39, CD73, TIGIT, CD80, CD47, arginaze, TDO, i PVRIG.
44
RS20220955A 2016-09-21 2017-09-20 Antitela protiv signalno-regulatornog proteina alfa i postupci za upotrebu RS63658B1 (sr)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662397752P 2016-09-21 2016-09-21
US201762515480P 2017-06-05 2017-06-05
PCT/US2017/052592 WO2018057669A1 (en) 2016-09-21 2017-09-20 Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use
EP17853838.5A EP3515490B8 (en) 2016-09-21 2017-09-20 Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS63658B1 true RS63658B1 (sr) 2022-11-30

Family

ID=61689740

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20220955A RS63658B1 (sr) 2016-09-21 2017-09-20 Antitela protiv signalno-regulatornog proteina alfa i postupci za upotrebu

Country Status (33)

Country Link
US (5) US11401338B2 (sr)
EP (2) EP3515490B8 (sr)
JP (3) JP7181874B2 (sr)
KR (1) KR102601298B1 (sr)
CN (3) CN109862915B (sr)
AU (1) AU2017332285B2 (sr)
BR (1) BR112019003027A2 (sr)
CA (1) CA3034480A1 (sr)
CL (2) CL2019000668A1 (sr)
CO (1) CO2019003809A2 (sr)
DK (1) DK3515490T3 (sr)
ES (1) ES2932602T3 (sr)
GE (4) GEP20237528B (sr)
HR (1) HRP20221323T1 (sr)
HU (1) HUE060170T2 (sr)
IL (2) IL297891B2 (sr)
JO (1) JOP20190009A1 (sr)
LT (1) LT3515490T (sr)
MA (1) MA46290A (sr)
MX (1) MX2019003168A (sr)
MY (1) MY197854A (sr)
PE (1) PE20190575A1 (sr)
PH (1) PH12019500600A1 (sr)
PL (1) PL3515490T3 (sr)
PT (1) PT3515490T (sr)
RS (1) RS63658B1 (sr)
SA (1) SA519401371B1 (sr)
SG (1) SG10201912878UA (sr)
SI (1) SI3515490T1 (sr)
SM (1) SMT202200426T1 (sr)
UA (1) UA126281C2 (sr)
WO (1) WO2018057669A1 (sr)
ZA (1) ZA201900937B (sr)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170151281A1 (en) 2015-02-19 2017-06-01 Batu Biologics, Inc. Chimeric antigen receptor dendritic cell (car-dc) for treatment of cancer
WO2017027422A1 (en) 2015-08-07 2017-02-16 Alexo Therapeutics Inc. Constructs having a sirp-alpha domain or variant thereof
RS66062B1 (sr) 2016-04-14 2024-11-29 Ose Immunotherapeutics Nova anti-sirpa antitela i njihove terapijske primene
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
CN118027200A (zh) 2016-12-09 2024-05-14 艾利妥 抗SIRPα抗体及其使用方法
JP7179743B2 (ja) * 2017-02-17 2022-11-29 オーエスイー・イミュノセラピューティクス 抗ＳＩＲＰｇ抗体の新規の使用
CN118267470A (zh) 2017-04-13 2024-07-02 赛罗帕私人有限公司 抗SIRPα抗体
MX2019012295A (es) 2017-04-14 2020-02-07 Tollnine Inc Polinucleotidos inmunomoduladores, conjugados de anticuerpos de los mismos y metodos para su uso.
JP7262440B2 (ja) 2017-08-02 2023-04-21 フェインズ セラピューティクス，インコーポレーテッド 抗ｃｄ４７抗体及びその使用
MX2020009774A (es) * 2018-03-21 2020-10-08 Alx Oncology Inc Anticuerpos contra proteína alfa reguladora de señal y métodos de uso.
AU2018418224B2 (en) * 2018-04-09 2025-04-17 Oricell Therapeutics Co., Ltd. Anti-PD-L1 antibody and use thereof
CA3097193A1 (en) * 2018-05-08 2019-11-14 Phanes Therapeutics, Inc. Anti-dll3 antibodies and uses thereof
EP3802602A1 (en) * 2018-05-25 2021-04-14 Alector LLC Anti-sirpa antibodies and methods of use thereof
CN110577597B (zh) * 2018-06-11 2021-10-22 康诺亚生物医药科技（成都）有限公司 一种阻断CD47和SIRPα相互作用的抗体
KR20250079073A (ko) 2018-07-10 2025-06-04 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 항 SIRPα 항체
WO2020033646A1 (en) * 2018-08-08 2020-02-13 Orionis Biosciences, Inc. SIRP1α TARGETED CHIMERIC PROTEINS AND USES THEREOF
CN110878123B (zh) * 2018-09-05 2022-08-23 华瑞同康生物技术（深圳）有限公司 一种抗tk1原核重组单链抗体及制备方法
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
SG11202102851XA (en) * 2018-09-27 2021-04-29 Celgene Corp SIRPa BINDING PROTEINS AND METHODS OF USE THEREOF
US12331320B2 (en) 2018-10-10 2025-06-17 The Research Foundation For The State University Of New York Genome edited cancer cell vaccines
JP7536025B2 (ja) * 2018-10-17 2024-08-19 タラック セラピューティクス，インク． 免疫調節性ポリヌクレオチドコンジュゲートと使用方法
CN113286613A (zh) * 2018-10-29 2021-08-20 Umc乌得勒支控股有限公司 IgA介导的通过中性粒细胞的CD47-SIRPα检查点抑制对异常细胞的杀伤
EP3876977A1 (en) 2018-11-06 2021-09-15 The Regents Of The University Of California Chimeric antigen receptors for phagocytosis
EP3880239A4 (en) * 2018-11-14 2022-11-23 Arch Oncology, Inc. THERAPEUTIC SIRPalpha ANTIBODIES
CA3118966A1 (en) * 2018-11-15 2020-05-22 Byondis B.V. Humanized anti-sirpa antibodies
US20220235144A1 (en) * 2019-03-04 2022-07-28 Qilu Puget Sound Biotherapeutics Corporation Anti-sirp-alpha antibodies
US11013764B2 (en) 2019-04-30 2021-05-25 Myeloid Therapeutics, Inc. Engineered phagocytic receptor compositions and methods of use thereof
BR112021024003A2 (pt) 2019-05-31 2022-04-19 Alx Oncology Inc Métodos de tratamento de câncer com fusão sirp alfa-fc em combinação com um inibidor de checkpoint imunológico
CN114206912B (zh) * 2019-06-07 2025-02-11 Alx肿瘤生物技术公司 用于在血清学测定中减少结合cd47的药物的干扰的方法和试剂
CR20210687A (es) 2019-06-25 2022-03-03 Gilead Sciences Inc PROTEÍNAS DE FUSIÓN FLT3L-Fc Y MÉTODOS DE USO
WO2021003074A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Crystal Bioscience Inc. Anti-cd38 antibody and methods of use thereof
US12441802B2 (en) 2019-07-03 2025-10-14 Crystal Bioscience Inc. Anti-B7-H3 antibody and methods of use thereof
KR102236127B1 (ko) 2019-08-08 2021-04-07 주식회사 하울바이오 티로시나아제를 억제하는 항-티로시나아제 항체 및 이의 용도
WO2021032078A1 (en) * 2019-08-20 2021-02-25 Elpiscience (Suzhou) Biopharma, Ltd. Novel anti-sirpa antibodies
JP7831937B2 (ja) 2019-09-03 2026-03-17 クリエイト・メディシンズ，インコーポレーテッド ゲノム組込みのための方法および組成物
CN114555123B (zh) 2019-10-18 2024-04-02 四十七公司 用于治疗骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病的联合疗法
CN110734897A (zh) * 2019-10-31 2020-01-31 浙江蓝盾药业有限公司 杂交瘤细胞株12g6、抗体及其应用
KR20220091576A (ko) 2019-10-31 2022-06-30 포티 세븐, 인코포레이티드 혈액암의 항-cd47 및 항-cd20 기반 치료
WO2021102173A1 (en) * 2019-11-21 2021-05-27 Unity Biotechnology Antibodies directed to tie-2 and methods of use
AU2020394204A1 (en) 2019-11-27 2022-06-02 ALX Oncology Inc. Combination therapies for treating cancer
US10980836B1 (en) 2019-12-11 2021-04-20 Myeloid Therapeutics, Inc. Therapeutic cell compositions and methods of manufacturing and use thereof
JP7437815B2 (ja) * 2019-12-24 2024-02-26 ラノバ メディシンズ リミテッド 抗ＳＩＲＰαモノクローナル抗体およびその使用
LT4081305T (lt) 2019-12-24 2024-11-25 Carna Biosciences, Inc. Diacilglicerolio kinazę moduliuojantys junginiai
TWI869528B (zh) 2020-01-13 2025-01-11 美商威特拉公司 C5ar1抗體分子及其用途
KR20260017503A (ko) 2020-02-14 2026-02-05 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 Ccr8에 결합하는 항체 및 융합 단백질, 및 이의 용도
BR112022017136A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Tallac Therapeutics Inc Conjugação mediada por transglutaminase
KR20210122185A (ko) * 2020-03-31 2021-10-08 웰마커바이오 주식회사 Igsf1에 대한 항체를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 이를 이용한 암 치료 방법
US12343377B2 (en) 2020-06-01 2025-07-01 ALX Oncology Inc. Combination therapies comprising a hypomethylation agent for treating cancer
AU2021288440A1 (en) * 2020-06-10 2022-12-22 Crystal Bioscience Inc. Anti-BDNF antibodies and methods of use thereof
WO2022020583A1 (en) * 2020-07-24 2022-01-27 The Board Of Trustees Of The Leland Standford Junior University Compositions and methods for modulation of sirpalpha-mediated signaling
EP4192883A4 (en) * 2020-08-05 2024-12-04 Crystal Bioscience Inc. Anti-tigit antibody and methods of use thereof
TW202219069A (zh) * 2020-09-04 2022-05-16 大陸商江蘇恆瑞醫藥股份有限公司 ＳＩＲＰγ變體及其融合蛋白
CA3197423A1 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Daniel Getts Engineered chimeric fusion protein compositions and methods of use thereof
JP7663265B2 (ja) * 2020-11-30 2025-04-16 クレ バイオテクノロジ （シャンハイ） カンパニー リミテッド 抗ＳＩＲＰα抗体またはその抗原結合断片および適用
WO2022120286A1 (en) 2020-12-06 2022-06-09 ALX Oncology Inc. Multimers for reducing the interference of drugs that bind cd47 in serological assays
CN112574310B (zh) * 2020-12-11 2023-05-05 浙江博锐生物制药有限公司 抗SIRPα抗体及其用途
EP4308133A4 (en) 2021-03-17 2025-01-22 Myeloid Therapeutics, Inc. MANIPULATED CHIMERIC FUSION PROTEIN COMPOSITIONS AND METHODS OF USE THEREOF
TW202302145A (zh) 2021-04-14 2023-01-16 美商基利科學股份有限公司 ＣＤ４７／ＳＩＲＰα結合及ＮＥＤＤ８活化酶Ｅ１調節次單元之共抑制以用於治療癌症
AU2022272235A1 (en) 2021-05-11 2023-12-21 Create Medicines, Inc. Methods and compositions for genomic integration
JP2024520902A (ja) 2021-05-13 2024-05-27 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド がんを治療するための併用療法
TW202313094A (zh) 2021-05-18 2023-04-01 美商基利科學股份有限公司 使用ＦＬＴ３Ｌ—Ｆｃ融合蛋白之方法
BR112023025194A2 (pt) 2021-06-04 2024-02-27 Boehringer Ingelheim Int Anticorpos anti-sirp-alfa
KR20240005901A (ko) 2021-06-23 2024-01-12 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 디아실글리세롤 키나제 조절 화합물
CA3222277A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271659A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
WO2022271677A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Gilead Sciences, Inc. Diacylglyercol kinase modulating compounds
JP2024527551A (ja) 2021-06-29 2024-07-25 シージェン インコーポレイテッド 非フコシル化抗ｃｄ７０抗体及びｃｄ４７アンタゴニストの組み合わせを用いるがんを処置する方法
WO2023010076A1 (en) * 2021-07-30 2023-02-02 Alector Llc Anti-sirp-alpha antibodies and methods of use thereof
WO2023020459A1 (zh) 2021-08-17 2023-02-23 杭州九源基因工程有限公司 靶向SIRPα的单克隆抗体及其用途
US20230183216A1 (en) 2021-10-28 2023-06-15 Gilead Sciences, Inc. Pyridizin-3(2h)-one derivatives
EP4422756A1 (en) 2021-10-29 2024-09-04 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
CA3236564A1 (en) * 2021-11-02 2023-05-11 Visterra, Inc. Fc variants with abolished binding to fcgammar and c1q
WO2023088429A1 (zh) * 2021-11-19 2023-05-25 杭州尚健生物技术有限公司 SIRPα变体及其应用
CN118488946A (zh) 2021-12-22 2024-08-13 吉利德科学公司 Ikaros锌指家族降解剂及其用途
EP4452415B1 (en) 2021-12-22 2026-02-25 Gilead Sciences, Inc. Ikaros zinc finger family degraders and uses thereof
TW202340168A (zh) 2022-01-28 2023-10-16 美商基利科學股份有限公司 Ｐａｒｐ７抑制劑
WO2023154578A1 (en) 2022-02-14 2023-08-17 Sana Biotechnology, Inc. Methods of treating patients exhibiting a prior failed therapy with hypoimmunogenic cells
CA3253296A1 (en) 2022-03-17 2023-09-21 Gilead Sciences, Inc. Zinc Finger Degradation Agents of the Ikaros Family and Their Uses
WO2023183313A1 (en) 2022-03-22 2023-09-28 Sana Biotechnology, Inc. Engineering cells with a transgene in b2m or ciita locus and associated compositions and methods
AU2023240346A1 (en) 2022-03-24 2024-09-19 Gilead Sciences, Inc. Combination therapy for treating trop-2 expressing cancers
TWI876305B (zh) 2022-04-05 2025-03-11 美商基利科學股份有限公司 用於治療結腸直腸癌之組合療法
CA3247812A1 (en) * 2022-04-20 2023-10-26 Biosion Inc. Antibodies targeting Syrp-Alpha and their uses
WO2023205719A1 (en) 2022-04-21 2023-10-26 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
JP2025523369A (ja) 2022-06-01 2025-07-23 エーエルエックス オンコロジー インコーポレイテッド 尿路上皮癌腫を治療するための併用療法
US20240116928A1 (en) 2022-07-01 2024-04-11 Gilead Sciences, Inc. Cd73 compounds
WO2024064668A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Gilead Sciences, Inc. FOCAL IONIZING RADIATION AND CD47/SIRPα DISRUPTION ANTICANCER COMBINATION THERAPY
KR102584898B1 (ko) * 2022-10-24 2023-10-04 연세대학교 산학협력단 자궁내막암 진단 방법 및 이를 이용한 키트
EP4619435A1 (en) 2022-11-16 2025-09-24 Boehringer Ingelheim International GmbH Predictive efficacy biomarkers for anti-sirpa antibodies
WO2024125330A1 (en) * 2022-12-16 2024-06-20 Beijing Neox Biotech Limited ANTIBODIES AGAINST SIRPα AND USES THEREOF
WO2024125331A1 (en) * 2022-12-16 2024-06-20 Beijing Neox Biotech Limited ANTIBODIES AGAINST SIRPα AND USES THEREOF
EP4638436A1 (en) 2022-12-22 2025-10-29 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
CN118546255A (zh) * 2023-02-24 2024-08-27 恒翼生物医药(上海)股份有限公司 一种靶向αvβ3和CD47的双功能融合蛋白以及其应用
CN120882725A (zh) 2023-04-11 2025-10-31 吉利德科学公司 Kras调节化合物
WO2024220917A1 (en) 2023-04-21 2024-10-24 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
US20250042922A1 (en) 2023-06-30 2025-02-06 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds
AU2024297978A1 (en) 2023-07-26 2026-02-05 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
US20250066328A1 (en) 2023-07-26 2025-02-27 Gilead Sciences, Inc. Parp7 inhibitors
AU2024337913A1 (en) 2023-09-08 2026-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine-containing polycyclic derivatives as kras g12d modulating compounds
WO2025054347A1 (en) 2023-09-08 2025-03-13 Gilead Sciences, Inc. Kras g12d modulating compounds
US20250154172A1 (en) 2023-11-03 2025-05-15 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2025137640A1 (en) 2023-12-22 2025-06-26 Gilead Sciences, Inc. Azaspiro wrn inhibitors
US20250376484A1 (en) 2024-05-21 2025-12-11 Gilead Sciences, Inc. Prmt5 inhibitors and uses thereof
WO2026039365A1 (en) 2024-08-12 2026-02-19 Gilead Sciences, Inc. Kras modulating compounds

Family Cites Families (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
EP0368684B2 (en) 1988-11-11 2004-09-29 Medical Research Council Cloning immunoglobulin variable domain sequences.
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP1690934A3 (en) 1990-01-12 2008-07-30 Abgenix, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ATE300615T1 (de) 1990-08-29 2005-08-15 Genpharm Int Transgene mäuse fähig zur produktion heterologer antikörper
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
FI941572L (fi) 1991-10-07 1994-05-27 Oncologix Inc Anti-erbB-2-monoklonaalisten vasta-aineiden yhdistelmä ja käyttömenetelmä
AU675929B2 (en) 1992-02-06 1997-02-27 Curis, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
US5472556A (en) 1993-06-24 1995-12-05 Alfred D. Lobo Co. Flow-through linear transfer system for making a laminate from synthetic resinous sheets
FR2707446B1 (fr) 1993-07-07 1995-08-11 Pouyet Int Dispositif terminal d'interconnexion téléphonique d'abonné.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
CA2219361C (en) 1995-04-27 2012-02-28 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
EP0823941A4 (en) 1995-04-28 2001-09-19 Abgenix Inc HUMAN ANTIBODIES DERIVED FROM IMMUNIZED XENO MOUSES
EP0914452A2 (en) 1996-06-17 1999-05-12 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Novel ptp20, pcp-2, bdp1, clk and sirp proteins and related products and methods
DE19782089T1 (de) 1996-10-29 1999-12-23 Univ Nebraska At Lincoln Linco Verfahren zum Nachweisen von Punktmutationen in DNA unter Verwendung von Fluoreszenzenergieübergang
US6143559A (en) 1996-11-18 2000-11-07 Arch Development Corporation Methods for the production of chicken monoclonal antibodies
EP1500329B1 (en) 1996-12-03 2012-03-21 Amgen Fremont Inc. Human antibodies that specifically bind human TNF alpha
GB9626026D0 (en) 1996-12-14 1997-01-29 Zeneca Ltd Chemical compounds
CA2226962A1 (en) 1998-02-16 1999-08-16 Marie Sarfati Use of binding agents to cd47 and its ligands in the treatment or the prophylaxis of various inflammatory, autoimmune and allergic diseases and in the treatment of graft rejection
EP1048299A1 (en) 1999-04-28 2000-11-02 Faculteit der Geneeskunde van de Vrije Universiteit Method for inhibiting cell functioning for use in anti-inflammatory and anti-tumour therapies
AU1701001A (en) * 1999-11-30 2001-06-12 Eberhard-Karls-Universitat Tubingen Universitatsklinikum Antibodies against signal regulator proteins
GB9930706D0 (en) 1999-12-24 2000-02-16 Medical Res Council Composition for inhibiting macrophage activity
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
AU2002315052A1 (en) 2001-05-15 2002-11-25 Emory University Polynucleotides and polypeptides relating to the modulation of sirp alpha-cd47
CA2513113A1 (en) 2003-01-23 2004-08-05 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
WO2005014653A2 (en) 2003-02-28 2005-02-17 Protein Design Labs, Inc. Humanized chicken antibodies
US20040213792A1 (en) 2003-04-24 2004-10-28 Clemmons David R. Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
US20100215640A1 (en) 2003-04-24 2010-08-26 The University Of North Carolina At Chapel Hill Method for inhibiting cellular activation by insulin-like growth factor-1
US8613922B2 (en) 2003-04-24 2013-12-24 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for inhibiting diabetic retinopathy with an antibody against integrin associated protein (IAP)
TW200902555A (en) 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
EP2860192B1 (en) 2005-10-12 2017-09-27 MorphoSys AG Generation and profiling of fully human HuCAL GOLD-derived therapeutic antibodies specific for human CD38
US20100239578A1 (en) 2007-10-11 2010-09-23 University Health Network Modulation of sirp-alpha - cd47 interaction for increasing human hematopoietic stem cell engraftment and compounds therefor
CA2965198C (en) 2008-01-15 2021-02-16 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Markers of acute myeloid leukemia stem cells
AU2009205665B2 (en) 2008-01-15 2013-12-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for manipulating phagocytosis mediated by CD47
EP2271657B1 (en) 2008-03-04 2017-03-01 Crystal Bioscience Inc. Gel microdrop composition and method of using the same
EP2111869A1 (en) 2008-04-23 2009-10-28 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Compositions and methods to enhance the immune system
US8592644B2 (en) 2009-08-13 2013-11-26 Crystal Bioscience Inc. Transgenic animal for production of antibodies having minimal CDRS
WO2011041453A1 (en) 2009-09-29 2011-04-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Isolation and use of melanoma cancer stem cells
KR101658479B1 (ko) 2010-02-09 2016-09-21 삼성전자주식회사 불휘발성 메모리 장치, 그것의 동작 방법, 그리고 그것을 포함하는 메모리 시스템
EP2609194B1 (en) 2010-08-27 2019-01-16 University Health Network Methods for enriching pluripotent stem cell-derived cardiomyocyte progenitor cells and cardiomyocyte cells based on sirpa expression
CA2835222C (en) 2011-05-24 2020-08-25 Crystal Bioscience Inc. Transgenic chicken comprising an inactivated immunoglobulin gene
WO2013056352A1 (en) * 2011-10-19 2013-04-25 University Health Network Antibodies and antibody fragments targeting sirp-alpha and their use in treating hematologic cancers
US9394372B2 (en) 2011-10-21 2016-07-19 Crystal Bioscience Inc. In vivo method for generating diversity in a protein scaffold
EP4721752A2 (en) 2011-12-30 2026-04-08 Cellscript, Llc Herstellung und verwendung von in vitro-synthetisierter ssrna zur einführung in säugetierzellen zur induktion einer biologischen oder biochemischen wirkung
CA2887706C (en) 2012-11-05 2022-08-02 Regeneron Pharmaceuticals Genetically modified non-human animals and methods of use thereof
ES2914814T3 (es) 2012-12-17 2022-06-16 Pf Argentum Ip Holdings Llc Tratamiento de células enfermas CD47+ con fusiones SIRP Alfa-Fc
CA2900256C (en) 2013-02-05 2023-03-21 Kim J. HASENKRUG Cd47 targeted therapies for the treatment of infectious disease
PT2970493T (pt) 2013-03-15 2019-06-27 Univ Leland Stanford Junior Métodos para obter doses terapeuticamente eficazes de agentes anti-cd47
ES2898627T3 (es) 2013-04-29 2022-03-08 Univ Leland Stanford Junior Uso de agentes anti-CD47 para mejorar la inmunización
ES2765483T3 (es) 2013-09-18 2020-06-09 Univ Leland Stanford Junior Modulación de las vías de eferocitosis para el tratamiento de una enfermedad aterosclerótica
ES3012974T3 (en) 2014-01-08 2025-04-10 Univ Leland Stanford Junior Targeted therapy for lung cancer
AU2015229448B2 (en) * 2014-03-11 2020-09-03 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Anti SIRP-alpha antibodies and Bi-specific Macrophage Enhancing antibodies
TWI759810B (zh) 2014-08-08 2022-04-01 美商Ａｌｘ腫瘤技術股份有限公司 信號調節蛋白α(signal-regulatory proteinα, SIRP-α)變體構築物及其用途
HUE046661T2 (hu) 2014-08-15 2020-03-30 Merck Patent Gmbh SIRP-alfa immunglobulin fúziós proteinek
FI3656869T4 (fi) 2014-08-26 2025-06-04 Univ Leland Stanford Junior Kantasolujen siirrostaminen kantasoluihin kohdentuvan aineen ja immunoregulatorista signaalia moduloivan aineen yhdistelmän kanssa
EP3012271A1 (en) 2014-10-24 2016-04-27 Effimune Method and compositions for inducing differentiation of myeloid derived suppressor cell to treat cancer and infectious diseases
EP3209769B1 (en) 2014-10-24 2020-08-05 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance
EP3247464B1 (en) 2015-01-21 2019-09-18 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Use of tlr agonist and anti-cd47 agent to enhance phagocytosis of cancer cells
US10618976B2 (en) 2015-06-16 2020-04-14 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University SIRP-α agonist antibody
RU2766690C2 (ru) 2015-07-28 2022-03-15 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Модифицированные моноциты/макрофаги, экспрессирующие химерные антигенные рецепторы, и их применения
EP3341015B2 (en) 2015-08-26 2023-12-27 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Enhanced depletion of targeted cells with cd47 blockade and an immune costimulatory agonist
JP7078533B2 (ja) 2015-10-21 2022-05-31 オーエスイー イムノセラピューティクス 炎症促進性細胞へのマクロファージ分極を改変して癌を治療するための抗ＳＩＲＰａ化合物
US10946042B2 (en) 2015-12-01 2021-03-16 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for selective phagocytosis of human cancer cells
AU2016365829B2 (en) 2015-12-11 2020-02-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Treatment of cancer with dual targeting of CD47 and EGFR
EP3442541B1 (en) 2016-04-10 2021-11-17 Georgia State University Research Foundation, Inc. Composition for use in treating cancer
RS66062B1 (sr) 2016-04-14 2024-11-29 Ose Immunotherapeutics Nova anti-sirpa antitela i njihove terapijske primene
SG11201808465UA (en) 2016-04-14 2018-10-30 Ose Immunotherapeutics NEW ANTI-SIRPa ANTIBODIES AND THEIR THERAPEUTIC APPLICATIONS
US20190153095A1 (en) 2016-07-05 2019-05-23 National University Corporation Kobe University Antitumor Agent
KR102878970B1 (ko) 2016-08-03 2025-10-30 더 보드 어브 트러스티스 어브 더 리랜드 스탠포드 주니어 유니버시티 항-SIRPalpha 항체 요법의 대식세포 증진 효능에서 Fc 수용체 참여의 붕괴
JOP20190009A1 (ar) 2016-09-21 2019-01-27 Alx Oncology Inc أجسام مضادة ضد بروتين ألفا منظم للإشارات وطرق استخدامها
CN118027200A (zh) 2016-12-09 2024-05-14 艾利妥 抗SIRPα抗体及其使用方法
JP7321934B2 (ja) 2017-01-30 2023-08-07 ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー 幹細胞移植のための非遺伝毒性移植前処置レジメン
CN118267470A (zh) 2017-04-13 2024-07-02 赛罗帕私人有限公司 抗SIRPα抗体
CN118271443A (zh) 2017-05-16 2024-07-02 拜奥迪斯私人有限公司 抗SIRPα抗体
WO2019023347A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Forty Seven, Inc. ANTI-SIRP-ALPHA ANTIBODIES AND ASSOCIATED METHODS
MX2020009774A (es) 2018-03-21 2020-10-08 Alx Oncology Inc Anticuerpos contra proteína alfa reguladora de señal y métodos de uso.
EP3802602A1 (en) 2018-05-25 2021-04-14 Alector LLC Anti-sirpa antibodies and methods of use thereof
KR20250079073A (ko) 2018-07-10 2025-06-04 고쿠리츠다이가쿠호진 고베다이가쿠 항 SIRPα 항체
US11591390B2 (en) 2018-09-27 2023-02-28 Celgene Corporation SIRP-α binding proteins and methods of use thereof
EP3880239A4 (en) 2018-11-14 2022-11-23 Arch Oncology, Inc. THERAPEUTIC SIRPalpha ANTIBODIES
CA3118966A1 (en) 2018-11-15 2020-05-22 Byondis B.V. Humanized anti-sirpa antibodies

Also Published As

Publication number Publication date
GEAP202215050A (en) 2022-11-10
SI3515490T1 (sl) 2023-06-30
US20220002434A1 (en) 2022-01-06
US20210363269A1 (en) 2021-11-25
PL3515490T3 (pl) 2022-12-19
US20260001960A1 (en) 2026-01-01
JP2024153615A (ja) 2024-10-29
CN117756937A (zh) 2024-03-26
HUE060170T2 (hu) 2023-02-28
IL265439B1 (en) 2024-04-01
JP7181874B2 (ja) 2022-12-01
JP7508425B2 (ja) 2024-07-01
CL2021000704A1 (es) 2021-07-30
US20180105600A1 (en) 2018-04-19
US11401338B2 (en) 2022-08-02
CN109862915A (zh) 2019-06-07
IL265439B2 (en) 2024-08-01
IL265439A (en) 2019-05-30
EP4119580B1 (en) 2025-11-05
JP2022003031A (ja) 2022-01-11
IL297891B1 (en) 2024-04-01
EP3515490A1 (en) 2019-07-31
EP3515490B8 (en) 2022-09-14
CO2019003809A2 (es) 2019-04-30
WO2018057669A1 (en) 2018-03-29
US20230018821A1 (en) 2023-01-19
GEAP202315361A (en) 2023-04-25
BR112019003027A2 (pt) 2019-05-14
ZA201900937B (en) 2023-05-31
CN109862915B (zh) 2023-12-12
EP3515490B1 (en) 2022-08-10
GEP20237528B (en) 2023-08-10
NZ750161A (en) 2025-08-29
PH12019500600A1 (en) 2019-06-03
RU2019111888A3 (sr) 2020-10-22
IL297891B2 (en) 2024-08-01
PE20190575A1 (es) 2019-04-22
SMT202200426T1 (it) 2022-11-18
GEP20237480B (en) 2023-03-27
US11242404B2 (en) 2022-02-08
MA46290A (fr) 2019-07-31
JOP20190009A1 (ar) 2019-01-27
RU2019111888A (ru) 2020-10-22
PT3515490T (pt) 2022-10-18
KR20190052100A (ko) 2019-05-15
CA3034480A1 (en) 2018-03-29
EP4119580A1 (en) 2023-01-18
AU2017332285B2 (en) 2024-07-04
SG10201912878UA (en) 2020-02-27
AU2017332285A1 (en) 2019-02-14
CN117946268A (zh) 2024-04-30
MX2019003168A (es) 2019-06-10
DK3515490T3 (da) 2022-10-24
US12404340B2 (en) 2025-09-02
SA519401371B1 (ar) 2022-12-04
UA126281C2 (uk) 2022-09-14
KR102601298B1 (ko) 2023-11-15
MY197854A (en) 2023-07-20
EP3515490A4 (en) 2020-04-29
LT3515490T (lt) 2022-11-10
CL2019000668A1 (es) 2019-05-31
HRP20221323T1 (hr) 2022-12-23
IL297891A (en) 2023-01-01
ES2932602T3 (es) 2023-01-23
JP2020503057A (ja) 2020-01-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11242404B2 (en) Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use
US20210284739A1 (en) Anti-cd74 antibodies, compositions comprising anti-cd74 antibodies and methods of using anti-cd74 antibodies
JP2021518142A (ja) シグナル調節タンパク質αに対する抗体及び使用方法
RS66901B1 (sr) Anti-cd3 antitela i njihova upotreba
RU2771964C2 (ru) Антитела против сигнал-регуляторного белка альфа и способы их применения
HK40009608B (zh) 针对信号调控蛋白α的抗体和使用方法
NL2022494B1 (en) Novel CD40-binding antibodies
HK40009608A (en) Antibodies against signal-regulatory protein alpha and methods of use
KR20250039403A (ko) 항-tigit 항체를 사용한 암 치료 방법
HK40011075A (en) Anti-tigit antibodies, anti-pvrig antibodies and combinations thereof